RS55148B1 - Smeša lipozoma - Google Patents

Description

Tehnička oblast

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na novu smešu lipozoma koja sadrži eri bulin ili njegove farmakološki prihvatljive soli. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na postupak za proizvodnju smeše lipozoma.

Osnova pronalaska

[0002] Lipozomi su mikroskopski zatvoreni mehurići kod kojih je unutrašnja faza inkapsulirana unutar jednog ili više dvojnih slojeva lipi da, i koji mogu da zadrže materije rastvorne u vodi u unutrašnjoj fazi, a lipofiine materije u lipidnom dvosloju. Kada je u Hpozomima inkapsulirano aktivno jedinjenje, i kada se ono isporučuje ciljnom tkivu, značajna pitanja su kako sa visokom efikasnošću inkapsulirati aktivno jedinjenje u Iipozom, i kako obezbediti stabilnu retenciju aktivnog jedinjenj a u lipozomu.

[0003] Prilikom inkapsulacije lipofilnih jedinjenja u Iipozom, relativno lako se može postići visok stepen inkapsulacije, ali, izuzev u slučaju jedinjenja koja imaju veoma visok membranski afinitet, kao što je amfotericin B (glavni agens u lipozomskom leku AmBisome), retenciona stabilnost u krvnoj plazmi je obično niska, pa je teško postići dovoljno poboljšanje farmakokinetike. Što se tiče postupaka za inkapsulaciju jedinjenja rastvorljivih u vodi u Iipozom, postoje različiti postupci, kao što je postupak lipidnog filma (Vorteks postupak), postupak reverzno faznog uparavanja, postupak uklanjanja surfaktanata, postupak zamrzavanja i otapanja, kao i postupci daljinskog punjenja (postupak sa pH gradijentom, postupak sa jonskim gradijentom). Međutim, samo postupci daljinskog punjenja imaju stepen inkapsulacije oko 100%; stepen inkapsulacije dobijen drugim postupcima je reda veličine svega 5 do 30%.

[0004]Od postupaka daljinskog punjenja, poznati su oni kod kojih se koristi pH gradijent i gradijent jona amonijum sulfata. Postupak sa pH gradijentom, sto je postupak daljinskog punjenja kod koga se koristi pH gradijent, predstavlja tehniku inkorporisanja jedinjenja u Iipozom pomoću pomeranja ravnoteže molekulske/jonske disocijacije usled pH vrednosti ciljnog jedinjenja.

[0005]Kao jedan od primera za jedinjenje inkapsulirano u lipozomu pomoću postupka sa pH gradijentom može, na primer, da se navede doksorubicin ( DOK, pKa: 8,2). Nakon pripreme rastvora lipozoma pomoću puferskog rastvora pH 4, spoljašnja faza lipozoma se zamenjuje puferskim rastvorom pH 7. U slučaju kada se DOX dodaje u ovaj rastvor lipozoma, pošto je molekulski DOX u rastvoru pH 7 lipofilan, on prelazi u lipozomsku membranu, a ne u vodenu fazu. U slučaju kada DOX koji je prešao u lipozomsku membranu dalje dolazi u kontakt sa unutrašnjom fazom lipozoma koja ima pH 4, on prelazi u jonski oblik, i inkorporše se u unutrašnju fazu lipozoma. Na ovaj način, DOX se transportuje od spoljašnje faze do unutrašnje faze lipozoma pomeranjem ravnoteže disocijacije (pogledajte Nepatentnu literaturu 1, Nepatentnu literaturu 2 i Patentnu literaturu 1).

[0006] Postoji veliki broj objavljenih tehnika za unapređenje ovog postupka daljinskog punjenja. U Nepatentnoj literaturi 3 opisana je tehnika za poboljšanje stepena inkapsulacije aktivnih jedinjenja, tako što je uz aktivno jedinjenje u spoljnu fazu lipozoma dodavan etanol, kada se postupak sa pH gradijentom primenjuje kod lipozoma specijalnog sastava, koji se zovu lipozomi bez holesterola.

[0007]U Patentnoj literaturi 2, pored postupka sa pH gradijentom, opisana je tehnika za poboljšanje stepena inkapsulacije aktivnih jedinjenja tako stoje omogućeno postojanje jona bakra u unutrašnjoj fazi lipozoma.

[0008] Umesto pH gradijenta kod postupka sa pH gradijentom, kod amonijum sulfatnog postupka, koji predstavlja postupak daljinskog punjenja kod koga se koristi jonski gradijent amonijum sulfata, kao tehnika za inkorporaciju aktivnih jedinjenja u unutrašnju fazu lipozoma koristi se jonski gradijent, kao što je bivalentni amonijum sulfat (pogledajte Nepatentnu literaturu 1 i Patentnu literaturu 3).

[0009]Pored jonskog gradijenta na osnovu amonijum sulfata, Patentna literatura 4 opisuje tehniku za inkorporaciju aktivnih jedinjenja u Iipozom tako što sc u spoljnu fazu lipozoma sa aktivnim jedinjenjem dodaje boronska kiselina.

[0010JUmesto jonskog gradijenta na osnovu amonijum sulfata, Patentna literatura 5 opisuje tehniku u kojoj je, u poređenju sa slučajem kada se koristi amonijum sulfat, stepen otpuštanja aktivnog jedinjenja poboljšan inkorporacijom aktivnog jedinjenja u Iipozom pomoću jonskog gradijenta glukuronske kiseline.

[0011]Stoga su, sa stanovišta stepena inkapsulacije, postupci daljinskog punjenja izvanredni postupci inkapsulacije. Međutim, u slučaju kada se primenjuju postupci daljinskog punjenja, osim u specijalnim slučajevima, kao što je doksil (lipozomski preparat DOX-a), gde je aktivno jedinjenje inkapsulirano u unutrašnjoj fazi lipozoma u kristalnom obliku, problem je što aktivno jedinjenje teži da iscuri iz lipozoma u krvnu plazmu, i retenciona stabilnost aktivnog jedinjenja je niska.

[0012]Kao što je gore opisano, trenutno je kod klasičnih tehničkih postupaka stanje takvo da je teško istovremeno postići visok stepen inkapsulacije aktivnog jedinjenja u Iipozom i retencionu stabilnost aktivnog jedinjenja u lipozomu.

Literatura dosadašnjeg stanja tehnike

Patentna literatura

[0013]

Patentna literatura 1: United States Patent No. 5192549, specifikacija

Patentna literatura 2: PCT International Publication WO 2006/037230, brošura

Patentna literatura 3: United States Patent No. 5316771, specifikacija

Patentna literatura 4: United States Patent No. 6051251, specifikacija

Patentna literatura 5: PCT International Publication WO 2005/046643, brošura

Nepatentna literatura

[0014]Nepatentna literatura 1: Yasuyuki Sazuka, „Liposome Preparation Method", ,,New Developments in Liposome Application: Toward the Development of Artificial Cells"

(Kazunari Akivoshi, Shigeru Tsujii, editorial supervision) NTS, (2005), str. 33-37.

Nepatentna literatura 2: Mayer LD et al., Biochimica et Biophysica Acta, (1986), 857: str, 123-126.

Nepatentna literatura 3: N. Dos Santos et al., Biochimica et Biophysica Acta, (2004), 1661 (1): str. 47-60.

Kratak pregled pronalaska

Problem koji pronalazak treba da reši

[0015] Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi smešu lipozoma sa visokim stepenom inkapsulacije i retencionom stabilnošću aktivnog jedinjenja.

Sredstva za rešavanje problema

[0016] Kao rezultat marljivog istraživanja sa ciljem rešavanja gore pomenutih problema, pronalazači ovog pronalaska su, u vezi sa sastavom lipozoma čije aktivno jedinjenje je eribulin ili njegova farmakološki prihvatljiva so, otkrili da su stepen inkapsulacije i retenciona stabilnost aktivnog jedinjenja u smeši lipozoma izuzetno visoki, čime su usavršili predmetni pronalazak.

[0017] Naime, predmetni pronalazak je sledeći.

(1) Smeša lipozoma koja sadrži Iipozom, i sadrži (i) aktivno jedinjenje, (ii)

amonijumovu so i (iii) so, kiselinu, bazu, i/ili aminokiselinu u unutrašnjoj fazi lipozoma, naznačena time što je aktivno jedinjenje eribulin ili njegova farmakološki prihvatljiva so.

(2) Smeša lipozoma u skladu sa tačkom 1, naznačena time što je smeša lipozoma u

čvrstom ili tečnom obliku.

(3) Smeša lipozoma u skladu sa tačkom 1 ili 2, naznačena time što je koncentracija

gore pomenute amomjumove soli 10 mM ili veća.

(4) Smeša lipozoma u skladu sa tačkom od 1 do 3, naznačena time što je koncentracija

gore pomenute soli 1 do 300 mmol/1.

(5) Smeša lipozoma u skladu sa tačkom od 1 do 4, naznačena time što je koncentracija

gore pomenute kiseline 1 do 300 mM.

(6) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 5, naznačena time što je koncentracija gore pomenute aminokiseline 1 do 300 mM. (7) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 6, naznačena time što je

koncentracija gore pomenute baze 1 do 300 mM.

(8) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od I do 7, naznačena time što je koncentracija gore pomenutog aktivnog jedinjenja 0,01 do 300 mg/ml. (9) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 8, naznačena time što je gore pomenuto aktivno jedinjenje eribulin mezilat. (10) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 9, naznačena time što unutrašnja faza lipozoma nadalje sadrži amonijum sulfat, limunsku kiselinu i aktivnojedinjenje. (11) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 10, naznačena time što spoljašnja faza lipozoma sadrži šećer, elektrolit, i/i I i aminokiselinu. (12) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 11, naznačena time što spoljašnja faza lipozoma sadrži šećer, elektrolit i aminokiselinu. (13) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 10, naznačena time što spoljašnja faza lipozoma sadrži šećer ili elektrolit, i aminokiselinu. (14) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 11 do 13, naznačena time što je koncentracija gore pomenutog šećera 2 do 20%. (15) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 11 do 14, naznačena time što je koncentracija gore pomenute aminokiseline 1 do 300 mM. (16) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 15, naznačena time što spoljašnja faza lipozoma sadrži saharozu ili natrijum hlorid, i histidin. (17) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 16, naznačena time što spoljašnja faza gore pomenutog lipozoma ne sadrži ciklodekstrin u značajnijoj količini. (18) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 17, naznačena time što Iipozom sadrži hidrogenizovani fosfatidilholin. (19) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 18, naznačena time što Iipozom sadrži holesterol. (20) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od l do 19, naznačena time što Iipozom sadrži kondenzat metoksipolietilen glikola. (21) Smeša lipozoma prema tački 20, naznačena time što je gore pomenuti kondenzat metoksipolietilen glikola, kondenzat distearoilfosfatidil etanolamino polietilen glikola. (22) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 21, naznačena time što Iipozom sadrži hidrogenizovani fosfatidiiholin, holesterol i kondenzat distearoilfosfatidil etanolamino polietilen glikola. (23) Smeša lipozoma prema tački 22, naznačena time što sadrži 10 do 80% gore pomenutog hidrogenizovanog fosfatidilholina, 1 do 60% gore pomenutog holesterola i 0 do 50% gore pomenutog kondenzata distearoilfosfatidil etanolamino polietilen glikola. (24) Smeša lipozoma u skladu sa bilo kojom tačkom od 1 do 23, naznačena time što Iipozom sadrži hidrogenizovani fosfatidiiholin iz soje, holesterol i polietilen glikol 2000-fosfatidiletanolamin. (25) Postupak za proizvodnju smeše lipozoma, prema bilo kojoj tački od 1 do 24, uključujući: korak dobijanja dispergovane tečnosti lipozoma, koja sadrži Iipozom; korak u kome se gore pomenuta dispergovana tečnost lipozoma meša sa gore pomenutim aktivnim jedinjenjem; i

korak u kome se gore pomenuto aktivno jedinjenje uvodi u unutrašnju fazu lipozoma gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma,

naznačen time što korak dobijanja gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma uključuje: korak u kome se dobija rastvor za pripremu lipozoma, koji sadrži Iipozom i koji sadrži amonijumovu so u unutrašnjoj fazi lipozoma i spoljašnjoj fazi lipozoma; i korak u kome se spoljašnja faza lipozoma gore pomenutog rastvora za pripremu lipozoma zamenjuje ili razblažuje, i

naznačen time sto je korak u kome se gore pomenuta spoljašnja faza lipozoma zamenjuje ili razblažuje, korak u kome se pH spoljašnje faze lipozoma

povećava u odnosu na pH unutrašnje faze lipozoma.

(26) Postupak prema tački 25, naznačen time što gore pomenuta dispergovana tečnost lipozoma ne sadrži značajnije količine amonijumove soli u spoljašnjoj fazi lipozoma. (27) Postupak prema tački 25 ili 26, naznačen time što pH spoljašnje faze lipozoma gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma iznosi 3 do 10. (28) Postupak u skladu sa bilo kojom tačkom od 25 do 27, naznačen time Što pH spoljašnje faze lipozoma gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma iznosi 7 do 10. (29) Postupak u skladu sa tačkom 27 ili 28, što gore pomenuti pH predstavlja pH spoljašnje faze lipozoma gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma u koraku u

kome se gore pomenuta dispergovana tečnost lipozoma i gore pomenuto aktivno jedinjenje mešaju.

(30) Postupak u skladu sa bilo kojom tačkom od 25 do 29, naznačen time što je korak

u kome se gore pomenuta spoljašnja faza lipozoma zamenjuje ili razblažuje, korak u kome razlika između pH spoljašnje faze lipozoma i pH unutrašnje faze lipozoma iznosi od 1 do 5.

(31) Postupak u skladu sa bilo kojom tačkom od 25 do 30, naznačen time što pH gore

pomenute unutrašnje faze lipozoma iznosi 3 do 9.

(32) Postupak u skladu sa bilo kojom tačkom od 25 do 31, naznačen time što pH gore

pomenute unutrašnje faze lipozoma iznosi 4 do 9.

(33) Postupak u skladu sa bilo kojom tačkom od 25 do 32, naznačen time što pH gore

pomenute unutrašnje faze lipozoma iznosi 5 do 8.

(34) Postupak u skladu sa bilo kojom tačkom od 25 do 33, naznačen time što je

spoljašnja faza lipozoma rastvor koji sadrži elektrolit u koraku u kojem se uvodi gore pomenuto aktivno jedinjenje.

(35) Postupak u skladu sa bilo kojom tačkom od 25 do 34, naznačen time što gore

pomenuta dispergovana tečnost lipozoma ne sadrži značajnije količine ciklodekstrina u unutrašnjoj fazi lipozoma. (36) Postupak u skladu sa bilo kojom tačkom od 25 do 35, koji dalje sadrži korak u kome se neutrališe pH spoljašnje faze lipozoma.

