RS55666B1 - Humani il-23 antigen vezujući proteini - Google Patents

Humani il-23 antigen vezujući proteini

Info

Publication number
RS55666B1
RS55666B1 RS20170119A RSP20170119A RS55666B1 RS 55666 B1 RS55666 B1 RS 55666B1 RS 20170119 A RS20170119 A RS 20170119A RS P20170119 A RSP20170119 A RS P20170119A RS 55666 B1 RS55666 B1 RS 55666B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antigen binding
binding protein
seq
antibody
chain variable
Prior art date
Application number
RS20170119A
Other languages
English (en)
Inventor
Jennifer E Towne
Janet D Cheng
Jason C O'neill
Yu Zhang
Yu Sun
Heather Cerne
Derek E Piper
Randal R Ketchem
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43413789&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS55666(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of RS55666B1 publication Critical patent/RS55666B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

POZADINA
[0001]Interleukin 23 (IL-23), heterodimerni citokin, je potentni izazivač pro-zapaljenskih citokina. IL-23 je povezan sa heterodimernim citokin Interleukinom 12 (IL-12) pri čemu oba dele zajedničku p40 subjedinicu. U IL-23, jedinstvena pl9 subjedinica kovalentno je vezana sa p40 subjedinicom. U IL-12, jedinstvena subjedinica je p35 (Oppmann et al., Immunitv, 2000, 13: 713-715). IL-23 heterodimerni protein se luči. Poput IL-12, IL-23 je eksprimiran od strane antigena koji predstavlja ćelije (kao što su dendritične ćelije i makrofagi) kao odgovor na aktivacione stimuluse kao što je CD40 ligacija, Tolični receptor agonisti i patogeni. IL-23 vezuje heterodimerni receptor koji obuhvata neku IL-12R01 subjedinicu (koja se deli sa IL-12 receptorom) i jedinstvenu receptor subjedinicu, IL-23R. IL-12 receptor se sastoji od IL-12Rpl i IL-12R|32. IL-23 vezuje svoj heterodimerni receptor i signalizira kroz JAK2 i Tyk2 radi aktiviranja STATI, 3,4 i 5 (Parham et al., J. Immunol. 2002,168:5699-708). Subjedinice ovog receptora predominanto su ko-eksprimirane na aktiviranim ili memorijskim T ćelijama i NK ćelijama, a takođe i na nižim nivoima na dendritičnim ćelijama, monocitima, makrofagima, mikroglia, keratinocitima i sinovijalnim fibroblastima. IL-23 i IL-12 deluju na različite Tčelijske podskupove i igraju suštinski različite uloge in vivo.
[0002]IL-23 deluje na aktiviranim i memorijskiim T ćelijama i promoviše opstanak i ekspanziju T ćelijskog podskupa, Thl7. Thl7 ćelije proizvode prozapaljenske citokine uključujući IL-6, IL-17, TNFa, IL-22 i GM-CSF. IL-23 takođe deluje na NK ćelije, dendritične ćelije i makrofage radi indukovanja prozapaljenske citokin ekspresije. Za razliku od IL-23, IL-12 indukuje diferencijaciju naivnih CD4+T ćelija u zrele Thl IFNv-proizvodne efektorske ćelije, i indukuje funkciju NK i citotoksičnih T ćelija stimulisanjem proizvodnje IFNv. Thl ćelije vođene od strane IL-12 prethodno su se smatrale patogenim T ćelijskim podskupom kod mnogih autoimunih bolesti, međutim, skorija ispitivanja na životinjama u modelima bolesti zapaljenja creva, psorijaze, zapaljenskog artritisa i multipla skleroze, u kojima su procenjeni pojedinačni doprinosi IL-12 versus IL-23, čvrsto su utvrdile da je IL-23, a ne IL-12, ključni pokretač kod autoimune/zapaljenske bolesti (Ahern et al., Immun. Rev. 2008 226:147-159; Cua et al., Nature 2003 421:744-748; Yago et al., Arthritis Res i Ther. 2007 9(5): R96). Smatra se da da IL-12 igra presudnu ulogu u razvoju zaštitnih urođenih i adaptivnih imunih odgovora na mnoge intraćelijske patogene i viruse i u tumor imunom nadzoru. Videti Kastelein, et al., Annual Revievv of Immunologv, 2007, 25: 221-42; Liu, et al., Rheumatologv, 2007, 46(8): 1266-73; Bowman et al., Current Opinion in Infectious Diseases, 2006 19:245-52; Fieschi i Casanova, Eur. J. Immunol. 2003 33:1461-4; Meeran et al., Mol. CancerTher. 2006 5: 825-32; Langowski et al., Nature 2006 442: 461-5. Kao takva, IL-23 specifična inhibicija (popustljivi IL-12 ili zajednička p40 subjedinica) trebalo bi da je potencijalno superiornije bezbedniji profil u poređenju sa dvostrukom inhibicijom IL-12 i IL-23.
[0003]Prema tome, upotreba IL-23 specifičnih antagonista koji inhibiraju ljudski IL-23 (kao što su antitela koja vezuju najmanje jedinstvenu pl9 subjedinicu ili vezuju obe i pl9 i p40 subjedinicu IL-23) koji štede IL-12, trebalo bi da obezbedi efikasnost jednaku ili veću od IL-12 antagonista ili p40 antagonista bez potencijalnih rizika povezanih sa inhibicijom IL-12. Opisana su murinska, humanizovana i antitela fagnog prikaza odabrana za inhibiciju rekombinantnog IL-23; videti na primer US Patent 7,491,391, WIPO Publikacije WO1999/05280, WO2007/0244846, WO2007/027714, WO 2007/076524, VVO2007/147019, VVO2008/103473, WO 2008/103432, VVO2009/043933 i VVO2009/082624. Međutim, postoji potreba za potpuno humanim terapeutskim agensima koji su sposobni da inhibiraju nativni humani IL-23. Takvi terapeutici veoma su specificirani na metu, naročito in vivo. Potpuna inhibicija mete in vivo može da rezultira kao formulacije niže doze, manje frekventno i/ili efektivnije doziranje koje sa druge strane rezultira kao umanjeni trošak i povećana efikasnost. Ovaj pronalazak obezbeđuje takve IL-23 antagoniste.
KRATAK OPIS
[0004]Obezbeđeni su antigen vezujući proteini koji vezuju IL-23, naročito nativni humani IL-23. Humani IL-23 antigen vezujući proteini mogu da redukuju, inhibiraju, ometaju, i/ili modulišu najmanje jedan od bioloških odgovora povezanih sa IL-23, i kao takvi, korisni su za ublažavanje efekata IL-23 povezanih bolesti ili poremećaja. IL-23 antigen vezujući proteini mogu se koristiti, na primer, radi redukovanja, inhibioranja, ometanja i/ili modulisanja IL-23 signaliziranja, IL-23 aktivacije Thl7 ćelija, IL-23 aktivacije NK ćelija, ili indukovanja proizvodnje prozapaljenskih citokina.
[0005]Ovde je obezbeđen antigen vezujući protein koji se vezuje za humani IL-23, pri čemu pomenuti antigen vezujući protein obuhvata:
(i)
(a) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata
CDRH1 koji ima SEQ ID NO:91,
CDRH2 koji ima SEQ ID NO: 92 i
CDRH3 koji ima SEQ ID NO:93,
i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata
CDRL1 koji ima SEQ ID NO:62,
CDRL2 koji ima SEQ ID NO:63 i
CDRL3 koji ima SEQ ID NO:64;
ili
(b) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata
CDRH1 koji ima SEQ ID N0:109,
CDRH2 koji ima SEQ ID NO: 116 i
CDRH3 koji ima SEQ ID N0:111,
i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata
CDRL1 koji ima SEQ ID NO:80,
CDRL2 koji ima SEQ ID N0:81 i
CDRL3 koji ima SEQ ID NO:76;
i pri čemu se pomenuti antigen vezujući protein prema (a) ili (b) vezuje za humani IL-23 sa KDod < 5x10 12M;
ili
(ii) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID N0:31 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:l; ili varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:46 ili 153 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID N0:15;
pri čemu je pomenuti antigen vezujući protein monoklonalno antitelo, rekombinantno antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov fragment antitela.
[0006]Takođe su obezbeđeni ekspresioni sistemi, uključujući ćelijske linije, za proizvodnju IL-23 antigen vezujućih proteina i medicinske upotrebe za tretiranje bolesti povezanih sa humanim IL-23.
[0007]Neki od antigen vezujućih proteina koji vezuju IL-23 ovde opisan, obuhvataju najmanje jedan varijabilni region teškog lanca koji obuhvata CDRH1, CDRH2 i CDRH3 odabrane iz grupe koju čine: CDRH1 koji se razlikuje za ne više od jedne amino kiselinske supstitucije, umetanja ili brisanja iz CDRH1 kako je prikazano na TABELI 3; CDRH2 koji se razlikuje za ne više od tri, dve ili jedne amino kiselinske supstitucije, umetanja i/ili brisanja iz CDRH2 kako je prikazano na TABELI 3; CDRH3 koji se razlikuje za ne više od tri, dve ili jedne amino kiselinske supstitucije, umetanja i/ili brisanja iz CDRH3 kako je prikazano na TABELI 3; i koji obuhvata najmanje jedan varijabilni region lakog lanca koji obuhvata CDRL1, CDRL2 i CDRL3 odabran iz grupe koju čine: CDRL1 koji se razlikuje za ne više od tri, dve ili jedne amino kiselinske supstitucije, umetanja i/ili brisanja iz CDRL1 kako je prikazano na TABELI 3; CDRL2 koji se razlikuje za ne više od jedne amino kiselinske supstitucije, umetanja ili brisanja iz CDRL2 kako je prikazano na TABELI 3; CDRL3 koji se razlikuje za ne više od jedne amino kiselinske supstitucije, umetanja ili brisanja iz CDRL3 kako je prikazano na TABELI 3. Ovde su takođe opisani izolovani antigen vezujući proteini koji obuhvataju: CDRH1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 94, 97,100, i 103; CDRH2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 95, 98,101,104,107, i 110; CDRH3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 96, 99, 102, i 105; CDRL1 odabran iz grupe koju čine SEOJD NO: 65, 68, 71, i 74; CDRL2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:66, 69,72,75, i 78; i CDRL3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 67,70 i 73. Ovde je takođe opisizolovani antigen vezujući protein koji obuhvata: CDRH1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 106,112, i 115; CDRH2 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 113,118,120,121, i 122; CDRH3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 108,114,117, i 119; CDRL1 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 77, 83, 85, 86, 87, 88, 89 i 90; CDRL2 je SEQ ID NO: 81; i CDRL3 odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 79, 82 i 84. Ovde je takođe opisizolovani antigen-vezujući protein koji obuhvata najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca. Ovde je takođe opisan izolovani antigen-vezujući protein kako je opisan gore koji obuhvata najmanje dva varijabilna regiona teškog lanca i najmanje dva varijabilna regiona lakog lanca. U jednom ostvarenju antigen vezujući protein kuplovan je sa grupom za obeležavanje.
[0008]Ovde su takođe opisani izolovani antigen vezujući proteini koji vezuju IL-23 odabran iz grupe koju čine a) antigen vezujući protein koji ima CDRH1 iz SEQ ID NO:129, CDRH2 iz SEQ ID NO:132, CDRH3 iz SEQ ID NO:136, i CDRL1 iz SEQ ID NO:123, CDRL2 iz SEQ ID NO:81, i CDRL3 iz SEQ ID NO: 76; b) antigen vezujući protein koji ima CDRH1 iz SEQ ID NO:131, CDRH2 iz SEQ ID NO: 134, CDRH3 iz SEQ ID NO:137 i CDRL1 iz SEQ ID NO:124, CDRL2 iz SEQ ID N0126 i CDRL3 iz SEQ ID NO:128; c) a) antigen vezujući protein koji ima CDRH1 iz SEQ ID NO:130, CDRH2 iz SEQ ID NO:133, CDRH3 iz SEQ ID NO:99 i CDRL1 iz SEQ ID NO:68, CDRL2 iz SEQ ID NO:69, i CDRL3 iz SEQ ID NO:67; i d) antigen vezujući protein koji ima CDRH1 SEQ ID NO:91, CDRH2 SEQ ID NO: 135, CDRH3 SEQ ID NO:138 i CDRL1 SEQ ID NO:125, CDRL2 SEQ ID NO:127, i CDRL3 SEQ ID NO:64.
[0009]Ovde su takođe opisani izolovani antigen vezujući proteini koji vezuju IL-23 koji obuhvata najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, odabran iz grupe koju čine: varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-35, 50-65 i 99-110 iz SEQ ID NO:34 i varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-35, 50-66 i 99-110 iz SEQID NO:36; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 23-36, 52-62 i 97-105 iz SEQ ID NO:4; varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-35, 50-66 i 99-114 iz SEQ ID NO:38; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 23-34, 50-61 i 94-106 iz SEQ ID NO:7; varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-35, 50-66 i 99-114 iz SEQ ID NO:40; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 24-34, 50-56 i 94-106 iz SEQ ID NO:9; varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-35, 50-66 i 99-114 iz SEQ ID NO:42; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 23-34, 50-61 i 94-106 iz SEQ ID NO:ll; varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-35, 50-65 i 98-107 iz SEQ ID NO:44; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 24-34, 50-56 i 89-97 iz SEQ ID NO:13; varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-37, 52-67 i 100-109 iz SEQ ID NO:48; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 24-34, 50-56 i 89-97 iz SEQ ID NO:17; varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-37, 52-67 i 101-109 iz SEQ ID NO:50; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 24-34, 50-56 i 89-97 iz SEQ ID NO:19; varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-35, 50-65 i 98-107 iz SEQ ID NO: 52; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 24-34, 50-56 i 98-107 iz SEQ ID NO:21; varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-37, 52-67 i 100-109 iz SEQ ID NO:54; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 24-34, 50-56 i 89-97 iz SEQ ID NO:23; varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-37, 52-67 i 100-109 iz SEQ ID NO:56; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 24-34, 50-56 i 89-97 iz SEQ ID NO:25; i varijabilni region teškog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 31-37, 52-57 i 100-109 iz SEQ ID NO:58; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata amino kiselinski ostaci 24-34, 500-56 i 89-97 iz SEQ ID NO:27.
[0010]Ovde je opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje IL-23 koji obuhvat varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca, pri čemu se sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca razlikuje za ne više od 13,12,11,10, 9, 8, 7, 6, 5,4, 3, 2 ili 1 amino kiselinske supstitucije, dodataka i/ili brisanja iz sekvence varijabilnog regiona teškog lanca kako je prikazano na TABELI 2; i pri čemu se sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca razlikuje za ne više od 13,12,11,10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 amino kiselinske supstitucije, dodataka i/ili brisanja iz sekvence varijabilnog regiona lakog lanca kako je prikazano na TABELI 1.
[0011]Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje IL-23 odabran iz grupe koju čine a) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:140 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 30; b) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:141 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:61; c) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:142 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:4; i d) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:143 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:139.
[0012]Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji obuhvata varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od amino kiselinske sekvence koja ima najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta sa SEQ ID NO:31, 34, 36, 38,40, 42,44, 46, 48, 50, 52, 54, 56 i 58; i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata neku amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 90% sekvencionog identiteta sa SEQ ID NO: 1,4, 7, 9,11,13,15,17,19, 21, 23, 25 i 27. Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji obuhvata varijabilni region teškog lanca odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 44, 48, 50, 52, 54, 56, i 58 i varijabilni region lakog lanca odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:13, 17,19, 21, 23, 25, i 27. Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji obuhvata varijabilni region teškog lanca odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 34, 36, 38,40 i 42, i varijabilni region lakog lanca odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO: 4, 7, 9 i 11.
[0013]Ovde je opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje IL-23 koji obuhvata varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca odabran iz grupe koju čine: a) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:34 ili 36 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:4;b) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:38 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 7; c) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:40 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:9; d) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:42 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: ll;e) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:44 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:13; f) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:48 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:17;g) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:50 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO: 19;h) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:52 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:21; i) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:54 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:23;j) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:56 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:25; i k) varijabilni region teškog lanca iz SEQ ID NO:58 i varijabilni region lakog lanca iz SEQ ID NO:27.
[0014]Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje humani IL-23, u kojem formirani prekriveni sloj kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 obuhvata preostale kontakte 30, 31, 32,49, 50, 52, 53, 56, 92 i 94 iz SEQ ID NO:15, pri čemu preostalih kontakata imaju diferencionu vrednost veću od ili jednaku 10 A2 kao što je određeno površinom izložene rastvaračem. Preostalih kontakata može da obuhvata ostatke 31-35, 54, 58-60, 66, i 101-105 iz SEQ ID NO:46..
[0015]Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje humani IL-23, u kojem formirani prekriveni sloj kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 obuhvata preostale kontakte 31-34, 51, 52, 55, 68,93 i 98 iz SEQ ID NO:l, u kojem preostalih kontakata imaju diferencionu vrednost veću od ili jednaku 10 A<2>kao što je određeno površinom izložene rastvaračem. Preostalih kontakata može da obuhvata ostatke 1, 26, 28, 31, 32, 52, 53, 59, 76, 101,102 i 104-108 iz SEOJD NO:31.
[0016]Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje humani IL-23, u kojem kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, antigen vezujući protein je 5 A ili manji od ostataka 32-35, 54, 58-60, 66 i 101-105 iz SEQ ID NO:46, kako je određeno X-zračnom kristalografijom. Antigen vezujući protein može biti 5 A ili manji od ostataka 31-35, 54, 56, 58-60, 66 i 101-105 iz SEQ ID NO:46.
[0017]Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje humani IL-23, u kojem kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, antigen vezujući protein je 5 A ili manji od ostataka 30-32, 49, 52, 53, 91-94 i 96 iz SEQ ID NO:15, kako je određeno X-zračnom kristalografijom.
[0018]Antigen vezujući protein može biti 5 A ili manji od ostataka 30-32,49, 50,52, 53, 56, 91-94 i 96 iz SEQID NO:15.
[0019]Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje humani IL-23, u kojem kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, antigen vezujući protein je 5 A ili manji od ostataka 26-28, 31, 53, 59,102 i 104-108 iz SEQ ID NO:31, kako je određeno X-zračnom kristalografijom. Antigen vezujući protein može biti 5 A ili manji od ostataka 1, 26-28, 30-32, 52, 53, 59,100, i 102-108 iz SEQ ID NO:31.
[0020]Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje humani IL-23, u kojem kada je pomenuti antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, pomenuti antigen vezujući protein je 5 A ili manji od ostataka 31-34, 51, 52, 55, 68 i 93 iz SEQ ID NO:l kako je određeno X-zračnom kristalografijom. Antigen vezujući protein može biti 5 A ili manji od ostataka 29, 31-34, 51, 52, 55, 68, 93 i 100 iz SEQ ID NO:l.
[0021]Antigen vezujući protein ovog pronalaska je monoklonalno antitelo, rekombinantno antitelo, humano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili njihov fragment antitela. U još jednom ostvarenju fragment antitela je Fab fragment, Fab' fragment, F(ab')2 fragment, Fv fragment, dijatelo, ili molekul jednolančanog antitela. U još daljem ostvarenju antigen vezujući protein je humano antitelo. U još daljem ostvarenju antigen vezujući protein je monoklonalno antitelo. U još jednom ostvarenju antigen vezujući protein je IgGl-, lgG2- lgG3- ili lgG4-tipa. U još daljem ostvarenju antigen vezujući protein je IgGl- ili lgG2-tipa.
[0022]Takođe je obezbeđen izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antigen vezujući protein kakav je opisan, u kojem nukleinska kiselina obuhvata nukleinsku kiselinu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 32 i nukleinsku kiselinu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 2, ili nukleinsku kiselinu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 47 i nukleinsku kiselinu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 16. Ovde je takođe opisan izolovani molekul nukleinske kiseline gde je najmanje jedan varijabilni region teškog lanca kodiran i izolovanim molekulom nukleinske kiseline odabrana iz grupe koju čine SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41,43,45,49, 51, 53, 55, 57, 59 i 152, a najmanje jedan varijabilni region lakog lanca kodiran je izolovanim molekulom nukleinske kiseline odabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 5, 6, 8,10,12,14,18, 20, 22, 24, 26, i 28. U još jednom ostvarenju obezbeđen je molekul nukleinske kiseline koji kodira antigen vezujući protein kakav je opisan pri čemu je molekul nukleinske kiseline operativno povezan za kontrolnu sekvencu. U još jednom ostvarenju obezbeđen je vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline kakav je opisan. U još daljem ostvarenju obezbeđena je ćelija domaćin koja obuhvata molekul nukleinske kiseline kakav je opisan. U još jednom ostvarenju obezbeđena je ćelija domaćin koja obuhvata vektor kakav je opisan. U još daljem ostvarenju izolovani polinukleotid je dovoljan za upotrebu kao hibridizaciona proba, PCR primer ili sekvencioni primer koji je fragment molekula nukleinske kiseline kako je opisan gore ili njegov komplement.
[0023]Takođe je obezbeđen postupak pripreme antigen vezujućeg proteina kakav je opisan, koji obuhvata fazu pripremanja pomenutog antigen vezujućeg proteina iz ćelije domaćina koja luči pomenuti antigen vezujući protein.
[0024]Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje humani IL-23, u kojem formirani prekriveni sloj kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 obuhvata preostali kontakt unutar ostataka 46-58, preostali kontakt unutar ostataka 112-120, i preostali kontakt unutar ostataka 155-163 humane IL-23pl9 subjedinice kako je opisano u SEQ ID NO:145, u kojem preostali kontakt ima diferencionu vrednost veću od ili jednaku 10A<2>kao što je određeno površinom izložene rastvaračem. Prekriveni sloj formiran kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 može da obuhvata jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest ili trinaest preostalih kontakata unutar ostataka 46-58, jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset preostalih kontakata unutar ostataka 112-120, ijedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam ili devet preostalih kontakata unutar ostataka 155-163 humane IL-23pl9 subjedinice kako je opisano u SEQ ID NO:145. Prekriveni sloj formiran kada se antigen vezujući protein vezuje za humani IL-23 može da obuhvata preostali kontakt unutar ostataka 121-125 humane IL-23p40 subjedinice kako je opisano u SEQ ID NO:147. Prekriveni sloj formiran kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 može da obuhvata jedan, dva, tri, četiri ili pet preostalih kontakata unutar ostataka 121-125 humane IL-23p40 subjedinice kako je opisano u SEQ ID NO:147. Prekriveni sloj formiran kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 može da obuhvata preostale kontakte 46,47,49, 50, 53,112-116,118,120,155, 156,159,160, i 163 iz SEQ ID NO:145. Prekriveni sloj formiran kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 može da obuhvata preostale kontakte 46, 47,49, 50, 53,112-118,120,155,156,159,160,
i 163 iz SEQ ID NO:145. Prekriveni sloj formiran kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23
može da obuhvata ostatke 46, 47, 49, 50, 53-55, 57, 58,112-116,118-120, 155,156,159,160,162 i 163 iz SEQ ID NO:145. Prekriveni sloj formiran kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 može da obuhvata preostali kontakt 122 humane IL-23p40 subjedinice kako je opisano u SEQ ID NO:147. Prekriveni sloj formiran kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 može da obuhvata preostale kontakte 122 i 124 humane IL-23p40 subjedinice kako je opisano u SEOJD NO:147. Prekriveni sloj formiran kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 može da obuhvata preostali kontakt 121-123 i 125 humane IL-23p40 subjedinice kako je opisano u SEQ ID NO:147. Prekriveni sloj formiran kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 može da obuhvata preostali kontakt 121-123, 125 i 283 humane IL-23p40 subjedinice kako je opisano u SEQ ID NO:147.
[0025]Ovde je takođe opisan izolovani antigen vezujući protein koji vezuje humani IL-23, u kojem kada je pomenuti antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 pomenuti antigen vezujući protein je 5A ili manji od ostatka unutar ostataka 46-58, od ostatka unutar ostataka 112-123, i od ostatka unutar ostataka 155-163 humane IL-23pl9 subjedinice kako je opisano u SEQ ID NO:145, kako je određeno X-zračnom kristalografijom. Kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, antigen vezujući protein može biti 5A ili manji od jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest ili trinaest ostataka unutar ostataka 46-58, od jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset, ostataka unutar ostataka 112-123, i od jednog, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam ili devet ostataka unutar ostataka 155-163 humane IL-23pl9 subjedinice kako je opisano u SEQ ID NO:145. Kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, antigen vezujući protein može biti 5A ili manji od ostataka 46-50,113-116, 120, 156,159, 160 i 163 iz SEQ ID NO:145. Kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, antigen vezujući protein može biti 5A ili manji od ostataka 46-50,112-120,156, 159,160 i 163 iz SEQ ID NO:145. Kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, antigen vezujući protein može biti 5A ili manji od ostataka 46-50, 53,112-120,156,159,160 i 163 iz SEQ ID NO:145. Kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, antigen vezujući protein može biti 5A ili manji od ostataka 46-50, 53-55, 58,113-116,120,121,156,159,160,162 i 163 iz SEQ ID NO:145. Kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, antigen vezujući protein može biti 5A ili manji od ostataka 46-51, 53-55, 57, 58,112-116,118-121, 123,155,156, 159,160,162 i 163 izSEO ID NO:145. Kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23 antigen vezujući protein može biti 5A ili manji od ostatka unutar ostataka 121-125, humane IL-23p40 subjedinice kako je opisano u SEQ ID NO:147, kako je određeno X-zračnom kristalografijom. Kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, pomenuti antigen vezujući protein može biti 5 A ili manji od ostataka 122 i 124 iz SEQ ID NO:147. Kada je antigen vezujući protein vezan za humani IL-23, antigen vezujući protein može biti 5 A ili manji od ostataka 121-123 i 125 iz SEQ ID NO:147.
[0026]Takođe je obezbeđen izolovani antigen vezujući protein kakav je opisan pri čemu antigen vezujući protein ima najmanje jednu osobinu odabranu iz grupe koju čine; a) smanjivanje aktivnosti humanog IL-23 u STAT-luciferaza ogledu; b) smanivanje proizvodnje prozapaljenskog citokina; c) sa Koff brzinom od < 5x10-6 l/s; i d) sa IC50 od < 400 pM.
[0027]Obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedan antigen vezujući protein kakav je opisan i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. U jednom ostvarenju obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja dalje obuhvata grupu za obeležavanje ili grupu efektora. U još daljem ostvarenju obezbeđena je farmaceutska kompozicija pri čemu je grupa za obeležavanje odabrana iz grupe koju čine izotopni obeleživači, magnetni obeleživači, redoks aktivni ostaci, optičke boje, biotinilovane grupe i prethodno određeni polipeptidni epitopi koji se prepoznaju sekundarnim reporterom. U još daljem ostvarenju obezbeđena je farmaceutska kompozicija pri čemu je grupa efektora odabrana iz grupe koju čine radioizotop, radionuklid, toksin, terapeutska grupa i hemoterapeutska grupa.
[0028]Takođe je obezbeđen antigen vezujući protein kakav je opisan za upotrebu u tretiranju ili preveniranju stanja povezanih sa IL-23 kod pacijenta, u kojem je stanje odabrano iz grupe koju čine zapaljenski poremećaj, reumatoidni poremećaj, autoimuni poremećaj, onkološki poremećaj i gastrointestinalni poremećaj, ili multipla skleroza, reumatoidni artritis, kancer, psorijaza, bolest zapaljenja creva, Krovona bolest, ulcerativni kolitis, sistemski lupus eritematosus, psorijatični artritis, autoimuni miokarditis; dijabetes tipa 1 i ankilozni spondilitis. U još daljem ostvarenju medicinske upotrebe, izolovani antigen-vezujući protein se daje sam ili kao kombinovana terapija.
[0029]Takođe je obezbeđen antigen vezujući protein kakav je opisan za upotrebu u terapiji pri čemu pomenuti antigen vezujući protein smanjuje IL-23 aktivnost kod pacijenta i antigen vezujući protein kakav je opisan za upotrebu, u kojem pomenuta IL-23 aktivnost indukuje proizvodnju prozapaljenskog citokina.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0030]FIG. 1A: Rezultati STAT-luciferaza reporter ogleda korišćenjem rekombinantnog humanog IL-23. Sva antitela poptunosu inhibirala rekombinantno humani IL-23 FIG. 1B: Rezultati iz STAT-luciferaza reporter ogleda korišćenjem nativnog humanog IL-23. Samo polovina onih antitela koja su poptuno inhibirala rekombinantno humani IL-23 bila us sposobna da potpuno inhibiraju nativni humani IL-23
DETALJAN OPIS
[0031]Ovaj pronalazak obezbeđuje kompozicije, i medicinske primene povezana sa IL-23 antigen vezujućim proteinima, uključujući molekule koji antagonizuju IL-23, kao što su anti-IL-23 antitela, fragmenti antitela, i derivati antitela, npr., antagonistička anti-IL-23 antitela, fragmenti antitela, ili derivati antitela. Takođe su obezbeđeni polinukleotidi, i njihovi derivati i fragmenti, koji obuhvataju sekvencu nukleinskih kiselina koja kodira antigen vezujući protein kakav je opisan, plazmide i vektore koji obuhvataju takve nukleinske kiseline, i ćelije ili ćelijske linije koje obuhvataju takve polinukleotide i/ili vektore i plazmide. Takođe je obezbeđen postupak pripreme, antigen vezujući proteini, kakav je opisan i medicinska primena za tretiranje stanja posredovanih sa IL-23, i za antagonizaciju biološke aktivnosti IL-23, in vivo ili in vitro.
