RS55281B1 - Metod za tretman glomerulonefritisa - Google Patents

Description

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na novu terapeutsku upotrebu za agense koji moduliraju aktivnost IL-6 ili intereaguju sa njim. Preciznije, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu takvih agensa u terapiji određenih glomerulonefritskih poremećaja. Određenije, predmetni pronalazak obezbeđuje inhibitore IL-6 aktivnosti za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi glomerulonefritisa povezanog sa vaskulitis poremećajem, kao što je Wegenerova bolest, navedeni tretman i/ili profilaksa sadrži ciljanje i regulaciju potipeptida IL-6, i agense koji interaguju sa polipeptidom ili moduliraju njegovu aktivnost( Hirano et al,, 1986 Nature 324, 73- 76),

[0002] Pokazano je da IL-6 igra centralnu ulogu u imunoregulaciji, inflamaciji, hematopoezi i onkogenezi. Unutar imunog sistema, IL-6 indukuje proizvodnju antitela B-ćelija povećavajući količinu poliklonskog imunoglobulina. Takođe izaziva ekspresiju receptora interleukin-2 (IL-2) na T-ćelije( Nomo et at., 1987, Immunot. tetters, 15, 3, 249- 253)i pomaže proizvodnju IL-2 u aktiviranim T-ćelijama čime indukuje i rast i diferencijaciju citotoksičnih T-ćelija( Okada et at., 1988 J. immunot 141, 5, 1543- 1549).IL-6 takođe može da utvrdi diferencijaciju monocita u makrofage( Chomarat

et al, 2000 Nature Immunol, 6:510- 514).

[0003] FunkcijaIL-6 nije ograničena na imuni odgovor zato što deluje u hematopoezi, trombopoezi, formaciji osteoklasta i izazivanju reakcije hepatične akutne faze što dovodi do povećanja C-reaktivnog proteina (CRP) i serum amiloid A (SM) proteina. Poznato je IL-6 može da bude i faktor rasta za epidermalne keratinocite, bubrežne mezangijalne ćelije, mijelomske i plazmađtomske ćelije( Grossman et at, 1989 Proc Natl Acad Sci, 86 ( 16) 6367- 6371; Hori! et al, 1989, J. Immunol, 143, 12, 3949- 3955;. Kawano et al, 1988, Nature 332, 6159, 83- 85).Širok spektar tipova ćelija proizvodi IL-6, uključujući monocite/makrofage, fibroblaste, epidermalne keratinocite, vaskutarne endotelne ćelije, bubrežne mezangijalne ćelije, glijalne ćelije, hondrocite, T i B-ćelije i neke ćelije tumora( Akira et al., 1990, FASEB J., 4, 11, 2860- 2867).Osim ćelija tumora koje konstitutivno proizvode IL-6, normalne ćelije ne proizvode IL-6 ukoliko nisu stimulisane na odgovarajući način.

[0004]IL-6 receptor, IL-6R, vezuje IL-6 sa niskim afinitetom. Zato što IL-6R nema domen intracelularnog signala transdukcije, samo vezivanje IL-6 sa IL-6R ne dovodi do ćelijske aktivacije kao element signalne transdukcije, gp130, je takođe potreban. Slično tome, ekspresija ćelijske površine IL-6R ne znači da ćelija reaguje na IL-6 stimulaciju. Proteolitičko razdvajanje dovodi do oslobađanja rastvorljivog IL-6R (slL-6R; sgp80) koji može da veže cirkulišući IL-6 i poveća poluživot IL-6. Obe vrste, i ćelijski vezan i rastvorljivi IL-6R, doprinose ćelijskoj aktivaciji. IL-6 signalizacija kroz IL-6R koji je ćelijski vezan je označena kao cis signalizacija dok ćetijska aktivacija kroz rastvorljivi IL-6R je deflnisana kao trans signalizacija. IL-6 koji vrši signalizaciju kroz IL-6R može stimulisati ćelije koje eksprimiraju gp130 ali ne i IL-6R.

[0005]Poznata su antitela koja neutrališu i blokiraju IL-6( Kalai et al, 1997, Eur. J. Biochem. 249, 690- 700;

Brakenhoff et al., 1990, Journal of lmmunolosy, 145, 561- 568;. Wendtin$ et al., 1993, J. Rheumatolo$ y, 29, 259- 262;

US patent 5, 856, 135)kao i neutrališuća autoantitela( Hansen et al, Eur. J. Immunol, 1995,25,348- 354).Terapeutska antitela na IL-6R su takodje opisana{ WO2004039826&Kishimoto, 2005, Ann. Rev. Immunot. 23:1- 21),druga napomena opisuje efikasnost u reumatoidnom artritisu. Takođe je zabeleženo da je isto antitelo pokazalo efikasnost u fazi II studije Kronove bolesti. Efikasnost je takođe pokazana na oba antitela anti-IL-6 i anti-lL-6R u bolesti sličnoj lupusu u NZB/W F1 miševa( Fink et al., 1994 J. Clin. tnvest. 94,585;Mihara et at., 1998, Clin. Exp. Immunol. 112, 397)i neutrališuće antitelo mišjeg IL-6 receptora je potisnulo kolitis u usvojenom modelu prenosa bolesti( Yamamoto et at., 2000, J. Immunol. 164, 4878; Atreya et at., 2000 Nature Med. 6, 583).Liang et al (/mmuno/ogy119, 296- 305)otkriva monoklonalno antitelo anti-IL6 koje inhibira autoimune reakcije u mišjem modelu sistemskog lupus eritematozusa.

[0006] Goodpastuerov sindrom je autoimuna bolest koju karakteriše taloženje antitela na glomerularnoj bazalnoj membrani (gbm) zajedno sa komplementom, progresivnim glomerulonefritisom 1 često bubrežnom insuficijencijom. Unakrsna reakcija sa bazalnom membranom u plućima uzrokuje plućno krvarenje. Goodpastuerov sindrom uglavnom pogađa mlade muškarce koji su belcl, u ovoj bolesti muška dominacija je između 2 i 9 đo 1. Dok kod dece utiče na oba pola podjednako. Klasifikacija može biti teška jer su ponekad pogođena ili pluća ili bubrezi, ali ne oba u isto vreme. Međutim, prisustvo autoantitela na glomerularnoj bazalnoj membrani je dijagnostička osobina kod koje je polumesečni glomerulonefritis karakteristična patološka osobina, gde većina glomerula pokazuje polumesece slične starosti( Salama

& Pusey, 2002; Curr. Opin. Nephrolosy and Hypertension, 11:279- 286).

[0007] Uopšteno, koriste se tri vrste tretmana za Goodpastuerov sindrom. Tretman bez lekova obuhvata intubaciju, mehaničku ventilaciju i hemodijalizu, koje su često potrebne u akutnoj fazi. Ponavljanjem plazmafereze antitela iz cirkulacije se uklanjaju sa anti-glomerularne bazalne membrane. Međutim, većina slučajeva napreduje do poslednjeg stadijuma bubrežne insuficijencije u roku od nekoliko meseci. Poslednji stadijum bolesti bubrega se može tretirati dugoročnom hemodijalizom. Lečenje tekovima uključuje visoke doze kortikosteroida sa ciklofosfamidom ili azatioprinom. Trajanje imunosupresivne terapije značajno varira i terapija može biti potrebna i duže od 12 do 18 meseci kod nekih pacijenata. U pogledu hirurških tretmana, posle bilateralne nefrektomije zabeležen je prestanak plućnog krvarenja. Transplantacija bubrega je takođe korišćena kao način za tretiranje bolesti u poslednjem stadijumu. Zbog teške prirode ovih tekova, potrebne su konkretnije i usmerenije terapije za lečenje glomerulonefritisa vezanog za Goodpastuerov sindrom.

[0008] Vaskulitis može biti sistemski i vaskulitis malih krvnih sudova kao onaj povezan sa bolestima sa antineutrofilnim cirkulišućim antitetima, na primer, VVegenerova bolest (tzv. VVegenerova granulomatoza). VVegenerova bolest podrazumeva zapaljenje arterija pluća, nosnih kanala i bubrega.

[0009] IgA nefropatija (IgAN, takođe poznata kao Bergerova bolest) je bolest bubrega, koja utiče na glomerule. IgA nefropatija je najčešći glomerulonefritis sa IgA naslagama u glomerulama. lako je mnogo istraživanja u toku, i dalje nije objašnjeno zašto je IgA deponovan u bubrezima i zašto može da izazove probleme kao što je hronična bubrežna insuficijencija.

[0010] Do sada nije poznato da li IL-6 igra bilo kakvu ulogu u patogenezi Goodpastuerovog sindroma, VVegenerove bolesti ili IgA nefropatije.

[0011] Predmetni pronalazak se zasniva na iznenađujućem otkriću da IL-6 predstavlja terapeutski cilj za lečenje i/ili profilaksu glomerulonefritisa povezanog sa jednim ili više poremećaja odabranih iz grupe koju čine Goodpastuerov sindrom, vaskulitis poremećaj, VVegenerova bolest, IgA nefropatija i inflamatorna bolest vezana za bazalnu membranu. Pronalazak pokazuje da su inhibitori IL-6 aktivnosti aktivni u životinjskom modelu Goodpastuerovog sindroma. Konkretno, pokazano je da je anti-IL-6 antitelo koje inhibira IL-6 aktivnost aktivno u životinjskim modelima Goodpastuerovog sindroma.

[0012] Pronalazak obezbeđuje agens koji komunicira sa IL-6 ili modulira njegovu aktivnost za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje 1/111 profilaksu glomerulonefritisa koji je vezan za vaskulitisni poremećaj, kao što je VVegenerova bolest.

[0013] Agensi koji interaguju sa IL-6 ili moduliraju njegovu aktivnost su u daljem tekstu obelezeni kao "inhibitori" IL- 6 aktivnosti, naročito aktivnosti IL-6 u vaskulitisnom poremećaju, kao što je VVegenerova bolest. Prema predmetnom pronalasku inhibitori (agensi) mogu delimično ili u potpunosti inhibirati IL-6 aktivnost. Inhibitori od koristi u predmetnom pronalasku obuhvataju, bez ograničenja, inhibitore koji su sposobni da intereaguju sa IL-6 ili IL-6R (npr. vezivanje, ili prepoznavanje) ili su sposobni da inhibiraju interakciju između IL-6 i IL-6R ili su sposobni da inhibiraju interakciju izmedju IL-6 i gp130 111 su sposobni da inhibiraju interakciju između kompleksa IL-6/IL-6R i gp130.

