RS56661B1 - Kompozicije i postupci za povećanje rasta mišića - Google Patents

Kompozicije i postupci za povećanje rasta mišića

Info

Publication number
RS56661B1
RS56661B1 RS20171263A RSP20171263A RS56661B1 RS 56661 B1 RS56661 B1 RS 56661B1 RS 20171263 A RS20171263 A RS 20171263A RS P20171263 A RSP20171263 A RS P20171263A RS 56661 B1 RS56661 B1 RS 56661B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
variable region
antibody
light chain
heavy chain
Prior art date
Application number
RS20171263A
Other languages
English (en)
Inventor
Catrin Berger
Tanja Herrmann
Chris Lu
Kelly-Ann Sheppard
Estelle Trifilieff
Stefanie Urlinger
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of RS56661B1 publication Critical patent/RS56661B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/02—Muscle relaxants, e.g. for tetanus or cramps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)

Description

TEHNIČKA OBLAST
[0001] Ovaj pronalazak je u oblasti antitela protiv aktivinskog receptora tipa IIB (ActRIIB). Naročito, odnosi se na pomenuta antitela za upotrebu u lečenju mišićnih poremećaja, kao što je gubitak mišića zbog bolesti ili neupotrebe.
STANJE TEHNIKE
[0002] Aktivini su dimerni faktorsi rasta i diferencijacije koji pripadaju superfamiliji strukturno srodnih signalnih proteina transformišućeg faktora rasta beta (TGF-beta). Aktivini daju signale putem heterodimernog kompleksa receptorske serin kinaze koji obuhvata najmanje dva tipa I (I i IB) i dva tipa II (II i IIB, aka ACVR2A i ACVR2B) receptora. Ovi receptori su svi transmembranski proteini, sačinjeni od ligand-vezujućeg ekstracelularnog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin specifičnošću. Receptori tipa I su neophodni za prenos signala, dok su receptori tipa II potrebni za vezivanje liganda i za ekspresiju receptora tipa I. Receptori tipa I i II obrazuju stabilan kompleks nakon vezivanja liganda što rezultuje u fosforilaciji receptora tipa I pomoću receptora tipa II.
[0003] Aktivinski receptor II B (ActRIIB) je receptor za miostatin. Interakcija između miostatina i ovog receptora reguliše inhibiciju diferencijacije skeletnih mišića preko signalnog puta zavisnog od Smad proteina. Na taj način, inhibicijom ili sprečavanjem miostatina da se veže za ActRIIB, može da se indukuje obrazovanje skeletnih mišića.
[0004] Razne grupe su razmatrale ovo pitanje. Bogdanovich et al (Nature, 2002, 420:418-421) opisuje da su anti-miostatin antitela bila sposobna da blokiraju miostatin, što rezultuje u povećanju mišićne mase u mišjem modelu Dišenove mišićne distrofije. Bradley et al (Cell Mol. Life Sci. 2008, 65:2119-2124) su izradili pregled raznih dostupnih pristupa za modulaciju interakcije miostatin/ActRIIB, uključujući prethodno pomenuta anti-miostatin antitela, inhibiciju oslobađanja zrelog miostatina primenom propeptida miostatina, primenu folistatina za blokiranje receptora za miostatin, primenu inhibitora HDAC za indukovanje proizvodnje folistatina, primenu izmenjenog peptida miostatina koji sprečava vezivanje miostatina za receptor i primenu rastvorljivog mamac-receptora za miostatin. US 6 656 475 opisuje da miostatin utiče na nakupljanje masti i da se miostatin vezuje za ActRIIB. Uprkos ovim potencijalnim terapijama, nema proizvoda koji je dostupan za lečenje pacijenata. Zaista, nedavno je jedna kompanija otkazala svoj projekat za anti-miostatin antitelo.
[0005] Prema tome postoji potreba za postupkom za povećanje mišićne mase i snage kod pacijenta.
OPIS PRONALASKA
[0006] Otkriveno je da antitela usmerena protiv ActRIIB receptora mogu da spreče vezivanje miostatina za receptor, sprečavajući na taj način inhibiciju diferencijacije mišića pomoću signalnog puta zavisnog od Smad proteina. Ovo vodi povećanju mišićne mase i snage kod pacijenta.
[0007] Stoga, u jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje humano monoklonsko anti-ActRIIB antitelo, ili funkcionalni protein koji sadrži antigen-vezujući deo pomenutog antitela. Polipeptidna sekvenca humanog ActRIIB je navedena u SEQ ID NO: 181 (AAC64515.1, GI:3769443). U određenom primeru izvođenja, anti-ActRIIB antitelo se odlikuje antigen-vezujućim regionom koji je specifičan za ciljni protein ActRIIB i vezuje se za ActRIIB ili za fragment ActRIIB. Antitelo je pogodno za upotrebu u terapiji.
[0008] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili funkcionalni fragment inhibira miostatinom indukovanu inhibiciju skeletne diferencijacije posredovane aktivinskim receptorom tipa IIB posredstvom puta zavisnog od Smad proteina.
[0009] Vezivanje može da se odredi pomoću jednog ili više ogleda koji mogu da se koriste za merenje aktivnosti antitela koja predstavlja ili antagonizam ili agonizam. Poželjno, ogledi mere bar jedno od dejstava antitela na ActRIIB koja uključuju: inhibiciju vezivanja miostatina za ActRIIB pomoću ELISA testa, inhibiciju prenosa signala indukovanog miostatinom (na primer putem testa za reporter gen zavisan od Smad proteina), inhibiciju miostatinom indukovane fosforilacije Smad proteina (P-Smad ELISA) i inhibiciju diferencijacije ćelije skeletnog mišića indukovane miostatinom (na primer pomoću testa za kreatin kinazu).
[0010] Opis obezbeđuje antitela koja se specifično vezuju za region za koji se vezuje miostatin (tj. ligand vezujući domen) ActRIIB. Ovaj ligand vezujući domen se sastoji od aminokiselina 19-134 sekvence SEQ ID NO: 181 i ovde je označen kao SEQ ID NO: 182.
[0011] Opisana antitela se vezuju za ActRIIB sa KDod 100nM ili manje, 10nM ili manje, 1nM ili manje. Poželjno, antitela pronalaska se vezuju za ActRIIB sa afinitetom od 100pM ili manje (tj.100pM, 50pM, 10pM, 1pM ili manje). Dodatno su opisana antitela pronalaska koja se vezuju za ActRIIB sa afinitetom od između 10 i 20pM.
[0012] Opisana antitela prvenstveno se vezuju za ActRIIB radije nego ActRIIA. Opisana su antitela koja se vezuju za ActRIIA sa afinitetom od 100pM ili više (tj.250pM, 500pM, 1nM, 5nM ili više).
[0013] Ovde su opisana antitela izotipa IgG2.
[0014] U jednom primeru izvođenja, antitela pronalaska su izotipa IgG1. U sledećem primeru izvođenja, antitela pronalaska su IgG1 izotipa i imaju izmenjenu efektorsku funkciju putem mutacije Fc regiona. U jednom primeru izvođenja, pomenuta izmenjena efektorska funkcija utišava aktivnost ADCC i CDC.
[0015] U još jednom povezanom opisu, antitela su u potpunosti humana IgG1 antitela bez aktivnosti ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) ili CDC aktivnosti i vezuju se za region ActRIIB koji se sastoji od aminokiselina 19-134 sekvence SEQ ID NO:181.
[0016] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovana humana antitela koja inhibiraju vezivanje miostatina za ActRIIB i aktiviraju diferencijaciju skeletnih mišića in vitro i in vivo. U određenim primerima izvođenja, antitela pronalaska su izvedena iz određenih sekvenci teškog i lakog lanca i/ili sadrže određena strukturna svojstva kao što su CDR regioni koji sadrže određene aminokiselinske sekvence. Pronalazak obezbeđuje izolovana antitela, postupke za pravljenje takvih antitela, imunokonjugate i multivalentne ili multispecifične molekule koji sadrže takva antitela i farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela, imunokonjugate ili bispecifične molekule pronalaska. Pronalazak se takođe odnosi na postupke upotrebe antitela za inhibiciju, tj. antagonizovanje, funkcije ActRIIB u cilju inhibicije aktivacije Smad proteina i time indukcije diferencijacije skeletnih mišića što, na primer, rezultuje u lečenju patološkog poremećaja.
[0017] Patološki poremećaj može da bude mišićno-skeletna bolest ili poremećaj, kao što je mišićna atrofija. Postoje mnogi uzroci mišićne atrofije, uključujući posledice lečenja glukokortikoidima kao što je kortizol, deksametazon, betametazon, prednizon, metilprednizolon, ili prednizolon. Mišićna atrofija može takođe da nastane kao rezultat denervacije izazvane oštećenjem nerva ili kao rezultat degenerativne, metaboličke, ili inflamatorne neuropatije (npr., Žilijen-Bar sindrom, periferna neuropatija, ili izlaganje toksinima okoline ili lekovima).
[0018] Dodatno, mišićna atrofija može da bude rezultat miopatije, kao što je miotonija; kongentialne miopatije, uključujući nemalinsku miopatiju, miopatiju sa brojnim malim jezgrima i miotubularnu (centronuklearnu) miopatiju; mitohondrijalnu miopatiju; familijarnu periodičnu paralizu; inflamatornu miopatiju; metaboličku miopatiju, kao što je ona izazvana bolešću skladištenja glikogena ili lipida; dermatomiozitis; polimiozitis; miozitis sa inkluzionim telima; osificirajući miozitis; rabdomiolizu i mioglobinuriju.
[0019] Miopatija može da bude uzrokovana sindromom mišićne distrofije, kao što je Dišenova, Bekerova, miotona, facioskapulohumeralna, Emeri-Drajfusova, okulofaringealna, skapulohumeralna, mišićna distrofija pojasnog oblika, Fukujama, kongenitalna mišićna distrofija, ili nasledna distalna miopatija. Mišićnoskeletna bolest može takođe da bude osteoporoza, prelom kosti, nizak rast, ili patuljasti rast.
[0020] Dodatno, atrofija mišića može da bude rezultat adultnog oboljenja motornih neurona, infantilne spinalne mišićne atrofije, amiotrofne lateralne skleroze, juvenilne spinalne mišićne atrofije, autoimune motorne neuropatije sa multifokalnim sprovodnim blokom, paraliza zbog moždanog udara ili povrede kičmene moždine, imobilizacija skeleta zbog povrede, produženo mirovanje, voljna neaktivnost, nevoljna neaktivnost, metabolički stres ili nedovoljna ishranjenost, kancer, AIDS, izgladnjivanje, poremećaj tiroidne žlezde, dijabetes, benigna kongenitalna hipotonija, bolest centralnog jezgra, opekotina, hronična opstruktivna bolest pluća, bolesti jetre (primeri su fibroza, ciroza), sepsa, renalna insuficijencija, kongestivno zatajenje srca, starenje, putovanje u svemir ili vreme provedenu u bestežinskom stanju.
[0021] Primeri stanja povezanih sa starenjem uključuju, sarkopeniju, atrofiju kože, gubitak mišića, atrofiju mozga, aterosklerozu, arteriosklerozu, plućni emfizem, osteoporozu, osteoartritis, imunološku nekompetentnost, visok krvni pritisak, demenciju, Hantingtonovu bolest, Alchajmerovu bolest, katarakte, makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, kancer prostate, moždani udar, smanjen očekivani životni vek, slabost, gubitak pamćenja, boranje, oštećenu bubrežnu funkciju, i gubitak sluha povezan sa starenjem; metaboličke poremećaje, ukljčujući dijabetes tipa II, metabolički sindrom, hiperglikemiju, i gojaznost.
[0022] Druga stanja koja mogu da se leče antitelima pronalaska uključuju akutnu i/ili hroničnu bubrežnu bolest ili insuficijenciju, fibrozu ili cirozu jetre, kancer kao što je kancer dojke, Parkinsonovu bolest; stanja povezana sa smrću neurona, kao što je ALS, atrofiju mozga, ili demenciju i anemiju.
[0023] Dodatna stanja uključuju kaheksiju, kaheksiju povezanu sa reumatoidnim artritisom i kaheksiju povezanu sa kancerom.
[0024] Do danas, razvijeno je vrlo malo pouzdanih ili efikasnih terapija za lečenje ovih bolesti.
[0025] Na osnovu objavljenih dokaza o ulozi vezivanja aktivina za ActRIIB između ostalih receptora (Werner and Alzheimer, Cytokine Growth Factors Rev 2006, 17(3):157-171), u doprinosu fibrozi jetre, bubrega i pluća, i o ulozi miostatina, aktivina, ili ActRIIB u kancerima (Tsuchida et al, Endo J, 2008, 55(1):11-21) antitela pronalaska mogu da se koriste za lečenje fibroze jetre, bubrega, pluća i kancera kao što su na primer, ali bez ograničenja rabdomiosarkomi, kanceri koji dovode do gubitka kosti, hepatocelularni karcinomi, gastrointestinalni kanceri.
[0026] Prevencija može da bude potpuna, npr., potpuno odsustvo stanja povezanog sa starenjem ili metaboličkog poremećaja. Prevencija može takođe da bude delimična, tako da je verovatnoća pojave stanja povezanog sa starenjem ili metaboličkog poremećaja kod subjekta manja nego kod subjekta koji ne prima antitelo predmetnog pronalaska.
[0027] U cilju boljeg razumevanja predmetnog pronalaska, određeni termini su prvo definisani. Dodatne definicije su date kroz detaljni opis.
[0028] Termin "imunski odgovor" odnosi se na delovanje, na primer, limfocita, antigen prezentujućih ćelija, fagocitnih ćelija, granulocita, i rastvorljivih makromolekula koje proizvode prethodno navedene ćelije ili jetra (uključujući antitela, citokine, i komplement) koje rezultuje u selektivnom oštećenju, uništavanju, ili eliminaciji iz ljudskog tela invazivnih patogena, ćelija ili tkiva inficiranih patogenima, kanceroznih ćelija, ili, u slučaju autoimunosti ili patološke inflamacije, normalnih humanih ćelija ili tkiva.
[0029] “Put prenosa signala” ili “signalna aktivnost” odnosi se na biohemijski uzročni odnos koji se obično pokreće interakcijom protein-protein kao što je vezivanje faktora rasta za receptor, koje rezultuje u prenosu signala iz jednog dela ćelije u drugi deo ćelije. Uopšteno, prenos uključuje specifičnu fosforilaciju jednog ili više tirozinskih, serinskih, ili treoninskih ostataka na jednom ili više proteina u nizu reakcija koje uzrokuju prenos signala. Pretposlednji procesi tipično uključuju događaje u jedru, koji dovode do izmenjene genske ekspresije.
[0030] Termin ActRIIB ili Act IIB receptor odnosi se na humani ActRIIB kao što je definisano u sekvenci SEQ ID NO: 181 (AAC64515.1, GI:3769443). Poliklonska i monoklonska anti-ActRIIB antitela čistoće koja odgovara za istraživanje su poznata u stanju tehnike, kao što su ona proizvođača R&D Systems<®>, MN, USA. Terapeutska anti-ActRIIB antitela nisu prethodno opisana. Naravno, antitela mogu da se proizvedu protiv ActRIIB drugih vrsta i koriste za lečenje patoloških stanja u ovim vrstama.
[0031] Termin "antitelo" kao što je ovde navedeno uključuje cela antitela i bilo koji antigen-vezujući fragment (tj. "antigen-vezujući deo") ili njihove pojedinačne lance. Prirodno "antitelo" je glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac je sačinjen od varijablnog regiona teškog lanca (ovde se koristi skraćenica VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca je sačinjen od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac je sačinjen od varijablnog regiona lakog lanca (ovde se koristi skraćenica VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca je sačinjen od jednog domena, CL. VHi VLregioni mogu dodatno da se podele na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), isprekidane regionima koji su konzervativniji, nazvanim okvirni regioni (FR). Svaki VHi VLse sastoji od tri CDR regiona i četiri FR regiona poređana od amino-kraja ka karboksi-kraju sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva domaćina ili faktore, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.
[0032] Termin "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "antigeni deo"), kako se ovde koristi, odnosi se na celu dužinu ili jedan ili više fragmenata antitela koji zadržava sposobnost da se specifično vezuje za antigen (npr. deo ActRIIB). Pokazano je da antigen-vezujuću funkciju antitela mmogu da postignu fragmenti antitela cele dužine. Primeri vezivanja fragmenata obuhvćenih terminom "antigenvezujući deo" antitela uključuju Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CLi CH1 domena; F(ab)2fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; Fd fragment koji se sastoji od VHi CH1 domena; Fv fragment koji se sastoji od VLi VHdomena pojedinačne ručice antitela; dAb fragment (Ward et al., 1989 Nature 341:544-546), koji se sastoji od VHdomena; i izolovani region za određivanje komplementarnosti (CDR).
[0033] Osim toga, iako su dva domena Fv fragmenta, VLi VH, kodirana odvojenim genima, oni mogu da se spoje, korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetskom spojnicom koja im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome se VLi VHregioni sparuju da bi obrazovali monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr. Bird et al., 1988 Science 242:423-426; i Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Predviđeno je da se takva jednolančana antitela takođe obuhvate terminom "antigen-vezujući region" antitela. Ovi fragmenti antitela se dobijaju korišćenjem uobičajenih tehnika poznatih stručnjaku u oblasti, i fragmenti se ispituju u smislu upotrebljivosti na isti način kao intaktna antitela.
[0034] "Izolovano antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo koje je suštinski bez drugih antitela koja imaju drugačije antigene specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za ActRIIB je suštinski lišeno antitela koja se specifično vezuju za antigene koji nisu ActRIIB). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za ActRIIB može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost prema drugim antigenima, kao što su ActRIIB molekuli drugih vrsta. Osim toga, izolovano antitelo može da bude suštinski lišeno drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.
[0035] Termini "monoklonsko antitelo" ili "kompozicija monoklonskog antitela", kako se ovde koristi, odnosi se na preparat molekula antitela jedinstvenog molekularnog sastava. Kompozicija monoklonskog antitela pokazuje jedinstvenu specifičnost vezivanja i afinitet za određeni epitop.
[0036] Termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, predviđen je da uključuje antitela koja imaju varijabilne regione u kojima su i okvirni i CDR regioni izvedeni iz sekvenci humanog porekla. Osim toga, ako antitelo sadrži konstantni region, konstantni region je takođe izveden iz takvih humanih sekvenci, npr. humanih sekvenci germinativne linije, ili mutiranih verzija humanih sekvenci germinativne linije ili antitelo sadrži konsenzus okvirne sekvence izvedene iz ispitivanja humanih okvirnih sekvenci, na primer, kao što je opisano kod Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86).
[0037] Humana antitela pronalaska mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim sekvencama (npr. mutacije uvedene nasumičnom ili mesto-specifičnom mutagenezom in vitro ili somatskom mutacijom in vivo). Međutim, termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije namenjen da uključuje antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativne linije druge sisarske vrste, kao što je miš, kalemljene na humane okvirne sekvence.
[0038] Termin "humano monoklonsko antitelo" odnosi se na antitela koja pokazuju jedinstvenu specifičnost vezivanja koja imaju varijabilne regione u kojima su i okvirni i CDR regioni izvedeni iz humanih sekvenci. U jednom primeru izvođenja, humana monoklonska antitela se proizvode pomoću hibridoma koji uključuje B ćeliju dobijenu iz transgene nehumane životinje, npr. transgenog miša, koji ima genom koji sadrži humani transgen za teški lanac i transgen za laki lanac, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.
[0039] Termin "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde koristi, uključuje sva humana antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomalna za humane imunoglobulinske gene ili iz hibridoma pripremljenog od njih, antitela izolovana iz ćelije-domaćina transformisane tako da eksprimira humano antitelo, npr. iz transfektoma, antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanog antitela, i antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koje druge načine koji uključuju splajsovanje celog ili dela sekvenci humanog imunoglobulinskog gena sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne regione u kojima su okvirni i CDR regioni izvedeni iz humanih imunoglobulinskih sekvenci germinativne linije. U određenim primerima izvođenja, međutim, takva rekombinantna humana antitela mogu da se podvrgnu mutagenezi in vitro (ili, kada se koristi životinja transgena za humane Ig sekvence, in vivo somatskoj mutagenezi) i na taj način su aminokiselinske sekvence VHi VLregiona rekombinantnih antitela sekvence koje, iako izvedene iz i srodne sa VHi VLsekvencama humane germinativne linije, ne moraju prirodno da postoje u repertoaru antitela humane germinativne linije in vivo.
[0040] Kako se ovde koristi, "izotip" se odnosi na antitelo klase (npr. IgM, IgE, IgG kao što je IgG1 ili IgG2) koje je obezbeđeno genima za konstantni region teškog lanca.
[0041] Izrazi "antitelo koje prepoznaje antigen" i "antitelo specifično za antigen" se ovde koriste međusobno zamenljivo sa terminom "antitelo koje se vezuje specifično za antigen”.
[0042] Kako se ovde koristi, predviđeno je da se antitelo koje se "specifično vezuje za ActRIIB polipeptid" odnosi na antitelo koje se vezuje za humani ActRIIB polipeptid sa KDod 100nM ili manje, 10nM ili manje, 1nM ili manje. Predviđeno je da se antitelo koje "unakrsno reaguje sa antigenom koji nije ActRIIB" odnosi na antitelo koje se vezuje za taj antigen sa KDod 10 x 10<-9>M ili manje, 5 x 10<-9>M ili manje, ili 2 x 10<-9>M ili manje. Predviđeno je da se antitelo koje "ne reaguje unakrsno sa određenim antigenom" odnosi na antitelo koje se vezuje za taj antigen, sa KDod 1.5 x 10<-8>M ili više, ili KDod 5-10 x 10<-8>M, ili 1 x 10<-7>M ili više. U određenim primerima izvođenja, takva antitela koja ne reaguju unakrsno sa antigenom ispoljavaju suštinski nedetektabilno vezivanje za ove proteine u standardnim testovima vezivanja. KDmože da se odredi korišćenjem biosenzor sistema, kao što je Biacore<®>sistem.
[0043] Kako se ovde koristi, termin “antagonističko antitelo” je namenjen da označi antitelo koje inhibira signalnu aktivnost indukovanu sa ActRIIB u prisustvu miostatina. Primeri ogleda za detekciju ovoga uključuju inhibiciju prenosa signala indukovanog miostatinom (na primer pomoću testa sa reporter genom zavisnim od Smad), inhibiciju fosforilacije Smad indukovanu miostatinom (P-Smad ELISA) i inhibiciju miostatinom indukovane inhibicije diferencijacije ćelija skeletnih mišića (na primer pomoću testa kreatin kinaze).
[0044] U nekim primerima izvođenja, antitela inhibiraju prenos signala indukovan miostatinom mereno pomoću testa sa reporter genom zavisnim od Smad na IC50 od 10nM ili manje, 1nM ili manje, ili 100pM ili manje.
[0045] Kako se ovde koristi, izraz antitelo “bez agonističke aktivnosti" je namenjen da označi antitelo koje ne povećava značajno signalnu aktivnost posredovanu sa ActRIIB u odsustvu miostatina u testu zasnovanom na ćelijama, kao što je inihibicija prenosa signala indukovanog miostatinom (na primer pomoću testa sa reporter genom zavisnim od Smad), inhibicija fosforilacije Smad indukovane miostatinom (P-Smad ELISA) i inhibicija miostatinom indukovane inhibicije diferencijacije ćelija skeletnih mišića (na primer pomoću testa kreatin kinaze). Takvi ogledi su detaljnije opisani u primerima u nastavku teksta.
[0046] Termin "Kasoc" ili "Ka", kako se ovde koristi, namenjen je da označi brzinu asocijacije određene interakcije antitelo-antigen, dok je termin "Kdis" ili "Kd," kako se ovde koristi, namenjen da označi brzinu disocijacije određene interakcije antitelo-antigen. Termin "KD", kako se ovde koristi, namenjen je da označi konstantu disocijacije, koja se dobija iz odnosa Kdprema Ka(tj. Kd/Ka) i izražava se kao molarna koncentracija (M). KDvrednosti za antitela mogu da se odrede korišćenjem postupaka koji su dobro ustanovljeni u stanju tehnike. KDantitela se određuje korišćenjem postupka rezonancije površinskog plazmona, kao što je biosenzor sistem Biacore<®>, ili titracije ravnoteže rastvora (SET).
[0047] Kako se ovde koristi, termin "afinitet" odnosi se na jačinu interakcije između antitela i antigena na pojedinačnom antigenom mestu. U okviru svakog antigenog mesta, varijabilni region “ručice” antitela interaguje putem slabih nekovalentnih sila sa antigenom na brojnim mestima; što je više interakcija, afinitet je jači.
[0048] Kako se ovde koristi, termin "aviditet" odnosi se na informativnu meru ukupne stabilnosti ili jačine kompleksa antitelo-antigen. On je kontrolisan pomoću tri glavna faktora: afiniteta epitopa antitela; valentnosti i antigena i antitela; i strukturnog uređenja delova koji interaguju. Na kraju ovi faktori definišu specifičnost antitela, odnosno, verovatnoću da se određeno antitelo vezuje za određeni epitop antigena.
[0049] Kako se ovde koristi, termin “ADCC” ili aktivnost “ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela” odnosi se na aktivnost smanjenja broja humanih B ćelija. Aktivnost ADCC može da se meri pomoću ogleda za određivanje smanjenja broja humanih B ćelija poznatih u stanju tehnike.
[0050] U cilju dobijanja probe sa višim aviditetom, može da se konstruiše dimerni konjugat (dva molekula proteina antitela vezana za FACS marker), čineći tako interakcije niskog afiniteta (kao što je slučaj sa antitelom germinativne linije) lakše detektabilnim pomoću FACS metode. Dodatno, drugi načini za povećanje aviditeta vezivanja antigena uključuju stvaranje dimera, trimera ili multimera bilo kojih od ovde opisanim konstrukata anti-ActRIIB antitela. Takvi multimeri mogu da se dobiju kovalentnim vezivanjem pojedinačnih modula, na primer, oponašanjem prirodnog vezivanja C-do-N-terminusa ili oponašanjem dimera antitela koja su povezana preko svojih konstantnih regiona. Veze koje se nalaze na Fc/Fc dodirnoj tački mogu da budu kovalentne ili nekovalentne. Dodatno, dimerizacioni ili multimerizacioni partneri drugačiji od Fc mogu da se koriste u ActRIIB hibridima za stvaranje takvih struktura višeg reda. Na primer, moguće je koristiti multimerizacione domene kao što je trimerizacioni domen opisan u WO2004/039841 ili pentamerizacioni domen opisan u WO98/18943.
[0051] Kako se ovde koristi, termin “selektivnost” antitela odnosi se na antitelo koje se vezuje za određeni ciljni polipeptid, ali ne i za blisko povezane polipeptide.
[0052] Kako se ovde koristi, termin "visok afinitet" antitela odnosi se na antitelo koje ima KDod 1nM ili manje za ciljni antigen. Kako se ovde koristi, termin "subjekat" uključuje bilo koje ljudsko biće ili životinju koja nije čovek.
[0053] Termin "životinja koja nije čovek" uključuje sve kičmenjake, npr. sisare i one koji nisu sisari, kao što su nehumani primati, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoške, vodozemci, gmizavci, itd.
[0054] Kako se ovde koristi, termin, "optimizovan" znači da je nukleotidna sekvenca izmenjena tako da kodira aminokiselinsku sekvencu korišćenjem kodona koji su poželjni u ćeliji ili organizmu koji je proizvodi, uopšteno eukariotskoj ćeliji, na primer, ćeliji Pichia, ćeliji Trichoderma, ćeliji ovarijuma kineskog hrčka (CHO) ili humanoj ćeliji. Optimizovana nukleotidna sekvenca je konstruisana tako da zadrži u potpunosti ili što je više moguće aminokiselinsku sekvencu originalno kodiranu polaznom nukleotidnom sekvencom, koja je poznata i kao "parentalna" sekvenca. Optimizovane sekvence ovde su konstruisane tako da imaju kodone koji su poželjni u sisarskim ćelijama CHO, međutim optimizovana ekspresija ovih sekvenci u drugim eukariotskim ćelijama ovde je takođe predviđena. Aminokiselinske sekvence kodirane pomoću optimizovanih nukleotidnih sekvenci su takođe označene kao optimizovane.
[0055] Različiti aspekti pronalaska su detaljno opisani u pododeljcima koji slede.
[0056] Standardni ogledi za procenu sposobnosti vezivanja antitela za ActRIIB različitih vrsta su poznati u stanju tehnike, uključujući na primer, ELISA testove, western blot testove i RIA testove. Pogodni ogledi su detaljno opisani u primerima. Afinitet vezivanja antitela može takođe da se oceni standardnim ogledima poznatim u stanju tehnike, kao pomoću Biacore testa ili testa titracije ravnoteže rastvora. Pomoću tehnika zasnovanih na rezonanciji površinskog plazmona kao što je Biacore može da se odredi kinetika vezivanja, što omogućava izračunavanje afiniteta vezivanja. Ogledi za procenu efekata antitela na funkcionalna svojstva ActRIIB (npr. vezivanje receptora, sprečavanje ili indukcija proliferacije humanih B ćelija ili proizvodnja IgG) su detaljno opisani u primerima.
[0057] Prema tome, jasno je da se antitelo koje "inhibira" jedno ili više od ovih ActRIIB funkcionalnih svojstava (npr. biohemijska, imunohemijska, ćelijska, fiziološka ili druga biološka dejstva, ili slično) određeno prema metodologijama poznatim u stanju tehnike i ovde opisanim, odnosi na statistički značajno smanjenje određene aktivnosti u odnosu na onu viđenu u odsustvu antitela (npr. ili kada je kontrolno antitelo irelevantne specifičnosti prisutno). Antitelo koje inhibira ActRIIB aktivnost postiže takvo statistički značajno smanjenje za najmanje10% merenog parametra, za najmanje 50%, 80% ili 90%, i u određenim primerima izvođenja antitelo pronalaska može da inhibira više od 95%, 98% ili 99% funkcionalne aktivnosti ActRIIB.
[0058] Termini "unakrsni blok", "unakrsno blokiran" i "unakrsno blokiranje" se ovde koriste naizmenično da označe sposobnost antitela ili drugog vezujućeg sredstva da interferira sa vezivanjem drugih antitela ili vezivanjem sredstava za ActRIIB, naročito za ligand vezujući domen, u standardnom ogledu kompetitivnog vezivanja.
[0059] Sposobnost ili stepen do koga je antitelo ili drugo vezujuće sredstvo sposobno da interferira sa vezivanjem drugog antitela ili vezujućeg molekula za ActRIIB, i da prema tome ima sposobnost da unakrsno blokira u skladu sa pronalaskom, može se odrediti korišćenjem standardnog ogleda kompetitivnog vezivanja. Pogodan ogled ukljčuje upotrebu Biacore tehnologije (npr. upotrebom instrumenta BIAcore (Biacore, Uppsala, Sweden)), koji može da meri stepen interakcija korišćenjem tehnologije rezonancije površinskog plazmona. Drugi ogled za merenje unakrsnog blokiranja koristi pristup zasnovan na ELISA-testu. Sledeći ogled koristi FACS analizu, gde se ispituje kompeticija različitih antitela za vezivanje za ćelije koje eksprimiraju ActRIIB (kao što je opisano u primerima).
[0060] U skladu sa pronalaskom, unakrsno blokirajuće antitelo ili drugo vezujuće sredstvo vezuje se za ActRIIB u opisanom ogledu unakrsnog blokiranja BIAcore tako da je zabeleženo vezivanje kombinacije (smeše) antitela ili vezujućih sredstava između 80% i 0.1% (npr. 80% do 4%) maksimalnog teorijskog vezivanja, specifično između 75% i 0.1% (npr. 75% do 4%) maksimalnog teorijskog vezivanja, i specifičnije između 70% i 0.1% (npr. 70% do 4%), i još specifičnije između 65% i 0.1% (npr. 65% do 4%) maksimalnog teorijskog vezivanja (kao što je gore definisano) dva antitela ili vezujućih sredstava u kombinaciji. Antitelo se definiše kao unakrsno blokirajuće anti-ActRIIB antitelo pronalaska u ELISA testu, ako je ispitivano antitelo sposobno da dovede do smanjenja vezivanja anti-ActRIIB antitela za ActRIIB između 60% i 100%, specifično između 70% i 100%, i specifičnije između 80% i 100%, u poređenju sa bunarčićima pozitivne kontrole (tj. isto anti-ActRIIB antitelo i ActRIIB, ali bez “ispitivanog” unakrsno blokirajućeg antitela). Primeri unakrsno blokirajućih antitela kao što je ovde citirano su MOR08159 i MOR08213.
Rekombinantna antitela
