RS55162B1 - Rekombinantni rsv antigeni - Google Patents

Description

POREKLO PRONALASKA

[0001] Ovo otkriće pripada oblasti imunologije. Još preciznije, ovo otkriće se odnosi na kompozicije i postupke za pobuđivanje imunog odgovora, specifičnog za respiratorni sincicijalni virus (RSV).

[0002] Humani respiratorni sincicijalni virus (RSV) je najrasprostranjeniji uzrok infekcija donjeg respiratornog trakta (LRI) kod odojčadi mlađih od 6 meseci i prevremeno rođenih beba sa manje od ili sa 35 nedelja trudnoće. Spektar RSV bolesti obuhvata široko polje respiratornih simptoma od rinitisa i otitisa do pneumonije i bronhiolita, a ove zadnje dve su povezane sa značajnim brojem oboljevanja i smrtnosti. Ljudi su jedini poznati nosioci RSV. Širenje virusa od infektivnih nosnih sekreta ide preko obilnih respiratornih kapljica, tako daje za transmisiju potreban blizak kontakt sa infektivnim pojedincem ili kontaminiranom površinom. RSV može da opstane više sati na igračkama ili drugim predmetima, čime se objašnjava velika brzina nosokomijalnih RSV infekcija, posebno u pedijatrijskim odeljcima.

[0003] Ukupna godišnja infekcija i smrtnost se procenjuje na 64 miliona i na 160.000 tim redom. Samo u U.S. se procenjuje daje RSV odgovoran za 18.000 do 75.000 hospitalizacija i 90 do 1900 smrti godišnje. U umerenim klimatskim uslovima, jasno je dokumentovano daje RSV uzročnik godišnjih zimskih epidemija akutnih LRI, uključujući bronhitis i pneumoniju. U USA, skoro sva deca do dve godine starosti su inficirana sa RSV. Sa druge strane, incidenca stope LRI povezane sa RSV zdrave dece se izračunava kao 37 na 1000 dece godišnje u prve dve godine života (45 po 1000 dece godišnje kod odojčadi mlađih od 6 meseci) a rizik od hospitalizacije je 6 na 1000 dece godišnje (na 1000 dece godišnje u prvih 6 meseci života). Incidenca je veća kod dece sa kardio-pulmonarnom bolešću i kod one dece koja su prevremeno rođena, koji čine skoro polovinu primljenih u bolnicu zbog infekcije sa RSV u USA. Deca koja su imala mnogo ozbiljniji RL1 izazvan sa RSV. kasnije imaju povećanu incidencu dečije astme. Ove studije pokazuju veliku potrebu za RSV vakcinama, kao i za njihovu upotrebu u industrijskim zemljama, gde su znatni troškovi nege pacijenata sa ozbiljnim LRI i njihovim posledicama. RSV se takođe sve više prepoznaje kao značajan uzročnik smrtnosti od bolesti sličnih influenci kod starih osoba.

[0004]Pokušani su različiti pristupi u naporima da se dobije bezbedna i efikasna RSV vakcina koja produkuje dugotrajan i zaštitni imuni odgovor kod zdrave i rizične populacije. Međutim, ni jedan do sada procenjen pokušaj nije se dokazao kao bezbedan i efikasan kao vakcina u cilju prevencije RSV infekcije i/ili redukcije ili prevencije RSV bolesti, uključujući infekcije donjih respiratornih puteva (LRI). Van Drunen Lihl-Van Den Hurk i saradnici, Revievvs in Medical Virologv (2007) Vol. 17 strane 9859-9864 su razmatrali različite pristupe RSV vakcinama i zaključili da su F i G proteini formulisani u sub jediničnim vakcinama generalno bezbedni.

KRATAK SADRŽAJ

[0005]Ovo otkriće se odnosi na rekombinantne antigene respiratornog sincicijalnog virusa (RSV). Još preciznije, ovo otkriće se odnosi na antigene koji uključuju rekombinantni F protein koji je modifikovan da stabilizuje trimeričku prefusionu konformaciju. Ovaj pronalazak se odnosi na rekombinantni antigen respiratornog sincicijalnog virusa (RSV) koji uključuje rastvorljiv F protein polipeptid uključujući F2domen i Fi domen RSV F protein polipeptida. pri čemu ne postoji furin na mestu cepanja između F2domena i Fi domena i pri čemu polipeptid dalje uključuje heterologni domen trimerizacije pozicioniran na C-završetku Fidomena. Otkriveni rekombinantni antigeni ispoljavaju superiornu imunogeniČnost i posebno imaju prednost kada se koriste kao komponente imunogeničnih kompozicija (na primer, vakcina) za zaštitu od RSV infekcija i/ili bolesti. Takođe su otkrivene nukleinske kiseline koje enkodiraju rekombinantne antigene, imunogenične kompozicije koje sadrže antigene i postupci za izradu i korišćenje antigena.

KRATAK OPIS SLIKA

[0006]

SLIKA 1A je šematski prikaz najhitnijih strukturnih karakteristika RSV F proteina.

SLIKA 1B je šematski prikaz RSV Prefusion F (PreF) antigena.

SLIKA 2 je linija grafički prikazanih reprezentativnih rezultata analize frakcionog protoka u asimetričnom polju (AFF-MALS) za PreF.

SLIKA 3 je grafička traka koja pokazuje neutralizaciju inhibicije humanog seruma sa PreF antigenom.

SLIKE 4A i B su grafičke trake koje pokazuju povećanje IgG titra seruma miševa kao odgovor na PreF antigen.

SLIKE 5A i B su grafici koji pokazuju titre neutralizacije antitela specifičnih za RSV pojačanih sa PreF antigenom.

SLIKE 6A i B su grafici koji pokazuju zaštitu od infekcije nastale sa RSV PreF antigenom kod miševa.

SLIKA 7 je grafik koji procenjuje BAL leukocite nakon imunizacije i infekcije.

DETALJAN OPIS

UVOD

[0007] Razvoj vakcina za prevenciju RSV infekcije je komplikovan zbog činjenice da se pokazalo da imuni odgovor domaćina igra ulogu u patogenezi bolesti. Rane studije iz 1960-ih su pokazale da su deca vakcinisana sa RSV vakcinom inaktiviranom formalinom oboljevala od mnogo težih bolesti pri kasnijem izlaganju virusu u poređenju sa nevakcinisanim kontrolnim subjektima. Ovi rani pokušaji su za rezultat imali hospitalizaciju 80% vakcinisanih i dva smrtna slučaja. Povećanje težine bolesti je reprodukovano na modelima životinja i smatra se da je to rezultat neadekvatnih vrednosti neutrališućih antitela u serumu, nedostatka lokalnog imuniteta i preterane indukcije imunog odgovora tip 2 pomagača sličnog T-ćeliji (Th2) sa pulmonarnom eozinofilijom i povećanom produkcijom IL-4 i IL-5 citokina. Nasuprot tome, uspešna vakcina koja štiti od RSV infekcije indukuje imuni odgovor na bazi Thl, koji se karakteriše produkcijom IL-2 i y-interferona (IFN).

[0008] Ovaj pronalazak se odnosi na rekombinantni antigen respiratornog sincicijalnog virusa (RSV) koji uključuje rastvorljiv F protein polipeptid, uključujući F2domen i Fi domen RSV F protein polipeptida, pri Čemu ne postoji furin kao mesto cepanja između F2domena i Fi domena i pri Čemu polipeptid dalje uključuje domen heterologne trimerizacije pozicioniran na C-terminalu Fidomena. Ovo otkriće se odnosi na rekombinantne antigene respiratornog sincicijalnog virusa (RSV) koji rešavaju probleme koji su se javili sa RSV antigenima prethodno korišćenim u vakcinama i poboljšavaju imunologiju kao i karakteristike antigena za proizvodnju. Ovde otkriveni rekombinantni RSV antigeni uključuju analog fusionog (F) proteina što obuhvata raslvorljivi F protein polipeptid koji je modifikovan da slabilizuje prefusionu konformaciju F proteina, to jest, konformaciju potpuno formiranog F proteina pre fuzije sa membranom ćelije domaćina. Ovi analozi F proteina su označeni kao "PreF" ili "PreF antigeni", u cilju jasnoće i jednostavnosti. Ovde otkriveni PreF antigeni se zasnivaju na neočekivanom otkriću da analozi rastvorljivog F proteina koji su modifikovani inkorporiranjem domena heterologne trimerizacije ispoljavaju poboljšane imunogenične karakteristike i da su bezbedni i pružaju visoku zaštitu kada se primene na subjektuin vivo. |0009]Ovde su dati detalji strukture RSV F proteina u skladu sa terminologijom i oznakama koje su široko prihvaćene u tehnici i šematski su ilustrovani u SLICI 1 A. Sematski prikaz primera PreF antigena je dat u SLICI 1B. Stručnjaku sa iskustvom u tehnici je jasno da bilo koji RSV F protein može da se modifikuje kako bi se stabilizovala prefusiona konformacija u skladu sa tehnikama koje su ovde date. Prema tome. kako bi se omogućilo razumevanje principa vođenja produkcije PreF antigena, pojedinačne strukturne komponente će biti pokazane sa referencom na primerni F protein, polinukleotid i sekvencu amino kiseline koji se javljaju u SEQ ID NOi: I i 2, tim redom. Slično tome, kada je to prihvatljivo, antigeni G proteina su opisani u odnosu na primerni G protein, polinukleotid i sekvence amino kiselina koji se javljaju u SEQ ID NOi:3 i 4, tim redom. (0010JU vezi sa sekvencom primame amino kiseline F protein polipeptida (SLIKA 1 A), koriste se sledeći termini za opis strukturnih karakteristika PreF antigena.

[0011]Naziv FO se odnosi na prekursor cele dužine premeštenog F proteina. FO polipeptid može dalje da se podeli na F2 domen i FI domen koji su razdvojeni posredstvom peptida, označenog kao pep27. U toku sazrevanja, FO polipeptid se podvrgava proteolitičkom cepanju na dva položaja furina koji se nalaze između F2 i FI u bočnim pep27. U cilju utvrđivanja diskusije, F2 domen obuhvata najmanje deo, a čak i sve amino kiseline 1-109 a raslvorljivi deo FI domena uključuje najmanje deo i čak sve amino kiseline 137-526 F proteina. Kako je prethodno navedeno, pozicije ovih amino kiselina (i pozicije svih narednih ovde označenih amino kiselina) su date u odnosu na primerni F protein prekursor polipeptida (FO) SEQ ID NO:2. f 0012]Prefusioni F (ili "PreF") antigen je rastvorljivi (to jest. nije vezan za membranu) analog F proteina koji uključuje najmanje jednu modifikaciju koja stabilizuje prefusionu konformaciju F proteina, kao što RSV antigen zadržava najmanje jedan imunodominantni epitop prefusione konformacije F proteina. Rastvorljivi F protein polipeptid obuhvata F2 domen i FI domen RSV F proteina (ali ne obuhvata domen transmembrane RSV F proteina). Kao primer otelotvorenja, F2 domen uključuje amino kiseline 26-105 a FI domen uključuje amino kiseline 137-516 F proteina. Međutim, takođe mogu da se koriste manji delovi, sve dok se održava trodimenzionalna konformacija stabilizovanog PreF antigena. Slično tome. polipeptidi koji uključuju dodatne strukturne komponente (na primer, spojene polipeptide) mogu takođe da se koriste umesto primernih F2 i FI domena sve dok dodatne komponente ne ometaju trodimenzionalnu konformaciju ili na drugi način ne ometaju stabilnost, produkciju ili stvaranje ili smanjuju imunogeničnost antigena. F2 i FI domeni su pozicionirano orijentisani od N-završetka do C-završetka da kopiraju savijanje i sklapanje analoga F proteina u konačnu prefusionu konformaciju. Za pojačavanje produkcije, F2 domen može da se stavi ispred peptida signala sekrecije. kao što je signalni peptid nativnog F proteina ili peptid heterolognog signala izabran da pojača produkciju i sekreciju u ćelijama domaćina u kojima treba da se pojavi rekombinantni PreF antigen.

[0013]PreF antigeni su stabilizovani (u trimeričkoj prefusionoj konformaciji) uvođenjem jedne ili više modifikacija, kao što su adicija. brisanje ili supstitucija ili uvođenjem jedne ili više amino kiselina. Jedna od takvih stabilizirajućih modifikacija je adicija sekvence amino kiseline koja uključuje heterologni stabilizirajući domen. U primernim aspektima, heterologni stabilizirajući domen je domen multimerizacionog proteina. Jedan posebno pogodan primer ovakvog domena multimerizacionog proteina je domen upredene zavojnice, kao stoje domen izoleucinskog zipera koji promoviše trimerizaciju više polipeptida koji imaju ovakav domen. Primer domena izoleucinskog zipera je opisan u SEQ ID NO: 11. Uobičajeno, heterologni stabilizirajući domen je pozicionirani C-završetak za FI domen.

[0014]Opciono, multimerizacioni domen je vezan za FI domen preko sekvence linkera kratke amino kiseline, kao što je GG sekvenca. Linker može takođe da bude duži linker (na primer, uključujući GG sekvencu, kao Što je sekvenca amino kiseline: GGSGGSGGS; SEQ ID NO: 14). U tehnici su poznati brojni konformaciono neutralni linkeri koji mogu da se koriste u ovom kontekstu bez remećenja konformacije PreF antigena.

[0015]Naredna stabilizirajuća modifikaci ja je eliminacija prepoznavanja furina i mesta cepanja koje se nalazi između F2 i FI domena u nativnom F0 proteinu. Jedno ili oba mesta prepoznavanja furina, lokalizovani na položajima 105-109 i na položajima 133-136 mogu da se eliminišu brisanjem ili supstitucijom jedne ili više amino kiselina na mestu prepoznavanja furina, tako da proteaza ne može da čepa PreF polipeptid u njegove sastavne domene. Opciono, intervenišući pep27 peptid može takođe da se ukloni ili supstituiše, na primer. pomoću linkera peptida. Pored toga ili opciono. ne-furin mesto cepanja (na primer, mesto metaloproteinaze na položajima 112-113) u blizini fuzije peptida može da se ukloni ili supstituiše.

[0016]Naredni primer stabilizirajuće mutacije je adicija ili supstitucija hidrofilne amino kiseline u hidrofobni domen F proteina. Uobičajeno, naeiektrisana amino kiselina, kao što je lizin, se dodaje ili supstituiše za neutralni ostatak, kao stoje leucin, u hidrofobnom regionu. Na primer, hidrofilna amino kiselina može da se doda u ili supstituiše za, hidrofobnu ili neutralnu amino kiselinu u okviru domena HRB upredene zavojnice ekstracelularnog domena F proteina. Kao primer, ostatak naelektrisane amino kiseline, kao što je lizin, može da se supstituiše sa leucinom koji se nalazi na položaju 512 F proteina. Alternativno ili pored toga, hidrofilna amino kiselina može da se doda u ili supstituiše sa hidrofobnom ili neutralnom amino kiselinom u okviru HRA domena F proteina. Na primer, jedna ili više naelektrisanih amino kiselina, kao što je lizin. može da se umetne na ili blizu položaja 105-106 (na primer. iza amino kiseline koja odgovara ostatku 105 u vezi sa SHQ ID NO:2. kao stoje između amino kiselina 105 i 106) PreF antigena. Opciono, hidrofilne amino kiseline mogu da se dodaju ili supstituišu u oba HRA i HRB domena. Alternativno, jedan ili više hidrofobnih ostataka može da se odvaja, sve dok ukupna konformacija PreF antigena nije ozbiljno poremećena.

[0017]Bilo koja i/ili sve stabilizirajuće modifikacije mogu da se koriste pojedinačno i/ili u kombinaciji sa bilo kojom drugom ovde otkrivenom stabilizirajućom modifikacijom kako bi se dobio PreF antigen. Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje PreF protein uključujući polipeptid koji sadrži F2 domen i FI domen bez delovanja furin mesta cepanja između F2 domena i FI domena i sa heterolognim stabilizirajućim domenom (na primer, trimerizacioni domen) na položaju C-završetka u FI domenu. U nekim aspektima, PreF antigen takođe uključuje jednu ili više adiciju i/ili supstituci ju hidrofilnog ostatka u hidrofobnom HRA i/ili HRB domenu. Opciono, PreF antigen je modifikovan na najmanje jednom ne-furin mestu cepanja, kao sto je mesto metaloproteinaze.

[0018]PreF antigen može opciono da uključi dodatnu polipeptidnu komponentu koja obuhvata najmanje jedan imunogenični deo RSV G proteina. To jest. u nekim aspektima. PreF antigen je himerični protein koji uključuje i F protein i G protein komponentu. F protein komponenta može da bude bilo koji od prethodno opisanih PreF antigena a G protein komponenta je izabrana da bude imunogenični aktivni deo RSV G proteina (sve do i/ili uključujući celu dužinu G proteina). U primernim aspektima, polipeptid G proteina uključuje amino kiseline 149-229 G proteina (pri čemu su položaji amino kiselina označeni u odnosu na sekvencu G proteina predstavljenu u SEQ ID NO:4). Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da razume da mogu da se koriste manji delovi ili fragmenti G proteina, sve dok izabrani deo zadržava dominantne imunološke karakteristike većeg fragmenta G proteina. Posebno, izabrani fragment zadržava imunološki dominantan epitop između približnih položaja amino kiselina 184-198 (na primer, amino kiselina 180-200) i dovoljno je dugačak da se savije i sklopi u stabilnu konformaciju koja ispoljava imunodominantni epitop. Takođe mogu da se koriste duži fragmenti, na primer od približno amino kiseline 128 do približno amino kiseline 229, do potpune dužine G proteina sve dok se izabrani fragment uključuje u stabilnu konformaciju u kontekstu himeričnog proteina i dok ne ometa produkciju, proces izrade ili stabilnost kada se rekombinantno produkuje u ćelijama domaćina. Opciono, komponenta G proteina se vezuje za komponentu F proteina preko sekvence kratkog linkera amino kiseline, kao što je sekvenca GG. Linker takođe može da bude duži linker, kao što je sekvenca amino kiseline: GGSGGSGGS: SEQ ID NO: 14). U ovom kontekstu mogu da se koriste brojni konformaciono neutralni linkeri poznati u tehnici bez negativnog uticaja na konformaciju PreF antigena.

[0019]Opciono, G protein komponenta može da uključi supstitucije jedne ili više amino kiselina, Što smanjuje ili sprečava pojačavanje virusne bolesti kod životinjskog modela RSV bolesti. To jest, G protein može da uključi supstituciju amino kiseline tako da kada se imunogenična kompozicija koja uključuje PreF-G himerični antigen primeni na subjektu izabranom od prihvaćenog životinjskog modela (na primer, model RSV miševa) subjekat ispoljava smanjene ili nema simptoma daje vakcina pojačala virusnu bolest (na primer, eozinofilija, neutrofilija), u poređenju sa kontrolnim životinjama koje su primile vakcinu koja sadrži nemodifikovani G protein. Smanjenje i/ili prevencija vakcinom pojačane virusne bolesti može da bude očigledno kada se imunogenične kompozicije primenjuju bez prisustva imunopotencijatora (ali ne, na primer, kada se antigeni primenjuju u prisustvu jakog Thl indukujućeg imunopotencijatora). Pored toga, supstitucija amino kiselina može da redukuje ili spreči vakcinom pojačanu virusnu bolest kada se primenjuje na humanom subjektu. Primer pogodne supstitucije amino kiseline je zamena aspargina na položaju 191 sa alaninom (Asn

—> Ala na amino kiselini 191: NI91 A).

[0020]Opciono, bilo koji prethodno opisani PreF antigen može da uključi dodatnu sekvencu koja služi kao pomoć u prečišćavanju. Jedan od primera je polihistiđin repić. Ovakav repić može da se ukloni iz finalnog produkta, ukoliko se želi.

[0021]Kada se pojave, PreF antigeni se podvrgavaju intramolekularnom uklapanju i raspoređivanju u potpuni protein koji uključuje multimerne polipeptide. Kao prednost, polipeptidi PreF antigena se raspoređuju u trimer koji je sličan prefusionoj konformaciji potpunog, izrađenog RSV F proteina.

