RS55763B1 - Jedinjenja enedina, njihovi konjugati, primene i metode - Google Patents

Description

OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PREDMETNI PRONALAZAK ODNOSI

Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenja enedina i njihove konjugate, metode za dobijanje i primenu takvih jedinjenja i konjugata, i kompozicije koje sadrže takva jedinjenja i konjugate.

STANJE TEHNIKE PREDMETNOG PRONALASKA

Enedini (enedivnes) su familija antibiotika koji poseduju karakterističan napregnut sistem prstena sa devet ili deset članova koji sadrži Z-ugljenik-ugljenik dvostruku vezu i dve ugljenik-ugljenik trostruke veze, obično uređen tako da druge dve oivičavaju prvu. Enedini imaju potentnost da oštećuju DNK, uzrokujući prekide na jednostrukim i dvostrukim lancima. Njihova potentnost se pripisuje njihovoj sposobnosti da se veže za DNK i prolazi kroz Bergmanovo preuređenje u kome je lančani prstenasti sistem konvertovan u visoko reaktivni 1,4-benzenoid diradikal, koji oštećuje DNK tako što apstrahuje vodonik iz njega.

Uncialamicin je enedin izolovan iz sojaStreptomycesnađenog na lišajuCladonia uncialis(Davieset al2005; 2007). (Kompletna navodjenja referenci koje se pominju u ovoj specifikaciji po imenu prvog autora ili pronalazača i godina su obezbeđena u odeljku pod nazivom "REFERENCE" kasnije ovde).

Struktura uncialamicina je potvrđena totalnom sintezom (Nicolaouet ah2007a; 2007b). U toku sinteze, primećeno je da je neprirodni 26(S) epimer bio skoro aktivan kao prirodni 26(R) epimer - to jest daje stereohemija C27 metila imala manji efekat na biološku aktivnost. Oba epimera su bila aktivna na nekoliko tumorskih ćelijskih linija ovarijuma. Vrednosti ICso su bile u opsegu od 9 x IO"12do 1 x 10"<10>, u zavisnosti od epimera i ćelijske linije ili pod-linije (Nicolaouet ah,2008).

Konjugati su važan metod za isporučivan]e antikancerskih lekova, koji su obično visoko citotoksični i mogli bi inače biti problematični za administraciju usled rizika od sistemske toksičnosti. U konjugatu, lek je konjugovan (kovalentno vezan) za ciljajući deo koji je specifično ili preferencijalno vezan za hemijski entitet karakterističan za kancersku ćeliju, tako isporučujući lek tamo sa visokom specifičnošću. Dalje, lek se drži u neaktivnom obliku dok se ne oslobodi iz konjugata, obično cepanjem kovalentnog veznika (linkera, veze).

Tipično, ciljajući deo je antitelo ili njegov antigen-vezujući deo, čiji antigen je prekomerno eksprimiran ili jedinstveno eksprimiran od strane kancerske ćelije ("tumor-povezani antigen" - antigen povezan sa tumorom). U takvim slučajevima, rezultujući konjugat se ponekad naziva kao "imunokonjugat" ili "konjugat antitelo-lek " (antibody-drug conjugate - ADC).

Poželjno tumor-povezani antigen je lociran na površini ćelije, ali takođe može biti onaj koji je sekretovan u susedan vanćelijski prostor. Nakon vezivanja, antigen-konjugat kompleks je internalizovan i najzad nalazi svoj put unutar vezikularnog tela kao što je lizozom, gde je kovalentni veznik pokidan, oslobađajući aktivni lek da ispolji svoj hemioterapijski efekat.

Povoljno, kovalentni veznik je dizajniran tako daje cepanje uzrokovano faktorom koji preovladava unutar kancerske ćelije ali ne u plazmi. Jedan takav faktor je niski lizozomalni pH, tako da kovalentni veznik može biti grupa osetljiva na kiselinu kao što je hidrazon. Drugi takav faktor je generalno visoka koncentracija glutationa, što dozvoljava cepanje disulfidne kovalentne veze pomoću mehanizma disulfidne razmene. Još jedan faktor je prisustvo lizozomalnih enzima kao što je katepsin B, koji može da čepa peptidne veze dizajnirane da budu poželjni supstrati (Dubovvchiketdl.2002).

Konjugati su korišćeni da isporučuju enedinske lekove u onkologiji. Gemtuzumab ozogamin (Mvlotarg®) je konjugat anti-CD33 monoklonskog antitela i derivat enedinskog kaliheamicina. Odobren je za lečenje akutne mijelogene leukemije ali je kasnije povučen sa tržišta. Nekoliko drugih enedinskih lekova, posebno u obliku konjugata, je bilo predmet napora koji su bili ulagani u razvoj. Kao prikaz, videti Shao 2008. WO 93/23046 koji stavlja na uvid javnosti jedinjenja koja cepaju DNK, koja su citotoksična i imaju antikancersko delovanje, a koja su enantiomerni fuzionisani prstenasti sistemi koji obuhvataju enedinski makrociklični prsten i epoksidni prsten.

KRATAK REZIME PREDMETNOG PRONALASKA

Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenja bazirana na građi unialamicina, koja su potentni citotoksini koji su korisni kao hemioterapijski lekovi, koji se koriste ili kao takvi ili u konjugatima. U jednom aspektu, obezbeđeno je jedinjenje koje ima strukturu predstavljenu formulom (I):

gde

R° je NHR<la>, NHC(=0)OR<lb>, NHC(=0)NHR<lb>, OC(=0)NHR<lb>, (CH2)i-4NHR<la>, F, Cl, Br, ORla, ili SR<lb>;

R<la>je H, Ci-Ce alkil, (CH2)nNH2, C(=0)(CH2)nNH2, C(=0)CHR<8>NH2, ili C(=0)R<9>NH2;

Rlb je H, Ci-Ce alkil, (CH2)nNH2,

R2 je H, R<10>, C(=0)R<10>, ili C(=0)OR10;

R3jeHCi-C6 alkil;

R<4>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR10, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, iliNHC(=0)R<10>;

R<5>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR10, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, ili NHC(=0)R<10>;

R<6>je H ili nesupstituisan ili supstituisan Ci-Cć alkil; ili R<5>i R<6>se kombinuju da formiraju =0;

R<7>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR10, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, ili NHC(=0)R10;

R<8>je ostatak bočnog lanca a-amino kiseline odabrane od grupe koja se sastoji od alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, y-karboksiglutaminska kiselina, citrulin, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, norleucin, norvalin, ornitin, fenilalanin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin;

R<9>je nesupstituisan ili supstituisan arilen, nesupstituisan ili supstituisan heteroarilen, nesupstituisan ili supstituisan alkilarilen, nesupstituisan ili supstituisan cikloalkilen ili nesupstituisan ili supstituisan heterocikloalkilen;

svaki R<10>je nezavisno nesupstituisan ili supstituisan C1-C6alkil, nesupstituisan ili supstituisan cikloalkil, nesupstituisan ili supstituisan heterocikloalkil, nesupstituisan ili supstituisan arilalkil, nesupstituisan ili supstituisan aril; ili nesupstituisan ili supstituisan heteroaril; i

nje 2, 3, 4, 5, ili 6;

ili farmaceutski prihvatljiva so istog.

Poželjno, u formuli (I) R° je NHR<la>.

Grupa NHR<la>može biti vezana za bilo koji od ugljenikovih atoma na položajima 6, 7, 8, ili 9 (videti strukturnu formulu za uncialamicin, iznad, za numerisanje ugljenikovih atoma). Prema tome, struktura formule (I) može biti ekvivalentno prikazana formulom (T)

Gde jedna od R11 grupa je R° i preostale R11 grupe su svaka H i R°, R<2>, R3,R4,R5,R<6>, i R<7>su definisane iznad za formulu (I).

Uncialamicin je potencijalni kandidat za komponentu leka u konjugatu, ali mu nedostaju funkcionalne grupe koje su lako upotrebljive kao mesta za konjugaciju sa ciljajućim molekulom bez kompromitovanja biološke aktivnosti. Otkrili smo da se može uvesti R° grupa u krajnji levi aromatični prsten u antrahinonskom delu, kao što je prikazano u formuli (I), bez neprihvatljivog gubitka biološke aktivnosti i dalje, da grupa R° je prilagodljivo mesto za konjugaciju. Prema tome, u drugom rešenju, predmetni pronalazak obezbeđuje konjugat koji sadrži jedinjenje prema formuli (I) kovalentno vezano za ciljajući ostatak koji se specifično ili preferencijalno vezuje za hemijski entitet ciljne ćelije, koja je poželjno kancerska ćelija. Poželjno, ciljajući ostatak je antitelo - poželjnije monoklonsko antitelo i još poželjnije humano monoklonsko antitelo - i hemijski entitet je antigen povezan sa tumorom.

U još jednom prikazu, obezbeđena je kompozicija materije koja sadrži jedinjenje predmetnog pronalaska i vezujući deo koji ima reaktivnu funkcionalnu grupu, pogodnu za konjugaciju sa ciljajućim delom.

U još jednom prikazu, predmetni pronalazak obezbeđuje metodu za inhibiranje proliferacije kancerskih ćelija kod subjekta koji boluje od kancera, koja sadrži administriranie subjektu terapijski efikasne količine jedinjenja predmetnog pronalaska ili konjugata istog sa ciljajućim delom (naročito antitelo). Kancerske ćelije mogu biti kancerske ćelije leukemije, kancera bubrega, kancera ovarijuma, kancera pluća, kancera debelog creva, kancera dojke, ili kancera prostate.

U još jednom prikazu, obezbeđena je metoda za lečenje kancera kod subjekta koji boluje od takvog kancera, koja sadrži administraciju subjektu terapijski efikasne količine jedinjenja predmetnog pronalaska ili konjugata istog sa ciljajućim delom (naročito antitelo). U još jednom prikazu, obezbeđena je primena jedinjenja predmetnog pronalaska ili konjugat istog sa ciljajućim ostatkom (naročito antitelo) za pripremanje leka za lečenje kancera kod subjekta koji boluje od takvog kancera. Kancer može biti leukemija, kancer bubrega, kancer ovarijuma, kancer pluća, kancer debelog creva, kancer dodjke, ili kancer prostate.

KRATAK OPIS NACRTA

Slike 1 do 6 prikazuju sheme za sintezu jedinjenja predmetnog pronalaska.

Slike 7 do 10 prikazuju reakcione sheme za povezivanje veznika i reaktivnih funkcionalnih grupa za jedinjenja predmetnog pronalaska, u pripremanju za konjugaciju.

Slike 11a i 11b prikazuju grafike antiproliferativne aktivnosti jedinjenja predmetnog pronalaska, u poređenju sa odabranim referentnim jedinjenj ima.

Slike 12a i 12b prikazuju grafike antiproliferativne aktivnosti dodatnih jedinjenja predmetnog pronalaska, u poređenju sa odabranim referentnim jedinjenj ima

Slike 13a, 13b, i 13c prikazuju grafike antiproliferativne aktivnosti konjugata antitelo-lek napravljenih od jedinjenja predmetnog pronalaska.

DETALJAN OPIS PREDMETNOG PRONALASKA

DEFINICIJE

"Antitelo" označava cela antitela i bilo koji antigen-vezujući fragment( tj."antigen-vezujući deo") ili njegove jednolančane varijante. Celo antitelo je protein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (Vh) i konstantni region teškog lanca koji sadrži tri domena Cm, Cm i Cro. Svaki laki lanac sadrži varijabilni region lakog lanca

(Vlili Vk) i konstantni region lakog lanca koji sadrži jedan pojedinačni domen, Cl. Regioni Vhi Vlmogu dalje biti opet podeljeni u regione hipervarijablnosti, regione koji su označeni da određuju komplementarnost (CDR), protkani sa više konzerviranih okvirnih regiona (FR). Svaki Vhi Vlsadrži tri CDR i četiri FR regiona, uređenih od amino- do karboksi-terminusa po sledećem redu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, i FR4. Varijabilni regioni obuhvataju vezujući domen koji intereaguje sa antigenom. Konstantni regioni mogu da posreduju vezivanje antitela za tkiva domaćina ili faktore, uključujući razne ćelije imunog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplemenata. Za antitelo se kaže da se "specifično vezuje" za antigen X ako se antitelo vezuje za antigen X sa Kdod 5 x IO"<8>M ili manje, poželjnije 1 x IO"<8>M ili manje, poželjnije 6 x IO"<9>M, poželj<n>ije 3 x IO"<9>M ili manje, još poželjnije 2 x IO"<9>M ili manje. Antitelo može biti himerno, humanizovano, ili, poželjno, humano. Konstantni region teškog lanca može biti projektovan da utiče na tip ili obim glikozilacije, da produži polu-život antitela, da pojača ili smanji interakcije sa efektorskim ćelijama ili sistemom komplemenata, ili da podesi neko drugo svojstvo. Projektovanje može biti postignuto zamenom, adicijom ili delecijom jedne ili više amino kiselina ili zamenom domena sa domenom od drugog tipa imunoglobulina, ili kombinacijom navedenih.

"Antigen vezujući fragment" i "antigen vezujući deo" antitela (ili jednostavno "deo antitela" ili fragment antitela") označava jedan ili više fragmenata ili antitela koji održava sposobnost da se specifično vezuje za antigen. Pokazano je da antigen-vezujuća funkcija antitela može biti izvršena fragmentima antitela u punoj dužini, kao što je (i) Fab fragment, a monovalentni fragment koji se sastoji od Vl, Vh, Cli Cm domena; (ii) F(ab')2 fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom na zglobnom regionu; (iii) Fab' fragment, koji je u suštini Fab sa delom zglobnog regiona (videti, na primer, Abbas et al., Cellular and Molecular Immunologv, 6th Ed., Saunders Elsevier 2007); (iv) Fd fragment koji se sastoji od Vhi Cm domena; (v) Fv fragment koji se sastoji od Vli Vhdomena jednog kraka antitela, (vi) dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od Vhdomena; (vii) izolovani region koji određuje komplementarnost (CDR); i (viii) nanotelo, varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od pojedinačnog varijabilnog domena i dva konstantna domena. Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta Vli Vh, kodirana odvojenim genima, oni mogu biti udruženi, korišćenjem rekombinantnih metoda, pomoću sintetičkog veznika koji omogućava da oni budu

napravlljeni kao pojedinačni proteinski lanac u kome su regioni Vli Vhupareni da formiraju monovalentne molekule (poznat kao pojedinačni lanac Fv, oili scFv);videti, npr.Bird et al.

(1988) Science 242:423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Takva jednolančana antitela su takođe obuhvaćena terminom "antigen-vezujući deo" antitela.

"Izolovano antitelo" označava antitelo koje je suštinski oslobođeno od drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti{ npr.,izolovano antitelo koje specifično vezuje antigen X je suštinski oslobođeno od antitela koja vezuju antigene koji nisu antigen X). Izolovano antitelo koje specifično vezuje antigen X, može, međutim, da unakrsno reaguje sa drugim antigenima, kao što su antigen X molekuli iz drugih vrsta. U određenim rešenjima, izolovano antitelo specifično vezuje humani antigen X i ne reaguje unakrsno sa drugim (ne-humanim) antigen X antigenima. Pored toga, izolovano antitelo može biti suštinski oslobođeno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.

"Monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskog antitela" označava pripremu molekula antitela pojedinačne molekularne kompozicije, koja pokazuje pojedinačno vezujujuću specifičnost i afinitet za poseban epitop.

"Humano antitelo" označava antitelo koje ima varijabilne regione u kojima i okvirni i CDR regioni (i konstantni region, ako je prisutan) su izvedeni od humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela mogu da uključe kasnije modifikacije, uključujući prirodne ili sintetičke modifikacije. Humana antitela mogu uključiti amino kiselinske ostatke koji nisu kodirani pomoću humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci{ npr.,mutacije uvedene pomoću nasumične ili mesto-specifične mutagenezein vitroili pomoću somatske mutacijein vivo).Međutim, "humano antitelo" ne uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativnih ćelija (embriona) druge sisarske vrste, kao što je miš, koji je kalemljen na humanim okvirnim sekvencama.

"Humano monoklonsko antitelo" označava antitelo koje pokazuje pojedinačnu vezujuću specifičnost, koje ima varijabilne regione u kojima i okvirni i CDR regioni su izvedeni iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. U jednom rešenju, humana monoklonska antitela su proizvedena pomoću hibridoma koji uključuje B ćeliju dobijenu iz transgena nehumane životinje, npr., transgenog miša, koji ima genom koji sadrži transgen humanog teškog lanca i transgen humanog lakog lanca fuzionisan sa besmrtnom ćelijom.

"Alifatični" označava ravan ili razgranat lanac, zasićen ili nezasićen, nearomatični ugljovodonični deo koji ima specifičan broj ugljenikovih{ npr.,kao u "C3alifatični," "C1-C5alifatični," ili"Ci do C5alifatični," druge dve fraze su sinonimi za afitatični deo koji ima od 1 do 5 ugljenikovih atoma) ili, gde broj ugljenikovih atoma nije eksplicitno naveden, od 1 do 4 ugljenikova atoma (2 do 4 ugljenika u slučaju nezasićenih alifatičnih delova).

"Alkil" označava zasićeni alifatični ostatak, sa istom konvencijom za označavanje broja ugljenikovih atoma koja se primenjuje. Za ilustraciju, C1-C4alkil delovi uključuju, ali nisu ograničeni na, metil, etil, propil, izopropil, izobutil,/-butil, 1-butil, 2-butil, i slično. "Alkilen" označava divalentni duplikat alkil grupe, kao što je CH2CH2, CH2CH2CH2, i CH2CH2CH2CH2.

