RS56893B1 - Novi prongf mutanti i njihove upotrebe u proizvodnji beta-ngf - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na nove proNGF mutante koji imaju supstitucije na prirodnim mestima za isecanje proteazom. Predmetni pronalazak dalje prikazuje postupak za proizvodnju biološki aktivnog humanog beta-NGF iz inaktivnog nerastvorljivog proNGF mutanta i upotrebu proNGF mutanta za proizvodnju humanog beta-NGF.

PRETHODNO STANJE PRONALASKA

[0002] Nervni faktor rasta (beta-NGF) je neurotrofni faktor koji ima ključnu ulogu u rastu i preživljavanju neurona (senzornih i simpatičkih) (Levi-Montalcini, R., Science 237 (1987) 1154; Thoenen, H., et al., Physiol. Rev.60 (1980) 1284; Yankner, B. A., et al., Annu. Rev. Biochem.51 (1982) 845). Beta-NGF pripada supefamiliji faktora rasta koji su vezani cisteinom sa predspostavljenom stabilnom dimernom proteinskom strukturom. Dalje, beta-NGF promoviše rast, diferencijaciju i vitalnost holinergičkih neurona centralnog nervnog sistema (Hefti, F. J., J. Neurobiol. 25 (1994) 1418). Mogude terapeutske indikacije za rekombinantni humani nervni faktor rasta uključuje periferne senzorne neuropatije, npr. povezane sa dijabetesom ili nepoželjne sporedne efekte kod AIDS terapije. Druge indikacije za beta-NGF su centralne neuropatije, npr. Alchajmerova bolest. U ovom slučaju, gubitak memorije je rezultat gubitka holinergičkih neurona. Takođe je pronađeno da je beta-NGF efikasan u lečenju humanih kutanih i kornealnih ulcera (Bernabei et al. Lancet 1999; Lambiase et al. NEJM 1998). Osim toga, takođe je pokazano da beta-NGF štiti delije mreženjače od degeneracije i apoptoze u eksperimentalnom životinjskom modelu glaukoma i da utiče na poboljšanje vizuelne funkcije kod nekoliko pacijenata koji imaju glaukom (Lambiase A, et al. PNAS 2009).

[0003] Zreli humani beta-NGF je protein sa 118 amino kiselina koji se translacijom dobija kao preproprotein koji se sastoji od 241 amino kiselina. Signalni peptid (prepeptid) od 18 amino kiselina se iseca tokom procesa translokacije u endoplazmin retikulum (ER). Dobijeni proprotein (proNGF) se obrađuje na njegovom N-kraju uklanjanjem pro-sekvence pomodu proteaznog isecanja. Zreli humani NGF pokazuje vedi stepen sličnosti (oko 90%) sa beta-NGF glodara (pacova i miševa). Za klinička ispitivanja ili terapeutske upotrebe, beta-NGF mora da bude obezbeđen u visokim koncentracijama. Submaksilarne žlezde miševa su prirodni izvor beta-NGF. Međutim, ovi beta-NGF preparati su heterogene smeše različitih dimera i prema tome nisu pogodni za terapeutske upotrebe. Dalje, pacijentima je poželjno davanje humanog oblika proteina. U humanom tkivu, međutim, neutrofni faktori se nalaze samo u niskim koncentracijama.

[0004] Prosekvenca je odvojeni domen od zrelog proteina (vidi podatak sekvence u slici 1, što je prosekvenca naznačena masnim slovima). Ova dva domena su odvojena pomodu izloženog mesta za isecanje proteazom sa ciljnom sekvencom bazne amino kiseline tipa Arg-Ser-Lys-Arg koja se nalazi na pozicijama 101 do 104 humane proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1). Ovaj motiv je prirodno mesto isecanja za serin endoproteazu Furin. Dodatno, mesto isecanja može da bude specifično obrađeno da drugim pogodnim proteazama, poželjno proteazama koje imaju specifičnost isecanja supstrata posle amino kiseline Arginin (Arg, R). Na primer, tripsin proteaza deluje isecanjem nakon baznih amino kiselina kao što je Lizin (Lys, K) ili Arginin (Arg, R).

[0005] Postupci za dobijanje biološki aktivnog beta-NGF od njegovog inaktivnog pro-oblika su dobro poznati u oblasti tehike. Na primer, EP 0994188 B1 opisuje postupak dobijanja biološki aktivnog beta-NGF od njegovog inaktivnog pro-oblika koji je slabo rastvorljiv. Prema ovom postupku, beta-NGF je mogude dobiti od rekombinantnog nerastvorljivog neaktivnog proNGF koji je rastvoren u denaturišudem rastvoru. Nakon toga, rastvoreni proNGF se prebacuje u rastvor koji ne omogudava denaturaciju ili slabo denaturišudi rastvor. Denaturisani proNGF zauzima biološki aktivnu konformaciju kao što je određeno disulfidnim vezama koje se nalaze u prirodnom beta-NGF. Nakon toga, prosekvenca proNGF se iseca što se dobija aktivni beta-NGF.

[0006] Humani proNGF sadrži mesto isecanja za prirodnu endoproteazu (Furin) Arg-Ser-Lys-Arg, prema tome ima slededi motiv sekvence: R<1>SK<3>R<4>. Za specifičnu proizvodnju procesi kao što su oni koji zahtevaju nivoe kvaliteta "Prakse dobre proizvodnje" (GMP), materijali kao što su enzimi moraju da budu obezbeđeni kao visoko kvalitetni. Proteaza Furin trenutno nije dostupna kao GMP-rangirana proteaza.

[0007] Prema tome, alternativna proteaza, Tripsin (EC 3.4.21.4), je odabrana za isecanje proNGF za dobijanje zrelog beta-NGF proteina. Serin proteaza Tripsin iseca peptidne lance na karboksilnoj strani baznih amino kiselina Arginina ili Lizina. U humanom proNGF-u, mesto isecanja koje se prirodno pojavljuje u humanom proNGF-u sadrži tri pozicije sa baznim amino kiselinama (pozicije 101, 103, i 104 SEQ ID NO: 1; ovde alternativno označene R<1>, K<3>i R<4>). Prema tome, isecanje proNGF-a Tripsinom može da dovede do brojnih različitih proizvoda koji se obrazuju nakon isecanja u zavisnosti od toga gde se tačno proces isecanja događa. Tpični proizvodi koji se dobijaju nakon isecanja su SK3R4-beta-NGF i R4-beta-NGF i zreli beta-NGF. Ovaj problem je u egzacerbaciji s obzirom da dimerizacija beta-NGF proteina vodi do još vedeg broja (do šest) nehomogenih proizvoda koji moraju da budu prečišdeni u slededim koracima (vidi sliku 2a).

TEHNIČKI PROBLEMI U OSNOVI PREDMETNOG PRONALASKA I NJIHOVO REŠENJE

[0008] Postupci za proizvodnju betaNGF su prethodno opisani u oblasti tehnike. Međutim, trenutno dostupni postupci proizvodnje imaju nekoliko nedostataka, kao što su nehomogeni beta-NGF proizvodi i niski prinosi beta-NGF.

[0009] Isecanje divljeg tipa pro-NGF sa Tripsinom za proizvodnju beta-NGF je pokazalo nisku efikasnost koja obavezuje upotrebu visokih količina enzima da bi se dobio dovoljan prinos isečenog beta-NGF. Ovo ima nekoliko nedostataka koji utiču na naredni proces prečišdavanja. Najpre, dalje smanjuje selektivnost isecanja koja dovodi do nekoliko proizvoda digestije. Drugo, prečišdavanje beta-NGF od enzima je neophodno s obzrom da enzim ne sme da se nalazi u krajnjem uzorku proteina. To podrazumeva nekoliko postupaka prečišdavanja za uklanjanje viška Tripsina. Prema tome, upotreba Tripsina kao enzima za isecanje u postupku oblasti tehnike dovodi ili do veoma niskih prinosa beta-NGF ili do problema sa prečišdavanjem proteina.

[0010] Nepotrebno je redi da ostaje potreba u oblasti tehnike za postupkom dobijanja beta-NGF bez nedostataka koji su opisani gore u tekstu. Prema tome, to predstavlja problem u osnovi predmetnog pronalaska da se obezbedi novi postupak za proizvodnju beta-NGF koji treba da se dobije u visokom kvalitetu, sa visokom efikasnosti i u visokim prinosima. Dalje, to je problem koji se nalazi u osnovi pronalaska da se obezbedi postupak za proizvodnju beta-NGF što dovodi do visokog prinosa u beta-NGF, koji je efikasan, jak, merljiv i koji može da se repodukuje.

[0011] Prednost pronalaska je proizvodnja beta-NGF iz novog proNGF mutanta. Novi mutant dovodi do homogenih beta-NGF proizvoda u dobom prinosu zbog toga što novi proNGF mutant sprečava nehomogenu digestiju proteazama i prema tome nehomogene beta-NGF proizvode. Problem pronalaska je rešen obezbeđivanjem proNGF mutanta pronalaska i postupka za proizvodnju beta-NGF od proNGF mutanta kao što se opisuje predmetnim pronalaskom.

[0012] Novi mutant dovodi do neočekivanog i značajnog povedanja u efikasnosti isecanja tripsina na relevantnom mestu u mutiranom proNGF-u pronalaska u poređenju sa divljim tipom. Ovo omogudava upotrebu ekstremno niskih količina tripsin proteaze u poređenju sa količinom koja treba da se koristi na divljem tipu i, kao posledica, dovodi do smanjenih problema u prečišdavanju beta NGF od samog enzima i od proizvoda isecanja.

[0013] Problemi koji su opisani gore u tekstu su rešeni i prednosti su postignute predmetom nezavisnih zahteva. Poželjna izvođenja pronalaska su uključena u zavisne zahteve kao i u slededem opisu, primerima i slikama.

[0014] Pregled iz gornjeg teksta ne opisuje neophodno sve probleme koji su rešeni predmetnim pronalaskom. Dalji problemi i kako se oni rešavaju mogu da budu očigledni stručnjaku iz oblasti tehnike nakon proučavanja predmetne prijave.

SUŠTINA PRONALASKA

[0015] U prvom aspektu predmetni pronalazak se odnosi na proNGF mutant, što je mesto isecanja proteazom R<1>SK<3>R<4>supstituisano najmanje na pozicijama R<1>i K<3>koje odgovaraju pozicijama 101 i 103 proNGF sekvence humanog divljeg tipa (SEQ ID NO: 1) amino kiselinom koja se bira od ne-baznih amino kiselina i Histidina.

[0016] U drugom aspektu predmetni pronalazak se odnosi na postupak za dobijanje biološki aktivnog humanog beta-NGF iz inaktivnog nerastvorljivog proNGF mutanta koji je supstituisan na prirodnom mestu isecanja proteazom R<1>SK<3>R<4>najmanje na pozicijama R<1>i K<3>koje odgovaraju poziciajma 101 i 103 proNGF sekvence humanog divljeg tipa (SEQ ID NO: 1), koja sadrži (i) obezbeđujudi proNGF mutant prema ovom pronalasku, i (ii) isecanje proNGF mutanta da se dobije aktivni humani beta-NGF.

[0017] Posebno, pronalazak se odnosi na sledede procese:

a. rastvaranja proNGF mutanta u denaturišudem rastvoru;

b. prebacivanja proNGF mutanta u rasvor koji omogudava ponovno savijanje (engl. „refolding“) što denaturisani proNGF zauzima biološki aktivnu konformaciju;

c. prečišdavanja proNGF mutanta iz rastvora za ponovno savijanje;

d. isecanja pro-sekvence proNGF mutanta da se dobije aktivni beta-NGF.

