RS56595B1 - Derivati estrogena za upotrebu u lečenju neuroloških poremećaja - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Prikazani pronalazak je iz oblasti medicine. Pronalazak se određenije odnosi na nove medicinske upotrebe jedne estrogenske komponente, estetrola (1,3,5(10)-estratrien-3,15α,16α,17βtetrola).

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0002] Neurološki poremedaji, naročito poremedaj centralnog nervnog sistema (CNS), obuhvataju brojne tegobe, uključujudi inter alia akutne povrede CNS (npr., hipoksično-ishemijske encefalopatije, moždani udar, traumatske povrede mozga, povrede kičmene moždine, cerebralnu paralizu), neurodegenerativne bolesti (npr., Alchajmerovu bolest, Parkinsonovu bolest, frontotemporalnu demenciju), i veliki broj diskuncija centralnog nervnog sistema (npr. depresiju, epilepsiju, i šizofreniju).

[0003] Neonatalna hipoksično-ishemijska encefalopatija (HIE) je neurološki poremedaj koji izaziva oštedenje delija mozga kod novorođenčadi usled neadekvatnog snabdevanja kiseonikom. Hipoksija i ishemija mozga usled sistemske hipoksemije i smanjenog cerebralnog protoka krvi (CBF) su primarni razlozi koji dovode do neonatalne HIE pradene sa povredama sive i bele materije koje se javljaju kod novorođenčadi. Neonatanalna HIE može izazvati smrt u periodu rođenja ili dovesti do kasnije prepoznatog zaostajanja u razvoju, metalne retardacije ili cerebralne paralize (CP). Čak iako su različite terapeutske strategije razvijene u skorije vreme, neonatalna HIE ostaje ozbiljno stanje koje izaziva značajnu smrtnost i morbidnost kod novorođenčadi pri rođenju ili u bliskom periodu, i prema tome ostaje izazov za perinatalnu medicinu.

[0004] U toku proteklih nekoliko godina, model pacova sa hipoksičnim povredama mozga je postao najkorišedniji model u perinatalnoj medicini. 7. dana posle rođenja (P7; dan rođenja = P1), mozak pacova je histopatološki sličan onome 32-do 34-nedelje gestacije humanog fetusa ili novorođenog deteta, tj., cerebralno neuronsko raslojavanje korteksa je gotovo, germinalni matriks je uključen i bela materija je ved podlegla malo mijelinaciji. U cilju dobijanja hipoksično-ishemijskog oštedenja mozga na 7-dana starim mladuncima pacova, oni su podvrgnuti unilateralnoj uobičajenoj ligaciji pradenoj sa sistemskom hipoksijom dobijenom inhalacijom 8% kiseonik/izbalansiran azotom, na konstantoj temperaturi (37°C) (Vanucci et al.2005. Dev Neurosci, vol.27, 81-86).

[0005] Model na pacovu je obezbedio važne informacije u vezi sa mehanizmima koji su u osnovi perinatalanih hipoksično-ishemijskih povreda mozga i kako povreda tkiva može biti sprečena ili minimizirana terapeutskom intervencijom. Posebno, fiziološka i terapeutska manipulacija su primenjene na model nezrelih pacova sa perinatalnim hipoksično-ishemijskim oštedenjem mozga u cilju procene potencijalnih tretmana, uključujudi hipotermiju, lečenje ksenonom i davanje eritropoietina.

[0006] Neuroprotektivna sredstva koja obedavaju, obuhvataju antiepileptične lekove, eritropoietin, melatonin i ksenon. Podaci životinjskih modela asfiksije dalje sugerišu da neurološki ishod HIE može biti poboljšan dodavanjem terapija adjuvanata pri hiperotermiji, polazedi u statima ili danima posle oštedenja. Ove obedavajude terapije treba da sada budu procenjene u kliničkim ispitivanjima. Faza 1-2 kliničkih ispitivanja pomodu biomarkera, npr., spektroskopijom fosforne magnetne rezonance, i uključivanje malog broja dece su ključ za procenu sigurnosti i potencijalne efikasnosti pre uzimanja novih lečenja za pragmatična ispitivanja. Faza 1-2 ispitivanja ksenona i eritropoietina su ved planirane ili u toku.

[0007] Terapije neuroloških poremedaja, naročito povreda CNS ili neurodegenerativnih povreda, mogu se usredsrediti na zaštitu mozga ili kičmene moždine od oštedenja ili povradaj aktivnosti nervnim delijama, npr., preko upotrebe neutrotropnih faktora. Neurotrofni faktori, kao što su npr., epidermalni faktor rasta (EGF) i transformišudi faktor rasta-alfa (TGF-α), su polipeptidi koji različito podržavaju opstanak, proliferaciju, diferencijaciju, veličinu i funkcionisanje nervnih delija. Lečenje neuroloških poremedaja može takođe obuhvatati davanje stem delija da bi se zamenile one nervne delije koje su izgubljene prirodnom delijskom smrdu, povrednom ili bolešdu.

[0008] Problem koji se srede sa davanjem takvih neurotrofnih fakora ili stem delija je krvno-moždana barijera, koja može omesti njihov prenos iz krvotoka u CNS. Prema tome, tretmani često zahtevaju direktnu primenu neurotrofnog faktora ili infuziju delija na mesto povrede ili oštedenja CNS kod subjekta kome je potreban taj tretman.

[0009] Imajudi u vidu slabost uspešnih tretmana generalno za neurološke poremedaje, postoji potreba za dodatnim terapeutskim sredstvima i postupcima, koja se poželjno ne oslanjaju na invazivne intrakranijalne postupke ili supstance sa poboljšanim prolazom kroz krvno-moždanu membranu.

SUŠTINA PRONALASKA

[0010] Prikazani pronalazak je definisan priloženim patentim zahtevima i njima je ograničen. Prikazani pronalazak se odnosi na jedan ili više diskutovanih potreba iz stanja tehnike. Kao što je prikazano u eksperimentalnom delu, pronalazači su ustanovili da estrogenska komponenta, estetrol, ima efekata na lečenje povreda mozga u hipokapusnom regionu. Na primer, pronalazači su iznenađujude pokazali da lečenje mladunaca pacova estetrolom ih štiti naspram povreda mozga usled hipoksije-ishemije. Takođe posebno, lečenje mladunaca pacova sa izvesnim estrogenim komponentama čiji je primer estetrol, posle (tj., nakon) hipoksije-ishemije je pokazano da dovodi do manje povreda mozga, potvrđujudi da ova jedinjenja pokazuju pogodne terapeutske efekte. Pored toga, pokazano je da lečenje mladunaca pacova sa izvesnim estrogenskim jedinjenjima, čiji primer je estetrol, pospešuju neurogenezu i vaskulogenezu.

[0011] Estetrol (E4) je estrogenska steroidna supstanca sintetizovana isključivo u fetalnoj jetri u toku humane trudnode i dolazi u majčin krvotok preko placente. Nađen je u majčinom urinu ved u 9 nedelja gestacije, značajno rastudi kako trudnoda napreduje (Holinka et al. 2008. J Steroid Biochem Mol Biol, vol. 110, 138-143). Nekonjugovani E4 je takođe nađen u amnionskoj tečnosti. Estetrol je glavni metabolit estradiola (E2), nastao iz njegovih prekursora pomodu hidroksilacije.

[0012] E4 se veruje da je manje aktivan u poređenju sa E2 usled njegovog niskog afiniteta za vezivanje receptora estrogena u poređenju sa E2. Kompetitivna ispitivanja vezivanja za receptor su otkrila nizak afinitet vezivanja E4 za nuklearne i citosolne receptore estrogenska relativno u odnosu na E2, pokazujudi vrednosti za vezivanje za citosolni receptor estrogena od 1,0 i 0,015 za E2 i E4, respektivno(Holinka et al. supra). E4 deluje kao slabi estrogen u stimulaciji rasta kultivisanih MCF-7 delija koje reaguju na estrogen u poređenju sa E2: jačina E2 je pokazano da je 50 puta viša od E4.

[0013] Warmerdam et al. 2008 (Climacteric, vol. 11 (suppl. 1), 59-63) su zabeležili particioni koeficijent oktanol-voda (Pow) koji je mera lipofilnih ili hidrofilnih osobina jedinjenja, izražen kao logratiam Pow ili "Pow Log" - estetrola, Pow Log = 1,47 ili 1,695, u zavisnosti od eksperimentalnih uslova. Zbog toga što se Pow Log od 2,0 smatra optimalnim da omogudi prolaz jedinjenjima kroz barijeru krv-mozak (Warmerdam et al. 2008, supra), jače neurozaštitno dejstvo estetrola na modelu pacova sa neonatalnim HIE je iznenađujude.

[0014] Skorašnji i klinički podaci podržavaju potencijalnu kliničku upotrebu E4 za primene kao što su hormonska terapija, kontracepcija, prevencija osteoporoze i valunga u menopauzi, terapija kacera i lečenje i prevencija kardiovaskularnih patologija. Prema našim saznanjima, ne postoje efekti estrogenskih komponenti prikazani sa E4 na centralni nervni sistem koji su do sada opisani.

[0015] Prema tome, u jednom aspektu, prikazani opis obezbeđuje estrogenu komponentu koja je izabrana iz grupe koju čine:

estrogenske supstance koje imaju formulu (I):

gde su R1, R2, R3, R4svaki nezavisno vodonikom atom, hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; gde svaki od R5, R6, R7hidroksilna grupa; i gde nisu više od 3 od R1, R2, R3, R4atomi vodonika; prekursori estrogenskih supstanci; i smeša jedne ili više estrogenskih supstanci i/ili prekursora ; za upotrebu u lečenju neuroloških poremedaja.

[0016] Opis se naročito odnosi na estrogenu komponetu izabranu iz grupe koju čine:

estrogenske supstance koje imaju formulu (I):

gde su R1, R2, R3, R4svaki nezavisno atom vodonika, hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; gde svaki od R5, R6, R7je hidroksilna grupa; i gde ne više od 3 R1, R2, R3, R4su atomi vodonika; prekursori estrogenskih supstanci, gde su prekursori derivati estrogenskih supstanci, gde atom vodonika bar jedne hirdoksilne grupe je supstituisan sa acil radikalom ugljovodonične karboksilne, sulfonske ili sulfamske kiseline 1-25 ugljenikovih atoma; tetrahidrofuranil; tetrahidropiranil; ili glikozidni ostatak sa ravnim ili razgranatim lancem koji sadrži 1-20 glikozidnih jedinica po ostatku; i smeše jedne ili više estrogenskih supstanci i/ili prekursora; za upotrebu u lečenju neurološkog poremedaja.

[0017] Prikazani opis takođe obezbeđuje postupak za lečenje neurološkog poremedaja kod pacijenta kome je potrebno takvo lečenje, koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine estrogenske komponete kao što je ovde navedeno pomenutom pacijentu.

[0018] Prikazani opis takođe obezbeđuje upotrebu estrogenske komponente kako je ovde navedeno za proizvodnju leka za lečenje neurološkog poremedaja.

[0019] U poželjnim izvođenjima R3predstavlja hidroksilnu grupu ili alkoksi grupu sa 1-5 ugljenikovih atoma, poželjnije R3predstavlja hidroksilnu grupu.

[0020] U poželjnim izvođenjima, bar 2, poželjnije 3 od R1, R2, R3i R4predstavljaju vodonikove atome. U naročito poželjnim izvođenjima, R1, R2i R4predstavljaju vodonikove atome.

[0021] U izvesnim izvođenjima, R3predstavlja hidroksilnu grupu ili alkoksi grupu sa 1-5 ugljenikovih atoma, poželjnije R3predstavlja hidroksilnu grupu, i bar 1, poželjnije bar 2, i čak poželjnije sva 3 grupa R1, R2i R4predstavljaju vodonikove atome.

[0022] U prikazanom pronalasku R1, R2i R4predstavljaju vodonikove atome i R3, R5, R6i R7su hidroksilne grupe; stoga, estrogenska supstanca ili estrogenska komponenta je 1,3,5(10)-estratrien-3,15,16,17-tetrol. Uprikazanom pronalasku, estrogenska supstanca ili estrogenska komponenta je 1,3,5(10)-estratrien3,15α,16α,17β-tetrol (estetrol).

[0023] U poželjnim izvođenjima, prekursori su derivati estrogenskih supstanci, gde atom vodonika bar jedne od hidroksilnih grupa je supstituisan sa acil radikalom ugljovodonične karboksilne, sulfonske ili sulfamske kiseline sa 1-25 ugljenikovih atoma; tetrahidrofuranil; tetrahidropiranil; ili glikozidnog ostataka sa ravnim ili razgranatim lancem koji sadrži 1-20 glikozidnih jedinica po ostatku.

[0024] Kao što je zabeležano, prikazani pronalazak obezbeđuje za estrogenske komponente kao što je gore nevedeno upotrebu u lečenju povreda mozga u hipokampusnom regionu.

[0025] U poželjnim izvođenjima, prikazani opis obezbeđuje estrogenu komponentu za koju je zahtevana zaštita, za upotrebu u tretmanu lečenja neurološkog poremedaja, tj., lečenja neurološkog poremedaja, gde je estrogenska komponenta davana subjektu kod koga je dijagnoziran neurološki poremedaj.

[0026] Pod izrazom "neurološki poremedaj " generalno se misli na poremedaj koji napada nervni sistem, uključujudi centralni nervni sistem i periferni nervni.

[0027] Neurološki poremedaj je povreda, poželjno povreda centralnog nervnog sistema, poželjnije povreda mozga ili neurodegenerativna bolest. Poželjno, neurološki poremedaj je prema tome izabran iz grupe koju čine povreda mozga, povreda kičmene moždine i neurodegenerativna bolest. U prikazanom pronalasku neurološki poremedaj je povreda mozga.

[0028] U poželjnom pronalasku, neurološki poremedaj je izabran iz grupe koju hipoksična povreda mozga, anoksična povreda mozga, traumatska povreda mozga.

[0029] Pod izrazima "hipoksična povreda" ili "anoksična povreda" se misli na povredu mozga kao rezultat nedostatka kiseonika ili usled mehanizama hipoksije (tj., smanjenog snabdevanja mozga kiseonikom) ili anoksije (tj potpunog nedostatka kiseonika u mozgu), respektivno. Hipoksične/anoksične povrede mogu bili lokalizovane na površini(nama) mozga ili na celom mozgu. U prikazanom pronalasku, hipoksične /anoksične/traumatske povrede mozga utiču na hipokampus.

[0030] U poželjnim izvođenjima prikazanog pronalaska, neurološki poremedaj je hipokično-ishemijska encefalopatija (HIE).

[0031] Pod izrazima "hipoksično-ishemijska encefalopatija" ili "HIE" specifično se ovde misli na stanje koje se javlja kada je ceo mozak lišen adekvatnog snabdevanja kiseonikom, ali nedostatak nije potpun. Neadekvatno snabdevanje kiseonikom može biti hipoksično po prirodi, tj., smanjeno snabdevanje kiseonika, i/ili ishemijskog porekla, tj., nedostatak kiseonika je usled poremedaja krvotoka. U prikazanom pronalasku, HIE utiče na hipokapus.

[0032] U naročito poželjnim izvođenja prema prikazanom pronalasku, estrogenska komponenta za koju je tražena zaštita je korišdena u lečenju neonatalne hipoksično-ishemijske encefalopatije (HIE).

[0033] Ovde korišdeni, izraz "lečenje neonatalne HIE" može obuhvatati zaštitu od oštedenja mozga, i može dalje obuhvatati sprečavanje, ublažavanje simptoma u vezi sa, ili smanjenje stepena neonatalnih poremedaja u vezi HIE, kao što su, npr., zaostajanje u razvoju, mentalna retardacija, ili cerebralna paraliza (CP) (ublažavanje CP obuhvata na primer poboljšanje u motornonim bihejvioralnim, i/ili kognitivnim funkcijama). Ovde korišden izraz "cerebralna paraliza" odnosi se na grupu stanja koja su karakterizovana hroničnim poremedajima kretanja ili držanja. Cerebralna paraliza može biti pradena poremedajima sa napadima, senzornim oštedenjima i/ili kognitivnim ograničenjima.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0034]

Slika 1 Post-operativne telesne mase mladučandi pacova.

