TW201417830A - 人類ｉｌ－２３抗原結合蛋白 - Google Patents

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Yu Zhang
Yu Sun
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Abstract

本發明提供結合於人類IL-23蛋白之抗原結合蛋白。亦提供編碼該抗原結合蛋白之核酸、載體，及編碼其之細胞，以及IL-23抗原結合蛋白用於診斷及治療目的之用途。

Description

人類IL-23抗原結合蛋白
本申請案根據35 U.S.C.119(e)主張2009年10月26日申請之美國專利申請案第61/254,982號及2010年9月9日申請之美國專利申請案第61/381,287號的權益，該等專利以引用的方式併入本文中。
介白素23(IL-23)為一種雜二聚細胞激素，其為促發炎細胞激素之有效誘導劑。IL-23與雜二聚細胞激素介白素12(IL-12)有關，兩者共享一共有p40次單元。在IL-23中，獨特p19次單元共價結合於p40次單元。在IL-12中，獨特次單元為p35(Oppmann等人，Immunity,2000,13：713-715)。IL-23雜二聚蛋白為分泌型蛋白質。類似IL-12，IL-23由抗原呈現細胞(諸如樹突狀細胞及巨噬細胞)回應於活化刺激(諸如CD40連接、Toll樣受體促效劑及病原體)而表現。IL-23結合包含IL-12Rβ1次單元(其係與IL-12受體共享)及獨特受體次單元IL-23R之雜二聚受體。IL-12受體由IL-12Rβ1及IL-12Rβ2組成。IL-23結合其雜二聚受體且經由JAK2及Tyk2進行信號傳導以活化STAT1、3、4及5(Parham 等人，J.Immunol.2002,168：5699-708)。該受體之次單主要共表現於活化或記憶T細胞及天然殺手細胞上並且亦以低含量共表現於樹突狀細胞、單核細胞、巨噬細胞、微神經膠質細胞、角質細胞及滑液纖維母細胞上。IL-23及IL-12作用於不同T細胞子集且在活體內起實質上不同的作用。
IL-23作用於活化及記憶T細胞且促進T細胞子集Th17之存活及擴 增。Th17細胞產生促發炎細胞激素，包括IL-6、IL-17、TNFα、IL-22及GM-CSF。IL-23亦作用於天然殺手細胞、樹突狀細胞及巨噬細胞以誘導促發炎細胞激素表現。不同於IL-23，IL-12誘導原生CD4+ T細胞分化成產生IFNγ之成熟Th1效應細胞，且藉由刺激IFNγ產生來誘導NK及細胞毒性T細胞功能。以前認為由IL-12驅動之Th1細胞為許多自體免疫性疾病中之病原性T細胞子集，然而，在發炎性腸病、牛皮癬、發炎性關節炎及多發性硬化症之模型(評估IL-12與IL-23之個別作用)中的最新近動物研究已明確確定IL-23而非IL-12為自體免疫性/發炎性疾病之關鍵驅動者(Ahern等人，Immun.Rev.2008 226：147-159；Cua等人，Nature 2003 421：744-748；Yago等人，Arthritis Res and Ther.2007 9(5)：R96)。咸信IL-12在對許多細胞內病原體及病毒之保護性先天及應變性免疫反應的發展中及在腫瘤免疫監視中起關鍵作用。參見Kastelein等人，Annual Review of Immunology,2007,25：221-42；Liu 等人，Rheumatology,2007,46(8)：1266-73；Bowman等人，Current Opinion in Infectious Diseases,2006 19：245-52；Fieschi及Casanova,Eur.J.Immunol.2003 33：1461-4；Meeran等人，Mol.Cancer Ther.2006 5：825-32；Langowski等人，Nature 2006 442：461-5。因此，與IL-12及IL-23之雙重抑制相比，IL-23特異性抑制(不破壞IL-12或共享之p40次單元)應具有潛在優良的安全概況。
因此，使用抑制人類IL-23且不破壞IL-12之IL-23特異性拮抗劑(諸如結合至少獨特p19次單元或結合IL-23之p19與p40次單元兩者的抗體)應提供等於或大於IL-12拮抗劑或p40拮抗劑之功效而無與抑制IL-12相關之潛在危險。已描述選用於抑制重組IL-23之鼠類、人類化及噬菌體呈現抗體；參見例如美國專利7,491,391、WIPO公開案WO1999/05280、WO2007/0244846、WO2007/027714、WO2007/076524、WO2007/147019、WO2008/103473、 WO2008/103432、WO2009/043933及WO2009/082624。然而，對能夠抑制原生人類IL-23之完全人類治療劑存在需要。該等治療劑對於目標、尤其活體內目標具有高度特異性。對活體內目標之完全抑制會使得調配物劑量較低、給藥較不頻繁及/或更有效，此又會使得成本降低及效率增加。本發明提供該等IL-23拮抗劑。
本發明提供結合IL-23、尤其原生人類IL-23之抗原結合蛋白。人類IL-23抗原結合蛋白可減少、抑制、干擾及/或調節至少一種與IL-23有關之生物反應，且因此，適用於改善IL-23相關性疾病或病症之影響。IL-23抗原結合蛋白可例如用於減少、抑制、干擾及/或調節IL-23信號傳導、Th17細胞之IL-23活化、NK細胞之IL-23活化，或促發炎細胞激素之誘導產生。
亦提供用於產生IL-23抗原結合蛋白之表現系統，包括細胞株，及診斷及治療與人類IL-23有關之疾病的方法。
所提供之一些結合IL-23之抗原結合蛋白包含至少一個重鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的CDRH1、CDRH2及CDRH3：與表3如中所示之CDRH1有不超過一個胺基酸取代、插入或缺失不同之CDRH1；與如表3中所示之CDRH2有不超過三個、兩個或一個胺基酸取代、插入及/或缺失不同之CDRH2；與如表3中所示之CDRH3有不超過三個、兩個或一個胺基酸取代、插入及/或缺失不同之CDRH3；且包含至少一個輕鏈可變區，其包含選自由以下組成之群的CDRL1、CDRL2及CDRL3：與如表3中所示之CDRL1有不超過三個、兩個或一個胺基酸取代、插入及/或缺失不同之CDRL1；與如表3中所示之CDRL2有不超過三個、兩個或一個胺基酸取代、插入及/或缺失不同之CDRL2；與如表3中所示之CDRL3有不超過三個、兩個或一個胺基酸取代、插入及/或缺失不同之CDRL3。在一實施例中，提供經分離 之抗原結合蛋白，其包含：選自由SEQ ID NO：91、94、97、100及103組成之群的CDRH1；選自由SEQ ID NO：92、95、98、101、104、107及110組成之群的CDRH2；選自由SEQ ID NO：93、96、99、102及105組成之群的CDRH3；選自由SEQ ID NO：62、65、68、71及74組成之群的CDRL1；選自由SEQ ID NO：63、66、69、72、75及78組成之群的CDRL2；及選自由SEQ ID NO：64、67、70及73組成之群的CDRL3。在另一實施例中，提供經分離之抗原結合蛋白，其包含：選自由SEQ ID NO：91、106、109、112及115組成之群的CDRH1；選自由SEQ ID NO：113、116、118、120、121及122組成之群的CDRH2；選自由SEQ ID NO：108、111、114、117及119組成之群的CDRH3；選自由SEQ ID NO：77、80、83、85、86、87、88、89及90組成之群的CDRL1：CDRL2為SEQ ID NO：81；及選自由SEQ ID NO：76、79、82及84組成之群的CDRL3。在另一實施例中，提供一種經分離之抗原結合蛋白，其包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區。在另一實施例中，提供一種如上文所述之經分離之抗原結合蛋白，其包含至少兩個重鏈可變區及至少兩個輕鏈可變區。在另一實施例中，提供一種經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白偶合於標記基團。
亦提供結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其選自由以下組成之群：a)具有SEQ ID NO：129之CDRH1、SEQ ID NO：132之CDRH2、SEQ ID NO：136之CDRH3以及SEQ ID NO：123之CDRL1、SEQ ID NO：81之CDRL2及SEQ ID NO：76之CDRL3的抗原結合蛋白；b)具有SEQ ID NO：131之CDRH1、SEQ ID NO：134之CDRH2、SEQ ID NO：137之CDRH3以及SEQ ID NO：124之CDRL1、SEQ ID NO126之CDRL2及SEQ ID NO：128之CDRL3的抗原結合蛋白；c)具有SEQ ID NO：130之CDRH1、SEQ ID NO：133之CDRH2、SEQ ID NO：99之CDRH3以及SEQ ID NO：68之CDRL1、SEQ ID NO：69之CDRL2及SEQ ID NO：67之CDRL3的抗原結合蛋白；及d)具有CDRH1 SEQ ID NO：91、CDRH2 SEQ ID NO：135、CDRH3 SEQ ID NO：138以及CDRL1 SEQ ID NO：125、CDRL2 SEQ ID NO：127及CDRL3 SEQ ID NO：64之抗原結合蛋白。
亦提供結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其包含選自由以下組成之群的至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區：包含SEQ ID NO：31之胺基酸殘基31-35、50-65及99-113的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：1之胺基酸殘基23-36、52-58及91-101的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：34之胺基酸殘基31-35、50-65及99-110的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：36之胺基酸殘基31-35、50-66及99-110的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：4之胺基酸殘基23-36、52-62及97-105的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：38之胺基酸殘基31-35、50-66及99-114的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：7之胺基酸殘基23-34、50-61及94-106的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：40之胺基酸殘基31-35、50-66及99-114的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：9之胺基酸殘基24-34、50-56及94-106的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：42之胺基酸殘基31-35、50-66及99-114的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：11之胺基酸殘基23-34、50-61及94-106的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：44之胺基酸殘基31-35、50-65及98-107的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：13之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：153之胺基酸殘基31-37、52-67及100-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：15之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：48之胺基酸殘基31-37、52-67及100-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：17之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：50之胺基酸殘基31-37、52-67及101-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：19之胺基酸殘基24-34、50-56及89- 97的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：52之胺基酸殘基31-35、50-65及98-107的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：21之胺基酸殘基24-34、50-56及98-107的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：54之胺基酸殘基31-37、52-67及100-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：23之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區；包含SEQ ID NO：56之胺基酸殘基31-37、52-67及100-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：25之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區；及包含SEQ ID NO：58之胺基酸殘基31-37、52-57及100-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：27之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區。
本文提供一種結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區及輕鏈可變區，其中該重鏈可變區序列與如表2中所示之重鏈可變區序列有不超過13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加及/或缺失不同；且其中該輕鏈可變區序列與如表1中所示之輕鏈可變區序列有不超過13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸取代、添加及/或缺失不同。
亦提供一種結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其選自由以下組成之群：a)SEQ ID NO：140之重鏈可變區及SEQ ID NO：30之輕鏈可變區；b)SEQ ID NO：141之重鏈可變區及SEQ ID NO：61之輕鏈可變區；c)SEQ ID NO：142之重鏈可變區及SEQ ID NO：4之輕鏈可變區；及d)SEQ ID NO：143之重鏈可變區及SEQ ID NO：139之輕鏈可變區。
亦提供一種經分離之抗原結合蛋白，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含與SEQ ID NO：31、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56及58具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列；及輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含與SEQ ID NO：1、4、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25及27具有至少90%序列一致性之胺基酸序列。在另一實施例中，為一種經分離之抗 原結合蛋白，其包含選自由SEQ ID NO：44、46、48、50、52、54、56、58及153組成之群的重鏈可變區，及選自由SEQ ID NO：13、15、17、19、21、23、25及27組成之群的輕鏈可變區。在另一實施例中，為一種經分離之抗原結合蛋白，其包含選自由SEQ ID NO：31、34、36、38、40及42組成之群的重鏈可變區，及選自由SEQ ID NO：1、4、7、9及11組成之群的輕鏈可變區。
亦提供一種結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區及輕鏈可變區：a)SEQ ID NO：31之重鏈可變區及SEQ ID NO：1之輕鏈可變區；b)SEQ ID NO：34或36之重鏈可變區及SEQ ID NO：4之輕鏈可變區；c)SEQ ID NO：38之重鏈可變區及SEQ ID NO：7之輕鏈可變區；d)SEQ ID NO：40之重鏈可變區及SEQ ID NO：9之輕鏈可變區；e)SEQ ID NO：42之重鏈可變區及SEQ ID NO：11之輕鏈可變區；f)SEQ ID NO：44之重鏈可變區及SEQ ID NO：13之輕鏈可變區；g)SEQ ID NO：46或SEQ ID NO：153之重鏈可變區及SEQ ID NO：15之輕鏈可變區；h)SEQ ID NO：48之重鏈可變區及SEQ ID NO：17之輕鏈可變區；i)SEQ ID NO：50之重鏈可變區及SEQ ID NO：19之輕鏈可變區；j)SEQ ID NO：52之重鏈可變區及SEQ ID NO：21之輕鏈可變區；k)SEQ ID NO：54之重鏈可變區及SEQ ID NO：23之輕鏈可變區；l)SEQ ID NO：56之重鏈可變區及SEQ ID NO：25之輕鏈可變區；及m)SEQ ID NO：58之重鏈可變區及SEQ ID NO：27之輕鏈可變區。
亦提供一種結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其包含至少一個包含CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區，其中該CDRH1包含根據AHO編號系統位置33之絲胺酸、位置34及38之甘胺酸、及位置39及40之酪胺酸；該CDRH2包含根據AHO編號系統位置59之組胺酸、位置67之天冬醯胺、位置68之蘇胺酸、位置69之酪胺酸、及位置75之離胺酸；且該CDRH3包含根據AHO編號系統位置110之精胺酸、位置 111之甘胺酸、位置112之苯丙胺酸、及位置133及134之酪胺酸；及至少一個包含CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中該CDRL1包含根據AHO編號系統位置32及33之絲胺酸、及位置40之色胺酸；該CDRL2包含根據AHO編號系統位置58之丙胺酸、位置68、69及72之絲胺酸殘基；且該CDRL3包含根據AHO編號系統位置110之天冬醯胺、及位置135之苯丙胺酸。在一實施例中，至少一個重鏈可變區包含根據AHO編號系統位置33及65之絲胺酸、位置34、38及111之甘胺酸、位置39、40、69、133及134之酪胺酸、位置59之組胺酸、位置67之天冬醯胺、位置68之蘇胺酸、位置75之離胺酸、位置110之精胺酸、及位置112之苯丙胺酸；且至少一個輕鏈可變區包含根據AHO編號系統位置32、33、68、69、72及111之絲胺酸、位置40之色胺酸、位置57之酪胺酸、位置58及109之丙胺酸、位置110之天冬醯胺、及位置135及137之苯丙胺酸。在其他實施例中，提供一種重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：46具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列；及一種輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：15具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
亦提供一種結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其包含至少一個包含CDRH1、CDRH2及CDRH3之重鏈可變區，其中該CDRH1包含根據AHO編號系統位置33之絲胺酸、及位置39之酪胺酸；該CDRH2包含根據AHO編號系統位置59之色胺酸、及位置60及69之酪胺酸；且該CDRH3包含根據AHO編號系統位置111之甘胺酸、位置112及132之酪胺酸、位置114及115之絲胺酸、位置131之色胺酸、及位置133之脯胺酸；及至少一個包含CDRL1、CDRL2及CDRL3之輕鏈可變區，其中該CDRL1包含根據AHO編號系統位置33之丙胺酸、位置34之甘胺酸、位置39之酪胺酸、及位置40之天冬胺酸；該CDRL2包含根據 AHO編號系統位置58之甘胺酸、及位置69之天冬醯胺；且該CDRL3包含根據AHO編號系統位置109之酪胺酸、及位置135之絲胺酸。在一實施例中，提供至少一種重鏈可變區，其包含根據AHO編號系統位置1之麩胺酸、位置27及111之甘胺酸、位置30及113之蘇胺酸、位置32、33、114及115之絲胺酸、位置39、60、69、112及132之酪胺酸、位置59及131之色胺酸、位置86之離胺酸、位置110之精胺酸、及位置133之脯胺酸；及至少一種輕鏈可變區，其包含根據AHO編號系統位置31之蘇胺酸、位置33之丙胺酸、位置34及58之甘胺酸、位置39、57及109之酪胺酸、位置40之天冬胺酸、位置69之天冬醯胺、位置82之離胺酸、位置135之絲胺酸、及位置137之色胺酸。在其他實施例中，提供一種重鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：31具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列；及一種輕鏈可變區，其包含與SEQ ID NO：1具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性之胺基酸序列。
亦提供一種如上文所述之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為抗體。在一實施例中，提供一種經分離之抗原結合蛋白，其中該抗體為單株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體或其抗體片段。在另一實施例中，提供一種經分離之抗原結合蛋白，其中該抗體片段為Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體(diabody)或單鏈抗體分子。在另一實施例中，提供一種經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為人類抗體。在又一實施例中，提供一種經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為單株抗體。在另一實施例中，提供一種經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。在另一實施例中，提供一種經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為 IgG1或IgG2型。
