RS56569B1 - Mikroorganizmi koji fermentišu pentozu - Google Patents

Mikroorganizmi koji fermentišu pentozu

Info

Publication number
RS56569B1
RS56569B1 RS20171170A RSP20171170A RS56569B1 RS 56569 B1 RS56569 B1 RS 56569B1 RS 20171170 A RS20171170 A RS 20171170A RS P20171170 A RSP20171170 A RS P20171170A RS 56569 B1 RS56569 B1 RS 56569B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
xylose
yeast cell
sequence
isomerase
seq
Prior art date
Application number
RS20171170A
Other languages
English (en)
Inventor
Zdravko Dragovic
Christian Gamauf
Christoph Reisinger
Ulrich Kettling
Original Assignee
Clariant Produkte Deutschland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Clariant Produkte Deutschland filed Critical Clariant Produkte Deutschland
Publication of RS56569B1 publication Critical patent/RS56569B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C12N9/92—Glucose isomerase (5.3.1.5; 5.3.1.9; 5.3.1.18)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
    • C12P1/02—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P5/00—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons
    • C12P5/02—Preparation of hydrocarbons or halogenated hydrocarbons acyclic
    • C12P5/026—Unsaturated compounds, i.e. alkenes, alkynes or allenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
    • C12P7/08—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate
    • C12P7/10—Ethanol, i.e. non-beverage produced as by-product or from waste or cellulosic material substrate substrate containing cellulosic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/16—Butanols
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
    • C12P7/20—Glycerol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/54—Acetic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/56—Lactic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/01—Intramolecular oxidoreductases (5.3) interconverting aldoses and ketoses (5.3.1)
    • C12Y503/01005—Xylose isomerase (5.3.1.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P2203/00—Fermentation products obtained from optionally pretreated or hydrolyzed cellulosic or lignocellulosic material as the carbon source
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Ksiloza predstavlja osnovnu gradivnu jedinicu biljne biomase, i nalazi se, kao sastojak brojnih osnovnih sirovina, u fokusu savremenih koncepata biorafinerija. Primeri takvih materijala bogatih ksilozom uključuju pšeničnu slamu, kukuruznu slamu ili drvene opiljke ili druge sporedne proizvode obrade drveta (Blake A Simmons et al. Genome Biol.2008; 9(12): 242).
[0002] Kao rezultat hidrolize polaznog materijala enzimskim, hemijskim ili hemijsko/enzimskim pristupima, dobijaju se međuproizvodi bogati ksilozom, pored drugih vrednih šećera (Deepak Kumar et al. Biotechnol Biofuels. 2011; 4: 27). Efikasno korišćenje rastvora bogatih C5 šećerima u spojenim linijama za fermentaciju je presudno i zahteva primenu fermentacionih sojeva (Sara Fernandes and Patrick Murray, Bioeng Bugs. 2010; 1(6): 424). Naročito C6 kvasci, kao što je Saccharomyces cerevisiae, koji su poželjni organizmi za korišćenje zahvaljujući dugoj istoriji uzgoja koja je rezultovala u svojstvima izuzetne tolerancije na etanol i visokih prinosa u konverziji glukoze, ostavljaju ksilozu potpuno netaknutu, smanjujući na taj način potencijalni prinos. Poznato je nekoliko pristupa za prevazilaženje ovog ograničenja. Ključni korak ovde predstavlja uspešno prevođenje ksiloze u ksilulozu izomerizacijom, za kojim sledi kaskada modifikacija neredukujućeg dela C5 šanta u uobičajeni ciklus glikolize kvasca Saccharomyces cerevisiae. Dok su intenzitet preuzimanja ksiloze kroz membranu specifičnim transporterima i dostižni fluks gustine kroz C5 šant podložni mogućim poboljšanjima (David Runquist et al. Microb Cell Fact. 2009; 8: 49), ključni korak izomerizacije iz ksiloze u ksilulozu postavlja najveći problem u celokupnom postupku. Za izvođenje tog koraka poznata su dva glavna puta. Prvi put, koji uključuje uzastopne korake redukcije u ksilitol (pomoću ksiloza-reduktaze) i oksidacije u ksilulozu (pomoću ksilitol dehidrogenaze), stvara veliku neravnotežu između kofaktora NADH i NADPH i vodi povećanom obrazovanju ksilitola pod uslovima fermentacije (Maurizio Bettiga et al. Biotechnol Biofuels. 2008; 1: 16). Alternativna neposredna izomerizacija, primenom ksiloza-izomeraze, ispoljava nedostatak raspoloživih gena za ksiloza-izomerazu koji kombinuju aktivnu ekspresiju u eukariotskim mikroorganizmima (posebno kvasacu kao što je Saccharomyces cerevisiae), visoku katalitičku efikasnost, optimum temperature i pH prilagođen temperaturi fermentacije i nisku inhibiciju sporednim proizvodima, posebno ksilitolom. Jedan aspekt predmetnog pronalaska je opis ćelije kvasca koja eksprimira protein koji ima aktivnost ksiloza-izomeraze u ćeliji kvasca, da bi se ispunio ovaj zahtev.
[0003] Put koji uključuje ksiloza-izomerazu je prirodan za bakterijske vrste i za retke kvasce. Nasuprot oksido-reduktaznom putu, izomerazni put ne zahteva kofaktore. Izomerazni put se sastoji najmanje od pojedinačnih enzima, heterolognih ksiloza-izomeraza (XI), koje neposredno pretvaraju ksilozu u ksilulozu. Kao kod oksidoreduktaznog puta, dodatno poboljšanje prinosa može da se postigne koekspresijom heterologne ksiluloza-kinaze (XK).
[0004] Prvi gen koji funkcionalno eksprimira XI, bio je gen xylA iz anaerobne gljive Piromyces sp E2 (Kuyper M. et al. FEMS Yeast Res. 2003; 4(1): 69). Konstruisan je haploidni soj kvasca sa sposobnošću fermentacije ksiloze kao jedinog izvora ugljenika pod anaerobnim uslovima. Većina ksiloza-izomeraza su bakterijski proteini i glavna prepreka bila je njihova ekspresija u kvascu. Međutim, skorašnji rad je pokazao funkcionalnu ekspresiju u kvascu (tabela 1). Zahvaljujući ključnoj važnosti aktivnosti ksiloza-izomeraze u konceptu organizama koji fermentišu C5, poželjno je koristiti optimalne ksiloza-izomeraze. Iz prethodnih izveštaja saznajemo da ksiloza-izomeraza Clostridium phytofermentans obezbeđuje nizak, ali najviši raspoloživi tehnički standard po ovom pitanju. Poboljšana korisna svojstva ksiloza-izomeraza koje eksprimira ćelija kvasca u okviru ovog pronalaska su zato veoma poželjna.
[0005] Muzny et al opisuju soj sa ksiloza-izomerazom u okviru unosa podataka genske banke XP-002681255 koji je gotovo identičan sa divljim tipom Eubacterium saburreum DSM3986.
[0006] Brat et al., Functional Expression of a Bacterial Xylose Isomerase in Saccharomyces cerevisiae, Applied and Environmental Microbiology, Apr. 2009, p. 2304-2311, opisuju načine kloniranja i ekspresije novih vrsta XI iz Clostridium phytofermentans u S. cerevisiae. Brat et al. su pokazali da ćelije kvasca imaju sposobnost da metabolišu D-ksilozu i koriste je kao jedini izvor ugljenika i energije.