Post-operativne telesne mase mladučadi pacova kojima su injektovane intraperitonealno od 4. dana do 7.dana ili nosač (rastvor soli) (nosač), 5 mg/kg E4 (E45 mg/kg) ili 50 mg/kg E4 (E450 mg/kg) ili nije injektovano (kontrola). Prikazana je srednja vrednost ± SEM telesne mase 7 mladunaca pacova iz kontrolne grupe, 11 mladunčad pacova grupe sa nosačem, 7 mladunaca pacova iz grupe E45 mg/kg i 5 mladunaca pacova iz grupe E450 mg/kg.

Slika 2 Masa mozgova mladunaca pacova. Mase mozgova mladunaca pacova kojima su injektovani intraperitonealno od dana 4 do dana 7 ili nosača (rastvor soli) (nosač), 5 mg/kg E4 (5 mg/kg) ili 50 mg/kg E4 (50 mg/kg) ili nije injektovano (kontrola). Pokazana je srednja vrednost ± SEM mase mozgova posle žrtvovanja dana 14. posle davanja, 7 mladunaca iz kontrolne grupe, 11 mladunaca pacova iz grupe nosača, 7 mladunaca pacova iz grupe E45 mg/kg i 5 mladunaca pacova iz grupe E4 50 mg/kg. Scalebar: 2mm.

Slika 3 Bojenje hematoksilin-eozinom delova mozga hipokampusnog regiona mladunaca pacova.

Mozak mladunaca pacova je uklonjen posle žrtvovanja 14.dana posle davanja i uzorci su fiksirani sa paraformaldehidom i smešteni u parafin pri čemu je nastavljeno sa sekcionisanjem hipokampusnog regiona bojenjem hematoksilin-eozinom. Mladuncima pacova je ili injektovano intraperitonealno od dana 4. do dana 7. ili nosač (rastvor soli) (nosač), 5 mg/kg E4 (E45 mg/kg) ili 50 mg/kg E4 (E450 mg/kg) ili nije injektovano (kontrolna grupa).

Slika 4 Brojanje intaktnih delija u hematoksilineozin-obojenim delovima moza mladunaca pacova.

Intakne delije su brojanje u hipokampusu zoni dentatnog girusa (DG), subgranularnoj zoni (SGZ) i kornu amonis (CA1, CA2/CA3) i u korteksu na delovima mozga obojenim hematoksilin-eozinom mladunaca pacova. Intaktne delije su brojane pri povedanju 400x na 3 polja odgovarajudeg oblasti mozga i srednja vrednost je izražena kao intaktni broj delija po vidnom polju. Prikazana je srednja vrednost ± SEM intaktnog broja delija / vizuelnog polja mase 7 mladunaca pacova iz kontrolne grupe, 11 mladunaca pacova grupe sa nosačem, 7 mladunaca pacova iz grupe E45 mg/kg i 5 mladunaca pacova iz grupe E450 mg/kg.

Slika 5 Post-operativna telesna masa mladunaca pacova koji su pretnodno tretirani sa estetrolom.

Svakog navedenog postnatalnog dana (X-osa), 6 stubaca predstavlja, od leva ka desno, postoperativnu telesnu masu (u g) mladunčadi pacova kojima respektivno, nije injektovan nosač ili E4 (kontrolna grupa, n=24), injektovan intraperitonealno od 4. postnatalnog dana do zaključno 7. dana nosač (grupa sa nosačem, n=14), injektovan intraperitonealno od 4. postnatalnog dana do zaključno 7. dana 1 mg/kg E4 (n=11), injektovano intraperitonealno od 4. postnatalnog dana do zaključno 7. dana 5 mg/kg E4 (n=14), injektovano intraperitonealno od 4. postnatalnog dana do zajključno 7. dana 10 mg/kg E4 n=(14), ili injektovano intraperitonealno od 4. postnatalnog dana do zaključno 7. dana 50 mg/kg E4 (n=19). Postnatalnog dana 7, 30 minuta posle injekcije, mladunci pacova su podvrgnuti hipoksično-ishemijskim uslovima. Kontrolne životinje su prošle sličnu proceduru bez hipoksičnoishemijskih uslova. Merenja su izražena kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 6 Masa mozga mladunaca pacova koji su prethodno tretirani sa estetrolom. Telesna masa (u g) mladunaca pacova kojima nije injektovan nosač ili E4 (Kontrolna hrupa, n=24), ili intraperitonealno injektovan od 4. postnatalnog dana do zaključno 7. dana nosač (grupa sa nosačem, n=14), 1 mg/kg E4 (n=11), 5 mg/kg E4 (n=14), 10 mg/kg E4 (n=14) ili 50 mg/kg E4 (n=19). Postnatalnog dana 7, 30 minuta posle poslednje injekcije, mladunci pacova su podvrgnuti hiposkično-ishemijskim uslovima. Kontrolne životinje prošle su kroz slične postupke bez hipoksično ishemijskih napada. Merenja su izražena kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 7 Bojenje hematoksilin-eozinom koronalnih preseka mozga i brojanje intaktnih delija kod mladunaaca pacova koji su prethodno tretirani sa estetrolom. Mladuncima pacova (a) nije injektovan nosač ili E4 (kontrolna grupa, n=14), ili je injektovan od 4. postnatalnog dana do zaključno 7. dana (b) nosač (grupa sa nosačem, n=16), (c) 1 mg/kg E4 (n=10), (d) 5 mg/kg E4 (n=13), (e) 10 mg/kg E4 n=(10) ili (f) 50 mg/kg E4 (n=14).7. postnatalnog dana, 30 minuta posle poslednje injekcije, mladunci pacova su podvrgnuti hipoksično-ishemijskim uslovima. Kontrolne životinje su prošle sličnu proceduru u hipoksično-ishemijskim uslovima. Mozgovi su uklonjeni posle žrtvovanja 14. postnatalnog dana i uzorci su fiksirani paraformaledehidom i smešteni u parafin koronalno su isečeni u regionu hipokampusa. Prikazano je bojenje hematokslin-eozinom (A) moždanih koronalnih preseka (scale bar: 2mm), (B) regiona hipokampusa (scale bar: 500 μm), i (C) korteksa(scale bar: 100 μm) ispitivanih gupa. (D) Intaktne delije su brojanje u različitim regionima hipokampusa: dentatni girus (DG), subgranularna zona (SGZ), i kornu amonis (CA1, CA2/CA3), i na korteksu na koronalnom preseku mozga bojenom sa hematoksilin-eozinom mladunaca pacova. Intaktne delije su brojanje pri povedanju od 400x u 3 polja odgovarajudih oblasti mozga i prosečna vrednost je izražena kao intaktni broj delija po vizuelnom polju. Za svaki navedeni region mozga (DG, SGZ, CA1, CA2/3, korteks na X-osi), 6 stubaca predstavlja, od leva ka desnom, intaktni broj delija po vizuelnom polju mladunca pacova, respektivno, kontrolne grupe, grupe sa nosačem, mladunaca pacova tretiranih sa 1 mg/kg E4, mladunaca pacova tretiranih sa 5 mg/kg E4, mladunaca pacova tretiranih sa 10 mg/kg E4 ili mladunaca pacova tretiranih sa 50 mg/kg E4. Sva merenja su prikazana kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 8 Bojenje proteina 2 vezanog za mikrotubule (MAP2) moždanih koronarnih preseka kod mladunaca pacova koji su prethodno tretirani sa estetrolom. Mladuncima pacova (a) nije injektovan nosač ili E4 (kontrolna grupa), ili je injektovano intraperitonealno od 4. podnatalnog dana do zaključno 7. dana uključujudi (b) nosač (grupa sa nosačem), (c) 1 mg/kg E4, (d) 5 mg/kg E4, (e) 10 mg/k gE4 ili (f) 50 mg/kg E4. 7. postnatalnog dana, 30 minuta posle poslednje injekcije, mladunci pacova su podvrgnuti hipoksično-ishemijskim uslovima. Kontrolne životinje su prošle slične postupke bez hipoksično-ishemijskih uslova. Mozgovi su uklonjeni posle žrtvovanja 14. postnatalog dana i uzorci fiksirani sa formaldehidom i smešteni u parafin su koronarno isečeni u regionu hipokapusa . Preseci su obrađivani za detekciju neuronskog citoskeletnog poremedaja preko imohistološkog bojenja sa anti-MAP2 antitelom. (A) MAP2 bojnenje moždanih koronarnih preseka (scale bar: 2 mm) je prikazano. (B) Odnos MAP2 pozitivnih oblasti je izračunat kao MAP2 pozitivna oblast ipsilateralne hemisfere podeljene sa MAP2 pozitivne oblasti kontralateralne hemisfere. 10 uzoraka iz svake ispitivane grupe je analizirano. Odnos MAP2 pozitivne oblasti u kontrolnoj grupi je uzet kao podrazumevajuda vrednost 1.

Slika 9 Bojenje dablkortinom (DCX) i vaskularnim endotelijalnim faktorom rasta (VEGF) hipokampusa i korteksa mladunaca prethodno tretiranih sa estetrolom. Mladuncima pacova nije injektovan ni nosač ni E4 (kontrolna grupa), ili je injektovano intraperitonealno posnatalnog 4.dana do zaključno 7. dana 7 nosač (grupa sa nosačem), 1 mg/kg E4, 5 mg/kg E4, 10 mg/kg E4 ili 50 mg/kg E4. Postnatalnog 7. dana , 30 minuta posle zadnje injekcije, mladunci pacova su podrvrgnuti hipoksično-ishemijskim uslovima. Kontrolne životinje su podvrgnute sličnim postupcima bez hipoksično-ishemijskih uslova. Mozgovi su uklonjeni posle žrtvovanja 14. postnatalnog dana i uzorci su fiksirani paraformaldehidom i stavljeni u parafin su kornarno isečeni u hipokampusnom regionu. Preseci su dvostruko bojeni sa anti-DCX antitelima i anti-VEGF antitelima. Procenat DCX (A) i VEGF (B) pozitivnih delija je kvantifikovan kao zbir ili DCX ili VEGF pozitivno bojenih delija podeljen sa ukupnim brojem DAPI pozitivnih delija. Napravljena je kvantifikacija u različitim regionima hipokampusa ((dentatni girus (DG), kornu amonis 1 (CA1), kornu amonis 2/3 (CA2/CA3)), i korteks. 10 uzoraka je analizirano u grupama kontrolnoj, 1 mg/kg E4, 5 mg/kg E4, 10 mg/kg E4, 50 mg/kg E4 i u poređenju sa 12 uzoraka iz grupe sa nosačem. Za svaki navedeni region mozga (DG, CA1, CA2/3, korteks na X-osi), 6 stubaca predstavlja, od levog do desnog, perocenat DCX (A) ili VEGF (B) pozitivnih delija, respektivno, u kontrolnoj grupi, grupi sa nosačem, 1 mg/kg E4 grupi, 5 mg/kg E4 grupi, 10 mg/kg E4 grupi, ili 50 mg/kg E4 grupi. Sva merenja su prikazana kao srednja vrednsot ± SEM.

Slika 10 Eksperija S100B i glijarnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) u krvnom serumu mladunaca pacova koji su prethodno tretirani sa estetrolom. Mladunci pacova nisu injektovani sa nosačem ili sa E4 (kontrolna grupa, n=20 i n=21 za S100B i GFAP, respektivno), ili injektovani intraperitonealno od 4. postnatalog dana do zaključno 7. dana sa nosačem (grupa sa nosačem, n=13 i n=15 za S100B i GFAP, respektivno), 1 mg/kg E4 (n=10 i n=11 za S100B i GFAP, respektivno), 5 mg/kg E4 (n=11 i n=11 za S100B i GFAP, respektivno), 10 mg/kg E4 (n=13 id n=10 za S100B i GFAP, respektivno) ili 50 mg/kg E4 (n=19 i n=18 za S100B i GFAP, respektivno). 7, postnatalnoog dana, 30 minuta posle poslednje injekcije, mladunci pacova su podvrgnuti hipoksično-ishemijskim uslovima. Kontrolne životinje su prošle kroz slične postupke bez hipoksično-ishemijskih uslova. Uzorci krvi su uzeti posle žrtvovanja 14. postnatalnog dana. ELISA za S100B i GFAP proteini su prirpemljeni za ispitivanje koncentracije S100B (A) GFAP (B) u krvnom serumu. Sva merenja su prikazana kao srednja vrednsot ± SEM.

Slika 11 Postoperativna telesna masa mladunaca pacova koji su tretirani sa estetrolom. 7. postnatalnog dana, mladunci pacova su podvrgnuti i hipoksično-ishemijskim uslovima. Posle oporavka od hipoksije, mladunci pacova su injektovani intraperitonealno sa jednom dozom nosača (grupa sa nosačem, n=20), 1 mg/kg E4 (n=16), 5 mg/kg E4 n=19), 10 mg/kg E4 (n=17) ili 50 mg/kg E4 (n=15). Kontrolne životinje su podvrgnute sličnim postupcima bez hipoksično-ishemijskih uslova i njima nije injektovan nosač ni E4 (kontrolna grupa, n=29). Svakog navedenog postnatalnog dana (X-osa), 6 stubaca predstavlja, od leva ka desno, postoperativne telesne mase (u g) mladunaca pacova iz, respektivno, kontrolne grupe, grupe sa nosačem, 1 mg/kg E4 grupe, 5 mg/kg E4 grupe, 10 mg/kg E4 grupe, ili 50 mg/kg E4 grupe. Merenja su izražena kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 12 Masa mozga mladunaca pacova koji su tretirani sa estetrolom. 7. postnatalnog dana, mladunci pacova su podvrgnuti hipoksično-ishemijskim uslovima. Posle oporavka od hipoksije, mladuncima pacova je injektovano intraperitonealno jedna doza nosača (grupa sa nosačem, n=20), 1 mg/kg E4 (n=16), 5 mg/kg E4 n=19), 10 mg/kg E4 (n=17) ili 50 mg/kg E4 (n=15). Kontrolne životinje su podvrgnute sličnim postupcima bez hipoksično-ishemijskih uslova i njima nije injektovan ni nosač ni E4 (kontrolna grupa, n=29). Prikazana je masa mozga (u g) mladunaca pacova. Merenja su izražena kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 13 Bojenje hematoksilin-eozinom koronalnih preseka mozga i brojanje intaktnih delija mladunaca pacova koji su tretirani sa estetrolom.

7. postnatalnog dana, mladunci pacova su podvrgnuti hipoksično-ishemijskim uslovima. Posle oporavka od hipoksije, mladuncima pacova je injektovano intraperitonealno jedna doza (b) nosača (grupa sa nosačem, n=10), (c) 1 mg/kg E4 (n=10), (d) 5 mg/kg E4 (n=10), (e) 10 mg/kg E4 (n=10) ili (f) 50 mg/kg E4 (n=10). Kontrolne životinje (a) su podvrgnute sličnim postupcima bez hipoksičnoishemijskih uslova i nije im injektovan ni nosač ni E4 (kontrolna grupa, n=10). Mozgovi su uklonjeni posle žrtvovanja 14. postnatalnog dana i uzorci fiksirani paraformaldehidom i smešteni u parafin su podvrgnuti koronalnom sečenju u regionu hipokampusa, a zatim bojeni sa hematoksilin-eozinom. Prikazano je bojenje hematoksilin-eozinom (A) koronalnih preseka mozga (scale bar: 2mm), (B) hipokampusnog regiona (scale bar: 500µm), i (C) korteksa(scale bar: 100 μm). (D) Intaktne delije su brojane u različitim regionima hipokamupsa: dentatni girus (DG), subgranularna zona (SGZ), i kornu amonis (CA1, CA2/CA3), i u korteksu na hematoksilin-eozinom bojenim koronalnim presecima mozga. Intaktne delije su brojane pri uvedanu od 400x na 3 polja odgovarajude oblasti mozga i prosečna vrednost je izračena kao broj intaktnih delija po vizuelnom polju. Za svaki navedeni region mozga (DG, SGZ, CA1, CA2/3, korteks na X-osi), 6 stubaca predstavlja, od leva ka desno, intaktni broj delija po vizuelnom polju mladunaca pacova, respektivno iz, kontrolne grupe, grupe sa nosačem, mladunaca pacova tretiranih sa 1 mg/kg E4, mladunaca pacova tretiranih sa 5 mg/kg E4, mladunaca pacova tretiranih sa 10 mg/kg E4, ili mladunaca pacova tretiranih sa 50 mg/kg E4. Sva merenja su prikazana kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 14 Bojenje proteina 2 vezanog za mikrotubule (MAP2) na moždanim koronarnim presecima kod mladunaca pacova tretiranih sa estetrolom. 7. postnatalnog dana, mladunci pacova koji su podvrgnuti hipoksično-ishemijskim uslovima. Posle oporavka od hipoksije, mladunci pacova su injektovani intraperitonealno sa jednom dozom (b) nosača (grupa sa nosačem, n=10), (c) 1 mg/kg E4 (n=10), (d) 5 mg/kg E4 (n=10), (e) 10 mg/kg E4 (n=10) ili (f) 50 mg/kg E4 (n=10). Kontrolne životinje (a) su podvrgnute sličnim postupcima bez hipoksično-ishemijskih uslova i nisu injektovani ni sa nosačem ni E4 (kontrolna grupa, n=10). Uklonjeni su mozgovi posle žrtvovanja 14. postnatalnog dana i uzorci fiksirani u paraformaldehidu i stavljeni u parafin su koronarno isečeni u hipokampusnom regionu. Preseci su obrađeni za detekciju neuronsko citoskeletnog poremedaja pomodu imunohistološkog bojenja sa antiMAP2 antitelom. Prikazano je (A) MAP2 bojenje koronalnih preseka mozga (scale bar: 2 mm). (B) Odnos MAP2 pozitivnih površina je izračunata kao MAP2 pozitivne površine ipsilateralne hemisfere podeljen sa MAP2-pozitivnom površinom koronalne hemisfere . 10 uzoraka iz svake grupe je analizirano. Odnos MAP2 pozitivne površine u kontrolnj grupi je uzet u obzir kao podrazumevajuda vrednost 1.0.