Efekti pronalaska

[0018]Prema predmetnom pronalasku, moguće je ponuditi novu smešu lipozoma. Smeša lipozoma iz predmetnog pronalaska sadrži aktivno jedinjenje, inkapsulirano u unutrašnjoj fazi lipozoma sa visokim stepenom efikasnosti, i ima visoku retencionu stabilnost aktivnog jedinjenja.

Kratak opis crteža

[0019](SI. 1) prikazujein vitropromene koncentracije eribulin mezilata u smeši lipozoma u plazmi iz krvi pacova (37°C).

(SI. 2) prikazujein vivoantitumorsku aktivnost eribulin mezilata zahvaljujući lipozomu, kod atimičnih miševa sa FaDu ćelijama kancera.

(SI. 3) prikazujein vivoantitumorsku aktivnost eribulin mezilata zahvaljujući lipozomu, kod atimičnih miševa sa ACHN ćelijama kancera.

Najbolji način za realizaciju pronalaska

[0020]U predmetnom pronalasku su specifično opisani načini za realizaciju pronalaska, ali predmetni pronalazak nije ograničen na sledeće načine za realizaciju pronalaska, i može biti realizovan sa različitim izmenama.

[0021]Sadržaji opisani u literaturi navedenoj u predmetnom pronalasku uključeni su u predmetni pronalazak kao reference.

(Definicije)

[0022]„Lipozom" znači mikroskopska zatvorena vezikula koja ima unutrašnju fazu inkapsuliranu lipidnim dvoslojem. U predmetnom pronalasku, u lipozom spada mali jednomembranski lipozom (SUV: mala unilamelama vezikula), veliki jednomembranski lipozom (LU V: velika unilamelarna vezikula), još veći jednomembranski lipozom (GUV: džinovska unilamelarna vezikula), višeslojni lipozom sa višestrukim koncentričnim membranama (MLV: multilamelarna vezikula), lipozom sa većim brojem membrana koje nisu koncentrične, nego nepravilne (MVV: multivezikularna vezikula), itd.

[0023]„Unutrašnja faza lipozoma" znači vodeni region inkapsuliran u lipidnom dvosloju lipozoma, i koristi se u istom značenju kao „unutrašnja vođena faza" i „unutrašnja vođena faza lipozoma." „Spoljašnja vodena faza lipozoma" znači region koji nije inkapsuliran u lipidnom dvosloju lipozoma (to jest, region nezavisan od unutrašnje faze i lipidnog dvosloja) u slučaju kada je lipozom dispergovan u tečnosti.

[0024]„Smeša lipozoma" znači smeša koja sadrži lipozom i koja nadalje sadrži eribulin mezilat u unutrašnjoj fazi lipozoma. U predmetnom pronalasku, smeša lipozoma sadrži i čvrste i tečne oblike.

[0025] „Dispergovana tečnost lipozoma" znači smeša koja sadrži lipozom, i predstavlja smešu koja prethodi uvođenju aktivnog jedinjenja u unutrašnju fazu lipozoma.

[0026]„Rastvor za pripremu lipozoma" znači rastvor koji sadrži lipozom, i predstavlja smešu koja prethodi podešavanju spoljašnje faze lipozoma u cilju inkapsulacije eribulin mezilata u unutrašnju fazu lipozoma.

[0027] „Lipozomski reagens" znači dispergovana tečnost lipozoma, u slučaju kada je u tečnom obliku. U slučaju kada je u Čvrstom obliku, to znači reagens iz koga može da se dobije dispergovana tečnost lipozoma putem rastvaranja ili suspendovanja u propisanom rastvaraču. Rastvarač je opisan u nastavku. Kao što je u nastavku opisano, čvrst lipozomski reagens može da se dobije, na primer, sušenjem dispergovane tečnosti lipozoma.

[0028] U predmetnoj specifikaciji, „mešanje čvrste i tečne faze" uključuje rastvaranje i suspendovanje čvrste supstance u tečnosti, a mešanje, rastvaranje i suspendovanje se koriste na međusobno zamenljiv način. Slično, rastvor i disperzioni medijum se takođe koriste na međusobno zamenljiv način.

[0029] Osim toga, smeša lipozoma, dispergovana tečnost lipozoma, rastvor za pripremu lipozoma i lipozomski reagens iz predmetnog pronalaska ne sadrže ciklodekstrin u značajnijoj količini. „Ne sadrži ciklodekstrin u značajnijoj količini" znači da se ne dodaje ciklodekstrin. Dovoljno je da ciklodekstrin ne bude prisutan u količini u kojoj bi bilo primetno značajno poboljšanje rastvorljivosti (nominalna rastvorljivost) aktivnog jedinjenja zahvaljujući ciklodekstrinu, a čak i u slučaju kada se on dodaje u količini u kojoj značajnije poboljšanje rastvorljivosti aktivnog jedinjenja nije primetno, ne treba da bude izuzet iz primene predmetnog pronalaska.

[0030] Nadalje, u poželjnom načinu predmetnog pronalaska, „dispergovana tečnost lipozoma koja ne sadrži značajniju količinu amonijumove soli u spoljašnjoj fazi lipozoma" znači da amonijumova so nije dodata u spoljašnju fazu lipozoma dispergovane tečnosti lipozoma. Dodavanje amonijumove soli u količini koja je u opsegu kojim može da se postigne cilj predmetnog pronalaska nije isključeno iz primene u predmetnom pronalasku. U slučaju kada je amonijumova so uključena u spoljašnju fazu lipozoma rastvora za pripremu lipozoma, moguće je pripremiti dispergovanu tečnost lipozoma koja ne sadrži značajnije količine amonijumove soli, zamenom ili razblaživanjem spoljašnje faze lipozoma rastvora za pripremu lipozoma, primenom rastvora koji ne sadrži amonijumovu so u značajnijoj količini.

(Aktivno jedinjenje)

[0031]Aktivno jedinjenje u predmetnom pronalasku je eribulin ili njegova farmakološki prihvatljiva so (u nastavku teksta se ponekad pominje kao „eribulin, itd."). Ne postoje naročita ograničenja za farmakološki prihvatljivu so, sve dok se formira eribulin i njegova so, bilo daje u pitanju so neorganske kiseline ili so organske kiseline. Na primer, može da se navede so hlorovođonične kiseline, so sumporne kiseline, citrat, so bromovodonične kiseline, so jodovodonične kiseline, so azotne kiseline, bisulfat, so fosforne kiseline, so superfosforne kiseline, so izonikotinske kiseline, so sirćetne kiseline, so mlečne kiseline, so salicilne kiseline, so vinske kiseline, so pantotenske kiseline, so askorbinske kiseline, so ćiiibarne kiseline, so maleinske kiseline, so fumarne kiseline, so glukonske kiseline, so saharinske kiseline, so mravlje kiseline, so benzojeve kiseline, so glutaminske kiseline, so metansulfonske kiseline, so etansulfonske kiseline, so benzensulfonske kiseline, so p-toluensulfonske kiseline, so pamoinske kiseline (pamoat), i tako dalje. Poželjne od njih su so hlorovođonične kiseline, so sumporne kiseline, so sirćetne kiseline, so fosforne kiseline, citrat i so metansulfonske kiseline, a najpoželjnija od svih je so metansulfonske kiseline. To jest, poželjno aktivno jedinjenje predmetnog pronalaska je eribulin mezilat. Osim toga, prihvatljivo je kao farmakološki prihvatljivu so eribulina koristiti eribulin i so aluminij uma, kalcijuma, litijuma, magnezijuma, kalcijuma[ sic],natrijuma, cinka i dietanolamina. Eribulin ili njegova farmakološki prihvatljiva soje jedinjenje registrovano u brošuri PCT International Publication WO 99/65894 ili u patentu United States Patent 6214865 (sadržaj ovih patenata je ovde obuhvaćen kao referenca), i ima farmakološko dejstvo, uključujući antitumorsko i antimitotičko dejstvo. Eribulin ili njegova farmakološki prihvatljiva so ispoljavaju antitumorsko dejstvo prema melanomu, fibrosarkomu, monocitnoj leukemiji, raku kolona, raku jajnika, raku dojke, raku kostiju, raku prostate, raku pluća i ras-transformisanim fibroblastima.

[0032]Međutim, aktivna jedinjenja koja mogu da se kombinuju sa eribulinom, itd, mogu biti izabrana između jedinjenja koja se primenjuju na polju medicine (uključujući dijagnostičke lekove), kozmetičkih proizvoda, prehrambenih proizvoda, i tako dalje. Kada su u pitanju aktivna jedinjenja, prihvatljivo je kombinovanje jednog ili više jedinjenja koja nisu eribulin itd.

[0033]Kao aktivna jedinjenja mogu se navesti jedinjenja male molekulske mase, itd. Među njima su pogodna jedinjenja koja se primenjuju kao antitumorski agensi, antibakterijski agensi, antiinflamatorni agensi, agensi protiv infarkta miokarda i kontrastni agensi.

[0034]Što se tiče molekulske mase aktivnog jedinjenja, poželjan je opseg od 100 do 2000, poželjniji je opseg od 200 do 1500, a još poželjniji je opseg od 300 do 1000. U tim opsezima je permeabilnost membrane lipozoma aktivnog jedinjenja uglavnom zadovoljavajuća, i predmetni pronalazak može biti primenjen na pogodan način.

[0035]Aktivna jedinjenja uključuju jedinjenja rastvorna u vodi i lipofilna jedinjenja, i sve dok su ona manje ili više rastvorna u vodi ili organskim rastvaračima, predmetni pronalazak može da se primeni.

[0036]Ne postoje posebna ograničenja za antitumorske agense u predmetnom pronalasku, i mogu da se navedu, na primer, derivati kamptotekina kao što je irinotekan hidrohlorid, nogitekan hidrohlorid, egzatekan, RFS-2000, lurtotekan, BNP-1350, Bay-383441, PNU-166148, IDEC-132, BN-80915, DB-38, DB-81, DB-90, DB-91, CKD-620, T-0128, ST-1480, ST-1481, DRF-1042, DE-310; derivati taksana kao što je docetaksel hidrat, docetaksel, pakritaksel, IND-5109, BMS-184476, BMS-188797, T-3782, TAX-1011, SB-RA-31012, SBT-1514 i DJ-927; ifosfamid, nimstin hidrohlorid, karvokon, ciklofosfamid, dakarbazin, tiotepa, busulfan, melfaran, ranimustin, estramustin fosfat natrij um, 6-merkaptopurin ribozid, enocitabin, gemcitabin hidrohlorid, karmfur, citarabin, citarabin okfosfat, tegafur, doksifluridin, hidroksikarbamid, fluorouracil, metotreksat, merkaptopurin, fludarabin fosfat, aktinomicin D, aklarubicin hidrohlorid, idarubicin hidrohlorid, pirarubicin hidrohlorid, epirubicin hidrohlorid, daunorubicin hidrohlorid, doksorubicin hidrohlorid, epirubicin, pirarubicin, daunorubicin, doksorubicin, pirarubicin hidrohlorid, bleomicin hidrohlorid, zinostatin stimalamer, neokarzinostatin, mitomicin C, bleomicin sulfat, peplomicin sulfat, etopozid, vinorelbin tartarat, vinkrestin sulfat, vindezin sulfat, vinblastin sulfat, amrubicin hidrohlorid, gefinitib, egzemestan, kapecitabin, TNP-470, TAK-165, KW-2401, KW-2170, KW-2871, KT-5555, KT-8391, TZT-1027, S-3304, CS-682, YM-511, YM-598, TAT-59, TAS-101, TAS-102, TA-106, FK-228, FK-317, E7070, (8E, 12E, I4E)-7-[(4-cikloheptipiperazin-1 -il)karbonil]oksi-3,6,16,21 -tetraliidroksi-6,10,12,16,20-pentametii-18,19-epoksitrikoza-8,12,14-tiren-ll-olid (E7107), KRN-700, KRN-5500, J-107088, HMN-214, SM-11355, ZD-0473, itd. Što se tiče jedinjenja koja su registrovana kao soli, među prethodno pomenutim antitumorskim agensima prihvatljiva je svaka so, a prihvatljiva su i slobodna tela. Što se tiče jedinjenja koja su registrovana kao slobodna tela, prihvatljiva je svaka so.

[0037]Ne postoje posebna ograničenja za antibakterijske agense, a mogu da se navedu, na primer, amfotericin B, cefotiam heksil, cefalosporin, hloramfenikol, diklofenak, itd. Što se tiče jedinjenja prethodno pomenutih antibakterijskih agenasa, prihvatljiva je svaka so.

[0038]Ne postoje posebna ograničenja za antiinflamatorne agense, a mogu da se navedu, na primer, prostaglandini (PGE1, PGE2), deksametazon, hidrokortizon, piroksikam, indometacin, prednizolon, itd. Što se tiče jedinjenja prethodno pomenutih antiinflamatornih agenasa, prihvatljiva je svaka so.

[0039]Ne postoje posebna ograničenja za agense protiv infarkta miokarda, a mogu da se navedu, na primer, adenozin, atenolol, pilsikainid, itd., a kao kontrastni agensi mogu da se navedu, na primer, jopamidol, joksaglinska kiselina, joheksol, jomeprol, itd. Što se tiče jedinjenja prethodno pomenutih agenasa protiv infarkta miokarda i kontrastnih agenasa, prihvatljiva je svaka so.

(Lipidi)

[0040]Poželjno je da konstituenti membrane lipozoma iz predmetnog pronalaska sadrže fosfolipide, i/ili derivate fosfolipida. Kao fosfolipidi i derivati fosfolipida, mogu da se nabroje, na primer, fosfatiđil etanolamin, fosfatidil holin, fosfatidil serin, fosfatidil inozkol, fosfatidil glicerol, kardiolipin, sfingomijelin, ceramid fosforiletanolamin, ceramid fosforil glicerol, ceramid fosforil glicerol fosfat, 1,2-dimiristoil-1,2-deoksifosfatidii holin, plazmalogen, fosfatidna kiselina, itd. Takođe je prihvatljivo da se kombinuje jedan ili više ovih fosfolipida i derivata fosfolipida.

[0041]Ne postoje posebna ograničenja za ostatke masnih kiselina u fosfolipidima i derivatima fosfolipida, a mogu da se navedu, na primer, zasićeni ili nezasićeni ostaci masnih kiselina sa brojem ugljenika od 12 do 20. Naročito, mogu da se navedu acil grupe dobijene od masnih kiselina kao što je laurinska kiselina, miristinska kiselina, palmitinska kiselina. stearinska kiselina, oleinska kiselina i linolna kiselina. Takođe mogu da se primene fbsfolipidi dobijeni od prirodnih supstanci, kao stoje lecitin iz žumanceta ili sojin lecitin, delimično hidrogenizovani lecitin iz žumanceta, (potpuno) hidrogenizovani lecitin iz žumanceta, delimično hidrogenizovani sojin lecitin i (potpuno) hidrogenizovani sojin lecitin, čiji ostaci nezasićenih masnih kiselina su delimično ili potpuno hidrogenizovani, itd.

