RS55346B1 - Postupak za proizvodnju kvasca bogatog aminokiselinama - Google Patents

Description

Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobij anje kvasca bogatog aminokiselinama.

Pozadina pronalaska

Trenutno se širom sveta, posebno u razvijenim zemljama kao Što su zemlje Evrope, SAD i Japan, traže prirodni i zdravstveno pogodni prehrambeni začini koji ne zahtevaju aditive. U takvim okolnostima, u industriji ekstrakta kvsca, razvijeni su ekstrakti visoke dodate vrednosti koji imaju pojačana svojstva ukusa (prijatnost ukusa, "umami") koji potiču od nukleinskih kiselina, a napredovao je i razvoj aminokiselina kao činilaca prijatnosti ukusa zajedno sa nukleinskim kiselinama.

Kada je reč o glutaminskoj kiselini, do sada se natrijum glutamat koristio kao hemijski začin. Međutim, poslednjih godina, u oblasti hrane i pića, favorizuje se upotreba kulture ili ekstrakta dobijenog gajenjem kvasca u kulturi, koji prirodno sadrže ne samo glutaminsku, već i druge aminokiseline.

Na primer, patentni dokument 1 navodi ekstrakt kvasca koji se odlikuje time što je količina aminokiselina 25% u masenim procentima, ili veća, kao i time što je ukupna količina aromatičnih komponenta na bazi nukleinskih kiselina 2% u masenim procentima, ili veća.

Takođe, patentni dokument 2 opisuje preparat ekstrakta kvasca dobijen iz kvasca iz rodaCandida tropicalis, Candida lipolyticailiCandida utilis,u kojem je ukupna količina slobodnih aminokiselina 3,0% ili više, količina alanina u ukupnoj količini aminokiselina je 10% ili više, količina giutaminske kiseline je 25% ili više, a količina histidinaje 10% ili više.

Takođe, patentni dokument 3 opisuje sredstvo za poboljšanje arome koje sadrži ekstrakt kvasca kao aktivnu komponentu, gde navedeni ekstrakt kvasca sadrži natrijum 5'-inozinat i(li) natrijum 5'-adenilat, natrijum 5'-guanilat, natrijum 5'-uridilat i natrijum 5'-citidilat, redom, u odnosu od 1 do 15%, te natrijum glutamat u udelu od 1 do 20%.

Takođe, patentni dokument 4 opisuje postupak za proizvodnju ekstrakta kvasca koji sadrži unutarćelijsku slobodnu glutaminsku kiselinu izvedenu iz glutamina u udelu od najmanje 3% u odnosu na čvrste delove ekstrakta, pri čemu postupak obuhvata korak digestije kvasca koji sadrži slobodni glutamin u količini od 15 mg ili više na 1 g suvih ćelija.

Dalje, patentni dokument 5 opisuje ekstrakt kvasca koji je ekstrakt kvasca dobijen digestijom ili razlaganjem kvasca, u kome peptidna frakcija sa molekulskom masom od 10,000 ili više predstavlja 10% ili više od ukupne količine celih peptida, gde se navedeni peptidi detektuju merenjem apsorpcije na 220 nm u tečnosti koja se dobija propuštanjem ekstrakta kvasca kroz filter membranu sa prečnikom pore od 1 mikrometar, nakon čega sledi gel filtracija tog dela koji je propušten kroz filter membranu.

Dalje, patentni dokument 6 opisuje ekstrakt kvasca bogat glutaminskom kiselinom koji sadrži 13% u masenim procentima, ili više, L-glutaminske kiseline (u obliku Na soli).

Dalje, patentni dokument 7 opisuje začinski preparat koji sadrži aktivnu komponentu arome na bazi nukleinskih kiselina, glutaminske kiseline, kalijuma i mlečne kiseline, natrijum laktata ili kalij um laktata, gde je molarni odnos aktivna komponenta arome na bazi nukleinskih kiselina : glutaminska kiselina od 1:2 do 40, dok je molarni odnos (aktivna komponenta arome na bazi nukleinskih kiselina + glutaminska kiselina): kalijum : (mlečna kiselina, natrijum laktat ili kalijum laktat) 1:5 do 80:10 do 80.

Takođe, patentni dokument 8 opisuje kvasac rezistentan na inhibitor rasta antagonist glutaminske kiseline i koji akumulira kiselinu u ćelijama.

Takođe, patentni dokument 9 opisuje postupak za proizvodnju ekstrakta kvasca, gde taj postupak obuhvata upotrebu kvascaYarrowia lipolitica,koji je rezistentan na lek nistatin, koji utiče na strukturu i funkciju ćelijske membrane, a ima i sposobnost da akumulira 530 mg/l ili više L-glutaminske kiseline u ćelijama.

Spisak referenci

Patentni dokumenti

Patentni dokument 1: Japanska neispitana patentna prijava, prva objava br. 2007-49989

Patentni dokument 2: Japanski patent br. 3,519,572

Patentni dokument 3: Japanski patent br. 3,088,709

Patentni dokument 4: Japanska neispitana patentna prijava, prva objava br. 2002-171961

Patentni dokument 5: Japanska neispitana patentna prijava, prva objava br. 2005-102549

Patentni dokument 6: Japanska neispitana patentna prijava, prva objava br. 2006-129835

Patentni dokument 7: Japanska neispitana patentna prijava, prva objava br. Hei 5-227911

Patentni dokument 8: Japanska neispitana patentna prijava, prva objava br. Hei 9-294581

Patentni dokument 9: Japanski patent br. 3,896,606

Kratak opis pronalaska

Tehnički problem koji pronalazak rešava

Međutim, u konvencionalnim postupcima, kako bi se uvela dovoljna količina slobodnih aminokiselina u slučaju proizvodnje različitih ekstrakta uz upotrebu biljnih proteina ili proteina životinjskog porekla, takve operacije često postaju veoma komplikovane, na primer, neophodno je sprovesti tretmane razlaganja, kao u slučaju hidrolizovanih boljnih proteina (HVP), hidrolizovanih životinjskih proteina (HAP) itd. Uz to, potreban je i postupak za proizvodnju ekstrakta kvasca koji sadrži aminokiseline ili slično u višoj koncentraciji nego što je koncentracija u trenutno dostupnom ekstraktu kvasca.