Slika 15 Bojenje dablkortina (DCX) i vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) u hipokamusu i korteksu mladunaca pacova tretiranih sa estetrolom. 7. postnatalnog dana, mladunci pacova su podvrgnuti hipoksično-ishemijskim uslovima. Posle oporavka od hipoksije , mladunci pacova su injektovani intraperitonealno sa jednom dozom nosača (grupa sa nosačem, n=10), 1 mg/kg E4 (n=10), 5 mg/kg E4 (n=10), 10 mg/kg E4 (n=10) ili 50 mg/kg E4 (n=10). Kontrolne životinje (a) su podvrgnute sličnim psotupcima bez hipoksično-ishemijskih uslova i nisu injektovani ni sa nosačem ili ni E4 (kontrolna grupa, n=10). Mozgovi su uklonjeni posle žrtvovanja 14. postnatalnog i uzorci fiksirani paraformaldehidom i smešteni u parafin su isečeni koronatno u regionu hipokampusa. Preseci su dvostruko bojeni sa anti-DCX antitelom i anti-VEGF antitelom. Procenat DCX (A) i VEGF (B) pozitivnih delija je kvantifikovan kao zbir ili DCX ili VEGF pozitivno obojenih delija podeljen sa ukupnim brojem DAPI pozitivnih delija. Kvantifikacija je učinjena u različitim regionima hipokamusa ((dentatni girus (DG), kornu amonis1 (CA1), kornu amonis 2/3 (CA2/CA3)), i korteksa. 10 uzoraka je analizirano u svakoj ispitivanoj grupi. Za svaki navedeni region mozga (DG, CA1, CA2/3, korteks na X-osi), 6 stubaca predstavljano, od leva na desno, procenat DCX (A) ili VEGF (B) pozitivnih delija u, respektivno, kontrolnoj grupi, grupi sa nosačem, 1 mg/kg E4 grupi, 5 mg/kg E4 grupi, 10 mg/kg E4 grupi, ili 50 mg/kg E4 grupi. Sva merenja su prikazana kao srednja vrednost ± SEM.

Slika 16 Ekspresija S100B i glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) u krvnom serumu mladunaca pacova koji su tretirani sa estetrolom. 7. postnatalnog dana, mladunci pacova su podvrgnuti hipoksično-ishemijskim uslovima. Posle oporavka od hipoksije, mladuncima pacova je injektovano u jednoj dozi nosač (grupa sa nosačem, n=14 i n=16 zaS100B i GFAP, respektivno)), 1 mg/kg E4 (n=13 i n=15 za S100B i GFAP, respektivno), 5 mg/kg E4 (n=16 i n=15 za S100B i GFAP, respektivno), 10 mg/kg E4 (n=13 i n=13 za S100B i GFAP, respektivno) ili 50 mg/kg E4 (n=15 i n=14 za S100B i GFAP, respektivno). Kontrolne životinje (a) koje su podvrgnute sličnim postupcima bez hipoksično-ishemijskih uslova nisu injektovane ni sa nosačem ni E4 (kontrolna grupa, n=20 i n=21 za S100B i GFAP, respektivno). Uzorci krvi su izvađeni posle žrtvovanja 14. postnatalnog dana. ELISA za S100B i GFAP proteine su izvedene za ispitivanje koncentracije S100B (A) GFAP (B) u krvnom serumu. Sva merenja su prikazana kao srednja vrednost ± SEM.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

[0035] Prikazani pronalazak je definisan priloženim zahtevima i njima je ograničen. Ovde korišdeni oblici jednine uključuju i jedninu i množinu ukoliko kontekst jasno ne sugeriše drugačije.

[0036] Izrazi "sadrži", "sastoji se" i "obuhvata" koji su ovde korišdeni su sinonimi sa "uključujudi", "uključuje" ili "obuhvatajudi", "ima", i uključujudi su ili otvoreni i ne isključuju dodatne, nenavedene članove, elemente ili korake postupka. Izraz takođe obuhvata "sastoji se od" i "sastoji se u suštini od".

[0037] Navođenje numeričkih opsega sa krajnjim tačkama obuvata sve brojeve i razlomke koji nalaze u odgovarajudim opsezima, kao i navedene krajnje tačke.

[0038] Izraz "oko" koji je ovde korišden odnosi se na merljive vrednosti kao što su parametar, količina, vremensko trajanje i slično se misli da obuhvata varijacije i od navedene vrednosti, naročito varijacije /-10% ili manje, poželjno /-5% ili manje, poželjnije /-1% ili manje, i još poželjnije /-0,1% ili manje i od navedene vrednosti, dokle god su varijacije odgovarajude da se izvede opisani pronalazak. Razume se da vrednost na koju modifikator "oko" se odnosi sam je takođe specifično i poželjno opisan.

[0039] Dok je izraz "jedan ili više", jedan ili više članova grupe članova, jasan za sebe, kao dalji primer, izraz obuhvata inter alia pozivanje na bilo kog pomenutog člana, ili bilo koja dva ili više pomenutih članova, kao što su, npr. bilo koja ≥3, ≥4, ≥5, ≥6 ili ≥7 itd. od pomenutih članova, i do svih pomenutih članova.

[0040] Osim ukoliko nije drugačije navedeno, svi izrazi korišdeni u opisu pronalaska, obuhvatajudi tehničke i naučne izraze, imaju značanje koje se uobičajeno podrazumeva od strane stručnjaka oblasti u koju spada pronalazak. Kao dalje objašnjenje, definicije izraza mogu biti obuhvadene da bolje ocene opis prikazanog pronalaska. Kada su izvesni termini objašnjeni ili definisani u vezi sa određenim aspektom ili izvođenje, namera je da se takva značenja primenjuju u čitavom opisu, tj., takođe za sve druge aspekte ili izvođenja, osim ukoliko nije drugačije navedeno ili ukoliko kontekst jasno ne sugeriše suprotno. Navedeni pronalazači su našli da estetrol i slične estrogenske komponente imaju neuro-zaštitne efekte, kako je prikazano na ustanovljenom modelu neonatalne hipoksično-ishemijske encefalopatije kod mladunaca pacova. Oni su takođe otkrili da estetrol i sprodna estrogenske komponente pokazuju terapeutske efekte kako je pozanao na istom modelu neonatalne hipoksično-ishemijske encefalopatije. Pored toga, oni su ustanovili da estetrol i srodne estrogenske komponente izazivaju ili pospešuju neurogenezu i vaskulogenezu u mozgu mladunaca pacova.

[0041] Ovde korišden izraz "estrogenska komponenta" odnosi se na estrogensku supstancu kao što je ovde rečeno, njenog prekursora ili smešu jedne ili više pomenutih estrogenskih supstanci i/ili prekursora.

[0042] U izvesnom izvođenju, estrogenska komponenta je izabrana iz grupe koju čine:

estrogenske supstance koje imaju formulu (I), u kojoj je R1atom vodonika, hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; gde je R2vodonikov atom, hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; gde je R3vodonikov atom, hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; gde je R4vodonikov atom, hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; gde je R5hidroksilna grupa; gde je R6is hidroksilna grupa; gde je R7hidroksilna grupa; i gde ne više od 3 R1, R2, R3, i R4su vodonikovi atomi; prekursori estrogenskih supstanci; i smeše jedne ili više estrogenskih supstanci i/ili prekursora.

[0043] U izvesnim izvođenjima, estrogenska komponenta je izabrana iz grupe koju čine: prekursori estrogenskih supstanci; i smeše jedne ili više estrogenskih supstanci i/ili prekursora.

[0044] U prikazanom opisu, estrogenska komponenta je izabrana iz grupe koju čine: estrogenska supstance koje imaju formulu (III):

gde je R1vodonikov atom, hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; gde je R2vodonikov atom, hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; gde je R3vodonikov atom, hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; gde je R4vodonikov atom, hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; i gde je bar jedan od R1, R2, R3, i R4hidroksilna grupa, ili alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma; prekursori estrogenskih supstanci; i smeše jedne ili više estrogenskih supstanci i/ili prekursora.

[0045] Izraz "alkoksi grupa sa 1-5 ugljenikovih atoma" može takođe biti obeležen kao "C1-5alkoksi" ili "C1-5alkiloksi" i odnosi se na radikal koji ima formulu: -OR<a>gde je R<a>C1-5alkil kao što je ovde definisano. Neograničavajudi primeri pogodni za C1-5alkiloksi obuhvata metiloksi, etiloksi, propiloksi, izopropiloksi, butiloksi, izobutiloksi, sek-butiloksi, terc-butiloksi, i pentiloksi. Estrogenske supstance kao što je navedeno ovde se razlikuju od estrogena biološkog i sintetičkog porekla koji se uobičajeno koriste u farmaceutskim formulacijama u 5-članom prstenu stereoidnog skeleta sadrže bar 3 hidroksilne supstance pre nego 0-2.

[0046] Estrogenske supstance takođe obuhvataju njihove steroizomerne oblike, njihove farmaceutski prihvatljive adicione soli, hidrate i solvate.

[0047] Estrogenske supstance predstavljene formulama (I) i (III) obuhvataju različite enantiomere s obzirom da ugljenikovi atomi koji nose hidroksilne supstituente, naročito R5, R6i R7, su hiralno aktivne. U poželjnim izvođenjima , estrogenska supstanca je 15α-hidroksi supstituisana. U drugim poželjnim izvođenjima supstanca je 16α-hidroksi susptituisana. U još drugim poželjnim izvođenjima, supstanca je 17β-hidroksi supstituisana. Najpoželjnije estrogenske supstance su 15α, 16α, 17βtrihidroksi supstitusiane. Druge hiralni aktivni ugljenikovi atomi u steroidnoj strukturi estrogenskih supstanci kako je ovde opisano poželjno imaju konfiguraciju koja odgovara ugljenikovim atomima u 17β-estradiolu i drugim biogenim estrogenima.

[0048] Poželjno, estrogene supstance koje su ovde korišdenje su takozvani biogeni estrogeni, tj. estogeni koji se javljaju prirodno u telu čoveka. Zbog toga što su biogeni estrogeni prirodno prisutni u fetusnom i ženskom telu, ne očekuje se javljanje nepoželjnih dejstva, naročito ne ukoliko nivoi seruma kao posledica endogenog davanja ne nadilaze u suštini koncentracije koje se prirodno javljaju.

[0049] U poželjnim izvođenjima, bar jedan, poželjnije samo jedan od R1, R2, R3, R4predstavlja hidroksilnu grupu, što znači da estrogenske supstance sadrže bar 4, poželjnije baš 4, hidroksilne grupe. U slučaju estrogenske supstance koja sadrži 4 hidroksilne grupe, takođe može biti obeležen kao tetrahidroksilovani estrogen. Primeri komercijalno dostupnih estrogena koji sadrže bar 4 hidroksilne grupe ili njihove prekursore su: 1,3,5(10)-estratrien-2,3, 15α, 16α, 17βpentol 2-metil etar; 1,3,5(10)-estratrien-2,3, 15β, 16α, 17β-pentol 2-metil etar; 1,3,5(10)-estratrien-3, 15α, 16α, 17βtetrol; 1,3,5(10)-estratrien-3, 15α, 16α, 17β-tetrol tetra acetat; ili 1,3,5(10)-estratrien-3, 15β, 16β, 17βtetrol tetraacetat.

[0050] U naročito poželjnim izvođenjima, estrogenska supstanca je 1,3,5(10)-estratrien-3, 15, 16, 17-tetrol. Prema pronalasku estrogena supstanca je estetrol. "Estetrol", "1,3,5(10)-estratrien-3, 15α, 16α, 17β-tetrol" i "E4" su sinonimi i korišdeni su zamenjivo ovde da se odnose na estrogensko jedinjenje, poznato da se proizvodi u prirodi iz fetusne humane jetre samo u toku trudnode. Tetrahidroksilovani estrogen, naznačen je prisustvom četiri hidroksilne grupe, kao njegov akronim E4. Njegova opšta formula je predstavljana formulom (II):

[0051] Prikazani opis se takođe odnosi na upotrebu prekursora estrogenskih supstanci kako je ovde navedeno. Ovi prekursori su u stanju da oslobađaju estrogenske supstance, naročito kada se koriste prema pronalasku, npr., kao rezultat metaboličke konverzije.

[0052] Poželjno, ovi prekursori su derivati estrogenskih supstanci, gde vodonikov atom bar jedne hidroksilne grupe je supstituisan sa acil radikalom ugljovodoničnim karboksilne, sulfonske ili sulfamske kiseline 1-25 ugljenikovih atoma; tetrahidrofuranila; tetrahidropiranila; ili pravih ili razgranatih glikozidnog ostatka koji sadrže 1-20 glikozidnih jedinica po ostatku.

[0053] Neograničavajudi primeri prekursora prema prikazanom opisu su esteri koji mogu biti dobijeni reagovanjem hidroksilnih grupa estrogenskih supstanci koje sadrže jednu ili više karboksi (M<+>OOC-) grupa, gde M<+>predstavlja vodonik ili (akalni) metalni katjon. Prema tome, naročito poželjni primeri prekursora su derivati estrogenskih supstanci, gde vodonikov atom bar jedne od hidroksilnih grupa u (I) ili (II) ili (III) je supstituisan sa -CO-R, gde R je ugljovodonični radikal koji sadrži od 1-25 ugljenikovih atoma, poželjno R je vodonik, ili alkil, alkenil, cikloalkil ili aril radikal koji sadrži od 1-20 ugljenikovih atoma.

[0054] Izraz "alkil", kao grupa ili deo grupe, odnosi se na hidrokarbil radikal formule Cn<H>2n+1 gde je n broj u opegu od 1 do oko 25. Poželjno, alkil grupe ovde sadrže od 1 do 20 ugljenikoviha toma, kao što su 1 do 10 ugljenikovih atoma, od 1 do 5 ugljenikovih atoma, od 1 do 4 ugljenikovih atoma, ili od 1 do 3 ugljenikovih atoma, poželjnije od 1 do 2 ugljenikova toam. Alkil grupe mogu biti prave ili razgranate i mogu biti supstituisane kao što je ovde nevedeno. Kada se koristi subskript ovde posle uljenikovog atoma, subskrit se odnosi na broj ugljenikovih atoma koji navedena grupa može da sadrži. Prema tome, na primer, C1-5alkil označava alkil sa jedan do pet uljenikoviha toma. Primeri alkil grupa, naročito C1-5alkil grupa, su metil, etil, propil, izopropil, butil, izobutil, sek-butil, terc-butil, 2-metilbutil, pentil, izo-amil i njihovi izomeri.

[0055] Izraz "alkenil", kao grupa ili kao deo grupe, odnosi se na nezasidenu hidrokarbil grupu, koja može biti prava ili razgranata, koja sadrži jednu ili više ugljenik-ugljenik dvostrukih veza. Alkenil grupe mogu sadržati bar 2 ugljenikova atoma, kao što su od 2 do oko 25 ugljenikovih atoma, i kako je ovde korišdeno poželjno od 2 do oko 20 ugljenikovih atoma, kao što je od 2 do 10 ugljenikovih atoma, od 2 do 5 ugljenikovih atoma, od 2 do 4 ugljenikovih atoma, ili od 2 do 3 ugljenikovih atoma. Primeri alkenil grupa su etenil, 2-propenil, 2-butenil, 3-butenil, 2-pentenil , 2-heksenil i njegovi izomeri, 2,4-pentadienil i slično.