亦提供一種編碼如上文所述之抗原結合蛋白的經分離之核酸分子。在一實施例中，提供一種經分離之核酸分子，其中至少一個重鏈可變區由選自由SEQ ID NO：32、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59及152組成之群的經分離之核酸分子編碼且至少一個輕鏈可變區由選自由SEQ ID NO：2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26及28組成之群的經分離之核酸分子編碼。在另一實施例中，提供一種核酸分子，其中該核酸分子可操作地連接於控制序列。在另一實施例中，提供一種載體，其包含如上文所述之核酸分子。在另一實施例中，提供一種宿主細胞，其包含如上文所述之核酸分子。在另一實施例中，提供一種宿主細胞，其包含上述載體。在另一實施例中，提供一種足以用作雜交探針、PCR引子或定序引子之經分離之聚核苷酸，其為如上文所述之核酸分子的片段或其互補序列。
亦提供一種製備如上文所述之抗原結合蛋白的方法，其包含自分泌該抗原結合蛋白之宿主細胞製備該抗原結合蛋白的步驟。
亦提供一種結合人類IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白結合人類IL-23之p19次單元的A、C及D螺旋之每一者而非B螺旋中的至少一個胺基酸殘基。
亦提供一種結合人類IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白結合SEQ ID NO：145之殘基46-58中之至少一個或多個殘基、殘基112-123中之至少一個或多個殘基及殘基155-163中之至少一個或多個殘基。在一實施例中，當抗原結合蛋白結合於人類IL-23時，SEQ ID NO：145之殘基46-58中之殘基、殘基112-123中之殘基及殘基155-163中之殘基具有大於或等於10Å2之差值。在一相關實施例中，SEQ ID NO：145之殘基46、47、49、50、53、112-116、118、 120、155、156、159、160及163具有大於或等於10Å2之差值。在另一相關實施例中，當抗原結合蛋白結合於人類IL-23時，SEQ ID NO：147之殘基121-125中之殘基具有大於或等於10Å2之差值。在另一實施例中，當抗原結合蛋白結合於人類IL-23時，抗原結合蛋白距離SEQ ID NO：145之殘基46-58中之殘基、殘基112-123中之殘基及殘基155-163中之殘基為5Å或更小。在一相關實施例中，當抗原結合蛋白結合於人類IL-23時，抗原結合蛋白距離SEQ ID NO：145之殘基46-50、113-116、120、156、159、160及163為5Å或更小。在另一相關實施例中，當抗原結合蛋白結合於人類IL-23時，抗原結合蛋白距離SEQ ID NO：147之殘基121-125中之殘基為5Å或更小。
亦提供一種如上文所述之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白具有至少一種選自由以下組成之群的性質：a)降低人類IL-23活性；b)減少促發炎細胞激素產生；c)以5×10-8 M之KD結合於人類IL-23；d)具有5×10-6 l/s之Koff速率；及d)具有400 pM之IC50。
提供一種醫藥組合物，其包含至少一種如上文所述之抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之賦形劑。在一實施例中，提供一種醫藥組合物，其進一步包含標記基團或效應基團。在另一實施例中，提供一種醫藥組合物，其中該標記基團係選自由以下組成之群：同位素標記、磁性標記、氧化還原活性部分、光學染料、生物素化基團，及由第二報導體識別之預定多肽抗原決定基。在另一實施例中，提供一種醫藥組合物，其中該效應基團係選自由以下組成之群：放射性同位素、放射性核種、毒素、治療基團及化學治療基團。
亦提供一種治療或預防患者之與IL-23相關之病狀的方法，其包含向有需要之患者投與有效量之至少一種如上文所述的經分離之抗原結合蛋白。在一實施例中，提供一種方法，其中該病狀係選自由發炎性病症、風濕性病症、自體免疫性病症、致癌病症及腸胃病症組成之 群。在另一實施例中，提供一種方法，其中該病狀係選自由以下組成之群：多發性硬化症、類風濕性關節炎、癌症、牛皮癬、發炎性腸病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬性關節炎、自體免疫性心肌炎；第1型糖尿病及僵直性脊椎炎。在又一實施例中，提供一種方法，其中該經分離之抗原結合蛋白係單獨投與或以組合療法形式投與。
亦提供一種降低患者之IL-23活性的方法，其包含投與有效量之至少一種如上文所述的抗原結合蛋白。在一實施例中，提供一種降低IL-23活性之方法，其中該IL-23活性為誘導促發炎細胞激素產生。
圖1A：使用重組人類IL-23進行之STAT-螢光素酶報導體檢定的結果。所有抗體均完全抑制重組人類IL-23。
圖1B：使用原生人類IL-23進行之STAT-螢光素酶報導體檢定的結果。僅一半彼等完全抑制重組人類IL-23之抗體能夠完全抑制原生人類IL-23。
本發明提供與IL-23抗原結合蛋白相關之組合物、套組及方法，該等IL-23抗原結合蛋白包括拮抗IL-23之分子，諸如抗IL-23抗體、抗體片段及抗體衍生物，例如拮抗性抗IL-23抗體、抗體片段或抗體衍生物。亦提供聚核苷酸及其衍生物及片段，其包含編碼結合於IL-23之多肽之全部或一部分的核酸序列，例如編碼抗IL-23抗體、抗體片段或抗體衍生物之全部或一部分的聚核苷酸；包含該等核酸之質體及載體；及包含該等聚核苷酸及/或載體及質體之細胞或細胞株。所提供之方法包括例如製備、鑑別或分離IL-23抗原結合蛋白(諸如抗IL-23抗體)之方法，判定分子是否結合於IL-23之方法，判定分子是否拮抗IL-23之方法，製備包含IL-23抗原結合蛋白之組合物(諸如醫藥組合 物)之方法，及向個體投與IL-23抗原結合蛋白之方法，例如治療由IL-23介導之病狀及活體內或活體外拮抗IL-23之生物活性的方法。
除非本文另有規定，否則與本發明關聯使用之科學及技術術語應具有一般技術者通常所瞭解之含義。此外，除非本文另有要求，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。通常，本文所述之與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學及雜交關聯使用之命名法及其術語為此項技術中所熟知及常用者。除非另有指示，否則本發明之方法及技術一般根據此項技術中熟知之習知方法來進行及如本說明書中通篇所引用及論述之各種一般及更特定之參考文獻中所述來進行。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)，及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)，及Harlow及Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明，如此項技術中通常所實現或如本文所述來進行。本文所述之與分析化學、合成有機化學及醫學及藥物化學關聯使用之術語及其實驗室程序與技術為此項技術中所熟知及常用者。對於化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及傳遞以及患者治療可使用標準技術。
所有專利及其他所標示公開案均明確地以全文引用的方式併入本文中用於描述及揭示例如該等公開案中所述之可與本文所述資訊關聯使用之方法的目的。
人類IL-23之p19次單元(SEQ ID NO：144及145)、共享之p40次單元(SEQ ID NO：146及147)、人類IL-23受體雜二聚次單元IL-12Rβ1(SEQ ID NO：150及151)及IL-23R(SEQ ID NO：148及149)的聚核 苷酸及蛋白質序列為此項技術中所已知，參見例如GenBank寄存編號AB030000、M65272、NM_005535、NM_144701，來自其他哺乳動物物種之序列同樣如此。重組IL-23及IL-23受體蛋白(包括單鏈及Fc蛋白)以及表現IL-23受體之細胞已有描述且可自商業來源獲得。(參見例如Oppmann等人，Immunity,2000,13：713-715；R&D Systems,Minneapolis.Minnesota；United States Biological,Swampscott,Massachusetts；WIPO公開案第WO 2007/076524號)。原生人類IL-23可使用此項技術中已知之方法(包括本文所述之方法)獲自人類細胞，諸如樹突狀細胞。
IL-23為包含獨特p19次單元共價結合於共享之p40次單元之雜二聚細胞激素。該p19次單元包含四個α螺旋，「A」、「B」、「C」及「D」，呈由位於A與B螺旋之間、B與C螺旋之間及C與D螺旋之間的三個螺旋內環連接之上-上-下-下基元形式，參見Oppmann等人，Immunity,2000,13：713-715，及Beyer等人，J Mol Biol,2008.382(4)：942-55。咸信4螺旋束細胞激素之A及D螺旋與受體結合有關。該p40次單元包含三個β片夾心域，D1、D2及D3(Lupardus及Garcia,J.Mol.Biol.,2008,382：931-941)。
術語「聚核苷酸」包括單股與雙股核酸且包括基因組DNA、RNA、mRNA、cDNA或不與自然界中通常發現之序列相關聯的合成來源或其一些組合。包含指定序列之經分離之聚核苷酸除該等指定序列外亦可包括多達10種或甚至多達20種其他蛋白質或其部分之編碼序列，或可包括控制所述核酸序列之編碼區之表現的可操作地連接的調節序列，及/或可包括載體序列。構成聚核苷酸之核苷酸可為核糖核苷酸或去氧核糖核苷酸或任一類型核苷酸之經修飾形式。修飾包括鹼基修飾，諸如溴尿苷及肌苷衍生物；核糖修飾，諸如2',3'-二去氧核糖；及核苷酸間鍵聯修飾，諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷 酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯及磷醯胺酸酯。
術語「寡核苷酸」意謂包含100個或更少核苷酸之聚核苷酸。在一些實施例中，寡核苷酸長度為10至60個鹼基。在其他實施例中，寡核苷酸長度為12、13、14、15、16、17、18、19或20至40個核苷酸。寡核苷酸可為單股或雙股，例如以供用於構建突變基因。寡核苷酸可為有義或反義寡核苷酸。寡核苷酸可包括用於偵測檢定之可偵測標記，諸如放射性標記、螢光標記、半抗原或抗原性標記。寡核苷酸可例如用作PCR引子、選殖引子或雜交探針。
術語「多肽」或「蛋白質」意謂具有原生蛋白質之胺基酸序列的大分子，亦即由天然存在及非重組細胞產生之蛋白質；或其由遺傳工程改造或重組細胞產生，且包含具有原生蛋白質之胺基酸序列的分子，或與原生序列之胺基酸殘基相比具有一或多個缺失、插入及/或取代之分子。該術語亦包括一或多個胺基酸為相應天然存在之胺基酸及聚合物之化學類似物的胺基酸聚合物。術語「多肽」及「蛋白質」涵蓋與抗原結合蛋白序列之胺基酸殘基相比具有一或多個缺失、添加及/或取代之IL-23抗原結合蛋白(諸如抗體)及序列。術語「多肽片段」係指與全長原生蛋白質相比具有胺基端缺失、羧基端缺失及/或內部缺失之多肽。與原生蛋白質相比，該等片段亦可含有經修飾之胺基酸。在某些實施例中，片段長度為約5至500個胺基酸。舉例而言，片段長度可為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400或450個胺基酸。適用多肽片段包括抗體之免疫功能片段，包括結合域。在IL-23抗原結合蛋白(諸如抗體)之情況下，適用片段包括(但不限於)一或多個CDR區、重鏈或輕鏈之可變域、抗體鏈之一部分、可變區之一部分(包括少於三個CDR)及其類似物。
「胺基酸」包括其在此項技術中之一般含義。二十種天然存在之 胺基酸及其縮寫遵循習知用法。參見Immunology-A Synthesis，第2版，(E.S.Golub及D.R.Gren編)，Sinauer Associates：Sunderland,Mass.(1991)。二十種習知胺基酸之立體異構體(例如D-胺基酸)、非天然胺基酸(諸如[α]-,[α]-雙取代之胺基酸)、N-烷基胺基酸及其他非習知胺基酸亦可為多肽之適合組分。非習知胺基酸之實例包括：4-羥基脯胺酸、[γ]-羧基麩胺酸、[ε]-N,N,N-三甲基離胺酸、[ε]-N-乙醯離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯絲胺酸、N-甲醯甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥基離胺酸、[σ]-N-甲基精胺酸，及其他類似胺基酸及亞胺基酸(例如4-羥基脯胺酸)。在本文中所使用之多肽表示法中，根據標準用法及慣例，左手方向為胺基端方向，右手方向為羧基端方向。
術語「經分離之蛋白質」係指自會干擾治療、診斷、預防、研究或其他用途之蛋白質或多肽或其他污染物純化之蛋白質，諸如抗原結合蛋白(其實例可為抗體)。如本文中所使用，「實質上純」意謂所述分子種類為存在之主要種類，亦即以莫耳計，其比同一混合物中之任何其他個別種類豐富。在某些實施例中，實質上純之分子為目標種類佔存在之所有大分子種類的至少50%(以莫耳計)之組合物。在其他實施例中，實質上純之組合物將佔組合物中存在之所有大分子種類的至少80%、85%、90%、95%或99%。在某些實施例中，基本上均質之物質已純化至藉由習知偵測方法不能在組合物中偵測到污染種類之程度，且因此組合物由單一可偵測之大分子種類組成。
多肽(例如抗原結合蛋白，諸如抗體)之「變異體」包含相對於另一多肽序列在胺基酸序列中有一或多個胺基酸殘基插入、缺失及/或取代之胺基酸序列。變異體包括融合蛋白。多肽之「衍生物」為以不同於插入、缺失或取代變異體之一些方式(例如經由結合於另一化學部分)進行化學修飾之多肽。
如說明書中與生物物質(諸如多肽、核酸、宿主細胞及其類似物) 關聯使用之術語「天然存在」或「原生」係指自然界中發現之物質，諸如原生人類IL-23。在某些態樣中，提供結合原生IL-23之重組抗原結合蛋白。在此文中，「重組蛋白」為使用重組技術(亦即經由本文所述之重組核酸表現)所製備之蛋白質。製備重組蛋白之方法及技術為此項技術中所熟知。
術語「抗體」係指任何同型之完整免疫球蛋白或其可與完整抗體競爭特異性結合於目標抗原之片段，且包括例如嵌合、人類化、完全人類及雙特異性抗體。因此，抗體為一種抗原結合蛋白。除非另有指示，否則術語「抗體」除包含兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈之抗體外亦包括其衍生物、變異體、片段及突變蛋白(mutein)，其實例描述如下。完整抗體一般將包含至少兩條全長重鏈及兩條全長輕鏈，但在一些情況下可包括較少鏈，諸如天然存在於駱駝類動物中之抗體可僅包含重鏈。抗體可僅來源於單一來源，或可為「嵌合的」，亦即抗體之不同部分可來源於兩種不同抗體，如下文進一步描述。抗原結合蛋白、抗體或結合片段可在融合瘤中藉由重組DNA技術或藉由完整抗體之酶促或化學裂解來產生。
如本文中所使用，抗體或免疫球蛋白鏈(重鏈或輕鏈)之術語「功能片段」(或簡稱「片段」)為包含缺少至少一些於全長鏈中所存在之胺基酸但能夠特異性結合於抗原的抗體之一部分(不考慮該部分如何獲得或合成)之抗原結合蛋白。該等片段具有生物活性，亦即其特異性結合於目標抗原且可與其他抗原結合蛋白(包括完整抗體)競爭特異性結合於指定抗原決定基。在一態樣中，該種片段將保留至少一個於全長輕鏈或重鏈中所存在之CDR，且在一些實施例中將包含單一重鏈及/或輕鏈或其部分。此等生物活性片段可藉由重組DNA技術來產生，或可藉由抗原結合蛋白(包括完整抗體)之酶促或化學裂解來產生。片段包括(但不限於)免疫功能片段，諸如Fab、Fab'、F(ab')2、 Fv、域抗體及單鏈抗體，且可來源於任何哺乳動物來源，包括(但不限於)人類、小鼠、大鼠、駱駝類動物或兔子。進一步預期本文所揭示之抗原結合蛋白的功能性部分(例如一或多個CDR)可共價結合於第二蛋白質或小分子以形成針對體內特定目標且具有雙功能治療性質或具有延長之血清半衰期的治療劑。
當在抗原結合蛋白(例如中和抗原結合蛋白或中和抗體)之情形中使用時，術語「競爭」意謂抗原結合蛋白之間的競爭，如藉由其中所測試抗原結合蛋白(例如抗體或其免疫功能片段)阻止或抑制參考抗原結合蛋白(例如配位體或參考抗體)特異性結合於共同抗原(例如IL-23蛋白或其片段)之檢定所判定。可使用許多類型之競爭性結合檢定，例如：固相直接或間接放射免疫檢定(RIA)、固相直接或間接酶免疫檢定(EIA)、夾心競爭檢定(參見例如Stahli等人，1983,Methods in Enzymology 92：242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Kirkland等人，1986,J.Immunol.137：3614-3619)；固相直接標記檢定、固相直接標記夾心檢定(參見例如Harlow及Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用I-125標記之固相直接標記RIA(參見例如Morel等人，1988,Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(參見例如Cheung等人，1990,Virology 176：546-552)；及直接標記RIA(Moldenhauer等人，1990,Scand.J.Immunol.32：77-82)。該種檢定通常涉及使用結合於帶有此等未標記之測試抗原結合蛋白及標記之參考抗原結合蛋白中之任一者的固體表面或細胞之經純化抗原。
競爭性抑制可藉由測定在測試抗原結合蛋白存在下結合於固體表面或細胞之標記的量來量測。測試抗原結合蛋白通常以過量存在。藉由競爭檢定鑑別之抗原結合蛋白(競爭抗原結合蛋白)包括與參考抗原結合蛋白結合相同抗原決定基的抗原結合蛋白及與足夠接近由參考抗 原結合蛋白結合之抗原決定基之相鄰抗原決定基結合從而發生位阻的抗原結合蛋白。通常，當競爭抗原結合蛋白以過量存在時，其將抑制參考抗原結合蛋白與共同抗原之特異性結合達至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%或75%。在一些情況下，抑制結合達至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。
術語「抗原決定基」或「抗原決定子」係指抗原上抗原結合蛋白所結合之位點。抗原決定基可由相連胺基酸或因蛋白質之三級摺疊而毗鄰之非相連胺基酸形成。由相連胺基酸形成之抗原決定基通常在暴露於變性溶劑時保留，而由三級摺疊形成之抗原決定基通常在用變性溶劑處理時喪失。抗原決定基決定子可包括分子之化學活性表面群組，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。抗原決定基通常在獨特空間構形中包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35個胺基酸。抗原決定基可使用此項技術中已知之方法來判定。
IL-23抗原結合蛋白
如本文中所使用，「抗原結合蛋白」意謂特異性結合指定目標抗原之蛋白質；如本文所提供之抗原為IL-23，尤其為人類IL-23，包括原生人類IL-23。如本文所提供之抗原結合蛋白與IL-23之獨特p19次單元的至少一部分相互作用，從而可偵測地結合IL-23；但不以任何顯著性結合於IL-12(例如IL-12之p40及/或p35次單元)，因此「不破壞IL-12」。因此，本文所提供之抗原結合蛋白能夠影響IL-23活性而不會招致抑制IL-12或共享之p40次單元之潛在危險。抗原結合蛋白可影響IL-23與其受體相互作用之能力，例如藉由影響與受體之結合，諸如藉由干擾受體締合。詳言之，該等抗原結合蛋白完全或部分降低、抑制、 干擾或調節IL-23之一或多種生物活性。與不存在抗原結合蛋白之反應相比，該抑制或中和破壞在抗原結合蛋白存在下之生物反應，且可使用此項技術中已知及本文所述之檢定進行測定。本文所提供之抗原結合蛋白抑制IL-23誘導之促發炎細胞激素產生，例如全血細胞中之IL-23誘導之IL-22產生、及NK及全血細胞中之IL-23誘導之IFNγ表現。生物活性之降低可為約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多。
抗原結合蛋白可包含結合於抗原之部分及允許抗原結合部分採用促進抗原結合蛋白結合於抗原之構形的視情況存在之骨架或構架部分。抗原結合蛋白之實例包括抗體、抗體片段(例如抗體之抗原結合部分)、抗體衍生物及抗體類似物。抗原結合蛋白可包含具有移植CDR或CDR衍生物之替代蛋白質骨架或人造骨架。該等骨架包括(但不限於)抗體衍生骨架，包含引入以例如穩定抗原結合蛋白之三維結構的突變；以及完全合成骨架，包含例如生物相容性聚合物。參見例如Korndorfer等人，Proteins：Structure,Function,and Bioinformatics,(2003)第53卷，第1期：121-129；Roque等人，Biotechnol.Prog.,2004,20：639-654。另外，可使用肽抗體模擬物(「PAM」)，以及基於利用纖維結合蛋白組分作為骨架之抗體模擬物的骨架。
本文所述之某些抗原結合蛋白為抗體或來源於抗體。該等抗原結合蛋白分別包括(但不限於)單株抗體、雙特異性抗體、微型抗體、域抗體、合成抗體、抗體模擬物、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、抗體融合物、抗體結合物、單鏈抗體及其片段。在一些情況下，抗原結合蛋白為抗體之免疫學片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2或scFv)。各種結構在本文中進一步描述及定義。
所提供之某些抗原結合蛋白可包含一或多個如本文所述之 CDR(例如1、2、3、4、5、6或更多個CDR)。在一些情況下，抗原結合蛋白包含(a)多肽結構及(b)一或多個插入該多肽結構中及/或聯接於該多肽結構之CDR。多肽結構可採用各種不同形式。舉例而言，其可為或包含天然存在之抗體或其片段或變異體的構架，或其在本質上可為完全合成的。各種多肽結構之實例在下文進一步描述。
當解離平衡常數(KD)為10-8M時，認為本發明之抗原結合蛋白「特異性結合」其目標抗原。當KD為5×10-9M時，抗原結合蛋白以「高親和力」特異性結合抗原，且當KD為5×10-10M時，抗原結合蛋白以「極高親和力」特異性結合抗原。在一實施例中，抗原結合蛋白將以5×10-12M之KD結合於人類IL-23，且在另一實施例中，其將以5×10-13M之KD結合。在本發明之另一實施例中，抗原結合蛋白之KD為5×10-12M且Koff為約5×10-6 l/s。在另一實施例中，Koff為5×10-7 l/s。
另一態樣提供一種抗原結合蛋白，其在活體外或活體內(例如當投與人類個體時)具有至少一天之半衰期。在一實施例中，抗原結合蛋白之半衰期為至少三天。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為四天或更長。在另一實施例中，抗體或其部分之半衰期為八天或更長。在另一實施例中，抗體或其抗原結合部分經衍生化或修飾以使得其半衰期比未經衍生化或未經修飾之抗體長。在另一實施例中，抗原結合蛋白含有點突變以增加血清半衰期，諸如WIPO公開案第WO 00/09560號中所描述。