"Alkenil" označava alifatični deo koji ima najmanje jednu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu, sa istom konvencijom za označavanje brojeva ugljenikovih atoma koja se primenjuje. Za ilustraciju, C2-C4alkenil uključuju, ali nisu ograničeni na, etenil (vinil), 2-propenil (alil ili prop-2-enil), cis-l-propenil, tams-l-propenil, E- (ili Z-) 2-butenil, 3-butenil, 1,3-butadienil (but-l,3-dienil) i slično.

"Alkinil" označava alifatični deo koji ima najmanje jednu ugljenik-trostruku vezu, sa istom konvencijom za označavanje brojeva ugljenikovih atoma koja se primenjuje. Za ilustraciju, C2-C4alkinil grupe euključuju etinil (acetilenil), propargil (prop-2-inil), 1-propinil, but-2-inil, i slično.

"Cikloalifatik" označava zasićeni ili nezasićeni aromatični ugljovodonični deo koji ima 1 do 3 prstena, svaki prsten ima od 3 do 8 (poželjno od 3 do 6) ugljenikovih atoma. "Cikloalkil" označava cikloalifatični deo u kome je svaki prsten zasićen. "Cikloalkenil" označava cikloalifatični deo u kome najmanje jedan prsten ima najmanje jednu ugljenik-ugljenik dvostruku vezu. "Cikloalkinil" označava cikloalifatični deo u kome najmanje jedan prsten ima najmanje jednu ugljenik-ugljenik trostruku vezu. Za ilustraciju, cikloalifatični delovi uključuju, ali nisu ograničeni na, ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, ciklopentenil, cikloheksil, cikloheksenil, cikloheptil, ciklooktil, i adamantil. Poželjni cikloalifatični delovi su cikloalkil, posebno ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, i cikloheksil. "Cikloalkilen" označava divalentni duplikat cikloalkil grupe.

"Heterocikloalifatik" označava cikloalifatični deo gde, u najmanje jednom njegovom prstenu, do tri (poželjno 1 do 2) ugljenika su zamenjeni sa heteroatomom koji je nezavisno

odabran od N, O, ili S, gde N i S po izboru mogu biti oksidovani i N može po izboru biti kvaternizovan. Slično, "heterocikloalkil," "heterocikloalkenil," i "heterocikloalkinil" označava cikloalkil, cikloalkenil, ili cikloalkinil deo, redom, u kome je najmanje jedan prsten istog tako modifikovan. Reprezentativni heterocikloalifatični delovi uključuju aziridinil, azetidinil, 1,3-dioksanil, oksetanil, tetrahidrofuril, pirolidinil, piperidinil, piperazinil, tetrahidropiranil, tetrahidrotiopiranil, tetrahidrotiopiranil sulfon, morfolinil, tiomorfolinil, tiomorfolinil sulfoksid, tiomorfolinil sulfon, 1,3-dioksolanil, tetrahidro-l,l-dioksotienil, 1,4-dioksanil, tietanil, i slično. "Heterocikloalkilen" označava divalentni duplikat heterocikloalkil grupe.

"Alkoksi," "ariloksi," "alkiltio," i "ariltio" označava -O(alkil), -O(aril), -S(alkil), i - S(aril), redom. Primeri su metoksi, fenoksi, metiltio, i feniltio, redom.

"Halogen" ili "halo" označava fluor, hlor, brom ili jod.

"Aril" označava ugljovodonični deo koji ima mono-, bi-, ili triciklični prstenasti sistem gde svaki prsten ima od 3 do 7 ugljenikovih atoma i najmanje jedan prsten je aromatičan. Prstenovi u sistemu prstenova mogu biti fuzionisani jedan za drugim (kao u naftilu) ili vezani jedan za drugi (kao u bifenilu) i mogu biti fuzionisani ili vezani za nearomatične prstenove (kao u indanilu ili cikloheksilfenilu). Za dalju ilustraciju, aril ostaci uključuju, ali nisu ograničeni na fenil, naftil, tetrahidronaftil, indanil, bifenil, fenantril, antracenil, i acenaftil. "Arilen" označava divalentni duplikat aril grupe, na primer 1,2-fenilen, 1,3-fenilen, ili 1,4-fenilen.

"Heteroaril" označava deo koji ima mono-, bi-, ili tricklični prstenasti sistem gde svaki prsten ima od 3 do 7 ugljenikovih atoma i najmanje jedan prsten je aromatični prsten koji se sastoji od 1 do 4 heteroatoma nezavisno odabranih od N, O, ili S, gde N i S po izboru mogu biti oksidovani i N po izboru može biti kvaternizovan. Takav najmanje jedan heteroatom koji se sastoji od aromatičnog prstena može biti fuzionisan za druge tipove prstenova (kao u benzofuranilu ili tetrahidroizohinolilu) ili direktno vezan za druge tipove prstenova kao u fenilpi-ridilu ili 2-ciklopentilpiridilu). Za dalju ilustraciju, heteroaril ostaci uključuju pirolil, furanil, tiofenil (tienil), imidazolil, pirazolil, oksazolil, izoksazolil, tiazolil, izotiazolil, triazolil, tetrazolil, piridil, N-oksopiridil, piridazinil, pirimidinil, pirazinil, hinolinil, izohinolinil, hinazolinil, cinolinil, hinozalinil, naftiridinil, benzofuranil, indolil, benzotiofenil, oksadiazolil, tiadiazolil, fenotiazolil, benzimidazolil, benzotriazolil,

dibenzofuranil, karbazolil, dibenzotiofenil, akridinil, i slično. "Heteroarilen" označava divalentni duplikat aril grupe.

Gde je naznačeno da deo može biti supstituisan, kao što je primenom formulacije "nesupstituisan ili supstituisan" ili "po izboru supstituisan" kao u "nesupstituisan ili supstituisan C1-C5alkil" ili "po izboru supstituisan heteroaril," takav deo može imati jedan ili više nezavisno odabranih supstituenata, poželjno jedan do pet u brojkama, poželjnije jedan ili dva u brojkama. Supstituenti i šabloni supstitucije mogu biti odabrani od strane prosečnog poznavaoca oblasti, imajući u vidu deo za koji je supstituent zakačen, da se obezbede jedinjenja koja su hemijski stabilna i koja mogu biti sintetisana tenikama koje su poznate u oblasti kao i metodama koje su ovde navedene.

"Arilalkil," (heterocikloalifatik)alkil," "arilalkenil," "arilalkinil," "biarilalkil," i slično označavaju alkil, alkenil, ili alkinil deo, kao što može biti slučaj, supstituisan sa arilnim heterocikloalifatičnim, biarilnim, itd, delom kao što može biti slučaj, sa otvorenom (negativnom) valencom na alkil, alkenil, ili alkinil delu, na primer u benzilu, fenetilu, N-imidazoiletilu, N-morfolinoetilu, i slično. Obrnuto, "alkilaril," "alkenilcikloalkil," i slično označavaju aril, cikloalkil, itd., deo, kao što može biti slučaj, supstituisan sa alkil, alkenil, itd., delom, kao što može biti slučaj, na primer u metilfenil (tolil) ili alilcikloheksil. "Hidroksialkil," "haloalkil," "alkilaril," "cijanoaril," i slično označavaju alkil, aril, itd., deo, kao što može biti slučaj, supstituisan sa jednim ili više identifikovanih supstituenata (hidroksil, halo, itd., kao što može biti slučaj).

Za ilustraciju, dozvoljeni supstituenti uključuju, ali nisu ograničeni na, alkil (naročito metil ili etil), alkenil (naročito alil), alkinil, aril, heteroaril, cikloalifatik, heterocikloalifatik, halo (naročito fluoro), haloalkil (naročito trifluorometil), hidroksil, hidroksialkil (naročito hidroksietil), cijano, nitro, alkoksi, -O(hidroksialkil), -O(haloalkil) (naročito -OCFs), - O(cikloalkil), -O(heterocikloalkil), -O(aril), alkiltio, ariltio, =0, =NH, =N(alkil), =NOH, =NO(alkil), -C(=0)(alkil), -C(=0)H, -CO2H -C(=0)NHOH, -C(=0)0(alkil), - C(=0)0(hidroksialkil), -C(=0)NH2, -C(=0)NH(alkil), -C(=0)N(alkil)2, -OC(=0)(alkil), - OC(=0)(hidroksialkil), -OC(=0)0(alkil), -OC(=0)0(hidroksialkil), -OC(=0)NH2, - OC(=0)NH(alkil), -OC(=0)N(alkil)2, azido, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), - NH(hidroksialkil), -NHC(=0)(alkil), -NHC(=0)H, -NHC(=0)NH2, -NHC(=0)NH(alkil), - NHC(=0)N(alkil)2, -NHC(=NH)NH2, -OS02(alkil), -SH, -S(alkil), -S(aril), -S(cikloalkil), - S(=0)alkil, -S02(alkil), -S02NH2, -S02NH(alkil), -S02N(alkil)2, i slično.

Kada je deo supstituisan u alifatičnom delu, poželjni supstituenti su aril, heteroaril, cikloalifatik, heterocikloalifatik, halo, hidroksil, cijano, ni tro, alkoksi, -O(hidroksialkil), - O(haloalkil), -O(cikloalkil), -O(heterocikloalkil), -O(aril), alkiltio, ariltio, =0, =NH, =N(alkil), =NOH, =NO(alkil), -C02H, -C(=0)NHOH, -C(=0)0(alkil), C(=0)0(hidroksialkil), -C(=0)NH2, -C(=0)NH(alkil), -C(=0)N(alkil)2, -OC(=0)(alkil), - OC(=0)(hidroksialkil), -OC(=0)0(alkil), -OC(=0)0(hidroksialkil), -OC(=0)NH2, - OC(=0)NH(alkil), -OC(=0)N(alkil)2, azido, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), - NH(hidroksialkil), -NHC(=0)(alkil), -NHC(=0)H, -NHC(=0)NH2, -NHC(=0)NH(alkil), - NHC(=0)N(alkil)2, -NHC(=NH)NH2, -OS02(alki), -SH, -S(alkil), -S(aril), -S(=0)alkil, - S(cikloalkil), -S02(alkil), -SO2NH2, -S02NH(alkil), i -S02N(alkil)2. Poželjniji supstituenti su halo, hidroksil, cijano, nitro, alkoksi, -O(aril), =0, =NOH, =NO(alkil), -OC(=0)(alkil), - OC(=0)0(alkil), -OC(=0)NH2, -OC(=0)NH(alkil), -OC(=0)N(alkil)2, azido, -NH2, - NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), -NHC(=0)(alkil), -NHC(=0)H, -NHC(=0)NH2, - NHC(=0)NH(alkil), -NHC(=0)N(alkil)2, i -NHC(=NH)NH2. Naročito poželjni su fenil, cijano, halo, hidroksil, nitro, Ci-C4alkioksi, 0(C2-C4alkilen)OH, i 0(C2-C4alkilen)halo.

Kada je deo koji je supstituisan cikloalifatični, heterocikloalifatični, arilni, ili heteroarilni deo, poželjni supstituenti su alkil, alkenil, alkinil, halo, haloalkil, hidroksil, hidroksialkil, cijano, nitro, alkoksi, -O(hidroksialkil), -O(haloalkil), -O(aril), -O(cikloalkil), - O(heterocikloalkil), alkiltio, ariltio, -C(=0)(alkil), -C(=0)H, -C02H, -C(=0)NHOH, - C(=0)0(alkil), -C(=0)0(hidroksialkil), -C(=0)NH2, -C(=0)NH(alkil), -C(=0)N(alkil)2, - OC(=0)(alkil), -OC(=0)(hidroksialkil), -OC(=0)0(alkil), -OC(=0)0(hidroksialkil), - OC(=0)NH2, -OC(=0)NH(alkil), -OC(=0)N(alkil)2, azido, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, - NH(aril), -NH(hidroksialkil), -NHC(=0)(alkil), -NHC(=0)H, -NHC(=0)NH2, - NHC(=0)NH(alkil), -NHC(=0)N(alkil)2, -NHC(=NH)NH2, -OS02(alkil), -SH, -S(alkil), - S(aril), -S(cikloalkil), -S(=0)alkil, -S02(alkil) -S02NH2, -S02NH(alkil), i -S02N(alkil)2. Poželjniji supstituenti su alkil, alkenil, halo, haloalkil, hidroksil, hidroksialkil, cijano, nitro, alkoksi, -O(hidroksialkil), -C(=0)(alkil), -C(=0)H, -C02H, -C(=0)NHOH, -C(=0)0(alkil), - C(=0)0(hidroksialkil), -C(=0)NH2, -C(=0)NH(alkil), -C(=0)N(alkil)2, -OC(=0)(alkil), - OC(=0)(hidroksialkil), -OC(=0)0(alkil), -OC(=0)0(hidroksialkil), -OC(=0)NH2, - OC(=0)NH(alkil), -OC(=0)N(alkil)2, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), - NHC(=0)(alkil), -NHC(=0)H, -NHC(=0)NH2, -NHC(=0)NH(alkil), -NHC(=0)N(alkil)2, i - NHC(=NH)NH2. Naročito poželjni su C1-C4alkil, cijano, nitro, halo, i Ci-C4alkoksi.

Gde je naveden opseg, kao u "C1-C5alkil" ili "5 to 10%," takav opseg uključuje krajnje tačke opsega, kao u Ci i C5u prvom slučaju i 5% i 10% u drugom slučaju.

Osim ako posebni stereoizomeri nisu specifično naznačeni (npr., pomoću podebljane ili isprekidane veze na relevantnom stereocentu u strukturnoj formuli, pomoću prikazivanja dvostruke veze kao da ima E ili Z konfiguraciju u strukturnoj formuli, ili primenom sterehemijske nomenklature za označavanje), svi stereoizomeri su obuhvaćeni domenom predmetnog pronalaska, kao čista jedinjenja kao i njihove smeše. Ukoliko nije drugačije navedeno, pojedinačni enantiomeri, diastereomeri, geometrijski izomeri, i njihove kombinacije i smeše su svi obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.

Prosečni poznavaoci oblasti će ceniti da jedinjenja mogu imati tautomerne forme{ npr.,keto i enol forme), rezonantne forme, i cviterjonske forme koje su ekvivalentne onima koji su prikazani u strukturnim formulama korišćenim ovde i da strukturne formule obuhvataju takve tautomerne, rezonantne, ili cviterjonske forme.

"Farmaceutski prihvatljiv estar" označava estar koji hidrolizirain vivo(na primer u telu čoveka) da proizvede parentalno (osnovno) jedinjenje ili so istog ili imaper seaktivnost sličnu onoj koju ima parentalno jedinjenje. Pogodni estri uključuju C1-C5alkil, C2-C5alkenil ili C2-C5alkinil estre, naročito metil, etil ili n-propil.

"Farmaceutski prihvatljiva so" označava jedinjenje pogodno za farmaceutsku formulaciju. Gde jedinjenje ima jednu ili više baznih grupa, so može biti kisela adiciona so, kao što je sulfat, hidrobromid, tartarat, mezilat, maleat, citrat, fosfat, acetat, pamoat (embonat), hidrojodid, nitrat, hidrohlorid, laktat, metilsulfat, fumarat, benzoat, fumarat, benzoat, sukcinat, mezilat, laktobionat, suberat, tozilat, i slično. Kada jedinjenje ima jednu ili više kiselih grupa, so može biti so kao što je kalcijumova so, kalijumova so, magnezijumova so, megluminska so, cinkova so, piperazinska so, trometaminska so, litijumova so, holinska so, dietilamin so, 4-fenilcikloheksilamin so, benzatin so, natrijumova so, tetrametilamonijum so, i slično. Polimorfne kristalne forme i solvati su takođe obuhvaćeni domenom predmetnog pronalaska.

KOMPOZICIJE

Poželjno rešenje prema formuli (I) je jedinjenje koje ima strukturu koja je predstavljena formulom (Ia), ili farmaceutski prihvatljiva so istog. U ovom rešenju grupa NHRla je prikačena za C6, gde Rla je kao što je definisano prethodno u kontekstu formule (I):

Poželjnije rešenje je jedinjenje koje ima strukturu koja je predstavljena formulom (lb), ili farmaceutski prihvatljiva so istog, gde R<la>je kao što je definisano prethodno u kontekstu formule (I). U formuli (lb) stereohemija od C27-metil odgovara onoj od prirodnih uncialamicina (videti strukturnu formulu za uncialamicin,supra).

U svakom od R°. R<la>, R<lb>. R2,R<3>, R<4>,R<5>,R<6>.i R<7>, gde se oni pojavljuju u formuli (I) ili drugim formulama bilo gde u ovoj specifikaciji, gde je alkil, alkilen, aril, arilen, heteroaril, heteroarilen, cikloalkil, cikloalkilen, heterocikloalkil, ili heterocikloalkilen grupa naznačena kao bilo nesupstituisana ili supstituisana, nesupstituisano rešenje je poželjno. Gde se pojavljuje u formuli (I) ili u drugim formulama bilo gde u ovoj specifikaciji, R<2>poželjno je H ili C1-C3alkil, poželjnije H. Gde se pojavljuje u formuli (I) ili u drugim formulama bilo gde u ovoj prijavi, R<3>poželjno je C1-C3alkil, poželjnije Me. Gde se pojavljuje u formuli (I) ili u drugim formulama bilo gde u ovoj specifikaciji, R<4>poželjno je OH, OR<10>, ili OC(=0)R<10>(saR10koje je poželjno C1-C3alkil), poželjnije OH. Gde se pojavljuje u formuli (I) ili u drugim formulama bilo gde u ovoj specifikaciji,R5 poželjno je OH, OR<10>, ili OC(=0)R<10>(sa R<10>koje je poželjno C1-C3alkil), poželjnije OH. Gde se pojavljuje u formuli (I) ili u drugim formulama bilo gde u ovoj specifikaciji, R<6>poželjnije je H. Gde se pojavljuje u formuli (I) ili u drugim formulama bilo gde u ovoj specifikaciji, R<7>poželjno je OH, OR<10>, ili OC(=0)R<10>(sa R<10>k<o>je je poželjno C1-C3alkil), poželjnije OH. Gde se pojavljuje u formuli (I) ili u drugim formulama bilo gde u ovoj specifikaciji, R<9>poželjno je Poželjnije, R9 je

naročito prvo.