[0014] Inhibitori IL-6 aktivnosti su dobro poznati u struci, kao što su i metode identifikacije i proizvodnje takvih inhibitora. Takvi inhibitori mogu biti, bez ograničavanja, antitela, nukleinske kiseline (npr. DNK, RNK, antisens RNK i siRNK), ugljeni hidrati, lipidi, proteini, polipeptldi, peptidi, peptidomimetici, mali molekuli i drugi lekovi. Prema pronalasku pogodan Inhlbitor je antitelo koje se vezuje za IL-6 ili IL-6R i utiče na IL-6R-ligand interakciju, antitelo koje se vezuje za IL-6 i utiče na IL-6-gp130 interakciju. Dakle, upotrebljivi agensi prema pronalasku uktjučuju, bez ograničenja, agense koji su sposobni da Intereaguju (npr. vezivanje, ili prepoznavanje) sa IL-6, ili su sposobni da moduliraju interakciju, ili aktivnost IL-6.

[0015] Inhibitori IL-6 aktivnosti su dobro poznati u struci, kao što su i postupci identifikacije i proizvodnje takvih inhibitora. Primeri uključuju, avimer proteine, videti primer,Sitverman et al., 2005, Nat. Biotecbnol.23(12):1556-61; antitela kao što je tociltzumab(Chugar Pharmaceutkal Co. Ltd.) ;CNTO-328{ Centocor Inc.) ;i sgpl30/slL-6R alfa fuzioni proteini{ Conaris Research Institute AO).Prema tome, primeri agensa kandidata uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela, nukleinske kiseline (npr. DNK i RNK), ugljene hidrate, lipide, proteine, polipeptide, peptide, peptidomimetike, male molekule (npr. NHE) i druge lekove.

[0016] Agensi se mogu dobiti korišćenjem bilo kog od brojnih pristupa u kombinatorijalnim metodama biblioteke poznatim u struci, uključujući: biološke biblioteke; prostorno adresabilne paralelne biblioteke čvrste faze ili rastvorljive faze; sintetičke metode biblioteke koje zahtevaju dekonvotuciju; "jedno zrno jedno jedinjenje" metod biblioteke; 1 sintetičke metode biblioteke koje koriste afinitet hromatografske selekcije. Pristup biološke biblioteke je pogodan za peptidne biblioteke, dok su ostala četiri pristupa primenljiva za peptide, ne-peptidne oligomere ili male molekulske biblioteke jedinjenja(Lom, 1997, Anticancer Drus Des. 12:145; U. S. 5, 738, 996; and U. S. 5, 807, 683).

[0017] Primeri pogodnih metoda zasnovanih na ovom opisu za sintezu molekularnih biblioteka se mogu naći u struci, na primer u: DeMtt etal., 1993, Proc.Nat!.Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al., 1994, Proc. Natt. Acad. Sci. USA

91:11422; Zuckermann et al., 1994, J. Med. Chem. 37:2678; Cho et al., 1993, Science 261:1303; Carrett etal., 1994,

An^ evf. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al., 1994, An$ ew. Chem. Int. Ed.£05/.33:2061; and Galiop et al., 1994, J. Med. Chem. 37:1233.Biblioteke jedinjenja mogu biti predstavljene, na primer, kao rastvor (e.g.Houshten, 1992, BiO/ Techniques 13:412- 421),ili zrna( Lam, 1991, Nature 354:82- 84),delići( Fodor, 1993, Nature 364:555- 556),bakterije (US5, 223, 409),spore(US5,571,698;5, 403, 484; and 5, 223, 409),plazmidi( Cult et ai, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865- 1869)ili bakteriofage{ Scott and Smith, 1990, Science 249:386- 390; Devtin, 1990, Science

249:404- 406; Cv/ irlaetal., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378- 6382; andFelki, 1991, J. Mol. Biot. 222:301- 310).

[0018] U najpoželjnijoj realizaciji, agens je antitelo koje po mogućstvu specifično prepoznaje IL- 6 ili IL-6R, Dakle, agens koji se upotrebljava u lečenju i/ili profilaksi glomerulonefritisa povezanog sa vaskulitičnšm poremećajem, kao što Wegenerova bolest je pogodno da bude antitelo koje intereaguje sa IL-6 (tj. vezuje ili prepoznaje) ili modulira aktivnost IL-6. Shodno tome, dobija se antitelo koje je inhibitor IL-6 aktivnosti za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje i/ili profilaksu glomerulonefritisa povezanog sa vaskulitičnim poremećajem, kao što je VVegenerova bolest.

[0019] U jednom primeru antitela selektivno intereaguju sa IL-6. Najpoželjnija su antitela koja specifično intereaguju sa IL-ć, poželjan je ljudski IL-6. Konkretno interakcija sa IL-6 (npr. prepoznavanje ili vezivanje) znači da antitela imaju veći afinitet za IL- 6 nego za druge polipeptide. Primeri pogodnih antitela su ona koja inhibiraju aktivnost IL-6 vezivanjem za IL-6 na takav način da ga sprečavaju da bude biološki aktivan, na primer sprečavanjem vezivanja IL-6 za njegov receptor.

[0020]U drugom primeru, antitela selektivno intereaguju sa IL-6 receptorom, IL-6R. Selektivna interakcija sa IL-6 (npr. prepoznavanje ili vezivanje) znači da antitela imaju veći afinitet za IL-6R polipeptid nego za druge polipeptide. Primeri pogodnih antitela su ona koja sprečavaju IL-6 da se veže za IL-6 receptor. U skladu sa time, predmetnim pronalaskom se obezbeđuje anti-IL-6R antitelo za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje i/ili profilaksu glomerulonefritisa povezanog sa vaskulitisnim poremećajem, kao što je VVegenerova bolest.

[0021]Ovde je takođe opisan agens koji je nukleinska kiselina koja intereaguje sa IL-6 ili IL-6R. Opisana je upotreba li—6 ili IL-6R nukleinske kiseline koja reaguje sa IL-6 ili moduliše ekspresiju 1li aktivnost sisarskog IL-6 polipeptida za proizvodnju leka za lečenje i/iU profilaksu glomerulonefritisa povezanog sa Goodpastuerovim sindromom, vaskulitisnim poremećajem, IgA nefropatijom i inftamatornom bolešću vezanom za bazalnu membranu. Opisano je da se molekuli IL-6 ili IL-6R nukleinske kiseline mogu koristiti kao anti-sens molekuli, da bi promenili ekspresiju svojih polipeptida vezivanjem za komplementarne nukleinske kiseline. IL-6 ili IL-6R nukleinske kiseline se mogu dobiti korišćenjem standardnih tehnika kloniranja iz na primer genomske DNK ili cDNK ili se mogu sintetisati primenom dobro poznatih i komercijalno dostupnih tehnika. IL-6 ili IL-6R nukleinske kiseline mogu sadržati jedan ili više nukleotidnih supstitucija, adicija ili delecija u nukleotidnu sekvencu IL-6 ili IL-6R nukleinske kiseline. Standardne tehnike poznate onima koji su vešti u ovoj struci se mogu koristiti za uvođenje mutacija, uključujući, na prime, mutagenezu usmerenu na položaj i PCR-usmerenu mutagenezu. Ovde opisana antisens nukleinska kiselina obuhvata IL-6 ili IL-6R nukleinsku kiselinu sposobnu za hibridiziranje zahvaljujući nekoj sekvenci komplementarnosti sa delom RNK (poželjno iRNK) koja kodira odgovarajući polipeptid. Antisens nukleinska kiselina može biti komplementarna kodirajućem i/ili nekodirajućem delu iRNK koja kodira takav polipeptid. Antisens nukleinske kiseline dovode do inhibicije ekspresije IL-6 ili IL-6R polipeptida. Stoga, opisan je metod za lečenje i/ili profilaksu MS-a koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine inhibitora IL-6 aktivnosti gde inhibitor obuhvata najmanje osam nukleotida koji su antisens na gen ili cDNK koja kodira IL-6 ili IL-6R polipeptid. Opisana je i upotreba nukleinskih kiselina koje sadrže najmanje osam nukleotida koji su antisens na gen ili cDNK koja kodira IL-6 ili IL-6R polipeptid za proizvodnju leka za lečenje i/ili profilaksu glomerulonefritisa povezanim sa jednim ili više poremećaja odabranih iz grupe koju čine Goodpastuerov sindrom, vaskulitisni poremećaj, VVegenerova bolest, IgA nefropatija i inflamatorne bolesti vezane za bazalnu membranu, a posebno Goodpastuerov sindrom.

[0022]IL-6 iliIL-6Rpolipeptidi ili ćelije koje eksprimiraju navedene polipeptide mogu da se koriste za proizvodnju antitela, npr. koje specifično prepoznaju navedene IL-6 ili 1L-6R polipeptide. IL-6 i IL-6R polipeptidi mogu biti 'zreli' polipeptidi ili biološki aktivni fragmenti ili derivati. IL-6 i IL-6R polipeptidi mogu biti pripremljeni postupcima dobro poznatim u struci iz genetski modifikovanih ćelija domaćina koje sadrže ekspresione sisteme ili se mogu preuzeti iz prirodnih bioloških izvora. U predmetnoj upotrebi, izraz "polipeptidi" uključuje peptide, polipeptide i proteine. Oni se koriste naizmenično ukoliko nije drugačije specifikovano. IL-6 i IL-6R polipeptidi mogu u nekim slučajevima biti deo većeg proteina kao što je fuzioni protein, koji je fuzionisan oznakom afiniteta. Antitela koja su generisana protiv IL-6 ili IL-6R polipeptida mogu se dobiti primenom polipeptida na životinji, poželjno neljudskoj životinji, korišćenjem dobro poznatih i rutinskih protokola, videti na primerHandbook of Experimental Immunoto3y, D.M.VVe/r ( ed.), Voi4,Blackwelt Scientific Publishers, Oxford, Ensland, 1986.Mnoge toplokrvne životinje, poput zečeva, miševa, pacova, ovaca, pilića, krava ili svinja mogu biti imunizovane. Međutim, miševi, zečevi, svinje i pacovi su generalno najpoželjniji.

[0023]Termin 'antitelo' kako se ovde koristi obuhvata kompletna antitela i funkcionalno aktivne fragmente ili njihove derivate i mogu biti, ali nisu ograničena na poliklonalna, monoklonalna, multivalentna, multispecifična, humanizovana ili himerna antitela, jednolančana antitela, Fab fragmente, Fab' i F(ab')2 fragmente, fragmente koje proizvodi Fab ekspresiona biblioteka, antiidiotipska (antild) antitela, i epltop vezujuće fragmente od bilo čega gore pomenutog(Wdet( na primer Hotliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23( 9) :1126- 1136).Antitela obuhvataju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, t.j. molekula koji sadrže antigen vezujući deo koji specifično vezuje antigen. Molekuli imunoglobulina iz ovog pronalaska mogu biti bilo koje klase (npr. IgG, IgE, IgM, IgD ili IgA) ili podklase molekula imunoglobulina.