[0061] Antitela pronalaska uključuju humana rekombinantna antitela, izolovana i strukturno okarakterisana, kao što je opisano u primerima. Aminokiselinske sekvence VHizolovanih antitela pronalaska su prikazane u sekvencama SEQ ID NOs: 99-112. Aminokiselinske sekvence VLizolovanih antitela pronalaska su prikazane u sekvencama SEQ ID NOs: 85-98, redom. Primeri poželjnih aminokiselinskih sekvenci pune dužine teškog lanca antitela pronalaska prikazani su u sekvencama SEQ ID NOs: 146-150 i 156-160. Primeri poželjnih aminokiselinskih sekvenci pune dužine lakog lanca antitela pronalaska prikazani su u sekvencama SEQ ID NOs: 141-145 i 151-155 redom. Druga antitela pronalaska uključuju aminokiseline koje su mutirane delecijom, insercijom ili supstitucijom aminokiselina, ali i dalje imaju najmanje 95 procenata identičnosti sa ovde opisanim sekvencama. Dodatno, parentalne nukleotidne sekvence varijabilnog teškog lanca prikazane su u sekvencama SEQ ID NOs: 127-140. Parentalne nukleotidne sekvence varijabilnog lakog lanca prikazane su u sekvencama SEQ ID NOs: 113-126. Nukleotidne sekvence pune dužine lakog lanca optimizovane za ekspresiju u sisarskoj ćeliji prikazane su u sekvencama SEQ ID NOs: 161-165 i 171-175. Nukleotidne sekvence pune dužine teškog lanca optimizovane za ekspresiju u sisarskoj ćeliji prikazane su u sekvencama SEQ ID NOs: 166-170 i 176-180. Budući da se svaako od ovih antitela vezuje za isti epitop i predstavlja potomstvo istog parentalnog antitela, sekvence VH, VL, lakog lanca pune dužine, i teškog lanca pune dužine (nukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence) mogu da budu "pomešane i sparene" da bi se stvorili drugi anti-ActRIIB vezujući molekuli pronalaska. Vezivanje ActRIIB takvih "pomešanih i sparenih" antitela može da se ispita korišćenjem testa vezivanja opisanog u prethodnom tekstu i u primerima (npr. ELISA testovi). Kada se ovi lanci pomešaju i dođe do njihovog sparivanja, VHsekvenca iz određenog VH/VLpara treba da bude zamenjena strukturno sličnom VHsekvencom. Slično, sekvenca pune dužine teškog lanca iz određenog para pune dužine teškog lanca / pune dužine lakog lanca treba da bude zamenjena strukturno sličnom sekvencom pune dužine teškog lanca. Slično, VLsekvenca iz određenog VH/VLpara treba da bude zamenjena strukturno sličnom VLsekvencom. Slično, sekvenca pune dužine lakog lanca iz određenog para pune dužine teškog lanca / pune dužine lakog lanca treba da bude zamenjena strukturno sličnom sekvencom pune dužine lakog lanca. Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovano rekombinantno anti-ActRIIB antitelo ili njegov antigen vezujući region koji ima: varijablni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 99-112; i varijablnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 85-98.
[0062] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje:
(i) izolovano rekombinantno anti-ActRIIB antitelo koje ima: teški lanac pune dužine koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:99-112; i laki lanac pune dužine koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:85-98.
[0063] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje:
(i) izolovano rekombinantno anti-ActRIIB antitelo koje ima teški lanac pune dužine kodiran nukleotidnom sekvencom koja je optimizovana za ekspresiju u sisarskoj ćeliji odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:127-140, i laki lanac pune dužine kodiran nukleotidnom sekvencom koja je optimizovana za ekspresiju u sisarskoj ćeliji odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:113-126.
Aminokiselinske sekvence CDR1 regiona VHantitela prikazane su u SEQ ID NOs: 1-14. Aminokiselinske sekvence CDR2 regiona VHantitela prikazane su u SEQ ID NOs: 15-28. Aminokiselinske sekvence CDR3 regiona VHantitela prikazane su u SEQ ID NOs: 29-42. Aminokiselinske sekvence CDR1 regiona VLantitela prikazane su u SEQ ID NOs: 43-56. Aminokiselinske sekvence CDR2 regiona VLantitela prikazane su u SEQ ID NOs: 57-70. Aminokiselinske sekvence CDR3 regiona VLantitela prikazane su u SEQ ID NOs: 71-84. CDR regioni su iskazani korišćenjem Kabat sistema (Kabat, E. A., et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health i Human Services, NIH Publication No.91-3242).
[0064] S obzirom da svako od ovih antitela može da se vezuje za ActRIIB i da je antigen-vezujuća specifičnost obezbeđena primarno pomoću CDR1, 2 i 3 regiona, CDR1, 2 i 3 sekvence VHi CDR1, 2 i 3 sekvence VLmogu da budu "pomešane i sparene" (tj. CDR regioni iz različitih antitela mogu da se pomešaju i spare), svako antitelo koje sadrži CDR1, 2 i 3 VHi CDR1, 2 i 3 VLstvaraju druge anti-ActRIIB vezujuće molekule pronalaska. Vezivanje za ActRIIB takvih "pomešanih i sparenih" antitela može da se ispita korišćenjem testova za vezivanje koji su opisani u prethodnom tekstu i u primerima (npr. ELISA testovi). Kada se CDR sekvence VHpomešaju i spare, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvenca iz određene VHsekvence treba da bude zamenjena strukturno sličnom CDR sekvencom(ama). Slično, kada se CDR sekvence VLpomešaju i spare, CDR1, CDR2 i/ili CDR3 sekvenca iz određene VLsekvence treba da bude zamenjena strukturno sličnom CDR sekvencom(ama). Stručnjaku u oblasti je sasvim jasno da nove VHi VLsekvence mogu da se proizvedu supstitucijom jedne ili više sekvenci CDR regiona VHi/ili VLstrukturno sličnim sekvencama iz CDR sekvenci koje su ovde prikazane za monoklonska antitela predmetnog pronalaska.
[0065] Izolovano rekombinantno anti-ActRIIB antitelo, ili njegov antigen vezujući region ima: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 1-14; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 15-28; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 29-42; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 43-56; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 57-70; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 71-84.
[0066] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 1; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 15; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 29; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 43; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 57; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 71.
[0067] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 2 CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 16; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 30; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 44; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 58; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 72.
[0068] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 3; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 17; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 31; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 45; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 59; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 73.
[0069] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 4; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 18; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 32; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 46; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 60; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 74.
[0070] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 5; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 19; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 33; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 47; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 61; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 75.
[0071] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 6; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 20; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 34; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 48; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 62; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 76.
[0072] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 7; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 21; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 35; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 49; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 63; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 77.
[0073] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 8; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 22; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 36; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 50 CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 64; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 78.
[0074] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 9; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 23; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 37; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 51; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 65; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 79.
[0075] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 10; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 24; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 38; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 52; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 66; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 80.
[0076] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 11; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 25; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 39; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 53; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 67; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 81.
[0077] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 12; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 26; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 40; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 54; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 68; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 82.
[0078] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 13; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 27; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 41; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 55; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 69; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 83.
[0079] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži: CDR1 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 14; CDR2 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 28; CDR3 varijablnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 42; CDR1 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 56; CDR2 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 70; i CDR3 varijablnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 84.
[0080] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži: (a) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 85 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 99; (b) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 86 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 100; (c) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 87 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 101; (d) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 88 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 102; (e) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 89 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 103; (f) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 90 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 104; (g) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 91 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 105; (h) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 92 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 106; (i) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 93 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 107; (j) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 94 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 108; (k) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 95 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 109; (l) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 96 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 110; (m) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 97 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 111; ili (n) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 98 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 112.
[0081] U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži: (a) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 146 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 141; (b) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 147 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 142; (c) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 148 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 143; (d) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 149 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 144; (e) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 150 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 145; (f) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 156 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 151; (g) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 157 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 152; (h) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 158 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 153; (i) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 159 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 154; ili (j) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 160 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 155.
[0082] Kako se ovde koristi, humano antitelo sadrži varijabilne regione teškog ili lakog lanca ili teške ili lake lance pune dužine koji su "proizvod" ili "izvedeni iz" određene sekvence germinativne linije ako su varijabilni regioni ili lanci pune dužine antitela dobijeni iz sistema koji koristi imunoglobulinske gene humane germinativne linije. Takvi sistemi uključuju imunizaciju transgenog miša koji nosi humane imunoglobulinske gene antigenom od interesa ili pregled humane imunoglobulinske genske biblioteke prikazane na fagu sa antigenom od interesa. Humano antitelo koje je "proizvod" ili "izvedeno iz" imunoglobulinske sekvence humane germinativne linije može da se identifikuje kao takvo poređenjem aminokiselinske sekvence humanog antitela sa aminokiselinskim sekvencama imunoglobulina humane germinativne linije i selektovanjem imunoglobulinske sekvence humane germinativne linije koja je najbliža po sekvenci (tj. najveći % identičnosti) sa sekvencom humanog antitela. Humano antitelo koje je "proizvod" ili "izvedeno iz" određene imunoglobulinske sekvence humane germinativne linije može da sadrži aminokiselinske razlike u poređenju sa sekvencom germinativne linije, zahvaljujući, na primer, prirodnim somatskim mutacijama ili namernom uvođenju mesto-specifične mutacije. Međutim, odabrano humano antitelo tipično je bar 90% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom genom za imunoglobulin humane germinativne linije i sadrži aminokiselinske ostatke koji identifikuju humano antitelo kao humano u poređenju sa aminokiselinskim sekvencama imunoglobulina germinativne linije druge vrste (npr. sekvencama mišje germinativne linije). U određenim slučajevima, humano antitelo može da bude najmanje 80%, 90%, ili najmanje 95%, ili čak najmanje 96%, 97%, 98%, ili 99% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom imunoglobulinskim genom germinativne linije. Tipično, humano antitelo izvedeno iz određene sekvence humane germinativne linije će ispoljiti ne više od 10 aminokiselinskih razlika u odnosu na aminokiselinsku sekvencu kodiranu imunoglobulinskim genom humane germinativne linije. U određenim slučajevima, humano antitelo može da ispolji ne više od 5, ili čak ne više od 4, 3, 2, ili 1 aminokiselinske razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu kodiranu imunoglobulinskim genom humane germinativne linije.
[0083] U jednom primeru izvođenja antitelo pronalaska je ono kodirano sa pBW522 ili pBW524 (deponovano u DSMZ, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Nemačka 18. avgusta 2009, pod depozitnim brojevima DSM22873 i DSM22874, redom).
Homologna antitela
[0084] U još jednom primeru izvođenja, antitelo pronalaska ima aminokiselinske sekvence pune dužine teškog i lakog lanca; nukleotidne sekvence pune dužine teškog i lakog lanca, nukleotidne sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca, ili aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca koje su homologne ovde opisanim aminokiselinskim i nukleotidnim sekvencama antitela, i gde antitela zadržavaju željena funkcionalna svojstva anti-ActRIIB antitela pronalaska.
[0085] Na primer, pronalazak obezbeđuje izolovano rekombinantno anti-ActRIIB antitelo (ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen vezujući deo) koji sadrži varijablni region teškog lanca i varijablni region lakog lanca, gde: varijablni region teškog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 9599% identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 99-112; varijabilni region lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 85-98; i antitelo ispoljava najmanje jedno od sledećih funkcionalnih svojstava: (i) ono inhibira vezivanje miostatina in vitro ili in vivo i/ili (ii) smanjuje inhibiciju diferencijacije mišića putem zavisnim od Smad proteina.
[0086] U sledećem primeru, pronalazak obezbeđuje izolovano rekombinantno anti-ActRIIB antitelo, (ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen vezujući deo) koji sadrži teški lanac pune dužine i laki lanac pune dužine, gde: teški lanac pune dužine sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 146-150 i 156-160; laki lanac pune dužine sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 141-145 i 151-155; i antitelo ispoljava najmanje jedno od sledećih funkcionalnih svojstava: (i) ono inhibira vezivanje miostatina in vitro ili in vivo i/ili (ii) smanjuje inhibiciju diferencijacije mišića putem zavisnim od Smad. Poželjno takvo antitelo se vezuje za ligand vezujući domen ActRIIB.
[0087] U sledećem primeru, pronalazak obezbeđuje izolovano rekombinantno anti-ActRIIB antitelo (ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen vezujući deo), koji sadrži teški lanac pune dužine i laki lanac pune dužine, gde je: teški lanac pune dužine kodiran nukleotidnom sekvencom koja je identična sa nukleotidnom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 166-170 i 176-180; laki lanac pune dužine je kodiran nukleotidnom sekvencom koja je identična sa nukleotidnom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 161-165 i 171-175; i antitelo ispoljava najmanje jedno od sledećih funkcionalnih svojstava: (i) ono inhibira vezivanje miostatina in vitro ili in vivo i/ili (ii) smanjuje inhibiciju diferencijacije mišića putem zavisnim od Smad. Poželjno takvo antitelo se vezuje za ligand vezujući domen ActRIIB.
[0088] Antitelo može da bude, na primer, humano antitelo, poželjno antitelo predstavlja u potpunosti humano IgG1 antitelo.
[0089] U drugim primerima izvođenja, aminokiselinske sekvence VHi/ili VLmogu da budu 95% identične sa sekvencama koje su navedene u prethodnom tekstu. Antitelo koje ima VHi VLregione koji imaju visok procenat (tj. 95% ili veći) identičnosti sa sekvencom VHi VLregiona SEQ ID NOs 99-112 i SEQ ID NOs: 85-98 redom, može da se dobije mutagenezom (npr. mutageneza koja je mestousmerena ili posredovana PCR postupkom) molekula nukleinske kiseline sekvence SEQ ID NOs: 127-140 i 113-126 redom, praćenim ispitivanjem očuvanosti funkcije kodiranih izmenjenih antitela (tj. prethodno navedenih funkcija) korišćenjem ovde opisanih funkcionalnih ogleda.
[0090] U drugim primerima izvođenja, aminokiselinske sekvence pune dužine teškog lanca i/ili pune dužine lakog lanca mogu da budu 95% identične sa sekvencama navedenim u prethodnom tekstu. Antitelo koje ima teški lanac pune dužine i laki lanac pune dužine koje ima visok procenat (tj. 95% ili više) identičnosti sa teškim lancima pune dužine bilo koje od sekvenci SEQ ID NOs: 146-150 i 156-160 i lakim lancima pune dužine bilo koje od sekvenci SEQ ID NOs: 141-145 i 151-155 redom, može da se dobije mutagenezom (npr. mesto-usmerenom ili PCR-posredovanom mutagenezok) molekula nukleinske kiseline SEQ ID NOs: 166-170 i 176-180 i SEQ ID NOs: 161-165 i 171-175 redom, praćenim ispitivanjem očuvanosti funkcije kodiranih izmenjenih antitela (tj. prethodno navedenih funkcija) korišćenjem ovde opisanih funkcionalnih ogleda.
[0091] Kako se ovde koristi, procenat identičnosti između dve sekvence predstavlja funkciju broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj. % identičnosti = br. identičnih pozicija/ukupan br. pozicija x 100), uzimajući u obzir broj praznina, i dužinu svake praznine, koje treba da se uvedu za optimalno poravnanje dve sekvence. Poređenje sekvenci i određivanje procenata identičnosti između dve sekvence može da se postigne upotrebom matematičkog algoritma, kao što je opisano u nastavku.
[0092] Procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može da se odredi korišćenjem algoritma prema E. Meyers i W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17, 1988) koji je uključen u program ALIGN (verzija 2.0), korišćenjem tabele težine ostataka PAM120, penala za dužinu praznine od 12 i penala za prazninu od 4. Dodatno, procenat identičnosti između dve aminokiselinske sekvence može da se odredi korišćenjem algoritma prema Needleman i Wunsch (J. Mol, Biol.48:444-453, 1970) koji je uključen u program GAP u softverskom paketu GCG (dostupan na http://www.gcg.com), korišćenjem ili matrice Blossom 62 ili matrice PAM250, i težine praznine 16, 14, 12, 10, 8, 6, ili 4 i težine dužine od 1, 2, 3, 4, 5, ili 6.
Antitela sa konzervativnim modifikacijama
[0093] U određenim primerima izvođenja, antitelo pronalaska ima varijablni region teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence i varijablni region lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence, gde jedna ili više od ovih CDR sekvenci ima navedene aminokiselinske sekvence zasnovane na ovde navedenim antitelima ili njihove konzervativne modifikacije, i gde antitela zadržavaju željena funkcionalna svojstva anti-ActRIIB antitela pronalaska. Prema tome, pronalazak obezbeđuje izolovano rekombinantno anti-ActRIIB antitelo, ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo, koji se sastoji od varijablnog regiona teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence i varijablnog regiona lakog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 sekvence, pri čemu je: aminokiselinska sekvenca CDR1 varijablnog regiona teškog lanca SEQ ID NO: 9, i njene konzervativne modifikacije; aminokiselinske sekvence CDR2 varijablnog regiona teškog lanca su odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18-28, i njihovih konzervativnih modifikacija; aminokiselinska sekvenca CDR3 varijablnog regiona teškog lanca je SEQ ID NOs: 37, i njene konzervativne modifikacije; aminokiselinska sekvenca CDR1 varijablnog regiona lakog lanca SEQ ID NOs: 51, i njene konzervativne modifikacije; aminokiselinska sekvenca CDR2 varijablnog regiona lakog lanca SEQ ID NOs: 65, i njene konzervativne modifikacije; aminokiselinske sekvence CDR3 varijablnog regiona lakog lanca odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 71-79, i njihovih konzervativnih modifikacija. Antitelo ispoljava najmanje jedno od sledećih funkcionalnih svojstava: (i) ono inhibira vezivanje miostatina in vitro ili in vivo i/ili (ii) smanjuje inhibiciju diferencijacije mišića putem zavisnim od Smad proteina.
[0094] U različitim primerima izvođenja, antitelo može da ispolji jedno ili oba funkcionalna svojstava navedena u prethodnom tekstu.
[0095] Kao što je ovde opisano, antitelo pronalaska optimizovano za ekspresiju u sisarskoj ćeliji ima sekvencu pune dužine teškog lanca i sekvencu pune dužine lakog lanca, gde jedna ili više od ovih sekvenci ima naznačene aminokiselinske sekvence zasnovane na ovde opisanim antitelima ili njihove konzervativne modifikacije, i gde antitela zadržavaju željena funkcionalna svojstava anti-ActRIIB antitela pronalaska. Prema tome, pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko anti-ActRIIB antitelo optimizovano za ekspresiju u sisarskoj ćeliji koje se sastoji od pune dužine teškog lanca i pune dužine lakog lanca gde: teški lanac pune dužine ima aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe sekvenci SEQ ID NOs: 146-150 i 156-160, i njihovih konzervativnih modifikacija; i laki lanac pune dužine ima aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe sekvenci SEQ ID NOs: 141-145 i 151-155, i njihovih konzervativnih modifikacija; i antitelo ispoljava najmanje jedno od sledećih funkcionalnih svojstava: (i) ono inhibira vezivanje miostatina in vitro ili in vivo i/ili (ii) smanjuje inhibiciju diferencijacije mišića putem zavisnim od Smad proteina.
[0096] Kako se ovde koristi, termin "konzervativne modifikacije sekvence" namenjen je da označi aminokiselinske modifikacije koje ne utiču značajno ili ne menjaju svojstva vezivanja antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu. Takve konzervativne modifikacije uključuju aminokiselinske supstitucije, adicije i delecije. Modifikacije mogu da se uvedu u antitelo pronalaska standardnim tehnikama poznatim u struci, kao što je mesto-usmerena mutageneza i PCR-posredovana mutageneza.
[0097] Konzervativne aminokiselinske supstitucije su one u kojima je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Familije aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u stanju tehnike. Ove familije uključuju aminokiseline sa baznim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-granatim bočnim lancima (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Tako, jedan ili više aminokiselinskih ostataka u CDR regionima antitela pronalaska može da bude zamenjen drugim aminokiselinskim ostacima iz iste familije bočnih lanaca, i korišćenjem ovde opisanih funkcionalnih ogleda može da se ispita očuvanje funkcije izmenjenog antitela.
Antitela koja se vezuju za isti epitop kao anti-ActRIIB antitela pronalaska
[0098] Sva antitela opisana u primerima koja imaju sposobnost da blokiraju vezivanje miostatina za ActRIIB vezuju se za isti epitop u ActRIIB sa visokim afinitetom, pomenuti epitop je sadržan između aminokiselina 19-134 sekvence SEQ ID NO:181.
[0099] Dodatna antitela mogu prema tome da se identifikuju na osnovu njihove sposobnosti da stupe u unakrsnu kompeticiju (npr. da potpuno inhibiraju vezivanje, na statistički značajan način) sa drugim antitelima pronalaska u standardnim ogledima vezivanja ActRIIB. Sposobnost ispitivanog antitela da inhibira vezivanje antitela predmetnog pronalaska za humani ActRIIB pokazuje da ispitivano antitelo može da kompetira sa tim antitelom za vezivanje za humani ActRIIB; takvo antitelo može, prema neograničavajućoj teoriji, da se vezuje za isti ili povezani (npr. strukturno sličan ili prostorno blizak) epitop na humanom ActRIIB kao antitelo sa kojim stupa u kompeticiju. Kao što je ovde opisano, antitelo koje se vezuje za isti epitop na humanom ActRIIB kao antitela predmetnog pronalaska može da se pripremi i izoluje kao što je opisano u primerima.
[0100] Nakon detaljnijih eksperimenata mapiranja epitopa, regioni vezivanja poželjnih antitela pronalaska su jasnije definisani.
[0101] Tako, ovde su opisana antitela koja se vezuju za epitop koji sadrži aminokiseline 78-83 sekvence SEQ ID NO: 181 (WLDDFN – SEQ ID NO:188).
[0102] Takođe su opisana antitela koja se vezuju za epitop koji sadrži aminokiseline 76-84 sekvence SEQ ID NO: 181 (GCWLDDFNC – SEQ ID NO:186).
[0103] Obezbeđena su i antitela koja se vezuju za epitop koji sadrži aminokiseline 75-85 sekvence SEQ ID NO: 181 (KGCWLDDFNCY – SEQ ID NO:190).
[0104] Takođe su opisana antitela koja se vezuju za epitop koji sadrži aminokiseline 52-56 sekvence SEQ ID NO: 181 (EQDKR – SEQ ID NO:189).
[0105] Takođe su opisana antitela koja se vezuju za epitop koji sadrži aminokiseline 49-63 sekvence SEQ ID NO: 181 (CEGEQDKRLHCYASW – SEQ ID NO:187).
[0106] Na taj način, ovde su opisana antitela koja se vezuju za epitop koji sadrži ili koji se sastoji od aminokiselina 78-83 sekvence SEQ ID NO: 181 (WLDDFN) i aminokiselina 52-56 sekvence SEQ ID NO: 181 (EQDKR).
Konstruisana i modifikovana antitela
[0107] Antitelo pronalaska dalje može da se pripremi korišćenjem antitela koje ima jednu ili više od ovde prikazanih VHi/ili VLsekvenci kao polaznog materijala za konstruisanje modifikovanog antitela, pri čemu modifikovano antitelo može da ima izmenjena svojstva u odnosu na polazno antitelo. Antitelo može da bude konstruisano modifikovanjem jednog ili više ostataka u jednom ili oba varijabilna regiona (tj. VHi/ili VL), na primer u jednom ili više CDR regiona i/ili u jednom ili više okvirnih regiona. Dodatno ili alternativno, antitelo može da bude konstruisano modifikovanjem ostataka u konstantnom regionu(ima), na primer da bi se izmenila efektorska funkcija(e) antitela.
[0108] Jedna vrsta konstruisanja varijabilnog regiona koja može da se izvede je kalemljenje CDR. Antitela interaguju sa ciljnim antigenima prvenstveno preko aminokiselinskih ostataka koji su smešteni u šest regiona za određivanje komplementarnosti (CDR regioni) teškog i lakog lanca. Iz tog razloga, aminokiselinske sekvence u CDR regionima se više razlikuju između pojedinih antitela nego sekvence van CDR regiona. Budući da su CDR sekvence odgovorne za većinu antitelo-antigen interakcija, moguće je eksprimirati rekombinantna antitela koja oponašaju svojstva specifičnih prirodnih antitela konstruisanjem ekspresionih vektora koji uključuju CDR sekvence iz specifičnog prirodnog antitela kalemljene na okvirne sekvence iz drugačijeg antitela sa drugačijim svojstvima (videti, npr. Riechmann, L. et al., 1998 Nature 332:323-327; Jones, P. et al., 1986 Nature 321:522-525; Queen, C. et al., 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.86:10029-10033; SAD patent br.5,225,539 za Winter, i SAD patente br.5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 za Queen et al.).
[0109] Prema tome, drugi primer izvođenja pronalaska odnosi se na izolovano monoklonsko anti-ActRIIB antitelo, ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen vezujući deo, koje sadrži varijablni region teškog lanca koji sadrži CDR1 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 9; CDR2 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18-28; CDR3 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 37, redom; i varijablnog regiona lakog lanca koji ima CDR1 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 51; CDR2 sekvence koje imaju aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 65; i CDR3 sekvence koja se sastoji od aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 71-79, redom. Tako, takva antitela sadrže VHi VLCDR sekvence monoklonskog antitela, ali i dalje mogu da sadrže drugačije okvirne sekvence od ovih antitela.
[0110] Takve okvirne sekvence mogu da se dobiju iz javnih baza podataka za DNK ili objavljenih referenci koje uključuju genske sekvence antitela germinativne linije. Na primer, DNK sekvence germinativne linije za gene humanog varijabilnog regiona teškog i lakog lanca mogu da se nađu u bazi podataka sekvenci humane germinativne linije "VBase" (dostupne na internetu na stranici www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), kao i kod Kabat, E. A., et al., [gore]; Tomlinson, I. M., et al., 1992 J. fol. Biol.
227:776-798; i Cox, J. P. L. et al., 1994 Eur. J Immunol.24:827-836.
[0111] Primer okvirnih sekvenci su one koje su strukturno slične okvirnim sekvencama koje sadrže odabrana antitela pronalaska, npr. konsenzus sekvence i/ili okvirne sekvence koje sadrže monoklonska antitela pronalaska. CDR1, 2 i 3 sekvence VH, i CDR1, 2 i 3 sekvence VL, mogu da se nakaleme na okvirne regione koji imaju identičnu sekvencu kao ona nađena u imunoglobulinskom genu germinativne linije iz koga je okvirna sekvenca izvedena, ili CDR sekvence mogu da se nakaleme na okvirne regione koji sadrže jednu ili više mutacija u poređenju sa sekvencama germinativne linije. Na primer, nađeno je da je u određenim slučajevima korisno mutirati ostatke u okvirnim regionima da bi se održala ili poboljšala sposobnost antitela da vezuje antigen (videti npr. SAD patente br. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 i 6,180,370 za Queen et al).
