RS55822B1 - Terapijski peptidi - Google Patents

Terapijski peptidi

Info

Publication number
RS55822B1
RS55822B1 RS20170344A RSP20170344A RS55822B1 RS 55822 B1 RS55822 B1 RS 55822B1 RS 20170344 A RS20170344 A RS 20170344A RS P20170344 A RSP20170344 A RS P20170344A RS 55822 B1 RS55822 B1 RS 55822B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
antibody
set forth
amino acid
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20170344A
Other languages
English (en)
Inventor
Kai W Wucherpfennig
Bettina Franz
Kenneth May Jr
Glenn Dranoff
F Stephen Hodi
Christopher Harvey
Original Assignee
Dana-Farber Cancer Institute Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dana-Farber Cancer Institute Inc filed Critical Dana-Farber Cancer Institute Inc
Publication of RS55822B1 publication Critical patent/RS55822B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
    • A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
    • A61K49/10—Organic compounds
    • A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
    • A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Gram-positive bacteria
    • C07K16/1282—Clostridium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/325—Carbamic acids; Thiocarbamic acids; Anhydrides or salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAKODNOSI
[0001]Ovaj pronalazak se odnosi na terapijske kompozicije u vezi sa humanim subjektima.
STANJE TEHNIKE
[0002]U oblasti su poznati humani subjekti koji kada su izloženi stanju ili bolesti pružaju izvor antitela sa terapijskim potencijalom i opšte metode za dobijanje takvih antitela. Međutim, metode za specifično dobijanje antitela sa terapijskim potencijalom su generalno ograničene niskom učestalošću, niskom stopom proliferacije, i niskim nivoima lučenja antitela B ćelija koje eksprimiraju takva antitela. Na primer, memorijske B ćelije sa definisanom specifičnošću tipično su odgovorne samo za jednu ćeliju na milion monojedarnih ćelija periferne krvi ili približno jedan mililitar krvi (Lanzavecchia et al., Curr. Opin. Immunol., 21:298-304 (2009): Yoshida et al., Immunol. Rev., 237:117-139 (2010)). Učestalost antitela sa terapijskim potencijalom jc verovatno čak niža kod pacijenata obolelih od kancera, koji zahtevaju postojanje novih pristupa koji omogućavaju izolaciju takvih ćelija sa visokom senzitivnošću i efikasnošću.
[0003]Konvencionalne metode se generalno oslanjaju na konverziju memorijskih B ćelija u ćelije koje sekretuju antitela pomoću in vitro kulture i/ili primene imunizovanih animalnih modela (npr, miševi) (Crotty et al., J. Immunol, 171:4969-4973 (2003): Fecteau et al., Immunologv, 128:e353-e365 (2009): Buisman et al, Vaccine, 28:179-186 (2009): Corti et al., PLoS One, 5:e8805 (2010)). Na primer, nakon in vitro kulture do jedne nedelje, antitela mogu biti merena u supernatantu kulture i učestalosti ćelija koje sekretuju antitela korišćenjem enzim-vezanog imunosorbent testa (enzvme-linked immunosorbent spot - EL1SPOT). Saopštena su ograničenja takvih metoda (Henn et al., J. Immunol., 183:31777-3187 (2009): Cao et al, J. Immunol., Metode, 358:56-65 (2010)). Na primer, in vitro kultura B memorijskih ćelija menja fenotip B ćelija da liče na plazma ćelija sa posebnim funkcionalnim karakteristikama (Jiang et al., Eur. J. Immunol., 37:2205-2213 (2007): Huggins et al., Blood, 109:1611-1619 (2007): Jourdan et al, Blood, 114:5173-5181 (2009)). Ograničenja za fluorescentne metode bazirane na antigenima su takođe saopštene (Hofer et al., Immunol. Rev., 211:295-302 (2006): Odendahl et al., Blood, 105:1614-1621 (2005);
Kunkel et al., Nat. Rev. Immunol., 3:822-829 (2003): Scheid et al, Nature, 458:636-640
(2009): Wu et al, Science, 329:856-861 (2010)).
[0004]Potrebne su poboljšane metode za specifično dobijanje ili ciljanje antitela sa terapijskim potencijalom.
[0005]MICA je ligand za NKG2D, lcktinu-sličan C-tipa, transmcmbranski rcccptor tipa II eksprimiran na većini humanih NK ćelija, y5 T ćelija, i CD8<+>T ćelija. Nakon ligacije, NKG2D signalizira kroz adaptorski protein DAP 10 da izazove citolizu zavisnu od perforina i da obezbedi ko-stimulaciju. Kod ljudi, NKG2D ligandi uključuju protein A povezan sa lancem MHC klase I (MICA), blisko povezane MICB, UL-16 vezujuće proteine (ULBP) 1-4, i RAE-1G Dok NKG2D ligandi obično nisu nađeni na zdravim tkivima, različiti oblici ćelijskog stresa, uključujući DNK oštećenja, mogu da pospeše ekspresiju liganada, rezultujući u njihovoj učestaloj detekciji u multiplim čvrstim i hematološkim malignitetima, uključujući melanom. NKG2D aktivacija putem ligand pozitivnih transformisanih ćelija doprinosi spoljašnjem suzbijanju tumora, pošto su miševi kojima nedostaje NKG2D i koji su wild type (divljeg tipa) tretirani sa anti-NKG2D blokirajućim antitelima pokazali pojačanu tumorsku osetljivost. Izbegavanje imunog odgovora može biti postignuto kod pacijenata, međutim, uklanjanjem NKG2D liganada iz tumorskih ćelija, što aktivira internalizaciju površinskog NKG2D i smanjenu funkciju citotoksičnih limfocita. Solubilni NKG2D ligandi mogu takođe da stimulišu ekspanziju regulatornih NKG2D+CD4+Foxp3- T ćelija koje mogu antagonizovati antitumorsku citotoksičnost preko Fas liganda, IL-10, i TGF-|3. MICA je NKG2D ligand uklonjen iz tumorskih ćelija, tj. oslobođen sa površine ćelije u okolni medijum, i serumi pacijenata sa kancerom tipično sadrže povišene nivoe solubilnog oblika (sMICA). MICA uklanjanje je postignuto delom preko interakcija sa proteinskom disulfidnom izomerazom ERp5, koja formira disulfidnu vezu sa kritičnim cisteinom što rezultuje u odvijanju a3 domena, čineći ih podložnim proteolizi pomoću ADAM-10/17 i MMP14. MICA polipeptidi koji se vezuju za MICA su opisani u WO 03/089616.
[0006]Angiogeneza je proces formiranja novih kapilara od postojećih kivnih sudova i pokazala se kao kritični deo tumorskog rasta i diseminacije. Tumori stimulišu angiogenezu da bi se zadovoljile povećane potrebe za kiseonikom i nutrijentima koje prevazilaze one koje mogu biti zadovoljene samo difuzijom. Stoga, tumori angažuju, remodeluju i proširuju postojeće krvne sudove da zadovolje njihove metaboličke zahteve. Zavisnost rastućih tumora i formiranja novih krvnih sudova je načinilo angiogenezu atraktivnom metom za antikancerske terapije. Veruje se da su mnogi citokini igrali ulogu u regulaciji angiogeneze. uključujući članove familije vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) i angiopoetine. Angiopoetini su otkriveni kao ligandi za "Tie", familiju tirozin kinaza koja je selektivno eksprimirana u vaskularnom endotelijumu. Postoje četiri poznata angiopoetina: angiopoetin-1 ("Ang-1") preko angiopoetina-4 ("Ang-4"). Studije su ukazale na to da angiopoetini (npr., Ang-1 i Ang-2) mogu biti uključeni u tumorska angiogenezu. Sa ovim formiranjem angiopoetini su iđentifikovani kao potencijalne mete kancerske terapije bazirane na imonološko odogovoru.
[0007]Postoji potreba da se identifikuju novi agensi koji specifično prepoznaju i vezuju mete kancerske terapije bazirane na imonološko odogovoru, kao što su MICA i angiopoetini. Takvi agensi bi bili korisni za dijagnostički skrining i terapijske intervencije u stanjima bolesti koje su povezane sa razvojem tumora.
REZIME
[0008]Kompozicije i metode koje se odnose na antitela sa terapijskim potencijalom su opisane ovde.
[0009]Predmetni pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže antitelo ili fragment antitela koji se imunospecifično vezuje za sekvencu A specifičnu za polipeptid MHC klase I (MICA), ili epitop na istom. Pomenuto antitelo ili fragment antitela sadrži varijabilni region teškog lanca (Vii) i varijabilni region lakog lanca (Vl) i region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 Vhnavedenog u sekvenci sa identifikacionim brojem - SEQ ID NO:212 od antitela čiji je ID 9; ili i region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 Vhkoji je naveden u SEQ ID NO: 158 od antitela čiji je 6. Dalje, kompozicije koje su opisane ovde sadrže peptide koji obuhvataju region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 od Vhod antitela čiji su ID 1, 6, 7, 8 ili 9 koji su navedeni u Tabeli 1, koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, i CDR3 Vodlantitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija. Takvi pcptidi mogu dalje da obuhvate region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 od Vhod antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 koji su prikazani u Tabeli 1, i CDR3 od Vlod antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 prikazanih u Tabeli 1. Peptidi opisani ovde mogu dalje da obuhvate CDR2 od Vhantitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 prikazanih u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, ili CDR2 od Vlod antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 prikazanih u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, ili oba. Takvi peptidi mogu da obuhvate region koji određuje komplementarnost CDR2 od Vhod antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 prikazanih u Tabeli 1, ili CDR2 od Vl od antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 prikazanih u Tabeli 1, ili oba. Peptidi opisani ovde mogu dalje da obuhvate CDR1 od Vhod antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 prikazanih u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, ili CDR1 od Vlod antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 prikazanih u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, ili oba. Takvi peptidi mogu da obuhvate region koji određuje komplementarnost CDR1 od Vhod antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 prikazanih u Tabeli 1, ili CDR1 od Vl od antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 prikazanih u Tabeli 1, ili oba.
[0010] Peptidi opisani ovde mogu biti antitela ili fragmenti antitela koji uključuju: Vhlanac koj je identičan sa SEQ ID NO:2, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vhod antitela čiji je ID 1 prikazanih u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, i regioni u okviru SEQ ID NO:2 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti kao FR1, FR2, FR3, FR4 od Vhod antitela čiji je ID 1 koji su prikazani u Tabeli 1; i Vl lanac koji je identičan saSEQ ID NO: 11, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR.1, CDR2, i CDR3 od Vlod antitela čiji je ID 1 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, i regioni u okviru SEQ ID NO: 11 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%>, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vlod antitela čiji je ID 1 koji su prikazani u Tabeli 1. Peptidi opisani ovde mogu da uključe antitelo ili fragment antitela koji sadrži Vhlanac koji sadrži SEQ ID NO:2 i Vllanac koji sadrži SEQ I D NO:l 1. Pored peptidima, kompozicije opisane ovde mogu dalje da uključe jedan ili više (npr., 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili manje od 20) anti-kancerskih terapeutika. Kompozicije opisane ovde mogu biti formulisane kao farmaceutske (npr., za administriranje subjektu).
[0011] Peptidi opisani ovde mogu biti antitela ili fragmenti antitela koja uključuju: Vhlanac sa identičnošću sa SEQ ID NO: 149, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vhod antitela čiji je ID 6 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru regiona CDR1, CDR2, i CDR3, i regione u okviru SEQ ID NO:149 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vhod antitela čiji je ID 6 koji su prikazani u Tabeli 1; i Vllanac koji je identičan saSEQ ID NO: 151, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vlantitela čiji je ID 6 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:151 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%,, 96%,, 97%, 98, 99%,, ili 100%, identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vl od antitela čiji je ID 6 prikazanih u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili fragment antitela koristan u predmetnom pronalasku sadrži Vhlanac koji sadrži SEQ I D NO: 149 i Vllanac koji sadrži SEQ ID NO:151. U nekim aspektima, pored antitela ili fragmenta antitela, kompozicije dalje obuhvataju jedan ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili manje od 20) antikancerskih terapeutika. U nekim aspektima, kompozicije su formulisane kao farmaceutske kompozicije (npr., za administriranje subjektu).
[0012]Peptidi opisani ovde mogu biti antitela ili fragmenti antitela koji uključuju: Vhlanac koji je identičan sa SEQ TD NO: 168, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vhantitela čiji je ID 7 prikazanih u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO: 168 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%,, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vhantitela čiji je 7 prikazanih u Tabeli 1; i Vllanac koji je identičan sa SEQ ID NO: 170, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 Vlantitela čiji je 7 prikazanih u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO: 170 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vlantitela čiji je ID 7 prikazanih u Tabeli 1. Peptidi opisani ovde mogu da obuhvate antitelo ili fragment antitela koji sadrži Vhlanac koji sadrži SEQ ID NO: 168 i Vllanac koji sadrži SEQ ID NO: 170. Kao dodatak peptidima, kompozicije opisane ovde mogu dalje da uključe jedan ili više (npr., 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili manje od 20) antikancerskih terapeutika. Kompozicije opisane ovde mogu biti formulisane kao farmaceutske kompozicije (npr., za administriranje subjektu).
[0013]Peptidi opisani ovde mogu biti antitela ili fragmenti antitela koji uključuju: Vhlanac koji je identičan sa SEQ ID NO: 186, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vhantitela čiji je ID 8 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:186 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 Vhantitela čiji je ID 8 koji su prikazani u Tabeli 1; i Vllanac koji je identičan sa SEQ ID NO: 188, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vlantitela čiji je ID 8 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO: 188 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vlantitela čiji je ID 8 koji su prikazani u Tabeli 1. Peptidi opisani ovde mogu da uključe antitelo ili fragment antitela koji sadrži Vhlanac koji sadrži SEQ ID NO: 186 i Vllanac koji sadrži SEQ ID NO: 188. Pored peptida, kompozicije opisane ovde mogu dalje da uključe jedan ili više (npr., 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili manje od 20) anti-kancerskih terapeutika. Kompozicije opisane ovde mogu biti formulisane kao farmaceutske kompozicije (npr., za administriranje subjektu).
[0014]Peptidi opisani ovde mogu biti antitela ili fragmenti antitela koji uključuju: Vhlanac koji je dientičan sa SEQ ID NO:204 gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vhantitela čiji je ID 9 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:204 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%,, 85%, 90%, 95%,, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 Vhantitela čiji je ID 9 koji su prikazani u Tabeli 1; i Vllanac koji je identičan sa SEQ ID NO:206, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 Vl antitela čiji je ID 9 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:206 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vl antitela čiji je ID 9 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim aspektima, antitelo ili fragment antitela korisno u predmetnom pronalasku sadrži Vhlanac koji sadrži SEQ ID NO:204 i Vllanac koji sadrži SEQ ID NO:206. U nekim aspektima, pored antitela ili fragmenta antitela, kompozicije dalje obuhvataju jedan ili više (npr., 1 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili manje od 20) anti-kancerskih terapeutika. U nekim aspektima, kompozicije su formulisane kao farmaceutske kompozicije (npr., za administriranje subjektu).
[0015] Dalje, kompozicije su opisane ovde da uključuju jedan ili više peptida koji vezuju angiopoetin ili epitop na istom. Peptidi kompozicija opisani ovde mogu da uključuju region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 na Vh antitela čiji je ID 2, 3, 4, 5 ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, i CDR3 na Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4 5 ili 10 prikazanih u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona. Peptidi opisani ovde mogu da uključe region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 na Vhantitela čiji je ID 2, 3, 4 ili 5 ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1, i CDR3 na Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4 ili 5 ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, ili CDR2 na Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4 ili 5 ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, ili oba. Takvi peptidi mogu da uključe region koji određuje komplementarnost CDR2 Vh antitela čiji je ID 2, 3, 4 ili 5 ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1, ili CDR2 na Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4 ili 5 ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1, ili oba. Peptidi opisani ovde mogu dalje da uključe CDR1 na Vhantitela čiji je ID 2, 3, 4 ili 5 ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, ili CDR1 na Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4, ili 5 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, ili oba. Takvi peptidi mogu da uključe region koji određuje komplementarnost CDR1 na Vh antitela čiji je ID 2, 3, 4 ili 5 ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1, ili CDR1 na Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4 ili 5 ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1, ili oba.
[0016] Peptidi opisani ovde mogu da obuhvate antitelo ili fragment antitela koji sadrži: Vhlanac koji je identičan sa SEQ ID NO:20, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vhantitela čiji je ID 2 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:20 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%», ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 Vhantitela čiji je ID 2 koji su prikazani u Tabeli 1; i Vllanac koji je identičan sa SEQ ID NO:29, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 Vlantitela čiji je ID 2 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzen'ativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:29 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 Vlantitela čiji je ID 2 koji su prikazani u Tabeli 1. Peptidi opisani ovde mogu da obuhvate antitelo ili fragment antitela koji sadrži Vhlanac koji sadrži SEQ ID NO:20 i Vllanac koji sadrži SEQ ID NO:29.
[0017]Peptidi opisani ovde mogu biti antitela ili fragmenti antitela koji sadrže: Vi-i lanac koji je identičan sa SEQ ID NO:38, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 Vhantitela čiji je ID 3 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:38 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vhantitela čiji je ID 3 koji su prikazani u Tabeli 1; i Vllanac koji je identičan sa SEQ ID NO:47, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 Vlantitela čiji je ID 3 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:47 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vlantitela čiji je ID 3 koji su prikazani u Tabeli 1. Peptidi opisani ovde mogu da obuhvate antitelo ili fragment antitela koji sadrže Vh lanac koji sadrži SEQ ID NO:38 i Vllanac koji sadrži SEQ ID NO:47.
[0018]Peptidi opisani ovde mogu da uključe antitelo ili fragment antitela koji sadrži: Vhlanac koji je identičan sa SEQ ID NO:56, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vhantitela čiji je ID 4 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:56 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vhantitela čiji je ID 4 koji su prikazani u Tabeli 1; i Vllanac koji je identičan sa SEQ ID NO:65, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 Vlantitela čiji je ID 4 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:65 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 Vl antitela čiji je ID 4 koji su prikazani u Tabeli 1. Peptidi opisani ovde mogu da uključe antitelo ili fragment antitela koji sadrže Vhlanac koji sadrži SEQ ID NO:56 i Vllanac koji sadrži SEQ ID NO:65.
[0019]Peptidi opisani ovde mogu da uključe antitelo ili fragment antitela koji sadrži: Vhlanac koji je identičan sa SEQ ID NO:74, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vhantitela čiji je ID 5 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:74 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 Vhantitela čiji je ID 5 koji su prikazani u Tabeli 1; i Vllanac koji je identičan sa SEQ ID NO:83, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vl antitela čiji je ID 5 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:83 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,, 98, 99%, ili 100 % identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vlantitela čiji je ID 5 koji su prikazani u Tabeli 1. Peptidi opisani ovde mogu da uključe antitelo ili fragment antitela koji sadrže Vhlanac koji sadrži SEQ ID NO:74 i sve lance koji sadrže SEQ ID NO:83. Peptidi opisani ovde mogu imunospecifično da se vežu najmanje za najmanje angiopoetin-2. Kompozicije opisane ovde mogu dalje da obuhvate jedan ili više anti-kancerskih terapeutika. Kompozicije opisane ovde mogu biti formulisane kao farmaceutske kompozicije.
[0020]Peptidi opisani ovde mogu da uključe antitelo ili fragment antitela koji sadrži: Vhlanac koji je identičan sa SEQ ID NO:222, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 od Vhantitela čiji je ID 10 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:222 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%>, 85%, 90%, 95%, 96%>, 97%, 98, 99%, ili 100% identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vh antitela čiji je ID 10 koji su prikazani u Tabeli 1; i Vllanac koji je identičan sa SEQ ID NO:224, gde regioni koji odgovaraju regionima CDR1, CDR2, i CDR3 sadrže CDR1, CDR2, i CDR3 Vlantitela čiji je ID 10 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u okviru CDR1, CDR2, i CDR3 regiona, i regioni u okviru SEQ ID NO:224 koji odgovaraju FR1, FR2, FR3, FR4, sadrže amino kiselinske sekvence sa najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, 99%, ili 100%> identičnosti sa FR1, FR2, FR3, FR4 od Vl antitela čiji je ID 10 koji su prikazani u Tabeli 1. Peptidi opisani ovde mogu da uključe antitelo ili fragment antitela koji sadrži Vhlanac koji sadrži SEQ ID NO:222 i Vllanac koji sadrži SEQ ID NO:224. Peptidi opisani ovde mogu imunospecifično da se vežu sa najmanje angiopoetin-2. Kompozicije opisane ovde mogu dalje da uključe jedan ili više anti-kancerskih terapeutika. Kompozicije opisane ovde mogu biti formulisane kao farmaceustka kompozicija.
[0021] Dalje, metode za lečenje kancera kod subjekta su opisane ovde. Metode mogu da obuhvate administriranje subjektu kompozicije koja je ovde opisana.
[0022] Takođe su ovde opisane metode izolovanja humanih antitela iz kancerskih pacijenata nakon imunoterapije.
[0023] Metoda za dobijanje imunih ćelija usmerena protiv sopstvenog antigena iz subjekta je ovde opisana, metoda koja sadrži identifikovanje subjekta koji ispoljava pozitivni imuni odgovor prema sopstvenom antigenu, obezbeđujući multimerni oblik sopstvenog antigena, dovodeći u kontakt multimerni oblik sopstvenog antigena sa uzorkom subjekta koji pokazuje pozitivni imuni odgovor na sopstveni antigen, i dobijajući imunske ćelije vezane za multimerni oblik sopstvenog antigena.
[0024] U nekim rešenjima, predmetna objava uključuje metodu za dobijanje imunskih ćelija iz kancerskog pacijenta usmerenih na sopstveni antigen, pri čemu metoda sadrži identifikovanje subjekta koji ispoljava imuni odgovor na sopstveni antigen; obezbeđujući multimerni oblik sopstvenog antigena; kontaktom multimernog oblika sopstvenog antigena sa uzorkom subjekta koji ispoljava pozitivni imuni odgovor prema sopstvenog antigenu, obezbeđujući multimerni oblik sopstvenog antigena, dovodeći u vezu multimerni oblik sopstvenog antigena sa uzorkom subjekta koji pokazuje pozitivni imuni odgovor na sopstveni antigen, i dobijajući imune ćelije vezane za multimerni oblik sopstvenog antigena.