[0007] U WO2012/009272 opisana je fermentacija pentoze pomoću rekombinantnog mikroorganizma. WO2012/009272 dalje opisuje konstrukte rekombinantne nukleinske kiseline koja sadrži polinukleotid ksiloza-izomeraze, rekombinantnu ćeliju-domaćina gljive koja sadrži rekombinantni polinukleotid ksiloza-izomeraze i povezane postupke.
[0008] WO2011/078262 opisuje eukariotske ćelije sposobne da asimiluju ksilozu i postupke za transformaciju eukariotskih ćelija, kao što je kvasac, korišćenjem DNK koja kodira ksiloza-izomerazu koja potiče iz protista termita, i ove nove eukariotske ćelije sposobne da usvajaju ksilozu.
Tabela 1: Primeri ksiloza-izomeraza za primenu u kvascima
[0009] Transport šećera kroz membranu ne ograničava fermentaciju heksoznih šećera, mada može da ograniči metabolizam pentoze posebno u slučaju istovremene fermentacija heksoze i pentoze. Sprovedeno je nekoliko ispitivanja ekspresije transportera pentoze.
Kratak opis pronalaska
[0010] Cilj pronalaska je da obezbedi ćeliju kvasca sposobnu da koristi C5 šećere, posebno ksilozu. Iznenađujuće je nađeno da se protein opisan sekvencom SEQ ID NO. 2 (sekvenca prethodno objavljena u genskoj banci NCBI s pristupnim brojem ZP_07904696.1) ili njegova N-terminalno skraćena verzija kojoj nedostaje prvih 18 aminokiselina (mktknniictialkgdif) (SEQ ID NO. 8), funkcionalno eksprimira u eukariotskim mikrobnim ćelijama, posebno kvascima kao Saccharomyces cerevisiae, kada su ove ćelije transformisane vektorom koji nosi ekspresionu kasetu koja sadrži sekvencu DNK koja kodira pomenuti protein sekvence SEQ ID NO. 2, na primer molekul DNK opisan sekvencom SEQ ID NO. 1 (prethodno objavljena u genskoj banci kao deo pristupnog broja NZ_AEPWO1000073.1 GI:315651683).
[0011] Predmetni pronalazak tako obezbeđuje ćeliju kvasca koja eksprimira protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti, najpoželjnije 90% identičnosti, daleko najpoželjnije 95% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO. 2 ili sekvencom SEQ ID NO.8, i poseduje aktivnost ksiloza-izomeraze u eukariotskoj ćeliji.
[0012] Dalje je nađeno, da transformisane ćelije pokazuju povećanu brzinu potrošnje ksiloze u poređenju sa netransformisanim ćelijama.
[0013] Kao sledeći aspekt, fermentacija biomase iz medijuma koji sadrži ksilozu kao izvor ugljenika je poboljšana i količina metabolita obrazovanih takvim transformisanim sojevima pod ovim uslovima je povećana u poređenju sa transformisanim kontrolama.
[0014] Drugi aspekt se odnosi na biokatalitička svojstva eksprimiranog proteina i njegovu primenu kao biokatalizatora in situ ili u prečišćenom obliku za proizvodnju proizvoda od izomerizovanog šećera ili intermedijernih jedinjenja.
Slike
[0015]
Slika 1: Put korišćenja ksiloze.
Slika 2: Poređenje rasta kolonija Saccharomyces cerevisiae transformisanih ekspresionim vektorom za XI iz Eubacterium saburreum (Es XI), Piromyces sp. (Pi XI) i Clostridum phytofermentas (Cp XI). Kao negativna kontrola korišćen je soj transformisan samim ekspresionim vektorom pSCMB454 (Vektor). Broj 1 na skali odgovara slabom rastu nakon 6 dana, dok broj 4 odgovara veoma snažnom rastu nakon 6 dana.
Slika 3: Ekspresioni plazmid Map kvasca.
Slika 4: Ekspresioni plazmid za EsXI.
Slika 5: Poređenje rasta kulture kvasca Saccharomyces cerevisiae transformisanog ekspresionim vektorom za XI iz Eubacterium saburreum (Es XI) i Clostridum phytofermentas (Cp XI). Kao negativna kontrola korišćen je soj transformisan samim ekspresionim vektorom pSCMB454 (Vektor).
Slika 6: Aktivnost ksiloza-izomeraze u ekstraktima ćelija Saccahromyces cerevisiae koje eksprimiraju XI iz Eubacterium saburreum (Es-sh XI, rombovi) i Clostridum phytofermentas (Cp XI krugovi). Kao negativna kontrola korišćen je soj transformisan samim ekspresionim vektorom pSCMB454 (Vektor). Formule za linearne krive (Abs340nm=v*Vreme+Abs3min) su prikazane ispod legende. Zbog jasnoće, na grafiku je prikazana samo kriva za negativnu (Vektor) kontrolu.
Slika 7: Specifična aktivnost prečišćenih ksiloza-izomeraza: Eubacterium saburreum Es-sh XI i Clostridum phytofermentas Cp XI. Kao negativna kontrola korišćena je reakciona smeša bez enzima (samo pufer). Specifična aktivnost se izražava kao % pretvorene ksiloze pri odnosu enzima prema supstratu (E/S) od 0.05% tež./tež.
Slika 8: Određivanje optimalnog pH za prečišćene ksiloza-izomeraze: Eubacterium saburreum (Es-sh XI, rombovi) i Clostridum phytofermentas (Cp XI, krugovi). Kao negativna kontrola korišćena je reakciona smeša bez enzima (Puf, trouglovi). Aktivnost se izražava kao % maksimalne aktivnosti.
Slika 9: Određivanje optimalne temperature za prečišćene ksiloza-izomeraze: Eubacterium saburreum (Es-sh XI, rombovi) i Clostridum phytofermentas (Cp XI, krugovi). Kao negativna kontrola korišćena je reakciona smeša bez enzima (Puf, trouglovi). Aktivnost se izražava kao % maksimalne aktivnosti.
Slika 10: Određivanjue Km za prečišćene ksiloza-izomeraze: Eubacterium saburreum (Es-sh XI) i Clostridum phytofermentas (Cp XI).
Detaljan opis
Definicije
[0016] Aktivnost ksiloza-izomeraze se ovde definiše kao enzimska aktivnost enzima koji pripada klasi ksiloza-izomeraza (EC 5.3.1.5), katalizujući na taj način izomerizaciju različitih aldoznih i ketoznih šećera i druge enzimske sporedne reakcije svojstvene ovoj klasi enzima. Ocena pripadnosti proteina klasi ksiloza-izomeraza izvodi se ili na osnovu obrasca aktivnosti ili na osnovu razmatranja homologije, u zavisnosti od toga šta je relevantije u datom slučaju. Aktivnost ksiloza-izomeraze može da se odredi korišćenjem vezanog enzimskog fotometrijskog testa korišćenjem sorbitol dehidrogenaze.
