RS57021B1 - Il-22 za upotrebu u tretiranju mikrobnih poremećaja - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se generalno odnosi na tretman mikrobnih poremećaja modulacijom imunološkog odgovora domaćina.

POZADINA

[0002] Infekcija mikrobnim patogenom predstavlja glavni uzrok smrti širom sveta i nastavlja da predstavlja ozbiljnu pretnju globalnom zdravlju (WHO, The World Health Report (2004)). Na primer, vezivanje i uklanjanje (A/E) bakterijskih patogena, kao što je enterohemoragijska Escherichia coli (EHEC) i enteropatogena E. coli (EPEC) spadaju među bakterije koje izazivaju dijareju, morbiditet i mortalitet, naročito kod dece i dece u zemljama u razvoju (2). E. coli O157:H7, jedan od vrsta EHEC-a, prouzrokovala je hospitalizaciju mnogih ljudi i 3 smrtna slučaja prošle godine u Sjedinjenim Državama (MMWR Morb Mortal Wkly Rep 55, 1045 (Sep 29, 2006)). Takođe se veruje da je više od 90% svih slučajeva hemolitičko uremijskog sindroma posle dijareje (HUS) u industrijalizovanim zemljama uzrokovano infekcijom E. coli O157:H7 (R. L. Siegler, Pediatr Clin North Am 42, 1505 (dec, 1995)). Drugi EPEC sojevi kao što su E. coli O55:H7 takođe uzrokuje crevne bolesti među novorođenčadima širom sveta (T. S. Whittam i dr., Infect Immun 61, 1619 (May, 1993)). Većina naših saznanja o tome kako domaćini kontrolišu infekciju A/E patogena dolazi iz proučavanja infekcije Citrobacter rodentium, prirodni patogen kod miševa (L. Eckmann, Ann NY Acad Sci 1072, 28 (August 1, 2006)). Slično patogenezi EHEC-a ili EHPC-a kod ljudi, intimno vezivanjem C. rodentium za epitelne ćelije miševa dovodi do uklanjanja mikrovil graničnih četkica, nazvane kao lezije vezivanja i uklanjanja (A/E) i hiperplazije debelog creva (D. B. Schauer, S. Falkow, Infect Immun 61, 2486 (Jun, 1993)).

[0003] I intestinalne epitelne i imuno ćelije igraju kritične uloge u odbrani domaćina protiv A/E patogena. Čvrste veze intestinalnih epitelnih ćelija predstavljaju prvu prepreku za sprečavanje stvaranja mikroba iz intestinalnog lumena (T. T. MacDonald, G. Monteleone, Science 307, 1920 (March 25, 2005)). Pored toga, epitelne ćelije luče antimikrobne peptide radi kontrole patogena u gastrointestinalnom (GI) traktu (A. Takahashi i dr., FEBS Lett 508, 484 (Nov 23, 2001)). Studija sa imunom deficijentnim mišjim sojem tokom C. rodentium infekcije je ustanovila da CD4+ T ćelije, B ćelije i anti-C. rodentium specifični odgovori antitela su sve suštinske komponente adaptivnog imuniteta za zadržavanje i iskorenjivanje infekcije (L. Bry, M. B. Brenner, J Immunol 172, 433 (January 1, 2004)). Mnogi citokini proizvedeni limfocitima tokom infekcije mogu poboljšati urođene imune reakcije epitelnih ćelija. Međutim, specifične funkcije ovih citokina ostaju nejasne tokom A/E patogene infekcije.

[0004] IL-22, porodični citokin IL-10, proizvodi se od strane limfocita, naročito Th17 ćelija (Y. Zheng i dr., Nature 445, 648 (Feb 8, 2007)). Th17 ćelije pripadaju nedavno otkrivenom CD4+ T pomoćnom podskupu koji takođe proizvodi IL-17. IL-17 ima važne funkcije u kontroli vanćelijskih bakterijskih infekcija (K. I. Happel i dr., J. Exp. Med. 202, 761 (September 19, 2005)). Međutim, uloga IL-22 u odbrani domaćina i dalje je u velikoj meri nepoznata. Zaključeni faktor tumorne nefroze (TNF) je u struci prepoznat kao velika porodica proteina koja ima različite aktivnosti od odbrane domaćina do imunološke regulacije do apoptoze. TNF je prvi identifikovan kao faktor koji je izveden iz seruma koji je bio citotoksičan za nekoliko transformisanih ćelijskih linija in vitro i izazvao je nekroze određenih tumora in vivo. Sličan faktor u superfamiliji je identifikovan i nazvan je limfotoksin ("LT"). Zbog posmatranih sličnosti između TNF i LT početkom 1980-ih, predloženo je da se TNF i LT nazivaju TNF-α i TNF-β, respektivno. Naučna literatura tako navodi obe nomenklature. Kao što se koristi u ovoj primeni, termin "TNF" se odnosi na TNF-α. Kasnije istraživanje je otkrilo dva oblika limfotoksina, nazvanih LTα i LTβ. US 2005-0129614 opisuje još jedan polipeptid član superfamilije TNF liganda zasnovan na strukturnim i biološkim sličnostima, označenim TL-5. Članovi proteina TNF-a postoje u oblicima vezanim za membrane koji deluju lokalno putem ćelijskih ćelija ili kao sekretirani proteini. Porodica receptora vezanih za TNF reaguje sa ovim proteinima i pokreće niz signalnih puteva uključujući smrt ćelije ili apoptozu, proliferaciju ćelija, diferencijaciju tkiva i proinflamatorne reakcije.

TNF-α je sam po sebi impliciran u inflamatornim oboljenjima, autoimunim bolestima, virusnim, bakterijskim i parazitskim infekcijama, malignim bolestima i/ili neurodegenerativnim bolestima i korisna je meta za specifičnu biološku terapiju kod bolesti kao što su RA i Kronova bolest.