[0032]Ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički izrazi upotrebljeni u vezi sa ovim pronalaskom imaće značenje koje se uobičajeno podrazuimeva od strane stručnjaka iz ove oblasti. Dalje, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, oblici jednine uključuju oblike množine, a izrazi u množini uključuju i jedninu. Generalno, nomenklature koje se koriste u vezi sa, i tehnike za, ćelijsku i tkivnu kulturu, molekularnu biologiju, imonologiju, mikrobiologiju, genetike i proteinska i amino kiselinska hernija i hibridizacija, koje su dobro poznate i uobičajene u stanju tehnike. Postupci i tehnike ovog pronalaska generalno se izvode prema konvencionalnim postupcima dobro poznatim u stanju tehnike i kako su opisani u raznim opštim i specifičnijim referencama koje su navedene i razmatrane kroz ovu specifikaciju ukoliko nije drugačije indikovano. Videti, npr., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 3-će izdanje, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001) i Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biologv, Greene Publishing Associates (1992), i Harlow and Lane Antibodies: A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Enizmatične reakcije i tehnike prečišćavanja izvedene su u skladu sa uputstvima proizvođača, kao se uobičajeno izvode u stanju tehnike ili su ovde opisane. Terminologija koja se primenjuje u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike za, analitičku herniju, sintetičku organsku herniju, i medicinsku farmaceutsku herniju, koje su ovde opisane dopbro su poznate i uobičajene i stanju tehnike. Standardne tehnike mogu se koristiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsko pripremanje, formulisanje, i dostavu, i tretiranje pacijenta.
[0033]Polinukleotidne i proteinske sekvence pl9 subjedinice humanog IL-23 (SEQ ID NO: 144 i 145), zajednička p40 subjedinica (SEQ ID NO:146 i 147), humani IL-23 receptor hererodimerne subjedinice IL-12RB1 (SEQ ID NO: 150 i 151) i IL-23R (SEQ ID NO: 148 i 149), poznati su u stanju tehnike, videti na primer, GenBank Accession Br. AB030000; M65272, NM_005535, NM_144701, kao i one od drugih vrsta sisara. Rekombinantni IL-23 i IL-23 receptor proteini uključujući jednostruki lanac i Fc proteine kao i ćelije koje eksprimiraju IL-23 receptor opisani su i dostupni od komercijalnih izvora, (videti na primer, Oppmann et al., Immunitv, 2000,13: 713-715; R&D Svstems, Minneapolis. Minnesota; United States Biological, Svvampscott, Massachusetts; WIPO Publikaciji Br. WO 2007/076524). Nativni humani IL-23 može biti dobijen iz humane ćelije kao što su dendritične ćelije korišćenjem postupaka poznatih u struci uključujući one ovde opisane.
[0034]IL-23 je heterodimerni citokin koji se sastoji od jedinstvene pl9 subjedinice koja je kovalentno vezana sa zajedničkom p40 subjedinicom. pl9 subjedinica obuhvata četiri a-heliksa, "A", "B", "C" i "D" uekom gore-gore-dole-dole motivu spojeni sa tri intra-heliksoidnim petljama između A i B heliksa, između B i C heliksa i između C i D heliks, videti Oppmann et al., Immunitv, 2000,13: 713-715 i Beyer, et al., J Mol Biol, 2008. 382(4): 942-55. Smatra se da su A i D heliksi 4 spiralna snopa citokina uključena u vezivanje receptora. p40 subjedinica obuhvata tri beta-listastih sendvič domena, Dl, D2 i D3 (Lupardus i Garcia, J. Mol. Biol., 2008, 382:931-941.
[0035]Izraz "polinukleotid" uključuje i jednolančane i dvolančane nukleinske kiseline i uključuje genomsku DNK, RNK, mRNK, cDNK, ili je sintetičkog porekla ili neke njihove kombinacije koje nisu povezane sa sekvencama koje se normalno nalaze u prirodi. Izolovani polinukleotidi koji obuhvataju specificirane sekvence mogu da uključuju, pored specificiranih sekvenci, kodirajuće sekvence za do deset ili čak do dvadeset drugih proteina ili njihovih delova, ili mogu da uključe operativno povezane regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju kodirajućeg regiona izrečene sekvence nukleinske kiseline, i/ili mogu da uključe vektorske sekvence. Nukleotidi koji obuhvataju polinukleotid mogu biti ribonukleotidi ili deoksiribonukleotidi ili mofidikovan oblik bilo kog tipa nukleotida. Modifikacije uključuju bazne modifikacije kao što derivati bromouridina i inozina, ribozne modifikacije kao što su 2',3'-dideoksiribosa, i modifikacije internukleotidne veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoate, fosforodiselenoate, fosforoanilotioat, fosoraniladat i fosforoamidat.
[0036]Izraz "oligonukleotid" označava polinukleotid koji obuhvata 100 ili manje nukleotida. U nekim ostvarenjima, oligonukleotidi su 10 do 60 bazas u dužini. U drugim ostvarenjima, oligonukleotidi su 12, 13,14,15,16,17,18,19, ili 20 do 40 nukleotida u dužini. Oligonukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani, npr., za upotrebu konstruisanju mutantnog gena. Oligonukleotidi mogu biti senzitivni ili antisenzitivni oligonukleotidi. Oligonukleotid može da uključi oznaku koja se može detektovasti, kao što su radiooznaka, fluorescentna oznaka, hapten ili antigenska oznaka, a zbog detekcionih ispitivanja. Oligonukleotidi se mogu primeniti, na primer, kao PCR primeri, primeri kloniranja ili hibridizacione probe.
[0037]Izrazi "polipeptid" ili "protein" označavaju makromolekul koji ima amino kiselinsku sekvencu nativnog proteina, to jest, protein proizveden prirodnom ne-rekombinantnom ćelijom; ili je proizveden genetski konstruisanom ili rekombinantnom ćelijom, i obuhvata molekule koji imaju amino kiselinsku sekvencu nativnog proteina, ili molekule koji imaju jedan ili više brisanja iz, umetanja u, i/ili supstitucije ostataka amino kiseline nativne sekvenca. Ovaj izraz takođe uključuje amino kiselinske polimere kod kojih su jedna ili više amino kiselina hemijski analozi odgovarajućih prirodnih amino kiselina i polimera. Izrazi "polipeptid" i "protein" obuhvataju IL-23 antigen vezujući proteine (kao što su antitela) i sekvence koje imaju jedno ili više brisanja iz, dodavanja u, i/ili supstitucija ostataka amino kiseline sekvence antigen vezujućeg proteina. Izraz "polipeptidni fragment" odnosi se na polipeptid koji ima amino-terminalno brisanje, karboksil-terminalno brisanje, i/ili internalno brisanje u poređenju sa nativnim proteinom pune dužine. Takvi fragmenti takođe mogu da sadrže mofidikovane amino kiseline u poređenju sa nativnim proteinom. U određenim ostvarenjima, fragmenti su dugi oko pet do 500 amino kiselina. Na primer, fragmenti mogu biti dugi najmanje 5, 6,7, 8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 50, 70, 100, 110,150, 200, 250, 300, 350, 400, ili 450 amino kiseline. Korisni polipeptidni fragmenti uključuju imunološki funkcionalni fragmenti antitela, uključujući domene vezivanja. U slučaju IL-23 antigen vezujućeg proteina, kao što su antitelo, korisni fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na jedan ili više CDR regiona, varijabilni domen teškog ili lakog lanca, deo lanca antitela, deo varijabilnog regiona uključujući manje od tri CDR, i slično.
[0038]"Amino kiselina" uključuje svoje uobičajeno značenje u ovoj oblasti. Dvadeset prirodnih amino kiselina i njihove skraćenice prate konvencionalnu upotrebu. Dideti, lmmunology-A Synthesis, 2nd Edition, (E. S. Golub i D. R. Gren, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991). Stereoizomeri (npr., D-amino kiseline) dvadeset konvencionalnih amino kiselina, ne-prirodnih amino kiselina kao što su [alfa]-, [alfaj-disupstituisane amino kiseline, N-alkil amino kiseline, i ostale nekonvencionalne amino kiseline takođe mogu biti pogodne komponente za polipeptide. Primeri nekoncencionalnih amino kiselina uključuju: 4-hidroksiprolin, [gamaj-karboksiglutamat, [epsilon]-N,N,N-trimetillizin, [epsilon]-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formlmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, [sigma]-N-metilarginin, i druge slične amino kiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin). U notaciji polipeptida koja se ovde koristi, smer levog boka je amino terminalni smer, a smer desnog boka je karboksil-terminalni smer, u skladu sa standardnom uzpotrebom i konvekcijom.
[0039]Izraz "izolovani protein" odnosi se na protein, kao što su antigen vezujući protein (što na primer može biti antitelo), koji je prečišćen od proteina ili polipeptida ili ostalih kontaminanata koji mogu da se mešaju sa njegovom terapeutskom, diagnostičkom, profilaktičkom, istraživačkom ili drugom upotrebom. Kako se ovde koristi, "suštinski čist" označava su opisane vrste molekula trenutno predominantne vrste, to jest, na molarnoj bazi su obilniji od bilo koje pojedinačne vrste u istoj mešavini. U određenim ostvarenjima, suštinski čist molekul je kompozicija u kojoj predmetna vrsta obuhvata najmanje 50% (na molarnoj bazi) svih prisutnih makromolekularnih vrsta. U drugim ostvarenjima, suštinski čista kompozicija će obuhvatati najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% svih makromolekularnih vrsta prisutnih u kompoziciji. U određenim ostvarenjima, esencijalno homogene supstance prečišćene su do takvog stepena da se kontaminirajuće vrste ne mogu detektovati u kompoziciji konvencionalnim postupcima delecije, te prema tome kompozicija se sastoji od jedne makromolekularne vrste koja se može detektovati.
[0040]"Varijanta" polipeptida (npr., antigen vezujući protein kao što su antitelo) obuhvata neku amino kiselinsku sekvencu gde su jedan ili više ostataka amino kiselina ubačeni u, obrisani iz i/ili supstituisani u amino kiselinsku sekvencu pored druge polipeptidne sekvence. Varijante uključuju fuzione proteine. "Derivat" polipeptida je polipeptid koji je hemjiski mofidikovan na određeni način različit od varijanti umetanja, brisanja, ili supstitucije, npr., konjugacijom u drugi hemijski deo.
[0041]Izrazi "prirodni" ili "nativni" kako se koriste kroz ovu specifikaciju u vezi sa biološkim materjalima kao što su polipeptidi, nukleinske kiseline, ćelije domaćini, i slično, odnosi se na materijale koji se mogu naći u prirodi, kao što su nativni humani IL-23. U određenim aspektima, rekombinantni antigen vezujući proteini koji vezuju nativni IL-23 su obezbeđeni. U ovom kontekstu, "rekombinantni protein" je protein izrađen korišćenjem rekombinantnim tehnikama, tj., kroz ekspresiju rekombinantne nukleinske kiseline kako je ovde opisano. Postupci i tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina dobro su poznate u struci.
[0042]Izraz "antitelo" odnosi se na intaktni imunoglobulin bilo kog izotipa, ili njegov fragment koji može biti u kompeticiji sa intaktnim antitelom za specifično vezivanje sa ciljanim antigenom, i uključuje, na primer, himerna, humanizovana, potpuno humana, i bispecifična antitela. Antitelo kao takvo je vrsta antigen vezujućeg proteina. Ukoliko nije drugačije naznačeno, izraz "antitelo" uključuje, pored antitela koje obuhvata dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, derivate, varijante, fragmente, i njihove muteine, čiji su primeri opisani ispod. Intaktno antitelo generalno obuhvata najmanje dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, ali u nekim slučajevima mogu da uključuju manje lance kao što su antitela koja se prirodno nalaze u kamelidima koje mogu da obuhvataju samo teške lance. Antitela može biti izvedena potpuno iz jednog izvora, ili mogu biti "himerna," to jest, različiti delovi antitela mogu biti izvedeni iz dva različita antitela kako je opisano u nastavku. Antigen vezujući proteini, antitela, ili vezivajući fragmenti mogu se proizvesti u hibridomima, rekombinantnim DNK tehnikama, ili enizmatičnim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela.
[0043]Izraz "funkcionalni fragment" (ili jednostavnije "fragment") antitela ili imunoglobulinskog lanca (teški ili laki lanac), kako se ovde koristi, je antigen vezujući protein koji obuhvata deo (bez obzira kako je taj deo dobijen ili sintetizovan) antitela kojem nedostaje najmanje neka od amino kiselina prisutnih u lancu pune dužine, ali koji je sposoban za specifično vezivanje za neki antigen. Takvi fragmenti su biološki aktivni tako da se specifično vezuju za ciljani antigen i i mogu da uđu u kompeticiju sa ostalim antigen vezujućim proteinima, uključujući intaktna antitela, radi specifičnog vezivanje za dati epitop. U jednom aspektu, takav fragment zadržava najmanje jedan CDR prisutan u lakom ili teškom lancu pune dužine, i u nekim ostvarenjima obuhvata jedan težak lanac i/ili laki lanac ili njihov deo. Ovi biološki aktivni fragmenti mogu se proizvesti rekombinantnim DNK tehnikama, ili se može proizvesti enizmatičnim ili hemijskim cepanjem antigen vezujućih proteina, uključujući intaktna antitela. Fragmenti uključuju, ali nisu ograničeni na, imunološki funkcionalne fragmente kao što su Fab, Fab', F(ab')2, Fv, domene antitela i jednolančana antitela, i se mogu izvesti iz bilo kog sisarskog izvora, uključujući ali ne ograničavajući se na, miša, pacova, lamu ili zeca. Dalje se smatra da funkcionalni deo antigen vezujućih proteina opisanih ovde, na primer, jedan ili više CDR, može biti kovalentno vezan sa drugim proteinom ili za mali molekum radi stvaranja terapeutskog agensa usmerenog ka određeno cilju u telju, sa bifunkcionalnim terapeutskim karakteristikama, ili koji ima produženi poluživot u serumu.
[0044]Izraz "ući u kompeticiju" kada se koristi u kontekstu antigen vezujućih proteina (npr., neutrališući antigen vezujući proteini ili neutrališuća antitela) označava kompeticiju između antigen vezujućih proteina kako je određeno ogledom u kojem antigen vezujući protein (npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalni fragment) koji se testira sprečava ili inhibira specifično vezivanje referentnog antigen vezujućeg proteina (npr., ligand, ili referentno antitelo) za uobičajeni antigen (npr., IL-23 protein ili njegov fragment). Brojni primeri ogleda kompetitivnog vezivanja mogu se primeniti, na primer: radioimunološki ogled direktne ili indirektne faze (RIA), enzimski ogled direktne ili indirektne faze (EIA), ogled sendivč kompeticije (videti, npr., Stahli et al., 1983, Methods in Enzvmologv 92:242-253); EIA čvrste faze sa biotin-avidin (videti, npr., Kirkli etal., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619) ogled direktnog obeležavanja sa čvrstom fazom, ogled direktnog sendvič obeležavanja sa čvrstom fazom (videti, npr., Harlow i Lane, 1988, Antitela, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA čvrste faze sa direktnom oznakom korišćenjem 1-125 oznake (videti, npr., Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); EIA čvrste faze sa biotin-avidin EIA (videti, npr., Cheung, et al., 1990, Virologv 176:546-552); i RIA sa direktnim obeležavanjem (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). Tipično, takav neki ogled uključuje upotrebu prečišćenog antigena vezanog za čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo koji od njih, neobeleženi test antigen vezujući protein i obelećeni referentni antigen vezujući protein.
[0045]Kompetitivna inhibicija izmerena je određivanjem količine oznake povezane sa čvrstom površinom ili ćelijama u prisustvu test antigen vezujućeg proteian. Obično je test antigen vezujući protein prisutan u višku. Antigen vezujući proteini identifikovani ogledom kompeticije (kompeticioni antigen vezujući proteini) uključuju vezivanje antigen vezujućih proteina za isti epitop kao i vezivanje referentnih antigen vezujućih proteina i antigen vezujućih proteina za susedni epitop koji je dovoljno blizu epitopu koji je vezan referetntnim antigen vezujućim proteinom kako bi se stvorila prostorna prepreka. Obično, kada je kompeticioni antigen vezujući protein prisutan u višku, on će inhibirati specifično vezivanje referentnog antigen vezujućeg proteina sa uobičajenim antigenom za najmanje 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ili 75%. U nekom stepenu, vezivanje je inhibirano za najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 98%, 99% ili više.
[0046]Izraz "epitop" ili" antigenska determinanta" odnosi se na mesto na antigenu za koje se antigen vezujući protein vezuje. Epitopi mogu biti formirani i iz susednih amino kiselina ili nesusednih amino kiselina suprodstavljene tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi formirani od susednih amino kiselina tipično su zadržani od izlaganja denaturacionim rastvaračima, pri čemu su epitopi formirani tercijarnim savijanjem tipično izgubljeni u tretiranju sa denaturacionim rastvaračima. Determinante epitopa mogu da uključe hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su amino kiseline, šećerni bočni lanci, fosforil ili sulfonil grupe, i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturalne karakteristike, i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop tipično uključuje najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11,12, 13,14,15,16,17,18,19, 20, 25, 30, 35 amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. Epitopi mogu biti određeni korišćenjem postupaka poznatim u struci.
IL-23 Antigen vezujući proteini
[0047]"Antigen vezujući protein" kako se ovde koristi označava protein specifično vezuje specificiran ciljni antigen; antigen kako je ovde obezbeđen je IL-23, naročito humani IL-23, uključujući nativni humani IL-23. Antigen vezujući proteini kako je ovde obezbeđen ulazi u interakciju sa najmanje delom jedinstvene pl9 subjedinice IL-23, primetno vezujući IL-23; ali se ni u kakvoj značanoj meri ne vezuje za IL-12 (npr., p40 i/ili p35 subjedinice IL-12), čime "oskuduje sa IL-12". Kao posledica, antigen vezujući proteini obezbeđeni ovde imaju sposobnost uticanja na IL-23 aktivnost bez potencijalnih rizika od eventalne inhibicije IL-12 ili zajedničke p40 subjedinice. Antigen vezujući proteini mogu da utiču na sposobnost IL-23 da uđe u interakciju sa njegovim receptorom, na primer uticanjem na vezivanje za receptor, kao što je uplitanjem sa povezivanjem receptora. Određenije, takvi antigen vezujući proteini potpuno ili delimično redukuju, inhibiraju, upliću se sa ili modulišu jednu ili više bioloških aktivnosti IL-23. Takva inhibicija ili neutralizacija remeti biološki odgovor u prisustvu antigen vezujućeg proteina u poređenju sa odgovorom u odsustvu antigen vezujućeg proteina i može se odrediti korišćenjem ogleda poznati u struci i opisani ovde. Antigen vezujući proteini obezbeđeni ovde inhibiraju IL-23-indukovanu proizvodnju prozapaljenskog citokina, na primer IL-23-indukovana IL-22 proizvodnja u celim krvnim ćelijama i IL-23-indukovanu IFNv ekspresiju u NK i celim krvnim ćelijama. Redukcija biološke aktivnosti može biti oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97% 98%, 99% ili više.
[0048]Antigen vezujući protein može da obuhvata deo koji se vezuje za antigen i, opciono, deo kičme ili okvira koji omogućava da antigen vezujući deo usvoji konformaciju koja promoviše vezivanje antigen vezujućeg proteina za antigen. Primeri antigen vezujućih proteina uključuju antitela, fragmente antitela (npr., antigen vezujući deo antitela), derivate antitela, i analoge antitela. Antigen vezujući protein može da obuhvata neku alternativnu proteinsku kičmu ili veštačku kičmu sa nakalemljenim CDR ili derivatima CDR. Takve kičme uključuju, ali nisu ograničene na, antitelo-izvedene kičme koje obuhvataju mutacije uvedene radi, na primer, stabilizacije tro-dimenzionalne strukture antigen vezujućeg proteina kao i potpuno veštačke kičme koje obuhvataju, na primer, biokompatiblan polimer. Videti, na primer, Korndorfer et al., Proteins: Structure, Function, i Bioinformatics, (2003) Tom 53, Izdanje 1:121-129; Roque et al., Biotechnol. Prog., 2004, 20:639-654. Pored toga, mogu se koristiti mimetici peptidnog antitela ("PAM"), kao i kičme bazirane na mimeticima antitela koji koriste fibronekcione komponente kao kičmu.
[0049]Određeni antigen vezujući proteini ovde opisani su antitela ili su izvedeni iz antitela. Takvi antigen vezujući proteini uključuju, ali nisu ograničeni na, monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, domen antitela, sintetička antitela, mimetike antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzije antitela, konjugate antitela, jednolančana antitela, i njihove fragmente, respektivno. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein je neki imunološki fragment antitela (npr., Fab, Fab', F(ab')2, ili scFv). Različite strukture opisane su i definisane u nastavku.
[0050]Određeni antigen vezujući proteini mogu da obuhvataju jedan ili više CDR kako su ovde opisani (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili više CDR). U nekim slučajevima, antigen vezujući protein obuhvata (a) polipeptidnu strukturu i (b) jedan ili više CDR koji su ubačeni u i/ili spojeni sa polipeptidnom strukturom. Polipeptidna struktura može biti u različitim oblicima. Na primer, može biti, ili obuhvatati, okvir prirodnog antitela, ili fragmenta ili njegove varijante, ili može biti potpuno sintetička po prirodi. Primeri raznih polipeptidnih struktura dalje su opisani u nastavku.
[0051]Za antigen vezujući protein ovog pronalaska kaže se da "specifično vezuje " svoj ciljni antigen kada je konstanta ravnoteže disocijacije (KD) < 10-8 M. Antigen vezujući protein specifično vezuje
antigen sa "visokim afinitetom" kada je KD < 5 x 10-9 M, i sa "veoma visokim afinitetom" kada je KD < 5 x 10-10 M. U jednom ostvarenju antigen vezujući protein se vezuje sa humanim IL-23 sa KD od < 5 x 10-12 M, a u još daljem ostvarenju vezuje se sa KD < 5 x 10-13 M. U još jednom ostvarenju ovog pronalaska, antigen vezujući protein ima KD od < 5 x 10-12 M i Koff od oko <5xl0-6 l/s. U još jednom ostvarenju, Koff je < 5xl0-71/s.
[0052]Još jedan aspekt obezbeđuje antigen vezujući protein koji ima polu-život od najmanje jedan dan in vitro ili in vivo (npr., kada se daje humanom subjektu). U jednom ostvarenju, antigen vezujući protein ima polu-život od najmanje tri dana. U još jednom ostvarenju, antitelo ili njegov deo ima polu-život od četiri dana ili duže. U još jednom ostvarenju, antitelo ili njegov deo ima polu-život od osam dana ili duže. U još jednom ostvarenju, antitelo ili njegov antigen vezujući deo izveden je ili mofidikovan tako da ima produžen polu-život u odnosu na neizvedeno ili nemofidikovano antitelo. U još jednom ostvarenju, antigen vezujući protein sadrži taćkaste mutacije radi produžavanja polu života u serumu, kao što je opisano u WIPO Publikaciji br. WO 00/09560.
[0053]U ostvarenjimau kojima se antigen vezujući protein koristi za terapeutske primene, antigen vezujući protein može da redukuje, inhibira, can reduce, inhibit, ometa ili moduliše jedan ili više bioloških aktivnosti IL-23, indukujući tako proizvodnju prozapaljenskih citokina. IL-23 ima mnogo različitih bioloških efekata, koji se mogu izmeriti mnogim različitim ogledima na različitim ćelijskim vrstama; primeri oavkvih i poznatih ogleda obezbeđeni su ovde.
[0054]Neki od antigen vezujućih proteina koji su obezbeđeni imaju strukturu tipično povezanu sa prirodnim antitelima. Strukturalne jedinice ovih antitela tipično obuhvataju jedan ili više tetramera, pri čemu je svaki sastavljen od dva identična kupleta polipeptidnih lanaca, do toga da neke vrste sisara takođe proizvode antitela koja imaju samo jedan teški lanac. Kod uobičajenog antitela, svaki par ili kuplet uključuje jedan "laki" lanac pune dužine (u određenim ostvarenjima, oko 25 kDa) ijedan "teški" lanac pune dužine (u određenim ostvarenjima, oko 50-70 kDa). Svaki pojedinačni imunoglobulinski lanac sastavljen je od nekoliko "imunoglobulinskih domena", pri čemu se svaki sastoji grubo od 90 do 110 amino kiselina i eksprimiraju karakteristike obrasca savijanja. Ovi domeni su bazne jedinice od kojih su polipeptidi antitela sastavljeni. Amino-terminalni deo svakog lanca tipično uključuje varijabilni region koji je odgovoran za antigensko prepoznavanje. Karboksi-terminalni deo je konzerviraniji evolucionarno u odnosu na drugi kraj lanca i odnosi se na "konstantan region" ili "C region". Humani laki lanci generalno su klasifikovani kao kapa i lambda laki lanci, a svaki od njih sadrži jedan varijabilni region i jedan konstantan domen (CLl).z Teški lanci tipično su klasifikovani kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon lanci, i oni definišu isotiop antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE, respektivno. IgG ima nekoliko podtipova, uključujući, ali neograničavajući se na, IgGl, lgG2, lgG3, i lgG4. IgM podtipovi uključuju IgM, i lgM2. IgA podtipovi uključuju IgAl i lgA2. Kod ljudi, IgA i IgD izotipovi sadrže četiri teška lanca i četiri laka lanca; IgG i IgE izotipovi sadrže dva teška lanca i dva laka lanca; i IgM izotip sadrži pet teških lanaca i pet lakih lanaca. Konstantni region (CH) teškog lanca tipično obuhvata jedan ili više domena koji mogu biti odgovorni za efektorsku funkciju. Broj domena konstantnog regiona teškog lanca zavisiće od izotipa. IgG teški lanci, na primer, svaki sadrže tri domna CH regiona poznati kao CH1, CH2 i CH3. Antitela koja se obezbeđuju mogu imati bilo koji od ovih izotipova i podtipova, na primer, IL-23 antigen vezujući protein je IgGl, lgG2, ili lgG4 podtip. Ukoliko je poželjan lgG4, takođe može biti potrebno uvođenje tačkaste mutacije (CPSCP->CPPCP) u šarkastom regionu kako je opisano kod Bloom et al., 1997, Protein Science 6:407) radi podizanja tendencije ka obrazovanju disulfidnih veza intra-H lanca koje vode ka heterogeniciteta kod lgG4 antitela. Antitela obezbeđena ovde koja su jednog tipa, mogu se promeniti u drugi tip korišćenjem postupaka menjanja podklasa. Videti, npr., Lantto et al., 2002, Methods Mol. Biol. 178:303-316.
[0055]Kod lakih i teških lanaca pune dužine, varijabilni i konstantni regioni su združeni "J" regionom od oko dvanaest ili više amino kiselina, pri čemu teški lanac takođe uključuje "D" region od oko deset dodatnih amino kiselina. Videti, npr., Fundamental Immunologv, 2nd ed., Ch. 7 (Paul, W., ed.) 1989, New York: Raven Press. Varijabilni regioni svakog para laki/teški lanac tipično obrazuju mesto vezivanja antigena.
[0056]Varijabilni regioni opisani i/ili zaštićeni
[0057]Razni varijabilni regioni teškog lanca i lakog lanca (ili domeni) ovde opisani i/ili zaštićeni prikazani su u TABELAMA 1 i 2. Svaki od ovih varijabilnih regiona može biti prikačen, na primer, za prethodno opisane konstantne regione teškog i lakog lanca. Dalje, svaka od generisanih sekvenci teškog i lakog lanca može se kombinovati radi obrazovanja kompletne strukture antigen vezujućeg proteina.
[0058]Ovde su opisani i/ili zaštićeni antigen vezujući proteini koji sadrže najmanje jedan varijabilni region teškog lanca (VH) odabran iz grupe koju čine VH1, VH2, VH3, VH4, VH5, VH6, VH7, VH8, VH9, VH10, VH11, VH12, VH13, VH14, VH15 i VH16 i/ili najmanje jedan varijabilni region lakog lanca (VL) odabran iz grupe koju čine VL1, VL2, VL3, VL4, VL5, VL6, VL7, VL8, VL9, VL10, VL11, VL12, VL13, VL14, VL15, i VL16 kako je prikazano u TABELAMA 1 i 2 ispod.