[0042] Ne postoje posebna ograničenja za količinu (molski udeo) fosfolipida i/ili derivata fosfolipida koji se koriste za pripremu lipozoma, ali je poželjno da bude 10 do 80% relativno, u odnosu na ukupni sastav membrane lipozoma, a poželjnije je 30 do 60%.

[0043] Što se tiče konstituenata membrane, osim fosfolipida i/ili derivata fosfolipida. lipozom iz predmetnog pronalaska može takođe da sadrži sterole, kao stoje holesterol i holestenol, kao stabilizatore membrane, masne kiseline sa zasićenim ili nezasićenim acil grupama sa brojem ugljenika od 8 do 22, i antioksidanse, kao stoje ct-tokoferol.

[0044] Ne postoje posebna ograničenja za količinu (molski udeo) ovih sterola koji se koriste za pripremu lipozoma, ali je poželjno da bude 1 do 60% relativno, u odnosu na ukupni sastav membrane lipozoma, poželjnije je 10 do 50% a 30 do 50% je još poželjnije.

[0045] Osim toga, ne postoje posebna ograničenja za količinu (molski udeo) masnih kiselina, ali je poželjno da bude 0 do 30% relativno, u odnosu na ukupni sastav membrane lipozoma, poželjnije je 0 do 20% a još poželjnije je 0 do 10%. Što se tiče količine (molskog odnosa) antioksidanasa, dovoljno je da se doda količina pomoću koje može da se postigne antioksidacioni efekat, ali je poželjno 0 do 15% u odnosu na ukupni sastav membrane lipozoma, poželjnije je 0 do 10%, a još poželjnije je 0 do 5%.

[0046] Lipozom iz predmetnog pronalaska takođe može da sadrži funkcionalne lipide i modifikovane lipide kao konstituente membrane.

[0047] Kao funkcionalni lipidi mogu da se navedu lipidni derivati koji se zadržavaju u krvi, lipidni derivati osetljivi na temperaturu, pH-osetljivi lipidni derivati, itd. Kao modifikovani lipidi mogu da se navedu PEG lipidi, šećerni lipidi, lipidi modifikovani antitelima, lipidi modifikovani peptidima, itd.

[0048]Kao lipidni derivati koji se zadržavaju u krvi, mogu da se navedu, na primer, glikoforin, gangliozid GM1, gangliozid GM3, derivati glukuronske kiseline, derivati glutaminske kiseline, poliglicerinski fosfolipidni derivati, derivati polietilen glikola (kondenzati metoksipolietilen glikola, itd.) kao stoje N - [karbonil - metoksi polietilen glikol

- 2000] - 1,2 - dipalmitoil - sn - glicero - 3 - fosfoetanolamin, N - [karbonil - metoksi polietilen glikol -5000] - 1,2 - dipalmitoil - sn - glicero - 3 - fosfoetanolamin, N - [karbonil - metoksi polietilen glikol - 750] - 1,2 - distearoil - sn - glicero - 3 - fosfoetanolamin, N -

[karbonil - metoksi polietilen glikol - 2000] - 1,2 - distearoil - sn - glicero - 3 - fosfoetanolamin (MPEG 2000 - distearoil fosfatidil etanolamin) i N - [karbonil - metoksi polietilen glikol - 5000] - 1,2 - distearoil - sn - glicero - 3 - fosfoetanolamin, koji su kondenzati fosfoetanolamina i metoksi polietilen glikola. Time što lipozom sadrži lipidne derivate koji se zadržavaju u krvi, omogućeno je da se poboljša zadržavanje lipozoma u krvi, jer je otežano hvatanje lipozoma u jetri itd., kao strane nečistoće.

[0049] Kao temperaturno osetljivi lipidni derivati mogu da se navedu, na primer, dipalmitoil fosfatidiiholin itd. Time što lipozom sadrži temperaturno osetijive lipidne derivate, omogućeno je uništavanje lipozoma na specifičnim temperaturama, i promena površinskih osobina lipozoma. Osim toga, kombinovanjem ovoga sa povećanjem temperature na ciljnoj lokaciji tumora, itd., moguće je uništavanje lipozoma na ciljnoj lokaciji i oslobađanje aktivnog jedinjenja na ciljnoj lokaciji.

[0050]Kao pH osetljivi lipidni derivati mogu da se navedu, na primer, dioleoil fosfatidil etanolamin, itd. Time što lipozom sadrži pH osetijive lipidne derivate, moguće je da se pospeši membranska fuzija lipozoma i endozoma kada se lipozom inkorporše u ćelije usleđ endocitoze, i poboljšava se prenos aktivnog jedinjenja u citoplazmu.

[0051]Kao šećerni lipidi, lipidi modifikovani antitelima i lipidi modifikovani peptidima, mogu da se navedu lipidi koji su vezani za šećere, antitela ili peptide, koji su kompatibilni sa ciljnim ćelijama ili ciljnim tkivom. Primenom modifikovanih lipida, lipozomi mogu aktivno da budu preneti do ciljnih ćelija ili ciljnog tkiva.

[0052]Ne postoje posebna ograničenja za količinu (molski udeo) lipidnih derivata koji se zadržavaju u krvi, koji se koriste za pripremu lipozoma, ali je poželjno da bude 0 do 50% relativno, u odnosu na ukupne lipide koji ulaze u sastav membrane lipozoma, poželjnije je 0 do 30% a 0 do 20% je još poželjnije.

(Lipozom)

[0053]Kao što je gore pomenuto, lipozom je mikroskopska zatvorena vezikula koja ima unutrašnju fazu inkapsuliranu lipidnim dvoslojem.

[0054]U idealnom slučaju, kada se radi o lipozomu, a) poželjno je da lipozom ima funkciju

barijere koja sprečava curenje eribulina, itd. u spoljašnju fazu lipozoma nakon što je eribulin itd. inkapsuliran u unutrašnju fazu lipozoma. U slučaju kada se koristi kao lek, poželjno je da lipozom ispoljavain vivostabilnost, i da lipozom ima funkciju barijere koja sprečava curenje eribulina, itd., u spoljašnju fazu lipozoma u krvi kada se lipozom primenjujein vivo.

[0055JStručnjaci u ovoj oblasti mogu, u skladu sa aktivnim jedinjenjem, ciljnim tkivom i slično, da odaberu pogodnu smešu konstituenata membrane za lipozom, koji ima takvu permeabilnost membrane koja omogućava praktičnu primenu, po potrebi koristeći izvođenje opisano dole (Hiroshi Kikuchi, et. al, „Liposome I-Preparation Method and Assay Method-," Cell Technology (1983), 2(9): str. 1136-1149, i referentna literatura navedena u pomenutoj literaturi).

[0056]Kada se koristi kao lek, poželjno je da eribulin, itd. bude oslobođen iz lipozoma nakon što lipozom dođe do ciljnog tkiva, ćelija, ili intracelularnih organela. Kada se radi o lipozomu, membranski konstituenti su sami po sebi uobičajeno biodegradabilni, i konačno se razlažu u ciljnom tkivu ili sličnom. Smatra se da se inkapsulirani eribulin itd. oslobađa na ovaj način. Osim toga, takođe je prihvatljivo da sam lipozom bude inkorporisan u ćelije.

[0057]Ne samo što smeša lipozoma može biti usmerena na ciljno tkivo kao što je čvrsti kancer, nego takođe može da se primeni za prenos aktivnih jedinjenja na hematološki kancer, i slično. Takođe može da se primeni kao formulacija za sporo oslobađanje, formulacija za kontrolisano oslobađanje, itd. u krvi.

[0058]Veličina čestice lipozoma može biti odabrana u zavisnosti od cilja. Na primer, ukoliko se namerava da se lipozom prenese do kanceroznog tkiva ili tkiva pod upalom, putem EPR

(povećana permeabilnost i retencija) efekta kao injekcija i slično, poželjno je da veličina čestice lipozoma bude 30 do 400 nm, a poželjnije je da veličina čestice bude 50 do 200 nm. U slučaju kada se namerava da se lipozom prenese do makrofaga, poželjno je da veličina čestica lipozoma bude 30 do 1000 nm, a poželjnije je da veličina čestica bude 100 do 400 nm. U slučaju kada će se smeša lipozoma upotrebljavati kao oralni preparat ili transdermalni preparat, veličina čestica lipozoma može da bude podešena na nekoliko mikrona. Treba napomenuti da (1) u normalnom tkivu, vaskularni zidovi služe kao barijera (jer su vaskularni zidovi sačinjeni od gusto raspoređenih endotelnih ćelija), a mikročestice kao što su supermolekuli i lipozomi navedene veličine ne mogu da budu raspoređeni u tkivu. Međutim, u obolelom tkivu su vaskularni zidovi oslabili (jer postoje šupljine između vaskularnih endoteliljalnih ćelija), Što povećava vaskularnu permeabilnost, pa supermolekuli i mikročestice mogu da se rasporede u ekstravaskularnom tkivu (povećana permeabilnost). Štaviše, (2), limfni sistem je u normalnom tkivu dobro razvijen, ali je poznato da limfni sistem nije razvijen u obolelom tkivu, i da supermolekuli ili mikročestice, kada budu inkorporisani, ne kruže kroz opšti sistem, i ostaju u obolelom tkivu (povećana retencija) - to se zove EPR efekat (Matsumura, Maeda, Cancer Research, (1986), 46: str. 6387-6392). Stoga je moguće kontrolisati farmakokinetiku podešavanjem veličine čestica lipozoma.

[0059]U predmetnom pronalasku, veličina čestica lipozoma znači prosečna težina čestice, određena postupkom dinamičkog rasipanja svetlosti (postupak kvazielastičnog rasipanja svetlosti). Ovde je prikazana veličina čestica merena instrumentima za dinamičko rasipanje svetlosti (npr. Zetasizer Nano ZS model, proizvođača Malvern Instruments Ltd. i ELS-8000. proizvođača Otsuka Electronics Co., Ltd.). Instrumenti mere Braunovo kretanje čestica, a veličina čestica se određuje na osnovu utvrđene metodološke teorije o dinamičkom rasipanju svetlosti.

[0060]Ne postoje posebna ograničenja za rastvarač unutrašnje faze lipozoma, i mogu da se navedu, na primer, puferski rastvori, kao što je fosfatni pufer, citratni pufer i fiziološki rastvor puferizovan fosfatnim puferom, fiziološka slana voda, medijumi za uzgajanje ćelijskih kultura, itd. U slučaju kada se kao rastvarač koristi puferski rastvor, poželjno je da koncentracija puferskog sredstva bude 5 do 300 mM, a poželjnije je 10 do 100 mM. Ne postoje posebna ograničenja za pH unutrašnje faze lipozoma, ali je poželjno da bude 3 do 11, a poželjnije je 4 do 9.

(Smešalipozoma)

[0061]Prema predmetnom pronalasku ponuđena je smeša lipozoma. Smeša lipozoma sadrži lipozom, i nadalje sadrži eribulin ili njegovu farmakološki prihvatljivu so, amonijumovu so i so, kiselinu, bazu i/ili aminokiselinu, u unutrašnjoj fazi lipozoma. Kao stoje gore pomenuto, smeša lipozoma uključuje i čvrst i tečan oblik. U slučaju kada je lipozom u čvrstom obliku, on može da se prevede u tečan oblik rastvaranjem ili suspendovanjem u propisanom rastvaraču, kao što je dole opisano. U slučaju kada je smeša lipozoma zamrznuta u čvrstom obliku, može da se prevede u tečan oblik otapanjem, tako što se ostavi na sobnoj temperaturi.

[0062]Koncentracija lipozoma i koncentracija aktivnog jedinjenja u smeši lipozoma mogu da se podese na odgovarajući način, u skladu sa ciljem i formulacijom smeše lipozoma, itd. U slučaju kada je smeša lipozoma u tečnom obliku, koncentracija lipozoma kao koncentracija svih lipida koji čine lipozom može biti podešena na 0,2 do 100 mM, a poželjno je 1 do 30 mM. Koncentracija (doza) aktivnog jedinjenja u slučaju kada se smeša lipozoma koristi kao lek opisana je u nastavku. Što se tiče količine ciklodekstrina u sastavu lipozoma, poželjno je da bude manja od 0,1 mol ekvivalent u relativnom odnosu na eribulin, itd, a poželjnije je da bude manja od limita detekcije.

[0063]U smeši lipozoma iz predmetnog pronalaska, eribulin, itd, može biti raspoređen u lipidnom dvosloju.

[0064]Ne postoje posebna ograničenja za rastvarač (disperzioni medijum) smeše lipozoma, u slučaju kada smeša lipozoma predstavlja tečnu formulaciju, i mogu da se navedu, na primer, puferski rastvori, kao što je fosfatni pufer, citratni pufer i fiziološki rastvor puferizovan fosfatnim puferom, fiziološka slana voda i medijumi za uzgajanje ćeiijskih kultura. Ne postoje posebna ograničenja za pH spoljašnje faze lipozoma, ali je poželjno da bude 3 do 11, a poželjnije je 4 do 9.

[0065]U smešu lipozoma takođe mogu da se dodaju sledeći sastojci: monosaharidi kao što je glukoza, galaktoza, manoza, fruktoza, inozitol, riboza i ksiloza; disaharidi, kao stoje laktoza, saharoza, celobioza, trehaloza i maltoza; trisaharidi, kao što je rafinoza i melizitoza; polisaharidi, kao što je ciklodekstrin; i šećerni alkoholi, kao što je eritritol, ksilitol, sorbitol, manitol i maltitol; polivalentni alkoholi, kao stoje glicerin, diglicerin, poliglicerin, propilen glikol, polipropilen glikol, etilen glikol, dietilen glikol, trietilen glikol, polietilen glikol, etilen glikol monoalkil etar, dietilen glikol monoalkil etar, 1,3-butilen glikol. Takođe mogu da se primene kombinacije šećera i alkohola.

[0066] U cilju stabilnog dugoročnog skladištenja lipozoma koji je dispergovan u rastvaraču (disperzionom medijumu), sa stanovišta fizičke stabilnosti, uključujući koagulaciju itd., poželjno je da se ukloni elektrolit iz rastvarača (disperzionog medijuma) u što većoj meri. Osim toga, sa stanovišta hemijske stabilnosti lipida, poželjno je da se pH rastvarača (disperzionog medijuma) podesi na kiseli do blizu neutralni (pH 3,0 do 8,0), i da se rastvoreni kiseonik ukloni uduvavanjem azota.