Kada je reč o patentnom dokumentu 1, uz komplikovanu operaciju u kojoj se koristi enzim, količina glutaminske kiseline u suvom prahu je oko 13%.

Dalje, kada je reč o patentnom dokumentu 2, uz komplikovanu operaciju u kojoj se sprovodi tretman mutacije gena i u kojoj se koristi enzim, bezbednost, poželjnost i slične osobine hrane su inferiornog kvaliteta.

Dalje, patentni dokument 3 opisuje ekstrakt kvasca koji sadrži 1 do 20% natrijum glutamata. Međutim, zapravo se koristi komercijalno dostupan proizvod koji sadrži 5,0% natrijum glutamata, a ostali nisu pomenuti.

Takođe, kada je reč o patentnom dokumentu 4, proizvodnja se sprovodi primenom genetske rekombinacije te je operacija komplikovana, dok su bezbednost, poželjnost i slične osobine hrane inferiornog kvaliteta.

Dalje, patentni dokument 5 navodi daje natrijum glutamat sadržan u udelu od 10% ili više, u odnosu na čvrstu supstancu, ali o tome se ništa ne pominje u primerima.

Dalje, kada je reč o patentnom dokumentu 6, operacija je komplikovana, na primer, izvodi se enzimogenacija.

Dalje, u vezi sa patentnim dokumentom 7, glutaminske kiseline se dodaju spolja, u maloj količini.

Dalje, u patentnom dokumentu 8, količina glutaminske kiseline u suvoj masi ćelija je mala.

Dalje, u patentnom dokumentu 9, operacija je komplikovana i, na primer, hemijska rezistencija je slabija nego kod matičnih sojeva.

Pod takvim okolnostima, pronađen je predmetni pronalazak a cilj predmetnog pronalaska je da se obezbedi postupak za proizvodnju kvasca bogatog aminokiselinama, koji sadrži aminokiseline u višim koncentracijama nego što je to slučaj kod konvencionalnog kvasca.

Rešenie tehničkog problema

Pronalazači predmetnog pronalaska uložili su intenzivne napore u istraživanje kako bi postigli prethodno opisane ciljeve i pronašli da se količina aminokiselina u kvascu povećava sa povećanjem pH u podlozi za gajenje kulture na određenu vrednost pH (pomeranje ka alkalnoj vrednosti) u toku gajenja kvasca u stacionarnoj fazi. Takođe su pronašli da ekstrakt kvasca sa visokom količinom aminokiselina može da se dobije proizvodnjom ekstrakta kvasca uz upotrebu ovog kvasca, čime je kompletiran predmetni pronalazak. Predmetni pronalazak odnosi se na sledeće:

[1] Postupak za proizvodnju kvasca bogatog aminokiselinama, koji podrazumeva: - gajenje kulture kvasca u tečnoj podlozi u logaritamskoj fazi rasta na temperaturi od 20 do 40°C i na pH 3,5 do 7,5, i

gajenje kulture kvasca u stacionanoj fazi rasta pod uslovima u kojima je pH

vrednost tečne podloge jednaka ili veća od 7,5 a manja od 11.

[2] Postupak za proizvodnju kvasca bogatog aminokiselinama u skladu sa tačkom [1], gde gajenje u tečnoj podlozi podrazumeva: podešavanje pH tečne podloge za gajenje kvasca u stacionarnoj fazi rasta na vrednost jednaku ili veću od 7,5 a manju od 11, te dalje gajenje kvasca u kulturi na tom opsegu pH vrednosti.

[3] Postupak za proizvodnju kvasca bogatog aminokiselinama u skladu sa tačkama [1] ili [2], gde je kvasacSaccharomycescerevisiaeiliCandida utilis.

[4] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na kvasac bogat aminokiselinama dobijen postupkom za đobijanje kvasca bogatog aminokiselinama u skladu sa bilo kojom od tačaka [1] do [3].

[5] Pronalazak opisuje kvasac bogat aminokiselinama u skladu sa tačkom [4], gde je ta količina slobodnih aminokiselina od 7,5 do 18,0% u masenim procentima, u odnosu na suvu masu ćelija kvasca.

[6] Pronalazak opisuje ekstrakt kvasca bogat aminokiselinama dobijen ekstrakcijom kvasca bogatog aminokiselinama u skladu sa tačkom [5].

[7] Predmetna prijava opisuje ekstrakt kvasca bogat aminokiselinama u skladu sa tačkom [6], gde je količina slobodnih aminokiselina dobijenih iz kvasca od 50 do 70%, u masenim procentima u odnosu na suvu masu.

[8] Predmetna prijava opisuje začinski preparat koji sadrži ekstrakt kvasca bogat aminokiselinama iz tačaka [6] ili [7],

[9] Predmetna prijava opisuje hranu i piće koji sadrže aminokiseline, uključujući kvasac bogat aminokiseilnama iz tačaka [4] ili [5], ekstrakt kvasca bogat aminokiselinama iz tačaka

[6] ili [7] ili začinski preparat iz tačke [8].

Korisni efekti pronalaska

Prema postupku za proizvodnju kvasca bogatog aminokiselinama prema predmetnom pronalasku, kvasac bogat aminokiselinama koji ima značajno povećane količine slobodnih aminokiselina može da se dobije na lak i jednostavan način, prostom promenom pH vrednosti u tečnoj podlozi za gajenje kvasca u stacionarnoj fazi rasta ka alkalnim vređnostima.

Izvođenjem operacije ekstrakcije iz kvasca bogatog aminokiselinama, dobija se ekstrakt kvasca bogatog aminokiselinama, koji sadrži visoke koncentracije slobodnih aminokiselina.