[0024]Antitela koja se upotrebljavaju u pronalasku mogu biti proizvedena bilo kojim pogodnim postupkom, poznatim u struci. Ovakva antitela uključuju, ali nisu ograničena na, poliklonalna, monoklonalna, humanizovana, antitela izvedena uz pomoć faga ili himerna antitela.

[0025]Monoklonalna antitela mogu biti pripremljena bilo kojom metodom poznatom u struci kao što je hibridoma tehnika( Kohler & Milstein, Nature, 1975, 256:495- 497),trioma tehnika, humana hibridoma tehnika B-ćelija(Kozboretal., Immunology Today, 1983, 4, 72)i EBV-hibridoma tehnika( Cole et al., " Monoctonal Antibodies and Cancer

Therapy", pp. 77- 96, Alan R. Liss, Inc., 1985).

[0026]Antitela koja se upotrebljavaju u ovom pronalasku mogu takođe biti proizvedena korišćenjem pojedinačnih metoda limfocit antitela kloniranjem 1 ekspresijom imunoglobulinske cDNK varijabilnog područja generisane iz pojedinačnih limfocita odabranih za proizvodnju specifičnih antitela, na primer, po metodama koje su opisane u

Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 93( 15), 7843- 7848, W0 92/ 02551, W02004/ 051268 and

WO2004/ 106377.

[0027]Himerna antitela su ona antitela koja su kodirana imunoglobulinskim genima napravljenim genetskim inženjeringom tako da se laki i teški genetski lanci sastoje od imunoglobulinskih segmenata gena koji pripadaju različitim vrstama.

[0028]Humanizovana antitela su molekuli antitela koji imaju jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) iz ne-humane vrste i jedan okvirni region iz molekula humanog imunoglobulina{ videti na primer, US 5, 585, 089).

[0029] Metode za kreiranje i proizvodnju rekombinantnih antitela su dobro poznate u struci (videti primer,8oss et al.,

US 4, 816, 397; Cabilly et al., US 6, 331, 415; Simmons et al., 2002, Journal of Immunotogical Methods, 263, 133- 147;

Shrader et al., WO 92102551; Orlandi et at., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 3833; Riechmann et al., 1988,

Nature, 322, 323; Oueen et al., US 5, 585, 089; Adair, V/ 091109967; Mountain and Adair, 1992, Biotechnol. Genet. Eng.

Rev, 10, 1- 142; Verma et at., 1998, J. Immunol. Methods, 216:165- 181; Hotli$ er and Hudson, 2005, Nature Biotech.

23( 9) :1126- 1136).

[0030] Antitela za primenu u predmetnom pronalasku takođe mogu biti generisana korišćenjem različitih metoda prikaza faga poznatih u struci i uključuju one objavljene uBrinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods, 182:41- 50;

Ames et al., 1995, J. Immunol. Methods, 184, 177- 186; Kettteboroush et at. 1994, Eur. J. Immunol., 24, 952- 958;

Persic et al., 1997, Gene, 187, 9- 18; and Burton et al., 1994, Advances in Immunol., 57, 191- 280; WO 90/ 02809; WO

91/ 10737; WO 92/ 01047; WO 92118619; WO 93/ 11236; WO 95/ 15982; and WO 95/ 20401; and US 5, 698, 426; 5, 223, 409;

5, 403, 484; 5, 580, 717; 5, 427, 908; 5, 750, 753; 5, 821, 047; 5, 571, 698; 5, 427, 908; 5, 516, 637; 5, 780, 225; 5, 658, 727;

5, 733, 743; and 5, 969, 108.

[0031]Takođe, transgeni miševi, ili drugi organizmi, uključujući druge sisare, se mogu koristiti za proizvodnju antitela

( videti primer US 6, 300, 129).

[0032]Fragmenti antitela i metode za njihovu proizvodnju su dobro poznate u struci, videti primerVerma et at.,

1998, Journal of Immunolosical Methods, 216, 165- 181.

[0033]Posebni primeri fragmenata antitela za primenu u predmetnom pronalasku su Fab fragmenti koji poseduju prirodan ili modifikovani zglobni region. Odredjeni broj zglobnih regiona je vec opisan, na primer, uUS 5,677,425, W099f5549, / W09825971 ioni su uključeni ovde po preporuci.

[0034]Dalji primeri pojedinih fragmenata antitela koji se upotrebljavaju u predmetnom pronalasku uključuju one opisane u Međunarodnim patentnim prijavamaVVO20O5O03169, WO2005003170 i V/ 02005003171.Naročito, poželjni su Fab fragmenti modifikovanih antitela koji su opisani uWO2005003f69.

[0035]Antitela koja se upotrebljavaju u pronalasku uključuju analoge i derivate koje modifikuje, na primer, ali bez ograničavanja, kovalentna veza bilo koje vrste molekula. Poželjno je da pomenuta veza ne ugrožava imunospecifično vezivanje. Tako, antitelo koje se koristi u predmetnom pronalasku može biti spojeno sa jednim ili više efektorskih molekula. Po mogućstvu, efektorni molekul može povećati poluživot antitela in vivo, i/ili smanjiti imunogenost antitela i/ili povećati prenos antitela preko epitelne barijere do imunog sistema. Primeri pogodnih efektorskih molekula ovoga tipa obuhvataju polimere, dekstran, hidroksipropilmetakrilamid (HPMA), albumin, albumin vezujuće proteine ili albumin vezujuća jedinjenja kao što su ona opisana uWO2005f J7984.

[0036] Kada je efektorni molekul polimer, on može, generalno, biti sintetički ili prirodni polimer, na primer opciono supstituisani ravnolančani ili razgranati lanačani polialkilen, potialkenilen ili polioksialkilen polimer ili razgranati ili ravni polisaharid, npr. homo- ili hetero- polisaharid. Videti primer,Veronese and Pasut, 2005, Drug Discoven/Today,

10( 21) :1451- 1458; Pasut et al., 2004, Expert Opinion in Therapeutic Patents, 14( 6) :859- 894.

[0037]Posebni opcioni supstituenti koji mogu biti prisutni na gore pomenutim sintetičkim polimerima obuhvataju jednu ili više hidroksi, metil ili metoksi grupa.

[0038] Posebni primeri sintetičkih polimera obuhvataju opciono supstituisane ravne Ili razgranate lančane poli(etilenglikol), poli(propilenglikol), poli(vinilalkohol) ili njihove derivate, posebno proizvoljno supstituisan poli(etilenglikol) kao sto je metoksipoli(etilenglikot) ili njegove derivate.

[0039]Određeni prirodni polimeri uključuju laktozu, amilozu, dekstran, glikogen ili njihove derivate.

[0040]Izraz "derivati" u ovom slučaju je namenjen da podrazumeva reaktivne derivate, na primer tiol-selektivne reaktivne grupe kao što su maleimidi i si. Reaktivna grupa može biti povezana direktno ili preko vezujućeg segmenta sa potimercm. Razume se da će ostatak takve grupe u nekim slučajevima formirati deo proizvoda kao vezujuća grupa između fragmenta antitela i polimera.

[0041]Veličina polimera može varirati po želji, ali obično imaju prosečnu molekulsku težinu u opsegu od 500Da do 50000Da, a poželjno bi bilo od 5000Da do 40000Da i još poželjnije od 200000a do 40000Da. Veličina polimera može biti posebno odabrana na osnovu namene proizvoda, na primer sposobnosti da lokalizuje određena tkiva kao što su tumori ili produži cirkulišući potu-život (zapregled videti Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531- 545).Tako, na primer, kada je svrha proizvoda da napusti cirkulaciju i prodre u tkivo, na primer, za upotrebu u lečenju glomerulonefritisa, može biti pogodno koristiti polimer sa malom molekulskom masom, na primer sa molekulskom težinom od oko 5000Da. Za primene gde proizvod ostaje u cirkulaciji, može biti pogodno da se koristi polimer veće molekulske težine, na primer, da ima molekulsku masu u opsegu od 20000Da do 40000Da.

[0042] Naročito poželjni polimeri uključuju polialkilen polimer, kao što je poli(etilenglikol) ili, naročito, metoksipoli(etilenglikol) ili njihov derivat, a naročito sa molekulskom težinom u rasponu od oko 15000Da do oko 40000Da.

[0043] U jednom primeru antitela koja se upotrebljavaju u predmetnom pronalasku su vezana za poli(etitenglikot)

(PEG) ostatke. U jednom posebnom primeru antitelo je fragment antitela i PEG molekuli mogu biti vezani preko bilo kojeg raspoloživog bočnog lanca amino kiselina ili terminal aminokiselinske funkcionalne grupe koja se nalazi u fragmentu antitela, na primer bilo koje slobodne amino, imino, tiol, hidroksil ili karboksil grupe. Takve aminokiseline se mogu prirodno javiti u fragmentu antitela ili se mogu ugraditi u fragment primenom metoda rekombinantne DNK( videti primer US 5, 219, 996; US 5, 667, 425; W098/ 25971).U jednom primeru, molekul antitela ovog pronalaska je modifikovani Fab fragment gde je modifikacija dodavanje na C-terminalni kraj svog teškog tanca od jedne ili više aminokiselina da bi se omogućilo vezivanje efektorskog molekula. Poželjno je da dodatne aminokiseline formiraju modifikovani zglobni region koji sadrži jedan ili više ostataka cisteina na koje efektorni molekul može da se veže. Višestruke lokacije se mogu koristiti za vezivanje dva ili više PEG molekula.

[0044] Poželjno je da su PEG molekuli kovalentno vezani preko tiol grupe od najmanje jednog cisteinskog ostatka koji se nalazi u fragmentu antitela. Svaki molekul polimera koji je vezan za modifikovani fragment antitela može biti kovalentno vezan za atom sumpora cisteinskog ostatka koji se nalazi u fragmentu. Kovalentna veza će uglavnom biti disulfid veza ili, posebno, ugljenik-sumpor veza. Kad se tiol grupa koristi kao mesto vezivanja odgovarajući aktivirani efektorski molekuli, na primer tiol selektivni derivati poput maleimida i dsteinskih derivata se mogu koristiti. Aktivirani polimer može biti korišćen kao početni materijal u pripremi polimer-modifikovanih fragmenata antitela kao što je opisano gore. Aktivirani polimer može biti bilo koji polimer koji sadrži tiol reaktivnu grupu kao što je alfa-halokarboksilna kiselina ili estrom, npr. jodoacetamid, imfd, npr. maleimld, sulfon vinil ili disulfid. Takvi polazni materijali se mogu dobiti komercijalno(npr. iz Nektara, nekada Shearvater Polimers Inc., Huntsvilte, AL, USA)1li se mogu pripremiti od komercijalno dostupnih početnih materijala korišćenjem konvencionalnih hemijskih postupaka. Određeni PEG molekuli sadrže 20K metoksi-PEG-amin (mojuse dobiti Iz Nektara, nekada Shearv/ ater; Rapp Potymere; i SunSlo) iMPEG-SPA(mogu se dobiti iz Nektara, nekada Shearmter).

