RS55173B1 - Uređaj i sistem za proizvodnju aerosola sa poboljšanim protokom vazduha - Google Patents

Description

Opis pronalaska

Polje pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na derivate benzokvinona koji su efikasni kao modulatori mitohondrijske funkcije i kao takvi su korisni za tretman patoloških stanja u kojima je ometena funkcija mitohondrija.

Pozadina pronalaska

Mitohonđrije, koje se ponekad opisuju kao "ćelijske elektrane" jer proizvode najveći deo ćelijskih zaliha adenozin trifosfata (ATP), od ključnog su značaja za život eukariota. Osim u obezbeđenju ćelijske energije, mitohonđrije sutakođe uključene u ceo spektar drugih procesa, kao što je signalizacija, diferencijacija ćelija, ćelijska smrt kao i kontrola ćelijskog ciklusa i rasta ćelija. Mitohonđrije su povezane sa nekoliko bolesti kod ljudi, uključujući i mitohondrijske poremećaje i srčanu disfunkciju, a moguće je da igraju ulogu i u procesu starenja.

Zbog njihove centralne uloge u ćelijskom metabolizmu, disfunkcija mitohondrija je važan faktor u širokom spektru bolesti ljudi.

Chrvsostomou et al. (Chrvsostomou V, Trounce IA, Crovvston JG. Ophthalmic Res. 2010;44(3): 173-8) izneli su hipotezu da disfunkcija mitohondrija, nasledna ili kao posledica povrede, Čini ćelije oka (posebno ćelije retikularnih ganglija) osetljivijim na degeneraciju. Stoga bi trebalo da terapeutski pristup koji je usmeren ka mitohondrijama obezbedi generalni način zaštite ćelija retinalnih ganglija i sočiva od degeneracije, bez obzira na etiologiju bolesti.

Shodno tome, trebalo bi da su jedinjenja koja su u stanju da zaštite ili povrate funkciju mitohondrija u oku korisna kao terapeutska sredstva za tretman bolesti koje se dovode u vezu sa poremećenom funkcijom mitohondrija u oku. Takve bolesti mogu s jedne strane da budu genetski mitohondrijski poremećaji oka, npr. oftalmološke indikacije kao što je Leberova nasledna optička neuropatija (LHON), autozomalna dominantna optička atrofija (DOA) ili oftalmološke indikacije kod kojih se javlja disfunkcija mitohondrija, kao što su makularna degeneracija, glaukom, retinopatija, katarakta, druže optičkog diska (ODD). Dalje, određeni genetski mitohondrijalno-neurodegenerativni poremećaji koji ne moraju sami po sebi biti oftalmološke bolesti, kao što su MELAS (mitohondrijalna miopatija, encefalomiopatija, laktička acidoza sa simptomima nalik slogu), MERFF (mioklonična epilepsija sa iskidanim mišićnim vlaknima), MBG1E (mioneurogenična gastrointestinalna encefalomiopatija), Kerns-Sajr sindrom, deficijencija CoQ10 ili deficijencije mitohondrijalnog kompleksa (tj. kompleksa I, II, III, IV, V i CPEO) takođe mogu da pokazuju oftalmološku komponentu kao deo svojih različitih simptoma i stoga takođe spadaju među prethodno navedene bolesti koje se dovode u vezu sa poremećenom funkcijom mitohondrija.

Štaviše, poremećaji mitohondrija često pokazuju sliku neuroloških poremećaja, ali se manifestuju i kao višesistemski poremećaji, uključujući miopatiju, dijabetes, višestruku endokrinopatiju ili raznolike druge sistemske manifestacije. Ovi poremećaji mogu da budu prouzrokovani mutacijama u mitohondrijskoj DNK, mutacijama jedarnih gena koji direktno kodiraju enzime oksidativne fosforilacije i defektima jedarnih gena koji su generalno značajni za mitohondrijsku funkciju. Uticaji okoline takođe mogu da interaguju sa naslednim predispozicijama, izazivajući mitohondrijske bolesti. Na primer, postoji snažna veza između izloženosti pesticidima i kasnije pojave Parkinsonove bolesti. Brojne druge patologije koje podrazumevaju disfunkciju mitohondrija obuhvataju šizofreniju, epilepsiju bipolarnog poremećaja, šlog i autizam (Jou et al. Chang Gung Med J. 2009; 32(4):370-9), demenciju, Alchajmerovu, Parkinsonovu i Hantingtonovu bolest (Yang et al. DNA Repair (Amst). 2008; 7(7): 1110-20), kardiovaskularne bolesti (Puddu et al. J Biomed Sci. 2009; 16:112), malignitete (Singh & Kulavviec: Methods Mol Biol. 2009; 471:291-303),retinitis pigmentom,metabolički sindrom, anoreksiju, gojaznost i dijabetes melitus (Burchell et al. Expert Opin Ther Targets 2010; 14(4):369-85; Pieczenik & Neustadt Exp Mol Pathol. 2007; 83(1 ):84-92).

Mutipla skleroza je najčešća netraumatska neurološka bolest kod mladih odraslih ljudi, saprevalencijom od 1:1000 u Severnoj Evropi i Severnoj Americi (Compston A Int MS J .2003. 10:29-31). Na početku, tok bolesti obično podrazumeva epizode; pogoršanja prate periodi remisije koji se odlikuju fokalnom infiltracijom leukocita i demijelinizacijom bele mase. Bolest postepeno postaje progresivnija, pri čemu demijelinizacija sive mase i aksonalna degeneracija bele mase postaju naglašenije (Hafler DA J. Clin. Invest. 2004; 113:788-794). Dostupne terapije su uglavnom imunomodulatorske, što je delotvorno u smanjenju broja recidiva. Ove terapije, međutim, ne menjaju tok bolesti (Filippini G et al. Lancet 2003; 361:545-552), što ukazuje da postoji potreba za novim terapeutskim strategijama orijentisanim ka neurološkoj zaštiti.

Smatra se da je jedan od kritičnih defekata koji se nalazi u osnovi ovih poremećaja nemogućnost oštećenih mitohondrija da obezbede dovoljno energije kako bi omogućile normalno funkcionisanje ćelije i(li) njihova karakteristika koja se odnosi na generisanje prekomernog oksidativnog stresa. Usled ovakvog nedostatka energije i makromolekulsih oštećenja, ćelije umiru. Ovo, opet, oštećuje funkciju ćelija i izaziva patologiju bolesti. Ova veza je najočiglednija kod mitohondrijskih poremećaja koji se odlikuju patologijama u tkivima sa visokim energetskim potrebama, kao što su moždane i mišićne ćelije, u kojima je gubitak ćelija ili ometena ćelijska funkcija kod ovih tkiva blisko povezana sa fenotipom pacijenta.

Iako postoji veći broj terapeutskih pristupa za prethodno navedene indikacije, veoma mali broj njih usmeren je ka mitohonđrijskoj disfunkciji koja leži u njihovoj osnovi. Stoga još uvek postoji potreba za novim terapeutskim pristupima za tretman stanja izazvanih poremećajima mitohondrija.

WO-A-2006130775 opisuje pokušaj lečenja ili supresije mitohondrijskih bolesti modulacijom energetskih biomarkera kao Što su koncentracije mlečne kiseline, koncentracije NAD, NADP, NADH i NADPH kao i parametara citohroma C. Jedinjenja opisana u predmetnoj prijavi ispitivana su kako bi se utvrdilo mogu li da spasu humane dermalne fibroblaste izolovane iz pacijenata koji pate od FRDA od oksidativnog stresa. Međutim, ovi podaci nisu predstavljeni u predmetnoj prijavi.

EP-A-0201196 se odnosi na derivate benzokvinona koji mogu da se koriste u profilaksi i tretmanu ishemijskih bolesti kao što su cerebralna apopleksija ili alergijske bolesti, na osnovu postulata o njihovoj inhibitornoj aktivnosti prema proizvodnji i oslobađanju SRS-A.

K. Okamoto et al. razmatraju sintezu, metabolizam iin vitrobiološku aktivnost jedinjenja srodnih 6-(10-hidroksidecil)-2,3-dimetoksi-5-metil-l,4-benzokvinonu u Chem. Pharm. Buli. 36(1), 178-189 (1988/ D. Y. Duveau et al. su pripremili i ispitali analoge mitoQ i idebenona kako bi defmisali strukturne elemente koji pružaju podršku potrošnji kiseonika u mitohondrijskom respiratornom lancu u publikaciji Bioorg. Med. Chem. 18 (2010), 6429-6411.

JP-A-58077839 opisuje 6-(10-hidroksidecil)-2,3-dimetoksi-5-metil-l ,4-benzokvinon kao terapeutsko sredstvo za malignu hipertenziju i cerebrovaskularne poremećaje.

Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi novi terapeutski tretman za patološka stanja u kojima je funkcija mitohondrija poremećena.

Pronađeno je, što je predstavljalo iznenađenje, da derivati benzokvinona sa formulom (1) koja je prikazana u tekstu koji sledi obezbeđuju rešenje za cilj predmetnog pronalaska.

Kratak opis pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na derivate benzokvinona prema formuli (I)

gde suR1,R<2>,R3i R<4>definisani kao u tekstu koji sledi za upotrebu u lečenju poremećaja kod kojih je mitohondrijska funkcija ometena.

Derivati benzokvinona sa formulom (I) posebno su korisni za lečenje mitohondrijskih bolesti.

Navedene mitohondrijske bolesti su izabrane iz grupe koja se sastoji od Leberove nasledne optičke neuropatije (LHON), autozomalne dominantne optičke atrofije (DOA), makularne degradacije, glaukoma, retinopatije, katarakte i druza optičkog diska (ODD).

Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupak za tretman poremećaja u kojima je funkcija mitohondrija ometena, gde navedeni postupak podrazumeva primenu delotvorne količine jedinjenja prema formuli (I) kod pacijenta kojem je to potrebno.

U poželjnom rešenju, navedeni pacijent je sisar, još poželjnije je da bude čovek.

Kratak opis slika

Slika 1 prikazuje zaštitno dejstvo jedinjenja IA na RCG-5 ćelije kaoin vitromodel mitohondrijske disfunkcije oftalmoloških ćelija, 1 dan nakon rotenonskog izazova.

Slika 2 prikazuje poređenje jedinjenja IA i propentofilina na vijabilnost RCG ćelija kod ometanja mitohondrijske funkcije rotenonom. Iako ćelijska zaštita propentofilinom nije bila značajna (p>0,05), dejstvo jedinjenja IA bilo je veoma značajno (p=0,0005).

Slika 3 prikazuje efekte prethodnog tretmana jedinjenjem IA na oštrinu vida u mišjemin vivomodelu bolesti oka koje se odlikuju disfunkcijom mitohondrija.

Detaljan opis pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje predstavljeno sledećom formulom

i tautomere, solvate ili farmaceutski prihvatljive soli takvog jedinjenja, za upotrebu u oralnom lečenju mitohondrijske bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od Leberove nasledne optičke neuropatije (LHON), autozomalne dominantne optičke atrofije (DOA), makularne degradacije, glaukoma, retinopatije, katarakte i druza optičkog diska (ODD). U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedeno jedinjenje predstavljeno je sledećom formulom

tj. navedeno jedinjenje je idebenon.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedena mitohondrijska bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od Leberove nasledne optičke neuropatije (LHON), autozomalne dominantne optičke atrofije (DOA), makularne degeneracije i glaukoma.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedena mitohondrijska bolest je Leberova nasledna optička neuropatija (LHON).

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedena mitohondrijska bolest je autozomalna dominantna optička atrofija (DOA).

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedena mitohondrijska bolest je makularna degeneracija.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedena mitohondrijska bolest je glaukom.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedena mitohondrijska bolest je retinopatija.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedena mitohondrijska bolest je katarakta. Drugim rečima, navedena bolest je nastanak katarakte.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedena mitohondrijska bolest je druza optičkog diska

(ODD).

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak se odnosi na derivate benzokvinona prema formuli (I)

i enantiomere, tautomere, solvate ili farmaceutski prihvatljive soli takvih jedinjenja u kojima je

gde su R<5>i R<6>oba atomi vodonika, ili je R<5>vodonikov atom a R<6>etil grupa, ili su R<5>i R<6>oba metil grupe,

R<2>je metil grupa.

R<3>je metoksi grupa i

R<4>je metoksi grupa;

za upotrebu u tretmanu poremećaja u kojima je ometena funkcija mitohondrija, a posebno u tretmanu mitohondrijskih poremećaja.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedena mitohondrijska bolest je izabrana iz grupe koja se sastoji od Leberove nasledne optičke neuropatije (LHON), autozomalne dominantne optičke atrofije (DOA), makularne degeneracije, glaukoma, retinopatije, katarakte i druže optičkog diska (ODD).

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedeno jedinjenje je jedinjenje sa formulom (I) gde je R<1>supstituent predstavljen formulom (II):

gde su R<5>i R<6>oba atomi vodonika,

R2 je metil grupa,

R<3>je metoksi grupa i

R4 je metoksi grupa.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedeno jedinjenje je jedinjenje sa formulom (I) gde je R<1>supstituent predstavljen formulom (II):

gde je R<s>atom vodonika a R<6>je etil grupa, R<2>je metil grupa, R<3>je metoksi grupa i R<4>je metoksi grupa.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedeno jedinjenje jejedinjenje sa formulom (I) gde je R<1>u formuli (I) supstituent predstavljen formulom (II):

gde su R<3>i R<6>oba metil grupe,

R2 je metil grupa,

R<3>je metoksi grupa i

R4 je metoksi grupa.

U još jednom rešenju, predmetni pronalazak usmeren je ka upotrebi jedinjenja predstavljenog sledećom formulom

i tautomera, solvata ili farmaceutski prihvatljivih soli takvih jedinjenja, za proizvodnju leka za oralno lečenje mitohondrijske bolesti izabrane iz grupe koja se sastoji od Leberove nasledne optičke neuropatije (LHON), autozomalne dominantne optičke atrofije (DOA), makularne degeneracije, glaukoma, retinopatije, katarakte i druza optičkog diska (ODD). U još jednom rešenju, predmetni pronalazak usmeren je ka upotrebi jedinjenja predstavljenog sledećom opštom formulom (I)

gde su R<1>do R<4>kao što je prethodno definisano, za proizvodnju leka za tretman mitohondrijskih bolesti.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, koriste se jedinjenja sa formulom (I) u kojima R<1>predstavlja formulu (II) a R<2>do R<6>su isti kao stoje prethodno definisano. Još poželjnije je da R<1>predstavlja formulu (II) a R<s>i R<6>oba predstavljaju atome vodonika.

Prema prethodnom pronalasku, jedinjenja sa formulom (I) su za upotrebu u tretmanu mitohondrijskih poremećaja.

Jedinjenja sa formulom (I)i slična jedinjenjasu poznata jedinjenja i ranije su već opisana.

Jedinjenje sa formulom (1) u kojem R<1>predstavlja formulu (II) a R<5>i R<6>oba predstavljaju atome vodonika poznato je pod imenom Idebenon (u daljem tekstu označen kao jedinjenje IA). Ovo jedinjenje se već koristi kao nootropni lek, a opisano je i da stimuliše nervni faktor rasta, što je odlika koja bi mogla biti značajna u tretmanu Alchajmerove i drugih neurodegenerativnih bolesti. WO 2006100017 opisuje upotrebu jedinjenja IA u tretmanu mišićnih distrofija kao što su Dušenova mišićna distrofija i Bekerova mišićna distrofija. Jedinjenje IA i njegovi preparati prvi put su opisani u opisu Japanske ispitane patentne prijave br. 3134/1987 koju je podnela kompanija Takeda Chemical Industries, Ltd.

Jedinjenje sa formulom (I) u kojem R<1>predstavlja formulu (II), R<s>predstavlja vodonikov atom, a R<6>predstavl ja etil grupu (u daljem tekstu označen kao jedinjenje IB) opisano je u publikaciji JP 58077839. Predložena je njegova upotreba kao leka za tretman maligne hipertenzije i cerebrovaskularnih poremećaja.