[0018] Tredi aspekt pronalaska se odnosi na upotrebu proNGF mutanta što najmanje Arginin na poziciji 101 i Lizin na poziciji 103 prirodnog mesta isecanja proteazom R<1>SK<3>R<4>na pozicijama 101 do 104 humanog divljeg tipa proNGF (SEQ ID NO: 1) je supstituisan sa ne-baznim amino kiselinama za dobijanje humanog beta-NGF.

[0019] Dalji aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na farmaceutske kompozicije koje sadrže beta-NGF koji je proizveden iz proNGF mutanta što najmanje Arginin na poziciji 101 i Lizin na poziciji 103 prirodnog mesta isecanja proteazom R<1>SK<3>R<4>na pozicijama 101 do 104 humanog divljeg tipa proNGF (SEQ ID NO: 1) su supstituisani sa amino kiselinom koja se bira iz ne-baznih amino kiselina i Histidina i farmaceutski prihvatljivog nosača ili rastvarača.

[0020] Ova suština pronalaska ne opisuje nephodno sve karakteristike predmetnog pronalaska. Druga izvođenja de biti očigledna iz pregleda detaljnog opisa koji sledi.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

Definicije

[0021] Pre nego što se predmetni pronalazak detaljno opiše u tekstu ispod, treba razumeti da pronalazak nije ograničen određenom metodologijom, protokolima i reagensima koji su ovde opisani, s obzirom na to da oni mogu da variraju. Takođe treba razumeti da metodologija koja se ovde koristi je samo za svrhu opisivanja određenih izvođenja, i nije namenjena da ograniči obim predmetnog pronalaska koji de biti ograničen priloženim zahtevima. Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi naučni i tehnički termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što to obično razume stručnjak iz oblasti tehnike kome ovaj pronalazak pripada.

[0022] Kroz specifikaciju i zahteve koji slede, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadržati", i varijacije kao što su "sadrži" i "koji sadrži", podrazumeva uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe brojeva iil koraka ali ne isključivanje bilo kog celog broja ili koraka ili grupe broja ili koraka.

[0023] U tekstu specifikacije se navodi nekoliko dokumenata (na primer: patenata, patentnih prijava, naučnih publikacija, instrukcija itd.). Ovde ništa ne treba tumačiti kao priznanje da pronalazak nema pravo da dozvoli takvo otkrivanje na osnovu prethodnog pronalaska.

[0024] Sekvence: Sve sekvence koje su ovde navedene prikazane su u dodatoj listi sekveci koja, sa njenim celim sadržajem i prikazom, jeste deo specifikacije.

[0025] Termin "oko" kada se koristi u vezi sa numeričkom vrednosti treba da obuhvati numeričke vrednosti u okviru opsega sa nižom granicom koja je 5% manja nego navedena numerička vrednost ima gornju granicu koja je 5% veda nego navedena numerička vrednsot.

[0026] Termin "proNGF" ili "pro-NGF" se odnosi na pro-oblik humanog beta-NGF. Puna humana proNGF sekvenca se definiše u SEQ ID NO: 1 (slika 1a). Da bi se dobio zreli beta-NGF, propeptid proNGF mora da bude isečen proteazama. Prosekvenca beta-NGF je domen koji je odvojen od zrelog beta-NGF. Između ova dva domena, nalazi se prirodno mesto isecanja proteazom Arg-Ser-Lys-Arg (ovde se navodi kao R<1>SK<3>R<4>, SEQ ID NO: 9) na pozicijama 101 do 104 SEQ ID NO: 1. Mesto isecanja može da bude specifično obrađeno pogodnim proteazama, posebno furin proteazom.

[0027] Termin "proNGF mutant" ili "proNGF mutein" odnosi se na modifikacije pro-oblika humanog beta-NGF pomodu supstitucija sa amino kiselinama. ProNGF mutein predmetnog pronalaska je supstituisan na prirodnom mestu isecanja proteazom R<1>SK<3>R<4>(SEQ ID NO: 9) na najmanje obe pozicije K<3>i R<1>koje odgovaraju pozicijama 101 i 103 proNGF sekvence humanog divljeg tipa (SEQ ID NO: 1) pomodu amino kiseline koja se bira iz ne-baznih amino kiselina i histidina.

[0028] U poželjnom izvođenju pronalaska, amino kiselina Lizin na poziciji K<3>(koja odgovara poziciji 103) je supstituisana sa Alaninom (vidi sliku 1d, SEQ ID NO: 4, sliku 1e, SEQ ID NO: 5, sliku 1g, SEQ ID NO: 8).

[0029] U drugom poželjnom izvođenju pronalaska, amino kiselina Arginin na poziciji R<1>(koja odgovara poziciji 101) je supstituisana sa Valinom (vidi sliku 1b, SEQ ID NO: 2, sliku 1e, SEQ ID NO: 5, sliku 1g, SEQ ID NO: 8).

[0030] U drugom poželjnom izvođenju pronalaska, amino kiselina arginin R<4>koja odgovara poziciji 104 proNGF sekvence divljeg tipa (SEQ ID NO: 1) može takođe da bude supstituisana sa amino kiselinom koja omogodava obradu proNGF proteolitičkim isecanjem da se dobije beta NGF, poželjno baznom amino kiselinom kao što je Arginin ili Lizin. Na primer, prisustvo Alanina na poziciji R<4>onemogudava obradu proNGF do beta NGF. Prema tome, mutant pronalaska ne može da sadrži Alanin na poziciji 104.

Tabela 1. Mesta isecanja pro NGF i proNGF muteina proteazom

(X se odnosina bilo koju amino kiselinu ali ne na Arg ili Lys)

[0031] Termin "ne-bazna amino kiselina" se odnosi na bilo koju amino kiselinu koja ne nosi pozitivno naelektrisanje. Temin se odnosi na bilo koji ostatak amino kiseline osim bazne amino kiseline. Termin isključuje amino kiseline Lizin ili Arginin što su amino kiseline sa pozitivnim bočnim lancima. Nebazne amino kiseline su negativno naelektrisane amino kiseline glutaminska kiselina i asparaginska kiselina, amino kiseline sa polarnim nenaelektrisanim bočnim lancima (serin, treonin, asparagin, glutamin), amino kiseline sa hidrofobnim bočnim lancem (alanin, valin, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, tirozin, triptofan) i amino kiseline cistein, glicin i prolin.

[0032] Termin "biološki aktivni pro-NGF" ili "proNGF sa biološki aktivnom konformacijom" kao takav se odnosi na biološku aktivnost pro-NGF. Biološki aktivna konformacija proNGF se određuje prisustvom disulfidnih mostova koji se nalaze u prirodnom beta-NGF. Aktivnost može da bude, na primer, određena prema testu kako je opisano u Chevalier et al. 1994, Blood 83: 1479-1485, 1994, što je ovde uključeno referencom. Primer 11 opisuje test za biološku aktivnost proNGF stimulacijom proliferacije TF1 delija.

[0033] Termin "beta-NGF" odnosi se na zreli beta-nervni faktor rasta, poželjno od čoveka. Sekvenca zrelog beta-nervnog faktora rasta prikazana je na slici 1 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, i SEQ ID NO: 8), sa početkomna poziciji 105.

[0034] Termin "aktivnost beta-NGF" ili "biološki aktivni beta-NGF" kao takav označava biološku aktivnost beta- NGF. Biološki aktivni beta-NGF postoji u obliku dimera. Beta-NGF mora da bude u dimernom obliku da bi imao biološki aktivnu konformaciju. Preduslov biološki aktivne konformacije beta-NGF je ispravno obrazovanje disulfidnih mostova u cistinski čvor. Aktivnost može da bude, na primer, određena prema DRG testu (test dorzalnog korena ganglije), vidi na primer Levi-Montalcini, R. et al., Cancer Res. 14 (1954) 49, and Varon, S. et al., Meth. in Neurochemistry 3 (1972) 203. U ovom testu stimulacija i preživljavanje senzornih neurona od disocirane ganglije dorzalnog korena embriona pileta se prati pomodu obrazovanja neurita.

[0035] Termin "supstitucija" ili "supstitucije" se odosi na modifikacije pro-oblika humanog beta-NGF pomodu zamena amino kiselina. Termin sadrži hemijsku modifikaciju amino kiselina npr. supstituisanjem ili dodavanjem hemijskih grupa ili ostataka na originalnu amino kiseinu. Korak modifikovanja odabranih amino kiselina se poželjno izvodi mutagenezom na genskom nivou. Poželjno, modifikacija proNGF se izvodi pomodu postupaka genetičkog inženjersta za izmenu DNK koja pripada proNGF. Modifikacije su mutacije koje uzrokuju zamenu nukleotida jedne baze sa drugim nukleotidom genetičkog materijala. Tačkaste (“point” ) mutacije dovode do kodiranja različitih amino kiselina u poređenju sa sekvencom divljeg tipa. Poželjno, ekspresija modifikovanog proNGF proteina se nakon toga izvodi u prokariotskim ili eukariotskim organizmina, najpoželjnije u prokariotskim organizmima.

[0036] Termin "denaturisanje" ili "denaturacija" se odnosi na postupak u kome je izmenjena struktura savijanja proteina. Termin se odnosi na otvaranje tercijerne strukture proNGF ili proNGF muteina. Promena strukture savijanja se događa zbog izlaganja određenim hemijskim ili fizičkim faktorima. Kao rezultat, neka od originalnih svojstava proteina, posebno njegova biološka aktivnost, je umanjena ili eliminisana. Zbog procesa denaturacije, proteini postaju biolški neaktivni. Dalje, denaturisani proteini mogu da ispolje širok opseg karakteristika, uključujudi gubitak biloške funkcije, gubitak rastvorljivosti i/ili nakupljanje.

[0037] Termin "refolding" ili "renaturisanje" ili "renaturacija" odnosi se na postupak pomodu kog protein zauvima prirodno funkcionalno savijanje ili konformaciju. Zbog renaturacije ili procesa ponovnog savijanja, protein postaje biloški aktivan.

[0038] Termin "rekombinantni" odnosi se postupak kloniranja DNK u vektore za ekpresiju proteina koji su kodirani sa DNK u pogodnom domadinu. Domadin je poželjno prokariot, poželjnije bakterija. "Rekombinantna ekspresija" kao što se ovde koristi se odnosi na ekspresiju proNGF ili proNGF muteina u prokariotskim delijama domadima, na primer, mogu da se koriste sojevi E. coli koji u pogodni za ekspresiju rekombinantnih proteina.

[0039] Termin "rastvorljiv" se odnosi na protein koji je podložan rastvaranju u nekom rastvaraču.

[0040] Termin "nerastvorljiv" se odnosi na protein koji nije podložan rastvaranju u nekom rastvaraču.

Opis pronalaska

ProNGF mutanti pronalaska

[0041] U prvom izvođenju pronalaska, predmetni pronalazak obezbeđuje proNGF mutant što mesto isecanja proteazom R<1>SK<3>R<4>je supstituisano najmanje na pozicijama R<1>i K<3>koje odgovaraju pozicijama 101 i 103 proNGF sekvence humanog divljeg tipa (SEQ ID NO: 1) amino kiselinom koja se bira od ne-baznih amino kiselina i histidina. Drugim rečima, najmanje Arginin R<1>na poziciji 101 i Lizin K<3>na poziciji 103 prirodnog mesta isecanja proteazom R<1>SK<3>R<4>na pozicijama 101 do 104 proNGF sekvence humanog divljeg tipa (SEQ ID NO: 1) su supstituisani bilo kojom amino kiselinom ali ne Argininom ili Lizinom.