[0022]Bilo koji od ovde otkrivenih PreF antigena (uključujući PreF-G antigena) mogu uspešno da se koriste u imunogeničnim kompozicijama u cilju izazivanja zaštitnog imunog odgovora u odnosu na RSV. Ovakve imunogenične kompozicije obično uključuju farmaceutski prihvatljiv nosač i/ili ekscipijent, kao što je pufer. Za pojačavanje imunog odgovora koji se javlja nakon primene. imunogenična kompozicija obično uključuje imunopotencijator. Kada su u pitanju imunogenične kompozicije za izazivanje zaštitnog imunog odgovora u odnosu na RSV (na primer, vakcine) kompozicije uspešno uključuju imunopotencijator koji predominantno izaziva Thl imuni odgovor (Thl uticajni imunopotencijator). Uobičajeno, imunopotencijator se bira tako da bude pogodan za primenu na ciljanoj populaciji na kojoj kompozicija treba da se primeni. Prema tome, u zavisnosti od primene, bira se imunopotencijator koji je pogodan za primenu, na primer, za tek rođenu decu ili za stare osobe.

[0023]Ovde opisane imunogenične kompozicije se uspešno koriste kao vakcine za redukciju ili prevenciju infekcije sa RSV, bez izazivanja patološkog odgovora (kao što su vakcine koje pojačavaju virusnu bolest) nakon primene ili nakon izlaganja RSV

[0024]U nekim aspektima, imunogenična kompozicija uključuje PreF antigen (kao što je primerni aspekt ilustrovan sa SEQ ID NO:6) i drugi polipeptid koji sadrži G protein komponentu. G protein komponenta obično uključuje najmanje amino kiseline 149-229 G proteina. Mada mogu da se koriste manji delovi G proteina, takvi fragmenti treba da uključe, kao minimum, imunološki dominantan epitop amino kiselina 184-198. Alternativno, G protein može da uključi veći deo G proteina, kao što su amino kiseline 128-229 ili 130-230, opciono kao element većeg proteina, kao što je G protein cele dužine ili himerični polipeptid.

[0025]U drugim aspektima, imunogenična kompozicija uključuje PreF antigen koji je himerični protein i takođe uključuje G protein komponentu (kao što su primerni aspekti iluslrovani sa SEQ ID NOi:8 i 10). G protein komponenta ovakvog himeričnog preF (ili PreF-G) antigena obično uključuje najmanje amino kiseline 149-229 G proteina. Kako je prethodno naznačeno, mogu takođe da se koriste manji ili veći fragmenti (kao što su amino kiseline 129-229 ili 130-230) G proteina, sve dok se zadržavaju imunodominantni epitopi a konformacija

PreF-G antigena nije ozbiljno poremećena.

[0026]Opciono, imunogenične kompozicije mogu takođe da uključe najmanje jedan dodatni antigen patogenog organizma različitog od RSV. Na primer, patogeni organizam je virus različit od RSV, kao što su parainfluenca virus (PIV). virus malih boginja, hepatitis B, poliovirus ili influenca virus. Alternativno, patogeni organizam može da bude bakterija, kao što su difterija, tetanus, pertusis,Haemophilus influenzaeiPneumococcus.

[0027]Rekombinantne nukleinske kiseline koje enkodiraju bilo koji od PreF antigena (uključujući PreF-G antigene) su takođe obuhvaćene ovim otkrićem. U nekim aspektima, polinukleotidna sekvenca nukleinske kiseline koja enkodira PreF antigen nukleinske kiseline je optimizirana za pojavljivanje u odabranom domaćinu (kao što su CHO ćelije, ostale ćelije sisara ili ćelije insekata). U skladu sa tim, vektori, uključujući vektore ekspresije (uključujući prokariotične i eukariotične vektore ekspresije) su deo ovog otkrića. Isto tako, ćelije domaćina uključujući ovakve nukleinske kiseline i vektore, su deo ovog otkrića. Ove nukleinske kiseline mogu takođe da se koriste u kontekstu imunogeničnih kompozicija za primenu na subjektu za pobuđivanje imunog odgovora specifičnog za RSV.

[0028]PreF antigeni se uspešno koriste za prevenciju i/ili tretman RSV infekcija. Prema tome, naredni aspekt ovog otkrića se odnosi na postupak za pobuđivanje imunog odgovora u odnosu na RSV. Postupak obuhvata primenu imunogenično efikasne količine kompozicije koja sadrži PreF antigen na subjektu (kao Što je humani ili životinjski subjekt). Primena imunogenično efikasne količine kompozicije pobuđuje imuni odgovor specifičan za epitope prisutne na PreF antigenu. Ovakav imuni odgovor može da uključi odgovore B ćelija (na primer, produkcijom neutrališućih antitela) i/ili odgovore T ćelija (na primer, produkcija citokina). Kao povoljno, imuni odgovor pobuđen PreF antigenom obuhvata elemente koji su specifični za najmanje jedan konformacioni epitop prisutan na prefusionoj konformaciji RSV F proteina. PreF antigeni i kompozicije mogu da se primene na subjektu bez pojačavanja virusne bolesti nakon kontakta sa RSV. Povoljno je što ovde otkriveni PreF antigeni i odgovarajuće formulisane imunogenične kompozicije pobuđuju Thl uticajni imuni odgovor Što redukuje ili sprečava infekciju sa RSV i/ili redukuje ili sprečava patološki odgovor nakon infekcije sa RSV.

[0029]Imunogenične kompozicije mogu da se primene različitim putevima, uključujući puteve kao što su intranazalno, čime se PreF antigen direktno dovodi u kontakt sa mukozom gornjeg respiratornog trakta. Alternativno, mogu da se primene tradicionalniji putevi primene. kao što je intramuskulami put primene.

[0030]Prema tome, takođe se ima u vidu upotreba bilo kog od otkrivenih RSV antigena (ili nukleinskih kiselina) u izradi medikamenta za lecenje RSV infekcije (na primer, profilaktički tretman ili prevencija RSV infekcije). U skladu sa tim. ovo otkriće obezbeđuje otkrivene rekombinantne RSV antigene ili imunogenične kompozicije za upotrebu u medicini, kao i njihovu upotrebu za prevenciju ili tretman bolesti povezanih sa RSV.

[0031]Dodatni detljii u vezi sa PreF antigenima i postupcima za njihovu upotrebu se nalaze u niže datom opisu i primerima.

NAZIVI

[0032]Kako bi omogućili pregled različitih otelotvorenja ovog otkrića, data su naredna objašnjenja naziva. Dodatni nazivi i objašnjenja mogu da se obezbede u kontekstu ovog otkrića.

[0033]Ukoliko nije drugačije objašnjeno, svi tehnički i naučni nazivi koji su ovde korišćeni imaju isto značenje koje stručnjak sa uobičajenim iskustvom obično koristi u tehnici kojoj pripada ovo otkriće. Definicije uobičajenih naziva u molekularnoj biologiji mogu da se nađu u Benjamin Lewin, Genes V, koje je objavio Oxford Universitv Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrevv i saradnici (eds.). The Encvclopeđia of Molecular Biologv, koje je objavio Blackvvell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-021 82-9); i Robert A. Mevers (ed.), Molecular Biologv and Biotechnologv: Comprehensive Desk Reference, koje je objavio VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).

[0034]Nazivi za jedninu se odnose i na množinu ukoliko iz konteksta nije jasno naznačeno drugačije. Isto tako, reČ "ili" treba da uključi "i" ukoliko iz konteksta nije jasno naznačeno drugačije. Naziv "množina" se odnosi na dva ili više. Dalje treba da se razume da su veličine svih baza ili veličine amino kiselina, i sve molekularne težine ili vrednosti molekularne mase, date za nukleinske kiseline ili polipeptide, aproksimativne i da su navedene zbog opisa. Pored toga, numeričke granice date u odnosu na koncentracije ili vrednosti supstance, kao što je antigen, treba da budu aproksimativne. Prema tome, kada je navedeno da je koncentracija najmanje (na primer) 200 pg, treba da se shvati da je koncentracija najmanje aproksimativno (ili "približno" ili "~")200pg.

[0035] Mada u primeni ili testiranju ovog otkrića mogu da se koriste postupci i materijali koji su slični ili ekvivalentni sa onima koji su ovde opisani, odgovarajući postupci i materijali su opisani u daljem tekstu. Naziv "uključuje" označava "obuhvata." Prema tome. ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "uključuje" i varijacije kao što su "uključivanje" i "uključujući" treba razumeti da se podrazumeva inkluzija navedenog jedinjenja ili kompozicije( na primer,nukleinska kiselina, polipeptid, antigen) ili faze ili grupe jedinjenja ili faza, ali bez isključivanja bilo kog drugog jedinjenja. kompozicije, faza ili njihovih grupa. Skraćenica," n. pr,"je izvedena od latinske exempli gratia, i ovde se koristi da označi ne-ograničavajući primer. Prema tome skraćenica" n. pr." jesinonim sa nazivom "na primer."

[0036] Respiratorni sincicijalni virus (RSV) je patogeni virus iz familije Paramyxoviridae, subfamilije Pneumovirinae, roda Pneumovirus. Genom RSV je negativna smislena sekvenca

RNK molekule koja enkodira 11 proteina. Čvrsta veza RNK genoma sa virusnim N proteinom formira nukleokapsid smešten unutar virusnog omotača. Opisane su dve grupe humanih RSV sojeva, A i B grupe, na osnovu razlika u antigeničnosti G glukoproteina. Do sada su izolovani brojni sojevi RSV. Primeri sojeva koji se nalaze u GenBank i/ili EMBL pristupni broj mogu da se nađu u VVO2008114149, koji je ovde inkorporiran kao referenca u cilju otkrivanja nukleinske kiseline i sekvenci polipeptida RSV F i G proteina pogodnih za upotrebu u PreF antigenima himeriČnog PreF-G antigena) i u kombinacija sa PreF antigenima. Verovatno da će biti izolovani dodatni sojevi RSV i da će biti obuhvaćeni u okviru gena RSV. Slično tome, geni RSV obuhvataju prirodno nastale varijante (na primer, prethodno ili naknadno identifikovani sojevi) genetičkim putem ili veštačkom sintezom i/ili rekombinacijom.

[0037] Naziv "F protein" ili "spojeni protein" ili "F protein polipeptida" ili "spojeni protein polipeptida" se odnosi na polipeptid ili protein koji ima celu ili deo sekvence amino kiselina RSV spojenog protein polipeptida. Slično tome, naziv "G protein" ili "G protein polipeptida" se odnosi na polipeptid ili protein koji ima celu ili deo sekvence amino kiselina RSV vezanog protein polipeptida. Brojni RSV spojeni i vezani proteini su opisni i poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici. WO2008114149 navodi primere varijanti F i G proteina (na primer, prirodno dobijene varijante) koje su javno raspoložive od datuma podnošenja ovog otkrića.

[0038] "Varijanta" kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili polipeptid( na primer,RSV F ili G protein nukleinske kiseline ili polipeptida ili PreF nukleinske kiseline ili polipeptida) je nukleinska kiselina ili polipeptid koji se razlikuju od referentne nukleinske kiseline iii polipeptida. Uobičajeno, razlikafe) između varijante i referentne nukleinske kiseline ili polipeptida čini proporcionalno mali broj razlika u poređenju sa referentnim uzorkom.

[0039] "Domen" polipeptida ili proteina je strukturno defmisan element unutar polipeptida ili proteina. Na primer, "trimerizacioni domen" je sekvenca amino kiseline u okviru polipeptida koja omogućava konstrukciju polipeptida u trimere. Na primer, trimerizacioni domen može da promoviše konstrukciju u trimere povezivanjem sa drugim trimerizacionim domenima (drugih polipeptida sa sekvencom iste ili različite amino kiseline). Naziv se takođe koristi u vezi sa polinukleotidom koji enkodira takav peptid ili polipeptid.

[0040] Nazivi "nativni" i "prirodno dobijen" se odnosi na element, kao što je protein, polipeptid ili nukleinska kiselina, koji je prisutan u istom stanju kao Što se nalazi u prirodi. To jest, element nije veštački modifikovan. Jasno je da. u kontekstu ovog otkrića, postoje brojne nativne/prirodno dobijene varijante RSV proteina ili polipeptida. na primer, dobijene od različitih prirodno nastalih sojeva ili izolata RSV.

[0041] Naziv "polipeptid" se odnosi na polimer u kome su monomeri ostaci amino kiseline koji su zajedno vezani preko amidnih veza. Nazivi "polipeptid" ili "protein", kako se ovde koriste, treba da obuhvate sekvencu bilo koje amino kiseline i uključuju modifikovane sekvence kao što su glikoproteini. Naziv "polipeptid" se posebno odnosi na prirodno dobijene proteine, kao i na one koji su produkovani rekombinantno ili sintetički. Naziv "fragment," u odnosu na polipeptid, se odnosi na deo (to jest, subsekvencu) polipeptida. Naziv "imunogenični fragment" se odnosi na sve fragmente polipeptida koji zadržavaju najmanje jedan predominantni imunogenični epitop referentnog proteina ili polipeptida cele dužine. Orijentacija unutar polipeptida je generalno navedena u pravcu od N-završetka do C-završetka, definisano orijentacijom amino i karboksi radikala pojedinačnih amino kiselina. Polipeptidi se pomeraju od N ili amino-završetka prema C ili karboksi završetku.

[0042] "Signalni peptid" je kratka sekvenca amino kiselina( naprimer,aproksimativno 18-25 amino kiselina u dužini) koja usmerava nove sintetizovane sekretorne ili proteine membrane ka i kroz membrane,na primer,endoplazmatičnog retikuluma. Signalni peptidi se često ali ne obavezno nalaze na N-završetku polipeptida i često se eliminišu cepanjem od strane signalnih peptida nakon Što protein prođe membranu. Signalne sekvence obično sadrže tri uobičajene strukturne karakteristike: polarni bazni region N-završetka (n-region). hidrofobno jezgro i hidrofilni region (c-region).

[0043] Nazivi "polinukleotid" i "sekvenca nukleinske kiseline" se odnose na polimemi oblik nukleotida dužine najmanje 10 baza. Nukleotidi mogu da budu ribonukleotidi.

đeoksiribonukleotiđi ili modifikovani oblici ovih nukleotida. Naziv obuhvata pojedinačne i dvostruke oblike DNK. Pod "izolovani polinukleotid" se podrazumeva polinukleotid koji nije odmah ograničen sa obe od kodirajućih sekvenci sa kojima se neposredno graniči (jedna na 5<1>i jedna na 3' završetku) u prirodno dobijenom genomu organizma iz koga se izdvaja. U jednom otelotvorenju, polinukleotid enkodira polipeptid. 5' i 3<*>pravac nukleinske kiseline se deiiniše u odnosu na povezivanje pojedinačnih nukleotidnih jedinica i označava u skladu sa položajima ugljenika u prstenu deoksiriboze (ili riboze) šećera. Informacioni (kodirajući) sadržaj polinukleotidne sekvence se Čita u smeru od 5' do 3".

|0044] "Recombinantna" nukleinska kiselina je ona koja ima sekvencu koja se ne đobija prirodno ili ima sekvencu koja se izrađuje veštačkom kombinacijom dva inače potpuno odvojena segmenta sekvence. Ova veslačka kombinacija može da se izvede hemijskom sintezom ili, mnogo češće, veštačkom manipulacijom izolovanih segmenata nukleinskih kiselina, to jest, tehnikama genetskog inžinjeringa. "Recombinantni" protein je onaj koji je enkodiran heterolognom( na primer,rekombinantnom) nukleinskom kiselinom, koja se uvodi u ćeliju domaćina, kao što su bakterijska ili eukariotična ćelija. Nukleinska kiselina može da se uvede na vektor ekspresije koji ima signale sposobne za ekspresiju proteina enkodiranog uvedenom nukleinskom kiselinom ili nukleinska kiselina može da se integriše u hromozom ćelije domaćina.

[0045] Naziv "heterolog" u vezi sa nukleinskom kiselinom, polipeptidom ili nekom drugom ćelijskom komponentom, ukazuje da se ta komponenta pojavljuje na mestu gde normalno ne može da se nađe u prirodi i/ili da vodi poreklo od različitih izvora ili sojeva.

[0046] Naziv "prečišćavanje"( naprimer,u vezi sa patogenom ili kompozicijom koja sadrži patogen) se odnosi na proces uklanjanja komponenti iz kompozicije kada njihovo prisustvo ni je poželjno. Prečišćavanje je relativan pojam i ne zahteva da se iz kompozcije uklone svi tragovi neželjene komponente. U kontekstu izrade vakcina, prečišćavanje obuhvata procese kao što su centrifugiranje, đializacija, hromatografija izmenom jona i hromatografija na bzi veličine čestica, afinitetno prečišćavanje ili precipitacija. Prema tome, naziv "prečišćen" ne zahteva apsolutnu čistoću; već se uzima kao relativni pojam. Prema tome. na primer, izrađena prečišćena nukleinska kiselina je ona u kojoj je navedeni protein više obogaćen nego sto je nukleinska kiselina u svom osnovnom okruženju, na primer, unutar ćelije ili u komori za biohemijsku reakciju. Izrada potupno čiste nukleinske kiseline ili proteina može da se izvede takvim prečišćavanjem da željena nukleinska kiselina predstavlja najmanje 50% ukupnog sadržaja nukleinskih kiselina u preparatu. U nekim otelotvorenjima, potpuno čista nukleinska kiselina predstavlja najmanje 60%, najmanje 70%. najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90% ili najmanje 95% ili više od ukupnog sadržaja izrađene nukleinske kiseline ili proteina.

[0047]"Izolovana" biološka komponenta (kao sto je molekula nukleinske kiseline, protein ili organcla) je suštinski odvojena ili prečišćena od drugih bioloških komponenti u ćeliji organizma u kome se komponenta prirodno pojavljuje, kao što su druge hromozomalne i ekstra-hromozomalne DNK i RNK, proteini i organele. Nukleinske kiseline i proteini koji su "izolovani" obuhvataju nukleinske kiseline i proteine prečišćene standardnim postupcima prečišćavanja. Naziv takođe obuhvata nukleinske kiseline i proteine izrađene rekombinantnom ekspresijom u ćeliji domaćina kao i hemijski sintetisane nukleinske kiseline i proteine.

[0048]"Antigen" je jedinjenje. kompozicija ili supstanca koja može da stimulišc produkciju antitela i/ili odgovor T ćelija kod životinja, uključujući kompozicije koje su injektovane, apsorbovane ili na drugi način unete u životinju. Naziv "antigen" obuhvata sve povezane antigenične epitope. Naziv "epitop" ili "antigenični determinant" se odnosi na položaj na antigenu na koji reaguju B i/ili T ćelije. "Dominantni antigenični epitopi" ili "dominantni epitop" su oni epitopi za koji se vezuju funkcionalno značajni imuni odgovori domaćina, na primer, odgovor antitelima ili odgovor T-ćelija. Prema tome, u vezi sa zaštitnim imunim odgovorom na patogen, dominantni antigenični epitopi su oni antigenični radikali koje, kada imuni sistem domaćina prepozna, dovode do zaštite od bolesti izazvane tim patogenom. Naziv "epitop T-ćelija" se odnosi na epitop koji je, kada je vezan za odgovarajuću MHC molekulu, specifično vezan sa T ćelijom (preko receptora T ćelije). "Epitop B-ćelija" je epitop koji je specifično vezan preko antitela (ili molekule receptora B ćelija).

[0049]"Imunopotencijator" je sredstvo koje pojačava produkciju imunog odgovora na ne-specifičan način. U uobičajene imunopotencijatore spadaju suspenzije minerala (aluminijum, aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat) na kojima je adsorbovan antigen; emulzije, uključujući emulzije voda-u-ulju, i ulje-u-vodi (i njihove varijante, uključujući dvostruke emulzije i reverzibilne emulzije), liposaharidi, lipopolisaharidi, imunostimulatorne nukleinske kiseline (kao što su CpG oligonukleotidi), lipozomi, antagonisti receptora slični Toll-u (posebno TLR2, TLR4. TLR7/8 i TLR9 agonisti) i različite kombinacije ovih komponenti.

[0050] "Imunogenična kompozicija" je kompozicija sastojaka pogodna za primenu na ljudima ili životinjama( na primer,u eksperimentalnoj fazi) koja je sposobna da izazove specifičan imuni odgovor,na primer,u odnosu na patogen, kao što je RSV. Kao takva, imunogenična kompozicija uključuje jedan i li više antigena (na primer, polipeptidne antigene) ili antigenične epitope. Imunogenična kompozicija može takođe da uključi jednu ili više dodatnih komponenti sposobnih đa pobude ili pojačaju imuni odgovor, kao što su ekscipijent, nosač i/ili imunopotencijator. U nekim slučajevima, imunogenične kompozicije se primenjuju kako bi pobudile imuni odgovor koji štiti subjekt od simptoma ili stanja izazvanih patogenima. U nekim slučajevima, simptomi ili oboljenja izazvani patogenima se sprečavaju (ili redukuju ili ublažavaju) inhibicijom replikacije patogena( na primer.RSV) nakon izlaganja subjekta patogenu. U kontekstu ovog otkrića, podrazumeva se da naziv imunogenična kompozicija obuhvata kompozicije koje su namenjene primeni na subjektu ili populaciji subjekata u cilju izazivanja zaštitnog ili palijativnog imunog odgovora na RSV (to jest, kompozicione vakcine ili vakcine).