[0025] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini ovde korišćeni imaju isto značenje kao oni koje obično razmeju prosečni poznavaoci oblasti kojima ovaj pronalazak pripada. Metode i materijali opisani ovde za primenu u predmetnom pronalasku; druge, pogodne metode i materijali poznati u oblasti mogu takođe biti korišćeni. Materijali, metode, i primeri su samo ilustrativni i bez namere da budu ograničavajući. Sve objave, patentne prijave, patenti, sekvence, unosi podataka u baze, i druge reference koji su pomenuti ovde su uključeni referencom u celosti. U slučaju konflikta, predmetna specifikacija, uključujući definicije, će kontrolisati.
[0026] Druge karakteristike i prednosti predmetnog pronalaska će biti očigledne iz detaljnog opisa i slika koje slede, i iz patentnih zahteva.
OPIS NACRTA
[0027]SLIKA 1 | Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog teškog (Vh) lanca antitela čiji je ID 1 (anti - sekvenca A srodna polipeptidu MHC klase 1 antitelo (MICA)) (SEQ ID NO:l).
SLIKA 2 | Sekvenca amino kiselina Vh lanca antitela čiji je ID 1 (anti-MICA antitelo)
(SEQ ID NO:2).
FIG 3 | Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog lakog (Vl) lanca antitela čiji je ID 1 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO: 10).
SLIKA 4 | Sekvenca amino kiselina Vllanca antitela čiji je ID 1 (anti-MICA antitelo)
(SEQ ID NO: 11).
SLIKA 5 | Sekvenca nukleinske kiseline Vhlanca antitela čiji je ID 2 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO: 19).
SLIKA 6 | Sekvenca amino kiselina Vhlanca antitela čiji je ID 2 (anti- angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:20).
SLIKA 7 | Sekvenca nukleinske kiseline Vllanca antitela čiji je ID 2 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:28).
SLIKA 8 | Sekvenca amino kiselina Vl lanca antitela čiji je ID 2 (anti- angiopoetin-2 antitelo) (SEQ IDNO:29).
SLIKA 9 | Sekvenca nukleinske kiseline Vhlanca antitela čiji je ID 3 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:37).
SLIKA 10 | Sekvenca amino kiselina Vhlanca antitela čiji je ID 3 (anti- angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:38).
SLIKA 11 | Sekvenca nukleinske kiseline Vllanca antitela čiji je ID 3 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:46).
SLIKA 12 | Sekvenca amino kiselina Vllanca antitela čiji je ID 3 (anti- angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:47).
SLIKA 13 | Sekvenca nukleinske kiseline Vhlanca antitela čiji je ID 4 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:55).
SLIKA 14 | Sekvenca amino kiselina Vhlanca antitela čiji je ID 4 (anti- angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:56).
SLIKA 15 Sekvenca nukleinske kiseline Vllanca antitela čiji je ID 4 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:64).
SLIKA 16 | Sekvenca amino kiselina Vllanca antitela čiji je ID 4 (anti- angiopoctin-2 antitelo) (SEQ ID NO:65).
SLIKA 17 | Sekvenca nukleinske kiseline Vhlanca antitela čiji je ID 5 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:73).
SLIKA 18 | Sekvenca amino kiselina Vhlanca antitela čiji je ID 5 (anti- angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:74).
SLIKA 19 | Sekvenca nukleinske kiseline Vllanca antitela čiji je ID 5 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:82).
SLIKA 20 | Sekvenca amino kiselina Vllanca antitela čiji je ID 5 (anti- angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:83).
SLIKA 21A-21F | Ilustruje reprezentativne metode za pravljenje antitela iz B-ćelija.
(A) Antigen je eksprimiran sa BirA oznakom za biotinilaciju na specifičnom mestu i tetramerizaciju sa fluorescentno-obeleženim streptavidinom. (B) B ćelije se boje sa
tetramerom i panelom monoklonskih antitela. Tetramer", memorijske B ćelije promenjene klase su pojedinačne ćelije sortirane u PCR trake. (C) iRNK amplifikacija je izvedena sa T7 RNK polimerazom. (D) Sekvenciranje PCR produkata je izvedeno korišćenjem 300-40()bp PCR produkata. (E) „Overlap" (preklapajući) PCR je korišcen za konstruisanje teških lanaca igGl u punoj dužini i kapa/lambda lakih sekvenci koje su klonirane u zasebne vektore. Vektori su prolazno transfektovani u CHO-S ćelije za ekpresiju kompletno humanih rekombinantnih antitela. (F) Antitela su testirana za vezivanje antigena i procenjena su potencijalna terapijska svojstva.
SLIKE 22A-22B | Grafici pokazuju poređenje monomernih i tetramemih antigena za identifikaciju memorijskih B ćelija. (A) Mono-biotinilovani TTCF ili CD80 antigeni su direktno obeleženi sa Alexa-488 fluoroforom; tetrameri su dobijeni sa neobeleženim streptavidinom. Obogaćene B ćelije od svakog donora su podcijene u tri frakcije i obojene sa kontrolnim CD80 tetramerom, TTCF monomerom, ili TTCF tetramerom pri istoj ukupnoj koncentraciji antigena od 0.125 ug/mL. FACS plotovi prikazuju CD19" CD27<+>IgM"meemorijske B ćelije zamenjenih klasa; brojevi u blizini gejta predtstvaljaju procente parentalnog gejta. (B) Frekvencije tetramer<+>memorijskih B ćelija detektovanih kod tri različita donora. Brojevi su izračunati kao tetramer<+>ćelija za lxlO<b>CD19<+>memorijskih B ćelija.
SLIKE 23A-23B | Linijski grafikoni pokazuju visok afinitet vezivanja TTCF pomoću antitela stvorenih iz plazmablasta i memorijskih B ćelija. Eksperimenti u vezi sa zasićenjem vezivanja su izvedeni da bi se odredili afiniteti rekombinantnih antitela. TTCF antigen je obeležen sa europijumom, koji emituje jak fluorescentni signal na 615nm nakon inkubacije sa helirajućim reagensom. Antitela su imobilisana na ploči sa 96 bunarića i inkubirana sa TTCF-europijumom (lOOnM do 4pM) tokom dva sata na 37°C. Brojanje fluorescencije na 615nm je snimljeno iKoje izračunata korišćenjem nelinearne regresione analize. Kontrolno antitelo (klon 8.18.C5) koje je takođe proizvedeno u CHO-S ćelijama je uključeno u sve eksperimente. (A) Rekombinanta TTCF Antitela 1 i 2 su generisana od TTCF tetramer<+>plazmablasta (donor 1). (B) TTCF antitela 3, 4, i 5 originated from TTCF tetramer<+>memorijske ćelije tri različita donora.
SLIKA 24 | Dijagrami vezivanja anti-MICA antitela za MICA-obložene lumineks perlice.
SLIKE 25A-250 | Linijski grafikoni vezivanja anti-MICA antitela za MICA-obložene perlice.
SLIKE 26A-26D | Dijagrami vezivanja četiri humana angiopoetin 2 specifična antitela kao i kontrolnog antitela za tri humana angiopoetina (angiopoetin-1, 2 i 4) i ang-slično-3. Rekombinant angiopoetini su imobilisani na ELISA ploči i vezivanje humanih rekombinantnih antitela je detektovano sa europijum-obeleženim streptavidinom.
SLIKE 27A-27C | Prikazuju grafikone i vezanost za gel angiopoetin-specifičnih antitela iz pacijenata sa kancerom pluća. (A) Angiopoetin-2 reaktivnost seruma pacijeneta sa kancerom pluća (L19) (razblažen 1:1000) određen je pomoću ELISA testa. (B) FACS plotovi pokazali su PBMC uzorak (vremenska tačka- 10/98) gejtovan (odabran) na CD19<+>, CD27<+>IgM-B ćelijama sa CD 19 na X-osi i fluorescentno-označen angiopoetin-2 na Y-osi. (C) Težak, laki lanac, i zglobni region PCR produkata od 10 angiopoetin-2 reaktivnih memorijskih B-ćelija izolovanih od pacijenta LI 9. Marker od 500 baznih parova je označen na levoj strani.
SLIKA 28 | Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog teškog (Vh) lanca antitela čiji je ID 6 (antitelo za sekvencu A specifično za polipeptid anti-MHC klase I (MICA))
(SEQ ID NO:148).
SLIKA 29 | Sekvenca amino kiselina Vhlanca antitela 6 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO: 149).
SLIKA 30 | Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog lakog (Vl) lanca antitela čiji je ID 6 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO: 150).
SLIKA 31 | Sekvenca amino kiselina Vllanca antitela čiji je ID 6 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO: 151).
SLIKA 32 | Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog teškog (Vh) lanca antitela čiji je ID 7 (antitelo za sekvencu A specifično za polipeptid anti-MHC klase I (MICA))
(SEQ ID NO:167).
SLIKA 33 | Sekvenca amino kiselina Vhlanca antitela čiji je ID 7 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO: 168).
SLIKA 34 | Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog lakog (Vl) lanca antitela čiji je ID 7 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO: 169).
SLIKA 35 | Sekvenca amino kiselina Vllanca antitela čiji je ID 7 (anti-MICA antitelo) (SEQ IDNO: 170).
SLIKA 36 | Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog teškog (VH) lanca antitela čiji je ID 8 (antitelo za sekvencu A specifično za polipeptid anti-MHC klase I (MICA))
(SEQ ID NO:185).
SLIKA 37 | Sekvenca amino kiselina VH lanca antitela čiji je ID 8 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO:186).
SLIKA 38 | Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog lakog (VL) lanca antitela čiji je ID 8 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO: 187).
SLIKA 39 | Sekvenca amino kiselina VL lanca antitela čiji je ID 8 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO: 188).
je ID 9 (antitelo za sekvencu A specifičnu za polipeptid anti-MHC klase I (MICA))
(SEO ID NO:203).
SLIKA 41 | Sekvenca amino kiselina Vhlanca antitela čiji je ID 9 (anti-MICA antitelo) (SEQ IDNO:204).
SLIKA 42 | Sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog lakog (Vl) lanca antitela čiji je ID 9 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO:205).
SLIKA 43 | Sekvenca amino kiselina Vllanca antitela čiji je ID 9 (anti-MICA antitelo) (SEQ ID NO: 206).
SLIKA 44 | Sekvenca nukleinske kiseline Vhlanca antitela čiji je ID 10 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:221).
SLIKA 45 | Sekvenca amino kiselina Vhlanca antitela čiji je ID 10 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:222).
SLIKA 46 | Sekvenca nukleinske kiseline Vllanca antitela čiji je ID 10 (anti-angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:223).
SLIKA 47 | Sekvenca amino kiselina Vllanca antitela čiji je ID 10 (anti- angiopoetin-2 antitelo) (SEQ ID NO:224).
SLIKE 48A-G | Linijski grafici koji pokazuju procenu MICA vezivanja specifi;nog za alele pomoću rekombinanntnog anti-MICA antitela.
SLIKA 49 | Linijski grafici koji pokazuju obeležavanje autolognih tumorskih ćelija sa anti-MICA antitclom CM24002 Ab2 (Ab je skraćenica za antitelo (antibodv)).
SLIKA 50 | Serija FACS plota koji pokazuje regulaciju NKG2D pomoću semmskog MICA. Humane NK ćelije su inkubirane sa kontrolnim serumom od pacijenta CM24002 i 1:10 razblaženjem tokom 48 sati. Naznačena natitela su dodata na početku inkubacije u koncentraciji od 10 u g/ml. NKG2D ekspresija je procenjena na CD56+ NK ćelijama pomoću protočne citometrije.
SLIKA 51 | Serija FACS plota koaj pokazuje regulaciju NKG2D pomoću rekombinantnog MICA. Humane NK ćelije su inkubirane sa rekombinantnim MICA u koncentraciji od 2 ng/ml tokom 48 sati. Naznačena antitela su dodata na početku inkubacije u koncentraciji od 10 ug/ml. Nakon 48 sati, NKG2D ekspresija je procenjena na CD56+ N K pomoću protočne citometrije.
SLIKA 52 | Linijski grafik pokazuje pojačavanje ćelijski-posredovane toksičnosti pomoću anti-MICA antitela CM24002 Ab2. Humane NK ćelije su inkubirane sa rekombinantnim MICA (2ng/ml) tokom 48 sati u prisustvu naznačenih antitela u 10 ug/ml. Sposobnost NK ćelija (efektora) da ubiju K562 ciljne ćelije je procenjena merenjem LDH oslobađanja nakon 4 sata inkubacije pri naznačenim razmerama. SLIKA 53 | Grafikoni pokazuju ćelijski-posredovanu toksičnost pomoću anti-MICA antitela CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29. Humane NK ćelije su inkubirane sa rekombinantnim MICA (2ng/ml) tokom 48 sati u prisistvu naznačenih antitela u 10 ug/ml. Sposobnost NK ćelija (effectors) da ubiju K562 ciljne ćelije je procenjena merenjem LDH oslobađanja nakon 4 sata inkubacije. NKG2D blokirajuće antitelo ili Fc blokirajuće antitelo je dodato tokom 4 sata inkubacije efektora i ciljnih ćelija da se proceni doprinos Fc receptora i NKG2D na ćelijski-posredovanu toksičnost.
SLIKA 54 | Serija linijskih grafikona koji pokazuju vezivanje MICA alfa 3 domena pomoću rekombinantnog anti-MICA antitela. Rekombinanti MICA alfa 3 domeni su biotinilovani i uhvaćeni na površini perlica presvučenih streptavidinom. Naznačena antitela su inkubirana pri lOug/ml sa perlicama presvučenim pojedinačnim rekombinantnim proteinom tokom 1 sata. Perlice su zatim isprane i inkubirame sa FITC-konjugovanim anti-humanim IgG sekundarnim antitelom. FITC fluorescencija je kvantifikovana pomoću protočne citometrije.
SLIKA 55 | Linijski grafikoni pokazuju obeležavanje tumorskih ćelija pomoću anti-MICA antitela CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29. Fluorescencija je određena protočnom citometrijom.
SLIKA 56 | Grafikoni koji pokazuju MICA alelnu specifičnost anti-MICA antitela CM33322 Ab29 kao što je određeno Lumineks testom.
SLIKA 57 | Grafikoni koji pokazuju vezivanje anti-angiopoetin 2 specifičnog antitela anti-Ang6 Ab2 kao i kontrolnog antitela za tri humana angiopoetina (angiopoetin-1, 2 i 4) i ang-sličan-3. Rekombinantni angiopoetini su imobilisani na ELISA ploči i vezivanje humanih rekombinantnih antitela je detektovana sa europijum-obeleženim
streptavidinom.
DETALJAN OPIS
[0028]Predmetna objava je bazirana, delom, na opažanju da antitela usmerena na terapijske mete važne kod bolesti mogu biti dobijena iz humanih subjekata izloženih bolesti pomoću obeležavanja B ćelija sa tetramernim oblikom antigena od interesa. Kao sto je opisano u delu o stanju tehnike iznad, prethodne metode su ograničene barem time da su neefikasne za identifikovanje odgovarajućih B ćelija kod humanih subjekata i/ili zato što prouzrokuju bilo koje uhvaćene b ćelije da prođu kroz fenotipske promene, tako smanjujući njihovu vrednost. Suprotno, metode opisane ovde koje dozvoljavaju hvatanje retkih B ćelija usmercnih prema antigenima koji su povezani sa specifičnim bolestima. Kako je opisano iznad, metode zahtevaju tetramerizaciju antigena povezanog sa bolestima, čiji postupak, kako je pokazano u primerima ispod, pojačava identifikaciju odgovarajućih memorijskih B ćelija. Specifično, metode ovde dozvoljavaju efikasnije hvatanje odgovarajućih memorijskih B ćelija tokom dužih vremenskih perioda koji slede nakon početnog izlaganja subjekta antigenu. Metode ovde takođe uključuju antitela (i peptide dobijene od sekvenci takvih antitela) dobijena korišćenjem genetičkog materijala dobijenog od memorijskih B ćelija uhvaćenih korišćenjem metoda opisanih ovde.
[0029]Ovde su opisana i humana antitela za sekvencu A specifičnu za polipetid MHC klase I (MICA) i humana antitela usmerena na angiopoetin-2. Oba tipa humanih antitela su identifikovana kod pacijenata koji su primili kancersku vakcinu na bazi ćelija (GM-CSF transdukovane autologne tumorske ćelije) pomoću metoda koje podrazumevaju upotrebu tetramernih antigena.
[0030]Metode za specifično dobijanje ili ciljanje antitela sa terapijskim potencijalom od odabranih humanih subjekata i terapijske kompozicije koje rezultuju odatle su ovde opisane. Ove metode mogu da obuhvate: dobijanje ili ciljanje imunskih ćelija u humanom subjektu, gde imunske ćelije obuhvataju ali nisu ograničene na, na primer, B ćelije i/ili memorijske B ćelija, izolaciju ili prečišćavanje genetičkog materijala (npr., DNK i/ili iRNK) od dobijenih ili ciljanih imunskih ćelija, i korišćenje izolovanog ili prečišćenog genetičkog materijala da se proizvedu terapijske kompozicije, npr., terapijske kompozicije koje su ovde stavljene na uvid javnosti. Dalji opis metoda je obezbeđen u odeljku pod naslovom „Metode," ispod.
[0031]Terapijske kompozicije (npr., uključujući terapijske peptide, uključujući antitela, fragmente antitela, derivate antitela, i/ili konjugate antitela) odnose se na antitela prisutna kod subjekata koji imaju ili su imali stanje ili bolest i koji su pokazivali pozitivni imunski odgovor prema stanju ili bolesti koji su takoše ovde opisani.
Terapijske kompozicije
[0032]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije ovde mogu da reaguju (npr., da se vezuju, vezuju specifično i/ili vezuju imunospecflčno) sa vezujućim parnjacima (npr., imunogen(i), antigen(i), i/ili epitop (i)) koji su u vezi sa bolešću ili stanje, gde interakcija između terapijske kompozicije i vezujućeg parnjaka rezultuje u pozitivnom imunom odgovoru prema stanju ili bolesti (npr., smanjenje nivoa simptoma bolesti istih kod subjekta).
[0033]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije mogu da uključe peptid koji uključuju (npr., sadrže, sastoje se u suštini od, ili se sastoje od) najmanje jedan (npr., jedan, dva, tri, četiri, pet, i/ili šest) regiona koji određuje komplementarnost (CDR) varijabilnog teškog lanca (Vh) i/ili varijabilnog lakog lanca (Vl) antitela čiji je ID 1, 2, 3, 4, ili 5, 5, 7, 8, 9 ili 10, koji su prikazani u Tabeli 1.
[0034]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije mogu da uključe peptide koji uključuju (npr., sadrže, sastoje se u suštini od, ili se sastoje od) najmanje jedan (npr., jedan, dva, tri, četiri, pet, i/ili šest) regiona koji određuje komplementarnost (CDR) varijabilnog teškog lanca (Vh) i/ili varijabilnog lakog lanca (Vl) antitela čiji je ID 1, 2, 3, 4, ili 5, 5, 7, 8, 9 ili 10, koji su prikazani u Tabeli 1, i koji interaguju sa (npr., da se vezuju, vezuju specifično i/ili vezuju imunospecfično) za sekvencu A specifičnu za polipeptid MHC klase I (MICA (npr., UniGene Hs. 130838)) (npr., solubilno MICA (sMTCA)) i/ili angiopoetin-2 (npr., UniGene Hs.583870), uključujući epitope istih.
[0035]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije mogu da uključe peptide koji uključuju jedan CDR Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 i/ili 9 koji su prikazani u Tabeli 1, gde se peptid vezuje (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) za MICA (npr., humani MICA (npr., solubilni MICA (sMICA))). U nekim slučajevima, peptidi mogu da uključe najmanje dva CDR regiona, gde najmanje dva CDR regioni su regioni CDR koji su prikazani u Tabeli 1 za različita antitela. Drugim rečima, CDR regioni (i FRs i/ili AA sekvence) koji su prikazani u Tabeli 1 za antitela I D 1, 6, 7, 8 i 9 su zamenljivi i mogu biti kombinovani da se generišu peptidi, sve dok se peptidi vezuju (npr., vezuju specifično i/ili vezuju imunospecifično) za MICA (npr., humani MICA (npr., solubilni MIC A (sMICA))). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi/ili Vl antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 i/ili 9 koji su prikazani u Tabeli 1, U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi Vlantitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 i/ili 9 i CDR1 i/ili CDR2 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 i/ili 9 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1 CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 i/ili 9. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vl antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 i/ili 9 i najmanje jedan od FR1 FR2 FR3, i/ili FR4 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 i/ili 9, koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju jednu od SEQ ID NO:2, 149, 168, 186 ili 204 i/ili jednu od SEQ ID NO:ll, 151, 170, 188, ili 206. U svakom slučaju, peptid može da veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) MICA (npr., humani MICA (npr., solubilni MICA (sMICA))). U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i MICA može biti između oko O.lnM do luM, na primer, oko lOnM.
[0036]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije mogu da uključe peptide koji uključuju najmanje jedan CDR Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 6 koji je prikazan u Tabeli 1, gde se peptidi vezuju (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) za MICA (npr., humani MICA (npr., solubilni MICA (sMICA))). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi/ili Vl antitela čiji je ID 6 koji je prikazan u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi Vlantitela čiji je I D 6 i CDR1 i/ili CDR2 Vhi/i 1 i Vlantitela čiji je ID 6 koji je prikazan u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vh i/ili Vlantitela čiji je ID 6. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 6 and sa najmanje jednim od FR1 FR2 FR3, i/ili FR4 Vh i/ili Vlantitela čiji je ID 6, koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju SEQ ID NO: 149 i/ili SEQ ID NO: 151. U svakom slučaju, peptid može da se veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) za MICA (npr., humani MICA (npr., solubilni MICA (sMICA))). U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i MICA može biti između oko O.lnM do luM, na primer, oko lOnM.
[0037]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije modu da uključe peptide koji uključuju najmanje jedan CDR Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 7 koji je prikazan u Tabeli 1, gde se peptid vezuje (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) za MICA (npr., humani MICA (npr., solubilni MICA (sMICA))). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi/ili Vl antitela čiji je ID 7 koji je prikazan u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi Vlantitela čiji je I D 7 i CDR1 i/ili CDR2 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 7 koji je prikazan u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vh i/ili Vlantitela čiji je ID 7. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 7 i najmanje jedan od FR1 FR2 FR3, i/ili FR4 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 7, koji je prikazan u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju SEQ ID NO: 168 i/ili SEQ ID NO: 170. U svakom slučaju, peptid može da se veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) za MICA (npr., humani MICA (npr., solubilni MICA (sMICA))). U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i MIC A može biti između oko O.lnM do luM, na primer, oko lOnM.