[0042] U humanom divljem tipu proNGF (SEQ ID NO: 1), prirodna sekvenca za isecanje proteazom se odnosi na pozicije amino kiselina 101 do 104 (ArgSerLysArg, RSKR, SEQ ID NO: 9). Amino kiselina Lizin K<3>na poziciji 103 divljeg tipa proNGF sekvence i amino kiselina Arginin R<1>na poziciji 101 su zamenjene sa bilo kojom amino kiselinom ali ne sa Arg ili Lys da se dobije proNGF sa unapređenim karakteristikama posebno za proizvodnju beta-NGF. Da bi se postigao gore navedeni cilj, tj. da se dobije mutein sa unapređenim karakteristikama za proizvodnju beta-NGF, Arginin (R<1>) ili Lizin (K<3>) može da bude supstituisan sa svim amino kiselinama koje se nalaze u prirodi, ili takođe sa veštačkim amino kiselinama, pod uslovom da ne obrazuju mesto isecanja za tripsin.

[0043] Prema tome, modifikacije amino kiseline prema jednoj ili više pozicija koje odgovaraju ostacima 101-103 mogu biti supstitucije koje zamenjuju bazne amino kiseline sa ne-baznim amino kiselinama. Ove supstitucije mogu da se koriste za dobijanje proNGF mutanata prema pronalasku, posebno, za dobijanje beta-NGF. Mutanti sadrže supstitucije najmanje na pozicijama Arg101 i Lys103. Ostaci amino kiseline su zamenjeni sa ne-baznom amino kiselinom ili Histidin. Poželjno, mutant pronalaska imaju supstitucije Arg101Val i Lys103Ala. Na primer, pomenute prirodne nebazne amino kiseline mogu da se odaberu iz grupe koja se sastoji od ostataka amino kiselina koje se nalaze u prirodi, kao što su Alanin, Asparagin, Aspartanska kiselina, Cistein, Glutamin, Glutaminska kiselina, Glicin, Izoleucin, Leucin, Metionin, Fenilalanin, Prolin, Serin, Treonin, Triptofan, Tirozin, Valin.

[0044] Amino kiseline za supstitucije na pozicijama 101 i 103 nisu odabrane od baznih (pozitivno naelektrisanih) amino kiselina Arginina (Arg) i Lizina (Lys). Takođe su manje poželjne amino kiseline Izoleucin (Ile), Leucin (Leu), ili Fenilalanin (Phe), Cistein (Cys), Prolin (Pro) ili Triptofan (Trp). Serin (Ser) se prirodno nalazi na poziciji 102 humane proNGF sekvence divljeg tipa. X na poziciji 102 (SEQ ID NO: 7 i SEQ ID NO: 8) se poželjno bira od Serina (Ser) koji se prirodno nalazi na poziciji 102 humane proNGF sekvence, ali može takođe da se odabere od bilo koje druge amino kiseline što amino kiselina mora da bude ne-bazna amino kiselina (tj. ne Arginin ili Lizin). Važno je da je amino kiselina na poziciji 102 ne-bazna amino kiselina (tj. ne Arg ili Lys).

[0045] Amino kiselina na poziciji 104 divljeg tipa humane proNGF sekvence je poželjno Arginin (Arg) koji se prirodno nalazi na poziciji 104 humane proNGF sekvence, ali takođe može da bude supstituisan sa bilo kojom drugom amino kiselinom, poželjno baznom amino kiselinom, poželjnije Lizinom, što omogudava obradu proNGF proteolitičkim isecanjem da se dobije beta NGF.

[0046] Na primer, prisustvo Alanina na poziciji 104 divljeg tipa humanog proNGF onemogudava obradu proNGF do beta NGF. Prema tome, Ala na poziciji 104 je isključen.

[0047] Tabela 2 sažeto prikazuje pogodne supstitucije za mesto isecanja proNGF proteazom.

Tabela 2A. Poželjne amino kiseline na pozicijama 101-104 u divljem tipu proNGF

Zvezdica (*) označava amino kiseline koje se nalaze u prirodi na mestu isecanja proteazom (divlji tip proNGF, SEQ ID NO: 1).

101 Val, Ala, Asn, Asp, Glu, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Met, His, Cys, Pro, Phe, Trp, He, Leu

102

103 Ala, Val, Asp, Asn, Glu, Gln, Gly, Ser, Thr, Tyr, Met, His, Cys, Pro, Phe, Trp, He, Leu 104 Arg*, Lys

[0048] Amino kiseline Cys, Pro, Phe, Trp, Ile i Leu su manje poželjne supstitucije na pozicijama 101, 102, i 103.

Tabela 2B. Najpoželjnije amino kiseline na pozicijama 101-104 divljeg tipa proNGF 101 Val, Ala, Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Gln, Tyr, Met, His

102 Ser*, Val, Ala, Gly, Thr, Asn, Asp, Glu, Gln, Tyr, Met, His

103 Ala, Val, Gly, Ser, Thr, Asn, Asp, Glu, Gln, Tyr, Met, His

104 Arg*, Lys

[0049] Važno je da se nalazi bilo koja amino kiselina ali ne Arg ili Lys na pozicijama 101, 102, i 103 proNGFmutein-a i da se nalazi bazna amino kiselina (Arg ili Lys) na poziciji 104 proNGF-mutein-a. Iznenađujude je pokazano da specfično dve zamene amino kiselina na pozicijama 101 i 103 dovode do proizvodnje beta-NGF sa visokom efikasnošdu.

[0050] U sekvenci najpoželjnijeg proNGF mutanta pronalaska (SEQ ID NO: 5), poželjna supstituisana amino kiselina na poziciji 101 humanog divljeg tipa proNGF je Valin, na poziciji 103 humanog divljeg tipa proNGF je Alanin, na poziciji 102 huamnog divljeg tipa proNGF je Serin, i na poziciji 104 huamnog divljeg tipa proNGF je Arginin. U posebno poželjnom izvođenju pronalaska, proNGF mutant pronalaska ima sekvencu koja odgovara SEQ ID NO: 5.

[0051] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na nukleinske kiseline koje kodiraju za proNGF mutante koji se takođe ovde opisuju.

Model dobijanja humanog beta-NGF od proNGF mutanta pronalaska

[0052] U drugom aspektu, predmetni pronalazak je usmeren na postupak za dobijanje biološki aktivnog humanog beta-NGF od inaktivnog nerastvorljivog proNGF mutanta koji je supstituisan na prirodnom mestu za isecanje proteazom R<1>SK<3>R<4>(SEQ ID NO: 9) na pozicijama 101 i 103 (R<1>i K<3>) humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1), koja sadrži proNGF mutant koji je supstituisan na prirodnom mestu za isecanje proteazom R<1>SK<3>R<4>na pozicijama 101 i 103 (R<1>i K<3>) humanog divljeg tipa proNGF sekvence, i isecanja proNGF mutanta da se dobije aktivni humani beta-NGF.

[0053] Poželjno, proNGF mutant se dobija rekombinantnom ekspresijom u prokariotskim delijama. Pogodni sojevi bakterija su dobro poznati u oblasti tehnike, npr., E. coli, Bacillus sp., i Salmonella, i kitovi za takve ekspresione sisteme su komercijalno dostupni. Poželjne delije domadina za rekombinantnu ekspresiju su E. coli, na primer E. coli BL21, JM 108/109 (K12), JM106, JM83 i TB1 ili njihovi derivati. Može da se koristi bilo koji drugi soj E. coli koji je pogodan za ekspresiju rekombinantnih proteina.

[0054] Polinukleotidi su operativno povezani sa sekvencama koje kontrolišu ekspresiju omogudavajudi ekspresiju fuzionih proteina pronalaska u prokariotskim delijama. Takve eskspresione kontrolne sekvence uključuju ali bez ograničenja inducibilne i neinducibilne promotore, operatore, represore i druge elemente koji su poznati stručnjaku u oblasti tehnike i koje pokredu ili na drugi način regulišu ekspresiju gena. Takvi regulatorni elementi uključuju na primer T7, TAC, PBAD, LAC promotere, LacI, LacIQ represore.

[0055] Sekvenca proNGF mutanta se uvodi u prokariotsku deliju domadina pomodu odgovarajudeg vektora. Pogodni vektori, mogu na primer da budu, ali bez ograničenja: pBR322, pMAL, pUC19 i svi derivati. Prokariotska delija domadina uključuje ali nije ograničena na prokariotske delije kao što su bakterije (na primer, E. coli ili B. subtilis), koje mogu da budu transformisane sa, na primer, plazmidnom DNK, rekombinantnom DNK bakteriofaga, ili kozmidnim DNK ekspresionim vektorima koji sadrže polinukleotidne molekule pronalaska. U jednom izvođenju pronalaska, koriste se plazmidni vektori. Na primer, ali bez ograničenja, mogu da se koriste plazmidni vektori koji su opisani u EP1697523B (koji su ovde uključeni referencom).

[0056] Da bi se eksprimirali proNGF muteini, koristi se ekspresioni vektor koji sadrži

a. jak promoter koji umerava transkripciju (npt. tac ili T7 promoter),

b. kodirajudu sekvencu za proNGF ili proNGF mutein

c. transkripcioni/translacioni terminator (npr. t0-terminator lambda bakteriofaga)

d. prvi marker gen za selekciju, npr. gen koji kodira za otpornost prema antibioticima (npr. za otpornost prema Kanamicinu, kan),

e. drugi marker gen za selekciju, npr. Gen koji kodira za proB i / ili proA.

f. represor gen (npr. lacI gen)

g. više početaka replikacije

[0057] U jednom izvođenju pronalaska, ekspresioni vektori vlasnika patenta (Scil Proteins GmbH, vidi EP1697523B1 za strukturi pogodnog ekspresionog vektora) ili komercijalno dostupni vektori mogu da se koriste za kloniranje. U odnosu na opšte informacije za vektore koji mogu da se koriste u postupku predmetnog pronalaska, pominje se prema gore navedenim detaljima. Međutim, bilo koji pogodni vektori mogu da se koriste kao što je poznato u oblasti tehnike.

[0058] Struktura ekspresionog vektora pSCIL101 vlasnika patenta kao jednog primera pogodnog vektora za transformaciju prokariotskih delija domadina, je predstavljena ispod:

[0059] Postupak za dobijanje proNGF mutanta se sastoji iz slededih početnih koraka:

i. dobijanja nukleinske kiseline koja kodira proNGF mutein

ii. uvođenja pomenute nukleinske kiseline u prokariotski ekspresioni vektor;

iii. uvođenja pomentog ekspresionog vektora u deliju domadina;

iv. kultivisanja delije domadina;

v. izlaganja delije domadina pogodnim uslovima kultivacije.

[0060] Zbog njegove ekspresije u prokariotskim delijama domadina, proNGF mutein se nalazi u neaktivnom nereastvorljivom obliku.

[0061] U poželjnom izvođenju, postupak dobijanja beta-NGF od proNGF mutanta prema predmetnom pronalasku sadrži korake:

a. rastvaranja proNGF mutanta koji je supstituisan na prirodnom mestu za isecanje proteazom R<1>SK<3>R<4>na pozicijama R<1>i K<3>koje odgovaraju pozicijiama 101 i 103 humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) solubilizacijom inkluzionih tela u denaturišudem rastvoru; b. prebacivanja proNGF mutanta u rastvor za ponovno savijanje što denaturisani proNGF zauzima biološki aktivnu konformaciju;

c. prečišdavanja proNGF mutanta iz rastvora koji omogudava ponovno savijanje;

d. isecanja pro-sekvence proNGF mutanta da se dobije aktivni beta-NGF.

[0062] Prema slededem, razmatraju se poželjni koraci postupka za proizvodnju beta-NGF od proNGF mutanta prema predmetnom pronalasku.