在將抗原結合蛋白用於治療應用之實施例中，抗原結合蛋白可降低、抑制、干擾或調節IL-23之一或多種生物活性，諸如促發炎細胞激素之誘導產生。IL-23具有許多不同生物作用，其可在許多不同檢定中在不同細胞類型中進行量測；該等檢定之實例為已知的且提供於本文中。
一些所提供之抗原結合蛋白具有通常與天然存在之抗體相關聯的結構。此等抗體之結構單元通常包含一或多個四聚體，各由相同的兩對多肽鏈構成，但一些哺乳動物物種亦產生僅具有單一重鏈之抗體。在一典型抗體中，各對包括一條全長「輕」鏈(在某些實施例中為約25kDa)及一條全長「重」鏈(在某些實施例中為約50-70kDa)。各個別免疫球蛋白鏈由若干個「免疫球蛋白域」構成，各域由約90至110個胺基酸組成且表現特徵性摺疊模式。此等域為構成抗體多肽之基本單元。各鏈之胺基端部分通常包括負責抗原識別之可變區。羧基端部分在演化上比鏈之另一端更保守且稱為「恆定區」或「C區」。人類輕鏈一般分類為κ及λ輕鏈，且此等鏈各含有一個可變區及一個恆定域(CL1)。重鏈通常分類為μ、δ、γ、α或ε鏈，且此等鏈分別將抗體之同型定義為IgM、IgD、IgG、IgA及IgE。IgG具有若干亞型，包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。IgM亞型包括IgM及IgM2。IgA亞型包括IgA1及IgA2。在人類中，IgA及IgD同型含有四條重鏈及四條輕鏈；IgG及IgE同型含有兩條重鏈及兩條輕鏈；而IgM同型含有五條重鏈及五條輕鏈。重鏈恆定區(CH)通常包含一或多個可能負責效應功能之域。重鏈恆定區域之數目將視同型而定。舉例而言，IgG重鏈各含有三個CH區域，稱為CH1、CH2及CH3。所提供之抗體可具有任何此等同型及亞型，例如IL-23抗原結合蛋白為IgG1、IgG2或IgG4亞型。若需要IgG4，則亦可需要如Bloom等人，1997,Protein Science 6：407中所述將點突變(CPSCP->CPPCP)引入鉸鏈區中以減輕形成會導致IgG4抗體異質性之H鏈內二硫鍵的趨勢。可使用子類轉換方法將一種類型之本文所提供之抗體變為不同類型。參見例如Lantto等人，2002,Methods Mol.Biol.178：303-316。
在全長輕鏈及重鏈中，可變區及恆定區由具有約12個或更多個胺基酸之「J」區聯接，其中重鏈亦包括具有約10個或更多個胺基酸之 「D」區。參見例如Fundamental Immunology，第2版，第7章(Paul,W.編)1989,New York：Raven Press。各輕鏈/重鏈對之可變區通常形成抗原結合位點。
可變區
本文提供之各種重鏈及輕鏈可變區(或域)描述於表1及2中。此等可變區各自可例如連接於上述重鏈及輕鏈恆定區。此外，如此產生之重鏈及輕鏈序列各自可組合形成完整抗原結合蛋白結構。
提供含有至少一個重鏈可變區(VH)及/或至少一個輕鏈可變區(VL)之抗原結合蛋白，該至少一個重鏈可變區選自由VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、VH6、VH7、VH8、VH9、VH10、VH11、VH12、VH13、VH14、VH15及VH16組成之群，該至少一個輕鏈可變區選自由VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、VL6、VL7、VL8、VL9、VL10、VL11、VL12、VL13、VL14、VL15及VL16組成之群，如下表1及2所示。
表2中所列之重鏈可變區各自可與表1中所示之任何輕鏈可變區組合形成抗原結合蛋白。在一些情況下，抗原結合蛋白包括來自表1及2中所列之至少一個重鏈可變區及/或一個輕鏈可變區。在一些情況下，抗原結合蛋白包括來自表1及2中所列之至少兩個不同重鏈可變區及/或輕鏈可變區。重鏈可變區之各種組合可與輕鏈可變區之各種組合的任一者組合。
在其他情況下，抗原結合蛋白含有兩個相同輕鏈可變區及/或兩個相同重鏈可變區。舉例而言，抗原結合蛋白可為抗體或免疫功能片段，其包含呈如表1及2中所列之輕鏈可變區對與重鏈可變區對之組合形式的兩個輕鏈可變區及兩個重鏈可變區。該等抗原結合蛋白之實例包含兩個相同重鏈及輕鏈可變區，包括：抗體A VH14/VL14；抗體B VH9/VL9；抗體C VH10/VL10；抗體D VH15/VL15；抗體E VH1/VL1、抗體F VH11/VL11；抗體G VH12/VL12；抗體H VH13/VL13；抗體I VH8/VL8；抗體J VH3/VL3；抗體K VH7/VL7；抗體L VH4/VL4；抗體M VH5/VL5及抗體N VH6/VL6。
一些所提供之抗原結合蛋白包含重鏈可變區及/或輕鏈可變區，其包含與選自表1及2之重鏈可變區及/或輕鏈可變區之序列僅有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基不同的胺基酸序列，其中該序列差異各獨立地為一個胺基酸之缺失、插入或取代。在一些抗原結合蛋白中，輕鏈及重鏈可變區包含與表1及2中所提供之胺基酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。其他抗原結合蛋白(例如抗體或免疫功能片段)亦包括如本文所述之變異型重鏈區形式及/或變異型輕鏈區形式。
術語「一致性」係指兩個或兩個以上多肽分子或兩個或兩個以上聚核苷酸之序列之間的關係，如藉由對準及比較序列所判定。「一致性百分比」意謂所比較分子之胺基酸或核苷酸之間的一致殘基百分比且基於所比較分子之最小者的大小來計算。
對於此等計算，須藉由特定數學模型或電腦程式(亦即「演算法」)處理對準中之間隙(若存在)。可用於計算所對準核酸或多肽之一致性的方法包括以下文獻中所述之方法：Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.編)，1988,New York：Oxford University Press；Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.編)，1993,New York：Academic Press；Computer Analysis of Sequence Data,Part I,(Griffin,A.M.及Griffin,H.G.編)，1994,New Jersey：Humana Press；von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York：Academic Press；Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M.及Devereux,J.編)，1991,New York：M.Stockton Press；及Carillo等人，1988,SIAM J.Applied Math. 48：1073。
在計算一致性百分比時，以獲得序列之間最大匹配的方式對準所比較之序列。用於確定一致性百分比之電腦程式為GCG程式包，其包括GAP(Devereux等人，1984,Nucl.Acid Res. 12：387；Genetics Computer Group,University of Wisconsin,Madison,WI)。電腦演算法GAP用於對準待確定序列一致性百分比之兩個多肽或聚核苷酸。將序列對準以最佳匹配其各別胺基酸或核苷酸(「匹配範圍」，如藉由演算法所確定)。間隙開放罰分(其計算為3×平均對角線，其中該「平均對角線」為所用比較矩陣之對角線的平均值；「對角線」為由特定比較矩陣賦予各完全胺基酸匹配的分數或數值)及間隙擴展罰分(其通常為間隙開放罰分之1/10)，以及比較矩陣(諸如PAM250或BLOSUM 62)與演算法結合使用。在某些實施例中，演算法亦使用標準比較矩陣(對於PAM 250比較矩陣，請參見Dayhoff等人，1978,Atlas of Protein Sequence and Structure 5：345-352；對於BLOSUM 62比較矩陣，請參見Henikoff等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89：10915-10919)。
使用GAP程式確定多肽或核苷酸序列之一致性百分比的推薦參數如下：演算法：Needleman等人，1970,J.Mol.Biol. 48：443-453；比較矩陣：BLOSUM 62，來自Henikoff等人，1992，同上；間隙罰分：12(但無末端間隙之罰分)，間隙長度罰分：4，相似性臨限值：0。用於對準兩個胺基酸序列之某些對準流程可導致兩個序列之僅較短區域匹配且此小對準區域可能具有極高序列一致性，即使在兩個全長序列之間不存在明顯關係。因此，必要時可調整所選對準方法(GAP程式)以獲得涵蓋目標多肽之至少50個相連胺基酸的對準。
本文所揭示之重鏈及輕鏈可變區包括來源於相關抗原結合蛋白群組之共同序列。分析重鏈及輕鏈可變區之胺基酸序列的相似性。出現四個群組，一個群組具有κ輕鏈可變區(VH9/VL9、VH10/VL10、VH11/VL11、VH13/VL13、VH14/VL14及VH15/VL15)，而三個群組具有λ輕鏈可變區：λ組1(VH5/VL5、VH6/VL6及VH7/VL7)、λ組2(VH3/VL3及VH4/VL4)及λ組3(VH1/VL1及VH2/VL2)。代表之輕鏈生殖系包括VK1/A30及VK1/L19。代表之輕鏈λ生殖系包括VL1/1e、VL3/3p、VL5/5c及VL9/9a。代表之重鏈生殖系包括VH3/3-30、VH3/3-30.3、VH3/3-33、VH3/3-48、VH4/4-31及VH4/4-59。如本文中所使用，「共同序列」係指具有許多序列中共有之保守性胺基酸及在指定胺基酸序列中改變之可變胺基酸的胺基酸序列。共同序列可使用對對應於本文所揭示之IL-23抗原結合蛋白的輕鏈及重鏈可變區進行之標準系統發生分析來確定。
κ組之輕鏈可變區共同序列為DX1QX2TQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGX3X4SX5WX6AWYQQKPGX7APX8LLIYAASSLQSGVPSRFSGSX9SGTX10FTLTISSLQPX11DFATYX12CQQANSFPFTFGPGTKVDX13K(SEQ ID NO：30)，其中X1選自I或S；X2選自M或L；X3選自G或V且X4選自S、F或I；X5選自S或G；X6選自F或L；X7選自K或Q； X8選自K、N或S；X9選自G或V；X10選自D或E，X11選自E或A；X12選自Y或F；且X13選自I、V或F。
λ組1之輕鏈可變區共同序列為QPX1LTQPPSASASLGASVTLTCTLX2SGYSDYKVDWYQX3RPGKGPRFVMRVGTGGX4VGSKGX5GIPDRFSVLGSGLNRX6LTIKNIQEEDESDYHCGADHGSGX7NFVYVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO：61)，其中X1選自V或E；X2選自N或S；X3選自Q或L且X4選自I或T；X5選自D或E；X6選自Y或S；且X7選自S或N。
λ組3之輕鏈可變區共同序列為QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNX1GAGYDVHWYQQX2PGTAPKLLIYGSX3NRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTX4RLTVL(SEQ ID NO：139)，其中X1選自T或I；X2選自V或L；X3選自G或N且X4選自R或K。
κ組之重鏈可變區共同序列為QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGGSIX1SGGYYWX2WIRQHPGKGLEWIGX3IX4YSGX5X6YYNPSLKSRX7TX8SVDTSX9NQFSLX10LSSVTAADTAVYYCAX11X12RGX13YYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：140)，其中X1選自N或S；X2選自S或T；X3選自Y或H且X4選自Y或H；X5選自S或N；X6選自S或T；X7選自V或I；X8選自I或M；X9選自K或Q；X10選自K或S，X11選自R或K；X12選自D或N；且X13選自H、F或Y。
λ組1之重鏈可變區共同序列為EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCX1X2SGFTFSX3X4SMNWVRQAPGKGLEWVSYISSX5SSTX6YX7ADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRDEDTAVYYCARRIAAAGX8X9X10YYYAX11DVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：141)，其中X1選自A或V；X2選自A或V；X3選自T或S且X4選自Y或F；X5選自S或R；X6選自R或I；X7選自H、Y或I；X8選自P或G；X9選自W或F；X10選自G或H 且X11選自M或L。
λ組2之重鏈可變區共同序列為QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYX1MHWVRQAPGKGLEWX2X3VISX4DGSX5KYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARERTTLSGSYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：142)，其中X1選自G或A；X2選自V或L；X3選自A或S，且X4選自F或H，且X5選自L或I。
λ組3之重鏈可變區共同序列為QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNX1YYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGYX2SSWYPDAFDIWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO：143)，其中X1選自E或K且X2選自T或S。
互補決定區
互補決定區或「CDR」係嵌埋在重鏈及輕鏈可變區之構架中，其中其構成負責抗原結合及識別之區域。相同物種之免疫球蛋白鏈的可變域例如一般展現類似總體結構；包含由高變CDR區聯接之相對保守性構架區(FR)。抗原結合蛋白可具有1、2、3、4、5、6個或更多個CDR。上述可變區例如通常包含三個CDR。重鏈可變區及輕鏈可變區之CDR通常經由構架區排列以形成特異性結合於目標抗原(例如IL-23)上之結構。自N端至C端，天然存在之輕鏈及重鏈可變區通常皆符合此等元件之以下順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。例示性輕鏈可變域及重鏈可變域之CDR及FR區在表1及2中突出顯示。應認識到，CDR及FR區之邊界可不同於彼等突出顯示區域。已設計用於賦予佔據此等各域中之位置的胺基酸編號之編號系統。指定抗原結合蛋白之互補決定區及構架區可使用此等系統來標識。編號系統在以下文獻中定義：Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，US Dept.of Health and Human Services,PHS,NIH,NIH Publication No.91-3242,1991，或Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989,Nature 342：878-883。用於免疫球蛋白鏈中之胺基酸的其他編號系統包括IMGT®(國際免疫遺傳學資訊系統(international ImMunoGeneTics information system)；Lefranc等人，Dev.Comp.Immunol.2005,29：185-203)；及AHo(Honegger及Pluckthun,J.Mol.Biol.2001,309(3)：657-670)。本文所提供之CDR可不僅用於界定傳統抗體結構之抗原結合域，而且亦可如本文所述嵌入多種其他多肽結構中。
本文所揭示之抗原結合蛋白為內部可移植、插入、嵌入及/或聯接一或多個CDR之多肽。抗原結合蛋白可具有例如一個重鏈CDR1(「CDRH1」)、及/或一個重鏈CDR2(「CDRH2」)、及/或一個重鏈CDR3(「CDRH3」)、及/或一個輕鏈CDR1(「CDRL1」)、及/或一個輕鏈CDR2(「CDRL2」)、及/或一個輕鏈CDR3(「CDRL3」)。一些抗原結合蛋白包括CDRH3與CDRL3兩者。特定實施例一般利用不重複CDR之組合，例如一般不使抗原結合蛋白在一個可變重鏈區中具有兩個CDRH2區等。抗原結合蛋白可包含一或多個與表3中所呈現之一或多個CDR的胺基酸序列一致或僅有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸殘基不同之胺基酸序列，其中各該種序列差異獨立地為一個胺基酸之缺失、插入或取代。一些抗原結合蛋白中之CDR包含與表3中所列之CDR序列具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的胺基酸序列。在一些抗原結合蛋白中，CDR嵌入「構架」區中，該「構架」區使CDR定向以便達成CDR之適當抗原結合性質。
表3例示性CDRH及CDRL序列
本文提供包含以下之CDR1區：SEQ ID NO：7及11之胺基酸殘基23-34；SEQ ID NO：9、13、15、17、19、21、23、25、27及29之胺基酸殘基24-34；SEQ ID NO：1、3及4之胺基酸殘基23-36；SEQ ID NO：31、33、34、38、40、44、52及60之胺基酸殘基31-35，及SEQ ID NO：46、48、50、54、56及58之胺基酸殘基31-37。
提供包含以下之CDR2區：SEQ ID NO：9、13、15、17、19、21、23、25、27及29之胺基酸殘基50-56；SEQ ID NO：7及11之胺基酸殘基50-61；SEQ ID NO：4之胺基酸殘基52-62；SEQ ID NO：31、33、 44及52之胺基酸殘基50-65；SEQ ID NO：36、38、40、42及60之胺基酸殘基50-66；SEQ ID NO：1及3之胺基酸殘基52-58，及SEQ ID NO：46、48、50、54、56及58之胺基酸殘基52-67。
亦提供包含以下之CDR3區：SEQ ID NO：13、15、17、19、21、23、25、27及29之胺基酸殘基89-97；SEQ ID NO：1及3之胺基酸殘基91-101；SEQ ID NO：7、9及11之胺基酸殘基94-106；SEQ ID NO：44及52之胺基酸殘基98-107；SEQ ID NO：4之胺基酸殘基97-105；SEQ ID NO：34及36之胺基酸殘基99-110；SEQ ID NO：112之胺基酸殘基99-112；SEQ ID NO：31及33之胺基酸殘基99-113；SEQ ID NO：38、40及42之胺基酸殘基99-114；SEQ ID NO：46、48、54、56及58之胺基酸殘基100-109；及SEQ ID NO：50之胺基酸殘基101-019。
本文所揭示之CDR包括來源於相關序列群組之共同序列。如先前所述，鑑別出四個可變區序列群組，亦即一個κ組及三個λ組。κ組之CDRL1共同序列由RASQX1X2SX3 WX4A(SEQ ID NO：123)組成，其中X1選自G或V；X2選自I、F或S；X3選自S或G且X4選自F或L。λ組1之CDRL1共同序列由TLX1SGYSDYKVD(SEQ ID NO：124)組成，其中X1選自N或S。λ組3之CDRL1共同序列由TGSSSNX1 GAGYDVH(SEQ ID NO：125)組成，其中X1選自I或T。
λ組1之CDRL2共同序列由VGTGGX1VGSKGX2(SEQ ID NO：126)組成，其中X1選自I或T且X2選自D或E。λ組3之CDRL2共同序列由GSX1NRPS(SEQ ID NO：127)組成，其中X1選自N或G。
CDRL3共同序列包括GADHGSGX1NFVYV(SEQ ID NO：128)，其中X1為S或N。
κ組之CDRH1共同序列由SGGYYWX1(SEQ ID NO：129)組成，其中X1選自S或T。λ組1之CDRH1共同序列由X1X2SMN(SEQ ID NO：131)組成，其中X1選自S或T且X2選自Y或F。λ組2之CDRH1共同序列由 SYX1MH(SEQ ID NO：130)組成，其中X1選自G或A。
κ組之CDRH2共同序列由X1IX2YSGX3X4YYNPSLKS(SEQ ID NO：132)組成，其中X1選自Y或H；X2選自Y或H；X3選自S或N且X4選自T或S。λ組1之共同序列由YISSX1SSTX2YX3ADSVKG(SEQ ID NO：134)組成，其中X1選自R或S，X2選自I或R，X3選自I、H或Y。λ組2之共同序列由VISX1DGSX2KYYADSVKG(SEQ ID NO：133)組成，其中X1為F或H且X2為L或T。λ組3之CDRH2共同序列由VIWYDGSNX1YYADSVKG(SEQ ID NO：135)組成，其中X1選自K或E。
κ組之CDRH3共同序列由X1RGX2YYGMDV(SEQ ID NO：136)組成，其中X1選自N或D且X2選自H、Y或F。λ組1之CDRH3共同序列由RIAAAGX1X2X3YYYAX4DV(SEQ ID NO：137)組成，其中X1選自G或P；X2選自F或W；X3選自H或G且X4選自L及M。λ組3之CDRH3共同序列由DRGYX1SSWYPDAFDI(SEQ ID NO：138)組成，其中X1選自S或T。
單株抗體
所提供之抗原結合蛋白包括結合於IL-23之單株抗體。單株抗體可使用此項技術中已知之任何技術來產生，例如藉由對完成免疫時程後自轉殖基因動物收集之脾細胞進行永生化。脾細胞可使用此項技術中已知之任何技術進行永生化，例如藉由使其與骨髓瘤細胞融合產生融合瘤。用於產生融合瘤之融合程序的骨髓瘤細胞較佳不產生抗體，具有高融合效率，及具有使其不能在僅支持所需融合細胞(融合瘤)生長之某些選擇性培養基中生長之酶缺陷。適合用於小鼠融合之細胞株的實例包括Sp-20、P3-X63/Ag8、P3-X63-Ag8.653、NS1/1.Ag 4 1、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7及S194/5XXO Bul；用於大鼠融合之細胞株的實例包括R210.RCY3、 Y3-Ag 1.2.3、IR983F及4B210。適用於細胞融合之其他細胞株為U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2及UC729-6。
在一些情況下，融合瘤細胞株係藉由以下步驟產生：用IL-23免疫原對動物(例如具有人類免疫球蛋白序列之轉殖基因動物)進行免疫；自經免疫動物收集脾細胞；使收集之脾細胞與骨髓瘤細胞株融合，由此產生融合瘤細胞；由融合瘤細胞建立融合瘤細胞株，並鑑別產生結合IL-23多肽而不破壞IL-12之抗體的融合瘤細胞株。該等融合瘤細胞株及由其產生之抗IL-23單株抗體為本申請案之態樣。
由融合瘤細胞株分泌之單株抗體可使用此項技術中已知之任何技術來純化。可進一步篩選融合瘤或mAb以鑑別具有特定性質(諸如抑制IL-23誘導之活性的能力)之mAb。
嵌合及人類化抗體