[0059]Svaki od varijabilnih regiona teškog lanca navedeni u TABELI 2 može biti kombinovan bilo kojim od varijabilnih regiona lakog lanca prikazani u TABELI 1 radi obrazovanja antigen vezujućeg proteina. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein uključuje najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i/ili jedan varijabilni region lakog lanca od onih navedenih u TABELAMA 1 i 2. U nekim slučajevima, antigen vezujući protein uključuje najmanje dva različita varijabilna regiona teškog lanca i/ili varijabilna regiona lakog lanca od onih navedenih u TABELAMA 1 i 2. Razne kombinacije varijabilnih regiona teškog lanca mogu se kombinovati sa bilo kojom od raznih kombinacija varijabilnih regiona lakog lanca.
[0060]U drugim slučajevima, antigen vezujući protein sadrži dva identična varijabilna regiona lakog lanca i/ili dva identična varijabilna regiona teškog lanca. Kao na primer, antigen vezujući protein može biti antitelo ili imunološki funkcionalni fragment koji obuhvata dva varijabilna regiona lakog lanca i dva varijabilna regiona teškog lanca u kombinacijama parova varijabilnih regiona lakog lanca i parova varijabilnih regiona teškog lanca kako su navedeni u TABELAMA 1 i 2. Primeri takvih antigen vezujućih proteina koji obuhvata dva identična varijabilna regiona teškog lanca lakog lanca uključuju: Antitelo A VH14/ VL14; Antitelo B VH9/ VL9; Antitelo C VH10/ VL10; Antitelo D VH15/ VL15; Antitelo E VH1/ VL1, Antitelo F VH11/ VL11; Antitelo G VH12/ VL12; Antitelo H VH13/ VL13; Antitelo I VH8/ VL8; Antitelo J VH3/ VL3; Antitelo K VH7/ VL7; Antitelo L VH4/ VL4; Antitelo M VH5/ VL5 i Antitelo N VH6/ VL6.
[0061]Neki antigen vezujući proteini koji su opisani obuhvataju varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca koji obuhvata sekvencu amino kiseline koja se razlikuje od sekvence varijabilnog regiona teškog lanca i/ili varijabilnog regiona lakog lanca odabarani iz TABELA 1 i 2 na samo 1, 2, 3, 4, 5, 6,7, 8, 9,10,11,12,13,14 ili 15 ostataka amino kiselina, u kojima je svaka takva razlika sekvence nezavisno bilo brisanje, umetanje ili supstitucija jedne od amino kiselina. Varijabilni regioni lakog i teškog lanca, kod nekih antigen vezujućih proteina, obuhvataju sekvence amino kiselina koje imaju najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% sekvencionog identiteta sa sekvencom amino kiseline obezbeđene u TABELAMA 1 i 2. Još dalji antigen vezujući proteini, npr., antitela ili imunološki funkcionalni fragmenti, takođe uključuju varijantu oblika regiona teškog lanca i/ili varijantu oblika regiona lakog lanca kako su ovde opisani.
[0062]Izraz "identitet" odnosi se na odnos između sekvence dva ili više polipeptidna molekula ili dva ili više polinukleotida, kako je određeno usklađivanjem i upoređivanjem sekvenci. "Procentualni identitet" označava procenat identičnih ostataka između amino kiselina ili nukleotida u poređenju sa molekulima i izračunava se na osnovu veličine najmanjih molekula koji se upoređuju.
Za ova izračunavanja, praznine u usklađivanju (ukoliko ih ima) moraju biti usmerene određenim matematičkim modelom ili kompjuterskim programom (tj., "algoritmom"). Postupci koji se mogu koristiti za izračunavanje identiteta usklađenih nukleinskih kiselina ili polipeptida uključuju one opisane u Computational Molecular Biologv, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford Universitv Press; Biocomputing Informatics i Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analvsis from Seqence Data, Part I, (Griffin, A. M., i Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersev: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biologv, New York: Academic Press; Sequence Analysis Example, (Gribskov, M. i Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; i Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073.
[0063]U izračunavanju procentualnog identiteta, sekvence koje se upoređuju su usklađene na način da se dobija najveće slaganje između sekvenci. Kompjuterski program koji se koristi za određivanje procentualnog identiteta je GCG programski paket, sa uključenim GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Grupa, University of Wisconsin, Madison, Wl). Kompjuterski algoritam GAP koristi se za usklađivanje dva polipeptida ili polinukleotida za koje treba da se odredi procentualni identitet sekvence. Sekvence su usklađene za optimalno slaganje njihove respektivne amino kiseline ili nukleotida ("raspon slaganja", kako je određeno logaritmom). Penal za otvaranje praznine u usklađivanju (koji se izračunava kao 3x prosečna dijagonala, gde je "prosečna dijagonala" prošek dijagonale uporedne matrice koja se koristi; "dijagonala" je rezultat ili broj dodeljen svakom savršenom slaganju amino kiselina određenim uporednim matriksom) i penal za produžavanje praznine (koji je obično 1/10 puta penal za otvaranje praznine), kao i uporedna matrica kao što je PAM 250 ili BLOSUM 62, koriste se u konjukciji sa algoritmom. U određenim ostvarenjima, standardna uporedna matrica (videti, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Proteine Seequence and Structure 5:345-352 za PAM 250 uporednu matricu; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919 za BLOSUM 62 uporedna matrica) takođe se koristi algoritmom.
[0064]Preporučeni parameteri za identifikovanje procentualnog identiteta za polipeptide ili nukleotidne sekvence korišćenjem GAP programa su kako slede: Algoritam: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453; Uporedna matrica: BLOSUM 62 odHenikoff et al.,1992,gore naveden;Penal za praznine: 12 (ali bez penala za krajnje praznine), Penal za dužinu praznine: 4, Prag sličnosti: 0. Određene šeme usklađivanja za usklađivanje dve amino kiselinske sekvence može da rezultira u podudaranju samo kratkog regiona dve sekvence i ovaj mali usklađeni region može da ima veoma visok identitet sekvence ćak iako ne postoji značajnog odnosa između dve sekvence pune dužine. Shodno tome, odabrabni postupak usklađivanja (GAP program) može biti podešen ukoliko je ti poželjno da rezultira kao usklađivanje koje obuhvata najmanje 50 susednih amino kiselina ciljanog polipeptida.
[0065]Varijabilni regioni teških i lakih lanaca opisani ovde uključuju konsenzus sekvence izvedene iz grupe povezanih antigen vezujućih proteina. Amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona teških i lakih lanaca analizirane su na sličnosti. Pojavile su se četiri grupe, jedna grupa koja ima kapa varijabilne regioni lakog lanca, (VH9/ VL9, VH10/ VL10, VH11/ VL11, VH13/ VL13, VH14/ VL14 i VH15/ VL15) i tri grupe koji imaju lambda varijabilne regione lakog lanca: lambda grupa 1 (VH5/ VL5, VH6/ VL6 i VH7/ VL7), lambda grupa 2 (Vh3/ Vl3 i Vh4/ Vl4), i lambda grupa 3 (VhI/ VlI i Vh2/ Vl2). Predstavljene germinativne linije lakog lanca uključuju VK1/A30 i VK1/L19. Predstavljene lambda germinativne linije lakog lanca uključuju VLl/le, VL3/3p, VL5/5c i VL9/9a. Predstavljene germinativne linije teškog lanca uključuju VH3/3-30, VH3/3-30.3, VH3/3-33, VH3/3-48, VH4/4-31 i VH4/4-59. Kako se ovde koristi, "konsenzus sekvenca" odnosi se na amino kiselinske sekvence koji imaju konzervirane amino kiseline uobičajeno među brojnim sekvencama i varijabilnim amino kiselinama koje variraju unutar datih amino kiselinskih sekvenci. Konsenzus sekvence može biti određen korišćenjem standardne filogenične analize varijabilnih regiona teških i lakih lanaca koje odgovaraju IL-23 antigen vezujućim proteinima opisanim ovde.
[0066]Konsenzus sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca za kapa grupu je
DXiQX2TQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGX3X4SX5WX6AWYQQKPGX7APX8LLIYAASSLQSGVPSR FS
GSX9SGTXioFTLTISSLQPXiiDFATYXi2CQQANSFPFTFGPGTKVDXi3K (SEQ ID NO:30) gde Xi je odabrano od I ili S; X2je odabrano od M ili L; X3je odabrano od G ili V i X4je odabrano od S, F ili I; X5je odabrano od S ili G; X6 je odabrano od F ili L; X7 je odabrano od K ili Q; X8je odabrano od K, N ili S; X9 je odabrano od G ili V; Xioje odabrano od D ili E, Xnje odabrano od E ili A; Xi2je odabrano od Y ili F; i Xi3je odabrano od I, V 111 R.
[0067]Konsenzus sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca za lambda grupu 1 je QPXi
LTQPPSASASLGASVTLTCTLX2SGYSDYKVDWYQX3RPGKGPRFVMRVGTGGX4VGSKGX5GI PDRFSVLGSGLNRX6LTIKNIQEEDESDYHCGADHGSGX7NFVYVFGTGTKVTVL (SEOJD NO:61) gdeXije
odabrano od V ili E; X2 je odabrano od N ili S; X3 je odabrano od Q ili L i X4 je odabrano od I ili T; X5 je odabrano od D ili E; X6j'e odabrano od Y ili S; i X7 je odabrano od S ili N.
[0068]Konsenzus sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca za lambda grupu 3 je
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNXiGAGYDVHWYQQX2PGTAPKLLIYGSX3NRPSGVPDRFSG
SKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTX4RLTVL (SEQ ID NO:139) gde Xije odabrano od T ili I; X2je odabrano od V ili L; X3je odabrano od G ili N i X4je odabrano od R ili K.
[0069]Konsenzus sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca za kapa grupu je
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGŠESTiSGGYYWX2WIRQHPGKGLEWIGX3lX4YSGX5X6YYNPSLK
SRX7TX8SVDTSX9NQFSLXioLSSVTAADTAVYYCAXiiXi2RGXi3YYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:140) gde Xije odabrano od N ili S; X2je odabrano od S ili T; X3je odabrano od Y ili H i X4je odabrano od Y ili H; X5je odabrano od S ili N; X6 je odabrano od S ili T; X7 je odabrano od V ili I; X8 je odabrano od I ili M; X9 je odabrano od K ili Q; Xi0je odabrano od K ili S, Xn je odabrano od R ili K; Xi2 je odabrano od D ili N; i Xi3 je odabrano od H, F ili Y.
[0070]Konsenzus sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca za lambda grupu 1 je
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCXiX2SGFTFSX3X4SMNWVRQAPGKGLEWVSYISSX5SSTX6YX7ADSV
KGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRIAAAGX8X9XioYYYAXiiDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:141)
gde Xije odabrano od A ili V; X2je odabrano od A ili V; X3je odabrano od T ili S i X4je odabrano od Y ili F; X5 je odabrano od S ili R; X6 je odabrano od R ili I; X7 je odabrano od H, Y ili I; X8 je odabrano od P ili G; X9je odabrano od W ili F; Xioje odabrano od G ili H i Xu je odabrano od M ili L.
[0071]Konsenzus sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca za lambda grupu 2 je
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYXiMHWVRQAPGKGLEWX2X3VISX4DGSX5KYYAD SV KGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERTTLSGSYFDYWGQGTLVTVSS (SEOJD NO:142) gde Xi je
odabrano od G ili A; X2je odabrano od V ili L; X3 je odabrano od A ili S i X4 je odabrano od F ili H i X5 je odabrano od L ili I.
[0072]Konsenzus sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca za lambda grupu 3 je
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNXiYYADSV KG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYX2SSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 143) gde Xi
je odabrano od E ili K i X2je odabrano od T ili S.
Regioni koji određuju komplementarnost
[0073]Regioni koji određuju komplementarnost ili "CDR" ugrađeni su unutar okvira u varijabilnim regionima teških i lakih lanaca gde konstituišu regione odgovorne za antigen vezivanje i prepoznavanje. Varijabilni domeni imunoglobulinskih lanaca iste vrste, na primer, generalno eksprimiraju sličnu ukupnu strukturu; obuhvatajući regione (FR) relativno konzerviranog okvira, spojene hipervarijabilnim CDR regionima. Antigen vezujući protein može da ima 1, 2, 3, 4, 5, 6 ili više CDR. Prethodno opisivani varijabilni regioni, na primer, tipično obuhvataju tri CDR. CDR iz varijabilnih regiona teškog lanca i varijabilnih regiona lakog lanca tipično su usklađeni regionima okvira radi obrazovanja strukture koja se specifično vezuje za ciljni antigen (npr., IL-23). Od N-terminala do C-terminala, prirodni varijabilni regioni lakog i teškog lanca oba su prilagođena sledećem redosledu ovih elemenata: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. CDR i FR regioni primernih varijabilnih domena lakog lanca i varijabilnih domena teškog lanca su obeleženi u TABELAMA 1 i 2. Prihvaćeno je da granice CDR i FR regiona mogu da variraju od onih obeleženih. Izmišljeni su sistemi numerisanja za dodeljivanje brojeva amino kiselinama koje zauzimaju položaje u svakom od ovih domena. Regioni koji određuju komplementarnost i regioni okvira datog antigen vezujućeg proteina mogu se identifikovati korišćenjem ovih sistema. Sistemi numerisanja definisani su u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunolgic Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publikaciji Br. 91-3242,1991, ili Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883. Drugi sistemi numerisanja za amino kiseline u imunoglobulinskim lancima uključuju IMGT<®>(Međunarodni ImunogeneTics informacioni sistem; Lefranc et al, Dev. Comp. Immunol. 2005, 29:185-203); i AHo (Honegger i Pluckthun, J. Mol. Biol. 2001, 309(3):657-670). CDR obezbeđeni ovde ne moraju se koristiti samo za definisanje domena antigen vezivanja tradicionalne strukture antitela, već se mogu uključiti u razne druge polipeptidne strukture, kako je ovde opisano.
[0074]Antigen vezujući proteini opisani ovde su polipeptidi u koje jedan ili više CDR može biti nakalemljeno, ubačeno, ugrađeno i/ili združeno. Antigen vezujući protein može da ima, na primer, jedan teški lanac CDR1 ("CDRH1"), i/ili jedan teški lanac CDR2 ("CDRH2"), i/ili jedan teški lanac CDR3 ("CDRH3"), i/ili jedan laki lanac CDR1 ("CDRL1"), i/ili jedan laki lanac CDR2 ("CDRL2"), i/ili jedan laki lanac CDR3 ("CDRL3"). Neki antigen vezujući proteini uključuju oba CDRH3 i CDRL3. Specifična ostvarenja generalno sprovode kombinacije CDR koji se ne ponavljaju, npr., antigen vezujući proteini generalno su izrađeni od dva CDRH2 regiona u jednom varijabilnom regionu teškog lanca, itd. Antigen vezujući proteini mogu da obuhvataju jednu ili više amino kiselinskih sekvenci koje su identične ili se razlikuju od amino kiselinske sekvence jednog ili više od CDR predstavljenih u TABELI 3 na samo 1, 2,3,4, 5, 6,7, 8, 9,10,11,12,13,14 ili 15 ostataka amino kiselina, u kojima je svaka takva razlika u sekvenci nezavisno bilo brisanje, umetanje ili supstitucija jedne od amino kiselina. CDR u nekim antigen vezujućim proteinima obuhvataju sekvence amino kiselina koje imaju najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% sekvencionog identiteta sa sekvencom CDR navedeni u TABELI 3. Kod nekih antigen vezujućih proteina, CDR su učvršćeni u region "okvira", koji orijentiše CDR(ove) tako da se postižu odgovarajuće karakteristike CDR(vi) antigen vezivanja.
[0075]Ovde opisani i/ili zaštićeni CDR1 regioni koji obuhvataju amino kiselinski ostaci 23-34 iz SEQ ID NO: 7 i 11; amino kiselinski ostaci 24-34 iz SEQ ID NO: 9,13,15, 17,19 21, 23, 25, 27 i 29; amino kiselinski ostaci 23-36 iz SEQ ID NO: 1, 3 i 4; amino kiselinski ostaci 31-35 iz SEQ ID NO:31, 33, 34, 38, 40, 44, 52 i 60 i amino kiselinski ostaci 31-37 ili SEQ ID NO: 46, 48, 50, 54, 56 i 58.
[0076]CDR2 regioni opisani i/ili zaštićeni, koji obuhvataju amino kiselinski ostaci 50-56 iz SEQ ID NO: 9, 13,15,17,19, 21, 23, 25, 27 i 29; amino kiselinski ostaci 50-61 iz SEQ ID NO: 7 i 11; amino kiselinski ostaci 52-62 iz SEQ ID NO:4; amino kiselinski ostaci 50-65 iz SEQ ID NO: 31, 33,44 i 52; amino kiselinski ostaci 50-66 iz SEQ ID NO: 36, 38, 40,42 i 60; amino kiselinski ostaci 52-58 iz SEQ ID NO: 1 i 3 i amino kiselinski ostaci 52-67 iz SEQ ID NO: 46, 48, 50, 54, 56 i 58.
[0077]CDR3 regioni koji obuhvataju amino kiselinski ostaci 89-97 iz SEQ ID NO: 13,15, 17, 19, 21, 23, 25, 27 i 29; amino kiselinski ostaci 91-101 iz SEQ ID NO: 1 i 3; amino kiselinski ostaci 94-106 iz SEQ ID NO: 7, 9 i 11; amino kiselinski ostaci 98-107 iz SEQ ID NO: 44 i 52; amino kiselinski ostaci 97-105 iz SEQ ID NO: 4; amino kiselinski ostaci 99-110 iz SEQ ID NO: 34 i 36; amino kiselinski ostaci 99-112 iz SEQ ID NO: 112; amino kiselinski ostaci 99-113 iz SEQ ID NO: 31 i 33; amino kiselinski ostaci 99-114 iz SEQ ID NO: 38,40 i 42; amino kiselinski ostaci 100-109 iz SEQ ID NO: 46, 48, 54, 56 i 58; i amino kiselinski ostaci 101-019 iz SEQ ID NO; 50; takođe su opisani i/ili zaštićeni.
[0078]CDR opisani ovde uključuju konsenzus sekvence izvedene iz grupe povezanih sekvenci. Kako je prethodno opisano, četiri grupe sekvenci varijabilnog regiona su identifikovane, kapa grupa i tri lambda grupe. CDRL1 konsenzus sekvenca iz kapa grupe sastoji se od RASQXiX2SXsWX4A (SEQ ID NO:123) gde Xije odabrano od G ili V; X2je odabrano od I, F ili S; X3je odabrano od S ili G i X4je odabrano od F ili L. CDRL1 konsenzus sekvenca iz lambda grupe 1 sastoji se od TLXiSGYSDYKVD (SEQID NO:124) gde Xi je odabrano od N ili S. CDRL1 konsenzus sekvence iz lambda grupe 3 sastoji se od TGSSSNXiGAGYDVH (SEQ ID NO:125) gde Xije odabrano od I ili T.
[0079]CDRL2 konsenzus sekvenca iz lambda grupe 1 sastoji se od VGTGGXiVGSKGX2(SEQ ID NO: 126) gde Xije odabrano od I ili T i X2je odabrano od D ili E. CDRL2 konsenzus sekvenca iz lambda grupe 3 sastoji se od GSXiNRPS (SEQ ID NO:127) gde Xije odabrano od N ili G.
[0080]CDRL3 konsenzus sekvence uključuju GADHGSGXiNFVYV (SEQIDN NO:128) gde Xije S ili N.
[0081]CDRH1 konsenzus sekvenca iz kappa grupe sastoji se od SGGYYWXi(SEQ ID NO:129) gde Xije odabrano od S ili T. CDRH1 konsenzus sekvenca iz lambda grupe 1 sastoji se od XiX2SMN (SEQ ID NO:131) gde Xije odabrano od S ili T i X2je odabrano od Y ili F. CDRH1 konsenzus sekvenca iz lambda grupe 2 sastoji se od SYXiMH (SEOJD NO:130), u kojem Xije odabrano od G ili A.
[0082]CDRH2 konsenzus sekvenca iz kapa grupe sastoji se od XilX2YSGX3X4YYNPSLKS (SEQ ID NO:132) gde Xije odabrano od Y ili H; X2je odabrano od Y ili H; X3je odabrano od S ili N i X4je odabrano od T ili S. Konsenzus sekvenca iz lambda grupe 1 sastoji se od YISSXiSSTX2YX3ADSVKG (SEOJD NO:134) gde Xije odabrano od R ili S, X2je odabrano od I ili R, X3je odabrano od I, H ili Y. Konsenzus sekvenca iz lambda grupe 2 sastoji se od VISXiDGSX2KYYADSVKG (SEQ ID NO:133) gde Xije F ili H i X2je LiliT. CDRH2 konsenzus sekvenca iz lambda grupe 3 sastoji se od VIWYDGSNXiYYADSVKG (SEQ ID NO:135) gde Xije odabrano od K ili E.
[0083]CDRH3 konsenzus sekvenca iz kapa grupe sastoji se od XiRGX2YYGMDV (SEQ ID NO:136) gde Xi je odabrano od N ili D i X2 je odabrano od H, Y ili F. CDRH3 konsenzus sekvenca iz lambda grupe 1 sastoji se od RIAAAGXiX2X3YYYAX4DV (SEQ ID NO:137) gde Xije odabrano od G ili P; X2je odabrano od F ili W; X3je odabrano od H ili G i X4 je odabrano od L i M. CDRH3 konsenzus sekvenca iz lambda grupe 3 sastoji se od DRGYXiSSWYPDAFDI (SEQ ID NO:138) gde Xije odabrano od S ili T.
Monoklonalna antitela
[0084]Antigen vezujući proteini koji su obezbeđeni uključuju monoklonalna antitela koja se vezuju za IL-23. Monoklonalna antitela mogu se proizvesti korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci, npr., imortalizovanjem ćelija slezine sakupljenih sa transgenih životinja nakon završenog rasporeda imunizacije. Ćelije slezine mogu se imortalizovati korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci, npr., njihovim fuzionisanjem sa ćelijama mijeloma radi proizvodnje hibridoma. Mijeloma ćelije za upotrebu u fuzionim procedurama za proizvodnju hibridoma poželjno ne proizvode antitela, imaju visoku fuzionu efikasnost, i enzimksu deficijencij koja ih čini nesposobnim za rast u određeno selektivnim medijima koji podržavaju rast samo željenih fuzionisanih ćelija (hibridoma). Primeri pogodnih ćelijskih linija za upotrebu in mišjim fuzijama uključuju Sp-20, P3-X63/Ag8, P3-X63-Ag8.653, NSl/l.Ag4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 i S194/5XXO Bul; primeri korišćenih ćelijskih linija u pacovskoj fuziji uključuju R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F i 4B210. Ostale ćelijske linije korisne za ćelijske fuzije su U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 i UC729-6.
[0085]U nekim slučajevima, ćelijska linija hibridoma proizvedena je imunizovanjem životinje (npr., transgena životinja koja ima humane imunoglobulinske sekvence) sa IL-23 imunogenom; sakupljanjem ćelija slezine iz imunizovane životinje; fuzionisanjem sakupljenih ćelija slezine u mijeloma ćelijskoj liniji, čime se generišu ćelije hibridoma; utvrđivanjem hibridoma ćelijske linije iz ćelija hibridoma, i identifikovanjem hibridoma ćelijske linije koja proizvodi antitelo koje vezuje neki IL-23 polipeptid štedeći IL-12. Takve hibridoma ćelijske linije, i anti-IL-23 monoklonalna antitela proizvedena od strane njih, predstavljaju aspekte ovog otkrića.
[0086]Monoklonalna antitela koja se luče od strane hibridoma ćelijske linije mogu se prečistiti korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci. Hibridoma ili mAbs može biti dalje skrinovan kako bi se identifikovao mAbs sa određenim osobinama, kao što su sposobnost da inhibira IL-23-indukovanu aktivnost.
Himerna i humanizovana antitela
[0087]Ovde su takođe obezbeđena himerna i humanizovana antitela bazirana na prethodno pomenutim sekvencama. Monoklonalna antitela za upotrebu kao terapeutski agensi mogu se mofidikovati na razne načine pre upotrebe. Jedan primer je himerno antitelo, koje je antitelo sastavljeno od proteinskih segmenata iz različitih antitela koja su kovalentno združena kako bi proizvela funkcionalne imunoglobulinske lake ili teške lance ili njihove imunološki funkcionalne delove. Generalno, deo teškog lanca i/ili lakog lanca je identičan ili homologan odgovarajućoj sekvenci u antitelima izvedenim iz određenih vrsta ili pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je/su preostao lanac(nci) identični sa ili homologni odgovarajućoj sekvenci u antitelima izvedenim iz druge vrste ili pripada drugoj klasi ili podklasi antitela. Za postupke povezane sa himernim antitelima, videti, na primer, US Patent Br. 4,816,567; i Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855. CDR kalmljenje je opisano, na primer, u US Patentima Br. 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089, i 5,530,101.
[0088]Jedan korisni tip himernog antitela je "humanizovano" antitelo. Generalno, humanizovano antitelo je proizvedeno iz monoklonalnog antitela uzgajanog inicijalno u ne-humanoj životinji. Određeni ostaci amino kiselina u ovom monoklonalnom antitelu, tipično od delova antitela koji ne prepoznaju antigen, mofidikovani su kako bi bili homologni odgovarajućim ostacima u humanom antitelu odgovarajućeg izotipa. Humanizacija se može izvesti, na primer, korišćenjem raznih postupaka supstiuisanjem najmanje dela pacovskog varijabilnog regiona za odgovarajuće regione humanog antitela
(videti, npr., US Patente Br. 5,585,089, i Br. 5,693,762; Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-27; Verhoeven et al., 1988, Science 239:1534-1536),
[0089]U određenim ostvarenjima, konstantni regioni iz vrsta koje nisu ljudi mogu se primeniti zajedno sa humanim varijabilnim regionom(ima) radi proizvodnje hibridnih antitela.
Potpuno humana antitela
[0090]Takođe su obezbeđena potpuno humana antitela. Dostupni su postupci za pravljenje potpuno humanih antitela specifična za dati antigen bez izlaganja ljudskih bića antigenu ("potpuno humana antitela"). Jedno specifično sredstvo obezbeđeno za implementiranje proizvodnje potpuno humanih antitela je "humanizacija" mišjeg humoralnog imunog sistema. Uvođenje humanih imunoglobulinskih (Ig) lokusa u miševe u kojima su endogeni Ig geni inaktivirani j jedano od stredstava proizvodnje potpuno humanih monoklonalnih antitela (mAbs) u mišu, životinji koja se može imunizovati bilo kojim željenim antigenom. Korišćenjem potpuno humanih antitela može da minimizira imunogenske i alergijske odgovore koji su ponekad izazvani davanjem mišjih ili iz miševa izvedenih mAbs ljudima kao terapeutski agensi.
[0091]Potpuno humana antitela mogu se proizvesti imunizovanjem transgenih životinja (obično miševa) koji mogu da proizvedu repertoar humanih antitela u odsustvu endogene imunoglobulinske proizvodnje. Antigeni za ovu svrhu tipično imaju šest ili više susednih amino kiselina, i opciono su konjugovane u nosaču, kao što je hapten. Videti, npr., Jakobovits et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258; i Bruggermann et al., 1993, Year in Immunol. 7:33. U jednom primeru ovakvog postupka, transgene životinje proizvedene su onesposobljavanjem endogenog mišje imunoglobulinskog lokusa koji kodira mišje teške i lake imunoglobulinske lance u njima, i umetanjem u mišji genom velikih fragmenata humanog genoma DNK koji sadrži lokus koji kodira proteine humanog teškog i lakog lanca. Delimično mofidikovane životinje, koje imaju manje od potpunog komplementa humanog imunoglobulinskog lokusa, zatim su ukrštane kako bi se dobila životinja koja ima sve od poželjnih modifikacija imunog sistema. Kada se daje neki imunogen, ove transgene životinje proizvode antitela koja su imunospecifična za taj imunogen, ali imaju humane pre nego murinske amino kiselinske sekvence, uključujući varijabilne regione. Za dodatne detalje ovakvih postupaka, videti, na primer, WIPO patentne publikacije VV096/33735 i WO94/02602. Dodatni postupci povezani sa transgenim miševima za izradu humanih antitela opisani su u US Patentima Br. 5,545,807; 6,713,610; 6,673,986; 6,162,963; 5,545,807; 6,300,129; 6,255,458; 5,877,397; 5,874,299 i 5,545,806; u WIPO patentnim publikacijama VVO91/10741, VVO90/04036, i u EP 546073B1 i EP 546073A1.
