RS56443B1 - Ddl3 modulatori i postupci primene - Google Patents

Ddl3 modulatori i postupci primene

Info

Publication number
RS56443B1
RS56443B1 RS20171006A RSP20171006A RS56443B1 RS 56443 B1 RS56443 B1 RS 56443B1 RS 20171006 A RS20171006 A RS 20171006A RS P20171006 A RSP20171006 A RS P20171006A RS 56443 B1 RS56443 B1 RS 56443B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
dll3
residues
cdr
Prior art date
Application number
RS20171006A
Other languages
English (en)
Inventor
Robert A Stull
Laura Saunders
Scott J Dylla
Orit Foord
David Liu
Michael Torgov
Hui Shao
Original Assignee
Abbvie Stemcentrx Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47790544&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS56443(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Abbvie Stemcentrx Llc filed Critical Abbvie Stemcentrx Llc
Publication of RS56443B1 publication Critical patent/RS56443B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/55—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole
    • A61K31/551—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having seven-membered rings, e.g. azelastine, pentylenetetrazole having two nitrogen atoms, e.g. dilazep
    • A61K31/5513—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine
    • A61K31/5517—1,4-Benzodiazepines, e.g. diazepam or clozapine condensed with five-membered rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. imidazobenzodiazepines, triazolam
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68035—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a pyrrolobenzodiazepine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6807—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug or compound being a sugar, nucleoside, nucleotide, nucleic acid, e.g. RNA antisense
    • A61K47/6809—Antibiotics, e.g. antitumor antibiotics anthracyclins, adriamycin, doxorubicin or daunomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6813—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin the drug being a peptidic cytokine, e.g. an interleukin or interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6819—Plant toxins
    • A61K47/6825—Ribosomal inhibitory proteins, i.e. RIP-I or RIP-II, e.g. Pap, gelonin or dianthin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A61K47/6829—Bacterial toxins, e.g. diphteria toxins or Pseudomonas exotoxin A
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6843—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6855—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from breast cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6857—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from lung cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6861—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from kidney or bladder cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6865—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from skin, nerves or brain cancer cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6867—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of a blood cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A61K47/6869—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from a cell of the reproductive system: ovaria, uterus, testes, prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A61K51/1093—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies
    • A61K51/1096—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody conjugates with carriers being antibodies radioimmunotoxins, i.e. conjugates being structurally as defined in A61K51/1093, and including a radioactive nucleus for use in radiotherapeutic applications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D487/16—Peri-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3023—Lung
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5752—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the lungs
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • G01N33/5759—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites involving compounds localised on the membrane of tumour or cancer cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/626—Diabody or triabody
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Description

Oblast tehnike
Ova prijava se uopšteno odnosi na nova jedinjenja, kompozicije i postupke njihove primene u dijagnostikovanju, prevenciji, lečenju ili amelioraciji proliferativnih poremećaja i njihovo bilo kakvo širenje, vraćanje ili metastaza. U širem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na primenu delta-sličnih ligand 3 (DLL3) modulatora, uključujući anti-DLL3 antitela i fuzione konstrukcije, za lečenje, dijagnozu ili profilaksu neuroplastičnih poremećaja. Izabrani primeri predmetnog pronalaska obezbeđuju primenu takvih DLL3 modulatora, uključujući konjugate antitelo lek, za imunoterapeutsko lečenje malignosti poželjno koji obuhvataju smanjenje u frekvenciji ćelija koje iniciraju tumor.
Stanje tehnike
Matična i progenitorna ćelijska diferencijacija i ćelijska proliferacija su normalni tekući procesi koji deluju u dogovoru da podrže rast tkiva tokom organogeneze i ćelijske zamene i popravke većine tkiva tokom životnog veka svih živih organizama. U normalnom toku događaja ćelijska diferencijacija i proliferacija je kontrolisana velikim brojem faktora i signala koji su uopšteno balansirani da održe odluku o sudbini ćelije i arhitekturi tkiva. Stoga, u velikoj meri to je kontrolisano mikrookruženje koje reguliše podelu ćelije i sazrevanje tkiva tamo gde su signali pravilno generisani na osnovu potrebe organizma. U tom pogledu, ćelijska proliferacija i diferencijacija normalno se dešava samo kao neophodnost za zamenu oštećenih ili umirućih ćelija ili za rast. Nažalost, prekid ćelijske proliferacije i/ili diferencijacije može rezultovati iz bezbroj faktora koji uključuju, na primer nedovoljno ili preterano razne signalne hemikalije, prisustvo izmenjenih mikrookruženja, genetske mutacije ili neke njihove kombinacije. Kada je normalna ćelijska proliferacija i/ili diferencijacija poremećena ili nekako prekinuta može da vodi do raznih oboljenja ili poremećaja koji uključuju proliferativne poremećaje kao što je kancer.
Uobičajeno lečenje za kancer uključuje hemoterapiju, radioterapiju, operaciju, imunoterapiju (npr., modifikatori biloškog odgovora, vakcine ili ciljani terapeutici) ili njihove kombinacije. Nažalost, neki kanceri daju minimalan ili nikakav odgovor na takvo lečenje. Na primer, kod nekih pacijenata tumori pokazuju genske mutacije koje ih čini neodgovarajućim uprkos opštoj efikasnosti odabranih terapija. ýak štaviše, u zavisnosti od vrste kancera i koji oblik uzima neki doprinose do refraktornih tumora koji se često manifestuju kao relativno agresivno oboljenje koje na kraju dokazuje da je ne izlečivo. Iako postoji veliki napredak u dijagnostikovanju i lečenju kancera tokom godina, ukupna stopa preživljavanja za mnoge čvrste tumore je ostala u velikoj meri nepromenjena usled neuspeha postojećih terapija da spreče povraćaj tumora i metastaze. Stoga, ostaje izazov da se razvije više ciljana i moćna terapija za proliferativne poremećaje. WO 2011/093097 se odnosi na anti-DLL3 antitelo. Anti-kancer agens koji sadrži antitelo je obezbeđen.
Kratak opis pronalaska
Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.
Ovi i drugi ciljevi su predviđeni ovim predmetnim pronalaskom koji, u širem smislu, je usmeren na postupke, jedinjenja, kompozicije i proizvode proizvodnje koji mogu da se koriste u lečenju DLL3 povezanih oboljenja (npr., proliferativni poremećaji ili neoplastični poremećaji). U tom cilju, predmetni pronalazak obezbeđuje nove Delta-slične ligand 3 (ili DLL3) modulatore koji efikasno ciljaju ćelije tumora i/ili matične ćelije kancera i mogu se koristiti za lečenje pacijenata koji pate od širokog spektra malignosti. Kao što će biti otkiveno u više detalja ovde, postoje najmanje dva DLL3 izooblika ili varijante koje se javljaju u prirodi i otkriveni modulatori se mogu selektivno uključiti ili pridružiti sa, jednim izooblikom ili drugim ili sa oba. Štaviše, u izvesnim rešenjima otkriveni DLL3 modulatori mogu dalje da reaguju sa jednim ili više članova DLL familije (npr., DLL1 ili DLL4) ili, u drugim rešenjima, mogu da budu generisana i odabrana tako da se ekskluzivno udružuju ili reaguju sa jednim ili više DLL3 izooblika. U svakom slučaju modulatori mogu da obuhvate bilo koje jedinjenje koje prepoznaje, ispunjava, agonizuje, antagonizuje, uzajamno deluje, vezuje ili povezuje sa DLL3 genotipskom ili fenotipskom determinantom (ili njihovi fragmenti) i moduliraju, podešavaju, prepravlja, reguliše, manja ili modifikuje impakt DLL3 proteina na jedan ili više fizioloških putanja i/ili eliminiše DLL3 povezane ćelije. Stoga, u širem smislu predmetni pronalazak je uopšteno usmeren na izolovane DLL3 modulatore i njihovu primenu. U poželjnom primeru pronalazak je prvenstveno usmeren na izolovane DLL3 modulatore koji sadrže antitela (odn. antitela koji imunopreferencijalno vezuju, reaguju sa ili povezuju sa bar jednim izooblikom DLL3) koji, u naročito povoljnom primeru, su povezani ili konjugovani za jedan ili više citotoksičnih agenasa. ýak štaviše, kao što je diskutovano u više detalja u nastavku, takvi modulatori mogu da se koriste kako bi se obezbedile farmaceutske kompozicije korisne za profilaksu, dijagnozu ili lečenje proliferativnih poremećaja koji uključuju kancer.
U odabranim primerima pronalaska, DLL3 modulatori mogu sadržati DLL3 polipeptid ili njegove fragmente, ili u izolovanom obliku ili spojen ili povezan sa drugim ostacima (npr., Fc-DLL3, PEG-DLL3 ili DLL3 povezan sa ciljanim ostatkom). U drugim odabranim primerima DLL3 modulatori mogu sadržati DLL3 antagoniste koji, za svrhu trenutne prijeve, će se smatrati bilo kojom konstrukcijom ili jedinjenjem koje prepoznaje, ogleda se, muđusobno deluju, vezuju ili povezuju sa DLL3 i neutrališe, eliminiše, smanjuje, čini osetljivijim, ponovo programira, inhibira ili kontroliše rast neoplastičnih ćelija koje obuhvataju ćelije koje iniciraju tumor. U poželjnim primerima DLL3 modulatori predmetnog pronalaska, sadrže anti-DLL3 antitela, ili njihove fragmente ili derivate, koji su neočekivano pronađeni da utišavaju, neutrališu, umanjuju, smanjuju, iscrpljuju, ublažuju, smanjuju, ponovo programiraju, eliminišu, ili drugačije inhibiraju sposobnost ćelija koje iniciraju tumor da se razmnožava, održava, širi, proliferira ili drugačije olakšava opstanak, ponavlja, regeneriše i/ili metastazira neoplastične ćelije. U naročito poželjnim primerima antitela ili imunoreaktivni fragmenti mogu biti povezani sa, ili konjugovani sa, jednim ili više anti-kancer agenasa (npr., citotoksični agens).
U pogledu na takve modulatore biće prihvaćena da kompatibilna antitela mogu da preuzmu bilo koji broj oblika koji uključuju, na primer, poliklonalna i monoklonalna antitela, himerna, CDR graftovana, humanizovana i humana antitela i imunoreaktivni fragmenti i/ili varijante svakog od prethodnog. Poželjna rešenja će sadržati antitela koja su relativno neimunogenska kao što su humanizovani ili potpuno humani konstruktori. Naravno, u pogledu predmetnog pronalaska stručna lica u odgovarajućoj oblasti će lako identifikovati jedan ili više komplementarnih određenih regiona (CDRs) povezani sa teškim i lakim lancima varijabilnih regiona DLL3 antitelnih modulatora i primena takvih CDRs u inženjerskim ili fabričkim himernim, humanizovanim ili CDR graftovanim antitelima bez nepotrebnog eksperimentisanja. Prema tome, u izvesnim poželjnim primerima DLL3 modulator sadrži antitelo koje inkorporira jedan ili više komplementarnih određenih regiona (CDRs) kao što je definisano na FIGS.11A i 11B i izvedeni iz lakog (FIG.11A) ili teškog (FIG.11B) graničnog lanca murinskih varijabilnih regiona (SEQ ID NOS: 20-203) postavljeni u njoj. Takvi CDR graftovani varijabilni regioni su takođe prikazani na FIG.11 koji sadrži SEQ ID NOS: 204-213. U poželjnim primerima takva antitela će sadržati monoklonalna antitela i, u čak još više poželjnijim primerima, će sadržati himerna, CDR graftovana ili humanizovana antitela.
Primerne sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju svaku amino kiselinu sekvenci postavljeni na FIGS.11A i 11B su priložene ovde u sekvencnoj listi i sadrži SEQ ID NOS: 220 do 413, u tom pogledu biće zahvalno da pronalazak dalje obuhvata molekule nukleinske kiseline (i povezane konstruktore, vektore i ćelije domaćina) koje kodiraju otkriveni antitelni varijabilni region amino kiselinskih sekvenci koje uključuju one postavljene u priloženoj sekvencnoj listi. Naročito u odabranim primerima kompatibilni DLL3 modulatori mogu sadržati antitelo koje ima laki lanac varijabilnog regiona i teški lanac varijabilnog regiona gde navedeni laki lanac varijabilnog regiona amino kiselinske sekvence ima najmanje 60% identiteta u amino kiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci postavljene u SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID "NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO; 76, SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO; 116, SEQ ID NO: 318, SEQ ID NO; 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO; 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO; 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140. SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 1,50, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 1.64, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO; 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 i SEQ ID NO: 202 i gde navedeni teški lanac varijabilnog regiona obuhvata amino kiselinsku sekvencu koja ima 60% identiteta u animo kiselinskoj sekvenci odabranu iz grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci postavljene u SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ E) NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113 , SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO; 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SBQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO; 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 i SEQ ID NO: 203. U drugim poželjnim primerima odabrani modulatori će sadržati terški i laki lanac varijabilnih regiona koji obuhvataju 65, 70, 75 ili 80% identiteta u prethodno navedenim murinskim sekvencama. U ipak drugim primerima, modulatori će sadržati terški i laki lanac varijabilnih regiona koji obuhvataju 85, 90 ili čak 95% identiteta u otkrivenim murinskim sekvencama.
U drugim poželjnim primerima odabrani modulatori će sadržati jedan ili više CDRs dobijeni iz bilo kog prethodno navedenog lakog i taškog lanca varijabilnog regiona amino kiselinskih sekvenci. Prema tome, odabrani primeri pronalaska obuhvataju DLL3 modulator koji sadrži jedan ili više CDRs iz bilo koje SEQ ID NOS: 20 do 203. Ipak u drugim primerima modulatori predmetnog pronalaska će sadržati bilo koje antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment koji se takmiči za vezivanje sa bilo kojim prethodno navedenim modulatorima.
Drugi primer pronalaska sadrži modulatore dobijene ili izvedene iz SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16,26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16,38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.S0, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC 16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.S0, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16,124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC 16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144. SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150. U drugim primerima pronalazak će sadržati DLL3 modulator koji ima jedan ili više CDRs iz bilo kog prethodno navedenih modulatora.
U ipak drugim kompatibilnim primerima predmetni pronalazak će sadržati CDR graftovane ili humanizovane DLL3 modulatore hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 i hSC 16.56. Ipak drugi primeri su usmereni na DLL3 modulator koji obuhvata humanizovano antitelo gde navedeno humanizovano antitelo sadrži laki lanac varijabilnog regiona i teški lanac varijabilnog regiona gde navedeni laki lanac varijabilnog regiona obuhvata amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta u amino kiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je postavljeno u SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210 i SEQ ID NO; 212 i gde navedeni teški lanac varijabilnog regiona obuhvata amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta u amino kiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je postavljeno u SEQ ID NO: 205. SEQ ID NO; 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211 i SEQ ID NO: 213. Osim toga, kao što je opisano odmah gore sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju humanizovane teške i lake lance varijabilnih regiona su postavljene u priloženoj sekvencnoj listi kao SEQ ID NOS: 404 - 413.
Osim gore pomenutih aspekata, drugi poželjni primeri predmetnog pronalaska će obuhvatati DLL3 modulatore povezane ili konjugovane za jedan ili više lekova kako bi obezbedili modulator konjugate koji mogu da budu naročito efikasni u lečenju proliferativnih poremećaja (sam ili u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim agensima). Uopšteno, jednom kada su modilatori pronalaska napravljeni i odabrani oni mogu da budu povezani sa, spojeni za, konjugovani za (npr., kovalentno ili ne kovalentno) ili drugačije povezani sa farmaceutski aktivnim ili dijagnostičkim ostacima ili biokompatibilnim modifikatorima. Kao što je korišćeno ovde termin "konjugovan" ili "modulatorski konjugovan" ili "antitelski konjugovan" će se koristiti široko i podrazumevaće bilo koji biološki aktivni ili uočljiv molekul ili lek povezan sa otkrivenim modulatorima bez obzira na metod udruživanja. U tom pogledu biće shvaćeno da takvi konjugati mogu, u odnosu na otkrivene modulatore, sadržati peptide, polipeptide, proteine, prolekove koji su metabolizovani u aktivni agens in vivo, polimere, molekule nukleinske kiseline, male molekule, vezujuće agense, mimetične agense, sintetičke lekove, neorganske molekule, organske molekule i radioizotope. Čak štaviše, kao što je naznaćeno gore odabrani konjugat može biti kovalentno ili ne-kovalentno povezan sa, ili vezan za, moldulator i pokazuje razne stehiometrijske molarne odnose u zavisnosti, bar delimično, od postupka korišćenog za konjugaciju.
Naročito poželjni aspetci predmetnog pronalaska će obuhvatati konjugatore modulatora antitela ili konjugate anitelo-lek koji mogu da budu korišćeni za dijagnozu i/ili lečenje profilaktičnih poremećaja. Takvi konjugati mogu biti predstavljeni sa formulom M-[L-D]n gde M označava otkriveni modulator ili ciljani vezujući ostatak, L je opciono linker ili vezna jedinica, D je kompatibilni lek ili prolek i n je ceo broj od oko 1 do oko 20. To će se ceniti, dok nije drugačije diktirano kontekstom, termini "konjugat antitelo-lek'' ili "ADC" ili formula M-[L-D]n će obuhvatati konjugate koji sadrže oba terapetske i dijagnostičke ostatke. Tako – na primer konjugat antitelo-lek jedinjenja će obično sadržati anti-DLL3 kao modulatornu jedinicu (M), terapeutski ili dijagnostički ostatak (D), i opciono linker (L) koji povezuje lek i antigenski vezujući agens. U poželjnom primeru, anitelo je DLL3 mAb koji sadrži bar jedan CDR iz teškog i lakog lanca varijabilnih regiona kao što je prethodno opisano.
Kao što je prethodno naznačeno jedan aspekt pronalaska može sadržati neočekivano terapeutsko povezivanje DLL3 polipeptida sa matičnim ćelijama kancera. Stoga, u izvesnim drugim primerima pronalazak će sadržati DLL3 modulator koji smanjuje fekvenciju ćelija koje iniciraju tumor nakon primene na subjekat. Poželjno, smanjenje u frekvenciji će biti određeno korišćenjem in vitro ili in vivo ograničavajuće analize razblaženja. U naročito poželjnim primerima takva analiza može biti sprovedena korišćenjem in vivo ograničavajuće analize razblaženja koja sadrže transplantaciju živih humanih tumornih ćelija u imunokompromizovanim miševa (npr., videti Primer 17 u nastavku). Alternativno, ograničavajuća analiza razblaženja može biti sprovedena korišćenjem in vitro ograničavajuće analize razblaženja koja sadrži ograničeno razblaženje taloga živih humanih ćelija tumora u in vitro koloniji podržavajućih uslova. U svakom slučaju, analiza, kalkulacija ili kvantifikacija redukcije u frekvenciji će poželjno obuhvatati primenu Poisson distribucione statistike kako bi se obezbedilo tačno računanje. Biće prihvaćeno da, iako su takve metode kvantifikacije poželjne, druge, manje radno intenzivne metodologije kao što su protočna citometrija ili imunohistohemija mogu takođe da budu korišćene kako bi se obezbedile željene vrednosti i, prema tome, su izričito razmatrani kao da su u okviru predmetnog pronalaska. U tom slučaju, smanjenje frekvencije može biti određeno korišćenjem protočne citometrijske ili imunohistohemijske detekcije površinskih markera tumorni ćelija poznati da obogaćuju ćelije koje iniciraju tumor.
Kao takav, drugi poželjan primer predmetnog pronalaska obuhvata postupak lečenja DLL3 povezanog poremećaja koji obuhvata primenu terapeutski efikasne količine DLL3 modulatora na subjekat kome je potrebno gde je frekvencija ćelija koje iniciraju tumor smanjena. Poželjno DLL3 povezani poremećaj koji obuhvata neoplastični poremećaj.
Ponovo, smanjenje u frekvenciji ćelija koje iniciraju tumor će poželjno da bude određena korišćenjem in vitro ili in vivo ograničavajuće analize razblaženja.
U pogledu sa tim biće prihvaćeno da je predmetni pronalazak zasnovan, bar delimično, nakon otkrića da su DLL3 imunogeni terapeutski povezani sa tumornim oživljenim ćelijama (odn., matične ćelije kancera) koje su uključene u etiologiju raznih proliferativnih poremećaja ukljućujući neoplaziju. Konkretno, predmetna prijava neočekivano pokazuje da primena raznih primernih DLL3 modulatora može posredovati, smanjivati, trošiti, inhibirati ili eliminisati tumorogensko signaliziranje od strane ćelija koje iniciraju tumor (odn., smanjuju frekvenciju ćelija koje iniciraju tumor). Ovo smanjuje signaliziranje, da li trošenjem, neutralizacijom, redukcijom, eliminacijom, ponovnim programiranjem ili utišivanjem ćelija koje iniciraju tumor ili modifikovanjem morfologije ćelije tumora (npr., indukovana diferencijacija, prekid niše), zauzvrat dozvoljava mnogo efikasnije lečenje DLL3 povezanih poremećaja inhibicijom tumorigeneze, održavanje tumora, širenje i/ili metastaza i vraćanje.
Pored pomenute povezanosti sa matičnim ćelijama karcinoma, postoji dokaz da DLL3 izooblici mogu biti implicirani u rast, vraćanje ili metastatični potencijal tumora koji obuhvataju ili pokazuju neuroendokrinske osobine ili determinante (genotipske- ili fenotipske). Za potrebe ovog pronalaska takvi tumori će sadržati neuroendokrinske tumore i pseudo neuroendokrinske tumore. Intervencije u proliferaciji takvih tumorskih ćelija koristeći nove DLL3 modulatore koji su opisani ovde, mogu prema tome poboljšati ili tretirati poremećaj sa više od jednim mehanizmom (npr., smanjenje ćelije koja inicira tumor i prekid onkogenske putanje signalizacije) kako bi se obezbedio dodatni ili sinergistički efekti. Ipak drugi poželjni primeri mogu preuzeti prednost ćelijske internalizacije ćelijske površine DLL3 proteina kako bi se dostavio modulatorski posredovani anti-kancerni agens. U tom pogledu biće povezano da predmetni pronalazak nije ograničen bilo kojim određenim mehanizmom dejstva već rađe obuhvata širu primenu otkrivenih modulatora da leče DLL3 povezane poremećaje (uključujući razne neoplazije).
Stoga, u drugim primerima predmetni pronalazak će obuhvatati primenu otkrivenih modulatora da leče tumore koji sadrže neuroendokrine osobine kod subjekta kome je to potrebno. Naravno, isti modulatori mogu biti korišćeni za profilaksu, prognozu, dijagnozu, teragnozu (kombnacija terapije i dijagnoze), inhibiciju ili održavanje terapije istih tumora.
Druge činjenice predmetnog pronalaska istražuju sposobnost otkrivenih modulatora da potencijalno prekinu onkogenske puteve (npr., Notch) dok istovremeno utišavaju ćelije koje iniciraju tumor. Takvi multiaktivni DLL3 modulatori (npr., DLL3 antagonisti) mogu dokazati da su naročito efikasni kada se koriste u kombinaciji sa standardnim agensima protiv kancera ili agensima za smanjenje zapremine. Stoga, poželjni primeri predmetnog pronalaska obuhvataju primenu otkrivenih modulatora kao anti-metastatični agensi za održavanje terapije koja je praćena početnim lečenjem. Dodatno, dva ili više DLL-3 antagonista (npr. antitela koja se posebno vezuju za dva diskretna epitopa na DLL3) može biti korišćeno u kombinaciji u skladu sa sadašnjim učenjima. Štaviše, kao što je diskutovano detaljno u daljem tekstu, DLL3 modulatori predmetnog pronalaska mogu biti korišćeni u konjugovanom ili ne konjugovanom stanju i, opciono, kao senzibilizući agens u kombinaciji sa raznim hemijskim ili biološkim anti-kancer agensima.
Prema tome, drugi poželjni primer predmetnog pronalaska obuhvata postupak senzibilizacije tumora kod subjekta za lečenje sa anti-kancer agensom koji obuhvata fazu primene DLL3 modulatora na navedeni subjekat. Drugi primeri obuhvataju postupak smanjenja metastaze ili povraćaja tumora praćeno lečenjem koje obuhvata primenu DLL3 modulatora na subjekat kome je to potrebno. U naročito poželjnom primeru pronalaska DLL3 modulator će konkretno rezultovati u smanjenju frekvencije ćelije koja inicira tumor koja je određena korićenjem in vitro ili in vivo ograničavajuće analize razblaženja.
Opšte poželjni primeri pronalaska obuhvataju postupak lečenja DLL3 povezanog poremećaja kod subjekta kome je to potrebno koji obuhvata korak primene DLL3 modulatora na subjekat. U naročito poželjnim primerima DLL3 modulator će biti povezan (npr., konjugovan) sa anti-kancernim agensom. U pak drugim primerima DLL3 modulator će se internalizovati nakon asocijacije ili vezivanja sa DLL3 na ili blizu površine ćelije. Štaviše, korisni aspetci predmetnog pronalaska, ukljućujući bilo kakvo prekidanje signalizacionih puteva i srodne koristi, mogu biti dostignuti da li predmetno tumorsko tkivo pokazuje povišene nivoe DLL3 ili smanjene ili umanjene nivoe DLL3 kada se poredi sa normalnim susednim tkivom. Naročito poželjni primeri će obuhvatati lečenje poremećaja koji pokazuju povećane nivoe DLL3 na tumorskim ćelijama kada se porede sa normalnim tkivom ili netumorskim ćelijama.
U ipak drugom primeru predmetni pronalazak će obuhvatati postupak lečenja subjekta koji pati od neoplastičnog poremećaja koji obuhata fazu primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog internalizovanog DLL3 modulatora. Poželjni primeri će obuhvatati primenu internalizovanih modulatora antitela gde su modulatori konjugovani ili povezani sa citotoksičnim agensom.
Drugi primeri su usmereno na postupak lečenja subjekta koji pati od DLL3 povezanog poremećaja koji obuhvat fazu primene terapeutski efikasne količine od najmanje jednog potrošenog DLL3 modulatora.
U drugom primeru predmetni pronalazak obezbeđuje postupke održavanja terapije gde otkriveni efektori ili modulatori se primenjuju tokom vremenskog perioda praćen početnom procedurom (npr., hemoterapija, zračenje ili operacija) naznačenom da ukloni bar deo mase tumora. Takvi režimi terapeutskog održavanja mogu se primenjivati tokom perioda od nekoliko nedelja, perioda od nekoliko meseci, perioda od nekoliko godina gde DLL3 modulatori mogu da deluju profilaktički kako bi inhibirali metastazu i/ili povraćaj tumora. U ipak drugim primerima otkriveni modulatori se mogu primenjivati u dogovoru sa poznatim režimima smanjenja zapremine kako bi se sprečila ili umanjila metastaza, održavanje ili ponavljanje tumora.
Kao što je prethodno pozivano na DLL3 modulatore predmetni pronalazak može da bude proizveden i/ili odabran kako bi reagovao sa oba izooblika DLL3 ili sa pojedinačnim izooblikom proteina ili, suprotno, može obuhvatati pan-DLL modulator koji reaguje ili povezuje sa bar jednim dodatnim DLL članom porodice u odnosu na DLL3. Naročito, poželjni modulatori kao što su antitela mogu biti generisana i odabrana tako da reaguju sa domenima (ili njihovim epitopima) koji su iskazani samo sa DLL3 ili sa domenima koji su bar donekle očuvani preko više ili svih DLL članova porodice.
Ipak u drugim poželjnim primerima modulatori će se povezivati ili vezivati za određeni epitop, deo, motiv ili domen DLL3. Kao što će se diskutovati u više detalja u nastavku, oba DLL3 izooblika pripajaju identičan ekstraćelijski region (videti FIG.1F) koji sadrži bar N-krajnji domen, DSL (Delta/Serrate/lag-2) domen i šest EGF-sličnih domena (odn., EGF1 -EGF6). Prema tome, u nekim primerima modulatori će se vezivati ili povezivati sa N-krajnjim domenom DLL3 (odn. amino kiselinama 27-175 u zrelom proteinu) dok u drugim odabranim primerima modulatori će se povezivati sa DSL domenom (odn., amino kiseline 176-215) ili njihovim epitopima. Drugi primeri predmetnog pronalaska obuhvataju modulatore koji povezuju ili se vezuju za određen epitop lociran u određenom EGF-sličnom domenu DLL3. U tom pogledu, određeni modulator može se povezivati ili vezivati za epitop lociran na EGF1 (amino kiseline 216-249), EGF2 (amino kiseline 274-310), EGF3 (amino kiseline 312-351), EGF4 (amino kiseline 353-389), EGF5 (amino kiseline 391-427) ili EGP6 (amino kiseline 429-465). Naročito će biti određeno da svaki prethodno navedeni domeni mogu sadržati više od jednog epitopa i/ili više od jednog bina. U naročito poželjnim primerima pronalazak će obuhvatati modulator koji se vezuje, raguje ili povezuje sa DSL domenom ili njegovim epitopom. U drugim poželjnim primerima pronalazak će obuhvatati modulatore koji se vezuju, reaguju ili povezuju sa određenim EGF-sličnim domenom ili njegovim epitopom. U ipak drugim poželjnim primerima modulatori će se vezivati, reagovati ili povezivati sa N-krajnjim domenom ili njegovim epitopom.
U pogledu na modulatorne ili antitelne "binove" ceniće se da DLL3 antigen može da bude analiziran ili mapiran kroz konkurentno vezivanje antitela koristeći poznate tehnike u tehnici kako bi se definisalo određeno ograđeno mesto koje je locirano na ili duž proteina. Dok je ovde detaljnije razmatrano i prikazano u Primerima 9 i 10 u nastavku, dva antitela (od kojih jedan može biti nazvan "referentno antitelo," "ograđeno mesto obeleženog antitela" ili "obeleženo antitelo") mogu se smatrati da su istom ograđenom mestu ukoliko se takmiče jedan sa drugim za vezivanje na ciljani antigen. U takvom slučaju predmetni epitopi antitela mogu biti identični, značajno identični ili dovoljno blizu (ili u linearnom smislu gde su odvojeni sa nekoliko amino kiselina ili konformacijski) tako da oba antitela su statički ili elektrostatički inhibirani ili isključeni iz vezivanja za antigen. Tako definisana ograđena mesta mogu uopšteno da budu povezana sa izvesnim DLL3 domenima (npr. referentno antitelo će se vezati sa epitopom koji je sadržan u određenom domenu) kroz korelaciju koja nije uvek precizna (npr., može da postoji više od jednog ograđenog mesta u domenu ili ograđeno mesto može da bude definisano konformacijski i da sadrži više od jednog domena). Ceniće se da oni obučeni u tehnici mogu lako odrediti odnos između DLL3 domena i empirijskih odreženim graničnih mesta.
U pogledu na predmetni pronalazak analiza konkurentnog vezivanja koja koristi tehnike poznate u tehnici (npr., ELISA, odgovor površinskog plazmona ili interferometrija bio-sloja) definiše najmanje devet različitih ograničenih mesta, od kojih je kod svakog pronađeno da sadrže veći broj modulatora antitela. Za svrhe predmetnog pronalaska devet ograničenih mesta je nazvano bin A do bin I. Stoga, odabrani primeri predmetnog pronalaska će obuhvatati modulator koji se nalaozu u bin odabranom između grupe koja se sastoji od bin A, bin B, bin C, bin D , bin E, bin F, bin G, bin H i bin I. U drugim primerima predmetni pronalazak obuhvata modulator koji se nalazi u definisamom bin-u od strane referentnog antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC 16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC 16.25, SC16.26, SC16.29, SC 16.30, SC16.31, SC16.34, SC 16.35, SC16.36, SC16.38, SC 16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC 16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC 16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.303, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16,107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC 16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC.16.131, SCI6.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150. U ipak drugim primerima pronalazak će obuhvatati modulatore iz bin A, modulatore iz bin B, modulatore iz bin C, modulatore iz bin D, modulatore iz bin E, modulatore iz bin F, modulatore iz bin G, modulatore iz bin H ili modulatore iz bin I. Ipak drugi primeri će obuhvatati referentni modulator antitela i bilo koje antitelo koje se takmiči sa referentnim antitelom.
Termin "takmiči" ili "takmičarsko antitelo" kada se koristi u kontekstu otkrivenih modulatora označava takmičenje u vezivanju između antitela kao što je određeno sa analizom gde referentno antitelo ili imunološki funkcionalni fragment značajno sprečava ili inhibira (npr., veći od 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ili 90%) određeno vezivanje testiranog antitela za uobičajeni antigen. Takmičarski postupci za određivanje takvog takmičenja obuhvataju tehnike dobro poznate u tehnici kao što su, na primer, interferometrija bio-sloja, odgovor površinskog plazmona, protočna citometrija, takmičarski ELISA, itd.
Pored prethodno navedenih modulatora, u odabranim primerima pronalazak obuhvata pan-DLL modulator koji je povezan sa DLL3 i sa bar jednim drugim članom DLL familije. U drugim odabranim primerima pronalazak obuhvata DLL3 modulator koji se imunospecifično vezuje sa jednim ili više izooblika DLL3, ali se ne vezuje imuno specifično sa bilo kojim drugim članom DLL familije. U ipak drugim primerima predmetni pronalazak obuhvata postupak lečenja subjekta kome je to potrebno obuhvatajući primenu terapeutski efikasne količine pan-DLL modulatora. Ipak drugi primeri obuhvataju postupak lečenja subjekta kome je to potrebno obuhvatajući primenu terapeutski efikasne količine DLL3 modulatora koji se imunospecifično vezuje sa jednim ili više izooblika DLL3, ali se ne vezuje imunospecifično za bilo kojim drugim članom DLL familije.
Pored terapeutskih primena koji su diskutovani prethodno, takođe će se ceniti da modulatori predmetnog pronalaska mogu koristiti da detektuju, dijagnostikuju ili klasifikuju DLL3 srodne poremećaje i, prvenstveno, proliferativne poremećaje. Takođe mogu da se koriste u prognozi i/ili teragnozi (kombinacija terapije i dijagnoze) takvih poremećaja. U nekim primerima modulator može da se primenjuje na subjekat i detektuje ili prati in vivo. Stručnjaci u tehnici će ceniti da takvi modulatori mogu biti označeni ili povezani sa efektorima, markerima ili reporterima kao što je otkirveno u nastavku i detektovani korišćenjem bilo kojih mnogobrojnih standardnih tehnika (npr., MRI, CAT scan, PET scan, itd).
Stoga, u nekim primerima pronalazak će obuhvatati postupak dijagnostikovanja, detekcije ili monitoringa DLL3 povezanog poremećaja in vivo kod subjekta kome je to potrebno koji obuhvata korak primene DLL3 modulatora.
U drugim primerima modulatori se mogu koristiti u in vitro dijagnostičkom podešavanju korišćenjem postupaka koji su priznati u tehnici (npr., imunohistohemija ili IHC). Kao takav, poželjni primer obuhvata postupak dijagnostikovanja hiperproliferativnog poremećaja kod subjekta kome je to potrebno koji obuhvata korake:
a. dobijanja uzorka tkiva iz navedenog subjekta;
b. kontakt uzorka tkiva sa bar jednim DLL3 modulatorom; i
c. detektovanje ili kvantifikovanje DLL3 modulatora povezanog sa uzorkom.
Takvi postupci mogu biti lako prepoznatljivi u konjukciji sa predmetnom prijavom i mogu biti lako izvedeni korišćenjem opšte dostupne uobičajene komercijalne tehnologije kao što su automatski čitači ploča, namenski reporterski sistemi, itd. U odabranim primerima DLL3 modulator će biti povezan sa oživljenim ćelijama tumora (odn., matičnim ćelijama kancera) prisutnim u uzorku. U drugim poželjnim primerima korak detekcije ili kvantifikacije će obuhvatati redukciju frekvencije ćelije koja inicira tumor koja se može pratiti kao što je ovde opisano.
Na sličan način predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kitove ili uređaje i povezane postupke koji su korisni u dijagnozi ili monitoringu DLL3 povezanih poremećaja kao što je kancer. Na kraju predmetni pronalazak poželjno obezbeđuje član proizvodnje koristan za detekciju, dijagnozu ili lečenje DLL3 povezanih poremećaja koji obuhvataju posudu koja sadrži DLL3 modulator i uputstvo za korišćenje navedenog DLL3 modulatora za lečenje, monitoring ili dijagnozu DLL3 povezanog poremećaja. U odabranim primerima uređaji povezani postupci će obuhvatati korak koji sadrži bar jednu cirkulacionu ćeliju tumora.
Drugi poželjni primeri takođe iskorišćavaju osobine otkrivenih modulatora kao instrument koristan za identifikovanje, karakterizaciju, izolaciju, sekcionisanje ili obogaćivanje populacija ili podpopulacija ćelija koje iniciraju tumor kroz postupke kao što su imunohistohemija, protočna citometrična analiza koja uključuje sortiranje fluorescentno aktivne ćelije (FACS) ili lasersko posredovano sekcionisanje.
Kao takav, drugi poželjni primer predmetnog otkrića je usmeren na postupak identifikovanja, izolacije, sekcionisanja ili obogaćivanja populacije ćelija koje iniciraju tumor koji obuhvata korak kontaktiranja navedenih ćelija koje iniciraju tumor sa DLL3 modulatorom.
Prethodno pomenuto predstavlja kratak pregled i stoga sadrži, po potrebi, pojednostavljene, generalizovane, i izostavljenje detalja; zbog toga, oni koji su obučeni u tehnici će ceniti da je kratak pregled samo ilustrativan i nema za nameru da bude na bilo koji način ograničen. Drugi aspekti, osobine, i prednosti postupaka, kompozicija i/ili uređaja i/ili drugih predmeta opisani ovde će postati očigledni u setu za obuku koji je postavljen ovde. Kratak pregled je obezbeđen kako bi uveo odabir koncepata u pojednostavljen oblik koji je dalje opisan u nastavku u Detaljnom Opisu. Ovaj kratak pregled nema za nameru da identifikuje glavne karakteristike ili bitne karakteristike zahtevanog predmeta, niti ima za nameru da se koristi kao pomoć u određivanju obima zahtevanog predmeta.
Kratak opis slika
FIGS.1A - 1F su različite reprezentacije DLL3 koje uključuju sekvence nukleinske kiseline ili amino kiseline gde puna dužina mRNKs koje sadrže ORFs (podvučene) kodiraju DLL3 izooblike su prikazane na FIGS.1A i 1B (SEQ ID NOS: 1 i 2), FIGS.1C i 1D obezbeđuju translaciju ORFs označene na FIGS.1A i 1B (SEQ ID NOS: 3 i 4), respektivno, sa podvučenim ostacima koji ukazuju predviđeni transmembranski obuhvaćeni domen za svaki proteinski izooblik, FIG.1E prikazuje poravnanje dva proteinska izooblika kako bi ilustrovali sekvencne razlike u citoplazmičnim krajevima svakog izooblika, ponovo sa podvučenim ostacima koji ukazuju predviđeni transmembrani obuhvaćeni domen i FIG.1F obezbeđuje šematski prikaz ekstraćelijskog regiona DLL3 proteina koji ilustruje pozicije raznih domena; FIGS.2A i 2B tabelarno prikazuju procenat identiteta na proteinskom nivou između DLL3 i drugih Delta-sličnih članova familije u humanom genomu (FIG.2A), ili najbližem humanom izoobliku DLL3 i rhesus majmunskih, mišijih i pacovskih DLL3 proteina (FIG.2B);
FIG.3 šematski ilustruje genetske interakcije između nekoliko "master" gena relevantno prema izboru ćelijske sudbine koja vodi do ili neuroendokrinskih ili ne-neuroendokrinskih fenotipa (strelice ukazuju promociju genske ekspresije, a deblje strelice ukazuju inhibiciju genske ekspresije), gde ekspresija transkripcionog faktora ASCL1 oba inicira gensku kaskadu (otvorena strelica) vodeći do neuroendokrinskog fenotipa dok istovremeno aktivira DLL3, koji zauzvrat susbija NOTCH1 i njegov efektorski HESi, gde su oba normalno odgovorna za suzbijanje ASCL1 i aktivaciju genske kaskade koja vodi do ne-neuroendokrinskog fenotipa;
FIGS.4A i 4B tabelarno (FIG.4A) i grafički (FIG.4B) prikazuju gensku ekspresiju nivoa DLL3 i, na FIG.4A, drugi Notch putevi gena ili gena koji su povezani sa neuroendokrisnskim fenotipom kao što je izmereno korišćenjem celog transkriptomskog (SOLiD) sekvencionisanja RNK izvedenog iz ćelije tumora podpopulacije ili normalnog tkiva;
FIG.5 predstavlja grafički prikaz relativno ekspresionih nivoa DLL3 mRNA transkriptne varijante 1 i 2 kao što je određeno sa celim transkriptomskim (SOLiD) sekvencionisanjem u odabranim ne-tradicionalnim ksenograftnim (NTX) tumorima izvedeni iz kancera pluća; FIGS.6A - 6D pokazuju gensku ekspresiju podataka i grupisanje tumora koji pokazuju neuroendokrinske karakteristike gde FIG.6A prikazuje grupisanje bez nadzora profila mikroniza za 46 tumornih linija i 2 normalna tkiva koji obuhvataju odabrane tumore i normalna kontrolna tkiva. FIGS.6B i 6C tabelarno prikazuju normalizovane vrednosti intenziteta koji odgovaraju relativno ekspresionim nivoima odabranih gena koji se odnose na neuroendokrinske fenotipe (FIG.6B) ili Notch koji signalizuju put (FIG.6C) gde ćelije bez sjaja i relativni niski brojevi ukazuju malo do bez ekspresije i tamne ćelije i relativno viši brojevi ukazuju veće ekspresione nivoe i FIG.6D predstavlja grafički prikaz koji pokazuje relativno ekspresione nivoe HES6 mRNK u raznim tumorima i normalnim tkivima kao što je izmereno korišćenjem qRT-PCR;
FIG.7 predstavlja grafički prikaz koji pokazuje relativne ekspresione nivoe DLL3 transkripta kao što je izmereno sa qRT-PCR u varijaciji RNK uzoraka izolovani iz normalnih tkiva, uglavnom, neplasirani uzorci tumora pacijenata (označeni sa "p0") ili nagomilani NTX tumori izvedeni iz pluća, bubrega i jajnika neoplazije gde su određeni NTX tumori pluća grupisani sa malim ćelijama kancera pluća (SCLC) i ne-malom ćelijom kancera pluća (NSCLC) (označeni sa p1, p2, p3 ili p4 kako bi odbili veći broj prolaza kroz miševe), gde je tumorski tip označen korišćenjem skraćenica koje su prethodno postavljene;
FIGS.8A - 8C predstavljaju grafički prikaz koji pokazuje relativne (FIG.8A) ili apsolutne (FIG.8B) genske ekspresione nivoe humanog DLL3 kao što je izmereno sa qRT-PCR u kompletnim uzorcima tumora (siva tačka) ili odgovaraju normalnom susednom tkivu (NAT; bela tačka) pacijenata sa jednim od osamanaest različitih vrsta čvrstog tumora dok FIG.8C pokazuje relativnu proteinsku ekspresiju humanog DLL3 kao što je izmereno korišćenjem elektrohemiluminiscentnog sendviča ELISA analize;
FIG.9 obezbeđuje grafički prikaz određivanja površine proteinske ekspresije raznih Notch receptora i liganada zasnovani na protočnoj citometriji (npr., DLL1, DLL4) kod pojedinačnih humanih populacija ćelije tumora iz bubrega, jajnika i malih tumorskih ćelija pluća NTX, prikazani kao histogranske parcele (crna linija) upućeno na fluorescenciju minus jedan (FMO) izotop-kontrolna obojena populacija (tamno siva) sa iniciranom srednjom vrednosti fluorescentnih intenziteta (MFI);
FIGS.10A - 10D obezbeđuju, respektivno, cDNK sekvencu (FIG.10A; SEQ ID NO; 5) i sekvencu amino kiseline (FIG.10B; SEQ ID NO; 6) koja kodira zreli murine DLL3 protein kloniran u lentivirusni ekspresioni vektor i cDNK sekvenca (FIG.10C; SEQ ID NO:7) i sekvenca amino kiseline (FIG.10D; SEQ ID NO: 8) koja kodira zreli cynomoigus DLL3 protein kloniran u lentivirusni ekspresioni vektor gde su vektori korišćeni da generišu ćelije koje previše iskazuju murin i cynomoigus DLL3:
FIGS.11A i 11B obezbeđuju, u tabelarnom obliku, kontinuirane sekvence amino kiseline (SEQ ID NOS: 20-213) lakog i teškog lanca varijabilnih regiona većeg broja murinskih i humanizovanih primernih DLL3 modulatora izolovani, klonirani i planirani kao što je opisano u Primerima ovde;
FIG.12 prikazuje četiri biohemijske i imunološke karakteristike primernih DLL3 modulatora kao i njihove sposobnosti da ubiju KDY66 NTX ćeliju in vitro kao što je prikazano u tabelarnom formatu;
FIGS.13A - 13C ilustruju karakteristike vezivanja odabranih modulatora gde FIGS.13A i 13B pokazuju komparativne karakteristike vezivanja odabranog murinskog modlulatora i njegov humanizovani duplikat korišćenjem površinske plazmonske rezonance dok FIG.13C obezbeđuje izvesne osobine humanizovanih konstruktora u tabelarnom obliku;
FIGS.14A i 14B prikazuju, respektivno u šematskom i grafičkom obliku, rezultate analize mapiranja nivoa domena primernih DLL3 modulatora izolovani, klonirani i projektovani kao što je opisano ovde u Primerima (FIG.14A) i koleraciju između vezujućeg domena odabranih modulatora i sposobnosti da ubije DLL3 koji iskazuje KDY66 NTX ćelije in vitro (FIG.14B);
FIGS.15A - 15C su protočni citometrijski histogrami koji pokazuju 014.3 ekspresiju korišćenjem primernog anti-DLL3 modulatora SC16.56 na prirodnim 293 ćelijama (FIG, 15A), 293 ćelija projektovani da previše ekspresuju humane DLL3 proteine (h293-hDLL3; FIG, 15B) ili 293 ćelija projektovani da previše ekspresuju murinski DLL3 protein (h293-mDLL3; FIG.15C);
FIGS.16A - 16F obuhvata protočne citometrijske histograme (FIGS.16A-16C) i imunohistohemijske rezultate u tabelarnom obliku (FIGS.16D-16F) ilustrujući, respektivno, relativno visoku površinsku ekspresiju DLL3 korišćenjem primernog anti-DLL3 modulatora SC16.56 na živim humanim ćelijama iz jajnika (OV26; FIG.16A), bubrega (KDY66; FIG. 16B) i plućne velike ćelije neuroendokrinskog karcinoma (LU37; FIG, 16C) NTX tumora i ekspresiju DLL3 proteina u raznim NTX tumorima (FIG.16D) i primarnoj maloj ćeliji karcinoma (FIG.16F) ćelija tumora dok pokazuje da normalnom tkivu nedostaje DLL3 ekspresija (FIG.16E);
FIGS.17A - 17C ilustruje sposobnost otkrivenih modulatora da efikasno usmeravaju citotoksične korisne sadržaje na ćelije koje ekspresuju DLL3 gde FIG.17A dokumentuje sposobnost primernih modulatora da ubiju KDY66 NTX tumore ili 293 ćelije koje previše ekspresuju hDLL3, a FIG.17B i 17C pokazuju sposobnost otkrivenih modulatora da dostave citotksične korisne sadržaje na OV26 (FIG.17B) i LU37 (FIG.17C) gde nagnuta na dole kriva je indikativna ćelijskom ubijanju kroz internazalni citotoksin;
FIGS.18A - 18E ilustruje razne osobine oktrivenih modulatora gde FIGS.18A i 18C prikazane sa protokom citometrije da DLL3 NSHP KDY66 i nativni KDY66 imaju ekspresiju DLL3 dok ekspresija DLL3 je uspešno srušena u DLL3HP2 KDY66 ćelijama. FIG.18B pokazuje da rast DLL3HP2 ćelija tumora zaostaje u odnosu na nativne KDY66 ćelije u FIGS.
18D i 18B pokazuju da konjugovana rešenja predmetnog pronalaska imunospecifično cilja i ubija KDY66 koji ekspresuje DLL3 ćelije tumora ali ne KDY66 sa DLL3 srušenim;
FIGS.19A - 19C pokazuju sposobnost odabranih konjugovanih primera predmetnog pronalaska da ubiju i/ili potisnu rast primernih plućnih tumorskih ćelija in vivo;
FIGS.20A - 20F prikazuju sposobnost konjugovanih modulatora predmetnog pronalaska da značajno iskorene tumore i spreče vraćanje tumora in vivo – postižući trajne remisije u imunodeficijentnim miševima koji su nakalemljeni sa primernim tumorima jajnika (FIG.20A), pluća (FIGS.20B -20D) i bubrega (FIGS.20E i 20F); i
FIGS.21A - 21F pokazuju da konjugovani modlulatori predmetnog pronalaska smanjuju frekcvenciju matićnih ćelija kancera kao što je određeno analizom ograničenog razblaživanja (LDA) za dva primerna tumora pluća male ćelije LU95 (FIGS.21A - 21C) i LU64 (FIGS.21D - 21F) gde FIGS.21A i 21D pokazuju efekat konjugata na rast tumora, FIGS.21B i 21E pokazuju rezultate LDA i FIGS.21C i 21F grafički predstavljaju redukciju u frekvenciji matičnih ćelija kancera uzrokovano sa lečenjem sa odabranim anti-DLL3 konjugatom antitela.
Detaljan opis pronalaska
I. Uvod
Dok se predmetni pronalazak može izvesti u više različitih oblika, ovde su prikazani njegova određena ilustrativna rešenja koja ilustruju principe pronalaska. Treba da se naglasi da predmetni pronalazak nije ograničen na određena ilustrovana rešenja. ýak štaviše, bilo koji deo poglavlja koji je ovde korišćen je samo za organizacione svrhe i neće biti konstruisan kao ograničenje opisanog predmeta. Na kraju, za svrhe predmetnog pronalaska sve identifikovane sekvence Pristupnih brojeva mogu se pronaći u NCBI Reference Sequence (RefSeq) bazi podataka i/ili NCBI GenBank® arhivi sekvence baze podataka ukoliko nije drugačije naznačeno.
Kao što je prethodno diskutovano iznenađujuće je pronađeno da DLL3 genotipske i/ili fenotipske determinante su povezane sa raznim proliferativnim poremećajima, uključujući neoplaziju koja pokazuje neuroendokrinske karakteristike, i da DLL3 i varijante ili njegovi izooblici obezbeđuju korisne tumorne markere koji mogu biti eksploatisani u lečenju srodnih oboljenja. Povrh toga, kao što je pokazano u predmetnoj prijavi neočekivano je pronađeno da DLL3 markeri ili determinante kao što je ćelijski površinski DLL3 protein su terapeutski povezani sa matičnim ćelijama kancera (takođe poznati kao oživljenje ćelije tumora) i mogu da budu efikasno iskorišćeni za eliminisanje ili utišavanje istog. Sposobnost da selektivno smanji ili eliminiše matične ćelije kancera (npr., kroz primenu konjugovanih DLL3 modulatora) je gotovo iznenađujuće tako da su takve ćelije poznate uopšteno da su otporne na mnoga uobičajena lečenja. To je, efikasnost tradicionalnog, isto kao i skorašnji ciljani postupci lečenja, je često ograničen postojanjem i/ili pojavljivanjem otpornih matičnih ćelija kancera koje su sposobne da aktiviraju rast tumora čak i u prisustvu ovih raznih postupaka lečenja. Dalje, determinante povezane sa matičnim ćelijama kancera često čine slabe terapeutske mete usled niske ili nedosledne ekspresije, neuspeh da ostane povezan sa tumorskom ćelijom ili neuspeh da bude prisutan na površini ćelije. U oštrom kontrastu sa Xčenjima iz stanja tehnike, trenutna otkrivena jedinjenja i postupci efikasno prevazilaze ovu naslednu otpornost i naročito eliminišu, troše, utišavaju ili promovišu diferenciju takvih matičnih ćelija kancera time negirajući njihovu spsobnost da sudrže ili smanje navedeni rast tumora. ýak štaviše, kao ekspresija DLL3 protein je u velikoj meri povezan sa intraćelisjkim lokacijama kao što je Golgi, nije bilo sigurno da bi se fenotipske determinante mogle uspešno iskoristiti kao terapeutska meta kao što se ovde mislilo.
Stoga, naročito je izvanredno to da DLL3 modulatori kao što su ovi koji su ovde otkriveni mogu se korisno iskoristiti u prognozi, dijagnozi, teragnozi, lečenju i/ili prevenciji odabranih proliferativnih (npr., neoplastičnih) poremećaja kod subjekata kojima je to potrebno. Biće prihvaćeno da, iako će se preferirani primeri pronalaska diskutovati više u nastavku, naročito u terminima određenih domena, regiona ili epitopa ili u kontekstu matičnih ćelija kancera ili tumora koji obuhvataju neuroendokrinske osobine i njihove interakcije sa otkrivenim modulatorima, stručna lica će prihvatiti da predmetni pronalazak nije ograničen sa takvim primerima. Radije, najugroženiji primeri predmetnog pronalaska su široko i izričito usmereni na DLL3 modulatore (uključujući konjugovane modulatore) i nihovu primenu u prognozi, dijagnozi, teragnozi, lečenju i/ili prevenciji raznih DLL3 povezanih ili posredovanih poremećaja, koji uključuju neoplastične ili ćelijske proliferativne poremećaje, bez obzira na bilo koji poseban mehanizam delovanja ili posebno ciljani tumor, ćelijska ili molekularna komponenta.
U tom cilju i kao što je prikazano u predmetnoj prijavi, neočekivano je pronađeno da otkriveni DLL3 modulatori mogu efikasno da budu korišćeni da ciljaju i eliminišu ili drugačije onesposobljavaju proliferativne ili tumorske ćelije i leče DLL3 povezane poremećaje (npr., neoplazija). Kao što je korišćeno ovde "DLL3 povezani poremećaji’’ će označavati bilo koji poremećaj ili oboljenje (uključujući proliferativne poremećaje) koje je markirano, dijagnostikovano, detektovano ili identifikovano sa fenotipskim ili genotipskim odstupanjem DLL3 genetskih komponenata ili ekspresija ("DLL3 determinante") tokom toka ili etiologije oboljenja ili poremećaja. U tom pogledu DLL3 fenotipsko odstupanje ili determinanta može, na primer, da obuhvati povišene ili potpisnutih nivoa DLL3 proteinske ekspresije, abnormalne DLL3 proteinske ekspresije na izvesnim definisanim ćelijskim populacijama ili abnormalne DLL3 proteinske ekspresije pri odgovarajućoj fazi ili stanju životnog ciklusa ćelije. Naravno, biće prihvaćeno da se slični ekspresioni šabloni genotipskih determinanti (npr., raRNK transkripcioni nivoi) DLL3 mogu koristiti za klasifikovanje, detektovanje ili lečenje DLL3 poremećaja.
Kao što je korišćeno ovde termin "determinanta’' ili "DLL3 determinanta" će označavati bilo koju prepoznatljivu karakteristiku, osobinu, marker ili faktor koji je raspoznatljivo povezan sa, ili posebno pronađeno u ili na određenoj ćeliji, ćelijskom polulacijom ili tkivom koji uključuje one identifikovane u ili na tkivu, ćeliji ili ćelijskoj polulaciji koja je zahvaćena sa DLL3 povezanim oboljenjem ili poremećajem. U odabranim poželjnim primerima DLL3 modulatori mogu se povezivati, vezivati ili reagovati direktno sa DLL3 determinantom (npr., ćelijski površinski DLL3 protein ili DLL3 mRNK) i time poboljšati poremećaj. Mnoge opšte determinante mogu biti morfološki, funkcionalno ili biohemijski po prirodi i mogu biti genotipski ili fenotipski. U drugim poželjnim primerima determinanta je ćelijski površinski antigen ili genetska komponenta koja je diferencijalno ili preferencijalno izraženo (ili nije) sa određenim ćelijskim tipovima (npr., matične ćelije kancera) ili sa ćelijama pod određenim uslovima (npr., tokom određenih tačaka ćelijskog ciklusa ili ćelija u naročitom udubljenju). U još drugim poželjnim primerima determinanta može obuhvatiti gen ili genetički entitet koji je drugačije regulisan (gore ili dole) u određenoj ćeliji ili diskretnoj ćelijskoj populaciji, gen koji je različito modifikovan u pogledu na njegovu fizičku strukturu i hemijsku kompoziciju ili protein ili kolekcija proteina fizički povezani sa genom koji pokazuju različite hemijske modifikacije. Determinante koje su ovde razmatrane su posebno držane kako bi bili pozitivni ili negativni i mogu označavati ćeliju, ćelijsku podpopulaciju ili tkivo (npr., tumori) sa njegovim prisustvom (pozitivan) ili odsustvom (negativan).
Na sličan način "DLL3 modulatori" pronalaska široko obuhvataju bilo koje jedinjenje koje prepoznaje, reaguje, takmiči, antagonizuje, međusobno reaguje, vezuje, agonizuje, ili povezuje sa DLL3 varijantom ili izooblikom (ili njegovim određenim domenima, regionima ili epitopima) ili njegovom genetskom komponentom. Ovim interakcijama, DLL3 modulatori mogu povoljno eliminisati, smanjiti ili ublažiti frekvenciju, aktivnost, povraćaj, metastazu ili mobilnost tumorskih ćelija (npr., ćelije koje oživljavaju tumore ili matične ćelije kancera). Primerni modulatori otkriveni ovde obuhvataju nukleotide, oligonukleotide, polinukleotide, peptide ili polipeptide. U nekim poželjnim primerima odabrani modulatori će obuhvatati antitela na DLL3 proteinskom izoobliku ili imunoraktivne fragmente ili njihove derivate. Takva antitela mogu antagonistički ili agonistički u prirodi i mogu opciono da budu konjugovani ili povezani sa terapeutskim ili dijagnostičkim agensom. ýak štaviše, takva antitela ili fragmenti antitela mogu obuhvatati potrošena, neutralizovana ili internalizovana antitela. U drugim primerima modulatori unutar predmetnog pronalaska će predstavljati DLL3 konstruktor koji sadrži DLL3 izooblik ili njegov reaktivni fragment. Biće prihvaćeno da takvi konstruktori mogu da sadrže fuzione proteine i mogu obuhvatati reaktivne domene iz drugih polipeptida kao što su imunoglobulini ili modifikatori biološkog odgovora. U još drugim primerima DLL3 modulator će obuhvatati ostatak nukleinske kiseline (npr. miRNK, siRNK, shRNK, antisensne konstrukcije, itd.) koje pokazuju željene efekte na genomskom nivou. Ipak drugi modulatori koji su kompatibilni sa predmetnim učenjem će biti u više detalja opisani u nastavku.
Uopšteno DLL3 modulatori predmetnog pronalaska šire obuhvataju bilo koje jedinjenje koje prepoznaje, reaguje, takmiči, antagonizuje, međusobno reaguje, vezuje, agonizuje, ili povezuje sa DLL3 determinantom (genotipski ili fenotipski) uključujući ćelijsku površinu DLL3 proteina. Koji god oblik modulatora je na kraju odabran on će poželjno biti u izolovanom ili prečišćenom stanju pre uvođenja u subjekat. U tom pogledu termin "izolovani DLL3 modulator" ili "izolovano DLL3 antitelo" će se u širem smislu tumačiti i u vezi sa standardnom farmaceutskom praksom označavati bilo koji preparat ili kompoziciju koja sadrži modulator u stanju koje je u suštini oslobođeno neželjenih kontaminanata (bioloških ili drugih). Štaviše, ovi preparati mogu da budu prečišćeni i formulisani kao što se želi korišćenjem raznih priznatih tehnologija u tehnici. Naravno, prihvatiće se da takvi "izolovani" preparati mogu da budu namerno formulisani ili kombinovani sa unutrašnjim ili aktivnim satojcima kao što se želi kako bi se poboljšali komercijalni, proizvođDčki ili terapeutski aspetci finalnog proizvoda i obezbedili farmaceutske kompozicije. U širem smislu, ista opšta razmatranja mogu se primenjivati na "izolovani" DLL3 izooblik ili varijantu ili "izolovanu" nukleinsku kiselinu koja kodira isti.
Dalje, izneneađujuće je pronađeno da modulatori koji međusobno reaguju, povezuju ili vezuju za određene DLL3 domene, motive ili epitopesu posebno efikasni u eliminisanju tumorskih ćelija i/ili utišavanjem ili prigušavanjem matične ćelije kancera koji utiče na rast tumora ili propagaciju. To je, dok su modulatori koji reaguju ili povezuju sa domenima koji su proksimalni ćelijskoj površini (npr., jednom od "EGF-sličnih domena) su efikasni u iscrpljivanju ili neutralisanju imunogenskih ćelija neočekivano je pronađeno da modulatori povezani ili vezani za domene, motive ili regione koji su relativno više udaljeni od ćelijske površine su takođe efikasni u eliminisanju, neutralisanju, iscrpljivanju ili utišavanju tumroskih ćelija. Naročito, i kao što je prikazano u priloženim Primerima, pronađeno je da modulatori koji reaguju, povezuju ili vezuju za DSL ili N-krajnje regione DLL3 proteina su iznenađujuće efikasni pri eliminisanju ili neutralisanju tumorskih ćelija koje uključuju one koje pokazuju neuroendokrinske karakteristike i/ili matićne ćelije kancera. Ovo je naročito istinito za konjugovane modulatore kao što su, na primer, konjugati leka anti-DLL3 antitela koji sadrže citotoksični agens. Kao takav, biće prihvaćen da izvesni poželjni primeri predmetnog pronalaska su usmereni na jedinjenja, kompozicije ili metode koje sadrže DLL3 modulatore koji povezuju, vezuju ili reaguju sa relativno distalnim delom DLL3 koji uključuje DSL domen i N-krajnji region.
Dok predmetni pronalazak izričito promatra primenu bilo kog DLL3 modulatora u lečenju bilo kog DLL3 poremećaja, uključujući bilo koji tip neoplazije, u naročito poželjnim primerima otkriveni modulatori mogu biti korišćeni da spreče, leče ili dijagnostikuju tumore koji sadrže neuroendokrinske karakteristike (genotipske ili fenotipske) uključujući neuroendokrinske tumore. Tačno ili "kanonski neuroendokrinalni tumori" (NETs) proizilaze iz dispergovanog endokrinskog sistema i obično su jako agresivni. Neuroendokrinski tumori se javljaju u bubrezima, genitourinarnom traktu (bešika, prostata, jajnik, cerviksa i endometrijum), gastrointestinalnom traktu (stomak, kolon), tiroidnoj žlezdi (moždani tiroidni kancer), i plućima (mala ćelija plućnog karcinoma i velika ćelija neuroendokrinskog kancera). ýak štaviše, otkriveni modulatori mogu povoljno da budu korišćeni za lečenje, prevenciju ili dijagnozu pseudo neuroendokrinskih tumora (pNETs) koji genotipski ili fenotipski imitiraju, sadrže, pojačavaju ili pokazuju zajedničke osobine sa kanonskim neuroendokrinskim tumorima. "Pseudo neuroendokrinski tumori" su tumori koji porizilaze iz ćelija difuznog neuroendokrinskog sistema ili iz ćelija gde neuroendokrinska diferencijalna kaskada je bila neprirodno reaktivirana tokom onkogenskog procesa. Takvi pNETs obično dele izvesne genotipske, fenotipske ili biohemijske karakteristike sa tradicionalno definisanim neuroendokrinskim tumorima, uključujući sposobnost da proizvedu podskup biloški aktivnih amina, neurotransmitera, i peptidnih hormona. Prema tome, za svrhu predmetnog pronalaska fraze "tumori koji sadrže neuroendokrinske karakteristike" ili "tumori koji pokazuju neuroendokrinske karakteristike'' će se držati kako bi obuhvatili oba neuroendokrinske tumore i pseudo neuroendokrinske tumore ukoliko nije drugačije navedeno kontekstom.
Pored povezanosti sa tumorima koji su uopšteno prethodno diskutovani, takođe postoje indikacije fenotipske ili genotipske povezanosti između odabranih ćelija koje iniciraju tumor (TIC) i DLL3 determinante. U tom pogledu odabrani TICs (npr., matićne ćelije kancera) mogu iskazivati povišene nivoe DLL3 proteina kada se porede sa normalnim tkivom ili netumorskim ćelijama (NTG), koje zajedno obično sadrže mnogo više čvrstog tumora.
Stoga, DLL3 determinante mogu obuhvatiti tumor povezan sa markerom (ili anitgenom ili imunogenom) i otkriveni modulatori mogu obezbediti efikasne agense za detekciju i supresiju TIC i povezanu neoplaziju usled izmenjenih nivoa proteina na ćelijskim površinama ili u tumorskom mikrookruženju. Prema tome, DLL3 modulatori, koji uključuju imunoreaktivne antagoniste i antitela koji povezuju, vezuju ili reaguju sa proteinima, mogu efikasno da smanje frekvenciju ćelija koje iniciraju tumor i mogu biti korisni u eliminisanju, iscrpljivanju, onesposobljavanju, smanjivanju, promovisanju diferencijacije, ili drugačije isključivanju ili ograničavanju sposbnosti ovih ćelija koje iniciraju tumor na lažnoj i/ili koji nastavlja da puni rast tumora, metastazu ili povraćaj kod pacijenta. U tom pogledu stručno lice će prihvatiti da predmetni pronalazak dalje obezbeđuje DLL3 modulatore i njihovu primenu u smanjivanju frekvencije ćelija koje iniciraju tumor.
II. DLL3 Fiziologija
Notch signalizacioni put, prvo je identifikovan u C. elegans mid Drosophila i kasnije prikazan da je evolucionarno sačuvan od strane beskičmenjaka do kičmenjaka, učestvuje u nizu osnovnih bioloških procesa uključujući normalni razvoj embriona, homeostaza tkiva odraslih i održavanje matičnih ćelija (D'Souza et al., 2010; Liu et a!., 2010). Notch signalizacija je kritična za različite tipove ćelija tokom specifikacije, uzorkovanja i morfogeneze. ýesto se to dešava kroz mehanizam lateralne inhibicije, u kojoj ćelije koje iskazuju Notch ligand(e) usvajaju uobičajenu ćelijsku sudbinu, ipak potiskuju ovu sudbinu u susednim ćelijama preko stimulacije Notch signalizacije (Sternberg, 1988, Cabrera 1990). Ova odabrana binarna ćelisjka sudbina posredovana sa Notch signalizacijom je pronađena da igra važnu ulogu u velikom broju tkiva, uključujući razvijanje nervnog sistema (de la Pompa et al..1997), hematopoetski i imuni sistemi (Bigas and Espinosoa, 2012; Hoyne et al 2011; Nagase et al., 2011), stomak (Pre et al., 2005; Fre et ah, 2009), endokrinski pankreas (Apelqvist et ah, 1999; Jensen et al, 2000), hipofiza (Raeteman et al., 2004), i difuzni neuroendokrinski sistem (Ito et al, 2000; Schonhoffet al, 2004). Generalizovani mehanizam za implementaciju ovog binarnog prekidača izgleda da se čuva uprkos širokom spektru razvojnih sistema gde Notch igra ulogu u ćelijama gde izbor stope uobičajenih ćelija je određen sa transkripcionim regulatorima koji su poznati kao bazni heliks-petlja-heliks (bHLH) proteini, Notch signalizacija vodi do aktivacije klase Notch odgovarajućih gena, koji zauzvrat potiskuju aktivnost bHLH proteina (Bail, 2004). Ove binarne odluke zauzimaju mesto "u širem kontekstu razvoja i signalizacionih tokova koji dozvoljavaju Notch signalizaciju da bi se uticalo na proliferaciju ili inhibiciju, i da aktivira samo obnavljanje ili inhibiciju.