亦提供基於上述序列之嵌合及人類化抗體。用作治療劑之單株抗體可在使用之前以各種方式進行修飾。一個實例為嵌合抗體，其為由來自不同抗體之蛋白質區段構成之抗體，該等區段共價聯接產生功能性免疫球蛋白輕鏈或重鏈或其免疫功能部分。重鏈及/或輕鏈之一部分一般與來源於特定物種或屬於特定抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源，而該等鏈之其餘部分與來源於另一物種或屬於另一抗體類別或子類之抗體中的相應序列一致或同源。關於與嵌合抗體相關之方法，請參見例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，1985,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855。CDR移植例如描述於美國專利第6,180,370號、第5,693,762號、第5,693,761號、第5,585,089號及第5,530,101號中。
一種適用類型之嵌合抗體為「人類化」抗體。人類化抗體一般自最初在非人類動物中產生之單株抗體製造。此單株抗體中之某些胺基酸殘基(通常來自抗體之非抗原識別部分)通常經修飾成與相應同型之 人類抗體中的相應殘基同源。人類化可例如使用各種方法，藉由用齧齒動物可變區之至少一部分取代人類抗體之相應區域來進行(參見例如美國專利第5,585,089號及第5,693,762號；Jones等人，1986,Nature 321：522-525；Riechmann等人，1988,Nature 332：323-27；Verhoeyen等人，1988,Science 239：1534-1536)。
在某些實施例中，來自除人類外之物種的恆定區可與人類可變區一起用於產生雜交抗體。
完全人類抗體
亦提供完全人類抗體。可獲得製備對於指定抗原具有特異性而無需使人類接觸抗原之完全人類抗體(「完全人類抗體」)的方法。提供用於實施完全人類抗體製造之一種特定方法為小鼠體液免疫系統之「人類化」。將人類免疫球蛋白(Ig)基因座引入內源性Ig基因已去活之小鼠體內為一種在小鼠(一種可用任何所需抗原進行免疫之動物)體內產生完全人類單株抗體(mAb)之方法。使用完全人類抗體可使有時可因向人類投與小鼠或小鼠衍生之mAb作為治療劑所引起之免疫原性及過敏性反應減至最少。
完全人類抗體可藉由對能夠在不存在內源性免疫球蛋白產生下產生人類抗體譜系之轉殖基因動物(通常為小鼠)進行免疫來製造。出於此目的，抗原通常具有6個或6個以上相連胺基酸，及視情況結合於載體(諸如半抗原)。參見例如Jakobovits等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551-2555；Jakobovits等人，1993,Nature 362：255-258；及Bruggermann等人，1993,Year in Immunol.7：33。在該種方法之一實例中，轉殖基因動物係藉由以下步驟產生：使其中編碼小鼠免疫球蛋白重鏈及輕鏈之內源性小鼠免疫球蛋白基因座失能，及向小鼠基因組中插入含有編碼人類重鏈及輕鏈蛋白質之基因座之人類基因組DNA的大片段。接著對具有少於一整套人類免疫球蛋白基因座之經部分修 飾之動物進行雜交育種以獲得具有所有所需免疫系統修飾之動物。當投與免疫原時，此等轉殖基因動物產生對免疫原具有免疫特異性、但具有人類而非鼠類胺基酸序列(包括可變區)之抗體。關於該等方法之其他詳情，請參見例如WIPO專利公開案WO96/33735及WO94/02602。其他用於製備人類抗體之與轉殖基因小鼠有關的方法描述於以下文獻中：美國專利第5,545,807號；第6,713,610號；第6,673,986號；第6,162,963號；第5,545,807號；第6,300,129號；第6,255,458號；第5,877,397號；第5,874,299號及第5,545,806號；WIPO專利公開案WO91/10741、WO90/04036，及EP 546073B1及EP 546073A1。
上述轉殖基因小鼠含有編碼未重排人類重鏈([μ]及[γ])及[κ]輕鏈免疫球蛋白序列以及使內源性[μ]及[κ]鏈基因座去活之靶向突變的人類免疫球蛋白基因微型基因座(Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859)。因此，小鼠展現小鼠IgM或[κ]之表現降低及對免疫作出反應，且所引入之人類重鏈及輕鏈轉殖基因經歷類別轉換及體細胞突變以產生高親和力人類IgG[κ]單株抗體(Lonberg等人，同上；Lonberg及Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546)。該等小鼠之製備詳細描述於以下文獻中：Taylor等人，1992,Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen等人，1993,International Immunology 5：647-656；Tuaillon等人，1994,J.Immunol.152：2912-2920；Lonberg等人，1994,Nature 368：856-859；Lonberg,1994,Handbook of Exp.Pharmacology 113：49-101；Taylor等人，1994,International Immunology 6：579-591；Lonberg及Huszar,1995,Intern.Rev.Immunol.13：65-93；Harding及Lonberg,1995,Ann.N.Y Acad.Sci.764：536-546；Fishwild等人，1996,Nature Biotechnology 14：845-85。進一步參見美國專利第5,545,806 號；第5,569,825號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,789,650號；第5,877,397號；第5,661,016號；第5,814,318號；第5,874,299號；及第5,770,429號；以及美國專利第5,545,807號；WIPO公開案第WO 93/1227號；第WO 92/22646號；及第WO 92/03918號。用於在此等轉殖基因小鼠體內產生人類抗體之技術亦揭示於WIPO公開案第WO 98/24893號及Mendez等人，1997,Nature Genetics 15：146-156中。舉例而言，可使用HCo7及HCo12轉殖基因小鼠品系來產生抗IL-23抗體。
使用融合瘤技術，可自諸如上述之轉殖基因小鼠產生及選擇具有所需特異性之抗原特異性人類mAb。該等抗體可使用適合載體及宿主細胞進行選殖及表現，或抗體可自培養之融合瘤細胞收集。
完全人類抗體亦可自噬菌體呈現文庫獲得(諸如Hoogenboom等人，1991,J.Mol.Biol.227：381；Marks等人，1991,J.Mol,Biol.222：581；WIPO公開案第WO 99/10494號中所揭示)。噬菌體呈現技術模擬經由使抗體譜系呈現於絲狀噬菌體之表面上並隨後使其結合於所選抗原對噬菌體進行選擇來進行免疫選擇。
雙特異性或雙功能性抗原結合蛋白
「雙特異性」、「雙重特異性」或「雙功能性」抗原結合蛋白或抗體分別為具有兩個不同抗原結合位點(諸如如上文所述之一或多個CDR或一或多個可變區)之雜交抗原結合蛋白或抗體。在一些情況下，其為具有兩個不同重鏈/輕鏈對及兩個不同結合位點之人造雜交抗體。多特異性抗原結合蛋白或「多特異性抗體」為靶向一個以上抗原或抗原決定基之抗原結合蛋白或抗體。雙特異性抗原結合蛋白及抗體為一類多特異性抗原結合蛋白及抗體且可藉由多種方法製造，包括(但不限於)使融合瘤融合或對Fab'片段進行連接。參見例如Songsivilai及Lachmann,1990,Clin.Exp.Immunol.79：315-321；Kostelny等人，1992,J.Immunol.148：1547-1553。
免疫學片段
抗原結合蛋白亦包括抗體之免疫學片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2或scFv)。「Fab片段」包含一條輕鏈(輕鏈可變區(VL)及其相應恆定域(CL))及一條重鏈(重鏈可變區(VH)及第一恆定域(CH1))。Fab分子之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵。「Fab'片段」含有一條輕鏈及一條重鏈中亦含有CH1域與CH2域之間的區域之一部分，以使得可在兩個Fab'片段之兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分子。因此，「F(ab')2片段」由利用兩條重鏈之間的二硫鍵保持在一起之兩個Fab'片段構成。「Fv片段」由抗體單一臂之可變輕鏈區及可變重鏈區組成。單鏈抗體「scFv」為重鏈及輕鏈可變區已由可撓性連接子連接形成單一多肽鏈，從而形成抗原結合區之Fv分子。單鏈抗體詳細論述於以下文獻中：WIPO公開案第WO 88/01649號、美國專利第4,946,778號及第5,260,203號；Bird,1988,Science 242：423；Huston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879；Ward等人，1989,Nature 334：544；de Graaf等人，2002,Methods Mol Biol.178：379-387；Kortt等人，1997,Prot.Eng.10：423；Kortt等人，2001,Biomol.Eng.18：95-108及Kriangkum等人，2001,Biomol.Eng.18：31-40。「Fc」區含有兩個包含抗體之CH1及CH2域之重鏈片段。兩個重鏈片段由兩個或兩個以上二硫鍵及CH3域之疏水性相互作用保持在一起。
亦包括域抗體，僅含有重鏈之可變區或輕鏈之可變區之免疫功能性免疫球蛋白片段。在一些情況下，兩個或兩個以上VH區由肽連接子共價聯接形成二價域抗體。二價域抗體之兩個VH區可靶向相同或不同抗原。雙功能抗體為包含兩條多肽鏈之二價抗體，其中各多肽鏈包含VH及VL域，該等域由過短而無法使同一鏈上之兩個域之間進行配對，從而使各域與另一多肽鏈上之互補域配對的連接子聯接(參見例如Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-48,1993及 Poljak等人，Structure 2：1121-23,1994)。類似地，微型三功能抗體及微型四功能抗體分別為包含三條及四條多肽鏈之抗體，且分別形成三個及四個可相同或不同之抗原結合位點。最大抗體包含二價scFv共價連接於IgG1之Fc區(參見例如Fredericks等人，2004,Protein Engineering,Design & Selection,17：95-106；Powers等人，2001,Journal of Immunological Methods,251：121-135；Shu等人，1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7995-7999；Hayden等人，1994,Therapeutic Immunology 1：3-15)。
各種其他形式
亦提供以上所揭示之抗原結合蛋白的變異形式，一些抗原結合蛋白在表1及2中所列之一或多個重鏈或輕鏈可變區或CDR中具有例如一或多個保守性胺基酸取代。
天然存在之胺基酸可基於常見側鏈性質分成以下類別：疏水性(正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile)；中性親水性(Cys、Ser、Thr、Asn、Gln)；酸性(Asp、Glu)；鹼性(His、Lys、Arg)；影響鏈取向之殘基(Gly、Pro)；及芳族(Trp、Tyr、Phe)。
保守性胺基酸取代可包括此等類別之一的成員與同一類別之另一成員的交換。保守性胺基酸取代可涵蓋非天然存在之胺基酸殘基，其通常藉由化學肽合成而非藉由生物系統中之合成來併入。此等殘基包括肽模擬物及其他反轉或倒轉形式之胺基酸部分。本文所述之抗原結合蛋白的功能性及/或生物化學特徵之該等實質性修飾可藉由在重鏈及輕鏈之胺基酸序列中形成取代來達成，該等取代在其對維持以下之作用方面顯著不同：(a)取代區域中分子骨架的結構，例如呈片狀或螺旋構形；(b)分子之目標位點處之電荷或疏水性；或(c)側鏈之體積。
非保守性取代可包括將以上類別之一的成員換成另一類別之成 員。該等取代之殘基可引入抗體中與人類抗體同源之區域或分子之非同源區域中。
在作出該等變化時，根據某些實施例，可考慮胺基酸之親水指數。蛋白質之親水概況係藉由賦予各胺基酸以數值(「親水指數」)且接著沿肽鏈重複計算此等值之平均值來計算。已基於疏水性及電荷特徵對各胺基酸賦予親水指數。其為：異白胺酸(+4.5)；纈胺酸(+4.2)；白胺酸(+3.8)；苯丙胺酸(+2.8)；半胱胺酸/胱胺酸(+2.5)；甲硫胺酸(+1.9)；丙胺酸(+1.8)；甘胺酸(-0.4)；蘇胺酸(-0.7)；絲胺酸(-0.8)；色胺酸(-0.9)；酪胺酸(-1.3)；脯胺酸(-1.6)；組胺酸(-3.2)；麩胺酸(-3.5)；麩醯胺酸(-3.5)；天冬胺酸(-3.5)；天冬醯胺(-3.5)；離胺酸(-3.9)；及精胺酸(-4.5)。
此項技術中瞭解親水概況對賦予蛋白質相互作用生物功能之重要性(參見例如Kyte等人，1982,J.Mol.Biol.157：105-131)。已知某些胺基酸可取代具有類似親水指數或分數之其他胺基酸且仍保留類似生物活性。在基於親水指數作出變化時，在某些實施例中，納入親水指數在±2內之胺基酸的取代。在一些態樣中，納入在±1內之彼等胺基酸，且在其他態樣中，納入在±0.5內之彼等胺基酸。
此項技術中亦應瞭解，類似胺基酸之取代可基於親水性有效地進行，尤其當由此形成之生物功能性蛋白質或肽意欲用於免疫學實施例中時，如在本發明之情況中。在某些實施例中，蛋白質之最大局部平均親水性(取決於其相鄰胺基酸之親水性)與其免疫原性及抗原結合或免疫原性(亦即與該蛋白質之生物性質)有關。
已賦予此等胺基酸殘基以下親水性值：精胺酸(+3.0)；離胺酸(+3.0)；天冬胺酸(+3.0±1)；麩胺酸(+3.0±1)；絲胺酸(+0.3)；天冬醯胺(+0.2)；麩醯胺酸(+0.2)；甘胺酸(0)；蘇胺酸(-0.4)；脯胺酸(-0.5±1)；丙胺酸(-0.5)；組胺酸 (-0.5)；半胱胺酸(-1.0)；甲硫胺酸(-1.3)；纈胺酸(-1.5)；白胺酸(-1.8)；異白胺酸(-1.8)；酪胺酸(-2.3)；苯丙胺酸(-2.5)及色胺酸(-3.4)。在基於類似親水性值作出變化時，在某些實施例中，納入親水性值在±2內之胺基酸的取代，在其他實施例中，納入在±1內之彼等胺基酸，且在其他實施例中，納入在±0.5內之彼等胺基酸。在一些情況下，亦可基於親水性自一級胺基酸序列鑑別抗原決定基。此等區域亦稱為「抗原決定基核心區」。
例示性保守性胺基酸取代闡述於表4中。
殘基=初始殘基，取代=例示性取代
熟習此項技術者將能夠使用熟知技術判定如本文所闡述之多肽的適合變異體。熟習此項技術者可藉由靶向咸信對於活性不重要之區域來鑑別分子中可改變而不破壞活性之適合區域。熟習此項技術者亦將能夠鑑別分子中在類似多肽中具有保守性之殘基及部分。在其他實施例中，甚至對於生物活性或對於結構可能重要之區域亦可進行保守性胺基酸取代而不破壞生物活性或不會不利地影響多肽結構。
另外，熟習此項技術者可回顧鑑別類似多肽中對於活性或結構重 要之殘基的結構-功能研究。鑒於該種比較，可預測蛋白質中對應於類似蛋白質中對於活性或結構重要之胺基酸殘基之胺基酸殘基的重要性。熟習此項技術者可選擇對該等所預測重要的胺基酸殘基進行化學上類似的胺基酸取代。
熟習此項技術者亦可與類似多肽之結構相聯繫對三維結構及胺基酸序列進行分析。鑒於該資訊，熟習此項技術者可關於抗體之三維結構預測其胺基酸殘基之排列。熟習此項技術者可選擇不對預測位於蛋白質表面上之胺基酸殘基作出根本變化，因為該等殘基可能參與與其他分子之重要相互作用。此外，熟習此項技術者可產生在各所需胺基酸殘基處含有單一胺基酸取代之測試變異體。接著可使用檢定針對IL-23活性篩選此等變異體，(參見以下實例)由此得到關於可改變哪些胺基酸及不可改變哪些胺基酸之資訊。換言之，基於自該等常規實驗收集之資訊，熟習此項技術者可容易地判定應避免單獨進行進一步取代或與其他突變組合進行進一步取代的胺基酸位置。
許多科學出版物已致力於預測二級結構。參見Moult,1996,Curr.Op.in Biotech.7：422-427；Chou等人，1974,Biochem.13：222-245；Chou等人，1974,Biochemistry 113：211-222；Chou等人，1978,Adv.Enzymol.Relat.Areas Mol.Biol.47：45-148；Chou等人，1979,Ann.Rev.Biochem.47：251-276；及Chou等人，1979,Biophys.J.26：367-384。此外，目前可使用電腦程式幫助預測二級結構。一種預測二級結構之方法係基於同源性模型化。舉例而言，序列一致性大於30%或相似性大於40%之兩種多肽或蛋白質通常具有類似結構拓撲學。蛋白質結構資料庫(PDB)之最新發展已使得二級結構之可預測性提高，包括多肽或蛋白質結構中之潛在摺疊數。參見Holm等人，1999,Nucl.Acid.Res.27：244-247。已表明(Brenner等人，1997,Curr.Op.Struct.Biol.7：369-376)指定多肽或蛋白質中存在有限數目的摺疊且一旦解析 臨界數目之結構，則結構預測將會變得顯著更準確。
預測二級結構之其他方法包括「穿線法(threading)」(Jones,1997,Curr.Opin.Struct.Biol.7：377-387；Sippl等人，1996,Structure 4：15-19)、「輪廓分析(profile analysis)」(Bowie等人，1991,Science 253：164-170；Gribskov等人，1990,Meth.Enzym.183：146-159；Gribskov等人，1987,Proc.Nat.Acad.Sci.84：4355-4358)及「演化關聯(evolutionary linkage)」(參見Holm,1999，同上；及Brenner,1997，同上)。
在一些實施例中，進行具有如下作用之胺基酸取代：(1)降低對蛋白水解之敏感性；(2)降低對氧化之敏感性；(3)改變結合親和力以形成蛋白質複合物；(4)改變配位體或抗原結合親和力；及/或(4)賦予該等多肽以其他物理化學或功能性質或改良該等性質，諸如維持取代區域中之分子骨架的結構，例如呈片狀或螺旋構形；維持或改變分子之目標位點處之電荷或疏水性，或維持或改變側鏈之體積。
舉例而言，可在天然存在之序列中進行單一或多個胺基酸取代(在某些實施例中為保守性胺基酸取代)。可在抗體中位於形成分子間接觸之結構域以外的部分中進行取代。在該等實施例中，可使用不會實質上改變親本序列之結構特徵的保守性胺基酸取代(例如不會破壞為親本或原生抗原結合蛋白之特徵的二級結構之一或多個置換胺基酸)。業內公認之多肽二級及三級結構的實例描述於以下文獻中：Proteins,Structures and Molecular Principles(Creighton編)，1984,W.H.New York：Freeman and Company；Introduction to Protein Structure(Branden及Tooze編)，1991,New York：Garland Publishing；及Thornton等人，1991,Nature 354：105。
其他變異體包括半胱胺酸變異體，其中親本或原生胺基酸序列中之一或多個半胱胺酸殘基已缺失或經另一胺基酸(例如絲胺酸)取代。 半胱胺酸變異體為適用的，尤其當抗體(例如)必須再摺疊成生物活性構形時。與原生蛋白質相比，半胱胺酸變異體可具有較少半胱胺酸殘基，且通常具有偶數個以使由未配對半胱胺酸引起之相互作用減至最少。
所揭示之重鏈及輕鏈可變區及CDR可用於製備含有可特異性結合於IL-23多肽之抗原結合區的抗原結合蛋白。「抗原結合區」意謂特異性結合指定抗原之蛋白質或蛋白質之一部分，諸如含有與抗原相互作用且賦予抗原結合蛋白其對於目標抗原之特異性及親和力的胺基酸殘基之區域。抗原結合區可包括一或多個CDR且某些抗原結合區亦包括一或多個「構架」區。舉例而言，表3中所列之一或多個CDR可共價或非共價併入分子(例如多肽)中以產生免疫黏附。免疫黏附可合併CDR作為較大多肽鏈之一部分，可使CDR共價連接於另一多肽鏈，或可非共價合併CDR。CDR能夠使免疫黏附特異性結合於所關注之特定抗原(例如IL-23多肽)。
其他抗原結合蛋白包括基於本文所述之可變區及CDR的模擬物(例如「肽模擬物」)。此等類似物可為肽、非肽或肽與非肽區域之組合。Fauchere,1986,Adv.Drug Res.15：29；Veber及Freidinger,1985,TINS第392頁；及Evans等人，1987,J.Med.Chem.30：1229。結構上類似於治療上適用之肽的肽模擬物可用於產生類似治療性或預防性作用。該等化合物通常藉助於電腦化分子模型化來開發。肽模擬物一般為結構上類似於顯示所需生物活性(諸如結合IL-23之能力)之抗原結合蛋白的蛋白質，但肽模擬物中一或多個肽鍵視情況藉由此項技術中熟知之方法置換為選自例如以下之鍵聯：-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH-CH-(順式及反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-及-CH2SO-。用同一類型之D-胺基酸系統性取代共同序列之一或多個胺基酸(例如用D-離胺酸替代L-離胺酸)可在某些實施例中用於產生更穩定的蛋白 質。另外，包含共同序列或實質上一致的共同序列變化之限制性肽可藉由此項技術中已知之方法(Rizo及Gierasch,1992,Ann.Rev.Biochem.61：387)產生，例如藉由添加能夠形成使肽環化之分子內二硫橋鍵的內部半胱胺酸殘基。
亦提供本文所述之抗原結合蛋白的衍生物。衍生化之抗原結合蛋白可包含賦予抗原結合蛋白或片段以所需性質(諸如在特定用途中半衰期增加)之任何分子或物質。衍生化之抗原結合蛋白可包含例如可偵測(或標記)部分(例如放射性、比色、抗原性或酶促分子、可偵測珠粒(諸如磁性或電子緻密(例如金)珠粒)或結合於另一分子之分子(例如生物素或抗生蛋白鏈菌素))、治療或診斷部分(例如放射性、細胞毒性或醫藥活性部分)、或增加抗原結合蛋白對於特定用途(例如向諸如人類個體之個體投藥，或其他活體內或活體外用途)之適用性的分子。可用於對抗原結合蛋白進行衍生化之分子的實例包括白蛋白(例如人類血清白蛋白)及聚乙二醇(PEG)。抗原結合蛋白之白蛋白連接型及聚乙二醇化衍生物可使用此項技術中熟知之技術來製備。在一實施例中，抗原結合蛋白結合或以其他方式連接於甲狀腺素轉運蛋白(transthyretin，TTR)或TTR變異體。TTR或TTR變異體可用例如選自由以下組成之群的化學物質進行化學修飾：葡聚糖、聚(n-乙烯基吡咯啶酮)、聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇及聚乙烯醇。
其他衍生物包括IL-23抗原結合蛋白與其他蛋白質或多肽之共價或聚集結合物，諸如藉由表現包含異源多肽融合於IL-23抗原結合蛋白之N端或C端的重組融合蛋白。舉例而言，結合之肽可為異源信號(或前導)多肽(例如酵母α-因子前導序列)，或肽(諸如抗原決定基標籤)。含有IL-23抗原結合蛋白之融合蛋白可包含經添加以促進IL-23抗原結合蛋白之純化或鑑別的肽(例如聚His)。IL-23抗原結合蛋白亦可 連接於FLAG肽，如Hopp等人，1988,Bio/Technology 6：1204及美國專利第5,011,912號中所述。FLAG肽具有高度抗原性且提供由特定單株抗體(mAb)可逆結合之抗原決定基，從而能夠實現對所表現之重組蛋白的快速檢定及簡便純化。適用於製備FLAG肽融合於指定多肽之融合蛋白的試劑可購得(Sigma,St.Louis,MO)。