Gde se pojavljuje u formuli (I) ili u drugim formulama bilo gde u ovoj specifikaciji, R<10>poželjno je C1-C6alkil, cikloheksil, ciklopentil, fenil, furanil, ili piridil. Poželjnije, R10 je metil, etil, propil, ili izopropil.

Gde se pojavljuje u formulama (I), (la), (lb) ili drugim formulama bilo gde u ovoj specifikaciji, R<8>poželjno je ostatak bočnog lanca a-amino kiseline odabrane od grupe koja se sastoji od arginin, asparaginska kiselina, citrulin, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, lizin, fenilalanin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin. Poželjnije, R<8>je ostatak bočnog lanca glicina, lizina, citrulina, ili serina. Poželjno, stereohemija na hiralnom ugljeniku odgovara onoj od prirodne proteogenske a-amino kiseline, tj. L-izomer.

U poželjnom rešenju jedinjenja koja imaju strukture prema formulama (I), (la), i/ili (lb), grupa Rla je odabrana od grupe koja se sastoji od H, Me,

U poželjnom rešenju jedinjenja koja imaju strukture prema formulama (I), (la), i/ili (lb), grupa Rla je H,

Specifična jedinjenja predmetnog pronalaska obuhvataju ona koja imaju strukture prema formulama (Ha) do (Uh), ili njihove farmaceutski prihvatljive soli:

KONJUGATI

Još jedno rešenje predmetnog pronalaska sadrži jedinjenje koje ima strukturu predstavljenu formulom (I), (la), (lb), (pa), (Ilb), (IIc), (Ud), (Ile), (Ilg), ili (Uh) je konjugovano za ciljajući deo koji se specifično ili preferencijalno vezuje za hemijski entitet na kancerskoj ćeliji. Poželjno, ciljajući deo je njegov antitelo- ili antigen- vezujući deo i hemijski entitet je antigen povezan sa tumorom. Poželjno, konjugacija je izvršena preko hemijske veze za grupu R°.

U još jednom prikazu, obezbeđen je konjugat koji sadrži citotoksično jedinjenje prema predmetnom pronalasku i ligand, predstavljen formulom (III)

gde Z je ligand; D je citotoksično jedinjenje prema predmetnom pronalasku{ npr.,jedinjenje prema formuli (I), (la), ili (lb)); i -(X<D>)aC(X<z>)b- se kolektivno nazivaju "vezujući deo" ili "veznik" jer povezuju Z i D. Unutar veznika, C je cepljiva grupa (grupa koja se čepa) konstruisana da se čepa na ili blizu mesta nameravane biološke aktivnosti jedinjenja D; X<D>i X<z>su nazvani kao delovi koji razdvajaju (ili "razdvojnici") jer oni razdvajaju D i C i C i Z, redom; indeksi a i b su nezavisno 0 ili 1 (to jest, prisustvo X<D>i/iliX<z>su opcioni); i indeks m je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 (poželjno 1, 2, 3, ili 4). D, X<D>, C, X<z>i Z su kompletnije opisani prethodno.

Ligand Z - na primer antitelo - obavlja funkciju ciljanja. Vezivanjem za ciljno tkivo ili ćeliju gde je njegov antigen ili receptor lociran, ligand Z tamo usmerava konjugat. Poželjno, ciljno tkivo ili ćelija je kancersko tkivo ili ćelija i antigen ili receptor je tkivno-asocirani antigen, to jest, antigen koji je jedinstveno eksprimiran od strane kancerskih ćelija ili je prekomerno eksprimiran od kancerskih ćelija, u poređenju sa nekancerskim ćelijama. Cepanje grupe C u ciljnom tkivu ili ćeliji oslobađa jedinjenje D da ispolji svoj citotoksični efekat lokalno. U nekim slučajevima, konjugat je internalizovan u ciljnu ćliju endocitozom i cepanje se dešava u ciljnoj ćeliji. Na ovaj način, precizna isporuka jedinjenja D je postignuta na mestu njegovog delovanja, smanjujući potrebnu dozu. Takođe, jedinjenje D je normalno biološki neaktivno (ili značajno manje aktivno) u njegovom konjugovanom stanju, tako smanjujući nepoželjnu toksičnost prema ne-ciljnom tkivu ili ćelijama. Kako su antikancerski lekovi obično veoma visoko toksični prema ćelijama uopšte, ovo je značajno razmatranje.

Ono što se ogleda u indeksu m, svaki molekul liganda Z može da konjugira sa više od jednog jedinjenja D, u zavisnosti od broja mesta koje ligand Z ima dostupne za konjugaciju i eksperimentalnih uslova koji su u toku. Prosečni poznavaoci oblasti će ceniti da, dok je svaki pojedinačni molekul liganda Z konjugovan za ceo broj jedinjenja D, pripremanje konjugata može da analizira za odnos u broju koji nije ceo jedinjenja D prema ligandu Z, odražavajući statističku sredinu.

Ligand Z i njegova konjugacija

Poželjno, ligand Z je antitelo. Radi prikladnosti i jasnoće, detaljan naknadna diskusija ovde o konjugaciji liganda Z je napisana u kontekstu njega kao antitela, ali prosečni poznavaoci oblasti će razumeti da drugi tipovi liganda Z mogu biti konjugovani,mutatis mutandis.Na primer, konjugati sa folnom kiselinom kao ligandi koji ciljaju ćelije imaju folatni receptor na njihovi površinama (Vlahov et a/., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18(16), 4558-4561; Leamon et al., Cancer Res. 2008, 68 (23), 9839-9844). Zbog istog razloga, detaljna diskusija ispod je primarno napisana u smislu odnosa 1:1 antitela Z prema jedinjenju

D.

Poželjno, ligand Z je antitelo za tumor-vezani antigen, dozvoljavajući konjugat koji sadrži takav ligand Z da selektivno cilja kancerske ćelije. Primeri takvih antigena uključuju: mezotelin, specifični membranski antigen prostate (PSMA), CD 19, CD22, CD30, CD70, CD200 (takođe poznat kao OX-2), B7H4 (takođe poznat kao 08E), protein tirozin kinazu 7 (PTK7), RG1, CTLA-4, i CD44. Antitelo može biti životinjsko (npr., mišje), himerno, humanizovano, ili, poželjno, humano. Antitelo je poželjno monoklonsko, naročito monoklonsko humano antitelo. Pripremanje humanih monoklonskih antitela za neke od prethodno pomenutih antigena je stavljeno na uvid javnosti u Korman et al, US 2009/0074660 Al (B7H4); Rao-Naik et al., US 2009/0142349 Al A2 (CD 19); King et al., US 2010/0143368 Al (CD22); Keler et al., US 7,387,776 B2 (2008) (CD30); Terrett et al., US 2009/0028872 Al (CD70); Gorczvnski et al., US 7,238,352 B2 (2007) (CD200); Korman et al., US 6,984,720 BI (2006) (CTLA-4); Korman et al., US 8,008,449 B2 (2011) (PD-1); Huang et al, US 2008/0279868 Al (PSMA); Terrett et al., US 2010/0034826 Al (PTK7); Harkins et al, US 7,335,748 B2 (2008) (RG1); Terrett et al, WO 2009/045957 Al (mezotelin); i Xu et al., US 2010/0092484 Al (CD44); objave koje su uključene ovde referencom.

Ligand Z može takođe biti fragment antitela ili mimetik antitelo, kao što je afitelo (affibodv), domen antitelo (dAb), nanotelo, unitelo (unibodv), DARPin, antikalin, versatelo (versabodv), duokalin, lipokalin, ili avimer.

Bilo koja od nekoliko različitih reaktivnih grupa na Ugandu Z može biti mesto konjugacije, uključujući s-amino grupe u lizinskim ostacima, deo koji visi sa ugljovodoničnih delova, grupe karboksilne kiseline, disulfidne grupe, i tiol grupe. Svaki tip reaktivne grupe predstavlja kompromis, koji ima nekoliko prednosti i mana. Za pregled reaktivnih grupa antitela pogodnih za konjugaciju, videti, npr., Garnett, Adv. Drug Deliverv Rev. 53 (2001), 171-216 and Dubovvchik and Walker, Pharmacologv & Therapeutics 83 (1999), 67-123, objave koje su uključene ovde referencom.

U jednom rešenju, ligand Z je konjugovan putem lizin s-amino grupe. Većina antitela ima višestruko izložene lizin e-amino grupe, koje mogu biti konjugovane putem amida, uree, tiouree, ili karbamatnih veza korišćenjem tehnika koje su poznate u oblasti, uključujući modifikaciju sa heterobifunkcionalnim agensom (kao što je dalje opisano u nastavku). Međutim, teško je kontrolisati koje i koliko e-amino grupa reaguju, vodeći do potencijalne varijabilnosti gomile prema gomili („batch-to-batch") u pripremanjima konjugata. Takođe, konjugacija može uzrokovati neutralizaciju protonizovane e-amino grupe značajne za održavanje nativne konformacije antitela ili može da se dešava na lizinu koji je blizu ili na antigen vezujućem mestu, pri čemu to nisu poželjne pojave.

U još jednom prikazu, ligand Z može biti konjugovan putem ugljenohidratnog bočnog lanca, kako je više antitela glikolizovano. Ugljenohidratni bočni lanac može biti oksidiran sa periodatom da se dobiju aldehidne grupe, koje zauzvrat mogu da reaguju sa aminima da formiraju imin grupu, kao u semikarbazonu, oksimu, ili hidrazonu. Ako je željeno, imin grupa može biti konvertovana u stabilniju aminsku grupu redukcijom sa natrijum cijanoborohidridom. Za dodatne objave konjugacije putem ugljenohidratnih bočnih lanaca, videti, npr. Rodwell et al., Pro. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986); objava koja je uključena ovde referencom. Kao sa lizin e-amino grupama, postoje brige u vezi sa reproduktivnošću lokacije mesta konjugacije i stehiometrije.

U još jednom rešenju, ligand Z može biti konjugovan putem grupe karboksilne kiseline. U jednom rešenju, terminalna karboksilna grupa je funkcionalna da stvori karbohidrazid, koji zatim reaguje sa konjugacionim ostatkom koji nosi aldehid. Videti Fisch et al, Biokonjugat Chemistrv 1992, 3, 147-153.

U još jednom rešenju, antitelo Z može biti konjugovano putem disulfidne grupe koja premošćava cisteinski ostatak na antitelu Z i sumpor na drugom delu konjugata. Neka antitela nemaju slobodne tiol (sulfhidril) grupe ali imaju disulfidne grupe, na primer u zglobnom regionu. U takvom slučaju, slobodne tiol grupe mogu biti generisane redukcijom nativnih disulfidnih grupa. Tiol grupe tako dobijene mogu zatim biti korišćene za konjugaciju. Videti, npr. Packard et al, Biochemistrv 1986, 25, 3548-3552; King et al, Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994); and Doronina et al., Nature Biotechnol. 21(7), 778-784 (2003); objave koje su uključene ovde referencom. Opet, postoje brige u vezi sa lokacijom kojugacionog mesta i stehiometrije i mogućeg poremećaja nativne konformacije antitela.

Poznato je nekoliko metoda za uvođenje slobodnih tiol grupa u antitela bez raskidanja nativnih disulfidnih veza, pri čemu metode mogu biti izvedene sa ligandom Z predmetnog pronalaska. U zavisnosti od metode koja se koristi, moguće je da se uvede predvidljiv broj slobodnih sulfhidrila na unapred određena mesta. U jednom pristupu, pripremljena su mutirana antitela u kojima je cistein supstituisan za druge amino kiseline. Videti, na primer, Eigenbrot et al., US 7,521,541 B2 (2009); Chilkoti et al., Biokonjugat Chem. 1994, 5, 504-507; Urnovitz et al., US 4,698,420 (1987); Stimmel et al, J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000); Bam et al., US 7,311,902 B2 (2007); Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon et al., J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995). U još jednom pristupu, dodatni cistein je dodat na C-teminus. Videti, npr. Cumber et al., J. Immunol., 149, 120-126 (1992); King et al, Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994); Li et al., Biokonjugat Chem., 13, 985-995 (2002); Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003); i Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004). Poželjna metoda za uvođenje slobodnih cisteina koji nose amino kiselinske sekvence je ona pokazana od strane Liu et al., WO 2009/026274 Al, u kojoj je cistein koji nosi amino kiselinsku sekvencu dodat na C-terminus teškog lanca antitela. Ovaj metod predstavlja poznat broj cisteinskih ostataka (jedan po teškom lancu) na poznatoj lokaciji daleko od mesta vezivanja antigena. Objave dokumenata citiranih u ovom paragrafu su ovde uključene pomoću referenci.

U još jednom rešenju, lizin e-amino grupe mogu biti modifikovane sa heterobifunkcionalnim reagensima kao što su 2-iminotiolan ili N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)-propionat (SPDP), koji konvertuju e-amino grupu u tiol ili disulfidnu grupu - kreirajući cistein surogat, takoreći. Međutim, ova metoda se odnosi na istu lokaciju konjugacije i stehiometrijska ograničenja povezana sa e-amino grupama podesno.

U još jednom poželjnom rešenju, ligand Z je konjugovan putem proizvoda nukleofilne adicije tiol grupe u deo primalac. Poželjni deo primalac je maleimidina grupa, čija reakcija sa tiol grupom antitela je generalno ilustrovana ispod. Tiol grupa može biti nativna, ili uvedena kao što je opisano iznad.

Ligand Z može takođe biti konjugovan putem funkcionalne grupe adaptirane za primenu sa „klik" hernijom, kako je niže opisano.

Veznik -{ JP) aC( Xz) b-

Kao što je navedeno gore, deo veznika konjugata predmetnog pronalaska sadrži do tri elementa: cepljivu grupu C i opciono razdvojnike X<z>i X<D>.

Cepljiva grupa C je grupa koja može da se čepa pod fiziološkim uslovima, poželjno odabrana tako daje relativno stabilna dok je konjugat u opštoj cirkulaciji u krvnoj plazmi, ali se spremno čepa kada konjugat dostigne svoje mesto gde će delovati, to jest, blizu, na, ili unutar ciljne ćelije. Poželjno, konjugat je internalizovan pomoću endocitoze od strane ciljne ćelije nakon vezivanja antitela Z za antigen ispoljen na površini ciljne ćelije. Nakon toga, cepanje grupe C se odigrava u vezikularnom telu ciljne ćelije (rani endozom, kasni endozom, ili, naročito, lizozom).

U jednom rešenju, grupa C je pH senzitivna grupa. pH u krvnoj plazmi je malo iznad neutralnog, dok je pH unutar lizozoma kiseo, otprilike 5. Prema tome, grupa C čije cepanje je katalizovano kiselinom će cepati brzinom nekoliko redova veličine brže unutar lizozoma nego što je brzina u krvnoj plazmi. Primeri pogodnih kiselo-senzitivnih grupa uključuju cis-aconitil amide i hidrazone, kako je opisano u Shen et al., US 4,631,190 (1986); Shen et al., US 5,144,011 (1992); Shen et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun. 102, 1048-1054 (1981) i Yang et al, Pro. Natl Acid. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988); objave koje su uključene ovde pomoću reference.

U još jednom prikazu, grupa C je disulfid. Disulfidi mogu biti cepani pomoću mehanizma tiol-disulfidne razmene, pri brzini koja zavisi od okolne koncentracije tiola. Kako je unutraćelijska koncentracija glutationa i drugih tiola viša nego njihove serumske koncentracije, brzina cepanja disulfida će biti viša unutar ćelije. Dalje, brzina tiol-disulfidne razmene može biti izmenjena podešavanjem sternih i elektronskih karakteristika disulfida (npr., alkil-aril disulfid prema alkil-alkil disulfidu; substitucija na aril prstenu, itd), omogućavajući konstruisanje disulfidnih povezivanja koji pojačavaju serumsku stabilnost ili posebnu brzinu cepanja. Za dodatne objave u vezi sa disulfidnim cepajućim grupama u konjugatima, videti, npr., Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988); Santi et al., US 7,541,530 B2 (2009); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., WO 2002/096910 Al; Boyd et al, US 7,691,962 B2; i Sufi et al, US 2010/0145036 Al; objave koje su uključene ovde pomoću reference.