[0045] U jednom aspektu, antitelo je modifikovani Fab fragment koji je PEGilovan, tj. ima PEG (poli(etilenglikol)) kovalentno vezan za sebe, npr. prema postupku opisanom u EP 0948544[videti i " Poly( ethyleneglycol) Chemistry,

Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris ( ed), Plenum Press, New York, " Poly( ethyleneglycol)

Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris i S. Zatlpsky ( eds), American Chemical Society,

Wash1nston DC i " Bioconjugation Protein Couplins Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam i A. Dent,

Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Đrus Delivery Reviews 2002, 54:531- 545].U jednom primeru PEG je vezan za cistein u zglobnom regionu. U jednom primeru, PEG modifikovani Fab fragment ima maleimld grupu kovalentno vezanu za jednu tiol grupu u modifikovanom zglobnom regionu. Lizin ostatak može biti kovalentno vezan za maleimid grupu i za svaku od amino grupa, na lizin ostataku može biti vezan metoksipoli(etilenglfkot) polimer koji ima molekulsku težinu od približno 20,000 Da. Stoga, ukupna molekulska težina PEG-a vezanog za Fab fragment može biti približno 40,000 Da.

[0046] U jednom primeru efektorski molekul je PEG i spojen je pomoću metoda opisanih uW098/25971 i WO2004072116pri čemu je lisilmaleimid grupa je vezana za cisteinski ostatak na C-terminalnom kraju teškog lanca, a svaka amino grupa lizil ostatka ima kovalentno vezan metoksipoli(etilenglikol) ostatak koji ima molekulsku masu od oko 20,000 Da. Dakle, ukupna molekulska težina PEG-a vezanog za antitelo je približno 40,000 Da.

[0047] PEG se vezuje za ove fragmente tako sto prvo smanjuje interlančanu disulfid vezu između interlančanih cisteina na CL i CH1 i naknadno pričvršćuje PEG za slobodne tiole. Kada je PEG vezan za interlančane cisteine ne postoji interlančana disulfid veza između teškog i lakog lanca. Pogodni redukujući agensi za smanjenje interlančane disulfid veze su široko poznati u struci, na primer oni opisani uSingh et at., 1995, Methods in Enzymotogy, 251, 167- 73.Posebni primeri uključuju tiol zasnovane redukcione agense poput redukovanog glutationa (GSH), 6 -merkaptoetanola (B-ME), B-mercaptoetilamina (B-MA) i ditiotreitola (DTT). Drugi postupci uključuju korišćenje elektrolitskih metoda, kao što je metoda opisana uLeach et ai, 1965, Div, Protein. Chem, 4, 23- 27 ipomoću fotoredukcionih metoda, poput metode opisane uEllison et al., 2000, Biotechniques, 28 ( 2), 324- 326.Poželjno je međutim, da redukujući agens nije baziran na tiolu, već da je jedan od triatkilfosfin redukujucih agensa( Ruegg UT and Rudinger, J., 1977, Methods in

Enzvmologv, 47, 111- 126; Burns J etal., 1991, J.Orj. Chem, 56, 2643- 2650; Cetz et al., 1999, Analytical Biochemhtry,

273, 73- 80; Han and Han, 1994, Analytical Biochemistry, 220, 5- 10; Seitz et al., 1999, Euro. J. Nudear Medicine, 26,

1265- 1273),posebni primeri uključuju tris(2-karboksietil), fosfin(TCEP), tris butu fosfin (TBP), tris-(2-cijanoetil), fosfin, tris-( 3-hidroksipropil), fosfin(THP) i tris-(2-hidroksietil) fosfin. Najpoželjniji su redukujući agensi TCEP i THP. Stručnjaku u delatnosti će biti jasno da se koncentracija redukcionog agensa može odrediti empirijski, na primer, variranjem koncentracije redukcionog agensa i merenjem broja slobodnih tiola koji su proizvedeni. Tipično se agens za redukovanje koristi preterano preko fragmenta antitela na primer između 2 11000 strukog molarnog viška. Poželjno je da agens za redukovanje bude u 2, 3, 4, 5, 10, 100 ili 1000 strukog v<g>ka. U jednoj realizaciji reduktant se koristi na između 2 i 5mM.

[0048] Reakcije redukcije i PEGilacije se obično mogu izvesti u rastvaraču, na primer, vodeni rastvor pufera kao što je acetat 111 fosfat, sa približno neutralnim pH, na primer od pH 4.5 do oko pH 8.5, obično je pH 4.5 do 8, a pogodan je pH 6 do 7. Reakcije se obično mogu izvesti na bilo kojoj pogodnoj temperaturi, na primer između oko 5'C i oko 70°C, na primer na sobnoj temperaturi. Rastvarač može opciono sadržati helađoni agens poput EDTA, EGTA, CDTAili DTPA. Po mogucstvu, rastvarač sadrži EDTA na između 1 i 5mM, a najpoželjnije je 2mm. Alternativno ili kao dodatak rastvarač moze biti helirajući pufer kao što je limunska kiselina, oksalna kiselina, folna kiselina, blcin, tricin, tris Ili ADA. PEG će generalno imati višak koncentracije u odnosu na koncentraciju fragmenta antitela. Obično je PEG između 2 i 100 strukog molarnog viška, a poželjno je 5, 10 ili 50 puta viska.

[0049] Tamo gde je potrebno, željeni proizvod koji sadrži željeni broj PEG molekula može biti odvojen od bilo kojih početnih materijala ili drugog proizvoda stvorenog tokom proizvodnog procesa konvencionalnim sredstvima, na primer tehnikama hromatograflje kao što je jonska izmena, isključivanje veličine, protein A, G ili L afinitetna hromatografija ili hidrofobna interaktivna hromatografija.

[0050] Oni koji su vešti u ovoj detatnosti mogu preduzeti veliki broj različitih pristupa kako bi identifikovali inhibitore IL-6 aktivnosti. U jednom primeru, inhibitori se identifikuju tako što se prvo identifikuju agensi koji interaguju sa IL-6 ili IL-6R, a zatim se ti agensi testiraju da bi se identifikovali oni koji inhibiraju IL-6 aktivnost. U jednom takvom primeru agens je antitelo.

[0051]Agensi koji intereaguju sa IL-6 ili IL-6R mogu se identifikovati korišćenjem bilo kojeg odgovarajućeg postupka, na primer korišćenjem ćelijski baziranog ili ne-ćelijskog test sistema gde je IL- 6 ili IL-6R polipeptidUkontaktu sa agensom kandidatom i njegova sposobnost da intereaguje sa polipeptidom je određena. Poželjno je da se sposobnost agensa kandidata za interakciju sa IL-6 ili IL-6R polipeptidom uporedi sa referentnim opsegom ili kontrolom. Po želji, ovaj test se može koristiti za skrining pluraliteta (npr. biblioteka) agensa kandidata koristeći pluralitet IL-6 ili IL-6R polipeptidnih uzoraka. U Jednom primeru testa bez ćelija, prvi i drugi uzorak koji sadrže izvorni ili rekombinantni IL-6 ili IL-6R polipeptid su u kontaktu sa agensom kandidatom ili kontrolnim agensom i sposobnost agensa kandidata za interakciju^ sa polipeptidom se određuje poređenjem razlike u interakciji između agensa kandidata i kontrolnog agensa. Poželjno je da se polipeptid prvo imobilizuje, na primer, kontaktiranjem polipeptida sa imobilisanim antitelom koje ga specifično prepoznaje i vezuje, ili dolaskom u kontakt sa prečišćenim polipeptidnim preparatom koji ima površinu dizajniranu da vezuje proteine. Polipeptid može biti detimično ili potpuno prečišćen (npr. delimično ili potpuno slobodan od drugih polipeptida) ili može biti deo ćelijskog lizata. Osim toga, polipeptid može biti fuzioni protein koji sadrži IL-6 ili IL-6R polipeptid ili njihov biološko aktivan deo 1 domen kao što je glutation S-transferaza ili Fc region lgG1. Kao druga opcija, polipeptid se može biotinilovati upotrebom tehnika koje su dobro poznate onima koji su verzirani u ovoj delatnosti (npr.btotinvtatlon kit, Pierce Chemicals; Rockford, IL).Sposobnost agensa kandidata za interakciju sa polipeptidom se može odrediti pomoću metoda koje su poznate stručnjacima u ovoj delatnosti, na primer ELISA, BlAcore™, protočna citometrija ili fluorescentno microvoiumenska test tehnologija (FMAT). U drugom primeru, gde se koristi ćelijski test, populacija ćelija koje eksprimiraju IL-6 ili IL-6R je u kontaktu sa agensom kandidatom i određuje se sposobnost agensa kandidata za interakciju sa polipeptidom. Poželjno je da se sposobnost agensa za interakciju sa IL-6 ili IL-6R uporedi sa referentnim opsegom ili kontrolom. Ćelija, na primer, može biti eukariotskog porekla (npr. kvasca ili sisara) i može eksprimirati IL-6 ili IL-6R polipeptid endogeno ili pomoću genetskog inženjeringa. U nekim slučajevima, IL-6 ili IL-6R polipeptid ili agens kandidat je obeležen, na primer sa oznakom za radioaktivnost (poput 32P, 35S ili 1251) ili oznakom za fluorescentnost (kao što su fluorescein izotiocijanat, rodamin, fikoeritrin, fikocijanin, alofikocijanin, o-ftaldehid 111 fluoreskamin) da bi se omogućilo otkrivanje interakcije između polipeptida i agensa kandidata. Alternativne metode kao što su ELISA, protočna citometrija i FMAT se takođe mogu koristiti.

[0052]Agensi koji inhibiraju IL-6 aktivnost se mogu identifikovati bilo kojim pogodnim postupkom, na primer: (i) poređenje aktivnosti IL-6 u prisustvu agensa kandidata sa aktivnošću navedenog polipeptida u odsustvu agensa kandidata ili u prisustvu kontrolnog agensa; i (ii) utvrđivanje da li agens kandidat inhibira aktivnost IL-6.

[0053]Takvi testovi se mogu koristiti za skrining agensa kandidata u kliničkom monitoringu ili razvoju lekova.

[0054]Kao što je opisano gore, agensi mogu po potrebi proći kroz predproveru da bi se identifikovali agensi {npr. antitelo) koji interaguju sa IL-6 ili IL-6R pre nego što se provere oni agensi koji su vezani za svoju sposobnost da inhibiraju IL-6 aktivnost.