含有一或多個IL-23抗原結合蛋白之寡聚物可用作IL-23拮抗劑。寡聚物可呈共價連接或非共價連接之二聚物、三聚物或更高級寡聚物形式。預期使用包含兩個或兩個以上IL-23抗原結合蛋白之寡聚物，其中一個實例為均二聚物。其他寡聚物包括雜二聚物、均三聚物、雜三聚物、均四聚物、雜四聚物等。亦包括包含經由融合於IL-23抗原結合蛋白之肽部分之間的共價或非共價相互作用連接之多個IL-23結合蛋白的寡聚物。該等肽可為肽連接子(間隔子)，或具有促進寡聚合之性質的肽。適合肽連接子包括美國專利第4,751,180號及第4,935,233號中所述之肽連接子。白胺酸拉鏈及來源於抗體之某些多肽亦為可促進所連接IL-23抗原結合蛋白之寡聚合的肽。適合於產生可溶性寡聚蛋白質之白胺酸拉鏈域的實例描述於WIPO公開案第WO 94/10308號；Hoppe等人，1994,FEBS Letters 344：191；及Fanslow等人，1994,Semin.Immunol.6：267-278中。在一種方法中，包含IL-23抗原結合蛋白片段或衍生物融合於白胺酸拉鏈肽之重組融合蛋白可在適合宿主細胞中表現，且自培養物上清液回收所形成之可溶性寡聚IL-23抗原結合蛋白片段或衍生物。
該等寡聚物可包含兩至四個IL-23抗原結合蛋白。寡聚物之IL-23抗原結合蛋白部分可呈任何上述形式，例如變異體或片段。較佳地，寡聚物包含具有IL-23結合活性之IL-23抗原結合蛋白。寡聚物可使用來源於免疫球蛋白之多肽來製備。包含某些異源多肽融合於抗體來源多肽之各種部分(包括Fc域)的融合蛋白之製備已例如由以下文獻描 述：Ashkenazi等人，1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535；Byrn等人，1990,Nature 344：677；及Hollenbaugh等人，1992「Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins」,Current Protocols in Immunology，增刊4，第10.19.1-10.19.11頁。
亦包括包含兩個藉由使IL-23抗原結合蛋白融合於抗體之Fc區所形成之融合蛋白的二聚物。該二聚物可藉由例如以下步驟製備：將編碼融合蛋白之基因融合物插入適當表現載體中，在經重組表現載體轉型之宿主細胞中表現基因融合物，及使所表現之融合蛋白更類似於抗體分子般組裝，隨後在Fc部分之間形成鏈間二硫鍵以得到二聚物。該等Fc多肽包括自抗體之Fc區得到的多肽之原生及突變蛋白形式。亦包括含有促進二聚合之鉸鏈區的該等多肽之截短形式。包含Fc部分之融合蛋白(及由其形成之寡聚物)提供藉由以蛋白質A或蛋白質G管柱進行親和層析來進行簡便純化之優點。WIPO公開案第WO 93/10151號及美國專利第5,426,048號及第5,262,522號中所述之一種適合的Fc多肽為自人類IgG1抗體之Fc區的N端鉸鏈區延伸至原生C端之單鏈多肽。另一適用Fc多肽為美國專利第5,457,035號及Baum等人，1994,EMBO J.13：3992-4001中所述之Fc突變蛋白。此突變蛋白之胺基酸序列與WIPO公開案第WO 93/10151號中提供之原生Fc序列一致，除了胺基酸19已由Leu變為Ala，胺基酸20已由Leu變為Glu，且胺基酸22已由Gly變為Ala以外。突變蛋白展現對於Fc受體之親和力降低。
糖基化
抗原結合蛋白可具有與天然物種中所見不同或有所改變之糖基化模式。如此項技術中所已知，糖基化模式可視蛋白質之序列(例如存在或不存在以下所論述之特定糖基化胺基酸殘基)或產生蛋白質之宿主細胞或生物體而定。以下論述特定表現系統。
多肽之糖基化通常為N-連接型或O-連接型。N-連接型係指碳水 化合物部分連接於天冬醯胺殘基之側鏈。三肽序列天冬醯胺-X-絲胺酸及天冬醯胺-X-蘇胺酸(其中X為除脯胺酸以外之任何胺基酸)為碳水化合物部分與天冬醯胺側鏈酶促連接之識別序列。因此，多肽中存在任一此等三肽序列形成潛在糖基化位點。O-連接型糖基化係指糖N-乙醯半乳胺糖、半乳糖或木糖中之一者連接於羥基胺基酸，最通常為絲胺酸或蘇胺酸，不過亦可使用5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸。
向抗原結合蛋白中添加糖基化位點宜藉由改變胺基酸序列以使得其含有一或多個上述三肽序列來實現(用於N-連接型糖基化位點)。該變化亦可藉由向起始序列中添加一或多個絲胺酸或蘇胺酸殘基或用絲胺酸或蘇胺酸殘基進行取代來進行(用於O-連接型糖基化位點)。出於便利性，抗原結合蛋白胺基酸序列可經由在DNA層面上進行改變來改變，尤其藉由使編碼目標多肽之DNA在預選鹼基處突變以使得產生將轉譯為所需胺基酸之密碼子。
另一增加抗原結合蛋白上碳水化合物部分之數目的方法為使糖苷化學或酶促偶合於蛋白質。此等程序為有利的，因為其不需要在具有糖基化能力之宿主細胞中產生蛋白質來進行N-連接型及O-連接型糖基化。視所用之偶合模式而定，糖可連接於(a)精胺酸及組胺酸；(b)游離羧基；(c)游離氫硫基，諸如半胱胺酸之氫硫基；(d)游離羥基，諸如絲胺酸、蘇胺酸或羥基脯胺酸之羥基；(e)芳族殘基，諸如苯丙胺酸、酪胺酸或色胺酸之芳族殘基；或(f)麩醯胺酸之醯胺基。此等方法描述於PCT公開案第WO 87/05330號及Aplin及Wriston,1981,CRC Crit.Rev,Biochem.，第259-306頁中。
起始抗原結合蛋白上存在之碳水化合物部分的移除可以化學方法或以酶促方法實現。化學去糖基化需要使蛋白質暴露於化合物三氟甲烷磺酸或等效化合物。此處理導致除了連接糖(N-乙醯葡糖胺或N-乙醯半乳糖胺)以外的大部分或所有糖裂解，同時保持多肽完整。化學 去糖基化由Hakimuddin等人，1987,Arch.Biochem.Biophys.259：52及Edge等人，1981,Anal.Biochem.118：131描述。多肽上之碳水化合物部分的酶促裂解可如Thotakura等人，1987,Meth.Enzymol.138：350所述藉由使用多種內切及外切糖苷酶來達成。可如Duskin等人，1982,J.Biol.Chem.257：3105所述藉由使用化合物衣黴素(tunicamycin)防止潛在糖基化位點處之糖基化。衣黴素阻斷蛋白質-N-糖苷鍵之形成。
因此，態樣包括抗原結合蛋白之糖基化變異體，其中與親本多肽之胺基酸序列相比，糖基化位點之數目及/或類型已有所改變。在某些實施例中，與親本多肽相比，抗原結合蛋白變異體包含更多或更少數目之N-連接型糖基化位點。消除或改變此序列之取代將防止添加親本多肽中存在之N-連接型碳水化合物鏈。舉例而言，可藉由使Asn缺失或藉由用不同胺基酸取代Asn來減少糖基化。抗體通常在Fc區中具有N-連接型糖基化位點。
標記及效應基團
抗原結合蛋白可包含一或多個標記。術語「標記」或「標記基團」係指任何可偵測標記。一般而言，標記分成多種類別，此視對其進行偵測之檢定而定：a)同位素標記，其可為放射性或重同位素；b)磁性標記(例如磁性粒子)；c)氧化還原活性部分；d)光學染料；酶促基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)；e)生物素化基團；及f)由第二報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、第二抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤等)。在一些實施例中，標記基團經由各種長度之間隔臂偶合於抗原結合蛋白以降低潛在位阻。標記蛋白質之各種方法為此項技術中所已知。適合標記基團的實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶促基 團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團，或由第二報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、第二抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，標記基團經由各種長度之間隔臂偶合於抗原結合蛋白以降低潛在位阻。標記蛋白質之各種方法為此項技術中所已知且可適當使用。
術語「效應基團」意謂偶合於抗原結合蛋白且充當細胞毒性劑之任何基團。適合效應基團的實例為放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)。其他適合基團包括毒素、治療基團或化學治療基團。適合基團的實例包括刺孢黴素(calicheamicin)、奧瑞他汀(auristatin)、格爾德黴素(geldanamycin)及美登素(maytansine)。在一些實施例中，效應基團經由各種長度之間隔臂偶合於抗原結合蛋白以降低潛在位阻。
編碼IL-23抗原結合蛋白之聚核苷酸
亦提供編碼本文所述之抗原結合蛋白或其部分的聚核苷酸，包括編碼抗體之一條或兩條鏈或其片段、衍生物、突變蛋白或變異體的聚核苷酸，編碼重鏈可變區或僅CDR之聚核苷酸，足以用作用於鑑別、分析、突變或擴增編碼多肽之聚核苷酸之雜交探針、PCR引子或序列引子的聚核苷酸，抑制聚核苷酸表現之反義核酸，及上述之互補序列。聚核苷酸可為任何長度。其長度可為例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、85、95、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、750、1,000、1,500、3,000、5,000個或更多個核酸，包括中間所有值，及/或其可包含一或多個其他序列(例如調節序列)及/或較大聚核苷酸之一部分(例如載體)。聚核苷酸可為單股或雙股且可包含RNA及/或DNA核酸及其人造變異體(例如肽核酸)。
編碼某些抗原結合蛋白或其部分(例如全長抗體、重鏈或輕鏈、可變域或CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2或CDRL3)之聚核苷酸可自已用IL-23或其免疫原性片段免疫之小鼠的B細胞分離。聚核苷酸可藉由諸如聚合酶鏈反應(PCR)之習知程序來分離。噬菌體呈現為可用以製備抗體之衍生物及其他抗原結合蛋白之已知技術的另一實例。在一種方法中，作為所關注之抗原結合蛋白之組分的多肽在任何適合重組表現系統中表現，且使所表現之多肽組裝形成抗原結合蛋白分子。亦使用噬菌體呈現經由鏈改組來獲得具有不同性質之抗原結合蛋白(亦即改變對於其所結合之抗原的親和力)，參見Marks等人，1992,BioTechnology 10：779。
由於遺傳密碼子簡併性，所以本文所述之各多肽序列亦由除彼等所提供者外之許多其他聚核苷酸序列編碼。舉例而言，本文所提供之重鏈可變域可由聚核苷酸序列SEQ ID NO：32、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57或59編碼。輕鏈可變域可由聚核苷酸序列SEQ ID NO：2、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26或28編碼。一般技術者應瞭解，本申請案由此提供充分書面描述及編碼各抗原結合蛋白之各簡併核苷酸序列的實施。
一態樣進一步提供在特定雜交條件下與其他聚核苷酸分子雜交之聚核苷酸。雜交核酸之方法、影響雜交條件選擇之基本參數及設計適合條件之指導原則為此項技術中所熟知。參見例如Sambrook,Fritsch及Maniatis(2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.and Current Protocols in Molecular Biology,1995,Ausubel等人編，John Wiley & Sons,Inc.。如本文所定義，中等嚴格雜交條件使用含有5×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)、0.5% SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)之預洗滌溶液，約50%甲醯胺、6×SSC及55℃之雜交溫度之雜交緩衝液(或其他類似雜交 溶液，諸如含有約50%甲醯胺之溶液，其中雜交溫度為42℃)，及60℃、0.5×SSC、0.1% SDS中之洗滌條件。嚴格雜交條件在45℃下在6×SSC中雜交，隨後在68℃下在0.1×SSC、0.2% SDS中洗滌一或多次。此外，熟習此項技術者可操作雜交及/或洗滌條件以增加或降低雜交之嚴格度以使得包含彼此至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致(包括中間所有值)之核酸序列的聚核苷酸通常保持彼此雜交。
可藉由在聚核苷酸中進行突變來引入變化，由此導致其所編碼之多肽(例如抗原結合蛋白或抗原結合蛋白衍生物)的胺基酸序列發生變化。可使用此項技術中已知之任何技術來引入突變，諸如定點突變誘發及隨機突變誘發。可表現突變多肽並根據所需性質進行選擇。突變可引入聚核苷酸中而不顯著改變其所編碼之多肽的生物活性。舉例而言，對非必需胺基酸殘基進行取代。或者，一或多個突變可引入聚核苷酸中，從而選擇性改變其所編碼之多肽的生物活性。舉例而言，突變可定量或定性地改變生物活性，諸如增加、降低或消除抗原結合蛋白之活性及改變抗原結合蛋白之抗原特異性。
另一態樣提供適用作用於偵測核酸序列之引子或雜交探針的聚核苷酸。聚核苷酸可僅包含編碼全長多肽之核酸序列之一部分，例如可用作探針或引子之片段，或編碼多肽之活性部分(例如IL-23結合部分)的片段。基於核酸序列之探針可用於偵測核酸或類似核酸，例如編碼多肽之轉錄物。探針可包含標記基團，例如放射性同位素、螢光化合物、酶或酶輔因子。該等探針可用於鑑別表現多肽之細胞。
表現抗原結合蛋白之方法
本文所提供之抗原結合蛋白可藉由許多習知技術中之任一者來製備。舉例而言，IL-23抗原結合蛋白可藉由重組表現系統，使用此項技術中已知之任何技術來產生。參見例如Monoclonal Antibodies, Hybridomas：A New Dimension in Biological Analyses,Kennet等人(編)Plenum Press,New York(1980)；及Antibodies：A Laboratory Manual,Harlow及Lane(編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1988)。
本文亦提供包含至少一種如上文所述之聚核苷酸的呈質體、表現載體、轉錄或表現卡匣形式之表現系統及構築體，以及包含該等表現系統或構築體之宿主細胞。如本文中所使用，「載體」意謂適用於將蛋白質編碼資訊轉移至宿主細胞中之任何分子或實體(例如核酸、質體、噬菌體或病毒)。載體之實例包括(但不限於)質體、病毒載體、非游離型哺乳動物載體及表現載體，例如重組表現載體。表現載體(諸如重組表現載體)適用於對宿主細胞進行轉型且含有引導及/或控制(結合宿主細胞)一或多個可操作地連接於其之異源編碼區之表現的核酸序列。表現構築體可包括(但不限於)影響或控制轉錄、轉譯及(若存在內含子)影響可操作地連接於其之編碼區之RNA剪接的序列。「可操作地連接」意謂該術語所應用之組分處於允許其執行其固有功能之關係中。舉例而言，載體中「可操作地連接」於蛋白質編碼序列之控制序列(例如啟動子)經排列以使得控制序列之正常活性引起蛋白質編碼序列轉錄，從而引起所編碼蛋白質之重組表現。
另一態樣提供其中已引入表現載體(諸如重組表現載體)之宿主細胞。宿主細胞可為任何原核細胞(例如大腸桿菌(E.coli))或真核細胞(例如酵母、昆蟲或哺乳動物細胞(例如CHO細胞))。載體DNA可經由習知轉型或轉染技術引入原核或真核細胞中。對於哺乳動物細胞之穩定轉染，已知視所用之表現載體及轉染技術而定，僅一小部分細胞可將外源DNA整合至其基因組中。為鑑別及選擇此等整合體，一般將編碼可選擇標記(例如針對對抗生素之抗性)之基因與所關注之基因一起引入宿主細胞中。較佳可選擇標記包括賦予針對諸如G418、潮黴素 (hygromycin)及甲胺喋呤(methotrexate)之藥物之抗性者。其中，經所引入之聚核苷酸穩定轉染的細胞可藉由藥物選擇來鑑別(例如已合併可選擇標記基因之細胞將存活，而其他細胞死亡)。
抗原結合蛋白可在融合瘤細胞株中(例如特定言之抗體可在融合瘤中表現)或在除融合瘤以外之細胞株中表現。編碼抗原結合蛋白之表現構築體可用於轉型哺乳動物、昆蟲或微生物宿主細胞。轉型可使用用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之任何已知方法來進行，包括例如將聚核苷酸封裝於病毒或噬菌體中及藉由此項技術中已知之轉染程序用構築體轉導宿主細胞，如由美國專利第4,399,216號、第4,912,040號、第4,740,461號、第4,959,455號所例示。所用之最佳轉型程序將視所轉型之宿主細胞類型而定。將異源聚核苷酸引入哺乳動物細胞中之方法為此項技術所熟知，且包括(但不限於)葡聚糖介導之轉染、磷酸鈣沈澱、凝聚胺(polybrene)介導之轉染、原生質體融合、電穿孔、聚核苷酸囊封於脂質體中、將核酸與帶正電之脂質混合、及將DNA直接顯微注射至細胞核中。
重組表現構築體通常包含編碼多肽之聚核苷酸。多肽可包含以下一或多者：一或多個CDR，諸如本文所提供之CDR；輕鏈可變區；重鏈可變區；輕鏈恆定區；重鏈恆定區(例如CH1、CH2及/或CH3)；及/或IL-23抗原結合蛋白之另一骨架部分。使用標準連接技術將此等核酸序列插入適當表現載體中。在一實施例中，重鏈或輕鏈恆定區附接於本文所提供之重鏈或輕鏈可變區的C端且連接於表現載體中。通常選擇在所用特定宿主細胞中有功能之載體(亦即載體與宿主細胞機構相容，從而允許進行基因之擴增及/或表現)。在一些實施例中，使用採用利用蛋白質報導體(諸如二氫葉酸還原酶)進行之蛋白質-片段互補檢定的載體(參見例如美國專利第6,270,964號)。適合表現載體可購自例如Invitrogen Life Technologies(Carlsbad,CA)或BD Biosciences(San Jose,CA)。其他適用於選殖及表現抗體及片段之載體包括Bianchi及McGrew,2003,Biotech.Biotechnol.Bioeng.84：439-44中所述者。其他適合表現載體例如論述於Methods Enzymol.，第185卷(D.V.Goeddel編)，1990,New York：Academic Press中。
通常，用於任何宿主細胞中之表現載體將含有用於質體維持及用於選殖及表現外源性核苷酸序列之序列。在某些實施例中，總稱為「側接序列」之該等序列通常將包括一或多個以下核苷酸序列：啟動子、一或多個強化子序列、複製起點、轉錄終止序列、含有供者及受者剪接位點之完整內含子序列、編碼用於多肽分泌之前導序列的序列、核糖體結合位點、聚腺苷酸化序列、用於插入編碼待表現多肽之聚核苷酸的多酶切點接頭區域及可選擇標記元件。所提供之表現載體可自起始載體(諸如市售載體)建構。該等載體可能含有或可能不含所有所需側接序列。當本文所述之一或多個側接序列尚不存在於載體中時，其可個別地獲得且連接於載體中。用於獲得各側接序列之方法為熟習此項技術者所熟知。
視情況，載體可含有「標籤」編碼序列，亦即位於IL-23抗原結合蛋白編碼序列之5'或3'末端的寡核苷酸分子；該寡核苷酸序列編碼聚His(諸如六His)；或另一「標籤」，諸如FLAG®、HA(血球凝集素(hemaglutinin)流感病毒)或myc，其中存在針對其之市售抗體。此標籤通常在多肽表現時融合於多肽，且可用作自宿主細胞對IL-23抗原結合蛋白進行親和純化或偵測之方法。親和純化可例如藉由管柱層析，使用針對標籤之抗體作為親和基質來實現。視情況，標籤可隨後藉由各種方法(諸如使用某些肽酶進行裂解)自經純化之IL-23抗原結合蛋白移除。
側接序列可為同源(亦即來自與宿主細胞相同之物種及/或菌株)、異源(亦即來自不同於宿主細胞物種或品系之物種)、雜交(亦即來自一 個以上來源之側接序列的組合)、合成或原生序列。因此，側接序列之來源可為任何原核或真核生物體、任何脊椎動物或無脊椎動物生物體或任何植物，其限制條件為側接序列在宿主細胞機構中具有功能且可由宿主細胞機構活化。
適用於載體中之側接序列可藉由此項技術中熟知之若干方法中的任一者來獲得。通常，適用於本文之側接序列將已藉由定位及/或藉由限制性核酸內切酶消化預先鑑別且因此可使用適當限制性核酸內切酶自適當組織來源分離。在一些情況下，側接序列之完全核苷酸序列可為已知的。在本文中，側接序列可使用本文所述用於核酸合成或選殖的方法來合成。
無論已知側接序列之全部抑或僅一部分，其均可使用聚合酶鏈反應(PCR)及/或藉由用適合探針(諸如來自相同或不同物種之寡核苷酸及/或側接序列片段)篩選基因組文庫來獲得。當側接序列不為已知時，含有側接序列之DNA的片段可自可含有例如編碼序列或甚至其他基因之較大DNA片段分離。分離可藉由限制性核酸內切酶消化以產生適當DNA片段，隨後使用瓊脂糖凝膠純化、Qiagen®管柱層析(Qiagen,Chatsworth,CA)或熟習此項技術者已知之其他方法進行分離來完成。選擇適合酶來實現此目的對於一般技術者將顯而易知。
複製起點通常為在市面上購得之彼等原核表現載體的一部分，且該起點幫助載體在宿主細胞中擴增。若所選載體不含複製起點位點，則其可基於已知序列以化學方法合成，且連接於載體中。舉例而言，來自質體pBR322(New England Biolabs,Beverly,MA)之複製起點適合於大部分革蘭氏陰性細菌(gram-negative bacteria)，且各種病毒起點(例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(VSV)或乳頭狀瘤病毒(諸如HPV或BPV))適用於在哺乳動物細胞中選殖載體。哺乳動物表現載體一般不需要複製起點組分(例如通常僅使用SV40起點，因為 其亦含有病毒早期啟動子)。
轉錄終止序列通常位於多肽編碼區末端之3'方向且用以終止轉錄。通常，原核細胞中之轉錄終止序列為富含G-C之片段，其後為聚T序列。雖然序列容易自文庫選殖或甚至作為載體之一部分在市面上購得，但其亦可容易使用核酸合成方法(諸如本文所述之彼等方法)合成。
可選擇標記基因編碼在選擇性培養基中生長之宿主細胞之存活及生長所必需之蛋白質。典型選擇標記基因編碼如下蛋白質：(a)賦予對抗生素或其他毒素(例如用於原核宿主細胞之安比西林(ampicillin)、四環素(tetracycline)或康黴素(kanamycin))之抗性；(b)補充細胞之營養缺陷；或(c)供應無法自複合培養基或限定培養基獲得之關鍵營養物。特定可選擇標記為康黴素抗性基因、安比西林抗性基因及四環素抗性基因。有利的是，新黴素(neomycin)抗性基因亦可用於原核與真核宿主細胞中之選擇。
其他可選擇基因可用於擴增將表現之基因。擴增為使產生對於生長或細胞存活關鍵之蛋白質所需之基因在連續數代重組細胞之染色體中串聯重複的過程。適合於哺乳動物細胞之可選擇標記的實例包括二氫葉酸還原酶(DHFR)及無啟動子胸苷激酶基因。將哺乳動物細胞轉型體置於選擇壓力下，其中由於載體中存在可選擇基因而使僅轉型體唯一適應得以存活。藉由在培養基中選擇藥劑之濃度逐次增加的條件下培養轉型細胞來施加選擇壓力，從而引起可選擇基因與編碼另一基因(諸如結合於IL-23之抗原結合蛋白)之DNA均發生擴增。因此，由擴增之DNA合成數量增加之多肽(諸如抗原結合蛋白)。
核糖體結合位點通常為rnRNA之轉譯啟始所必需且特徵為Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。該元件通常位於啟動子之3'方向及待表現多肽之編碼序列的5'方向。