REZIME PRONALASKA

[0005] Predmetni pronalazak je takav kako je definisano u patentnim zahtevima. Posebno, pronalazak obezbeđuje polipeptid koji sadrži IL-22 za upotrebu u postupku lečenja mikrobiološkog poremećaja kod subjekta, koji obuhvata davanje pomenutom subjektu delotvorne količine polipeptida, pri čemu je mikrobiološki poremećaj inflamatorna bolest creva (IBD). Pronalazak dalje daje IL-22 agonist koji povećava aktivnost IL-22 za upotrebu u postupku tretiranja mikrobiološkog poremećaja kod subjekta, koji obuhvata davanje subjektu efektivne količine IL-22 agonista, pri čemu je mikrobiološki poremećaj IBD i gde je IL-22 agonist odabran iz grupe:

(a) fuzionog polipeptida IL-22-Fc

(b) nukleinske kiseline IL-22;

(c) fuzionog polipeptida IL-22;

(d) antitela ili njegovog biološki aktivnog fragmenta, gde se antitelo ili fragment vezuju za IL-22, IL-22R ili IL-22BP;

(e) monoklonsko antitelo koje se vezuje za IL-22, IL-22R ili IL-22BP; i

(f) humanizovano antitelo koje se vezuje za IL-22, IL-22R ili IL-22BP.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0006]

Sl. 1 prikazuje podatke o odbranu domaćina od C. rodentium infekcija. Sl. 1(A) prikazuje rezultate RT-PCR analize u realnom vremenu na podjedinicama receptora za IL-22 u neinficiranoj GI traktu divljih miševa; Sl.1 (B-F) prikazuje RT-PCR analizu u realnom vremenu na različitim citokinskim izrazima u kolonama divljeg miša usled C. rodentium infekcije; Sl. 1 (G) prikazuje opstanak C57B1/6 (n=5), IL-23p40 (n=5) i IL-6 (n=5) miševa posle C. rodentium infekcije; i Sl.1 (H) prikazuje vremenski tok RT-PCR analize u realnom vremenu na IL-22 i IL-17 ekspresijama u C57B1/6, IL-23p40<-/->, i IL-6<-/->mišjim kolonama usled C. rodentium infekcije. Za C. rodentium infekcije, miševi su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU bakterijama. Svi navedeni podaci predstavljaju dva nezavisna eksperimenta.

Sl. 2 prikazuje podatke koji pokazuju da deficijent IL-22 čini miševe podložnim C. rodentium infekciji. IL-226-7 nedelja (Fig. 2(A-C)), IL-17RC (D), IL-20Rβ stari miševi (sl.2 (F)) ili divlji miševi (slika 2 (A-C, E)) su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium i teži određenim vremenskim tačkama. Histološka analiza kolona iz IL-22<-/->i divljih miševa 8 dana nakon inokulacije korišćenjem hematoksilin-eozin (H&E) boje (sl. 2(B i C)). Strelice ukazuju na submukozno zapaljenje (sl.2 (B)) i bakterijsku invaziju u mukozne žlezde (Sl.2 (C)). Prikazani su reprezentativni podaci (kolona = 100 mm za Sliku 2 (B) i kolona = 25 mm za Sliku 2 (C)). Divlji C57B1/6 miševi su primili 150 mg anti-IL-22 mAb ili izotip kontrolu IgG1 mAb intraperitonealno, svaki drugi dan, počevši od dana 0 ili 8 dana nakon inokulacije (Slika 2 (E)). * *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Svi podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta.

Sl. 3 prikazuje podatke koji pokazuju efekat nedostatka IL-22 kod miševa tokom C. rodentium infekcije. C57B1/6 miševi (Sl. 3 (A, B i F)), IL-22<-/->i divlji miševi (Sl. 3 (C-E, i G)) su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium. Miševi su takođe primili 150 mg anti-IL-22 mAb ili izotipa kontrole IgG1 mAb intraperitonealno svakog drugog dana počevši od istog dana kao C. rodentium inokulacija (Sl.3 (A i B)). Na dan 10, debela creva su snimljena i izmerena je dužina pojedinačnog debelog creva (Sl. 3 (A)). Histološka analiza debelog creva obavljena je korišćenjem hematoksilin-eosin (H & E) boje (Sl.3 (B)). Histološka analiza debelog creva i jetre (dan 8) kod inficiranih IL-22<-/->i miševa divljeg tipa izvedeni su korišćenjem H & E bojenja (Sl.

3 (C i E)). Strelice na slici 3 (C) ukazuju na transmuralnu inflamaciju debelog creva i ulceraciju. Sl. 3 (E) prikazuje jetrenu septičku mikroabsces u IL-22<-/->miševa. Reprezentativni podaci su prikazani na slici 3 (C), gde su kolone = 500 mm za gornje panele i kolone = 100 mm za donje panele. Na slici 3 (E), kolone = 25 mm. Sl. 3 (D) prikazuje dnevnik10 CFU C. rodentium u debelom crevu, jetri, slezini i mezenteričnom limfnom čvoru. Sl.3 (F-G) prikazuje serumski anti-C. rodentium IgG nivoe ELISA. *p < 0.05. Svi navedeni podaci predstavljaju dva nezavisna eksperimenta.

Sl. 4 prikazuje podatke koji pokazuju da IL-22 indukuje anti-mikrobni RegIII porodičnu proteinsku ekspresiju tokom C. rodentium infekcije. In vitro kultura C57B1/6 kolona miševa je tretirana sa 10 mg IL-22 tokom 24 sata, RNK su izolovani i korišćeni za analizu mikroorganizama (Sl.4 (A)) i RT-PCR analiza u realnom vremenu (Sl.4 (B )). Na slici 4 (C), 1L-22<-/->miševi i divlja legla su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium, i RT-PCR u realnom vremenu obavljen je na RNK izolovano od pojedinačnog debelog creva miša sakupljenog u određenim vremenskim tačkama. Svi podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta.

Sl.5 prikazuje podatke koji pokazuju ciljani mišji poremećaj IL-17RC gena. Slika 5 (A) prikazuje strategiju generisanja nokaut miševa IL-17RC. Ekson 1-5 (otvorene kutije) obuhvataju IL-17RC kodirajuću sekvencu zamenjenu sa kasetom za otpornost na neomicin. Slika 5 (B) prikazuje genotipizaciju potomaka od divljeg tipa (VT) i nokaut (KO) miševa koristeći naznačene grupe prajmera (PI, P2 i P3). Fibroblasti repnog konca iz WT i KO miševa su generisani i stimulisani u različitim koncentracijama IL-17A i IL-17F in vitro tokom 24 časa, i supernatant za kulturu je sakupljen za IL-6 ELISA (Slika 5 (C)).

