RS55989B1 - Sastavi i postupci terapeutske nukleaze - Google Patents

Sastavi i postupci terapeutske nukleaze

Info

Publication number
RS55989B1
RS55989B1 RS20170510A RSP20170510A RS55989B1 RS 55989 B1 RS55989 B1 RS 55989B1 RS 20170510 A RS20170510 A RS 20170510A RS P20170510 A RSP20170510 A RS P20170510A RS 55989 B1 RS55989 B1 RS 55989B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
domain
artificial sequence
polypeptide
dna
rnase
Prior art date
Application number
RS20170510A
Other languages
English (en)
Inventor
Jeffrey A Ledbetter
Martha Hayden-Ledbetter
Keith Elkon
Xizhang Sun
Original Assignee
Univ Washington
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Washington filed Critical Univ Washington
Publication of RS55989B1 publication Critical patent/RS55989B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/12—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for climacteric disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/06—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier attached to the carrier via a bridging agent
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/27—Endoribonucleases producing 3'-phosphomonoesters (3.1.27)
    • C12Y301/27005—Pancreatic ribonuclease (3.1.27.5)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak je ostvaren uz podršku iz Nacionalnog instituta za zdravlje (grantovi AI44257, NS065933, i AR048796), Alijansa za istraživanje lupusa, i fonda Washington State Life Science Discovery (2087750). Vlada ima određena prava u pronalasku.
POZADINA
[0002] Prekomerno oslobađanje (ribo)nukleoproteinskih čestica iz mrtvih i umirućih ćelija može da izazove lupus oboljenja putem dva mehanizma: (i) taloženje ili in situ formiranje hromatin/anti-hromatin kompleksa koji uzrokuju nefritis i dovode do gubitka bubrežne funkcije; i (ii) nukleoproteini aktiviraju urođeni imunitet kroz tolični receptor (TLR) 7, 8, i 9, kao i kroz TLR-nezavisne puteve. Oslobađanje nukleoproteina može poslužiti kao potentni antigen za autoantitela u SEL, obezbeđući amplifikaciju B ćelija i DC aktivaciju putem koangažovanja antigen receptora i TLR-a. Stoga, postoji potreba za način za uklanjanje podstičućih antigena i/ili ublažavanje imune stimulacije, imunološkog pojačavanja i bolesti posredovanih imunim kompleksom kod pacijenata kojima je to potrebno.
[0003] Dwyer et al (J Biol Chem.1999 Apr 2;274(14):9738-43) istražuju DNKaze sa potencijalno poboljšanim osobinama i izgradili su molekularnu fuziju ljudske DNKaze I sa zglobnom i Fc regijom ljudskog IgG1 teškog lanca, stvarajući fuzioni protein DNKaza I-Fc.
SAŽETAK
[0004] Pronalazak je naveden u patentnim zahtevima. U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje polipeptid koji obuhvata RNKazu i varijantu Fc domena, gde je RNKaza operativno kuplovana, opciono sa veznikom, za varijantu Fc domena, gde varijanta Fc domena predstavlja varijantu ljudskog IgG1 Fc domena koji se sastoji od aminokiselinske supstitucije koja smanjuje vezivanje, u poređenju sa divljim tipom, za Fcγ receptor ili komplementni protein ili oboje, pri čemu polipeptid ima smanjene efektorske funkcije opciono odabrane iz grupe koju čine opsonizacija, fagocitoza, citotoksičnost zavisna od komplemenata i ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela.
[0005] U drugom aspektu pronalazak obezbeđuje sastav koji sadrži polipeptid prvog aspekta i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0006] Dalji aspekti pronalaska obezbeđuju nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid prvog aspekta, rekombinantni vektor eksprimiranja koji kodira tu nukleinsku kiselinu, i ćeliju domaćina transformisanu sa tim rekombinantnim vektorom eksprimiranja.
[0007] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje postupak za dobijanje polipeptida prvog aspekta, koji obuhvata: obezbeđivanje ćelije domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid; i održavanje ćelije domaćina pod uslovima u kojima je polipeptid eksprimiran.
[0008] Sledeći aspekt pronalaska obezbeđuje polipeptid prvog aspekta, za upotrebu u postupku za tretiranje ili prevenciju stanja vezanog sa abnormalnim imunim odgovorom.
[0009] Obelodanjen ovde je hibridni molekul nukleaze koji sadrži prvi domen nukleaze i Fc domen, gde je prvi domen nukleaze operativno vezan za Fc domen. U nekim opisanim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze dalje obuhvata prvi veznik domen, i prvi domen nukleaze je operativno kuplovan sa Fc domenom od prvog veznik domena.
[0010] U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze je polipeptid, pri čemu aminokiselinska sekvenca prvog domena nukleaze sadrži sekvencu ljudskog, divljeg tipa RNKaza aminokiseline, pri čemu je prvi veznik domen (Gly4Ser)n, gde n je 0, 1, 2, 3, 4 ili 5, pri čemu aminokiselinska sekvenca Fc domena sadrži ljudski, divlji tip IgG1 Fc domen aminokiselinske sekvence, i gde je prvi veznik domen kuplovan za C-terminus prvog nukleaza domena i N-terminus Fc domena. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze je polipeptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence prikazane u Tabeli 2. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze je polipeptid koji sadrži SEQ ID NO: 149. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze predstavlja polipeptid koji sadrži SEQ ID NO: 145. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze je polipeptid koji sadrži SEQ ID NO: 161. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze je polipeptid koji sadrži SEQ ID NO: 162. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze je polipeptid koji sadrži SEQ ID NO: 163.
[0011] U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sadrži divlji tip ljudske DNKaze1 vezane za divlji tip ljudskog IgG1. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sadrži ljudsku DNKazu1 G105R A114F vezanu za divlji tip ljudskog IgG1 Fc domena od putem (gly4ser)n veznik domena gde je n = 0, 1, 2, 3, 4 ili 5. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sadrži divlji tip ljudske RNKaze1 vezane za divlji tip ljudskog IgG1 vezanog za divlji tip ljudske DNKaze1. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sadrži divlji tip ljudske RNKaze1 vezane za divlji tip ljudskog IgG1 vezan ljudsku DNKazu1 G105R A114F. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze je polipeptid, pri čemu aminokiselinska sekvenca prvog domena nukleaze sadrži sekvencu aminokiselinsku RNKaze, gde je prvi veznik domen dugačak između 5 i 32 aminokiselina, pri čemu aminokiselinska sekvenca Fc domena sadrži ljudsku aminokiselinsku sekvencu Fc domena, i gde je prvi veznik domen je kuplovan za C-terminus prvog domena nukleaze i N-terminus Fc domena. U nekim otelotvorenjima, veznik domen uključuje (gly4ser)5 i restriktivna mesta Bg1II, AgeI i XhoI. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze je polipeptid, pri čemu aminokiselinska sekvenca prvog domena nukleaze sadrži ljudsku aminokiselinsku sekvencu RNKaze, gde je prvi veznik domen NLG peptid dugačak između 5 i 32 aminokiselina, pri čemu aminokiselinska sekvenca Fc domena sadrži ljudski divlji tip sekvence Fc domena aminokiseline, i pri čemu je prvi veznik domen kuplovan za C-terminus prvog domena nukleaze i N-terminus Fc domena.
[0012] U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, Fc domen se vezuje za Fc receptor na ljudskim ćelijama. U nekim otelotvorenjima, poluživot molekula u serumu je znatno duži od poluživota u serumu samog prvog domena nukleaze. U nekim otelotvorenjima, aktivnost nukleaze prvog domena molekula nukleaze je ista ili veća od samog domena nukleaze. U nekim otelotvorenjima, primena molekula na miševe povećava stopu preživljavanja miša merenu mišjim modelom lupus testa.
[0013] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje lider sekvencu. U nekim otelotvorenjima, lider sekvenca je ljudski VK3LP peptid iz ljudske porodice kapa lakog lanca, i lider sekvenca je kuplovana za N-terminus prvog domena nukleaze.
[0014] U nekim otelotvorenjima, molekul je polipeptid. U nekim otelotvorenjima, molekul je polinukleotid.
[0015] U nekim otelotvorenjima, prvi domen nukleaze sadrži RNKazu. U nekim otelotvorenjima, RNKaza je ljudska RNKaza. U nekim otelotvorenjima, RNKaza je polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% sličnu RNKaza aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u Tabeli 2. U nekim otelotvorenjima, RNKaza je čovek član ljudske porodice RNKaza. U nekim otelotvorenjima, RNKaza je ljudska pankreasna RNKaza1.
[0016] U nekim otelotvorenjima, prvi domen nukleaze sadrži DNKazu. U nekim otelotvorenjima, DNKaza je ljudska DNKaza. U nekim otelotvorenjima, DNKaza je polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% sličnu DNKaza aminokiselinskoj sekvenci prikazanoj u Tabeli 2. U nekim otelotvorenjima, DNKaza se bira iz grupe koju čine ljudska DNKaza I, TREX1, i ljudska DNKaza 1L3.
[0017] U nekim otelotvorenjima, Fc domen je ljudski Fc domen. U nekim otelotvorenjima, Fc domen je divlji tip Fc domena. U nekim otelotvorenjima, Fc domen je mutant Fc domen. U nekim otelotvorenjima, Fc domen je ljudski IgG1 Fc domen. U nekim otelotvorenjima, Fc domen je polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% sličnu Fc domenu aminokiselinske sekvence date u Tabeli 2.
[0018] U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen ima dužinu od oko 1 do oko 50 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen ima dužinu od oko 5 do oko 31 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen ima dužinu od oko 15 do oko 25 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen ima dužinu od oko 20 do oko 32 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen ima dužinu od oko 20 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen ima dužinu od oko 25 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen ima dužinu od oko 18 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen sadrži gly/ser peptid. U nekim otelotvorenjima, gly/ser peptid ima formulu (Gly4Ser)n, gde je n pozitivan ceo broj izabran iz grupe koju čine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10. U nekim otelotvorenjima, gly/ser peptid sadrži (Gly4Ser)3. U nekim otelotvorenjima, gly/ser peptid sadrži (Gly4Ser)4. U nekim otelotvorenjima, gly/ser peptid sadrži (Gly4Ser) 5. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen obuhvata najmanje jedno restrikciono mesto. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen obuhvata oko 12 ili više nukleotida uključujući najmanje jedno restrikciono mesta. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen uključuje dva ili više restrikcionih mesta. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen uključuje mnoštvo restrikcionih mesta. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen sadrži NLG peptid. U nekim otelotvorenjima, prvi veznik domen sadrži N-vezano mesto glikozilacije.
[0019] U nekim otelotvorenjima, prvi domen nukleaze je vezan za N-terminus Fc domena. U nekim otelotvorenjima, prvi domen nukleaze je vezan na C-terminus Fc domena.
[0020] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze dalje obuhvata drugi domen nukleaze. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi domeni nukleaze su različiti domeni nukleaze. U nekim otelotvorenjima, prvi i drugi domen nukleaze su isti domeni nukleaze. U nekim otelotvorenjima, drugi domen nukleaze je vezan za C-terminus Fc domena. U nekim otelotvorenjima, drugi domen nukleaze je vezan za N-terminus Fc domena. U nekim otelotvorenjima, drugi domen nukleaze je vezan za C-terminus prvog domena nukleaze. U nekim otelotvorenjima, drugi domen nukleaze je vezan za N-terminus prvog domena nukleaze.
[0021] Takođe je ovde otkriven dimerni polipeptid koji sadrži prvi polipeptid i drugi polipeptid, pri čemu prvi polipeptid sadi prvi domen nukleaze, i Fc domen, gde je prvi domen nukleaze operativno kuplovan za Fc domen. U nekim otelotvorenjima, drugi polipeptid je drugi hibridni molekul nukleaze koji sadrži drugi domen nukleaze i drugi Fc domen, pri čemu je drugi domen nukleaze operativno kuplovan za drugi Fc domen.
[0022] Takođe je ovde obelodanjen farmaceutski sastav koja sadrži najmanje jedan hibridni molekul nukleaze i/ili najmanje jedan dimerni polipeptid kao što je ovde opisano, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
[0023] Takođe je ovde obelodanjen molekul nukleinske kiseline koji kodira ovde opisan hibridni molekul nukleaze. Takođe je ovde obelodanjen rekombinantni vektor eksprimiranja koji sadrži ovde opisan molekul nukleinske kiseline. Takođe je ovde obelodanjena ćelija domaćin transformisana sa ovde opisanim rekombinantnim vektorom eksprimiranja.
[0024] Takođe je ovde obelodanjen postupak izrade ovde opisane hibridne nukleaze, koji sadrži: obezbeđivanje ćelije domaćina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira hibridni molekul nukleaze; i održavanje ćelije domaćina pod uslovima u kojima je eksprimiran hibridni molekul nukleaze.
[0025] Takođe je ovde obelodanjen postupak za lečenje ili prevenciju stanja povezanog sa abnormalnim imunim odgovorom, koji obuhvata davanje pacijentu prema njegovoj potrebi efikasne količine izolovanog ovde opisanog hibridnog molekula nukleaze. U nekim otelotvorenjima, stanje je autoimuna bolest. U nekim otelotvorenjima, autoimuna bolest izabrana iz grupe koju čine insulin-zavisni dijabetes melitus, multipla skleroza, eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis, reumatoidni artritis, eksperimentalni autoimuni artritis, mijastenija gravis, tiroiditis, eksperimentalni oblik uveoretinitisa, Hašimotov tiroiditis, primarna mikoedema, tirotoksikoza, perniciozna anemija, autoimuni atrofični gastritis, Adisonova bolest, prevremena menopauza, neplodnost muškaraca, juvenilni dijabetes, Gudpasterov sindrom, pemfigus vulgaris, pemfigoid, simpatetička oftalmija, fakogeni uveitis, autoimuna hemolitička anemija, idiopatska leukopenija, primarna žučna ciroza, aktivni hronični hepatitis Hbs-ve, kriptogena ciroza, ulcerativni kolitis, Sjogrenov sindrom, skleroderm, Vegnerova granulomatoza, polimiozitis, dermatomiozitis, diskoidni LE, sistemski lupus eritematozus (SLE) i bolest vezivnog tkiva. U nekim otelotvorenjima, autoimuna bolest je SLE.
KRATAK OPIS NEKOLIKO PRIKAZA SLIKA
[0026] Ove i druge osobine, aspekti i prednosti ovog pronalaska će se bolje razumeti u kontekstu daljem opisa i pripadajućih slika, gde:
Slika 1 pokazuje nukleotidnu i aminokiselinsku sekvencu mRNKaze-mIgG2a sa mutacijama na P238S, K322S, i P331 S. Ova sekvenca je data u listingu sekvenci kao huVK3LP+mrib1+mIgG2A-C-2S (SEQ ID NO:114).
Slika 2 pokazuje šematski dijagram nekih otelotvorenja ovde opisanih hibridnih molekula nukleaze.
Slika 3 pokazuje SDS-PAGE želatin analizu mRNKaze-mIgG2a-c pod redukcionim i neredukcionim uslovima.
Slika 4 pokazuje želatinsku imunoprecipitacija analizu mRNKazemIg2a-c.
Slika 5 pokazuje anti-RNK antitelo ELISA titer pre i posle intravenske injekcije RNKaza-Ig hibridnog molekula nukleaze od miša 410. Podaci pokazuju da je injekcija RNKaza-Ig izazvala redukciju u titer anti-RNK antitela koja se održala tokom 3 nedelje.
Slika 6 pokazuje da je dodavanje RNKaza-Ig ukinulo indukciju interferona-α iz ljudskih mononuklearnih perifernih ćelija krvi stimulisanih korišćenjem imunih kompleksa formiranih sa serumom od SLE pacijeta (J11) plus nuklearni ekstrakt (NE). Titer anti-RNK antitela je redukovan nakon injekcije RNKaze-Ig.
Slika 7 pokazuje da je dodavanje RNKaza-Ig ukinulo indukciju interferona-α iz ljudskih mononuklearnih perifernih ćelija krvi stimulisanih korišćenjem imunih kompleksa formiranih sa serumom od SLE pacijenta (J11) plus nuklearni ekstrakt. Slika 8 pokazuje jednu analizu radijalne difuzije enzima (SRED) od dva RNKaza transgenična (Tg) miša u poređenju sa normalnim B6 mišem.
Slika 9 pokazuje koncentraciju RNKazeA kod Tg i dvostruko Tg (DTg) miševa, mereno sa ELISA. Svaka tačka predstavlja koncentraciju izmerenu kod pojedinačnog miša.
Slika 10 pokazuje preživljavanje TLR7.1 Tg u poređenju sa TLR7.1xRNKazaA DTg miševima.
Slika 11 pokazuje kvantitativan PCR od IRG-a u slezinama Tg u poređenju sa DTg miševima.
Slika 12 pokazuje prototip strukturu za kreiranje različitih otelotvorenja hibridnih molekula nukleaze.
Slika 13 pokazuje kinetiku enzima za hRNKaza1-G88D-hIgG1 SCCH-P238S-K322S-P331 S hibridne molekule nukleaze, kako je izmereno koristeći RNase Alert™ supstrat.
Slika 14 pokazuje vezivanje hRNKaza1-WT-hIgG1-WT za ljudske monocitne ćelijske linije U937 i THP1. Vrh na levoj strani na oba grafikona je kontrola i vrh na desnoj strani na oba grafikona je hRNKaza1-WT-hIgG1-WT.
Slika 15 pokazuje aktivnost blokiranja ljudskog IVIg za vezivanje za U937 i THP-1 ćelije putem hRNKaze1-WT-hIgG1-WT.
Slika 16 pokazuje rezultate testa digestije DNK pomoću Trex1-(g4s)n-mIgG alternativnih oblika.
Slika 17 pokazuje rezultate Western Blot za trex1-(Gly4S)4-Ig i trex1-(Gly4S)5-Ig kulturu supernanata od COS-7 prolaznih transfekcija.
Slika 18 pokazuje obrasce digestije DNK pomoću različitih stabilno trasnfektovanih CHO DG44 klonova obeleženih kao 2A3, 3A5, i 8H8, koji eksprimiraju DNKse1L3-mIgG2a-c hibridne molekule nukleaze.
Slika 19 pokazuje obrasce digestije DNK sa opadajućim količinama DNKaza1L3-Ig hibridnih molekula nukleaze nakon različitih vremena inkubacije sa i bez heparina kao enzimskog inhibitora.
Slika 20 pokazuje Western blot imunoprecipitirane fuzije proteina na prolazno transfektovanim COS ćelijama koje eksprimiraju različita otelotvorenja hRNKaza1-Ig-hDNKazal ili hDNKaza1-Ig hibridnog molekula nukleaze.
Slika 21 pokazuje SRED analizu kako bi se procenilo prisustvo RNKaza aktivnosti kod COS supernatanta koji eksprimiraju različita otelotvorenja hRNKaza1-IghDNKaza ili hDNKaza1-Ig hibridnog molekula nukleaze.
Slika 22 pokazuje kompozitnu sliku koja pokazuje rezultate testova aktivnosti nukleaze od DNKaze obavljene na COS supernatantima od transfektovanih ćelija. Opis numeracije (npr., 090210-8 i 091210-8) Slike 21 primenjuje se i na ovu sliku. Slika 23 pokazuje kinetiku enzima analiziranu koristeći RNase Alert supstrat (Ambion/IDT) i fluorescenciju kvantifikovanu sa Spectramax M2 čitačem mikroploča. Podaci su analizirani koristeći Softmax Pro softver (Molecular Devices). Merene su stope reakcije na različitim koncentracijama supstrata i podaci su prikazani kao Lajnviver-Burkov dijagram. Vidljiva Km, korigovana za zapreminu je 280 nM. Slika 24 pokazuje nivoe anti-RNK antitela u mišjim serumima od H564 i H564-RNKazaA dvostruko transgeničnih miševa na uzastopnim intervalima kako su transgenični miševi starili.
DETALJAN OPIS
[0027] Izrazi upotrebljeni u patentnim zahtevima i opisu definisani su kako sledi, ukoliko nije drugačije naznačeno. U slučaju direktnog konflikta sa izrazom korišćenim u matičnoj provizornoj patentnoj prijavi, izraz koji se koristi u ovom opisu će imati prednost.
[0028] „Aminokiseline“ se odnose na prirodne i sintetičke aminokiseline, kao i analoge aminokiselina i mimetike aminokiselina koji funkcionišu na način sličan prirodnim aminokiselinama. Sintetičke aminokiseline su one koje kodira genetski kod, kao i one aminokiseline koje su kasnije modifikovane, npr., hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, i O-fosfoserin. Analozi aminokiselina odnosi se na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina, tj. nivo α ugljenika koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupe, i R grupu, npr. homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi imaju modifikovane R grupe (npr. norleucin) ili modifikovane peptidne okosnice, ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina. Mimetici aminokiselina se odnosi na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu koja se razlikuje od opšteg hemijske strukture aminokiselina, ali koja funkcionišu na način koji sličan prirodno nastalim aminokiselinama.
[0029] Aminokiseline mogu biti spomenute bilo sa svoja uobičajeno poznata tri slovna simbola, ili sa jednoslovnim simbolima po preporuci IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Nukleotidi, isto tako, mogu se spominjati prema svojim uobičajeno prihvaćenih jednoslovnim kodovima.
[0030] „Supstitucija aminokiselina“ odnosi se na zamenu najmanje jednog postojećeg aminokiselinskog ostatka u unapred određenoj aminokiselinskoj sekvenci (aminokiselinskoj sekvenci polaznog polipeptida) sa drugim, drugačiji „zamenskim“ aminokiselinskim ostatkom. „Umetanje aminokiselina“ se odnosi na ugrađivanje najmanje jedne dodatne aminokiseline u unapred određenu aminokiselinsku sekvencu. Dok se umetanje obično sastoje od umetanja jednog ili dva aminokiselinska ostatka, mogu da se urade veća „umetanja peptida“, npr. umetanje oko tri do oko pet, ili čak do oko deset, petnaest ili dvadeset aminokiselinskih ostataka. Ubačeni ostaci mogu biti prirodni ili oni koji se ne javljaju u prirodi, kao što je opisano gore. „Brisanje aminokiselina“ odnosi se na uklanjanje najmanje jednog aminokiselinskog ostatka iz unapred određene aminokiselinske sekvence.
[0031] „Polipeptid“, „peptid“ i „protein“ su ovde korišćeni naizmenično tako da označavaju polimer aminokiselinskih ostataka. Uslovi važe za aminokiselinske polimere u kojima su jedan ili više aminokiselinskih ostataka veštački hemijski mimetici odgovarajuće prirodne aminokiseline, kao i na prirodne aminokiselinske polimere i aminokiselinske polimere koji se ne javljaju u prirodi.
[0032] „Nukleinska kiselina“ se odnosi na dezoksiribonukleotide ili ribonukleotide i njihove polimere, bilo u obliku jednostrukog- ili dvostrukog-lanca. Ukoliko se specifično ograničen, izraz obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida koji imaju slične osobine vezivanja kao referentna nukleinska kiselina i koji se metabolišu na način sličan prirodnim nukleotidima. Ukoliko nije drugačije naznačeno, određena sekvenca nukleinske kiseline takođe implicitno obuhvata njihove konzervativno modifikovane varijante (npr. supstitucije degenerisanog kodona) i komplementarne sekvence i kao i eksplicitno naznačene sekvence. Konkretno, supstitucije degenerisanog kodona mogu se postići generisanjem sekvenci u kojima je treći položaj jednog ili više odabranih (ili svih) kodona supstituisan sa mešovitom-bazom i/ili dezoksinozinskim ostacima (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081, 1991; Ohtsuka et al., J. Biol. Chem.260:2605-2608, 1985); and Cassol et al., 1992; Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98, 1994). Za arginin i leucin, modifikacije na drugoj bazi takođe mogu biti konzervativne. Pojam nukleinska kiselina se naizmenično koristi sa genom, cDNK i mRNK kodiranim od strane gena.
[0033] Polinukleotidi ovog pronalaska mogu biti sastavljeni od bilo kog poliribonukleotida ili polidezoksiribonukleotida, koji mogu biti nemodifikovani RNK ili DNK ili modifikovani RNK ili DNK. Na primer, polinukleotidi mogu biti sastavljeni od jednostrukog i dvostrukog lanca DNK, DNK koja je smeša jednolančanih i dvolančanih regija, jednolančanog i dvolančanog RNK, i RNK koja je smeša jednolančanih i dvolančanih regija, hibridnih molekula koji sadrže DNK i RNK koje mogu biti jednolančani ili, tipičnije, dvolančani ili smeša jednolančanih i dvolančanih regija. Pored toga, polinukleotid može biti sastavljen od trolančanih regija koje obuhvataju RNK ili DNK ili i RNK i DNK. Polinukleotid može takođe da sadrži jednu ili više modifikovanu bazu ili DNK ili RNK kičme modifikovane za stabilnost ili iz drugih razloga. „Modifikovane“ baze obuhvataju, na primer, tritilovane baze i neobične baze kao što je inozin. Mnogobrojne modifikacije mogu se izvršiti na DNK i RNK; dakle, „polinukleotid“ obuhvata hemijski, enzimski ili metabolički modifikovane oblike.
[0034] Kad se ovde koristi, izraz „hibridni molekul nukleaze“ se odnosi na polinukleotide ili polipeptide koji sadrže najmanje jedan domen nukleaze i najmanje jedan Fc domen. Hibridni molekuli nukleaze takođe se nazivaju fuzioni proteini i fuzioni geni. Na primer, u jednom aspektu, hibridni molekul nukleaze može biti polipeptid koji sadrži najmanje jedan Fc domen povezan sa domenima nukleaze kao što su DNKaza i/ili RNKaza. Kao drugi primer, hibridni molekul nukleaze može uključivati RNKaza domen nukleaze, veznik domen i Fc domen. SEQ ID NO: 161 je primer hibridnog molekula nukleaze. Drugi primeri su opisani detaljnije u nastavku. U jednom otelotvorenju hibridni molekul nukleaze prema pronalasku može uključivati dodatne modifikacije. U sledećem otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze može biti modifikovan kako bi dodao funkcionalnu grupu (npr., PEG, lek ili oznaku).
[0035] U određenim aspektima, hibridni molekuli nukleaze pronalaska mogu koristiti jedan ili više „veznik domen“, kao što su polipeptidni veznici. Kako je ovde korišćen, izraz „veznik domen“ se odnosi na sekvencu koja povezuje dva ili više domena u linearnoj sekvenci. Kako je ovde korišćen, izraz „polipeptidni veznik“ se odnosi na peptidnu ili polipeptidnu sekvencu (npr. sintetičku peptidnu ili polipeptidnu sekvencu) koja povezuje dva ili više domena u linearnoj aminokiselinskoj sekvenci polipeptidnog lanca. Na primer, polipeptidni veznici se mogu koristiti za povezivanje domena nukleaze za Fc domen. Poželjno, takvi polipeptidni veznici mogu pružiti fleksibilnost molekula polipeptida. U određenim otelotvorenjima polipeptidni veznik se koristi za povezivanje (npr. genetički fuzioniše) jednog ili više Fc domena i/ili jednog ili više domena nukleaze. Hibridni molekul nukleaze prema pronalasku može sadržati više od jednog veznik domena ili peptidnog veznika.
[0036] Kad se ovde koristi, izraz „gly-ser polipeptidni veznik“ odnosi se na peptid koji se sastoji od glicina i ostataka serina. Primerni Gly/ser sadrži aminokiselinsku sekvencu Ser (Gly4Ser) n. U jednom otelotvorenju, n = 1. U jednom otelotvorenju, n = 2. U drugom otelotvorenju, n = 3, tj. Ser(Gly4Ser)3. U drugom otelotvorenju, n = 4, tj. Ser(Gly4Ser) 4. U drugom otelotvorenju, n = 5. U još jednom otelotvorenju, n = 6. U drugom otelotvorenju, n = 7. U još jednom otelotvorenju, n = 8. U drugom otelotvorenju, n = 9. U još jednom otelotvorenju, n = 10. Drugi primerni Gly/ser polipeptidni veznik sadrži aminokiselinsku sekvencu Ser(Gly4Ser)n. U jednom otelotvorenju, n = 1. U jednom otelotvorenju, n = 2. U poželjnom otelotvorenju, n = 3. U drugom otelotvorenju, n = 4. U drugom otelotvorenju, n = 5. U još jednom otelotvorenju, n = 6.
[0037] Kako se ovde koriste, izrazi „vezan“, „fuzionisan“ ili „fuzija“, koriste se naizmenično. Ovi izrazi se odnose na sjedinjavanje dva ili više elementa ili komponente ili domena, bilo kojim sredstvima, uključujući hemijske konjugacije ili rekombinantna sredstva. Postupci hemijske konjugacije (npr., korišćenjem agenasa za heterobifunkcionalno unakrsno povezivanje) poznati su u struci.
[0038] Kad se ovde koristi, izraz „Fc regija“ se definiše kao deo prirodnog imunoglobulina formiran od odgovarajućih Fc domena (ili Fc delova) od svoja dva teška lanca.
[0039] Kad se ovde koristi, izraz „Fc domen“ se odnosi na deo jednog imunoglobulina (Ig) teškog lanca. Kao takav, Fc domen može biti označen kao „Ig“ ili „IgG“. U nekim otelotvorenjima, Fc domen počinje u zglobnoj regiji tek uzvodno od papain cepanja i završava se na C-terminusu antitela. Shodno tome, potpuni Fc domen obuhvata najmanje zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen. U određenim otelotvorenjima, Fc obuhvata najmanje jedno od: zglobni (npr. gornja, srednja i/ili niža zglobna regija) domen, CH2 domen, CH3 domen, CH4 domen, ili njegovu varijantu, deo ili fragment. U drugim otelotvorenjima, Fc domen obuhvata kompletan Fc domen (tj., zglobni domen, CH2 domen, i CH3 domen). U jednom otelotvorenju, Fc domen obuhvata zglobni domen (ili njegov deo) fuzionisan za CH3 domen (ili njegov deo). U drugom otelotvorenju, Fc domen obuhvata CH2 domen (ili njegov deo) fuzionisan za CH3 domen (ili njegov deo). U drugom otelotvorenju, Fc domen se sastoji od CH3 domena ili njegovog dela. U drugom otelotvorenju, Fc domen se sastoji od zglobnog domena (ili njegovog dela) i CH3 domena (ili njegovog dela). U drugom otelotvorenju, Fc domen se sastoji od CH2 domena (ili njegovog dela) i CH3 domena. U drugom otelotvorenju, Fc domen se sastoji od zglobnog domena (ili njegovog dela) i CH2 domena (ili njegovog dela). U jednom otelotvorenju, Fc domenu nedostaje najmanje deo CH2 domena (npr., ceo ili deo CH2 domena). U jednom otelotvorenju, Fc domen pronalaska obuhvata najmanje deo Fc poznatog u struci da je neophodan za FcRn vezivanje. U drugom otelotvorenju, Fc domen pronalaska obuhvata najmanje deo Fc poznatog u struci da je neophodan za FcγR vezivanje. U jednom otelotvorenju, Fc domen pronalaska obuhvata najmanje deo Fc poznatog u struci da je neophodan za vezivanje proteina. U jednom otelotvorenju, Fc domen pronalaska obuhvata najmanje deo Fc poznatog u struci da je neophodan za vezivanje protein G. Fc domen ovde se obično odnosi na polipeptid koji obuhvata ceo ili deo Fc domena teškog lanca imunoglobulina. To uključuje, ali nije ograničeno na, polipeptide koji obuhvataju cele CH1, zglobne, CH2, i/ili CH3 domene kao i fragmente takvih peptida koji obuhvataju samo, npr., zglobni, CH2, i CH3 domen. Fc domen može biti dobijen od imunoglobulina bilo koje vrste i/ili bilo kog podtipa, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ljudska IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ili IgM antitela. Fc domen obuhvata prirodne Fc i varijante Fc molekula. Kao sa varijantama Fc i prirodnim Fc, izraz Fc domen uključuje molekule u monomernom ili multimernom obliku, digestovane iz celog antitela ili dobijene na druge načine.
[0040] Kao što je navedeno prethodno,razumeti onaj ko je uobičajeno stručan u oblasti da bilo koji Fc domen može biti modifikovan tako da varira u sekvenci aminokiseline od prirodnog Fc domena prirodnog imunoglobulinskog molekula. U određenim otelotvorenjima iz primera, Fc domen zadržava efektorsku funkciju (npr. FcγR vezivanje).
[0041] Fc domeni polipeptida pronalaska mogu biti izvedeni iz različitih molekula imunoglobulina. Na primer, Fc domen polipeptida može sadržati CH2 i/ili CH3 domen izveden iz IgG1 molekula i zglobnu regiju poreklom iz IgG3 molekula. U drugom primeru, Fc domen može da sadrži himernu zglobnu regiju izvedenu, delimično iz IgG1 molekula i delimično iz IgG3 molekula. U drugom primeru, Fc domen može da sadrži himerni zglob izveden, delimično iz IgG1 molekula i delimično iz IgG4 molekula.
[0042] Polipeptid ili aminokiselinska sekvenca „izvedena iz“ određenog polipeptida ili proteina se odnosi na poreklo polipeptida. Poželjno, sekvenca polipeptida ili aminokiselina koja se dobija iz određene sekvence ima aminokiselinsku sekvencu koja je suštinski identična toj sekvenci ili njenom delu, gde se deo sastoji od najmanje 10-20 aminokiselina, poželjno najmanje 20-30 aminokiseline, još poželjnije najmanje 30-50 aminokiselina, ili, kako je inače prepoznatljivo onome ko je uobičajeno stručan u oblasti, tako da ima svoje poreklo u sekvenci.