Poželjna grupa C sadrži peptidnu vezu koja je iscepana (prekinuta), prvenstveno pomoću proteaze na mestu na kom se vrši delovanje, što je suprotno onom pomoću proteaze u serumu. Tipično, grupa C sadrži od 1 do 20 amino kiselina, poželjno od 1 do 6 amino kiselina, poželjnije od 1 do 3 amino kiselina. Amino kiselina (kiselina) mogu biti prirodne i/ili neprirodne a-amino kiseline. Prirodne su one kodirane na osnovu genetičkog koda, kao i aminokiseline izvedene iz toga, npr., hidroksiprolin, y-karboksiglutamat, citrulin, i O-fosfoserin. Termin amino kiselina uključuje amino kiselinske analoge i mimetike. Analozi su jedinjenja koja imaju istu opštu H2N(R)CHC02H strukturu prirodne amino kiseline, osim toga da R grupa nije jedna od onih koje su među prirodnim amino kiselinama. Primeri analoga uključuju homoserin, norleucin, metionin-suloksid, i metionin metil sulfonijum. Amino kiselinski mimetik je jedinjenje koje ima strukturu koja je različita od opšte hemijske strukture a-amino kiseline ali funkcioniše na sličan način onom. Termin „neprirodna amino kiselina" treba da predstavi "D" stereohemijski oblik, pri čemu prirodne amino kiseline imaju ,,L" oblik.

Poželjno, grupa C se sastoji od amino kiselinske sekvence koja ima sekvencu za cepanje koja prepoznaje proteazu. Mnoge sekvence za prepoznavanje cepanja su poznate u oblasti. Videti,npr.,Matavoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzvmol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzvmol. 244: 175 (1994); Thornberrv, Meth. Enzvmol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzvmol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzvmol. 244: 412 (1994); i Bouvier et al. Meth. Enzvmol. 248: 614 (1995); objave koje su uključene ovde pomoću reference.

Za konjugate koji ne treba da budu internalizovani pomoću ćelije, grupa C može biti izabrana tako da se čepa proteazom prisutnom u vanćelijskom matriksu u blizini ciljnog tkiva, npr., proteaza oslobođena od strane susednih umirućih ćelija ili tumor-asociranih proteaza. Reprezentativne vanćelijske tumor-asocirane proteaze su matriksne metaloproteinaze (MMP), timet oligopeptidaze (TOP) i CD 10.

Za konjugate koji su konstruisani da budu internalizovani od strane ćelije, grupa C poželjno sadrži amino kiselinsku sekvencu koja je odabrana za cepanje pomoću endozomalne ili lizozomalne proteaze, naročito druge. Neograničavajući primeri takvih proteaza uključuju katepsine B, C, D, H, L i S, naročito katepsin B. Katepsin B prvenstveno čepa peptide na sekvenci -AA<2->AA'- gde je AA<1>osnovna ili aminokiselina koja jako vezuje vodonik (kao što je lizin, arginin, ili citrulin) i AA<2>je hidrofobna amino kiselina (kao što je fenilalanin, valin, alanin, leucin, ili izoleucin), na primer Val-Cit (gde Cit označava citrulin) ili Val-Lys. (Ovde, amino kiselinske sekvence su napisane u smeru N-do-C, kao u H2N-AA<2->AA<1->C02H, ukoliko kontekst ne nalaže drugačije.) Za dodatne informacije u vezi sa katepsin-cepajućim grupama, videti Dubovvchik et al, Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998); Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352 (1998); i Dubowchik et al., Biokonjugat Chem. 13, 855-869 (2002); objave koje su uključene ovde pomoću reference. Drugi enzim koji može biti koristan za cepanje peptidil veznika je legumain, lizozomalna cistein proteaza koja prvenstveno čepa na Ala-Ala-Asn.

U jednom rešenju, grupa C je peptid koji sadrži dve-amino kiselinske sekvence, - AA<2->AA'- gde AA<1>je lizin, arginin, ili citrulin i AA<2>je fenilalanin, valin, alanin, leucin ili izoleucin. U još jednom prikazu, C se sastoji od sekvence jedne do pet amino kiselina, odabranih iz grupe koja se sastoji od Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Ala-Ala-Asn, Lys, Cit, Ser, i Glu.

Priprema i dizajn cepljivih grupa C koja se sastoji od pojedinačne amino kiseline je stavljena na uvid javnosti u Chen et al., US 2010/0113476 Al objava koja je uključena ovde pomoću reference.

Grupa C takođe može biti fotocepljiva, na primer nitrobenzil etar je cepljiv nakon izlaganja svetlosti.

Grupa C može biti vezana direktno za antitelo Z ili jedinjenje D; to jest, razdvojnici X<z>i X<D>, kao što može da bude slučaj, mogu biti odsutni. Na primer, ako je C disulfid, jedan od dva sumpora može biti cisteinski ostatak ili njegov surogat na antitelo Z. Ili, grupa C može biti hidrazon vezan za aldehid na ugljenohidratnom bočnom lancu antitela. Ili, grupa C može biti peptidna veza formirana sa lizin e-amino grupom antitela Z. U poželjnom rešenju, jedinjenje D je direktno vezano za grupu C putem peptidil veze za karboksil ili amino grupu u jedinjenj u D.

Kada je prisutan, razdvojnik X<z>obezbeđuje prostorno razdvajanje između grupe C i antitela Z, da ne bi prvi prostorno ometao vezivanje antigena pomoću drugog ili drugi prostorno ometao cepanje prvog. Dalje, razdvojnik X<z>može biti korišćen da dodeli osobine povećavanja rastvorljivosti ili smanjivanja agregacije konjugatima. Razdvojnik X<z>može da sadrži jedan ili više modularnih segmenata, koji mogu biti udruženi u bilo kom broju kombinacija. Primeri pogodnih segmenata za razdvojnik X<z>su:

Gde indeks q je 0 ili 1 i indeks r je 1 do 24, poželjno 2 do 4. Ovi segmenti mogu biti kombinovani, kao što je prikazano ispod:

Razdvojnik X<D>, ako je prisutan, obezbeđuje prostorno razdvajanje između grupe C i jedinjenja D, da ne bi drugi prostorno ometao ili elektronski sa cepanjem prvog. Razdvojnik X<D>takođe služi da uvede dodatnu molekulsku masu i hemijsku funkcionalnost u konjugat. Generalno, dodatna masa i funkcionalnost će uticati na polu-život seruma i druge osobine konjugata. Tako, razumnim izborom razdvojnih grupa, polu-život seruma konjugata može biti izmenjen. Razdvojnik X<D>takođe može biti sklopljen od modularnih segmenata, kako je opisano iznad u kontekstu razdvojnika X<z>.

Razdvojnici X<z>i/iliX<D>, gde su prisutni, poželjno obezbeđuju linearno razdvajanje od 5 do 15 atoma, između Z i C ili D i C, redom.

Bilo razdvojnik X<z>ili X<D>, ili oba, mogu sadržati deo koji se sam žrtvuje. Deo koji se sam žrtvuje je deo koji (1) je vezan za grupu C i bilo antitelo Z ili citotoksin D i (2) ima strukturu koja rascep od grupe C inicira reakcionu sekvencu rezultujući u delu koji se sam žrtvuje razdvajajući se od antitela Z ili citotoksina D, kao što može biti slučaj. Drugim rečima, reakcija na mestu udaljenom od antitela Z ili citotoksina D (cepanje od grupe C) uzorkuje da se X<z->Z ili X<D->D veza takođe prekine. Prisustvo dela koji se sam žrtvuje je poželjno u slučaju razdvojnika X<D>zato što, ako, nakon cepanja konjugata, razdvojnik X<D>ili njegov deo ostanu prikačeni za citotoksin D, biološka ativnost drugog može biti oštećena. Primena dela koji se sam žrtvuje je naročito poželjna kada je cepljiva grupa C polipeptid.

Reprezentativni delovi koji se sami žrtvuju (i)-(v) vezani za hidroksil ili amino grupu ili partnerski molekul D su prikazani ispod:

Deo koji se sam žrtvuje je struktura između tačkastih linija a i b, sa susednim strukturnim karakteristikama prikazanim da obezbede kontekts. Delovi koji se sami žrtvuju (i) i (v) su vezani za jedinjenje D-NH2(tj, jedinjenje D je konjugovano putem amino grupe), dok delovi koji se sami žrtvuju (ii), (iii), i (iv) su vezani za jedinjenje D-OH (tj. jedinjenje D je konjugovano putem hidroksilne ili karboksilne grupe). Cepanje amidne veze na tačkastoj liniji b oslobađa amidni azot kao aminski azot, inicirajući reakcionu sekvencu koja rezultuje cepanjem veze na tačkastoj liniji a i nakon toga oslobađanje D-OH ili D-NH2kao što može biti slučaj. Za dodatne objave delova koji se sami žrtvuju, videti Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981); Carl et al., WO 81/01145 (1981); Dubovvchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999); Firestone et al., US 6,214,345 BI (2001); Toki et al, J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002); Doronina et al, Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003)

( erratum,p. 941); Boyd et al, US 7,691,962 B2; Boyd et al., US 2008/0279868 Al; Sufi et al., WO 2008/083312 A2; Feng, US 7,375,078 B2; i Senter et al., US 2003/0096743 Al; objave koje su uključene ovde pomoću reference.

U još jednom prikazu, deo koji je ciljan antitelom i citotoksično jedinjenje D su povezani pomoću veznika koji ne može da se čepa. Degradacija antitela konačno smanjuje veznik do malog prikačenog dela koji se ometa biološku aktivnost citotoksičnog jedinjenja D.

Jedinjenje D - Lanker Kompozicije

U jedinjenjima predmetnog pronalaska konjugacija je poželjno izvršena kroz vezivanje za grupu R° kao što je definisano u formuli (I). Poželjno, R° je NHR<la>. Gde Rla je H ili alkil, veza može biti azot od R<la>NH. Gde R<la>je (CH2)nNH2, C(=0)(CH2)nNH2, C(=0)CHR<8>NH2, ili C(=0)R<9>NH2, konjugacija može biti izvršena putem amino (NH2) grupe R<la>. Tako, u zavisnosti od strukture R<la>NH, D može biti predstavljeno kao:

gde R<12>je Ci-Ce alkil iR2, R<3>,R<4>,R<5>, R<6>, R7,R8,R<9>, i n su definisani u odnosu na formulu (I).

Odgovarajuće strukture mogu biti izvedene iz formula (la), (lb), ili (Ha) do (Uh),

mutatis mutandis.

Poželjno, D je

Konjugati predmetnog pronalaska poželjno su pripremljeni prvim povezivanjem jedinjenja D i veznika (X<D>)aC(X<z>)bda se formira lek-veznik kompozicija predstavljena pomoću formule (IV): gde R<31>je funkcionalna grupa pogodna za reagovanje sa funkcionalnom grupom na antitelu Z da formira konjugat. Primeri pogodnih grupa R<31>uključuju azid, ciklooktin,

gde R<32>je Cl, Br, F, mezilat, ili tozilat i R<33>je Cl, Br, I, F, OH, -O-N-sukcinimidil, - 0-(4-nitrofenil), -O-pentafluorofenil, ili -O-tetrafluorofenil. Hernija generalno upotrebljiva za pripremanje pogodnih delova D-(X<D>)aC(X<z>)b-R<31>je stavljena na uvid javnosti u Ng et al., US 7,087,600 B2 (2006); Ng et al., US 6,989,452 B2 (2006); Ng et al., US 7,129,261 B2 (2006); Ng et al, WO 02/096910 Al; Boyd et al., US 7,691,962 B2; Chen et al, US 7,517,903 B2

(2009); Gangvvar et al, US 7,714,016 B2 (2010); Boyd et al., US 2008/0279868 Al; Gangvvar et al., US 7,847,105 B2 (2010); Gangwar et al., US 7,968,586 B2 (2011); Sufi et al., US 2010/0145036 Al; i Chen et al., US 2010/0113476 Al; objave koje su uključene ovde pomoću reference.

Poželjno reaktivna funkcionalna grupa -R<31>je -NH2, -OH, -CO2H, -SH, maleimido, ciklooktin, azido (-N3), hidroksilamino (-ONH2)ili N-hidroksisukcinimido. -OH grupa može biti esterifikovana pomoću karboksilne grupe na antitelu, na primer, na bočnom lancu asparaginske ili glutaminske kiseline. -CO2H grupa može biti esterifikovana sa -OH grupom ili amidovana sa amino grupom (na primer na bočnom lancu lizina) na antitelu.

N-hidroksisukcinimidna grupa je funkcionalno aktivirana karboksilna grupa i može povoljno biti amidovana reakcijom sa amino grupom (npr., od lizina).

Maleimidna grupa može biti konjugovana sa -SH grupom na antitelu (npr., od cistein ili od hemijske reakcije antitela da se uvede sulfhidrilna funkcionalnost), u reakciji Majklove adicije.

-SH grupa je posebno korisna za konjugaciju gde je antitelo modifikovano da se uvede maleimidna grupa tamo, u Majklovoj reakciji adicije koja je „lik u ogledalu" gornje

opisanog. Antitela mogu biti modifikovana da imaju maleimidne grupe sa N-sukcinimidil 4-(maleimidometil)-cikloheksankarbokislatom (SMCC) ili njegovom sulfonovanom varijantom sulfo-SMCC, oba reagenska su dostupna od Sigma-Aldrich.

Azid i ciklooktin su komplementarne funcionalne grupe koje mogu da utiču na konjugaciju putem takozvane „klik hernije" oslobođene bakra, u kojoj se azid dodaje preko napregnute alkinske veze ciklooktina da formira 1,2,3-triazol prsten. Videti, npr., Agard et al., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047; Best, Biochemistrv 2009, 48, 6571-6584. Azid može biti reaktivna funkcionalna grupa R<31>u formuli (IV) i ciklooktin može da bude smešten na antitelu ili antigen vezujućem delu istog, ili obrnuto. Ciklooktinska grupa može biti obezbeđena pomoću DIBO reagesna (dostupan od Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, Oregon).

Tehnike za uvođenje ne-prirodnih amino kiselina u antitela može biti korisna, sa ne-prirodnim amino kiselinama koje obezbeđuju funkcionalnost za konjugaciju sa reaktivnom funkcionalnom grupom. Na primer, ne-prirodna amino kiselina p-acetilfenilalanin može da bude inkorporirana u antitelo, kako je predstavljeno u Tian et al., WO 2008/030612 A2

(2008). Ketonska grupa u p-acetilfenialaninu može biti konjugaciono mesto formiranjem oksima sa hidroksilamino reaktivnom funkcionalnom grupom.

Amin (NH2) grupa može da se koristi za konjugaciju korišćenjem enzima transglutaminaze, kako je pokazano u Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995 - 9997.

Konjugacija može takođe da bude izvršena korišćenjem enzima Sortaze A, kako je pokazano u Levarv et a/., PLoS One 2011, 6(4), el8342; Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10; Ploegh et a/., WO 2010/087994 A2 (2010); and Mao et al., WO 2005/051976 A2 (2005). Motiv prepoznavanja Sortaze A (tipično LPXTG, gde X je bilo koja prirodna amino kiselina) može da bude lociran na Ugandu Z i nukleofilni akceptorski motiv (tipično GGG) može da bude grupa R<31>u formuli (IV), ili obrnuto.

Primeri kompozicija prema formuli (IV) uključuju one koje imaju strukture predstavljene formulama (IVa)-(IVg):

Pripremanje konjugata

Sledeća je ilustrativna procedura, bazirana na osnovu uvođenja slobodnih tiol grupa u antitelo reakcijom lizin e-amino grupa sa 2-iminotiolanom, praćeno sa reakcijom sa lek-veznik delom koji sadrži maleimid kao što je opisano iznad. Inicijalno je antitelu izmenjen pufer u 0.1 M fosfatni pufer (pH 8.0) koji se sastoji od 50 mM NaCl i 2 mM dietilen triamin pentasirćetne kiseline (DTPA) i koncentrovan do 5-10 mg/mL. Tiolacija je postignuta preko adicije 2-iminotiolana antitelu. Količina 2-iminotiolana koja se dodaje treba da bude određena preliminarnim eksperimentom i varira od antitela do antitela. U preliminarnom eksperimentu, titracija povećanih količina 2-iminotiolana je dodata antitelu, i sledi inkubacija sa antitelom tokom 1 sata na RT (sobna temperatura, otprilike 25 °C), uklonjena je so iz antitela u 50 mM pH 6.0 HEPES puferu korišćenjem SEPHADEX™ G-25 kolone i nekoliko tiol grupa koje su uvedene određene su brzo pomoću reakcije sa ditiopiridinom (DTDP). Reakcija tiol grupa sa DTDP rezultovala je oslobađanjem tiopiridina, što može biti praćeno spektroskopski na 324 nm. Uzorci pri koncentraciji proteina od 0.5-1.0 mg/mL su tipično korišćeni. Apsorbanca na 280 nm može biti korišćena da se tačno odredi koncentracija proteina u uzorcima, i zatim se alikvot svakog uzorka (0.9 mL) inkubira sa 0.1 mL DTDP (5 mM štok (polazni) rastvor u etanolu) tokom 10 min na RT. Blank uzorci samog pufera plus DDT su takođe inkubirani po dužini. Nakon 10 min, apsorbanca na 324 nm je izmerena i nekoliko tiol grupa je kvantifikovano korišćenjem ekstinkcionog koeficijenta za tiopiridin 19,800 M"<1>.

Tipično nivo tiolacije od oko tri tiol grupe po antitelu je poželjan. Na primer, sa nekim antitelima ovo može biti postignuto dodavanjem 15-strukog molarnog viška 2-iminotiolana praćeno sa inkubacijom na RT tokom 1 h. Antitelo je zatim inkubirano sa 2-iminotiolanom pri željenom molarnom odnosu i zatim je uklonjena so u konjugacionom puferu (50 mM pH 6.0 HEPES pufer koji se sastoji od 5 mM glicina i 2 mM DTP A). Tiolovani materijal je održavan na ledu dok je nekoliko tiola uvedenih kvantifikovano kako je opisano iznad.