[0038]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije modu da uključe peptide koji uključuju najmanje jedan Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 8 koji su prikazani u Tabeli 1, gde se peptid vezuje (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) za MICA (npr., humani MICA
(npr., solubilni MICA (sMICA))). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 8 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi Vlantitela čiji je ID 8 i CDR1 i/ili CDR2 Vh i/ili Vlantitela čiji je ID 8 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1 CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 8. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je I D 8 i najmanje jedan od FR1 FR2 FR3, i/ili FR4 Vhi/ili Vl antitela čiji je ID 8, koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju SEQ ID NO:186 i/ili SEQ ID NO:188. U svakom slučaju, peptid može da se veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) za MICA (npr., humani MICA (npr., solubilni MICA (sMICA))). U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i MICA može biti između oko O.lnM do luM, na primer, oko lOnM.
[0039]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije modu da uključe peptide koji uključuju najmanje jedan Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 9 koji su prikazani u Tabeli 1, gde se peptid vezuje (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) za MICA (npr., humani MICA (npr., solubilni MICA (sMICA))). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 9 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi Vlantitela čiji je ID 9 i CDR1 i/ili CDR2 Vh i/ili Vlantitela čiji je ID 9 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1 CDR2, i CDR3 Vh i/ili Vlantitela čiji je ID 9. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 9 i najmanje jedan od FR2 FR3, i/ili FR4 Vhi/ili Vl antitela čiji je ID 9, koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju SEQ ID NO:204 i/ili SEQ ID NO:206. U svakom slučaju, peptid može da se veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) za MICA (npr., humani MICA (npr., solubilni MICA (sMICA))). U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i MIC A može biti između oko O.lnM do 1 uM, na primer, oko lOnM.
[0040]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije modu da uključe peptide koji uključuju najmanje jedan Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4, 5, i/ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1, gde se peptid vezuje (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., humani angiopoetin-2). U nekim slučajevima, peptidi mogu da uključe najmanje dva CDR regiona, gde najmanje dva CDR regiona su CDR regioni koji su prikazani u Tabeli 1 za različita antitela. Drugim rečima, CDR regioni (i FRs i/ili AA sekvence) koji su prikazani u Tabeli 1 za antitela ID 2, 3 4, 5, i 10 su zamenljivi i mogu biti kombinovani da se generišu peptidi, sve dok se peptidi vezuju (npr., vezuju specifično i/ili vezuju imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., humani angiopoetin-2). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4, 5, i/ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4, 5, i/ili 10 i CDR1 i/ili CDR2 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4, 5, i/ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vi-i i/ili Vl antitela čiji je ID 2, 3, 4, 5, i/ili 10. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1 CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4, 5, i/ili 10 i najmanje jedan od FR2 FR3, i/ili FR4 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 2, 3, 4, 5, i/ili 10 5, koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju jednu od SEQ ID NO:20, 38, 56, 74, ili 222 i/ili jednu od SEQ ID NO:29, 47, 65, 83 ili 224. U nekim slučajevima, peptidi uključuju jednu od SEQ ID NO:20, 38, 56, 74, ili 222 i jednu od SEQ ID NO:29, 47, 65, 83 ili 224. U svakom slučaju, peptid može da se veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr,, humani angiopoetin-2 (npr., UniGene Hs.583870)).
[0041]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije mogu da uključe peptide koji uključuju najmanje jedan Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 2 koji su prikazani u Tabeli 1, gde se peptid vezuje (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) to angiopoetin-2 (npr., human angiopoetin-2). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vh i/ili Vlantitela čiji je ID 2 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vm Vlantitela čiji je ID 2 i CDR1 i/ili CDR2 Vh i/ili Vlantitela čiji je ID 2 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vhi''ili Vlantitela čiji je ID 2. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1 CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 2 i najmanje jedan od FR2 FR3, i/ili FR4 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 2, koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju SEQ ID NO:20 i/ili SEQ ID NO:29. U svakom slučaju, peptid može da se veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., humain angiopoetin-2). U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i angiopoetin-2 može biti između oko O.lnM do luM, na primer, oko lOnM.
[0042]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije modu da uključe peptide koji uključuju najmanje jedan Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 3 koji su prikazani u Tabeli 1, gde se peptid vezuje (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., human angiopoetin-2). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 3 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi Vlantitela čiji je ID 3 i CDR1 i/ili CDR2 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 3 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 3. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1 CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 3 i najmanje jedan od FR2 FR3, i/ili FR4 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 3, koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju SEQ ID NO:38 i/ili SEQ ID NO:47. U svakom slučaju, peptid može da se veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., humani angiopoetin-2). U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i angiopoetin-2 može biti između oko O.lnM do luM, na primer, oko lOnM.
[0043] U nekim slučajevima, terapijske kompozicije modu da uključe peptide koji uključuju najmanje jedan Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 4 koji su prikazani u Tabeli 1, gde se peptid vezuje (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., human angiopoetin-2). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je I D 4 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi Vl antitela čiji je ID 4 i CDR1 i/ili CDR2 Vhi/ili Vl antitela čiji je ID 4 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 4. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1 CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 4 i najmanje jedan od FR2 FR3, i/ili FR4 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 4, koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju SEQ ID NO:56 i/ili SEQ ID NO:65. U svakom slučaju, peptid može da se veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., human angiopoetin-2). U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i angiopoctina-2 može biti između X-Y, na primer, X-Y, X-Y. U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i angiopoetina-2 može biti između oko O.lnM do luM, na primer, oko lOnM.
[0044] U nekim slučajevima, terapijske kompozicije modu da uključe peptide koji uključuju najmanje jedan CDR3 od Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 5 koji su prikazani u Tabeli 1, gde se peptid vezuje (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., human angiopoetin-2). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 5 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi Vlantitela čiji je ID 5 i CDR1 i/ili CDR2 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 5 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 5. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1 CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 5 i najmanje jedan od FR2 FR3, i/ili FR4 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 5, koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju SEQ ID NO:74 i/ili SEQ ID NO:83. U svakom slučaju, peptid može da se veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., humani angiopoetin-2). U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i angiopoetin-2 može biti između oko O.lnM do luM, na primer, oko lOnM.
[0045]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije modu da uključe peptide koji uključuju najmanje jedan Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 10 koji su prikazani u Tabeli 1, gde se peptid vezuje (npr., vezuje specifično i/ili vezuje imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., human angiopoetin-2). U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 10 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR3 Vhi Vlantitela čiji je ID 10 i CDR1 i/ili CDR2 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 10 koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1, CDR2, i CDR3 VhL-'ili Vlantitela čiji je TD 10. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju CDR1 CDR2, i CDR3 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 10 i najmanje jedan od FR2 FR3, i/ili FR4 Vhi/ili Vlantitela čiji je ID 10, koji su prikazani u Tabeli 1. U nekim slučajevima, takvi peptidi uključuju SEQ ID NO:222 i/ili SEQ ID NO:224. U svakom slučaju, peptid može da se veže (npr., veže specifično i/ili veže imunospecifično) za angiopoetin-2 (npr., humani angiopoetin-2). U nekim slučajevima, afinitet vezivanja između peptida i angiopoetina-2 može biti između oko O.lnM to luM, na primer, oko lOnM.
[0046]U nekim slučajevima, peptidi koji se vezuju za angiopoetin-2 mogu takođe da se vezuju za angiopoetin-1 (npr., Unigene Hs.369675) i/ili angiopoetin-4 (npr., Unigene Hs.278973). Na primer, u nekim slučajevima, peptidi koji se vezuju za angiopoetin-2 mogu takođe da se vezuju specifično i/ili imunospecifično u odnosu na druge antigene (koji nisu angiopoetin-l)za angiopoetin-1. U nekim slučajevima, peptidi koji se vezuju za angiopoetin-2 mogu takođe da se vezuju specifično i/ili imunospecifično u odnosu na druge antigene (koji nisu angiopoetin-4) za angiopoetin-4.
[0047]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije modu da uključe peptid koji uključuju: SEQ ID NO: 2 i/ili SEQ ID NO:l 1; SEQ ID NO: 149 i/ili SEQ ID NO:151; SEQ ID NO: 168 i/ili SEQ ID NO:170; SEQ ID NO: 186 i/ili SEQ ID NO:188; SEQ ID NO: 204 i/ili SEQ ID NO:206; SEQ ID NO:20 i/ili SEQ ID NO:29; SEQ ID NO:38 i/ili SEQ ID NO:47; SEQ ID NO:56 i/ili SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:74 i/ili SEQ ID NO:83; i SEQ ID NO: 222 L/ili SEQ ID NO:224.
[0048]Dok su CDR i FR regioni prikazani iznad, takvi regioni mogu takođe biti deflnisani prema Kabatu (Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 i 1991)). Amino kiselinsko numerisanje antitela ili fragmenata koji se vezuju za antigene je takođe prema onom po Kabatu.
[0049]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije mogu da uključe peptid, uključujući na primer, antitela, uključujući antitela u punoj dužini i/ili intaktna antitela, ili fragmenti antitela. "Antitelo" je imunoglobulinski molekul sposoban da se specifično vezuje za matu, kao što je ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid, polipeptid, itd., preko najmanje jednog mesta za prepoznavanje antigena, koje se nalazi u varijabilnom regionu imunoglobulinskog molekula. Kao što je ovde korišćeno, termin „antitelo" obuhvata ne samo intaktna poliklonska ili monoklonska antitela, već takođe bilo koji fragment za vezivanje antigena (tj., "antigen-vezujući deo") ili pojedinačni lanac istog, fuzione proteine koji sadrže antitelo, i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju imunoglobulinskog molekula koji sadrži mesto za vezivanje antigena. Antitelo uključuje antitelo bilo koje klase, kao što su IgG, IgA, ili IgM (ili podklase istih), i antitelo ne treba da bude bilo koje posebne klase. U zavisnosti od amino kiselinske sekvence antitela konstantnog regiona njegovih teških lanaca, imunoglobulini mogu biti raspodeljeni u različite klase. Postoje pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i nekoliko ovih može biti dalje podeljeno u podklase (izotipove), npr., IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl i IgA2. Konstantni regionu teških lanaca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se nazivaju alfa, delta, epsilon, gama, i mu, redom. Strukture subjcdinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate. Reprezentativna antitela i fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, monoklonska antitela (uključujući monoklonska antitela u punoj dužini), poliklonska antitela, multispecifična antitela formirana od najmanje dva različita epitopska fragmenta (npr., bispecifična antitela), kamilja antitela, himerna antitela, jednolančani Fvs (scFv), jednolančana antitela, antitela pojedinačnog domena, antitela domena, Fab fragmenti, F(ab')2 fragmenti, fragmenti antitela koji ispoljavaju željenu biološku aktivnost (npr. deo koji vezuje antigen), disulfidno-vezani Fvs (dsFv), i anti-idiotipska (anti-Id) antitela (uključujući, npr., anti-Id antitela do antitela korisna u predmetnom pronalasku), intratela, i epitop-vezujuće fragmente bilo čega iznad. Antitela ili fragmenti antitela mogu biti humani ili humanizovani.
[0050]Fragmenti antitela su pogodni za primenu u metodama koje su ovde opisane sve dok zadržavaju željeni afinitet i specifičnost antitela u punoj dužini. Prema tome, fragment anti-MICA antitela ili anti-angiopoetin antitelo će zadržati sposobnost da se veže za MICA ili angiopoetin, redom, u Fv delu i sposobnost da se veže za Fc receptor na dendritskim ćelijama u Fc delu. Takvi fragmenti su okarakterisani osobinama koje su slične odgovarajućem anti-MlCa antitelu u punoj dužini ili anti-angiopoetin antitelu, to jest, fragmenti će specifično vezati humani MICA antigen ili angiopoetin antigen, redom, eksprimiran na površini humane ćelije ili odgovarajućeg sMICA antigena koji je bio ispušten u medijum.
[0051] Fv fragment je fragment antitela koji sadrži kompletno antigensko mesto vezivanja i prepoznavanja. Ovaj region se sastoji od dimera varijabilnog regiona jednog teškog i jednog lakog lanca koji su u tesnoj vezi, koja može biti kovalentna po prirodi, na primer u scFv. U ovoj konfiguraciji tri CDR regiona svakog varijabilnog domena interaguju da definišu antigen vezujuće mesto na površini VH-VL dimera. Kolektivno, šest CDR regioana ili podskup istih daje specifičnost za vezivanje antigena antitelu. Međutim, čak i pojedinačni varijabilni domen (ili polovina Fv sadrži samo tri CDR regiona specifična za antigen) može imati asposobnost da prepozna i veže antigen, iako obično sa manjim afinitetom nego celokupno mesto za vezivanje.
[0052] Jcdnolančani Fv ili (scFv) fragmenti antitela sadrže Vhi Vldomene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u vidu pojedinačnog polipeptidnog lanca. Generalno Fv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između Vhi Vldomena, koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje antigena.
[0053] Fab fragment se sastoji od varijabilnog i konstantnog domena lakog lanca i varijabilnog domena i prvog konstantnog domena (CH1) teškog lanca. F(ab')2 fragmenti antitela sadrže par Fab fragmenata koji su generalno kovalentno vezani blizu njihovih karboksi terminusa pomoću zglobnih cisteina između njih. Druga hemijska sparivanja fragmenata antitela su takođe poznata u oblasti.
[0054] Dijatela (dimerna antitela - „diabodies") su mali fragmenti antitela sa dva antigen-vezujuća mesta. Pri čemu fragmenti sadrže Vhpovezan sa Vlu istom polipeptidnom lancu (Vhi Vl). Korišćenjem veznika (linkera) koji je previše kratak da dozvoli sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su primorani da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i da kreiraju dva nova antigen-vezujuća mesta.
[0055] Linearna antitela sadrže par tandemskih Fd segmenata (Vh-CH1-Vh-CH1) koji, zajedno sa komplementarnim polipetidima lakog lanca, foimiraju par antigen vezujućih regiona. Linearna antitela mogu da budu bispecifična ili monospecifična.
[0056]Antitela i fragmenti antitela koji su korisni u predmetnom pronalasku mogu biti modifikovani u Fc regionu da se obezbede željene efektorske funkcije ili polu-život seruma. U nekim slučajevima, Fc region može biti konjugovan za PEG ili albumin da se poveća polu-život seruma, ili neke druge konjugacije koje rezultuju željenim efektom. Alternativno, gde je pežljeno da se eliminiše ili smanji efektorska funkcija, tako da se minimizuju sporedni efekti ili terapijske komplikacije, određeni Fc regioni mogu biti korišćeni.
[0057]Humana i humanizovana antitela obuhvataju antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji su izvedeni iz (ili imaju istu sekvencu amino kiselina kao oni izvedeni iz) humane germinativne imunoglobulinske sekvence (npr., mutacije uvedene nasumičnom ili mutagenezom na odrejenom mestu in vitro ili pomoću somatskih mutacija in vivo), na primer u CDR regionima i posebno CDR3.
[0058]„CDR" varijabilnog domena su amino kiselinski ostaci u okviru hipervarijabilnog regiona koji su identifikovani u skladu sa definicijama Kabat-a, Chothia, kumulacije oba i Kabata i Chothia, AbM, kontakta, i/ili konformacionih definicija ili bilo koje metode određivanja CDR poznatih u oblasti. CDR regioni antitela mogu biti identifikovani kao hipervarijabilni regioni originalno definisani od strane Kabat et al. Videti, npr., Kabat et al., 1992, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Položaji CDR regiona mogu takođe biti identifikovani kao strukture strukturnih petlji originalno opisane od strane Chothia i ostalih. Videti, npr., Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883. Drugi pristupi CDR identifikaciji uključuju "AbM definiciju," koja je kompromis između Kabata i Chothia i izvedena je korišćenjem softvera za modelovanje AbM antitela pod nazivom ,,Oxford Molecular's AbM antibodv modeling software" (sada Accelrvs®), ili "definiciju kontakta" CDR regiona baziranu na opaženim kontaktima antigena, koji su navedeni u MacCallum et al, 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745. U još jednom pristupu, ovde označena kao "komformaciona definicija" CDR regiona, položaji CDR regiona mogu biti identifikovani kao ostaci koji mogu entalpijksi da doprinesu vezivanju antigena. Videti, npr., Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistrv, 283:1156-1166. Još neke druge CDR granične definicije ne moraju striktno da prate jedan od gornjih pristupa, ali će se ipak preklopiti sa najmanje jednim delom Kabat CDR regiona, iako mogu biti skraćeni ili produženi u smislu predviđanja ili eksperimentalnih zaključaka da posebni ostaci ili grupe ostataka ili čak celi CDR regioni ne utiču značajno na vezivanje atigena. Kako je ovde korišćeno, CDR može da se odnosi na CDR regione koji su definisani pomoću bilo kog pristupa poznatog u oblasti, uključujući kombinacije pristupa. Metode korišćene ovde koje mogu da koriste CDR regione prema bilo kom od ovih pristupa. Za bilo koje dato rešenje koje obuhvata više od jednog CDR, CDR regioni mogu biti definisani u skladu sa bilo kojim od Kabata, Chothia, produženih, AbM, kontakt, i/ili konformacionih definicija.
[0059] U nekim slučajevima, sekvence amino kiselina peptida koji su ovde stavljeni na uvid javnosti mogu biti modifikovani i menjani da se kreiraju varijante peptida (npr., peptidi sa definisanom homologijom sekvenci sa peptidima koji su ovde stavljeni na uvid javnosti), na primer, sve dok se svojstvo vezivanja antigena peptidne varijante održava ili poboljšava u odnosu na nemodifikovani peptid (osobien vezivanaj antigena bilo kog modifikovanog peptida mogu biti procenjene korišćenjem in vitro i/ili in vivo testova opisanih ovde i/ili tehnika poznatih u oblasti).
[0060] Dok su varijante peptida generalno opažene i razmotrene na nivou amino kiselina, stvarne modifikacije su tipično uvedene ili izvedene na nivou nukleinskih kiselina. Na primer, varijante sa 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98, ili 99% identita aminokiselinske sekvence sa peptidima koji su prikazani u Tabeli 1 mogu biti generisani modifikacijom nukleinskih kiselina koje kodiraju SEQ ID NOs:l, 10, 19, 28, 37, 46, 55, 64, 73, i/ili 82 ili delove/fragmente istih, korišćenjem tehnika (npr., tehnike kloniranja) poznatih u oblasti i/ili koje su ovde stavljene na uvid javnosti.
[0061] Modifikacije sekvenci amino kiselina tipično spadaju u jednu ili više od tri klase: supstitucione, insercione, ili delecione modifikacije. Insercije obuhvataju amino i/ili terminalne fuzije kao i insercije unutar sekvenci pojeedinačnih ili multiplih aminokiselinskih ostataka. Insercije će obično biti manje insercije nego što su one kod amino ili karboksilnih terminalnih fuzija, na primer, reda jedan do četiri ostatka. Delecije su okarakterisane uklanjanjem jednog ili više amino kiselinskih ostataka iz proteinske sekvence. Tipično, ne više od oko 2 do 6 ostataka su izbrisani sa bilo kog mesta u okviru proteinskog molekula. Amino kiselinske supstitucije se tipično odnose na pojedinačne ostatke, ali mogu da se dese na različitim lokacijama odjednom, insercije će obično biti reda od oko 1 do 10 amino kiselinskih ostataka; i delecije će biti u opsegu od oko 1 do 30 ostataka. Delecije ili insercije mogu biti načinjene u susednim parovima, tj. delecije 2 ostatka ili insercije 2 ostatka. Supstitucije, delecije, insercije ili bilo koja kombinacija istih može biti iskombinovana da se dođe do finalnog konstrukta. Mutacije ne moraju da postave sekvencu van okvira čitanja i poželjno neće kreirati regione komplementarnosti koji bi mogli da proizvedu sekundarnu iRNK strukturu. Supstitucione modifikacije su one u kojima je najmanje jedan ostatak uklonjen i drugačiji ostatak je insertovan na njegovo mesto. U nekim slučajevima, supstitucije mogu biti konzervativne aminokiselinske supstitucije u odnosu na peptid koji je prikazan u Tabeli 1. Na primer, varijante mogu da obuhvate 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20-30, 30-40, ili 40-50 konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u odnosu na peptid koji je prikazan u Tabeli 1. Alternativno, varijante mogu da uključe 50 ili manje, 40 ili manje, 30 ili manje, 20 ili manje, 10 ili manje, 9 ili manje, variante mogu da uključe 50 ili manje, 40 ili manje, 30 ili manje, 20 ili manje, 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija u odnosu na peptid koji je prikazan u Tabeli 1. Takve supstitucije su generalno načinjene u skladu sa sledećom Tabelom 2 i nazivaju se konzervativne supstitucije. Metode za predviđanje tolerancije na proteinske modifikacije su poznate u oblasti (videti, npr., Guo et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 101(25):9205-9210
(2004)).
[0062]U nekim slučajevima, supstitucije nisu konzervativne. Na primer, amino kiselina u peptidu koji je prikazan u Tabeli 1 može biti zamenjena amino kiselinom koja može da menja neko svojstvo ili aspekt peptida. U nekim slučajevima, ne-konzervativne amino kiselinske supstitucije mogu biti načinjene, npr., da promene strukturu peptida, da promene osobine vezivanja peptida (npr., da povećaju ili smanje afinitet vezivanja peptida za antigen i/ili ili da izmene povećaju ili smanje specifičnost vezivanja peptida za antigen).
[0063]U nekim slučajevima, peptidi i/ili varijante peptida mogu da uključe ili mogu biti fragmenti peptida koji su prikazani u Tabeli 1. Takvi fragmenti mogu da uključe, na primer, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 50-100, 101-150, manje maino kiselina od CDR regiona, FR regiona, i/ili amino kiselina koje su prikazani u Tabeli 1, npr., sve dok fragmenti zadržavaju najmanje delom osobine vezivanja peptida u punoj dužini (npr., sa najmanje 50%, 60%), 70%>, 80%, 90%, ili 100%) osobina vezivanja peptida u punoj dužini). Skraćenja mogu biti načinjena na amino-terminusu, karboksi-terminusu, i/ili u okviru peptida ovde.
[0064]U nekim slučajevima, intereagujuća površina varijante peptida može biti ista (npr., suštinski ista) kao nemodifikovan peptid, npr., da izmeni (npr., poveća ili smanji), sačuva, ili održi osobine vezivanja varijante peptida u odnosu na nemodifikovan peptid. Metode za identifikaciju intereagujuće površine peptida su poznate u oblasti (Gong et al., BMC: Bioinformatics, 6:1471-2105 (2007); Andrade and Wei et al., Pure and Appl. Chem., 64(11):1777-1781 (1992); Choi et al., Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, 77(l):14-25 (2009); Park et al., BMC: and Bioinformatics, 10:1471-2105 (2009).
