RS55305B1 - Upotreba helatirajućeg sredstva i peptidnih antimikrobnih jedinjenja - Google Patents

Description

Oblast pronalaska

[0001]Pronalazak se odnosi na oblast antimikrobnih sredstava koja ciljno deluju na biljne patogene.

Uvod

[0002]Kontrola biljnih patogena i zaštita kulturnih biljaka je ozbiljan svetski problem koji postaje rastuća briga sa nedavnim povećanjima u svetskoj populaciji i sa tim povezanim nedostatkom hrane. Pored toga, moderna poljoprivredna praksa u vezi sa žetvom i skladištenjem ima tendenciju obezbeđivanja dobrih uslova za rast patogena.

[0003]Upotreba hemijskih pesticida je bila standardni pristup kontroli štetočina. Međutim, mnogi trenutno korišćeni pesticidi imaju nekoliko ozbiljnih nedostataka. Na primer, mnogi imaju štetan uticaj na životnu sredinu i mnogi imaju nisku ili opadajuću efikasnost. Posebno su zabrinjavajući niska potencija i/ili uzak spektar aktivnosti nekih jedinjenja, zajedno sa razvojem otpornosti patogena.

[0004]Među ciljevima predmetnog pronalaska je pokušati rešiti ove probleme, i naročito na primer obezbediti sredstva za poboljšanje aktivnosti antimikrobnih sredstava koja su efikasna protiv mikroorganizama biljnih patogena.

[0005]Poznato je sledeće stanje tehnike: John M Wells et al: "In vitro inhibition of Soft-Rotting Bacteria by EDTA and Nisin and in vivo Response on Inoculated Fresh Cut Carrots", Plant Disease, 1 Januarv 1998, pages 491-495. Ovaj dokument navodi da je kompozicija koja sadrži etilendiamin tetraacetat (EDTA) i polipeptidno antimikrobno sredstvo nisin inhibirala pektolitičke bakterije vlažne truležiCytophagae johnsonae, Xanthomonas campestris, Pseudomonas

viriđae, Erwinia carotovora, Pseudomonas fluorescens i Erwinia chrvsanthemiuin

vitroanalizi gde je zagrevanje povećalo antimikrobni efekat.

[0006]Ferreira et al: "The structure of Lupinus seed storage proteins. Recent developments", Current Topics in Plant Biologv, Trivandrum: Research Trends, India, vol. 4, 1 Januarv 2003, pages 139-150. Ovaj dokument navodi da 20 kDa polipeptid koji je proizvod razgradnje |3-konglutina iz vrsteLupinusispoljava određeni broj biohemijskih i bioloških aktivnosti, naime snažne antigljivične efekte.

[0007]WO 2007/010459 se odnosi na ekstrakciju proteina iz semena, kotiledona ili biljaka rodaLupinuskao i na način za njegovu proizvodnju u rekombinantnom obliku i ekspresiju u genetički modifikovanim biljkama.

[0008]Monteiro et al: "Chapter 29: Testing Blad, a potent antifungal protein", 30 November 2007, Plant Pathologv Concepts and Laboratorv Exercises. 2nd Edition, CRC Press, Boca Raton, Tavlor & Franics, pages 323-328. Ovaj dokument navodi da su kotiledoni izLupinus albuszamrznuti u tečnom azotu, mleveni i ekstrahovani sa rastvorom pufera koji sadrži Tris-HCI pufer, natrijum hlorid, etilendiamin tetraacetat i etilenglikol bis (P-aminoetil etar)-N,N,N',N'-tetraacetat. Rastvor je zatim centrifuguran i desalinizovan na GE Healthcare PD-10 koloni za desaliniranje. Desalinizovani ekstrakt koji sadrži Blad je korišćen za antigljivičnu analizu. Određivan je antigljivični efekat na germinaciju konidija i na rast micelijumaBotrytis cinerea.

Rezime pronalaska

[0009]Pronalazak je naveden u priloženim patentnim zahtevima.

Kratak opis crteža

[0010]

Slika 1 prikazuje sekvencu koja kodira prekursor P-konglutinaLupinus albus(SEQ UD NO: l);i

Slika 2 prikazuje interni fragment sekvence koja kodira prekursor P-konglutina koja odgovara Blad (SEQ ID NO: 3).

Detaljan opis pronalaska

[0011]Pronalazači su našli da, kada se koristi kombinacija helatirajućeg sredstva i antimikrobnog sredstva koja je efikasna protiv mikroorganizma biljnog patogena, navedena kombinacija je naročito efikasna u inhibiciji rasta i/ili ubijanju mikroorganizma biljnog patogena. U jednom aspektu, prema tome, pronalazači daju kompoziciju koja sadrži, ili koja se uglavnom sastoji od, helatirajućeg sredstva i antimikrobnog sredstva koji su efikasni protiv mikrooganizma biljnog patogena. Kompozicija koja sadrži helatirajuće sredstvo i antimikrobno sredstvo koja je efikasna protiv mikroorganizma biljnog patogena takođe može biti formulacija koja sadrži drugo jedinjenje(a) dodato u kompoziciju od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike.