Sl. 6 prikazuju podatke RT-PCR analize u realnom vremenu na IL-19, IL-20 i IL-24 ekspresiji u debelim crevima miševa kod divljih miševa tokom C. rodentium infekcije, u toku vremena. C57B1/6 miševi su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium. Debela creva su sakupljana u navedenim vremenskim tačkama, a izolovane RNK su korišćene za RT-PCR analizu u realnom vremenu.

Sl.7 prikazuje podatke koji pokazuju ekspresiju IL-20Rα i IL-20Rβ u GI traktu. RT-PCR analiza u realnom vremenu na podjedinicama receptora za IL-19, IL-20 i IL-24 u neinficiranom GI traktu divljeg tipa.

Sl. 8 prikazuje podatke koji pokazuju ciljani poremećaj miševa IL-20Rβ gena. Slika 8 (A) prikazuje strategiju generisanja nokaut miševa IL-20Rβ. Ekson 1 (otvorene kutije) zamenjen je kasetom za otpornost na neomicin. Na slici 8 (B) prikazana je fenotipizacija potomaka kod divljih (VT), heterozigotnih (HET) i nokautnih (KO) miševa korišćenjem naznačenih skupa prajmera (p1, p2 i p3). Slika 8 (C) VT i KO uši miša su intradermalno ubrizgavane sa 500 ng rekombinantnog IL-20 u 20 ml PBS ili sa samo 20 ml PBS. 24 sata kasnije, uši miševa su sakupljene za izolaciju RNK. Izolovane RNK su korišćene za RT-PCR analizu u stvarnom vremenu za gene za koje je poznato da su regulisani nakon signalizacije IL-20.

Sl. 9 prikazuju podatke histološke analize debelog creva divljih miševa protiv virusa IL-22 mAb koji se inokuliraju sa C. rodentium. C57B1/6 miševi su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium. Miševi su takođe primili 150 mg anti-IL-22 mAb ili izotipa kontrole IgG1 mAb intraperitonealno svakog drugog dana počevši od istog dana kao C. rodentium inokulacija. Na dan 10, rutinska histološka analiza debelog creva obavljena je korišćenjem hematoksilin-eosin (H & E) boje. Strelice ukazuju na mukoznu ulceraciju sa transmuralnom inflamacijom. Prikazuju se reprezentativne slike, kolona = 500 mm za gornje panele i kolona = 250 mm za donje panele.

Sl. 10 prikazuje podatke koji pokazuju nivo seruma Ig kod IL-22<-/->miševa i divljih miševa u toku C. rodentium infekcije. IL-22<-/->i miševa divljeg tipa, bili su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium. U navedenim vremenskim tačkama, sakupljena je krv miša. Nivoi ukupnog IgM i IgG seruma (Slika 10 (A)) i serumski anti-C. rodentium IgG2a, IgG2b, IgG2c i IgG3 (Slika 10 (B)) su određeni pomoću ELISA. Svi podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta.

Sl. 11 prikazuje podatke koji pokazuju ex vivo ELISA IL-22 (Slika 11 (A)) i IL-17 (Sl.11 (B)) ekspresiju u C57B1/6, IL-23p19<-/->, i IL-6<-/->nakon toga C. rodentium infekcije. Za C. rodentium infekciju, miševi su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU bakterija. Svi podaci su reprezentativni za najmanje dva nezavisna eksperimenta.

Sl.12 prikazuje FACS analizu IL-22R ekspresije na izolovanim miševima IEL, LPMC i epitelnim ćelijama debelog creva (slika 12 (A)), i FACS analiza IL-22R ekspresije na primarnim epitelnim ćelijama čoveka (Slika 12 (B)). Svi podaci su reprezentativni za najmanje dva nezavisna eksperimenta.

Sl. 13 prikazuje podatke koji pokazuju da je IL-22, proizveden od strane dendritskih ćelija (DC), kritičan za urođene imune reakcije protiv C. rodentium infekcija. Na slici 13 (A), Rag2<-/->i miševi divljeg tipa Balb/c su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium. Na slici 13 (B i C), miševi su takođe primili 150 mg izotipskih kontrolnih IgG1 mAb ili anti-IL-22 mAb intraperitonealno svakog drugog dana, počevši od istog dana kao i inokulacija bakterija i stečene su u navedenim vremenskim tačkama. Slika 13 (B) prikazuje vremenski tok RT-PCR analize u realnom vremenu, a (Sl.13 (C)) prikazuje ex vivo ELISA kulture debelog creva IL-22 i IL-17 ekspresije u debelom crevu divljeg miša Balb/c i Rag2<-/->miševa sledeće C. rodentium infekcije. Slika 13 (D) prikazuje imunohistohemijsko bojenje za IL-22, CD11c i DAPI u debelom crevu od 4 dana od C. rodentium zaraženi Rag2<-/->miševaMagnification: 400x. Slika 13 (E) prikazuje podatke koji pokazuju da IL-23 direktno indukuje IL-22 proizvodnju, prema merenju pomoću ELISA, iz izolovanog CD11c miševa+ DCs in vitro. Svi podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta.

Sl.14 prikazuje podatke koji pokazuju da IL-22 može izazvati STAT3 aktivaciju u linijama ljudskih ćelija debelog creva. Na slici 14 (A), IL-22<-/->miševi i legla divljeg miša su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium. Jedna grupa IL-22<-/->miševa su takođe primali mRegIIIγ-Ig fuzioni protein. Životinje su stečene i nadgledane u navedenim vremenskim tačkama. *p < 0.05, ** p <0.01. Na slici 14 (B), IL-23 direktno indukuje IL-22 proizvodnju iz izolovanih humanih DC, merenih pomoću ELISA. Slika 14 (C) prikazuje IL-22R ekspresiju FACS na ćelijskim linijama čoveka debelog creva. Slika 14 (D) prikazuje Zapadnu upijanje koje pokazuje da IL-22 može izazvati STAT3 aktivaciju u ćelijskim linijama čoveka debelog creva. Slika 14 (E) prikazuje RT-PCR analizu u realnom vremenu za RegIIIβ i RegIIIγ ekspresiju u epitelnim ćelijskim linijama čoveka tretiranih IL-22. Svi podaci su reprezentativni za dva nezavisna eksperimenta.