在一些情況下，諸如當真核宿主細胞表現系統中需要糖基化時，可操作各種前序列或原序列來改良糖基化或產量。舉例而言，可改變特定信號肽之肽酶裂解位點，或添加原序列，其亦可能會影響糖基化。最終蛋白質產物可能在-1位置(相對於成熟蛋白質之第一胺基酸)具有一或多個附帶表現之額外胺基酸，其可能尚未完全移除。舉例而言，最終蛋白質產物可具有在肽酶裂解位點中所發現之一或兩個胺基酸殘基連接於胺基端。或者，使用一些酶裂解位點可能產生所需多肽之稍微截短的形式，若該酶在成熟多肽中之該區域切割。
表現及選殖通常將含有由宿主生物體識別且可操作地連接於編碼IL-23抗原結合蛋白之分子的啟動子。啟動子為位於結構基因起始密碼子之上游(亦即5')的非轉錄序列(一般在約100至1000bp內)，其控制該結構基因之轉錄。啟動子通常分成兩類：誘導性啟動子及組成性啟動子。誘導性啟動子回應於培養條件之一些變化(諸如存在或不存在營養物或溫度變化)引發在其控制下自DNA之轉錄量增加。另一方面，組成性啟動子均一地轉錄其可操作地連接之基因，亦即對基因表現之控制極小或無控制。由多種潛在宿主細胞識別之許多啟動子為熟知的。藉由使用限制酶消化自來源DNA移除啟動子並將所需啟動子序列插入載體中來使適合啟動子可操作地連接於編碼IL-23抗原結合蛋白之重鏈可變區或輕鏈可變區的DNA。
適用於酵母宿主之啟動子亦為此項技術中所熟知。酵母強化子宜與酵母啟動子一起使用。適合用於哺乳動物宿主細胞之啟動子為熟知的且包括(但不限於)自以下病毒基因組獲得之彼等啟動子：諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、細胞巨大病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒及猿猴病毒40(SV40)。其他適合哺乳動物啟動子包括異源哺乳動物啟動子，例如熱休克啟動子及肌動蛋白啟動子。
可能受到關注之其他啟動子包括(但不限於)：SV40早期啟動子(Benoist及Chambon,1981,Nature 290：304-310)；CMV啟動子(Thornsen等人，1984,Proc.Natl.Acad.U.S.A.81：659-663)；勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)之3'長末端重複序列中所含的啟動子(Yamamoto等人，1980,Cell 22：787-797)；疱疹胸苷激酶啟動子(Wagner等人，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；來自金屬硫蛋白基因之啟動子及調節序列(Prinster等人，1982,Nature 296：39-42)；及原核啟動子，諸如β-內醯胺酶啟動子(Villa-Kamaroff等人，1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)；或tac啟動子(DeBoer等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。亦關注以下動物轉錄控制區，其展現組織特異性且已在轉殖基因動物中使用：在胰臟腺泡細胞中具有活性之彈性蛋白酶I基因控制區(Swift等人，1984,Cell 38：639-646；Ornitz等人，1986,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald,1987,Hepatology 7：425-515)；在胰臟β細胞中具有活性之胰島素基因控制區(Hanahan,1985,Nature 315：115-122)；在淋巴細胞中具有活性之免疫球蛋白基因控制區(Grosschedl等人，1984,Cell 38：647-658；Adames等人，1985,Nature 318：533-538；Alexander等人，1987,Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴及肥大細胞中具有活性之小鼠乳腺瘤病毒控制區(Leder等人，1986,Cell 45：485-495)；在肝中具有活性之白蛋白基因控制區(Pinkert等人，1987,Genes and Devel.1：268-276)；在肝中具有活性之α-胎蛋白基因控制區(Krumlauf等人，1985,Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987,Science 253：53-58)；在肝中具有活性之α1-抗胰蛋白酶基因控制區(Kelsey等人，1987,Genes and Devel.1：161-171)；在骨髓細胞中具有活性之β-血球蛋白基因控制區(Mogram等人，1985,Nature 315：338-340；Kollias等人，1986,Cell 46：89-94)；在腦中之寡樹突神經膠質細胞中具有活性之髓鞘鹼性蛋白基因控制區(Readhead等人，1987,Cell 48：703-712)；在骨骼肌中具有活性之肌凝蛋白輕鏈-2基因控制區(Sani,1985,Nature 314：283-286)；及在下視丘中具有活性之促性腺釋放激素基因控制區(Mason等人，1986,Science 234：1372-1378)。
可在載體中插入強化子序列以增加高等真核生物之轉錄。強化子為DNA之順式作用元件，通常長度為約10-300bp，其作用於啟動子以增加轉錄。強化子相對不依賴於取向及位置，已發現其位於轉錄單元之5'與3'方向的位置。可自哺乳動物基因獲得之若干個強化子序列為已知的(例如血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白及胰島素)。然而，通常使用來自病毒之強化子。此項技術中已知之SV40強化子、細胞巨大病毒早期啟動子強化子、多瘤病毒強化子及腺病毒強化子為用於活化真核啟動子之例示性強化元件。當強化子可位於載體中編碼序列之5'或3'方向時，其通常位於啟動子5'之位點。編碼適當原生或異源信號序列(前導序列或信號肽)之序列可併入表現載體中以促進抗體之細胞外分泌。信號肽或前導序列之選擇視待產生抗體之宿主細胞的類型而定，且異源信號序列可置換原生信號序列。在哺乳動物宿主細胞中具有功能之信號肽的實例包括以下：美國專利第4,965,195號中所述之介白素-7的信號序列；Cosman等人，1984,Nature 312：768中所述之介白素-2受體的信號序列；EP專利第0367 566號中所述之介白素-4受體信號肽；美國專利第4,968,607號中所述之I型介白素-1受體信號肽；EP專利第0 460 846號中所述之II型介白素-1受體信號肽。
已建構載體後，可將完成之載體插入適合於擴增及/或多肽表現之宿主細胞中。將抗原結合蛋白之表現載體轉型至所選宿主細胞中可藉由熟知方法完成，包括轉染、感染、磷酸鈣共沈澱、電穿孔、顯微 注射、脂質轉染法、DEAE-葡聚糖介導之轉染或其他已知技術。所選方法將部分與待使用之宿主細胞類型有關。此等方法及其他適合方法為熟習此項技術者所熟知，且陳述於例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)中。
宿主細胞在適當條件下培養時合成蛋白質，隨後該蛋白質可自培養基收集(若宿主細胞將其分泌於培養基中)或直接自產生其之宿主細胞收集(若其未分泌)。適當宿主細胞之選擇將視各種因素而定，諸如所需表現量、活性所需或必需之多肽修飾(諸如糖基化或磷酸化)及摺疊成生物活性分子之容易性。
可獲得用作表現宿主的哺乳動物細胞株為此項技術中所熟知且包括(但不限於)購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)之永生化細胞株，包括(但不限於)中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、海拉細胞(HeLa cell)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)、人類肝細胞癌細胞(例如Hep G2)及許多其他細胞株。在某些實施例中，可經由判定哪些細胞株具有高表現量且組成性產生具有IL-23結合性質之抗原結合蛋白來選擇細胞株。在另一實施例中，亦可選擇來自不產生自身抗體但具有產生及分泌異源抗體之能力的B細胞譜系之細胞株。
人類IL-23抗原結合蛋白用於診斷及治療目的之用途
抗原結合蛋白適用於偵測生物樣品中之IL-23及鑑別產生IL-23之細胞或組織。特異性結合於IL-23之抗原結合蛋白可用於診斷及/或治療有需要之患者的與IL-23有關之疾病。舉例而言，IL-23抗原結合蛋白可用於診斷檢定，例如偵測及/或定量血液、血清、細胞或組織中所表現之IL-23的結合檢定。另外，IL-23抗原結合蛋白可用於降低、抑制、干擾或調節細胞或組織中之IL-23的一或多種生物活性。因 此，結合於IL-23之抗原結合蛋白在改善與IL-23有關之疾病方面可具有治療用途。
適應症
本發明亦係關於IL-23抗原結合蛋白用於預防或治療性處理醫學病症(諸如本文所揭示之彼等病症)之用途。IL-23抗原結合蛋白適用於治療IL-23與基礎疾病或病症相關或在造成基礎疾病或病症中起作用或在其他方面造成負面症狀之多種病狀。
IL-23抗原結合蛋白可有效治療之病狀在發炎性反應中起作用。該等發炎性病症包括牙周疾病；肺部病症，諸如哮喘；皮膚病症，諸如牛皮癬、異位性皮膚炎、接觸性皮膚炎；風濕性病症，諸如類風濕性關節炎、進行性全身性硬化症(硬皮病)；全身性紅斑狼瘡；脊椎關節病，包括僵直性脊椎炎、牛皮癬性關節炎、腸病性關節炎及反應性關節炎。亦涵蓋葡萄膜炎，包括福格特-小柳-原田氏病(Vogt-Koyanagi-Harada disease)、特發性前葡萄膜炎及後葡萄膜炎、及與脊椎關節炎相關之葡萄膜炎。亦涵蓋使用IL-23抗原結合蛋白治療自體免疫性病症，包括多發性硬化症；自體免疫性心肌炎；第1型糖尿病及自體免疫性甲狀腺炎。
腸胃系統之退化性病狀可用IL-23抗原結合蛋白來治療或預防。該等腸胃病症包括發炎性腸病：克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎及乳糜瀉。
亦包括使用IL-23抗原結合蛋白來治療移植物抗宿主疾病及併發症，諸如由實體器官移植引起之移植物排斥反應，諸如心臟、肝、皮膚、腎、肺或其他移植物，包括骨髓移植物。
本文亦提供使用IL-23抗原結合蛋白治療各種腫瘤病症之方法，該等病症包括各種形式之癌症，包括結腸癌、胃癌、前列腺癌、腎細胞癌、子宮頸癌及卵巢癌以及肺癌(SCLC及NSCLC)。亦包括實體腫 瘤，包括肉瘤、骨肉瘤及癌瘤，諸如腺癌及鱗狀細胞癌、食管癌、胃癌、膽囊癌、白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、骨髓白血病、慢性或急性淋巴母細胞性白血病及毛細胞白血病)及多發性骨髓瘤。
診斷方法
所述抗原結合蛋白可出於診斷目的用於偵測、診斷或監測與IL-23相關之疾病及/或病狀。適用於偵測IL-23存在之方法的實例包括免疫檢定，諸如酶聯免疫吸附檢定(ELISA)及放射免疫檢定(RIA)。
對於診斷應用，通常以可偵測標記基團對抗原結合蛋白進行標記。適合標記基團的實例包括(但不限於)以下：放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、若丹明、鑭系元素磷光體)、酶促基團(例如辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團，或由第二報導體識別之預定多肽抗原決定基(例如白胺酸拉鏈對序列、第二抗體之結合位點、金屬結合域、抗原決定基標籤)。在一些實施例中，標記基團經由各種長度之間隔臂偶合於抗原結合蛋白以降低潛在位阻。標記蛋白質之各種方法為此項技術中所已知且可使用。
提供鑑別表現IL-23之細胞的其他診斷方法。在一特定實施例中，用標記基團標記抗原結合蛋白且偵測經標記抗原結合蛋白與IL-23之結合。在另一特定實施例中，活體內偵測抗原結合蛋白與IL-23之結合。在另一特定實施例中，分離IL-23抗原結合蛋白且使用此項技術中已知之技術進行量測。參見例如Harlow及Lane,1988,Antibodies：A Laboratory Manual,New York：Cold Spring Harbor(1991年編及定期增刊)；John E.Coligan編，1993,Current Protocols In Immunology New York：John Wiley & Sons。
提供偵測與所提供之抗原結合蛋白競爭結合於IL-23之測試分子之存在的其他方法。一種該檢定之一實例涉及在存在或不存在測試分子下偵測含有一定量之IL-23的溶液中游離抗原結合蛋白之量。游離抗原結合蛋白(亦即未結合於IL-23之抗原結合蛋白)之量增加將指示測試分子能夠與抗原結合蛋白競爭IL-23結合。在一實施例中，用標記基團標記抗原結合蛋白。或者，對測試分子進行標記且在存在及不存在抗原結合蛋白下監測游離測試分子之量。
治療方法：醫藥調配物、投藥途徑
提供包含治療有效量之一種或多種抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之賦形劑、稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、防腐劑及/或佐劑的醫藥組合物。另外，包括投與該等醫藥組合物來治療患者之方法。術語「患者」包括人類患者。術語「治療」涵蓋減輕或預防病症之至少一種症狀或其他態樣，或降低疾病嚴重程度，及其類似作用。術語「治療有效量」或「有效量」係指所測定之IL-23抗原結合蛋白在哺乳動物體內產生任何治療反應的量。該等治療有效量容易由此技術中一般技術者確定。
抗原結合蛋白無需影響完全治癒，或根除疾病之每種症狀或表現，即構成可行治療劑。如相關領域中所認知，用作治療劑之藥物可降低指定疾病病況之嚴重程度，而無需消除疾病之每種表現，即視為適用治療劑。類似地，預防性投與治療無需完全有效地預防病狀發作，即構成可行預防劑。僅降低疾病影響(例如藉由降低其症狀之數目或嚴重程度，或藉由增加另一治療之有效性，或藉由產生另一有益作用)或降低個體疾病發生或惡化之可能性即足夠。本文所提供之某些方法包含向患者投與IL-23拮抗劑(諸如本文所揭示之抗原結合蛋白)足以誘導反映特定病症嚴重程度之指標相對於基線持續改善的量及時間。
如相關領域中所瞭解，以適合適應症之方式向患者投與包含本發明分子的醫藥組合物。醫藥組合物可藉由任何適合技術投與，包括(但不限於)非經腸、局部或吸入。若注射，則醫藥組合物可例如經由關節內、靜脈內、肌肉內、病灶內、腹膜內或皮下途徑，藉由快速注射(bolus injection)或連續輸注投與。涵蓋局部投藥(例如在疾病或損傷部位)，亦涵蓋經皮傳遞及自植入物持續釋放。藉由吸入傳遞包括例如經鼻或經口吸入、使用霧化器、吸入氣溶膠形式之拮抗劑，及其類似方式。其他替代方式包括滴眼劑；口服製劑，包括丸劑、糖漿、含片(lozenges)或口嚼錠；及局部製劑，諸如洗劑、凝膠、噴霧及軟膏。
亦涵蓋在離體程序中使用抗原結合蛋白。舉例而言，可使患者之血液或其他體液與結合IL-23之抗原結合蛋白離體接觸。抗原結合蛋白可結合於適合之不溶性基質或固體支撐材料。
抗原結合蛋白宜以包含一或多種其他組分(諸如生理上可接受之載劑、賦形劑或稀釋劑)之組合物形式投與。視情況，該組合物另外包含一或多種生理活性劑以用於組合療法。醫藥組合物可包含IL-23抗原結合蛋白以及一或多種選自由以下組成之群的物質：緩衝劑、抗氧化劑(諸如抗壞血酸)、低分子量多肽(諸如少於10個胺基酸之彼等多肽)、蛋白質、胺基酸、碳水化合物(諸如葡萄糖、蔗糖或糊精)、螯合劑(諸如EDTA)、麩胱甘肽、穩定劑及賦形劑。中性緩衝生理食鹽水或與同種血清白蛋白混合之生理食鹽水為適當稀釋劑之實例。根據適當工業標準，亦可添加諸如苯甲醇之防腐劑。組合物可使用適當賦形劑溶液(例如蔗糖)作為稀釋劑來調配成凍乾物。適合組分在所用之劑量及濃度下對接受者無毒性。可用於醫藥調配物中之組分的其他實例提供於Remington's Pharmaceutical Sciences，包括第21版(2005),Mack Publishing Company,Easton,PA中。
醫學從業者使用之套組包括IL-23抗原結合蛋白及關於在治療本文所論述之任何病狀中使用的標籤或其他說明。在一實施例中，該套組包括一或多種IL-23結合抗原結合蛋白之無菌製劑，其可呈如以上所揭示之組合物形式，且可存在於一或多個小瓶中。
投藥之劑量及頻率可根據以下因素來改變：諸如投藥途徑、所用之特定抗原結合蛋白、待治療疾病之性質及嚴重程度、病狀為急性抑或慢性、及個體之體型及一般狀況。適當劑量可藉由相關技術中已知之程序來確定，例如在可涉及劑量遞增研究之臨床試驗中確定。
典型劑量視上文所提及之因素而定可在約0.1μg/kg至約30mg/kg或更大之範圍內。在特定實施例中，劑量可在0.1μg/kg至約30mg/kg、視情況1μg/kg至約30mg/kg、視情況10μg/kg至約10mg/kg、視情況約0.1mg/kg至5mg/kg或視情況約0.3mg/kg至3mg/kg之範圍內。
給藥頻率將視所用調配物中特定人類IL-23抗原結合蛋白之藥物動力學參數而定。臨床醫師通常投與組合物直至達到達成所需作用之劑量。因此，組合物可隨時間以單次劑量或以兩次或兩次以上劑量(其可能含有或可能不含相同量之所需分子)投與，或經由植入裝置或導管以連續輸注形式投與。適當劑量可經由使用適當劑量-反應資料來確定。本發明之IL-23抗原結合蛋白可例如在一段時間內以規律時間間隔投與例如一次或超過一次。在特定實施例中，投與IL-23抗原結合蛋白持續至少一個月或更長時間，例如持續一個月、兩個月或三個月或甚至無限期投與。對於治療慢性病狀，長期治療一般最有效。然而，對於治療急性病狀，較短期投藥(例如一至六週)可能即足夠。一般而言，投與抗原結合蛋白直至患者關於所選指標相對於基線表現出醫學上相關程度之改善。
預期在足以誘導至少一種反映所治療病症之嚴重程度之指標之改 善(較佳為持續改善)的量及時間下向患者投與IL-23抗原結合蛋白。可評估反映患者疾病或病狀程度之各種指標以判定治療之量及時間是否足夠。該等指標包括例如所述病症之疾病嚴重程度、症狀或表現之臨床上認可的指標。在一實施例中，若個體顯示間隔兩至四週出現至少兩次改善，則改善視為持續改善。改善程度一般由醫師判定，該醫師可基於徵兆、症狀、活組織檢查或其他測試結果來作出此判定，且該醫師亦可利用給予個體之調查表，諸如開發用於指定疾病之生活品質調查表。
本發明之方法及組合物的特定實施例涉及使用IL-23抗原結合蛋白及一或多種其他IL-23拮抗劑，例如兩種或兩種以上本發明之抗原結合蛋白，或本發明之抗原結合蛋白及一或多種其他IL-23拮抗劑。亦提供單獨投與或與適用於治療患者所患病狀之其他藥劑組合投與之IL-23抗原結合蛋白。該等藥劑之實例包括蛋白質性與非蛋白質性藥物。該等藥劑包括具有消炎性質之治療性部分(例如非類固醇消炎劑、類固醇、免疫調節劑及/或其他細胞激素抑制劑，諸如拮抗例如IFN-γ、GM-CSF、IL-6、IL-8、IL-17、IL-22及TNF之彼等抑制劑)，或IL-23抗原結合蛋白之治療性部分及一或多種其他治療(例如手術、超音波或有效減少炎症之治療)。當共投與多種治療劑時，可適當地調整劑量，如相關技術中所公認或已知。可與IL-23抗原結合蛋白組合之適用藥劑包括用於治療例如克羅恩氏病或潰瘍性結腸炎之彼等藥劑，諸如胺基水楊酸鹽(例如美沙胺(mesalamine))；皮質類固醇(包括潑尼松(predisone))；抗生素，諸如甲硝噠唑(metronidazole)或環丙沙星(ciprofloxacin)(或適用於治療例如罹患瘺管病之患者的其他抗生素)；及免疫抑制劑，諸如硫唑嘌呤(azathioprine)、6-巰基嘌呤、甲胺喋呤、他克莫司(tacrolimus)及環孢靈(cyclosporine)。該或該等藥劑可經口投與或藉由另一途徑投與，例如經由栓劑或灌腸劑投與。可與 IL-23結合蛋白組合治療牛皮癬之藥劑包括局部或全身使用之皮質類固醇、鈣泊三醇(calcipotriene)及其他維生素D衍生物、阿維A脂(acetretin)及其他視黃酸衍生物、甲胺喋呤、他克莫司及環孢靈。該等藥劑可同時、連續、交替或根據使得總體治療過程有效之任何其他方案來投與。
除人類患者外，IL-23抗原結合蛋白亦適用於治療非人類動物，諸如家養寵物(犬、貓、鳥、靈長類動物等)、家養農畜(馬、牛、綿羊、豬、鳥等)。在該等情況下，可根據動物體重來確定適當劑量。舉例而言，可使用0.2-1mg/kg之劑量。或者，根據動物表面積來確定劑量，例示性劑量範圍為0.1-20mg/m2或更佳為5-12mg/m2。對於小型動物(諸如犬或貓)，適合劑量為0.4mg/kg。IL-23抗原結合蛋白(較佳由自來源於接受者物種之基因建構)藉由注射或其他適合途徑每週投與一或多次直至動物病狀得到改善，或其可無限期投與。
以下實例(包括所進行之實驗及所達成之結果)僅出於說明性目的提供且不應理解為限制隨附申請專利範圍之範疇。
實例 實例1 產生人類IL-23抗體
使用XenoMouseTM技術(Amgen,Thousand Oaks,CA)來開發識別及抑制原生人類IL-23活性而不破壞人類IL-12之人類單株抗體。該等抗體亦識別及抑制重組獼猴IL-23，但不識別鼠類或大鼠IL-23。
使用下文所述之STAT-螢光素酶報導體檢定選擇識別及完全抑制自人類單核細胞衍生之樹突狀細胞(MoDC)獲得的原生人類IL-23之抗體。使用陰性選擇自來自健康供者之周邊血液單核細胞分離人類單核細胞(單核細胞分離套組II，Miltenyi Biotec,Auburn,CA)。藉由將單核細胞與人類GM-CSF(50ng/ml)及人類IL-4(100ng/ml)一起在含有 10%胎牛血清完全培養基之RPMI 1640中培養7天來產生MoDC。接著用PBS洗滌MoDC兩次，隨後再用人類CD40L(1μg/ml)刺激48小時。經CD40L刺激之MoDC上清液含有IL-23、IL-12及IL-12/23p40。使用ELISA測定IL-12p70(R&D System,Minneapolis,MN)、IL-23(eBiosciences,San Diego,CA)及IL-12/23p40(R&D Systems)之量。STAT-螢光素酶檢定對IL-23有反應而對IL-12或游離IL-12/23p40無反應，因此可將檢定用於粗上清液以評估IL-23活性。對於在下文所述之NK細胞檢定中使用，相繼使用IL-23親和管柱及尺寸排阻層析來純化原生人類IL-23粗上清液。使用IL-23特異性ELISA(eBiosciences)測定濃度。
亦在STAT-螢光素酶檢定中針對重組人類(rhu)IL-23及重組獼猴(cyno)IL-23測試經純化之抗體上清液。在完全抑制重組人類IL-23之所測試抗體中，僅一半彼等抗體識別及完全抑制原生人類IL-23。識別及完全抑制重組人類IL-23並不預示識別及完全抑制原生人類IL-23，亦與其無關。如完全抑制重組人類IL-23之抗體上清液的圖1A及1B中所示，僅一半彼等抗體完全抑制原生人類IL-23。選擇識別及完全抑制原生人類IL-23之彼等抗體進行進一步表徵。
實例2 功能檢定
a)STAT-螢光素酶檢定
已知IL-23結合其雜二聚受體且經由JAK2及Tyk2進行信號傳導來活化STAT 1、3、4及5。在此檢定中，使用經STAT/螢光素酶報導基因轉染之細胞來評估IL-23抗體抑制IL-23誘導之生物活性的能力。