[0043] Polipeptidi izvedeni iz drugog peptida mogu imati jednu ili više mutacija u odnosu na polazni polipeptid, npr., jedan ili više aminokiselinskih ostataka koje su supstituisani sa drugim aminokiselinskim ostatkom, ili koji imaju jedno ili više dodavanje ili brisanje aminokiselinskih ostatka.
[0044] Polipeptid može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja se ne javlja prirodno.
Ovakve varijante obavezno imaju manje od 100% identičnosti sekvence ili sličnosti sa početnim hibridnim molekulima nukleaze. U poželjnom otelotvorenju, varijanta će imati aminokiselinsku sekvencu od oko 75% do manje od 100% identičnosti aminokiselinske sekvence ili sličnosti sa aminokiselinskom sekvencom početnog polipeptida, najpoželjnije od oko 80% do manje od 100%, poželjnije od oko 85% do manje od 100%, poželjnije od oko 90% do manje od 100% (npr.91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%), a najpoželjnije od oko 95% do manje od 100%, npr., preko dužine varijante molekula.
[0045] U jednom otelotvorenju, postoji jedna aminokiselinska razlika između polazne polipeptidne sekvence i sekvence izvedene iz nje. Identičnost ili sličnost u vezi sa ovom sekvencom ovde je definisana kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični (tj. isti je ostatak) sa početnim aminokiselinskim ostacima, posle poravnanja sekvenci i ubacivanja razmaka, ukoliko je potrebno, kako bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence.
[0046] U jednom otelotvorenju, polipeptid pronalaska sastoji se od, sastoji se značajno od, ili obuhvata aminokiselinsku sekvencu izabranu iz Tabele 2 i njene funkcionalno aktivne varijante. U otelotvorenju, polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnu aminokiselinskoj sekvenci datoj u Tabeli 2. U otelotvorenju, polipeptid uključuje susednu aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnu susednoj aminokiselinskoj sekvenci datoj u Tabeli 2. U otelotvorenju, polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, ili 500 (ili bilo koji ceo broj sa ovim ciframa) susednih aminokiselina aminokiselinske sekvence date u Tabeli 2.
[0047] U otelotvorenju, peptidi pronalaska s u kodirani od strane nukleotidne sekvence.
Nukleotidne sekvence pronalaska mogu biti korisne u velikom broju primena, uključujući: kloniranje, genetsku terapiju, eksprimiranje i prečišćavanje proteina, uvođenje mutacije, DNK vakcinaciju domaćina kom je to potrebno, generisanje antitela za, npr., pasivnu imunizaciju, PCR, generisanje prajmera i sondi, generisanje i dizajn siRNK (pogledati, npr., Dharmacon siDesign vebsajt), u slično. U otelotvorenju, nukleotidna sekvenca pronalaska obuhvata, sastoji se od, ili se sastoji značajno od, nukleotidne sekvence izabrane iz Tabele 2. U otelotvorenju, nukleotidna sekvenca uključuje nukleotidnu sekvencu najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnu nukleotidnoj sekvenci datoj u Tabeli 2. U otelotvorenju, nukleotidna sekvenca uključuje susednu nukleotidnu sekvencu najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnu susednoj nukleotidnoj sekvenci datoj u Tabeli 2. U otelotvorenju, nukleotidna sekvenca uključuje nukleotidnu sekvencu koja ima najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 300, 400, ili 500 (ili bilo koji ceo broj sa ovim ciframa) susednih nukleotida nukleotidne sekvence date u Tabeli 2.
[0048] Poželjni hibridni molekuli nukleaze pronalaska sadrže sekvence (na primer, najmanje jedan Fc domen) izvedene iz sekvence ljudskog imunoglobulina. Međutim, obelodanjene sekvence mogu da sadrže jednu ili više sekvenci od druge vrste sisara. Na primer, primatski Fc domen ili domen nukleaze mogu biti uključeni u predmetne sekvence. Alternativno, jedna ili više mišja aminokiselina može biti prisutna u polipeptidu. U nekim otelotvorenjima, polipeptidne sekvence obelodanjenja nisu imunogene i/ili imaju smanjenu imunogenost.
[0049] Takođe će biti jasno stručnjaku iz oblast da hibridni molekuli nukleaze pronalaska mogu biti promenjeni tako da se razlikuju po sekvenci od prirodnih sekvenci iz kojih su izvedeni, zadržavajući poželjnu aktivnost prirodnih sekvenci. Na primer, mogu se napraviti nukleotidne ili aminokiselinske supstitucije koje dovode do konzervativnih supstitucija ili promena na „ne-esencijalnim“ aminokiselinskim ostacima. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira neprirodnu varijantu hibridnog molekula nukleaze poreklom iz imunoglobulina (npr. Fc domena) može se kreirati uvođenjem jedne ili više nukleotidnih supstitucija, dodavanja ili brisanja u nukleotidnoj sekvenci imunoglobulina tako da se jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, dodavanja ili brisanja uvode u kodirani protein.
Mutacije se mogu uvesti standardnim tehnikama, kao što je mutageneza usmerena na mesto i PCR-posredovana mutageneza.
[0050] Peptidni hibridni molekuli nukleaze pronalaska mogu sadržati konzervativne aminokiselinske supstitucije na jednom ili više aminokiselinskih ostataka, npr., u esencijalnim ili ne-esencijalnim aminokiselinskim ostacima. „Konzervativna aminokiselinska supstitucija“ je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen sa aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u struci, uključujući bazne bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Tako, ne-esencijalni aminokiselinski ostatak u polipeptidu za vezivanje je poželjno zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom iz iste familije bočnog lanca. U još jednom otelotvorenju, niz aminokiselina može biti zamenjen strukturno sličnim nizom koji se razlikuje u redosledu i/ili sastava članova porodice bočnog lanca. Alternativno, u drugom otelotvorenju, mutacije mogu biti nasumično uvedene duž celog ili duž dela kodirajuće sekvence, kao što je mutageneza saturacije, a nastali mutanti se mogu ugraditi u vezujuće polipeptide iz ovog pronalaska, i ispitati za svoju sposobnost da se veže za željenu metu.
[0051] Izraz „ublažavanje“ se odnosi na bilo koji terapeutski koristan rezultat u lečenju stanja bolesti, npr. autoimunog stanja bolesti (npr. SLE), uključujući profilaksu, smanjenje ozbiljnosti ili napredovanja, remisije ili izlečenje.
[0052] Izraz „in situ“ se odnosi na procese koji se dešavaju u živim ćelijama koje rastu odvojeno od živog organizma, npr., rastu u kulturi tkiva.
[0053] Izraz „in vivo“ se odnosi na procese koji se javljaju u živom organizmu.
[0054] Izraz „sisar“ ili „pacijent“, kad se ovde koriste, uključuju i ljude i životinje i obuhvataju, ali nisu ograničeni na ljude, ne-ljudske primate, pase, mačke, miševe, goveda, konje, i svinje.
[0055] Izraz procenat „identičnosti“, u kontekstu dve ili više sekvenci nukleinske kiseline ili polipeptida, odnosi na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje imaju određeni procenat nukleotida ili aminokiselinskih ostataka koji su isti kada se porede i poravnaju za maksimalno odgovaranje, mereno pomoću jednog od algoritama za poređenje sekvence opisane u daljem tekstu (npr. BLASTP i BLASTN ili drugim algoritmima dostupnim stručnim licima) ili vizuelnim pregledom. U zavisnosti od primene, procenat „identičnosti“ može postojati preko regija sekvence koje se porede, npr. preko funkcionalnog domena, ili, alternativno, postoji celom dužinom dve sekvence koje se porede.
[0056] Za poređenje sekvenci, jedna sekvenca tipično deluje kao referentna sekvenca sa kojom se upoređuju testirane sekvence. Kada se koristi algoritam za poređenje sekvenci, test i referentne sekvence se unose u računar, označavaju se koordinate podsekvenci, ako je potrebno, i označavaju se programski parametri algoritma sekvenci. Algoritam poređenja sekvence zatim izračunava procenat identičnosti sekvenci testiranih sekvenci u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu unetih parametara programa.
[0057] Optimalno upoređivanje sekvenci za poređenje može se sprovoditi, npr. algoritmom lokalne homologije od Smith & Waterman, Adv. Appl. Math.2:482 (1981), algoritmom homologije poravnavanja od Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol.48:443 (1970), pretraživanjem za postupak sličnosti od Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), kompjuterizovanim implementacijama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), ili vizuelnim pregledom (pogledati generalno Ausubel et al., infra).
[0058] Jedan primer algoritma koji je pogodan za određivanje procenta identičnosti sekvence i sličnosti sekvence je algoritam BLAST, koji je opisan u Altschul et al., J. Mol. Biol.
215:403-410 (1990). Softver za obavljanje BLAST analize je javno dostupan kroz vebsajt Nacionalnog centara za biotehnološke informacije (National Center for Biotechnology Information).
[0059] Izraz „dovoljna količina“ označava količinu dovoljnu da proizvede željeni efekat, npr. količinu dovoljnu da modulira agregaciju proteina u ćeliji.
[0060] Izraz „terapeutski efikasna količina“ je količina koja je efikasna u ublažavanju simptoma bolesti. Terapeutski efektivna količina može biti „profilaktički efikasna količina“ jer se profilaksa može smatrati terapijom.
[0061] Treba napomenuti da, kad se koristi u specifikaciji i pridodatim patentnim zahtevima, oblici jednine uključuju množinu osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.
Sastavi
Hibridni molekuli nukleaze
[0062] U nekim otelotvorenjima, sastav uključuje hibridni molekul nukleaze. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje domen nukleaze operativno vezan za Fc domen. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje domen nukleaze vezan za Fc domen. U nekim otelotvorenjima hibridni molekul nukleaze je protein nukleaze. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze je polinukleotid nukleaze.
[0063] U nekim otelotvorenjima, domen nukleaze je vezan za Fc domen preko veznik domena. U nekim otelotvorenjima, veznik domen je peptidni veznik. U nekim otelotvorenjima, veznik domen je nukleotidni veznik. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sadrži lider molekul, npr. lider peptid. U nekim otelotvorenjima, lider molekul je lider peptid postavljen na N-terminusu domena nukleaze. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze će uključivati zaustavni kodon. U nekim otelotvorenjima, zaustavni kodon će biti na C-terminusu Fc domena.
[0064] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze dalje obuhvata drugi domen nukleaze. U nekim otelotvorenjima, drugi domen nukleaze je vezan za Fc domen preko drugog veznik domena. U nekim otelotvorenjima, drugi veznik domen će biti na C-terminusu Fc domena. Slika 12 prikazuje najmanje jednu varijantu hibridnog molekula nukleaze. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sadrži sekvencu prikazanu u Tabeli 2.
[0065] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze je RNKaza molekul ili molekul DNKaze ili multi-enzimski molekul (npr. i RNKaza i DNKaza ili dve RNK ili DNK nukleaze sa različitim specifičnostima za supstrat) vezan za Fc domen koji se specifično vezuje za vanćelijske imune komplekse. U nekim otelotvorenjima, Fc domen efektivno ne vezuje Fcγ receptore. U jednom aspektu, hibridni molekul nukleaze ne vezuje efektivno C1q. U drugim aspektima, hibridni molekul nukleaze sadrži u okviru Fc domen od IgG1. U drugim aspektima, hibridni molekul nukleaze dalje uključuje mutacije kod zglobnog, CH2 i/ili CH3 domena. U drugim aspektima, mutacije su P238S, P331 S ili N297S, i mogu uključivati mutacije u jednom ili više od tri zglobna cisteina. U nekim takvim aspektima, mutacije u jednoj ili više od tri zglobna cisteina mogu biti SCC ili SSS. U drugim aspektima, molekuli sadrže SCC zglobove, ali su inače divlji tip za ljudske IgG1 Fc CH2 i CH3 domene, i vezuju se efikasno za Fc receptore, olakšavajući uzimanje hibridnog molekula nukleaze u endocitni odeljak ćelija na koje su vezani. U drugim aspektima, molekul poseduje aktivnost protiv pojedinačnih i/ili dvostrukih RNK supstrata.
[0066] U nekim aspektima, aktivnost hibridnog molekula nukleaze se može detektovati in vitro i/ili in vivo. U nekim aspektima, hibridni molekul nukleaze se vezuje za ćelije, maligne ćelije ili ćelije raka i ometa njegovu biološku aktivnost.
[0067] U drugom aspektu, dat je multifunkcionalni molekul RNKaze koji je priključen na drugi enzim ili antitelo koji imaju specifičnost vezivanja, kao što je scFv targetiran za RNK ili drugi domen nukleaze sa istim ili različitim specifičnostima kao prvi domen.
[0068] U drugom aspektu, dat je multifunkcionalni molekul DNKaze koji je priključen na drugi enzima ili antitelo koji imaju specifičnost vezivanja, kao što je scFv targetiran za DNK ili drugi domen nukleaze sa istim ili različitim specifičnostima kao prvi domen.
[0069] U drugom aspektu, hibridni molekul nukleaze je prilagođen za sprečavanje ili lečenje bolesti ili poremećaja kod sisara, davanjem hibridnog molekula nukleaze vezanog za Fc regiju, u terapeutski efektivnoj količini, sisaru kome je potreban takav tretman, pri čemu se bolest sprečava ili leči. U drugim aspektima, bolest ili poremećaj su autoimuna bolest ili rak. U nekim takvim aspektima, autoimuna bolest je insulin-zavisni dijabetes melitus, multipla skleroza, eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis, reumatoidni artritis, eksperimentalni autoimuni artritis, miastenija gravis, tiroiditis, eksperimentalni oblik uveoretinitisa, Hašimotov tiroiditis, primarna miksoedema, tirotoksikoza, perniciozna anemija, autoimuni atrofični gastritis, Adisonova bolest, prevremena menopauza, neplodnost muškaraca, juvenilni dijabetes, Gudpasterov sindrom, pemfigus vulgaris, pemfigoid, simpatetička oftalmija, fakogenični uveitis, autoimuna hemolitička anemija, idiopatska leukopenija, primarna žučna ciroza, aktivni hronični hepatitis Hbs-ve, kriptogena ciroza, ulcerativni kolitis, Sjogrenov sindrom, skleroderm, Vegnerov granulomatozis, polimiozitis, dermatomiozitis, diskoidni LE, sistemski lupus eritematozus ili bolesti vezivnog tkiva.
[0070] U nekim otelotvorenjima, mete RNKaza enzimske aktivnosti RNKaza hibridnih molekula nukleaze su prvenstveno vanćelijske, i sastoje se od, na primer, RNK sadržane u imunim kompleksima sa anti-RNP autoantitelom i RNK eksprimiranom na površini ćelija podvrgnutih apoptozi. U nekim otelotvorenjima, RNKaza hibridni molekul nukleaze je aktivan u kiseloj sredini endocitnih vezikula. U nekim otelotvorenjima, RNKaza hibridni molekul nukleaze uključuje divlji tip (wt) Fc domena kako bi, npr., omogućio molekulu da veže FcR i uđe u endocitni odeljak kroz ulazni put korišćen od strane imunih kompleksa. U nekim otelotvorenjima, RNKaza hibridni molekul nukleaze uključujući wt Fc domen prilagođen da bude aktivan i u vanćeljskoj i u endocitnoj sredini (gde se TLR7 može eksprimirati). U nekim aspektima, ova omogućuje RNKza hibridnom molekulu nukleaze koji uključujuće wt Fc domen da zaustavi TLR7 signalizaciju kroz prethodno zahvaćene imune komplekse ili RNK koje aktiviraju TLR7 nakon virusne infekcije. U nekim otelotvorenjima, wt RNKaza jednog RNKaza hibridnog molekula nukleaze nije otporna na inhibiciju pomoću RNKaza citoplazmičnog inhibitora. U nekim otelotvorenjima, wt RNKaza jednog RNKaza hibridnog molekula nukleaze nije aktivna u citoplazmi ćelije.
[0071] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze koji uključuje wt Fc domen se koristi za terapiju autoimune bolesti, na primer, SLE.
[0072] U nekim otelotvorenjima, vezivanje Fc domena za Fc receptor (FcR) se povećava, npr. putem promene glikozilacije i/ili promena u aminokiselinskoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze ima jednu ili više Fc promena koje povećavaju FcR vezivanje.
[0073] Predviđeni su alternativni načini za konstruisanje hibridnog molekula nukleaze vezani za Fc domen. U nekim otelotvorenjima, orijentacija domena može se izmeniti konstruisanjem Ig-RNKaza molekula ili Ig-DNKaza molekula ili RNKaza-Ig molekula ili RNKza-Ig molekula koji zadržava FcR vezivanje i ima aktivni domen nukleaze.
[0074] U nekim otelotvorenjima, DNKaza hibridni molekul nukleaze uključuje wt Fc domen koji može omogućiti, na primer, da se molekuli podvrgnu endocitozi posle vezivanja FcR. U nekim otelotvorenjima, DNKaza hibridni molekuli nukleaze mogu biti aktivni prema vanćelijskim imunih kompleksima koji sadrže DNK, npr. u rastvorljivom obliku, ili deponovani kao nerastvorljivi komplekse.
[0075] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze obuhvataju i DNKazu i RNKazu. U nekim otelotvorenjima, ovi hibridni molekuli nukleaze mogu poboljšati terapiju SEL jer mogu, na primer, digestovati imune komplekse koji sadrže RNK, DNK, ili kombinaciju RNK i DNK; i kada dalje obuhvataju wt Fc domen, aktivni su i u vanćelijskom i u endocitnom odeljku gde se mogu naći TLR7 i TLR9.
[0076] U nekim otelotvorenjima, veznik domeni uključuju (gly4ser) 3, 4 ili 5 varijante koje menjaju dužinu veznika za 5 aminokiselina. U sledećem otelotvorenju, veznik domena je oko 18 aminokiselina u dugačak i uključuje N-povezano mesto glikozilacije, koje može da bude osetljivo za cepanje proteaza in vivo. U nekim otelotvorenjima, N-povezano mesto glikozilacije može zaštititi hibridne molekule nukleaze od cepanja u veznik domenu. U nekim otelotvorenjima, N-povezano mesto glikozilacije može pomoći u odvajanju savijanje nezavisnih funkcionalnih domena odvojenih veznik domenom.
[0077] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze mogu da obuhvate i mutant i/ili divlji tip ljudskih IgG1 Fc domena. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze mogu biti eksprimirani iz COS prolaznih i CHO stabilnih transfekcija. U nekim otelotvorenjima, CD80/86 vezivanje i RNKaza aktivnosti su sačuvane u hibridnim molekulima nukleaze. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze uključuju DNKaza1L3-Ig-veznik-RNKaza konstrukte. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje DNKaza1-Ig-veznik-RNKaza konstrukt ili RNKaza-Ig-veznik-DNKaze konstrukt. U nekim otelotvorenjima, optimizovani su fuzioni spojevi između enzim domena i ostalih domenima hibridnog molekula nukleaze.
[0078] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze uključuju DNKaza-Ig hibridne molekule nukleaze i/ili hibridne DNKaza-RNKaza hibridne molekule nukleaze.
[0079] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje TREX1. U nekim otelotvorenjima, TREX1 hibridni molekul nukleaze može digestovati hromatin. U nekim otelotvorenjima, TREX1 hibridni molekul nukleaze je eksprimiran od strane ćelije. U nekim otelotvorenjima, eksprimiran hibridni molekul nukleaze uključuje mišji TREX-1 i mišji (wt ili mutant) Fc domen. U nekim otelotvorenjima, 20-25 aminokiselinski (aa) veznik domen između TREX1 i IgG zgloba može biti neophodan za omogućavanje aktivnosti DNKaze. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sa 15 aa veznik domenom nije aktivan. U nekim otelotvorenjima, korišćenje 20 i 25 aminokiselinskog veznik domena (plus 2 ili više aminokiselina kako bi se ugradila restrikciona mesta) rezultate u funkcionalnoj aktivnosti mereno digestijom hromatina. U nekim otelotvorenjima, hidrofobna regija od približno 72 aa može da se ukloni iz COOH kraja TREX-1 pre fuzije sa Fc domenom preko veznika domena. U nekim otelotvorenjima, 20 aminokiselinski veznik domen verzija hibridnog molekula nukleaze pokazuje visok nivo eksprimiranja u poređenju sa kontrolama i/ili drugim hibridnim molekulima nukleaze. U nekim otelotvorenjima, kinetički enzimski testovi se koriste za poređenje enzimske aktivnosti hibridnih molekula nukleaze i kontrole na kvantitativan način.
[0080] U nekim otelotvorenjima, dalja optimizacija fuzionog spoja izabrana za skraćivanje TREX1 enzima može da se koristi za poboljšanje eksprimiranja hibridnih molekula nukleaze.
[0081] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sadrži ljudski TREX1-veznik-Ig Fc domen hibridni molekul nukleaze sa 20 i/ili 25 aa veznik domena. U nekim otelotvorenjima, veznik domeni su varijante (gly4ser)4 ili (gly4ser)5 kaseta sa jednim ili više restrikcionih mesta za ugradnju u konstrukte hibridnih molekula nukleaze. U nekim otelotvorenjima, zbog glava-rep dimerizacije korisne za aktivnost TREX1 enzima; fleksibilan, duži veznik domen može da se koristi kako bi se olakšalo pravilno sklapanje.
[0082] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze predstavlja TREX1-tandem hibridni molekul nukleaze. U nekim otelotvorenjima, alternativni postupak za olakšavanje glava-rep savijanja TREX1 je generisanje TREX1-TREX1-Ig hibrid hibridnog molekula nukleaze koji uključuje dva TREX1 domena u tandemu, nakon čega sledi veznik domen i jedan Ig Fc domen. U nekim otelotvorenjima, pozicioniranje TREX1 kaseta na glava-rep način može biti korigovano za glava-rep savijanje na bilo kom kraku imunoenzima i uvođenjem jedinstvenog TREX1 funkcionalnog domena u svaki kraj molekula. U nekim otelotvorenjima, svaki imunoenzim hibridnog molekula nukleaze ima dva funkcionalna TREX1 enzima zakačena za jedan IgG Fc domen.
[0083] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje TREX1-veznik1-Igveznik2-RNKazu.
[0084] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje RNKaza-Ig-veznik-TREX1. U nekim otelotvorenjima, kasete su izvedene i za amino i za karboksi fuzije svakog enzima za ugradnju u hibridne molekule nukleaze gde je konfiguracija enzima obrnuta. U nekim otelotvorenjima, RNKaza enzim pokazuje sličnu funkcionalnu aktivnost, bez obzira na svoje položaje u hibridnim molekulima nukleaze. U nekim otelotvorenjima, alternativni hibridni molekuli nukleaze mogu biti osmišljeni tako da testiraju da li određeni konfiguracija pokazuje poboljšano eksprimiranje i/ili funkciju komponenti hibridnog molekula nukleaze.
[0085] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje 1L3-Ig. U nekim otelotvorenjima, 1L3 DNKaza je konstruisana od mišije sekvence i eksprimirana. U nekim otelotvorenjima, enzim je aktivan. U nekim otelotvorenjima, mišiji 1L3 DNKaza-Ig-RNKaza hibridna nukleaza je konstruisana i eksprimirana. U nekim otelotvorenjima, molekul sadrži ljudski 1L3-Ig, ljudsku 1L3-Ig-RNKazu, i/ili ljudski RNKaza-Ig-1L3.
[0086] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje DNKaza1-Ig. U nekim otelotvorenjima, prirodna varijanta alela, A114F, koja pokazuje smanjenu osetljivost prema aktinu, uključena je u DNKaza1-Ig hibridni molekul nukleaze. U nekim otelotvorenjima, ova mutacija se uvodi u hibridni molekul nukleaze da generiše stabilniji derivat ljudske DNKaze1. U nekim otelotvorenjima, napravljen je DNKaza1-veznik-Ig koji sadrži 20 ili 25 aa veznik domena. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze uključuju RNKaza-Ig-veznik-DNKaza1 gde se DNKaza1 domen nalazi na COOH strani Ig Fc domena. U nekim otelotvorenjima, napravljeni su hibridni molekuli nukleaze da inkorporiraju DNKazu1 i uključuju: DNKaza1-veznik-Ig-veznik2-RNKazu, i/ili RNKaza-Ig-veznik-DNKazu1.
[0087] Drugi aspekt ovog obelodanjenja je korišćenje postupka genske terapije za lečenje ili prevenciju poremećaja, bolesti i stanja sa jednim ili više hibridnih molekula nukleaze.
Postupci genske terapije odnose na uvođenju sekvence nukleinske kiseline (DNK, RNK i antisens DNK ili RNK) hibridnog molekula nukleaze u životinju kako bi se postiglo eksprimiranje jednog ili više polipeptida prema predmetnom pronalasku. Ovaj postupak može obuhvatati uvođenje jednog ili više polinukleotida koji kodiraju polipeptid hibridnog molekula nukleaze ovog pronalaska operativno vezan za promotor i bilo kojih drugih genetskih elemenata neophodnih za eksprimiranje polipeptida od strane targetiranog tkiva.
[0088] U primenama genske terapije, geni hibridnog molekula nukleaze su uvedeni u ćelije kako bi se postigla in vivo sinteza terapeutski efikasnog genskog proizvoda. „Genska terapija“ uključuje konvencionalne genske terapije gde se trajni efekat postiže jednim tretmanom i primenom genskih terapeutskih agenasa, koja uključuje jednovremenu ili ponovljenu primenu terapeutski efikasne DNK ili mRNK. Oligonukleotidi mogu biti modifikovani da poboljšaju svoj unos, npr. supstitucijom njihovih negativno naelektrisanih fosfodiestar grupa sa nenaelektrisanim grupama.
Fc domeni
[0089] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje Fc domen. Fc domeni korisni za proizvodnju hibridnih molekula nukleaze prema predmetnom pronalasku mogu se dobiti iz brojnih različitih izvora. U poželjnim otelotvorenjima, Fc domen hibridnog molekula nukleaze potiče iz ljudskog imunoglobulina. Razume se, međutim, da Fc domen može biti izveden iz imunoglobulina druge vrste sisara, uključujući na primer, vrste glodara (npr. miš, pacov, zeca, zamorče) ili ne-ljudskih primata (npr. šimpanza, makaki). Štaviše, Fc domen hibridnog molekula nukleaze ili njegov deo mogu biti izvedeni iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotipa imunoglobulina, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U poželjnom otelotvorenju, koristi se ljudski izotip IgG1.
[0090] Različite genske sekvence Fc domena (npr. genske sekvence ljudske konstantne regije) su dostupni u vidu javno dostupnih depozita. Domeni konstantne regije koji sadrže Fc domen sekvencu mogu biti izabrani da imaju određenu efektorsku funkciju (ili da nemaju određenu efektorsku funkciju) ili sa određenom modifikacijom da smanje imunogenost. Mnoge sekvence antitela i gena koji kodiraju antitela su objavljene i pogodne su sekvence Fc domena (npr. zglob, CH2 i/ili CH3 sekvence, ili njihovi delovi) i mogu se izvesti iz ovih sekvenci korišćenjem tehnika u struci. Genetski materijal je dobijen korišćenjem nekog od navedenih postupaka može biti promenjen ili sintetisan za dobijanje polipeptida iz ovog pronalaska. Dalje će biti prihvaćeno da obim ovog pronalaska obuhvata alele, varijante i mutacije stalne regije DNK sekvenci.
[0091] Sekvence Fc domena mogu da se kloniraju, npr. koristeći lančanu reakciju polimeraze i prajmere koje su izabrani da pojačaju željeni domen. Za kloniranje sekvenci Fc domena iz antitela, iRNK se može izolovati iz hibridoma, slezine ili limfnih ćelija, reverzno transkribovati u DNK, i geni antitela su pojačani pomoću PCR. Postupci PCR pojačavanja su detaljno opisani u U.S. Pat. Nos.4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; i u, npr., "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications" Innis et al. eds., Academic Press, San Diego, Calif. (1990); Ho et al.1989. Gene 77:51; Horton et al.1993. Methods Enzymol. 217:270). PCR može pokrenut konsenzusom prajmera konstantne regije ili više specifičnih prajmera na osnovu objavljenih DNK teškog i lakog lanca i aminokiselinskih sekvence. Kao što je gore diskutovano, PCR se takođe mogu koristiti za izolovanje DNK klonova koji kodiraju antitela lakog i teškog lanca. U ovom slučaju biblioteke mogu biti ispitivane pomoću konsenzus prajmera ili većih homolognih sondi, poput sondi mišje konstantne regije. Brojni kompleti prajmera pogodni za pojačavanje gena antitela su poznati u struci (npr.5' prajmeri koji se zasnivaju na N-terminalnoj sekvenci prečišćenih antitela (Benhar and Pastan.1994. Protein Engineering 7:1509); brza amplifikacija cDNK krajeva (Ruberti, F. et al.1994. J. Immunol. Methods 173:33); lider sekvence antitela (Larrick et al.1989 Biochem. Biophys. Res. Commun. 160:1250). Kloniranje sekvenci antitela je dalje opisano u Newman et al., U.S. Pat. No.5,658,570, podneto 25. januara 1995.
[0092] Hibridni molekuli nukleaze pronalaska mogu da sadrže jedan ili više Fc domen (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više Fc domena). U jednom otelotvorenju, Fc domeni mogu biti različitog tipa. U jednom otelotvorenju, najmanje jedan Fc domen prisutan u hibridnom molekulu nukleaze sadrži zglobni domen ili njegov deo. U drugom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji sadrži najmanje jedan CH2 domen ili njegov deo. U drugom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji sadrži najmanje jedan CH3 domena ili njegov dela. U drugom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji sadrži najmanje jedan CH4 domen ili njegov deo. U drugom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji sadrži najmanje jedan zglobni domena ili njegov dela i najmanje jedan CH2 domen ili njegov deo (npr., u zglob-CH2 orijentaciji). U drugom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji sadrži najmanje jedan CH2 domen ili njegov deo i najmanje jedan CH3 domen ili njegov dela (npr., u CH2-CH3 orijentaciji). U drugom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji se sastoji od najmanje jednog zglobnog domena ili njegovog dela, najmanje jednog CH2 domena ili njegovog dela, i najmanje jednog CH3 domena ili njegovog dela, na primer u orijentaciji zglob-CH2-CH3, zglo-CH3-CH2, ili CH2-CH3-zglob.
[0093] U određenim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sadrži najmanje jednu kompletnu Fc regiju izvedenu iz jednog ili više imunoglobulinskih teških lanaca (npr. Fc domen koji uključuje zglob, CH2 i CH3 domene, iako oni ne moraju biti izvedeni iz istog antitela). U drugim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sadrži najmanje dva kompletna Fc domena izvedena iz jednog ili više imunoglobulinskih teških lanaca. U poželjnim otelotvorenjima, kompletan Fc domen je izveden od ljudskog teškog lanca IgG imunoglobulina (na primer, ljudski IgG1).
[0094] U sledećem otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji sadrži kompletan CH3 domen. U sledećem otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji sadrži kompletan CH2 domen. U sledećem otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji sadrži najmanje jedan CH3 domen, i najmanje jedno od zglobne regije i CH2 domena. U jednom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji sadrži zglobni i CH3 domen. U sledećem otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji sadrži zglobni, CH2, i CH3 domen. U poželjnim otelotvorenjima, Fc domen je izveden od ljudskog teškog lanca IgG imunoglobulina (na primer, ljudski IgG1).
[0095] Domeni konstantne regije ili njihovi delovi koji čine Fc domen hibridnog molekula nukleaze pronalaska mogu biti izvedeni iz različitih molekula imunoglobulina. Na primer, polipeptid prema pronalasku može da sadrži CH2 domen ili njegov dela izveden iz IgG1 molekula i CH3 regije ili njen deo izveden iz IgG3 molekula. U drugom primeru, hibridni molekul nukleaze može da sadrži Fc domen koji sadrži zglobni domena izveden, delimično, od IgG1 molekula i, delimično, od IgG3 molekula. Kako sledi, obični stručnjaci u oblasti će razumeti da Fc domen može da se izmeni tako da varira u aminokiselinskoj sekvenci od prirodnog molekula antitela.
[0096] U drugom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži jedan ili više skraćen Fc domen, koji su ipak dovoljni da Fc regiji prenesu svojstva vezivanja Fc receptora (FcR). Tako, Fc domen hibridnog molekula nukleaze pronalaska može da obuhvati ili se sastoje od dela za vezivanje FcRn. Delovi za vezivanje FcRn mogu biti izvedeni iz teških lanaca bilo kog izotipa, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom otelotvorenju, koristi se deo za vezivanje FcRn iz antitela ljudskog izotipa IgG1. U sledećem otelotvorenju, koristi se deo za vezivanje FcRn iz antitela ljudskog izotipa IgG4.