In Drvsophila, Notch signalizacija je posredovana uglavnom sa jednim Notch receptorskim genom i dva ligandna gena, poznati kao Nazubljeni and Delta (Wharton et al, 1985; Rebay et al, 1991). Kod ljudi, postoje četiri poznata Notch receptora i pet DSL (Delta-Nazubljeni LAG2) liganada - dva homologa Nazubljenog, poznat kao Šiljasti 1 i Šiljasti 2, i tri homologa Delta, nazvani delta-slični ligandi ili DLL1, DLL3 i DLL4. Uopšteno, Notch receptori na površini ćelije koja prima signal su aktivirane interakcijama sa ligandima koji su ekspresovani na površini suprotne ćelije koja odašilje signal (nazvana trans-interakcija). Ove transinterakcije vode do sekvence proteaze posredovane cepljenjem Notch receptora. Kao posledica, Notch receptor intraćelijskog domena je slobodan da translocira od membrane do nukleusa, gde učestvuje sa CSL familijom transkripcionih faktora (RBPJ u ljudima) i konvertuje ih od transkripcionih represora u aktivatore Notch odgovarajućih gena.
Od ljudskih Notch liganada, DLL3 je različit po tome što je izgleda nesposoban da aktivira Notch receptor preko trans-interakcija (Ladi et al, 2005). Notch ligandi mogu takođe da međusobno reaguju sa Notch receptorima u cis (na istoj ćeliji) vodeći do inhibicije Notch signala, iako tačni mehanizmi cis-inhibicije ostaju nejasni i mogu jako da zavise od liganda (na primer, videti Klein et al, 1997; Ladi et ah, 2005; Glittenherg et al, 2006). Dva hipotezna moda inhibicije obuhvataju modulisani Notch koji signalizuje na površini ćelije sprečavanjem trans-interakcija, ili smanjenjem količine Notch receptora na površini ćelije zbunjivanjem procesa receptora ili fizički izazivajući zadržavanje receptora u endoplastičnom retikulumu ili Golđiju (Sakamoto et al, 2002; Dunwoodie, 2009). Jasno je, međutim, da stohastičke razlike u ekspresiji Notch receptora i liganda na susednim ćelijama mogu biti pojačane kroz transkripcijske i ne-transkripcijske procese, i suptilne ravnoteže cis- i trans-interakcija mogu rezultirati finim podešavanjem Notch posredovanog ocrtavanja divergentnih ćelijskih sudbina u susednim tkivima (Sprinzak etaL, 2010).
DLL3 (takođe poznat kao Delta-sličan 3 ili SCDO1) je član familije sličnoj Delta Notch DSL liganada. Predstavnik DLL3 proteinskih ortologa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ljude (Pristupni Br. NP 058637 i NP 982353), čimpanze (Pristupni Br. XP 003316395), miševi (Pristupni Br. NPJBI892), i pacove (Pristupni Br. NP 446118). Kod ljudi, DLL3 gen se sastoji od 8 eksona koji obuhvataju 9.5 kBp locirani na hromozomu 19q13. Alternativno spajanje unutar poslednjeg eksona daje dostignuće do dva obrađena transkripta, jedan od 2389 baza (Pristupni Br. NM 016941; FIG.1A, SEQ ID NO; 1) i jedna od 2052 baza (Pristupni Br. NM 2Q3486: FIG. IB, SEQ ID NO: 2). Prethodni transkript kodira 618 amino kiselinskim proteina (Pristupni Br. NP 058637; FIG.1C, SEQ ID NO: 3), gde drugi kodira 587 amino kiselinskih proteina (Pristupni Br. NP 982353; FIG.1D, SEQ ID NO: 4). Ova dva proteinska izooblika DLL3 dele udeo od 100% identifikacija preko svojih ekstracelularnih domena i njihovih transmembranskih domena, koji se razliku samo po tome što duži izooblik sadrži produženi citoplazmični rep koji sadrži 32 dodatna ostatka na karboksi kraju proteina (FIG.1E). Biloški značaj izooblika je nejasan, i ako oba izooblika mogu biti detektovana u ćelijama tumora (FIG.5). Procenat identiteta za svaki član delta-slične familije proteina u ljudima je prikazan na FIG.2A, kao i identiteta unakrsnih identiteta na FIG.2B.
Uopšteno DSL ligandi su sastavljeni od serije strukturnih domena: jedinstveni N-krajnji domen, praćen sa konzervisanim DSL domenom, ponavljači slični višestrukom tandem epidermalnom faktoru rastaa (EGF), transmembranski domen, i citoplazmični domen koji nije jako konzerviran duž liganada već samo sadrži višestruke ostatke lizina koji predstavljaju moguća mesta za ubikitinaciju jedinstvenim E3 ubikutnim ligazama. DSL domen je degenerisani EGF-domen koji je neophodan ali nije dovoljan za međusobne reakcije sa Notch receptorima (Shimizu et al, 1999). Dodatno, prva dva EGF-slična ponavljača većine DSL liganada sadrže manju proteinsku sekvencu motiva poznat kao DOS domen koji kooperativno međusobno reaguje sa DSL domenom kada se aktivira Notch signalizacija.
FIG.1F prikazuje šematski dijagram ekstraćelijskog regiona DLL3 proteina koji ilustruje uopšteno položaj jedan pored drugoga šest JBGF-sličnih domena, pojedinačni DSL domen i N-krajnji domen. Uopšteno, EGF domeni su prepoznati kao da se javljaju na oko približno 216-249 amino kiselinskih ostataka (domen 1), 274-310 (domen 2), 312-351 (domen 3), 353-389 (domen 4-), 391-427 (domen 5) i 429-465 (domen 6), sa DSL domenom na oko 176-215 amino kiselinskih ostataka i N-krajnji domen na oko 27-175 amino kiselinskih ostataka hDLL3 (SEQ ID NOS: 3 i 4). Kao što je diskutovano u više detalja ovde i kao što je prikazano u Primeru 10 u nastavku, svaki od EGF-sličnih domena, DSL domena i N krajnjeg domena obuhvata deo DLL3 proteina kao što je definisano sa jasnim amino kiselinskom sekvencom. Napomenuti da, za svrhe predmetnog pronalaska respektivni EGF-slični domeni mogu biti označeni EGF1 do EGF6 sa EGF1 koji je najbliži N-krajnjem delu proteina. U pogledu na strukturnu kompoziciju proteina jedan značajni aspekt predmetnog pronalaska je taj da otkriveni DLL3 modulatori mogu biti generisani, proizvedeni, projektovani ili odabrani tako da reaguju sa odabranim domenom, motivom ili epitopom. U izvesnim slučajevima takvo mesto specifičnih modulatora može obezbediti poboljšanu reaktivnost i/ili efikasnost u zavisnosti od njihovog primarnog moda dejstva.
Napomenuti da, kao što je korišćeno ovde termini "zreli protein" ili ''zreli polipeptid" kao što je korišćeno ovde odnose se na oblik(e) proteina dobijenog ekspresijom ćelije sisara.
Generalno je hipotezirano da jednom izvezeni lanac rastućeg proteina duž grubog endoplastičnog retikuluma je iniciran, proteini odabrani ćelijama sisara imaju signalnu peptidnu (SP) sekvencu koja je odcepljena od komplentog polipeptida kako bi se dobio "zreo" oblik proteina. U oba izooblika DLL3 zreli protein sadrži signalni peptid od 26 amino kiselina koje mogu biti odsečene pre ekspresije na površinu ćelije. Stoga, u zrelim proteinima N-krajnji domen će se produžiti sa pozicije 27 u proteinu do početka DSL domena. Naravno, ako protein nije obrađen na ovaj način, N-krajnji domen će se držati da bi se proširio na poziciju jedan od SEQ ID NOS: 3 & 4.
Od različitih Delta-sličnih liganada, DLL3 Je najrazličitiji od ostalih u porodici, pošto sadrži degenerisani DSL domen, bez DOS motiva, i intraćelijski domen kome nedostaju ostaci lizina. Degenerativni DSL i nedostatak DOS motiva su u skladu sa nemogućnošću DLL3 da aktivira Notch signalizaciju u trans (između ćelija), predlažući da DLL3, za razliku od DLL1 ili DLL4, deluje samo kao inhibitor Notch signalizacije (Ladi et ah, 2005). Studije su pokazale da DLL3 može biti rezident uglavnom u cis-Golđi (Goffers et at, 2007), što bi bilo u skladu sa hipotetičkom sposobnošću da zadrži Notch receptor intracelularno, ili da ometa sa obradom Notch receptora, sprečavajući eksport na površinu ćelije i umesto toga, poništavajući ga u lizozomu (Chapman et al., 2011). Neki DLL3 protein može se pojaviti na površini ćelije, međutim, kada je protein veštački previše iskazan u sistemu modela (Ladi et al., 2005), ali nije očigledno da će to biti slučaj u normalnim biološkim kontekstima niti u tumorima u kome je DLL3 mRNA transkript povišen; donekle iznenađujuće, nivo proteina detektovan u tipovima tumora ovde otkriveni ukazuje da značajan DLL3 protein beži na površinu ćelije raznih tumora.
Defekti u DLL3 genu su povezani sa spondilokostalnom disostozom kod ljudi, težak kongenitalni defekat pri rođenju dovodi do nastanka abnormalnih pršljenova i abnormaliteta rebara (Dunvoodie, 2009). Ovo je povezano sa izmenama u Notch signalizaciji, za koje se zna da igraju ključnu ulogu u određivanju polariteta i uzorkovanja somita, embrionalnih prekursora na pršljenu kojima je potrebno fino regulisano osciliranje uzajamno delujući između Notch, Wnt i FGF signalnih puteva za pravilan razvoj ( Kageiama i sar., 2007;
Goldbeter i Pourkuie, 2008). Iako su DLL1 i DLL3 obično izraženi na sličnim lokacijama unutar embriona koji se razvijaju, eksperimenti sa transgenskim mišem pokazali su da DLL3 ne kompenzuje DLL1 (Geffers et al., 2007). DLL1 omamljeni miševi su embrionalni smrtonosni, ali DLL3 mutirani miševi preživljavaju i pokazuju fenotip sličan onom koji se nalazi kod ljudi sa spondilokostalnom disostozom (Kusumi i sar., 1998; Shinkai i sar., 2004). Ovi rezultati su u skladu sa suptilnim uzajamnim dejstvom Notch trans- i cis-interakcija koje su bitne za normalan razvoj.
Dalje, kao što je već rečeno, signalizacija Notch igra ulogu u razvoju i održavanju neuroendokrinskih ćelija i tumora koji pokazuju neuroendokrinske osobine. U tom smislu je uključena Notch signalizacija u širem spektru odluka o sudbini ćelija u normalnim endokrinskim organima i difuznom neuroendokrinskom sistemu. Na primer, u pankreasu, Notch signalizacija je neophodna za suzbijanje razvoja primarnog endokrinog fenotipa posredovanog sa bHLH transkripcijskim faktorima NGN3 (Habener et al, 2005). Slično Notch posredovana supresija sudbine endokrinih ćelija se javlja u enteroendokrinskim ćelijama (Schonhoff et al, 2004), tiroidnim parafolikularnim ćelijama (Cook et al, 2010), u specificiranju relativnih odnosa neuroendokrinskih ćelijskih vrsta u hipofizi (Dutta et al., 2011), i verovatno je uključena u odlučivanju ćelija unutar pluća da usvoje neuroendokrinski ili ne-neuroendokrinski fenotip (Chen et ai, 1997; Ito et al., 2000; Sriuranpong et al., 2002). Otuda je jasno da u mnogim tkivima suzbijanje Notch signalizacije je povezano sa neuroendokrinskim fenotipima.
Kod odgovarajuće reaktivacije razvojnih signalnih puteva ili disregulacije normalnih signalnih puteva najčešće se primećuju u tumorima, a u slučaju Notch signalizacije, povezani su sa brojnim tipovima tumora (Koch i Radtke, 2010; Harris et al., 2012). Notch put je proučavan kao onkogen u limfomskim, kolorektalnom, pankreasnom i nekim vrstama ne malih ćelija raka pluća (vidi Zarenczan i Chen, 2010 i reference u njemu). Nasuprot tome, izveštava se da Notch deluje kao tumorni supresor u tumorima sa neuroendokrinskim karakteristikama (vidi Zarenczan i Chen, 2010 supra). Tumori sa neuroendokrinskim karakteristikama se javljaju retko u širokom spektru primarnih mesta, i dok njihova iscrpna klasifikacija ostaje problematična (Yao et al., 2008; Klimstra et al, 2010: Kloppel, 2011), mogu se klasifikovati u četiri glavne vrste: benigni karcinoidi niskog stupnja, dobro diferencirani neuroendokrinski tumori sa malignim ponašanjem niskog stupnja, tumori sa mešanim neuroendokrinskim i epitelnim osobinama, i slabo diferencirani neuroendokrinski karcinomi visokog stepena. Od ovih klasifikacija, slabo diferencirani neuroendokrinalni karcinomi, koji obuhvataju male ćelije raka pluća (SCLC) i podskupove ne malih ćelija raka pluća (NSCLC), su vrste kancera sa lošim prognozama. Pretpostavljeno da je SCLC bronhogen poreklom, koji se delom javlja iz plućnih neuroendokrinskih ćelija (Galfuzzo i Bocchetta, 2011). Bez obzira na specifičan ćelijski izvor porekla za svaki od ovih tumora koji imaju neuroendokrinski fenotip, može se Rčekivati da potiskivanje Notch signalizacije, bilo direktnim lezijama u Notch putu samih gena, ili aktiviranjem drugih gena koji potiskuju Notch signalizaciju, može dovesti do sticanje neuroendokrinskog fenotipa ovih tumora. Dodatno, geni koji dovode do ometanja Notch puta mogu da pruže terapeutske ciljeve za lečenje tumora sa neuroendokrinskim fenotipima, posebno za indikacije koje trenutno imaju loše kliničke rezultate.
ASCL1 je jedan takav gen koji izgleda da međusobno reaguje sa Notch signalnizacionim putem preko DLL3. Jasno je da mnogi neuroendokrinski tumori pokazuju slabo diferenciran (tj. delimično potpun) endokrinski fenotip; na primer, obeležena elevacija ili ekspresija raznih endokrinskih proteina i polipeptida (npr. hromogranin A, CHGA, kalcitonin, CALCA, propiomelanoeorin, POMC, somatostatin, SST), proteini povezani sa sekretornim vesikulama (npr., sinaptofizin, SYP) i geni koji su uključeni u biohemijske puteve koji su odgovorni za sintezu bioaktivnih amina (npr. dopa dekarboksilaza, DDC). Možda nisu iznenađujući, ovi tumori često previše izražavaju ASCL1 (poznat i kao mASH1 kod miševa ili hASH1 kod ljudi), faktor transkripcije je poznat da igra ulogu u orkestriranju genskih kaskada koje vode do neuronskih i neuroendokrinskih fenotipova. Iako određeni molekularni detalji kaskade ostaju nejasno definisani, sve je više jasno da za određene vrste ćelije, naročito tiroidne parafolikularne ćelije (Kameda i sar., 2007), hromafinske ćelije nadbubrežne medule (Huber et ah, 2002) i ćelija pronađene u difuznom neuroendokrinskom sistemu pluća (Chen et al., 1997; Itur et al, 2000; Sriuranpong et al., 2002), ASCL1 je deo finalno podešene razvojne regulacione petlje u kojoj su izbori ćelijske sudbine posredovani ravnotežom ASCL1-posredovane i Notch-posredovane genske ekspresije kaskada (FIG, 3). Na primer, ASCL1 je pronađen da bude izražen u normalnim plućnim neuroendokrinskim ćelijama kod miševa, dok je Notch signalizacijski efektor HES1, izražen u plućnim ne-neuroendoinskim ćelijama (Ito et al., 2000). Da su ove dve kaskade u dobrom balansu sa potencijalnim unakrsnim regulacijama je od naročitog značaja. Utvrđeno je da Notch efektor HES1 smanjuje ASCLI ekspresiju (Chen et at, 1997; Sriuranpong et al., 2002). Ovi rezultati jasno pokazuju da Notch signalizacija može potisnuti neuroendokrinsku diferencijaciju. Međutim, demonstracija da se ASCL1 vezuje za DLL3 promotor aktivira DLL3 ekspresiju (Henke et al, 2009) i zapažanje da DLL3 oslabljuje Notch signalizaciju (Ladi et al., 2005) zatvara genetski krug za izbor ćelijske sudbine između neuroendokrinskih i ne-neuroendokrinskih fenotipa.
S obzirom na to da Notch signalizacija je evoluirala kako bi se pojačale fine razlike između susednih ćelija da dozvoli oštro ograničene domene tkiva sa odvojenim diferencijalnim putevima (npr. "bočna inhibicija", kao što je opisano gore), ovi podaci zajedno sugerišu da finalno podešena razvojna regulatorna petlja (FIG.3) postaje reaktivirana i neregulisana kod kancera sa neuroendokrinskim fenotipima. Iako nije očigledno da bi DLL3 obezbedili pogodnu ćelisku površinsku metu za razvoj terapije antitelom, s obzirom na njegovo normalno prebivalište u unutrašnjim membranskim odeljcima ćelije (Geffers et al ., 2007) i njegove pretpostavljene međusobne reakcije sa Notch u njoj, moguće je da rezultirajuća elevacija DLL3 ekspresije u neuroendokrinskim tumorima može ponuditi jedinstvenu terapeutsku metu za tumore sa neuroendokrinskim fenotipom (npr., NETs i pNETs).
Uobičajeno se primećuje da ogromna prekomerna ekspresija proteina u laboratorijskim sistemima može izazvati pogrešnu lokalizaciju previše izraženog proteina unutar ćelije. Zbog toga je razumna hipoteza, ali nije očigledna bez eksperimentalne provere, da prekomerna ekspresija DLL3 u tumorima može dovesti do neke ekspresije proteina na površini ćelije, i time prezentovati metu za razvoj antitela terapeutika.
III. Matične ûelije Kancera
Kao što je prethodno navedeno, iznenađujuće je pronađeno da je neprirodna DLL3 ekspresija (genotipska i/ili fenotipska) povezana sa raznim tumorogenskim ćelijskim podpopulacijama. U tom pogledu predmetni pronalazak obezbeđuje DLL3 modulatore koji mogu biti naročito korisni za ciljanje takvih ćelija, i posebno oživljene ćelije tumora, čime se olakšava lečenje, upravljanje ili prevencija neoplastičnih poremećaja. Prema tome, u poželjnim primernim modulatorima DLL3 determinanti (fenotipski ili genotipski) mogu se pogodno koristiti za smanjenje ćelijske frekvencije koja inicira tumor u skladu sa predmetnim Xčenjima i time olakšava lečenje ili upravljanje proliferativnim poremećajima.
Za svrhu predmetne prijave termin "ćelija koja inicira tumor" (TIC) obuhvata oba "ćelije koje oživljavaju tumor" (TPC; odn., matične ćelije kancera ili CSC) i visoko proliferativne "tumor oživljen ćelijama" (nazvan TProg), koji zajedno uopšteno obuhvataju jedinstvenu podpoulaciju (odn.0.1-40%) zapremine tumora ili mase. Za svrhe predmetnog pronalaska termini "ćelije koje oživljavaju tumor" i "matične ćelije kancera" ili "neoplastične matične ćelije" su ekvivalneti i mogu se koristiti naizmenično ovde. TPC se razlikuje od TProg po tome što TPC može upotpunosti sumirati kompoziciju ćelija tumora koje postoje unutar tumora i imaju neograničeni samo obnovljivi kapacitet kao što je prikazano serijom transplatacija (dva ili više prolaza kroz miša) malog broja izolovanih ćelija, dok TProg neće pokazivati neograničeno samo obnovljivi kapacitet.
Oni koji su stručnjaci u ovoj oblasti će ceniti da fluorescentno aktivirana ćelija koja sortira (FACS) koristeći odgovarajuće ćelijske površinske markere je pouzdan metod za izolaciju jako obogaćene podpulacije matičnih ćelija karcera (npr > 99,5% čistoće) zbog, barem delom, na njegovu sposobnost da diskriminituje između pojedinačnih ćelija i gomile ćelija (odn. duplo, itd.). Korišćenjem takvih tehnika pokazalo se da kada se mali broj ćelija visoko prečišćenih TProg ćelija transplantira u imunokompromisovane miševe, oni mogu povećati rast tumora u primarnoj transplantaciji. Međutim, za razliku od pročišćenih TPC podpopulacija, TProg generisani tumori ne odražavaju potpuno roditeljski tumor u heterogenskoj fenotipskoj ćeliji i očigledno su neefikasni u ponovnom pokretanju serije tumorigeneze u narednim transplatacijama. U suprotnosti, TPC podpopulacije u potpunosti rekonstruišu ćelijsku heterogenost roditeljskih tumora i mogu efikasno iniciraju tumore kada su serijski izolovani i transplantirani. Stoga, stručnjaci u tehnici će prepoznati da definitivna razlika između TPC i TProg, iako i oba mogu biti tumor koji generiše u primarne transplante, je jedinstvena sposobnost TPC-a da konstantno snabdeva heterogeni rast tumora na serijskoj transplantaciji kod malog broja ćelija. Drugi uobičajeni pristupi za karakterizaciju TPC uključuju morfologiju i ispitivanje ćelijskih površinskih markera, transkripcijskog profila i odgovora na lekove, iako se markerski izraz može promeniti sa uslovima kulture i prolaza ćelijske linije in vitro.
Shodno tome, u svrhu predmetnog pronalaska ćelije koje oživljavaju tumor, kao što su normalne matične ćelije koje podržavaju ćelijske hijerarhije u normalnom tkivu, su poželjno definisani sa njihovom sposobnošću da se samostalno obnovi na neodređeno vreme dok se održava kapacitet za multilineaznu diferenciju. ûelije koje oživljavaju tumor su tako sposobne da generišu oba tumorska potomstva (odn., ćelije koje oživljavaju tumor: TPC i TProg) i ne-tumorsko (NTG) potomstvo. Kao što je korišćeno ovde, "ne-tumorska ćelija" (NTG) se odnosi na ćeliju tumora koja potiče iz ćelija koje iniciraju tumor, ali sama nema sposobnost da samostalno obnovi ili generiše heterogenu vezu tumorskih ćelija koje sadrže tumor. Eksperimentalno, NTG ćelije nisu sposobne za ponovnu obnovu formiranja tumora kod miševa, čak i kada su transplantirane u velikom broju ćelija.
Kao što je navedeno, TProg su takođe kategorizovani kao ćelije koje iniciraju tumor (ili TIC) zbog svoje ograničene sposobnosti da generišu tumore kod miševa. TProg su potomci TPC i obično su sposobni za konačan broj ne samostalno obnovljivih ćelijskih podela. Štaviše, TProg ćelije se mogu dalje podeliti na rane ćelije koje oživljavaju tumor (ETP) i kasnije ćelije koje oživljavaju tumor (LTP), od kojih se svaki može razlikovati po fenotipu (npr., ćelijski površinski markeri) i različitim kapacitetima za rekapitaciju tumorske ćelijske arhitekture. Uprkos takvim tehničkim razlikama, i ETP i LTP funkcionalno se razlikuju od TPC po tome što su uglavnom manje sposobni za serijske rekonstitucione tumore kada se transplantiraju na malom broju ćelija i obično ne odražava heterogenost roditeljskog tumora. Uprkos gore navedenim razlikama, takođe je pokazano da razne populacije TProg mogu, u retkim prilikama, dobiti sposobnosti samostalnog obnavljanja koje se obično pripisuju matičnim ćelijama i same postaju TPC (ili CSC). U svakom slučaju, oba tipa ćelija koje iniciraju tumore su najverovatnije predstavljene u tipičnoj tumorskoj masi jednog pacijenta i podložne su lečenju sa modulatorima kao što je ovde otkriveno. To jest, otkrivene kompozicije su uglavnom efikasne u smanjivanju frekvencije ili promeni hemosenzitivnosti takvih DLL3 pozitivnih ćelija koje iniciraju tumor bez obzira na konkretno rešenje ili smešu predstavljenu u tumoru.
U kontekstu ovog pronalaska, TPC su više tumorski, relativno više mirujući i često više hemorezistentni nego TProg (oba ETP i LTP), NTG ćelije i ne-TPC izvedene ćelije koje se infiltriraju u tumor (npr., fibroblast/stroma, endotelijalne i hematopoetske ćelije) koje čine zapreminu tumora. S obzirom na to da su konvencionalne terapije i režimi u velikoj meri konstruisane kako za debulk tumore, tako i za hitne proliferativne ćelije, TPC su verovatno otporniji na uobičajene terapije i režime nego brže proliferativne TProg i druge populacije ćelija zapreminskog tumora. Pored toga, TPC često izražava druge karakteristike koje ga čine relativno hemorezistentnim na uobičajene terapije, kao što su povećana ekspresija rezistentnog transportera na više lekova, poboljšani mehanizmi popravke DNK i antiapoptotični proteini. Ove osobine, od kojih svaka doprinosi toleranciji leka od strane TPC, predstavljaju ključni razlog za neuspeh standardnih onkoloških režima lečenja kako bi se osigurala dugoročna korist za većinu pacijenata sa naprednim stadijumom neoplazije; odn. neuspeh da se adekvatno usmere i iskorene te ćelije koje snabdevaju kontinuirani rast i povraćaj tumor (odn. TPC ili CSC).
Za razliku od mnogih tretmana iz stanja tehnike, nove kompozicije predmetnog pronalaska poželjno smanjuju učestalost ćelija koje iniciraju tumor nakon primene na subjekat bez obzira na oblik ili određenu metu (npr., genetski materijal, DLL3 antitelo ili ligandski fuzioni konstruktor) izabranog modulatora. Kao što je gore navedeno, smanjenje u frekvenciji ćelije koja inicira tumor može se pojaviti kao rezultat: a) eliminacije, osiromašenja, aktivacije, utišavanja ili inhibicije ćelija koje iniciraju tumor; b) kontrolisanje rasta, ekspanzije ili ponovnog pokretanja ćelija koje iniciraju tumor; c) prekidanje inicijacije, širenja, održavanja ili proliferacije ćelija koje iniciraju tumor; ili d) inače sprečavanjem opstanka, regeneracije i/ili metastazu tumorskih ćelija. U nekim rešenjima, smanjenje frekvencije ćelija koje iniciraju tumor se javlja kao rezultat promene jednog ili više fizioloških puteva. Promena u putu, bilo redukcijom ili eliminacijom ćelija koje iniciraju ili modifikuje njihov potencijal (npr., izazvana diferencijacija, poremećaj niche) ili na drugi način ometa njihovu sposobnost da utiče na tumorsko okruženje ili druge ćelije. Zauzvrat dopušta mnogo efikasnije lečenje poremećaja povezanih sa DLL3 inhibiranjem tumorigeneze, održavanje tumora i/ili metastaza i povraćaj.
Među postupcima koji su priznati u tehnici koji se mogu koristiti za procenu takve redukcije u frekvenciji ćelija koje iniciraju tumor jeste analiza ograničenog razblaženja bilo u in vitro ili in vivo, poželjno praćeno sa brojanjem korišćenjem Poisson distribucione statistike ili procena frekvencije prethodno definisanih konačnih događaja kao što je sposobnost generisanja tumora in vivo ili ne. Dok takva analiza ograničavajućeg razblaženja obuhvata poželjne metode izračunavanja redukcije frekvencije ćelije koja inicira tumor, druge manje zahtevne metode, mogu se takođe koristiti za efikasno određivanje željenih vrednosti, iako nešto tačnije, i u potpunosti su kompatibilne sa ovim koje se ovde uče. Stoga, kao što će se ceniti od strane stručnjaka u tehnici, takođe je moguće odrediti redukciju vrednosti frekvencija putem dobro poznatih srednjih vrednosti protočne citometrije ili imunohistohemije. Što se tiče svih gore pomenutih metoda videti, na primer, Dilla et al.2008, PMID: 18560594 & Hoey et al. 2009, PMID; 19664991
U pogledu analizu ograničenog razblaživanja, in vitro brojanje frekvencije ćelije koja inicira tumor može se postići deponovanjem bilo frakcionisanih ili nefrakcionisanog ćelija humanog tumora (npr., iz lečenih i nelečenih tumora, respektivno) u in vitro uslovima rasta koji podstiču formiranje kolonija. Na ovaj način, ćelije koje formiraju koloniju mogu biti nabrojane jednostavnom brojanjem i karakterizacijom kolonija, ili analizom koja se sastoji od, na primer, taloženja ćelija humanog tumora na ploče u serijskim razblaženjima i bodovanjem svakog ili kao kao pozitivan ili negativan za formiranje kolonija najmanje 10 dana nakon postavljanja na ploču. In vivo eksperimenti ili analize ograničavajućeg razblaženja, koji su obično mnogo tačniji u njihovoj sposobnosti da se utvrdi frekvencija ćelije koja inicira tumor obuhvatanjem transplantacije ćelija humanog tumora, iz bilo netretirane kontrole ili tretirane populacije, na primer, u imunokompromitovanim miševima u serijskim razblaženima i potom bodovanje svakog miša ili kao pozitivan ili negativan za formiranje tumora najmanje 60 dana nakon transplantacije. Izvođenje vrednosti frekvencije ćelija analizom ograničavanja razblaženja in vitro ili in vivo je poželjno urađeno primenom Poisson distribucione statistike na poznatu frekvenciju pozitivnih i negativnih događaja, čime se obezbeđuje frekvencije za događaje koji ispunjavaju definiciju pozitivnog događaja; u ovom slučaju, formiranje kolonija ili tumora, respektivno.
Što se tiče drugih metoda kompatibilnih sa predmetnim pronalaskom koje se mogu koristiti za izračunavanje frekvencije ćelije koja inicira tumor, najčešće obuhvataju kvantitativne tehnike protočne citometrije i procedure imunohistohemijskog bojenja. Iako nisu precizne kao što su tehnike analize ograničenog razblaženja opisane odmah iznad, ove procedure su mnogo manje radno intenzivne i pružaju razumne vrednosti u relativno vremenskom okviru. Prema tome, biće prihvaćeno da kvalifikovani stručnjak može koristiti određivanje profilnog protočnog citometrijskog ćelijskog površinskog markera koristeći jedno ili više antitela ili reagensa koji vezuju tehnički prepoznatljive proteinske površinske ćelije koje su poznate da obogaćuju ćelije koje iniciraju tumor (npr., potencijalno kompatibilni markeri kao što je navedeno u PCT objavi WO 2012/031280) i time meri TIC nivoe iz različitih uzoraka. U još jednoj kompatibilnoj metodi kvalifikovani stručnjak u tehnici može nabrojati TIC frekvenciju in situ (npr., u odeljku tkiva) pomoću imunohistohemije koristeći jedno ili više antitela ili reagensa koji su u stanju da vezuju proteinske površinske ćelije za koje se misli da razgraničavaju ove ćelije.
Stručnjaci u ovoj oblasti će prepoznati da su brojni markeri (ili njihovo odsustvo) povezani sa različitim populacijama matičnih ćelija raka i da se koriste za izolaciju ili karakterizaciju podpopulacija ćelije tumora. U tom pogledu, primeri markera matičnih ćelija obuhvataju OCT4, Nanog, STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, transferinski receptor, JAM3, karboksipeptidaza M, ADAM9, onkostatin, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, nestin, Sox1, Bmi-1, eed, easyh1, easyh2, mf2, yy1, smarcA3, smarkA5, smarkD3, smarkE1, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WMT5A, WMT10B, WNT16, AXIN1, BCL9. MYC, (TCF4) SLC7A8, IL1RAP, TEM8, TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11, PPAP2C, CAV1, CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY6E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, ȕ-katenin, CD2, CD3, CD9, CD 14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, dekorin, EGFR, CD 105, CD64, CD 16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b, i CD49f. Videti, na primer, Schulenburg et al., 2010, PM1D: 20185329, U.S.P.R 7,632,678 i U.S.P.Br.2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 i 2011/0020221.
Takođe će biti od značaja da svaki od gore navedenih markera može takođe da bude korišćen kao sekundarni ciljani antigen u kontekstu bispecifičnih ili multispecifičnih antitela predmetnog pronalaska.
Slično, ne ograničavajući primeri fenotipa površinske ćelije povezane sa matičnim ćelijama kancera izvesih tipova tumora obuhvataju CD44<hi>CD24<low>, ALDH<+>, CD133<+>, CD123<+>, CD34<+>CD38-, CD44<+>CD24-, CD46<hi>CD324<+>CD66c-, CD133<+>CD34<+>CD10-CD19-, CD138-D34-D19<+>, CD133<+>RC2<+>, CD44<+>Į2ȕ1<hi>CD133<+>, CD44<+>CD24<+>ESA<+>, CD271<+>, ABCB5<+>kao i drugi površinski fenotipi matičnih ćelija kancera koji su poznati u tehnici. Videti, na primer, Schulenburg et al., 2010, supra, Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 and U.S.P.N.
2008/0138313.
Stručnjaci u ovoj oblasti će ceniti da se fenotipi markera, kao što su oni navedeni odmah iznad, mogu koristiti zajedno sa standardnom protočnom citometrijskom analizom i tehnikama sortiranja ćelija kako bi se karakterizovale, izolovale, prečistile ili obogatile TIC i / ili TPC ćelije ili ćelijske populacije za dalju analizu. Od interesa u pogledu predmetnog pronalaska CD46, CD324 i opciono, CD66c su ili visoko ili heterogeno izraženi na površini mnogih humanih ćelija tumora kolorektalnog ("CR"), dojke ("BR"), ne male ćelije pluća (NSCLC), male ćelije pluća (SCLC), pankreasa ("PA"), melanoma (Mel), jajnika ("OV"), i raka glave i vrata ("HN"), bez obzira na to da li su uzorci tumora bili primarni uzorci pacijenta sa tumorom ili NTX tumori izvedeni iz pacijenata.
Koristeći bilo koji od gore navedenih metoda i odabranih markera koji su poznati u stanju tehnike (i prikazani u Primeru 17 u nastavku), onda je moguće kvantifikovati smanjenje u frekvenciji TIC (ili TPC u njima) obezbeđen otkriveni DLL3 modulatorima (uključujući one koji su konjugovani u citotoksične agense) u skladu sa ovde navedenim učenjima. U nekim slučajevima, jedinjenja predmetnog otkrića mogu smanjiti frekvenciju TIC ili TPC (raznim mehanizmima koji su navedeni gore, uključujući eliminaciju, izazvanu diferencijaciju, poremećaj niche, utišavanje, itd.) za 10%, 15%, 20%, 25%, 30% ili čak za 35%. U drugim slučajevima, smanjenje frekvencije TIC ili TPC može biti 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ili 65%. U određenim slučajevima otkrivena jedinjenja smanjuju frekvenciju TIC ili TPC za 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili čak 95%, Naravno da će biti prihvaćeno da svako smanjenje frekvencije TIC ili TPC verovatno rezultira u odgovarajućem smanjenju u tumorigeničnostii, upornosti, ponavljanju i agresivnosti neoplazije.
IV. DLL3 Modulatori
U svakom slučaju, predmetni pronalazak je usmeren na upotrebu DLL3 modulatora, uključujući DLL3 antagoniste, za dijagnozu, teragnozu, lečenje i/ili profilaksu raznih poremećaja, uključujući bilo koji od maligniteta povezanih sa DLL3. Otkriveni modulatori mogu biti korišćeni sami ili u kombinaciji sa širokim spektrom antikancerogenih jedinjenja kao što su hemoterapeutski ili imunoterapeutski agensi (npr., terapijska antitela) ili modifikatori biološkog odgovora. U drugim odabranim primerima, dva ili više diskretnih DLL3 modulatora mogu se koristiti u kombinaciji da bi se obezbedili poboljšani anti-neoplastični efekti ili se mogu koristiti za izradu multispecifičnih konstruktora.
U određenim primerima, DLL3 modulatori predmetnog pronalaska će sadržati nukleotide, oligonukleotide, polinukleotide, peptide ili polipeptide. Naročito, primerni modulatori pronalaska mogu da sadrže antitela i fragmente koji vezuju antigen ili njihove derivate, proteine, peptide, glikoproteine, glikopeptide, glikolipide, polisaharide, oligosaharide, nukleinske kiseline, antisens konstrukte, siRNK, miRNK, bioorganske molekule, peptidomimetike, farmakološke agense i njihove metabolite, transkripcione i translacione kontrolne sekvence, i slično. U određenim primerima, modulatori će sadržati rastvorljiv DLL3 (sDLL3) ili oblik, varijantu, derivat ili njegov fragment, uključujući, na primer, DLL3 fuzioni konstruktori (npr., DLL3-Fc, DLL3-ciljani ostatak, itd.) ili DLL3-konjugati (npr., DLL3-PEG, DLL3-citotoksični agens, DLL3-brm, itd.). U drugim poželjnim primerima, DLL3 modulatori sadrže antitela ili imunoreaktivne fragmente ili njihove derivate. U naročito poželjnim primerima, modulatori predmetnog pronalaska će obuhvatati neutralizuća, osiromašena ili internalizujuća antitela ili derivate ili njihove fragmente. Štaviše, kao i gore pomenuti fuzioni konstruktori, takvi modulatori antitela mogu biti konjugovani, povezani ili drugačije povezani sa odabranim citotoksičnim agensima, polimerima, modifikatorima biološkog odgovora (BRMs) ili slično kako bi pružili usmerene imunoterapije sa raznim (i opciono višestrukim) mehanizmima delovanja. Kao što je već pomenuto gore takva antitela mogu biti pan-DLL antitela i povezana sa dva ili više članova DLL familije ili, alternativno, sadrže molekule koji vezuju antigen koji selektivno reaguju sa jednim ili oba izooblika DLL3. U još nekim poželjnim primerima, modulatori mogu raditi na genetičkom nivou i mogu sadržati jedinjenja kao antisensni konstruktori, siRNK, miRNK i slično koji međusobno reaguje ili povezuje sa genotipskom komponentom DLL3 determinante.
Dalje će se uvažiti da otkriveni DLL3 modulatori mogu uticati, utišati, neutralisati, eliminisati ili inhibirati rast, širenje ili preživljavanje tumorskih ćelija, uključujući TPC, i / ili povezane neoplazije putem različitih mehanizama, uključujući agonizaciju ili antagonizaciju izabranih puteva ili eliminišuće specifične ćelije u zavisnosti, na primer, od oblika DLL3 modulatora, bilo koji povezani korisni teret ili doziranje i način isporuke. Stoga, iako poželjni primeri, otkriveni ovde su usmereni na smanjenje, inhibiciju ili utišavanje određenih tumorskih ćelijskih podpopulacija tako da su ćelije koje oživljavaju tumor ili modulatori koji deluju sa određenim epitopom ili domenom, mora se naglasiti da su takva rešenja samo ilustrativna i nisu ograničena u bilo kom smislu. Umesto toga, kako je navedeno u priloženim patentnim zahtevima, predmetni pronalazak je široko usmerena na DLL3 modulatore i njihovu primenu u lečenju, upravljanju ili profilaksi raznih poremećaja vezanih za DLL3 bez obzira na bilo koji određeni mehanizam, vezujući region ili ciljanu populaciju tumorskih ćelija.
Bez obzira na oblik odabranog modulatora, biće prihvaćeno da odabrano jedinjenje može biti antagonistički u prirodi. Kao što je ovde korišćeno, "antagonist" se odnosi na molekul sposoban za neutralizaciju, blokiranje, inhibiranje, ukidanje, smanjenje ili ometanje sa aktivnosti određene ili specifične mete (npr., DLL3), uključujući vezivanje receptora za ligande ili interakcije enzima sa supstratima. U tom pogledu biće prihvaćeno da DLL3 antagonisti predmetnog pronalaska mogu da sadrže bilo koji ligand, polipeptid, peptid, fuzioni protein, antitelo ili imunološki aktivni fragment ili njegov derivat koji prepoznaje, reaguje, vezuje, kombinuje, konkuriše, povezuje ili na drugi način međusobno reaguje sa DLL3 proteinom ili njegovim fragmentom i eliminiše, utišava, smanjuje, inhibira, ometa, zadržava ili kontroliše rast tumora iniciranim sa ćelijama ili drugim neoplastičnim ćelijama koje uključujuću masovni tumor ili NTG ćelije. Kompatibilni antagonisti mogu dalje uključivati inhibitore malih molekula, aptamere, antisensne konstruktore, siRNK, miRNA i slične, molekule receptora ili liganda i njihove derivate koji prepoznaju ili povezuju sa DLL3 genotipskom ili fenotipskom determinantom čime menjaju šablone ekspresije ili odvajanje njegovog vezivanja ili interakcije sa supstratom, receptorom ili ligandom.
Kao što je ovde korišćeno i primenjeno na dva ili više molekula ili jedinjenja, termini "prepoznaje" ili "povezuje" će oznaćavati reakciju, vezivanje, specifično vezivanje, kombinaciju, interakciju, povezivanje, vezivanje, udruživanje, koalescenciju, spajanje ili povezivanje, kovalentno ili ne-kovalentno, molekula pri čemu jedan molekul deluje na drugi molekul.
Pored toga, kao što je prikazano u ovde navedenim primerima (npr., videti FIG.2B), neki modulatori humanog DLL3 mogu, u određenim slučajevima, unakrsno reagovati sa DLL3 iz druge vrste, osim od čoveka (npr., miševi). U drugim slučajevima, primerni modulatori mogu biti specifični za jednu ili više izooblika humanog DLL3 i neće pokazivati unakrsnu reakciju sa DLL3 ortolozima iz drugih vrsta. Naravno, u vezi sa učenjem ovdje takvi primeri, mogu sadržati pan-DLL antitela koja se povezuju sa dva ili više članova DLL porodice iz jedne vrste ili antitela koja se isključivo povezuju sa DLL3.
U svakom slučaju i kako će se razmatrati u više detalja u nastavku, stručnjaci u tehnici će ceniti da se otkriveni modulatori mogu koristiti u konjugovanom ili nekonjugovanom obliku. To znači da modulator može biti povezan sa ili konjugovan za (npr., kovalentno ili nekovalentno) farmaceutska aktivna jedinjenja, modifikatorie biološkog odgovora, anti-kancer agense, citotoksične ili citostatične agense, dijagnostičke delove ili biokompatibilne modifikatore. U tom smislu biće shvaćeno da takvi konjugati mogu obuhvatati peptide, polipeptide, proteine, fuzione proteine, molekule nukleinske kiseline, male molekule, mimetičke agense, sintetičke droge, neorganske molekule, organske molekule i radioizotope. Osim toga, kao što je ovde naznačeno, odabrani konjugat može biti kovalentno ili nekovalentno povezan za DLL3 modulator u različitim molarnim odnosima, u zavisnosti, barem delimično, na metodu koja se koristi za delovanje na konjugaciju.
V. Izrada modulatora i Snabdevanje
A. Modulatori Antitela
1. Pregled
Kao što je prethodno navedeno na naročito poželjne primere predmetnog pronalaska sadrže DLL3 modulatore u obliku antitela koja se preferentno povezuju sa jednim ili više domena izooblika DLL3 proteina i, opciono, drugih članova DLL familije. Oni obične veštine u tehnici će ceniti dobro razvijenu bazu znanja o antitelima kao što su, na primer, navedene, u Abbas et al, Cellular and Molecular Immunology, 6. izd., W.B. Saunders Company (2010) ili Murphey et al., Janeway's Immunobiology, 8. izd., Garland Science (2011).
Izraz "antitelo" je namenjen da pokrije poliklonalna antitela, multiklonalna antitela, monoklonalna antitela, himerna antitela, humanizovana i primatizovana antitela, humana antitela, rekombinantno proizvedena antitela, intratela, multispecifična antitela, bispecifična antitela, monovalentna antitela, multivalentna antitela, anti-idiotipska antitela, sintetička antitela, uključujući muteine i njihove varijante; fragmente antitela, kao što su fragmenti Fab, fragmenti F (ab '), jednolančani FvFcs, jednolančani Fvs; i njihovi derivati, uključujući Fc fuzione i druge modifikacije, i bilo koji drugi imunološki aktivni molekul, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (odn., antigensko povezivanje ili vezivanje). Štaviše, termin dalje sadrži sve klase antitela (odn. IgA, IgD, IgE, TgG i IgM) i sve izotipove (odn., IgGl, IgG4, IgG3, IgG4, IgAl i lgA2), kao i njegove varijacije osim ako je drugačije diktirano kontekstom. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama antitela označeni su označeni grčkim slovom Į, ȕ, İ, Ȗ i µ, respektivno. Laki lanci antitela od bilo koje vrste kičmenjaka mogu se dodijeliti jednom od dva jasno izražena tipa, koja se zovu kapa (ț) i lambda (Ȝ), zasnovana na amino kiselinskim sekvencama njihovih konstantnih domena.
Dok su sva takva antitela u okviru predmetnog pronalaska, poželjna rešenja koja sadrže IgG klasu imunoglobulina biće ovde detaljno diskutovana isključivo u svrhu ilustracije.
Kao što je poznato, varijabilni domeni oba lakog (VL) i teškog (VH) lančanog dela određuju prepoznavanje antigena i specifičnost, a konstantni domeni lakog lanca (CL) i teškog lanca (CH1 CH2 ili CH3) daju i regulišu važne biološke osobine kao što su sekreciju, transplacentalna mobilnost, cirkulacija polu veka, komplementarno vezivanje i slično.
"Varijabilni" region obuhvata hipervariabilna mesta koja se manifestuju u tri segmenta koja se obično nazivaju regioni za određivanje komplementarnosti (CDRs), u oba varijabilna domena lakog lanca i teškog lanca. Što su više konzervisani delovi varijabilnih domena u kojima se nalaze CDRs, nazivaju se okvirnim regionima (FRs). Na primer, kod prirodnih monomernih imunoglobulinskih G (IgG) antitela, šest CDRs prisutnih na svakom račvanju "Y" su kratke, ne-susedne sekvence amino kiselina koje su posebno pozicionirane da bi se obrazovalo mesto za vezivanje antigena kao što antitelo pretpostavlja svoju trodimenzionalnu konfiguraciju u vodenom okruženju. Stoga, svako prirodno IgG antitelo se sastoji od dva identična mesta vezivanja proksimalna do amino krajeva svakog račvanja Y.
Biće prihvaćeno da se pozicija CDR može lako identifikovati od strane stručnjaka u tehnici koristeći standardnih tehnika. Takođe poznati onima u tehnici jeste sistem numeracije opisan u Kabat et al. (1991, NIH Publication, 91-3242. National Technical Information Service, Springfield, Va.). U tom pogledu, Kabat i sar. definišu sistem numeracije za sekvence varijabilnog domena koje se primenjuje na bilo koje antitelo. Jedan od stručnjaka u ovoj oblasti može nedvosmisleno dodeliti ovaj sistem "Kabat numeracija" u bilo koju varijablnu domensku sekvencu, bez oslanjanja na bilo koji eksperimentalni podatak izvan same sekvence. Osim ako nije drugačije navedeno, reference za brojanje određenih pozicija amino kiselinskih ostataka u antitela su u skladu sa Kabat sistemom numeracije.
Prema tome, prema Kabatu, u VH, ostaci 31-35 sadrže CDR1, ostaci 50-65 čine CDR2, a 95-102 sadrže CDR3, dok u VL, ostaci 24-34 su CDR1, 50-56 sadrže CDR2, i 89-97 čine CDR3. Za kontekst, u VH, FR1 odgovara domenu varijabilnog regiona koji obuhvata amino kiseline 1-30; FR2 odgovara domenu varijabilnog regiona koji obuhvata amino kiseline 36-49; FR3 odgovara domenu varijabilnog regiona koji obuhvata amino kiseline 66-94, a FR4 odgovara domenu varijabilnog regiona od amino kiselina 103 do kraja varijabilnog regiona. FRs za laki lanac su slično razdvojeni svakim CDRs varijabilnog regiona lakog lanca.
Treba imati na umu da se CDRs znatno razlikuju od antitela do antitela (i po definiciji neće pokazati homologiju sa Kabat konsenzus sekvencama). Pored toga, identitet određenih pojedinačnih ostataka na bilo kom datom Kabat mestu broj može da varira od lanca antitela do lanca antitela usled međuprostora ili alelnih divergencija. Alternativno numerisanje je predstavljeno u Chothia et a., J. Mot. Biol.196: 901-917 (1987) i MacCallum et al., J. Mel, Biol 262: 732-745 (1996), iako kao u Kabatu, granice FR su odvojene odgovarajućim CDR krajevima kao što je gore opisano. Videti takođe Chothia et al., Nature 342, str.877-883 (1989) i S. Dubel, ed., Handbook of Therapeutic Antibodies, 3. izd., WILEY-VCH Verlag GmbH i Co. (2007), gde definicije uključuju preklapanje ili podskupove amino kiselinskih ostataka u poređenju sa svakim drugi.
Amino kiselinski ostaci koji obuhvataju vezne regione ili CDRs kao što je definisano svakim od prethodno navedenih referenci i podešeni su za poređenje u nastavku.
CDR Definicije
U kontekstu predmetnog pronalaska bi će prihvaćeno da bilo koji od otkrivenih lakih i teških lanaca CDR izvedenih iz mišijeg varijabilnog regiona amino kiselinskih sekvenci prikazanih na FIG.11A ili FIG.11B se mogu kombinovati ili preurediti kako bi se obezbedila optimizovana anti-DLL3 (npr., humanizovana ili himerna anti-hDLL3) antitela u skladu sa predmetnim učenjem. To jest, jedan ili više CDRs izvedenih iz složenog varijabilnog regiona lakog lanca amino kiselinskih sekvenci prikazan na FIG.11A (SEQ ID NOS: 20 - 202, parni brojevi) ili složenog varijabilnog regiona teškog lanca amino kiselinskih sekvenci prikazan na FIG.11B (SEQ ID NOS: 21 -203, neparni brojevi) se mogu inkorporirati u DLL3 modulator i, u naročito poželjnim primerima, u graftovanom CDR ili humanizovanom antitelu koje se Iimunospecifično povezuje sa jednim ili više DLL3 izooblika. Primeri lakog (SEQ ID NOS: 204-212, parni brojevi) i teškog (SEQ ID NOS; 205 - 213, neparni brojevi) lanca varijabilnog regiona amino kiselinskih sekvenci takvih humanizovanih modulatora takođe su prikazani na FIGS.11A i 11B. Uzete zajedno ove nove amino kiselinske sekvence prikazuju devedeset dva mišijih i pet humanizovanih primernih modulatora u skladu sa predmetnim pronalaskom. Pored toga, odgovarajuće sekvence nukleinskih kiselina svakog od devedeset dva primerna mišija modulatora i pet humanizovanih modulatora koji su prikazani na FIG.11A i 11B su uključene u navedenu sekvencu priložene predmetnoj prijavi (SEQ ID NOS: 220 - 4.13).
Na FIGS.11A i 11B naznačeni CDR su definisani korišćenjem Chothia numeracije.
Međutim, kako je ovde diskutovano i prikazano u Primeru 8 u nastavku, stručnjak u tehnici može lako definisati, identifikovati, izvesti i/ili nabrojati CDRs, kao što je definisano od strane Kabat et al., Chothia et al. ili MacCallum et al. za svaku sekvencu teškog i lakog lanca koji je prikazan na FIG.11A ili FIG.11B. Shodno tome, svaka od predmetnih CDR-ova i antitela koja sadrže CDR, definisana sa svom takvom nomenklaturom su izričito obuhvaćena u okviru obima predmetnog pronalaska. U širem smislu, termini "varijabilni region CDR amino kiselinskog ostatka" ili jednostavnije "CDR" uključuju amino kiseline u CDR kao što je identifikovano korišćenjem osnovnog modela bilo koje sekvenci ili strukture kako je gore navedeno.
2. Generisanje Modulatora Antitela
a. Poliklonalna antitela
Proizvodnja poliklonalnih antitela u raznim domaćim životinjama, uključujući zečeve, miševe, pacove, itd., je opšte poznato u tehnici. U nekim primerima, poliklonalno anti-DLL3 antitelo koje sadrži serum je dobijeno krvarenjem ili žrtvovanjem životinje. Serum može biti korišćen u istraživačke svrhe u obliku dobijenom iz životinje ili, alternativno, anti-DLL3 antitela mogu biti delimično ili upotpunosti prečišćeni kako bi se obezbedile imunoglobulinske frakcije ili homogeni preparati antitela.
Ukratko, odabrana životinja je imunizovana sa DLL3 imunogenom (npr., rastvorni DLL3 ili sDLL3) koji može, na primer, da sadrži odabrane izooblike, domene i/ili peptide, ili žive ćelije ili preparate ćelija koje iskazuju DLL3 ili njegove imunoreaktivne fragmente. U tehnici poznati adjuvansi koji mogu da se koriste kako bi se povećao imunološki odgovor, zavise od inokulisanih vrsta koje obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Freund-ove (potpune ili nepotpune) mineralne gelove kao što je aluminujum hidroksid, površinski aktivne supstance kao što su lizolecitin, pluronski polioli, polianioni, peptidi, uljane emulzije, keyhole limpet hemocianini, dinitrofenol, i potencijalno korisni humani adjuvansi kao što je BCG (bacil Calmette-Guerfn) i korinbaclertum parvara. Takvi adjuvansi mogu zaštiti antigen od brze disperzije izolovanjem u lokalnom depozitu, ili mogu sadržati supstance koje stimulišu domaćina da izlaže faktore koji su hemotaktički za makrofage i druge komponente imunog sistema. Poželjno imunizacija će obuhvatati dve ili više primena odabranog imunogena da se širi preko prethodno određenog perioda vremena.
Amino kiselinska sekvenca DLL3 proteina kao što je prikazano na FIGS.1C ili 1D može biti analizirana kako bi se odabrali određeni regioni DLL3 proteina za generisanje antitela. Na primer, hidrofobne i hidrofilne analize DLL3 amino kiselinske sekvence su korišćene kako bi se identifikovali hidrofilni regioni u DLL3 strukturi, regionima DLL3 proteina koji pokazuje imunogensku strukturu, kao i druge regione kiselinskih domena, mogu lako da budu identifikovani korišćenjem raznih drugih metoda koje su pozante u tehnici, kao što su Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karpius-Schultz ili Jameson-Wolf analiza. Prosečni fleksibilni profili mogu biti generisani korišćenjem postupka od strane Bhaskaran R., Ponnuswamy P. K„ 1988, int. j. Pept. Protein Res.32:242-255. Beta-turn profili mogu biti generisani korišćenjem postupka od strane Deleage, G.. Roux B„ 1987, Protein Engineering 1:289-294. Stoga, svaki DLL3 region, domen ili motiv identifikovan sa ovim programima ili postupcima je u okviru obima predmetnog pronalaska i može biti izolovan ili projektovan kako bi se obezbedili imunogeni što dovodi do modulatora koji sadrže željene osobine. Poželjni postupci za generisanje DLL3 antitela su dalje ilustrovani nizom Primera koji su ovde opisani. Postupci za dobijanje proteina ili polipeptida za korišćenje kao imunogen su opšte poznati u tehnici. Takođe dobro poznati u tehnici su postupci za dobijanje imunogenskih konjugovanih proteina sa nosačem, kao što je BSA, KLH ili drugi nosač proteina. U nekim uslovima, direktna konjugacija koja koristi, na primer, karbodiimidne reagense je korišćena. Udrugim slučajevima vezujući regagensi su efikasni. Primena DLL3 imunogena je često sprovedena ubacivanjem preko pogodnog vremenskog perioda i sa primenom pogodnih adjuvanasa, kao što je shvaćeno u tehnici. Tokom imunizacionog rasporeda, titri antitela se mogu uzeti kao što je opisano u Primerima u nastavku kako bi se odredila adekvatna formacija antitela.
b. Monoklonska antitela
Pored toga, pronalazak se odnosi na upotrebu monoklonskih antitela. Kao što je poznato u tehnici, termin "monoklonsko antitelo" (ili mAb) odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije u suštinski homogenim antitelima, odn., pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična osim za moguće mutacije (npr., prirodno nastale mutacije), koje mogu biti prisutne u manjim količinama. U određenim slučajevima takvo monoklonalno antitelo obuhvata antitelo koje sadrži polipeptidnu sekvencu koja se vezuje ili povezuje sa antigenom, pri čemu je polipeptidna sekvenca koja vezuje antigen dobijena postupkom koji obuhvata izbor pojedinačne mete koja se vezuje za polipeptidnu sekvencu iz mnoštva polipeptidnih sekvenci.
Uopšteno, i kao što je prikazano u Primeru 6 ovde, monoklonska antitela mogu biti dobijena korišćenjem širokog spektra tehnika poznatih u tehnici uključujući hibridom, rekombinantne tehnike, tehnologije fagnog prikaza, transgenske životinje (npr., XenoMouse®) ili neku njihovu kombinaciju. Na primer, monoklonska antitela mogu se proizvoditi korišćenjem hibridoma i tehnika biohemijskog i genetskog inženjeringa koje su poznate u tehnici, kao što je opisano detaljnije u Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley and Sons, 1. izd., 2009; Shire et. al. (eds.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science -f- Business Media LLC, 1. izd., 2010; Harlow et ah, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd., 1988: Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies andT-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981). Trebalo bi shvatiti da se odabrana vezujuća sekvenca može dalje promeniti, na primer, da se poboljša afinitet za cilj, da se humanizuje ciljna sekvenca vezivanja, da se poboljša njegova proizvodnja u ćelijskoj kulturi, da se smanji njegova imunogenost in vivo, da se stvori multispecifično antitelo i slično, i da antitelo koje sadrži izmenjenu ciljanu sekvencu vezivanja je takođe antitelo ovog pronalaska.
c. Himerna antitela
U drugom slučaju, antitelo pronalaska može da sadrži himerna antitela izvedena iz kovalentno spojenih proteinskih segmenata iz najmanje dve različite vrste ili tipova antitela. Kao što je poznato u tehnici, termin "himerna" antitela je usmeren na konstrukcije u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koji pripadaju određenoj klasi antitela ili podklasi, dok je ostatak lanca(aca) identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili koji pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, sve dok pokazuju željenu biološku aktivnost (US. P.N.4,816.567; Morrison et al, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).
U jednom rešenju, himerno antitelo u odnosu na učenja koja su ovde navedena mogu sadržati mišije VHi VLamino kiselinske sekvence i konstantne regione izvedeni iz humanog izvora. U drugim odgovarajućim primerima himerno antitelo predmetnog pronalaska može sadržati humanizovano antitelo kao što je opisano u nastavku. U drugom rešenju, takozvano "CDR-graftovano" antitelo, antitelo obuhvata jedan ili više CDRs iz odgovarajućih vrsta ili pripada određenoj klasi ili podklasi antitela, dok ostatak laca(aca) antitela i/ili identičan sa ili homologan odgovarajućoj sekvenci antitela izvedeni iz drugih vrsta ili pripada drugoj klasi ili podklasi antitela. Za primenu kod ljudi, odabrani ostaci CDRs mogu biti graftovana u humano antitelo, menjajući jedan ili više varijabilnih regiona koji se javljaju u prurodi ili CDRs humanog antitela. Ovi konstruktori uopšteno imaju prednost obezbeđujući modulatorne funkcije pune jačine (npr., CDC (komplementarno zavisna citotoksičnost), ADCC (antitelno zavisna ćelijsko posredovana citotoksičnost, itd.) dok se smanjuju neželjeni imuni odgovori na antitelo od strane subjekta.
d. Humanizovana antitela
Slično CDR-graftovanom antitelu jeste i "humanizovano" antitelo. Kao što je ovde korišćeno, "humanizovani" oblici ne-humanih (npr., mišijih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu od jednog ili više ne-humanih imunoglobulina. U jednom aspektu, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (primalac ili akceptor antitela) u kome se ostaci iz CDR primaoca zamjenjuju ostatkom CDR ne-ljudske vrste (donorsko antitelo) kao što su miš, pacov, zec, ili nehumanog primata koji ima željenu specifičnost, afinitet i/ili kapacitet. U određenim poželjnim rešenjima, ostaci u jednom ili više FR u varijabilnom domenu humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim nehumanim ostacima iz donorskog antitela kako bi se održala odgovarajuća trodimenzionalna konfiguracija graftovanog CDR i time poboljšao afinitet. Osim toga, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji nisu pronađeni u prijemnom antitelu ili u donorskom antitelu, na primer, dodatno poboljšavaju performanse antitela.
CDR graftovanje i humanizovana antitela su opisana, na primer, u U.S.P.Br.6,180,370 i 5,693,762. Humanizovano antitelo opciono može takođe da sadržati barem deo imunoglobulina Fc, obično onog humanog imunoglobulina. Za dalje detalje, pogledati, npr., Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); i U.S.P.Br, 6,982,321 i 7,087,409. Još jedan metod se naziva "humani" koji je opisan, na primer u U.S.P.N.2005/0008625. Pored toga, nehumano antitelo može takođe biti modifikovano specifičnim uklanjanjem humanih T-ćelijskih epitopa ili "deimunizacijom" metodima otkrivenim u WO 98/52976 i WO 00/34317.
Humanizovana antitela mogu takođe biti bioinžinjerovana koristeći uobičajene tehnike molekularne biologije, kao što su izolacija, manipulacija i ekspresija sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju sve delove varijabilnih regiona imunoglobulina iz najmanje jednog od teškog ili lakog lanca. U odnosu na izvore takve nukleinske kiseline koja je zabeležena gore, dostupne su humane sekvence germinativnih linija, kao što je otkriveno, na primer, u Tomlinson, I. A. et al (1992) J. Mot Biol.227:776-798; Cook, G. P. et al (1995) Immunol Today 16: 237-242; Chothia, D. et al (1992) J. Ado I , Biol 227:799-817; i Tomlinson et al (1995) EMBO J 14:4628-4638. V-BASB priručnik (VBASE2 - Retter et al, Nucleic Acid Res.
33; 671-674, 2005) obezbeđuje sveobuhvatni direktorijum sekvenci humanog imunoglobulinskog varijabilnog regiona (sastavljen od strane Tomlinson, I, A. et al MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK). Konsenzusni humani FRs takođe mogu da se koriste, npr., kao što je opisano u U.S.P.N.6,300,064.
U odabranim primerima, i kao što je detaljno opisano u Primeru 8 u nastavku, najmanje 60%, 65%, 70%, 75% ili 80% humanizovanih ili CDR graftovanih antitela teških ili lakih lanaca amino kiselinskih ostataka varijabilnog regiona će odgovarati onim primaocima humanih FR i CDR sekvenci. U drugim rešenjima najmanje 85% ili 90% ostataka varijabilnog regiona humanizovanog antitela će odgovarati onim primaocima FR i CDR sekvenci. U daljem poželjnom rešenju, više od 95% ostataka varijabilnog regiona humanizovanog antitela će odgovarati onim primaocima FR i CDR sekvenci.
e. Humana antitela
U drugoj realizaciji, antitela mogu da sadrže potpuno ljudska antitela. Termin "humano antitelo" odnosi se na antitelo koje poseduje amino kiselinsku sekvencu koja odgovara onom antitelu proizvedenom od strane čoveka i / ili je napravljen pomoću bilo koje od tehnika za izradu humanih antitela.
Humana antitela se mogu dobiti korišćenjem raznih tehnika koje su poznate u tehnici. Jedna tehnika je displej fage gde biblioteka (poželjno humana) antitela je sintetizovana na fagama, biblioteka je prikazana sa antigenom od interesa ili njegovim antitelnim vezujućim delom, i faga koja vezuje antigen je izolovana, od kojih se mogu dobiti imunoreaktivni fragmenti. Postupci za dobijanje i prikazivanje takvih biblioteka su opšte poznati u tehnici i opreme za generisanje biblioteka fagnog prikaza su komercijalno dostupni (npr., Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, katalog br.27-9400-01; i Stratagene SurfZAP™ phage display kit, katalog br.240612). Postoje i druge metode i reagensi koji se mogu koristiti u generisanju i prikazivanju biblioteka prikaza antitela (videti, npr., U.S.P.N.
5,223,409; PCT Objave Br. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; i Barbas et al, Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:7978-7982 (1991)).
U jednom primeru, rekombinanta humana antitela mogu biti izolovana prikazivanjem rekombinantne kombinatorne antitelne bibloteke dobijene kao što je navedeno. U jednom primeru, biblioteka je scFv biblioteka fagnog prikaza, generisana korišćenjem humanog VLi VHcDNKs dobijenog iz mRNK izolovane iz B-ćelija.
Antitela proizvedena prirodnim bibliotekama (bilo prirodnim ili sintetičkim) mogu biti umerenog afiniteta (Kaod oko 10<6>do 10<7>M<-1>), ali sazrevanje afiniteta može da se oponaša in vitro konstruisanjem i ponovnim odabirom iz sekundarnih biblioteka kao što je opisano u tehnici. Na primer, mutacija može biti uvedena nasumice in vitro korišćenjem polimeraze sklone greškama (navedeni u Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)). Dodatno, sazrevanje afiniteta se može obavljati nasumično mutacijom jednog ili više CDRs, npr. korišćenjem PGR sa prajmerima koji nose nasumičnu sekvencu koja obuhvata CDR od interesa, u određenim pojedinačnim Fv klonovima i skriningu za klonove visokog afiniteta. WO 9607754 opisuje metodu za izazivanje mutageneze u CDR lakom lancu imunoglobulina za stvaranje biblioteke gena lakog lanca. Još jedan efikasan pristup je da rekombinuje VHili VLdomene odabrane fagnim prikazom sa repertoarima V varijantama domena koji se javlja u prirodi dobijeni iz neimunizovanih donatora i skriningom za veći afinitet u nekoliko rundi lanca preispitivanjem kao što je opisano u Marks et al., Biotecknol, 10 ; 779-783 (1992). Ova tehnika omogućava proizvodnju antitela i fragmenata antitela sa konstantom disocijacije KD (koff/kon) od oko 10<-9>M ili manje.
U drugim primerima slične procedure mogu biti angažovane korišćenjem bibloteke koja sadrži eukariotske ćelije (npr., kvasac) koje iskazuju vezujuće delove na njihovoj površini. Videti, na primer, U.S.P.Br, 7,700,302 i U.S.P.Br, 12/404,059. U jednom primeru, humano antitelo je odabrano iz fagne bibloteke, gde ta fagna bibloteka iskazuje humana antitela (Vaughan et al Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al Proc. Nail. Acad. Set. USA 95:61576162 (1998). U drugim primerima, humani vezujući delovi mogu biti izolovani iz kombinatornih biblioteka antitela koji su generisani u eukariotskim ćelijama kao što je kvasac. Videti, npr., U.S.P.Br, 7,700,302. Takve tehnike povoljno dozvoljavaju za skeniranje veliki broj kandidata modulatora i obezbeđuju za relativno laku manipulaciju kandidatskih sekvenci (npr., afinitetom sazrevanja ili rekombinantim mešanjem).