[0065]Prosečni poznavaoci oblasti lako razumeju kako da odrede identitet dva polipeptida (npr., nemodifikovan peptid i varijanta peptida). Na primer, identitet može biti izračunat nakon poravnanja dve sekvence tako daje identitet na njegovom najvišem nivou. Drugi način izračunavanja identiteta može biti izveden objavljivanjem algoritama. Optimalno poravnjanje sekvence za peređenje može biti izvedeno lokalnim algoritmom identiteta Smih-a i Waterman-a, Adv. Appl. Math, 2:482 (1981), pomoću algoritma poravnjanja identiteta Needleman-A i Wunsch-a, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pretragom metode sličnosti Pearson-a i Lipman-a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), kompjuterskom implementacijom ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u softverskom paketu - Wisconsin Geneti.cs Softvvare Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ili inspekcijom.
[0066]Isti tipovi identiteta mogu biti dobijeni za nukleinske kiseline pomoću, npr, algoritama koji su stavljeni na uvid javnosti u Zuker, Science 244:48-52 (1989); Jaeger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-10 (1989); Jaeger et al., Metode Enzvmol. 183:281-306 (1989). Razume se da bilo koja od metoda mogu biti tipično korišćene i da u nekim slučajevima rezultati ovih različitih metoda mogu da se razlikuju, ali prosečan poznavalac oblasti će razumeti da lije identitet pronađen barem sa jednom od ovih metoda, reklo bi se da sekvence imaju navedeni identitet i da su ovde stavljene na uvid javnosti.
[0067]U nekim slučajevima, kako je opisano u više detalja u donjem delu Metode, terapijske kompozicije koje su ovde stavljene na uvid javnosti mogu biti proizvedene korišćenjem genetičkog materijala (npr., DNK i/ili iRNK) izolovane ili prečišćene iz imunskih ćelija (npr., B ćelija, uključujući memorijske B ćelije) koje su dobijene korišćenjem metoda koje su ovde stavljene na uvid javnosti. Jednom kada je dobijen takav genetički materijal, metode za korišćenje istog da se proizvedu terapijske kompozicije ovde stavljene na uvid su poznate u oblasti i/ili su sažete ispod.
[0068]U nekim slučajevima, peptidi mogu da uključe detektabilnu oznaku. Kako je ovde korišćeno, "oznaka" se odnosi na deo koji ima najmanje jedan element, izotop, ili funkcionalnu grupu uključenu u deo koji omogućava detekciju peptida za koji je oznaka vezana. Oznake mogu biti direktno vezane, (tj. putem veze) ili mogu biti vezane preko veznika (linkera) (npr., kao što su, ciklični ili neciklićni, razgranati ili nerazgranati, supstituisani ili nesupstituisani alkilen; ciklični ili neciklični, razgranati ili nerazgranati, supstituisani ili nesupstituisani alkenilen; ciklični ili neciklični, razgranati ili nerazgranati, supstituisani ili nesupstituisani alkinilen; ciklični ili neciklični, razgranati ili nerazgranati, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkilen; ciklični ili neciklični, razgranati ili nerazgranati, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkenilen; ciklični ili neciklični, razgranati ili nerazgranati, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkinilen; supstituisani ili nesupstituisani arilen; supstituisani ili nesupstituisani heteroarilen; ili supstituisani ili nesupstituisani acilen, ili bilo koja kombinacija istih, koja može da nadoknadi veznik). Oznake vezane za peptid na bilo kom položaju koji ne ometa biološku aktivnost ili karakteristike inventivnog polipeptida koji se detektuje.
[0069]Oznake mogu da uključe: oznake koje sadrže izotopske ostatke, koji mogu biti radioaaktivni ili teški izotopi, uključujući, ali bez ograničenja na,<2>H,<3>H<13>C, 1<4>C, 1<5>N, jlP, 3<2>P,<35>S,67Ga,<99m>Tc(Tc-99m),<in>In,<123>I,<125>I,<169>Yb, i 186Re; oznake koje uključuju imunske ili imunoreaktivne delove, koji mogu biti antitela ili antigeni, koji mogu biti vezani za enzime {npr., kao što je peroksidaza rena); oznake koje su obojene, luminescentne, fosforescentne, ili uključuju fluorescentne delove (npr., kao što je fluorescentna oznaka FITC); oznake koje imaju jedan ili više fotoafinitetnih delova; oznake koje imaju delove liganada sa jednim ili više poznatih vezujućih parnjaka (kao što su biotin-streptavidin, FK506-FKBP, itd.).
[0070]U nekim slučajevima, oznake mogu da uključe jedan ili više fotoafinitetnih delova za direktno objašnjenje unutarmolekularnih interakcija u biološkim sistemima. Mnoštvo poznatih fotofora može biti korišćeno, najviše se oslanjajući na fotokonverziju diazo jedinjenja, azida, ili diazirina do nitrena ili karbena (videti, npr., Bayley, H., Photogenerated Reagents in Biochemistrv and Molecular Biologv (1983), Elsevier, Amsterdam). U određenim rešenjima predmetnog pronalaska, fotoafinitene oznake koje su upotrebljene su o-, m- i p-azidobenzoili, substituisani sa jednim ili više halogenih segmenata, uključujući, ali bez ograničenja na 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoevu kiselinu.
[0071]Oznake mogu takođe biti ili služiti kao imidžing agensi. Reprezentativni imidžing agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, one korišćene u pozitronskoj emisionoj tomografiji (PET), tomografiji uz pomoć kompjutera (CAT), kompjuterizovanoj emisionoj tomografiji pojedinačnim fotonom, rentgen, fluroskopija, i magnetni rezonantni imidžing (MRI), anti-emetici: i agensi za kontrast. Reprezentativni dijagnostički agensi uključuju ali nisu ograničeni na, fluorescentne segmente, luminescentne segmente, magnetne segmente, gadolinijum helate (npr., gadolinijum helati sa DTPA, DTPA-BMA, DOTA i HP-D03A), helate gvožđa, helate magnezijuma, helate manhana, helate bakra, helate hroma, materijali na bazi joda korisni za CAT i rendgenski imidžing, i radionuklide. Pogodni radionuklidi uključuju, ali nisu ograničeni na,<123>I,<125>I,<1>30I,<131>I,<133>I, 135I, 47Sc, 72As,<72>Se, 9<0>Y, 88Y, 97Ru,100Pd, ,01mRh,U9Sb,128Ba, l97Hg,211 At,2l2Bi, 212Pb,<1>09Pd, lllIn,67Ga,68Ga, 67Cu, 75Br, 77Br,99mTc,14C,13N,150, 3<2>P, 3<3>P, i 1<8>F.
[0072]Fluorescentni i luminescentni segmenti uključuju, ali nisu ograničeni na, mnoštvo različitih organskih ili neorganskih malih molekula obično nazivanih kao "boje," "oznake," ili "indickatori." Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, lluorescein, rodamin, akridin boje, Aleksa boje, cijaninske boje, itd. Fluorescentni i luminescentni segmenti mogu da obuhvate mnoštvo prirodnih proteina i njihovih derivata, npr., varijante genetičkog inženjeringa. Na primer, fluorescentni proteini uključuju zeleni fluorescentni protein (GFP), pojačani GFP, crveni, plavi, žuti, cijano, i safirne fluorescentne proteine, fluorescentne proteine koralnog grebena, itd. Luminescentni proteini uključuju luciferazu, aekvorin i derivate istih. Brojne fluorescente i luminescente boje i proteini su poznati u oblasti (videti, npr., Američku patentnu objavu 2004/0067503; Valeur, B., "Molecular Fluorescencija: Principles and Applications," John Wiley and Sons, 2002; i Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, Molecular Probes, 9th edition, 2002).
[0073]Termin "prečišćen" kako je ovde korišćeno, se odnosi na druge molekule, npr. polipeptid, molekule nukleinskih kiselina koji su identifikovani i odvijeni i/ili oporavljeni od komponente njegovog prirodnog okruženja. Tako, u jednom rešenju antitela korisna u predmetnom pronalasku su prečišćena antitela u kojima su oni razdvojeni od jedne ili više komponenti njihovog prorodnog okruženja.
[0074]Termin "epitop" kako je ovde korišćeno se odnosi na proteinsku determinantu sposobnu da vezuje antitelo. Epitopi obično obuhvataju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su amino kiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju karakterističnu specifičnu trodimenzionalnu strukturu, kao i svojstva specifičnog naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što vezivanje za prve ali ne i druge je izgubljeno i prisustvu denaturišućih rastvarača.
[0075]Nukleotidne sekvence koje odgovaraju (npr., kodirajuće) objavljenim peptidima (npr., stavljeni na uvid javnosti u tabeli 1) su ovde opisane. Ove sekvence uključuju sve degenerisane sekvence u vezi sa objavljenim peptidima, tj. sve nukleinske kiseline koje imaju sekvencu koja kodira jedan poseban peptid i varijante i derivati istih. Prema tome, dok svaka pojedinačna sekvenca nukleinske kiseline ovde možda nije napisana, razume se da su sve i svaka sekvenca je u stvari stavljena na uvid javnosti kroz objavljene polipeptidne sekvence.
[0076]U nekim slučajevima, nukleinske kiseline predmetne objave mogu da uključe ekspresione vektore. Primeri pogodnih vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide, veštačke hromozome, kao što su B AC, YAC, ili PAC, i viralne vektore.
[0077]Vektori opisani ovde takođe mogu da uključe, na primer, početke replikacije, i/ili markere. Marker gen može da dodeli selektabilni fenotip, npr., rezistenciju na antibiotik, na ćeliji. Proizvod markera je korišćen da se odredi da lije vektor bio isporučen na ćeliju i da li je eksprimiran kada je isporučen. Primeri selektabilnih markera za sisarske ćelije su dihidrofolat reduktaza (DHFR), timidin kinaza, analog neomicina G418, higromicin, puromicin, i blasticidin. Kada su takvi selektabilni markeri uspešno preneseni u sisarsku ćeliju domaćina, transformisana sisasrka ćelija domaćina može da preživi ako je postavljena pod selektivni pritisak. Primeri drugih markera obuhvataju, na primer, E. coli lacZ gen, zeleni fluorescentni protein (GFP), i luciferazu. Dodatno, ekspresioni vektor može da uključi sekvencu oznake dizajniranu da olakša manipulaciju ili detekciju (npr., prečišćavanje ili lokalizaciju) eksprimiranog polipeptida. Sekvence oznaka, kao što su GFP, glutation S-transferaza(GST), polihistidin, c-myc, hemaglutinin, ili FLAG™ oznaka (Kodak; New Haven, CT) sekvence su tipično eksprimirane kao fuzija sa kodiranim polipeptidom. Takve oznake mogu biti insertovane bilo gde u okviru polipeptida uključujući ili karboksilni ili amino terminus.
[0078]Ćelije su ovde opisane da sadrže nukleinske kiseline (npr., vektore) i/ili peptid koji su ovde stavljeni na uvid javnosti. Ćelije mogu da uključe, na primer, eukariotske i/ili prokariotske ćelije. Uglavnom, ćelije koje mogu biti korišćene ovde su komercijalno dostupne od Američke kolekcije tipova kultura (American Type Culture Collection - ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108. See also F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, (1998). Metode transformacije i transfekcije korisne u generisanju ćelija stavljenih ovde na uvid javnosti su opisane, npr., in F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, NY, (1998).
Farmaceutske formulacije
[0079]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije koje su ovde stavljene na uvid javnosti mogu da uključe druga jedinjenja, lekove, i/ili agense koji se koriste za lečenje kancera. Takva jedinjenja, lekovi i/ili agensi mogu da uključe, lekove za hemioterapiju, lekove u vidu malih molekula ili antitela koja stimulišu imuni odgovor kod određenog kancera. U nekim slučajevima, terapijske kompozicije mogu da uključe, na primer, jedan ili više peptida koji su ovde objavljeni ijedan ili više anti-CTLA-4 antitela ili peptida, anti-PD-1 antitelo ili peptid, i/ili anti-PDL-1 antitelo ili peptid. Na primer, u nekim slučajevima, terapijske kompozicije stavljene ovde na uvid javnosti mogu biti kombinovane sa jednim ili više (npr., jedan, dva, tri, četiri, pet, ili manje od deset) jedinjenja.
[0080]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije stavljene ovde na uvid javnosti mogu da uključe druga jedinjenja uključujući histon deacetilazne inhibitore ("HDAC"). Primeri HDAC inhibitora obuhvataju, na primer, hidroksamičnu kiselinu, Vorinostat (Zolinza); suberoilanilid hidroksamičnu kiselinu (SAHA)(Merck), Trihostatin A (TSA), LAQ824 (Novartis), Panobinostat (LBH589) (Novartis), Belinostat (PXD101)(CuraGen), ITF2357 Italfarmaco SpA (Cinisello), Ciklični tetrapeptid; Depsipeptid (romidepsin, FK228) (Gloucester Pharmaceuticals), Benzamid; Entinostat (SNDX-275/MS-275)(Syndax Pharmaceuticals), MGCD0103 (Celgene), alifatične kiseline sa kratkim lancem, Valproinsku kiselinu, fenil butirat, AN-9, pivaneks (Titan Pharmaceutical), CHR-3996 (Chroma Therapeutics), i CHR-2845 (Chroma Therapeutics).
[0081]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije stavljene ovde na uvid javnosti mogu da uključe druga jedinjenja uključujući inhibitore proteazoma, uključujući, na primer, Bortezomib, (Millennium Pharmaceuticals), NPI-0052 (Nereus Pharmaceuticals), Carfilzomib (PR-171)(Onyx Pharmaceuticals), CEP 18770, i MLN9708
[0082]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije stavljene ovde na uvid javnosti mogu da uključe alkilujuće agense kao što su melfalan i topoizomerazni inhibitori kao što je Adriamicin (doksorubicin) koji su pokazani da povećavaju MICA ekspresiju, što bi moglo da poveća efikasnost anti-MICA monoklonskog antitela.
[0083]U nekim slučajevima, terapijske kompozicije stavljene ovde na uvid javnosti mogu biti formulisane za primenu kao ili u farmaceutskim kompozicijama. Takve kompozicije mogu biti formulisane ili adaptirane za administriranje subjektu na bilo koji način, npr., bilo koji način koji je odobren od strane Uprave za hranu i lekove (Food and Drug Administration - FDA). Reprezentativne metode su opisane u upustvu Uprave za hranu i lekove „CDER Data Standards Manual", broj verzije 004 (koji je dostupan na fda.give/cder/dsm/DRG/drg00301 .htm).
[0084]U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije mogu da uključe efikasnu količinu jednog ili više peptida. Termini "efikasna količina" ili "efikasan da leči," kako je ovde korišćeno, odnose se na količinu ili koncentraciju jednog ili više peptida tokom perioda vremena (uključujući akutnu ili hroničnu administraciju i periodičnu ili neprekidnu administraciju) koja je efikasna u okviru konteksta njegove administracije za uzrokovanje željenog dcjstva ili fiziološkog ishoda.
[0085]U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije mogu da uključe jedan ili više petida i bilo koji farmaceutski prihvatljiv transporter, adjuvans, i/ili nosač. U nekim slučajevima, farmaceutske supstance mogu dalje da obuhvate jedan ili više dodatnih terapijskih agenasa u količinama efikasnim za postitanje modulacije bolesti ili simptoma bolesti.
[0086]Termin "farmaceutski prihvatljiv transporter ili adjuvans" se odnosi na transporter ili adjuvans koji može biti administriran pacijentu, zajedno sa peptidom koji je ovde opisan, i koji ne uništava farmakološku aktivnost istih i netoksičan je kada se administrira u dozama dovoljnim da se isporuči terapijska količina jedinjenja.
[0087]Farmaceutski prihvatljivi transporteri, adjuvansi i nosači koji mogu biti korišćeni u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, transportere, adjuvanse i nosače koji mogu biti korišćeni u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na izmenjivače jona, aluminijum, aluminijum stearat, lecitin, samo-emulgujući sistemi za isporuku lekova (emulsifving drug deliverv svstems - SEDDS) kao što su d-I-tokoferol polietilenglikol 1000 sukcinat, surfaktanti korišćeni u farmaceutskim doznim oblicima kao što su Tvinovi (Tween) ili drugi slični polimerni materijali za isporučivanje, serumski proteini, kao što su serum albumim, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, delimične gliceridne smeše zasićenih biljnih masnih kiselina, voda, soli ili elektroliti, kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, cinkove soli, koloidni silicijum dioksid, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze, polietilen glikol, natrijum karboksimetilceluloza, poliakrilati, voskovi, polietilen-polioksipropilen-blok polimeri, polietlien glikol i vunena mast. Ciklodekstrini kao što su I-, ?-, i K-ciklodekstrin, mogu takođe biti povoljno korišćeni da pojačaju isporuku jedinjenja sa formulama opisanim ovde.
[0088] Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu da obuhvate bilo koje konvencionalne ne-toksične farmaceustki prihvatljive transportere, adjuvanse ili nosače. U nekim slučajevima, pH formulacije može biti prilagođen sa farmacetski prihvatljivim kiselinama, bazama ili puferima da se pojača stabilnost formulisanog jedinjenja ili njegov oblik za isporučivanje. Termin parcntcralno kako je ovde korišćeno uključuje subkutanc, intrakutane, intravenozne, intramuskularne, intraartikularne, intraarterijalne, intrasinovijalne, intrasternalne, intratekalne, intralezionalne, i intrakranijalne injekcije ili infuzione tehnike.
[0089] Farmaceutske kompozicije mogu biti u obliku rastvora ili praha za inhalaciju i/ili nazalnu administraciju. Takve kompozicije mogu biti formulisane prema tehnikama poznatim u oblasti korišćenjem pogodnih dispergujućih agenasa ili agenasa za vlaženje (kao što je, na primer, Tween 80) i suspendujućih agenasa. Sterilni injektabilni preparat može takođe biti sterilni injektabilni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom diluentu ili rastvaraču, na primer, kao rastvor u 1,3-butandiolu. Među prihvatljivim nosačima i rastvaračima koji mogu biti upotrebljeni su manitol, voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Dodatno, sterilna, stabilna ulja, su konvencionalno upotrebljena kao rastvarač ili suspendujući medijum. U ovu svrhu, bilo koje blago stabilno ulje može biti upotrebljeno uključujući sintetičke mono- ili diglideride. Masne kiseline, kao što su oleinska kiselina i njeni gliceridni derivati su korisni u pripremanju injektabilnh preparata, kao što su farmaceutski prihvatljiva ulja, kao što su maslinovo ulje ili ricinusovo ulje, posebno u njihovim polioksietilovanim verzijama. Ovi uljani rastvori ili suspenzije mogu takođe da sadrže dilucnt alkohola dugog lanca ili dispcrzant, ili karboksimctil celulozu ili slična dispergujuća sredstva koja se obično koriste u formulaciji ili framaceutski prihvatljivim doznim oblicima kao što su emulzije ili suspenzije. Drugi uobičajeno korišćeni surfaktanti kao što su Tween ili Span i/ili drugi slični emulgujući agensi ili pojačivači biodostupnosti koji su obično korišćeni u proizvodnji farmaceutski prihvatljive čvrste supstance, tečnosti, ili drugih doznih oblika mogu takođe biti korišćeni u formulacijama.
[0090] Farmaceutske kompozicije mogu biti oralno administrirane u bilo kom oralnom prihvatljivom doznom obliku uključujući, ali bez ograničenja na, kapsule, tablete, emulzije, i vodene suspenzije, disperzije i rastvore. U slučaju tableta za oralnu upotrebu, transporteri koji su obično korišćeni uključuju laktozu i kukuruzni škrob. Agensi za lubrikaciju, kao što su magnezijum stearat, su takođe tipično dodavani. Za oralnu administraciju u obliku kapsule, korisni diluenti uključuju laktozu i osušeni kukuruzni škrob. Kada su vodene suspenzije i/ili emulzije administrirane oralno, aktivni sastojak može biti suspendovan ili rastvoren u uljanoj fazi je kombinovan sa emulgujućim //ili suspendujućim agensima. Ako je poželjno, određeni agensi za zaslađivanje i/ili dodavanje ukusa i/ili bojenje mogu biti dodati.
[0091] Alternativno ili dodatno, farmaceutske kompozicije mogu biti administrirane nazalnim aerosolom ili inhalacijom. Takve kompozicije su pripremljene prema tehnikama koje su dobro poznate u oblasti farmaceutskih formulacija i mogu biti pripremljene kao rastvori u slanom rastvoru, upotrebljavajući benzil alkohol ili druge pogodne konzervanse, apsorpcione promotere kako bi se poboljšala biodraspoloživost, fluorougljenike, i/ili druge solubilizirajuće ili dispergujuće agense koji su poznati u oblasti.
[0092] Metode su opisane ovde za korišćenje bilo kog jednog ili više peptida ili farmaceutskih kompozicija (označeni sipod kao 'X') koji su stavljeni ovde na uvid javnosti u sledećim metodama: Supstanca X za primenu kao lek za lečenje jedne ili više bolesti ili stanja koji su stavljeni ovde na uvid javnosti (npr., kancer, označen u sledećim primerima kao 'Y'). Primena supstance X za proizvodnju leka za lečenje Y; i supstanca X za primenu u lečenju Y.
[0093] U nekim slučajevima, terapijske kompozicije stavljene ovde na uvid javnosti mogu biti formulisane za prodaju u SAD, uvoz u SAD, i/ili izvoz iz SAD-a.
Metode
[0094]U nekim slučajevima, metode mogu da uključe selekciju humanog subjekta koji ima ili je imao stanje ili bolest i koji ispoljava ili je ispoljavao pozitivan imuni odgovor prema stanju ili bolesti. U nekim slučajevima, pogodni subjekti uključuju, na primer, subjekte koji imaju ili su imali stanje ili bolest ali su resili bolest ili aspekt istog, prisutne smanjene simptome bolesti (npr., u odnosu na druge subjekte (npr., većina subjekata) sa istim stanjem ili bolešću), i/ili koji preživljavaju tokom produženih perioda vremena sa stanjem ili bolešću (npr., u odnosu na druge subjekte (npr., većina subjekata) sa istim stanjem ili bolešću, npr., u stanju bez simptoma (npr., u odnosu na druge subjekte (npr., većina subjekata) istim stanjem ili bolešću). U nekim slučajevima, subjekti mogu biti odabrani ako su vakcinisani (npr., prethodno vakcinisani i/ili vakcinisani ili revakcinisani (npr., primili dodatnu vakcinu (revakcinu)) za stanje ili bolest.