Antimikrobna sredstva

[0012]Mikroorganizam je poželjno bakterija (Gram-pozitivna ili Gram-negativna) ili gljiva, poželjno gljiva (koja može biti kvasac ili buđ). Antimikrobno sredstvo sadrži (ili se sastoji od) polipeptida, kao što je antigljivični protein. Pogodni primeri antigljivičnih proteina obuhvataju hitinaze, hitin-vezujuće proteine, hitosanaze, P-l,3-glukanaze i P-N-acetil-D-glukozaminidaze. Određeni primeri mikroorganizama na koje se može ciljno delovati antimikrobnim sredstvom dati su u daljem tekstu.

Blad polipeptid

[0013]Antimikrobno sredstvo sadrži (ili se uglavnom sastoji od) polipeptida, pri čemu navedeni polipeptid sadrži (ili se uglavnom sastoji od) Blad ili njegove aktivne varijante.

[0014]Blad ("banda deLupinus albusdoce" - traka iz slatkogL. albus)je naziv koji dat stabilnom i intermedijernom proizvodu razgradnje P-konglutina, glavnom proteina za skladištenje prisutno u semenima rodaLupinus.On je okarakterisan kao 20 kD polipepetid, sastavljen od 173 aminokiselinska ostatka, i kodiran internim fragmentom (519 nukleotida, deponovan u GenBank pod pristupnim brojem ABB13526) gena koji kodira prekursor P-konglutina izLupinus(1791 nukleotida, objavljen u GenBank, pod pristupnim brojem AAS97865). Kada su prajmeri koji kodiraju Blad terminalne sekvence korišćeni za amplifikaciju sekvence iz genomske DNKLupinus,dobijen je -620 bp proizvod, što ukazuje na prisustvo introna u genskom fragmentu koji kodira Blad. Prirodni Blad je glavna komponenta 210 kD glikooligomera koji se akumulira isključivo (posle intenzivne ograničene proteolize P-konglutina) u kotiledonima vrsta Lupinus, između dana 4 i 12 posle početka germinacije. Dok je navedeni oligomer glikozilovan, prirodni Blad je neglikozilovan. Glikooligomer koji sadrži Blad je sastavljen od nekoliko polipeptida, pri čemu oni glavni ispoljavaju molekulske mase od 14, 17, 20, 32, 36, 48 i 50 kD. 20 kD polipeptid, Blad, je daleko najčešći polipeptid unutar oligomera i izgleda da je jedini sa aktivnošću lecitina. Prirodni Blad čini približno 80% ukupnog proteina kotiledona u biljkama starosti 8-dana.

[0015]Sekvenca koja kodira prekursor P-konglutinaL. albus(SEQ ID NO: 1) je data na Slici 1. Sekvenca koja kodira ishodnu podjedinicu P-konglutina se nalazi na ostacima 70 do 1668. Kodirani, od 533 aminokiselina, ostatak ishodne podjedinice P-konglutina (SEQ ID NO: 2) je:

[0016]Interni fragment sekvence koja kodira prekursor P-konglutina koji odgovara Blad (SEQ ID NO: 3) je dat na Slici 2. Blad polipeptid (SEQ ID NO: 4) je:

[0017]Prema tome, antimikrobno sredstvo sadrži (ili se uglavnom sastoji od) polipeptid koji sadrži (ili se uglavnom sastoji od) Blad ili njegovu aktivnu varijantu, pri čemu navedeno sredstvo sadrži (ili se uglavnom sastoji od) polipeptidne sekvence koja sadrži (ili se uglavnom sastoji od) SEQ ID NO: 4 ili njegove aktivne varijante.

[0018]Aktivna varijanta Blad je varijanta Blad koja zadržava sposobnost da deluje kao antimikrobno sredstvo (tj. ima antimikrobnu aktivnost - videti u daljem tekstu za opis nivoa takve aktivnosti i kako je izmeriti). "Aktivna varijanta Blad" obuhvata unutar svog obima fragment SEQ ID NO: 4. Fragment SEQ ID NO: 4 ima dužinu od najmanje 100 aminokiselinskih ostataka, kao što je najmanje 100, 120, 140, 160 ili 173 aminokiselinska ostatka.

[0019]"Aktivna varijanta Blad" takođe obuhvata unutar svog obima polipeptidnu sekvencu koja ima homologiju sa SEQ ID NO: 4, kao što je najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjno najmanje 90%, poželjno najmanje 95%, poželjno najmanje 97%, i najpoželjnije najmanje 99% identičnosti, na primer preko cele sekvence ili preko regiona od najmanje 100, poželjno najmanje 120, poželjno najmanje 140, i najpoželjnije najmanje 160 ili više uzastopnih aminokiselinskih ostataka. Postupci za merenje homologije proteina su dobro poznati u tehnici i stručnjacima iz date oblasti tehnike biće jasno da u predstavljenom kontekstu, homologija se izračunava na osnovu aminokiselinske identičnosti (nekada označena kao "stroga homologija").