Sl.15 opisuje karakterizaciju anti-IL-22 mAb za imunohistohemiju. Slika 15 (A) prikazuje delove debelog creva od dana 4 C. rodentium infekcije IL-22<-/->miševa ili neinficirani miševi divljeg tipa, obojeni sa Alexa555 konjugovanim anti-IL-22 mAb (8E11) ili kontrolom izotipa. Slika 15 (B) prikazuje ćelijske pelete IL-22-ekspresivnih 293 ćelija obojenih sa Alexa555 konjugovanim anti-IL-22 mAb (8E11) ili kontrolom izotipa. Povećanje je 200x.

Sl. 16 prikazuje analizu vremenskog toka RegIIIγ i RegIIIβ ekspresije kod C57B1/6 i IL-23p19<-/->debelog creva miševa koji slede C. rodentium infekciju. C57B1/6 i IL-23p19<-/->miševi su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium. U navedenim vremenskim tačkama, debela creva miševa su sakupljena za ekstrakciju RNK, a zatim RT-PCR analizu u realnom vremenu na RegIIIγ i RegIIIβ mišu.

Sl. 17 prikazuje analizu vremenskog kursa o drugim članovima Reg porodice u IL-22<-/->i debelog creva miša sledeći C. rodentium infekciju. IL-22<-/->i miševe divljeg tipa su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium. U navedenim vremenskim tačkama, debela creva miša su sakupljena za ekstrakciju RNK, a zatim RT-PCR analizu u realnom vremenu.

Sl.18 prikazuje podatke koji pokazuju da rekombinantni humani RegIII_fuzioni protein može delimično zaštititi IL-22<-/->sledeći C. rodentium infekciju. IL-22<-/->miševi i legla divljeg tipa su oralno inokulirani sa 2x10<9>CFU C. rodentium. Jedna grupa IL-22<-/->miševa je takođe primila fuzione proteine čoveka RegIII-cFlag. Životinje su stečene i nadgledane u navedenim vremenskim tačkama. *p < 0.05.

Sl. 19 A-C prikazuje 161 gen diferencijalno izraženih u debelom crevu, od lečenja IL-22.

Sl. 20 prikazuje 2D hijerarhijsku grupu od 161 gena diferencijalno izraženih u debelom crevu iz tretmana IL-22, gde su odabrani geni grupisani iterativnom aglomeracijom vektora koji su najčešće povezani sa koeficijentom korelacije Pearson-a, sa podacima za aglomerisane vektore sumirane srednjim vezama.

Sl. 21 prikazuju podatke koji pokazuju LTbRFc i anti-IL-22 mAb dovode do smrtnosti nakon infekcije C. rodentium.

Sl. 22 prikazani su podaci koji pokazuju regulaciju putanje LT na višestrukim uzvodnim aspektima koji su uključeni u proizvodnju IL-22.

Sl. 23 prikazuju podatke koji pokazuju da IL-22 delimično spašava defektove vidjene kod miševa koji se tretiraju sa LTbR.

Sl. 24 prikazuju podatke koji pokazuju da tretman protiv IL-22 mAb dovodi do smanjenja folikula debelog creva, kompromitovanog B/T organizacije i smanjenih brojeva ćelija DC, T ćelija i B ćelija.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0007] Pronalazači su otkrili su novi put citokina koji posreduje imuno odgovoru i rezistenciji sisara na zarazne mikrobiološke patogene. Konkretno, pronalazači su otkrili da je IL-22 jedan od ključnih citokina koji premašuje adaptivni imuno odgovor i urođenu epitelnu odbranu tokom rane infekcije bakterijskog patogena (A/E) vezivanja ili uklanjanja (A/E).

[0008] Kao što je prikazano ovde, citokini kao što je IL-22 koji su proizvedeni od strane imunih ćelija u ranim stadijumima infekcije su neophodni za intestinalne epitelne ćelije da bi izazvali potpuni antimikrobiološki odgovor i reakciju zarastanja rana kako bi se sprečila sistemska invazija patogenih mikroba u domaćinu. Studije ovde pokazuju da IL-22 štiti integritet intestinalne epitelne barijere i sprečava bakterijsku invaziju sa sistemskim širenjem. Nadalje, studije u nastavku pokazuju da je IL-22 uključen u izazivanje ranih anti-bakterijskih IgG reakcija i neophodan je za indukciju antimikrobnih lektina, kao što je RegIIIβ i RegIIIγ, od epitelnih ćelija debelog creva tokom bakterijske infekcije. Nedostatak jednog ili oba ova mehanizma može doprineti kompromitovanom odgovoru odbrane domaćina sa povećanim sistemskim širenjem i mortalitetom IL-22<-/->miševa tokom C. rodentium infekcije.

[0009] Kao što je prikazano ovde, indukcija RegIIIβ i RegIIIγ pokazuje da IL-22 može imati šire funkcije u kontroli različitih bakterijskih infekcija. Studije u nastavku podržavaju ulogu ThIL-17ćelije i njihove efektorske citokine u infektivnim poremećajima i autoimunom poremećajima. Dalje, studije u ovom dokumentu ukazuju da IL-22 i njegovi nizvodni proizvodi, kao što su RegIIIβ i RegIIIγ, mogu biti korisni za lečenje zaraznih poremećaja.

GENERALNE TEHIKE

[0010] Tehnike i postupci opisani ili ovde napomenuti su uglavnom dobro razumljivi i obično upotrebljeni korišćenjem konvencionalne metodologije od strane stručnjaka u oblasti, kao što su, na primer, široko korišćene metodologije opisane u Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, i dr. eds., (2003)); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. (1995)), Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis i dr., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan i dr., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cancer: Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita i dr., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

I. DEFINICIJE

[0011] U svrhu tumačenja ovog opisa primenjuju se sledeće definicije i kad god je to odgovarajuće, termini koji se koriste u singularnom će uključivati i množinu i obrnuto.