[0067] Ne postoje posebna ograničenja za koncentraciju šećera ili polivalentnog alkohola sadržanog u smeši lipozoma, ali kada je lipozom dispergovan u rastvaraču, na primer, poželjno je da koncentracija šećera bude 2 do 20% (masena koncentracija, w/V), a poželjnije je 5 do 10 % (w/V). Što se tiče koncentracije polivalentnog alkohola, poželjno je 1 do 5%

(w/V), a poželjnije je 2 do 2,5%(w/V).Ovi rastvarači takođe mogu da se primene za spoljašnju fazu lipozoma u dispergovanoj tečnosti lipozoma, a zamenom ili razblaživanjem spoljašnje faze lipozoma u rastvoru za pripremu lipozoma pomoću ovih rastvarača, moguće je da se rastvor spoljašnje faze lipozoma zameni ovim rastvorima.

[0068] Poželjno je da čvrste formulacije smeše lipozoma sadrže, na primer, monosaharide kao što je glukoza, galaktoza, manoza, fruktoza, inozitol, riboza i ksiloza; disaharide, kao što je laktoza, saharoza, celobioza, trehaloza i maltoza; trisaharide, kao stoje rafinoza i melizitoza; polisaharide, kao što je ciklodekstrin; i šećerne alkohole, kao što je eritritol, ksilitol, sorbitol, manitol i maltitol. Poželjnije su mešavine glukoze, laktoze, saharoze, trehaloze i sorbitola. Još poželjnije su mešavine laktoze, saharoze i trehaloze. Na ovaj način, čvrste formulacije mogu stabilno da se skladište u dužem periodu. Kada su zamrznute, poželjno je da čvrste formulacije sadrže polivalentne alkohole (vodene rastvore) kao što je glicerin, diglicerin, poliglicerin, propilen glikol, polipropilen glikol, etilen glikol, dietilen glikol, trietilen glikol, polietilen glikol, etilen glikol monoalkil etar, dietilen glikol monoalkil etar i 1,3-butilen glikol. Što se tiče polivalentnih alkohola (vodenih rastvora), poželjni su glicerin, propilen glikol i polietilen glikol, a poželjniji su glicerin i propilen glikol. Na ovaj načinje moguće u dužim periodima skladištiti čvrstu formulaciju. Šećeri i polivalentni alkoholi mogu da se upotrebe u kombinaciji.

(Postupak za pripremu smeše lipozoma)

[0069]Prema predmetnom pronalasku, obezbeđen je postupak za pripremu smeše lipozoma koja sadrži eribulin ili njegovu farmakološki prihvatljivu so. Postupak za pripremu smeše lipozoma uključuje: korak u kome se dobija dispergovana tečnost lipozoma koja sadrži lipozom; korak u kome se gore pomenuta dispergovana tečnost lipozoma meša sa gore pomenutim aktivnim jedinjenjem (eribulinom ili njegovom farmakološki prihvatljivom solju); i korak u kome se gore pomenuto aktivno jedinjenje uvodi u unutrašnju fazu lipozoma gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma.

[0070]Korak u kome se dobija gore pomenuta dispergovana tečnost lipozoma tu uključuje: korak u kome se dobija rastvor za pripremu lipozoma, koji sadrži lipozom i koji sadrži amonijumovu so u spoljašnjoj fazi lipozoma i unutrašnjoj fazi lipozoma; i korak u kome se spoljašnja faza lipozoma gore pomenutog rastvora za pripremu lipozoma zamenjuje ili razblažuje, i korak u kome se gore pomenuta spoljašnja faza lipozoma zamenjuje ili razblažuje predstavlja korak u kome se pH spoljašnje faze lipozoma povećava u odnosu na pH unutrašnje faze lipozoma.

[0071]Rastvor za pripremu lipozoma može da se dobije, na primer, pripremom lipozoma u rastvoru koji sadrži amonijumovu so. Pripremom rastvora za pripremu lipozoma u rastvoru koji sadrži amonijumovu so, moguće je da se napravi dispergovana tečnost lipozoma koja takođe sadrži amonijumovu so u unutrašnjoj fazi lipozoma.

[0072]Ne postoje posebna ograničenja za rastvor koji sadrži amonijumovu so koja se koristi za dobijanje rastvora za pripremu lipozoma, i može da se primeni svaki rastvor koji sadrži amonijumovu so.

[0073]Kao amonijumova so može da se navede, na primer, amonijum hlorid, amonijum borat, amonijum sulfat, amonijum format, amonijum acetat, amonijum citrat, amonijum tartarat, amonijum sukcinat i amonijum fosfat. Od njih su poželjni amonijum sulfat, amonijum acetat, amonijum citrat, amonijum tartarat i amonijum fosfat; poželjniji su amonijum sulfat, amonijum citrat i amonijum tartarat; a najpoželjniji je amonijum sulfat.

[0074] Može se koristiti kombinacija od dve ili više od ovih amonijumovih soli.

[0075] Koncentracija amonijumove soli u rastvoru koji sadrži amonijumovu so može da se podesi na odgovarajući način, u zavisnosti od količine eribulina, itd. koji treba da se inkapsulira, i veća koncentracija je bolja; poželjno je 10 mM ili više; poželjnije je 20 mM ili više; još poželjnije je 50 mM ili više. Što se tiče pH rastvora koji sadrži amonijumovu so, poželjno je da bude 3 do 9, poželjnije je 4 do 9 sa stanovišta uravnoteženja stepena inkapsulacije i stabilnosti, a još poželjnije je 5 do 8.

[0076] Za podešavanje pH rastvora koji sadrži amonijumovu so, može da se primeni sredstvo za podešavanje pH. Ne postoje posebna ograničenja za koncentraciju pojedinačnog sredstva za podešavanje pH u rastvoru koji sadrži amonijumovu so, ali je poželjno da bude 1 do 300 mM, a poželjnije je 5 do 100 mM.

[0077] Kao sredstvo za podešavanje pH mogu da se navedu, na primer, aminokiseline, kao što je arginin, histidin i glicin; kiseline, kao što je askorbinska kiselina, benzojeva kiselina, ćilibarna kiselina, limunska kiselina, glutaminska kiselina, fosforna kiselina, sirćetna kiselina, propionska kiselina, vinska kiselina, ugljena kiselina, mlečna kiselina, borna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, jabučna kiselina, adipinska kiselina, hlorovodonična kiselina i sumporna kiselina; soli gore pomenutih kiselina, kao što je natrijumova so, kalijumova so i amonijumova so; i alkalna jedinjenja (baze), kao što je tris-hidroksimetilamino metan, amonijačna voda (amonijak), natrijum hidroksid i kalijum hidroksid. Za podešavanje pH su poželjni natrijum hidroksid, hlorovodonična kiselina, amonijačna voda, sirćetna kiselina, mlečna kiselina, vinska kiselina, ćilibarna kiselina, limunska kiselina i fosforna kiselina; poželjniji su natrijum hidroksid, amonijačna voda, hlorovodonična kiselina, sirćetna kiselina, limunska kiselina i fosforna kiselina; a još poželjniji su natrijum hidroksid, amonijačna voda, hlorovodonična kiselina, limunska kiselina i fosforna kiselina. Kao sredstvo za podešavanje pH može da se primeni kombinacija dve ili više amonijumovih soli. Pored toga, za podešavanje pH takođe mogu da se koriste puferski rastvori, kao što je fosfatni pufer, citratni pufer i fiziološki slani rastvor puferizovan fosfatnim puferom.

[0078]Kao rastvor za pripremu lipozoma, najbolje je koristiti rastvor koji je dobijen pripremom lipozoma bez značajnog uključivanja ciklodekstrina. Kao rastvor za pripremu lipozoma, unutrašnja faza lipozoma takođe sadrži so, kiselinu, bazu i/ili aminokiselinu. U tom slučaju, poželjno je da unutrašnja faza lipozoma sadrži aktivno jedinjenje, amonijumovu so i kiselinu. Kao amonijumova so može da se navede amonijum sulfat kao poželjan primer; kao poželjan primer kiseline može da se navede limunska kiselina.

[0079]Što se tiče pripreme lipozoma, može da se navede postupak lipidnog filma (Vorteks postupak), postupak reverzno faznog uparavanja, ultrazvučni postupak, postupak sa prethodnim stvaranjem vezikula, postupak sa injektovanjem etanola, postupak sa mutilicom, postupak uklanjanja holne kiseline, postupak Triton-X 100 šarži, postupak fuzije Ca<2+>, postupak sa injektovanjem etra, postupak žarenja, postupak zamrzavanja i otapanja, itd.

[0080]Na pogodan način mogu da se odaberu različiti uslovi (količine konstituenata membrane, temperatura, itd.) za pripremu lipozoma, u skladu sa postupkom za pripremu lipozoma, ciljnom smešom lipozoma, veličinom čestica, itd. (pogledajte Op. cit, Kikuchi

(1983), itd.).

[0081]Veličina čestica lipozoma može da se podešava po potrebi. Veličina čestica može, na primer, da se podesi pomoću ekstruzije (ekstruziona filtracija) pod visokim pritiskom, uz upotrebu membranskog filtera uobičajenog prečnika pora. Podešavanje veličine čestica može da se sprovede bilo kada u toku proizvodnje smeše lipozoma iz predmetnog pronalaska. Na primer, može da se sprovede pre podešavanja spoljašnje faze lipozoma u rastvoru za pripremu lipozoma, posle podešavanja spoljašnje faze lipozoma u rastvoru za pripremu lipozoma, ili posle uvođenja aktivnog jedinjenja u unutrašnju fazu lipozoma. Poželjno je da se podešavanje veličine Čestica izvodi pre uvođenja aktivnog jedinjenja u unutrašnju fazu lipozoma, a poželjnije je da se izvede pre podešavanja spoljašnje faze lipozoma u rastvoru za pripremu lipozoma.

[0082]Dispergovana tečnost lipozoma može da se dobije zamenom ili razblaživanjem spoljašnje faze dobijenog rastvora za pripremu lipozoma. Zamena ili razblaživanje spoljašnje faze lipozoma može da se izvede jednom, ili kombinacija različitih postupaka zamene ili razblaživanja može da se izvede više puta.

[0083]Kao postupci za zamenu spoljašnje faze lipozoma rastvora za pripremu lipozoma mogu da se navedu dijaliza, centrifugalna separacija i gel filtracija. Zamenom spoljašnje faze lipozoma, predmetni pronalazak može da se primeni tako da spoljašnja faza lipozoma ne sadrži značajnije količine ciklodekstrina ili amonijumove soli. Osim toga, zamenom ili razblaživanjem spoljašnje faze lipozoma, moguće je efikasno inkapsulirati eribulin ili njegove farmakološki prihvatljive soli u unutrašnju fazu lipozoma.

[0084] Dijaliza može, na primer, da se izvede pomoću membrane za dijalizu. Kao membrana za dijalizu može da se navede membrana sa nominalnim ograničenjem molekulske težine, kao što je crevo od celuloze ili Spectra/Por.

[0085]Što se tiče centrifugalne separacije, može da se primeni centrifugalno ubrzanje do 100.000 g ili više, a poželjnije do 300.000 g ili više. Supstitucijom spoljašnje faze lipozoma centrifugiranjem, takođe može da se izvede koncentracija lipozoma istovremeno sa supstitucijom spoljašnje faze lipozoma centrifugiranjem.

[0086]Gel filtracija može da se izvede, na primer, frakcionisanjem na osnovu molekulske težine uz upotrebu kolone kao što je Sephadex ili Sepharose.

[0087]Kao rastvarač (disperzioni međijum) koji se primenjuje prilikom supstitucije ili razblaživanja spoljašnje faze lipozoma, može da se navede, na primer, rastvor saharoze, slani rastvor i medijum za uzgajanje ćelijskih kultura. Upotrebom ovih rastvarača moguće je pripremiti stabilnu smešu lipozoma.

[0088]Ne postoje posebna ograničenja za pH pomenutog rastvora, ali može da se podesi da bude u opsegu između 2 i 11; poželjno je3dol0;6do!0je poželjnije, a 7 do 10 je još poželjnije. Kao što je dole opisano, može da se primeni pH gradijent za uvođenje eribulina, itd. u unutrašnju fazu lipozoma. U tom slučaju, pH rastvarača može da se podesi tako da spoljašnja faza lipozoma dostigne ciljni pH.

[0089] Za podešavanje pH pomenutog rastvora može da se upotrebi sredstvo za podešavanje pH. Ne postoje posebna ograničenja za koncentraciju koja se primenjuje, ali je poželjno da bude 1 do 300 mM, a poželjnije je 5 do 100 mM.

[0090] Kao sredstvo za podešavanje pH mogu da se navedu, na primer, aminokiseline, kao što je arginin, histidin i glicin; kiseline, kao Što je askorbinska kiselina, benzojeva kiselina, ćilibarna kiselina, limunska kiselina, giutaminska kiselina, fosforna kiselina, sirćetna kiselina, propionska kiselina, vinska kiselina, ugljena kiselina, mlečna kiselina, borna kiselina, maleinska kiselina, fumarna kiselina, jabučna kiselina, adipinska kiselina, hlorovodonična kiselina i sumporna kiselina; soli gore pomenutih kiselina, kao što je natrijumova so, kalijumova so i amonijumova so; i alkalna jedinjenja, kao što je tris-hidroksimetilamino metan, amonijačna voda, natrijum hidroksid i kalijum hidroksid. Poželjni su natrijum hidroksid, hlorovodonična kiselina, histidin, vinska kiselina, ćilibarna kiselina, limunska kiselina i fosforna kiselina; poželjniji su natrijum hidroksid, hlorovodonična kiselina, histidin. vinska kiselina, limunska kiselina i fosforna kiselina; a još poželjniji su natrijum hidroksid, hlorovodonična kiselina, histidin i fosforna kiselina.

[0091] Da bi se poboljšao stepen inkapsulacije eribulina ili njegove farmakološki prihvatljive soli u lipozomu, stepen inkapsulacije može da se poveća dodatkom rastvora (rastvora soli) koji sadrži elektrolit, u spoljašnju fazu lipozoma da bi se povećao jonski intenzitet. Ne postoje posebna ograničenja za elektrolit (so) koji se nalazi u spoljašnjoj fazi lipozoma, ali su poželjni natrijum hlorid i kalijum hlorid, a poželjniji je natrijum hlorid. Takođe može da se upotrebi fiziološki slani rastvor. Osim toga, kao spoljašnja faza dispergovane tečnosti lipozoma ili slično, može biti uključen šećer, elektrolit i/ili aminokiselina, a takođe može biti uključen šećer ili elektrolit i aminokiselina. Kao šećer, može da se navede saharoza kao poželjni primer; kao elektrolit, mogu da se navedu fiziološki slani rastvor i natrijum hlorid kao poželjni primeri; a kao aminokiselina, može da se navede histidin kao poželjan primer.

[0092] Poželjno je da dobijena dispergovana tečnost lipozoma ne sadrži ciklodekstrin ili amonijumovu so u značajnijoj količini u spoljašnjoj fazi lipozoma i u unutrašnjoj fazi lipozoma, ali u predmetnom pronalasku, eribulin ili njegova farmakološki prihvatljiva so mogu biti uvedeni u unutrašnju fazu lipozoma čak i u slučaju kada je iz nekog razloga dodat ciklodekstrin ili amonijumova so u spoljašnju fazu lipozoma dispergovane tečnosti lipozoma, pa čak i kada dispergovana tečnost lipozoma sadrži ciklodekstrin ili amonijumovu so.