Jedinjenje sa formulom (I) gde R<1>predstavlja formulu (II) a R^ i R<6>oba predstavljaju metil grupu (u daljem tekstu označen kao jedinjenje IC) i njegova sinteza opisani su samo u Okamoto et al., Chem. Pharm. Buli. 1988, 36, 178 i u EP-A-0201196. Autori su razmatrali različite moguće terapeutske upotrebe jedinjenja opisanog u EP-A-0201196, npr. terapiju ishemijskih bolesti kao što su cerebralna apopleksija i insuficijencija srca. Takođe su pomenuli inhibitorno dejstvo jedinjenja koje je u toj publikaciji opisano na proizvodnju i oslobađanje SRS-A kod sisara, kao i njihovu aktivnost u poboljšanju stanja kod ciruklatornih smetnji. Trebalo bi, međutim, imati u vidu da predloženi tretmani nisu podržani farmakološkim podacima. Do danas, koliko je poznato, nije poznata praktična terapeutska upotreba jedinjenja

IC.

Jedinjenje sa formulom (I) gde jeR<1>-(CH.2)io-OH grupa a svaki od R2 doR4 predstavlja metil grupu može se smatrati analogom Idebenona (u daljem tekstu označeno kao jedinjenje ID). Opšti postupak sinteze benzokvinonskih jedinjenja kao što je jedinjenje ID opisan je u EP-A-0038674. Navedena patentna prijava takođe ispituje upotrebu benzokvinonskih jedinjenja kao što je jedinjenje ID u inhibiciji proizvodnje i oslobađanja SRS-A i razmatra njihovu potencijalnu upotrebu u tretmanu alergijskih bolesti.

Jedinjenje sa formulom (I) u kome je R<1>-(CH2)io-CH3 grupa, a R<2>i R<4>oba predstavljaju hidroksi grupu dok R<3>predstavlja vodonikov atom (u daljem tekstu označeno kao jedinjenje IE) takođe je poznato pod imenom Embelin jer je prvobitno identifikovano iz biljkeEmbelia ribes,iako je danas komercijalno dostupno preko različitih dobavljača. Pokazano je da navedeno jedinjenje pokazuje anti-tumorsku, protivzapaljensku i apoptotičnu aktivnost putem nepoznatog mehanizma.

Na primer, u Molecular Carcinogenesis (2010) 49(4), 324-336 navedeno je da Embelin, mali molekularni inhibitor XIAP poseduje širok spektar bioloških aktivnosti sa snažnom inhibicijom nuklearnog faktora kapa B i nishodnih antiapoptotičnih gena, ali mehanizam kojim ono indukuje ćelijsku smrt nije poznat. Dalja ispitivanja ukazuju da Embelin može da se ponaša kao kompetitivni antioksidans u fiziološkim uslovima (Chemico-Biological Interactions

(2007), 167(2), 125-134).

Jedinjenje sa formulom (I) u kojem jeR<1>-(CH2)io-CH3 grupa,R<2>i R<4>oba predstavljaju metoksi grupu a R<3>je atom vodonika derivat je embelina (u daljem tekstu označeno kao jedinjenje IF). Postupak za sintezu jedinjenja IF je, na primer, naveden u Tetrahedron (1998), 54(49), 14791-802. Terapeutska upotreba za jedinjenje IF nije naznačena, međutim, moguće je da ovo jedinjenje pokazuje određenu aktivnost u terapiji hepatitisa C što može da se zaključi iz studije o inhibitornim dejstvima biljnih ekstrakata koji se često sreću u sudanskoj tradicionalnoj medicini na proteazu virusa hepatitisa C (Phytotherapy Research (2000), 14(7), 510-6). Pronađeno je da su dva benzokvinonska jedinjenja estrahovana izEmbelia schimperi,embelin i 5-O-metilembelin, moćni inhibitori proteaze virusa hepatitisa C.

Jedinjenja sa formulom (I) su mođulatori mitohondrijskih poremećaja, te su stoga generalno korisna u tretmanu mitohondrijskih bolesti.

Oralna biološka dostupnost jedinjenja sa formulom (I) je uopšteno posmatrano veoma niska, što se vidi iz primera za jedinjenje IA (Torii H, Yoshida K, Kobayashi T, Tsukamoto T, Tanavama S. J Pharmacobiodyn. 1985 Jun; 8(6): 457-67). Iako se lako i brzo apsorbuje u crevima kada se primeni oralno, najveći deo leka se metaboliše izrazito snažno pri prvom prolasku kroz jetru, te stoga samo mali delovi primenjene doze cirkulišu kroz krvotok.

Pokušaji da se zaobiđe taj snažan efekat prvog prolaska idebenona (jedinjenja IA) kroz jetru obuhvataju i primenu jedinjenja drugim putevima, a ne oralnim putem. Parenteralne preparate je teško dobiti, jer idebenon pokazuje samo veoma malu rastvorljivost u vodi. US2010/0130619, US2010/0129431A1, US2010/0215725A1 i US2010/0099775A1 opisuju parenteralne preparate idebenona pogodne za intravenske injekcije ili infuziju.

WO2008/019769 opisuje transmukozni preparat idebenona kojim se zaobilazi efekat prvog prolaska kroz jetru. Iako se ovaj preparat uzima oralno, telo potpuno drugačije prerađuje lek u poređenju sa oralnom primenom. Nasuprot oralnoj primeni, transmukozni (npr. sublingvinalni) preparat leka dovodi do apsorpcije preko sluzokože, što omogućava leku da dospe do cirkulacije bez da se prethodno obradi u gastrointestinalnom traktu, te se stoga zaobilazi efekat prvog prolaska kroz jetru. Podnosioci prijave navode da doza leka može značajno da se smanji u poređenju sa oralnom dozom, a da se istovremeno dostignu slične visoke koncentracije u plazmi, te tvrde da takvi preparati mogu da budu korisni u tretmanu mitohondrijskih, neuroloških i neuromuskulamih bolesti, uključujući FRDA (Fridrihovu ataksiju), LHON (Leberovu naslednu optičku neuropatiju), MELAS (mitohondrijalnu miopatiju, encefalopatiju, laktičnu acidozu sa epizodama nalik šlogu) i mitohondrijalne miopatije.

Posledica izbegavanja efekta prvog prolazaje da krvotokom cirkulišu više koncentracije leka, te konačno, da mogu da se postignu veće koncentracije leka u tkivima koja su od značaja za posmatranu bolest.

Parenteralna, npr. intravenska primena jedinjenja Često se smatra ili neprimenljivom, ili primenom koja podrazumeva značajne troškove nege kada je reč o genetskoj (te stoga i hroničnoj) bolesti, gde pacijenti žive kod kuće a ne u bolnici ali moraju da uzimaju lek tokom celog života.

Transmukozalni preparat bi mogao da podrazumeva dodatne poteškoće, u pogledu pridržavanja pacijenata propisane terapije - posebno u slučaju jedinjenja sa formulom (I) zbog njihove intenzivne boje i potencijalno neprijatnog ukusa.

Još jedan način da se zaobiđe snažan efekat prvog prolaza je da se jedinjenja sa formulom (I) primene u obliku topijskog preparata, uključujući dermalni, bukalni, sublingvalni i intraokularni preparat.

Osim efekta prvog prolaska, dalji nedostatak jedinjenja sa formulom (I), koji opet može da se ilustruje jedinjenjem IA kao predstavnikom ove klase jedinjenja je činjenica da ova jedinjenja stižu do mozga u veoma ograničenim količinama, ukoliko se primene oralno. Na primer, iz literature je poznato (Torii H, Yoshida K, Kobavashi T. Tsukamoto T. Tanavama S. J Pharmacobiođvn. 1985 jun; 8(6): 457-67) da oralna doza idebenona od 10 mg/kg (jedinjenje IA) kod pacova dvodi do koncentracija ukupnog idebenona u plazmi od približno 1000 ng/ml, mereno preko radioaktivnosti nakon oralne primene radioaktivno obeleženog jedinjenja IA. Ukupna koncentracija označava idebenon i njegove metabolite. Primenjujući faktor ispravke koji su izračunali Torii et al. kako bi se dobila koncentracija nemetabolisanog polaznog jedinjenja IA, dobija se rezultat za 3 ng/ml idebenona u plazmi. Odgovarajuće koncentracije u mozgu su 10 ng/ml ukupnog idebenona (što znači da su opet obuhvaćeni i metaboliti), što dovodi od samo 0,03 ng/ml samog početnog idebenona. Samim tim, odnos koncentracije u mozgu i plazmi je oko 1%. Ovo je u skladu sa rezultatima Nagai et al (Nagai Y, Yoshida K, Narumi S, Tanavama S, Nagaoka A. Brain distribution of idebenone and its effect on local cerebral glucose utilization in rats. Arch Gerontol Geriatr. 1989; 8(3): 257-72), gde veće oralne doze idebenona (100 mg/kg) dovode do sličnog niskog odnosa koncentracije u mozgu naspram koncentracije u plazmi od 1-2%, kod pacova.

Lekovi koji moraju da stignu do mozga da bi ispoljili svoje dejstvo moraju da prođu kroz takozvanu krvno-moždanu barijeru (KMB). Efluksne pumpe kao što su P-glikoproteini (P-gp) i proteini višestruke rezistencije na lekove (MRP) predstavljaju najvažniju prepreku za prolazak supstanci kroz BBB i štite mozak od ulaska potencijalno toksičnih supstanci.

Oko se obično smatra delom centralnog nervnog sistema. Ovo postaje očigledno kada se uzme u obzir Činjenica da, veoma slično krvno-moždanoj barijeri, krvno-retinalna barijera štiti retinu od neželjene difuzije potencijalno toksičnih jedinjenja. Zapravo, krvno-možđana barijera i krvno-retinalna barijera se zajedno nazivaju krvno-neuralna barijera (Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 mart, 46(3), 1047-53: Functional characterization and comparison of the outer blood-retina barrier and the blood brain barrier: Steuer H et al. i Kim, JH et al.).

Stoga bi, znajući koliko su male koncentracije IA koji dospe u mozak nakon primene, bilo za očekivati da jedinjenja te vrste, a posebno jedinjenja sa formulom (I) takođe neće stići ni do oka u nekoj značajnoj, odnosno terapeutski relevantnoj koncentraciji kada se primene oralno.

Stoga je bilo veoma iznenađujuće da su, nakon oralne primene klinički relevantne doze jedinjenja IA, mogle su da se detektuju koncentracije jedinjenja IA u tečnosti oka kod miša (u vodenoj i staklastoj tečnosti) koje su nekoliko puta više od onih koje su prethodno izmerene u mozgu glodara i pasa (Torii H, Yoshida K, Kobavashi T, Tsukamoto T, Tanavama S. J Pharmacobiođvn. 1985 jun; 8(6): 457-67).

U predmetnom pronalasku, predstavljeni su farmakokinetički podaci koji pokazuju značajne koncentracije jedinjenja IA u staklastoj i vodenoj tečnosti oka nakon pojedinačne oralne doze.

Stoga je po prvi put zaključeno đa bi oralni preparati jedinjenja sa formulom (I), posebno jedinjenja IA, mogli da se koriste za efikasno dejstvo protiv bolesti oka koje se dovode u vezu sa oštećenjem mitohondrija.

Bilo bi veoma poželjno kada bi jedinjenja sa formulom (I) mogla da se primene u okviru jednostavne oralne formulacije, što bi bilo savršeno sa stanovišta pridržavanja pacijenata propisane terapije, za pacijente koji su na kućnoj nezi a potreban im je tretman tokom celog života.

Otkriće iznenađujuće visokih koncentracija jedinjenja sa formulom (I) u oku, ilustrovanih primerom oralne primene idebenona (jedinjenje IA), a sada i predmetni pronalazak, daće snažne argumente za kliničare i regulatorna tela, da istraže kroz studije i konačno odobre upotrebu lekova kao što je oralni idebenon, za upotrebu kod mitohondrijskih bolesti očiju, kao što je ovde opisano.

Koncentracije jedinjenja IA u oku, dobijene nakon oralne primene, dovoljne su da u značajnoj meri povrate izgubljeni vid u životinjskom modelu (Zhang X., Jones D., Gonzalez-Lima F. Mouse model of optic neuropathv caused by mitochondrial complex I dysfunction. Neurosci. Lett., 2002.) Što je relevantno za bolesti u čijoj osnovi se nalaze poremećaji mitohondrija u retini.

S jedne strane, ove bolesti su oftalmološke mitohondrijske bolesti kao Što su Leberova nasledna optička neuropatija (LHON), autozomalna dominantna optička atrofija (DOA) i oftalmološki poremećaji kod kojih se javlja disfunkcija mitohondrija, kao što su makularna degeneracija, glaukom, retinopatija, katarakta, druže optičkog diska (ODD).

S druge strane, ovakve bolesti su genetske mitohondrijalno-neurodegenerativne bolesti sa oftalmološkom komponentom među različitim simptomima, kao što su MELAS (mitohondrijalna miopatija, encefalomiopatija, laktička acidoza sa simptomima nalik šlogu), MERFF (mioklonična epilepsija sa iskidanim mišićnim vlaknima), MBGIE (mioneurogenična gastrointestinalna encefalomiopatija), Kerns-Sajr sindrom, deficijencija CoQ10 ili deficijencije mitohonđrijalnog kompleksa (tj. kompleksa I, II, III, IV, V i CPEO).

Kada se navode u predmetnoj prijavi, sledeće bolesti označene su kao "mitohondrijske bolesti": Leberova nasledna optička neuropatija (LHON), autozomalna dominantna optička atrofija (DOA), makularna degeneracija, glaukom, retinopatija, katarakta, druže optičkog diska (ODD), mitohondrijalna miopatija, encefalomiopatija, laktička acidoza, simptomi nalik šlogu (MELAS), mioklonična epilepsija sa iskidanim mišićnim vlaknima (MERRF), mioneurogenična gastrointestinalna encefalomiopatija (MNGIE), Kerns-Sajr sindrom, deficijencija CoQ10 i deficijencije mitohonđrijalnog kompleksa (tj. kompleksa 1-5 i CPEO).

Za idebenon (jedinjenje IA) je poznato da je simulator nervnog faktora rasta (NGF)

(Takeuchi, R., Murase, K., Furukawa Y., Furukawa, S., Hayashi, K. Stimulation of nerve growth factor synthesis/secretion by 1,4-benzoquinone and its đerivatives in cultured mouse astroglial cells. FEBS Lett. 1990, 261, 63-66).

Propentofilin je jedinjenje iz potpuno različite klase jedinjenja a takođe je opisan kao stimulator NGF-a (Shinoda et al, Stimulation of nerve grovvth factor synthesis/secretion by propentophylline in cultured mouse astroglial cells, Biochem. Pharmacol., tom 39, 1990,1813-1816). U publikaciji VVO2000/032197 objavljeni su podaci koji pokazuju pozitivna dejstva propentofilina u testu preživljavanja ćelija retinalnih ganglija (RCG). Isključivo iz podataka dobijenih iz propentofilina, podnosioci prijave zaključuju da i druga jedinjenja koja su takođe poznata kao stimulatori NGF-a - iako potiču iz potpuno različite klasa hemijskih jedinjenja - imaju slično blagotvorno dejstvo na preživljavanje RGC. Shodno tome, podnosioci prijave tvrde da su idebenon i neka druga jedinjenja iz različitih klasa hemijskih jedinjenja korisna u lečenju neuropatije retine ili neuropatije glave poreklom od optičkog nerva.

Štaviše, podnosioci prijave tvrde da njihova jedinjenja mogu da se koriste oralno. Ovo je u skladu sa mehanizmom dejstva koji - ukoliko zaista uspostavlja racionalnu vezu između ovih jedinjenja i lečenja bolesti - ne zahteva da samo jedinjenje dostigne određenu koncentraciju u oku, već negde drugde u telu, kako bi se stimulisala proizvodnja NGF koji potom stiže u relevantna tkiva, npr. oko.