[0051]"Imuni odgovor" je odgovor ćelija imunog sistema, kao što su B ćelije, T ćelije ili monociti, na stimulanse. Imuni odgovor može da bude odgovor B ćelija, koji dovodi do produkcije specifičnih antitela. kao što su antigen specifična neutrališuća antitela. Imuni odgovor može takođe da bude odgovor T ćelija, kao što su CD4+ odgovor ili CD8+ odgovor. U nekim slučajevima, odgovor je specifičan za određeni antigen (to jest, "antigen-specifični odgovor"). Ukoliko antigen potiče od patogena, antigen specifični odgovor je "patogen specifični odgovor." "Zaštitni imuni odgovor" je imuni odgovor koji inhibira determinisane funkcije ili aktivnost patogena, redukuje infekciju izazvanu patogenom ili smanjuje simptome (uključujući smrtni ishod) koji nastaju od infekcije patogenom. Zaštitni imuni odgovor može da se meri, na primer. inhibicijom replikacije virusa ili formiranjem plaka u analizi redukcije plaka ili ELISA-neutralizujućoj analizi ili merenjem rezistencije na nadražaj patogenomin

vivo.

[0052]Imuni odgovor pod uticajem "Thl" se karakteriše prisustvom CD4+ pomagača T ćelija koje produkuju IL-2 i IFN-y i samim tim, sekrecijom ili prisustvom IL-2 i IFN-y. Nasuprot tome, imuni odgovor pod uticajem "Th2" se karakteriše predominacijom CD4+ pomagača ćelija koje produkuju IL-4. IL-5 i IL-13.

[0053]"Imunogenična efektivna količina" je količina kompozicije (obično imunogenične kompozicije) upotrebljene da pobudi imuni odgovor kod subjekta na kompoziciju ili na antigen u kompoziciji. Uobičajeno, željeni rezultat je produkcija antigen (na primer. patogen) specifičnog imunog odgovora koji je sposoban da doprinese zaštiti subjekta od patogena. Međutim, da bi se dobio zaštitni imuni odgovor na patogen može da bude potrebna višestruka primena imunogenične kompozicije. Prema tome, u kontekstu ovog otkrića, naziv imunogenično efektivna količina obuhvata podcijene doze koje u kombinaciji sa prethodnim ili naknadnim primenama doprinose postizanju zaštitnog imunog odgovora.

[0054] Pridev "farmaceutski prihvatljiv" pokazuje daje određena supslanca pogodna za primenu na subjektu( na primer.humani ili životinjski subjekt). Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co.. Easion. PA, 15th Edition (1975), opisuje kompozicije i formulacije (uključujući razblaženja) pogodne za korišćenje u terapeutskim i/ili profilaktičkim kompozicijama, uključujući imunogenične kompozicije.

[0055] Naziv "moduliranje" u odnosu na odgovor, kao što je imuni odgovor, označava odlaganje ili promenu početka, snage trajanja ili karakteristika odgovora. Sredstvo koje modulira imuni odgovor menja najmanje jedno od početka, snage, trajanja ili karakteristika imunog odgovora nakon njegove primene ili menja najmanje jedno od početka, snage, trajanja ili karakteristika u poređenju sa referentnim sredstvom. [0056) Naziv "redukuje" je relativni pojam, tako da sredstvo redukuje odgovor ili stanje ukoliko se odgovor ili stanje kvantitativno umanjuje nakon primene sredstva ili ukoliko se umanjuje nakon primene sredstva u poređenju sa referentnim sredstvom. Slično tome, naziv "sprečava" ne mora obavezno da znači da sredstvo u potpunosti eliminiše odgovor ili stanje, već daje eliminisana najmanje jedna karakteristika odgovora ili stanja. Prema tome, imunogenična kompozicija koja redukuje ili sprečava infekciju ili odgovor, kao što je patološki odgovor,na primer,vakcina koja pojačava virusno oboljenje, može, ali ne mora potpuno da eliminiše takvu infekciju ili odgovor, već je infekcija ili odgovor merljivo nestala, na primer, za najmanje približno 50% ili za najmanje približno 70% ili približno 80% ili čak za približno 90% (to jest za 10% ili manje nego) infekcije ili odgovora bez prisustva sredstva, u poređenju sa referentnim sredstvom.

[0057] "Subjekat" je živi višećelijski organizam, kičmenjak. U kontekstu ovog otkrića, subjekat može da bude eksperimentalni subjekat, kao što su životinje,na primer.miševi, pamuk pacovi ili majmuni primati. Alternativno, subjekt može da bude humani subjekt.

PreF ANTIGENi

[0058] U prirodi se RSV F protein pojavljuje kao pojedinačni polipeptid prekursor dužine 574 amino kiselina, označen kao F0.In vivo.F0 oligomerizuje u endoplazmatičnom retikulumu i proteolitički se deli pomoću furin proteaze na dve furin bliske sekvence (furin položaji cepanja), RARR<109>(SEQ ID NO: 15) i RK.RR'36 (SEQ ID NO: 16) za generisanje oligomera koji sadrži dva disulfid-vezana fragmenta. Manji od ovih fragmenata se označava kao F2 i potiče od N-terminalnog dela FO prekursora. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da prepozna da se skraćenice FO, FI i F2 obično označavaju kao Fo, Fii F2u stručnoj literaturi. Veći. C-terminalni FI fragment vezuje F protein u membrani preko sekvence hidrofobnih amino kiselina, koje se nalaze u susedstvu sa 24 amino kiseline citoplazmatičnog repića. Tri F2-F1 dimera zajedno formiraju kompletni F protein, koji poprima metastabilnu prefusogeničnu ("prefusija") konformaciju čime se stvara mogućnost da se podvrgne konformacionoj promeni nakon kontakta sa ciljanom ćelijskom membranom. Ova konformaciona promena izlaže hidrofobnu sekvencu. poznatu kao fuzioni peptid, koja je povezana sa membranom ćelije domaćina i potpomaže fuziju membrane virusa ili inficirane ćelije, sa membranom ciljane ćelije.

[0059]FI fragment sadrži najmanje dva heptadna ponavljajuća domena, označena kao HRA i HRB i smeštena u blizini fuzionog peptida i transmembrane vezanih domena, tim redom. U prefusionoj konformaciji, F2-F1 dimer formira strukturu globularne glave i stabljike, pri čemu su HRA domeni u segmentiranoj (produženoj) konformaciji u globulamoj glavi. Nasuprot tome, HRB domeni formiraju stabljiku od tri upredene zavojnice koja se širi iz regiona glave. U toku tranzicije od prefusije do postfuzione konformacije. HRA domeni propadaju i prelaze blizu HRB domena da formiraju anti-paralelni snop Šest zavojnica. U postfusionom stanju fuzija peptida i transmembranskih domena zajedno omogućavaju fuziju membrane.

[0060]Mada je prethodno dat opis konformacije zasnovan na molekuklarnom modeliranju kristalografskih podataka, strukturne razlike između prefusionih i postfusionih konformacija mogu da se prate bez pribegavanja kristalografiji. Na primer. elektronska mikrografija može da se koristi za uočavanje razlike između prefusionih i postfusionih (alternativno označene kao prefusogenične i fuzogenične) konformacija, kako su pokazali Calđer i saradnici, Virology, 271:122-131 (2000) i Morton i saradnici, Virologv, 311:275-288, što je ovde inkorporirano kao referenca zbog svojih tehnoloških saznanja. Prefusiona konformacija može takođe da se razlikuje od fusogenične (postfusione) konformacije analizom povezanom sa lipozomom kako su opisali Connolly i saradnici. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:17903-17908 (2006), stoje takođe ovde inkorporirano kao referenca zbog svojih tehnoloških saznanja. Pored toga, prefusione i fusogenične konformacije mogu da se razlikuju upotrebom antitela( naprimer,monoklonalnih antitela) koja specifično prepoznaju konformacione epitope prisutne najednom ili drugom prefusionom ili fusogeničnom obliku RSV F proteina, ali ne na drugom obliku. Ovakvi konformacioni epitopi mogu da se jave zbog preferencijalnog izlaganja antigeničnoj determinanti na površini molekule. Alternativa konformacioni epitopi mogu da nastanu iz susednog položaja amino kiselina koje nisu susedne u linearnom polipeptida. 10061]Ovde otkriveni PreF antigeni su koncipirani da stabilizuju i održavaju prefusionu konformaciju RSV F proteina, tako da je u populaciji pojavljenih proteina, značajan deo populacije pojavljenog proteina u prefusogeničnoj (prefusionoj) konformaciji( na primer,kako je predviđeno strukturnim i/ili termodinamičkim modeliranjem ili kako je procenjeno jednim ili više prethodno otkrivenih postupaka). Stabilizirajuće modifikacije su uvedene u nativni (ili sintetički) F protein, kao što je primerni F protein SEQ ID NO:2, tako da se glavni imunogenični epitopi prefusione konformacije F proteina održavaju nakon uvođenja PreF antigena u celularnu ili ekstracelulamu sredinu (na primer,in vivo, na primer,nakon primene na subjektu).

[0062]Prvo, heterologni stabilizirajući domen može da se postavi na C-završetak na kraju konstrukcije kako bi zamenio domen FO peptida koji vezuje membranu. Ovaj stabilizirajući domen je predviđen da kompenzuje nestabilnost HRB, pomažući da se stabiliše prefusioni konformer. U primernim otelotvorenjima, heterologni stabilizujući domen je domen multimerozacionog proteina. Jedan posebno poželjan primer ovakvog domena multimerizacionog proteina je domen trimerizacije. Primeri domena trimerizacije smeštenih u upredenoj zavojnici koja potpomaže slaganje u trimere višestrukih polipeptida koji imaju takve domene upredenih zavojnica. Jedan od poželjnih primera domena trimerizacije je izoleucinski ziper. Primer domena izoleucinskog zipera je projektovana varijanta GCN4 isoleucina kvasca, kako su opisali Harburv i saradnici, Science 262:1401-1407 (1993). Sekvenca jednog odgovarajućeg domena izoleucinskog zipera je predstavljena sa SEQ ID NO:l 1, mada su takođe pogodne varijante ove sekvence koje zadržavaju sposobnost da formiraju upredenu zavojnicu stabilizirajućeg domena. Alternativni stabilizirajući domeni trimerizacije upredene zavojnice uključuju: TRAF2 (GENBANK® Pristupni broj OJ2933 [gi:23503103]; amino kiseline 299-348); Thrombospondin I (Pristupni broj P07996 [gi: 135717]; amino kiseline 291-314); Matrilin-4 (Pristupni broj 095460 [gi: 14548117]; amino kiseline 594-618; CMP (matrilin-1) (Pristupni broj NP 002370 [gi:45051 11]; amino kiseline 463-496; HSF1 (Pristupni broj AAX42211 [gi:61362386]; amino kiseline 165-191: i Cubilin (Pristupni broj NP_001072 [gi:4557503]; amino kiseline 104-138. Očekuje se da odgovarajući domeni trimerizacije dovedu do sastavljanja značajnog dela pojavljenog proteina u trimere. Na primer, najmanje 50% rekombinantnog PreF polipeptida koji ima domen trimerizacije će da se rasporedi u trimere( na primer,kako je procenjeno pomoću AFF-MALS). Uobičajeno, najmanje 60%, još poželjnije najmanje 70% a najpoželjnije je da najmanje približno 75% ili više pojavljenih polipeptida egzistira kao trimer. [00631Kako bi se još više stabilizovao HRB, ostatak leucina koji se nalazi na položaju 512 (u odnosu na prirodni FO protein) PreF može da se supstituiše sa lizinom (L482K primernog PreF antigen polipeptida SEQ ID NO:6). Ova supstitucija unapređuje periodičnost upredene zavojnice hidrofobnog ostatka. Slično tome, lizin može da se doda iza amino kiseline na položaju 105.

[0064]Drugo, pep27 može da se ukloni. Analiza strukturnog modela RSV F proteina u stanju prefusije pokazuje da pep27 stvara veliku spontanu petlju između FI i F2. Ova petlja ne doprinosi stabilizaciji stanja prefusije i uklanja se nakon cepanja nativnog proteina furinom.

[0065JTreće, jedan ili oba motifa cepanja furinom mogu da se uklone. Sa ovim, fuzioni peptid nije otcepljen od F2, što sprečava oslobađanje iz globularne glave prefusionog konformera i dostupnost susednim membranama. Predviđa se da je interakcija između fusionog peptida i membrane međuspoja glavni uzrok nestabilnosti u stanju prefusije. U toku procesa fusije, interakcija između peptida fusije i ciljane membrane dovodi do izlaganja peptida fusije iz okvira strukture globularne glave, čime se pojačava nestabilnost stanja prefusije i dolazi do sklapanja u post-fusioni konformer. Ova konformaciona promena omogućava proces fusije membrane. Predviđa se da uklanjanje jednog ili oba mesta cepanja furinom sprečava dostupnost membrane za deo N-završetka fusionog peptida, stabilizujući prefusiono stanje

[0066JOpciono, takođe može da se ukloni najmanje jedno non-furin mesto cepanja, na primer, supstitucijom jedne ili više amino kiselina. Na primer, eksperimentalne probe pokazuju da pod uslovima pogodnim za cepanje pomoću nekih metaloproteinaza, PreF antigen može da se čepa u blizini amino kiselina 110-118 (na primer, do cepanja može da dođe između amino kiselina 112 i 113 PreF antigena; između leucina na položaju 142 i glicina na položaju 143 referentnog F protein polipeptida SEQ ID NO:2). U skladu sa tim, modifikacija jedne ili više amino kiselina unutar ovog regiona može da redukuje cepanje PreF antigena. Na primer, leucin na položaju 112 može da se supstituiše sa nekom drugom amino kiselinom, kao što je izoleucin ili triptofan. Alternativno ili dodatno, glicin na položaju 113 može da se supstituiše sa serinom ili alaninom.

[0067]Nativni F protein polipeptid može da se selektuje od bilo kog proteina RSV A ili RSV B soja ili od njihovih varijanti (kako je prethodno đefinisano). U nekim primernim otelotvorenjima. F protein polipeptida je F protein predstavljen sa SEQ ID NO:2. Kako bi se omogućilo razumevanje ovog otkrića, položaji ostataka svih amino kiselina, bez obzira na soj, su dati u odnosu na (to jest, položaji ostataka amino kiselina odgovaraju) položaj amino kiselina u primernom F proteinu. Stručnjaci sa uobičajenim iskustvom u tehnici mogu lako da odrede položaje uporedivih amino kiselina bilo kog drugog RSV A ili B soja usklađivanjem sekvenci amino kiselina selektovanog RSV soja sa primernim sekvencama, koristeći lako raspoložive i dobro poznate regulacione algoritme (kao sto je BLAST, na primer. koristeći podrazumevane parametre). Brojni dodatni primeri F protein polipeptida iz različitih RSV sojeva su otkriveni u WO2008114149 (koji je ovde inkorporiran kao referenca u cilju obezbeđivanja dodatnih primera RSV F i G protein sekvenci). Dodatne varijante mogu da nastanu u toku prenošenja gena ili mogu veštački da se produkuju koristeći mesta usmerene ili nasumične mutageneze ili rekombinacijom dve ili više prethodno postojeće varijante. Ovakve dodatne varijante su takođe pogodne u kontekstu ovde otkrivenih PreF (i PreF-G) antigena.

[0068]U selekciji F2 i FI domena F proteina, stručnjak sa iskustvom u tehnici će da razume da nije striktno neophodno da se uključi celokupan F2 i/ili FI domen. Uobičajeno, razmatranja konformacije su važna kada se selektuje subsekvenca (ili fragment) F2 domena. Prema tome, F2 domen obično uključuje deo F2 domena koji omogućava sastavljanje i stabilnost polipeptida. U nekim primernim varijantama. F2 domen uključuje amino kiseline 26-105. Međutim, varijante koje imaju minorne modifikacije u dužini (dodavanjem ili isključivanjem jedne ili više amino kiselina) su takođe moguće.

[0069]Uobičajeno, najmanje jedna subsekvenca (ili fragment) FI domena je izabrana i usmerena da održava stabilnu konformaciju koja uključuje imunodominantne epitope F proteina. Na primer, generalno je poželjno da se selektuje subsekvenca FI polipeptid domena koja obuhvata epitope prepoznatljive po neutralizaciji antitela u regionima amino kiselina 262-275 (palivizumab neutralizacija) i 423-436 (Centocor's chlOlF MAb). Pored toga, poželjno je da se uključe epitopi T ćelija, na primer, u regionu amino kiselina 328-355. Najčešće, kao pojedinačni dodirni deo FI subjedinice( naprimer,obuhvatajući amino kiseline 262-436) ali epitopi bi mogli da se zadrže u sintetičkoj sekvenci koja ulkjučuje ove imunodominantne epitope kao diskontinuirane elemente ugrađene u stabilnu konformaciju. Prema tome, FI domen polipeptida obuhvata najmanje približno amino kiseline 262-436 RSV F protein polipeptida. U jednom ovde datom ne ograničavajućem primeru, FI domen obuhvata amino kiseline 137 do 516 nativnog F protein polipeptida. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da razume da po odluci praktičara mogu da se koriste i druge kraće subsekvence.

[0070]Kada se selektuju subsekvence F2 ili FI domena (ili kako će niže biti diskutovano u vezi sa G protein komponentom određenih PreF-G antigena), kao dodatak konformacionom sagledavanju, može da bude poželjno da se izaberu sekvence( naprimer,varijante, subsekvence i slično) zasnovane na inkluziji dodatnih imunogenićnih epitopa. Na primer, dodatni epitopi T ćelija mogu da se iđeiitifikuju korišćenjem vezanih motifa ili drugih postupaka, kao što su neurološka mreža ili polinomijalne determinacije, poznate u tehnici, videti, na primer, RANKPEP (raspoloživi na internet stranici: mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html); ProPredl (raspoloživo na internet stranici: imtech.res.in/raghava/propredI/index.html); Bimas (raspoloživo na internet stranici: www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla bind/index.html); i SYFPEITH (raspoloživo na internet stranici: syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm). Na primer, algoritmi se koriste za određivanje "početka vezivanja" peptida i za izbor onih čiji rezultati pokazuju veliku verovatnoću da imaju određeni afinitet za vezivanje MHC ili antitela. Algoritmi su zasnovani ili na efektima vezivanja određene amino kiseline na određenom položaju na MHC, na efektima vezivanja određene amino kiseline na određenom položaju antitela ili na efektima vezivanja određene supstitucije u peptidu koji sadrži motif. U okviru konteksta imunogeničnog peptida, "konzervirani ostatak" je onaj za koji se misli da se javlja mnogo češće nego što bi se to očekivalo slučajnim rasporedom na određenom položaju u peptidu. Vezani ostaci su konzervirani ostaci koji obezbeđuju tačku kontakta sa molekulom MHC. Epitopi T ćelija koji su identifikovani ovakvim predvidljivim postupcima mogu da se potvrde merenjem njihovog vezivanja za specifični MHC protein ili njihovom sposobnošću da stimulišu T ćelije kada su prisutni u kontekstu MHC proteina.

[0071] Povoljno je što PreF antigeni (uključujući PreF-G antigene kako je prethodno diskutovano) uključuju signalni peptid koji odgovara sistemu ekspresije, na primer, signalni peptid sisara ili virusa, kao sto je RSV FO nativna signalna sekvenca( na primer,amino kiseline 1-25 SEQ ID NO:2 ili amino kiseline 1-25 SEQ ID NO:6). Uobičajeno, signalni peptid se selektuje tako da bude kompatibilan sa ćelijama selektovanim za rekombinantnu ekspresiju. Na primer, signalni peptid (kao što je signalni peptid bakulovirusa ili melitin signalni peptid) može da se supstituiše za ekspresije u ćelijama insekata. U tehnici su poznati odgovarajući signalni peptidi biljaka, ukoliko se preferira sistem ekspresije biljaka. U tehnici su poznati brojni primeri signalnih peptida, (videti,na primer,Zhang & Henzel, Protein Sci., 13:2819-2824 (2004), koji opisuju brojne humane signalne peptide) i nalaze se u katalogu,na primer,u SPdb bazi podataka signalnih peptida. koja obuhvata signalne sekvence arheja. prokariota i eukariota (http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/). Opciono. bilo koji od prethodnih antigena može da obuhvati dodatnu sekvencu ili repić. kao što je His-reptć da omogući prečišćavanje.J0072]Opciono. PreF antigen može da uključi dodatne imunogenične komponente. U izvesnim posebno povoljnim otelotvorenjima, PreF antigen obuhvata RSV G protein antigeničnu komponentu. Primeri himeričnih proteina koji imaju PreF i G komponentu obuhvataju sledeće PreFJVl (predstavljen sa SEQ ID N0i:7 i 8) i PreF_V2 (predstavljen sa SEQ ID N0i:9 i 10).