[0092]Transgeni miševi opisani gore sadrže humani imunoglobulinski genski minilokus koji kodira nepreraspoređene humane imunoglobulinske sekvence teškog ([mu] i [gama]) i [kappa] lakog lanca, zajedno sa ciljanim mutacijama koje inaktiviraju endogeni lokus [mu] i [kappa] lanca (Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859). Na taj način, miševi pokazuju redukovanu ekspresiju mišjeg IgM ili [kappa] i u odgovoru na imunizaciju, a uvedeni humani transgeni teškog i lakog lanca prolaze zamenu klasa i somatsku mutaciju radi generisanja humanih IgG [kappa] monoklonalnih antitela visokog afiniteta (Lonberget al., gore naveden. ;Lonberg i Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93; Harding i Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546). Pripremanje takvih miševa opisano je detaljnije u Tavlor et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen et al., 1993, International Immunologv 5:647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859; Lonberg, 1994, Handbook of Exp. Pharmacologv 113:49-101; Tavlor et al., 1994, International Immunologv 6:579-591; Lonberg and Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; Harding and Lonberg, 1995, Ann. N.Y Acad. Sci. 764:536-546; Fishwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14:845-85. Dodatno pogledati Američki patent Br. 5,545,806; Br. 5,569,825; Br. 5,625,126; Br. 5,633,425; Br. 5,789,650; Br. 5,877,397; Br. 5,661,016; Br. 5,814,318; Br. 5,874,299; i Br. 5,770,429; kao i Američki patent Br. 5,545,807; WIPO publikacije Br. WO 93/1227; WO 92/22646; i WO 92/03918. Tehnologije upotrebljene za proizvodnju humanih antitela u ovim transgenim miševima opisane se takođe u WIPO Publikaciji Br. WO 98/24893, i Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156. Na primer, sojevi HCo7 i HCol2 transgenih miševa mogu se primeniti za generisanje anti-IL-23 antitela.
[0093]Korišćenjem hibridom tehnologije, antigen-specifični humani mAbs sa poželjnom specifičnošću mogu se proizvesti i odabrati od transgenih miševa kao što su oni opisani gore. Takva antitela mogu se klonirati i eksprimirati korišćenjem pogodnog vektora i ćelije domaćina, ili se antitela mogu sakupiti iz kultivisanih hibridoma ćelija.
[0094]Potpuno humana antitela mogu takođe biti izvedena iz biblioteka fag-prikaza (kao što su opisani u Hoogenboom et al., 1991, J. Mol. Biol. 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581; WIPO publikacije Br. WO 99/10494). Tehnike Fag-prikaza imitiraju imuni odabir kroz prikaz repertoara antitela na površini filamentoznih bakteriofaga, i naknadnim odabirom faga njihovim vezivanjem za odabrani antigen.
Bispecifični ili bifunkcionalni antigen vezujući proteini
[0095]A "bispecifični," "dvostruko-specifični" ili "bifunkcionalni" antigen vezujući protein ili antitelo je hibrid antigen vezujući protein ili antitelo, respektivno, koji ima dva različiti mesta antigen vezivanja, kao što su jedan ili više CDR ili jedan ili više varijabilnih regiona kako je opisano gore. U nekim slučajevima oni su veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teški/laki lanac i dva različita mesta vezivanja. Multispecifični antigen vezujući protein ili "multispecifično antitelo" je ono koje cilja više od jednog antigena ili epitopa. Bispecifični antigen vezujući proteini i antitela su vrste multispecifičnog antigen vezujućeg proteinskog antitela i mogu se proizvesti raznim postupcima uključujući, ali neograničavajući se, fuziju hibridoma ili povezivanje Fab' fragmenata. Videti, npr., Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321; Kostelnv et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553.
Imunološki fragmenti
[0096]Antigen vezujući proteini takođe uključuju imunološke fragmente antitela (npr., Fab, Fab', F(ab'h, ili scFv). "Fab fragment" je sastavljen od jednog lakog lanca (varijabilni region lakog lanca (Vl) i njegovog odgovarajućeg konstantnog domena (Cl)) i jednog teškog lanca (varijabilni region teškog lanca (VH) i prvi konstantan domen (ChI)). Teški lanac Fab molekula ne može da obrazuje disulfidnu vezu sa još jednim molekulom teškog lanca. "Fab' fragment" sadrži jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji takođe sadrži region između ChI i Ch2 domena, tako da se može obrazovati međulančana disulfidna veza između dva teška lanca dva Fab' fragmenta radi obrazovanja F(ab'h molekula. "Ffab'h fragment" je prema tome sastavljen od dva Fab' fragmenta koji se drže zajedno disulfidnom vezom između dva teška lanca. "Fv fragment" sastoji se od jednokrakih antitela varijabilnog regiona lakon lanca i varijabilnog regiona teškog lanca. Jednolančana antitela "scFv" su Fv molekuli u kojima su varijabilni regioni teških i lakih lanaca povezani fleksibilnim veznikom radi obrazovanja jednog polipeptidnog lanca, koji formira region antigen vezivanja. Jednolančana antitela opisana su detaljnije u WIPO Publikaciji Br. WO 88/01649, U.S. Patentu Br. 4,946,778 i Br. 5,260,203; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-387; Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108 i Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40. "Fc" region sadrži dva fragmenta teškog lanca koji obuhvataju ChI i Ch2 domene antitela. Dva fragmenta teškog lanca drže se zajedno sa dve ili više disulfidnih veza i hidrofobnim interakcijama Ch3 domena.
[0097]Takođe su uključena domenska antitela, imunološki funkcionalni imunoglobulinski fragmenti koji sadrže samo varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više Vhregiona kovalentno su spojeni peptidnim veznikom radi stvaranja bivalentnog domenskog antitela. Dva VHregiona bivalentog domenskog antitela može da cilja iste ili različite antigene. Dijatela su bivalentna antitela koja obuhvataju dva polipeptidna lanca, u kojem svaki polipeptidni lanac obuhvata Vhi Vldomene spojene veznikom koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, čime se omogućava da se svaki domen upari sa complementarnim domenom na drugom polipeptidnom lancu (videti, npr., Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-48, 1993 i Poljak et al., Structure 2:1121-23,1994). Slično, tritela i tetratela su antitela koja obuhvataju tri i četiri polipeptidna lanca, respektivno, i obrazuju tri i četiri mesta antigen vezivanja, respektivno, koja mogu biti ista ili različita. Maksitela obuhvataju bivalentne scFvs kovalentno prikačene za Fc region IgGi, (videti, npr., Fredericks et al, 2004, Protein Engineering, Design & Selection, 17:95-106; Powers et al., 2001, Journal of immunological methods, 251:123-135; Shu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7995-7999; Havden et al., 1994, Therapeutic Immunologv 1:3-15).
Razni drugi oblici
[0098]Takođe su obezbeđeni varijantni oblici antigen vezujućih proteina koji su ovde opisani, pri čemu neki od antigen vezujućih proteina imaju, na primer, jednu ili više konzervativnnih supstitucija amino
kiselina u jednom ili više od teških ili lakih lanaca,varijabilnih regiona ili CDR navedeni u TABELAMA 1 i 2.
[0099]Prirodne amino kiseline mogu se podeliti na klase na osnovu sličnih karakteristika bočnog lanca: hidrofobna (norleukin, Met, Ala, Val, Leu, Ile); neutralno hidrofilna (Cys, Ser, Thr, Asn, Gln); kiselia (Asp, Glu); bazna (His, Lvs, Arg); ostaci koji utuču na orijentaciju lanca (Gly, Pro); i aromatična (Trp, Tyr, Phe).
[0100]Konzervativne supstitucije amino kiselina mogu da uključe zamenu člana jedne od ovih klasa sa još jednim članom iste klase. Konzervativne supstitucije amino kiselina mogu da obuhvate ne-prirodne amino kiselinski ostaci, koje su tipično inkorporirane hemijskom sintezomn peptida pre nego sintezom u biološkim sistemima. One uključuju peptidomimetike i druge obrnute ili invertne oblike delova amino kiselina. Takve suštinske modifikacije u funkcionalnim i/ili biohemijskim karakteristikama antigen vezujućih proteina koji su opisani ovde, može se postići stvaranjem supstitucija u amino kiselinskoj sekvenci teških i lakih lanaca koji se razlikuju značajno u svom efektu u održavanju (a) strukture molekularne kičme u površini supstitucije, na primer, kao listasta ili helikoidna konformacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobičnosti molekula na ciljanom mestu, ili (c) masivnosti bočnog lanca.
[0101]Ne-konzervativne supstitucije mogu da uključe zamenu člana jedne od gornjih klasa sa članom druge klase. Takvi supstituisani ostaci mogu se uvesti u regione antitela koji su homologni sa humanim antitelima, ili u ne-homologone regione molekula.
[0102]U izvođenju takih promena, u skladu sa određenim ostvarenjima, može se uzeti u obzir hidropatski indeks amino kiselina. Hidropatski profil proteina izračunat je dodeljivanjem numeričke vrednosti ("hidropatski indeks") svakoj amino kiselini, a zatim uprosečavanjem ovih vrednosti u više navrata duž peptidnog lanca. Svakoj amino kiselini je dodeljen hidropatski indeks na osnovu njenih karakteristika hidrofobičnosti i naelektrisanja. One su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistin (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9); i arginin (-4.5).
[0103]Značaj hidropatskog profila u dodeljivanju interaktivne biološke funkcije proteinu podrazumeva se u struci (videti, npr., Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131). Poznato je da se određene amino kiseline mogu supstituisati za druge amino kiseline koji imaju slični hidropatski indeks ili rezultat, a da i dalje zadrže sličnu biološku aktivnost. U pravljenju razlike na osnovu hidropatskog indeksa, u određenim ostvarenjima, uključena je supstitucija amino kiselina čiji su hidropatski indeksi unutar +2. U nekim aspektima, uključene su one koje su unutar ±1, a u drugim aspektima, uključene su one unutar ±0.5.
[0104]Takođe se podrazumeva u struci da se supstitucija sličnih amino kiselina može izvesti efektivno na bazi hidrofilnosti, naročito ako je biološki funkcionalni protein ili peptid u njemu kreiran namenjen za upotrebu u imunološkim ostvarenjima, kao što j u ovom slučaju. U određenim ostvarenjima, najveća lokalna hidrofilnost proteina, koja se vodi hidrofilnosti susednih amino kiselina, u korelaciji je sa njenim imunogenim i antigen vezivanjem ili imunogenosti, to jest, biološkim svojstvom proteina.
[0105]Sedeće hidrofilne vrednosti dodeljene su ovim ostacima amino kiselina: arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0+1); glutamat (+3.0±1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.5±1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucin (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5) i triptofan (-3.4). U izvođenju izmena na osnovu sličnih hidrofilnih vrednosti, u određenim ostvarenjima, uključena je supstitucija amino kiselina čije su hidrofilne vrednosti unutar ±2, u drugim ostvarenjima, uključene su one koje su unutar ±1, i u daljim ostvarenjima, uključene su one unutar ±0.5. U nekim slučajevima, jedna takođe može identifikovati epitope iz primarnih amino kiselinskih sekvenci na osnovu hidrofilnosti. Ovi regioni se takođe nazivaju " regioni epitopnog jezgra."
[0106]Primerne konzervativne supstitucije amino kiselina navedene su u TABELI 4.
[0107]Stručnjak će moći da odredi pogodne varijante polipeptida kakvi su ovde navedeni korišćenjem dobro poznatih tehnika. Stručnjak može identifikovati pogodne površine molekula koje se mohu promeniti bez uništavanja aktivnosti ciljanjem regiona za koje se veruje da su važni za tu aktivnost. Stručnjak će takođe moći da identifikuje ostatke i delove molekula koji su konzervirani među sličnim polipeptidima. U daljim ostvarenjima, Čak i površine koje mogu biti važne za biološku aktivnost ili za struktur mogu biti podvrgnute konzervativnim supstitucijama amino kiselina bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez štetnog uticaja na polipeptidnu strukturu.
[0108]Dodatno, stručnjak može pregledati ispitivanja struktrua-funkcija identifikujući ostatke u sličnim polipeptidima koji su bitni za aktivnost ili strukturu. U pogledu takvog upoređivanja, može se predvideti značaj ostataka amino kiselina u proteinu koji odgovaraju ostacima amino kiselina koji su bitni za aktivnost ili strukturu kod sličnih proteina. Stručnjak može izabrati hemijski slične amino kiselinske supstitucije za takve važne predviđene ostatke amino kiselina.
[0109]Stručnjak takođe može izanalizirati 3-dimenzionalnu strukturu i amino kiselinsku sekvencu u odnosu na strukturu kod sličnih polipeptida. U pogledu takve informacije, stručnjak može da predvidi usklađivanje ostataka amino kiselina nekog antitela u odnosu na njegovu trodimenzionalnu strukturu. Stručnjak može da izabere da ne pravi radikalne promene na ostacima amino kiselina koje su predviđene da budu na površini proteina, budući da takvi ostaci mogu biti uključeni u bitne interakcije sa drugim molekulima. Štaviše, stručnjak može generisati test varijante koje sadrže jednu amino kiselinsku supstituciju na svakom poželjnom amino kiselinskom ostatku. Ove varijante se mogu skrinovati korišćenjem ogleda za IL-23 aktivnost, (videti primere ispod) čime se dobija informacija u pogledu koje amino kiseline se mogu promeniti, a koje se ne smeju promeniti. Drugim rečima, na osnovu informacija skupljenih iz takvih rutinskih eksperimenata, stručnjak lako može da odredi amino kiselinske položaje u kojima bi se dalje supstitucije trebalo izbegavati bilo same ili u kombinaciji sa svojim ostalim mutacijama.
[0110]Brojne naučne publikacije posvećene su predviđanju sekundarne strukture. Videti, Moult, 1996, Curr. Op. in Biotech. 7:422-427; Chou et al., 1974, Biochem. 13:222-245; Chou et al., 1974, Biochemistrv 113:211-222; Chou et al., 1978, Adv. Enzvmol. Relat. Areas Mol. Biol. 47:45-148; Chou et al., 1979, Ann. Rev. Biochem. 47:251-276; i Chou et al., 1979, Biophvs. J. 26:367-384. Štaviše, trenutno su dostupni komjuterski programi koji mogu da asistiraju u predviđanju sekundarne strukture. Jedan postupak predviđanja sekundarne strukture baziranje na homolognom modelovanju. Na primer, dva polipeptida ili proteina koji imaju sekvencioni identitet veći od 30%, ili sličnost veću od 40% često imaju slične strukturalne topologije. Skorašnji porast proteinske strukturalne baze podataka (PDB) obezbedio je pojačanu predvidljivost sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj savijanja unutar polipeptidne ili proteinske strukture. Videti, Holm etal., 1999, Nucl. Acid. Res. 27:244-247. Predloženo je (Brenneret al., 1997, Curr. Op. Struct. Biol. 7:369-376) da postoji ograničen broj savijanja u datom polipeptidu ili
proteinu i da kada se razreši kritičan broj struktura, strukturalno predviđanje će postati značajno tačnije.
[0111]Dodatni postupci predviđanja sekundarne strukture uključuju "nizanje" (Jones, 1997, Curr. Opin. Struct. Biol. 7:377-387; Sippl et al., 1996, Struktura 4:15-19), "analizu profila" (Bowie et al., 1991, Science 253:164-170; Gribskov et al., 1990, Meth. Enzym. 183:146-159; Gribskov et al., 1987, Proc. Nat. Acad. Sci. 84:4355-4358), i "evolucionarno povezivanje" (Videti, Holm, 1999,gore naveden;i Brenner, 1997,
gore naveden).
[0112]U nekim ostvarenjima, amino kiselinske supstitucije izrađene su tako da: (1) redukuju osetljivost na proteolizu, (2) redukuju osetljivost na oksidaciju, (3) menjaju afinitet vezivanja radi formiranja proteinskih kompleksa, (4) menjaju afinitete vezivanja liganda ili antigena, i/ili (4) dodeljuju ili modifikuju druge fizikohemijske ili funkcionalne karakteristike na takvim polipeptidima, kao što je održavanje strukture molekularne kičme u području supstitucije, na primer, kao listasta ili helikoidna konformacija; održavanje ili menjanje naelektrisanja ili hidrofobičnosti molekula na ciljanom mestu, ili održavanje ili menjanje masivnosti bočnog lanca.
[0113]Na primer, pojedinačne ili višestruke amino kiselinske supstitucije (u određenim ostvarenjima, konzervativne supstitucije amino kiselina) mogu se izvesti u prirodnoj sekvenci. Supstitucije se mogu izvesti u onom delu antitela koje leži izvan domena(a) koji obrazuje intermolekularne kontakte). U takvim ostvarenjima, konzervativne supstitucije amino kiselina mogu se koristiti da suštinski ne promene strukturalne karakteristike roditeljske sekvence (npr., jedna ili više zamena amino kiselina koje ne utiču na sekundarnu strukturu koja karakteriše roditeljski ili nativni antigen vezujući protein). Primeri u struci poznatih polipeptidnih sekundarnih i tercijarnih struktura opisani su Proteins, Strukturas i Molecular Principles (Crosamon, Ed.), 1984, W. H. New York: Freeman i Companv; Introduction to Protein Struktura (Branden i Tooze, eds.), 1991, New York: Garli Publishing; i Thornton et al., 1991, Nature 354:105.
[0114]Dodatne varijante uključuju cisteinske varijante gde su jedan ili više cisteinskih ostataka roditeljskoj ili nativnoj amino kiselinskoj sekvenci obrisani iz ili supstituisani sa drugom amino kiselinom (npr., serin). Cisteinske varijante su korisne,interaliakada je potrebno da se antitela (na primer) ponovo saviju u biološki aktivnu konfortaciju. Cisteinske varijante mogu imati manje cisteinskih ostataka od nativnog proteina, i tipično imaju isti broj kako bi se minimizirale interakcije koje su rezultat neuparenih cisteina.
[0115]Varijabilni region teškog i lakog lanca i CDR koji su ovde opisani mogu se primeniti za pripremu antigen vezujućih proteina koji sadrže region vezivanja antigena koji može da se specifično veže za IL-23 polipeptid. "Region vezivanja antigena" označava protein, ili deo proteina, koji specifično vezuje specificiran antigen, kao što je region koji sadrži ostatke amino kiselina koje ulaze u interakciju sa antigenom i dodeljuju antigen vezujućem proteinu njegovu specifičnost i afinitet za ciljni antigen. Region vezivanja antigena može da uključi jedan ili više CDR, a određeni regioni vezivanja antigena takođe uključuju jedan ili više regiona "okvira". Na primer, jedan ili više CDR navedeni u TABELI 3 mogu biti inkorporirani u molekul( npr.,polipeptid) kovalentno ili nekovalentno kako bi se izvela imunoadhezija. Imunoadhezija može inkorporirati CDR(ove) kao deo većeg polipeptidnog lanca, može kovalentno povezati CDR(ove) sa drugim polipeptidnim lancem, ili može inkorporirati CDR(ove) nekovalentno. CDR(ovi) pmogućavaju da se imunoadhezija veže specifično za određeni antigen od interesa (npr., IL-23 polipeptid).
[0116]Drugi antigen vezujući proteini uključuju mimetike (npr., "peptidne mimetike" ili "peptidomimetike") na osnovu varijabilnih regiona i CDR koji su ovde opisani. Ovi analozi mogu biti peptidi, ne-peptidi ili kombinacije regiona peptida i ne-peptida. Fauchere, 1986, Adv. Drug Res. 15:29; Veber i Freidinger, 1985, TINS p. 392; i Evans et al., 1987, J. Med. Chem. 30:1229. Peptidni mimetici koji su strukturalno slični terapeutski korisnim peptidima mogu se koristiti za proizvodnju sličnog terapeutskog ili profilaktičkog efekta. Takva jedinjenja često se razvija pomoću kompujterizovanog molekularnog modelovanja. Generalno, peptidomimetici su proteini koji su strukturalno sličnni antigen vezujućem proteinu koji prikazuje željenu biološku aktivnost, kao što je sposobnost da veže IL-23, a peptidomimetici imaju jednu ili više peptidnih veza opciono zamnjenih vezom odabranom od, na primer: -CH2NH-, -CH2S-, -CH2-CH2-, -CH-CH-(cis i trans), -COCH2-, -CH(OH)CH2-, i -CH2SO-, postupcima dobro poznatim u struci. Sistematična supstitucija jedne ili više amino kiselina konsenzus sekvence sa D-amino kiselinom istog tipa (npr., D-lizin umesto L-lizina) može se primeniti u određenim ostvarenjima radi generisanja stabilnijih proteina. Pored toga, ograničeni peptidi koji obuhvataju konsenzus sekvencu ili suštinski identičnu varijantu konsenzus sekvence, mogu se generisati postupcima poznatim u struci (Rizo i Gierasch, 1992, Ann. Rev. Biochem. 61:387), na primer, dodavanjem internih cisteinskih ostataka sposobnih za obrazovanje intramolekularnih disulfidnih mostova koji ciklišu peptid.
[0117]Ovde su takođe obezbeđeni derivati antigen vezujućih proteina koji su ovde opisani. Derivatizovani antigen vezujući proteini mogu da obuhvate bilo koji molekul ili supstancu koja daje želejnu karakteristiku antigen vezujućem proteinu ili fragmentu, kao što je povećan polu-život u određenoj primeni. Derivatizovani antigen vezujući protein može da obuhvata, na primer, detektujući (ili obeležavajući) deo( npr.,radioaktivni, kolorimetrični, antigenski ili enizmatični molekul, detektujuću perlu (kao što su magnetna ili elektrodensna( npr.,zlatna) perla), ili molekul koji se vezuje za drugi molekul( npr.,biotin ili streptavidin)), terapeutski ili diagnostički deo( npr.,radioaktivni, citotoksični, ili farmaceutski aktivan deo), ili molekul koji povećava pogodnost antigen vezujućeg proteina za određenu primenu( npr.,davanje subjektu, kao što je humani subjekt, ili drugein vivoiliin vitroupotrebe). Primeri molekula koji se mogu primeniti za derivatizovanje antigen vezujućeg proteina uključuju albumin (npr., albunim u humanom serumu) i polietilene glikol (PEG). Albumin-povezani i PEGilovani derivati antigen vezujućih proteina mogu se pripremiti korišćenjem tehnika dobro poznatim u struci. U jednom ostvarenju, antigen vezujući protein je konjugovan ili drugačije povezan za transtiretin (TTR) ili varijantu TTR. TTR ili TTR varijanta mogu biti hemijski mofidikovane sa, na primer, hemijski odabrani iz grupe koju čine dekstran, poli(n-vinil pirolidon), polietilen glikoli, propropilen glikol homopolimeri, polipropilen oksid/etilen oksid ko-polimeri, polioksietilisani polioli i polivinil alkoholi.
[0118]Drugi derivati uključuju kovalentne ili agregativne konjugate IL-23 antigen vezujućih proteina sa drugim proteinima ili polipeptidima, kao što su ekspresijom rekombinantno fuzionih proteina koji obuhvataju heterologne polipeptide fuzionisane za N-terminus ili C-terminus IL-23 antigen vezujućeg proteina. Na primer, konjugovani peptid može biti heterologni signalni (ili vodeći) polipeptid, npr., alfa-faktor lider kvasca, ili peptid kao što je neka epitopska oznaka. Fuzioni proteini koji sadrže IL-23 antigen vezujući protein mogu da obuhvataju peptide dodate radi olakšanja prečišćavanja ili identifikacije IL-23 antigen vezujućeg proteina (npr., poli-His). IL-23 antigen vezujući protein takođe može biti povezan sa FLAG peptidom kako je opisano u Hopp et al., 1988, Bio/Technologv 6:1204; i US Patentu Br. 5,011,912. FLAG peptid je veoma antigen i obezbeđuje epitop reverzibilno vezan specifičnim monoklonalnim antitelom (mAb), omogućavajući rapidni ogled i olakšavajući prečišćavanje eksprimiranog rekombinantnog proteina. Reagensi korisni za pripremanje fuzionih proteina u kojima je FLAG peptid fuzionisan za dati polipeptid komercijalno su dostupni (Sigma, St. Louis, MO).
[0119]Oligomeri koji sadrže jedan ili više IL-23 antigen vezujućih proteina može biti uposlen kao IL-23 antagonisti. Oligomeri mogu biti u obliku kovalentno-povezanih ili ne-kovalentno-povezanih dimera, trimera, ili viših oligomera. Oligomeri koji obuhvataju dva ili više IL-23 antigen vezujućih proteina predviđeni su za upotrebu, od kojih jedan primer predstavlja homodimer. Drugi oligomeri uključuju heterodimere, homotrimere, heterotrimere, homotetramere, heterotetramere, itd. Takođe su uključeni oligomeri koji obuhvataju više IL-23-vezujućih proteinaspojenih putemkovalentnih ili ne-kovalentnih interakcija između peptidni delova fuzionisanih za IL-23 antigen vezujuće proteine. Takvi peptidi mogu biti peptidni veznici (razmaknice), ili peptidi koji imaju karakteristiku promovisanja oligomerizacije. Među pogodnim peptidnim veznicima su oni opisani u US Patentu Br. 4,751,180 i 4,935,233. Leucinski zatvarači i određeni polipeptidi izvedeni antitela su među peptidima koji mogu da promovišu oligomerizaciju IL-23 antigen vezujući proteina prikačenih za njih. Primeri domena leucinskog zatvarača pogodni za proizvodnju rastvorljivih oligomernih proteina opisani su in WIPO Publikaciji Br. WO 94/10308; Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191; i Fanslovv et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-278. U jednom pristupu, rekombinantno fuzioni proteini koji obuhvataju neki fragment IL-23 antigen vezujućeg proteina ili derivat fuzionisan za peptidni leucinski zatvarač, eksprimirani su u pogodnim ćelijama domaćina, a rastvorljivi oligomerni fragmenti IL-23 antigen vezujućeg proteina ili derivati koji se obrazuzjz, dobijeni su iz supernatant kulture.
[0120]Takvi oligomeri mogu da obuhvataju od dva to četiri IL-23 antigen vezujuća proteina. Delovi IL-23 antigen vezujućeg proteina oligomera mogu biti u bilo kom gore obisanom obliku, npr., varijantama ili fragmentima. Poželjno, oligomeri obuhvataju IL-23 antigen vezujuće proteine koji imaju IL-23 vezujuću aktivnost. Oligomeri se mogu pripremiti korišćenjem polipeptida izvedenih iz imunoglobulina. Priprema fuzionih proteina koji obuhvataju određene heterologne polipeptide fuzionisane za razne delove polipeptida izvedenih iz antitela (uključujući Fc domen), opisana je, npr., od strane Ashkenazi et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; i Hollenbaugh et al., 1992 " Konstruktion of Immunoglobulin Fusion Proteins ", u Current Protocols in Immunologv, Suppl.4, strane 10.19.1-10.19.11.
[0121]Takođe su uključeni dimeri koji obuhvataju dva fuziona proteina izrađena fuzionisanjem nekog IL-23 antigen vezujućeg proteina za Fc region antitela. Dimer može biti izrađen pomoću, na primer, umetanjem fuzionoggena koji kodira fuzioni protein u pogodan ekspresioni vektor, eksprimirajući fuzioni gen u ćelijama domaćina transformirane sa rekombinantno ekspresiionim vektorom, i omogućavajući da eksprimirani fuzioni protein da sakupi slično kao molekuli antitela, posle čega se obrazuju interlančane disulfidne veze između Fc delova kako bi dale dimer. Takvi Fc polipeptidi uključuju nativne i muteinske oblike polipeptida izvedenih iz Fc region antitela. Skraćeni oblici takvih polipeptida koji sadrže šarkasti region koji promoviše dimerizaciju, takođe su uključeni. Fuzioni proteini koji obuhvataju Fc delove (i oligomere obrazovane od njih) obezbeđuju prednost lakšeg prečišćavanja afinitetnom hromatografijom preko Protein A ili Protein G kolona. Jedan pogodan Fc polipeptid, opisan u WIPO Publikaciji Br. WO 93/10151 i US Patentu Br. 5,426,048 i 5,262,522, je jednolančani polipeptid koji se pruža od N-terminalnog šarkastog regiona do nativnog C-terminusa Fc regiona humanog IgGl antitela. Još jedan koristan Fc polipeptid je Fc mutein opisan u US Patentu Br. 5,457,035, i u Baum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001. Amino kiselinska sekvenca ovog muteina je identična onoj nativnoj Fc sekvenci predstavljenoj u WIPO Publikaciji Br. WO 93/10151, osim što je amino kiselina 19 promenjena iz Leu u Ala, amino kiselina 20 je promenjena iz Leu u Glu, i amino kiselina 22 je promenjena iz Glv u Ala. Mutein pokazuje redukovan afinitet prema Fc receptorima.