Kada je reč o patološkim mitohondrijskim oftalmološkim stanjima, relevantnost testa preživljavanja RCG koji je korišćen u WO2000/032197 kako bi se pokazali pozitivni efekti propentofilina pod velikim je znakom pitanja jer uslovi koji se koriste, tj. pad koncentracije u serumu koji dovodi do smrti RCG ne odslikavaju uslove koji vladaju u posmatranim bolestima.

Predmetna prijava objavljuje podatke koji pokazuju da propentofilin nema dejstvo na preživljavanje RCG kada se koristi u testu koji je zasnovan na smrti RCG usled inhibicije kompleksa I rotenonom, što su uslovi koji dobro odslikavaju patologiju mnogih mitohondrijskih poremećaja koji su prethodno opisani (revizija u Wong-Riley M., Energy Metabolism of the Visual System, Eye and Brain, 2010, 2 99-116).

Zaključujući iz ovih negativnih efekata propentofilina i prateći argumentaciju iznesenu u WO2000/032197, zaključilo bi se da se očekuje da idebenon (jedinjenje IA) takođe ne pokazuje nikakav efekat u ovom testu preživljavanja RCG relevantnom za ove bolesti, tj. zasnovanom na inhibiciji kompleksa I. Umesto toga, bilo je potpuno neočekivano otkriti da idebenon - potpuno suprotno propentofilinu - pokazuje dobru zaštitu RCG od smrti pod uslovima koji odslikavaju patološku situaciju disfunkcije mitohondrija, što dalje govori u prilog predmetnom pronalasku.

Autozomalna dominantna optička atrofija (DOA) može da se smatra mitohondrijskom bolešću. Patogene mutacije OPA1 dovode do autozomalne dominantne optičke atrofije, stanja koje se odlikuje preferencijalnim gubitkom ćelija retinalnih ganglija i progresivnom degeneracijom optičkog nerva. Približno 20% pacijenata koji su pogođeni ovom bolešću razvija i ozbiljnije neuromišićne komplikacije. Što je važna podgrupa u okviru ove bolesti označena kao DOA(+). Pokazano je da OPA1 kontroliše i fuziju mitohondrija i morfologiju krista. Uz to, studije gubitka funkcije OPA1 su pokazale da OPA1 reguliše i indukciju apoptoze (Liesa M et al. Phvsiol Rev. 2009; 89:799-845). Iako se eksprimira u svim tkivima koja su testirana, OPA1 pokazuje veoma specifičan obrazac tkivne ekspresije, pri čemu je najveća ekspresija u retini, mozgu, testisima, jetri, srcu, skeletnim mišićima i pankreasu. Gubitak OPA1 dovodi do značajnog smanjenja potencijala mitohondrijske membrane i smanjenja bazaine respiracije, kao i do nemogućnosti pojačavanja potrošnje kiseonika u prisustvu sredstva za dekuplovanje 2,4-dinitrofenola. Humani fibroblasti izolovani iz pacijenata sa određenim mutacijama OPA1 (koje dovode do autozomalne dominantne optičke atrofije ili ADOA), uz smanjenje stope fuzije mitohondrija, takođe pokazuju smetnje u sintezi ATP pod uticajem supstrata kompleksa I. Zbog svoje sposobnosti da pojačaju sintezu ATP-a, jedinjenja sa formulom (I) korisna su u tretmanu

DOA.

Mitohondrijske bolesti takođe obuhvataju različite poremećaje humanog optičkog sistema kao što su makularna degeneracija, glaukom, retinopatija, katarakta, druže optičkog diska (ODD).

Iako se neke makularne distrofije koje pogađaju mlađe osobe ponekad opisuju kao makularna degeneracija, ovaj izraz se generalno odnosi na starosnu makularnu degeneraciju (AMD), koja je jedan od glavnih uzroka slabljenja vida kod starijih osoba (>50 godina). I za naslednu (VD) i za stečenu formu makularne degeneracije, glavni faktori rizika za razvoj poremećaja su starost, pušenje, hipertenzija i dijabetes. AMD, kao i LHON, je medicinsko stanje koje dovodi do gubitka vida u centru vidnog polja (makuli) usled oštećenja retine. Iako su promene strukture i funkcije mitohondrija, kao što su gubitak nabora (krista) i gustine matriksa normalna odlika starenja, ove promene su značajno veće kod AMD nego kod normalnog starenja, a dešavaju se ranije, u smislu starosti pacijenta (Feher J, Kovacs I, Artico M, Cavallotti C, Papale A, Balacco Gabrieli C. Neurobiol Aging. 2006 juli; 27(7): 983-937), što ukazuje daje stepen promena mitohondrija različit kod AMD i normalnog starenja te da bi vreme oštećenja retinalnih ćelija moglo da bude od kritičnog značaja za razvoj AMD. Dalje, pacijenti koji pate od AMD pokazuju selektivno veći broj mutacija mtDNK u retini u poređenju sa krvnim ćelijama, a prijavljene su i promene mitohondrijskog proteoma u vezi sa AMD. U skladu sa učešćem mitohondrija u patologiji AMD, SanGiovanni et al. (2009) su opisali višestruke polimorfizme (SNP) u mtDNK koji su dovedeni u vezu sa AMD, pomoću grupe od 215 pacijenata sa uznapredovalom AMD. Ove veze su u potpunosti zavisile od T2 halogrupe a odlikuju se dvema varijantama u genima za kompleks I (Al 1812G u MT-ND4 i A14233G u MT-ND6), što podseća na mutacije kompleksa 1 koje dovode do LHON. Kao rezultat, pokušano je lečenje pacijenata koji pate od AMD jedinjenjima koja utiču na mitohondrijsku funkciju (mitotropnu) (Feher J, Papale A, Mannino G, Gualdi L, Balacco Gabrieli C. Ophthalmologica. 2003 septembar-oktobar; 217(5): 351-7), iako su efekti do sad samo marginalni.

Glaukom (optička neuropatija) je bolest kod koje je oštećen optički nerv, što dovodi do progresivnog, ireverzibilnog gubitka vida koji je često, ali ne uvek, povezan sa povećanim pritiskom očne tečnosti. Neurološka oštećenja pogađaju ćelije retinalnih gangliona sa karakterističnim obrascem. Postoji mnogo podtipova glaukoma, ali svi se mogu smatrati vrstom optičke neuropatije. Povećani intraokularni pritisak značajan je faktor rizika za razvoj glaukoma. Netretirani glaukom dovodi do trajnog oštećenja optičkog nerva i posledičnog gubitka vidnog polja koji može da napreduje do slepila. Učešće mitohondrija u patologiji glaukoma podržano je radovima koje je objavio Guo (Guo Y, Johnson EC. Cepurna WO, Dyck J, Doser T, Morrison JC. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2010 4. novembar (elektronska publikacija pre štampe)), koji je pokazao selektivno smanjenje ekspresije mitohondrijskih gena i gena koji su u vezi sa proizvodnjom energije kod modela glaukoma kod pacova. Dalje, slično kao kod rezultata opisanih za makularnu degeneracij u, i kod pacijenata koji pate od glaukoma pronađena je veća prevalencija izmena u mtDNK. Konačno, preterana ekspresija mitohondrijskog proteina OPA1, koji je kod DOA mutiran, pokazuje zaštitno dejstvo u mišjem modelu glaukoma (Ju WK, Kim KY, Duong-Polk KX, Lindsey JD, Ellisman MH, Weinreb RN. Increased optic atrophy type 1 expression protects retinal ganglion cells in a mouse model of glaucoma. Mol Vis. 2010, 15. juli; 16:1331-42), što jasno pokazuje uzročno-posledičnu vezu disfunkcije mitohondrija kod stečenih patologija oka, kao Što je glaukom. Disfunkcija mitohondrija može da potiče od jedarnih ili mitohondrijskih gena, mehaničkog stresa, nedovoljne cirkulacije, hronične hipoperfuzije koja je posledica uobičajeno povišenog intraokularnog pritiska kod glaukoma, ili toksičnih ksenobiotika).

Retinopatija je opšti pojam koji se odnosi na neke oblike nezapaljenskog oštećenja retine oka. Osim genetskih ili naslednih oblika retinopatije, spontani oblici mogu da nastanu pod dejstvom lekova, toksina i radijacije (jonizujućim i ultraljubičastim zračenjem). Retinopatije su često okularne manifestacije sistemskih bolesti kao što su dijabetes, hipertenzija, srpasta anemija ili ciliopatije kao što je Barde-Bidlov sindrom. Slično kao kod makularne degeneracije i glaukoma, učešće mitohondrija kod retinopatija podrobno je opisano (revizija u Jarrett SG, Levvin AS, Boulton ME. Ophthalmic Res. 2010;44(3): 179-90. Lee S, Van Bergen NJ, Kong GY, Chrvsostomou V, Waugh HS. O'Neill EC, Crovvston JG, Trounce I A. Exp Eye Res. 2010, 4. avgust (elektronska publikacija pre štampe).

Katarakta je zamućenje koje se razvija u kristalnom sočivu oka ili u njegovom omotaču, a varira od neznatne, do potpune zamućenosti i sprečavanja prolaska svetlosti. Postepeno žutenje i zamućenje sočiva može da smanji percepciju plavih boja, Katarakte obično napreduju polako, dovodeći do gubitka vida, i potencijalno mogu da dovedu do slepila ako se ne leče. Ovo stanje obično pogađa oba oka, ali slično kao kod patologija LHON i VD, jedno oko je skoro uvek pogođeno ranije od drugog. Kao i kod prethodno opisanih patologija, učešće mitohondrija u nastanku katarakte jasno je opisano. Dalje, nastanak katarakte je u direktnoj vezi sa nekim mitohondrijskim poremećajima kao što su dominantna optička atrofija sa kataraktom, autozomalna dominantna progresivna eksterna oftalmoplegija (PEOA3), PEOA2, mitohondrijska miopatija izazvana mutacijama COX II ili različitih drugih gena, Sengersov sindrom, kao i mutacije mitohondrijskih gena tRNA-Ser (MTTS2), GFER, OPA3 ali i velikih mitohondrijskih delecija.

Druže optičkog nerva (ODD) ili druže glave optičkog nerva (ONHD) su globule mukoproteina i mukopolisaharida koje se progresivno kalcifikuju unutar optičkog diska. Smatra se da su zaostatak aksonalnog transportnog sistema degenerisanih ćelija retinalnih gangliona. ODD se takođe nazivaju i urođeno izdignutim ili anomaličnim diskovima, pseudopapiledemima, pseudoneuritisom, potopljenim đruzama diska i hijalinskim teiima diska. Dovode se u vezu sa različitim stepenima gubitka vida i povremeno dovode do slepila. Oštećenje mitohondrija usled preopterećenosti Ca<2+>jonima predloženo je kao faktor u procesu nastanka druza (Tso MO. Ophthalmology. 1981 oktobar; 88(10): 1066-80). Dalje, u slučaju starosne makulopatije, takođe je pronađeno da je veći rizik od mekih druza u vezi sa mitohondrijskim halotipom J, dok je halotip H doveden u vezi sa značajno nižim rizikom (Jones MM, Manvvaring N, VVang JJ, Rochtchina E, Mitchell P, Sue CM. Arch Ophthalmol. 2007 septembar; 125(9): 123 5-40).

Stoga su Chrvsostomou et al. (Chrysostomou V. Trounce IA, Crowston JG. Ophthalmic Res. 2010;44(3): 173-8) izneli hipotezu da disfunkcija mitohondrija, nasledna ili kao posledica povrede, čini ćelije oka (posebno ćelije retikularnih ganglija) osetljivijim na degeneraciju. Stoga bi trebalo da terapeutski pristup koji je usmeren ka mitohondrijama obezbedi generalni način zaštite ćelija retinalnih ganglija i sočiva od degeneracije, bez obzira na etiologiju bolesti.

Jedinjenja sa formulom (I) takođebi moglada budu korisna za lečenje psihijatrijskih poremećaja, metaboličkih poremećaja, raka, multiple skleroze, primarne progresivne multiple skleroze ili disfunkcije imunog sistema, kao što će biti detaljno navedeno u tekstu koji sledi.

Kod dijabetesa tipa II, ustanovljena je jasna veza između preterane proizvodnje kiseoniČnih radikala, disfunkcije mitohondrija i napredovanja bolesti [pregled: Friederich M, Hansell P, Palm F Curr Diabetes Rev. 2009 maj; 5(2): 120-44], dok se, u širem smislu, većina patologija kod metaboličkog sindroma, kao što je otkazivanje srca, može takođe pripisati poremećaju regulacije mitohondrija [pregled: Bugger H, Abel ED. Clin Sci (Lond). 2008 februar; 114(3): 195-210].

Pod uslovima u kojima je smanjena ćelijska proizvodnja energije, kao što je slučaj kod starosnog opadanja mitohondrijske funkcije [Boumezbeur F, Mason GF, de Graaf RA, Behar KL, Cline GW, Shulman GI, Rothman DL, Petersen KF J Cereb Blood Flow Metab. 2009, 30. septembar] ili tokom napornih aktivnosti, korisno je povećati proizvodnju ATP-a kako bi se sprečio predviđeni gubitak ćelija ili toksičnost usled nedostatka energije. Nasuprot tome, pod specijalnim uslovima, kao što je gojaznost, takođe može biti korisno da se kapacitet mitohondrija za proizvodnju ATP-a ograniči, kako bi se potpomogli terapeutski napori za smanjenje telesne težine.

Pronađeno je, što je predstavljalo iznenađenje, da jedinjenja sa formulom (I) imaju dejstvo na povećanje telesne mase, za koje je moguće da potiče od dejstva na proizvodnju ATP-a, koja bi mogla da se demonstrirain vitro.Stoga postoje snažne indikacije da jedinjenja sa formulom (I) pokazuju korisno dejstvo u tretmanu dijabetesa tipa II, gojaznosti i metaboličkog sindroma.

Iako je predložena upotreba modulatora funkcije mitohondrija kao sredstava protiv kancera, uglavnom putem njihove funkcije u indukciji apoptoze, nedavni podaci takođe direktno dovode u vezu metastatiČki potencijal tumora i mitohondrijske DNK i proizvodnje radikala u mitohondrijama [pregled: Ishikavva K, Koshikavva N, Takenaga K, Nakada K, Havashi J Mitochondrion. 2008;8(4): 339-44]. Samim tim, modulacija mitohondrija u tom kontekstu ne samo da bi mogla da se koristi kao strategija za borbu protiv kancera, već i za prevenciju metastaza kod maligniteta, što čini jedinjenja sa formulom (I) korisnim u terapiji kancera.

Izmenjeni mitohondrijski metabolizam takođe je doveden u vezu sa višestrukom disfunkcijom imunog sistema. Kod pacijenata sa sistemskim juvenilnim idiopatskim artritisom, na primer, uočena je smanjena ekspresija mitohondrijskih gena respiratornog lanca [Ishikawa S, Mima T, Aoki C, Yoshio-Hoshino N, Adachi Y, Imagavva T, Mori M, Tomiita M. Iwata N, Murata T, Miyoshi M, Takei S, Aihara Y, Yokota S, Matsubara K, Nishimoto N Ann Rheum Dis. 2009;68(2):264-72]. Objavljeno je da su oksidativni stres i mitohondrijska patologija povezani sa sepsom [Victor VM, Espulgues JV, Hernandez- Mijares A. Rocha M Infect Disord Drug Targets. 2009;9(4): 376-89]. Dalje, ciljanje mitohondrijske funkcije predloženo je kao strategija za tretman nekoliko autoimunih poremećaja, kao Što su artritis i psorijaza [JJ. Bednarski, R.E. Warner, T. Rao, F. Leonetti, R. Yung, B. C. Richardson, K. J. Johnson, J. A. Ellman, A. W. Opipari Jr., & G. D. Glick Arthritis & Rheumatism, 2003; 48, 757] i moglo bi da se primeni u cilju modulacije višestrukih imunoloških ciljeva, kao što je infekcija mikroorganizmima [pregled: Arnoult D, Carneiro L, Tattoli I, Girardin SE Semin Immunol. 2009; 21 (4): 223-32] i alergija [Chodaczek G, Bacsi A, Dharajiya N, Sur S. Hazra TK, Boldogh I. Mol Immunol. 2009; 46(13): 2505-14]. Stoga su jedinjenja sa formulom (I) takođe korisna u tretmanu artritisa, psorijaze, sepse, alergije i infekcija mikroorganizmima.