Kratak opis crteža

Slika 1 predstavlja grafik krive zavisnosti povećanja broja ćelija od vremena gajenja u kulturi u primeru 1.

Slika 2 predstavlja krivu zavisnosti povećanja mase suvih ćelija kvasca od vremena gajenja u kulturi iz primera 1.

Slika 3 je grafik koji prikazuje promenu pH u tečnoj podlozi u zavisnosti od vremena gajenja kulture iz primera 1.

Opis rešenja

Postupak za proizvodnju kvasca bogatog aminokiselinama prema predmetnom pronalasku obuhvata gajenje kvasca u tečnoj podlozi u logaritamskoj fazi rasta na temperaturi od 20 do 40°C na pH 3,5 do 7,5, te gajenje kvasca u tečnoj podlozi u stacionarnoj fazi rasta u uslovima u kojima je pH vrednost te tečne podloge jednaka ili veća od 7,5 a manja od 11.

U daljem tekstu biće detaljno opisana rešenja prema predmetnom pronalasku.

Kvasac može da bude jednoćelijska gljiva, a specifični primeri takvih kvasaca obuhvataju gljive iz rodaSaccharomyces,gljive iz rodaShizosaccharomyces,gljive iz rodaPichia,gljive iz rodaCandida,gljive iz rodaKluyveromyces,gljive iz rodafVilliopsis,gljive iz rodaDebaryomyces,gljive iz rodaGalactomyces,gljive iz rodaTorulaspora,gljive iz rodaRhodotorula,gljive iz rodaYarrowia,gljive iz rodaZygosaccharomycesi slične.

Među ovim kvascima, sa stanovišta jestivosti, poželjnije suCandida tropicalis, Candida lypolitica, Candida utilis, Candida sake, Saccharomyces cerevisiaei slične, a obično su poželjnije vrsteSaccharomyces cerevisiaeiCandida utilis.

Kako bi se realizovao predmetni pronalazak, nakon što je kvasac gajen u tečnoj podlozi koja sadrži izvor ugljenika, izvor azota, neorganske soli i slično do stacionarne faze rasta, kvasac može da se gaji u uslovima u kojima je pH vrednost tečne podloge u kojima se gaji kvasac u stacionarnoj fazi rasta jednaka ili veća od 7,5 a manja od 11.

Sastav podloge za ove sojeve mikro organizama nije posebno ograničen, te mogu da se koriste preparati koji su u upotrebi u konvencionalnim postupcima. Na primer, kao izvor ugljenika mogu da se koriste jedna, dve ili više vrsta izvora izabranih iz grupe koja se sastoji od glukoze, saharoze, sirćetne kiseline, etanola, melase, otpadnog rastvora sulfitne pulpe i sličnih, koji su u uobičajenoj upotrebi u gajenju mikroorganizama u kulturi. Kao izvor azota, mogu da se koriste jedna, dve ili više vrsta izvora izabranih iz grupe koja se sastoji od uree, amonijaka, neorganskih soli kao što su amonijum sulfat, amonijum hlorid ili amonijum fosfat i organske supstance koje sadrže azot, kao što su voda od namakanja kukuruza (CSL,eng. corn steep liquor),kazein, ekstrakt kvasca ili pepton. Dalje, u podlogu mogu da se dodaju fosfatna komponenta, kalijumska komponenta i magnezijumska komponenta, a mogu da se koriste konvencionalne industrijske sirovine kao što su kalcijum superfosfat, amonijum fosfat, kalijum hlorid, kalijum hidroksid, magnezijum sulfat i magnezijum hidrohlorid. Uz to, mogu da se koriste neorganske soli kao što su soli cinka, bakra, mangana i gvožđa. Uz to, mogu da se dodaju i vitamini i supstance koje su u vezi sa nukleinskim kiselinama.

Kao oblik gajenja u kulturi, može da se koristi bilo kakvo gajenje u baču, gajenje u polu-baču i kontinualno gajenje. Međutim, industrijski se primenjuju gajenje u polu-baču i kontinualno gajenje.

Uslovi za gajenje u kulturi pre podešavanja pH mogu da budu u skladu sa opštim uslovima za gajenje kvasca u kulturi i, na primer, da podrazumevaju temperaturu od 20 do 40°C, a poželjno je od 25 do 35°C, dok je pH vrednost u opsegu od 3,5 do 7,5, a posebno je poželjno da bude od 4,0 do 6,0. Uz to, poželjni su aerobni uslovi.

Poželjno je da se gajenje u kulturi odvija uz aeraciju i mešanje. Intenzitet aeracije i mešanja se pogodno određuju uzimajući u obzir zapreminu i vreme gajenja u kulturi, kao i početnu koncentraciju gljive. Na primer, gajenje u kulturi može da podrazumeva aeraciju od oko 0,2 do 2 zapremine po zapremini u minutu (VVM) i mešanje od oko 50 do oko 800 rpm.

Postupak gajenja u kulturi u uslovima u kojima je pH vrednost tečne podloge za gajenje kvasca u stacionarnoj fazi proliferacije jednaka ili viša od 7,5 a niža od 11 nije posebno ograničen. Na primer, pH vrednost tečne podloge može da se podesi tako da bude jednaka ili viša od 7,5 i niža od 11 kada rast kvasca u kulturi dostigne stacionarnu fazu. Alternativno, podloga može da se alkalizuje dodatkom uree u podlogu unapred, tako da pH prirodno dostigne vredosti veće ili jednake 7,5 i manje od 11 sa protokom vremena gajenja.

Količina uree ili sličnih sredstava koja se dodaju u podlogu nije posebno ograničena a poželjno je da se kreće od oko 0,5 do 5% u odnosu na podlogu, iako to zavisi od koncentracije ćelija kvasca koji se gaji u kulturi.