[0112] Druga vrsta modifikacija varijabilnog regiona je mutiranje aminokiselinskih ostataka u CDR1, CDR2 i/ili CDR3 regionima VHi/ili VLkako bi se poboljšalo jedno ili više svojstava vezivanja (npr. afinitet) antitela od interesa, poznato kao "sazrevanje afiniteta". Mesto-usmerena mutageneza ili PCR-posredovana mutageneza može da se izvede za uvođenje mutacije(a) i dejstvo na vezivanje antitela, ili drugo funkcionalno svojstvo od interesa, može da se proceni in vitro ili in vivo ogledima koji su ovde opisani i obezbeđeni u primerima. Mogu da se uvedu konzervativne modifikacije (kao što je u prethodnom tekstu diskutovano). Mutacije mogu da budu aminokiselinske supstitucije, adicije ili delecije. Osim toga, tipično se menja ne više od jednog, dva, tri, četiri ili pet ostataka u CDR regionu.
Kalemljenje antigen-vezujućih domena u alternativne okvirne regione ili nosače
[0113] Raznovrsni okvirni regioni ili nosači antitela/imunoglobulina mogu da se koriste sve dok rezultujući polipeptid uključuje najmanje jedan vezujući region koji se specifično vezuje za ActRIIB. Takvi okvirni regioni ili nosači uključuju 5 glavnih idiotipova humanih imunoglobulina, ili njihove fragmente (kaoo što su oni koji su ovde opisani na drugom mestu), i uključuju imunoglobuline drugih životinjskih vrsta, poželjno koje imaju humanizovane aspekte. Antitela sa jednim teškim lancem kao što su ona identifikovana kod kamelida su od posebnog interesa u tom pogledu. Stručnjaci u oblasti nastavljaju da otkrivaju i razvijaju nove okvirne regione, nosače i fragmente.
[0114] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na stvaranje antitela koja nisu zasnovana na imunoglobulinu korišćenjem neimunoglobulinskih nosača na koje mogu da se nakaleme CDR regioni pronalaska. Mogu da se koriste poznati, ili oni koji će tek biti otkriveni neimunoglobulinski okvirni regioni i nosači, sve dok sadrže vezujući region specifičan za ciljne proteinske sekvence SEQ ID NO: 181 (poželjno, njihov ligand vezujući domen kao što je prikazano u sekvenci SEQ ID NO: 182). Takva jedinjenja su ovde označena kao “polipeptidi koji sadrže ciljno-specifičan vezujući region”. Primeri neimunoglobulinskog okvirnog regiona su dodatno opisani u sledećem odeljku (antitela kamelida i nosač koji ne potiče iz antitela).
Antitela kamelida
[0115] Proteini antitela dobijeni od članova familije kamila i jednogrbih kamila (Camelus bactrianus i Camelus dromaderius) uključujući članove novog sveta kao što su vrste lama (Lama paccos, Lama glama i Lama vicugna) su okarakterisani u smislu veličine, strukturne kompleksnosti i antigenosti za humane subjekte. Određenim IgG antitelima ove familije sisara nađenim u priordi nedostaju laki lanci i po tome se strukturno razlikuju od tipične kvarternarne strukture sa četiri lanca koja obuhvata dva teška i dva laka lanca, antitela drugih životinja (videti WO94/04678).
[0116] Region antitela kamelida koji predstavlja mali pojedinačni varijabilni domen identifikovan kao VHHmože da se dobije genetskim inžinjeringom da bi dao mali protein koji ima visok afinitet za ciljni molekul, rezultujući u proteinu niske molekulske težine izvedenom iz antitela poznatom kao “nanoantitelo kamelida” (videti US5,759,808; Stijlemans, B. et al., 2004 J Biol Chem 279: 1256-1261; Dumoulin, M. et al., 2003 Nature 424: 783-788; Pleschberger, M. et al. 2003 Bioconjugate Chem 14: 440-448; Cortez-Retamozo, V. et al. 2002 Int J Cancer 89: 456-62; i Lauwereys, M. et al.1998 EMBO J 17: 3512-3520). Konstruisane biblioteke antitela kamelida i fragmenata antitela su komercijalno dostupne, na primer, kod Ablynx, Ghent, Belgium. Kao i kod drugih antitela nehumanog porekla, aminokiselinska sekvenca antitela kamelida može da bude izmenjena rekombinantno da bi se dobila sekvenca koja više liči na humanu sekvencu, tj. nano-antitelo može da bude “humanizovano”. Na taj način prirodno niska antigenost antitela kamelida za ljude može dodatno da se smanji.
[0117] Nano-antitelo kamelida ima molekulsku težinu od približno jedne desetine molekula humanog IgG, i protein ima fizički prečnik od samo nekoliko nanometara. Jedna od posledica male veličine je sposobnost nano-antitela kamelida da se vezuju za antigena mesta koja su funkcionalno nevidljiva za veće proteine antitela, tj. nano-antitela kamelida su korisna kao reagensi koji otkrivaju antigene koji su inače skriveni pri korišćenju klasičnih imunoloških tehnika, i kao moguća terapeutska sredstva. Na taj način je još jedna posledica male veličine ta da nano-antitela kamelida mogu da inhibiraju kao rezultat vezivanja za specifično mesto u žlebu ili uskom useku ciljnog proteina, i prema tome mogu da služe u svojstvu koje više liči na funkciju klasičnog leka male molekulske težine nego klasičnog antitela.
[0118] Mala molekulska težina i kompaktna veličina dalje rezultuju u tome da su nano-antitela kamelida izuzetno termostabilna, stabilna pri ekstremnom pH i proteolitičkoj digestiji, i slabo antigena. Druga posledica je ta da nano-antitela kamelida lako prelaze iz cirkulatornog sistema u tkiva, i čak prolaze krvno-moždanu barijeru i mogu da leče poremećaje koji pogađaju nervno tkivo. Nano-antitela mogu dalje da olakšaju transport leka kroz krvno-moždanu barijeru (videti US2004/0161738). Ova svojstva kombinovana sa niskom antigenošću za ljude ukazuju na odličan terapeutski potencijal. Dalje, ovi molekuli mogu da budu u potpunosti eksprimirani u prokariotskim ćelijama kao što je E. coli, i eksprimiraju se kao fuzioni proteini sa bakteriofagom i funkcionalni su.
[0119] Anti-ActRIIB nano-antitela kamelida se konstruišu, tj. proizvode selekcijom na primer iz biblioteke na fagu koja prikazuje odgovarajuće mutirane proteine nano-antitela kamelida korišćenjem postupaka selekcije prema afinitetu sa ActRIIB kao ciljnim molekulom kao što je ovde opisano u primerima. Konstruisana nano-antitela mogu dalje da se prilagode genetskim inžinjeringom tako da imaju polu-život u primaocu od 45 minuta do dve nedelje. Antitela kamelida ili nano-antitela se dobijaju kalemljenjem sekvenci CDR regiona teškog ili lakog lanca humanih antitela pronalaska u nano-antitela ili okvirne sekvence antitela sa jednim domenom, kao što je opisano na primer u WO94/04678.
Nosač koji ne potiče iz antitela
[0120] Poznati neimunoglobulinski okvirni regioni ili nosači uključuju, ali bez ograničenja, adnektine (fibronektin) (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), ankirin (Molecular Partners AG, Zurich, Switzerland), domenska antitela (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) i Ablynx nv (Zwijnaarde, Belgium)), lipokalin (Antikalin) (Pieris Proteolab AG, Freising, Germany), male modularne imunofarmaceutike (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maksi-antitela (Avidia, Inc. (Mountain View, CA)), protein A (Affibody AG, Sweden) i afilin (gama-kristalin ili ubikvitin) (Scil Proteins GmbH, Halle, Germany), mimetike proteina epitopa (Polyphor Ltd, Allschwil, Switzerland).
(i) Fibronektinski nosač
[0121] Fibronektinski nosači su zasnovani poželjno na domenu fibronektina tipa III (npr. deseti modul fibronektina tipa III (10 Fn3 domen)). Domen fibronektina tipa III ima 7 ili 8 beta lanaca koji su raspoređeni između dve beta ploče, koje su spakovane jedna prema drugoj tako da obrazuju jezgro proteina, i dalje sadrži petlje (analogne CDR regionima) koje međusobno povezuju beta lance i izložene su rastvaraču. postoje najmanje tri takve petlje na svakoj ivici sendviča beta ploča, gde je ivica granica proteina normalna na pravac beta lanaca (US 6,818,418).
[0122] Ovi nosači bazirani na fibronektinu nisu imunoglobulin, mada je ukupna struktura blisko povezana sa onom kod najmanjeg funkcionalnog fragmenta antitela, varijabilnog regiona teškog lanca, koji sadrži celu jedinicu za prepoznavanje antigena kod IgG kamila i lama. Zbog ove strukture, neimunoglobulinsko antitelo oponaša svojstva vezivanja antigena koja su slična prirodnim i afinitet antitela. Ovi nosači mogu da se koriste u strategiji randomizacije i mešanja petlji in vitro koja je slična procesu sazrevanja afiniteta antitela in vivo. Ovi molekuli zasnovani na fibronektinu mogu da se koriste kao nosači pri čemu regioni petlje molekula mogu da budu zamenjeni CDR regionima pronalaska korišćenjem standardnih tehnika kloniranja.
(ii) Ankirin – molekularni partneri
[0123] Tehnologija se zasniva na korišćenju proteina sa ponovljenim modulom izvedenim iz ankirina kao nosača koji nose varijabilne regione koji mogu da se koriste za vezivanje za različite ciljne molekule. Ankirinski ponovljeni modul je polipeptid od 33 aminokiseline koji se sastoji od dva antiparalelna α-heliksa i β-okreta. Vezivanje varijabilnih regiona je uglavnom optimizovano korišćenjem prikaza na ribozomu.
(iii) Maksi-antitela/avimeri - Avidia
[0124] Avimeri su izvedeni iz prirodnog proteina koji sadrži A-domen kao što je LRP-1. Ovi domeni se prirodno koriste za protein-protein interakcije i kod čoveka preko 250 proteina je strukturno bazirano na A-domenima. Avimeri se sastoje od brojnih različitih monomera “A-domena” (2-10) povezanih aminokiselinskim spojnicama. Avimeri mogu da budu napravljeni tako da se vezuju za ciljni antigen korišćenjem metodologije opisane u, na primer, US2004/0175756; US2005/0053973; US2005/0048512; i US2006/0008844.
(vi) Protein A – “Affibody”
[0125] Affibody® afinitetni ligandi su mali, jednostavni proteini sačinjeni od snopa od tri spirale zasnovani na nosaču jednog od IgG-vezujućih domena proteina A. Protein A je površinski protein bakterije Staphylococcus aureus. Ovaj domen nosača se sastoji od 58 aminokiselina, od kojih je 13 nasumično odabrano da bi se napravile biblioteke Affibody® sa velikim brojem varijanti liganda (Videti npr. US 5,831,012). Molekuli Affibody® oponašaju antitela, oni imaju molekulsku težinu od 6 kDa, u poređenju sa molekulskom težinom antitela, koja je 150 kDa. Uprkos svojoj maloj veličini, vezivno mesto Affibody® molekula je slično onom kod antitela.
(v) Antikalini – Pieris
[0126] Anticalins® su proizvodi razvijeni u kompaniji Pieris ProteoLab AG. Oni su izvedeni iz lipokalina, rasprostranjene grupe malih i robusnih proteina koji su obično uključeni u fiziološki transport ili skladištenje hemijski osetljivih ili nerastvornih jedinjenja. Nekoliko prirodnih lipokalina nalazi se u humanim tkivima ili telesnim tečnostima.
[0127] Arhitektura proteina podseća na imunoglobuline, sa hipervarijabilnim petljama na vrhu krutog okvirnog regiona. Međutim, nasuprot antitelima ili njihovim rekombinantnim fragmentima, lipokalini se sastoje od jednog polipeptidnog lanca sa 160 do 180 aminokiselinskih ostataka, koji su neznatno veći od jednog imunoglobulinskog domena.
[0128] Grupa od četiri petlje, koje čine vezujući džep, pokazuje izraženu strukturnu plastičnost i dopušta raznovrsnost bočnih lanaca. Mesto vezivanja može stoga da bude preoblikovano patentiranim postupkom u cilju prepoznavanja propisanih ciljnih molekula različitog oblika sa visokim afinitetom i specifičnošću.
[0129] Jedan protein lipokalinske familije, bilin-vezujući protein (BBP) iz Pieris brassicae korišćen je za razvoj antikalina mutagenezom grupe od četiri petlje. Jedan primer patentne prijave koja opisuje "antikaline" je WO1999/16873.
(vi) Affilin – Scil proteini
[0130] Affilin™ molekuli su mali neimunoglobulinski proteini koji su dizajnirani za specifične afinitete prema proteinima i malim molekulima. Novi Affilin™ molekuli mogu da budu veoma brzo odabrani iz dve biblioteke, od kojih se svaka zasniva na različitim proteinu- nosaču humanog porekla.
[0131] Affilin™ molekuli ne pokazuju nikakvu strukturnu homologiju sa imunoglobulinskim proteinima. Scil proteini koriste dva Affilin™ nosača, od kojih je jedan gama kristalin, humani strukturni protein očnog sočiva a drugi predstavlja "ubikvitin" superfamiliju proteina. Oba humana nosača su veoma mala, pokazuju visoku temperaturnu stabilnost i gotovo su otporni na promene pH i denaturišuća sredstva. Ova visoka stabilnost se javlja uglavnom zbog proširene strukture beta naborane ploče proteina. Primeri proteina izvedenih iz gama kristalina su opisani u WO2001/004144, a "ubikvitinu sličnih" proteina su opisani u WO2004/106368.
(vii) Mimetici proteinskog epitopa (PEM)
[0132] PEM su srednje veličine, ciklični, peptidu slični molekuli (MW 1-2kDa) koji oponašaju sekundarne strukture beta-ukosnice proteina, glavnu sekundarnu strukturu uključenu u protein-protein interakcije.
Konstruisanje okvirnih regiona ili Fc
[0133] Konstruisana antitela pronalaska uključuju ona u kojima su modifikacije izvedene na ostacima u okvirnom regionu unutar VHi/ili VL, npr. da bi se poboljšala svojstva antitela. Tipično takve modifikacije okvirnog regiona se uvode da bi se smanjila imunogenost antitela. Na primer, jedan pristup je "povratno mutiranje" jednog ili više ostataka okvirnog regiona u odgovarajuću sekvencu germinativne linije. Specifičnije, antitelo koje je pretrpelo somatsku mutaciju može da sadrži ostatke okvirnog regiona koji se razlikuju od sekvence germinativne linije iz koje je antitelo izvedeno. Takvi ostaci mogu da se identifikuju poređenjem sekvence okvirnog regiona antitela sa sekvencama germinativne linije iz koje je antitelo izvedeno. Da bi se sekvence okvirnog regiona vratile u konfiguraciju germinativne linije, somatske mutacije mogu da se "povratno mutiraju" u sekvencu germinativne linije pomoću, na primer, mesto-usmerena mutageneza ili PCR-posredovane mutageneze. Takva "povratno mutirana" antitela su takođe obuhvaćena pronalaskom.
[0134] Druga vrsta modifikacija okvirnog regiona uključuje mutiranje jednog ili više ostataka u okvirnom regionu, ili čak u jednom ili više CDR regiona, da bi se uklonili T-ćelijski epitopi kako bi se smanjila potencijalna imunogenost antitela. Takav pristup takođe je označen kao "deimunizacija" i opisan je detaljnije u US2003/0153043.
[0135] Dodatno ili alternativno modifikacijama urađenim u okvirnim regionima ili CDR regionima, antitela pronalaska mogu da budu konstruisana tako da uključuju modifikacije u Fc regionu, tipično da bi se izmenilo jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela, kao serumski polu-život, fiksacija komplementa, Fc vezivanje receptora, i/ili antigen-zavisna ćelijska citotoksičnost. Osim toga, antitelo pronalaska može da bude hemijski modifikovano (npr. jedan ili više hemijskih fragmenata može da bude dodat na antitelo) ili da bude modifikovan tako da se izmeni njegova glikozilacija, opet da bi se izmenilo jedno ili više funkcionalnih svojstava antitela. Svaki od ovih primera izvođenja opisan je u detaljnije u nastavku. Numeracija ostataka u Fc regionu urađena je prema EU indeksu Kabata.
[0136] U jednom primeru izvođenja, region zgloba CH1 je modifikovan tako da je broj cisteinskih ostataka u regionu zgloba izmenjen, npr. povećan ili smanjen. Ovaj pristup je dodatno opisan u US5,677,425. Broj cisteinskih ostataka u regionu zgloba CH1 je izmenjen da bi se, na primer, olakšalo sklapanje lakih i teških lanaca ili da bi se povećala ili smanjila stabilnost antitela.
[0137] U drugom primeru izvođenja, Fc region zgloba antitela je mutiran da bi se smanjio biološki polu-život antitela. Specifičnije, jedna ili više aminokiselinskih mutacija se uvode u region dodirne površine CH2-CH3 domena fragmenta Fc-zglobni region, tako da antitelo smanjuje vezivanje stafilokoknog proteina A (SpA) u odnosu na vezivanje SpA kod nativnog Fc-zglobnog domena. Ovaj pristup je detaljno opisan u US 6,165,745.
[0138] U drugom primeru izvođenja, antitelo je modifikovano da bi se povećao biološki polu-život. Mogući su različiti pristupi. Na primer, jedna ili više od sledećih mutacija može da se uvede: T252L, T254S, T256F, kao što je opisano u US6,277,375. Alternativno, da bi se povećao biološki polu-život, antitelo može da bude izmenjeno u CH1 ili CL regionu tako da sadrži epitop koji vezuje receptor za oporavak uzet iz dve petlje CH2 domena Fc regiona IgG, kao što je opisano u US5,869,046 i US6,121,022.
[0139] U još jednom primeru izvođenja, Fc region je izmenjen zamenom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka drugačijim aminokiselinskim ostatkom da bi se izmenile efektorske funkcije antitela. Na primer, jedna ili više aminokiselina može da bude zamenjeno drugačijim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjen afinitet za efektorski ligand ali zadržava antigen-vezujuću sposobnost parentalnog antitela. Efektorski ligand za koji je afinitet izmenjen može da bude, na primer, Fc receptor ili C1 komponenta komplementa. Ovaj pristup je detaljno opisan u US5,624,821 i US5,648,260, oba od Winter et al. Naročito, ostaci 234 i 235 mogu da budu mutirani. Naročito, ove mutacije mogu da budu u alanin. Tako u jednom primeru izvođenja antitelo pronalaska ima mutaciju u Fc regionu na jednoj ili obe aminokiseline 234 i 235. U drugom primeru izvođenja, jedna ili obe aminokiseline 234 i 235 mogu da budu supstituisane u alanin.
[0140] U drugom primeru izvođenja, jedna ili više aminokiselina odabranih od aminokiselinskih ostataka može da bude zamejena drugim aminokiselinskim ostatkom tako da antitelo ima izmenjeno C1q vezivanje i/ili smanjenu ili ukinutu citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Ovaj pristup je detaljno opisan u US6,194,551.
[0141] U drugom primeru izvođenja, jedan ili više aminokiselinskih ostataka su izmenjeni kako bi se izmenila sposobnost antitela da fiksira komplement. Ovaj pristup je detaljno opisan u WO94/29351.
[0142] U još jednom primeru izvođenja, Fc region je modifikovan da bi se povećala sposobnost antitela da posreduje u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC) i/ili da bi se povećao afinitet antitela za Fcγ receptor modifikacijom jedne ili više aminokiselina. Ovaj pristup je detaljno opisan u WO00/42072. Osim toga, mesta vezivanja na humanom IgG1 for FcγRl, FcγRII, FcγRIII i FcRn su mapirana i varijante sa poboljšanim vezivanjem su oisane (videti Shields, R.L. et al., 2001 J. Biol. Chen.276:6591-6604).
[0143] U još jednom opisu, glikozilacija antitela je modifikovana. Na primer, antitelo koje nije glikozilovano može da se napravi (tj. antitelo kome nedostaje glikozilacija). Glikozilacija može da se izmeni da bi se, na primer, povećao afinitet antitela za antigen. Takve modifikacije ugljovodonika mogu da se postignu pomoću; na primer, izmene jednog ili više mesta glikozilacije u sekvenci antitela. Na primer, može da se izvede jedna ili više aminokiselinskih supstitucija koje rezultuju u uklanjanju jednog ili više mesta glikozilacije okvirnog regiona varijabilnog regiona kako bi se eliminisala glikozilacija na tom mestu. Takav izostanak glikozilacije može da poveća afinitet antitela za antigen. Ovakav pristup je detaljno opisan u SAD patentima br.5,714,350 i 6,350,861 od Co et al.
[0144] Dodatno ili alternativno, može da se napravi antitelo koje ima izmenjen tip glikozilacije, kao hipofukozilovano antitelo koje ima smanjene količine fukozil ostataka ili antitelo koje ima povećane račvaste GlcNac strukture. Pokazano je da takvi izmenjeni obrasci glikozilacije povećavaju sposobnost antitela za ADCC aktivnost. Takve modifikacije ugljovodonika mogu da se postignu pomoću, na primer, eksprimiranja antitela u ćeliji-domaćinu sa izmenjenim aparatom za glikozilaciju. Ćelije sa izmenjenim aparatom za glikozilaciju su opisane u stanju tehnike i i mogu da se koriste kao ćelijedomaćini u kojima se eksprimiraju rekombinantna antitela pronalaska da bi se tako proizvelo antitelo sa izmenjenom glikozilacijom. Na primer, EP 1,176,195 od Hang et al. opisuje ćelijsku liniju sa funkcionalno poremećenim geneom FUT8, koji kodira fukozil transferazu, tako da antitela eksprimirana u takvoj ćelijskoj liniji ispoljavaju hipofukozilaciju. Stoga, u jednom primeru izvođenja, antitela pronalaska su proizvedena rekombinantnom ekspresijom u ćelijskoj liniji koja ispoljava obrazac hipofukozilacije, na primer, sisarskoj ćelijskoj liniji sa smanjenom ekspresijom gena FUT8 koji kodira fukoziltransferazu. WO03/035835 opisuje varijantu CHO ćelijske linije, Lecl3 ćelije, sa smanjenom sposobnošću da vežu fukozu za ugljovodonike vezane za Asn(297), takođe rezultujući u hipofukozilaciji antitela eksprimiranih u toj ćeliji-domaćinu (videti takođe Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740). WO99/54342 opisuje ćelijske linije konstruisane da eksprimiraju glikozil transferaze koje modifikuju glikoproteine (npr. beta(1,4)-N acetilglukozaminiltransferazu III (GnTIII)) tako da antitela eksprimirana u konstruisanim ćelijskim linijama ispoljavaju povećanje račvastih GlcNac struktura koje rezultuje u povećanju ADCC aktivnosti antitela (videti takođe Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativno, antitela pronalaska mogu da se proizvedu u kvascu ili filamentoznim gljivama konstruisanim za obrazac glikozilacije sličan sisarskom, i sposobnim da proizvedu antitela kojima nedostaje fukoza kao obrazac glikozilacije (videti na primer EP1297172B1).
[0145] Druga modifikacija antitela ovde je pegilacija. Antitelo može da bude pegilovano da bi se, na primer, povećao biološki (npr. serumski) polu-život antitela. Da bi se pegilovalo antitelo, antitelo, ili njegov fragment, tipično reaguje sa polietilen glikolom (PEG), kao što je reaktivni estar ili aldehid izveden iz PEG, pod uslovima u kojima jedna ili više PEG grupa biva vezana za antitelo ili fragment antitela. Pegilacija može da se sprovede reakcijom acilacije ili reakcijom alkilacije sa reaktivnim molekulom PEG (ili analogno reaktivnim polimerom rastvorljivim u vodi). Kako se ovde koristi, termin "polietilen glikol" namenjen je da obuhvati bilo koji oblik PEG koji je korišćen da derivatizuje druge proteine, kao mono (C1-C10) alkoksi- ili ariloksi-polietilen glikol ili polietilen glikol-maleimid. U određenim primerima izvođenja, antitelo koje treba da se pegiluje je aglikozilovano antitelo. Postupci za pegilaciju proteina su poznati u stanju tehnike i mogu da se primene na antitela pronalaska (videti na primer, EP0154316 i EP0401384).
[0146] Još jedna modifikacija antitela je fuzija konjugata ili proteina bar antigen-vezujućeg regiona antitela pronalaska sa serumskim proteinom, kao što je humani serumski albumin ili njegov fragment da bi se povećao polu-život rezultujućeg molekula (videti, na primer, EP0322094).
[0147] Druga mogućnost je fuzija bar antigen-vezujućeg regiona antitela pronalaska sa proteinima sposobnim da se vežu za serumske proteine, kao humani serumski albumin, da bi se povećao poluživot rezultujućeg molekula (videti, na primer, EP0486525).
Postupci za konstruisanje izmenjenih antitela
[0148] Kao što je prethodno diskutovano, anti-ActRIIB antitela koja imaju VHi VLsekvence ili sekvence pune dužine teškog i lakog lanca koja su ovde prikazana mogu da se koriste za stvaranje novih anti-ActRIIB antitela modifikovanjem sekvenci pune dužine teškog lanca i/ili lakog lanca, VHi/ili VLsekvence, ili konstantnog(ih) regiona spojenog sa njima. Tako, u drugom aspektu pronalaska, strukturne karakteristike anti-ActRIIB antitela pronalaska koriste se za dobijanje strukturno povezanog anti-ActRIIB antitela koje zadržava najmanje jedno funkcionalno svojstvo antitela pronalaska, kao što je vezivanje za humani ActRIIB, ali takođe inhibira jedno ili više funkcionalnih svojstava ActRIIB (na primer, inhibicija aktivacije Smad).
[0149] Na primer, jedan ili više CDR regiona antitela predmetnog pronalaska, ili njegove mutacije, može da se kombinuje rekombinantno sa poznatim okvirnim regionima i/ili drugim CDR regionima da bi nastala dodatna, rekombinantno-konstruisana, anti-ActRIIB antitela, kao što je prethodno diskutovano. Druge vrste modifikacija uključuju one opisane u prethodnom odeljku. Polazni materijal za postupak za konstruisanje je jedna ili više od VHi/ili VLsekvenci koje su ovde obezbeđene, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Da bi se proizvelo konstruisano antitelo, nije neophodno zaista pripremiti (tj. eksprimirati kao protein) antitelo koje ima jednu ili više od VHi/ili VLsekvenci koje su ovde obezbeđene, ili jedan ili više njihovih CDR regiona. Radije se koristi informacija sadržana u sekvenci(ama) kao polazni materijal za dobijanje "druge generacije" sekvence(i) izvedene iz originalne sekvence(i) i nakon toga se sekvenca(e) "druge generacije" pripremaju i eksprimiraju kao protein.
[0150] Prema tome, u drugom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu anti-ActRIIB antitela koji se sastoji od: sekvence varijablnog regiona teškog lanca antitela koja ima CDR1 sekvencu SEQ ID NOs: 9, CDR2 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 18-28 i/ili CDR3 sekvencu SEQ ID NOs: 37; i sekvence varijablnog regiona lakog lanca koja ima CDR1 sekvencu SEQ ID NOs: 51, CDR2 sekvencu SEQ ID NOs: 65 i/ili CDR3 sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 71-79; menjanjem najmanje jednog aminokiselinskog ostatka u sekvenci varijablnog regiona teškog lanca antitela i/ili sekvenci varijablnog regiona lakog lanca antitela da bi se dobila najmanje jedna izmenjena sekvenca antitela; i eksprimiranjem izmenjene sekvence antitela kao proteina.
[0151] Prema tome, u drugom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu anti-ActRIIB antitela optimizovanog za ekspresiju u sisarskoj ćeliji koja se sastoji od: sekvence pune dužine teškog lanca antitela koje ima sekvencu odabranu iz grupe sekvenci SEQ ID NOs: 146-150 i 156-160; i sekvence pune dužine lakog lanca antitela koje ima sekvencu odabranu iz grupe sekvenci SEQ ID NOs: 141-145 i 151-155; menjanjem najmanje jednog aminokiselinskog ostatka u sekvencama pune dužine teškog lanca antitela i/ili sekvencama pune dužine lakog lanca antitela da bi se proizvela najmanje jedna izmenjena sekvenca antitela; i eksprimiranjem izmenjene sekvence antitela kao proteina.
[0152] Izmenjena sekvenca antitela može da se pripremi pretraživanjem biblioteka antitela koje imaju fiksirane CDR3 sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 29-42 i SEQ ID NO: 71-84 ili minimalne osnovne determinante vezivanja kao što je opisano u US2005/0255552 i raznovrsne CDR1 i CDR2 sekvence. Pretraživanje može da se izvede prema bilo kojoj tehnologiji pretraživanja pogodnoj za pretraživanje antitela iz biblioteka antitela, kao što je tehnologija prikaza na fagu.
[0153] Standardne tehnike molekularne biologije mogu da se koriste za pripremu i eksprimiranje izmenjene sekvence antitela. Antitelo kodirano izmenjenom sekvencom antitela je ono koje zadržava jedno, neka ili sva funkcionalna svojstava anti-ActRIIB antitela koja su ovde opisana, gde funkcionalna svojstava uključuju, ali bez ograničenja, specifično vezivanje za humani ActRIIB i inhibiciju aktivacije Smad proteina.
[0154] Izmenjeno antitelo može da ispolji jedno ili više, dva ili više, ili tri ili više prethodno diskutovanih funkcionalnih svojstava.
[0155] Funkcionalna svojstava izmenjenih antitela mogu da se procene korišćenjem standardnih ogleda dostupnih u stanju tehnike i/ili ovde opisanih, kao što su oni opisani u primerima (npr. ELISA testovi).
[0156] U određenim primerima izvođenja postupaka za konstruisanje antitela pronalaska, mutacije mogu da se uvedu nasumično ili selektivno duž cele ili dela sekvence koja kodira anti-ActRIIB antitelo i rezultujućim modifikovanim anti-ActRIIB antitelima može da se ispita aktivnost vezivanja i/ili druga funkcionalna svojstava kao što je ovde opisano. Postupci za uvođenje mutacija su opisani u stanju tehnike. Na primer, WO02/092780 opisuje postupke za dobijanje i ispitivanje mutacija antitela korišćenjem saturacione mutageneze, sintetske ligacije, ili njihove kombinacije. Alternativno, WO03/074679 opisuje postupke za korišćenje računarske metode pretraživanja za optimizaciju fizičkohemijskih svojstva antitela.
Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju antitela pronalaska
[0157] Još jedan aspekt pronalaska odnosi se na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitela pronalaska. Primeri nukleotidne sekvence pune dužine lakog lanca optimizovane za ekspresiju u sisarskoj ćeliji prikazani su u sekvencama SEQ ID NOs: 161-165 i 171-175. Primeri nukleotidne sekvence pune dužine teškog lanca optimizovane za ekspresiju u sisarskoj ćeliji prikazani su u sekvencama SEQ ID NOs: 166-170 i 176-180.
[0158] Nukleinske kiseline mogu da budu prisutne u celim ćelijama, u ćelijskom lizatu, ili mogu da budu nukleinske kiseline u delimično prečišćenom ili suštinski čistom obliku. Nukleinska kiselina je "izolovana" ili "učinjena suštinski čistom" kada se prečisti od drugih ćelijskih komponenti ili drugih kontaminanata, npr. drugih ćelijskih nukleinskih kiselina ili proteina, standardnim tehnikama, uključujući obradu rastvorom alkalije/SDS, CsCl tehniku traka, hromatografiju na koloni, elektroforezu na agaroznom gelu i druge dobro poznate u stanju tehnike. Videti, F. Ausubel, et al., ed.1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Nukleinska kiselina pronalaska može da bude, na primer, DNK ili RNK i može ali ne mora da sadrži intronske sekvence. U primeru izvođenja, nukleinska kiselina je molekul cDNK. Nukleinska kiselina može da bude prisutna u vektoru kao što je vektor fagnog prikaza, ili u rekombinantnom plazmidnom vektoru. Pronalazak takođe obezbeđuje vektore označene kao pBW522 i pBW524 (deponovane u DSMZ, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Nemačka, 18. avgusta 2009, pod depozitnim brojevima DSM22873 i DSM22874, redom).
[0159] Nukleinske kiseline pronalaska mogu da se dobiju korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije. Za antitela eksprimirana u hibridomima (npr. hibridomima pripremljenim od transgenih miševa koji nose humane imunoglobulinske gene kao što je opisano u nastvku teksta), cDNK koje kodiraju lake i teške lance antitela nastale u hibridomu mogu da se dobiju standardnim tehnikama PCR amplifikacije ili cDNK kloniranja. Za antitela dobijena iz imunoglobulinske genske biblioteke (npr. korišćenjem tehnika prikaza na fagu), nukleinska kiselina koja kodira antitelo može da se izdvoji iz različitih klonova faga koji su članovi biblioteke.
[0160] U obim pronalaska su takođe uključene varijante sekvence nukleinske kiseline koje sadrže jednu ili više delecija, adicija ili supstitucija. U jednom primeru izvođenja, pronalazak sadrži jednu ili više sekvenci SEQ ID NOs: 113-140 ili 161-180, koja sadrži konzervativnu nukleotidnu supstituciju. Zbog degeneracije genetskog koda, aminokiselina može da bude kodirana sa više od jednog kodona. Tako, moguće je izmeniti nukleotidnu sekvencu, dok translatirana aminokiselinska sekvenca ostaje ista.
[0161] Jednom kada se dobiju DNK fragmenti koji kodiraju VHi VLsegmente, ovim fragmentima DNK može dalje da se manipuliše standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer da bi se geni za varijabilni region pretvorili u gene za lanac antitela pune dužine, u gene za Fab fragment ili u gene za scFv. U ovim manipulacijama, DNK fragment koji kodira VLili VHje operativno vezan za drugi DNK molekul, ili za fragment koji kodira drugi protein, kao što je konstantni region antitela ili fleksibena spojnica. Termin "operativno vezan", kada se koristi u ovom kontekstu, znači da su dva DNK fragmenta spojena na funkcionalni način, na primer, tako da aminokiselinske sekvence kodirane sa dva DNK fragmenta ostaju u okviru čitanja, ili tako da se protein eksprimira pod kontrolom željenog promotora.