用STAT-螢光素酶報導體短暫轉染表現人類IL-23受體之中國倉鼠卵細胞隔夜。在96孔板中連續稀釋IL-23抗體(以37.5μg/ml開始，12個點的1：4連續稀釋液)。原生人類IL-23(製備方法描述於實例1中)添加 至各孔中至2ng/ml之濃度並在室溫下培育15-20分鐘。添加經短暫轉染之細胞(8×103個細胞)至每孔100μl之最終體積且在37℃、10% CO2下培育5小時。培育後，在室溫下使用每孔100μL Glo溶解緩衝液(1×)(Promega,Madison,Wisconsin)溶解細胞5分鐘。將50微升細胞溶解產物與50μL Bright-Glo螢光素酶受質(Promega)一起添加至96孔板中且在光度計上讀取。
統計分析可使用GraphPad PRISM軟體(GraphPad Software,La Jolla,CA)進行。結果可表述為平均值±標準偏差(SD)。
如在表5中可見，所有IL-23抗體均以劑量依賴性方式有效且完全抑制原生人類IL-23誘導之STAT/螢光素酶報導體。抗體亦有效且完全抑制重組人類(rhu)IL-23及重組獼猴(cyno)IL-23。抗體之IC50值均在微微莫耳濃度範圍內。
b)NK細胞檢定
已知IL-23作用於天然殺手細胞以誘導促發炎細胞激素(諸如干擾素γ(IFNγ))之表現。在此檢定中，使用人類初級天然殺手(NK)細胞來評估在表現人類IL-23之原生受體的細胞中IL-23抗體抑制IL-23誘導之IFNγ活性的能力。
經由陰性選擇自多個人類供者分離NK細胞(NK細胞分離套組，Miltenyi Biotec,Auburn,CA)。將經純化之NK細胞(每毫升1×106個細胞)添加至6孔板中之補充有重組人類IL-2(10ng/ml，R&D Systems,Minneapolis,MN)的RPMI 1640加10%胎牛血清完全培養基中至每孔10ml之最終體積。在37℃、5% CO2下培養細胞7天。接著在IL-23抗體之連續稀釋液(以3μg/ml開始，11個點的1：3連續稀釋液)存在下用rhuIL-23或cyno IL-23(10ng/ml)及重組人類IL-18(20ng/ml，R&D Systems,Minneapolis,MN)刺激經IL-2活化之NK細胞24小時。根據製造商之說明，藉由IFNγ ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)量測上清液中之IFNγ含量。
統計分析可使用GraphPad PRISM軟體進行。結果可表述為平均值±標準偏差(SD)。
如在表6中可見，所有抗體均以劑量依賴性方式有效抑制NK細胞中之rhuIL-23及cyno IL-23誘導之IFNγ表現。抗體之IC50值均在微微莫耳濃度範圍內。使用原生人類IL-23(30μg/ml，製備方法描述於實例1中)及rhuIL-18(40ng/ml，R&D Systems)對抗體子集進行檢定且得到表6中所示之結果。與對IL-23特異性抗體之選擇一致，使用上述檢定，此等抗IL-23抗體對NK細胞中之IL-12刺激之IFNγ產生無影響，而IL-12p35特異性中和抗體mAb219(R&D Systems,Minneapolis,MN)有效抑制重組人類IL-12。
表6. NK細胞檢定中IL-23抗體之平均IC50(pM)值的表格。
c)人類全血檢定
使用Refludan®(Bayer Pittsburgh,PA)作為抗凝血劑，自多個健康供者收集人類全血。全血中Refludan®之最終濃度為10μg/ml。將rhuIL-23或cyno IL-23(最終濃度為1ng/ml)+rhuIL-18(最終濃度為20ng/ml)+rhuIL-2(最終濃度為5ng/ml)於RPMI 1640+10% FBS中之刺激混合物添加至96孔板中，最終體積為每孔20μl。以每孔20μl添加連續稀釋之IL-23抗體(以3μg/ml開始，11個點的1：3連續稀釋液)且在室溫下與該刺激混合物一起培育30分鐘。接著添加全血(每孔120μl)且用RPMI 1640+10% FBS將最終體積調整至每孔200μl。全血之最終濃度為60%。在37℃、5% CO2下培育板24小時。收集無細胞上清液且根據製造商之說明，藉由IFNγ ELISA(R&D Systems)量測上清液之IFNγ含量。
統計分析可使用GraphPad PRISM軟體進行。結果可表述為平均 值±標準偏差(SD)。
如在表7中可見，所有抗體均以劑量依賴性方式有效抑制全血細胞中之rhuIL-23誘導及cyno IL-23誘導之IFNγ表現。抗體之IC50值均在微微莫耳濃度範圍內。
d)IL-22檢定
已知IL-23為促發炎細胞激素之有效誘導劑。IL-23作用於活化及記憶T細胞且促進產生促發炎細胞激素(包括IL-22)之Th17細胞的存活及擴增。在此檢定中，使用人類全血來評估IL-23抗體抑制IL-23誘導之IL-22產生的能力。
以與上述相同之方式進行全血檢定，其中修改之處為使用1ng/ml之rhuIL-23或cynoIL-23及10ng/ml之rhuIL-18來誘導IL-22產生。藉由IL-22 ELISA(R&D Systems,Minneapolis,MN)測定IL-22濃度。
如在表8中可見，抗體以劑量依賴性方式有效抑制全血細胞中之rhuIL-23誘導及cyno IL-23誘導之IL-22產生。抗體之IC50值均在微微莫耳濃度範圍內。
表8. IL-22人類全血檢定中IL-23抗體之平均IC50(pM)值的表格
實例3 使用KinExA技術測定抗IL-23抗體之平衡解離常數(K D )
使用動力學排阻檢定(KinExA檢定，Sapidyne Instruments,Inc.,Boise,ID)評估rhuIL-23與IL-23抗體之結合親和力。用rhuIL-23預塗佈正常人類血清(NHS)活化之瓊脂糖4速流珠粒(Amersham Biosciences，GE Healthcare之部門，Uppsala,Sweden)且用含10mg/mL BSA之1m Tris緩衝液阻斷。在室溫下將50pM IL-23抗體與rhuIL-23(以800pM開始，12個點的1：2稀釋液)一起培育72小時，隨後使其流過塗有rhuIL-23之瓊脂糖珠粒。利用經螢光(Cy5)標記之山羊抗人類Fc抗體(Jackson Immuno Research,West Grove,Pa.)定量結合珠粒之抗體的量。在平衡狀態下結合信號與游離抗體之量成正比。
使用KinExA Pro軟體，自曲線擬合獲得解離平衡常數(KD)及締合速率(Kon)。解離速率(Koff)自以下得到：KD=Koff/Kon。
如在表9中可見，抗體對於結合於人類IL-23具有高親和力。所有抗體之KD值均在低pM至次pM範圍內。
實例4 使用X-射線結晶學進行結構測定
一種測定抗體-抗原複合物之結構的方法為使用X-射線結晶學，參見例如Harlow及Lane Antibodies：A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)，第23頁。已測定IL-23之晶體結構(參見Lupardus及Garcia,J Mol Biol,2008,382：931-941)且已揭示IL-23/Fab複合物之晶體結構(參見Beyer等人J Mol Biol,2008.382(4)：942-55)。使用X-射線結晶學獲得IL-23與本文所主張之抗體的Fab片段之結構測定。
用於結晶之蛋白質
使用以重組方式獲得之人類IL-23雜二聚體進行結晶研究(參見Beyer等人，同上)。人類p19次單元之序列包含SEQ ID NO：145之殘基20-189、SEQ ID NO：154之信號序列及C端6-His標籤SEQ ID NO：155。人類p40次單元之序列在SEQ ID NO：147之位置222處自天冬醯胺突變為麩醯胺酸以阻止此位點之糖基化(Beyer等人，同上)。
自抗體B及抗體E獲得之Fab表現於併有卡斯蛋白酶裂解位點之IgG1骨架上。藉助於蛋白酶裂解對Fab進行處理。
複合物形成及結晶
IL-23-抗體B Fab複合物藉由將2倍莫耳過量之抗體B Fab與上述人類雜二聚IL-23混合來製備。藉由尺寸排阻層析純化該複合物以移除過量抗體B Fab並濃縮至約12mg/ml以供結晶。IL-23-抗體B Fab複合物在0.1M Hepes(pH 7)、8% PEG 8000中結晶。
IL-23-抗體E Fab複合物藉由將2倍莫耳過量之抗體E Fab與上述人類雜二聚IL-23混合來製備。根據製造商之說明，使用JBS甲基化套組(Jena Bioscience,Jena,Germany)對複合物進行甲基化。接著用PNGase處理複合物以使蛋白質去糖基化。此等處理後，藉由尺寸排阻層析純化複合物以移除過量抗體E Fab並濃縮至13.5mg/ml以供結晶。IL-23-抗體E Fab複合物在0.1M Tris(pH 8.5)、0.2M氯化鎂、15% PEG 4000中結晶。
資料收集及結構測定
IL-23-抗體B Fab晶體以單位晶胞尺寸為a=70.93、b=71.27、c=107.37Å、β=104.98°之P21空間群生長且繞射至2.0Å解析度。藉由分子置換，用程式MOLREP(CCP4，The CCP4 suite：programs for protein crystallography.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,1994.50(Pt 5)：第760-3頁)，使用IL-23結構(Beyer等人，同上)作為起始搜尋模型來解出IL-23-抗體B Fab結構。保持IL-23溶液固定，使用抗體可變域作為搜尋模型。保持IL-23-抗體可變域溶液固定，使用抗體恆定域作為搜尋模型。經由多輪使用量子(Quanta)進行模型建立及使用cnx進行改進來改良完整結構(Brunger等人，Acta Crystallogr D Biol Crystallogr,1998,54(Pt 5)：第905-21頁)。
使用程式PyMOL(DeLano,W.L.The PyMOL Graphics System.Palo Alto,2002)(Schrodinger,LLC；New York,NY))計算蛋白質原子之間的距離。若至少一個原子位於與搭配物蛋白質之所需距離臨限值內，則選擇胺基酸。
當IL-23結合於抗體B Fab時，IL-23之p19次單元之A、B、C及D螺旋的邊界包括SEQ ID NO：145之A螺旋殘基28-47、B螺旋殘基86-105、C螺旋殘基119-134及D螺旋殘基154-187。
當IL-23p19次單元結合於抗體B Fab時，IL-23p19次單元上之相互 作用區域包括SEQ ID NO：145之Ser46-Glu58、Glu112-Glu123及Pro155-Phe163中的殘基。
具有距離抗體B Fab 4Å或更小之原子的IL-23p19次單元胺基酸殘基包括SEQ ID NO：145之Ser46、Ala47、His48、Pro49、Leu50、His53、Met54、Asp55、Glu58、Pro113、Ser114、Leu115、Leu116、Pro120、Val121、Trp156、Leu159、Leu160、Arg162及Phe163。具有距離抗體B Fab 4Å與5Å之間的原子之IL-23p19胺基酸殘基包括SEQ ID NO：145之Va151、Arg57、Glu112、Asp118、Ser119、Gln123、Pro155。
具有距離抗體B Fab 4Å或更小之原子的IL-23p40次單元胺基酸殘基包括SEQ ID NO：147之Glu 122及Lys 124。
具有距離IL-23雜二聚體4Å或更小之原子的抗體B Fab重鏈胺基酸殘基包括SEQ ID NO：46之Gly32、Gly33、Tyr34、Tyr35、His54、Asn58、Thr59、Tyr60、Lys66、Arg101、Gly102、Phe103、Tyr104及Tyr105。具有距離IL-23雜二聚體5Å之原子的抗體B Fab重鏈胺基酸殘基包括SEQ ID NO：46之Ser31、Gly32、Gly33、Tyr34、Tyr35、His54、Ser56、Asn58、Thr59、Tyr60、Lys66、Arg101、Gly102、Phe103、Tyr104及Tyr105。
具有距離IL-23雜二聚體4Å或更小之原子的抗體B Fab輕鏈胺基酸殘基包括SEQ ID NO：15之Ser30、Ser31、Trp32、Tyr49、Ser52、Ser53、Ala91、Asn92、Ser93、Phe94及Phe96。具有距離IL-23雜二聚體5Å之原子的抗體B Fab輕鏈胺基酸殘基包括SEQ ID NO：15之Ser30、Ser31、Trp32、Tyr49、Ala50、Ser52、Ser53、Ser56、Ala91、Asn92、Ser93、Phe94及Phe96。
IL-23-抗體E Fab複合物晶體以單位晶胞尺寸為a=61.60、b=97.59、c=223.95Å之P2221空間群生長且繞射至3.5Å解析度。如上 文所述，藉由分子置換，用程式Phaser(CCP4，同上)，使用IL-23結構、抗體可變域及抗體恆定域作為三個起始搜尋模型來解出IL-23-抗體E Fab複合物結構。經由多輪使用量子(Quanta)進行模型建立及使用cnx進行改進來改良完整結構(Brunger等人，同上)。抗體E Fab恆定域由於蛋白質之彼部分的電子密度極低而不保留最終改進結構中。
當IL-23p19次單元結合於抗體E Fab時，所鑑別之IL-23p19次單元上的相互作用區域包括SEQ ID NO：145之Ser46-His53、Glu112-Val120及Trp156-Phe163中的殘基。
具有距離抗體E Fab 4Å或更小之原子的IL-23p19胺基酸殘基包括SEQ ID NO：145之Ser46、Ala47、His48、Pro49、Leu50、Glu112、Pro113、Ser114、Leu115、Leu116、Pro117、Asp118、Ser119、Pro120、Trp156、Leu159、Leu160及Phe163。具有距離抗體E Fab 4Å與5Å之間之原子的IL-23p19胺基酸殘基包括SEQ ID NO：145之His53。
具有距離抗體E Fab 4Å或更小之原子的IL-23p40胺基酸殘基包括SEQ ID NO：147之Lys121、Glu 122、Pro123及Asn 125。
具有距離IL-23雜二聚體4Å或更小之原子的抗體E Fab重鏈胺基酸殘基包括SEQ ID NO：31之Gly26、Phe27、Thr28、Ser31、Tyr53、Tyr59、Tyr102、Ser104、Ser105、Trp106、Tyr107及Pro108。具有距離IL-23雜二聚體5Å之原子的抗體E Fab重鏈胺基酸殘基包括SEQ ID NO：31之Gln1、Gly26、Phe27、Thr28、Ser30、Ser31、Tyr32、Trp52、Tyr53、Tyr59、Arg100、Tyr102、Thr103、Ser104、Ser105、Trp106、Tyr107及Pro108。
具有距離IL-23雜二聚體4Å或更小之原子的抗體E Fab輕鏈胺基酸殘基包括SEQ ID NO：1之Ala31、Gly32、Tyr33、Asp34、Tyr51、Gly52、Asn55、Lys68及Tyr93。具有距離IL-23雜二聚體5Å或更小 之原子的抗體B Fab輕鏈胺基酸殘基包括SEQ ID NO：1之Thr29、Ala31、Gly32、Tyr33、Asp34、Tyr51、Gly52、Asn55、Lys68、Tyr93及Trp100。
實例5 經由溶劑可接近表面積差來確定IL-23-抗體複合物接觸殘基
使用溶劑可接近表面積差來確定互補位(抗體中識別抗原之部分)及其所結合之由人類IL-23-抗體B Fab複合物及人類IL-23-抗體E Fab複合物中之互補位結合的抗原部分中之殘基接觸。溶劑可接近表面積計算係使用Molecular Operating Environment(Chemical Computing Group,Montreal,Quebec)來進行。
IL-23-抗體B Fab複合物中之互補位殘基的溶劑可接近表面積差藉由將抗體B Fab殘基設定為所需組來計算。使用實例4中獲得之關於IL-23-抗體B Fab複合物的結構資訊且計算在IL-23雜二聚體存在下抗體B Fab之胺基酸殘基的殘基溶劑可接近表面積並代表該組之「結合面積」。
計算在IL-23抗原不存在下各抗體B Fab殘基之殘基溶劑可接近表面積且代表該組之「游離面積」。
接著自「游離面積」減去「結合面積」，得到組內各殘基之「溶劑接觸表面積差」。當複合時，表面積無變化或差值為零之抗體B Fab殘基不與IL-23抗原之殘基接觸。差值10Å2之抗體B Fab殘基被視為明顯與IL-23抗原中之殘基接觸以使得當抗體B Fab結合於人類IL-23時，此等抗體B Fab殘基至少部分至完全被遮蔽。此組抗體B Fab殘基構成「覆蓋補丁」，當抗體B Fab結合於人類IL-23時該等殘基牽涉於界面結構中，參見表10及11。此覆蓋補丁內之抗體B Fab殘基可能不全部牽涉於與IL-23抗原之殘基的結合相互作用中，但覆蓋補丁內任何單個殘基之突變可能引入能量差異，此將影響抗體B Fab與人類IL- 23之結合。除Tyr49外，所有殘基均位於抗體B Fab輕鏈及重鏈之CDR區中。當IL-23抗原結合於抗體B Fab時，此等殘基亦在IL-23抗原之5Å或更小以內，如實例4中所述。
如上文所述計算IL-23-抗體E Fab複合物中之殘基的溶劑可接近表面積差。差值10Å2之抗體E Fab殘基被視為明顯與IL-23抗原中之殘基接觸且當抗體E Fab結合於人類IL-23時，此等抗體E Fab殘基至少部分至完全被遮蔽。此組抗體E Fab殘基構成覆蓋補丁，當抗體E Fab結合於人類IL-23時該等殘基牽涉於界面結構中，參見表12及13。此覆蓋補丁內之抗體E Fab殘基可能不全部牽涉於與IL-23抗原之殘基的結合相互作用中，但覆蓋補丁內任何單個殘基之突變可能引入能量差異，此將影響抗體E Fab與人類IL-23之結合。此等覆蓋補丁殘基大部分位於抗體E Fab重鏈及輕鏈之CDR區中。當IL-23抗原結合於抗體E Fab時，此等殘基亦在IL-23抗原之5Å或更小以內，如實例4中所述。
IL-23雜二聚體中由抗體B Fab之互補位結合之部分的溶劑可接近表面積差藉由將IL-23雜二聚體殘基設定為所需組來計算。使用實例4中所獲得之關於抗體B Fab-IL-23複合物的結構資訊且計算在抗體B Fab存在下IL-23雜二聚體之胺基酸殘基的殘基溶劑可接近表面積並代表該組之結合面積。
計算在抗體B Fab不存在下各IL-23雜二聚體殘基之殘基溶劑可接近表面積且代表該組之游離面積。
如上文所述，自游離面積減去結合面積，得到各IL-23殘基之溶 劑接觸表面積差。當複合時，表面積無變化或差值為零之IL-23雜二聚體殘基不與抗體B Fab之殘基接觸。差值10Å2之IL-23雜二聚體殘基被視為明顯與抗體B Fab之殘基接觸且當人類IL-23雜二聚體結合於抗體B Fab時，此等IL-23雜二聚體殘基至少部分至完全被遮蔽。此組IL-23雜二聚體殘基構成覆蓋補丁，當人類IL-23雜二聚體結合於抗體E Fab時該等殘基牽涉於界面結構中，參見表14。此覆蓋補丁內之IL-23雜二聚體殘基可能不全部牽涉於與抗體B Fab上之殘基的結合相互作用中，但覆蓋補丁內任何單個殘基之突變可能引入能量差異，此將影響抗體B Fab與人類IL-23之結合。此等殘基亦在距離抗體B Fab 5Å或更小以內，如實例4所述。
如上文所述計算IL-23雜二聚體中由抗體E Fab之互補位結合之部分的溶劑可接近表面積差。差值10Å2之IL-23雜二聚體殘基被視為明顯與抗體E Fab之殘基接觸且當人類IL-23雜二聚體結合於抗體E Fab時，此等IL-23雜二聚體殘基至少部分至完全被遮蔽。此組IL-23雜二聚體殘基構成覆蓋補丁，當人類IL-23雜二聚體結合於抗體E Fab時該等殘基牽涉於界面結構中，參見表15。此覆蓋補丁內之IL-23雜二聚體殘基可能不全部牽涉於與抗體E Fab上之殘基的結合相互作用中，但覆蓋補丁內任何單個殘基之突變可能引入能量差異，此將影響抗體E Fab與人類IL-23之結合。此等殘基亦在距離抗體E Fab 5Å或更小以內，如實例4中所述。
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 116
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 117
<210> 118
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 118
<210> 119
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人
<400> 119
<210> 120
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 120
<210> 121
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
<210> 122
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
<210> 123
<211> 11
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為Gly或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可為Ile、Phe或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為Ser或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> Xaa可為Phe或Leu
<400> 123
<210> 124
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為Asn或Ser
<400> 124
<210> 125
<211> 14
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可為Ile或Thr
<400> 125
<210> 126
<211> 12
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可為Ile或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (12)..(12)
<223> Xaa可為Asp或Glu
<400> 126
<210> 127
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為Asn或Gly
<400> 127
<210> 128
<211> 13
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為Ser或Asn
<400> 128
<210> 129
<211> 7
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可為Ser或Thr
<400> 129
<210> 130
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為Gly或Ala
<400> 130
<210> 131
<211> 5
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa可為Tyr或Phe
<400> 131
<210> 132
<211> 16
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為Tyr或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可為Thr或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可為Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為Thr或Ser