Postupak prilagođavanja pH vrednosti tečne podloge na vrednost jednaku ili višu od 7,5 a manju od 11 nakon što kultura kvasca uđe u stacionarnu fazu rasta nije posebno ograničen. Na primer, doda se prigodno izabrana alkalna komponenta, nakon čega pH vrednost tečne podloge može da se podesi na vrednost jednaku ili višu od 7,5 a manju od 11, poželjno je da to bude na vrednost jednaku ili višu od 7,5 a manju od 10.

Podešavanje pH vrednosti može da se izvrši u bilo kom trenutku u kome se kvasac nalazi u stacionarnoj fazi rasta, a poželjno je da se prilagođavanje pH izvrši neposredno nakon što kvasac uđe u stacionarnu fazu rasta. To je zbog toga što ne samo da se tako dovoljno povećava koncentracija slobodnih aminokiselina u kvascu, već se i vreme potrebno za ispunjenje svih koraka skraćuje.

Kada se pH tečne podloge za gajenje kvasca koji je u logaritamskoj fazi rasta podesi na vrednost jednaku ili višu od 7,5 a manju od 11, rast kvasca se usporava, te samim tim ne raste ni koncentracija slobodnih aminokiselina, što je nepovoljno.

Primeri alkalne komponente obuhvataju, ali nisu ograničeni na neorganske alkalne supstance kao što su NH4OH (vodeni rastvor amonijaka), gasoviti amonijak, natrijum hiđroksid, kalijum hidroksid, kalcijum hidroksid i magnezijum hiđroksid; alkalne baze( soli, prim. prev)kao Što su natrijum karbonat i kalijum karbonat; organske baze kao što je urea, i slične.

Među ovim komponentama, poželjne su vodeni rastvor amonijaka, gasoviti amonijak i urea.

Temperatura i drugi uslovi gajenja, u vreme kada kvasac u kulturi dostigne stacionarnu fazu rasta u tečnoj podlozi čija je vrednost jednaka ili viša od 7,5 a manja od 11, mogu da odgovaraju uobičajenim uslovima za gajenje kvasca u kulturi i, na primer, temperaura se kreće u opsegu od 20 do 40°C, a poželjno je od 25 do 35°C.

Postoji tendencija da se količina slobodnih aminokiselina u kvascu, nakon što se pH vrednost podesi na vrednost jednaku ili višu od 7,5 a manju od 11, povećava sa protokom vremena te, kada dostigne maksimum, da počne da se smanjuje. Ovo dodatno zavisi od uslova kao što su koncentracija ćelija u kulturi, pH i temperatura. Pretpostavlja se da uticaj alkalne sredine postaje prejak ukoliko se kultura predugo gaji u alkalnim uslovima. Stoga se, u predmetnom pronalasku, može pogodno odabrati optimalno vreme za sve uslove gajenja u kulturi, posebno za svako pH nakon promene ka alkalnoj sredini. Pripremom ekstrakta kvasca upotrebom kvasca koji je upravo dostigao maksimum vrednosti, dobija se ekstrakt kvasca bogat slobodnim aminokiselinama sa veoma velikom količinom aminokiselina.

Stoga, završavanjem gajenja kvasca u kulturi u trenutku dostizanja maksimuma, te prikupljanjem kvasca, može se dobiti ekstrakt kvasca bogat slobodnim aminokiselinama sa veoma velikom količinom slobodnih aminokiselina od 7,5% u masenim procentima, ili više, u odnosu na suvu masu ćelija kvasca. Takođe, proizvodnjom ekstrakta kvasca upotrebom kvasca koji je upravo dostigao maksimum, može da se dobije ekstrakt kvasca bogat slobodnim aminokiselinama sa veoma velikom količinom slobodnih aminokiselina od 30% u masenim procentima.

Prema predmetnom pronalasku, izraz "količina slobodnih aminokiselina u odnosu na suvu masu ćelija kvasca" označava odnos (u masenim procentima) slobodnih aminokiselina sadržanih u čvrstoj supstanci koja se dobija sušenjem ćelija kvasca. Takođe, "količina slobodnih aminokiselina u odnosu na suvu masu ekstrakta kvasca" označava odnos (u masenim procentima) slobodnih aminokiselina sadržanih u suvoj supstanci dobijenoj sušenjem ekstrakta kvasca.

Što se tiče postupka merenja količine slobodnih aminokiselina u ćelijama kvasca ili ekstraktu kvasca, količina može da se meri pomoću postupka za obeležavanje AccQ-Tag Ultra pomoću analizatora Acquity UPLC proizvođača Waters (USA). Može da se izradi kalibraciona kriva, na primer, upotrebom mešanog standarda aminokiselina tipa H (proizvođača Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Moguće je selektivno odrediti količinu slobodnih aminokiselina u uzorku ovim postupkom.

Količina takođe može da se meri upotrebom automatskog analizatora za aminokiseline koji proizvodi JEOL Ltd., Model JLC-500/V, ali sam postupak nije posebno ograničen.

Konkretnije, količina slobodnih aminokiselina u kvascu se postepeno povećava sa protokom vremena, nakon alkalizacije podloge za gajenje kulture (nakon podešavanja pH vrednosti podloge na vrednost jednaku ili višu od 7,5 a manju od 11). Nakon što dostigne maksimum, u vremenskom opsegu od 6 do 12 časova, čak i ako se gajenje u kulturi nastavi još oko 48 časova, postoji tendencija da se održi količina slobodnih aminokiselina veća od one koja je bila prisutna pre alkalizacije. Stoga, kako bi se dobio kvasac sa velikom količinom slobodnih aminokiselina, poželjno je da vreme gajenja u kulturi nakon alkalizacije bude u okviru 48 časova, još poželjnije je da to bude 12 časova a najpoželjnije je da to bude 1 do 6 Časova nakon podešavanja pH.

Kao što je prethodno opisano, prema postupku u skladu sa predmetnim pronalaskom, može da se dobije kvasac koji ima veoma veliku količinu slobodnih aminokiselina. Takođe, proizvodnjom ekstrakta iz ovako dobijenog kvaca, na veoma lak i jednostavan način može da se dobije ekstrakt kvasca bogat aminokiselinama, koji je zadovoljavajuća aromatična aktivna komponenta.