[0012] "Anti-mikrobni polipeptid" ili "AMP" je polipeptid koji posreduje ili na drugi način deluje na antimikrobni imunološki odgovor na mikrobiološki patogen i obuhvata fragment, varijantu, analog, derivat ili mimetik koji zadržava AMP aktivnost, npr. antimikrobnu aktivnost, ili aktivnost za moduliranje imunološkog odgovora na mikrobiološku aktivnost. Ovi postupci se mogu koristiti za lečenje inficiranih osoba ili osoba sa rizikom od infekcije sa zaraznim mikrobiološkim patogenom, npr. virusom ili bakterijom. Aktivnost AMP-a može se modulisati ili diferencijalno regulisati (npr., gore ili dole regulisano) u odnosu na drugi AMP ili isti AMP.

[0013] AMP obuhvata izvorni AMP i varijantne forme (koji su dalje definisani ovde), i mogu biti izolovani iz različitih izvora, kao što su ljudsko tkivo ili iz nekog drugog izvora ili pripremljeni rekombinantnim ili sintetičkim metodama. Izvorni AMP može biti iz bilo koje vrste, npr. miševa ili čoveka. AMP uključuju, ali nisu ograničeni na, LT, IL-6, IL-18, IL-22, IL-23 (uključujući npr. IL-23 p19 ili IL-23 p40) i Reg ili Reg-povezane proteine kodirane genima Super familije Reg. Super porodica obuhvata Reg i Reg-gene čoveka, pacova i miša i grupisani su u četiri podklase, tipovi I, II, III i IV. Na primer, tip I uključuje ljudski REG Iα, ljudski REG 1β, pacovski RegI, i mišji RegI; tip II uključuje mišji RegII; tip III obuhvata humani REG III, humani HIP/PAP (gen izražen u hepatocelularnom karcinomu-creva-pankreasa/gena koji kodira pankreatitis-pridruženi protein), pacovski PAP/Peptide23, pacovski RegIII/PAPII, pacovski PAP III, mišji REGIII, REGIII, REGIII, mišji RegIIIδ, i hrčaka INGAP (otok vezan za neogenezu). Tip IV sadrži humani REG IV. Pored toga, ljudska regulaciona sekvenca (RS) je navodno pseudogen. U jednom aspektu, REG protein je kodiran sa članom humanog REG gena porodice koja uključuje, ali se ne ograničava na, REG Ia, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV i Regvezanu sekvencu (RS).

[0014] Limfotoksin (LT) je trimerni citokin u porodici tumorske nekroze; izraženi aktiviranim T, B i NK ćelijama; i uključeni u signalizaciju inflamatornog odziva i sekundarne limfoidne strukture organa. "Limfotoksin-" ili "LT" je ovde definisan kao biološki aktivni polipeptid koji ima sekvencu aminokiselina prikazanu na Sl. 2A patenta SAD br. 5,824,509. "LT" je definisan tako da izričito isključuje humane TNFα ili njegove prirodne analoge životinja (Pennica i dr., Nature 312:20/27:724-729 (1984) and Aggarwal i dr., J. Biol. Chem. 260: 2345-2354 (1985)). Kako se ovde koristi, "LT" se odnosi na jednu ili više LT podjedinica kako je ovde opisano.

[0015] "Limfotoksin-α" ili "LTα" je definisan tako da specifično isključuje human LTβ kao što je definisano, na primer, u US 5,661,004. "Limphotoksinα-3 trimer" ili "LTα3" odnosi se na homotrimer LTa monomera. Ovaj homotrimer je usidren na površini ćelija pomoću LTβ, transmembranskih i citoplazemskih domena.

[0016] "Limphotoksin-αβ" ili "LTαβ" ili "LTαβ kompleks" odnosi se na heterotrimer LTα sa LTβ. Ovi heterotrimeri sadrže ili dve podjedinice LTα i jednu podjedinicu LTβ (LTα2β1), ili jednu podjedinicu LTα i dve LTβ (LTα1β2). Termin "LTαβ" ili "LTαβ" kako se ovde koristi odnosi se na heterotrimer koji se sastoji od jedne podjedinice LTα i dva od LTα (LTα1β2).

[0017] "Receptor faktora tumorske nekroze-1" ili "TNFRI" i "receptor faktora tumorske nekroze-II" ili "TNFRII" se odnosi na ćelijske površinske TNF receptore za homotrimer LTα3, takođe poznat kao p55 i p75, respektivno."Limfotoksin-β receptor" ili "LTβ-R" se odnosi na receptor na koji se vezuju LTαβ heterotrimeri.

[0018] Aminokiselinska sekvenca AMP može sadržati aminokiselinsku sekvencu izabranu iz sledeće grupe: SEQ ID NO: 2 (humani IL-6), SEQ ID NO: 4 (humani IL-12B), SEQ ID NO: 6 (humani IL-23), SEQ ID NO: 8 (humani IL-22), SEQ ID NO: 10 (humani IL-23 p19 ili IL-23A), SEQ ID NO: 12 (humani REG1A), SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 18 (humani REG3A, varijanta 2), SEQ ID NO: 20 (humani REG3A, varijanta 3), SEQ ID NO: 22 (humani REG1B) SEQ ID N0: 26 (humani REG4), SEQ ID NO: 28 (mišji IL-6), SEQ ID NO: 30 (mišji IL -12B), SEQ ID NO: 32 (mišji IL-18), SEQ ID NO: 34 (mišji IL-22), SEQ ID NO: 36 (mišji IL-23 p19 ili IL-23A), SEQ ID NO: 38 SEQ ID N0: 44 (mišji REG3A), SEQ ID NO: 46 (mišji REG3), SEQ ID NO: 42 (SEQ ID NO: 42) SEQ ID NO: 52 (humani LT4), SEQ ID NO: 50 (humani LTa), SEQ ID NO: 52 (humani LTβ), SEQ ID NO: 54 ).