Nakon verifikacije nekoliko tiola koji su predstavljeni, lek-veznik deo je dodat u 3-strukom molarnom višku po tiolu. Konjugaciona reakcija je ostavljena da pređe u konjugacioni pufer koji takođe sadrži finalnu 5% dimetilsulfoksida (DMSO), ili sličnog alternativnog rastvarača. Obično, štok rastvor lek-veznik je rastvoren u 100% DMSO. Štok rastvor je dodat direktno i tiolovano antitelo, koje ima dovoljno DMSO dodatog da se dobije finalna koncentracija do 10%, ili prethodno rastvoren u konjugacionom puferu koji ima finalonu koncentraciju od 10% DMSO, praćeno sa adicijom jednakog volumena tiolovanog antitela.

Konjugaciona rekaciona smeša je inkubirana na RT tokom 2 sata sa mešanjem. Nakon inkubacije, konjugaciona rekaciona smeša je centrifugirana i filtrirana kroz filter od 0.2 um. Prečišćavanje konjugata može biti postignuto putem hromatografije korišćenjem nekoliko metoda. U jednoj metodi, konjugat je prečišćen korišćenjem ekskluzione hormatografije na osnovu veličine na SEPHACRYL™ S200 koloni prethodno ekvilibrisanoj sa 50 mM pH 7.2 HEPES puferom koji se sastoji od 5 mM glicina i 50 mM NaCl. Hromatografija je izvedena pri linearnoj stopi protoka od 28 cm/h. Frakcije koje sadrže konjugat su sakupljene, pulovane i koncentrovane. U alternativnoj metodi, prečišćavanje može biti postignuto putem jono-izmenjivačke hromatografije. Uslovi variraju od antitela do antitela i trebaju biti optimizovani u svakom slučaju. Na primer, antitelo-lek konjugat reakciona smeša je primenjena na - SP-SEPHAROSE™ koloni prethodno ekvilibrisanoj sa 50 mM pH 5.5 HEPES koji se sastoji od 5mM glicina. Konjugat antitela je eluiran korišćenjem gradijenta 0-1 M NaCl u ekvilibracionom puferu na pH 5.5. Relevante frakcije koje obuhvataju konjugat su pulovane i dijalizovane naspram formulacionog pufera (50 mM pH 7.2 HEPES pufer koji sadrži 5 mM glicini 100 mM NaCl).

Prosečni poznavaoci oblasti će razumeti da iznad opisani uslovi i metodologija su primeri i ne ograničavaju i da su drugi pristupi poznati u oblasti i upotrebljivi u predmetnom pronalasku.

Strukture nekih poželjnih konjugata prema predmetnom pronalasku su prikazane formulama (Va) do (Vg), gde Ab predstavlja antitelo i m je 1, 2, 3, ili 4:

BIOLOŠKA AKTIVNOST

Podaci o biološkoj aktivnosti jedinjenja i konjugata predmetnog pronalaska je obezbeđena u Primerima 13 i 14 ove patentne specifikacije.

Prosečni poznavaoci oblasti će razumeti da kada su jedinjenja sa formulom (I), (la), ili (lb) kada grupa R<la>je H2NCHR<8>C(=0) - kao što je predstavljeno ujedinjenjima (Ilb), (Uf), (Ilg) ili (Uh) - korišćeni u konjugatu, deo R<la>može biti fragment enzimski cepljivog peptidil veznika čije cepanje ne regeneriše originalno jedinjenje -npr.,(Ilb), (Uf), (Ilg), ili (Uh) - ili, radije, jedinjenje (Ha).

FARMACEUSTKE KOMPOZICIJE

U drugom aspektu, predmetna objava obezbeđuje farmaceustku kompoziciju koja sadrži jedinjenje premetnog pronalaska, ili konjugata istog, formulisanog zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom. To može opciono da sadrži jedan ili više dodatnih farmaceutski aktivnih sastojaka, kao što je antitelo ili drugi lek. Farmaceutske kompozicije mogu biti administrirane u kombinovanoj terapiji sa drugim terapijskim agensom, naročito drugim antikancerskim agensom.

Farmaceutska kompozicija može da sadrži jedan ili više ekscipijenasa. Ekscipijensi koji mogu biti korišćeni uključuju nosače, površinske aktivne sastojke, agense za zgušnjavanje ili emulzifikaciju, čvrsta veziva, disperziona ili suspendujuća sredstva, solubilizatore, sredstva za bojenje, sredstva za ukus, premaze, dezintegrišuće agense, lubrikante, zaslađivače, konzervanse, izotonične agense, i njihove kombinacije. Selekcija i primena pogodnih ekscipijenasa je predstavljena u Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacv, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003), objave koje su uključene ovde sa referencom.

Poželjno, farmaceutska kompozicija je pogodna za intravensku, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu administraciju{ npr.,pomoću injekcije ili infuzije). U zavisnosti od načina administracije, aktivno jedinjenje može biti obloženo materijalom koji bi ga zaštitio od delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu da ga inaktivišu. Fraza "parenteralna administracija" označava načine administracije koje nisu enteralna i topikalna administracija, obično putem injekcije, i uključuje, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju. Alternativno, farmaceutska kompozicija može da se administrira na ne-parentalan način, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni način administracije, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, sublingvalno, ili topikalno.

Farmaceutske kompozicije mogu biti u obliku sterilnih vodenih rastvora ili disperzija. Mogu takođe biti formulisane u mikroemulziji, lipozomu, ili drugim uređenim strukturama pogodnim da se postigne visoka koncentracija leka. Kompozicije mogu takođe biti obezbeđene u obliku liofilata, za rekostruisanje u vodi pre administracije.

Količina aktivnog sastojka koji može da se kombinuje sa materijalom nosača da proizvede jediničnu doznu formu će varirati u zavisnosti od subjekta koji se leči i posebnog načina administracije i generalno će to biti količina kompozicije koja proizvodi terapijski efekat. Generalno, u jednom od sto procenata, ova količina će biti u opsegu od 0.01 procenat do oko 99 procenata aktivnog sastojka, poželjno od oko 0.1 procenata do oko 70 procenata, najpoželjnije od oko 1 procenat do oko 30 procenata aktivnog sastojka u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivi nosačem.

Dozni režimi su prilagođeni da obezbede terapijski odgovor. Na primer, pojedinačni bolus može biti administriran, nekoliko podeljenih doza mogu biti administrirano tokom vremena, ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana na šta ukazuje hitnost situacije. Naročito je povoljno da se formulišu kompozicije u doznom jediničnom obliku za lakoću administracije i uniformnost doziranja. "Dozna jedinična forma" odnosi se na fizički diskretne jedinice kao jedinična doziranja za subjekte koji se leče; svaka jedinica se sastoji od unapred određene količine aktivnog jedinjenja izračunate da se proizvede željen terapijski odgovor, u vezi sa zahtevanim farmaceutskim nosačem.

Doza je u rasponu od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i uobičajenije od 0.01 do 5 mg/kg, telesne mase domaćina. Na primer doze mogu biti 0.3 mg/kg telesne mase, 1 mg/kg telesne mase, 3 mg/kg telesne mase, 5 mg/kg telesne mase ili 10 mg/kg telesne mase ili unutar opsega 1-10 mg/kg. Reprezentativni režimi lečenja su administracija jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom svaka 3 meseca, ili jednom svakih tri do 6 meseci. Poželjni dozni režimi obuhvataju 1 mg/kg telesne mase ili 3 mg/kg telesne mase putem intavenske administracije, korišćenjem jednog od sledećih doznih rasporeda: (i) svake četiri nedelje za šest doza, zatim svaka tri meseca; (ii) svake tri nedelje; (iii) 3 mg/kg telesne mase jedno praćeno sa 1 mg/kg telesne mase svake tri nedelje. U nekim metodama, doza je podešena da se dostigne koncentracija antitela u plazmi od oko 1-1000 ug/mL i u nekim metodama oko 25-300 ug /mL.

„Terapijski efikasna količina" jedinjenja predmetnog pronalaska poželjno rezultuje u smanjenju težine simptoma bolesti, povećanju frekvencije i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili prevenciji oštećenja ili onesposobljvanja usled bola prisutnog kod bolesti. Na primer, za lečenje subjekata koji imaju tumor, "terapijski efikasna količina" poželjno inhibira rast tumora za najmanje oko 20%, poželjnije za najmaje oko 40%, još poželjnije za najmanje oko 60%, i još poželjnije za najmanje oko 80% u odnosu na netretirane subjekte. Terapijski efikasna količina terapijskog jedinjenja može da smanji veličinu tumora, ili drugačije da ublaži simptome kod subjekta, koji je tipično čovek ali može biti drugi sisar.

Farmaceutska kompozicija može biti formulacija sa kontrolisanim ili produženim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere, i mikroenkapsulirane sisteme isporučivanja. Biorazgradivi, biokopatibilni polimeri mogu biti korišćeni, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polimlečna kiselina. Videti, npr., Sustained and Controlled Release Drug Deliverv Svstems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Terapijske kompozicije mogu biti administrirane putem medicinskih uređaja kao što su (1) potkožni uređaji za injektiranje bez igala (npr., US 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; i 4,596,556); (2) mikro-infuzione pumpe (US 4,487,603); (3) transdermalni uređaji (US 4,486,194); (4) infuzioni aparati (US 4,447,233 i 4,447,224); i (5) osmotski uređaji (US 4,439,196 i 4,475,196); objave koje su uključene ovde sa referencom.

U određenim prikazima, farmaceutska kompozicija može biti formulisana da osigura pravu distribucijuin vivo.Na primer, da osigura da terapijska jedinjenja predmetnog pronalaska prolaze kroz barijere krv-mozak, ona mogu biti formulisana u lipozome, koji mogu dodatno da sadrže ciljajuće delove da pojačaju selektivni transport do specifičnih ćelija ili organa. Videti, npr. US 4,522,811; 5,374,548; 5,416,016; i 5,399,331; V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al, (1988) Biochem. Biophvs. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al.

(1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; i Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

PRIMENE

Jedinjenja predmetnog pronalaska ili njihovi konjugati mogu biti korišćeni za lečenje bolesti kao što su, ali bez ograničenja na, hiperproliferativne bolesti, uključujući: kancere glave i vrata koji uključuju tumore glave, vrata, nosne šupljine, paranazalne sinuse, nazofarinks, oralnu šupljinu, orofarinks, grkljana, hipofaniksa, pljuvačnih žlezda, i; kanceri jetre i bilijarnog stabla, posebno hepatoceluarni; intestinalni kanceri, posebno kolorektalni kancer; kancer ovarijuma; sitno ćelijski nesitno ćelijski kanceri pluća (SCLC i NSCLC); sarkomi kancera dojke, kao što je fibrosarkom, maligni fibrozni histiocitom, embrionalni rabdomiosarkom, neurofibrosarkom, osteosarkom, sinovijalni sarkom, liposarkom, i alveolarni sarkom mekih tkiva; leukemije kao što su akutna promijelocitna leukemija (APL), akutna mijelogena leukemija(AML), akutna limfoblastna leukemija (ALL), i hronična mijelogena leukemija (CML); neoplazme centralnog nervnog sistema, posebno kancer mozga, multipli mijelom (MM), limfomi kao što je Hodgkin-ov limfom, limfoplazmacitoidni limfom, folikularni limfom, limfom limfoidnog tkiva povezan sa mukozom, limfom „mantle" ćelija, limfom velikih ćelija B-loze, Burkitt-ov limfom, i T-ćelijski limfom anaplastičnih velikih ćelija. Klinički, praktikovanje metoda i primena kompozicija ovde opisanih će rezultirati redukcijom u veličini ili broju kancerskog rasta i/ili u redukciji povezanih simptoma (gde je moguće). Patološki, praktikovanje metoda i primena kompozicije opisaih ovde će proizvesti patološki relevantan odgovor, kao što je: inhibicija proliferacije kancerskih ćelija, redukcija veličine kancera ili tumora, prevencija daljih metastaza, i inhibicija angiogeneze tumora. Metoda za lečenje takvih bolesti sadrži administraciju terapijski efikasne količine inventivne kombinacije subjektu. Metoda može da se ponovi ako je neophodno. Naročito, kancer može biti kolorektalni kancer, kancer jetre, kancer dojke, melanom, glioblastom, kancer pluća, kancer pankreasa, kancer ovarijuma, multipli mijelom, kancer bubrega, leukemija (naročito ALL, APL, iliAML), ili limfom.

Jedinjenja predmetnog pronalaska ili njihovi konjugati mogu biti administrirani u kombinaciji sa drugim terapijskim agensima, uključujući antitela, alikilujuće agense, inhibitore angiogeneze, antimetabolite, agense koji cepaju DNK, agense koji poprečno vezuju DNK, interkalirajuće DNK agesne, agense koji se vezuju za malu petlju DNK, enedine, proteine toplotnog šoka, imunomodulatore, stabilizatore mikrotubula, nukleozidne (purin ili pirimidin) analoge, inhibitore jedarnog izvoza, inhibiote proteazoma, topoizomerazazne inhibitore (I ili II), tirozin kinazne inhibitore, i serine/treonin kinazne inhibitore. Specifični terapijski agensi uključuju adalimumab, ansamitocin P3, auristatin, bendamustin, bevacizumab, bicalutamid, bleomicin, bortezomib, busulfan, kalistatin A, kamptotecin, kapecitabin, karboplatin, karmustin, cetuksimab, cisplatin, kladribin, citarabin, kriptoficini, dakarbazin, dasatinib, daunorubicin, docetaksel, doksorubicin, duokarmicin, dinemicin A, epotiloni, etopozid, floksuridin, fludarabin, 5-fluorouracil, gefitinib, gemcitabin, ipilimumab, hidroksiurea, imatinib, infliksimab, interferoni, interleukini, P-lapahon, lenalidomid, irinotekan, majtanzin, mehloretamin, melfalan, 6-merkaptopurin, metotreksat, mitomicin C, nilotinib, oksaliplatin, paklitaksel, prokarbazin, suberoilanilid hidroksamična kiselina (SAHA), 6-tioguanidin, tiotepa, tenipozid, topotekan, trastuzumab, trihostatin A, vinblastin, vinkristin, i vindezin.

PRIMERI

Praksa predmetnog pronalaska može dalje biti shvaćena pozivanjem na primere koji slede, koji su obezbeđeni za ilustraciju i ne radi ograničenja.

Primer 1 - Jedinjenje ( Ha)

Ovaj primer opisuje pripremanje jedinjenja (Ha), ili 8-aminouncialamicina. Shema sinteze za njegovu pripremu je prikazana na Slici 1, gde je označeno jedinjenje 9.

2, 2, 2- trihloroetil ( 3- okso- l, 3- dihidroizobenzofuran- 5- il) karbamat 2.U suspenziju 6-aminoizobenzofuran-l(3H)-ona 1 (Mavbridge, 13.43 g, 90 mmol) u dihlormetanu (DCM, 200 mL) na 0 °C dodat je 2,2,2-trihloroetil karbonohloridat (carbonochloridate - ugljenik-hlordioksid) la (18.23 mL, 135 mmol) i piridin (17.79 mL, 180 mmol). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi (RT, ca. 25 °C) tokom 1 h. Tankoslojna hromatografija (TLC) i tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) pokazala je da je reakcija kompletna. Reakciona smeša je filtrirana i isprana sa DCM (2x30 mL) da se dobije karbamat 2 kao bela čvrsta supstanca (17.03g, 58%). LCMS: [M+l] = 324.

Hidroksiftalid 3.Suspenzija karbamata 2 (17.0 g, 52.4 mmol), N-bromosukcinimid (NBS, 10.26 g, 57.6 mmol) u CCU (150 mL) je mešana i zagrejana do refluksa (85 °C uljano kupatilo). Reakciona smeša je izložena svetlu od strane sunčane lampe koja je postavljena otprilike 10 cm od suda. Nakon 2h TLC pokazao je da je reakcija kompletna. HPLC je pokazao višestruke pikove usled labilne prirode intermedijernog bromida. Koncentracija na rotacionom evaporatoru dala je braon čvrstu supstancu. Voda (200 mL) je dodata u čvrstu susptancuin situi zagrejena do refluksa tokom 5 h da se proizvede skoro čist rastvor sa nekim nerastvornim materijalom. TLC i HPLC pokazali su da je reakcija kompletna. Koncentracija na rotacionom evaporatoru praćena prečišćavanjem sa COMBIFLASH™ jedinicom korišćenjem 0-50% EtOAc gradijenta u heksanima na 120 g silikatnoj koloni dala je hidroksiftalid 3 (13.55g, 76%). LCMS: [M+l] = 340.

Cijanoftalid 5.Suspenziji od hidroksiftalida 3 (1.391 g, 4.09 mmol) i kalijum cijanida (399 mg, 6.14 mmol, 1.5 ekv.) u vodi (4 mL) je polako dodata 33% vodena HC1 (1.2 mL) na 0 °C (ledeno kupatilo). Ledeno kupatilo je uklonjeno i mešanje je nastavljeno tokom 2 h. LCMS (m+l = 368) pokazala je formirane jedinjenja 4. Reakciona smeša je ekstrakovana sa EtOAc, osušena preko MgS04, i koncentrovana do 20 mL. Nakon hlađenja do 0 °C, rastvor je tretiran dicikloheksil karbodiimidom (DCC, 1.2 ekv.) i mešanje je nastavljeno na RT tokom 8 h. Reakciona smeša je filtirana da se ukloni urea kao sporedni proizvod i filtrat je koncentrovan pomoću fleš hromatografije na koloni sa 30% EtOAc/gradijent heksana da se dobije cijanoftalid 5 (1.116 g, 78% prinos) kao bela čvrsta supstanca. 'H NMR(400 MHz, CDCb): 8 8.10 (d, /= 2.0 Hz, IH), 7.93 (dd, /= 8.8, 2.0 Hz, IH), 7.67 (d,J=8.8 Hz, IH), 6.06 (s, IH), 4.87 (s, IH).