[0017] Ekspresioni konstrukt ovde se definiše kao sekvenca DNK koja sadrži sve potrebne elemente sekvence za uspostavljanje ekspresije sadržanog otvorenog okvira čitanja (ORF) u ćeliji-domaćinu uključujući sekvence za započinjanje (promotori), završavanje i regulisanje transkripcije, mesta za započinjanje translacije, regione za stabilnu replikaciju ili integraciju u genom domaćina i selektabilni genetski marker. Funkcionalno uređenje može da bude već uspostavljeno ili dostignuto preuređivanjem (integracijom, itd.) u ćeliji-domaćinu. U poželjnom primeru izvođenja ekspresioni konstrukt sadrži promotor koji je funkcionalno vezan za otvoreni okvir čitanja praćen izbornom sekvencom terminatora. Regulatorne sekvence za ekspresiju u eukariotskim ćelijama sadrže sekvence promotora, vezujuća mesta za faktore regulacije transkripcije, sekvence za započinjanje translacije i sekvence terminatora. Regulatorne sekvence za ekspresiju u eukariotskim ćelijama označavaju DNK ili RNK kodirane regione koji se nalaze u funkcionalnoj vezi sa procesom transkripcije i/ili translacije kodirajućih lanaca DNK u eukariotskim ćelijama, kada se nađu povezane sa lancem DNK same, ili u kombinaciji sa drugim regulatornim sekvencama. Razmatraju se promotorske sekvence spojene sa inventivnim genima za ksiloza-izomerazu omogućavajući tako njihovu ekspresiju u eukariotskim ćelijama odabranih kvasaca ili gljiva. Kombinacija eukariotskog promotora i DNK sekvenci koje kodiraju ksiloza-izomerazu vodi ekspresiji ksiloza-izomeraze u transformisanoj ćeliji kvasca. Poželjni promotori su promotori kvasca Saccharomyces cerevisiae srednje do visoke aktivnosti, aktivni pod fermentativnim uslovima. Primeri takvih poželjnih promotora su promotori glikolitičkog puta ili transporta šećera, naročito promotori gena poznatih kao PFK1, FBA1, PGK1, ADH1, ADH2, TDH3 kao i njihove skraćene ili mutirane varijante. Elementi za uspostavljanje mitotske stabilnosti su poznati u stanju tehnike i sadrže polazno mesto replikacije 2µ plazmida S. cerevisiae, centromerne sekvence (CEN), autonomnu replikativnu sekvencu (ARS) ili homologne sekvence bilo koje dužine za pospešivanje integracije hromozoma putem spajanja homolognih krajeva. Selektabilni markeri uključuju genetske elemente koji se odnose na otpornost na antibiotike ćelije-domaćina. Primeri su kan i ble marker geni. Mogu da se koriste auksotrofni markeri koji komplementiraju definisane auksotrofije soja ćelijadomaćina. Primeri takvih markera koje treba pomenuti su geni i mutacije koje odražavaju put leucina (LEU2) ili uracila (URA3), ali i ksiloza-izomeraze.
[0018] Pojačana potrošnja ksiloze je ovde definisana kao bilo koja brzina potrošnje ksiloze koja rezultuje u rastu i umnožavanju ćelija, obrazovanju metabolita i/ili stvaranju energije koja je povećana u poređenju sa brzinom potrošnje ksiloze kod nemodifikovane ćelije (kulture) u odnosu na razmatrano svojstvo. Brzina potrošnje može da se odredi na primer fenomenološki praćenjem gustine obrazovanih ćelija ili veličine kolonija, određivanjem brzine potrošnje kiseonika, brzine obrazovanja etanola ili neposrednim merenjem koncentracije ksiloze u medijumu za rast tokom vremena. Potrošnja je u ovom kontekstu ekvivalentna terminima korišćenje, fermentacija ili razgradnja.
[0019] Geni uključeni u metabolizam ksiloze su opisani kod različitih autora i kodiraju transportere heksoze i pentoze, ksilulokinazu, ribuloza-5-fosfat-3-epimerazu, ribuloza-5-fosfat izomerazu, transketolazu, transaldolazu i homologne gene.
[0020] Ćelija koja eksprimira ksiloza-izomerazu ovde se pominje kao mikrobna eukariotska ćelija koja je genetski modifikovana tako da nosi ekspresioni konstrukt za ekspresiju opisane ksiloza-izomeraze. U poželjnom primeru izvođenja ćelija kvasca koja eksprimira ksilozaizomerazu je odabrana iz grupe Pichia, Pachysolen, Yarrowia, Saccharomyces, Candida, Arxula, Ashbya, Debaryomyces, Hansenula, Hartaea, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Trichosporon, Xanthophylomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, a najpoželjnije predstavlja Saccharomyces cerevisiae.
Detaljan opis pronalaska
[0021] Predmetna prijava obezbeđuje rešenja za genetsku konstrukciju eukariotskih ćelija sa pojačanim metabolizmom ksiloze, poboljšano obrazovanje biomase u prisustvu ksiloze i/ili poboljšano obrazovanje metabolita. Ovo su poželjna svojstva i prisutan problem za mnoge sojeve za industrijsku proizvodnju, posebno proizvodne sojeve roda Saccharomyces, da navedemo Saccharomyces cerevisiae kao neograničavajući primer. Prijava rešava ovaj problem obezbeđivanjem proteina i DNK sekvence gena za ksiloza-izomerazu koji se funkcionalno eksprimiraju u nižim eukariotskim ćelijama, posebno kvascima čiji su istaknuti primer kvasci roda Saccharomyces, da ponovo navedemo Saccharomyces cerevisiae kao neograničavajući primer. Stvoreni soj ćelija koje eksprimiraju ksiloza-izomerazu pokazuje potencijalno pojačanu potrošnju ksiloze. Željeno svojstvo aktivnosti ksiloza-izomeraze proizvedeno pomoću ćelije koja eksprimira ksiloza-izomerazu je teško postići na zadovoljavajući način sredstvima poznatim u stanju tehnike.
[0022] Predmetni pronalazak tako obezbeđuje ćeliju kvasca koja eksprimira protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti, poželjno 85% identičnosti, najpoželjnije 90% identičnosti, daleko najpoželjnije 95% identičnosti sa sekvencom SEQ NO.2 ili SEQ NO.8 i poseduje aktivnost ksiloza-izomeraze u ćeliji kvasca. U poželjnom primeru izvođenja, protein se sastoji od takve aminokiselinske sekvence. U drugom poželjnom primeru izvođenja, protein se sastoji od takve aminokiselinske sekvence fuzionisane sa drugim delom drugih proteina, poželjno delovima takvih proteina koji pokazuju visoke nivoe identičnosti sa poznatim ksiloza-izomerazama ili pokazanu aktivnost ksiloza-izomeraze sami po sebi.
[0023] U poželjnom primeru izvođenja, protein se sastoji od sekvence SEQ ID NO. 2, ili od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 80% identičnosti, najpoželjnije 90% identičnosti, daleko najpoželjnije 95% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO. 2 i poseduje aktivnost ksiloza-izomeraze u eukariotskoj ćeliji.
[0024] Homologni proteini će takođe sadržati sekvence skraćenog proteina sa očuvanom aktivnošću ksiloza-izomeraze. Poseban primer takve sekvence skraćenog proteina dat je kao sekvenca SEQ ID NO.8 ili njene varijante koje pokazuju najmanje 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO.8.
[0025] Protein ili kompozicija koja sadrži pomenuti protein, poželjno je drugačija od proteina ili kompozicije koja se dobija pri ekspresiji u prokariotskoj ćeliji. Protein je tako uopšteno onaj koji može da se dobije putem ekspresije u eukariotskoj ćeliji.
[0026] Protein poželjno pokazuje optimalnu aktivnost ksiloza-izomeraze u opsegu pH od 7.5 do 8.5, kao što je određeno postupkom opisanim u primerima.
[0027] Nivoi identičnosti mogu da se odrede pomoću kompjuterskog programa AlignX, koji se prodaje u paketu Vector-NTI-Package kod Lifetm Technology. Primenjena su podrazumevana podešavanja komponente paketa u verziji 10.3.0.