Predmetni pronalazak može da proizvede kvasac bogat aminokiselinama jednostavnim korakom alkalizacije tečne podloge za gajenje kulture. Kao što je prethodno opisano, nije neophodno koristiti neku posebnu podlogu, već kvasac može da se proizvede iz ekonomičnih sirovina kao što je amonijak.

U skladu sa postupkom prema predmetnom pronalasku, dobija se kvasac bogat aminokiselinama koji sadrži slobodne aminokiseline u visokim koncentracijama u ćelijama. Međutim, iz kvasca bogatog aminokiselinama može se dobiti frakcija koja sadrži aminokiseline.

Kao postupak za frakcionisanje frakcije koja sadrži aminokiseline iz kvasca bogatog aminokiselinama može da se koristi bilo koji postupak, sve dok je to postupak koji je u uobičajenoj upotrebi.

Ekstrakt kvasca bogat aminokiselinama može da se dobije iz kvasca bogatog aminokiselinama, gajenog kao što je prethodno opisano. Kao postupak dobijanja ekstrakta kvasca bogatog aminokiselinama, može da se koristi bilo koji postupak, sve dok je to postupak koji je u uobičajenoj upotrebi, te se koriste postupak samodigestije, postupak enzimskog razlaganja, postupak razlaganja kiselinom, postupak ekstrakcije bazama, postupak ekstrakcije toplom vodom i slični. Uobičajeno je da se smatra da su aminokiseline u ekstraktu kvasca dobijenom samo ekstrakcijom toplom vodom slobodne aminokiseline u približno kvantitativnim količinama, za razliku od ekstrakta kvasca koji se dobija postupcima sa enzimskim reakcijama kao što je postupak autodigestije.

Kvasac bogat aminokiselinama sadrži velike količine slobodnih aminokiselina i može da sadrži slobodne aminokiseline u koncentraciji od 7,5% u masenim procentima ili više, a poželjno je da to bude od 7,5% do 18,5% u masenim procentima, u odnosu na suvu masu ćelija kvasca. Stoga, čak i kada se ekstrakt kvasca jednostavno estrahuje tretmanom toplom vodom, dobija se ekstrakt kvasca sa zadovoljavajućom aromom.

Do sada se za pojačanje količine aromatičnih aktivnih aminokiselina, kao što je slobodna glutaminska kiselina, koristio tretman hidrolize pomoću kiselina ili baza, uz upotrebu životinjskih ili biljnih proteina. Međutim, hidrolizat proteina ima taj problem što sadrži MCP (hloropropanole) za koje se pretpostavlja da su karcinogeni.

Nasuprot tome, budući da kvasac bogat aminokiselinama dobijen postupkom prema predmetnom pronalasku originalno ima visok sadržaj slobodnih aminokiselina, ekstrakt kvasca koji ima dovoljno veliku količinu slobodnih aminokiselina može da se pripremi bez tretmana razlaganja kiselinama ili bazama, ili bez enzimskog tretmana, nakon što se kvasac estrahuje procesom ekstrakcije toplom vodom ili sličnim postupcima. Drugim rečima, upotrebom kvasca bogatog aminokiselinama, može na lak i jednostavan način da se dobije ekstrakt kvasca koji je odličan i po svojstvima aktivnih aromatičnih supstanci i po svojstvima bezbednosti.

Tako dobijeni ekstrakt kvasca bogat aminokiselinama sadrži slobodne aminokiseline iz kvasca u koncentraciji od 30% u masenim procentima ili više, a poželjno je da to bude 30 do 70% u masenim procentima, u odnosu na suvu masu ekstrakta kvasca.

Stoga ekstrakt kvasca dobijen u skladu sa postupkom prema predmetnom pronalasku ima veoma visoka svojstva aromatičnosti, te njegovom upotrebom u proizvodnji hrane i pića mogu da se dobiju hrana i piće bogatog i raskošnog ukusa.

Dalje, formulisanjem ekstrakta kvasca bogatog aminokiselinama u praškove, dobija se ekstrakt kvasca bogatog aminokiselinama u prahu, a odgovarajućim odabirom gljive kvasca, dobija se ekstrakt kvasca u prahu koji sadrži slobodne aminokiseline u koncentraciji od 30% u masenim procentima ili više.

Iz kulture kvasca bogatog aminokiselinama gajene prethodno opisanim postupkom može da se dobije suvi kvasac. Kao postupak proizvodnje suvog kvasca, može da se koristi bilo koji postupak, sve dok je to postupak koji je u uobičajenoj upotrebi. Ipak, industrijski se koriste postupci liofilizacije, sušenja prskanjem, sušenja u bubnju i slični.

Kvasac bogat aminokiselinama, suvi kvasac takvog kvasca, ekstrakt kvasca dobijen iz takvog kvasca i ekstrakt kvasca u prahu mogu da se formulišu u začinski preparat. Začinski preparat može da se sastoji od ekstrakta kvasca, ili može da sadrži i druge komponente kao što su stabilizatori, konzervansi i slični uz ekstrakt kvasca. Začinski preparat može pogodno da se koristi za različitu hranu i piće, slično drugim začinskim preparatima.

Dalje, predmetna prijava opisuje hranu i piće koji sadrže kvasac bogat aminokiselinama dobijen prethodno opisanim postupkom, ili ekstrakt kvasca bogat aminokiselinama dobijen ekstrakcijom iz kvasca bogatog aminokiselinama. Dodatkom kvasca bogatog aminokiselinama i sličnih, mogu da se dobiju hrana i piće koji sadrže slobodne aminokiseline u visokim koncentracijama.

Obično ovakva hrana i piće mogu da budu bilo kakvi hrana i piće, sve dok su to hrana i piće u koje mogu da se dodaju suvi kvasac, ekstrakt kvasca ili začinski preparat koji ih sadrži, a primeri obuhvataju alkoholna pića, bezalkoholna pića, fermentisanu hranu, začine, supe, hlebove, konditorske proizvode i slične.