Glikolizacija
[0122]Antigen vezujući protein može da ima glikolizacioni obrazac koji je različit ili izmenjen od onog koji se može naći kod nativnih vrsta. Kako je poznato u struci, glikolizacija obrasci mogu da zavise i od sekvence proteina (npr., prisustvo ili odsustvo određenih glikolizacionih ostataka amino kiselina, objašnjeno u nastavku), ili ćelije domaćina ili organizma u kjem se protein proizvodi. Određeni ekspresioni sistemi razmatrani su u nastavku.
[0123]Glikolizacija polipeptida tipično je bilo N-povezana ili O-povezana. N-povezana odnosi se na pričvršćivanje dela uglenog hidrata za bočni lanac asparaginskog ostatka. Tro-peptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde X je bilo koja amino kiselina osim prolina, predstavljaju sekvence prepoznavanja radi enizmatičnog pričvršćivanja dela uglenog hidrata za asparaginski bočni lanac. Prema tome, prisustvo bilo ovih tro-peptidnih sekvenci u polipeptidu, stvara potencijalno mesto glikolizacije. O-povezana glikolizacija odnosi se na pričvršćivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze, za hidroksiamino kiselinu, mnajčešće serin ili treonin, iako se mogu primeniti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.
[0124]Dodavanje mesta glikolizacije antigen vezujućem proteinu uobičajeno se postiže menjanjem amino kiselinske sekvence tako da ona sadrži jedan ili više od prethodno opisane tro-peptidne sekvence (za N-povezana glikolizaciona mesta). Menjanje se takođe može izvesti dodavanjem, ili supstituisanjem, jednog ili više serin ili treonin ostataka u početnoj sekvenci (za O-povezana glikolizaciona mesta). Jednostavnije, amino kiselinska sekvenca antigen vezujućeg proteina može se izmeniti izmenama na DNK nivou, naročito mutiranjem DNK koji kodira ciljani polipeptid na osnovu predselekcije tako da se generišu kodoni koji se prevode u željene amino kiseline.
[0125]Još jedan sredstvo povećavanja broja ugljenohidratnih delova na antigen vezujućem proteinu je himijskim ili enizmatičnim kuplovanjem glikozida za protein. Ove procedure su pogodne budući da ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji domaćinu koji ima glikolizacione sposobnosti za N- i O-povezanu glikolizacija. U zavisnosti od primenjenog postupka kuplovanja, šećer(i) može biti prikačen za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksil grupe, (c) slobodne sulfhidril grupe kao što su one od cisteina, (d) slobodne hidroksil grupe kao što su one od serina, treonina, ili hidroksiprolina, (e) aromatični ostaci kao što su oni od fenilalanina, tirozina, ili triptofana, ili (f) amidna grupa glutamina. Ovi postupci opisani su u PCT Publikaciji Br. WO 87/05330, i u Aplin i Wriston, 1981, CRC Crit. Rev, Biochem., str. 259-306.
[0126]Uklanjanje ugljeno hidratnih delova prisutnih u početnom antigen vezujućem proteinu može se sprovesti hemijski ili enizmatično. Hemijska deglikolizacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluorometansulfonske kiseline, ili nekom ekvivalentnom jedinjenju. Ovo tretiranje rezultita cepanjem većine ili svih šećera osim veznog šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), ostavljajući polipeptid intaktan. Hemijska deglikolizacija opisana je u Hakimuddin etal., 1987, Arch. Biochem. Biophvs. 259:52 i u Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. Enizmatično cepanje ugljeno hidratnih delova na polipeptidima može se postići upotrebom raznih endo- i ekso-glikolidaza kako je opisano u Thotakura et al., 1987, Meth. Enzvmol. 138:350. Glikolizacija na potencijalnim mestima glikolizacije može se sprečiti upotrebom jedinjenja tunikamicin kako je opisano u Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. Tunikamicin blokira formiranje veza protein-N-glikozid.
[0127]Stoga, aspekti uključuju glikolizacione varijante antigen vezujućih proteina gde je broj i/ili vrsta mesta(a) glikolizacije izmenjen u odnosu na amino kiselinske sekvence roditeljskog polipeptida. U određenim ostvarenjima, varijante antigen vezujućeg proteina obuhvataju veći ili manji broj N-povezanih glikolizacionih mesta od roditeljskog polipeptida. Supstitucije koje eliminišu ili menjaju ovu sekvencu sprečavaju dodavanje N-povezanog ugljeno hidratnog lanca prisutnog u roditeljskom polipeptidu. Na primer, glikolizacija se može redukovati brisanjem Asn ili supstituisanjem Asn sa različitom amino kiselinom. Antitela tipično imaju N-povezano glikolizaciono mesto u Fc regionu.
Obeleživači i grupe efektora
[0128]Antigen vezujući proteini mogu da obuhvataju jedan ili više obeleživači. Izraz "obeleživač" ili "grupa za obeležavanje" odnosi se na bilo koji obeleživač koji se može detektovati. Uopšteno, obeleživači spadaju u različite klase, u zavisnosti od ogleda u kojem treba da se detektuju: a) izotopni obeleživači, koji mogu biti radioaktivni ili teški izotopi; b) magnetni obeleživači (npr., magnetne čestice); c) redoks aktivni ostaci; d) optičke boje; enizmatične grupe (npr. peroksidaza rena, B-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza); e) biotinilovane grupe; i f) prethodno određeni polipeptidni epitop koji se prepoznaju sekundarnim reporterom (npr., par sekvence leucinskog zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni vezivanja metala, epitopne oznake, itd.). U nekim ostvarenjima, grupa za obeležavanje kuplovana je sa antigen vezujućim proteinomputemkraka za razmicanje raznih dužina radi redukovanja potencijalnog sternog ometanja. Razni postupci za obeležavanje proteina dorbo su poznati u struci. Primeri pogodnih grupa za obeležavanje uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide( npr.,3H, 14C,1<5>N, 35S,90Y, "Tc,<m>ln, 125l, 131l), fluorescentne grupe( npr.,FITC, rodamin, lantanid fosfori), enizmatične grupe( npr.,peroksidaza rena, B-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentne grupe, biotinilovane grupe, ili prethodno određeni polipeptidni epitop koji se prepoznaje sekundarnim reporterom( npr.,par sekvenci leucinskog zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni vezivanja metala, epitopne oznake). U nekim ostvarenjima, grupa za obeležavanje kuplovana je sa antigen vezujućim proteinomputemkraka za razmicanje raznih dužina radi redukovanja potencijalnog sternog ometanja. Razni postupci za obeležavanje proteina dorbo su poznati u struci i mogu se koristiti kao što je viđeno da je prikladno.
[0129]Izraz "grupa efektora" označava bilo koju grupu kuplovanu sa antigen vezujućim proteinom koja deluje kao citotoksičan agens. Primeri za pogodne grupe efektora su radioizotopi ili radionuklidi( npr.,3H,14C,15N,35S,9<0>Y, "Tc,<m>ln, 125l, 131l). Druge pogodne grupe uključuju toksine, terapeutske grupe, ili hemoterapeutske grupe. Primeri pogodnih grupa uključuju kaliheamicin, auristatine, geldanamicin i maitanzin. U nekim ostvarenjima, grupa efektora kuplovana je sa antigen vezujućim proteinomputemkraka za razmicanje radi redukovanja potencijalnog sternog ometanja.
Polinukleotidi koji kodiraju IL-23 antigen vezujuće proteine
[0130]Polinukleotidi koji kodiraju antigen vezujuće proteine ovde opisane, ili njihovi delovi, takođe su opisani i/ili zaštićeni uključujući polinukleotide koji kodiraju jedan ili oba lanca antitela, ili derivat fragmenta, derivat, mutein, ili njihovu varijantu, polinukleotide koji kodiraju varijabilne regione teškog lanca ili samo CDR, polinukleotide dovoljne za upotrebu kao hibridizacione probe, PCR primere ili sekvencione primere za identifikovanje, analiziranje, mutaciju ili pojačavanje polinukleotida koji kodira polipeptid, anti-senzitivne nukleinske kiseline za inhibiranje ekspresije polinukleotida, i complementarne sekvence napred navedenog. Polinukleotidi može biti bilo koje dužine. Oni mogu biti, na primer, 5,10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 85, 95,100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1,000,1,500, 3,000, 5,000 ili više nukleinskih kiselina u dužini, uključujući sve sve vrednosti između, i/ili mogu da obuhvate jednu ili više dodatnih sekvenci, na primer, regulatorne sekvence, i/ili da su deo većeg polinukleotida, na primer, vektora. Polinukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani i mogu da obuhvataju RNK i/ili DNK nukleinske kiseline i njihove veštačke varijante (npr., peptidne nukleinske kiseline).
[0131]Polinukleotidi koji kodiraju određene antigen vezujuće proteine, ili njihove delove (npr., antitelo pune dužine, teški ili laki lanac, varijabilni domen, ili CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, ili CDRL3) mogu se izolovati iz B-ćelija miševa koji su imunizovani sa IL-23 ili njegovim imunogenim fragmentom. Polinukleotid može biti izolovani konvencionalnim prostupcima kao što su reakcija polimerazna lančana reakcija (PCR). Prikaz faga je još jedan primer poznate tehnike kojima se derivati antitela i drugi antigen vezujući proteini mogu pripremiti. U jednom pristupu, polipeptidi koji su komponentne antigen vezujućeg proteina od interesa, eksprimirani su u bilo kom pogodnom rekombinantnom ekspresionom sistemu, a eksprimiranim polipeptidima je omogućeno da se okupe radi obrazovanja molekula antigen vezujućeg proteina. Prikaz faga se takođe primenjuje za izvođenje antigen vezujućih proteina koji imaju različita svojstva (tj., varirajuće afinitete za antigen za koji se vezuju) putem mešanja lanaca, videti Marks et al., 1992, BioTechnologv 10:779.
[0132]Zbog degeneracije genetskog koda, svaka od ovde prikazanih polipeptidnih sekvenci takođe je kodirana velikim brojem drugih polinukleotidnih sekvenci pored ovih obezbeđenih. Na primer, varijabilni domeni teškog lanca obezbeđeni ovde mogu se kodirati polinukleotidnim sekvencama SEQ ID NO: 32, 35, 37, 39, 41,43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, ili 59. Varijabilni domeni lakog lanca mogu se kodirati polinukleotidnim sekvencama SEQ ID NO:2, 5, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18, 20, 22, 24, 26, ili 28. Stručnjak će ceniti da ova prijava prema tome obezbeđuje adekvatan pisani opis i omogućavanje za svaku degenerisanu nukleotidnu sekvencu koji kodira svaki antigen vezujući protein.
[0133]Jedan aspekt dalje obezbeđuje polinukleotide koji se hibridizuju sa drugim molekulima polinukleotida pod određenim uslovima hibridizacije. Postupci za hibridizaciju nukleinske kiseline, osnovni parametri koji utiču na izbor hibridizacionih uslova i smernice za osmišljavanje odgovarajućih uslova dobro su poznati u struci. Videti, npr., Sambrook, Fritsch, i Maniatis (2001, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. i Current Protocols in Molecular Biologv, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc.. Kako je ovde definisano, umereno strogi hibridizacioni uslovi koriste rastvor za pretpranje koji sadrži 5x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC), 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), hibridizacioni pufer od oko 50% formamida, 6x SSC, i hibridizacionu temperaturu od 55°C (ili druge slične hibridizacione rastvore, kao što neki koji sadrži oko 50% formamida, sa hibridizacionom temperaturom od 42°C), i uslove pranja od 60°C, u 0.5x SSC, 0.1% SDS. Strožiji hibridizacioni uslovi hibridizuju se u 6x SSC at 45°C, prateći jedno ili više pranja u 0.1x SSC, 0.2% SDS na 68°C. Dalje, stručnjak će moći da menja hibridizacione i/ili uslove pranja kako bi povećao ili smanjio strogoću hibridizacije tako da polinukleotidi koji obuhvataju sekvence nukleinske kiseline koje su najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% međusobno identične, uključujući sve vrednosti između, tipično ostaju međusobno hibridizovani.
[0134]Promene se mogu uvesti mutacijom u polinukleotid, što vodi ka promenama u amino kiselinskoj sekvenci polipeptida( npr.,antigen vezujući protein ili derivat antigen vezujućeg proteina) koji se kodira. Mutacije se mogu uvesti korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci, kao što su mesto-usmerena mutageneza i nasumična mutageneza. Mutantni polipeptidi mogu biti eksprimirani i odabrani za poželjno sredstvo. Mutacije se mogu uvesti u polinukleotid bez značajnijeg menjanja biološke aktivnosti polipeptida koji se kodira. Na primer, supstitucijama na ne-esencijalnim ostacima amino kiselina. Alternativno, jedna ili više mutacija mogu se uvesti u polinukleotid što selektivno menja biološku aktivnost polipeptida koji se kodira. Na primer, mutacija može kvantitativno ili kvalitativno da menja biološku aktivnost, kao što je povećavanje, redukovanje ili eliminisanje aktivnosti i menjanje antigen specifičnosti antigen vezujućeg proteina.
[0135]Još jedan aspekt obezbeđuje polinukleotide koji su pogodni za upotrebu kao primeri ili hibridizacione probe za detektovanje sekvenci nukleinske kiseline. Polinukleotid može da obuhvati samo deo sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid pune dužine, na primer, fragment koji se može primenii kao proba ili primer ili fragment koji kodira aktivan deo (npr., IL-23 vezujući deo) polipeptida. Probe na bazi sekvence nukleinske kiseline mogu se primeniti za detektovanje nukleinske kiseline ili sličnih nukleinskih kiselina, na primer, transkripta koji kodiraju polipeptid. Probe mogu da obuhvataju neku obeleživačku grupu, npr., radioizotop, fluorescentno jedinjenje, enzim, ili enzimeski ko-faktor. Takve probe mogu se koristiti za identifikovanje ćelije koja eksprimira polipeptid.
Postupci eksprimiranja antigen vezujućeg proteina
[0136]Antigen vezujući proteini obezbeđeni ovde mogu se pripremiti bilo kojoj od brojnih konvencionalnih tehnika. Na primer, IL-23 antigen vezujući proteini mogu se proizvesti rekombinantno ekspresionim sistemima, korišćenjem bilo koje tehnike poznate u struci. Videti,npr.,Monoclonal Antibodies, Hvbridomas: A New Dimension in Biological Analvses, Kennet et al.(eds.) Plenum Press, New York (1980); and Antibodies: A Laboratorv Manual, Harlovv and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988).
[0137]Ekspresioni sistemi i konstrukti u obliku plazmida, ekspresionih vektora, transkripcionih ili ekspresionih kaseta, koji obuhvataju najmanje jedan polinukleotid kako je opisan gore, takođe su ovde obezbeđeni, kao i ćelije domaćini koje obuhvataju takve ekspresione sisteme ili konstrukte. Kako se ovde koristi, "vektor" označava bilo koji molekul ili entiter( npr.,nukleinska kiselina, plazmid, bakteriofa ili virus) pogodni za upotrebu u transferu protein kodirajuće informacije u ćeliju domaćina. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmid, viralni vektore, ne-epizomalni vektori ko sisara i ekspresioni vektori, na primer, rekombinantno ekspresioni vektori. Ekspresioni vektori, kao što su rekombinantno ekspresioni vektori, korisni su za transformisanje ćelije domaćina i sadrže sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i/ili kontrolišu (u konjukciji sa ćelijom domaćina) ekspresiju jednog ili više heterologna kodirajuća regiona operativno povezani na njih. Ekspresija konstrukta može da uključi, ali nije ograničena na, sekvence koje utiču na ili kontrolišu transkripciju, translaciju, i, ukoliko su introni prisutni, da utiče na RNK spajanje kodirajućeg regiona operativno povezanog za njega. "Operativno povezan" označava da su komponente za koje je izraz upotrebljen u vezi koja im omogućava da iznesu svoje inherentne funkcije. Na primer, kontrolna sekvenca, npr., promoter, u vektoru koji je "operativno povezan" sa protein kodirajućom sekvencom postavljenje tako da normalna aktivnost kontrolne sekvence vodi ka transkripciji protein kodirajuće sekvence što rezultira rekombinantnom ekspresijom kodiranog proteina.
[0138]Još jedan aspekt obezbeđuje ćelije domaćina u koje se uvodi neki ekspresioni vektor, kao što je rekombinantno ekspresioni vektor. Ćelija domaćin može biti bilo koja prokariotska ćelija (na primer,E. coli)ili eukariotska ćelija (na primer, ćelije kvasca, insekta, ili sisara (npr., CHO ćelije)). Vektor DNK se uvesti u prokariotske ili eukariotske ćelijeputemkonvekcionalnih tehnika transformacije ili transfekcije. Za stabilnu transfekciju ćelija sisara, poznato je da, u zavisnosti od upotrebljenog ekspresionog vektora i transfekcione tehnike, samomala frakcija čelija može se integrisati stranu DNK u njihov genom. Kako bi se indetifikovali i odabrali ovi integranti, gen koji kodira marker koji se može birati (npr., za otpornost na antibiotike) generalno se uvodi u ćelije domaćina zajedno sa genom od interesa. Poželjni markeri koji se mogu birati uključuju one koji dodaju rezistentnost ka lekovima, kao što su G418, higromicin i metotreksat. Ćelije stabilno transfektovane sa uvedenim polinukleotidom mogu se identifikovati odabirom leka (npr., ćelije koje inkorporiraju gen marker koji se može odabrati će preživeti, dok će ostale ćelije umreti), između ostalih postupaka.
[0139]Antigen vezujući proteini mogu biti eksprimirani u hibridoma ćelijskim linijama( npr.,određena antitela mogu biti eksprimirana u hibridomu) ili u ćelijskskim linijama različitim od hibridoma. Ekspresioni konstrukti koji kodiraju antigen vezujuće proteine mogu se koristiti da transformišu ćeliju domaćina sisara, insekta ili mikroba. Transformacija se može izvesti korišćenjem bilo kog poznatog postupka za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer pakovanje polinukleotida u virus ili bakteriofag i prenošenje ćelija domaćina sa konstruktom postupcima transfekcije poznatim u struci, kako je dato kao primer u US Patentima Br. 4,399,216; 4,912,040; 4,740,461; 4,959,455. Optimalne transformacione procedure koje se koriste zavisiće od kof tipa ćelije domaćina je transformiran. Postupci za uvođenje heterolognih polinukleotida u ćelije sisara dobro su poznati u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na, dekstranom posredovana transfekcija, kalcijum fosfatno taloženje, polibrenom posredovana transfekcija, protoplastična fuzija, elektroporacija, enkapsulacija polinukleotida(a) u lipozomima, umešavanje nukleinske kiseline sa pozitivno naelektrisanim lipidima, i direktno mikroinjektovane DNK u jezgra.
[0140]Rekombinantno ekspresioni konstrukti tipično obuhvataju polinukleotid koji kodira polipeptid. Polipeptid može da obuhvata jedan ili više od sledećeg: jedan ili više CDR kakvi su obezbeđeni ovde; varijabilni region lakog lanca; varijabilni region teškog lanca; konstantni region lakog lanca; konstantni region teškog lanca(npr.,ChI, Ch2 i/ili Ch3); i/ili još jedan deo skele IL-23 antigen vezujućeg proteina. Ove sekvence nukleinske kiseline umetnute su u odgovarajući ekspresioni vektor korišćenjem standardnih tehnika ligacije. U jednom ostvarenju, konstantni region teškog ili lakog lanca je priložen C-terminusu varijabilnog regiona teškog ili lakog lanca obezbeđeni ovde i ligiran u ekspresioni vektor. Vektor je tipično odanran da bude funkcionalan u određenoj uposlenoj ćeliji domaćina( tj.,vektor je kompatibilan sa mašinerijom ćelije domaćina, dozvoljavajući amplifikaciju i/ili ekspresiju gena). U nekim ostvarenjima, vektori se koriste da uposle komplementacioni gledi protein-fragment korišćenjem proteinskih reportera, kao što je dihidrofolatna reduktaza( videti,na primer, U.S. Pat. Br. 6,270,964). Pogodni ekspresioni vektori mogu se kupiti, na primer, od Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA) ili BD Biosciences (San Jose, CA). Drugi korisni vektori za kloniranje i eksprimiranje antitela i fragmenata uključuju those opisane u Bianchi i McGrevv, 2003, Biotech. Biotechnol. Bioeng. 84:439-44. Dodatni pogodni ekspresioni vektori opisani su u, na primer, Methods Enzvmol., vol. 185 (D. V. Goeddel, ed.), 1990, New York: Academic Press.
[0141]Tipično, ekspresioni vektori koji se koriste u bilo kojim ćelijama domaćinima sadržeće sekvence za održavanje plazmidai za kloniranje i ekspresiju eksogenih nukleotidnih sekvenci. Takve sekvence, kolektivno nazvane "flankirajuće sekvence" u određenim ostvarenjima tipično uključuju jednu ili više od sledećih nukleotidnih sekvenci: promoter, jedan ili više pojačivača sekvenci, mesto početka replikacije, transkripcionalnu terminacionu sekvence, kompletnu intronsku sekvencu koja sadrži donorsko i prihvatačko mesto isecanja, sekvencu koja kodira lider sekvencu za polipeptidnu sekreciju, mesto vezivanje ribozoma, poliadenilacionu sekvencu, polilinkerski region za umetanje polinukleotida koji kodira polipeptid koji treba da se eksprimira, i marker element koji se kože odabirati. Ekspresioni vektori koji su obezbeđeni mogu biti konstruisani od početnog vektora kao što je komercijalno dostupan vektor. Takvi vektori mogu ili ne moraju da sadrže sve od željenih flankirajućih sekvenci. Gde jedna ili više od ovde opisanih flankirajućih sekvenci još uvek nisu prisutne u vektoru, one se mogu pojedinačno obeznediti i ligirati u vektor. Postupci koji se koriste za dobijanje svake od flankirajućih sekvenci, dobro su poznati stručnjaku.
[0142]Opciono, vektor može da sadrži "oznaku"-koja kodira sekvencu,tj.,oligonukleotidni molekul smešten na 5' ili 3' kraju kodirajuće sekvence IL-23 antigen vezujućeg proteina; oligonukleotidna sekvenca koja kodira poliHis (kao što su heksaHis), ili još jedna "oznaka" kao što su FLAG<*>, HA (hemaglutinin influenza virus), ili myc, za koje postoje komercijalno dostupna antitela. Ova oznaka tipično je fuzionisana za polipeptid nakon ekspresije polipeptida, i i može da služi kao označivač za afinitetno prečišćavanje ili detekciju IL-23 antigen vezujućeg proteina iz ćelije domaćina. Afinitetno prečišćavanje može se postići, na primer, hromatografijom na koloni korišćenjem antitela nasuprot oznake afinitetne matrice. Opciono, oznaka može biti naknadno uklonjena iz prečišćenog IL-23 antigen vezujućeg proteina raznim sredstvima kao što su korišćenjem određenih peptidaza za cepanje.
[0143]Flankirajuće sekvence mogu biti homologne( tj.,od istih vrsta i/ili soja kao ćelija domaćin), heterologne( tj.,od vrste drugačije od vrste ili soja ćelije domaćina), hibridne (tj., kombinacija flankirajućih sekvenci od više od jednog izvora), sintetičke ili nativne. Kao takve, izvor flankirajućih sekvenci može biti bilo koji prokariotski ili eukariotski organizam, bilo koji organizam kičmenjaka ili bezkičmenjaka, ili bilo koja biljka, dokle god je flankirajuća sekvenca funkcionalna u, i može se aktivirati mašinerijom ćelije domaćina.
[0144]Flankirajuće sekvence korisne u vektorima mogu se dobiti bilo kojim od nekoliko postupaka dobro poznatih u struci. Tipično, flankirajuće sekvence koje su ovde korine prethodno su identifikovane mapiranjem i/ili restrikcionom endonukleaza digestijom te se prema tome mogu izolovati iz odgovarajućeg tkivnog izvora korišćenjem pogodnih restrikcionih endonukleaza. U nekim slučajevima, puna nukleotidna sekvenca flankirajuće sekvence može biti poznata. Ovde, flankirajuća sekvenca može biti sintetizovana korišćenjem postupaka ovde opisanih za sintezu ili kloniranje nukleinske kiseline.
[0145]Bilo da je poznata cela ili samo deo flankirajuće sekvence, ona se može obezbediti korišćenjem polimeraznom lančanom reakcijom (PCR) i/ili skriningom genomske biblioteke pogodni probama kao što su fragment oligonukleotidne i/ili flankirajuće sekvence iz iste ili neke druge vrste. Kada flankirajuća sekvenca nije poznata, fragment DNK koji sadrži flankirajuću sekvencu, može biti izolovan iz većeg dela DNK koji može da sadrži, na primer, kodirajuću sekvencu ili čak još jedan gen ili gene. Izolovanje se može postići restrikcionom endonucleaznom digestijom kako bi se proizveo odgovarajući DNK fragment praćeno izolovanjem korišćenjem prečišćavanjem na agaroza gelu, Qiagen<®>hromatografija na koloni
(Ojagen, Chatsvvorth, CA), ili drugih postupaka poznatih stručnjaku. Odabir pogodnih enzima kako bi se ispunio ovaj cilj, biće očogledni stručnjaku iz ove oblasti.
[0146]Poreklo replikacije je tipično deo onih prokariotskih ekspresionih vektora koji se komercijalno nabavljaju, a poreklo pomaže u amplifikaciji vektora u ćeliji domaćinu. Ako vektor po izboru ne sadrži poreklo replikacionog mesta, on se može hemijski sintetizovati na bazi poznate sekvence, i ligovati u vektor. Na primer, poreklo replikacije iz plazmida pBR322 (New Engli Biolabs, Beverlv, MA) pogodan za većinu gram-negativnih bakterija, i razna virusna porekla (npr., SV40, polioma, adenovirus, vezikularni stomatitus virus (VSV), ili papilomavirusi kao što su HPV ili BPV) korisni su za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Generalno, poreklo replikacione komponente nije potrebno za ekspresione vektore sisara (na primer, SV40 poreklo se obično koristi jer takođe sadrži i virusni rani promoter).
[0147]Sekvenca za završetak transkripcije tipično je locirana 3' na kraju polipeptida kodirajućeg regiona i služi da završi transkripciju. Uglavnom, sekvenca zazavršetak transkripcije u prokariotskim ćelijama je G-C bogati fragment praćen poli-T sekvencom. Dok se sekvenca lako klonira iz biblioteke ili se čak kupuje komercijalno kao deo vektora, ona se takođe može lako sitetizovati korišćenjem postupaka za sintezu nukleinske kiseline kao što su one opisani ovde.
[0148]Marker gen koji se može odabrati, kodira protein neophodan za opstanak i rast ćelije domaćina koja se uzgaja u selektivnom medijumu kulture. Tipični selekcioni marker geni kodiraju proteine koji (a) dodeljuju rezistentnost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicillin, tetraciklin, ili kanamicin za prokariotske ćelije domaćine; (b) dopunjuju auksotrofične nedostatke ćelije; ili (c) snabdevaju kritičnim nutrijentima koji nisu dostupni iz kompleksa ili definisanog medijuma. Specifični markeri koji se mogu odabrati su gen otporan na kanamicin, gen otporan na ampicillin, i gen otporan na tetraciklin. Poželjno, gen otporan na neomicin takođe može biti primenjen selekciju u obe i prokariotskoj i eukariotskoj ćeliji domaćinu.
[0149]Ostali geni koji se mogu birati mogu se primeniti da amplifiraju gen koji će se eksprimirati. Amplifikacija je proces u kojem su geni koji su potrebni za proizvodnju proteina kritičnog za rast ili preživljavanje ćelija, ponovljeni u tandemu unutar hromozoma suksesivnih generacija rekombinantnih ćelija. Primeri pogodnih selektivnih markera za ćelije sisara uključuju gene dihidrofolatne reduktaze (DHFR) i timidinske kinaze bez promotera. Transformanti čelije sisara smešteni su pod selekcionim pritiskom u kojem se samo transformati koji su unikatno adaptirani za preživljavanje pomoću selektivnih gena, prisutni u vektoru. Selekcioni pritisakje nametnut kultivisanjem transformiranih ćelija pod uslovima u kojima je koncentracija selekcionog agensa u medijumu dovoljno povišena, što vodi ka amplifikaciji oba i selektivnog gena i DNK koja kodira još neki gen, kao što su antigen vezujući protein koji se vezuje za IL-23. Kao rezultat, povećane količine polipeptida kao što su antigen vezujući protein, sintetizovane su iz amplificirane DNK.
[0150]Mesto vezivanja ribozoma obično je potrebno za započinjanje translacije rnRNK i okarakterisano je Shine-Dalgarno sekvencom (prokariotima) ili Kozak sekvencom (eukariotima). Ta element je tipično smešten 3' do promotera i 5' do kodirajuće sekvence polipeptida koji se eksprimira.