[0097] U jednom otelotvorenju, hibridnom molekulu nukleaze pronalaska nedostaje jedan ili više domena konstantne regije kompletne Fc regije, tj. oni su delimično ili potpuno izbrisani. U određenim otelotvorenjima, hibridnom molekulu nukleaze pronalaska će nedostajati čitav CH2 domen (ΔCH2 konstrukti). Stručnjacima iz oblasti biće jasno da takvi konstrukti mogu imati prednost zbog regulatornih svojstava CH2 domena na katabolickoj stopi antitela. U određenim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze pronalaska sadrže Fc regije sa izbrisanim CH2 domenom izvedene iz vektora (npr., od IDEC Pharmaceuticals, San Diego) koji kodira IgG1 ljudski domen konstantne regije (pogledati, npr., WO 02/060955A2 i WO02/096948A2). Ovaj primerni vektor je konstruisan da obriše CH2 domen i pruži sintetički vektor koji eksprimira IgG1 konstantnu regiju sa izbrisanim domenom. Može se primetiti da su ovi primerni konstrukti prvenstveno konstruisani tako da spoje vezujući CH3 domen direktno na zglobnu regiju odgovarajućeg Fc domena.
[0098] U drugim konstruktima može biti poželjno da se obezbedi peptidni distancer između jednog ili više konstitutivnih Fc domena. Na primer, peptidni distancer može biti postavljen između zglobne regije i CH2 domena i/ili između CH2 i CH3 domena. Na primer, kompatibilni konstrukti mogu eksprimirati tamo gde je CH2 domen uklonjen i preostali CH3 domen (sintetički ili nesintetički) je spojen zu zglobnu regiju sa 1-20, 1-10 ili 1-5 aminokiselinskim peptidnim distancerom. Takav peptidni distancer može biti dodat, na primer, kako bi se osiguralo da regulatorni elementi domena konstantne regije ostanu slobodni i dostupni ili da zglobna regija ostane fleksibilna. Poželjno, svaki veznik peptid u skladu sa predmetnim pronalaskom će biti relativno ne-imunogen i neće ometati pravilno savijanje Fc.
Promene Fc aminokiselina
[0099] U nekim otelotvorenjima, Fc domen korišćen u hibridnom molekulu nukleaze pronalaska je izmenjen, npr. aminokiselinskom mutacijom (npr. dodavanje, brisanje ili supstitucija). Kad se ovde koristi, izraz „varijanta Fc domena“ se odnosi na Fc domen koji ima najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u poređenju sa divljim tipom Fc iz kog je izveden Fc domen. Na primer, kad je Fc domen izveden iz ljudskog IgG1 antitela, varijanta obuhvata najmanje jednu aminokiselinsku mutaciju (npr. supstituciju) u poređenju sa divljim tipom aminokiseline na odgovarajućem položaju ljudske IgG1 Fc regije.
[0100] Aminokiselinske supstitucije Fc varijanti mogu biti locirane na položaju unutar Fc domena koje se smatraju odgovarajućim broju porcija koji će biti dat ostatku i Fc regiji antitela.
[0101] U jednom otelotvorenju, Fc varijanta obuhvata supstituciju na aminokiselinskom položaju koji se nalazi u zglobnom domenu ili njegovom delu. U drugom otelotvorenju, varijanta Fc obuhvata supstituciju na aminokiselinskom položaju koji se nalazi u CH2 domenu ili njegovom delu. U drugom otelotvorenju, varijanta Fc obuhvata supstituciju na aminokiselinskom položaju koji se nalazi u CH3 domenu ili njegovom delu. U drugom otelotvorenju, varijanta Fc obuhvata supstituciju na aminokiselinskom položaju koji se nalazi u CH4 domenu ili njegovom delu.
[0102] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze pronalaska sadrže varijantu Fc koja sadrži više od jedne aminokiselinske supstitucije. Hibridni molekuli nukleaze pronalaska mogu sadržati, na primer, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselinskih supstitucija.
Poželjno, aminokiselinske supstitucije se prostorno pozicionirane jedna od druge na intervalima od najmanje 1 aminokiselinskog položaja ili više, na primer, najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih položaja ili više. Poželjnije, konstruisane aminokiseline su prostorno pozicionirane jedna od druge na intervalima od najmanje 5, 10, 15, 20, ili 25 aminokiselinskih položaja ili više.
[0103] U određenim otelotvorenjima, varijanta Fc daje poboljšanje u najmanje jednoj efektorskoj funkciji, što je pruženo pomoću Fc domena koji sadrži pomenuti divlji tip Fc domena (npr. poboljšanje sposobnosti Fc domena da se vezuje za Fc receptore (npr. FcγRI, FcγRII, ili FcγRIII) ili komplementne proteine (npr. C1q) ili da pokrene citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fagocitozu ili citotoksičnost zavisnu od komplemenata (CDCC)). U drugim aspektima, varijanta Fc daje cistein ostatak.
[0104] Hibridni molekuli nukleaze pronalaska mogu koristiti varijante Fc poznati u struci, za koje se zna da doprinose poboljšanju u efektorskoj funkciji i/ili FcR vezivanju. Konkretno, hibridni molekul nukleaze prema pronalasku može uključivati, na primer, promenu (npr. supstitucija) na jednom ili više aminokiselinskih položaja obelodanjenih u International PCT Publications WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351 A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, i WO06/085967A2; US Patent Publication Nos. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056; ili U.S. Pat. Nos.5,648,260; 5,739,277; 5,834,250; 5,869,046; 6,096,871; 6,121,022;
6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; i 7,317,091. U jednom otelotvorenju, specifična promena (npr. specifična supstitucija jednog ili više aminokiselinskih položaja opisanih u struci) može biti na jednom ili više opisanih aminokiselinskih položaja. U sledećem otelotvorenju, mogu se uraditi različite promene na jednom ili više opisanih aminokiselinskih položaja (npr. različita supstitucija jednog ili više aminokiselinskih položaja opisanih u struci).
[0105] U određenim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži aminokiselinsku supstituciju sa Fc domenom koji menja efektorskih funkcija antitela nezavisne od antigen, naročito cirkulacioni poluživot antitela. Takvi hibridni molekuli nukleaze ispoljavaju povećano ili smanjeno vezivanje za FcRn u poređenju sa hibridnim molekulima nukleaza koji nemaju ove supstitucije i, dakle, povećan ili smanjen poluživot u serumu, respektivno. Za varijante Fc sa poboljšanim afinitetom za FcRn je predviđeno da imaju duži poluživot u serumu, i takvi molekuli imaju korisne primene u postupcima lečenja sisara gde se traži dug poluživot primenjenog polipeptida, npr. za lečenje hronične bolesti ili poremećaja. Nasuprot tome, za varijante Fc sa smanjenim afinitetom vezivanja FcRn se očekuje da imaju kraće vreme polu-života, i takvi molekuli su takođe korisni, na primer, za primenu kod sisara gde skraćeno vreme cirkulacije može biti korisno, npr. za in vivo dijagnostičko snimanje ili u situacijama gde početni polipeptid ima toksične sporedne efekte kada je prisutan u cirkulaciji tokom dužeg perioda. Za varijante Fc sa smanjenim afinitetom vezivanja FcRn takođe je manja verovatnoća da prolaze kroz placentu i time su takođe korisni u tretmanu bolesti ili poremećaja kod trudnica. Pored toga, ostale primene u kojima je smanjen afinitet vezivanja FcRn mogu poželjno da uključuju one primene gde je poželjna lokalizacija mozga, bubrega, i/ili jetre. U jednom primernom otelotvorenju, hibridni molekuli nukleaze pronalaska ispoljavaju umanjen transport preko epitela bubrežnih glomerula iz vaskulature. U drugom otelotvorenju, hibridni molekuli nukleaze pronalaska ispoljavaju umanjena transporta kroz krvno-moždanu barijeru (BBB) iz mozga, u vaskularni prostor. U jednom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze sa izmenjenim FcRn vezivanjem koji sadrži bar jedan Fc domena (npr. jedan ili dva Fc domena) imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija unutar „petlje FcRn vezivanja“ Fc domena. Primeri aminokiselinskih supstitucija koje menjaju FcRn vezujuću aktivnost opisani su u International PCT Publication No.
WO05/047327.
[0106] U drugim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži Fc varijantu koja se sastoji od aminokiselinske supstitucije koja menja efektorske funkcije polipeptida zavisne od antigena, naročito ADCC ili aktiviranje komplemenata, npr. u poređenju sa divljim tipom Fc regije. U primeru otelotvorenja, navedeni hibridni molekuli nukleaze ispoljavaju izmenjeno vezivanje za Fc gama receptor (npr. CD16). Takvi hibridni molekuli nukleaze ispoljavaju povećano ili smanjeno vezivanje za FcR gama u poređenju sa divljim tipom polipeptida, i stoga posreduju poboljšanu ili umanjenu efektorsku funkciju, respektivno. Za varijante Fc sa poboljšanim afinitetom za FcγR se predviđa da poboljšaju efektorske funkcije, i takvi molekuli imaju korisne primene u postupcima lečenja sisara gde se traži uništavanje targetiranog molekula. Nasuprot tome, od varijanti Fc sa smanjenim afinitetom vezivanja FcγR se očekuje da smanje efektorske funkcije, i takvi molekuli su takođe korisni, na primer, za lečenje stanja u kojima uništenje targetiranih ćelija nije poželjno, na primer, gde normalne ćelije mogu eksprimirati targetirane molekule, ili gde hronična primena polipeptida može da dovede do neželjenog aktiviranja imunog sistema. U jednom otelotvorenju, polipeptid koji sadrži Fc ispoljava najmanje jednu izmenjenu efektorsku funkciju zavisnu od antigena izabranu iz grupe koju čine opsonizacija, fagocitoza, citotoksičnost zavisna od komplemenata, ćelijsku citotoksičnost zavisna od antigena (ADCC) ili modulacija efektorskih ćelija u poređenju sa osnovnim polipeptidom koji sadrži divlji tip Fc regije.
[0107] U jednom otelotvorenju hibridni molekul nukleaze ispoljava izmenjeno vezivanje za aktiviranje FcγR (npr. FcγI, FcγIIa, ili FcγRIIIa). U sledećem otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze ispoljava izmenjenim afinitetom vezivanja za inhibitorni FcγR (npr. FcγRIIb). Primeri aminokiselinskih supstitucija koje menjaju FcR ili dopunjuju aktivnost vezivanja su opisani u International PCT Publication No. WO05/063815.
[0108] Hibridni molekul nukleaze prema pronalasku može takođe sadržati aminokiselinsku supstituciju koja menja glikozilaciju hibridnog molekula nukleaze. Na primer, Fc domen hibridnog molekula nukleaze može sadržati Fc domen koji ima mutaciju koja vodi do smanjenja glikozilacije (npr. N- ili O-povezana glikozilacija) ili može da sadrži izmenjen glikoform na divljem tipu Fc domena (npr. niska fukoza ili fukoza bez glikana). U drugom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze ima aminokiselinsku supstituciju blizu ili unutar glikozilacionog motiva, na primer, N-povezan motiv glikozilacije koji sadrži aminokiselinske sekvence NXT ili NKSS. Primeri aminokiselinskih supstitucija koje smanjuju ili menjaju glikozilaciju su opisani u International PCT Publication No. WO05/018572 i US Patent Publication No.2007/0111281.
[0109] U drugim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze pronalaska sadrži najmanje jedan Fc domen koji ima cistein ostatak ili njegov analog koji se nalazi na rastvaračem izloženoj površini. Poželjno projektovani cistein ostatak ili njegov analog se ne meša sa efektorskom funkcijom dodeljenog Fc. Poželjnije, promena ne utiče na sposobnost Fc da se vezuje za Fc receptore (npr. FcγRI, FcγRII, ili FcγRIII) ili komplementarne proteine (npr.
C1q), ili da aktivira imunološku efektorsku funkciju (npr., citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fagocitozu ili citotoksičnost zavisnu od komplemenata (CDCC)). U poželjnim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze pronalaska sadrže Fc domen koji sadrži najmanje jedan konstruisan slobodan cisteinski ostatak ili njegov analog koji je suštinski bez disulfidnog vezivanja za drugi cistein ostatak. Bilo koji od gore konstruisanih cistein ostataka ili analoga mogu naknadno biti konjugovani sa funkcionalnim domenom korišćenjem tehnika koje su poznati u struci (npr. konjugovanje sa tiol-reaktivnim heterobifunkcionalnim veznikom).
[0110] U jednom otelotvorenju, hibridni molekul nukleaze prema pronalasku može da sadrži genetski fuzionisan Fc domen koji ima dva ili više svoja sadržana Fc domena, koji su nezavisno odabrani od Fc domena koji su ovde opisani. U jednom otelotvorenju, Fc domeni su isti. U drugom otelotvorenju, bar dva Fc domena su različita. Na primer, Fc domeni hibridnih molekula nukleaze prema pronalasku obuhvataju isti broj aminokiselinskih ostataka, ili se mogu razlikovati po dužini za jedan ili više aminokiselinskih ostataka (npr. za oko 5 aminokiselinskih ostataka (npr., 1, 2 , 3, 4, ili 5 aminokiselinskih ostataka), oko 10 ostataka, oko 15 ostataka, oko 20 ostataka, oko 30 ostataka, oko 40 ostataka, ili oko 50 ostataka). U još drugih otelotvorenjima, Fc domeni hibridnih molekula nukleaze pronalaska mogu se razlikovati u sekvenci na jednom ili više položaja aminokiselina. Na primer, najmanje dva Fc domena mogu se razlikovati na oko 5 aminokiselinskih položaj (npr., 1, 2, 3, 4, ili 5 aminokiselinskih položaj), oko 10 položaja, oko 15 položaja, oko 20 položaja, oko 30 položaja, oko 40 položaja, ili oko 50 položaja).
Veznik domeni
[0111] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze uključuje veznik domen. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze sadrži mnoštvo veznik domena. U nekim otelotvorenjima, veznik domen je polipeptidni veznik. U određenim aspektima, poželjno je koristiti polipeptidni veznik da spoji jedan ili više Fc domena na jedan ili više nukleaza domena kako bi formirali hibridni nukleaze molekul.
[0112] U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik je sintetički. Kako je ovde korišćen, izraz „sintetički“ u vezi sa polipeptidnim veznikom uključuje peptide (ili polipeptide) koji uključuju aminokiselinsku sekvencu (koja može ili ne mora biti prirodna) koja je vezana u linearnoj aminokiselinskoj sekvenci za sekvencu (koja može ili ne mora biti prirodna) (npr.
Fc domen sekvenca) na koju nije prirodno povezana u prirodi. Na primer, polipeptidni veznik može sadržati neprirodne polipeptide koji su modifikovani oblici prirodnih polipeptida (npr., sadrže mutacije kao što su dodavanje, susptitucija ili brisanje) ili koja sadrže prvu aminokiselinsku sekvenca (koja može ili ne mora biti prirodna). Polipeptidni veznici pronalaska mogu da se koriste, na primer, kako bi se osiguralo da se Fc domeni postavljeni jedan naspram drugog kako bi se osiguralo pravilno sklapanje i formiranje funkcionalnog Fc domena. Poželjno, polipeptidni veznik kompatibilan predmetnom pronalasku će biti relativno ne-imunogen i neće inhibirati ni jednu ne-kovalentnu vezu među monomernih podjedinica vezujućeg proteina.
[0113] U nekim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze pronalaska koriste polipeptidni veznik da pridruže bilo koja dva ili više domena u okviru u jednog lanca polipeptida. U jednom otelotvorenju, dva ili više domena mogu biti nezavisno izabrani iz bilo kog od ovde navedenih Fc domena ili nukleaza domena. Na primer, u nekim aspektima, polipeptidni veznik može da se koristi za fuzionisanje identičnih Fc domena, čime se formira homomerna Fc regija. U drugim aspektima, polipeptidni veznik može da se koristi za fuzionisanje različitih Fc domene (npr. divlji tip Fc domena i varijanta Fc domena), čime se formira heteromerna Fc regija. U drugim aspektima, polipeptidni veznik prema pronalasku može se koristiti za genetsku fuziju C-terminusa prvog Fc domena (npr. zglobni domen ili njegov deo, CH2 domen ili njegov deo, kompletan CH3 domen ili njegov deo, deo za vezivanje FcRn vezivanje, deo za vezivanje FcγR, deo za vezivanje komplemenata, ili njihov deo) za N-terminusu drugog Fc domena (npr., kompletan Fc domen).
[0114] U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik sadrži deo Fc domena. Na primer, u jednom aspektu, polipeptidni veznik može da sadrži imunoglobulin zglobnog domena IgG1, IgG2, IgG3 i/ili IgG4 antitela. U sledećem otelotvorenju, polipeptidni veznik može da sadrži CH2 domen IgG1, IgG2, IgG3 i/ili IgG4 antitela. U drugim otelotvorenjima, polipeptidni veznik može da sadrži CH3 domen IgG1, IgG2, IgG3 i/ili IgG4 antitela. Drugi delovi imunoglobulina (npr. ljudskog imunoglobulina) takođe se mogu koristiti. Na primer, polipeptidni veznik može da sadrži CH1 domen ili njegov deo, CL domen ili njegov deo, VH domen ili njegov deo, ili VL domen ili njegov deo. Navedeni delovi mogu biti izvedeni iz bilo kog imunoglobulina, uključujući na primer, IgG1, IgG2, IgG3 i/ili IgG4 antitela.
[0115] U primernim otelotvorenjima, polipeptidni veznik može sadržati bar deo zglobne regije imunoglobulina. U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik sadrži gornji zglobni domen (npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 gornji zglobni domen). U drugom otelotvorenju, polipeptidni veznik sadrži srednji zglobni domen (npr., IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 srednji zglobni domena). U drugom otelotvorenju, polipeptidni veznik sadrži donji zglobni domen (npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 donji zglobni domen).
[0116] U drugim otelotvorenjima, polipeptidni veznici mogu biti konstruisani tako da kombinuju zglobne elemente izvedene iz istih ili različitih izotipa antitela. U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik sadrži himerni zglob koji sadrži najmanje deo IgG1 zglobne regije i najmanje deo IgG2 zglobne regije. U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik sadrži himerni zglob koji sadrži najmanje deo IgG1 zglobne regije i najmanje deo IgG3 zglobne regije. U drugom otelotvorenju, polipeptidni veznik sadrži himerni zglob koji sadrži najmanje deo IgG1 zglobne regije i najmanje deo IgG4 zglobne regije. U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik sadrži himerni zglob koji sadrži najmanje deo IgG2 zglobne regije i najmanje deo IgG3 zglobne regije. U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik sadrži himerni zglob koji sadrži najmanje deo IgG2 zglobne regije i najmanje deo IgG4 zglobne regije. U jednom aspektu, polipeptidni veznik sadrži himerni zglob koji sadrži najmanje deo IgG1 zglobne regije, najmanje deo IgG2 zglobne regije i najmanje deo IgG4 zglobne regije. U drugom otelotvorenju, polipeptidni veznik može sadržati motiv ponavljanja IgG1 gornjeg i srednjeg zgloba i IgG3 srednjeg zgloba. U drugom otelotvorenju, polipeptidni veznik može sadržati IgG4 gornji zglob, IgG1 srednji zglob i IgG2 niži zglob.
[0117] U drugom otelotvorenju, polipeptidni veznik obuhvata ili se sastoji od Gly-ser veznika. Kako je ovde korišćen, izraz „Gly-ser veznik“ odnosi se na peptid koji se sastoji od ostataka glicina i serina. Primer Gly/ser veznika obuhvata aminokiselinsku sekvencu prema formuli (Gly4Ser)n, gde je n pozitivni ceo broj (npr.1, 2, 3, 4, ili 5). Poželjni Gly/SER veznik je (Gly4Ser)4. Drugi poželjni Gly/SER veznik je (Gly4Ser)3. Drugi poželjni Gly/SER veznik je (Gly4Ser)5. U određenim otelotvorenjima, Gly-ser veznik može biti ubačen između dve druge sekvence polipeptidnog veznika (na primer, neka od ovde opisanih sekvenci polipeptidnog veznika). U drugim otelotvorenjima, Gly-ser veznik je vezan na jednom ili oba kraja drugom sekvencom polipeptidnog veznika (na primer, neka od ovde opisanih sekvenci polipeptidnog veznika). U još drugih otelotvorenja, dva ili više Gly-ser veznika su sadržana u seriji u polipeptidnom vezniku. U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik pronalaska sadrži barem deo gornje zglobne regije (npr. izveden iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 molekula), barem delom srednje zglobne regije(npr. izvedene iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 molekula) i serijom Gly/ser aminokiselinskih ostataka (npr., Gly/ser veznik kao što je (Gly4Ser)n).
[0118] U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik iz pronalaska sadrži imunoglobulinski domen zglobne regije koji se ne javlja u prirodi, npr., sa domenom zglobne regije koji se prirodno ne nalazi u polipeptidu koji sadrži domen zglobne regije i/ili domen zglobne regije koji je promenjen tako da se razlikuje po aminokiselinskoj sekvenci od prirodnog imunoglobulinskog domena zglobne regije. U jednom otelotvorenju, mutacije mogu da se urade na domenima zglobne regije kako bi se dobio polipeptidni veznik pronalaska. U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik pronalaska sadrži zglobni domen koji ne sadrži prirodni broj cisteina, tj. polipeptidni veznik obuhvata manje cisteina ili više cisteina nego prirodni zglobni molekul.
[0119] U drugim otelotvorenjima, polipeptidni veznik pronalaska sadrži biološki relevantnu peptidnu sekvencu ili sekvencu njegovog dela. Na primer, biološki relevantna peptidna sekvenca može uključivati, ali se ne ograničava na, sekvence izvedene iz peptida protiv odbijanja transplanata ili protiv upalnih peptida. Pomenuti peptidi protiv odbijanja transplanata ili protiv upalni peptid mogu biti izabrani iz grupe koju čine inhibitorni peptid citokina, inhibitori peptid adhezije ćelija, inhibitorni peptid trombin, i inhibitorni peptid trombocita. U jednom poželjnom otelotvorenju, polipeptidni veznik obuhvata peptidnu sekvencu izabranu iz grupe koju čine IL-1 inhibitorna ili antagonist peptidna sekvenca, eritropoetin (EPO)-mimetička peptidna sekvenca, trombopoetin (TPO)-mimetička peptidna sekvenca, G-CSF mimetička peptidna sekvenca, TNF-antagonist peptidna sekvenca, integrinvezujuća peptidna sekvenca, selekcioni antagonist peptidna sekvenca, anti-patogena peptidna sekvenca, vazoaktivni intestinalni peptid (VIP) mimetička peptidna sekvenca, kalmodulin antagonist peptidna sekvenca, antagonist mastocita, SH3 antagonist peptidna sekvenca, antagonist urokinaza receptora (UKR) peptidna sekvenca, somatostatin ili cortistatin mimetička peptidna sekvenca, peptidne sekvence za inhibiranje makrofaga i/ili T-ćelija. Primeri peptidnih sekvenci, i svaka od njih koja može da se koristi kao polipeptidni veznik, objavljene su otkriveni u U.S. Pat. No.6,660,843.
[0120] Podrazumeva se da se mogu kreirati varijante oblika ovih primera polipeptidnih veznika uvođenjem jedne ili više nukleotidnih supstitucija, dodavanja ili brisanja u nukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptidni veznik tako da su jedan ili više aminokiselinska supstitucija, dodavanje ili brisanje uvedeni u polipeptidni veznik. Na primer, mutacije se mogu uvesti standardnim tehnikama, kao što su mutageneza usmerena na mesto i PCR-posredovana mutageneza.
[0121] Polipeptidni veznici pronalaska su najmanje jednu aminokiselinu dugački i mogu biti različite dužine. U jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik pronalaska je od oko 1 do oko 50 aminokiselina dugačak. Kada se koristi u ovom kontekstu, izraz „oko“ označava /- dva aminokiselinska ostatka. Pošto dužina veznika mora biti pozitivan ceo broj, dužina od oko 1 do oko 50 aminokiselina u dužini, znači dužinu od 1 do 48-52 aminokiselina u dužini. U još jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik pronalaska je od oko 10-20 aminokiselina dugačak. U još jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik pronalaska je od oko 15 do oko 50 aminokiselina dugačak.
[0122] U drugom otelotvorenju, polipeptidni veznik pronalaska je od oko 20 do oko 45 aminokiselina dugačak. U još jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik pronalaska je od oko 15 do oko 25 aminokiselina dugačak. U još jednom otelotvorenju, polipeptidni veznik pronalaska je od oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 , 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 ili više aminokiselina dugačak.
[0123] Polipeptidni veznici se mogu uvesti u polipeptidne sekvenci, korišćenjem tehnika poznatih u struci. Modifikacije mogu da se potvrdi analizom DNK sekvence. Plazmid DNK se može koristiti za transformaciju ćelija domaćina za stabilnu proizvodnju proizvedenih polipeptida.
Domeni nukleaze
[0124] U određenim aspektima, hibridni molekul nukleaze uključuje domen nukleaze.
Shodno tome, hibridni molekuli nukleaze pronalaska tipično sadrže najmanje jedan domen nukleaze i najmanje jedan vezan Fc domen. U određenim aspektima, hibridni molekul nukleaze sadrži mnoštvo domena nukleaze.
[0125] U nekim otelotvorenjima, domen nukleaze je DNKaza. U nekim otelotvorenjima, DNKaza je Tip I izlučene DNKaze. U nekim otelotvorenjima, DNKaza je DNKaza 1 i/ili enzim nalik DNKazi 1- (DNKazaL), 1-3. U nekim otelotvorenjima, DNKaza je TREX1.
[0126] U nekim otelotvorenjima, domen nukleaze je RNKaza. U nekim otelotvorenjima, RNKaza je vanćelijska ili izlučena RNKaza od RNKaza A superporodice, npr. RNKaza A.
[0127] U jednom otelotvorenju, domen nukleaze je operativno povezan (npr. hemijski konjugovan ili genetički fuzionisan (npr., bilo direktno ili preko polipeptidnog veznika)) na N-terminus Fc domena. U drugom otelotvorenju, domen nukleaze je operativno povezan (npr. hemijski konjugovan ili genetički fuzionisan (npr., bilo direktno ili preko polipeptidnog veznika)) na C-terminus Fc domena. U drugim otelotvorenjima, domen nukleaze je operativno povezan (npr. hemijski konjugovan ili genetički fuzionisan (npr., bilo direktno ili preko polipeptidnog veznika)) putem bočnog lanca aminokiselina Fc domena. U određenim primernim otelotvorenjima, domen nukleaze je fuzionisan sa Fc domenom preko ljudskog zglobnog domena imunoglobulina ili njegovog dela.
[0128] U određenim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze pronalaska sadrže dve ili više domena nukleaze i najmanje jedan Fc domen. Na primer, domeni nukleaze mogu biti funkcionalno povezani i za N-terminus i za C-terminus Fc domena. U drugim primernim otelotvorenjima, domeni nukleaze mogu biti operativno povezani i za N- i za C-terminalne krajeve više Fc domena (npr., dva, tri, četiri, pet ili više Fc domenima) koji su međusobno povezani u seriji kako bi se formirao tandem niz Fc domena.
[0129] U drugim otelotvorenjima, dva ili više domena nukleaze su međusobno povezani (npr. putem polipeptidnog veznika) u nizu, i tandem niz domena nukleaza je operativno povezan (npr. hemijski konjugovan ili genetički fuzionisan (npr. bilo direktno ili preko polipeptidnog veznika)) ili za C-terminus ili za N-terminus Fc domena ili tandem niz Fc domena. U drugim otelotvorenjima, tandem niz domena nukleaze je operativno povezan i za C-terminus i ua N-terminus Fc domena ili tandem niz Fc domena.
[0130] U drugim otelotvorenjima, jedan ili više domeni nukleaze mogu biti ubačeni između dva Fc domena. Na primer, jedan ili više domen nukleaze može da formira ceo ili deo polipeptidnog veznika hibridnog molekula nukleaze pronalaska.
[0131] Poželjni hibridni molekuli nukleaze pronalaska sadrže najmanje jedan domen nukleaze (npr. RNKza ili DNKaza), najmanje jedan veznik domen, i najmanje jedan Fc domen.
[0132] U određenim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze pronalaska imaju najmanje jedan domen nukleaze specifičan za targetirani molekul koji posreduje biološki efekat. U drugom otelotvorenju, vezivanje hibridnih molekula nukleaze pronalaska za targetirani molekul (npr. DNK ili RNK) dovodi do smanjenja ili eliminacije targetiranog molekula, npr., od ćelije, tkiva ili iz cirkulacije.
[0133] U određenim otelotvorenjima, hibridne molekuli nukleaze pronalaska mogu sadržati dva ili više domena nukleaze. U drugom otelotvorenju, domeni nukleaze su identični, npr. RNKaza i RNKaza ili TREX1 i TREX1. U drugom otelotvorenju, domeni nukleaze se razlikuju, npr. DNKaza i RNKaza.
[0134] U drugim otelotvorenjima, hibridni molekuli nukleaze pronalaska mogu biti sastavljeni zajedno ili sa drugim polipeptidima da formiraju vezujuće proteine koji imaju dva ili više polipeptida („multimeri“), pri čemu je najmanje jedan polipeptid od multimera hibridni molekul nukleaze pronalaska. Primeri multimernih oblika uključuju dimerne, trimerne, tetramerne i heksamerne izmenjene vezujuće proteine i slično. U jednom otelotvorenju, polipeptidi multimera su isti (tj. homomerni izmenjenih vezujući proteini, npr. homodimeri, homotetrameri). U drugom otelotvorenju, polipeptidi multimera se razlikuju (npr. heteromerni).
Postupci izrade hibridnih molekula nukleaze
[0135] Hibridni molekuli nukleaze ovog pronalaska uglavnom se mogu napraviti u transformisanim ćelijama domaćinima korišćenjem tehnika rekombinantne DNK. Da bi se to uradilo, pripremljen je rekombinantni DNK molekul koji kodira peptid. Postupci za pripremanje takvih DNK molekula su dobro poznati u struci. Na primer, sekvence koje kodiraju peptide mogu biti isečene iz DNK korišćenjem pogodnih restrikcionih enzima. Alternativno, molekul DNK se može sintetisati korišćenjem hemijskih tehnika sinteze, kao što je postupak fosforoamidata. Takođe, može se koristiti kombinacija ovih tehnika.
[0136] Pronalazak takođe obuhvata vektor sposoban da eksprimira peptide u odgovarajućem domaćinu. Vektor sadrži DNK molekul koji kodira peptide operativno povezan sa odgovarajućim sekvencama za kontrolu eksprimiranja. Postupci koji utiču na ovo operativno povezivanje, pre ili posle nego što je molekul DNK umetnut u vektor, dobro su poznati. Sekvence za kontrolu eksprimiranja uključuju promotore, aktivatore, pojačivače, operatore, domene ribozomske nukleaze, signale za počinjanje, signale za zaustavljanje, signale za ograničavanje, poliadenilacione signale i druge signale uključene u kontrolu transkripcije ili translacije.
[0137] Dobijeni vektor koji ima DNK molekul dalje se koristi za transformaciju odgovarajućeg domaćina. Ova transformacija se može izvesti primenom postupaka koji su dobro poznati u struci.
[0138] Bilo koji od velikog broja dostupnih i poznatih ćelija domaćina može se upotrebiti u praksi ovog pronalaska. Izbor određenog domaćina zavisi od broja faktora priznatih u struci. Oni uključuju, na primer, kompatibilnost sa izabranim vektorom eksprimiranja, toksičnosti peptida koje kodira DNK molekul, stope transformacije, lakoće oporavka peptida, karakteristika eksprimiranja, bio-bezbednosti i troškova. Ravnoteža ovih faktora mora biti sklopljena uz razumevanje da ne mogu svi domaćini biti jednako efikasni u eksprimiranju određene DNK sekvence. Unutar ovih opštih smernica, korisni mikrobni domaćini obuhvataju bakterije (kao što je E. coli sp.), kvasac (kao što je Saccharomyces sp.) i druge ćelije gljiva, insekata, biljaka, sisara (uključujući ljude) u kulturi, ili druge domaćine koji su poznati u struci.
[0139] Dalje, transformisani domaćin je kultivisan i prečišćen. Ćelije domaćini mogu se kultivisati pod konvencionalnim uslovima za fermentaciju tako da se eksprimirana željena jedinjenja. Takvi uslovi fermentacije su dobro poznati u struci. Konačno, peptidi su prečišćeni iz kulture postupcima koji su dobro poznati u struci.
[0140] Jedinjenja se takođe mogu napraviti postupcima sinteze. Na primer, mogu se koristiti tehnike sinteze čvrste faze. Pogodne tehnike su dobro poznate u struci i obuhvataju one opisane u Merrifield (1973), Chem. Polypeptides, pp.335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.); Merrifield (1963), J. Am. Chem. Soc.85: 2149; Davis et al. (1985), Biochem. Intl.10: 394-414; Stewart and Young (1969), Solid Phase Peptide Synthesis; U.S. Pat. No.3,941,763; Finn et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 105-253; i Erickson et al. (1976), The Proteins (3rd ed.) 2: 257-527. Sinteza čvrste faze je poželjna tehnika izrade pojedinačnih peptida jer je to najisplativiji postupak pravljenja malih peptida. Jedinjenja koja sadrže derivatizovane peptide ili koja sadrže ne-peptidne grupe mogu biti sintetisati poznatim tehnikama organske hemije.
[0141] Drugi postupci eksprimiranja/sinteze molekula su generalno poznati u prosečnom stručnjaku u oblasti.