Kako bi se dobila takva hrana i piće, u procesu proizvodnje takve hrane i pića može da se doda preparat dobijen iz prethodno opisanog kvasca bogatog aminokiselinama, ili frakcija kvasca bogatog aminokiselinama. Uz to, kvasac bogat aminokiselinama može da se koristi kao takav, kao sirovina.

Predmetni pronalazak će biti detaljnije opisan kroz primere, ali predmetni pronalazak nije ni na koji način ograničen navedenim primerima.

Primeri

Primer 1

Saccharomyces cerevisiae,soj AB9813 gajenje u kulturi u tečnoj podlozi za gajenje kvasca, te je izvedena analiza slobodnih aminokiselina, postupcima koji su prikazani u tačkama 1 do 8 koje slede.

<1> Pre gajenja u kulturi

Pripremljene su dve podloge koje imaju sastav kao što je dole navedeno (zapremina 350 ml, dvolitarski erlenmajer sa usecima).

Sastav podloge

Postpak pripreme

(1) Melasa (sadržaj šećera 36%, 167 ml) se razblaži do 750 ml pomožu mili-Q vode, nakon čega se 350 ml prenese u dvolitarski erlenmajer sa usecima.

(2) Podloga se autoklavira (12 PC, 15 min).

(3) Prilikom upotrebe, doda se 1/50 količine (po 7 ml) mešanog rastvora azotne komponente (xl00), sterilno, u podlogu koja sadrži samo melasu.

Uslovi za gajenje u kulturi

Količina gljive za inokulaciju: 300 ml

<2> Glavni deo gajenja u kulturi

Podloga sa sleđećim sastavom pripremljena je u zapremini od 2000 ml (podešenoj na 3 1 nakon završetka gajenja u polubaču).

Sastav podloge

Nakon toga, kultura je gajena pod sledećim uslovima.

Uslovi gajenja u kulturi

Kontrola pH: kontrola donje granice na pH 5,0 (pomoću 10% vodenog rastvora amonijaka), bez kontrole gornje granice

Sredstvo protiv penušanja štok rastvor Adekanata

Podloga za gajenje u polubaču - melasa (procenat šećera 36%), zapremina 800 ml (u boci za podlogu od 11, konačna koncentracija 8%)

<3> Promena pH

Potom se, neposredno nakon što je kvasac ušao u stacionarnu fazu rasta, pH kulture podešava u alkalni opseg (što će se u daljem tekstu označavati kao promena pH) pomoću vodenog rastvora NH4OH (10%) (Čime se pH podešava na 9,0), nakon čega sledi nastavak gajenja kulture kvasca. 48 časova nakon početka glavnog dela gajenja kvasca u kulturi, gajenje se završava.

<4>Postupak za prikupljanje ćelija

(1) TeČnost sa kulturom, u kojoj je gajen kvasac tokom glavne faze gajenja u kulturi, prenese se u plastičnu kivetu za centrifugiranje od 50 ml (Falcon 2070), te se centrifugira (3.000 g, 25°C, 5 min, HP-26). (2) Supernatant se odbaci te se talog suspenduje u 20 ml mili-Q vode, nakon čega se centrifugira (3.000 g, 20°C, 5 min, HP26). Ovaj korak se ponavlja dva puta.

(3) Supernatant se odbaci te se talog suspenduje u 20 ml mili-Q vode.

<5> Merenje mase suvih ćelija kvasca

U aluminijumsku posudu (prečnika 5 cm) koja je prethodno odmerena, uliveno je 2 ml suspenzije kvasca, koja je zatim sušena na 105°C 4 časa.

Izmerena je masa nakon sušenja (masa nakon sušenja kvasca), te je izračunata masa suvih čestica (masa suvih ćelija kvasca, u jedinicama g/l) pomoću sledeće jednačine (1)

Masa kvasca nakon sušenja - masa aluminijumskog suda = masa suvih ćelija kvasca

<6>Dobijanje rastvora ekstrakta postupkom ekstrakcije toplom vodom

(1) Ostatak suspenzije kvasca (oko 18 ml) je centrifugiran (3.000 g, 20°C, 5 min, HP-26). (2) Preostala suspenzija (1,5 ml) je prebačena u ependorf kivetu, koja je postavljena u blok grejač a potom zagrevana na 80°C 30 minuta (konverzija u ekstrakt). Alternativno, ona može jače da se zagreje u vodenom kupatilu na 100°C u toku 10 minuta (konverzija u ekstrakt). (3) Nakon toga, supernatant (rastvor ekstrakta) je odvojen centrifugiranjem (6.000 g, 4°C, 5 min).

<7>Postupak za merenje količine slobodne aminokiseline

Izmerena je količina slobodnih aminokiselina u rastvoru ekstrakta. Količina slobodnih aminokiselina merena je pomoću postupka obeležavanja AccQ-Tag Ultra uz upotrebu analizatora Acquity UPLC proizvođača Waters (SAD). Izrađena je kalibraciona kriva pomoću mešanog standardnog rastvora aminokiselina (tip H) (proizvođača Wako Pure Chemical Industries Ltd.). Rezultati merenja su prikazani u tabeli 1. U tabeli 1, "ukupne aminokiseline" označavaju količinu ukupnih aminokiselina (sumu sadržaja odgovarajućih aminokiselina) u odnosu na masu suve ćelije kvasca.

<8>Postupak za merenje brzine razlaganja

Rastvor ekstrakta (500 ul) prebačen je u aluminijumski sud i osušen na 105°C u toku 4 časa. Nakon toga, računat je maseni odnos u ekstraktu (m/m) iz suve mase pre konverzije u ekstrakt.

Količina ukupnih slobodnih aminokiselina u suvim ćelijama kvasca polako se povećava sve do 6 časova nakon promene pH vrednosti ka alkalnoj. Čak i 48 časova nakon početka gajenja, održava se vrednost veća od one koja je bila prisutna pre promene pH ka alkalnoj vrednosti.