[0095]Termin "subjekat," kako je ovde korišćeno, se odnosi na bilo koju životinju. U nekim slučajevima, subjekat je sisar. U nekim slučajevima, termin "subjekat", kako je ovde korišćeno, se odnosi na čoveka (npr., čovek, žena, ili dete). Uzorci za primenu u metodama mogu da uključe uzorke seruma, npr., dobijene od odabranog subjekta.
[0096]U nekim slučajevima, odabir subjekata može da uključi dobijanje uzorka od subjekta (npr., subjekat kandidat) i testiranje uzorka za indikaciju daje subjkeat pogodan za selekciju. U nekim slučajevima, subjekat može biti potvrđen ili identifikovan, npr., od strane zdravstvenog stručnjaka, kao da je imao ili ima stanje ili bolest. U nekim slučajevima, prikaz pozitivnog imunog odgovora prema stanju ili bolesti može biti sačinjen na osnovu evidencije o pacijentu, porodične istorije, i/ili detekcije indikacije pozitivnog imunog odgovora. U nekim slučajevima više grupa može biti uključeno u selekciju subjekata. Na primer, prva grupa može da pribavlja uzorak od subjekta kandidata i druga grupa može da testira uzorak. U nekim slučajevima, subjekti mogu biti odabrani i/ili preporučeni od lekara opšte prakse (npr., lekar). U nekim slučajevima, selekcija subjekata može da uključi dobijanje uzorka od selektovanog subjekta i čuvanje uzorka i/ili korišćenje u metodama koje su stavljene ovde na uvid javnosti. Uzorci mogu da uključe, na primer, ćelije ili populacije ćelija.
[0097]U nekim slučajevima, dobijanje ili ciljanje imunskih ćelija može da uključi jedan ili više kombinacija od, na primer: dobijanje ili obezbeđivanje tetramemih imunogena koji mogu da se vežu (npr., vežu specifično) za ciljnu imunsku ćeliju; kontakt tetramernog imunogena sa uzorkom; detekcija tetramernog imunogena; određivanje da li je tetramerni imunogen vezan za ciljnu imunsku ćeliju, zatim dobijanje ciljne imunske ćelije.
[0098]Tetramerni imunogeni mogu da uključe imunogene u vezi sa stanjem ili bolešču i/ili koji se vezuju (npr., vezuju specifično) za ciljnu imunsku ćeliju, npr., gde ciljna imunska ćelija se odnosi na odabrano stanje ili bolest. Imunogeni i ciljne imunske ćelije u vezi sa određenim stanjem ili bolešću uključuju, na primer, imunogene ili imunske ćelije prisutne kod subjekta bez stanja ili bolesti; i/ili imunogene ili imunske ćelije prisutne u izmenjenim nivoima (npr., povećanim) kod subjekata sa određenim stanjem ili bolešću u odnosu na subjekte bez stanja ili bolesti. U nekim slučajevima, imunogeni ili imunske ćelije mogu biti specifične za kancer. Imunogeni mogu biti solubilni. Tetramerni imunogen može da uključi tetramerni (uključujući, npr., tetramerizovan monomerni, dimerni, i/ili trimerni antigenski imunogen (npr., antigen i/ili epitop). U nekim slučajevima, tetramerni imunogen ima povećano vezivanje za ćeliju u odnosu na nivo vezivanja između ne-tetramernog oblika imunogena za ćeliju pod sličnim uslovima. U nekim slučajevima, tetramerni antigen uključuje detektabilni deo, npr., streptavidinski deo. Metode tetramerizacije su poznate u oblasti i stavljene su ovde na uvid javnosti.
[0099] Detektovanje tetramernog imunogena i/ili određivanje da li je tetramerni imunogen vezan za ciljnu ćeliju može biti izvedeno korišćenjem metoda poznatih u oblasti i/ili stavljenih ovde na uvid javnosti. Na primer, metode mogu da uključe protočnu citometriju. Optimizacione metode za protočnu citometriju, uključujući metode sortiranja i gejtovanja (vrstu selekcije), su poznate u oblasti i/ili su stavljene ovde na uvid javnosti. U nekim slučajevima, metode mogu da uključe analizu nivoa vezivanja, afiniteta vezivanja, i/ili specifičnosti vezivanja između tetramernog imunogena vezanog za ciljnu imunsku ćeliju. Na primer, ciljna imunska ćelija može biti dobijena ako (npr., samo ako) unapred određeni nivo vezivanja između tetramernog imunogena i targetne imune ćelije je određen. Unapred određeni nivoi vezivanja mogu biti specifični nivo i/ili mogu biti relativni nivoi. Dobijanje ciljnih imunskih ćelija može da obuhvati dobijanje, obezbeđivanje, identifikaciju, selekciju, prečišćavanje, i/ili izolovanje ciljne imunske ćelije. Takve metode mogu da uključe, na primer, metode sortiranja ćelija, obogaćivanje ćelija, i/ili smanjenje pozadinskih efekata (okoline).
[0100] U nekim slučajevima, dobijanje imunskih ćelija usmerenih na sopstveni antigen može da uključi jednu ili više i/ili kombinacije od, na primer, identifikacija subjekta koji ispoljava pozitivni imunski odgovor prema sopstvenom antigenu; kontakt multimernog oblika sopstvenog antigena sa uzorkom od subjekta koji ispoljava pozitivni imuni odgovor prema sopstvenom antigenu; dobijanje imunskih ćelija vezanih za multimerni oblik sopstvenog antigena.
[0101] U nekim slučajevima, metode mogu da uključe dobijanje imunskih ćelija usmerenih na sopstveni antigen od kancerskog pacijenta, mogu da uključe jednu ili više i/ili kombinacije od, na primer, identifikacije subjekta koji ispoljava pozitivni imuni odgovor prema sopstvenog antigenu; obezbeđivanje multimernog oblika sopstvenog antigena; kontakt multimernog oblika sopstvenog antigena sa uzorkom od subjekta koji ispoljava pozitivni imuni odgovor prema sopstvenom antigenu; i dobijanje imunskih ćelija vezanih za multimerni oblik sopstvenog antigena.
[0102] Multimerni oblici sopstvenog antigena mogu da uključe sopstvene antigene u vezi sa stanjem ili bolešću i/ili koji se vezuju (npr., vezuju specifično) za ciljnu imunsku ćeliju, npr., gde ciljna imunska ćelija je u vezi sa odabranim stanjem ili bolešću. Sopstveni antigeni i ciljne imunske ćelije u vezi sa stanjem ili bolešću uključuju, na primer, antigene ili imunske ćelije prisutne kod subjekata sa određenim stanjem ili bolešću, ali ne kod subjekata bez stanja ili bolesti; i/ili imunogene ili imunske ćelije prisutne u izmenjenim nivoima (npr., povećanim) kod subjekata sa određenim stanjem ili bolešću u odnosu na subjekte bez stanja ili bolesti. U nekim slučajevima, stanje ili bolest može biti kancer. U nekim rešenjima, kancer je melanom, kancer pluća, dojke, bubrega, ovarijuma, prostate, pankreasa, želudca, i debelog creva, limfom ili leukemija. U nekim slučajevima, soptsveni antigeni ili imunske ćelije mogu biti specifični. Sopstveni antigeni mogu bti solubilni. Multimerni oblik sopstvenog antigena može da uključi tetramerni oblik (uključujući, npr., tetramerizovani monomemi, dimerni, i/ili trimerni antigen) sopstvenog antigena (npr., antigen i/ili epitop). U nekim slučajevima, multimerni oblik sopstvenog antigena uključuje detetabilni segment, npr., streptavidinski segment. Metode multimerizacije su poznate u oblasti i ovde su stavljene na uvid javnosti.
[0103] Metode za izolaciju ili prečišćavanje genetičkog materijala (npr., DNK i/ili iRNK) iz dobijene ciljne imunske ćelije su poznate u oblasti i prikazane u primerima ispod. Jednom kad se dobije takav genetički materijal, metode za korišćenje istog da se proizvedu terapijske kompozicije stavljene ovde na uvid javnosti su poznate u oblasti i/ili su rezimirane ispod. Kao što je gore razmotreno, genetički materijal može biti raznolik, korišćenjem tehnika poznatih u oblasti da se ki'eiraju peptidne varijante stavljene ovde na uvid javnosti.
[0104] Generisanje peptida od nukleinskih kiselina (npr., cDNK) koji su obuhvaćeni unutar ili dobijeni od ciljne ćelije mogu da uključe, na primer, analizu, npr., sekvenciranje varijabilnih domena teškog i lakog lanca iz ciljne imunske ćelije (npr., pojedinačnih ili izolovanih identiflkovanih ciljnih imunskih ćelija). TJ nekim slučajevima, metode mogu da uključe generisanje kompletno humanih antitela, ili njihovih fragmenata (npr., kako je stavljeno iznad na uvid javnosti), i humanizovanje ne-humanih antitela. DNK može biti lako izolovana i/ili sekvencirana iz dobijenih imunskih ćelija korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., pomoću oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se vezuju specifično za gene koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela).
[0105]Jednom izolovana, DNK može biti postavljena u ekspresione vektore, koji su zatim transfektovani u ćelije domaćina kao što suEscherichia colićelije, majmunske COS ćelije, ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), ili ćelije mijeloma koje drugačije ne proizvode proteinska antitela, da se prourokuje sinteza monoklonskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. Revijski radovi na temu rekombinantne ekspresije kod bakterija kod kojih DNK kodira antitelo obuhvataju Skerra et al., Curr. Opinion in Tmmunol., 5:256-262
(1993) i Pluckthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992).
[0106]Rekombinantna ekpresija antitela ili varijanti istog generalno zahteva konstruisanje ekspresionog vektora koji obuhvata polinukleotid koji kodira antitelo. Prema tome, replikabilni vektori su opisani ovde koji sadrže nukleotidnu sekvencu koja kodira molekul antitela, težak ili lak lanac antitela, varijabilni domen teškog ili lakog lanca antitela ili deo istog, ili težak ili lak lanac CDR, operativno vezan za promoter. Takvi vektori mogu da uključe nukleotidnu sekvencu koja kodira konstantni region molekula antitela (videti, npr., Američke patente br. 5,981,216; 5,591,639; 5,658,759 i 5,122,464) i varijabilni domen antitela može biti kloniran u takav vektor za ekspresiju za ceo težak, ceo lak lanac, ili oba teška i laka lanca u celosti.
[0107]Jednom kad je ekspresioni vektor prebačen u ćeliju domaćina pomoću konvencionalnih tehnika, i transfektovane ćelije su zatim kultivisane konvencionalnim tehnikama da se proizvede antitelo. Tako, ćelije domaćina su opisane ovde da sadrže polinukleotid koji kodira antitelo korisno u predmetnom pronalasku ili fragmenti istog, ili težak ili lak lanac istog, ili deo istog, ili jednolančano antitelo korisno u predmetnom pronalasku, operativno vezano za heterologni promoter. U doređenim rešenjima za ekspresiju antitela sa duplimlancima, vektori koji kodiraju i teške i lake lance mogu biti istovremeno eksprimirani u ćeliji domaćina za ekspresiju celog imunoglobulinskog molekula, kako je opisano u detaljima ispod.
[0108]Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela su dobro poznate u oblasti i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije dosupne od strane Američke kolekcije tipova kultura (ATCC), uključujući ali ne ograničavajući se na ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije mladunčeta hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), humane ćelije hepatocelularnog karcinoma (npr., Hep G2), humane epitelne ćelije bubrega 293, i nekoliko drugih ćelijskih linija. Različite ćelije domaćina imaju karakteristike i specifične mehanizme za obradu nakom translacije i modifikacije proteina i genskih produkata. Odgovarajuće ćelijske linije ili sistemi domaćina mogu biti izabrani da se osigura ispravna modifikacija i obrada antitela ili njegovog dela koji je eksprimiran. U tom cilju, eukariotske ćelije domaćina koje poseduju ćelijsku mašineriju za odgovarajuće obrađivanje primarnog transkripta, glikozilaciju, i fosforilaciju genskog produkta mogu biti korišćene. Takve sisarske ćelije domaćina uključuju ali nisu ograničene na CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 i T47D, NSO (ćelijska linija mišjeg melanoma koja endogeno ne proizvodi bilo kakve funkcionalne imunoglobulinske lance), SP20, CRL7030 i HsS78Bst ćelije. U jednom rešenju, humane ćelijske linije razvijene imortalizacijom humanih limfocita mogu biti korišćene da se rekombinantno proizvedu monoklonska antitela. U jednom rešenju, humana ćelijska linija PER.C6. (Crucell, Netherlands) može biti korišćena da se rekombinantno proizvedu monoklonska antitela.
[0109]U nekim slučajevima, peptidi stavljeni ovde na uvid javnosti mogu biti generisani sintetički. Sintetičke hemijske trans formacije i metodologije zaštitnih grupa (protekcija i deprotekcija (uklanjanaje zaštite)) korisni u sintezi peptida opisanih ovde su poznati u oblasti i uključuju, na primer, one kao što su opisani u R. Larock, Comprchcnsivc Organic Transformations, VCH Publishers (1989); T.W. Greene i P.G.M. Wuts, Protective Groups u Organic Svnthesis, 3d. Ed., John Wiley and Sons (1999); L. Fieser and M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for Organic Svnthesis, John Wiley and Sons (1994); i L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995), i njihova kasnija izdanja.
[0110]Peptidi mogu takođe biti napravljeni pomoću metoda hemijske sinteze, koje su dobro poznate prosečnom poznavaocu oblasti. Videti, na primer, Fields et al., Chapter 3 in Sintetički Peptids: A User's Guide, ed. Grant, W. H. Freeman & Co., New York, N.Y., 1992, p. 77. Stoga, peptidi mogu biti sintetisani korišćenjem automatizovanim Merrifield tehnikama sinteze čvrste faze saC1-NH2zaštićenim pomoću ili t-Boc ili Fmoc hernije korišćenjem amino kiselina sa zaštićenim bočnim lancem na, na primer, modelu Applied Biosystems Peptid Synthesizer Model 43 0A or 431.
[0111]C-terniinalna amino kiselina je prikačena na unakrsno-povezanu polistirensku smolu putem kisele labilne veze sa molekulom veznika. Ova smola je nerastvorna u rastvaračima korišćenim za sintezu, čineći relativno jednostavnim i brzim uklanjanje viška reagensa i nus proizvoda pranjem. N-terminus je zaštićen sa Fmoc grupom, koja je stabilna u kiselini, ali koaj može a se ukloni pomoću baze. Bilo koje funkcionalne grupe bočnih lanaca su zaštićene sa bazom stabilne, kisele labilne grupe.
[0112]duži peptidi mogu biti načinjeni sjedinjavanjem pojedinačnih individalnih peptida korišćenjem nativne hemijske ligacije. Alternativno, duži sintetički peptidi mogu biti sintetisani dobro poznatim tehnikama rekombinantne DNK. Takve tehnike su obezbeđene u dobro poznatim standardnim uputstvima sa detaljnim protokolima. Da se kontruiše gen koji kodira peptid opisan ovde, sekvenca amino kisline je reverzno translatirana da se dobije sekvenca nukleinske kiseline koja kodira sekvencu amino kiseline, poželjno sa kodonima koji su optimum za organizme u kojima se gen eksprimira. Zatim, sintetički gen je napravljen, tipično sintetisanjem oligonukleotida koji kodiraju peptid i bilo koje regulatorne elemente, ako je neophodno. Sintetički gen je insertovan u pogodni vektor za kloniranje i transfektovan u ćeliju domaćina. Peptid je zatim eksprimiran pod pogodnim uslovima odgovarajućim za odabrani eskpresioni sistem i domaćina. Peptid je prečišćen i okarakterisan pomoću standardnih metoda. [0113|Peptidi mogu biti napravljeni u visoko-propusnom, kombinatornom maniru, npr., korišćenjem visoko-propusnog multiplog kanalnog kombinatornog sintetizatora (high-throughput multiple channel combinatorial svnthesizer) dostupnog od Advanced Chemtech.
[0114]Peptidne veze mogu biti zamenjene, npr., da se poveća fiziološka stabilnost peptida, pomoću: retro-inverznih veza (C(O)-NH); smanjene amino veze (NH-CH2); tiometilen veze (S-CH2ili CH2-S); oksomctilcn veze (O-CH2ili CH2-O); etilen veze (CH2-CH2); tioamid veze (C(S)-NH); trans-olefin veze (CH=CH); fluoro supstituisane trans-olefin veze (CF=CH); ketometilen veze (C(O)-CHR) ili CHR-C(O) gde R je H ili CFb; i fluoro-ketometilen veze (C(O)-CFR ili CFR-C(O) gde R je H ili F ili CH3.
[0115]Peptidi mogu dalje biti modifikovani pomoću: acetilacija, amidacija, biotinilacija, cinamoilacija, famezilacija, fluoresceinacija, formilacija, miristoilacija, palmitoilacija, fosforilacija (Ser, Tyr ili Thr), stearoilacija, sukcinilacija i sulfurilacija kako je naznačeno iznad, peptidi mogu biti konjugovani za, na primer, polietilen glikol (PEG); alkil grupe (npr., C1-C20 ravne ili razgranate alkil grupe); radikale masnih kiselina; i njihove kombinacije.
[0116]U nekim slučajevima, peptidi mogu biti prečišćeni pomoću bilo koje metode koja je poznata u oblasti za prečišćavanje imunoglobulinskog molekula, na primer, pomoću hromatografije (npr., jono izmenjivačka, aiinitetna, naročito pomoću afiniteta za specifične antigene protein A ili protein G, i hromatografija na koloni za razdvajanje po veličini), centrifugiranje, diferencijalna solubilnost, ili bilo kojom dragom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Dalje, antitela korisna u predmetnom pronalasku ili fragmenti istih mogu biti fuzionisani za heterologne polipeptidne sekvence (označene ovde kao „oznake") opsiane su iznad ili drugačije poznate u oblasti da olakšavaju prečišćavanje.
[0117]Primerni, ne-ograničavajući, pregled metoda je prikazan na Slici 21. Redosled nije bitan.
Metode primene
[0118]Metode lečenja su opisane ovde koje obuhvataju aministriranje subjektu kompozicije stavljene ovde na uvid javnosti.
[0119]Metode za lečenje i/ili prevenciju kancera ili simptoma kancera kod subjekta su opisane ovde koje sadrže administraciju subjektu terapijski efikasne količine kompozicije koja sadrži peptid koji se imunospecifično vezuje za polipeptidu-srodne sekvence A MHC kalse T (MICA), gde peptid sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 Vhantitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, i CDR3 Vl antitela čiji je ID 1, 6, 7, 8 ili 9 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija. U nekim rešenjima kancer je kancer povezan sa prekomernom ekspresijom MICA. U nekim rešenjima, kancer je melanom, karcinom pluća, dojke, bubrega, jajnika, prostate, pankreasa, želudca, i kolona, limfom ili leukemija. U nekim rešenjima, kancer je melanoma. U nekim rešenjima, kancer je malignitet plazma ćelija, na primer, multipli mijelom (MM) ili premaligno stanje plazma ćelija. U nekim rešenjima subjektu je postavljena dijagnoza da ima kancer ili da ima predipoziciju za kancer.
[0120]Metode za lečenje i/ili prevenciju kancera ili simptoma kancera kod subjekta koje su ovde opisane sadrže administraciju subjektu terapijski efikasne količine kompozicije koja sadrži izolovano antitelo koje se specifično vezuje za sekvencu A specifičnu za polipeptid MHC klase I (MICA), gde antitelo sadrži varijablni region teškog lanca (VH) koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 kako je prikazano u VH sekvenci sa SEQ ID NO: 11, 149, 168, 186, ili 204 i varijabilni region lakog lanca (VL) sekvence sa SEQ ID No: 4, 151, 170, 189, ili 206.
[0121]Takođe su ovde opisane metoda za lečenje i/ili prevenciju kancera ili simptoma kancera kod subjekta koji sadrže administraciju subjektu terapijski efikasne količine peptida koji se imunospecifično vezuje za angiopoetin, gde peptid sadrži region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 VH antitela čiji je ID 2, 3, 4 ili 5 ili 10 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija, i CDR3 VL antitela čiji je ID 2, 3, 4 or 5 koji su prikazani u Tabeli 1 koji imaju 5 ili manje konzervativnih amino kiselinskih supstitucija. U nekim rešenjima kancer je povezan sa prekomernom ekspresijom MICA. U nekim rešenjima, kancer je melanom, karcinom pluća, dojke, bubrega, jajnika, prostate, pankreasa, želudca, i kolona, limfom ili leukemija. U nekim rešenjima, kancer je melanom. U nekim rešenjima, kancer je malignitet plazma ćelija, na primer, multipli mijelom (MM) ili premaligno stanje plazma ćelija. LT nekim rešenjima subjektu je postavljena dijagnoza da ima kancer ili da ima predipoziciju za kancer.
[0122]Metode za lečenje i/ili prevenciju kancera ili simptoma kancera kod subjekta koje su ovde opisane sadrže administraciju subjektu terapijski efiakasne količine kompozicije koja sadrži izolovano antitelo koje se specifično vezuje za angiopoetin (npr., angiopoetin-2), gde antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži VH CDR1, VH CDR2, i VH CDR3 kako je prikazano u VH sekvenci sa SEQ ID NO: 20, 38, 56, 74, 222 i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) sekvence sa SEQ ID No: 29, 47, 65, 83, ili 224.
[0123]Simptomi kancera su dobro poznati prosečnim poznavaocima oblasti i obuhvataju, bez ograničenja, neobična svosjstva mladeža, pramenu u izgledu mladeža, uključujući asimetriju, ivice, boju i/ili dijametar, novo pigmentovani deo kože, abnormalni mladež, tamnu oblast ispod kože, čvoriće na dojci, promene na bradavicama, ciste an dojkama, bol u grdima, smrt, gubitak težine, slabost, preteran zamor, otežano uzimanje hrane, gubitak apetita, hronični kašalj, pogoršavanje kratkog daha, iskašljavanje krvi, krv u urinu, krv u stolici, mučninu, povraćanje, metastazu jetre, metastazu kostiju, abdominalnu punačkost, nadimanje, tečnost u peritonealnoj šupljini, vaginalno krvarenje, konstipaciju, abdominalnu distenziju, perforaciju kolona, akutni peritonitis (infekcija, groznica, bol), bol, povraćanje krvi, jako znojenje, groznicu, visok krvni pritisak, anemiju, dijareju, žuticu, vrtoglavicu, drhtavicu, mišićni spazam, metastaze kolona, metastaze pluća, metastaze debelog creva, metastaze bešike, metastaze jetre, metastaze kostiju, i metastaze pankreasa, teško gutanje, i slično.