Farmaceutski sastavi i terapijske upotrebe
[0142] U određenim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze se primenjuje sam. U određenim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze se primenjuje pre primene bar još jednog terapijskog agensa. U određenim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze se primenjuje istovremeno sa primenom najmanje još jednog terapijskog agensa. U određenim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze se primenjuje nakon primene bar još jednog terapijskog agensa. U drugim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze se primenjuje pre primene bar još jednog terapijskog agensa. Kao što će biti jasno stručnjaku u oblasti, u nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze se kombinuje sa drugim agensom/jedinjenjem. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze i drugi agens se primenjuju paralelno. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze i drugi agens se ne primenjuju istovremeno, gde se hibridni molekul nukleaze primenjuje pre ili posle primenjivanja agensa. U nekim otelotvorenjima, pacijent prima i hibridni molekul nukleaze i drugi agens tokom istog perioda prevencije, nastanka poremećaja i/ili perioda lečenja.
[0143] Farmaceutski sastavi pronalaska mogu se primenjivati u kombinovanoj terapiji, tj. u kombinaciji sa drugim agensima. U određenim otelotvorenjima, kombinovana terapija obuhvata molekul nukleaze, u kombinaciji sa najmanje jednim drugim agensom. Agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, in vitro sintetički pripremljene hemijske sastave, antitela, antigen vezujuće regije, i njihove kombinacije i konjugate. U određenim otelotvorenjima, agens može da deluje kao agonist, antagonist, alosterični modulator ili toksin.
[0144] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutske sastave koji sadrže hibridni molekul nukleaze zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem, rastvaračem, emulgatorom, konzervansom i/ili adjuvansom.
[0145] U nekim otelotvorenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastavi koji sadrže hibridni molekul nukleaze i terapeutski efikasnu količinu barem jednog dodatnog terapeutskog agensa, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem, rastvaračem, emulgatorom, konzervansom i/ili adjuvansom.
[0146] U nekim otelotvorenjima, prihvatljivi materijali za formulacije su poželjno netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste. U nekim otelotvorenjima, formulacija materijala su za s.c. i/ili i.v. primenu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav može sadržati formulacione materijale za modifikovanje, održavanje ili konzervaciju, na primer, pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije sastava. U određenim otelotvorenjima, pogodni formulacioni materijali obuhvataju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin); antimikrobe; antioksidante (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen sulfit); pufere (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline); agensi za zgušnjavanje (kao što su manitol ili glicin); helirajući agensi (kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); agensi za stvaranje kompleksa (kao što su kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin); punioci; monosaharidi; disaharidi; i drugi ugljeni hidrati (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); proteini (kao što su serum albumin, želatin ili imunoglobulini); agensi za bojenje, arome i agensi za razblaživanje; emulgatori; hidrofilni polimeri (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide male molekulske mase; kontrajoni za formiranje soli (kao što je natrijum); konzervansi (kao što su benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarači (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerni alkoholi (kao što su manitol ili sorbitol); agensi za suspenzovanje; surfaktanti ili agensi za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što su polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); agensi za poboljšavanje stabilnosti (kao što su saharoza ili sorbitol); agensi za poboljšavanje toničnosti (kao što su halidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol, sorbitol); dostavni nosači; razblaživači; ekscipijensi i/ili farmaceutski adjuvansi. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995). U nekim otelotvorenjima, formulacija sadrži PBS; 20 mM NaOAc, pH 5,2, 50 mM NaCI, i/ili 10 mM NaOAc, pH 5,2, 9% saharozu.
[0147] U određenim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze i/ili terapeutski molekul je povezan za nosač za produženje poluživota poznat u struci. Takvi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol, glikogen (npr. glikozilacija hibridnog molekula nukleaze), i dekstran. Takvi nosači su opisani, na primer, u U.S. application Ser. No.09/428,082, sad U.S. Pat. No.6,660,843 i objavljenoj PCT Application No. WO 99/25044.
[0148] U određenim otelotvorenjima, optimalni farmaceutski sastav će biti određen od strane stručnjaka u oblasti u zavisnosti od, na primer, nameravanog načina primene, formata primene i željene doze. Pogledati, na primer, Remington 's Pharmaceutical Sciences, supra. U određenim otelotvorenjima, takvi preparati mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo i brzinu klirensa in vivo antitela prema predmetnom pronalasku.
[0149] U određenim otelotvorenjima, primarni nosač u farmaceutskom sastavu može biti vodene ili nevodene prirode. Na primer, u nekim otelotvorenjima, pogodni nosač može biti voda za injekcije, fiziološki slani rastvor ili veštački likvor, verovatno dopunjeni drugim materijalima uobičajenim u sastavima za parenteralnu primenu. U nekim otelotvorenjima, slani rastvor sadrži izotonični fosfatni pufer. U određenim otelotvorenjima, neutralni puferovani slani rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa serum albuminom su dalje primeri nosača. U određenim otelotvorenjima, farmaceutski sastavi sadrže Tris pufer oko pH 7,0-8,5, ili acetatni pufer od oko pH 4,0-5,5, koji dodatno mogu uključivati sorbitol ili njegovu pogodnu zamenu. U nekim otelotvorenjima, sastav koji sadrži hibridni molekul nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog agensa, može se pripremiti za skladištenje mešanjem izabranog sastava koji ima željeni stepen čistoće, sa opcionim agensima za formulaciju (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) u oblik liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u nekim otelotvorenjima, sastav koji sadrži hibridni molekul nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog agensa, može biti formulisana kao liofilizat korišćenjem pogodnih ekscipijenasa kao što je saharoza.
[0150] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav se može odabrati za parenteralnu isporuku. U određenim otelotvorenjima, sastavi mogu biti izabrani za inhalaciju ili za isporuku kroz digestivni trakt, kao što je oralno. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih sastava je unutar sposobnosti stručnjaka sa iskustvom u struci.
[0151] U nekim otelotvorenjima, komponente formulacije su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto primene. U određenim otelotvorenjima, puferi se koriste da održe kompoziciju na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, obično u opsegu pH od oko 5 do oko 8.
[0152] U određenim otelotvorenjima, kada se razmatra parenteralna primena, terapeutski sastav može biti u obliku bez pirogena, parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji sadrži željeni hibridni molekul nukleaze, sa ili bez dodatnih terapeutskih agenasa, u farmaceutski prihvatljivom nosaču. U nekim otelotvorenjima, agens za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je hibridni molekul nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, formulisan kao sterilni, izotonični rastvor, pravilno očuvan. U određenim otelotvorenjima, sastav može da obuhvati formulaciju željenog molekula sa agensima kao što su injektibilne mikrosfere, Bio-erodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što su poliaktinska kiselina ili poliglikolna kiselina), perlice ili lipozomi, koji obezbeđuju kontrolisano ili odloženo oslobađanje proizvoda koji može zatim biti isporučen putem deponovane injekcije. U određenim otelotvorenjima, hijaluronska kiselina se takođe može koristiti i može imati efekat promovisanja produženog trajanja u cirkulaciji. U određenim otelotvorenjima, implantabilni uređaji za dopremanje leka mogu se koristiti za uvođenje željenog molekula.
[0153] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav se može formulisati za inhalaciju. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog agensa, može biti formulisan kao suvi prah za inhalaciju. U određenim otelotvorenjima, inhalacioni rastvor koji sadrži hibridni molekul nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog agensa, može se formulisati sa propelantom za dopremanje u obliku aerosola. U određenim otelotvorenjima, rastvori mogu biti raspršeni. Pulmonarna primena je dalje opisana u PCT application no. PCT/US94/001875, koja opisuje plućno dopremanje hemijski modifikovanih proteina.
[0154] U nekim otelotvorenjima, razmatrano je da se formulacije primenjuje oralno. U nekim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog agensa, koji se primenjuje na ovaj način, može biti formulisan sa ili bez onih nosača koji se obično koriste u pakovanju čvrstih oblika doziranja kao što su tablete i kapsule. U određenim otelotvorenjima, kapsula može biti dizajnirana da otpušta aktivni deo formulacije u onoj tački gastrointestinalnog trakta kada je bioraspoloživost maksimalna, a presistemska degradacija minimalna. U određenim otelotvorenjima, najmanje jedan dodatni agens može se uključiti da olakša apsorpciju hibridnog molekula nukleaze i/ili bilo kojih dodatnih terapeutskih agenasa. U nekim otelotvorenjima, razblaživači, aromati, voskovi niske tačke topljenja, biljna ulja, lubrikanti, agensi za suspendovanje, tablete za dezintegraciju i veznici mogu da se koristite.
[0155] U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav može da obuhvati efikasnu količinu hibridnog molekula nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog agensa, u smeši sa ne-toksičnim inertnim puniocima koji su pogodni za proizvodnju tableta. U određenim otelotvorenjima, rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi, ili drugom odgovarajućem nosači, rastvori mogu biti pripremljeni u obliku jedinične doze. U određenim otelotvorenjima, pogodni ekscipijensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktoza ili kalcijum fosfat; ili vezujući agensi, kao što su skrob, želatin ili akacija; ili lubrikante kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina ili talk.
[0156] Dodatni farmaceutski sastavi će biti očigledni stručnjacima u oblasti, uključujući formulacije koje obuhvataju hibridni molekul nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog agensa, u trajnim ili formulacijama sa kontrolisanim oslobađanjem. U određenim otelotvorenjima, tehnike za formulisanje različitih drugih trajnih ili kontrolisanih načina oslobađanja, kao što su nosači lipozoma, Bio-erodibilne mikročestice ili porozne perlica i deponovane injekcije, takođe su poznati prosečnom stručnjaku. Pogledati na primer, PCT Application No. PCT/US93/00829 koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za dostavljanje farmaceutskih sastava. U određenim otelotvorenjima, sastavi za trajno oslobađanje mogu uključivati polupropustljive polimerne matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova ili mikrokapsula. Matrice za trajno oslobađanje mogu uključivati poliestre, hidrogelove, poliaktide (U.S. Pat. No.3,773,919 and EP 058,481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli(2-hidroksietil-metakrilat) Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) i Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etilen vinil acetat (Langer et al., supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibutirična kiselina (EP 133,988). U određenim otelotvorenjima, sastavi za trajno oslobađanje mogu takođe da sadrže lipozome, koji se mogu pripremiti bilo kojim od više postupaka poznatih u struci. Pogledati, npr., Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 and EP 143,949.
[0157] Farmaceutski sastav koji se koristi za in vivo primenu obično je sterilan. U određenim otelotvorenjima, ovo se može postići filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. U određenim otelotvorenjima, kada je sastav liofilizovan, sterilizacija koristeći ovaj postupak može da se sprovede ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. U određenim otelotvorenjima, sastav za parenteralnu primenu može se čuvati u liofilizovanom obliku, ili u rastvoru. U određenim otelotvorenjima, parenteralni sastavi se generalno stavljaju u posudu koja ima sterilan pristup, na primer, intravenozna kesica rastvora ili bočica koja ima zapušač koji treba da se probuši iglom hipodermičke injekcije.
[0158] U određenim otelotvorenjima, kada je farmaceutski sastav formulisan, može se čuvati u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, želatin, emulzija, čvrsta supstanca ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. U određenim otelotvorenjima, ovakve formulacije mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr. liofilizovanom) koji se rekonstituiše neposredno pre primene.
[0159] U određenim otelotvorenjima, kompleti su dati za proizvodnju pojedinačne doze za primenu. U određenim otelotvorenjima, komplet može da sadrži prvi kontejner koji ima suvi protein i drugi kontejner sa vodenom formulacijom. U nekim otelotvorenjima, uključeni su kompleti koji sadrže pojedinačne i multi-komorične prethodno napunjene špriceve (npr. tečni špricevi i liošrpicevi).
[0160] U određenim otelotvorenjima, efikasna količina farmaceutskog sastava koji sadrži hibridni molekul nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog agensa, koji se koristi u terapiji zavisiće, na primer, od terapeutskog konteksta i ciljeva. Stručnjak u ovoj oblasti razumeće da će odgovarajući nivoi doza za lečenje, prema određenim otelotvorenjima, tako varirati u zavisnosti, delimično, od molekula koji se dostavlja, indikacije zbog koje se hibridni molekul nukleaze koristi, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog agensa, načina primene, i veličine (telesna masa, površine tela ili veličina organa) i/ili stanja (starost i opšte zdravlje) pacijenta. U određenim otelotvorenjima, kliničar može da podešava dozu i modifikuje put primene, kako bi se dobio optimalni terapeutski efekat. U određenim otelotvorenjima, tipična doza može biti u opsegu od oko 0,1 µg/kg do oko 100 mg/kg ili više, zavisno od gore pomenutih faktora. U određenim otelotvorenjima, doza može da varira od 0,1 µg/kg do oko 100 mg/kg; ili 1 µg/kg do oko 100 mg/kg; ili 5 µg/kg do oko 100 mg/kg.
[0161] U određenim otelotvorenjima, učestalost doziranja će uzeti u obzir farmakokinetičke parametre hibridnog molekula nukleaze i/ili bilo kojih dodatnih terapeutskih agenasa u formulaciji. U određenim otelotvorenjima, kliničar će davati preparat sve dok se ne dostigne doza koja postiže željeno dejstvo. U određenim otelotvorenjima, preparat može da se primenjuje kao pojedinačna doza, ili kao dve ili više doza (koje mogu ali ne moraju da sadrže istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinuirana infuzija preko uređaja za implantaciju ili katetera. Dalja podešavanja odgovarajuće doze se rutinski sprovode od stane stručnjaka, i unutar je zadataka koje oni rutinski obavljaju. U određenim otelotvorenjima, odgovarajuće doze mogu da se odrede upotrebom odgovarajućih podataka o odgovoru na dozu.
[0162] U određenim otelotvorenjima, način primene farmaceutskog sastava je u skladu sa poznatim postupcima, npr. oralno, injekcijom intravenskim, intraperitonealnim, intracerebralnim (intra-parenhimalnim), intracerebroventrikularnim, intramuskularnim, potkožnim, intraokularnim, intraarterijskim, intraportalnim, ili intralezionalnim putevima; sistemima za odloženo oslobađanje ili ureajima za implantaciju. U određenim otelotvorenjima, sastavi se mogu primenjivati bolus injekcijom ili kontinuirano infuzijom ili uređajem za implantaciju.
[0163] U određenim otelotvorenjima, sastav može da se primeni lokalno implantacijom membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na koji je željeni molekul apsorbovan ili inkapsuliran. U nekim otelotvorenjima, kada se koristi implantaciju, uređaj se može ugraditi u bilo koje pogodno tkivo ili organ, i dostavljanje željenog molekula može biti putem difuzije, sporim oslobađanjem bolusa ili kontinuiranom primenom.
[0164] U određenim otelotvorenjima, može biti poželjno da se koristi farmaceutski sastav koji sadrži hibridni molekul nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog agensa, na ex vivo način. U takvim slučajevima, ćelije, tkiva i/ili organi koji su uklonjeni iz pacijenta su izloženi farmaceutskom sastavu koji sadrži hibridni molekul nukleaze, sa ili bez bar jednog dodatnog terapeutskog sredstva, nakon čega se ćelije, tkiva i/ili organi naknadno implantiraju nazad u pacijenta.
[0165] U određenim otelotvorenjima, hibridni molekul nukleaze i/ili bilo koji dodatni terapeutski agens mogu biti dostavljeni implantacijom određenih ćelija koje su genetskim inženjeringom, korišćenjem postupaka koji su ovde opisani, modifikovane da eksprimiraju i luče polipeptide. U određenim otelotvorenjima, takve ćelije mogu biti životinjske ili ljudske ćelije i mogu da budu autologne, heterologne ili ksenogene. U određenim otelotvorenjima, ćelije mogu biti besmrtne. U određenim otelotvorenjima, kako bi se smanjila mogućnost pojave imunog odgovora, ćelije mogu biti inkapsulirane kako bi se izbegla infiltracija okolnih tkiva. U određenim otelotvorenjima, materijali za enkapsulaciju su tipično biokompatibilni, polu-propusni polimerni omotači ili membrane koje omogućavaju otpuštanje proteinskih proizvoda, ali sprečavaju destrukciju od strane ćelija imunog sistema pacijenta ili druge štetnim faktore iz okolnih tkiva.
[0166] Hibridni molekuli nukleaze ovog pronalaska su posebno efikasni u lečenju autoimunih poremećaja ili nenormalnih imunih odgovora. U tom smislu, biće napomenuto da hibridni molekuli nukleaze predmetnog pronalaska mogu da se koristite za kontrolu, suzbijanje, moduliranje, tretiranje ili eliminisanje neželjenih imunih odgovora na spoljašnje antigene i autoantigene. U još drugih otelotvorenja, polipeptidi predmetnog pronalaska mogu da se koriste za lečenje imunih poremećaja koji uključuju, ali nisu ograničeni na, insulin-zavisni dijabetes melitus, multiplu sklerozu, eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis, reumatoidni artritis, eksperimentalni autoimuni artritis, mijasteniju gravis, tireoiditis, eksperimentalni oblik uveoretinitisa, Hašimotov tiroiditis, primarni mikoedem, tirotoksikozu, pernicioznu anemiju, autoimuni atrofični gastritis, Adisonovu bolest, prevremenu menopauzu, neplodnost muškaraca, juvenilni dijabetes, Gudpasterov sindrom, pemfigus vulgaris, pemfigoid, simpatetičku oftalmiji, fakogeni uveitis, autoimunu hemolitičku anemiju, idiopatsku leukopeniju, primarnu žučnu cirozu, aktivni hronični hepatitis Hbs-ve, kriptogenu cirozu, ulcerativni kolitis, Sjogrenov sindrom, skleroderma, Vegnerovu granulomatozu, polimiozitis, dermatomiozitis, diskoidni LE, sistemski lupus eritematozus ili bolesti vezivnog tkiva.
PRIMERI
[0167] Slede primeri specifičnih otelotvorenja za otelotvorenje ovog pronalaska. Primeri se nude samo u ilustrativne svrhe, i nisu predviđeni da ograniče obim ovog pronalaska na bilo koji način. Napori su učinjeni da se osigura tačnost u pogledu korišćenih brojeva (npr. količine, temperature, itd), ali poneke eksperimentalne greške i odstupanja su, naravno, mogući.
[0168] Primena predmetnog pronalaska će koristiti, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke hemije proteina, biohemiju, tehnike rekombinantne DNK i farmakologije, koji su poznati u struci. Takve tehnike su potpuno objašnjene u literaturi. Pogledati, npr., T.E. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W.H. Freeman and Company, 1993); A.L. Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., current addition); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.);
Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Carey and Sundberg Advanced Organic Chemistry 3rd Ed. (Plenum Press) Vols A and B(1992).
Primer 1: Konstrukcija RNKaza-Ig fuzionih gena.
[0169] Mišja RNKaza 1 je pojačana kao cDNK pune dužine od jedne EST biblioteke (od Dr. C. Raine, Albert Einstein School of Medicine, Bronx, NY) koja je poslala klona bez MTA našoj laboratoriji. Sekvencno specifični 5' i 3' prajmeri su korišćeni iz objavljenih sekvenci. Sekvenca klona je verifikovana analizom sekvenciranja. Genebank pristupni broj je NCBI geneID 19752. Ljudska RNKaza 1 pune dužine je izolovana iz nasumice prajmiranog i oligo dT prajmiranog cDNK poreklom iz ukupne RNK ljudskog pankreasa (Ambion/Applied Biosystems, Austin, TX).
[0170] Kada je klon pune dužine izolovan, prajmeri su dizajnirani da stvore fuzioni gen sa mišjim IgG2a (SEQ ID NO: 114) ili ljudskim IgG1 (SEQ ID NO: 110) Fc domenima. Dva različita prajmera su dizajnirana za 5' sekvencu fuzionisanu na amino terminus Fc repa; prvo je ugrađen prirodni lider peptid iz mišje (ili ljudske) RNKaze, dok je zatim pripojeno AgeI mesto za amino terminus RNKaze na predviđenom mestu cepanja signalnog peptida kako bi fuzionisao RNKazu za ljudski VKIII lider peptid koji smo već je klonirali i koristili za druga ispitivanja eksprimiranja. Za mišju RNKazu, sekvenca prvog prajmera je:
mribNL5'
30mer (RNKaza 5' sa prirodnim liderom i HindIII+Kozak)
gTT AAg CTT gCC ACC ATg ggT CTg gAg AAg TCC CTC ATT CTg-3' (SEQ ID NO:1)
[0171] Drugi prajmer stvara spoj fuzionisanja gena između postojeće lider sekvence i zrele sekvence na 5‘ kraju RNKaze, ili blizu predviđenog mesta cepanja lider peptida.
[0172] 27mer (RNKaza 5' zrela sekvenca (bez lidera, sa AgeI mestom)
5'-gAT ACC ACC ggT Agg gAA TCT gCA gCA CAg AAg TTT CAg-3' (SEQ ID NO:2)
[0173] Sekvenca 3‘ prajmera za fuziju za mišji IgG2a na karboksi kraju RNKaze i amino terminusu Fc repa je kako sledi:
mrib3NH2
28mer (RNKaza 3' kraj sa XhoI mestom za fuziju za mIgG2a).
[0174] 5'-ggC TCg AgC ACA gTA gCA TCA AAg tGG ACT ggT ACg TAg g-3' (SEQ ID NO:3)
[0175] Još dva oligola su dizajnirana da stvore -Ig-RNKaza fuzioni gen, gde je -Ig rep amino terminal za enzimski domen RNKaze.
[0176] mrib5X
36mer RNKaza 5' kraj sa veznikom aa i XbaI mestom za fuziju za karboksi kraj Fc domena.
[0177] mrib3X
31mer RNKaza 3' kraj sa dva zaustavna kodona i XbaI mestom za fuziju za karboksi kraj Fc domena.
[0178] 5'-TCT AgA CTA TCA CAC AgT AgC ATC AAA gTg gAC Tgg TAC gTA g-3' (SEQ ID NO:5)
Primer 2: Izolacija anti-RNK ili anti-DNK scFv iz monoklonskog antitela koje eksprimira hibridome.
[0179] Anti-RNK hibridoma označen kao H564 je korišćen za izolovanje V regija specifičnih za RNK. Pre prikupljanja, H564 ćelije anti-RNK hibridoma su držane u beleženju faze rasta nekoliko dana u RPMI 1640 medijumu (Invitrogen/Life Technologies, Gaithersburg, Md.) pbogaćenom sa glutaminom, piruvatom, DMEM ne-esencijalnim aminokiselinama i penicillin-streptomicinom. Ćelije su grupisane centrifugiranjem iz medijuma kulture, a 2x10<7>ćelija je korišćeno za izradu RNK. RNK je izolovana iz ćelija hibridoma upotrebom QIAGEN RNAeasy kompleta (Valencia, Calif.) totalnim kompletom za izolovanje RNK i QIAGEN QIAshredder prema funkcionalnim uputstvima proizvođača koje dolazi sa kompletom. Četiri mikrograma (4 µg) ukupne RNK je korišćeno kao kalup za pripremu cDNK reverznom transkripcijom. RNK, 300 ng nasumičnih prajmera, i 500 ng Oligo dT (12-18), i 1 µl 25 mM dNTP su kombinovani i denaturisani na 80°C 5 minuta pre dodavanja enzima. Superscript III reverzna transkriptaza (Invitrogen, Life Technologies) je dodata u RNK plus prajmer smeši u ukupnoj zapremini od 25 µl u prisustvu pufera lanca 5 puta. Drugi lanac pufer i 0,1 M DTT dati su sa enzimom. Obrnuta reakcija transkripcije je ostavljena da se odvija na 50°C tokom 1 sata.
[0180] cDNK generisana u reakciji reverzne transkriptaze je prečišćen QIAquick PCR kompletima za prečišćavanja (QIAGEN, Valencia CA) i praćeno sa poli-G sekvencom koristeći terminalnu transferazeu (Invitrogen, Carlsbad, CA) prema instrukcijama proizvođača. Praćen cDNK je ponovo prečišćen QIAquick PCR prečišćavanjem i eluiran u 30 µl eluacionom puferu (EB pufer) koji je dat sa kompletima. Dva mikrolitra praćenog cDNK je korišćeno kao kalup zajedno sa sidrom praćenja 5' prajmerom koji sadrži poli-C domenu, i specifičnu konstantnu regiju, degenerišući 3' prajmere za amplifikaciju putem PCR varijabilnih regija za laki i teški lanac za H564 antitela. Dva varijabilna lanca su dizajnirani sa restrikcionim mestima enzima tako da scFv može da se sklopi od tri načina vezivanja dve V regije sa veznik sekvencom nakon pojačavanja i digestije restrikcionim enzimom.
[0181] (gly4ser)4 peptidni veznik koji se može umetnuti između dve V regije je inkorporiran pojačavanjem ove veznik sekvence putem produžetka preklapanja PCR korišćenjem preklapajućih prajmera koji kodiraju dve polovine molekula. PCR fragmenti su izolovani elektroforezom na agaroza želatinu, fragmenti su izolovani presecanjem odgovarajućih veza iz želatina i prečišćavanje pojačanog DNK pomoću QIAquick kompleta za ekstrakciju želatina (QIAGEN, Valencia, CA). scFv derivati iz H564 hibridoma su sastavljeni kao VH-veznik-VL fuzioni gena koji se mogu vezati na oba kraja većeg -IG fuzionog gena. V.sub.H domen je pojačan bez vodećeg peptida, ali je uključivao 5' AgeI restrikciono mesto za fuziju za V.sub.L i Bg1II restrikciono mesto na 3' kraju za fuziju veznik domena.
[0182] The scFv-Ig je sastavljen ubacivanjem scFv HindIII-XhoI fragmenta u pDG koji sadrži IgG1 ljudski zglob, CH2 i CH3 regije, koje su digestovane sa restrikcionim enzimima, HindIII i Xhol. Nakon ligacije, proizvodi ligacije su transformisani u DH5-alfa bakterije. ScFv-Ig cDNK je podvrgnut ciklusnom sekvenciranju na PE 9700 termalnom cikleru koristeći program 25 ciklusa putem denaturacije na 96°C tokom 10 sekundi, kalemljenja na 50°C tokom 30 sekundi, i proširujući na 72°C tokom 4 minuta. Sekvencioni prajmeri su pDG prednji i reverzni prajmeri i unutrašnji prajmer koji je kalemljen na CH2 domen u delu ljudske IgG konstantne regije. Reakcije sekvenciranja su izvedene korišćenjem Big Dye Terminator Ready Sequencing Mix v3.1 (PE-Applied Biosystems, Foster City, Calif.) prema uputstvima proizvođača. Uzorci su naknadno prečišćeni korišćenjem Autoseq G25 kolone (GE Healthcare) i eluati su sušeni u Savant vakuum sušionici, denaturisani u Template Suppression Reagent (PE-ABI) i analizirani na ABI 310 Genetic Analyzer (PE-Applied Biosystems). Sekvenca je izmenjena, translacirana i analizirana korišćenjem Vector Nti version 10.0 (Informax/Invitrogen, North Bethesda, Md.).
[0183] Konstrukcija ljudskog RNKazaI-hIgG1 (SEQ ID NO:125-127) fuzionog gena.
[0184] Ljudska RNKaza1 (SEQ ID NO: 113) je izolovana PCR pojačavanjem iz ljudske ukupne RNK pankreasa dobijene od Ambion/Applied Biosystems (Austin, TX). Četiri mikrograma (4 µg) ukupne RNK je korišćeno kao kalup za pripremu cDNK reverznom transkripcijom. RNK, 300 ng nasumičnih prajmera, i 500 ng Oligo dT (12-18), i 1 µl 25 mM dNTPs su kombinovani i denaturisani na 80°C 5 minuta pre dodavanja enzima. Superscript III reverzna transkriptaza (Invitrogen, Life Technologies) je dodata u RNK plus prajmer smeši u ukupnoj zapremini od 25 µl u prisustvu drugog lanca pufera i 0,1 M DTT datog sa enzimom. Obrnuta reakcija transkripcije je ostavljena da se odvija na 50°C tokom 1 sata. Reakcije su dalje prečišćene pomoću QIAquick PCR kolona za prečišćavanje, i cDNK je eluiran u 40 mikrolitara EB pufera pre upotrebe u PCR reakcijama. Dva mikrolitra cDNK eluata je dodato PCR reakcijama koje sadrže 50 pmol 5' i 3' prajmere specifične za ljudsku RNKazu1 i 45 mikrolitara PCR supersmese viskoke pouzdanosti (Invitrogen, Carlsbad, CA) je dodato u 0,2 ml PCR reakcije epruvete. PCR reakcije su izvedene korišćenjem C1000 termalnog ciklera (BioRad, Hercules CA). Reakcije su uključike inicijalni korak denaturacijom na 95°C tokom 2 minuta, zatim 34 ciklusa sa 94°C, 30 sekundi denaturacije, 50°C, 30 sekundi kalemljenja, i 68°C, 1 minut korak produžetka, nakon čega je usledilo konačnih 4 minuta produženja na 72°C. Kada su repovi divljeg tipa izolovani, fragmenti su TOPO klonirani u pCR2.1 vektore; DNK je pripremljena korišćenjem QIAGEN spin plazmid miniprep kompleta prema uputstvima proizvođača. Plazmid DNK je sekvencionirana korišćenjem ABI Dye Terminator v3.1 spremne reakcione smeše prema uputstvima proizvođača.
Primer 3: Izolacija ljudskih i mišjih -Fc domena i uvođenje mutacija u kodirajuće sekvence.
[0185] Za izolaciju mišjih (SEQ ID NO: 114) i ljudskih -Fc domena (SEQ ID NO: 110), RNK je izveden iz mišjeg ili ljudskog tkiva kao što sledi. Jedna suspenzija ćelija je generisana iz mišje slezine u RPMI medijumu kulture. Alternativno, ljudskih PBMC su izolovani iz sveže, cele krvi koristeći medijum za razdvajanje limfocita (LSM) Organon Teknika (Durham, NC) puferno oblaganje je prikupljeno u skladu sa uputstvima proizvođača, i ćelije su isprane tri puta u PBS pre upotrebe. Ćelije su peletirane centrifugiranjem iz medijuma kulture, a 2x10<7>ćelija je korišćeno za izradu RNK. RNK je izolovana iz ćelija upotrebom QIAGEN RNAeasy kompleta (Valencia, CA.) za totalno RNK izolovanje i kolona QIAGEN QIAshredder prema uputstvima proizvođača koje prate komplete. Jedan mikrogram (4 µg) ukupne RNK je korišćen kao kalup za pripremu cDNK reverznom transkripcijom. RNK, 300 ng nasumičnih prajmera, i 500 ng Oligo dT (12-18), i 1 µl 25 mM dNTPs su kombinovani i denaturisani na 80°C 5 minuta pre dodavanja enzima. Superscript III reverzna transkriptaza (Invitrogen, Life Technologies) je dodata u RNK plus prajmer smeši u ukupnoj zapremini od 25 µl u prisustvu drugog lanca pufera i 0,1 M DTT datog sa enzimom. Obrnuta reakcija transkripcije je ostavljena da se odvija na 50°C tokom 1 sata.. cDNK je prečišćena korišćenjem QIAquick (QIAGEN) PCR kolona za prečišćavanje u skladu sa uputstvima proizvođača, i eluirana u 40 mikrolitara EB pufera pre upotrebe u PCR reakcijama.
[0186] Divlji tip mišjih i ljudskih -FC domena je izolovan pomoću PCR amplifikacije korišćenjem gore opisanog cDNK kao šablona. Sledeći prajmeri su korišćeni za inicijalnu amplifikaciju sekvenci divljeg tipa, ali s inkorporirali željene mutacione promene u zglobni domen:
mahIgG1CH2M: 47 mer
5'-tgtccaccgtgtccagcacctgaactcctgggtggatcgtcagtcttcc-3' (SEQ ID NO:6)
hlgG1-5scc: 49 mer
5'-agatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgtccaccgtgt-3' (SEQ ID NO:7) mahIgG1S: 51 mer
5'-tctagattatcatttacccggagacagagagaggctcttctgcgtgtagtg-3' (SEQ ID NO:8) muIgG2aCH2:58mer
5'-cctccatgcaaatgcccagcacctaacctcttgggtggatcatccgtcttcatcttcc-3' (SEQ ID NO:9) mIgG2a-5scc: 47mer
5'-gaagatctcgagcccagaggtcccacaatcaagccctctcctcca-3' (SEQ ID NO: 10) mIgG2a3S: 48mer
5'-gtttctagattatcatttacccggagtccgagagaagctcttagtcgt-3' (SEQ ID NO:11)
[0187] PCR reakcije su obavljene korišćenjem C1000 termalnog ciklera (BioRad, Hercules CA) ili Eppendorf termalnog ciklera (ThermoFisher Scientific, Houston TX). Reakcije su uključile inicijalni korak denaturacije na 95°C u trajanju od 2 minuta, zatim 34 ciklusa sa 94°C, 30 sekundi denaturacije, 50°C, 30 sekundi kalemljenja, i 72°C, 1 minut koraka produžetka, zatim konačna 4 minuta produžetka na 72°C. Kada su repovi divljeg tipa izolovani, fragmenti su TOPO klonirani u pCR2.1 vektore; DNK je pripremljena korišćenjem QIAGEN spin plazmid miniprep kompleta prema uputstvima proizvođača. Plazmid DNK je sekvencionirana korišćenjem ABI Dye Terminator v3.1 spremne reakcione smeše prema uputstvima proizvođača.