[0056] Izraz "cikloalkil", kao grupa ili deo grupe, odnosi se na zasideni ili delimično nezasideni hidrokarbil radikal koji ima 1 (tj., monociklični) ili više, kao što je 2 (tj., biciklični), ciklične struktue . Dalje prstenovi cikloalkil radikala sa više prstenova mogu biti ili kondenzovani, premošdeni i/ili spojeni preko jednog ili više spiro atoma. Cikloalkil grupe mogu sadržati nezavisno 3 ili više ulgljenikovih atoma, kao što je od 3 do 25 ugljenikovih atoma, poželjno od 3 do 20 ugljenikovih atoma, poželjnije od 3 do 8 ugljenikovih atoma, kao što je 5, 6 ili 7 ugljenikovih atoma. Poželjno, cikloalkil grupe je ovde namera da se odnose na monociklične cikloalkil grupe i sadrže od 3 do 20 ugljenikovih atoma. Primeri monocikličnih cikloalkil radikala uključuju ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, i slično.

[0057] Izraz "aril" kao grupa ili deo grupe odnosi se na polinezasidenu, aromatičnu hidrokarbil grupu koja sadrži jedan aromatični prsten (npr., fenil) ili više (npr., dva, tri ili četiri) aromatičnih prstenova zajedno spojenih (npr., naftil) ili kovalento vezanih (npr., bifenil). Aril grupe sadrže bar 6 ugljenikovih atoma i poželjno 6 do oko 20 ugljenikovih atoma, poželjnije 6 do 10 ugljenikovih atoma u prstenu. Aromatični prsten u aril gupi može opciono obuhvatati jedan ili dva dodatna prstena (cikloalkil, heterociklil i/ili heteroaril) za koja su spojeni. Neograničavajudi aril obuhvata fenil, bifenilil, 5-ili 6-tetralinil, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7- ili 8-azulenil, naftalen-1-ili -2-il, 4-, 5-, 6 ili 7-indenil, 1-2-, 3-, 4ili 5-acenaftilenil, 3-, 4- ili 5-acenaftenil, 1-, 2-, 3-, 4-ili 10-fenantril, 1- ili 2-pentalenil, 4- ili 5-indanil, 5-, 6-, 7- ili 8-tetrahidronaftil, 1,2,3,4-tetrahidronaftil, 1,4-dihidronaftil, 1-, 2-, 3-, 4-ili 5-pirenil.

[0058] Kao je zabeleženo, estrogenske komponente kako je za njih zatraženo su korisne u lečenju neuroloških poremedaja kod subjekta.

[0059] Ovde korišdeni izrazi "lečenje" ili "treatman" se odnose na na terapeutski tretman i pofilaktičke ili preventivne mere, gde je cilj sprečavanje ili usporavanje (ublažavanje) neželjenih fizioloških promena ili poremedaja, kao što je razvoj neurološkog poremedaja. Korisni ili željeni klinički rezultati obuhvataju, ali bez ograničenja, sprečavanje poremedaja, smanjenje učestalosti javljanja, ublažavanje simptoma koji su u vezi sa poremedajem, ublažavanje obima poremedaja, stabilizovanje (tj., nepogrošavanje) stanja poremedaja, odlaganje ili usporavanje napredovanja poremedaja, ublažavanje ili palijaciju stanja poremedaja, remisiju (ili delimičnu ili totalnu), bilo detektabilnu ili nedetektabilnu, ili njihovu kombinaciju. "Lečenje" takođe može značiti produžavanje preživljavanja u poređenju sa očekivanim preživljavanjem onoga ko nije lečen.

[0060] U izvesnim izvođenjima, estrogenske komponente za koje je zahtevana zaštita mogu biti korišdene za profilaktičko ili preventivno lečenje neuroloških poremedaja, tj., kada se subjektu daje estrogenska komponenta kada mu nije dijagnostifikovan (npr., pre dijagnoze) neurološki poremedaj. Na primer, može se smatrati da je subjekt u riziku od javljanja/ razvijanja neurološkog poremedaja. Prema tome, cilj takvog lečenja je sprečavanje neurološkog poremedaja.

[0061] U poželjnim izvođenjima, estrogenske komponente za koje je tražena zaštita mogu biti korišdene za terapeutski tretman neurološkog poremedaja. Prema tome, u poželjnim izvođenjima, pronalazak se odnosi na estrogenske komponente kao što je ovde navedeno za upotrebu u lečenju neurološkog poremedaja, gde se estrogena komponenta daje subjektu kome je dijagnoziran neurološki poremedaj. Prema tome, takvo lečenje cilja terapiju postojedeg neurološkog poremedaja.

[0062] Ovde korišdeni izrazi "teraputsko lečenje" ili "terapija" i slično, odnose na lečenja gde je cilj da se dovede telo subjekata ili neki njegov deo od neželjene fiziološke promene ili poremedaja, kao što je neurološki poremedaj u željeno stanje, kao što je manje ozbiljno ili manje neprijatno stanje (npr., ublažavanje ili palijacija), ili vradanje u normalu, u zdravo stanje (npr., ozdravljenje, fizički integritet ili fizičko blagostanje subjekta), da bi ga zadržao (tj., da se ne pogorša) pri pomenutim neželjenim fizioloških promenama ili poremedajima (npr., stabilizaciji), ili u sprečavanju ili usporavnju napredovanja do mnogo ozbiljnijeg ili goreg stanja u poređenju sa pomenutim neželjenim fiziološkim promenama ili poremedajem.

[0063] Osim kada je zabeleženo, "subjekat" ili "pacijent" su zamenjivo korišdeni i odnose se na životinje, poželjno toplokrvne životinje, poželjnije kičmenjake, čak poželjnije sisare, još poželjnije primate, i posebno obuhvata humane pacijente i nehumane sisare i primate. "Sisarski" subjekti se odnose samo na životinje klasifikovane tako da uključuju, ali bez ograničenja, ljude, domade životinje, komercijalne životinje, životinje sa farme, životinje u zoo vrtu, sportske životinje, ljubimce i eksperimentalne životinje kao što su psi, mačke, zamorci, zečevi, pacovi, miševi, konji, govede, krave, primati kao što su čovekoliki majmun, majmun, orangutan, i šimpanza; kanidi kao što su psi i vukovi; felidi kao što su mačke, lavovi i tigrovi; ekvidi kao što su konji, magarci, i zebre; životinje za ishranu kao što su krave, svinje i ovce; kopitari kao što su jeleni i žirafe; glodari kao što su miševi, pacovi, hrčci i zamorci; i tako dalje. Poželjni pacijenti su humani subjekti.

[0064] Ovde korišdeni izraz kao "subjekt kome je potrebno lečenje" obuhvata subjekte koji de imati koristi od lečenja, poželjno terapeutsko lečenje, nevedenih poremedaja, naročito neurološkog poremedaja. Takvi subjekti mogu obuhvatati, bez ograničenja, one kod kojih je dijagnoziran pomenuti poremedaj, one sklone dobijanju ili razvijanju pomenutog poremedaja i/ili one kod kojih pomenuti poremedaj treba da se spreči. Naročito su uzeti u obzir oni pacijenti kod kojih je dijagnoziran neurološki poremedaj ili kome treba da se spreči neurološki poremedaj.

[0065] Ovde korišden izraz "dijagnoza" odnosi se na ustanovljavanje i zaključivanje da subjekt koji ima navedeni poremedaj, naročito neurološki poremedaj. Dijagnoza može biti zasnovana na simptomima koji su u vezi sa navedenim poremedajem (kao što su, npr., klinička dijagnoza). Alternativno ili dodatno, dijagnoza može biti data pre ispitivanja simptoma (tj., predklinička dijagnoza) ili zbog toga što su simptomi blagi ili nisu ograničeni na navedeni poremedaj u celini, npr. detektovanjem biomarkera koji su indikativni za navedenei poremedaj i/ili tehnike snimanja.

[0066] Izraz "terapeutski efikasna količina" koji se ovde koristi odnosi se na količinu estrogenskih komponenti ili farmaceutske kompozicije koja se ovde smatra efikasnom za lečenje neurološkog poremedaja kod subjekta, tj., da se dobiju željeni lokalni ili sistemski efekti i izvođenja. Izraz prema tome se odnosi na kvantitet estrogene komponente ili farmaceutske kompozicije koja izazva biološki ili medicinski odgovor u tkivima, sistemu, životinji ili čoveku, koji je primeden od strane istraživača, veterinara, doktora medicine ili drugog kliničara. Naročito, izraz odnosi se na kvalitet estrogenih komponenti ili farmaceutske kompozicije na koju se ovde misli koja je neophodna da spreči, izleči, ublaži ili bar smanji kliničko pogoršanje, simptome ili komplikacije u vezi sa neurološkim poremedajima u jednoj ili višestrukim dozama.

[0067] Ovde korišdeni izraz "lečenje neuroloških poremedaja", kao što je terapeutsko lečenje neurološkog poremedaje, može obuhvatati zaštitno sredstvo ili prevenciju oštedenja mozga, uključujudi poremedaje integriteta moždanih delija i/ili gubitak strukture moždanih delija ili funkcije, smanjenje ošedenja mozga, nepogoršavanje ošedenja mozga ili vradanja oštedenja mozga, i može dalje obuhvatati izazivanje ili pospešivanje neurogeneze i/ili vaskulogeneze.

[0068] U izvesnim izvođenjima, lečenje neurološkog poremedaja, kao što je terapeutsko lečenje neurološkog poremedaja, obuhvata zaštitu naspram oštedenja mozga, smanjenje stepena oštedenja mozga, nepogoršavanje oštedenja mozga ili vradanja oštedenja mozga. U naročitom izvođenju, terapeutsko lečenje neurološkog poremedaja obuhvata nepogoršavanje oštedenja mozga ili vradanje oštedenja mozga.

[0069] U izvođenjima, lečenje neurološkog poremedaja, kao što je terapeutsko lečenje neurološkog poremedaja, obuhvata pospešivanje neurogeneze, vaskulogeneze, ili neurogeneze i vaskulogeneze. Primeri ispitivanja oštedenja mozga, neurogeneze i vaskulogeneze obuhvataju tehnike snimanja, naročito tehnike neurosnimanja, i detekcije i merenja pogodnih biomarkera u npr. serumu krvi ili cerebrospinalnoj tečnosti. Pogodne tehnike neurosnimanja obuhvataju snimanje magnetne (MRI) i pozitronsku emisionu tomografiju (PET). Pogodni biološki markeri za oštedenje mozga obuhvataju na primer S100B i glijarni fibrilarni kiseli protein (GFAP). Tehnike detektovanja i merenja bioloških markera u telesnim tečnostima su dobro poznate i obuhvataju, na primer, enzimski vezani imunosrbentne testove (ELISAs).

[0070] Ovde korišden izraz "neurološki poremedaj" odnosi se na bilo koju neurološku bolest, neurološko stanje, neurološko ponašanje i/ili simptom u vezi sa njima, koji napada centralni nervni sistem i/ili periferni nervi sistem.

[0071] Poželjno, neurološki poremedaj može napasti centralni nervni sistem, uključujudi mozak i kičmenu moždinu, poželjnije može napasti bar mozak, čak poželjnije može napasti bar hipokampus, kao što je bar hipokampus i korteks.

[0072] Izrazi "hipokampus" i "hipokampusne formacije" su korišdene ovde kao sinonimi i odnose se na regione mozga koji su smešteni u medijalno temporalni režanj mozga koji je uključen u pamdenje, i prostornu memoriju i orijentaciju. Sisar koji imaju dva hipokmpusa, na svakoj strani mozga i izraz obuhvata oba hipokamupsa. Ovde korišden izraz, hipokamups odnosi se na dentatni girus (DG), kornu amonis (CA) i subikulum. Dentatni girus obuhvata fascia dentata, hilus, subgranularnu zonu (SGZ), granularni delijski sloj i molekularni sloj. Subgranularna zona (SGZ) je uski sloj delija lociran između granularnog delijskog sloja i hilusa DG. Kornu amonis (CA) je diferenciran u polja cornu amonis 1 (CA1), cornu amonis 2 (CA2), cornu amonis 3 (CA3), i cornu amonis 4 (CA4). Neurološki poremedaj može može uticati na bar jedan, više od jednog ili sve ove regione, kao što su naročito bar jedan, više od jedan ili svi dentatni girusi, cornu amonis 1, cornu amonis 2, cornu amonis 3, ili subgranularna zona.

[0073] Izrazi "korteks" i "cerebralni korteks" su ovde korišdeni kao sinonimi i generalno obeležavaju najudaljniji sloj neurološkog tkiva cerebruma. Korteks se može generalno smatrati da je sastavljen od senzornih, motornih i asocijativnih oblasti.

[0074] Neurološki poremedaj može uticati na korteks, kao što je bilo koji region korteksa i naročito može uticati na primerni somatosenzorni korteks, određenije primarni region skladištenja primarnog somatosenzornog korteksa vezanog za primarni motorni korteks.

[0075] Neurološki poremedaji koji se leče pomodu estrogenskih komponenti ili farmaceutskih kompozicija koje su ovde razmatrane mogu uključivati neuronske disfunkcije i/ili degeneracije, oštedenja ili gubitke. Poželjno, neurološki poremedaji koji se leče obuhvataju neuronsku degeneraciju, oštedenja ili gubitak kao što su na primer ali bez ograničenja, povrede mozga, kičmene moždine ili neurodegenerativnih poremedaja.

[0076] Primeri povreda mozga obuhvataju, ali bez ograničenja samo na njih, hipoksične/anoksične povrede glave, uključujudi hipoksično-ishemijsku encefalopatiju (HIE) kao što je poželjno neonatalna HIE, i dalje ishemije mozga, ili udari, ili traumatske povrede mozga.

[0077] Poželjno, povredna mozga, kao što su hipoksična povreda mozga, anoksična povreda ili traumatska povreda mozga, utiču bar na hipokampus, poželjnije povreda mozga koja narušava delijski integritet mozga u bar hipokampusu.

[0078] Primeri povreda kičmene moždine i sa njima u vezi ganglijama, obuhvataju ali bez ograničenja post-polio sindrom, traumatsku povredu, hirušku povredu ili paralitičke bolesti.

[0079] Pod izrazom "neurodegenerativna bolest ili poremedaj" se generalno misli na neurološki poremedaj karakterisan sa progresivnim gubitkom strukture ili funkcije nerurona, uključujudi smrt neurona.

[0080] Poželjni primeri neurodegenrativnih bolesti uključuju, ali bez ograničenja bolesti karakterisane progresivnim gubitkom funkcije neurona u hipokampusu i/ili korteksu, kao što su Alchajmerova bolest (AD), Parkinsonova bolest (PD), frontotemporalna demencija (FD) (koja pokriva opseg stanja uključujudi Pikovu bolest, degeneraciju frontalnog režnja), amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS); bolesti karakterisane progresivnim gubitkom strukture ili funkcije neurona, uključujudi smrt neurona u bazalnim ganglijama (naročito subtalamični nukleus, substancia nigra, i globus palidus), moždanom stablu (naročito delu srednjeg mozga gde se nalaze supranuklearni pokreti očiju), dentatni nukleus malog mozga, kao što je progeresivna supranuklearna paraliza, striatonigralna degeneracija, kortikobazalna degeneracija, olivopontocerebelarna atrofija, i slično.

[0081] Drugi primeri neurodegenerativnih bolesti obuhvataju, ali bez ograničenja, Alchajemerovu bolest (AD), Parkinsonovu bolest (PD), frontotemporalnu demenciju (FTD), amiotrofnu lateralnu sklerozu (ALS), Huntingtonovu bolest (HD) i druge poliglutaminske ekspanzione bolesti, Pikovu bolest, progresivnu supranuklearnu paralizu, striatonigralnu degeneraciju, kortiko-bazalnu degeneraciju, olivopontocerebelarnu atrofiju, Leigovu bolest, infantilnu nekrotizaciju encefalomijelopatije, Hunterovu bolest, mukopolisaharidozu, različite leukodistrofije (kao što su Krabova bolest, Pelizaeus-Merzbacherova bolest i slično), amaurotična (porodična) idiotija, Kufova bolest, Spielmajer-Vogt-ova bolest, Tay Sachs-ova bolest, Batenova bolest, Jansky-Bielschowsky bolest, Reye-ova bolesti, cerebralna ataksija, hronični alkoholizam, beri-beri, Hallervorden-Spatz; sindrom, cerebelarne degeneracija, i slično.