[0055] U jednom primeru ćelijski zasnovan test sistem se koristi za identifikaciju agensa sposobnih da inhibiraju aktivnost IL-6. U jednom konkretnom primeru, test koji se koristi za identifikaciju Inhibitora IL-6 aktivnosti uključuje inhibiciju IL-6 zavisne proliferacije plazmacitoma ćelijske linije T1165 ili DS-1 ćelijske linije kao što je opisano u Savvamura et al.( 1990, Grov/ th Factors, 3, 181- 190; Bock et at., 1993, Cvtokine, 5, 480- 489).

[0056] Opisani su inhibitori IL-6 koji mogu nishodno regulisati ekspresiju IL-6 ili IL-6R polipeptida, na primer antisens inhibitori. Takvi inhibitori mogu biti identif i kovani bilo kojim postupkom poznatim u delatnosti. U jednom primeru takvi inhibitori su Identifikovani u ćelijski zasnovanom test sistemu. Shodno tome, populacija ćelija koje eksprimiraju IL-6 ili IL-6R polipeptid ili nukleinsku kiselinu kontaktira sa agensom kandidatom i njegovom sposobnošću da menja ekspresiju IL-6 ili IL- 6R polipeptida ili se nukleinska kiselina utvrđuje upoređivanjem sa referentnim opsegom ili kontrolom. U jednom primeru, populacije ćelija koje eksprimiraju IL-6 ili IL-6R polipeptid su u kontaktu sa agensom kandidatiom ili kontrolnim agensom i njegova sposobnost da menja ekspresiju IL-6 ili IL-6R polipeptida ili nukleinske kiseline se određuje upoređivanjem razlike u nivou ekspresije IL-6 ili IL-6R polipeptida ili nukleinskih kiselina između tretiranih i kontrolnih populacija ćelija. Po želji, ovaj test se može koristiti za skrining pluraliteta (npr. biblioteke) agensa kandidata. Ćelija, na primer, može biti eukariotskog porekla (npr. kvasca ili sisara) i može eksprimirati IL-6 ili IL-6R polipeptid endogeno ili pomoću genetskog inženjeringa. Sposobnost agensa kandidata da menjaju ekspresiju pomenutih polipeptida H1 nuklelnskih kiselina se može odrediti metodama koje su poznate stručnjacima u delatnosti na pnmer 1 bez ograničavanja, protočnom citometrljom, radioobeležavanjem, scintilacionim testom' imunoprecipitacijom, "VVestern blot" analizom, "Northern blot" analizom ili RT-PCR.

[0057]Agensi koji inhibiraju aktivnost IL-6 mogu biti identifikovani ili dalje testirani da hi se odredile na primer terapeutski efikasne količine u jednom ili više životinjskih modela. Primeri pogodnih životinja uključuju, ali nisu ograničeni na, miševe, pacove, zečeve, majmune, zamorce, pse i mačke. Poželjno je da životinja koja se koristi predstavlja model glomerulonefritisa povezanim sa jednim ili više poremećaja odabranih iz grupe koju čine Goodpastureov sindrom, vaskulitisn) poremećaj, VVegenerova bolest, IgA nefropatija i inflamatorna bolest vezana za bazalnu membranu, najpoželjnije, Goodpastureov sindrom.

[0058] Agensi koji inhibiraju ekspresiju IL-6 ili IL- 6R se, na primer, primenjuju na prvu i drugu grupu sisara i sposobnost agensa kandidata da inhibira ekspresiju IL-6 ili IL-6R polipeptida ili nukleinske kiseline se određuje poredenjem razlika u nivou ekspresije između prve i druge grupe sisara. Po želji, ekspresioni nivoi IL-6 ili IL-6R polipeptida ili nukleinske kiseline u prvoj i drugoj grupi sisara se mogu uporediti sa nivoom IL-6 ili IL-6R polipeptida ili nukleinske kiseline u kontrolnoj grupi sisara. Agens kandidat ili kontrolni agens se mogu primenjivati načinima poznatim u struci (npr. oralno, rektalno ili parenteralno kao što je intraperitonealno ili intravenozno). Promene u ekspresiji polipeptida ili nukleinske kiseline se mogu proceniti korišćenjem gore navedenih postupaka. Modeli glomerulonefritisa koji su povezani sa Goodpastureovom bolešću su poznati u struci i opisani su u reviji( Erwi$ et at.,

2001, Curr. Opin. Nephrot. Hvpertens. 10:341- 347).

[0059]U sledećem primeru, inhlbicija IL-6 aktivnosti se može odrediti praćenjem ublažavanja ili poboljšanja simptoma bolesti, odloženog početka ili sporog napredovanja bolesti, na primer, ali bez ograničavanja, smanjenja proteinurije. Tehnike poznate lekarlma koji su upoznati sa glomerulonefrftisom povezanim sa jednim ili više poremećaja odabranih iz grupe koju čine Goodpastureov sindrom, vaskulitisni poremećaj, VVegenerova bolest, IgA nefropatija i inflamatorna bolest vezana za bazalnu membranu se mogu koristiti da bi se odredilo da li je agens kandidat promenio jednan ili više simptoma povezanih sa bolešću.

[0060]Kao što je ovde diskutovano, agensi koji interaguju sa IL-6 polipeptidom imaju primenu u lečenju i/ili profilaksi glomerulonefritisa vezanog za vaskulitisni poremećaj, kao što je VVegenerova bolest. Za takvu upotrebu će se agensi uopšteno primenjivati u obliku farmaceutske kompozicije.

[0061]Dakle, prema pronalasku, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži agens koji intereaguje ili modulira ekspresiju ili aktivnost sa IL-6 polipeptidom i farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, ekscipijentom i/ili nosačem. Farmaceutske kompozicije mogu takođe imati primenu kao vakcine i mogu sadržati dodatne komponente prihvatljive za upotrebu vakcina i mogu sadržati jedan ili više pogodnih adjuvanata kao što je jednom stručnjaku poznato.

[0062]U daljem tekstu, agensi koji se upotrebljavaju u pronalasku, i IL-6 polipeptidi i tL-6 nukleinske kiseline za upotrebu u tretmanu i/ili profilaksi nazivaju se "aktivni agensi". Kada se u ovom radu napravi napomena o metodi za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja koristeći pojedinačni aktivni agens ili kombinaciju agensa, podrazumeva se da je namenjeno da takva referenca treba da uključi upotrebu tog aktivnog agensa ili kombinacije agensa u pripremi leka za lečenje i/ili profilakse bolesti ili stanja. Dakle, takođe je obezbedjeno anti-IL-6 antitelo kao aktivni agens za upotrebu u terapiji glomerulonefritisa povezanog sa vaskulitisnim poremećajima, kao što je VVegenerova bolest. Ovakvo antitelo može biti predstavljeno kao zakačeno za efektorski molekul ili povezano sa efektorskim molekulom kao što je prethodno opisano.

[0063]Preparat se obično isporučuje kao deo sterilnog, farmaceutskog sastava koji obično uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač. Ovaj preparat može biti u bilo kom pogodnom obliku (u zavisnosti od željenog načina njegovog davanja pacijentu).

[0064]Aktivni agensi iz ovog pronalaska se mogu davati subjektu bilo kojim od načina koji se konvencionalno koriste za davanje leka, na primer, mogu se primenjivati parenteralno, oralno, topikalno (uključujući bukalno, sublingvalno ili transdermalno ili putem česticama posredovane intracelularne isporuke direktno u ćelije kože) ili inhalacijom. Česticama posredovanu isporuku je najbolje opisaoHaynes, JR, 2004, Expert Opinion on 8iolo$ icat Therapy, 4:889- 900.Najpogodniji način za davanje e u svakom datom slučaju zavisiti od konkretnog aktivnog agensa, poremećaja o kojem se radi, subjekta, i prirode i ozbiljnosti bolesti i fizičkog stanja subjekta.

[0065]Aktivni agensi se mogu davati u kombinaciji, npr. simultano, sekvencijalno ili odvojeno, sa jednim ili više drugih terapeutski aktivnih, npr. antiinflamatornih, jedinjenja.

[0066]Farmaceutske kompozicije mogu biti pogodno predstavljene u obliku jediničnih doza koje sadrže prethodno određenu količinu aktivnog agensa iz pronalaska po dozi. Takva jedinica može da sadrži, na primer, ali bez ograničavanja, 750mg/kg do 0.1 mg/kg u zavisnosti od stanja koje se tretira, načina davanja i starosti, težine i stanja subjekta.

[0067] Farmaceutski prihvatljivi nosači koji se upotrebljavaju u pronalasku mogu imati različite oblike zavisno, npr. od načina primene.

[0068]Preparati za oralnu primenu mogu biti tečni ili čvrsti. Oralni tečni preparati mogu biti u obliku, na primer, vodene ili uljane suspenzije, rastvora, emulzija, sirupa ili eliksira ili mogu biti predstavljeni kao suvi proizvod za rekonstrukciju sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Oralni tečni preparati mogu da sadrže agense za suspendovanje kao što je poznato u struci.

[0069]U slučaju oralnih čvrstih preparata, kao što su praškovi, kapsule i tablete, nosači kao što su škrobovi, šećeri, mikrokristalna celuloza, razblaživači, agensi za granulaciju, lubrikanti, veziva, agensi za dezintegraciju, i slični mogu biti uključeni. Zbog lakoće njihovog davanja, tablete i kapsule predstavljaju najbolje forme jedinice oralnog doziranja u kojem slučaju se čvrsti farmaceutski nosači generalno koriste. Pored uobičajenih doznih oblika koji su prethodno navedeni, aktivni agensi iz ovog pronalaska se mogu takođe primenjivati putem sredstava kontrolisanog oslobađanja i/ili uređaja za dopremanje. Tablete i kapsule mogu da sadrže konvencionalne nosače ili ekscipijente kao što su vezujući agensi na primer, sirup, akacija, želatin, sorbitol, tragakant, ili polivinilpirolidon; punioci, na primer laktoza, Šećer, kukuruzni škrob, kalcij um fosfat, sorbitol ili glicin; tabtetarni lubrikanti, na primer magnezijum stearat, talk, polietilen glikol ili silicijum; dezintegratori, na primer krompirov škrob; ili prihvatljivi agensi za vlaženje kao što je natrijum lauril sulfat. Tablete mogu biti obložene standardnim vodenim ili nevodem'm tehnikama prema postupcima dobro poznatim u standardnoj farmaceutskoj praksi.

[0070]Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska pogodne za oralnu primenu mogu biti oblikovane kao posebne jedinice kao što su kapsule, kašete ili tablete, od kojih svaka sadrži prethodno određenu količinu aktivnog agensa, kao prašak ili granule, ili kao rastvor ili suspenzija u vodenoj tečnosti, nevodenoj tečnosti, emulziji ulje-u-vodi ili tečnoj emulziji voda-u-ulju. Takve kompozicije mogu biti pripremljene bilo kojim od farmaceutskih postupaka ali svi postupci obuhvataju korak dovođenja u vezu aktivnog agensa sa nosačem, koji sadržijedan ili više neophodnih sastojaka. Uopšteno, smeše se pripremaju ravnomernim i bliskim mešanjem aktivnog sredstva sa tečnim nosačima ili fino podeljenim čvrstim nosačima ili oba, 1 zatim, ako je potrebno, oblikovanjem proizvoda u Željenu formu. Na primer, tableta može biti pripremljena kompresovanjem ili oblikovanjem, opciono sa jednim ili više pomoćnih sastojaka.