[0073]U PreF-G antigenima, antigenični deo G proteina( na primer,skraćeni G protein, kao što su ostaci amino kiselina 149-229) se doda na kraj C-zavrŠetka konstrukcije. Uobičajeno, G protein komponenta je vezana za F protein komponentu preko fleksibilne l inker sekvence. Na primer, u primernom PreF Vl konceptu. G protein je vezan za PreF komponentu pomoću - GGSGGSGGS- linkera (SEQ ID NO: 14). U PreF_V2 konceptu, linker je kraći. Umesto da ima -GGSGGSGGS- linker (SEQ ID NO: 14). PreF_V2 ima 2 glicina (-GG-) za linker.

[0074]Kada je prisutan, domen G protein polipeptida može da obuhvati ceo ili deo G proteina selektovanog iz bilo kog RSV A ili RSV B soja. U izvesnim primernim otelotvorenjima, G protein je (ili je 95% identičan sa) G protein predstavljen sa SEQ ID NO:4. Dodatni primeri pogodnih sekvenci G proteina mogu da se nađu u WO2008114149 (koji je ovde inkorporiran kao referenca).

[0075]G protein polipeptid komponenta je selektovana da uključi najmanje subsekvencu (ili fragment) G proteina koja zadržava imunodominantni epitop(e) T ćelija,na primer,u regionu amino kiselina 183-197, kao što su fragmenti G proteina koji uključuju amino kiseline 151-229, 149-229 ili 128-229 nativnogG proteina. U jednom primernom otelotvorenju. G protein polipeptid je subsekvenca (ili fragment) nativnog G protein polipeptida koja obuhvata sve ili deo ostataka amino kiselina 149 do 229 nativnog G protein polipeptida. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će jednostavno da razume da duži i kraći delovi G proteina mogu takođe da se koriste, sve dok kao selektovani deo konformaciono ne destabilšu ili ometaju ekspresiju, savijanje ili nastajanje PreF-G antigena. Opciono, domen G proteina obuhvata supstituciju amino kiselina na položaju 191, za koje je prethodno pokazano da su uključene u redukciju i/ili prevenciju pojačavanja oboljenja koje karakteriše eozinofilija a koja su povezana sa formalinom inaktiviranim RSV vakcinama. Kroz ceo opis mogu da se nađu osobine prirodno dobijenih i supstituisanih (NI91 A) G proteina,na primer,u US Patentnoj publiikaciji broj 2005/0042230, koja je ovde inkorporirana u referenci.

[0076] Na primer, u odnosu na selekciju sekvenci koje odgovaraju prirodno dobijenim sojevima, jedan ili više domena može u sekvenci da odgovara RSV A ili B soju, kao što su jednostavni laboratorijski izolati označeni kao A2 ili Long ili bilo koji drugi prirodno dobijeni soj ili izolat (kako je otkriveno u prethodno pomenutom WO2008114149). Kao dodatak ovim prirodno dobijenim i izolovanim varijantama, projektovane varijante koje mešaju sekvence slično sa prethodno pomenutim sekvencama mogu takođe da se obuhvate kontekstom PreF (uključujući PreF-G) antigena. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da razume da sličnost između PreF antigen polipeptida (i polinukleotidnih sekvenci kako je opisano u daljem tekstu), kao polipeptida (i nukleotidnih sekvenci generalno), može da se izrazi nazivima za sličnost između sekvenci, drugačije nazvano identitčnost sekvenci. Identičnost sekvence se često meri kao procenat identiteta (ili sl ičnosti); ako je veći procenat, veća je sličnost primarnih struktura dve sekvence. Generalno, što je veća sličnost primarnih struktura sekvenci dve amino kiseline (ili polinukleotida) veća je sličnost struktura višeg reda, što potiče od savijanja i sklapanja. Varijante sekvenci PreF polipeptida (i polinukleotida) obično imaju jedan ili mali broj odbačenih amino kiselina, adicija ili supstitucija ali bez obzira na to dele veoma veliki procenat njihovih amino kiselina i generalno njihovih polinukleotidnih sekvenci. Još važnije, varijante zadržavaju strukturne i prema tome, konformacione osobine referentnih sekvenci koje su ovde otkrivene.

[0077] Postupci za određivanje identičnosti sekvenci su dobro poznati u tehnici i primenljivi su na PreF antigen polipeptide kao i na nukleinske kiseline koje ih enkodiraju( na prime?:kako je niže opisano). Različiti programi i odgovarajući algoritmi su opisani u: Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Higgins and Sharp, Gene 73:237.1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet i saradnici, Nucleic Acids Research 16:10881. 1988; i u Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988. Altschul i saradnici. Nature Genet. 6:119. 1994, gde su prisutna detaljna sagledavanja postupaka i izračunavanja homologije odgovarajućih sekvenci. NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul i saradnici, J. Mol. Biol. 215:403, 1990) je raspoloživ iz više izvora, uključujući National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) i na internetu, za upotrebu u konekciji sa programima blastp, blastn, blastx, tblastn i tblastx, za analizu sekvenci. Opis kako da se odredi identičnost sekvenci uz korišćenje ovog programa se nalazi na NCBI internet stranici.

[0078| U nekim slučajevima, PreF antigeni imaju modifikovanu jednu ili vise amino kiselina u odnosu na sekvencu amino kiseline prirodno dobijenog soja iz koga je izdvojena( na

primer.kao dodatak prethodno pomenutih stabilizirajući]! modifikacija). Ove razlike mogu da budu adicija, odbacivanje ili supstitucija jedne ili više amino kiselina. Varijante se obično razlikuju za ne više od približno 1% ili 2% ili 5% ili 10% ili 15% ili 20% od ostataka amino kiseline. Na primer, varijanta PreF antigen (uključujući PreF-G) polipeptidne sekvence može da uključi 1 ili 2 ili do 5 ili do približno 10 do približno 15 ili do približno 50 ili do približno 300 razlika amino kiselina u poređenju sa primernom PreF antigen polipeptidnom sekvencom SEQ ID NOi:6, 8, i/ili 10. Prema tome. varijanta u kontekstu RSV F ili G proteina ili PreF antigena (uključujući PreF-G antigen), obično deli najmanje 80% ili 85%, još češće, najmanje približno 90% ili više, kao sto je 95% ili čak 98% ili 99% identičnosti sekvence sa referentnim proteinom, na primer, referentnim sekvencama ilustrovanim u SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 i/ili 10 ili u odnosu na bilo koji ovde otkriven primerni PreF antigen. Dodatne varijante koje su uključene kao karakteristika ovog otkrića su PreF antigeni (uključujući PreF-G antigene) koji obuhvataju ceo ili deo nukleotida ili sekvence amino kiselina selektovanih od prirodno dobijenih varijanti otkrivenih u WO2008114149. Dodatne varijante mogu da nastanu u toku genetičke slučajnosti ili mogu veštački da se produkuju koristeći mesta usmerene ili nasumične mutageneze ili rekombinacijom dve ili više prethodno postojeće varijante. Ovakve dodatne varijante su takođe pogodne u kontekstu ovde otkrivenih PreF (i PreF-G) antigena. Na primer, modifikacija može da bude supstitucija jedne ili više amino kiselina (kao što su dve amino kiseline, tri amino kiseline, četiri amino kiseline, pet amino kiselina, do približno deset amino kiselina ili više) koje ne menjaju konformaciju ili imunogenične epitope u nastalom PreF antigenu.

[0079]Alternativno ili dodatno, modifikacija može da uključi izbacivanje jedne ili više amino kiselina i/ili dodavanje jedne ili više amino kiselina. Naravno, ukoliko se želi, jedan ili više domena polipeptida može da bude sintetički polipeptid koji ne odgovara bilo kom pojedinačnom soju, ali uključuje komponentu subsekvenci iz više sojeva ili Čak konsenzus sekvenca izvedenim usklađivanjem više sojeva RSV virus polipeptida. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više domena polipeptida je modifikovano dodavanjem sekvence amino kiseline koja konstituiše repić, što omogućava naknadne procese ili prečišćavanje. Ovakav repić može da bude antigenični ili epitopni repić, enzimatični repić ili polisaharidni repić. Uobičajeno, repić se nalazi najednom ili drugom kraju proteina, kao što je C-završetak ili N-završetak antigena ili fuzionog proteina.

NUKLEINSKE KISELINE KOJE ENKOĐIRAJU PREF ANTIGENE

[0080] Naredni aspekt ovog otkrića se odnosi na rekombinantne nukleinske kiseline koje enkođiraju PreF antigene, kako je prethodno opisano. U nekim otelotvorenjima, rekombinantne nukleinske kiseline su kodon optimiziran za ekspresiju u izabranim prokariotičnim ili eukarioličnim ćelijama domaćina. Na primer. SEQ ID NOi: 5 i 12 su dva različita, neograničavajuća primera sekvenci koje enkođiraju PreF antigen, koji je kodon optimiziran za ekspresiju kod sisara, na primer, u CHO ćelijama. Kako bi se omogućila replikacija i ekspresija, nukleinske kiseline mogu da se inkorporiraju u vektor, kao stoje prokariotični ili eukariotični vektor ekspresije. Ćelije domaćini koje uključuju rekombinantne PreF antigen-enkodirajuće nukleinske kiseline su takođe karakteristika ovog otkrića. U pogodne ćelije domaćine spadaju prokariotične( to Jest,bakterijske) ćelije domaćini, kao što jeE. col i,kao i brojne eukariotične ćelije domaćini, uključujući ćelije gljivica( na primer.kvasac), ćelije insekata i ćelije sisara (kao što su CHO, VERO i HEK293 ćelije).

[0081] Kako bi se omogućila replikacija i ekspresija, nukleinske kiseline mogu da se inkorporiraju u vektor, kao stoje prokariotični ili eukariotični vektor ekspresije. Mada ovde otkrivene nukleinske kiseline mogu da se uključe u bilo koji od različitih vektora (uključujući, na primer, bakterijske plazmide; fage DNK; bakulovirus; plazmide kvasca; vektore izdvojene iz kombinacije plazmida i iaga DNK, kao što su vakcina, adenovirus, virus boginja živine, pseudorabijes, adenovirus, adeno-povezani virus, rctrovirus i mnogi drugi), najčešći vektor je vektor ekspresije pogodan za generisanje polipeptidnih produkata ekspresije. U vektoru ekspresije, nukleinska kiselna koja enkodira Pref antigen je obično uređena u blizini i orijentisana na odgovarajuću transkripciju kontrolne sekvence (promoter i opciono, jedan ili više pojačivača) da usmere sintezu mRNK. To jest, sekvenca polinukleotida od interesa je operativno povezana sa odgovarajućom transkripcionom kontrolnom sekvencom. Primeri ovakvih promotera uključuju: otvoren rani promoter CMV, LTR ili SV40 promotera, polihedrin promoter bakulovirusa,E. colilac ili trp promoter, fag 77 i lamda Pi, promoter i drugi promoteri za koje se zna da kontrolišu ekspresiju gena u prokariotičnim ili eukariotičnim ćelijama ili njihovim virusima. Vektor ekspresije obično takođe sadrži ribozom sa vezujućim mestom za početak translacije i završetak transkripcije. Vektor opciono obuhvata odgovarajuće sekvence za pojačavanje ekspresije. Pored toga, vektori ekspresije opciono uključuju jedan ili više selektabilnih markera gena kako bi se obezbedila karakteristika fenotipa za selekciju transformisanih ćelija domaćina, kao što su dihidrofolat reduktaza ili neomicin rezistencija za eukariotićne ćelijske kulture ili kao što su rezistencije na kanamicin, tetraciklin ili ampicilin uE. coli.

[0082]Vektor ekspresije može takođe da uključi dodatne elemente ekspresije, na primer, za poboljšanje efikasnosti translacije. Ovi signali mogu da uključe, na primer, kodon inicijacije ATG i susednih sekvenci. U nekim slučajevima, na primer. kodon inicijacije translacije i elementi povezanih sekvenci su umetnuti u odgovarajući vektor ekspresije istovremeno sa polinukleotidom sekvence od interesa( na primer.nativni početni kodon). U ovim slučajevima, nisu potrebni dodatni translacioni kontrolni signali. Međutim, u slučaju kada je umetnuta samo polipeptid-kodirajuća sekvenca, ili njen deo, egzogeni translacioni kontrolni signali, uključujući ATG kodon inicijacije, su potrebni za iranslaciju nukleinske kiseline koja enkodira PreF antigen. Kodon inicijacije se nalazi u okviru korektnog očitavanja da se osigura translacija polinukleotidne sekvence od interesa. Egzogeni transkripcioni elementi i kodoni inicijacije mogu da budu različitog porekla, i prirodni i sintetički. Ukoliko je potrebno, efikasnost ekspresije može dalje da se poveća inkluzijom odgovarajućih pojačivača u sistem ćelija koji se koristi (Scharf i saradnici (1994) Results Probi Cell Differ 20:125-62; Bitter i saradnici (1987) Methods in Enzvmol 153:516-544).

[0083]U nekim slučajevima, nukleinska kiselina (kao što je vektor) koja enkodira PreF antigen uključuje jedan ili više dodatnih elemenata sekvence izabranih da povećaju i/ili optimizuju ekspresiju PreF enkodirajuće nukleinske kiseline kada se umetnu u ćeliju domaćina. Na primer, u nekim otelotvorenjima, nukleinske kiseline koje enkođiraju PreF antigen uključuju intron sekvencu, kao što je humana herpes virus 5 intron sekvenca( videti, na primer,SEQ ID NO: 13). Introni su više puta pokazali da pojačavaju ekspresiju homolognih i heterolognih nukleinskih kiselina kada su na odgovarajući način pozicionirani u rekombinantnoj konstrukciji. Naredna grupa pojačivača ekspresije sekvenci uključuje epigenetski element kao što je Matrix Attachment Region (ili MAR) ili sličan epigenični element, na primer, STAR elementi (na primer, kao što su STAR elementi otkriveni od strane Otte i saradnici, Biotechnol. Prog. 23:801-807, 2007). Bez vezivanja za teoriju, veruje se da MARi posreduju u učvršćivanju ciljane DNK sekvence za nuklearni matriks, generišući domene hromatin petlje koja se proteže sa spoljne strane heterohromatinskog jezgra. Mada MARi ne sadrže bilo koju očigledno usklađenu ili prepoznatljivu sekvencu, smatra se je njihova najkonzistentnija karakteristika ukupno visoki sadržaj A/T i C baze koje su predominantne na jednoj zavojnici. Izgleda da ovi regioni formiraju savi jene sekundarne strukture koje mogu da budu sklone separaciji zavojnice i mogu da uključe nezavojne elemente jezgra (CUE) koji služe kao tačka nukleacije za separaciju zavojnice. Nekoliko motifa jednostavne AT-bogate sekvence je povezano sa MAR sekvencama:na primer.A-box, T-box, motifi nezavojne DNK. SATB1 vezujuća mesta (H-box. A/T/C25) i saglasna mesta topoizomeraze II za kičmenjake ili Drosophila. Primeri MAR sekvenci su opisani u objavljenoj US patentnoj aplikaciji broj 20070178469 i u internacionalnoj patentnoj aplikaciji broj WO02/074969 (koje su ovde inkorporirane u referenci). Dodatne MAR sekvence koje mogu da se koriste za pojačavanje ekspresije nukleinske kiseline koja enkodira PreF antigen uključuju pileći lizozom MAR, MARpl-42, MARpl-6, MARpl-68 i MARpx-29. koje su opisali Girod i saradnici, Nature Methods, 4:747-753, 2007 (otkriveno u GenBank Accession Nos. EA423306, Dl 107030, Dl 106196, Dl 107561 i Dl 106512, tim redom). Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da prihvati da ekspresija dalje može da se modulira selekcijom MAR koji produkuju srednji nivo vrednosti pojačavanja, kao što je objavljeno za MAR 1-9. Ukoliko je potrebno, alternativne MAR sekvence za povećanje ekspresije PreF antigena mogu da se identifikuju pretraživanjem baze podataka za sekvence, na primer, korišćenjem softvera kao što su MAR-Finder (raspoloživ na internet stranici futuresoft.org/MarFinder). SMARTest (raspoloživ na internet stranici genomatix.de) ili SMARScan 1 (Levitskv i saradnici, Bioinformatics 15:582-592, 1999). U nekim otelotvorenjima, MAR je uveden( na primer,transfektovan) u ćeliju domaćina na istoj nukleinskoj kiselini[ na primer,vektoru) kao i PreF antigen koji enkodira sekvencu. U alternativnom otelotvorenju. MARje uveden na odvojenu nukleinsku kiselinu( naprimer,u trans) i može opciono da se kointegriše sa PreF antigen-enkodirajućom polinukleotid sekvencom.

[0084]Primeri procedura koje su dovoljne da vode stručnjaka sa uobičajenim iskustvom u tehnici kroz proces produkcije rekombinantnog PreF antigena nukleinskih kiselina može da se nađe u Sambrook i saradnici, Molecular Cloning A Laboratorv Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, 1989; Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel i saradnici, Current Protocols in Molecular Biologv, Greene Publishing Associates. 1992 (i suplementi do 2003.); i Ausubel i saradnici, Short Protocols in Molecular Biologv: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biologv, 4th ed., Wiley & Sons, 1999.

[0085]Primeri nukleinskih kiselina koje enkođiraju PreF antigen polipeptide su predstavljeni sa SEQ ID NOi: 5, 7, 9, 12 i 13. Dodatne varijante mogu da se produkuju sastavljanjem analoga F i G protein polipeptidnih sekvenci izabranih od bilo kog poznatog (ili naknadno) otkrivenog soja RSV,na primer,kako je otkriveno u WO2008114149. Dodatne varijante sekvenci koje dele identične sekvence sa primernim varijantama mogu da produkuju stručnjaci sa iskustvom u tehnici. Uobičajeno, varijante nukleinskih kiselina će da enkođiraju polipeptide koji se ne razlikuju više nego 1% ili 2% ili 5% ili 10% ili 15% ili 20% od ostataka amino kiseline. To jest, enkodirani polipeptidi dele najmanje 80% ili 85%, još češće, najmanje približno 90% ili više, kao što je 95% ili čak 98% ili 99% identičnost sekvenci. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će jasno da razume da sekvence polinukleotida koji enkođiraju PreF polipeptide, mogu same da dele manju identičnost sekvenci zbog preobilja genetičkog koda. U nekim slučajevima. PreF antigeni imaju modifikacije jedne ili više amino kiselina u odnosu na sekvence amino kiselina prirodno nastalih sojeva iz kojih su izdvojene( naprimer,pored prethodno pomenutih stabilizujućih modifikacija). Ove razlike mogu da budu u dodavanju, oduzimanju ili supstituciji jednog ili više nukleotida ili amino kiselina, tim redom. Varijante se obično razlikuju za ne više od približno 1% ili 2% ili 5% ili 10% ili 15% ili 20% od ostataka nukleotida. Na primer, varijanta PreF antigen (iuključujući PreF-G) nukleinske kiseline može da uključi 1 ili 2 ili do 5 ili do približno 10 ili do približno 15 ili do približno 50 ili do približno 100 nukleotidnih razlika u poređenju sa primernim PreF antigen nukleinskim kiselinama SEQ ID NOi: 5. 7, 9, 12 i/ili 13. Prema tome, varijanta u kontekstu RSV F ili G protein ili PreF antigen (uključujući PreF-G antigen) nukleinske kiseline, obično deli najmanje 80% ili 85%, još Češće, najmanje približno 90% ili više, kao što je 95% ili čak 98% ili 99% identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom.na primer.referentne sekvence ilustrovane u SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 12 ili 13 ili bilo kojom drugom primernom PreF antigen nukleinskom kiselinom koja je ovde otkrivena. Kao karakteristike ovog otkrića koje su uključene kao dodatne varijante su PreF antigeni (uključujući PreF-G antigene) koji obuhvataju celu ili deo nukleotidne sekvence selektovane iz prirodno nastalih varijanti otkrivenih u WO2008114149. Dodatne varijante mogu da nastanu u toku genetike konstrukcije ili mogu da se produkuju veštački koristeći mesta usmerenih ili slučajnih mutageneza ili rekombinacijom dve ili više prethodno postojeće varijante. Ovakve dodatne varijante su takođe pogodne u kontekstu ovde otkrivenih PreF (i PreF-G) antigena.