[0028] Stručnjaku u oblasti je jasno da se veliki broj različitih molekula DNK translatira u istu proteinsku sekvencu, i da će oni biti obuhvaćeni predmetnim pronalaskom kao takvi. Na taj način, takođe je obezbeđen molekul DNK koji sadrži (poželjno se sastoji od) DNK sekvence koja kodira protein, tj. protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti, poželjno 85% identičnosti, najpoželjnije 90% identičnosti, daleko najpoželjnije 95% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO. 2 i poseduje aktivnost ksilozaizomeraze u ćeliji kvasca, ili poželjni primer izvođenja kao što je gore ilustrovano, u kome je DNK sekvenca operativno vezana za eukariotsku regulatornu sekvencu, tj. regulatornu sekvencu koja omogućava ekspresiju u ćeliji kvasca. Neograničavajući primeri DNK sekvence su dati u sekvencama SEQ ID NO. 1 ili SEQ ID NO. 7. Postupci za kompjutersko poboljšanje DNK sekvenci u odnosu na nivoe proizvodnje proteina su poznati. Oni bez ograničenja uključuju postupke koji koriste statističku procenu poželjnih kodona (tabele upotrebe kodona), algoritme za predviđanje sekundarne strukture iRNK i statističke modele zasnovane na HMM ili NN. Poželjne su DNK sekvence predviđene iz ciljne proteinske sekvence, koje su optimizovane na taj način. Takođe su uključene DNK sekvence dobijene primenom rekurzivnih ili nerekurzivnih koraka mutageneze, i selekcijom ili skriningom poboljšanih varijanti. To je uobičajena tehnika za poboljšanje sekvence DNK i proteina i sekvence dobijene takvim postupcima ne mogu da se isključe iz inventivnog koncepta. To će se videti nezavisno od pitanja da li DNK sekvenca dobijena takvim eksperimentom ostavlja translatiranu proteinsku sekvencu nedirnutu, ili dovodi do mutacija u njima, sve dok nivoi identičnosti ne padnu ispod poželjno 75%, 80%, 85%, 90% ili 95% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO. 2 ili SEQ ID NO. 8, redom. Poželjni primer izvođenja zaista primenjuje takav postupak poboljšavanja za podešavanje opisanih molekula nukleinske kiseline i proteinskih sekvenci prema konkretnom problemu.
[0029] Drugi aspekt se odnosi na himerne sekvence stvorene fuzijom delova sekvence ksiloza-izomeraze sa delovima drugih proteina, poželjno delovima takvih proteina koji pokazuju visoke nivoe identičnosti sa poznatim ksiloza-izomerazama ili pokazuju aktivnost ksiloza-izomeraze sami po sebi, kao i na molekule nukleinskih kiselina koji kodiraju takve himerne proteine. Posebno će biti istaknute kao poželjne fuzije N-terminalnog dela sekvence SEQ ID NO.2 ili SEQ ID NO.8 proteina ili 5’-dela sekvence SEQ ID NO.1 ili SEQ ID NO.
7 molekula nukleinske kiseline. Autorima predmetnog pronalaska bilo je jasno da je korak izomerizacije ksiloze onaj kome je potrebna glavna promena, i da će za postizanje efikasnog fluksa ugljenika sa ksilozom kao polaznom jedinicom, možda biti neophodne dodatne promene ćelije koja eksprimira ksiloza-izomerazu. Pitanja poznata autorima uključuju transmembranski transport ksiloze, naročito preuzimanje iz medijuma za rast, fosforilaciju i metaboličke korake C5 šanta (neoksidativni deo šanta pentoza fosfata). Prema tome, dodatne promene uvedene u ćeliju kvasca, posebno one koje se odnose na rešavanje poznatih problema i promenu nivoa ekspresije gena uključenih u metabolizam ksiloze, predstavljaju poželjan primer izvođenja pronalaska. Redosled uvođenja takvih izmena u ćelije kvasca, koje mogu da se izvedu jedna za drugom ili paralelno, nasumičnim ili određenim redom, neće se izdvajati u ovom trenutku, i sve moguće strategije se smatraju sastavnim delom i posebnim primerima izvođenja pronalaska.
[0030] Predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju kvasca koja eksprimira protein koji se poželjno sastoji od sekvence SEQ ID NO. 2 ili SEQ ID NO. 8. Ćelija kvasca je poželjno odabrana iz grupe Pichia, Pachysolen, Yarrowia, Saccharomyces, Candida, Arxula, Ashbya, Debaryomyces, Hansenula, Hartaea, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Trichosporon, Xanthophylomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, a najpoželjnije predstavlja Saccharomyces cerevisiae. Pronalazak prema tome takođe obezbeđuje genetski modifikovanu ćeliju kvasca koja sadrži egzogeni gen za ksiloza-izomerazu funkcionalan u pomenutoj ćeliji kvasca, gde je poželjno egzogeni gen za ksiloza-izomerazu operativno vezan za sekvencu promotora i terminatora koje su funkcionalne u pomenutoj ćeliji kvasca. U poželjnom primeru izvođenja, egzogeni gen za ksiloza-izomerazu je molekul DNK. Genetski modifikovana ćelija kvasca je poželjno odabrana iz grupe Pichia, Pachysolen, Yarrowia, Saccharomyces, Candida, Arxula, Ashbya, Debaryomyces, Hansenula, Hartaea, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Trichosporon, Xanthophylomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, a najpoželjnije predstavlja Saccharomyces cerevisiae.
[0031] Ćelija kvasca koja ima povišene nivoe aktivnosti ksiloza-izomeraze poželjno se dobija transformacijom soja kvasca divljeg tipa sa DNK. Sledeći aspekt se odnosi na primenu ksiloza-izomeraze ili ćelije kvasca pronalaska koja eksprimira ksiloza-izomerazu za proizvodnju biohemikalija baziranu na sirovini koja sadrži ksilozu, kao što je putem fermentacije biomase. Biohemikalije uključuju biogoriva kao etanol ili butanol, kao i sirovine na bazi bio-materiajala za masovnu proizvodnju hemikalija, kao mlečna kiselina, itakonska kiselina, da nabrojimo neke primere. Lista mogućih biohemikalija je objavljena od strane Odeljenja za energiju SAD. Protein ili ćelija kvasca pronalaska takođe mogu da se koriste kao biokatalizator in situ ili u prečišćenom obliku za proizvodnju proizvoda od izomerizovanog šećera ili intermedijera, poželjno proizvoda od izomerizovanog šećera.
[0032] Sledeći aspekt pronalaska se odnosi na upotrebu enzima ksiloza-izomeraza izolovanog iz kvasca kao domaćina ekspresije, gde pomenuta ksiloza-izomeraza ne sadrži bakterijske kontaminante ili fragmente bakterijske prirode. Moguće primene takve ksiloza-izomeraze obuhvataju pripremu hrane i stočne hrane, gde prisustvo pomenutih kontaminanata čak i na veoma niskim nivoima predstavlja rizik za bezbednost proizvoda. Pitanje vezano za neposrednu primenu Eubacterium sabbureum kao domaćina za proizvodnju, mora da se reši u ovom trenutku. Primena ksiloza-izomeraze u kvascu predstavlja jasnu prednost.