[0151]U nekim slučajevima, kao gde je glikolizacija poželjna u ekspresionom sistemu eukariotske ćelije domaćina, može se upravljati raznim pre- ili pro-sekvencama kako bi se poboljšala glikolizacija ili prinos. Na primer, može izmeniti mesto cepanja peptidaze određenog signalnog peptida, ili dodati prosekvence, koje takođe mogu da utiču na glikolizaciju. Finalni proteinski proizvod može imati, u -1 poziciji (u odnosu na prvu amino kiselinu zrelog proteina), jednu ili više dodatnih amino kiselina incidentnih za ekspresiju, koje ne moraju biti potpuno uklonjene. Na primer, finalni proteinski proizvod može imati jedan ili dva amino kiselinska ostatka pronađena na mestu cepanja peptidaze, prikačeni za amino-terminus. Alternativno, upotreba nekih mesta cepanja enzima može da rezultira neznatno skraćenim oblikom željenog polipeptida, ukoliko enzim seče takvu površinu unutar zrelog polipeptida.
[0152]Ekspresija i kloniranje tipično će sadržati promoter koji prepoznaje organizam domaćin i operativno je povezan sa molekulom koji kodira neki IL-23 antigen vezujući protein. Promoteri su netranskribovane sekvence smeštene uzvodno( tj.,5') od početnog kodona strukturalnog gena (generalno unutar oko 100 do 1000 bp) koji kontroliše transkripciju strukturalnog gena. Promoteri su konvencionalno grupisani u jednu od dve klase: inducibilni promoteri i konstitutivni promoteri. Inducibilni promoteri iniciraju povećane nivoe transkripcije iz DNK pod njihovom kontrolnom kao odgovor na neku promenu u uslovima kulture, kao što su prisustvo ili odsustvo nutrienta ili promene u temperaturi. Konstituivni promoteri, sa druge strane, uniformno transkribuju gen za koji su operativno povezani, to jest, sa malo ili ni malo kontrole nad ekspresijom gena. Veći broj promotera, koje prepoznaju razne potencijalne ćelije domaćini, dobro su poznati. Pogodni promoter je operativno povezan sa DNK koji kodira varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca IL-23 antigen vezujućeg proteina uklanjajući promoter iz izvorne DNK restrikcionom enzimskom digestijom i umetanjem željene promoterike sekvence u vektor.
[0153]Pogodni promoteri za upotrebu sa domaćinom kvasca dobro su poznati u struci. Pojačivači kvasca pogodno se koriste sa promoterima kvasca. Pogodni promoteri za upotrebu sa ćelijama domaćina sisara dobro su poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, one koji se dobijaju iz genoma virusa kao što su polioma virus, kokošiji pok virus, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, ptičiji sarkoma virus, citomegalovirus, retrovirusi, hepatitis-B virus, i Simian Virus 40 (SV40). Drugi pogodni promoteri sisara uključuju heterologne promotere sisara, na primer, promoteri toplotnog šoka i promoter aktina.
[0154]Dodatni promoteri koji mogu biti od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na: SV40 rani promoter (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); CMV promoter (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); promoter sadržan u 3' dugom terminalnom ponavljanju Rous sarkom virusu (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); herpes timidin kinaza promoter (VVagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); promoterska i regulatorna sekvence iz metalotionin gena (Prinsteret al., 1982, Nature 296:39-42); i prokariotski promoteri kao što su beta-laktamaza promoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); ili tak promoter (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). Od interesa su takođe i sledeći životinjski transkripcioni kontrolni regioni, koji eksprimiraju tkivnu specifičnost i koji se koriste kod transgenih životinja: gen kontrolni region elastaze I koji je aktivan u acinarnim ćelijama pankreasa (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Svmp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatologv 7:425-515); Region genska kontrole insulina koji je aktivan u pankreatitnim beta ćelijama (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); Region genske kontrole imunoglobulina koji je aktivan u limfoidnim ćelijama (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); region kontrole mišjeg virusa tumora dojke, koji je aktivan in ćelijama testisa, dojke, limfe i mastocitima (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); region kontrole gena albumina, koji je aktivan u jetri (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276); region kontrole gena alfa-feto-proteina, koji je aktivan u jetri (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); region kontrole gena alfa 1-antitripsina, koji je aktivan u jetri (Kelsev et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171); region kontrole gena beta-globina, koji je aktivan in ćelijama mijeloma (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); region kontrole gena mijeloidnog osnovnog proteina, koji je aktivan u oligodendrocitnim ćelijama u mozgu (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); region kontrole gena miozin lakog lanca-2, koji je aktivan mišićima skeleta (Sani, 1985, Nature 314:283-286); i region kontrole gena gonadotropičnog oslobađanja hormona, koji je aktivan u hipotalamusu (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).
[0155]Pojačivačka sekvenca može se umetnuti u vektor kako bi povećala transkripciju višim eukariotima. Pojačivači su cis-aktivni elementi DNK, obično oko 10-300 bp u dužini, koji deluju na promoter radi povećavanja transkripcije. Pojačivači su relativno orijentisani i pozicionirani nezavisno, pri čemu su nađeni na obe pozicije i 5' i 3' do transkripcione jedinice. Poznato je nekoliko pojačivačkih sekvenci dostupnih iz sisara (npr., globin, elastaza, albumin, alfa-feto-protein i insulin). Međuti, uobičajeno, koristi se pojačivač iz virusa. SV40 pojačivač, citomegalovirusni pojačivač ranog promotera, pojačivač poliom, i adenovirusni pojačivači poznati u struci predstavljaju primerne pojačivačke elemente za aktivaciju eukariotskih promotera. Dok pojačivač može biti pozicioniran u vektoru bilo 5' ili 3' do kodirajuće sekvence, on je tipično smešten na mestu 5' od promotera. Sekvenca koja kodira pogodni nativnu ili heterolognu signalnu sekvencu (leader sekvenca ili signalni peptid) može se inkorporirati u ekspresioni vektor, kako bi promovisala ekstraćelijsko lučenje antitela. Odabir signalnog peptida ili lidera zavisi od vrste čelija domaćina u kojima će se antitelo proizvesti, a heterologna signalna sekvenca može zameniti nativnu signalnu sekvencu. Primeri signalnih peptida koji su funkcionalni u ćelijama domaćina sisara uključuju sledeće: signalnu sekvencu za interleukin-7 opisan u US Patentu Br. 4,965,195; signalna sekvenca za interleukin-2 receptor opisan u Cosman et al., 1984, Nature 312:768; signalni peptid interleukin-4 receptora opisan u EP Patentu Br. 0367 566; signalni peptid tipa I interleukin-1 receptora opisan u U.S. Patentu Br. 4,968,607; signalni peptid tip II interleukin-1 receptora opisan u EP Patentu Br. 0 460 846.
[0156]Pošto su vektori konstruisani, upotpunjeni vektor se može insertovati u pogodnu ćeliju domaćina radi amplifikacije i/ili polipeptidne ekspresije. Transformisanje ekspresionog vektora za antigen vezujući protein u odabranoj ćeliji domaćinu može se postići dobro poznatim postupcima uključujući transfekciju, infekciju, kalcijum fosfatno ko-taloženje, elektroporaciju, mikroinjektvanje, lipofekciju, DEAE-dekstranom posredovanu transfekciju, ili drugim poznatim tehnikama. Postupak koji je odabran biće deo funkcije tipa ćelije domaćina koja će se upotrebiti. Ovi postupci i drugi pogodni postupci dobro su poznati stručnjaku, i navedeni su, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).
[0157]Ćelija domaćin, kada se uzgaja pod pogodnim uslovima, sintetizuje protein koji se može naknadno sakupiti iz medijuma kulture (ukoliko ga ćelija domaćin luči u medijum) ili ditekrno iz ćelije domaćina koja ga proizvodi (ukoliko nije izlučen). Odabir pogodne ćelije domaćina zavisiće od raznih faktora, kao što su nivoi željene ekspresije, polipeptidne modifikacije koje su poželjne ili neophodne za aktivnost (kao što su glikolizacija ili fosforilacija) jednostavnost savijanja u biološki aktivan molekul.
[0158]Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju, dobro su poznate u struci i uključuju, ali nisu ograničene na, imortalizovane ćelijske linije dostupne od American Tvpe Culture Collection (ATCC), uključujući ali neograničavajući se na ćelije jajnika kineskog krčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), humane hepatoćelijske ćelije kancera (npr., Hep G2), i brojne druge ćelijske linije. U određenim ostvarenjima, ćelijske linije mogu se odabrati kroz određivanje koje ćelijske linije imaju visoke ekspresione nivoe i konstituivnu proizvodnju antigen vezujućih proteina sa IL-23 vezivajućim osobinama. U još jednom ostvarenju, takođe se može odabrati ćelijska linija iz B ćelija loze koja ne proizvodi svoje sopstveno antitelo, ali ima kapacitet da proizvede i luči heterologno antitelo.
Upotreba humanih IL-23 antigen vezujućih proteina za dijagnostičke i terapeutske svrhe
[0159]Antigen vezujući proteini korisni su za detektovanje IL-23 u biološkim uzorcima i identifikciju ćelija ili tkiva koja proizvode IL-23. Antigen vezujući proteini koji se specifično vezuju za IL-23 može se koristiti u dijagnostici i/ili tretiranju bolesti povezane sa IL-23 kod pacijenta kome je to potrebno. Na primer, IL-23 antigen vezujući proteini mogu se primeniti u dijagnostičkim ogledima, npr., ogledima vezivanja kako bi se detektovao i/ili kvantifikovao IL-23 eksprimiran u krvi, serumu, ćelijama ili tkivu. Pored toga, IL-23 antigen vezujući proteini mogu se primeniti da redukuju, inhibiraju, ometaju ili modulišu jednu ili više bioloških aktivnosti IL-23 u ćeliji ili tkivu. Tako, antigen vezujući proteini koji se vezuju za IL-23 mogu imati terapeutsku upotrebu u ublažavanju bolesti povezanih sa IL-23.
Indikacije
[0160]Ovaj pronalazak takođe se odnosi na upotrebu IL-23 antigen vezujućih proteina za upotrebu u prevenciji ili terapeutskom tretmanu medicinskih poremećaja, kao što oni opisani ovde. IL-23 antigen vezujući proteini korisni su u tretiranju raznih stanja u kojima je IL-23 povezan sa ili igra ulogu u doprinošenju osnovnoj bolesti ili poremećaju ili na nbeki drugi način doprinosi negativnom simptomu.
[0161]Stanja efektivno tretirana IL-23 antigen vezujućim proteinima, igraju glavnu ulogu u zapaljenskom odgovoru. Takvi zapaljenski poremećaji uključuju paraodontalniu bolest; poremećaje pluća kao što je astma; poremećaje kože kao što su psorijaza, atopični dermatitis, kontaktni dermatitis; reumatski poremećaji kao što su reumatoidni artritis, progresivna sistemska skleroza (skleroderma); sistemski lupus eritematozus; spondiloartritis uključujući ankilozni spondilitis, psorijazni artritis, enteropatični artritis i reaktivni artritis. Takođe je obuhvaćen uveitis uključujući Vogt-Kovanagi-Harada bolest, idiopatski anteriorni i posteriorni uveitis, i uveitis povezan sa spondiloartritisom. Upotreba IL-23 antigen vezujućih proteina takođe se pogodna za tretiranje autoimunih poremećaja uključujući multipla sklerozu; autoimuni miokarditis; dijabetes tip 1 i autoimuni tiroiditis.
[0162]Degenerativna stanja gastrointestinalnog sistema mogu se tretirati ili prevenirati sa IL-23 antigen vezujućim proteinima. Takvi gastrointestinalni poremećaji uključujući zapaljensku bolest creva: Kronovu bolest, ulcerativni kolitis i bolest Celijakiju.
[0163]Takođe je uključena upotreba IL-23 antigen vezujućih proteina u tretiranju bolesti transplantant-versus-domaćin, i komplikacija kao što su odbacivanje transplantata, koje rezultira iz transplantacije čvrstih organa, kao što su srce, jetra, koža, bubreg, pluća ili ili ostali transplantati, uključujući transplantate koštane srži.
[0164]Ovde su takođe obezbeđene medicinske primene za korišćenje IL-23 antigen vezujućih proteina za tretiranje raznih onkoloških poremećaja uključujući razne oblike kancera uključujući kanecere kolona, želuca, prostate, renalnih ćelija, cervikalne i ovarijarne, i kancer pluća (SCLC i NSCLC). Takođe su uključeni čvrsti tumori, uključujući sarkom, osteosarkom, i karcinom, kao što su adenokarcinom i karcinom skvamoznih ćelija, kancer jednjaka, kancer želuca, karcinom žučne kese, leukemija, uključujući akutna mijeloidna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, mijeloidna leukemija, hronična ili akutna limfoblastična leukemija i leukemija vlasastih ćelija, i multiple mijeloma.
Dijagnostički Postupci
[0165]Opisani antigen vezujući proteini mogu se primeniti u dijagnostičke svrhe kako bi se detektovale, diagnostikovale, ili pratile bolesti i/ili stanja povezana sa IL-23. Primeri postupaka korisnih u detektovanju prisustva IL-23 uključuju imunooglede, kao što su enzim povezani imunoadsorpcioni test (ELISA) i radioimunoogled (RIA).
[0166]Za dijagnostičke primene, antigen vezujući protein tipično je obeležen detektujućom grupom za obeležavanje. Pogodne grupe za obeležavanje uključuju, ali nisu ograničene na sledeće: radioizotopi ili radionuklidi( npr.,3H,14C,15N,35S,90Y,9<9>Tc,<m>ln,<125>l,<131>l), fluorescentne grupe (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfori), enizmatične grupe (npr., peroksidaza rena, B-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentne grupe, biotinilovane grupe, ili prethodno određeni polipeptidni epitop koji se prepoznaje sekundarnim reporterom (npr., par sekvenci leucinskog zatvarača, mesta vezivanja za sekundarna antitela, domeni vezivanja metala, epitopne oznake). Obeležavajuća grupa može biti kuplovana sa antigen vezujućim proteinomputemrazmakivačkih kraka raznih dužina radi redukovanja potencijalnog sternog ometanja. Razni postupci za obeleživačke proteine poznati su u struci i mogu se primenjivati.
[0167]Drugi dijagnostički postupci opisani su za identifikovanje ćelije ili ćelija koje eksprimiraju IL-23. Antigen vezujući protein može biti obeležen sa grupom za obeležavanje, a prićuje se vezivanje obeleženog antigen vezujućeg proteina za IL-23. Vezivanje antigen vezujućeg proteina za IL-23 može se detektovatiin vivo.IL-23 antigen vezujući protein može biti izolovan i izmeren korišćenjem tehnika poznatih u struci. Videti, na primer, Harlovv i Lane, 1988, Antibodies: A Laboratorv Manual, New York: Cold Spring Harbor (ed. 1991 i periodic supplements); John E. Coligan, ed., 1993, Current Protocols In Immunologv New York: John Wiley & Sons.
[0168]Opisai su drugi postupci za detektovanje prisustva test molekula koji ulazi u kompeticiju za vezivanje sa IL-23 sa antigen vezujućim proteinima. Primer jednog takvog testa uključuje detektovanje količine slobodnog antigen vezujućeg proteina u rastvoru koji sadrži neku količinu IL-23 u prisustvu ili odsustvu test molekul. Povećanje u količini slobodnog antigen vezujućeg proteina (tj., antigen vezujući protein koji nije vezan za IL-23) indikuje da je test molekul sposoban da uđe u kompeticiju za IL-23 vezivanje sa antigen vezujućim proteinom. Antigen vezujući protein može biti obeležen sa grupom za obeležavanje. Alternativno, test molekul je obeležen, a količina slobodnog test molekula prati se u prisustvu i odsustvu antigen vezujućeg proteina.
[0169] Medicinske primene Farmaceutske formulacije, Putanje davanja
[0170]Obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje obuhvataju terapeutski efektivnu količinu jednog ili a više antigen vezujućih proteina i neki farmaceutski prihvatljiv ekscipijens, razblaživač, nosač, sredstvo za poboljšanje rastvaranja, emulgator, prezervativ, i/ili adjuvans. Pored toga, uključene su medicinske primene tretiranja pacijenta davanjem takve farmaceutske kompozicije. Izraz "pacijent" uključuje humane pacijente. Izrazi "tretirati" i "tretiranje" obuhvata ublažavanje ili prevenciju najmanje jednog simptoma ili drugog aspekta poremećaja, ili redukciju težine bolesti, i slično. Izraz "terapeutski efektivna količina" ili "efektivna količina" odnosi se na količinu IL-23 antigen vezujućeg proteina određenog da proizvede bilo koji terapeutski odgovor kod sisara. Stručnjak iz ove oblasti lako može odrediti takve terapeutske efektivne količine.
[0171]Antigen vezujući protein ne mora da utiče na potpuno izlečenje, ili da iskoreni svaki simptom ili manifestaciju bolesti, da bi bio isplativ terapeutski agens. Kako što se podrazumeva u odgovarajućem polju, lekovi uposleni kao terapeutski agensi mogu da redukuju ozbiljnost stanja date bolesti, ali ne moraju da ukinu svaku manifestaciju bolesti da bi se smatrali korisnim terapeutskim agensima. Slično, profilaktičko davanje tretmana ne mora biti potpuno efektivno u preveniranju početka stanja da bi se smatralo isplativim profilaktičkim agensima. Dovoljno je jednostavno redukovanje uticaja bolesti (na primer, redukovanjem broja ili ozbiljnosti njenih simptoma, ili povećavanjem efikasnosti još jednog tretiranja, ili proizvodnjom još jednog dobrobitnog efekta), ili redukovanjem mogućnosti od pojavljivanja ili pogoršavanja bolesti kod subjekta. Određene medicinske primene obezbeđeni ovde obuhvataju davanje pacijentu ovde zaštićenih antigen vezujućih proteina u količini i vremenu dovoljnom da indukuju produženo poboljšanje iznad osnovne linije indikatora koji utiče na ozbiljnost određenog poremećaja.
[0172]Kako se podrazumeva u relevantnom polju, farmaceutske kompozicije koje obuhvataju molekule ovog pronalaska daju se pacijentu na način koji odgovara indikaciji. Farmaceutske kompozicije mogu biti davane bilo kojom pogodnom tehnikom, uključujući ali neograničavajući se na, parenteralnu, topicalnu, ili inhalacijom. Ukoliko se injektuje, farmaceutska kompozicija može se davati, na primer, intra-artikularnimr, intravenoznim, intramuskularnim, intralezionalnim, intraperitonealnim ili subkutanim putanjama, bolus injekcijama, ili kontinulanom infuzijom. Lokalizovano davanje, npr. koje podrazumeva na mestu oboljenja ili povrede, kao što je transdermalna dostava i produženo oslobađanje iz implanta. Dostava inhalacijom uključuje, na primer, nazalnu ili oralnu inhalaciju, upotrebu nebulizatora, inhalaciju antagonista u obliku aerosoli, i slično. Druge alternative uključuju kapi za oči; oralne preparati uključuju pilule, sirupe, lozenge ili žvakaće gume; i topikalni preparati kao što su losioni, gelovi, sprejevi, i masti.
[0173]Takođe je razmatrana upotreba antigen vezujućih proteina uex vivoprocedurama. Na primer, kvr pacijenta ili druga telesna tečnost može biti doveneda u kontakt sa antigen vezujućim proteinom koji vezuje IL-23ex vivo.Antigen vezujući protein može biti vezan sa pogodnom nerastvorljivom matricom ili čvrstim nosećim materijalom.
[0174]Pogodno, antigen vezujući proteini daju se u obliku neke kompozicije koja obuhvata jednu ili više dodatnih komponenti kao što su fiziološki prihvatljiv nosač, ekscipijens ili razblaživač. Opciono, kompozicija dodatno obuhvata jedan ili više fiziološki aktivni agenasa za kombinovanu terapiju. Farmaceutska kompozicija može da obuhvata IL-23 antigen vezujući protein zajedno sa jednim ili više supstanci odabranih iz grupe koju čine pufer, antioksidant kao što su askorbinska kiselina, polipeptid male molekularne mase (kao što su oni koji imaju manje od 10 amino kiselina), protein, amino kiselina, ugljeni hidrati kao što su glukozae, saharoza ili dekstrini, helirajući agensi kao što su EDTA, glutation, stabilizator, i ekscipijens. Neutralni puferaovani fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor umešan sa konspecifičnim albuminom u serumu predstavljaju primere pogodnih razblaživača. U skladu sa pogodnim industrijskim standardima, takođe se mogu dodati prezervativi kao što benzil alkohol. Kompozicija se može formulisati kao liofilizat korišćenjem pogodnih rastvora ekscipijenasa (npr., saharoza) kao razblaživača. Pogodne komponente su netoksične za primaoce u uključenim dozama i koncentracijama. Dalji primeri komponenata koje se mogu uposliti u farmaceutskim formulacijama prikazane su u bilo kom Remington's Pharmaceutical Sciences uključujući 21 izdanje (2005), Mack Publishing Companv, Easton, PA.
[0175]Kompleti za upotrebu od strane medicinskog osoblja uključuju IL-23 antigen vezujući protein i neki obeleživač ili druge instrukcije za upotrebu u tretiranju bilo kog stanja koje je prethodno navedeno. Komplet može da uključi sterilnu pripremu jednog ili više IL-23 vezujućih antigen vezujućih proteina, koji mogu biti u obliku kompozicije kako je prethodno opisana, i može biti u jednoj ili više bočica.
[0176]Doziranje i frekventnost davanja može da varira u odnosu na takve faktore kao što su putanja davanja, određeni antigen vezujući proteini koji su uposleni, priroda i ozbiljnost bolesti koja se tretira, bilo da je stanje akutno ili hronično, i veličina i generalno stanje subjekta. Pogodne doze mogu se odrediti procedurama poznatim u odgovarajućem polju, npr. u klinička ispitivanja mogu se uključiti ispitivanja koja se tiču povećavanja doze.
[0177]Tipična doza može da se kreće od oko 0.1 p.g/kg čak do oko 30 mg/kg ili više, u zavisnosti od prethodno pomenutih faktora. U specifičnim ostvarenjima, doza može da se kereće od 0.1 p.g/kg čak do oko 30 mg/kg, opciono od 1 u.g/kg čak do oko 30 mg/kg, opciono od 10 pg/kg čak do oko 10 mg/kg, opciono od oko 0.1 mg/kg do 5 mg/kg, ili opciono od oko 0.3 mg/kg do 3 mg/kg.
[0178]Frekventnost doziranja zavisi od farmakokinetičkih parametara određenog humanog IL-23 antigen vezujućeg proteina koji se koristi u formulaciji. Tipično, kliničaj daje kompoziciju dok se ne dostigne doza koja postiže željeni efekat. Kompozicija se prema tome može davati kao pojedinačna doza, ili kao dve ili više doza (koje mogu ili ne moraju da sadrže istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinualna infuzijaputemimplantacionih uređaja ili katetera. Pogodne doze mogu biti ustanovljene upotrebom pogodnih podataka doza-odgovor. IL-23 antigen vezujući protein ovog pronalaska može se davati, na primer, jednom ili više puta, npr., u regularnim intervalima tokom određenog vremenskog perioda. U određenim ostvarenjima, IL-23 antigen vezujući protein se daje tokom perioda od najmanje jednog meseca ili više, npr., tokom jednog, dva ili tri meseca ili čak i na neodređeno vreme. Za tretiranje hroničnih stanja, dugoročni tretman je generalno najefektivniji. Međutim, za tretiranje akutnog stanja, savanje tokom kraćih perioda, npr. od jedne doi šest nedelja, može biti dovoljno. Uopšteno, antigen vezujući protein se daje dok pacijent ne pokaže medicinski relevantan stepen poboljšanja iznad osnovne linije za izabran indikator ili indikatore.
[0179]Razmatrano je da se IL-23 antigen vezujući protein daje pacijentu u količini i tokom vremena dovoljnih da indukuju poboljšanje, poželjno produženo poboljšanje, u najmanje jednom indikatoru koji reflektuje ozbiljnost poremećaja koji se tretira. Razni indikatori koji reflektuju produženje bolesti pacijenta, bolesti ili stanja može se proceniti radi određivanja da su količina i vreme tretiranja dovoljni. Takvi indikatori uključuju, na primer, klinički poznate indikatore ozbiljnosti bolesti, simptomi, ili manifestacije poremećaja o kom je reč. U jednom ostvarenju, poboljšanje se smatra produženim ako subjekat pokazuje poboljšanje u najmanje an improvement je considered to be sustained if the subject exhibits the improvement on najmanje dve prilike odvojene za dve do četiri nedelje. Stepen poboljšanja generalno određuje specijalista, koji donosi ovo određivanje na osnovu znakova, simptoma, biopsija i ostalih rezultata testova, i koji takođe može da uključi upitnike koji se sporovode nad subjektu, kao što su upitnici u vezi sa kvalitetom života, a koji se razvijaju za datu bolest.
[0180]Određena ostvarenja medicinske primene i kompozicije ovog pronalaska uključuju upotrebu IL-23 antigen vezujućeg proteina i jedan ili više dodatnih IL-23 antagonista, na primer, dva ili više antigen vezujuća proteina ovog pronalaska, ili antigen vezujući protein ovog pronalaska i jedan ili više drugih IL-23 antagonista. Takođe su obezbeđeni IL-23 antigen vezujući proteini koji se daju sami ili u kombinaciji sa ostalim agensima korisnim za tretiranje stanja sa kojim je pacijent pogođen. Primeri takvih agenasa uključuju i proteinske i ne-proteinske lekove. Takvi agensi uključuju terapeutske delove koji imaju anti-zapaljenska svojstva (na primer, ne-steroidni anti-zapaljenski agensi, steroidi, imunomodulatori i/ili drugi inhibitori citokina kao što su oni koji antagonizuju, na primer, IFN-v, GM-CSF, IL-6, IL-8, IL-17, IL-22 i TNFs), ili od IL-23 antigen vezujućih proteina i jedan ili više drugih tretmana (npr., hirurgija, ultrazvuk, ili tretman efektivan da redukuje zapaljenje). Kada se daje više terapeutika ko-administira, doze se mogu podesiti na taj način, kako je uobičajeno ili poznato u struci. Korisni agensi koji se mogu kombinovati sa IL-23 antigen vezujućim proteinima uključuju one koji se koriste za tretiranje, na primer, Kronove bolesti ili ulcerativnog kolitisa, kao što su aminosalicilat (na primer, mesalamin), kortikosteroidi (uključujući predizon), antibiotici kao što su metronidazol ili ciprofloksacin (ili drugi antibiotici korisni za tretiranje, na primer, pacijenata pogođenih fistulama), i imunosupresanti kao što su azatioprin, 6-merkaptopurin, metotreksat, takrolimus i ciklosporin. Takav agens(i) može se davati oralno ili drugim putem, na primer putem supositorija ili klistira. Agensi koji se mogu kombinovati sa IL-23 vezivajućim proteinima u tretiranju psorijaze uključuju kortikosteroide, kalcipotrien i druge derivate vitamina D, acetretin i druge derivate retinoinske kiseline, metotreksat, takrolimus, i ciklosporin koji se koriste topikalno ili sistemski. Takvi agensi mogu se davati simultano, uzastopno, naizmenično, ili prema bilo kom drugom režimu koji omogućava da je ukupan tok terapije efektivan.
[0181]Pored humanih pacijenata, IL-23 antigen vezujući proteini korisni su u tretiranju ne-humanih životinja, kao što su kućni ljubimci (psi, mačke, ptice, primati, itd.), domaće životinje sa farme (konji, goveča, ovce, svinje, perad, itd). U takvim slučajevima, pogodna doza se može odrediti u odnosu na telesnu težinu životinje. Na primer, doza od 0.2-1 mg/kg može se koristiti. Alternativno, doza se određuje u odnosu na prekrivnu površinu, pri čemu se primerna doza kreće od 0.1-20 mg/m2, ili više poželjno, od 5-12 mg/m2. Za male životinje, kao što su psi ili mačke, pogodna doza je 0.4 mg/kg. IL-23 antigen vezujući protein (poželjno konstruisan iz gena izvedenih iz vrste primaoca) daje se injekcijom ili drugom pogodnom putanjom jedan ili više puta nedeljno dok se stanje životinje ne poboljša, ili se može davati na neodređeno.
[0182]Sledeći primeri, uključujući sprovedene eksperimente i postignute rezultate, obezbeđeni su samo u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni da ograniče okvir priloženih patentnih zahteva.
PRIMERI
Primer 1
Generisanje humanih IL-23 antitela
[0183]XenoMouse " tehnologija (Amgen, Thousi Oaks, CA) korišćena je za razvijanje humanih monoklonalnih antitela koja prepoznaju i inhibiraju aktivnost nativnog humanog IL-23 aktivnost koji oskudeva sa humanim IL-12. Antitela takođe prepoznaju i inhibiraju rekombinantni cinomologus IL-23, ali ne prepoznaju IL-23 miša ili pacova.