[0086] Kao dodatak prethodno opisanim varijantama nukleinskih kiselina, nukleinske kiseline koje grade hibride sa jednom ili više primernih nukleinskih kiselina predstavljenih sa SEQ ID NOi:l, 3, 5, 7, 9, 12 i 13 mogu takođe da se koriste da enkođiraju PreF antigene. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da uvaži da pored merenja % identičnosti sekvence kako je prethodno diskutovano, druga indicija sličnosti sekvence između dve nukleinske kiseline je sposobnost za hibridizaciju. Sto je veća sličnost sekvenci dve nukleinske kiseline to su jači uslovi pod kojima će da dođe do hibridizacije. Jačina uslova za hibridizaciju zavisi od sekvence i razlikuje se u zavisnosti od različitih parametara sredine. Prema tome, uslovi za hibridizaciju koji su rezultat određenog stepena snage će da variraju u zavisnosti od prirode izabranog postupka hibridizacije i kompozicije i dužine sekvenci hibridizirajućih nukleinskih kiselina. Generalno, temperatura hibridizacije i jačina jona (posebno koncentracija Na+ i/ili Mg++) pufera za hibridizaciju će da odredi snagu hibridizacije preko vremena ispiranja koje takođe utiče na snagu. Generalno, uslovi jačine se biraju tako da budu približno 5°C do 20°C niži od termičke tačke topljenja (Tm) za specifičnu sekvencu pri definisanoj snazi jona i pH. Tm je temperatura (pod definisanom jonskom jačinom i Ph) na kojoj 50% ciljane sekvence prelazi u hibrid na potpuno podešenoj sondi. Uslovi za hibridizaciju nukleinske kiseline i izračunavanje jačine mogu da se nađu, na primer. u Sambrook i saradnici. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001; Tijssen, Hvbridization With Nucleic Acid Probes, Part I: Theorv and Nucleic Acid Preparation, Laboratorv Techniques in Biochemistrv and Molecular Biologv, Elsevier Science Ltd., NY, NY, 1993. i Ausubel i saradnici. Short Protocols in Molecular Biologv, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 1999.

[0087] U svrhu ovog pronalaska, "uslovi jačine" obuhvataju uslove pod kojima će da dođe do hibridizacije samo ukoliko je manje od 25% usaglašenosti između molekule za hibridizaci ju i ciljane sekvence. "Uslovi jačine" mogu da se prekinu na određenom nivou jačine zbog preciznije definicije. Prema tome, kako se ovde koristi, uslovi "umerene jačine" su oni pod koima molekule sa više od 25% usaglašenosti sekvenci neće da grade hibride; uslovi "srednje jačine" su oni pod kojima molekule sa više od 15% usaglašenosti neće da grade hibride a uslovi "visoke jačine" su oni pod kojima sekvence sa više od 10% usaglašenosti neće da grade hibride. Uslovi "vrlo velike jačine" su oni pod kojima sekvence sa više od 6% usaglašenosti neće da grade hibride. Nasuprot tome, nukleinske kiseline koje grade hibride pod uslovima "male jačine" obuhvataju one sa mnogo manjom identičnosšću sekvenci ili sa identičnošću sekvenci samo sa kratkim subsekvencama nukleinske kiseline. Prema tome, razumljivo je da su različite varijante nukleinskih kiselina koje su obuhvaćene ovim otkrićem sposobne da grade hibride sa najmanje jednom od SEQ ID NOi:l, 3, 5, 7, 9 i/ili 12 preko njihove skoro cele dužine.

POSTUPCI ZA PRODUKCIJU RSV ANTIGENIĆNIH POLIPEPTIDA

[0088]Ovde otkriveni PreF antigeni (uključujući PreF-G antigene i takođe, kada je prihvatljivo, G antigene), se produkuju pomoću dobro utvrđenih procedura za ekspresiju i

prečišćavanje rekombinantnih proteina. Procedure dovoljne da upute stručnjaka sa iskustvom u tehnici mogu da se nađu u sledećim referencama: Sambrook i saradnici. Molecular Cloning: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratorv Press. Cold Spring Harbor, NY. 200; i Ausubel i saradnici Short Protocols in Molecular Biologv, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 999. Dodatni i specifični detalji su dati u daljem tekstu.

[0089] Rekombinantne nukleinske kiseline koje enkođiraju PreF antigene se umeću u ćelije domaćine bilo kojom od različitih dobro poznatih procedura, kao što su elektroporacija, transfekcija pomoću lipozoma( naprimer,korišćenjem komercijalno raspoloživog reagensa za lipozomnu transfekciju. kao što su LIPOFECTAMINE™2000 ili IRANSFECTIN™). precipitacija sakalcijum fosfatom, infekcija, transfekcija i slično, u zavisnosti od izbora vektora i ćelija domaćina. Primeri nukleinskih kiselina koje enkođiraju PreF antigene (uključujući PreF-G antigene) su obezbeđeni u SEQ ID NOi:5, 7. 9. 12 i 13. Stručnjak sa iskustvom u tehnici će da razume da su sekvence SEQ ID NOi:5, 7, 9, 12 i 13 ilustrativne i ne treba da budu ograničavajuće. Na primer, polinukleotidne sekvence koje enkođiraju iste proteine kao i SEQ ID NOi:5, 7 i 9,( naprimer,predstavljene sa SEQ ID NOi: 6, 8 i 10), ali koje se razlikuju samo preobimnim genetičkim kodom (kao što je alternativna optimizacija kodona, kako je pokazano u SEQ ID NO: 12). mogu jednostavno da se koriste umesto primernih sekvenci SEQ ID NOi:5, 7 i 9. Slično tome, mogu da se koriste polinukleotidne sekvence koje obuhvataju elemente pojačavanja ekspresije, kao što su interno pozicioni introni (ili dodavanjem promotera, pojačivača, introna ili drugih sličnih elemenata), kako je ilustrovano u SEQ ID NO: 13. Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u tehnici će da razume da su kombinacije ovih modifikacija isto tako pogodne. Slično tome, homologne sekvence selektovane od bilo kog RSV A ili RSV B soja i/ili druge sekvence koje dele skoro potpunu identičnost sekvenci, kako je prethodno diskutovano, mogu takođe da se koriste za ekspresije PreF antigena. Naravno, bilo koja od prethodno otkrivenih varijanti nukleinskih kiselina može pogodno da se uvede u ćelije domaćine i koristi za produkciju PreF antigena (uključujući PreF-G antigene) i kada je prihvatljivo, G polipeptida.

[0090] Ćelije domaćini koji uključuju rekombinantni PreF antigen enkodiran nukleinskim kiselinama su, prema tome. takođe odlika ovog otkrića. U odgovarajuće ćelije domaćine spadaju prokariotične( to jesi,bakterijske) ćelije domaćini, kao što jeE. coli,kao i brojne eukariotične ćelije domaćini, uključujući ćelije gljivica{ naprimer,kvasca, kao što suSaccharomyces cerevisiaeiPicchiapastoris).ćelije insekata. ćelije biljaka i ćelije sisara (kao Što su CHO i HEK293 ćelije). Rekombinantne PreF antigen nukleinske kiseline su umetnute{ naprimer,transdukcijom, transformacijom ili transfekcijom) u ćelije domaćine, na primer. preko vektora, kao što je vektor ekspresije. Kako je prethodno opisano, vektor je najčešće plazmid, ali ovi vektori mogu takođe da budu, na primer. čestice virusa, fag, itd. U primere odgovarajućih domaćina ekspresije spadaju: bakterijske ćelije, kao što suE. voli, S( reptomyces i Salmoneila typhimurium;gljivične ćelije, kao što suSaccharomyces cerevisiae, Pichiapastoris i Neuruspora crassa;ćelije insekata kao što suDrosophilaiSpodoplera frugiperda:ćelije sisara kao što su 3T3, COS. CHO, BHK, HEK 293 ili Bovves melanoma; ćelije biljaka, uključujući ćelije algi, itd. [00911Ćelije domaćini mogu da se uzgajaju u uobičajenom hranljivom medijumu koji je odgovarajuće modifikovan za aktivaciju promotera. selkciju transformacija ili pojačavanje ubačenih polinukleotidnih sekvenci. Uslovi uzgajanja, kao što su temperatura. pH i slično, su onakvi kakvi su prethodno korišćeni za selekciju ćelija domaćina za ekspresiju a stručnjaku sa iskustvom u tehnici će to biti jasno i uz ovde citirane reference, uključujući, na primer, Freshnev (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York i ovde citirane reference. Produkti ekspresije koji odgovaraju nukleinskim kiselinama iz pronalaska mogu takođe da se produkuju u ne-životinjskim ćelijama, kao što su biljke, kvasac, gljivice, bakterije i slično. Pored autora Sambrook, Berger and Ausubel, detalji u vezi sa uzgajanjem ćelija mogu da se nadu u: Pavne i saradnici (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) i u Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.

[0092]U bakterijskim sistemima, broj vektora ekspresije može da bude selektovan u zavisnosti od nameravane upotrebe produkta ekspresije. Na primer, kada su za produkciju antitela potrebne velike količine polipeptida ili njihovih fragmenata, prvenstveno se koriste vektori koji omogućavaju visok nivo ekspresije fuzionih proteina koji se lako prečišćavaju. Ovi vektori obuhvataju, ali bez ograničenja na, multifunkcionalne vektore kloniranja i ekspresijeE. colikao što je BLUESCRIPT (Stratagene). u kojima tražena kodirajuća sekvenca,na primer,polinukleotid iz pronalaska kako je prethodno opisano, može da bude povezan u vektoru zajedno sa sekvencama za amino-završetak translaciju iniciranu metioninom i narednih 7 ostataka beta-galaktozidaze. čime se produkti je katalitički aktivan beta galaktozidaza fuzioni protein; pIN vektori (Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509); pET vektori {Novagen, Madison WI). u kojima je amino-završni metionin povezan zajedno sa histidin repićem; i slično. [0093jIsto tako, u kvascu, kao što jeSaccharomyces cerevisiae,broj vektora koji sadrže konstitutivne ili inducibilne promotere kao što su alfa faktor, alkohol oksidaza i PGH mogu da se koriste za produkciju željenih produkata ekspresije. Za pregled, videti Berger, Ausubel, i,na primer,Grant i saradnici (1987; Methods in Enzymology 153:516-544). U ćelijama domaćinima kod sisara, mogu da se koriste brojni sistemi ekspresije uključujući i sisteme na bazi plazmida i na bazi virusa.

[0094]Ćelija domaćin je opciono izabrana zbog svoje sposobnosti da modulira ekspresiju umetnutih sekvenci ili da procesuira ekspresovani protein na željeni način. Ovakve modifikacije proteina uključuju, ali bez ograničenja na, glikozilaciju (kao i,na primer,acetilaciju, karboksilaciju, fosforilaciju, lipidaciju i acilaciju). Na primer, post-translacioni proces kojim se čepa oblik prekursora u završni oblik proteina (na primer, furin proteazom) se opciono vrši u kontekstu ćelije domaćina. Različite ćelije domaćini kao što su 3T3. COS, CHO, HeLa, BHK, MDCK, 293. WI38, itd. imaju specifičnu ćelijsku mašineriju i karakteristične mehanizme za ovakve post-translacione aktivnosti i mogu da se izaberu kako bi se osigurala korektna modifikacija i procesuiranja uvedenih proteina sa strane.

[0095]Za dugotrajnu, visoko prinosnu produkciju ovde otkrivenih rekombinantnih PreF antigena, uobičajeno se koriste sistemi stabilne ekspresije. Na primer, ćelijske linije u kojima se stabilno pojavljuje PreF antigen polipeptid se umeću u ćeliju domaćina preko vektora ekspresije koji sadrže viruse, koji potiču od replikacije ili elemenata endogene ekspresije i marker gen po izboru. Nakon uvođenja vektora, ćelije se ostave da rastu u toku 1 -2 dana u obogaćenom medijumu pre nego što se prebace u selektivni medijum. Cilj selektibilnog markera je da doda rezistenciju za selekciju a svojim prisustvom omogućava rast i obnavljanje ćelija u kojima se uspešno pojavljuju uvedene sekvence. Na primer. proliferacija rezistentnih grupa ili kolonija stabilno transformisanih ćelija može da se izvrši tehnikama koje koriste kulturu tkiva odgovarajućem tipu ćelija. Ćelije domaćini transformisane sa nukleinskom kiselinom koja enkodira PreF antigen se opciono uzgajaju pod uslovima pogodnim za ekspresiju i obnavljanje enkodiranog proteina iz ćelijske kulture.

[0096]Nakon transdukcije odgovarajuće linije ćelije domaćina i rasta ćelija domaćina do odgovarajuće gustine ćelija, izabrani promoter se indukuje odgovarajućim sredstvima (na primer, promenom temperature ili hemijskom indukcijom) i ćelije se uzgajaju za dodatni period. Opciono, medijum uključuje komponente i/ili aditive koji smanjuju degradaciju ispoljenih proteina od strane proteinaza. Na primer. medijum koji se korisi za uzgajanje ćelija za produkciju PreF antigena može da uključi inhibitor proteaze, kao što su sredstvo za izradu helata ili inhibitor male molekukle( naprimer,AZ11557272. AS111793.itd).da smanji ili eliminiše neželjeno cepanje od strane ćelijskih ili ekstraćelijskih (na primer, matriks) proteinaza.

[0097]Produkt izlučenog polipeptida se nakon toga obnavlja iz medijuma za uzgajanje. Alternativno, ćelije mogu da se sakupe centrifugiranjem, razdvoje fizičkim ili hemijskim postupcima a nastali sirovi ekstrakt zadržava za dalje prečišćavanje. Eukariotične ili mikrobne ćelije korišćene u ekspresiji proteina mogu da se odvoje bilo kojim uobičajenim postupkom, uključujući ciklus zamrzavanje-topljenje, sonikaciju. mehaničko razdvajanje ili upotrebom sredstava za liziranje ćelija, ili drugim postupcima koji su dobro poznati stručnjaku sa iskustvom u tehnici.

[0098]Ispoljeni PreF antigeni mogu da se obnove i prečiste iz rekombinantnih ćelijskih kultura bilo kojim od brojnih postupaka koji su dobro poznati u tehnici, uključujući precipitaciju amonijum sulfatom ili etanolom. ekstrakciju kiselinom, filtraciju, ultrafiltraciju, centrifugiranje, hromatografiju izmenom anjona ili katjona. hromatografiju fosfocelulozom, hromatografiju hidrofobnom interakcijom, afinitetnu hromatografiju (na primer, korišćenjem bilo kog od sistema markiranja koji su ovde navedeni), hidroksilapatitnu hromatografiju i lecitin hromatografiju. Ukoliko se želi, mogu da se koriste faze ponovnog sklapanja proteina u završnoj fazi centrifugiranja kompletnog proteina. Konačno, u fazi finalnog prečišćavanja može da se koristi visoko efikasna tečna hromatografija (HPLC). Pored prethodno navedenih referenci, u tehnici su dobro poznati različiti postupci prečišćavanja, uključujući,na primer.one koji su navedeni od strane Sandana (1997) Bioseparation of Proteins. Academic Press, Inc.; i Bollag i saradnici (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss. NY; VV'alker (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press. NJ, Harris and Angal (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford. U.K.; Scopes

(1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rđ Edition Springer Verlag, NY; Janson and Ryden (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY; i Walker (1998) Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ.

[0099]U nekim primerima, nukleinske kiseline se uvode u ćelije preko vektora pogodnih za uvođenje i ekspresiju u prokariotičnim ćelijama,na primer,ćelijamaE. coii.Na primer. nukleinska kiselina koja uključuje polinukleotiđnu sekvencu koja enkodira PreF antigen može da se uvede u bilo koji od različitih komercijalno raspoloživih ili postojećih vektora, kao što su pET serije vektora ekspresije( naprimer,pET9b i pET2d). Ekspresija kodirajuće sekvence može da se indukuje pomoću IPTG, što za rezultat ima visoke nivoe ekspresije proteina. Polinukleotidna sekvenca koja enkodira PreF antigen je transkribovana pod fag T7 promoterom. Takođe su pogodni alternativni vektori, kao sto je pL)RV22 koji uključuje lambda pL promoter koji može da se indukuje toplotom.

[0100]Vektor ekspresije se uvodi( naprimer.elektroporacijom) u pogodan bakterijski domaćin. Raspoloživi su brojni pogodni sojeviE. colii stručnjak sa iskustvom u tehnici može da ih izabere, na primer, Rosetta i BL21 (DE3) sojevi su se dokazali kao pogodni za ekspresiju rekombinantnih vektora koji sadrže polinukleotidne sekvence za enkodrianje PreF antigena.

[0101]Još češće, polinukleotidi koji enkođiraju PreF antigene su inkorporirani u vektore ekspresije koji su pogodni za uvođenje i ekspresiju u eukariotičnim( naprimer,ćelijama insekata ili sisara) ćelijama. Kao prednost, ovakve nukleinske kiseline su kodoni podešeni za ekspresiju u odabranoj vektor/domaćin ćeliji (na primer, sekvence ilustrovane u SEQ ID NOi: 5, 7, 9 i 12 su kodoni optimizovani za ekspresiju u CHO ćelijama). U jednom primernom otelotvorenju, polinukleotidna sekvenca koja enkodira PreF antigen je uključena u vektor, kao stoje pEE14 vektor koji je razvijen u firmi Lonza Biologicals. Polipeptid se pojavljuje pod konstitutivnim promoterom, kao što je direktan CMV (citomegalovirus) promoter. Selekcija stabilno transfektovanih ćelija za ekspresiju polipeptida se vrši na osnovu sposobnosti transfektovanih ćelija da rastu bez prisustva izvora glutamina. Ćelije koje imaju uspešno integrisan pEE 14 su sposobne da rastu bez prisustva egzogenog glutamina, zato što se u pEE 14 vektoru ispoljava GS (glutamin sintetaza) enzim. Izabrane ćelije mogu da se šire kloniranjem i karakterišu za ekspresiju željenog PreF polipeptida.

[0102]U narednom primeru, polinukleotidna sekvenca koja enkodira PreF antigen je umetnuta u ćelije insekata koristeći bakulovirus vektor sistem ekspresije (BEVS). Rekombinantni bakulovirus sposoban da inficira ćelije insekta može da se generiše pomoću komercijalno raspoloživih vektora, kitova i/ili sistema, kao što su BD BacuIoGold sistem od BD BioScience. Ukratko, polinukleotidna sekvenca koja enkodira antigen je umetnuta u pAcSG2 transfer vektor. Nakon toga, ćelije domaćina SF9( Spodoptera frugiperda)se ko-transfektuju pomoću pAcSG2 himeričnog plazniida i BD BacuIoGold, koji sadrži linearizovanu genomićnu DNKbakulovirusa Antographa califbrnica nuckar polyhedrosisvirus(AcNPV). Nakon transfekcije, đolazhi do homologne rekombinacije između pACSG2 plazmida i bakulovirus genoma da se generiše rekombinantni virus. U jednom primeru, PreF antigen se pojavljuje pod regulatornom kontrolom polihedrin promotera (pH). Slični vektori transfera mogu da se produkuju korišćenjem drugih promotera. kao što su bazni (Ba) i plO promotori. Slično tome, mogu da se koriste alternativne ćelije insekata, kao što je SF21 koja je blisko povezana sa Sf9 i High Five ćelijska linija izdvojena iz kupusne gusenice,

Trichoplusia ni.

[0103]Nakon transfekcije i indukcije ekspresije (u skladu sa odabranim promoterom i/ili pojačivačem ili drugim regulatornim elementima) ispoljeni polipeptidi se obnavljaju( na primer,prečišćavaju ili obogaćuju) i ponovo dovode u prirodno stanje kako bi se osiguralo zadržavanje u konformaciji antigeniČno aktivne prefusije.

IMUNOGENIČNE KOMPOZICIJE I METODE

[0104]Takođe su obezbeđene imunogenične kompozicije koje uključuju bilo koji od prethodno otkrivenih PreF antigena (kao što su oni navedeni u SEQ ID NOi: 6, 8 i 10) i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.