[0188] DNK iz ispravnih klonova su korišćeni kao šablon u proširenju preklapanja PCR kako bi se uvele mutacije na željene položaje u kodiranoj sekvenci za mišji IgG2a ili ljudski -IgG1. PCR reakcije su postavljene korišćenjem divljeg tipa klonova pune dužine kao šablona (1 mikrolitar), 50 pmol 5' i 3' prajmera za PCR svakog dela -Fc domena, do i uključujući, željeno mesto mutacije iz oba smera, i PCR supersmešu visoke pouzdanosti (Invitrogen, Carlsbad CA), u 50 mikrolitarskih reakcionih zapremina korišćenjem kratkog ciklusa pojačavanja. Kao primer preklapajuće PCR mutageneze, prajmer kombinacija korišćena za uvođenje P331S mutacije u ljudski -IgG1, bila je kako sledi:
[0189] 5' subfragment je pojačan korišćenjem divljeg tipa klona pune dužine kao šablon, i 5‘ prajmer je bio hIgG1-5scc: 5'-agatctcgagcccaaatcttctgacaaaactcacacatgtccaccgtgt-3' (SEQ ID NO:12), dok je 3‘ prajmer bio P331AS: 5'-gttttctcgatggaggctgggagggctttgttggagacc-3' (SEQ ID NO:13).3' subfragment je pojačan korišćenjem divljeg tipa klona pune dužine kao šablon, i 5‘ prajmer je bio P331 S: 5'aaggtctccaacaaagccctcccagcctccatcgagaaaacaatctcc-3' (SEQ ID NO:14), dok je 3‘ prajmer bio mahIgG1S: 5'-tctagattatcatttacccggagacagagagaggctcttctgcgtgtagtg-3' (SEQ ID NO:15).
[0190] Kada su subfragmenti pojačani i izolovani elektroforezom na agaroza želatinu, prečišćeni su QIAquick kolonama želatin prečišćavanje i eluirani u 30 mikrolitara EB pufera prema uputstvima proizvođača. Dve runde PCR su zatim izvedena sa dva podfragmente kao šabloni preklapanja u nove reakcijama. Cikler je pauziran i 5' (hIgG1-5scc, pogledati gore) i 3' (mahIgG1S, pogledati gore) bočni prajmeri su dodati reakcijama (50 pmol svaki). PCR pojačavanja su zatim sprovedena za 34 ciklusa pri uslovima opisanim za molekule divljeg tipa iznad. Fragmenti pune dužine su izolovani putem želatin elektroforeze, i TOPO klonirani u pCR2.1 vektore za analizu sekvence. Fragmenti iz klonova sa ispravnim redosledom su zatim subklonirani u vektore eksprimiranja za izradu različitih ovde opisanih hibridnih molekula nukleaze.
Primer 4: Eksprimiranje RNKza-Ig (SEQ ID NO 124, 125, 126, 127, 174 (nukleotid) ili 160, 161, 162.163, 175 (aminokiselina)), DNKaza-Ig (SEQ ID NO: 118, 119.120.121.122.123, 186 (nukleotid) ili SEQ ID NO 154, 155, 156, 157, 158, 159, 187 (aminokiselina)), multi-podjedinica Ig fuzionih konstrukata (SEQ ID NO: 115, 116, 117, 172, 176, 178, 180 (nukleotid) ili SEQ ID NO 151152, 153, 173, 177, 179, 181 (aminokiselina)), i H564 scFv-Ig fuzioni proteini u stabilnim CHO ćelijskim linijama.
[0191] Ovaj primer ilustruje eksprimiranje različitih -Ig fuzionih gena koji su ovde opisani u eukariotskim ćelijskim linijama i karakterizaciju iskazanih fuzionih proteina pomoću SDS-PAGE i IgG sendvič ELISA.
[0192] -Ig fragmenti fuzionog gena sa ispravnim redosledom su ubačeni u pDG vektor eksprimiranja sisara, i DNK iz pozitivnih klonova je pojačan korišćenjem QIAGEN kompleta za pripremu plazmida (QIAGEN, Valencia, CA). DNK rekombinantnog plazmida (100 µg) je zatim linearizovana u neesencijalnu regiju digestijom sa AscI, prečišćena ekstrakcijom fenola, pa resuspenzovana u medijumu kulture tkiva, Excell 302 (Catalog #14312-79P, JRH Biosciences, Lenexa, Kans./SAFC). Ćelije za transfekciju, CHO DG44 ćelije, su držane na logaritamskom rastu, i 10<7>ćelija je prikupljeno za svaku reakciju transfekcije. Linearizovan DNK je dodat CHO ćelijama u ukupnoj zapremini od 0,8 ml za elektroporaciju.
[0193] Stabilna proizvodnja fuzionog proteina -Ig je postignuta elektroporacijom selektabilnog plazmida koji se može pojačati, pDG, koji sadrži RNKaza-Ig cDNK pod kontrolom CMV promotera, u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO). pDG vektor je modifikovana verzija pcDNK3 koji kodira selektivni marker DHFR sa oslabljenim promoterom kako bi povećao selekcioni pritisak za plazmid. DNK plazmida je pripremljena korišćenjem QIAGEN maxiprep kompleta, i prečišćeni plazmid je linearizovan po jedinstvenoj AscI mestu pre ekstrakcije fenola i taloženja etanola. DNK sperme lososa (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) je dodata kao noseća DNK, i 100 µg svakog plazmida i DNK nosača je korišćena za transfekciju 10<7>CHO DG44 ćelija elektroporacijom. Ćelije su gajene do logaritamske faze u Excell 302 medijumu (JRH Biosciences) koji sadrži glutamin (4 mM), piruvat, rekombinantni insulin, penicilin-streptomicin i 2xDMEM neesencijalne aminokiseline (sve od Life Technologies, Gaithersburg, Md.), u daljem tekstu se naziva „Excell 302 kompletni“ medijum. Medijumi za netransficirane ćelije takođe sadrže HT (razblažen iz 100x rastvora hipksantina i timidina) (Invitrogen/Life Technologies). Medijumi za transfekciju pod selekcijom sadrže različite nivoe metotreksata (Sigma-Aldrich) kao selektivni agens, od 50 nM do 1 µm. Elektroporacije su izvedene na 280 volti, 950 mikroFarada. Transfektovane ćelije su ostavljene da se oporave tokom noći u ne-selektivnim medijuma pre selektivnog zasejavanja u 96-komorične ploče sa ravnim dnom (Costar) pri različitim serijskim razblaženjima u rasponu od 125 ćelija/komorica do 2000 ćelija/komorica. Medijum za ćelijsko kloniranje je Excell 302 kompletan, sadrži 50 nM metotreksata. Nakon što je klonski izrastak dovoljan, serijska razblaženja kulture supernatanta iz master komorica su ispitivana za eksprimiranje -Ig fuzionog proteina upotrebom -IgG sendvič ELISA.
Ukratko, NUNC Immulon II ploče su obložene preko noći na 4°C sa 7,5 mikrograma/ml F(ab'2) kozjeg anti-mišjeg IgG (KPL Labs, Gaithersburg, MD) u PBS. Ploče su blokirane u PBS/3% BSA, i serijska razblaženja supernatanta kulture su inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 2-3 sata. Ploče su isprane tri puta u PBS/0,05% Tween 20, i inkubirane sa peroksidaza ren konjugovanim F(ab'2) kozjim anti-mišjim IgG2a (Southern Biotechnologies) i kozjim anti-mišjim IgG (KPL) pomešanim zajedno, svaki na 1:3500 u PBS/1,0% BSA, tokom 1-2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane četiri puta u PBS/0,05% Tween 20, i vezivanje je detektovano sa SureBlue Reserve, TMB supstratom (KPL Labs, Gaithersburg, MD). Reakcije su zaustavljene dodavanjem jednakog obima IN HCI, i ploče su pročitane na 450 nm na Spectramax Pro čitaču ploča (Microdevices, Sunnyvale CA). Klonovi sa najvećom proizvodnjom fuzionog proteina su proširene u T25, i zatim T75 boce da obezbede adekvatan broj ćelija za zamrzavanje i skaliranje do proizvodnje fuzionog proteina. Nivo proizvodnje je dalje povećan u kulturama od četiri najbolja klona progresivnim pojačavanjem u medijumu kulture koji sadrži metotreksat. Na svakom sukcesivnom prolasku ćelija, Excell 302 kompletni medijum sadrži povećanu koncentraciju metotreksata, tako da samo ćelije koje pojaćavaju DHFR plazmid mogu da opstanu. Nivo proizvodnje od prve četiri nepojačane master komorice iz RNKazaIg CHO transfektanta kretala se od 30-50 mikrograma/ml kulture. Pojačane kulture se trenutno testiraju za određivanje nivoa proizvodnje.
[0194] Supernatanti su sakupljeni iz CHO ćelija koje eksprimiraju RNKaze-Ig, filtriran kroz 0,2 µm PES filtere eksprimiranja (Nalgene, Rochester, NI), i provučeni su preko Protein A-agaroza (IPA 300 unakrsno povezana agaroza) kolone (Repligen, Needham, Mass.). Kolona je isprana puferom za pranje kolone (90mm Tris-Base, 150mM NaCl, 0,05% natrijum azida, pH 8,7), i vezani protein je eluiran korišćenjem 0.1 M citratnog pufera, pH 3,0. Fragmenti su sakupljeni i koncentracija proteina je određena na 280nm koristeći Nanodrop (Vilmington DE) spektrofotometr za mikrouzorke, i prazno određivanje korišćenjem 0,1 M citratnog pufera, pH 3.0. Fragmenti koje sadrže fuzioni protein su sakupljeni, i razmena pufera je izvršena serijskim spinova u PBS korišćenjem centrikon koncentratora, a zatim filtrirana kroz 0,2 µm filter uređaj, kako bi se smanjila mogućnost kontaminacije endotoksinom. Koeficijent izumiranja od 1,05 je određena pomoću alatki za analizu proteina u Vektor Nti Version 10.0 softverskom paketu (Informax, North Bethesda, Md.) i predviđeno mesto cepanja iz onlajn ExPasy alata za analizu proteina.
Primer 5: SDS-PAGE analiza RNKazaIg fuzionog proteina.
[0195] Prečišćen RNKaza-Ig (SEQ ID NO: 115) je analiziran elektroforezom na SDS-poliakrilamid želatinima. Uzorci fuzionog proteina su kuvani u SDS puferu za uzorke sa i bez redukcije disulfidnih veza i primenjeni na SDS 10% Tris-BIS želatine (Catalog # NP0301, Novex, Carlsbad, CA.). Pet mikrograma svakog prečišćenog proteina je naneto na želatine. Proteini su vizualizovani posle elektroforeze pomoću Coomassie Blue bojenja (Pierce želatin Code Blue Stain Reagent, Catalog #24590, Pierce, Rockford, Ill.), i uklonjena im je boja u destilovanoj vodi. Markeri molekularne težine su uključeni na isti želatinu (Kaleidoscope Prestained Standards, Catalog #161-0324, Bio-Rad, Hercules, Calif). Ostali uzorci su kako sledi: RNKaza-lg fuzioni protein u puferu za uzorkovanje (62,5mM Tris-HCI, pH6,8, 2% SDS, 10% glicerola, 0.01% bromofenolom plave) sa i bez 5% 2-merkaptoetanola) je nanet na 4-12% prefabrikovan želatin (Bio-Rad). želatin je pušten na 100 volti dok boja nije otišla sa želatina. želatin je obojen u želatinCode Blue (Thermo Scientific) na sobnoj temperaturi preko noći i zatim ispran vodom.
[0196] Slika 3 prikazuje RNKaza-Ig fuzioni protein u poređenju sa mišjim IgG. RNKaza-Ig je prečišćen iz supernatantom transficiranih CHO ćelija vezivanjem i koncentracije od Protein A sefaroze. SDS-PAGE želatin pokazuje da je RNKaza-Ig oko 50 kDa kada je redukovana i oko 110 kDa kada je neredukovana.
Primer 6: Detekcija RNKaza-Ig u mišjem serumu.
SRED test
[0197] 2% agaroza želatin je dobijen destilovanom vodom. Poli-IC (Sigma) je rastvoren u destilovanoj vodi na 3 mg/ml, i želatin pločica je pripremljena kako sledi: 1,5 ml reakcionog pufera (0,2M Tris-HCI pH 7,0, 40mm EDTA i 0,1 mg/ml etidijum bromid), 1 ml Poli-IC i 0,5 ml vode su smešteni u cev i održavani na 50°C tokom 5 minuta.3 ml agaroze (čuvane na 50°C) je dodato u epruvetu. Smeša je odmah sipana na staklenu ploču. Komorice sa uzorcima su napunjene sa želatinom.2 µl svakog uzorka seruma je napunjeno u rupice, i želatin je inkubiran na 37°C tokom 4 časa u vlažnoj komori. Zatim je želatin je inkubiran u puferu (20 mM natrijum acetat pH5,2, 20mg/ml etidijum bromid) na ledu tokom 30 min. i čitati pod UV.
[0198] Slika 4 prikazuje RNKaza aktivnosti od tri miša (410, 413 i 418) posle intravenske injekcije RNKza-Ig fuzionog proteina (SEQ ID NO: 150) (prečišćeno u ovom eksperimentu iz supernatanta transfektovanih COS ćelija vezivanjem i eluiranjem sa protein A sefarozom). Standardna je korišćen u gornjem redu. Obratiti pažnju na drugu injekciju za miša 410 (pogledati strelicu) posle 2 nedelje.2 µl serum od svakog od tri miševa je nanet na 1% agaroza želatin koji sadrži 0,5mg/ml poli-C. želatin je inkubirane tokom 4 sata u vlažnoj komori na 37°C, i zatim uronjen u pufer koji sadrži 20mM natrijum acetata i 20ug/ml etidijum bromida tokom 30 minuta. Aktivnost RNKazni se ogleda u veličini i intenzitetu oko centralne komorice. Ovi podaci pokazuju da RNKaza-Ig fuzioni protein ima produžen poluživot u serumu miša.
Primer 7: Upotreba anti-RNK ELISA za merenje RNK specifičnih antitela u mišjem serumu.
[0199] 96-komorična ploča (Nunc, Thermal fisher scientific) je obložena sa 50 µg/ml Poli-L-lizina (Sigma) preko noći. Nakon ispiranja pet puta sa PBS koji sadrži 0,05% Tween, ploča je obložena sa 10 µg/ml RNK kvasca u PBS na 4°C tokom noći. Nakon ispiranja pet puta, ploča je blokirana sa PBS koji sadrži 1% BSA na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Uzorci seruma u 1:50 razblaženju su dodati na ploču i inkubirani na 4°C tokom noći. Hibridoma H564 (anti-RNK) medijum kulture je upotrebljen kao standard, koristeći dvostruka serijska razblaženja počevši od 1:300. Antitelo za detekciju je bio anti-mišji IgG konjugovanim sa alkalnom fosfatazoom (Jackson Lab), i dodat na ploču u 1:5000 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Fosfataza supstrat (Sigma) je rastvoren u razvojnom puferu (ThermoFisher Scientific) i dodat na ploču pri 50 µl/komorica. Uzorci su pročitani na 405nm koristeći Spectramax Plus čitača ploče (Microdevices, Sunnyvale, CA).
[0200] Slika 5 pokazuje rezultate sa anti-RNK antitela ELISA titra pre i posle intravenske injekcije RNKaza-Ig fuzionog proteina (SEQ ID NO: 150) od miša 410. Prethodno obložena Poli-L-lizin (50 µg/ml) ploča je obložena sa 10 µg/ml RNK kvasca. Serum (1:50) je stavljen na ploču i inkubiran preko noći na 4°C. Antitelo za detekciju je anti-mišja IgG-alkalna fosfataza (Jackson Labs) na 1:5000 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi, i zatim je dodat fosfataza supstrat i očitano je na 405nm. Podaci pokazuju da injekcije RNKaza-Ig izazivaju smanjenje titra anti-RNK antitela koje je održano preko 3 nedelje.
[0201] Slika 6 prikazuje rezultate sa anti-RNK antitelo ELISA titra pre i posle injekcije RNKaza-Ig fuzionog proteina (SEQ ID NO: 150) unutar tri nedelje od miša 413. Eksperiment je urađen kao što je opisano za miša 410. Titar anti-RNK antitelo je redukovan nakon injekcije RNKaza-Ig.
Primer 8: IFN-alfa proizvodnja pomoću ljudskih PBMC je inhibirana sa RNKazaIg dodavanjem kulturama in vitro.
[0202] RNKaza-Ig (SEQ ID NO: 150) dodavanje je ukinulo indukciju interferona-α iz ljudskih mononuklearnih ćelija periferne krvi stimulisanih pomoću imunih kompleksa formiranih sa serumom od SLE pacijenata (J11) plus nuklearni ekstrakt (NE). Ukratko, ELISA ploče su obložene sa 50 mikrolitara 1:2500 antitela za hvatanje (anti-IFN alpha, PBL 21112-1, Piscataway, NJ), i inkubirane preko noći na 4°C. Ploče su isprane sa PBS/0,05% Tween 20, blokirane u PBS/1% BSA tokom 2 sata na sobnoj temperaturi, oprane sa PBS/0,05% Tween-20, i inkubirane sa standardnim razblaženjima IFN-alfa, ili sa serijskim razblaženjima seruma i inkubiran tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i inkubirane sa 1:2000 antitela za detekciju (PBL 31101-2, Piscataway, NJ) u PBS/1% BSA.
Ploče su isprane u PBS/0.05% Tween-20, i inkubirane sa 50 mikrolitara magarećeg antizečjeg HRP (Jackson Immunoresearch, Westgrove, PA) na 1:12,000 u PBS/1% BSA. Ploče su isprane pet puta pre dodavanja TMB supstrata. Reakcije su zaustavljene dodavanjem 1⁄2 zapremine 2N H2SO4, i uzorci su očitani na 450 nm na Spectramax Pro čitaču ploča (Microdevices, Sunnyvale, CA). Rezultati su prikazani na Slici 7, što pokazuje da je RNKaza-Ig dodatak ukinuo indukciju interferona-α iz ljudskih mononuklearnih ćelija periferne krvi stimulisanih pomoću imunih kompleksa formiranih sa serumom od SLE pacijenata (J11) plus nuklearni ekstrakt.
Primer 9: Fenotip TLR7.1kRNKazaA dvostruko transgenih miševa.
[0203] Stvorili smo miševe koji prekomerno eksprimiraju RNKazuA (RNKaza T g). Ova nukleaza se eksprimira na visokim nivoima kod RNKaza Tg miševa (pogledati sl.8). Razvili smo postupak jednostruke radijalne difuzije (SRED) (levo), kao i mnogo kvantitativniji ELISA za kvantifikaciju RNKaze u serumu (pogledati Sliku 9). Ukrstili smo RNKazaA Tg sa TLR7.1 Tg miševima kako bi dobili dvostruki Tg (DTg). TLR7.1 miševi imaju 8-16 kopije TLR7 i razvijaju veoma agresivnu, brzo progresivnu bolest nalik lupusu i počeli su da umru na 3 meseca starosti sa srednjim preživljavanjem od 6 meseci. U preliminarnoj analizi,puštena je krv DTg miševima, kao i kontrolnim miševima iz istog legla na 3 meseca starosti kako bi se videlo da li su DTg miševi pokazali znake poboljšanja. Kao što je prikazano na Slici 8, DTg miševi su imali veoma visok nivo RNKaze u svojom serumu (ekvivalentno > 13 U/ml RNKaze na osnovu našeg standarda sa specifičnom aktivnošću 993 U/mg). Koncentracija RNKazeA kod Tg i DTg miševa je takođe merena ELISA testom kao što je prikazano na Slici 9. RNKaza Tg i TLR7.1XRNKazaA DTg miševi imaju koncentracije RNKze A u serumu između 1-2 ng/ml.
Detaljan postupak za RNKaza A ELISA (Primer 9, Slika 9)
[0204]
1. Obložena ploča sa anti-RNKazaA Abcam Ab(ab6610) : 2,5-10ug/ml O/N u 4C. 2. Oprati ploču 3 puta sa 0,05% Tween/1XPBS
3. Blokirati sa 1%BSA u PBS tokom bar 1 sata
4. Oprati ploču 3 puta sa 0,05% Tween/1XPBS
5. Staviti uzorke. Rastvori uzoraka na 1:50
6. Inkubirati na sobnoj temperaturi tokom 2 sata
7. Oprati ploču 3 puta sa 0,05% Tween/1XPBS
8. Pripremiti rastvor biotinom obeleženog Anti RNKaza antitela na rastvoru od 1:4500 (2,2ug/ml). Ostaviti na sobnoj temperaturi tokom 1 sata (Rockland 200-4688:
10mg/ml).
9. Oprati ploču 3 puta
10. Rastvoriti StrepAV HRP (Biolegend 405210) 1:2500. Pokriti sa folijom i ostaviti na sobnoj temperaturi tokom 25-30 minuta.
11. Oprati 7 puta, ostaviti tečnost u komoricama najmanje 30 sekundi između pranja. 12. Dodati BD OptEIA supstrat A+B 1:1. Čekati do promene boje najviše 5-10min minuta. Ne dozvoliti da standard gornje komorice pređe 1,0. Dodati 80 µl. (CatNos: 51-2606KC;ReagensA, 51-2607KC;ReagensB)
13. Dodati 40ul 1M sumporne kiseline kako bi se zaustavila reakcija
Informacije o proizvodu/reagensu
[0205]
RNKazaA Ab: ab6610 (90mg/ml)
ELISA pufer: 1%BSA in PBS
ELISA pufer za ispiranje: 0,05% Tween/1XPBS
Anti RNKazaA biotinom konjugovatno antitelo: Rockland: 200-4688(10mg/ml) Strep AV HRP: Biolegend 405210
BD OptEIA reagensi A i B: 51-2606KC i 51-2607KC
Primer 10. Krive preživljavanja za TLR7.1 linije transgenih miševa.
[0206] Postojala je veoma značajna razlika između preživljavanja DTg i kontrolnih TLR7.1 miševa iz istog legla. Kao što je prikazano na Slici 10, na 10 meseci 61% TLR7.1 miševa je umrlo, dok je 31% DTg miševa je umrlo. Ovi podaci pokazuju da je prekomerno eksprimiranje RNKazeA izvršilo snažan terapeutski efekat. Razlozi zbog kojih TLR7.1 miševi umiru prerano nije sasvim jasan, iako bi teška anemija, trombocitopenija i glomerulonefritis mogali da igraju ulogu. Da bi se odredilo da li je eksprimiranje RNKaze A kod DTg miševa imalo pozitican uticaj na eritrocite i trombocite, obavljen im je merenje krvi ali nisu pronađene razlike između TLR7.1 i DTg miševa. Nasuprot tome, došlo je do značajnog poboljšanja histopatologije bubrega kod DTg miševa. Primetili smo smanjeno taloženje IgG i C3 kod DTg miševa. PAS bojenje, što odražava upalu u mesangijumu, je takođe smanjeno kod DTg miševa u poređenju sa TLR7.1 kontrolama iz istog legla. Kada smo sada uporedili infiltraciju makrofaga bubrega pomoću anti-MAC-2 (galectin3) antitela (Lyoda et al. Nephrol Dial Transplat 22: 3451, 2007), bilo je mnogo manje mac-2 pozitivnih ćelija u glomerula od DTg miševa. Rezultati brojanja 20 glomerula po mišu kod 5 miševa u svakoj grupi otkrilo je srednja /- SE od 3,8 /- 1,1 i 1,4 /- 0,2 za pojedinačne u odnosu na DTg, respektivno, p = ,05. Osim toga, kvantifikovali smo veličinu glomerularnog tufta i primetili značajno smanjenje glomerularne veličine tufta kod DTg miševa (179 /- 41 u odnosu na 128 /- 16,8 um2 kod pojedinačnih u odnosu na DTg, respektivno, p = 0,037). Ukratko, TLR7.1KSRNKazaA DTg miševi žive duže od pojedinačnih Tg TLR7.1 miševa iz istog legla i imaju manje upale i povrede u svojim bubrezima.
Primer 11. Analiza IRGs u slezinama TLR Tg miševa.
[0207] Analiza gena za odgovor interferona (IRG) u slezini TLR7.1 Tg i TLR7.1 X RNKazaA DTg miševa pokazala je da je eksprimiranje gena IRF7 bilo znatno niže kod DTg miševa (p = 0,03). Neke druge IRG, uključujući MX1 i VIG1, bile su niže kod DTg miševa u odnosu na Tg miševima, ali razlike nisu bile značajne. Pogledati Sliku 11. Kvantitativna PCR je izvedena na sledeći način: ukupna RNK je izolovana iz slezine miša pomoću RNeasy mini kompleta (Qiagen, Valencia, CA, USA), DNKaza je tretiratna primenom Turbo DNK-free (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA ) i prvi lanac cDNK je proizvedena sa RNK-docDNK kompleta (Applied Biosystems) korišćenjem nasumičnih prajmera.260/280 je bio između 1,7 i 2,0 izolovanog RNK mereno sa NanoDrop (Thermo Scientific, Valtham, MA, USA). cDNK je razblažena do ekvivalenta 1 ng/µl ukupne RNK, i korišćeni su 8ul po reakciji. Prajmeri za referentni gen (18S) i gena od interesa (GOI) su sintetisani (IDT, Coralville, Iowa, USA) i razblaženi do odgovarajućih koncentracija za kPCR koristeći vodu molekularnog nivoa. BLAST rezultati prajmera pokazuju specifičnu sekvencijalnu homologiju samo sa referentnim genima ili GOI. Reakcije u duplikatu (20ul) se radi na ABI Fast 7500 sistemu korišćenjem 1:1 mešavine obrasca i prajmer SensiMix SYBR master smeše sa niskim ROX (Bioline, London, UK). Relativna kvantifikacija je izračunata 2<-ddCT>postupkom sa starosti koja odgovara divljem tipu B6 miševa kao osnovici kako bi se odredio stepen promena za svaki GOI. Krive disocijacije reakcije pokazuju jedan vrh topljenja za svaki gen. Standardna kriva je pokazala sličnu efikasnost pojačavanja za svaki gen, i da su koncentracije šablona unutar linearnog dinamičkog opsega za svaki od setova prajmera.
Primer 12. Strukture za generisanje hibridnih molekula nukleaze.
[0208] Hibridni molekuli nukleaze su dizajnirani da sadrže željene strukture i funkcionalne aktivnosti pojedinačnih struktura enzima ili multi-enzima kao modularnih kasete sa kompatibilnim restrikcionim položajima enzima za prevoz i razmenu domena. Šematska struktura različite konfiguracije hibridnih molekula nukleaze je ilustrovana na Slici 12. Prajmeri su prikazani u Tabeli 1.Nukleotida i aminokiselinske sekvence reprezentativnih hibridnih molekula nukleaze prikazani su u Tabeli 2.
Opšti pristup za generisanje hibridnih molekula nukleaze
[0209] Ljudske cDNK su izolovane iz ljudskog pankreasa RNK (Ambion) ili ljudskih PBMC RNK iz normalnih ljudskih limfocita periferne krvi (oko 5x10e6) koristeći QIAGEN RNAeasy komplete (Valencia, CA) i QIAshredder komplet da homogenizuje ćelijske lizate (QIAGEN, Valencia, CA). Ljudski PBMC su izolovani iz heparinizirane ljudske krvi razblažene 1:1 u D-PBS i postavljeni preko LSM medijuma za razdvajanje limfocita (MP Biomedicals, Irvine, CA) Fikol gradijenti.
[0210] RNK mišje slezine je izolovan korišćenjem QIAGEN RNAeasy kompleta (Valencia, CA) sa oko 5x10e6 splenocita. Ćelije su peletirane centrifugiranjem iz medijuma kulture, a 5x10e6 ćelije se koriste za izradu RNK. RNK je izolovana iz ćelija upotrebom QIAGEN RNAeasy kompleta (Valencia, CA.) komplet za totalno izolovanje RNK i QIAGEN QIAshredder prema uputstvima proizvođača koja prate komplete. Jedan do dva mikrograma (1-2 µg) ukupne RNK je korišćeno kao kalup za pripremu cDNK reverznom transkripcijom. RNK, 300 ng nasumičnih prajmera, i 500 ng Oligo dT (12-18), i 1 µl 25 mM dNTP su kombinovani i denaturisani na 80°C tokom 5 minuta pre dodavanja enzima. Superscript III reverzna transkriptaza (Invitrogen, Life Technologies) je dodata u RNK plus prajmera smešu u ukupnoj zapremini od 25 µl u prisustvu 5 puta drugog lanca pufera i 0,1 M DTT datog sa enzimom. Reakcija reverzne transkripcije je ostavljena da se odvija na 50°C tokom jednog sata.
[0211] Između 10-100ng cDNK je korišćeno u PCR reakcijama pojačavanja koristeći prajmere specifične za gen nukleaze od interesa (RNKazaA, RNKaza1, DNKaza1, Trex1, DNKaza1L3, itd). Za prve reakcije kloniranja, prajmeri su dizajnirani kako bi se izolovao cDNK pune dužine ili skraćeni proizvodi koji kodiraju gen od interesa. PCR fragmenti pune dužine ili skraćeni su izolovani elektroforezom na agaroza želatinu i prečišćeni upotrebom QIAGEN QIAquick kolona kako bi se uklonili nukleotidi, prajmeri i neželjeni amplifikovani proizvodi. Prečišćeni fragmenti su klonirani u pCR2.1 TOPO vektore kloniranja (Invitrogen, Carlsbad, CA) i transformisani u TOP10 kompetentne bakterije. Izolovane kolonije su sakupljene u Luria Broth medijumu koji sadrži 50 µg/ml karbenicilina i ostavljeni da rastu preko noći kako bi se izolovali plazmidi. TOPO klonovi su pregledani za umetke odgovarajuće veličine digestijom sa EcoRI (NEB, Ipsvich, MA) restrikcionim enzimom i elektroforezom na agaroza želatinu na digestovanim fragmentima. Analiza DNK sekvence pozitivnih klonova je izvedena sa ABI Ready Reaction Mix v 3.1 i analizirani pomoću ABI 3730 XSL DNK sekvencera. Nakon što su dobijeni ispravni klonovi, dalje modifikacije sekvence su dizajnirane i PCR reakcije su obavljene za generisanje željenih alela ili kaseta za eksprimiranje. Skraćivanje proizvoda i alela je generisano PCR mutagenezom korišćenjem preklapajućih prajmera za uvođenje mutacija na specifične položaje u genima. Veznici su sintetisani preklapanjem PCR koristeći interne preklapajuće prajmere i uzastopne runde PCR kako bi se vezale dodatne sekvence na svaki završetak. Hibridni molekuli nukleaze su sastavljeni kao niz nekoliko međusobno zamenljivih kaseta. Molekuli poželjnog otelotvorenja sadrže fiksni lider peptida, kasetu za nukleaze, opcione kasete koje kodiraju izbor nekoliko različitih polipeptidnih veznika, -Ig Fc domen kasetu sa STOP kodonom ili veznikom na karboksilnom kraju CH3 domena, i za resolvICase tip molekula, drugu veznik kasetu, i zatim drugu kasetu za nukleaze. Slika 12 ilustruje tip i strukturu kaseta ovih hibridnih molekula nukleaza i primere potencijalnih sekvenci koje se unose na svakom položaju. Kada su hibridni molekuli nukleaze sklopljeni, prebačeni su do sisarskog pDG plazmida za eksprimiranje pogodnog za prolazno eksprimiranje u COS7 ili drugim ćelijama i stabilno eksprimiranje u CHO DG44 ćelijama uz izbor za DHFR sa metotreksatom.
Prolazno eksprimiranje hibridnih molekula nukleaze
[0212] COS-7 ćelije su prolazno transfektovane sa pDG vektorom za eksprimiranje koji sadrži hibridni molekul nukleaze umetnutih gena. Dan pre transfekcije, ćelije su zasejane u 4x10e5 ćelija po 60 mm posudi u 4 ml DMEM (ThermoFisher/Mediatech cell gro) 10% FBS za medijum kulture tkiva. DMEM bazalni medijum je obogaćen sa 4,5 g/L glukozom, natrijum piruvatom, L-glutaminom 4 mM, i ne-esencijalnim aminokiselinama. Fetalni goveđi serum (Hyclone, Logan, UT ThermoFisher Scientific) je dodat medijumu na 10% konačne zapremine. Ćelije su inkubirane na 37°C, 5% CO2 preko noći i bile su otprilike 40-80% konfluentne na dan transfekcije. Plazmidna DNK je pripremljena korišćenjem QIAGEN (Valencia, CA) QIAprep miniprep kompleta prema uputstvima proizvođača, i eluirana u 50 µl EB pufera. Koncentracije DNK su merene korišćenjem Nanodrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington DE) spektrofotometra. Plazmidna DNK je transfektovana upotrebom Polifect (QIAGEN, Valencia, CA) reagensa za transfekciju prema uputstvima proizvođača, koristeći 2,5 µg plazmidni DNK po 60 mm posudi i 15 µl polifektnog reagensa u 150 µl DMEM koktelima transfekcije bez seruma. Nakon formiranja kompleksa, reakcije su razblažene u 1 ml medijumu rasta ćelija koji sadrži serum i sve dodatke, i dodate kapanjem u ploče koje sadrže 3 ml svežeg DMEM potpunog medijuma kulture. Prolazne transfekcije su inkubirane tokom 48-72 sati pre prikupljanja kulture supernatanta za dalju analizu.