Korak a: Rastvaranje proNGF mutanta

[0063] Korak a) odgovara rastvaranju proNGF mutanta koji je supstituisan na prirodnom mestu za isecanje proteazom R<1>SK<3>R<4>na pozicijma R<1>i K<3>koje odgovaraju pozicijama 101 i 103 humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) rastvaranjem inkluzionih tela u denaturišudem rastvoru. Napominjemo da je proNGF mutant pronalaska u koraku a) obično u neaktivnom nerastvorljivom oblika zbog njegove ekspresije u prokariotskim delijama domadina. Neaktivni proNGF koji ima slabu rastvorljivost se obrazuje tokom prekomerne ekspresije proteina u citoplazmi prokariota. U ovom slučaju, proNGF koji se dobija rekombinacijiom ostaje u citoplazmi u nerastvorljivom obliku i nakupljenom obliku. Ove nakupine proteina, njihova izolacija kao i njihovo prečišdavanje opisani su na primer u Marston, F. A., Biochem. J.240 (1986).

[0064] Da bi se izolovale ove nekativne nakupine proteina (inkluziona tela), prokariotske delije se prekidaju nakon čega sledi fermentacija. Prekidanje delija može da se izvede pomodu konvencionalnih postupaka, npr. homogenizacijom sa visokim pritskom, sonifikacijom ili lizozimom (Rudolph, R., et al. (1997); Folding proteins. In: Creighton, T. E. (ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp.57-99).

[0065] Dalje, inkluziona tela se rastvaraju. Inkluziona tela (IB) su nakupine obično defektnih ili nepotpuno savijenih proteina. One se obrazuju unutar delije, na primer bakterijskim delijama, kao što su E. coli, u slučaju vede ekspresije rekombinantnih proteina. Inkluziona tela koja se koriste prema pronalasku poželjno sadrže proNGF mutein. Ovo zanači da sadrže najmanje 60, najmanje 70, ili najmanje 80 ili najmanje 90 mas.% pro-NGF (na osnovu ukupne količine proteina).

[0066] Pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje muteina od proNGF, gde inkluziona tela koja nisu pravilno savijena (engl. non-folded), inaktivna, nerastvorljivog proNGF muteina ili njegovog derivata su rastvorena u puferu za denaturaciju (rastvoru).

[0067] Denaturišudi rastvor korak a) poželjno sadrži rastvor koji obuhvata (i) haotropno sredstvo, (ii) helator, (iii) pufer, i (iv) i redukujude sredstvo.

[0068] Denaturišudi pufer sadrži najmanje jednu haotropnu supstancu (sredstvo). Hemijske supstance koje stvaraju uređene vodonične mostove u vodi se nazivaju haotropi. S obzirom da su vodonične veze i mostovi otvoreni prekidanjem, haotropne supstance inteferiraju sa strukturom vode i osiguravaju neuređenje (povedanje u entropiji). Razlog za ovo je u tome je što je sprečeno obrazovanje H2O struktura kaveza koji su neophodni za rastvaranje. U slučaju amino kiselina, one smanjuju hidrofobne efekte i imanju denaturišude dejstvo na proteinima, s obzirom da je pokretačka sila za savijanje proteina sklapanje hidrofobnih amino kiselina u vodi. Generalno, bilo koja supstanca koja ispoljava hidrofobni efekat u puferu za rastvaranje i prema tome ima denaturišude dejstvo na proteinima može da se upotrebi kao haotropna supstanca. Uopšteno, haotropne supstance su soli ili jedinjenja sa niskom molekulskom masom, kao što je urea. Haotropne supstance se jasno razlikuju od deterdženata, s obzirom na to da one u molekulu ne sadrže hidrofobni radikal, kako što je alkil radikal. Uopšteno, haotropno delovanje se povezuje sa poboljašanjem rastvorljivosti proteina, u ovom slučaju pretrombina.

[0069] U poželjnom izvođenju pronalaska, haotropno jedinjenje se bira od gvanidinijum soli, posebno gvanidinijum hlorovodonika i gvanidinijum tiocijanata, jodida, barijumovih soli, tiocijanata, uree i prehlorata.

[0070] Haotropna jedinjenja se koriste u konvecijalnim količinama. Na primer, 4 - 8 M gvanidinijum hlorovodonik ili 4 - 9 M urea može da se koristi.

[0071] Denaturišudi pufer sadrži jedinjenje redukujudeg sredstva, na primer disulfidno jedinjenje kao što je Glutation (GSH). Disulfidno jedinjenje može da obrazuje pomešane disulfide sa tiolnim grupama (-SH) cisteina koji se nalaze u polipeptidima u inkluzionim telima. Disulfid se dodaje u rastvor. Disulfid ne označava proteine koje sadrže inkluziona tela i koji mogude sadrže disulfidne mostove. Poželjno, disulfid nije pravi peptid. Poželjno, disulfid je jedinjenje niske molekulske mase. Molekulska masa je, na primer, niža od 2000 g/mol ili od 1000 g/mol. Disulfid se koristi na primer, u koncentraciji od oko 5 mM do 1 M, posebno 10 mM do 0,5 M.

[0072] U poželjnom izvođenju pronalaska, disulfidno jedinjenje je glutation disulfid. Glutation (GSH), takođe γ-L-glutamil-L-cisteinilglicin, je pseudo-tripeptid što se obrazuje iz tri amino kiseline glutaminske kiseline, cisteina i glicina. GSH se nalazi u citoplazmi i prokariota i eukariota i uključen je u obrazovanje disulfidnih mostova. U ravnoteži je sa GSSG, koji sadrži disulfidni most. Glutation reaguje sa cisteinima R-SH i R’-SH iz dva polipeptida ili iz jednog polipeptida u reakciji razmene disulfida:

R-SH GSSG → R-S-S-G GSH.

[0073] RSSG se zove pomešani disulfid. Dalje reaguje sa cisteinom polipeptida, tako da se kao rezultat dobija disulfidni most između dva cisteina:

R-S-S-G HS-R’ → R-S-S-R’ GSH.

[0074] Glutation se enzimski drži u redukovanom obliku (GSH) u citolazmi. "Redukujudi uslovi" u citoplazmi se, prema tome na to odnose. Uslovi su uspostavljeni u puferu za rastvaranje tako da disulfidno jedinjenja koje sadrži katalizuje obrazovanje disulfidnih mostova prema reakcijama koje su opisane gore u tekstu. GSSG se koristi, prema tome, u koncentraciji od oko 10 mM do 0,5 M.

[0075] Alternativno, kao redukujude sredstvo (reduktant), može da se koristi cistein.

[0076] U poželjnom izvođenju pronalaska, denaturišudi rastvor je Tris pufer.

[0077] Denaturišudi rastvor dalje može da sadrži konvencionalne aditive, na primer EDTA ili soli. pH pufera za rastvaranje je, na primer, između 7 i 10, poželjno pH 8. Rastvaranje se poželjno mehanički pomaže, na primer sa konvencionalnim aparatim za homogenizaciju ili upotrebom ultrazvuka. Nakon rastvaranja, čvrste supstance koje preostaju se poželjno odvajaju. Supernatant sadrži rastvoreni pro-NGF.

[0078] U jednom izvođenju pronalaska, denaturišudi rastvor sadrži

i. Gvanidinijum-HCl, 1 - 8 M, poželjno 4-6 M, najpoželjnije 4 M, GSH ili cistein, 1 - 100 mM, poželjno 5 mM

ii. Tris, 0,01 - 1 M, poželjno 0,1 M,

iii. EDTA, 1 - 50 mM, poželjno 10 mM

iv. pH 7,0 -10,0, poželjno pH 8,0

[0079] Koncentracija 4 M Gvanidinijum-HCl je u vedini slučajeva dovoljna za kompletnu denaturaciju proNGF muteina.

Korak b: Ponovno savijanje proNGF mutanta

[0080] Nakon rastvaranja proNGF mutanta iz inkluzionih tela neophodno je ponovno savijanje proteina do njegove prirodne konformacijie. Za proces savijanja važno je smanjiti reakcije kompeticije kao što su pogrešeno savijanje i nakupljanje. Za sprečavanje nakupljanja, ponovno savijanje se dešava na veoma niskim koncentracijama proteina zbog toga što je nakupljanje proteina predominantno na vedim koncnetracijama proteina. U koraku b), prebacivanje proNGF mutanta u pufer za ponovno savijanje se dešava gde denaturisani proNGF zauzima biološki aktivnu konformaciju. Biološki aktivna konformacija može da se odredi određivanjem prisustva disulfidnih mostova koji se nalaze kod prirodnog beta-NGF.

[0081] U poželjnom izvođenju pronalaska, rastvoreni proNGF mutant je renaturisan u rastvoru za ponovno savijanje koji sadrži najmanje jedan šaperon, najmanje jedan helator metala, i sistem redoks izmene.

[0082] U poželjnom izvođenju, postupak prema predmetnom pronalasku koristi rastvor za ponovno savijanje u koraku b) koji se sastoji iz

i. šaperona, poželjno Arginina, 0,5-1,0 M, poželjno 0,75 M,

ii. helatora metala, poželjno EDTA, 1-10 mM, poželjno 5 mM,

iii. sistema za redoks izmenu, na 0,1-10 mM, poželjno 1 mM L-Cistin i 5 mM L-Cistein, ili 1 mM GSSG (oksidovani glutation) i 5 mM GSH (redukovani glutation).

iv. pH 8,0 - pH 11,0, poželjno pH 9,5

[0083] Alternativni sistemi izmene redoks stanja kao što su Cistamin/Cisteamin mogu da se koriste.

[0084] U poželjnom izvođenju pronalaska, sredstvo za pomaganje savijanja je Arginin. Jedinjenja koja pospešuju savijanje proteina mogu generalno da se koriste kao "pomodna sredstva za savijanje". Takva jedinjenja su pozanta stručnjacima iz oblasti tehnike. Ona mogu da pomažu u savijanju na različite načine. Pretpostavlja se da arginin destabilizuje neispravno savijene intermedijere, tako da se oni bar delom ponovo otvaraju (od temodinamičkog kraja) i prema tome, ponovo mogu da se ispravno saviju. Sa druge strane, glicerol obično stabilizuje proteine. Jedinjenja koja povedavaju apsolutni prinos savijenih pro-NGF muteina u postupku prema pronalasku za više od 5 %, posebno više od 10 % ili više od 20 % (na osnovu ukupne količine pro-NGF koji se koristi za savijanje), u poređenju sa postupkom bez upotrebe pomodnog sredstva za savijanje, posebno su pogodna kao pomodna sredstva za proces savijanja.

[0085] Ponovno savijanje se poželjno izvodi na pH između 8 i 11, i posebno pH 9,5.

[0086] Za povedanje koncentracije proteina u posudi za ponovno savijanje, izvodi se pulsna renaturacija. Za ograničavanje broja pulseva je koncentracija Gvanidinijum-HCl koja ne treba da pređe preko 0,3 M. Koncentracija proteina po pulsu na treba da pređe 50 µg/ml u odnosu na konačnu zapreminu za ponovno savijanje.

[0087] U poželjnom izvođenju pronalaska, solubilizat se dodaje u partiju za savijanje u nekoliko frakcija ili kontinuirano tokom nekoliko dana. Poželjno, solubilizat se dodaje "pulsnom renaturacijom" brzim rastvaranjem solubilizata. U ovom kontekstu, kao primer ali bez ograničenja, najmanje 6 pulseva mogu da se izvode u vremenskom intervalu, od na primer, 24 časova. Broj pulseva je postavljen tako da nakon dodavanja jedinice za solubilizaciju koncentracija proteina koji nije savijen nije previse visoka, s obzirom na to da se u suprotnom dobijanju nakupine. Na primer, sa svakim pulsom 0,05 g/l do 0,2 g/l, poželjno 0,1 g/l protein se novo prebacuje u kadicu za savijanje (na osnovu koncentracije proteina u kadici za savijanje nakon dodavanja solubilizata). Na primer, za svaki korak ponovnog savijanja treba 1-2 h.

