BRPI1014522B1 - anticorpo anti-actriib ou fragmento funcional, processo de produção dos mesmos, composição farmacêutica e usos - Google Patents

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Tanja Herrmann
Chris Lu
Kelly-Ann Sheppard
Estelle TRIFILIEFF
Stefanie Urlinger
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Abstract

composições e métodos para aumentar o crescimento muscular. a presente invenção refere-se ao campo dos anticorpos do receptor anti-activina iib (actriib). em particular, refere-se ao uso dos ditos anticorpos para o tratamento de distúrbios musculares, tais como perda de massa muscular devido a doença ou desuso.

Description

CAMPO TÉCNICO
[0001] A presente invenção está no campo dos anticorpos do receptor anti-Activina I IB (ActRIIB). Em particular, refere-se ao uso dos ditos anticorpos para o tratamento de distúrbios musculares, tais como a perda de massa muscular devido a doença ou desuso.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[0002] As ativinas são o crescimento dimérico e os fatores de diferenciação os quais pertencem à superfamília do fator de crescimento transformador beta (TGF-beta) das proteínas de sinalização estruturalmente relacionadas. A sinalização de ativinas através de um complexo heterodimérico do receptor serina quinase inclui pelo menos os receptores dois do tipo I (I e IB) e dois do tipo II (II e IIB, aka ACVR2A e ACVR2B). Esses receptores são todos proteínas da transmembrana, compostos de um domínio extracelular de ligação do ligante com a região rica em cisteína, um domínio da transmembrana e um domínio citoplasmático com a especificidade da serina/treonina prevista. Os receptores do tipo I são essenciais para a sinalização, enquanto que os receptores do tipo II são necessários para ligação dos ligantes e para a expressão dos receptores do tipo I. Os receptores do tipo I e os receptores do tipo II formam um complexo estável após a ligação do ligante resultando na fosforilação dos receptores do tipo I por meio dos receptores do tipo II.
[0003] O receptor de ativina II B (ActRIIB) é um receptor para a miostatina. A interação entre a miostatina e este receptor regula a inibição da diferenciação do músculo esquelético através da via dependente de Smad. Dessa maneira, por meio da inibição ou prevenção da miostatina a partir da ligação ao ActRIIB, pode-se induzir a formação de músculo esquelético.
[0004] Vários grupos têm observado isto. Bogdanovich et al. (Nature, 2002, 420:418 a 421) descreve que os anticorpos antimiostatina foram capazes de bloquear a miostatina, resultando em um aumento da massa muscular em um modelo do camundongo da distrofia muscular de Duchenne. Bradley et al (Cell Mol. Sei Vida. 2008, 65:2119 a 2124) revisaram as diferentes abordagens disponíveis para a modulação da interação de miostatina/ActRIlB, incluindo os ditos anticorpos anti miostatina referidos anteriormente, inibindo a liberação de miostatina madura por meio da administração do propeptídeo de miostatina, administrando folistatina para bloquear o receptor da miostatina, administrando os inibidores HDAC para induzir a produção de folistatina, administrando um peptídeo da miostatina alterado o qual impede a miostatina de se ligar ao receptor e administrando um receptor solúvel chamariz para a miostatina.
[0005] Apesar destas terapias em potencial, não há nenhum produto disponível para o tratamento dos pacientes.Na verdade, recentemente uma empresa cancelou seu projeto de anticorpos antimiostatina.
[0006] Há, portanto, a necessidade de um método para aumentar a massa muscular e força em um paciente.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[0007] Foi descoberto que os anticorpos dirigidos ao receptor ActRIIB podem impedir a miostatina de se ligar ao receptor, evitando, dessa maneira, a inibição da diferenciação muscular por meio da via dependente de Smad. Isto leva a um aumento da massa muscular e força em um paciente.
[0008] Portanto, em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-ActRUB, ou uma proteína funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígenos dos ditos anticorpos. Em uma modalidade, o ActRIIB é ActRIIB humano. A sequência de polipeptídeos de ActRIIB humano é descrita na SEQ ID NO: 181 (AAC64515.1, Gl: 3769443). Em uma modalidade, o anticorpo ou a proteína funcional é de um mamífero, tendo uma origem tal como de ser humano ou de camelídeo. Dessa maneira, o anticorpo pode ser um anticorpo quimérico, humano ou humanizado. Em uma modalidade particular, o anticorpo anti-ActRUB é caracterizado como tendo uma região de ligação ao antígeno que é específica para a proteína do ActRIIB alvo e se liga ao ActRIIB ou a um fragmento de ActRIIB. De preferência, o anticorpo é adequado para uso em terapia.
[0009] Em uma modalidade, os anticorpos de acordo com a presente invenção são antagonistas de ActRIIB sem ou com baixa atividade agonística. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou o fragmento funcional liga-se a proteína do ActRIIB alvo e diminui a ligação da miostatina para ActRIIB a um nível basal. Em um aspecto desta modalidade, o anticorpo ou o fragmento funcional reduz a quantidade de miostatina que se liga ao ActRIIB.Em um outro aspecto desta modalidade, o anticorpo ou o fragmento funcional impedem completamente a miostatina de ligar-se ao ActRIIB. Em uma modalidade adicional, o anticorpo ou o fragmento funcional inibe a ativação de Smad. Em uma modalidade adicional, o anticorpo ou o fragmento funcional inibe o receptor de ativina do tipo IIB mediado pela inibição induzida por miostatina de diferenciação esquelética através da via dependente de Smad.
[00010] A ligação pode ser determinada por um ou mais ensaios que podem ser usados para medir uma atividade que é tanto de antagonismo ou de agonismo pelo anticorpo. De preferência, os ensaios medem pelo menos um dos efeitos do anticorpo em ActRIIB, os quais incluem: a inibição da miostatina ligaando-se ao ActRIIB por ELISA, a inibição da miostatina induzida por sinalização (por exemplo, por meio de um ensaio do gene repórter dependente de Smad), a inibição da miostatina induzida pela fosforilação de Smad (P-Smad ELISA) e a inibição da miostatina induzida pela inibição da diferenciação de células do músculo esquelético (por exemplo, por meio de um ensaio de creatina quinase).
[00011] Em uma modalidade, a presente invenção fornece os anticorpos que se ligam, de forma específica, à região de ligação da miostatina (isto é, do domínio de ligação ao ligante) de ActRIIB. Esse domínio de ligação ao ligante consiste em 19 a 134 aminoácidos da SEQ ID NO: 181 efoi atribuído à SEQ ID NO: 182 na presente invenção.
[00012] Em uma modalidade, os anticorpos se ligam ao ActRIIB com um KD de 100 nM ou menos, 10 nM ou menos, 1 nM ou menos. De preferência, os anticorpos da presente invenção se ligam ao ActRIIB com uma afinidade de 100pM ou menos (isto é, 100 pM, 50 pM, 10 pM, 01:00 ou menos). Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção se ligam ao ActRIIB com uma afinidade de entre 10 e 20 pM.
[00013] Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção não reagem de forma cruzada com uma proteína relacionada ao ActRIIB e, mais particularmente, não reagem de forma cruzada com ActRIlA humano (NP_001607.1, Gl: 4501897).
[00014] Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção se ligam, de forma preferencial, ao ActRIIB em vez de ActRIlA. Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção se ligam ao ActRIIB com afinidade 5 vezes maior do que eles se ligam ao ActRIlA, mais preferivelmente 10 vezes, ainda mais preferivelmente 50 vezes, ainda mais preferivelmente 100 vezes.
[00015] Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção se ligam ao ActRIlA com uma afinidade de 100 pM ou mais (isto é, 250 pM, 500 pM, 1 nM, 5 nM ou mais).
[00016] Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção são do isotipo lgG2.
[00017] Em uma outra modalidade, os anticorpos da presente invenção são do isotipo lgG1. Em uma modalidade adicional, os anticorpos da presente invenção são do isotipo lgG1 e têm uma função efetora alterada através da mutação da região Fc. Em uma modalidade, a dita função efetora alterada é a atividade ADCC e CDC reduzida. Em uma modalidade, a dita função efetora alterada é a atividade ADCC e CDC silenciada.
[00018] Em uma outra modalidade relacionada, os anticorpos de acordo com a presente invenção são os anticorpos lgG1 plenamente humanos ou humanizados sem nenhuma atividade de citotoxicidade da célula dependente do anticorpo (ADCC) ou atividade CDC e se ligam a uma região de ActRIIB consistindo em 19 a 134 aminoácidos da SEQ ID NO:181.
[00019] Em uma outra modalidade relacionada, os anticorpos de acordo com a presente invenção são os anticorpos lgG1 plenamente humanos ou humanizados sem nenhuma atividade de citotoxicidade da célula dependente do anticorpo (ADCC) ou atividade CDC e se ligam a uma região de ActRIIB consistindo em 19 a 134 aminoácidos da SEQ ID NO:181.
[00020] A presente invenção refere-se aos anticorpos isolados, particularmente os anticorpos humanos ou humanizados que inibem a miostatina de ligar-se ao ActRIIB e ativar a diferenciação do músculo esquelético in vitro e in vivo. Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são derivados das sequências da cadeia leve e pesada, em particular, e/ou compreendem as características estruturais particulares, tais como as regiões CDR compreendendo as sequências de aminoácidos, em particular. A presente invenção refere-se aos anticorpos isolados, métodos de fazer tais anticorpos, moléculas Petição 870200074827, de 16/06/2020, pág. 9/140 6/127 imunoconjugadas e multivalentes ou multiespecíficas compreendendo tais anticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, moléculas imunoconjugadas ou bioespecíficas da presente invenção. A presente invenção também refere-se aos métodos de usar os anticorpos para inibir, isto é, antagonizar, a função de ActRIIB, a fim de inibir a ativação de Smad e, dessa maneira, induzir a diferenciação do músculo esquelético, por exemplo, resultando no tratamento de um distúrbio patológico.
[00021] O distúrbio patológico pode ser uma doença ou distúrbio osteomuscular, tal como a atrofia muscular. Existem muitas causas para a atrofia muscular, incluindo como resultado do tratamento com glicocorticoides, tais como o cortisol, dexametasona, betametasona, prednisona, metilprednisolona ou prednisolona. A atrofia muscular pode também ser um resultado de denervação devido ao trauma do nervo ou um resultado de neuropatia degenerativa, metabólica ou inflamatória (por exemplo, síndrome de Guillain-Barré, neuropatia periférica ou exposição às toxinas ambientais ou fármacos).
[00022] Além disso, a atrofia muscular pode ser resultado de uma miopatia, tal como a miotonia; uma miopatia congential, incluindo miopatia nemaleno, miopatia multi/mininúcleo e miopatia miotubular (centronuclear); miopatia mitocondrial; paralisia periódica familiar; miopatia inflamatória; miopatia metabólica, tal como causada por uma doença de depósito de glicogênio ou de lipídios; dermatomiolocals; polimiolocal; miolocal do corpo de inclusão; miolocal ossificante, rabdomiólise e mioglobinurias.
[00023] A miopatia pode ser causada por uma síndrome de distrofia muscular, tais como Duchenne, Becker, miotônica, fascioescapulohumeral, Emery-Dreifuss, Oculofaríngea, escapuloumeral, membros da cintura, Fukuyama, distrofia muscular congênita ou miopatia distal hereditária. A doença osteomuscular também pode ser osteoporose, uma fratura óssea, baixa estatura ou nanismo.
[00024] Além disso, a atrofia muscular pode ser um resultado de uma doença do neurônio motor adulto, atrofia muscular espinhal infantil, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal juvenil, neuropatia motora autoimune com bloqueio multifocal condutor, paralisia devido à lesão da medula espinhal ou ao acidente vascular cerebral, imobilização do esqueleto devido ao trauma, repouso prolongado, inatividade voluntária, inatividade involuntária, estresse metabólico ou insuficiência nutricional, câncer, AIDS, jejum, um distúrbio da glândula tireoide, diabetes, hipotonia benigna congênita, doença do núcleo central, queimaduras, doença pulmonar obstrutiva crônica, doenças do fígado (exemplos, tais como a fibrose e a cirrose), sepse, insuficiência renal, insuficiência cardíaca congestiva, envelhecimento, viagens espaciais ou o tempo gasto em um ambiente de gravidade zero.
[00025] Exemplos de condições relacionadas à idade que podem ser tratados incluem, sarcopenia, atrofia da pele, perda de massa muscular, atrofia cerebral, aterosclerose, arteriosclerose, enfisema pulmonar, osteoporose, osteoartrite, incompetência imunológica, hipertensão arterial, demência, doença de Huntington, doença de Alzheimer, cataratas, degeneração macular relacionada com a idade, câncer de próstata, acidente vascular cerebral, expectativa de vida diminuída, fraqueza, perda de memória, rugas, função renal debilitada e perda auditiva relacionada com a idade; distúrbios metabólicos, incluindo diabetes tipo II, síndrome metabólica, hiperglicemia e obesidade.
[00026] Outras condições que podem ser tratadas com os anticorpos da presente invenção incluem doença ou insuficiência renal crônica e/ou aguda, fibrose ou cirrose do fígado, câncer, tais como câncer de mama, doença de Parkinson; condições associadas com a morte neuronal, tais como ALS, atrofia cerebral, ou demência e anemia.
[00027] Outras condições incluem caquexia, caquexia associada a uma artrite reumatoide e caquexia associada ao câncer.
[00028] Até o momento, muito poucas terapias confiáveis ou eficazes têm sido desenvolvida para tratar estes distúrbios.
[00029] Com base na evidência relatada de um papel de ligação de Ativinas ao ActRIIB entre outros receptores (Werner e Alzheimer, Fatores de Crescimento de citocinas (Cytokine Growth Factors) Rev 2006, 17 (3): 157 a 171), em contribuir para a fibrose do fígado, rins e pulmonar e de um papel para miostatina, Ativinas, ou ActRIIB em cânceres (Tsuchida etal, Endo J, 2008, 55 (1):11 a 21) os anticorpos da presente invenção podem ser usados para tratar fígado, rim, fibrose pulmonar e cânceres exemplificados, mas não restritos, para rabdomiossarcomas, cânceres induzindo à perda óssea, carcinoma hepatocelular, câncer gastrointestinal.
[00030] A prevenção pode ser completa, por exemplo, a total ausência de uma condição relacionada à idade ou distúrbio metabólico. A prevenção também pode ser parcial, de tal forma que a probabilidade da ocorrência da condição relacionada à idade ou distúrbio metabólico em um sujeito é menos provável de ocorrer do que no que diz respeito a um sujeito que não recebeu um anticorpo da presente invenção.
[00031] A fim de que a presente invenção possa ser mais facilmente compreendida, certos termos serão definidos primeiro. As definições adicionais são estabelecidas ao longo da descrição detalhada.
[00032] O termo "resposta imune"refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células apresentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulócitos e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou o fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento), resultarem em danos, destruição ou eliminação seletiva do corpo humano de patógenos invasores, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células normais ou tecidos humanos.
[00033] O termo "via de transdução de sinal" ou o termo "atividade de sinalização"refere-se a uma relação de bioquímicos causal geralmente iniciada por meio da interação de proteína-proteína, tal como a ligação de um fator de crescimento a um receptor, resultando na transmissão de um sinal a partir de uma parte de uma célula para outra parte de uma célula. Em geral, a transmissão envolve a fosforilação específica de um ou mais resíduos de tirosina, serina ou treonina em uma ou mais proteínas na série de reações que causam a transdução de sinal. Os penúltimos processos tipicamente incluem os eventos nucleares, resultando em uma mudança na expressão do gene.
[00034] O termo ActRIIB ou o receptor IIB refere-se ao ActRIIB humano, tal como definido na SEQ ID NO: 181 (AAC64515.1, Gl: 3769443). Uma pesquisa no grau de anticorpos anti-ActRUB policlonais e monoclonais é conhecida na técnica, como aquelas feitas por R & D Systems®, MN, EUA. Os anticorpos anti-ActRUB terapêuticos não foram previamente descritos. É claro, os anticorpos poderiam ser levantados contra ActRIIB de outras espécies e usados para tratar as condições patológicas nas espécies.
[00035] O termo "anticorpos", como referido na presente invenção, inclui todos os anticorpos e qualquer fragmento de ligação do antígeno (isto é, "a porção de ligação ao antígenos ") ou as cadeias simples dos mesmos. O "anticorpo" de ocorrência natural é uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por meio de ligações dissulfeto. Cada cadeia pesada é composta de uma região variável da cadeia pesada (na presente invenção abreviado como VH) e uma região constante da cadeia pesada. A região constante da cadeia pesada é composta de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é composta de uma região variável da cadeia leve (na presente invenção abreviado como VL) e uma região da cadeia leve constante. A região constante da cadeia leve é composta de um domínio CL. As regiões VH e VL podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com as regiões que são mais conservadas, chamadas de regiões da estrutura (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs organizadas a partir do terminal amino ao terminal carbóxi, na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina para hospedar os tecidos ou os fatores, incluindo as várias células do sistema imunitário (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (CLq) do sistema de complemento clássico.
[00036] O termo "porção de ligação ao antígeno " de um anticorpo (ou simplesmente "porção do antígeno"), como usado na presente invenção, refere-se ao comprimento total ou um ou mais fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de se ligarem especificamente a um antígeno (por exemplo, uma porção de ActRIIB).Tem sido demonstrado que a função de ligação aos antígenos de um anticorpo pode ser realizada por meio de fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos por meio do termo " porção de ligação aos antígenos " de um anticorpo incluem um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1, um fragmento F(ab)2, um fragmento bivalente constituído por dois fragmentos Fab ligados por meio de uma ligação dissulfeto na região da dobradiça; um fragmento Fd que consiste nos domínios VH e CH1; um fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo;, um fragmento de dAb (Ward et al,Nature 341:544 a 546 1989), que consiste em um domínio VH, e uma região isolada de determinação de complementaridade (CDR).
[00037] Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por meio dos genes separados, eles podem ser unidos, usando os métodos recombinantes, por meio de um ligador sintético que permite que eles sejam feitos como uma cadeia de proteína única, em que os pares das regiões VL e VH formam moléculas monovalente (conhecidas como cadeia única de Fv (scFv); vide, por exemplo Bird et al, 1988 242:423 a 426 Ciência (Science) e Huston et al, 1988 Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 5879 a 5883). Tais anticorpos da cadeia única também se destinam a serem abrangidos por meio do termo "região de ligação aos antígenos" de um anticorpo.Estes fragmentos de anticorpos são obtidos utilizando as técnicas convencionais conhecidas por aqueles versados na técnica, e os fragmentos são selecionados para a utilidade da mesma maneira como são anticorpos intactos.
[00038] O termo "anticorpo isolado", como usado na presente invenção, refere-se a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos com especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao ActRIIB é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente aos antígenos que não ActRIIB). Um anticorpo isolado que se liga especificamente ao ActRIIB pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outros antígenos, tais como moléculas de ActRIIB de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de material celular e/ou outros produtos químicos.
[00039] O termo "anticorpo monoclonal"ou "composição de anticorpos monoclonal", como usados na presente invenção, referem- se a uma preparação de moléculas de anticorpos de composição molecular única.Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade de ligação única e afinidade para um epítopo particular.
[00040] O termo "anticorpo humano", como usado na presente invenção, tem como objetivo apresentar os anticorpos tendo regiões variáveis em que ambas as regiões de CDR e estrutura são derivadas das sequências de origem humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de tais sequências humanas, por exemplo, as sequências de linhagem germinal humana, ou versões mutantes das sequências de linhagem germinal humana ou anticorpos contendo as sequências de estrutura de consenso derivadas da análise das sequências de estrutura humanas, por exemplo, como descrito no Knappik, et al. (2000. Mol Biol J 296, 57 a 86).
[00041] Os anticorpos humanos da presente invenção podem incluir os resíduos de aminoácidos não codificados por meio da sequência humana (por exemplo, as mutações introduzidas por meio da mutagênese aleatória de local específico in vitroou por meio da mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", como usado na presente invenção, não se destina a incluir os anticorpos no qual as sequências de CDR derivam da linhagem da linhagem germinal de outras espécies de mamíferos, tal como um camundongo, que foram enxertadas em sequências de estrutura humana.
[00042] O termo "anticorpo monoclonal humano", como usado na presente invenção, refere-se aos anticorpos exibindo uma especificidade única ligação que têm regiões variáveis em que ambas as regiões de estrutura e CDR são derivadas das sequências de humanos. Em uma modalidade, os anticorpos humanos monoclonais são produzidos por meio de um hibridoma, os quais incluem uma célula B obtida a partir de um animal transgênico não humano, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma que compreende um transgene da cadeia humana pesada e um transgene da cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.
[00043] O termo "anticorpo humano recombinante", como usado na presente invenção, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meio recombinante, tais como anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromosomal para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparados a partir destes, os anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar os anticorpos humanos, por exemplo, a partir de um transfectoma, anticorpos isolados a partir de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatoriais e recombinantes, e anticorpos preparados, expressos, isolados ou criados por qualquer outro meio que envolvem o entrelaçamento de todos ou uma parte de um gene de imunoglobulina humana, sequências de outras sequências de DNA. Tais anticorpos recombinantes humanos têm regiões variáveis em que as regiões de estrutura e CDR são derivadas da sequências de imunoglobulina humana da linhagem germinais. Em certas modalidades, no entanto, tais anticorpos recombinantes humanos podem ser submetidos a mutagênese in vitro(ou, quando um animal transgênico para as sequências lg humanas for utilizado, mutagênese somática in vivo) e, dessa maneira, as sequências de aminoácidos das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são sequências que, embora derivem a partir de e relacionam-se com as sequências da linhagem da linhagem germinal humana VH e VL, não pode, naturalmente, existirem dentro do repertório de anticorpos humanos da linhagem germinais in vivo.
[00044] Como usado na presente invenção, o termo "isotipo"refere- se à classe de anticorpos (por exemplo, IgM, IgE, IgG, como lgG1 ou lgG2) que é fornecida por meio dos genes da região constante da cadeia pesada.
[00045] As frases "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas, de forma alternada, na presente invenção com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".
[00046] Como usado na presente invenção, um anticorpo que "se liga especificamente ao polipeptídeo de ActRIIB" destina-se para se referir a um anticorpo que se liga a um polipetídeo de ActRIIB humano com um KD de 100 nM ou menos, 10nM ou menos, 1nm ou menos. Um anticorpo que " reage de forma cruzada com um antígeno que não ActRIIB" destina-se para se referir a um anticorpo que se liga a esse antígeno com um KD de 10 x 10-9 M ou menos, 5 x 10-9 M ou menos, ou 2 x 10 -9 ou menos. Um anticorpo que "não reage de forma cruzada com um determinado antígeno " destina-se para se referir a um anticorpo que se liga a esse antígeno, com um KD de 1,5 x 10-8 M ou superior, ou um KD de 50-10 x 10 - 8 M, ou 1 x 10 -7 M ou superior. Em certas modalidades, tais anticorpos que não reagem de forma cruzada com o antígeno exibem, de forma essenncial, a ligação indetectável contra essas proteínas nos ensaios de ligação padrão. KD pode ser determinado usando um sistema de biossensor, como um sistema Biacore®, ou Titulação de Equilíbrio da Solução.
[00047] Como usado na presente invenção, o termo "anticorpo antagonista" destina-se para se referir a um anticorpo que inibe a atividade de sinalização induzida ao ActRIIB na presença de miostatina. Exemplos de um ensaio para detectar estes incluem a inibição da miostatina induzida por meio da sinalização (por exemplo, por meio de um ensaio de gene repórter dependente de Smad), a inibição da miostatina induzida por meio da fosforilação de Smad (P-Smad ELISA) e a inibição da miostatina induzida por meio da inibição da diferenciação de células do músculo esquelético (por exemplo, por meio de um ensaio de creatina quinase).
[00048] Em algumas modalidades, os anticorpos inibem a miostatina induzida por meio da sinalização medida em um ensaio de gene repórter dependente de Smad em um IC50 de 10 nM ou menos, 1 nm ou menos, ou 100 pM ou menos.
[00049] Como usado na presente invenção, um anticorpo com "atividade não agonística" destina-se para se referir a um anticorpo que não agonística"destina-se para se referir a um anticorpo que não aumenta, de forma significativa, a atividade de sinalização mediada por ActRIIB na ausência de miostatina em um ensaio baseado em células, tal como a inibição da miostatina induzida por meio da sinalização (por exemplo, por meio de um ensaio de gene repórter dependente de Smad), a inibição da miostatina induzida por meio da fosforilação de Smad (P-Smad ELISA) e a inibição da miostatina induzida por meio da inibição da diferenciação de células do músculo esquelético (por exemplo, por meio de um ensaio de creatina quinase). Tais ensaios são descritos em mais detalhes nos exemplos abaixo.