Humana antitela mogu se takođe napraviti uvođenjem humanih imunoglobulinskih lokusa u transgenske životinje, npr. miševe u kojima su endogeni imunoglobulinski geni delimično ili upotpunosti inaktivirani i humani imunoglobulinski geni su uvedeni. Nakon izazivanja, proizvodnja humanog antitela je posmatrana, što usko podseća na to što se kod ljudi vidi u svim aspektima, uključujući preuređivanje gena, sklapanje i repertoar antitela. Ovaj pristup je opisan, na primer, u U.S.P.Br.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, i U.S.P.Br.6,075,181 i 6,150,584 u pogledu XenoMouse® tehnologije; i Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol 13:65-93 (1995). Alternativno, humano antitelo može biti pripremljeno putem besmrtalizacije humanih B limfocita koji proizvode antitelo usmereno protiv ciljnog antigena (takvi B limfociti mogu se oporaviti od osobe koja pati od neoplastičnog poremećaja ili može biti imunizirana in vitro). Videti, npr., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Aim R. Liss, p.77 (1985); Boemer et al., J. Immunol, 147 (I):86-95 (.1991); i U.S.P.Br.5,750,373.
3. Dalja Obrada
Bez obzira na to kako se dobijaju, ćelije koje proizvode modulator (npr., hibridomi, kolonije kvasca, itd.) mogu biti izabrane, klonirane i dalje prikazane za poželjne karakteristike uključujući, na primer, robusni rast, visoku proizvodnju antitela i, kao što je detaljnije opisano u nastavku, poželjne karakteristike antitela. Hibridomi se mogu proširiti in vivo kod singenskih životinja, kod životinja kojima nedostaje imuni sistem, npr., goli miševi, ili u ćelijskoj kulturi in vitro. Metode odabranog, klonirajućih i proširujućih hibridoma i/ili kolonija, od kojih svaka proizvede diskretne vrste antitela, su dobro poznate stručnjaku u tehnici.
B. Rekombinatna Modulatorna Proizvodnja
1. Pregled
Jednom kada je izvor usavršen, DNK koja kodira željene DLL3 modulatore može se lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., pomoću oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Izolovane i subklonirane hibridomske ćelije (ili kolonije izvedene iz faga ili kvasca) mogu služiti kao preferirani izvor takve DNK ako je modulator antitelo. Ako je poželjno, nukleinska kiselina može dalje biti manipulisana kako je ovde opisano, kako bi se stvorili agensi koji uključuju fuzione proteine ili himerna, humanizovana ili potpuno humana antitela. Naročito, izolovana DNK (koja se može modifikovati) može se koristiti za kloniranje sekvenci konstantnog i varijabilnog regiona za proizvodnju antitela.
Prema tome, u primernim slučajevima antitela mogu biti proizvedena rekombinantno, koristeći konvencionalne procedure (kao što su one navedene u Al-Rubeai; An, and Shire et. al. ail supra, and Sambrook J, & Russell D, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. izd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)) u kojima izolovane i subklonirane hibridomske ćelije (ili kolonije dobijene iz fage ili kvasca) služe kao poželjni izvor molekula nukleinske kiseline.
Termin "molekul nukleinske kiseline", kao što je ovde korišćen, ima za cilj da uključi molekule DNK i molekule RNK i njihove veštačke varijante (npr., peptidne nukleinske kiseline), bilo jednolančane ili dvolančane. Nukleinske kiseline mogu kodirati jedan ili oba lanca antitela pronalaska, ili fragment ili njegov derivat. Molekuli nukleinske kiseline pronalaska takođe uključuju polinukleotide dovoljne za upotrebu kao hibridizacione probe, PCR prajmeri ili prajmeri za sekvenciranje za identifikaciju, analizu, mutiranje ili amplifikaciju polinukleotida koji kodira polipeptid; anti-sense nukleinske kiseline za inhibiranje ekspresije polinukleotida, kao i komplementarne sekvence. Nukleinske kiseline mogu biti bilo koje dužina. One mogu biti, na primer, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 , 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 ili više nukleotida u dužini, i/ili mogu da sadrže jednu ili više dodatnih sekvenci, na primer, regulatorne sekvence i/ili biti deo veće nukleinske kiseline, na primer, vektor. Biće prihvaćeno da se takve sekvence nukleinskih kiselina mogu dalje manipulisati kako bi se stvorili modulatori koji uključuju himerna, humanizovana ili potpuno humana antitela. Prvenstveno, izolovani molekuli nukleinske kiseline (koji mogu biti modifikovani) mogu se koristiti za kloniranje sekvenci konstantnog i varijabilnog regiona za proizvodnju antitela kako je opisano u U.S.P.Br.7,709,611,
Izraz "Izolovana nukleinska kiselina" znači da je nukleinska kiselina (i) amplifikovana in vitro, na primer polimeraznom lančanom reakcijom (PCR), (ii) rekombinantno proizvedena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, cepanjem i gel-elektroforetskom frakcijom, ili (iv) sintetizovana, na primer hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna za manipulaciju rekombinantnom DNK tehnikom.
Da li je izvor nukleinske kiseline koji kodira željeni imunoreaktivni deo antitela dobijen ili izveden iz tehnologije fagnog prikaza, biblioteke kvasca, tehnologije zasnovane na hibridomima ili sintetički, treba se shvatiti da predmetni pronalazak obuhvata molekule i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju antitela ili fragmente vezanih za antigen ili njihove derivate. Dalje, predmetni pronalazak je usmeren na vektore i ćelije domaćina koji sadrže takve molekule nukleinske kiseline.
2. Hibridizacija i Sekvencni Identitet
Kao što je navedeno, pronalazak dalje obezbeđuje nukleinske kiseline koje se hibridizuju sa drugim nukleinskim kiselinama pod određenim uslovima hibridizacije. Preciznije, pronalazak obuhvata molekule nukleinskih kiselina koji hibridizuju pod umerenim ili visoko strogim uslovima hibridizacije (npr., kako je definisano u nastavku), do molekula nukleinske kiseline pronalaska. Postupci za hibridizaciju nukleinskih kiselina su dobro poznati u tehnici. Kao što je poznato, umereno strogi uslovi hibridizacije obuhvataju rastvor za pred pranje koji sadrži 5x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC), 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8,.0), hibridizacioni pufer od oko 50% formamida, 6xSSC, i temperaturu hibridizacije od 55°C (ili druge slične hibridizacijske rastvore, kao što je onaj koji sadrži oko 50% formamida, sa temperaturom hibridizacije od 42°C) i uslove ispiranja od 60°C, u 0.5xSSC, 0.1% SDS. Nizom upoređivanja hibridizacija pod strogim uslovima hibridizacije obuhvata ispiranje sa 6xSSC na 45°C, praćeno sa jednim ili više ispiranja u 0.1xSSC, 0.2% SDS na 68°C. Osim toga, jedan od stručnjaka u tehnici može manipulisati uslovima hibridizacije i/ili ispiranja kako bi povećalo ili smanjilo strogost hibridizacije tako da nukleinske kiseline koje sadrže nukleotidne sekvence koje su najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 95%, 98% ili 99% identične jedni drugima, obično ostaju hibridizovane jedni prema drugima.
Pronalazak takođe obuhvata molekule nukleinske kiseline koji su "u suštini identični" opisanim molekulima nukleinske kiseline. U jednom primeru, termin koji je u suštini identičan u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline može se tumačiti kao sekvenca molekula nukleinske kiseline koja pokazuje najmanje oko 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ili 90% identiteta sekvence. U drugim slučajevima, molekuli nukleinske kiseline pokazuju 95% ili 98% identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom nukleinske kiseline.
Osnovni parametri koji utiču na izbor uslova hibridizacije i smernice za izradu odgovarajućih uslova su, na primer, izloženi, Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989. Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11; and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et ah, eds.. John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6,3-6.4), i mogu se lako odrediti onima koji imaju stručnost u struci na osnovu, na primer, dužine i/ili bazne kompozicije nukleinske kiseline.
Sličnost sekvence za polipeptide, koja se takođe odnosi na identitet sekvence, se obično meri korišćenjem softvera za analizu sekvence. Softver za analizu proteina se podudara sa sličnim sekvencama koristeći mere sličnosti dodeljene različitim supstitucijama, brisanjima i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne amino kiselinske supstitucije. Na primer, alat za analizu sekvence GCG (Acceiris Softvare Inc.) sadrži programe kao što su "GAP" i "BEST-FIT" koji se mogu koristiti sa dodeljenim parametrima kako bi se odredila homologija sekvence ili identitet sekvence između blisko povezanih polipeptida, kao što su homologni polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između proteina divljeg tipa i njegovog mutanta.
(Videti, npr., GCG Verziju 6.1 ili Dwbin et. Ah, Biological Sequence Analysis; Probabilistic models of proteins and nucleic acids, Cambridge Press (.1998)).
Polipeptidne sekvence se takođe mogu upoređivati pomoću FASTA koristeći dodeljene ili preporučene parametre, program u GCG verziji 6.1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) obezbeđuje poravnanje i procenat identičnost sekvenci regiona najboljeg preklapanja između upita i sekvenci koje se pretražuju (Pearson (2000) supra). Još jedan poželjan algoritam kada se poredi sekvenca pronalaska u bazi podataka sa velikim brojem sekvenci iz različitih organizama je računarski program BLAST, posebno blastp ili tblastn, koristeći dodeljene parametre. Videti, npr., Altschul et al. (1990) j, Moi. Biol.215: 403410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res, 25:3389402.
U tom pogledu pronalazak takođe obuhvata molekule nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptide koji su "suštinski identični" u odnosu na polipeptidnu sekvencu antitela varijabilnog regiona (npr., ili donor lakog ili teškog lanca varijabilnog regiona ili akceptant lakog ili teškog lanca varijabilnog regiona). Kao što se primenjuje na takve polipeptide, termin "značajni identitet" ili "u suštini identičan" znači da su dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je sa programima GAP ili BEST-FIT koristeći dodeljenu težinu među prostora, dele na najmanje 60% ili 65% identiteta sekvence, poželjno najmanje 70%, 75%, 80%, 85% ili 90% identiteta sekvence, čak poželjnije najmanje 93%, 95%, 98% ili 99% identiteta sekvence. Poželjno, položaji ostatka koji nisu identični razlikuju se po konzervativnim amino kiselinskim supstitucijama. "Konzervativna amino kiselinska supstitucija" je ona u kojoj je amino kiselinski ostatak supstituisan sa drugim amino kiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac (R grupa) sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., naelektrisanje ili hidrofobičnost). Uopšteno, konzervativna amino kiselinska supstitucija neće bitno promeniti funkcionalne osobine proteina. U slučajevima kada se dve ili više amino kiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identiteta sekvence ili stepen sličnosti može se prilagoditi prema gore navedenom kako bi se ispravio za konzervativnu prirodu supstitucije.
3. Izrazi
Različiti procesi rekombinantne ekspresije, odn., proizvodnja RNK ili "RNK i protein/peptid, dobro su poznati kao što je navedeno, na primer, u Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.: Sambrook. et ah, Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed,), Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., (2000); i Current Protocols in Molecular Biology, F. M, Ausubel et al,, eels., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc.. (supplemented through 2006).
Pojedini termini od značaja uključuju "ekspresionu kontrolnu sekvencu" koja obuhvata promotere, mesta vezivanja ribozoma, poboljšače i druge kontrolne elemente koji regulišu transkripciju gena ili translaciju mRNK. Kao što je dobro poznato, "promoter" ili "promoterski region" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja se uglavnom nalazi uzvodno (5') do sekvence nukleinske kiseline koja se iskazuje i kontroliše ekspresiju sekvence obezbeđujući mesto prepoznavanja i vezivanja za RNK-polimerazu.
Primeri promotera koji su kompatibilni prema pronalasku obuhvataju promotere za SP6, T3 i T7 polimerazu, humani U6 RNA promoter, CMV promoter i njihoe veštačke hibridne promotere (npr. CMV) gde deo ili delovi budu spojeni sa delom ili delovima promotera gena drugih ćelijskih proteina kao što su npr. humani GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza) i obuhvata ili ne obuhvata dodatni(e) intron(e).
U određenim slučajevima, molekul nukleinske kiseline može biti prisutan u vektoru, gde je pogodno sa promoterom, koji kontroliše ekspresiju nukleinske kiseline. Poznati termin "vektor" obuhvata bilo koje posredničko sredstvo za nukleinsku kiselinu koja osposobljava pomenutu nukleinsku kiselinu, na primer, da se unose u prokariotske i/ili eukariotske ćelije i, gde je to potrebno, da se integrišu u genom. Metode transformisanja ćelija sisara su dobro poznate u struci. Vidi, na primer, U.S.P.Br.4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 i 4,959,455. Vektori mogu uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo pronalaska (npr., celokupno antitelo, teški ili laki lanac antitela, VH ili VL antitela ili njegov deo, ili teški ili laki lanac CDR, Fv sa jednim lancem, ili njihove fragmente ili varijante), operativno povezani sa promoterom (videti npr., PCT Objavu WO 86/05807; PCT Objavu WO 89/01036; i U,S.P.Br, 5,122,464).
Različiti domaćinski ekspresioni vektorski sistemi su komercijalno dostupni, a mnogi su kompatibilni sa učenjima ovde i mogu da se koriste za ekspresiju modulatora pronalaska. Takvi sistemi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme kao što su bakterije (npr., E. coll, B. subtilis, Streptomices) transformisane sa rekombinantnom bakteriofagnom DNK, plazmidnom DNK ili kozmidnim DNK ekspresionim vektorima koji sadrže modulator kodirajućih sekvenci; kvasac (npr., Saccharomices, Pichia) transfektovane sa rekombinantnim ekspresionim vektorima kvasca koji sadrže modulator kodirajućih sekvenci; ćelijske sisteme insekta inficirane sa rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr., bakulovirus) koji sadrže modulator kodirajućih sekvenci; ćelijske sisteme biljaka (npr., Nicotiana, Arabidopsis, Lemnaceae, kukuruz, pšenica, krompir, itd.) inficirane sa rekombinantnim virusnim ekspresionim vektorima (npr., mozaik virus karfiola; mozaik virus duvana) ili transfektovane sa rekombinantnim ekspresionim vektorima plazmida (npr., Ti plazmid) koji sadrže modulator kodirajućih sekvenci; ili ćelijski sistem sisara (npr., COS, CHO, BHK, 293, 3T3 ćelije, itd.) koji skriva rekombinantne ekspresione konstruktore koji sadrže promotere izvedene iz genoma ćelija sisara (npr., metaliothionein promoter) ili iz virusa sisara (npr., adenovirus kasnog promotera; vakcina virusa 7.5K promotera).
Kao što je ovde korišćeno, termin "ćelija domaćin" obuhvata bilo kakvu vrstu ćelijskog sistema koja može da bude porojektovana da generiše polipeptide i molekule vezujućeg antigena predmetnog pronalaska. U jednom slučaju, ćelija domaćin je napravljena tako da dozvoljava proizvodnju molekula koji vezuje antigen sa modifikovanim gikoformima. U poželjnom primeru, molekul koji vezuje antigen, ili varijantni molekul koji vezuje antigen, je antitelo, fragment antitela ili fuzioni protein. U određenim slučajevima, ćelije domaćina su dalje manipulisane da bi izrazile povećane nivoe jednog ili više polipeptida koji imaju N-acetilglukozamintransferazu III (GnT111) aktivnost. Kompatibilne ćelije domaćina obuhvataju kultivisane ćelije, npr., sisarske kultivisane ćelije, kao što su CHO ćelije, BHK ćelije, NSO ćelije, SP2/0 ćelije, ćelije YO mieloma, ćelije mieloma P3X63 miša, PER cepljive ćelije, PER.C6 ćelije ili ćelije hibridoma, ćelije kvasca, ćelije insekata i ćelije biljaka, da imenuju samo nekoliko, ali i ćelije koje se nalaze u transgenskoj životinji, transgenskoj biljci ili kultivisanom biljnom ili životinjskom tkivu.
Za dugotrajnu proizvodnju rekombinantnog proteina visokog prinosa, poželjno je stabilno izražavanje proteina. Prema tome, ćelijske linije koje stabilno izražavaju izabrani modulator mogu se konstruisati koristeći standardne tehnike poznate u tehnici. Umesto da koriste ekspresione vektore koji sadrže virusno poreklo replikacije, ćelije domaćina mogu se transformisati pomoću DNK kontrolisane pomoću odgovarajućih elemenata za kontrolu ekspresije (npr., promoter, pojačivač, sekvence, transkripcioni terminatori, lokacija poliadenizacije, itd.), i odabranog markera. Bilo koji od odabranih sistema koji su dobro poznati u tehnici mogu se koristiti, uključujući ekspresioni sistem glutaminske sinteze gena (sistem GS) koji obezbeđuje efikasan pristup za poboljšanje ekspresije pod određenim uslovima. GS sistem je otkriven u celini ili delimično u vezi sa EP patentima 0216846, 0 256055, 0323997 i 0338841 i U.S.P.Br.5,591,639 i 5,879,936.
Još jedan poželjniji ekspresioni sistem, Freedom<TM>CHO-S Kit je komercijalno obezbeđen od strane Life Technologies (Kataloški broj A13696-01) takođe omogućava razvoj stabilnih ćelijskih linija koje mogu biti korišćene za proizvodnju modulatora.
Takvi sistemi za izražavanje domaćina predstavljaju sredstvo pomoću kojih kodirajuće sekvence od značaja se mogu proizvesti i potom prečistiti, ali takođe predstavljaju ćelije koje mogu, kada su transformisane ili transfektovane sa odgovarajućim nukleotidnim kodirajućim sekvencama da iskazuju molekul pronalaska in situ. ûelija domaćina može biti ponovo transfektovana sa dva ekspresiona vektora pronalaska, na primer, prvi vektor koji kodira polipeptid izveden iz teškog lanca, a drugi vektor koji kodira polipeptid izveden iz lakog lanca.
Prema tome, u izvesnim primerima, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantne ćelije domaćina koje dozvoljavaju ekspresiju antitela ili njegovih delova. Antitela koja su dobijena ekspresijom u tako rekombinovanim ćelijama domaćina se odnose ovde kao rekombinantna antitela. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje progenske ćelije takvih ćelija domaćina, i antitela dobijena na isti način.
C. Hemijske Sinteze
Dodatno, modulatori mogu biti hemijski sintetizovani korišćenjem tehnika koje su poznate u tehnici (npr., videti Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W,H. Freeman & Co., N.Y., and Hunkapiiler, M., et al, 1984, Nature 310:105-111). Dalje, ako se želi, neklasične amino kiseline ili hemijski analozi amino kiselina (kao što su D-izomeri uobičajenih amino kiselina, 2,4-diaminobuterna kiselina, Į-amino izobuterna kiselina, 4-aminobuterna kiselina, i slično) mogu biti uvedeni kao supstitucija ili adicija u polipeptidnu sekvencu.
D. Transgenski Sistem
U drugim slučajevima modulatori mogu biti transgenski proizvedeni putem generisanja sisara ili biljke koji je transgenski za rekombinantne molekule kao što su sekvence teškog i lakog lanca imunoglobulina i koje proizvode željena jedinjenja u obliku koji se može povratiti. Ovo uključuje, na primer, proizvodnju proteinskih modulatora (npr. antitela) u, i oporavak od, mleka koza, krava ili drugih sisara. Videti, npr., U.S.P.Br.5,827,690, 5,756,687, 5,750,172, i 5,741,957. U nekim primerima, ne-humane transgene životinje koje obuhvataju humani imunoglobulinski lokus su imunizirane da proizvedu antitela.
Druge transgenske tehnike su prikazane u Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2nd ed.. Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al, Mouse-Genetics and Transgenics; A Practical Approach, Oxford University Press (2000); i Pinkerf, Transgenic Animal Technology; A Laboratory Handbook, Academic Press (1999) i U.S. P.Br.
6,417,429. U nekim primerima, nehumane životinje su miševi, pacovi, ovce, svinje, koze, stoka ili konji, a željeni proizvodi su dobijeni iz krvi, mleka, urina, pljuvački, suza, sluzi i drugih telesnih tečnosti iz kojih se lako mogu dobiti korišćenjem tehnika prečišćavanja koje su priznate u tehnici.
Drugi kompatibilni proizvodni sistemi uključuju postupke za dobijanje antitela u biljkama kao što je opisano, na primer, u U.S.P.Br.6,046.037 i 5,959.177.
E. Izolacija/Prečišćavanje
Jednom kada je modulator pronalaska proizveden rekombinantnom ekspresijom ili bilo kojom drugom opisanom tehnikom, može se prečistiti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici za prečišćavanje imunoglobulina ili proteina. S tim u vezi, modulator može biti "izolovan" što znači da je identifikovan i odvojen i/ili oporavljen iz komponente njegove prirodne sredine. Kontaminantne komponente njegove prirodne sredine su materijali koji bi ometali dijagnostičke ili terapeutske primene za polipeptid i mogu obuhvatati enzime, hormone i druge proteinske, ili neproteinske molekule. Izolovani modulatori obuhvataju modulator in situ u rekombinantnim ćelijama zbog toga što barem jedna komponenta prirodnog okruženja polipeptida neće biti prisutna.
Ako je željeni molekul proizveden intracelularno, kao prvi korak, ostaci čestice, ili ćelije domaćina ili lizidni fragmenti, mogu se ukloniti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Kada se modulator sekretira u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se uglavnom prvo koncentrišu koristeći komercijalno dostupni filter za koncentraciju proteina, na primer, Amicon ili Pellicon ultrafiltracionu jedinicu (Millipore Corp.). Nakon uklanjanja nerastvornih kontaminanata preparat modulatora se može dalje prečistiti primenom standardnih tehnika kao što su, na primer, hromatografija hidroksilapatita, elektroforeza gela, dijaliza i afinitetna hromatografija, sa afinitetnom hromatografijom od posebnog interesa. U tom pogledu protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela koja su bazirana na humanim IgG1, IgG2 ili IgG4 teškim lancima (Lmclmark, et al, J Immunol Meth 62:1 (1983)) dok se protein G preporučuje za sve izotipe miša i za humani IgG3 (Guss, et al, EMBO J 5:1567 (1986)). Druge tehnike za pročišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na koloni za razmenu jona, taloženje etanola, HPLC reverzna faza, hromatografija na silika, hromatografija na heparinu, sefarozna hromatografija na anjonskoj ili katjonskoj izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliaspartične kiseline), hromatofokusiranje, SDSPAGE i taloženje amonijum sulfatom su takođe dostupna u zavisnosti od antitela koji se treba oporaviti. U posebno poželjnim primerima, modulatori predmetnog pronalaska će biti prečišćeni, barem delimično, korišćenjem proteinske A ili proteinske G afinitetne hromatografije.
VI. Fragmenti i Derivati DLL3 Modulatora
Bez obzira koja je metodologija generisanja i proizvodnje odabrana, modulatori predmetnog pronalaska će reagovati, vezivati, kombinovati, kompleksirati, povezivati, spajati, udruživati ili na drugi način povezivati sa ciljnom determinantom (npr., antigen) i time pružiti željene rezultate. Tamo gde modulator sadrži antitelo ili fragment, konstrukciju ili njegov derivat, takva povezivanja mogu biti preko jednog ili više "mesta vezivanja" ili "komponenti vezivanja" izraženih na antitelu, gde mesto vezivanja sadrži region polipeptida koji je odgovoran za selektivno vezivanje za ciljani molekul ili antigen od značaja. Vezujući domeni sadrže najmanje jedno mesto vezivanja (npr., netaknuto IgG antitelo će imati dva vezujuća domena i dva mesta vezivanja). Primeri vezujući domeni obuhvataju varijabilni domen antitela, domen koji vezuje receptor liganda, domen koji vezuje ligand receptora ili enzimski domen.
A. Antitela
Kao što je već ranije navedeno, termin "antitelo" ima za cilj da pokrije najmanje, poliklonalna antitela, multiklonalna antitela, himerna antitela, CDR graftovana antitela, humanizovana i primatizovana antitela, humana antitela, rekombinantno proizvedena antitela, intratela, multispecifična antitela, bispecifična antitela, monovalentna antitela, multivalentna antitela, anti-idiotipska antitela, kao i sintetička antitela.
B. Fragmenti
Bez obzira koji oblik modulatora (npr., himerni, humanizirani, itd.) je odabran da primenjuje pronalazak, smatraće se da se imunoreaktivni fragmenti istog mogu koristiti u skladu sa ovim učenjem. "Fragment antitela" sadrži barem deo netaknutog antitela. Kao što se ovde koristi, termin "fragment" molekula antitela obuhvata fragmente koji vezuju antigen antitela, a termin "fragment koji vezuje antigen" odnosi se na polipeptidni fragment imunoglobulina ili antitela koji se imunospecifično vezuje ili reaguje sa odabranim antigenom ili njegovom imunogenskom determinantom ili se takmiči sa netaknutim antitelima iz kojih su fragmenti izvedeni za specifično vezivanje antigena.
Primerni fragmenti obuhvataju; VL, VH, scFv, F(ab')2 fragment, Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, pojedinačni domen fragmenta antitela, diatela, linearna antitela, molekule jednolančanog antitela i multispecifična antitela obrazovani iz fragmenata antitela. Pored toga, aktivni fragment obuhvata deo antitela koji zadržava sposobnost interakcije sa antigenom/ supstratima ili receptorima i modifikuje ih na sličan način kao kod netaknutih antitela (mada možda i sa nešto manjom efikasnosti).
U drugim izvođenjima, fragment antitela je onaj koji obuhvata Fc region i koji zadržava barem jednu od bioloških funkcija koje su obično povezane sa Fc regionom kada su prisutne u netaknutom antitelu, kao što je FcRn vezivanje, modulacija polu-veka antitela, ADCC funkcija i vezivanje komplementa. U jednom rešenju, fragment antitela je monovalentno antitelo koje ima in vivo polu-vek značajno sličan netaknutom antitelu. Na primer, takav fragment antitela može sadržati račvu antigenskog vezivanja koja se vezuje za Fc sekvencu koja je sposobna da prenese in vivo stabilnost u fragment.
Kao što bi dobro poznato stručnjaku u ovoj oblasti, fragmenti se mogu dobiti hemijskim ili enzimskim tretmanom (kao što je papain ili pepsin) netaknutog ili kompletnog antitela ili lanca antitela ili pomoću rekombinantnih sredstava. Videti, npr., Fundamental Immunology, W, E. Paul, ed,, Raven Press, N.Y, (1999), za više detaljan opis fragmenata antitela.
C. Derivati
Pronalazak dalje obuhvata imunoreaktivne derivate modulatora i antigenske vezujuće molekule koji sadrže jedan ili više modifikatora.
1. Multivalentna Antitela
U jednom slučaju, modulatori pronalaska mogu biti monovalentni ili multivalentni (npr., dvovalentni, trivalentni, itd.). Kao što je ovde korišćeno, termin "valenca" odnosi se na broj potencijalnih ciljnih mesta vezivanja povezanih sa antitelo. Svako ciljno mesto vezivanja specifično vezuje jedan ciljni molekul ili specifičnu poziciju ili lokus na ciljni molekul. Kada je antitelo monovalentno, svako mesto vezivanja molekula se specifično vezuje za pojedinu poziciju antigena ili epitopa. Kada antitelo sadrži više od jednog ciljanog mesta vezivanja (multivalentno), svako ciljno vezujuće mesto može specifično vezati iste ili različite molekule (npr., može se vezati za različite ligande ili različite antigene, ili različite epitope ili položaje na istom antigenu). Videti, na primer, U.S.P.Br.2009/0130105. U svakom slučaju, najmanje jedno od mesta vezivanja će sadržati epitop, motiv ili domen povezan sa izooblikom DLL3.
U jednom slučaju, modulatori su bispecifična antitela u kojima dva lanca imaju različite specifičnosti, kako je opisano u Millstein et al., 1983, Nature, 305: 537-539. Druge varijante uključuju antitela sa dodatnim specifičnostima kao što su trispecifična antitela. Drugi su sofisticirano kompatibilni multispecifični konstruktori i postupci njihovog dobijanja su prikazani u U.S.P.Br.2009/0155255, kao i WO 94/04690: Suresh et al., 1986, Methods in Enzymobgy, 121:210; i WO96/27011.
Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, multivalentna antitela mogu se imunospecifično vezati za različite epitope željenog ciljnog molekula ili se mogu imunospecifično vezati za ciljani molekul, kao i heterologni epitop, kao što je heterologni polipeptid ili čvrsti noseći materijal. Iako poželjna rešenja anti-DLL3 antitela samo vezuju dva antigena (odn., bispecifično antitelo), antitela sa dodatnim specifičnostima kao što su trispecifična antitela takođe su obuhvaćena predmetnim pronalaskom. Bispecifična antitela takođe uključuju unakrsna ili "heterokonjugovana" antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može se spojiti sa avidinom, a drugo sa biotinom. Takva antitela, na primer, su predložena da ciljaju ćelije imunog sistema na neželjene ćelije (U.S.P.Br.4,676,980), i za lečenje HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/200373 i EP 03089). Heterokonjugovana antitela se mogu dobiti korišćenjem bilo kog postupka za unakrsno vezivanje. Pogodni agensi za unakrsno vezivanje su dobro poznati u tehnici i otkriveni su u U.S. P.Br.4,676,980, zajedno sa nizom tehnika unakrsnog vezivanja.
U još nekim rešenjima, varijabilni domeni antitela sa željenim vezujućim specifičnostima (kombinovana mesta antitela i antigena) su spojeni za sekvence imunoglobulinskog konstantnog domena, kao što je konstantni domen teškog lanca imunoglobulina koji sadrži barem deo zglobne veze, CH2 i/ili CH3 regiona, koristeći metode koje su poznate stručnjacima u struci.
2. Modifikacije Fc Regiona
U odnosu na razne modifikacije, supstitucije, dodavanja ili brisanja u varijabilnom ili vezujućem regionu predmetni modulatora (npr. Fc-DLL3 ili anti-DLL3 antitela) koji su navedeni gore, stručnjaci u struci će ceniti da odabrani primeri predmetnog pronalaska mogu takođe sadržati supstitucije ili modifikacije konstantnog regiona (odn, Fc regiona). Naročito, DLL3 modulatori pronalaska mogu sadržati, između ostalog, jednu ili više dodatnih supstitucija amino kiselinskih ostataka, mutacija i/ili modifikacija koje rezultiraju u jedinjenju sa poželjnim karakteristikama, obuhvatajući, ali bez ograničenja da: menja farmakokinetiku, povećava serumski poluvek, povećava afinitet vezivanja, smanjuje imunogenost, povećava proizvodnju, menja vezivanje Fc liganda za Fc receptor (FcR), poboljšava ili redukuje "ADCC" (ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela) ili "CDC" (komplementno zavisna citotoksičnost) aktivnost, povećava glikolizaciju i/ili disulfidno vezivanje i modifikuje specifičnost vezivanja. U tom pogledu biće prihvaćeno da se ove Fc varijante mogu pogodno koristiti da poboljšaju efikasne anti-neoplastične osobine predmetnih modulatora.
U tom smislu, određena rešenja pronalaska mogu sadržati supstitucije ili modifikacije Fc regiona, na primer dodavanje jednog ili više amino kiselinskih ostataka, supstitucije, mutacija i/ili modifikacija da bi se dobilo jedinjenje sa poboljšanim ili poželjnim Fc efektorskim funkcijama. Na primer, promene u amino kiselinskim ostacima koji su uključeni u interakciju između Fc domena i Fc receptora (npr., FcȖRI, FcȖRIIA and B, FcȖRIII and FcRn) može voditi do citotoksičnosti i/ili farmakokinetike, kao što je povećani serumski polu vek (videti, na primer, Ravetch and Kinet, Amur. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capet et al., Iwmunometbods 4:25-34 (1994); and de Haas etal, J, Lab, Clin. Med.126:330-41 (1995)).
U odabranim rešenjima, antitela sa povećanim in vivo polu vekom mogu biti generisana modifikovanjem (npr., supstitucija, brisanje ili dodavanje) amino kiselinskih ostataka koji su identifikovani kao što je uključeno u ineterakciji između Fc domena i FcRn receptora (videti, npr., Međunarodne Objave Br. WO 97/34631; WO 04/029207; U.S.P.Br.6,737,056 i U.S.P.Br.2003/0190311. U pogledu na takva rešenja, Fc varijante mogu obezbediti polu vek kod sisara, poželjno ljudi, više od 5 dana, više od 10 dana, više od 15 dana, više od 20 dana, više od 25 dana, više od 30 dana, više od 35 dana, više od 40 dana, više od 45 dana, više od 2 meseca, više od 3 meseca, više od 4 meseca, ili više od 5 meseci. Povećani polu vek rezultuje u većem serumskom titru koji prema tome smanjuje frekvenciju primene antitela i/ili smanjuje koncentraciju antitela koja se primenjuje. Vezivanje za humani FcRn in vivo i serumski polu vek humanog FcRn peptida sa visokim afinitetom vezivanja može biti analiziran, npr., kod transgenskih miševa ili transfektovanih humanih ćelijskih linija koje iskazuju humani cRn, ili kod primata gde se polipeptidi sa varijantnim Fc regionom primenjuju. WO 2000/42072 opisuje varijante antitela sa poboljšanim vezivanjem za FcRns. Videti, takođe, npr., Shields et al J, Biol. Chero.9(2):6591-6604 (2001).
U jednom rešenju, Fc promene mogu voditi do povećane ili smanjene ADCC ili CDC aktivnosti. Kao što je poznato u tehnici, CDC se odnosi na liziranje ciljane ćelije u prisustvu komplementa, a ADCC se odnosi na obrazovanje citotoksičnosti gde se sekretovani Ig vezuje za FcRs prisutan na izvesnim citotoksičnim ćelijama (npr., prirodne ćelije ubice, neutrofili, i makrofage) koje onemogućavaju ovim citoroksičnim efektorskim ćelijama da se vezuju specifično za ciljanu ćeliju koja nosi antigen i potom ubija ciljanu ćeliju sa citotoksinima. U kontekstu predmetnog pronalaska varijante antitela su obezbeđene "izmenjenim" FcR vezujućim afinitetom, koji ili poboljšava ili smanjuje vezivanje kada se poredi sa roditeljskim ili nemodifikovanim antitelom ili sa antitelom koji sadrži prirodnu sekvencu FcR. Takve varijante koje prikazuju smanjeno vezivanje mogu posedovati malo ili bez znatnog vezivanja, npr., 0-20% vezivanje za FcR kada se poredi sa prirodnom sekvencom, npr., kao što je određeno sa tehnikama koje su opšte poznate u tehnici. U drugim rešenjima, vertijante će pokazivati poboljšano vezivanje kada se poredi sa prirodnim imunoglobulinskim Fc domenom. Biće prihvaćeno da se ove vrste Fc varijanti mogu prednostno koristiti za poboljšanje efikasnosti anti-neoplastičnih osobina predmetnih antitela. U još nekim rešenjima, takve promene dovode do povećanog afiniteta vezivanja, smanjene imunogenosti, povećane proizvodnje, izmenjene glikozilacije i/ili disulfidnih veza (npr., za mesta konjugacije), modifikovane vezivne specifičnosti, povećane fagocitoze; i/ili regulaciju ćelijskih površinskih receptora (npr., B ćelijski receptor; BCR), itd.
3. Izmenjena Glikozilacija
Još neki drugi primeri sadrže jedan ili više inženjerskih gliooblika, odn. DLL3 modulator koji sadrži izmenjeni obrazac glikozilacije ili izmenjenu kompoziciju ugljenih hidrata koja je kovalentno vezan za protein (npr., u Fc domenu). Videti, na primer, Shields, R. L. i dr. (2002) J. Biol. Ckem.277: 26733-26740. Konstruisani gliooblici mogu biti korišćeni u različite svrhe, uključujući, ali ne ograničavajući se na povećanje ili smanjenje efektorske funkcije, povećavajući afinitet modulatora za cilj ili olakšavanje proizvodnje modulatora. U određenim rešenjima gde je poželjna redukovana efektorska funkcija, molekul može biti projektovan tako da izrazi aglikoziatni oblik. Supstitucije koje mogu dovesti do otklanjanja jednog ili više varijabilnih regiona okvira glikozilacionih mesta kako bi se time eliminisali glikozilacija na tom mestu su dobro poznati (videti npr. U.S. P.Br.5,714,350 i 6,350,861). Nasuprot tome, poboljšane efektorske funkcije ili poboljšano vezivanje može se preneti na molekul koji sadrži Fc inženjeringom na jednom ili više dodatnih mesta za gikozilaciju.
Druga rešenja obuhvataju Fc varijantu koja ima izmenjen sastav giikozilacije, kao što je hipofukozilovano antitelo koje ima smanjene količine fukozilnih ostataka ili antitelo koje ima povećanu podeljenu GlcNAc strukturu. Takvi promenjeni glikozilacioni šabloni su pokazali da povećavaju ADDC sposobnost antitela. Konstruisani glikooblici mogu biti generisani bilo kojom metodom poznatom stručnjaku, na primer korišćenjem inženjerskih ili varijantnih sintetičkih ekspresija, putem istoimene ekspresije sa jednim ili više enzima (na pr. N-acetilglukozaminil transferaza III (GnT111)), izražavajući molekul koji sadrži Fc region u različitim organizmima ili ćelijskim linijama iz različitih organizama ili modifikovanjem ugljohidrata nakon izražavanja molekula koji sadrži Fc region (videti, na primer, WO 2012/117002).
4. Dodatna Obrada
Modulatori mogu biti različito modifikovani za vreme ili posle proizvodnje, npr., glikozilacijom, fosforilacijom, amidacijom, derivatizacijom sa poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, vezivanjem za molekul antitela ili drugi ćelijski ligand, itd. Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija mogu se vršiti poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući, specifično hemijsko cepanje sa cijanogen bromidom, tripsinom, himotripsinom, papainom, V8 proteazom, NaBH4, acetilacijom, formulacijom, oksidacijom, redukcijom, metaboličkom sintezom u prisustvu tunikamicina, itd.
Razne post-translacione modifikacije, takođe su obuhvaćene ovim pronalaskom uključujući, na primer, N-vezane ili O-vezane ugljovodonične lance, obradu N-terminalnih ili C-terminalnih krajeva, vezivanje hemijskih ostataka za skelet amino kiseline, hemijske modifikacije N-vezanih ili O-vezanih ugljovodoničnih lanaca i dodavanje ili brisanje ostataka N-terminalnog metionin kao rezultat ekspresije prokariotske ćelije domaćina. Štaviše, modulatori takođe mogu da budu modifikovani sa detektovanom oznakom, kao što je enzimska, fluorescentna, radioizotopska ili afinitetna oznaka kako bi se dozvolila detekcija i izolacija modulatora.
VII. Modulatorne Karakteristike
Bez obzira na to kako su dobijeni ili koji od navedenih oblika modulator uzima, različiti primeri otkrivenih modulatora mogu pokazati određene karakteristike. U odabranim slučajevima, ćelije koje proizvode antitelo (npr., hibridomi ili kolonije kvasca) mogu biti odabrane, klonirane i dalje skenirane za povoljne osobine, uključujući, na primer, robusni rast, visoku modulacionu proizvodnju i, kao što je u više detalja diskutovano u nastavku, poželjne modulatorne karakteristike. U drugim slučajevima, karakteristike modulatora mogu se preneti ili uticati odabirom određenog antigena (npr., specifični DLL3 izooblik) ili imunoreaktivnog fragmenta ciljnog antigena za inokulaciju životinje. U još nekim slučajevima odabrani modulatori mogu biti konstruisani kao što je gore opisano kako bi se unapredile ili preradile imunohemijske karakteristike kao što su afinitet ili farmakokinetike.
A. Neutrališući Modulatori
U određenim slučajevima, modulatori će sadržati ''neutrališuća'’ antitela ili derivate ili njihove fragmente. To jest, predmetni pronalazak može obuhvatati molekule antitela koji vezuju određene domene, motive ili epitope i mogu da blokiraju, redukuju ili inhibiraju biološku aktivnost DLL3. U opštem slučaju, termin "neutrališuće antitelo" odnosi se na antitelo koje se vezuje ili međusobno reaguje sa ciljanim molekulom ili ligandom i sprečava vezivanje ili spajanje ciljnog molekula za vezujući učesnik kao što je receptor ili supstrat, čime se prekida biološki odgovor koji ne bi inače bio rezultat interakcije molekula.
Biće prihvaćeno da se kompetentne vezujuće analize poznate u tehnici mogu koristiti za procenu vezivanja i specifičnosti antitela ili imunološki funkcionalnog fragmenta ili njegovog derivata. Što se tiče ovog pronalaska, antitelo ili fragment će se zadržati da bi inhibirali ili redukovali vezivanje DLL3 za vezujućeg učesnika ili supstrat kada višak antitela smanjuje količinu vezujućeg učesnika vezanog za DLL3 za najmanje oko 20%, 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili više kao što je izmereno, na primer, pomoću Notch receptora aktivnosti ili in vitro kompetitivnim vezivnim testom. U slučaju antitela na DLL3, na primer, neutrališuće antitelo ili antagonist će poželjno promeniti aktivnost Notch receptora za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90 %, 95%, 97%, 99% ili više. Biće prihvaćeno da se ova modifikovana aktivnost može meriti direktno korišćenjem tehnika priznate u tehnici ili se može izmeriti uticajem izmenjene aktivnosti koju ima nizvodno (npr., onkogeneza, preživljavanje ćelija ili aktivacija ili supresija Notch odgovarajućih gena). Poželjno, sposobnost antitela da neutralizuje aktivnost DLL3 procenjena je sa inhibicijom vezivanja DLL3 na Notch receptor ili procenom njegove sposobnosti da se oslobodi DLL3 posredovana represija Notch signalizacije.
B. Interni Modulatori
Postoje dokazi da značajan deo izraženog DLL3 proteina ostaje povezan sa površinom ćelija tumora, što omogućava lokalizaciju i internalizaciju otkrivenih modulatora. U poželjnim primerima, takvi modulatori mogu biti povezani sa, ili konjugovani za, anti-kancerne agense kao što su citotoksični ostaci koji ubijaju ćeliju nakon internalizacije. U posebno poželjnim primerima, modulator će sadržati internališući konjugat lek antitela.
Kao što je ovde korišćeno, modulator koji "internalizuje" je onaj koji se uzima (zajedno sa bilo kojim korisnim opterećenjem) od strane ćelije nakon vezivanja za pridruženi antigen ili receptor. Kako će se razumeti, modulator za internalizaciju može, u poželjnim slučajevima, obuhvatati antitelo koje uključuje fragmente antitela i njihove derivate, kao i konjugate antitela.
Internalizacija se može desiti in vitro ili in vivo. Za terapeutske primene, internalizacija će se poželjno pojaviti in vivo kod subjekta kome to treba. Broj internalizovanih molekula antitela može biti dovoljan ili adekvatan za ubijanje ćelija koje ekspresuju antitelo, naročito matićne ćelije koje ekspresuju antitelo. U zavisnosti od potencijala antitela ili konjugata antitela, u nekim slučajevima, uzimanje pojedinačnog molekula antitela u ćeliju dovoljno je da ubije ciljanu ćeliju na koju se antitelo vezuje. Na primer, određeni toksini su toliko snažni da je internalizacija nekoliko molekula toksina konjugovanih na antitelu dovoljna da ubije tumorsku ćeliju. Bilo da se antitelo internalizuje nakon vezivanja na ćeliju sisara, može se odrediti raznim analizama uključujući i one opisane u sledećim primerima u nastavku (npr., primeri 12 i 15-17), Metode koje otkrivaju da li se antitelo internalizuje u ćeliju takođe su opisane u U.S.P.Br.7.619.068.
C. Iscrpljeni Modulatori
U drugim primerima antitela će obuhvatati iscrpljena antitela ili derivate ili njihove fragmente. Termin "iscrpljeno" antitelo se odnosi na antitelo koje se poželjno vezuje za ili povezuje sa, antigenom na ili blizu površine ćelije i indukuje, promoviše ili izaziva smrt ili eliminiše ćeliju (npr., sa CDC, ADCC ili unošenje citotoksičnog agensa). U nekim rešenjima, odabrana iscrpljena antitela će biti povezana ili konjugovana za citotoksični agens.
Poželjno, antitelo koje je iscrpljeno biće u stanju da ukloni, onesposobi, eliminiše ili ubije najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% DLL3 tumorskih ćelija u definisanoj populaciji ćelije. U nekim rešenjima, populacija ćelije može sadržati obogaćene, podeljene, prečišćene ili izolovane ćelije koje oživljavaju tumor. U drugim rešenjima, populacija ćelije može da sadrži celokupne tumorske uzorke ili heterogene tumorske ekstrakte koji sadrže ćelije koje oživljavaju tumor. Stručnjaci u ovoj oblasti će ceniti da standardne biohemijske tehnike kao što su opisane u Primerima u nastavku (npr., Primeri 13 i 14) mogu da se koriste za praćenje i kvantifikovanje iscrpljenih tumorskih ćelija ili ćelija koje oživljavaju tumor u skladu s učenjem ovde.
D. Grupisanje i Vezivanje Epitopa
Dalje će biti priznati otkriveni modulatori anti-DLL3 antitela koji će se povezati sa, ili vezati za, ili diskretne epitope ili imunogene determinante predstavljene od strane odabranog cilja ili njegovog fragmenta. U određenim rešenjima, epitop ili imunogene determinante obuhvataju hemijski aktivne površinsko grupisane molekule, kao što su amino kiseline, bočni lanci šećera, fosforilne grupe ili sulfonilne grupe, i, u određenim rešenjima, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Stoga, kao što je ovde korišćen, izraz "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu za specifično vezivanje za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor ili na drugi način međusobno reagujući sa molekulom. U određenim rešenjima, rečeno je da antitelo specifično vezuje (ili imunospecifično vezuje ili reaguje) antigen kada prepoznaje svoj ciljani antigen u kompleksnoj smeši proteina i/ili makromolekula. U poželjnim rešenjima, rečeno je da antitelo specifično vezuje antigen kada je konstanta disocijacije ravnoteže (KD) manja ili jednaka 10<-6>M ili manja ili jednaka 10<-7>M, još poželjnije kada je konstanta ravnotežne disociacije manja ili jednaka 10<-8>M, a prvenstveno kada je konstanta disocijacije manja ili jednaka 10<-9>M.
Više direktno, izraz "epitop" je korišćen u svom uobičajenom biohemijskom smislu i odnosi se na onaj deo ciljnog antigena koji je sposoban da bude prepoznat i specifično vezan određenim modulatorom antitela. Kada je antigen polipeptid kao što je DLL3, epitopi mogu generalno biti formirani od obe kontinualne amino kiseline i bez graničnih amino kiselina upotpunjene tercijarnim preklapanjem proteina ("konformacioni epitopi"). U takvim konformacijskim epitopima tačke interakcije se javljaju preko amino kiselinskog ostatka na protein koji su linearno odvojeni jedni od drugih. Epitopi formirani iz graničnih amino kiselina (ponekad se nazivaju "linearni" ili "kontinuirani" epitopi) se obično zadržavaju nakon denaturisanja proteina, dok se epitopi formirani pomoću tercijalnog preklapanja tipično izgube nakon denaturisanja proteina. U svakom slučaju, epitop antitela obično obuhvata najmanje 3, a obično najmanje 5 ili 8-10 amino kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
U tom pogledu biće prihvaćeno da u određenim slučajevima, epitop može biti povezan sa, ili boravi u, jednim ili više regiona, domena ili motiva DLL3 proteina (npr., amino kiseline 1-618 izooblika 1). Kao što je diskutovano u više detalja ovde ekstracelularni region DLL3 proteina obuhvata niz opšte poznatih domena koji uključuju šest EGF-sličnih domena i DSL domen. Za svrhu predmetnog pronalaska termin "domen" će se koristiti u skladu sa njegovim opšte prihvaćenim značenjem i odnosiće se na identifikacioni ili definisani konzervirani strukturalni entitet u okviru proteina koji pokazuje određeni sekundarni strukturni sadržaj. U mnogim slučajevima, homologni domeni sa zajedničkim funkcijama će obično prikazati sekvencne sličnosti i mogu se naći u nizu različitih proteina (npr., EGF-slični domeni su navodno pronađeni u najmanje 471 različita proteina). Slično tome, termin "motiv", koji je priznat u tehnici, će se koristiti u skladu sa njegovim opštim značenjem i generalno se odnosi na kratki, konzervirani region proteina koji je obično deset do dvadeset graničnih amino kiselinskih ostataka. Kao što je diskutovano kroz opis, odabrani primeri sadrže modulatore koji se povezuju ili vezuju za epitop ununtar određenih regiona, domena ili motivima DLL3.
U svakom slučaju, kada se odredi željeni epitop na antigenu, moguće je generisati antitela na taj epitop, npr., imuniziranjem sa peptidom koji sadrži epitop koristeći tehnike opisane u ovom pronalasku. Alternativno, tokom procesa pronalaska, generisanje i karakterizacija antitela mogu da objasne informacije o poželjnim epitopima koji se nalaze u određenim domenima ili motivima. Iz ovih informacija, onda je moguće konkurentno prikazati antitela za vezivanje za isti epitop. Pristup da se sprovede ovo jeste da se sprovedu studije konkurencije da bi se pronašla antitela koja se kompetitivno vezuju jedan sa drugima, odn. antitela se takmiče za vezivanje za antigen. Proces visokog protoka za grupisanje antitela bazirani na njihovim unakrsnim konkurencijama je opisano u WO 03/48731. Ostali postupci grupisanja ili nivo domena ili mapiranje epitopa koji sadrže takmičarski modulator ili ekspresiju fragmenta antigena na kvascu je izložen u Primerima 9 i 10 u nastavku.
Kako se ovde koristi, termin "grupisanje" odnosi se na postupke koji se koriste za grupisanje ili klasifikaciju antitela na osnovu njihovih karakteristika vezivanja antigena i konkurencije. Iako su tehnike korisne za definisanje i kategorizaciju modulatora predmetnog pronalaska, grupa se ne uvek direktno uzajamno vezuje sa epitopama, a takva inicijalna određivanja vezivanja epitopa mogu se dodatno odnositi i potvrditi drugim metodologijama koje su priznate u tehici, kao što je ovde opisano. Međutim, kako je diskutovano i prikazano u Primerima u nastavku, empirijsko dodeljivanje modulatora antitela na pojedine grupe daje informacije koje mogu biti indikativne za terapeutski potencijal otkrivenih modulatora.
Preciznije, može se odrediti da li se izabrano referentno antitelo (ili njegov fragment) vezuje za isti epitop ili unakrsne konkurencije za vezivanje sa drugim test antitelom (odn., je u istoj grupi) korišćenjem postupaka poznatih u tehnici i izloženih u Primerima ovde. U jednom primeru, referentni modulator za antitelo je povezan sa DLL3 antigenom pod uslovima zasićenja, a zatim se sposobnost sekundarnog ili test modulatora antitela da se vezuje za DLL3 utvrđuje korišćenjem standardnih imunohemijskih tehnika. Ako je test antitelo sposobno da se u suštini vezuje za DLL3 u isto vreme kao i referento anti-DLL3 antitelom, onda se sekundarno ili test antitelo vezuje za različit epitop od primarnog ili referentnog antitela. Međutim, ako test antitelo nije u stanju da se u suštini veže za DLL3 u isto vreme, onda test antitelo se vezuje za isti epitop, preklapajući epitop, ili epitop koji je u neposrednoj blizini (bar sterički) do epitopa koji vezuje sa primarnim antitelom. To jest, test antitelo se takmiči za vezivanje antigena i nalazi se u istoj grupi kao referentno antitelo.
Termin "takmičenje" ili "konkurentno antitelo" kada se koristi u kontekstu otkrivenih modulatora označava konkurenciju između antitela utvrđenih testom u kojem test antitelo ili imunološki funkcionalni fragment pod testom sprečava ili inhibira specifično vezivanje referentnog antitela na zajednički antigen. Obično, takav test obuhvata upotrebu prečišćenog antigena (npr., DLL3 ili domena ili njegovog fragmenta) vezan za čvrstu površinu ili ćelije koje nose bilo šta od ovoga, neoznačeni test imunoglobulin i označeni referentni imunoglobulin. Konkurentna inhibicija je izmerena sa određivanjem količine etikete vezane za čvrstu površinu ili ćelije u prisustvu testnog imunoglobulina. Obično je testni imunoglobulin prisutan u višku i/ili je dozvoljeno da se prvo vezuje. Antitela identifikovana pomoću konkurentskog testa (konkurentna antitela) uključuju antitela koja se vezuju za isti epitop kao i referentno antitelo i antitela koja se vezuju za susedni epitop dovoljno proksimalan za epitop vezan za referentno antitelo za steričnu smetnju koja se dešava. Dodatni detalji u vezi sa metodama za određivanje konkurentskog vezivanja su navedeni u Primerima ovde. Uobičajeno kada je prisutno nadmetanje antitela, on će inhibirati specifično vezivanje referentnog antitela na zajednički antigen za najmanje 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% Ili 75%. U nekim slučajevima, vezivanje je inhibirano za najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 97% ili više.
Nasuprot tome, kada je referentno antitelo vezano poželjno će inhibirati vezivanje naknadno dodatog test antitela (odn. DLL3 modulator) za najmanje 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ili 75%. U nekim slučajevima, vezivanje test antitela je inhibirano za najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 97% ili više.
Što se tiče predmetnog pronalaska, i kao što je navedeno u Primerima 9 i 10 u nastavku, utvrđeno je (preko površinske plazmonske rezonance ili bio-slojne interferometrije) da ekstracelularni domen DLL3 definiše najmanje devet grupa sa kompetitivnim vezivanjem nazvan "grupa A" do "grupa I" ovde. S obzirom na rezoluciju koja je obezbeđena sa modulatornim vezujućim tehnikama, veruje se da ovih devet grupa sadrže većinu grupa koji su prisutni u ekstracelularnom regionu DLL3 proteina.
U tom pogledu, i kao što je poznato u ovoj oblasti i detaljno opisano u Primerima u nastavku, mogu se dobiti željeni podaci o grupisanju ili konkurentnom vezivanju korišćenjem direktne ili indirektne čvrste faze radioimuno analize (RIA), direktne ili indirektne čvrste faze enzimske imuno analize (EIA ili ELISA), sendvič konkurentske analize, Biacore™ 2000 sistem (odn., površinska plazmonska rezonanca - GE Healthcare), ForteBio® Analizator (odn., bio-slojna interferometrija - ForteBio, Inc.) ili metodologija protočne citometrije. Termin "površinska plazmonska rezonanca", kako se ovde koristi, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu realnog vremena specifičnih interakcija putem detekcije izmena u koncentracijama proteina unutar biosenzorskog matriksa. Termin "bio-slojna interferometrija" odnosi se na optičku analitičku tehniku koja analizira interferencijalni obrazac bele svetlosti reflektovane sa dve površine: sloj imobilizovanog proteina na vrhu biosenzora i unutrašnjeg referentnog sloja. Svaka promena u broju molekula vezanih za vrh biosenzora izaziva promenu u šablonu međusobnog uticaja koji može da bude izmeren u realnom vremenu. U posebno poželjnim rešenjima analiza (bilo površinska plazmonska rezonanca, bio-slojna interferometrija ili protočna citometrija) se izvodi korišćenjem instrumenta Biacore ili ForteBio ili protočne citometrije (npr. FACSAria II) kao što je prikazano u dole navedenim primerima.
U cilju dalje karakterizacije epitopa koje otkriveni modulatori antitela DLL3 povezuju ili se vezuju, mapiranje epitopa na nivou domena je izvedeno korišćenjem modifikacije protokola opisanog od strane Cochran et al. (J Immunol Methods, 287 (1-2):147-158 (2004)).
Ukratko, pojedinačni domeni DLL3 koji sadrže specifične sekvence amino kiseline su izraženi na površini kvasca i vezivanje za svako DLL3 antitelo je određeno protočnom citometrijom. Rezultati su opisani u nastavku u Primeru 10 i prikazani na FIGS.14A i 14B.
Druge kompatibilne tehnike mapiranja epitopa obuhvataju skeniranje mutanata alaninom, peptidne blotove (Reineke (2004) Metode Mol Biol 248: 443-63) ili analizu cepanja peptida. Pored toga, mogu se koristiti metode poput ekspresije epitopa, ekstrakcije epitopa i hemijske modifikacije antigena (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). U drugim rešenjima, profiliranje pomoću modifikacije (MAP), takođe poznato kao profilisanje antitela na osnovu strukture antigena (ASAP), obezbeđuje metodu koja kategorizuje veliki broj monoklonskih antitela (mAbs) usmerenih protiv istog antigena prema sličnostima veznog profila svako antitelo za hemijske ili enzimsko modifikovane površine antigena (U.S.P.Br.2004/0101920,). Svaka kategorija može odražavati jedinstveni epitop ili se jasno razlikuju od ili delimično se preklapaju sa epitopom koji je predstavljen drugom kategorijom. Ova tehnologija omogućava brzo filtriranje genetski identičnih antitela, tako da se karakterizacija može fokusirati na genetski različita antitela. Biće prihvaćeno da se MAP može koristiti za sortiranje h.DLL3 modulatora antitela pronalaska u grupe antitela koje vezuju različite epitope.
Agensi korisni za promenu strukture imobilizovanog antigena uključuju enzime kao što su proteolitički enzimi (npr., tripsin, endoproteinaze Glu-C, endoproteinaza Asp-N, himotripsin itd.). Agensi koji su korisni za promenu strukture imobilizovanog antigena mogu takođe biti hemijski agensi, kao što su sukcinimidil estri i njihovi derivati, jedinjenja koja sadrže primarne amine, hidrazini i karbohidrazini, slobodne amino kiseline, itd.
Antigenski protein se može imobilizovati ili na površinama biosenzorskog čipa ili polistirenskim perlama. Ovaj drugi se može obraditi pomoću, na primer, testa kao što je multipleks LUMINEKS™ test za detekciju (Lummok Corp.). Zbog kapaciteta LUMiNEKS-a da se bavi multipleks analizom sa do 100 različitih tipova perli, LUMINEKS obezbeđuje skoro neograničene antigenske površine sa različitim modifikacijama, rezultujući u poboljšanoj rezoluciji u profiliranju epitopa antitela u toku biosenzorske analize.
E. Vezujuće Karakteristike Modulatora
Pored specifičnosti epitopa, otkrivena antitela mogu da se karakterizuju koristeći fizičke karakteristike kao što su, na primer, afiniteti vezivanja. U tom pogledu, predmetni pronalazak dalje obuhvata upotrebu antitela koja imaju visoki vezivni afinitet za jednu ili više izooblika DLL3 ili, u slučaju pan-antitela, više od jednog člana DLL familije.
Termin "KD" kao što je ovde korišćeno, ima za nameru da se odnosi na konstatnu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Za antitelo pronalaska je rečeno da imunospecifično vezuje njegov ciljani antigen kada je konstanta disocijacije KD(koff/kon) < 10<-7>M. Antitelo posebno vezuje antigen sa visokim afinitetom kada je KD< 5x10<-9>M, i sa veoma visokim afinitetom kada je KD< 5x10<-10>M. U jednom rešenju pronalaska, antitelo ima KD< 10<-9>M i offstopa od oko 1x10<-4>/sec. U jednom rešenju pronalaska, off-stopa je < 1x10<-5>/sec. U drugim rešenjima pronalaska, antitela će se vezati za DLL3 sa KDizmeđu oko 10<-7>M i 10<-10>M, a pak u drugom rešenju vezaće se sa KD< 2x10<-10>M. Ipak drugi odabrani primeri predmetnog pronalaska obuhvataju antitela koja imaju konstantu disocijacije ili KD(koff/kon) manje od 10<-2>M, manje od 5x10<-2>M, manje od 10<-3>M, manje od 5x10<-3>M, manje od 10<-4>M, manje od 5x10<-4>M, manje od 10<-5>M, manje od 5x10<-5>M, manje od 10<-6>M, manje od 5x10<-6>M, manje od 10<-7>M, manje od 5x10<-7>M, manje od 10<-8>M, manje od 5x10<-8>M, manje od 10<-9>M, manje od 5x10<-9>M, manje od 10<-10>, manje od 5x10<-10>M, manje od 10<-11>, manje od 5x10<-11>M, manje od 10<-12>M, manje od 5x10<-12>M, manje od 10<-13>M, manje od 5x10<-13>M, manje od 10<-14>M, manje od 5x10<-14>M, manje od 10<-15>M ili manje od 5x10<-15>M.
U određenim primerima, antitelo pronalaska koje se imunospecifično vezuje za DLL3 ima konstantu stope vezivanja ili kon(ili ka) stopu (DLL3 (Ab) antigen (Ag)<k>
onĸAb-Ag) od najmanje 10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 2x10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 5X10<5>M<-1>s<-1>, najmanje 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 5x10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 10<7>M<-1>s<-1>, najmanje 5X10<7>M<-1>s<-1>, ili najmanje 10<8>M<-1>s<-1>.
U drugom primeru, antitelo pronalaska koje se imunospecifično vezuje za DLL3 ima konstatnu stope disocijacije ili koff(ili kd) stopu (DLL3 (Ab) antigen (Ag)<k>
offĸAb-Ag) manje od 10<-1>s<-1>, manje od 5x10<-1>s<-1>, manje od 10<-2>s<-1>, manje od 5x10<-2>s<-1>, manje od 10<-3>s<-1>, manje od 5x10<-3>s<-1>, manje od 10<-4>s<-1>, manje od 5x10<-4>s<-1>, manje od 10<-5>s<-1>, manje od 5x10<-5>s<-1>, manje od 10<-6>s<-1>, manje od 5x10<-6>s<-1>, manje od 10<-7>s<-1>, manje od 5x10<-7>s<-1>, manje od 10<-8>s<-1>, manje od 5x10<-18>s<-1>, manje od 10<-9>s<-1>, manje od 5x10<-9>s<-1>ili manje od 10<-10>s<-1>.
U drugim odabranim rešenjima predmetnog pronalaska anti-DLL3 antitela će imati konstatnu afiniteta ili Ka(kon/koff) od najmanje 10<2>M<-1>, najmanje 5x10<2>M<-1>, najmanje 10<3>M<-1>, najmanje 5x10<3>M<-1>, najmanje 10<4>M<-1>, najmanje 5x10<4>M<-1>, najmanje 10<5>M<-1>, najmanje 5x10<5>M<-1>, najmanje 10<6>M<-1>, najmanje 5x10<6>M<-1>, najmanje 10<7>M<-1>, najmanje 5x10<7>M<-1>, najmanje 10<8>M<-1>, najmanje 5x10<8>M<-1>, najmanje 10<9>M<-1>, najmanje 5x10<9>M<-1>, najmanje 10<10>M<-1>, najmanje 5x10<10>M<-1>, najmanje 10<11>M<-1>, najmanje 5x10<11>M<-1>, najmanje 10<12>M<-1>, najmanje 5x10<12>M<-1>, najmanje 10<13>M<-1>, najmanje 5x10<13>M<-1>, najmanje 10<14>M<-1>, najmanje 5x10<14>M<-1>, najmanje 10<15>M<-1>ili najmanje 5x10<15>M<-1>.
Osim gore pomenutih modulatorskih karakteristika, antitela predmetnog pronalaska mogu se dodatno okarakterisati pomoću dodatnih fizičkih karakteristika koje uključuju, na primer, termičku stabilnost (npr., temperaturu topljenja; Tm) i izoelektrične tačke. (Videti, npr., Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14:1023; Vermeer et al., 2000, Biophys. J.78:394-404; Vermeer etaL, 2000, Biophys. J.79: 2150-2154).
VIII. Konjugovani Modulatori
A. Pregled
Jednom kada su modulatori pronalaska generisani i/ili izrađeni i odabrani u skladu sa ovde navedenim učenjima, oni mogu biti vezani sa, spojeni sa, konjugovani na (npr., kovalentno ili ne-kovalentno) ili na drugi način povezani sa farmaceutskim aktivnim ili dijagnostičkim delovima ili biokompatibilnim modifikatorima. Kao što se ovde koristi termin "konjugat" ili "konjugat modulatora" ili "konjugat antitela" biće široko korišćen i označava bilo koji biološki aktivan ili detektabilan molekul ili lek koji je povezan sa otkrivenim modulatorima bez obzira na metod povezivanja. U tom pogledu biće shvaćeno da takvi konjugati mogu, u odnosu na otkrivene modulatore, da sadrže peptide, polipeptide, proteine, prolekove koji su metabolizirani u aktivni agens in vivo, polimere, molekule nukleinske kiseline, male molekule, vezivne agense, mimetičke agense, sintetički lekovi, neorganski molekuli, organski molekuli i radioizotopi. Osim toga, kao što je prethodno naznačeno, odabrani konjugat može biti kovalentno ili ne-kovalentno povezan sa modulatorom ili vezan za njega i pokazuje različite stehiometrijske molarne odnose, u zavisnosti, bar delimično, od metode koja se koristi za uticanje na konjugaciju.
Posebno poželjni aspekti predmetnog pronalaska će obuhvatiti konjugate antitela modulatora ili konjugate antitela i leka koji se mogu koristiti za dijagnozu i/ili lečenje proliferativnih poremećaja. Biće prihvaćeno da, ukoliko nije drugačije diktirano kontekstom, termin "konjugat antitelo-lek" ili "ADC" ili formula M-[L-D]n će se držati da obuhvate konjugate koji sadrže oba, i terapeutske i dijagnostičke grupe. U takvim slučajevima jedinjenja konjugata antitela i leka sadrže DLL3 modulator (tipično anti-DLL3 antitelo) kao modulator ili ćelijska vezivna jedinica (skraćeno kao CBA, M ili Ab ovde), terapeutik (npr., sredstvo protiv karcinoma) ili dijagnostički deo (D), i opciono linker (L) koji povezuje lek i agens za vezivanje antigena. Za svrhu predmetnog pronalaska "n’’ će se smatra da označava ceo broj od 1 do 20. U poželjnom slučaju, modulator je DLL3 mAb koji sadrži najmanje jedan CDR iz varijabilnih regiona teškog i lakog lanca kako je prethodno opisano.
Stručnjaci u ovoj oblasti će ceniti da postoji veliki broj različitih reakcija za vezivanje ili povezivanje terapeutskih ili dijagnostičkih ostataka i/ili linkera za vezujuće agense. U odabranim primerima, ovo se može postići reakcijom amino kiselinskih ostataka vezujućeg agensa, npr., molekul antitela, koji uključuje amino grupe lizina, slobodne karboksilne kiselinske grupe glutaminske i aspartinske kiseline, sulfhidrilne grupe cisteina i razne grupe aromatičnih amino kiselina. Jedna od najčešće korišćenih nespecifičnih metoda kovalentnog vezivanja je karbodiimidna reakcija za vezivanje karboksi (ili amino) grupe jedinjenja za amino (ili karboksi) grupama antitela. Dodatno, bifunkcionalni agensi kao što su dialdehidi ili imidoesteri koriste se za povezivanje amino grupe jedinjenja sa amino grupama molekula antitela. Takođe dostupno za vezivanje lekova na agense za vezivanje je Schiff bazna reakcija. Ovaj postupak podrazumeva periodičnu oksidaciju leka koji sadrži glikol ili hidroksi grupe, čime se formira aldehid, koji potom reaguje sa vezujućim agensom. Vezivanje se odvija formiranjem Schiff baze sa amino grupama vezujućeg agensa. Izotiocianati i azlaktoni se takođe mogu koristiti kao agensi za kuplovanje za kovalentno vezivanje lekova za agense za vezivanje.