[0184]Antitela su odabrana za prepoznavanje i potpunu inhibiciju nativnog humanog IL-23 dobijenog iz humanih monocitno-izvedenih dendritičnih ćelija (MoDCs), korišćenjem STAT-luciferaza reporter ogleda koji je opisan u nastavku. Human monociti su izolovani iz munonuklearnih čelija iz periferne krvi od zdravih donora korišćenjem negativne selekcije (Monocvte Isolation Kit II, Miltenvi Biotec, Auburn, CA). MoDCs su generisane kultivisanjem monocita sa humanim GM-CSF (50 ng/ml) i humanim IL-4 (100 ng/ml) tokom 7 dana u RPMI 1640 sa kompletnim medijumom 10% fetalnog goveđeg seruma. MoDCs su zatim oprane dvaputa sa PBS prateći stimulaciju sa humanim CD40L (lpg/ml) tokom dodatnih 48 sati. CD40L-stimulisani MoDC supernatant sadrži IL-23, IL-12 i IL-12/23p40. ELISA su upotrebljene kako bi odredile količinu IL-12p70 (R&D Svstem, Minneapolis, MN), IL-23 (eBiosciences, San Diego, CA) i IL-12/23p40 (R&D Svstems). Odgovori STAT-luciferaza ogleda na IL-23, a ne na IL-12 ili na slobodni IL-12/23p40, te se prema tome ogled može koristiti sa sirovim supernatantima kako bi se odredila IL-23 aktivnost. Za upotrebu u ogledu NK ćelija, koji je opisan u nastavku, nativni humani IL-23 sirovi supernatant prečišćen je korišćenjem IL-23 afinitetne kolone prateći eksluzionu hromatografiju na osnovu veličine. Koncentracije je određena korišćenjem IL-23 specifičnog ELISA (eBiosciences).
[0185]Prečišćeni supernatanti antitela takođe su testirani na rekombinantno humani (rhu) IL-23 i rekombinantno cinomolgus (cvno) IL-23 u STAT-luciferaza ogledu. Od testiranih antitela koja su poptuno inhibirala rekombinantno humani IL-23, samo polovina tih antitela prepoznala je i poptuno inhibirala nativni humani IL-23. Prepoznavanje i potpuna inhibicija rekombinantno humanog IL-23 ne može se predvideti od, niti u je u vezi sa, prepoznavanjem i kompletnom inhibicijom nativnog humanog IL-23. Kako je prikazano u FIG. 1A i 1B, od supernatanata antitela koji su poptuno inhibirali rekombinantno humani IL-23, samo polovina tih antitela poptuno su inhibirala nativni humani IL-23. Ona antitela koja su prepoznala i poptuno inhibirala nativni humani IL-23 odabrana su za dalju karakterizaciju.
PRIMER 2
Funkcionalni Ogledi
a) STAT-luciferaza ogled
[0186]Poznato je da IL-23 vezuje svoj heterodimerni receptor i signale preko JAK2 i Tyk2 kako bi
aktivirao STAT 1, 3, 4 i 5. U ovom ogledu, ćelije transfektovane sa STAT/luciferaza reporter genom, korišćene su kako bi se procenila sposobnost IL-23 antitela da inhibira IL-23-indukovanu bioaktivnost.
[0187]Ovarijarne ćelije Kineskog hrčka koje eksprimiraju humani IL-23 receptor preivremeno su transfektovane sa STAT-luciferaza reporterom tokom noći. IL-23 antitela seriojski su razblažena (12 tačaka od 1:4 serijskih razblaženja počevši od 37.5 ug/ml) u pločama sa 96 bunarčića. Nativni humani IL-23 (postupak pripreme opisan je u Primeru 1) dodat je u svaki bunarčić pri koncentraciji od 2 ng/ml i inkubisan je na sobnoj temperaturi tokom 15-20 minuta. Privremeno transfektovane ćelije dodate su (8 x IO<3>ćelije) u konačnu zapreminu od 100 u.l/bunarčić i inkubisane tokom 5 sati na 37°C, 10% CO2. Nakon inkubacije, ćelije su lizirane korišćenjem 100 ui/bunarčić Glo Lysis pufera (lx) (Promega, Madison, VVisconsin) na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta. Pedeset mikrolitara ćelijskog lizata dodato je u ploču sa 96 bazenčića zajedno sa 50 u± Bright-Glo luciferaza substratom (Promega) i iščitano na luminometru.
[0188]Statistička analiza može biti izvedena korišćenjem GraphPad PRISM softvera (GraphPad Softvera, La Jolla, CA). Rezultati mogu biti izraženi kao srednja ± standarna devijacija (SD).
[0189]Kao što se može videti iz TABELE 5, sva IL-23 antitela potentno i poptuno su inhibirala nativni humani IL-23-indukovan STAT/luciferaza reporter na dozno zavistan način. Antitela su takođe potentno i poptuno inhibirala rekombinantno humani (rhu) IL-23 i rekombinantno cino (cyno) IL-23. Antitela su sva imala IC50 vrednosti u pikomolarnom opsegu.
b) Ogled NK ćelija
[0190]Poznato je da IL-23 deluje na prirodno ubilačke ćelije kako bi indukovao ekspresiju pro-zapaljenskih citokina, kao što su interferon y (IFNy). U ovom ogledu, humani primarne prirodno ubilačke (NK) ćelije koriste se radi procene sposobnosti IL-23 antitela da inhibira IL-23-indukovanu IFNy aktivnost u ćelijama koje eksprimiraju nativni receptor za humani IL-23.
[0191]NK ćelije izolovane su od više humanih donora putem negativne selekcije (Kit za NK Ćelijsku izolaciju Kit, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Prečišćene NK ćelije (1 x IO<6>ćelije/ml) dodate su u ploče sa 6 bunarčića u RPMI 1640 plus kompletni medijum od 10% fetalnog goveđeg seruma dopunjen sa rekombinantno humanim IL-2 (lOng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN), do potpune zapremine od lOml/bunarčić. Ćelije su kultivisane tokom 7 dana na 37°C, 5% CO2. IL-2-aktivirane NK ćelije zatim su stimulisane sa rhulL-23 ili cyno IL-23 (10 ng/ml) i rekombinantno humanim IL-18 (20ng/ml, R&D Systems, Minneapolis, MN) u prisustvu serijskih razblaženja (11 tačka od 1:3 serijskih raszblaženja počevši od 3u.g/ml) IL-23 antitela tokom 24 sata. IFNy nivoi mereni su u supernatantu pomoću IFNy ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN) u skladu sa instrukcijama proizvođača.
[0192]Statistička analiza može biti izvedena korišćenjem GraphPad PRISM softvera. Rezultati mogu biti izraženi kao srednja ± standarna devijacija (SD).
[0193]Kao što se može videti iz TABELE 6, sva antitela potentno su inhibirala rhulL-23 i cvno IL-23-indukovanu IFNy ekspresiju u NK ćelijama na dozno zavistan način. Antitela su sva imala IC50vrednosti u pikomolarnom opsegu. Ogled je izveden na podskupu antitela korišćenjem nativnog humanog IL-23 (30u.g/ml, postupak pripreme je opisan u Primeru 1) i rhulL-18 (40 ng/ml, R&D Svstems), a dobijeni Rezultati prikazani su na TABELI 6. Konzistentno sa odabirom za IL-23 specifična antitela, ova anti-IL-23 antitela nisu imala efeketa na IL-12 stimulisanu IFNy proizvodnju u NK ćelijama korišćenjem ogleda opisanog gore, pri čemu je IL-12p35 specifično neutrališuće antitelo, mAb219 (R&D Systems, Minneapolis, MN) potentno inhibiralo rekombinantno humani IL-12.
c) Ogled cele humane krve
[0194]Cela humana krv sakupljena je od više zdravih donora korišćenjem Refludan<*>(Bayer Pittsburgh,
PA) kao anti-koagulanta. Finalna koncentracija Refludan<*>u celoj krvi bila je 10 u.g/ml. Stimulaciona mešavina rhulL-23 ili cyno IL-23 (finalna koncentracija 1 ng/ml) + rhulL-18 (finalna koncentracija 20 ng/ml) + rhulL-2 (finalna koncentracija 5 ng/ml) u RPMI 1640 + 10% FBS, dodata je u ploču sa 96 bazenčića, finalne zapremine 20 uJ/bunarčić. Serijski razblažena IL-23 antitela (11 tačaka 1:3 serijskog razblaženja počevši od 3u.g/ml) dodata su u 20pl/bunarčić i inkubisana sa stimulacionom mešavinom tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Cela krv je zatim dodata (120 uJ/bunarčić) a finalna zapremina je podešena na 200 uJ/bunarčić sa RPMI 1640 + 10% FBS. Finalna koncentracija cele krvi bila je 60%. Ploče su inkubisane tokom 24 sata na 37°C, 5% CO2. Ćelija oslobođene od supernatanata sakupljene su i izmereni su IFNy nivoi iz supernatanata pomoću IFNy ELISA (R&D Svstems) u skladu sa uputstvima proizvođača.
[0195]Statistička analiza može biti izvedena korišćenjem GraphPad PRISM softvera. Rezultati mogu biti izraženi kao srednja ± standarna devijacija (SD).
[0196]Kao što se može videti iz TABELE 7, sva antitela potentno su inhibirala rhulL-23-indukovanu i cyno-IL-23-indukovanu IFNy ekspresiju u ćelijama cele krvi dozno zavistan način. Antitela su sva imala IC50 vrednosti u pikomolarnom opsegu.
d) IL-22 ogled
[0197]Poznato je da je IL-23 potentni indukator prozapaljenskih citokina. IL-23 deluje na aktivirane i
memorisjke T ćelije i promoviše preživljavanje i ekspanziju Thl7 ćelija koje proizvode prozapaljenske citokine uključujući IL-22. U ovom ogledu, humana cela krv korišćena je kako bi se procenila sposobnost IL-23 antitela da inhibiraju IL-23-indukovanu IL-22 proizvodnja.
[0198]Ogled cele krvi sproveden je na isti način kako je opisan gore sa modifikacijom korišćenja rhulL-23 ili cynolL-23 pri lng/ml i rhulL-18 pri lOng/ml kako bi se indukovala IL-22 proizvodnja. IL-22 koncentracija određena je pomoću IL-22 ELISA (R&D Svstems, Minneapolis, MN).
[0199]Kao što se može videti iz TABELE 8, antitela potentno su inhibirala rhulL-23-indukovanu i cyno IL-23-indukovanu IL-22 proizvodnju u ćelijama cele krvi na dozno zavistan način. Antitela su sva imala IC50vrednosti u pikomolarnom opsegu.
Primer 3
Određivanje ravnoteže konstante disocijacije(KD)za anti-IL-23 antitela korišćenjem KinExA
tehnologije
[0200]Afinitet vezivanja rhulL-23 za IL-23 antitela procenjen je korišćenjem kinetičkog ekskluzionog ogleda (KinExA ogled, Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID). Normalnim humanim serumom (NHS)-aktivirane Sefaroza 4 perlice brzog protoka (Amersham Biosciences, part of GE Healthcare, Uppsala, Svveden), prethodnu su premazane sa rhulL-23 i blokirane sa 1 m Tris puferom sa lOmg/mL BSA. 50pM IL-23 antitela inkubisano je sa rhulL-23 (12 tačaka 1:2 razblaživanja počevši od 800 pM) na sobnoj temperaturi tokom 72 sata pre nego što je prošao kroz rhulL-23-obložene Sefaroza perlice. Količina perlicom-vezanog antitela kvantifikovana je fluorescentnim (Cy5) obeleženim kozjim anti-humanim-Fc antitelom (Jackson Immuno Research, West Grove, Pa.). Signal vezivanja proporcijalan je količini slobodnog antitela u ravnoteži.
[0201]Disocijacija konstante ravnoteže (KD) i štipa asocijacije (Kon) dobijene su iz krive dobijene korišćenjem KinExA Pro softvera. Stopa disocijacije (K0ff) izvedena je iz: KD=K0ff/Kon
[0202]Kao što se može videti iz TABELE 9, antitela imaju visoki afinitet za vezivanje za humani IL-23. Sve su imale KDvrednosti u niskom do pod pM opsegu.
Primer 4
Određivanje strukture korišćenjem kristalografije X-zraka
[0203]Jedannačin da se odredi struktura antitelo-antigen kompleksa je korišćenjem kristalografije X-zraka, videti na primer, Harlovv and Lane Antibodies: A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), p.23. Određena je kristalna struktura IL-23 određena, (videti Lupardus and Garcia, J Mol Biol, 2008, 382: 931-941), a kristalna struktura IL-23/Fab kompleksa je opisana, (videti Bever et al. J Mol Biol, 2008. 382(4): 942-55). Strukturalna determinacija IL-23 sa Fab fragmentima zaštićenih antitela dobijena je korišćenjem kristalografije X-zraka.
Protein za kristalizaciju
[0204]A rekombinantno izveden humani IL-23 heterodimer korišćen je za kristalizacione oglede (videti Bever et al., gore naveden). Sekvenca humane pl9 subjedinice obuhvata ostatke 20-189 iz SEQ ID NO: 145, signalnu sekvencu iz SEQ ID NO:154 i C-terminal 6-His oznaku SEQ ID NO:155. Sekvenca humane p40 subjedinice mutirana je iz asparagina u glutamina na položaju 222 iz SEQ ID NO:147 radi sprečavanja glikolizacije na ovom mestu (Bever, et al.,gore naveden).
[0205]Fabs izvedeni iz Antitela B i Antitela E eksprimirani su na IgGl kičmi koja je inkorporira that incorporated mesto cepanja kaspaze. Fabs su obrađeni označavanjem cepanja proteaze.
Formiranje kompleksa i kristalizacija
[0206]Kompleks IL-23-Antitela B Fab obrazovan je umešavanjem 2X molarnog viška antitela B Fab sa humanim heterodimernim IL-23 opisani gore. Kompleks je prečišćen ekskluzionom hromatografijom po veličini kako bi se uklonio višak antitela B Fab i koncentrovao do~12 mg/ml za kristalizaciju. IL-23-antitelo B Fab kompleks kristalizovan je u 0.1 M Hepes pH 7, 8% PEG 8000.
[0207]Kompleks IL-23-Antitelo E Fab obrazovan je umešavanjem 2X molarnog viška antitela E Fab sa humanim heterodimernog IL-23 opisan gore. Kompleks je metilisan korišćenjem JBS Metilacionog kompleta u skladu sa uputstvima proizvođača (Jena Bioscience, Jena, Germanv). Kompleks je tretiran sa PNGaza kako bi se deglikolizovao protein. Nakon ovih tretmana, kompleks je prečišćen ekskluzionom hromatografijom po veličini kako bi se uklono višak antitela E Fab i koncentrovao do 13.5 mg/ml za kristalizaciju. IL-23-Antitelo E Fab kompleks kristalizovan je u 0.1 M Tris pH 8.5, 0.2 M magnezijum hloridu, 15% PEG 4000.
Sakupljanje podataka i određivanje strukture
[0208]Kristali IL-23-Antitela B Fab uzgajani su u P2iprostornoj grupu sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=70.93, b=71.27, c=107.37A, 6=104.98° i difrakcionisane do 2.0 A rezolucije. Struktura IL-23- Antitela B Fab rastvorena je molekularnom zamenom sa programom MOLREP (CCP4, CCP4 suite: programi za proteinsku kristalografiju. Acta Crvstallogr D Biol Crvstallogr, 1994. 50(Pt 5): p. 760-3) korišćenjem IL-23 strukture (Bever et al.gore naveden)kao početni model pretrage. Održavanjem IL-23 rastvora fiksiranim, varijabilni domen antitela primenjen je kao model pretrage. Održavanjem IL-23-rastvora varijabilnog domena antitela fiksiranim, konstantan domen antitela primenjen je kao model pretrage. Kompletna struktura poboljšana je višestrukim rundama građenja modela sa Ouanta i prečišćen sa cnx (Brunger, et al., Acta Crvstallogr D Biol Crvstallogr, 1998, 54(Pt 5): p. 905-21).
[0209]Distance između atoma proteina izračunate su korišćenjem programa PyMOL(DeLano, W.L. The PyMOL Graphics System. Palo Alto, 2002) (Schrodinger, LLC; New York, NY)). Amino kiseline su izabrane ukoliko je najmanje jedan atom lociran unutar traženog praga distance do partnerskog proteina.
[0210]Granice A, B, C i D heliksa pl9 subjedinice IL-23 kada je vezana sa antitelom B Fab, uključuju A heliksne ostatke 28-47, B heliksne ostatke 86-105, C heliksne ostatke 119-134 i D heliksne ostatke 154-187 izSEQID NO:145.
[0211]Regioni interakcije na IL-23pl9 subjedinici kada je vezana sa antitelom B Fab uključuju ostatke unutar Ser46-Glu58, Glull2-Glul23 i Prol55-Phel63 iz SEQ ID NO:145.
[0212]Amino kiselinski ostaci IL-23pl9 subjedinice sa atomima 4 A ili manji od antitela B Fab uključuju Ser46, Ala47, His48, Pro49, Leu50, His53, Met54, Asp55, Glu58, Proll3, Serll4, Leull5, Leu 116, Prol20, Vall21, Trpl56, Leul59, Leul60, Argl62 i Phel63 iz SEQ ID NO :145. Amino kiselinski ostaci IL-23pl9 sa atomima između 4 A i 5 A od antitela B Fab uključuju Val51, Arg57, Glull2, Aspll8, Serll9, Glnl23, Prol55 iz SEQ ID NO:145.
[0213]Amino kiselinski ostaci IL-23p40 subjedinice sa atomima 4 A ili manji od antitela B Fab uključuju Glu 122 i Lys 124 iz SEQ ID NO:147.
[0214]Amino kiselinski ostaci teškog lanca antitela B Fab sa atomima 4 A ili manji od IL-23 heterodimera uključuju Gly32, Gly33, Tyr34, Tyr35, His54, Asn58, Thr59, Tyr60, Lys66, ArglOl, Glyl02, Phel03, Tyrl04 i Tyrl05 iz SEQ ID NO:46. Amino kiselinski ostaci teškog lanca antitela B Fab sa atomima < 5 A od IL-23 heterodimera uključuju Ser31, Gly32, Gly33, Tyr34, Tyr35, His54, Ser56, Asn58, Thr59, Tyr60, Lys66, ArglOl, Glyl02, Phel03, Tyrl04 i Tyrl05 iz SEQ ID NO:46.
[0215]Amino kiselinski ostaci lakog lanca antitela B Fab sa atomima 4 A ili manji od IL-23 heterodimera uključuju Ser30, Ser31, Trp32, Tyr49, Ser52, Ser53, Ala91, Asn92, Ser93, Phe94, i Phe96 iz SEQ ID NO:15. amino kiselinski ostaci lakog lanca antitela B Fab sa atomima < 5 A od IL-23 heterodimera uključuju Ser30, Ser31, Trp32, Tyr49, Ala50, Ser52, Ser53, Ser56, Ala91, Asn92, Ser93, Phe94, i Phe96 iz SEQ ID NO:15
[0216]Kristali kompleksa IL-23-antitela E Fab uzgajani su u P222iprostornoj grupi sa jediničnim ćelijskim dimenzijama a=61.60, b=97.59, c=223.95 A i difraktovane do 3.5 A rezolucije. Struktura kompleksa IL-23-Antitela E Fab rastvorena je molekularnom zamenom programom Phaser (CCP4,gore naveden)korišćenjem IL-23 strukture, varijabilnog domena antitela i konstantnog domena antitels kao tri početna modela pretrage, kako je opisano gore. Kompletna struktura je poboljšana višestrukim rundama građenja modela sa Ouanta i prečišćen sa cnx (Brunger, et al.,gore naveden).Konstantan dome antitela E Fab ostavljen je bez finalne prečišćene strukture zbog veoma slabe gustine elektrona za taj deo proteina.
[0217]Regioni interakcije na IL-23pl9 subjedinici identifikovani kada je vezana sa antitelom E Fab uključuju ostatke unutar Ser46-His53, Glull2-Vall20 i Trpl56-Phel63 iz SEQ ID NO:145.
[0218]Amino kiselinski ostaci IL-23pl9 sa atomima 4 A ili manji od antitela E Fab uključuju Ser46, Ala47, His48, Pro49, Leu50, Glull2, Proll3, Serll4, Leull5, Leull6, Proll7, Aspll8, Serll9, Prol20, Trpl56, Leul59, Leul60 i Phel63 iz SEQ ID NO: 145. Amino kiselinski ostaci IL-23pl9 sa atomima između 4 A i 5 A od antitela E Fab uključuju His53 iz SEQ ID NO:145.
[0219]Amino kiselinski ostaci IL-23p40 sa atomima 4 A ili manji od antitela E Fab uključuju Lysl21, Glu 122, Prol23 i Asn 125 iz SEQ ID NO:147.
[0220]Amino kiselinski ostaci teškog lanca antitela E Fab sa atomima 4 A ili manji od IL-23 heterodimera uključuju Gly26, Phe27, Thr28, Ser31, Tyr53, Tyr59, Tyrl02, Serl04, Serl05, Trpl06, Tyrl07, i Prol08 iz SEQ ID NO:31. Amino kiselinski ostaci teškog lanca antitela E Fab sa atomima < 5 A od IL-23 heterodimera uključuju Glnl, Gly26, Phe27, Thr28, Ser30, Ser31, Tyr32, Trp52, Tyr53, Tyr59, ArglOO, Tyrl02, Thrl03, Serl04, Serl05, Trpl06, Tyrl07, i Prol08 iz SEQ ID NO:31.
[0221]Amino kiselinski ostaci lakog lanca antitela E Fab sa atomima 4 A ili manji od IL-23 heterodimera uključuju Ala31, Gly32, Tyr33, Asp34, Tyr51, Gly52, Asn55, Lys68, i Tyr93 iz SEQ ID NO:l. Amino kiselinski ostaci lakog lanca antitela B Fab sa atomima < 5 A od IL-23 heterodimera uključuju Thr29, Ala31, Gly32, Tyr33, Asp34, Tyr51, Gly52, Asn55, Lys68, Tyr93, i TrplOO iz SEQ ID NO:l.
Primer 5
Determinacija kontaktnih ostataka kompleksa IL- 23- antitela kroz površinske razlike dostupnosti
rastvarača na površini
[0222]Preostali kontakti u paratopu ( deo antitela koji prepoznaje antigen) i deo antigena koji vezuje granicu paratopom u kompleksu humanog IL-23-antitela B Fab i u kompleksu humanog IL-23-antitela E Fab određeni su korišćenjem razlika površinske dostupnosti rastvarača na površini. Izračunavanja površinske dostupnosti rastvarača na površini izvedena su korišćenjem Molekularne Sredine Rada (Chemical Computing Group, Montreal, Ouebec).
[0223]Površinske razlike dostupnosti rastvarača na površini ostataka paratopa u kompleksu IL-23-antitela B Fab izračunate su postavljanjem ostataka antitela B Fab kao željeni set. Strukturalna informacija dobijena u Primeru 4 za komleks IL-23-Antitela B Fab je primenjena i ostatak površinske dostupnosti rastvarača na površini amino kiselinskih ostataka antitela B Fab u prisustvu IL-23 heterodimera izračunate su i predstavljaju " granične površine" za set.
[0224]Ostatak površinske dostupnosti rastvarača na površini svakog ostatka antitela B Fab u odsustvu IL-23 antigena izračunati su i predstavljeni "slobodnim površinam" seta.
[0225]"Granične površine" zatim su oduzete od "slobodnih površina" što rezultira kao "površinska razlika površine izložene u rastvaraču" za svaki ostatak u setu. Ostaci antitela B Fab koji nemaju nikakvu promenu u površini, ili nula razlike, nemaju kontakt sa ostacima IL-23 antigena kada je kompleksan. Ostaci antitela B Fab koji imaju vrednost razlike >10 A2 smatra se da su u značajnom kontaktu sa ostacima u IL-23 antigenu tako da su ti ostaci antitela B Fab najmanje delimično do potpuno zaklonjeni kada je antitelo B Fab vezano sa humanim IL-23. Ovaj set ostataka antitela B Fab čine "pokrivenu zakrpu", pri čemu su ostaci uključeni u strukturu interfejsa kada je antitelo B Fab vezano sa humanim IL-23, videti Tabele 10 i 11. Ostaci antitela B Fab u ovoj pokrivenoj zakrpi ne moraju biti uključeni u interakcije vezivanja sa ostacima IL-23 antigena, ali mutacija bilo kog pojedinačnog ostatka unutar prekrivenog sloja može da uvede energetske razlike koje mogu da utiču na vezivanje antitela B Fab sa humanim IL-23. Sa izuzetkom od Tyr49, svi ostaci locirani su u CDR regionima lakog i teškog lanca antitela B Fab. Ovi ostaci takođe su unutar 5A ili manje od 11-23 antigena kada su vezani sa antitelom B Fab, kako je opisano u Primeru 4.
[0226]Površinske razlike dostupnosti rastvarača na površini ostataka u kompleksu IL-23-Antitela E Fab izračunate su kako je opisan gore. Ostaci antitela E Fab koji su imali vrednost razlike >10 A<2>smatra se da su u značajnom kontaktu sa ostacima u IL-23 antigenu i ovi ostaci antitela E Fab najmanje su delimično do potpuno zaklonjeni kada je antitelo E Fab vezano sa humanim IL-23. Ovaj set ostataka antitela E Fab čine prekriveni sloj, pri čemu su ostaci uključeni u strukturu interfejsa kada je antitelo E Fab vezano sa humanim IL-23, videti Tabele 12 i 13. Ostaci antitela E Fab u ovoj prekrivenoj zakrpi ne moraju biti uključeni u interakcije vezivanja sa ostacima IL-23 antigena, ali mutacija bilo kog pojedinačnog ostatka unutar prekrivenog sloja može da uvede energetske razlike koje mogu da utiču na vezivanje antitela E Fab sa humanim IL-23. Za većinu delova, ovi ostaci pokrivene zakrpe locirani su unutar CDR regiona teških i lakih lanaca antitela E Fab. Ovi ostaci su takođe unutar 5A ili manji od IL-23 antigena kada je vezan sa antitelom E Fab, kako je opisano u Primeru 4.
[0227]Površinske razlike dostupnosti rastvarača na površini dela IL-23 heterodimera ograničenog paratopom antitela B Fab izračunate su postavljanjem IL-23 heterodimernih ostataka kao željeni set. je Primenjena je strukturalna informacija dobijena u Primeru 4 za kompleks antitela B Fab-IL-23, i izračunat je ostatak površinske dostupnosti rastvarača na površini amino kiselinskih ostataka IL-23 heterodimera u prisustvu antitela B Fab i predstavljaju granične površine za set.
[0228]Ostatak površinske dostupnosti rastvarača na površini svakog od IL-23 heterodimernih ostataka u odsustvu antitela B Fab izračunati su i predstavljaju slobodne površine seta.
[0229]Kako je opisano gore, granične površine su oduzete od slobodne površine što rezultira kao površinska razlika površine izložene u rastvaraču za svaki IL-23 ostatak. IL-23 heterodimerni ostaci koji nisu imali nikakvu promenu u površini, ili nula razlike, nisu imali kontakt sa ostacima antitela B Fab kada je kompleksiran. IL-23 heterodimerni ostaci koji su imali vrednost razlike >10 A2 smatra se da su u značajnom kontaktu sa ostacima antitela B Fab i ovi 11-23 heterodimerni ostaci were najmanje su delimično do potpuno preklopljeni kada je humani IL-23 heterodimer vezan sa antitelom B Fab. Ovaj set IL-23 heterodimernih ostataka čini prekriveni sloj, pri čemu su ostaci uključeni u strukturu interfejsa kada je humani IL-23 heterodimer vezan sa antitelom E Fab, videti Tabelu 14. 11-23 heterodimerni ostaci u ovoj prekrivenoj zakrpi ne moraju biti uključeni u interakcije vezivanja sa ostacima na antitelu B Fab, ali mutacija bilo kog pojedinačnog ostatka unutar prekrivenog sloja može da uvede energetske razlike koje mogu da utiču na vezivanje antitela B Fab za humani IL-23. Ovi ostaci takođe su unutar 4A ili manji od antitela B Fab, kako je opisano u Primeru 4.
[0230]Površinske razlike dostupnosti rastvarača na površini dela IL-23 heterodimera ograničenog paratopom antitela E Fab izračunate su kako je opisano gore. IL-23 heterodimerni ostaci koji su imali vrednost razlike >10 A<2>smatra se da su u značajnom kontaktu sa ostacima antitela E Fab i ovi 11-23 heterodimerni ostaci najmanje delimično do potpuno su prekriveni kada je humani IL-23 hetrerodimer vezan sa antitelom E Fab. Ovaj set IL-23 heterodimernih ostataka čini prekriveni sloj, pri čemu su ostaci uključeni u strukturu interfejsa kada je humani IL-23 heterodimer vezan sa antitelom E Fab, videti Tabelu 15.11-23 heterodimerni ostaci u ovoj prekrivenoj zakrpi ne moraju biti uključeni u interakcije vezivanja sa ostacima na antitelu E Fab, ali mutacija bilo kog pojedinačnog ostatka unutar prekrivenog sloja može da uvede energetske razlike koje mogu da utiču na vezivanje antitela E Fab za humani IL-23. Ovi ostaci su takođe unutar 5A ili manji od antitela E Fab, kako je opisano u Primeru 4.