<400> 132
<210> 133
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為Phe或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為Leu或Thr
<400> 133
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為Arg或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可為Ile或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可為Ile、His或Tyr
<400> 134
<210> 135
<211> 17
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可為Lys或Glu
<400> 135
<210> 136
<211> 10
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可為Asn或Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可為His、Tyr或Phe
<400> 136
<210> 137
<211> 16
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可為Gly或Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可為Phe或Trp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Xaa可為His或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (14)..(14)
<223> Xaa可為Leu及Met
<400> 137
<210> 138
<211> 15
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa可為Ser或Thr
<400> 138
<210> 139
<211> 112
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa可為Ile或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (41)..(41)
<223> Xaa可為Val或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> Xaa可為Gly或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (107)..(107)
<223> Xaa可為Arg或Lys
<400> 139
<210> 140
<211> 120
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (30)..(30)
<223> Xaa可為And或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (37)..(37)
<223> Xaa可為Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (52)..(52)
<223> Xaa可為Tyr或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> Xaa可為Tyr或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa可為Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (59)..(59)
<223> Xaa可為Ser或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (69)..(69)
<223> Xaa可為Ser或Thr
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (71)..(71)
<223> Xaa可為Val或Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(77)
<223> Xaa可為Ile或Met
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (83)..(83)
<223> Xaa可為Lys或Gln
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (99)..(99)
<223> Xaa可為Arg或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (100)..(100)
<223> Xaa可為Asp或Asn
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (103)..(103)
<223> Xaa可為His、Phe或Tyr
<400> 140
<210> 141
<211> 125
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (23)..(23)
<223> Xaa可為Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> Xaa可為Ala或Val
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Xaa可為Thr或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可為Tyr或Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (54)..(54)
<223> Xaa可為Ser或Arg
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa可為Arg或Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (60)..(60)
<223> Xaa可為His、Tyr或Ile
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (105)..(105)
<223> Xaa可為Pro或Gly
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (106)..(106)
<223> Xaa可為Trp或Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (107)..(107)
<223> Xaa可為Gly或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (112)..(112)
<223> Xaa可為Met或Leu
<400> 141
<210> 142
<211> 121
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (33)..(33)
<223> Xaa可為Gly或Ala
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (48)..(48)
<223> Xaa可為Val或Leu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (49)..(49)
<223> Xaa可為Ala或Ser
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (53)..(53)
<223> Xaa可為Phe或His
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (57)..(57)
<223> Xaa可為Leu及Ile
<400> 142
<210> 143
<211> 124
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 共同序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (58)..(58)
<223> Xaa可為Glu或Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (103)..(103)
<223> Xaa可為Thr或Ser
<400> 143
<210> 144
<211> 1026
<212> DNA
<213> 智人
<400> 144
<210> 145
<211> 189
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
<210> 146
<211> 1399
<212> DNA
<213> 智人
<400> 146
<210> 147
<211> 328
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
<210> 148
<211> 2826
<212> DNA
<213> 智人
<400> 148
<210> 149
<211> 629
<212> PRT
<213> 智人
<400> 149
<210> 150
<211> 2100
<212> DNA
<213> 智人
<400> 150
<210> 151
<211> 662
<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
<210> 152
<211> 360
<212> DNA
<213> 智人
<400> 152
<210> 153
<211> 120
<212> PRT
<213> 智人
<400> 153
<210> 154
<211> 23
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> 蜜蜂蜂毒肽信號
<400> 154
<210> 155
<211> 6
<212> PRT
<213> 人造序列
<220>
<223> His標籤
<400> 155

Claims (44)

  1. 一種結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其包含：具有SEQ ID NO：129的CDRH1；具有SEQ ID NO：132的CDRH2；具有SEQ ID NO：136的CDRH3；具有SEQ ID NO：123的CDRL1；具有SEQ ID NO：81的CDRL2；及具有SEQ ID NO：76的CDRL3。
  2. 如請求項1之經分離之抗原結合蛋白，其包含至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區。
  3. 如請求項1之經分離之抗原結合蛋白，其包含至少兩個重鏈可變區及至少兩個輕鏈可變區。
  4. 一種結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其包含選自由以下組成之群之至少一個重鏈可變區及至少一個輕鏈可變區：a)包含SEQ ID NO：46或153之胺基酸殘基31-37、52-67及100-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：15之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區；b)包含SEQ ID NO：48之胺基酸殘基31-37、52-67及100-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：17之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區；c)包含SEQ ID NO：50之胺基酸殘基31-37、52-67及101-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：19之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕 鏈可變區；d)包含SEQ ID NO：54之胺基酸殘基31-37、52-67及100-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：23之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區；e)包含SEQ ID NO：56之胺基酸殘基31-37、52-67及100-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：25之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區；及f)包含SEQ ID NO：58之胺基酸殘基31-37、52-57及100-109的重鏈可變區；及包含SEQ ID NO：27之胺基酸殘基24-34、50-56及89-97的輕鏈可變區。
  5. 一種結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其包含：包含與SEQ ID NO：46、48、50、54、56及58具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區；及包含與SEQ ID NO：15、17、19、23、25及27具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  6. 如請求項5之經分離之抗原結合蛋白，其包含：包含與SEQ ID NO：46、48、50、54、56及58具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區；及包含與SEQ ID NO：15、17、19、23、25及27具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  7. 如請求項5之經分離之抗原結合蛋白，其包含：包含與SEQ ID NO：46、48、50、54、56及58具有至少97%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區；及 包含與SEQ ID NO：15、17、19、23、25及27具有至少97%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  8. 如請求項5之經分離之抗原結合蛋白，其包含：包含與SEQ ID NO：46、48、50、54、56及58具有至少98%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區；及包含與SEQ ID NO：15、17、19、23、25及27具有至少98%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  9. 如請求項5之經分離之抗原結合蛋白，其包含：選自由SEQ ID NO：46、48、50、54、56、58及153組成之群的重鏈可變區，及選自由SEQ ID NO：15、17、19、23、25及27組成之群的輕鏈可變區。
  10. 一種結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其包含選自由以下組成之群的重鏈可變區及輕鏈可變區：a)SEQ ID NO：46或153之重鏈可變區及SEQ ID NO：15之輕鏈可變區；b)SEQ ID NO：48之重鏈可變區及SEQ ID NO：17之輕鏈可變區；c)SEQ ID NO：50之重鏈可變區及SEQ ID NO：19之輕鏈可變區；d)SEQ ID NO：54之重鏈可變區及SEQ ID NO：23之輕鏈可變區；e)SEQ ID NO：56之重鏈可變區及SEQ ID NO：25之輕鏈可變區；及f)SEQ ID NO：58之重鏈可變區及SEQ ID NO：27之輕鏈可變區。
  11. 一種結合IL-23之經分離之抗原結合蛋白，其包含：包含與SEQ ID NO：46具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區；及包含與SEQ ID NO：15具有至少90%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  12. 如請求項11之經分離之抗原結合蛋白，其包含：包含與SEQ ID NO：46具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區；及包含與SEQ ID NO：15具有至少95%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  13. 如請求項11之經分離之抗原結合蛋白，其包含：包含與SEQ ID NO：46具有至少97%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區；及包含與SEQ ID NO：15具有至少97%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  14. 如請求項11之經分離之抗原結合蛋白，其包含：包含與SEQ ID NO：46具有至少98%序列一致性之胺基酸序列的重鏈可變區；及包含與SEQ ID NO：15具有至少98%序列一致性之胺基酸序列的輕鏈可變區。
  15. 如請求項1至14中任一項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為抗體。
  16. 如請求項15之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗體為單株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體、嵌合抗體、多特異性抗體，或其抗體片段。
  17. 如請求項16之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗體片段為Fab片 段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、雙功能抗體(diabody)或單鏈抗體分子。
  18. 如請求項16之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為人類抗體。
  19. 如請求項16之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為單株抗體。
  20. 如請求項15之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4型。
  21. 如請求項20之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白為IgG1或IgG2型。
  22. 一種經分離之核酸分子，其編碼如請求項1至14中任一項之抗原結合蛋白。
  23. 如請求項22之經分離之核酸分子，其中至少一個重鏈可變區由選自由SEQ ID NO：47、49、51、55、57、59及152組成之群的經分離之核酸分子編碼，及至少一個輕鏈可變區由選自由SEQ ID NO：16、18、20、24、26及28組成之群的經分離之核酸分子編碼。
  24. 如請求項23之經分離之核酸分子，其中該核酸分子可操作地連接於控制序列。
  25. 一種載體，其包含如請求項22之核酸分子。
  26. 一種宿主細胞，其包含如請求項22之核酸分子。
  27. 一種宿主細胞，其包含如請求項25之載體。
  28. 一種經分離之聚核苷酸，其足以用作雜交探針、PCR引子或定序引子，其為如請求項23之核酸分子的片段或其互補序列。
  29. 一種製備如請求項1至14中任一項之抗原結合蛋白的方法，其包含自分泌該抗原結合蛋白之宿主細胞製備該抗原結合蛋白的步 驟。
  30. 如請求項1至14中任一項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白結合人類IL-23之p19次單元的A、C及D螺旋之每一者而非B螺旋中的至少一個胺基酸殘基。
  31. 如請求項1至14中任一項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白結合SEQ ID NO：145之胺基酸殘基46-58中之至少一個殘基、殘基112-123中之至少一個殘基、及殘基155-163中之至少一個殘基。
  32. 如請求項31之經分離之抗原結合蛋白，其中當該抗原結合蛋白結合於人類IL-23時，SEQ ID NO：147之殘基121-125中的殘基具有大於或等於10Å2之差值。
  33. 如請求項1至14中任一項之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白具有至少一種選自由以下組成之群的性質：a)降低人類IL-23活性；b)減少促發炎細胞激素產生；c)以5×10-8M之KD結合於人類IL-23；d)具有5×10-6 l/s之Koff速率；及e)具有400pM之IC50。
  34. 一種醫藥組合物，其包含至少一種如請求項1至14中任一項之抗原結合蛋白及醫藥學上可接受之賦形劑。
  35. 如請求項34之醫藥組合物，其進一步包含標記基團或效應基團。
  36. 如請求項35之醫藥組合物，其中該標記基團係選自由以下組成之群：同位素標記、磁性標記、氧化還原活性部分、光學染料、生物素化基團、及由第二報導體識別之預定多肽抗原決定基。
  37. 如請求項35之醫藥組合物，其中該效應基團係選自由以下組成之群：放射性同位素、放射性核種、毒素、治療基團及化學治療基團。
  38. 如請求項35之經分離之抗原結合蛋白，其中該抗原結合蛋白偶合於標記基團。
  39. 一種如請求項1至14中任一項之經分離之抗原結合蛋白的用途，其係用於製造用於治療或預防IL-23相關病狀的藥劑。
  40. 如請求項39之用途，其中該病狀係選自由發炎病症、風濕性病症、自體免疫性病症、致癌病症及腸胃病症組成之群。
  41. 如請求項40之用途，其中該病狀係選自由以下組成之群：多發性硬化症、類風濕性關節炎、癌症、牛皮癬、發炎性腸病、克羅恩氏病(Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、全身性紅斑狼瘡、牛皮癬性關節炎、自體免疫性心肌炎；第1型糖尿病及僵直性脊椎炎。
  42. 如請求項39之用途，其中該經分離之抗原結合蛋白係單獨投與或以組合療法投與。
  43. 一種如請求項1至14中任一項之抗原結合蛋白的用途，其係用於製造用於降低IL-23活性之藥劑。
  44. 如請求項43之用途，其中該IL-23活性為誘導促發炎細胞激素產生。
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