[0082] Poželjno, neurodegenerativna bolest je Alchajemerova bolest (AD) ili Parkinsonova bolest (PD).

[0083] U Alchajmerovoj bolesti, hipokampus je jedan od prvih regiona mozga koji pati od oštedenja (Hampel et al. 2008. Alzheimer & Dementia 4: 38-48). Estrogenske komponente ili farmaceutske kompozicije koje su ovde date mogu prema tome u nekim izvođenjima biti naročito pogodne za lečenje, naročito terapeutsko lečenje, subjekata u najranijim stadijumima AD, kao što su pred klinički stadijum ili najraniji klinički stadijumi AD. Prema tome, u izvesnim poželjnim izvođenjima, neurološki poremedaj koji se leči je rani stadijum AD (tj., predklinički stadijum ili najraniji klinički stadijumi - AD).

[0084] Takođe Parkinsonova bolest je u vezi sa hipokampusnim oštedenjem. Naročito, hipokamusna atrofija je primedena kod pacijenata sa ranim stadijumom nedemencione PD koja pokazuje pogoršanu memoriju (Brück et al. 2004. J Neurol Neurosurg Psychiatry 75: 1467-1469) i kod pacijenata sa PD koji imaju blaga kognitivna pogoršanja ili demenciju (Camicioli et al. 2003. Mov Disorder 18: 784-790). Prema tome, u izvesnim poželjnim izvođenjima, neurološki poremedaj koji se leči je rani stupanj nedemecione PD ili PD sa blagim kognitivnim pogoršanjem (MCI).

[0085] Dalji poželjni primeri neuroloških poremedaja koji mogu biti tretirani sa ovde opisanim estrogenskim komponentama ili farmaceutskim kompozicijama mogu obuhvatati ali bez ograničenja: autoimune poremedaje demijelinizacije, kao što su multiple skleroza; neurološki deficit izazvan infekcijom inflamatorne bolesti ili infekcijom, virusne bolesti centralnog nervnog sistema (CNS), kao što su AIDS encefalopatija, post-encefalitični Parkinsonizam, virusni encefalitis, bakterijski meningitis ili drugi CNS efekti infektivnih bolesti; poremedaji kortikalno senzore percepcije, kao što je poremedaji vestibularne funkcije, poremedaji ravnoteže i koordinacije, vrtoglavica, problemi sa pokretljivošdu, disleksija, nespretnost, audio diskriminacija i poremedaji modulacije, problemi sa vidom, poremedaji pokretanja očiju i koordinacije, ili senzorni poremedaji kao simptomi neuroloških bolesti; poremedaji u funkcionisanju creva kao što su konstipacija ili inkosntipacija; i poremedaji kontrolisanja mokradne bešike, kao što je urinatrna inkontinenca, kao simptomi CNS bolesti: respiratorna disfunkcija koja prati cerebralnu paralizu; poremedaji funkcije autonomnog nervnog sistema koji izazova abnormalan protok krvi kroz kožu, abnormalni seksualni odgovor, erektilnu disfunkciju, glavobolje, bol u vratu, bol u leđima, encefalomijelopatiju pri traumi, posturalni ortostatsku tahikardiju, ortostatsku intolerancu, ortostatsku hipotenziju, sinkopu, neurogena creva, i neurogenu bešiku. Primeri neuroloških poremedaja koji mogu biti lečeni pomodu ovde opisanih estrogenskih komponenti ili farmaceutskih kompozicija obuhvataju, ali bez ograničenja samo na njih: autoimune poremedaje demijelinizacije, kao što je multiple skleroza; neurološke deficite izazvane infekcijom inflamatornih bolesti, kao što je Creutzfeldt-Jacob-ova bolest ili druge spore virusne infekcije centralnog nervnog sistema (CNS), encefalopatija usled AIDS-a, post-encefalitični Parkinsonizam, virusni encefalitis, bakterijski meningitis ili drugi CNS efekti infektivnih bolesti; bolesti kortikomotornog funkcionisanja, kao što su spastičnost, pareza, klonovi, ili hiper-refleksija; poremedaji kortiko snezorne percepcije, kao što su poremedaji vestibularne funkcije, poremedaji ravnoteže i koordinacije, vrtoglavica, problemi sa pokretljivošdu, disleksija, nespretnost, zostatak u razvoju, audio diskriminacija i poremedaji modulacije, odloženi i mehanički poremedaji govora, problemi sa vidom, poremedaji pokreta očiju i koordincaije, ili poremedaji poremedaja senzora; disfunkcije nižih kranijalnih nerava, kao što su nedostatak koordinacije između govora, gutanja ili jasne artikulacije;poremedaji funkcije creva, kao što su, problemi kontrole gastroezofagusnog sfinktera; abnormalno urinarno funkcionisanje, kao što je enureza, mokrenje u krvetu, ili poremedaji kontrole mokradne bešike; respiratorne disfukcije, kao što je prekomerno hrkanje, obstruktivna ili centralna apnea, ili abnormalni respiratorni odgovor na nivoe kiseonika i ugljen dioksida; poremedaji disanja u snu, kao što su nodna apnea, muskularna disfunkcija, ili iznenadna smrt odojčadi; poremedaji u razvoju kao što su Kijarijeva malformacija; ili kogenitalne bolesti, kao što su Daunov sindrom, Morkvijev sindrom, spondiloepifizna diplazija, ahondroplazija, ili osteogeneza; neurološki bihejvioralni pormedaji, kao što je poremedaj pažnje i hiperaktivnost, psihološki problemi, uključujudi uznemirenost, bipolarni poremedaj, šizofreniju, ili depresiju, spektar autističnih poremedaja, uključujudi autizam, Aspergerov sindrom, i prožimajudi bihejviroalni poremedaji koji nisu na drugom mestu specifikovani; anatomska stanja, kao što je platibazija, retrofleksija nastavka drugog kičmenog pršljena, bazilarna invaginacija, i stenoza foramen magnuma; stečena stanja krtosti kostiju, kao što je rahitis, Padžetova bolest, ili hiperparatiroidizam; metabolički poremedaji kostiju; poremedaji vezivnih tkiva, uključujudi poremedaj hipermobilinost vezivnih tkiva, kao što su Ehlers Danlosov sindrom; cerviko-medularni sindrom; renalni, metabolički, ili endokrini sindromi; poremedaji autonomne neuronske funkcije koji izazivaju abnormalni protok krvi kroz kožu, abnormalni seksualni odgovor, GERDS, dispraksiju, idiopatsku skoliozu, glavobolje, bol u vratu, bol u leđima, bol u glavi, encefalomijelopatija usled traume, neoplazma, poziciona ortostatska tahikardija, i bulbarni nalazi.

[0086] Kao što je prikazano u eksperimentalnom delu, ovde opisane estrogenske komponente pokazuju terapeutske efekte na oštedenje mozga i izazivaju neurogenezu i vaskulogenezu posle hipoksije-ishemije. Prema tome, ovde opisane estrogenske komponente ili farmaceutske kompozicije mogu biti pogodne za lečenje hipoksičnih povreda mozga, anoksičnih povreda moza i/ili traumatskih povreda mozga, gde se estrogena komponenta ili farmaceutska kompozicija daju posle hipoksije, ishemije i/ili traume. Naročito, ovde opisane estrogenske komponente ili farmaceutske kompozicije mogu biti pogodne za lečenje hipoksično-ishemijskih encefalopatija, kao što su poželjno neonatalna hipoksično-ishemijska encefalopatija, gde su estrogena komponenta ili farmaceutska kompozicaja davani posle hipoksijeishemije (tj., terapeutsko lečenje HIE). Poželjno, estrogena komponenta ili farmaceutska kompozicija je davana što je pre mogude posle hipoksije, ishemije, traume ili hipoksijeishemije, kao što je između 12 sati, 9 sati, ili 6 sati posle hipoksije, ishemije, traume ili hipoksijeishemije, poželjnije u toku 6 sati, kao što je između 5 sati, 4 sata, 3 sata, 2 sata, 1 sata, 30 minuta ili 15 minuta, posle hipoksije, ishemije, traume ili hipoksije-ishemije, kod subjekata kao što su humani subjekti.

[0087] Kao što je ovde zabeleženo, ovde opisane estrogenske komponente ili farmaceutske kompozicije mogu takođe biti naročito pogodne za lečenje AD. Na primer, ovde opisane estrogenske komponente ili farmaceutske kompozicije mogu biti pogodne za profilaktičko ili preventino lečenje AD, gde estrogenska komponenta ili farmaceutska kompozicija je davana ženama u menopauzi sa prodičnom istorijom AD. Ovde opisane estrogenske komponente ili farmaceutske kompozicije mogu takođe biti pogodne za terapeutsko lečenje ranog stadijuma AD, gde estrogene komponente ili farmaceutska kompozicija ili farmaceutksa kompozicija se daju pacijentu kome je dijagnoziran rani stadijum AD.

[0088] Dijagnoza ranog stadijuma AD može se postidi, npr., neurosnimanjem, kao što je MRI, gde su pacijenti sa ranim stadijumom AD karakterisani atrofijom hipokampusne formacije (Hampel et al.

2008. supra). Alternativno ili dodatno, dijagnoza ranog stadijuma AD može biti ustanovljena na bazi procene biomarkera, kao što su, npr., amiloid beta 42 (Aβ42), odnos amiloid beta 40 (Aβ40), ukupni tau protein, hiperfosforilovani tau protein, β-sekretaza (BACE), ili bilo koja njihova kombinacija, u cerebrospinalnoj tečnosti (Hampel et al.2008. supra).

[0089] Kako je gore navedeno, ovde opisane estrogenske komponente ili farmaceutske kompozicije mogu takođe biti naročito pogodne za lečenje ranog stadijuma nedemencione PD ili PD sa blagim kognitivnim pogoršanjem (MCI), poželjnije terapeutski tretman ranog stadijma nedemencione PD ili PD sa blagim kognitivnim pogoršanjem, gde se estrogenska komponenta ili farmaceutska kompozicija daju pacijentu kod koga je dijagnoziran rani stadijum nedemencione PD, naročito kod pacijenta kod koga je dijagnozirain rani stadijum nedemencione PD koji pokazuje oštedenu memoriju, ili pacijenta kod koga je dijagnoziran PD koji ima MCI.

[0090] Dijagnoza pacijenta sa ranim stadijumu nedemencione PD može biti zasnovana na ispitivanju kliničkih simptoma PD, gde pacijenti sa ranom nedemencionom PD imaju bar dva PD simptoma izabrana iz grupe koju čine tremor, krutost, i hipokinezija, opciono u kombinaciji sa tehnikama neuoro snimanja kao što su, npr., MRI. Volumetrijsko MRI snimanje može obezbediti rani marker za demenciju kod PD, gde klijenti sa ranim stadijumom nedemencione PD i PD pacijentima koji ima blaga kognitivna pogoršanja su karakterisani atrofijom hipokamusa. Oštedena memorija može biti procenjena kroz neuropsihološke testove, kao što su na primer Wechsler-ova memorijska skala – Revidirani test verbalne memorije (VEM).

[0091] Ovde navedene estrogenske komponente mogu biti korišdene same ili u kombinaciji sa bilo kojim poznatim terapijama za neurološke poremedaje ("kombinovana terapija").

[0092] Kombinovane terapije koje su ovde razmatrane mogu sadržati davanje bar jedne ovde opisane estrogene komponente i bar jednog drugog farmaceutskog ili biološki aktivnog sastojka. Pomenuta estrogenska(e) komponenta(e) i pomenuti farmaceutski ili biološki aktivni sastojak(ci) mogu biti davani u ili iste ili odvojenih bilo kojim redom.

[0093] Bar jedan "drugi farmaceutski ili biološki aktivni sastojak" naročito se odnosi na supstancu koja je drugačija od ovde opsianih estrogenih komponenti, koja je efikasna u lečenju neurološkog pormedaja i koja može ili ne može voditi sinergijskom efektu sa estrogenom komponentom. Neograničavajudi primeri farmaceutskih ili biološki aktivnih sastojaka pogodnih za kombinovano davanje sa ovde opisanim estrogenskim komponentama, naročito za upotrebu u lečenju HIE kao štoje poželjno neonatalni HIE, uključujudi antiepileptičke lekove, eritropoietin, melatonin i ksenon.

[0094] Takođe je ovde razmatrana kombinacija davanja bar jedne ovde opisane sa umerenom hipotermijom (tj., smanjenjem telesne temeprature na 33°C do 34°C). Takva kombinovana terapija može biti naročito pogodna za lečenje, poželjno terapeutsko lečenje, hipoksično-ishemijske encefalopatije (HIE) kao što je poželjno neonatalna HIE.

[0095] Estrogenske komponente koje su ovde opisane mogu biti formulisane u farmaceutske kompozicije ili formualcije sa jednim ili više farmaceutsko prihvatljivih nosača /ekscipijenata. Farmaceutske kompozicije mogu sadržati jednu ili više ovde opisanih estrogenskih komponenti. Farmaceutske kompozicije mogu takođe dalje sadržati jedan ili više farmaceutski aktivnih sastojaka kako je ovde definisano. Prema tome, ovde je takođe opisana farmaceutska kompozicija koja sadrži ovde opisanu estrogensku komponentu.

[0096] Izraz "farmaceutski prihvatljiv"kako je ovde korišden je konzistentan sa onim u stanju tehnike i označva kompatibilnost sa drugim sastojcima farmaceutske kompozicije i nije štetan za njegovog primaoca.

[0097] Ovde korišden, "nosač" ili "ekscipijent" obuhvata bilo koji ili sve rastvarače, razblaživače, pufere kao što je, npr., neutralni puferisani rastvor soli, fosfatni puferisani rastvor, ili opciono tris-HCl, acetatni ili fosfatni puferi), sredstva za poboljšavanje rastvaranja (kao što su, npr., Tween 80, Polysorbate 80), koloidi, disperzioni medijum, nosači, punioci, sredstva za helatiranje (kao što su, npr., EDTA ili glutation), amino kiseline (kao što su, npr., glicin), proteini, sredstva za dezintegraciju, vezivna sredstva, lubrikansi, sredstva za kvašenje, stabilizatori, emulzifikatori, zaslađivači, boje, koregensi ukusa, arome, zgušnjivači, sredstva za postizanje depo efekta, obloge, antifungicidna sredstva, konzervansi (kao što su, npr., ThimerosalTM, benzil alkohol), antiooksidansi (kao što su, npr., askorbinska kiselina, natrijum beta bisulfit), sredstva za kontrolu osmotskog pritiska, sredstva za odlaganje apsorpcije, adjuvanti, sredstva za davanje mase (kao što su, npr., laktoza, manitol) i slično. Upotreba takvih medijuma i sredstava za formulisanje farmaceutskih kompozicija je dobro poznata u ovoj oblasti. Osim toga, bilo koji konvencionalni medijum ili sredstvo koji je nekompatibilano sa aktivnim sredstvom(ima), može biti razmatrana njegova upotreba u terapeutskim kompozicijama. Pogodni farmaceutski nosači su opisani inter alia u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).

[0098] Farmaceutska kompozicija može biti pripremljena na način poznat per se stručnjaku iz ove oblasti. Za ovu svrhu, bar jedna ovde opisana estrogenska komponenta, jedan ili više tečnih farmaceutskih ekscipijenta i, ukoliko je poželjno, u kombinaciji sa jednim ili više drugih farmaceutskih ili biološki aktivnih sastojaka kako je ovde definisano, je dovedeno u pogodan oblik za davanje ili dozni oblik koji može biti korišden kao farmaceutik u humanoj medicini ili veterinarskoj medicini. Precizna priroda nosača ili ekcipijenta ili drugog materijala de zavisiti od načina davanja. Takvi pogodni oblici za davanje – koji mogu biti čvrsti, polu-čvrsti ili tečni, zavise od načina davanja kao i postupaka i korišdenih nosača u njihovom dobijanju, i bide jasni osobi iz struke; pozivamo se na primer na standardni priručnik, kao što jes Remington’s Pharmaceutical Sciences (supra).