[0019] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira AMP može sadržati sekvencu nukleinske kiseline izabrane iz sledeće grupe: SEQ ID NO: 1 (humani IL-6), SEQ ID NO: 3 (humani IL-12B), SEQ ID NO: 5 (humani IL-23), SEQ ID NO: 7 (humani IL-22), SEQ ID NO: 9 (humani IL-23 p19 ili IL-23A), SEQ ID NO: 11 (humani REG3A, varijanta 2), SEQ ID NO: 19 (humani REG3A, varijanta 3), SEQ ID NO: 21 (humani REG3B), SEQ ID NO: 15 REG3G, varijanta 2), SEQ ID NO: 23 (humani REG3G, varijanta 1), SEQ ID NO: 25 (humani REG4), SEQ ID NO: 27 (mišji IL-6), SEQ ID NO: 12b), SEQ ID NO: 31 (mišji IL-18), SEQ ID NO: 33 (mišji IL-22), SEQ ID NO: 35 (mišji IL-23 p19 ili IL-23A), SEQ ID NO: 37 SEQ ID N0: 41 (mišji REG2), SEQ ID NO: 43 (mišji REG3A), SEQ ID NO: 45 (mišji REG3D), SEQ ID NO: 47 SEQ ID NO: 49 (humani LTα), SEQ ID NO: 51 (humani LTβ), SEQ ID NO: 53 (mišji LTα) i SEQ ID NO: 55 (mišji LTβ).

[0020] "AMP polipeptid u prirodnoj sekvenci" ili "AMP polipeptid u prirodnoj sekvenci" odnosi se na polipeptid koji sadrži istu aminokiselinsku sekvencu kao odgovarajući AMP polipeptid dobijen iz prirode. Ovakve matične sekvence AMP polipeptida mogu biti izolovane iz prirode ili mogu biti proizvedene rekombinantnim ili sintetičkim sredstvima. Pojmovi konkretno obuhvataju prisutne skraćene ili izlučene oblike specifičnog AMP polipeptida (npr. IL-22 bez prisutnog signalnog peptida), prirodno nastalih varijantnih oblika (npr. alternativno spojeni oblici) i prirodno prisutnih alelnih varijanti polipeptida. AMP polipeptidi koji su ovde opisani u prirodnoj sekvenci su zrele polipeptidne matične sekvence ili polipeptidne sekvence celokupne izvorne dužine.

[0021] "Varijantni" polipeptid, odnosi se na aktivni polipeptid koji ima najmanje oko 80% identiteta aminokiselinske sekvence sa prirodnom polipeptidnom sekvencom u punoj dužini. Obično, varijantni polipeptid će imati najmanje oko 80% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 81% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 82% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 83% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 84% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 85% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 86% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 87% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 88% alternativno najmanje oko 89% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 90% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 91% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 92% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 93% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 94% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 95% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 96% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 97% identiteta aminokiselinske sekvence, alternativno najmanje oko 98% identiteta aminokiselinske sekvence i alternativno najmanje oko 99% aminokiselina identitet sekvence sa punom dužinom ili zrelo prirodnom polipeptidnom sekvencom.

[0022] "Procenat (%) identiteta aminokiselinske sekvence" je definisan kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u specifičnoj ili referentnoj polipeptidnoj sekvenci, nakon usklađivanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao identitet maksimalnog procenta sekvence, a ne uzimanje u obzir konzervativnih supstitucija kao deo sekvencijalnog identiteta. Usaglašavanje u cilju određivanja procenta identiteta procenata amino kiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su u skladu sa tehnikom ove oblasti, na primer, korišćenjem javno dostupnog računarskog softvera kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softver. Stručnjaci u stanju tehnike mogu odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, uključujući bilo koji algoritam koji je potreban da se postigne maksimalno poravnanje duž pune dužine upoređenih sekvenci. Za upoređivanje aminokiselinske sekvence, % identiteta aminokiselinske sekvence date amino kiselinske sekvence A do, sa ili prema datoj aminokiselinskoj sekvenci B (koja se alternativno može formulisati kao zadata aminokiselinska sekvenca A koja ima ili sadrži određeni % identiteta aminokiselinske sekvence sa ili sa datom aminokiselinskom sekvencom B) izračunava se na sledeći način:

100 puta udeo X / Y

gde je X broj ostataka aminokiselina koji su postignuti kao identična podudaranja programom za poravnavanje sekvence u algoritmu A i B programa, a gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Zahvalno je da kada je dužina aminokiselinska sekvenca A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % identiteta aminokiselinske sekvence A do B neće izjednačiti % identiteta aminokiselinske sekvence B do A. Kao primeri izračunavanja % identiteta aminokiselinske sekvence pomoću ove metode, tačke 1 i 2 dole pokazuju kako izračunati identitet aminokiselinske sekvence aminokiselina označene "Referentni protein" označava sekvencu aminokiseline "IL-22", pri čemu "IL-22" predstavlja aminokiselinsku sekvencu interesa polipeptida IL-22, "Referentni protein" predstavlja aminokiselinsku sekvencu polipeptida u odnosu na koji se upoređuje polipeptid "IL-22", a "X," Y "i" Z "predstavljaju različite ostatke aminokiselina.

Tabela 1

IL-22 XXXXXXXXXXXXXXX (Dužina = 15 amino kiselina)

Referentni protein XXXXXYYYYYYY (Dužina = 12 amino kiselina)

% identiteta aminokiselinske sekvence = (broj identičnih odgovara aminokiselinskim ostacima između dve polipeptidne sekvence) podeljen sa (ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka IL-22 polipeptida) = 5 podeljeno sa 15 = 33.3%

Tabela 2

IL-22 XXXXXXXXXX (Dužina = 10 amino kiselina)

Referentni protein XXXXXYYYYYYZZYZ (Dužina = 15 amino kiselina)

% identiteta aminokiselinske sekvence = (broj identičnih odgovara aminokiselinskim ostacima između dve polipeptidne sekvence) podeljen sa (ukupnim brojem aminokiselinskih ostataka polipeptida IL-22) = 5 deljeno sa 10 = 50%

[0023] "Izolovani" biološki molekul, kao što su razni polipeptidi, polinukleotidi i antitela koji se ovde obelodanjuju, odnosi se na biološki molekul koji je identifikovan i odvojen i/ili je dobijen od najmanje jedne komponente njegove prirodne sredine.