[0105]U nekim otelotvorenjima, obično u otelotvorenjima u kojima PreF antigen ne uključuje G protein komponentu (kao što je SEQ ID NO:6), imunogenična kompozicija može da uključi izolovani, rekombinantni i/ili prečišćeni G protein. Brojni pogodni G proteini su opisani u tehnici i obuhvataju celu dužinu rekombinantnih G proteina i himerične proteine izrađene od dela G proteina (kao što su amino kiseline 128-229 ili 130-230) i fuzionog partnera (kao što je tioredoksin) ili signalne i/ili vodeće sekvence, što omogućava ekspresiju i/ili prečišćavanje. Primeri G proteina za korišćenje u smeši sa PreF antigenom mogu da se nađu u WO2008114149, US Patent No. 5,149.650, US Patent No. 6,113,911, US Published Application No. 20080300382 i US Patent No. 7.368.537. koji su svaki ovde inkorporirani kao referenca. Kako je navedeno u vezi sa himeričnim PreF-G proteinima, manji fragment G proteina, kao stoje deo izimeđu amino kiselina 149-229 ili deo između približno 128 do približno 229 mogu uspešno da se koriste u kontekstu smeša koje uključuju PreF (bez G) i G. Kako je prethodno diskutovano, posebno je važno prisustvo imunodominantnih epitopa, na primer, uključenih unutar regiona amino kiselina 183-197. Alternativno, u ovim kompozicijama može da se koristi cela dužin G proteina.

[0106]Farmaceutski prihvatljivi nosači i ekscipijenti su dobro poznati i stručnjak sa iskustvom u tehnici može da ih izabere. Na primer, povoljno je da nosač ili ekscipijent uključe pufer. Opciono, nosač ili ekscipijent takođe sadrže najmanje jednu komponentu koja stabiliše rastvori)ivost i/ili stabilnost. Primeri sredstava za soiubiiizaciju/stabilizaciju uključuju deterdžente, na primer, lauril sarkozin i/ili tvveen. U alternativna sredstva za soiubiiizaciju/stabilizaciju spadaju arginin i polioli koji formiraju staklo (kao što su saharoza, trehaloza i slično). U tehnici su poznati i opisani brojni farmaceutski prihvatljivi nosači i/ili farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti, na primer. u Remington's Pharmaceutical Sciences, autora E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA. 5th Edition (975).

[0107]U skladu sa tim, stručnjak sa iskustvom u tehnici će da odabere pogodne ekscipijente i nosače za izradu formulacije pogodne za korišćenje na subjektu u zavisnosti od izabranog načina primene.

[0108]U pogodne ekscipijente spadaju, bez ograničenja, gliccrol, polietilen glikol (PEG). sorbitol, trehaloza, N-laurilsarkozin natrijumova so, L-prolin. ne peneći sulfobetain, gvanidin hidrohlorid, urea, trimetilamino oksid, KC1, Ca<2+>, Mg<2+>. Mn<2+>, Zn<2+>i drugi dvovalentni katjoni odgovarajućih soli, ditiotreitol, ditioeritrol i p-merkaptoetanol. Drugi ekscipijenti mogu da budu deterdženti (uključujući: Tween80. Tween20, Triton X-00, NP-40, Empigen BB, oktiglukozid, lauroil maltozid, cviter sredstvo 3-08, cviter sredstvo 3-0, cviter sredstvo 3-2, cviter sredstvo 3-4, cviter sredstvo 3-6, CHAPS. natrijumdeoksiholat, natrijum dodecil sulfat, cetiltrimetilamonijum bromid). [0109[Opciono, imunogenične kompozicije takođe uključuju imunopotencijator. U kontekstu imunogenične komopzicije pogodne za primenu na subjektu u cilju pobuđivanja zaštitnog imunog odgovora na RSV, imunopotencijator je izabran da pobudi Thl zadobijeni imuni odgovor.

[0110]Imunoptencijator je obično izabran da pojača Thl zadobijeni imuni odgovor kod subjekta ili populacije subjekata, na kojima se primenjuje komopzicija. Na primer. kada je imunogenična kompozicija za primenu na subjektu iz grupe određene starosti koja je podložna (ili postoji povećani rizik od) RSV infekciji, imunopotencijator se bira tako da bude bezbedan i efikasan na subjektu ili populaciji subjekata. Premalome, kada se formuliše imunogenična kompozicija koja sadrži RSV PreF antigen za primenu na starijem subjektu (kao što je subjekt stariji od 65 godina), bira se imunopotencijator da bude bezbedan i efikasan kod starijih subjekata. Slično tome, kada je imunogenična kompozicija koja sadrži RSV PreF antigen namenjena za primenu na novorođenčadi ili bebama (kao što su subjekti između dana rođenja i dve godine starosti) bira se imunopotencijator da bude bezbedan i efikasan kod novorođenčadi i beba.

[0111]Pored toga, imunopotencijator se obično bira da pojača Thl imuni odgovor kada se primenjuje određenim načinom primene. kojim se primenjuje imunogenična kompozicija. Na primer, kada se formuliše imunogenična kompozicija koja sadrži PreF antigen za nazalnu primenu, pogodni su proteozom i protolin kao Thl-zadobijeni imunopotencijatori. Nasuprot tome, kada je imunogenična kompozicija formulisana za intramuskulamu primenu, prvenstveno se biraju imunopotencijatori koji uključuju jedan ili više 3D-MPL, skvalen( na primer,QS21), lipozome i/ili emulzije ulje u vodi.

[0112]Jedan pogodan imunopotencijator za upotrebu u kombinaciji sa PreF antigenima je derivat ne-toksiČnog bakterijskog lipopolisaharida. Primer pogodnog ne-toksičnog derivata lipida A je monofosforil lipid A ili, još preciznije, 3-deacilovani monofosforil lipid A (3D-MPL). 3D-MPL je u prodaji pod nazivom MPL proizvođača GlaxoSmithKline Biologicals N.A. i kroz ceo dokument se označava kao MPL ili 3D-MPL. Videti, na primer, US Patente broj 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 i 4,912,094. 3D-MPL primarno promoviše odgovore CD4+ T ćelija sa IFN-y (Thl) fenotipom. 3D-MPL može da se produkuje u skladu sa postupcima otkrivenim u GB2220211 A. Hemijski je to smeša 3-deacilisanog monofosforil lipida A sa 3,4, 5 ili 6 acilisanim lancima. U kompozicijama iz ovog pronalaska, mogu da se koriste male čestice 3DMPL. Male čestice 3D-MPL imaju takvu veličinu da mogu da se sterilišu filtriranjem kroz filter promera pora od 0.22pm. Ovakve izrade su opisane u W094/21292.

[0113]Lipopolisaharid, kao Sto je 3D-MPL. može da se koristi u količinama između 1 i 50pg pod dozi imunogenične kompozicije za ljude. Tako, 3D-MPL može da se koristi u količini od približno 25pg. na primer između 20-30 ug, pogodno je između 21-29 ug ili između 22 i 28 ug ili između 23 i 27 ug ili između 24 i 26 ug ili 25 pg. U narednom otelotvorenju, humana doza imunogenične kompozicije uključuje 3D-MPL u količini od približno 10pg, na primer između 5 i 15 ug, pogodno između 6 i 14 ug, na primer između 7 i 13 pg ili između 8 i 12 ug ili između 9 i 11 pg ili 10 ug. U narednom otelotvorenju, humana doza imunogenične komozicije uključuje 3D-MPL u količini od približno 5 pg, na primer između 1 i 9 pg ili između 2 i 8 pg ili još pogodnije između 3 i 7 pg ili 4 i 6 ug ili 5 pg.

[0114]U narednim otelotvorenjima. lipopolisaharid može da bude p(l-6) glukozamin disaharid, kako je otkriveno u US Patentu broj 6,005.099 i EP Patentu broj 0 729 473 BI. Stručnjaku sa iskustvom u tehnici će da bude jednostavno da produkuje različite ]ipopolisaharide, kao što je 3D-MPL, na osnovu uputstava iz ovih referenci. Manjeviše, svaka od ovih referenci je ovde inkorporirana kao referenca. Pored prethodno pomenutih imunostimulansa (koji su po strukturi slični sa strukturom LPS ili MPL ili 3D-MPL), derivati acilovanih monosaharida i disaharida koji su sub-deo prethodne strukture MPL. su takode pogodni imunopotencijatori. U drugim otelotvorenjima, imunopotencijator je sintetički derivat lipida A, od kojih su neki opisani kao TLR-4 agonisti i uključuju, ali bez ograničenja na: OMI 74 (2-deoksi-6-o-[2-deoksi-2-[(R)-3-dodekanoiloksitetra-dekanoilamino]-4-o-fosfono-[3-D-glukopiranozil]-2-[(R)-3-hidroksitetradekanoilami-no]-a-D-glukopiranozildihidrogenfosfat), (W0 95/14026); OM 294 DP (3S, 9R)-3-[(R)-dodekanoiloksitetradekanoilamino]-4-okso-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidroksitetradekanoilamino]dekan-1.10-diol,l,10-bis(dihidrogenofosfat) (WO 99/64301 i WO 00/0462); i OM 197 MP-Ac DP (3S, 9R)-3-[(R)-dodekanoiloksitetradekanoilamino]-4-okso-5-aza-9-[(R)-3-hidroksitetradekanoilamino]decan-1.10-diol, 1 -dihidrogenofosfat 10-(6-aminoheksanoat) (WO 01/46127).

[0115]Drugi TLR4 Ugandi koji mogu da se koriste su alkil glukozaminid fosfati (AGPi) kao što su oni otkriveni u WO 98/50399 ili US Patentu broj 6,303,347 (procesi za izradu AGPi su takođe otkriveni), odgovarajuće RC527 ili RC529 ili farmaceutski prihvatljive soli AGPi kako je otkriveno u US Patentu broj 6,764,840. Neki AGPi su TLR4 agonisti a neki su TLR4 antagonisti. I jedni i drugi su korisni kao imunopotencijatori.

[0116]Drugi pogodni TLR-4 ligandi, sposobni da izazovu signalni odgovor preko TLR-4 (Sabroe i saradnici, JI 2003 pl 630-5) su, na primer, lipopolisaharid iz gram-negativnih bakterija i njegovi derivati ili njegovi fragmenti, posebno netoksičan derivat LPS (kao što je 3D-MPL). Drugi pogodni TLR agonisti su: protein inaktiviran toplotom (HSP) 10, 60, 65, 70, 75 ili 90; surfaktant proteina A, hijaluronski oligosaharidi. fragmenti heparin sulfata, fragmenti fibronektina, fibrinogen peptidi i b-defensin-2 i muramil dipeptid (MDP). U jednom otelotvorenju, TLR agonist je HSP 60, 70 ili 90. Drugi pogodni TLR-4 ligandi su kako je opisano WO 2003/011223 i u WO 2003/099195, kao što su jedinjenje I, jedinjenje II i jedinjenje III otkriveni na stranicama 4-5 \VO2003/011223 ili na stranicama 3-4 WO2003/099195 a posebno ona jedinjenja koja su otkrivena u WO2003/011223 kao ER803022, ER803058, ER803732, ER804053, ER804057, ER804058. ER804059, ER804442, ER804680 i ER804764. Na primer, jedan pogodan TLR4 ligand je ER804057.

[0117]I drugi TLR agonisti su takode korisni kao imunopotencijatori. Naziv "TLR agonist" se odnosi na sredstvo koje je sposobno da izazove odgovor signalizacije preko puteva TLR signalizacije, ili kao direktni ligand ili indirektno generisanjem endogenih ili egzogenih liganda. Ovakvi prirodni ili sintetički TLR agonisti mogu da se koriste kao alternativa ili dodatak imunopotencijatorima. Kratak pregled uloge TLRa kao imunopotencijatora receptora su dali Kaisho & Akira, Biochimica el Biophvsica Acta 1589:1-13, 2002. Ovi potencijalni imunopotencijatori uključuju, ali se ne ograničavaju samo na agoniste za TLR2, TLR3, TLR7, TLR8 i TLR9. U skladu sa tim, u jednom otelotvorenju, imunopotencijator i imunogenična kompozicija dalje uključuju imunopotencijator koji je izabran iz grupe koja se sastoji od: TLR-1 agonista, TLR-2 agonista, TLR-3 agonista. TLR-4 agonista, TLR5 agonista, TLR-6 agonista, TLR-7 agonista, TLR-8 agonista, TLR-9 agonista ili njihove kombinacije.

[0118]U jednom otelotvorenju ovog pronalaska, koristi se TLR agonist koji je sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-1. Shodno tome, TLR agonist sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-1 je izabran od: tri-acilovanih lipopeptida (LPi): fenol rastvorljivog modulina; Mvcobacterium tuberculosis LP; S-(2,3-bis(palmitoiloksi)-(2-RS)-propil)-N-palmitoil-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-OH. trihidrohlorid (Pam3Cys) LP koji oponaša acetilovani amino terminus bakterijskog lipopoliproteina i OspA LP odBorrelia

burgdorferi.

[0119]U alternativnom otelotvorenju. koristi se TLR agonist koji je sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-2. Shodno tome, TLR agonist sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-2 je jedan ili više l ipoproteina, peptidoglikan, bakterijski lipopeptid odM tuberculosis, B burgdorferiiliTpallidum;peptidoglikani iz sojeva uključujućiStaphylococcw aureus;lipoteiholne kiseline, manuronske kiseline, Neisseria porins, bakterijske fimbrije, faktori Yersina virulencije, CMV virioni, hemaglutinin ospica i zimosan iz kvasca.

[0120]U alternativnom otelotvorenju, koristi se TLR agonist koji je sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-3. Shodno tome, TLR agonist sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-3 je dvostruko uvijena RNK (dsRNK) ili poliinozinsko-policitidiolna kiselina (Poly IC), uzorak molekularne nukleinske kiseline povezan sa virusom infekcije.

[0121]U alternativnom otelotvorenju, koristi se TLR agonist koji je sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-5. Shodno tome, TLR agonist sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR -5 je bakterijski flagelin.

[0122]U alternativnom otelotvorenju, koristi se TLR agonist koji je sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-6. Shodno tome, TLR agonist sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-6 je mikobakterijski lipoprotein. di-acilovani LP i fenol rastvorljivi modulin. Drugi TLR6 agonisti su opisani u WO 2003/043572.

(0123)U alternativnom otelotvorenju, koristi se TLR agonist koji je sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-7. Shodno tome, TLR agonist sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-7 je jednostruko uvijena RNK (ssRNK), loksoribin, analog gvanozina na položajima N7 i C8 ili jedinjenje imidazokvinolina ili njegov derivat. U jednom otelotvorenju, TLR agonist je imikvimod. Drugi TLR7 agonisti su opisani u WO 2002/085905.

[0124]U alternativnom otelotvorenju, koristi se TLR agonist koji je sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-8. Shodno tome, TLR agonist sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-8 jednostruko uvijena RNK (ssRNK). molekula imidazokvinolina sa anti-virusnim delovanjem, na primer, rezikvimod (R848); rezikvimod je takođe sposoban za prepoznavanje sa TLR-7. Drugi TLR-8 agonisti koji mogu da se koriste obuhvataju one koji su opisani u WO 2004/071459.

[0125]U alternativnom otelotvorenju, koristi se TLR agonist koji je sposoban da izazove odgovor signalizacijom preko TLR-9. U jednom otelotvorenju, TLR agonist sposoban da izazove odgovor signalizacijom kroz TLR-9 je HSP90. Alternativno, TLR sposoban da izazove odgovor signalizacijom kroz TLR-9 je bakterijska ili virusna DNK, DNK koja sadrži nemetilovane CpG nukleotide, a posebno sadržaji sekvenci poznati kao CpG motifi. Oligonukleotidi koji sadrže CpG indukuju predominantni Thl odgovor. Ovakvi oligonukleotidi su dobro poznati i opisani su, na primer, u WO 96/02555, WO 99/33488 i U.S. Patentima brojevi 6,008,200 i 5,856,462. Shodno tome, CpG nukleotidi su CpG oligonukleotidi. Pogodni oligonukleotidi za upotrebu u imunogeničnim kompozicijama iz ovog pronalaska su oligonukleotidi koji sadrže CpG, koji opciono sadrže dva ili više nukleotid CpG motifa razdvojena sa najmanje tri, pogodno je sa najmanje šest ili više nukleotida. CpG motif je citozin nukleotid iza koga je guanin nukleotid. CpG oligonukleotidi iz ovog pronalaska su obično deoksinukleotidi. U specifičnom otelotvorenju, intemukleotid u oligonukleotidu je fosforoditioat ili pogodna fosforotioatna veza. mada su fosfodietarska i druge internukleotidne veze obuhvaćene okvirom pronalaska. LI okvir pronalaska su takode uključeni oligonukleotidi sa mešanim internukleotidnim vezivanjem. Postupci za produkciju fosforotioat oligonukleotida ili fosforoditioata su opisani u US Patentima brojevi 5,666,153, 5,278,302 i WO 95/26204.

[0126]Drugi imunopotencijatori koji mogu da se koriste u imunogeničnim kompozicijama sa PreF antigenima, na primer. samo sa njima ili u kombinaciji sa 3D-MPL ili drugim ovde opisanim imunopotencijatorima, su saponini. kao što je QS21.

[0127]Saponini su pokazani u: Lacaille-Dubois, M i Wagner H. (1996. A revievv of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2 pp 363-386). Saponini su steroidni ili triterpen glikozidi široko rasprostranjeni u biljkama i životinjama morskog carstva. Za saponine se zna da formiraju koloidne rastvore u vodi koji mućkanjem pene i da precipitiraju holesterol. Kada se saponini nalaze pored ćelijskih membrana, u membrani stvaraju strukture slične porama koje dovode do pucanja membrana. Hemoliza eritrocita je primer ovog fenomena koji predstavlja osobinu nekih, ali ne svih saponina.

[0128]Saponini su poznati kao imunopotencijatori u vakcinama za sistemsku primenu. Imunopotencijatorsko i hemolitičko delovanje pojedinačnih saponina je intenzivno ispitano u tehnici (Lacaille-Dubois and Wagner, kao gore). Na primer, Quil A (dobijen od kore južno američkog drveta Cmillaja Saponaria Molina) i njegove frakcije, su opisani u US 5,057,540 and "Saponins as vaccine adjuvants". Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (l-2):l-55; i EP 0 362 279 BI. Određene strukture, označene kao imuno stimulirajući kompleksi (ISCOMS), koji uključuju frakcije Quil A su hemoiitici i korišćeni su u proizvodnji vakcina (Morein, B„ EP 0 109 942 BI; WO 96/11711; WO 96/33739). Hemolitićki saponini QS21 i QS17 (frakcije Quil A prečišćene sa HPLC) su opisani kao potentni sistemski imunopotencijatori a postupak za njihovu izrađuje otkriven u US Patentu broj5,057.540 i u EP 0 362 279 BI. koji su ovde inkorporirani u referenci. Drugi saponini koji se koriste u studijama sistemske vakcinacije uključuju saponine dobijene od drugih biljnih vrsta, kao što su Gypsophila i Saponaria (Bomford i saradnici, Vaccine, 10(9):572-577, 1992).

[0129]QS21 je Hplc prečišćena netoksična frakcija izdvojena iz kore Quillaja Saponaria Molina. Postupak za produkciju QS21 je otkriven u US Patentu broj 5,057.540. Formulacije ne-reaktogenih imunopotencijatora koji sadrže QS21 su opisani u WO 96/33739. Prethodno pomenute reference su ovde inkorporirane u referenci. Navedeni imunološki aktivan saponin, kao što je QS21, može da se koristii u količinama između 1 i 50pg, po dozi imunogenične kompozicije za ljude. Prednost je kada se QS2l koristi u količini od približno 25 pg, na primer između 20-30 pg, bolje je između 21-29 pg ili između 22 -28 pg ili između 23 -27 pg ili između 24 -26 pg ili 25 pg. U narednom otelotvorenju, doza imunogenične kompozicije za ljude sadrži QS21 u količini od približno 10 pg, na primer između 5 i 15 pg, bolje je između 6 -14 ug. na primer između 7 -13 pg ili između 8-12 pg ili između 9-11 pg ili 10 pg. U još jednom otelotvorenju. doza imunogenične kompozicije za ljude sadrži QS21 u količini od približno 5<p>g, na primer između 1-9<p>g ili između 2 -8 pg ili bolje je između 3-7 pg ili 4 -6 pg ili 5 pg. Ovakve formulacije koje uključuju QS21 i holesterol su se pokazale uspešne kao imunopotencijatori koji stimulišu Thl kada su formulisane zajedno sa antigenom. Prema tome, na primer, povol jno je kada se PreF polipeptidi koriste u imunogeniČnim kompozicijama sa imunopotencijatorom koji uključuje kombinaciju QS21 i holesterola.