[0124]Metode stavljene ovde na uvid javnosti mogu biti primenjene na širok spektar vrsta, npr., ljude, primate koji nisu ljudi (npr., majmuni), konje, goveda, svinje, ovce, jelen, los, koze, pse, mačke, mustelide, zečeve, zamorčiće, hrčke, pacove, i miševe.
[0125]Termini "lečiti" ili "lečenje," kako je ovde korišćeno, se odnosi na delimično ili potpuno ublažavanje, inhibiranje, poboljšanje, i/ili oslobađanje od bolesti ili stanja od kojih subjekt pati. U nekim slučajevima, lečenje može rezultovati u nastavljenom odsustvu bolesti ili stanja o dkojeg subjekat pati.
[0126] Generalno, metode obuhvataju odabir subjekta koji ima rizik za ili ima stanje ili bolest. U nekim slučajevima, stanje ili bolest subjekta se može lečiti sa farmaceutskom kompozicijom stavljenom ovde na uvid javnosti. Na primer, u nekim slučajevima, metode uključuju odabiranje subjekta sa kancerom, npr., gde kancer subjekta može biti lečen pomoću ciljanja jednog ili oba od MICA i/ili angiopoetin-2.
[0127] U nekim slučajevima, metode lečenja mogu da uključe pojedinačnu administraciju, višestruke administracije, i ponavljajuće adminsitracije kako je zahtevano profilaksom ili lečenjem bolesti ili stanja od koje subjekat boluje. U nekim slučajevima metode lečenja mogu da uključe procenu nivoa bolesti kod subjekta pre lečenja, tokom lečenja, i/ili nakon lečenja. U nekim slučajevima, lečenje može da se nastavi do opaženog opadanja nivoa bolesti kod subjekta.
[0128] Termini "administrirati," "administriranje," ili "administracija," kako je ovde korišćeno se odnosi na implantaciju, apsorpciju, konzumiranje, injektiranje, ili udisanje, inventivnog peptida (tj. antitela ili fragmenta antitela), nezavisno od oblika. U nekim slučajevima, jedan ili više peptida koji su stavljeni ovde na uvid javnosti mogu biti administrirani subjektu topikalno (npr., nazalno) i/ili oralno. Na primer, metode ovde uključuju administraciju efikasne količine jedinjenja ili kompozicije jedinjenja da se dostigne željeni ili navedeni efekat. Specifični dozni i režimi lečenja za bilo kog posebnog pacijenta će zavisiti od mnoštva faktora, uključujući aktivnog specifičnog upotrebljenog jedinjenja, starosti, telesne težine, opšteg zdravstvenog stanja, pola, načina ishrane, vremena administracije, stope ekskrecije, kombinacije lekova, težine i toka bolesti, stanja ili simptoma, dispozicije pacijenta za bolest, stanja ili simptoma, i procene lekara koji leči.
[0129] Nakon administriranja, subjekat može biti pregeldan da se detektuje, proceni ili odredi njegov nivo bolesti. U nekim slučajevima, lečenje može da se nastavi do opažanja promene (npr., redukcije) nivoa bolesti kod subjekta.
[0130] Nakon poboljšanja pacijentovog stanja (npr., promene (npr., smanjenje) nivoa bolesti kod subjekta), doza održavanja jedinjenja, kompozicije ili kombinacije ovog pronalaska može biti administrirana, ako je potrebno. Zatim, doza ili učestalost administracije, ili oba, može biti smanjena, kao funkcija simptoma, do nivoa na kom se pobolljšano stanje održava. Pacijenti mogu, međutim, zahtevati isprekidano lečenje na dugoročnom nivou pri bilo kom vraćanju simptoma bolesti.
[0131]Metode za detektovanje imunskih ćelija npr., B ćelija i/ili memorijskih B ćelija, od humanog subjekta su ovde opisane. Takve metode mogu biti korišćene, na primer, kako bi sc pratili nivoi imunskih ćekija npr., B ćelija i/ili memorijskih B ćelija, kod humanog subjekta, npr., praćenjem događaja. Reprezentativni događaji mogu da uključe, ali nisu ograničeni na, detektovanje bolesti, infekciju; administraciju terapijske kompozicije stavljene ovde na uvid javnosti, administraciju terapijskog agensa ili režima lečenja, administraciju vakcine, indukovanje imunskog odgovora. Takve metode mogu biti upotrebljene na klinici i/ili za istraživanja.
PRIMERI
[0132]Predmetni pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima, koji ne ograničavaju obim predmetnog pronalaska opisan u patetntnim zahtevima.
[0133]Metode koje su ovde opisane dozvoljavaju osetljivu, specifičnu, i pouzdanu detekciju retkih memorijskih B ćelija, sa definisanom antigenskom specifičnošću, od ograničenih kvantiteta periferne krvi. Metode su dozvolile vizualizaciju i izolaciju memorijskih B ćelija mesecima ili godinama nakon što je antigen očišćen.
[0134]Dokaz principa metoda koje su stavljene ovde na uvid javnosti je uspostavljen korišćenjem tetramera tetanus toksinskog C-fragmenta (TTCF), kako je kako je detaljno opisano u Franz et al. (Blood, 118(2):348-357 (2011)).
[0135]TTCG (tj. C-terminalni netoksični fragment od 52 kDa, od TTCF) je odabran kao model antigen jer je većina pojedinaca vakcinisana sa tetanusnim toksoidom i titri izdržljivih IgG antitela su indukovani pomoću vakcine (Amanna et al., N. Engl. J. Med., 357:1903-1915, 2007). Prema tome, primena TTCF dala je veliki skup subjekata u kome bi metode koje su stavljene ovde na uvid javnosti mogle biti verifikovane. Prosečan poznavalac oblasti će ceniti, međutim, da prisutne metode mogu biti adaptirane da uključe bilo kakav antigen povezan sa bolestima korišćenjem rutinskih veština. Kako je pokazano u primerima ispod, takva adaptacija je prikazana preko sticanje antitela usmerenih na MICA i angiopoetin-2, kojis u antigteni povezani sa kancerom.
Primer 1: Ekspresija antigena i formiranje tetramera
[0136]Kako je opisano u daljem tekstu ispod, TTCF je eskprimiran uEschericia colii BirA mesto je prikačeno za N-terminus za mesto-specifičnu mono-biotinilacija pomoću BirA enzima. Fleksibilni veznik je postavljen između proteina i mesto biotinilacije da se spreči sterna smetnja vezivanja antitela. TTCF je prečišćen pomoću anjon-izmenjivačke hromatografije, biotinilovan sa BirA, i odvojen od slobodnog biotina i BirA gel filtracionom hromatograiijom. TTCF tctramcri su gcncrisani inkubacijom fluorescentno označenog streptavidina sa biotinilovanim TTCF antigenom u molamom odnosu od 1:4. Ovi tetrameri su zatim korišćeni zajedno sa panelom antitela (Abs) - mAbs za identifikaciju tetanusnih toksokoidnih specifičnih memorijskih B ćelija.
[0137]TTCF je kloniran u pET-15b (Novagen). Proteinska ekspresija je indukovana u BL21(DE3)Eschericia colisa ImM izopropil P-D-l-tiogalaktopiranozid (IPTG) tokom 4 sata na 28°C. Ćelije su isprane, lizirane, i dobijem" supematant je sakuplje. TTCf je prečišćen korišćenjem HIS-Select afinitetne kolone (Sigma). His-oznaka je uklonjena proteolitički. Mišji CD80 membranski proksimalni domen je proizveden korišćenjem sličnih metoda. Proteini su mono-biotinilovani. Za određene eksperimente, molekuli Alexa-488 boje (Molecular Probes) su vezani za primarne amine na biotinilovanim TTCF ili CD80.
[0138]Antigenski tetrameri su pripremljeni inkubacijom biotinilovanog antigena sa visoko kvalitetnim PE obeleženim streptavidinom (Molecular Probes) tokom najmanje 20 minuta na ledu pri molarnom odnosu od 4:1. Pre upotrebe, preparati tetramera su centrifugirani da se uklone agregati. U nekim ekperimentima, tetrameri su formirani sa Alexa-fluor-488 označenima antigenima i ne-fluorescentnim streptavidinom u razmeri 4:1.
Primer 2: Metode za identifikaciju
[0139]M etode su izvedene kao što je opisano u Franz et al., Blood, 118(2):348-357 (2011).
[0140]Ćelije su sortirane na aparatu za sortiranje (razvrstavanje) ćelija - BD FACS Aria II. ćelije su sortirane pojedinačno. Uzorci su prvo gejtovani (selektovani) na CD 19* ćelije koje su negativne za panel markera za isključenje (CD3, CD14, CD16, 7AAD) zatim gejtovani na plazmablaste, identifikovani pomoću visokih nivoa CD27 i neposrednog nivoa CD 19 ekspresije, i konačno na tetramer<+>CD19<+>ćelije.
[0141]Usled niske frekvencije memorijskih B ćelija, neophodno je pažljivo smanjiti pozadinske signale (efekte okoline) koliko god je moguće. B ćelije su prvo obogaćene negativnom selekcijom (koktel antitela za CD2, CD3, CD14, CD16, CD56 i glikoforin A) da se ukloni većina ćelija koje mogu nespecifilno da vežu tetramer. Obogaćene ćelije su podeljene jednako i obojene sa TTCF ili kontrolnim tetramerom praćeno obeležavanjem sa CD 19, CD27 i IgM da specifično selektuju memorisje B ćelije koje su zamenile klasu. Strategija gejtovanja (selekcije) uzimala je u ekspresiju CD 19, nedostatak obeležavanja sa panelom markera za iskuljučenje (CD3, CD 14, CD 16, 7AAD), ekspresija memorijskog markera CD27 i nedostatak IgM ekspresije kao dokaz zamene klasa. Bojenje tetramera je naneseno (ucrtano) naspram CD27 bojenja za vizuelizaciju memorijskih B ćelija sa antigcnskoms pccifičnošću od interesa. Tctramcr-pozitivnc B ćelije su direktno sortirane u PCR trake koje sadrže 3 ul iRNK pufera za ekstrakciju.
[0142]Epruvete su držane na hladnom tokom sortiranja i sortirane ćelije su zamrznute i čuvane na -80°C. CD 19+ CD27+ IgM- B ćelije su korišćene kao pozitivne kontrole.
[0143]Prethodno saopšten protokol „nest" PCR-a je korišćen za amplifikaciju varijabilnih segmenata teškog i lakog lanca (Wang et al., J. Immunol. Metode., 244:217-225, 2000). iRNK amplifikacija je izvedena u uslovima koji su pogodni za smanjenje kontaminacije. Primeri koji su korišćeni obuhvataju:
„Nested" (umreženi) RT-PCR je izveden kao što je opisano u Franz et al., Blood, 118(2):348-357(2011).
[0144]Negativne kontrole su bile uključene radi praćenja i čuvanja od kontaminacije. Od ukupno 35 pojedinačnih ćelija obeleženih sa TTCF tetramerom, 32 segmenta teških lanaca i 30 segmenta lakih lanaca su amplifikovani i direktno sekvencirani od gelom-prečišćenih PCR produkata, koji odgovaraju opštoj PCR efiaksnosti od 89%. Analiza sekvenci je otkrila da su TTCF tetramer<+>ćelije koristile mnoštvo različitih VhD-Jhgenskih segmenata, bez dominacije jednog posebnog genskog segmenta. Sekvence koje su posmatrane pokazale su da klonovi koji predstavljaju ćelije modifikovane somatskom hipermutacijom.
[0145]Proizvodnja antitela i prečišćavanje obuhvatali su kloniranje DNK teškog i lakog varijabilnog domena u odvojene pcDNA3.3 ekspresione vektore koji su sadržali goveđu prolaktinsku signalnu peptidnu sekvencu kao i konstantne domene IgGl teškog ili kapa lakog lanca u punoj dužini. Antitela su eksprimirana u CHO-S medijumu (Invitrogen) obogaćenom sa 8mM Glutamax (Gibco) u „sinner" flaskovima od 100 ml na 37 °C sa 8% CO2. Jedan dan pre transfekcije, ćelije su podcijene u 6xl0<5>ćelije/ml. Na dan transfekcije, ćelije su bile podešene, ako je bilo potrebno, do 1x1 ()b ćelije/ml. 25 ug plazmidne DNK teškog i lakog lanca su ko-transfektovane korišćenjem MAX reagensa za transfekciju (Invitrogen) i transefktovane ćelije su kultivisane tokom 6-8 dana. Protein je dobijen korišćenjem Protein G sefaroznih perlica i antitelo je eluirano korišćenjem lOOmM glicina pH2.5 i razdvojeno od perlica korišćenjem Spin-X epruveta za centrifugu. Prečišćeno antitelo je izmenjeno u fosfatnom slanom puferu (PBS) korišćenjem Micro Bio-Spin kolona (BioRad). Koncentracija proteina je procenjena pomoću apsorbance na 280 nm.
[0146]Za test zasićenja vezivanja, ne-biotinilovano, MonoQ prečišćeno TTCF je obeleženo sa europijumom i slobodni europijum je uklonjen. Ploče sa ravnim dnom sa 96-bunarića su obložene tokom noći sa 20ng antitela po bunariću u lOOmM NaHCCbpuferu na pH 9.6. Blokiranje je izvedeno sa puferom za esej koji je obogaćen sa goveđim serum albuminom (BSA) i goveđim gama globulinima. TTCF-europijum je razblažen u puferu za esej (lOOnM do 4pM) i 200ul je dodato po bunariću u triplikatu. Ploče su inkubirane tokom 2 sata na 37 °C i isprane tri puta sa 200 ul pufera za ispiranje (50mM Tris pH 8, 150mM NaCl, 20 uM EDTA, 0.05% Tween). 100 ul rastvora za pojačavanje je dodato u svaki bunarić i brojanje (prisustvo) fluorescencije je izmereno korišćenjem Victor- čitača ploča na 615nm.
[0147]Sekvence varijabilnih domena lakih i teških lanaca su analizirane korišćenjem IMGT/V-Quest i J10NSOLVER softvera. Podaci sa protočnog citometra su evaluirani korišćenjem ,,FlowJo analysis" softvera. Statističke analize su izvedene korišćenjem GraphPad Prisni 5 softvera korišćenjem nesparenog t-testa. Da se odrede Kdvrednosti antitela, podaci o zasićenju vezivanja su fitovani (podešavani) korišćenjem GraphPad Prism 5 softvera korišćenjem ne-linearne regresione analize.
Primer 3: Multimerizacija pojačava identifikaciju memorijskih B ćelija
[0148]Tetramerni i monomerni TTCF su upoređeni. TTCF je fluorescentno obeležen sa Alexa-488 i zatim korišćen u monomernoj formi ili je konvertovan u tetramer korišćenjem neobeleženog streptavidina (videti iznad). Obogaćene B ćelije su zatim inkubirane sa tetramernim ili monomernim TTCF-Alexa-488 pri istoj koncentraciji. Kontrolni protein (CD80 membranski proksimalni domen) je obeležen na isti način i takođe korišćen kao tetramer.
[0149]Kao što je prikazano na Slikama 22A i 22B, TTCF je obeležio neke memorijske ćelije, ali frekvencije identifikovane tetramerom su suštinski veće (1.6-7.3 fold) korišćenjem ćelija od tri donora. U jednom od tri donora TTCF specifične memorijske ćelije mogu biti detektovane sa tetramerom ali ne sa m on om erom.
[0150]Ovi rezultati pokazuju da antigenski tetrameri omogućavaju osetljivu detekciju ćelija na osnovu antigenske specifičnosti njihovog BCR, uprkos tome da su takve ćelije veoma retke u perifernoj krvi. Memorijske ćelije izmenjene klase specifične za TTCF su jarko obeležene odgovarajućim tetramernim TTCF antigenom, dok je obeležavanje pozadine sa kontrolnim tetramerom bilo konstantno nisko.
Primer 4: MetodaA'alidacija antitela
[0151]Kompletno humana antitela su generisana pomoću spajanja konstantnih regiona igG teških i kapa lanaca da se izoluju varijabilni regioni putem preklapajućeg („overlap") PCR. Antitela su eksprimirana u prelaznom, oslobođenom od seruma, sisarskoin ekspresionom sistemu korišćenjem CHO-S ćelija tokom perioda od 6-8 dana. Antitela su prečišćena korišćenjem protein G i gel flltracione hromatografije.
[0152]Kao što je prikazano na slici 23, antitela izolovana iz TTCF-specifičnih plazmablasta su pokazala visoke afinitete ka vezivanju za TTCF antigen, saKnod 2.2 nM (TTCF Ab 1) i 323 pM (TTCF Ab 2) (SLIKA 23B. Antitela izolovana iz memorijskih ćelija takođe su pokazivala visoke afinitete vezivanja, sa Ab od 382 pM, 228 pM, i 1.4 nM, za druga antitela (TTCF Abs 3, 4, i 5)(SLIKA 23B).
[0153]Ovi podaci podržavaju specifičnost metoda koje su stavljene ovde na uvid javnosti. Pored toga, specifičnost metoda ovde je demonstrirana pomoću konstruisanja pet anti-TTCF antitela od tri različita donora, od kojih su svi vezani za TTCF sa visokim afinitetima.
[0154]Podaci ovde takođe pokazuju da antigenski tetrameri omogućavaju detekciju memorijskih ćelija dugo nakon uklanjanja antigena iz domaćina.
Primer 5: Dobijanje Anti-MICA Antitela
[0155]Antitela koja se imunospecifično vezuju za MICA su razvijena korišćenjem metoda ovde.
[0156]Ukratko, MICA antigen (UniGene Hs.130838) je ekprimiran sa C-terminalnom BirA oznakom (GLNDIFEAQKIEWHE (SEQ ID NO: 238)), koja omogućava mono-biotinilaciju antigena. Antigen je tetramerizovan sa streptavidinom (SA) koji je obeležen sa R-fikoeritrinomn (PE) u molarnom odnosu od 4 MICA: 1 SA. Mononuklearne ćelije periferne krvi su dobijene iz pacijenta sa uznapredovalim melanomom koji su vakcinisani sa autolognim tumorskim ćelijama koje su transdukovane sa GM-CSF ekspresionim vektorom
(GVAX) (PNAS 103: 9190, 2006), i zatim tretirane sa anti-CTLA-4 monoklonskim antitelom ipilimumab (YERVOY™ (dostupan od Bristol Myers Squib)) Mononukleame ćelije iz periferne krvi su brzo otopljene, isprane i resuspendovane pri 5x10<6>u slanom fosfatnom puferu (pH 7.2) obogaćenom sa 2% fetalnom telećeg seruma i obojene sa približno 0. lug/ml tetramera tokom 30 minuta na ledu. Antitela su dodata da se identifukuju one koje su izmenile klasu, memorijske-ćelije (CD19<+>, CD27<+>, i IgM"). Panel isključenih antitela koja obeležavaju T-ćelije, prirodne ćelije ubice, makrofage i mrtve ćelije su obuhvaćene da smanje bojenje pozadine tetramerom (CD3, CD14, CD16, 7-AAD). Pojedinačne B-ćelije koje se vezuju za MICA tetramer su sortirane u trake od 8 epruveta za PCR korišćenjem BD FACS Aria II. B-ćelijski receptor (BCR) iRNK je amplifikovan korišćenjem komercijalnog seta od Epicentre Biotechnologies (kataloški broj: MBCL90310) korišćenjem genskih specifičnih prajmera prikazanih ispod:
iRNK Amplifikacija
PCR Jedan
[0157]
PCR Dva
[0158]
[0159]Prajmeri i uslovi PCR ciklusa skoji u korišćeni u PCR reakciji jedan i PCr reakciji dva su adaptirani od Wang and Stollar et al. (journal of immunological methods2000).
[0160]Set naizmeničnih uzvodnih prajmera varijabilnog regiona teškog lanca je razvijen da se pokriju sekvence varijabilnog regiona teškog lanca koji potencijalno nije odgovarajuće pokriven pomoću gornjeg seta prajmera. Sledeći naizmenični prajmeri su generisani: PCR jedan
[0161]
PCR Dva
[0162]
[0163]Ukratko, 2ul cDNK koja je generisana iRNK amplifikacijom je korišćena kao šablon za prvi krug PCR, sa sledećim uslovima ciklusa: 3 ciklusa preamplifikacije (94°C/45 sekundi, 45°C/45 sekundi, 72<Q>C/1()5 sekundi); 30 ciklusa amplifikacije (94°C/45 sekundi, 50°C/45 sekundi, 72°C/105 sekundi); 10 minuta konačne elongacije na 72°C.
[0164]3ul produkta prvog kruga PCR-a služilo je kao šablon za drugi krug „nested" PCR-a. Isti uslovi ciklusa su korišćeni za prvi krug PCR-a, ali 3 ciklusa preamplifikacije su izostavljena. Oba koraka PCR-a su izvedena korišćenjem klonirane Pfu polimeraze AD (Agilent Technologies). PCR produkti su razdvojeni na 1% agaroznim gelovima i produkti od 300-400 nukleotida po veličini su izolovani primenom seta - Zvmoclean DNA gel recoverv kit-a (Zymo Research). Sekvenciranje je izvedeno primenorn uzvodnih i reverznih prajmera korišćenim za drugi krug „nested" PCR. „Nested" PCR iz dva koraka amplifikuje BCR varijabilne domene teških i lakih lanaca (videti iznad). Mononuklearne ćelije iz periferne krvi su dobijene iz pacijenata sa uznapredovalim melanomom koji su vakcinisani sa autolognim tumorskim ćelijama transdukovanim sa GM-CSF ekspresionim vektorom (GVAX) (PNAS 103: 9190, 2006). Antitela su eksprimirana kao IgGl antitela u punoj dužini u prelaznom CHO-S ekspresionom sistemu.