Primeri
1. Identifikacija potencijalnih genskih sekvenci sa funkcijom ksiloza-izomeraze
[0033] Za nalaženje sekvenci ksiloza-izomeraze u genskoj banci izabran je program BlastP (Stephen F. Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 1997; 25: 3389-3402) na internet stranici NCBI za genomske sekvence BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi). Kao sekvenca za pretraživanje, izabrana je eksperimentalna proteinska sekvenca iz gena za ksiloza-izomerazu Escherichia coli K12 (SEQ ID NO. 3). Standardni parametri programa nisu modifikovani i ispitivanje je sprovedeno po bazama podataka bakterijskih proteina uključujući bazu podataka za Eubacterium saburreum DSM 3986 izgrađenu na rezultatima sekvencioniranja organizma metodom „sekvencioniranje sačmarom“ (pristupni broj NZ_AEPW01000000). Uzete su u obzir sekvence sa značajnim nivoom homologije celom dužinom sekvence. Pretraga je otkrila brojne potencijalne gene-kandidate koji su zatim klonirani u S. cerevisiae i ispitana je njihova funkcionalna ekspresija. Svi takvi geni-kandidati su obrađeni kao unos ZP_07904696.1 (SEQ ID NO. 2) što je ksiloza-izomeraza (EsXI) iz Eubacterium saburreum DSM 3986 kao što je opisano u narednim odeljcima. Unos povezane kodirajuće sekvence (NZ_AEPW01000073 REGION: 2583..3956: SEQ ID NO. 1) je uzet kao osnova za konstruisanje prajmera za kloniranje.
2. Amplifikacija gena za ksiloza-izomerazu (EsXI) iz Eubacterium saburreum DSM 3986
[0034] Postupci za rukovanje molekulima nukleinske kiseline su opšte poznati stručnjaku u oblasti i ovde su uključeni putem referenci (1. Molecular cloning: a laboratory manual, Joseph Sambrook, David William Russell; 2. Current Protocols in Molecular Biology. Last Update: January 11, 2012. Page Count: approx. 5300. Print ISSN: 1934-3639;.). Genomska matrica DNK iz Eubacterium saburreum DSM 3986 je nabavljena od DSMZ (Deutsche Stammsammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen). Parovi graničnih prajmera su dizajnirani da odgovaraju N- i C-terminalnim krajevima sekvence SEQ ID NO. 1. Za amplifikaciju verzije sekvence SEQ ID NO. 1 koja je skraćena na N-kraju, vezujući region sens-prajmera je premešten 54 bp nishodno (počevši sa A55). PCR reakcija je postavljena korišćenjem polimeraze visoke vernosti Finnzymes Phusion<tm>(HF-Buffer system) poštujući preporuke dobavljača za koncentracije dNTP, prajmera i pufera. Amplifikacija proizvoda PCR reakcije je urađena u aparatu Eppendorf Thermocycler korišćenjem standardnog programa za polimerazu Phusion (98°C 30" inicijalna denaturacija praćena sa 35 ciklusa koraka 98°C (20") - 60°C (20") - 72°C (1’20"), i finalne faze elongacije na 72°C tokom 10 minuta. Proizvodi PCR reakcije očekivane veličine su prečišćeni pomoću preparativne elektroforeze na TAE-Agarose gelu obojenom etidijum bromidom i izdvojeni sa gela upotrebom kita Promga Wizard SV-PCR and Gel Purification. Za fuziju C-terminalnog 6xHis-Tag, primarni proizvodi PCR reakcije su korišćeni kao matrica za ponovnu amplifikaciju celog fragmenta DNK korišćenjem produženog reverznog prajmera sa odgovarajućim 5’ produžetkom, pod istim uslovima (PCR sa hibridizacijom 6xHIS-Tag). Dobijeni proizvodi PCR reakcije su ponovo prečišćeni elektroforezom na agaroznom gelu i izdvojeni sa gela korišćenjem kita Promga Wizard SV-PCR and Gel Purification. On sadrži verziju gena EsXI sa C-terminalnim 6x-His TAG ili verziju gena Es-sh XI (skraćeni EsXI) sa C-terminalnim 6x-His TAG, redom.
[0035] Amplifikacija gena za ksiloza-izomerazu sa optimizovanim sastavom kodona je urađena sa optimizovanih genskih obrazaca naručenih od Geneart Regensburg, Germany. Optimizacioni algoritmi za optimizaciju sekvence su korišćeni kako je predvidela ova kompanija.
3. Kloniranje ORF EsXI i Es-shXI u ekspresioni plazmid Saccharomyces cerevisiae
[0036] Plazmidni preparat plazmida pSCMB454 izolovanog iz kulture Escherichia coli je linearizovan isecanjem pomoću endonukleaze XmnI i isečeni fragmenti su razdvojeni od neobrađenih vrsta pomoću elektroforeze na agaroznom gelu. Linearizovana strukturna osnova vektora je izdvojena sa gela prema uputstvima iz kita Promga Wizard SV-PCR and Gel Purification. Amplifikovani proizvodi PCR reakcije su klonirani u strukturnu osnovu vektora dobijenu digestijom sa XmnI korišćenjem standardnih postupaka za kloniranje. Transformacija je urađena na ćelijama Escherichia coli W Mach1, koje su hemijskim putem učinjene kompetentnim, prema protokolu dobavljača. Transformisane ćelije su gajene preko noći na pločama LB-Ampicillin i ispravnost im je ispitana pomoću plazmid MINI-prep sistema i kontrolnom digestijom, kao i sekvenciranjem DNK. Veća količina plazmidne DNK je pripremljena iz potvrđenog klona korišćenjem sistema Promega PureYield™ Plasmid Midiprep. Primer sekvence rezultujuće ekspresione kasete koja uključuje sekvencu GPD-promotora i terminatora cycl data je u sekvenci SEQ ID NO.6.
4. Transformacija Saccharomyces cerevisiae
[0037] Soj ATCC 204667 (MATa, ura3-52, mal GAL+, CUP(r)) Saccharomyces cerevisiae korišćen je kao domaćin za sve eksperimente transformacije.
[0038] Transformacija je izvedena korišćenjem standardnih postupaka poznatih stručnjaku u oblasti (videti, npr., Gietz, R.D. and R.A. Woods. (2002) Transformation of yeast by the LiAc/ss carrier DNA/ PEG method. Methods in Enzymology 350: 87-96). Kao selekcioni marker korišćena je intaktna verzija gena ura3 S. cerevisiae, sadržana u ekspresionom vektoru i transformisane ćelije su selektovane prema rastu na minimalnom medijumu bez uracila. Minimalni medijum se sastojao od 20 g·l-1 glukoze, 6.7 g·l-1 azotne baze za kvasac bez aminokiselina, 40 mg·l-1 L-tirozina, 70 mg·l-1 L-fenilalanina, 70 mg·l-1 L-triptofana, 200 mg·l-1 L-valina i 50 mg·l-1 svakog od adenin hemisulfata, L-arginin hidrohlorida, L-histidin hidrohlorid monohidrata, L-izoleucina, L-leucina, L-lizin hidrohlorida, L-metionina, L-serina i L-treonina. Vrednost pH je podešena do 5.6 i dodato je 15 g·l<-1>agara za dobijanje čvrstog medijuma.
5. Rast sojeva Saccharomyces koji eksprimiraju ksiloza-izomeraze na medijumu sa ksilozom
[0039]
A) Pojedinačne kolonije sojeva Saccharomyces transformisanih ekspresionim vektorom za ksiloza-izomerazu iz Eubacterium saburreum (Es XI) i Clostridum phytofermentas (Cp XI), kao i samim ekspresionim vektorom pSCMB454, prebačene su na ploče sa minimalnim medijumom sa glukozom kao jedinim izvorom ugljenika. Pojedinačne kolonije su zatim prenete na ploče sa minimalnim medijumom sa ksilozom kao jedinim izvorom ugljenika (20 g·l-1) i inkubirane na 30°C. Nakon 7 dana samo transformisane ćelije sa ekspresionim vektorima koji nose gen za ksilozaizomerazu su vidljivo rasle (sl.2).