(0130]Opciono, imunopotencijator može takođe da uključi mineralne soli kao što su soli aluminijuma ili kalcijuma, posebno aluminijum hidroksid. aluminijum fosfat i kalcijum fosfat. Na primer, imunopotencijator koji sadrži 3D-MPL u kombinaciji sa aluminijumovom solju( na primer,aluminijum hidroksid ili "alum") je pogodan za formulaciju u imunogeničnoj kompozici ji koja sadrži PreF antigen za primenu na humanom subjektu.

[0131 jNaredna klasa pogodnih imunopotencijatora pod uticajem Thl za upotrebu u formulacijama sa PreF antigenima uključuju imunostimulatome kompozicije na bazi OMP. Imunostimulatorne kompozicije na bazi OMP su posebno pogodne kao mukozni imunopotencijatori, na primer, za intranazalnu primenu. Imunostimulatome kompozicije na bazi OMP su vrsta preparata proteina spoljašnje membrane (OMPi, uključujući neke porine) iz gram-negativnih bakterija, kao što su, ali bez ograničenja na,Neisseriaspecies (videti,na primer.Lowell i saradnici, J. Exp. Med. 167:658, 1988; Lovvell i saradnici, Science 240:800, 1988; Lynch i saradnici, Biophvs. J. 45:104, 1984; Lovvell, u "New Generation Vaccines" 2nd ed., Marcel Dekker, Inc., New York, Basil, Hong Kong, strana 193. 1997; U.S. patent broj 5,726,292; U.S. patent broj 4,707,543), koje su korisne kao nosači ili u kompozicijama za imunogeneze, kao što su bakterijski ili virusni antigeni. Neke imunostimulatorne kompozicije na bazi OMP mogu da budu označene kao "Proteozomi," koji su hidrofobni i bezbedni za ljudsku upotrebu. Proteozomi imaju sposobnost da se sami postave u vezikule ili klastere OMP slične vezikulama od približno 20 nm do približno 800 nm i da se nekovalentno inkorporiraju, usaglase, povežu( na primer.elektrostatički ili hidrofobno) ili na drugi način da budu u vezi sa antigenima proteina (Ags), posebno antigenima koji imaju hidrofobni radikal. Bilo koji postupak izrade koji za rezultat ima komponentu proteina spoljašnje membrane u vezikularnom ili vezikuli-sliČnom obliku, uključujući multi-molekularne membranozne strukture ili OMP kompozicije slične otopljenom globularu sa jednim ili više OMPa, je uključen u definiciju proteozoma. Proteozomi mogu da se izrade, na primer, na način koji je opisan u tehnici (videti,na primer.U.S. patent broj 5.726.292 ili U.S. patent broj 5,985,284).

Proteozomi mogu takođe da sadrže endogeni lipopolisaharid ili lipooligosaharid (LPS ili LOS, tim redom) koji potiču od bakterije korišćene za produkciju OMP porina( naprimer, Neisseriavrste), koji generalno čine manje od 2% ukupno izrađenog OMP.

[0132]Proteozomi su prvenstveno sastavljeni od hemijski ekstrahovanih proteina spoljašnje membrane (OMPe) odNeisseria menigilidis(najveći deo porina A i B i kao klasa 4 OMP) održavajući se u rastvoru pomoću deterdženta (Lovvell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral ili Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC, Kaper JB, Cobon GS, eds, Nevv Generation Vaccines. Nevv York: Marcel Dekker. Inc. 1997; 193-206). Proteozomi mogu da se formulišu sa različitim antigenima kao što su prečišćeni ili rekombinantni proteini dobijeni iz virusnih izvora, uključujući ovde otkrivene PreF polipeptide, na primer, dijafillracijom ili tradicionalnim procesima dijalize. Postepeno uklanjanje deterdženta omogućava formiranje kompleksa hidrofobnog partikulata sa približno 100-200nm u prečniku (Lovvell GH. Proteosomes for Improved Nasal, Oral ili Injectable Vaccines. In: Levine MM, Woodrow GC. Kaper JB, Cobon GS, eds, Nevv Generation Vaccines. Nevv York: Marcel Dekker, Inc. 1997; 193-206).

[0133] "Proteozom:LPS ili protolin", kako se ovde koristi, se odnosi na izradu proteozoma izmešanih sa,na primer,egzogenim dodavanjem, sa najmanje jednom vrstom lipopolisaharida da se dobije OMP-LPS kompozicija (koja može da deluje kao imunostimulatorna kompozicija). Prema tome, OMP-LPS kompozicija može da uključi dve od bazih komponenti protolina, u koje spadaju (1) izrada proteina spoljašnje membrane proteozoma( na primer,projuvant) izrađen od gram negativne bakterije kao što jeNeisseria meningitidis i(2) izrada jednog ili više liposaharida. Lipo-ol igosaharid može da bude endogeni( naprimer,da se prirodno nalazi u toku izrade OMP proteozoma), može da se meša ili kombinuje sa OMP izrađenim od egzogeno pripremljenog lipo-olisaharida( na primer,izrađen od drugačije kulture ili mikroorgazima od izrađenog OMP) ili može da bude njihova kombinacija. Ovaj egzogeno dodati LPS može da bude ođ iste gram negativne bakterije od koje se izrađuje OMP ili ođ različite gram-negativne bakterije. Takođe treba da se razume da protolin može opciono da uključi lipide, glikolipide, glikoproteine, male molekule ili slično, i njihove kombinacije. Protolin može da se izradi, na primer. na način koji je opisan u U.S.

Patent Application Publication No. 2003/0044425.

[0134]Kombinacije različitih imunopotencijatora, kao što su ovde prethodno pomenuti, mogu takođe da se koriste u kompozicijama sa PreF antigenima. Na primer, kako je već navedeno, QS21 može da se formuliše zajedno sa 3D-MPL. Odnos QS21 : 3D-MPL je obično od 1 : 10 do 10 : 1; kao stoje 1:5 do 5 : 1 i često stvarno 1:1. Uobičajeno, odnos je u opsegu 2.5 : 1 do 1 : 1 3D-MPL: QS21. Naredna formulacija kombinacije imunopotencijatora uključuje 3D-MPL i so aluminijuma, kao što je aluminijum hidroksiid. Kada je formulisana u kombinaciji, ova kombinacija može da pojača antigen-specifični Thl imuni odgovor.

[0135]U nekim slučajevima, formulacija imunopotencijatora uključuje emulziju ulje-u-vodi ili mineralnu so kao stoje so kalcijuma ili aluminijuma, na primer, kalcijum fosfat, aluminijum fosfat ili aluminijum hidroksid.

[0136]Jedan primer emulzije ulje-u-vodi uključuje ulje koje može da se metaboliše, kao što je skvalen, tokol kao što je tokoferol,na primer,alfa-tokoferol i surfaktant. kao što su polisorbat 80 ili Tvveen 80, u vodenom nosaču, i ne sadrži bilo koji dodatni imunistimulans(e), a posebno ne sadrži ne-toksične derivate lipida A (kao sto je 3D-MPL) ili saponin (kao što je QS21). Vodeni nosač može da bude, na primer, pufer fosfatnih soli. Pored toga, emulzija ulje-u-vodi može da sadrži span 85 i/ili lecitin i/ili trikaprilin.

[0137]U narednom otelotvorenju pronalaska je data komoziciona vakcina koja uključuje antigen ili kompoziciju antigena i kompoziciju imunopotencijatora koja uključuje emulziju ulje-u-vodi i opciono jedan ili više drugih imunostimulanasa, pri čemu pomenuta emulzija ulje-u-vodi sadrži 0.5-10 mg ulja koje može da se metaboliše (obično skvalen), 0.5-11 mg tokola (obično tokoferol, kao što je alfa-tokoferol ) i 0.4-4 mg emulgatora.

[0138]U jednom izrađen u obliku emulzije, kao što je emulzija ulj-u-vodi. U nekim slučajevima, emulzija ima male Čestice veličine manje od 0.2pm u prcčniku, kako je otkriveno u WO 94/21292. Na primer. čestice 3D-MPL mogu da budu dovoljno male da se sterilišu filtriranjem kroz membranu promera 0.22 mikrona (kako je opisano u evropskom patentu broj 0 689 454). Alternativno, 3D-MPL može da se izradi u liposomalnoj formulaciji. Opciono, imunopotencijator koji sadrži 3D-MPL (ili njegov derivat) može da uključi dodatnu imunostimulatornu komponentu.

[0139]Na primer, kada je imunogenična kompozicija sa PreF polipeptidnim antigenom formulisana za primenu na bebama, doza imunopotencijatora se određuje tako da bude efikasna i relativno ne-reaktogenična kod beba. Generalno, doza imunopotencijatora u formulaciji za bebe je niža nego kada se koristi u formulacijama pripremljenim za primenu na odraslima( naprimer,odrasli od 65 ili stariji). Na primer, količina 3D-MPL je obično u rasponu od 1 pg-200pg, kao što je 10-100 pg ili 10 pg -50 pg po dozi. Doza za bebe je obično na nižem kraju ovog opsega, na primer, od približno 1 pg do približno 50pg. kao sto je od približno 2 pg ili približno 5 pg ili približno 1 Opg. do približno 25pgili do približno 50 pg. Obično, kada se u formulaciji koristi QS21, opsezi se upoređuju i u skladu su sa prethodno navedenim odnosima. Za odrasle i stariju populaciju, formulacije obično uključuju veću količinu komponente imunopotencijatora nego što se obično nađe u formulaciji za bebe. U određenim formulacijama u kojima se koristi emulzija ulje-u-vodi. takva emulzija može da uključi dodatne komponente, kao što su. na primer, hoiesterol. skvalen, alfa tokoferol i/ili deterdžent, kao što su tvveen 80 ili span 85. U primernim formulacijama, ove komponente mogu da budu prisutne u sledećim količnama: od približno l-50mg holesterola, od 2 do 10% skvalena, od 2 do 10% alfa tokoferola i od 0.3 do 3% tveen 80. Uobičajeno, odnos skvalen : alfa tokoferol je jednak sa ili manji od 1. čime se obezbeduje mnogo stabilnija emulzija. U nekim slučajevima, formulacija može takođe da sadrži stabilizator. Kada je, na primer u kombinaciji sa 3D-MPL prisutan aluminijum hidroksid. količina je obično između približno lOOpg i lmg, kao što je približno lOOpg ili približno 200pg do približno 750pg, kao što je približno 500pg po dozi.

[0140]Imunogenična kompozicija obično sadrži imunoprotektivnu količinu (ili njegovu frakcionu dozu) antigena i može da se izradi uobičajenim tehnikama. Izrada imunogeničnih kompozicija, uključujući one za primenu na humanim subjektima je generalno opisana u Phannaceutical Biotechnologv, Vol.61 Vaccine Designthe subunit and adjuvant approach, editeđ by Powell and Nevvman, Plenum Press, 1995. Nevv Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller i saradnici, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Enkapsulaciju unutar lipozoma su opisali, na primer. Fullerton, U.S. Patent 4,235,877. Konjugacija proteina u makromolekule je otkrivena, na primer, od strane Likhite, U.S. Patent 4,372,945 i od Armor i saradnici. U.S. Patent 4,474,757.

[0141]Uobičajeno, količina proteina u svakoj dozi imunogenične kompozicije je izabrana kao količina koja indukuje imunoprotektivni odgovor bez značajnih, štetnih neželjenih dejstava kod prosečnog subjekta. Imunoprotekcija u ovom kontekstu ne mora da znači potpunu zaštitu od infekcije; ona znači zaštitu od simptoma ili bolesti, posebno od teških bolesti izazvanih virusom. Količina antigena može da varira u zavisnosti od toga koji se specifični imunogen koristi. Generalno, očekuje se svaka humana doza sadrži 1-lOOOpg proteina, kao stoje od približno 1 pg do približno lOOpg, na primer, od približno 1 pg do približno 50pg, kao što je približno lpg, približno 2pg, približno 5pg, približno lOpg, približno 15pg. približno 20pg, približno 25pg, približno 30pg, približno 40pg ili približno 50pg. Količina koja se koristi u imunogeničnoj komopziciji se određuje na osnovu populacije subjekata (na primer, bebe ili stare osobe). Optimalna količina za određenu kompoziciju može da se proceni standardnim studijama koje uključuju posmatranje titra antitela i druge odgovore kod subjekata. Nakon prve vakcinacije, subjekti mogu da prime revakcinu za približno 4 nedelje.

[0142] Treba da se napomene da nezavisno od izabranog imunopotencijatora, koncentracija u finalnoj formulaciji se izračunava tako da bude bezbedna i efikasna za ciljanu populaciju. Na primer, imunogenične kompozicije za pobuđivanje imunog odgovora na RSV kod ljudi se prvenstveno primenjuju na bebama( na primer,bebe tek rođene i do jedne godine, kao sto je između 0 i 6 meseci, u vreme početne doze). Imunogenične kompozicije za pobuđivanje imunog odgovora na RSV se takođe prvenstveno primenjuju na starijim ljudima (na primer. same ili u kombinaciji sa antigenima drugih patogena povezanih sa COPD). Jasno je da izbor imunopotencijatora može da bude različit za ove različite aplikacije i da stručnjak sa iskustvom u tehnici može empirijski da odredi optimalni imunopotencijator i koncentraciju za svaku situaciju.

[0143] U nekim otelotvorenjima, imunogenične kompozicije su vakcine koje redukuju ili sprečavaju infekciju sa RSV. U nekim otelotvorenjima, imunogenične kompozicije su vakcine koje redukuju ili sprečavaju patološki odgovor nakon infekcije sa RSV. Opciono, imunogenične kompozicije koje sadrže preF antigen su formulisane sa najmanje jednim dodatnim antigenom patogenog organizma koji nije RSV. Na primer, patogeni organizam može da bude patogen respiratornog trakta (kao što su virus ili bakterija koji izazivaju respiratornu infekciju). U nekim slučajevima, imunogenična kompozicija sadrži antigen dobijen od patogenog virusa koji nije RSV, kao što je virus koji izaziva infekciju respiratornog trakta, kao što su influenca ili parainfiuenca. U drugim otelotvorenjima. dodatni antigeni su izabrani tako da omoguće primenu ili smanje broj inokulacija potrebnih da se subjekt zaštiti od većeg broja infektivnih organizama. Na primer, antigen može da se dobije od jednog ili više izazivača influence, hepatitisa B, difterije, tetanusa, pertusisa, hemofilne influence, polivirusa, streptokoka ili pneumokoka, između ostalog.

[0144] U skladu sa upotrebom PreF antigena ili nukleinskih kiselina koje ih enkoodraju u izradi medikamenta za lečenje (ili terapeutski nakon ili profilaktički pre) izlaganju ili infekciji sa RSV je takođe karakteristika ovog otkrića. Isto tako, postupci za pobuđivanje imunog odgovora na RSV kod subjekta su karakteristika ovog otkrića. Ovi postupci uključuju primenu imunološki efektivne količine kompozicije koja sadrži PreF antigen na subjektu, kao što je humani subjekt. Uobičajeno, kompozicija obuhvata imunopotencijator koji pobuđuje imuni odgovor pod uticajem Thl. Kompozicija je formulsana da pobudi imuni odgovor specifičan za RSV bez pojačavanja virusnog oboljenja nakon kontakta sa RSV. To jest, kompozicija je formulisana da dovodi do imunog odgovora pod uticajem Thl koji redukuje ili sprečava infekciju sa RSV i/ili redukuje ili sprečava patološki odgovor nakon infekcije sa RSV. Mada kompozicija može da se primeni velikim brojem različitih puteva, imunogenične kompozicije se najčešće oslobađaju intramuskularnim ili intranazalnim putem primene.

[0145]Imunogenična kompozicija obično sadrži imunoprotektivnu količinu (ili njegovu frakcionu dozu) antigena i može da se izradi uobičajenim tehnikama. Izrada imunogeničnih komopzicija, uključujući one za primenu na humanim subjektima, je genealno opisana u Pharmaceutical Biotechnologv. Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach. edited by Powell and Nevvman. Plenum Press, 1995. Nevv Trends and Developments in Vaccines, edited by Voller i saradnici, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978. Enkapsulaciju unutar lipozoma je opisao, na primer, Fullerton, U.S. Patent 4,235.877. Konjugacija proteina u makromolekule je otkrivena, na primer, od strane Likhite, U.S. Patent 4,372,945 i od strane Armor i saradnika. U.S. Patent 4.474,757.

[0146]Uobičajeno, količina proteina u svakoj dozi imunogenične kompozicije je izabrana kao količina koja indukuje imunoprotektivni odgovor bez značajnih, neželjenih sporednih efekata kod tipičnog subjekta. U ovom kontekstu, imunoprotektivna zaštita ne znači obavezno potpunu zaštitu od infekcije; ona označava zaštitu od simptoma ili bolesti, posebno teških bolesti izazvanih virusom. Količina antigena može da varira u zavisnosti od toga koji je specifični imunogen upotrebljen. Generalno, očekuje se da svaka humana doza sadrži 1 do lOOOpg proteina, kao što je od približno 1 pg do približno lOOpg, na primer, od približno 1 pg do približno 50pg, kao što je približno 1 pg, približno 2pg, približno 5[ig, približno lOpg, približno 15pg, približno 20pg, približno 25pg, približno 30pg, približno 40mg ili približno 50 pg. Količina koja se koristi u imunogeničnoj kompoziciji je izabrana na osnovu populacije subjekta (na primer, bebe ili stare osobe). Optimalna količina za određenu kompoziciju može da se proceni standardnim studijama koje uključuju posmatranje titra antitela i drugih odgovora kod subjekta. Nakon prve vakcinacije. subjekti mogu da prime revakcinu posle približno 4-12 nedelja. Na primer, kada se primenjuje imunogenična kompozicija koja sadrži PreF antigen na bebama, prva i naknadne inokulacije mogu da se primene istovremeno sa drugim vakcinama koje se primenjuju u toku ovog perioda. [0147)Naredni primeri su dati da ilustruju izvesne određene karakteristike i/ili otelotvorenja. Ovi primeri nisu dati da ograniče pronalazak na opisane određene karakteristike ili otelotvorenja.

PRIMERI

Primer 1: primerni PreF antigeni

[0148]PreF antigen je modifikovan u poređenju sa nativnim RSV F proteinom kako bi se stabilizovano protein u svojoj prefusionoj konformaciji na osnovu predviđanja da bi imuni odgovor generisan prefusionom konformacijom F preferencijalno ukjučio antitela koja će da spreče vezivanje, promenu konformacije i/ili druge pojave uključene u fusiju membrane, i na taj način povećavaju efikasnost zaštitnog odgovora.

[0149]SLIKE 1A i B šematski ilustruju karakteristike RSV FO i primerne PreF rekomobinantne antigene. SLIKA 1A predstavlja RSV FO protein. FO je pre-protein koji se sastoji od 574 amino kiseline. FO pre-protein se proteolitički procesuira i glikozilira nakon translacije. Signalni peptid, koji se kasnije ukloni signalnom peptidazom, usmerava translaciju Fo pre-proteina u endoplazmatični retikulum (RE). Nascentni peptid u RE se nakon toga N-glikozilira na više položaja (predstavljeno trouglovima). Furin cepanjem FO se generišu domeni F2 i FI peptida, koji se zajedno savijaju i slažu kao trimer F2-F1 heterodimera (to jest, 3 puta F2-fl). U svom nativnom stanju, F protein se vezuje za membranu transmembranskom petljom u regionu C-završetka. U dodatne karakteristike FO polipeptida spadaju 15 cistein ostataka, 4 karakterisana epitopa neutralizacije. 2 regiona upredene zavojnice i motif lipidacije. SLIKA 1B ilustruje karakteristike primernih PreF antigena. Za konstrukciju PreF antigena. FO polipeptid se mođifikuje da stabiliše prefusionu konformaciju F proteina, čime se zadržavaju predominantni imunogenični epitopi F proteina kako je predstavljeno RSV virusom pre vezivanja za i fusijom sa ćelijama domaćina. Naredne stabilizirajuće mutacije su uvedene u PreF antigen u odnosu na FO polipeptid. Prvo, stabilizirajući domen upredene zavojnice se nalazi na kraju C-završetka ekstracelularnog domena FO polipeptida, zamenjujući domen koji je vezan za membranu FO. Drugo. pep27 peptid (smešten između F2 i FI domena u nativnom domenu) se ukloni. Treće, oba furin motifa se uklanjaju. U alternativnim otelotvorenjima, (označeni PreF VI i PreF_V2), imunološki aktivni deo (na primer, amino kiseline 149-229) RSV C3 proteina se doda u domen C-završetka.