Kao što je jasno iz opisanih rezultata, količina slobodnih aminokiselina u kvascu se povećava daljim gajenjem kvasca kroz podešavanje pH na vrednost jednaku ili veću od 7,5 a manju od 11, nakon dostizanja stacionarne faze. Količina slobodnih aminokiselina povećavala se nakon promene pH, dok je količina slobodnih aminokiselina u roku od 48 časova nakon promene pH bila u svakom slučaju veća od količine slobodne aminokiseline pre promene pH.

Primer 2

Procedura pre gajenja kulture izvedena je na isti način kao u primeru 1<<>1<>>, a gajenje je nakon toga izvedeno pod sledećim uslovima.

Bez promene pH nakon dostizanja stacionarne faze rasta, u podlogu za glavnu fazu gajenja unapred je dodata urea, te je dobijen kvasac bogat aminokiselinama pod uslovima u kojima se pH podloge prirodno menja.

Prvo je pripremljena podloga sledećeg sastava u zapremini od 2000 ml (podešenoj na 3 1 nakon završetka gajenja u polubaču).

Kultura je gajena pod svim ostalim uslovima istim kao u primeru 1. Slika 1 je grafik koji prikazuje krivu povećanja broja ćelija u zavisnosti od vremena. Slika 2 je grafik koji prikazuje krivu povećanja mase suvih ćelija kvasca u zavisnosti od vremena. Slika 3 je grafik koji prikazuje promenu pH u podlozi za gajenje kulture u zavisnosti od vremena gajenja kulture.

Kao što je prikazano na slici 1, potvrđeno je daje rast broja ćelija (xl0<6>ćelija/ml) dostigao stacionarnu fazu nakon 18 časova gajenja, te je kvasac ušao u stacionarnu fazu rasta. Uz to, masa suvih ćelija kvasca (g/l) takođe je stigla približno do stacionarnog stanja nakon 24 časa gajenja u kulturi, te je potvrđena stacionarna faza rasta. Izmerena je pH vrednost tečnosti u kojoj se gaji kultura, te je, nakon tog merenja, kao što je pokazano na slici 3, pH vrednost podešena na alkalnu vrednost (7,5 ili višu, ali manju od 11), nakon Što je kvasac ušao u stacionarnu fazu rasta. Količina ukupnih slobodnih aminokiselina u odnosu na masu suvih ćelija kvasca i količina ukupnih aminokiselina u odnosu na suvu masu ekstrakta kvasca prikazane su u tabeli 2.

Kao što se vidi iz prethodno opisanog rezultata, sadržaj slobodnih aminokiselina u kvascu može da se poveća dodatkom uree, pre početka gajenja, u podlogu za glavnu fazu gajenja nakon čega se kvasac dalje gaji nakon stacionarne faze u uslovima u kojima se pH vrednost prirodno menja.

Primer 3

Potom je u određenoj količini ekstrakta kvasca dobijenog iz kvasca (pH 9,0) na isti način kao što je opisano u primeru 1 i komercijalno dostupnih ekstrakata kvasca (komparativni primeri 1 do 8) izmerena i upoređena količina ukupnih slobodnih aminokiselina, na osnovu suve mase ekstrakta kvasca. Količina( koncentracija prim, prev.)(u masenim procentima) ukupnih slobodnih aminokiselina u odnosu na suvu masu svakog od ekstrakata kvasaca prikazana je u tabeli 3. U tabeli 3, "količina ukupnih aminokiselina" označava ukupnu količinu slobodnih aminokiselina u suvoj masi svakog od ekstrakata kvasca.

Kao što je iz rezultata očigledno, ekstrakt kvasca sadrži veliku količinu slobodnih aminokiselina.

Komercijalno dostupni ekstrakti kvasca koji su ovde ispitani sadržali su slobodne aminokiseline u koncentraciji od najviše 21% u masenim procentima, te nisu bili ekstrakti kvasca koji sadrže slobodne aminokiseline u veoma visokoj koncentraciji od 60% u masenim procentima, kao što to jesu ekstrakti kvasca opisani u predmetnoj prijavi, Stoga je iznesena hipoteza da su ekstrakti kvasca estrahovani iz kvasca proizvednog u skladu sa predmetnim pronalaskom poželjniji kao začini.

Primer 4

Dalje, napravljene su miso supa i konsome supa pomoću ekstrakta kvaca u prahu (đobijenog iz kvascaSaccharomyces cerevisiae,soj AB9813, sadržaj aminokiselina: 60,2% u masenim procentima) koji je dobijen formulacijom ekstrakta kvasca đobijenog iz kvasca pripremljenog kao u primeru 1 (pH 9,0) u prah. Količina ekstrakta kvasca koja se meša sa miso supom ili konsome supom je 0,2%.

Kao komparativni primer, na sličan način su pripremljene miso supa i konsome supa uz upotrebu ekstrakta kvasca Meast Powder N (proizvođača ASAHI FOOD & HEALTHCARE CO., LTD.) (sadržaj aminokiselina: 35,9% u masenim procentima), nakon čega je izvedena olfaktorna ocena sleđećim postupkom.

Postupak ocene

Komparativni olfaktorni test je izveden pomoću slepog poređenja u dve tačke, a izvelo gaje 10 članova komisije. Izveden je t-test kao parni test za poređenje dva seta podataka.

Kriterijumi za ocenu

Što se tiče tri tačke za ocenjivanje, na primer, slanoće (efekta redukcije soli), prijatnosti ukusa i bogatstva ukusa, izvedena je petostepena ocena, pri čemu su standardna miso supa i standardna konsome supa bile ocenjene kao 0.

"Snažno" = +2,

"Umereno snažno" = +1,

"Nijedno" = 0

"Umereno slabo" = -1,

"Slabo" = -2.

Rezultati za miso supu su prikazani u tabeli 4, a rezultati za konosome supu su prikazani u tabeli 5.