Aminocijanoftalid 6.Cink (8.58 g, 131 mmol) je dodat u rastvor cijanoftalida 5 (3 g, 8.58 mmol) u sirćetnoj kiselini (82 mL) i vodi (4.3 mL) na RT. Nakon 30 min TLC i HPLC pokazali su da je reakcija kompletna sa 3:1 odnosom proizvoda i monodeclorinovanim sporednim proizvodom. Filtriranje preko CELITE™ i ispiranje sa EtOAc (50 mL) i vodom (50 mL), praćeno je koncentrovanjem i prečišćavanjem COMBIFLASH™ 40g silika koloni korišćenjem 0-50% EtOAc/gradijent heksana dalo je aminocijanoftalid 6 kao belu čvrstu supstancu (980 mg, 66% prinos). 'H NMR (400 MHz, CDCb): 8 7.46 (d,J =8.4 Hz, IH), 7.05 (dd, / = 8.4, 2.4 Hz, IH), 6.95 (d, /= 2.4 Hz, IH), 6.47 (s, IH).

8- Aminouncialamicin- OTES 8.Procedura „Hauserova anelacija" (Hauser annulation) je upotrebljena. U rastvor aminocijanoftalida 6 (155 mg, 0.891 mmol) u tetrahidrofuranu (THF, 5.3 mL) na -70 °C je dodat litijum bis(trimetilsilil)amid (LiHMDS, 1.782 mL, 1.782 mmol). Reakciona smeša je mešana tokom 20 min. Prethodno ohlađen rastvor iminohinona 7 (napravljen po Nicolaouet al.2007a, 125 mg, 0.297 mmol) u THF (12.5 mL) je dodat. Reakciona smeša je mešana na istoj temperaturi tokom 5 min i zatim blago zagrejana do RT tokom 30 min. Reakcija je kvenčovana sa fosfatnim puferom (pH 6.8, 100 mL) i ekstrakovana sa EtOAc (3x75 mL). Kombinovani ekstrakti su osušeni preko MgS04da se dobije sirov proizvod. Prečišćavanje na COMBIFLASH™ 12 g koloni od slika gela korišćenjem 0-50% EtOAc/gradijent heksana dalo je proizvod 8 kao ljubičasta čvrsta supstanca (60 mg, 36% prinos). LCMS: [M+l] = 569. 'H NMR (400 MHz, CDsCN): 8 13.14 (s, IH), 9.96 (d,J=4.0 Hz, IH), 8.40 (m, IH), 8.03 (d, /= 9.6 Hz, IH), 7.38 (m, IH), 7.02 (td,J=8.0 Hz,J =1.6 Hz IH), 5.92 (dd, /= 24, 9.6 Hz, 2H), 5.20 (s, 2H), 5.12 (d, /= 4.4 Hz, IH), 4.94 (d,J=4.0 Hz, IH), 4.65 (m, IH), 4.55 (q,J=6.4 Hz, IH), 4.46 (d, /= 4.8 Hz, IH), 3.41 (m, IH), 1.40 (d, /= 6.0 Hz, 3H), 1.00 (t,J=8.0 Hz, 9H), 0.68 (q,J=7.2 Hz, 3H).

8- Aminouncialamicin 9.Aminouncialamicin-OTES 8 (30 mg) je rastvoren u THF (3 mL) i tretiran rastvorom Et3N»3HF u THF (1:1, 1.5 mL) na RT. Nakon 1 h, desililacija je kompletna i praćena pomoću TLC i HPLC. Reakciona smeša je sipana u EtOAc, isprana sa zasićenim NaHCOs rastvorom, osušena preko MgS04i koncentrovana. Prečišćavanje na COMBIFLASH™ koloni od silika gela korišćenjem 0-55% EtOAc/gradijent heksana dalo je 8-aminouncialamicin 9 kao ljubičastu čvrstu supstancu (80% prinos). LCMS: [M+l] = 455.

Prosečni poznavaoci oblasti će znati da varijante jedinjenja (Ha) sa amino grupom lociranom na drugim položajima u prstenu mogu mogu biti napravljene korišćenjem početnog materijala varijanti jedinjenja 1 sa njegovim amino grupama bilo gde u prstenu ili zamenjene sa različitom grupom, kao u:

Primer 2 - Jedinjenja ( Ilb), ( Ilg), i ( Uh)

Iako 8-amino grupa u 8-aminouncialamicinu nije naročito reaktivna, može biti amidovana sa hloridom a-amino kiseline u prisustvu srebro cijanida. Slika 2 prikazuje ilustrativne procedure za pripremanje jedinjenja jedinjenja (Ilb), (Uh), i (Ilg), putem ove procedure. Na slici 2 jedinjenja (Ilb), (Uh), i (Ilg) su obeležena 13a, 13b, i 13c', redom.

Fmoc- Gly- NH- uncialamicin- OTES 11a.Aminouncialamicin-OTES 8 (5 mg) i Fmoc-zaštićenog glicin hlorid 10a (Chem-Impex, 8.4 mg, 3 ekv) su rastvoreni u acetonitrilu (2 mL) i mešani u prisustvu AgCN (7 mg, 6 ekv) preko noći. Reakcija je završena što je praćeno pomoću TLC i HPLC. Koncentracija i prečišćavanje na COMBIFLASH™ koloni od silika gela korišćenjem 0-40% EtOAc/gradijent heksana dalo je proizvod 11a kao ljubičastu čvrstu supstancu (90% prinos). LCMS: [M+l] = 848.

Fmoc- Gly- NH- itncialamicin 12a.Proizvod 11a (4 mg) je rastvoren u THF (0.5 mL) i tretiran rastvorom Et3N»3HF«THF (1:1, 0.25 mL) na RT. Nakon 1 h desililacija je kompletirana što je praćeno sa TLC i HPLC. Reakciona smeša je sipana u EtOAc, isprana sa zasićenim NaHCOs rastvorom, osušena preko MgS04i koncentrovana. Prečišćavanje na COMBIFLASH™ koloni od silika gela korišćenjem 0-55% EtOAc/gradijent heksana dalo je jedinjenje 12a kao ljubičastu čvrstu supstancu (80% prinos). LCMS: [M+l] = 734.

Gly- NH- uncialamicin 13a.Jedinjenje 12a (2 mg) je tretirano sa 20% piperidinom u N,N-dimetilformamidu (DMF,1 mL) na RT tokom 15 min. Koncentracija i prečišćavanje korišćenjem HPLC na reverznoj fazi (R-HPLC) sa 0.1% TFA u eluentu acetonitril/voda dalo je jedinjenje 13a (50% prinos). LCMS: [M+l] = 512.

Analogna lizin i serin jedinjenja 13b i 13c' su pripremljeni korišćenjem istih opštih procedura. Kiseli hloridi 10b i 10c su pripremljeni od odgovarajućih karboksilnih kiselina (obe od Chem-Impex) reakcijom sa tionil hloridom ili Ghosez-ovim reagensom. Uklanjanje TES grupe iz jedinjenja 13c može biti postignuto sa sirćetnom kiselinom. Jedinjenje 13b: LCMS [M+l] = 583.2; jedinjenje 11c: LCMS [M+l] = 770.3.

Primer 3 - Jedinjenje ( lij)

Procedura iz prethodnog primera nije bila upotrebljiva sa citrulinom, zbog nestabilnosti citrulinskog kiselog hlorida. Alternativni pristup sintezi je osmišljen, u kome je citrulin bio prikačen za ftalid pre kondenzacije sa jedinjenjem 7, kao što je prikazano na slici 3, da se proizvede jedinjenje (Ili), označeno 17 na slici.

Fmoc- citrulinom kuplovan cijanoftalid 14.Boc-zaštićeni citrulin 6a (Chem-Impex, 0.726 g, 2.64 mmol) i N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimid hidrohlorid (EDC, 0.578g, 2.9 mmol) u DCM:DMF (17:3,20 mL) je mešan na RT tokom 30 min. Zatim aminocijanoftalid 6 (0.23 g, 1.32 mmol) je dodat i mešan na RT tokom 18 h. Reakciona smeša je obrađena sa etil acetatom, isprana sa zasićenim NaHC03rastvorom, i dalje isprana sa vodom i slanim rastvorom. Koncentracija i prečišćavanje sa COMBIFLASH kolonom eluirano je sa 17% MeOH u DCM dalo je cijanoftalid 14 (40% prinos). LCMS: [M+l] = 432.

'H NMR (400 MHz, DMSO-de): 5 10.50 (s, IH), 8.37(d, J =8.4 Hz, IH), 7.96 (m, IH), 7.91(d, J=8.0 Hz, IH), 7.16 (d,J=8.0 Hz, IH), 6.72 (s, IH), 5.40 (s, 2H), 4.02 (m, 2H), 2.92 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.36 (m, 9H).<13>C NMR (100 MHz, DMSO-de): 5 172.7, 168.3, 159.3, 156.0, 141.9, 137.0, 126.7, 125.0, 124.5, 115.7, 114.8, 78.5, 66.7, 55.3, 29.4, 28.6, 27.3.

Jedinjenje 15.Ftalid 14 je tretiran sa DCM-trifluorosirćetnom kiselinom (TFA) (1:1) da se dobije jedinjenje 15. LCMS: [M+l] = 332.

Jedinjenje 17.Bez daljeg prečišćavanja, TFA so jedinjenja 15 je podvrgnuta procesu Hauser-ove anelacije sa iminohinonom 7, korišćenjem opštih uslova gore opisanih da se dobije TES zaštićeno jedinjenje 16 (10% prinos). Desilacija jedinjenja 16 sa Et3N»3HF praćena sa R-HPLC koristeći 0.1% TFA u CFfjCN/voda dalo je jedinjenje 17. LCMS: [M+l] = 612.

Primer 4 - Jedinjenje ( IIc)

Slika 4 pokazuje shemu sinteze jedinjenja (IIc), obeleženu sa 22.

Jedinjenje 19.U rastvor aminocijanoftalida 6 (300 mg, 1.723 mmol), jedinjenja 18 (Aldrich-Sigma, 823 mg, 5.17 mmol) i sirćetne kiseline (5 ekv) u CICH2CH2CI (30 mL) je dodat natrijum triacetoksi borohidrid (3 ekv) i mešan je na RT tokom 5 h. HPLC pokazala je 90% konverzije. Reakciona smeša je sipana u DCM (100 mL) i isprana sa zasićenim NaHCOs rastvorom(50 mL). Koncentracija i prečišćavanje korišćenjem COMBI-FLASH™ kolone sa 40% EtOAc/heksani kao eluenta dalo je jedinjenje 19. 'H NMR (400 MHz, DMSO-de): 5 7.53 (d,J =8.4 Hz, IH), 7.07 (dd,J =8.8, 2.4 Hz, IH), 6.89 (d,J =2.0 Hz, IH), 6.85 (brs, IH), 6.56 (s, IH), 4.0 (brs, IH), 3.06-3.13 (m, 4H), 1.34 (m, 9H).

Jedinjenja 20a.Jedinjenje 19 je rastvoreno u DCM (6 mL) i tretirano sa TFA (3 mL) na 0 °C. Temperatura je ostavljena da se poveća do RT i reakciona smeša je mešana tokom 30 min. HPLC je pokazala daje reakcija kompletna. Reakciona smeša je koncentrovana da se dobije gumasti materijal, koji je ispran sa etrom (2x20 mL), rastvorena u acetonitrilu/vodi i liofilizovana da se dobije jedinjenje 20a (601 mg, 78% prinos). LCMS: [M+l] = 218.

Jedinjenje 20b. U rastvor jedinjenja 20a (200 mg, 0.451 mmol, kao bis-TFA so) u DMF (2 mL) na 0 °C je dodat trietilamin (0.314 mL, 2.256 mmol) praćeno sa (hloro(4-metoksifenil)metilen)dibenzenom (167 mg, 0.541 mmol) u DCM (2 mL). Reakciona smeša je mešana na RT tokom 1 h obrađena sa EtOAc i vodom. Prečišćavanje na neutralnoj koloni od aluminijum oksida (alumina)koristeći 30% EtOAc u heksanu dalo jep-metoksifenildifenilmetilom (MMT) zaštićeni proizvod 20b kao bledo žuta čvrsta supstanca (105 mg, 48% prinos). Čistoća je proverena pomoću TLC sa trietilamin:EtOAc:heksan (1:30:70) mobilnoj fazi. 'H NMR (400 MHz, CDCb): 5 7.2-7.7 (m, 16H), 7.0 (m, 2H), 6.8 (m, 3H), 6.19 (s, IH), 4.57 (brs, IH), 3.77 (m, 3H), 3.28 (m, 2H), 2.50 (m, 2H).

Jedinjenje 22.U rastvor proizvoda 20b (92 mg, 0.188 mmol) u THF (2 mL) na -70 °C je dodat LiHMDS (0.376 mL, 0.376 mmol). Reakciona smeša je mešana tokom 20 min. Prethodno ohlađen rastvor iminohinona 7 (52.8 mg, 0.125 mmol) u THF (2.6 mL) je dodat i mešan na istoj temperaturi tokom 5 min. Reakciona smeša je polako zagrejana do RT tokom 20 min, kvenčovana sa fosfatnim puferom (pH 6.8, 20 mL) i ekstrakovana sa EtOAc (3x15 mL). Kombinovane organske faze su isprane sa slanim rastvorom (30 mL) i osušene preko MgS04da se dobije sirov proizvod 21. Neprečišćen proizvod 21 je rastvoren u DMSO (2 mL) i tretiran sa Et3N»3HF (0.5 mL) na 4 °C i mešan na RT. Nakon lh LCMS pokazala je formiranje proizvoda. Sirov proizvod je prečišćen na X-Bridge preparativnoj Cl 8 koloni 5um OBD (30x150 mm) korišćenjem 0.1% TFA u acetonitrilu/vodi kao mobilnoj fazi. Dobijeni prozvod liofilizacije 22 (14.4 mg, 23% prinos preko dva koraka). LCMS [M+l] = 498.3.

Primer 5 - Jedinjenja ( Ile)

Slika 5 pokazala je shemu sinteze jedinjenja (Ile), obeleženog sa 25 na slici.

8- Metilaminouncialamicin 25.U rastvor aminocijanoftalida 6 (34 mg, 0.195 mmol), paraformaldehida (11.72 mg, 0.390 mmol) i sirćetne kiseline u CICH2CH2CI (2 mL) je dodat natrijum triacetoksi borohidrid. Reakciona smeša je držana na na RT tokom 24 h. HPLC je pokazala 90% konverzije. Reakciona smeša je sipana i EtOAc (20 mL) i isprana sa zasićenim NaHC03rastvorom (10 mL). Koncentracija i prečišćavanje pomoću R-HPLC dala je proizvod 23 (15 mg, 41% prinos). MS (m+l) = 189. Proizvod 23 je podvrgnut procesu Hauser-ove anelacije praćeno sa TES uklanjanjem zaštite kao što je opisano u tekstu da se dobije 8-metilaminouncialamicin 25. LCMS: (M+l) = 467.

Primeri 6 - Jedinjenje ( Ud)

Slika 6 prikazuje shemu za sintezu jedinjenja (Ud), obeleženo sa 30 na slici.

Jedinjenje 30.Kombinacija 4-((terc-butoksikarbonil)amino)benzoeve kiseline 26 (Fluka, 1.885 g, 7.95 mmol) i EDC (1.676 g, 8.74 mmol) u DCM (24 mL) je mešana na RT tokom 30 min. Zatim aminocijanoftalid 6 (0.346 g, 1.987 mmol) u DMF (6.00 mL) je dodat. Reakciona smeša je mešana na RT tokom 5 h. Temperatura je povećana do 50 °C; nakon 40 h DCM je uklonjen evaporacijom. Ostatak je sipan u EtOAc. EtOAc je isprana sa zasićenim NaHC03, vodom, i slanim rastvorom. Koncentracija i prečišćavanje na COMBIFLASH™ jedinici korišćenjem 15% MeOH u DCM eluentu da se dobije jedinjenje 27 kao žuta čvrsta supstanca (587 mg, 75% prinos). LCMS: [M+l] = 394. 'H NMR (400 MHz, DMSO-de): 5 10.53 (s, IH), 9.71 (s, IH), 8.42 (d,J=2.0 Hz, IH), 8.19 (dd,J=8.4, 2.0 Hz, IH), 7.9 (m, 3H), 7.59 (dd,J=7.2,J=2.0 Hz, 2H), 6.74 (s, IH), 1.47 (m, 9H). Ovaj materijal 27 (567 mg, 1.441 mmol) je suspendovan u DCM (2 mL) i TFA (2 mL, 26.0 mmol) je dodat. Nakon mešanja na RT tokom 50 min, LCMS i HPLC pokazali su da je reakcija kompletna. Koncentracija i sušenje pod visokim vakuumom tokom 2h dalo je jedinjenje 28, koje je podvrgnuto procesu Hauser-ove anelacije praćeno sa TES uklanjanjem zaštite sa Et3N»3HF kao što je iznad opisano da se dobije jedinjenje 30 (18% prinos). LCMS: M+l=574.2.