Kada je reč o tretmanu multiple skleroze (MS), prva veza između mitohondrija i multiple skleroze ustanovljena je zahvaljujući pronalasku bolesti nalik na MS u podgrupi pacijenata koji pate od Leberove nasledne optičke neuropatije (LHON), bolesti koju izazivaju mutacije u mitohondrijskoj (mt)DNK (Olsen NK, et al. Acta Neurol. Scand. 1995; 91: 326-329). Slično nalazima koji se javljaju kod pacijenata koji pate od mitohondrijske bolesti, povišene koncentracije metabolita iz vanmitohondrijskog metabolizma glukoze nađene su u cerebrospinalnoj tečnosti (CST) pacijenata koji pate od MS i dovedene u vezu sa napretkom bolesti (Regenold WT et al. J. Neurol. Sci. 2008; 275:106-112). Kako se vanmitohondrijski metabolizam glukoze pojačava sa poremećajima mitohondrijskog metabolizma glukoze (Seyama K et al. Acta Neurol. Scand. 1989; 80: 561-568), to ukazuje na disfunkciju mitohondrija kod napredovanja bolesti MS. Štaviše, pronađeno je da mitohonđrije u ćelijskim telima neurona u ne-demijelinizovanoj sivoj masi kod MS pokazuju smanjenu aktivnost kompleksa I i III, te bi, kako neuroni delimično obezbeđuju mitohonđrije za svoje aksone, ovo moglo dalje da ometa funkciju mitohondrija u hronično demijelinizovanim aksonima (Dutta, R. et al. Ann. Neurol. 2006; 59:478-489). Stoga su jedinjenja sa formulom (I) korisna u lečenju multiple skleroze.

Velika većina pacijenata kod kojih je upravo dijagnostifikovana MS razvijaju relapsno-remitentni oblik bolesti (RRMS) u kojem su periodi neurološkog pogoršanja praćeni periodima spontane remisije, bar na početku bolesti. Oko 10-15% pacijenata razvije primarnu progresivnu MS (PP-MS) koja se odlikuje progresivnom akumulacijom neurološkog invaliditeta od same pojave bolesti, bez ikakvih dodatnih pogoršanja (tj. recidiva) ili poboljšanja (remisija).

Ono što je važno je da se pacijenti koji pate od primarne progresivne MS (PP-MS) razlikuju od pacijenata koji pate od RR-MS po nekoliko veoma važnih odlika: obično su stariji u trenutku pojave bolesti (srednja vrednost 40 naspram 30 godina); muškarci i žene su obično podjednako pogođeni; klinički je velika prevatencija kortiko-spinalne disfunkcije koja se odlikuje progresivnom slabošću i spazmima; kod pacijenata je učešće kičmene moždine naglašenije a generalno imaju manji broj jasno vidljivih lezija u beloj masi (tzv. plaka) u mozgu i manje dokaza o zapaljenskoj aktivnosti u mozgu; i, što je najvažnije, pacijenti koji pate od MM-MS ne reaguju na imunomodulatorske terapije sa dokazanom efikasnošću prema RR-MS. I nove metode vizuelizacije (snimanja) i patološki podaci ukazuju daje kod PP-MS patologija CNS-a difuznija i da se, do određene mere, odvija nezavisno od fokalnih lezija.

Trenutno ne postoji tretman sa dokazanom terapeutskom efikasnošću za PP-MS. Pronađeno je, što je predstavljalo iznenađenje, da jedinjenja sa formulom (I), koja su delotvorna kao modulatori mitohondrijskih bolesti, mogu da ublaže simptome PP-MS.

D obijanje

Kao što je već rečeno na drugim mestima u predmetnoj prijavi, postupci dobijanja jedinjenja sa formulom (I) opisani su u patentnoj literaturi, kao i u naučnoj literaturi.

Kada je reč o dobijanju jedinjenja ID, opšti postupak opisan u EP-A-0038674 za dobijanje odgovarajuće karboksilne kiseline (COOH umesto CH2OH) ne može da se koristi za dobijanje jedinjenja ID jer bi redukcija karboksilne funkcionalne grupe dovela do istovremene redukcije kvinonskog sistema. Analog koji ima heksametilenski lanac umesto dekametilena opisan je u US4139545 (Takeda). koji je citiran u dokumentu EP-A-0038674. Međutim, ispostavilo se da ovaj sintetski put daje nezadovoljavajuće rezultate u pogledu obrade reakcionih smeša i prinosa. Pronađeno je da jedinjenje ID može da se dobije sledećim novim postupkom pripreme (Šema 1).

Kao što se može videti iz šeme 1, 2,3,5-trimetilfenol stupa u reakciju sa metil sebacoil hloridom u prisustvu katalizatora kao što je aluminijum hlorid u rastvaraču kao što je 1,1,2,2-tetrahloretan (korak 1) nakon Čega sledi redukcija redukcionim sredstvom kao stoje amalgam cinka u rastvaraču kao što je toluen (korak 2). Dobijeni estar se redukuje reagensom poput litijum aluminijum hidrida u rastvaraču kao što je tetrahidrofuran (korak 3). Reakcija sa kalijum nitrozodisulfonatom u prisustvu baze kao što je kalijum hidroksid daje konačno jedinjenje ID (korak 4).

Soli

Izraz "farmaceutski prihvatljive soli" se odnosi na soli dobijene iz farmaceutski prihvatljivih netoksičnih baza ili kiselina, uključujući neorganske ili organske baze i neorganske ili organske kiseline. Soli dobijene iz neorganskih baza uključuju aluminijumove, amonijumove, kalcijumove, bakarne, gvožđe (III), gvožđe (II), litijumove, magnezijumove, mangan (II), mangan (III), kalijumove, natrijumove, cinkove soli i slične. Posebno su poželjne soli amonijuma, kalcijuma, litijuma, magnezijuma, kalijima i natrijuma. Soli dobijene iz farmaceutski prihvatljivih netoksičnih baza obuhvataju soli primarnih, sekundarnih i tercijarnih amina, supstituisane amine uključujući supstituisane amine koji se javljaju u prirodi, ciklične amine i bazne jonoizmenjivačke soli, kao što su arginin, betain, kofein, holin, N,N'-dibenziletilendiamin, dietilamin, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilamino-etanol, etanolamin, etilendiamin, N-etilmorfolin, N-etilipiperidin, glukamin, glukozamin, histidin, hidrabamin, izopropilamin, lizin, metilglukamin, morfolin, piperazin, piperidin, poliaminske soli, prokain, purine, teobromin. trietilamin, trimetilamin, tripropilamin, trometamin i slične.

Kada je jedinjenje prema predmetnom pronalasku bazno, soli mogu da se dobiju iz farmaceutski prihvatljivih netoksičnih kiselina, uključujući neorganske i organske kiseline. Takve kiseline obuhvataju sirćetnu, benzensulfonsku, benzoevu, kamforsulfonsku, limunsku, etansulfonsku, mravlju, fumarnu, glukonsku, glutaminsku, bromovodoničnu, hlorovodoničnu, izetionsku, mlečnu, maleinsku, jabučnu, bademovu, metansulfonsku, malonsku, micinsku, azotnu, pamoinsku, pantotensku, fosfornu, propionsku, ćilibarnu, sumpornu, tartarsku, p-toluensulfonsku, trifluor sirćetatni acetat sirćetne kiseline i slične. Posebno su poželjni limunska, fumarna, bromovodonična, hlorovodonična, maleinska, fosforna, sumporna i tartarska kiselina.

Podrazumeva se da su, kada se koriste u predmetnoj prijavi, reference na jedinjenja sa formulom (I) namenjene da takođe obuhvataju farmaceutski prihvatljive soli.

Primena

Poželjno je da jedinjenja sa formulom (I) budu formulisana u neki dozni oblik pre primene. Shodno tome, predmetni pronalazak takođe obuhvata farmaceutski preparat koji sadrži jedinjenje sa formulom (I) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so ili sol vat i pogodan farmaceutski nosilac.

Nosilac(oci) mora(ju) da bude(u) "prihvatljivi" u smislu da su kompatibilni sa ostalim sastojcima preparata i da nisu štetni za pacijenta koji će preparat uzimati. Pravilno formulisanje zavisi od odabranog puta primene. Mogu da se koriste bilo koji od dobro poznatih tehnika, nosioca i ekscipijenasa, kao stoje u struci poznato; npr. Remington's Pharmaceutical Sciences. Farmaceutski preparati prema predmetnom pronalasku mogu da budu proizvedeni na način koji je sam po sebi poznat, npr. uobičajenim mešanjem, rastvaranjem, granulisanjem, izradom dražeja, sprašivanjem, emulgovanjem, enkapsulacijom, zarobljivanjem ili kompresijom.

Može da se koristi bilo koji pogodan put primene kako bi se kod sisara, posebno čoveka, primenila delotvorna doza jedinjenja sa formulom (I).

Pogodni putevi primene podrazumevaju oralni, parenteralni (uključujući potkožni. intradermalni, intramuskularni, intravenski, intraartikularni i intramedularni), intraperitoenalni, transmukozalni, transdermalni, rektalni i topijski (uključujući dermalni, bukalni, sublingvinalni i intraokularni) put primene, iako najpogodniji put može da zavisi od, na primer, stanja i poremećaja kod pacijenta.

U poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedeni put primene je oralni. U još jednom poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedeni put primene je okularni. U još jednom poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedeni put primene je intraokularna injekcija. U još jednom poželjnom rešenju, u kombinaciji sa bilo kojim od prethodno opisanih rešenja i rešenja koja će kasnije biti opisana, navedeni put primene je intraokularni implant sa depoom.

Preparati i dozni opsezi

Preparati mogu, što ih Čini jednostavnim za primenu, da budu obezbeđeni u jediničnim doznim oblicima i mogu da se dobiju bilo kojim postupkom koji je dobro poznat u farmaceutskoj struci. Svi postupci obuhvataju korak dovođenja u dodir jedinjenja prema predmetnom pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli ili solvata ("aktivnog sastojka") sa nosiocem koji čine jedan ili veći broj pomoćnih sastojaka. Uopšteno posmatrano, preparati se dobijaju uniformnim i bliskim mešanjem aktivnog sastojka sa tečnim nosiocem ili fino sprašenim čvrstim nosiocima, ili sa oba, a potom, ukoliko je potrebno, oblikovanjem proizvoda u željeni preparat.

Preparati prema predmetnom pronalasku pogodni za oralnu primenu mogu da budu obezbeđeni kao diskretne jedinice kao što su kapsule, kasete ili tablete, gde svaka sadrži prethodno određenu količinu aktivnog sastojka. Aktivni sastojak može dalje da bude obezbeđen u obliku praška ili granula; kao rastvor ili suspenzija u vodenoj tečnosti ili nevodenoj tečnosti; ili kao tečna emulzija ulje-u-vodi ili tečna emulzija voda-u-ulju. Aktivni sastojak takođe može da bude u obliku bolusa, leka pomešanog sa medom ili paste.

Farmaceutski preparat koji može da se koristi oralno obuhvata tablete, dvodelne kapsule od želatina kao i meke, zalivene kapsule od želatina i plastifikatora, kao što su glicerol ili sorbitol. Tablete mogu da se dobiju sabijanjem ili izlivanjem u kalup, opciono sa jednim ili većim brojem dopunskih sredstava. Komprimovane tablete mogu da se dobiju sabijanjem aktivnog sastojka u pogodnoj mašini u slobodno-tekućem obliku kao što su praškovi ili granule, koji se opciono mešaju sa vezivnim sredstvima, inertnim razblaživačima ili lubrikansima, površinski aktivnim sredstvima ili sredstvima za dispergovanje. Tablete iz kalupa mogu da se dobiju izlivanjem iz kalupa u odgovarajućoj mašini, iz smeše sprašenog jedinjenja nakvašenog inertnim tečnim razblaživaćem. Tablete mogu opciono da budu obložene ili iscrtane, a mogu da budu formulisane tako da obezbeđuju sporo ili kontrolisano oslobađanje aktivnog sastojka u njima.

Sve formulacije za oralnu primenu bi trebalo da budu u doznim oblicima pogodnim za takvu primenu. Dvodelne kapsule koje se zatvaraju mogu da sadrže aktivne sastojke u smeši sa puniocem kao što je laktoza, vezivnim sredstvima kao što su škrobovi i(li) lubrikansima kao što su talk ili magnezijum stearat i, opciono, stabilizatorima. Kod mekih kapsula, aktivna jedinjenja mogu da budu rastvorena ili suspendovana u pogodnim tečnostima, kao što su masna ulja, tečni parafin ili tečni polietilen glikoli. Takođe mogu da se dodaju stabilizatori. Jezgra dražeja se oblažu odgovarajućim oblogama. U te svrhe, mogu da se koriste koncentrovani rastvori šećera, koji mogu opciono da sadrže gumu arabiku, talk, polivinil pirolidon, karbopol gel, polietilen glikol i(li) titanijum dioksid, rastvore lakova i pogodne organske rastvarače ili smeše rastvarača. U tablete ili jezgra dražeja mogu da se dodaju boje ili pigmenti u svrhu identifikacije, ili da bi se označile različite kombinacije doza aktivnih jedinjenja.

Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu da budu formulisana za parenteralnu primenu injekcijom, npr. kao intraokularne, intravenske, potkožne, intramuskularne ili intraarterijalne injekcije. Navedene injekcije mogu da se primenjuju kao bolus injekcije ili kao kontinualna infuzija. Preparati za injekcije mogu da budu obezbeđeni u jediničnim doznim oblicima, npr. ampulama, ili u pakovanjima sa više doza, sa dodatim konzervansom. Preparati mogu da budu u oblicima kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljanim ili vodenim nosiocima i mogu da sadrže sredstva za formulisanje kao što su sredstva za suspenziju, stabilizaciju i(li) disperziju. Preparati mogu da budu obezbeđeni u ambalaži sa pojedinačnom dozom ili više doza, na primer, zaptivenim ampulama i bočicama, i mogu da se čuvaju u praškastom ili liofilizovanom obliku, koji zahtevaju samo dodatak sterilnog tečnog nosioca, na primer, sterilnog fiziološkog rastvora ili sterilne vode bez pirogena, neposredno pre upotrebe. Rastvori i suspenzije za injekcije koji se pripremaju neposredno pred upotrebu mogu da se pripreme iz sterilnih praškova, granula i tableta kakve su prethodno opisane.

Formulacije za parenteralnu primenu obuhvataju vodene i nevodene (uljane) sterilne rastvore aktivnih jedinjenja za injekcije, koji mogu da sadrže antioksidanse, pufere, bakteriostatska sredstva i rastvorljiva sredstva koja čine formulaciju izotoničnom sa krvlju pacijenta kojem su namenjene; kao i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da pođrazumevaju sredstva za suspendovanje i zgušnjavanje. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosioci obuhvataju masna ulja kao što su susamovo ulje ili sintetski estri masnih kiselina, kao što su etil oleat ili trigliceriđi, ili lipozome. Vodene suspenzije za injekcije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskoznost suspenzije, kao što su natrijum karboksimetil celuloza, sorbitol ili dekstran. Opciono, navedena suspenzija takođe može da sadrži pogodne stabilizatore ili sredstva koja povećavaju rastvorljivost jedinjenja, kako bi se omogućila priprema visoko koncentrovanih rastvora.