Ispitivanje prosečne veličine kolonije sojeva Saccharomyces koji eksprimiraju različite ksiloza-izomeraze ukazuje na to da je najjači efekat primećen sa Es XI. Cp XI i Pi XI su imale slično izražene efekte u ovom fiziološkom testu, ali je efekat bio primetno slabiji nego kod Es XI. Negativna kontrola, soj Saccharomyces transformisan sa samim pSCMB454 (običnim vektorom), pokazala je samo slab pozadinski rast koji ne može da se razlikuje od pozadinskog rasta netransformisanog kvasca Saccharomyces.
B) Rast sojeva je procenjivan i na tečnom medijumu. Minimalni medijum sa 20 g·l<-1>ksiloze kao jedinog izvora ugljenika, s vrednošću pH podešenom na 5.6, inokulisan je jednom kolonijom. Nakon 7 dana, kulture su raspodeljene na jednake zapremine, skladištene na -80°C i korišćene kao polazne kulture za eksperiment rasta. Eksperiment rasta je izveden na istom minimalnom medijumu inokulisanom polaznim kulturama. Inkubacija je izvedena tokom 10 dana u bocama mućkanim na 250 obr/min, na 30°C. Rast je procenjen merenjem OD600nm(sl.5).
Kao što se može zaključiti sa slike 5, rast soja Saccharomyces transformisanog sa Es XI je malo jači nego soja sa Cp XI. Greške predstavljaju jednu standardnu devijaciju za 3 merene mućkane boce po soju i ukazuju na statističku značajnost merenja.
6. Priprema ekstrakata bez ćelija kvasca
[0040] Pojedinačne kolonije sojeva Saccharomyces koji eksprimiraju Es XI, Cp XI, prenete su na minimalni medijum koji sadrži 20 g·l<-1>ksiloze, 6.7 g·l<-1>azotne baze za kvasac bez aminokiselina. Vrednost pH je podešena do 5.6. Kulture su inkubirane aerobno na 30°C, 250 obr/min tokom 7 do 10 dana. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem i oprane jednom sterilnom vodom na RT, resuspendovane u sterilnoj dd vodi pri OD600nm> 200 i zamrznute na -80°C.
[0041] Zamrznuta ćelijska suspenzija je odmrznuta na ledu i podešena do OD600nm= 200. Na 1000 µl ćelijske suspenzije dodato je 100 µl štoka pufera NMDT (250 mM NaCl, 10 mM MnCl2, 1 mM DTT, 250 mM Tris/HCl pH 7.5) i 11 µl štoka PMSF (100 mM u izopropanolu). 500 µl puferisane ćelijske suspenzije je preneto u kit Precellys-Glass 0,5 mM (kat. broj #91 PCS VK05) i mehanički lizirano u homogenizatoru Precellys 24 (Peqlab). Liziranje je rađeno 2 x 15 sekundi na 5500 obr/min. Ostaci ćelija su uklonjeni centrifugiranjem na 13.200 g /4°C. Dobijeni lizat raspoređen u jednake zapremine, zamrznut u tečnom azotu i skladišten na -80°C.
7. Testovi za merenje aktivnosti ksiloza-izomeraze
[0042]
A) Za neka merenja aktivnosti ksiloza-izomeraze primenili smo spektrofotometrijski test na bazi sorbitol dehidrogenaze (SD). Kao proizvod ksiloza-izomeraze, obrazuje se izomerni šećer ksiluloza. U enzimskom testu, meri se količina proizvedene ksiluloze. Za merenje aktivnosti izomeraze u celokupnim ćelijskim lizatima, enzimski test je izveden u obliku povezanog testa XI-SD (sl. 6). Za sve druge eksperimente enzimski test je izveden u dva koraka, izomerizacije ksiloze kao prvog koraka, praćenog određivanjem koncentracije ksiluloze kao drugog koraka. U protokolu koji se sastoji od dva koraka, inaktivacija ksilozaizomeraze je izvedena (95°C, 10 min) nakon prvog koraka. Sastav smeše za enzimski test je dat ispod:
Test je izveden u mikrotitar pločama sa 96 bunarčića i kinetika je praćena na 340 nm. Procena enzimske aktivnosti u ekstraktima ćelija Saccharomyces cerevisiae koje eksprimiraju različite enzime XI (sl. 6) pokazalo je da je najviša aktivnost dobijena sa XI iz Eubacterium saburreum. Aktivnost XI iz Clostridum phytofermentas bila je merljiva i iznad pozadinskog nivoa ekstrakta ćelija bez XI, ali značajno niža u poređenju sa druga dva ekstrakta.
B) Za neka merenja aktivnosti ksiloza-izomeraze primenjen je postupak na bazi HPLC metoda. Količina proizvedene ksiluloze merena je indirektno preko smanjenja koncentracije ksiloze (sl. 7). Merenje je izvedeno pomoću H kolone i instrumenta Dionex Ultimate 3000.
8. Ekspresija ksiloza-izomeraze u E. coli, prečišćavanje ksiloza-izomeraze i merenja aktivnosti
[0043] Sve ksiloza-izomeraze su eksprimirane u ćelijama E. coli K12 Top10 pod inducibilnim promotorom za arabinozu korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Ekspresija XI je indukovana sa 0,02% arabinozom na 25°C i 200 obr/min tokom 14 časova. Kulture su sakupljne centrifugiranjem, supernatanti odbačeni i ćelije su resuspendovane u 100 mM fosfatnog pufera pH 7.0 pri OD600nmizmeđu 200 i 300. Ćelije su lizirane dejstvom ultrazvuka prema standardnim metodama prečišćavanja. Lizirane ćelije su centrifugirane 30 min na 20.000 g na 4°C. Izbistreni supernatanti su raspoređeni u jednake zapremine i zamrznuti na -80°C. Pre prečišćavanja lizati su odmrznuti na ledu i dodat je imidazol do finalne koncentracije od 10 mM. Prečišćavanje je urađeno na spin kolonama Ni-NTA od 500 µl (Biorad). Kolone su uravnotežene 100 mM fosfatnim puferom pH 7.0, i ćelijski lizati su naneti na kolone. Kolone su oprane jednom 100 mM fosfatnim puferom pH 7.0 sa 20 mM imidazola i eluirane istim puferom koji sadrži 250 mM imidazola. Uklanjanje imidazola i izmena pufera (iz fosfatnog u Tris-Cl) sprovedena je na kolonama Micro Bio-Spin (Biorad) prema uputstvu za upotrebu. Test SDS-PAGE je urađen na 10% gelovima (Birad Criterion XT) prema uputstvu za upotrebu. Svi proteini su prečišćeni do homogenosti (>99%). Koncentracija proteina je određena pomoću reagensa Bradford kompanije Biorad prema uputstvu za upotrebu. Goveđi serum albumin je korišćen kao standard. Svi prečišćeni proteini su dobijeni u finialnoj koncentraciji od približno 2 g/l.
[0044] Polazna merenja aktivnosti prečišćenih proteina su urađena pomoću metoda završne tačke na bazi HPLC (videti gore u tekstu). Merenja su izvedena pri odnosu enzima prema supstratu (odnos E/S) od 0.05%, na 60°C i tokom 2 časa. Nakon izomerizacije reakcije su inaktivirane kao što je prethodno opisano.