[00050] O termo "Kassoc" ou "Ka", como usado na presente invenção, pretende referir-se à taxa de associação de uma determinada interação antígeno-anticorpo, enquanto o termo "Kdis" ou "Kd", como usado na presente invenção, destina-se para se referir à taxa de dissociação de uma determinada interação antígeno-anticorpo. O termo "KD", como usado na presente invenção, destina-se para se referir à constante de dissociação, que é obtida a partir da relação de Kd para Ka (ou seja, Kd/Ka) e é expresso como uma concentração molar (M). Os valores KD dos anticorpos pode ser determinado usando os métodos bem-estabelecidos na técnica. Um método para determinar o KD de um anticorpo é por meio da utilização da ressonância de superfície plasmônica, tais como o sistema biossensor de Biacore®, ou a Titulação do Equilíbio da Solução (SET) (vide Friguet B et al (1985) J. Immunol Methods;. 77 (2): 305 a 319, e Hanel C et al (2005) Anal Biochem; 339 (1):. 182 a 184).
[00051] Como usado na presente invenção, o termo "afinidade"refere-se à força de interação entre os antígenos e os anticorpos em locais antigênicos únicos. Dentro de cada local antigênico, a região variável do "braço" do anticorpo interage através de forças não covalentes fracas com o antígeno em diversos locais; quanto maior a interação, mais forte a afinidade.
[00052] Como usado na presente invenção, o termo "avidez" refere- se a uma medida informativa da estabilidade global ou a força do complexo antígeno-anticorpo. É controlado por meio de três fatores principais: a afinidade do epítopo do anticorpo; a valência de ambos os antígenos e os anticorpos, e o arranjo estrutural das partes que interagem. Em última análise, estes fatores definem a especificidade do anticorpo, isto é, a probabilidade de que o anticorpo específico é ligado a um epítopo do antígeno preciso.
[00053] Como usado na presente invenção, o termo "ADCC" ou "anticorpo dependente da citotoxicidade da célula" refere-se à atividade esgotando as células B humanas. A atividade ADCC pode ser medida por meio dos ensaios esgotando as células B humanas conhecidas na técnica.
[00054] A fim de obter uma maior avidez da sonda, um conjugado dimérico (duas moléculas de uma proteína do anticorpo acopladas a um marcador FACS) pode ser construído, tornando, dessa maneira, as interações de baixa afinidade (tal como com o anticorpo da linhagem germinal) mais facilmente detectadas por FACS. Além disso, outra forma de aumentar a avidez da ligação do antígeno envolve gerar dímeros, trímeros ou multímeros de qualquer um dos constructos na presente invenção descritos dos anticorpos anti-ActRUB. Tais multímeros poderão ser gerados através da ligação covalente entre os módulos individuais, por exemplo, imitando a ligação dos terminais C a N naturais ou imitando os dímeros de anticorpo que são mantidos juntos através de suas regiões constantes. As ligações de engenharia na interface Fc/Fc podem ser covalentes ou não covalentes. Além disso, a dimerização ou a multimerizção de parceiros que não Fc pode ser usada em híbridos de ActRIIB para criar tais estruturas de ordem superior. Por exemplo, é possível usar os domínios de multimerização tais como o domínio de trimerização descrito no W02004/039841 ou domínio de pentamerização descrito no WO98/18943.
[00055] Como usado na presente invenção, o termo "seletividade" para um anticorpo refere-se a um anticorpo que se liga a um determinado polipeptídeo-alvo, mas não polipeptídeos intimamente relacionados.
[00056] Como usado na presente invenção, o termo "alta afinidade" para um anticorpo refere-se a um anticorpo tendo um KD de 1 nM ou menos para um antígeno-alvo. Como usado na presente invenção, o termo "sujeito" inclui qualquer animal humano ou não humano.
[00057] O termo "animal não humano" compreende todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
[00058] Como usado na presente invenção, o termo "otimizado" significa que uma sequência de nucleotídeos foi alterada para codificar uma sequência de aminoácidos usando códons que são preferidos na produção de célula ou organismo, geralmente uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula de Pichia, um célula de Trichoderma, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO) ou uma célula humana. A sequência de nucleotídeos otimizada é projetada para reter completamente ou tanto quanto possível, a sequência de aminoácidos codificada originalmente por meio da sequência de nucleotídeos de partida, que também é conhecida como a sequência "parental". As sequências otimizadas na presente invenção foram projetadas para ter códons que são preferidos em células de mamíferos de CHO, porém a expressão otimizada dessas sequências em outras células eucarióticas também está prevista na presente invenção. As sequências de aminoácidos codificadas por meio das sequências de nucleotídeos otimizadas também são referidas como otimizadas.
[00059] Vários aspectos da presente invenção são descritos em mais detalhes nas subseções a seguir.
[00060] Ensaios-padrão para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos para ActRIIB de várias espécies são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, os testes ELISA, western blots e RIAs. Os ensaios adequados são descritos em detalhes nos exemplos. A afinidade de ligação dos anticorpos também pode ser avaliada por ensaios-padrão conhecidos na técnica, tal como por meio da análise Biacore ou Titulação de Equilíbrio da Solução. A ressonância de superfície plasmônica baseada nas técnicas, tais como Biacore, pode determinar os cinéticos de ligação que permitem o cálculo da afinidade de ligação. Os ensaios para avaliar os efeitos dos anticorpos com propriedades funcionais de ActRIIB (por exemplo, ligação aos receptores, prevenção ou indução da proliferação de células B humanas ou a produção IgG) são descritos em mais detalhes nos exemplos.
[00061] Dessa maneira, um anticorpo que "inibe" uma ou mais dessas propriedades funcionais de ActRIIB (por exemplo, atividades bioquímicas, imunoquímicas, celulares, fisiológicas ou outras biológicas, ou similares), como determinado de acordo com metodologias conhecidas na técnica e na presente invenção descrito, será entendido de se relacionar com uma diminuição estatisticamente significativa na atividade específica em relação ao observado na ausência do anticorpo (por exemplo, ou quando um anticorpo de controle de especificidade irrelevante está presente). Um anticorpo que inibe os efeitos da atividade ActRIIB, tal como a diminuição estatisticamente significativa em pelo menos 10% do parâmetro medido, em pelo menos 50%, 80% ou 90%, e em certas modalidades um anticorpo da presente invenção pode inibir mais do que a 95%, 98% ou 99% da atividade funcional de ActRIIB.
[00062] Os termos "bloqueio cruzado" e "bloqueamento cruzado" são usados, de forma alternada, ora para significar a capacidade de um anticorpo ou outro agente de ligação para interferir com a ligação de anticorpos ou outros agentes de ligação para ActRIIB, particularmente um domínio de ligação ao ligante, em um ensaio de ligação competitivo padrão.
[00063] A capacidade ou até que ponto um anticorpo ou um outro ligante é capaz de interferir com a ligação de outro anticorpo ou a ligação da molécula ao ActRIIB e, portanto, pode-se dizer que o bloqueio cruzado de acordo com a presente invenção, pode ser determinado usando o ensaio de ligação competitivo padrão. Um ensaio adequado envolve o uso da tecnologia Biacore (por exemplo, utilizando um instrumento BIAcore (Biacore, Uppsala, Suécia)), o qual pode medir a extensão das interações usando a tecnologia da superfície de ressonância plasmônica. Outro ensaio para medir o bloqueio de cruzamento usa uma abordagem baseada em ELISA. Um ensaio adicional utiliza a análise FACS, em que a competição de vários anticorpos para a ligação ao ActRIIB expressando as células é testada (tais como descrito nos exemplos).
[00064] De acordo com a presente invenção, um anticorpo de bloqueio cruzado ou outro agente de ligação de acordo com a presente invenção se liga ao ActRIIB no ensaio de bloqueamento cruzado descrito no ensaio BIAcore de tal forma que a ligação gravada da combinação (mistura) dos anticorpos ou agentes de ligação é entre 80% e 0,1% (por exemplo, 80% a 4%) da ligação máxima teórica, especialmente entre 75% e 0,1% (por exemplo, 75% a 4%) da ligação máxima teórica, e mais especificamente entre 70% e 0,1% (por exemplo, 70% a 4%), e mais especificamente entre 65% e 0,1% (por exemplo, 65% a 4%) de ligação máxima teórica (como definido anteriormente) dos dois anticorpos ou agentes de ligação em combinação.
[00065] Um anticorpo é definido como bloqueando de forma cruzada um anticorpo anti-ActRUB da presente invenção em um ensaio ELISA, se o anticorpo teste for capaz de causar uma redução do anticorpo anti- ActRIlB ligando-se ao ActRIIB entre 60% e 100%, mais especificamente entre 70% e 100%, e mais especificamente entre 80% e 100%, quando comparado às cavidades de controle positivas (isto é, o mesmo anticorpo anti-ActRUB e ActRIIB, mas nenhum anticorpo de bloqueamento cruzado de "teste"). Exemplos de anticorpos de bloque- amento cruzados como citado na presente invenção são MOR08159 e MOR08213. Dessa maneira, a presente invenção fornece os anticorpos de bloqueamento cruzado MOR08159 ou MOR08213 para a ligação com ActRIIB.
Anticorpos recombinantes
[00066] Os anticorpos da presente invenção incluem os anticorpos humanos recombinantes, isolados e caracterizados estruturalmente, como descrito nos exemplos. As sequências de aminoácidos VH dos anticorpos isolados da presente invenção são mostradas nas SEQ ID NOs: 99 a 112. As sequências de aminoácidos VL dos anticorpos isolados da presente invenção são mostradas nas SEQ ID NOs: 85 a 98, respectivamente. Os exemplos das sequências de aminoácidos da cadeia pesada de comprimento total preferenciais dos anticorpos da presente invenção são mostrados nas SEQ ID NOs: 146 a 150 e 156 a 160. Os exemplos das sequências de aminoácidos da cadeia leve de comprimento total preferenciais dos anticorpos da presente invenção são mostrados nas SEQ ID NOs: 141 a 145 e 151 a 155, respectivamente. Outros anticorpos da presente invenção incluem os aminoácidos que têm sido mutados por meio da inserção, exclusão ou substituição dos aminoácidos, ainda tem pelo menos 60, 70, 80, 90, 95, 97 ou 99 por cento de identidade nas regiões de CDR com as regiões de CDR retratadas nas sequências descritas acima. Em algumas modalidades, isto inclui as sequências de aminoácidos mutantes em que não mais de 1,2, 3, 4 ou 5 aminoácidos têm sido mutados por meio da inserção, exclusão ou substituição dos aminoácidos nas regiões de CDR quando comparado com as regiões de CDR retratadas na sequência descrita acima.
[00067] Além disso, as sequências de nucleotídeos parentais da cadeia pesada variável são mostradas nas SEQ ID NOs: 127 a 140. As sequências de nucleotídeos parentais da cadeia leve variável são mostradas na SEQ ID NOs: 113 a 126. As sequências de nucleotídeos da cadeia leve de comprimento total otimizadas para a expressão em células de mamíferos são mostradas nas SEQ ID NOs: 161 a 165 e 171 a 175. As sequências de nucleotídeos da cadeia pesada de comprimento total otimizadas para a expressão em uma célula de mamífero são mostradas nas SEQ ID NOs: 166 a 170 e 176 a 180. Outros anticorpos da presente invenção incluem os aminoácidos ou ácidos nucleicos que tem sido mutados, no entanto, possuem pelo menos 60 ou mais (isto é, 80, 90, 95, 97, 99 ou mais) por cento de identidade para as sequências descritas acima. Em algumas modalidades, as mesmas incluem as sequências de aminoácidos mutantes em que não mais de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos têm sido mutados por meio da inserção, exclusão ou substituição dos aminoácidos nas regiões variáveis quando comparadas com as regiões variáveis retratadas nas sequências descritas acima.
[00068] Uma vez que cada um desses anticorpos liga o mesmo epítopo e são progénies do mesmo anticorpo parental, as sequências da cadeia leve de comprimento total e as sequências da cadeia pesada de comprimento total, VH e VL, (sequências de nucleotídeos e as sequências de aminoácidos) podem ser "misturadas e combinadas" para criar outras moléculas de ligação anti-ActRIIB da presente invenção. A ligação ao ActRIIB de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada usando os ensaios de ligação descritos acima e nos exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando estas cadeias são misturadas e combinadas, uma sequência VH a partir de um emparelhamento VH/VL especial deve ser substituída por uma sequência VH estruturalmente semelhante. Da mesma forma, uma sequência da cadeia pesada de comprimento total a partir de um emparelhamento da cadeia leve de comprimento total/cadeia pesada de comprimento total em particular deve ser substituída por uma sequência da cadeia pesada de comprimento total estruturalmente semelhante. Da mesma forma, uma sequência de VL a partir de um emparelhamento VH/VL em particular deve ser substituída por uma sequência VL de estrutura semelhante. Da mesma forma, uma sequência da cadeia pesada de comprimento total a partir de um emparelhamento da cadeia leve de comprimento total/cadeia pesada de comprimento total em particular deve ser substituída por uma sequência da cadeia leve de comprimento total estruturalmente semelhante. Dessa maneira, em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti-ActRIIB recombinante isolado ou a região de ligação ao antígeno do mesmo tendo: uma região variável da cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 99 a 112; e uma região variável da cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo nas SEQ ID NOS: 85 a 98.
[00069] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece: (i) um anticorpo anti-ActRIIB recombinante isolado tendo: uma cadeia pesada de comprimento total que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:99 a 112, e uma cadeia leve de comprimento total compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:85 a 98, ou (ii) uma proteína funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos.
[00070] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece: (i) um anticorpo anti-ActRUB recombinante isolado tendo uma cadeia pesada de comprimento total codificada por meio de uma sequência de nucleotídeos que foi otimizada para a expressão na célula de um mamífero selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 127 a 140, e uma cadeia leve de comprimento total codificada por meio de uma sequência de nucleotídeos que foi otimizada para a expressão na célula de um mamífero selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs:113 a 126, ou (ii) uma proteína funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos.
[00071] As sequências de aminoácidos das CDR1s VH dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 1 a 14. As sequências de aminoácidos das CDR2s VH dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 15 a 28. As sequências de aminoácidos das CDR3s VH dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 29 a 42. As sequências de aminoácidos das CDR1s VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 43 a 56. As sequências de aminoácidos das CDR2s VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 57 a 70. As sequências de aminoácidos das CDR3s VL dos anticorpos são mostradas nas SEQ ID NOs: 71 a 84. As regiões da CDR são delineadas usando o sistema de Kabat (Kabat, EA, et al., 1991 Sequências Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, EUA, Departamento de Saúde e Serviços Humanos, NIH Publication N° 91 a 3242). Um método alternativo de determinação das regiões de CDR usa o método desenvolvido por Chothia (Chothia et al. 1989, Nature, 342:877 a 883). A definição Chothia é com base na localização das regiões do laço estrutural. No entanto, devido às mudanças no sistema de numeração usado por Chothia (vide, por exemplo http://www.bio- chem.ucl.ac.uk/~martin/abs/Generallnfo.htmle http://www.bioinf.or- g.uk/abs /), este sistema é agora menos usado. Outros sistemas para a definição de CDRs existem e também são mencionados nestes dois sites da internet.
[00072] Tendo em conta que cada um desses anticorpos pode ligar- se ao ActRIIB e que a especificidade de ligação aos antígenos é fornecida principalmente por meio das regiões CDR1, 2 e 3, a CDR1 VH, as sequências 2 e 3 e CDR1 VL, as sequências 2 e 3 podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, CDRs a partir de diferentes anticorpos podem ser misturadas e combinadas, cada uma contendo um anticorpo CDR1 VH, 2 e 3 e uma CDR1 VL, 2 e 3 que cria outras moléculas de ligação ao anti-ActRUB da presennte invenção. A ligação ao ActRIIB de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada usando os ensaios de ligação descritos acima e nos exemplos (por exemplo, ELISAs). Quando as sequências de CDR VH são misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VH em particular deve ser substituída por uma sequência (s) de CDR estruturalmente semelhante (s). Da mesma forma, quando as sequências de CDR VL são misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência VL em particular deve ser substituída por uma sequência (s) de CDR estruturalmente semelhantes (s). Será facilmente perceptível para aquele versado na técnica que as nivas sequências de VH e VL podem ser criadas por meio da substituição de uma ou mais das regiões das sequências de CDR VH e/ou VL com sequências estruturalmente similares a partir das sequências CDR mostradas na presente invenção para os anticorpos monoclonais da presente invenção.
[00073] Um anticorpo anti-ActRUB recombinante isolado, ou a região de ligação ao antígeno do mesmo tem: uma cadeia pesada da região variável CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 14; uma cadeia pesada da região variável CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 15 a 28; uma cadeia pesada da região variável CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 29 a 42; uma cadeia leve da região variável CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID: 43 a 56; uma cadeia leve da região variável CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 57 a 70, e uma cadeia leve da região variável CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 71 a 84.
[00074] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 1; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 15; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 29; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 43; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 57, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 71.
[00075] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 2; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 16; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 30; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 44; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 58; e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 72.
[00076] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 3; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 17; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 31; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 45; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 59, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 73.
[00077] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 4; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 18; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 32; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 46; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 60, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 74.
[00078] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 5; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 19; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 33; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 47; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 61, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 75.
[00079] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 6; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 20; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 34; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 48; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 62, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 76.
[00080] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 7; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 21; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 35; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 49; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 63, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 77.
[00081] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 8; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 22; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 36; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 50 a cadeia leve CDR2 região variável da SEQ ID NO: 64, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 78.
[00082] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 9; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 23; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 37; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 51; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 65, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 79.
[00083] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 10; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 24; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 38; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 52; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 66, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 80.
[00084] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 11; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 25; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 39; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 53; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 67, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 81.
[00085] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 12; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 26; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 40; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 54; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 68, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 82.
[00086] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 13; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 27; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 41; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 55; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 69, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 83.
[00087] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: uma cadeia pesada da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 14; uma cadeia pesada da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 28; uma cadeia pesada da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 42; uma cadeia leve da região variável CDR1 da SEQ ID NO: 56; uma cadeia leve da região variável CDR2 da SEQ ID NO: 70, e uma cadeia leve da região variável CDR3 da SEQ ID NO: 84.
[00088] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo: (a) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 85 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 99; (b) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 86 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 100; (c) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 87 e sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 101; (d) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 88 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 102; (e) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 89 e sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 103; (f) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 90 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 104; (g) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 91 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 105; (h) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 92 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 106; (i) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 93 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 107; (j) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 94 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 108; (k) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 95 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 109; (I) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 96 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 110; (m) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 97 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 111, ou (n) a sequência da cadeia pesada variável da SEQ ID NO: 98 e a sequência da cadeia leve variável da SEQ ID NO: 112.
[00089] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um anticorpo compreendendo: (a) a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 146 e a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 141; (b) a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 147 e a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 142; (c) a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 148 e a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 143; (d) a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 149 e a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 144; (e) a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 150 e a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 145; (f) a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 156 e a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 151; (g) a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 157 e a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 152; (h) a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 158 e a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 153; (i) a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 159 e a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 154, ou (j) a sequência da cadeia pesada da SEQ ID NO: 160 e a sequência da cadeia leve da SEQ ID NO: 155.
[00090] Como usado na presente invenção na presente invenção, um anticorpo humano compreende regiões da cadeia pesada ou da cadeia leve variáveis ou cadeias pesadas ou leves de comprimento total que são "o produto de" ou "derivam de" uma determinada sequência de células da linhagem germinais se as regiões variáveis ou as cadeias de comprimento total do anticorpo são obtidos a partir de um sistema que usa os genes de imunoglobulina humana da linhagem germinais. Tais sistemas incluem imunizar um camundongo transgênico portador dos genes de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse ou a triagem de uma biblioteca de genes da imunoglobulina humana exibida no fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "deriva de" uma sequência de imunoglobulina humana da linhagem germinal pode ser identificado como tal, comparando a sequência de aminoácidos do anticorpo humano para as sequências de aminoácidos das imunoglobulinas humanas da linhagem germinais e selecionando a sequência de aminoácidos das imunoglobulinas humanas da linhagem germinais que é a mais próximo em sequência (isto é, a maior % em identidade) para a sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma determinada sequência de imunoglobulina humana da linhagem germinal pode conter diferenças de aminoácidos, em comparação com a sequência de linha da linhagem germinal, devido, por exemplo, as mutações somáticas que ocorrem de forma natural ou a introdução intencional de mutação direcionada ao local. No entanto, um anticorpo humano selecionado é, pelo menos, normalmente 90% idêntico em uma sequência de aminoácidos para uma sequência de aminoácidos codificada por um gene da imunoglobulina humana da linhagem germinal e contém resíduos de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como ser humano quando comparado às sequências de aminoácidos das imunoglobulinas humanas da linhagem germinais de outras espécies (por exemplo, as sequências murinas da linhagem germinais). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser, pelo menos, 80%, 90%, ou, pelo menos, 95%, ou até mesmo, pelo menos, 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntico na sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos codificadas por meio do gene de imunoglobulina da linhagem germinais.Tipicamente, um anticorpo humano derivado a partir de uma determinada sequência humana da linhagem germinal irá exibir mais de 10 diferenças de aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada por meio do gene de imunoglobina humana da linhagem germinal. Em certos casos, o anticorpo humano pode exibir mais do que 5, ou até mesmo não mais de 4, 3, 2, ou uma diferença de aminoácidos da sequência de aminoácidos codificada por meio do gene de imunoglobulina da linhagem germinal.
[00091] Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é codificado por pBW522 ou pBW524 (depositado no DSMZ, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Alemanha, em 18 agosto de 2009 com os números de depósitos e DSM22873 DSM22874, respectivamente).
Anticorpos Homólogos
[00092] Em ainda uma outra modalidade, um anticorpo da presente invenção tem sequências de aminoácidos da cadeia pesada e da cadeia leve de comprimento total; sequências de nucleotídeos da cadeia pesada e da cadeia leve de comprimento total, sequências de nucleotídeos da cadeia pesada e da cadeia leve da região variável ou sequências de nucleotídeos da cadeia pesada e da cadeia leve da região variável que são homólogos aos aminoácidos e sequências de nucleotídeos dos anticorpos descritos na presente invenção, e no qual os anticorpos mantêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-ActRIIB da presente invenção.
[00093] Por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo antiActRIIB recombinante isolado (ou uma proteína funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos) que compreende uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, em que: a região variável da cadeia pesada é composta por uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, ou, pelo menos, 90% (de preferência pelo menos 95, 97 ou 99%) idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 99 a 112; a região variável da cadeia leve compreende um sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, ou, pelo menos, 90% (de preferência pelo menos 95, 97 ou 99%) idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 85 a 98; e o anticorpo exibe pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: (i) inibe a ligação de miostatina in vitro ou in vivo e/ou (ii) diminui a inibição da diferenciação muscular através da via dependente de Smad.
[00094] Em mais um exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-ActRIIB isolado recombinante, (ou uma proteína funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos) compreendendo uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento total, em que: a cadeia pesada de comprimento total compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos Petição 870200074827, de 16/06/2020, pág. 36/140 33/127 80%, ou, pelo menos, 90% (de preferência pelo menos 95, 97 ou 99%) idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 146 a 150 e 156 a 160; a cadeia leve de comprimento total é composta por uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80%, ou, pelo menos, 90% (de preferência pelo menos 95, 97 ou 99%) idêntica a uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 141 a 145 e 151 a 155; e o anticorpo apresenta pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: (i) inibe a ligação à miostatina in vitro ou in vivo e/ou (ii) diminui a inibição da diferenciação muscular através da via Smad-dependente. De preferência como um anticorpo se liga ao domínio de ligação do ligante de ActRIIB.
[00095] Em um outro exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo anti-ActRUB isolado recombinante (ou uma proteína funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos), compreendendo uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento total, em que: a cadeia pesada de comprimento total é codificada por meio de uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80%, ou, pelo menos, 90% (de preferência pelo menos 95, 97 ou 99%) idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 166 a 170 e 176 a 180, a cadeia leve de comprimento total é codificada por meio de uma sequência de nucleotídeos que é pelo menos 80%, ou, pelo menos, 90% (de preferência pelo menos 95, 97 ou 99%) idêntica a uma sequência de nucleotídeos selecionada do grupo que consiste na SEQ ID NOs: 161 a 165 e 171 a 175; e o anticorpo apresenta pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: (i) inibe a ligação à miostatina in vitroou in vivo e/ou (ii) diminui a inibição da diferenciação muscular através da via dependente de Smad. De preferência, tal anticorpo se liga ao domínio de ligação ao ligante de ActRIIB.
[00096] Em modalidades diversas, o anticorpo pode apresentar um ou mais, dois ou mais, ou três das propriedades funcionais discutidas acima. O anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico. De preferência, o anticorpo é um anticorpo IgG 1 plenamente humano.
[00097] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos VH e/ou VL podem ser de 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica às sequências estabelecidas acima. Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos VH e/ou VL podem ser idênticas, exceto em uma substituição de aminoácido em não mais de 1,2, 3,4 ou 5 posições de aminoácidos. Um anticorpo tendo as regiões VH e ou VL possuindo alta identidade (isto é, 80% ou mais) para as regiões VH e VL das SEQ ID NOS: 99 a 112 e SEQ ID NOs: 85 a 98, respectivamente, podem ser obtidas por meio da mutagênese (por exemplo, mutagênese mediada por PCR ou direcionada ao local) das moléculas de ácido nucleico das SEQ ID NOs: 127 a 140 e 113 a 126, respectivamente, seguido pelo teste do anticorpo codificado alterado para a função retida (isto é, as funções estabelecidas acima) usando os ensaios funcionais descritos na presente invenção.