[0093] Što se tiče koncentracije lipida lipozoma u dispergovanoj tečnosti lipozoma, poželjno je da bude 1 do 100 mM, a poželjnije je 1-50 mM. U tim opsezima, moguće je da se na podesan način formira veći broj Čestica lipozoma bez pogoršavanja fizičkih osobina dispergovane tečnosti lipozoma.

[0094] Smeša lipozoma može da se dobije mešanjem dobijene dispergovane tečnosti lipozoma i aktivnog jedinjenja eribulina, itd., i uvođenjem aktivnog jedinjenja u unutrašnju fazu lipozoma dispergovane tečnosti lipozoma. Poželjno je da korak uvođenja uključuje korak u kome se povećava membranska permeabilnost lipozoma u pomešanom rastvoru dispergovane tečnosti lipozoma i aktivnog jedinjenja. Na taj način, u kraćem vremenskom roku može da se postigne inkapsulacija eribulina, itd. u lipozom. Međutim, čak i ako se ne sprovode posebne operacije u svrhu povećavanja membranske permeabilnosti lipozoma nakon meŠanja dispergovane tečnosti lipozoma i eribulina, itd., moguće je inkapsulirati eribulin, itd. u lipozom ukoliko se dopusti dovoljno vremena.

[0095] U koraku u kome se eribulin ili njegova farmakološki prihvatljiva so mešaju, moguće je upotrebiti supstancu rastvorenu u rastvaraču ili čvrstu supstancu kao eribulin itd. Ne postoje posebna ograničenja za rastvarač, i može da se koristi, na primer, supstanca identična spoljašnjoj fazi lipozoma dispergovane tečnosti lipozoma.

[0096] Ukoliko je potrebno, moguće je upotrebiti pH gradijent da bi se eribulin, itd. uveo u unutrašnju fazu lipozoma. U tom slučaju, što se tiče pH vrednosti unutrašnje faze lipozoma dispergovane tečnosti lipozoma, poželjno je da bude 3 do 9, poželjnije je 4 do 9, a još poželjnije je 5 do 8.

[0097] Osim toga, moguće je da se pH spoljašnje faze lipozoma podesi da bude viši nego kod unutrašnje faze lipozoma, da bi se napravio pH gradijent. Poželjan je pH gradijent od 1 do 5, a poželjniji je 2 do 3.

[0098]Štaviše, moguće je povećati stepen inkapsulacije u lipozomu tako što će se pH spoljašnje faze lipozoma približiti pKa vrednosti eribulina, itd. Poželjno je da bude 7,5 do 12,5, poželjnije je 8,5 do 11,5, a još poželjnije je 9 do 10,5 (pKa eribulin mezilata je 9,6).

[0099]Kao rastvor za pripremu lipozoma, optimalno je koristiti rastvor koji je dobijen pripremom lipozoma bez značajnijeg uključivanja ciklodekstrina.

[0100]Kao postupak za povećanje membranske permeabilnosti lipozoma u đobijenom mešanom rastvoru, može da se navede postupak zagrevanja mešanog rastvora, metod dodavanja sredstva za utečnjavanje membrane u mešani rastvor, itd.

[0101]U slučaju kada se mešani rastvor zagreva, aktivno jedinjenje generalno može na efikasan način da se uvede u unutrašnju fazu lipozoma zagrevanjem na više temperature. Posebno, poželjno je da se temperatura zagrevanja podesi uzimajući u obzir termalnu stabilnost aktivnog jedinjenja i upotrebljenih konstituenata membrane lipozoma. Naročito je poželjno da se temperatura zagrevanja podesi na temperaturu fazne transformacije lipidne dvoslojne membrane lipozoma, ili višu.

[0102]„Temperatura fazne transformacije" dvoslojne lipidne membrane lipozoma označava temperaturu na kojoj počinje apsorpcija toplote (temperaturu na kojoj počinje endotermna reakcija) pod uslovima diferencijalne termalne analize ili povišene temperature. Diferencijalna termalna analiza je tehnika koja omogućava analizu termalnih svojstava uzoraka putem merenja temperaturnih razlika uzorka ili referentne supstance kao funkcije vremena ili temperature, prilikom promene temperature uzorka ili referentne supstance. U slučaju kada se diferencijalna termalna analiza izvodi u odnosu na konstituente membrane lipozoma, konstituenti membrane lipozoma prelaze u tečno stanje sa povećanjem temperature, i opaža se endotermna reakcija. Kao stoje opšte poznato u ovoj tehničkoj oblasti, temperaturni opseg u kome se opaža endotermna reakcija veoma mnogo varira, u zavisnosti od komponenata membrane lipozoma. Na primer, u slučaju kada se komponente membrane lipozoma sastoje od Čistog lipida, temperaturni opseg u kome se opaža endotermna reakcija je veoma uzak, a endotermna reakcija se često opaža u relativnom opsegu od ± 1°C u odnosu na temperaturu endotermnog pika. Sa druge strane, u slučaju kada se komponente membrane lipozoma sastoje od više lipida, a naročito u slučaju kada se komponente membrane lipozoma sastoje od lipida koji su dobijeni od prirodnih materijala, temperaturni opseg u kome se opaža endotermna reakcija ima tendenciju da se širi, i endotermna reakcija se opaža, na primer, u relativnom opsegu od ± 5°C u odnosu na temperaturu enđotermnog pika (to jest, opaža se široki pik, itd.). Prema predmetnom pronalasku, smatra se da se utečnjavanje membrane lipozoma povećava, i membranska permeabilnost aktivnog jedinjenja se povećava ako se temperatura povisi iznad temperature fazne transformacije lipidne dvoslojne membrane lipozoma.

[0103]Na primer, iako zavisi od termalne stabilnosti i tako dalje aktivnog jedinjenja i upotrebljenih konstituenata membrane lipozoma, poželjno je da imamo temperaturni opseg od temperature fazne transformacije dvoslojne lipidne membrane lipozoma do +20°C od temperature fazne transformacije; poželjniji je temperaturni opseg od temperature fazne transformacije do + 10°C od temperature fazne transformacije; a još poželjniji je temperaturni opseg od +5°C od temperature fazne transformacije do +10°C od temperature fazne transformacije.

[0104]Temperatura zagrevanja je obično od 20 do 100°C; poželjno je 40 do 80°C; a 45 do 65°C je poželjnije.

[0105]Posebno, u slučaju membrane lipozoma čiji glavni sastojci su dipalmitoil fosfatidiiholin (temperatura fazne transformacije kao proste supstance: 41°C) i holesterol, mada takođe zavisi od njenog sastava, obično je poželjna temperatura zagrevanja od 40 do

60°C, a poželjnije je 45 do 50°C. Posebno, u slučaju membrane lipozoma čiji glavni sastojci su hidrogenizovani fosfatidiholin iz soje (HSPC; temperatura fazne transformacije kao proste supstance: 50 do 60°C) i holesterol, mada takođe zavisi od njenog sastava, obično je poželjna temperatura zagrevanja od 50 do 70°C, a poželjnije je 55 do 65°C. Međutim, te temperature zagrevanja ni na koji način ne ograničavaju predmetni pronalazak.

[0106]U koraku zagrevanja, ne postoje posebna ograničenja o vremenskoj dužini održavanja temperature, na temperaturi fazne transformacije ili višoj, i to može prikladno da se podesi u opsegu od, na primer, nekoliko sekundi do 30 minuta. Uzimajući u obzir termalnu stabilnost aktivnog jedinjenja i lipida, kao i efikasnu masovnu proizvodnju, poželjno je da se postupak izvede u kratkom roku. To jest, poželjno je da period održavanja povišene temperature bude 1 do 30 minuta, a poželjnije je 2 do 5 minuta. Međutim, ta vremena održavanja temperature ni na koji način ne ograničavaju predmetni pronalazak.

[0107]Osim toga, kao što je gore rečeno, takođe je moguće povećati permeabilnost membrane lipozoma dodavanjem sredstva za utečnjavanje membrane u đobijeni mešani rastvor (to jest, njegovim dodavanjem u spoljašnju fazu lipozoma). Kao sredstvo za utečnjavanje membrane, mogu da se navedu organski rastvarači, surfaktanti, enzimi, itd., koji su rastvorni u vodenim rastvaračima. Još specifičnije, kao organski rastvarači mogu da se navedu, na primer, monovalentni alkoholi kao što je etil alkohol i benzil alkohol; polivalentni alkoholi, kao što je glicerin i propilen glikol; aprotični polarni rastvarači kao što je dimetil sulfoksid (DMSO). Kao surfaktanti, mogu da se navedu, na primer, anjonski surfaktanti, kao što su natrijumove soli masnih kiselina, monoalkil sulfat i monoalkil fosfat; katjonski surfaktanti, kao stoje alkil trimetil amonijumova so; amfolitični surfaktanti, kao stoje alkil dimetilamin oksid; i neanjonski surfaktanti, kao što je polioksietilen alkiletar, alkil monogliceril etar i estar masne kiseline i sorbitana. Kao enzimi mogu da se navedu, na primer, holinesteraza i holesterol oksidaza. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu da podese količinu sredstva za utečnjavanje membrane prema sastavu konstituenata membrane lipozoma, sredstva za utečnjavanje membrane itd, i uzimajući u obzir stepen efikasnosti inkapsulacije aktivnog jedinjenja usled dodatka sredstva za utečnjavanje membrane, stabilnost lipozoma, itd.

[0108]Postupak za proizvodnju smeše lipozoma iz predmetnog pronalaska može da uključi korak podešavanja pH spoljašnje faze lipozoma dobijene smeše lipozoma nakon gore pomenutog uvodnog koraka.

[0109]pH spoljašnje faze koji treba podesiti nije posebno ograničen, ali je poželjno da bude 4 do 10, poželjnije je 5 do 9, a još poželjnije je da bude neutralan, od 6 do 8, sa stanovišta hemijske stabilnosti fosfolipida koji ulaze u sastav lipozoma.

[0110]Pored toga, može dodatno da se uključi korak sušenja dobijenog lipozoma. To jest, kada se smeša lipozoma koristi kao tečna formulacija, smeša lipozoma u tečnom stanju dobijena u gore pomenutom uvodnom koraku može da se koristi bez modifikovanja. kao konačna smeša lipozoma, ili spoljašnja faza lipozoma u tečnoj smeši lipozoma dobijena u gore pomenutom uvodnom koraku može da se podesi (zameni, itd.) da bi se dobila konačna smeša lipozoma. Kada se to radi, podešavanje spoljašnje faze lipozoma može da se izvede slično podešavanju spoljašnje faze lipozoma u tečnosti za pripremu lipozoma. U slučaju kada je smeša lipozoma tečna formulacija, ona može da se koristi bez daljeg modifikovanja.

[0111] Nadalje, u slučaju kada smeša lipozoma treba da se prevede u čvrst preparat, tečna smeša lipozoma dobijena u gore pomenutom uvodnom koraku može da se osuši da bi se dobila konačna čvrsta smeša lipozoma. Liofilizacija i atomizacija mogu da se navedu kao primeri postupka za sušenje smeše lipozoma. U slučaju kada je smeša lipozoma čvrst preparat, ona može da se rastvori ili suspenduje u pogodnom rastvaraču, i da se primeni kao tečna formulacija. Rastvarač koji će se primeniti može da se prilagodi shodno primeni, itd., smeše lipozoma, i u slučaju da se smeša lipozoma koristi kao proizvod za injekciju, na primer, poželjno je da rastvarač bude sterilna destilovana voda. U slučaju da se smeša lipozoma koristi kao lek, lekar ili pacijent mogu da injektuju rastvarač u bočicu u kojoj je čvrsti preparat, na primer, da bi napravili preparat u trenutku primene. U slučaju kada je tečna smeša lipozoma čvrst zamrznut preparat, ona može da se primeni kao tečna formulacija skladištenjem u zamrznutom stanju, a zatim vraćanjem u tečno stanje nakon otapanja na sobnoj temperaturi ili ubrzanog otapanja uz zagrevanje u vreme primene.

(Farmaceutske smeše, itd.)

[0112] Smeša lipozoma iz predmetnog pronalaska može da se koristi za lečenje u oblasti medicine. Specifično, smeša lipozoma iz predmetnog pronalaska može da se primeni kao antitumorska farmaceutska smeša.

[0113] U slučaju kada se smeša lipozoma iz predmetnog pronalaska primenjuje kao farmaceutska smeša, smeša lipozoma može biti data putem injekcije (intravenski, intraarterijski ili lokalnim injektovanjem), oralno, nazalno, supkutano, pulmonalno, ili putem kapi za oči, a posebno je poželjno lokalno injektovanje u ciljnu grupu ćelija ili organ ili drugo takvo injektovanje, uz intravensko injektovanje, supkutano injektovanje, intrakutano injektovanje, i intraarterijsko injektovanje. Tableta, prašak, granulat, sirup, kapsula, tečnost i slično mogu biti navedeni kao primeri formulacije smeše lipozoma u slučaju oralne primene. Injekcioni proizvod, infuziona injekcija, kapi za oči, mast, supozitorija, suspenzija, kataplazma, losion, aerosol, flaster, i slično, mogu da se navedu kao primeri formulacije smeše lipozoma u slučaju neoralne primene, a naročito su poželjni injekcioni proizvod i sredstvo za infuzionu injekciju.

[0114]Doziranje farmaceutske smeše jasno se razlikuje u zavisnosti od vrste ciljne bolesti, vrste aktivnog jedinjenja, kao i starosti, pola i težine pacijenta, ozbiljnosti simptoma, zajedno sa drugim faktorima, ali obično dnevna doza eribulina ili njegovih farmakološki prihvatljivih soli za odrasle nije posebno ograničena, mada je za eribulin mezilat, koji je pogodna so, obično 0,1 do 10 mg. Takođe, primena može biti podeljena u više od jedne doze na dan. Smeša lipozoma koja sadrži, na primer, 0,01-300 mg/ml eribulina ili njegove farmakološki prihvatljive soli može da se primeni kao smeša lipozoma iz predmetnog pronalaska.

(Komplet)

[0115]Prema predmetnom pronalasku, obezbeđen je komplet za pripremu smeše lipozoma. Komplet može da se primeni za pripremu smeše lipozoma kao leka, koji može da se koristi od strane lekara u kliničkom okruženju, ili od strane pacijenta.