Primer 7 - Adaptacija jedinjenja ( Ilb) za konjugaciju

Slika 7 prikazuje reakcione sheme za adaptiranje jedinjenja (lib) za konjugaciju.

Jedinjenje 32.Jedinjenja 13a (1 ekv.) i 31 (Dubowchiket al.2002; 1.2 ekv) u DMSO su tretirani sa N,N-diizopropiletilaminom (DIPEA, 3 ekv) na RT tokom 1 h. Prečišćavanje pomoću R-HPLC korišćenjem 0.1% TFA u CThCN/voda eluentu dalo je jedinjenje 32 (50% prinos). LCMS: [M+l] = 1082. 'H NMR (400 MHz, DMSO-de): 8 13.12 (s, IH), 10.62 (s, IH), 9.67 (m, IH), 8.49 (s, IH), 8.29(d, J=9. 2 Hz, IH), 8.19 (d,/=9.2 Hz, IH), 8.07 (m, IH), 7.83 (d,J =8.4 Hz, IH), 7.57 (m, 2H), 7.29 (m, 2H), 6.98 (m, IH), 6.65 (d,J =4.8 Hz, IH), 5.99 (dd,J=30, 9.2 Hz, 2H), 5.38 (d,J=4.8 Hz, IH), 5.14 (d, /= 4.8 Hz, IH), 5.03 (m, IH), 4.97 (s, IH), 4.16 (t,J=7.6 Hz, IH), 4.08 (q, /= 5.2 Hz, 4H), 3.86 (d,J=6.0 Hz, IH), 3.38 (t, /= 6.8 Hz, IH), 2.90 (m, 2H), 1.94 (m, 2H), 1.69 (m, 2H), 1.29 (d,J=6.4 Hz, 3H), 0.83 (m, 6H).

Jedinjenje 34.Slična reakcija N-hidroksisukcinimid estra maleimidobuterne kiseline 33 (TC1) dalo je jedinjenje 34. LCMS: [M+l] = 677.

Primer 8 - Adaptacija jedinjenja ( lij) za konjugaciju

Slika 8 prikazuje reakcione sheme za adaptiranje jedinjenja (Uf) za konjugaciju.

Jedinjenje 38.U rastvor jedinjenja 17 (5 mg) i 35 (Bachem, 10 mg, 22 umol) u DMF (2 mL) je dodat DIPEA (16 ul). Reakciona smeša je mešana na RT tokom 7h. Koncentracija i prečišćavanje sa COMBIFLASH™ jedinicom korišćenjem 30% MeOH u DCM eluentu dalo je jedinjenje 36 (29% prinos). Jedinjenje 36 je tretirano sa 20% piperidinom u DMF (2 mL). Nakon mešanja na RT tokom 15 min, LCMS je pokazao daje reakcija kompletna. Piperidin je uklonjen na rotacionom evaporatoru. Reakciona smeša je apsorbovana na silika gelu i prečišćena sa COMBIFLASH™ jedinicom korišćenjem 30% metanola u DCM eluentu da se dobije proizvod 37 (60% prinos). Proizvod 37 je spojen sa N-hidroksi-sukcinimidnim estrom 33 (6 mg) u DIPEA (16 ul) u DMSO (1 mL) na RT tokom 3h. Prečišćavanje pomoću R-HPLC dalo je proizvod 38 (1.56 mg). LC MS (m+l = 876).

Jedinjenje 39.U rastvor jedinjenja 17 (1.68 mg) i 33 (2 mg, 22 umol) u DMF (0.5 mL) je dodat DIPEA (5 ul). Reakciona smeša je mešana na RT tokom Ih. Prečišćavanje pomoću R-HPLC dalo je proizvod 39 (0.776 mg). LC MS (m+l = 777).

Primer 9 - Adaptacija jedinjenja ( IIc) za konjugaciju

Slika 9 prikazuje reakcione sheme za adaptiranje jedinjenja (IIc) za konjugaciju.

Jedinjenje 40.Rastvor jedinjenja 22 (4.89 mg, 8 umol), jedinjenja 31 (5.68 mg, 8.00 umol) i DIPEA (6.95 ul, 40.0 umol) u DMSO (3 mL) su mešani na RT tokom lh. Prečišćavanje pomoću R-HPLC i liofilizacija dali su 4.6 mg željenog jedinjenja 40 (54% prinos). LC MS (m/2+1 = 535). 'H NMR (400 MHz, DMSO-de): 8 13.07 (s, IH), 9.87 (m, IH), 8.37 (s, IH), 8.01 (d,J=7.2 Hz, IH), 7.91 (d,J=8.4 Hz, IH), 7.77 (d,J=8.4 Hz, IH), 7.51( d, J=8.8 Hz, IH), 7.2 (m, 5H), 6.95 (m, 3H), 5.92 (dd,J=30, 9.2 Hz, 2H), 5.35 (m, 2H), 5.08 (s, IH), 4.08 (t,J =7.6 Hz, IH), 3.31 (t,J =6.8 Hz, IH), 2.93 (m, 2H), 2.09 (m, 2H), 1.90 (m, IH), 1.63 (m, 2H), 1.29 (d,J=6.4 Hz, 3H), 0.78 (m, 6H).

Jedinjenje 41.U rastvor jedinjenje 22 (4.89 mg, 8 umol) u DMSO (3 mL) je dodat DIPEA (4.35 ul, 25.00 umol) i jedinjenje 33a (TCI, 2.466 mg, 8.00 umol). Reakciona smeša je mešana na RT. Nakon 30 min drugih 0.5 ekv jedinjenja 33a and DIPEA (5 ekv) su dodati i mešanje je nastavljeno tokom 30 min. HPLC and LCMS pokazali su da je reakcija kompletna. Prečišćavanje pomoću R-HPLC i liofilizacija dali su 2.35 mg jedinjenja 41 (43% prinos). LC MS (m+l = 691.3). 'H NMR (400 MHz, DMSO-de): 8 13.07 (s, IH), 9.87 (m, IH), 8.38 (s, IH), 7.89 (m, 2H), 7.1 - 7.5 (m, 2H), 6.7-7.0 (m, 4 H), 6.4- 6.6 (m, 2 H), 5.92 (dd,J=30.4, 10.0 Hz, 2H), 5.28 (m, IH), 5.08 (s, IH), 4.91 (m, IH), 4.24 (m, IH), 1.98 (m, 4H), 1.40 (m, 2H), 1.24 (d,J=6.0 Hz, 3H), 1.0-1.2 (m, 4H).

Primer 10 - Adaptacija jedinjenja ( Ud) za konjugaciju.

Slika 10 prikazuje reakcione sheme za adaptiranje jedinjenja (Ud) (obeleženo 30) za ko<n>jugaciju.

Jedinjenje 43.DIPEA (0.012 mL, 68.3 umol) je dodato u rastvor jedinjenja 30 (6.53 mg, 11.39 umol), Fmoc-zaštićeni citrulin 42 (Chem-Impex, 9.05 mg, 22.77 umol), i jV,7V,7V<r>',7V'-tetrametil-0-(7-azabenzotriazol-l-il)uronijum heksafluorofosfat (HATU, 8.66 mg, 22.77 umol) u DMF (1 mL). Reakciona smeša je mešana na RT tokom 16 h i obrađena je sa zasićenim NaHC03rastvorom i slanim rastvorom. Prečišćavanje pomoću COMBIFLASH™ hromatografije na 12 g silikatne kolone korišćenjem 12% MeOH u DCM eluentu dalo je proizvod 43 (29% prinos). LCMS [[M+l] = 953.

Jedinjenje 44.U rastvor jedinjenja 43 (4 mg, 4.20 umol) u DMF (0.8 mL) je dodat piperidin (200 uL, 2.020 mmol). Nakon mešanja na RT tokom 15 min, LCMS pokazala je da je reakcija kompletna. Piperidin je uklonjen rotacionom evaporacijom. Reakciona smeša je apsorbovana na silika gelu i prečišćena sa COMBIFLASH™ hromatografijom sa 25-65% MeOH/DCM gradijentom kao eluentom da se dobije jedinjenje 44 (80% prinos). LCMS [M+l] = 731.

Maleimido jedinjenje 45.EDC (2 ekv.) je dodat u rastvor t-butanola (1 ekv), t-butil valina (1.05 ekv) i maleimida (2.11 g, 1.0 Ekv.) u DCM (50 mL) na RT. Nakon lh, smeša je sipana u EtOAc, isprana je sa vodenim rastvorom limunske kiseline, vodenim rastvorom natrijum bikarbonata i slanim rastvorom. Organska faza je osušena i koncentrovana pomoću evaporacije da se ukloni rastvarač. Ostatak je propušten kroz kolonu (EtOAc/heksan 0-80% gradijent) da se dobije 3.02 g ulja. Ovo ulje je rastvoreno u DCM-TFA (3:2; 20 mL) na RT. Nakon 4 h rastvor je evaporisan i osušen pod visokim vakuumom preko noći da se dobije jedinjenje 45 kao bela čvrsta supstanca (2.1 g, 68% prinos). LCMS: (M+l) = 311.

Jedinjenje 46.U rastvor maleimido jedinjenja 45 (3.12 mg, 10.06 umol) i jedinjenja 44 (2.45 mg, 3.35 umol) u DMF (1 mL) je dodat HATU (4.59 mg, 0.012 mmol) praćeno sa DIPEA (5.26 ul, 0.030 mmol). Reakciona smeša je mešana na RT tokom 17h. Prečišćavanje pomoću R-HPLC dalo je proizvod 46 (0.455 mg, 13% prinos). LCMS (m+l = 1023).

Primer 11 - Konjugacija sa anti- mezotelin antitelom

Ovaj primer opisuje konjugaciju jedinjenja (IVe) (obeležen 41) na Slici 9, i (IVf)

(obeleženo 40 na Slici 9) sa anti-mezotelin antitelom.

Monokslonsko anti-mezotelin antitelo 6A4 (Terrett et al., WO 2009/045957 Al), pri koncentraciji od 5.3 mg/mL u 100 mM natrijum fosfatu, 150 mM NaCl, pH 8.0, je tiolovano sa 10-strukim molarnim viškom 2-iminotiolana. Reakcija tiolacije je ostavljena da teče tokom lh na RT uz neprekidno mešanje.

Nakon tiolacije, antitelu 6A4 je izmenjen pufer u konjugacioni pufer (50 mM HEPES, 5 mM glicin, pH 7.0) sa PD10 kolom (Sephadex G-25). Koncentracija tiolovanog antitela je određena UV spektroskopijom na 280 nm. Koncentracija tiola je izmerena korišćenjem ditiodipiridin eseja. 2 mM štok rastvora jedinjenja (IVe) ili (IVf), kao što može biti slučaj, u DMSO je dodat na 1.5-strukom molarnom višku po tiol grupi u antitelu 6A4. DMSO je dodat da se dobije finalna koncentracija od 20% i zatim TWEEN-80™ do finalne koncentracije od 0.1%. Reakciona smeša je mešana tokom 2 h na RT. Nakon ovog konjugacionog koraka, 100 mM N-etilmaleimida (NEM) u DMSO je dodato pri 10-strukom molarnom višku preko tiol grupa i antitelu 6A4 da se kvenčuju neizreagovane tiol grupe. Reakcija kvenčovanja je ostavljena da se odigrava tokom jednog sata na RT sa neprekidnim mešanjem.

Konjugovano antitelo 6A4 je filtrirano kroz 0.2 um filter i zatim podvrgnuto prečišćavanju pomoću katjon-izmenjivačke hromatografije (CEX). SP Sepharose High Performance CEX kolona je regenirisana sa 5 kolonskih zapremina (CVs) puferom od 50 mM HEPES-a, 5 mM glicina, IM NaCl, na pH 7.0. nakon regenerisanja, kolona je ekvilibrisana sa 3 CVs pufera za ekvilibrisanje (50 mM HEPES, 5 mM glicin, pH 7.0). Konjugat antitela 6A4 sa jedinjenj em (IVe) ili (IVf), kao što može biti slučaj, je naliven u kolonu i kolona je isprana jednom sa puferom sa ekvilibrisanje. Konjugat je eluiran sa 50 mM HEPES, 5 mM glicin, 110 mM NaCl, pH 7.0. Eluat je sakupljen u frakcijama. Kolona je zatim regenerisana sa 50 mM HEPES, 5 mM glicin, IM NaCl, pH 7.0, da se uklone proteinski agregati i bilo koje jedinjenje koje nije izreagovalo (IVe) ili (IVf).

Frakcije eluata koje se sastoje od konjugata monomernih antitela su pulovane. Konjugat antitela i razmere supstitucije su određeni merenjem apsorbance na 280 i 560 nm.

Prečišćeni CEX pul eluata konjugata je podvrgnut izmeni pufera u 50 mM HEPES, 5 mM glicin, 100 mM NaCl, 0.01% TWEEN 80™, pH 7.0, pomoću dijalize koristeći 10 MWCO membranu. Posle dijalize, koncentracija konjugata antitela i razmera supstitucije su određeni, merenjem apsorbance na 280 i 560 nm. Karakteristike konjugata koji su dobijeni sumarizovane su u Tabeli 1, ispod:

Primer 12 — Konjugacija sa anti- CD70 antitelom

Ovaj primer opisuje konjugaciju jedinjenja (IVe) i (Ivi) sa anti-CD70 antitelom.

Monoklonsko anti-CD70 antitelo 2H5 (Terrett et al, US 2009/0028872 Al), pri koncentraciji od 5.5 mg/mL u 20 mM natrijum fosfata, 50 mM NaCl, 0.02% TWEEN-80™, pH 7.5, je tiolovano 15-strukim molarnim viškom 2-iminotiolana. Reakcija tiolacije je ostavljena da se odigrava tokom 1 h na RT sa neprekidnim mešanjem.

Nakon tiolacije, antitelo 2H5 je podvrgnuto izmeni pufera u konjugacioni pufer (50 mM HEPES, 5 mM glicin, pH 7.0) preko PD10 kolone (Sephadex G-25). Koncentracija tilovanog antitela je određena pomoću UV spektroskopije na 280 nm. Koncentracija tiola je izmerena korišćenjem ditiodipiridinskog eseja. 2 mM štok rastvor jedinjenja (IVe) ili (IVf), kao što može biti slučaj, u DMSO je dodat pri 1.5-strukom molarnom višku po tiol grupi u antitelu 2H5. DMSO je dodat da se dobije finalna koncentracija od 20% i TWEEN-80™ do finalne koncentracije od 0.1%. Reakcioni medjum je mešan tokom 2 h na RT. Nakon ovog konjugacionog koraka, 100 mM NEM u DMSO je dodato u 10-strukom molarnom višku preko tiol grupa u antitelu 6A4 da se kvenčuju bilo kakve tiol grupe koje nisu izreagovale. Reakcija kvenčovanja je ostavljena da se odigrava tokom 1 h na RT RT sa neprekidnim mešanjem.

Konjugovano antitelo 2H5 je filtrirano kroz 0.2 um filter i zatim podvrgnuto CEX hromatografskom prečišćavanju. SP Sepharose High Performance CEX kolona je regenerisana sa 5 CVs puferom 50 mM HEPES, 5 mM glicina, IM NaCl, pH 7.0. Nakon regenerisanja, kolona je ekvilibrisana sa 3 CVs ekvilibracionog pufera (50 mM HEPES, 5 mM glicin, pH 7.0). Konjugat antitela 2H5 konjugat sa jedinjenjem (IVe) ili (IVf), kao što može biti slučaj, je naliveno na kolonu i kolona je isprana jednom sa ekvilibracionim puferom. Konjugat je eluiran sa 50 mM HEPES, 5 mM glicin, 110 mM NaCl, pH 7.0. Eluat je sakupljen u frakcijama. Kolona je zatim regenerisana sa 50 mM HEPES, 5 mM glicin, IM NaCl, pH 7.0, kad se uklone agregati proteina i bilo kakvo neizregovano jedinjenje (IVe) ili (IVf).

Konjugat koji se sastoji od frakcija je pulovan, pufer je izmenjen, i dijalizovan kao što je opisano u prethodnom primeru. Karakteristike konjugata koji je dobijen su sumarizovane u tabeli 2

Primer 13 - Biološka aktivnost jedinjenja

Antiproliferativna aktivnost jedinjenja predmetnog pronalaska ili njihovih konjugata je ispitana kao što sledi. Humane tumorske ćelijske linije su dobijene iz Američke kolekcije kultura sojeva (American Type Culture Collection - ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, SAD, i kultivisane su prema instrukcijama od ATCC. Ćelije su zasađene u koncentracijama 1.0 x IO<3>ili 1.0 x IO<4>ćelija/bunariću u ploče sa 96 bunarića tokom 3 h za ATP testove ili<3>H timidin testove, redom. 1:3 serijska razblaženja slobodnih (nekonjugovanih) jedinjenja ili njihovih konjugata su dodata u bunariće. Ploče su ostavljene da se inkubiraju tokom 24 do 72 h.<3>H timidin ploče su izložene 1.0 uCi<3>H-timidinu po bunariću tokom poslednja 24 sata ukupnog inkubacionog perioda, sakupljene i očitane na brojaču Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments, Meriden, CT). Nivoi ATP-a u ATP pločama su izmereni korišćenjem seta za merenje viajabilnosti ćelija luminiscencijom - CELLTITER-GLO<®>Luminescent Cell Viability kit praćenjem uputstva proizvođača i očitane su na luminometru GLOMAX<®>20/20 (oba od Promega, Madison,WI, USA). EC50vrednosti - koncentracija pri kojoj agens inhibira ili smanjuje ćelijsku proliferaciju za 50% - određene su korišćenjem PRISM™ softvera, verzija 4.0 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA).