[0045] Analiza je korišćena kako bi se dobio uvid u specifičnu aktivnost prečišćenih enzima. Kao što je prikazano na slici 7, najviša specifična aktivnost je primećena sa XI Eubacterium saburreum (11.9%). Najniža specifična aktivnost je dobijena sa XI Clostridum phytofermentas (2.1%). Dobijeni podaci su konzistentni sa merenjima aktivnosti XI u sirovim ćelijskim ekstraktima. U oba slučaja dve nove izomeraze opisane u ovoj prijavi, imale su višu aktivnost od referentne Cp XI.
9. Određivanje optimuma pH za prečišćene ksiloza-izomeraze
[0046] Optimum pH vrednosti za prečišćene enzime XI je određen pomoću prethodno opisane enzimske analize završne tačke bazirane na sorbitol dehidrogenazi. Korišćen je opisani protokol koji sadrži dva koraka. Kao mera aktivnosti izomeraze, korišćena je količina oksidovanog NADH (NAD+; praćena kao smanjenje na 340 nm) na završnoj tački reakcije. Količina oksidovanog NADH je ekvimolarna količini molekula ksiluloze obrazovanih tokom koraka izomerizacije. Vodilo se računa da ne dođe do smanjenja NADH u bilo kojoj od reakcija korišćenih za određivanje optimalne pH vrednosti. Dva puferska sistema su korišćena za određivanje optimalne pH vrednosti: BisTris za pH 5.5-7.5 i Tris od 7.5-9.5. Poređenje enzimskih aktivnosti u dva puferska sistema je urađeno na pH 7.5. Nisu primećene nikakve značajne razlike.
[0047] Određeni optimum pH, kao što je prikazano na slici 8, pokazuje nekoliko razlika između referentne Cp XI i dva nova XI opisana u ovom pronalasku. Prvo: optimum pH za Cp XI je neutralan (pH=7.0) a optimum pH za Es XI i Cp XI se nalazi u alkalnoj oblasti (pH=8.0). Drugo: rezidualna aktivnost Es XI (pH=5.5) predstavlja 50% (niža strelica) od maksimalne aktivnosti. Rezidualna aktivnost Cp XI na pH=5.5 praktično je jednaka nuli. Treće: dva nova oblika XI obrazuju relativno širok pik između pH 7.0 (>90%, gornja strelica) i pH 8.0 (=100%). Kao poređenje, Cp XI zadržava <80% aktivnosti na pH=8.0.
10. Određivanje optimuma temperature za prečišćene ksiloza-izomeraze
[0048] Optimum temperature za prečišćene enzime XI je određen pomoću prethodno opisane enzimske analize završne tačke. Takođe, i u ovom eksperimentu se vodilo računa da ne dođe do smanjenja NADH u bilo kojoj od reakcija korišćenih za određivanje temperaturnog optimuma. Temperaturni gradijenti su napravljeni pomoću uobičajenih laboratorijskih aparata PCR cycler (Eppendorf).
[0049] Određivanje temperaturnog optimuma (slika 9) otkrilo je nekoliko razlika između referentne Cp XI i Es XI, opisanih u ovom pronalasku. Prvo: temperaturni optimum za Cp XI je definisan relativno oštrim pikom na 56.2°C. Es XI pokazuje značajno šire pikove u opsegu od 53.8°C do 61.6°C. Drugo: aktivnost Es XI na 67°C je oko 50%, a za Cp XI praktično je jednaka nuli. Zajedno uzevši, podaci o temperaturnom optimumu pokazuju da XI koje su opisane u ovoj prijavi imaju značajno veću temperaturnu stabilnost nego referentna Cp XI.
11. Određivanje Km za prečišćene ksiloza-izomeraze
[0050] Vrednosti Km su određene pomoću enzimske analize opisane u prethodnim primerima. Za eksperiment su korišćene ksiloza-izomeraze prečišćene iz E. coli.
[0051] Određivanje Km za prečišćene ksiloza-izomeraze pokazalo je Km za Es-sh XI od 18.4 mM. Vrednost Km za Cp XI (Km=36.6 mM). (Sl.10)
Lista sekvenci
[0052]
SEQ ID NO. 1: Sekvenca DNK sekvence koja kodira ksiloza-izomerazu (NZ_AEPW01000073.1 GI:315651683) Eubacterium sabbureum DSM 3986
SEQ ID NO.2: Proteinska sekvenca translatirane sekvence DNK iz Eubacterium sabbureum DSM 3986, koja kodira ksiloza-izomerazu (ZP_07904696.1) (EsXI)
SEQ ID NO.3: Ksiloza-izomeraza iz Eschericha coli (Protein)
SEQ ID NO.4: Ksiloza-izomeraza iz Clostridium phytofermentas (CpXI) (Protein)
SEQ ID NO.5: Ksiloza-izomeraza iz Piromyce sp. (Protein - PI_XI)
SEQ ID NO. 6: Ekspresiona kaseta EsXI (PODEBLJANA VELIKA SLOVA: kodirajuća sekvenca gena EsXI sa C-terminalnim fuzijom 6x-His-Tag i spajanje sa linkerom; MALA VELIKA SLOVA: GPD-promotor; podvučeno: ostaci XnmI mesta; italik: terminator CYC1)
SEQ ID NO. 7: Optimizovana DNK S. cerevisiae koja kodira skraćenu verziju Es-sh_XI sa C-terminalnom fuzijom 6xHis TAG.
SEQ ID NO 8: N-terminalno skraćena Es-sh_XI iz Eubacterium sabbureum DSM 3986
LISTA SEKVENCI

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Ćelija kvasca koja eksprimira protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% identičnosti, najpoželjnije 90% identičnosti, daleko najpoželjnije 95% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO. 2 i poseduje aktivnost ksiloza-izomeraze u ćeliji kvasca.
2. Ćelija kvasca prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što se protein sastoji od sekvence SEQ ID NO.2 i poseduje aktivnost ksiloza-izomeraze u ćeliji kvasca.
3. Ćelija kvasca prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se protein sastoji od sekvence SEQ ID NO. 8, ili od aminokiselinske sekvence koja ima najmanje 75% identičnosti, poželjno 80% identičnosti, najpoželjnije 90% identičnosti, daleko najpoželjnije 95% identičnosti sa sekvencom SEQ ID NO. 8 i poseduje aktivnost ksiloza-izomeraze u ćeliji.
4. Ćelija kvasca prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što protein ima optimum aktivnosti ksiloza-izomeraze u opsegu pH od 7.5 do 8.5.
5. Ćelija kvasca prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koja sadrži molekul DNK koji sadrži DNK sekvencu koja kodira protein, kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što je DNK sekvenca operativno vezana za eukariotsku regulatornu sekvencu.
6. Ćelija kvasca prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što se molekul DNK sastoji od sekvence SEQ ID NO.1 ili sekvence SEQ ID NO.7.
7. Ćelija kvasca prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time što je ćelija kvasca odabrana iz grupe Pichia, Pachysolen, Yarrowia, Saccharomyces, Candida, Arxula, Ashbya, Debaryomyces, Hansenula, Hartaea, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Trichosporon, Xanthophylomyces, Schizosaccharomyces, Zygosaccharomyces, a najpoželjnije predstavlja Saccharomyces cerevisiae.