[00098] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos da cadeia pesada de comprimento total e/ou da cadeia leve de comprimento total podem ser de 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas às sequências estabelecidas acima. Um anticorpo tendo uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento total tendo alta identidade (isto é, 80% ou mais) para as cadeias pesadas de comprimento total de qualquer uma das SEQ ID NOS: 146 a 150 e 156 a 160 e as cadeias leves de comprimento total de qualquer uma das SEQ ID NOS: 141 a 145 e 151 a 155, respectivamente, podem ser obtidas por meio da mutagênese (por exemplo, mutagênese mediada por PCR ou direcionada ao local) das moléculas de ácido nucleico das SEQ ID NOs: 166 a 170 e 176 a 180 e das SEQ ID NOs: 161 a 165 e 171 a 175, respectivamente, seguido pelo teste do anticorpo codificado alterado para a função retida (isto é, as funções estabelecidas acima) usando os ensaios funcionais descritos na presente invenção.
[00099] Em outras modalidades, as sequências de aminoácidos da cadeia pesada de comprimento total e/ou da cadeia leve de comprimento total podem ser de 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica às sequências estabelecidas acima.
[000100] Em outras modalidades, as sequências de nucleotídeos das regiões variáveis da cadeia pesada e/ou da cadeia leve podem ser de 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica às sequências estabelecidas acima.
[000101] Como usado na presente invenção, a identidade por cento entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas por meio das sequências (isto é, a % de identidade = n0 de posições idênticas/no total de posições x 100), tendo em conta o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, que precisam ser introduzidos para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação das sequências e a determinação da identidade por cento entre duas sequências podem ser realizadas utilizando um algoritmo matemático, como descrito abaixo.
[000102] A porcentagem da identidade entre as duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e Miller W. (Comput. Appl. Biosci., 4:11 a 17, 1988) que foi incorporada ao programa ALIGN (versão 2.0), utilizando uma tabela de resíduo em peso PAM120, uma penalidade de comprimento da lacuna de 12 e uma penalidade da lacuna de 4. Além disso, a porcentagem de identidade entre as duas sequências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol, Biol. 48:444-453, 1970) que foi incorporada ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso da lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1,2, 3, 4, 5 ou 6.
Anticorpos com modificações conservadoras
[000103] Em certas modalidades, um anticorpo da presente invenção tem uma região variável da cadeia pesada compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 sequências e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3, em que uma ou mais dessas sequências CDR tem as sequências de aminoácidos especificadas com base nos anticorpos descritos na presente invenção ou as modificações conservadoras dos mesmos, e no qual os anticorpos mantem as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-ActRUB da presente invenção. Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo anti-ActRUB isolado recombinante, ou uma proteína funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos, consistindo em uma região variável da cadeia pesada compreendendo as sequências CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências CDR1, CDR2, e CDR3, em que: as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada CDR1 são selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 14, e as modificações conservadoras dos mesmos; sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada CDR2 são selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 15 a 28, e as modificações conservadoras dos mesmos; as sequências de aminoácidos da região variável da cadeia pesada CDR3 são selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 29 a 42, e as modificações conservadoras dos mesmos; as sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve CDR1 são selecionadas a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 43 a 56, e as modificações conservadora dos mesmos; as sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve CDR2 são selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 57 a 70, e as modificações conservadora do mesmo; as sequências de aminoácidos das regiões variáveis da cadeia leve CDR3 são selecionadas do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 71 a 84, e as modificações conservadores do mesmo. De preferência o anticorpo apresenta pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: (i) inibe a ligação à miostatina in vitroou in vivo e/ou (ii) diminui a inibição da diferenciação muscular através da via dependente de Smad.
[000104] Em modalidades diversas, o anticorpo pode apresentar uma ou ambas as propriedades funcionais listadas acima. Tais anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.
[000105] Em outras modalidades, um anticorpo da presente invenção otimizado para a expressão em uma célula de mamífero tem uma sequência da cadeia pesada de comprimento total e uma sequência da cadeia leve de comprimento total, no qual uma ou mais dessas sequências tenha especificado as sequências de aminoácidos com base na anticorpos descritos na presente invenção ou modificações conservadora dos mesmos, e no qual os anticorpos mantêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-ActRUB da presente invenção. Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo monoclonal anti-ActRUB isolado otimizado para a expressão em uma célula de mamíferos consistindo em uma cadeia pesada de comprimento total e uma cadeia leve de comprimento total, em que: a cadeia pesada de comprimento total tem sequências de aminoácidos selecionadas do grupo das SEQ ID NOs: 146 a 150 e 156 a 160, e as modificações conservadora dos mesmos, e a cadeia leve de comprimento total tem as sequências de aminoácidos selecionadas do grupo das SEQ ID NOS: 141 a 145 e 151 a 155, e as modificações conservadora dos mesmos, e o anticorpo apresenta pelo menos uma das seguintes propriedades funcionais: (i) inibe a ligação à miostatina in vitro ou in vivo e/ou (ii) diminui a inibição da diferenciação muscular através da via dependente de Smad.
[000106] Em modalidades diversas, o anticorpo pode apresentar uma ou ambas as propriedades funcionais listadas acima. Tais anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados ou anticorpos quiméricos.
[000107] Como usado na presente invenção, o termo "modificações da sequência conservadora" pretende referir-se às modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácidos. Tais modificações conservadoras incluem as substituições, adições e exclusões de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da presente invenção por meio das técnicas padrão conhecidas na técnica, como mutagênese direcionada ao local e mutagênese mediada por PCR.
[000108] As substituições conservadoras de aminoácidos são aquelas em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. As famílias dos resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas na técnica. Essas famílias incluem os aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares sem carga (por exemplo, glicina, asparagina, serina, glutamina, treonina, cisteína, tirosina, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Dessa maneira, um ou mais resíduos de aminoácidos nas regiões CDR de um anticorpo da presente invenção pode ser substituído por outros resíduos de aminoácidos da mesma família de cadeia lateral, e os anticorpos alterados podem ser testados para a função retida usando os ensaios funcionais descritos na presente invenção.
[000109] Anticorpos que se ligam aos mesmos epítopos que os anticorpos anti-ActRUB da presente invenção
[000110] Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece os anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que os vários anticorpos anti-ActRUB específicos da presente invenção descritos aqui. Todos os anticorpos descritos nos exemplos que são capazes de bloquear a ligação à miostatina ao ActRIIB ligante o mesmo epítopo em ActRIIB com alta afinidade, o dito epítopo sendo compreendido entre os aminoácidos 19 a 134 da SEQ ID NO: 181.
[000111] Os anticorpos adicionais podem, portanto, serem identificados com base em sua capacidade de competição cruzada (por exemplo, para inibir competitivamente a ligação do, de maneira estatisticamente significativa) com outros anticorpos da presente invenção em ensaios de ligação ao ActRIIB padrão. A capacidade de um anticorpo teste para inibir a ligação dos anticorpos da presente invenção para ActRIIB humano demonstra que o anticorpo teste pode competir com os anticorpos para a ligação com ActRIIB humanos; um anticorpo pode, de acordo com uma teoria não limitante, se ligar ao mesmo a um epítopo relacionado (por exemplo, um estruturalmente semelhante ou espacialmente proximal) aoActRIIB humano como o anticorpo com o qual concorre. Em uma modalidade certa, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo no ActRIIB humano como os anticorpos da presente invenção é um anticorpo humano recombinante. Tais anticorpos humanos recombinantes podem ser preparados e isolados, como descrito nos exemplos.
[000112] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 85, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 99.
[000113] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada em SEQ ID NO: 86, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 100.
[000114] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 87, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 101.
[000115] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 88, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 102.
[000116] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 89, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 103.
[000117] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 90, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 104.
[000118] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 91, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 105.
[000119] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 92, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 106.
[000120] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 93, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 107.
[000121] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 94, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 108.
[000122] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 95, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 109.
[000123] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 96, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 110.
[000124] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 97, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 111.
[000125] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo reconhecido por um anticorpo tendo a sequência da cadeia pesada variável recitada na SEQ ID NO: 98, e a sequência da cadeia leve variável recitada na SEQ ID NO: 112.
[000126] Os seguintes experimentos mais detalhados de mapeamento do epítopo, as regiões de ligação de anticorpos preferidos da presente invenção têm sido mais claramente definidos
[000127] Dessa maneira, a presente invenção fornece um anticorpo que se liga a um epítopo compreendendo os aminoácidos 78 a 83 da SEQ ID NO: 181 (WLDDFN - SEQ ID NO: 188).
[000128] A presente invenção também fornece um anticorpo que se liga a um epítopo compreendendo os aminoácidos 76 a 84 da SEQ ID NO: 181 (GCWLDDFNC - SEQ ID NO: 186).
[000129] A presente invenção também fornece um anticorpo que se liga a um epítopo compreendendo os aminoácidos 75 a 85 da SEQ ID NO: 181 (KGCWLDDFNCY - SEQ ID NO: 190).
[000130] A presente invenção também fornece um anticorpo que se liga a um epítopo compreendendo os aminoácidos 52 a 56 da SEQ ID NO: 181 (EQDKR - SEQ ID NO: 189).
[000131] A presente invenção também fornece um anticorpo que se liga a um epítopo compreendendo os aminoácidos 49 a 63 da SEQ ID NO: 181 (CEGEQDKRLHCYASW - SEQ ID NO: 187).
[000132] A presente invenção também fornece os anticorpos que se ligam aos epítopos constituídos por essas sequências ou epítopos compreendendo as combinações destas regiões do epítopo.
[000133] Dessa maneira, a presente invenção também fornece um anticorpo que se liga a um epítopo compreendendo ou que seja constituído dos aminoácidos 78 a 83 da SEQ ID NO: 181 (WLDDFN) e os aminoácidos 52 a 56 da SEQ ID NO: 181 (EQDKR).
Anticorpos projetados e modificados
[000134] Um anticorpo da presente invenção ainda pode ser preparado usando um anticorpo com uma ou mais das sequências VH e/ou VL mostradas na presente invenção como um material de base para projetar um anticorpo modificado, o qual o anticorpo modificado pode ter alterado as propriedades do anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser projetado modificando um ou mais resíduos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura. Adicional ou De forma alternativa, um anticorpo pode ser projetado através da modificação de resíduos na (s) região (ões) constante (s), por exemplo, para alterar a (s) função (ões) efetora (s) do anticorpo.
[000135] Um tipo de engenharia da região variável que pode ser executada é o enxertamento da CDR. Os anticorpos interagem com os antígenos-alvo predominantemente através dos resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões de detrminação da complementaridade (CDRs) da cadeia pesada e da cadeia leve. Por esta razão, as sequências de aminoácidos dentro das CDRs são mais diversificadas entre os anticorpos individuais do que sequências fora das CDRs. Porque as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações antígeno-anticorpo, é possível expressar os anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos específicos que ocorrem naturalmente através da construção de vetores de expressão que incluem as sequências de CDR a partir do anticorpo específico que ocorre naturalmente enxertado em sequências de estrutura de um anticorpo diferente com diferentes propriedades (vide, por exemplo Riechmann, L. et al, 1998 Nature 332:323 a 327;. Jones, P. et al, 1986 Nature 321:522 a 525;. Queen, C. et al, 1989 Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86: 10029 a 10033; Patente dos EUA N° 5.225.539 de Winter, e Patentes dos EUA N °s 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 de Queen etal).
[000136] Dessa maneira, uma outra modalidade da presente invenção diz respeito a um anticorpo anti-ActRUB monoclonal isolado, ou uma proteína funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo uma região variável da cadeia pesada compreendendo as sequências CDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1 a 14; sequências CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 15 a 28; sequências de CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 29 a 42, respectivamente; e uma região variável da cadeia leve CDR1 tendo as sequências tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 43 a 56; sequências CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 57 a 70, e sequências CDR3 consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 71 a 84, respectivamente. Dessa maneira, tais anticorpos contêm as sequências VH e VL de CDR dos anticorpos monoclonais, mas que podem conter as sequências da estrutura diferente desses anticorpos.
[000137] As sequências de tal estrutura podem ser obtidas a partir de bases de dados de DNA público ou referências publicadas que incluem as sequências do gene dos anticorpos da linhagem germinal. Por exemplo, as sequências de DNA da linhagem germinal para os genes humanos das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve podem ser encontradas no banco de dados "Vbase" da sequência de células das linhagens germinais humanas (disponível na Internet em www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, EA, et al, [supra];. Tomlinson, IM, et al, 1992 J. fol.. Biol. 227: 776 a 798, e Cox, J. P. L. etal, 1994 Eur. J. Immunol. 24:827 a 836.
[000138] Um exemplo da sequências de estrutura para a utilização nos anticorpos da presente invenção são aqueles que são estruturalmente similares às sequências de estrutura usadas por anticorpos selecionados da presente invenção, por exemplo, as sequências consenso e/ou as sequências de estrutura usadas por anticorpos monoclonais da presente invenção. As sequências VH CDR1,2 e 3 e as sequências VL CDR1,2 e 3 podem ser enxertadas em regiões de estrutura que têm a sequência idêntica como a encontrada no gene de imunoglobulina da linhagem germinal a partir do qual a sequência de estrutura deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas nas regiões da estrutura que contêm uma ou mais mutações em comparação com as sequências da linhagem germinal. Por exemplo, verificou-se que, em certos casos, é benéfico a mutação dos resíduos dentro das regiões da estrutura para manter ou aumentar a capacidade de ligação do antígeno do anticorpo (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.530.101;. 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queens et al).
[000139] Outro tipo de modificação da região variável é a mutação dos resíduos de aminoácidos dentro das regiões VH e/ou VL CDR1, CDR2 e/ou CDR3 para, assim, melhorar uma ou mais propriedades de ligação (afinidade, por exemplo) do anticorpo de interesse, conhecido como "maturação de afinidade ". A mutagênese direcionada pelo local ou a mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a (s) mutação (ões) e o efeito sobre a ligação de anticorpos, ou outras propriedades funcionais de interesse, podem ser avaliadas em ensaios in vitroou em ensaios in vivo, como descrito na presente invenção e fornecidas nos exemplos. As modificações conservadores (como discutido acima) podem ser introduzidas. As mutações podem ser substituições, acréscimos ou diminuições de aminoácidos. Além disso, geralmente não mais de um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados.
[000140] Dessa maneira, em uma outra modalidade, a presente invenção fornece anticorpos anti-ActRUB monoclonais isolados, ou uma proteína funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos, consistindo em uma região variável da cadeia pesada tendo: a região VH CDR1 consistindo em uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo tendo as SEQ ID NOS: 1 a 14 ou uma sequência de aminoácidos tendo um, dois, três, quatro ou cinco substituições, supressões ou diminuições de aminoácidos em comparação às SEQ ID NOS: 1 a 14; uma região VH CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 15 a 28, ou uma sequência de aminoácidos tendo um, dois, três, quatro ou cinco substituições, supressões ou diminuições de aminoácidos, em comparação com as SEQ ID NOs: 15 a 28; uma região VH CDR3 que tem uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 29 a 42, ou uma sequência de aminoácidos tendo um, dois, três, quatro ou cinco substituições, supressões ou diminuições de aminoácidos, em comparação com as SEQ ID NOs: 29 a 42; uma região VL CDR1 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 43 a 56, ou uma sequência de aminoácidos tendo um, dois, três, quatro ou cinco substituições supressões ou diminuições de aminoácidos em comparação às SEQ ID NOS: 43 a 56; uma região VL CDR2 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 52 a 70, ou uma sequência de aminoácidos tendo um, dois, três, quatro ou cinco substituições, supressões ou diminuições de aminoácidos em comparação à SEQ ID NOS: 52 a 70, e uma região VL CDR3 tendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 71 a 84, ou uma sequência de aminoácidos tendo um, dois, três, quatro ou cinco substituições, supressões ou diminuições de aminoácidos em comparação à SEQ ID NOS: 71 a 84.
Enxertamento dos domínios de ligação ao antígeno em estruturas ou suportes alternativos
[000141] Uma grande variedade de estruturas ou suportes de anticorpos/imunoglobulina pode ser empregada, desde que o polipeptídeo resultante inclua pelo menos uma região de ligação que se liga especificamente ao ActRIIB. Tais estruturas ou suportes incluem os 5 idiotipos principais das imunoglobulinas humanas, ou fragmentos dos mesmos (tais como aqueles descritos em outros lugares na presente invenção), e incluem as imunoglobulinas de outras espécies animais, de preferência tendo aspectos humanizado. Os anticorpos da cadeia pesada única, como os identificados nos camelídeos, são de particular interesse a este respeito. Novas estruturas, suportes e fragmentos continuam a ser descobertos e desenvolvidos por aqueles versados na técnica.
[000142] Em um aspecto, a presente invenção diz respeito a geração de não imunoglobulina com base nos anticorpos usando suportes de não imunoglobulina no qual as CDRs da presente invenção podem ser enxertadas. Conhecidas ou futuras estruturas e suportes de não imunoglobulina podem ser empregadas, desde que elas compreendam a região de ligação específica para a proteína alvo da SEQ ID NO: 181 (de preferência, o domínio ligante de ligação do mesmo, como mostrado na SEQ ID NO: 182). Tais compostos são conhecidos na presente invenção como "polipeptídeos compreendendo uma região de ligação específica alvo ". Exemplos de estrutura de não imunoglobulina estão descritos nas seções abaixo (anticorpos de camelídeos e suportes de não anticorpo).
Anticorpos de camelídeos
[000143] As proteínas de anticorpos obtidas a partir dos membros da família do camelo e dromedário (Camelus bactrianus e Camelus dromaderius), incluindo os membros do novo mundo, tal como a espécie de lhama (Lama paccos, Lama glama e Lama vicugna)foram caracterizadas com relação ao tamanho, complexidade estrutural e antigenicidade para indivíduos humanos. Certos anticorpos IgG a partir desta família de mamíferos como encontrados na natureza faltam cadeias leves, e são, portanto, estruturalmente diferentes da estrutura da cadeia quaternária de quatro típicas tendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, para anticorpos de outros animais (vide WO94/04678).
[000144] A região do anticorpo de camelídeo que é o único domínio variável pequeno identificado como YHU pode ser obtida por meio da engenharia genética para produzir uma pequena proteína com alta afinidade para um alvo, resultando em um baixo peso molecular de anticorpos derivados de proteína conhecida como "camelídeo Nanobody "(vide US5, 759,808; Stijlemans, B. et al, 2004 J Biol Chem 279: 1256 a 1261; Dumoulin, M. et al, 2003 Nature 424: 783 a 788; Pleschberger, M. et al 2003 Bioconjugate. Chem 14: 440 a 448; CortezRetamozo, V. et al 2002 Int J Cancer 89: 456 a 62, e Lauwereys, M. et al 1998 EMBO J 17: 3512 a 3520). As bibliotecas de engenharia de anticorpos e fragmentos de anticorpos de camelídeos estão comercialmente disponíveis, por exemplo, a partir de Ablynx, Ghent, na Bélgica. Tal como acontece com outros anticorpos de origem não humana, uma sequência de aminoácidos de um anticorpo camelídeo pode ser alterada recombinantemente para obter uma sequência que lembra mais uma sequência humana, isto é, o Nanocorpo pode ser "humanizado". Dessa maneira, a antigenicidade natural baixa de anticorpos de camelos para os seres humanos pode ser ainda mais reduzida. O Nanocorpo de camelídeo tem um peso molecular de aproximadamente um décimo de uma molécula de IgG humana, e a proteína tem um diâmetro físico de apenas alguns nanômetros. Uma consequência do pequeno tamanho é a capacidade de nanocorpos de camelídeo de ligar os locais antigênicos que são funcionalmente invisíveis para proteínas maiores de anticorpos, isto é os nanocorpos de camelídeo são úteis como reagentes de detecção de antígenos que são de outra maneira enigmáticos utilizando as técnicas imunológicas clássicas, e como possíveis agentes terapêuticos. Dessa maneira, mais uma consequência do tamanho reduzido é que um Nanocorpo de camelídeo pode inibir como resultado de uma ligação a um local específico em um sulco ou fenda estreita de uma proteína-alvo, e, portanto, podem servir em uma capacidade que mais se assemelha a função de um clássico de fármacos de baixo peso molecular do que a de um anticorpo clássico.
[000145] O baixo peso molecular e o tamanho compacto resultam ainda em nanocorpos de camelídeo sendo extremamente termoestável, estável a pH extremos e à digestão proteolítica, e mal antigênica. Outra consequência é que os nanocorpos de camelídeo facilmente movem-se do sistema circulatório nos tecidos, e até mesmo atravessam a barreira hemato-encefálica e podem tratar os distúrbios que afetam o tecido nervoso. Os nanocorpos podem ainda facilitar o transporte do fparmaco através da barreira hematoencefálica (vide US2004/0161738). Estes recursos, combinados com a baixa antigenicidade para os seres humanos indicam grande potencial terapêutico. Além disso, essas moléculas podem ser totalmente expressas em células procarióticas como a E. coli e são expressas como as proteínas de fusão com bacteriófagos e são funcionais.
[000146] Dessa maneira, uma característica da presente invenção é um anticorpo ou nanocorpo de camelídeo tendo alta afinidade para ActRIIB. Em certas modalidades na presente invenção, o anticorpo ou o nanocorpo de camelídeo é produzido naturalmente no animal camelídeo, isto é, é produzido por meio do camelídeo seguindo a imunização com ActRIIB ou um fragmento de peptídeo do mesmo, usando técnicas nele descritas para outros anticorpos. De forma alternativa, o nanocorpo de camelídeo anti-ActRUB é projetado, isto é, produzidos por meio da seleção por exemplo, de uma biblioteca de fago que exibe adequadamente as proteínas do nanocorpo de camelídeo mutagenizadas utilizando os procedimentos com ActRIIB como um destino, como descrito nos exemplos na presente invenção. A engenharia dos nanocorpos pode ainda ser personalizada por meio da engenharia genética para ter uma meia vida em um indivíduo receptor de 45 minutos a duas semanas. Em uma modalidade específica, os anticorpos ou o nanocorpo de camelídeos são obtidos por enxertamento das sequências de CDRs da cadeia pesada ou leve dos anticorpos humanos da presente invenção em um nanocorpo ou em sequências da estrutura de anticorpos em um único domínio, como descrito por exemplo em WO94/04678.
Suporte de Não anticorpo
[000147] As estruturas ou suportes de não imuniglobulina conhecidos incluem, mas não estão limitadas a, Adnectinas (fibronectina) (Compound Therapeutics, Inc., Waltham, MA), anquirina (Partners Molecular AG, Zurich, Suíça), anticorpos de domínio (Domantis, Ltd (Cambridge, MA) e Ablynx nv (Zwijnaarde, Bélgica)), lipocalina (Anticalin) (Pieris Proteolab AG, Freising, Alemanha), pequenos moduladores imuno-farmacêuticos (Trubion Pharmaceuticals Inc., Seattle, WA), maxicorpos (Avidia, Inc. (Mountain View, CA)), Proteína A. (Affibody AG, Suécia) e afilina (ácido gama-cristalinas ou ubiquitina) (SCIL Proteínas GmbH, Halle, Alemanha), miméticos de proteínas do epítopo (Polyphor Ltd, Allschwil, Suíça) (i) Suporte de fibronectina
[000148] Os suportes de fibronectina são baseados, de forma preferencial, no domínio de fibronectina tipo III (por exemplo, o décimo módulo da fibronectina tipo III (domínios 10 FN3)). O dominio de fibronectina tipo II tern 7 ou 8 cepas beta, que são distribuídas entre duas cepas beta, as quais se embalam umas contra as outras para formar o núcleo da proteína, e ainda contendo loops (análogo ao CDRs) que ligam as cepas beta umas as outras e são solventes expostos. Há pelo menos três loops como em cada extremidade do sanduíche da cepa beta, onde a borda é o limite da proteína perpendicular à direção das cepas fios beta (Patente U.S. 6.818.418).