[0162] Izolovana DNK koja kodira VHregion može da se prevede u gen za teški lanac pune dužine pomoću operativnog vezivanja DNK koja kodira VHza drugi molekul DNK koji kodira konstantni region teških lanaca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence gena za humani konstantni region teškog lanca su poznate u stanju tehnike (videti npr. Kabat, E. A., et al. [gore]) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu da se dobiju standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može da bude konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD. U nekim primerima izvođenja, kontstantni region teškog lanca je odabran među IgG1 izotipovima. Za gen za teški lanac Fab fragmenta, DNK koja kodira VHmože da bude operativno vezana za drugi molekul DNK koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca.
[0163] Izolovana DNK koja kodira VLregion može da se prevede u gen za teški lanac pune dužine (kao i u gen za laki lanac Fab) pomoću operativnog vezivanja DNK koja kodira VLza drugi molekul DNK koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvenca gena za humani konstantni region lakog lanca je poznata u stanju tehnike (videti npr. Kabat, E. A., et al. [gore]) i DNK fragmenti koji obuhvataju ove regione mogu da se dobiju standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može da bude kapa ili lambda konstantni region.
[0164] Za dobijanje scFv gena, DNK fragmenti koji kodiraju VHi VLsu operativno vezani za drugi fragment koji kodira fleksibilnu spojnicu, npr. koji kodira aminokiselinsku sekvencu (Gly4 -Ser)3, tako da VHi VLsekvence mogu da se eksprimiraju kao susedni jednolančani protein, sa VLi VHregionima spojenim fleksibilnom spojnicom (videti npr. Bird et al., 1988 Science 242:423-426; Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990 Nature 348:552-554).
Dobijanje monoklonskih antitela pronalaska
[0165] Monoklonska antitela (mAb) mogu da se proizvedu različitim tehnikama, uključujući uobičajenu metodologiju monoklonskog antitela npr. standardnu tehniku hibridizacije somatske ćelije prema Kohler and Milstein (1975 Nature 256: 495). Mnoge tehnike za proizvodnju monoklonskog antitela mogu da se koriste npr. viralna ili onkogena transformacija B limfocita.
[0166] Životinjski sistem za pripremu hibridoma je mišji sistem. Proizvodnja hibridoma u mišu je dobro ustanovljen postupak. Protokoli imunizacije i tehnike za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju su poznati u stanju tehnike. Fuzioni partneri (npr. mišje ćelije mijeloma) i postupci za fuziju su takođe poznati.
[0167] Antitela pronalaska su humana monoklonska antitela. Takva humana monoklonska antitela usmerena protiv ActRIIB mogu da se dobiju korišćenjem transgenih ili transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunskog sistema radije nego mišjeg sistema. Ovi transgeni i transhromozomski miševi uključuju miševe ovde označene kao HuMAb miševi i KM miševi, redom, i koji su ovde zajednički označeni kao "miševi sa humanim Ig".
[0168] HuMAb mouse<®>(Medarex, Inc.) sadrži mini lokuse humanog imunoglobulinskog gena koji kodiraju nerearanžirane imunoglobulinske sekvence humanog teškog (µ i γ) i ĸ lakog lanca, zajedno sa ciljnim mutacijama koje inaktivišu endogene lokuse µ i ĸ lanca (videti npr. Lonberg, et al., 1994 Nature 368(6474): 856-859). Prema tome, miševi ispoljavaju smanjenu ekspresiju mišjeg IgM ili ĸ, i kao odgovor na imunizaciju, uvedeni transgeni za humani teški i laki lanac podležu promeni klase i somatskoj mutaciji da bi stvorili humano IgGĸ monoklonsko antitelo visokog afiniteta (Lonberg, N. et al., 1994 [gore]; reviewed in Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. and Huszar, D., 1995 Intern. Rev. Immunol.13: 65-93, i Harding, F. and Lonberg, N., 1995 Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). Priprema i upotreba HuMAb miševa, i genomske modifikacije koje nose takvi miševi, su dalje opisane kod Taylor, L. et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., 1993 International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:3720-3724; Choi et al., 1993 Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al., 1993 EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al., 1994 J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al., 1994 International Immunology 579-591; i Fishwild, D. et al., 1996 Nature Biotechnology 14: 845-851, čiji je sadržaj ovde specifično sadržan po referenci u celosti. Videti dalje, SAD patente br.
5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; 5,770,429; i 5,545,807; kao i WO92/103918, WO93/12227, WO94/25585, WO97/113852, WO98/24884; WO99/45962; i WO01/14424.
[0169] U drugom primeru izvođenja, humana antitela pronalaska mogu da se razviju korišćenjem miša koji nosi humane imunoglobulinske sekvence na transgenima i transhomozomima kao što je miš koji nosi transgen za humani teški lanac i transhromozom za humani laki lanac. Takvi miševi, ovde označeni kao "KM miševi", opisani su detaljno u WO02/43478.
[0170] Dalje, alternativni transgeni životinjski sistemi eksprimiranja humanih imunoglobulinskih gena su dostupni u stanju tehnike i mogu da se koriste za dobijanje anti-ActRIIB antitela pronalaska. Na primer, može da se koristi alternativni transgeni sistem označen kao “Xenomouse” (Abgenix, Inc.).
Takvi miševi su opisani u, npr. SAD patentu br. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6, 150,584 i 6,162,963.
[0171] Osim toga, alternativni transgeni životinjski sistemi eksprimiranja humanih imunoglobulinskih gena su dostupni u stanju tehnike i mogu da se koriste za dobijanje anti-ActRIIB antitela pronalaska. Na primer, miševi koji nose i transhromozom za humani teški lanac i transhromozom za humani laki lanac, označeni kao "TC miševi" mogu da se koriste; takvi miševi su opisani kod Tomizuka et al., 2000 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Osim toga, krave koje nose transhromozome za humani teški i laki lanac su opisane u stanju tehnike (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889-894) i mogu da se koriste za dobijanje anti-ActRIIB antitela pronalaska.
[0172] Humana rekombinantna antitela pronalaska mogu da se pripreme korišćenjem postupaka prikaza na fagu za pretraživanje biblioteka humanih imunoglobulinskih gena. Takvi postupci prikaza na fagu za izdvajanje humanih antitela su uspostavljeni u stanju tehnike ili opisani u primerima u nastavku. Videti na primer: SAD patente br. 5,223,409; 5,403,484; 5,571,698; 5,427,908; 5,580,717; 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081.
[0173] Humana monoklonska antitela pronalaska mogu da se pripreme korišćenjem SCID miševa u koje su rekonstituisane humane imunske ćelije tako da nakon imunizacije može da se dobije odgovor humanog antitela. Takvi miševi su opisani u, na primer, SAD patentima br.5,476,996 i 5,698,767.
Proizvodnja hibridoma koji proizvode humana monoklonska antitela
[0174] Da bi se proizveli hibridomi koji proizvode humana monoklonska antitela pronalaska, splenociti i/ili ćelije limfnog čvora iz imunizovanih miševa mogu da se izoluju i fuzionišu sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je mišja ćelijska linija mijeloma. Rezultujući hibridomi mogu da se ispitaju na proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Na primer, suspenzije pojedinačnih ćelija limfocita slezine iz imunizovanih miševa mogu da se fuzionišu sa jednom šestinom broja nesekretujućih mišjih ćelija mijeloma P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) sa 50% PEG. Ćelije se zaseju na otprilike 2 x 145 u mikrotitar ploče sa ravnim dnom, nakon čega se inkubiraju dve nedelje u selektivnom medijumu koji sadrži 20% fetalnog Clone seruma, 18% "653" kondicioniranog medijuma, 5% origen (IGEN), 4 mM L-glutamina, 1 mM natrijum piruvata, 5mM HEPES, 0:055 mM 2-merkaptoetanola, 50 jedinica/ml penicilina, 50 mg/ml streptomicina, 50 mg/ml gentamicina i 1X HAT (Sigma; HAT se dodaje 24 časa nakon fuzije). Nakon otprilike dve nedelje, ćelije mogu da se gaje u medijumu u kome je HAT zamenjen sa HT. Pojedinačni bunarčići mogu zatim da se ispitaju pomoću ELISA testa na humana monoklonska IgM i IgG antitela. Jednom kada dođe do ekstenzivnog rasta hibridoma, medijum može da se pregleda obično posle 10-14 dana. Hibridomi koji sekretuju antitelo mogu da se ponovo zaseju, ponovo ispitaju, i ako su i dalje pozitivni na humani IgG, monoklonska antitela modu da se subkloniraju najmanje dva puta metodom ograničenog razblaženja.
Stabilni subklonovi mogu da se gaje in vitro da bi se proizvele male količine antitela u medijumu kulture tkiva za karakterizaciju.
[0175] Da bi se prečistila humana monoklonska antitela, selektovani hibridomi mogu da se gaje u dvolitarskim spiner-flaskovima za prečišćavanje monoklonskih antitela. Supernatanti mogu da se filtriraju i koncentruju pre afinitetne hromatografije sa protein A-sefarozom (Pharmacia). Eluirani IgG može da se proveri pomoću gel elektroforeze i tečne hromatografije visoke performanse da bi se osigurala čistoća. Puferski rastvor može da se zameni PBS-om, i koncentracija može da se odredi pomoću OD280korišćenjem koeficijenta ekstinkcije od 1.43. Monoklonska antitela mogu da se alikvotiraju i skladište na -80°C.
Proizvodnja transfektoma koji proizvode monoklonska antitela
[0176] Antitela pronalaska mogu takođe da se proizvedu u ćeliji-domaćinu transfektoma korišćenjem, na primer, kombinacije tehnike rekombinantne DNK i metoda genske transfekcije kao što je dobro poznato u stanju tehnike (npr. Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
[0177] Na primer, za eksprimiranje antitela, ili fragmenata antitela, DNK koje kodiraju delove ili lake i teške lance pune dužine, mogu da se dobiju standardnim tehnikama molekularne biologije (npr. PCR amplifikacijom ili kloniranjem cDNK korišćenjem hibridoma koji eksprimira antitelo od interesa) i DNK mogu da se ubace u ekspresione vektore tako da geni budu operativno vezani za transkripcione i translacione kontrolne sekvence. U ovom kontekstu, termin "operativno vezan" označava da je gen za antitelo ubačen u vektor tako da transkripcione i translacione kontrolne sekvence u vektoru obavljaju svoju ulogu regulisanja transkripcije i translacije gena za antitela. Ekspresioni vektor i ekspresione kontrolne sekvence se biraju tako da budu kompatibilne sa ćelijom-domaćinom koja se koristi za ekspresiju. Gen za laki lanac antitela i gen za teški lanac antitela mogu da se ubace u različite vektore ili, tipičnije, da se oba gena ubace u isti ekspresioni vektor. Geni za antitelo se ubacuju u ekspresioni vektor standardnim postupcima (npr. ligacijom komplementarnih restrikcionih mesta na fragmentu gena za antitelo i vektora, ili ligacijom ravnih krajeva ako restrikciona mesta nisu prisutna). Varijablni region lakih i teških lanaca ovde opisanih antitela mogu da se koriste za stvaranje gena za antitelo pune dužine bilo kog izotipa antitela njihovim ubacivanjem u ekspresione vektore koji već kodiraju konstantne regione teških lanaca i konstantne regione lakih lanaca željenog izotipa tako da je VHsegment operativno vezan za CH segment(e) u vektoru i VLsegment operativno vezan za CL segment u vektoru. Dodatno ili alternativno, rekombinantni ekspresioni vektor može da kodira signalni peptid koji olakšava sekreciju lanca antitela iz ćelije-domaćina. Gen za lanac antitela može da se klonira u vektor tako da signalni peptid bude povezan u okviru čitanja sa amino krajem gena za lanac antitela. Signalni peptid može da bude imunoglobulinski signalni peptid ili heterologni signalni peptid (tj. signalni peptid iz neimunoglobulinskog proteina).
[0178] Pored gena za lanac antitela, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska nose regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju gena za lanac antitela u ćeliji-domaćinu. Termin "regulatorna sekvenca" je namenjen da uključuje promotore, pojačivače i druge kontrolne elemente ekspresije (npr. poliadenilacioni signali) koji kontrolišu transkripciju ili translaciju gena za lanac antitela. Takve regulatorne sekvence su opisane, na primer, kod Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA 1990). Stručnjaci u oblasti će razumeti da dizajn ekspresionog vektora, uključujući izbor regulatornih sekvenci, može da zavisi od takvih faktora kao što je izbor ćelije-domaćina koja će se transformisati, željemog nivoa ekspresije proteina, itd. Regulatorne sekvence za ekspresiju u sisarskoj ćeliji-domaćinu uključuju viralne elemente koji upravljaju visokim nivoima proteinske ekspresije u sisarskim ćelijama, kao što su promotori i/ili pojačivači koji potiču iz citomegalovirusa (CMV), Simian virusa 40 (SV40), adenovirusa (npr. adenovirusni glavni kasni promotir (AdMLP)), i polioma virusa. Alternativno, mogu da se koriste neviralne regulatorne sekvence, kao što je ubikvitinski promotor ili P-globin promotor. Osim toga, regulatorni elementi koji se sastoje od sekvenci iz različitih izvora, kao što je SRa promotorski sistem, koji sadrži sekvence iz ranog promotora SV40 i duge terminalne ponovke virusa leukemije tipa 1 humane T ćelije (Takebe, Y. et al., 1988 Mol. Cell. Biol.8:466-472).
[0179] Pored gena za lanac antitela i regulatornih sekvenci, rekombinantni ekspresioni vektori pronalaska mogu da nose dodatne sekvence, kao što su sekvence koje regulišu replikaciju vektora u ćelijama-domaćinima (npr. polazne tačke replikacije) i gene za selektabilne markere. Geni za selektabilne markere olakšavaju selekciju ćelija-domaćina u koje je vektor uveden (videti, npr. SAD patente br.4,399,216, 4,634,665 i 5,179,017). Na primer, tipično gen za selektabilne markere doprinosi otpornosti na lekove, kao što je G418, higromicin ili metotreksat, ćelije-domaćina u koju je vektor uveden. Geni za selektabilne markere uključuju gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR) (za upotrebu u dhfr-ćelijama-domaćinima sa metotreksat selekcijom/amplifikacijom) i neo gen (za selekciju sa G418).
[0180] Za ekspresiju lakih i teških lanaca, ekspresioni vektor(i) koji kodira teške i lake lance se transficira u ćeliju-domaćina standardnim tehnikama. Različiti oblici termina "transfekcija" su namenjeni da obuhvate raznolike tehnike uobičajeno korišćene za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju-domaćina, npr. elektroporaciju, precipitaciju sa kalcijum-fosfatom, transfekciju DEAE-dekstranom i slično. Teoretski je moguće eksprimirati antitela pronalaska u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama-domaćinima. Ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama, posebno sisarskim ćelijama-domaćinima, se razmatra jer takve eukariotske ćelije, i posebno sisarske ćelije, će sa većom verovatnoćom nego prokariotske ćelije da sastave i sekretuju pravilno sklopljeno i imunološki aktivno antitelo. Prokariotska ekspresija gena za antitela je opisana kao neefikasna za proizvodnju visokih prinosa aktivnog antitela (Boss, M. A. and Wood, C. R., 1985 Immunology Today 6:12-13).
[0181] Sisarske ćelije-domaćini za eksprimiranje rekombinantnih antitela pronalaska uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO ćelije) (uključujući dhfr- CHO ćelije, opisane kod Urlaub and Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220 korišćene sa DH FR selektabilnim markerom, npr. kao što je opisano kod R.J. Kaufman and P.A. Sharp, 1982 Mol. Biol.159:601-621), NSO ćelije mijeloma, COS ćelije i SP2 ćelije. U jednom primeru izvođenja ćelije-domaćini su CHO K1PD ćelije. Naročito, za upotrebu sa NSO ćelijama mijeloma, drugi ekspresioni sistem je GS sistem za ekspresiju gena prikazan u WO87/04462, WO89/01036 i EP 338,841. U jednom primeru izvođenja, sisarske ćelijedomaćini za eksprimiranje rekombinantnih antitela pronalaska uključuju sisarske ćelijske linije kojima nedostaje FUT8 genska ekspresija, na primer kao što je opisano u US6,946,292B2. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene za antitelo uvedu u sisarske ćelije-domaćine, antitela se proizvode gajenjem ćelija-domaćina tokom perioda vremena dovoljnog da se omogući ekspresija antitela u ćelijama-domaćinima ili sekrecija antitela u medijum kulture u kome se ćelijedomaćini gaje. Antitela mogu da se izdvoje iz medijum kulture korišćenjem standardnih postupaka za prečišćavanje proteina.
Imunokonjugati
[0182] U drugom aspektu, predmetni opis se odnosi na anti-ActRIIB antitelo, ili njegov fragment, konjugovan sa terapeutskim fragmentom, kao što je citotoksin, lekom (npr. imunosupresivom) ili radiotoksinom. Takvi konjugati su ovde označeni kao "imunokonjugati". Imunokonjugati koji uključuju jedan ili više citotoksina su označeni kao "imunotoksini." Citotoksin ili citotoksično sredstvo uključuje bilo koje sredstvo koje je štetno za ćelije (npr. ubija ih).
[0183] Citotoksini mogu da budu konjugovani sa antitelima pronalaska korišćenjem tehnologije spojnice dostupne u stanju tehnike. Primeri tipova spojnica koje su korišćene za konjugovanje citotoksina sa antitelom uključuju, ali bez ograničenja, hidrazone, tioetre, estre, disulfide i spojnice koje sadrže peptid. Spojnica može da se odabere tako da, na primer, bude podložna isecanju na niskom pH u lizozomskom odeljku ili podložna isecanju proteazama, kao što su proteaze prvenstveno eksprimirane u tumorskom tkivu kao što su katepsini (npr. katepsini B, C, D).
[0184] Za dalje razmatranje citotoksina, spojnica i postupaka za konjugovanje terapeutskih sredstava za antitela, videti takođe Saito, G. et al., 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al., 2003 Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G.2003 Cancer Cell 3:207-212; Allen, T.M., 2002 Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. and Kreitman, R. J., 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. and Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev.53:247-264.
[0185] Antitela predmetnog pronalaska takođe mogu da budu konjugovana sa radioaktivnim izotopom da bi se napravili citotoksični radiofarmaceutici, takođe označeni kao radioimunokonjugati. Primeri radioaktivnih izotopa koji mogu da budu konjugovani sa antitelima za dijagnostičku ili terapeutsku upotrebu uključuju, ali bez ograničenja, jod<131>, indijum<111>, itrijum<90>, i lutecijum<177>. Postupci za pripremu radioimunkonjugata su uspostavljeni u stanju tehnike. Primeri radioimunokonjugata su komercijalno dostupni, uključujući Zevalin<TM>(DEC Pharmaceuticals) i Bexxar<TM>(Corixa Pharmaceuticals), i slični postupci mogu da se koriste za pripremu radioimunokonjugata korišćenjem antitela pronalaska.
[0186] Konjugati antitela mogu da se koriste za modifikovanje datog biološkog odgovora, i fragment leka ne treba razumeti kao ograničen na uobičajena hemijska terapeutska sredstva. Na primer, fragment leka može da bude protein ili polipeptid koji ima željenu biološku aktivnost. Takvi proteini mogu da uključuju, na primer, enzimski aktivan toksin, ili njegov aktivni fragment, kao što je abrin, ricin A, egzotoksin pseudomonasa, ili toksin difterije; protein kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-γ; ili, modifikatore biološkog odgovora kao što su, na primer, limfokini, interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), faktor stimulacije kolonije granulocita i makrofaga ("GM-CSF"), faktor stimulacije kolonije granulocita ("G-CSF"), ili drugi faktori rasta.
[0187] Tehnike za konjugovanje takvih terapeutskih fragmenata za antitela su dobro poznati, videti, npr. Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc.
1985); Hellstrom et al., " Antibodies For Drug Delivery", u Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutical Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Inmunol. Rev., 62:119-58 (1982).
Bispecifični molekuli
[0188] U drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na bispecifične ili multispecifične molekule koji sadrže anti-ActRIIB antitelo, ili njegov fragment, pronalaska. Antitelo pronalaska, ili njegovi antigen-vezujući regioni, mogu da budu derivatizovani ili vezani za drugi funkcionalni molekul, npr. drugi peptid ili protein (npr. drugo antitelo ili ligand za receptor) da bi se proizveoa bispecifični molekul koji se vezuje za najmanje dva različita mesta vezivanja ili ciljna molekula. Antitelo pronalaska može zapravo da bude derivatizovano ili vezano za više od jednog dodatnog funkcionalnog molekula da bi se dobili multispecifični molekuli koji se vezuju za više od dva različita mesta vezivanja i/ili ciljna molekula; takvi multi-specifični molekuli su takođe predviđeni da budu obuhvaćeni terminom "bispecifičan molekul" kako se ovde koristi. Da bi se proizveo bispecifičan molekul, antitelo pronalaska može da bude funkcionalno vezano (npr. hemijskim kuplovanjem, genetskom fuzijom, nekovalentnom vezom ili drugačije) za jedan ili više dodatnih vezujućih molekula, kao što je drugo antitelo, fragment antitela, peptid ili mimetik vezivanja, tako da nastane bispecifičan molekul.
[0189] Dodatno, u sistuacijama u kojima je bispecifičan molekul multi-specifičan, molekul može dalje da uključuje treću specifičnost vezivanja, pored prvog i drugog ciljnog epitopa.
[0190] Bispecifični molekuli opisa sadrže kao specifičnost vezivanja najmanje jedno antitelo, ili fragment antitela, uključujući, npr. Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ili jednolančani Fv. Antitelo može takođe da bude dimer lakog lanca ili teškog lanca, ili bilo koji minimalni njihov fragment kao što je Fv ili jednolančani konstrukt kao što je opisano kod Ladner et al. US4,946,778, čiji je sadržaj uključen po referenci.
[0191] Bispecifični molekuli predmetnog opisa mogu da se pripreme konjugovanjem konstituenta specifičnosti vezivanja, korišćenjem postupaka poznatih u stanju tehnike. Na primer, svaka specifičnost vezivanja bispecifičnog molekula može da se proizvede odvojeno, a zatim da se konjuguju jedna sa drugom. Kada su specifičnosti vezivanja proteini ili peptidi, različita sredstva za kuplovanje ili unakrsno vezivanje mogu da se koriste za kovalentnu konjugaciju. Primeri sredstava za unakrsno vezivanje uključuju protein A, karbodiimid, N-sukcinimidil-S-acetil-tioacetat (SATA), 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzojevu kiselinu) (DTNB), o-fenilendimaleimid (oPDM), N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), i sulfosukcinimidil 4-(N-maleimidometil) ciklohaksan-l-karboksilat (sulfo-SMCC) (videti npr. Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Drugi postupci uključuju one opisane u Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. No.78,118-132; Brennan et al., 1985 Science 229:81-83), i Glennie et al., 1987 J. Immunol.139: 2367-2375). Sredstva za konjugovanje SATA i sulfo-SMCC su oba dostupna kod Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
[0192] Kada specifičnosti vezivanja predstavljaju antitela, ona mogu da budu konjugovana sulfhidrilnim vezivanjem C-terminusa regiona zgloba dva teška lanca. U posebnom primeru izvođenja, region zgloba je modifikovan tako da sadrži neparan broj sulfhidrilnih ostataka, na primer jedan, pre konjugacije.
[0193] Alternativno, obe specifičnosti vezivanja mogu da budu kodirane u istom vektoru i eksprimirane i sastavljene u istoj ćeliji-domaćinu. Ovaj postupak je posebno koristan kada je bispecifični molekul mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2ili fuzioni protein ligand x Fab. Bispecifični molekul može da bude jednolančani molekul koji sadrži jedno jednolančano antitelo i determinantu vezivanja, ili jednolančani bispecifični molekul koji sadrži dve determinante vezivanja. Bispecifični molekuli mogu da sadrže najmanje dva jednolančana molekula. Postupci za pripremu bispecifičnih molekula su opisani na primer u SAD patentima br. 5,260,203; 5,455,030; 4,881,175; 5,132,405; 5,091,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; i 5,482,858.
[0194] Vezivanje bispecifičnih molekula za njihove specifične ciljeve može da se potvrdi, na primer, pomoću enzimski vezanog imunosorbentnog testa (ELISA), radioimunoeseja (RIA), FACS analize, biološkog ogleda (npr. inhibicija rasta), ili Western Blot testa. Svaki od ovih testova uopšteno detektuje prisustvo protein-antitelo kompleksa od posebnog interesa korišćenjem obeleženog reagensa (npr. antitela) specifičnog za kompleks od interesa.
Multivalentna antitela
[0195] U drugom aspektu, predmetni opis se odnosi na multivalentna antitela koja sadrže najmanje dva identična ili različita antigen-vezujuća dela antitela pronalaska koja se vezuju za ActRIIB. U jednom primeru izvođenja, multivalentna antitela obezbeđuju najmanje dva, tri ili četiri antigenvezujuća dela antitela. Antigen-vezujući delovi mogu da budu međusobno povezani putem proteinske fuzije ili kovalentne ili nekovalentne veze. Alternativno, postupci za povezivanje su opisani za bispecifične molekule. Tetravalentna jedinjenja mogu da se dobiju na primer unakrsnim povezivanjem antitela pronalaska sa antitelom koje se vezuje za konstantne regione antitela pronalaska, na primer Fc ili region zgloba.
Farmaceutske kompozicije
[0196] U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju, npr. farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jedno ili kombinaciju monoklonskih antitela, ili njegov antigen-vezujući deo/delove, predmetnog pronalaska, formulisano zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Takve kompozicije mogu da uključuju jedno ili kombinaciju (npr. dva ili više različitih) antitela, ili imunokonjugate ili bispecifične molekule pronalaska. Na primer, farmaceutska kompozicija pronalaska može da sadrži kombinaciju antitela koja se vezuju za različite epitope na ciljnom antigenu ili koja imaju komplementarne aktivnosti.
[0197] Farmaceutske kompozicije pronalaska takođe mogu da se primene u kombinovanoj terapiji, tj. kombinovane sa drugim sredstvima. Na primer, kombinovana terapija može da uključuje anti-ActRIIB antitelo predmetnog pronalaska kombinovano sa najmanje jednim dodatnim sredstvom za povećanje mišićne mase/snage, na primer, IGF-1, IGF-2 ili varijante IGF-1 ili IGF-2, anti-miostatin antitelo, propeptid miostatina, mamac-protein miostatin koji se vezuje za ActRIIB ali ga ne aktivira, beta 2 agonist, agonist grelina, SARM, agoniste/mimetike GH ili folistatin. Primeri terapeutskih sredstava koji mogu da se koriste u kombinovanoj terapiji opisani su detaljnije u nastavku teksta u odeljku o upotrebi antitela pronalaska.
[0198] Kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slična sredstva koja su fiziološki kompatibilna. Nosač treba da bude pogodan zar intravensku, intramuskularnu, subkutanu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (npr. injekcijom ili infuzijom). U zavisnosti od puta primene, aktivno jedinjenje, tj. antitelo, imunokonjugat, ili bispecifični molekul, može da bude obloženo materijalom kako bi se jedinjenje zaštitilo od delovanja kiselina i drugih prirodnih uslova koji mogu da inaktivišu jedinjenje.
[0199] Farmaceutska jedinjenja pronalaska mogu da uključuju jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli. "Farmaceutski prihvatljiva so" odnosi se na so koja zadržava željenu biološku aktivnost parentalnog jedinjenja i ne daje bilo kakve neželjena toksikološka dejstva (videti npr. Berge, S.M., et al., 1977 J. Pharm. Sci. 66:1-19). Primeri takvih soli uključuju kisele adicione soli i bazne adicione soli. Kisele adicione soli uključuju one izvedene iz netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforasta i slično, kao i iz netoksičnih organskih kiselina kao što su alifatične mono- i di-karboksilne kiseline, fenilsupstituisane alkanske kiseline, hidroksi alkanske kiseline, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sulfonske kiseline i slično. Bazne adicione soli uključuju one izvedene iz zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum i slično, kao i iz netoksičnih organskih amina, kao što su N,N'-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilendiamin, prokain i slično.
[0200] Farmaceutska kompozicija pronalaska takođe može da uključuje farmaceutski prihvatljiv antioksidans. Primeri farmaceutski prihvatljivih antioksidanasa uključuju: antioksidanase rastvorljive u vodi, kao što je askorbinska kiselina, cistein hidrohlorid, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfit, natrijum sulfit i slično; antioksidanase rastvorljive u ulju, kao što su askorbil palmitat, butilisani hidroksianisol (BHA), butilisani hidroksitoluen (BHT), lecitin, propil galat, alfa-tokoferol, i slično; i metal-helatna sredstva, kao što je limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina, fosforna kiselina, i slično.
[0201] Primeri pogodnih nosača koji su na vodenoj bazi i koji nisu na vodenoj bazi koji mogu da budu uključeni u farmaceutske kompozicije pronalaska uključuju vodu, etanol, poliole (kao što je glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom surfaktanata.
[0202] Ove kompozicije mogu takođe da sadrže adjuvanse kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulzifikujuća sredstva i sredstva za dispergovanje. Sprečavanje prisustva mikroorganizama može da se osigura postupcima sterilizacije, gore, i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifungalnih sredstva, na primer, parabena, hlorobutanola, fenol sorbinske kiseline, i slično. Takođe može da bude poželjno uključivanje izotoničnih sredstava, kao što su šećeri, natrijum hlorid, i slično u kompozicije. Dodatno, produžena apsorpcija injektabilnog farmaceutskog oblika može da se postigne uključivanjem sredstva koje odlaže apsorpciju kao što je aluminijum monostearat i želatin.
[0203] Farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za magistralnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je poznata u stanju tehnike. Osim ukoliko je bilo koji uobičajeni medijum ili sredstvo nekompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, njegova upotreba u farmaceutskim kompozicijama pronalaska se podrazumeva. Dodatna aktivna jedinjenja mogu takođe da budu uključena u kompozicije.
[0204] Terapeutske kompozicije tipično moraju da budu sterilne i stablne pod uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može da bude formulisana kao rastvor, mikroemulzija, lipozom, ili druge uređene strukture pogodne za visoku koncentraciju leka. Nosač može da bude rastvarač ili medijum za dispergovanje koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost može da se održava, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. U mnogim slučajevima, u kompoziciju mogu da se uključe izotonična sredstva, na primer, šećeri, polialkoholi kao što je manitol, sorbitol, ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektabilne kompozicije može da se postigne uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatina.
[0205] Sterilni injektabilni rastvori mogu da se pripreme dodavanje aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini odgovarajućem rastvaraču sa jednim ili kombinacijom sredstava koja su prethodno nabrojana, ako je potrebno, praćenim sterilizacionom mikrofiltracijom. Uopšteno, disperzije se pripremaju dodavanjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i druga potrebna sredstva od onih koja su prethodno nabrojana. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, postupci za pripremu su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavanjem (liofilizacija) koja daje prašak aktivnog sredstva i bilo koje željeno dodatno sredstvo iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0206] Količina aktivnog sredstva koja može da se kombinuje sa materijalom nosača da bi se proizveo pojedinačni dozni oblik će varirati u zavisnosti od subjekta koji se leči, i konkretnog načina primene. Količina aktivnog sredstva koja može da se kombinuje sa materijalom nosača da bi se proizveo pojedinačni dozni oblik će uopšteno biti ona količina kompozicije koja proizvodi terapeutsko dejstvo. Uopšteno, od sto procenata, ova količina će biti u opsegu od oko 0.01 procenat do oko devedeset devet percenata aktivnog sredstva, od oko 0.1 procenat do oko 70 procenta, ili od oko 1 procenat do oko 30 procenta aktivnog sredstva u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0207] Dozni režimi su prilagođeni da obezbede optimalni željeni odgovor (npr. terapeutski odgovor). Na primer, jedan bolus može da se primeni, nekoliko podeljenih doze može da se primeni tokom vremena ili doza može da se proporcionalno smanji ili poveća kao što ukazuje potreba terapeutske situacije. Naročito je pogodno formulisati parenteralne kompozicije u obliku dozne jedinice za jednostvnost primene i ravnomernost doziranja. Dozna jedinica kako se ovde koristi odnosi se na fizički odvojene jedinice koje odgovaraju jedinstevenim dozama za subjekte koji treba da se leče; pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja proračunatu da proizvede željeno terapeutsko dejstvo zajedno sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za dozne jedinice pronalaska je uslovljena i neposredno zavisi od jedinstvenih svojstava aktivnog jedinjenja i konkretnog terapeutskog dejstva koje treba postići, i ograničenja svojstvenih oblast sačinjavanja takvog aktivnog jedinjenja za lečenje senzitivnosti kod pojedinaca.