Generisanje stabilnih CHO DG44 transfektanata koji eksprimiraju hibridne molekule nukleaze od interesa
[0213] Stabilna proizvodnja hibridnih molekula nukleaze je postignuta elektroporacijom selektabilnog plazmida koji se može pojačati, pDG, koji sadrži nukleaza-Ig cDNK pod kontrolom CMV promotera, u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO). pDG vektor je modifikovana verzija pcDNK3 koji kodira selektivni marker DHFR sa oslabljenim promoterom kako bi povećao selekcioni pritisak za plazmid. DNK plazmida je pripremljena korišćenjem QIAGEN maxiprep kompleta, i prečišćeni plazmid je linearizovan po jedinstvenom AscI mestu pre ekstrakcije fenola i taloženja etanola. DNK sperme lososa (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.) je dodata kao noseća DNK, i 100 µg svakog plazmida i DNK nosača je korišćeno za transfekciju 10<7>CHO DG44 ćelija elektroporacijom. Ćelije su gajene do logaritamske faze u Excell 302 medijumu (JRH Biosciences) koji sadrži glutamin (4 mM), piruvat, rekombinantni insulin, penicilin-streptomicin i 2xDMEM neesencijalne aminokiseline (sve od Life Technologies, Gaithersburg, Md.), u daljem tekstu se naziva „Excell 302 kompletni“ medijum. Medijumi za netransficirane ćelije takođe sadrže HT (razblažen iz 100x rastvora hipksantina i timidina) (Invitrogen/Life Technologies). Medijumi za transfekciju pod selekcijom sadrže različite nivoe metotreksata (Sigma-Aldrich) kao selektivni agens, od 50 nM do 1 µm. Elektroporacije su izvedene na 280 volti, 950 mikroFarada. Transfektovane ćelije su ostavljene da se oporave tokom noći u ne-selektivnim medijuma pre selektivnog zasejavanja u 96-komorične ploče sa ravnim dnom (Costar) pri različitim serijskim razblaženjima u rasponu od 125 ćelija/komorica do 2000 ćelija/komorica. Medijum za ćelijsko kloniranje je Excell 302 kompletan, sadrži 50 nM metotreksata. Nakon što je klonski izrastak dovoljan, serijska razblaženja kulture supernatanta iz master komorica su ispitivana za eksprimiranje hibridnih molekula nukleaze upotrebom -IgG sendvič ELISA. Ukratko, NUNC Immulon II ploče su obložene preko noći na 4°C sa 7,5 mikrograma/ml F(ab'2) kozjeg anti-mišjeg IgG (KPL Labs, Gaithersburg, MD) u PBS. Ploče su blokirane u PBS/2-3% BSA, i serijska razblaženja supernatanta kulture su inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 2-3 sata. Ploče su isprane tri puta u PBS/0,05% Tween 20, i inkubirane sa peroksidaza ren konjugovanim F(ab'2) kozjim anti-mišjim IgG2a (Southern Biotechnologies) i kozjim anti-mišjim IgG (KPL) pomešanim zajedno, svaki na 1:3500 u PBS/1,0% BSA, ili u preoksidaza ren konjugovanom F(ab‘)2 kozjem anti-ljudskom IgG1 (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) na 1:2500 tokom 1-2 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane četiri puta u PBS/0,05% Tween 20, i vezivanje je detektovano sa SureBlue Reserve, TMB supstratom (KPL Labs, Gaithersburg, MD). Reakcije su zaustavljene dodavanjem jednakog obima IN HCI, i ploče su pročitane na 450 nm na Spectramax Pro čitaču ploča (Microdevices, Sunnyvale CA). Klonovi sa najvećom proizvodnjom hibridnog molekula nukleaze su prošireni u T25, i zatim T75 boce da obezbede adekvatan broj ćelija za zamrzavanje i skaliranje do proizvodnje fuzionog proteina. Nivo proizvodnje je dalje povećan u kulturama od četiri najbolja klona progresivnim pojačavanjem u medijumu kulture koji sadrži metotreksat. Na svakom sukcesivnom prolasku ćelija, Excell 302 kompletni medijum sadrži povećanu koncentraciju metotreksata, tako da samo ćelije koje pojaćavaju DHFR plazmid mogu da opstanu.
[0214] Supernatanti su sakupljeni iz CHO ćelija koje eksprimiraju hibridni molekul nukleaze, filtrirani kroz 0,2 µm PES filtere eksprimiranja (Nalgene, Rochester, NI), i provučeni su preko Protein A-agaroza (IPA 300 unakrsno povezana agaroza) kolone (Repligen, Needham, Mass.). Kolona je isprana puferom za pranje kolone (90mm Tris-Base, 150mM NaCl, 0,05% natrijum azida, pH 8,7), i vezani protein je eluiran korišćenjem 0.1 M citratnog pufera, pH 3,0. Fragmenti su sakupljene i koncentracija proteina je određena na 280nm koristeći Nanodrop (Vilmington DE) spektrofotometar za mikrouzorke, i prazno određivanje korišćenjem 0,1 M citratnog pufera, pH 3.0. Fragmenti koje sadrže hibridni molekul nukleaze su sakupljeni, i razmena pufera je izvršena serijskim spinova u PBS korišćenjem centrikon koncentratora, a zatim filtrirana kroz 0,2 µm filter uređaj, kako bi se smanjila mogućnost kontaminacije endotoksinom.
Primer 13. Analiza kinetike enzima za hRNKaza1-G88D-hIgG1 [SCCH-P238S-K322S-P331S1.
[0215] Ljudska RNKaza1 sekvenca je izolovana iz RNK ljudskog pankreasa nasumičnom prajmovanom cDNK reverznom transkripcijom i PCR pojačavanjem, kao što je opisano u Primeru 12 za molekule nukleaza. Sledeći prajmeri na 50 pmol po reakciji su korišćeni od seta prajmera navedenog u tabeli PCR prajmera.
hRNKaza5'age: accggtaaggaatcccgggccaagaaattcc (SEQ ID NO:16)
hRNKaza3'bx: ctcgagatctgtagagtcctccacagaagcatcaaagtgg (SEQ ID NO: 17)
[0216] Mutant oblik ljudske RNKaze G88D je napravljen korišćenjem sledećih dva prajmera u PCR i preklapanjem PCR reakcija kako bi se uvela mutacija na položaju 88 koja menja otpornost enzima na citoplazmičnoi inhibitor.
hRNKazaG88D-S: agactgccgcctgacaaacgactccaggtaccc (SEQ ID NO:18) hRNKazaG88D-AS: gggtacctggagtcgtttgtcaggcggcagtct (SEQ ID NO: 19)
[0217] I divlji tip i mutant verzije ljudske RNKaze1 se izolovani i klonirani kao što je opisano gore za hibridne molekule nukleaze. Divlji tip sekvence je kloniran pomoću prva dva gore navedena prajmera. Kada su fragmenti RNKaze TOPO klonirani i sekvencirani, AgeI-Xhol kasete su prenete u pDG vektor eksprimiranja koji već sadrži ljudski VK3LP umetak i ljudsku IgG1-VT kasetu. Konstrukti su potvrđeni digestijom, i DNK plazmida je pripremljena za prolaznu transfekciju. Kada je funkcija potvrđena za manji obim prolazne transfekcije, molekuli su stabilno transfektovani u CHO DG44 radi eksprimiranja dovoljne količine za dalju in vitro analizi. Divlji tip ljudskog RNKaza1 fuzionog proteina prikazan je u Tabeli 2, hVK3LP-hRNKaza1-WT-hIgG1-WT (SEQ ID NO: 163). Slično tome, divlji tip ljudske RNKaze1 je takođe eksprimiran kao fuzioni gen sa (gly4ser)4 (SEQ ID NO: 125 ili SEQ ID NO: 161) ili (gly4ser)5 (SEQ ID NO: 126 ili SEQ ID NO: 162) veznik domenom umetnutim između hRNKaza kasete i hIgG1 Fc domena. G88D mutant ljudskog RNKaza1 je takođe eksprimiran kao fuzioni gen označen kao hVK3LP-hRNKaza-G88D-hIgG1-VT (SEQ ID NO: 124 ili 160), ili hIgG1-SCCH-P238S-K322S-P331S (SEQ ID NO: 174 ili 175 ), navedeni u Tabeli 2.
[0218] Lajnviver-Burkov dijagram kinetike enzima za mutant hRNKaza1-G88D-hIgG1 [SCCH-P238S-K322S-P331S] (SEQ ID NO: 175) je prikazan na Slici 13. Za dodatno definisanje funkcionalne karakteristike dvovalentnog RNKaza-Ig fuzionog proteina, izveli smo preliminarno određivanje Mihaelis konstante, Km. Kinetika enzima prečišćenog ljudskog RNKaza1-Ig fuzionog proteina je testirana primenom RNase Alert supstrata(Ambion/IDT, San Diego, CA.) prema uputstvima proizvođača, i testa fluorescencije pomoću Spectramax M2 čitača mikroploča (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Podaci fluorescencije su sakupljeni na intervalima od 30 sekundi tokom 30 minuta inkubacije, i analizirani korišćenjem SoftmakPro softvera (Molecular Devices). Brzine reakcije na različitim koncentracijama supstrata su merene i podaci su prikazane u obliku Lajnviver-Burkovog dijagrama.
Primer 14. Analiza vezivanje hRNKaza1-hI2G linija ljudskih monocita.
[0219] Protein A prečišćena hibridni molekuli nukleaze hRNKaza1-hIgG1-VT su inkubirani sa ćelijskim linijama ljudskih monocita THP-1 ili U937 za procenu FcR posredovanog vezivanja divljeg tipa ili mutanta Fc koji sadrži molekule. Slika 14 pokazuje obrazac vezivanja hRNKaza1-VT-hIgG1-VT (SEQ ID NO: 161) za ove dve ćelijske linije. Ćelije su inkubirane sa 5 µg/ml prečišćenim fuzionim proteinom u PBS/2% FBS tokom 45 minuta na ledu, isprane tri puta u PBS/2% FBS, i inkubirane sa FITC-kozjim anti-ljudskim IgG (Fc specifičan) (Jackson ImmunoResearch Wst Grove, PA) na 1: 200 tokom 45 minuta na ledu. Ćelije su isprane dva puta u PBS/2% FBS i analizirane protočnom citometrijom koristeći FACS Canto (BD, Franklin Lakes, NJ) protočni citometar, i FlowJo softver (TreeStar, Ashland, OR).
Primer 15. IVig Blokiranje hRNKaza1-hIgG1 vezivanja za linije ljudskih monocita.
[0220] THP-1 ili U937 ćelije su prethodno inkubirane sa IVIg sa početkom na 10 mg/ml i otelotvorenjem 10 puta serijskih razblaženja preko komorica ploče sa 96 komorica. Ćelije (oko 1x10e6 po komorici) su inkubirane na ledu tokom 45 minuta. Unapred vezane ćelije su isprane dva puta i AF750 konjugovan hRNKaza1-VT-hIgG1-VT (SEQ ID NO: 161) na približno 5 µg/ml je dodato svakoj komorici. Reakcije vezivanja su inkubirane tokom 45 minuta na ledu, oprane dva puta u PBS/2% FBS, i analizirane protočnom citometrije kao što je opisano gore. IVIg je uspeo da delimično da blokira vezivanje obeleženog fuzionog proteina nukleaze, ali čak i na 10 mg/ml, još uvek je bilo zaostalog vezivanja detektovanog iznad pozadine. Slika 15 prikazuje blokirajuću aktivnost ljudskog IVIg za vezivanje za U937 i THP-1 ćelije po hRNKaza1-VT-hlgG1-VT (SEQ ID NO: 161).
Primer 16. Trex1-Ig test aktivnosti.
[0221] Mišji Trex1 je kloniran iz mišje cDNK upotrebom prajmera navedenih u nastavku:
mTrex1-5'age: accggtatgggctcacagaccctgccccatggtcaca (SEQ ID NO:20) mTrex1-3'bx: ctcgagatctgttgttccagtggtagccggagtgccgtacatg (SEQ ID NO:21)
[0222] PCR reakcije su izvedene upotrebom 50 pmol svakog prajmera u ukupnoj zapremini od 50 µl, pod profilom pojačavanja od 94C 30 sekundi; 50C 60 sekundi; 68C 90 sekundi za 35 ciklusa pojačavanja. PCR proizvodi su klonirani u pCR2.1 vektoru i TOPO klonovi su ispitivani kako je prethodno opisano za prototip kloniranja fuzionog gena nukleaze. Nakon što je sekvenca verifikovana, kasete su subklonirane u pDG vektor eksprimiranja fuzionisan za sa mIgG repa ili ko-klonirani sa jednim od (g4s)n veznika za konstruisanje Trex1-lnk molekula sa različitom dužinom veznika. Izolati plazmida su privremeno transfektovani u COS ćelije kao što je opisano, i stabilni CHO transfektanti su generisani kao što je opisano za prototip fuzionih gena nukleaze.
[0223] Fuzioni geni su konstruisani kodirajući Trex1Ig na sledeći način: geni inkorporiraju ljudski VK3 lider peptid fuzionisan na mišji Trex1 skraćen na COOH terminusu za 72 aminokiseline (kako bi se uklonile sekvence za međućelijsko targetiranje jezgara) fuzionisan za (gly4ser)4 ( SEQ ID NO:130) ili (gly4ser) 5 veznik (SEK ID BR: 131), fuzionisan za mišji IgG2a/c alel koji obuhvata neke promene iz IgGc sekvenci Balb/c IgG2a alel.
[0224] Aktivnosti egzonukleaze Trex1-Ig su merene u 30ul reakcijama koje sadrže 20 mM Tris (pH 7,5), 5mm MgCl2, 2 mM DTT, koristeći 36-mer oligonukleotid kao supstrat.
Inkubacije reakcija su ostavljene da teku tokom 20-30 min na 37°C. Uzorci su podvrgnuti elektroforezi na 23% poliakrilamid DNK želatinima preko noći. Želatini su inkubirani u TBE puferu koji sadrži 0,5 µg/ml etidijum bromida. DNK je vizualizovan primenom UV transiluminatora i fotografisan Kodak EDAS 290 digitalnim fotoaparatom opremljenim etidijum bromid filterima i analiziran korišćenjem Kodak Molecular Imaging softvera.
Rezultati testa trex1 aktivnosti za COS proizvedene mTrex1-(g4s)4-mIgG2a-c (SEQ ID NO:166) i mTrex1-(g4s)5-mIgG2a-c (SEQ ID NO:167) prikazani su na Slici 16.
Primer 17. Western Blot za mTrex1-Ig pojedinačne hibridne molekule nukleaze proizvedene COS-7 prolaznom transfekcijom.
[0225] COS-7 ćelije su privremeno transfektovane sa plazmidima koji sadrže hibridne molekule nukleaze koje kodiraju Trex1-Ig na sledeći način: geni inkorporiraju ljudski VK3 liderski peptida fuzionisan za mišji Trex1 skraćen na COOH terminusu za 72 aminokiseline (kako bi se uklonile sekvence za targetiranje jezgara) fuzionisan za (gly4ser)4 ( SEQ ID NO:130) ili (gly4ser) 5 veznik (SEK ID BR: 131), fuzionisan za mišji IgG2a/c alel koji obuhvata neke promene iz IgGc sekvenci Balb/c IgG2a alel. COS supernatanti su prikupljeni nakon 72 sata i ,5-1,0 ml uzorci (zavisno od eksperimenta) su imunoprecipitirani preko noći na 4°C sa 100 µl protein A-agaroza perlama. Protein A perle su centrifugirane i isprane dva puta u PBS pre resuspenzovanja u redukcionom SDS-PAGE puferu za nanošenje. Uzorci su termički tretirani na 100C tokom 5 minuta, protein A perle su centrifugirane do peleta, i pufer za uzorak je nanet na 10% SDS-PAGE želatine. Uzorci su podvrgnuti elektroforezi na 150 volti tokom 1,5-2 sati, i želatini su umrljali membrane nitroceluloze na 30 mAmp tokom 1 sata. Western blot su blokirani u TBS/5% nemasnog mleka preko noći. Mrlje su inkubirane sa 1: 2500 HRP (peroksidaza ren) konjugovanim kozjim anti-mišjim IgG2a/c (Fc specifičan, KPL) tokom 1,5 sati na sobnoj temperaturi, isprani u PBS/0,5% Tween 20 pet ili više puta, i mrlje su razvijene korišćenjem ECL reagensa. Slika 17 prikazuje Western blot imunoprecipitate od COS7 kulture supernatanta koji eksprimiraju mTrex1- (g4s)4 (SEQ ID NO: 166) ili (g4s)5-mIgG2a-c (SEQ ID NO: 167) fuzione proteine.
Primer 18. Aktivnost egzonukleaze od DNKaza1L3Ig CHO izvedenih fuzionih proteina.
[0226] DNKaza1L3 je klonirana iz cDNK mišje slezine koristeći sledeći par prajmera za kloniranje mDNKaze1L3 uključujući prirodnu lidersku peptidnu sekvencu.
mDNKaza1L3-NL: GTT AAG CTT GCC ACC ATG TCC CTG CAC CCA GCT TCC CCA CGC CTG (SEQ ID NO:22)
MDNKaza1L3-3bx: CTC GAG ATC TGA GGA GCG ATT GCC TTT TTT TCT CTT TTT GAG AG (SEQ ID NO:23)
[0227] Alternativno, PCR reakcije su postavljene korišćenjem sledećeg para prajmera kako bi se vezali za ljudski VK3 liderski peptida umesto za prirodnog lidera.
mDNKaza1L3-age: ACC GGT CTA AGG CTC TGC TCC TTC AAT GTG AGG TCC TTT GGA (SEQ ID NO:24)
MDNKaza1L3-3bx: CTC GAG ATC TGA GGA GCG ATT GCC TTT TTT TCT CTT TTT GAG AG (SEQ ID NO:25)
[0228] PCR reakcije su izvedene upotrebom 50 pmol svakog prajmera u ukupnoj zapremini od 50 µl, pod profilom pojačavanja od 94C 30 sekundi; 50C 60 sekundi; 68C 90 sekundi za 35 ciklusa pojačavanja. PCR proizvodi su klonirani u pCR2.1 vektoru i TOPO klonovi su ispitivani kako je prethodno opisano za prototip kloniranja fuzionog gena nukleaze. Nakon što je sekvenca verifikovana, kasete su subklonirane u pDG vektor eksprimiranja fuzionisan za sa mIgG rep. Izolati plazmida su privremeno transfektovani u COS ćelije kao što je opisano, i stabilni CHO transfektanti su generisani kao što je opisano za prototip fuzionih gena nukleaze.
[0229] Aktivnosti egzonukleaze u ekstraktima proteina iz DNKaza1L3Ig (SEQ ID NO: 185) CHO klonova je merena na 30ul reakcijama koje sadrže 20mM Tris (pH 7,5), 5mM MgCl2, 2 mM DTT i supstrat. Inkubacija je bila 20-30 min na 37°C. Uzorci su zatim podvrgnuti želatinu DNK agaroze preko noći. želatin je inkubiran u puferu koji sadrži TBE etidijum bromid. DNK je vizuelizovana pod UV. Rezultati analize digestije hromatina su prikazani na Slici 18.
Primer 19. Titracija doza sve većih količina CHO supernatanta za aktivnost egzonukleaze.
[0230] Slika 19 pokazuje analizu titracije za obrasce digestije egzonukleaze dobijene iz COS supernatanta koji eksprimiraju DNKaza1L3Ig fuzione proteine (SEQ ID NO: 183 ili 185). Testovi razgradnje DNK jezgra su izvedeni kao što sledi: HeLa ćelije su kultivisane u DMEM medijumu i jezgra iz 10e5 ćelija su izolovana korišćenjem NP-40 lize. Jezgra su razblažena u 200 µl reakcionog pufera koji sadrži 10 mM HEPES (pH 7,0), 50 mM NaCI, 2 mM MgCl2, 2mM CaCl2i 40mM b-glicerofosfata. Jezgra su inkubirana tokom 3 sata na 37°C u zapremina kulture supernatanta navedenim na slici iz DNKaza1L3 transfektovanih COS ćelija. DNK jezgra je izolovana korišćenjem QiAmp DNK krvi minikompleta. DNK je analizirana pomoču 1,5% agaroza želatina. Za kontrolne reakcije, heparin je korišćen na 250 i.u./mL, da inhibira aktivnost nukleaze.
Primer 20: Konstrukcija i eksprimiranje DNKaza1-Ig pojedinačnog i dualnog enzima hibridnih molekula nukleaze.
[0231] Prijavljeni su prirodni aleli ljudske DNKaze1 ili molekula nalik DNKazi1. A114F mutacija je ranije prijavljena da se događa u prirodnim varijantama enzima nalik ljudskoj DNKazi1, i da dovede do rezistentnosti na aktin kod enzima koji sadrže ovu promenu sekvence. Pogledati Pan, CQ, Dodge TH, Baker DL, Prince WE, Sinicropi DV, and Lazarus RA. J Biol Chem 273: 18374-18381, (1998); Zhen A, Parmelee D, Hyaw H, Coleman TA, Su K, Zhang J, Gentz R, Ruben S, Rosen C, and Li Y. Biochem and Biophys Res Comm 231: 499-504 (1997); and Rodriguez AM, Rodin D, Nomura H, Morton CC, Weremowicz S, i Schneider MC. Genomics 42: 507-513 (1997).
[0232] Slično tome, G105R mutacija je nedavno prijavljena kao polimorfizam pojedinačnog nukleotida u genu koji kodira ljudsku DNKazu1 koja je polimorfna u nekim ili svim populacijama, i koja je relevantna za autoimunitet. (pogledati Yasuda T, Ueki M, Takeshita H, Fujihara J, Kimura-Kataoka K, Lida R, Tsubota E, Soejima M, Koda Y, Dato H, Panduro A. Int J Biochem Cell Biol 42(7): 1216-1225 (2010)). Alelske varijante na ovom položaju rezultuju u visokoj aktivnosti čuvanja DNKaza 1 izoforme u odnosu na divlji tip. Druge prirodne polimorfne mutacije (R21S) su takođe prijavljene da ispoljavaju veću aktivnost. (pogledati Yasuda, supra)
[0233] Za SLE pacijente je prijavljeno da imaju znatno smanjen nivo DNKaza1 aktivnosti (pogledati Martinez-Valle F, Balada E, Ordi-Ros J, Bujan-Rivas S, Sellas-Fernandez A, Vilardell-Tarres M. Lupus 18(5): 418-423 (2009)).
[0234] Prirodnih varijanti enzima tako mogu biti manje imunogene kada se daju pacijentima, pošto se ovi izoformi javljaju u ljudskoj populaciji. Rezonovali smo da će kombinacija svojstava rezistentnosti na aktin od alela sličnih A114F sa povećanom enzimskom aktivnošću alela poput G105R generisati nove alelske varijante ljudske DNKaze1 koji se mogu pokazati poboljšanu kliničku aktivnost in vitro i in vivo. Prema našim saznanjima, ovo je prvi izveštaj o ovom novom mutiranom obliku DNKaze1 generisane iz kombinacije dve prirodne varijante G105R i A114F.
[0235] Ljudska DNKaza 1 je izolovana kako je prethodno opisano iz RNK ljudskog pankreasa (Ambion), postupkom nasumice prajmovanog cDNK i PCR koristeći sledeće setove prajmera:
5'hDNKaza1-age: GTT ACC GGT CTG AAG ATC GCA GCC TTC AAC ATC CAG (SEQ ID NO:26)
5'hDNKaza1-bx: GTT CTC GAG ATC TTT CAG CAT CAC CTC CAC TGG ATA GTG (SEQ ID NO:27)
Alternativno, 3' DNKaza kasete su pojačane pomoću PCR koristeći naredni par prajmera.
3'hDNKaza1-RV: GTT GAT ATC CTG AAG ATC GCA GCC TTC AAC ATC CAG (SEQ ID NO:28)
3'hDNKaza1-stop: GTT TCT AGA TTA TCA CTT CAG CAT CAC CTC CAC TGG ATA GTG (SEQ ID NO:29)
[0236] PCR reakcije se obavljaju upotrebom 50 pmol svakog prajmera, 2 µl cDNK, u ukupnoj zapremini od 50 µl koristeći Platinum PCR supersmešu kako je prethodno opisano. Profil pojačavanja je 94C 30 sekundi; 55C 30 sekundi; 68C 90 sekundi za 35 ciklusa.
[0237] Kada je divlji tip gena pojačan pomoću PCR, fragmenti su podvrgnuti želatin elektroforezi i 850 bp fragmenti su prečišćeni QIAquick kolonom prečišćavanja. Fragmenti su klonirani u pCR2.1, transformisani TOPO kloniranjem u skladu sa uputstvima proizvođača kao što je opisano za druge konstrukte. Nakon što je sekvenca verifikovana, PCR prajmeri su korišćeni za generisanje podfragmenta koji sadrže prirodne alele za DNKazu1 za koje je prijavljeno da poboljšavaju specifično dejstvo i poboljšavaju rezistentnost na inhibitornu aktivnost aktina. Ovi podfragmenti sadrže preklapajuću sekvencu, što dozvoljava pojačavanje kompletnih DNKaza1 subklonova koji sadrže željene alelne varijacije. COS 7 ćelije su prolazno transfektovane u 60 mm posudama pomoću Polyfect (QIAGEN, Valencia, CA) transfekcionog reagensa. DNK plazmida je pripremljena korišćenjem Qiagen QIAprep miniprep kompleta prema uputstvima proizvođača. Plazmidi su eluirani u 50 µl EB pufera. Koncentracija DNK je merena korišćenjem Nanodrop i alikvot ekvivalentna do 2,5 µg DNK plazmida korišćene za svaku reakciju transfekcije. Svaka DNKazaIg (SEQ ID NOS.: 118, 119, 120, 121, 122 ili 123) ili RNKaza-Ig-DNKaza (SEQ ID NOS.: 115, 116, 117) kaseta za eksprimiranje je umetnuta u sisarski vektor za eksprimirianje pDG, i derivat je pcDNK3.1. Transfektovane ćelije su inkubirane tokom 72 sata na 37°C, 5% CO2, pre prikupljanja supernatanta kulture za dalju analizu. Supernatanti kulture su sakupljeni, rezidualne ćelije centrifugirane iz rastvora, i tečnost prebačena u nove epruvete.
[0238] COS-7 ćelije su privremeno transfektovane sa plazmidima koji sadrže ljudski divlji tip DNKaze1 (SEQ ID NO: 118) ili prirodne DNKaza 1 mutirane alele (G105R i/ili A114F) (SEQ ID NO: 115, 116, ili 117) fuzionisane za divlji tip ljudskog IgG1 Fc domena. Ova zglob-CH2-CH3 kaseta sadrži jednu C→S mutaciju u zglobnoj regiji da eliminiše prvi cistein u ovom domenu jer je neuparen zbog odsustva svog partnera za uparivanje koji je prisutan u lakom lancu antitela. Pored toga, složeniji fuzioni proteini višestruke nukleaze su takođe eksprimirani od strane prolaznih transfekcijama COS ćelija. Western blot analiza je izvedena na supernatantima iz prolaznih transfektanata. Molekuli prikazani na Slici 20 sadrže ljudsku DNKazu1 fuzionisanu na ljudski IgG1 divlji tip Fc domena (SEQ ID NO: 154, 155, 156, ili 159) ili uključuju ljudsku RNKazu1 (divlji tip) fuzionisanu za SCC zglob-CH2-CH3 Fc domen ljudskog IgG1, praćeno novim veznikom koji sadrži N-povezano mesto glikozilacije da zaštiti veznik domen iz razlaganja proteaza, i divlji tip (SEQ ID NO: 153) ili mutant alel (SEQ ID NO: 151 ili 152) formiraju ljudsku DNKazu1 na karboksi terminusu molekula. COS supernatanti su prikupljeni nakon 72 sata i ,5-1,0 ml uzorci (zavisno od eksperimenta) su imunoprecipitirani preko noći na 4°C sa 100 µl protein A-agaroza perlama. Protein A perle su centrifugirane i isprane dva puta u PBS pre resuspenzovanja u SDS-PAGE puferu za nanošenje, za NuPage LDS pufer za uzorak za redukovanje ili neredukovanje želatina. Uzorci su zagrejani prema uputstvima proizvođača, protein A perle su centrifugirne do peleta, i pufer za uzorak je nanet na 5-12% NuPAGE gradijent želatine. Uzorci su podvrgnuti elektroforezi na 150 volti tokom 1,5-2 sati, i želatini su umrljali membrane nitroceluloze na 30 mAmp tokom 1 sata. Western blot su blokirani u TBS/5% nemasnog mleka preko noći. Mrlje su inkubirane sa 1: 2500 HRP (peroksidaza ren) konjugovanim kozjim anti-ljudskim IgG (Fc specifičan, Jackson Immunoresearch) ili kozjim anti-mišjim IgG tokom 1,5 sati na sobnoj temperaturi, isprani u PBS/0,5% Tween 20 pet ili više puta, i mrlje su razvijene korišćenjem ECL reagensa.
Primer 22. Ispitivanje COS supernatanta za aktivnost enzima nukleaze.
[0239] Slika 21 pokazuje rezultate testova analize RNKazne aktivnosti (SRED) na prikupljenim COS supernatantima koji eksprimiraju hDNKazalIg i hRNKaza1-Ig-hDNKaza1 fuzione proteine putem SRED.
[0240] COS supernatanti iz prolaznih transfekcija hDNKazaIg pojedinačnih ili multispecifičnih nukleaza su testirani na aktivnosti nukleaze kako sledi.2% agaroza želatin je pripremljen sa destilovanom vodom. Poli-C (Sigma) je rastvoren u destilovanoj vodi na 3 mg/ml. želatin ploča je pripremljena kako sledi: 1,5 ml reakcionog pufera (0,2M Tris-HCl pH 7,0, 40mm EDTA i 0,1 mg/ml etidijum bromida), 1 ml Poli-C i 0,5 ml vode je smešteno u cev i održavano na 50C tokom 5 min.3 ml agaroze (čuvne na 50°C) je dodati u epruvetu. Smeša je odmah sipana na staklene ploče. Komorice za uzorke su probušene u želatinu. Približno 2 µl svakog uzorka je naneseno, i želatin je inkubiran na 37°C tokom 4 sata u vlažnoj komori. Zatim je želatin je inkubiran u puferu (20 mM natrijum acetata pH5,2, 20mg/ml etidijum bromida) na ledu tokom 30 minuta. želatini su fotografisani na UV transiluminatoru koristeći Kodak digitalni fotoaparat DC290 sistem opremljen etidijum bromid filterima i analizirani koristeći Kodak Molecular Imaging softver.
[0241] Slika 22 pokazuje kompozitnu sliku koja pokazuje rezultate testova DNKaza aktivnosti nukleaze sprovedenih na COS supernatantima iz transfektovanih ćelija. Kultura supernatanta je prikupljena 72 sata posle transfekcije sledećih klonova divljeg tipa DNKaze1 i mutiranih -Ig fuzionih proteina: (1) 090210-8=hDNKaza1-WT-hIgG1 WT (SEQ ID NO:154); (2) 090210-9=hDNKaza1-G105R;A114F-hIgG1 WT (SEQ ID NO:159); (3) 091210-8=hRNKaza1-WT-hIgG1-WT-DNKaza1-G105R;A114F (SEQ ID NO:151), i (4) 091210-14=hRNKaza-WT-hIgG1-WT-DNKaza1-A114F (SEQ ID NO:152).
[0242] pH supernatanta je prilagođen do ,0 sa bikarbonatnim puferom da olakša vezivanje eksprimiranih -Ig fuzionih proteina sa protein A agaroza perlama. Panel A. na Slici 23 pokazuje analizu želatin elektroforeze digestije DNK plazmida: Protein A agaroza mulj (50 µl po uzorku) je ispran u PBS, i inkubiran preko noći na 4°C sa 100 µl supernatantu kulture da imunoprecipitira -Ig fuzione proteine. Imunoprecipitati su isprani 4-5 puta u 750 µl PBS, centrifugirani na približno 3500 obrtaja, što je praćeno aspiracijom PBS-a. Konačni protein A talozi su resuspendovani u 50 µl reakcionom puferu koji sadrži 20 mM Tris pH 7,5.2 mM CaCl2 i 2 mM MgCl2 koji sadrži 1,5 µg DNK plazmid (pDG vektor eksprimiranja). Reakcije su inkubirane tokom 30 minuta na 37°C, grejane na 65°C tokom 5 min, i DNK prisutna u reakcijama je analiziran elektroforezom na agaroza želatinu na 1,5% TBE-agaroza želatinima.