[0020]Homologa aktivna Blad varijanta se tipično razlikuje od polipeptidne sekvence SEQ ID NO: 4 po supstituciji, inserciji ili deleciji, na primer od 1, 2, 3, 4, 5 do 8 ili više supstitucija, delecija ili insercija. Supstitucije su poželjno 'konzervativne', to jest aminokiselina može biti supstituisana sa sličnom aminokiselinom, putem čega slične aminokiseline dele jednu od sledećih grupa: aromatične ostatke (F/H/W/Y), nepolarne alifatične ostatke (G/A/P/I/L/V), polarne nenaelektrisane alifatike (C/S/T/M/N/Q) i polarne-naelektrisane alifatike (D/E/K/R). Poželjne podgrupe sadrže: G/A/P; I7L/V; C/S/T/M; N/Q;

D/E; i K/R.

[0021]Polipeptid koji sadrži Blad ili njegovu aktivnu varijantu (kao što je opisana u prethodnom tekstu) može da se sastoji od Blad ili njegove aktivne varijante sa bilo kojim brojem aminokiselinskih ostataka dodatih na N-terminus i/ili C-terminus uz uslov da polipeptid zadržava antimikrobnu aktivnost (ponovo, videti u daljem tekstu za opis nivoa takve aktivnosti i kako je izmeriti). Poželjno, ne više od 300 aminokiselinskih ostataka se dodaje na bilo koji ili oba kraja Blad ili nejgove aktivne varijante, poželjnije ne više od 200 aminokiselinskih ostataka, poželjno ne više od 150 aminokiselinskih ostataka, poželjno ne više od 100 aminokiselinskih ostataka, poželjno ne više od 80, 60 ili 40 aminokiselinskih ostataka, najpoželjnije ne više od 20 aminokiselinskih ostataka.

[0022]Polipeptid koji sadrži (ili se uglavnom sastoji od) Blad ili njegovu aktivnu varijantu (kao što je opisano u prethodnom tekstu) može biti korišćen u pronalasku u obliku prečišćenog (npr. uklonjenog iz biljnog, životinjskog ili mikrobnog izvora) ili izolovanog oblika, i/ili može biti rekombinantan. Proizvodnja rekombinantnog oblika omogućava proizvodnju aktivnih varijanti Blad.

[0023]Postupci za prečišćavanje prirodnog Blad su već opisani u tehnici (npr. Ramos et al

(1997) Planta 203(1): 26-34 i Monteiro et al (2010) PLoS ONE 5(1): e8542). Pogodan izvor prirodnog Blad je biljka rodaLupinus,kao što jeLupinus albus,poželjno kotiledon navedene biljke, poželjno sakupljene između oko 4 do oko 14 dana posle početka germinacije, poželjnije sakupljene 6 do 12 dana posle početka germinacije (kao što je 8 dana posle početka germinacije). Postupci su opisani u tehnici za ekstrakciju ukupnog proteina koja dovodi do sirovog ekstrakta koji sadrži Blad, i za prečišćavanje proteina takvog ekstrakta koje dovodi do delimično prečišćenog ekstrakta npr. koji sadrži glikooligomer koji sadrži Blad.

[0024]Da bi izolovani sam Blad moguće je zatim koristiti SDS-PAGE i/ili, poželjno, reverzno faznu (RP)-HPLC na C-18 koloni.

[0025]Alternativan način dobijanja delimično prečišćenog ekstrakta koji sadrži glikooligomer koji sadrži Blad je korišćenjem aktivnosti Blad u vidu vezivanja hitina. Glikooligomer se veoma snažno vezuje za hitinsku kolonu kao deo prečišćavanja hitin-afinitetnom hromatografijom, koja je eluirana sa 0.05 N HC1. Detalji o primeru ovog postupka prečišćavanja su kao što sledi: Kotiledoni od osam dana starih biljaka obrnike sakupljeni su i homogenizovani u Milli-Q plus vodi (pH podešena do 8.0), koja sadrži 10 mM CaCb i 10 mM MgCk. Homogenat je filtriran kroz gazu i centrifugiran na 30,000 g u trajanju od 1 časa na 4°C. Talog je zatim suspendovan u 100 mM Tris-HCl puferu, pH 7.5, koji sadrži 10%

(tež./zapr.) NaCl, 10 mM EDTA i 10 mM EGTA, mešan 1 čas na 4°C, i centrifuiran na 30,000 g u trajanju od 1 časa na 4°C. Ukupna globulinska frakcija, sadržana u supernatantu, je istaložena sa amonijum sulfatom (561 g/l), ostavljena da se meša u hladnom u trajanju od 1 časa i centrifugirana na 30,000 g u trajanju od 30 min na 4°C. Dobijeni talog je rastvoren u 50 mM Tris-HCl puferu, pH 7.5, desalinizovan u PD-10 kolonama ekvilibrisanim u istom puferu i propušten kroz hitin-afinitetnu hromatografsku kolonu prethodno ekvilibrisanu u istom puferu. Kolona je isprana sa 50 mM Tris-HCl puferom, pH 7.5, i vezani proteini su eluirani sa 0.05 N HC1. Eluirane frakcije su odmah neutralizovane sa 2 M Tris i frakcije koje su imale pik su sakupljene, liofilizovane i analizirane pomoću SDS-PAGE.