[0024] "Aktivan" ili "aktivnost", u odnosu na polipeptid, odnosi se na biološku i/ili imunološku aktivnost izvornog polipeptida, pri čemu se "biološka" aktivnost odnosi na biološku funkciju izvornog polipeptida, a ne sposobnost indukovanja proizvodnje antitela protiv antigenskog epitopa koji poseduje izvorni polipeptid. "Imunološka" aktivnost se odnosi na sposobnost da indukuje proizvodnju antitela protiv antigenskog epitopa koji poseduje izvorni polipeptid.

[0025] Termin "antagonist" se koristi u najširem smislu i uključuje bilo koji molekul koji delimično ili potpuno blokira, inhibira ili neutrališe biološku aktivnost polipeptida. Takođe obuhvaćeni "antagonistom" su molekuli koji u potpunosti ili delimično inhibiraju transkripciju ili translaciju mRNK koja kodira polipeptid. Pogodni antagonistički molekuli uključuju, na primer, antagonistička antitela ili fragmente antitela; fragmente ili varijante aminokiselinskih sekvenci izvornog polipeptida; peptide; antisens oligonukleotide; male organske molekule; i nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptidne antagoniste ili antagonistička antitela. Referenca na "an" antagonist obuhvata jedinstveni antagonist ili kombinaciju dva ili više različitih antagonista.

[0026] Termin "agonist" se koristi u najširem smislu i obuhvata bilo koji molekul koji delimično ili potpuno imitira biološku aktivnost polipeptida, npr., izvornog AMP-a. Takođe obuhvaćeni "agonistom" su molekuli koji stimulišu transkripciju ili translaciju mRNK koja kodira polipeptid. Pogodni molekuli agonista uključuju, na primer, agonistička antitela ili fragmente antitela; prirodni polipeptid; fragmente ili varijante aminokiselinskih sekvenci izvornog polipeptida; peptide; antisens oligonukleotide; male organske molekule; i nukleinske kiseline koje kodiraju agoniste polipeptida ili antitela. Pozivanje na "an" agonist obuhvata jedinstveni agonist ili kombinaciju dva ili više različitih agonista.

[0027] "Antimikrobni imuni odgovor" uključuje, ali nije ograničen na, otpornost ili odbranu od infekcije mikrobiološkog patogena. Ovakva otpornost ili odbrana može dovesti do inhibicije ili smanjenja mikrobiološke infektivnosti, replikacije, proliferacije ili druge aktivnosti mikrobiološkog patogena. Konkretno, tretman koji dovodi do antimikrobnog imunološkog odgovora može rezultirati ublažavanjem mikrobiološkog poremećaja ili simptoma mikrobnog poremećaja.

[0028]"Ublaženje", "ublažavanje" ili njegovi ekvivalenti, odnosi se na terapeutski tretman i profilaktičke ili preventivne mere, pri čemu je cilj poboljšanje, sprečavanje, usporavanje (umanjenje), smanjenje ili inhibiranje ciljanog mikrobiološkog poremećaja ili njegovog simptoma. Oni koji imaju potrebu za lečenjem uključuju one koji već imaju poremećaj, kao i oni koji su skloni da imaju poremećaj ili osobe kojima je poremećaj sprečen.

[0029] U pogledu lečenja mikrobiološkog poremećaja, "tretman", "lečenje" ili njegovi ekvivalenti, odnosi se na ublažavanje mikrobiološkog poremećaja ili simptoma mikrobiološkog poremećaja kod subjekta koji ima poremećaj.

[0030] "Hronična" primena se odnosi na primenu agensa u kontinuiranom režimu, nasuprot akutnom režimu, kako bi se održao početni terapijski efekat u dužem vremenskom periodu. "Intermitentna" primena je tretman koji se ne vrši neprekidno bez prekida, već je cikličan po svojoj prirodi.

[0031] "Sisar" za potrebe tretmana odnosi se na bilo koju životinju klasifikovanu kao sisara, uključujući ljude, glodare (npr., miševe i pacove) i majmune; domaće i životinje sa farme; i životinje, sportske, laboratorijske ili kućne ljubimce, kao što su psi, mačke, stoka, konji, ovce, svinje, koze, zečevi i sl. U nekim otelotvorenjima sisar je izabran između čoveka, glodara ili majmuna. Slično tome, "predmet" u svrhu lečenja, odnosi se na subjekt sisara, a uključuje i ljudske i životinjske subjekte.

[0032] Upotreba "u kombinaciji sa" jednim ili više daljih terapijskih agenasa uključuje istovremenu (istovremenu) i uzastopnu primenu u bilo kom redosledu.

[0033] "Nosači", kao što se ovde koriste, uključuju farmaceutski prihvatljive nosače, ekscipijense ili stabilizatore koji su netoksični za ćeliju ili sisara koji su mu izloženi u dozama i koncentracijama koje se koriste. Često je fiziološki prihvatljiv nosač vodeni puferski rastvor pH. Primeri fiziološki prihvatljivih nosača uključuju pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanse uključujući askorbinsku kiselinu; polipeptid niskomolekularne mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumini, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatirajući agensi kao što su EDTA; šećerne alkohole kao što su manitol ili sorbitol; formirajuće soli kontra-joni kao što je natrijum; i/ili nejonski površinski aktivne materije kao što su TWEEN ™, polietilen glikol (PEG) i PLURONICS™.

[0034] "Antitela" (Abs) i "imunoglobulin" (Igs) su glikoproteini koji imaju slične strukturne karakteristike. Dok antitela pokazuju vezivnu specifičnost specifičnog antigena, imunoglobulini uključuju i antitela i druge molekule slične antitelu, koji uglavnom nemaju specifičnost antigena. Polipeptidi druge vrste su, na primer, proizvedeni na niskim nivoima limfnog sistema i na povećanim nivoima kod mijeloma.