[0088] Nakon ponovnog savijanja, reakcija ponovnog savijanja treba da bude prečišdena pre stavljanja na kolonu. Ovo može da se uradi pomodu bilo kod postupka koji je poznat u oblasti tehnike, npr ceđenjem.

[0089] U poželjnom izvođenju, postupak za dobijanje ispravno savijenog pro-NGF mutanta uključuje sledede korake:

a) Inkluziona tela koja sadrže nerastvorljivi proNGF mutanta se rastvaraju u denaturišudem rastvoru kao što se opisuje gore u tekstu, i

b) ratvoreni pro-NGF se zatim renaturiše u puferu za renaturaciju kao što se opisuje gore u tekstu.

[0090] U poželjnom izvođenju pronalaska, denaturišudi rastvor i/ili rastvor za ponovno savijanje ne sadrži deterdžent. Pronađeno je da, upotreba deterdženata nije neophodna za ratvaranje i/ili ponovno savijanje pro-NGF muteina. Ovo predstavlja značajnu prednost, s obzirom na to da su određeni deterdženti relativno agresivne hemijske supstance koje farmaceutski proizvodi i ne treba da sadrže ili treba da sadrže u samo malim količinama i prema tome moraju biti uklonjeni na način koji košta. Postupak prema pronalasku je prema tome povoljan u poređenju sa Soejima et al., 2001, gde se takvi agresivni deterdženti koriste (Triton X-100 ili Brij-58) za savijanje proteina. Drugim rečima, u čitavom postupku za dobijanje prema predmetnom pronalasku se ne koriste detrdženti, i postupak proizvodnje je stoga bez deterdženata.

Korak c: Prečišćavanje proNGF mutanta hromatografijom

[0091] Izvođenjem postupka prema pronalasku sa denaturacijom i naknadnim ponovnim savijanjem, dobija se vodeni rastvor savijenog pro-NGF muteina. Savijeni pro-NGF mutein može zatim da se prečisti pomodu poznatih postupaka.

[0092] U poželjnom izvođenju proNGF mutant se prečišdava iz ponovo savijenih (npr. koji nisu ili su slabo denaturisani) rastvora prečišdavanjem omodu hromatorgrafije, posebno pomodu hromatorgrafije sa pomešanim načinom (korak c postupka dobijanja beta NGF od proNGF mutanta pronalaska). Najpoželjnija kolona hromatografije je kolona koja ima sintetički afinitetni ligand, poželjno 4-merkapto-etil-piridin (MEP Hypercell; Pall). Prednosti ovog medijuma su te da je vezivanje nezavisno od jonske jačine, slaganje soli nije neophodno i mogude su vede stope protoka za ubrzavanje postupka. Dalje, ispiranje se izvodi pomeranjem pH.

[0093] Ostale kolone sa pomešanim materijalnom su poznate i mogu da se koriste. Na primer, ali bez ograničenja, MEP (Pall; afinitetni ligand je 4-Merkapto etil piridin), HEA (Pall; afinitetni ligand: Heksilamino), PPA (Pall, afinitetni ligand: Fenilpropilamino), MBI (Pall; afinitetni ligand: 2-Merkapto-5-benzamidazol sulfo kislina), Capto MMC (GEHC), Capto adhere (GEHC; afinitetni ligand: N-benzil-N-metil etanolamin), CHT hidroksiapatit (BioRad), CHT fluoroapatid). MEP, HEA, PPA, i MBI kolone imaju hidrogobno vezivanje, dok je Capto MMC katjonski izmenjivač sa pomešanim načinom funkcionisanja i Capto adhere je anjonski izmenjivač sa pomešanim načinom funkcionisanja. BioRad kolone su jonoizmenjivačke kolone sa hidrofobnim komponentama. Bilo koja kolona sa pomešanim materijalom koja ovde nije navedena može takođe da se koristi za prečišdavanje proNGF mutanta.

Korak d: Isecanje proNGF do beta-NGF

[0094] proNGF je prekursor beta-NGF. Prema tome, u koraku d) postupka dobijanja beta-NGF od proNGF mutanta pronalaska, pro-sekvenca proNGF mutant se iseca da se dobije aktivni beta-NGF.

[0095] Proteaze koje imaju specifičnost supstrata sličnu tripsinu seku protein bez razlaganja aktivnog dela molekula proteina. Proteaze slične tripsinu seku peptidne veze posle pozitivno naelektrisane amino kiseline kao što je Arginin ili Lizin. Kao protease slične tripsinu, nekoliko serin proteaza (serin endopeptidaza) se uzimaju u obzir za obradu proNGF da se dobije beta-NGF. Poželjno, serin proteaza Tripsin se koristi za isecanje pro-sekvence ali druge proteaze mogu da se koriste umesto toga.

[0096] Uočava se da isecanje nije ograničeno samo na tripsin, ved može da uključi druge proteaze koje imaju supstrate slične tripsinu takođe. Generalno, odnos proNGF prema tripsinu (ili druga proteaza) je pogodno podešen, ispravno savijen, zreli beta-NGF nede biti isečen ovom proteazom. Suprotno, denaturisani proteini kao i savijeni intermedijeri izlažu sekvence koje su osetljive na napad proteazom.

[0097] Poželjno za isecanje proNGF mutanta do beta-NGF, odnos tripsina (ili druge proteaze) prema proNGF mutantu je od 1 : 200 - 1 : 100000, poželjnije od 1 : 5000 - 1 : 20000 po masi, najpoželjniji je odnos 1 : 10000 (mas/mas). U najpoželjnijem izvođenju, isecanje se događa 8-23 časova na sobnoj temperaturi, najpoželjnije 18 čaova. Pod uslovima koji se korist eu ovom pronalasku, proNGF mutant je u potpunosti isečen i skoro da se ne obrazuje nijedan sporedni proizvod. Nije uočeno nakupljanje.

[0098] Kao što je jasno opisano u Primerima, pronalazači su pronašli da modifikacije amino kiselina koje se uvode u proNGF mutant pronalaska ne samo da izbegavaju isecanje proteina na nepoželjnim mestima za isecanje ved takođe neočekivano dovode do velikog povedanja efikasnosti isecanja tripsinom upoređenju sa divljim tipom proNGF, koji omogudava da se izvođenje izvodi pod jako selektivim uslovima za dobijanje veoma čistog proizvoda.

[0099] Detaljnije, eksperimentalni podaci jasno pokazuju da na ved niskom Tripsin/Protein odnosu kao što je 1:100000, proNGF mutant pronalaska (SEQ ID NO: 5) ima za rezultat visoko prečišdeni rekombinantni humani beta-NGF sa visokim prinosom isecanja (oko 85%). Dalje, divlji tip proNGF (SEQ ID NO: 1) u istom Tripsin/Protein odnosu pokazuje niski prinos isecanja (oko 5%). Zadovoljavajudi prinos se dobija na samo vedim tripsin/protein odnosima (1/250), ali je ovo pradeno niskom selektivnošdu i visokom degradacijom proizvoda zbog prekomenog razlaganja.

Korak e: Dalje prečišćavanje beta-NGF

[0100] beta-NGF koji se dobija od proNGF mutanta pronalaska je dalje prečišden, na primer, upotrebom nekoliko postupaka hromatografije. Dalji koraci prečišdavanja su neophodni za razdvajanje Tripsina i nečistoda koje su povezane sa proizvodom digestije tripsinom od beta-NGF. Koraci prečišdavanja treba da smanje HCP-e, Endotoksine, i DNK. Bilo koji postupci u oblasti tehnike koji su poznati za prečišdavanje proteina mogu da se koriste. Najpoželjnija su prečišdavanja upotrebom postupaka hromatografije, na primer kolonama od sefaroze (npr. SP Sepharose HP, Q Sepharose FF).

[0101] Konačni proizvod beta-NGF koji se dobija od proNGF se analizira prema njegovoj čistodi pomodu SDS-PAGE, rp-HPLC, SE-HPLC, i IEX-HPLC. HPLC analize pokazuju čistodu beta-NGF od najmanje 97%.

[0102] U poželjnom izvođenju pronalaska, postupak dobijanja pro-NGF muteina koji je pogodan za dobijanje beta-NGF uključuje sledede korake:

a) ekresija pro-NGF mutanta sa supstituisanim mestom za isecanje proteazom u prokariotskim delijama

b) izolacija inkluzionih tela koja sadrže pro-NGF mutein,

c) mešanja inkluzionih tela sa pogodnim denaturišudim puferom koji sadrži najmanje (i)haotropnu supstancu, (ii) helator, (iii) pufer, i (iv) redukujude sredstvo

d) ponovno savijanja u rastvoru za savijanje koji sadrži najmanje šaperon, helator metala, i sistem za redoks izmenu,

e) prečišdavanja ponovo savijenog pro-NGF mutanta,

f) isecanja u aktivni oblik beta-NGF pomodi proteaza koa što je tripsin

g) izolacija i prečišdavanje beta-NGF.

Upotreba proNGF za dobijanje beta-NGF

[0103] U tredem aspektu, pronalazak je usmeren na upotrebu proNGF mutanta predmetnog pronalaska za dobijanje humanog beta-NGF.

Farmaceutska kompozicija betaNGF koja se dobija od proNGF mutanata pronalaska

[0104] U daljem aspektu, pronalazak je usmeren na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži betaNGF koji se dobija od proNGF-mutanta koji je supstituisan na prirodnom mestu za isecanje proteazom R<1>SK<3>R<4>na pozicijama 101 i 103 (K<3>i R<1>) humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) kao što se opisuje gore u tekstu i farmaceutski prihvatjivog nosača.

[0105] U jednom izvođenju pronalaska, farmaceutski aktivni beta-NGF se daje pacijentu pomodu postupaka genske terapije. U genskoj terapiji, dostupna su dva osnovna postupka, pogodna za uvođenje gena, u predmentom slučaju gena koji kodira za beta-NGF, u pacijenta.

[0106] U ex vivo davanju, farmaceutski aktivni gen koj kodira beta-NGF se uvodu u telo delije pomodu vektora, gde je telo delije poželjno glijalna delija, i delija koja je na ovaj način tretirana se ponovo uvodi u pacijenta, na primer pomodu mikro ili nano čestica. Posebno je poželjna specifična integracija beta-NGF gena u delijski genom.

[0107] U in vivo genskoj terapiji, beta-NGF gen se transportuje u ciljanu deliju u telu pomodu vektora, na primer, pomodu virusa, koji sa jedne strane mogu da inficiraju ciljnu deliju i, prema tome, mogu da uvedu farmaceutski aktivni beta-NGF gen, ali, sa druge strane, ne mogu da se sami umnože unutar ciljne delije. U ovom pristupu, nano ili mikročestice, na primer lipozomi, koji mogu da se fuzionišu sa delijskom membranom, mogu takođe da se koriste kao vektori.

[0108] Kao vektor za beta-NGF gen, kao primer može da se koristi virus ili antitelo, koji specifično može da inficira deliju domadina ili koji imunoreaguje sa antigenom u ciljnoj deliji. Kao viralni nosač, retrovirusi mogu, na primer, da se koriste. Dalje mogude je, koristiti adenoviruse ili vektore sa Vaccinia osnovom, na primer, modifikovani vaccinia virus Ankara (MVA).