[0026]Za pripremu hitinske kolone, sirtovi hitin je dobijen iz Sigma i obrađen kao što sledi: uzorak hitina je obimno ispran sa Milli-Q plus vodom, a zatim sa 0.05 N HC1. Zatim je ispran sa 1% (tež./zapr.) natrijum karbonatom i zatim etanolom, sve dok apsorbanca tečnog ostatka od ispiranja nije bila manja od 0.05. Hitin je zatim pakovan u vrh pipete i ekvilibrisan sa 50 mM Tris-HCl puferom, pH 7.5.

[0027]Postupci za proizvodnju rekombinantnih proteina su dobro poznati u tehnici. Takvi postupci kao što su ovde primenjeni obuhvataće inseriranje polinukleotida koji kodira polipeptid koji sadrži Blad ili njegovu aktivnu varijantu u pogodan ekspresioni vektor - omogućavajući postavljanje navedenog polinukleotida pored jednog ili više promotora (npr. inducibilnog promotora, kao što je T71ac) i pored drugih polinukleotida ili gena od interesa - uvođenje ekspresionog vektora u pogodnu ćeliju ili organizam (npr.Escherichia coli),koji eksprimira polipeptid u transformiranoj ćeliji ili organizmu i uklanjanje eksprimiranog rekombinantnog polipeptida iz te ćelije ili organizma. Da bi se pomoglo takvo prečišćavanje ekspresioni vektor može biti konstruisan tako da polinukleotid dodatno kodira, na primer, terminalnu oznaku koja može da pomogne u prečišćavanju: npr., oznaka histidinskih ostataka za afinitetno prečišćavanje. Pošto je rekombinantni polipeptid prečišćen, oznaka za prečišćavanje može biti uklonjena iz polipeptida, npr., proteolitičkim odvajanjem.

[0028]U kompoziciji prema pronalasku koja sadrži antimikrobno sredstvo koje sadrži (ili se uglavnom sastoji od) polipeptida, navedeni polipeptid je poželjno u delimično prečišćenom obliku, poželjnije u prečišćenom obliku. Navedeni polipeptid je delimično prečišćen kada je prisutan u sredini kojoj nedostaju jedan ili više drugih polipeptida sa kojima je prirodno povezan i/ili je predstavljen sa najmanje oko 10% ukupnog prisutnog proteina. Navedeni polipeptid je prečišćen kada je prisutan u sredini kojoj nedostaju svi, ili većina, drugih polipeptida sa kojima je on prirodno povezan. Na primer, prečišćeni Blad označava da Blad predstavlja najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, ili najmanje oko 99% ukupnog proteina u kompoziciji.

[0029]U kompoziciji prema pronalasku koja sadrži antimikrobno sredstvo, sadržaj proteinaLupinusmože uglavnom da se sastoji od glikooligomera koji sadrži Blad koji sadrži polipeptid koji sadrži (ili se uglavnom sastoji od) Blad ili njegovu aktivnu varijantu.

Mikroorganizmi biljni patogeni

[0030]Mikroorganizam biljni patogen protiv koga je antimikrobno sredstvo efikasno je bilo koji mikroorganizam sposoban da izazove bolest na ili u biljci. Naročito poželjna bakterijska ciljna mesta obuhvataju patogene vrstePseudomonas,kao što suPseudomonas aeruginosa, Pseudomonas syringae, Pseudomonas tolaasiiiPseudomonas agarici(poželjnoP. syringae) ;patogene vrsteErwinia,kao što suErwinia persicina, Pectobacterium carotovorum, Erwinia amylovora, Erwinia chrysanthemi, Envinia psidiiiErwinia tracheiphila,i patogene vrsteStreptomyceskao što jeStreptomyces griseus.