Uz preparate koji su prethodno opisani, navedena jedinjenja takođe mogu da se formulišu kao depo preparati. Takve formulacije sa dugotrajnim dejstvom mogu da se primenjuju implantacijom (na primer, intraokularno ili potkožno ili intramuskularno) ili intramuskularnom injekcijom. Tako, na primer, jedinjenja mogu da budu formulisana sa odgovarajućim polimernim ili hidrofobnim materijalima (na primer, kao emulzije u prihvatljivim uljima) ili jonoizmenjivačkim smolama, ili sa derivatima koji su slabo rastvorni, na primer, slabo rastvorljive soli.

Za bukalnu ili sublingvinalnu primenu, preparati mogu da budu u obliku tableta, lozengi, pastila ili gelova formulisanih na uobičajeni način. Takvi preparati mogu da sadrže aktivni sastojak u aromatičnom nosiocu, kao što su saharoza i guma akacija ili tragakant.

Jedinjenja takođe mogu da budu formulisana u rektalne preparate kao što su supozitorije ili retencione klizme, npr. tako da sadrže uobičajene baze za supozitorije kao što su kakao buter, polietilen glikol i drugi gliceridi.

Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu da se primenjuju topijski, tj. nesistemskom primenom. Ona obuhvata primenu jedinjenja prema predmetnom pronalasku eksterno, naepiderm ili usnu šupljinu i apsorbovanje takvog jedinjenja u uho, oko i nos, tako da jedinjenje ne prodre u cirkulaciju u nekoj značajnoj meri. Nasuprot tome, sistemska primena se odnosi na oralnu, intravensku, intraperitonealnu i intramuskularnu primenu.

Formulacije pogodne za topijsku primenu obuhvataju tečne ili polutečne preparate pogodne za prodor kroz kožu na mesto zapaljenja, kao što su gelovi, melemi, losioni, kreme, obloge ili paste, kao i kapi pogodne za primenu u oko, uho ili nos.

Kod topijskog preparata za okularnu primenu, količina jedinjenja sa formulom (I) će se generalno kretati u opsegu od 0,001 do 10% (masa/zapremini, %m/v). Poželjnan opseg koncentracije je od 0,1 do 5% m/v. Topijski preparat se primenjuje u oko jednom do šest puta dnevno. Uobičajeni preparat sadrži 0,1 - 5% jedinjenja sa formulom (I), 0,5% m/v hidroksipropilmetilceluloze (HPMC), 0,8% m/v natrijum hlorida, 0,28% m/v natrijum fosfata, 0,01 % m/v edetat dinatrijuma, 0,01% m/v benzalkonijum hlorida. pH preparata se podešava do 7,2 - 7,4. Prečišćena voda se dodaje q.s.

Gelovi za topijsku ili transdermalnu primenu jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže, generalno, smešu isparljivih rastvarača, neisparljivih rastvarača i vode. Komponenta isparljivog rastvarača u puferskom sistemu rastvarača može poželjno da obuhvata niže (Ci-Cć) alkil alkohole, niže alkil glikole i niže glikolne polimere. Još poželjnije je daje isparljivi rastvaraČ etanol. Smatra se da isparljiva komponenta rastvarača deluje kao sredstvo za poboljšanje prodora, istovremeno dajući efekat hlađenja na koži dok isparava. Neisparljiva komponenta rastvarača u okviru puferisanog sistema rastvarača bira se iz grupe koja se sastoji od nižih alkilen glikola i nižih polimera glikola. Poželjno je da se koristi propilen glikol. Neisparljivi rastvarač usporava isparavanje isparljivog rastvarača i smanjuje napon pare puferisanog sistema rastvarača. Količina ove neisparljive komponente rastvarača, kao i u slučaju isparljivog rastvarača, određuje se u odnosu na farmaceutsko jedinjenje ili lek koji se koristi. Kada je u sistemu premalo neisparljivog rastvarača, farmaceutsko jedinjenje može da kristališe usled isparavanja isparljivog rastvarača, dok višak dovodi do smanjene biološke dostupnosti usled slabog otpuštanja leka iz smeše rastvarača.

Puferska komponenta puferisanog sistema rastvarača može da bude izabrana iz grupe koja se sastoji od svih pufera koji se obično koriste u struci; poželjno je da se koristi voda. Postoji nekoliko opcionih sastojaka koji mogu da se dodaju u topijski preparat. Oni obuhvataju, ali nisu ograničeni na helatore i sredstva za geliranje. Pogodna sredstva za geliranje mogu da obuhvataju, ali nisu ograničena na, polusintetske derivate celuloze (kao što je hidroksipropilmetilceluloza) i sintetske polimere, kao i kozmetička sredstva.

Losioni prema predmetnom pronalasku obuhvataju one koji su pogodni za primenu na kožu ili oko. Losion za oko može da sadrži sterilni vodeni rastvor koji opciono sadrži baktericid i može da se pripremi postupcima sličnim kao oni koji se primenjuju za pripremu kapi. Losioni ili obloge za primenu na kožu takođe mogu da sadrže sredstvo koje ubrzava sušenje i hladi kožu, kao što su alkohol ili aceton, i(li) hidratantno sredstvo kao što je glicerol ili ulje kao što su ricinusovo ulje ili ulje kikirikija.

Kreme, melemi ili paste prema predmetnom pronalasku su polučvrsti preparati aktivnog sastojka za spoljašnju upotrebu. Oni se izrađuju mešanjem aktivnog sastojka u fino granulisanom ili sprašenom obliku, samog ili u rastvoru ili suspenziji u vodenoj ili nevodenoj tečnosti, uz pomoć pogodnih mašina, sa masnom ili nemasnom bazom. Baza može da sadrži ugljovodonike kao što su čvrsti, meki ili tečni parafin, glicerol, pčelinji vosak, metalni sapun, voskovi; ulja prirodnog porekla kao što su bademove, kukuruzno, ulje kikirikija, ricinusovo ili maslinovo ulje, lanolin ili njegovi derivati ili masne kiseline kao što su stearinska ili oleinska kiselina, zajedno sa alkoholom kao što je propilen glikol, ili makrogel. Preparat može da obuhvata bilo koje površinski aktivno sredstvo kao što je anjonsko, katjonsko ili nejonsko površinski aktivno sredstvo, kao što su sorbitan estri ili njihovi polioksietilenski derivati. Sredstva za suspendovanje kao što su prirodne gume, derivati celuloze ili neorganski materijali kao što su silikati i drugi sastojci, kao sto je lanolin, takođe mogu da se uvrste u sastav preparata.

Kapi prema predmetnom pronalasku mogu da sadrže sterilne vodene ili uljane rastvore ili suspenzije i mogu da se dobiju rastvaranjem aktivnog sastojka u pogodnom vodenom rastvoru baktericidnog i(li) fungicidnog sredstva i(ii) bilo kog drugog pogodnog konzervansa, a poželjno je da obuhvataju površinski aktivna sredstva.

Preparati za topijsku primenu u usta, na primer, bukalnu ili sublingvinalnu, obuhvataju lozenge koje sadrže aktivni sastojak u aromatičnoj bazi kao što je saharoza i guma akacija ili tragakant, kao i pastile koje sadrže aktivni sastojak u bazi poput želatinske ili glicerinske, ili saharozne sa gumom akacija.

Za primenu inhalacijom, jedinjenja prema predmetnom pronalasku se dopremaju iz insuflatora, kaseta za nebulizator pod pritiskom ili drugim pogodnim načinima dopremanja aerosola u spreju. Kasete pod pritiskom mogu da sadrže propelent kao što su dihlordifluormetan, trihlorfluormetan, dihlortetrafluoretan, ugljen dioksid ili neki drugi pogodan gas. U slučaju aerosola pod pritiskom, dozna jedinica može da se odredi obezbeđivanjem ventila koji omogućava dopremanje tačno odmerene količine. Alternativno, za primenu inhalacijom ili insuflacijom, jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu da budu u obliku suvog praha, na primer, praskaste smeše jedinjenja i pogodnog praha kao što su laktoza ili škrob. Praškasti preparat može da bude obezbeđen u jediničnom obliku, na primer, u kapsulama, kasetama, želatinskim ili blister pakovanjima iz kojih se prah može dopremiti uz pomoć inhalatora ili insuflatora.

Poželjne jedinične doze su one koje sadrže delotvornu dozu, kao što je ovde navedeno, ili odgovarajući deo takve doze aktivnog sastojka.

Trebalo bi imati u vidu da, osim sastojaka koji su konkretno navedeni u prethodnom tekstu, preparati prema predmetnom pronalasku mogu da obuhvataju druge sastojke koji su uobičajeni u ovoj struci, imajući u vidu vrstu preparata, na primer, oni koji su pogodni za oralnu primenu mogu da sadrže i arome.

Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu da se primene bilo kojim putem primene, kao što je prethodno navedeno, u doznom opsegu za odrasle ljude koji se, uopšteno posmatrano, kreće od 0.01 mg/mg/dan, još poželjnije je da to bude od 0,01 mg/kg/dan do 30 mg/kg/dan, a najpoželjnije je da to bude od 0,01 mg/kg/dan do 15 mg/kg/dan.

Količina aktivnog sastojka koja može da se kombinuje sa nosiocima kako bi se dobio pojedinačni dozni oblik zavisiće od domaćina koji se tretira i konkretnog puta primene.

Jedinjenja prema predmetnom pronalasku mogu da se primene različitim putevima, npr. oralno, topijski ili injekcijom. Ordinirajući lekar će odrediti preciznu količinu jedinjenja koje se primenjuje kod pacijenta. Specifična doza za konkretnog pacijenta zavisiće od različitih faktora, uključujući aktivnost konkretnog jedinjenja koje se koristi, starost, telesnu masu, opšte zdravstveno stanje, pol, način ishrane, vreme primene, put primene, brzinu izlučivanja, kombinaciju lekova, konkretan poremećaj koji se leči i ozbiljnost indikacije ili stanja koje se leči. Uz to, put primene može da se menja u zavisnosti od stanja i njegove ozbiljnosti.

Analitička LC-MS

Jedinjenja sa formulom (I) analizirana su pomoću analitičke LC-MS. Uslovi su ukratko predstavljeni u tekstu koji sledi:

Kratak pregled analitičkih uslova:

LClOAdvp-Pump (Shimadzu) sa detektorom sa nizom dioda u UV/Vis spektru SPD-MlOAvp (Shimadzu) i MS detektorom QP2010 (Shimadzu) u ESI+ programu rada sa UV detekcijom na 214, 254 i 275 nm, kolona: Waters XTerra MS Cl8, 3,5 jim, 2.1<*>100 mm, linearni gradijent sa acetonitrilom ui vodi (0,15% HCOOH).

Brzina protoka 0,4 ml/min;

Pokretna faza A: voda (0,15% HCOOH)

Pokretna faza B: acetonitril (0,15% HCOOH)

Postupci su:

A: Polarni linearni gradijent QC; početna koncentracija 1% acetonitrila

B: Srednji linearni gradijent QC; početna koncentracija 10% acetonitrila

C: Unipolarni linearni gradijent QC; početna koncentracija 15% acetonitrila B. Podešavanje krive za krivu gradijenta tečnosti B (C, D) u programu rada sa gradijentom. Kriva u C. kriva 0<=t<=T može da se izračuna sledećom jednačinom, gde je c(t) D. kriva koncentracije tečnosti B (C, D) u relativnom vremenu t u svakom vremenskom intervalu, T je vreme gradijenta a a je vednost za [B(C,D).krivu].

Cl: početna vrednost [B(C,D).konc]

C2: konačna vrednost [B(C,D).konc] (podešava se iz LC programa -10 -10

Primeri

Sinteza jedinjenja ID:

Intermediier IDa) :

U rastvor 2,3,5-trimetilfenola (0,5 g, 1 ekv) u 1,1,2,2-tetrahIoretanu (15 ml) dodat je rastvor aluminijum hlorida (1,22 g, 2,5 ekv.) i metil sebacoil hlorida (1,03 g, 1,2 ekv) u 1,1,2,2-tetrahloretanu (5 ml) na 0°C u atmosferi argona. Reakciona smeša je mešana na 140°C 24 časa a potom hidrolizovana na 0°C vodom (10 ml) i 2N rastvorom hlorovodonične kiseline (10 ml). Rastvor je estrahovan etilacetatom (20 ml). Nakon razdvajanja faza, vodeni sloj je estrahovan etilacetatom (2 x 20 ml), organski slojevi su spojeni a rastvarači udaljeni pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom pod pritiskom gasa (etil acetat cikloheksan).

Intermediier IDb) :

U balonu sa okruglim dnom, cink (13 g, 11 ekv), živa hloriđ (1,3 g, 0,26 ekv), voda (15 ml) i koncnetrovana hlorovodonična kiselina (0.15 ml) mešani su pet minuta, nakon čega je rastvor odliven. Cink je ispran vodom i prenesen u novi, čist okrugli balon. U ovaj amalgamovani cink dodata je voda (2 ml), konc. hlorovodonična kiselina (10 ml), toluen (10 ml) i međuproizvod IDa (6 g, 1 ekv). Reakciona smeša je žustro mešana na sobnoj temperaturi 10 minuta i na 140°C 3 dana. Dodata je ista količina amalgamovanog cinka kao prethodno, te je reakciona smeša mešana 3 dodatna dana na 140°C. Reakciona smeša je prenesena u levak za odvajanje, te je dobijeni organski sloj prenesen u nov, čist balon sa okruglim dnom. U ovu reakcionu smešu dodati su voda (0,5 ml), hlorovodonična kiselina (2 ml) i sveže aktivirani cink (2 g). Reakciona smeša mešana je 2 dodatna dana na 140°C. Rastvor je dekantovan kako bi se odvojio od neizreagovanog cinka i estrahovan dva puta etilacetatom. Spojeni organski ekstrakti isprani su 0,1 M vodenim rastvorom hlorovodonične kiseline (25 ml), osušeni preko natrijum sulfata, proceđeni a isparljive komponente su uklonjene pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod prečišćen je hromatografijom pod pritiskom gasa (etilacetat-cikloheksan).

Intermediier IDc) :

Intermedijer IDb (3,7 g, 1 ekv.) rastvoren je u tetrahidrofuranu (100 ml) te mu je dodat litijum aluminijum hidrid (0,26 g, 1,1 ekv) na 0°C u atmosferi argona. Reakciona smeša je mešana na 0°C 10 minuta dok nije postignuta potpuna konverzija. Rastvor je izliven u zasićeni rastvor amonijum hlorida (200 ml) na 0°C te je dodat etilacetat (200 ml). Nakon razdvajanja faza, vodena faza je estrahovana etilacetatom (150 ml). Spojeni organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, proceđeni, pa su rastvarači udaljeni pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod prečišćen je hromatografijom pod pritiskom gasa (etilacetat-cikloheksan).

Primer ID:

Indermedijer IDc (1,62 g, 1 ekv.) je rastvoren u smeši metanola (50 ml) i N,N-đimetilformamida (50 ml). U ovaj rastvor dodati su rastvor 0,5% kalijum hidroksida (80 ml) i kalijum nitrodisulfonat (4 g, 3 ekv), te je reakciona smeša mešana na sobnoj temperaturi 14 časova do potpune konverzije. U rastvor je dodat IM vodeni rastvor hlorovodonične kiseline (100 ml) te je rastvor estrahovan etilacetatom (2 x 200 ml). Spojeni organski slojevi su osušeni preko natrijum sulfata, proceđeni, pa su isparljive komponente udaljene pod sniženim pritiskom. Sirovi proizvod prečišćen je hromatografijom pod pritiskom gasa (etilacetat-cikloheksan) a potom preparativnom HPLC-MS. LCMS: postupak C, tR (min) = 8,86 MW (izr.) = 306,44, [M+HJ+ (nađena) = 307.