[0071]Pogodni farmaceutski preparati za parenteralnu primenu mogu biti pripremljeni kao rastvori ili suspenzije aktivnih agensa iz ovog pronalaska u vodi, prikladno pornešani sa surfaktantom kao što je hidroksipropilceluloza. Disperzije mogu takođe biti pripremljene u glicerolu, tečnim polietilen glikolima, i njihovim mešavinama u uljima. Pod normalnim uslovima skladištenja i upotrebe, ovi preparati sadrže konzervans da bi se sprečio rast mikroorganizama.

[0072]Farmaceutski oblici pogodni za korišćenje u vidu injekcija obuhvataju vodene ili ne-vodene sterilne injekcione rastvore koji mogu da sadrže antioksidante, pufere, bakteriostate i rastvore koji čine sastave izotoničnim sa krvlju nameravanog primaoca, i vodene i ne-vodene sterilne suspenzije koje mogu da obuhvataju agense za suspendovanje i agense za zgušnjavanje. Nepripremljeni injekcioni rastvori, disperzije i suspenzije mogu biti pripremljeni od sterilnih praškova, granula i tableta.

[0073]Farmaceutski preparati se mogu primenjivati sa medicinskim uređajima koji su poznati u struci. Na primer, u poželjnoj realizaciji, farmaceutski sastav iz ovog pronalaska se može primenjivati hipodermičkim uređajem za ubrizgavanje bez igle, kao što su uređaji opisani u US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413 ; 4,941,880; 4,790,824; ili 4,596,556. Primeri korisnih poznatih implanata i modula u predmentnom pronalasku obuhvataju: US 4,487,603, koji opisuje implantabilnu mikro-infuzionu pumpu za doziranje lekova kontrolisanom brzinom; US 4,486,194, koji opisuje terapeutski uređaj za primenu lekova kroz kožu; US 4,447,233, koji opisuje infuzionu pumpu za isporuku leka preciznom infuzijskom brzinom; US 4,447,224, koji opisuje implantabilni infuzioni aparat promenjivog toka za kontinuirano oslobađanje leka; US 4,439,196, koji opisuje osmotski sistem isporuke leka koji ima višekomorne odeljke; i US 4,475,196, koji opisuje osmotski sistem isporuke leka. Mnogi drugi takvi implanti, sistemi za oslobađanje i moduli su poznati stručnjacima u delatnosti.

[0074]U nekim rešenjima, farmaceutski preparati iz predmetnog pronalaska se mogu formulisati tako da obezbede odgovarajuću in vivo distribuciju. Na primer, krvno-moždana barijera isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja i može biti poželjno da se dostave farmaceutski preparati u Upozomima. Tako, u jednom ostvarenju pronalaska, aktivni agensi Iz pronalaska su formulisani u lipozome; u još poželjnijem aspektu, ovi tipozomi uključuju target polovinu.

[0075]Formulacije aktivnih agensa se mogu isporučiti u fluorougljenicima kao plućne, topikalne ili oftalmološke i mogu uključiti aktivne agens-u-fluorougljeniku suspenzije, obrnute voda-u-fluorougljeniku emulzije, ulje-u-fluorougljeniku emulzije, višestruke emulzije, mikroemulzije, fluorougljenične gelove, fluorovane lipozome i fluorovane tubuse.

[0076] Preparati mogu biti izloženi u posudama za jednostruku ili višestruku dozu, na primer u zapečaćenim ampulama i bočicama 1 da bi se poboljšala stabilnost, mogu se čuvati u zaledjeno-osušenom (liofilizovanom) stanju koje zahteva samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer voda za injekcije, neposredno pre upotrebe. Sterilni tečni nosač može biti obezbeđen u posebnoj bočici ili ampuli i može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (npr. gliceroi, propilen glikol i tečni polietilen glikol), njihove pogodne smeše, i biljna ulja. Korisno je sto agensi kao što je lokalni anestetik, konzervans i agensi za puferovanje mogu biti sadržani u sterilnom tečnom nosaču.

[0077]Farmaceutski preparati prilagođeni za topikalnu primenu mogu biti u obliku masti, krema, suspenzija, loslona, praškova, rastvora, pasta, gelova, impregniranih zavoja, sprejeva, aerosola ili ulja, transdermalnih uređaja, prahova i slično. Ovi preparati se mogu dobiti konvencionalnim metodama koje sadrže aktivni agens. Stoga, oni mogu da sadrže kompatibilne konvencionalne nosače i aditive, kao što su konzervansi, rastvaračl koji pomažu prodiranju leka, emolijensiUkremama ili mastima i etanol ili oleit alkohol za losione. Takvi nosači mogu biti prisutni u oko 1 % do oko 98%_sastava. Češće formiraju do oko 80% sastava. Samo radi iluzije, krem ili mast se priprema mešanjem dovoljnih količina hidrofilnog materijala i vode, sadrži od oko 5-10% težinskih jedinjenja, u dovoljnim količinama da proizvede krem ili mast koja ima željenu konzistenciju.

[0078] Farmaceutski preparati prilagođeni za transdermalnu primenu mogu biti obliku diskretnih flastera namenjenih da ostanu u bliskom kontaktu sa epidermom primaoca tokom dužeg vremenskog perioda. Na primer, aktivni agens se može oslobađati iz flastera jontoforezom.

[0079]Za primenu na spoljasnja tkiva, na primer na usta i kožu, preparati se poželjno primenjuju kao površinske masti ili kreme. Kada se formuliše u mast, aktivni agens može biti korišćen sa parafinski baziranom mašću ili onom koja se meša sa vodom. Takodje, aktivni agens može biti formulisan u kremu sa ulje-u-vodi ili voda-u-ulju bazom za kremu.

[0080]Farmaceutski preparati prilagođeni za topikalnu primenu u ustima obuhvataju lozenge, pastile i tečnosti za ispiranje usta.

[0081]Farmaceutski preparati prilagođeni za topikalnu primenu na oko obuhvataju kapi za oči u kojima je aktivni agens rastvoren ili suspendovan u pogodnom nosaču, naročito vodenom rastvaraču. Oni takođe uključuju topikalne masti ili kreme kao što je gore pomenuto.

[0082]Farmaceutski preparati koji su pogodni za rektalnu primenu u kojima je nosač čvrst su najpoželjniji u obliku supozitorije pojedinačne doze. Pogodni nosači obuhvataju kakao puter ili druge gliceride ili materijale koji se uobičajeno koriste u struci, i supozitorije mogu biti prikladno formirane mešanjem kombinacije sa omekšanim ili rastopljenim nosačem (nosačima), a zatim hlađenjem i oblikovanjem kalupa. Oni se takođe mogu primenjivati kao klistiri.

[0083] Farmaceutski preparati prilagođeni za vaginalnu primenu mogu biti u obliku uložaka, tampona, krema, gelova, pasti, pena ili sprej preparata. Oni mogu da sadrže emolijente ili baze kao što je uobičajeno u delatnosti.

[0084]Doza aktivnog agensa koja se daje će varirati u zavisnosti od određenog aktivnog agensa, poremećaja o kojem se radi, subjekta, prirode i ozbiljnosti bolesti i fizičkog stanja subjekta, starosti, težine i pola subjekta, ishrane, vremena i učestalosti davanja, kombinacija lekova, reakcione osetljivosti, tolerancije/reakcije na terapiju, i izabranog načina primene; i lekar će na kraju odrediti odgovarajuće doze za korišćenje. Ova doza se može ponavljati po potrebi. Generalno, terapeutski efektivna količina je od 0.01 mg/kg do 100 mg/kg, poželjno je od 0.1 mg/kg do 20 mg/kg. Učestalost doze zavisi od poluživota molekula antitela i trajanja njegovog efekta. Ako molekul antitela ima kratak poluživot (npr. 2 do 10 sati) može biti potrebno da se daje jedna ili više doza dnevno. U suprotnom, ako molekul antitela ima dug poluživot (npr. 2 do 15 dana) može biti potrebno da se doza daje samo jednom dnevno, jednom nedeljno ili čak jednom u 1 ili 2 meseca. Ako se razviju nuspojave količina i/ili učestalost doze može da se izmenjeni ili smanji, u skladu sa normalnom kliničkom praksom.

[0085]Farmaceutski preparati mogu biti pogodno predstavljeni u oblicima pojedinačne doze koja sadrži unapred određenu količinu aktivnog agensa iz pronalaska po dozi. Posebno, doza prema kojoj se molekul antitela iz predmetnog pronalaska primenjuje zavisi od prirode stanja koje se leci, obima prisutnog zapaljenja i toga da li se molekul antitela koristi profilaktički ili za lečenje postojećeg stanja.

[0086]Za lečenje U ili profilaksu glomerulonefritisa povezanog sa jednim ili više poremećaja odabranih iz grupe koju čine Goodpastureov sindrom, vaskulitisni poremećaj, VVegenerova bolest, IgA nefropatija i inflamatorna bolest vezana za bazalnu membranu, i, naročito, kod ljudi i životinja farmaceutski preparati koji sadrže antitela se mogu primeniti kod pacijenta (npr. humani subjekti) u terapeutski ili profilaktički efikasnim dozama (npr. doze koje kao ishod imaju smanjenje glomerulonefritisa) koristeći bilo koji način primene, kao što su injekcije i drugi načini primene poznati u struci za kliničke proizvode na bazi antitela.

[0087]Preparati mogu sadržati od 0.1 ^ težine, poželjno je od 10-60%, ili više, po težini aktivnog agensa iz ovog pronalaska, u zavisnosti od načina primene.

[0088]Preparati se mogu davati pojedinačno pacijentu ili se mogu davati u kombinaciji (npr. simultano, sekvencijalno ili odvojeno) sa drugim sredstvima, lekovima ili hormonima.

[0089]Ovde je opisana nukleinska kiselina koja se može davati kao inhibitor preko genske terapije( videti na primer

Hoshida, T. et al., 2002, Pancreas, 25:111- 121; Ikuno, Y. 2002, Invest. Ophthatmol. Vis. Sci. 2002 43:2406- 2411;

Bollard, C, 2002, Blood 99:3179- 3187; Lee£.,2001, Mol. Med. 7:773- 782).Genska terapija se odnosi na davanje ekspresovane ili ekspresivne nukleinske kiseline. U jednom primeru to je ili IL-6 ili IL-6R nukleinska kiselina ili njihovi delovi.