[0109] Stručnjak iz oblasti tehnike može da odabere pogodnu formulaciju na osnovu rutinskog razmatranja i može da odabere odgovarajudi oblik za davanje predmetne farmaceutske kompozicije pacijentu. Na primer, farmaceutska kompozcija može da sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih sastojaka, na primer nosača ili rastvarača. Između ovih klasa supstanci, mogu se nazvati sredstva za punjenje, soli, puferi, stabilizatori, pojačivači prodiranja i drugi dobro poznati materijali. Tehnike za formulaciju farmaceutskih kompozicija predmentnog pronalaska mogu da se pronađu u dobro poznatim standardnim udžbenicima kao što su "Remington’s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition.

[0110] Doza betaNGF koja se dobija postupkom proizvodnje kao što se opisuje u predmetnom pronalasku može da bude u opsegu od 0,1 µg/kg do 500 µg/kg telesne mase, ukoliko se daje infuzijom, i od 2 µg/kg do 2 µg/kg telesne mase ukoliko se daje injekcijom.

KRATAK OPIS SLIKA

[0111]

Slika 1 pokazuje sekvencu pro-NGF i pro-NGF mutanata pronalaska.

Masnim slovima je prikazana sekvenca pro-oblika huamnog beta-NGF. Mesto isecanja proteazom (tripsinom) je prikazano masnim slovima i podvučeno (amino kiselne 101-104 SEQ ID NO: 1; mesta isecanja tripsinom su između amino kiselina 101-102 (R<1>), 103-104 (K<3>) i 104-105 (R<4>)). X u sekvenci može da bude bilo koja amino kiselina.

Slika 1a pokazuje sekvencu humanog proNGF (SEQ ID NO: 1) sa mestom isecanja proteazom RSKR (SEQ ID NO: 9).

Slika 1b pokazuje sekvencu proNGF mutanta pronalaska (SEQ ID NO: 2) sa mestom isecanja proteazom VSXR (SEQ ID NO: 10).

Slika lc pokazuje sekvencu proNGF mutanta pronalaska (SEQ ID NO: 3) sa mestom isecanja proteazom koje je mutirano do XSXR (SEQ ID NO: 11).

Slika 1d pokazuje sekvencu proNGF mutanta pronalaska (SEQ ID NO: 4) sa mestom isecanja proteazom koje je mutirano do XSAR (SEQ ID NO: 12).

Slika le pokazuje sekvencu proNGF mutanta pronalaska (SEQ ID NO: 5) sa mestom isecanja proteazom koje je mutirano do VSAR (SEQ ID NO: 13).

Slika 1f pokazuje sekvencu proNGF mutanta pronalaska (SEQ ID NO: 7) sa mestom isecanja proteazom koje je mutirano do XXXR (SEQ ID NO: 14).

Slika lg pokazuje sekvencu proNGF mutanta pronalaska (SEQ ID NO: 8) sa mestom isecanja proteazom koje je mutirano do VXAR (SEQ ID NO: 15).

Slika 1h pokazuje sekvence mesta isecanje proteazom (SEQ ID NO:s 6, 9-15).

Slika 2. Obrađivanje proNGF ili pro NGF mutanata do beta-NGF

Slika 2a pokazuje šest beta NGF proizvoda isecanja nakon isecanja tripsinom upotrebom divljeg tipa proNGF koji ima prirodno mesto isecanja furinom RSKR. Slika jasno pokazuje da isecanje divljeg tipa proNGF do betaNGF dovodi do nehomogene smeše mnogih različitih proizvoda isecanja.

Slika 2b pokazuje prirodne beta NGF proizvode isecanja nakon isecanja tripsinom upotrebom proNGF mutanta SP174-101 (SEQ ID NO: 5) sa delecijom prirodnog mesta za isecanje furinom. Mesto isecanja proteazom RSKR (SEQ ID NO: 9) je supstituisano sa dve amino kiseline da se dobije mesto VSAR (SEQ ID NO: 12). Ovo mesto može samo da bude isečeno proteazom posle amino kiseline Arginin na poziciji 104; Tripsin može da iseče samo na jedenom mestu za isecanje (umesto tri). Slika jasno pokazuje da isecanje mutantnog proNGF SP174-101 (SEQ ID NO: 5) do beta-NGF dovodi do samo jednog homogenog proizvoda isecanja (beta-NGF).

Slika 3 pokazuje ponovno savijanje proNGF mutanta SP174-101 (SEQ ID NO: 5)u poređenju sa divljim tipom proNGF. Slika poredi prinos ponovno savijanja divljeg tipa proNGF (kontinuirana linija) i proNGF mutanta (isprekidana linija) sa mestom za isecanje proteazom koje je mutirano do VSAR. Sa slike se može jasno uočiti da je identična efikasnost ponovnog savijanja divljeg tipa i mutiranog proNGF.

Slika 4 pokazuje prečišdavanje proNGF mutanta SP174-101 sa mestom za isecanje proteazom koje je mutirano do VSAR (SEQ ID NO: 5) pomodu MEP HyperCel kolone. Na slici se uočava profil ispiranja MEP HyperCel prečišdavanja ponovo savijenog i ceđenog proNGF mutanta.

Slika 5 pokazuje isecanje proNGF mutanta SP174-101 sa mestom za isecanje proteazom koje je mutirano do VSAR (SEQ ID NO: 5) pomodu Tripsina. Slika pokazuje Coomassie obojeni SDS-PAGE gel frakcija isečenih tripsinom. Proizvod isecanja tripsinom proNGF mutanta može da se vidi u trakama 4-7. Slike jasno pokazuju da prečišdeni proNGF mutant dovodi do samo jednog proizvoda isecanja (beta-NGF).

Slika 6 pokazuje prečišdavanje beta-NGF. Slika pokazuje profil SP Sepharose HP kolona nakon isecanja tripsinom. Reakcija digestije isecanja tripsinom se puni na SP Sepharose HP kolonu. Elucija se odvija kroz tri koraka (a.25 % 25 mM natrijum fosfat, 1 M NaCl, pH 6,5 (pufer B), b. u linearnom gradijentu od 25-50 % pufera B, i c.100 % puferu B (brzina protoka 60 cm/h)).

PRIMERI

[0112] Slededi primeri su predstavljeni da obezbede stručnjacima u oblasti tehnike kompletan prikaz i opis kako da se dobiju i iskoriste postupci i kompozicije pronalaska, i nisu namenjenii da ograniče obim onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom. Uloženi su napori da bi se osigurala tačnost u odnosu na borojeve koji se koriste ali eksperimentalne greške i devijacije treba uzeti u obzir. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, molekulska masa je srednja molekulska masa, temperatura je u Celzijusovim stepenima, i pritisak je na ili blizu atmosferskog.

Primer 1. Supstitucija divljeg tipa pro NGF na mestu isecanja proteazom na pozicijama 101 do 104 (R<1>SK<3>R<4>)

[0113] Supstitucija Arginina R<1>i Lizina K<3>koji odgovaraju pozicijama 101 i 103 humanog pro-NGF (SEQ ID NO: 1) se ostvaruje na nivou DNK upotrebom sintetisanog gena pomodu postupaka koji su poznati stručanjaku iz oblasti tehnike. Serin na poziciji 102 ili ostaje nepromenjen ili se supstitucija na poziciji 102 humanog pro-NGF (SEQ ID NO: 1) takođe ostvaruje na nivou DNK upotrebom sintetisanog gena pomodu postupaka koji su poznati stručanjaku iz oblasti tehnike. Lizin K<4>koji odgovara poziciji 104 nije supstituisan. Sekvence su prikazane na slici 1.

Primer 2. Rekombinantna ekspresija proNGF mutanta SP174-101 (SEQ ID NO: 5) u prokariotskim delijama

[0114] Bakterijski domadin E. coli JM108 koji se koristi za ekspresiju rh-proNGF (DSMZ 5585; F thi Δ (lac-proAB) end AI gyr A96 relA1 phx hsdR17 supE44 recA) je prolin-auksotrofni, koji se neutralizuje upotrebom plazmida sa naznakom pSCIL101. Plazmid pSCIL101 se zasniva na plazmidu pSCIL008 (vidi WO05061716). Soj ne može da sintetiše tiamin (Vieira & Messing, 1982 Gene. Oct;19(3):259-68). Pro-NGF mutant koji je prikazan u SEQ ID NO: 5 se eksprimira pod kontrolom tac promotora koji se nalazi na pSCIL101. Vektor pSCIL101 koji se ovde koristije plazmid sa visokim brojem umnoženih kopija koji nosi gen za otpornost na kanamicin. Ekspresija se izvodi u definisanom medijumu mineralne soli i indukuje se dodavanjem IPTG. Pro-NGF mutant je deponovan u citoplazmi u obliku inkluzionih tela (IBs).

Ćelijska linija:

[0115]

� soj domadina, npr. E. coli HMS174 (K12) ili JM108 (K12)

� proNGF mutant SP174-101 (SEQ ID NO: 5)

� Tac promoter (IPTG indukcija)

� ColE1 replikon

� otpornost na kanamicin

� proBA selekcija

� sistem vektora vlasnika pSCIL 101 (npr. vidi WO05/061716)

Primer 3. Fermentacija

[0116] Cilj ove fermentacije je da se dobije proizvod i biomasa za naredne korake obrade. Da bi se pratila prekomerna ekspresija ciljnog proteina tokom procesa fermentacije, uzorci se analiziraju pomodu SDS-PAGE pre i nakon idukcije.

� 1 medijum mineralne soli bez antibiotika

� Faza serije µ ≈ 0.25 h<-1>(ODend=18)

� Napajana serija faza I eksponencijalne ishrane µset= 0,18 h-1

� Napajana serija faza II: konstantna brzina ishrane

� Tačka indukcije ODind= 60 ±5

� 1,0 mM IPTG

� Vreme indukcije 5 h

� Konačna OD = 82 ±4

� Vreme obrade 28,5 h ±1,25

� Stabilnost plazmida 100 %

� Prinos: 40 mg/g proNGF; 1,2 g/L ± 0,2 g/L proNGF

Primer 4. Primarni oporava inkluzionihtela koja sadrže SP174-101

[0117] U bakterijskim delijama, rekombinantni protein se nalazi u obliku nakupina. Ekspresija pro-NGF muteina se dešava u obliku IBs. Narušavanje strukture delije i dobijanje IB preparata se izvode u skladu sa standardnim protokolima i mogu da se izvedu na laboratorijskog skali do prečišdavanja približno. 200 g biomase. Dobijanje ovih "inkluzionih tela" koja sadrže proNGF mutein se izvodi prema Rudolph, R., et al. (1987); Folding proteins. In: Creighton, T. E. (ed.): Protein Function: A Practical Approach. Oxford University Press, pp. 57-99, i prema EP0994188B1. Za narušavanje delije, delijske pelete se resuspenduju u pogodnom puferu i nakon toga se narušava struktura delija upotrebom homogenizacije sa visokim pritiskom u 50 mM Natrijum fosfatu pH 7,0, 1 mM EDTA.

Primer 5. Rastvaranje proNGF mutanta SP174-101 u denaturišudem rastvoru (rastvaranje inkluzionih tela)

[0118] Inkluziona tela se rastvaraju u denaturišudem rastvoru koji sadrži rastvor (i) haotropno sredstvo, (ii) helator, (iii) pufer, i (iv) redukujde sredstvo. Za rastvaranje, Gvanidinijum HCl (GvaHCl) se testira u opsegu koncentracija od 4,0-6,0 M. Pufer za rastvaranje se meša u različitim odnosima sa talogom inkluzionih tela (eng. “IB slurry”). Svi ekspreimenti imaju konačnu koncentraciju cisteina od 5 mM i izvode se na sobnoj temperaturi. Rezultati se analiziraju pomodu SDS-PAGE (podaci nisu prikazani). Eksperimenti su pokazali da je koncentracija 4 M GvaHCL dovoljna da se završi rastvaranje inkluzionih tela. Odnos inkluzionog tela prema puferu je 1 1,25 (v/v) (IB talog :pufer). Konačni uslovi denaturišudeg rastvora za rastvranje inkluzionih tela su:

i. 4 M Gvanidinijum-HCl,

ii.0,1 M Tris,

iii.10 mM EDTA

iv. 5 mM Cistein

v. pH 8,0

[0119] Solubilizat se prečišdava dubinskim ceđenjem prema standardnim postupcima.