U drugim slučajevima otkriveni modulatori pronalaska mogu biti konjugovani ili povezani sa proteinima, polipeptidima ili peptidima koji prenose izabrane karakteristike (npr., biotoksine, biomarkere, oznake prečišćavanja, itd.). U određenim poželjnim primerima predmetni pronalazak obuhvata primenu modulatora ili njihovih fragmenata rekombinantno spojeni ili hemijski konjugovani (uključujući obe, i kovalentne i ne-kovalentne konjugacije) na heterologni protein ili peptid gde protein ili peptid sadrži najmanje 10, u najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 60, najmanje 70, najmanje 80, najmanje 90 ili najmanje 100 amino kiselina. Konstrukt ne mora biti direktno vezan, već se može javiti kroz amino kiselinske linker sekvence. Na primer, antitela se mogu koristiti za ciljanje heterolognih polipeptida na određene vrste ćelija koje iskazuju DLL3, bilo in vitro ili in vivo, spajanjem ili konjugacijom modulatora predmetnog pronalaska na antitela specifična za određene receptore ćelijske površine da bi se obezbedili bispecifični konstrukti. Pored toga, modulatori koji su spojeni ili konjugovani za heterologne polipeptide takođe mogu biti korišćeni in vitro imuno analizi i mogu biti posebno kompatibilni sa metodologijom prečišćavanja (npr., njegovim oznakama), kao što je poznato u tehnici. Videti, npr.
Međunarodnu objavu Br. WO 93/21232; Evropski patent Br. EP 439,095; Naramura et al, 1994, Immunol Lett.39:91-99; U.S. Pat. Br.5,474,981; Gillies et al, 1992, PNAS 89:1428-1432; i Fell et al, 1991, J. Immunol.146:2446-2452.
B. Linkeri
Osim gore pomenutih peptidnih linkera ili distancera, ceniće se da nekoliko drugih vrsta ili tipova linkera može biti korišćeno za povezivanje otkrivenih modulatora sa farmaceutskim aktivnim ili dijagnostičkim ostacima ili biokompatibilnim modifikatorima. U nekim rešenjima, linker se može odcepiti pod intracelularnim uslovima, tako da cepanje linkera oslobađa jedinicu leka iz antitela u intracelularno okruženje. U još nekim rešenjima, linker jedinica se ne može odcepiti i lek se oslobađa, na primer, degradacijom antitela.
Linkeri ADC su poželjno stabilni ekstracelularno, sprečavajući agregaciju ADC molekula i zadržavaju ADC slobodnu rastvorljivost u vodenom medijumu i u monomernom stanju. Pre transporta ili isporuke u ćeliju konjugat antitelo-lek (ADC) je poželjno stabilan i ostaje netaknut, odn., antitelo ostaje povezano sa ostatkom leka. Linkeri su stabilni izvan ciljane ćelije i mogu se odcepiti sa nekom efikasnom brzinom unutar ćelije. Jedinstveni linker će: (i) zadržati specifična vezujuća svojstva antitela; (ii) dozvoliti intracelularnu isporuku konjugovanog ili lekovitog ostatka; (iii) ostati stabilan i neoštećene, odn. ne odcepljen, sve dok konjugat nije isporučen ili transportovan na ciljanu lokaciju; i (iv) održati citotoksični efekta ubijanja ćelija ili citostatički efekat PBD ostatka leka. Stabilnost ADC se može meriti pomoću standardnih analitičkih tehnika kao što su masena spektroskopija, HPLC i tehnika separacije/analize LC/MS. Kovalentno vezivanje antitela i ostatka leka zahteva linker da ima dve reaktivne funkcionalne grupe, odn. blivalentnost u reaktivnom smislu. Bivalentni linkerski reagensi koji su korisni za vezivanje dva ili više funkcionalnih ili biološki aktivnih ostataka, kao što su peptidi, nukleinske kiseline, lekovi, toksini, antitela, haptene i reporter grupe su poznati, a metode su opisane kao rezultujući konjugati (Hermanson, G.T, (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, str.234-242).
U tom smislu, određena rešenja pronalaska obuhvataju primenu linkera koji se može odcepiti agensom za cepanje koje je prisutan u intraćelijskom okruženju (npr., unutar lizozoma ili endosoma ili caveolae). Linker može biti, na primer, peptidil linker koji je odcepljen intraćelijskom peptidazom ili proteaznim enzimom, uključujući, ali bez ograničenja, lizozomsku ili endosomnu proteazu. U nekim rešenjima, peptidil linker je dugačak najmanje dve amino kiseline ili najmanje tri amino kiseline. Agensi za cepanje obuhvataju katepsine B i D i plazmin, od kojih je svaki poznat da hidrolizuje derivate dipeptidnih lekova što rezultira u oslobađanju aktivnog leka unutar ciljnih ćelija. Primeri peptidil linkera koji su razdvojivi sa tiol-zavisnom proteaza Katepsin-B su peptidi koji sadrže Phe-Leu, jer je utvrđeno da je Katepsin-B visoko izražen u kanceroznom tkivu. Drugi primeri takvih linkera su opisani, na primer, u U.S.P.Br.6,214,345 i U.S.P.Br.2012/0078028.
U specifično poželjnom rešenju peptidil linker koji se može razdvojiti intracelularnom proteazom je linker Val-Cit, Ala-Val linker ili linker Phe-Lys kao što je opisao u U.S.P.Br. 6,214,345. Jedna prednost korišćenja intracelularnog proteolitičkog oslobađanja terapeutskog agensa je u tome što je agens tipično oslabljen kada je konjugovan i serumska stabilnost konjugata je tipično visoka.
U drugim rešenjima, odcepljeni linker je pH osetljiv, odn., osetljiv na hidrolizu pri određenim pH vrednostima. Obično, pH-osetljivi linker se hidrolizira pod kiselim uslovima. Na primer, može se koristiti kiselinski labilni linker koji je hidrolizovan u lizozomu (npr., hidrazon, oksim, semikarbazon, tiosemikarbazon, cis-akonitskiamid, ortoestar, acetal, ketal ili slično) (videti, npr., U.S.P.Br.5,122,368; 5,824,805; 5,622,929). Takvi linkeri su relativno stabilni u uslovima neutralnog pH, kao što su oni u krvi, ali su nestabilni ispod pH 5,5 ili 5,0, približni pH lizozoma.
U još nekim rešenjima, linker se može otcepiti u uslovima redukcije (npr., disulfidni linker). Različiti disulfidni linkeri su poznati u tehnici, uključujući, na primer, one koji se mogu formirati pomoću SATA (N-sukcinimidil-S-acetitioiacetat), SPDP (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat), SPDB (N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)butirat) i SMPT (N-sukcinimidiloksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridilditio)toluen). U još nekim konkretnim rešenjima, linker je malonatni linker (Johnson et al, 1995, Anticancer Res, 15:1387-93), maleimidobenzoilni linker (Lau et al, 1995, Bioorg-Med-Chem.3(10): 1299-1304), ili 3'-N-amid zajedno (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem, 3(10): 1305-12). U ipak drugim rešenjima, linkerna jedinica nije cepljiva i lek je otpušten sa degradacijom antitela. (Videti U.S. Objavu Br.2005/0238649). Naročito, u poželjnim rešenjima (postavljenim u U.S.P.Br.2011/0256157) kompatibilni linkeri će obuhvatati:
gde zvezdica ukazuje tačku vezivanja za citotoksični agens, CBA je ćelijski vezujući agens/modlulator, L<1>je linker, A je grupa vezivanja koja vezuje L<1>za ćelijski vezujući agens, L<2>je kovalentna veza ili zajedno sa -OC(=O)- obrazuje samo-imolativni linker, i L<1>ili L<2>je razdvojivi linker.
L<1>je poželjno razdvojivi linker, i može se odnositi kao aktivator za aktivaciju linkera za razdvajanje.
Priroda L<1>i L<2>, gde je prisutna, može da se razlikuje široko. Ove grupe su izabrane na osnovu njihovih karakteristika cepanja, koje mogu biti diktirane stanjima na mestu za koje se konjugat isporučuje. Oni linkeri koji se cepaju delovanjem enzima su poželjni, iako se takođe mogu koristiti linkeri koji se mogu odcepiti promenama u pH (npr., kiselom ili baznom promenom), temperaturi ili po zračenju (npr. fotopromenljive). Linkeri koji se mogu odcepiti pod uslovima redukcije ili oksidacije mogu takođe naći upotrebu u predmetnom pronalasku.
L<1>mogu sadržati kontinuirane sekvence amino kiselina. Amino kiselinska sekvenca može biti ciljani supstrat za enzimatsko cepanje, time dozvoljavajući otpuštanje R<10>sa N10 pozicije.
U jednom rešenju, L<1>je odcepljen dejstvom enzima, U jednom rešenju, enzim je esteraza ili peptidaza.
U jednom rešenju, L<2>je prisutan i zajedno sa -C(=O)O- obrazuje samo-imolativni linker. U jednom rešenju, L<2>je supstrat za enzimatsku aktivnost, time dozvoljavajući otpuštanje R<10>sa N10 pozicije.
U jednom rešenju, gde L<1>je odcepljiv dejstvom enzima i L<2>je prisutan, enzim ocepljuje vezu između L<1>i L<2>.
L<1>i L<2>, gde su prisutni, mogu biti spojeni vezom odabranom između:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, i -NHC(=O)NH-.
Amino grupa L<1>koja se vezuje za L<2>može da bude N-terminus amino kiseline ili može da bude izvedena iz amino grupe bočnog lanca amino kiseline, na primer lizin bočnog lanca amino kiseline.
Karboksilna grupa L<1>koja se vezuje za L<2>može da bude C-terminus amino kiseline ili može da bude izvedena iz karboksilne grupe bočnog lanca amino kiseline, na primer glutaminska kiselina bočnog lanca amino kiseline.
Hidroksi grupa L<1>koja se vezuje za L<2>može da bude izvedena iz hidroksi grupe bočnog lanca amino kiseline, na primer serin bočnog lanca amino kiseline.
Termin "bočni lanac amino kiseline" obuhvata one grupe pronađene kod: (i) amino kiselina koje se javljaju u prirodi kao što su alanin, arginin, asparagin, aspartinska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin i valine; (ii) manjih amino kiselina kao što su ornitin i citrina; (iii) neprirodnih amino kiselina, beta-ammo kiselina, sintetički analozi i derivati amino kiselina koje se javljaju u prirodi; i (iv) svi enantiomeri, dijastereomeri, izomerički obogaćeni, izotopski označeni (npr.<2>H,<3>H,<14>C,<15>N), zaštićeni oblici, i njihove racemske smeše.
U jednom rešenju, -C(=O)O- i L<2>zajedno obrazuju grupu:
gde zvezdica ukazuje tačku vezivanja za lek ili poziciju citotoksičnog agensa, talasasta linija ukazuje na tačku vezivanja za linker L<1>, Y je -N(H)-, -O-, -C(=O)N(H)- ili -C(=O)O-, i n je 0 do 3. Periferni prsten je opciono supstituisan sa jednim, dva ili tri supstituenta kao što je ovde opisano. U jednom rešenju, fenilen grupa je opciono supstituisana sa halo, NO2, R ili OR.
U jednom rešenju, Y je NH.
U jednom rešenju, n je 0 ili 1. Poželjno, n je 0.
Gde Y je NH i n je 0, samo-imolativni linker može se odnositi na p-aminobenzilkarbonil linker (ABC).
Samo-imolativni linker će dozvoliti odpuštanje zaštićenog jedinjenja kada je udaljeno mesto aktivirano, nastavljajući duž linije prikazane u nastavku (za n=0):
gde L<*>je aktivirani oblik preostalog dela linkera. Ove grupe imaju prednost odvajanja mesta aktivacije od jedinjenja koje je zaštićeno. Kao što je gore opisano, fenilen grupa može biti opciono supstituisana.
U jednom rešenju opisanom ovde, grupa L* je linker L<1>kao što je ovde opisano, koja može da obuhvata dipeptidnu grupu.
U drugom rešenju, -C(=O)O- i L<2>zajedno obrazuju grupu odabranu između:
gde zvezdica, talasasta linija, Y, i n su kao što su definisani gore. Svaki fenilski prsten je opciono supstituisan sa jednim, dva ili tri supstituenta kao što je ovde opisano. U jednom rešenju, fenilni prsten koji ima Y supstituent je opciono supstituisan, a fenilni prsten koji nema Y supstituent je nesupstituisan. U jednom rešenju, fenilni prsten koji ima Y supstituent je nesupstituisan, a fenilni prsten koji nema Y supstituent je opciono supstituisan.
U drugom rešenju, -C(=O)O- i L<2>zajedno obrazuju grupu odabranu između:
gde zvezdica, talasasta linija, Y, i n su kao što su definisani gore. E je O, S ili NR, D je N, CH, ili CR, i F je N, CH, ili CR.
U jednom rešenju, D je N.
U jednom rešenju, D je CH.
U jednom rešenju, E je O ili S.
U jednom rešenju, F je CH.
IU poželjnom rešenju, linker je catepsin labile linker.
U jednom rešenju, L<3>obuhvata dipeptid. Dipeptid može biti predstavljen kao -NH-X1-X2-CO-, gde -NH- i -CO- predstavljaju N- i C-terminale amino kiselinskih grupa X1i X2respektivno.
Amino kiseline u dipeptidu mogu biti bilo koje kombinacije prirodnih amino kiselina. Tako gde je linker catepsin labile linker, dipeptid može da bude mesto dejstva za catepsinposredovano cepanje.
Dodatno, za one amino ksielinske grupe koje imaju karboksil ili amino funkcionalnost bočnog lanca, na primer Glu i Lys respektivno, CO i NH mogu predstavljati tu funkcionalnost bočnog lanca.
U jednom rešenju, grupa -X1-X2- u dipeptidu, -NH-X1-X2-CO-, je odabrana između:
-Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -lle-Cit-, -Phe-Arg- i -Trp-Cit- gde Cit je citrulin.
Poželjno, grupa -X1-X2- u dipeptidu, -NH-X1-X2-CO-, je odabrana između:
-Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, i -Val-Cit-.
Najpoželjnija, grupa -X1-X2- u dipeptidu, -NH-X1-X2-CO-, je -Phe-Lys- ili -Val-Ala-.
Druge dipeptidne kombinacije mogu da se koriste, uključujući one opisane u Dubowchik et al, Bioconjugate Chemistry, 2002,13,855-869.
U jednom rešenju, bočni lanac amino kiseline je derivatizovan, gde je potrebno. Na primer, amino grupa ili karboksi grupa bočnog lanca amino kiseline može biti derivatizovana.
U jednom rešenju, amino grupa NH2bočnog lanca amino kiseline, kao što je lizin, je derivatizovani oblik odabran između grupe koja se sastoji od NHR i NRR’.
U jednom rešenju, karboksi grupa COOH bočnog lanca amino kiseline, kao što je aspartinska kiselina, je derivatizovani oblik odabran između grupe koja se sastoji od COOR, CONH2, CONHR i CONRR’.
U jednom rešenju, bočni lanac amino kiseline je hemijski zaštićen, gde je potrebno. Zaštitna grupa bočnog lanca može biti grupa diskutovana u nastavku u vezi sa grupom R<L>. Zaštićene amino kiselinske sekvence su odcepljene enzimima. Na primer, ustanovljeno je da dipeptidna sekvenca koja sadrži Boc zaštićeni bočni lanac Lys ostatka je odcepljena sa catepsinom.
Zaštitne grupe bočnih lanaca amino kiselina su opšte poznate u tehnici i opisane su u Novabiochem Catalog. Dodatne strategije zaštitne grupe su postavljene u Protective Groups in Organic Synthesis, Greene and Wuts.
Moguće zaštitne grupe bočnog lanca su prikazane u nastavku za one amino kiseline koje imaju funkcionalnost reaktivnog bočnog lanca:
Arg: Z, Mtr, Tos;
Asn: Trt, Xan;
Asp: Bzi, t-Bu;
Cys: Acrn, Bzl, BzI-OMe, Bzl-Me,
Trt; Glu: Bzl, t-Bu;
Gln: Trt, Xan;
His; Boc, Dnp, Tos, Trt;
Lys; Boc, Z-Cl, Prnoc, Z, Alloc;.
Sen Bzl, TBDMS, TBDPS;
Thr: Bz;
Tip: Boc;
Tyr: Bzi, Z, Z-Br.
U jednom rešenju, zaštita bočnog lanca je izabrana da bude ortogonalna za grupu koja je obezbeđena kao, ili kao deo, blokirajuća grupa, gde je prisutna. Prema tome, uklanjanje zaštitne grupe bočnog lanca ne uklanja blokirajuću grupu, ili bilo koju funkcionalnost zaštitne grupe koja je deo blokirajuće grupe.
U drugim rešenjima pronalaska, odabrane amino kiseline su one koje imaju ne reaktivnu funkcionalnost bočnog lanca. Na primer, amino kiseline mogu biti izabrane između: Ala, Gly, He, Leu, Met, Phe. Pro, i Val.
U jednom rešenju, dipeptide je korišćen u kombinaciji sa samo-imolativnim linkerom. Samoimolativni linker može biti spojen za -X2-.
Tamo gde je samo-imolativni linker prisutan, -X2- je spojen direktno za samo-imolativni linker. Poželjno, grupa -X2-CO- je spojen za Y, gde Y je NH, time obrazujući grupu -X2-CO-NH-.
-NH-X1- je spojen direktno za A. A može da obuhvata funkcionalnost -CO- time obrazujući amidnu vezu sa -X-.
U jednom rešenju, L<1>i L<2>zajedno sa -OC(=O)- obuhvataju grupu NH-X1-X2-CO-PABC-. PABC grupa je spojena direktno za citotoksični agens. Poželjno, samo-imolativni linker i dipeptid zajedno obrazuju grupu -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC-, koja je ilustrovana dole:
gde zvezdica ukazuje tačku vezivanja za odabrani citotoksični ostatak, a talasasta linija ukazuje tačku vezivanja za preostali deo linkera L ili tačku vezivanja za A. Poželjno, talasasta linija ukazuje tačku vezivanja za A. Bočni lanac Lys amino kiseline može biti zaštićen, na primer, sa Boc, Fmoc, ili Alloc, kao što je gore opisano.
Alternativno, samo-imolativni linker i dipeptid zajedno obrazuju grupu -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC-, koja je ilustrovana u nastavku:
gde zvezdica i talasasta linija su prethodno definisani.
Alternativno, samo-imolativni linker i dipeptid zajedno obrazuju grupu -NH-Val-Cit-CO-NH-PABG-, koja je ilustrovana u nastavku:
gde zvezdica i talasasta linija su prethodno definisani.
U nekim rešenjima predmetnog pronalaska, može biti poželjno da, ako ostatak leka sadrži nezaštićenu imino grupu, npr., ako ostatak B je prisutan, onda linker ne sadrži slobodnu amino (H2N-) grupu. Stoga, ukoliko linker ima strukturu -A-L<1>-L<2>- onda ovo poželjno neće sadržati slobodnu amino grupu. Ova prednost je posebno relevantna kada linker sadrži dipeptid, na primer kao L<1>. U ovom rešenju, biće poželjno da jedna od dve amino kiseline nije odabrana iz lizina.
Bez želje da se vezuje teorijom, kombinacija nezaštićene imine veze u ostatku leka i slobodne amino grupe u linkeru može prouzrokovati dimerizaciju ostatka lek-linker, koja može ometati konjugaciju takvog ostatka lek-linker na antitelo. Unakrsna reakcija ovih grupa može biti ubrzana u slučaju da je prisutna slobodna amino grupa kao amonijum jon (H3N<+>-), kao što je kada je jaka kiselina (npr. TFA) korišćena da ukloni zaštitu sa slobodne amino grupe.
U jednom rešenju, A je kovalentna veza. Stoga, L<1>i ćelijski vezujući agens su direktno povezani. Na primer, gde L<1>obuhvata kontinuiranu amino kiselinsku sekvencu, N-terminus sekvence koje se mogu direktno vezati za ćelijski vezujući agens.
Stoga, gde A je kovalentna veza, veza između ćelijskog vezujućeg agensa i L<1>može biti odabrana između:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -C(-O)NHC(=O)-, -S-, -S-S-. -CH2C(=O)-, i =N-NH-.
Amino grupa L<1>koja se vezuje za DLL3 modulator može biti N-terminus amino kiseline ili može biti izvedena iz amino grupe bočnog lanca amino kiseline, na primer bočni lanac amino kiseline lizina.
Karboksi grupa L<1>koja se vezuje za modulator može biti C-terminus amino kiseline ili može biti izvedena iz karboksilne grupe bočnog lanca amino kiseline, na primer glutaminske kiseline bočnog lanca amino kiseline.
Hidroksi grupa L<1>koja se vezuje za ćelijski vezujući agens može biti izvedena iz hidroksi grupe bočnog lanca amino kiseline, na primer bočni lanac amino kiseline serina.
Tiol grupa L<1>koja se vezuje za modulatorni agens može biti izvedena iz tiol grupe bočnog lanca amino kiseline, na primer bočni lanac amino kiseline serina.
Komentari iznad u odnosu na amino, karboksil, hidroksil i tiol grupe L<1>takođe se primenjuju na ćelijski vezujući agens.
U jednom rešenju, L<2>zajedno sa -OC(=O)- predstavlja:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za N10 poziciju, talasasta linija označava tačku vezivanja L<1>, n je 0 do 3, Y je kovalentna veza ili funkcionalna grupa, a E je aktivirana grupa, na primer dejstvom enzima ili svetlosti, na taj način generišući samo-imolativnu jedinicu. Fenilenski prsten je opciono dalje supstituisan sa jednim, dva ili tri supstituenta kao što je ovde opisano. U jednom rešenju, fenilenska grupa je opciono dalje supstituisana sa halo, NO2, R ili OR. Poželjno, n je 0 ili 1, najpoželjnije 0.
E je odabran tako da je grupa podložna aktivaciji, npr. putem svetlosti ili delovanjem enzima. E može biti -NO2-; Ili glukoronska kiselina. Prvi može biti podložan dejstvu nitroreduktaze, a drugi na dejstvo ȕ-glukoronidaze.
U ovom rešenju, sam-imolativni linker će omogućiti oslobađanje zaštićenog jedinjenja kada se aktivira E, postupajući duž linija prikazanih u daljem tekstu (za n=G):
gde zvezdica označava tačku vezivanja na položaj N10, E* je aktivirani oblik E, a Y je kako je gore opisano. Ove grupe imaju prednost odvajanja mesta aktivacije od zaštićenog jedinjenja. Kao što je prethodno opisano, fenilenska grupa može opciono biti dalje supstituisana.
Grupa Y može biti kovalentna veza za L<1>.
Grupa Y može biti funkcionalna grupa odabrana između:
-C(=O)-, -NH-, -O-, -C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -NHC(=O)NH, -C(=O)NHC(=O)-, i -S-.
Gde L<1>je dipeptid, poželjno je da Y je -NH- ili -C(=O)-, tako da obrazuje amidnu vezu ozmeđu L<1>i Y. U ovom rešenju, dipeptidna sekvenca netreba da bude supstrat za enzimsku aktivnost.
U drugom rešenju, A je grupa razdvajanja. Prema tome, L<1>i agens za vezivanje ćelije su indirektno vezani.
L<1>i A mogu biti funkcionalne grupe odabrane između:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O)-, -OC(=O)-, -OC(=O)CK -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, i -NHC(=O)NH-.
Poželjno, linker sadrži elektrofilnu funkcionalnu grupu za reakciju sa nukleofilnom funkcionalnom grupom na modulatoru. Nukleofilne grupe na antitelima obuhvataju, ali se ne ograničavaju na: (i) N-terminalne aminske grupe, (ii) bočni lanac aminskih grupa, npr. lizin, (iii) bočni lanci tiolnih grupa, npr. cistein i (iv) šećerni hidroksil ili amino grupe gde je antitelo glikozilovano. Amin, tiol i hidroksilne grupe su nukleofilne i sposobne da reaguju kako bi obrazovali kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na linker ostacima i linker reagensima uključujući: (i) maleimidne grupe, (ii) aktivirane disulfide, (iii) aktivne estre kao što je NHS (N-Hidroksisukcinimid) estri, HOBt (N-hidroksibenzotriazol) estri, haloformati i kiselinski halidi: (iv) alkil i benzil halide kao što su haloacetamidi; i (v) aldehidi, ketoni, karboksil, od kojih su neki prikazani na sledeći način:
Pojedina antitela imaju redukovani interlanac disulfida, tj. cistein mostove. Antitela mogu biti reaktivna za konjugaciju sa linker reagensima tretiranjem sa redukcionim agensom kao što je DTT (ditiotreitol). Na taj način svaki cisteinski most će obrazovati, teoretski, dva reaktivna nukleofila tiola. Dodatne nukleofilne grupe mogu se uvesti u antitela kroz reakciju lizina sa 2-iminotiolanom (Trautov reagens) što rezultira konverzijom amina u tiol. Reaktivne tiol grupe mogu biti uvedene u antitelo (ili njegov fragment) uvođenjem jednog, dva, tri, četiri ili više cistein ostatka (npr., pripremanje mutantnih antitela koji sadrže jedan ili više neprirodnih cistein amino kiselinskih ostataka). US 7521541 opisuje konstruisanje antitela uvođenjem reaktivnog cisteina amino ksielina.
U nekim rešenjima, linker ima reaktivnu nukleofilnu grupu koja je reaktivna sa elektrofilnom grupom prisutnom na antitelu. Korisne elektrofilne grupe na antitelu obuhvataju, ali nisu ograničene na, aldehidne i keton karbonilne grupe. Heteroatom nukleofilne grupe Linkera može reagovati sa elektrofilnom grupom na antitelu i formirati kovalentnu vezu sa antitelesnom jedinicom. Korisne nukleofilne grupe na linkeru uključuju, ali bez ograničenja, hidrazid, oksim, amino, hidroksi, hidrazin, tiosemikarbazon, hidrazin karboksilat i arilhidrazid. Elektrofilna grupa na antitelu nudi pogodan položaj za vezivanje na Linker.
U jednom rešenju, grupa A je:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za L<1>, talasasta linija ukazuje na tačku vezivanja za ćelijski vezujući agens, i n je 0 do 6. U jednom rešenju, n je 5.
U jednom rešenju, grupa A je:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za L<1>, talasasta linija ukazuje na tačku vezivanja za ćelijski vezujući agens, i n je 0 do 6. U jednom rešenju, n je 5.
U jednom rešenju, grupa A je:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za L<1>, talasasta linija ukazuje na tačku vezivanja za ćelijski vezujući agens, i n je 0 ili 1, i m je 0 do 30. U poželjnom rešenju, n je 1 i m je 0 do 10, 1 do 8, poželjno 4 do 8, a naročito 4 ili 8. U drugom rešenju, m je 10 do 30, i poželjno 20 do 30. Alternativno, m je 0 do 50. U ovom rešenju, m je poželjno 10-40 i n je 1.
U jednom rešenju, grupa A je:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za L<1>, talasasta linija ukazuje na tačku vezivanja za ćelijski vezujući agens, i n je 0 ili 1, i m je 0 do 30. U poželjnom rešenju, n je 1 i m je 0 do 10, 1 do 8, poželjno 4 do 8, a naročito 4 ili 8. U drugom rešenju, m je 10 do 30, i poželjno 20 do 30. Alternativno, m je 0 do 50. U ovom rešenju, m je poželjno 10-40 i n je 1.
U jednom rešenju, veza između ćelijskog vezujućeg agensa i A je preko tiol ostatka ćelijskog vezujućeg agensa i maleimidna grupe A.
U jednom rešenju, veza između ćelijskog vezujućeg agensa i A je:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za preostali deo A a talasasta linija ukazuje na tačku vezivanja za preostali deo ćelijskog vezujućeg agensa. U ovom rešenju, S atom je obično izveden iz modulatora.
U svakom o prethodnih rešenja, alternativna funkcionalnost može biti korišćena umesto maleimidne izvedene grupe prikazane u nastavku:
gde talasasta linija ukazuje na tačku vezivanja za ćelijski vezujući agens kao ranije, a zvezdica ukazuje na vezu za preostali deo A grupe.
U jednom rešenju, maleimidna izvedena grupa je zamenjena sa grupom:
gde talasasta linija ukazuje na tačku vezivanja za ćelijski vezujući agens kao ranije, a zvezdica ukazuje na vezu za preostali deo A grupe.
U jednom rešenju, maleimidna izvedena grupa je zamenjena sa grupom, koja opciono zajedno sa ćelijskim vezujućim agensom, je odabrana između:
-C(=O)NH-, -C(=O)O-, -NHC(=O), -OC(=O)-, -OC(=O)O-, -NHC(=O)O-, -OC(=O)NH-, -NHC(=O)NH-, -NHC(=O)NH, -C(O)NHC(=O)-, -S-, -S-S-, -CH2C(O)-, -C(=O)CH2-, =N-NH- i -NH-N=.
U jednom rešenju, maleimidna izvedena grupa je zamenjena sa grupom, koja opciono zajedno sa ćelijskim vezujućim agensom, je odabrana između:
gde talasasta linija ukazuje ili na tačku vezivanja za ćelijski vezujući agens ili vezu za preostali deo A grupe, i zvezdica ukazuje na drugu tačku vezivanja ćelijskog vezujućeg agensa ili vezu za preostali deo A grupe.
Druge grupe pogodne za vezivanje za odabrani modulator su opisane u WO 2005/082023.
U još jednom poželjnom slučaju, modulatori predmetnog pronalaska mogu biti povezani sa biokompatibilnim polimerima koji sadrže jedinice vezivanja leka. U tom pogledu jedna takva vrsta kompatibilnog polimera sadrži Piekimer® polimere (Mersana Therapeutics). Ovi polimeri su navodno biorazgradivi, dobro se tolerišu i klinički su potvrđeni. Štaviše, takvi polimeri su kompatibilni sa brojem prilagođenih tehnologija povezivanja i hemija koji omogućavaju kontrolu farmakokinetike, lokalizaciju otpuštanja leka i poboljšanu biodistribuciju.
Odabrani modulatori takođe mogu biti direktno konjugovani radioizotopi ili mogu sadržati makrociklične helatore korisne za konjugovanje radio-metalnih jona (kao što je ovde opisano). U određenim rešenjima, makrociklični helator je 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-N,N',N",N" -tetrasirćetna kiselina (DOTA) koja se može povezati sa antitelom putem molekula linkera. Takvi linker molekuli su poznati u tehnici i opisani su u Denardo et al,. 1998, Clin Cancer Res.4:2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug, Chem.10:553; i Zimmerman et al., 1999, Nucl Med. Biol 26:943.
Uopšteno, dobro su poznate tehnike za konjugovanje terapeutskih ostataka ili citotoksičnih agenasa u modulatore. Kao što je već rečeno, ostaci se mogu konjugovati u modulatore bilo kojim postupcima koji su prepoznati u tehnici, uključujući, ali ne ograničavajući se na aldehid/Schiff veze, sulfidrilnu vezu, kiselinsko-labilnu vezu, vezu cis-aconitil, hidrazonsko vezu, enzimsko razgradivu vezu (videti uopšteno Garnett, 2002, Adv Drag Deliv Rev 53:171). Takođe videti, npr., Anion et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drags In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeid et al. (eds.), str.243-56 (Alan R, Liss, Inc.1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed,), Robinson et al. (eds.), pp.623-53 (Marcel Dekker, Inc.
1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al (eds,), str. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp.303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al,, 1982, Immunol. Rev.62:119. U poželjnim primerima, DLL3 modulator koji je konjugovan u terapeutski ostatak ili citotoksični agens može biti internalizovan sa ćelijom nakon vezivanja za molekul DLL3 koji je povezan sa površinom ćelije, čime se isporučuje terapeutski korisni opseg.
C. Biokompatibilni Modifikatori
U odabranim primerima modulatori pronalaska mogu biti konjugovani ili na drugi način povezani sa biokompatibilnim modifikatorima koji se mogu koristiti da prilagode, menjaju, poboljšaju ili ograniče karakteristike modulatora po želji. Na primer, antitela ili fuzioni konstrukti sa povećanim in vivo polu vekom mogu se generisati vezivanjem molekula polimera velike molekulske težine kao što su komercijalno dostupni polietilenglikol (PEG) ili slični biokompatibilni polimeri. Stručnjaci u ovoj oblasti će ceniti da se PEG može dobiti u mnogim različitim molekulskim težinama i molekulskim konfiguracijama koje se mogu odabrati da daju specifična svojstva antitelima (npr., polu vek se može prilagoditi). PEG može biti vezan za modulatore ili fragmente antitela ili derivate sa ili bez multifunkcionalnog linkera bilo putem specifične lokacije konjugacije PEG na N- ili C-kraju pomenutih antitela ili fragmenata antitela ili preko epsilon-amino grupa prisutnih na ostacima lizina. Linearna ili razgranata derivatizacija polimera koja rezultira u minimalnom gubitku biološke aktivnosti se može koristiti. Stepen konjugacije se može pažljivo pratiti SDS-PAGE i masenom spektrometrijom kako bi se osigurala optimalna konjugacija PEG molekula na molekulima antitela. Ne izreagovani PEG se može odvojiti od konjugata antitelo-PEG sa, npr.,isključivanjem veličine ili hromatografijom razmene jona. Na sličan način, otkriveni modulatori mogu biti konjugovani sa albuminom kako bi antitelo ili fragment antitela postao stabilniji in vivo ili imao duži polu vek in vivo. Tehnike su dobro poznate u struci, videti npr. Međunarodne objave Br. WO 93/15199, WO 93/15200 i WO 01/77137; i Evropski patentn br.
0 413, 622. Ostali biokompatibilni konjugati su očigledni onima koji su obučeni u toj oblasti i mogu se odmah identifikovati u skladu sa ovim učenjima.
D. Diagnostički ili Detekcioni Agensi
U drugim poželjnim primerima, modulatori predmetnog pronalaska ili fragmenti ili njihovi derivati, su konjugovani sa dijagnostičkim ili detektujućim agensom, markerom ili reporterom koji može biti, na primer, biološki molekul (npr., peptid ili nukleotid), mali molekul, fluorofor ili radioizotop. Označeni modulatori mogu biti korisni za nadgledanje razvoja ili progresije hiperproliferativnog poremećaja ili kao deo postupka kliničkog ispitivanja da bi se utvrdila efikasnost određene terapije uključujući otkrivene modulatore (odn. terapnosti) ili odredio budući tok lečenja. Takvi markeri ili reporteri takođe mogu biti korisni u prečišćavanju odabranog modulatora, analizi modulatora (npr., vezivanje epitopa ili grupisanje antitela), odvajanja ili izolaciji TIC ili u prekliničkim procedurama ili toksikološkim studijama.
Takva dijagnostička analiza i/ili detekcija može se postići spajanjem modulatora u detektne supstance, uključujući, ali bez ograničenja na, različite enzime koje sadrže, na primer, horseradish perokidazu, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; prostetične grupe, kao što su ali bez ograničenja na, streptavidinbiotin i avidin/biotin; fluorescentne materijale, kao što su ali bez ograničenja na, umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilarain fluorescein, dansil hlorid ili ficoeritrin; luminescentne materijale, kao što su ali bez ograničenja na, luminol; bioiuminesentne materijale, kao što su ali bez ograničenja na, luciferaza, luciferin, i aekuorin; radioaktivne materijale, kao što su ali bez ograničenja na jod (<131>I,<125>I,<123>I,<121>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<15>S), tritijum (<3>H), indijum (<115>In,<113>In,<112>In,<111>In), i tehnetijum (<99>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibdenum (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor (<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<159>Gd,<,149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru,<68>Ge,<57>Co,<65>Zn,<85>Sr,<32>P,<153>Gd,<169>Yb,<51>Cr,<54>Mn,<75>Se,<113>Sn, i<117>Tin; pozitron koji emituje metale koristeći različite pozitronske emisione tomografije, neradioaktivne paramagnetne metalne jone, i molekule koji su radio označeni ili konjugovani specifičnim radioizotopima. U takvim slučajevima odgovarajuća metodologija detekcije je dobro poznata u struci i dostupna je iz brojnih komercijalnih izvora.
Kao što je gore navedeno, u drugim primerima modulatori ili njihovi fragmenti mogu biti spojeni ili konjugovani sa markerskim sekvencama ili jedinjenjima, kao što su peptid ili fluorofor, kako bi se olakšali postupci prečišćavanja ili dijagnostikovanja ili analitički postupci kao što su imunohistohemija, bio-slojna interferometrija, površinska plazmonska rezonanca, protočna citometrija, konkurentna ELISA, FACs, itd. U poželjnim rešenjima, marker sadrži njegovu oznaku, kao što je ona koju pruža vektor pQE (Qiagen), između ostalog, mnogi od njih su komercijalno dostupni. Druge peptidne oznake korisne za prečišćavanje uključuju, ali nisu ograničeni na, hemaglutinin "HA" oznaku, koja odgovara epitopu koji je izveden iz proteina hemaglutinina influence (Vilson et al., 1984, Cell 37: 767) i "flag" oznake (U.S.P.Br.
4,703,004).
B. Terapeutski Ostaci
Kao što je prethodno navedeno za modulatore ili fragmente ili njegove derivate, takođe mogu biti konjugovani, povezani ili spojeni sa ili na drugi način povezani sa "terapeutskim ostatkom" ili "lekom", kao što je antiproliferatni ili anti-kancerogeni agena koji obuhvata, ali ne ograničava se na, citotoksični agensi, citostatički agensi, anti-angiogene agense, agense za deblokiranje, hemoterapeutski agensi, radioterapijski i radioterapeutski agensi, ciljani antikancerogeni agensi, BRM, terapijska antitela, vakcine protiv karcinoma, citokini, hormonske terapije, terapija zračenjem i anti-metastatički agensi i imunoterapeutski agensi.
Poželjni primerni anti-kancerogeni agensi obuhvataju citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vincristin, vinblastin, coiebicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksi antracin, maitansinoidi kao što su DM-3 i DM-4 (Immunogen, Inc.), dion, mitoksamron, mitramicin, actinomicin D, 1 -dehidrotestosteron, glukokortikoidi, procain, tetracain, udocain, propranolol, puromicin, epirubicin, i ciklofosfamid i njihovi analozi ili homolozi. Dodatni kompatibilni citotoksini obuhvataju dolastatine i auristatine, uključujući monoroetil auristatin B (MMAE) i monometil auristatin F (MMAF) (Seattle Genetics, Inc.), amanitini kao što su alfa-amanitin, beta-amanitin, gama-amanitin ili epsilon-amanitin (Heidelberg Pharraa AG), DNK minorni žrebasti vezujući agesni kao što su duocarmicin derivati (Syntarga, B.V.) i modifikovani pirolobenzodiazepin dimeri (Spirogen, Ltd,), spajajući inhibitori kao što su meaiamicin analozi ili derivati (npr., FR901464 kao što je priakzano u U.S.P.Br.7,825,267), tubularni vezujući agensi kao što su epotilon analozi i paclitaksel i DNK štetni agensi kao što su cailheamseini i esperamieini. Osim toga, u nekim primerima DLL3 modulatori predmetnog pronalaska mogu biti povezani sa anti-CD3 vezujućim molekulima kako bi regrutovali citotoksične T-ćelije i da ih ciljaju na ćelije koje iniciraju tumor (BiTE tehnologija; videti npr., Fuhrmann, S, et, al. Annual Meeting of AACR Abstract No. 5625 (2010)).
Još dodatni kompatibilni anti-kancer agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, antimetabolite (npr., metotreksat, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, citarabin, 5-fluorouracil decarbazin), alkilacione agense (npr., mehlorotamin, tioepa, hlorambucil, melfalan, carmustin (BCNU) i lomustin (CCNU), busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, i cisdihlorodiamin platinum (II) (DDP) cisplatin), antracikline (npr., daunorubicin (bivši daunomicin) i doksorubicin), antibiotici (npr., daktinomicin (bivši aktinomicin), bleomicin, i antramicin (AMC), i anti-mitotični agensi (npr., vincristin i vinblastin). Detaljnija lista terapijskih ostataka se može naći u PCT objavi WO 03/075957 i U.S.P.N, 2009/0155255.
Kao što je prethodno naznačeno, odabrana rešenja predmetnog pronalaska su usmerena na konjugovane DLL3 modulatore, kao što su konjugati leka anti-DLL3 antitela koji sadrže pirolobenzodiazepin (PBD) kao citotoksični agens. Biće prihvaćeno da PBD su sredstva za alkilaciju koja vrše antitumornu aktivnost kovalentnim vezivanjem za DNK u malom žlebu i inhibirajući sintezu nukleinske kiseline. U tom pogledu pokazano je da PBD imaju potentne antitumorske osobine dok pokazuju minimalnu depresiju koštane srži. PBD kompatibilni sa predmetnim pronalaskom mogu biti povezani sa DLL3 modulatorom korišćenjem bilo kog od nekoliko vrsta linkera (npr., peptidil linker koji sadrži maleimido ostatak sa slobodnim suifhidrilom) i, u nekim rešenjima su dimerni u obliku (odn., PBD dimeri). Kompatibilni PBD (i opcioni linkeri) koji se mogu konjugovati na otkrivenim modulatorima opisani su, na primer, u U.S.P.Br.6,362,331, 7,049,311, 7,189,710, 7,429,658, 7,407,951, 7,741,319, 7,557,099, 8,034,808, 8,163,736 U.S.P.Br.2011/0256157 i PCT podnošenja WO 2011/130613, WO 2011/128650 i WO 2011/130616.
Shodno tome, u posebno poželjnim primerima modulator će sadržati anti DLL3 antitelo konjugovano ili povezano sa jednim ili više PBD dimera (odn., DLL3-PBD ADC).
U posebno poželjnim primerima, kompatibilni PBD koji se mogu konjugovati sa otkrivenim modulatorima su opisani u U.S.P.Br.2011/0256157. U ovom pronalasku, PBD dimeri, odn. oni koji sadrže dve PBD grupe mogu biti poželjni. Prema tome, poželjni konjugati predmetnog pronalaska su oni koji imaju formule (AB) ili (AC):
gde:
isprekidane linije ukazuju opciono prisustvo dvostruke veze između C1 i C2 ili C2 i C3;
R<2>je nezavisno odabran između H, OH, =O, -CH2, CN, R, OR, =CH-R<D>, =C(R<D>)2, O-SO2-R, CO2R i COR, i opciono dalje odabran između halo ili dihalo;
gde R<D>je nezavisno odabrana između R, CO2R, COR, CHO, CO2H, i halo:
R<6>i R<9>su nezavisno odabrani između H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn i halo;
R<7>je nezavisno odabran između H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn i halo;
R<10>je linker povezan za modulator ili fragment ili njegov derivat, kao što je prethodno opisano;
Q je nezavisno odabran između O, S i NH;
R<11>je ili H, ili R ili, gde Q je O, SO3M, gde M je katjon metala;
R i R<1>su svaki nezavisno odabrani između opciono supstituisanih C1-2alkil, C3-20heterociklil i C5-20aril grupa, i opciono u odnosu na grupu NRR’, R i R' zajedno sa atomom azota za koju su vezani obrazuju opciono supstituisani 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten: i gde R<2">, R<6">, R<7">, R<9">, X", Q" i R<11">su definisani prema R<2>, R<6>R<7>, R<9>, X, Q i R<11>respektivno, i R<C>je zaštitna grupa.
Dvostruka Veza
U jednom rešenju, ne postoji dvostruka veza koja je prisutna između C1 i C2, i C2 i C3. U jednom rešenju, isprekidane linije ukazuju opciono prisustvo dvostruke veze između C2 i C3, kao što je prikazano u nastavku:
U jednom rešenju, dvostruka veza je prisutna između C2 i C3 kada R<2>je C5-20aril ili C1-12alkil.
U jednom rešenju, isprekidane linije označavaju opciono prisustvo dvostruke veze između C1 i C2, kao što je prikazano u nastavku:
U jednom rešenju, dvostruka veza je prisutna između C1 i C2 kada R<2>je C5-20aril ili C1-12alkil.
R<2>
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno odabran između H, OH, -O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R<D>, =C(R<D>)2, O-SO2-R, CO2R i COR, i opciono dalje odabran između halo ili dihalo.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno odabran između H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R<D>, -C(R<D>)2, O-SO2-R, CO2R i COR.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno odabran između H, =O, =CH2, R, =CH-R<D>, i =C(R<D>)2.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno H.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno =O.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno =CH2.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno =CH-R<D>. Sa PBD jedinjenjem, grupa =CH-R<D>može imati ili konfiguraciju prikazanu u nastavku:
U jednom rešenju, konfiguracija je konfiguracija (I).
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno =C(R<D>)2.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno =CF2.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno R.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno opciono supstituisani C5-20aril
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno opciono supstituisani C1-12alkil.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno opciono supstituisani C5-20aril.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno opciono supstituisani C5-7 aril.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno opciono supstituisani C8-10 aril.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno opciono supstituisani fenil.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno opciono supstituisani naftil.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno opciono supstituisani piridil.
U jednom rešenju, R<2>je nezavisno opciono supstituisani hinolinil ili izohinolinil.
U jednom rešenju,R<2>nosi jednu do tri supstituisane grupe, sa 1 i 2 koji su poželjniji, i pojedinačno supstituisana grupa koja je najpoželjnija. Supstituenti mogu bit na bilo kojoj poziciji.
Gde R<2>je C5-7aril grupa, pojedinačni supstituent je poželjno na atomu prstena koji nije vezan za vezu sa ostatkom jedinjenja, odn. poželjno je ȕ ili Ȗ za vezu sa ostatkom jedinjenja.
Stoga, tamo gde je C5-7aril grupa fenil, supstituent je poželjno u meta- ili para- pozicijama, a prvenstveno je para- pozicija.
U jednom rešenju, R<2>je odabran između:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja.
Gde R<2>je C8-10aril grupa, na primer hinolinil ili izohinolinil, može da nosi bilo koji broj supstituentata na bilo kojoj poziciji hinolinilnog ili izohinolinilnog prstena. U nekim rešenjima, nosi jedan, dva ili tri supstituenta, i to može da bude ili na proksimalnom i distalnom prstenu ili na oba ( ukoliko je više od jednog supstituenta).
U jednom rešenju, gde R<2>je opciono supstituisan, supstituenti su odabrani između onih supstituenata koji su dati u odeljku koji se odnosi na supstituente u nastavku.
Gde R je opciono supstituisan, supstituenti su poželjno odabrani između:
Halo, Hidroksil, Etar, Formil, Acil, Karboksi, Estar, Aciloksi, Amino, Amido, Acilamido, Aminokarboniloksi, Ureido, Nitro, Cijano i Tioetar.
U jednom rešenju, gde R ili R<2>je opciono supstituisan, supstituenti su odabrani između grupe koja se sastoji od R, OR, SR, NRR', NO2, halo, CO2R, COR, CONH2, CONHR i CONRR'.
Gde R<2>je C1-12alkil, opcioni supstituent može dodatno da obuhvata C3-20heterociklil i C5-20aril grupe.
Gde R<2>je C3-20heterociklil, opcioni supstituent može dodatno da obuhvata C1-12alkil i C5-20aril grupe.
Gde R<2>je C5-20aril grupe, opcioni supstituent može dodatno da obuhvata C3-20heterociklil i C1-12alkil grupe.
Podrazumeva se da termin "alkil" obuhvata pod klase alkenil i alkinil kao i cikloalkil. Stoga, gde R<2>je opciono supstituisan C1-12alkil, podrazumeva se da alkil grupa opciono sadrži jednu ili više ugljenik-ugljenik dvostruke ili trostruke veze, koje mogu biti deo konjugovanog sistema. U jednom rešenju, opciono supstituisana C1-12alkil grupa sadrži bar jednu ugljenikugljenik dvostruku ili trostruku veu, i ova veza je konjugovana sa dvostrukom vezom prisutnom između C1 i C2, ili C2 i C3. U jednom rešenju, C1-12alkil grupa je grupa odabrana između zasićenog C1-12alkil, C2-12alkenil, C2-12alkinil i C3-12cikloalkil.
Ako je supstituent na R<2>halo, onda je poželjno F ili CI, naročito CI.
Ako je supstituent na R<2>etar, onda u nekim rešenjima može biti alkoksi grupa, na primer, C1-
7alkoksi grupa (npr. metoksi, etoksi) ili može u nekim rešenjima da bude C5-7ariloksi grupa (npr. fenoksi, piridiloksi, furaniloksi).
Ako je supstituent na R<2>C1-7alkil, poželjno može da bude C1-4alkil grupa (npr. metil, etil, propil, butil).
Ako je supstituent na R<2:>C3-7heterociklil, u nekim rešenjima može da bude C6azot koji sadrži heterociklil grupu, npr. morfolino, tiomorfolino, piperidinil, piperazinil. Ove grupe mogu biti vezane za ostatak PBD ostataka preko atoma azota. Ove grupe mogu dalje da budu supstituisane, na primer, sa C1-4alkil grupama.
Ako je supstituent na R<2>bis-oksi-C1-3alkilen, to je poželjno bis-oksi-metilen ili bis-oksi-etilen.
Naročito poželjni supstituenti za R<2>obuhvataju metoksi, etoksi, floro, hloro, cijano, bis-oksimetilen, metil-piperazinil, morfolino i metil-tienil.
Naročito poželjne supstituisane R<2>grupe obuhvataju, ali nisu ograničeni na, 4-metoksi-fenil, 3-metoksifenil, 4-etoksi-fenil, 3-etoksi-fenil, 4-fluoro-fenil, 4-hloro-fenil, 3,4-bisoksimetbilenfeniI, 4-metiltienil, 4-cijanofenil, 4-fenoksifenil, hinolin-3-il i hinolin-6-il, izohinolin-3-il i izohinolin-6-il, 2-tienil, 2-furanil, metoksinaftil, i naftil.
U jednom rešenju, R<2>je halo ili dihalo. U jednom rešenju, R<2>je -F ili -F2, čiji supstituenti su ilustrovani u nastavku kao (III) i (IV) respektivno:
R<D>
U jednom rešenju, R<D>je nezavisno odabran između R, CO2R, COR, CHO, CO2H, i halo. U jednom rešenju, R<D>je nezavisno R.
U jednom rešenju, R<D>je nezavisno halo.
R<6>
U jednom rešenju, R<6>je nezavisno odabran između from H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn- i Halo.
U jednom rešenju, R<6>je nezavisno odabran između H, OH, OR, SH, NH2, NO2i Halo.
U jednom rešenju, R<6>je nezavisno odabran između H i Halo.
U jednom rešenju, R<6>je nezavisno H.
U jednom rešenju, R<6>i R' zajedno obrazuju grupu –O-(CH2)p-O-, gde p je 1 ili 2.
R<7>
R<7>je nezavisno odabran između H , R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR<5>, NO2, Me3Sn i halo.
U jednom rešenju, R<7>je nezavisno OR.
U jednom rešenju, R<7>je nezavisno OR<7A>, gde R<7A>je nezavisno opciono supstituisan C1-6alkil.
U jednom rešenju, R<7A>je nezavisno opciono supstituisan zasićeni alkil.
U jednom rešenju, R<7A>je nezavisno opciono supstituisan C2-4alkenil.
U jednom rešenju, R<7A>je nezavisno Me.
U jednom rešenju, R<7A>je nezavisno CH2Ph.
U jednom rešenju, R<7A>je nezavisno altil.
U jednom rešenju, jedinjenje je dimer gde R<7>grupe svakg monomera obrazuju zajedno dimerni most koji ima formulu X-R"-X koja vezuje monomere.
R<8>
U jednom rešenju, jedinjenje je dimer gde R<8>grupe svakog monomera obrazuju zajedno dimerni most koji ima formulu X-R"-X koja vezuje monomere.
U jednom rešenju, R<8>je nezavisno OR<8A>, gde R<8A>je nezavisno opciono supstituisan C1-4alkil.
U jednom rešenju, R<8A>je nezavisno opciono supstituisan zasićeni C1-6alkil opciono supstituisani C2-4alkenil.
U jednom rešenju, R<8A>je nezavisno Me.
U jednom rešenju, R<8A>je nezavisno CH2Ph.
U jednom rešenju, R<8A>je nezavisno alil.
U jednom rešenju, R<8>i R<7>zajedno obrazuju grupu -O-{CH2)p-O-, gde p je 1 ili 2.
U jednom rešenju, R<8>i R<9>zajedno obrazuju grupu -O-(CH2)p-O-, gde p je 1 ili 2.
R<9>
U jednom rešenju, R<9>je nezavisno odabran između H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR', NO2, Me3Sn- i Halo,
U jednom rešenju, R<9>je nezavisno H,
U jednom rešenju, R<9>je nezavisno R ili OR.
R i R‘
U jednom rešenju, R je nezavisno odabran između opciono supstituisanih C1-12alkil, C3-20heterociklil i C5-20aril grupa. Ove grupe su svaka definisana u nastavku u odeljku supstituenti.
U jednom rešenju, R je nezavisno opciono supstituisan C1-12alkil.
U jednom rešenju, R je nezavisno opciono supstituisan C3-20, heterociklil.
U jednom rešenju, R je nezavisno opciono supstituisan C5-20aril.
U jednom rešenju, R je nezavisno opciono supstituisan C1-12alkil.
Prethodno opisano u vezi sa R<2>su razna rešenja koja se odnose na poželjne alkil i aril grupe i identit i veći broj opcionih supstituenata. Odabrane preference za R<2>kao što se primenjuje za R su prihvatljive, gde je odgovarajuće, na sve druge grupe R, na primer gde R<6>, R<7>, R<8>ili R<9>je R.
Preference za R se takođe primenjuju za R’.
U nekim rešenjima pronalaska obezbeđeno je jedinjenje koje ima supstituent grupu -NRR'. U jednom rešenju, R i R’ zajedno sa atomom azota za koji su vezani obrazuju opciono supstituisan 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten. Prsten može sadržati dalje heteroatom, na primer N, O ili S.
U jednom rešenju, heterociklični prsten sam je supstituisan sa grupom R. Gde dalje N heteroatom je prisutan, supstituent može biti na N heteroatomu.
R"
R" je C3-12alkilen grupa, čiji lanac može biti prekinut, sa jednim ili više heteroatoma, npr. O, S, N(H), NMe i/ili aromatičnim prstenovima, npr. benzen ili piridin, čiji prstenovi su opciono supstituisani.
U jednom rešenju, R" je C3-12alkilen grupa, čiji lanac može biti prekinut sa jednim ili više heteroatoma i/ili aromatičnih prstenova, npr. benzen ili piridin.
U jednom rešenju, alkilen grupa je opcino prekinuta sa jednim ili više heteroatoma odabrani između O, S, i NMe i/ili aromatičnim prstenovima, čiji prstenovi su opciono supstituisani.
U jednom rešenju aromatični prsten je C5-20arilen grupa, gde arilen pripada divalentnom ostatku dobijenom uklanjanjem dva atoma vodonika iz dva atoma aromatičnog prstena aromatičnog jedinjenja, čiji ostatak ima od 5 do 20 atoma prstena.
U jednom rešenju, R" je C3-12alkilen grupa, čiji lanac može biti prekinut sa jednim ili više heteroatoma, npr. O, S, N(H), NMe i/ili aromatičnim prstenovima, npr. benzen ili piridin, čiji prstenovi su opciono supstituisani sa NH2.
U jednom rešenju, R" je C3-12alkilen grupa.
U jednom rešenju, R" je odabran između C3, C5, C7, C9i C11alkilen grupe. U jednom rešenju, R" je odabran između C3, C5i C7alkilen grupe. U jednom rešenju, R" je odabran između C3i C5alkilen grupe. U jednom rešenju, R" je C3alkilen grupa. U jednom rešenju, R" je C5alkilen grupa.
Alkilen grupe prethodno navedene mogu opciono da budu prekinute sa jednim ili više heteroatoma i/ili aromatičnim prstenovima, npr. benzen ili piridine, čiji prstenovi su opciono supstituisani.
Alkilen grupe prethodno navedene mogu opciono da budu prekinute sa jednim ili više heteroatoma i/ili aromatičnim prstenovima, npr. benzen ili piridin.
Alkilen grupe prethodno navedene mogu da budu nesupstituisane linearne alifatične alkilen grupe.
X
U jednom rešenju, X je odabran između O, S, ili N(H).
Poželjno, X je O.
Poželjni kompatibilni linkeri kao što su oni prethodno opisani vezuju DLL3 modulator (CBA/Ab/M), za PBD ostatak leka D putem konavelntne(ih) veze(a) na R<10>poziciji (odn., N10). Linker je bifunkcionalan ili multifunkcionalan ostatak koji može da se korsiti da vezuju jedan ili više ostataka leka (D) i modulator (poželjno antitelo) kako bi obrazovali konjugate antitelo-lek (ADC). Linker (L) može da bude stabilan van ćelije, odn. ekstraćelijski, ili može da bude odcepljen sa enzimatskom aktivnosti, hidrolizom, ili drugim metaboličkim stanjima. Konjugati antitelo-lek (ADC) mogu biti uobičajeno dobijeni korišćenjem linkera koji ima reaktivnu funkcionalnost za vezivanje za ostatak leka i antitelo. Cistein tiol, ili amin, npr. N-terminus ili bočni lanac amino kiseline kao što je lizin, antitelo (Ab) može obrazovati vezu sa funkcionalnom grupom linkera ili reagensom razmicanja, PBD ostatak leka (D) ili reagens lek-linker (D-L).
Mnoge funkcionalne grupe na linkeru vezane za N10 poziciju PDB ostatka mogu biti korisne da reaguju sa ćelijskim vezujućim agensom. Na primer, estar, tioestar, amid, tioamid, karbamat, tiokarbamat, urea, tiourea, etar, tioetar, ili disulfidni linkeri mogu biti obrazovani iz reakcije linker-PBD intermedijera leka i ćelijskog vezujućeg agensa.
U drugom rešenju, linker može biti supstituisan sa grupama koje moduliraju taloženje, rastvorljivost ili reaktivnost. Na primer, supstituent sumpora može povećati rastvorljivost u vodi reagensa i olakšati reakciju kuplovanja vezujućeg reagensa sa antitelom ili ostatkom leka, ili olakšati reakciju kuplovanja Ab-L sa D, ili D-L sa Ab, u zavisnosti od sintetičke rute koja se koristi za pripremu ADC.
U jednom poželjnom rešenju, R<10>je grupa:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za poziciju N10, CBA je ćelijski vezujući agens/modulator, L<1>je linker, A je vezujuća grupa koja vezuje L<1>za ćelijski vezujući agens, L<2>je kovalentna veza ili zajedno sa -OC(=O)- obrazuje samo-imotivni linker, i L<1>ili L<2>je uklonjivi linker.
L<1>je uklonjivi linker, i može se odnositi kao na okidač za aktivaciju linkera za cepanje.
Kao što je diskutovano u prethodnom odeljku koji se odnosi na linker priroda L<1>i L<2>, gde je prisutna, može se mnogo razlikovati. Ove grupe se biraju na osnovu njihovih karakteristika cepanja, koje mogu biti diktirane uslovima na mestu na koju se konjugat isporučuje. Oni linkeri koji se cepaju delovanjem enzima su poželjni, iako se mogu koristiti linkeri koji se mogu utkloniti promenama u pH (npr. kiselim ili baznim rastvorom), temperaturi ili nakon zračenja (npr. fotolabilni). Linkeri koji se mogu odcepiti u uslovima redukcije ili oksidacije mogu takođe naći upotrebu u ovom pronalasku.
L<1>može sadržati susednu sekvencu amino kiselina. Amino kiselinska sekvenca može biti ciljni supstrat za enzimsko cepanje, čime se omogućava oslobađanje R<10>sa N10 pozicije.
U jednom rešenju, L<1>je odcepljen dejstvom enzima. U jednom rešenju, enzim je esteraza ili peptidaza.
U jednom rešenju, L<2>je prisutan i zajedno sa -C(=O)O- obrazuju samo-imolativni linker. U jednom rešenju, L<2>je supstrat za enzimsku aktivaciju, time dozvoljavajući otpuštanje R<10>sa N10 pozicije.
U jednom rešenju, gde L<1>je odcepljen dejstvom enzima i L<2>je prisutan, enzim odcepljuje vezu između L<1>i L<2>.
Što se tiče vezivanja izabranog linkera na izabranu PBD grupu R<C>se može ukloniti sa položaja N10 određenih PBD ostataka da bi se ostavila N10-C11 iminska veza, karbinolamin, supstituisan karbinolamin, gde QR<11>je OSO3M, bisulfidni proizvod reakcije adicije, tiokarbinolamin, supstituisani tiokarbinolamin, ili supstituisani karbinolamin.
U jednom rešenju, R<C>može biti zaštitna grupa koja može da se ukloni da napusti N10-C11 imin vezu, karbinolamin, supstituisani karbinolamin, ili, gde QR<11>je OSO3M, bisulfidni proizvod reakcije adicije. U jednom rešenju, R<C>je zaštitna grupa koja se može ukloniti da napusti N10-C11 imin vezu.
Grupa R<C>ima za nameru da se ukloni pod istim uslovima kao i za uklanjanje grupe R<C>na primer da da N10-C11 imin vezu, karbinolamin i tako dalje. Grupa za zatvaranje deluje kao zaštitna grupa namenjenu za funkcionalnost na poziciji N10. Grupa za zatvaranje je namenjena da ne bude reaktivna prema agensu za vezivanje ćelija. Na primer, R<C>nije isto što i R<L>.
Jedinjenja koja imaju grupu za zatvaranje mogu da se koriste kao intermedijeri u sitezama dimera koji imaju ursin monomer. Alternativno, jedinjenja koja imaju grupu za zatvaranje mogu da se koriste kao konjugati, gde grupa za zatvaranje je uklonjena na ciljanoj lokaciji kako bi se dobio imin, karbinolamin, supstituisani karbinolamin i tako dalje. Stoga, u ovom rešenju, grupa za zatvaranje se može odnositi na terapeutiski uklonjivu azotnu zaštitnu grupu, kao što je definisano u WO 00/12507.
U jednom rešenju, grupa R<C>se može ukloniti pod uslovima koji cepaju linker R<L>iz grupe R<10>. Prema tome, u jednom rešenju, grupa za zatvaranje je odvojiva dejstvom enzima.
U alternativnom rešenju, grupa za zatvaranje se može ukloniti pre vezivanja za linker R<L>za modulator. U ovom rešenju, grupa za zatvaranje se može ukloniti pod uslovima koji ne odvajaju linker R<L>.
Gde jedinjenje uključuje funkcionalnu grupu G<1>kako bi obrazovalo vezu za agens za vezivanje ćelije, grupa za zatvaranje je uklonjena pre dodavanja ili demaskiranja G<1>.
Grupa za zatvaranje se može koristiti kao deo strategije 3 zaštitne grupe kako bi se osiguralo da samo jedna od monomernih jedinica u dimeru je povezana za agens za vezivanje ćelije.
Grupa za zatvaranje se može koristiti kao maska za N10-C11 iminsku vezu. Grupa za zatvaranje se može ukloniti u trenutku kada imin zahteva funkciju imina u jedinjenju. Grupa za zatvaranje takođe maska za karbinolamin, supstituisani kabinolamin, i bisulfitni proizvod reakcije adicije, kao što je gore opisano.
U jednom rešenju, R<C>je karbamat zaština grupa.
U jednom rešenju, karbamat zaštitna grupa je odabrana između:
Alloc, Fmoc, Boc, Tree, Teoc, Psec, Cbz and PNZ.
Opciono, karbamat zaštitna grupa je dalje odabrana između Moc.
U jednom rešenju, R<C>je linker grupa R<L>kojoj nedostaje funkcionalna grupa za povezivanje sa agensom za vezivanje ćelija.
Ova prijeva se naročito odnosi na one R<C>grupe koje su karbamati.
U jednom rešenju, R<C>je grupa:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za N10 poziciju, G<2>je grupa prekida, L<3>je kovalentna veza ili linker koji se odcepljuje L<1>, L<2>je kovalentna veza ili zajedno sa OC(=O) obrazuje samo-imolativni linker.
Gde L<3>i L<2>su obe kovalentne veze, G<2>i OC(=O) zajedno obrazuju karbamatnu zaštitnu grupu kao što je gore definisano.
L<1>je kao što je prethodno definisano u vezi sa R<10>.
L<2>je kao što je prethodno definisano u vezi sa R<10>.
Razne prekidajuće grupe su opisane u nastavku, uključujući one zasnovane na dobro poznatim zaštitnim grupama.
U jednom rešenju L<3>je odcepljujući linker L<1>i L<2>, zajedno sa OC(=O), obrazuju samoimolativni Iiker. U ovom rešenju, G<2>je Ac (acetil) ili Moc, ili karbamatna zaštitna grupa odabrana između: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz i PNZ. Opciono, karbamatna zaštitna grupa je dalje odabrana između Moc.
U drugom rešenju, G<2>je acil grupa -C(=O)G<3>, gde G<3>je odabrana između alkil (uključujući cikloalkil, alkenil i alkinil), heteroalkil, heterociklil i aril (uključujući heteroaril i karboaril). Ove grupe mogu biti opciono supstituisane. Acil grupa zajedno sa amino grupom L<3>ili L<2>, gde je to moguće, mogu formirati amidnu vezu. Acil grupa zajedno sa hidroksi grupom L<3>ili L<2>, gde je to moguće, mogu formirati estersku vezu.
U jednom rešenju, G<3>je heteroalkil. Heteroalkil grupa može obuhvatiti polietilen glikol.
Heteroalkil grupa može imati heteroatom, kao što je O ili N, susedno acil grupi, time obrazujući karbamatnu ili karbonatnu grupu, gde je to moguće, sa heteroatomom prisutnim u grupi L<3>ili L<2>, gde je to moguće.
U jednom rešenju, G<3>je odabran između NH2, NHR i NRR'. Poželjno, O<3>je NRR',
U jednom rešenju, G<2>je grupa:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za L<3>, n je 0 do 6 i G<4>je odabran između OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR’, NO2, i halo. Grupe OH, SH, NH2i NHR su zaštitećene. U jednom rešenju, n je 1 do 6, i poželjno n je 5. U jednom rešenju, G<4>je OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR’, i NRR’. U jednom rešenju, G<4>je OR, SR, i NRR'. Poželjno G<4>je odabran između OR i NRR’, prvenstveno G<4>je OR.
Prvenstveno G<4>je OMe.
U jednom rešenju, grupa G<2>je:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za L<3>, i n i G<4>su kao što su prethodno definisani.
U jednom rešenju, grupa G<2>je:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za L<3>, n je 0 ili 1, m je 0 do 50, i G<4>je odabran između OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, i halo. U poželjnom rešenju, n je 1 i m je 0 do 10, 1 do 2, poželjno 4 do 8, i naročito 4 ili 8. U drugom rešenju, n je 1 i m je 10 do 50, poželjno 20 do 40. Grupe OH, SH, NH2, i NHR su zaštićeni. U jednom rešenju, G<4>je OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', i NRR'. U jednom rešenju, G<4>je OR, SR, i NRR'. Poželjno G<4>je odabran između OR i NRR<’>, prvenstveno G<4>je OR. Poželjno G<4>je OMe.