[0208] Za primenu antitela, doza se nalazi u opsegu od oko 0.0001 do 100 mg/kg, i češće 0.01 do 5 mg/kg, telesne težine domaćina. Na primer doze mogu da budu 0.3 mg/kg telesne težine, 1 mg/kg telesne težine, 3 mg/kg telesne težine, 5 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u opsezima od 1-10 mg/kg ili 3-7 mg/kg. Primer režima lečenja zahteva primenu jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje, jednom svake tri nedelje, jednom svake četiri nedelje, jednom mesečno, jednom na svaka 3 meseca ili jednom na svaka tri do 6 meseci. Alternativno, antitelo može da se primeni oko jednom godišnje ili samo jednom. Takva primena može da se sprovede intravenski ili subkutano. Dozni režimi za anti-ActRIIB antitelo pronalaska uključuju 1 mg/kg telesne težine ili 3 mg/kg telesne težine intravenskom primenom, sa antitelom datim korišćenjem najmanje jednog od sledećih rasporeda doziranja: svake četiri nedelje za šest doza, zatim na svaka tri meseca; svake tri nedelje; 3 mg/kg telesne težine jednom praćeno sa 1 mg/kg telesne težine svake tri nedelje.
[0209] Doza treba da bude ona koja dovodi do ushodne regulacije mišićne mase i/ili snage. Poželjno dejstvo se ispoljava na skeletnom mišiću. Poželjno, doza prouzrokuje mišićnu hipertrofiju sa ne više od proporcionalnog povećanja veličine unutrašnjih organa (npr. srca, pluća, jetre, bubrega). Takvo proporcionalno povećanje može da se uporedi merenjem mase ili zapremine. U nekim postupcima, dva ili više monoklonskih antitela sa različitim specifičnostima vezivanja primenjuju se istovremeno, u kom slučaju se doza svakog primenjenog antitela nalazi u naznačenim okvirima. Antitelo se obično primenjuje u više navrata. Intervali između pojedinačnih doza mogu da budu, na primer, nedeljno, mesečno, svaka tri meseca, svakih šest meseci ili godišnje. Intervali mogu takođe da budu nepravilni kao što je naznačeno merenjem nivoa antitela u krvi za ciljni antigen kod pacijenta. U nekim postupcima, doza je prilagođena postizanju koncentracije antitela u plazmi od oko 1-1000 µg/ml i u nekim postupcima oko 25-300 µg/ml. Na primer, ActRIIB antitelo pronalaska može da se primeni zajedno sa anti-miostatin antitelom.
[0210] Alternativno, antitelo može da se primeni kao formulacija sa produženim oslobađanjem, u kom slučaju je potrebna manje učestala primena. Doza i učestalost variraju u zavisnosti od polu-života antitela kod pacijenta. Uopšteno, humana antitela pokazuju najduži polu-život, nakon toga humanizovana antitela, himerna antitela, i nehumana antitela. Doza i učestalost primene mogu da variraju u zavisnosti od toga da li je lečenje profilaktičko ili terapeutsko. U profilaktičkim primenama, relativno niska doza se primenjuje u relativno retkim intervalima tokom dugog perioda vremena. Neki pacijenti nastavljaju da primaju tretman do kraja života. U terapeutskim primenama, ponekad je potrebna relativno visoka doza u relativno kratkim intervalima do smanjenja ili okončanja progresije bolesti ili dok pacijent ne pokaže delimično ili potpuno poboljšanje simptoma bolesti. Nakon toga, kod pacijenta može da se primeni profilaktički režim.
[0211] Konkretni nivoi doze aktivnog sredstva u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska mogu da se menjaju tako da se dobije količina aktivnog sredstva koja je efikasna u postizanju željenog terapeutskog odgovora za određenog pacijenta, kompoziciju, i način primene, a da pri tom nije toksična za pacijenta. Odabrani nivo doze će zavisiti od različitih farmakokinetičkih faktora uključujući aktivnost određene kompozicije predmetnog pronalaska koja se koristi, ili njenog estra, soli ili amida, puta primene, vremena primene, puta izlučivanja određenog jedinjenja koje se koristi, trajanja lečenja, drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala upotrebljenih u kombinaciji sa određenim kompozicijama koje se koriste, starosti, pola, težine, stanja, opšteg zdravlja i prethodne medicinske istorije pacijenta koji se leči, i sličnih faktora dobro poznatih u oblasti medicine.
[0212] "Terapeutski efikasna doza" anti-ActRIIB antitela pronalaska može da rezultuje u smanjenju ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanju učestalosti i trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili sprečavanju oštećenja ili invaliditeta zbog pogođenosti bolešću tj. povećnju mišićne mase i/ili snage.
[0213] Kompozicija predmetnog pronalaska može da se primeni jednim ili više puteva primene, korišćenjem jednog ili više različitih postupaka poznatih u stanju tehnike. Kao što će stručnjak razumeti, put i/ili način primene će varirati u zavisnosti od željenih rezultata. Putevi primene antitela pronalaska uključuju intravenski, intramuskularni, intradermalni, intraperitonealni, subkutani, spinalni ili druge parenteralne puteve primene, na primer injekcijom ili infuzijom. Izraz "parenteralna primena", kako se ovde koristi, označava načine primene koji nisu enteralna i topikalna primena, obično pomoću injekcije, i uključuju, bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijačnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrastemalnu injekciju i infuziju. U jednom primeru izvođenja antitelo se primenjuje intravenski. U drugom primeru izvođenja antitelo se primenjuje subkutano.
[0214] Alternativno, antitelo pronalaska može da se primeni putem koji nije parenteralni, kao što je topikalni, epidermalni ili mukozni put primene, na primer, intranazalno, oralno, vaginalno, rektalno, sublingvalno ili topikalno.
[0215] Aktivna jedinjenja mogu da se pripreme sa nosačima koji će štititi jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante, transdermalne flastere, i mikroinkapsulirane sisteme za dostavu. Mogu da se koriste biodegradabilni, biokompatibilni polimeri, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentirani ili opšte poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, npr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0216] Terapeutske kompozicije mogu da se primene sa medicinskim uređajima poznatim u stanju tehnike. Na primer, u jednom primeru izvođenja, terapeutska kompozicija pronalaska može da se primeni uređajem za hipodermijsku injekciju bez igle, kao što su uređaji prikazani u SAD patentima br.
5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824 ili 4,596,556. Primeri dobro poznatih implanta i modula korisnih u predmetnom pronalasku uključuju: SAD patent br. 4,487,603, koji prikazuje implantabilnu mikro-infuzionu pumpu za dostavljanje leka kontrolisanom brzinom; SAD patent br. 4,486,194, koji prikazuje terapeutski uređaj za primenu lekova kroz kožu; SAD patent br.
4,447,233, koji prikazuje medicinsku infuzionu pumpu za dostavu leka određenom brzinom infuzije; SAD patent br. 4,447,224, koji prikazuje implantabilni infuzioni aparat sa varijabilnim protokom za neprekidnu dostavu leka; SAD patent br. 4,439,196, koji prikazuje osmotski sistem za dostavu leka koji ima višekomorne odeljke; i SAD patent br. 4,475,196, koji prikazuje osmotski sistem za dostavu leka. Mnogi drugi takvi implanti, sistemi za dostavu, i moduli su poznati stručnjacima u oblasti i uključuju one napravljene u MicroCHIPS<TM>(Bedford, MA).
[0217] U određenim primerima izvođenja, humana monoklonska antitela pronalaska mogu da se formulišu tako da osiguraju ispravnu raspodelu in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) isključuje mnoga visoko hidrofilna jedinjenja. Kako bi se osiguralo da terapeutska jedinjenja pronalaska prolaze BBB (ako je poželjno), ona mogu da budu formulisana, na primer, u lipozomima. Za postupke za proizvodnju lipozoma, videti, npr. SAD patente 4,522,811; 5,374,548; i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jedan ili više fragmenata koji se selektivno transportuju u specifične ćelije ili organe, pojačavajući tako ciljnu dostavu leka (videti, npr. V.V. Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol.
29:685). Primeri ciljnih fragmenata uključuju folat ili biotin (videti, npr. SAD patent 5,416,016); manozide (Umezawa et al., 1988 Biochem. Biophys. Res. Commun.153:1038); antitela (P.G. Bloeman et al., 1995 FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., 1995 Antimicrob. Agents Chernother. 39:180); receptor za surfaktantni protein A (Briscoe et al., 1995 Am. J. Physiol.1233:134); p120 (Schreier et al., 1994 J. Biol. Chem.269:9090); videti takođe K. Keinanen; M.L. Laukkanen, 1994 FEBSLett.346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273.
Upotrebe i postupci pronalaska
[0218] Antitela predmetnog pronalaska imaju in vitro i in vivo dijagnostičke i terapeutske koristi. Na primer, ovi molekuli mogu da se primene na ćelije u kulturi, npr. in vitro ili ex vivo, ili kod subjekta, npr. in vivo, za lečenje, prevenciju ili dijagnozu različitih poremećaja. Termin "subjekat" kako se ovde koristi namenjen je da uključi ljude i životinje koje nisu ljudi. Životinje koje nisu ljudi uključuju sve kičmenjake, npr. sisare i one koji nisu sisari, kao što su nehumani primati, ovce, psi, mačke, krave, konji, kokoške, vodozemci, i gmizavci.
[0219] Pronalazak obezbeđuje anti-ActRIIB antitelo za upotrebu u lečenju pacijenta koji pati od patološkog poremećaja (kao što je bolest ili poremećaj gubitka mišića) koje obuhvata primenu terapeutski efikasne količine anti-ActRIIB antitela.
[0220] Pronalazak takođe obezbeđuje anti-ActRIIB antitelo za upotrebu u terapiji.
[0221] Pronalazak takođe obezbeđuje upotrebu anti-ActRIIB antitela u proizvodnji leka za lečenje patološkog poremećaja.
[0222] Anti-ActRIIB antitela su naročito pogodna za lečenje, prevenciju, poboljšanje ili dijagnozu patoloških poremećaja.
[0223] Kako se ovde koristi, “patološki poremećaj” uključuje, ali nije ograničen na, mišićnoskeletne bolesti ili poremećaje, kao što je mišićna atrofija. Postoje mnogi uzroci mišićne atrofije, uključujući posledice lečenja glukokortikoidima kao što je kortizol, deksametazon, betametazon, prednizon, metilprednizolon, ili prednizolon. Mišićna atrofija može takođe da bude rezultat denervacije zbog povrede nerva ili rezultat degenerativne, metaboličke, ili inflamatorne neuropatije (npr., Žilijen-Bar sindrom, perirerna neuropatija, ili izlaganje toksinima sredine ili lekovima).
[0224] Dodatno, mišićna atrofija može da bude rezultat miopatije, kao što je miotonija; kongentialne miopatije, uključujući nemalinsku miopatiju, miopatiju sa brojnim malim jezgrima i miotubularnu (centronuklearnu) miopatiju; mitohondrijalnu miopatiju; familijarnu periodičnu paralizu; inflamatornu miopatiju; metaboličku miopatiju, kao što je ona izazvana bolešću skladištenja glikogena ili lipida; dermatomiozitis; polimiozitis; miozitis sa inkluzionim telima; osificirajući miozitis; rabdomiolizu i mioglobinuriju.
[0225] Miopatija može da bude uzrokovana sindromom mišićne distrofije, kao što je Dišenova, Bekerova, miotona, facioskapulohumeralna, Emeri-Drajfusova, okulofaringealna, skapulohumeralna, mišićna distrofija pojasnog oblika, Fukujama, kongenitalna mišićna distrofija, ili nasledna distalna miopatija. Mišićno-skeletna bolest može takođe da bude osteoporoza, prelom kosti, nizak rast, ili patuljasti rast.
[0226] Dodatno, atrofija mišića može da bude rezultat adultnog oboljenja motornih neurona, infantilne spinalne mišićne atrofije, amiotrofne lateralne skleroze, juvenilne spinalne mišićne atrofije, autoimune motorne neuropatije sa multifokalnim sprovodnim blokom, paraliza zbog moždanog udara ili povrede kičmene moždine, imobilizacija skeleta zbog povrede, produženo mirovanje, voljna neaktivnost, nevoljna neaktivnost, metabolički stres ili nedovoljna ishranjenost, kancer, AIDS, izgladnjivanje, poremećaj tiroidne žlezde, dijabetes, benigna kongenitalna hipotonija, bolest centralnog jezgra, opekotina, hronična opstruktivna bolest pluća, bolesti jetre (primeri su fibroza, ciroza), sepsa, renalna insuficijencija, kongestivno zatajenje srca, starenje, putovanje u svemir ili vreme provedenu u bestežinskom stanju.
[0227] Primeri stanja povezanih sa starenjem uključuju, sarkopeniju, atrofiju kože, gubitak mišića, atrofiju mozga, aterosklerozu, arteriosklerozu, plućni emfizem, osteoporozu, osteoartritis, imunološku nekompetentnost, visok krvni pritisak, demenciju, Hantingtonovu bolest, Alchajmerovu bolest, katarakte, makularnu degeneraciju povezanu sa starenjem, kancer prostate, moždani udar, smanjen očekivani životni vek, slabost, gubitak pamćenja, boranje, oštećenu bubrežnu funkcija, i gubitak sluha povezan sa starenjem; metaboličke poremećaje, ukljčujući dijabetes tipa II, metabolički sindrom, hiperglikemiju, i gojaznost. Naravno, pacijenti mogu da istovremeno pate od jednog ili više od ovih stanja, na primer, sarkopenije i plućnog emfizema, ili sarkopenije i oslebljene funkcije bubrega.
[0228] Druga stanja koja mogu da se leče antitelima pronalaska uključuju akutnu i/ili hroničnu bubrežnu bolest ili insuficijenciju, fibrozu ili cirozu jetre, kancer kao što je kancer dojke, Parkinsonovu bolest; stanja povezana sa smrću neurona, kao što je ALS, atrofiju mozga, ili demenciju i anemiju.
[0229] Dodatna stanja uključuju kaheksiju, kaheksiju povezanu sa reumatoidnim artritisom i kaheksiju povezanu sa kancerom.
[0230] Do danas, razvijeno je vrlo malo pouzdanih ili efikasnih terapija za lečenje ovih bolesti.
[0231] Na osnovu objavljenih dokaza o ulozi vezivanja aktivina za ActRIIB između ostalih receptora (Werner and Alzheimer, Cytokine Growth Factors Rev 2006, 17(3):157-171), u doprinosu fibrozi jetre, bubrega i pluća, i o ulozi miostatina, aktivina, ili ActRIIB u kancerima (Tsuchida et al, Endo J, 2008, 55(1):11-21) antitela pronalaska mogu da se koriste za lečenje fibroze jetre, bubrega, pluća i kancera kao što su na primer, ali bez ograničenja rabdomiosarkomi, kanceri koji dovode do gubitka kosti, hepatocelularni karcinomi, gastrointestinalni kanceri.
[0232] Prevencija može da bude potpuna, npr., potpuno odsustvo stanja povezanog sa starenjem ili metaboličkog poremećaja. Prevencija može takođe da bude delimična, tako da je verovatnoća pojave stanja povezanog sa starenjem ili metaboličkog poremećaja kod subjekta manja nego kod subjekta koji ne prima antitelo predmetnog pronalaska.
[0233] Stanje povezano sa godinama kao što je ovde navedeno može da započne u starosnom dobu od 50 godina ili kasnije (tj.60, 70, 80 ili više).
[0234] U jednom primeru izvođenja, pacijent može da bude prethodno lečen anti-ActRIIB antitelom pre očekivanog perioda prinudnog odmora/neaktivnosti. Takav period može da se dogodi kada je pacijent primljen u bolnicu, na primer zbog operacije kuka ili noge. Neaktivnost može da bude lokalizovana, kao što je zbog učvrršćivanja polomljenog ekstremiteta ili zgloba, ili primene paralitičkog sredstva.
[0235] U jednom primeru izvođenja, pacijent koji se leči ima prelom ekstremiteta (tj. nogu ili ruku) ili zgloba (tj. koleno ili kuk). Tako, u jednom primeru izvođenja, pacijent koji se leči ima prelom jedne ili više od ramene, palačne, lakatne, karpalne, metakarpalne, ključne, lopatične, butne, karlične, čašice, golenjače, lišnjače, skočne, petne, tarzalne, metatarzalne, sedne ili bedrene kosti. U drugom primeru izvođenja, pacijent koji se leči je pretrpeo, ili će pretrpeti operaciju na jednom ili više od sledećih zglobova: koleno, kuk, članak, rame, lakat. Takva operacija uključuje operativnu zamenu kuka i zamenu kolena.
[0236] Atrofija zbog imobilizacije može se dogodi brzo, ali se obično odvija sporo. Stoga, u jednom primeru izvođenja, pacijentu je zglob ili ekstrmitet imobilisan, ili će biti imobilisan, tokom 2 nedelje ili duže (tj. 3 nedelje, 4 nedelje, 6 nedelja, 8 nedelja ili duže). U jednom primeru izvođenja, pacijentu je zglob ili ekstrmitet imobilisan, ili će biti imobilisan, tokom 1-8 nedelja, 2-6 nedelja ili 3-5 nedelja.
[0237] U sledećem primeru izvođenja, pacijent može da bude neko ko nije odgovaro na prethodna anabolička lečenja kosti. Na primer, pacijent je mogao da ne odgovara na lečenje sa IGF-1, IGF-2 ili varijantama IGF-1 ili IGF-2, anti-miostatin antitelom, propeptidom miostatina, mamac-proteinom miostatina koji se vezuje za ActRIIB ali ga ne aktivira, beta 2 agonistom, agonistom grelina, SARM, agonistima/mimeticima GH ili folistatinom. Jednostavan način za merenje odgovora pacijenta na lečenje može da bude vreme potrebno pacijentu da se popne na poznatu visinu stepenica i poređenje rezultata pre i posle lečenja.
[0238] Antitela pronalaska mogu da se primene kao jedino aktivno sredstvo ili u spoju sa, npr. kao adjuvans za, ili u kombinaciji sa drugim lekovima npr. IGF-1, IGF-2 ili varijantama IGF-1 ili IGF-2, anti-miostatin antitelom, propeptidom miostatina, mamac-proteinom miostatina koji se vezuje za ActRIIB ali ga ne aktivira, beta 2 agonistom, agonistom grelina, SARM, agonistima/mimeticima GH ili folistatinom. Na primer, antitela pronalaska mogu da se koriste u kombinacija sa mimetikom IGF-1 kao što je opisano u WO2007/146689.
[0239] U skladu sa prethodno navedenim predmetni pronalazak obezbeđuje u još jednom aspektu:
Anti-ActRIIB antitelo za upotrebu u lečenju kao što je gore definisano koje obuhvata zajedničku primenu, npr. istovremeno ili u nizu, terapeutski efikasne količine antagonista ActRIIB, npr. antitela pronalaska, i najmanje jedne druge supstance leka, gde je pomenuta druga supstanca leka IGF-1, IGF-2 ili varijante IGF-1 ili IGF-2, anti-miostatin antitelo, propeptid miostatina, mamac-protein miostatina koji se vezuje za ActRIIB ali ga ne aktivira, beta 2 agonist, agonist grelina, SARM, agonisti/mimetici GH ili folistatin.
[0240] Opis se dalje odnosi na terapeutsku kombinaciju, npr. kit, koji se sastoji od terapeutski efikasne količine a) ActRIIB antagonista, npr. antitela pronalaska, i b) najmanje jedne druge supstance odabrane od IGF-1, IGF-2 ili varijanti IGF-1 ili IGF-2, anti-miostatin antitela, propeptida miostatina, mamacproteina miostatina koji se vezuje za ActRIIB ali ga ne aktivira, beta 2 agonista, agonista grelina, SARM, agonista/mimetika GH ili folistatina, npr. kao što je prethodno navedeno. Kit može dodatno da sadrži uputstva za njegovu primenu.
[0241] Kada se antitela pronalaska primenjuju zajedno sa drugim aktivnim sredstvom, doze jedinjenja zajednički primenjene kombinacije će svakako varirati u zavisnosti od vrste dodatnog leka koji se koristi, od specifičnog leka koji se koristi, od stanja koje se leči i tako dalje.
[0242] U drugom primeru izvođenja, antitela pronalaska se primenjuju samo kod populacije pacijenata koja je odabrana među pacijentima koji pate od mišićne atrofije. U drugom primeru izvođenja, antitela pronalaska se primenjuju kod populacija pacijenata koji pate od atrofije skeletnih mišića. U drugom primeru izvođenja, antitela pronalaska se primenjuju samo kod populacije pacijenata koja je odabrana u grupi pacijenata koji odgovaraju na lečenje sa anti-ActRIIB. Biomarkeri koji identifikuju pacijente koji imaju povećanu verovatnoću odgovora na lečenje sa anti-ActRIIB mogu da budu bilo koji od sledećih bez ograničenja na njih: visoki nivoi serumskog miostatina, GDF-11 ili aktivina u poređenju sa kontrolnim pacijentom.
[0243] U jednom primeru izvođenja, antitela pronalaska mogu da se koriste za detekciju nivoa ActRIIB, ili nivoa ćelija koje sadrže ActRIIB. Ovo može da se postigne, na primer, dovođenjem u kontakt uzorka (kao što je in vitro uzorak) i kontrolnog uzorka sa anti-ActRIIB antitelom pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa između antitela i ActRIIB. Bilo koji kompleksi obrazovani između antitela i ActRIIB se detektuju i porede u uzorku i kontroli. Na primer, standardni postupci za detekciju, dobro poznati u stanju tehnike, kao što je ELISA i test protočne citometrije, mogu da se izvedu korišćenjem kompozicija pronalaska.
[0244] Prema tome, u jednom aspektu, opis se dodatno odnosi na postupke za detekciju prisustva ActRIIB (npr. humanog ActRIIB) u uzorku, ili merenje količine ActRIIB, koji obuhvataju dovođenje u kontakt uzorka, i kontrolnog uzorka, sa antitelom pronalaska, ili njegovim antigen-vezujućim regionom, koji se specifično vezuje za ActRIIB, pod uslovima koji omogućavaju obrazovanje kompleksa između antitela ili njegovog dela i ActRIIB. Obrazovanje kompleksa se zatim detektuje, pri čemu razlika u obrazovanju kompleksa između uzorka i kontrolnog uzorka ukazuje na prisustvo ActRIIB u uzorku.
[0245] Oblasti pronalaska pripadaju i kitovi koji se sastoje od kompozicije (npr. antitela, humanih antitela i bispecifičnih molekula) pronalaska i uputstava za upotrebu. Kit može dodatno da sadrži najmanje jedan dodatni reagens, ili jedno ili više dodatnih antitela pronalaska (npr. antitelo koje ima komplementarnu aktivnost koje se vezuje za epitop na ciljnom antigenu drugačiji nego prvo antitelo). Kitovi tipično uključuju oznaku koja označava namenjenu upotrebu sadržaja kita. Termin oznaka uključuje bilo koji pisani, ili snimljeni materijal isporučen na ili sa kitom, ili koji drugačije prati kit. Kit može dodatno da sadrži alate za dijagnostikovanje da li pacijent pripada grupi koja će odgovoriti na lečenje anti-ActRIIB antitelom, kao što je gore definisano. Takvi kitovi mogu da sadrže antitelo pronalaska u liofilizovanom obliku, razblaživač i uputstva za upotrebu.
[0246] Pronalazak koji je u potpunosti opisan, dodatno je ilustrovan sledećim primerima i patentnim zahtevima, koji su ilustrativni i nisu predviđeni da budu ograničavajući.
Opšte
[0247] Termin “koji sadrži” označava “koji uključuje” kao i “koji se sastoji” npr. kompozicija “koja sadrži” X može da se sastoji isključivo od X, ali može da uključuje nešto dodatno npr. X Y.
[0248] Termin “oko” u vezi sa brojnom vrednošću x označava, na primer, x+10%.
OPIS SLIKA
[0249]
Slika 1 prikazuje određivanje EC50 za MOR07079 pomoću FACS titracije na parentalnoj i HEK293T/17 ćelijskoj liniji transficiranoj sa ActRIIB.
Slika 2 prikazuje inhibiciju ekspresije luciferaze indukovane miostatinom u testu sa reporter genom sa višestrukim anti-ActRIIB Fabs na 2, 10 i 50µg/ml.
Slika 3 prikazuje određivanje IC50 za Fabs u testu sa reporter genom za luciferazu indukovanu miostatinom.
Slika 4 prikazuje vezivanje antitela za primarne humane ćelije skeletnog mišića.
Slika 5 prikazuje određivanje IC50 IgG u testu inhibicije diferencijacije skeletnih mišića indukovane miostatinom.
Slika 6 prikazuje ispitivanje na mišu: in vivo ispitivanje efikasnosti na naivnim životinjama – povećanje telesne težine i težine mišića nakon 6 nedelja lečenja sa MOR08159 ili MOR08213 pri 10mg/kg
Slika 7 prikazuje ispitivanje na mišu: doza-odgovor in vivo ispitivanje efikasnosti na naivnim životinjama – 6 nedelja lečenja sa MOR08213 pri 25, 5, 1 mg/kg, dozno-zavisno povećanje telesne težine i težine mišića.
Slika 8 prikazuje rezultate FACS koji pokazuju unakrsno blokiranje između MOR08213 (podebljane crtice) i MOR08159 (podebljano crno), u poređenjusa izotipskom kontrolom (crno) ili izotipskom kontrolom u prisustvu MOR08213 (crtice).
Slika 9 prikazuje pregled ostataka ActRIIB (SEQ ID NO:181) za koje se vezuje MOR08159, korišćenjem različitih tehnika za određivanje epitopa.
NAČINI IZVOĐENJA PRONALASKA
Funkcionalni ogledi
OGLED SA REPORTER GENOM (RGA)
Gajenje HEK293T/17 ćelijskih linija
[0250] Parentalne HEK293T/17 ćelije su održavane u DMEM koji sadrži 10% FBS, 2 mM L-glutamina, penicilin (50 IE/ml) i streptomicin (50 µg/ml). Ćelije su gajene u inkubatoru na 37°C i 5% CO2i supkultivisane svakih 3-4 dana. Ćelije su odvojene od podloge korišćenjem Accutase<TM>i zatim prebačene u novi flask koji sadrži svež medijum.
[0251] HEK293T/17 ćelije stabilno transficirane sa CAGA-12 luc su gajene kao što je gore opisano za parentalne HEK293T/17 ćelije, ali je medijum za rast ćelija obogaćen sa 4 mM L-glutamina i 3 µg/ml blasticidina pored FBS, penicilina i streptomicina.
Ogled sa reporter genom za luciferazu indukovanu miostatinom
[0252] Da bi se odredio kapacitet anti-ActRIIB antitela da inhibiraju prenos signala indukovan miostatinom, izveden je test za reporter gen koji koristi stabilnu reportersku ćelijsku liniju HEK293T/17 CAGA-12 luc. CAGA-12 luciferaza reporter konstrukt nosi gen za luciferazu nishodno od minimalnih promotorskih i višestrukih CAGA box regiona koji su specifični za fosforilisani Smad-2 i Smad-3. Dodatak prečišćenog miostatina (ali i GDF-11, aktivina ili TGFß) indukuje fosforilaciju Smad i time vezivanje za CAGA-12 reporter i vodi ekspresiji gena za luciferazu.
[0253] Pri konfluentnosti od 90% ćelija HEK293T/17 CAGA-12 luc, ćelije su odvojene od podloge kao što je opisano i razblažene u medijumu za kulturu do koncentracije od 2.5x10<5>ćelija/ml. Nakon toga, zasejano je 100 µl ćelija po bunarčiću u ploče sa 96 bunarčića sa ravnim dnom i inkubirano na 37°C i 5% CO2preko noći.
[0254] Sledećeg dana, antitela (Fab ili IgG) i rekombinantni humani ActRIIB/Fc, koji je služio kao pozitivna kontrola, razblaženi su u PBS do željenih koncentracija. U zasejane bunarčiće od prethodnog dana dodato je 20 µl rastvora antitela i ćelije su gajene 1 čas da se omogući vezivanje antitela. Konačno, 50 ng/ml miostatina je dodato u bunarčiće i ćelije su dalje gajene preko noći.
[0255] Sledećeg jutra, u svaki bunarčić je dodato120 µl Bright-Glo luciferaza reagensa (Promega). Posle 2 minuta inkubacije, luminiscencija je očitana na luminometru. Polovina maksimalne inhibitorne koncentracije (vrednosti IC50) je izračunata nakon celokupne titracije odgovarajućih antitela.
SPECIFIČNOST ELISA TESTOVA
[0256] Specifičnost anti-ActRIIB Fab antitela za humani ActRIIB i ukrštena reaktivnost sa humanim ActRIIA i mišjim ActRIIB je procenjena ELISA testom. Dodatno je određeno vezivanje za povezane receptore (protiv-ciljni molekuli: humani TGF-βRII/Fc (R&D systems), mišji TGF-βRI (ALK-5)/Fc (R&D systems), humani Aktivin RIB (ALK-4)/Fc (R&D systems)). Za ovo, dodato je 5 µg/ml (ako nije drugačije naznačeno) rekombinantnih proteina razblaženih u PBS u crnu ploču sa 96 bunarčića ravnog dna MaxiSorp<TM>i inkubirano preko noći na 4°C za oblaganje.
[0257] Sledećeg jutra, ploče su oprane sa TBST i blokirane sa MTBST. Nakon pranja ploče nekoliko puta, dodato je 5 µg/ml anti-ActRIIB Fab i inkubirano tokom 2.5 časa. Nakon toga Fab fragmenti vezani za antigen su detektovani inkubacijom sa alkalnom fosfatazom konjugovanom sa kozjim-antihumanim IgG specifičnim za Fab, nakon čega je dodat supstrat za fluorescenciju AttoPhos. Fluorescentna emisija na 535 nm je zabeležena sa ekscitacijom na 430 nm u čitaču ploča TECAN Spectrafluor.
ELISA test za interakciju vezivanja ActRIIB/Fc-miostatin
[0258] Da bi se procenilo da li inhibitorni Fab fragmenti deluju putem blokiranja mesta vezivanja miostatina na humanom ActRIIB, izveden je ELISA test za interakciju hActRIIB/Fc-miostatin. Za ovo, rekombinantni miostatin je razblažen do 5 µg/ml u PBS i obložen na crnu ploču sa 96 bunarčića ravnog dna Maxisorp. Sledećeg jutra bunarčići su blokirani sa MTBST. U međuvremenu 50 µg/ml anti-ActRIIB Fab fragmenata je pre-inkubirano sa 10 µg/ml ActRIIB/Fc u TBST tokom 1.5 časa na sobnoj temperaturi i konačno dodato u obložene i blokirane bunarčiće (1.5 čas na sobnoj temperaturi). Nakon pranja sa TBST puferom, detekcija vezanog ActRIIB/Fc je izvedena korišćenjem neobeleženog mišjeg anti-humanog Ig Fc-specifičnog antitela i POD-obeleženog antitela ovce protiv mišjeg IgG za detekciju. Nakon pranja bunarčića nekoliko puta sa TBST puferom, dodat je Quanta Blu™ Fluorogenic peroksidaza supstrat. Fluorescencija je očitana na čitaču GENiosPro<TM>(ekscitacija 320 nm, emisija 430 nm).
VEZIVANJE ZA ĆELIJE
Ćelije
[0259] Stabilne humane ActRIIA- i humane ActRIIB-transficirane HEK293T/17 ćelije, proizvedene korišćenjem HEK293T/17 ćelija (ATCC) transficiranih sa linearizovanim pEGFP (Clontech)-ActRIIB(ECD) ili -ActRIIA(ECD) i pPGK-puro (AddGene) korišćenjem FuGENE6 (Roche), su održavane u DMEM koji sadrži 10% FBS, 2 mM L-glutamina, penicilin (50 IE/ml), streptomicin (50 µg/ml) i puromicin (2 µg/ml). Ćelije su gajene u inkubatoru na 37°C i 5% CO2i supkultivisane svakih 3-4 dana. Ćelije su odvojene od podloge korišćenjem Accutase<TM>i zatim prenete u novi flask koji sadrži sveže medijume.
[0260] Humane ćelije skeletnog mišića (huSkMC) (Cambrex) su sakupljene pri konfluentnosti od oko 70 – 90%. Za ove ćelije, medijum za kulturu, medijum za rast (GM) koji se sastoji od bazalnog medijuma za skeletni mišić (skBM; Lonza) obogaćenog sa 20% FCS (Amimed), je izvučen aspiracijom, i ćelije su oprane sa HEPES-BSS i inkubirane sa tripsin /EDTA. Nakon što su ćelije odvojene od podloge, tripsin je neutralisan dodatkon neutrališućeg rastvora za tripsin. Ćelije su centrifugirane na 220 x g tokom 5 minuta i talog je resuspendovan u medijumu za rast skeletnog mišića. Ćelije su zatim korišćene za eksperimente ili zasejane za supkultivaciju pri ćelijskoj gustini od ~ 3500 ćelija/cm<2>. Ćelije su gajene u inkubatoru na 37°C i 5% CO2i supkultivisane svakih 5-6 dana.
FACS titracija na ćelijama koje eksprimiraju hActRIIB i hActRIIA
[0261] Polovina maksimalne efikasne koncentracije (EC50) anti-ActRIIB antitela određena je putem vezivanja za ćelijski hActRIIA i hActRIIB pomoću FACS metode.
[0262] Za ovo, serijska razblaženja anti-ActRIIB Fab ili IgG su inkubirana sa 1x10<4>hActRIIA-transficiranih, hActRIIB-transficiranih ili parentalnih HEK293T/17 ćelija po bunarčiću 1 čas na 4°C. Nakon nekoliko koraka pranja, Fab fragmenti ili molekuli IgG vezani za ćelije su detektovani sa fikoeritrin-konjugovanim kozjim sekundarnim antitelom protiv humanog IgG (H+L). Posle jednog časa inkubacije na 4°C, ćelije su ponovo oprane i resuspendovane u puferu za FACS i intenzitet fluorescencije ćelija je određen u instrumentu FACSArray<TM>.
Vezivanje za primarne humane ćelije skeletnog mišića
[0263] Anti-ActRIIB Fab ili IgG, kao i izotipska kontrola Fab ili IgG (10μg) su inkubirani sa 10<5>huSkMC u FACS puferu (PBS, 2% FCS, 1mM EDTA) po epruveti 1 čas na 4°C. Nakon koraka pranja, Fab fragmenti ili molekuli IgG vezani za ćelije detektovani su sa fikoeritrin-konjugovanim kozjim sekundarnim antitelom protiv humanog IgG (H+L) koje je bilo razblaženo 1:200 u puferu za FACS. Nakon jednog časa inkubacije na 4°C na šejkeru, ćelije su ponovo oprane i resuspendovane u puferu za FACS i intenzitet fluorescencije ćelija je određen u instrumentu FACSCaliber<TM>.
ODREĐIVANJE AFINITETA
Određivanje afiniteta odabranih anti-humanih ActRIIB Fab fragmenata korišćenjem rezonancije površinskog plazmona (Biacore)
[0264] Za direktnu imobilizaciju antigena korišćena je standardna hemijska rekcija kuplovanja amina preko EDC-NHS. Čipovi CM5 (Biacore, Sweden) su obloženi sa približno 6000 RU humanog ili mišjeg ActRIIB/Fc, ili približno 1500 RU humanog-ActRIIA/Fc (prema aktivnosti antigena) u 10 mM acetatnog pufera, pH 4.5. Za referentnu protočnu ćeliju, korišćena je odgovarajuća količina HSA. Regeneracija je urađena sa 5 µl 10mM glicin/HCl pufera pH 1.5.