[0090]Isporuka terapeutske nukleinske kiseline u pacijenta može da bude direktna genska in vivo terapija (tj. pacijent je direktno izložen nukteinskoj kiselini ili nukleinskom vektoru koji sadrži kiselinu) ili indirektna genska ex vivo terapija (tj. ćelije se prvo transformišu u nukleinsku kiselinu in vitro, a zatim se transplantuju u pacijenta).

[0091] Na primer, za in vivo gensku terapiju, ekpresioni vektor koji sadrži IL-6 ili IL-6R nukleinsku kiselinu se može primenjivati na takav način da postaje intracelularni, tj. Infekcijom, korišćenjem neispravnog ili atenuiranog retrovirusa ili drugih virusnlh vektora kao što je opisano, na primer, uUS 4, 980, 286 ili Robbins et oL, 1998, Pharmacot.

Ther. 80:35- 47.

[0092]Različiti retroviratni vektori koji su poznati u struci su kao oni opisani u Miller et al. (1993,Meth. Enzymol. 217:581- 599)koji su modifikovani da uklone one retrovirusne sekvence koje nisu potrebne za pakovanje virusnog genoma i kasniju integraciju u DNK ćelije domaćina. Takođe se mogu koristiti adenovirusni vektori koji imaju prednost zbog svoje sposobnosti da inficiraju nedetjive ćelije i takvi adenovirusni vektori visokog kapaciteta su opisani u Kochanek (f 999,Human Gene Therapy, 10:2451- 2459).Hfmerni virusni vektori koji se mogu koristiti su oni opisani u Revnolđs et al.( 1999, Motecular Medicine Today, 1:25 - 31).Hibridni vektori se takode mogu koristiti i opisani su u Jacoby et al.(J997, Gene Therapy, 4:1282- 1283).

[0093] Direktno ubrizgavanje čiste DNK, ili putem upotrebe "bombardovanja mikročesticama" {npr.Gene Gon®; Biolistic, Dupont)ili premazivanje lipidima se takođe može koristiti u genskoj terapiji. Receptori/transfekcijska jedinjenja na površini ćelija iti kroz kapsuliranje u lipozomima, mikročesticama ili mikrokapsuiama ili davanjem nukleinske kiseline povezane sa peptidom koji ulazi u jezgro ili primenjivati ga tako Što se veže za Ugand koji je predisponiran za endocitozu posredovanu receptorom( Pogledajte Wu&Wu, 1987, J. Biol. Chem., 262:4429- 4432)se mogu koristiti za nalaženje tipova ćelija koje specifično izražavaju receptore od značaja.

[0094] U ex vivo genskoj terapiji, gen se prenosi u ćelije in vitro, koristeći kulturu tkiva i ćelije se dostavljaju pacijentu raznim postupcima kao što je subkutana injekcija, ubacivanje ćelija u graft kože i intravenska injekcija rekombinantnih krvnih ćelija poput hematopoetskih matičnih ili roditeljskih ćelija.

[0095] Ćelije u koje IL-6 ili IL-6R nukleinska kiselina može da se uvede radi genske terapije uključuju, na primer, epitelne ćelije, endotelne ćelije, keratinocite, fibroblaste, mišićne ćelije, hepatocite 1 krvna zrnca. Krvne ćelije koje se mogu koristiti uključuju, na primer, T-limfocite, B-Umfocite, monocite, makrofage, neutrofile, eozinofile, megakariotcite, granutocite, hematopoetske ćelije ili roditeljske ćelije, i slično.

[0096] Ovde je opisan farmaceutski preparat koji sadrži IL-6 ili IL-6R nukleinsku kiselinu, navedena nukleinska kiselina je deo ekspresionog vektora koji eksprimiraIL-6ili IL-6R polipeptid ili himerni protein istog u pogodnom domaćinu. Posebno, takva nukleinska kiselina ima pokretač koji je operativno povezan sa reglonom polipeptida za kodiranje, pomenuti pokretač je indukovani 111 konstitutivni (i, opciono, tkivno-specifičan).

[0097] Rekombinantni IL-6 polipeptidi mogu biti pripremljeni postupcima dobro poznatim u struci iz genetski modifikovanih ćelija domaćina koje sadrže ekspresione sisteme. Shodno tome, predmetni pronalazak se takođe odnosi na ekspresione sisteme koji sadrže IL-6 polipeptid ili IL- 6 nukleinsku kiselinu, na ćelije domaćina koje su napravljene genetskim inženjeringom sa takvim ekspresionim sistemima i na proizvodnju IL-6 polipeptida rekombinantnim tehnikama. Sistemi translacije bez ćelija se mogu takode koristiti za proizvodnju rekombinantnih polipeptida (npr. zečiji reticulocitni lizat, lizat pšeničnih klica, SP6/T7 in vitro T&T i RTS 100 E. Coli HY transkripcioni i translacioni kompleti od Roche Diagnostics Ltd., Leves, Velikoj Britaniji i TNT "Ciuick coupleđ" transkrlpcioni/translacioni sistem iz Promega Velike Britanije, Southampton, Velika Britanija.

[0098] Za rekombinantnu proizvodnju IL-6 polipeptida, ćelije domaćini mogu biti napravljene genetskim inženjeringom da sadrže sisteme ekspresije ili njihove detove za IL-6 nukleinske kiseline. Ovo ugrađivanje se može izvesti korišćenjem postupaka koji su dobro poznati u delatnosti, kao što je, kalcijum fosfat transfekcija, DEAD-dekstran posredovana transfekcija, transvekcija, m i kro injekcija, katjonski lipid-posredovana transfekcija, elektroporacija, transdukcija, "scrape loading", balističko uvođenje ili infekcija( videti npr. Daviš et al., Basic

Methods in Motecular Biolo$ y, 1986 and Sambrook et al., Motecular Cloning: A Laboratory Alanuol, 2nd Ed., Cotd

Spring Harbour taboratory Press, Cold Spring Harbour, NY, 1989).

[0099] Reprezentativni primeri ćelija domaćina uključuju bakterijske ćelije npr. E. Coli, Streptokoke, Stafilokoke, Streptomice i Bacillus subtilis ćelije; gljivične ćelije, poput ćelija kvasca i Aspergillus ćelije; ćelije insekata kao što su Drosoflla S2 1 Spodoptera Sf9 ćelije; životinjske ćelije kao što su CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, HEK 293, BHK i ćelije Boves melanoma; i biljne ćelije.

[0100] Širok spektar ekspresionih sistema se mogu koristiti, kao sto su, i bez ograničenja, hromozomski, epizomalni i sistemi dobijeni virusima, npr. vektori izvedeni iz bakterijskih plazmida, od bakteriofaga, iz transpozona, iz epizoma kvasca, iz umetnih elemenata, od hromozomsklh elemenata kvasca, od virusa poput bakulovirusa, papova virusa poput SV40, vaccinia virusa, adenovirusa, virusa boginja živine, virusa lažnog besnila i retrovirusa, i vektora izvedenih iz njihovih kombinacija, kao što su oni izvedeni iz plazmida 1 genetskih elemenata bakteriofaga, poput kozmida i fagemida. Ekspresioni sistemi mogu sadržati regione kontrole koji regulišu ali i izazivaju ekspresiju. Generalno, se može koristiti bilo koji sistem ili vektor koji je sposoban da održi, razmnožava ili eksprimira nukleinsku kiselinu za proizvodnju polipeptida u domaćinu. Odgovarajuća sekvenca nukleinske kiseline može biti ubačena u ekspresioni sistem bilo kojim od različitih poznatih i rutinskih tehnika, kao što su one navedene u Sambrook et al., supra. Odgovarajući sekrecioni signali mogu biti ugrađeni u IL-6 polipeptid kako bi se omogućila sekrecija prevedenog proteina u lumen endoplazmatskog retlkuluma, periplazmički prostor Hi ekstracelularnu okolinu. Ovi signali mogu biti endogeni za IL-6 polipeptid ili mogu biti heterologni signali.

[0101] IL-6 polipeptidi se mogu povratiti i prečistiti iz rekombinantnih ćelijskih kultura ili iz drugih bioloških izvora dobro poznatim metodama uključujući, amonijum sulfatsku ili etanolsku percipitaciju, ekstrakcije kiselinom, hromatografiju razmene anjona ili katjona, fosfoceluloznu hromatografiju, afinitetnu bromatografiju, hromatografiju hidrofobne interakcije, hidroksilapatit hromatografiju, hromatografiju molekularnog prosejavanja, metode centrifugiranja, metode elektroforeze i tecitin hromatografiju. U jednoj realizaciji, se koristi kombinacija ovih metoda. U drugoj realizaciji, se koristi tečna hromatografija visokih performansi. U sledećoj realizaciji, antitelo koje se specifično vezuje za IL-6 polipeptid se može koristiti da iscrpi uzorak koji sadrži IL-6 polipeptid navedenog polipeptida ili da pročisti navedeni polipeptid. Dobro poznate tehnike u struci, se mogu koristiti za tzv. refotding da bi se reginerisale nativne ili aktivne konformacije IL-6 polipeptida kada su polipeptidi denaturisani tokom izolovanja i/ili prečišćavanja. U kontekstu ovog pronalaska, IL-6 polipeptidi se mogu dobiti iz biološkog uzorka iz bilo kog izvora, kao što je i bez ograničavanja, uzorak krvi.

[0102] IL-6 ili IL6R nukleinske kiseline se mogu dobiti korišćenjem standardnih tehnika kloniranja i skrininga, iz biblioteke cDNK izvedene iz iRNK u humanim ćelijama, korišćenjem "expressed sequence tag" (EST) analize( Adams, M. et al., 1991, Science, 252:1651- 1656; Adams, M. et al., 1992, Nature 355:632- 634; Adams, M. et al., 1995, Nature,

377:Suppt: 3- 174).IL-6 nukleinske kiseline mogu takođe da se dobiju iz prirodnih izvora kao što su genomske DNK biblioteke ili se mogu sintetisati primenom dobro poznatih i komercijalno dostupnih tehnika. IL-6 ili IL-6R nukleinske kiseline koje sadrže kodirajuće sekvence za IL-6 ili IL-6R polipeptide se mogu koristiti za rekombinantnu proizvodnju pomenutih polipeptida. IL-6 ili IL-6R nukleinske kiseline mogu uključivati samu kodirajuću sekvencu za zreli polipeptid; ili sekvencu kodiranja za zreli polipeptid u okviru čitanja sa drugim sekvencama kodiranja, poput onih koje kodiraju lider ili sekretornu sekvencu, pre-, pro- ili prepro- proteinsku sekvencu, razdvojnu sekvencu ili druge fuzione peptid delove, kao što su afinitetni tag ili dodatna sekvenca koja daje stabilnost tokom proizvodnje polipeptida. Poželjni afinitetni tagovi uključuju višestruke histidin ostatke( na primer pogledatiGentz etal., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:821- 824),FLAG tag, HA tag ili "myc" tag. IL-6 nukleinske kiseline mogu takođe sadržati ne-kodirajuće 5 'i 3' sekvence, kao što su transkribovane, neprevedene sekvence, spojne i poliadenilacione signale, mesta koja vezuju ribozome i sekvence koje stabilizuju iRNK.