Slika 11a je grafik antiproliferativne aktivnosti jedinjenja (Ha) na HL-60 ćelijama leukemije, kako je izmereno pomoću ATP testa korišćenjem 72 h inkubacionog perioda, u poređenju sa tri referentna jedinjenja: doksorubicin (adriamicin), uncialamicin, i Jedinjenje A, koje je DNK alkilujući agens koje ima sledeću strukturu:

EC50vrednosti izvedene sa Slike 11a su prikazane u Tabeli 3. Potentnost jedinjenja (Ha) je veća od one koju ima sam uncialamicin.

Slika 11b je analogan grafik antiproliferativne aktivnosti na doksorubicin-rezistentnoj ćelijskoj liniji kancera ovarijuma (Adr), takođe koristeći ATP test i 72 h inkubacioni period. Odgovarajuće EC50vrednosti su prikazane u Tabeli 4. Potentnost jedinjenja (Ha) - opet čak veća od one koju ima sam uncialamicin - je vredna pažnje u pogledu gubitka potentnosti doksorubicina i jedinjenja A kada su suočeni sa rezistentnom ćelijskom linijom.

Tabela 5 prikazuje dodatne podatke o antiproliferativnosti za jedinjenje (Ha), u poređenju sa dva druga toksina koja su korišćena u konjugatima: Jedinjenje A i doksorubicin. Metoda testa je ATP metoda. Kancerske ćelijske linije koje su testirane su A2780 (ovarijuma), A549 (pluća), CCRF-CEM (akutne limfoblastne leukemije), COLO205 (kolona), DU4475 (dojke), H2087 (pluća, ne-sitne ćelije), H661 (pluća, krupne ćelije), HCT116 (kolona), LNCaP (prostate), LS174T (kolona), MDA MB468 (dojke), MDA MB231 (dojke), i SET2 (leukemije). Antiproliferativni efekti su prikazani kao IC50vrednosti, tj. koncentracija toksina koja proizvodi 50% inhibitorni efekat.

Slika 12a prikazuje dodatne podatke o antiproliferativnosti, za jedinjenja (Ha), (IIc), (Ud), i (Ile), sa doksorubicinom kao jedinjenjem za poređenje, na ćelijama kancera bubrega 786-0. EC50vrednosti koje su izvedene sa Slike 12a su obezbeđene u Tabeli 6. ATP test je korišćen, sa periodom inkubacije od 72h.

Slika 12b je sličan antiproliferative grafik, ali na ćelijama kancera pluća. Izvedene EC50vrednosti su obezbeđene u Tabeli 7. ATP test je korišćen, sa periodom inkubacije od 72h.

Primer 14 - Biološka aktivnost konjugata

Koristeći iste metode za testiranje kao iznad, antiproliferativna aktivnost konjugata nastalih od jedinjenja pronalaska je izmerena.

Slika 13a prikazuje antiproliferativnu aktivnost na 786-0 ćelijama korišćenjem testa ugradnje<3>H timidina (72 h inkubacija), od 4 konjugata nastalih od jedinjenja predmetnog pronalaska: (a) konjugat antitela 2H5 (anti-CD70, Terrett et al., US 2009/0028872 Al) sa jedinjenjem (IVf), (b) konjugat antitela 6A4 (anti-mezotelin, Terrett et al., WO 2009/045957 Al) sa jedinjenjem (IVf), (c) konjugat antitela 2H5 sa jedinjenjem (IVe), i (d) konjugat antitela sa jedinjenjem (IVe). Na Slici 13a (i takođe na narednim Slikama 13b i 13c), vrednosti na X-osi za „koncentraciju toksina" su prilagođene za razmeru supstitucije (substitution ratio - SR) - to jest, vrednosti su jednake molarnoj koncentraciji konjugata puta SR. Vrednosti ECso izvedene sa grafika na slici 13a su prikazane u Tabeli 8.

Slika 13b prikazuje antiproliferativnu aktivnost četiri ista konjugata na ćelijama. Izvedene ECso vrednosti su prikazane u Tabeli 9.

Slika 13c je još jedan grafik antiproliferativne aktivnosti konjugata 2H5-(IVf) i 6A4-(IVf) na H226 ćelijama, ali merene korišćenjem ATP testa, sa periodom inkubacije od 72h. Izvedene ECso vrednosti bile su 6.630 ai 0.1548 nM, redom.

Prethodno pomenuti detaljan opis predmetnog pronalaska obuhvata delove koji su prvenstveno ili isključivo vezani za posebne delove ili aspekte predmetnog pronalaska. Treba razumeti daje to zbog jasnoće i upotrebljivosti, da posebno svojstvo može biti relevantno u više od jednog dela u kome je stavljeno na uvid javnosti, i da ova objava uključuje sve odgovarajuće kombinacije informacija koje su nađene u različitim delovima. Slično, iako se razne slike i opisi odnose na specifična rešenja predmetnog pronalaska, treba razumeti daje specifično svojstvo stavljeno na uvid javnosti u kontekstu posebne slike ili rešenja, pri čemu takvo svojstvo takođe može biti korišćeno, dokle je to odgovarajuće, u kontekstu druge slike ili rešenja, u kombinaciji sa drugim svojstvom, ili u predmetnom pronalasku, uopšte.

Dalje, dok je predmetni pronalazak posebno opisan u smislu određenih poželjnih rešenja, predmetni pronalazak nije ograničen na takva poželjna rešenja. Poželjno, obim predmetnog pronalaska je defenisan patentnim zahtevima u prilogu.

REFERENCE

Kompletna navođenja za sledeće reference koje su pominjane u skraćenoj verziji po prvom autoru (ili pronalazaču) i datumu ranije u ovoj specifikaciji prikazana su ispod. Svaka od ovih referenci je uključena ovde pomoću reference za sve svrhe.

Davies et al., Org. Lett. 2005, 7 (23), 5233-5236.

Davies et al., WO 2007/038868 A2 (2007).

Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869.

Nicolaou et al., Ang. Chem. 2007, 119,4788-4791 [2007a].

Nicolaou et al., Ang. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 4704-4707 [2007b].

Nicolaou et al., Ang. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 185-189.

Shao, Curr. Mol. Pharmacology 2008, 1, 50-60.

Claims (13)

1. Jedinjenje koje ima strukturu predstavljenu formulom (I) gde R° je NHR<la>, NHC(=0)OR<lb>, NHC(=0)NHRlb,OC(=0)NHR<lb>, (CH2)i-4NHRla,F, Cl, Br, OR<la>, ili SR<lb>; R<la>je H, Ci-Ce alkil, (CH2)nNH2, C(=0)(CH2)nNH2, C(=0)CHR<8>NH2, ili C(=0)R<9>NH2; Rlb je H, Ci-C6 alkil, (CH2)nNH2, R2 je H, R<10>, C(=0)R<10>, ili C(=0)OR10; R<3>je H ili nesupstituisani ili supstituisani Ci-Cć alkil; R<4>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR<10>, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, iliNHC(=0)R<10>; R<5>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR10, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, ili NHC(=0)R<10>; R<6>je H ili nesupstituisani ili supstituisani Ci-Cć alkil; ili R<5>i R<6>se kombinuju da formiraju =0; R<7>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR1<0>, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb; OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, ili NHC(=0)R10; R<8>je ostatak bočnog lanca a-amino kiseline odabrane od grupe koja se sastoji od alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, y-karboksiglutaminska kiselina, citrulin, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, norleucin, norvalin, ornitin, fenilalanin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin; R<9>je nesupstituisan ili supstitusan arilen, nesupstituisan ili supstitusan heteroarilen, nesupstituisan ili supstitusan alkilarilen, nesupstituisan ili supstitusan cikloalkilen ili nesupstituisan ili supstitusan heterocikloalkilen; svako R<10>je nezavisno nesupstituisan ili supstitusan Ci- Ce alkil, nesupstituisan ili supstitusan cikloalkil, nesupstituisan ili supstitusan heterocikloalkil, nesupstituisan ili supstitusan arilalkil, nesupstituisan ili supstitusan aril; ili nesupstituisan ili supstitusan heteroaril; gde supstituenti supstituisanih delova su nezavisno jedan od drugog odabrani od alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril, cikloalifatik, heterocikloalifatik, halo, haloalkil, hidroksil, hidroksialkil, cijano, nitro, alkoksi, -O(hidroksialkil), -O(haloalkil), -O(cikloalkil), - O(heterocikloalkil), -O(aril), alkiltio, ariltio, =0, =NH, =N(alkil), =NOH, =NO(alkil), - C(=0)(alkil), -C(=0)H, -CO2H, -C(=0)NHOH, -C(=0)0(alkil), -C(=0)0(hidroksialkil), - C(=0)NH2, -C(=0)NH(alkil), -C(=0)N(alkil)2, -OC(=0)(alkil), -OC(=0)(hidroksialkil), - OC(=0)0(alkil), -OC(=0)0(hidroksialkil), -OC(=0)NH2, -OC(=0)NH(alkil), - OC(=0)N(alkil)2, azido, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), -NH(hidroksialkil), - NHC(=0)(alkil), -NHC(=0)H, -NHC(=0)NH2, -NHC(=0)NH(alkil), -NHC(=0)N(alkil)2, - NHC(=NH)NH2, -OS02(alkil), -SH, -S(alkil), -S(aril), -S(cikloalkil), -S(=0)alkil, -S02(alkil), -S02NH2, -S02NH(alkil), i -S02N(alkil)2; i nje 2, 3, 4, 5, ili 6; ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

2. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, koje ima strukturu predstavljenu formulom (la):

3. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 1, koje ima strukturu predstavljenu formulom (lb):

4. Jedinjenje u skladu sa patentnim zahtevom 3, gde R<la>je odabrano od grupe koja se sastoji od H, Me,

5. Konjugat, koji ima strukturu predstavljenu formulom (III) gde Z je ciljajući deo; XD je prvi deo koji razdvaja; Xz je drugi deo koji razdvaja; C je cepljiva grupa (grupa koja se čepa); indeksi a i b su nezavisno 0 ili 1; indeks m je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10; i D je odabrano iz grupe koja se sastoji od gde R2 je H, R<10>, C(=0)R<10>, ili C(=0)OR10; R<3>je H ili nesupstituisan ili supstituisan Ci-Cć alkil; R<4>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR<10>, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, ili NHC(=0)R10; R<5>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR10, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, iliNHC(=0)R<10>; R<6>je H ili nesupstituisan ili supstituisan Ci- Cs alkil; ili R<5>i R<6>kombinuju se da formiraju =0; R<7>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR10, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, iliNHC(=0)R<10>; R<8>je bočni lanac ostatka a-amino kiseline odabran od grupe koja se sastoji od alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, y-karboksiglutaminska kiselina, citrulin, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, norleucin, norvalin, ornitin, fenilalanin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin; R<9>je nesupstituisan ili supstituisan arilen, nesupstituisan ili supstituisan heteroarilen, nesupstituisan ili supstituisan alkilarilen, nesupstituisan ili supstituisan cikloalkilen ili nesupstituisan ili supstituisan heterocikloalkilen; svako R<10>je nezavisno nesupstituisan ili supstituisan Ci-Cć alkil, nesupstituisan ili supstituisan cikloalkil, nesupstituisan ili supstituisan heterocikloalkil, nesupstituisan ili supstituisan arilalkil, nesupstituisan ili supstituisan aril; ili nesupstituisan ili supstituisan heteroaril; R12jeCi-C6 alkil; gde supstituenti supstituisanih delova su nezavisno jedan od drugog odabrani od alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril, cikloalifatik, heterocikloalifatik, halo, haloalkil, hidroksil, hidroksialkil, cijano, nitro, alkoksi, -O(hidroksialkil), -O(haloalkil), -O(cikloalkil), - O(heterocikloalkil), -O(aril), alkiltio, ariltio, =0, =NH, =N(alkil), =NOH, =NO(alkil), - C(=0)(alkil), -C(=0)H, -CO2H, -C(=0)NHOH, -C(=0)0(alkil), -C(=0)0(hidroksialkil), - C(=0)NH2, -C(=0)NH(alkil), -C(=0)N(alkil)2, -OC(=0)(alkil), -OC(=0)(hidroksialkil), - OC(=0)0(alkil), -OC(=0)0(hidroksialkil), -OC(=0)NH2, -OC(=0)NH(alkil), OC(=0)N(alkil)2, azido, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), -NH(hidroksialkil), - NHC(=0)(alkil), -NHC(=0)H, -NHC(=0)NH2, -NHC(=0)NH(alkil), -NHC(=0)N(alkil)2, - NHC(=NH)NH2, -OS02(alkil), -SH, -S(alkil), -S(aril), -S(cikloalkil), -S(=0)alkil, -S02(alkil), -S02NH2, -S02NH(alkil), i -S02N(alkil)2; i nje 2, 3,4, 5, ili 6.

6. Kompozicija koja ima strukturu u skladu sa formulom (IV) gde R<31>je reaktivna funkcionalna grupa; XD je prvi deo koji razdvaja; Xz je drugi deo koji razdvaja; C je cepljiva grupa; indeksi a i b su nezavisno 0 ili 1; indeks m je 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10; i D je odabrano od grupe koja se sastoji od gde R<2>je H, R<10>, C(=0)R<10>, ili C(=0)OR10; R<3>je H ili nesupstituisani ili supstituisani Ci-Ce alkil; R<4>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR10, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, iliNHC(=0)R<10>; R<5>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR10, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, ili NHC(=0)R10; R<6>je H ili nesupstituisan ili supstituisan Ci-Cć alkil; ili R<3>i R<6>koji se kombinuju da formiraju =0; R<7>je OH, SH, NH2, OR<10>, SR<10>, NHR10, N(R<10>)2, NHC(=0)OR<10>, OC(=0)NHRlb, OC(=0)R<10>, SC(=0)R<10>, ili NHC(=0)R<10>; R<8>je ostatak bočnog lanca a-amino kiseline odabrane od grupe koja se sastoji od alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, y-karboksiglutaminska kiselina, citrulin, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, norleucin, norvalin, ornitin, fenilalanin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin; R<9>je nesupstituisan ili supstituisan arilen, nesupstituisan ili supstituisan heteroarilen, nesupstituisan ili supstituisan alkilarilen, nesupstituisan ili supstituisan cikloalkilen ili nesupstituisan ili supstituisan heterocikloalkilen; svaki R<10>je nezavisno nesupstituisan ili supstituisan Ci-Cć alkil, nesupstituisan ili supstituisan cikloalkil, nesupstituisan ili supstituisan heterocikloalkil, nesupstituisan ili supstituisan arilalkil, nesupstituisan ili supstituisan aril; ili nesupstituisan ili supstituisan heteroaril; R<12>is Ci-Ce alkil; gde su susptituenti suptituisanih delova nezavisno jedan od drugog izabrani od alkil, alkenil, alkinil, aril, heteroaril, cikloalifatik, heterocikloalifatik, halo, haloalkil, hidroksil, hidroksialkil, cijano, nitro, alkoksi, -O(hidroksialkil), -O(haloalkil), -O(cikloalkil), - O(heterocikloalkil), -O(aril), alkiltio, ariltio, =0, =NH, =N(alkil), =NOH, =NO(alkil), - C(=0)(alkil), -C(=0)H, -CO2H, -C(=0)NHOH, -C(=0)0(alkil), -C(=0)0(hidroksialkil), - C(=0)NH2, -C(=0)NH(alkil), -C(=0)N(alkil)2, -OC(=0)(alkil), -OC(=0)(hidroksialkil), - OC(=0)0(alkil), -OC(=0)0(hidroksialkil), -OC(=0)NH2, -OC(=0)NH(alkil), OC(=0)N(alkil)2, azido, -NH2, -NH(alkil), -N(alkil)2, -NH(aril), -NH(hidroksialkil), - NHC(=0)(alkil), -NHC(=0)H, -NHC(=0)NH2, -NHC(=0)NH(alkil), -NHC(=0)N(alkil)2, - NHC(=NH)NH2, -OS02(alkil), -SH, -S(alkil), -S(aril), -S(cikloalkil), -S(=0)alkil, -S02(alkil), -S02NH2, -S02NH(alkil), and -S02N(alkil)2; i nje 2, 3, 4, 5, ili 6.

7. Kompozicija prema patentnom zahtevu 6, gde R<31>je -NH2, -OH, -C02H, -SH, maleimido, ciklooktin, azido, hidroksilamino, ili N-hidroksisukcinimido.

8. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 ili konjugat prema patentnom zahtevu 5 za primenu u metodi za lečenje kancera kod subjekta koji je oboleo od takvog kancera.

9. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 za primenu u metodi za lečenje kancera prema patentnom zahtevu 8, gde je jedinjenje konjgovano za ciljajući deo koji je antitelo.

10. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 za primenu u metodi za lečenje kancera prema patentnom zahtevu 9, gde se antitelo vezuje za antigen koji je prekomerno eksprimiran ili jedinstveno eksprimiran pomoću kancera.

11. Kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 ili konjugat prema patentnom zahtevu 5 za primenu u metodi za lečenje kancera prema patentnom zahtevu 8, gde je kancer odabran iz grupe koja se sastoji od leukemije, kancera bubrega, kancera ovarijuma, kancera pluća, kancera debelog creva, kancera dojke, i kancera prostate.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat prema patentnom zahtevu 5 farmaceutski prihvatljiv nosač.