U jednom rešenju, grupa G<2>je:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za L<3>, a n, m i G<4>su kao što su prethodno definisani.
U jednom rešenju, grupa G<2>je:
gde n je 1-20, m je 0-6, i G<4>je odabran između OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR', NH2, NHR, NRR', NO2, i halo. U jednom rešenju, n je 1-10. U drugom rešenju, n je 10 do 50, poželjno 20 do 40. U jednom rešenju, n je 1. U jednom rešenju, m je 1. Grupe OH, SH, NH2i NHR su zaštićene. U jednom rešenju, G<4>je OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR’, i NRR’. U jednom rešenju, G<4>je OR, SR, i NRR'. Poželjno G<4>je odabran između OR i NRR’, prvenstveno G<4>je OR. Naročito G<4>je OMe.
U jednom rešenju, grupa G<2>je:
gde zvezdica ukazuje na tačku vezivanja za L<3>, a n, m i G<4>su kao što su prethodno definisani.
U svakom od prethodnih rešenja G<4>može biti OH, SH, NH2i NHR. Ove grupe su poželjno zaštićene.
U jednom rešenju, OH je zaštićen sa Bzl, TBDMS, ili TBDPS.
U jednom rešenju, SH je zaštićen sa Acra, Bzl, Bzl-OMe, Bzi-Me, ili Trt.
U jednom rešenju, NH2ili NHR su zaštićeni sa Boc, Moc, Z-Ci, Fmoc, Z, ili Alloc.
U jednom rešenju, grupa G<2>je prisutna u kombinaciji sa grupom L<3>, čija grupa je dipeptid.
Grupa za zatvaranje nije namenjena za povezivanje sa modulatorom. Tako, drugi monomer prisutan u dimeru služi kao tačka povezivanja sa modulatorom preko linkera. Shodno tome, poželjno je da funkcionalnost prisutna u grupi za zatvaranje nije dostupna za reakciju sa modulatorom. Dakle, reaktivne funkcionalne grupe kao što su OH, SH, NH2, COOH su poželjno izbegnute. Međutim, takva funkcionalnost može biti prisutna u grupi za zatvaranje ako je zaštićena, kao što je prethodno opisano.
Prema tome, u skladu sa ovim učenjem, jedno rešenje pronalaska sadrži konjugat koji sadrži jedinjenje:
u kome CBA je agens za vezivanje ćelije/modulator, a n je 0 ili 1. L<1>je prethodno definisan, i R<E>i R<E>" su svaki nezavisno odabrani između H ili R<D>.
U drugom rešenju, konjugat obuhvata jedinjenje:
u kome CBA je agens za vezivanje ćelije/modulator, L<1>je prethodno definisan, Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno opciono supstituisani C5-20aril, a n je 0 ili 1.
Oni obučeni u tehnici će ceniti da su drugi simetrični i asimetrični PBD dimeri i linkeri kompatibilni sa trenutnim pronalaskom i mogli bi se izabrati bez nepotrebnog eksperimentisanja na osnovu učenja ovde i stanja tehnike.
Drugi aspekt pronalaska obuhvata ADCs koji obuhvata radioizotope. Primeri radioizotopa koji mogu da budu kompatibilni sa takvim rešenjima obuhvataju, ali nisu ograničeni na, jod (<131>I,<125>I,<123>I,<121>l), ugljenik (<14>C), bakar (<62>Cu,<64>Cu,<67>Cu), sumpor (<35>S), tritijum (<3>H), indijum (<115>ln,<113>In,<112>In,<111>In,), bismut (<212>Bi,<213>Bi), tehnetijum (<99>Tc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibdenum (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor (<18>F),<153>Sm,<177>Lu,<559>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Yb,<166>Ho,<90>Y,<47>Sc,<186>Re,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru,<68>Ge,<57>Co,<65>Z,<85>Sr,<32>P,<153>Gd,<169>Yb,<51>Cr,<54>Mn,<75>Se,<113>Sn,<117>Sn,<225>Ac,<76>Br, i<211>At. Drugi radionuklidi su takođe dostupni kao dijagnostički i terapeutski agensi, naročito oni u energetskom opsegu od 60 do 4,000 keV. U zavisnosti od stanja koje treba tretirati i željenog terapeutskog profila, stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako izabrati odgovarajući radioizotop za upotrebu sa otkrivenim modulatorima.
DLL3 modulatori predmetnog pronalaska takođe su konjugovani sa terapeutskim ostatkom ili lekom koji modifikuje dati biološki odgovor (npr. modifikatori biološkog odgovora ili BRM). To znači da terapeutski agensi ili grupe kompatibilni sa predmetnim pronalaskom ne treba tumačiti kao ograničene na klasične hemijske terapeutske agense. Na primer, u naročito poželjnim izvođenjima ostatak leka može biti protein ili polipeptid ili njegov fragment koji poseduje željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu, na primer, obuhvatati toksin kao abrin, ricin A, Onkonaza (ili drugu citotoksična RNaza), pseudomonas eksotoksin, toksin holere ili toksin difterije; protein kao što je faktor tumorske nekroze, Į-interferon, ȕ-iterferon, faktor rasta nerva, faktor rasta koji se dobija od trombocita, aktivator tkiva plazminogena, apoptotično sredstvo, npr., TNF- Į, TNF-ȕ, AIM I (videti, Međunarodnu Objavu Br. WO 97/33899), AIM II (videti, Međunarodnu Objavu Br. WO 97/34911), Fas ligand (Takahashi et at, 1994, J. Immunol., 6:5567), i VEGI (videti, Međunarodnu objavu Br. WO 99/23105), trombotični agens ili anti-angiogenski agent, npr., angiostatin ili endostatin; ili, modifikator biloškog odgovora kao što je, na primer, limfokin (npr., interieukin-1 ("lL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije kolonije granulocitne makrofage ("GM-CSF"), i granulocitni koloniji stimulativni faktor ('G-CSF")), ili faktor rasta (npr., hormon rasta ("GH")). Kao što je gore navedeno, u tehnici su poznate metode za fiksiranje ili konjugovanje modulatora na polipeptidne grupe. Pored prethodno otkrivenih predmetnih referenci, videti, npr., U.S.P.Br.5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053: 5,447,851, i 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; PCT Objave WO 96/04388 i WO 91/06570; Ashkenazi et al, 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng et al, 1995, J Immunol 154:5590; i ViI et al, 1992, PNAS USA 89;11337.
Štaviše, kao što je gore navedeno, asocijacija modulatora sa takvim delovima ne mora nužno da bude direktna, već se može desiti kroz linkerske sekvence. Kao što je ranije pomenuto, takvi linker molekuli su uobičajeno poznati u tehnici i opisani u Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4:2483; Peterson et al, 1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26:943: Gamett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171.
IX. Dijagnoze i Skrining
A. Dijagnoze
U još nekim slučajevima, pronalazak obezbeđuje in vitro ili in vivo metode za detektovanje, dijagnostikovanje ili praćenje proliferativnih poremećaja i metoda skeniranja ćelija iz pacijenta kako bi se identifikovale tumorske ćelije koje uključuju CSC. Takve metode obuhvataju identifikaciju pojedinca koji ima rak za lečenje ili nadgledanje progresije raka koja obuhvata kontaktiranje pacijenta ili uzorka dobijenog iz pacijenta (odn. bilo in vivo ili in vitro) sa modulatorom kao što je ovde opisano i detektovanje prisustva ili odsustva, ili nivoa vezivanja modulatora za vezu ili slobodni ciljani molekuli u uzorku. U posebno poželjnim slučajevima, modulator će obuhvatiti detektibilnu etiketu ili reporterski molekul kao što je ovde opisano.
U nekim slučajevima, vezivanje modulatora, kao što je antitelo, sa određenim ćelijama u uzorku, verovatno označava da uzorak može sadržati CSCs, na taj način ukazujući na to da osoba koja ima rak može biti efikasno lečena sa modulatorom kako je ovde opisano. Metode mogu dalje obuhvatati korak upoređivanja nivoa vezivanja za kontrolu. Nasuprot tome, kada je modulator Fc-konstruktor, osobine vezivanja mogu biti eksploatisane i nadgledane (direktno ili indirektno, in vivo ili in vitro) kada su u kontaktu sa uzorkom da obezbede željenu informaciju.
Primeri kompatibilnih metoda ispitivanja uključuju radioimuno analizu, imunoanalize enzima, testove kompetitivnog vezivanja, fluorescentnu imunoanalizu, imunoblot analizu, Western Blot analizu, analize protočne citometrije i ELISA analizu. Kompatibilna in vivo teragnostika ili dijagnostika mogu da sadrže slike prepoznate tehnike ili tehnike praćenja kao što su magnetna rezonanca, kompjuterizovana tomografija (npr. CAT skeniranje), pozitronska tomografija (npr. PET sken), radiografija, ultrazvuk, itd. kao što bi bilo poznato od strane stručnjaka u oblasti.
U drugom primeru, pronalazak obezbeđuje metod za analiziranje napredovanja raka i/ili patogeneze in vivo. U drugom primeru, analiza napredovanja raka i/ili patogeneze in vivo obuhvata određivanje stepena napredovanja tumora. U drugom primeru, analiza obuhvata identifikaciju tumora. U drugom slučaju, analiza napredovanja tumora se izvodi na primarnom tumoru. U drugom slučaju, analiza se vrši tokom vremena u zavisnosti od tipa kancera kako je poznato stručnjaku. U drugom slučaju, dalja analiza sekundarnih tumora poreklom iz metastazirajućih ćelija primarnog tumora analizira se in vivo. U drugom primeru analizira se veličina i oblik sekundarnih tumora. U nekim slučajevima se vrši još ex vivo analiza.
U drugom slučaju, pronalazak obezbeđuje metod za analizu napredovanja raka i/ili patogeneze in vivo uključujući određivanje ćelijske metastaze ili detektovanje i kvantifikovanje nivoa cirkulirajućih ćelija tumora. U još jednom slučaju, analiza ćelijske metastaze obuhvata određivanje progresivnog rasta ćelija na mestu koje je diskontinuirano iz primarnog tumora. U drugom slučaju, mesto analize ćelijskih metastaza obuhvata put neoplastičnog širenja. U nekim slučajevima, ćelije se mogu rasporediti preko krvne vaskulature, limfatike, unutar šupljina tela ili njihovih kombinacija. U drugom slučaju, mesto analize ćelijskih metastaza se vrši u cilju migracije ćelija, diseminacije, ekstravazacije, proliferacije ili njihovih kombinacija.
Shodno tome, u posebno poželjnom primeru modulatori iz ovog pronalaska mogu se koristiti za detekciju i kvantifikaciju DLL3 nivoa u pacijentovom uzorku (npr. plazmi ili krvi), koji se, pak, mogu koristiti za detekciju, dijagnozu ili praćenje DLL3 povezanih poremećaja uključujući proliferativne poremećaje. U relevantnim slučajevima modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti za detekciju, nadgledanje i/ili kvantifikaciju ćelija tumora u cirkulaciji bilo in vivo ili in vitro (videti, na primer, WO 2012/0128801). U još nekim drugim poželjnim rešenjima tumorne ćelije mogu da sadrže matične ćelije raka.
U određenim primerima, tumorske ćelije kod subjekta ili uzorku iz subjekta mogu se proceniti ili okarakterisati korišćenjem otkrivenih modulatora pre terapije ili režima za uspostavljanje osnovne linije. U drugim primerima uzorak je izveden iz subjekta koji je bio tretiran. U nekim primerima uzorak se uzima iz subjekta najmanje oko 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 30, 60, 90 dana, 6 meseci, 9 meseci, 12 meseci, ili > 12 meseci nakon što subjekat započne ili završi lečenje. U određenim primerima, tumorske ćelije se procenjuju ili se karakterišu nakon određenog broja doza (npr., nakon 2, 5, 10, 20, 30 ili više doza terapije). U drugim primerima, tumorske ćelije se karakterišu ili procenjuju posle 1 nedelje, 2 nedelje, 1 meseca, 2 meseca, 1 godine, 2 godine, 3 godine, 4 godine ili više posle primene jedne ili više terapija.
U drugom aspektu, i kako je detaljnije razmatrano u nastavku, predemetni pronalazak obezbeđuje komplete za detektovanje, nadgledanje ili dijagnostikovanje hiperproliferatvnog poremećaja, identifikovanjem pojedinca koji ima takav poremećaj za moguće lečenje ili praćenje progresije (ili regresije) poremećaja kod pacijenta, pri čemu oprema sadrži modulator kao što je ovde opisano, i reagense za detekciju uticaja modulatora na uzorku.
Još jedan primer predmetnog pronalaska obuhvata primenu označenog DLL3 za imunohistohemiju (IHC). U tom pogledu, DLL-3 IHC se može koristiti kao dijagnostički alat za pomoć u dijagnozi različitih proliferativnih poremećaja i za praćenje potencijalnog odgovora na tretmane uključujući DLL3 modulatorsku terapiju. Kompatibilni dijagnostički testovi mogu se izvesti na tkivima koji su hemijski fiksirani (uključujući, ali ne ograničavajući se na: formaldehid, gluteraldehid, osmijum tetroksid, kalijum dihromat, sirćetna kiselina, alkoholi, cinkove soli, merkurni hlorid, hrom tetroksid i pikrinska kiselina) uključujući, ali ne ograničavajući se na: glikol metakrilat, parafin i smole) ili konzervirani putem zamrzavanja. Kao što je detaljnije razmotreno, takve analize mogu se koristiti za vođenje odluka o lečenju i određivanje režima doziranja i određivanja vremena.
B. Skrining
U određenim primerima, modulatori se takođe mogu koristiti za skeniranje ili identifikovanje jedinjenja ili agenasa (npr. lekovi) koji menjaju funkciju ili aktivnost tumorskih ćelija ili njegovog progena interakcijom sa antigenom (npr., genotipske ili fenotipske komponente). Takva jedinjenja i agensi mogu biti kandidati za lekove koji su prikazani za lečenje proliferativnog poremećaja, na primer. U jednom primeru, sistem ili postupak uključuje tumorske ćelije koje sadrže DLL3 i jedinjenje ili agens (npr., lek), pri čemu su ćelije i jedinjenje ili agens u kontaktu jedan sa drugim. U takvim slučajevima ćelije subjekta mogu biti identifikovane, nadgledane i/ili obogaćene korišćenjem otkrivenih modulatora.
U još jednom slučaju, postupak uključuje kontaktiranje, direktno ili indirektno, tumorskih ćelija ili njihovih progena sa testiranim agensom ili jedinjenjem i određivanje da li test agens ili jedinjenje modulira aktivnost ili funkciju tumorskih ćelija povezanih sa antigenom. Jedan primer direktne interakcije je fizička interakcija, dok indirektna interakcija uključuje dejstvo kompozicije na posredni molekul koji, pak, deluje na referentni entitet (npr., ćelija ili ćelijska kultura). Primerne aktivnosti ili funkcije koje se mogu modulirati uključuje promene u morfologiji ćelije ili održivosti, ekspresija markera, diferencijacije ili de-diferencijacije, respiratornih ćelija, mitohondrijalne aktivnosti, integriteta membrane, sazrevanja, proliferacije, preživljavanja, apoptoze ili smrti ćelije.
Metode skrininga i identifikacioni agensi i jedinjenja uključuju one pogodne za skrining velikog protoka, koji uključuju nizove ćelija (npr., mikrostrukture) pozicionirane ili postavljene, opciono na unapred određenim lokacijama ili adresama. Na primer, ćelije se mogu pozicionirati ili postaviti (prethodno zasejane) na posudu za kulturu, cev, bočicu, bočicu ili ploču (npr., pojedinačna ploču ili posuda sa više ploča, kao što su 8, 36, 32, 64, .96, 384 i 1536 višeslojna ploča ili posuda). Robotski ili ručni postupci visokog protoka mogu proučiti hemijske interakcije i odrediti nivoe ekspresije mnogih gena u kratkom vremenskom periodu.
Izrađene su tehnike koje koriste molekularne signale (npr., putem fluorofora) i automatske analize koje obrađuju informacije veoma brzom brzinom (videti, npr., Firthasov et al, Comb. Chem. High Throughput Screen.7:133 (2004)). Na primer, tehnologija mikropodručja se intenzivno koristi za ispitivanje interakcija hiljada gena odjednom, dok obezbeđuje informacije za određene gene (videti, npr., Mocellin and Rossi, Adv. Exp. Med. Biol.593:19 (2007)).
Biblioteke koje se mogu pregledati obuhvataju, na primer, biblioteke malih molekula, biblioteke fagnog prikaza, biblioteke prikaza potpunog humanog antitela kvasca (Adimab, LLC), siRNK biblioteke, i vektori transfekcije adenovirusa.
X. Farmaceutski Preparati i Terapeutske Primene
A. Formulacije i Načini Primene
U zavisnosti od oblika modulatora zajedno sa bilo kojim opcionim konjugatom, način predviđene isporuke, bolest koja se tretira ili prati i brojne druge varijable, kompozicije pronalaska mogu se formulisati po želji korišćenjem tehnika priznate u tehnici. U nekim rešenjima, terapeutski preparati pronalaska se mogu primenjivati uredno ili sa minimalnim dodatnim komponentama, dok drugi mogu opciono da budu formulisani da sadrže odgovarajuće farmaceutski prihvatljive nosače koji sadrže ekscipijente i pomoćne supstance koja su dobro poznata u struci (videti npr. Gennaro , Remington: The Science and Practice of Pharmaci with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20. izd. (2003); Ansel et a., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Deliveri Sistems, 7. izd., Liopeneott Villiams i Vilkms 2004), Kibbe et al, Handbook of Pharmaceutical Ekcipients, 3. izd., Pharmaceutical Press (2000)). Različiti farmaceutski prihvatljivi nosači, koji uključuju nosače, adjuvante i razblaživače, lako su dostupni iz brojnih komercijalnih izvora. Štaviše, na raspolaganju su i asortiman farmaceutiki prihvatljivih pomoćnih supstanci, kao što su podešavanje pH i agensi za puferovanje, agensi za podešavanje toničnosti, stabilizatori, sredstva za vlaženje i slično. Pojedini neograničavajući primerni nosači uključuju slani rastvor, puferni slani rastvor, dekstrozu, vodu, glicerol, etanol i njihove kombinacije.
Prvenstveno, biće prihvaćeno da se u nekim rešenjima terapeutske kompozicije pronalaska mogu davati urednim ili sa minimalnim dodatnim komponentama. Nasuprot tome, DLL3 modulatori predmetnog pronalaska mogu se opciono formulisati tako da sadrže odgovarajuće farmaceutski prihvatljive nosače koji sadrže ekscipijense i pomoćne supstance koje su dobro poznate u tehnici i relativno inertne supstance koje olakšavaju davanje modulatora ili koje pomažu obradu aktivnog jedinjenja u preparatima koji su farmaceutici optimizovani za isporuku do mesta delovanja. Na primer, ekscipijens može dati oblik ili konzistentnost ili delovati kao razblaživač za poboljšanje farmakokinetike ili stabilnosti modulatora. Pogodni ekscipijensi ili aditivi uključuju, ali se ne ograničavaju na, sredstva za stabilizaciju, sredstva za vlaženje i emulziju, soli za različitu osmolarnost, sredstva za enkapsulaciju, pufere i poboljšače penetracije kože. U određenim poželjnim rešenjima farmaceutske kompozicije mogu biti obezbeđene u liofilizovanom obliku i rekonstituisane u, na primer, puferni slani rastvor pre primene.
Otkriveni modulatori za sistemsku primenu mogu se formulisati za enteralnu, parenteralnu ili lokalnu primenu. Zaista, sva tri tipa formulacije mogu se istovremeno koristiti za postizanje sistemske primene aktivnog sastojka. Ekscipijensi, kao i formulacije za parenteralnu i neparentralnu isporuku lekova su predstavljeni u Remingtonu, Nauka i praksa farmacije 20. izd, Mack Publishing (2000). Pogodne formulacije za parenteralnu primenu uključuju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku koji se rastvara u vodi, na primer, soli koji rastvorljivi u vodi. Osim toga, mogu se primenjivati suspenzije aktivnih jedinjenja u slučaju uljanih injekcionih suspenzija. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači obuhvataju masna ulja, na primer, heksil supstituisani poli (laktid), susamovo ulje ili estre sintetičke mosne kiseline, na primer, etil oleat ili trigliceridi. Vodene injekcione suspenzije mogu sadržati supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije i uključuju, na primer, natrijum karboksimetil celulozu, sorbitol i/ili dekstran. Opciono, suspenzija može takođe sadržati stabilizatore, a lipozomi se takođe mogu koristiti za inkapsulaciju agensa za isporuku u ćeliju.
Pogodne formulacije za enteralnu primenu uključuju tvrde ili meke želatinske kapsule, pilule, tablete, uključujući obložene tablete, eliksire, suspenzije, sirupe ili inhalacije i oblike sa kontrolisanim otpuštanjem.
Uopšteno, jedinjenja i kompozicije pronalaska, koja sadrže DLL3 modulatore, mogu se davati in vivo, subjektu koji je potreban, putem različitih pravaca, uključujući, ali bez ograničenja, oralno, intravenozno, intra-arterijsko, subkutano, parenteralno, intranazalno, intramuskularno, intrakranijalno, intrakardialno, intraventrikularno, intratrahealno, bukalno, rektalno, intraperitonealno, intradermalno, topično, transdermalno i intratekalno, ili inače implantacijom ili inhalacijom. Predmetne kompozicije se mogu formulisati u preparate u čvrstim, polučvrstim, tečnim ili gasovitim oblicima; uključujući, ali ne ograničavajući se na, tablete, kapsule, praškove, granule, masti, rastvore, supozitorije, klistere, injekcije, inhalante i aerosole. Odgovarajuća formulacija i način primene mogu se izabrati prema nameni i terapeutskom režimu.
B. Doziranja
Slično tome, posebni režim doziranja, odn. doziranje, vreme i ponavljanje, zavisiće od određene osobe i medicinske istorije tog pojedinca, kao i empirijskih razloga kao što je farmakokinetika (npr. polu-vek, brzina čišćenja itd.). Učestalost primene može se odrediti i prilagoditi tokom terapije i zasniva se na smanjenju broja proliferativnih ili tumorskih ćelija, održavajući smanjenje takvih neoplastičnih ćelija, smanjujući proliferaciju neoplastičnih ćelija ili odlaganje razvoja metastaza. U drugim rešenjima, primenjena doza može se podesiti ili oslabiti za upravljanje potencijalnih neželjenih efekata i/ili toksičnosti. Alternativno, trajne formulacije kontinualnog oslobađanja predmetne terapeutske kompozicije mogu biti prikladne.
Uopšteno, modulatori pronalaska mogu se primenjivati u različitim rasponima. To uključuje oko 10 µg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine po dozi; oko 50 µg/kg telesne težine do oko 5 mg/kg telesne težine po dozi; oko 100 µg/kg telesne težine do oko 10 mg/kg telesne težine po dozi. Ostali opsezi uključuju oko 100 µg/kg telesne težine do oko 20 mg/kg telesne težine po dozi i oko 0.5 mg/kg telesne težine do oko 20 mg/kg telesne težine po dozi. U određenim rešenjima, doza je najmanje oko 100 µg/kg telesne težine, najmanje oko 250 µg/kg telesne težine, najmanje oko 750 µg/kg telesne težine, najmanje oko 3 mg/kg telesne težine, najmanje oko 5 mg/kg telesne težine, najmanje oko 10 mg/kg telesne težine.
U odabranim primerima, modulatori će se primenjivati na približno 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 µg/kg telesne težine po dozi. Drugi primeri će sadržati administraciju modulatora na 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 ili 900 µg/kg telesne težine po dozi. U drugim poželjnim primerima otkriveni modulatori će se primenjivati na 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mg/kg. U još nekim primerima, modulatori se mogu primenjivati na 12, 14, 16, 18 ili 20 mg/kg telesne težine po dozi. U drugim primerima modulatori se mogu primenjivati na 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 , 60, 65, 70, 75, 80, 90 ili 100 mg/kg telesne težine po dozi. U skladu sa ovim učenjima biće prihvaćeno da se pomenute doze primenjuju i na nekonjugovane modulatore i modulatore konjugovane sa citotoksičnim agensom. Jedan od stručnjaka u tehnici može lako da odredi odgovarajuće doze za različite konjugovane i nekonjugovane modulatore na osnovu prekliničkih studija na životinjama, kliničkih opažanja i standardnih medicinskih i biohemijskih tehnika i merenja.
Što se tiče konjugovanih modulatora, naročito poželjna rešenja sadrže doze od oko 50 µg/kg do oko 5 mg/kg telesne težine po dozi. U tom pogledu konjugovani modulatori mogu se primenjivati na 50, 75 ili 100 µg/kg ili na 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 ili 1 mg/kg telesne težine po dozi. U drugim poželjnim rešenjima konjugovani modulatori predmetnog pronalaska mogu se primenjivati na 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25, 2.5, 2.75, 3, 3.25, 3.5, 3.75, 4, 4.25, 4.5, 4.75 ili 5 mg/kg telesne težine po dozi. U posebno poželjnim rešenjima takve konjugovane modulatorske doze će se primenjivati intravenozno tokom određenog vremenskog perioda. Osim toga, takve doze mogu se davati više puta tokom određenog toka lečenja.
Ostali dozni režimi mogu se zasnivati na proračunima područja telesne površine (Body Surface Area (BSA)) kako je otkriveno u U.S.P.N.7,744,877. Kao što je poznato, BSA se izračunava koristeći visinu i težinu pacijenta i daje meru veličine subjekta kao što je predstavljeno površinom područja njegovog ili njenog tela. U određenim primerima, modulatori se mogu primenjivati u dozama od 10 mg/m<2>do 800 mg/m<2>; od 50 mg/m<2>do 500 mg/m<2>i pri dozama od 100 mg/m<2>, 150 mg/m<2>, 200 mg/m<2>, 250 mg/m<2>, 300 mg/m<2>, 350 mg/m<2>, 400 mg/m<2>ili 450 mg/m<2>.
Takođe će se smatrati da se priznata tehnika i empirijske tehnike mogu koristiti za određivanje odgovarajuće doze za konjugovane modulatore (odn., ADCs).
U svakom slučaju, DLL3 modulatori (oba i konjugovani i nekonjugirani) poželjno se primenjuju po potrebi na subjekte kojima je potrebno. Određivanje učestalosti davanja može da se izvede od strane stručnjaka u struci, kao što je lekar koji se pojavi na osnovu razmatranja stanja koje se leči, starosti subjekta koji se leči, težine stanja koji se leči, opšteg zdravstvenog stanja subjekt koji se tretira i slično. Uopšteno, efektivna doza DLL3 modulatora se primenjuje na subjekta jednom ili više puta. Naročito, efektivna doza modulatora se primenjuje na subjekta jednom mesečno, više od jednom mesečno ili manje od jednom mesečno. U određenim slučajevima, efektivna doza DLL3 modulatora može se primenjivati više puta, uključujući i periode od najmanje mesec dana, najmanje šest meseci, najmanje godinu dana, najmanje dve godine ili period od nekoliko godina. U još nekim slučajevima, nekoliko dana (2, 3, 4, 5, 6 ili 7) nekoliko nedelja (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8) ili nekoliko mjeseci (1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7 ili 8), pa čak i godinu ili više godina može proći između primene otkrivenih modulatora.
U određenim poželjnim rešenjima tok lečenja koji uključuje konjugovane modulatore će sadržati višestruke doze odabranog lekovitog proizvoda (odn., ADC) tokom perioda od nekoliko nedelja ili meseci. Preciznije, konjugovani modulatori ovog pronalaska mogu se primenjivati jednom dnevno, svakih dva dana, svakih četiri dana, svake nedelje, svakih deset dana, svake dve nedelje, svake tri nedelje, svakog meseca, svakih šest nedelja, svakih dva meseca, svakih deset nedelja ili svaka tri meseca. U tom smislu biće prihvaćeno da se doze mogu menjati ili da se interval može prilagoditi na osnovu odgovora pacijenta i kliničke prakse.
Doziranje i režimi takođe se mogu odrediti empirijski za otkrivene terapeutske kompozicije kod pojedinaca kojima je data jedna ili više administracija. Na primer, pojedincima mogu da se daju inkrementalne doze terapeutske kompozicije proizvedene kao što je opisano ovde. U odabranim primerima doziranje se može postepeno povećavati ili smanjivati ili oslabiti na bazi empirijski određenih ili posmatranih neželjenih efekata ili toksičnosti. Da bi se procenila efikasnost odabrane kompozicije, može se pratiti marker određene bolesti, poremećaja ili stanja, kao što je prethodno opisano. U slučajevima gde pojedinac ima rak, uključuju direktna merenja veličine tumora putem palpacije ili vizuelnog posmatranja, indirektno merenje veličine tumora pomoću rengenskih ili drugih tehnika snimanja; poboljšanje koje se procenjuje direktnom biopsijom tumora i mikroskopskim pregledom uzorka tumora; merenje indirektnog tumorskog markera (npr., PSA za rak prostate) ili antigena identifikovan prema metodima opisanim ovde, smanjenje bola ili paralize; poboljšan govor, vid, disanje ili druga nesposobnost povezana sa tumorom; povećan apetit; ili povećanje kvaliteta života mereno prihvatljivim testovima ili produženim preživljavanjem. Biće očigledno jednom stručnjaku da doziranje varira u zavisnosti od pojedinca, tipa neoplastičnog stanja, stadijuma neoplastičnog stanja, da li je neoplastično stanje počelo metastazirati na drugu lokaciju u pojedinci, i prošlosti i istovremeni tretmani koji se koriste.
C. Kombinovane Terapije
Kombinovane terapije mogu biti naročito korisne u smanjenju ili inhibiranju neželjene proliferacije neoplastičnih ćelija, smanjenju pojave karcinoma, smanjenju ili sprečavanju ponovnog kancera ili smanjenju ili sprečavanju širenja ili metastaze kancera. U takvim slučajevima modulatori predmetnog pronalaska mogu funkcionisati kao senzibilizujući ili hemosenzitivni agensi pomeranje CSCs koji bi na neki način podržali i uvećavali masu tumora i na taj način omogućili efikasnije korišćenje trenutnog standarda nege otklanjajućim ili anti-kancerogenim agensima. To znači da otkriveni modulatori mogu u određenim slučajevima obezbediti poboljšani efekat (npr., aditiv ili sinergistički u prirodi) koji potencira način delovanja drugog terapeutskog agensa. U kontekstu predmetnog pronalaska "kombinovana terapija" treba široko tumačiti i samo se odnosi na primenu modulatora i jednog ili više agenasa za zaštitu od kancera koji uključuju, ali bez ograničavanja na, citotoksične agense, citostatičke agense, anti-angiogene agensi, agense za deblokiranje, hemoterapeutske agense, radioterapija i radioterapijskih agenasa, ciljani anti-kancerogeni agensi (uključujući i monoklonska antitela i entitete malih molekula). BRM, terapeutska antitela, vakcine protiv karcinoma, citokini, hormonske terapije, terapija zračenjem i antknetastatski agensi i imunoterapeutski agensi, uključujući i specifične i nespecifične pristupe.
Ne postoji zahtev da kombinovani rezultati budu aditivni za efekte koji se primećuju kada se svaki tretman (npr., antitelo i agens protiv kancera) sprovodi odvojeno. Iako su barem aditivni efekti poželjni, bilo koji povišeni anti-tumorski efekat iznad jedne pojedinačne terapije je od koristi. Dalje, pronalazak ne zahteva kombinovani tretman da pokaže sinergijske efekte. Međutim, stručnjaci u ovoj oblasti će ceniti da sa određenim odabranim kombinacijama, koje obuhvataju poželjna izvođenja, se može posmatrati sinergizam.
Kod kombinovane terapije koja se primenjuje, modulator i agens protiv kancera se mogu davati subjektu istovremeno, bilo u pojedinačnoj kompoziciji, ili kao dve ili više različitih kompozicija koristeći iste ili različite načine primene. Alternativno, modulator može prethoditi ili slediti tretman sa agensom protiv kancera, na primer, intervalima koji se kreću od nekoliko minuta do sedmica. Vremenski period između svake isporuke je takav da agens protiv kancera i modulator mogu biti u kombinaciji sa tumorom. U barem jednom slučaju i agens protiv kancera i modulator se primenjuju u roku od oko 5 minuta do dve nedelje jedna od druge. U drugim slučajevima nekoliko dana (2, 3, 4, 5, 6 ili 7), nekoliko sedmica (1,2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8), ili nekoliko mjeseci (1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7 ili 8) mogu proći između primene modulatora i agensa protiv kancera.
Kombinovana terapija može se primenjivati jednom, dvaput ili barem u određenom vremenskom periodu sve dok se stanje tretira, ne dođe do zapaljenja ili izleči. U nekim rešenjima, kombinovana terapija se primenjuje više puta, na primer, od tri puta do jednom svakih šest meseci. Primena može biti u rasporedu tri puta dnevno, dva puta dnevno, jednom dnevno, jednom na dva dana, jednom na svaka tri dana, jednom nedeljno, jednom svake dve sedmice, jednom mesečno, jednom na svaka dva mjeseca, jednom u tri mjeseca, jednom na svakih šest meseci ili se može kontinuirano primenjivati putem minipumpe.
Kombinovana terapija može se primenjivati putem bilo koje rute, kao što je ranije navedeno. Kombinovana terapija se može davati na mestu daleko od mesta tumora.
U jednom primeru, modulator se primenjuje u kombinaciji, sa jednim ili više agenasa za kratak ciklus tretmana prema subjektu kojem je to potrebno. Pronalazak takođe predviđa prekidnu primenu ili dnevne doze podeljene na nekoliko parcijalnih primena. Modulator i agens protiv kancera mogu se primenjivati naizmenično, u alternativnim danima ili nedeljama; ili sekvencu tretmana antitela, praćeno sa jednim ili više tretmana terapije protiv kancera. U svakom slučaju, kao što će biti razumljivo od strane stručnjaka, odgovarajuće doze hemoterapeutskih agenasa će biti uglavnom oko onih koji su već zaposleni u kliničkim terapijama gde se hemoterapeutici primenjuju sami ili u kombinaciji sa drugim hemoterapijama.
U još jednom poželjnom primeru, DLL3 modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti u održavanju terapije kako bi se smanjile ili eliminisale šanse za ponovnu pojavu tumora nakon inicijalne prezentacije bolesti. Poželjno je da se poremećaj tretira, a početna masa tumora eliminiše, smanjuje ili na neki drugi način poboljšava tako da je pacijent asimptomatičan ili u remisiji. U tom trenutku subjektu se može davati farmaceutska efikasna količina otkrivenih modulatora jednom ili više puta, iako postoji mali ili nikakav indikator bolesti koristeći standardne dijagnostičke procedure. U nekim primerima, modulatori će se redovno primenjivati u određenom vremenskom periodu, kao što su nedeljno, svake dve nedelje, mesečno, svakih šest nedelja, svaka dva meseca, svaka tri meseca, svakih šest meseci ili godišnje. Uzimajući u obzir ovde učešće, stručnjak u tehnici može lako odrediti povoljne doze i režime doziranja kako bi se smanjio potencijal ponovnog nastanka bolesti. Štaviše, takvi tretmani mogu se nastaviti na period od nekoliko nedelja, meseci, pa čak i na neodređeno vreme u zavisnosti od odgovora pacijenta i kliničkih i dijagnostičkih parametara.
U još jednom poželjnom primeri modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti za profilaktičku ili kao adjuvantska terapija za sprečavanje ili smanjenje mogućnosti metastaze tumora nakon postupka otkrivanja. Kao što se koristi u predmetnom pronalasku "postupak otkrivanja" je široko definisan i podrazumeva bilo koju proceduru, tehniku ili postupak koji eliminiše, smanjuje, tretira ili poboljšava proliferaciju tumora ili tumor. Primeri postupaka otkrivanja uključuju, ali se ne ograničavaju na, operaciju, radijaciju (odn. zračenje snopom), hemoterapiju, imunoterapiju ili ablaciju. U odgovarajućim vremenskim intervalima određeni od strane stručnjaka u tehnici u pogledu na predmetni pronalazak, otkriveni modulatori se mogu davati prema uputstvu kliničkog, dijagnostičkog ili teragostatičkog postupka kako bi se smanjila tumorska metastaza. Modulatori se mogu primenjivati jedan ili više puta u farmaceutski efikasnim dozama kao što je određeno korišćenjem standardnih tehnika.
Poželjno, režim doziranja će biti praćen odgovarajućim tehnikama dijagnostike ili praćenja koji omogućavaju njegovu izmenu.
Ipak, drugi primeri pronalaska sadrže primenu otkrivenih modulatora na subjekte koji su asimptomatični ali sa rizikom od razvoja proliferativnog poremećaja. To znači da modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti u istinski preventivnom smislu i dati pacijentima koji su ispitivani ili testirani i imaju jedan ili više faktora rizika (npr., genomske indikacije, porodične istorije, in vivo ili in vitro test rezultati, itd.), ali nisu razvili neoplaziju. U takvim slučajevima, stručnjaci u tehnici bi mogli da odrede efikasan režim doziranja putem empirijskog posmatranja ili putem prihvaćene kliničke prakse.
D. Anti-Kancerogeni Agensi
Termin "anti-kancerogeni agens" ili "anti-proliferativni agens" označava bilo koji agens koji može da se koristi za lečenje poremećaja ćelijske proliferacije kao što je kancer, i obuhvata, ali nije ograničen na, citotoksične agense, citostatičke agense, anti-angiogenske agense, debulking agensi, hemoterapeutski agensi, radioterapija i radioterapeutski agensi, ciljani anti-kancer agensi, BRMs, terapeutska antitela, kancer vakcine, citokini, hormonske terapije, terapije zračenjem i anti -metastatične agense i imunoterapeutske agense. Biće od koristi, u odabranim primerima kao što je prethodno opisano, takvi anti-kancerogeni agensi mogu sadržati konjugate i mogu biti povezani sa modulatorima pre primene. U izvesnim primerima otrkiveni anti-kancerogeni agens će biti povezan sa DLL3 modulatorom kako bi obezbedio ADC kako je ovde navedeno.
Kao što je korišćeno ovde termin "citotoksični agens" označava supstancu koja je toskična za ćelije i smanjuje ili inhibira funkciju ćelija i/ili izaziva destrukciju ćelija. Obično, supstanca je molekul koji se javlja u prirodi i koji je izveden iz živog organizma. Primeri citotoksičnih agenasa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, male molekulske toksine ili enzimatske aktivne toksine bakterije (npr., Diptheria toxin, Pseudomonas endotoksin i eksotoksin, Staphylococcal enterotoxin A), gljive (npr., a-sarcin, restrictocin), biljke (npr., abrin, ricin, modecin, viscumin, anti-virusni protein vinobojke, saporin, gelonin, momoridin, trihosantin, toksin ječma, Aleurites fordii proteini, diantin proteini, Phytolacca mericana proteini (PAPi, PAPII, i PAP-S), Momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, saponarla officinalis inhibitor, gelonin, mitegellin, restrictocin, phenomycin, neomycin, i tricothecenes) ili životinje, (npr., citotoksične RNases, kao što je ekstraćelijska pankreatska RNases; DNase 1, koja obuhvata fragmente i/ili njihove varijante).
Za svrhu predmetnog pronalaska "hemoterapeutski agens" obuhvata hemijsko jedinjenje koje neodređeno smanjuje ili inhibira rast, proliferaciju i/ili opstanak kancerogenih ćelija (npr., citotoksični ili citostatički agensi). Takvi hemijski agensi su često usmereni na intraćelijske postupke neophodni za rast ili podelu ćelije, i stoga su naročito efikasni protiv kancerogenih ćelija, koje uopšteno brzo rastu i dele se. Na primer, vincristin depolimerizuje mikrotubule, i na taj način inhibira ćelije da ulaze u mitozu. Uopšteno, hemoterapeutski agensi mogu obuhvatati bilo koji hemijski agens koji inhibira, ili je usmeren da inhibira kancerogenu ćeliju ili ćeliju koja lako može da postane kancerogena ili uopšteno tumorski progen (npr., TIC). Takvi agensi se često primenjuju, i često su najefikasniji, u kombinaciji, npr., u režimima kao što je CHOP ili FOLFIRL. Ponovo, u odabranim slučajevima takvi hemoterapeutski agensi mogu biti konjugovani sa otkrivenim modulatorima.
Primeri anti-kancerogenih agenasa koji se mogu koristiti u kombinaciji sa (ili konjugovanim na) modulatorima predmetnog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, alkilacione agense, alkil sulfonate, aziridine, etilenimine and metilamelamine, acetogenine, kamptotecin, briostatin, calistatin, CC-1065, criptoficine, dolastatin, duocarmicin, eleuterobin, pancratistatin, sareodictin, spongistatin, nitrogen mustarde, antibiotike, enedine antibiotike, dinemicin, bisfosfonate, esperamicin, hromoprotein enedin antiobiotik hromofore, aclacinomisine, actinomicin, autramicin, azaserin, bleomicine, cactinomicin, karabicin, carminomicin, karzinophilin, hromomicine, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYC1N® doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini, mikofenolnu kiselinu, nogalamicin, olivomicine, peplomicin, potfiromycin, puromicin, helamicin, rodorabicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite, eriotinib, vemurafenib, crizotinib, sorafenib, lbrutinib, enzalutamid, analoge folne kiseline, purine analoge, androgene, anti-adrenale, pomoćna folna kiselina kao što je frolinska kiselina, aceglaton, aldofosfamid glikozid, aminolevulinsku kiselinu, eniluracil, amsacrin, bestrabucil, bisantren, edatraksat, defofamin, demecolcine, diazihon, elfornitin, eliptinium acetat, epotilon, etoglucid, galium nitrat, hidroksiurea, lentinan, lonidainin, maitansinoide, mitoguazon, mitoksantron, mopidanmol, nitraerin, pentostatin, fenamet, pirarubicin, iozoksantron, podofilinsku kiselinu, 2- etilhidrazid, procarbazin, PSK<®>polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoksan; rizoksin; sizofiran; spirogermanium; tenuazonski kiselinu; triazihon; 2,2’,2''-trihlorotrietilamin; trihotecene (prvenstveno T-2 toksin, veracurin A, roridin A i anguldin); uretan; vindesin; dacarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoide, hloranbucil; GEMZAR<®>gemcitebin; 6-tioguanin; mercaptopurin; metotreksat; platinum analoge, vinblastin; platinum; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitoxksantron; vincristin; NAVELBINE<®>vinorelbin; novantron; teniposid; edatreksat; daunomicin; aminoplerin; kseloda; ibandronat; irinotecan (Camptosar, CPT-11), topoizomeraza inhibitor RPS 2000; difluorometilornitin; retinoide; capecitabin; combretastatin; leucovorin: oksaliplatin; inhibitore PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR i VEGF-A koji redukuju ćelijsku proliferaciju i farmaceutske prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kog od gore. Takođe uključeni u ovu definiciju su anti-hormonalni agensi koji deluju tako da regulišu ili inhibiraju delovanje hormona na tumorima kao što su anti-estrogeni i selektivni modulatori estrogenskih receptora, inhibitori aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnim žlezdama, i anti-androgeni; kao i troksacitabin (1,3- dioksolan nukleozid citozin analog); antiosetljivi oligonukleotidi, ribozomi kao što su VBGF ekspresioni inhibitor i HER2 ekspresioni inhibitor; vakcine, PROLEUKIN<®>rlL-2; LURTOTECAN<®>topoizomeraza I inhibitor; ABARELIX<®>rmRH; Vinorelbin i Esperamicini i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore.
U drugim primerima modulatori predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa bilo kojim brojem antitela (ili imunoterapeutskim agensima) koje trenutno postoje u kliničkim ispitivanjima ili komercijalno dostupnim. S tim u vezi, otkriveni modulatori mogu se koristiti u kombinaciji sa antitelom izabranim iz grupe koja se sastoji od abagovoraab, adecatumumab, efutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuksimab, anatumomab, arcitumomab, bavituksimab, bectumomab, bevacizumab, bivatuzumab, blinatumomab, brentuksimab, cantuzumab, catumaksomab, cetuksimab, citatuzumab, ciksutumumab, clivatuzumab, conatumumab, daratumumab, drozitumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, daiotuzumab, ecromeximab, elotuzumab, ensituksimab, ertumaksomab, etaracizumab, ferletuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanvotumab, futuksimab, ganitumab, gemtuzumab, girentuksimab, glembatumumab, ibritumomab, igovomab, imgatuzumab, indatuksimab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, leksatumumab, lintuzumab, lorvotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moksetumomab, namatumab, naptumomab, necitumumab, nimotuzumab, nofetumomabn, ocaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregovomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab, radretumab, rilotumumab, rituksimab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuximab, simtuzumab, soiltomab. tacatuzumab, taplltumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tucotuzumab, ublituksimab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumuinab, zalutumumab, CC49, 3F8 i njihove kombinacije.
Još naročito poželjni primeri će obuhvatiti primenu antitela odobrenih za terapiju karcinoma, uključujući, ali bez ograničenja, rituksimab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamcin, alemtuzumab, ibritumomab tiuksetan, tositumomab, bevacizumab, cetuksimab, panitumumab, ofatumumab, ipilimumab i brentuksimab vedotin. Stručnjaci u ovoj oblasti će biti u stanju da lako identifikuju dodatne anti-kancerogene agense koji su kompatibilni sa ovim učenjem.
E. Radioterapija
Predmetni pronalazak takođe omogućava kombinaciju modulatora sa radioterapijom (odn., bilo koji mehanizam za iniciranje oštećenja DNK lokalno unutar tumorskih ćelija kao što su gama-zračenje, rendgenski zraci, UV zračenje, mikrotalasi, elektronske emisije i slično). Kombinovana terapija koja koristi usmerene isporuke radioizotopa na tumorne ćelije se takođe posmatra, i može se koristiti u vezi sa ciljanim anti-kancerogenim agensom ili drugim sredstvima za ciljanje. Obično, terapija zračenjem se primenjuje u pulsevima tokom perioda od oko 1 do oko 2 nedelje. Terapija zračenjem se može primenjivati na subjekte koji imaju kancer glave i vrata od oko 6 do 7 nedelja. Opciono, terapija zračenjem se može primenjivati kao pojedinačna doza ili kao višestruka, sekvencijalna doza.
XI. Indikacije
Biće prihvaćeno da se modulatori predmetnog pronalaska mogu koristiti za dijagnozu, lečenje ili sprečavanje pojave ili ponovnog nastanka bilo kog poremećaja povezanog sa DLL3. Shodno tome, bilo da se primenjuju sami ili u kombinaciji sa anti-kancerogenim agensom ili radioterapijom, modulatori pronalaska su naročito korisni za opšte lečenje neoplastičnih stanja kod pacijenata ili subjekata koji mogu uključivati benigne ili maligne tumore (npr., nadbubrežni, jetra, bubreg, bešika, dojke, želudac, jajnika, kolorektalni, prostate, pankreasa, pluća, štitne žlezde, hepatični, grlić materice, endometrijum, ezofagealni i uterni karcinomi; sarkoma, glioblastoma; i različiti tumori glave i vrata); leukemiju i limfoidnu malignost; drugi poremećaji kao što su neuronalni, glialni, astrocitalni, hipotalamični i drugi glandularni, makrofagalni, epitelijski, stromalni i blastkoelični poremećaji; i zapaljenski, angiogeni, imunološki poremećaj i poremećaj izazvan patogenima. Naročito, ključni ciljevi za lečenje su neoplastični uslovi koji sadrže čvrste tumore, iako su hematološke malignosti u okviru pronalaska. Poželjno, "subjekat" ili "pacijent" koji treba da se leči biće ljudski, iako, kako se ovde koristi, termini se izričito drže da obuhvataju bilo koju vrstu sisara.
Preciznije, neoplastični uslovi koji podležu postupku u saglasnosti sa predmetnim pronalaskom mogu biti izabrani iz grupe koja obuhvata, ali ne ograničava se na, nadbubrežne žlezde tumora, AIDS-povezane kancere, alveolarnu sarkomu mekog dela, astrocitične tumore, kancer bešike (karcinom skvamoznih ćelija i karcinom prelaznog epitela), rak kostiju (adamantinoma, aneurismalne koštane ciste, osteohondroma, osteosarkoma), kancer mozga i kičmene moždine, metastatske tumore mozga, rak dojke, karotidni telesni tumori, rak grlića materice, hondrosarkomu, hordomu, karcinom hromofobne renalne ćelije, jasan ćelisjki karcinom, kancer debelog creva, kolorektalni kancer, kožnu benignu vlaknastu histiocitomu, desmoplastične tumore malih okruglih ćelija, ependimomas, Ewing-ovi tumori, ektraskeletalni miksoidni hondrosarkom, fibrogenezni imperfektni osijum, vlaknasta displazija kostiju, kancer žuči i žučnih puteva, trudnička trofoblastna bolest, tumore germ ćelije, kancer glave i vrata, tumori islet ćelije, Kaposi-jev sarkom, kancer bubrega (nefroblastom, papilarni renalni ćelijski karcinom), leukemije, lipom/benigni lipomatous tumori, liposarkoma/malignantni lipomatous tumori, karcinom jetre (hepatoblastom, hepatocelularni karcinom), limfoma, kancer pluća (karcinom malih ćelija, adenokarcinom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom velike ćelije), meduloblastoma, melanom, meningioma, multipla endokrinska neoplazija, multiple mijelom, mijelodisplastični sindrom, neuroblastoma, neuroendokrinski tumori, kancer jajnika, kanceri pankreasa, papilarni karcinom štitne žlezde, paratiroidne tumore, pedijatrijske kancere, tumore perifernih nervnih ćelija, ferohromocitoma, tumor hipofize, kancer prostate, posterious unvealni melanom, retke hematološke poremećaje, renalni metastatski karcinom, rhabdoidni tumor, rhabdomisarkoma, sarkomi, kancer kože, sarkom mekog tkiva, kancera skvamoznih ćelija, kancer stomaka, sinovijalni sarkom, kancer testisa, karcinom timusa, timom, metastatski rak tiroidne žlezde i karcinom materice (karcinom grlića materice, endometrijalni karcinom i leiomioma).
U određenim poželjnim rešenjima proliferativni poremećaj će obuhvatiti čvrsti tumor koji obuhvata, ali nije ograničen na, nadbubrežni, jetru, bubrege, bešiku, dojke, želudac, jajnika, cervikal, materice, ezofagealni, kolorektalni, prostate, pankreasa, pluća (i mala ćelija i nemala ćelija), štitne žlezde, karcinomi, sarkoma, glioblastoma i različiti tumori glave i vrata. U drugim poželjnim primerima, kao što je prikazano u Primerima u nastavku, otkriveni modulatori su posebno efikasni u lečenju kancera pluća malih ćelija (SCLC) i kancera pluća ne-malih ćelija (NSCLC) (npr., kancer skuamozne ćelije ne-male ćelije pluća ili kancer skuamozne ćelije male ćelije pluća). U jednom rešenju, rak pluća je uporan, vraća se ponovo ili otporan na agens na bazi platine (npr., karboplatin, cisplatin, oksaliplatin, topotecan) i/ili taksan (npr., docetaksel, paclitaksel, larotaksel ili kabazitaksel). Dalje, u posebno poželjnim primerima otkriveni modulatori se mogu koristiti u konjugovanom obliku za lečenje kancera male ćelije pluća.
Kada je reč o kanceru male ćelije pluća, naročito poželjna rešenja će obuhvatati primenu konjugovanih modulatora (ADC). U odabranim rešenjima konjugovani modulatori će se primenjivati na pacijente koji imaju ograničenu fazu bolesti. U drugim primerima otkriveni modulatori će se primenjivati na pacijente koji imaju opsežnu fazu bolesti. U drugim poželjnim rešenjima otkriveni konjugovani modulatori će se primenjivati na uporne pacijente (odn., oni koji se ponavljaju tokom ili kratko nakon završetka toka inicijalne terapije). Ipak drugi primeri obuhvataju primenu otkrivenih modulatora na osetljive pacijente (odn., oni čiji povraćaj je duži od 2-3 meseca nakon primarne terapije. U svakom slučaju biće prihvaćeno da kompatibilni modulatori mogu biti u konjugovanom ili nekonjugovanom stanju u zavisnosti od izabranog režima doziranja i kliničkih dijagnoza.
Kao što je ranije rečeno, otkriveni modulatori se mogu dalje koristiti za sprečavanje, lečenje ili dijagnostikovanje tumora sa neuroendokrinim osobinama ili fenotipima uključujući neuroendokrinske tumore. Tačni ili kanonski neuroendokrinski tumori (NET) koji nastaju iz disperzovanog endokrinskog sistema su relativno retki, sa incidencom 2-5 na 100.000 ljudi, ali vrlo agresivno. Neuroendokrinski tumori se javljaju u bubregu, genitourinarnom traktu (bešika, prostata, jajnici, grlić materice i endometrijum), gastrointestinalnom traktu (debelo crevo, želudac), tiroidne žlezde (medularni karcinom tiroidne žlezde) i pluća (karcinom pluća malih ćelija i neuroendokrinski karcinom velikih ćelija). Ovi tumori mogu izdvajati nekoliko hormona uključujući serotonin i/ili hromogranin A koji mogu prouzrokovati simptome poznati kao karcinoidni sindrom. Ovakvi tumori mogu se označiti pozitivnim imunohistohemijskim markerima kao što je neonska specifična enolaza (NSE, poznata i kao gama enolaza, simbol gen = ENO2), CD56 (ili NCAM1), hromogranin A (CHGA) i sinaptofizin (SIP) ili genomima za koje je poznato da imaju izražen izraz kao što je ASCL1. Nažalost, tradicionalne hemoterapije nisu bile naročito efikasne u lečenju NETs i metastaza jetre je zajednički ishod.
Iako se otkriveni modulatori mogu korisno koristiti za lečenje neuroendokrinskih tumora, oni se takođe mogu koristiti za lečenje, prevenciju ili dijagnozu pseudo neuroendokrinskih tumora (pNETs) koje genotipski ili fenotipski imitiraju, liče ili pokazuju zajedničke osobine sa kanonskim neuroendokrinim tumorima. Pseudo neuroendokrini tumori ili tumori sa neuroendokrinim osobinama su tumori koji nastaju iz ćelija difuznog neuroendokrinog sistema ili od plafona u kojima je kaskada neuroendokrinske diferencijacije aberantno reaktivirana tokom onkogenog procesa. Takvi pNETs obično dele određene fenotipske ili biohemijske karakteristike sa tradicionalno definisanim neuroendokrinskim tumorima, uključujući sposobnost proizvodnje podsetova biološki aktivnih amina, neurotransmitera i peptidnih hormona. Histološki, takvi tumori (NBTs i pNETs) dele zajednički izgled koji često pokazuje gusto povezane ćelije sa minimalnom citoplazmom blage citopatologije i okruglih do ovalnih nukleusa. Za potrebe ovog pronalaska često izraženi histološki markeri ili genetski markeri koji se mogu koristiti za definisanje neuroendokrinskih i pseudo neuroendokrinskih tumora obuhvataju, ali bez ograničenja, hromogranin A, CD56, sinaptofizin, PGP9.5, ASCL1 i neuron-specifične enolaze (NSE).
Shodno tome, modulatori predmetnog pronalaska mogu se korisno koristiti za lečenje i pseudo neuroendokrinskih tumora i kanonskih neuroendokrinskih tumora. U tom smislu, modulatori se mogu koristiti kao što je ovde opisano za lečenje neuroendokrinskih tumora (i NET i pNET) koji proizlaze iz bubrega, genitourinarnog trakta (bešike, prostate, jajnika, grlića materice i endometrijuma), gastrointestinalnog trakta (debelo crevo, želudac), tiroidne žlezde (medularni karcinom tiroidne žlezde) i pluća (karcinom malih ćelija pluća i karcinom velikih ćelija neuroendokrina). Štaviše, modulatori predmetnog pronalaska mogu se koristiti za lečenje tumora koji iskazuju jedan ili više markera izabranih iz grupe koja se sastoji od NSE, CD56, sinaptofizina, hromogranina A, ASCL1 i PGP9.5 (UCHL1). Stoga, predmetni pronalazak se može koristiti za lečenje subjekta koji pati od tumor koji je NSE<+>ili CD56<+>ili PGP9.5<+>ili ASCL1<+>ili SYP<+>ili CHGA<+>ili neke njihove kombinacije.
Što se tiče hematoloških maligniteta, dalje će biti prihvaćeno da jedinjenja i postupci predmetnog pronalaska mogu biti posebno efikasni u lečenju različitih limfoma B-ćelije, uključujući limfom folikularnih ćelija niskog nivoa/NHL (FCC), limfom pločastih ćelija (MCL). difuzni limfom velikih ćelija (DLCL), mali limfocitni (SL) NHL, srednji stepen/folikularni NHL, difuzni NHL srednjeg kvaliteta, visokokvalitetni imunoglastički NHL, visokokvalitetni limfoblastni NHL, visokokvalitetni malokalibrisani ćelijski NHL, obimno oboljenje NHL, Waldenstrom's Makroglobulinemija, limfoplazmacitoidna limfoma (LPL), mantle ćelijska limfoma (MCL), folikularni limfom (FL), difuzni limfom velikih ćelija (DLCL), Surkitt-ov limfom (BL), limfomi povezani sa AIDS, limfom monocitne B ćelije, angioimunoblastična limfoadenopatija, mala limfocitna, folikularna, difuzna velika ćelija, difuzna mala rastvorena ćelija, velika ćelija imunoblastinog limfoblastoma, mala, ne-odcepljena, Burkitt-ova i ne-Burkitt-ova, folikularna, pretežno velika ćelija; folikularni, pretežno mala odcepljena ćelija; i folikularna, mešana malo odcepljena i velike ćelijske limfoma. Vidi, Gaidono i et al., "Limfomi", IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol.2: 2131-2145 (DeVita et al., Eds., 5.sup.th ed, 1997). Stručnjacima u ovoj oblasti treba da bude jasno da će ovi limfomi često imati različita imena zbog promene sistema klasifikacije i da pacijenti koji imaju limfome koji su klasifikovani pod različitim nazivima takođe mogu imati koristi od kombinovanih terapeutskih režima ovog pronalaska.
Predmetni pronalazak takođe omogućava preventivno ili profilaktično lečenje osoba sa prisutnim benignim ili prekanceroznim tumorima. Pored toga što je povezan sa poremećajem DLL3, ne veruje se da bi bilo koji posebni tip tumora ili proliferativni poremećaj trebalo isključiti iz lečenja koristeći ovaj pronalazak. Međutim, tip tumorskih ćelija može biti relevantan za upotrebu otkrića u kombinaciji sa sekundarnim terapeutskim agensima, posebno hemoterapeutskim agensima i ciljanim anti-kancerogenim agensima.
XII. Predmeti Proizvodnje
Farmaceutski paketi i kompleti koji sadrže jedan ili više posuda, koji sadrže jednu ili više doza DLL3 modulatora takođe su obezbeđeni. U određenim rešenjima, obezbeđena je jedinična doza gde jedinična doza sadrži prethodno određenu količinu preparata koji sadrži, na primer, anti-DLL3 antitelo, sa ili bez jednog ili više dodatnih agenasa. Za druga rešenja, takva jedinična doza se isporučuje u injekcionom špricu za jednokratnu primenu. U još nekim rešenjima, kompozicija sadržana u jediničnoj dozi može sadržati fiziološki rastvor, saharozu, ili slično; pufer, kao što je fosfat, ili slično; i/ili se formulišu u stabilnom i efektivnom pH opsegu. Alternativno, u određenim rešenjima, kompozicija može biti obezbeđena kao libofilizovani prah koji se može rekonstituisati nakon dodavanja odgovarajuće tečnosti, na primer, sterilne vode. U određenim poželjnim rešenjima, kompozicija sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju taloženje proteina, uključujući, ali bez ograničenja, saharozu i arginin. Svaka etiketa na, ili povezana sa, posudom(ama) ukazuje da se zatvorena kompozicija koristi za dijagnosticiranje ili lečenje bolesnog stanja izbora.
Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje komplete za proizvodnju pojedinačnih doza ili višestrukih doza za jediničnu primenu DLL3 modulatora i, opciono, jednog ili više antikancerogenih agenasa. Komplet sadrži posudu i etiketu ili paket ubačen u ili povezan sa posudom. Pogodne posude obuhvataju, na primer, bočice, posude, špriceve i sl. Posude mogu biti obrazovane od različitih materijala kao što su staklo ili plastika i sadrže farmaceutsku efikasnu količinu otkrivenih modulatora u konjugovanom ili nekonjugovanom obliku. U drugim poželjnim primerima posuda(e) sadrži sterilan pristupni otvor (na primer, posuda može biti vreća za intravenski rastvor ili bočica koja ima zatvarač sa injekcionom iglom). Takvi kompleti će uglavnom sadržati u odgovarajućoj posudi farmaceutsku prihvatljivu formulaciju DLL3 modulatora i, opciono, jedan ili više anti-kancerogenih agenasa u istim ili različitim posudama. Kompleti mogu takođe sadržati i druge farmaceutske prihvatljive formulacije, bilo za dijagnozu ili kombinovanu terapiju. Na primer, pored DLL3 modulatora pronalaska, takvi kompleti mogu sadržati bilo koji ili više grupa antikancerogenih agenasa kao što su hemoterapeutski ili radioterapeutski lekovi; anti-angiogenski agensi; anti-metastatski agensi; ciljani anti-kancerogeni agensi; citotoksični agensi; i/ili drugi antikancerogeni agensi. Takvi kompleti takođe mogu obezbediti odgovarajuće reagense za konjugovanje DLL3 modulatora sa anti-kancerogenim agensom ili dijagnostičkim agensom (npr., videti U.S.P.Br.7,422,739).
Preciznije, kompleti mogu imati jednu posudu koja sadrži DLL3 modulator, sa ili bez dodatnih komponenti, ili mogu imati različite posude za svaki željeni agens. Kada su kombinovane terapije obezbeđene za konjugaciju, pojedinačni rastvor se može unapred mešati, bilo u molarno ekvivalentnoj kombinaciji, ili sa jednom komponentom koja je u višku u odnosu na drugu. Alternativno, DLL3 modulator i bilo koji opcioni anti-kancerogeni agens ovog kompleta mogu se održavati odvojeno u različitim posudama pre primene na pacijenta. Kompleti mogu takođe sadržati drugo/treće sredstvo za posudu radi održavanja sterilnog, farmaceutski prihvatljivog pufera ili drugog razblaživača, kao što je bakteriostatička voda za ubrizgavanje (BVFI), fosfatno puferni fiziološki rastvor (PBS), Ringerov rastvor i rastvor dekstroze.
Kada su komponente kompleta obezbeđene u jednom ili više tečnim rastvorima, tečni rastvor je poželjno vodeni rastvor, pri čemu je posebno poželjan sterilni vodeni rastvor. Međutim, komponente kompleta mogu biti obezbeđene kao suhi prah(ovi). Kada su reagensi ili komponente postavljeni kao suhi prah, prah se može rekonstituisati dodavanjem odgovarajućeg rastvarača. Predviđeno je da se rastvarač može takođe obezbediti u drugoj posudi.
Kao što je navedeno ukratko iznad, komplet može takođe sadržati sredstvo kojim se antitelo i bilo koja opciona komponenta daju životinji ili pacijentu, npr., jedna ili više igala ili špriceva, ili čak kapi za oči, pipeta ili drugi takvi aparati, iz koje se formulacija može ubrizgati ili uvesti u životinju ili primeniti na obolelu površinu tela. Kompleti predmetnog pronalaska takođe će uobičajeno uključivati sredstva za čuvanje bočica ili slično, i druge komponente u čvrstom zatvaranju za komercijalnu prodaju, kao što su, npr., plastične posude za ubrizgavanje ili uduvavanje u koje su željene bočice i drugi aparati postavljeni i zadržani. Bilo koja etiketa ili umetak pakovanja ukazuje da se DLL3 modulatorna kompozicija koristi za lečenje raka, na primer rak malih ćelija pluća.
U drugim poželjnim primerima modulatori predmetnog pronalaska se mogu koristiti u konjukciji sa, ili sadržati, dijagnostičke ili terapijske uređaje korisne u dijagnozi ili lečenju proliferativnih poremećaja. Na primer, u poželjnom primeru jedinjenja i kompozicije predmetnog pronalaska se mogu kombinovati sa određenim dijagnostičkim uređajima ili instrumentima koji se mogu koristiti za detekciju, nadgledanje, kvantifikaciju ili profiliranje ćelija ili marker jedinjenja uključeni u etiologiju ili manifestaciju proliferativnih poremećaja. Za odabrane primere marker jedinjenja mogu sadržati NSE, CD56, sinaptofizin, hromogranin A, i PGP9.5.
U posebno poželjnim primerima uređaji se mogu koristiti za detekciju, nadgledanje i/ili kvantifikaciju cirkulacionih tumornih ćelija ili in vivo ili in vitro (videti, na primer, WO 2012/0128801).
U još nekim drugim poželjnim rešenjima, i kao što je gore opisano, cirkulacione tumorske ćelije mogu da sadrže matične ćelije raka.
XIII. Reagensi Istraživanja
Drugi poželjni primeri pronalaska eksploatišu osobine otkrivenih modulatora kao instrument koristan za identifikaciju, praćenje, izolaciju, sekciju ili obogaćivanje populacija ili podpopulacija ćelija koje izazivaju tumor putem metoda kao što su protočna citometrija, fluorescentno aktivirano sortiranje ćelija (FACS), sortiranje magnetno aktiviranih ćelija (MACS ) ili lasersko posredovano sekcionisanje. Stručnjaci iz odgovarajuće oblasti će znati da modulatori mogu biti korišćeni u nekoliko kompatibilnih tehnika za karakterizaciju i manipulaciju TIC uključujući kancer matične ćelije (npr., videti U.S.S.Br.12/686,359, 12/669,136 i 12/757,649).
XIV. Ostalo
Ukoliko se ovde ne definiše drugačije, naučni i tehnički termini koji se koriste u vezi sa ovim pronalaskom imaju značenja koja se obično shvataju od strane stručnjaka u struci. Dalje, ukoliko nije drugačije određeno u kontekstu, jedinstveni pojmovi uključuju množine i množine termina uključuju jedninu. Preciznije rečeno, kako se koristi u ovom opisu i priloženim patentnim zahtevima, pojedinačne forme "a", "an" i "the" uključuju reference množine ukoliko kontekst jasno ne diktira drugačije. Tako, na primer, upućivanje na "protein" uključuje množinu proteina; upućivanje na "ćeliju" uključuje množinu ćelija i slično. Osim toga, opsezi navedeni u opisu i priloženim zahtevima uključuju i krajnje tačke i sve tačke između krajnjih tačaka. Dakle, opseg od 2.0 do 3.0 uključuje 2.0, 3.0 i sve tačke između 2.0 i 3,0.