[0120] Nakon toga se određuje koncentracija proteina upotrebom postupka Bradford (Bradford, M. M., Anal. Biochem.72 (1976) 248). Koncentracija proteina proNGF muteina je između 10-20 mg/ml.

Primer 6. Prebacivanje proNGF mutanta SP174-101 u pufer za ponovno savijanje gde denaturisani proNGF zauzima biološki aktivnu konformaaciju

[0121] Nakon rastvaranja, neophodno je ponovno savijanje proteina u njegovu prirodnu konformaciju i prema tome smanjenje pogrešnog savijanja i nakupljanja. Zadobijanje biološki kativnog proNGF muteina prema pronalasku iz solubilizovanih materijala, oni su rastvoreni u rastvoru za ponovno savijanje u kome proNGF zauzima biološki aktivnu konformaciju.

[0122] Finalni rastvor za ponovno savijanje za rastvaranje na osnovu IB-taloga sadrži

i. 0,75 M Arginin

ii. 5 mM EDTA

iii.1 mM L-Cistin i 5 mM L-Cistein

iv. pH 9,5

[0123] Dobijanje NGF u aktivnoj konformaciji je potvrđeno prisustvom dislfidnih mostova koji se nalaze u zrelom humanom beta-NGF.

[0124] Da bi se povedala koncentracija proteina procesu ponovnog savijanja, izvodi se pulsna renaturacija. Puls se daje svaki sat po 50 mg/ml proNGF mutiranog proteina. Koncentracija Gvanidinijum-HCl u rastvoru ne treba da pređe preko 0,3 M. Da bi se ovo postiglo, neophodno je 15 pulseva. Prečišdena ponovo savijena frakcija je ceđena pre daljeg punjenja na kolone.

[0125] Performansa reakcije ponovnog savijanja se analizira nakon svakog pulsa upotrebom rp-HPLC. Dobijena oblast sa maksimalnim efektom se predstavlja u odnosu na broj pulseva. Za rp-HPLC, koristi se kolona sa reverznom fazom (npr., 214MS54, 4,6 x 250 mm; 300 Å, 5 μm, Vydac) za zaštitnom kolonom (npr.214GK54; 300 Å; Vydac). Puferi su H2O sa 0,05 % trifluorosirdetnom kiselinom (TFA) i Acetonitril sa 0,05 % TFA. Brzina protoka je 1 mL/min. Rezultati su prikazani na slici 3. Sa Slike 3 može da se vidi da je efikasnost ponovnog savijanja divljeg tipa i mutanta proNGF identična.

Primer 7. Prečišdavanje proNGF mutanta SP174-101 iz rastvora za ponovno savijanje upotrebom kolone sa načinom pomešanog materijala

[0126] Koristi se kolona sa sintetičkim afinitetnim ligandom, 4-merkapto-etil-piridin (MEP). Elucija se događa promenom pH-vrednosti. Dalje, elucija se izvodi sa niskom koncentracijom soli što je korisno za efikasan dizajn procesa.

[0127] Kolona je uravnotežena sa 0,75 M Argininom, 5 mM EDTA, pH 9,5. Pročišdena reakcija ponovnog savijanja je napunjena na MEP HyperCel column (Pall) sa maksimalnim kapacitetom punjenja 5 g proNGF mutanta po L medijumu kolone. U koraku ispiranja, vedina nečistoda i nevezanih proteina su otklonjeni korišdenjem pufera 2 M GvaHCl, 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 i 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Elucija se izvodi linearnim gradijentom od 0-70 % 50 mM Acetata, pH 4,0 (brzina protoka 120 cm/h). Slika 4 pokazuje elucioni profil MEP HyperCel prečišdavanja ponovo savijenog i ceđenog proNGF mutanta sa mestom ua isecanje proteazom koje je mutirano do VSAR (SEQ ID NO: 5) pronalaska. Na koraku ispiranja sa GvaHCL "mnoge nečistode su uklonjene. Na "pulu", oko 60-70% proNGF mutanta je oporavljeno.

Primer 8. Isecanje proNGF mutanta SP174-101 da se dobije aktivni beta-NGF

[0128] Za digestiju tripsinom proNGF mutanta do beta-NGF, koristi se takav fosfatni pufer, koji ne inhibira aktivnost proteaze. Natrijum fosfatni pufer se dodaje u MEP-eluat to do konačne koncentracije 25 mM natrijum fosfata. Vrednost pH se podešava do pH 6,5. Za proteolizu, Tripsin (Roche, GMP grade) se dodaje u odnosu 1:10000 (mas/mas) (tripsin:proNGF). Proteoliza se izvodi upotrebom vremena inkubacije od 18 h na sobnoj temperaturi. Performasa i prinos digestije tripsinom su analizirani pomodu SDS-PAGE, rp-HPLC i UV/VIS280nm.

Slika 5 pokazuje SDS-PAGE frakcija nakon isecanja tripsinom. Koristi se 4-12 % Bis/Tris-Gel, 1 mm, 1x MES kao pufer (Invitrogen). Linije 5-7 pokazuju proizvode isecanja tripsinom u poređenju sa neisečenim proNGF mutantom (rhproNGF*, vidi liniju 3) i do zrelog beta-NGF (NGF; vidi liniju 8). Slike jasno pokazuju da prečišdeni proNGF mutant dovodi do samo jednog proizvoda isecanja (beta-NGF). Može da se uoči kompletna digestija proNGF mutanta do beta-NGF.

Primer 9. Prečišdavanje aktivno beta NGF

[0129] Nakon digestije tripsinom, beta-NGF se puni na SP Sefaroza HP kolonu da bi se potrošio Tripsin, sporedni proizvodi isecanja i dalje nečistode. SP Sefaroza HP prečišdavanje je prikazano na Slici 6.

[0130] Kolona je uravnotežena sa 25 mM Na-fosfatnim puferom (pH 6,5). Reakcija digestije tripsinom se puni na SP Sefarozu HP kolonu (2 g beta-NGF/L medijum) i nevezani protein se ispira sa ekvilibracionim puferom. Elucija se izvodi kroz tri koraka (3 cv 25 % 25 mM Na-fosfat pH 6,5 / 1 M NaCl (pufer B), 10 cv u linearnom gradijentu od 25-50 % pufer B, i 3 cv 100 % pufer B (brzina protoka 60 cm/h)).

[0131] Slika 6 pokazuje prečišdavnje beta-NGF. Slika pokazuju profil SP Sefaroze HP kolone nakon isecanja tripsinom. Prinos beta-NGF je 85-95 % (maksimum vrednosti "elucije uzorka").

Primer 10. Efikasnost isecanja tripsinom na mutantu SP174-101 i divlji tip proNGF

[0132] Ovaj postupak se paralelno primenjuje i za proNGF-mutant SP174-101 (SEQ ID NO: 5) i humani divlji tip proNGF (SEQ ID NO: 1; rhProNGF).

[0133] 5 mL od prečišdenih rhProNGF je dijalizirano prema 25 mM fosfatnom puferu pH 6,5. Slededi dijalizu, koncentracija proteina od 0,08 mg/mL se meri pomodu HPLC-UV. Po uzorku za digestiju, koristi se 80 µg proNGF. Posle proteolize, svi uzorci su analizirani sa HPLC-UV.

[0134] Koristi se odnos mase 1/10000 mas/mas tripsina/rhProNGF mutanta, dok se koriste različiti odnosi masa tripsina/rhProNGF divljeg tipa (vidi Tabelu 3). Za rastvor tripsina se koristi 1,0 µg/mL i 10 µg/mL. Nakon inkubacije preko nodi (oko 17 časova) na sobnoj temperaturi, analizirani su svi uzorci. Kao kontrola, takođe je inkubiran rhProNGF mutant bez dodatne proteaze.

Tabela 3

[0135] Performanse i prinosi svih digestija tripsino su analizirani sa HPLC-UV upotrebom Vydac 214MS C4 kolone.

[0136] Tabela 4 pokazuje prinose isecanja koji se dobijaju nakon digestije tripsinom. Eksperimentalni podaci jasno pokazuju da isecanje proNGF mutanta SEQ ID NO: 5 sa Tripsinom dovodi do samo jednog proizvoda (beta-NGF) u visokom prinosu isecanja (oko 85%) upotrebom veoma niskog odnosa tripsina/proteina (1/10000). Ovo može da se uporedi sa isecanjem divljeg tipa proNGF (SEQ ID NO: 1) što pokazuje niski prinos isecanja (samo oko 5%) pri niskom odnosu tripsina/proteina (1/10000) i visokoj degradaciji proizvoda (prekomerna digestija) pri visokom odnosu tripsina/proteina (1/250).

Tabela 4

Primer 11. Test za biološku aktivnost proNGF pomodu stimulacije proliferacije TF1 delija

[0137] TF1 delije (ATCC, katalog br. CRL2003) su kultivisane prema standardnim procedurama. Medijum za testiranje (90% medijum RPMI 1640, 10% serum fetusa govečeta FBS, 50 U/ml Penicilin i 50 µg/ml Streptomicin) se dodaju u delije i centrifugiraju se. Pelet se resuspenduje u gustini od 1,5·10<5>delija/ml u medijum za testiranje na 37 °C. Delijska suspenzija se mesa sa različitim koncentracijama proNGF proteina (10<-10>M, 3-10<-10>M, 10<-9>M, 3·10<-9>M, 10<-8>M, 3·10<-8>M, 10<-7>M, 3·10<-7>M, 10<-6>M, 3·10<-6>M, 10<-5>M i 3·10<-5>M) i analizira se na ploči sa 96 bunarida. Posle inkubacije u trajanju od 48 h na 37 °C, dodaje se reagens za proliferaciju delija (npr. WST-1, Roche Applied Science, kat br. 1644807) i ploče se ponovo inkubiraju 4 h na 37 °C. Apsorpcija se meri na 450 nm i EC50-vrednost se određuje upotrebom odgovarajudih programa (z. Bsp. Sigma-Plot 2000).

[0138] Ova prijva dalje obuhvata sledede stavke:

1. ProNGF mutant što mesto isecanja proteazom R<1>SK<3>R<4>je supstituisano najmanje na pozicijama R<1>i K<3>koje odgovaraju pozicijama 101 i 103 humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) amino kiselinom koja se bira od ne-bazne amino kiseline i histidina.

2. ProNGF mutant prema stavki 1, što je mesto isecanja proteazom supstituisano na pozicijama 101 i 103 bilo kojom amino kiselinom ali ne sa Argininom ili Lizinom.

3. ProNGF mutant prema stavki 1, što je mesto isecanja proteazom supstituisano na pozicijama 101 i 103 bilo kojom amino kiselinom koja se bira od Alanina, Glicina, Valina, Serina, Treonina, Metionina, Tirozina, Histidina, Asparagina, Asparaginske kiseline, Glutamina, Glutaminske kiseline, Fenilalanina, Izoleucina, Leucina, Triptofana, Cisteina, i Prolina.

4. ProNGF mutant prema stavki 1, što je mesto isecanja proteazom supstituisano na pozicijama 101 i 103 bilo kojom amino kiselinom koja se bira od Alanina, Valina, Glicina, Serina, Treonina, Metionina, Tirozina, Histidina, Asparagina, Asparaginske kiseline, Glutamina, Glutaminske kiseline.