[0031]Naročito poželjna gljivična ciljna mesta obuhvataju patogene vrsteAlternaria,kao što

suAlternaria alternata, Alternaria arborescens, Alternaria arbusti, Alternaria brassicae,

Alternaria brassicicola, Alternaria carotiincultae, Alternaria conjuncta, Alternaria dauci,

Alternaria euphorbiicola, Alternaria gaisen, Alternaria infectoria, Alternaria japonica,

Alternaria petroselini, Alternaria selini, Alternaria solaniiAlternaria smyrnii,patogene vrsteFusarium,kao što suFusarium oxysporumiFusarium graminearum(poželjnoF. oxysporum) ;patogene vrsteBotrytis,kao što jeBotrytis cinerea;i patogene vrsteColletotrichum,kao što suColletotrichum actuatum, Colletotrichum coccodes,

Colletotrichum capsici, Colletotrichum crassipes, Colletotrichum gloeosporioides,

Colletotrichum graminicola, Colletotrichum kahawae, Colletotrichum lindemuthianum,

Colletotrichum musae, Colletotrichum nigrum, Colletotrichum orbiculare, Colletotrichum

pisiiColletotrichum sublineolum.

Helatirajuća sredstva

[0032] Helatirajuće sredstvo (takođe poznato kao helant, helator ili sekvestirajuće sredstvo) je bilo koje jedinjenje koje se vezuje za jon metala da bi se formirao nekovalentni kompleks i smanjila aktivnost jona. Pogodna helatirajuća sredstva obuhvataju poliamino karboksilate, kao što su EDTA (etilendiamintetrasirćetna kiselina) i EGTA (etilenglikol bis(P-aminoetil etar)-N,N,N',N'-tetrasirćetna kiselina). Poželjno, EDTA se koristi kao helatirajuće sredstvo, poželjno u koncentraciji od najmanje 10 ug/ml, najmanje 50 ug/ml, ili najmanje 100 ug/ml, i do 500 ug/ml, do 1 mg/ml, do 5 mg/ml, do 10 mg/ml, ili do 20 mg/ml. Poželjno, EDTA se koristi u koncentraciji od između 0.1 mg/ml i 20 mg/ml, poželjnije između 1 mg/ml i 20 mg/ml.

Ishodi

[0033] Antimikrobno sredstvo, u kombinaciji sa helatirajućim sredstvom, se može koristiti za inhibiciju rasta mikroorganizma biljnog patogena (što znači da ima mikrobistatičku aktivnost) i/ili za ubijanje navedenog mikroorganizma (što znači da ima mikrobijalnu aktivnost). Stručnjak iz date oblasti tehnike će biti sposoban da identifikuje, preko rutinskih postupaka, pogodnu dozu i/ili koncentraciju antimikrobnog sredstva, u određenoj koncentraciji izabranog helatirajućeg sredstva, da bi se dobila naročito poželjna inhibicija rasta ili ubijanje mikroorganizma. Poželjno, kombinacija antimikrobnog sredstva i helatirajućeg sredstva je netoksična za ljude ili životinje.

[0034] Poželjno, kada je kombinacija antimikrobnog sredstva i helatirajućeg sredstva (npr. kompozicija prema pronalasku) korišćena kao mikrobistatik, kombinacija smanjuje stopu rasta za 10%, poželjnije za 50%, poželjnije za 75%, poželjnije za 90%, poželjnije za 95%, poželjnije za 98%, poželjnije za 99% i čak poželjnije za 99.9% u poređenju sa ekvivalentnim uslovima gde kombinacija nije prisutna. Najpoželjnije kombinacija sprečava bilo kakav rast mikroorganizma.

[0035] Poželjno, kada je kombinacija antimikrobnog sredstva i helatirajućeg sredstva (npr. kompozicija prema pronalasku) korišćena kao mikrobicidal, kombinacija ubija 10% populacije mikroorganizma, poželjnije 50% navedene populacije, poželjnije 75% navedene populacije, poželjnije 90% navedene populacije, poželjnije 95% navedene populacije, poželjnije 98% navedene populacije, poželjnije 99% navedene populacije i čak poželjnije za 99. 9% navedene populacije u poređenju sa ekvivalentnim uslovima gde kombinacija nije prisutna. Najpoželjnije kombinacija ubija celokupnu populaciju mikroorganizma.

[0036] Kada se koristi za prevenciju ili inhibiciju infekcije biljke mikroorganizmom navedena kombinacija je poželjno korišćena u efikasnoj količini, to jest količini koja obezbeđuje nivo inhibicije rasta i/ili ubijanja mikroorganizma takav da je postignut detektabilni nivo prevencije infekcije ili inhibicije (npr. postignut je detektabilan nivo prevencije ili inhibicije oštećenja biljnog tkiva), poželjno u poređenju sa ekvivalentnim uslovima gde kombinacija nije prisutna.