Uopšteno, nomenklatura korišćena u vezi sa, i tehnikama ćelijske i tkivne kulture, molekularne biologije, imunologije, mikrobiologije, genetike i proteina i hemije nukleinske kiseline i hibridizacije opisane ovde su poznate i najčešće korišćene u tehnici. Metode i tehnike predmetnog pronalaska se generalno izvode u skladu sa konvencionalnim postupcima koji su dobro poznati u struci i kako su opisani u raznim opštim i određenim referencama koje se navode i razmatraju u celom predmetnom opisu, osim ako nije drugačije naznačeno. Videti, npr., Abbas et al,. Cellular and Molecular Immunology, 6. izd., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manuai, 3. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
(2000); Ausubel et al, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1998); i Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode u skladu sa opisima proizvođDča, što se obično postiže u tehnici ili kako je ovde opisano. Nomenklatura korišćena u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije opisane ovde su poznate i najčešće korišćene u tehnici. Osim toga, naslovi poglavlja koji se koriste ovde su samo u organizacijske svrhe i ne smiju se tumačiti kao ograničenje opisanog predmeta.
XV. DLL3 Reference
Apeiqvist A et al. (1999). Notch signalling controls pancreatic cell differentiation. Nature. 400:877-81, PMID: 10476967.
Bigas A and Espinosa L (2012). Hematopoietic stem ceils: to be or Notch to be. Blood.2012 PMID: 22308291.
Cabrera CV (1990), Lateral inhibition and ceil fate during neurogenesis in Drosophila: the interactions between seine. Notch and Delta. Development.110:733-42. PMID: 1709404, Chapman G et al. (2011), Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Hum Moi Genet.20:905-1.6. PMID: 21147753.
Chen H et al. (1997). Conservation of the Drosophila lateral inhibition pathway in human lung cancer: a hairy-related protein (HES-1) directly represses achaete-scute homolog-l expression. ProoNatl Acad SciUS A.94:5355-60. PMID: 9144241.
Cook M et al., (2010), Notch in the development of thyroid C-cells and the treatment of medullary thyroid cancer. Ara J Trans! Res.2:119-25. PMID: 20182588, de la Pompa JL et al (1997). Conservation of the Notch signaling pathway in mammalian neurogenesis.
Development, 124:1139-48. PMID: 9102301,
D'Souza B et al. (2010). Canonical and non-canonical Notch ligands, Curr Top Dev Biol. 92:73129, PMID: 20816393.
Dunwoodie SL (2009). The role of Notch in patterning the human vertebral column. Curr Opirt Genet Dev, 19:329-37. PMID: 19608404.
Dutta S et al, (2008). Notch signaling regulates endocrine cell specification in the zebrafish anterior pituitary. Dev Biol, 319:248-57. PubMed PMID: 1S534570.
Pre S et al. (2005), Notch signals control the fate of immature progenitor cells in the intestine, Nature, 435:964-8. PMID: 15959516,
Pre S et al. (2009), Notch and Wnt signals cooperatively control cell proliferation, and tumorigenesis In the intestine. ProcNaU Acad Sci U S A.106:6309-14. PMID: 19251639. Galluzzo P. and Boechetta M (2011), Notch signaling in long cancer. Expert Rev Anticancer Then 11:533-40, PMID: 21504320,
Geffers I et al. (2007), Divergent functions and distinct localization of the Notch ligands DLL I and DLL3 In vivo. J Cell Biol.178:465-76. PMID: 17664336,
Glittenberg M, et al, (2006). Role of conserved intracellular motifs in Serrate signalling, elsinhibition and endocytosis. EM BO J.25:4697-706. PMID: 17006545.
Goldbeter A, and PourquM O (2008). Modeling trie segmentation clock as a network of coupled oscillations in the Notch, Wnt and FGF signaling pathways. J Tbeor Biol, 252:574-85.PMID;
18308339,
Habener JF et al. (2005). Mfaireview: transcriptional regulation in pancreatic development. Endocrinology.146; 1025-34. PMID: 15604203.
Harris PI et al (2012). Targeting embryonic signaling pathways In cancer therapy. Expert Opin Ther Targets, PMID: 22239436.
Henke RM et al. (2009). Ascfl and Neurog2 form novel complexes and regulate De(ta-like3 (DLL3) expression in the neural tube. Dev Btol 328:529-40. PMID; 19389376, Hoyne GF, et a!. (2011), A cell autonomous role for the Notch ligand Delta-like 3 in a(J T-celi development. Immunol Cell Biol.89:696-705, PMID; 21151194.
Huber K et ah, (2002), Development of chromaffin cells depends on MA SHI function.
Development.129:4729-38, PMID; 12361965.
Ito T et al. (2000). Basic helix-loop-helix transcription factors regulate the neuroendocrine differentiation of fetal mouse pulmonary epithelium, Development.127:3913-21. PMID:
10952889.
Jensen J et al. (2000). Control of endodermal endocrine development by Hes-1. Nat Genet, 24:36-44. PMID: 10615124.
Kageyama R, et al, (2007). Oscillator mechanism of Notch pathway in the segmentation clock. Dev Dyn.236:1403-9. PMID: 17366573.
Kameda Y et al. (2007). Mashl regulates the development of C cells in mouse thyroid glands, Dev Dyn, 236:262-70. PMID; 17103415.
Klein T, et al. (1997), An Intrinsic dominant negative activity of serrate that is modulated during wing development in Drosophila, Dev Biol, 189:123-34, PMID; 9281342.
Klimstra DS, et al. (2010). The pathologic classification of neuroendocrine tumors: a review of nomenclature, grading, and staging systems. Pancreas.39:707-12. PMID; 20664470. KIöppel G. (2011). Classification and pathology of gastroenteropancreatlc neuroendocrine neoplasms. Endocr Relat Cancer.18 Suppi LSl-16. PMID: 22005112.
Koch U and Radtke F (2010), Notch signaling in solid tumors, Curr Top Dev Biol.92:411-55, PMID: 20816403.
Kusumi K et al, (1998). The mouse pudgy mutation disrupts Delta homologue DLL3 and initiation of early somite boundaries, Nat Genet.19:274-8, PMID; 9662403. Ladi E et ai. (2005). The divergent DSL ligand DLL 3 does not activate Notch signaling but cell autonomously attenuates signaling induced by other DSL ligands, J Cell Biol, 170:983-92, PMID: 16144902.
Liu J et al. (2010). Notch signaling in the regulation of stem cell self-renewal and differentiation. Curr Top Dev Biol.92:367-409. PMID: 20816402.
Nagase H et al. (2011). y-Secretase-regulated signaling pathways, such as notch signaling, mediate the differentiation of hematopoietic stem ceils, development of the immune system, and peripheral immune responses. Curr Stem Cell Res Ther.6:131-41. PMID: 21190540. Raetzman LT et al, (2004). Developmental regulation of Notch signaling genes In the embryonic pituitary; Propl deficiency affects Notch2 expression. Dev Biol, 265:329-40, PMID; 14732396.
Rebay L et al., (1.991). Specific EGP repeats of Notch mediate interactions with Delta and Serrate: implications for Notch as a multifunctional receptor. Ceil 67:687-99. PMID: 1657403. Sakamoto K et al. (2002). Intracellular cell-autonomous association of Notch and Its ligands: a novel mechanism of Notch signal modification. Dev Biol, 241:313-26. PMID: 11784114. Schonhoff SE et al. (2004), Minireview: Development and differentiation of gut endocrine cells, Endocrinology.145:2639-44. PMID: 15044355,
Shimizu K et al. (1999). Mouse jagged1 physically interacts with notch2 and other notch receptors. Assessment by quantitative methods, J Biol Chem.274:32961-9. PMID;
10551863.
Shinkai Y et al. (2004). New mutant mouse with skeletal deformities caused by mutation, in delta like 3 (DLL3) gene. Exp Anim.53:129-36, PMID: 15.153675,
Schonhoff SE et al, (2004). Minireview: Development and differentiation of gut endocrine cells. Endocrinology.145:2639-44. PMID: 15044355.
Sprinzak D etal. (2010). Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature, 465:86-90, PMID; 20418862.
Sriuranpong V et al. (2002). Notch signaling induces rapid degradation of achaete-scute homo log I. Mol Cell Biol.22:3129-39, PMID; 11940670.
Sternberg PW (1988). Lateral inhibition during vulval induction in Caenorhabditis eiegans. Nature.335:551-4, PMID; 3419532,
Wharton KA, et al., (1985), Nucleotide sequence from the neurogenic locus notch implies a gene product that shares homology with proteins containing EGF-iike repeats. Cell.43:567-81. PMID: 3935325.
Yao JC et al, (2008), One hundred years after "carcinoid"; epidemiology of and prognostic factors for neuroendocrine tumors In 35,825 cases in the United States, J Clin Oncol, 26:306372. PMID: 18565894.
Zarebczan B, Chen H (201.0). Signaling mechanisms in neuroendocrine tumors as targets for therapy. Endocrinol Metafa Clin North Am, 39:801-10. PMID; 21095546.
XVI. Odabrani primeri pronalaska
U odnosu na pronalazak i Primere ovde, predmetni pronalazak je usmeren na odabrane primere posebno podešene odmah u nastavku.
Odabrani primeri:
1. Izolovani DLL3 modulator.
2. Izolovani DLL3 modulator iz 1, gde DLL3 modulator obuhvata DLL3 antagonist.
3. Izolovani DLL3 modulator iz 1, gde DLL3 modulator obuhvata antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
4. Izolovani DLL3 modulator iz 3, gde antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment obuhvata monoklonalno antitelo.
5. Izolovani DLL3 modulator iz 4 gde monoklonalno antitelo je odabrano između grupe koja se sastoji od himernih antitela, humanizovanih antitela i humanih antitela.
6. Izolovani DLL3 modulator iz 4 gde navedeno monoklonalno antitelo obuhvata neutralizovano antitelo.
7. Izolovani DLL3 modulator iz 4 gde navedeno monoklonalno antitelo obuhvata osiromašeno antitelo.
8. Izolovani DLL3 modulator iz 4 gde navedeno monoklonalno antitelo obuhvata internalizovano antitelo.
9. Izolovani DLL3 modulator iz 8 gde navedeno mnonoklonalno antitelo dalje obuhvata citotoksični agens.
10. Izolovani DLL3 modulator iz 4 gde navedeno monoklonalno antitelo obuhvata laki lanac varijabilnog regiona koji ima tri komplementarno određena regiona i teški lanac varijabilnog regiona koji ima tri komplementarna određena regiona gde teški i laki lanac komplementarnog određenog regiona je prikazan na FIG.11A i FIG.11B.
11. Izolovani DLL3 modulator iz 4 gde navedeno monoklonalno antitelo sadrži laki lanac varijabilnog regiona i teški lanac varijabilnog regiona pri čemu navedeni laki lanac varijabilnog regiona obuhvata amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta na amino kiselinskoj sekvenci odabranoj između grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO; 30, SEQ ID NO; 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO; 48, SEQ ID NO; 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO; 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO; 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO; 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO; 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO; 108, SEQ ID NO; 110, SEQ ID NO; 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: i 16, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO; 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO; 134, SEQ ID NO; 136, SEQ ID NO; 138, SEQ ID NO; 140, SEQ ID NO; 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO; 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO; 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO; 162 SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ I D NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO; 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 i SEQ ID NO: 202 i pri čemu navedeni teški lanac varijabilnog regiona obuhvata amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta za amino kiselinsku sekvencu odabranu između grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO; 21, SEQ ID NO; 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 3 L SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO; 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO; 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO; 131, SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO; 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO; 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO; 173, SEQ ID NO: 1,75, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO; 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 i SEQ ID NO: 203.
12. Izolovani DLL3 modulator koji sadrži CDR iz bilo kog teškog ili lakog lanca varijabilnih regiona prikazanog u 11.
13. Izolovani DLL3 modulator koji sadrži konkurentno antitelo pri čemu navedeno konkurentno antitelo inhibira vezivanje izolovanog DLL3 modulatora iz 10 ili 11 do DLL3 sa oko 40%.
14. Nukleinska kiselina koja kodira amino kiselinu teškog lanca varijabilnog regiona ili amino kiselinu lakog lanca varijabilnog regiona iz 11.
15. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu iz 14.
16. Izolovani DLL3 modulator iz 1 koji sadrži amino kiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO: 3 ili njegov fragment.
17. Izolovani DLL3 modulator iz 16 gde DLL3 modulator dalje obuhvata bar deo imunoglobulinskog konstantnog regiona.
18. Izolovani DLL3 modulator iz 1 gde navedeni modulator redukuje frekvenciju ćelija koje izazivaju tumor nakon primene na subjekta kome je potrebno.
19. Izolovani DLL3 modulator iz 18 gde redukcija u frekvenciji je određena korišćenjem protočne citometrijske analize površinskih markera ćelije tumora za koje se zna da se obogaćuje za ćelije koje izazivaju tumor.
20. Izolovani DLL3 modulator iz 18 gde redukcija u frekvenciji je određena korišćenjem imunohistohemijske detekcije površinskih markera ćelije tumora za koje se zna da se obogaćuje za ćelije koje izazivaju tumor.
21. Izolovani DLL3 modulator iz 18 gde navedene ćelije koje izazivaju tumor obuhvata ćelije koje održavaju tumor.
22. Izolovani DLL3 modulator iz 1 dalje obuhvata citotoksični agens.
23. Farmaceutska kompozicija obuhvata izolovani DLL3 modulator iz 1.
24. Farmaceutska kompozicija iz 23 gde navedeni izolovani DLL3 modulator obuhvata monoklonalno antitelo.
25. Farmaceutska kompozicija iz 24 gde navedeno monoklonalno antitelo obuhvata humanizovano antitelo.
26. Farmaceutska kompozicija iz 25 gde navedeno humanizovano antitelo obuhvata citotoksični agens.
27. Farmaceutska kompozicija iz 26 gde navedeni citotoksični agens obuhvata pirolobenzodiazepin.
28. Postupak lečenja DLL3 povezuje poremećaj koji obuhvata primenu teraputske efikasne količine DLL3 modulatora na subjekta kome je to potrebno.
29. Postupak iz 28 gde navedeni DLL3 modulator sadrži DLL3 antagonist.
30. Postupak iz 28 gde navedeni DLL3 modulator sadrži antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
31. Postupak iz 30 gde antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment sadrži monoklonalno antitelo.
32. Postupak iz 31 gde monoklonalno antitelo je odabrano između grupe koja se sastoji iz himernih antitela, humanizovanih antitela i humanih antitela.
33. Postupak iz 32 gde navedeno monoklonalno antitelo obuhvata laki lanac varijabilnog regiona i teški lanac varijabilnog regiona pri čemu navedeni laki lanac varijabilnog regiona sadrži amino kisleinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta na amino ksielinsku sekvencu odabranu između grupe koja se sastoji od amino kiselinkih sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 122, SEQ ID NO: 124, SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 134, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 142, SEQ ID NO: 144, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 148, SEQ ID NO: 150, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO:154, SEQ ID NO: 156, SEQ ID NO: 158, SEQ ID NO: 160, SEQ ID NO: 162 SEQ ID NO: 164, SEQ ID NO: 166, SEQ ID NO: 168, SEQ ID NO: 170, SEQ ID NO: 172, SEQ ID NO: 174, SEQ ID NO: 176, SEQ ID NO: 178, SEQ ID NO: 180, SEQ ID NO: 182, SEQ ID NO: 184, SEQ ID NO: 186, SEQ ID NO: 188, SEQ ID NO: 190, SEQ ID NO: 192, SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 196, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200 i SEQ ID NO: 202 i pri čemu navedeni teški lanac varijabilnog regiona obuhvata amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta na amino kiselinsku sekvencu odabranu između grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO; 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO:131, SEQ ID NO:133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEQ ID NO: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEQ ID NO: 201 i SEQ ID NO: 203.
34. Postupak iz 33 gde navedeno monoklonalno antitelo je humanizovano antitelo.
35. Postupak iz 31 gde navedeno monoklonalno antitelo sadrži neutralizovano antitelo. 36. Postupak iz 31 gde navedeno monoklonalno antitelo sadrži internalizovano antitelo. 37. Postupak iz 36 gde navedeno internalizovano antitelo sadrži citotoksični agens.
38. Postupak iz 37 gde navedeni citotoksični agens sadrži pirolobenzodiazepin.
39. Postupak iz 38 gde navedeni DLL3 povezani poremećaj obuhvata neoplastični poremećaj.
40. Postupak iz 39 gde navedeni neoplastični poremećaj obuhvata tumor koji pokazuje neuroendokrinske karakteristike.
41. Postupak iz 40 gde navedeni tumor koji pokazuje neuroendokrinske karakteristike obuhvata neuroendokrinski tumor.
42. Postupak iz 39 gde navedeni neoplastični poremećaj obuhvata hematološku malignost.
43. Postupak iz 42 gde navedena hematološka malignost obuhvata leukemiju ili limfomu.
44. Postupak iz 39 gde subjekat koji pati od navedenog neoplastičnog poremećaja pokazuje tumore koji sadrže ćelije koje izazivaju tumor.
45. Postupak iz 44 dalje obuhvata korak redukcije frekvencije ćelija koje izazivaju tumor u navedenom subjektu.
46. Postupak iz 45 gde je redukcija u frekvenciji određena korišćenjem protočne citometrijske analize površinskih markera ćelije tumora za koje se zna da se obogaćuju za ćelije koje izazivaju tumor ili imunohistohemijske detekcije površinskih markera ćelije tumora za koje se zna da se obogaćuju za ćelije koje izazivaju tumor.
47. Postupak iz 45 gde redukcija u frekvenciji je određena korišćenjem in vitro ili in vivo analize ograničenog razblaženja.
48. Postupak iz 47 gde redukcija u frekvenciji je određena korišćenjem in vivo analize ograničenog razblaženja koja obuhvata transplantaciju živih humanih ćelija tumora u imunokompromitovanim miševima.
49. Postupak iz 48 gde redukcija u frekvenciji je određena korišćenjem in vivo analize ograničenog razblaženja koja obuhvata kvantifikaciju ćelije koja izaziva tumor korišćenjem statistike distribucije otrova.
50. Postupak iz 47 gde redukcija u frekvenciji je određena korišćenjem in vitro analize ograničenog razblaženja koja obuhvata ograničeno razblaženje depozicije živih humanih ćelija tumora u in vitro kolonskim podržavajućim stanjima.
51. Postupak iz 50 gde redukcija u frekvenciji je određena korišćenjem in vitro analize ograničenog razblaženja koja obuhvata kvantifikaciju ćelije koja izaziva tumor korišćenjem statistike distribucije otrova.
52. Postupak iz 28 dalje obuhvata korak primene anti-kancerogenog agensa.
53. Postupak iz 28 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata jedan ili više CDRs iz bilo koje od SEQ lD NOS: 20 do 203.
54. Postupak iz 28 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata pan-DLL modulator.
55. Postupak redukcije frekvencije ćelija koje izazivaju tumor kod subjekta kome je to potrebno obuhvata korak primene DLL3 modulatora na navedeni subjekat.
56. Postupak iz 55 gde ćelije koje izazivaju tumor obuhvataju ćelije koje održavaju tumor. 57. Postupak iz 56 gde navedene ćelije koje održavaju tumor su CD324<+>ili CD46<+>ćelije. 58. Postupak iz 55 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata antitelo.
59. Postupak iz 58 gde navedeno antitelo obuhvata monoklonalno antitelo.
60. Postupak iz 59 gde navedeno monoklonalno antitelo dalje obuhvata citotoksični agens.
61. Postupak iz 55 gde subjekat boluje od neoplastičnih poremećaja odabranih iz grupe koja se sastoji od adrenalnog kancera, kancera bešike, kancer grlića materice, endometrialni kancer, kancer bubrega, kancer jetre, kancer pluća, kakcer jajnika, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, kancer prostate i kancer dojke.
62. Postupak iz 55 gde frekvencija ćelija koja izaziva tumor je smanjena za najmanje 10%.
63. Postupak iz 55 gde redukcija u frekvenciji je određena korišćenjem protočne citometrijske analize površinskih markera ćelije tumora za koje se zna da obogaćuju za ćelije koje izazivaju tumor ili imunohistohemijske detekcije površinskih markera ćelije tumora za koje se zna da obogaćuju za ćelije koje izazivaju tumor.
64. Postupak lečenja subjekta koji boluje od hematološke malignosti obuhvata korak primene DLL3 modulatora na navedeni subjekat.
65. Postupak iz 64 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata monoklonalno antitelo.
66. Postupak senzibilizacije tumora kod subjekta za lečenje sa anti-kancerogenim agensom obuhvata korak primene DLL3 modulatora na navedeni subjekat.
67. Postupak iz 66 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata antitelo.
68. Postupak iz 66 gde navedeni tumor je čvrsti tumor.
69. Postupak iz 66 gde navedeni anti-kancerogeni agens obuhvata hemoterapeutski agens.
70. Postupak iz 66 gde navedeni anti-kancerogeni agens obuhvata imunoterapeutski agens.
71. Postupak dijagnostikovanja proliferativnog poremećaja kod subjekta kojme je to potrebno, sadrži korake:
a. dobijanja uzorka tkiva iz navedenog subjekta;
b. kontaktiranje uzoraka tkiva sa bar jednim DLL3 modulatorom; i
c. detektovanje ili kvantifikovanje DLL3 modulatora povezanog sa uzorkom.
72. Postupak iz 71 gde DLL3 modulator sadrži monoklonalno antitelo.
73. Postupak iz 72 gde je antitelo operativno povezano sa reporterom.
74. Predmet proizvodnje pogodan za dijagnostikovanje ili lečenje poremećaja povezanih sa DLL3 koji sadrže kutiju koja sadrži DLL3 modulator i instrukcijske materijale za korišćenje pomenutog DLL3 modulatora za lečenje ili dijagnostifikovanje poremećaja povezanih sa DLL3.
75. Predmet proizvodnje iz 74 gde navedeni DLL3 modulator je monoklonalno antitelo. 76. Predmet proizvodnje iz 74 gde kutija obuhvata čitljivu posudu.
77. Postupak lečenja subjekta koji pati od neoplastičnog poremećaja koji obuhvata korak primene terapeutski efikasne količine najmanje jednog internalizirajućeg DLL3 modulatora.
78. Postupak iz 77 gde navedeni DLL3 modulator sadrži antitelo.
79. Postupak iz 78 gde navedeno antitelo sadrži monoklonalno antitelo.
80. Postupak iz 79 gde monoklonalno antitelo dalje sadrži citotoksični agens.
81. Postupak iz 80 dalje obuhvata korak primene anti-kancerogenog agensa.
82. Postupak lečenja subjekta koji boluje od neoplastičnog poremećaja koji obuhvata korak primene terapeutski efikasne količine bar jednog neutralizovanog DLL3 modulatora.
83. Postupak iz 82 gde navedeni DLL3 modulator sadrži antitelo.
84. Postupak iz 83 gde navedeno antitelo sadrži monoklonalno antitelo.
85. Postupak iz 84 gde navedeno monoklonalno antitelo sadrži humanizovano antitelo. 86. Postupak iz 85 gde navedeno humanizovano antitelo dalje sadrži citotoksični agens. 87. Postupak iz 82 gde neoplastični poremećaj obuhvata tumor koji iskazuje neuroendokrinske karakteristike.
88. Postupak identifikovanja, izolacije, podele ili obogaćenja populacije ćelija koje izazivaju tumor obuhvata korak kontaktiranja navedenih ćelija koje izazivaju tumor sa DLL3 modulatorom.
89. Postupak iz 88 gde navedeni DLL3 modulator sadrži antitelo.
90. DLL3 modulator sadrži humanizovano antitelo gde navedeno humanizovano antitelo sadrži laki lanac varijabilnog regiona i teški lanac varijabilnog regiona gde navedeni laki lanac varijabilnog regiona sadrži amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta za amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210 i SEQ ID NO: 212 i gde navedeni teški lanac variabilnog regiona sadrži amino kiselinsku sekvencu koja ima najmanje 60% identiteta za amino kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od amino kiselinskih sekvenci kao što je prikazano u SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: 211 i SEQ ID NO: 213.
91. Postupak koji inhibira ili sprečava metastazu kod subjekta kome je to potrebno, sadrži korak primene farmaceutski efikasne količine DLL3 modulatora.
92. Postupak iz 91 gde predmet podleže postupku deblokiranja pre ili posle primene DLL3 modulatora.
93. Postupak iz 92 gde navedeni postupak deblokiranja obuhvata primenu najmanje jednog anti-kancerogenog agensa.
94. Postupak izvođenja terapije održavanja na subjektu kojem je to potrebno obuhvata korak primene farmaceutski efikasne količine DLL3 modulatora.
95. Postupak iz 94 gde navedeni subjekat je lečen za neoplastični poremećaj pre primene DLL3 modulatora.
96. Postupak iscrtavanja ćelija koje izazivaju tumor kod subjekta koji boluje od proliferativnog poremećaja koji obuhvata korak primene DLL3 modulatora.
97. Postupak dijagnostikovanja, otkrivanja ili praćenja DLL3 povezanog poremećaja in vivo kod subjekta kome je to potrebno obuhvata korak primene DLL3 modulatora.
98. Postupak dijagnostikovanja, otkrivanja ili praćenja povezanog poremećaja DLL3 kod subjekta kome je to potrebno, koji obuhvata korak kontaktiranja cirkulacionih ćelija tumora sa DLL3 modulatorom.
99. Postupak iz 98 gde se navedeni korak kontaktiranja dešava in vivo.
100. Postupak iz 98 gde se navedeni korak kontaktiranja dešava in vitro.
101. Postupak lečenja tumora koji pokazuje neuroendokrinske karakteristike kod pacijenta kome je to potrebno, koji obuhvata korak primene terapeutski efikasne količine DLL3 modulatora.
102. Postupak iz 101 gde navedeni tumor koji pokazuje neuroendokrinske karakteristike je neuroendokrinski tumor.
103. DLL3 modulator izveden iz antitela odabranog iz grupe koja se sastoji od SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150.
104. Izolovani DLL3 modulator koji se vezuje za epitop povezan sa EGF1 domenom iz DLL3.
105. DLL3 modulator iz 104 gde navedeni DLL3 modulator sadrži antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
106. DLL3 modulator iz 105 gde navedeno antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment obuhvata monoklonalno antitelo.
107. DLL3 modulator iz 106 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata ADC.
108. DLL3 modulator iz 107 gde navedeni ADC obuhvata pirolobenzodiazopin.
109. DLL3 modulator iz 108 dalje obuhvata linker.
110. Izolovani DLL3 modulator koji se vezuje za epitop povezan sa EGF2 domenom iz DLL3.
111. DLL3 modulator iz 110 gde navedeni DLL3 modulator sadrži antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
112. DLL3 modulator iz 111 gde navedeno antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment obuhvata monoklonalno antitelo.
113. DLL3 modulator iz 112 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata ADC.
114. DLL3 modulator iz 113 gde navedeni ADC obuhvata pirolobenzodiazopin.
115. DLL3 modulator iz 114 dalje obuhvata linker.
116. Izolovani DLL3 modulator koji se vezuje za epitop povezan sa EGF3 domenom iz DLL3.
117. DLL3 modulator iz 116 gde navedeni DLL3 modulator sadrži antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
118. DLL3 modulator iz 117 gde navedeno antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment obuhvata monoklonalno antitelo.
119. DLL3 modulator iz 118 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata ADC.
120. DLL3 modulator iz 119 gde navedeni ADC obuhvata pirolobenzodiazopin.
121. DLL3 modulator iz 120 dalje obuhvata linker.
122. Izolovani DLL3 modulator koji se vezuje za epitop povezan sa EGF4 domenom iz DLL3.
123. DLL3 modulator iz 122 gde navedeni DLL3 modulator sadrži antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
124. DLL3 modulator iz 123 gde navedeno antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment obuhvata monoklonalno antitelo.
125. DLL3 modulator iz 124 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata ADC.
126. DLL3 modulator iz 125 gde navedeni ADC obuhvata pirolobenzodiazopin.
127. DLL3 modulator iz 126 dalje obuhvata linker.
128. Izolovani DLL3 modulator koji se vezuje za epitop povezan sa EGF5 domenom iz DLL3.
129. DLL3 modulator iz 128 gde navedeni DLL3 modulator sadrži antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
130. DLL3 modulator iz 129 gde navedeno antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment obuhvata monoklonalno antitelo.
131. DLL3 modulator iz 130 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata ADC.
132. DLL3 modulator iz 131 gde navedeni ADC obuhvata pirolobenzodiazopin.
133. DLL3 modulator iz 132 dalje obuhvata linker.
134. Izolovani DLL3 modulator koji se vezuje za epitop povezan sa EGF6 domenom iz DLL3.
135. DLL3 modulator iz 134 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
136. DLL3 modulator iz 135 gde navedeno antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment obuhvata monoklonalno antitelo.
137. DLL3 modulator iz 136 gde navedeni DLL3 modulator sadrži ADC.
138. DLL3 modulator iz 137 gde navedeni ADC obuhvata pirolobenzodiazepin.
139. DLL3 modulator iz 138 dalje sadrži linker.
140. Izolovani DLL3 modulator koji se vezuje za epitop povezan sa DSL domenom iz DLL3.
141. DLL3 modulator iz 140 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
142. DLL3 modulator iz 141 gde navedeno antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment obuhvata monoklonalno antitelo.
143. DLL3 modulator iz 142 gde navedeni DLL3 modulator sadrži ADC.
144. DLL3 modulator iz 143 gde navedeni ADC obuhvata pirolobenzodiazepin.
145. DLL3 modulator iz 144 dalje sadrži linker.
146. Izolovani DLL3 modulator koji se vezuje za epitop povezan sa N-terminalnim domenom iz DLL3.
147. DLL3 modulator iz 146 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
148. DLL3 modulator iz 147 gde navedeno antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment obuhvata monoklonalno antitelo.
149. DLL3 modulator iz 148 gde navedeni DLL3 modulator sadrži ADC.
150. DLL3 modulator iz 149 gde navedeni ADC obuhvata pirolobenzodiazepin.
151. DLL3 modulator iz 150 dalje sadrži linker.
152. Izolovani DLL3 modulator se nalazi u bin odabranom iz grupe koja se sastoji od bin A, bin B, bin C, bin D, bin E, bin F, bin G, bin H i bin I.
153. Izolovani DLL3 modulator se nalazi u bin definisanom sa referentnim antitelom odabranom između grupe koja se sastoji od SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC.16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16,139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 and SC16.150.
154. Konjugat leka antitela formule:
M-[L-D]n
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so gde
a) M sadrži DLL3 modulator;
b) L sadrži opcioni linker;
c) D je anti-proliferativni agens; i
d) n je ceo broj od oko 1 do oko 20.
155. Konjugat leka antitela iz 154 gde navedeni DLL3 modulator obuhvata antitelo ili njegov imunoreaktivni fragment.
156. Konjugat leka antitela iz 155 gde navedeno antitelo obuhvata monoklonalno antitelo.
157. Konjugat leka antitela iz 156 gde navedeno antitelo je izvedeno iz antitela odabrnaog između grupe koja se sastoji od SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150.
158. Konjugat leka antitela iz 157 gde navedeno antitelo je humanizovano.
159. Konjugat leka antitela iz 154 gde linker sadrži odcepljujući linker.
160. Konjugat leka antitela iz 159 gde navedeni odcepljujući linker sadrži peptidil linker. 161. Konjugat leka antitela iz 154 gde navedeni antiproliferativni agens dasrži citotoksični agens.
162. Konjugat leka antitela iz 161 gde navedeni citotoksični agens sadrži pirolobenzodiazopin.
163. Konjugat leka antitela iz 162 gde navedeni pirolobenzodiazepin sadrži pirolobenzodiazepin dimer.
164. DLL3 modulator sadrži CDR iz bilo kog SEQ ID NOS: 20-203.
165. DLL3 modulator iz 164 gde navedeni modulator sadrži množinu CDRs iz bilo kog SEQ ID NOS: 20-203.
166. DLL3 modulator antitela koji se takmiči za vezivanje DLL3 proteina sa referentnim antitelom odabranim između grupe koja se sastoji od SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150 gde vezivanje DLL3 modulatora antitela za DLL3 protein je inhibiran sa najmanje 30%.
167. DLL3 modulator koji se vezuje za DLL3 protein epitop koji sadrži amino kiseline Q93, P94, G95, A96 i P97 (SEQ ID NO: 9).
168. DLL3 modulator koji se vezuje za DLL3 protein epitop koji sadrži amino kiseline G203, R205 i P206 (SEQ ID NO: 10).
PRIMERI
Predmetni pronalazak, koji je generalno prethodno opisan, biće lakše shvaćen uzimajući u obzir sledeće primere, koji su dati ilustracijom i nisu namenjeni da ograniče ovaj pronalazak. Primeri nisu nameravani da predstavljaju da su eksperimenti u nastavku svi ili samo jedini eksperimenti koji su izvedeni. Osim ako nije drugačije naznačeno, delovi su težinski delovi, molekulska masa je prosečna težina molekulske mase, temperatura je u stepenima Celzijusa, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer 1
Analiza Marker Izraza u odabranim tumorima sa neuroendokrinskim karakteristikama
Neuroendokrinalni tumori (NET) koji proističu iz dispergovanog endokrinog sistema su retki, sa incidencom od 2-5 na 100.000 ljudi, ali veoma agresivan. Neuroendokrinski tumori se javljaju u nadbubrežnoj žlezdi, bubregu, genitourinarnom traktu (bešika, prostata, jajnik, materica i endometrijum), pankreasu, gastrointestinalnom traktu (želudac i debelo creva), tiroidnoj žlezdi (medularni karcinom tiroidne žlezde) i plućima (karcinom pluća malih ćelija, neuroendokrinski karcinom velikih ćelija i karcinoid). Ovi tumori mogu izdvajati nekoliko hormona uključujući serotonin i/ili hromogranin A koji mogu izazvati simptome poznati kao karcinoidni sindrom. Ovi tumori se mogu označiti pozitivnim imunohistohemijskim markerima kao što su neonsko specifična enolaza (NSE, takođe poznata kao gama enolaza, simbol gena = ENO2), CD56 / NCAM1 i sinaptofizin. Tradicionalne hemoterapije nisu bile uspešne u lečenju NET, a smrtnost zahvaljujući metastatičkom širenju je česti ishod. Nažalost, u većini slučajeva, operacija je jedini potencijalni lekarski tretman, pod uslovom da se odvija nakon ranog otkrivanja i pre metastaze tumora. U ovom kontekstu rad je bio utvrđen da bi se identifikovali novi terapeutski ciljevi povezani sa tumorima koji sadrže neuroendokrinske osobine.
Da bi se identifikovali i okarakterisali takvi tumori koji postoje kod pacijenata sa karcinomom, razvijena je i održavana velika ne-tradicionalna ksenograftna (NTKS) banka tumora pomoću tehnički poznatih tehnika. NTKS banka tumora, koja sadrži znatan broj diskretnih linija tumorskih ćelija, je propagirala kod imunokompromitovanih miševa kroz višestruke prolaze heterogenih tumorskih ćelija prvobitno dobijenih od brojnih bolesnika koji boluju od karcinoma pogođenih različitim malignitetima čvrstog tumora. (Imati na umu da je u nekim od Primera i FIG.-ova ovde broj prolaza testiranog uzorka označen sa p0-p# dodat označenom uzorku gdje je p0 indikativan neprolaznom uzorku koji se dobija direktno iz tumora pacijenta, a p# je indikativan broj puta kada je tumor prošao kroz miš pre testiranja.) Stalna dostupnost velikog broja diskretnih ranih prolaza NTX tumorskih ćelijskih linija koje imaju dobro definisane linije u velikoj meri olakšavaju identifikaciju i karakterizaciju ćelija pročišćenih iz ćelijskih linija. U takvom radu korišćenje minimalno prolazna NTX ćelijska linija pojednostavljuje in vivo eksperimentisanje i daje lako potvrdne rezultate. Pored toga, NTX tumori u ranom prolazu reaguju na terapeutska sredstva kao što su irinotekan (odn.
Camptosar<®>) i režimi Cisplatin/Etoposid, koji obezbeđuju klinički relevantne uvide u osnovne mehanizme koji izazivaju rast tumora, otpornost na trenutnu terapiju i ponavljanje tumora.
Kako su utvrđene NTX tumorske ćelijske linije, njihov fenotip je okarakterisan na razne načine kako bi se ispitalo globalno izražavanje gena. Da bi identifikovali koje NTX linije u banci mogu biti NET, profili ekspresije gena su generisani celokupnim transkriptom analize sekvenciranja i/ili mikroniza. Konkretno, ispitivani su podaci da bi se identifikovali tumori koji izražavaju visoke nivoe specifičnih gena za koje se zna da su povišeni u NET-u ili se koriste kao histohemijski markeri neuroendokrinih diferencijacija (npr. ASCL1, NCAM1, CHGA), kao i tumori sa promenama u NOTCH putanji gena koji pokazuje suzbijanje NOTCH signala (npr. smanjeni nivoi NOTCH receptora, i promene liganda i efektorskih molekula).
Konkretno, nakon uspostavljanja različitih NTX tumorskih ćelijskih linija kako se obično radi za humane tumore u teško imuno kompromitovanim miševima, tumori su isećeni nakon dostizanja 800 - 2000 mm<3>i ćelije su disocirane i dispergovane u suspenziju korišćenjem tehnika enzimske digestije koje su poznate u tehnici (vidite, na primer, U.S.P.N.
2007/0292414).
Disocirani ćelijski preparati iz ovih NTX linija su zatim osiromašene mišije ćelije, a humane tumorske ćelije podpopulacija su potom dalje izolovane sortiranjem ćelija aktivirane fluorescencijom i lizovane u RLTplus RNK lizin puferu (Qiagen). Ovi lizati su zatim skladišteni na -80 °C do upotrebe. Nakon odmrzavanja, ukupna RNK je ekstrahovana korišćenjem RNeasi izolacionog kompleta (Qiagen) prateći uputstva proizvođDča i kvantifikovana na Nanodrop spektrofotometru (Thermo Scientific) i Bioanalizer 2100 (Agilent Technologies), ponovo koristeći protokole proizvođDča i preporučene postavke instrumenta. Dobijeni ukupni RNK preparati su pogodni za genetsko sekvenciranje i analizu genske ekspresije.
Celokupno transkriptomsko sekvencioniranje korišćenjem Applied Biosystems (ABI) SOLID (Sequencing by Oligo Ligation/Detection) 4.5 ili SOLiD 5500x1 sistem sledeće generacije sekvencionisanja (Life Technologies) je izvedena na RNK uzorcima iz NTX linija. cDNK je generisana iz ukupnih RNK uzoraka korišćenjem ili modifikovanog celokupnog protokola transkriptoma (WT) iz ABI dizajniran za nizak ukupan ulaz RNK ili Ovation RNA-Seq System V2™ (NuGEN Technologies Inc.). Modifikovani niski ulazni WT protokol koristi 1.0 ng ukupni RNK kako bi pojačao mRNK na 3’ kraj koji vodi do teškog 3’ pada mapirane ekspresije gena, dok NuGen’s sistem dozvoljava konzistentnije pojačavanje tokom transkripta, i uključuje amplifikaciju oba i mRNK i ne-poliadenililovanog transkripta cDNK korišćenjem nasumićnih heksamera. cDNK biblioteka je fragmentovana, i adapteri barkodova su dodati kako bi se omogućilo udruživanje biblioteke fragmenta iz različitih uzoraka.
ABI’s SOLiD 4.5 i SOLiD 5500x1 platforme sledeće generacije sekvencioniranja omogućava paralelno sekvencioniranje transkriptoma iz višestrukih NTX linija i sortiranih populacija. cDNK biblioteka je konstruisana iz svakog RNK uzorka, koji je fragmentiran i barkodiran. Barkodovi na svakom frgamentu biblioteke dozvoljavaju većem broju uzoraka da budu udruženi pri jednakim koncentracijama i obrađeni zajedno dok se obezbeđuje specifičnost uzorka. Uzorci su propušteni kroz emulziju PCR korišćenjem ABI’s SOLiD™ BZ Bead™ robotskog sistema, što osigurava konzistentnost uzoraka. Sekvenciranje uparenog kraja generiše 50 osnovno čitanje u 5’ do 3’ smeru i 25 osnovno čitanje u 3’ do 5’ smeru za svaki klonalno pojačani fragment na jednoj kuglici koja postoji u zajednici. U slučaju 5500x1 platforme, za svaki set od 8 uzoraka udruženi u gore pomenutom postupku, kuglice su ravnomerno odložene u 6 pojedinačnih kanala na jednom čipu. Ovo će u proseku generisati više od 50 miliona 50 osnovnih čitanja i 50 miliona 25 osnovnih čitanja na svakom od 8 uzoraka i generisati veoma precizno predstavljanje mRNK transkriptnog nivoa u tumornim ćelijama. Podaci generisani sa SOLiD platformom mapirani na 34,609 genima kao što je naznačeno sa RefSeq verzija 47 korišćenjem NCBI verzije hg19.2 objavljenog humanog genoma i obezbeđeni verifikovanim merenjima nivoa RNK u većini uzoraka.
SOLiD platforma je u stanju da uhvati ne samo izraz, već i SNPs, poznate i nepoznate alternativne spojeve, male nekodirajuće RNKs, i potencijalno nova otkrića egzona zasnovanih isključivo na pokrivanju čitanja (čitanje se jedinstveno mapira na ranije neoznačene genomske lokacije). Stoga, korišćenje ove sekvencionarne platforme sledeće generacije uparene sa vlasničkim podacima analize i softverom za vizualizaciju omogućilo je otkrivanje diferencijalnog transkripta, kao i razlike i/ili preferencije za specifične varijante spojene ekspresije mRNK. Podaci o sekvenciranju sa SOLiD platforme su nominalno predstavljeni kao vrednost ekspresije transkripta korištenjem RPM metrika (čitača po milionu) i RPKM (čitanje po kilobazi po milion), omogućavajući analizu osnovnih diferencijalnih izraza kao što je standardna praksa.
Celokupno sekvencioniranje transkriptoma četiri tumora malih ćelija pluća (SCLC) (LU73, LU64, LU86 i LU95), jednog tumora jajnika (OV26) i velikog ćelijskog neuroendokrinog karcinoma (LCNEC, LU37) doveli su do određivanja šablona genske ekspresije koji su najčešće pronađeni u NETs (Slika 4A). Preciznije, ovi tumori su imali visoku ekspresiju nekoliko NET markera (ASCL1, NCAM1, CHGA), kao i smanjene nivoe Notch receptora i efektorskih molekula (npr. HES1, HEI1) i povišene markere Notch supresije (npr. DLL3 i HBS6) . Nasuprot tome, 4 uobičajena uzorka pluća, tri tumora plućnog adenokarcinoma (LU137, LU146 i LU153) i 3 skvamozna ćelijska karcinoma pluća (LU49, LU70 i LU76) imaju ekspresiju različitih Notch receptora i efektorskih molekula, i ne pokazuju povišeni izraz Notch supresora kao što su HES6 i DLL3.
Posle identifikovanja koji NTX u banci tumora su NETs, svaki je analiziran korišćenjem celokupnih transkriptoma sekvencionalnih podataka kako bi se pronašli mogući terapeutski ciljevi prethodno regulisani u NETs kada se porede sa ne-NETs (uključujući LU_SCC, LU_Ad, i normalna pluća). Visoka ekspresija DLL3 je pronađena u NET NTX tumorima koji obuhvataju SCLC, LCNEC, i OV26, poređeni sa niskom do ne-postojećom ekspresijom u normalnim plućima, normalnim jajnicima, drugim OV NTX, LU_Ad i LU_SCC NTX linijama (FIG 4B). Visoka ekspresija DLL3 u NETs u odnosu na niz tipičnih tipova tkiva bila je od velike koristi, pošto DLL3 je poznati supresor Notch signalizacije. S obzirom na to, i s obzirom na generisane podatke, DLL3 je odabran za dalju analizu kao potencijalni imunoterapijski cilj.
Sa otkrićem da se DLL3 može dokazati da je održivi cilj za modulaciju i lečenje određenih proliferativnih poremećaja, rad je izvršen da bi se odredio obrazac i nivoi DLL3 varijanti. Kao što je prethodno rečeno, postoje dve poznate spojene varijante DLL3 koji kodiraju proteine koji se razlikuju samo u tome što izooblik 1 ima prošireni intracelularni C-terminus (FIG.1E). Konkretno, izooblik 2 je 587 aminokiselinski protein (FIG.1D; SEQ ID NO: 4) koji je kodiran sa mRNK varijantom 2 (FIG.1B, SEQ ID NO: 2), koji sadrži eksone 8a i 8c dok izooblik 1 je 618 amino kiselinski protein (FIG.1C, SEQ ID NO: 3) kodiran sa mRNK varijantom I (FIG.
1A, SEQ ID NO: 1), koji sadrži ekson 8b. Šematski dijagram koji ilustruje identični ekstracelularni domen (BCD) izooblika 1 i izooblika 2 u predstavljenom FIG.1F.
Ponovo, korišćenjem celokupnih transkriptoma podataka dobijenih kao što je prethodno opisano, odabrani NET tumori su ispitivani da bi se odredili šabloni izraza gore pomenutih eksona koji, prema ekstenziji, daje ekspresioni odnos dva izooblika. Kao što je prikazano na FIG.5 pronađeno je da, iako određeni odnos ekspresije između dva izooblika može malo da varira, ekspresija izooblika 1 je pretežno u svakom tumoru. U tom pogledu važno je napomenuti da je, kako je gore opisano, kumulativni DLL3 izraz (oba izooblika) u svakom od ispitanih tumora povišen u odnosu na normalna tkiva. Shodno tome, iako odnosi izooblika mogu biti indikativni za određene tipove tumora i relevantni za selekciju genotipskog modulatora, to nije toliko kritično u odnosu na fenotipske modulatorske strategije. To je zato, što je ECD region oba DLL3 izooblika identičan, očekuje se da će fenotipski modulator predmetnog pronalaska usmeren na ECD region (npr., anti-DLL3 antitelo) reagovati sa bilo kojim izooblikom. Dakle, to je apsolutni nivo ekspresije DLL3 ECD (bez obzira na izoobliku) koji je dispozitivan u pogledu na efikasnosti takvih strategija.
Primer 2
Mikropodručje i RT-PCR Analiza Ekspresije Gena u Odabranim NTX Tumorima sa Neuroendokrinskim Karakteristikama
U nastojanju da se identifikuju dodatni NETs u pomenutoj NTX banci izvan onih za koje su postojale celoviti transkriptni podataci SOLiD-a, veći set NTX linija je ispitivano korišćenjem analize mikropodručja. Konkretno, 2-6 µg ukupnih uzoraka RNK izvedenih iz celokupnih tumora u 46 NTX linija ili iz 2 normalnog tkiva su analizirani korišćenjem platforme mikropodručja OneArrai<®>(Phalank Biotech Group), koja sadrži 29.187 proba naznačeni protiv 19.380 gena u humanom genomu. Preciznije, dobijeni su RNK uzorci (kao što je opisano u Primeru 1) od četrdeset i šest pacijenata izvedenih od celokupnih NTX tumora koji sadrže kancere kolorektalni (CR), melanom (SK), bubreg (KD), pluća (LU), jajnik (OV), endometrijalni (EM), dojke (BR), jetre (LIV) ili pankreasa (PA). Normalna kolorektalna (NormCR) i normalna pankreasna (NormPA) tkiva su korišćena kao kontrole. Još konkretnije, tumori pluća su dalje potkvalifikovani kao kancer malih ćelija pluća (SCLC), skvamozni karcinom ćelija (SCC) ili neuroendokrinski karcinoma velikih ćelija (LCNEC). RNK uzorci su vođeni u tri kopije koristeći protokole proizvođDča, a dobijeni podaci su analizirani korišćenjem standardnih industrijskih praksi za normalizaciju i transformaciju vrednosti merenih intenziteta dobijenih za predmetni gen u svakom uzorku. Jednostavniji algoritam hijerarhijskog klasteriranja Pearson Spearman u pogodnim R/BioConductor paketima pod nazivom hclust.2 korišćen je za kreiranje standardnog mikrograma dendrograma za ovih 48 uzoraka. Kao što je poznato u tehnici R/ BioConductor je otvoreni izvor, statistički programski jezik koji se široko koristi u akademskoj, finansijskoj i farmaceutskoj industriji za analizu podataka. Uopšteno, tumori su raspoređeni i grupisani na osnovu obrazaca gena, izraženog intenziteta itd.
Kao što je prikazano na FIG.6A, dendrogram izveden iz 48 uzoraka i za sve gene 19380, grupisane NTX linije zajedno na osnovu njihovog tipa tumora ili tkiva porekla. Nekoliko tumora tipično povezanih sa neuroendokrinskim fenotipima grupisani zajedno na granici označenom sa (1); ovi uključuju kancere kože, brojne karcinome pluća i druge NETs.
Zanimljivo je da je pod-grana, označena sa (2), pokazala da su dva velika ćelijska kancera pluća sa neuroendokrinim osobinama (LU50.LCNEC i LU37.LCNEC) i mali ćelijski karcinomom pluća (LU102.SCLC) grupisani sa jajnicima (OV26) i tumor bubrega (KD66) (klaster C) koji sugerišu da su ovi kasniji tumori takođe imali neuroendokrinske fenotipove. Štaviše, FIG.6A pokazuje klaster D koji se sastoji od 3 dodatna SCLC tumora, a sa desne strane je mali klaster koji sadrži dodatni SCLC NTX (LU100) i neuroendokrinalni endometrijalni tumor (EM6), za koji se očekuje da poseduju neke neuroendokrinske osobine koje se generalno shvaćaju iz literature i patološkog iskustva u klinici. ýinjenica da se klaster G, koji se sastoji od skvamoznih ćelijskih karcinoma pluća, može naći na potpuno drugoj grani dendrograma na FIG.6A pokazuje da grupisanje nije izvedeno isključivo poreklom za tumor.
Bliža inspekcija kolekcije genskih markera povezanih sa NETs (FIG.6B) pokazuje da su jako izraženi u tumorima koji sadrže klastere C i D, dok su minimalno izraženi u tumorima u Klaster G (skvamozne ćelije karcinoma pluća), što ukazuje klastere C i D koji predstavljaju NETs ili tumore sa neuroendokrinskim fenotipom. Konkretnije, klaster C NETs veoma izražavaju ASCL1, CALCA, CHGA, SST i NKX2-1, dok klaster D NET izuzetno izražava CHGA, ENO2 i NCAM1, a to je izraz ovih neuroendokrinskih fenotipskih gena koji je delimično odgovoran za grupisanje ovih tumora. Zanimljiva karakteristika je jak izraz KIT u klasteru D, gen koji se povremeno javlja da je povezan sa neuroendokrinskim tumorima, ali je jasno povezan sa onkogenezom u drugim kontekstima. Ovo je u suprotnosti sa SCC tumorima u klasteru G koji nemaju snažan izraz bilo kog od ovih gena (FIG.6B).
U pogledu na Notch signalizacije, tumori u klasteru C pokazuju fenotip koji odgovara redukciji Notch signalizacije: nedostatak ekspresije bilo kog Notch receptora, relativnog nedostatka ekspresije JAG1 i HES1, i jakih nivoa ekspresije ASCL1 (FIG.6C) . Interesantno, klaster D pokazuje visoku ekspresiju HES6, transkripcionog faktora koji može podržati ASCL1 aktivnost antagonizacijom HES1 aktivnosti kroz formiranje heterodimera. Najvažnije, ovi podaci mikropodručja pokazuju visoke nivoe DLL3 transkripcije u tumorima u klasterima C i D (u odnosu na klaster G), što ukazuje na to da u ovim tipovima tumora DLL3 pruža atraktivnu terapijsku metu za lečenje NETs.
S obzirom na gore navedene rezultate, ekspresija mRNK HES6 ispitivana je iz različitih NTX linija i normalnih tkiva pomoću aplikacije Applied Biosistems 7900HT Machine (Life Technologies) za izvođenje Takmanovog kvantitativnog RT-PCR (kRT-PCR) u realnom vremenu u skladu sa proizvođDčevim protokolima. RNK je izolovana kao što je prethodno opisano i provereno kako bi se obezbedilo da je kvalitet pogodan za analizu ekspresije gena. Nabavljen je RNK iz normalnih tkiva (Agilent Technologies i Life Technologies).200 ng RNK korišćeno je za sintezu cDNK pomoću cDNK arhivne opreme (Life Technologies). cDNK je korišćen za qRT-PCR analizu nizova niske gustine Taqmana (TLDA; Life Technologies) koja sadrži HES6 Takman test za merenje nivoa mRNK HES6.
HES6 nivoi mRNK su prikazani za svaku NTX liniju ili uzorak normalnog tkiva (pojedinačna tačka na grafikonu) posle normalizacije do endogenih kontrola. Normirane vrednosti su prikazane u odnosu na prosečnu ekspresiju u normalnim tkivima toksičnosti (NormTox). Ova tehnika omogućila je brzu identifikaciju i karakterizaciju različitih tumora koji imaju neuroendokrine osobine iz NTX tumorske banke kroz merenje HBS6 i drugih relevantnih markera. FIG.6D ilustruje opštu prekomernu ekspresiju HBS6 u uzorkovanim tumorima sa neuroendokrinskim osobinama (npr., LU-SCLC, LULCNEC) u poređenju sa normalnim tkivima, grudima, debelim crevom, jetrom i drugim izabranim tumorima. Značajno je da ovi podaci mikropodručja i qPCR pokazuju da bar neki tumori endometrijuma, bubrega i jajnika mogu pokazati neuroendokrinske funkcije tumora (FIGS.6A i 6D).
Primer 3
RT- PCR Analiza DLL3 u Tumorima sa Neuroendokrinskim Karakteristikama
Da bi se potvrdili generisani podaci SOLiD i mikropodručja i proširili analizu na dodatne NTX uzorke, ekspresija DLL3 mRNK je analizirana pomoću kRT-PCR korišćenjem RNK uzoraka iz različitih NTX linija, primarnih biopsija i normalnih tkiva. Analiza je ponovo izvršena korišćenjem Applied Biosistems 7900HT Machine (Life Technologies) u suštini kao što je opisano odmah iznad, ali optimizovano za otkrivanje DLL3. DLL3 ekspresija je prikazana u odnosu na prosečnu ekspresiju u normalnim tkivima i normalizovan je na ekspresiju endogenog kontrolnog gena ALAS 1. Kao što se vidi na FIG.7, qRT-PCR ispitivanje ekspresije gena pokazalo je da je DLL3 mRNK povišeno više od 10.000.000 puta u populacijama NET-a u poređenju sa normalnim tkivima. U ovom Primeru uzorkovani tumori uključuju dodatne SCLC NTX linije osim onih prethodno testiranih, kao i brojnih uzoraka RNK izvedenih iz primarnih biopsija (p0). Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da se ekspresija DLL3 gena dramatično reguliše u tumorima koji pokazuju neuroendokrinske osobine i, s obzirom na to da se isti primer vidi u primarnim biopsijskim uzorcima, da posmatrana prethodna regulacija nije predmet za upotrebu rastućih humanih tumora kod miševa.
Pored toga, tri podtipa NSCLC, kao što je definisano sa kliničkom patologijom, takođe su predstavljena na FIG.7: LU25 je plućni karcinom vretenastih ćelija, LU50 je velika ćelija neuroendokrinskog karcinoma (LCNEC), a LU85 je karcinom skvamoznih ćelija (SCC). Najviši DLL3 izraz je prikazan u LCNEC tumoru LU50, iako su povišeni nivoi takođe zabeleženi u SCC i tumorima vretenskih ćelija. KDY66 i OV26, tumor bubrega i jajnika, respektivno, grupisani su na mikrpodručju sa SCLC i LCNEC tumorima (FIG.6A), što ukazuje na to da sadrže tumore koji pokazuju neuroendokrinske osobine (odn. NETs ili pNETs). Takav zaključak potvrđuje visok nivo mRNK DLL3 koji se vidi u oba tumorska uzorka (FIG.7). Iako svi tumori pokazuju jaku prethodnu regulaciju DLL3 mRNK u odnosu na normalna tkiva (FIG.7), poređenje tumora pronađenih i na FIG.6A i 7 pokazuju da suptilne razlike u izmerenoj DLL3 mRNK ekspresiji na FIG.7 odgovaraju diferencijalnom grupisanju na FIG.6A; npr., klaster C sadrži KD66, LU50, OV26 i LU102, koji su na visokom kraju DLL3 ekspresije kao što je prikazano na FIG.7, dok su LU85 i LU100, od kojih se svaka od njih klasterira iz klastera C i D na FIG.6A, spadaju u donji kraj DLL3 ekspresije za izmerene uzorke tumora. Tumori kancera pluća malih ćelija u klasteru D na FIG.6A (npr., LU86, LU64 i LU95) pokazuju srednje vrednosti nivoa DLL3 mRNK ekspresije i mogu vrlo dobro biti podložni tretiranju sa modulatorima trenutnog otkrivanja.
Primer 4
Ekspresija DLL3 mRNK i Proteina u Raznim Uzorcima Tumora
Da bi se proširila analiza DLL3 ekspresije na širem nizu uzoraka tumora, Taqman qRT-PCR je bio izveden u suštini kao što je opisano u prethodnim Primerima na TissueScan™ qPCR (Origene Technologies) nizu 384-bunarčLća. Ovaj niz omogućava poređenje ekspresije gena preko 18 različitih tipova čvrstog tumora, sa više uzoraka dobijenih od pacijenata za svaki tip tumora i iz normalnog susednog tkiva.
U tom pogledu, FIG.8A i 8B prikazuju relativne i apsolutne nivoe ekspresije gena DLL3 u celokupnim uzorcima tumora (sive tačke) ili normalnom susednom tkivu (NAT, bele tačke) od pacijenata sa jednim od osamnaest različitih tipova čvrstog tumora. Podaci su normalizovani na FIG.8A protiv srednje ekspresije gena u NAT za svaki analizirani tip tumora. Uzorcima u kojima nije otkriven DLL3 dodeljena je Ct vrednost od 50, što predstavlja poslednji ciklus amplifikacije u eksperimentalnom protokolu. Svaka tačka predstavlja jedan uzorak tkiva, sa geometrijskom srednjom vrednošću koja je predstavljena kao crna linija. Korišćenjem ovog Origene TissueScan Niza, prekomerna ekspresija DLL3 uočena je u podsetu nadbubrežnog, grudnog, cervikalnog, endometrijskog, plućnog, jajnika, pankreasa, karcinoma štitnjače i karcinoma bešike, od kojih mnogi mogu predstavljati NETs ili tumore sa slabo diferenciranim neuroendokrinskim fenotipima. Podset tumora pluća je pokazao najveću preteranu ekspresiju DLL3. Najviši izraz je prikazan u 2 LCNEC tumorima na nizu. Kao što je prikazano apsolutnim genskim izrazom na FIG.8B, normalni testis je jedino normalno tkivo sa visokom ekspresijom DLL3. Ovo ukazuje na to da ekspresija DLL3 u NET i drugim tumorigenskim ćelijama može igrati ulogu u tumorigenezi i/ili progresiji tumora u širokom spektru tumora.
S obzirom na povećane nivoe transkripta DLL3 koji su povezani sa različitim tumorima, rad je izveden kako bi se pokazalo odgovarajuće povećanje ekspresije DLL3 proteina u NET u odnosu na druge tumore. Za to je DLL3 sendvič ELISA razvijen korišćenjem MSD Platforme Otkrića (Meso Scale Discoveri, LLC) za otkrivanje i kvantifikovanje DLL3 ekspresije u odabranim NTX tumorskim uzorcima. Ukratko, uzorci NTX tumora bili su lizovani, a ukupna koncentracija proteina, kao i koncentracija DLL3 proteina, merena su u lizatima koristeći sendvič ELISA format na bazi detekcije elektrohemiluminiscencije. Preciznije, koncentracije DLL3 iz uzoraka su interpolirane iz elektrohemoiluminiscentnih vrednosti koristeći standardnu krivu generisanu iz prečišćenog rekombinantnog proteina i izražene su na FIG.
8C kao nanogrami DLL3 na miligram ukupnog proteina.
Preciznije, NTX tumori su izrezani iz miševa i brzo zamrznuti na suvom ledu/etanolu. Pufer proteinske ekstrakcije (Biochain Institute, Inc.) je dodat u odmrznute komade tumora, a tumori su usitnjeni pomoću sistema Tissue Lyser (Qiagen). Lizati su očišćeni centrifugiranjem (20.000 g, 20 minuta, 4°C) i protein je kvantifikovan pomoću bicinhoninske kiseline (BCA). Lizati proteina se čuvaju na -80ºC dok se ne analiziraju.
MSD standardne ploče (Meso Scale Discoveri, LLC) su prekrivene preko noći na 4°C sa 30 µl SC16.S4 antitela (dobijen kao što je navedeno u Primeru 7 u nastavku) na 2 µg/ml u PBS. Ploče su isprane u PBST i blokirane u 150 ul MSD 3% Blocker A rastvoru na 1 sat. Ploče su ponovo isprane u PBST.25 µl SC16.4 antitela (dobijen kao što je navedeno u Primeru 7 u nastavku) konjugovano sa MSD sulfo-tagom i dodat je ispranim pločama u 0.5 µg/ml u MSD 1% Bloker A.25 µl 10x razblaženog lizata u MSD 1% Bloker A ili serijski razblaženi rekombinantni DLL3 standard u MSD 1% Blokeru A koji sadrži 10% Pufera Ekstrakcije Proteina je takođe dodan u bunare i inkubiran tokom 2 sata. Ploče su isprane PBST. MSD Crveni Pufer T sa površinskim aktivnim supstancama razređen je do 1X u vodi i dodato je 150 µl u svaki bunar. Ploče su pročitane na MSD Sector lmager 2400 koristeći integrisani program za analizu softvera za izvođenje DLL3 koncentracija u NTX uzorcima putem interpolacije. Vrednosti su zatim podeljene sa ukupnom koncentracijom proteina kako bi se dobili nanogrami DLL3 po miligramu ukupnog lizatnog proteina. Rezultujuće koncentracije su prikazane na FIG.8C gde svako mesto predstavlja koncentracije izvedene iz jedne NTX tumorske linije. Dok je svako mesto izvedeno iz jedne NTX linije, u većini slučajeva višestruki biološki uzorci su testirani iz iste NTX linije i vrednosti su usrednjene kako bi se dobila tačka podataka.
U svakom slučaju FIG.8C pokazuje da je najveća ekspresija DLL3 pronađena u SCLC, LCNEC, kao i drugim neuroendokrinskim tumorima, uključujući odabrane uzorke bubrega i jedan tumor jajnika. FIG.8C takođe pokazuje da određene NTX linije melanoma pokazuju povišenu ekspresiju DLL3 proteina što je naročito zanimljivo zbog toga što su ove NTX linije takođe grupisane u blizini NET NTX linija u analizi mikroniza sprovedenoj u Primeru 4 (FIG.
6A).
Ovi podaci, u kombinaciji sa transkripcijskim podacima za DLL3 ekspresiju koja je gore navedena, snažno potkrepljuju tvrdnju da determinante DLL3 pružaju atraktivne ciljeve za terapijsku intervenciju.
Primer 5
Ekspresija NOTCH Receptora i Delta-sličnih
Uganda na Površini ûelije Odabranih NTX Tumorskih Linija
Da bi se dalje proširila posmatranja iz Primera 1 i 2 gore, ćelije izolovane iz nekoliko NTX tumora pronađenih u Klasterima C i D (KDY66, OV26, LU64; FIG 6A), kao i SCLC tumor za kog je utvrđeno da ima visoku ekspresiju DLL3 pomoću SOLiD sekvence ili qRT-PCR (LU73, FIGS.4 i 7) su analizirani pomoću protočne citometrije za određivanje nivoa ekspresije proteina za različite Notch receptore i druge članove DLL familije. Generalno podaci o ekspresiji proteina na bazi protočne citometrije su generisani pomoću FACSCanto II (BD Biosciences) prema uputstvima proizvođDča. Podaci na FIG.9 prikazuju pojedinačne ćelije tumora prikazane kao histogramske ploče, pri čemu je pozadinsko bojenje antitela za kontrolisanje izotipova prikazano u sivim, popunjenim histogramima i ekspresija proteina od interesa, kao što je određeno korišćenjem komercijalno dostupnih antitela prikazano je tamnom crnom linijom.
Kao što se vidi grafički na FIG.9, nije bilo ni malo ekspresije bilo kog Notch receptora (npr., NOTCH1-4) u bilo kom od ovih tumora, kao što je određeno u odnosu na fluorescentne minus jedan (FMO) obojane ćelije koje kontrolišu izotope. Ovo je grafički prikazano sa histogramima, kao i numerički u prijavljenim srednjim intenzitetima fluorescencije (MFI) za svako merenje. Slično tome, dve NKX ćelije izvedene iz raka pluća nisu pokazala nikakvu ekspresiju DLL1 ili DLL4. Blaga ekspresija samo DLL4 (OV26) ili DLL1 i DLL4 (KDY66) se može posmatrati za dva tumora. Uopšteno govoreći, ovo posmatranje potvrđuje dobijene rezultate i prezentovane u prethodnim Primerima 1 i 2, da ti tipovi tumora pokazuju malo do nikakve ekspresije komponenti putanje signala Notch, u skladu sa gubitkom Notch signala u NETs ili slabo diferenciranim tumorima sa neuroendokrinskim fenotipima.
Primer 6
Generacija anti-DLL3 Modulatora
DLL3 modulatori u obliku mišjeg antitela proizvedeni su u skladu sa ovim učenjem putem inokulacije sa rekombinantnim humanim DLL3-Fc ili sa humanim DLL3-His (svaki sadrži zrele ECD DLL3 prikazane na FIG.1C, SEQ ID NO: 3 ) u dve odvojene kampanje imunizacije. U vezi sa tim, tri soja miševa (Balb/c, CD-1 i FVB) su inokulisani sa humanim rekombinantnim DLL3 da bi se obezbedili hibridomi koji sekretuju visoki afinitet, modulatora mišjih monoklonskih antitela.
hDLL3-Fc fuzioni konstruktur je dobijen iz Adipogen International (Kataloški br. AG-40A-0113) gde je lit pročišćeni iz supernatanta DLL3-Fc previše ekspresovanih HEK 293 ćelija kako je opisano u podacima proizvođDča o proizvodu. Rekombinantni hDLL3-His protein je prečišćen iz supernatantnih ćelija CHOK1, konstruisanih za prekomerno izražavanje hDLL3-His.10 µg hDLL3-Fc ili hDLL3-His imunogena je emulgovano sa jednakom zapreminom TITERMAX<®>Gold (CytRx Corporation) ili alum adjuvansom i koristi se za imunizaciju svakog miša. Rezultujuće emulzije su zatim ubrizgane u tri ženke miševa (1 po jedna: Balblc, CD-1 i FVB) preko putanje podnožja.
Analize čvrste faze ELISA su korišćene za prikazivanje seruma miševa za mišja IgG antitela specifična za humani DLL3. Pozitivan signal iznad pozadine pokazuje antitela specifična za DLL3. Ukratko, ploče sa 96 bunarčLća (VWR International, Cat. # 610744) su prekrivene rekombinantnim DLL3-His u 0.5 µg/ml u BLISA puferu za presvlaćenje preko noći. Nakon ispiranja sa PBS koji sadrži 0.02% (v/v) Tveen 20, bunaričLći su blokirani sa 3% (w/v) BSA u PBS, 200 µL/bunarčLću za 1 sat na sobnoj temperaturi (RT). Serum miša je titriran (1:100, 1:200, 1:400 i 1:800) i dodat na DLL3 obložene ploče sa 50 µl/bunarčLću i inkubiran na RT 1 sat. Ploče se isprane i potom inkubirane sa HRL-označenim kozijim anti-mišijim IgO razblažen 1:10,000 u 3% BSA-PBS ili 2% FCS u PBS tokom 1 sata na RT. Ponovo su isprane ploče i dodato je 40 µL/bunarčLću TMB supstratnog rastvora (Thermo Scientific 34028) tokom 15 minuta na RT. Nakon razvijanja, jednaka zapremina 2N H2SO4je dodata kako bi se zaustavio razvoj supstrata, i ploče su analizirane sa spektrofotometrom na OD 450.