5. ProNGF mutant prema stavki 1, što je prirodno mesto isecanja proteazom supstituisano na pozicijama 101 i 103 bilo kojom amino kiselinom koja se bira od Alanina i Valina.

6. ProNGF mutant prema stavkama 1 do 3, što je mesto isecanja proteazom supstituisano na poziciji 101 Valinom.

7. ProNGF mutant mutant prema stavkama 1 do 6, što je mesto isecanja proteazom supstituisano na poziciji 103 Alaninom.

8. ProNGF mutant prema stavkama 1 do 7 što amino kiselina R<4>koja odgovara poziciji 104 humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) se bira od Arginina ili Lizina.

9. ProNGF mutant prema stavkama 1 do 8, što supstituisana amino kiselina na pozicijama 102 humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) se bira od amino kiselina Serina, Glicina, Cisteina, Asparagina, Tirozine, Treonin, Asparaginske kiseline, Glutamina, Alanina, Valine, Glutaminske kiseline, Histidina, Izoleucina, Leucina, Fenilalanina, Prolina, Triptofana, Metionina.

10. ProNGF mutant prema stavkama 1 do 9, što amino kiselina na poziciji 101 humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) je supstutisan sa Valinom, na poziciji 102 pomodu Serina, na poziciji 103 pomodu Alanina, i što amino kiselina na poziciji 104 je Arginin.

12. ProNGF mutant prema stavkama 1 do 11, što se mutant dobija rekombinantnom ekspresijom u prokariotskim delijama.

13. ProNGF mutant prema stavki 12, što se mutant dobija rekombinantnom ekspresijom u E. coli.

14. Postupak dobijanja biološki aktivnog humanog beta-NGF koji sadrži

(i) dobijanje proNGF mutanta prema bilo kom od zahteva 1 do 13, i

(ii) isecanje proNGF mutanta da se dobije aktivni humani beta-NGF.

15. Postupak prema stavki 14 koji obuhvata korake:

a. rastvaranja proNGF mutanta prema bilo kom od zahteva 1-13 pomodu rastvaranja inkluzionih tela u denaturišudem rastvoru;

b. prebacivanja proNGF mutanta u rastvor za ponovno savijanje što denaturisani proNGF zauzima biološki aktivnu konformaciju,

c. prečišdavanja ponovo savijenog proNGF mutanta,

d. isecanja pro-sekvence proNGF mutanta da se dobije aktivni beta-NGF.

16. Postupak prema stavki 15, gde denaturišudi rastvor sadrži rastvor koji sadrži (i) haotropnu supstancu, (ii) helator, (iii) pufer, i (iv) redukujude sredstvo.

17. Postupak prema stavki 16, što denaturišudi rastvor sadrži

v. 1 - 8 M Gvanidinijum-HCl, poželjno 4-6 M,

vi. 0,01 - 1 M Tris,

vii.1 - 50 mM EDTA,

viii.1 - 100 mM odabrano od Glutiona (GSH) ili Cisteina,

ix. pH 7,0 – 10,0

18. Postupak prema stavki 17, što denaturišudi rastvor sadrži

i. 4 M Gvanidinijum-HCl,

ii. 0,1 M Tris,

iii.10 mM EDTA

iv. 5 mM GSH ili Cistein

v. pH 8,0

19. Postupak prema stavki 15, što denaturišudi rastvor sadrži

i. 0,5-1,0 M šaperona,

ii. 1- 10 mM helatora metala,

iii.0,1 - 10 mM Sistema za redoks izmenu,

iv. pH 8,0 - pH 11,0.

20. Postupak prema zahtevu 18, što denaturišudi rastvor sadrži

i. 0,75 M Arginin,

ii. 5 mM EDTA

iii. 1 mM L-Cistin i 5 mM L-Cistein, ili 1 mM GSSG (oksidovani glutation) i 5 mM GSH (redukovani glutation),

iv. pH 9,5.

21. Postupak prema stavkama 15 i 17 - 20 što se ponovno savijanje izvodi kao pulsna renaturacija.

22. Postupak prema stavki 21 što u odnosu na konačnu zapreminu tokom pulsne renaturacije, koncentracija Gvanidinijum HCl ne prelazi preko 0,3 M i koncentracija proteina po pulsu ne treba da pređe preko 50 µg/ml.

23. Postupak prema bilo kojim stavkama 15, što proNGF mutant se prečišdava pomodu hromatografije sa pomešanim načinom.

24. Postupak prema zahtevu 23, što je kolona homatografije kolona pomešanog materijala sa sintetičkim afinitetnim ligandom.

25. Postupak prema stavki 24, što je kolona sa pomešanim materijalom kolona sa 4-merkaptoetilpiridinom (MEP), Heksilamino (HEA), Fenilpropilamino (PPA), 2-Merkapto-5-benzamidazol sulfo kiselinom (MBI), Capto MMC (GEHC), N-benzil-N-metil etanolaminom (GEHC)), CHT hidroksiapatitom ili CHT fluoroapatidom.

26. Postupak prema stavki 25, što je kolona sa pomešanim materijalom kolona sa 4-merkaptoetilpiridinom (MEP).

27. Postupak prema stavkama 14 do 26, što je pro-oblik proNGF mutanta isečen proteazom.

28. Postupak prema stavki 27, što je pro-oblik proNGF mutanta isečen serin proteazom.

29. Postupak prema bilo kojoj od stavki 28, što je pro-oblik proNGF mutanta isečen tripsinom.

30. Postupak prema stavkama 27 do 29, što je odnos tripsina prema proNGF mutantu od 1 : 200 - 1 : 100.000.

31. Postupak prema stavki 30, što je odnos tripsina prema proNGF mutantu od 1 : 5.000 - 1 : 20.000 po masi.

32. Postupak prema stavki 31, što je odnos tripsina prema proNGF mutantu is odnos od 1 : 10.000 (mas/mas).

33. Postupak prema zahtevima 14 do 32 koji dalje sadrži dodatni korak prečišdavanja beta-NGF.

34. Postupak prema stavki 33 koji dalje sadrži dodatni korak prečišdavanja beta-NGF hromatografijom na koloni.

35. Postupak prema stavki 34 koji dalje sadrži dodatni korak prečišdavanja beta-NGF pomodu SP Sefaroza HP kolone.

36. Upotreba proNGF mutanta prema bilo kojoj od stavki 1-14 za dobijanje humanog beta-NGF.

LISTA SEKVENCI

[0139]

<110> Wacker Chemie AG

<120> Novi proNGF mutanti i njihove upotrebe za dobijanje beta-NGF

<130> F-30038/EP/DIV

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 222

<212> PRT

<213> homo sapiens

<400> 1

Claims (14)

Patentni zahtevi

1. ProNGF mutant koji ima sekvencu koja se sastoji od sekvence humanog divljeg tipa proNGF (SEQ ID NO: 1) što je mesto isecanja proteazom R<1>SK<3>R<4>supstituisano najmanje na pozicijama R<1>i K<3>koje odgovaraju pozicijama 101 i 103 humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) bilo kojom amino kiselinom koja se bira od ne-baznih amino kiselina i histidina.

2. ProNGF mutant prema zahtevu 1, što je mesto isecanja proteazom supstituisano u pomenutim pozicijama 101 i 103 amino kiselinom koja se bira od Alanina, Glicina, Valina, Serina, Treonina, Metionina, Tirozina, Histidina, Asparagina, Asparaginske kiseline, Glutamina, Glutaminske kiseline, Fenilalanina, Izoleucina, Leucina, Triptofana, Cisteina, i Prolina, poželjno se bira od Alanina, Valina, Glicina, Serina, Treonina, Metionina, Tirozina, Histidina, Asparagina, Asparaginske kiseline, Glutamina, Glutaminske kiseline, poželjnije se bira od Alanina i Valina.

3. ProNGF mutant prema zahtevima 1 ili 2, što se amino kiselina na poziciji R<4>koja odgovara poziciji 104 humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) bira od Arginina ili Lizina.

4. ProNGF mutant prema zahtevima 1 do 3, što se amino kiselina na poziciji 102 pomenutog mesta isecanja proteazom humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) bira od amino kiselina Serina, Glicina, Cisteina, Asparagina, Tirozina, Treonina, Asparaginske kiseline, Glutamina, Alanina, Valina, Glutaminske kiseline, Histidine, Izoleucina, Leucine, Fenilalanina, Prolina, Triptofana, Metionina.

5. ProNGF mutant prema zahtevima 1 to 4, što je amino kiselina na poziciji 101 humanog divljeg tipa proNGF sekvence (SEQ ID NO: 1) supstituisana sa Valinom, na poziciji 102 sa Serinom, na poziciji 103 sa Alaninom, i što je amino kiselina na poziciji 104 Arginin.

6. ProNGF mutant prema zahtevima 1 do 5, što se mutant dobija rekombinantnom ekspresijom u prokariotskim delijama, poželjno u E. coli.

7. Postupak dobijanja biološki aktivnog humanog beta-NGF koji sadrži

(i) dobijanje proNGF mutanta prema bilo kom od zahteva 1 do 6, i

(ii) isecanje proNGF mutanta da se dobije aktivni humani beta-NGF.

8. Postupak prema zahtevu 7 koji obuhvata korake:

a. rastvaranja proNGF mutanta prema bilo kom od zahteva 1-6 rastvaranjem inkluzionih tela u denaturišudem rastvoru;

b. prebacivanja proNGF mutanta u rastvor za ponovno savijanje što denaturisani proNGF zauzima biološki aktivnu konformaciju,

c. prečišdavanja ponovo savijenog proNGF mutanta,

d. isecanja pro-sekvence proNGF mutanta da se dobije aktivni beta-NGF.

9. Postupak prema zahtevu 8, što denaturišudi rastvor sadrži rastvor koji sadrži (i) haotropnu supstancu, (ii) helator, (iii) pufer, i (iv) redukujude sredstvo, poželjno, što denaturišudi rastvor sadrži

i.1 - 8 M Gvanidinijum-HCl, poželjno 4-6 M,

ii.0,01 - 1 M Tris,

iii.1 - 50 mM EDTA,

iv.1 - 100 mM odabran od Glutiona (GSH) ili Cisteina,

v. pH 7,0-10,0

i poželjnije sadrži

i.4 M Gvanidinijum-HCl,

ii.0,1 M Tris,

iii.10 mM EDTA

iv.5 mM GSH ili Cistein

v. pH 8,0

poželjno, što rastvor za ponovno savijanje sadrži

i.0,5-1,0 M šaperona,

ii.1- 10 mM ,

iii.0,1 - 10 mM sistema za redoks izmenu,

iv. pH 8,0 - pH 11,0.

i poželjnije sadrži

i.0.75 M Arginin,

ii.5 mM EDTA

iii.1 mM L-Cistin i 5 mM L-Cistein, ili 1 mM GSSG (oksidovanog glutationa) i 5 mM GSH (redukovani glutation),

iv. pH 9,5.

10. Postupak prema zahtevima 8 ili 9, što se ponovno savijanje izvodi kao pulsna renaturacija.

11. Postupak prema zahtevu 8, što se proNGF mutant prečišdava hromatografijom sa pomešanim načinom.

12. Postupak prema zahtevima 7 to 11, što se pro-oblik proNGF mutanta iseca proteazom, poželjno serin proteazom, poželjnije tripsinom.

13. Postupak prema zahtevima 7 do 12, koji dalje sadrži dodatni korak prečišdavanja beta-NGF, poželjno pomodu hromatografije na koloni.

14. Upotreba proNGF mutanta prema bilo kom od zahteva 1 do 6, za proizvodnju humanog beta-NGF.