[0265] Alternativno, antigeni nisu imobilisani direktno, već učvršćeni na čipu CM5, koji je modifikovan antitelom protiv humanog-Fc (Fc capture kit, GE Healthcare / Biacore). Na referentnom protoku ćelija, pričvršćujuće antitelo je imobilisano, ali antigen nije pričvršćen. Regeneracija je postignuta korišćenjem 2 injekcije od 5 µL 3M MgCl2.
[0266] Kinetička merenja su urađena u Dulbecco-vom PBS pri brzini protoka od 20 µl/min korišćenjem serijskog razblaženja uzoraka Fab. Koncentracije Fab su bile u opsegu od 15.6 do 500 nM. Vreme injektovanja za svaku koncentraciju bilo je 1 minut. Vreme disocijacije je podešeno na najmanje 2 minuta (ili više, prema određenom afinitetu). Injekcija blanka protočnog pufera je korišćena za dvostruku referencu. Svi senzorgrami su globalno prilagođeni krivoj korišćenjem BIA kompjuterskog programa za evaluaciju 3.2 (Biacore, Sweden).
OGLED ZA CK (kreatin kinaza)
[0267] Diferencijacija je inicirana 24 časa nakon zasejavanja ćelija promenom iz GM u medijum za diferencijaciju bez seruma koji se sastoji od bazalnog medijuma za skeletni mišić (skBM). Ćelije su diferencirale tokom 3 dana u odsustvu i prisustvu miostatina (R&D systems) ili drugih TGF-b proteina i ispitivanih antitela na datim koncentracijama. Ćelije su oprane sa PBS i zatim lizirane dodatkom reporter pufera za lizu (Promega) i skladištene do merenja na -80°C. CK aktivnost je merena korišćenjem CK (IFCC) reagensa (Thermo Electron). CK reagens je pripremljen prema uputstvima proizvođača. Ćelijski lizati su podešeni na sobnu temperaturu, CK reagens je dodat i apsorbancija je odmah očitavana na 340 nm tokom 20 min, sa intervalom čitanja od 1 minut. CK standardne krive su sveže pripremljene korišćenjem CK iz zečjeg mišića (Roche Diagnostics). Sadržaj proteina je određen korišćenjem kita BCA.
Životinjski modeli
[0268] Ženke CB17/ICR-Prkdc<scid>/Crl miševa stare devet nedelja (n=10 po grupi, Charles River, Germany) su nasumično odabrane po telesnoj težini i zatim tretirane intraperitonealno antitelima protiv humanog ActRIIB (MOR8159, MOR8213) ili IgG kontrolnim antitelom u dozi od 10 mg/kg (Ispitivanje 1; uporedno ispitivanje), ili sa MOR8213 u dozi od 25, 5, ili 1 mg/kg (Ispitivanje 2; ispitivanje doza-odgovor) na dan 0, 3, 7, 14, 21, 28 i 35 (jednom nedeljno sa danom 3). Telesne težine su određivane dva puta nedeljno. Šest nedelja (42 dana) nakon primene, miševi su eutanazirani sa CO2. Tibijalni mišić, gastroknemijus sa plantarisom, kvadriceps i pektoralni mišić su sakupljeni i izmerena im je težina.
PROTOKOL TRETMANA
[0269]
Kontrolno antitelo: anti-kokošiji lizozim-hIgG,
Koncentracija: 2 mg/mL (studija 1), 5 mg/mL (studija 2), primenjena zapremina: 5 mL/kg Vehikulum: 50 mM citrat, 140 mM NaCl ili PBS
anti-humana ActRIIB antitela: anti-ActRIIB-MOR8159 i MOR8213, hIgG,
Koncentracija: 2 mg/mL (studija 1), 5 mg/mL (studija 2), 1 mg/mL (studija 2), 0.2 mg/mL (studija 2), primenjena zapremina: 5 mL/kg
Vehikulum: 50 mM citrat, 140 mM NaCl
TRETMANSKE GRUPE:
[0270]
Studija 1; poređenje MOR08159 i MOR08213
1 IgG kontrola, i.p. (anti-kokošiji lizozim IgG), 10 mg/kg
2 anti-ActRIIB-MOR8159, i.p., 10 mg/kg
3 anti-ActRIIB-MOR8213, i.p, 10 mg/kg
Studija 2; doza-odgovor za MOR08213
1 IgG kontrola, i.p. (anti-kokošiji lizozim IgG), 25 mg/kg
2 anti-ActRIIB-MOR8213, i.p., 25 mg/kg
3 anti-ActRIIB-MOR8213, i.p., 5 mg/kg
4 anti-ActRIIB-MOR8213, i.p., 1 mg/kg
Uslovi održavanja
[0271] Životinje su smeštene u grupama od četiri do pet životinja na 25°C sa ciklusom svetlosti i tame od 12:12 časova. Hranjene su uobičajenom laboratorijskom hranom koja sadrži 18.2% proteina i 3.0% masti sa energijom od 15.8 MJ/kg (NAFAG 3890, Kliba). Hrana i voda su davane po želji. Eksperimenti na životinjama su izvedeni u skladu sa regulativama koje su na snazi u kantonu grada Bazela, Švajcarska.
Postupci
Statistička analiza
[0272] Rezultati su izraženi kao srednja vrednost /-SEM. Statistička analiza je sprovedena korišćenjem Dunnett-ovog testa višestrukog poređenja praćenog jednosmernom analizom varijanse. Ocenjivana je razlika među rezultatima dobijenim za tretmansku grupu (anti-ActRIIB antitela MOR8159 i MOR8213) u odnosu na kontrolnu grupu (kontrolno antitelo) i razlika je smatrana značajnom kada je vrednost verovatnoće bila < 0.05: *: P < 0.05, *: P < 0.01, NS: nema značajnosti u odnosu na IgG kontrolu. Statistička analiza je izvedena pomoću programa GraphPad Prism version 5.0 (GraphPad Software, Inc). Telesne težine su računate oduzimanjem telesne težine na dan 0, i težina mišića je normalizovana u odnosu na telesnu težinu na dan 0 (polazna telesna težina).
Selekcije prema afinitetu (paning), identifikacija i karakterizacija antitela
[0273] Terapeutska antitela protiv humanog ActRIIB proteina su dobijena selekcijom klonova koji imaju visoke afinitete vezivanja, korišćenjem kao izvora varijanti proteina antitela komercijalno dostupne biblioteke prikazane na fagu, biblioteke MorphoSys HuCAL GOLD®.
[0274] Biblioteka HuCAL GOLD® je biblioteka Fab fragmenata (Knappik et al., 2000) u kojoj je svih šest CDR regiona izmenjeno odgovarajućim postupcima, i koja koristi tehnologiju CysDisplay<TM>za vezivanje Fab za površinu faga (WO01/05950).
[0275] HuCAL GOLD<®>fagmid biblioteka (Rothe et al., 2008) je korišćena za selekciju specifične Fab fragmente antitela.
Selekcija ActRIIB-specifičnih antitela iz biblioteke pomoću paninga
[0276] Za selekciju antitela koja prepoznaju humani ActRIIB primenjeno je nekoliko strategija selekcije prema afinitetu.
[0277] Ukratko, biblioteka antitela na fagu HuCAL GOLD<®>je podeljena na nekoliko grupa koje sadrže različite master gene za VH.
[0278] Ovi pulovi su pojedinačno podvrgavani diferencijalnoj selekciji ćelija prema afinitetu, pri čemu su se ciklusi selekcije na ćelijama koje su prolazno transficirane humanim ActRIIB smenjivali sa ciklusima selekcije na rekombinantnom humanom ActRIIB/Fc proteinu.
i. Selekcija prema afinitetu na celim ćelijama
[0279] Za selekcije, čestice faga razblažene u PBS su pomešane sa jednakom zapreminom PBS/BSA i blokirane. Paralelno, takođe u prethodno blokiranim epruvetama, 1x10<7>ćelija koje eksprimiraju odgovarajući hActRIIB po grupi faga je resuspendovano u PBS/ 3% FCS/ 0.04% NaN3i blokirano tokom jednog časa na 4°C na šejkeru. Blokirane ćelije su centrifugirane, resuspendovane u preblokiranim česticama faga i inkubirane tri časa. U međuvremenu, pripremljeno je 1x10<7>ćelija sa isključenim hActRIIB po grupi faga.
[0280] Kompleksi fag-ćelija su oprani u PBS/BSA, nakon čega su oprani u PBS. Elucija čestica faga sa ćelija koje eksprimiraju hActRIIB je izvedena kiselom elucijom sa glicinskim puferom, pH 2.2. Nakon centrifugiranja, eluat je neutralisan dodatkom nepuferisanog Tris.
[0281] Nakon infekcije i naknadnog centrifugiranja, bakterijski talozi su resuspendovani u medijumu 2xYT, zasejani na LB/CAM/Glc pločama agara i inkubirani preko noći na 37°C. Sledećeg jutra, kolonije su odvojene sa ploča i fagi su izdvojeni i umnoženi.
ii. Selekcija prema afinitetu na čvrstoj fazi
[0282] Za selekciju prema afinitetu na čvrstoj fazi, rekombinantni humani ActRIIB/Fc je obložen na ploču MaxiSorp<TM>na 4°C preko noći. Nakon pranja sa PBS obloženi bunarčići su blokirani sa 5% MPBST.
[0283] Pre selekcija, HuCAL GOLD<®>fagi su pre-adsorbovani u puferu za blokiranje. Blokirani fagi su dodati obloženom antigenu i inkubirani 2 časa na sobnoj temperaturi. Nespecifični fagi su isprani sa PBST i PBS. Vezani fagi su eluirani dodatkom 20 mM DTT. Eluati su korišćeni za infekciju E. coli kulture TG-1. Nakon infekcije, bakterije su zasejane na ploče agara LB/CAM/Glc i inkubirane preko noći na 37°C. Sledećeg jutra, kolonije su odvojene sa ploča i fagi su izdvojeni i umnoženi.
[0284] Pokazalo se da najuspešniji pristup selekcije prema afinitetu predstavlja diferencijalni paning ćelija/protein sa prvim ciklusom selekcije na HEK293T/17 ćelijama transficiranim sa ActRIIB, praćenim ciklusom selekcije na rekombinantnom humanom ActRIIB/Fc i ponovo na transficiranim ćelijama.
[0285] Selektovani Fab fragmenti su ispitani na vezivanje za parentalne ili HEK293 ćelije transficirane sa rhActRIIB.
[0286] MOR07079 Fab se vezuje prvenstveno za ActRIIB-transficirane ćelije sa EC50 od 20nM (Slika 1). U ELISA testu za inhibiciju vezivanja miostatinom, MOR07079 Fab su pokazali inhibitornu aktivnost i blokirali vezivanje rhActRIIB/Fc za miostatin. Snažna inhibicija vezivanja miostatina u ELISA testu se odražavala u inhibiciji miostatina u testu sa reporter genom korišćenjem HEK293-CAGA12 za MOR07079. Korišćenjem ELISA testa za specifičnost, MOR07079 su pokazala da se specifično vezuju za humani i mišji ActRIIB ali ne i za nepovezane TGFβRII, ALK4 i ALK5 receptore. MOR7079 su takođe da se prvenstveno vezuju za ActRIIB u poređenju sa ActRIIA.
Proizvodnja HuCAL<®>imunoglobulina
i. Pretvaranje Fabs u IgG format
[0287] U cilju eksprimiranja pune dužine imunoglobulina (Ig), fragmenti varijabilnog domena teških (VH) i lakih lanaca (VL) su subklonirani iz pMORPH<®>X9_FH Fab ekspresionih vektora u pMORPH<®>2_h_Ig serije vektora series za humani IgG2. Odabrani klonovi su takođe prevedeni u tihi IgG1LALA format u kome su leucini na pozicijama 234 i 235 mutirani u alanine da bi se ukinulo vezivanje FcRγ i oslabile efektorske funkcije.
[0288] Korišćeni su odgovarajući restrikcioni enzimi (Knappik et al., 2000) za subkloniranje fragmenata VH i VL domena u pMORPH<®>2_h_IgG2, pMORPH<®>2_h_IgG1LALA, pMORPH<®>2_h_Igκ, i pMORPH<®>2_h_Igλ2.
[0289] Svi preparati DNK su podvrgnuti analizi sekvence pre transfekcije u HKB11 ćelije.
ii. Prolazna ekspresija i prečišćavanje humanog IgG
[0290] Eukariotske HKB11 ćelije su transficirane ekspresionim vektorom sa DNK za teški i laki lanac IgG. Supernatant ćelijske kulture je sakupljen 3. ili 7. dana posle transfekcije i podvrgnut standardnoj afinitetnoj hromatografiji na protein A. Ako nije drugačije naznačeno, izmena pufera je izvedena u 1 x Dulbecco-ov PBS (pH 7.2) i uzorci su sterilno filtrirani (0.2 µm).
Biblioteke za sazrevanje afiniteta CDR-L3 i CDR-H2
[0291] Da bi se povećao afinitet i biološka aktivnost selektovanih fragmenata antitela, CDR-L3 i CDR-H2 regioni su optimizovani paralelno pomoću kasetne mutageneze korišćenjem mutageneze usmerene trinukleotidom (Virnekas et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:5600-5607), dok su okvirni regioni održavanu konstantnim (Nagy et al., 2002, Nature Medicine, 8:801-807). Pre kloniranja biblioteka za sazrevanje afiniteta, svi parentalni Fab fragmenti su preneti sa ekspresionog vektora pMORPH<®>X9 na CysDisplay™ vektor za sazrevanje afiniteta pMORPH<®>25 preko XbaI/EcoRI restrikcionih mesta. Ovaj vektor obezbeđuje fagni protein pIII koji je N-terminalno fuzionisan za cisteinski ostatak kao i C-terminalni cistein fuzionisan za Fd fragment antitela i na taj način omogućava preko disulfidne veze prikaz odgovarajućih Fab fragmenata na površini faga.
[0292] Za dobijanje biblioteka CDR-H2, CDR-H2 region svakog parentalnog Fab je isečen i zamenjen pomoću kasete za sazrevanje afiniteta sa visoko izmenjenim CDR-H2.
[0293] Paralelno, CDR-L3 region parentalnih klonova je zamenjen izmenjenim CDR-L3 na kaseti za sazrevanje afiniteta.
[0294] Veličine biblioteka za sazrevanje afiniteta su u okviru od 4x10<5>do 1x10<8>klonova. Vektorski šum je u svim slučajevima bio ispod 1%. Kontrola kvaliteta izvedena sekvenciranjem pojedinačnih klonova je pokazala visok kvalitet svake biblioteke.
[0295] Za svaku biblioteka za sazrevanje afiniteta CDR-L3 i CDR-H2, pripremljen je fag koji prikazuje antitelo i titrovi faga su određeni tačkastom titracijom.
Strategije selekcije prema afinitetu za sazrevanje afiniteta
[0296] Fagi koji prikazuju antitelo iz sledećih biblioteka za sazrevanje afiniteta podvrgnuti su odvojenim selekcijama i ispitivanjima:
Lider 1: MOR07079 (sazrevanje L-CDR3)
Lider 1: MOR07079 (sazrevanje H-CDR2)
[0297] Selekcije za sazrevanje afiniteta korišćenjem odgovarajućih antitela su izvedene na biotinilizovanom hActRIIB/Fc i na huSkMC.
[0298] Bilo 2x10<10>ili 1x10<11>faga po subkodu, izdvojenih iz novonastalih biblioteka za sazrevanje afiniteta korišćeno je za prve cikluse selekcije.
[0299] Nekoliko diferencijalnih selekcija je izvedeno pri čemu su se ciklusi selekcije na rekombinantnom biotinilizovanom hActRIIB/Fc smenjivali sa ciklusima selekcije na huSkMC.
[0300] Za prvi i treći ciklus paninga u rastvoru biotinilizovani rekombinantni hActRIIB/Fc je učvršćen na Dyna-perle obložene streptavidinom. Primenjen je sledeći protokol: za svaku grupu faga, perle sa streptavidinom su oprane sa PBS i resuspendovane u puferu za blokiranje. Čestice faga razblažene u PBS su pomešane sa puferom za blokiranje koji sadrži 0.1% Tween20 i držane na rotirajućem disku. Predčišćenje čestica faga za uklanjanje faga vezanih za streptavidin ili perle je izvedeno dva puta po grupi faga, blokirane streptavidin perle su dodate blokiranim česticama faga i inkubirane na rotirajućem disku. Nakon razdvajanja perli pomoću magnetnog uređaja supernatant faga je prenet u svežu, prethodno blokiranu reakcionu epruvetu i pre-adsorpcija je ponovljena.
[0301] Nakon postupka za blokiranje, biotinilizovani hActRIIB/Fc antigen je dodat prethodno očišćenim i blokiranim česticama faga i inkubiran na rotirajućem disku. Kompleksi fag-antigen su uhvaćeni korišćenjem blokiranih perli sa streptavidinom, dodati grupama faga nastalih paningom i dodatno inkubirani. Čestice faga vezane za streptavidin perle su sakupljene. Perle su zatim oprane sa PBST i PBS. Elucija čestica faga sa streptavidin perli je izvedena dodatkom 20 mM DTT. Eluat je sakupljen i korišćen za infekciju E. coli kulture TG-1 gajene do postizanja OD600nmod 0.6-0.8.
[0302] Nakon infekcije i naknadnog centrifugiranja, bakterijski talozi su resuspendovani u medijumu 2xYT, zaselani na ploče sa agarom LB/CAM/Glc i inkubirani preko noći na 37°C. Sledećeg jutra, kolonije su odvojene od ploča i fagi su izdvojeni i umnoženi uglavnom kao što je opisano (Krebs et al., 2001) osim što su ćelije inficirane helper fagima rasle na 22°C preko noći u medijumu koji sadrži 0.25 mM IPTG. Treći ciklusi selekcije prema afinitetu u rastvoru na biotinilizovanom hActRIIB/Fc su izvedeni prema protokolu za prvi ciklus osim smanjene količine korišćenog antigena i povećane strogosti uslova pranja.
[0303] Za drugi ciklus selekcije prema afinitetu (na huSkMC koje eksprimiraju endogeni hActRIIB), čestice faga razblažene u PBS pomešane su sa jednakom zapreminom PBS/BSA i blokirane. Paralelno, za svaki subkod, 9x10<5>huSkMC je blokirano sa PBS/FCS/0.02% NaN3na 4°C. Blokirane ćelije su centrifugirane, resuspendovane zajedno sa prethodno blokiranim česticama faga i dodatno inkubirane.
[0304] Kompleksi fag-ćelija su oprani sa PBS/BSA, nakon čega su oprani sa PBS. Ćelije su centrifugirane na 410 x g tokom 2 minuta na 4°C. Kisela elucija čestica faga sa huSkMC koje eksprimiraju hActRIIB je izveden pomoću koraka inkubacije od 10 minuta sa glicinskim puferom, pH 2.2.
[0305] Nakon centrifugiranja, eluat je neutralisan dodatkom enpuferisanog Tris. Supernatant koji sadrži fage je korišćen za infekciju E. coli kulture TG-1 gajene do postizanja OD600nmod 0.6-0.8.
[0306] Nakon infekcije i centrifugiranja nakon toga, bakterijski talozi su resuspendovani u medijumu 2xYT, zaselani na ploče sa agarom LB/CAM/Glc i inkubirani preko noći na 37°C. Sledećeg jutra, kolonije su odvojene od ploča i fagi su izdvojeni i umnoženi uglavnom kao što je opisano (Krebs et al., 2001) osim što su ćelije inficirane helper fagima rasle na 22°C preko noći u medijumu koji sadrži 0.25 mM IPTG.
[0307] Pokazalo se da je najuspešniji pristup paninga koji je rezultovao proizvodom koji se veoma snažno vezuje diferencijalni paning sa prvim i trećim ciklusom izvedenim na biotinilizovanom ActRIIB/Fc i drugim ciklusom na huSkMC.
[0308] Posle sekvenciranja, Fab fragmenti su selektovani za ekspresiju i prečišćavanje, i oni koji su najviše obećavali su dodatno okarakterisani.
[0309] Većina anti-ActRIIB antitela je ispoljila vezivanje za HEK293T/17 ćelije transficirane sa hActRIIB sa vrednostima EC50 izraženim u nanomolarnim opsezima jednocifrenim do nižim dvocifrenim brojevima. Nekoliko Fab fragmenata je moglo da istisne miostatin sa ActRIIB/Fc u ELISA testu za inhibiciju vezivanja miostatinom, ali je među njima samo MOR08067 ispoljio potpunu inhibiciju miostatinom indukovane aktivnosti u ogledu sa reporter genom (slika 2).
Sumirani afiniteti većine obećavajućih Fab za humani i mišji ActRIIB/Fc su prikazani u tabeli u nastavku (tabela 1).
Tabela 1: Podaci o afinitetu anti-ActRIIB Fab-FH prema ActRIIB antigenima
[0310] Fab klon MOR08067 je ispoljio dobru inhibiciju u testu sa reporter genom (RGA) indukovanom miostatinom kao i vezivanje za HEK293 ćelije transficirane sa rhActRIIB. Određivanje afiniteta pomoću Biacore pokazalo je vrednosti KD prema humanom i mišjem ActRIIB/Fc ispod 100 pM. MOR08067 i drugi kandidati su odabrani da dalju optimizaciju pristupom unakrsnog kloniranja, dok je MOR08067, koje sadrži potencijalno N-vezano mesto glikolzilacije takođe podvrgnuto obradi pristupom deglikozilacije.
Optimizacija antitela dobijenih u prvoj fazi sazrevanja afiniteta
a) Deglikozilacija MOR08067
[0311] Prema analizi sekvence ovo antitelo je sadržalo potencijalno N-vezano mesto glikolzilacije u CDR-H2 teškog lanca. Ovo mesto je uklonjeno da bi se dobila MOR08156 i MOR08159 antitela. Karakterizacija ovih derivata antitela MOR08067 je opisana u nastavku teksta.
b) Unakrsno kloniranje optimizovanih Fab fragmenata
[0312] Za dodatno funkcionalno poboljšanje i uklanjanje potencijalnih N-vezanih mesta glikolzilacije u CDR-H2 regionima i/ili CDR-L3 regionima, nezavisno optimizovani CDR-H2 i CDR-L3 regioni iz pojedinačnih Fab regiona sa sazrelim afinitetom dobijenih u prvoj fazi sazrevanja afiniteta su kombinovani uz odvajanje familija. Potomstvo MOR07079 je podvrgnuto unakrsnom kloniranju. Približno 200 bakterijskih lizata je ispitano pomoću FACS metode za rangiranje afiniteta prema HEK293T/17/ActRIIB i klonovi Fab koji su najviše obećavali, MOR08144 i MOR08213 su eksprimirani, i prečišćeni.
c) Karakterizacija optimizovanih antitela
[0313] U sledećim odeljcima, deglikozilovano potomstvo MOR08067 (MOR08156, MOR08159) i dva unakrsna klona izvedena iz MOR08067 (MOR08144 i MOR08213) su detaljno opisani.
[0314] Sposobnost optimizovanih Fab fragmenata da inhibiraju miostatinski signalni put određena je testom sa reporter genom, sa svim vezujućim molekulima sposobnim da indukuju >95% inhibicije pri najvišoj koncentraciji (slika 3).
[0315] U eksperimentima za određivanje afiniteta korišćenjem Biacore, MOR08159 i MOR08213 su identifikovani kao veoma snažni vezujući molekuli i za humani i za mišji ActRIIB (tabela 2). Očigledno je da povećani afinitet sazrelih i optimizovanih Fab fragmenata odražava povećanu potentnost u testu sa reporter genom indukovanom miostatinom.
Tabela 2: Podaci o afinitetu anti-ActRIIB Fab fragmenata prema ActRIIB antigenima
IgG2 konverzija Fab fragmenata sa sazrelim afinitetom (1. sazrevanje)
[0316] Fab fragmenti koji najviše obećavaju dobijeni nakon prvog sazrevanja afiniteta selektovani su za IgG2 konveziju.
[0317] Ekspresija IgG2 je izvedena prolaznom transfekcija HKB11 ćelija i imunoglobulini pune dužine su prečišćeni iz supernatanta ćelijske kulture.
[0318] Nakom konverzije u IgG, svi kandidati su zadržali svoju sposobnost da dozno-zavisno inhibiraju aktivnost u testu sa reporter genom indukovanom miostatinom (tabela 3).
Tabela 3: određivanje IC50 anti-ActRIIB IgG antitela u testu sa reporter genom za luciferazu indukovanu miostatinom
[0319] Ispitana je sposobnost MOR08159 i MOR08213 da se vezuju za humane primarne mišićne mioblaste pomoću FACS, i opisano je specifično vezivanje za ove ćelije, u skladu sa niskom ekspresijom ActRIIB na ovim ćelijama (slika 4).
[0320] MOR08159 i MOR08213 su pokazali sposobnos da potpuno preokrenu miostatinom indukovanu inhibiciju diferencijacije primarnih skeletnih mioblasta (slika 5). Ova antitela su takođe povećala diferencijaciju iznad bazalnog nivoa u odsustvu egzogenog miostatina, zahvaljujući njihovoj sposobnosti da neutrališu endogeno proizvedene ActRIIB ligande.
Drugo sazrevanje afiniteta
[0321] Izbor kandidata za drugo sazrevanje afiniteta za dalje poboljšanje efikasnosti.
i. Konstruisanje biblioteka za sazrevanje afiniteta CDR-L3 i CDR-H2
[0322] Da bi se povećao i afinitet i biološka aktivnost odabranih fragmenata antitela (npr. MOR08067), regioni CDR-L1 i CDR-H2 su optimizovani kasetnom mutagenezom korišćenjem mutageneze usmerene trinukleotidom (Virnekas et al. [gore]), pri čemu su okvirni regioni održavani konstantnim (Nagy et al. [gore]). Pre kloniranja biblioteka za sazrevanje afiniteta, svi parentalni Fab fragmenti su preneti iz ekspresionog vektora pMORPH<®>X9 u CysDisplay™ vektor za sazrevanje afiniteta pMORPH<®>25 putem restrikcionih mesta XbaI/EcoRI.
[0323] Veličine biblioteka za sazrevanje afiniteta su dale uvek najmanje 1x10<7>nezavisnih klonova. Vektorski šum je u svim slučajevima bio ispod 1%. Kontrola kvaliteta izvedena sekvenciranjem pojedinačnih klonova je pokazala visok kvalitet svake biblioteke.
[0324] Za svaku biblioteka za sazrevanje afiniteta CDR-L1 i CDR-H2, pripremljen je fag koji prikazuje antitelo i titrovi faga su određeni tačkastom titracijom.
ii. Strategije selekcije prema afinitetu, rangiranje afiniteta i pretraživanje poboljšanih antitela
[0325] Diferencijalne selekcije prema afinitetu za drugi ciklus sazrevanja afiniteta uključivale su parentalne HEK293T/17 ćelije i huSkMC koje endogeno eksprimiraju humani ActRIIB na niskim nivoima. Dodatno, rekombinantni biotinilizovani hActRIIB/Fc antigen je bio uključen u sve strategije selekcije prema afinitetu.
[0326] Za rangiranje anti-ActRIIB Fab fragmenata, oko 2700 bakterijskih lizata (~ 88 klonova za svaki selektovani subkod) bilo je rangirano prema afinitetu na rekombinantnom biotinilizovanom hActRIIB/Fc antigenu i preparatima membranskih vezikula HEK293T/17 ćelija transficiranih sa hActRIIB u postupku zasnovanom na MSD. Pogoci sa visokim faktorom afiniteta su sekvencirani.
[0327] Dodatno, slučajno odabrani klonovi koji nisu predstavljali pogotke su procenjeni FACS metodom za rangiranje afiniteta. Za ovo, bakterijski lizati su pretraženi korišćenjem parentalnih HEK293T/17 ćelija i/ili HEK293T/17 ćelija transfekovanih sa hActRIIB. Fab fragmenti vezani za ćelije su detektovani sa sekundarnim antitelom fikoeritrinom-konjugovanim kozjim anti-humanim IgG (H+L). Kvantifikacija ekspresije Fab u lizatima je izvedena paralelno.
[0328] Sve strategije selekcije prema afinitetu su dale anti-ActRIIB specifična antitela. Potomstvo MOR08067 bi moglo da bude identifikovano nakon analize sekvence. Svi vezujući molekuli su imali sazrevanje afiniteta CDR-H2.
IgG2 konverzija i karakterizacija IgG2 (2. sazrevanje afiniteta)
[0329] Ponovo, Fab fragmenti koji najviše obećavaju dobijeni nakon prvog sazrevanja afiniteta selektovani su za IgG2 konveziju. Ekspresija IgG2 je izvedena prolaznom transfekcija HKB11 ćelija i imunoglobulini pune dužine su prečišćeni iz supernatanta ćelijske kulture.
[0330] Svi ispitani IgG fragmenti su bili sposobni da potpuno preokrenu inhibiciju diferencijacije primarnih skeletnih mioblasta indukovanu miostatinom (tabela 4).
Tabela 4: Određivanje IC50 anti-ActRIIB IgG fragmenata u testu za miostatinom indukovanu inhibiciju diferencijacije skeletnih mišića
[0331] Procenjivali smo sposobnost anti-ActRIIB antitela da neutrališu vezivanje miostatina kao i drugih liganda familije TGFβ za ActRIIB na primarnim humanim skeletnim mioblastima. U testu diferencijacije mioblasta, procenjivali smo potencijale različitih liganda da inhibiraju diferencijaciju u odsustvu ili prisustvu MOR08159 ili MOR08213.
Tabela 5: Određivanje IC50 i Emax inhibicije indukovane različitim ligandima u testu diferencijacije skeletnih mišića u prisustvu ili odsustvu MOR08159/MOR08213 (10μg/ml)
[0332] Miostatin i GDF-11 su sposobni da inhibiraju diferencijaciju humanih mioblasta sa sličnom efikasnošću i u sličnom stepenu. U prisustvu jedne koncentracije MOR08159 ili MOR08213, zavisnost doza-odgovor za miostatin i GDF-11 se pomerala paralelano. Aktivin A je takođe bio sposoban da inhibira diferencijaciju, međutim u prisustvu MOR08159 ili MOR08213, primetili smo pomeranje koje nije paralelno praćeno promenom Emaxi efikasnosti. Na odgovor BMP-2 nije uticalo prisustvo MOR08159 ili MOR08213, ukazujući na to da se on ne ostvaruje preko vezivanja ActRIIB.
Karakterizacija anti-ActRIIB antitela u in vivo studijama na miševima.
[0333] Sposobnost anti-ActRIIB antitela da indukuje hipertrofiju mišića procenjena je na SCID miševima kod kojih su primenjivani MOR08159 ili MOR08213, 10mg/kg i.p. nedeljno, tokom 6 nedelja (slika 6).
[0334] Oba antitela su bila sposobna da indukuju značajnu hipertrofiju svih ispitivanih mišića na kraju studije. Značajno povećanje ukupne telesne težine kod miševa tretiranih sa anti-ActRIIB antitelom detektovano je već posle 1 nedelje tretmana.
[0335] MOR08213 je bio sposoban da indukuje dozno-zavisnu značajnu hipertrofiju svih ispitivanih mišića pri dozama sa 5 i 25 mg/kg dok značajne promene nisu primećene pri dozi od 1mg/kg (slika 7).
Studije unakrsnog blokiranja
[0336] Humane HEK293T/17 ćelije stabilno transficirane sa ActRIIB održavane su u DMEM koji sadrži 10% FBS, 2 mM L-glutamina, penicilin (50 IE/ml), streptomicin (50 µg/ml) i puromicin (2 µg/ml). Ćelije su gajene u inkubatoru na 37°C i 5% CO2i supkultivisane svaka 3-4 dana. Ćelije su odvojene od podloge korišćenjem Accutase<TM>i zatim prenete u novi flask koji sadrži svež medijum.
[0337] Sposobnost anti-ActRIIB antitela da se vezuju za isti epitop humanog ActRIIB je procenjena pomoću FACS metode korišćenjem ćelija koje eksprimiraju hActRIIB.
[0338] Za ovo, anti-ActRIIB IgG je inkubirano sa 1x10<5>ćelija transficiranih sa hActRIIB po bunarčiću tokom 1 časa na 4°C. Nakon pranja, različiti biotinilizovani anti-ActRIIB IgG ili kontrolni biotinilizovani IgG su inkubirani u ekvimolarnim koncentracijama prema prvom anti-ActRIIB IgG tokom 1 časa na 4°C. Nakon pranja, biotinilizovani IgG vezani za ćeliju su detektovani sa streptavidin-APC (Biolegend). Nakon jednog časa inkubacije na 4°C, ćelije su ponovo oprane i resuspendovane u puferu za FACS i intenzitet fluorescencije ćelija je određen u instrumentu FACSArray<TM>.
[0339] Ispitana je sposobnost MOR08159 i MOR08213 da se zajednički vežu za humane ćelije transficirane sa ActRIIB pomoću FACS metode, i specifično vezivanje samog MOR08159 (podebljano crno) ili u prisustvu MOR08213 (podebljane crtice) je opisano u poređenju sa izotipskom kontrolom (crno) ili izotipskom kontrolom u prisustvu MOR08213 (crtice) (slika 8).
[0340] U prisustvu MOR08213, vezivanje MOR08159 je značajno smanjeno što ukazuje na to da se ova dva antitela ili vezuju za ista mesta ili za mesta koja mogu da imaju izvesni stepen preklapanja, ili da vezivanje MOR08213 za odvojeno, ali blisko smešteno mesto, može sterno da ometa vezivanje MOR08159.
Mapiranje epitopa
[0341] Nekoliko komplementarnih metoda je korišćeno za određivanje epitopa za koji se antitelo MOR08159 vezuje. U ovom primeru, numeracija ostataka se odnosi na aminokiselinsku sekvencu pune dužine ActRIIB (SEQ ID NO: 181).
Dot Blot
[0342] Izveden je dot blot test za epitop MOR08159. Nativni i denaturisani (redukovani i denaturisan toplotom) ActRIIB su naneti na nitroceluloznu membranu, ispitani sa MOR08159, i detektovani sa obeleženim anti-humanim antitelom. Samo nativni ActRIIB, ali ne i redukovani i toplotno-denaturisani ActRIIB je detektovan. Rezultati ukazuju na to da epitop predstavlja konformacioni epitop.
Mutacione studije
[0343] Biblioteka ekstracelularnog domena ActRIIB (ak 21 – 120) je napravljena pomoću PCR reakcije sklone greškama i varijante su eksprimirane u periplazmi E. coli. Vezivanje od oko 30 000 (male frakcije od teoretske veličine biblioteke) ovih varijanti za MOR08159 je ispitano pretraživanjem kolonija na filteru i “western” bojenjem. Varijante koje su pokazale samo slabo ili nikakvo vezivanje za MOR08159 dodatno su potvrđene pomoću ELISA testa. Nivo ekspresije (detektovan sa anti-Flag antitelom) i vezivanje varijanti ActRIIB za MOR08159 je upoređeno sa divljim tipom ActRIIB. Ako je ekspresija bila najmanje 75% od divljeg tipa i vezivanje za MOR08159 bilo manje od 25%, mutacija je procenjena kao uključena u vezivanje za MOR08159. Samo varijante koje imaju jednu tačkastu mutaciju, koja očigledno ne narušava strukturu (kao što bi bila npr. mutacija cisteina koji gradi S-S most) su razmatrane.
[0344] Većina mutacija koje sprečavaju vezivanje za MOR08159 su nađene u nizu od pozicije K75 do D81, što ukazuje na to da je ovaj region važan za vezivanje antitela. Nađeno je da mutacije na pozicijama W78, D80 i D81 značajno smanjuju vezivanje za MOR08159.
Nizovi cikličnih peptida
[0345] Kolekcija cikličnih peptida izvedenih iz antigena prikazana na peptidnim mikročipovima je inkubirana sa antitelima od interesa. Određivanje vezivanja peptid-antitelo je izvedeno pomoću RepliTope-analize u kojoj je peptidni mikročip inkubiran sa primarnim antitelom, a zatim sa fluorescentno obeleženim sekundarnim antitelom usmerenim protiv Fc-dela primarnog antitela. Nakon nekoliko koraka pranja, peptidni mikročipovi su osušeni korišćenjem centrifuge za mikročip i skenirani u sistemu za skeniranje mikročipova visoke rezolucije sa odogvarajućim podešavanjima talasnih dužina.
[0346] Mikročip se sastoji od tri podčipa, gde svaki prikazuje ciklične peptide izvedene iz ActRIIB (sa Cys ostatkom izmenjenim u Ser), koji su skenirani (peptidni sken formata 15/12). Kao kontrolni eksperiment, jedna inkubacija sa nepovezanim antitelom (ACE18543, izotipska kontrola) praćena inkubacijom sa fluorescentno obeleženim sekundarnim antitelom (Cy-5 obeleženi anti-humani IgG) je izvedena da bi se odredili lažno pozitivni signali. Dodatno, izvedena je inkubacija sa ciljnim antitelom, praćena inkubacijom sa fluorescentno obeleženim sekundarnim antitelom.
[0347] Pokazano je da antitelo MOR08159 (ACE19819) prepoznaje jedan epitop, koji je nađen u tri od ispitivanih peptida (br.18-20).
18 IELVKKGSWLDDFNS (SEQ ID NO: 183)
19 VKKGSWLDDFNSYDR (SEQ ID NO: 184)
20 GSWLDDFNSYDRQES (SEQ ID NO: 185)
[0348] Sekvenca koja je zajednička ovim peptidima za koju se, kako je ustanovljeno, vezuje MOR08159 je 76GCWLDDFNC84 (SEQ ID NO: 186).
[0349] Drugi region sa karakteristikama slabijeg vezivanja je takođe identifikovan korišćenjem ovog postupka. Ovaj drugi region ima sekvencu 49CEGEQDKRLHCYASW63 (SEQ ID NO: 187).
Kristalografija X-zraka
[0350] Eksprimirani su fragmenti humanog ActRIIB koji uključuju ak 20-120 i ak 24-117. Dodatno, Fab i Fv regioni MOR08159 su eksprimirani i prečišćeni (sve ekspresije su izvedene u E.coli). Korišćenjem ovih proteina, pripremljena su četiri proteinska kompleksa, prečišćena i kristalizovana (MOR08159Fab-ActRIIB 20-120, MOR08159Fab-ActRIIB 24-117, MOR08159Fv-ActRIIB 20-120, MOR08159Fv-ActRIIB 24-117).
[0351] Rendgenska strukturna analiza Fab fragmenta MOR08159 je razrešena do rezolucije od 1.78Å. Rendgenska strukturna analiza Fv kompleksa sa ActRIIB-LBD je razrešena do rezolucije od 3.35Å. Korišćenjem standardne granične vrednosti za udaljenost od 3.9Å za određivanje kontakta ostataka, potvrđeno je da je sekvenca 76GCWLDDFNC84 značajan region, sa preovlađujućim doprinosom vezivanju koji daje sekvenca 78WLDDFN83 (SEQ ID NO: 188). Dodatno, interakcija je nađena i sa peptidnim regionom 49CEGEQDKRLHCYASW63.
[0352] Rezultati različitih eksperimenata za mapiranje epitopa su sažeti na slici 9.
LISTA SEKVENCI