[0116]Komplet sadrži lipozomski reagens. Lipozomski reagens može biti u čvrstom ili u tečnom obliku. Ukoliko je lipozomski reagens u tečnom obliku, gore pomenuta dispergovana tečnost lipozoma može da se primeni kao lipozomski reagens. Takođe, ukoliko je lipozomski reagens u čvrstom obliku, lipozomski reagens može da se rastvori ili suspenduje u odgovarajućem rastvaraču da bi se dobila dispergovana tečnost lipozoma, a gore pomenuta dispergovana tečnost lipozoma može da se osuši da bi se dobio lipozomski reagens. Sušenje može da se izvede slično gore pomenutom sušenju smeše lipozoma. Kada se koristi komplet, ukoliko je lipozomski reagens u čvrstom obliku, lipozomski reagens može da se rastvori ili suspenduje u odgovarajućem rastvaraču da bi se napravila dispergovana tečnost lipozoma. Kada se to radi, rastvarač je sličan spoljašnjoj fazi lipozoma u gore pomenutoj dispergovanoj tečnosti lipozoma.

[0117]Komplet iz predmetnog pronalaska nadalje sadrži eribulin ili njegovu farmakološki prihvatljivu so (pogodna soje eribulin mezilat). Eribulin ili njegova farmaceutski prihvatljiva so mogu da budu ili u čvrstom ili u tečnom obliku (stanje rastvoreno ili suspendovano u rastvaraču). Kada se koristi komplet, ukoliko je eribulin i slično u čvrstom obliku, poželjno je da se rastvori ili suspenduje u odgovarajućem rastvaraču da bi se dobio tečni oblik. Rastvarač može da se podesi na odgovarajući način u zavisnosti od fizičkih osobina i slično eribulina i slično, i može, na primer, da se napravi da bude sličan spoljašnjoj fazi lipozoma gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma. Komplet iz predmetnog pronalaska može da uključi aktivno jedinjenje koje nije eribulin ni njegova farmakološki prihvatljiva so.

[0118]U kompletu, lipozomski reagens i aktivno jedinjenje mogu da budu zapakovani odvojeno, ili mogu biti u čvrstom obliku i pomešani zajedno.

[0119]U slučaju kada je lipozomski reagens u čvrstom obliku, isključujući slučaj rastvaranja ili suspendovanja da bi se dobila dispergovana tečnost lipozoma kao stoje gore navedeno, komplet može da se primeni izvodeći korak sličan onom kod mešanja dispergovane tečnosti lipozoma i aktivnog jedinjenja i uvođenja aktivnog jedinjenja u unutrašnju fazu lipozoma dispergovane tečnosti lipozoma u postupku za proizvodnju gore pomenute smeše lipozoma.

[0120]Tako je moguće da se proizvede smeša lipozoma u kojoj je aktivno jedinjenje uvedeno u unutrašnju fazu lipozomskog reagensa.

[0121]U slučaju kada su i lipozomski reagens i aktivno jedinjenje u čvrstom obliku i zapakovani zajedno, smeša lipozomskog reagensa i aktivnog jedinjenja se na prikladan način rastvori ili suspenduje u rastvaraču. Kada se to radi, rastvarač je sličan spoljašnjoj fazi lipozoma u gore pomenutoj dispergovanoj tečnosti lipozoma. Tako je moguće da se formira stanje u kome su dispergovana tečnost lipozoma i aktivno jedinjenje pomešani, nakon čega je omogućena upotreba izvođenjem drugih koraka uvođenja aktivnog jedinjenja u unutrašnju fazu lipozoma dispergovane tečnosti lipozoma u postupku za proizvodnju gore pomenute smeše lipozoma.

Izvođenja

[0122]Predmetni pronalazak je specifično opisan davanjem izvođenja i primera za poređenje, ali nije ograničen na dolenavedena izvođenja.

(Izvođenje 1)

<Priprema vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma>

[0123]396,4 mg amonijum sulfata i 189,1 mg monohidrata limunske kiseline rastvoreno je u čistoj vodi, i to je razblaženo do 15 ml da bi se dobio 200 mM amonijum sulfat u 60 mM vodenom rastvoru limunske kiseline. Nakon što je pH 2,5 ml 200 mM amonijum sulfata/60 mM vodenom rastvoru limunske kiseline podešen pomoću vodenog rastvora amonijaka na 5,5, vodeni rastvor za unutrašnju fazu lipozoma je razblažen čistom vodom do 5 ml.

<Priprema tečnosti za pripremu lipozoma>

[0124]Nakon rastvaranja 317,9 mg hidrogenizovanog fosfatidilholina iz soje (proizvođača Lipoid), 116,0 mg holesterola (proizvođača Sigma) i 130,4 mg polietilen glikola 2000-fosfatidiletanolamina (proizvođača Genzvme, MPEG 2000-distearoil fosfatidiletanolamin) u 10 ml hloroforma, to je precizno raspoređeno u tri bočice, nakon čega je hloroform iz jedne bočice uklonjen pod sniženim pritiskom u rotacionom uparivaču, da bi se dobio lipidni film.

5 ml vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma zagrejano je na oko 60°C i dodato u dobijeni lipidni film, a zatim promućkano da se dobije tečnost za pripremu lipozoma. Nakon tretiranja tečnosti za pripremu lipozoma ultrazvučnim talasima tokom 20 minuta, ona je

granulisana pomoću ekstrudera (proizvođača Lipex Biomembranes) zagrejanog na oko 65°C da bi se dobila tečnost za pripremu lipozoma. Veličina čestica lipozoma u dobijenoj tečnosti za pripremu lipozoma izmerena je pomoću postupka dinamičkog rasipanja svetlosti, i sve su bile između 90 i 100 nm.

<Priprema dispergovane tečnosti lipozoma>

[0125]Upotrebom Sephadex G-50 kolona, dobijena tečnost za pripremu lipozoma je eluirana pomoću vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina (pH=7,6), zamenjujući spoljašnju fazu lipozoma vodenim rastvorom 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina. Nakon zamene spoljašnje faze lipozoma, dobijeni rastvor je centrifugiran 30 minuta na 400.000 g. Nakon centrifugiranja je usledila redisperzija, i vodeni rastvor 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina je korišćen da bi se dobila zapremina od 5 ml dispergovane tečnosti lipozoma.

<Priprema rastvora aktivnog jedinjenja<>>

[0126]Eribulin mezilat je rastvoren u vodenom rastvoru 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina i dobijen je rastvor eribulin mezilata koncentracije 1 mg/mi.

<Priprema smeše lipozoma >

[0127]0,5 ml dispergovane tečnosti lipozoma i 0,5 ml rastvora eribulin mezilata pomešano je u staklenom sudu od 10 ml, i držano 3 minuta na vodenom kupatilu temperature 55°C, da bi se dobila smeša lipozoma sa eribulin mezilatom koji se nalazi unutar lipozoma.

<Merenje stepena inkapsulacije>

[0128]Stepen inkapsulacije je određen na način opisan u nastavku.

[0129]Smeša lipozoma sa inkapsuliranim aktivnim jedinjenjem centrifugirana je 30 minuta na ultracentrifugi na 400.000 g. Koncentracija aktivnog jedinjenja u filtratu je izmerena pomoću HPLC-a, pri čemu je određena količina aktivnog jedinjenja koje nije inkapsulirano u lipozomima. Stepen inkapsulacije je izračunat prema dole navedenoj formuli.

[0130]Stepen inkapsulacije eribulin mezilata je iznosio 90,9%.

(Izvođenje 2)

<Priprema vodenog rastvora za unutrašnju fazu !ipozoma>

[0131]Slično izvođenju 1, 264,3 mg amonijum sulfata i 126,1 mg monohidrata limunske kiseline rastvoreno je u čistoj vodi, i razblaženo u graduisanom sudu do 10 ml da bi se dobio 200 mM amonijum sulfat u 60 mM vodenom rastvoru limunske kiseline. Uzet je 1 ml tog rastvora i pH je podešen na 5,5 pomoću amonijačne vode, nakon Čega je rastvor razblažen čistom vodom do 2 ml da bi se dobio vodeni rastvor za unutrašnju fazu lipozoma.

<Priprema tečnosti za pripremu lipozoma>

[0132]Odmereno je 80 mg svake od lipidnih smeša (hidrogenizovani fosfatidiiholin iz soje : holesterol : polietilen glikol 2000-fosfatidiletanolamin = 58,6 : 19,2 :22,2 (težinski)), 2 ml vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma je zagrejano do oko 80°C i dodato u smešu, koja je zatim mućkana da bi se dobila tečnost za pripremu lipozoma. Ova tečnost za pripremu lipozoma je granulisana pomoću ekstrudera (proizvođača Lipex Biomembranes) zagrejanog na oko 80°C đa bi se dobila tečnost za pripremu lipozoma.

<Priprema dispergovane tečnosti lipozoraa>

[0133]Dobijena tečnost za pripremu lipozoma je razblažena do 10 ml pomoću vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina (pH=7,6), i zatim centrifugirana 30 min na 400.000 g. Sav filtrat je odbačen nakon centrifugiranja. Talog je ponovo dispergovan pomoću vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina, i pomoću graduisanog suda je pripremljen 1 ml tečnosti, dajući dispergovanu tečnost lipozoma.

<Priprema rastvora leka>

[0134]Eribulin mezilat (eribulin mesvlate) je rastvoren u vodenom rastvoru 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina, i dobijen je rastvor eribulin mezilata koncentracije 5 mg/ml.

<Pripremasmešelipozoma>

[0135]0,96 ml dispergovane tečnosti lipozoma i 0,24 ml rastvora eribulin mezilata pomešano je u staklenom sudu od 10 ml, i inkubirano 3 minuta na vodenom kupatilu temperature 60°C, da bi se dobila smeša lipozoma sa eribulin mezilatom koji se nalazi unutar lipozoma.

<Stabilnost u krvnoj plazmipacova>

[0136]Pomešano je 0,2 ml pripremljenog lipozoma sa inkapsuliranim eribulin mezilatom i 1,8 ml krvne plazme pacova, a zatim mućkano na 37°C pomoću inkubatora tečne faze. Odmah nakon pripreme, uzeti su uzorci na 6 sati, 12 sati, 24 sata, 48 sati i 72 sata posle početka mućkanja, i rezidualna količina eribulin mezilata u lipozomima je merena pomoću HPLC-a.

[0137]Rezultati merenja su prikazani na si. 1. Kao što se vidi na si. 1, pokazano je da se eribulin mezilat stabilno zadržava u krvnoj plazmi, čak i u dugom vremenskom roku od 120 sati, i moguće je postepeno otpuštanje.

(Izvođenje3)

<Priprema vodenog rastvorazaunutrašnju fazu Iipozoma>

[0138]264,3 mg amonijum sulfata i 126,1 mg monohidrata limunske kiseline rastvoreno je u čistoj vodi, tako da se dobije oko 15 ml. Nakon podešavanja pH na 7,0 pomoću vodenog rastvora natrijum hidroksida, rastvor je razblažen čistom vodom do 20 ml da bi se dobio vodeni rastvor za unutrašnju fazu lipozoma (100 mM amonijum sulfat/30 mM limunska kiselina).

<Priprematečnosti zapripremulipozoma>

[0139)Odmereno je 378 mg lipidne smeše (hidrogenizovani fosfatidiiholin iz soje : holesterol: polietilen glikol 2000-fosfatidiletanolamin = 58,6 : 19,2 : 22,2 (težinski)), 10 ml gore pomenutog vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma je zagrejano na oko 80°C i dodato u smešu, koja je zatim mešana da bi se dobila tečnost za pripremu lipozoma. Ova tečnost za pripremu lipozoma je granulisana pomoću ekstrudera (proizvođača Lipex Biomembranes) opremljenog polikarbonatnim membranskim filterom od 50 nm i zagrejanog na oko 80°C da bi se dobila tečnost za pripremu lipozoma sa veličinom čestica od oko 80 nm.

<Priprema dispergovane tečnosti lipozoma>

[0140]Upotrebom Sephadex G-50 kolona, dobijena tečnost za pripremu lipozoma je eluirana pomoću vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina (pH=7,6), zamenjujući spoljašnju fazu lipozoma vodenim rastvorom 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina. Nakon zamene spoljašnje faze lipozoma, dobijeni rastvor je centrifugiran 30 minuta na 400.000 g. Nakon centrifugiranja je usledila ponovna disperzija u vodenom rastvoru 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7,6), i 10 ml rastvora je razblaženo do 10 ml da bi se dobila dispergovana tečnost lipozoma.

<Priprema rastvora leka>

[0141]Eribulin mezilat je rastvoren u vodenom rastvoru 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7,6), i dobijen je rastvor eribulin mezilata koncentracije 5 mg/ml.

<Priprema smešelipozoma>

[0142]9,6 mg dispergovane tečnosti lipozoma i 1,2 ml rastvora eribulin mezilata je pomešano u staklenom sudu od 10 ml, i pH je podešen na 9,5 pomoću natrijum hidroksida. To je inkubirano 3 minuta na vodenom kupatilu temperature 60°C da bi se dobila smeša lipozoma sa eribulin mezilatom unutar lipozoma. Nakon hlađenja, pH je podešen na 7,5 pomoću hlorida. Slično izvođenju 1, stepen inkapsulacije je izmeren, i iznosio je 99%.

(Izvođenje 4)

<Priprema vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma>

[0143]Slično Izvođenju 1, pripremljen je rastvor 100 mM amonijum sulfata/30 mM limunske kiseline (pH=5,5).

<Priprema tečnosti za pripremu lipozoma>

[0144]Hidrogenizovani fosfatidiiholin iz soje, holesterol i polietilen glikol 2000-fosfatidiletanolamin odmereni su prema količinama prikazanim u tabeli 1 u nastavku. Nakon rastvaranja svakog od njih u 3 ml hloroforma, hloroform je uklonjen pod sniženim pritiskom u rotacionom uparivaču, i dobijen je lipidni film. 10 ml pripremljenog vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma zagrejano je na oko 80°C i dodato u dobijeni lipidni film, a zatim promućkano da se dobije tečnost za pripremu lipozoma. Ona je granulisana pomoću ekstrudera (proizvođača Lipex Biomembranes) zagrejanog na oko 80°C da bi se dobila granulisana tečnost za pripremu lipozoma. Veličina čestica lipozoma u dobijenoj tečnosti za pripremu lipozoma izmerena je pomoću postupka dinamičkog rasipanja svetla, i Rp. 1 je iznosio 77 nm, Rp. 2 95 nm, Rp. 3 79 nm, a Rp. 4 128 nm.

(Tabela 1)

Rp. Hidrogenizovani fosfatidiiholin iz Holesterol Polietilen glikol 2000-

soje fosfatidiletanolamin

1 234 mg 76 mg 15 mg 2 234 mg 76 mg 15 mg 3 222 mg 73 mg 87 mg 4 222 mg 73 mg 87 mg

<Priprema smeše lipozoma >

[0145]Slično Izvođenju 1, dobijena je dispergovana tečnost lipozoma. Takođe, eribulin mezilat je rastvoren u vodenom rastvoru 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina i dobijen je rastvor eribulin mezilata koncentracije 5 mg/ml.