Kao što se vidi iz rezultata u tabeli 4, za miso supu, postojala je razlika u prosečnoj slanoći i prijatnosti ukusa, dok je u bogatstvu ukusa postojala značajna razlika. Kao što se vidi iz rezultata u tabeli 5, za konsome supu, postojala je razlika u prosečnoj slanoći i bogatstvu ukusa, a značajna razlika u prijatnosti ukusa. Smatra se daje ovo zbog toga što ekstrakt kvasca ima značajno veći sadržaj slobodnih aminokiselina u poređenju sa konvencionalnim ekstraktom kvasca.

Primer 5

Na isti način kao u primeru 1, osim što je kvasac koji je gajen bioSaccharomyces cerevisiaesoj ABS1, odgajen je kvasac, te su izvedeni postupci ekstrakcije ekstrakta iz tečne kulture kvasca i analize aminokiselina. Izmerene vrednosti za sadržaj aminokiselina pre i nakon promene pH prikazane su u tabeli 5.

Primer 6

Na isti način kao u primeru 1, osim što je kvasac koji je gajen bioSaccharomyces cerevisiaesoj ABS2, odgajen je kvasac, te su izvedeni postupci ekstrakcije ekstrakta iz tečne kulture kvasca i analize aminokiselina. Izmerene vrednosti za sadržaj aminokiselina pre i nakon promene pH prikazane su u tabeli 6.

Primer 7

Na isti način kao u primeru 1, osim što je kvasac koji je gajen bioSaccharomyces cerevisiaesoj ABS3, odgajen je kvasac, te su izvedeni postupci ekstrakcije ekstrakta iz tečne kulture kvasca i analize aminokiselina. Izmerene vrednosti za sadržaj aminokiselina pre i nakon promene pH prikazane su u tabeli 6.

Primer 8

Na isti način kao u primeru 1, osim što je kvasac koji je gajen bioSaccharomyces cerevisiaesoj ABS5, odgajen je kvasac, te su izvedeni postupci ekstrakcije ekstrakta iz tečne kulture kvasca i analize aminokiselina. Izmerene vrednosti za sadržaj aminokiselina pre i nakon promene pH prikazane su u tabeli 6.

Primer 9

Na isti način kao u primeru 1, osim Što je kvasac koji je gajen bioCamellia(hlebni kvasac), odgajen je kvasac, te su izvedeni postupci ekstrakcije ekstrakta iz tečne kulture kvasca i analize aminokiselina. Izmerene vrednosti za sadržaj aminokiselina pre i nakon promene pH prikazane su u tabeli 6.

Primer 10

Na isti način kao u primeru 1, osim što je kvasac koji je gajen bioCandida utilissoj ABC 1, odgajen je kvasac, te su izvedeni postupci ekstrakcije ekstrakta iz tečne kulture kvasca i analize aminokiselina. Izmerene vrednosti za sadržaj aminokiselina pre i nakon promene pH prikazane su u tabeli 6.

Primer 11

Na isti način kao u primeru 1, osim što je kvasac koji je gajen bioCandida utilissoj ABC2, odgajen je kvasac, te su izvedeni postupci ekstrakcije ekstrakta iz tečne kulture kvasca i analize aminokiselina. Izmerene vrednosti za sadržaj aminokiselina pre i nakon promene pH prikazane su u tabeli 6.

Primer 12

Na isti način kao u primeru 1, osim što je kvasac koji je gajen bioCandida utilissoj ABC3, odgajen je kvasac, te su izvedeni postupci ekstrakcije ekstrakta iz tečne kulture kvasca i analize aminokiselina. Izmerene vrednosti za sadržaj aminokiselina pre i nakon promene pH prikazane su u tabeli 6.

Kao što se vidi iz rezultata u tabeli 6, fenomen povećanja sadržaja aminokiselina potvrđen je promenom u pH, kao i u drugim sojevimaSaccharomyces cerevisiaekoji su testirani u primeru 1.

Primer 13

Na isti način kao u primeru 1, osim što je kvasac koji je gajen bioSaccharomyces cerevisiaeABS4 i što je zadata pH vrednost za promenu pH vrednosti bila u inkrementima od 0,5 u opsegu od 7,0 do 9,5, odgajen je kvasac, te su izvedeni postupci ekstrakcije ekstrakta iz tečne kulture kvasca i analize aminokiselina. Izmerene vrednosti za sadržaj aminokiselina pre i nakon promene pH prikazane su u tabeli 7.

Industrijska primenljivost

U skladu sa postupkom prema predmetnom pronalasku za dobij anje kvasca bogatog aminokiselinama, moguće je dobiti kvasac koji sadrži slobodne aminokiseline koje se održavaju u visokoj koncentraciji u ćelijama, te stoga predmetni pronalazak može da se koristi u industriji proizvodnje hrane, kao što je proizvodnja ekstrakta kvasca.

Claims (3)

1. Postupak za proizvodnju kvasca bogatog aminokiselinama naznačen time što podrazumeva korake: gajenja kvasca u tečnoj kulturi u logaritamskoj fazi rasta na temperaturi od 20 do 40°C i na pH 3,5 do7,5, te gajenja kvasca u tečnoj kulturi u stacionarnoj fazi rasta pod uslovima u kojima je pH tečne podloge jednak ili veći od 7,5 a manji od 11.

2. Postupak za proizvodnju kvasca bogatog aminokiselinama prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što korak gajenja kvasca u tečnoj kulturi u stacionarnoj fazi rasta podrazumeva: podešavanje pH tečne podloge za kvasac u stacionarnoj fazi rasta na vrednost jednaku ili višu od 7,5 a nižu od 11, te gajenje kvasca u tom opsegu pH.

3. Postupak za proizvodnju kvasca bogatog aminokiselinama prema patentnim zahtevima 1 ili 2, naznačen time što je navedeni kvasacSaccharomyces cerevisiaeiliCandida utilis.