[0165]Validacija vezivanja anti-MICA antitela za MICA je izvedeno korišćenjem dva nezavisna eseja na bazi perlica. Prvi esej je koristio komercijalno dostupan set eseja sa perlicama na bazi rastvora dizajniran za detekciju anti-MICA antitela reaktivnih na mnoštvo MICA alela (One Lambda, kataloški broj LSMICA001). Varirajuće koncentracije MICA antitela su inkubirane sa perlicama, zatim isprane, i inkubirane anti-humanim IgG antitelom koje je konjugovano sa fikoeritrinom. Nakon drugog koraka ispiranja, perlice su analizirane na Luminex mašini. Negativna kontrola se sastojala od inkubacije perlica sa anti-humanim IgG antitelom koje je konjugovano samo sa fikoeritrinom (bez anti-MIC A antitela). Pozitivna kontrola se sastojala od inkubacije perlica sa komercijalno dostupnim anti-MICA/MICB monoklonskim antitelom (klon 6D4) direktno konjugovanim za fikoeritrinom (BioLegend kataloški broj 320906). Drugi esej je razvijen interno korišćenjem polistirenskih perlica koje su konjugovane sa streptavidinom. Perlice su konjugovane sa monobiotinilovanim MICA proteinom, i inkubirane sa varirajućim koncentracijama anti-MICA antitela, anti-TTCF antitela (izotipska negativna kontrola), ili BioLegend anti-MICA/MICB antitelom direktno konjugovanim za fikoeritrinom (pozitivna kontrola). Perlice inkubirane sa anti-MICA antitelom ili anti-TTCF antitelom su isprane i zatim inkubirane sa anti-humanim IgG antitelom konjugovanim sa Alexa488. Kako bi se odredilo pozadinsko vezivanje za perlice, ista inkubacija je izvedena korišćenjem streptavidin-konjugovanih perlica koje nisu obložene sa MICA proteinom za poređenje. Perlice su analizirane za vezivanje za antitela na FACS Caliber protočnom citometru.
[0166]Kao što je prikazano na Slikama 24 i 25, anti-MICA antitela (MICA-AM2 i MICA-Ab20) se vezuju sa vioskim afinitetom za MICA. MICA-Ab2() odgovara anti-MICA antitelu ID-1 opisanom u Tabeli 1.
Primer 6: Anti-MICA Antitela
[0167]Dodatna anti- MICA antitela sa klinički relevantnim osobinama su razvijena korišćenjem metoda kojw su opisane ovde. MICA-specifična antitela reaktivna na uobičajene alele su identifikovana kod pacijenata koji su primili ćelijska kancersku vakcinu (GM-CSF transdukovane kancerske ćelije, označene kao GVAX) i antitelo koje blokira inhibitorni CTLA-4 receptor na T ćelijama ipilimumab (YERVOY™ (koji proizvodi Bristol Myers Squib)). MICA tetrameri su zatim korišćeni da se izoluju B ćelije iz mononuklearnih ćelija periferne krvi pacijenata sa najvišom serumskom MICA reaktivnošću. Sekvence teških i lakih lanaca su određene iz ovih B ćelija pomoću PCR pojedinačnih ćelija, kao što je istaknuto u primeru 5. Ovaj napor je vodio ka identifikaciji antitela koja prepoznaju alele uobičajene u severno američkoj populaciji.
[0168]CM24002 Ab2 (anti-MICA antitelo ID-6 opisano u Tabeli 1) je antitelo izolovano od pacijenta sa akutnom mijeloidnom leukemijom (AML) koji je pokazao značajan klinički odgovor na GVAX + Ipilimumab kombinovanu terapiju i čija plazma jako reaguje sa MICA. Nukleotidi i amino kiseline CM24002 Ab2 lakog lanca (SLIKE 30 i 31) i teškog lanca (SLIKE 28 i 29) su prikazane, sa CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencama koje su podvučene. Dodatno antitelo sa jakim vezivanjem je dobijeno od istog pacijenta i obeleženo je kao CM24002 Ab4 (anti-MICA antitelo ID-7 opisano u Tabeli 1). Nukleotidi i amino kiseline CM24002 Ab4 lakog lanca (SLIKE 34 i 35) i teškog lanca (SLIKE. 23 i 32) su prikazani, sa CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencama koje su podvučene.
[0169]CM33322 Abl 1 (anti-MICA antitelo ID-8 opisano u Tabeli 1) i CM33322 Ab29 (anti-MICA antitelo ID-9 opisano u Tabeli 1) su antitela izolovana iz pacijenta sa metastatskim melanomom koji je dugoročno odgovarao (>15 godina) na GVAX + Ipilimumab kombinovanu terapiju. Nukleotidi i amino kiseline CM33322 Abll lakog lanca ((SLIKE 38 i 39) i dugog lanca (SLIKE 36 i 37) su prikazani, sa CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencama koje su podvučene. Nukleotidi i amino kiseline CM33322 Ab29 lakog lanca ((SLIKE 42 i 43) i dugog lanca (SLIKE 40 i 41) su prikazani, sa CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencama koje su podvučene. Usled dugoročnog kliničkog odgovora ovog pacijenta, ova antitela su naročito interesantna.
[0170]Nakon početne identifikacije, kloniranje i ekspresija antitela od interesa, specifičnost ovih antitela za različite MICA alele je određena pomoću citometrijskog eseja sa perlicama. Ukratko, solubilni, rekombinantni MICA aleli 002, 008, 009 i MICB sa pojedinačnim BirA mestom biotinilacije su eksprimirani, prečišćeni, i uhvaćeni na streptavidinskim perlicama. Označena anti-MICA antitela su zatim inkubirana sa perlicama obloženim sa rekombinantnim MICA pri različitim koncentracijama tokom jednog sata, zatim isprani, i inkubirani sa FITC-obeleženim anti-humanim IgG sekundarnim antitelom. Nakon drugog koraka ispiranja, kvantifikacija perlicama-vezane FITC fluorescencije je završena pomoću protočnog citometra. MICA aleli 002, 008, 009 kao i vezani MICB protein su izabrani na osnovu njihove prevalence u severno američkoj populaciji (SLIKA 48). MICA aleli 002, 008, 009 kao i povezani MICB protein su takođe izabrani na osnovu njihove generalne prevalence širom sveta. Značajno je da se, CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29 vezuju sa jakim afinitetom za sve MICA alele kao i za MICB. Dva druga antitela vezana za podskup alela: CM24002 Ab4 vezanih jako za MICA<*>009 i MICB, i CM33322 Abll vezan jako za MICA<*>002, MICA<*>008, i MICB. (SLIKE 48A-F) Specifičnost je dokumentovana primenom negativnog humanog kontrolnog antitela generisanog sa istom tehnologijom (specifičnom za tetanus toksikoidnog C-terminalnog fragmenta, TTCF) i pozitivnog kontrolnog antitela za MICA (komericjalno mišje antitelo od BioLegend-a usmerenog protiv MICA). Ove studiej identifikovale su CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29 kao potencijalne kandidate za kliničku primenu.
Primer 7: Vezivanje Anti-MICA antitela za autologne tumorske ćelije
[0171]Sposobnost izolovanih anti-MICA antitela CM24002 Ab2 da se vežu za autologne tumorske ćelije je ispitana protočnom citometrijom (SLIKA 49). Koštana srž je dobijena od pacijenta CM24002 i testirano je vezivanje za tumorske ćelije pomoću CM24002 Ab2. Tumorske ćelije su zatim identifikovane iz uzorka koštane srži kao CD33+ CD34+ ćelije. Tumorske ćelije su zatim obojene sa 10 ug/ml sa anti-MICA antitelom CM24002 Ab2, pozitivnim kontrolnim komercijalnim MICA antitelom (BioLegend) ili negativnim kontrolnim antitelom (TTCF specifično). Kao što je prikazano na slici 49, CM24002 Ab2 se jako vezuje za ove ćelije. CM24002 Ab2 ne pokazuje vezivanje za ne-tumorske ćelije (CD16+ i CD3+ ćelije) i samo pozadinske vezivanje za CD14+ ćelije, pokazujući anti-tumorsku specifičnost (podaci nisu prikazani).
Primer 8. Inhibicija Anti-MICA antitela NKG2D Receptora na NK Ćelijama.
[0172]Sposobnost izolovanog anti-MICA antitela CM24002 Ab2 da spreči solubilnim MICA-posredovanu negativnu regulaciju srodnog receptora, NKG2D je ispitana. Serum od pacijenta CM24002 je korišćen u razblaženju 1:10 i inkubiran tokom perioda od 48 h. CM24002 Ab2 (koncentracija od lOug/ml), pozitivno kontrolno komercijalno MICA antitelo (BioLegend) ili negativno kontrolno antitelo (TTCF specifično) su dodati ovim kulturama. NKG2D ekspresija je procenjena protočnom citometrijom na 48 h (SLIKA 50). Serum iz pacijenta CM24002 je jako negativno regulisao ekspresiju NKG2D (tako onemogućavajući funkciju ovog receptora). CM24002 Ab2 i pozitivno kontrolno MICA antitelo delimično su obnovili NKG2D površinsku ekspresiju NK ćelija. Da se pokaže specifičnost, ponovili smo gornji eksperiment inkubiranjem ćelija sa rekombinantnim MICA u 2ng/ml umesto serumom pacijenta (SLIKA 51). CM24002 Ab2 kompletno je sprečilo MICA-posredovanu negativnu regulaciju NKG2D ekspresije, dok negativno kontrolno antitelo (specifično za TTCF) nije imalo efekta (SLIKA 51). Ovi podaci pokazali su da humana MICA antitela mogu da spreče inhibiciju kritičnog N KG2D receptora na humanim NK ćelijama.
Primer 9: Ćelijski posredovana citotoksičnost anti-MICA Antitela
[0173]Da se odredi da li CM24002 Ab2 omogućava ćelijski-posredovanu citotoksičnost, humane NK ćelije (efektorske ćelije) su inkubirane tokom 48 sati sa rekombinantnim MICA (2ng/mi) u prisustvu CM24002 Ab2, antitelom koje je nagtivna kontrola (TTCF specifično) ili antitelom koje je pozitivna kontrola (BioLegend), sva u lOug/ml. Nakon 48 sati, ćelije su isprane i inkubirane sa K562 tumorskim ćelijama u razmeri efektoncilju od 20:1, 10:1, i 5:1 tokom 4 sata. Specifična liza ciljnih ćelija pomoću NK ćelija je određena oslobađanjem citozolnog proteina (LDH) od K562 tumorskih ćelija. U odsustvu MICA antitela, nije bilo ubijanja K562 tumorskih ćelija pomoću NK ćelija. Međutim, CM24002 Ab2 veoma je pojačao lizu K562 tumorskih ćelija posredovanu NK ćelijama i bio je efiaksniji nego pozitivno kontrolno mišje anitelo u svim razmerama efektoncilj (SLIKA 52). Dalje je pokazano da ubijanje K562 tumorskih ćelija je zaista posredovano pomoću NKG2D puta (radije nego Fc receptorima). Gornji eksperiment je ponovljen, sa dodatkom dve eksperimentalne grupe: blokirajuće antitelo za NKG2D i humani Fc blok. Dodatno, CM33322 Ab29 je takođe testirano. Podaci pokazuju da je dodatak CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29 omogućio NK ćelijama posredovanu citotoksičnost. Ubijanje K562 ćelija se nije desilo kada je dodato blokirajuće NKG2D, dok je Fc blokirajući reagens imao malo efekta (SLIKA 53). Ovi podaci pokazuju da su CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29 obnovili anti-tumorsku funkciju NKG2D puta.
Primer 10: Vezivanje Anti-MICA antitela za alfa 3 MICA domen
[0174]NKG2D receptor se vezuje za gornje alfa 1 i alfa 2 domene MICA, i antitela koja se vezuju za isto mesto mogu da se takmiče sa NKG2D receptorom i time blokiraju ubijanje tumorskih ćelija pomoću NK ćelija. Antitela koja se vezuju za alfa 3 domen su od naročitog interesa jer ne mogu da blokiraju vezivanje NKG2D receptora. U isto vreme, takva antitela mogu da ometaju proteolitičko cepanje MICA sa površine tumora. Sposobnost anti-MICA antitela za MICA alfa 3 domen je procenjena korišćenjem prethodno opisanog citometrijskog eseja sa perlicama. Biotinilovani rekombinantni protein je sakupljen pomoću streptavidinskih perlica. Perlice su zatim inkubirane sa antitelima CM24002 Ab2, CM24002 Ab4, CM33322 Abll, CM33322 AB29, negativnim kontrolnim antitelom (TTCF specific) ili pozitivnim kontrolnim antitelom (BioLegend), u 10ug/ml praćeno sa FITC-obeleženim anti-humanim IgG sekundarnim antitelom i kvantifikacijom perlicama-vezane FITC fluorescencije pomoću protočne citometrije (SLIKA 54). Kao što je prikazano na slici 54, CM33322 Ab29 se vezao za MICA alfa 3 domen i stoga je od velikog interesa u terapijskim primenama.
Primer 11: Vezivanje Anti-MICA antitela za tumorske ćelije
[0175]Potencijal CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29 koji se koristi kao meta širokog opsega kancera je procenjena. Panel ćelija multiplog mijeloma (RPMI 8226 and Xg-1), kancera ovarijuma (OVCAR3), akutne mijeloidne leukemije (U937), melanoma (K028), kancera pluća (1792 i 827), i kancera dojke (MCF7) je testirano za obeležavanje pomoću CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29. Tumorske ćelije su resuspendovane u koncentraciji od 1x10<6>ćelije/ml u PBS sa 1% BSA i obojene sa CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29, kao i pozitivne i negativne kontrole (mišje MICA antitelo i TTCF-specifično antitelo, redom) (direktno konjugovano) u koncentraciji od 10 ug/ml tokom 1 sata na 4°C. Obeležavanje je procenjeno protočnom citometrijom (SLIKA 55). CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29 oba vezuju svaki testirani tip tumorske ćelije, sa obeležavanjem koje je veće nego komercijalna pozitivan kontrola za većinu testiranih ćelijskih linija.
Primer 11a: MICA Alelna specifičnost anti-MICA antitela
[0176]Alelna specifičnost CM33322 Ab29 je procenjena korišćenjem komercijalno dostupnog Luminex eseja. Komercijalni set testova se sastoji od rekombinantnih MICA alela (MICA<*>001,<*>002,<*>007,<*>012,<*>017,<*>018,<*>027,<*>004,<*>009, i<*>015) direktno konjugovanih za Luminex perlice, svaki sa unutrašnjim fluorescentnim svojstvima koja omogućavaju da vezivanje bude procenjeno u pojedinačnom uzorku. Luminex perlice obložene sa naznačenim MICA alelima su inkubirane sa CM33322 Ab29, BioLegend pozitivnom kontrolom, i negativnom kontrolom (TTCF), u 10 ug/ml tokom 1 sata, sa naknadnom inkubacijom, sa PE-konjugovanim anti-humanim IgG sekundarnim antitelom. Fluorescencija je određena nakon inkubacije od 60 minuta sa naznačenim antitelima i naknadnom inkubacijom sa anti-humanim PE-konjugovanim sekundarnim antitelom korišćenjem Luminex 200 instrumenta (SLIKA 56). CM33322 Ab29 je sposoban da se veže za sve alele prisutne u komericijalnom eseju, naznačavajući da može biti korišćen kod pacijenata bez obzira na MICA genotip.
[0177]Ovi podaci pokazuju veliku biološka aktivnost CM24002 Ab2 i CM33322 Ab29 i njihovu sposobnost da obnove NK ćelijama posredovanu lizu tumorskih ćelija. Ovi podaci pokazuju da pacijenti sa kancerom koji su odgovorili na imunoterapiju proizvode MICA antitela koaj obnavljaju anti-tumorsku aktivnost NK ćelija. Zajedno, ovi rezultati ističu terapijski potencijal anti-MICA antitela da se prevaziđe imunska supresija i promoviše uništavanje tumora kod pacijenata sa kancerom.
Primer 12: Dobijanje Anti-Angiopoetin-2 Antitela
[0178]Antitela koja se vezuju za angiopoetin-2 su razvijena korišćenjem metoda ovde. Ukratko, biotinilovani angiopoetin-2 (UniGene Hs.583870) je kupljen od R&D Svstems. Mononuklearne ćelije iz periferne krvi su brzo otopljene, isprane i resuspendovane u 5xl0<6>u fosfatnom slanom puferu (pH 7.2) obogaćenom sa 2% fetalnog telećeg seruma i obojene sa približno 0.5ug/ml angiopoetin-2 tokom 30 minuta na ledu. Ćelije su isprane dva puta sa 4ml PBS/2% FCS. Zatim su antitela dodata da se identifikuju memorijske-ćelije koje su izmenile klasu (CD 19+, CD27+, i IgM-) kao i SA-PE da obeleže B-ćelije sa biotinilovanim angiopoetinom na površini. Panel isključivih antitela koja obeležavaju T-ćelije, prirodne ćelije-ubice, makrogafe, i mrtve ćelije su uključene da smanje pozadinsko vezivanje tetramera (CD3, CD14, CD16, 7-AAD). Pojedinačne B-ćelije koje se vezuju za angiopoetin-2 su sortirane u trake za PCR sa 8 epruvetica korišćenjem the BD FACS Aria II. iRNK B-ćelijskog receptora (BCR) je amplifikovana korišćenjem komercijalnog seta od Epicentre Biotechnologies (kataloški broj: MBCL90310) korišćenjem genskih specifičnih prajmera (videti iznad). „Nested" PCR od dva koraka amplifikuje BCR varijabilne domene teških i lakih lanaca (videti iznad). Mononuklearne ćelije iz periferne krvi su dobijene od pacijenta sa malignim ne-sitno ćelijskim karcinomom pluća koji su vakcinisani sa autolognim tumorskim ćelijama transdukoavnim sa GM-CSF ekspresionim vektorom (GVAX) (Cancer Res. 70: 10150, 2010). Antitela su eksprimirana kao kompletna IgGl antitela u prelaznom CHO-S ekspresionom sistemu.
[0179]Validacija vezivanja anti-angiopoetin-2 antitela za angiopoetin-2 je izvedena korišćenjem ELISA eseja. Ukratko, angiopoetin-2 je obložen preko noći pri 4ug/ml u lOOmM natrijum bikarbonatnom puferu pH 9.6 u pločama sa 96 bunariča sa ravnim dnom (PerkinElmer) na 4<C>C. Ploče su blokirane sa puferom za esej koji sadrži goveđi serum albumin i goveđe gama globuline (PerkinElmer) na sobnoj temperaturi tokom tri sata. Antitela su razblažena u puferu za esej u 20ug/ml-0.16ug/ml i inkubirana tokom 1 sata na 4°C. Ploče su ipsrane tri puta sa 200ul pufera za ispiranje (50mM Tris pH8, 150mM NaCl, 20mM EDTA, 0.05% Tween). lOOul rastvor za pojačavanje (PerkinElmer) je dodat u svaki bunarić i merena je fluorescencije korišćenjem Victor3 čitača ploča (PerkinElmer) na talasnoj dužini od 615nm. Humani angiopoetin-1 i -4 su takođe testirani za vezivanje i pokazali su sličnu reaktivnost.
[0180]Relevatni podaci su prikazani na Slikama 27A-27C, koje obezbeđuju grafikone i gel koji se odnose na izolaciju angiopoetin-specifičnih antitela iz pacijenta sa kacerom pluća. (A) Angiopoetin-2 reaktivnost u serumu pacijenta sa kancerom pluća (LI9) (razblaženom 1:1000) određenje pomoću ELISA testa. Datumi sakupljanja seruma su prikazani na X-osi. Kontrolni proteinski goveđi serum albumin (BSA) je uključen kao negativna kontrola. (B) FACS plotovi pokazuju PBMC uzorak (vremenska tačka- 10/98) gejtovan na CD 19+, CD27+ IgM-B ćelijama sa CD 19 na X-osi i fluorescentno-označen angiopoetin-2 na Y-osi. Gejt (okvir) označava približno gde je načinjen prekid sortiranja. Deset B-ćelija je sortirano iz ovog uzorka. (C) težak, lak lanac i zglobni region PCR produkata od 10 angiopoetin-2 reaktivnih memorijskih-ćelija su izolovani iz pacijenta LI9. PCR produkti teškog (gornji deo) i lakog (donji deo) lanca nakon dva kruga „nested" PCR-a su oko 350 baznih parova.
Primer 13: Vezivanje Anti-Angiopoetin-2 Antitela naspram članova familije humanih
rekombinantnih angiopoetina
[0181]Ploče sa 96 bunarića su obložene tokom noći sa 4 ug/mL rekombinantnim angiopoetinom-1, - 2, i -4 (R&D Svstems) u natrijum bikarbonatnom pufera pH9.6. Ploče su naknadno blokirane tokom 3 sata na sobnoj temperaturi sa puferom za esej (Perkin Elmer) koji sadrži goveđi seruma albumim (BSA) i goveđe gama globuline. Antitela ID 2, 3, 4, i 5 (videti Table 1), razblažena između 20 ug/mL-0.16 ug/mL, su inkubirana na pločama tokom 1 sata na 4°C sa rotiranjem. Ploče su naknadno isprane pre nego što su inkubirane sa anti-humanim IgG-Europijum antitelom (Perkin Elmer). Brojanje fluorescencije na 615 nm je izvršeno putem čitača ploča. Negativno kontrolno antitelo (klon 8.18.C5) je korišćen da se odredi specifičnost. Podaci su određeni u duplikatu.
[0182]Kao što je prikazano na Slikama 26A-26C, antitela ID 2, 3, 4, i 5 (videti Tabelu 1) se vezuju sa visokom specifičnošću za angiopoetin-1 -2, i -4. Antitela se ne vezuju za Ang-sličan-3, strukturno-povezani protein (videti SL. 26D).
[0183]Dodatno anti- angiopoetin antitelo, označeno anti-Ang2 Ab6 (anti-MICA antitelo ID-10 opisano u Tabeli 1) sa klinički relevantnim biološkim osobinama su razvijeni korišćenjem metoda ovde. Vezivanje anti-Ang2 Ab6 za članove familije humanih rekombinantnih angiopoetina su analizirani kako je opisano iznad. Ukratko, ELISA ploče su obložene sa 4 ug/ml angiopoetina Ang-1, Ang-2, Ang4, i vezivanje Ang-sličnog-3, detekcija pomoću anti-Ang2 Ab6 je testirana na 20 ug/ml. 4 ug/ml, 0.8 ug/ml, i 0.16 ug/ml. Europijumom konjugovano anti-humani sekundarni IgG je korišćen, sa brojanjem europijuma koje je mereno nakon 45 minuta. Kao što je prikazano na slici 57, anti-Ang2 Ab6 se vezuju za sve angiopoetine na dozno zavistan način.

Claims (14)

1. Kompozicija koja sadrži antitelo ili fragment antitela koje se imunospecifično vezuje za sekvencu A koja je srodna polipeptidima MHC I klase (MICA), gde antitelo ili fragment antitela sadrži varijabilni region teškog lanca (Vh) i varijabilni region lakog lanca (Vl) i, (a) region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 naveden u SEQ ID NO (sekvenca sa identifikacionim brojem): 212 Vhantitela ID 9; ili (b) region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 naveden u SEQ ID NO: 158 Vhantitela TD 6.