[0037] Izabrano antimikrobno sredstvo sadrži polipeptid koji sadrži Blad ili njegovu aktivnu varijantu zatim, u kombinaciji sa helatirajućim sredstvom (npr. EDTA u bilo kojoj od koncentracija opisanih u prethodnom tekstu), pri čemu pogodne koncentracije sa kojom se koristi navedeni polipeptid obuhvataju najmanje 5 ug/ml, najmanje 10 ug/ml, najmanje 20 ug/ml, najmanje 50 ug/ml, najmanje 100 ug/ml ili najmanje 500 ug/ml, i do 1 mg/ml, do 2.5 mg/ml, do 5 mg/ml ili do 10 mg/ml. Poželjno koncentracija navedenog polipeptida je između 50 ug/ml i 10 mg/ml, poželjnije između 500 ug/ml i 5 mg/ml, i čak poželjnije između 1 mg/ml i 5 mg/ml (kao što je oko 2.5 mg/ml). Na primer, u 50 mM (tj. oko 15.8 mg/ml) EDTA koncentracija Blad od 1 mg/ml ili 2.5 mg/ml može se koristiti npr. za inhibiciju rastaB. cinereailiF. oxysporumrespektivno. Ovo je iznenađujući nalaz imajući u vidu da Blad sam po sebi treba da se koristi u oko 5 mg/ml ili 10 mg/ml (respektivno) da bi se inhibirao rast ovih patogena. Nalaz pronalazača omogućava a) efikasnu upotrebu antimikrobnih sredstava (koji su efikasni protiv biljnih patogena) na nižim koncentracijama preko upotrebe helatirajućeg sredstva ili b) povećanu efikasnost antimikrobnih sredstava (koja su efikasna protiv biljnih patogena) u standardnim koncentracijama preko upotrebe helatirajućeg sredstva. Ovo omogućava ekonomičniju/efikasniju upotrebu takvih antimikrobnih sredstava za prevenciju ili lečenje infekcije biljke (ili njenog dela) mikroorganizmom.

Upotrebe i postupci

[0038]Pronalazači su takođe dali upotrebu kompozicije prema pronalasku za inhibiciju rasta i/ili ubijanje mikroorganizma biljnog patogena na biljci. U tom cilju oni takođe obezbeđuju postupak za inhibiciju rasta i/ili ubijanja mikroorganizma biljnog patogena koji sadrži primenu na biljku kod koje postoji potreba za tim kompozicije prema pronalasku (npr. efikasne količine navedene kompozicije).

[0039]Pronalazači su takođe dali upotrebu helatirajućeg sredstva i antimikrobnog sredstva koje je efikasno protiv mikroorganizma biljnog patogena za inhibiciju rasta i/ili ubijanja mikroorganizma biljnog patogena na biljci. Oni takođe obezbeđuju upotrebu helatirajućeg sredstva za povećanje aktivnosti antimikrobnog sredstva koje je efikasno protiv mikroorganizma biljnog patogena. U tom cilju, oni takođe daju: a) postupak za inhibiciju rasta i/ili ubijanja mikroorganizma biljnog patogena koji sadrži primenu na biljku kod koje postoji potreba za tim helatirajućeg sredstva i antimikrobnog

sredstva koje je efikasno protiv mikroorganizma biljnog patogena (npr. efikasne količine kombinacije navedenih sredstava); i

b) postupak za povećanje aktivnosti antimikrobnog sredstva koje je efikasno protiv mikroorganizma biljnog patogena koji sadrži upotrebu navedenog antimikrobnog

sredstva sa helatirajućim sredstvom.

[0040]U ovim primerima izvođenja navedeno antimikrobno sredstvo i navedeno helatirajuće srestvo mogu biti primenjivani na navedenu biljku kao deo iste kompozicije ili posebno. Ako se ova dva sredstva primenjuju posebno tada primena može biti uzastopna (pri čemu se svako sredstvo primenjuje prvo) ili istovremena. Primena na biljku može se postići na primer nanošenjem (npr. prskanjem) sredstava (ili kompozicije koja sadrži navedena sredstva) na biljku (ili bilo koji njen deo) ili potapanjem biljke ili njenog dela (npr. semena) u odgovarajući rastvor (rastvore).

[0041]Kada je helatirajuće sredstvo korišćeno za povećanje aktivnosti antimikrobnog sredstva koje je efikasno protiv mikroorganizma biljnog patogena navedeno helatirajuće sredstvo (i njegova koncentracija) je poželjno izabrano tako da kombinacija navedenog antimikrobnog sredstva i navedenog helatirajućeg sredstva daje povećani nivo inhibicije rasta i/ili ubijanja mikroorganizma biljnog patogena (npr. tako da se postiže povećani nivo prevencije ili inhibicije biljne infekcije npr. postiže se povećani nivo prevencije ili inhibicije oštećenja biljnog tkiva), poželjno u poređenju sa ekvivalentnim uslovima gde helatirajuće sredstvo nije prisutno.

[0042]U primerima izvođenja upotrebe/postupka prema pronalasku antimikrobno sredstvo i helatirajuće sredstvo su kao što su opisani detaljno u prethodnom tekstu.