[000149] Estes suportes baseados na fibronectina não são uma imunoglobulina, embora o dobramento geral está intimamente relacionado com o do menor fragmento do anticorpo funcional, a região variável da cadeia pesada, que compreende a unidade de reconhecimento total do antígeno na IgG do camelo e da lhama. Devido a esta estrutura, o anticorpo de não imunoglobulina imita as propriedades de ligação ao antígeno que são semelhantes em natureza e afinidade com as dos anticorpos. Estes suportes podem ser usados em um loop de estratégia de randomização e embaralhamento in vitro que seja semelhante ao processo de maturação de afinidade dos anticorpos in vivo. Estas moléculas baseadas em fibronectina podem ser usadas como suportes, onde as regiões de loop da molécula podem ser substituídas por CDRs da presente invenção usando técnicas de clonagem padrão. (ii) Parceiros Moleculares - anquirina
[000150] A tecnologia é baseada no uso de proteínas com módulos de repetição derivados de anquirina como suporte para sustentar as regiões variáveis que podem ser usadas para a ligação com alvos diferentes. O módulo de repetição de anquirina é um aminoácido 33 do polipeptídeo que consiste em duas a-hélices antiparalelas e um β-turn. A ligação das regiões variáveis é mais otimizada usando a exibição do ribossomo. (iii) Maxicorpos/Avímeros - Avidia
[000151] Os avímeros são derivados a partir da proteína contendo o domínio A natural tais como LRP-1. Estes domínios são usados pela natureza para interações da proteína-proteína e em seres humanos mais de 250 proteínas são estruturalmente baseadas nos domínios A. Os avímeros consistem em um número de monômeros do "domínio A"diferentes (2 a 10) ligados através de ligadores de aminoácidos. Os avímeros podem ser criados, os quais podemm se ligar ao antígeno- alvo utilizando a metodologia descrita, por exemplo, US2004/0175756; US2005/0053973; US2005/0048512 e US2006/0008844. (vi) Proteína A - Afficorpo
[000152] Os ligantes Affibody® de afinidade são proteínas pequenas, simples compostos por um conjunto de três hélices com base no suporte de um dos domínios de ligação a IgG da proteína A. A proteína A é uma proteína de superfície da bactéria Staphylococcus aureus. Esse domínio de suporte consiste em 58 aminoácidos, 13 dos quais foram distribuídos aleatoriamente para gerar bibliotecas Affibody® com um grande número de variantes do ligante (Vide, por exemplo EUA 5.831.012). As moléculas de Affibody® imitam os anticorpos, elas têm um peso molecular de 6 kDa, em comparação com o peso molecular dos anticorpos, que é de 150 kDa. Apesar de seu pequeno tamanho, o local de ligação de moléculas Affibody® é semelhante ao de um anticorpo. (v)
Anticalinas - Pieris
[000153] Anticalins® são produtos desenvolvidos pela empresa Pieris ProteoLab AG. Elas são derivados de lipocalinas, um grupo generalizado de proteínas pequenas e robustas que estão normalmente envolvidas no transporte fisiológico ou armazenamento de compostos quimicamente sensíveis ou insolúveis. Várias lipocalinas naturais ocorrem em tecidos humanos ou líquidos do corpo.
[000154] A arquitetura de proteína é uma reminiscência das imunoglobulinas, com loops hipervariáveis em cima de uma estrutura rígida. No entanto, em contraste com os anticorpos ou os fragmentos recombinantes dos mesmos, as lipocalinas são compostas por uma única cadeia de polipeptídeo com 160 a 180 resíduos de aminoácidos, sendo apenas marginalmente maior do que um domínio de imunoglobulina único.
[000155] O conjunto de quatro loops, que constitui o bolso de ligação, mostra a plasticidade estrutural pronunciada e tolera uma variedade da cadeias laterais. O local de ligação pode assim ser reformulado em um processo patenteado, a fim de reconhecer as moléculas-alvo prescritas de forma diferente com alta afinidade e especificidade.
[000156] Uma proteína da família de lipocalina, a proteína de ligação á bilina (BBP) de Pieris brassicae tem sido usada para desenvolver as anticalinas por meio da mutagênese do conjunto de quatro loops. Um exemplo de um pedido de patente descrevendo as "anticalinas" é WO1999/16873. (vi) Afilina - Proteínas SCIL
[000157] Moléculas Affilin® são pequenas proteínas de não imunoglobulina que são projetadas para afinidades específicas para proteínas e pequenas moléculas. As novas moléculas Affilin® podem ser muito rapidamente selecionadas a partir de duas bibliotecas, cada uma dos quais é baseada em uma proteína de suporte derivado de ser humano diferente.
[000158] As moléculas Affilin®não apresentam homologia estrutural das proteínas de imunoglobulina. As proteínas SCIL empregam dois suportes Affilin® um dos quais é gama cristalina, uma proteína estrutural da lente do olho humana e o outro é a superfamília de proteínas "ubiquitina". Ambos os suportes humanos são muito pequenos, mostram estabilidade de temperatura alta e são quase resistente às mudanças de pH e agentes desnaturantes. Esta alta estabilidade é principalmente devido à estrutura expandida da cepa beta das proteínas. Exemplos de gama cristalina derivados das proteínas são descritos em W02001/004144 e exemplos de proteínas do tipo "ubiquitina" são descritos no W02004/106368. (vii) Miméticos da Proteína do Epítopo (PEM)
[000159] PEM são moléculas de tamanho médio, cíclicas, do tipo peptídeo (MW 1-2kDa) imitando as estruturas secundárias beta hairpin [página 33/linha 16] das proteínas, a principal estrutura secundária envolvidos nas interações proteína-proteína.
Estrutura ou engenharia de Fc
[000160] A engenharia dos anticorpos da presente invenção inclui aqueles em que as modificações foram feitas para resíduos da estrutura em VH e/ou VL, por exemplo, para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, tais modificações da estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem é "mutada" em um ou mais resíduos da estrutura para a sequência da linha da linhagem germinal correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter resíduos de estrutura que diferem da sequência da linha da linhagem germinal a partir do qual o anticorpo é derivado. Estes resíduos podem ser identificados por meio da comparação das sequências da estrutura dos anticorpos para as sequências da linha da linhagem germinal a partir do qual o anticorpo é derivado. Para retornar a sequência da região da estrutura para a sua configuração da linhagem germinal, as mutações somáticas podem ser "mutadas" para a sequência da linha da linhagem germinal, por exemplo, a mutagênese de local direcionado ou a mutagênese mediada por PCR. Tais anticorpos "mutados" também se destinam a ser abrangidos pela presente invenção.
[000161] Outro tipo de modificação da estrutura envolve a mutação de um ou mais resíduos na região da estrutura, ou mesmo dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover as células T epítopos para assim reduzir o potencial da imunogenicidade de anticorpos. Esta abordagem é também referida como "desimunização" e é descrita em mais detalhes no US2003/0153043.
[000162] Além disso, ou uma alternativa para as modificações feitas na estrutura ou regiões CDR, os anticorpos da presente invenção podem ser projetados para incluir modificações no interior da região Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais dos anticorpos, tais como a fixação meia-vida do complemento, soro, a ligação do receptor Fc e/ou a citotoxicidade celular dependente do antígeno. Além disso, um anticorpo da presente invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais porções de produtos químicos pode ser anexado ao anticorpo) ou ser modificado para alterar a sua glicosilação, mais uma vez para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma dessas modalidades é descrita em detalhes mais adiante. A numeração de resíduos na região Fc é a do índice europeu de Kabat.
[000163] Em uma modalidade, a região da dobradiça da CH1 é modificada de tal forma que o número de resíduos de cisteína na região da dobradiça é alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta abordagem é descrita adiante na Patente U.S. 5.677.425. O número de resíduos de cisteína na região da dobradiça da CH1 é alterado para, por exemplo, facilitar a montagem das cadeias leves e pesadas ou para aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.
[000164] Em uma outra modalidade, a região Fc da dobradiça de um anticorpo é modificada para diminuir a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface do domínio CH2-CH3 do fragmento da dobradiça Fc de modo que o anticorpo tem prejudicado a ligação da proteína A de Staphylococcyl (SpA) à ligação do domínio nativo SpA da dobradiça de Fc. Esta abordagem está descrita em mais detalhes na Patente U.S. 6.165.745.
[000165] Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar a sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, como descrito na Patente U.S.6.277.375. Como alternativa, para aumentar a meia vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro do CH1 ou da região CL para conter um receptor de salvamento de ligação ao epítopo tomado a partir de dois loops de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, como descrito na Patente U.S. 5.869.046 e Patente U.S. 6.121.022.
[000166] Em ainda outras modalidades, a região Fc é alterada por meio da substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar as funções efetoras dos anticorpos. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo aminoácido diferente de tal forma que o anticorpo tem uma afinidade alterada para um ligante efetor, mas retém a capacidade de ligação ao antígeno do anticorpo pai. O ligante efetor para o qual a afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc ou o componente C1 do complemento. Esta abordagem está descrita em mais detalhes na Patente U.S. 5.624.821 e Patente U.S. 5.648,260, ambas por Winter et al. Em particular, os resíduos 234 e 235 podem ser mutante. Em particular, estas mutações podem ser a alanina. Dessa maneira, em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção tem uma mutação na região Fc em um ou ambos os aminoácidos 234 e 235. Em outra modalidade, um ou ambos os aminoácidos 234 e 235 podem ser substituídos para alanina. A substituição de ambos os aminoácidos 234 e 235 para alanina resulta em uma atividade ADCC reduzida.
[000167] Em uma outra modalidade, um ou mais aminoácidos selecionados a partir dos resíduos de aminoácidos podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de tal forma que o anticorpo alterou a ligação C1q e/ou reduziu ou suprimiu a citotoxicidade dependente do complemento (CDC). Esta abordagem está descrita em mais detalhes na Patente U.S. 6.194.551.
[000168] Em uma outra modalidade, um ou mais resíduos de aminoácidos são alterados para assim alterar a capacidade do anticorpo em fixar o complemento. Esta abordagem é descrita adiante na WO94/29351.
[000169] Em ainda uma outra modalidade, a região Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo para mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e/ou para aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor Fcγ modificando um ou mais aminoácidos. Esta abordagem é descrita adiante no WO00/42072. Além disso, os pontos de ligação da IgG1 humana para FcγRl, FcγRII, FcγRIII e FcRn foram mapeados e as variantes com ligação melhorada têm sido descritas (vide Shields, RL et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591 a 6604).
[000170] Em ainda uma outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo não glicosilado pode ser feito (isto é, o anticorpo não tem glicosilação). A glicosilação pode ser alterada, por exemplo, aumentando a afinidade do anticorpo para o antígeno. As modificações de carboidratos como pode ser feita, por exemplo, alterando um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência de anticorpos. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácidos podem ser feitas, as quais resultam na eliminação de uma ou mais variáveis da estrutura da região dos locais de glicosilação para assim eliminar a glicosilação naquele llocal. Tal não glicolisação pode aumentar a afinidade do anticorpo para o antígeno. Tal abordagem é descrita em mais detalhes na Patente U.S, N ºs 5.714.350 e 6.350.861 por Co et al.
[000171] Adicional ou de forma alternativa, um anticorpo pode ser feito de maneira tal que tem um tipo alterado de glicosilação, como um anticorpo hipofucosilado o qual possui quantidades reduzidas de resíduos fucosila ou um anticorpo tendo aumentado a biseção das estruturas GlcNAc. Tais padrões de glicosilação alterados têm sido demonstrados para aumentar a capacidade ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidratos podem ser feitas, por exemplo, por meio da expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com máquinas de glicosilação alteradas. As células com máquinas de glicosilação alteradas têm sido descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras para expressar os anticorpos recombinantes da presente invenção para, assim, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, EP 1176195 da Hang et al. descreve uma linhagem de células com um gene FUT8 funcionalmente interrompido, que codifica uma transferase de fucosila, de modo que os anticorpos expressos em tais linhagem de células que exibem uma hipofucosilação. Portanto, em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção são produzidos por meio da expressão recombinante em uma linhagem de células que apresenta um padrão de hipofucosilação, por exemplo, uma linhagem de células de mamíferos com a expressão deficiente do gene que codifica FUT8 fucosiltransferase. WO03/035835 descreve uma variante da linhagem de células CHO, as células Lecl3, com capacidade reduzida para anexar fucose para Asn (297) ligada aos hidratos de carbono, também resultando em hipofucosilaçção de anticorpos expressos nesse célula hospedeira (vide também Shields, RL et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733 a 26740). WO99/54342 descreve as linhagens de células projetadas para expressar as transferases de glicosila modificando a glicoproteína (por exemplo, beta (1,4)-N acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) tais que os anticorpos expressos na engenharia das linhagens celulares apresentam um aumento da biseção das estruturas GlcNAc o que resulta em aumento da atividade ADCC dos anticorpos (vide também Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176 a 180). De forma alternativa, os anticorpos da presente invenção podem ser produzidos em uma levedura ou fungos filamentosos projetados para a glicosilação padrão do tipo de mamíferos, e capaz de produzir os anticorpos com falta de fucose como glicosilação padrão (vide, por exemplo EP1297172B1).
[000172] Outra modificação dos anticorpos na presente invenção que é contemplada pela presente invenção é a peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado, por exemplo, aumentando a meia-vida biológica (soro, por exemplo) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo ou fragmento do mesmo, normalmente é reagido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivados de aldeídos de PEG, nas condições em que um ou mais grupos PEG se ligam ao fragmento de anticorpo ou anticorpos. A peguilação pode ser realizada por meio de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula PEG reativa (ou um análogo reativo do polímero solúvel em água). Como usado na presente invenção, o "polietileno glicol" é destinado a enquadrar qualquer uma das formas de PEG, que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1-C10)-alcóxi ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol- maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo não glicosilado. Os métodos para peguilação das proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da presente invenção (vide, por exemplo, EP0154316 e EP0401384).
[000173] Outra modificação dos anticorpos que é contemplada pela presente invenção é um conjugado ou uma proteína de fusão de pelo menos a região de ligação ao antígeno do anticorpo da presente invenção às proteínas séricas, tais como albumina de soro humano ou um fragmento do mesmo para aumentar a meia-vida da molécula resultante (vide, por exemplo, EP0322094).
[000174] Outra possibilidade é uma fusão de pelo menos a região de ligação ao antígeno do anticorpo da presente invenção às proteínas capazes de se ligares às proteínas séricas, como a albumina de soro humano para aumentar a meia-vida da molécula resultante (vide, por exemplo, EP0486525). Métodos de engenharia de anticorpos alterados
[000175] Como discutido acima, os anticorpos anti-ActRUB possuem as sequências VH e VL ou as sequências da cadeia leve e pesada de comprimento total mostradas na presente invenção que podem ser usadas para criar novos anticorpos anti-ActRUB modificando as sequências da cadeia de comprimento total e/ou a cadeia leve de comprimento total, as sequências VH e/ou VL, ou a (s) região (ões) constante (s) a ele inerentes. Dessa maneira, em um outro aspecto da presente invenção, as características estruturais de um anticorpo anti- ActRIlB da presente invenção são usadas para criar estruturalmente os anticorpos anti-ActRUB que mantêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da presente invenção, tal como a ligação para ao ActRIIB humano mas também inibem uma ou mais propriedades funcionais de ActRIIB (por exemplo, a inibição da ativação Smad).
[000176] Por exemplo, uma ou mais regiões CDR dos anticorpos da presente invenção, ou mutações das mesmas, podem ser combinadas com as regiões recombinantemente combinadas com as regiões de estrutura e/ou outras CDRs conhecidas para criar anticorpos anti- ActRIlB de engenharia recombinantemente adicionais da presente invenção, como discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aqueles descritos na seção anterior. O material de partida para o método de engenharia é uma ou mais das sequências VH e/ou VL contidas na presente invenção, ou uma ou mais regiões CDR do mesmo. Para criar a engenharia do anticorpo, não é necessário para realmente preparar (isto é, expressa como uma proteína) um anticorpo com um ou mais das sequências VH e/ou VL contidas na presente invenção, ou uma ou mais regiões CDR do mesmo. Em vez disso, as informações contidas na (s) sequência (s) são usadas como material de partida para criar sequência (s) de "segunda geração" derivada da (s) sequência (s) original (is) e então a sequência (s) de "segunda geração"é preparada e expressa como uma proteína.
[000177] Dessa maneira, em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método para preparar um anticorpo anti-ActRUB que consiste em: uma sequência de anticorpo da região variável da cadeia pesada possuindo uma sequência CDR1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 1 a 14, uma sequência CDR2 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 15 a 28 e/ou uma sequência CDR3 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 29 a 42, e uma sequência de anticorpo da região variável da cadeia leve CDR1 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 43 a 56, uma sequência CDR2 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 57 a 70 e/ou uma sequência CDR3 selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 71 a 84; alterar pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo da região variável da cadeia pesada e/ou da sequência de anticorpo da região variável da cadeia leve para criar pelo menos uma sequência de anticorpos alterada, e expressando a sequência de anticorpos alterada como uma proteína.
[000178] Dessa maneira, em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um método para preparar um anticorpo anti ActRIIB otimizado para expressão em uma célula de mamíferos consistindo em: uma sequência de anticorpo da cadeia pesada de comprimento total possuindo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOS: 146 a 150 e 156 a 160, e uma sequência de anticorpo da cadeia leve de comprimento total possuindo uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 141 a 145 e 151 a 155; alterar pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência de anticorpo da cadeia pesada de comprimento total e/ou sequência de anticorpo da cadeia leve de comprimento total para criar pelo menos uma sequência de anticorpos alterada, e expressando a sequência de anticorpos alterada como uma proteína.
[000179] A sequência de anticorpos alterada também pode ser preparada por meio de bibliotecas de pesquisa de anticorpos tendo fixado as sequências CDR3 selecionadas entre o grupo que consiste nas SEQ ID NO: 29 a 42 e SEQ ID NO: 71 a 84 ou determinantes de ligação mínima essenciais, como descrito no US2005/0255552 e a diversidade de CDR1 e CDR2 nas sequências. A triagem pode ser realizada de acordo com qualquer tecnologia de rastreio adequada para os anticorpos de triagem das bibliotecas de anticorpos, tais como a tecnologia de exposição de fago.
[000180] As técnicas de biologia molecular padrão podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpos alterada. O anticorpo codificado por meio da sequência (s) de anticorpos alterada (s) é aquele que mantém uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos anti-ActRUB descritos na presente invenção, tendo em vista que as propriedades funcionais incluem, mas não estão limitadas a, ligação a ActRIIB humanos e a inibição da ativação Smad.
[000181] O anticorpo alterado pode apresentar uma ou mais, duas ou mais, três ou mais das propriedades funcionais discutidas acima.
[000182] As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas usando os testes padrão disponíveis na técnica e/ou descritas na presente invenção, tais como as estabelecidos nos Exemplos (por exemplo, ELISAs).
[000183] Em certas modalidades dos métodos de engenharia dos anticorpos da presente invenção, as mutações podem ser introduzidas de forma aleatória ou seletiva ao longo de todo ou parte de uma sequência de codificação dos anticorpos anti-ActRUB e os anticorpos anti-ActRUB modificados resultantes podem ser rastreados para a atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais como descritas na presente invenção. Os métodos de mutações foram descritos na técnica. Por exemplo, W002/092780 descreve os métodos para criar e a triagem das mutações dos anticorpos, por meio da mutagênese de saturação, a montagem da ligação sintética, ou uma combinação dos mesmos. De forma alternativa, WO03/074679 descreve os métodos de usar os métodos de triagem computacional para otimizar as propriedades físico-químicas dos anticorpos.
Moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos da presente invenção
[000184] Outro aspecto da presente invenção diz respeito às moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos da presente invenção. Os exemplos das sequências de nucleotídeo da cadeia leve de comprimento total otimizadas para a expressão em uma célula de mamífero são mostrados nas SEQ ID NOs: 161 a 165 e 171 a 175. Exemplos das sequências de nucleotídeo da cadeia pesada otimizadas para a expressão em uma célula de mamífero são mostrados nas SEQ ID NOs: 166 a 170 e 176 a 180.
[000185] Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisado celular, ou podem ser ácidos nucleicos em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente puro. Um ácido nucleico é "isolado" ou "prestado substancialmente puro" quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, por meio de técnicas-padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, cromatografia em coluna CsCI, eletroforese em gel de agarose e outros bem-conhecidos na técnica. Vide, F. Ausubel, et al., Ed. 1987 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, New York. Um ácido nucleico da presente invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter sequências intrônicas. Em uma modalidade, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA. O ácido nucleico pode estar presentes em um vetor como um vetor de exposição de fago, ou em um vetor recombinante de plasmídeo. A presente invenção também fornece os vetores referidos como pBW522 e pBW524 (depositadas no DSMZ, Inhoffenstr. 7B, D- 38124 Braunschweig, Alemanha em 18 de Agosto de 2009 sob os números de depósitos e DSM22873 DSM22874, respectivamente).
[000186] Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser obtidos por meio das técnicas de biologia molecular. Para anticorpos expressos por meio dos hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados a partir de camundongos transgênicos portadores de genes de imunoglobulina humana como descrito mais abaixo), codificação de cDNAs das cadeias leve e pesada do anticorpo feita pelo hibridoma pode ser obtido por amplificação por PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA. Para a detecção de anticorpos obtidos a partir de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (por exemplo, usando técnicas de exposição de fago), o ácido nucleico codificando os anticorpos pode ser recuperados a partir dos vários clones de fago que são membros da biblioteca.
[000187] Também estão incluídas no âmbito da presente invenção as sequências de ácido nucleico variante que compreendem uma ou mais exclusões, adições ou substituições. Em uma modalidade, a presente invenção compreende uma ou mais das SEQ ID NOS: 113 a 140 ou 161 a 180, que compreende uma substituição conservadora de nucleotídeos. Devido à degeneração do código genético, um aminoácido pode ser codificado por mais de um códon. Dessa maneira, é possível alterar a sequência de nucleotídeos, enquanto que a sequência de aminoácido traduzida permanece a mesma.
[000188] Uma vez que os fragmentos de DNA codificando os segmentos VH e VL são obtidos, esses fragmentos de DNA podem ainda ser manipulados por meio de norma técnicas de DNA recombinante, por exemplo, para converter os genes da região variável para os genes da cadeia de anticorpos de comprimento total, os genes do fragmento Fab a um gene scFv. Nessas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VL ou VH é operativamente ligado a outra molécula de DNA, ou a um fragmento de codificação de uma outra proteína, como uma região de anticorpos constante ou um ligador flexível. O termo "ligados de forma operacional", como usado neste contexto, pretende significar que os dois fragmentos de DNA são unidos de forma funcional, por exemplo, de tal forma que as sequências de aminoácidos codificadas por dois fragmentos de DNA permanecem na estrutura, ou de tal forma que a proteína é expressa sob controle de um promotor desejado.
[000189] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido para um gene da cadeia pesada de comprimento total por meio da ligação, de forma operacional, ao DNA que codifica VH para outra molécula de DNA de codificação das regiões constante da cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes da cadeia pesada humana da região constante são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat, EA, et al. [Supra]) e os fragmentos de DNA que englobam essas regiões podem ser obtidos por meio da amplificação PCR padrão. A região constante da cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG 1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD. Em algumas modalidades, a região contstante da cadeia pesada é selecionada entre os isotipos lgG1. Para um gene da cadeia pesada do fragmento Fab, o DNA de codificação VH pode ser ligada, de forma operacional, a outra molécula de DNA que codifica apenas a cadeia pesada CH1 da região constante.
[000190] O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido para um gene da cadeia leve de comprimento total (bem como a um gene da cadeia leve de Fab) por meio da ligação, de forma operacional, ao DNA que codifica VL para outra molécula de DNA de codificação das regiões constante da cadeia leve. As sequências de genes da cadeia leve humana da região constante são conhecidos na técnica (vide, por exemplo Kabat, EA, et al. [Supra]) e os fragmentos de DNA que englobam essas regiões podem ser obtidos por meio da amplificação de PCR padrão. A região constante da cadeia leve pode ser um kappa ou lâmbda de uma região constante.
[000191] Para criar um gene scFv, os fragmentos de codificação de DNA VH e VL são operativamente ligado a outro fragmento de codificação de um ligador flexível, por exemplo, codificando a sequência de aminoácidos (Gly4-Ser) 3, tal que as sequências VH e VL podem ser expressas como uma única proteína da cadeia contígua, com as regiões VL e VH unidas pelo ligador flexível (vide, por exemplo Bird et al., 1988 Science 242:423 a 426; Huston et al, 1988 Proc Natl Acad Sei EUA 85:5879 a 5883; McCafferty et al, 1990 Nature 348:552 a 554).
[000192] Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser usados na prestação de gene. Isto é, os ácidos nucleicos codificando os polipeptídeos (anticorpos ou proteínas funcionais) da presente invenção podem ser entregues diretamente a um paciente para a tradução no paciente.
[000193] O ácido nucleico é tipicamente "empacotado"para a administração a um paciente. Os veículos de entrega de genes podem ser não virais, tais como lipossomas, ou vírus deficiente de replicação, como adenovirus como descrito por Berkner, KL, em Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 39 a 66 (1992) ou vetores do vírus associado a adeno (AAV), como descrito por Muzyczka, N., em Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97 a 129 (1992) e Patente U.S. N° 5.252.479. De forma alternativa, um retrovirus, tal como um lentivírus podem ser usados. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser projetada para a expressão em um vetor retroviral defeituosa no que diz respeito à replicação. Este constructo de expressão pode então ser isolado e introduzido em uma célula de embalagens transduzidas com um vetor retroviral contendo plasmídeo que codifica o RNA polipeptídeo, de modo que a célula de embalagem agora produza partículas virais infecciosas que contém o gene de interesse. Estas células produtoras podem ser administradas a um indivíduo para as células de engenharia in vivo e para a expressão do polipeptídeo in vivo (vide Capítulo 20, Gene Therapy Genética and Other Molecular Genetic based Theerapeutic Appproaches, (e referências citada) em Human Molecular Genetics (1996), T Strachan e Read AP, BIOS Scientific Publishers Ltd).