[0243] Panel B pokazuje rezultate testa aktivnosti nukleaze obavljenog na istoj kulturi supernatanta pomoću DNase Alert kompleta (IDT/Ambion). Reakcione epruvete koje sadrže liofilizovan DNase Alert supstrat (50 pmol) se resuspenzuju sa 5 µl ddH2O bez nukleaze koji se dobija sa kompletom, 5 µl 10X DNKaze alert puferom, i 40 µl protein a muljem imunoprecipitiranog na sledeći način: Za ova imunoprecipitiraja, 50 µl protein A agaroza perli je inkubirano preko noći sa 50 µl kulturom supernatanta. Uzorci su zatim isprani 5 puta sa 0,75 ml PBS. Konačni talozi proteina su resuspenzovani u 80 µl ddH2O bez nukleaza, i 40 µl suspenzije (jedna polovina taloga) je preneseno u reakcionu cev. Negativne kontrole sa lažno transficiranim IP i ddH20 su takođe postavljene. Pozitivne kontrole su takođe postavljene da sadrže DNKazu1 datu u kompletu (2 jedinice). Reakcije su inkubirane tokom 1 sata na 37°C, i izložene UV transluminaciji kratke talasne dužine kako bi se vizuelizovala fluorescencija. Relativne količine DNK digestije su označene stepenom fluorescencije.
Primer 22: Ispitivanje mac-2 pozitivnih ćelija kod DTg miševa.
[0244] Rana smrtnost kod lupusa je obično usled nefritisa ili infekcija usled imunosupresije za lečenje nefritisa. Zbog toga, izuzetno važan ishod za svaku novu terapiju je napredak sa nefritisom. Dok su klinička ispitivanja na ljudima ograničena na kvantifikaciju proteinurije i kreatinina, kod miševa se može dobiti tačna procenu upale i oštećenja bubrega pomoću histologije i imunohistohemije. Izveštavamo da su TLR7.1 x RNKaza dvostruko transgeni (DTg) miševi pokazali manje anti-RNK antitela, nižu aktivaciju B ćelija, niže imune depozite i niže PAS pozitivno bojenjem glomerula. Dodatno smo potvrdili infiltraciju makrofaga bubrega koristeći antitelo-Mac-2 anti(galectin3) antitelo (Iyoda et al. Nephrol Dial Transplant 22: 3451, 2007) Zamrznuti delovi iz bubrega dobijenih jednim ili dvostrukim Tg ispitani su za veliki broj Mac-2+ makrofaga kao i za glomerularnu veličina kao što je opisano (Iyoda et al). Dvadeset slučajno izabrana glomerula (od spoljašnje do unutrašnje strane bubrega) su računati za pozitivne ćelije. Postoji mnogo manje mac-2 pozitivnog bojenja ćelija u glomerulama DTg u poređenju sa pojedinačnim Tg miševima (podaci nisu prikazani).
Rezultati brojanja 20 glomerula po mišu u pilot ispitivanju od n = 4-5 u svakoj grupi, otkrili su srednju vrednost /- SE od 3,8 /- 1,1 i 1,4 /- 0,2 za pojedinačne u poređenju sa DTg, respektivno, p = 0,05. Osim toga, kvantifikovali smo glomerularne veličinu tufta i primetili značajno smanjenje glomerularne veličine tufta kod DTg miševa (179,4 /- 41 u poređenju sa 128 /- 16,8 um2 kod pojedinačnih u poređenju sa DTg, respektivno, p = 0.037).
Primer 23: Km prečišćenog mišjeg RNKazaA-Ig fuzionog proteina
[0245] Kako bi se dalje definisale funkcionalne karakteristike dvovalentnog RNKaza-Ig fuzionog proteina (SEQ ID NO: 150), izveli smo određivanje Mihaelisove konstante, Km. Kao što je prikazano na Slici 23, enzim ima visoki afinitet sa privremenom Km od 280 nM (kao poređenja, RNKaza A ima KM 34 nM koristeći poliC kao supstrat (delCardayre et al, Prot Eng 8:261, 1995)). Slika 23 pokazuje enzimsku kinetiku koja je testirana primenom RNase Alert supstrata (Ambion/IDT), i fluorescencija je kvantifikovana uz Spectramax M2 čitač mikroploča. Podaci su analizirani korišćenjem Softmax Pro softvera (Molecular Devices). Brzine reakcije u različitim koncentracijama supstrata su merene i podaci su prikazani kao Lajnviver-Burkov dijagram. Vidljiv Km, korigovan za obim je 280 nM.
Primer 24. Analiza 564Igi Tg miševa za anti-RNK antitela.
[0246] 564 Igi Tg iševi: Dr. Imanishi-Kara je uneo preuređene VDJ gena iz H564 hibridoma u endogene IGH i IGK lokuse kako bi stvorip 564Igi miša na B6 pozadini. Serumi iz ovih miševa boje citoplazmu i jezgra fiksiranih ćelija, što ukazuje na preovlađujuću anti-RNK specifičnost. U skladu sa ovim nalazom i od posebnog značaja za ovu patentnu prijavu, proizvodnja antitelo je inhibirana kada su ti miševi učinjeni deficijentnim za TRL7, što ukazuje na to da je stimulus za proizvodnju antitela zaista RNK. Ovaj soj miševa razvija kasni početak glomerulonefritisa. Analizirali smo eksprimiranje anti-RNK antitela kod miševa transgenih za H564 i takođe kod dvorstruko transgenih miševa koji eksprimiraju 564Ig i RNKaza transgene. Slika 24 poredi nivoe anti-RNK antitela kod mišjeg seruma na sukcesivnim intervalima kako su ti transgeni miševi starili.
[0247] Pogledati Gavalchin, J., R.A. Seder, and S.K. Datta.1987. NZB X SWR model lupus nefritisa I. Unakrsno reaktivni idiotipi monoklonskih anti-DNK antitela u odnosu na antigensku specifičnost, naelektrisanje i alotip. Identifikacija povezanih idiopatskih porodica nasleđena od normalnih SWR i autoimunih NZB roditelja. J. Immunol. 138:128-137; and Berland, R., L. Fernandez, E. Kari, J.H. Han, I. Lomakin, S. Akira, H.H. Wortis, J.F. Kearney, A.A. Ucci, and T. Imanishi-Kari. 2006. Tolični receptor 7-zavisni gubitak tolerancije B ćelija u patogenim autoantitelima knockin miševa. Immunity 25:429-440.
Primer 25: In vitro procena biološke aktivnosti hibridnog molekula nukleaze.
[0248] Jedan ili više hibridnih molekula nukleaze su prečišćeni, npr. afinitetnom ili hromatografijom izmene jona, kao što je prethodno opisano u gornjim primerima. U nekim slučajevima hibridni molekul nukleaze je polipeptid. U nekim slučajevima, hibridni molekul nukleaze sadrži jednu ili više sekvenci iz Tabele 2. U nekim slučajevima molekul je SEQ ID NO: 161, 162 ili 163. U nekim slučajevima molekul sadrži SEQ ID NO: 145 i SEQ ID NO: 149. U nekim slučajevima molekul je SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205 ili 207. Hibridni molekul nukleaze može biti bilo koji od ovde obelodanjenih i bilo koji koji može biti konstruisan sa ovde opisanim sekvencama (pogledati Tabelu 2), npr., uzimanjem domena nukleaze i njegovim povezivanjem za Fc domen; ili, na primer, uzimanjem domena nukleaze i njegovim povezivanjem za Fc domen sa veznik domenom. Različiti veznik domeni (npr., oni opisane ovde) mogu da se koriste za povezivanje Fc domena i/ili domena nukleaze. Na primer, mogu da se koriste veznik domeni dugački 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ili više aminokiselina. Molekuli su in vitro analizirani za specifičnu aktivnost nukleaze, koristeći kvalitativne testove da se verifikuje da poseduju željenu funkciju nukleaze. Konkretne aktivnosti su uglavnom onda utvrđene fluorescencijom na osnovu kinetičkih testova koje koriste supstrate poput RNKaza ili DNase Alert komplet reagenasa, i čitača fluorescentnih ploča podešenog da pravi očitavanja u funkciji vremena. Pored toga, protein rastvori se obično proveravaju za kontaminaciju endotoksinom korišćenjem komercijalno dostupnih kompleta, kao što je Pyrotell Limulus Amebocyte Lysate (LAL) komplet, 0,06 EU/ml granice detekcije od Cape Cod ,Inc. (E. Palmouth, MA). Molekuli su zatim analizirani pomoću različitih in vitro testova za biološke aktivnosti.
[0249] Jedna serija in vitro testova će meriti efekat molekula na proizvodnju citokina od strane ljudskih PBMC kao odgovor na različite stimuluse, u prisustvu ili odsustvu molekula u kulturi. Normalni ili pacijentov ljudski PBMC (približno 1x10e6 ćelija) je kultivisan tokom 24, 48 ili 96 sati u zavisnosti od testa. PBMC su gajene u prisustvu stimulusa poput TLR liganda, kostimulatornih antitela, imunih kompleksa, i normalanih ili autoimunih seruma. Efekti molekula na proizvodnju citokina se mere pomoću komercijalno dostupnih reagenasa, kao što su kompleti za uparena antitela od Biolegend (San Diego, CA) za IL-6, IL-8, IL-10, IL-4, IFN-gama, TNF-alfa. Supernanti kulture iz in vitro kulture su sakupljeni na 24, 48 sati, ili u kasnijoj vremenskoj tački, kako bi se utvrdili efekti molekula na proizvodnju citokina. Proizvodnja IFN-alfa je merena korišćenjem, na primer, anti-ljudskih IFN-alfa antitela i reagenasa standardne krive, dostupnih iz PBL interferon izvora (Piscataway, NJ). Sličan set testova se vrši korišćenjem subpopulacija ljudskih limfocita (izolovani monociti, B ćelije, pDC, T ćelije, itd); prečišćeni korišćenjem, na primer, komercijalno dostupnih izolacionih kompleta na osnovi magnetnih dostupnih odz Miltenyi Biotech (Auburn, CA).
[0250] Osim toga, efekat molekula na eksprimiranje receptora za aktivaciju limfocita poput CD5, CD23, CD69, CD80, CD86 i CD25 je procenjena u različitim vremenskim tačkama posle stimulacije. PBMC ili izolovane ćelijske subpopulacije su podvrgnute višebojnoj protočnoj citometrije kako bi se utvrdilo kako ovi molekuli utiču na eksprimiranje različitih receptora povezanih sa aktivacijom imunih ćelija.
[0251] Druga grupa testova će meriti efekte ovih molekula na proliferaciju različitih subpopulacija limfocita in vitro. Ovi testovi će koristiti, npr. CFDA-SE bojenje (Invitrogen, Carlsbad, CA) ljudskih PBMC pre stimulacije. CFSE na 5mM je razblažena 1:3000 u PBS/0,5% BSA sa 10e7-10e8 PBMC ili prečišćenim ćelijskim subsetovima, i reakcije obeležavanja su inkubirane 3-4 minuta na 37°C pre ispiranja nekoliko puta u RPMI/10% FBS radi odstranjivanja zaostalog CFSE. CFSE obeležene ćelije su zatim inkubirane u reakcijama ko-kulture sa različitim stimulansima (TLR ligandi, kostimulatorna antitela, itd) i molekulima tokom 4 dana pre analize ćelijske proliferacije pomoću protočne citometrije koristeći bojomkonjugovanu ćelijsku subpopulaciju specifičnih antitela.
[0252] Efekat ovih molekula na in vitro sazrevanje monocita i DC i makrofage takođe se procenjuje korišćenjem normalnih i pacijentovih PBMC uzoraka.
[0253] Efikasnost hibridnog molekula nukleaze je demonstrirana poređenjem rezultata testa ćelija tretiranih sa ovde obelodanjenim hibridnim molekulom nukleaze sa rezultatima testa ćelija tretiranih kontrolnim formulacijama. Posle tretmana, nivoi različitih prethodno opisanih markera (npr. citokini, receptori na površini ćelija, proliferacije) su generalno poboljšani u efektivnoj molekulom tretiranoj grupi u odnosu na nivoe markera koji su postojali pre tretmana, ili relativnim nivoima merenim u kontrolnoj grupi.
Primer 26: Davanje hibridnog molekula nukleaze sisaru kome je to potrebno.
[0254] Sisari (npr. miševi, pacovi, glodari, ljudi, zamorci) korišćeni su u ispitivanju. Sisarima su dati (npr., intravenski) jedan ili više hibridni molekuli nukleaze koji sadrže jednu ili više sekvencu iz Tabele 2 ili kontrola. U nekim slučajevima molekul je SEQ ID NO: 161, 162 ili 163. U nekim slučajevima molekul uključuje SEQ ID NO: 145 i SEQ ID NO: 149. U nekim slučajevima molekul je SEQ ID NO: 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 166, 167, 169, 170, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, ili 207. Hibridni molekul nukleaze može biti bilo koji od ovde obelodanjenih i bilo koji koji može biti konstruisan sa ovde opisanim sekvencama (pogledati Tabelu 2), npr., uzimanjem domena nukleaze i njegovim povezivanjem za Fc domen; ili, na primer, uzimanjem domena nukleaze i njegovim povezivanjem za Fc domen sa veznik domenom. Različiti veznik domeni (npr., oni opisane ovde) mogu da se koriste za povezivanje Fc domena i/ili domena nukleaze. Na primer, mogu da se koriste veznik domeni dugački 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 ili više aminokiselina. U nekim slučajevima hibridni molekul nukleaze je formulisan kao farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim slučajevima molekul je formulisana kako je opisano u gore navedenom odeljku o farmaceutskim sastavima. Hibridni molekul nukleaze targetira RNKazu i/ili DNKazu.
[0255] Višestruki krugovi doziranja se koriste gde smatraju korisnim. Efekti na IFN-alfa nivoe, nivoe gena za odgovore na IFN-alfa, titre autoantitela, funkcionisanje i patologiju bubrega i/ili nivoe cirkulišućih imunih kompleksa se prate kod sisara. Slična ispitivanja su izvedena sa različitim protokolima lečenja i načinima primene (npr. intramuskularna primena, itd). Efikasnost hibridnog molekula nukleaze je pokazana poređenjem nivoa IFN-alfa, nivoa gena za odgovore na IFN-alfa, titara autoantitela, funkcionisanja i patologije bubrega, i/ili nivoa cirkulišućih imunih kompleksa kod sisara koje su tretirani sa ovde obelodanjenim hibridnim molekulom nukleaze u poređenju sa sisarima koji su tretirani kontrolnim formulacijama.
[0256] U primeru, ljudski pacijent kome je potreban tretman izabran ili identifikovan.
Pacijentu može biti potrebna, na primer, redukcija uzrok ili simptoma SEL. Identifikacija pacijenta može se desiti u kliničkom okruženju, ili negde drugde, na primer, kod kuće pacijenta kroz pacijentovu ličnu upotrebu kompleta za samo-testiranje.
[0257] U nultoj vremenskoj tački, pogodna prva doza hibridnog molekula nukleaze je data pacijentu. Hibridni molekul nukleaze je formulisan kao što je ovde opisano. Nakon određenog vremena posle prve doze, npr., 7 dana, 14 dana i 21 dana, stanje pacijenta se ocenjuje, npr. merenjem nivoa IFN-alfa, nivoa gena za odgovore na IFN-alfa, titara autoantitela, funkcionisanja i patologije bubrega, i/ili nivoa cirkulišućih imunih kompleksa. Ostali relevantni kriterijumi takođe mogu biti mereni. Broj i snaga doza su prilagođeni prema potrebama pacijenta.
[0258] Posle tretmana, pacijentovi nivoi IFN-alfa, nivoi gena za odgovore na IFN-alfa, titri autoantitela, funkcionisanje i patologije bubrega, i/ili nivoi cirkulišućih imunih kompleksa se spuštaju i/ili poboljšavaju u odnosu na nivoe koji su postojali pre tretmana ili u odnosu na nivoe merene kod slično obolelog ali netretiranog/kontrolnog pacijenta.
[0259] U sledećem primeru, pacijent glodar kome je potreban tretman je izabran ili identifikovan. Identifikacija pacijenta se mogu dogoditi u laboratoriji ili drugde.
[0260] U nultoj vremenskoj tački, pogodna prva doza hibridnog molekula nukleaze je data pacijentu. Hibridni molekul nukleaze je formulisan kao što je ovde opisano. Nakon određenog vremena posle prve doze, npr., 7 dana, 14 dana i 21 dana, stanje pacijenta se ocenjuje, npr. merenjem nivoa IFN-alfa, nivoa gena za odgovore na IFN-alfa, titara autoantitela, funkcionisanja i patologije bubrega, i/ili nivoa cirkulišućih imunih kompleksa. Ostali relevantni kriterijumi takođe mogu biti mereni. Broj i snaga doza su prilagođeni prema potrebama pacijenta.
[0261] Posle tretmana, pacijentovi nivoi IFN-alfa, nivoi gena za odgovore na IFN-alfa, titri autoantitela, funkcionisanje i patologije bubrega, i/ili nivoi cirkulišućih imunih kompleksa se spuštaju i/ili poboljšavaju u odnosu na nivoe koji su postojali pre tretmana ili u odnosu na nivoe merene kod slično obolelog ali netretiranog/kontrolnog pacijenta.
TABELE
[0262]
TABELA 2
SPISAK SEKVENCI
[0263]
<110> UNIVERSITY OF WASHINGTON
<120> SASTAVI I POSTUPCI TERAPEUTSKE NUKLEAZE <130> 27067-17583 PCT
<140> PCT/US10/55131
<141> 2010-11-02
<150> 61/370,752
<151> 2010-08-04
<150> 61/257,458
<151> 2009-11-02
<160> 223
<170> PatentIn verzija 3.5
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 1
gttaagcttg ccaccatggg tctggagaag tccctcattc tg 42 <210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 2
gataccaccg gtagggaatc tgcagcacag aagtttcag 39 <210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 3
ggctcgagca cagtagcatc aaagtggact ggtacgtagg 40 <210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički oligonukleotid <400> 4
aaatctagac ctcaaccagg tagggaatct gcagcacaga agtttcag 48 <210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički oligonukleotid <400> 5
tctagactat cacacagtag catcaaagtg gactggtacg tag 43 <210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 6
tgtccaccgt gtccagcacc tgaactcctg ggtggatcgt cagtcttcc 49 <210> 7
<211> 49
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer agatctcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgt ccaccgtgt 49 <210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 8
tctagattat catttacccg gagacagaga gaggctcttc tgcgtgtagt g 51 <210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 9
cctccatgca aatgcccagc acctaacctc ttgggtggat catccgtctt catcttcc 58 <210> 10
<211> 45
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 10
gaagatctcg agcccagagg tcccacaatc aagccctctc ctcca 45 <210> 11
<211> 48
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 11
gtttctagat tatcatttac ccggagtccg agagaagctc ttagtcgt 48 <211> 49
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 12
agatctcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgt ccaccgtgt 49 <210> 13
<211> 39
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 13
gttttctcga tggaggctgg gagggctttg ttggagacc 39
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 14
aaggtctcca acaaagccct cccagcctcc atcgagaaaa caatctcc 48 <210> 15
<211> 51
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 15
tctagattat catttacccg gagacagaga gaggctcttc tgcgtgtagt g 51 <210> 16
<211> 31
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 16
accggtaagg aatcccgggc caagaaattc c 31 <210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 17
ctcgagatct gtagagtcct ccacagaagc atcaaagtgg 40 <210> 18
<211> 33
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 18
agactgccgc ctgacaaacg actccaggta ccc 33 <210> 19
<211> 33
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 19
gggtacctgg agtcgtttgt caggcggcag tct 33 <210> 20
<211> 37
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 20
accggtatgg gctcacagac cctgccccat ggtcaca 37 <210> 21
<211> 43
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 21
ctcgagatct gttgttccag tggtagccgg agtgccgtac atg 43 <210> 22
<211> 45
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 22
gttaagcttg ccaccatgtc cctgcaccca gcttccccac gcctg 45 <210> 23
<211> 44
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 23
ctcgagatct gaggagcgat tgcctttttt tctctttttg agag 44 <210> 24
<211> 42
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer accggtctaa ggctctgctc cttcaatgtg aggtcctttg ga 42 <210> 25
<211> 44
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 25
ctcgagatct gaggagcgat tgcctttttt tctctttttg agag 44 <210> 26
<211> 36
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 26
gttaccggtc tgaagatcgc agccttcaac atccag 36 <210> 27
<211> 39
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 27
gttctcgaga tctttcagca tcacctccac tggatagtg 39 <210> 28
<211> 36
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 28
gttgatatcc tgaagatcgc agccttcaac atccag 36 <211> 42
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 29
gtttctagat tatcacttca gcatcacctc cactggatag tg 42 <210> 30
<211> 49
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 30
tgtccaccgt gtccagcacc tgaactcctg ggtggatcgt cagtcttcc 49 <210> 31
<211> 49
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 31
agatctcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgt ccaccgtgt 49 <210> 32
<211> 42
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 32
gaagatctcg agcccaaatc ttctgacaaa actcacacat gt 42 <210> 33
<211> 43
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 33
gttagatctc gagcccaaat cttctgacaa aactcacaca tct 43 <210> 34
<211> 51
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 34
tctagattat catttacccg gagacagaga gaggctcttc tgcgtgtagt g 51 <210> 35
<211> 48
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 35
aaggtctcca acaaagccct cccagcctcc atcgagaaaa caatctcc 48 <210> 36
<211> 39
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 36
gttttctcga tggaggctgg gagggctttg ttggagacc 39
<210> 37
<211> 43
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 37
aagcttgcca ccatggctct ggagaagtct cttgtccggc tcc 43 <210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 38
ctcgagatct gtagagtcct ccacagaagc atcaaagtgg 40 <210> 39
<211> 31
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 39
accggtaagg aatcccgggc caagaaattc c 31
<210> 40
<211> 45
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 40
gatatccctt ccctgggcaa ggaatcccgg gccaagaaat tccag 45 <210> 41
<211> 45
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer gtttctagat tattaggtag agtcctccac agaagcatca aagtg 45 <210> 42
<211> 45
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 42
ggtaagcttg ccaccatgtc acgggagctg gccccactgc tgctt 45 <210> 43
<211> 42
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 43
ctcgagatct gaggagcgtt tgctctttgt tttcttcctt ag 42 <210> 44
<211> 41
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 44
accggtatga ggatctgctc cttcaacgtc aggtcctttg g 41 <210> 45
<211> 36
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 45
gttaccggtc tgaagatcgc agccttcaac atccag 36 <211> 39
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 46
gttctcgaga tctttcagca tcacctccac tggatagtg 39
<210> 47
<211> 36
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 47
gttgatatcc tgaagatcgc agccttcaac atccag 36
<210> 48
<211> 42
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 48
gtttctagat tatcacttca gcatcacctc cactggatag tg 42
<210> 49
<211> 60
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 49
gatggctgcg agccctgcag gaacgacacc ttcaaccgag agccattcat tgtcaggttc 60 <210> 50
<211> 60
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 50
gaacctgaca atgaatggct ctcggttgaa ggtgtcgttc ctgcagggct cgcagccatc 60 <210> 51
<211> 39
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 51
ggagaagaac ctgacaatga atggctctcg gttgaaggt 39
<210> 52
<211> 39
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 52
accttcaacc gagagccatt cattgtcagg ttcttctcc 39
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 53
accggtatgg gccctggagc tcgcagacag ggcag 35
<210> 54
<211> 34
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 54
ctcgagatct ttggtcctag cagaggctgt gacc 34 <210> 55
<211> 37
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 55
accggtctcg agatgggccc tggagctcgc agacagg 37 <210> 56
<211> 31
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 56
ctcgagtttg gtcctagcag aggctgtgac c 31 <210> 57
<211> 37
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 57
accggtatgg gctcacagac cctgccccat ggtcaca 37 <210> 58
<211> 43
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer ctcgagatct gttgttccag tggtagccgg agtgccgtac atg 43 <210> 59
<211> 45
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 59
gttaagcttg ccaccatgtc cctgcaccca gcttccccac gcctg 45 <210> 60
<211> 44
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 60
ctcgagatct gaggagcgat tgcctttttt tctctttttg agag 44 <210> 61
<211> 42
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 61
gttaagcttg ccaccatggg tctggagaag tccctcattc tg 42 <210> 62
<211> 40
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 62
ggctcgagca cagtagcatc aaagtggact ggtacgtagg 40 <211> 58
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 63
cctccatgca aatgcccagc acctaacctc ttgggtggat catccgtctt catcttcc 58 <210> 64
<211> 53
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 64
agatctcgag cccagaggtc ccacaatcaa gccctctcct ccatgcaaat gcc 53 <210> 65
<211> 45
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 65
gaagatctcg agcccagagg tcccacaatc aagccctctc ctcca 45 <210> 66
<211> 39
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 66
atcaagccct ctcctccatc taaatcccca gcacctaac 39
<210> 67
<211> 57
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 67
agtggcaagg agttcaaatg ctcggtcaag aagaaagacc tcccagcgtc catcgag 57 <210> 68
<211> 55
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 68
ggttctctcg atggacgctg ggaggtcttt gttgttgacc gagcatttga actcc 55 <210> 69
<211> 48
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 69
gtttctagat tatcatttac ccggagtccg agagaagctc ttagtcgt 48
<210> 70
<211> 37
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 70
gctagctccg tcgactttac ccggagacag agagagg 37
<210> 71
<211> 51
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 71
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc tcggtctcca acaaagccct c 51 <210> 72
<211> 51
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 72
gagggctttg ttggagaccg agcacttgta agacttgcca ttcagccagt c 51 <210> 73
<211> 45
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 73
ccgcgggagg agcagtacag cagcacgtac cgtgtggtca gcgtc 45 <210> 74
<211> 45
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 74
gacgctgacc acacggtacg tgctgctgta ctgctcctcc cgcgg 45 <210> 75
<211> 45
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
gatatctcta gatttacccg gagtccgaga gaagctctta gtcgt 45 <210> 76
<211> 47
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 76
gatatctccg gagtcgactt tacccggagt ccgagagaag ctcttag 47 <210> 77
<211> 44
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 77
cacaaaccca tagagaggat tacagcagta ctctccgggt ggtc 44 <210> 78
<211> 44
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 78
gaccacccgg agagtactgc tgtaatcctc tctatgggtt tgag 44 <210> 79
<400> 79
000
<210> 80
<211> 51
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 80
gatatcaccg gtagaaccac ctccaccact cccacctcct ccagtgcctc c 51 <210> 81
<211> 50
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 81
gtcgactccg gaggaggtgg ctcaggtggt ggaggcagtg gaggaggtgg 50 <210> 82
<211> 48
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 82
aaagtcgacg gagctagcag ccccgtgaac gtgagcagcc ccagcgtg 48 <210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 83
cccatgatat cctgcacgct ggggctgctc 30
<210> 84
<211> 41
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 84
accggtatga ggatctgctc cttcaacgtc aggtcctttg g 41 <210> 85
<211> 42
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 85
agatctttat caggagcgtt tgctctttgt tttcttcctt ag 42 <210> 86
<211> 44
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 86
tctagattat caggagcgat tgcctttttt tctctttttg agag 44 <210> 87
<211> 42
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 87
accggtctaa ggctctgctc cttcaatgtg aggtcctttg ga 42 <210> 88
<211> 39
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer <400> 88
gataccaccg gtagggaatc tgcagcacag aagtttcag 39 <210> 89
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 89
aaatctagac ctcaaccagg tagggaatct gcagcacaga agtttcag 48 <210> 90
<211> 42
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 90
tctagactat cacacagtag catcaaagtg gactggtacg ta 42 <210> 91
<211> 33
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 91
agactgccgc ctgacaaacg actccaggta ccc 33
<210> 92
<211> 33
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 92
gggtacctgg agtcgtttgt caggcggcag tct 33
<210> 93
<211> 52
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 93
ggctcaggtg gtggaggatc tggaggaggt ggctcaggtg gtggaggatc tg 52 <210> 94
<211> 46
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 94
gttagatctc tccggaggag gtggctcagg tggtggagga tctgga 46 <210> 95
<211> 46
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 95
ctcgagactc ccacctcctc cagatcctcc accacctgag ccacct 46 <210> 96
<211> 50
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 96
aaagatctct ccggaggagg tggctcaggt ggtggaggat ctggaggagg 50 <210> 97
<211> 50
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 97
ctcgagaccg gtagaaccac ctccaccact cccacctcct ccagatcctc 50 <210> 98
<211> 28
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 98
gttagatctc tccggaggag gtggctca 28
<210> 99
<211> 32
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički prajmer
<400> 99
accggtctcg agactcccac ctcctccaga tc 32
<210> 100
<211> 82
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički oligonukleotid <400> 100
<210> 101
<211> 97
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički oligonukleotid
<210> 102
<211> 91
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički oligonukleotid <400> 102
<210> 103
<211> 462
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 103
<210> 104
<211> 798
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 104
<210> 106 <211> 798
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 106
<210> 107
<211> 795
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 107
<210> 109 <211> 795 <212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 109
<211> 858
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 111
<210> 114
<211> 1162
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 114
<211> 2004
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <220>
<221> modified_base
<222> (1921)..(1921)
<223> a, c, t, g, nepoznato ili drugo
<400> 115
<211> 2004
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 116
<211> 2004
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid
<210> 118
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 118
<210> 119
<211> 1569
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 119
<210> 120
<211> 1641
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 120
<210> 121
<211> 1656
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 121
<210> 122
<211> 1650
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 122
<210> 123
<211> 1569
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 123
<210> 124
<211> 1173
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 124
<210> 125
<211> 1245
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 125
<211> 1254
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 126
<211> 1173
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 127
<211> 945
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 128
<211> 735
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 129
<210> 130
<211> 1593
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 130
<211> 1596
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 131
<211> 57
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički oligonukleotid
<400> 132
gtcgacggcg cggccgccag ccccgtgaac gtgagcagcc ccagcgtgca ggatatc 57 <210> 133
<211> 2328
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid
<211> 1749
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 134
<211> 1758
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 135
<211> 27
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid <400> 136
<210> 137
<211> 32
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 137
<210> 138
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 138
<210> 139
<211> 262
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 139
<211> 262
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 140
<211> 262
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 141
<211> 265
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 142
<211> 265
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 143
<211> 265
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 144
<211> 234
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 145
<211> 150
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 146
<211> 280
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 147
<211> 305
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 148
<211> 152
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 149
<211> 378
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 150
<211> 660
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <220>
<221> MOD_RES
<222> (637)..(637)
<223> Bilo koja amino kiselina
<400> 151
<211> 660
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid
<211> 660
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 153
<211> 514
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 154
<211> 514
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 155
<211> 538
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 156
<211> 543 <212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 157
<211> 541
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 158
<211> 514
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 159
<211> 382
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 160
<211> 406
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 161
<211> 409
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 162
<211> 382
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 163
<211> 314
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 164
<211> 245 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 165
<211> 519
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid
<211> 524
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 167
<211> 19
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid <400> 168
<210> 169
<211> 768
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 169
<211> 573
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 170
<211> 578 <212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 171
<211> 2091
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 172
<211> 688
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 173
<211> 1185
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 174
<211> 386
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 175
<211> 2106
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 176
<211> 693
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 177
<211> 2100
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 178
<211> 691
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 179
<211> 2019
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 180
<211> 664
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 181
<211> 1652
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 182
<211> 541
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 183
<211> 1667
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <220>
<221> modified_base
<222> (826)..(826)
<223> a, c, t, g, nepoznato ili drugo
<220>
<221> modified_base
<222> (832)..(832)
<223> a, c, t, g, nepoznato ili drugo
<400> 184
<211> 546
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <220>
<221> MOD_RES
<222> (270)..(270)
<223> Bilo koja amino kiselina
<220>
<221> MOD_RES
<222> (272)..(272)
<223> Bilo koja amino kiselina <400> 185
<211> 2094
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 186
<211> 689
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 187
<211> 1620
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 188
<211> 532
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 189
<211> 1692
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 190
<211> 556
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 191
<211> 2199
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 192
<211> 725
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 193
<211> 2115
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 194
<211> 697
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 195
<211> 2166
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 196
<211> 713
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 197
<211> 2154
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 198
<211> 709
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 199
<211> 2586
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 200
<211> 853
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 201
<211> 2583
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <220>
<221> modified_base
<222> (2500)..(2500)
<223> a, c, t, g, nepoznato ili drugo
<400> 202
<211> 853
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <220>
<221> MOD_RES
<222> (830)..(830)
<223> Bilo koja amino kiselina
<400> 203
<211> 2190
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid
<211> 721
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 205
<211> 2589
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <400> 206
<211> 854
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 207
<211> 25
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> Ova sekvenca može da obuhvata 0 do 5 "GGGGS" ponavljajućih jedinica <400> 208
<210> 209
<211> 25
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid
<400> 209
<210> 210
<211> 50
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(50)
<223> Ova sekvenca može da obuhvata 1 do 10 "GGGGS" ponavljajućih jedinica <400> 210
<210> 211
<211> 15
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid
<400> 211
<210> 212
<211> 20
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid
<400> 212
<211> 5
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid
<400> 213
<210> 214
<211> 51
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(51)
<223> Ova regija može da obuhvata 1 do 10 "GGGGS" ponavljajućih jedinica <400> 214
<210> 215
<211> 16
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid
<400> 215
<211> 21
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid
<400> 216
<210> 217
<211> 31
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(31)
<223> Ova regija može da obuhvata 1 do 6 "GGGGS" ponavljajućih jedinica <400> 217
<210> 218
<211> 25
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> Ova sekvenca može da obuhvata 3 do 5 "GGGGS" ponavljajućih jedinica <400> 218
<210> 219
<211> 25
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> Ova sekvenca može da obuhvata 1 do 5 "GGGGS" ponavljajućih jedinica <400> 219
<210> 220
<211> 18
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički oligonukleotid
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> Ova sekvenca može da obuhvata 1 do 12 ponavljajućih "t" nukleotida <400> 220
tttttttttt tttttttt 18
<210> 221
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički peptid <400> 221
<210> 222
<211> 1177
<212> DNA
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polinukleotid <220>
<221> CDS
<222> (16)..(1164)
<400> 222
<211> 383
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<223> Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid <400> 223

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Polipeptid koji obuhvata RNKazu i varijantu Fc domena, gde je RNKaza operativno spojena, opciono sa veznikom za varijantu Fc domena, gde je varijanta Fc domena varijanta ljudskog IgG1 Fc domena koji obuhvata aminokiselinsku supstituciju koja smanjuje vezivanje, u poređenju sa divljim tipom, za Fcγ receptor ili komplementarnim proteinom ili oba, gde polipeptid ima redukovanu efektorsku funkciju opciono izabranu iz grupe koju čine opsonizacija, fagocitoza, citotoksičnost zavisna od komplemenata i ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela.