Primer 2: produkcija i prečišćavanje PreF rekombinantnog proteina iz CHO ćelija.

[0150]Rekombinantna polinukleotidna sekvenca koja enkodira primerni PreF antigen se uvodi u CHO ćelije domaćina za produkciju PreF antigena. Tranzietno transfektovane ćelije domaćini ili proširene stabilne populacije koje uključuju uvedenu polinukleotidnu sekvencu se odgajaju u medij umu i pod uslovima pogodnim za rast na prihvatljivoj skali za traženi cilj( naprimer,kako je generalno opisano u Freshnev (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Techn ique, third edition, Wiley- Liss, Nevv York i ovde navedenim referencama). Uobičajeno, ćelije se uzgajaju u medijumu bez seruma, u bocama za mućkanje, na 37°C sa 5% CO2i ostave u intervalimia 2-3 dana ili u bioreaktorima na 29°C uz održavanje p02 na 20%.

[0151]Za obnavljanje rekombinantnog PreF antigena, ćelijska kultura se centrifugira a supernatant ćelijske kulture se čuva na 80°C do dalje upotrebe. Za dalje analize, alikvote od po dva litra supernatanta ćelijske kulture se razblaže 2x sa prečišćenom vodom i podese na pH 9.5 sa NaOH. Supernatant se pri brzini od 14 ml/min nanosi na Q Sepharose FF kolonu jonskih izmenjivača (60 ml, 11.3 cm), uravnoteženoj u 20 mM piperazina, pH 9.5. Nakon ispiranja kolone sa početnim puferom, eluacija se vrši sa NaCl gradijentom od 0 do 0.5 M NaCl u 20 zapremina kolone (veličina frakcije 10 ml). Frakcije se analiziraju na SDS PAGE gelu bojenjem srebrom i vvestern blot analizom. Frakcije koje sadrže najveći deo PreF proteina se zatim izvuku pre daljeg procesuiranja.

[0152] Izvučeni eluat iz Q faze (-130 ml) se podvrgne izmeni pufera u 10 mM fosfata, pH 7.0, koristeći spravu za merenje TFF sistema proizvođača Millipore sa kasetom Pelllicon XL PES Biomax 100 (MWCO 10,000 Da) membrane. Dobijeni materijal ima pH od 7.0 i provodljivost od 1.8 mS/cm. 100 ml ovog uzorka se pri brzini od 5 ml/min. nanosi na 10 ml Hvdroksi apatit tip II (HA TII) gela (XK 16, visina=5cm) uravnoteženog sa 10 mM PO4(Na) puferom pH 7.0. Nakon ispiranja kolone sa početnim puferom, eluacija se vrši sa gradijentom od 10 mM do 200 mM P04 (Na) pH 7.0 u 20 zapremina kolone. Frakcije se ponovo analiziraju na SDS PAGE sa bojenjem srebrom i kumasi plavim i pozitivne frakcije se izvuku.

[0153]Nakon afinitetne hromatografije, izvučene frakcije se koncentruje a pufer zameni u DPBS (pH -7.4) koristeći jedinicu Vivaspin 20 koncentratom, 10,000 Da MWCO. Finalni produkt je približno 13 ml. Koncentracija proteina je 195 pg/ml, ispitano Lowry analizom. Čistoća je veća od 95%. Ovaj preparat prečišćenog PreF antigena se steriliše filtriranjem i čuva na -20°C pre upotrebe.

Primer 3: karakteri zaci i a PreF rekombinantnog proteina produkovanog u CHO ćelijama.

[0154]PreF rekombinantni protein produkovan u CHO ćelijama se karakteriše frakcionisanjem u asimetričnom polju protoka (AFF-M ALS) i upoređuje sa himeričnim antigenom koji uključuje komponente RSV F i G proteina. AFF-MALS omogućava razdvajanje vrsta proteina u skladu sa veličinom njihovih molekula u protoku tečnosti sa minimalnom inteakcijom matriksa i daljom analizom pomoću multi-ugaonog razlaganja svetlosti za precizno određivanje molekulske težine. SLIKA 2A pokazuje da je za više od 65% prečišćenog FG materijala nađeno da su to oligomeri velike molekulske težine (1000-100 000 KDa) u finalnom PBS puferu dok 3% zadržava oblik monomera.

[0155]SLIKA 2B pokazuje da se prečišćeni PreF protein savija u svoj trimerni oblik do proporcije od 73% u PBS puferu. Za 10% materijala je nađeno da su to oligomeri od 1000 do 20 000 KDa. Ovi rezultati pokazuju daje rekombinantni PreF protein ispoljen u CHO ćelijama uvijen kao trimer kako je predviđeno za nativno stanje.

[0156]Prečišćeni PreF protein je takođe unakrsno vezan sa glutaraldehidom u cilju dvostruke potvrde prirode rastvorljivosti proteina u rastvoru fosfatnog pufera i generisanja agregata za upoređivanje u in vivo evaluaciji sa FG proteinom (videti niže dat Primer 7). Poznato je da unakrsno povezivanje glutaraldehida obezbeđuje dobru procenti kvaternarne strukture proteina i opisano je u (Biochemistry, 36:10230-10239 (1997); Eur. J. Biochem., 271:4284-4292 (2004)).

[0157]Protein se inkubira sa 1%, 2% i 5% sredstva za unakrsno vezivanje glutaraldehida u toku četiri sata na 4°C i reakcija se prekida dodavanjem NaBILi. Višak glutaraldehida se ukloni odsoljavanjem kolone u PBS puferu. Dobijeni protein se kvantifikuje apsorpcijom na 280nm i procenjuje pomoću SDS PAGE u uslovima denaturacije i redukcije. Utvrđeno je da se najveći deo prečišćenog rekombinantnog PreF premešta u PBS rastvor. Povećanje temperature inkubacije na 23°C je potrebno za konverziju većine primernog trimeričnog proteina u agregate velike molekulske težine, kako je potvrđeno sa SDS PAGE.

Primer 4:In viironeutralizacija inhibicije sa PreF antigenom

[0158JHumani serum dobijen od volontera se pregleda zbog reaktivnosti na RSV A pomoću ELISA testa i koristi u analizi neutralizacije inhibicije (NI) pri relevantnom razblaženju zasnovanom na prethodno titraciji potencijalne RSV neutralizacije ustanovljenoj za svaki uzorak seruma. Ukratko, serum se izmeša sa inhibitorom proteina (PreF ili kontrolni protein

koji u osnovi odgovara himeričnom FG otkrivenom u US Patentu broj 5.194,595. označenom kao RixFG) pri koncentracijama od 25pg/ml u DMEM sa 50% 199-H medijunia, sa 0.5% FBS, 2 mM glutamina, 50 pg/ml genamicina (svi proizvodjača Invitrogen) i inkubiraju 1.5 do 2 sata na 37°C na rotirajućem točku. Po 20 pl serijskih razblaženja seruma i proteina se izmeša u ploči sa 96 otvora okruglog dna sa titrom RSV A da se optimizuje stepen inhibicije za svaki uzorak seruma. Dobijene smeše se inkubiraju 20 minuta na 33°C uz 5% CO2da se održi pH.

[0159]SmeŠe serum-inhibitor-virus se nakon toga prenesu u ploče sa 96 otvora ravnog dna prethodno zasejane sa Vero ćelijama i inkubiraju 2 sata na 33°C, a nakon toga se doda 160 pl medijuma. Ploče se nakon toga inkubiraju 5-6 dana na 33°C uz 5% CO2sve dok se imunofluorescentnom analizom detektuje NI titar. Nakon fiksacije u toku 1 sat sa 1 % paraformaldehidom u puferu fosfatnih soli (PBS), ploče se blokiraju sa 2% mleko/PBS i puferom za blokiranje. Anti RSV antitelo koze (Biodesign Internation; 1:400) se doda u svaki otvor bez ispiranja i inkubira 2 sata na sobnoj temperaturi (RT). Uzorci se isperu 2x sa PBS i u svaki otvor se doda anti-kozji IgG-FITC (Sigma; 1:400) u puferu za blokiranje. Ploče se ponovo inkubiraju 2 sata na RT i pre očitavanja isperu 2x kao prethodno. Otvor se smatra pozitivnim kada se detektuje > 1 fluorescentni sincitijum. Izračunavanje 50% infektivne doza kulture tkiva (TCID50) se izvodi pomoću Spearman-Karber (SK) postupka a procenti NI se izračunavaju na sledeći način: [(Neut titar Opg/ml inhibitora - Neut titar 25pg/ml inhibitora)/Neut titar Opg/ml inhibitor] X 100. Primerni rezultati pokazani na SLICI 3 pokazuju daje PreF superioran za FG u Ni u 16/21 testiranih donora.

Primer 5: PreF antigen je imunogeničan

[0160]Za demonstraciju imunogeničnosti PreF antigena, miševi se imuniziraju IM dva puta u intervalu od dve nedeije sa PreF (6.5. 3.1. 0.63, 0.13 i 0.025 pg/ml) i Thl imunopotencijatorom koji sadrži 3D MPL i QS21 za 1/20 humane doze ("AS01E") ili sa PreF (I, 0.2 i 0.04 pg/ml) i Thl imunopotencijatorom koji sadrži 3D MPL i aluminijum hidroksid od 1/10 humane doze ("AS04C") a serum se uzima tri nedeije kasnije.

[0161]Antigen-specifični titri IgG antitela se određuju na uzorcima izdvojenog seruma ELISA testom u skladu sa standardnim procedurama. Ukratko, ploče sa 96 otvora se oblože sa prečišćenim inaktiviranim RSV A, RSV B i homolozima PreF proteina i inkubiraju u toku noći na 4°C. Uzorci seruma se serijski razblaže u puferu za blokiranje, počevši od inicijalne koncentracije od 1:50, zajedno sa prečišćenim mišjim IgG (Sigma, ON) pri početnim koncentracijama od 200 ng/ml i inkubiraju 2h na sobnoj temperaturi. Vezano antitelo se detektuje sa ren peroksidaza (HRP)-konjugovani anti-mišji IgG (Sigma. ON). Kao substrat za HRP se koristi 3,3A,5.5A-tetrametilbenzidin (TMB, BD Opt FIATM. BD Biosciences. ON). Za zaustavljanje reakcije se u svaki otvor doda po 50pl 1M rastvora H2SO4. Vrednosti apsorpcije za svaki otvor se detektuju na 450 nm na uređaju za molekularno očitavanje mikroploče (Molecular Devices, USA).

[0162]Reprezentativni rezultati su detal jno dati na SLIKAMA 4A i 4B i pokazuju da su jaki titri pobuđeni i na RSV A i na RSV B nakon imunizacije sa PreF antigenom.

Primer 6: PreF pobuđuje neutralizaciju antitela

[0163]Prisustvo i količna neutrališućih antitela se procenjuje u uzorcima seruma miševa imuniziranih kako je prethodno opisano u Primeru 5. Izdvojeni serum od imuniziranih životinja se serijski razblaži počevši sa razblaženjem od 1:8 u RSV medijumu u pločama sa 96 otvora (20 pl/otvor). Kontrolni otvori sađže samo RSV medijum ili kozje anti-RSV antitelo pri 1:50 (Biodesign international). U otvore se doda 500-1000 infektivnih doza reprezentativnih RSV A ili B sojeva i ploče se inkubiraju 20 minuta na 33°C, uz 5% CO2, a nakon toga se smeša prenese u ploče sa 96 otvora ravnog dna koje su prethodno zasejane sa 1x10<5>ćclijc/mL sa Vero ćelijama. Ćelije se inkubiraju približno 2 sata na 33°C, uz 5% CO2i ostave pre inkubacije u toku 5-6 dana na istoj temperaturi. Supernatanti se uklone, ploče se isperu sa PBS a vezane ćelije fiksiraju sa 1% paraformaldehidom sa PBS u toku 1 sat, a nakon toga se detektuju indirektnom imunofluorescencijom (JFA) koristeći kozje anti RSV primarno antitelo i anti-kozji IgG-FlTC.

[0164]Reprezentativni rezultati pokazani na SLIKAMA 5A i 5B, tim redom, pokazuju đa su značajna neutrališuća antitela na oba RSV soja detektovana u serumu životinja imuniziranih sa PreF.

Primer 7: PreF štiti od RSV nadražaja

[0165]Miševi se imuniziraju IM dva puta u intervalu od dve nedeije kako je prethodno opisano i tri nedeije nakon druge injekcije se inficiraju sa RSV A. Zaštita od RSV se procenjuje merenjem prisustva virusa u plućima nakon infekcije. Ukratko, pluća imuniziranih životinja se aseptički uklone nakon eutanazije i isperu u RSV medijumu koristeći dve zapremine od 10 ml/pluću u epruvetama od 15 ml. Pluća se nakon toga izmere i pojedinačno homogeniziju u RSV medijumu sa automatskim Potter homogenizatorom (Fisher, Nepean ON) i centrifugiraju 2 minuta na 4°C pri 2655 x g. Virusi prisutni u supernatantima se titriraju serijskim razblaženjem (osam replikata počevši od 1:10) u pločama sa 96 otvora prethodno zasejanim jednoslojnim Vero ćelijama (ATCC# CCL-81) i inkubiraju 56 dana. RSV se detektuju indirektnom IFA nakon fiksiranja u 1% paraformalđehid/PBS Ph 7.2, sa kozjim-anti RSV primarnim antitelom i FITC obeleženim antikozjim IgG sekundarnim antitelom.

[0166]Reprezentatitivni rezultati pokazani na SLIK AMA 6A i 6B pokazuju da doze jednake sa ili veće od 0.04pg kada se daju u prisustvu imunopotencijatora pobuđuju jaku zaštitu od

RSV.

Primer 8: PreF doze ne indukuju jačanje pulmonarne eoziiiofilije nakon infekcije

[0167]Za procenu mogućnosti da PreF antigen provocira pogoršanje bolesti nakon imunizacije i naredne infekcije, grupe miševa (5 miševa po grupi) su dva puta imunizovane svaki sa (a) 10 pg glutaraldehid-tretiranim PreF. (b) lOpg PreF ili (c) lOpg FG bez imunopotencijatora. Miševi se inficiraju sa RSV A 3 nedeije nakon revakcinacije a bronhoalveolarna lavaža (BAL) se vrši 4 dana nakon infekcije. Ukupni infiltrat leukocita u BAL su nabrojani po mišu kao i diferencijalne enumeracije (300 ćelija) na osnovu ćelijske morfologije makrofaga/monocita, neutrofila, eozinofila i Iimfocita.

[0168]Ukupni brojevi ćelija se množe sa diferencijalnim procentima eozinofila za svaku životinju. Predstavljene su geometrijske sredine po grupi sa ograničenjem na 95% upliva. Reprezentativni rezultati pokazani u SLICI 7 pokazuju da eozinofili nisu dospeli u pluća nakon imunizacije sa PreF i infekcije. Osim toga, ovi rezultati pokazuju da rastvorljiva priroda PreF antigena, u poređenju sa odmereno agregatnim oblikom PreF (tretman sa gluteraldehiđom) ili FG antigenom (prirodno agregatni) ne favorizuje eozinofile.

Listing sekvenci

[0169]

SEQ1DN0:1

Nukleotidna sekvenca koja enkodira RSV koja se odnosi na fuziju proteina soja A2 GenBank Pristupni broj U50362

SEQ ID NO:2

Sekvenca amino kiseline RSV koja se odnosi na F protein precursor FO soja A2 GenBank Pristupni broj AAB86664

SEQ ID NO:3

Sekvenca nukleotida enkodirajućeg RSV koja se odnosi na G protein Long soja

SEQ IDN0:4

Sekvenca amino kiseline RSV koja se odnosi na G protein

Seq ID NO:5

Nukleotidna sekvenca PreF analoga optimiziranog za CHO

SEQ IDNO:6

Sekvenca amino kiseline PreF analoga

Seq ID NO:7

Nukleotidna sekvenca koja enkodira PreF_ VI optimiziranog za CHO

Seq ID NO:8

PreFJVl peptid za CHO

Seq ID NO:9

PreF_V2 za CHO

Seq ID NO: 10 PreF_V2 peptid za CHO

SEQ ID NO: 11

Primerna upredena zavojnica (izoleucinski ziper)

EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA

SEQ ID NO: 12

PreF antigen polinukleotida CH02

SEQ IDN0:13

PreF antigen polinukleotida sa intronom

SEQ IDNO:14

Sekvenca sintetičkog linkera

GGSGGSGGS

SEQIDN0:15 Mesto furin cepanja

RARR

SEQ IDNO:16 Mesto furin cepanja

RKRR

Claims (24)

1. Rekombinantni antigen respiratornog sincicijalnog virusa (RSV) uključuje rastvorljivi F protein polipeptida koji uključuje F: domen i Fi domen RSV F protein polipeptida, naznačen time što nema fuirn mesta cepanja između F2domena i Fidomena i pri čemu polipeptid dalje uključuje domen heterologne trimerizacije pozicioniran na C-završetku za Fi domen.

2. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što F2domen uključuje najmanje deo RSV F protein polipeptida koji odgovara amino kiselinama 26-105 referentnog F protein prekursor polipeptida (Fn) SEQ ID NO:2.

3. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 ili 2, naznačen time što Fi domen uključuje najmanje deo RSV F protein polipeptida koji odgovara amino kiselinama 137-516 referentnog F protein prekursor polipeptida (Fo) SEQ ID NO:2.

4. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-3, naznačen time što F2domen uključuje RSV F protein polipeptida koji odgovara amino kiselinama 26-105 i/ili pri čemu Fidomen uključuje RSV F protein polipeptida koji odgovara amino kiselinama 137-516 referentnog F protein prekursor polipeptida (Fo) SEQ ID NO:2.

5. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-4, naznačen time stoje RSV antigen polipeptid koji uključuje SEQ ID NO:6.

6. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 -5, naznačen time što dalje uključuje signalni peptid.

7. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-6, naznačen time što domen heterologne trimerizacije uključuje domen uvijene zavojnice.

8. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa patentnim zahtevom 7, naznačen time što domen heterologne trimerizacije uključuje izoleucinski ziper.

9. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-8. naznačen time što RSV antigen uključuje: (i) brisanje najmanje jednog mesta ne-furin cepanja; (ii) brisanje jedne ili više amino kiselina pep27 domena; i (iii) najmanje jednu supstituciju ili adiciju hidrofilne amino kiseline u hidrofobnom domenu ekstracelularnog domena F proteina.

10. Imunogenična kompozicija, naznačena time što uključuje rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-9 i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijent.

11. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačen time Što nosač ili ekscipijent sadrže pufer.

12. Imunogenična kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačena time što dalje sadrži imunopotencijator.

13. Imunogenična kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 12, naznačena time što imunopotencijator uključuje najmanje jedan od: 3D-MPL, QS21. emulziju ulje-u-vodi i Alum.

14. Imunogenična kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 10-13, naznačena time što imunogenična kompozicija smanjuje ili sprečava infekciju respiratornim sincicijalnim virusom (RSV).

15. Imunogenična kompozicija u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 10-14, naznačena time što dalje uključuje najmanje jedan dodatni antigen patogenog organizma koji nije RSV.

16. Rekombinantna nukleinska kiselina, naznačena time što uključuje polinukleotidnu sekvencu koja enkodira rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-9.

17. Rekombinantna nukleinska kiselina u skladu sa patentnim zahtevom 16, naznačena time stoje polinukleotidna sekvenca koja enkodira RSV antigen kodon optimiziran za ekspresiju u selektovanoj ćeliji domaćinu.

18. Ćelija domaćin, naznačena time što uključuje nukleinsku kiselinu u skladu sa patentnim zahtevom 16 iii 17.

19. Upotreba RSV antigena u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-9, naznačena time što je za izradu medikamenta za lečenje RS V infekcije.

20. Upotreba RSV antigena u skladu sa patentnim zahtevom 19, naznačena time što se medikament primenjuje u cilju profilaktičkog lečenja RSV infekcije.

21. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 -9 ili imunogenična kompozicija u skadu sa bilo kojim od patentnih zahteva 10-15, naznačeni time što su za upotrebu u medicini.

22. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim ođ patentnih zahteva 1-9 ili imunogenična kompozicija u skadu sa bilo kojim od patentnih zahteva 10-15, naznačeni time što su za prevenciju ili tretman oboljenja povezanih sa RSV.

23. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-9, naznačen time što je rekombinantni RSV antigen stabilizovan u prefusionoj konformaciji F proteina.

24. Rekombinantni RSV antigen u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1-9 ili 23, naznačen time stoje rekombinantni RSV antigen rastvorljivi RSV F protein polipeptida stabilizovan u prefusionoj konformaciji F proteina.