[000194] Outra abordagem é a administração de "DNA nu", no qual o gene terapêutico é injetado diretamente na corrente sanguínea ou no tecido muscular.
Geração de anticorpos monoclonais da presente invenção
[000195] Os anticorpos monoclonais (mAbs) podem ser produzidos por meio de uma variedade de técnicas, incluindo,a metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a norma técnica de hibridação somática da célula de Kohler e Milstein (1975 Nature 256: 495). Muitas técnicas para a produção de anticorpos monoclonais podem ser empregadas por exemplo, transformação viral ou oncogênicos de linfócitos B.
[000196] Um sistema animal para preparar hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para o isolamento de esplenócitos imunizados para a fusão são conhecidos na área. Os parceiros de fusão (por exemplo, as células de mieloma murino) e os procedimentos de fusão também são conhecidos. Os anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na sequência de um anticorpo monoclonal murino preparado como descrito acima. DNA que codifica a imunoglobulinas da cadeia leve e pesada pode ser obtido a partir do hibridoma murino de interesse e de engenharia para conter as sequências de imunoglobulina não murino (humanos, por exemplo) usando técnicas de biologia molecular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis de murino podem ser ligadas às regiões constantes humanas usando os métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, a Patente U.S. 4.816.567). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões murino de CDR podem ser inseridas em uma estrutura humano usando os métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo Patente U.S. Nº 5.225.539; 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370).
[000197] Em uma determinada modalidade, os anticorpos da presente invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra ActRIIB podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossômicos carregando partes do sistema imunológico humano em vez do sistema de camundongo. Esses camundongos transgênicos e camundongos transcromossômicos incluem os camundongos referidos na presente invenção como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente mencionados na presente invenção como "camundongos humanos lg."
[000198] O camundongo HuMAb® (Medarex, Inc.) contém o gene miniloci da imunoglobulina humana que codifica as sequências de imunoglobulina humana da cadeia leve K e pesada(p e y) não reorganizadas, articulaçãomente com as mutações que inativam o alvo p endógeno e loci da cadeia K (vide, por exemplo Lonberg, et al, 1994 Nature 368 (6474):. 856 a 859). Dessa maneira, os camundongos apresentam a expressão reduzida de camundongo IgM ou K, e em resposta à imunização, os transgenes da cadeiia leve e da cadeia pesada humanos introduzidos submetem a classe de comutação e mutação somática para gerar alta afinidade humano IgGK monoclonal (Lonberg, N. et al., 1994 [supra]; revisto em Lonberg, N., 1994 Handbook of Experimental Pharmacology 113:49 a 101; Lonberg, N. e Huszar, D., 1995 Intern Rev. Immunol.13: 65 a 93, e Harding, F. e Lonberg, N., 1995 Ann. NY Acad. Sci. 764:536 a 546). A preparação e a utilização de camundongos HuMAb, e as modificações do genoma realizadas por meio de tais camundongos, é descrita em Taylor, L. et al, 1992 Nucleic Acids Research 20:6287 a 6295; Chen, J. et al, 1993 Internacional Immunology 5: 647 a 656; Tuaillon et al, 1993 Proc Natl. Acad. Sci. EUA 94:3720 a 3724; Choi etal, 1993 Nature Genetics 4:117 a 123; Chen, J. etal, 1993 EMBOJ. 12:. 821 a 830; Tuaillon etal, 1994 J. Immunol. 152:2912 a 2920; Taylor, L. et al, 1994 Internacional Immunology 579 a 591; e Fishwild, D. et al, 1996 Nature Biotechnology 14: 845 a 851, o conteúdo de todos que estão na presente invenção especificamente incorporados por referência em sua totalidade. Vide ainda, Patente U.S. N°s 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.770.429 e 5.545.807, bem como WO92/103918, WO93/12227, WO94/25585, WO97/113852, WO98/24884; WO99/45962 e WO01/14424.
[000199] Em uma outra modalidade, os anticorpos humanos da presente invenção podem ser levantados usando um camundongo que traz sequências de imunoglobulina humana nos transgenes e transcromossomos como um camundongo que carrega um transgene humano da cadeia pesada e um transcromossomo humano da cadeia leve. Tais camundongos, referidos na presente invenção como "camundongos KM", são descritos em detalhe no WO02/43478.
[000200] Ainda mais, os sistemas alternativos de animais transgênicos expressando os genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para elevar os anticorpos anti-ActRUB da presente invenção. Por exemplo, um sistema alternativo transgênico referido como o Xenocamundongo (Abgenix, Inc.) poderá ser usado. Os camundongos como são descritos em, por exemplo, Patente U.S. N°s 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963.
[000201] Além disso, sistemas alternativos de animais transcro-mossômicos expressando os genes de imunoglobulina humana estão disponíveis na técnica e podem ser usados para aumentar os anticorpos anti-ActRUB da presente invenção.Por exemplo, os camundongos portadores tanto de um transcromossomo humano da cadeia pesada quanto um trancromossomo humano da cadeia leve, referido como "camundongos TC" podem ser usados; os camundongos como são descritas em Tomizuka et al, 2000 Proc.. Natl. Acad. Sei. EUA 97:722- 727. Além disso, as coroas de suporte de trancromossomo humano da cadeia leve e transcromossomo humano da cadeia pesada transcromossomo humano da cadeia pesada têm sido descritos na técnica (Kuroiwa et al., 2002 Nature Biotechnology 20:889 a 894) e podem ser usadas para aumentar os anticorpos anti ActRIIB da presente invenção.
[000202] Os anticorpos humanos recombinantes da presente invenção também podem ser preparados usando os métodos de exibição fago para bibliotecas de triagem de genes de imunoglobulina humana. Os tais métodos de exposição de fago para isolar os anticorpos humanos são estabelecidos na técnica ou descritos nos exemplos abaixo. Vide, por exemplo: Patente U.S. N°s 5.223.409; 5.403.484; 5.571.698; 5.427.908; 5.580.717; 5.969.108; 6.172.197; 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081.
[000203] Os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção também podem ser preparados usando camundongos SCID em que as células imunológicas humanas foram reconstituídas tal que uma resposta de anticorpos humanos pode ser gerada após a imunização. Os camundongos são descritos como, por exemplo, nas Patentes U.S. N°s 5.476.996 e 5.698.767.
[000204] Geração de hibridomas produzindo os anticorpos monoclonais humanos
[000205] Para gerar os hibridomas produzindo os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção, esplenócitos e/ou células de linfonodo de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos para uma linhagem de célula apropriada imortalizada, como uma linhagem de células de camundongo mieloma. Os hibridomas resultantes podem ser rastreados para a produção de antígeno- anticorpos específicos. Por exemplo, as suspensões únicas da célula de linfócitos esplénicos de camundongos imunizados podem ser fundidas a um sexto do número de P3X63-Ag8.653 não secretando as células de mieloma do camundongo (ATCC, CRL 1580) com 50% de PEG. As células são banhadas em aproximadamente 2 x 145 em placas de microtitulação de fundo plano, seguido de uma incubação de duas semanas em um meio seletivo contendo 20% de soro fetal do Clone, 18% de "653" meio condicionado, 5% Orígenes (IGEN), 4 mM L- glutamina, piruvato de sódio a 1 mM, HEPES a 5mM, 0:055 mM 2- mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, estreptomicina a 50 mg/ml, gentamicina a 50 mg/ml e 1X HAT (Sigma, o HAT é adicionado 24 horas após a fusão). Depois de aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em um meio em que o HAT é substituído com HT. Os poços individuais podem então ser analisados por ELISA para IgM monoclonal humano e anticorpos IgG. Uma vez que o crescimento de hibridoma extenso ocorre, o meio pode ser observado normalmente após 10 a 14 dias. Os hibridomas secretores de anticorpos podem ser repostos, exibidos novamente, e se ainda positivo para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes ao limitar a diluição. Os subclones estáveis podem ser cultivadas in vitropara gerar pequenas quantidades de anticorpos em um meio de cultura de tecidos para a caracterização.
[000206] Para purificar os anticorpos monoclonais humanos, os hibridomas selecionados podem ser cultivadas em dois litros de frascos giratórios para a purificação de anticorpos monoclonais. O sobrenadante pode ser filtrado e concentrado antes da cromatografia de afinidade com a proteína A-Sepharose (Pharmacia). IgG eluída pode ser verificada por meio da eletroforese em gel e por meio da cromatografia líquida de alta eficiência para garantir a pureza. A solução tampão pode ser trocado em PBS, e a concentração pode ser determinada por mieo de OD280 usando 1,43 coeficiente de extinção. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e estocados a -80°C.
Geração de transfectomas produzindo os anticorpos monoclonais
[000207] Os anticorpos da presente invenção também podem ser produzidos em uma célula hospedeira de transfectoma usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção gênicos como é bem-conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).
[000208] Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpos dos mesmos, DNAs codificando as cadeias pesadas e leves de comprimento total podem ser obtidos por meio das normas técnicas de biologia molecular (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de cDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão de tal forma que os genes são ligados de forma operacional para as sequências de controle transcricional e translacional. Neste contexto, o termo "ligados de forma operacional" pretende significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor de tal forma que as sequências de controle transcricional e translacional dentro do vetor servem com uma função objetiva de regular a transcrição e a tradução do gene de anticorpos. O vetor de expressão e as sequências de controle da expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de anticorpo da cadeia leve e o gene de anticorpo da cadeia pesada pode ser inserido no vetor separado ou, mais geralmente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpos são inseridos no vetor de expressão por meio dos métodos convencionais (por exemplo, a ligação dos locais de restrição complementares sobre o fragmento de gene dos anticorpos e vetor, ou a ligação da extremidade sem corte, se nenhum local de restrição estiver presente). As regiões variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada dos anticorpos descritos na presente invenção podem ser usadas para criar genes dos anticorpos de comprimento total de qualquer isotipo de anticorpos, inserindo-os em vetores de expressão já codificando as regiões constantes de cadeia pesada e as regiões constantes da cadeia leve do isotipo desejado de tal forma que o segmento VH é operativamente ligado ao segmento CH dentro do vetor e o segmento VL é operativamente ligados ao segmento CL dentro do vetor. Adicional ou De forma alternativa, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpos a partir de uma célula hospedeira. O gene da cadeia de anticorpos pode ser clonado no vetor de tal forma que o peptídeo sinal é ligado na estrutura para o terminal amino do gene da cadeia de anticorpos. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heteróloga (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína de não imunoglobulina).
[000209] Além dos genes da cadeia de anticorpos, os vetores de expressão recombinantes da presente invenção realizam as sequências regulatórias que controlam a expressão dos genes de anticorpos da cadeia em uma célula hospedeira. A "sequência regulatória" destina-se a incluir os promotores, realçadores e os elementos de outra expressão de controle (sinais de poliadenilação, por exemplo) que controlam a transcrição ou tradução dos genes da cadeia de anticorpos. Tais sequências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel (Tecnologia da Expressão Gênica. Métodos em Enzimologia 185, Academic Press, San Diego, CA 1990).Será apreciado por aqueles versados na técnica que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção da sequências regulatórias, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira para ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. as sequências regulatórias de expressão de mamífero da célula hospedeira incluem os elementos virais que dirigem os altos níveis de expressão da proteína em células de mamíferos, como promotores e/ou realçadores de derivados de citomegalovírus (CMV), Simian Virus 40 (SV40), adenovírus (por exemplo, o adenovírus tardio dos principais promotores (AdMLP)), e polioma. Em alternativa, as sequências regulatórias não virais podem ser usadas, como o promotor da ubiquitina ou o promotor P-globina. Ainda mais, os elementos de regulamentação compostos pelas sequências de diferentes fontes, como o sistema promotor SRA, que contém sequências do promotor SV40 precoce e a repetição do terminal longo de células T humanas do vírus de leucemia 1 (Takebe, Y. et al., 1988 Mol Cell.. Biol. 8:466 a 472).
[000210] Além dos genes de anticorpos da cadeia e as sequências regulatórias, os vetores de expressão recombinante da presente invenção podem levar as sequências adicionais, tais como as sequências que regulam a replicação do vetor nas células do hospedeiro (por exemplo, as origens de replicação) e os genes marcadores de seleção. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras em que o vetor foi introduzido (vide, por exemplo, Patente dos EUA N°s 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017). Por exemplo, normalmente o gene marcador selecionável confere resistência aos fármacos, como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira em que o vetor foi introduzido. Os genes marcadores de seleção incluem o gene diidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras DHFR com a seleção metotrexato/amplificação) e o gene neo (para a seleção G418).
[000211] Para a expressão das cadeias leves e pesadas, o (s) vetor (es) de expressão de codificação da cadeias pesadas e leves é (são) transfectado (s) em uma célula hospedeira por meio das técnicas convencionais. As várias formas do termo "transfecção" destinam-se a abranger uma grande variedade de técnicas comumente utilizadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, trasnfecção DEAE-dextrano e similares. É teoricamente possível expressar os anticorpos da presente invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas. A expressão de anticorpos em células eucarióticas, em particular células hospedeiras de mamíferos, é discutida, porque tais células eucarióticas, e em particular as células de mamíferos, são mais propensas do que as células procariotas de montarem e secretarem um anticorpo adequadamente dobradas e imunologicamente ativas. A expressão dos genes do anticorpo procariótico tem sido relatada a ser ineficaz para a produção de rendimentos elevados de anticorpos ativos (Boss, MA e Wood, CR, 1985 Immunology Today 6:12 a 13).
[000212] As células hospedeiras de mamíferos para expressar os anticorpos recombinantes da presente invenção incluem ovário de hamster chinês (células CHO) (incluindo células DHFR-CHO, descritas em Urlaub e Chasin, 1980 Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 77:4216 a 4220 usado com um marcador DHFR selecionável, por exemplo, como descrito no RJ Kaufman e Sharp PA, 1982 Mol. Biol. 159:601 a 621), células de mieloma NSO, células COS e células SP2. Em uma modalidade, as células hospedeiras são células CHO K1PD. Em particular, para uso com células de mieloma NSO, outro sistema de expressão é o sistema de expressão do gene GS mostrado na WO87/04462, W089/01036 e PE 338.841. Em uma modalidade, as células hospedeiras de mamíferos para expressar os anticorpos recombinantes da presente invenção incluem as linhagens de células de mamíferos deficientes para expressão do gene de FUT8, por exemplo, como descrito na Patente U.S. 6.946.292 B2. Quando os vetores de expressão recombinantes que codificam os genes de anticorpos são introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, os anticorpos são produzidos por meio do cultivo das células do hospedeiro por um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou secreção do anticorpo para o meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura utilizando métodos de purificação de proteína-padrão.
Imunoconiuqados
[000213] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta um anticorpo anti-ActRUB, ou um fragmento do mesmo, conjugado a uma pporção terapêutica, tal como uma citotoxina, um fármacoo (por exemplo, um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Os conjugados são referidos na presente invenção como "imunoconjugados". Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas". A citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial para as células (por exemplo, matam).
[000214] As citotoxinas podem ser conjugadas com anticorpos da presente invenção usando a tecnologia do ligante disponível na técnica. Os exemplos dos tipos de ligantes que têm sido usados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, mas não estão limitados a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetos e peptídeo contendo ligadores. Um ligador pode ser escolhido, isto é, por exemplo, susceptível à clivagem por baixo pH no interior do compartimento lisossomal ou susceptível à clivagem por proteases, tais como proteases preferencialmente expressas no tecido tumoral, tais como as catepsinas (por exemplo catepsinas B, C, D).
[000215] Para uma discussão mais aprofundada dos tipos de citotoxinas, os ligadores e os métodos para conjugar os agentes terapêuticos para anticorpos, vide também Saito, G. et al., 2003 Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199 a 215; P.A. Trail, et al., 2003 Immunol Cancer. Immunother. 52:328 a 337; Payne, G. Cancer Cell 2003 3:207 a 212; Allen, TM, 2002 Nat. Rev. Cancer 2:750 a 763; Pastan, I. e Kreitman, RJ, 2002 Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089 a 1091; Senter, P.D. e Springer, C.J., 2001 Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247 a 264.
[000216] Os anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados com um isótopo radioativo para gerar radiofármacos citotóxicos, também conhecidos como radioimmunoconjugados. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados com anticorpos para uso diagnóstico ou terapêutico incluem, mas não estão limitados a, iodina131, índiol 11, ítrio90 e lutetiol 77. Os métodos para preparar os radioimunconjugados estão estabelecidos na técnica. Os exemplos de radioimunoconjugados estão comercialmente disponíveis, incluindo ZevalinTM (DEC Pharmaceuticals) e BexxarTM (Corixa Pharmaceuticals), e métodos similares podem ser usados para preparar radioimunoconjugados usando os anticorpos da presente invenção.
[000217] Os anticorpos conjugados da presente invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica, e a porção do fármaco não deve ser interpretada como limitada a agentes químicos terapêuticos clássicos. Por exemplo, a molécula do fármaco pode ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou mesmo fragmento ativo, como ABRIN, a ricina A, exotoxina pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína, como fator de necrose tumoral ou interferon-y, ou, como modificadores da resposta biológica como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL- 1"), a interleucina-2 ("IL-2"), a interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulante de colônias de granulócitos macrófagos ("GM-CSF "), fator estimulante de colônias de granulócitos (" G-CSF "), ou outros fatores de crescimento.
[000218] As técnicas para conjugar a fração terapêutica de tais anticorpos são bem-conhecidas, vide, por exemplo, Amon et al. "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243 a 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson etal. (eds.), pp. 623 a 53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475 a 506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin etal. (eds.), pp. 303a 16 (AcademicPress 1985), and Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody- Toxin Conjugates", Inmunol. Rev., 62:119 a 58 (1982).
Moléculas Bioespecificas
[000219] Em um outro aspecto, a presente invenção apresenta as moléculas bioespecificas ou multiespecíficas compreendendo um anticorpo anti-ActRUB, ou um fragmento do mesmo, da presente invenção. Um anticorpo da presente invenção, ou regiões de ligação ao antígeno dos mesmos, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula bioespecífica que se liga a pelo menos dois diferentes locais de ligação ou moléculas-alvo. O anticorpo da presente invenção pode ser de fato derivatizado ou vinculado a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois diferentes locais de ligação e/ou moléculas-alvo, tais moléculas multi-específicas também se destinam a ser abrangidas pelo termo "molécula bioespecífica", como usado na presente invenção. Para criar uma molécula bioespecífica da presente invenção, um anticorpo da presente invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, química de acoplamento, fusão genética, associação não covalente ou de uma outra maneira) a uma ou mais outras moléculas de adesão como outro anticorpo, fragmentos de anticorpos, peptídeos ou ligações miméticas, de tal forma que resulta em uma molécula bioespecífica.
[000220] Dessa maneira, a presente invenção inclui as moléculas bioespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para ActRIIB e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítopo alvo. Por exemplo, o segundo epítopo alvo pode ser outro epítopo de ActRIIB diferente do primeiro epítopo-alvo.
[000221] Além disso, para a presente invenção em que a molécula bioespecífica é multiespecíficas, a molécula pode ainda incluir uma terceira especificidade de ligação, além dos primeiro e segundo epítopos-alvo.
[000222] Em uma modalidade, as moléculas bioespecíficas da presente invenção compreendem como uma especificidade de ligação, pelo menos, um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F (ab') 2, Fv, ou uma única cadeia Fv. O anticorpo também pode ser uma cadeia leve ou cadeia de pesada de dímero, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo como um Fv ou um constructo de cadeia única, como descrito no Ladner et al. US4, 946778, cujo conteúdo é expressamente incorporado por referência.
[000223] Outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas bioespecíficas da presente invenção são anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.
[000224] As moléculas bioespecíficas da presente invenção podem ser preparadas por meio da conjugação das especificidades constituintes de ligação, usando os métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula bioespecífica pode ser gerada separadamente e, em seguida, conjugada uma a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de acoplamento ou agentes de reticulação pode ser usada para a conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem a proteína A, carbodi-imida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), ofenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) e ciclo-hexano-l-carboxilato de sulfossuccinimidil 4-(Nmaleimidometil) (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky et al., 1984 J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al., 1985 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus, 1985 Behring Ins. Mitt. Nº 78,118 a 132; Brennan et al., 1985 Science 229:81 a 83), e Glennie et al., 1987 J. Immunol. 139: 2367-2375). Os agentes conjugados são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis a partir de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).
[000225] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, elas podem ser conjugadas por meio da ligação de sulfidrila das regiões de dobradiça do terminal C das duas cadeias pesadas. Em uma modalidade particularmente, a região da dobradiça é modificada para conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, por exemplo um, antes da conjugação.
[000226] Em uma alternativa, tanto as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor quanto expressas e montadas Petição 870200074827, de 16/06/2020, pág. 84/140 81/127 na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil quando a molécula bioespecífica é um mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F (ab ') 2 ou Fab ligante x proteína de fusão. Uma molécula bioespecífica da presente invenção pode ser uma molécula da cadeia simples compreendendo um anticorpo da cadeia única e determinante de ligação, ou uma molécula bioespecífica da cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas bioespecíficas podem comportar pelo menos duas moléculas da cadeia única. Os métodos para preparar as moléculas bioespecíficas são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498 e 5.482.858.
[000227] A ligação das moléculas bioespecíficas aos seus objetivos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por meio do ensaio imunosorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), a análise FACS, bioensaio (inibição do crescimento, por exemplo), ou teste de Western Blot. Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de proteína-anticorpo de interesse particular, empregando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse.
Anticorpos multi valentes
[000228] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece os anticorpos multivalentes que compreendem pelo menos duas porções idênticas ou diferentes de ligação ao antígenos da presente invenção ligando-se ao ActRIIB. Em uma modalidade, os anticorpos multivalentes fornecem pelo menos duas, três ou quatro porções de ligação ao antígeno dos anticorpos. As porções de ligação ao antígenos podem ser ligadas através de proteína de fusão ou ligação covalente ou não covalente. De forma alternativa, os métodos de ligação têm sido descritos para as moléculas bioespecíficas. Os compostos tetravalente podem ser obtidos, por exemplo, por meio da reticulação dos anticorpos dos anticorpos da presente invenção com um anticorpo que se liga às regiões constantes dos anticorpos da presente invenção, por exemplo, a região Fc ou dobradiça.
Composições farmacêuticas
[000229] Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou porção (ões)) de ligação ao antígeno do mesmo, da presente invenção, formulada em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas bioespecífica da presente invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da presente invenção pode incluir uma combinação de anticorpos que se liga a diferentes epítopos do antígeno-alvo ou que tenham atividades complementares.
[000230] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia combinada pode incluir um anticorpo anti-ActRUB da presente invenção combinado com pelo menos um outro agente de massa museular/força crescente, por exemplo, IGF-1, IGF-2 ou variantes de IGF-1 ou IGF-2, um anticorpo antimiostatina, um propeptídeo da miostatina, uma proteína chamariz de miostatina que se liga a ActRIIB mas não para ativá-lo, um agonista beta 2, um agonista grelina, um SARM, agonistas/ miméticos GH ou folistatina. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados na terapia de combinação são descritos em maiores detalhes abaixo na seção sobre os usos dos anticorpos da presente invenção.
[000231] Como usado na presente invenção, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, isotônicos e agentes de atraso de absorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. O veículo deve ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por meio de injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpos, imunoconjugado, ou molécula bioespecífica, pode ser revestido com um material para proteger o composto a partir da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.
[000232] Os compostos farmacêuticos da presente invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. O termo "sal farmaceuticamente aceitável"refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto original e não gera nenhum efeito toxicológico indesejado (vide, por exemplo Berge, SM, et al, 1977 J. Pharm Sei 66:1 a19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem os derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como o clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodídrico, fósforo e similares, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos mono-e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos substituídos por fenila, ácidos hidróxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similares. Sais de adição de base incluem os derivados de metais alcalinos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como as aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'- dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similares.
[000233] Uma composição farmacêutica da presente invenção também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: antioxidantes solúveis em água, tais como o ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfeto de sódio, sulfeto de sódio e similares; óleo solúvel em antioxidantes, como palmitato de ascorbila, butil-hidroxianisol (BHA), butil-hidroxitolueno (BHT), lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol, e similares; e agentes quelantes de metal, tais como o ácido cítrico, ácido etlilenodiaminotetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.
[000234] Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da presente invenção incluem água, etanol, polióis (tais como o glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis , tais como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessária no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.
[000235] Estas composições também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada tanto por meio dos procedimentos de esterilização, supra, e por meio da inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido sórbico fenol, e similares. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, sódio, cloro e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma injetável farmacêutica pode ser provocada por meio da inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como, monoestearato de alumínio e gelatina.
[000236] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem as soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de meios e agentes de substâncias farmacologicamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio convencional ou agente é incompatível com o composto ativo, seu uso nas composições farmacêuticas da presente invenção é contemplado. Os compostos ativos complementares também podem ser incorporados nas composições.
[000237] As composições terapêuticas normalmente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomas, ou outra estrutura ordenada adequada para alta concentração do fármaco. O veículo pode ser um meio de solvente ou dispersão contendo, por exemplo, misturas de água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e similares), e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessária no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, pode-se incluir os agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis como o manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser provocada por meio da inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo sais, monoestearato e gelatina.