2. Polipeptid patentnog zahteva 1 gde:
(a) RNKaza je ljudska RNKaza, kao što je ljudska RNKaza 1 pankreasa; i/ili
(b) Fc domen obuhvata zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen; i/ili
(c) je liderska sekvenca, kao što je ljudski VK3LP peptid, uparena za N-terminus RNKaze.
3. Polipeptid patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, gde:
(a) Fc domen obuhvata modifikovan zglobni domen koji obuhvata barem jednu supstituciju, opciono gde modifikovan zglobni domen obuhvata mutacije u jednom ili više od tri zglobna cisteina, kao što su SCC ili SSS; i/ili
(b) gde Fc domen obuhvata modifikovan CH2 domen koji obuhvata barem jednu supstituciju, opciono gde je supstitucija izabrana iz grupe koju čine P238S, P331S, N297S ili njihova kombinacija.
4. Polipeptid patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, gde
(a) RNKaza obuhvata aminokiselinu sekvenca barem 90% identičnu aminokiselinskoj sekvenci datoj u SEQ ID NO:149 opciono bez svoje liderske sekvence, ili obuhvata 100 ili više susednih aminokiselina od SEQ ID No.149; i/ili
(b) Fc domen obuhvata aminokiselinsku sekvencu barem 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ili 98% identičnu aminokiselinskoj sekvenci datoj u SEQ ID NO:145, opciono obuhvata modifikovan zglobni domen koji obuhvata barem jednu supstituciju, opciono gde modifikovan zglobni domen obuhvata mutaciju na jednom ili više od tri zglobna cisteina, kao što su SCC ili SSS; i/ili opciono koji obuhvata jednu ili više Fc mutacija izabranih od P238S, P331S, K322S, i N279S.
5. Polipeptid patentnog zahteva 1, gde:
polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu barem 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ili 98% identičnu aminokiselinskoj sekvenci datoj u SEQ ID NO:163, opciono bez svoje liderske sekvence; ili
polipeptid obuhvata aminokiselinsku sekvencu barem 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ili 98% identičnu aminokiselinskoj sekvenci datoj u SEQ ID NO:161, opciono bez svoje liderske sekvence;
opciono gde Fc domen obuhvata modifikovan zglobni domen koji obuhvata barem jednu supstituciju, opciono gde modifikovan zglobni domen obuhvata mutaciju na jednom ili više od svoja tri zglobna cisteina, kao što su SCC ili SSS; i/ili modifikovan CH2 domen koji obuhvata barem jednu supstituciju izabranu iz grupe koju čine P238S, P331S, N297S ili njihova kombinacija.
6. Polipeptid bilo kog prethodnog patentnog zahteva, gde:
je RNKaza operativno vezana za Fc domen putem veznik domena, opciono gde je veznik domen polipeptidni veznik, kao što je gly-ser veznik; i/ili
gde je RNKaza operativno vezana za N-terminus Fc domena, opciono sa veznikom; i/ili gde je RNKaza operativno vezana za C-terminus Fc domena, opciono sa veznikom; i/ili gde polipeptid obuhvata ljudsku VK3LP peptid lidersku sekvencu vezanu N-terminus RNKaze.
7. Sastav koji obuhvata polipeptid prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu i farmaceutski prihvatljiv nosač.
8. Molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 6.
9. Rekombinantni vektor eksprimiranja koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 8.
10. Ćelija domaćin transformisana sa rekombinantnim vektorom za eksprimiranje prema patentnom zahtevu 9.
11. Postupak pravljenja polipeptida prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 6, koji obuhvata: obezbeđivanje ćelije domaćina koja obuhvata sekvencu nukleinske kiselina koja kodira polipeptid; i održavanje ćelije domaćina pod uslovima pod kojima se polipeptid eksprimira.
12. Polipeptid prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 6 za primenu u postupku za tretiranje ili prevenciju stanja povezanog sa abnormalnim imunim odgovorom;
opciono gde je stanje autoimuno oboljenje, opciono sistemski lupus eritematozus (SLE), ili opciono izabrano iz grupe koju čine insulin-zavisni dijabetes melitus, multipla skleroza, eksperimentalni autoimuni encefalomijelitis, reumatoidni artritis, eksperimentalni autoimuni artritis, mijastenija gravis, tiroiditis, eksperimentalni oblik uveoretinitisa, Hašimotov tiroiditis, primarna mikoedema, tirotoksikoza, perniciozna anemija, autoimuni atrofični gastritis, Adisonova bolest, prevremena menopauza, neplodnost muškaraca, juvenilni dijabetes, Gudpasterov sindrom, pemfigus vulgaris, pemfigoid, simpatetička oftalmija, fakogeni uveitis, autoimuna hemolitička anemija, idiopatska leukopenija, primarna žučna ciroza, aktivni hronični hepatitis Hbs-ve, kriptogena ciroza, ulcerativni kolitis, Sjogrenov sindrom, skleroderm, Vegnerova granulomatoza, polimiozitis, dermatomiozitis, diskoidni LE, sistemski lupus eritematozus (SLE) i bolest vezivnog tkiva.
13. Dimerni polipeptid koji obuhvata polipeptid prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 6, opciono homodimer.
14. Sastav koji obuhvata dimerni polipeptid patentnog zahteva 13 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.
15. Polipeptid prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 6, sastav prema patentnom zahtevu 7, dimerni polipeptid prema patentnom zahtevu 13 ili sastav prema patentnom zahtevu 14, za primenu u postupku tretmana sistemskog lupus eritematozusa (SLE).
RS20170510A 2009-11-02 2010-11-02 Sastavi i postupci terapeutske nukleaze RS55989B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US25745809P 2009-11-02 2009-11-02
US37075210P 2010-08-04 2010-08-04
PCT/US2010/055131 WO2011053982A2 (en) 2009-11-02 2010-11-02 Therapeutic nuclease compositions and methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55989B1 true RS55989B1 (sr) 2017-09-29

Family

ID=43923071

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170510A RS55989B1 (sr) 2009-11-02 2010-11-02 Sastavi i postupci terapeutske nukleaze

Country Status (25)

Country Link
US (10) US20130089546A1 (sr)
EP (3) EP3460056B1 (sr)
JP (7) JP6199033B2 (sr)
KR (5) KR102624939B1 (sr)
CN (3) CN106399276B (sr)
AU (4) AU2010313103B2 (sr)
BR (1) BR112012010202A2 (sr)
CA (2) CA3091939A1 (sr)
CY (3) CY1119166T1 (sr)
DK (3) DK3202898T3 (sr)
ES (2) ES2626000T3 (sr)
HR (2) HRP20170757T1 (sr)
HU (2) HUE041426T2 (sr)
IL (4) IL297588A (sr)
LT (3) LT3202898T (sr)
MX (3) MX341084B (sr)
NZ (1) NZ813794A (sr)
PL (2) PL2496691T3 (sr)
PT (2) PT2496691T (sr)
RS (1) RS55989B1 (sr)
SG (3) SG10201912573YA (sr)
SI (3) SI2496691T1 (sr)
SM (1) SMT201700248T1 (sr)
WO (1) WO2011053982A2 (sr)
ZA (3) ZA201705246B (sr)

Families Citing this family (75)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3202898T3 (en) 2009-11-02 2019-01-14 Univ Washington THERAPEUTIC NUCLEASE COMPOSITIONS AND PROCEDURES
PH12013502441B1 (en) * 2011-04-29 2019-02-08 Univ Washington Therapeutic nuclease compositions and methods
WO2013066438A2 (en) 2011-07-22 2013-05-10 President And Fellows Of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
FR2983212A1 (fr) * 2011-11-28 2013-05-31 Lfb Biotechnologies Aptameres anti-fh, procede pour leur obtention et utilisations
US9603906B2 (en) 2012-02-01 2017-03-28 Protalix Ltd. Inhalable liquid formulations of DNase I
WO2014152955A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Apelin fusion proteins and uses thereof
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
SI3063275T1 (sl) 2013-10-31 2020-02-28 Resolve Therapeutics, Llc Terapevtske fuzije nukleaza-albumin in postopki
CN106459995B (zh) 2013-11-07 2020-02-21 爱迪塔斯医药有限公司 使用统治型gRNA的CRISPR相关方法和组合物
WO2015077491A1 (en) 2013-11-20 2015-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aplnr modulators and uses thereof
US20150166984A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 President And Fellows Of Harvard College Methods for correcting alpha-antitrypsin point mutations
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
WO2016069889A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-06 Resolve Therapeutics, Llc Therapeutic nuclease-transferrin fusions and methods
SG10202104041PA (en) 2015-10-23 2021-06-29 Harvard College Nucleobase editors and uses thereof
AU2017290389B2 (en) 2016-07-01 2024-09-26 Resolve Therapeutics, Llc Optimized binuclease fusions and methods
KR20250103795A (ko) 2016-08-03 2025-07-07 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
US11661590B2 (en) 2016-08-09 2023-05-30 President And Fellows Of Harvard College Programmable CAS9-recombinase fusion proteins and uses thereof
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
SG11201903089RA (en) 2016-10-14 2019-05-30 Harvard College Aav delivery of nucleobase editors
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
EP3351263A1 (en) 2017-01-20 2018-07-25 Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf Pharmaceutical preparation for treating or preventing tissue adhesion
EP3592381A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cancer vaccine
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
WO2018165629A1 (en) 2017-03-10 2018-09-13 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018176009A1 (en) 2017-03-23 2018-09-27 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins
JP6263298B1 (ja) * 2017-05-09 2018-01-17 東京瓦斯株式会社 検針データの処理システム、その処理プログラム、その処理装置、その処理方法、およびガスメータ
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
ES3008982T3 (en) 2017-08-18 2025-03-25 Neutrolis Inc Engineered dnase enzymes and use in therapy
US10947295B2 (en) 2017-08-22 2021-03-16 Sanabio, Llc Heterodimers of soluble interferon receptors and uses thereof
EP3676376B1 (en) 2017-08-30 2025-01-15 President and Fellows of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
WO2019118949A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
KR20250133482A (ko) 2018-05-11 2025-09-05 빔 테라퓨틱스, 인크. 프로그래밍가능한 염기 편집기 시스템을 이용하여 단일 뉴클레오티드 다형성을 편집하는 방법
US12157760B2 (en) 2018-05-23 2024-12-03 The Broad Institute, Inc. Base editors and uses thereof
EP3820495A4 (en) 2018-07-09 2022-07-20 The Broad Institute Inc. RNA-PROGRAMMABLE EPIGENETIC RNA MODIFIERS AND THEIR USES
CN112805379B (zh) 2018-08-03 2024-08-20 比姆医疗股份有限公司 多效应核碱基编辑器和使用其修饰核酸靶序列的方法
US10988746B2 (en) 2018-10-08 2021-04-27 Neutrolis, Inc. Manufacturing and engineering of DNASE enzymes for therapy
EP3864147A4 (en) 2018-10-08 2022-07-06 Neutrolis, Inc. MANIPULATION OF DNASE ENZYMES FOR MANUFACTURE AND THERAPY
US11058724B2 (en) 2018-10-08 2021-07-13 Neutrolis, Inc. Methods of using DNASE1-like 3 in therapy
WO2020092453A1 (en) 2018-10-29 2020-05-07 The Broad Institute, Inc. Nucleobase editors comprising geocas9 and uses thereof
WO2020102659A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 The Broad Institute, Inc. G-to-t base editors and uses thereof
JP7499257B2 (ja) * 2019-01-04 2024-06-13 リゾルブ セラピューティクス， エルエルシー ヌクレアーゼ融合タンパク質によるシェーグレン病の処置
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
US11352613B2 (en) 2019-02-04 2022-06-07 Neutrolis, Inc. Engineered human extracellular DNASE enzymes
WO2020181202A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to t:a base editing through adenine deamination and oxidation
WO2020181195A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenine excision
WO2020181193A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through adenosine methylation
WO2020181178A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. T:a to a:t base editing through thymine alkylation
WO2020181180A1 (en) 2019-03-06 2020-09-10 The Broad Institute, Inc. A:t to c:g base editors and uses thereof
EP3942043A2 (en) 2019-03-19 2022-01-26 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for editing nucleotide sequences
WO2020214842A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
WO2021030666A1 (en) 2019-08-15 2021-02-18 The Broad Institute, Inc. Base editing by transglycosylation
US12435330B2 (en) 2019-10-10 2025-10-07 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for prime editing RNA
US20230086199A1 (en) 2019-11-26 2023-03-23 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for evaluating cas9-independent off-target editing of nucleic acids
CN115066494A (zh) * 2020-01-11 2022-09-16 耶鲁大学 用于治疗、改善、和/或预防由DNAse1和/或DNAse1L3缺陷引起或与之相关的疾病或障碍的组合物和方法
EP4100519A2 (en) 2020-02-05 2022-12-14 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors and uses thereof
EP3881862A1 (de) * 2020-03-18 2021-09-22 Pharis Biotec GmbH Polypeptid zur therapie von glomerulären nierenerkrankungen und analyse des verlaufes und prognose der abhängigen syndrome
WO2021222318A1 (en) 2020-04-28 2021-11-04 The Broad Institute, Inc. Targeted base editing of the ush2a gene
BR112022022603A2 (pt) 2020-05-08 2023-01-17 Broad Inst Inc Métodos e composições para edição simultânea de ambas as fitas de sequência alvo de nucleotídeos de fita dupla
AU2021288567A1 (en) * 2020-06-08 2023-02-09 Yale University Compositions and methods for treating and/or preventing coagulopathy and/or sepsis in patients suffering from bacterial and/or viral infections
EP4171614A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Resolve Therapeutics, LLC Treatment of sjogren's syndrome with nuclease fusion proteins
US12336973B2 (en) 2020-09-25 2025-06-24 Providence Health & Services—Oregon Cancer therapeutic compositions and methods targeting DNAse1L3
AU2022224584A1 (en) * 2021-02-19 2023-09-21 Theripion, Inc. Paraoxonase fusion polypeptides and related compositions and methods
WO2022178307A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Beam Therapeutics Inc. Recombinant rabies viruses for gene therapy
CA3230629A1 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Beam Therapeutics Inc. Viral guide rna delivery
EP4573191A1 (en) 2022-08-16 2025-06-25 The Broad Institute, Inc. Evolved cytosine deaminases and methods of editing dna using same
EP4652271A1 (en) 2023-01-18 2025-11-26 The Broad Institute, Inc. Base editing-mediated readthrough of premature termination codons (bert)
WO2025147696A1 (en) 2024-01-05 2025-07-10 Resolve Therapeutics, Llc Treatment of symptoms associated with sars-cov viral infection or a prior sars-cov viral infection with nuclease agents
US12416020B2 (en) * 2024-02-20 2025-09-16 Wyvern Pharmaceuticals Inc. Plasmid encoding a TLR3 and Fc fusion protein
WO2026072421A2 (en) 2024-09-27 2026-04-02 The Broad Institute, Inc. Base editing methods and compositions for editing prnp in the treatment of prion disease

Family Cites Families (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3941763A (en) 1975-03-28 1976-03-02 American Home Products Corporation PGlu-D-Met-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 and intermediates
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4615885A (en) 1983-11-01 1986-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing urokinase
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5453269A (en) * 1986-04-14 1995-09-26 The General Hospital Corporation Heterobifunctional antibodies having dual specificity for fibrin and thrombolylic agents and methods of use
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5559212A (en) 1988-04-06 1996-09-24 Alfacell Corporation Frog embryo and egg-derived tumor cell anti-proliferation protein
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5840840A (en) 1990-04-17 1998-11-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selective RNase cytotoxic reagents
AU653937B2 (en) 1991-04-17 1994-10-20 Medisup International N.V. Water-soluble polypeptides having high affinity for interferons alpha and beta
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US5470582A (en) 1992-02-07 1995-11-28 Syntex (U.S.A.) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous polymeric microparticles
GB9300686D0 (en) 1993-01-15 1993-03-03 Imp Cancer Res Tech Compounds for targeting
US20030108548A1 (en) 1993-06-01 2003-06-12 Bluestone Jeffrey A. Methods and materials for modulation of the immunosuppressive activity and toxicity of monoclonal antibodies
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6348343B2 (en) 1995-02-24 2002-02-19 Genentech, Inc. Human DNase I variants
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
WO1997014719A1 (en) * 1995-10-16 1997-04-24 Unilever N.V. A bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6482626B2 (en) 1996-02-05 2002-11-19 Genentech, Inc. Human DNase
US6716974B1 (en) * 1996-05-31 2004-04-06 Maine Medical Center Research Institute Therapeutic and diagnostic methods and compositions based on jagged/notch proteins and nucleic acids
US6391607B1 (en) 1996-06-14 2002-05-21 Genentech, Inc. Human DNase I hyperactive variants
WO1998005787A1 (en) 1996-08-02 1998-02-12 Bristol-Myers Squibb Company A method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
US7247302B1 (en) 1996-08-02 2007-07-24 Bristol-Myers Squibb Company Method for inhibiting immunoglobulin-induced toxicity resulting from the use of immunoglobulins in therapy and in vivo diagnosis
WO1998016254A1 (en) 1996-10-17 1998-04-23 Immunomedics, Inc. Non-antigenic toxin-conjugate and fusion protein of internalizing receptor system
US6653104B2 (en) 1996-10-17 2003-11-25 Immunomedics, Inc. Immunotoxins, comprising an internalizing antibody, directed against malignant and normal cells
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
US6956108B2 (en) 1997-06-16 2005-10-18 Genentech, Inc. PRO1184 antibodies
US20020192659A1 (en) 1997-09-17 2002-12-19 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6280991B1 (en) 1997-10-15 2001-08-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Engineered cytotoxic ribonclease
US5840296A (en) 1997-10-15 1998-11-24 Raines; Ronald T. Engineered cytotoxic ribonuclease A
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
IL138608A0 (en) 1998-04-02 2001-10-31 Genentech Inc Antibody variants and fragments thereof
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
US6239257B1 (en) 1998-12-30 2001-05-29 Alfacell Corporation Family of proteins belonging to the pancreatic ribonuclease a superfamily
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR100940380B1 (ko) 1999-01-15 2010-02-02 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
IL147270A0 (en) 1999-07-02 2002-08-14 Genentech Inc Fusion peptides comprising a peptide ligand domain and a multimerization domain
US6175003B1 (en) 1999-09-10 2001-01-16 Alfacell Corporation Nucleic acids encoding ribonucleases and methods of making them
EP1246643A4 (en) 1999-10-14 2005-05-11 Jeffery A Ledbetter DNA VACCINES ENCODING ANTIGEN ASSOCIATED WITH CD40-BINDING DOMAIN
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
JP4336498B2 (ja) 2000-12-12 2009-09-30 メディミューン，エルエルシー 延長した半減期を有する分子ならびにその組成物および用途
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
KR20030091978A (ko) 2001-01-29 2003-12-03 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션 변형된 항체 및 사용 방법
WO2002096948A2 (en) 2001-01-29 2002-12-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
HUP0303428A2 (hu) 2001-03-07 2004-01-28 Merck Patent Gmbh. Expressziós eljárás hibrid izotípusú antitestcsoportot tartalmazó fehérjékhez
JP4586310B2 (ja) 2001-07-04 2010-11-24 株式会社Ihi セラミックス複合部材の製造方法
US20060040262A1 (en) 2002-12-27 2006-02-23 Morris David W Novel compositions and methods in cancer
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
US7662925B2 (en) 2002-03-01 2010-02-16 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2003209446B2 (en) 2002-03-01 2008-09-25 Immunomedics, Inc. Bispecific antibody point mutations for enhancing rate of clearance
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
AU2003276711A1 (en) 2002-06-14 2003-12-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Ribonuclease zymogen design
WO2004016750A2 (en) 2002-08-14 2004-02-26 Macrogenics, Inc. FcϜRIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
WO2004029207A2 (en) * 2002-09-27 2004-04-08 Xencor Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
US20060235208A1 (en) 2002-09-27 2006-10-19 Xencor, Inc. Fc variants with optimized properties
WO2004035752A2 (en) 2002-10-15 2004-04-29 Protein Design Labs, Inc. ALTERATION OF FcRn BINDING AFFINITIES OR SERUM HALF-LIVES OF ANTIBODIES BY MUTAGENESIS
EP1578367A4 (en) 2002-11-01 2012-05-02 Genentech Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE TREATMENT OF IMMUNE DISEASES
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
EP2368578A1 (en) 2003-01-09 2011-09-28 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US7067298B2 (en) 2003-03-31 2006-06-27 Ambion, Inc. Compositions and methods of using a synthetic Dnase I
US7666417B2 (en) * 2003-04-22 2010-02-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Methods and compositions for treating autoimmune diseases or conditions
US7754209B2 (en) * 2003-07-26 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals Binding constructs and methods for use thereof
CN1871259A (zh) 2003-08-22 2006-11-29 比奥根艾迪克Ma公司 具有改变的效应物功能的经改进的抗体和制备它的方法
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
PT1692182E (pt) 2003-11-05 2010-05-13 Roche Glycart Ag Anticorpos de cd20 com uma afinidade de ligação acrescida ao receptor fc e uma função efectora acrescida
WO2005063815A2 (en) 2003-11-12 2005-07-14 Biogen Idec Ma Inc. Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto
EP2385069A3 (en) 2003-11-12 2012-05-30 Biogen Idec MA Inc. Neonatal Fc rReceptor (FcRn)- binding polypeptide variants, dimeric Fc binding proteins and methods related thereto
WO2005077981A2 (en) 2003-12-22 2005-08-25 Xencor, Inc. Fc POLYPEPTIDES WITH NOVEL Fc LIGAND BINDING SITES
BRPI0417916A (pt) 2003-12-31 2007-04-10 Merck Patent Gmbh proteìna de fusão de fc-eritropoietina com farmacocinética melhorada
EP1706424B1 (en) 2004-01-12 2009-07-22 Applied Molecular Evolution, Inc. Fc region variants
AU2005214361B2 (en) 2004-02-13 2011-03-24 Immunomedics, Inc. Fusion proteins containing recombinant cytotoxic RNAses
WO2005092925A2 (en) 2004-03-24 2005-10-06 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
JP2008505853A (ja) 2004-04-13 2008-02-28 クインテセンス バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド 細胞傷害性薬剤としての非天然のリボヌクレアーゼ複合体
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
EP3342782B1 (en) 2004-07-15 2022-08-17 Xencor, Inc. Optimized fc variants
CA2578613A1 (en) 2004-08-11 2007-01-25 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain fusion proteins
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
DE102005009219A1 (de) 2005-02-25 2006-08-31 Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg Ribonuclease-Tandemenzyme und Verfahren zu ihrer Herstellung
WO2006104989A2 (en) 2005-03-29 2006-10-05 Verenium Corporation Altered antibody fc regions and uses thereof
JP2008539753A (ja) 2005-05-09 2008-11-20 グリクアート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 修飾ｆｃ領域およびｆｃ受容体との結合変更を有する抗原結合分子
ATE485379T1 (de) 2005-06-16 2010-11-15 Wisconsin Alumni Res Found Zytotoxische ribonukleasevarianten
EP1896579A2 (en) 2005-06-16 2008-03-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Cytotoxic ribonuclease variants
US20080279850A1 (en) 2005-07-25 2008-11-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. B-Cell Reduction Using CD37-Specific and CD20-Specific Binding Molecules
EP2295080A3 (en) 2005-07-25 2011-06-22 Emergent Product Development Seattle, LLC B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules
JP4860702B2 (ja) 2005-10-21 2012-01-25 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー ポリペプチドのリコンビナント発現のための方法
JP2009538273A (ja) 2006-04-14 2009-11-05 トルビオン ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 改造されたＦＣエフェクター機能を持つ、免疫グロブリン・ヒンジ領域とＦｃ領域とを備える結合タンパク質
US20100015661A1 (en) 2006-04-21 2010-01-21 Mab-Factory Gmbh Antibody-rnase-conjugate
GB0611444D0 (en) * 2006-06-09 2006-07-19 Medical Res Council Technology Rnase H2 complex and genes therefor
CN105837690A (zh) 2006-06-12 2016-08-10 新兴产品开发西雅图有限公司 具有效应功能的单链多价结合蛋白
EP1905841A1 (en) * 2006-09-25 2008-04-02 Max Delbrück Centrum für Molekulare Medizin (MDC) Berlin-Buch; Trex1 as a marker for lupus erythematosus
CA2682605A1 (en) 2007-04-18 2008-10-30 Zymogenetics, Inc. Single chain fc, methods of making and methods of treatment
WO2008150485A2 (en) * 2007-05-29 2008-12-11 Wyeth Erbb2 binding proteins and use thereof
CN101842389A (zh) 2007-06-12 2010-09-22 惠氏有限责任公司 抗cd20治疗组合物和方法
CN101990439A (zh) 2007-07-06 2011-03-23 特鲁比昂药品公司 具有置于c末端的特异性结合结构域的结合肽
WO2009015345A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions comprising fc fusion proteins
CA2720628A1 (en) 2007-07-26 2009-01-29 Novagen Holding Corporation Fusion proteins having mutated immunoglobulin hinge region
CA2705542A1 (en) * 2007-11-13 2009-05-22 Sapphire Energy, Inc. Production of fc-fusion polypeptides in eukaryotic algae
PT2132228E (pt) 2008-04-11 2011-10-11 Emergent Product Dev Seattle Imunoterapia de cd37 e sua combinação com um quimioterápico bifuncional
AU2009296393A1 (en) 2008-09-26 2010-04-01 Genentech, Inc. Methods for treating, diagnosing, and monitoring lupus
CN102227443B (zh) 2008-10-01 2014-05-14 昆特森斯生物科学公司 治疗性核糖核酸酶
DK3202898T3 (en) 2009-11-02 2019-01-14 Univ Washington THERAPEUTIC NUCLEASE COMPOSITIONS AND PROCEDURES
TWI529163B (zh) 2011-01-25 2016-04-11 陶氏農業科學公司 用於製備４－胺基－５－氟－３－鹵素－６－（經取代之）吡啶甲酸酯的方法
JP2014506482A (ja) 2011-02-23 2014-03-17 アムジエン・インコーポレーテツド Ｕｖｃ露光のための細胞培養培地およびそれに関連した方法
BR112013021785A8 (pt) 2011-02-25 2018-07-03 Recombinetics Inc animais geneticamente modificados e métodos para fazer os mesmos
US8642752B2 (en) 2011-04-21 2014-02-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of Hepatitis B virus (HBV) expression
PH12013502441B1 (en) 2011-04-29 2019-02-08 Univ Washington Therapeutic nuclease compositions and methods
US20140178479A1 (en) 2011-08-12 2014-06-26 Perosphere, Inc. Concentrated Felbamate Formulations for Parenteral Administration
WO2013180295A1 (ja) 2012-06-01 2013-12-05 日本電信電話株式会社 パケット転送処理方法およびパケット転送処理装置
SI3063275T1 (sl) 2013-10-31 2020-02-28 Resolve Therapeutics, Llc Terapevtske fuzije nukleaza-albumin in postopki
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof
AU2017290389B2 (en) 2016-07-01 2024-09-26 Resolve Therapeutics, Llc Optimized binuclease fusions and methods
JP6349003B1 (ja) 2017-03-17 2018-06-27 東洋ビーネット株式会社 耐熱性ルシフェラーゼ

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201705246B (en) 2018-09-26
CN102770533A (zh) 2012-11-07
CA3091939A1 (en) 2011-05-05
AU2016202135B2 (en) 2017-11-30
SG10201912573YA (en) 2020-02-27
PT3202898T (pt) 2018-12-28
SI3202898T1 (sl) 2019-04-30
SG10201406801XA (en) 2014-11-27
NZ774435A (en) 2024-08-30
KR102624939B1 (ko) 2024-01-16
ES2702053T3 (es) 2019-02-27
HUE032166T2 (en) 2017-09-28
US20180187174A1 (en) 2018-07-05
CN106399276B (zh) 2021-08-10
EP3460056B1 (en) 2020-08-19
JP2018087224A (ja) 2018-06-07
KR20190002735A (ko) 2019-01-08
AU2018201071B2 (en) 2020-01-23
AU2010313103A1 (en) 2012-05-31
US8841416B2 (en) 2014-09-23
KR101934923B1 (ko) 2019-04-10
EP3202898B1 (en) 2018-09-26
AU2010313103B2 (en) 2016-01-07
SI3460056T1 (sl) 2021-04-30
US20140227269A1 (en) 2014-08-14
KR20120112446A (ko) 2012-10-11
US20260035680A1 (en) 2026-02-05
IL297588A (en) 2022-12-01
IL274309A (en) 2020-06-30
EP2496691A2 (en) 2012-09-12
JP7081935B2 (ja) 2022-06-07
DK3202898T3 (en) 2019-01-14
US20130089546A1 (en) 2013-04-11
IL263180B (en) 2020-05-31
SI2496691T1 (sl) 2017-07-31
US20120225066A1 (en) 2012-09-06
KR102118584B1 (ko) 2020-06-05
US12435322B2 (en) 2025-10-07
CY1119166T1 (el) 2018-02-14
LT3202898T (lt) 2019-01-25
DK3460056T3 (da) 2020-11-09
CA2779615C (en) 2023-03-14
WO2011053982A2 (en) 2011-05-05
MX2012005062A (es) 2012-11-29
US20230057085A1 (en) 2023-02-23
KR20200063266A (ko) 2020-06-04
PT2496691T (pt) 2017-05-31
KR20240007725A (ko) 2024-01-16
US20130177561A1 (en) 2013-07-11
IL219475A0 (en) 2012-06-28
JP2013509201A (ja) 2013-03-14
EP2496691B1 (en) 2017-02-22
CN102770533B (zh) 2016-11-23
JP2021006026A (ja) 2021-01-21
US20130184334A1 (en) 2013-07-18
KR20220038546A (ko) 2022-03-28
CN113528485A (zh) 2021-10-22
LT3460056T (lt) 2020-12-28
AU2020202688A1 (en) 2020-05-14
US11306297B2 (en) 2022-04-19
IL274309B (en) 2022-12-01
WO2011053982A3 (en) 2011-06-23
KR102378465B1 (ko) 2022-03-28
MX2018013333A (es) 2020-11-12
IL263180A (en) 2018-12-31
SG10201912571XA (en) 2020-02-27
HRP20182102T1 (hr) 2019-02-08
AU2018201071A1 (en) 2018-03-08
JP2023075185A (ja) 2023-05-30
EP2496691A4 (en) 2013-07-24
ZA201805962B (en) 2019-11-27
US20130183308A1 (en) 2013-07-18
CN113528485B (zh) 2025-06-27
JP7657249B2 (ja) 2025-04-04
WO2011053982A8 (en) 2011-09-15
US20150037871A1 (en) 2015-02-05
DK2496691T3 (en) 2017-06-06
JP2021007390A (ja) 2021-01-28
CY1123684T1 (el) 2022-03-24
NZ813794A (en) 2025-11-28
CA2779615A1 (en) 2011-05-05
MX341084B (es) 2016-08-05
IL274309B2 (en) 2023-04-01
BR112012010202A2 (pt) 2015-09-22
JP7237045B2 (ja) 2023-03-10
EP3202898A1 (en) 2017-08-09
JP2025041849A (ja) 2025-03-26
CY1121220T1 (el) 2020-05-29
US9790479B2 (en) 2017-10-17
PL3202898T3 (pl) 2019-04-30
ZA202005216B (en) 2020-11-25
CN106399276A (zh) 2017-02-15
HUE041426T2 (hu) 2019-05-28
HRP20170757T1 (hr) 2017-07-28
ES2626000T3 (es) 2017-07-21
JP6199033B2 (ja) 2017-09-20
JP2016174604A (ja) 2016-10-06
EP3460056A1 (en) 2019-03-27
AU2020202688B2 (en) 2022-12-22
LT2496691T (lt) 2017-06-12
PL2496691T3 (pl) 2017-09-29
SMT201700248T1 (it) 2017-07-18
MX360465B (es) 2018-11-01
AU2016202135A1 (en) 2016-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12435322B2 (en) Therapeutic nuclease compositions and methods
AU2023201735B2 (en) Therapeutic Nuclease Compositions and Methods
AU2013203097B2 (en) Therapeutic nuclease compositions and methods
HK1173660B (en) Therapeutic nuclease compositions and methods
HK1173660A (en) Therapeutic nuclease compositions and methods
HK40006279A (en) Therapeutic nuclease compositions and methods
HK40006279B (en) Therapeutic nuclease compositions and methods
HK1242370B (en) Therapeutic nuclease compositions and methods
HK1242370A1 (en) Therapeutic nuclease compositions and methods