Claims (30)

Patentni zahtevi
1. Humano monoklonsko terapeutsko anti ActRIIB antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo, koje sadrži sekvencu polipeptida VH koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa bar jednom od SEQ ID NOs: 99-112 i sekvencu polipeptida VL koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa bar jednom od SEQ ID NOs: 85-98, naznačeno time što pomenuto antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo inhibira vezivanje miostatina za ActRIIB.
2. Antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što pomenuto antitelo, ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo, sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 9; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci SEQ ID NOs: 18-28; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 37; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 51; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 65; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od sekvenci SEQ ID NOs: 71-79.
3. Antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo, prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, koje sadrži:
(a) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 1; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 15; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 29; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 43; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 57; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 71,
(b) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 2; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 16; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 30; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 44; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 58; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 72,
(c) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 3; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 17; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 31; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 45; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 59; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 73,
(d) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 4; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 18; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 32; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 46; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 60; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 74,
(e) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 5; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 19; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 33; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 47; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 61; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 75,
(f) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 6; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 20; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 34; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 48; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 62; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 76,
(g) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 7; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 21; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 35; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 49; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 63; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 77,
(h) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 8; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 22; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 36; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 50; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 64; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 78,
(i) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 9; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 23; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 37; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 51; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 65; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 79,
(j) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 10; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 24; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 38; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 52; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 66; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 80,
(k) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 11; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 25; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 39; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 53; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 67; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 81,
(l) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 12; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 26; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 40; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 54; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 68; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 82,
(m) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 13; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 27; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 41; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 55; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 69; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 83, ili
(n) CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 14; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 28; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 42; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 56; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 70; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 84.
4. Antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što sadrži CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 9; CDR2 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 23; CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 37; CDR1 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 51; CDR2 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 65; i CDR3 varijabilnog regiona lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 79.
5. Antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što pomenuto antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu pune dužine teškog lanca koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa bar jednom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 146-150 i 156-160 i naznačeno time što pomenuto antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo sadrži aminokiselinsku sekvencu pune dužine lakog lanca koja ima najmanje 95% identičnosti sekvence sa bar jednom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs:141-145 i 151-155.
6. Humano monoklonsko terapeutsko anti ActRIIB antitelo koje sadrži:
(a) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 85 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 99;
(b) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 86 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 100;
(c) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 87 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 101;
(d) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 88 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 102;
(e) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 89 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 103;
(f) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 90 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 104;
(g) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 91 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 105;
(h) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 92 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 106;
(i) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 93 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 107;
(j) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 94 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 108;
(k) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 95 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 109;
(l) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 96 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 110;
(m) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 97 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 111; ili
(n) sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 98 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 112.
7. Humano monoklonsko terapeutsko anti ActRIIB antitelo prema patentnom zahtevu 6, naznačeno time što sadrži sekvencu varijabilnog lakog lanca SEQ ID NO: 93 i sekvencu varijabilnog teškog lanca SEQ ID NO: 107.
8. Humano monoklonsko terapeutsko anti ActRIIB antitelo naznačeno time što sadrži:
(a) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 146 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 141;
(b) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 147 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 142;
(c) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 148 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 143;
(d) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 149 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 144;
(e) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 150 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 145;
(f) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 156 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 151;
(g) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 157 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 152; (h) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 158 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 153;
(i) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 159 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 154; ili (j) sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 160 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 155.
9. Humano monoklonsko terapeutsko anti ActRIIB antitelo prema patentnom zahtevu 8, naznačeno time što sadrži sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 146 i sekvencu lakog lanca SEQ ID NO: 141;
10. Anti-ActRIIB antitelo prema bilo kom prethodnom zahtevu, naznačeno time što pomenuto antitelo predstavlja IgG1 izotip.
11. Anti-ActRIIB antitelo prema bilo kom prethodnom zahtevu, koje ima efektorsku funkciju izmenjenu putem mutacije Fc regiona.
12. Izolovana polinukleotidna sekvenca koja kodira antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom prethodnom zahtevu.
13. Izolovana polinukleotidna sekvenca prema patentnom zahtevu 12, naznačena time što sadrži jednu ili više od sekvenci SEQ ID NOs: 113-140 ili 161-180.
14. Vektor za kloniranje ili ekspresioni vektor koji sadrži jednu ili više izolovanih polinukleotidnih sekvenci prema patentnom zahtevu 12 ili patentnom zahtevu 13.
15. Vektor prema patentnom zahtevu 14, naznačen time što pomenuti vektor sadrži jednu ili više od sekvenci SEQ ID NOs: 113-140 ili 161-180, ili njihov fragment koji kodira bar jedan CDR region.
16. Izolovanu ćelju-domaćina koja sadrži jedan ili više vektora prema patentnom zahtevu 14 ili patentnom zahtevu 15.
17. Postupak za proizvodnju antitela ili funkcionalnog proteina koji sadrži njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, naznačen time što obuhvata gajenje ćelije-domaćina prema patentnom zahtevu 16 i izolovanje pomenutog antitela ili funkcionalnog proteina koji sadrži njegov antigen-vezujući deo.
18. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigenvezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11.
19. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 18, koja dodatno sadrži farmaceutski prihvatljiv razblaživač ili nosač.
20. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 18 ili 19, koja dalje sadrži jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava.
21. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 20, naznačena time što je pomenuto dodatno aktivno sredstavo odabrano od IGF-1, IGF-2 ili varijanti IGF-1 ili IGF-2, anti-miostatin antitela, propeptida miostatina, mamac-proteina miostatina koji se vezuje za ActRIIB ali ga ne aktivira, beta 2 agonista, agonista grelina, SARM, agonista/mimetika GH ili folistatina.
22. Antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 18-21 za upotrebu kao lek.
23. Antitelo ili funkcionalni protein koji sadrži njegov antigen-vezujući deo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 18-21 za upotrebu u lečenju mišićno-skeletne bolesti ili poremećaja; akutne i/ili hronične bubrežne bolesti ili insuficijencije; fibroze ili ciroze jetre; kancera kao što je kancer dojke; Parkinsonove bolesti; stanja povezanih sa umiranjem neurona, kao što je ALS, atrofija mozga, ili demencije i anemije; fibroze jetre, bubrega i pluća; i kancera, kao što su na primer, ali bez ograničenja, rabdomiosarkomi, kanceri koji indukuju gubitak kosti, hepatocelularni karcinomi, gastrointestinalni kanceri.
24. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 23, naznačeno time što pomenuta mišićno-skeletna bolest ili poremećaj predstavlja mišićnu atrofiju, na primer izazvanu miopatijom, kao što je miotonija, kongentialna miopatija, uključujući nemalinsku miopatiju, miopatiju sa brojnim malim jezgrima i miotubularnu (centronuklearnu) miopatiju, mitohondrijalnu miopatiju, familijarnu periodičnu paralizu, inflamatornu miopatiju, metaboličku miopatiju, kao što je ona izazvana bolešću skladištenja glikogena ili lipida, dermatomiozitis, polimiozitis, miozitis sa inkluzionim telima, osificirajući miozitis, rabdomiolizu i mioglobinuriju; distrofiju, kao što je Dišenova, Bekerova, miotona, facioskapulohumeralna, Emeri-Drajfusova, okulofaringealna, skapulohumeralna, mišićna distrofija pojasnog oblika, Fukujama, kongenitalna mišićna distrofija, ili nasledna distalna miopatija; osteoporoza; prelom kosti; nizak rast; patuljasti rast; produženo mirovanje; voljna neaktivnost; ili nevoljna neaktivnost.
25. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 24, naznačeno time što je pacijent koji se leči bio prethodno lečen sa IGF-1, IGF-2 ili varijantama IGF-1 ili IGF-2, anti-miostatin antitelom, propeptidom miostatina, mamac-proteinom miostatina koji se vezuje za ActRIIB ali ga ne aktivira, beta 2 agonistom, agonistom grelina, SARM, agonistima/mimeticima GH ili folistatinom.
26. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 24, naznačeno time što je pacijent koji se leči bio prethodno otporan na lečenje sa IGF-1, IGF-2 ili varijantama IGF-1 ili IGF-2, anti-miostatin antitelom, propeptidom miostatina, mamac-proteinom miostatina koji se vezuje za ActRIIB ali ga ne aktivira, beta 2 agonistom, agonistom grelina, SARM, agonistima/mimeticima GH ili folistatinom.
27. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 24, naznačeno time što je pacijent koji se leči starijeg doba, proveo je vreme u bestežinskom stanju ili je pretrpeo period neaktivnosti.
28. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 24, naznačeno time što pacijent koji se leči ima prelom ekstremiteta (tj. noge ili ruke) ili zgloba (tj. kolena ili kuka).
29. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 24, naznačeno time što je pacijent bio podvrgnut ili će biti podvrgnut, operativnoj zameni kuka ili kolena.
30. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 kodirano sa pBW522 ili pBW524, deponovano pod depozitnim brojevima DSM22873 i DSM22874, redom.
RS20171263A 2009-04-27 2010-04-23 Kompozicije i postupci za povećanje rasta mišića RS56661B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17300409P 2009-04-27 2009-04-27
US30613710P 2010-02-19 2010-02-19
EP10714332.3A EP2424895B1 (en) 2009-04-27 2010-04-23 Compositions and methods for increasing muscle growth
PCT/EP2010/055458 WO2010125003A1 (en) 2009-04-27 2010-04-23 Compositions and methods for increasing muscle growth