[000238] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por meio da incorporação do composto ativo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um ou uma combinação de agentes enumeradas acima, como necessário, seguido de microfiltração de esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros agentes necessários daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação são de secagem a vácuo e liofilização (liofilização) que produzem um pó do agente ativo mais qualquer agente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada com um filtro do mesmo.
[000239] A quantidade de agente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única vai variar dependendo do indivíduo a ser tratado, e o modo particular de administração. A quantidade de agente ativo que pode ser combinada com um material veículo produz uma forma de dosagem única, geralmente, essa quantidade de composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, fora de cem por cento, esse valor será de cerca de 0,01 por cento para cerca de 99 por cento do agente ativo, de cerca de 0,1 por cento para cerca de 70 por cento, ou cerca de 1 por cento, para cerca de 30 por cento do agente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[000240] Os regimes de dosagem são ajustados para dar a resposta ideal desejada (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um único bolus pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, como indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular as composições parentais em uma unidade de dosagem de administração para facilitar a administração e a uniformidade da dosagem. A forma de unidade da dosagem, tal como referida na presente invenção, refere-se às unidades discretas fisicamente adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados, cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para a unidade das formas farmacêuticas da presente invenção são ditadas por e diretamente dependente das características únicas do composto ativo e o efeito terapêutico a ser alcançado, e as limitações inerentes à técnica da composição ctal omo um composto ativo para o tratamento de sensibilidade nos indivíduos.
[000241] Para a administração do anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais geralmente de 0,01 a 5 mg/kg, do peso de corpo do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser de 0,3 em peso corporal mg/kg, 1 mg/kg em peso corporal, 3 mg/kg em peso corporal, 5 mg/kg em peso corporal ou 10 mg/kg em peso corporal ou dentro dos intervalos de 10 a 10 mg/kg ou 3 a 7 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar envolve a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada três meses ou uma vez a cada três a seis meses. De forma alternativa, o anticorpo pode ser administrado uma vez por ano ou uma vez só. Tal administração pode ser realizada por via intravenosa ou subcutânea. Os regimes de dosagem de um anticorpo anti-ActRIIB da presente invenção incluem um 1 mg/kg em peso corporal ou 3 mg/kg em peso corporal por administração intravenosa, com o anticorpo a ser dado através de um dos esquemas seguinte de dosagem: a cada quatro semanas para seis doses, em seguida, a cada três meses; a cada três semanas, 3 mg/kg em peso corporal uma vez seguido por 1 mg/kg em peso corporal a cada três semanas.
[000242] A dosagem deve ser aquela que provoca uma regulação alta de massa e/ou força muscular. De preferência, o efeito é no músculo esquelético. De preferência, a dosagem provoca hipertrofia muscular com não mais do que um aumento proporcional no tamanho dos órgãos internos (por exemplo, coração, pulmões, fígado, rins).Tal aumento proporcional pode ser comparado através da medição tanto da massa quanto do volume.
[000243] Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado cai dentro dos intervalos indicados. O anticorpo é geralmente administrado em múltiplas ocasiões. Os intervalos entre as dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses, a cada seis meses ou anualmente. Os intervalos também podem ser irregulares, como indicado por medir os níveis sanguíneos de anticorpos contra o antígeno-alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para atingir uma concentração de anticorpos no plasma de cerca de 1000 a 1000 mg/ml e, em alguns métodos de 25 a 300 mcg/ml. Por exemplo, um anticorpo ActRIIB da presente invenção pode ser co-administrado com um anticorpo antimiostatina.
[000244] De forma alternativa, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso em que a administração menos frequente é necessária. A dosagem e a frequência variam de acordo com a meia-vida dos anticorpos no paciente. Em geral, os anticorpos humanos mostram uma meia-vida mais longa, seguido por anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e os anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência de administração pode variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente pouco frequentes durante um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é algumas vezes necessária, até à progressão da doença ser reduzida ou suprimida ou até que o paciente apresente melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Posteriormente, o paciente pode ser administrado em um regime profilático.
[000245] Os níveis de dosagem reais dos agentes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do agente ativo que é eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um determinado paciente, a composição e o modo de administração, sem ser tóxicos para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições em particular empregadas da presente invenção, ou o éster, sal ou amida do mesmo, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico que está sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições especialmente empregadas, a idade, sexo, peso, condição geral de saúde e história médica prévia do paciente a ser tratado, e como os fatores bem-conhecidos nas técnicas médicas.
[000246] O termo "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti-ActRUB da presente invenção pode resultar em uma diminuição na gravidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e na duração da doença, períodos livres de sintomas, ou um programa de prevenção de deficiência ou incapacidade devido à doença, isto é, um aumento da massa e/ou força muscular.
[000247] A composição da presente invenção pode ser administrada por uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será apreciado por aqueles versdos na técnica, a via e/ou o modo de administração variam de acordo com os resultados desejados. As vias de administração para anticorpos da presente invenção incluem as vias intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parenteral, por exemplo, injecção ou perfusão. A frase "administração parenteral", usada na presente invenção significa os modos de administração diferentes da administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, por via intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, infraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subaracnoide, subcapsular, injeção, intra- e intrastemal epidural e a infusão. Em uma modalidade o anticorpo é administrado por via intravenosa. Em uma outra modalidade, o anticorpo é administrado por via subcutânea.
[000248] De forma alternativa, um anticorpo da presente invenção pode ser administrado por uma rota não parenteral, tais como uma rota tópica, epidérmica ou mucosa da administração, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, por via sublingual ou tópica.
[000249] Os compostos ativos podem ser preparados com os veículos que irão proteger o composto contra a liberação rápida, tais como uma formulação de liberação controlada, incluindo os implantes, adesivos transdérmicos e os sistemas de entrega microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como vinil acetato de etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecido por aqueles versados na técnica. Vide, por exemplo Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, JR Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[000250] As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, uma composição terapêutica da presente invenção pode ser administrada com um dispositivo hipodérmico da agulha da injeção, tais como os dispositivos mostrados nas Patentes U.S. N °s 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824 ou 4.596.556. Exemplos de implantes bem-conhecidos e os módulos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. n° 4.487.603, a qual mostra uma bomba de infusão micro-implantável para dispensar a medicação a uma velocidade controlada; Patente U..S. n 0 4.486.194, a qual mostra um dispositivo terapêutico para a administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. n° 4.447.233, a qual mostra uma bomba de infusão de medicamentos para a entrega de medicamento a uma taxa de infusão precisa; Patente U.S. n° 4.447.224, a qual mostra um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para a entrega contínua do fármaco; Patente U.S. n° 4.439.196, a qual mostra um sistema de entrega de fármaco osmótica que possui uma câmara de multi-compartimentos, e Patente U.S. n° 4.475.196, a qual mostra um sistema de entrega de fármaco osmótica. Muitos outros implantes, sistemas de entrega, e os módulos são conhecidos por aqueles versados na técnica e incluem aquelas feitas por MicroCHIPSTM (Bedford, MA).
[000251] Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos da presente invenção podem ser formulados para garantir a distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hematoencefálica (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para garantir que os compostos terapêuticos da presente invenção atravessem o BBB (caso desejado), os mesmos podem ser formulados, por exemplo, em lipossomas. Para os métodos de fabricação de lipossomas, vide, por exemplo Patente U.S. 4.522.811; 5.374.548 e 5.399.331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas em células específicas ou órgãos e, dessa maneira, melhoram a entrega de fármacos específicos (vide, por exemplo VV Ranade, 1989 J. Clin Pharmacol. 29:685). As porções exemplares visando incluir folato ou biotina (vide, por exemplo Patente U.S. 5.416.016); Manosídeos (Umezawa et al, 1988 Biochem Biophys Res Commun 153:1038.); Anticorpos (PG Bloeman et al, 1995 FEBS Lett 357: 140; M. Owais et al, 1995 Antimicrob Agents Chernother 39:180); receptor do tensoativo da proteína A (Briscoe et al, 1995 Am J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al,. 1994 J. Biol Chem 269:9090);. vide também K. Keinanen; ML Laukkanen, 1994 FEBSLett.346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler, 1994 Imrnunomethods 4:273.
Usos e métodos da presente invenção
[000252] Os anticorpos da presente invenção têm utilitários de diagnóstico e terapêuticosa in vitro e in vivo. Por exemplo, essas moléculas podem ser administradas para as células em cultura, por exemplo, in vitroou ex vivoex vivo, ou em um indivíduo, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de distúrbios. Dessa maneira, os anticorpos podem ser usados em ambos o tratamento de profilaxia da doença, e para retardar o aparecimento dos sintomas da doença. O termo "indivíduo", como usado na presente invenção, é a intenção de incluir os animais humanos e não humanos. Os animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelhas, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios e répteis.
[000253] A presente invenção fornece um método de tratar um paciente que sofre de um distúrbio patológico (como uma doença ou distúrbio da perda de massa muscular) compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-ActRUB.
[000254] A presente invenção também fornece um anticorpo anti- ActRIlB para uso em terapia.
[000255] A presente invenção também proporciona o uso de um anticorpo anti-ActRUB na fabricação de um medicamento para o tratamento de um distúrbio patológico.
[000256] Os métodos são particularmente adequados para o tratamento, prevenção, melhorou diagnótico dos distúrbios patológicos.
[000257] Como usado na presente invenção, o termo "distúrbio patológico" inclui, mas não está limitado a, doenças ou distúrbios osteomusculares, tais como a atrofia muscular. Existem muitas causas de atrofia muscular, incluindo como resultado do tratamento com glicocorticoides, tais como o cortisol, dexametasona, betametasona, prednisona, metilprednisolona, ou prednisolona. A atrofia muscular pode também ser um resultado de denervação devido ao trauma do nervo ou resultado de neuropatia degenerativa, metabólica ou inflamatória (por exemplo, de Guillain-Barré, neuropatia periférica, ou exposição a toxinas ambientais ou fármacos).
[000258] Além disso, a atrofia muscular pode ser resultado de uma miopatia, tais como a miotonia, uma miopatia congential, incluindo miopatia de nemaleno, miopatia multi-Zminicore e miopatia miotubular (centronuclear); miopatia mitocondrial; paralisia periódica familiar; miopatia inflamatória; miopatia metabólica, tais como causada por uma doença de depósito de glicogênio ou de lipídios; dermatomiolocal; polimiolocal; miolocal do corpo de inclusão; miolocal ossificante, rabdomiólise e mioglobinurias.
[000259] A miopatia pode ser causada por uma síndrome de distrofia muscular, tais como Duchenne, Becker, miotônica, fasciosca- pulohumeral, Emery-Dreifuss, Oculofaríngea, das cinturas de membros, escapuloumeral, Fukuyama, a distrofia muscular congênita, ou miopatia distai hereditária. A doença osteomuscular também pode ser osteoporose, uma fratura óssea, baixa estatura, ou nanismo.
[000260] Além disso, a atrofia muscular pode ser resultado de uma doença motora do neurônio adulto, atrofia muscular espinhal infantil, esclerose lateral amiotrófica, atrofia muscular espinhal juvenil, neuropatia motora autoimune com bloco condutor multifocal, paralisia devido à lesão da medula espinhal ou acidente vascular cerebral, a imobilização do esqueleto devido ao trauma, repouso prolongado, inatividade voluntária, inatividade involuntária, estresse metabólico ou insuficiência nutricional, câncer, AIDS, jejum, distúrbio da glândula de tireoide, diabetes, hipotonia benigna congênita, doença do núcleo central, queimaduras, doença pulmonar obstrutiva crônica, doenças do fígado (exemplos como a fibrose, cirrose), sepse, insuficiência renal, insuficiência cardíaca congestiva, envelhecimento, viagens espaciais ou o tempo gasto em um ambiente de gravidade zero.
[000261] Exemplos de condições relacionadas à idade que podem ser tratados incluem, sarcopenia, atrofia da pele, perda de massa muscular, atrofia cerebral, aterosclerose, arteriosclerose, enfisema pulmonar, osteoporose, osteoartrite, incompetência imunológica, hipertensão arterial, demência, doença de Huntington, doença de Alzheimer, cataratas, degeneração macular relacionada com a idade, o câncer de próstata, acidente vascular cerebral, a expectativa de vida diminuída, fraqueza, perda de memória, rugas, função renal, e perda auditiva relacionada à idade; distúrbios metabólicos, incluindo diabetes tipo II, síndrome metabólica, hiperglicemia e obesidade. É claro, os pacientes podem, simultaneamente, sofrerem de uma ou mais dessas condições, por exemplo sarcopenia, e enfisema pulmonar, ou sarcopenia e a função renal.
[000262] Outras condições que são consideradas como sendo "patologias", tal como citadas na presente invenção, incluem doença aguda e/ou crônica ou insuficiência renal, fibrose hepática ou cirrose, câncer, tais como câncer de mama, doença de Parkinson; condições associadas com a morte neuronal, como a ALS, atrofia do cérebro ou demência e anemia.
[000263] Outras condições incluem caquexia, caquexia associada a uma artrite reumatoide e caquexia associada ao câncer
[000264] Até o momento, muito poucas terapias confiáveis ou eficazes têm sido desenvolvidas para tratar estes distúrbios.
[000265] Com base na evidência relatada de um papel de ligação de Ativinas ao ActRIIB entre outros receptores (Werner e Alzheimer, Cytokine Growth Factors Rev 2006, 17 (3): 157 a 171), em contribuir para a fibrose do fígado, rins e pulmão e de um papel para miostatina, Ativinas, ou ActRIIB em cânceres (Tsuchida et al, J Endo, 2008) os "distúrbios patológicos" citados na presente invenção incluem fibrose do fígado, rim e pulmão e cânceres exemplificados mas não restritos a rabdomiossarcomas, câncer induzindo a perda óssea, carcinoma hepatocelular, câncer gastrointestinal.
[000266] A prevenção pode ser completa, por exemplo, a total ausência de uma condição relacionada à idade ou distúrbio metabólico. A prevenção também pode ser parcial, de tal forma que a probabilidade da ocorrência da condição relacionada à idade ou doença metabólica em um indivíduo é menos provável de ocorrer do que o indivíduo que não recebeu um anticorpo da presente invenção.
[000267] Uma condição relacionada com a idade, tal como referido na presente invenção, pode começar na idade de 50 anos ou mais (isto é, 60, 70, 80 ou mais).
[000268] Em uma modalidade, um paciente pode ser pré-tratado com um anticorpo anti-ActRUB antes de um período previsto de descanso/inatividade forçado. Tal período pode ocorrer quando um paciente é internado em hospital, por exemplo, para cirurgia de quadril ou pernas. A inatividade pode ser localizada, como por vazamento de um membro ou articulação quebradoa, ou por administração de um agente paralisante.
[000269] Em uma modalidade, o paciente a ser tratado tem uma fratura de um membro (isto é, perna ou braço) ou articulação (isto é, joelho ou quadril). Dessa maneira, em uma modalidade, o paciente a ser tratado tem uma fratura de um ou mais do úmero, rádio, ulnar, carpal, metacarpo, clavical, fêmur, escapular, coxas, patela, tíbia, fibula, tálus, calcâneo, tarso, metatarso, ísquio ou íleo. Em uma outra modalidade, o paciente a ser tratado sofreu, ou será submetido à cirurgia em uma ou mais das articulações seguinte: joelho, quadril, tornozelo, ombro, cotovelo. Tal cirurgia inclui a substituição de quadril e joelho.
[000270] A atrofia devido à imobilização pode ocorrer rapidamente, mas normalmente ocorre lentamente. Portanto, em uma modalidade, o paciente, a articulação ou o membro foi imobilizado, ou será imobilizado, por duas semanas ou mais (isto é, 3 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas ou mais). Em uma modalidade, o paciente, o membro ou a articulação foi imobilizado, ou será imobilizado, por 1 a 8 semanas, 2 a 6 semanas ou 3 a 5 semanas.
[000271] Em uma modalidade adicional, o paciente pode ser alguém que não tem respondido a tratamentos anabólicos anteriores no osso. Por exemplo, o paciente pode não ter respondido ao tratamento com IGF-1, IGF-2 ou variantes de IGF-1 ou IGF-2, um anticorpo antimiostatina, uma propeptídeo miostatina, uma proteína chamariz de miostatina que se liga a ActRIIB mas não para ativá-lo, um agonista beta 2, um agonista grelina, um SARM, agonistas/miméticos GH ou folistatina. Uma maneira simples de medir a resposta do paciente ao tratamento pode ser marcar quanto tempo leva para um paciente subir uma altura conhecida de escadas e comparar os resultados antes e após o tratamento.
[000272] Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados como o único agente ativo ou em conjunto com, por exemplo, como adjuvante ou em combinação com outros fármacos, por exemplo IGF-1, IGF-2 ou variantes de IGF-1 ou IGF-2, um anticorpo antimiostatina, uma propeptídeo miostatina, uma proteína chamariz de miostatina que liga a ActRIIB mas não para ativá-lo, um agonista beta 2, um agonista grelina, um SARM, agonistas/miméticos GH ou folistatina. Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ser usados em combinação com um IGF-1 mimético como descrito na W02007/146689.
[000273] De acordo com o exposto, a presente invenção proporciona ainda um aspecto em que:
[000274] um método como definido acima composto por coadministração, por exemplo, concomitantemente ou em sequência, de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antagonista ActRIIB, por exemplo, um anticorpo da presente invenção, e pelo menos uma segunda substância do fármaco, a dita segunda substância do fármaco sendo IGF-1, IGF-2 ou variantes de IGF-1 ou IGF-2, um anticorpo anti- miostatina, uma propeptídeo miostatina, um proteína chamariz de miostatina que se liga a ActRIIB mas não para ativá-lo, um agonista beta 2, um agonista grelina, um SARM, agonistas/miméticos GH ou folistatina.
[000275] A presente invenção ainda fornece uma combinação terapêutica, por exemplo, um kit, composto de uma quantidade terapeuticamente eficaz de a) um antagonista de ActRIIB, por exemplo, um anticorpo da presente invenção, e b) pelo menos uma segunda substância selecionada de uma IGF-1, IGF-2 ou variantes de IGF-1 ou IGF-2, um anticorpo antimiostatina, um propeptídeo da miostatina, uma proteína chamariz de miostatina que se liga a ActRIIB, mas não para ativá-lo, um agonista beta 2, um agonista grelina, um SARM, agonistas/miméticos GH ou folistatina, por exemplo, como indicado acima. O kit pode ainda compreender instruções para a sua administração.
[000276] Onde os anticorpos da presente invenção são administrados em conjunto com outro agente ativo, as dosagens da combinação do composto coadministrado, naturalmente, variam dependendo do tipo de fármacos coempregado, do fármaco específico empregado, da condição a ser tratada e similares.
[000277] Em uma outra modalidade, os anticorpos da presente invenção são administrados apenas para uma população de pacientes que é selecionada entre os pacientes que sofrem de atrofia muscular. Em uma outra modalidade, os anticorpos da presente invenção são administrados para populações de pacientes que sofrem de atrofia do músculo esquelético. Em uma outra modalidade, os anticorpos da presente invenção são administrados apenas para uma população de pacientes que é selecionado entre um grupo de pacientes que respondem ao tratamento anti-ActRUB. Os biomarcadores que identificam os pacientes que têm uma maior probabilidade de responder ao tratamento anti ActRIIB podem ser qualquer um dos seguintes sem serem limitados a estes: os altos níveis de soro da miostatina, GDF-11 ou Ativinas comparados a um controle de paciente.
[000278] Em uma modalidade, os anticorpos da presente invenção podem ser usados para detectar os níveis de ActRIIB, ou níveis de células que contêm ActRIIB. Isto pode ser conseguido, por exemplo, entrando em contato com uma amostra (como uma amostra in vitro)e uma amostra de controle com o anticorpo anti-ActRUB em condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e ActRIIB. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e ActRIIB são detectados e comparados na amostra e no controle. Por exemplo, os métodos de detecção padrão, bem-conhecidos na técnica, tais como o ensaio ELISA e os ensaios de fluxo citométicos, podem ser realizadoos utilizando as composições da presente invenção.
[000279] Dessa maneira, em um aspecto, a presente invenção ainda fornece métodos para detectar a presença de ActRIIB (por exemplo, ActRIIB humano) em uma amostra, ou medir a quantidade de ActRIIB, compreendendo contatar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo da presente invenção, ou uma região de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente ao ActRIIB, em condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou parte dele e ActRIIB. A formação de um complexo é, então, detectada, em que a diferença na formação do complexo entre a amostra em relação ao controle de amostra é indicativa da presença de ActRIIB na amostra.
[000280] Também presentes no âmbito da presente invenção estão os kits compostos das composições (por exemplo, anticorpos, anticorpos humanos e moléculas bioespecíficas) da presente invenção e instruções de uso. O kit pode ainda conter pelo menos um reagente adicional, ou um ou mais anticorpos adicionais da presente invenção (por exemplo, um anticorpo, com uma atividade complementar que se liga a um epitopo do antígeno alvo distinto do primeiro anticorpo). Os kits normalmente incluem um rótulo indicando o uso pretendido para o conteúdo do kit. O termo "rótulo" inclui qualquer material escrito ou fornecido gravado no ou com o kit, ou que de outra acompanhe o kit. O kit pode ainda compreender ferramentas para diagnosticar se o paciente pertence a um grupo que vai a resposta a um tratamento de anticorpos anti-ActRIIB, como definido acima. Esses kits podem incluir um anticorpo da presente invenção na forma liofilizada, um diluente e instruções de uso.
[000281] A presente invenção tem sido totalmente descrita, é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos e reivindicações, que são ilustrativos e não pretendem ser ainda limitantes.
Geral
[000282] O termo "compreendendo" significa "incluindo", bem como o termo "consistindo" por exemplo, uma composição "compreendendo" X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
[000283] O termo "sobre" em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x +- 10%.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[000284] A figura 1 mostra a determinação de EC50 de MOR07079 por meio da titulação de FACS nas linhagens de células HEK293T/17 transfectadas por ActRIIB e parental.
[000285] A figura 2 mostra a inibição da expressão de luciferase induzida por miostatina em um ensaio de gene repórter por meio de múltiplos de anti-ActRUB Fabs em 2, 10 e 50 pg/ml.
[000286] A figura 3 mostra determinação de IC50 de Fabs em um ensiao do gene repórter de luciferase induzido por miostatina.
[000287] A figura 4 mostra a ligação do anticorpo às células do músculo esquelético primárias.
[000288] A figura 5 mostra a determinação de IC50 de IgG na inibição induzida por miostatina no ensaio de diferenciação do músculo esquelético.
[000289] A figura 6 mostra o estudo com camundongo: no estudo de eficácia in vivo em animais ingênuos - 6 semanas de tratamento com MOR08159 ou MOR08213 a 10mg/kg em peso corporal e muscular. As mudanças são mostradas para (A), peso corporal (B) tibial, (C) com Gastrocnêmio plantar, (D) quadriceps e (E) peitoral.
[000290] A figura 7 mostra o estudo com camundongo: dosagem- resposta no estudo de eficácia in vivo em animais ingênuos - 6 semanas de tratamento com MOR08213 a 25, 5, 1 mg/kg, a dosagem dependentemente aumenta o peso corporal e muscular. As mudanças são mostradas para (A), peso corporal (B) tibial, (C) Gastrocnêmio plantar, (D) quadriceps e (E) peitoral.
[000291 ] A figura 8 mostra uma saída FACS demonstrando o bloqueio cruzado entre MOR08159 na presença de MOR08213 (negrito tracejado) e MOR08159 sozinho (negrito), em comparação com isotipo de controle sozinho (preto) ou o controle isotipo na presença de MOR08213 (tracejado).
[000292] A figura 9 mostra uma visão geral de resíduos ActRIIB (SEQ ID: 181) ao qual se liga MOR08159, usando técnicas de determinação de vários epítopos.
MODOS PARA REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO Ensaios funcionais ENSAIO DO GENE REPÓRTER (RGA) Cultivo de linhagens de células HEK293T/17
[000293] Células HEK293T/17 parentais foram mantidas em DMEM contendo FBS a 10%, L-glutamina a 2 mM, penicilina (50 IE/ml) e estreptomicina (50 mg/ml). As células foram cultivadas em estufa a 37°C e 5% de CO2 e subcultivadas a cada 3 a 4 dias. As células foram destacadas usando AccutaseTM e depois transferidas para um balão novo contendo meio fresco.
[000294] As células HEK293T/17 estavelmente transfectadas com CAGA-12 luc foram cultivadas como descrito acima para as células HEK293T/17 parentais, mas o meio de crescimento da célula foi suplementado com L-glutamina a 4 mM e blasticidina a 3 ug/ml, além de FBS, penicilina e estreptomicina.
Ensaio do gene repórter de Luciferase induzida por miostatina
[000295] Para determinar a capacidade dos anticorpos anti-ActRUB para inibir a sinalização induzida por miostatina, foi realizado um ensaio de gene repórter utilizando a linhagem de células estáveis HEK293T/17 repórter CAGA-12 luc. O constructo repórter da luciferase CAGA-12 carrega o gene luciferase a jusante de um promotor mínimo e várias caixas CAGA as quais são específicas para Smad-2 e Smad-3 fosforilado. Além da miostatina purificada (mas também da GDF-11, activina ou TGFB) induzir a fosforilação Smad e, portanto, ligar-se ao repórter CAGA-12 e leva a expressão do gene da luciferase.