[0099] Na primer, ovde opisana farmaceutska kompozicija može biti davana parenteralno (kao što je intravenski, intracerebralno, intracerebroventrikularno, intramuskularno, ili subkutanoznom injekcijom ili intravenskom infuzijom) u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora, koji je bez pirogena i ima pogodnu pH, izotoničnost i stabilnost. Alternativno, ovde opisana farmaceutska kompozicija može biti data oralno, na primer u obliku pilula, tableta, tableta sa oblogom, tableta oloženih šederom, granula, tvrdih i mekanih želatinskih kapsula, vode, alkoholnih ili uljanih rastvora, sirupa, emulzija ili suspenzija, ili rektalno, na primer u obliku supozitorja, perkutanozno ili lokalno (uključujudi očnu primenu), na primer u obliku masti, tinktura, sprejeva ili transdermalnih terapeutskih sistema (kao što su, npr. flasteri za kožu), ili inhalacijom u obliku nazalnih sprejeva ili smeša aerosola, ili, na primer, u obliku mikrokapusla, implanata ili šipki.

[0100] Za dobijanje pilula, tableta, tableta obloženih šederom i tvrdih želatinskih kapsula mogude je korišdenje, na primer, laktoze, skroba, na primer skroba kukuruza, ili derivata skroba, talka, stearinske kiseline ili njegovih soli, itd. Nosači za meke želatinske kapsule i supozitorije su, na primer, masti, voskovi, polu-čvrsti i tečni polioli, prirodna ili očvrsla ulja itd. Pogodni nisači za dobijanje rastvora, na primer rastvora za injekcije, ili emulzije ili sirupe su na primer, voda, fiziološki natrijum hloridni rastvor, alkoholi, kao što su etanol, glicerol, polioli, saharoza, invertni šeder, glukoza, manitol, biljna ulja, itd. Takođe je mogude liofilizovati aktivni sastojak(ke) i koristiti dobijene liofilizate, na primer, za dobijanje preparata za injekciju ili infuziju. Pogodni nosači za mikrokapsule, implante ili šipke su na primer kopolimeri glikolne kiseline i mlečne kiseline.

[0101] Za oralni oblik davanja, kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu biti pomešane sa pogodnim aditivima, kao što su ekscipijenti, stabilizatori, ili inertni razblaživači, i dovedeni pomodu uobičajenih postupaka u pogodne oblike za davanje, kao što su tablete, obložene tablete, tvrde kapsule, vodeni, alkoholni ili uljani rastvori. Primeri pogodnih inertnih nosača su guma arabika, magnezijum oksid, magnezijum karbonat, kalijum fosfat, laktoza, glukoza, ili skrob, naročito, kukuruzni skrob. U ovom slučaju, dobijanje može biti izvedeno u obliku suvih i vlažnih granula. Pogodni uljani ekscipijenti ili rastvarači su biljna ulja ili životinjska ulja, kao što su suncokretovo ulje ili ulje jetre bakalara. Pogodni rastvarači za vodene i alkoholne rastvore su voda, etanol rastvori šedera ili njihove smeše. Polietilen glikoli i polipropilen glikoli su takođe korisni kao dalje pomodne supstance za druge oblike za davanje . Kao tablete sa trenutnim oslobađanje, ove kompozicije mogu sadržati mikrokristalnu celulozu, dikalcijum fosfat, skrob, magnezijum stearat, i laktozu i/ili druge ekscipijente, nosače, produživače, sredstva za raspadanje, razblaživače i lubrikanse poznate u ovoj oblasti.

[0102] Oralno davanje farmaceutske kompozicije koja sadrži bar jednu ovde opisanu estrogensku komponentu, je pogodno postignuto jednoobrznim i intimnim mešanjem zajedno pogodne količine pomenute komponente u obliku praha, opciono koja takođe obuhvata fino sprašen čvrsti nosač, i inkapsuliranu smešu u na primer tvrdoj želatinskoj kapsuli. Čvrsti nosač može obuhvatiti jednu ili više supstanci, koji deluju kao sredstva za vezivanje, lubrikat, sredstva za raspadanje, sredstva za bojenje, i slično. Pogodni čvrsti nosači obuhvataju, na primer, kalcijum fosfat, magnezijum stearat, talk, šedere, laktozu, dekstrin, skrob, želatin, celulozu, polivinilpirolidon, voskove sa niskom tačkom topljenja i jonoizmenjivačke smole.

[0103] Komprimovane tablete koje sadrže farmaceutsku kompoziciju koja je ovde opisana i mogu biti pripremljene jednoobraznim i intimnim mešanjem aktivnih sastojaka sa čvrstim nosačem kao kao što je gore opisano da se dobije smeša koja ima neophodne osobine pri komprimovanju, i zatim kompaktna smeša se u pogodnoj mašini dovede u željeni oblik i veličinu. Livene tablete se mogu napraviti livenjem u pogodnoj mašini, smešom sprašenih aktivnih sastojaka ovlaženih sa intertnim tečnim razblaživačem.

[0104] Kada se daju nazalnim aerosolom ili inhalacijom, ove kompozicije mogu biti pripremljene prema dobro poznatim tehnikama u ovoj oblasti farmaceutskog fomrulisanja i mogu biti dobijene kao rastvori u soli, pri čemu se koristi benzil alkohol ili drugi poželjen konzervans, pospešivači apsorpcije da bi se povedaja biodostupnost, fluorougljenici, i/ili druga sredstva za rastvaranje ili za dispergovanje poznata u ovoj oblasti. Pogodne farmaceutske formulacije za davanje u obliku aerosola ili sprejeva su, na primer, rastvori, suspenzije, ili emulzije jedinjenja prema pronalasku ili njegove fiziološki prihvatljive soli u farmaceutski prihvatljivim rastvaračima, kao što su etanol ili voda, ili smeša takvih rastvarača. Ukoliko je potrebno, formulsacija može takođe dodatno sadržati druge farmacetuske pomodne supstance kao što su površinski aktivna sredstva, emulgatori i stabilizatori kao i propelanti.

[0105] Za subkutanozno ili intravensko davanje, ovde opisane estrogenske komponente, ukoliko je poželjno sa uobičajenim supstancama kao što su sredstva za rastvaranje, emulgatori, ili druge pomodne supstance, su dodate u rastvor, suspenziju ili emulziju. Aktivni sastojci mogu takođe biti liofilizovani i dobijeni liofilizati korišdeni na primer za dobijanje injekcionih ili infuzionih preparata. Pogodni rastvarači su na primer, voda, fiziološki rastvor soli, ili alkoholi, npr. etanol, propanol, glicerol, pored takođe rastvora šedera kao što su rastvori glukoze ili manitola, ili alternativno smeša različitih pomenutih rastvarača. Injektibilni rastvori ili suspenzije mogu biti formulisane poznatom stanju tehnike, pomodu netoksičnih, parenteraln prihvatljivih razblaživača, ili rastvarača kao što su manitol, 1,3-butandiol, voda, Ringerov rastvor, ili izotonični natrijum hloridni rastvor, ili pogodna sredstva za dispergovanje ili sredstva za vlaženje i sredstva za suspendovanje, kao što su sterilna, mešovita, fiksna ulja, koja uključuju sintetički mono- ili digliceridi, i masne kiseline, ukljudujudi oleinsku kiselinu.

[0106] Kada se rektalno daje u obliku supozitorija, ove formulacije mogu biti dobijene mešanjem ovde opisane estrogenske komponente sa pogodnim neiritirajudim ekscipijentom, kao što je kakao buter, sintetički gliceridni ili polietilen glikoli, koji su čvrsta susptanca na običnoj temperaturi, ali postaje tečna i/ili se rastvara u rektalnoj šuupljini da bi se oslobodio lek.

[0107] Neki poželjni, ali neograničavajudi primeri takvih preparata obuhvataju tablete, pilule, prahove, lozenge, kesice, kačete, eliksire, suspenzije, emulzije, rastvore, sirupe, aerosole, masti, kreme, losione, mekane i tvrde želatinske kapsule, supozitorije, kapi, sterilne injektibilne rastvore i sterilne upakovane prahove (koji se uglavnom rekonstruišu pre upotrebe) za davanje kao bolus i/ili kao kontinualno davanje, koji mogu biti formulsani sa nosačima, ekscipijentima i razblaživalima koji su pogodni per se za takve formulacije, kao što su laktoza, dekstroza, saharoza, sorbitol, manitol, skrobovi, guma akacija, kalcijum fosfat, alginati, tragakant, želatin, klacijum silikat, mikrokristalna celuloza, polivinilpirolidon, polietilen glikol, celuloza, (sterilna) voda, metilceluloza, metil- i propilhidroksibenzoati, talk, magnezijum stearat, jestiva ulja, biljna ulja i mineralna ulja ili njihove pogodne smeše. Formulacije mogu opciono sadržati druge farmaceutski aktivne supstance (koje mogu ili ne moraju voditi sinergijskom efektu sa jedinjenjima prema pronalasku) i druge supstance koje se uobičajeno koriste u farmacutskim formulacijama, kao što su sredstva za klizanje, sredstva za kvašenje, emulgovanje i sredstva za suspendovanje, sredstva za dispergovanje, dezintegratori, sredstva koja daju masu, punioci, konzervansi, zaslađivači, sredstva za davanje ukusa, regulatori protoka, sredstva za oslobađanje, itd.

[0108] Farmakološke kompozicije mogu biti formulisane tako da obezbeđuju brzo, produženo ili odloženo oslobađanje aktivnih sastojaka koji se u njima nalaze, na primer pomodu lipozoma ili hidrofilnih pomimernih matrica na bazi prirodnih gelova ili sintetičkih polimera.

[0109] Doza ili količina ovde opisane korišdene estrogene komponente, opciono u kombinaciji sa jednim ili više drugih farmakoloških ili biološki aktivnih sastojaka kao što je gore definisano, zavisi u pojedinačnom slučaju i uobičajeno je da bude prilagođena pojedinačnim okolnostima da bi se postigao optimalni efekat. Prema tome, to zavisi od prirode i ozbiljnosti poremedaja koji se leči, i takođe od pola, godina, telesne mase, ishrane, opšteg zdravlja, pojedinačne osetljivosti čoveka ili životinje koja se leči, od efikasnosti, metaboličke stabilnosti i trajanja, da li je terapija akutna ili hronična ili profilaktična, ili od načina i vremena davanja, brzine ekskrecije, da li je terapija akutna ili hronična ili profilatička ili da li se drugi farmaceutski ili biološki aktivni sastojci koji su gore definisani dalju ili druge terapije primenjuju, pored estrogenske komponente.

[0110] Bez ograničenja, u zavisnosti od tipa i ozbiljnosti poremedaja, tipična dnevna doza može biti u opsegu od oko 1 μg/kg do oko 250 μmg/kg telesne mase ili više, kao što je od 1 μg/kg do oko 100 mg/kg telesne mase, od oko 1 μg/kg do oko 50 mg/kg telesne mase, od oko 1 μg/kg do oko 10 mg/kg telesne mase, od oko 1 μg/kg do oko 1 mg/kg telesne mase, od oko 1 μg/kg do oko 0,4 mg/kg telesne mase ili od oko 5 μg/kg do oko 0,4 mg/kg telesne mase, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Poželjno, dnevna doza može biti u opsegu od oko 0,5 mg/kg do oko 100 mg/kg telesne mase, poželjnije od oko 1 mg/kg do oko 50 mg/kg telesne mase, čak poželjnije od oko 2 mg/kg do oko 25 mg/kg telesne mase, kao što je oko 5 mg/kg telesne mase ili 10 mg/kg telesne mase.

[0111] Za ponovljena davanja u toku nekoliko dana ili duže, lečenje je produženo do pojave željenog suzbijanja simptoma bolesti. Poželjna doza estrogenske komponente može biti u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 100 mg/kg telesne mase, poželjnije od oko 0,1 mg/kg do oko 50 mg/kg telesne mase, čak poželjnije od oko 1 mg/kg do oko 20 mg/kg telesne mase. Prema tome, jedna ili više doza oko 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ili 20 mg/kg (ili bilo koja njegova kombinacija) može biti davana pacijentu.

[0112] Druge dostupne doze mogu biti u opsegu od oko 0,01 do oko 20 mg/kg, kao što je od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Prema tome, jedna ili više doza od oko 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1,0 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) mogu biti davane pacijentu. Takve doze mogu biti davane kao jedna dnevna doza, podeljana u jednu do više dnevnih doza, ili u suštini kontinualna, npr., pomodu ukapavanja infuzijom, ili prekidno, npr svake nedelje ili svake tri nedelje.

[0113] Ovde opisani farmaceutski preparati su poželjno jedinični dozni oblik, i mogu biti pogodno spakovani, na primer u kutiju, blister, fiolu, bočicu, kesicu, ampulu, ili bilo koji drugu nosač ili kontejner jedne doze ili višestrukih doza (koji može biti jasno obeležen); opciono sa jednim ili više uputstava koji sadrže informacije o proizvodu i/ili uputstva za upotrebu. Generalno, takve dozne jedinice de sadržati između 1 i 1000 mg, kao što je između 5 i 500 mg, bar jedne estrogene komponente prema pronalasku, npr., oko 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 or 1000 mg po jediničnoj dozi.

[0114] U zavisnosti od načina davanja, farmaceutska kompozicija de poželjno sadržati od 0,05 do 99 % u odnosu na masu, poželjnije od 0,1 do 70 % u odnosu na masu, čak poželjnije od 0,1 do 50 % u odnosu na masu estrogenske komponente kako je ovde opisano i od 1 do 99,95 % u odnosu na masu, poželjnije od 30 do 99,9 % u odnosu na masu, čak poželjnije od 50 do 99,9 % u odnosu na masu farmaceutski prihvaljivog nosača, sve procenti su zasnovani na ukupnoj masi kompozicije.

[0115] Farmaceutske kompozicije mogu biti davane odvojeno u različita vremena u toku terapije ili konkurentno u odvojenim ili jednom kombinovanom obliku. Prikazani opis obuhvata sve režime simultalnog ili naizmeničnog davanja i izraz "davanje" treba prema tome interpretirati.

[0116] Davanje može biti izvedeno sa hranom, npr. obrokom bogatim mastima. Izraz "sa hranom" označava korišdenje obroka ili u toku ili više od sat pre ili posle davanja ovde opisane farmaceutske formulacije.

PRIMERI

Primer 1: Eksperimentalni postupci

Ispitivane životinje:

[0117] Sprague-Dawley gravidni pacovi su dobijeni iz Janvier (France). Posle rođenja novorođeni mladunci pacova su smešteni sa njihovim majkama i odgajani noramalno na sobnoj temperaturi (25°C) pri ciklusu 12-sati svetlo-tama. Svi eksperimentalni protokoli su bili odobreni od strane University of Liege Ethical Committee. Svi napori su učinjeni da se smanji patnja životinja.

In vivo manipulacija:

[0118] Novorođeni mladunci pacova su podeljeni u kontrolnu grupu, grupu sa nosačem, ili E4 grupu.

[0119] Estetrol (E4) u različitim koncentracijama je rastvoren u rastvoru soli i jednake zapremine (5 μl/g) rastvora su bile injektovane intraperitonealno mladuncima iz E4 grupa(e). Mladuncima pacova iz grupe sa nosačem je intraperitonealno injektovan rastvor soli. Mladuncima pacova iz kontrolne grupe nije ništa injektovano.

[0120] Ishemija je izazvana hiruški obuhvataudi dvostruku ligaciju leve obične karotidne arterije i prekidanje; hipoksija je izazvana inhalacijom 11%-8% kiseonika uravnoteženog sa azotom pri opadajudoj koncentraciji kiseonika u toku 20 minuta, a zatim pradenom inhalacijom 8% kiseonika i 92% azota pri konstantnoj koncentraciji u toku 35 minuta. Kontrolna grupa nije podvrgnuta hiposično-ishemijskim uslovima.

[0121] Sve manipulacije su izvedene na 37°C.

Merenje rektalne temperature mladunaca pacova :

[0122] Merena je rektalna temperatura mladunaca pacova sa termometrom za različite namene (BAT-10R, Physitemp Instruments Inc., Clifton, NJ, US) zajedno sa rektalnom sondom (RET-4, BioMedical Instruments, Zollnitz, Germany) na 0, 2, i 4 sata posle izlaganja hiposkičnim uslovima. Da bi se zadržala varjabilnost niske temperature, merenja rektalne temperature su učinjena u sobi na 25°C 15 min posle uklanjanja mladunaca iz gnezda (osim 1. merenja posle hipoksije koje je učinjeno odmah). Pokazano je da rektalna temperatura odgovara dobro temperaturi središta mozga (Thoresen et al.1996. Arch Dis Child Fetal Neonatal 74: F3-F9, Yager et al.1993. Pediatr Res 34: 525-529).