Claims (17)

1. Antigen vezujući protein koji se vezuje za humani IL-23, pri čemu pomenuti antigen vezujući protein obuhvata: 0) (a) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata
CDRH1 koji ima SEOJD NO:91,
CDRH2 koji ima SEQ ID NO: 92 i
CDRH3 koji ima SEQ ID NO:93,
i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata
CDRL1 koji ima SEQ ID NO:62,
CDRL2 koji ima SEQ ID NO:63 i
CDRL3 koji ima SEQ ID NO:64;
ili (b) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata
CDRH1 koji ima SEQ ID N0:109,
CDRH2 koji ima SEQ ID NO: 116 i
CDRH3 koji ima SEQ ID N0:111,
i varijabilni region lakog lanca koji obuhvata
CDRL1 koji ima SEQ ID NO:80,
CDRL2 koji ima SEQ ID N0:81 i
CDRL3 koji ima SEQ ID NO:76;
i pri čemu se pomenuti antigen vezujući protein prema (a) ili (b) vezuje za humani IL-23 sa KDod < 5xlO"12M;
ili (ii) varijabilni region teškog lanca sa SEQ ID N0:31 i varijabilni region lakog lanca sa SEQ ID N0:1; ili varijabilni region teškog lanca sa SEQ ID NO:46 ili 153 i varijabilni region lakog lanca sa SEOJD NO:15;
pri čemu je pomenuti antigen vezujući protein monoklonalno antitelo, rekombinantno antitelo, humano antitelo, himerno antitelo, multispecifično antitelo, ili neki njihov fragment antitela.
2. Antigen vezujući protein prema zahtevu 1 deo (i)(a), pri čemu se pomenuti antigen vezujući protein vezuje za humani IL-23 sa KDod < 5xl0"<13>M.
3. Antigen vezujući protein prema zahtevu 1 deo (i)(b), pri čemu pomenuti antigen vezujući protein ima Koffbrzinu od < 5x10<6>l/s.
4. Antigen vezujući protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je pomenuti antigen vezujući protein antitelo, opciono antitelo IgGl-, lgG2- lgG3- ili lgG4-tipa.
5. Antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-3, u kojem (i) pomenuti fragment antitela je Fab fragment, Fab' fragment, F(ab'h fragment, Fv fragment, dijatelo, ili molekul jednolančanog antitela; (ii) pomenuti antigen vezujući protein je humano antitelo; ili (iii) pomenuti antigen vezujući protein je monoklonalno antitelo.
6. Molekul nukleinske kiseline, u kojem pomenuti molekul nukleinske kiseline kodira antigen vezujući protein prema bilo kom od prethodnih zahteva, pri čemu je pomenuti molekul nukleinske kiseline opciono operativno povezan za kontrolnu sekvencu.
7. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 6, u kojem molekul nukleinske kiseline obuhvata nukleinsku kiselinu varijabilnog regiona teškog lanca SECl ID NO: 32 i nukleinsku kiselinu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 2.
8. Molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 6, u kojem molekul nukleinske kiseline obuhvata nukleinsku kiselinu varijabilnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 47 i nukleinsku kiselinu varijabilnog regiona lakog lanca SEQ ID NO: 16.
9. Vektor koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva 6-8.
10. Ćelija domaćin koja obuhvata molekul nukleinske kiseline prema bilo kom od zahteva 6-8 ili vektor prema zahtevu 9.
11. Postupak pripreme antigen vezujućeg proteina prema bilo kom od zahteva 1-5 koji obuhvata fazu pripremanja pomenutog antigen vezujućeg proteina iz ćelije domaćina koja luči pomenuti antigen vezujući protein.
12. Antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu pomenuti antigen vezujući protein ima najmanje jednu osobinu odabranu iz grupe koju čine: a) smanjivanje aktivnosti humanog IL-23 u STAT-luciferaza ogledu; b) smanivanje proizvodnje prozapaljenskog citokina; c) sa Koff brzinom od < 5xl0"6 l/s; i d) sa IC50 od < 400 pM.
13. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata najmanje jedan antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-5 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
14. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 13, gde pomenuta farmaceutska kompozicija (i) dalje obuhvata grupu za obeležavanje ili grupu efektora; (ii) dalje obuhvata grupu za obeležavanje, gde je pomenuta grupa za obeležavanje odabrana iz grupe koju čine izotopni obeleživači, magnetni obeleživači, redoks aktivni ostaci, optičke boje, biotinilovane grupe i prethodno određeni polipeptidni epitopi koji se prepoznaju od strane sekundarnog reportera; (iii) dalje obuhvata grupu efektora, gde je pomenuta grupa efektora odabrana iz grupe koju čine radioizotop, radionuklid, toksin, terapeutska grupa i hemoterapeutska grupa; ili (iv) dalje obuhvata grupu za obeležavanje, gde je pomenuti antigen vezujući protein kuplovan sa grupom za obeležavanje.
15. Najmanje jedan antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-5 za upotrebu u tretiranju ili preveniranju stanja povezanog sa IL-23 kod pacijenta; pri čemu je stanje odabrano iz grupe koju čine (i) zapaljenski poremećaj, reumatoidni poremećaj, autoimuni poremećaj, onkološki poremećaj i gastrointestinalni poremećaj; ili (ii) multipla skleroza, reumatoidni artritis, kancer, psorijaza, bolest zapaljenja creva, Krovona bolest, ulcerativni kolitis, sistemski lupus eritematozus, psorijatični artritis, autoimuni miokarditis; dijabetes tipa 1 i ankilozni spondilitis.
16. Antigen vezujući protein za upotrebu prema zahtevu 15, u kojem se antigen-vezujući protein daje sam ili kao kombinovana terapija.
17. Najmanje jedan antigen vezujući protein prema bilo kom od zahteva 1-5 za upotrebu u terapiji, pri čemu pomenuti antigen vezujući protein smanjuje IL-23 aktivnost kod pacijenta i gde pomenuta IL-23 aktivnost indukuje proizvodnju prozapaljenskog citokina.
RS20170119A 2009-10-26 2010-10-26 Humani il-23 antigen vezujući proteini RS55666B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25498209P 2009-10-26 2009-10-26
US38128710P 2010-09-09 2010-09-09
PCT/US2010/054148 WO2011056600A1 (en) 2009-10-26 2010-10-26 Human il-23 antigen binding proteins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55666B1 true RS55666B1 (sr) 2017-06-30

Family

ID=43413789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170119A RS55666B1 (sr) 2009-10-26 2010-10-26 Humani il-23 antigen vezujući proteini

Country Status (39)

Country Link
US (9) US8722033B2 (sr)
EP (3) EP3656790A1 (sr)
JP (5) JP5930968B2 (sr)
KR (3) KR101652609B1 (sr)
CN (3) CN104761642A (sr)
AR (1) AR078778A1 (sr)
AU (1) AU2010315557B2 (sr)
BR (2) BR122020002402B8 (sr)
CA (2) CA3030092C (sr)
CL (1) CL2012001096A1 (sr)
CO (1) CO6531481A2 (sr)
CR (1) CR20120210A (sr)
CY (1) CY1118576T1 (sr)
EA (1) EA025366B1 (sr)
ES (1) ES2613236T3 (sr)
HK (1) HK1212357A1 (sr)
HR (1) HRP20170037T1 (sr)
HU (1) HUE030871T2 (sr)
IL (3) IL219241A (sr)
JO (1) JO3244B1 (sr)
LT (1) LT2493925T (sr)
MA (1) MA33757B1 (sr)
MX (1) MX358249B (sr)
MY (1) MY156286A (sr)
NZ (2) NZ599875A (sr)
PE (2) PE20161327A1 (sr)
PH (1) PH12012500771A1 (sr)
PL (1) PL2493925T3 (sr)
PT (1) PT2493925T (sr)
RS (1) RS55666B1 (sr)
SG (2) SG10201800682SA (sr)
SI (1) SI2493925T1 (sr)
SM (1) SMT201700069T1 (sr)
TN (1) TN2012000167A1 (sr)
TW (2) TWI432210B (sr)
UA (1) UA113609C2 (sr)
UY (1) UY32971A (sr)
WO (1) WO2011056600A1 (sr)
ZA (1) ZA201203058B (sr)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO3244B1 (ar) 2009-10-26 2018-03-08 Amgen Inc بروتينات ربط مستضادات il – 23 البشرية
MX2019000046A (es) 2010-11-04 2023-10-05 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-il-23.
BR112013018374A2 (pt) * 2011-01-25 2016-10-11 Monell Chemical Senses Centre composições e métodos para fornecer ou modular o sabor doce e métodos para rastrear os mesmos
EP2583979B1 (en) * 2011-10-19 2015-12-16 Effimune Methods to prepare antibodies directed against p19 subunit of human IL-23
PL3326649T3 (pl) * 2012-05-03 2022-04-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Przeciwciała anty-il-23p19
ES2729603T3 (es) 2012-06-27 2019-11-05 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos IL-23 antihumanos cristalinos
SG11201507483PA (en) * 2013-03-15 2015-10-29 Amgen Inc Methods for treating crohn's disease using an anti-il23 antibody
SG11201507482UA (en) * 2013-03-15 2015-10-29 Amgen Inc Methods for treating psoriasis using an anti-il-23 antibody
CA2927695C (en) 2013-10-21 2022-03-01 Dyax Corp. Diagnosis and treatment of autoimmune diseases
WO2015061183A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Dyax Corp. Assays for determining plasma kallikrein system biomarkers
JP2017513854A (ja) 2014-04-15 2017-06-01 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッドＳｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． Ｗｉｓｐ１に結合する抗原結合タンパク質
US10695406B2 (en) 2014-05-27 2020-06-30 The University Of Queensland Modulation of cellular stress using a B-cell oxidative and/or endoplasmic reticulum stress inhibitor and a targeting agent
AU2015289874A1 (en) 2014-07-14 2017-02-02 Amgen Inc. Crystalline antibody formulations
EP3708679A1 (en) 2014-07-24 2020-09-16 Boehringer Ingelheim International GmbH Biomarkers useful in the treatment of il-23a related diseases
EA202193002A2 (ru) 2014-09-03 2022-03-31 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Соединение, нацеленное на ил-23a и фно-альфа, и его применение
AU2016215535B2 (en) 2015-02-04 2021-09-16 Boehringer Ingelheim International Gmbh Methods of treating inflammatory diseases
CN108290058B (zh) 2015-09-17 2023-05-16 美国安进公司 使用il23途径生物标志物预测il23拮抗剂的临床应答
TWI811716B (zh) * 2015-09-18 2023-08-11 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 治療發炎性疾病之方法
EP4354146B1 (en) 2015-10-19 2026-04-15 Takeda Pharmaceutical Company Limited Immunoassay for the detection of cleaved high molecular weight kininogen
US11220541B2 (en) 2015-12-22 2022-01-11 Amgen Inc. CCL20 as a predictor of clinical response to IL23-antagonists
US10093731B2 (en) 2017-02-24 2018-10-09 Kindred Biosciences, Inc. Anti-IL31 antibodies for veterinary use
JOP20190248A1 (ar) * 2017-04-21 2019-10-20 Amgen Inc بروتينات ربط مولد ضد trem2 واستخداماته
WO2019023812A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 The Hospital For Sick Children VACCINE COMPOSITION AGAINST MALARIA AND METHOD THEREOF
WO2019023811A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 The Hospital For Sick Children NANOPARTICLE PLATFORM FOR ANTIBODY AND VACCINE DELIVERY
TWI744617B (zh) 2018-03-30 2021-11-01 美商美國禮來大藥廠 治療潰瘍性結腸炎之方法
CN112689643A (zh) * 2018-07-13 2021-04-20 阿斯特捷利康合作创业有限责任公司 用布雷库单抗治疗溃疡性结肠炎
GB201820687D0 (en) * 2018-12-19 2019-01-30 Kymab Ltd Antagonists
MA56124A (fr) * 2019-06-04 2022-04-13 Janssen Biotech Inc Méthode sûre et efficace de traitement de l'arthrite psoriasique au moyen d'un anticorps spécifique anti-il23
CN120441704A (zh) 2019-06-26 2025-08-08 圆祥生技股份有限公司 T细胞活化抗体
TW202535466A (zh) 2019-09-09 2025-09-16 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 抗-il-23p19抗體調配物
JP7758672B2 (ja) 2019-12-20 2025-10-22 ノヴァロック バイオセラピューティクス， リミテッド 抗インターロイキン－２３ ｐ１９抗体およびそれの使用方法
CN111718414B (zh) * 2020-06-12 2021-03-02 江苏荃信生物医药有限公司 抗人白介素23单克隆抗体及其应用
WO2022041390A1 (zh) * 2020-08-28 2022-03-03 江苏荃信生物医药股份有限公司 包含高浓度抗人白介素23单克隆抗体的低粘度液体制剂及其制备方法
TW202428304A (zh) 2020-09-10 2024-07-16 美商美國禮來大藥廠 治療性抗體調配物
CN114773466B (zh) * 2020-11-26 2023-08-29 江苏荃信生物医药股份有限公司 一种抗人白介素23及包含其的试剂盒及其检测方法
US20220373539A1 (en) * 2021-05-24 2022-11-24 Amgen Inc. Prediction of clinical response to il23-antagonists using il23 pathway biomarkers
JP2024526201A (ja) * 2021-06-25 2024-07-17 サンガモ セラピューティクス，インコーポレイテッド Ｉｌ－２３ｒに特異的な抗原結合体及びその使用
WO2023056417A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Eli Lilly And Company Anti-il-23p19 antibody regulation of genes involved in bowel urgency in ulcerative colitis
CN114994331B (zh) * 2022-05-17 2023-02-24 无锡科金生物科技有限公司 一种检测蛋白表达水平的试剂盒及其制备方法和应用
WO2024077113A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 Eli Lilly And Company Methods of treating fatigue in ulcerative colitis
WO2025083549A1 (en) 2023-10-16 2025-04-24 Sun Pharma Advanced Research Company Limited Methods and combinations of inhibitors of il-23 pathway and modulators of s1p signaling pathway for the treatment of autoimmune disorders
WO2026058045A1 (en) 2024-09-12 2026-03-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Alpha4beta7 inhibitor and il-23 inhibitor combination therapy
WO2026060205A1 (en) 2024-09-13 2026-03-19 Eli Lilly And Company PAN-ELR+ CXC CHEMOKINE ANTIBODIES AND IL-23p19 ANTIBODIES FOR THE TREATMENT OF ULCERATIVE COLITIS

Family Cites Families (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4751180A (en) 1985-03-28 1988-06-14 Chiron Corporation Expression using fused genes providing for protein product
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
EP0281604B1 (en) 1986-09-02 1993-03-31 Enzon Labs Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5011912A (en) 1986-12-19 1991-04-30 Immunex Corporation Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system
US4965195A (en) 1987-10-26 1990-10-23 Immunex Corp. Interleukin-7
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
AU643427B2 (en) 1988-10-31 1993-11-18 Immunex Corporation Interleukin-4 receptors
US5457038A (en) 1988-11-10 1995-10-10 Genetics Institute, Inc. Natural killer stimulatory factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5780597A (en) 1989-12-22 1998-07-14 Hoffmann-La Roche Inc. Monoclonal antibodies to cytotoxic lymphocyte maturation factor
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6713610B1 (en) 1990-01-12 2004-03-30 Raju Kucherlapati Human antibodies derived from immunized xenomice
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
WO1991018982A1 (en) 1990-06-05 1991-12-12 Immunex Corporation Type ii interleukin-1 receptors
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0590076A4 (en) 1991-06-14 1997-02-12 Dnx Corp Production of human hemoglobin in transgenic pigs
CA2113113A1 (en) 1991-07-08 1993-01-21 Simon W. Kantor Thermotropic liquid crystal segmented block copolymer
EP0613495B1 (en) 1991-11-14 2005-02-02 WEISSMANN, Charles Transgenic non-human animals lacking prion proteins
US5262522A (en) 1991-11-22 1993-11-16 Immunex Corporation Receptor for oncostatin M and leukemia inhibitory factor
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
PT672141E (pt) 1992-10-23 2003-09-30 Immunex Corp Metodos de preparacao de proteinas oligomericas soluveis
US5457035A (en) 1993-07-23 1995-10-10 Immunex Corporation Cytokine which is a ligand for OX40
CA2722378C (en) 1996-12-03 2015-02-03 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that bind tnf.alpha.
CA2196496A1 (en) 1997-01-31 1998-07-31 Stephen William Watson Michnick Protein fragment complementation assay for the detection of protein-protein interactions
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
ZA986596B (en) 1997-07-25 1999-02-08 Schering Corp Mammalian cytokine related reagents
US6060284A (en) 1997-07-25 2000-05-09 Schering Corporation DNA encoding interleukin-B30
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
CN100374159C (zh) * 1998-03-17 2008-03-12 中外制药株式会社 一种包含il-6拮抗剂活性成分的炎性肠道疾病的预防或治疗剂
DE69942607D1 (de) 1998-04-14 2010-09-02 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Neues cytokinartiges protein
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US7883704B2 (en) 1999-03-25 2011-02-08 Abbott Gmbh & Co. Kg Methods for inhibiting the activity of the P40 subunit of human IL-12
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
US7090847B1 (en) 1999-09-09 2006-08-15 Schering Corporation Mammalian cytokines; related reagents and methods
AU780163B2 (en) 1999-09-09 2005-03-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Mammalian interleukin-12 P40 and interleukin B30, combinations thereof, antibodies, uses in pharmaceutical compositions
WO2004042009A2 (en) 2002-10-30 2004-05-21 Genentech, Inc. Inhibition of il-17 production
WO2004058178A2 (en) 2002-12-23 2004-07-15 Schering Corporation Uses of mammalian cytokine; related reagents
US20040219150A1 (en) 2003-02-06 2004-11-04 Cua Daniel J. Uses of mammalian cytokine; related reagents
US7282204B2 (en) 2003-03-10 2007-10-16 Schering Corporation Uses of IL-23 agonists and antagonists; related reagents
CN101052726A (zh) 2003-05-09 2007-10-10 森托科尔公司 IL－23p40特异性免疫球蛋白衍生蛋白、组合物、方法和用途
US20050287593A1 (en) 2004-05-03 2005-12-29 Schering Corporation Use of cytokine expression to predict skin inflammation; methods of treatment
BRPI0510617A (pt) 2004-05-03 2007-10-30 Schering Corp uso de expressão de il-17 para prever inflamação de pele; processos de tratamento
AR051444A1 (es) 2004-09-24 2007-01-17 Centocor Inc Proteinas derivadas de inmunoglobulina especifica de il-23p40, composiciones, epitopos, metodos y usos
US7820168B2 (en) 2004-12-20 2010-10-26 Schering Corporation Treatment of diabetes using antibodies to IL-23, IL-23 receptor and IL-17
MY157915A (en) 2004-12-21 2016-08-15 Centocor Inc Anti-il-12 antibodies, epitopes, compositions, methods and uses.
SI2452694T1 (sl) * 2005-06-30 2019-05-31 Janssen Biotech, Inc. Protitelesa proti-IL-23, sestavki in postopki uporabe
CN103145842A (zh) 2005-06-30 2013-06-12 Abbvie公司 Il-12/p40结合蛋白
DE602006015830D1 (de) 2005-08-25 2010-09-09 Lilly Co Eli Anti-il-23-antikörper
PT1931710T (pt) 2005-08-31 2017-03-28 Merck Sharp & Dohme Anticorpos anti-il-23 manipulados
CN1955248B (zh) 2005-10-28 2011-10-12 安集微电子（上海）有限公司 钽阻挡层用化学机械抛光浆料
CN101389769A (zh) 2005-12-28 2009-03-18 森托科尔公司 用于评价和治疗银屑病及相关疾病的标记与方法
HUE034269T2 (en) 2005-12-29 2018-02-28 Janssen Biotech Inc Human anti-IL-23 antibodies, preparations, methods and applications
US7910703B2 (en) 2006-03-10 2011-03-22 Zymogenetics, Inc. Antagonists to IL-17A, IL-17F, and IL-23P19 and methods of use
US7790862B2 (en) 2006-06-13 2010-09-07 Zymogenetics, Inc. IL-17 and IL-23 antagonists and methods of using the same
KR20090100461A (ko) * 2007-01-16 2009-09-23 아보트 러보러터리즈 건선의 치료방법
TWI426918B (zh) 2007-02-12 2014-02-21 Merck Sharp & Dohme Ｉｌ-２３拮抗劑於治療感染之用途
ES2708988T3 (es) 2007-02-23 2019-04-12 Merck Sharp & Dohme Anticuerpos anti-IL-23p19 obtenidos por ingeniería genética
JP2010518858A (ja) * 2007-02-23 2010-06-03 シェーリング コーポレイション 操作された抗−ｉｌ−２３ｐ１９抗体
AR068723A1 (es) 2007-10-05 2009-12-02 Glaxo Group Ltd Proteina que se une a antigenos que se une a il-23 humana y sus usos
EP2650311A3 (en) 2007-11-27 2014-06-04 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against heterodimeric cytokines and/or their receptors and polypeptides comprising the same
WO2009082624A2 (en) * 2007-12-10 2009-07-02 Zymogenetics, Inc. Antagonists of il-17a, il-17f, and il-23 and methods of using the same
WO2009117289A2 (en) 2008-03-18 2009-09-24 Abbott Laboratories Methods for treating psoriasis
KR20160116056A (ko) 2008-08-14 2016-10-06 테바 파마슈티컬즈 오스트레일리아 피티와이 엘티디 항-ｉｌ-12/ｉｌ-23 항체
EP2331078B1 (en) 2008-08-27 2012-09-19 Merck Sharp & Dohme Corp. Lyophilized formulations of engineered anti-il-23p19 antibodies
US20120128689A1 (en) 2009-04-01 2012-05-24 Glaxo Group Limited Anti-il-23 immunoglobulins
WO2010115092A2 (en) 2009-04-02 2010-10-07 The Johns Hopkins University Compositions and methods for treating or preventing inflammatory bowel disease and colon cancer
US20120264917A1 (en) 2009-05-27 2012-10-18 Ablynx N.V. Biparatopic protein constructs directed against il-23
SG179135A1 (en) 2009-09-14 2012-05-30 Abbott Lab Methods for treating psoriasis
JO3244B1 (ar) * 2009-10-26 2018-03-08 Amgen Inc بروتينات ربط مستضادات il – 23 البشرية
PH12012501364A1 (en) 2010-01-15 2012-10-22 Amgen K A Inc Antibody formulation and therapeutic regimens
JP2013520426A (ja) 2010-02-18 2013-06-06 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｉｌ−２３に結合する、フィブロネクチンをベースとする足場ドメインタンパク質
WO2012009760A1 (en) 2010-07-20 2012-01-26 Cephalon Australia Pty Ltd Anti-il-23 heterodimer specific antibodies
CN103813804A (zh) 2010-10-06 2014-05-21 Abbvie公司 用于治疗银屑病的方法
CN103154031A (zh) 2010-10-08 2013-06-12 诺华有限公司 利用il-17拮抗剂治疗牛皮癣的方法
MX2019000046A (es) 2010-11-04 2023-10-05 Boehringer Ingelheim Int Anticuerpos anti-il-23.
TW201242976A (en) 2011-01-07 2012-11-01 Abbott Lab Anti-IL-12/IL-23 antibodies and uses thereof
SG11201507483PA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Amgen Inc Methods for treating crohn's disease using an anti-il23 antibody
CN108290058B (zh) 2015-09-17 2023-05-16 美国安进公司 使用il23途径生物标志物预测il23拮抗剂的临床应答
US11220541B2 (en) 2015-12-22 2022-01-11 Amgen Inc. CCL20 as a predictor of clinical response to IL23-antagonists
CN112689643A (zh) 2018-07-13 2021-04-20 阿斯特捷利康合作创业有限责任公司 用布雷库单抗治疗溃疡性结肠炎
US20210079086A1 (en) 2019-08-21 2021-03-18 Astrazeneca Collaboration Ventures, Llc Use of Brazikumab to Treat Crohn's Disease

Also Published As

Publication number Publication date
US9487580B2 (en) 2016-11-08
PE20161327A1 (es) 2016-12-03
UA113609C2 (xx) 2017-02-27
JP7278355B2 (ja) 2023-05-19
WO2011056600A1 (en) 2011-05-12
UY32971A (es) 2010-11-30
KR20140062186A (ko) 2014-05-22
HK1212357A1 (en) 2016-06-10
US20140212428A1 (en) 2014-07-31
BR112012009854B1 (pt) 2020-12-15
BR112012009854A2 (pt) 2016-11-22
BR122020002402B1 (pt) 2022-02-08
TW201121567A (en) 2011-07-01
SG10202103260TA (en) 2021-05-28
TWI432210B (zh) 2014-04-01
CR20120210A (es) 2012-07-20
MX358249B (es) 2018-08-10
NZ599875A (en) 2014-10-31
CL2012001096A1 (es) 2012-09-28
MA33757B1 (fr) 2012-11-01
IL219241A0 (en) 2012-06-28
US12012449B2 (en) 2024-06-18
IL244801A0 (en) 2016-04-21
NZ625630A (en) 2016-09-30
US20170002070A1 (en) 2017-01-05
KR101568461B1 (ko) 2015-11-12
JP2022033730A (ja) 2022-03-02
US20190071498A1 (en) 2019-03-07
MX2012004868A (es) 2012-08-03
JO3244B1 (ar) 2018-03-08
MY156286A (en) 2016-01-29
CA3030092C (en) 2023-12-19
US8722033B2 (en) 2014-05-13
US20200181255A1 (en) 2020-06-11
HUE030871T2 (en) 2017-06-28
SI2493925T1 (sl) 2017-05-31
PL2493925T3 (pl) 2017-09-29
EP2493925A1 (en) 2012-09-05
HRP20170037T1 (hr) 2017-03-10
AU2010315557B2 (en) 2014-02-27
KR20120090091A (ko) 2012-08-16
US9951129B2 (en) 2018-04-24
CA2778112A1 (en) 2011-05-12
CA3030092A1 (en) 2011-05-12
JP2020018308A (ja) 2020-02-06
CN110407936A (zh) 2019-11-05
IL219241A (en) 2016-03-31
KR20160118278A (ko) 2016-10-11
ZA201203058B (en) 2013-01-30
PH12012500771A1 (en) 2012-11-26
KR101652609B1 (ko) 2016-08-30
CN104761642A (zh) 2015-07-08
PE20121579A1 (es) 2012-12-13
LT2493925T (lt) 2017-04-25
IL274871A (en) 2020-07-30
ES2613236T3 (es) 2017-05-23
HK1177469A1 (en) 2013-08-23
SMT201700069T1 (it) 2017-05-08
SG10201800682SA (en) 2018-03-28
TN2012000167A1 (en) 2013-12-12
EP3656790A1 (en) 2020-05-27
PT2493925T (pt) 2017-02-14
AU2010315557A1 (en) 2012-09-20
US20210024626A1 (en) 2021-01-28
US20130004501A1 (en) 2013-01-03
JP2016102122A (ja) 2016-06-02
US20190322737A1 (en) 2019-10-24
CA2778112C (en) 2019-02-26
JP2013507991A (ja) 2013-03-07
CN102741285B (zh) 2015-03-25
JP5930968B2 (ja) 2016-06-08
JP7023908B2 (ja) 2022-02-22
EA201270571A1 (ru) 2012-09-28
AR078778A1 (es) 2011-11-30
BR112012009854A8 (pt) 2019-10-08
BR112012009854B8 (pt) 2021-05-25
CY1118576T1 (el) 2017-07-12
JP2018117626A (ja) 2018-08-02
US20220056122A1 (en) 2022-02-24
EP2493925B1 (en) 2016-11-23
IL244801B (en) 2020-05-31
US20210230267A1 (en) 2021-07-29
TW201417830A (zh) 2014-05-16
EP3181586A1 (en) 2017-06-21
CN102741285A (zh) 2012-10-17
CO6531481A2 (es) 2012-09-28
EA025366B1 (ru) 2016-12-30
BR122020002402B8 (pt) 2022-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12012449B2 (en) Human IL-23 antigen binding proteins
HK40030834A (en) Human il-23 antigen binding proteins
HK1240241A1 (en) Human il-23 antigen binding proteins
AU2017200537A1 (en) Human IL-23 antigen binding proteins
EP3946592A2 (en) Patient populations amenable to il23-antagonist therapy
HK1177469B (en) Human il-23 antigen binding proteins