[0103] IL-6 Hl IL-6R potipeptidni derivati pomenuti gore se mogu kreirati uvođenjem jedne ili više nukleotidnlh supstitucija, adicija ili delecija u nukleotidne sekvence IL-6 ili IL-6R nukleinske kiseline koje su takve da se jedna ili više aminokiselinsklh supstitucija, adicija ili delecija uvode u kodirani protein. Standardne tehnike poznate onima koji su verzirani u delatnosti se mogu koristiti za uvođenje mutacija, uključujući, na primer, usmerenu mutagenezu i PCR-posredovanu mutagenezu. Poželjno, konzervativne aminokiselinske supstitucije su napravljene na jednom ili više predviđenih neesencijalnih aminokiselinsklh ostataka.

[0104] IL-6 ili IL-6R nukleinska kiselina koja kodira IL-6 ili IL-6R polipeptid, uključujući homologe i ortologe iz vrsta koje nisu ljudske, se može dobiti pomoću postupka koji obuhvata korake skrininga odgovarajuće biblioteke pod strogim uslovima hibridizacije sa označenom sondom i izolovanjem cDNK pune dužine i genomskim klonovima koji sadrže pomenutu sekvencu nukleinske kiseline. Takve tehnike hibridizacije su dobro poznate u delatnosti. Jedan primer strogih uslova hibridizacije je gde se pokušaj hibridizacije obavlja na temperaturi od oko 35'C do oko 65<*>C, koristeći rastvor soli od oko 0.9M. Međutim, stručnjak će moći da promeni takve uslove po potrebi kako bi se uzele u obzir promenljive kao što su dužina sonde, sastav baza, tip prisutnih jona, itd. Za visok stepen selektivnosti, relativno strogi oslovi poput niskog stepena soli ili uslova visoke temperature, se koriste da bi se formirali dupleksi. Vrlo strogi uslovi obuhvataju hibridizaciju da bi se filtrirao vezani DNK u 0,5M NaHPCM,7%natrijum dodecil sulfat (SDS), 1mM EDTA na 65'C, i ispiranje u 0.1kSSC/0.1% SDS na 68°C( Ausubel F. M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Motecular Biolog)/, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley Et Sons, Inc., New York, at p. 2. 10. 3).Za neke aplikacije, potrebni su manje strogi uslovi za formiranje dupleksa. Umereno strogi uslovi uključuju pranje u 0.2kSSC/0.1% SDS na 42"C( Ausubel et al., 1989, supra).Uslovi hibridizacije mogu biti učinjeni strožim dodavanjem rastućih količina formamida, da bi se destabilizovao hibridni dupleks. Dakle, posebni uslovi hibridizacije se mogu lako manipulisati, pa se generalno biraju prema potrebi. Uopšteno, pogodne temperature hibridizacije u prisustvu 50% formamida su: 42<*>C za sondu koja je 95-100% identična sa fragmentom gena koji kodira polipeptid kao što je ovde definisano, 37'C za 90-95% sličnosti i 32'C za 70-90% sličnosti.

[0105]Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da će, u mnogim slučajevima, izolovana cDNK sekvenca biti nepotpuna, a da je kodiranje regiona za polipeptid prekinuto na 5 'cDNK kraju. Ovo je posledica reverzne transkriptaze, enzima sa inherentno niskom procesivnošću (merenje sposobnosti enzima da ostane spojen sa šablonom tokom reakcije polimerizacije), nemogućnosti probijanja DNK kopije mRNK šablona tokom prve sinteze niti cDNK.

[0106]Postupci za dobijanje pune dužine cDNK ili za produžavanje kratke cDNK su dobro poznati u struci, na primer RACE( Rapld amptifkation of cDNA ends; e. g. Frohman et al.,1988,Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:8998- 9002).Skorašnje modifikacije ove tehnike, primer je Maraton"<1>tehnologija( Ctontech Laboratories Inc.)su značajno pojednostavile potragu za dugom cDNK. Ova tehnologija koristi cDNK dobijenu iz iRNK koja je ekstrahovana iz odabranog tkiva praćena vezivanjem jedne sekvence adaptera na svaki kraj. PCR se onda vrši da pojača nedostajući 5-kraj cDNK koristeći kombinaciju gen specifičnih i adapter specifičnih oiigonukleotidnih prajmera. PCR reakcija se zatim ponavlja korišćenjem umetnutih prajmera koji su dizajnirani da se rekombinuju sa amplifikovanim proizvodom, tipično adapter specifični prajmer koji rekombinuje dalji 3' u adapter sekvenci i specifični prajmer gena koji rekombinuje dalji 5' u poznate sekvence gena. Proizvodi ove reakcije mogu zatim biti analizirani DNK sekvenciranjem 1 cDNK pune dužine može biti konstruisana ili spajanjem proizvoda direktno sa postojećom cDNK dajući kompletnu sekvencu ili izvođenjem zasebnog PCR pune dužine korišćenjem novih sekvencionih informacija za projektovanje 5' prajmera.

[0107]Poželjne karakteristike svake realizacije u ovom pronalasku su za svaku od drugih realizacija mutatis mutandis

[0108]Pronalazak će sada biti opisan uz pozivanje na sledeće primere, koji su samo ilustrativni i ne treba ni na koji način tumačiti kao da ograničavaju obim ovog pronalaska.

Opis slika

[0109] Slika 1 Histohemija pokazuje tipičan polumesečni gtomerulonefritis u bubregu CD1 miševa 12 nedelja posle imunizacije sa rekombinantnim a3(IV)NC1. Strelice ukazuju na vlaknasti poiumesec. Slika 2 pokazuje efekat tretmana sa antilL-6 antitelom na proteinurii CD 1 miševa 3 nedelje [panel (A)], 6 nedelja [panel <B)], 9 nedelja [panel (C)] ili 12 nedelja [panel (D)] nakon imunizacije sa rekombinantnim a3(IV)NC1. Slika 3 pokazuje efekat tretmana sa antill_-6 antitelom na bubrežne anomalije CD 1 miševa 12 nedelja nakon imunizacije sa rekombinantnim a3(IV)NC1.

Primer 1. Priprema rekombinantnog alfa 3 tanca tipa IV koiagen [a3(IV)NC1]

[0110] Rekombinantni a3(IV)NC1 je pripremljen kao što je opisano u Reynolds et al.( Reynolđs et at., 2005, J Am Soc

Nephrot., 16:1350- 1359).

Primer 2. Mišji model Goodpastureovog sindroma

[0111] CD1 miševi su bili imunlzovani sa rekombinantnim a3(IV)NC1 u CFAs.c. na dnu repa zatim sa jos 2 dopune u IFA s.c. 1 1 2 nedelje kasnije. Miševi su razvili cirkulišuća i depozftna antitela anti-glomerularne membrane, proteinuriju i fokalni proliferativni glomerulonefritis od 6. nedelje nakon injekcije Što je napredovalo do ozbiljnog potumesečnog glomerulonefritisa u nedelji 12. Histologija iz imunizovane životinje koja ima naglašene glomerularne ožiljke sa vlaknastim polumesecima, tubulointersticijalne ožiljke sa cevastom atrofijom i tubulointersticijatnu upalu u bubregu je prikazano na Stici 1.

Primer 3. Tretman IL-6 antitelom

[0112] Grupe CD1 miševa (n-=10) su dobile Irelevantno antitelo (pozitivna kontrola) ili anti-IL-6 monoklonalno antitelo u dozi od 30mg/kg (subkutano) nedeljno u toku 12 nedelja od dana pre imunizacije sa rekombinantnim a3(IV)NC1.

[0113] Životinje su smeštene u metaboličke kaveze na 24 sata svake 3 nedelje, sa slobodnim pristupom hrani i vodi, kako bi se omogućilo prikupljanje urina. Proteinurija u urinu je detektovana metodom sulfosalicilne kiseline(K/ian et al., 2005, Kidney Int., 67: 1812- 1820).Životinje kojima je dat antilL-6 mAb su pokazale primetno smanjenje proteinurije u poredenju .sa pozitivnim kontrolama kao što je prikazano na slici 2A-D. 12 nedelja posle imunizacije nivoi proteinurije kod antilL-6 tretiranih miševa je bio samo 8mg/dan u poredenju sa 39mg/đan kod miševima tretiranim sa irelevantnim kontrolnim antitelom. Broj glomerularnih anomalija je takođe smanjen kod miševa tretiranih sa anti-IL-6 antitelom kao što je prikazano na slici 3 (kontrola, 29% prema anti-IL-6 mAb,2%).

[0114] Rezultati ukazuju da se eksperimentalni autoimuni glomerulonefritis može pouzdano indukovati kod CD1 miša i da je anti-IL-6 mAb efikasan u prevenciji glomerularnih povreda u ovom modelu. Stoga, rezultati pokazuju važnost uloge IL-6 u razvoju eksperimentalnog autoimunog glomerulonefritisa i ukazuju na to da strategije koje targetiraju IL-6 mogu pružati novi pristup u lečenju ljudskog glomerulonefritisa.

Claims (6)

1. Inhibitor IL-6 aktivnosti koji je antitelo ili funkcionalno aktivni fragment, koje antitelo ili funkcionalno aktivni fragment selektivno intereaguje sa IL-6 polipeptidom ili IL-6R polipeptidom za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi glomerulonefritisa povezanog sa vaskulitis poremećajem.

2. Inhibitor IL-6 aktivnosti koji je antitelo ili funkcionalno aktivni fragment, koje antitelo ili funkcionalno aktivni fragment se vezuje za IL-6 ili za IL-6R i utiče na IL-6R-ligand interakciju ili se vezuje za IL-6 I utiče na IL-6-gp130 interakciju, za upotrebu u lečenju i/ili profilaksi glomerulonefritisa povezanog sa vaskulitis poremećajem.

3. Inhibitor IL-6 aktivnosti prema patentnim zahtevima 1 ili 2, gde je antitelo IgG.

4. Inhibitor IL-6 aktivnosti prema patentnim zahtevima 1, 2 ili 3, koji je tocilizumab.

5. Inhibitor IL-6 aktivnosti prema patentnim zahtevima 1, 2 ili 3, pri čemu je antitelo monoklonalno, poliklonalno, himerično, humanizovano ili bispecifično.

6. Inhibitor IL-6 aktivnosti prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, pri čemu je vaskulitis poremećaj VVegenerova bolest.