Pripremanje uzoraka krvi i mozga:

[0123] Mladunci pacova su žrtvovani 14. posnatalnog dana. Životinje su uvedene u duboku anesteziju sa prekomernom količinom natrijum pentobarbitala (100 mg/kg, ip).

[0124] Uzeta je krv, centrifugirana i uzorci seruma su čuvani na -80°C.

[0125] Životinje su zatim transkardijalno natopljene sa 0,9% rastvorom soli na 4°C, i zatim sa 4% paraformaldehidom u 0,1-mol/L rastvora soli puferisanim sa fosfatom (pH 7,4) na 4°C. Mozgovi su bili brzo izolovani, izmereni i uronjeni u isti rastvor za fiksiranje na 4°C u toku 24 sati, dehidrirani sa gradijentnim serijama etanola i ksilena, i smešteni u parafin.

Bojenje hematoksilin-eozina (histohemija):

[0126] Uzorci uklonjenih mozgova fiksirani paraformaldehidom i smešteni u parafin su koronarno isečeni na istom nivou hipokampusnog regiona prema Paxinos-ovom atlasu mozga pacova (Paxinos and Watson 2007. In: The rat brain in stereotaxic coordinates, 6th edition). Debljina preseka je bila 5 μm. Izvedeno je bojenje hematoksilineozinom. Ukratno, preseci su deparafinizovani u ksilenu i ponovo hidrirani u gradijentnim koncentracijama etanola pre bojenja. Preseci su bojeni sa hematoksilinom isprani u toku nekoliko sekundi u vodi, zatim smešteni u 1% eozin i isprani, dehidrirani, i pokriveni.

Brojanje intaktnih delija:

[0127] Brojanje intaktnih delija je izvedeno na presecima bojenim hematoksilin-eozinom mozgova mladunaca pacova pri povedanju 400x u 3 polja odgovarajude oblasti mozga. Brojanje je izvedeno u korteksu i hipokampusu (regionima: dentatni girus (DG), subgranularna zona (SGZ), cornu amonis (CA1, CA2/CA3)). Preseci su analizirani uz pomod mikroskopa (Olympus BX51, Olympus, Tokyo, Japan), skenera slike (DotSlide Digital Virtual Microscopy, Olympus, Germany) i ImageJ softvera (NIH, US).

[0128] Intaktne delije su nepovređene. Povređene delije su karakterisane sa bledim eozinofilnim bojenjem zajedno sa nejedoobraznim nuklearnim gustinama - nakupinama, kondenzovanim, ili bledim i uvedanim.

Bojenje proteina 2 vezanog za mikrotubule (MAP2):

[0129] Delovi mozga su obrađivani za imunohistohemijsku detekciju neuronsko citoskeletnih poremedaja. Za pretraživanje antigena isaečci su zagrevani u 10 mmol/L citratnom puferu (pH 6,0) na 100 C° u toku10 minuta. Endogena peroksidazna aktivnost je blokirana sa 3% vodenik peroksidom u toku 10 minuta i posle drugog blokiranja sa 5% normalnim kozijim serumom, isečci su inkubirani sa antitelom proteinom 2 vezanim za mikrotubule (MAP2), razblaženim na 1:1000 (mišje monoklonalno antitelo; Sigma, St. Louis, Missouri, US) 1h na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja, dodat je biotinilovani kozji anti-mišji imunoglobulin G (Vector Laboratories, Burlingame, California), i detekcija antitela je izvedena sa postupkom sa avidin-biotin kompleksom (Vector Laboratories), sa 3,3’-diaminobenzidinoma (DAB) kao hromogenom. Pratedi rekaciju sa DAB, pločice su isprane, dehidratisane, i poklopljene.

[0130] Uzorci su analizirani uz pomod skenera slike (Nanozoomer Virtual Microscopy, Hamamatsu, Tokyo, Japan) i ImageJ softvera (NIH, US). Merene su MAP2 pozitivne površine u impsilateralnim i kontralateralnim hemisferama. Odnos MAP2 pozitivnih površina je izračunavan kao MAP2 pozitivne površine ipsilateralne hemisfere podeljene sa MAP2 pozitivnim površinama kontralateralne hemisfere. Odnos MAP2 pozitivne površine u kontrolnoj grupi je 1,0 kao podrazumevajuda vrednost.

Dvostruko bojenje dablkortinom-vaskularnim endotelijalnim faktorom rasta:

[0131] Preseci su zagrevani u 10 mmol/L citratnom puferu (pH 6,0) na 100°C u toku 10 minuta. Endogena peroksidna aktivnost je blokirana sa 3% vodonik perioksidom u toku 10 minuta i posle drugog blokiranja sa 5% normalnim kozjim serumom, preseci su inkubirani antitelom antidablekortina (DCX), razblaženi na 1:1000 (zečijim poliklonalnim antitelom; Abcam, Cambridge, UK) i antitelom anti-vaskularnog endotelijalnog faktora rastva (VEGF), razblaženim na 1:100 (mišijim monoklonalim natitelom; Abcam, Cambridge, UK) u toku nodi na 4°C. Posle ispiranja, dodati su Alexa Fluor® koziji anti-mišiji, razblažen na 1:1000 i Alexa Fluor® koziji anti-mišiji, razblažen na 1:1000 (Invitrogen Inc., Ghent, Belgium) i preseci su inkubirani 1h na sobnoj temperaturi. Korišden je montažni medijum koji sadrži 4’,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) za florescentna ispitivanja (Vector Laboratories). Uzorci su analizirani uz pomod mikroskopa (Olympus Vanox AHBT3, Olympus), i ImageJ softvera (NIH). Procenat pozitivno obojenih delija je kvantifikovan kao suma delija pozitivno obojenih ili sa DCX ili VEGF podeljena sa ukupnim brojem DAPI pozitivnih delija izraženih u procentima.

Detekcija S100B i glijarnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) u uzorcima delijskog seruma:

[0132] ELISAs za detektovanje markera oštedenja mozga S100B proteina (Catalog# CSB-E08066r, Cusabio Biotech Co., LTD, China), i glijarnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP) (Catalog# E90068Ra, Uscn Life sciences Inc., China) u uzorcima seruma krvi su izvedeni prema preporukama izvođača.

Statističke analize:

[0133] Analiza je izvedena pomodu StatView softvera (Abacus Concepts, Inc., Berkeley, CA, US). Statististička upoređenja su izvedena pomodu ANOVA pradenim sa Fisher’s PLSD, Scheffe’s and Bonferroni/Dunn post-hok testovima sa P < 0,05 smatranim da ukazuju na značajnost. Sve vrednosti su izražene kao srednja vrednost ± SEM.

Primer 2: Neuroprotektivni efekat estetrola na životinjskom modelu neonatalane hipoksičnoishemijske encefalopatije

[0134] Posle porođaja, novorođena mladunčad pacova su raspoređena u jednu od sledede 4 grupe: kontrolna grupa, grupa sa nosačem, grupa E45 mg/kg/po danu i grupa E450 mg/kg/po danu. Od 4. dana do zaključno 7. dana, mladuncima pacova je injektovano intraperitonealno ili sredstvo (grupa sa nosačem) ili E4 (5mg/kg ili 50 mg/kg prema tome u koju su grupu raspoređenii) ili nije uopšte ništa injektovano (kontrolna grupa). Dana 7., 30 minuta posle poslednje injekcije, životinje iz grupa sa nosačem i E4 (5 mg/kg ili 50 mg/kg) su prošle kroz operaciju koja obuhvata dvostruku ligaciju obične leve karotidne arterije i prekidanje, pradeno hipoksijom izazvanom inhalacijom 11%-8% kiseonika uravnoteženog sa azotom pri koncentraciji koja opada u toku 20 minuta, pradene inhalacijom 8% kiseonika i 92% azota pri konstantoj koncentraciji u toku 35 minuta. Kontrolna grupa je prošla kroz slične postupke bez ligacije karotidne arterije i hipoksije. Sve manipulacije su izvedene na 37°C. Mladunci su se oporavili sa njihovim majkama do 14. postnatalnog dana.

Težine mladunca pacova

[0135] Merenje težine mladunaca pacova je izvedeno od 4. dana do 7. dana u cilju određivanja količine nosača i E4 neophodnog za injektovanje, i od 7. dana do 14. dana u cilju pradenja postoperativnog stanja mladunaca pacova.

[0136] Postoperativno 13. i 14. dana mladunci pacova tretirani sa 5mg/kg E4 su imali znatno više telesne mase od životinja tretiranih nosačem, dok je drugim postoperativnim danima kontrolna gupa imala znatno više telesne mase od ostalih grupa: dana 8 (kontrola vs. nosač i 5 mg/kg E4), 10 (kontrola vs. 50 mg/kg E4), 12 (kontrola vs. nosač), 13 (kontrola vs. nosač) i 14 (kontrola vs. nosač) (Slika 1).

Masa mozga

[0137] Merenje mase mozgova je otkrilo da su bili značajno viši u 5 mg/kg E4 i kontrolnim grupama nego u grupi tretiranoj sa nosačem (Slika 2).

Bojenje hematoksilin-eozin (Histohemija):

[0138] Samo preseci iz grupe tretirane sa nosačem pokazuju vidljivu dezorganizaciju hipokamusnog regiona ipsilateralno prema oštedenju (leva strana), okruženi sa površinama ugroženim infarktom koje se protežu ka hipokapusnom regiono kontralateralano prema oštedenjima (desna strana) (Slika 3). Ovi rezultati prikazuju da E4, pri obe doze, ima neuroprotektivni efekat.

Broj intaktnih delija:

[0139] U DG regionu hipokampusa broj intaktnih delija po vidnom polju je bio značajno viši u 5 mg/kg E4i kontrolnim grupama negu u grupi sa nosačem (Slika 4). U SGZ intaktni broj delija je bio znatno viši samo u 5 mg/kg E4 grupi u poređenju sa kontolnom grupom i grupom sa nosačem, gde je u CA1 primedena neznačajna razlika između ispitivanih grupa. U CA2/CA3 regionu hipokamupsa samo 50 mg/kg E4 grupa ima značajno viši broj intaktnih delija nego grupa tretiranih sa nosačem i 5 mg/kg E4, gde u korteksu 50 mg/kg E4 grupa ima značajno viši broj intaktnih delija u poređenju sa grupom samo sa nosačem. Ovi rezultati pokazuju da estetrol ima neuroprotektivno dejstvo.

Primer 3: Neuroprotektivan efekat estetrola na životinjskom modelu neonatalne hipoksičnoishemijske encefalopatije

[0140] Novorođeni mladunci su raspoređeni u jednu od slededih 6 grupa od 4. postnatalnog dana: kontrolna grupa (n=24), grupa sa nosačem (n=14), grupa 1 mg/kg/po danu E4 (n=11), grupa 5 mg/kg/po danu E4 (n=14), grupa 10 mg/kg/po danu E4 (n=14), ili grupa 50 mg/kg/po danu E4 (n=19). Od postnatalnog dana 4, mladuncima pacova je intraperitonealno injektovan ili nosač (grupa sa nosačem) ili E4 (1, 5, 10, ili 50 mg/kg/po danu u zavisnosti u koju E4 grupu je raspoređen) ili ni nosač ni E4 (kontrolna grupa). Dana 7., 30 minuta posle poslednje injekcije, životinje su anestezirane sa izofluranom (indukcija, 3,0%; održavanje, 1,5%), i mladunci pacova iz grupa sa nosačem i E4 su prošli kroz operaciju koja obuhvata dvostruku ligaciju leve obične karotidne arterije i prekidanje. Posle postupka, mladunci su vradeni njihovim majkama i omogudeno je da se oporave u toku 1 sata. Mladunci su zatim smešteni u vlažni hipoksični in vivo ormar (CoyLab, Grass Lake, MI, USA). Hipoksija je izvedena inhalacijom 11%-8% kiseonika uravnoteženog azotom uz smanjenje koncentracije kiseonika u toku 20 minuta, a zatim pradenim inhalacijom 8% kiseonika i 92% azota pri konstantoj koncentraciji u toku 35 minuta. Sve manipulacije su izvedene na 37°C. Kontrolna grupa je prošla kroz slične postupke bez ligacije leve obične karotidne arterije pradene hipoksijom i injekcijom. Mladunci pacova su se oporavili sa njihovim majkama i normalno su odgajani do žrtvovanja14. potnatalnog dana.

Rektalna temperatura:

[0141] Rektalne temperature nisu bile značajno različite između ispitivanih grupa, ukazujudi da prethodno tretiranje sa estetrolom nije uticalo na telesnu temperaturu (podaci nisu prikazani).

Telesne mase

[0142] Radi pradenja postoperativnog stanja mladunaca pacova usled izvedenih manipulacija i prethodog tretmana sa estetrolom, telesne mase su pradene od 7. postantalnog dana do zaključno 14. dana. Slika 5 pokazuje da 8. postnatalnog dana i 13. kontrolna grupa i mladunci pacova prethodno tretirani sa estetrolom imaju značajno više post-operativne telesne mase nego životinje prethodno tretirane sa nosačem. Dalje, 9. dana postnatalno životinje kontrolne grupi i grupe prethodno tretirane sa 10mg/kg estetrola imaju značajno višu telesnu masu od grupe sa nosačem, gde 10, 11 i 12 dana posle rođenja mladucni pacova kontrolne grupe, prethodno tretiranih sa 1 mg/kg i 10 mg/kg estetrola pokazuju značajno više telesne mase od grupe sa nosačem. 14. postnatalnog dana životinje kontrolne grupe i prethodno tretirane sa 1 mg/kg, 5 mg/kg, i 10 mg/kg estetrola imaju značano višu telesnu masu nego grupa samo sa nosačem. Međutim, 8, 9, 10, 12 postnatalnog dana telesne mase životinja iz kontrolne grupa su bile značajno više od grupa prethodno tretiranih sa 5 mg/kg i 50 mg/kg estetrola, pri čemu 11., 13., 14. postnatalnog dana životinje iz kontrolne grupe su imale znatno više telesne mase od same grupe prethodno tretirane sa 50 mg/kg estetrola.

Mase mozgova

[0143] Da bi se porcenilo mogude oštedenje mozga, izvedeno je merenje mozgova mladunaca pacova. Slika 6 pokazuje da je masa mozga bila znatno viša kontrolnoj grupi (1,225±0,006 g), i 1 mg/kg E4 (1,155±0,022 g), 5 mg/kg E4 (1,181±0,023 g), 10 mg/kg E4 (1,179±0,012 g), i 50 mg/kg E4 (1,163±0,016 g) prethodno tretiranim grupama nego u grupama sa nosačem (1,016±0,042 g).

Bojenje hematoksilin-eozinom i brojanje intaktnih delija:

[0144] Preseci mozga mladunaca pacova prethodno tretiranih sa nosačem su pokazivali vidljivu dezorganizaciju i oštedenja hipokampusnog regiona ipsilateralno oštedenju (leva strana) koje se proteže ka korteksu (Slika.7 A-C).

[0145] U DG region hipokampusa broj intaktnih delija po vizuelnom polju je značajno viši u kontrolnoj grupi životinja (154,5±7,942) (Slika 7B(a)) i životinja injektiranih sa 5 mg/kg E4 (121,0±8,098) (Slika 7B(d)) nego u grupi sa nosačem (84,563±5,954) (Slika 7B(b)) (Slika 7D). Dalje, broj SGZ intaktnih delija je bio znatno viši u kontrolnoj grupi (58,357±3,653) (Slika. 7B(a)), grupi 5 mg/kg E4 (42,846± 3,884) (Slika 7B(d)) i grupi 10 mg/kg E4 (47,6± 4,672) (Slika 7B(e)) nego u grupi sa nosačem (23,875±3,363) (Slika 7B(b)) (Slika 7D), gde je u istom regionu kontrolna grupa pokazala znatno vedi broj intaktnih delija nego grupa 1 mg/kg E4 (35,6±2,75) (Slika 7B(c)) i grupa 50 mg/kg E4 (30,714±3,615) (Slika 7B(f)) (Slika 7D). U CA1 regionu značajna razlika je detektovana između kontrolne grupe (70,714±4,819) (Slika 7B(a)), i 1 mg/kg E4 (43,2± 2,435) (Slika 7B(c)) i 10 mg/kg E4 (57,4±4,566) (Slika 7B(e)) grupe, dok druge grupe ne pokazuju značajnu razliku (Slika 7D). U CA2/CA3 regionu hipokampusa kontrolna grupa (56,929±4,859) (Slika 7B(a)) i 50 mg/kg E4 (53,0±4,7) (Slika 7B(f)) grupa su imale značajno viši broj intaktnih delije nego grupa sa nosačem (29± 3,543) (Slika 7B(b)), gde sama kontrolna grupa ima značajno viši broj intaktnih delija nego grupa 1 mg/kg E4 (32,8±2,808) (Slika 7B(c)) (Slika 7D).U korteksu 50 mg/kg E4 grupe (76,286±3,962) (Slika 7C(f)) pokazan je zanatno viši broj intaktnih delija nego u grupi samo sa nosačem (51,938± 5,304) (Slika 7C(b)) (Slika 7D).