[0146]4,8 ml svake od dispergovanih tečnosti lipozoma i 0,6 ml rastvora eribulin mezilata pomešano je u staklenom sudu od 10 ml, i inkubirano 3 minuta na vodenom kupatilu temperature 60°C, da bi se dobila smeša lipozoma sa eribulin mezilatom koji se nalazi unutar lipozoma. U svaku od lipozomskih smeša je dodato 24,6 ml vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina, a za filtriranje i sterilizaciju je korišćen poliviniliden fluoridni filter (PVDF) od 0,22 um, dajući uzorak za primenu (eribulin mezilat koncentracije: 0.1 mg/ml). Slično Izvođenju 1, izmeren je stepen inkapsulacije, i potvrđeno je da iznosi najmanje 90% u svakom od preparata.

[0147]Ženke atimičnih miševa (NU/NU, Charles River Laboratories Japan, Inc.) supkutano su inokulisane ćelijama humanog melanoma LOX, i nakon 11 ili 12 dana, dati su uzorci u repne vene, tako da bude 10 ml/kg (1,0 mg/kg eribulin mezilata). Uzet je uzorak krvi i ekstrahovan je uzorak tumorskog tkiva kardijalnom punkturom u određenim periodima nakon primene (15 minuta, 30 minuta, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 36 i 48 sati) (n=3). Uzorak krvi je uzet u epruvetu koja sadrži heparin, i u roku od 30 min nakon uzorkovanja, krv je razdvojena centrifugiranjem na 1.500 g tokom 10 minuta na 4°C da bi se dobila krvna plazma. Ekstrahovano je celokupno tumorsko tkivo, isprano pomoću PBS, obrisano upijajućim papirom, a zatim je odmah odmerena i zabeležena težina tkiva. Tkivo je ubačeno u epruvetu i ohlađeno u ledenoj vodi, a zatim uskladišteno na -80°C do sprovođenja analize.

[0148]Eribulin mezilat u krvnoj plazmi i tumorskom tkivu meren je LC/MS/MS tehnikom.

[0149]FK parametri su izračunati pomoću softvera za analizu otvorenog modela (WinNonlin verzija 5.0.1). Rezultati za FK parametre krvne plazme i tumorskog tkiva za eribulin mezilat prikazani su u tabeli 2, odnosno tabeli 3.

[0150]Iz tabele 2 i tabele 3 se vidi daje AUC vrednost krvne plazme i tkiva tumora povećana u poređenju sa slobodnim eribulin mezilatom u sve četiri smeše lipozoma Rp. 1 do 4, i stoga je poboljšana količina eribulin mezilata koji prelazi u tumor i njegova retencija u tumoru.

(Izvođenje 5)

<Priprema vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma>

[0151]Slično Izvođenju 1, pripremljen je 100 mM amonijum sulfat/30 mM vodeni rastvor limunske kiseline (pH=5,5).

<Priprema tečnosti za pripremu lipozoma>

[0152]Odmereno je 221,8 mg hidrogenizovanog fosfatidilholina iz soje, 72,5 mg holesterola

i 86,9 mg polietilen glikola 2000-fosfatidiletanolamina. Nakon njihovog rastvaranja u 3 ml hloroforma, hloroform je uklonjen pod sniženim pritiskom u rotacionom uparivaču, i dobijen je lipidni film. 10 ml dobijenog vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma zagrejano je na oko 80°C i dodato u dobijeni lipidni film, a zatim mućkano da se dobije tečnost za pripremu lipozoma. Ona je granulisana pomoću ekstrudera (proizvođača Lipex Biomembranes) zagrejanog na oko 80°C i dobijena je granulisana tečnost za pripremu lipozoma. Kada je veličina Čestica lipozoma u dobijenoj tečnosti za pripremu lipozoma izmerena pomoću postupka dinamičkog rasipanja svetlosti, Čestice su bile oko 90 nm.

<Pripremadispergovane tečnosti lipozoma>

[0153] Upotrebom Sephadex G-50 kolona, dobijena tečnost za pripremu lipozoma je eluirana pomoću vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina (pH=7,6), zamenjujući spoljašnju fazu lipozoma vodenim rastvorom 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina. Nakon zamene spoljašnje faze lipozoma, dobijeni rastvor je centrifugiran 30 minuta na 400.000 g. Nakon centrifugiranja je usledila redisperzija, i vodeni rastvor 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina je upotrebljen da bi se dobilo 10 ml tečnosti, dajući dispergovanu tečnost lipozoma.

<Priprema rastvora leka>

[0154] Eribulin mezilat je rastvoren u vodenom rastvoru 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina i dobijen je rastvor eribulin mezilata koncentracije 1 mg/ml. Takođe, za uzorke slobodnih tela za primenu, rastvor eribulin mezilata je razblažen pomoću vođenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina, i PVDF filter od 0,22 um je korišćen za filtriranje i sterilizaciju, kako bi se dobili uzorci za primenu (koncentracije eribulin mezilata: 0,3 mg/ml i 0,4 mg/ml).

<Priprema smeše lipozoma >

[0155] 1,8 ml dispergovane tečnosti lipozoma i 1,2 ml rastvora eribulin mezilata pomešano je u staklenom sudu od 10 ml, koji je inkubiran 3 minuta na vodenom kupatilu temperature 60°C, da bi se dobila smeša lipozoma sa eribulin mezilatom koji se nalazi unutar lipozoma. Dobijena smeša lipozoma je razblažena pomoću vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina, i PVDF filter od 0,22 prnje korišćen za filtriranje i sterilizaciju, kako bi se dobili uzorci za primenu (koncentracija eribulin mezilata: 0,2 mg/ml). Slično Izvođenju 1, izmeren je stepen inkapsulacije, i potvrđeno je da iznosi najmanje 90%.

[0156] FaDu (dobijena od American Type Culture Collection), linija humanih faringealnih skvamoznih ćelija karcinoma, uzgajana je i rasla u MEM medijumu za ćelijske kulture koji sadrži 10% goveđeg fetalnog seruma. Ćelije su odvojene od boce pomoću 0,05% rastvora tripsin-EDTA i sakupljene. Nakon ispiranja PBS-om, ćelije su suspendovane u PBS-u tako da bude 5 * IO7 ćelija/ml, i ostavljene u ledu. 0,1 ml tečnosti iz ćelijske suspenzije je supkutano injektovano u desni ventralni deo 6-nedeljnih atimičnih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.). Svaki mišje svakodnevno posmatran, i pravljene su odgovarajuće beleške u slučajevima kada su primećena abnormalna stanja. Veličina tumora tokom vremena merena je pomoću pomičnog merila, a veličina tumora je izračunavana pomoću formule: glavna osa x (manja osa na kvadrat)+2. U trenutku kada je veličina tumora bila 100 do 200 mm<3>, miševi su podeljeni u grupe tako da su prosečne vrednosti veličine tumora i telesna težina miševa bile uniformne između ispitivanih grupa (pet miševa po ispitivanoj grupi), i lek je davan u kaudalnu venu (0,2 ml/20 g; 3 puta u 7-dnevnim intervalima). ;[0157]Rezultujuće promene u srednjoj zapremini tumora nakon davanja uzorka prikazane su na si. 2. ;[0158]Kao što je prikazano na si. 2, efekat smanjenja tumora nije postignut čak ni pri 4 mg/kg, što je maksimalna doza koja se toleriše za slobodna tela, jer je FaDu ćelijska linija sa malom osetljivošću na eribulin mezilat. U međuvremenu, u slučaju kompozita lipozoma, nađen je jasan efekat smanjenja tumora, čak i pri primeni 2 mg/kg, što je ispod maksimalne doze tolerancije, što ukazuje da izuzetno visok farmakološki efekat može da se dobije čak i za vrste kancera protiv kojih eribulin mezilat nije bio uspešan. ;(Izvođenje 6);<Priprema vodenog rastvora za unutrašnju fazu Hpozoma>;[0159]Slično Izvođenju 1, pripremljen je rastvor 100 mM amonijum sulfata/30 mM vodenog rastvora limunske kiseline (pH=5,5). ;<Priprema rastvora leka>;[0160]Slično Izvođenju 5, dobijeni su uzorci za primenu (koncentracije eribulin mezilata: 0,2 mg/ml, 0,3 mg/ml i 0,4 mg/ml) slobodnih tela. ;<Priprema smeše lipozoma >;[0161]Osim za primenu vodenog rastvora unutrašnje faze lipozoma[ sic:vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma] pripremljenog kao što je objašnjeno u gornjem tekstu, smeša lipozoma (koncentracija eribulin mezilata: 0,3 mg/ml) dobijena je slično Izvođenju 5. Slično Izvođenju 1, stepen inkapsulacije je izmeren, i iznosio je najmanje 90%. ;[0162]ACHN (dobijena od American Type Culture Collection), ćelijska linija humanog renalnog karcinoma, uzgajana je i rasla u MEM medijumu za ćelijske kulture koji sadrži 10% goveđeg fetalnog seruma. Ćelije su odvojene od boce pomoću 0,05% rastvora tripsin-EDTA i sakupljene. Nakon ispiranja PBS-om, ćelije su suspendovane u PBS-u tako da bude 5 * IO7 ćelija/ml, i čuvane u ledu. 0,1 ml ćelijske suspenzione tečnosti supkutano je injektovano u desni ventralni deo 6-nedeljnih atimičnih miševa (Charles River Laboratories Japan, Inc.). Svaki mišje svakodnevno posmatran, i pravljene su odgovarajuće beleške u slučajevima kada su primećena abnormalna stanja. Veličina tumora tokom vremena merena je pomoću pomičnog merila, a veličina tumora je izračunavana pomoću formule: glavna osa x (manja osa na kvadrat) + 2. U trenutku kada je veličina tumora bila 150 do 200 mm<3>, miševi su podeljeni u grupe tako da su prosečne vrednosti veličine tumora i telesna težina miševa bile uniformne između ispitivanih grupa (pet miševa po ispitivanoj grupi), i lek je davan u kaudalnu venu (0,2 ml/20 g; 3 puta u 7-dnevnim intervalima).

[0163]Rezultujuće promene u srednjoj zapremini tumora nakon davanja uzorka prikazane su na si. 3.

[0164]Kao što je prikazano na si. 3, pošto je ACHN ćelijska linija rezistentna na eribulin mezilat, nije primećena značajna razlika između grupa za slobodna tela sa primenom doza od 2 mg/kg, 3 mg/kg i 4 mg/kg, (maksimalna doza tolerancije) i netretirane grupe 45 dana od početka primene uzoraka. U međuvremenu, u grupi sa primenom smeše lipozoma od 3 mg/kg, otkriven je efekat supresije rasta tumora, i značajno manja zapremina tumora je pokazana za netretiranu grupu i grupe sa primenom slobodnih tela 45 dana od početka primene uzoraka. Kao što je na taj način pokazano, moguće je odložiti rast tumora pripremom formulacije lipozoma za tumor kod koga nikad ranije nije postignut terapeutski efekat sa eribulin mezilatom.

(Izvođenje7)

<Priprema vodenog rastvora za unutrašnju fazu Iipozoma>[0165]Pripremljeno je 12 vrsta vodenih rastvora za unutrašnju fazu, koji su prikazani u nastavku, u tabeli 4.

<Priprema tečnosti za pripremu lipozoma>

[0166]U epruvete je odmereno 120 mg lipidne smeše (hidrogenizovani fosfatidiiholin iz soje : holesterol: polietilen glikol 2000-fosfatidiletanolamin = 58,6 : 19,2 : 22,2 (težinski)), i 3 ml svakog uzorka vodenog rastvora za unutrašnju fazu je zagrejano na 80<C>C.

[0167] Tečnost za pripremu lipozoma je granulisana pomoću ekstrudera zagrejanog na oko 80°C i dobijena je tečnost za pripremu lipozoma.

<Priprema lipozomske disperzione tečnosti>

[0168] Upotrebom Sephadex G-50 kolona, dobijena tečnost za pripremu lipozoma je eluirana pomoću vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina, zamenjujući spoljašnju fazu lipozoma vodenim rastvorom 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina.

[0169] Nakon zamene spoljašnje faze lipozoma, usledilo je centrifugiranje, 1 sat na 400.000 g, i filtrat je uklonjen u potpunosti. Talog je ponovo suspendovan pomoću vodenog rastvora 96 mg saharoze/10 mM histidina (pH=7,5), tako da se dobije oko 2 ml.

[0170] Veličina čestica u dobijenoj dispergovanoj tečnosti lipozoma izmerena je pomoću postupka dinamičkog rasipanja svetlosti, i sve su bile oko 80 nm.

<Priprema rastvora Ieka>

[0171] Eribulin mezilat je rastvoren u vodenom rastvoru 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina, i dobijen je rastvor eribulin mezilata koncentracije 5 mg/ml.

<Priprema smeše lipozoma >

[0172] Dispergovana tečnost lipozoma i rastvor eribulin mezilata pomešani su u staklenom sudu od 10 ml, tako daje bilo 0,2 mg/ml eribulin mezilata, a ukupna koncentracija lipida je bila 16 |imol/ml. To je grejano 5 minuta na 60°C da bi se dobila smeša lipozoma sa eribulin mezilatom unutar lipozoma.

<Merenje stepena inkapsulacije>

[0173] Stepen inkapsulacije je izmeren na sličan način kao u Izvođenju 1, i rezultati su prikazani u tabeli 4. Kao što se vidi iz tabele 4, nezavisno od toga koja amonijumova so je upotrebljena za unutrašnju fazu, stepen inkapsulacije eribulin mezilata je očigledno poboljšan. Poboljšanje stepena inkapsulacije je naročito bilo izraženo kada je korišćen amonijum sulfat, amonijum citrat, amonijum fosfat i amonijum tartarat.

(Izvođenje 8)

<Priprema vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma>

[0174]Slično izvođenju 7, vodeni rastvor za unutrašnju fazu lipozoma pripremljen je od 100 mM amonijum sulfata/30 mM vodenog rastvora limunske kiseline (pH=7,5).

<Priprema tečnostizapripremu lipozoma>

[0175]Slično izvođenju 7, gore pomenuti vodeni rastvor za unutrašnju fazu lipozoma korišćen je za pripremu tečnosti za pripremu lipozoma.

<Priprema dispergovane tečnosti lipozoma>

[0176]Upotrebom Sephadex G-50 kolona, dobijena tečnost za pripremu lipozoma je eluirana pomoću vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina, zamenjujući spoljašnju fazu lipozoma vodenim rastvorom 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina.

[0177]Nakon zamene spoljašnje faze lipozoma, usledilo je centrifugiranje, 1 sat na 400.000 g, i filtrat je uklonjen u potpunosti. Talog je ponovo suspendovan u vodenom rastvoru 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7,5), spoljašnja faza lipozoma je zamenjena vodenim rastvorom 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7.5), i dobijena je dispergovana tečnost lipozoma. Veličina čestica u dobijenoj dispergovanoj tečnosti lipozoma izmerena je pomoću postupka dinamičkog rasipanja svetlosti, i bila je oko 80 nm.