Sera-pozitivni imunizovani miševi su imolativni i odvodni limfni čvorovi (poplitealni i inguinalni i medijalni iliac ukoliko su uvećani) razdvojeni i koriste se kao izvor za ćelije koje proizvode antitela. Jedna ćelijska suspenzija B ćelija (228.9x10<6>ćelija) je spojena sa ne-sekretujućim ćelijama mieloma P3x63Ag8.653 (ATCC # CRL-1580) u odnosu 1:1 sa elektrofuzijom.
Elektrofuzija je izvedena pomoću BTKS Hibrimmune™ sistema, (BTKS Harvard Apparatus) prema uputstvima proizvođDča. Nakon postupka fuzije, ćelije su resuspendovane u medijumu za selekciju hibridoma uz dodatak azaserina (Sigma # A9666), visokog glukoznog DMEM medija sa natrijum piruvatom (Cellgro cat # 15-017-CM) koji sadrži 15% fetalnog klona I seruma (Hiclone), 10 % BM Condimed (Roche Applied Sciences), 4 mM L-glutamin, 100 IU Penicillin-Streptomicin i 50 µM 2-merkaptoetanola, a zatim se pokrivaju u tri T225 boce u 90 mL selekcionom medijumu po boci. Boce su zatim postavljene u vlažni inkubator na 37°C koji sadrži 5% CO2 i 95% vazduha na 6-7 dana.
Posle šest do sedam dana rasta, biblioteka koja se sastoji od ćelija odraslih u T225s je postavljena u 1 ćeliji po bunarčLću u Falcon ploćama sa U dnom i sa 96 bunarčLća korišćenjem sortera Aria I ćelije. Odabrani hibridomi su zatim rasli u 200 µL kulturnog medija koji sadrži 15% fetalnog klona I seruma (Hyclone), 10% BM-Condimed (Roche Applied Sciences), 1 mM natrijum piruvate, 4 mM L-glutamina, 100 IU Penicilin-Streptamicin, 50 µM 2-merkaptoetanola, i 100 µM hipoksantina. Bilo koje preostale neiskorišćene ćelije biblioteke hibridoma su zamrznute za dalje testiranje biblioteke. Posle deset do jedanaest dana rasta supernatanti iz svakog bunarčLća postavljenih ćelija su analizirani za antitela koja su reaktivna za DLL3 pomoću ELISA i FACS testova.
Za skrining pomoću ELISA ploča sa 96 bunarčLća je obložena sa denaturisanim humanim DLL3 ili ćelijskim lizatima 293 ćelija koje prekomerno iskazuju humani DLL3 (dobijen kao što je opisano u nastavku), u natrijum karbonatnom puferu preko noći na 4°C. Ploče su isprane i blokirane sa 3% BSA u PBS/Tween tokom jednog sata na 37°C i odmah su korišćene ili držane na 4°C. Nerazređeni hibridoma supernatanti su inkubirani na pločama tokom jednog sata na RT. Ploče su isprane i ispitivane pomoću HRP-a označenog kozjeg anti-mišijege IgG razblaženog 1: 10,000 u 3% BSA-PBS tokom jednog sata na RT. Ploče su zatim inkubirane sa rastvorom supstrata kao što je prethodno opisano i očitano na OD 450. BunarčLći koji sadrže imunoglobulin koji pretežno vezuje humani DLL3, kao što je određeno signalom iznad pozadine, su prebačene i proširene.
Rast pozitivnog hibridoma u bunarčLćima koji izlučuje mišji imunoglobulin su takođe skrinirani za humanu DLL3 specifičnost i makaki, pacova i mišjeg DLL3 unakrsnom reaktivnosti pomoću protočne citometrije osnovne analize sa 293 ćelija konstruisane da prekomerno iskazuju ili humani DLL3 (h293-hDLL3), cinomolgus DLL3 (h293 -cDLL3), pacova (h293-rDLL3) ili mišjih DLL3 (h293-mDLL3) proteina. h293-hDLL3 ćelije su napravljene sa transdukcijom 293T ćelija korišćenjem lentivirusa napravljenog iz komercijalnog bicistroničnog lentiviralnog vektora (Open Biosistems) koji iskazuje i hDLL3 i GFP marker. h293-mDLL3 ćelije su napravljene transdukcijom 293T ćelija koristeći bicistronski lentiviralni vektor izražavajući i mDLL3 i RFP marker, izgrađen kao što sledi. DNK fragmenta (FIG.10A; SEQ ID NO:.5) koji kodira zreli mišji DLL3 protein (FIG.10B; SEQ ID NO:.6) dobijen je sa PCR amplifikacijom iz komercijalnog mišjeg DLL3 konstruktora (Origene) i subkloniran nizvodno IgG K signalne peptidne sekvence koja je prethodno napravljena uzvodno od višestruke klonirajuće lokacije pCDH-EF1-MCS-IRES-RFP (Sistem Biosciences) koristeći standardne tehnike molekularnog kloniranja. Slično, h293-rDLL3 ćelije su napravljene prenošenjem 293T ćelija korišćenjem bicistronskog lentiviralnog vektora koji iskazuje oba i DLL3 pacova i GFP marker, konstruisan kloniranjem sintetičkog DNK fragment (GeneWiz) koji sadrži sekvencu kodon-optimizovanu za kodiranje proteina DLL3 zrelog pacova (pristup NP_446118.1, ostaci 25 - 589) nizvodno od IgK signalne peptidne sekvence prethodno projektovane uzvodno od lokacije za više mesta kloniranja pCDH-EF1-MCS-IRES-GFP (Sistem Biosciences) koristeći standardne tehnike molekularnog kloniranja. Konačno, cinomolgus (npr., Macaca fascicularis) DLL3 (cDLL3) sekvenca je izvedena korišćenjem humane DLL3 sekvence za BLAST protiv javno dostupnog Macaca fascicularis celog genoma susednih sekvenci, i sklapanje ekson sekvenci Cynomolgus gena pod pretpostavkom da održava eksoničnu strukturu u genu preko vrsta. Ubrzanje PCR i direktno sekvenciranje pojedinačnih eksona 2 -7 iz Cynomolgus genomskog DNK (Zyagen) korišćeni su za potvrđivanje da je deducirana sekvenca ispravna u ECD regionu proteina. cDLL3 DNK sekvenca (FIG.10C; SEQ ID NO: 7), koja kodira cDLL3 protein (FIG.10D; SEQ ID NO: 8), je proizveden sintetički (GeneWiz) i subkloniran nizvodno od IgG K signalne peptidne sekvence prethodno projektovanog uzvodno od lokacije za višestruko kloniranje pCDH-EF1-MCS-IRES-GFP (Sistem Biosciences) koristeći standardne tehnike molekularnog kloniranja. Transdukcija 293T ćelija sa ovim vektorom je dala h293-cDLL3 ćelije.
Za ispitivanje protočne citometrije, 50x10<4>h293 ćelije transdukovane sa humanim, cinomolgusom, pacovima ili mišjim DLL3 su inkubirane 30 minuta sa 25-100 µL hibridoma supernatantom. ûelije su isprane sa PBS, 2% FCS, dva puta i zatim inkubirane sa 50 µL kozijim anti-mišjim IgG Fc fragmentom specifično sekundarno konjugiranog za DyLight 649 razblaženim 1:200 u PBS/2% sa FCS. Posle 15 minuta inkubacije, ćelije su isprane dva puta sa PBS/2% FCS i ponovo suspendovane u PBS/2% FCS sa DAPI i analizirane sa protočnom citometrijom koristeći FACSCanto II prema uputstvima proizvođDča. BunarčLći koji sadrže imunoglobulin koji preferencijalno vezuju DLL3<+>GFP<+>ćelije su prenete i proširene. Dobijeni hDLL3 specifični klonalni hibridomi su kriosačuvani u CS-10 medijumu za zamrzavanje (Biolife Solutions) i skladišteni u tečnom azotu. Antitela koja vezuju h293-hDLL3, h293-cDLL3, h293-rDLL3 i/ili h293-mDLL3 ćelije su označene kao unakrsne reakcije (vidi FIG.12). Na osnovu ovog testa svi odabrani modulatori koji su bili reaktivni sa mišjim antigenom takođe su bili reaktivni sa antigenom pacova.
ELISA i protočna citometrijska analiza potvrdila je da prečišćeno antitelo od većine ili svih ovih hibridoma povezuje DLL3 na koncentraciono-zavistan način. Jedna fuzija svake kampanje imunizacije je obavljena i zasejana u 64 ploče (6144 bunarčLća pri približno 60 -70% efikasnosti kloniranja). Kampanja imunizacije hDLL3-Fc i skrininga dala je približno 90 mišijih antitela specifičnih za humani DLL3, od kojih su neki bili unakrsno reaktivni sa mišjim DLL3. hDLL3-His kampanja imunizacije dala je 50 dodatnih mišjih antitela specifičnih za humani DLL3, od kojih je broj unakrsno reagovao sa mišjim DLL3.
Primer 7
Sekvencioniranje Mišijih DLL3 Modulatora
Na osnovu navedenog, veliki broj primernih različitih monoklonskih antitela koja vezuju imobilizovane humane DLL3 ili h293-hDLL3 ćelije sa očigledno visokim afinitetom su odabrane za sekvenciranje i dalju analizu. Kao što je prikazano u tabularnom prikazu na FIG.11A i 11B, sekvencna analiza varijabilnih regiona lakog lanca (FIG.11A) i varijabilnih regiona teškog lanca (FIG.11B) iz odabranih monoklonskih antitela generisanih u Primeru 6 potvrdila su da su mnogi imali novu komplementarnost određivanja regiona i često prikazivali nove VDJ aranžmane. Imati na umu da komplementarno određeni regioni prikazani na FIG.
11A i 11B su definisani prema Chothia et al., supra.
Kao prvi korak u sekvencioniranju primernih modulatora, odabrane ćelije hibridoma su lizirane u Trizol<®>reagensu (Trizol Plus RNA sistem za prečišćavanje, Life Technologies) za pripremu RNK. U tom pogledu između 10<4>i 10<5>ćelija je ponovo suspendovano u 1 mL Trizola i snažno mešano nakon dodavanja 200 µL hloroforma. Zatim su uzorci centrifugirani na 4°C tokom 10 minuta i vodena faza je prebačena u svežu mikrofugnu cev gde je dodata jednaka zapremina izopropanola. Cevi su ponovo snažno mešane i ostavljene da se inkubiraju na RT 10 minuta pre centrifugiranja na 4°C tokom 10 minuta. Rezultujuće pelete RNK su isprane jednom sa 1 mL 70% etanola i kratko su osušene na RT pre nego što su ponovo suspendovane u 40 µL vode tretirane sa DEPC. Kvalitet preparata RNK određen je frakcionisanjem 3 µL u 1% agaroznom gelu pre skladištenja na -80°C do upotrebe.
Varijabilni region Ig teškog lanca svakog hibridoma je amplifikovan pomoću 5' prajmerne smeše koja sadrži trideset dva mišija određena liderska sekvenciona prajmera, dizajnirane da ciljaju kompletan repertoar mišjeg VHu kombinaciji sa 3' mišji CȖprajmer specifičan za sve mišije Ig izotipove. PCR fragment VHod 400 bp je sekvencioniran sa oba kraja koristeći iste PCR prajmere. Slično tome, smeša od trideset i dva 5 'Vțliderska sekvencna prajmera dizajniranih da ampliciraju svaku od familija Vțmiševa u kombinaciji sa jednim obrnutim prajmerom specifičnim za mišiju kapa konstantnu regiju, korišćeni su za pojačavanje i sekvencioniranje kapa lakog lanca. VHi VLtranskripti su amplifikovani od 100 ng ukupne RNK koristeći reverznu transkriptaznu polimeraznu lančanu reakciju (RT-PCR).
Za svaki hibridom je izvršeno ukupno osam RT-PCR reakcija: četiri za Vțlaki lanac i četiri za V gama teški lanac (Ȗ1). Komplet One Step RT-PCR je korišćen za amplifikaciju (Qiagen). Ovaj komplet pruža mešavinu Sensiscript i Omniscript Reverse Transcriptaze, HotStarTaq DNK Polimeraze, dNTP smešu, pufer i Q-Rastvor, novi aditiv koji omogućava efikasno pojačavanje "teških" (npr., GC bogatih) šablona. Reakcione smeše su pripremljene koje su uključivale 3 µL RNK, 0.5 od 100 µM ili teškog lanca ili kapa lakog lanca prajmera (sintetizovano pomoću IDT), 5 µL 5x RT-PCR pufera, 1 µL dNTPs, 1 µL enzimske smeše koja sadrži reverznu transkriptazu i DNK polimerazu i 0.4 µL inhibitora ribonukleaze RNasin (1 jedinice). Reakciona smeša sadrži sve reagense koji su potrebni kako za reverznu transkripciju, tako i za PCR. Program termičkog ciklusa postavljen je za RT korak 50°C tokom 30 minuta, 95°C tokom 15 minuta, nakon čega sledi 30 ciklusa PCR (95°C u trajanju od 30 sekundi, 49°C u trajanju od 30 sekundi, 72°C za jedan minut). Zatim je došlo do konačne inkubacije na 72°C tokom 10 minuta.
Za pripremu PCR proizvoda za direktno sekvenciranje DNK, oni su prečišćeni pomoću QIAquick™ PCR Opreme za Prečišćavanje (Qiagen) prema proizvođDčevom protokolu. DNK je eluiran iz centrifugalne kolone koristeći 50 µL sterilne vode, a zatim sekvencirana direktno iz oba dela. Ekstrakovani PCR proizvodi su direktno sekvencionirani korišćenjem specifičnih prajmera V regiona. Nukleotidne sekvence su analizirane koristeći IMGT za identifikaciju germlinije V, D i J članova gena sa najvišom homologijom sekvencom.
Izvedene sekvence su upoređene sa poznatim germlinijskim DNK sekvencama Ig V- i J-regija koristeći V-BASE2 (Retter i sar., Supra) i usklađivanjem VHi VLgena sa bazom podataka za mišiji germliniju da bi se obezbedile postavljene pribeležene sekvence prikazane na FIGS.11A i 11B.
Preciznije, FIG.11A prikazuje susedne amino kiselinske sekvence devedeset dva nova mišija varijabilna regiona lakog lanca iz anti-DLL3 antitela (SEQK ID NOS: 20 - 202, parni brojevi) i pet humanizovanih varijabilih regiona lakog lanca (SEQ ID NOS: 204-212, parni brojevi) izvedeni iz reprezentativnih mišijih lakih lanaca. Slično tome, FIG.11B prikazuje susedne amino kiselinske sekvence devedeset dva nova mišija varijabilna regiona teškog lanca (SEQ ID NOS: 21 - 203, neparni brojevi) od istih anti-DLL3 antitela i pet humanizovanih varijabilih regiona teškog lanca (SEQ ID NOS: 205 - 213, neparni brojevi) od istih mišjih antitela koja obezbeđuju humanizovane lake lance. Prema tome, uzeta zajedno FIG.11A i 11B pružaju pribeležene sekvence od dvanaest i dva operativna mišja anti-DLL3 antitela (nazvana SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, Sic16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16,67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16,121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136. SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16,150) i pet humanizovanih antitela (nazvana hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 i hSC16.56). Imati na umu da se ove iste oznake mogu odnositi na klon koji proizvodi predmetno antitelo i, kao takvo, upotreba bilo koje posebne oznake treba tumačiti u kontekstu pronalaska koji okružuje.
Za svrhe predmetnog pronalaska SEQ ID NOS svakog određenog antitela su sledeće.
Prema tome, mAb SC16.3 sadrži SEQ ID NOS: 20 i 21 za varijabilne regione lakog i teškog lanca respektivno. U tom pogledu SC16.4 sadrži SEQ ID NOS: 22 i 23, SC16.5 sadrži SEQ ID NOS: 24 i 25, i tako dalje. Štaviše, odgovarajuće sekvence nukleinske kiseline za svaku amino kiselinsku sekvencu na FIGS.11A i 11B dodaju se predmetnoj prijavi u sekvencnoj listi koja je ovde priložena. U predmetnoj sekvencnoj listi uključene nukleinske sekvence sadrže SEQ ID NOS koji su dvesta veći od odgovarajuće amino kiselinske sekvence (laki ili teški lanac). Tako, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju amino kiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca mAb SC16.3 (odn., SEQ ID NOS: 20 i 21) sadrži SEQ ID NOS: 220 i 221 u sekvencnoj listi. U tom smislu sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju sve otkrivene amino kiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog i teškog lanca, uključujući i one koji kodiraju humanizovane konstrukte, su numerisane slično i obuhvataju SEQ ID NOS: 220 - 413.
Primer 8
Humanizacija DLL3 Modulatora
Kao što je pomenuto gore, pet mišjih antitela iz Primera 7 je humanizovano korišćenjem oplemenjivanje komplementarno određenog regiona (CDR). Ljudski okviri za teške i lake lance su odabrani na bazi sekvence i strukturne sličnosti u odnosu na funkcionalne humane germline gene. U tom pogledu, strukturna sličnost je procenjena upoređivanjem mišije kanoničke CDR strukture sa ljudskim kandidatima sa istim kanonskim strukturama kao što je opisano u Chothia et al. (supra).
Naročito mišija antitela SC16.13, SC16.15, SC16.25, SC16.34 i SC16.56 su humanizovana korišćenjem CDR-grafting metode uz pomoć kompjutera (Abysis Database, UCL Business Plc.) i standardnih tehnika molekularnog inženjeringa kako bi se dobili hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 i hSC16.56 modulatori. Ljudski okvirni regioni varijabilnih regiona su odabrani na osnovu njihove najviše sekvencne homologije prema predmetnoj mišijoj okvirnoj sekvenci i njegove kanonske strukture. U svrhu analize humanizacije, dodeljivanje amino kiselina za svaki CDR domen je u skladu sa Kabat et al. brojanjem (supra).
Postupci molekularnog inženjeringa su sprovedeni korišćenjem tehnika priznatim u tehnici. Na taj kraj ukupna mRNK je ekstrakovana iz hibridoma i pojačana kao što je navedeno u Primeru 7 odmah iznad.
Iz informacija o nukleotidnoj sekvenci dobijeni su podaci koji se odnose na V, D i J genske segmente teških i lakih lanaca predmetnih mišjih antitela. Na osnovu podataka o sekvenci novi setovi prajmera specifični za lidersku sekvencu Ig VHi VKlakog lanca antitela su konstruisani za kloniranje rekombinantnog monoklonskog antitela. Nakon toga, V- (D) -J sekvence su poravnate sa mišjim Ig germ linijskim sekvencama. Dobijeni genetski aranžmani za svaki od pet humanizovanih konstrukcija su prikazani u Tabeli 1 odmah u nastavku.
TABELA 1
Sekvence prikazane u TABELI 1 odgovaraju pribeleženim sekvencama teškog i lakog lanca navedenim u FIGS.11A i 11B za predmetne klonove. Preciznije, unosi u Tabeli 1 iznad odgovaraju graničnim sekvencama varijabilnog regiona koje su navedene u nastavku SEQ ID NOS: 204 i 205 (hSC16.13), SEQ ID NOS: 206 i 207 (hSC16.15), SEQ ID NOS: 208 i 209 (hSC16.25), SEQ ID NOS: 210 i 211 (hSC16.34) i SEQ ID NOS: 212 i 213 (hSC16.56). Osim toga, TABELA 1 pokazuje da je veoma malo promena okvira neophodno za održavanje povoljnih osobina vezujućih modulatora. U tom pogledu nije bilo promena u okvirima ili povratnih mutacija u varijabilnim regionima teškog lanca i izvršene su samo dve okvirne modifikacije u varijabilnim regionima lakog lanca (odn., 87F u hSC16.15 i hSC16.34).
Nakon humanizacije svih odabranih antitela pomoću CDR graftinga, rezultujuće amino kiselinske sekvence varijabilnog regiona lakog i teškog lanca su analizirane da bi se odredila njihova homologija u odnosu na varijabilne regione lakog i teškog lanca mišijeg donora i humanog akceptora. Rezultati, prikazani u Tabeli 2 odmah u nastavku, otkrivaju da su humanizovani konstrukti dosledno pokazivali višu homologiju u odnosu na humane sekvence akceptora nego kod sekvenci donora miševa. Naročito, varijabilni regioni teškog i lakog lanca kod miševa pokazuju sličnu ukupnu procentnu homologiju najbližem poklapanju gena humanih germlinijskih gena (85% -93%) u poređenju sa homologijom humanizovanih antitela i donorskih sekvenci proteina hibridoma (74%-83%).
TABELA 2
Nakon testiranja, i kao što će se detaljnije diskutovati u nastavku, svaki humanizovani konstrukt pokazuje povoljne karakteristike vezivanja grubo uporedivi sa onima koje pokazuju antitela roditeljskog miša.
Bilo da su humanizovani ili mišji, kada se odrede sekvence nukleinske kiseline varijabilnih regiona, antitela predmetnog pronalaska se mogu izraziti i izolovati korišćenjem tehnike koje su priznate u tehnici. Na taj način sintetički DNK fragmenti izabranog varijabilnog regiona teškog lanca (humanizovanog ili mišijeg) su klonirani u humani IgG1 ekspresioni vektor. Slično tome, DNK fragment varijabilnog regiona lakog lanca (ponovo humanizovan ili mišji) je kloniran u ekspresioni vektor humanog lanca. Odabrano antitelo je zatim iskazano sa ponovnom transfektacijom izvedenih konstruktora nukleinske kiseline teškog i lakog lanca u CHO ćelije.
Naročito, jedna kompatibilna metoda proizvodnje antitela uključivala je usmereno kloniranje mišjih ili humanizovanih gena varijabilnog regiona (amplificirano primenom PCR) u odabrane humane imunoglobulinske ekspresione vektore. Svi prajmeri koji se koriste u Ig gen specifičnog PCRs uključuju mesta restrikcije koja omogućavaju direktno kloniranje u vektore ekspresije koji sadrže konstantne regione humanog IgG1 teškog lanca i lakog lanca.
Ukratko, proizvodi PCR-a su prečišćeni Qiaquick PCR-ovim opremom za prečišćavanje (Qiagen), nakon čega sledi varenje sa AgeI i Xhol (za teški lanac) i XmaI i DraIII (za lakši lanac) respektivno. Svareni PCR proizvodi su prečišćeni pre ligacije u ekspresione vektore. Reakcije ligacije su izvedene u ukupnoj zapremini od 10 µL sa 200U T4-DNA Ligaze (Nev England Biolabs), 7.5 µL digestivnog i prečišćenog specifično genskog PCR proizvoda i 25ng linearizovanog vektorskog DNK. Kompetentne E. coli DH10B bakterije (Life Technologies) su transformisane pomoću toplotnog udara na 42°C sa 3 µl proizvoda za ligaciju i postavljene na pločice ampicilina (100 mg/mL). AgeI-EcoRI fragment VHregiona je potom ubačen na isto mesto pEE6.4HuIgG1 ekspresionog vektora sa sintetičkim XmaI-DraIII VK insertom koji je kloniran na XmaI-DraIII mesto odgovarajućeg pEE12.4Hu-Kapa ekspresionog vektora.
ûelije koje proizvode odabrano antitelo su generisane sa transfekcijom HEK 293 ćelija sa odgovarajućim plazmidima koristeći 293fectin. U tom pogledu plazmid DNK je prečišćen sa QIAprep Spin kolonama (Qiagen). ûelije humanog embrijonskog bubrega (HEK) 293T (ATCC No CRL-11268) su kultivisane na 150mm pločama (Falcon, Becton Dickinson) pod standardnim uslovima u Dulbecco’s Modified Eagle’s Medijumu (DMEM) suplementovanom sa 10% toplotno inaktivisanim FCS, 100 µg/mL streptomicina, 100 U/mL penicilina G (svi iz Life Technologies).
Za prelaznu transfekciju ćelije su rasle do 80% konfluentnosti. Jednake količine IgH i odgovarajući IgL lančani vektor DNK (12.5 µg svakog) je dodat u 1.5 mL Opti-MEM smeše sa 50 µL HEK 293 transfekcionog reagensa u 1.5 mL opti-MEM. Smeša je inkubirana 30 min na sobnoj temperaturi i distribuirana jednako u ploče za kultivaciju. Supernatanti su pokupljeni tri dana posle transfekcije, zamenjeni sa 20 mL svežeg DMEM suplementovanog sa 10% FBS i ponovo prikupljeni 6 dana posle transfekcije. Supernatanti kulture su očišćeni od ćelijskih ostataka centrifugiranjem na 800xg 10 min i skladišteni na 4°C. Rekombinantna himerna i humanizovana antitela su prečišćena sa Proteinskim G kuglicama (GE Healthcare) i skladištena pod odgovarajućim uslovima.
Primer 9
Karakteristike DLL3 Modulatora
Različite metode su korišćene za analizu vezivanja i imunohemijskih karakteristika izabranih DLL3 modulatora generisanih kao što je gore navedeno. Konkretno, određeni broj modulatora antitela su karakterisani kao afinitet, kinetika, binovanje, mesto vezivanja i unakrsna reaktivnost u odnosu na humano, cinomolgno, pacovsko i mišje antigensko prepoznavanje (odn., korišćenje ćelija i konstrukta iz Primera 6) pomoću metode koji su priznati u tehnici uključujući protočnu citometriju. Konstante afiniteta i kinetike koni koffodabranih modulatora su izmereni korišćenjem bio-slojne interferometrijske analize na ForteBio RED (ForteBio, Inc.) ili površinske plazmonske rezonance koristeći Biacore 2000 po instrukcijama proizvođDča.
Rezultati karakterizacije su prikazani u tabelarnom obliku na FIG.12 gde se može videti da odabrani modulatori uglavnom pokazuju relativno visoke afinitete u nanomolarnom opsegu i, u mnogim slučajevima, bili su unakrsno reaktivni. FIG.12 dalje navodi empirijski određeni modulator bina kao i DLL3 domen vezan sa predmetnim modulatorom, kao što je određeno korišćenjem ekspresije posredovanog fragmenta antigena posredstvom kvasca, kao što je detaljnije opisano u Primeru 10 odmah u nastavku. Pored toga, FIG.12 dalje uključuje sposobnost modulatora da posreduje citotoksično indukovanje ubijane ćelije NTX linije tumora bubrega (% živih ćelija) određenih kao što je prikazano u Primeru 12 u nastavku. Uzet zajedno, ovi podaci pokazuju različita veziva svojstva otkrivenih modulatora, kao i njihov potencijal za upotrebu u farmaceutskom okruženju.
Što se tiče binovanog antitela, ForteBio RED je korišćen po uputstvima proizvođDča da bi se identifikovala suprotna antitela koja se vezuju za iste ili različite binove. Ukratko, referentno antitelo (Ab1) je uhvaćeno na anti-mišjem čipu za hvatanje, a potom je korišćena visoka koncentracija nevezujućeg antitela za blokiranje čipa i prikupljena je bazna linija.
Monomerni, rekombinantni humani DLL3-Flag (Adipogen International) je zatim zarobljen sa specifičnim antitelom (Ab1) i vrh je potopljen u bunarčLć sa istim antitelom (Ab1) kao kontrolom ili u bunar sa različitim test antitelom (Ab2). Ako je uočeno dodatno vezivanje sa novim antitelom, onda su Ab1 i Ab2 određeni da budu u različitom binu. Ako nije došlo do daljeg vezivanja, kako je određeno upoređivanjem nivoa vezivanja sa kontrolom Ab1, onda je Ab2 određen da bude u istom binu. Kao što je poznato u tehnici, ovaj postupak se može proširiti da prikaže velike biblioteke jedinstvenih antitela koristeći pun niz antitela koji predstavlja jedinstvene binove na ploči sa 96 bunarčLća. U predmetnom slučaju ovaj proces binovanje je pokazao skenirana antitela vezana za najmanje devet različitih binova (naznačenih kao Bins A iako 1 na FIG.12) na DLL3 proteinu. Na osnovu očigledne veličine DLL3 antigena (gde BCD je približno 56kD) i rezolucije korišćene metodologije binovanja, veruje se da devet identifikovanih binova predstavljaju većinu binova prisutnih na DLL3 ekstracelularnom antigenu.
Pored procene primernih modulatora kao što je gore navedeno, izvršena je protočna citometrija kako bi se potvrdilo da odabrani modulatori antitela SC16 mogu imunospecifično da se vezuju sa humanim DLL3 i da odrede da li isti modulatori unakrsno reaguju sa cinomolgusom, pacovskim i/ili mišjim DLL3. Prvenstveno, primerni mišiji modulari su analizirani sa protočnom citometrijom koristeći FACSCanto II i 293 ćelije koja prekomerno ekspresuju mišji, pacovski, cinomolgusni ili humani DLL3 (odn. h293-hDLL3, h293-cDLL3, h293-rDLL3 i h293-mDLL3 koji ekspresuju GFP) suštinski kao što je opisano u Primeru 6 gore. U nekim slučajevima, primerni modulatori miševa su analizirani protočnom citometrijom pomoću FACSCanto II i ćelija kvasca koji prikazuju cinomologus DLL3 koristeći metode opisane u Cochran etal. (J Immunol Methods.287 (1-2):147-158 (2004).
Na osnovu protočne citometrije utvrđeno je da se svi izabrani modulatori antitela vezuju za ljudski DLL3 prekomerno ekspresovani na 293 ćelije (podaci nisu prikazani), dok je pronađeno nekoliko ispitanih antitela sa unakrsnim reagovanjem sa cinomolgusom i/ili mišjim DLL3 (sva antitela koja reaguju sa mišem reagovala su i sa pacovom). U tom pogledu, kao i na FIG.12, otkriveno je da osam od trinaest modulatora koji imunospecifično reaguju sa humanim DLL3 takođe reaguju sa mišijim (ili pacovskim) DLL3. Konkretno, mAbs SC16.4, SC16.8, SC16.15, SC16.34, SC16.39, SC16.46, SC16.51 i SC16.56 su u većoj ili manjoj meri proučavali unakrsnu reakciju sa mišjim DLL3, dok mAbs SC16.7, SC16.10, SC16.13, SC16.25 i SC16.65 nisu znatno povezani sa mišjim DLL3. Takvi rezultati nisu neočekivani s obzirom na to da je mišji DLL3 približno 83% homologan sa izooblikom 2 humanog DLL3 (vidi FIG.2B). Biva priznato da ova unakrsna reaktivnost može biti korisno iskorišćena u kontekstu ovog pronalaska kroz upotrebu životinjskih modela u otkrivanju i razvoju lekova.
Osim gore pomenutih analiza, humanizovani konstrukti hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 i hSC16.56 iz Primera 8 analizirani su da bi se utvrdilo da li je postupak CDR graftovanja značajno promenio njihove karakteristike vezivanja. U tom pogledu humanizovani konstrukti (CDR graftovani) su upoređeni sa "tradicionalnim" himernim antitelima koja obuhvataju varijabilne domene teškog i lakog lanca mišjeg roditelja (ili donora) i humani konstantni region značajno ekvivalentan onom koji se koristi u humanizovanim konstruktima. Sa ovim konstrukcijama površinska plazmonska rezonanca (SPR) je sprovedena koristeći Biacore 2000 (GE Healthcare) kako bi se identifikovale bilo koje suptilne promene u konstantama brzine koja je izazvana proces humanizacije.
Primeri rezultata za jedan od testiranih modulatora (SC16.15) i tabelarni rezime rezultata za svaki od humanizovanih i himernih konstrukcija prikazani su na FIG.13A - 13C. Na osnovu serije koncentracija od 25 i 12.5 nM humanog DLL3 antigena (generisanje krivih od vrha do dna na slikama 13A i 13B za SC16.15) i korišćenjem 1:1 Langmuir vezujućeg modela, KDSC16.15 vezivanja antitela za humani DLL3 antigen je procenjen na 0.2 nM. Slični eksperimenti su potom vođeni sa drugim humanizovanim konstruktima i himernim konstruktima (podaci nisu prikazani) kako bi se obezbedile vrednosti afiniteta prikazane na FIG.13C. Takvi rezultati ukazuju na to da proces humanizacije nije bitno uticao na afinitet modulatora.
Primer 10
Domensko i Epitopno Mapiranje DLL3 Modulatora
Da bi se okarakterisali i postavili epitopi kojima se otkriveni DLL3 modulatori antitela povezuju ili vezuju, mapiranje epitopa na nivou domena izvršeno je korišćenjem modifikacije protokola opisanog od strane Cochran et al., 2004 (supra). Ukratko, pojedinačni domeni DLL3 koji sadrže specifične amino kiselinske sekvence su ekspresovane na površini kvasca, a vezivanje svakog DLL3 antitela je određeno protočnom citometrijom.
Prvenstveno, kvasci koji prikazuju plazmidne konstruktore su kreirani za ekspresiju sledećih konstruktora: DLL3 ekstraćelijski domen (amino kiseline 27-466); DLL1-DLL3 himera, koja se sastoji od N-terminalnog regiona i DSL domena DLL1 (amino kiseline 22-225) spojene za EGF-slične domene 1 kroz 6 DLL3 (amino kiseline 220-466); DLL3-DLL1 himera, koja se sastoji od N-terminalnog regiona i DSL domena DLL3 (amino kiseline 27-214) spojenog za EGF-slične domene 1 kroz 8 DLL1 (amino kiseline 222-518); EGF-slični domen #1 (amino kiseline 215-249); EGF-slični domen #2 (amino kiseline 274-310); EGF-slični domens #1 i #2 (amino kiseline 215-310); EGF-slični domen #3 (amino kiseline 312-351); EGF-slični domen #4 (amino kiseline 353-389); EGF-slični domen #5 (amino kiseline 391-427); i EGF-slični domen #6 (amino kiseline 429-465). (Za informaciju o domenu videti uopšteno UniProtKB/Swiss-Prot bazu podataka ulaza Q9NYJ7. Zabeležiti da brojanje amino kiselina je po referenci neobrađenog DLL3 proteina sa vodećom sekvencom kao što je prikazano u SEQ ID NO.3.) Za anlizu N-terminalnog regiona ili EGF domena kao celog, himeri sa brojem familije DLL1 (DLL1-DLL3 i DLL3-DLL1) su korišćeni kao suprotno od fragmenata kako bi se minimizirali potencijalni problemi sa presavijanjem proteina. Domen-mapirana antitela koja su prethodno prikazana da ne reaguju unakrsno sa DLL1 ukazuje da bilo koje vezivanje za ove konstruktore se dešava kroz vezivanje sa DLL3 delom konstruktora. Ovi plazmidi su tranformisani u kvasce, koji su potom rasli i indukovani kao što je opisano u Cochran et al.
Da bi se testiralo vezivanje za određeni konstrukt, 200.000 indukovanih ćelija kvasca koje su izrazile željeni konstrukt su isprane dva puta u PBS 1 mg/mL BSA (PBSA) i inkubirane u 50 µL PBSA sa biotinilovanim anti-HA klonom 3F10 (Roche Diagnostics) na 0,1 µg/mL i ili 50nM prečišćenim antitelom ili 1: 2 razblaženim supernatantom iz hibrida koji se kultiviše 7 dana. ûelije su inkubirane 90 minuta na ledu, nakon čega sledi 2 ispiranje u PBSA. ûelije su zatim inkubirane u 50 µL PBSA sa odgovarajućim sekundarnim antitelima: za mišja antitela, Alexa 488 konjugovani streptavidin i Alexa 647 konjugovani kozji anti mišji (obe Life Technologies) su dodati na 1 µg/mL svaki, a za humanizovana ili himerna antitela, Alexa 647 konjugovani streptavidin (Life Technologies) i R-ficoerithrin konjugovani kozji anti humani (Jackson Immunoresearch) su dodati na 1 µg/mL svaki. Nakon dvadeset minutne inkubacije na ledu, ćelije su isprane dva puta sa PBSA i analizirane na FACS Canto II.
Antitela koja su vezana za DLL3-DLL1 himeru su označena kao vezivanje za N-terminalni region DSL. Antitela koje se specifično vezuju za epitop prisutan na određenom EGF-sličnom domenu su označena kao vezujuća za njegov odgovarajući domen (FIG.14A).
Radi klasifikacije epitopa kao konformacijskog (npr., diskontinuiranog) ili linearnog, kvasac koji prikazuje DLL3 ekstracelularni domen je tretiran toplotom tokom 30 minuta na 80°C, a potom je ispran dva puta u ledeno-hladnom PBSA. Kvasac koji prikazuje denaturisani antigen (denaturisani kvasac) je potom podvrgnut istom protokolu za bojenje i protočnoj citometrijskoj analizi kao što je gore opisano. Antitela koja su vezana za denaturisani i prirodni kvasac su klasifikovana kao vezivanje za linearni epitop, dok antitela koja vezuju prirodni kvasac, ali ne i denaturisani kvasac, su klasifikovana kao konformacijska specifična.
Šematski prikaz podataka o mapiranju epitopa na nivou domena testiranih antitela je prikazan na FIG.14A, sa antitelima koji vezuju linearni epitop podvučen i, gde je određeno, odgovarajući bin zabeležen u zagradama. Pregled FIG.14A pokazuje da većina modulatora ima tendenciju da mapira na epitopima koje se nalaze u N-terminalnom/DSL regionu DLL3 ili na drugi EGF-slični domen. Kao što je prethodno aludirano, FIG.12 predstavlja slične podatke u vezi sa određivanjem bina i mapiranjem domena za određeni broj odabranih modulatora u tabelarnom obliku.
Da bi se dokumentovala sposobnost otkrivenih modulatora da efikasno eliminišu tumorigenske ćelije uprkos vezivanju za različite regione DLL3, podaci o ubijanju su u korelaciji sa vezivanjem domena. Preciznije, FIG.14B prikazuje modulator posredovan in vitro ubijanjem KDY66 PDX linije (izveden kao što je prikazano u Primeru 12 dole) plotiranom protiv domena vezivanja izabranog modulatora. Ovi podaci pokazuju da je ubijanje modulatora specifičnog domena donekle varijabilno kao što je izmereno pomoću ove in vitro analize ubijanja. Međutim, za modulatore koji su efikasni, pojavljuje se zanimljiv trend u kome se povećava maksimalno ubijanje u svakom domenu dok se epitop pomera prema N-terminusu u primarnoj sekvenci. Konkretno, maksimalna efikasnost ubijanja se poboljšava od EGF6 do EGF2, i zaravan preko N-terminalnog domena, EGF1 i EGF2. Pored toga, iz antitela testiranih u ovoj analizi, najveći procenat efikasnih antitela se vezuje na N-terminalnom domenu. Ovo ukazuje na to da modulatori koji se povezuju ili vezuju sa DSL domenom ili N-terminalnim regionom DLL3 mogu biti posebno efikasni kao lekovi ili kao ciljevi za citotoksične agense.
Fino mapiranje epitopa je dalje izvedeno na odabranim antitelima koristeći jednu od dve metode. Prva metoda je koristila Ph.D.-12 komplet za biblioteku peptidnih fag-prikaza (New England Biolabs E8110S) koja je korišćena u skladu sa uputstvima proizvođDča. Ukratko, antitelo za mapiranje epitopa je prekriveno preko noći na 50 µg/mL u 3 mL 0.1 M rastvora natrijum bikarbonata, pH 8, na Nunc MaxiSorp cevi (Nunc). Cev je blokirana sa 3% BSA rastvorom u bikarbonatnom rastvoru. Zatim je dozvoljeno da se veže 10<11>ulazni fag u PBS 0.1% tween-20, praćeno sa deset uzastopnih ispiranja na 0.1% Tween-20 da ispere nevezujući fag. Preostale fage se eluirane sa 1 mL 0.2 M glicinom tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi uz nežno mešanje, praćeno sa neutralizacijom sa 150 µL 1M Tris-HCl pH 9. Eluirani fag se primenjuje i panira ponovo sa 10<11>ulaznim fagom, koristeći 0.5% Tween-20 tokom koraka ispiranja kako bi se povećala jačina izbora. DNK iz 24 plakova eluiranog faga iz drugog kruga je izolovan korišćenjem Qiaprep M13 Spin kit (Qiagen) i sekvencioniran. Vezivanje klonalnog faga je potvrđeno korišćenjem ELISA analize, gde je mapirano antitelo ili kontrolno antitelo obloženo na ELISA ploči, blokirano i izloženo svakom fagnom klonu. Vezivanje fage je otkriveno pomoću peroksidaze rena konjugovanog anti-M13 antitela (GE Healthcare) i 1-Step Turbo TMB ELISA rešenja (Pierce). Peptidne sekvence fage iz specifično vezujuće fage su poravnate pomoću Vektor NTI (Life Technologies) protiv antigenske ECD peptidne sekvence za određivanje epitopa vezivanja.
Alternativno, metod prikazivanja kvasca (Chao et al., Nat Protoc.1(2): 755-768, 2007) je korišćen za epitopsku mapu odabranih antitela. Ukratko, biblioteka DLL3 ECD mutanata je generisana sa greškom sklopa PCR koristeći nukleotidne analoge 8-okso-2’deoksiguanozin-5’-trifosfat i 2’-deoksi-p-nukleozid-5’trifosfat (oba iz TriLink Bio) za ciljanu mutageneznu stopu jedne amino kiselinske mutacije po klonu. Ovi su transformisani u format prikaza kvasca. Korišćenjem tehnike koja je prethodno opisana za mapiranje nivoa domena, biblioteka je obojana za HA i vezivanje antitela na 50nM. Koristeći FACS Aria (BD), sortirani su klonovi koji su pokazali gubitak vezivanja u poređenju sa divljim tipom DLL3 ECD. Ovi klonovi su ponovo uzgajani i podvrgnuti su drugom krugu FACS sortiranja za gubitak vezivanja za ciljano antitelo. Pomoću Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep opreme (Zymo Research), pojedinačni BCD klonovi su izolovani i sekvencionirani. Gde je neophodno, mutacije su reformatizovane kao pojedinačni mutant ECD klonovi koristeći mesto brze promene usmerene mutageneznom opremom (Agilent).
Pojedinačni ECD klonovi su sledeći provereni da bi se utvrdilo da li je gubitak vezivanja posledica mutacije u epitopu, ili mutacije koja je izazvala nepravilnost. Mutacije koje su uključivale cistein, prolin i stop kodone su automatski odbačene zbog velike verovatnoće mutacije koja se dešava. Preostali ECD klonovi su zatim provereni za vezivanje za nekonkurentno, konformacijsko specifično antitelo. ECD klonovi koji su izgubili vezivanje za nekonkurentna, konformacijski specifična antitela su zaključeni da sadrže pogrešne mutacije, dok su ECD klonovi koji su zadržali ekvivalentno vezivanje kao divlji tip DLL3 ECD zaključeni da su pravilno sklopljeni. Mutacije u ECD klonovima u kasnijoj grupi su zaključene da budu u epitopu. Rezultati su navedeni u TABELI 3 odmah ispod.
TABELA 3
Preciznije, rezime odabranih antitela sa njihovim izvedenim epitopama koji sadrže amino kiselinske ostatke koji su uključeni u vezivanje antitela naveden je u TABELI 3. U tom pogledu antitela SC16.34 i SC16.56 očigledno međusobno reaguju sa zajedničkim amino kiselinskim ostacima koji je u skladu sa informacijama u vezi binovanja i rezultata mapiranja domena prikazani na FIG.14A. Štaviše, pronađeno je da SC16.23 međusobno reaguje sa posebnim susednim epitopom i pronađeno je da se ne binuje sa SC16.34 od SC16.56. Imati na umu da će za potrebe prateće sekvencne liste SEQ ID NO: 10 obuhvatiti držač amino kiseline na poziciji 204.
Primer 11
Osnovna Detekcija DLL3 Citometrijskog Protoka na Površini ûelija i Imunohistohemijsko Bojenje DLL3 u Tumorima
Da bi se potvrdila imunospecijalna priroda otkrivenih modulatora, primerni modulatori antitela SC16 su testirani pomoću protočne citometrije da bi se utvrdila njihova sposobnost selektivnog prepoznavanja 293 ćelijskih linija koje izražavaju DLL3 protein na svojoj površini. U tom smislu ćelije ekspresije DLL3 proizvedene su u suštini u Primeru 6, izložene odabranim modulatorima i ispitivane protočnom citometrijom kako je ovde opisano. Obojeni izotopi i fluorescentna minus jedna (FMO) kontrola su korišćeni da bi se potvrdila specifičnost bojenja. Kao što je pokazano reprezentativnim podacima prikazani na FIG.15 za SC16.56 modulator, neke od SC16 antitela (npr. SC16.56) daju jako bojenje 293-hDLL3 ćelija (FIG.15B) i 293-mDLL3 ćelije (FIG.15C), ali ne i od ne-DLL3 izražavajući roditeljske 293 ćelije (FIG.15A). Ovi podaci pokazuju, putem protočne citometrije, da otkriveni modulatori imunospecifično prepoznaju humani DLL3, kao na primer SC16.56, takođe i mišji DLL3.
Kako bi se potvrdila otkrića i demonstrirala da se DLL3 ekspresija može detektovati na humanim ćelijama tumora, DLL3 proteinska ekspresija na površini odabranih NTX tumora je procenjena sa protočnom citometrijom koristeći nekoliko primernih SC16 antitela. U tom pogledu podaci za jedno od ovih antitela, SC16.56, i tri određena tumora, OV26, KDY66, i LU37, su prikazani na FIG.16. Preciznije, NTX tumori su sakupljeni, disocirani i ponovo obojeni sa komercijalno dostupnim anti-mišjim CD45, anti-mišjim H-2Kd, anti-humanim EpCAM i gore opisanim DLL3 anti-humanim/mišjim (SC16.56 ) antitelima. Slično eksperimentima 293 bojenja koji su prethodno opisani, korišćene su izotop obojene i fluorescentne minus jedan (FMO) kontrole za potvrđivanje nedostatka nespecifičnog bojenja. Kao što se vidi na FIG.16, anti-DLL3 bojenje je bilo veće u delu humanih NTX tumorskih ćelija, kao što je prikazano sa fluorescentnim profilom pomeren u desno, i promenama srednjih vrednosti fluorescentnog intenziteta (MFI), za tumorske ćelijske linije janika OV26 NTX (FIG.16A), bubrega KDY66 NTX (FIG.16B) i pluća LU37 NTX (FIG.16C). SCLC NTX tumori su takođe obojeni na identičan način i na sličan način pokazali pozitivnu ekspresiju DLL3 (podaci nisu prikazani). Ovi podaci ukazuju na to da se DLL3 protein iskazuje na površini raznih NTX tumora i stoga se može podesiti modulaciji pomoću modulatora tipa DLL3 antitela.
Da bi se dalje potkrepilo prisustvo DLL3 proteina i lokalizovalo ga u tumorskoj arhitekturi, imunohistohemija (IHC) je obavljena na NTX tumor izvedenim tumorima ljudskih pacijenata, normalnim ljudskim tkivima i primarnim SCLC tumorima. Preciznije, IHC je izveden na formalin fiksiranim parafinskim ugrađenim (FFPE) tkivnim sekcijama, koristeći indirektni metod detekcije, uključujući osnovno mnoklonalno antitelo miša protiv DLL3 (SC16.65), mišja specifična biotin konjugovana sekundarna antitela, kompleks avidina/biotina spojen sa peroksidazom rena, amplifikaciju signala tiramida i DAB detekciju (Nakene PK 1968; 16: 557-60). Kada se boji tumor ljudskog pacijenta izvedenog iz NTX tumora, mišji IgG blokirajući korak je korišćen za smanjivanje pozadine zbog nespecifičnog vezivanja.
SC16.65 je prvo validiran i potvrđen da je prikladan za IHC pokazivanjem specifičnog bojenja u 293 ćelijama koje preterano iskazuju DLL3, ali ne i DLL3 koji ne izražavaju roditeljske 293 ćelije, i da je bojenje smanjeno u ćelijama koje su tretirane sa DLL3 ciljanim ukosnicama dizajniranim i validiranim da obore ekspresiju DLL3 RNK i proteina (videti Primer 14 u daljem tekstu, podaci nisu prikazani). IHC na panelu ksenograft NTX tumora pokazuje da je DLL3 lokalizovan kako na membrani, tako i u citoplazmi mnogih SCLC NTX i NET tumora koji su prethodno testirani pozitivno za DLL3 mRNK (FIG.16D). Intenzitet bojenja je postignut bez bojenja (-) do visokog izraza (+++) sa procentom pozitivnih ćelija koje su takođe zabeležene. Bojenje normalnih ljudskih tkiva nije pokazalo detektabilnu ekspresiju DLL3 (FIG.16E). Značajno, bojenje primarnih uzoraka SCLC tumora potvrđuje da su tumori 36/43 bili pozitivni za DLL3 (FIG.16F). Hromagranin A (CHGA) bojenje je takođe izvedeno da bi se potvrdilo da su tumori zaista bili SCLC tumori. Većina tumora kojima nedostaje DLL3 takođe nedostaje oštećenje CHGA, ukazujući na to da ti delovi možda ne sadrže tumorsko tkivo ili da je tkivo ugroženo tokom obrade. Dva tumora koja su bila pozitivna za DLL3, ali su bila negativna za CHGA, bili su kasniji stadijum (IIIa) SCLC tumora. Ovi podaci sugerišu da DLL3 pruža efektivan terapijski cilj jer nije uopšteno izražen u normalnim ljudskim tkivima, ali je prisutan u većini SCLC tumora.
Primer 12
DLL3 Modulatorska Olakšana Isporuka Citotoksičnih Agenasa
Da bi se utvrdilo da li modulatori DLL3 antitela u predmetnom pronalasku mogu da posreduju isporukom citotoksičnog agensa živim ćelijama, in vitro testiranje ubijanja ćelija je izvedeno pomoću nasumice odabranih modulatora DLL3 antitela.
Naročito, 2,500 ćelija/bunarčLć humanog KDY66, NET NTX koji iskazuje endogenozni DLL3, su razdvojeni na pojedinačnu ćelijsku suspenziju i postavljene na BD Primaria™ ploče (BD Biosciences) u rastućem faktoru suplementovanog serumskog slobodnog medijuma kao što je poznato u tehnici, jedan dan pre dodavanja antitela i toksina. Razne koncentracije prečišćenih DLL3 modulatora, kao što su one opisane u Primerima 6 i 7, i fiksirane koncentracije od 4 nM anti-Mišijeg IgG Fab fragmenta kovalentno povezan za saporinski toksin (Napredni Ciljani Sistemi, #IT-48) su dodate kulturama u toku nekoliko dana. Za ubijanje na 293-hDLL3, 500 ćelija/bunarčLću je postavljeno u pojedinačnu ćelijsku suspenziju i postavljeno na BD tkivnim kulturnim pločama u DMEM sa 10% FBS na dan pre dodavanja antitela i toksina. Dve koncentracije raznih DLL3 modulatora i fiksiranih koncentracija 2 nM anti-Mišija IgG Fab fragmenta kovalentno vezana za sporin su dodata kulturama u toku tri dana. Sposobnost saporinskih kompleksa da internalizuje i ubije ćelije je određeno numeracijom broja preživelih ćelija koristeći Cell Titer Glo® (Promega) prema proizvođDčevim instrukcijama. Sirova vrednost luminscencije korišćenjem kultura koje sadrže ćelije sa saporinskim Fab fragmentom su postavljene kao 100% referentne vrednosti, a sva druga brojanja su izračunata u skladu s tim (odnose se kao "Normalizovana RLU").
Korišćenjem analize pokazano je da podset DLL3 antitela testiranog na 500 i 50 pM ubijenih KDY66 ćelija, kao i podset testiranih antitela na 250 i 25pM na 293-hDLL3 previše ekspresovanim ćelijama (FIG.17A). Kontrolni izotopi ne utiču na brojanje ćelija kao što je prikazano sa IgG2a, IgG2b, i MOPC trakama na levoj strani grafikona (FIG.17A).
Podset DLL3 modulatora koji pokazuju efikasno ubijanje u prvoj analizi opisanoj gore je testiran u razblaženju kako bi se odredile EC50 vrednosti za aktivnost. Dva takva koja predstavljaju antitela, SC16.34 i SC16.15, su prikazana na FIG.17B, gde je određeno da SC16.15 pokazuje efikasno ubijanje OV26, tumora jajnika NET NTX, sa podpikomolarnim EC50 (npr., 0.14 pM) u odnosu na profil ubijanja prikazan sa SC16.34 (npr., 5.7 pM). Pošto saporin ubija ćelije samo nakon unošenja u citoplazmu gde inaktivira ribozome, ova analiza takođe pokazuje da se unutrašnjost može javiti nakon vezivanja DLL3 određenog antitela na površinu ćelije, bez potrebe za dodatnim unakrsnim povezivanjem ili dimerizacijom.
Na kraju, LU37 je tretiran sa humanizovanim SC16.15 konjugovanim sa ADC1 ili sa humanizovanim IgG1 kontrolnim ADC1 (konjugovano prema Primeru 13 odmah ispod). Konkretno, 2.500 LU37 NTX ćelije su postavljene u svaki bunarčLć na BD PrimariaTM pločama (BD Biosciences) u suplementovanom serumu faktora rasta kako je poznato u tehnici jedan dan pre dodavanja konjugovanih antitela. Različite koncentracije huIgG1-ADC1 ili hSC16.15-ADC su dodane kulturama sedam dana, a sposobnost citotoksičnih agenasa da se ubiju je određena numerisanjem ćelijskih brojeva (kao što je već opisano). Koristeći ovaj test dokazano je da hSC16.15-ADC1 efikasno ubija LU37. Za razliku od > 1,000 ng/ml kontrolnog ADC potrebno je ubiti 50% LU37, < 10 ng/ml hSC16.15-ADC1 ubijeno 50% of LU37 (FIG.17C).
Primer 13
Dobijanje DLL3 Konjugata Antitelo-Lek
Na osnovu gore navedenih rezultata sa saporinom i dalje pokazanom svestranosti predmetnog pronalaska, konjugati anti-DLL3 antitela lek (DLL3-ADC) su pripremljeni korišćenjem kovalentno vezanih citotoksičnih agenasa. Preciznije, DLL3-ADC su pripremljeni koji sadrže linker kao što je ovde opisano, ili u referencama odmah ispod, i izabranim dimerima pirolobenzodiazepina (PBD) koji su kovalentno vezani za otkrivene modulatore (videti npr., U.S.P.Br.2011/0256157 i 2012/0078028 i U.S.P.N 6,214,345).
Kombinacije PBD lek-linkera su sintetizovane i prečišćene korišćenjem tehnike priznatih u tehnici s obzirom na citirane reference. Dok su različiti PBD dimeri i linkeri korišćeni za izradu izabranih kombinacija lek-linkera, svaka linker jedinica sadrži terminalne maleimido grupe sa slobodnim sulfhidrilom. Koristeći ove linkere, konjugacije su pripremljene preko delimične redukcije mAb sa tris (2-karboksietil)-fosfinom (TCEP) praćeno reakcijom redukovanih Cis ostataka sa korisnom masom maleimido-linkera.
Preciznije, odabrani modulator DLL3 antitela je redukovan sa 1.3 mol TCEP po mol mAb 2 hr na 37°C u 25 mM Tris HCl pH 7.5 i 5 mM EDTA puferu. Reakcija je ostavljena da se ohladi do 15°C i dodat je korisni linker u DMSO pri odnosu od 2.7 mol/mol mAb praćeno sa dodatnom količinom DMSO do finalne koncentracije od 6% (v/v). Reakcija je omogućena da se nastavi 1 sat. Ne izreagovani lek-linker je ograničen dodavanjem viška N-acetil cisteina. DLL3-ADC (ili SC16-ADC) je potom prečišćen sa kolonskom jonskom razmenom koristeći AKTA Explorer FPLC sistem (G.E. Healthcare) kako bi se uklonilo istaloženo antitelo velike molekulske mase, korastvarač i mali molekuli. Eluirani ADC je potom puferno razmenjen sa tangencijalnom protočnom filtracijom (TFF) u formulacioni pufer, nakon čega sledi podešavanje koncentracije i dodavanje deterdženta. Konačni ADC je analiziran za koncentraciju proteina (merenjem UV), taloženje (SEC), odnos leka prema antitelu (DAR) pomoću HPLC sa reverznom fazom (RP), prisustvo nekonjugovanog antitela hidrofobnom interakcijskom hromatografijom (HIC), ne-proteinaznim materijala pomoću RP HPLC i in vitro citotoksičnosti korišćenjem DLL3 ekspresivne ćelijske linije.
Korišćenjem gore pomenutog postupka, ili suštinski slične metodologije, broj ADCs (odn., M-[L-D]n) koji sadrži razne DLL3 modulatore i PBD dimere je generisan i testiran u raznim in vivo i in vitro modelima. Za svrhe ovih Primera i predmetnog pronalaska, takvi ADCs mogu uopšteno biti nazvani DLL3-ADCs ili SC16-ADCs. Diskretni ADC će biti nazvani prema antitelima (npr., SC16.13) a određeni linker citotoksični agens označen ADC1, ADC2, itd. Prema tome, primerni modulatori kompatibilni sa predmetnim pronalaskom koji mogu sadržati SC16.13-ADC1 ili SC16.67-ADC2 gde ADC1 i ADC2 predstavljaju individualne PBD dimer citotoksične agense (i opciono linker).
Primer 14
Specifičnost Anti-DLL3 Konjugata Antitelo-Lek Posredovane Toksičnosti
Da bi se pokazalo da je toksičnost iz anti-DLL3 konjugata antitela-lek specifična za ćelije koje iskazuju endogeni DLL3, eksperimenti su izvedeni kako bi se pokazalo da tumorske ćelije za koje je poznato da imaju endogenu ekspresiju DLL3 više nisu ubijeni sa SC16-ADC in vitro kada je DLL3 izraz potisnut obarajućom ekspresijom DLL3 mRNK i proteina koristeći kratku ukosnicu RNK (shRNA).
KDY66 ksenograft izveden iz pacijenta iz papilarnih karcinom bubrežnih ćelija koji pokazuju neuroendokrine karakteristike i ekspresije DLL3 mRNK i proteina (npr., videti FIG.7 i FIG.
16B). Ekspresija DLL3 je redukovana kod KDY66 ćelija transdukcijom sa GIPZ Lentiviral Human DLL3-ciljanim shRNK (Thermo Fisher Scientific Inc.) koji sadrži anti-DLL3 shRNK. Preciznije, lentiviralni vektor je generisan kroz transfekciju 293T ćelija sa bicistronskim tentiviralnim plazmidom koji iskazuje anti-DLL3 shRNK (DLL3HP2) ili kontroliše ne-utišanu shRNK (DLL3NSHP) u prisustvu virusnih pakovanih plazmida. Rezultirajuće lentiviralne čestice koje su sadržane u supernatantu su koncentrisane i sakupljene ultracentrifugacijom. Ove čestice su zatim korišćene za transdukciju KDY66 ćelijskih kultura i uvode shRNK (tj., DLL3HP2 ili NSHP) gde se anti-DLL3 shRNA vezuje endogenom DLL3 mRNK i cilja na uništenje i time sprečava translaciju u DLL3 protein. Oba vektorska konstrukta sadržana u ekspresionom modulu Nezavisnog GFP za verifikaciju uspešne transdukcije i selekciju transdukovanih ćelija.
Nakon transdukcije, ekspresija DLL3 je procenjena protočnom citometrijom. Ukratko, uzorak disociranja, suspenzija pojedinačne ćelije DLL3HP2-transdukovanih ćelija je označena sa DLL3 modulatorom (SC16.34) konjugovan sa Alexa Fluor 647 (Life Technologies) i analiziran na FACS Canto II protočnom citometru pod standardnim uslovima. Da bi se demonstrirala redukcija ekspresije DLL3 proteina na površini transdukovanih ćelija DLL3HP2, intenzitet fluorescencije je upoređivan sa slično pripremljenim uzorkom KDY66 DLL3NSHP ćelija obojenih sa ne-reaktivnim kontrolnim antitelima (647-IgG1) i KDY66 DLL3NSHP ćelijama obojenim sa 647-DLL3. Otkrivene su DLL3NSHP.KDY66 ćelije koje pokazuju ekspresiju DLL3 proteina koja je u suštini ekvivalentna nativnim KDY66 ćelijama (podaci nisu prikazani). Kao što se vidi na FIG.18A, površinska ekspresija DLL3 proteina je smanjena u ćelijama transdukovanim sa DLL3HP2 u poređenju sa nativnim ćelijama obojenim sa istim antitelom označenim sa AlexaFluor-647.
Da bi se ispitale posledice DLL3 ekspresije na rast tumora transdukovane ćelije DLL3HP2 (DLL3-) i nativne KDY66 ćelije (DLL3<+>) su transplantirane u imunodeficijentne miševe. Iz uzorka pripremljenog kao što je prethodno opisano, žive humane GFP<+>ćelije su sortirane da bi sakupljale ćelije koje sadrže anti-DLL3 shRNK. Pet-miševa u grupi su ubrizgani (140 ćelija/miš) sa ili DLL3HP2 ili nativnim KDY66 ćelijama, a rast tumora je praćen nedeljno. Od svake grupe, dva od pet primaoca uvećani su tumori. Formacija tumora u dva DLL3HP2.KDY66 recipijenta je zaostala otprilike 22 dana iza nastanka tumora u dva nativna KDY66 recipijenta (FIG.18B). Ovo uočeno kašnjenje rasta ukazuje na to da ekspresija DLL3 može biti povezana sa povećanim ili ubrzanim formiranjem tumora, s obzirom da je obaranje DLL3 uticalo na rast tumora.
Kako su dostigli odgovarajuću zapreminu za randomizaciju (~ 160 mm3), DLL3HP2 KDY66 tumori i nativni KDY66 tumori su sakupljeni od miševa primaoca i dispergovani u suspenzije pojedinačnih ćelija. Nastavak redukcije ekspresije DLL3 (odn., da DLL3 ekspresija nije izazvana tokom in vivo rasta) u DLL3HP2 ćelijama je potvrđena na suspenzijama pojedinačnih tumorskih ćelija sa protočnom citometrijom kao što je opisano gore. U tom pogledu FIG.18C pokazuje da DLL3HP2 transdukovane ćelije koje rastu in vitro pokazuju redukovanu ekspresiju DLL3 proteina kada se poredi sa nativnim rastom ćelija pri sličnim uslovima.
Korišćenje standardnih biohemijskih tehnika nativnih KDY66 ćelija ili DLL3HP2 KDY66 ćelija je postavljeno u 96 bunarčLća na pločama i raslo u serumskom slobodnom medijumu. Serije razređivanja ili humanizovanih hSC16.56-ADC1 (SC16-ADC1) ili humanizovanih anti-hapten IgG-ADC1 (kao kontrolni) konjugata antitelo-lek proizvedeni kao što je postavljeno prethodno su dodate ćelijama trostruko. Nakon 7 dana izlaganja konjugat antitelo-lek, količina živih ćelija je izmerena sa luminiscencnom osnovnom detekcijom ATP u ćelijskim lizatima svakog bunarčLća (Cell Titer Glo, Promega) u suštini kao što je navedeno u Primeru 12.
Dok je 50% nativnih KDY66 ćelija ubijeno sa relativno niskom dozom od 13.27 pM SC16-ADC, ni jedna doza od SC16-ADC1 nije bila u mogućnosti da ubije čak 20% DLL3HP2.KDY66 ćelija (FIGS.18D i 18E). Za belešku, gubitak endogenozne DLL3 proteinske ekspresije u kompletnom gubitku in vitro ubijanja sa SC16-ADC1. Ovo pokazuje da hSC16-ADC1 je citotoksičnost specifično usmerena na DLL3-ekspresujuće ćelije sa malo, ako postoji, nespecifične toksičnosti.
Primer 15
Konjugovani DLL3 Modulatori koji Smanjuju Rast Tumora
Na osnovu gore pomenutih rezultata izvršena je radnja kako bi se pokazalo da konjugovani DLL3 modulatori predmetnog pronalaska smanjuju i potiskuju rast DLL3 koji iskazuje humane tumore in vivo. U vezi s tim, određeni broj odabranih modulatora mišjeg antitela je kovalentno povezano sa PBD citotoksičnim agensom, a rezultujući ADCs su testirani da bi pokazali svoju sposobnost da suzbiju humani rasta NTX tumora kod imunodeficijentnih miševa.
U tom cilju, NTX tumori izvedeni iz pacijenata su rasli subkutano u bokovima ženki NOD/SCID miševa primaoca koristeći tehnike poznate tehnici. Zapremine tumora i težine miša su praćene dva puta nedeljno. Kada su zapremine tumora dostigle 150-250 mm<3>, miševi su nasumično dodeljeni u terapijske grupe i injektirani sa naznačenim dozama SC16-ADC2 ili anti-hapten kontrolnim IgG1-ADC2 (svaki proizveden u suštini kao što je opisano u Primeru 13 gore korišćenjem PBD dimera ADC2) putem intraperitonealne injekcije.
Miševima su date tri jednake injekcije, raspoređene ravnomerno tokom sedam dana. Nakon lečenja, zapremine tumora i težine miša su nadgledani sve dok tumori ne prekorače 800 mm<3>ili miševi su postali bolesni. Za sve testove, lečeni miševi nisu pokazali štetne efekte na zdravlje osim onih koje se obično vide u imunodeficijentnim tumorskim NOD/SCID miševima.
FIG.19 pokazuje uticaj otkrivenih ADCs na rast tumora kod miševa sa različitim tumorima pluća koji pokazuju neuroendokrine osobine (dva karcinoma pluća malih ćelija i jedan karcinom pluća velikih ćelija sa neuroendokrinim osobinama). U tom pogledu lečenje LU37, neuroendokrinskog karcinoma pluća, sa tri primerna modulatora (SC16.13, SC16.46 i SC16.67) konjugovano za ADC2 dovelo je do potiskivanja rasta tumora u trajanju do 20 dana u slučaju SC16.13-ADC2 i SC16.67-ADC2 (Slika 19A); obratno, iako je SC16.46 umereno smanjen rast tumora, pokazao je manju aktivnost od ostalih testiranih modulatora. Slično tome, lečenje LU73, karcinom pluća malih ćelija, sa četiri primera modulatora (SC16.4, SC16.13, SC16.15 i SC16.46), proizvele su trajne remisije, u nekim slučajevima, posle 120 dana nakon lečenja (FIG.19B). Međutim, kao i kod antitela koja su testirana protiv LU37, antitela koja su testirana protiv LU73 variraju donekle tokom trajanja represije tumora. Konačno, lečenje LU86, još jedan karcinom pluća malih ćelija, sa dva konjugovana modulatora (SC16.46-ADC2 i SC16.67-ADC2), dovodi do smanjivanja tumora sa vremenom do progresije od 40 dana u jednom slučaju (SC16.67-ADC2; FIG.19C). Imati na umu da na FIG.19C se dve krivine suštinski preklapaju (mIgG1-ADC2 i SC16.46-ADC2) i teško je razlikovati.