[000296] Em 90% de confluência das células HEK293T/17 CAGA-12 luc, as células foram destacadas como descrito e diluídas em um meio de cultura a uma concentração de 2.5 x 105 células/ml. Posteriormente, 100 ug de células por poço foram semeados em um plano de fundo de placas de 96 poços e incubadas a 37°C e 5% de CO2 durante a noite.
[000297] No dia seguinte, os anticorpos (Fab ou IgG) e ActRIIB/Fc recombinante humano, os quais serviram como controle positivo, foram diluídos em PBS para as concentrações desejadas. 20 ul da solução de anticorpos foram adicionados aos poços semeados do dia anterior e as células cultivadas por 1 hora para permitir a ligação dos anticorpos. Finalmente, 50 ng/ml miostatina foram adicionados aos poços e as células mais cultivadas ainda durante a noite.
[000298] Na manhã seguinte, 120 uL do reagente de luciferase Bright- Glo ml_ (Promega) foram adicionados a cada poço. Após 2 min do tempo de incubação, a luminescência foi lida em um luminômetro. A metade da concentração máxima inibitória (valores IC50) foi calculada após a titulação completa dos anticorpos respectivos.
ESPECIFICIDADE DE ELISAs
[000299] A especificidade de anticorpos anti-ActRUB Fab para anticorpos ActRIIB humanos e a reatividade cruzadda para ActRIlA humano e ActRIIB de camundongo foi avaliada em um cenário de ensaio ELISA. Além disso, a ligação aos receptores relacionados (contra-alvos: TGF-βRII/Fc humano (sistemas R & D), camundongo TGF-βRI (ALK-5)/Fc (sistemas R & D), RIB de Activinahumano (ALK- 4)/Fc (sistemas R & D)) foi determinada. Para isso, 5 mg/ml (se não for indicado o contrário) das proteínas recombinantes diluídas em PBS foram adicionadas a uma placa de fundo plano MaxiSorpTM preta de 96 poços e incubados durante a noite a 4°C para o revestimento.
[000300] Na manhã seguinte, as placas foram lavadas com TBST e bloqueadas com MTBST. Depois de lavar as placas várias vezes, 5 mg/ml de anti-ActRUB Fab foram adicionados e incubados por 2,5 horas. Posteriormente, Fabs ligados ao antígeno foram detectados por incubação com conjugado fosfatase alcalino de cabra anti-humano específico de IgG de Fab humana, seguido pela adição de substrato de fluorescência de AttoPhos. A emissão da fluorescência em 535 nm foi gravada com excitação em 430 nm em um leitor de placas TECAN Spectrafluor.
Interação de ELISA à ligação de Miotastina ao ActRIIB/Fc
[000301] Para avaliar se o Fabs inibitório atua através do bloqueamento do local da ligação à miostatina de ActRIIB humano, uma interação da miotastina ao hActRIIB/Fc- através do ensaio ELISA foi realizada. Para isso, miostatina recombinante foi diluída a 5 mg/ml em PBS e revestida em uma placa de fundo plano preta de 96 poços. Na manhã seguinte, os poços foram bloqueados com MTBST. Enquanto isso, 50 mg/ml de anti-ActRUB Fabs foram pré-incubados com 10 mg/ml de ActRIIB/Fc em TBST por 1,5 horas em temperatura ambiente e, finalmente, adicionadas aos poços revestidos e bloqueados (1,5 hora à temperatura ambiente). Após a lavagem com o tampão TBST, a detecção de ActRIIB/Fc foi realizada utilizando um camundongo sem rótulo anti-humano de anticorpos lg Fc-específico e um POD marcado do anticorpo de cabra anticamundongo IgG de detecção. Depois de lavar os poços várias vezes com tampão TBST Quanta Blu®, o substrato de Peroxidase Fluorogênico foi adicionado. A fluorescência foi lida em um leitor GENiosProTM (excitação 320 nm, a emissão de 430 nm).
LIGAÇÃO ÀS CÉLULAS Células
[000302] As células HEK293T/17 transfectadas por ActRIlA humano estável e ActRIIB humano, geradas usando as células HEK293T/17 (ATCC) transfectadas com pEGFP linearizado (Clontech)-ActRIIB (ECD) ou ActRIlA (ECD) e pPGK-puro (AddGene) usando FuGENE6 ( Roche), foram mantidas em DMEM contendo FBS a 10%, L-glutamina a 2 mM, penicilina (50 IE/ml), estreptomicina (50 mg/ml) e puromicina (2 mg/ml). As células foram cultivadas em estufa a 37°C e 5% de CO2 e subcultivadas a cada 3 a 4 dias. As células foram destacadas usando Accutase® e depois transferidas para um novo balão contendo novos meios.
[000303] As células do músculo esquelético (huSkMC) (Cambrex) foram colhidas em uma confluência de cerca de 70 a 90%. Para as células, o meio de cultura, o meio de crescimento (GM), constituído por meio de músculo esquelético basal (skBM; Lonza) suplementado com FCS a 20% (Amimed), foi aspirado e as células foram lavadas com HEPES-BSS e incubadas com tripsina/EDTA. Depois que as células foram destacadas, a tripsina foi neutralizada com solução de tripsina de neutralização. As células foram centrifugadas a 220 xg por 5 min e o pélete foi ressuspenso em um meio de crescimento muscular esquelético.As células foram então usadas para experiências ou semeados de subcultura em uma densidade de células de ~ 3500 célula/cm2. As células foram cultivadas em estufa a 37°C e 5% de CO2 e subcultivadas a cada 5 a 6 dias.
Titulação FACS em Células expressando hActRUB e hActRUA
[000304] A metade da concentração máxima eficaz (EC50) dos anticorpos anti-ActRUB foi determinada através da ligação para hActRUA e hActRUB celular por FACS.
[000305] Para isso, as diluições em série de anti-ActRUB Fab ou IgG foram incubadas com 1 x 104 hActRUA transfectadas, hActRUB transfectadas ou células HEK293T/17 parentais por poço por 1 hora a 4°C. Após várias etapas de lavagem Fabs ou IgGs ligados às células foram detectados anticorpos secundários com ficoeritrina conjugada de IgG anti-humano de cabra (H + L). Depois de uma hora de incubação a 4°C, as células foram lavadas novamente e ressuspensas em tampão FACS e a intensidade de fluorescência das células foi determinada em um instrumento FACSArray®. Ligação às células primárias do músculo esquelético
[000306] Anti-ActRIIB Fab ou IgG, assim como controle de isotipo IgG ouFab (10  g) foram incubadas com 105 huSkMC no tampão FACS (PBS, FCS a 2%, 1mM EDTA) por tubo por 1 hora a 4°C. Após as etapas de lavagem, Fabs ou IgGs ligadas às células foram detectadas com o anticorpo secundário de IgG anti-humano de cabra conjugado a ficoeritrina (H + L) que tinha sido diluído 1:200 em tampão FACS. Após uma hora de incubação a 4°C num agitador, as células foram lavadas novamente e ressuspensas em tampão FACS e a intensidade da fluorescência das células determinada no instrumento FACSCaliber®. DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE Determinação da afinidade de Fabs ActRIIB anti-humano Selecionado Usando a Superfície de Ressonância Plasmônica (Biacore)
[000307] Para imobilização de antígeno direta padrão de amina EDCNHS, a química de acoplamento foi usada. Chips CM5 (Biacore, Suécia) foram revestidos com aproximadamente 6000 RU humana ou camundongo-ActRIIB/Fc, ou cerca de 1500 RU ActRIIA/Fc humano (de acordo com a atividade dos antígenos) em tampão de acetato a 10 nM, pH 4,5. Para a célula de fluxo de referência, a respectiva quantidade de HSA foi usada. A regeneração foi feita com 5 mL de tampão Glicina/HCl a 10 nM, pH 1,5.
[000308] De forma alternativa, os antígenos não foram imobilizados diretamente, mas capturados em um chip de CM5, que foi modificado com um anticorpo anti-humano Fc ( kit de captura Fc, GE Healthcare/Biacore). Na célula de fluxo de referência, o anticorpo de captura foi imobilizado, mas nenhum antígeno capturado. A regeneração foi realizada com duas injeções de 5 mL de MgCl2 a 3M.
[000309] As medições cinéticas foram feitas em PBS Dulbecco a uma vazão de 20 ul/min usando uma linha de diluição em série de amostras Petição 870200074827, de 16/06/2020, Fab. As concentrações Fab variaram de 15,6 a 500 nM. O tempo de injeção para cada concentração foi de 1 min. O tempo de dissociação foi definido para pelo menos 2 min (ou mais, de acordo com a afinidade determinada). A injeção em branco de tampão de corrida foi usada para fazer referência dupla. Todos os sensogramas foram equipados a nível mundial utilizando software de avaliação BIA 3.2 (Biacore, Suécia).
ENSAIO CK
[000310] A diferenciação foi iniciada 24 horas após a semeadura das células alteradas, a partir do meio de diferenciação livre do soro GM que consiste em um meio do músculo esquelético basal (skBM). As células foram diferenciadas para três dias, na ausência e na presença de miostatina (sistemas R & D) ou outras proteínas TGF-b e anticorpos testados em dadas concentrações. As células foram lavadas com PBS e, em seguida lisadas com tampão de lise Repórter (Promega) e armazenadas até a medição a -80°C. A atividade de CK foi medida usando o reagente de CK (IFCC) (Thermo Electron). O reagente de CK foi preparado de acordo com as instruções do fabricante. Os lisados celulares foram ajustados à temperatura ambiente, o reagente CK foi adicionado e a absorbância foi imediatamente lida a 340 nm por 20 min, a leitura com intervalo de 1 minuto. Curvas CK padrão foram preparadas com CK do músculo de coelho (Roche Diagnostics). O teor de proteína foi determinado usando kit BCA.
Modelos animais
[000311] Camundongos CB17/ICR-Prkdcscid/Crl de nove semanas de idade (n = 10 por grupo, Charles Rivide, Alemanha) foram randomizados com o peso corporal e então tratados de forma intraperitoneal com os anticorpos anti-humanos ActRIIB (MOR8159, MOR8213) ou o anticorpo de controle de IgG na dosagem de 10 mg/kg (Estudo 1; estudo de comparação), ou com MOR8213 em doses de 25, 5 ou 1 mg/kg (Estudo 2, o estudo de dosagem-resposta) no dia 0, 3, 7, 14, 21, 28 e 35 (uma vez por semana com dia 3). Os pesos corporais foram determinados duas vezes por semana. Seis semanas (42 dias) após a administração, os camundongos foram sacrificados com CO2. Tibial, gastrocnêmio plantar, quadriceps e peitoral foram coletados e pesados. PROTOCOLO DE TRATAMENTO Anticorpo de controle: anti-frango lisozima hIgG, Concentração: 2 mg/mL (estudo 1), 5 mg/mL (estudo 2), volume de aplicação: 5 mL/kg Veículo: Citrato a 50 mM, NaCI a 140 mM ou PBS Anticorpos ActRIIB anti-humano: anti-ActRIIB-MOR8159 e MOR8213, hlgG, Concentração: 2 mg/mL (estudo 1), 5 mg/mL (estudo 2), 1 mg/mL (estudo 2), 0,2 mg/mL (estudo 2) volume de aplicação: 5 mL/kg Veículo: Citrato a 50 mM, NaCI a 140 mM GRUPOS DE TRATAMENTO: Estudo 1; Comparação de MOR08159 e MOR08213 1 IgG controle, i.p. (Anti-galinha lisozima-lgG), 10 mg/kg 2 anti-ActRIIB-MOR8159, i.p., 10 mg/kg 3 anti-ActRIIB-MOR8213, i.p, 10 mg/kg Estudo 2; dosagem-resposta de MOR08213 1 IgG controle, i.p. (Anti-galinha lisozima-lgG), 25 mg/kg 2 anti-ActRIIB-MOR8213, i.p., 25 mg/kg 3 anti-ActRIIB-MOR8213, i.p., 5 mg/kg 4anti-ActRIIB-MOR8213, i.p., 1 mg/kg
Condições de manutenção
[000312] Os animais foram alojados em grupos de 4 a 5 animais a 25°C com uma ciclo claro-escuro12:12 h. Eles foram alimentados com uma dieta padrão de laboratório contendo proteína 18,2% e 3,0% de gordura com energia de 15,8 MJ/kg (NAFAG 3890, Kliba). Alimentos e água foram fornecidas ad libitum. A experimentação animal foi realizada de acordo com as normas em vigor no cantão de Basileia-Cidade, na Suíça.
Métodos Análise estatística
[000313] Os resultados são expressos como média + /-SEM. A análise estatística foi realizada utilizando testes de comparação múltiplos de Dunnett seguindo a análise de variância. O tratamento (anticorpos anti- ActRIIB MOR8159 e MOR8213 foram testados para a diferença de controle (anticorpo de controle) e as diferenças foram consideradas significativas quando o valor de probabilidade <0,05: *: P <0,05, **: P <0,01, NS: não significãncia em relação IgG controle. As análises estatísticas foram realizadas pelo GraphPad Prism versão 5.0 (GraphPad Software, Inc). O peso corporal foi calculado subtraindo-se o peso corporal no dia 0, e peso muscular foi normalizado pelo peso corporal no dia 0 (peso corporal inicial).
Identificação, panning dos anticorpos e caracterização
[000314] Anticorpos terapêuticos contra a proteína terapêutica de ActRIIB humano foram gerados por seleção de clones com alta afinidade de ligação, usando como fonte de proteínas variantes de anticorpos de uma biblioteca de exibição do fago comercialmente disponíveis, a biblioteca MorphoSys HuCAL GOLD®.
[000315] HuCAL GOLD® é uma biblioteca de Fab (Knappik et al., 2000) em que todas as seis CDRs são diversificadas por métodos adequados, e que emprega a tecnologia CysDisplayTM para ligar a Fab na superfície de fagos (W001/05950).
[000316] A biblioteca de HuCAL GOLD® (Rothe etal., 2008) foi usada para selecionar fragmentos de anticorpos específicos Fab.
[000317] Seleção por "panning"de anticorpos ActRIIB específicos da biblioteca
[000318] Para a seleção de anticorpos reconhecendo várias estratégias de panning ActRIIB humano foram aplicadas.
[000319] Em suma, os fagos do anticorpo HuCAL GOLD® foram divididos em vários pools compreendendo diferentes genes VH mestre.
[000320] Estes pools foram individualmente submetidos aos pannings celulares diferenciais por meio do qual as rondas de seleção nas células transfectadas ActRIIB humanas de forma transitória com fases de selecção sobre a proteína recombinante ActRIIB/Fc humana.
i. Células inteiras de panning
[000321] Para os pannings, as partículas do fago diluídas em PBS foram misturadas com igual volume de PBS/BSA e bloqueadas. Em paralelo, também em tubos pré-bloqueados, 1x107 das respectivas hActRUB expressando células por pool de fagos foram ressuspensas em PBS/3%% FCS/0,04 NaN3 e bloquearam por uma hora a 4°C em um agitador. As células bloqueadas foram giradas para baixo, ressuspensas em partículas de fago pré-bloqueadas e incubadas por três horas. Nesse meio tempo, as células knock-down 1x107 hActRUB por pool do fago foram preparadas.
[000322] Os complexos das células do fago foram lavados em PBS/BSA, seguidos por lavagem em PBS. A eluição das partículas do fago a partir das células expressando hActRUB foi realizada por meio da eluição acídica com tampão glicina, pH 2,2. Após a centrifugação, o eluato foi neutralizado por meio da adição de Tris não tamponado.
[000323] Após a infecção e a centrifugação posteriores, os péletes de bactérias foram ressuspensos em um meio 2xYT, semeados em placas LB/CAM/Glc ágar e incubadas durante toda a noite a 37°C. Na manhã seguinte, as colônias foram raspadas das placas e os fagos foram resgatados e ampliados.
ii. Panning de Fase sólida
[000324] Para panning de fase sólida, ActRIIB/Fc de recombinante humano foi revestido em uma placa MaxiSorpTM a 4°C durante a noite. Após a lavagem com PBS as cavidades foram bloqueadas com MPBST a 5%.
[000325] Antes da seleção, o fago HuCAL GOLD® foi pré-adsorvido em um tampão de bloqueio. O fago bloqueado foi adicionado ao antígeno revestido e incubado durante 2 horas em temperatura ambiente. Os fago inespecíficos foram lavados com PBST e PBS. Fago vinculado foi eluído pela adição de DTT a 20 mM. Os eluatos foram usados para a infecção de uma cultura de E. coli TG-1. Após a infecção, as bactérias foram semeadas em placas de LB/CAM/Glc ágar e incubadas durante toda a noite a 37°C. Na manhã seguinte, as colônias foram raspadas das placas e os fagos foram resgatados e ampliados.
[000326] A abordagem de panning mais bem sucedida provou ser panning de células/proteína diferenciais com primeira rodada de panning no ActRIIB transfectado nas células HEK293T/17 seguido de rodada de seleção de ActRIIB/Fc recombinante humano e novamente em células transfectadas.
[000327] Fabs selecionados foram analisados para a ligação com rhActRUB parentais transfectadas nas células HEK293.
[000328] MOR07079 Fab liga-se preferencialmente às células transfectadas ao ActRIIB com uma EC50 de 20nm (figura 1). Em uma ligação de inibição da miostatina ELISA, MOR07079 Fab mostrou atividade inibitória e bloqueou a ligação de rhActRIIB/Fc à miostatina. A inibição forte da ligação da miostatina obrigatória em ELISA foi refletida pela inibição da miostatina no ensaio do gene repórter utilizando HEK293-CAGA12 para MOR07079. Usando a especificidade ELISA, MOR07079 mostrou ligar-se especificamente para ActRIIB humanos e murinos e não ao TGF β alheios RH, ALK4 ALK5 e receptores. MOR7079 também foi mostrado para ligar preferencialmente para ActRIIB comparação com ActRIlA.
Produção de imunoglobulinas HuCAL® i. Conversão de Fabs no formato IgG
[000329] Para expressar a imunoglobulina (lg) do comprimento total, os fragmentos de domínio variável da cadeia pesada (VH) e da cadeia leve (VL) foram subclonados da pMORPH® X9_FH vetores de expressão Fab na série vector pMORPH® 2_h_lg para lgG2 humana. Clones selecionados também foram convertidos para o formato IgG 1LALA em que leucinas nas posições 234 e 235 foram mutadas para alaninas para revogar a ligação de FcRy e atenuar as funções efetoras.
[000330] As enzimas de restrição apropriadas (Knappik et al., 2000) foram usadas para subclonagem dos fragmentos do domínio VH e VL pMORPH® 2_h_lgG2, pMORPH® 2_h_lgG1LALA, pMORPH® 2_h_lgK e pMORPH® 2_h_lgÀ2.
[000331] Todas as preparações de DNA foram submetidas à análise da sequência antes da transfecção em células HKB11.
ii. Expressão transitória e Purificação de IgG humana
[000332] As células HKB11 eucarióticas foram transfectadas com IgG das cadeias pesada e leve do vetor de expressão do DNA. O sobrenadante de cultura das células foi colhido em 3 ou 7 dias após a transfecção e submetido a proteína padrão A da cromatografia de afinidade. Salvo quando indicado de uma outra mandeira, o tampão de troca foi realizado a 1 x Dulbecco PBS (pH 7,2) e as amostras foram filtradas estéril (0,2 mm).
As bibliotecas de maturação CDR-L3 e CDR-H2
[000333] Para aumentar a afinidade e a atividade biológica dos fragmentos de anticorpos selecionados, as regiões CDR-L3 e CDR-H2 foram otimizadas em paralelo por meio da mutagênese do cassete utilizando a mutagênese dirigida aos trinucleotídeos (Virnekas et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:5600 a 5607), em que as regiões da estrutura foram mantidas constantes (Nagy etal. 2002, Nature Medicine, 8:801 a 807). Antes da clonagem das bibliotecas de maturação, todos os fragmentos Fab parentais foram transferidos a partir da expressão do vetor de expressão pMORPH ® X9 CysDisplay® no vetor de maturação pMORPH ® 25 através dos locais Xbal/EcoRI de restrição. Este vetor fornece a proteína do fago PUI fundido ao terminal N de um resíduo de cisteína, bem como uma cisteína no terminal C fundida com a cadeia de anticorpo e, portanto, o fago ligado ao dissulfeto permite a exibição dos fragmentos Fab respectivos na superfície do fago.
[000334] Para a geração das bibliotecas CDR-H2 da região CDR-H2 de cada Fab parental foi retirado e substituído pelo cassete de maturação CDR-H2 altamente diversificado.
[000335] Em paralelo, a região de CDR-L3 dos clones parentais foi substituída por um cassete de maturação de CDR-L3 diversificado.
[000336] Os tamanhos das bibliotecas de maturação variaram de 4x105 para 1x108 clones. O antecedente do vetor foi abaixo de 1% em todos os casos. O controle de qualidade através do sequenciamento dos clones únicos revelou uma elevada qualidade de cada biblioteca.
[000337] Para cada biblioteca de maturação CDR-L3 e CDR-H2, os fagos exibindo os anticorpos foram preparados e os de títulos fago determinados por meio da titulação local.
Estratégias de panning para maturação de afinidade
[000338] Os fagos exibindo os anticorpos a partir das bibliotecas de maturação seguintes foram submetidos a pannings separados e triagem: Carga 1: MOR07079 (L-CDR3 maturação) carga 1: MOR07079 (H-CDR2 maturação)
[000339] Pannings de maturação, utilizando os respectivos anticorpos foram realizados em hActRUB biotinilado/Fc e huSkMC.
[000340] Fagos 2x1010 ou 1x1011 fagos por subcódigo, resgatado das bibliotecas de maturação recém-geradas foram usados para a primeira rodada de selecção.
[000341] Vários pannings diferenciais foram realizadas em rodadas de seleção na qual hActRIIB/Fc recombinante biotinilado alternava com uma primeira rodada de seleção em huSkMC.
[000342] Para a primeira e a terceira rodada do panning da solução, hActRIIB/Fc recombinante biotinilado foi capturado em Estreptavidina revestido por Dynabeads. O protocolo a seguir foi aplicado: para cada pool de fagos, cepas Estreptavidina foram lavadas com PBS e ressuspensas em tampão de bloqueio. As partículas de fago diluídas em PBS foram misturadas com tampão de bloqueio 0,1% de Tween 20 e mantidos em uma roda giratória. O pré-clareamento das partículas do fago para a remoção de estreptavidina ou contas de ligação de fagos foi realizado duas vezes: pools de fago Per bloqueado nas contas Estreptavidina foram acrescentados às partículas de fago bloqueadas e incubadas em uma roda giratória. Após a separação das contas através de um dispositivo magnético, o sobrenadante do fago foi transferido para um novo tubo de reação, pré-bloqueado e a pré-adsorção foi repetida.
[000343] Após o procedimento de bloqueio, o antígeno hActRIIB/Fc biotinilado foi adicionado às partículas do fago pré-clareadas e bloqueadas e incubado em uma roda giratória. Os complexos antígeno- fago foram capturados usando contas de estreptavidina bloqueado, adicionadas ao fago de panning do pools e incubados. As partículas do fago ligadas às contas de estreptavidina foram coletadas. As contas foram então lavadas com PBST e PBS. A eluição das partículas do fago da contas de estreptavidina foi realizada por adição de 20 mM a DTT.O eluato foi coletado e usado para a infecção de uma cultura de E. coli TG-1 cresceu a uma ODβOOnm de 0,6 a 0,8.
[000344] Após a infecção e a centrifugação posterior, os péletes de bactérias foram ressuspensos em um meio 2xYT, semeados em placas LB/CAM/Glc ágar e incubados durante toda a noite a 37°C. Na manhã seguinte, as colônias foram raspadas das placas e os fagos foram resgatados e ampliados principalmente como descrito (Krebs et al., 2001), com a ressalva de que os fagos ajudadores das células infectadas foram cultivados a 22°C durante a noite em um meio contendo 0,25 mM IPTG. As terceiras rodadas dos pannings da solução em hActRIIB/Fc biotinilado foram realizados de acordo com o protocolo da primeira rodada, exceto para valores decrescentes de antígeno usados e maior rigor das condições de lavagem.
[000345] Para a segunda rodada de panning (em huSkMC expressando os hActRUB endógenos), as partículas do fago diluídas em PBS foram misturadas com igual volume de PBS/BSA e bloqueadas. Em paralelo, para cada subcódigo de 9x105 huSkMC foi bloqueado com PBS/FCS/0,02% NaN3 a 4°C. As células foram bloqueadas giradas para baixo, ressuspensas em conjunto com as partículas do fago pré- bloqueadas e incubadas ainda mais.