8. Ćelija kvasca prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 koja sadrži egzogeni gen za ksiloza-izomerazu funkcionalan u pomenutoj ćeliji kvasca, naznačena time što je egzogeni gen za ksiloza-izomerazu operativno vezan za sekvence promotora i terminatora, koje su funkcionalne u pomenutoj ćeliji kvasca, što vodi ekspresiji proteina kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4.
9. Ćelija kvasca prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što egzogeni gen za ksilozaizomerazu predstavlja molekul DNK kao što je definisano u patentnom zahtevu 5 ili 6.
10. Upotreba ćelije kvasca prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za fermentaciju biomase iz medijuma koji sadrži ksilozu kao izvor ugljenika.
11. Upotreba ćelije kvasca prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 kao biokatalizatora in situ ili u prečišćenom obliku za proizvodnju proizvoda od izomerizovanog šećera, poželjno za proizvode od izomerizovanog šećera.
12. Postupak za proizvodnju proizvoda fermentacije odabranog iz grupe mlečne kiseline, sirćetne kiseline, sukcinske kiseline, aminokiselina, 1,3-propan-diola, etilena, glicerola, βlaktamskih antibiotika, cefalosporina, biogoriva, butanola, etanola, mlečne kiseline, itakonske kiseline, poželjno butanola, najpoželjnije etanola, pri čemu postupak obuhvata korake:
a) fermentacije medijuma koji sadrži izvor ksiloze ćelijom kvasca kao što je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9,
i izborno,
b) izdvajanja proizvoda fermentacije.
RS20171170A 2012-02-07 2013-02-07 Mikroorganizmi koji fermentišu pentozu RS56569B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP12000783.6A EP2626423A1 (en) 2012-02-07 2012-02-07 Pentose-fermenting microorganism
PCT/EP2013/052407 WO2013117631A1 (en) 2012-02-07 2013-02-07 Pentose fermenting microorganisms
EP13706186.7A EP2812430B1 (en) 2012-02-07 2013-02-07 Pentose fermenting microorganisms

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56569B1 true RS56569B1 (sr) 2018-02-28

Family

ID=47750621

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171170A RS56569B1 (sr) 2012-02-07 2013-02-07 Mikroorganizmi koji fermentišu pentozu

Country Status (19)

Country Link
US (2) US20140377813A1 (sr)
EP (2) EP2626423A1 (sr)
CN (1) CN104204202B (sr)
AU (1) AU2013218001B2 (sr)
BR (1) BR112014019578B1 (sr)
CA (1) CA2863734C (sr)
DK (1) DK2812430T3 (sr)
EA (1) EA035000B1 (sr)
ES (1) ES2643046T3 (sr)
HR (1) HRP20171583T1 (sr)
HU (1) HUE035703T2 (sr)
MX (1) MX350005B (sr)
MY (1) MY171359A (sr)
NO (1) NO2812430T3 (sr)
PL (1) PL2812430T3 (sr)
RS (1) RS56569B1 (sr)
SI (1) SI2812430T1 (sr)
WO (1) WO2013117631A1 (sr)
ZA (1) ZA201405761B (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9187743B2 (en) 2013-03-11 2015-11-17 E I Du Pont De Nemours And Company Bacterial xylose isomerases active in yeast cells
CA2991707C (en) 2015-07-13 2023-08-01 MARA Renewables Corporation Enhancing microbial metabolism of c5 organic carbon
BR112018002284A2 (pt) 2015-08-05 2018-12-11 Cargill Inc método de fermentação para produzir um bioproduto, levedura crabtree negativa geneticamente engenheirada e método para reduzir a produção de glicerol por uma levedura engenheirada
EP3559210A1 (en) * 2016-12-21 2019-10-30 Vib Vzw Xylose isomerases that confer efficient xylose fermentation capability to yeast
KR20200135469A (ko) * 2018-03-27 2020-12-02 바스프 에스이 자일로스 대사 효모

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60325457D1 (de) * 2002-01-23 2009-02-05 Royal Nedalco B V Fermentation von pentosezuckern
DE102008031350B4 (de) * 2008-07-02 2011-02-10 Johann Wolfgang Goethe-Universität Frankfurt am Main Prokaryotische Xylose-Isomerase zur Konstruktion Xylose-vergärender Hefen
CN102791858B (zh) * 2009-12-22 2014-11-26 株式会社丰田中央研究所 木糖异构酶及其利用
WO2012009272A2 (en) * 2010-07-14 2012-01-19 Codexis, Inc. Pentose fermentation by a recombinant microorganism

Also Published As

Publication number Publication date
US20140377813A1 (en) 2014-12-25
US20160312177A1 (en) 2016-10-27
EA035000B1 (ru) 2020-04-16
CA2863734A1 (en) 2013-08-15
EP2626423A1 (en) 2013-08-14
AU2013218001A1 (en) 2014-08-28
EP2812430A1 (en) 2014-12-17
CN104204202B (zh) 2017-08-01
HRP20171583T1 (hr) 2017-12-01
MY171359A (en) 2019-10-10
BR112014019578A8 (pt) 2017-07-11
MX2014009496A (es) 2014-09-11
PL2812430T3 (pl) 2018-02-28
SI2812430T1 (en) 2018-03-30
NO2812430T3 (sr) 2018-02-03
BR112014019578B1 (pt) 2022-10-11
EP2812430B1 (en) 2017-09-06
ZA201405761B (en) 2015-11-25
ES2643046T3 (es) 2017-11-21
BR112014019578A2 (en) 2019-10-15
HUE035703T2 (en) 2018-05-28
DK2812430T3 (en) 2017-10-23
WO2013117631A1 (en) 2013-08-15
MX350005B (es) 2017-08-22
CA2863734C (en) 2020-03-24
CN104204202A (zh) 2014-12-10
EA201400877A1 (ru) 2015-01-30
AU2013218001B2 (en) 2016-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11624057B2 (en) Glycerol free ethanol production
US7833764B2 (en) DNA encoding xylitol dehydrogenase
WO2015028583A2 (en) Glycerol and acetic acid converting cells with improved glycerol transport
JP2004532008A (ja) Ｌ−アラビノースの利用のための操作菌類
AU2002233382A1 (en) Engineering fungi for the utilisation of L-arabinose
US20200024619A1 (en) Improved glycerol free ethanol production
CA3094172A1 (en) Methods for ethanol production using engineered yeast
US20160312177A1 (en) Pentose fermenting microorganisms
WO2019185737A1 (en) Xylose metabolizing yeast
Dmytruk et al. Autophagy-related gene ATG13 is involved in control of xylose alcoholic fermentation in the thermotolerant methylotrophic yeast Ogataea polymorpha
US8748152B1 (en) Prevotella ruminicola xylose isomerase and co-expression with xylulokinase in yeast for xylose fermentation
WO2015141705A1 (ja) 耐酸耐塩性付与方法と耐酸耐塩性酵母を用いた有用物質生産
JP7298674B2 (ja) エタノール発酵によるエタノール生産性の向上に関与する変異遺伝子及びこれを用いたエタノールの製造方法
JP7298673B2 (ja) エタノール発酵によるエタノール生産性の向上に関与する変異遺伝子及びこれを用いたエタノールの製造方法
CA3045740C (en) Improved glycerol free ethanol production
CA3081833A1 (en) Mutant gene associated with improvement in ethanol productivity via ethanol fermentation and method for producing ethanol using the same
Kokaew et al. Cloning and nucleotide sequence analysis of xylose reductase (XR) gene from thermotolerant methylotrophic yeast Ogataea siamensis N22