[0043]Biljka kod koje postoji potreba za kombinacijom antimikrobnog sredstva koja je efikasna protiv mikroorganizma biljnog patogena i helatirajućeg sredstva može biti bilo koja biljka kod koje postoji rizik od infekcije ili koja ima infekciju, pri čemu je navedena infekcija uzrokovana mikroorganizmom biljnim patogenom. Poželjno, biljka je kulturna biljka (npr. bilo koja biljka koja se gaji tako da bude sakupljena radi obezbeđivanja hrane, stočne hrane, goriva, vlakana ili bilo kog drugog komercijalno korisnog proizvoda). Poželjno, navedena kulturna biljka je hranljiva kulturna biljka, kao što je biljka koja daje šećer (npr. šećerna repa, šećerna trska), voće (uključujući orahe), povrće ili seme. Posebne biljke koje obezbeđuju semena obuhvataju žitarice (npr. kukuruz, pšenicu, ječam, sirak, proso, pirinač, ovas i raž) i leguminoze (npr. pasulj, grašak i sočivo).

[0044]Pronalazači su takođe dali upotrebu kompozicije koja sadrži (ili se uglavnom sastoji od) antimikrobni polipeptid koji sadrži (ili se uglavnom sastoji od) Blad ili njegove aktivne varijante za ubijanje, ili inhibiciju rasta, bakterije biljnog patogena na biljci. U tom cilju pronalazači dalje daju postupak za ubijanje ili inhibiciju rasta, bakterije biljnog patogena na biljci, pri čemu navedeni postupak sadrži primenu na navedenu biljku kompozicije koja sadrži (ili se uglavnom sastoji od) efikasnu količinu antimikrobnog polipeptida koji sadrži (ili se uglavnom sastoji od) Blad ili njegovu aktivnu varijantu. Izborno antimikrobni polipeptid koji sadrži (ili se uglavnom sastoji od) Blad ili njegovu aktivnu varijantu može biti korišćen u izolovanom obliku.

[0045]U poželjnim primerima izvođenja, navedena kompozicija je naneta na biljku kod koje postoji poreba za tim. Biljka kod koje postoji potreba za navedenom kompozicijom može biti bilo koja biljka koja je u riziku od dobijanja infekcije ili koja ima infekciju, pri čemu je navedena infekcija uzrokovana bakterijom biljnim patogenom. Poželjne biljke su kao što su opisane u prethodnom tekstu. Značenja 'ubijanje/inhibicija rasta bakterije', i 'efikasna količina', su kao što su opisana u prethodnom tekstu u vezi sa kombinacijom antimikrobnog sredstva i helatirajućeg sredstva.

Primeri

[0046] U sledećim Primerima BLAD označava prirodni glikooligomer koji sadrži Blad, odnosno koji sadrži 20 kD Blad polipeptid, prečišćen prema Ramos et al (1997) Planta 203(1): 26-34: videti "Plant material and growth conditions" i "Purification of proteins" delove iz dela Materijal i metode tog dokumenta.

Definicije:

[0047] MIC - minimalna inhibitorna koncentracija: najniža koncentracija antimikrobnog sredstva koja inhibira vidljivi rast mikroorganizma.

MFC/MBC - minimalna fungicidna/baktericidna koncentracija (ili minimalna letalna koncentracija): najniža koncentracija antimikrobnog sredstva koja je potrebna da se ubije 99.9% početnog inokuluma posle 24 časa pod standardizovanim setom uslova.

Primer 1 - Baktericidna aktivnost BLAD i sinergistički efekat EDTA.

[0048] A. Nađeno je da je BLAD bakteriostatičan u 100 ug/ml i baktericidan u 250 ug/ml protivP. aeruginosa.ProtivP. aeruginosaBLAD u 50 ug/ml ili EDTA u 1 mg/ml inhibira rast (tj. oba su bakteri ostati čki), ali kombinacija ta dva je baktericidna.

B. ProtivErwinia pirsicinaBLAD ima MIC od 32 ug/ml i EDTA ima MIC od 15 mM. Međutim, u prisustvu sub-inhibitomih količina EDTA (0.75 mM) MIC za BLAD je snižen do 16 ug/ml. C. ProtivStreptomyces griseusBLAD ima MIC od 1024 ug/ml i EDTA ima MIC od 16 mM. Međutim, u prisustvu sub-inhibitornih količina EDTA (8 mM) MIC za BLAD je snižen do 256 ug/ml.

Primer 2 - Sinergistički efekat EDTA na fungicidalnu aktivnost BLAD.

Podaci o zoni inhibicije za BLAD sa i bez EDTA protivBotrytis cinereana krompirovom dekstroznom agaru (PDA) na 1.2% tež./zapr. agara (inkubacija 3 dana na 25°C):

[0049]

[00501RastB. cinema jeinhibiran sa 200 ug i 100 ug BLAD. Ova inhibicija je stimulisana dodavanjem 50 mM (približno 15.8 mg/ml) EDTA.

[0051]Nije zabeležena inhibicija rasta upotrebom samo BLAD u 20 ug ili 50 ug ili upotrebom samo EDTA u 50 mM. Međutim, inhibicija je zabeležena kada je BLAD na bilo kojoj koncentraciji kombinovan sa 50 mM EDTA.