Biološki testovi:

A . Test citotoksičnosti

Ovaj test ispituje citotoksičnost koja se definiše kao svojstvo nekog hemijskog jedinjenja da ubija ćelije, nezavisno od mehanizma ćelijske smrti. Ćelijska linija HepG2 heptoblastoma je jedna od najčešćih humanih ćelijskih linija u ispitivanju hepatotoksičnosti. Iako samim ćelijama nedostaje deo metaboličkih enzima koji su prisutni u svežim hepatocitima, pokazano je da su one koristan instrument za proučavanje toksičnosti hepatotoksina. Ovaj test meri metaboličku aktivnost živih ćelija pomoću srestva za proliferaciju ćelija WST-1 (Roche Diagnostics). Tetrazolijumova so WST-1 se hidrolizuje do formazana rastvornog u vodi, dejstvom ćelijskih enzima. Povećanje broja ćelija koje mogu da prežive (vijabilnih ćelija) dovodi do povećanja ukupne aktivnosti mitohondrijalnih dehidrogenaza u uzorku. Ovo povećanje u enzimskoj aktivnosti dovodi do povećanja količine nastale boje - formazana, što je u direktnoj korelaciji sa brojem metabolički aktivnih ćelija u kulturi. Formazanska boja koju proizvode metabolički aktivne ćelije direktno se kvantitativno određuje u skenirajućem spektrofotomeru sa više polja, merenjem apsorbance formazanske boje između 420 i 480 nm. Zdrave HepG2 ćelije, kada se gaje u kulturi, stalno se dele i razmnožavaju u toku vremena. Toksično hemijsko sredstvo, bez obzira na mesto i mehanizam dejstva, ometaće ovaj proces i dovesti do smanjenja brzine rasta koji se odslikava na broj ćelija.

Eksperimentalna procedura:Hep-G2 ćelije se zaseju u mikrotitar ploču sa 96 polja i gaje u kulturi 24 časa. Potom se izlože ispitivanom jedinjenju, u osam različitih koncentracija. Nakon 24 časa izlaganja, ćelije se inkubiraju u prisustvu reagensa WST-1 30 minta pre merenja apsorbancije nastale formazanske boje. Citotoksičnost se izražava kao smanjenje konverzije formazanske boje, zavisno od koncentracije, usled smanjenja proliferacije ćelija u poređenju sa netretiranim ćelijama. TC50 (50% toksična koncentracija) se definiše kao koncentracija ispitivanih jedinjenja koja je potrebna za smanjenje vijabilnosti ćelija za 50% u odnosu na kontrolnu kulturu. Što je niža TC50 vrednost, to je viši citotoksični potencijal ispitivanog jedinjenja. Vrednosti TC 50% su izračunate prema sledećoj formuli:

a) Konc. > 50 = maksimalna izmerena koncentracija sa % kontrole rastvarača > 50 % b) Konc. < 50 = minimalna izmerena koncentracija sa % kontrole rastvarača < 50%

c) % > 50 = relativna apsorbanca pri a) u %

d) % < 50 = relativna apsorbanca u b) u %

Kao što se može videti iz tabele 3, jedinjenja sa formulom (I) jasno pokazuju da nisu

toksična u dozama koje su ocenjivane.

B . ATP test

Elektroni donirani iz ciklusa limunske kiseline u obliku NADH se prenose između kompleksa I, II i III respiratornog lanca. U ovom procesu, potencijal mitohondrijske membrane se generiše preko protonskih pumpi u unutrašnjoj membrani mitohondrija. Ovaj elektrohemijski gradijent sa različitih strana unutrašnje membrane mitohondrija u zdravim ćelijama se koristi za obezbeđivanje energije koje je pogonska sila za proizvodnju ATP-a. Samim tim, koncentracija ATP-a unutar ćelije je dobar pokazatelj funkcije mitohondrija. U više različitih bolesti (tj. Alchajmerovoj, Parkinsonovoj, Hantingtonovoj bolesti i mitohondrijskim poremećajima) ovaj način proizvodnje ATP-a je ometen, te se koriste različiti načini proizvodnje ATP-a koji mogu da se dovedu u vezu sa toksičnim sporednim proizvodima (tj. laktičnom acidozom usled povećane anaerobne glikolize). Postoji opšti koncenzus da, posebno u tkivima sa visokim energetskim potrebama, kao što su mišići i mozak, hronično smanjenje koncentracije ATP-a na kraju dovodi do ćelijske smrti. Stoga, jedinjenja koja značajno smanjuju koncentraciju ATP-a u normalnim uslovima rastain vitromogu da se smatraju jedinjenjima koja nose određeni potencijal za toksičnost. Međutim, za neka jedinjenja je opisano da imaju pozitivna dejstva na životni vek i patološke ciljne parametre kao što je oksidativni stres, uprkos smanjenju proizvodnje enrgije (Onken & DriscolI 2010). Potencijalna inhibicija mitohondrijskog disanja može da se detektuje pomoću posebnih uslova rastain vitro.C može da napravi razliku između mitohondrijske i nemitohonđrijske proizvodnje ATP-a (tj. glikolize), pošto se u uslovima niske koncentracije glukoze ATP uglavnom proizvodi oksidativnom fosforilacijom.

Eksperimentalna procedura:Ovaj test se stoga izvodi u odsustvu glukoze u podlozi za rast. Međutim, treba imati u vidu da će niske koncentracije glukoze sadržane u serumu dovesti do procenjene koncentracije glukoze od približno 0,5 mM. Stoga ovo stanje označavamo kao stanje "sa niskom glukozom". Imortalizovane limfoblastoidne ćelije (BC1 LCL) korišćene su za karakterizaciju efekata jedinjenja na koncentracije ATP-a u različitim koncentracijama glukoze, u reakciji luciferaze zavisnoj od ATP-a. Ukratko, ćelije su zasejane u ploču sa 24 polja pri gustini od 5<*>10^ ćelija/ml po polju, u đve različite podloge koje sadrže 25 mM ili ne sadrže glukozu, redom. U obe podloge dodato je 10% fetalnog goveđeg seruma, 1% Pen/Strep, 200 mM L-glutamina. Ćelije su tretirane sa 0,1% (v/v) rastvorom jedinjenja (10 mM u DMSO-u; konačna koncentracija: 10 uM) i inkubirane u toku 72 h na 37 °C, 5% CO2, i uz 90% rH. Ćelije su izbrojane, te su nakon kratkog ispiranja u PBS-u i odvajanja centrifugiranjem (5 min; 200 x

g) ćelije lizirane u zapremini od 0,5 ml rastvora za liziranje (4 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) u toku 15 minuta, na ledu, te je 10 ul lizata dodato u belu ploču sa 96 polja. Paralelno sa tim, i

standardi za ATP (koncentracije: 0, 1, 2, 4,6, 8 i 12 p.M u PBS-u) su takođe dodati u navedenu ploču sa 96 polja. Reakcija je započeta dodatkom 100 ul reakcione smeše (300 uM D-luciferin, 5 ng/ml luciferaze svica, 75 uM DTT, 25 mM HEPES, 6,25 mM MgCl2, 625 uM EDTA i 1 mg/ml BSA) te je kvantitativno određena luminescencija signala u multimodalnom čitaču ploča (Tevan Ml 000 čitač ploča; vreme integracije luminescencije: 100 ms). Koncentracija ćelijskog ATP-a normalizovana na broj ćelija računa se za svako polje, te se računa prosečna vrednost iz merenja u triplikatu. Koncentracije ATP-a navedene su u tabeli 2.

Uopšteno posmatrano, pod normalnim uslovima rasta, veća koncentracija ATP-a je korisna za ćeliju. Međutim, u uslovima niske koncentracije glukoze, smanjenje koncentracije ATP-a zavisno od tretmana može da ukaže na inhibiciju mitohondrijske respiracije, što imitira uslove ograničenja kalorijskog unosa i stoga je verovatno da će pokrenuti sva pozitivna dejstva koja se dovode u vezu sa ograničenjem kalorijskog unosa, kao stoje dugovečnost (Copeland et al. Current Biol 2009; 19:1-8). Pa ipak, treba utvrditi da nema toksičnih ili drugih neželjenih dejstava kao što je proizvodnja ROS, koji bi se mogli dovesti u vezu sa ovim smanjenjem respiracije.

C: Test lipidne peroksidacije

Lipidna peroksidacija predstavlja dobro definisani mehanizam oštećenja ćelija i kod životinja i kod biljaka, koji se odvija u toku starenja i tokom nekih bolesti. Ovaj proces se odvija slobodnoradikalskim lančanim mehanizmom. Najčešće pogađa polinezasićene masne kiseline, jer one sadrže više dvogubih veza između kojih se nalaze metilenske -CHb- grupe Čiji su vodonici posebno reaktivni. Ukoliko se reakcija ne zaustavi dovoljno brzo, lipidna peroksidacija oštećuje ćelijske membrane, utiče na fluidnost membrane i na mitohondrijsku funkciju. Uz to, konačni proizvodi lipidne peroksidacije mogu da budu mutageni i karcinogeni. Na primer, reaktivni krajnji proizvod lipidne peroksidacije, malondialdehid, direktno izaziva oštećenje DNK.

Eksperimentalna procedura:Fluorescentna BODIPY® (4,4-difluor-3a,4a-diaza-s-indacen) fluorofora je delotvoran indikator za praćenje prometa lipida, kao i korisna membranska proba opšte namene. BODIPY 581/591-C11 može da se koristi za merenje antioksidativne aktivnosti u lipidnim sredinama, tako što se koristi njen gubitak fluorescencije pri interakciji sa peroksidnim radikalima. Primami humani fibroblasti C4 (GM04545, Corietl)

(prolaz < 12) zasejani su u koncentraciji od 2000 ćelija/polju u crne ploče sa 96 polja i inkubirani 72 časa u DMEM-u u prisustvu 10 uM ispitivanog jedinjenja, ili samo DMSO-a. Nakon toga, dodat je 0,1 ml sveže pripremljenog rastvora boje (HBSS, koji sadrži BODIPY boju, 1:1000 iz štok rastvora), te su ćelije vraćene u inkubator na 30 minuta. Nakon 2 kratka ispiranja sapo 0,1 ml zagrejanog PBS-a, merenaje fluorescencija u 50 pJ PBS-a. Fluorescencija je individualno kvantitativno određena za 4 pojedinačne zone na dve talasne dužine (Exl: 490, Eml: 600; Ex2: 490, Em2: 530, širina pojasa 10 nm, 50 impulsa osvetljenja, frekvencija 400 Hz, vreme integracije 20 p.s).

Stepen lipidne peroksidacije različitih jedinjenja prema predmetnom pronalasku prikazanje u tabeli 3 koja sledi.

Izmenjena mitohondrijska funkcija, kao stoje slučaj kod mitohondrijskih poremećaja, može da dovede do oštećenja ćelija lipidnom peroksidacijom. Izmena mitohondrijske funkcije putem malih molekula stoga nosi rizik od izazivanja lipidne peroksidacije. U tom kontekstu, sva jedinjenja u tabeli 3 koja ostavljaju bazalnu lipidnu peroksidaciju na nepromenjenom nivou (oko 100%) ne pokazuju nikakvu značajnu opasnost od toksičnosti, sto je pokazano podacima uvršćenim u tabelu 1.

D: Merenje aktivnosti mitohondriiskos kompleksa II

Kompleks II (CTI) je enzimski kompieks vezan za unutrašnju mitohondrijsku membranu sa strane matriksa. Sastoji se od četiri podjedinice, sa nekoliko različitih enzimskih aktivnosti. Jedan od ovih enzima je enzim ciklusa limunske kiseline, sukcinat dehidrogenaza, koji katalizuje konverziju sukcinata u fumarat. U ovoj reakciji, elektroni se premeštaju sa sukcinata na prostetsku grupu FAD, dajući FADH2 (Ackrell 2000). Ovi elektroni se potom prenose sa redukovanog FADH2 na ubikvinon, sa ubikvinona na reakcione centre kompleksa III (CIII) i konačno na citohrom c. U toku ovog procesa prenošenja elektrona, kompleks III pumpa četiri protona iz matriksa u međumembranski prostor. Ovaj protok protona može da se detektuje u vidu električne struje pomoću SURFE2R senzora na bazi SSM (http://www.sdheidelberg. de/index.html). U SURFE2R CII-CIII testu i CII i CIII se aktiviraju istovremeno, najpre ekvilibracijom senzora sukcinatom a potom aktivacijom CII-CIII reakcije pomoću oksidovanog citohroma c. Dobijeni izlazak protona iz membranskog odeljka dovodi do nastanka negativne struje, koja je osetljiva na CII i CIII inhibitore malonat i antimicin A, redom.

Eksperimentalna procedura;SURFE2R SSM senzor je obložen unutrašnjom mitohondrijskom membranom u skladu sa standardnim protokolima. Ukratko, senzori su napunjeni sa po 50 ul rastvora SensorPrep A i inkubirani 10-15 minuta. Nakon toga, rastvor je udaljen, senzori su isprani dejonizovanom vodom tri pita, osušeni u struji azota i inkubirani 15 minuta na sobnoj temperaturi kako bi se udaljili ostaci rastvarača. 1,5 ul SensorPrep BI rastvora naneseno je na senzor i odmah preliveno sa 50 ul pufera (150 mM Na-glukonat, 30 mM Hepes pH 7,2/NMG, 10 mM MgCb, 12,5 mM NaPi pH7,2, sveže dodati 0.2 mM DTT). Senzor je inkubiran 15-60 minuta na 4°C. Jedan alikvot (10 ul) suspenzije unutrašnje mitohondrijske membrane (čuvane na - 80°C) brzo je otopljen, razblažen sa 190 ul pufera za pripremu senzora koji je prethodno korišćen i podvrgnut sonikaciji u Ependorf kiveti od 1,5 ml, primenom 5 impulsa sa amplitudom od 30% i vremenskim odnosom ciklusa od 0,5 (ultrazvučni procesor UP 50 H, Dr. Hielscher GmbH, Nemačka, opremljen nastavkom MS 1). 5 ul membranske suspenzije naneseno je na površinu senzora, što predstavlja ukupan sadržaj proteina od 4,3 ug po senzoru. Senzori su centrifugirani 45 minuta na 2500 x g, inkubirani na 4°C 3-5 časova i zamrznuti na -80°C. Biosenzori su otopljeni neposredno pre eksperimenta i mereni uređajima SURFE2R VVorkstation 50 ili 500. CII-CIII aktivnost je proučavana brzom izmenom "neaktivirajućeg" rastvora "aktivirajućim" rastvorom koji sadrži 3 uM oksidovanog citohroma c. Nakon 2 s neaktivirajućeg pufera, sledilo je 1 s aktivirajućeg pufera, a onda opet 1 s neaktivirajućeg pufera. Nakon toga, senzor je ispran 3 puta sa 1 ml neaktivirajućeg pufera. Dalja aktivacija citohroma c izvedena je nakon vremena inkubacije od -11 min. Oba pufera su sadržala 1 mM sukcinat i 350 mg/l BSA kako bi se poboljšala rastvorljivost ispitivanih jedinjenja. Za aktivnost CII-III, ocenjivan je maksimum struje (amplituda struje). Izvedena merenja CII-III aktivnosti sastojala su se iz dva dela. Prvo je aktivnost CII-III beležena u odsustvu jedinjenja (umesto njega, bilo je dodato 0,01% DMSO) u toku oko 50 minuta, kako bi se dobila konstantna CII-CIII aktivnost (konstantni maksimumi amplituda struje). Nakon toga, u aktivirajući i neaktivirajući rastvor dodato je ispitivano jedinjenje (-4 uM) te je CII-CIII aktivnost beležena daljih~50 minuta (ukupno 110 minuta). Za svaki senzor, svi maksimumi struja su normalizovani na srednju vrednost aktivnosti nakon 24, 36 i 48 minuta. Za svako ispitivano jedinjenje, ispitana su najmanje dva različita biosenzora u toku ukupno 110 minuta, stoje označeno kao n (t 0-110) = 2. Za ona ispitivana jedinjenja koja su aktivirala CII-CIII za više od 30% u vremenu od 90 do 110 minuta, aktivnost CII-CIII je snimana još dodatnih

-50 minuta (do 160 minuta ukupno).

Rezultati za različita jedinjenja upotrebljena u predmetnom pronalasku navedeni su u tabeli 4 koja sledi.