[000346] Os complexos das células do fago foram lavados com PBS/BSA, seguido por lavagem em PBS. As células foram centrifugadas a 410 xg por 2 min a 4°C. A eluição acídica de partículas do fago do hActRUB expressando huSkMC foi realizada por uma etapa de incubação de 10 min com tampão glicina, pH 2,2. Após a centrifugação, o eluato foi neutralizado por meio da adição de Tris não- tamponado. O fago contendo o sobrenadante foi usado para a infecção de uma cultura de E. coli TG-1 cresceu a uma ODβOOnm de 0,6 a 0,8.
[000347] Após a infecção e a centrifugação posterior, os péletes de bactérias foram ressuspensos em um meio 2xYT, semeados em placas LB/CAM/Glc ágar e incubadas durante a noite a 37°C. Na manhã seguinte, as colônias foram raspadas das placas e os fagos foram resgatados e ampliados principalmente como descrito (Krebs et al., 2001), com a ressalva de que as células ajudadoras dos fagos infectados foram cultivadas a 22°C durante a noite em um meio contendo IPTG a 0,25 mM.
[000348] A abordagem mais bem-sucedida de panning resultou no panning dos ligantes muito potente que provou ser o panning diferencial com a primeira e a terceira rodada realizada em ActRIIB/Fc biotinilado e a segunda rodada em huSkMC.
[000349] Após o sequenciamento, Fabs foram selecionadas para expressão e a purificação, e os mais promissores ainda caracterizados.
[000350] A maioria dos anticorpos anti-ActRUB mostrou ligação com hActRUB transfectado às células HEK293T/17 com valores EC50 na única baixa faixa de dois dígitos nanomolares. Várias Fabs de miostatina poderiam deslocar a partir de ActRIIB/Fc em uma ligação de inibição da miostatina ELISA, mas apenas entre aqueles da inibição completa de MOR08067 da miostatina induzida por atividade no ensaio do gene repórter (figura 2).
[000351] As afinidades resumidas dos Fab mais promissores para ActRIIB/Fc humana e do camundongo estão listadas na tabela abaixo (tabela 1). Tabela 1: Dados de afinidade do anti-ActRUB Fab-FH aos antígenos ActRIIB
Figure img0001
[000352] A Fab do clone MOR08067 exibiu boa inibição na miostatina induzida por RGA, bem como ligação ao rhActRIIB transfectado por células HEK293. A afinidade por determinação Biacore revelou os valores KD ao ser humano e do ActRIIB/Fc de camundongo abaixo de 100 pM. MOR08067 e outros candidatos foram selecionados para otimizar ainda mais por uma abordagem de clonagem cruzada, enquanto MOR08067, contendo um local de glicolisação potencial N ligada também foi submetida a uma abordagem de deglicosilação.
[000353] Otimização dos anticorpos derivados a partir da primeira maturação de afinidade a) deglicosilação de MOR08067
[000354] De acordo com a análise da sequência, este anticorpo continha um local potencial de glicosilação N ligado dentro do CDR-H2 da cadeia pesada. Este local foi removido para produzir MOR08156 e MOR08159. A caracterização destes MOR08067 derivados é descrita abaixo. b) Clonagem Cruzada de Fabs Otimizadas
[000355] Para uma melhoria e remoção funcional dos potenciais locais de glicosilação Nligados em CDR-H2s e/ou CDR-L3s, as regiões CDR-H2 e CDR-L3 independentemente otimizadas de afinidade única amadureceu Fabs resultante da primeira maturação de afinidade as quais foram combinados enquanto mantiveram cada família separada. Os descendentes de MOR07079 apresentaram clonagem cruzada. Cerca de 200 lisados bacterianos foram testados em FACS no ranking de afinidade em HEK293T/17/ActRIIB e os clones mais promissores Fab, MOR08144 e MOR08213 foram expressos e purificados. c) Caracterização dos Anticorpos Otimizados
[000356] Nas seções seguintes, as progênies de MOR08067 Petição 870200074827, de 16/06/2020, pág. 120/140 117/127 deglicosilado (MOR08156, MOR08159) e os dois clones derivados de cruzamento MOR08067 (MOR08144 e MOR08213) são descritos em detalhe.
[000357] A capacidade de Fabs otimizada inibir a sinalização da miostatina no ensaio gene repórter foi determinada, com todos os ligantes sendo capazes de induzir inibição de > 95% na concentração mais elevada (figura 3).
[000358] Em experimentos de determinação de afinidade usando Biacore, MOR08159 e MOR08213 foram identificados como ligantes altamente potentes para tanto ActRIIB de camundongo quanto humano (tabela 2).Tornou-se óbvio que o aumento da afinidade de Fabs amadureceu e os Fabs otimizados refletem a potência aumentada no ensaio do gene repórter induzido por miostatina. Tabela 2: Dados de Afinidade de anti-ActRIIB Fabs aos antígenos ActRIIB
Figure img0002
Conversão de IgG2 de Fabs de Afinidade Maturada (1ª Maturação)
[000359] Fabs mais promissoras derivadas da primeira maturação de afinidade foram selecionadas para conversão de IgG2.
[000360] A expressão de IgG2 foi realizada por meio da transfecção transitória das células HKB11 e as imunoglobulinas de comprimento total foram purificadas a partir do sobrenadante de cultura das células.
[000361] Após a conversão para IgG, todos os candidatos mantiveram a capacidade de inibir a dosagem dependente induzida por meio da atividade da miostatina no ensaio do gene repórter (tabela 3). Tabela 3: Determinação de IC50 de anti-ActRIIB IgGs no ensaio do gene repórter da luciferase induzido por miostatina
Figure img0003
[000362] MOR08159 e MOR08213 foram testados por sua capacidade de se ligar aos mioblastos musculares primário por FACS, e a ligação específica a essas células foi relatada, em uma linhagem com baixa expressão de ActRIIB nessas células (figura 4).
[000363] MOR08159 e MOR08213 exibiram capacidade para reverter completamente a inibição induzido pela miostatina da diferenciação primária de mioblastos esqueléticos (figura 5). Esses anticorpos também aumentou a diferenciação acima do nível basal, na ausência de miostatina exógena, devido à sua capacidade de neutralizar endogenamente os ligantes de ActRIIB produzidos.
Maturação da Segunda Afinidade
[000364] Seleção de candidatos para a maturação da segunda afinidade para melhorar ainda mais a eficácia.
i. Construção de Bibliotecas de Maturação de CDR-L3 e CDR-H2
[000365] Para aumentar a afinidade e a atividade biológica dos fragmentos de anticorpos selecionados (por exemplo, MOR08067), as regiões CDR-L1 e CDR-H2 foram otimizadas por meio do cassete de mutagênese utilizando mutagênese dirigida pelos trinucleotídeos (Virnekas etal. [Supra]), em que as regiões da estrutura foram mantidas constante (Nagy et al. [supra]). Antes da clonagem das bibliotecas de maturação, todos os fragmentos Fab parentais foram transferidos a partir da expressão do vetor de expressão pMORPH ® X9 no CysDisplay® e do vetor de maturação pMORPH ® 25 através dos locais de restrição Xbal/EcoRI.
[000366] Os tamanhos de todas as bibliotecas de maturação renderam sempre um mínimo de clones 1x107 independentes. O antecedente do vetor foi abaixo de 1% em todos os casos. O controle de qualidade através do sequenciamento dos clones revelou uma elevada qualidade de cada biblioteca.
[000367] Para cada biblioteca de maturação CDR-L1 e CDR-H2, os anticorpos exibindo fagos foram preparados e os títulos de fago foram determinados por meio da titulação local.
ii. Estratégias de panning. Ranking de afinidade e triagem dos anticorpos melhorada
[000368] Pannings diferenciais para a segunda rodada de maturação de afinidade incluída das células HEK293T/17 parentais e huSkMC expressando ActRIIB humano de forma endógena em níveis baixos. Além disso, os antígenos hActRIIB/Fc recombinantes biotinilado foram incluídos em todas as estratégias de panning.
[000369] Para o ranking da Fabs anti-ActRUB, cerca de 2.700 lisados bacterianos (~ 88 clones para cada subcódigo de panning) foram classificados em antígenos hActRIIB/Fc recombinantes biotinilado e as preparações de membrana da vesícula hActRUB transfectadas pelas células HEK293T/17 em um método baseado em MSD. Acessos com fator de alta afinidade classificação foram sequenciados.
[000370] Além disso, os clones selecionados aleatoriamente que não aparecerama como acertos foram avaliados em ranking de afinidade de FACS. Para isso, os lisados bacterianos foram testados com HEK293T/17 parentais e/ou hActRUB transfectadas pelas células HEK293T/17. Os Fabs ligados às células foram detectados com ficoeritrina conjugado de cabra anti-lgG humana (H + L) do anticorpo secundário. A quantificação da expressão de Fab nos lisados foi realizada em paralelo.
[000371] Todas as estratégias de panning renderam anticorpos anti- ActRIlB específicos. Progénies de MOR08067 poderiam ser identificadas após a análise da sequência. Todos os ligantes foram maturados em CDR-H2.
Conversão de loG2 e Caracterização de lqG2 (2a Maturação)
[000372] Novamente, Fabs mais promissoras derivadas da maturação da segunda afinidade foram selecionados para conversão de lgG2. A expressão de lgG2 foi realizada por meio da transfecção transitória das células HKB11 e as imunoglobulinas de comprimento total foram purificadas a partir do sobrenadante de cultura de células.
[000373] Todas as IgGs testadas foram plenamente capazes de reverter a inibição induzida por miostatina a partir da diferenciação primária dos mioblastos esqueléticos (tabela 4). Tabela 4: Determinação de IC50 de anti-ActRUB IgGs em inibição induzida por miostatina do ensaio de diferenciação do músculo esquelético
Figure img0004
[000374] Avaliou-se a capacidade do Ab anti-ActRUB para neutralizar a ligação da miostatina, bem como outros ligantes da família TGFβ para ActRIIB humano dos mioblastos esqueléticos. No ensaio de diferenciação dos mioblastos, foram avaliados os diversos ligantes com potencial para inibir a diferenciação na ausência ou presença de MOR08159 ou MOR08213. Tabela 5: Determinação de IC50 e Emax da inibição induzida pelos vários ligantes do ensaio de diferenciação do músculo esquelético na presença ou na ausência de MOR08159/MOR08213 (10 p g/ml)
Figure img0005
[000375] Miostatina e GDF-11 são capazes de inibir a diferenciação de mioblastos humanos com eficiências semelhantes e de igual forma. Na presença de uma concentração única de MOR08159 ou MOR08213 de miostatina e as respostas da dosagem de GDF-11 foram deslocadas de forma paralela. Ativina A também foi capaz de inibir a diferenciação, no entanto, na presença de MOR08159 ou MOR08213, observou-se uma mudança paralela não acompanhada por uma mudança no Emax e potência. A resposta de BMP-2 não foi afetada pela presença de MOR08159 ou MOR08213, sugerindo que não ocorre através da ligação ActRIIB.
[000376] Caracterização dos anticorpos anti-ActRUB em estudos in vivo de camundongos.
[000377] A capacidade de anticorpos anti-ActRUB para induzir hipertrofia muscular foi avaliada em camundongos SCID administrada em MOR08159 ou MOR08213, 10mg/kg ip por semana durante 6 semanas (figura 6).
[000378] Ambos os anticorpos foram capazes de induzir uma hipertrofia profunda de todos os músculos examinados no final do estudo. O aumento significativo no peso corporal total de camundongos de anticorpos anti-ActRUB tratados foi detectado logo após 1 semana de tratamento.
[000379] MOR08213 foi capaz de induzir uma hipertrofia dependente de dosagem profunda de todos os músculos examinados aos 5 e 25 mg/kg, enquanto nenhuma mudança significativa foi observada na dosagem de 1 mg/kg (figura 7).
Estudos de Bloqueio Cruzado
[000380] As células HEK293T/17 transfectadas por ActRIIB humano estável foram mantidas em DMEM contendo 10% FBS, L-glutamina a 2 mM, penicilina (50 IE/ml), estreptomicina (50 mg/ml) e puromicina (2 mg/ml). As células foram cultivadas em estufa a 37°C e 5% de CO2 e subcultivadas a cada 3 a 4 dias. As células foram destacadas usando Accutase® e depois transferidas para um novo balão contendo novos meios.
[000381] A capacidade dos anticorpos anti-ActRUB para se ligar ao mesmo epítopo de ActRIIB humano foi avaliada por FACS usando células que expressam hActRUB.
[000382] Para isso, um anti-lgG ActRIIB foi incubado com 1x105 de células hActRUB transfectadas por cavidade por 1 hora a 4°C. Após a lavagem, anti-lgG ActRIIB diferente biotinilado ou um controle de IgG biotinilado foi incubado à concentração equimolar para o primeiro anti- lgG ActRIIB por 1 hora a 4°C. Após a lavagem, a célula ligada biotonilatada ao IgG foi detectada com estreptavidina-APC (Biolegend). Depois de uma hora de incubação a 4°C, as células foram lavadas novamente e ressuspensas em tampão FACS e intensidade de fluorescência das células foi determinada em um instrumento FACSArray®.
[000383] MOR08159 e MOR08213 foram testados por sua capacidade de se ligar ao ActRIIB das células transfectadas humanas por FACS, e ligação específica de MOR08159 sozinho (negrito) ou na presença de MOR08213 (negrito tracejado) foi relatada em relação ao isotipo de controle (preto) ou isotipo de controle na presença de MOR08213 (tracejada) (figura 8).
[000384] Na presença de MOR08213, a ligação da MOR08159 é significativamente reduzida, sugerindo que esses dois anticorpos se ligam tanto para os mesmos locais quanto para os locais que podem ter algum grau de sobreposição ou de ligação a um local MOR08213 distinta, mas próximas, podendo dificultar estericamente a ligação de MOR08159.
Mapeamento de epítopos
[000385] Diversos métodos complementares foram usados para determinar o epítopo para o qual o anticorpo se liga ao MOR08159. Neste exemplo, numeração de resíduos é com referência ao comprimento da sequência de aminoácidos ActRIIB completa (SEQ ID: 181).
Dot Blot
[000386] Uma análise dot blot do epítopo MOR08159 foi realizada. ActRIIB nativo e desnaturado (reduzido e calor desnaturado) foi flagrado em uma membrana de nitrocelulose, sondado com MOR08159, e detectado com um anticorpo marcado anti-humano. Apenas ActRIIB nativo, mas não reduziu e calor desnaturado de ActRIIB foi detectado. Os resultados indicaram que o epítopo é um epítopo conformacional.
Estudos mutacionais
[000387] A biblioteca do domínio extracelular do ActRIIB (aa 21 a 120) foi gerada por erro-prone de PCR e as variantes foram expressas na periplasma de E. coli. A ligação de cerca de 30.000 (pequena fração do tamanho da biblioteca teórica) dos variantes para MOR08159 foi testada pela triagem da colónia do filtro e coloração ocidental. Variantes as quais mostraram apenas fraca ou nenhuma ligação com MOR08159 foram também confirmadas por ELISA. O nível de expressão (detectado com um anticorpo anti-Bandeira) e MOR08159 ligado das variantes ActRIIB foram comparados aos do tipo selvagem de ActRIIB. Se a expressão foi de pelo menos 75% do tipo selvagem e MOR08159 foi inferior a 25%, a mutação foi classificado para ser envolvida na ligação a MOR08159. As variantes só tem um único ponto de mutação, o que não é, obviamente, distorcendo a estrutura (como por exemplo, a mutação de uma cisteína SS da ponte) foram consideradas.
[000388] A maioria das mutações que impediram a ligação de MOR08159 foi encontrada em um trecho a partir da posição K75 a D81, o que indica que esta região é importante para a ligação do anticorpo. Mas mutações nas posições W78, D80 e D81 foram encontrados para reduzir significativamente a ligação a MOR08159.
Ensaios Cíclicos de peptídeo
[000389] Uma coleção de peptídeos derivada do antígeno cíclico exibido em microensaios de peptídeo foi incubada com os anticorpos de interesse. A determinação do peptídeo de ligação de anticorpos foi realizada por análise RepliTope onde o microensaio de peptídeo foi incubada com o anticorpo primário seguido por um anticorpo secundário fluorescente etiquetado dirigido contra a parte de Fc do primário. Depois de lavar várias etapas do microensaios do peptídeo onde secou-se usando uma centrífuga de microensaio e digitalizou-se em um sistema de varredura de alta resolução do microensaio com as configurações de comprimento de onda apropriadas.
[000390] O microensaio é composto por três submatrizes, cada uma exibindo os peptídeos cíclicos derivados de ActRIIB (com resíduo de Cys trocado para Ser), que foram digitalizadas (peptídeo do formato scan 15/12). Como experimento de controle, uma incubação com o anticorpo independente (ACE18543, isótopo de controle), seguido por anticorpo secundário fluorescente etiquetado (Cy-5 anti-humana marcado de IgG) foi realizada para determinar falsos sinais positivos. Além disso, a incubação com o anticorpo-alvo, seguido por anticorpo secundário fluorescente etiquetado, foi realizada.
[000391] Anticorpo MOR08159 (ACE19819) foi mostrado para reconhecer um epítopo, que foi encontrado em três dos peptídeos testados (nn. 18-20). 18 IELVKKGSWLDDFNS (SEQ ID NO: 183) 19 VKKGSWLDDFNSYDR (SEQ ID NO: 184) 20 GSWLDDFNSYDRQES (SEQ ID NO: 185)
[000392] A sequência comum para estes peptídeos aos quais MOR08159 é considerada ligar-se a 76GCWLDDFNC84 (SEQ ID NO: 186).
[000393] A segunda região com características de ligação mais fraca também foi identificada por esse método. Esta região tem a segunda sequência 49CEGEQDKRLHCYASW63 (SEQ ID NO: 187). Cristalografia de raios X
[000394] ActRIIB Humano aa20-120 e aa24-117 foram expressos. Além disso, MOR08159 Fab e regiões Fv foram expressos e purificados (toda a expressão foi realizado em E.coli). Usando essas proteínas, quatro complexos de proteína foram preparados, purificados e cristalizados (MOR08159Fab-ActRIIB 20-120, 24-117 MOR08159FabActRIIB, MOR08159Fv-ActRIIB 20-120, 24-117 MOR08159Fv-ActRIIB).
[000395] A estrutura de raio-x livre de MOR08159 Fab estava resolvida a resolução 1.78Å. A estrutura de raio-x do complexo Fv com ActRIIB-LBD foi resolvida com a resolução 3.35Å. Usando a distância padrão 3.9A cut-off para determinar resíduos de contato, foi confirmado que a sequência de 76GCWLDDFNC84 é uma região importante de ligação com a contribuição dominante a partir da sequência 78WLDDFN83 (SEQ ID NO: 188). Além disso, a interação também foi encontrada com a região peptídica 49CEGEQDKRLHCYASW63.
[000396] Os resultados para os experimentos de mapeamento de vários epítopos são resumidos na figura 9.
Confirmação de afinidade pelo SET
[000397] Diluições seriadas de antígeno (domínio extracelular de ActRIIB ou ActRIlA) foram preparadas em PBS a 0,5% (p/v) BSA/0,02% (p/v) de Tween 20 e anticorpos (MOR08159) foi adicionado a cada concentração de antígeno para chegar a uma constante concentração de anticorpos. 10Opl/poço de cada mistura de diluição foram distribuídos em duplicatas para um polipropileno MTP de 96 poços (Greiner). O tampão de ensaio serviu como controle negativo e uma amostra que não contém o antígeno como controle positivo (Bmax). A placa foi selada e incubada durante toda a noite. Bind MTP de 96 poços (Meso Escala Discovery) foi revestida com 25pl de 0.1 pg/ml de ActRIIB-Fc de camundongo diluído em PBS. Também esta placa foi selada e incubada durante a noite a 4°C. Após a incubação o antígeno revestido por MTP Bind foi lavado com PBS/0.05% (w/v) de Tween 20. Posteriormente, a placa foi bloqueada com PBS/5% (w/v) BSA. As etapas de lavagem foram repetidas e 50 pl/poço da preparação antígeno-anticorpo do MTP polipropileno foi transferido para o MTP Bind antígeno revestido. Bind MTP foi incubado por 25 min em temperatura ambiente. Após mais três etapas de lavagem, 25pl de 1 pg/ml sulfo-Tag-cabra marcado do anticorpo de detecção anti-humano (Meso Escala Discovery) diluído em tampão de ensaio foram adicionados a cada poço e incubados uma hora à temperatura ambiente. Após a lavagem da placa, 50pl de tampão Read (Meso Escala Discovery) foram transferidos para cada poço. Sinais de eletroquimioluminescência (ECL) foram gerados e detectados por um leitor de 6000 Sector Imager (Descoberto da escala Meso).
[000398] Valores de ECL foram plotados contra as concentrações do antígeno correspondente. KD foi determinado pela montagem do plot com o modelo descrito por Piehler J, et al.(J Immunol Methods, 1997, 201 (2): 189 a 206).
[000399] Os valores relatados KD e os desvios-padrão foram determinados a partir dos valores individuais obtidos pelos experimentos KD independentes.
[000400] A partir desses experimentos, um valor médio para o equilíbrio de dissociação de KD constante de 1,73 (± 0,31) foi determinado para pM ActRIIB humano, enquanto um valor médio para o equilíbrio de dissociação de KD constante de 434 (± 25) foi determinado para pM ActRIlA.
[000401] Será entendido que a presente invenção tem sido descrita como exemplo apenas e as modificações podem ser feitas, permanecendo no âmbito

Claims (19)

1. Anticorpo anti-ActRUB ou fragmento funcional compre-endendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma CDR1 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9; uma CDR2 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23; uma CDR3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 37; e uma CDR1 da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 51; uma CDR2 da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 65, e uma CDR3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 79; ou (b) uma CDR1 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 11; uma CDR2 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 25; uma CDR3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 39; e uma CDR1 da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 53; uma CDR2 da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 67, e uma CDR3 da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 81.
2. Anticorpo anti-ActRUB ou fragmento funcional ou fragmento funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende (a) a sequência da cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 93 e a sequência da cadeia leve variável de SEQ ID NO: 107; ou (b) a sequência da cadeia pesada variável de SEQ ID NO: 95 e a sequência da cadeia leve variável de SEQ ID NO: 109.
3. Anticorpo anti-ActRUB ou fragmento funcional compre-endendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é do isotipo lgG1.
4. Anticorpo anti-ActRUB ou fragmento funcional compre-endendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que alterou a função efetora através de mutação da região Fc.
5. Processo para produzir um anticorpo ou ou fragmento funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira compreendendo em vetor de clonagem ou expressão codificando o anticorpo ou fragmento funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo como definido na reivindicação 1; e isolar o anticorpo ou fragmento funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo.
6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo ou ou fragmento funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo como definido na reivindicação 1.
7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um diluente ou um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais agentes ativos adicionais.
9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o agente ativo adicional é selecionado a partir de IGF-1, IGF-2 ou variantes ativas de IGF-1 ou IGF-2, um anticorpo antimiostatina, um propeptídeo de miostatina, uma proteína chamariz de miostatina que se liga a ActRIIB, mas não para ativá-lo, um agonista beta 2, um agonista grelina, um SARM, agonistas/miméticos GH ou folistatina.
10. Uso de um anticorpo ou ou fragmento funcional compre-endendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para aumentar massa muscular em um paciente com uma doença ou distúrbio osteomuscular; doença ou insuficiência renal aguda e/ou crônica, fibrose do fígado ou cirrose; câncer; câncer de mama; doença de Parkinson; condições associadas com a morte neuronal; esclerose lateral amiotrófica; atrofia cerebral; demência; anemia; fibrose do fígado, rins e dos pulmões e uma ou mais condições relacionadas à idade, rabdomiossarcoma, cânceres induzindo a perda óssea, carcinoma hepatocelular; e/ou câncer gastrointestinal.
11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido na reivindicação 1.
12. Uso de um anticorpo ou ou fragmento funcional compre-endendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para amenizar os efeitos da perda de massa muscular decorrente de inatividade forçada ou o tempo gasto em um ambiente de gravidade zero, em que o medicamento deve ser administrado antes do período de inatividade forçada ou o tempo gasto em um ambiente de gravidade zero.
13. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o paciente a ser tratado tem uma fratura de um membro ou articulação.
14. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o paciente foi submetido ou está prestes a sofrer cirurgia no quadril ou joelho.
15. Anticorpo, caracterizado pelo fato de ser codificado por pBW524 (DSM22874).
16. Uso de um anticorpo anti-ActRUB ou fragmento funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para aumentar massa muscular em um paciente em necessidade.
17. Uso de um anticorpo anti-ActRUB ou fragmento funcional compreendendo uma porção de ligação ao antígeno do mesmo como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um medicamento para aumentar massa muscular em um ser humano.
18. Anticorpo anti-ActRUB ou fragmento funcional compre-endendo uma porção de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 9; uma CDR2 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 23; uma CDR3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 37; uma CDR1 da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 51; uma CDR2 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 65; uma CDR3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 79.
19. Anticorpo anti-ActRUB ou fragmento funcional compre-endendo uma porção de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma CDR1 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 11; uma CDR2 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 25; uma CDR3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 39; uma CDR1 da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 53; uma CDR2 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 67; uma CDR3 da região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 81.
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