Podaci o zoni inhibicije za BLAD saibez EDTA protivFusarium oxysporumna krompirovom dekstroznom agaru (PDA) na 1.2% tež./zapr. agara (inkubacija 3 dana na 25°C):

[0052]

[0053]RastF. oxysprumje inhibiran sa 200 ug BLAD. Ova inhibicija je stimulisana dodavanjem 50 mM EDTA.

[0054] Nije zabeležena inhibicija rasta upotrebom samo BLAD u 20ug,50 ug ili 100 ug, ili upotrebom samo EDTA u 50 mM. Međutim, inhibicija je zabeležena kada je 50ugili 100 ug BLAD kombinovano sa 50 mM EDTA.

Primer 2 - Sinergistički efekat EDTA na fungicidnu aktivnost BLAD.

Podaci o zoni inhibicije za BLAD sa/bez EDTA protivBotrytis cinereana krompirovom dekstroznom agaru (PDA) na 1.2% tež./zapr. agara (inkubacija 3 dana na 25°C):

[0055]

[0056]RastB. cineraje inhibiran sa 200 ug i 100 ug BLAD. Ova inhibicija je stimulisana dodavanjem 50 mM (približno 15.8 mg/ml) EDTA.

[0057] Inhibicija rasta nije zabeležena upotrebom samo BLAD u 20 ug ili 50 ug ili upotrebom samo EDTA u 50 mM. Međutim, inhibicija je zabeležena kada je BLAD u bilo kojoj koncentraciji kombinovan sa 50 mM EDTA.

Podaci o zoni inhibicije za BLAD saibez EDTA protivFusarium oxysporumna krompirovom dekstroznom agaru (PDA) u 1.2% tež./zapr. agara (inkubacija 3 dana na 25°C):

[0058]

[00591RastF. oxysprumje inhibiran sa 200 ug BLAD. Ova inhibicija je stimulisana dodavanjem 50 mM EDTA.

[0060]Inhibicija rasta nije zabeležena upotrebom samo BLAD u 20ug,50ugili 100ug,ili upotrebom samo EDTA u 50 mM. Međutim, inhibicija je zabeležena kada je 50ugili 100 ug BLAD kombinovani sa 50 mM EDTA.

Claims (12)

1. Upotreba helatirajućeg sredstva i antimikrobnog sredstva koje je efikasno protiv mikroorganizma biljnog patogena za inhibiciju rasta i/ili ubijanje mikroorganizma biljnog patogena na biljci; pri čemu navedeno antimikrobno sredstvo sadrži polipeptid koji sadrži Blad sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 4 ili njenu aktivnu varijantu koja ima antimikrobnu aktivnost i koja sadrži sekvencu koja ima najmanje 70% identičnosti sa SEQ ID NO:4 ili sa fragmentom SEQ ID NO:4 koji je najmanje 100 aminokiselina u dužinu.

2. Upotreba helatirajućeg sredstva za povećanje aktivnosti antimikrobnog sredstva koje je efikasno protiv biljnog patentnog mikroorganizma; pri čemu je navedeno antimikrobno sredstvo kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

3. Upotreba prema patentnom zahtevu 1 ili 2naznačena timešto se navedeno helatirajuće sredstvo i navedeno antimikrobno sredstvo nanose na biljku kod koje postoji potreba za tim.

4. Upotreba prema patentnom zahtevu 3 naznačena time što se navedeno antimikrobno sredstvo i navedeno helatirajuće sredstvo primenjuju na navedenu biljku: a) kao deo iste kompozicije; ili b) posebno, bilo uzastopno ili istovremeno.

5. Upotreba prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva naznačena time što je antimikrobno sredstvo efikasno protiv bakterije ili gljive biljnog patogena.

6. Upotreba prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva naznačena time helatirajuće sredstvo je poliamino karboksilat.

7. Upotreba prema patentnom zahtevu 6, naznačena time što helatirajuće sredstvo je EDTA.

8. Postupak za inhibiciju rasta i/ili ubijanja mikroorganizma biljnog patogena koji sadrži primenu na biljku kod koje postoji potreba za tim helatirajućeg sredstva i antimikrobnog sredstva koje je efikasno protiv mikroorganizma biljnog patogena; pri čemu navedeno antimikrobno sredstvo je kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

9. Postupak za povećanje aktivnosti antimikrobnog sredstva koje je efikasno protiv mikroorganizma biljnog patogena koji sadrži upotrebu navedenog antimikrobnog sredtva sa helatirajućim sredstvom; pri čemu je navedeno antimikrobno sredstvo kao što je definisano u patentnom zahtevu 1.

10. Upotreba prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što mikroorganizam je bakterija biljni patogen.

11. Upotreba prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što bakterija je patogena vrsta iz jednog od sledećih rodova:Pseudomonas, ErwiniaiStreptomyces.

12. Postupak prema patentnom zahtevu 8 ili 9, naznačen time što mikroorganizam je bakterija biljni patogen.