Funkcionalna restrikcija unosa kalorija može da prebaci metabolizam sa glukoze na pojačanu upotrebu lipida kao glavnog izvora energije, stoje delotvorno pokazano kroz studije koje koriste SIRT aktivatore (Lomb et al. Biochim Biophv Acta. 2010; 1804(8): 1652-7). Lipidi se obično razlažu u toku mitohondrijske beta oksidacije masnih kiselina (FA). Kako se smatra da se ekvivalenti elektrona iz lipidne peroksidacije radije usmeravaju u respiratorni lanac mitohondrija na nivou kompleksa II (Bruss et al. Am. J. Phvsiol. Edocrinoi. Metab. 2010; 298:E108-E116), značajno je utvrditi da funkcija ovog kompleksa nije izmenjenapod dejstvom tretmana.

E: Test mikromreže i analiza puta

Kako nisu dostupni skoro nikakvi radovi o efektima kratkolančanih kvinona na obrasce ekspresije genainv/vo, sproveli smo analizu mikromreže srčanog tkiva dobijenog iz miševa nakon dugoročnog tretmana jedinjenjem IA.

Eksperimentalna procedura:Mužjaci C57BI/6 miševa gajeni su u standardnim laboratorijskim uslovima (12 časova svetlosti dnevno, 22±2 °C, 40-60% vlažnost) sa hranom i vodom koje su bile dostupnead libitum.Kada su napunili tri nedelje starosti, kod miševa je primenjeno jedinjenje IA (200 mg/kg, formulisano u standardnu hranu za glodare) p.o. u toku tri nedelje. Bočice koje su sadržale po 8 g kaše od hrane davane su životinjama, koje su gajene po jedna u kavezu, na početku tamnog ciklusa, uz omogućavanje pristupa dodatnoj hraniad libitum.Nakon perioda tretmana, životinje su žrtvovane te je leva srčana komora odmah disektirana i lizirana, kako bi se estrahovala RNK. RNK je prečišćena primenom standardnih protokola. Dvolančana cDNK je sintetisana iz 1,8 ug RNK pomoću reverzne transkripcije jednolančane cDNK, primenom SuperScript II polimeraze i T7-(N)6 prajmera, nakon čega je usledila sinteza dvolančane cDNK pomoću DNK polimeraze 1. Nakon transkripcijein vitropreko noći kojom je dobijena cRNK, jednolančana cDNK je sintetisana reverznom transkripcijom pomoću SuperScript II, slučajno odabranih prajmera i dUTP-a, nakon čega je očišćena od RNK obrazaca. Uzorci su hibridizovani na Affymetrix GeneChip® Mouse Exon 1.0 ST Arrays mreže koji pokrivaju milion egzonskih grupacija (Affymetrix, Santa Clara, CA, SAD) u skladu sa instrukcijama proizvođača. Analiza podataka (analiza glavne komponente; PCA i promene u ekspresiji individualnih gena) izvedena je pomoću dva programa: Partek softvera za analizu gena (Partek Incorporated, St. Louis, MO, SAD) i Agilent Genespring GX10 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, SAD). Ocena ekspresije svih gena određena je pomoću ermineJ (Lee et al, BMC Bioinformatics 6:269, 2005). Za funkcionalnu analizu koja obuhvata samo gene koji su različito eksprimirani, korišćen je DAVID (Huang DW et al, Nature Protoc.

4(l):44-57, 2009; Dennis G et al, Genome Biol. 4(5):P3, 2003). Analiza obogaćenja kompleta gena izvedena je pomoću programa Ariadne Pathway Studio 6 (Ariadne Genomics, Rockville,

MD, SAD).

Rezultati:Nakon tronedeljnog tretmana jedinjenjem IA, više od 650 gena bilo je različito eksprimirano. Veći broj analiza, uključujući i preradu genske ocene, jasno je ukazalo daje metabolički parametar u srčanom tkivu na koji je tretman jedinjenjem IA najviše uticao bio metabolizam masnih kiselina.

F: Dejstva jedinjenja na unos hrane Uli ) telesnu masu

Iako je za kratkolančana kvinonska jedinjenja kao što je jedinjenje IA opisano da imaju višestruko zaštitno dejstvo na funkciju mitohondrija, trenutno nisu objavljeni nikakvi podaci o promenama metabolizmain vivo.Zbog rezultata analize sa mikromreže, procenjivali smo moguće efekte jedinjenja na telesnu masu i unos hrane.

Eksperimentalna procedura:Mužjaci C57BL/6J miševa stari osam nedelja nabavljeni su preko dobavljača Janvier (Francuska). Nakon perioda od nedelju dana aklimatizacije u ustanovi (12 sati svetla dnevno, 22±2 °C, vlažnost 60%), životinje su premeštene po jedna u kavez sa obogaćenim životnim okruženjem (tj. sa točkovima za trčanje) i primale su dnevnu dozu od 200 mg/kg jedinjenja IA u hrani, kao što je prethodno opisano za analizu na mikromreži. Porcije koje su iznosile 75% dnevnog kalorijskog unosa obogaćene su veštačkim zaslađivačem kako bi bile ukusnije životinjama. Pojedinačne porcije su čuvane na -20°C i davane svakog dana, pre početka perioda tame. Porcije za kontrolne životinje su pripremane na identičan način, osim što je izostavljano jedinjenje IA. Uz to, miševi su imali pristup hraniad libitum.Telesna masa životinja i unos hrane iz porcijead libitumgranula mereni su tri puta nedeljno u periodu od četiri nedelje. Telesna masa životinja, kao i relativni kumulativni unos hrane u odnosu na telesnu masu korišćeni su kao konačni parametri.

G . Celijska vijabilnost ćelija nalik na RCG

Oštećenje mitohondrija direktno utiče na preživljavanje ćelija. Ćelije koje pokazuju visoku potrošnju energije, kao što su neuroni, posebno su osetljive. Samim tim, ove ćelije i tkiva najverovatnije će pokazivati najintenzivniji odgovor na strategiju usmerenu ka funkciji mitohondrija. Pozabavili smo se ovom mogućnošću tako što smo ocenjivali vijabilnost ćelijske linije retinalnih gangliona RGC-5, koja je podvrgnuta izazovu inhibitorom mitohondrijskog kompleksa I rotenonom, u odsustvu ili prisustvu jedinjenja.

Eksperimentalna procedura:RGC-5 ćelije su gajene u kulturi pri normalnim uslovima (37 °C, 5% CO2, vlažnost 90%) u DMEM podlozi (1 g/l glukoze; 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), penicilin-streptomicin-glutamin (PSG)). RGC-5 ćelije su zasejane u DMEM podlozi (1 g/l glukoze; 2% FBS) u BD Falcon™ ploče za gajenje kulture. Pre inhibicije kompleksa I indukovane rotenonom, ćelije su prethodno tretirane jedinjenjem IA ili nosiocem. Za istovremeni tretman jedinjenjem IA i rotenonom, novo jedinjenje dodavano je zajedno sa podlogom za gajenje ćelija koja sadrži rotenon. Nakon izlaganja rotenonu, podloga je promenjena i zamenjena Hanksovom BSS podlogom na 1 dan inkubacije nakon tretmana rotenonom. Podloga za naknadni tretman sadržala je jedinjenje IA ili samo nosilac. Kao mera ćelijske vijabilnosti, analiziranje ćelijski sadržaj ATP-a pomoću luminescencije proistekle iz enzimske oksidacije luciferina zavisne od ATP-a enzimom luciferazom. RGC-5 ćelije su isptane u PBS-u i lizirane u puferu za lizu (4 mM EDTA, 0,2% Triton X-100) na sobnoj temperaturi. U pločama od po 96 polja, pufer za merenje ATP-a (25 mM HEPES pH 7,25, 300 uM D-luciferin, 5 ug/ml luciferaza svica, 75 uM DTT, 6,25 mM MgCh, 625 uM EDTA i 1 mg/ml BSA) spojen je sa lizatom kako bi se pokrenula reakcija. Luminescencija je odmah kvantitativno određivana pomoću čitača ploča sa višestrukim programom rada (Tečan Ml000, Tečan iControl 1.6 sofver; Tečan Austria GmbH, Grodig, Austrija). Efekti na vijabilnost ćelija definisani su kao procenat promene u vijabilnosti ćelija u kojoj je posredovalo jedinjenje u odnosu na smanjenje ćelijske vijabilnosti izazvano rotenonom. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM (standardna greška srednje vrednosti). Parni Studentov t-test je korišćen za poređenje nenormalizovanih podataka. Statistička značajnost zadata je pri p<0,05(<*>), p<0,01(**) i p<0,001(<***>).

Rezultati:U ovom sistemu, rotenon je doveo do smanjenja vijabilnosti ćelije za 59% u RCG-5 ćelijama tretiranim DMSO-om, dok je jedinjenje IA značajno očuvalo ("spasilo") vijabilnost RCG-5 ćelija, na način zavisan od doze, pri koncentracijama > 10 nM (videti sliku 1). Tretman jedinjenjem IA, koji je obuhvatao i 1 dan prethodnog inkubiranja, uticao je na značajno očuvanje ćelijske vijabilnosti pri 100 11M i 1000 nM, dok je tretman koji je podrazumevao 2 dana prethodnog inkubiranja sa jedinjenjem IA pokazao efekat značajnog očuvanja ćelijske vijabilnosti već pri 10 nM. Konkretnije, prethodna inkubacija sa jedinjenjem IA u toku 1 dana (slika 1, bele trake) povećala je vijabilnost RCG-5 do 26% (pri 1 uM), dok su koncentracije od 1 i 10 nM pokazale blago, ali ne značajno zaštitno dejstvo. U poređenju sa prethodnim tretmanom u trajanju od 1 dan (slika 1, bele trake), zaštita ćelijske vijabilnosti bila je značajno bolja u slučaju prethodnog tretmana u trajanju od 2 dana (slika 1, crne trake). Pri koncentracijama od 10 nM, 100 nM i 1000 nM, jedinjenje IA značajno je povećalo ćelijsku vijabilnost za 7%, 35% i 58%, redom.

Smatra se da neurotropni faktori kao što je NGF utiču na ćelijsko preživljavanje neurona. Stoga se smatra da bi jedinjenja koja mogu da dovedu do ekspresije neurotropnih faktora, kao što je propentofilin, mogla da imaju neuroprotektivno dejstvo. Međutim, kada je jedinjenje IA upoređeno sa propentofilinom (slika 2) u pogledu zaštitne uloge u sistemu kulture ćelija za proučavanje disfunkcije mitohondrija koj i je prethodno opisan, propentofilin (100 uM) nije pokazao nikakvu značajnu zaštitnu aktivnost (p > 0,05) dok je zaštitno dejstvo na preživljavanje ćelija koje je pokazalo jedinjenje IA (1 uM) bilo veoma značajno (p-0,0005).

H . Mišji model za bolesti koje se dovode u vezu sa oštećenjem mitohondrija kod bolesti

očiju

Ovaj mišji model se koristi da bi se procenio terapeutski potencijal jedinjenja u oftalmološkim poremećajima koji se odlikuju disfunkcijom mitohondrija, kao što su LHON, DOA, makularna degeneracija, retinopatija i deficijencija kompleksa I. Reč je o široko prihvaćenomin vivomodelu zasnovanom na intravitrealnoj injekciji inhibitora kompleksa I - rotenona u jedno oko odraslog miša. Intravitrealna injekcija rotenona dovodi do neurotoksičnosti kroz disfunkciju mitohondrijskog kompleksa I u mrežnjači, koji je glavna molekulska disfunkcija koja se dovodi u vezu sa ovim poremećajima. Uticaj prethodnog oralnog tretmana ispitivanim jedinjenjima u trajanju od 3 nedelje se ocenjuje histološki, ispitivanjem integriteta mrežnjače u različitim vremenskim tačkama u odnosu na injekciju rotenona. Histološka analiza obuhvata kvantitativno merenje debljine mrežnjače (cele mrežnjače i pojedinačnih slojeva), analizu apoptoze i ćelijske smrti RCG, oksidativnog stresa. ekspresije glutamin sintetaze i glioze. Oko u koje nije data injekcija se koristi kao kontrola u okviru iste jedinke, odnosno intraindividualna kontrola.

Eksperimentalna procedura ( I) : Histopatološka analiza degeneracije mrežnjače

Mužaci C57BL/6J miševa divljeg tipa (7 nedelja starosti, oko 25 g telesne mase) gajeni su u individualnim Makrolon kavezima tipa II sa standardnom steljom i slobodnim pristupom hrani i vodi u regularnom ciklusu svetlosti i tame od 12 časova (8 ujutru do 8 uvece). Miševi su tretirani jednom dnevno, u toku tri nedelje, ispitivanim jedinjenj ima u različitim dozama (20 do 2000 mg/kg telesne mase u CMC 0,5%) ili nosiocem (CMC 0,5%), kroz hranu (jedinjenja pomešana 1:1 sa autoklaviranom hranom u prahu, uz dodatak 10% saharoze; 5,5 g/dan) ili putem sonde (p.o.; 10 ml/kg telesne mase/dan) pre intravitrealne injekcije rotenona ujedno oko (15 mM u DMSO-u, 1 p.1) ili injekcije DMSO nosioca (1 ul). Miševi su anestezirani (inhalacijom 1,5% do 2% izoflurana) te je rotenon (ili DMSO nosilac) ubrizgan u staklastu komoru desnog oka pomoću Hamiltonovog šprica od 10p.1sa malom iglom. Vrh igle se uvede u gornju hemisferu oka, u nivoupars plana,pod uglom od 45° kroz skleru. Ubrizgavanje se izvodi u toku 2 minuta, a igla se drži na istom mestu još 3 minuta, nakon čega se nežno ukloni. Sterilni hirurški lepak (Histoacrvl, BRAUN/Aesculap AG, Nemačka) se koristi za zatvaranje mesta injekcije, dok se na tretirano oko nanosi sterilni antimikrobni oftalmološki melem (Neosporin, GlaxoSmithKline, Velika Britanija) kako bi se izbegla eventualna infekcija. Miševi se potom vraćaju u njihove kaveze, gde su stalno izloženi ispitivanom jedinjenju (ili nosiocu), sve do žrtvovanja za histološku analizu (1 i 7 dana nakon injekcije rotenona). Ukratko, miševi se anesteziraju i.p. injekcijom ketamina/ksilazina (2/1, 200 ul), nakon čega se intrakardijačno uvede rastvor 4% paraformaldehida u fosfatnom puferu (PB 0,1 M) za fiksaciju oka. Očne jabučice se uklone, mrežnjače odvoje disekcijom, fiksiraju dodatnih 2 časa na 4°C, inkubiraju u 0,1 M PB i 30% saharozi preko noći, zamrznu u smeši za optimalnu temperaturu disekcije (OCT, Tissue-Tek, Miles Laboratories, Elkhart, IN, SAD), isecaju na debljinu od 14 u,m i postavljaju na staklene slajdove za imunobojenje. Imunobojenje se izvodi prema uobičajenim postupcima, primenom više primarnih antitela. Za vizuelizaciju pod fluorescentnim mikroskopom koriste se sekundarna antitela konjugovana za flurescentni obeleživač i DAP1. Sve procedure izvode se u skladu sa propisima Švajcarske i pod licencom koju je odobrio "Kantonales Veterinaramt Basel-Land".

Rezultati:U prvoj studiji, prethodni tretman odraslih C57/B6 miševa jedinjenjem IA (400 i 2000 mg/kg/dan) u toku 3 nedelje pokazao je snažno zaštitno dejstvo od toksičnosti intravitrealne injekcije inhibitora kompleksa I rotenona, u pogledu konačnih parametara koji se dovode u vezu sa LHON, kao što su ćelijska smrt ćelija retinalnih gangliona (RGC), smanjena debljina mrežnjače, glioza i ekspresija glutamin sintetaze. Rezultati su prikazani u tabeli 5 koja sledi.