MAP2 bojenje:

[0146] Gubitak ipsilateralnog MAP2 bojenja koje je određeno posle hipoksije-ishemije (HI) 14. postnatalnog dana je korišden kao marker ranog gubitka sive materije. Oblast sa intaktnim neuronima pokazala je bojenje sa MAP2, gde su oblasti oštedene infarktnom pokazale gubitak MAP2 bojenja. Naročito, u grupi sa nosačem bio je gubitak MAP2 bojenja u hipokampusnoj oblasti ipsilateralno oštedenoj hemisferi protežudi se do korteksa (Slika 8A(b)). Kvantifikacija odnosa MAP2-pozitivnih oblasti otkriva da posle predtretmana sa estetrolom (Slika 8B) odnos MAP2-pozitivnih oblasti je bio značajno viši kod životinja kontrolne grupe (podrazumevajuda vrednost 1,0) (Slika 8A(a)), i grupama prethodno tretiranim estetrolom (1 mg/kg E4 (0,929±0,019) (Slika 8A(c)), 5 mg/kg E4 0,889±0,063 (Slika 8A(d)), 10 mg.kg E4 (0.89860.022) (Slika 8A(e)), 50mg/kg E4 (0.92260.031) (Slika 8A(f))) nego u grupi sa nosačem (0,675±0,046) (Slika 8A(b)).

Dvostruko bojenje dablkortin-vaskularni endotelijalni faktora rasta:

[0147] Ekspresija DCX i VEGF 14. posnatalnog dana je korišdena kao marker neuro- i vaskulogeneze, respektivno. Pretretman estetrolom doveo je do znatno višeg procenta u DG regionu hipokapusa DCX pozitivno bojenih delija kod životinja pre-tretiranih sa 10 mg/kg E4 (55,8±5,658%) nego grupa sa nosačem (32,833±2,625%) (Slika 9A), gde u istom regionu procenat VEGF pozitivno bojenih delija je bio znatno viši nego u grupi prethodno tretiranoj sa 1 mg/kg E4 (43,5±2,083%), 5 mg/kg E4 (46,0±4,361%), 10 mg/kg E4 (47,0± 5,362%), i 50 mg/kg E4 (46,0±4,465%) nego u grupi sa nosačem (25,333±2,271%) (Slika 9B). Pored toga, u CA1 regionu procenat DCX pozitivno bojenih delija je bio znatno viši u grupama 5 mg/kg E4 (35,2± 3,309%), i 10 mg/kg E4 (34,1± 6,664%) nego u grupi sa nosačem (11± 1,518%) (Slika 9A), gde procenat VEGF pozitivno bojednih delija je bio znatno viši samo u grupi 10 mg/kg E4 (37,4± 7,645%) (Slika 9B). U CA2/CA3 regionu procenat DCX pozitivno bojenih delija je bio znatno viši u 5 mg/kg E4 grupi (30,3± 3,7%) nego u grupi sa nosačem (6,417± 1,033%), gde je procenat VEGF pozitivno bojenih delija bio značajno različiti samo u grupi sa 1 mg/kg E4 (34,1±6,855%) (Slika 9B). U korteksu procenat DCX iVEGF pozitivno bojenih delija je bio značajno viši u grupi sa 10 mg/kg E4 (52,1±7,762% i 46,2± 7,646%, respektivno) nego u grupi samo sa nosačem (26,0±4,156% i 20,5±2,414%, respektivno) (Slika 9A-B, respektivno).

S100B i glijarni fibrilarni kiseli protein (GFAP) u krvnom serumu:

[0148] S100B i glijarni fibrilarni kiseli protein (GFAP) su korišdeni kao markeri oštedenja mozga. Njihova koncentracija je merena u krvnom serumu sa ELISA zaS100B i GFAP proteine. Kako je prikazano na slici 10A, posle prethodnog tretmana sa estetrolom koncentracija S100B je bila značajno niža kod životinja iz kontrolne grupe (344,614±50,328 pg/ml), i 50 mg/kg E4 grupi (361±32,914 pg/ml) nego kod životinja prethodno tretiranih nosačem (698,925±657,342pg/ml), mada u 10 mg/kg E4 grupi koncentracija S100B je značajno viša nego u kontrolnoj grupi, 5 mg/kg E4, i 50 mg/kg E4 grupama.

[0149] Slika 10B pokazuje da je primeden značajan pad u koncentraciji GFAP kod životinja kontrolne grupe (407,567±49,258 pg/ml), i životinja prethodno tretiranih sa 50 mg/kg E4 (300,388±31,232 pg/ml) nego u grupi sa nosačem (1003,926±288,345 pg/ml).

Zaključak:

[0150] Prikazani rezultati pokazuju da estetrol ima neuroprotektivan doznozavisan efekat na hipokampusne formacije i korteks na životinjskom modelu HIE. Takođe prema prikazanim rezultatima, prethodan tretman sa estetrolom smanjuje rani gubitak sive materije i pospešuje neuro i vaskulogenezu. Pored toga, prethodan tretman sa estetrolom nema neželjena dejstva na telesnu masu, masu mozga i telesnu temperaturu.

Primer 4: Terapeutski efekat estratriola na životinjskom modelu neonatalne hipoksično-ishemijske encefalopatije

[0151] Da bi se ispitao terapeutski efekat estetrola, novorođeni mladunci pacova su raspoređeni u jednu od slededih 6 grupa 7. postnatalnog dana: kontrolna grupa (n=29), grupa sa nosačem (n=20), 1 mg/kg E4 grupa (n=16), 5 mg/kg E4 grupa (n=19), 10 mg/kg po danu E4 (n=17) i 50 mg/kg po danu E4 grupa (n=15). 7. postnatalnog dana životinje su anestezirane sa izofluranom (indukcija, 3,0%; održavanje, 1,5%), i mladunci pacova iz grupa sa nosačem i E4 su prošli kroz operaciju koja obuhvata dvostruku ligaciju leve obične karotidne arterije i presecanje. Posle operacije, mledunci pacova su vradeni njihovim mamama i omogudeno je da se oporave u toku 1 sata. Mladunci su zatim smešteni u vlažni hipoksični in vivo orman (CoyLab). Hipoksija je izazvana inhalacijom 11%-8% kiseonika uravnoteženog sa azotom pri smanjenoj koncentraciji kiseonika u toku 20 minuta, pradena inhalacijom 8% kiseonika i 92% azota pri konstantnoj koncentraciji u toku 35 minuta. Sve manipulacije su izvedene na 37°C.

[0152] Posle vađenja iz hioksične komore mladuncima pacova je injektovano intraperitonealno ili nosač (grupa sa nosačem) ili E4 (1 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg ili 50 mg/kg),prema tome u koju su grupu raspoređeni. Životinje iz kontrolne grupe su prošle kroz slične postupke ali bez ligacije leve obične karotidne arterije i presecanja, pradenih hipoksijom i bez davanja nosača ili estetrola. Mladunci pacova su se oporavljeni sa njihovim majkama do njihovog žrtvovanja 14. postnatalnog dana.

Rektalna temperatura:

[0153] Rektalne temperature nisu bile značajno različite između ispitivanih grupa, ukazujudi da tretiranje sa estetrolom ne utiče značajno na telesnu temperaturu (podaci nisu pokazani).

Telesne mase

[0154] Da bi se procenilo postoperativno stanje mladunaca pacova usled izvedenih manipulacija i tretmana sa estetrolom, post-operativne telesne mase su merene 7. i 14. postnatalnog dana. Slika 11 pokazuje da 14. postnatalnog dana životinje iz kontrolne grupe i životinje iz 1 mg/kg E4, 5 mg/kg E4, 10 mg/kg E4, i 50 mg/kg E4 grupa su imala znatno više telesne mase od grupe sa nosačem. Životinje iz kontrolne grupe su pokazale značajno više telesne mase nego grupa tretirana sa 5 mg/kg E4.

Masa mozga

[0155] Slika 12 pokazuje da ja masa mozga bila značajno viša kod životinja iz kontrolne grupe (1,214±0,007 g), i 1 mg/kg E4 (1,099±0,037 g), 5 mg/kg E4 (1,06±0,035 g), 10 mg/kg E4 (1,12±0,33 g), i 50 mg/kg E4 (1,163±0,025 g) grupa nego u grupi sa nosačem (0,937±0,022 g). Životinje iz kontrolne grupe su pokazale značajno više mase mozga nego u grupi 5 mg/kg E4. Ovaj uzorak rezultata je isti kao u primeru 3.

Bojenje hematoksilin-eozinom i brojanje intaktnih delija:

[0156] U DG i SGZ regionima hipokampsua broj intaktnih delije po vidnom polju je bio znatno viši kod životinja iz kontrolne grupe (Slika 13B(a)) nego kod životinja iz grupe sa nosačem (Slika 13B(b)) (160,8±7,074 vs. 88,2±19,477, i 60,8±4,635 vs. 28.366.73, respektivno) (Slika 13D). U CA1 regionu broj intaknih delija je značajno viši u kontrolnoj grupi (69,4± 5,256) (Slika 13B(a)) i 1 mg/kg E4 grupi (51,5± 2,5) (Slika 13B(c)) nego u grupi sa nosačem (28,4± 6,997) (Slika 13B(b)), i u kontrolnoj grupi nego u 5 mg/kg E4 grupi (45,3±2,989) (Slika 13B(d)), 10 mg/kg E4 grupi (46,0±3,19) (Slika 13B(e)), i 50 mg/kg E4 grupi (46,6±5,336) (Slika 13B(f)) (Slika 13D). U CA2/CA3 regionu hipokampusa životinje iz kontrolne grupe (57,1± 6,192) (Slika 13B(a)) i životinje tretirane sa 10 mg/kg E4 (35,2± 3,169) (Slika 13B(e)) imaju značajno viši broj intaktnih delija negu u grupi sa nosačem (13,8±3,018), gde kontrolna grupa ima značajno viši broj intaktnih delija nego u 1 mg/kg E4 (33,9±4,306), 5 mg/kg E4 (33,8±4,704), 10 mg/kg E4 (35,2±3,169), i 50 mg/kg E4 (30,5±2,527) grupama (Slika 13D). U korteksu životinja iz kontrolne grupe (70,1± 6,165) (Slika 13C(a)) i životinje tretirane sa 5 mg/kg E4 (57,1± 7,012) (Slika 13C(d)), 10 mg/kg E4 (56,9± 5,958) (Slika 13C(e)) i 50 mg/kg E4 (54,5± 3,403) (Slika 13C(f)) je pokazala značajno vedi broj intaktnih delija negu u grupi sa nosačem (23,2±3,872) (Slika 13C(b)), gde je kontrolna grupa imala značajno viši broj intaktnih delija nego 1 mg/kg E4 grupa (42,4±4,865) (Slika 13C(c)) (Slika 13D).

MAP2 bojenje:

[0157] Isti uzorak MAP2 bojenja je primeden u primeru 3. Kvantifikacijom odnosa MAP2-pozitivnih površina (Slika 14B) je ustanovljeno da je odnos MAP2-pozitivnih površina bio znatno viši kod životinja iz kontrolne grupe (podrazumevajuda vrednost 1,0) (Slika 14A(a)), i grupa tretiranih estetrolom (1 mg/kg E4 (0,943±0,028) (Slika 14A(c)), 5 mg/kg E40,89±0,037 (Slika 143A(d)), 10 mg/kg E4 (0,938±0,044) (Slika 14A(e)), 50 mg/kg E4 (0,966±0,036) (Slika 14A(f))) nego u grupi sa nosačem (0,656±0,091) (Slika 14A(b)).

Dvostuko bojnje dablekortin-Vaskularni Endotelijalni faktor rasta:

[0158] U DG region hipokampusa ni DCX ni VEGF bojenje nije bilo značajno različito u ispitivanim grupama (Slika 15). U CA1 regionuprocenat DCX pozitivno obojenih delija je bio znatno viši u grupama sa 10 mg/kg E4 (37,1± 3,84) i grupama sa 50 mg/kg E4 (37,3± 4,784%) nego u grupi sa nosačem (12,8±2,947%) (Slika15 A), gde je procenat VEGF pozitivno bojenih delija bio znatno viši u grupama 5 mg/kg E4 (37,4±4,833%), 10 mg/kg E4 (37,1±3,84%), i 50 mg/kg E4 (45,1±4.,753%) nego kod životinja tretiranim sa nosačem (15,7± 4,924%) (Slika 15B). U CA2/CA3 regionu procenat DCX pozitivno obojenih delija je značajno viši u grupi 10 mg/kg E4 (42,5±5,986%) nego kod životinja tretiranih sa nosačem (10,4± 2,868%) (Slika 15A), gde procenat VEGF pozitivno obojenih delija nije bio značano drugačiji između ispititvanih grupa (Slika 15B). Ukorteksu procenat DCX pozitivno obojenih delija je bio značano viši u grupi sa 5 mg/kg E4 (45,2±3,339%), 10 mg/kg E4 (49,4±4,949%), i 50 mg/kg E4 (49,6± 3,11%) nego u grupi sa nosačem (23,3±4,74%) (Slika 15A), gde procenat VEGF pozitivno bojenih delija je značano niži kod životinja kontrolne grupe (24,6±3,7%) nego u grupi tretiranoj sa 10 mg/kg E4 (49,4±4,949%) (Slika 15B).

S100B i glijarno fibrilarni kiseli protein (GFAP) u krvnom serumu:

[0159] Kao što je prikazano na slici 16, značajno niža ekspresija S100B i GFAP proteina je primedena kod životinja iz kontrolne grupe i životinja tretiranih estetrolom u odnosu na grupu sa nosačem.

Zaključak:

[0160] Prikazani rezultati pokazuju da estetrol ima terapeutsko dozno zavisne efekte na hipokampusne formacije i korteks na životinjskom modelu HIE. Takođe prema prikazanim rezultatima, tretman sa estetrolom smanjuje gubitak sive materije i pospešuje neuro- i vaskulogenezu. Pored toga, tretiranje sa estetrolin nema neželjenog dejstva na telesnu masu, masu mozga ili telesnu temperaturu.

Primer 5: Terapeutski efekti estetrola kod novorođenčadi posle perinatalne ili neonatalne asfiksije

[0161] Novorođenčad koja su pretrpela asfiksiju pri rođenju i koja su pokazali bar jedan od slededih simptoma: smanjenu svesnost i acidozu (pH < 7,00 ili deficit baze ≥ 12), 10-minuta Apgarovo bodovanje ≤ 5, ili kontinuiranu reanimaciju 10 minuta, su tretirani sa estetrolom.

[0162] Estetrol je davan intravenski u jednoj injekciji ili infuzijom u toku 6 sati posle rođenja pri dozi od 5 mg/kg telesne mase ili10 mg/kg telesne mase. Doze mogu biti ponovljene.

[0163] Opciono, novorođeni mogu biti simultano podvrnutiti hipotremiji u toku 72 sata polazedi 6 sati od porođaja .

Claims (5)

PATENTI ZAHTEVI

1. 1,3,5(10)-estratrien-3, 15α, 16α, 17β-tetrol (Estetrol) za upotrebu u lečenju povreda moga u hipokampusnom regionu.

2. Estetrol za upotrebu prema zahtevu 1, gde je lečenje povrede mozga terapeutsko.

3. Estetrol za upotrebu prema zahtevima 1 ili 2, gde je povreda mozga izabrana iz grupe koju čine hipoksična povreda mozga, anoksična povreda mozga , traumatska povreda mozga.

4. Estetrol za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 3, za upotrebu u lečenju hipoksičnoishemijske encefalopatije (HIE).

5. Estetrol za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, za upotrebu u lečenju neonatalne hipoksično-ishemijske encefalopatije (HIE).