2. Kompozicija iz patentnog zahteva 1, gde antitelo ili fragment antitela sadrži, (a) region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 naveden u SEQ ID NO:212 Vhantitela ID 9, i CDR3 naveden u SEQ ID NO:219 Vlantitela ID 9; ili (b) region koji određuje komplementarnost (CDR) 3 naveden u SEQ ID NO: 158 Vhantitela ID 6, i CDR3 naveden u SEQ ID NO: 164 Vlantitela ID 6.
3. Kompozicija iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, gde antitelo ili fragment antitela naveden u (a) dalje sadrži region koji određuje komplementarnost CDR2 naveden u SEQ ID NO:210 Vhantitela ID 9, i CDR2 naveden u SEQ ID NO:217 Vlantitela ID 9; ili gde peptid naveden u (b) dalje sadrži region koji određuje komplementarnost CDR2 naveden u SEQ ID NO: 156 Vhantitela ID 6, i CDR2 naveden u SEQ ID NO: 162 Vl antitela ID 6.
4. Kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-3, gde antitelo ili fragment antitela naveden u (a) sadrži region koji određuje komplementarnost CDR1 naveden u SEQ ID NO:208 Vhantitela ID 9, i CDR1 naveden u SEQ ID NO:215 Vlantitela ID 9; ili gde peptid naveden u (b) sadrži region koji određuje komplementarnost CDR1 naveden u SEQ ID NO:153 Vhantitela ID 6, i CDR1 naveden u SEQ ID NO:16() Vlantitela ID 6.
5. Kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-4, gde antitelo ili fragment antitela sadrži: (a) Vh lanac sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98 ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO:
204; ili (b) Vhlanac sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98 ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO:
149.
6. Kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-5, gde antitelo ili fragment antitela sadrži (a) Vl lanac sa najmanje 95%, 96%, 97%o, 98 ili 99% identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 206, gde Vlsadrži ne više od jedne amino kiselinske supstitucije unutar CDR regiona u odnosu na VlCDR1 amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 215, VlCDR2 amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 217, i Vl CDR3 amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:219; ili (b) Vllanac sa najmanje 95%>, 96%, 97%, 98 ili 99% identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 151, gde Vlsadrži ne više od jedne amino kiselinske supstitucije unutar CDR regiona u odnosu na VlCDR1 amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 160, VlCDR2 amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 162, i VlCDR3 amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 164.
7. Kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-6, gde antitelo ili fragment antitela sadrži, (a) Vh CDR1 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 208, Vi-i CDR2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 210, VhCDR3 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:212, VlCDR1 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 215, VlCDR2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 217 i VlCDR3 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:219; ili (b) VhCDR1 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 153, VhCDR2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 156, Vh CDR3 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 158, VlCDR1 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 160, VlCDR2 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 162 i VlCDR3 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:164.
8. Kompozicija iz patentnog zahteva 7, gde antitelo ili fragment antitela sadrži, (a) Vhlanac sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98%> ili 99% identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 204 i Vllanac sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%) identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:
206; ili Vh lanac sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 149 i Vllanac sa najmanje 95%>, 96%), 97%, 98% ili 99% identičnosti sa amino kiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 151.
9. Kompozicija iz patentnog zahteva 8, gde antitelo ili fragment antitela sadrži Vi-i lanac koji sadrži SEQ ID NO: 204 i Vllanac koji sadrži SEQ ID NO: 206; ili Vhlanac koji sadrži SEQ ID NO: 149 i Vllanac koji sadrži SEQ ID NO: 151.
10. Kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-9, dalje sadrži antikancersko terapeutsko sredstvo.
11. Kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-10, formulisana kao farmaceutska kompozicija.
12. Kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-11, dalje sadrži histon deacetilazni inhibitor (HDAC) odabran iz grupe koja se sastoji od hidroksamične kiseline, vorinostata, suberoilanilid hidroksamične kiseline (SAHA, trihostatina A (TSA), LAQ824, panobinostat (LBH589), belinostata (PXD101), ITF2357 italfarmako SpA, cikličnog tetrapeptida, depsipeptida (romidepsin, FK228), benzamida; entinostata (SNDX-275/MS-275), MGCD0103, alifatičnih kiselina sa kratkim lancem, valproinske kiseline, fenil butirata, AN-9, pivaneksa, CHR-3996, i CHR-2845.
13. Kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-12, dalje sadrži proteazomalni inhibitor odabran iz grupe koja se sastoji od bortezomiba, NPI-0052, karfilzomiba (PR-171), CEP 18770, i MLN9708.
14. Kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva 1-13, dalje sadrži antitelo odabrano iz grupe koja se sastoji od anti-CTLA-4 antitela, anti-PD-1 antitela, anti-PDL-1 antitela i kombinacije jednog ili više istih.
RS20170344A 2011-09-30 2012-09-28 Terapijski peptidi RS55822B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161541921P 2011-09-30 2011-09-30
PCT/US2012/057839 WO2013049517A2 (en) 2011-09-30 2012-09-28 Therapeutic peptides
EP12835118.6A EP2760471B9 (en) 2011-09-30 2012-09-28 Therapeutic peptides

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55822B1 true RS55822B1 (sr) 2017-08-31

Family

ID=47996757

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170344A RS55822B1 (sr) 2011-09-30 2012-09-28 Terapijski peptidi

Country Status (31)

Country Link
US (2) US9402905B2 (sr)
EP (3) EP3210625B1 (sr)
JP (2) JP2014532053A (sr)
KR (2) KR102017070B1 (sr)
CN (2) CN103958543B (sr)
AU (1) AU2012315792B2 (sr)
BR (1) BR112014007487A2 (sr)
CA (1) CA2850542A1 (sr)
CL (1) CL2014000786A1 (sr)
CO (1) CO7020866A2 (sr)
CY (1) CY1119567T1 (sr)
DK (1) DK2760471T3 (sr)
EA (1) EA201490644A1 (sr)
ES (3) ES2925654T3 (sr)
HK (1) HK1243427A1 (sr)
HR (1) HRP20170494T1 (sr)
HU (1) HUE034044T2 (sr)
IL (1) IL231604B (sr)
LT (1) LT2760471T (sr)
MX (1) MX355877B (sr)
NZ (2) NZ721184A (sr)
PE (1) PE20142361A1 (sr)
PH (1) PH12014500635B1 (sr)
PL (1) PL2760471T3 (sr)
PT (1) PT2760471T (sr)
RS (1) RS55822B1 (sr)
SG (1) SG11201401104WA (sr)
SI (1) SI2760471T1 (sr)
SM (1) SMT201700221T1 (sr)
TN (1) TN2014000134A1 (sr)
WO (1) WO2013049517A2 (sr)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2665090A1 (en) * 2006-09-22 2008-03-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating mica-related disorders
ES2925654T3 (es) 2011-09-30 2022-10-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Péptidos terapéuticos que comprenden anticuerpos que se unen a la secuencia A relacionada con el polipéptido del CMH de clase I (MICA)
EP2812027A1 (en) 2012-02-07 2014-12-17 Innate Pharma Mica binding agents
JP6518199B6 (ja) 2013-03-15 2019-06-12 ノヴェロジックス・バイオテクノロジー，インコーポレーテッド Ｍｉｃａおよびｍｉｃｂタンパク質に対する抗体
KR20150130462A (ko) 2013-03-15 2015-11-23 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 치료 펩티드
JP6450381B2 (ja) * 2013-07-05 2019-01-09 ユニバーシティ オブ ワシントン スルー イッツ センター フォー コマーシャリゼーション がんを処置するための可溶性ｍｉｃ中和モノクローナル抗体
EA201691078A1 (ru) 2013-12-06 2017-01-30 Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. Терапевтические пептиды
WO2015139020A2 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccine compositions and methods for restoring nkg2d pathway function against cancers
CA2945822A1 (en) * 2014-05-21 2015-11-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer with anti bip or anti mica antibodies
US10744157B2 (en) 2015-03-26 2020-08-18 The Trustees Of Dartmouth College Anti-MICA antigen binding fragments, fusion molecules, cells which express and methods of using
KR20180088458A (ko) 2015-12-04 2018-08-03 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 암의 치료를 위한 mica/b 알파 3 도메인의 백신접종
US10448746B2 (en) * 2016-03-15 2019-10-22 Nadia Galloway Bed sheet with an integrated body positioner
RU2018128215A (ru) * 2016-03-15 2020-04-15 Иннейт Фарма Антитела против mica
TWI794171B (zh) 2016-05-11 2023-03-01 美商滬亞生物國際有限公司 Ｈｄａｃ抑制劑與ｐｄ-ｌ１抑制劑之組合治療
TWI808055B (zh) 2016-05-11 2023-07-11 美商滬亞生物國際有限公司 Hdac 抑制劑與 pd-1 抑制劑之組合治療
WO2018022831A1 (en) * 2016-07-28 2018-02-01 Musc Foundation For Research Development Methods and compositions for the treatment of cancer combining an anti-smic antibody and immune checkpoint inhibitors
CA3040421A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Novelogics Biotechnology, Inc. Antibodies to mica and micb proteins
EP3532091A2 (en) * 2016-10-29 2019-09-04 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-mic antibidies and methods of use
KR102775647B1 (ko) 2017-03-31 2025-03-06 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 종양을 치료하는 방법
US20200239577A1 (en) 2017-10-15 2020-07-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
JP7458993B2 (ja) * 2018-01-25 2024-04-01 クリナン ミカ コーポレイション Ｍｉｃａ／ｂ抗体および使用方法
PE20210665A1 (es) 2018-03-23 2021-03-31 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra mica y/o micb y sus usos
EP3774911A1 (en) 2018-03-30 2021-02-17 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating tumor
MX2021001254A (es) 2018-07-31 2021-05-12 Cullinan Mica Corp Anticuerpos anti-mica/b que bloquean la liberación de mica/b y métodos de uso.
WO2020035345A1 (en) * 2018-08-14 2020-02-20 Innate Pharma Treatment of colorectal cancer by a combination of an anti-mica antibody and an anti-nkg2a antibody
WO2021072211A1 (en) * 2019-10-09 2021-04-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating cytotoxic t cell resistant tumors
CA3184940A1 (en) 2020-07-07 2022-01-13 Jennifer Donglan WU Mic antibodies and binding agents and methods of using the same
CN113637077B (zh) * 2021-10-14 2021-12-24 尚健单抗（北京）生物技术有限公司 一种抗mica的抗体及其应用

Family Cites Families (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0351410A1 (en) 1987-03-18 1990-01-24 3i RESEARCH EXPLOITATION LIMITED Complement-binding peptide
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
GB8709290D0 (en) 1987-04-16 1987-05-20 Secretary Trade Ind Brit Precision motion slideways
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
AUPN568095A0 (en) 1995-09-27 1995-10-26 Austin Research Institute, The Anti-Galalpha(1,3)Gal antibody binding peptides
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
CA2275141A1 (en) 1996-10-29 1998-05-07 Thomas Spies Cell stress regulated human mhc class i gene
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US5830698A (en) 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
WO1998052976A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
ES2292236T3 (es) 1998-04-02 2008-03-01 Genentech, Inc. Variantes de anticuerpos y sus fragmentos.
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US20090175821A1 (en) 1999-05-17 2009-07-09 Bridon Dominique P Modified therapeutic peptides with extended half-lives in vivo
US6475220B1 (en) 1999-10-15 2002-11-05 Whiteside Biomechanics, Inc. Spinal cable system
HUP0204475A2 (en) 2000-02-11 2003-04-28 Merck Patent Gmbh Enhancing the circulating half-life of antibody-based fusion proteins
US6725230B2 (en) 2000-07-18 2004-04-20 Aegis Analytical Corporation System, method and computer program for assembling process data of multi-database origins using a hierarchical display
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
WO2002068615A2 (en) 2001-02-28 2002-09-06 Fred Hutchinson Cancer Research Center, Inc. Activation of lymphocyte populations expressing nkg2d using anti-nkg2d antibodies and ligand derivatives
US20040115198A1 (en) 2001-02-28 2004-06-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center Activation of lymphocyte populations expressing NKG2D using anti-NKG2D antibodies and ligand derivatives
US6566208B2 (en) 2001-07-25 2003-05-20 Chartered Semiconductor Manufacturing Ltd. Method to form elevated source/drain using poly spacer
US7084257B2 (en) * 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US7745140B2 (en) 2002-01-03 2010-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of T-cells using an engineered multivalent signaling platform as a research tool
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
AU2003225093A1 (en) * 2002-04-22 2003-11-03 Fred Hutchinson Cancer Research Center Soluble mic polypeptides as markers for diagnosis, prognosis and treatment of cancer and autoimmune diseases or conditions
US7524630B2 (en) 2002-04-22 2009-04-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Functionalized nanoparticles and methods of use
EP1534335B9 (en) 2002-08-14 2016-01-13 Macrogenics, Inc. Fcgammariib-specific antibodies and methods of use thereof
WO2004029207A2 (en) 2002-09-27 2004-04-08 Xencor Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
DE60334141D1 (de) 2002-10-15 2010-10-21 Facet Biotech Corp VERÄNDERUNG VON FcRn-BINDUNGSAFFINITÄTEN ODER VON SERUMHALBWERTSZEITEN VON ANTIKÖRPERN MITTELS MUTAGENESE
JP2006524039A (ja) 2003-01-09 2006-10-26 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 変異型Ｆｃ領域を含む抗体の同定および作製ならびにその利用法
US7666417B2 (en) 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
US20100069614A1 (en) * 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
CN102558352A (zh) * 2003-06-27 2012-07-11 艾默根佛蒙特有限公司 针对表皮生长因子受体的缺失突变体的抗体及其使用
US7871610B2 (en) * 2003-08-12 2011-01-18 Dyax Corp. Antibodies to Tie1 ectodomain
US8101720B2 (en) 2004-10-21 2012-01-24 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions and substitutions
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
CA2552788C (en) 2004-01-12 2013-09-24 Applied Molecular Evolution, Inc. Fc region variants
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
KR100912994B1 (ko) * 2004-04-05 2009-08-21 더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Ｎｋｇ２ｄ의 조절
PL1776384T3 (pl) 2004-08-04 2013-10-31 Mentrik Biotech Llc WARIANTY REGIONÓW Fc
BRPI0518209A (pt) * 2004-10-19 2008-11-04 Amgen Inc agentes de ligação especìficos à angiopoietina-2
US7780963B2 (en) 2004-10-25 2010-08-24 Merck & Co., Inc. Anti-ADDL antibodies and uses thereof
US20080148432A1 (en) * 2005-12-21 2008-06-19 Mark Scott Abad Transgenic plants with enhanced agronomic traits
BRPI0519596B1 (pt) * 2004-12-21 2022-01-18 Astrazeneca Ab Agente de ligação alvejado, anticorpo monoclonal que se liga a angiopoietina-2, molécula de ácido nucleico, vetor, e, uso do agente de ligação alvejado
CN101355965A (zh) 2005-06-08 2009-01-28 达纳－法伯癌症研究院 通过抑制程序性细胞死亡1（pd-1）途经治疗持续性感染和癌症的方法及组合物
BRPI0617167B8 (pt) * 2005-09-21 2021-05-25 Nycomed Gmbh sulfonilpirróis como inibidores de hdac's, seu uso, composição farmacêutica e combinação
EP1949107A1 (en) 2005-11-03 2008-07-30 Fred Hutchinson Cancer Research Center Negative immunomodulation of immune responses by nkg2d-positive cd4-positive cells
US8248965B2 (en) 2005-11-03 2012-08-21 Motorola Solutions, Inc. Method and apparatus regarding use of a service convergence fabric
CA2633211A1 (en) * 2005-12-15 2007-06-21 Astrazeneca Ab Combination of angiopoietin-2 antagonist and of vegf-a, kdr and/or flt1 antagonist for treating cancer
DE102006009847A1 (de) 2006-03-01 2007-09-06 Sweredjuk, Robert, Dr. Verfahren von Absorbieren von Schadstoffen und Gerüchen
WO2008021076A2 (en) 2006-08-07 2008-02-21 President And Fellows Of Harvard College Protein matrix vaccines and methods of making and administering such vaccines
US20110060120A1 (en) 2006-09-08 2011-03-10 Obeid Michel Sarkis Immunogenic treatment of cancer by peptides inducing the plasma membrane exposure of erp57
CA2665090A1 (en) 2006-09-22 2008-03-27 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating mica-related disorders
EP2862579B1 (en) * 2006-10-04 2017-05-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tumor immunity
EP1944611A1 (en) * 2007-01-11 2008-07-16 Université de la Méditerranée Biomarker for the medicine and the biology of the reproduction
CA2685056C (en) 2007-04-23 2015-08-25 Fred Hutchinson Cancer Research Center Negative immunomodulation of immune responses by erp5
MX2009012343A (es) * 2007-05-14 2010-02-10 Biogen Idec Inc Regiones fc (sc fc) de cadena sencilla, polipeptidos de enlace que comprenden las mismas, y metodos relacionados con ello.
US9370558B2 (en) 2008-02-13 2016-06-21 President And Fellows Of Harvard College Controlled delivery of TLR agonists in structural polymeric devices
WO2011063336A2 (en) 2009-11-20 2011-05-26 President And Fellows Of Harvard College Secondary site of antigen stimulation for therapeutic vaccination
US10328133B2 (en) 2008-02-13 2019-06-25 President And Fellows Of Harvard College Continuous cell programming devices
JO2913B1 (en) * 2008-02-20 2015-09-15 امجين إنك, Antibodies directed towards angiopoietin-1 and angiopoietin-2 proteins and their uses
WO2010011242A2 (en) * 2008-03-24 2010-01-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods and compositions for the treatment and diagnoisis of systemic anthrax infection
US8182809B1 (en) 2008-09-08 2012-05-22 University Of Washington Methods for treating cancer by inhibiting MIC shedding
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
US8207497B2 (en) 2009-05-08 2012-06-26 Ionsense, Inc. Sampling of confined spaces
JO3182B1 (ar) 2009-07-29 2018-03-08 Regeneron Pharma مضادات حيوية بشرية عالية الالفة مع تولد الاوعية البشرية - 2
KR101688522B1 (ko) 2009-12-15 2016-12-21 삼성전자주식회사 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
US8796420B2 (en) 2009-12-31 2014-08-05 Avidbiotics Corp. Non-natural MIC proteins
SI2501817T2 (sl) * 2010-02-08 2021-09-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miš z navadno lahko verigo
US8753640B2 (en) 2011-05-31 2014-06-17 University Of Washington Through Its Center For Commercialization MIC-binding antibodies and methods of use thereof
CN102911270A (zh) * 2011-08-05 2013-02-06 浙江大学 一种抑制移植器官慢性排斥反应的抗体的制备及纯化方法
ES2925654T3 (es) * 2011-09-30 2022-10-19 Dana Farber Cancer Inst Inc Péptidos terapéuticos que comprenden anticuerpos que se unen a la secuencia A relacionada con el polipéptido del CMH de clase I (MICA)
EP2812027A1 (en) * 2012-02-07 2014-12-17 Innate Pharma Mica binding agents
KR20150130462A (ko) 2013-03-15 2015-11-23 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 치료 펩티드
BR112015024543A2 (pt) 2013-03-28 2017-07-18 Honda Motor Co Ltd sistema de notificação, dispositivo eletrônico, método de notificação e programa
US9572898B2 (en) 2013-09-09 2017-02-21 Seton Hall University Functionalized fluorine containing phthalocyanine molecules
EA201691078A1 (ru) 2013-12-06 2017-01-30 Дана-Фарбер Кэнсер Инститьют, Инк. Терапевтические пептиды
WO2015139020A2 (en) 2014-03-14 2015-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Vaccine compositions and methods for restoring nkg2d pathway function against cancers
CA2945822A1 (en) 2014-05-21 2015-11-26 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer with anti bip or anti mica antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CN103958543B (zh) 2016-12-14
CO7020866A2 (es) 2014-08-11
KR102017070B1 (ko) 2019-09-02
DK2760471T3 (en) 2017-05-08
PE20142361A1 (es) 2015-01-16
HUE034044T2 (en) 2018-01-29
EP3210625A2 (en) 2017-08-30
EP3628329A1 (en) 2020-04-01
PH12014500635A1 (en) 2014-05-05
KR102225422B1 (ko) 2021-03-08
PH12014500635B1 (en) 2018-10-31
ES2757473T3 (es) 2020-04-29
SG11201401104WA (en) 2014-09-26
WO2013049517A2 (en) 2013-04-04
HRP20170494T1 (hr) 2017-06-02
CY1119567T1 (el) 2018-03-07
WO2013049517A3 (en) 2014-05-08
HK1243427A1 (zh) 2018-07-13
JP2014532053A (ja) 2014-12-04
EP3210625A3 (en) 2017-10-25
HK1199835A1 (en) 2015-07-24
EP3628329B1 (en) 2022-08-10
US20140004112A1 (en) 2014-01-02
AU2012315792B2 (en) 2017-09-07
US10793633B2 (en) 2020-10-06
EP2760471A4 (en) 2015-06-03
US20170008962A1 (en) 2017-01-12
KR20190112756A (ko) 2019-10-07
CA2850542A1 (en) 2013-04-04
IL231604B (en) 2018-08-30
US9402905B2 (en) 2016-08-02
NZ623086A (en) 2016-08-26
AU2012315792A1 (en) 2014-04-17
ES2619707T3 (es) 2017-06-26
EP2760471A2 (en) 2014-08-06
SI2760471T1 (sl) 2017-04-26
LT2760471T (lt) 2017-04-25
EP2760471B1 (en) 2017-02-01
SMT201700221T1 (it) 2017-05-08
KR20140076600A (ko) 2014-06-20
CN107098967A (zh) 2017-08-29
MX2014003601A (es) 2014-05-28
CL2014000786A1 (es) 2014-11-14
EA201490644A1 (ru) 2014-09-30
PT2760471T (pt) 2017-03-22
EP2760471B9 (en) 2017-07-19
MX355877B (es) 2018-05-03
PL2760471T3 (pl) 2017-07-31
IL231604A0 (en) 2014-05-28
JP2018048139A (ja) 2018-03-29
TN2014000134A1 (en) 2015-07-01
ES2925654T3 (es) 2022-10-19
CN103958543A (zh) 2014-07-30
BR112014007487A2 (pt) 2017-04-04
EP3210625B1 (en) 2019-08-28
NZ721184A (en) 2018-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2012315792B2 (en) Therapeutic peptides
JP6397886B2 (ja) 治療用ペプチド
ES2755129T3 (es) Péptidos terapéuticos
HK1199835B (en) Therapeutic peptides