U tabeli 5, histološki podaci su izraženi kao % od kontrole (ubrizgan DMSO) ± SEM. Broj RCG ćelija zasnovan je na broju RCG ćelija/mm<2>1 dan nakon injekcije; debljina mrežnjače (pm) odnosi se na stanje 7 dana nakon injekcije; glioza se zasniva na broju relativnih fluorescentnih jedinica (RFU) GFAP-specifičnog imunobojenja 7 dana nakon injekcije; glutaminsintetaza (GS) se zasniva na broju relativnih fluorescentnih jedinica (RFU) GS-specifičnog imunobojenja 1 dan nakon injekcije. IA 400 označava prethodni tretman jedinjenjem IA u dozi od 400 mg/kg, slično tome, IA 2000 označava prethodni tretman jedinjenjem IA u dozi od 2000 mg/kg. Statistička značajnost u odnosu na grupu koja je primala nosilac + rotenon je p<<>0,05 (<*>), p < 0,01 (<**>). nje broj mrežnjača u grupi.

Ovi rezultati su ponovljeni u drugojin vivostudiji uz uključenje niže koncentracije jedinjenja IA (200 mg/kg/dan) uz primenu istog model sistema. Korišćen je modifikovani, manje invazivan postupak ubrizgavanja kako bi se još smanjila oštećenja nastala usled same injekcije. Ovo je dovelodo toga da nije primećen nikakav značajan pad u broju RCG 24 časa nakon injekcije rotenona te stoga nije bilo moguće pokazati nikakav zaštitni efekat u tom trenutku. Pa ipak, 7 dana nakon rotenonskog izazova, broj RCG bio je značajno smanjen (<35% preostalih ćelija) u poređenju sa kontrolama kojima je ubrizgan samo nosilac (tabela 2). Pod ovim uslovima, jedinjenje IA pokazalo je značajnu zaštitu preživljavanja RCG u dozama od 400 i 2000 mg/kg, kao i trend (p = 0,102) ka zaštiti u dozi od 200 mg/kg. Jedinjenje IA takođe je značajno štitilo od smanjenja debljine mrežnjače 7 dana nakon injekcije rotenona (tabela 2). Dok je rotenon u prošeku smanjivao debljinu mrežnjače sa oko 300 um (kontrola, ubrizgan nosilac) na 220 pm (ubrizgan rotenon), prethodni tretman jedinjenjem IA sprečio je ovo smanjenje u različitom obimu, u zavisnosti od koncentracije. Kod životinja koje su prethodno tretirane jedinjenjem IA u dozi od 200 mg/kg pokazana je zaštita debljine mrežnjače (272 pm) iako ovaj efekat nije dostigao statistički značaj (p = 0,1347). Pri dozi od 400 mg/kg jedinjenja IA uočena je jasna, značajna zaštita (269 pm; p = 0,03), dok je pri 2000 mg/kg uočen snažan zaštitni trend (258 pm; p = 0,06). Dalje, kao odgovor na rotenon, snažan signal specifičan za GFAP, koji se dovodi u vezu sa vlaknima, a koji ukazuje na gliozu, bio je očigledan nakon 7 dana, a značajno je smanjen dejstvom jedinjenja IA. Dobijeni podaci ukratko su predstavljeni u tabeli 6 koja sledi.

U tabeli 6, histološki podaci sedmog dana nakon injekcije su izraženi kao % od kontrole (ubrizgan DMSO) ± SEM. Broj RCG se bazira na broju RCG ćelija/mm<2>; debljina mrežnjače se meri u pm a glioza se zasniva na broju relativnih fluorescentnih jedinica (RFU) u imunobojenju specifičnom za GFAP. "S" u tabeli 6 označava kontrolnu injekciju - šlepu probu (DMSO); "V" označava tretman nosiocem; "R" označava tretman rotenonom. Izraz IA 200 definiše tretman jedinjenjem IA u koncentraciji od 200 mg/kg; slično tome, IA 400 i IA 2000 označavaju tretman jedinjenjem IA u dozama od 400 mg/kg ili 2000 mg/kg, redom. Statistička značajnost u odnosu na grupu koja je primala nosilac + rotenon je p < 0,05 (<*>). n je broj mrežnjača u grupi.

Eksperimentalna procedura ( II) :Optomotorno testiranje

Kako se gubitak RCG dovodi u vezu sa oštećenjem oštrine vida, ispitali smo da li neuroprotektivno dejstvo ispitivanog jedinjenja IA takođe pokazuje korelaciju i sa povraćajem funkcije vida. Za te svrhe, oštrina vida detektovana je kvantitativnim određivanjem optomotornog odogovora životinja podvrgnutih sistemu koji je prethodno opisan. Optomotomi odgovor meren je kao stoje prethodno opisano (viđeti Jellali A., Meziane H., Ouagazzal A-VL, et al. Vis. Res., 2005). Miševi su postavljeni na centralnu platformu okruženu motorizovanim valjkom sa crnim i belim vertikalnim trakama, koji može da rotira i u smeru kazaljke na satu i u suprotnom smeru, različitim brzinama (što može da se podesi kako bi se izazvao optimalni optokinetički odgovor) i pod uslovima konstantnog osvetljenja. Miševima je omogućeno da se naviknu na eksperimentalne uslove 5 minta, pre nego što su trake rotirane, naizmenično u smeru kazaljke na satu i u suprotnom smeru, po 2 minuta u svakom pravcu sa intervalom od 30 s između dve rotacije. Miševi su snimljeni na računar pomoću digitalne video kamere postavljene iznad aparata, kako bi se, nakon eksperimenta, ocenio broj pokreta glavom ručnim brojanjem. Pokreti glavom su beleženi samo kada je ugaona brzina okreta glave odgovarala ugaonoj brzini rotacije bubnja. Nakon što bi istraživač snimio i kodirao podatke, drugi istraživač, za koga je ta analiza bila šlepa, sprovodio je sve procene. Šifre su otkrivene nakon snimanja podataka, a otkrio ih je treći istraživač. Svaki mišje ispitan u različitim vremenskim tačkama, a aparatura je čišćena između miševa. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM (standardna greška srednje vrednosti). Upareni Studentov t-test i analiza varijanse (ANOVA) korišćeni su da se uporede nenormalizovani podaci. Statistička značajnost zadata je pri p<0,05(<*>), p<0,01(<**>)ip<0,001(<***>).

Kvantitativno određivanje oštrine vida na osnovu optomotomog odgovora izvršeno je kod miševa koji su prethodno tretirani nosiocem i idebenonom 2000 mg/kg u hrani u toku 3 nedelje. Rezultati su izraženi kroz srednju vrednost broja pokreta glave/2 min ± SEM; n = broj miševa u grupi.

Kvantitativno određivanje optomotomog odgovora izvedeno je 5 nedelja nakon injekcije 1 i 5 mM rotenona. Miševi su tretirani u toku 3 nedelje nosiocem i idebenonom 2000 mg/ kg u hrani, pre injekcije rotenona. Optomotomi odgovor je ispitivan i za smer kretanja kazaljke na satu (a) i za suprotan smer (b), gde su pokreti glavom zarad praćenja rotacije u smeru kretanja kazaljke na satu i suprotnom smeru odslikavali oštrinu vida oka u koje je ubrizgan rotenon (levo) i onog u koje nije (desno), redom. Broj pokreta glave u smeru kretanja kazaljke na satu/2 min: nosilac + rotenon 1 mM = 0,5 ± 0,5 (n=2), nosilac + rotenon 5 mM = 0,4 ± 0,4 (n = 5), idebenon 2000 mg/kg + rotenon 1 mM =9 ±2 (n = 2), idebenon 2000 mg/kg + rotenon 5 mM == 3,5 ± 1,5 (n = 7). Broj pokreta glavom u smeru suprotnom od smera kazaljke na satu / 2 min: nosilac + rotenon 1 mM = 12 ± 0 (n=2), nosilac + rotenon 5 mM = 13,6 ± l (n = 5), idebenon 2000 mg/kg + rotenon 1 mM = 12,5 ± 4,5 (n = 2), idebenon 2000 mg/kg + rotenon 5 mM = 10,5 ± 0,6 (n = 6). Rezultati su izraženi kroz srednju vrednost broja pokreta glave/2 min±SEM; n = broj miševa u grupi; id2000 = idebenon 2000 mg/kg telesne mase.

Rezultati:

Nakon intravitrealne injekcije rotenona, životinje koje su primile tretman šlepom probom izgubile su oštrinu vida (što je dokazano potpunim gubitkom pokreta glave u smeru kretanja kazaljke na satu). Međutim, životinje koje su prethodno oralno tretirane jedinjenjem IA povratile su oštrinu svog vida tokom perioda od 56 dana (tabela 7, slike 3 i 4).

/. Farmakokinetička analiza ispitivanog jedinjenja i srodnih metabolita u plazmi i

očnim tečnostima

Farmakokinetička analiza ispitivanih jedinjenja nakon oralne primene usmerena je ka određivanju njegove biološke dostupnosti i klirensa iz plazme, ali i u očnim tečnostima (vodena i staklasta tečnost). Ispitivana jedinjenja kvantitativno se određuju u plazmi i u vodenoj i staklastoj tečnosti nakon akutnog i ponavljanog tretmana (sa različitim putevima primene). Potom se određuje koncentracija u funkciji vremena, kao i farmakokinetički parametri (Cma\, AUCo-i, tmax).

Eksperimentalna procedura:Mužaci C57BL/6J miševa divljeg tipa (7 nedelja starosti, oko 25 g telesne mase) gajeni su u individualnim Makrolon kavezima tipa II sa standardnom steljom i slobodnim pristupom hrani i vodi u regularnom ciklusu svetlosti i tame od 12 časova (8 ujutru do 8 uveče). Miševi su primali pojedinačnu, ili svakodnevnu oralnu dozu ispitivanih jedinjenja (u opsegu doza od 20 do 2000 mg/kg telesne mase) ili nosioca kroz hranu ili putem gastrične sonde, na kraju svetle faze dnevnog ciklusa. Tretman može da prati jedan period ispiranja. Uzorci za farmakokinetičku analizu uzimani su u različitim vremenskim intervalima nakon primene jedinjenja. Miševi su anestezirani inhalacijom 5% isoflurana u indukcionoj komori i žrtvovani cervikalnom dislokacijom. Krv je sakupljana iz reza na glavi, za potrebe ekstrakcije plazme. Očne jabučice su disecirane kako bi se prikupile vodena i staklasta tečnost. Uzorci su brzo zamrznuti u tečnom azotu i čuvani (-80°C) do analize pomoću LC-MS/MS u skladu sa standardi zovanim procedurama. Sve procedure sa miševima izvode se u skladu sa propisima Švajcarske i pod licencom koju je odobrio "Kantonales Veterinaramt Basel-Land".

Procenjen je farmakokinetički profd idebenona (jedinjenja IA), nakon pojedinačne oralne doze date sondom mužjacima miševa. Nakon pojedinačne oralne doze od 400 mg/kg, koncentracija idebenona u plazmi, staklastoj i vodenoj tečnosti generalno je dostigla maksimum već u vreme prvog uzorkovanja (15 minuta nakon doze), što ukazuje na brzu apsorpciju i unos idebenona u oko (tabela 8). Nakon toga, koncentracija idebenona u plazmi, staklastoj i vodenoj tečnosti generalno je opadala u toku perioda od 6 časova nakon primene doze, što ukazuje na izostanak sekvestracije idebenona u oku. Dalje, čini se da je odnos (staklasta tečnost/plazma i vodena tečnost/plazma) nezavisan od vremena proteklog od primene doze, što govori u prilog izostanku akumulacije idebenona u oku. Ukupna izloženost idebenonu u staklastoj tečnosti, merena pomoću AUCo-ćhpredstavljala je oko 2% od one koja je uočena u plazmi (odnos staklasta tečnost/plazma; tabela 8). Slično tome, stepen izloženosti idebenonu u vodenoj tečnosti predstavljao je oko 3% od one primećene u plazmi (odnos vodena tečnost/plazma; Tabela 8).

Uočeni terminalni poluživot ( ha) idebenona u plazmi bio je 1,70 časova, redom (tabela 8). (Uočeni terminalni životil\ nidebenona nisu mogli da se procene za staklastu i vodenu tečnost, usled ograničenih podataka).

Rezultati:

Ukratko, nakon oralnog unosa jedinjenja IA, bilo sa hranom ili putem gastrične sonde, kod miševa je došlo do brze apsorpcije idebenona iz GI trakta.

Ono što je predstavljalo iznenađenje je da je uočen brz unos idebenona u oko, tj. staklastu i vodenu tečnost miša (maksimalno < 15 min nakon primene doze). Koliko je nama poznato, u literaturi ranije nikada nije navedena ni jedna studija koja bi proučavala koncentracije jedinjenja IA u oku. Konkretnije, ne postoji presedan bilo kakvog merenja koncentracije idebenona u oku nakon jednostavne oralne primene (sondom ili u hrani).

Stoga smo pronašli, što je predstavljalo iznenađenje, da jednostavna oralna primena (sondom ili djetom) dovodi do dovoljnih koncentracija jedinjenja IA u oku, kako bi se ispoljila povoljna dejstva na mitohondrijske bolesti kao što su LHON, autozomalna dominantna optička atrofija (DOA), makularna degeneracija, glaukom, retinopatija, katarakta, druže optičkog diska (ODD), MELAS (mitohondrijalna miopatija, encefalomiopatija, laktička acidoza sa simptomima nalik šlogu), MERFF (mioklonična epilepsija sa iskidanim mišićnim vlaknima), MNGIE (mioneurogenična gastrointestinalna encefalomiopatija), Kerns-Sajr sindrom, deficijencija CoQ10 ili deficijencije mitohonđrijalnog kompleksa (tj. kompleksa 1-5 i CPEO), pri čemu su sve ove bolesti u vezi sa oftalmološkim fenotipom.

Odgovarajuće koncentracije jedinjenja IA u staklastoj i vodenoj tečnosti povećavale su se približno proporcionalno sa dozom. Stoga jedinjenje IA (IA) pokazuje, što je važna odlika kada je reč o mogućnosti razvoja lekova, linearnu kinetiku apsorpcije u tečnosti oka, jer je odnos (staklasta tečnost/plazma i vodena tečnost/plazma) nezavisan od primenjene doze. Dalje, ni je došlo do akumulacije jedinjenja IA u oku, jer je odnos (staklasta tečnost/plazma i vodena tečnost/plazma) nezavisan od trajanja doziranja ili vremena proteklog od doziranja. Takođe nije pronađena sekvestracija jedinjenja IA u oku.

Claims (5)

1. Jedinjenje predstavljeno opštom formulom (I) i enantiomeri, tautomeri, solvati ili farmaceutski prihvatljive soli takvih jedinjenja u kojima je R<1>supstituent predstavljen formulom (II): gde su R-' i R<6>oba atomi vodonika ili R<5>je atom vodonika a R6 je etil grupa, ili R<3>i R<6>su oba metil grupe, R2 je metil grupa, R<3>je metoksi grupa, a R<4>je metoksi grupa; za upotrebu u tretmanu mitohondrijske bolesti, naznačenu time što je navedena mitohondrijska bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od Leberove nasledne optičke neuropatije (LHON), autozomalne dominantne optičke atrofije (DOA), makularne degeneracije, glaukoma, retinopatije, katarakte i druza optičkog diska (ODD).

2. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što su R<J>i R<6>oba vodonikovi atomi.

3. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što se navedeno jedinjenje primenjuje oralno.

4. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 3. naznačeno time što je navedena mitohondrijska bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od Leberove nasledne optičke neuropatije (LHON), autozomalne dominantne optičke atrofije (DOA), makularne degeneracije i glaukoma.

5. Upotreba jedinjenja sa opštom formulom (I) gde su R<1>do R<4>kao što je definisano u patentnom zahtevu 1, za pripremu leka za tretman mitohondrijske bolesti, naznačena time što je navedena mitohondrijska bolest izabrana iz grupe koja se sastoji od Leberove nasledne optičke neuropatije (LHON), autozomalne dominantne optičke atrofije (DOA), makularne degeneracije, glaukoma, retinopatije, katarakte i druza optičkog diska (ODD).