Iznenađujuća sposobnost različitih konjugovanih modulatora da dramatično zaustave ili potisnu rast tumora in vivo u dužem vremenskom periodu dodatno potvrđuje upotrebu DLL3 kao terapeutske meta za lečenje proliferativnih poremećaja.
Primer 16
Humanizovani DLL3 ADC Modulatori koji Potiskuju Rast Tumora
S obzirom na impresivne rezultate obezbeđene sa DLL3-ADC2, izvedeni su dodatni eksperimenti kako bi se demonstrirala efikasnost primernih humanizovanih ADC modulatora u lečenju različitih tipova tumora (uključujući rak jajnika, pluća i bubrega) in vivo. Konkretno, izabrana humanizovana anti-DLL3 antitela (hSC16.13, hSC16.15, hSC16.34 i hSC16.56 proizvedeni kao što je prikazano u Primeru 8 gore) su konjugovana (preko jedinice za povezivanje) sa dva diskretna PBD citotoksična agensa (ADC1 i ADC2) kao što je prethodno opisano i, sa kontrolama, primenjivano na NTX tumoru implantiranim imunodeficijentnim miševima kao što je navedeno u prethodnom Primeru. U svakoj studiji, zapremina tumora i težine miša kontrolnih životinja su nadgledani sve dok tumori ne prelaze 800 mm<3>ili su miševi postali bolesni. Rezultati ovih eksperimenata su predstavljeni na FIGS.20A do 20F.
Pregled FIG.20A-20F pokazuju da je smanjenje zapremine tumora i izdržljiva remisija postignuta kod različitih tipova tumora, a neki pokazuju neuroendokrine osobine, prateći lečenje sa 1 mg/kg hSC16-ADC. Na primer, režimi lečenja, gde se primena objašnjava vertikalnim linijama na predmetnim slikama, proizvela su potpune i trajne eliminacije tumorske mase u karcinomu jajnika sa neuroendokrinskim osobinama (OV26, hSC16.15-ADC2, FIG.20A), papilarnog karcinoma bubrežnih ćelija sa neuroendokrinim karakteristikama (KDY66, hSC16.34-ADC1, FIG.20E) i tri karcinoma pluća malih ćelija (LU86, hSC16.13-ADC1, FIG.20B), (LU64, hSC16.13-ADC1, SL.20C; LU64, hSC16.13-ADC2 hSC16.13-ADC1, FIG.20D). U svim ovim slučajevima odsustvo vraćanja tumora je bilo opaženo više od 100 dana, a u nekim slučajevima i preko 225 dana nakon lečenja gde su miševi praćeni u dužem vremenskom periodu. Pored toga, lečenje sa otkrivenim modulatorima dovodi do smanjenja zapremine tumora i supresije rasta u ksenografu jasnih ćelija renalnih ćelija karcinoma koji pokazuju visoke nivoe DLL3 koristeći nižu dozu od 0.5 mg/kg (KDY27, hSC16.56-ADC1, FIG.20F).
Konačno, treba napomenuti da su određeni vraćeni tumori i dalje osetljivi na hSC16-ADC toksičnost. Osamdeset dana nakon inicijalnog lečenja sa SC16.13-ADC2, uočeno je vraćanje kod LU64 (FIG.20D). Lečenje vraćenog tumora sa hSC16.13-ADC1 rezultirao je eliminacijom posmatrane tumorske mase koja je istrajala više od 100 dana nakon drugog lečenja.
Ponovo ovi rezultati pokazuju iznenađujuću svestranost i primenljivost modulatora ovog pronalaska u lečenju različitih proliferativnih poremećaja.
Primer 17
Redukcija Frekvencije Matičnih ûelija Raka pomoću DLL3 Konjugata Antitelo-Lek
Kao što je prikazano u prethodnim Primerima otkriveni modulatori su izuzetno efikasni u suzbijanju rasta tumora, posebno u obliku ADC. Štaviše, kao što je prethodno pokazano, ekspresija DLL3 je povezana sa matičnim ćelijama karcinoma koje su opšte poznate i kao otporne na lekove i ponovno vraćanje tumora i metastaza. Shodno tome, da bi se pokazalo da lečenje sa DLL3-ADCs smanjuje potencijal vraćanja NTX linija, in vivo analize ograničenog razblaživanja (LDA) su izvedene kako bi se odredila učestalost tumorskih inicijativnih ćelija (TIC) kod tumora pluća malih ćelija koja prati lečenje sa hSC16.13-ADC1 (označen SC16-ADC na FIG 21).
Tumori ksenografta karcinoma pluća malih ćelija iz pacijenata (LU95 i LU64) su rasli subkutano kod imunodeficijentnih miševa domaćina. Kada je zapremina tumora u proseku iznosila 150 mm<3>- 250 mm<3>, miševi su nasumično odvojeni u dve grupe od sedam miševa. Preko intraperitonealne injekcije, miševi su injektirani u danima 0, 4 i 7 (FIG.21A i 21D, isprekidane vertikalne linije), ili sa humanim IgG1-ADC1 (1 mg/kg, n = 7 miševa) kao negativnom kontrolom ili hSC16.13-ADC1 (1 mg/kg; n = 7 miševa). Na dan 8, dva reprezentativna miša iz svake grupe bili su eutanizovani i njihovi tumori su sakupljeni i disperzovani u jedno-ćelijske suspenzije. Kao što je prikazano na FIG.21A i 21D dok su tumori tretirani sa hIgG1-ADC1 (IgG1-ADC) nastavili da rastu u pet preostalih miševa, zapremine tumora tretiranih sa hSC16.13-ADC1 (SC16-ADC) su smanjene na nulu ili skoro nula u pet preostalih miševi.
Koristeći standardne tehnike protočne citometrije i označeno anti-DLL3 antitelo, dva sakupljena tumora iz svake od dve lečene grupe su potvrdila da imaju sličnu pozitivnu DLL3 ekspresiju. ûelije tumora iz svake odgovarajuće terapijske grupe su zatim grupisane i žive humane ćelije su izolovane sa FACS korišćenjem FACSAria III (Becton Dickenson) u skladu sa uputstvima proizvođDča i tehnikom priznatom u tehnici. Ukratko, ćelije su označene FITC konjugovanim anti-mišjim H2Kd i anti-mišjim CD45 antitelima (oba BioLegend, Inc.), a zatim resuspendovane u 1 µg/ml DAPI. Dobijena suspenzija je zatim sortirana pod standardnim uslovima sa DAPI", mH2Kd" i mCD45" humanim ćelijama koje su sakupljene, a mišje ćelije su odbaćene.
Kohorti pet miševa primaoca su zatim transplantirani sa ili 2000, 500, 120 ili 30 sortiranih živih humanih ćelija iz tumora tretiranih sa hSC16.13-ADC1. Za poređenje, kohorti pet miševa primaoca su transplantovani sa ili 1000, 250, 60 ili 15 sortiranih živih humanih ćelija iz tumora tretiranih sa kontrolnim IgG1-ADC1. Tumori u miševima primaoca su mereni nedeljno, a pojedinačni miševi su eutanizovani pre nego što su tumori dosegli 1500 mm<3>. Nakon početka rasta tumora, studija je završena posle četiri uzastopne sedmice bez novog tumora koji se pojavljuje u bilo kojem dodatnom mišu. U to vreme, miševi primaoci su bili ocenjeni kao pozitivni ili negativni za rast tumora, uz pozitivan rast koji ima zapreminu od preko 100 mm<3>.
U svim dozama ubrizganih ćelija, primaoci LU95 ćelija tretiranih sa hSC16.13-ADC1 proizveli su samo jedan tumor, u poređenju sa dvanaest u primaocima LU95 ćelija tretiranih sa IgG1-ADC1 (FIG.21B). Slično tome, primaoci LU64 ćelija tretiranih sa SC16.13-ADC1 proizveli su tri tumora, u poređenju sa 13 tumora kod primaoca LU64 ćelija tretiranih sa IgG1-ADC1 (FIG.21E).
Korišćenjem Poisson-ove statistike distribucije (L-Calc softver, Stemcell Technologies), injektirane doze ćelija primalaca sa i bez tumora u 18 nedelja nakon transplantacije su korišćene za izračunavanje frekvencija ćelija koje iniciraju tumor u svakoj populaciji. Broj TIC na 10.000 živih humanih ćelija u LU95 je smanjen više od 100 puta, od 78.1 u tumorima tretiranim sa IgG1-ADC do 0.769 u tumorima tretiranim sa hSC16.13-ADC1 (FIG.21C, od 1:128 ćelija u kontroli tretirana sa 1:12,998 u tretiranom modulatoru). U LU64, broj TIC je smanjen 16,6 puta, od 47,4 TIC do 2,86 TIC na 10,000 živih ćelija u tumorima tretiranim sa IgG1-ADC1 ili hSC16,13-ADC1, respektivno (FIG.21F, od 1:211 ćelija u kontroli tretiran na 1: 3,500 ćelija u tretiranom modulatoru). Ovo značajno smanjenje TIC (npr. matične ćelije karcinoma) pokazuje da, pored smanjenja zapremine tumora, kao što je prethodno pokazano, modulator predmetnog pronalaska je značajno i specifično smanjuje populacije matičnih ćelija raka i, prema ekstenziji, recidivnost, metastazi i potencijalnom ponovnom rastu tumora. Ovo smanjenje potencijala ponovnog vraćanja i ponovnog rasta snažno potvrđuje značajan opstanak bez tumora koji je primećen u navedenim Primerima.
LISTA SEKVENCI
<110> STEM CENTRX, INC.
<120> NOVEL MODULATORS AND METHODS OF USE <130> 11200.0013-00304
<140>
<141>
<150> 61/719,803
<151> 2012-10-29
<150> 61/603,173
<151> 2012-02-24
<160> 413
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2387
<212> DNK
<213> Homo sapiens
<400> 1
<211> 618
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<211> 587
<212> PRT
<213> Homo sapiens <400> 4
<212> DNK <213> Mus sp.
<212> PRT <213> Mus sp. <400> 6
<211> 1794
<212> DNK
<213> Macaca fascicularis <400> 7
<211> 597
<212> PRT
<213> Macaca fascicularis <400> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2) .. (2)
<223> Bilo koja amino kiselina
<400> 10
<210> 11
<400> 11
000
<210> 12
<400> 12
000
<210> 13
<400> 13
000
<210> 14
<400> 14
000
<210> 15
<400> 15
000
<210> 16
<400> 16
000
<210> 17
<400> 17
000
<210> 18
<400> 18
000
<210> 19
<400> 19
000
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<210> 21
<211> 123
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 22
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 23
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 24
<211> 124
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 26
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 28
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 29
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 31
<210> 32
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 32
<210> 33
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 33
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 34
<211> 124
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 36
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 37
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 38
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid "
<400> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 40
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 42
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 43
<211> 113
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 44
<211> 124
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 45
<211> 105
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 46
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 47
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 48
<211> 124
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 49
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 50
<211> 124
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 51
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 52
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 53
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 54
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 55
<211> 108
<212> PRT
213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 58
<210> 59
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 60
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 62
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 63
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 64
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 65
<211> 104
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 66
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 67
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 68
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 69
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 70
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 71
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 72
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 73
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 74
<210> 75
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 75
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 76
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 77
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 78
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 79
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 80
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 81
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 82
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 83
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 84
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 85
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 86
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 87
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 88
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 89
<211> 113
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 90
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 91
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 92
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 93
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 94
<211> 114
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 95
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 96
<211> 124
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 97
<211> 109
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 98
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 99
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 100
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 101
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 102
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 103
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 104
<211> 123
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 105
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 106
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 107
<211> 113
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 108
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 109
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 110
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 112
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 113
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 114
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 115
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 116
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 117
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 118
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 119
<211> 111
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 120
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 121
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 122
<211> 115
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 123
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 124
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 125
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 126
<211> 115
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 127
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 128
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 129
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 130
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 131
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 132
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 133
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 134
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 135
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 136
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 137
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 138
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 139
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 140
<211> 123
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 141
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 142
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 143
<211> 111
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 144
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 145
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 146
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 147
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 148
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 149
<211> 114
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 150
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 151
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 152
<211> 124
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 153
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 154
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 155
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 156
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 157
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 158
<211> 123
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 159
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 160
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 161
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 162
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 163
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 164
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 165
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 166
<211> 120
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 167
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 168
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 169
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 170
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 171
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 172
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 173
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 174
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 175
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 176
<211> 121
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 177
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 178
<211> 122
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 179
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 180
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 181
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 182
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 183
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 184
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 185
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 186
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 187
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 188
<211> 115
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 189
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 190
<211> 115
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 191
<211> 112
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 192
<211> 119
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 193
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 194
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 195
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 196
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 197
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 198
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 199
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 200
<211> 116
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 201
<211> 114
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 202
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 203
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 204
<211> 124
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 205
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 206
<211> 117
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 207
<211> 106
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 208
<211> 125
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 209
<211> 107
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 210
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 211
<211> 108
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 212
<211> 118
<212> PRT
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 213
<400> 214 000 <210> 215 <400> 215 000 <210> 216 <400> 216 000 <210> 217 <400> 217 000 <210> 218 <400> 218 000 <210> 219 <400> 219 000
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 220
<210> 221
<211> 369
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 221
<210> 222
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 222
<210> 223
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 223
<210> 224
<211> 319
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 224
<211> 372
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 225
<210> 226
<211> 337
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 226
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 227
<210> 228
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 228
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 229
<210> 230
<211> 410
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 230
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 231
<210> 232
<211> 337
<212> DNK
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 232
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 233
<210> 234
<211> 319
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 234
<210> 235
<211> 371
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 235
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 236
<210> 237
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 237
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 238
<210> 239
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 239
<210> 240
<211> 320
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 240
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 241
<210> 242
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 242
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 243
<210> 244
<211> 339
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 244
<210> 245
<211> 372
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 245
<211> 315
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 246
<210> 247
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 247
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 248
<210> 249
<211> 372
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 249
<210> 250
<211> 319
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 250
<211> 372
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 251
<210> 252
<211> 337
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 252
<211> 337
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 253
<210> 254
<211> 320
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 254
<210> 255
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 255
<210> 256
<211> 325
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 256
<210> 257
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 257
<211> 337
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 258
<210> 259
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 259
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 260
<210> 261
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 261
<210> 262
<211> 323
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 262
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 263
<210> 264
<211> 318
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 264
<211> 352
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 265
<210> 266
<211> 313
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 266
<210> 267
<211> 348
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 267
<211> 323
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 268
<210> 269
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 269
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 270
<210> 271
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 271
<210> 272
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 272
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 273
<210> 274
<211> 337
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 274
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 275
<210> 276
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 276
<210> 277
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 277
<210> 278
<211> 319
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 278
<210> 279
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 279
<211> 322
<212> /note="Description
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 280
<210> 281
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 281
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 282
<210> 283
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 283
<210> 284
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 284
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 285
<210> 286
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 286
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 287
<210> 288
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 288
<210> 289
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 289
<211> 340
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 290
<210> 291
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 291
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 292
<210> 293
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 293
<210> 294
<211> 316
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 294
<211> 342
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 295
<210> 296
<211> 304
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 296
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 297
<210> 298
<211> 328
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 298
<210> 299
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 299
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 300
<210> 301
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 301
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 302
<210> 303
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 303
<210> 304
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 304
. <210> 305
<211> 369
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 305
<210> 306
<211> 312
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 306
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 307
<210> 308
<211> 338
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 308
<210> 309
<211> 348
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 309
<211> 323
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 310
<210> 311
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 311
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 312
<210> 313
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 313
<210> 314
<211> 319
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 314
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 315
<210> 316
<211> 325
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 316
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 317
<210> 318
<211> 325
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 318
<210> 319
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 319
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 320
<210> 321
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 321
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 322
<210> 323
<211> 345
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 323
<210> 324
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 324
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 325
<210> 326
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 326
<211> 345
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 327
<210> 328
<211> 323
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 328
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 329
<210> 330
<211> 323
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 330
<210> 331
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<210> 332
<211> 319
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 332
<210> 333
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 333
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 334
<210> 335
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 335
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 336
<210> 337
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 337
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 338
<210> 339
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 339
<210> 340
<211> 320
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<210> 341
<211> 369
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 341
<210> 342
<211> 337
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 342
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 343
<210> 344
<211> 334
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 344
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 345
<210> 346
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 346
<210> 347
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 347
<211> 335
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 348
<210> 349
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 349
<211> 341
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 350
<210> 351
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 351
<211> 316
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 352
<210> 353
<211> 372
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 353
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 354
<210> 355
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 355
<210> 356
<211> 325
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid
<210> 357
<211> 366
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 357
<210> 358
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 358
<211> 369
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 359
<210> 360
<211> 321
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 360
<211> 355
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 361
<210> 362
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 362
<211> 348
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 363
<210> 364
<211> 323
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 364
<211> 348
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 365
<210> 366
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 366
<211> 360
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 367
<210> 368
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 368
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 369
<210> 370
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 370
<211> 348
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 371
<210> 372
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 372
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 373
<210> 374
<211> 335
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 374
<210> 375
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<210> 376
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 376
<210> 377
<211> 363
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 377
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 378
<210> 379
<211> 366
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 379
<211> 318
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 380
<210> 381
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 381
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 382
<210> 383
<211> 348
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 383
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 384
<210> 385
<211> 357
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 385
<210> 386
<211> 335
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 386
<210> 387
<211> 348
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 387
<210> 388
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 388
<211> 345
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 389
<210> 390
<211> 323
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 390
<211> 333
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 391
<210> 392
<211> 337
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 392
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 393
<210> 394
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 394
<210> 395
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 395
<210> 396
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 396
<210> 397
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 397
<211> 319
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 398
<210> 399
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 399
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 400
<210> 401
<211> 348
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 401
<211> 341
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 402
<210> 403
<211> 351
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid"
<400> 403
<211> 319
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 404
<210> 405
<211> 373
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 405
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 406
<210> 407
<211> 352
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 407
<210> 408
<211> 319
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 408
<211> 354
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 409
<210> 410
<211> 322
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 410
<211> 355
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 411
<210> 412
<211> 324
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 412
<211> 353
<212> DNK
<213> Veštačka Sekvenca
<220>
<221> izvor
<223> /note="Opis Veštačke Sekvence: Sintetički polipeptid" <400> 413

Claims (26)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugat antitelo lek koji supresuje tumor formule M-[L-D]n, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, gde: M sadrži anti-DLL3 antitelo koje se posebno vezuje za epitop unutar DSL domena DLL3 proteina prikazanog kao SEQ ID NO: 3 ili 4; L sadrži opcioni linker; D sadrži citotoksični agens; i n je ceo broj od 1 do 20.
  2. 2. Konjugat antitelo lek prema zahtevu 1, gde anti-DLL3 antitelo posebno se vezuje za epitop koji sadrži amino kiseline G203, R205 i P206 (SEQ ID NO: 10).
  3. 3. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-2, gde anti-DLL3 antitelo je internalizovano antitelo.
  4. 4. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-3, gde anti-DLL3 antitelo je odabrano između grupe koja se sastoji od monoklonalnog antitela, himernog antitela, CDR-graftovanog antitela, humanizovanog antitela, humanog antitela, primatizovanog antitela, multispecifičnog antitela, bispecifičnog antitela, monovalentnog antitela, multivalentnog antitela, diatela, Fab fragmenta, F(ab’)2fragmenta, Fv fragmenta, i ScFv fragmenta; ili njihovog imunoreaktivnog fragmenta koji se posebno vezuje za epitop unutar DSL domena DLL3 proteina prikazanim kao SEQ ID NO: 3 ili 4.
  5. 5. Konjugat antitelo lek prema zahtevu 4, gde anti-DLL3 antitelo je himerno antitelo, CDR-graftovano antitelo, humano antitelo, ili humanizovano antitelo.
  6. 6. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-5, gde anti-DLL3 antitelo sadrži ili se takmiče za vezivanje za humani DLL3 protein sa antitelom koji sadrži laki lanac varijabilnog regiona prikazan kao SEQ ID NO: 60 i teški lanac varijabilnog regiona prikazan kao SEQ ID NO: 61.
  7. 7. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-6, gde anti-DLL3 antitelo sadrži tri CDRs lakog lanca varijabilnog regiona prikazan kao SEQ ID NO: 60 i tri CDRs teškog lanca varijabilnog regiona prikazan kao SEQ ID NO: 61.
  8. 8. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-7, gde anti-DLL3 antitelo sadrži ostatke 23-34 SEQ ID NO: 60 za CDR-L1, ostatke 50-56 SEQ ID NO: 60 za CDR-L2, ostatke 89-97 SEQ ID NO: 60 za CDR-L3, ostatke 26-32 SEQ ID NO: 61 za CDR-H1, ostatke 50-58 SEQ ID NO: 61 za CDR-H2 i ostatke 95-102 SEQ ID NO: 61 za CDR-H3, gde su ostaci numerisani prema Chothia.
  9. 9. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-7, gde anti-DLL3 antitelo sadrži ostatke 30-36 SEQ ID NO: 60 za CDR-L1, ostatke 46-55 SEQ ID NO: 60 za CDR-L2, ostatke 89-96 SEQ ID NO: 60 za CDR-L3, ostatke 30-35 SEQ ID NO: 61 za CDR-H1, ostatke 47-58 SEQ ID NO: 61 za CDR-H2 i ostatke 93-101 SEQ ID NO: 61 za CDR-H3, gde su ostaci numerisani prema MacCallum.
  10. 10. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-7, gde anti-DLL3 antitelo sadrži ostatke 24-34 SEQ ID NO: 60 za CDR-L1, ostatke 50-56 of SEQ ID NO: 60 za CDR-L2, ostatke 89-97 SEQ ID NO: 60 za CDR-L3, ostatke 31-35 SEQ ID NO: 61 za CDR-H1, ostatke 50-65 SEQ ID NO: 61 za CDR-H2 i ostatke 95-102 SEQ ID NO: 61 za CDR-H3, gde su ostaci numerisani prema Kabat.
  11. 11. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-5, gde anti-DLL3 antitelo sadrži laki lanac varijabilnog regiona koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 210 i teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 211.
  12. 12. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-5, gde anti-DLL3 antitelo sadrži ili se takmiči za vezivanje humanog DLL3 proteina sa antitelom koje sadrži laki lanac varijabilnog regiona prikazan kao SEQ ID NO: 84 i teški lanac varijabilnog regiona prikazan kao SEQ ID NO: 85.
  13. 13. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-5 ili 12, gde anti-DLL3 antitelo sadrži tri CDRs lakog lanca varijabilnog regiona prikazan kao SEQ ID NO: 84 i tri CDRs teškog lanca varijabilnog regiona prikazan kao SEQ ID NO: 85.
  14. 14. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-5, 12 ili 13, gde anti-DLL3 antitelo sadrži ostatke 23-34 SEQ ID NO: 84 za CDR-L1, ostatke 50-56 SEQ ID NO: 84 za CDR-L2, ostatke 89-97 SEQ ID NO: 84 za CDR-L3, ostatke 26-32 SEQ ID NO: 85 za CDR-H1, ostatke 50-58 SEQ ID NO: 85 za CDR-H2 i ostatke 95-102 SEQ ID NO: 85 za CDR-H3, gde su ostaci numerisani prema Chothia.
  15. 15. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-5, 12 ili 13, gde anti-DLL3 antitelo sadrži ostatke 30-36 SEQ ID NO: 84 za CDR-L1, ostatke 46-55 SEQ ID NO: 84 za CDR-L2, ostatke 89-96 SEQ ID NO: 84 za CDR-L3, ostatke 30-35 SEQ ID NO: 85 za CDR-H1, ostatke 47-58 SEQ ID NO: 85 za CDR-H2 i ostatke 93-101 SEQ ID NO: 85 za CDR-H3, gde su ostaci numerisani prema MacCallum.
  16. 16. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-5, 12 ili 13, gde anti-DLL3 antitelo sadrži ostatke 24-34 SEQ ID NO: 84 za CDR-L1, ostatke 50-56 SEQ ID NO: 84 za CDR-L2, ostatke 89-97 SEQ ID NO: 84 za CDR-L3, ostatke 31-35 SEQ ID NO: 85 za CDR-H1, ostatke 50-65 SEQ ID NO: 85 za CDR-H2 i ostatke 95-102 SEQ ID NO: 85 za CDR-H3, gde su ostaci numerisani prema Kabat.
  17. 17. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-5, gde anti-DLL3 antitelo sadrži laki lanac varijabilnog regiona koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 212 i teški lanac varijabilnog regiona koji sadrži amino kiselinsku sekvencu prikazanu kao SEQ ID NO: 213.
  18. 18. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-17, gde D je pirolobenzodiazepin (PBD).
  19. 19. Konjugat antitelo lek prema zahtevu 18, gde pirolobenzodiazepin sadrži konjugat formule AC:
    gde: isprekidane linije ukazuju opciono prisustvo dvostruke veze, i gde samo jedna isprekidana linija u datom prstenu može biti dvostruka veza; R<2>je odabran između H, OH, =O, =CH2, CN, R, OR, =CH-R<D>, =C(R<D>)2, O-SO2-R, CO2R, COR, i halo, gde R<D>je odabran između R, CO2R, COR, CHO, CO2H, i halo, poželjno gde R<2>je R; R<6>i R<9>su svaki nezavisno odabrani između H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Mc3Sn i halo, poželjno gde R<6>i R<9>su H; R<7>je odabran između H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR’, NO2, Me3Sn i halo, poželjno gde R<7>je OR, i poželjno gde R je C1alkil; R<10>je linker koji je vezan za anti-DLL3 antitelo; Q je odabran između O, S i NH, poželjno gde Q je O; R<11>je ili H, ili R ili, gde Q je O, SO3M, gde M je metal katjon, poželjno gde R<11>je H; R i R’ su svaki nezavisno odabrani između opciono supstituisanih C1-12alkil, C3-20heterociklil i C5-20aril grupa, i opciono u vezi sa grupom NRR’, R i R’ zajedno sa atomom azota za koji su vezani obrazuju opciono supstituisani 4-, 5-, 6- ili 7-člani heterociklični prsten; X je odabran između O, S, i N(H); R<2">, R<6">, R<7">, R<9">, i X" su kao što je definisano prema R<2>, R<6>, R<7>, R<9>, i X, respektivno, poželjno gde X i X" su O; i R" je C3-12alkilen grupa, koja obuhvata lanac opciono prekinut sa jednim ili više heteroatoma, jednim ili više prstenova, ili jednim ili više heteroatoma i jednim ili više prstenova, gde opciono jedan ili više prstenova su opciono supstituisani.
  20. 20. Konjugat antitelo lek prema zahtevu 19, sadrži strukturu: (i)
    gde: CBA je agens za vezivanje ćelija koji je anti-DLL3 antitelo, n je 0 ili 1, L<1>je linker, i R<E>i R<E">su svaki nezavisno odabrani između H ili R<D>; ili (ii)
    gde: CBA je agens za vezivanje ćelija koji je anti-DLL3 antitelo, L<1>je linker, Ar<1>i Ar<2>su svaki nezavisno opciono supstituisani C5-20aril, i n je 0 ili 1.
  21. 21. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-20, gde linker sadrži odcepljujući linker, opciono dipeptidni linker.
  22. 22. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-21, koji sadrži strukturu:
    gde: CBA je agens za vezivanje ćelija, koji je anti-DLL3 antitelo M; A, L<1>, i L<2>su komponente linkera L; A je vezujuća grupa koja vezuje L<1>za agens za vezivanje ćelija (CBA); L<1>je opciono odcepljujući linker; L<2>je kovalentna veza ili zajedno sa -OC(=O)- grupom obrazuje samo-imolativni linker; i gde linker L je vezan za pirolobenzodiazepin (PBD) na poziciji zvezdice (*); i gde opciono ostatak:
    sadrži strukturu:
    gde talasasta linija ukazuje na tačku vezivanja strukture direktno za A ili za preostali deo L<1>koji je dalje vezan za A.
  23. 23. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-22 za primenu kao farmaceutski proizvod.
  24. 24. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-22 za primenu u postupku lečenja proliferativnog obolenja kod subjekta, gde je proliferativni poremećaj kancer, opciono gde kancer sadrži neuroendokrinski tumor, i opciono gde je kancer kancer pluća malih ćelija, kancer prostate, kancer tiroidne žlezde ili neuroendokrinski karcinom velikih ćelija.
  25. 25. Konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-22 za primenu u postupku redukcije frekvencije ćelija koje iniciraju tumor kod subjekta.
  26. 26. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat antitelo lek prema bilo kom od zahteva 1-22. X/2017
RS20171006A 2012-02-24 2013-02-22 Ddl3 modulatori i postupci primene RS56443B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261603173P 2012-02-24 2012-02-24
US201261719803P 2012-10-29 2012-10-29
PCT/US2013/027391 WO2013126746A2 (en) 2012-02-24 2013-02-22 Novel modulators and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56443B1 true RS56443B1 (sr) 2018-01-31

Family

ID=47790544

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171006A RS56443B1 (sr) 2012-02-24 2013-02-22 Ddl3 modulatori i postupci primene

Country Status (31)

Country Link
US (31) US8986972B2 (sr)
EP (4) EP3095797B1 (sr)
JP (4) JP6089047B2 (sr)
KR (1) KR20150003169A (sr)
CN (1) CN104520324A (sr)
AU (3) AU2013203459B2 (sr)
BR (1) BR112014020826A8 (sr)
CA (2) CA2865404C (sr)
CL (2) CL2014002240A1 (sr)
CO (1) CO7111274A2 (sr)
CY (1) CY1119590T1 (sr)
DK (1) DK2817338T3 (sr)
ES (2) ES2645272T3 (sr)
HK (3) HK1231488A1 (sr)
HR (1) HRP20171549T1 (sr)
HU (1) HUE037021T2 (sr)
IL (2) IL234155B (sr)
LT (1) LT2817338T (sr)
ME (1) ME02928B (sr)
MX (2) MX2014010074A (sr)
NZ (1) NZ628804A (sr)
PE (2) PE20190658A1 (sr)
PH (1) PH12014501876A1 (sr)
PL (1) PL2817338T3 (sr)
PT (1) PT2817338T (sr)
RS (1) RS56443B1 (sr)
RU (1) RU2014138474A (sr)
SG (2) SG11201405131XA (sr)
SI (1) SI2817338T1 (sr)
SM (1) SMT201700467T1 (sr)
WO (1) WO2013126746A2 (sr)

Families Citing this family (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS62387B1 (sr) * 2010-01-29 2021-10-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dll3 antitelo
CA2865404C (en) * 2012-02-24 2019-08-27 Stem Centrx, Inc. Dll3-binding antibodies and drug conjugates thereof to treat cancer
KR102134088B1 (ko) 2012-08-24 2020-07-14 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 Ror1 암을 치료하고 전이를 저해하는데 이용을 위한 항체와 백신
GB201302447D0 (en) * 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
MX2015010682A (es) 2013-02-22 2016-05-31 Stemcentrx Inc Nuevos conjugados de anticuerpos y usos de los mismos.
CA2922544A1 (en) * 2013-08-28 2015-03-05 Stemcentrx, Inc. Engineered anti-dll3 conjugates and methods of use
JP2016531915A (ja) 2013-08-28 2016-10-13 ステムセントリックス， インコーポレイテッド 部位特異的抗体コンジュゲーション方法および組成物
EP3046588B1 (en) 2013-09-17 2022-03-02 OBI Pharma, Inc. Compositions of a carbohydrate vaccine for inducing immune responses and uses thereof in cancer treatment
US20160280787A1 (en) 2013-11-11 2016-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule containing modified antibody variable region
TWI700295B (zh) * 2013-12-16 2020-08-01 馬來西亞商Ｍａｂ探索私人有限公司 對會感染人類之腸病毒具有專一性之抗體
WO2015127407A1 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Stemcentrx, Inc. Anti-dll3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
BR112016020009A2 (pt) 2014-04-10 2017-10-17 Obi Pharma Inc anticorpo, composição farmacêutica, método para inibir a proliferação de células cancerígenas, hibridoma
US9732145B2 (en) * 2014-07-31 2017-08-15 The Israel Institute of Biological Research (IIBR) Antibodies directed to Bacillus anthracis protective antigen
MX377344B (es) 2014-07-31 2025-03-07 Amgen Res Munich Gmbh Constructos de anticuerpos de cadena sencilla biespecífica específicos para especies cruzadas optimizadas.
JP7125248B2 (ja) 2014-11-11 2022-08-24 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子のライブラリ
MA41613A (fr) * 2015-02-23 2018-01-02 Abbvie Stemcentrx Llc Récepteurs antigéniques chimériques anti-dll3 et procédés d'utilisation desdits récepteurs
EP3292150B1 (en) * 2015-05-04 2020-02-05 Cytomx Therapeutics Inc. Activatable anti-cd166 antibodies, and methods of use thereof
KR20190080992A (ko) 2015-05-21 2019-07-08 하푼 테라퓨틱스, 인크. 삼중특이성 결합 단백질 및 사용 방법
WO2016207103A1 (de) * 2015-06-23 2016-12-29 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Antikörper-wirkstoff-konjugate (adcs) von ksp-inhibitoren mit anti-b7h3-antikörpern
WO2017011550A1 (en) * 2015-07-13 2017-01-19 University Of Utah Research Foundation Methods of making red blood cells and platelets in vitro and uses thereof
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TW202346349A (zh) 2015-07-31 2023-12-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Dll3及cd3抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
HK1257056A1 (zh) * 2015-08-20 2019-10-11 Abbvie Stemcentrx Llc 抗dll3抗体药物缀合物以及使用方法
HK1256912A1 (zh) 2015-09-04 2019-10-04 台湾浩鼎生技股份有限公司 聚糖阵列以及使用方法
WO2017095805A1 (en) 2015-11-30 2017-06-08 Abbvie Inc. ANTI-huLRRC15 ANTIBODY DRUG CONJUGATES AND METHODS FOR THEIR USE
JP2019501124A (ja) 2015-11-30 2019-01-17 アッヴィ・インコーポレイテッド 抗ｈｕＬＲＲＣ１５抗体薬物コンジュゲート及びその使用方法
TN2018000266A1 (en) 2016-02-03 2020-01-16 Amgen Res Munich Gmbh Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs.
EA039325B1 (ru) * 2016-02-03 2022-01-13 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Конструкции биспецифических антител, связывающиеся с дпб3 (dll3) и кд3 (cd3)
WO2017157505A1 (en) 2016-03-17 2017-09-21 Merck Patent Gmbh Method for purifying poloxamers
US10980894B2 (en) 2016-03-29 2021-04-20 Obi Pharma, Inc. Antibodies, pharmaceutical compositions and methods
TWI780045B (zh) * 2016-03-29 2022-10-11 台灣浩鼎生技股份有限公司 抗體、醫藥組合物及方法
CN116790614A (zh) 2016-04-04 2023-09-22 比奥贝拉蒂美国公司 抗补体因子bb抗体以及其用途
JP7544465B2 (ja) 2016-04-22 2024-09-03 オービーアイ ファーマ，インコーポレイテッド グロボシリーズの抗原を介した免疫活性化又は免疫調節によるがん免疫療法
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
EP3493844A4 (en) 2016-05-20 2021-03-24 Harpoon Therapeutics Inc. SINGLE DOMAIN SERUM ALBUMIN BINDING PROTEIN
US10688181B2 (en) 2016-06-27 2020-06-23 The Regents Of The University Of California Cancer treatment combinations
JP2019527690A (ja) 2016-07-27 2019-10-03 オービーアイ ファーマ，インコーポレイテッド 免疫原性／治療用グリカン組成物およびその使用
EP3491026A4 (en) 2016-07-29 2020-07-29 OBI Pharma, Inc. HUMAN ANTIBODIES, PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS AND PROCESSES
WO2018027203A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 Allakos, Inc. Anti-siglec-7 antibodies for the treatment of cancer
US10042362B2 (en) 2016-11-18 2018-08-07 Waymo Llc Dynamic routing for autonomous vehicles
TWI767959B (zh) 2016-11-21 2022-06-21 台灣浩鼎生技股份有限公司 共軛生物分子、醫藥組成物及方法
EP3545000A4 (en) 2016-11-22 2020-07-08 DendroCyte BioTech Pty Ltd ANTI-CD300F ANTIBODIES AND USES THEREOF
MX2019006043A (es) 2016-11-23 2019-09-26 Harpoon Therapeutics Inc Proteína de unión de antígeno prostático específico de membrana.
JP7215997B2 (ja) 2016-11-23 2023-01-31 ハープーン セラピューティクス，インク． 前立腺特異的膜抗原（ｐｓｍａ）を標的とする三重特異性タンパク質と使用方法
KR20250072712A (ko) 2016-12-02 2025-05-26 앤젤레스 테라퓨틱스, 인코포레이티드 합성 면역 수용체 및 이의 사용 방법
GB201700553D0 (en) 2017-01-12 2017-03-01 Genagon Therapeutics Ab Therapeutic agents
WO2018160754A2 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
JP7209936B2 (ja) 2017-05-12 2023-01-23 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｍｓｌｎ標的三重特異性タンパク質及びその使用方法
CN121159691A (zh) 2017-05-12 2025-12-19 哈普恩治疗公司 间皮素结合蛋白质
EP4088783A1 (en) 2017-08-01 2022-11-16 Ab Studio Inc. Bispecific antibodies and uses thereof
WO2019075220A1 (en) 2017-10-11 2019-04-18 Bioverativ Usa Inc. METHODS FOR INDUCING COMPLEMENT ACTIVITY
PE20201183A1 (es) 2017-10-13 2020-11-03 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas trispecificas y metodos de uso
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
TW201938194A (zh) 2017-12-05 2019-10-01 日商中外製藥股份有限公司 包含結合cd3及cd137的改變的抗體可變區之抗原結合分子
TWI817974B (zh) 2017-12-28 2023-10-11 日商中外製藥股份有限公司 細胞毒性誘導治療劑
US12247060B2 (en) 2018-01-09 2025-03-11 Marengo Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered T cells for the treatment of diseases
CA3087968A1 (en) * 2018-01-11 2019-07-18 Allakos, Inc. Anti-siglec-7 antibodies having reduced effector function
WO2019195408A1 (en) * 2018-04-03 2019-10-10 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting dll3, and use thereof
CN112074278B (zh) * 2018-04-03 2023-04-25 湖南远泰生物技术有限公司 Bcma-car-t细胞
TWI842703B (zh) * 2018-04-10 2024-05-21 美商安進公司 Dll3 的嵌合受體及其使用方法
MX2020011914A (es) 2018-05-08 2021-01-29 Phanes Therapeutics Inc Anticuerpos anti-dll3 y usos de los mismos.
BR112020023330A2 (pt) 2018-05-14 2021-04-20 Harpoon Therapeutics, Inc. porção de ligação para ativação condicional de moléculas de imunoglobulina
TWI848953B (zh) * 2018-06-09 2024-07-21 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
TWI853822B (zh) 2018-06-27 2024-09-01 台灣浩鼎生技股份有限公司 用於糖蛋白工程的糖苷合成酶變體及其使用方法
JP7554742B2 (ja) 2018-07-03 2024-09-20 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｔｃｒ抗体分子およびその使用
US12370264B1 (en) 2018-08-02 2025-07-29 Dyne Therapeutics, Inc. Complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and method of delivering oligonucleotide to a subject
KR20210081322A (ko) 2018-08-02 2021-07-01 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 디스트로핀병증을 치료하기 위한 그의 용도
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
US12097263B2 (en) 2018-08-02 2024-09-24 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US20220193250A1 (en) 2018-08-02 2022-06-23 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US12497464B1 (en) 2018-08-03 2025-12-16 Berkeley Therapeutics, Inc. Antibody, antibody fragments or peptide for treating cancer and methods of formation and administration
SG11202101152QA (en) 2018-08-03 2021-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule containing two antigen-binding domains that are linked to each other
WO2020061482A1 (en) 2018-09-21 2020-03-26 Harpoon Therapeutics, Inc. Egfr binding proteins and methods of use
MX2021003554A (es) 2018-09-25 2021-05-27 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas de union a dll3 y metodos de uso.
WO2020069349A1 (en) * 2018-09-27 2020-04-02 Colorado State University Research Foundation Scfv's for live cell imaging and other uses
MX2021003609A (es) 2018-09-28 2021-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union a antigeno que comprende una region variable de anticuerpo alterada.
IL282735B2 (en) 2018-11-01 2025-10-01 Gracell Biotechnologies Shanghai Co Ltd Preparations and methods for engineering T cells
BR112021012647A2 (pt) * 2018-12-27 2021-09-14 Akeso Biopharma, Inc Anticorpo, polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, vetor, célula hospedeira, métodos para preparar o anticorpo e para a prevenção e/ou tratamento e/ou tratamento adjuvante e/ou diagnóstico de uma doença, conjugado de anticorpo, anticorpo multiespecífico, proteína de fusão, composição farmacêutica, kit, usos do anticorpo, método in vivo ou in vitro, célula de hibridoma e anticorpo monoclonal
US12463463B2 (en) 2019-01-28 2025-11-04 Ab Therapeutics, Inc. Bispecific antibodies and uses thereof
AU2020226893B2 (en) 2019-02-21 2025-02-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
PH12021551720A1 (en) 2019-03-01 2022-03-28 Allogene Therapeutics Inc Dll3 targeting chimeric antigen receptors and binding agents
CN113874526A (zh) * 2019-03-08 2021-12-31 肿瘤实验室诊断有限公司 癌症的诊断和预后
AU2020271012A1 (en) * 2019-04-08 2021-09-09 Phanes Therapeutics, Inc. Humanized anti-DLL3 chimeric antigen receptors and uses thereof
WO2020219959A1 (en) * 2019-04-24 2020-10-29 Magenta Therapeutics, Inc. Anti-cd45 antibody drug conjugates and uses thereof
CA3140430A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Harpoon Therapeutics, Inc. Epcam binding proteins and methods of use
EP3980129A1 (en) * 2019-06-07 2022-04-13 Mythic Therapeutics, Inc. Antigen-binding protein constructs and uses thereof
BR112022000216A2 (pt) * 2019-07-11 2022-05-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anticorpos direcionados a dll3 e usos dos mesmos
WO2021041300A2 (en) * 2019-08-23 2021-03-04 Ab Therapeutics, Inc. Bispecific antibodies and uses thereof
CN112442126B (zh) * 2019-09-04 2022-07-29 杭州济元基因科技有限公司 一种抗人cs1抗原的单克隆抗体及其car-t细胞
EP3819312A1 (en) * 2019-11-10 2021-05-12 Amgen, Inc Dosing regimen for anti-dll3 agents
GB2609554B (en) 2020-01-03 2025-08-20 Marengo Therapeutics Inc Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
WO2021142307A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CA3164090A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Jonathan Kurtis Antibodies to pfgarp kill plasmodium falciparum malaria parasites and protect against infection and severe disease
IL294479A (en) * 2020-01-10 2022-09-01 Dyne Therapeutics Inc Muscle targeting complexes and their uses for the treatment of myotonic dystrophy
CA3163608A1 (en) * 2020-01-10 2021-07-15 Romesh R. Subramanian Muscle-targeting complexes and uses thereof
KR20220125801A (ko) * 2020-01-10 2022-09-14 다인 세라퓨틱스, 인크. 근육 표적화 복합체 및 안면견갑상완 근육 이영양증을 치료하기 위한 그의 용도
WO2021150382A1 (en) * 2020-01-24 2021-07-29 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes and uses thereof in treating muscle atrophy
WO2021167952A2 (en) * 2020-02-20 2021-08-26 The Feinstein Institutes For Medical Research Agonist antibodies against endoglin and uses thereof
JP7735291B2 (ja) 2020-02-21 2025-09-08 エーアールエス ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッド ネクチン－４抗体コンジュゲートおよびその使用
CA3170833A1 (en) 2020-02-21 2021-08-26 Harpoon Therapeutics, Inc. Flt3 binding proteins and methods of use
CN116096751A (zh) * 2020-02-25 2023-05-09 璟尚生物制药公司 三特异性t细胞接合器
IL296803A (en) 2020-03-31 2022-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Multispecific antigen binding molecules targeting dll3 and their uses
AU2021250381A1 (en) 2020-03-31 2022-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing multispecific antigen-binding molecules
PH12022552558A1 (en) 2020-04-20 2024-04-22 Genzyme Corp Humanized anti-complement factor bb antibodies and uses thereof
CN115702003A (zh) * 2020-04-23 2023-02-14 瑞美德生物医药科技有限公司 趋化因子受体4(cxcr4)拮抗剂抗体
KR20230019152A (ko) * 2020-06-02 2023-02-07 아르커스 바이오사이언시즈 인코포레이티드 Tigit에 대한 항체
EP4175673A1 (en) 2020-07-01 2023-05-10 ARS Pharmaceuticals Inc. Anti-asgr1 antibody conjugates and uses thereof
JP7828349B2 (ja) 2020-09-16 2026-03-11 アムジェン インコーポレイテッド 癌の治療のために二重特異性ｔ細胞誘導分子の治療用量を投与する方法
WO2022087316A1 (en) * 2020-10-21 2022-04-28 La Jolla Institute For Immunology Chimeric anti-sars-cov2 nucleoprotein antibodies
AU2021372988A1 (en) * 2020-11-06 2023-06-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and systems for classification and treatment of small cell lung cancer
AU2021401052A1 (en) 2020-12-18 2023-06-22 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
TW202245844A (zh) 2021-01-13 2022-12-01 紀念斯隆凱特琳癌症中心 抗dll3抗體-藥物結合物
KR20230146521A (ko) 2021-01-13 2023-10-19 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 항체-피롤로벤조디아제핀 유도체 접합체
CA3226366A1 (en) 2021-07-09 2023-01-12 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating dystrophinopathies
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
CN113528583A (zh) * 2021-07-15 2021-10-22 澳门大学 自动化显微注射方法、装置、系统、设备及存储介质
WO2023006084A1 (zh) 2021-07-30 2023-02-02 上海复旦张江生物医药股份有限公司 一种抗dll3抗体及其制备方法、其药物偶联物和应用
US20250085287A1 (en) * 2021-08-19 2025-03-13 Adicet Therapeutics, Inc. Methods for detection of membrane bound glypican-3
WO2023053272A1 (en) 2021-09-29 2023-04-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Uses of dll3-targeting multispecific antigen-binding molecules
KR20250004770A (ko) 2022-04-15 2025-01-08 다인 세라퓨틱스, 인크. 근긴장성 이영양증을 치료하기 위한 근육 표적화 복합체 및 제제
JP2025519056A (ja) * 2022-05-18 2025-06-24 ザ ブリガム アンド ウィメンズ ホスピタル インコーポレイテッド Ｋｌｒｂ１結合剤及びその使用方法
CN119019548B (zh) * 2022-07-05 2025-06-24 东莞市朋志生物科技有限公司 抗甲型流感病毒抗体、检测甲型流感病毒的试剂和试剂盒
CN116355079B (zh) * 2022-08-19 2023-12-26 上海迈科康生物科技有限公司 检测重组人轮状病毒vp8抗原（vp8 p[8]）的单克隆抗体及其应用
KR20250071294A (ko) 2022-08-22 2025-05-21 압데라 테라퓨틱스 인크. Dll3 결합 분자 및 이의 용도
EP4624489A1 (en) 2022-11-25 2025-10-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing protein
CN116731184B (zh) * 2022-11-25 2024-06-14 厦门康基生物科技有限公司 一种特异性结合Taq酶的单克隆抗体F6H12及其应用
IL320471A (en) * 2022-12-08 2025-06-01 Amgen Inc Methods for treating DLL3-expressing cancers
CN116173202A (zh) * 2022-12-28 2023-05-30 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种抗lilrb4单克隆抗体注射制剂
US20250034210A1 (en) * 2023-06-14 2025-01-30 Mariana Oncology Inc. Dll3 targeting peptides and constructs thereof
US20250049970A1 (en) * 2023-06-14 2025-02-13 Mariana Oncology Inc. Dll3 targeting peptides and constructs thereof
KR20260026051A (ko) * 2023-06-14 2026-02-25 마리아나 온콜로지 인크. Dll3 표적화 펩티드 및 이의 구성체
CN119490592B (zh) * 2023-08-14 2025-11-18 东莞市朋志生物科技有限公司 一种抗κ型轻链抗体及其应用
CN116966202B (zh) * 2023-09-22 2023-12-01 再少年(北京)生物科技有限公司 iPS诱导定向分化成的神经干细胞联合药物用于治疗阿尔茨海默症的用途
WO2025085796A1 (en) * 2023-10-18 2025-04-24 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Armored immunoresponsive cells targeting dll3 and uses thereof
WO2025179168A1 (en) * 2024-02-22 2025-08-28 Mariana Oncology Inc. Synthesis of dll3-binding peptides
WO2025250696A1 (en) * 2024-05-28 2025-12-04 New York University Anti-ttyh2 antibodies and methods of use thereof
CN120137041B (zh) * 2025-03-14 2025-11-28 深圳市欧安蒂生物科技有限公司 一种抗gprc5d抗体及其在car-t中的应用
CN120350014B (zh) * 2025-06-26 2025-08-22 上海交通大学医学院附属仁济医院 核酸适体、核酸适体衍生物及其应用

Family Cites Families (146)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901464A (fr) 1943-01-23 1945-07-27 Boehringer & Soehne Gmbh Procédé d'obtention de vanilline
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4703004A (en) 1984-01-24 1987-10-27 Immunex Corporation Synthesis of protein with an identification peptide
AU584417B2 (en) 1985-04-01 1989-05-25 Lonza Group Ag Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5336603A (en) 1987-10-02 1994-08-09 Genentech, Inc. CD4 adheson variants
IL89220A (en) 1988-02-11 1994-02-27 Bristol Myers Squibb Co Anthracycline immunoconjugates, their production and pharmaceutical compositions containing them
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5879936A (en) 1988-04-18 1999-03-09 Aluguisse Holding A.G. Recombinant DNA methods, vectors and host cells
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5750373A (en) 1990-12-03 1998-05-12 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins having altered binding properties, M13 phagemids, and growth hormone variants
KR900005995A (ko) 1988-10-31 1990-05-07 우메모또 요시마사 변형 인터류킨-2 및 그의 제조방법
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
AU641673B2 (en) 1989-06-29 1993-09-30 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
US5112946A (en) 1989-07-06 1992-05-12 Repligen Corporation Modified pf4 compositions and methods of use
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
WO1991006570A1 (en) 1989-10-25 1991-05-16 The University Of Melbourne HYBRID Fc RECEPTOR MOLECULES
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5349053A (en) 1990-06-01 1994-09-20 Protein Design Labs, Inc. Chimeric ligand/immunoglobulin molecules and their uses
DE69132709T2 (de) 1990-06-29 2002-06-20 Large Scale Biology Corp., Vacaville Melaninproduktion durch transformierte mikroorganismen
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69133476T2 (de) 1990-08-29 2006-01-05 GenPharm International, Inc., Palo Alto Transgene Mäuse fähig zur Produktion heterologer Antikörper
EP0517895B1 (en) 1990-12-14 1996-11-20 Cell Genesys, Inc. Chimeric chains for receptor-associated signal transduction pathways
DK1820858T3 (da) 1991-03-01 2009-11-02 Dyax Corp Kimært protein omfatende mikroprotein med to eller flere disulfidbindinger og udförelsesformer deraf
WO1992018619A1 (en) 1991-04-10 1992-10-29 The Scripps Research Institute Heterodimeric receptor libraries using phagemids
WO1992020373A1 (en) 1991-05-14 1992-11-26 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5622929A (en) 1992-01-23 1997-04-22 Bristol-Myers Squibb Company Thioether conjugates
US5667988A (en) 1992-01-27 1997-09-16 The Scripps Research Institute Methods for producing antibody libraries using universal or randomized immunoglobulin light chains
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5447851B1 (en) 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
WO1994004670A1 (en) 1992-08-26 1994-03-03 President And Fellows Of Harvard College Use of the cytokine ip-10 as an anti-tumor agent
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
PL174494B1 (pl) 1992-11-13 1998-08-31 Idec Pharma Corp Kompozycja farmaceutyczna do leczenia chłoniaka z limfocytów B i sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej do leczenia chłoniaka z limfocytów B
ES2146648T3 (es) 1993-03-09 2000-08-16 Genzyme Corp Procedimiento de aislamiento de proteinas de la leche.
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
DE69505991T2 (de) 1994-07-13 1999-04-08 Sca Hygiene Paper Ab, Goeteborg/Gotenburg Verfahren zur herstellung eines vliesstoffes
CN1117155C (zh) 1994-07-29 2003-08-06 史密丝克莱恩比彻姆有限公司 新型化合物
US6046037A (en) 1994-12-30 2000-04-04 Hiatt; Andrew C. Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DK1143006T3 (da) 1995-08-18 2008-07-14 Morphosys Ip Gmbh Vektorer/DNA-sekvenser fra humane kombinatoriske antistofbiblioteker
DE69626849T2 (de) 1995-12-22 2003-12-24 Bristol-Myers Squibb Co., Princeton Verzweigte hydrazongruppen enthaltende kuppler
WO1997033899A1 (en) 1996-03-14 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
JP4046354B2 (ja) 1996-03-18 2008-02-13 ボード オブ リージェンツ，ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 増大した半減期を有する免疫グロブリン様ドメイン
CA2248868A1 (en) 1996-03-22 1997-09-25 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule ii
US20030180784A1 (en) * 1997-04-04 2003-09-25 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel human Delta3 compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
AU736549B2 (en) 1997-05-21 2001-08-02 Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung Method for the production of non-immunogenic proteins
CA2309541C (en) 1997-11-03 2011-01-11 Human Genome Sciences, Inc. Vegi, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
ATE240334T1 (de) 1998-08-27 2003-05-15 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepine
GB9818731D0 (en) 1998-08-27 1998-10-21 Univ Portsmouth Compounds
JP2002534959A (ja) 1998-12-08 2002-10-22 バイオベーション リミテッド 免疫原性タンパク質の改変方法
HUP0104865A3 (en) 1999-01-15 2004-07-28 Genentech Inc Polypeptide variants with altered effector function
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US6908748B2 (en) 1999-07-29 2005-06-21 Kenji Sobue Genes associated with the maintenance of differentiation of smooth muscle cells
US6703221B1 (en) 1999-08-19 2004-03-09 Chiron Corporation Notch receptor ligands and uses thereof
AU6913100A (en) 1999-08-19 2001-03-13 Chiron Corporation Notch receptor ligands and uses thereof
EP1803730A1 (en) 2000-04-12 2007-07-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP1309614A2 (en) 2000-08-11 2003-05-14 Eli Lilly And Company Novel secreted proteins and their uses
US7138496B2 (en) 2002-02-08 2006-11-21 Genetastix Corporation Human monoclonal antibodies against human CXCR4
AU2002248184C1 (en) 2000-12-12 2018-01-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US6362331B1 (en) 2001-03-30 2002-03-26 Council Of Scientific And Industrial Research Process for the preparation of antitumor agents
DE10131904A1 (de) 2001-07-04 2003-01-16 Putzmeister Ag Vorrichtung zum Fördern von fließ- oder schüttfähigem Fördergut
US7771951B2 (en) 2001-12-03 2010-08-10 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
WO2003075957A1 (en) 2002-03-04 2003-09-18 Medimmune, Inc. The prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents
SI2345671T1 (sl) 2002-09-27 2016-03-31 Xencor Inc. Optimizirane Fc-variante in postopki za njihovo izdelavo
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
GB0226593D0 (en) 2002-11-14 2002-12-24 Consultants Ltd Compounds
US20050008625A1 (en) 2003-02-13 2005-01-13 Kalobios, Inc. Antibody affinity engineering by serial epitope-guided complementarity replacement
US7619068B2 (en) 2003-05-09 2009-11-17 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
US8029984B2 (en) 2003-08-08 2011-10-04 Licentia, Ltd. Materials and methods for colorectal cancer screening, diagnosis and therapy
GB0321295D0 (en) 2003-09-11 2003-10-15 Spirogen Ltd Synthesis of protected pyrrolobenzodiazepines
NZ583292A (en) 2003-11-06 2012-03-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
CA2556752C (en) 2004-02-23 2016-02-02 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
GB0404577D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
PL1720881T3 (pl) 2004-03-01 2013-05-31 Medimmune Ltd Pochodne 11-hydroksy-5h-pirolo[2,1-c][1,4]benzodiazepin-5-onu jako kluczowe związki pośrednie do otrzymywania C2 podstawionych pirolobenzodiazepin
US7189710B2 (en) 2004-03-30 2007-03-13 Council Of Scientific And Industrial Research C2-fluoro pyrrolo [2,1−c][1,4]benzodiazepine dimers
FR2869231B1 (fr) 2004-04-27 2008-03-14 Sod Conseils Rech Applic Composition therapeutique contenant au moins un derive de la pyrrolobenzodiazepine et la fludarabine
ES2414460T3 (es) 2004-08-04 2013-07-19 Amgen Inc. Anticuerpos para Dkk-1
EP1791565B1 (en) 2004-09-23 2016-04-20 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
US20070123448A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 The Hospital For Sick Children Novel chemical entities affecting neuroblastoma tumor-initiating cells
CA2633593A1 (en) 2005-12-16 2007-10-04 Genentech, Inc. Method for diagnosing, prognosing and treating glioma
CA2637267A1 (en) 2006-01-16 2007-07-19 Compugen Ltd. Novel nucleotide and amino acid sequences, and methods of use thereof for diagnosis
SI1813614T1 (sl) 2006-01-25 2012-01-31 Sanofi 174 Citotoksična sredstva, ki obsegajo nove tomajmicinske derivate
WO2007103114A2 (en) 2006-03-07 2007-09-13 The Brigham & Women's Hospital, Inc. Notch inhibition in the treatment or prevention of atherosclerosis
EP2032694A4 (en) 2006-06-06 2010-09-15 Univ Tennessee Res Foundation COMPOSITIONS ENRICHED WITH NEOPLASTIC STEM CELLS AND THESE COMPREHENSIVE METHODS
ES2781402T7 (es) 2006-09-07 2021-06-09 Scott & White Memorial Hospital Métodos y composiciones basadas en conjugados de toxina diftérica-interleucina-3
US7825267B2 (en) 2006-09-08 2010-11-02 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Synthesis of FR901464 and analogs with antitumor activity
CA2666559A1 (en) 2006-10-20 2008-04-24 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising anti-hb-egf antibody as active ingredient
AU2008207945A1 (en) 2007-01-22 2008-07-31 Macrogenics West, Inc. Human cancer stem cells
EP2190481B1 (en) 2007-07-17 2014-12-24 The General Hospital Corporation Methods to identify and enrich for populations of ovarian cancer stem cells and somatic ovarian stem cells and uses thereof
EP2022848A1 (en) 2007-08-10 2009-02-11 Hubrecht Institut A method for identifying, expanding, and removing adult stem cells and cancer stem cells
US20090130105A1 (en) 2007-08-28 2009-05-21 Biogen Idec Ma Inc. Compositions that bind multiple epitopes of igf-1r
WO2009043051A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
EP2947097A1 (en) * 2008-04-07 2015-11-25 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against the Notch pathways and uses thereof
US8384551B2 (en) 2008-05-28 2013-02-26 MedHab, LLC Sensor device and method for monitoring physical stresses placed on a user
WO2010037134A2 (en) 2008-09-29 2010-04-01 Stemlifeline, Inc. Multi-stage stem cell carcinogenesis
KR20110108390A (ko) 2009-01-12 2011-10-05 신텔렉트 인코포레이티드 레이저로 매개된 박막 절개 및 세포 군체의 이동
US20110020221A1 (en) 2009-04-09 2011-01-27 The Johns Hopkins University Cancer stem cell expression patterns and compounds to target cancer stem cells
RS62387B1 (sr) * 2010-01-29 2021-10-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dll3 antitelo
KR101687054B1 (ko) 2010-04-15 2016-12-15 메디뮨 리미티드 증식성 질환 치료용 피롤로벤조디아제핀
PH12012501836A1 (en) 2010-04-15 2013-02-04 Medimmune Ltd Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
WO2011130613A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Seattle Genetics, Inc. Targeted pyrrolobenzodiazapine conjugates
GB201006340D0 (en) 2010-04-15 2010-06-02 Spirogen Ltd Synthesis method and intermediates
WO2013119964A2 (en) 2012-02-08 2013-08-15 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US20130061340A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
SG189212A1 (en) 2010-09-03 2013-05-31 Stem Centrx Inc Identification and enrichment of cell subpopulations
US20130061342A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
US8637642B2 (en) 2010-09-29 2014-01-28 Seattle Genetics, Inc. Antibody drug conjugates (ADC) that bind to 191P4D12 proteins
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
EP2681244B1 (en) 2011-03-02 2017-11-29 Roche Glycart AG Cea antibodies
BR112014006703A8 (pt) 2011-09-20 2018-01-09 Spirogen Sarl "pirrolobenzodiazepinas
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
CN118515766A (zh) 2011-11-16 2024-08-20 勃林格殷格翰国际有限公司 抗il-36r抗体
CA2865404C (en) 2012-02-24 2019-08-27 Stem Centrx, Inc. Dll3-binding antibodies and drug conjugates thereof to treat cancer
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
MX2015010682A (es) 2013-02-22 2016-05-31 Stemcentrx Inc Nuevos conjugados de anticuerpos y usos de los mismos.
US9683039B2 (en) 2013-03-14 2017-06-20 New York University Notch agonists for the treatment of cancer
JP2016531915A (ja) 2013-08-28 2016-10-13 ステムセントリックス， インコーポレイテッド 部位特異的抗体コンジュゲーション方法および組成物
CA2922544A1 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Stemcentrx, Inc. Engineered anti-dll3 conjugates and methods of use
WO2015127407A1 (en) 2014-02-21 2015-08-27 Stemcentrx, Inc. Anti-dll3 antibodies and drug conjugates for use in melanoma
WO2016064749A2 (en) 2014-10-20 2016-04-28 Igenica Biotherapeutics, Inc. Novel antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods of use
WO2018026742A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Askgene Pharma Inc. Novel antibody-albumin-drug conjugates (aadc) and methods for using them

Also Published As

Publication number Publication date
EP3093294A1 (en) 2016-11-16
US9353182B2 (en) 2016-05-31
US20140364593A1 (en) 2014-12-11
US9855343B2 (en) 2018-01-02
EP2817338B1 (en) 2017-07-26
US9358304B1 (en) 2016-06-07
MX2014010074A (es) 2014-09-12
US20170266313A1 (en) 2017-09-21
PT2817338T (pt) 2017-11-13
US9090683B2 (en) 2015-07-28
CO7111274A2 (es) 2014-11-10
US9133271B1 (en) 2015-09-15
US20170274094A1 (en) 2017-09-28
JP2018162257A (ja) 2018-10-18
HK1231485A1 (en) 2017-12-22
KR20150003169A (ko) 2015-01-08
HRP20171549T1 (hr) 2017-11-17
SG11201405131XA (en) 2014-10-30
IL234155B (en) 2018-10-31
JP2016098233A (ja) 2016-05-30
US9352051B1 (en) 2016-05-31
AU2018282328A1 (en) 2019-01-17
PH12014501876A1 (en) 2014-11-17
US20160136296A1 (en) 2016-05-19
US9480757B2 (en) 2016-11-01
US20190247510A1 (en) 2019-08-15
US20150328332A1 (en) 2015-11-19
IL262110A (en) 2018-11-29
CY1119590T1 (el) 2018-03-07
CA2865404A1 (en) 2013-08-29
HK1231486A1 (en) 2017-12-22
US20140363455A1 (en) 2014-12-11
US20180036422A1 (en) 2018-02-08
HK1200174A1 (en) 2015-07-31
US20140364590A1 (en) 2014-12-11
ES2645272T3 (es) 2017-12-04
US20180015178A1 (en) 2018-01-18
US20140363826A1 (en) 2014-12-11
US11033634B2 (en) 2021-06-15
SI2817338T1 (sl) 2017-11-30
JP6010241B2 (ja) 2016-10-19
BR112014020826A8 (pt) 2017-09-19
US9931420B2 (en) 2018-04-03
US20160158379A1 (en) 2016-06-09
US20160228571A1 (en) 2016-08-11
US9089615B2 (en) 2015-07-28
US9770518B1 (en) 2017-09-26
US8986972B2 (en) 2015-03-24
RU2014138474A (ru) 2016-04-10
US9931421B2 (en) 2018-04-03
US20140370037A1 (en) 2014-12-18
US20160075779A1 (en) 2016-03-17
US9481727B2 (en) 2016-11-01
US20170266312A1 (en) 2017-09-21
HK1231488A1 (en) 2017-12-22
US20160151513A1 (en) 2016-06-02
US20180036421A1 (en) 2018-02-08
JP2016098232A (ja) 2016-05-30
AU2016244333B2 (en) 2018-10-25
US9089617B2 (en) 2015-07-28
CN104520324A (zh) 2015-04-15
US9173959B1 (en) 2015-11-03
WO2013126746A3 (en) 2014-03-20
US9345784B1 (en) 2016-05-24
CA3050672A1 (en) 2013-08-29
US10137204B2 (en) 2018-11-27
PL2817338T3 (pl) 2017-12-29
US9764042B1 (en) 2017-09-19
US9334318B1 (en) 2016-05-10
EP3093293A1 (en) 2016-11-16
HUE037021T2 (hu) 2018-08-28
US9867887B1 (en) 2018-01-16
JP6089047B2 (ja) 2017-03-01
US9089616B2 (en) 2015-07-28
US9107961B2 (en) 2015-08-18
WO2013126746A2 (en) 2013-08-29
US20150265724A1 (en) 2015-09-24
US20170266315A1 (en) 2017-09-21
PE20190658A1 (es) 2019-05-08
SMT201700467T1 (it) 2017-11-15
US20170368195A1 (en) 2017-12-28
US20190046656A1 (en) 2019-02-14
MX2018010548A (es) 2023-02-23
US20160251431A1 (en) 2016-09-01
US20200138969A1 (en) 2020-05-07
US20140363887A1 (en) 2014-12-11
CL2014002240A1 (es) 2015-05-15
AU2013203459B2 (en) 2016-11-03
US20170000901A1 (en) 2017-01-05
US9486537B2 (en) 2016-11-08
EP3095797A1 (en) 2016-11-23
US20170307622A1 (en) 2017-10-26
ME02928B (me) 2018-04-20
PE20150090A1 (es) 2015-02-16
EP3095797B1 (en) 2020-05-20
SG10201806867VA (en) 2018-09-27
CA2865404C (en) 2019-08-27
NZ628804A (en) 2017-08-25
JP2015509947A (ja) 2015-04-02
EP2817338A2 (en) 2014-12-31
ES2812849T3 (es) 2021-03-18
DK2817338T3 (en) 2017-10-23
US9775916B1 (en) 2017-10-03
US9155803B1 (en) 2015-10-13
US9878053B2 (en) 2018-01-30
US20160250348A1 (en) 2016-09-01
US20170266314A1 (en) 2017-09-21
US9861708B2 (en) 2018-01-09
US20160130331A1 (en) 2016-05-12
LT2817338T (lt) 2017-11-10
US9937268B2 (en) 2018-04-10
BR112014020826A2 (pt) 2017-07-04
CL2016001616A1 (es) 2017-02-03
AU2016244333A1 (en) 2016-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9931421B2 (en) Methods of delivering DLL3 antibody drug conjugates
HK1200174B (en) Dll3 modulators and methods of use