[0178]Dispergovana tečnost lipozoma je raspoređena u sedam bočica, i u spol jašnju fazu lipozoma je dodat amonijum sulfat (čiji pH je podešen na 7,5 pomoću vodenog rastvora natrijum hidroksida) u poznatoj količini, tako daje koncentracija u bočicama bila kao u tabeli 5, i dobijena je lipozomska disperziona tečnost u kojoj je bila poznata koncentracija amonijum sulfata u spoljašnjoj fazi lipozoma.

<Priprema rastvoraleka>

[0179]Eribulin mezilat je rastvoren u vodenom rastvoru 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina, i dobijen je rastvor eribulin mezilata koncentracije 5 mg/ml.

<Priprema smešelipozoma>

[0180]Dispergovana tečnost lipozoma i rastvor eribulin mezilata pomešani su u staklenom sudu od 10 ml, tako daje bilo 0,2 mg/ml eribulin mezilata, a ukupna koncentracija lipida je bila 16 mM. To je grejano 5 minuta na 60°C da bi se dobila smeša lipozoma sa eribulin mezilatom unutar lipozoma.

<Merenje stepena inkapsulacije>

[0181]Stepen inkapsulacije je izmeren na sličan način kao u Izvođenju 1, i rezultati su prikazani u tabeli 5. Oni pokazuju da, čak i ako je u spoljašnjoj fazi lipozoma prisutan amonijum sulfat u koncentraciji od 0,4 mM, stepen inkapsulacije naglo opada, a ukoliko je prisutan amonijum sulfat koncentracije 10 mM, gotovo da uopšte nema inkapsulacije.

(Tabela 5)

Br. Unutrašnja vodena Koncentracija amonijum sulfata u Stepen inkapsulacije faza spoljašnjoj fazi (mM)(%)~~i 0 90A

~ Y~0,016 90^83100 mM amonijum O^OŠ" 91,34sulfat 0/i 75^9530 mM limunska 2 36,8 ~T~ kiselina fo 16J

~ T~PH=7'5 50 8^6

(Izvođenje 9)

<Priprema vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma>

[0182]Slično Izvođenju 7, vodeni rastvor za unutrašnju fazu lipozoma pripremljen je od 100 mM amonijum sulfata/30 mM vodenog rastvora limunske kiseline (pH=7,5).

<Priprema tečnosti za pripremu lipozoma>

[0183]Slično Izvođenju 7, gore pomenuti vodeni rastvor za unutrašnju fazu lipozoma korišćen je za pripremu tečnosti za pripremu lipozoma.

<Priprema lipozomske disperzione tečnosti>

[0184]Upotrebom Sephadex G-50 kolona, dobijena tečnost za pripremu lipozoma je eluirana pomoću vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina, zamenjujući spoljašnju fazu lipozoma vodenim rastvorom 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina.

[0185]Nakon zamene spoljašnje faze lipozoma, tečnost je centrifugirana 1 sat na 400.000 g i filtrat je uklonjen u potpunosti. Talog je ponovo suspendovan pomoću vodenog rastvora 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7,5), spoljašnja faza lipozoma je zamenjena vodenim rastvorom 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7,5), i dobijena je dispergovana tečnost lipozoma. Veličina čestica u dobijenoj dispergovanoj tečnosti lipozoma izmerenaje pomoću postupka dinamičkog rasipanja svetlosti, i bila je oko 80 nm.

<Priprema rastvora leka>

[0186] Eribulin mezilat je rastvoren u vodenom rastvoru 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina, i dobijen je rastvor eribulin mezilata koncentracije 5 mg/ml.

<Priprema smeše lipozoma>

[0187] Dispergovana tečnost lipozoma i rastvor eribulin mezilata pomešani su u staklenom sudu od 10 ml, tako daje bilo 0,2 mg/ml eribulin mezilata, a ukupna koncentracija lipida je bila 16 mM. Kao što je pokazano u tabeli 6, pH svake spoljašnje faze lipozoma je podešen pomoću 1 M vodenog rastvora natrijum hidroksida. Zatim su grejane 5 minuta na 60°C da bi se dobila smeša lipozoma sa eribulin mezilatom unutar lipozoma. Potom je pH spoljašnje faze podešen na 7,5 pomoću hlorovođonične kiseline.

<Merenje stepena inkapsulacije>

[0188] Stepen inkapsulacije je izmeren na sličan način kao u Izvođenju 1, i rezultati su prikazani u tabeli 6. Pored toga što je povećan pH spoljašnje faze lipozoma, stepen inkapsulacije je značajno povišen, dostižući stepen inkapsulacije od skoro 100%.

(Izvođenje 10)

<Priprema vodenog rastvora za unutrašnju fazu lipozoma>

[0189]Slično Izvođenju 7, vodeni rastvor za unutrašnju fazu lipozoma pripremljen je od 100 mM amonijum sulfata/30 mM vodenog rastvora limunske kiseline (pH=7,5).

<Priprema tečnosti za pripremu lipozoma>

[0190]Slično Izvođenju 7, gore pomenuti vodeni rastvor za unutrašnju fazu lipozoma korišćen je za pripremu tečnosti za pripremu lipozoma.

<Priprema lipozomske disperzione tečnosti>

[0191]Upotrebom Sephadex G-50 kolona, dobijena tečnost za pripremu lipozoma je eluirana pomoću vodenog rastvora 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina, zamenjujući spoljašnju fazu lipozoma vodenim rastvorom 0,9% natrijum hlorida u 10 mM histidina.

[0192]Dispergovana tečnost lipozoma je raspoređena u četiri bočice, koje su centrifugirane 1 sat na 400.000 g, i filtrat je u potpunosti uklonjen. Talog iz dve bočice je ponovo suspendovan u vodenom rastvoru 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7,5), i spoljašnja faza lipozoma je zamenjena vodenim rastvorom 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7,5). Talog iz dve preostale bočice je ponovo suspendovan u vodenom rastvoru 0,9 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7,5), i spoljašnja faza lipozoma je zamenjena vodenim rastvorom 0,9 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7,5). Veličina Čestica u dobijenoj dispergovanoj tečnosti lipozoma izmerena je pomoću postupka dinamičkog rasipanja svetlosti, i sve čestice su bile oko 80 nm.

<Priprema rastvora leka>

[0193]Eribulin mezilat je rastvoren u vodenom rastvoru 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina, i dobijen je rastvor eribulin mezilata koncentracije 5 mg/ml. Slično tome, eribulin mezilat je rastvoren u vodenom rastvoru 0,9% natrijum hlorida/10 mM histidina i dobijen je rastvor eribulin mezilata koncentracije 5 mg/ml.

<Priprema smeše lipozoma>

[0194]Dispergovana tečnost lipozoma i rastvor eribulin mezilata pomešani su u staklenom sudu od 10 ml, tako daje bilo 0,2 mg/ml eribulin mezilata, a ukupna koncentracija lipidaje bila 16 mM. pH spoljašnje faze lipozoma iz jedne od dve bočice sa vodenim rastvorom 96 mg/ml saharoze/10 mM histidina (pH=7,5) podešen je na 9,5 dodatkom natrijum hidroksida. Slično tome, pH spoljašnje faze lipozoma iz jedne od dve bočice sa vodenim rastvorom 0,9 % natrijum hlorida/10 mM histidina (pH=7,5) podešen je na 9,5 dodatkom natrijum hidroksida. One su grejane 5 minuta na 60°C da bi se dobila smeša lipozoma sa eribulin mezilatom unutar lipozoma.

<Mcrenjc stepena inkapsulacijc>

[0195]Stepen inkapsulacije je izmeren na sličan način kao u Izvođenju 1, i rezultati su prikazani u tabeli 7. U poređenju sa slučajem kada je spoljašnja faza lipozoma saharoza, koja nije elektrolit, u slučaju natrijum hlorida, koji je elektrolit, jasno se dobija veoma visok stepen inkapsulacije. Pored elektrolitnog efekta, primenom pH gradijenta da bi spoljašnja faza lipozoma bila alkalija, postiže se stepen inkapsulacije od 100%.

Industrijska primenljivost

[0196]Predmetni pronalazak može da obezbedi postupak za proizvodnju lipozoma sa velikom retencionom stabilnošću aktivnog jedinjenja sa visokim stepenom inkapsulacije.

[0197]Smeša lipozoma iz predmetnog pronalaska je pogodna za terapeutsku primenu putem farmakološkog efekta eribulina ili njegove farmakološki prihvatljive soli.

Claims (36)

1. Smeša lipozoma koja sadrži lipozom, i sadrži (i) aktivno jedinjenje, (ii) amonijumovu so i (iii) so, kiselinu, bazu i/ili aminokiselinu u unutrašnjoj fazi lipozoma. Što je aktivno jedinjenje eribulin ili njegova farmakološki prihvatljiva so.

2. Smeša lipozoma prema zahtevu 1, gde je smeša lipozoma u čvrstom ili tečnom obliku.

3. Smeša lipozoma prema zahtevu 1 ili 2, gde je koncentracija gore pomenute amonijumove soli 10 mM ili viša.

4. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 3, gde je koncentracija gore pomenute soli 1 do 300 mM.

5. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 4, gde je koncentracija gore pomenute kiseline 1 do 300 mM.

6. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 5, gde je koncentracija gore pomenute aminokiseline 1 do 300 mM.

7. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 6, gde je koncentracija gore pomenute baze 1 do 300 mM.

8. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 7, gde je koncentracija gore pomenutog aktivnog jedinjenja 0,01 do 300 mg/ml.

9. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 8, gde je gore pomenuto aktivno jedinjenje eribulin mezilat.

10. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 9, gde unutrašnja faza lipozoma dalje sadrži amonijum sulfat, limunsku kiselinu i aktivno jedinjenje.

11. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva I do 10, gde spoljašnja faza lipozoma sadrži šećer, elektrolit, i/ili aminokiselinu.

12. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 11, gde spoljašnja faza lipozoma sadrži šećer, elektrolit, i aminokiselinu.

13. SmeŠa lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 10, gde spoljašnja faza lipozoma sadrži šećer ili elektrolit, i aminokiselinu.

14. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 11 do 13, gde je koncentracija gore pomenutog šećera 2 do 20%.

15. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 11 do 14, gde je koncentracija gore pomenute aminokiseline 1 do 300 mM.

16. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 15, gde spoljašnja faza lipozoma sadrži saharozu ili natrijum hlorid, i histidin.

17. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 16, gde gore pomenuta spoljašnja faza lipozoma ne sadrži ciklodekstrin u značajnijoj količini.

18. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 17, gde lipozom sadrži hidrogenizovani fosfatidiiholin.

19. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 18. gde lipozom sadrži holesterol.

20. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 19, gde lipozom sadrži kondenzat metoksipolietilen glikola.

21. Smeša lipozoma prema zahtevu 20, gde je gore pomenuti kondenzat metoksipolietilen glikola, kondenzat distearoilfosfatidil etanolamino polietilen glikola.

22. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 21, gde lipozom sadrži hidrogenizovani fosfatidiiholin, holesterol i kondenzat distearoilfosfatidil etanolamino polietilen glikola.

23. Smeša lipozoma prema zahtevu 22, koja sadrži 10 do 80% gore pomenutog hidrogenizovanog fosfatidilholina, 1 do 60% gore pomenutog holesterola i 0 do 50% gore pomenutog kondenzata distearoilfosfatidil etanolamino polietilen glikola.

24. Smeša lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 23, gde lipozom sadrži hidrogenizovani fosfatidiiholin iz soje, holesterol i polietilen glikol 2000-fosfatidiletanolamin.

25. Postupak za proizvodnju smeše lipozoma prema bilo kom od zahteva 1 do 24, uključujući: korak u kome se dobija dispergovana tečnost lipozoma koja sadrži lipozom; korak u kome se gore pomenuta dispergovana tečnost meša sa gore pomenutim aktivnim jedinjenjem; i korak u kome se gore pomenuto aktivno jedinjenje uvodi u unutrašnju fazu lipozoma gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma, gde korak dobijanja gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma uključuje: korak u kome se dobija rastvor za pripremu lipozoma, i koji sadrži amonijumovu so u unutrašnjoj fazi lipozoma i spoljašnjoj fazi lipozoma; i korak u kome se spoljašnja faza lipozoma gore pomenutog rastvora za pripremu lipozoma zamenjuje ili razblažuje, i gde je korak u kome se gore pomenuta spoljašnja faza lipozoma zamenjuje ili razblažuje, korak u kome se pH spoljašnje faze lipozoma povećava u odnosu na pH unutrašnje faze lipozoma.

26. Postupak prema zahtevu 25, gde gore pomenuta dispergovana tečnost lipozoma ne sadrži značajnije količine amonijumove soli u spoljašnjoj fazi lipozoma.

27. Postupak prema zahtevu 25 ili 26, gde pH spoljašnje faze lipozoma gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma iznosi 3 do 10.

28. Postupak prema bilo kom od zahteva 25 do 27, gde pH spoljašnje faze lipozoma gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma iznosi 7 do 10.

29. Postupak prema zahtevu 27 ili 28, gde gore pomenuti pH predstavlja pH spoljašnje faze lipozoma gore pomenute dispergovane tečnosti lipozoma u koraku u kome se gore pomenuta dispergovana tečnost lipozoma i gore pomenuto aktivno jedinjenje mešaju.

30. Postupak prema bilo kom od zahteva 25 do 29, gde je korak u kome se gore pomenuta spoljašnja faza lipozoma zamenjuje ili razblažuje, korak u kome razlika između pH spoljašnje faze lipozoma i pH unutrašnje faze lipozoma iznosi 1 do 5.

31. Postupak prema bilo kom od zahteva 25 do 30, gde pH gore pomenute unutrašnje faze lipozoma iznosi 3 do 9.

32. Postupak prema bilo kom od zahteva 25 do 31, gde pH gore pomenute unutrašnje faze lipozoma iznosi 4 do 9.

33. Postupak prema bilo kom od zahteva 25 do 32, gde pH gore pomenute unutrašnje faze lipozoma iznosi 5 do 8.

34. Postupak prema bilo kom od zahteva 25 do 33, gde je spoljašnja faza lipozoma rastvor koji sadrži elektrolit u koraku u kojem se uvodi gore pomenuto aktivno jedinjenje.

35. Smeša lipozoma prema biloM kom od zahteva 25 do 34, gde gore pomenuta dispergovana tečnost lipozoma ne sadrži ciklodekstrin u značajnijoj količini.

36. Postupak prema bilo kom od zahteva 25 do 35, koji dalje sadrži korak u kome se neutrališe pH spoljašnje faze lipozoma.