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS56661B1 true RS56661B1 (sr) 2018-03-30

Family

ID=42306628

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20171263A RS56661B1 (sr) 2009-04-27 2010-04-23 Kompozicije i postupci za povećanje rasta mišića

Country Status (41)

Country Link
US (6) US8388968B2 (sr)
EP (2) EP3275900A1 (sr)
JP (3) JP5766179B2 (sr)
KR (1) KR101836501B1 (sr)
CN (2) CN104725512A (sr)
AR (1) AR076402A1 (sr)
AU (1) AU2010243697B2 (sr)
BR (1) BRPI1014522B8 (sr)
CA (2) CA2993053A1 (sr)
CL (1) CL2011002660A1 (sr)
CO (1) CO6460759A2 (sr)
CR (1) CR20110487A (sr)
CU (1) CU23945B1 (sr)
CY (1) CY1119664T1 (sr)
DK (1) DK2424895T3 (sr)
EA (2) EA201650137A1 (sr)
EC (1) ECSP11011484A (sr)
ES (1) ES2655877T3 (sr)
HN (1) HN2011002817A (sr)
HR (1) HRP20171870T1 (sr)
HU (1) HUE035240T2 (sr)
IL (1) IL215168A0 (sr)
JO (1) JO3313B1 (sr)
LT (1) LT2424895T (sr)
MA (1) MA33279B1 (sr)
MX (1) MX2011011352A (sr)
MY (1) MY153078A (sr)
NO (1) NO2424895T3 (sr)
NZ (1) NZ595235A (sr)
PE (1) PE20120532A1 (sr)
PL (1) PL2424895T3 (sr)
PT (1) PT2424895T (sr)
RS (1) RS56661B1 (sr)
SG (1) SG174273A1 (sr)
SI (1) SI2424895T1 (sr)
SV (1) SV2011004043A (sr)
TN (1) TN2011000463A1 (sr)
TW (2) TWI528974B (sr)
UY (1) UY32583A (sr)
WO (1) WO2010125003A1 (sr)
ZA (1) ZA201106538B (sr)

Families Citing this family (102)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1771470B1 (en) * 2004-07-23 2013-06-26 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
AU2006213686A1 (en) 2005-02-09 2006-08-17 Avi Bio Pharma, Inc. Antisense composition and method for treating muscle atrophy
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
KR20190006086A (ko) 2005-11-23 2019-01-16 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 골 성장을 촉진하기 위한 이들의 용도
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
EP2111229B1 (en) 2007-02-01 2013-04-10 Acceleron Pharma, Inc. Pharmaceutical compositions comprising Activin-ActRIIA antagonists for use in preventing or treating breast cancer metastasis or breast cancer related bone loss
TWI782836B (zh) 2007-02-02 2022-11-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
ES2756725T3 (es) * 2007-02-09 2020-04-27 Acceleron Pharma Inc Composiciones farmacéuticas que comprenden antagonistas de Activina-ActRIIA
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
EP3243524A1 (en) 2007-09-18 2017-11-15 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for decreasing or inhibiting fsh secretion
AU2009262970A1 (en) * 2008-06-26 2009-12-30 Acceleron Pharma Inc. Methods for dosing an activin-ActRIIa antagonist and monitoring of treated patients
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
SMT202300222T1 (it) 2008-08-14 2023-09-06 Acceleron Pharma Inc Trappole di gdf
SG10201703067QA (en) 2008-11-26 2017-05-30 Amgen Inc Variants Of Activin IIB Receptor Polypeptides And Uses Thereof
US8138142B2 (en) * 2009-01-13 2012-03-20 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin in a patient in need thereof
JP5766179B2 (ja) * 2009-04-27 2015-08-19 ノバルティス アーゲー 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法
BRPI1010587A2 (pt) * 2009-06-08 2019-04-09 Acceleron Pharma Inc. métodos para aumentar adipócitos termogênicos
EP2440577A4 (en) 2009-06-12 2013-01-23 Acceleron Pharma Inc SHORTEN ACTRIIB FC FUSION PROTEINS
BR112012005225B8 (pt) * 2009-09-09 2023-01-10 Acceleron Pharma Inc Uso de uma proteína de fusão actriib-fc para o tratamento de um transtorno relacionado ao osso ou associado à perda de músculo por crescimento muscular insuficiente
EP3818988A1 (en) * 2009-11-03 2021-05-12 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
JP6267425B2 (ja) 2009-11-17 2018-01-24 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 筋ジストロフィー治療のためのユートロフィン誘導に関するａｃｔｒｉｉｂタンパク質およびその改変体およびその使用
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RU2013120302A (ru) 2010-10-01 2014-11-20 Модерна Терапьютикс, Инк. Сконструированные нуклеиновые кислоты и способы их применения
CN103298832A (zh) 2010-11-08 2013-09-11 阿塞勒隆制药公司 Actriia结合剂及其用途
EP2691101A2 (en) 2011-03-31 2014-02-05 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
HUE040276T2 (hu) 2011-07-01 2019-02-28 Novartis Ag Eljárás metabolikus rendellenességek kezelésére
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
RU2648950C2 (ru) 2011-10-03 2018-04-02 Модерна Терапьютикс, Инк. Модифицированные нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты и их применение
US20130085139A1 (en) 2011-10-04 2013-04-04 Royal Holloway And Bedford New College Oligomers
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
WO2013063536A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Actriib binding agents and uses thereof
AU2012339722B2 (en) 2011-11-14 2017-09-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing muscle mass and muscle strength by specifically antagonizing GDF8 and/or Activin A
CN104114572A (zh) 2011-12-16 2014-10-22 现代治疗公司 经修饰的核苷、核苷酸和核酸组合物
US10039813B2 (en) 2012-02-07 2018-08-07 Massachusetts Institute Of Technology Use of antagonists of ghrelin or ghrelin receptor to prevent or treat stress-sensitive psychiatric illness
AU2013243948A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins associated with human disease
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
JP2015525230A (ja) 2012-06-11 2015-09-03 アムジエン・インコーポレーテツド デュアル受容体アンタゴニスト性抗原結合タンパク質およびその使用
WO2014030683A1 (ja) * 2012-08-21 2014-02-27 国立大学法人九州大学 貧血患者の貧血の要因を検出するためのバイオマーカー
CN104968801B (zh) * 2012-10-24 2021-06-15 细胞基因公司 用于治疗贫血症的生物标志物
NZ707477A (en) 2012-11-02 2019-09-27 Celgene Corp Activin-actrii antagonists and uses for treating bone and other disorders
WO2014081507A1 (en) 2012-11-26 2014-05-30 Moderna Therapeutics, Inc. Terminally modified rna
JP6499080B2 (ja) 2012-12-18 2019-04-10 ノバルティス アーゲー 安定化されたインスリン様成長因子ポリペプチド
SG10201706148WA (en) 2013-02-01 2017-08-30 Santa Maria Biotherapeutics Inc Administration of an anti-activin-a compound to a subject
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2014144231A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Massachusetts Institute Of Technology Use of antagonists of growth hormone or growth hormone receptor to prevent or treat stress-sensitive psychiatric illness
WO2014172448A2 (en) * 2013-04-17 2014-10-23 Anaptysbio, Inc. Antibodies directed against activin receptor type ii (actrii)
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
KR20160042987A (ko) * 2013-08-14 2016-04-20 노파르티스 아게 산발성 봉입체 근염을 치료하는 방법
EP3756661A1 (en) 2013-09-09 2020-12-30 vTv Therapeutics LLC Use of a ppar-delta agonist for treating muscle atrophy
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
US20160271265A1 (en) 2013-10-02 2016-09-22 Novartis Ag Insulin-like growth factor mimetics for use in therapy
JP2016538829A (ja) 2013-10-03 2016-12-15 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 低密度リポタンパク質受容体をコードするポリヌクレオチド
UY35874A (es) 2013-12-12 2015-07-31 Novartis Ag Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas
EP3094751A4 (en) * 2014-01-14 2017-06-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin inhibitor response prediction and uses for treatment
US20170248609A1 (en) 2014-01-27 2017-08-31 Novartis Ag Biomarkers predictive of muscle atrophy, method and use
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
WO2015192111A1 (en) 2014-06-13 2015-12-17 Acceleron Pharma, Inc. Methods and compositions for treating ulcers
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
HK1243940A1 (zh) 2014-11-06 2018-07-27 Scholar Rock, Inc. 抗原肌肉生长抑制素/潜在肌肉生长抑制素的抗体及其用途
WO2016090035A2 (en) * 2014-12-02 2016-06-09 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Modulators of activin and methods for modulating immune responses and t follicular helper cells
JP2018501307A (ja) 2014-12-03 2018-01-18 セルジーン コーポレイション アクチビン−ＡｃｔＲＩＩアンタゴニスト及び貧血を治療するための使用
MX2017007519A (es) 2014-12-08 2017-08-22 Novartis Ag Antagonistas de miostatina o activina para el tratamiento de sarcopenia.
WO2016138099A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 Massachusetts Institute Of Technology Use of ghrelin or functional ghrelin receptor agonists to prevent and treat stress-sensitive psychiatric illness
MA41795A (fr) 2015-03-18 2018-01-23 Sarepta Therapeutics Inc Exclusion d'un exon induite par des composés antisens dans la myostatine
WO2016168613A1 (en) 2015-04-15 2016-10-20 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of increasing strength and functionality with gdf8 inhibitors
PT3286206T (pt) 2015-04-22 2021-04-01 Biogen Ma Inc Novas proteínas híbridas bloqueadoras de ligando actriib para tratar doenças de desgaste muscular
LT3350220T (lt) 2015-09-15 2021-09-27 Scholar Rock, Inc. Anti pro/latentinio miostatino antikūnai ir jų panaudojimas
EP3858993A1 (en) 2015-10-09 2021-08-04 Sarepta Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating duchenne muscular dystrophy and related disorders
IL258574B2 (en) 2015-11-11 2025-01-01 Novartis Ag Uses of myostatin antagonists, combinations containing them and their uses
CN115814077A (zh) 2016-01-08 2023-03-21 供石公司 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法
JP2019511911A (ja) 2016-02-17 2019-05-09 ノバルティス アーゲー Ｔｇｆベータ２抗体
JP6987072B2 (ja) * 2016-03-10 2021-12-22 アクセレロン ファーマ インコーポレーテッド アクチビン２型受容体結合タンパク質及びその使用
WO2017177013A1 (en) 2016-04-06 2017-10-12 Acceleron Pharma Inc. Alk7 antagonists and uses thereof
WO2017189724A1 (en) * 2016-04-27 2017-11-02 Novartis Ag Antibodies against growth differentiation factor 15 and uses thereof
AU2017283546C1 (en) 2016-06-13 2020-11-19 Scholar Rock, Inc. Use of myostatin inhibitors and combination therapies
RU2019101226A (ru) 2016-06-22 2020-07-22 Новартис Аг Ингибиторы wnt для применения при лечении фиброза
JP2019529509A (ja) * 2016-10-05 2019-10-17 アクセレロン ファーマ インコーポレーテッド 腎臓疾患を治療するための組成物および方法
JOP20190085A1 (ar) 2016-10-20 2019-04-17 Biogen Ma Inc طرق علاج الضمور العضلي ومرض العظام باستخدام بروتينات احتجاز مركب ترابطي actriib هجين حديثة
GB201620119D0 (en) 2016-11-29 2017-01-11 Pharmafox Therapeutics Ag Compounds
JOP20190152A1 (ar) 2016-12-21 2019-06-20 Novartis Ag مضادات الميوستاتين، الآكتيفين أو مستقبلات الآكتيفين للاستخدام في علاج السمنة والحالات ذات الصلة
ES2944357T3 (es) 2017-01-06 2023-06-20 Scholar Rock Inc Tratamiento de enfermedades metabólicas inhibiendo la activación de miostatina
EP4707403A2 (en) 2017-03-10 2026-03-11 UCL Business Ltd Method relating to myostatin pathway inhibition
FI3600415T3 (fi) * 2017-03-24 2025-12-05 Novartis Ag Aktiviinireseptorin tyypin ii reseptorin vastainen vasta-aine käytettäväksi sydämen vajaatoiminnan hoidossa
EP3645564A1 (en) * 2017-06-28 2020-05-06 Novartis AG Methods for preventing and treating urinary incontinence
CN111787981B (zh) 2018-03-01 2025-12-30 瑞泽恩制药公司 增加肌肉量和减少脂肪量的方法
AU2020284038A1 (en) * 2019-05-30 2021-12-02 Acceleron Pharma Inc. ActRII-binding proteins and uses thereof
JP7663559B2 (ja) 2019-09-03 2025-04-16 ノバルティス アーゲー Ａｃｔｒｉｉ受容体拮抗薬を含む肝疾患または肝臓障害の治療
IL300362A (en) 2020-08-20 2023-04-01 Regeneron Pharma Methods to prevent and treat poor cardiac function and covid-19 with activin A antagonists
MX2023008372A (es) * 2021-01-13 2023-07-26 Astellas Pharma Inc Anticuerpo multiespecifico que se une a actriia, actriib y fn14.
JP2024532619A (ja) 2021-08-27 2024-09-05 バーサニス バイオ、インコーポレイテッド 併用療法
WO2023147309A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Reneo Pharmaceuticals, Inc. Use of ppar-delta agonists in the treatment of disease
WO2024014989A1 (ru) * 2022-07-14 2024-01-18 Общество с ограниченной ответственностью "БИОМЕД-РЕСУРС" Рекомбинантный белок gbd-actriib для увеличения мышечной массы сельскохозяйственных животных и птицы
TW202417505A (zh) 2022-08-26 2024-05-01 美商維紗妮絲生物公司 Actrii抗體固定單位劑量治療
IL321628A (en) 2022-12-22 2025-08-01 Scholar Rock Inc Selective and potent inhibitory antibodies for myostatin activation
AU2024317572A1 (en) 2023-07-31 2026-03-12 Sixpeaks Bio Ag Antibody conjugates and fusion proteins
WO2025068454A1 (en) 2023-09-28 2025-04-03 Sixpeaks Bio Ag Antibodies targeting actriia and actriib
WO2025183966A1 (en) 2024-02-28 2025-09-04 Versanis Bio, Inc. Actrii antibodies with extended half life
WO2025245160A1 (en) 2024-05-21 2025-11-27 Scholar Rock, Inc. Myostatin-selective inhibitors for treating metabolic disorders

Family Cites Families (125)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US5179017A (en) 1980-02-25 1993-01-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4634665A (en) 1980-02-25 1987-01-06 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4475196A (en) 1981-03-06 1984-10-02 Zor Clair G Instrument for locating faults in aircraft passenger reading light and attendant call control system
US4447233A (en) 1981-04-10 1984-05-08 Parker-Hannifin Corporation Medication infusion pump
US4439196A (en) 1982-03-18 1984-03-27 Merck & Co., Inc. Osmotic drug delivery system
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4447224A (en) 1982-09-20 1984-05-08 Infusaid Corporation Variable flow implantable infusion apparatus
US4487603A (en) 1982-11-26 1984-12-11 Cordis Corporation Implantable microinfusion pump system
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4486194A (en) 1983-06-08 1984-12-04 James Ferrara Therapeutic device for administering medicaments through the skin
EP0154316B1 (en) 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
US4596556A (en) 1985-03-25 1986-06-24 Bioject, Inc. Hypodermic injection apparatus
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4881175A (en) 1986-09-02 1989-11-14 Genex Corporation Computer based system and method for determining and displaying possible chemical structures for converting double- or multiple-chain polypeptides to single-chain polypeptides
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5013653A (en) 1987-03-20 1991-05-07 Creative Biomolecules, Inc. Product and process for introduction of a hinge region into a fusion protein to facilitate cleavage
US5091513A (en) 1987-05-21 1992-02-25 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
ATE243754T1 (de) 1987-05-21 2003-07-15 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US5132405A (en) 1987-05-21 1992-07-21 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic antibody binding sites
US4941880A (en) 1987-06-19 1990-07-17 Bioject, Inc. Pre-filled ampule and non-invasive hypodermic injection device assembly
US4790824A (en) 1987-06-19 1988-12-13 Bioject, Inc. Non-invasive hypodermic injection device
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5677425A (en) 1987-09-04 1997-10-14 Celltech Therapeutics Limited Recombinant antibody
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
US5476996A (en) 1988-06-14 1995-12-19 Lidak Pharmaceuticals Human immune system in non-human animal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0401384B1 (en) 1988-12-22 1996-03-13 Kirin-Amgen, Inc. Chemically modified granulocyte colony stimulating factor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US5064413A (en) 1989-11-09 1991-11-12 Bioject, Inc. Needleless hypodermic injection device
US5312335A (en) 1989-11-09 1994-05-17 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5383851A (en) 1992-07-24 1995-01-24 Bioject Inc. Needleless hypodermic injection device
AU701578B2 (en) 1992-08-21 1999-02-04 Vrije Universiteit Brussel Immunoglobulins devoid of light chains
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5444047A (en) * 1994-06-16 1995-08-22 Dipasquale; Gene Treatment of arthritic and post-surgical orthopedic conditions with Insulin-like Growth Factor-I
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CN1099839C (zh) * 1996-05-20 2003-01-29 诺沃奇梅兹有限公司 一种获得蛋白质水解物的方法
EP0938571B8 (en) 1996-10-28 2008-07-02 University of Lausanne Method for the oligomerisation of peptides
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
WO1998052976A1 (en) 1997-05-21 1998-11-26 Biovation Limited Method for the production of non-immunogenic proteins
US6696260B1 (en) * 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6891082B2 (en) * 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
AU8666398A (en) 1997-08-01 1999-02-22 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2434961T5 (es) 1998-04-20 2018-01-18 Roche Glycart Ag Ingeniería de glicosilación de anticuerpos para mejorar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo
US6818418B1 (en) 1998-12-10 2004-11-16 Compound Therapeutics, Inc. Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US6682736B1 (en) * 1998-12-23 2004-01-27 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to CTLA-4
HU230769B1 (hu) 1999-01-15 2018-03-28 Genentech Inc. Módosított effektor-funkciójú polipeptid-változatok
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
DE19932688B4 (de) 1999-07-13 2009-10-08 Scil Proteins Gmbh Design von Beta-Faltblatt-Proteinen des gamma-II-kristallins antikörperähnlichen
ES2327382T3 (es) 1999-07-20 2009-10-29 Morphosys Ag Metodos para presentar (poli)peptidos/proteinas en particulas de bacteriofagos a traves de enlaces disulfuro.
IL148079A0 (en) 1999-08-24 2002-09-12 Medarex Inc Human ctla-4 antibodies and compositions containing the same
US7943129B2 (en) 2000-05-26 2011-05-17 National Research Council Of Canada Single-domain brain-targeting antibody fragments derived from llama antibodies
EP2322644A1 (en) 2000-06-28 2011-05-18 GlycoFi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US7060802B1 (en) * 2000-09-18 2006-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tumor-associated marker
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
CN1487996B (zh) 2000-11-30 2010-06-16 米德列斯公司 用于生产人类抗体的转基因转染色体啮齿动物
BRPI0116728B1 (pt) * 2001-01-05 2018-10-30 Pfizer Inc. anticorpos para receptor de fator de crescimento i semelhante à insulina
US20040175756A1 (en) 2001-04-26 2004-09-09 Avidia Research Institute Methods for using combinatorial libraries of monomer domains
US20050053973A1 (en) 2001-04-26 2005-03-10 Avidia Research Institute Novel proteins with targeted binding
US20050048512A1 (en) 2001-04-26 2005-03-03 Avidia Research Institute Combinatorial libraries of monomer domains
EP1421203A4 (en) 2001-05-17 2005-06-01 Diversa Corp NEW ANTIGEN-BINDING MOLECULES FOR THERAPEUTIC, DIAGNOSTIC, PROPHYLACTIC, ENZYMATIC, INDUSTRIAL AND AGRICULTURAL APPLICATIONS AND METHOD FOR THE PRODUCTION AND SCREENING THEREOF
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
AU2003217912A1 (en) 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
JP2005536992A (ja) * 2002-06-28 2005-12-08 セントカー・インコーポレーテツド 哺乳動物のｅｐｏ模倣ｃｈ１欠失ミメティボディ、組成物、方法および使用
EP2311867A1 (en) 2002-10-29 2011-04-20 Anaphore, Inc. Trimeric binding proteins for trimeric cytokines
DE10324447A1 (de) 2003-05-28 2004-12-30 Scil Proteins Gmbh Generierung künstlicher Bindungsproteine auf der Grundlage von Ubiquitin
BRPI0410927A (pt) * 2003-06-02 2006-06-27 Wyeth Corp métodos terapêuticos e profiláticos para distúrbios neuromusculares
JP4782700B2 (ja) 2004-01-20 2011-09-28 カロバイオス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド 最低限必須な結合決定基を用いた抗体特異性の移入
WO2005116052A2 (en) * 2004-04-27 2005-12-08 Research Development Foundation ANTAGONISM OF TGF-β SUPERFAMILY RECEPTOR SIGNALING
US20060008844A1 (en) 2004-06-17 2006-01-12 Avidia Research Institute c-Met kinase binding proteins
EP1771470B1 (en) * 2004-07-23 2013-06-26 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
GB0417487D0 (en) * 2004-08-05 2004-09-08 Novartis Ag Organic compound
AU2005272646A1 (en) * 2004-08-12 2006-02-23 Wyeth Combination therapy for diabetes, obesity, and cardiovascular diseases using GDF-8 inhibitors
CA2538208A1 (en) * 2005-05-04 2006-11-04 Universite Laval Modulation of myostatin and use thereof in cell transplantation-based treatment of muscle disease
ES2534760T3 (es) * 2005-08-19 2015-04-28 Wyeth Llc Anticuerpos antagonistas contra GDF-8 y sus usos en el tratamiento de ELA y otros trastornos asociados con GDF-8
WO2007027957A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Cell Signaling Technology, Inc. Reagents for the detection of protein phosphorylation in leukemia signaling pathways
US8067562B2 (en) * 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
JP2009518422A (ja) 2005-12-06 2009-05-07 アムジェン インコーポレイテッド ミオスタチン・アンタゴニストの使用
WO2007109668A2 (en) * 2006-03-20 2007-09-27 The Uab Research Foundation Compositions and methods for improving bone mass through modulation of novel receptors of pth and fragments thereof
CL2007001614A1 (es) 2006-06-09 2008-08-08 Novartis Ag Polipeptido que comprende una proteina del precursor del factor de crecimiento tipo insulina, igf-1 humana, en la cual la escision del peptido e mediante una proteasa se reduce a traves de la modificacion de la proteina del precursor; y su uso para t
US8097596B2 (en) * 2006-06-30 2012-01-17 Lakewood-Amedex, Inc. Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
US8309068B2 (en) * 2006-08-03 2012-11-13 Myostin Therapeutics Pty Ltd. Isolated polypeptides and methods of improving muscle strength
TWI782836B (zh) * 2007-02-02 2022-11-01 美商艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ActRIIB的變體與其用途
TWI573802B (zh) 2007-03-06 2017-03-11 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
JP5766179B2 (ja) * 2009-04-27 2015-08-19 ノバルティス アーゲー 筋肉増殖を増加させるための組成物および方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN102753578B (zh) 2015-04-22
HN2011002817A (es) 2014-08-25
CU23945B1 (es) 2013-10-29
HUE035240T2 (hu) 2018-05-02
PE20120532A1 (es) 2012-05-18
JO3313B1 (ar) 2019-03-13
ES2655877T3 (es) 2018-02-22
CN104725512A (zh) 2015-06-24
US8551482B2 (en) 2013-10-08
KR20120104490A (ko) 2012-09-21
SV2011004043A (es) 2012-01-03
ECSP11011484A (es) 2011-12-30
SG174273A1 (en) 2011-10-28
EP2424895B1 (en) 2017-09-06
IL215168A0 (en) 2011-12-29
CR20110487A (es) 2011-12-07
BRPI1014522A2 (pt) 2016-04-05
ZA201106538B (en) 2012-05-30
EA201650137A1 (ru) 2017-09-29
DK2424895T3 (en) 2017-12-18
PL2424895T3 (pl) 2018-03-30
US20100272734A1 (en) 2010-10-28
NZ595235A (en) 2013-06-28
SI2424895T1 (en) 2018-01-31
CL2011002660A1 (es) 2012-05-25
JP2012525128A (ja) 2012-10-22
LT2424895T (lt) 2017-12-27
CA2993053A1 (en) 2010-11-04
BRPI1014522B1 (pt) 2020-10-20
US20180134791A9 (en) 2018-05-17
TN2011000463A1 (en) 2013-03-27
CU20110199A7 (es) 2012-06-21
EA027071B1 (ru) 2017-06-30
MY153078A (en) 2014-12-31
AU2010243697B2 (en) 2013-05-23
CY1119664T1 (el) 2018-04-04
US8388968B2 (en) 2013-03-05
JP2014158480A (ja) 2014-09-04
US20120237521A1 (en) 2012-09-20
CA2758290C (en) 2018-04-10
JP2017014207A (ja) 2017-01-19
PT2424895T (pt) 2017-12-15
US20180194846A1 (en) 2018-07-12
KR101836501B1 (ko) 2018-03-08
TW201615213A (zh) 2016-05-01
TWI528974B (zh) 2016-04-11
EP3275900A1 (en) 2018-01-31
EA201101571A1 (ru) 2012-05-30
HRP20171870T1 (hr) 2018-01-12
TW201041594A (en) 2010-12-01
UY32583A (es) 2010-11-30
NO2424895T3 (sr) 2018-02-03
WO2010125003A1 (en) 2010-11-04
CA2758290A1 (en) 2010-11-04
AR076402A1 (es) 2011-06-08
BRPI1014522B8 (pt) 2021-05-25
CO6460759A2 (es) 2012-06-15
JP5766179B2 (ja) 2015-08-19
US20130344091A1 (en) 2013-12-26
US20160031993A1 (en) 2016-02-04
MA33279B1 (fr) 2012-05-02
MX2011011352A (es) 2011-11-18
AU2010243697A1 (en) 2011-10-20
CN102753578A (zh) 2012-10-24
US20240425602A1 (en) 2024-12-26
EP2424895A1 (en) 2012-03-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240425602A1 (en) Compositions and methods for increasing muscle growth
EP2567709B1 (en) Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (LRP6)
US11834508B2 (en) Method of treating structural and/or functional cardiac abnormalities by administering an anti-ActRII receptor antibody
RS54299B1 (sr) Sastavi i metode upotrebe terapijskih antitela
HK1162543A (en) Compositions and methods for increasing muscle growth
HK1162543B (en) Compositions and methods for increasing muscle growth
AU2013203891A1 (en) Compositions and methods for increasing muscle growth
HK1178790B (en) Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (lrp6)
HK1178790A (en) Molecules and methods for modulating low-density-lipoprotein receptor-related protein 6 (lrp6)