[0035] Termini "antitelo" i "imunoglobulin" koriste se naizmenično u najširem smislu i uključuju monoklonska antitela (npr. punu dužinu ili netaknuta monoklonska antitela), poliklonska antitela, monovalentna antitela, multivalentna antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela sve dok ona pokazuju željenu biološku aktivnost) i mogu uključiti i određene fragmente antitela (kao što je detaljnije opisano ovde). Antitelo može biti himerno, ljudsko, humanizovano i/ili zrelog afiniteta.

[0036] Antitelo koje se specifično vezuje za određeni antigen odnosi se na antitelo koje je sposobno da vezuje antigen sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens u ciljanju antigena. Poželjno, stepen vezivanja takvog antitela na ne-ciljani polipeptid je manji od oko 10% vezivanja antitela prema ciljnom antigenu, kao što je mereno, npr., putem radioimunskog testa (RIA). U određenim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za ciljani antigen ima konstantu disociacije (Kd) od ≤ 1mM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM ili ≤ 0,1 nM.

[0037] "Varijabilni region" ili "varijabilni domen" antitela se odnosi na aminoterminalne domene teškog ili lakog lanca antitela. Varijabilni domen teškog lanca može se nazvati "VH". Varijabilni domen lakog lanca može se nazvati "VL". Ovi domeni su uglavnom najrazličitiji delovi antitela i sadrže mesta za vezivanje antigena.

[0038] Termin "varijabla" se odnosi na činjenicu da se određeni delovi varijabilnih domena obično razlikuju u nizu među antitelima i koriste se u vezivanju i specifičnosti svakog pojedinačnog antitela za njegov određeni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena u varijabilnim domenima antitela. Koncentrisana je u tri segmenta koji se zovu regioni koji određuju komplementarnost (CDR) ili hipervarijabilni regioni (HVR-ovi) kako u varijabilnom domenu lakog lanca tako i kod teškog lanca. Što su više konzervisani delovi varijabilnih domena nazvani su okvirni regioni (FR). Svaka varijabilna područja domaćih teških i lakih lanaca čine četiri FR regione, u velikoj meri usvajaju konfiguraciju beta ploče, povezana sa tri CDR-a, koja formiraju petlje koje se povezuju, a u nekim slučajevima i sastavni deo strukture beta-lista. CDR-ovi u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini od strane FR regiona i sa CDR-ima iz drugog lanca, doprinose stvaranju antigen-vezujućeg mesta antitela (vidi Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Heath, Bethesda, MD (1991)). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antitela na antigen, već imaju različite efektorske funkcije, kao što je učešće antitela u ćelijskoj toksičnosti zavisnog od antitela.

[0039] "Laki lanci" antitela (imunoglobulina) bilo koje vrste kičmenjaka mogu se dodeliti jednom od dva jasno izražena tipa, koja se zovu kapa (κ) i lambda (λ), bazirana na aminokiselinskim sekvencama njihovih konstantnih domena.

[0040] U zavisnosti od sekvenci aminokiselina konstantnih domena njihovih teških lanaca, antitela (imunoglobulini) mogu se dodeliti različitim klasama. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina; IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko od njih mogu se dalje podeliti na podklase (izotipe), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni težeg lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se nazivaju α, δ, ε, γ, i μ, respektivno. Podjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate i opisane generalno u, na primer, Abbas i dr. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (2000). Antitelo može biti deo većeg fuzionog molekula, formiranog kovalentnom ili ne-kovalentnom vezom antitela sa jednim ili više drugih proteina ili peptida.

[0041] Izrazi "antitela pune dužine", "netaknuto antitelo" i "celokupno antitelo" se ovde koriste naizmenično, kako bi se označilo antitelo u njegovom suštinski neoštećenom obliku, a ne fragmentima antitela kako je definisano u daljem tekstu. Termini se posebno odnose na antitelo sa teškim lancima koji sadrže Fc region.

[0042] "Frakcije antitela" sadrže samo deo netaknutog antitela, pri čemu deo zadržava najmanje jedan, i onoliko koliko je većina ili sve, funkcije koje su obično povezane sa tim delom kada su prisutne u netaknutim antitelima. U jednom otelotvorenju, fragment antitela sadrži mesto vezivanja antigena netaknutog antitela i na taj način zadržava sposobnost da se veže antigen. U još jednom otelotvorenju fragment antitela, na primer, onaj koji obuhvata Fc region, zadržava bar jednu od bioloških funkcija koje su obično povezane sa regionom Fc kada su prisutne u netaknutom antitelu, kao što je FcRn vezivanje, modulacija polu-života antitela, ADCC funkcija i vezivanje komplementa. U jednom otelotvorenju, fragment antitela je monovalentno antitelo koje ima in vivo polu-život suštinski sličan sa netaknutim antitelima. Na primer, takav fragment antitela može se sastojati od armature za vezivanje antigena vezane za Fc sekvencu koja je sposobna da prenese in vivo stabilnost na fragmentu.

[0043] Papain digestijom antitela proizvedu se dva identična fragmenta vezivanja antigena, pod nazivom "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigenom vezujućim mestom i ostatak fragmenta "Fc", čije ime odražava njegovu sposobnost lake kristalizacije. Terapija pepsinom daje F(ab')2 fragment koji ima dva antigen-kombinovana mesta i još uvek je sposoban za unakrsno povezivanje antigena.

[0044] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno antigen vezujuće mesto. U jednom otelotvorenju, dvocilindrična Fv vrsta se sastoji od dimera jednog varijabilnog domena teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, ne-kovalentnoj vezi. U jednolančanoj Fv (scFv) vrsti, jedan varijabilni domen teškog i jednog lakog lanca može biti kovalentno povezan sa fleksibilnim peptidnim linkerom tako da se laki i teški lanci mogu povezati u "dimernoj" strukturi analognoj onoj u dvostepenoj vrsti Fv. U ovoj konfiguraciji se tri CDR-ova svakog varijabla domena interaguju da definišu antigen vezujuće mesto na površini VH-VL dimera. Kolektivno, šest CDR-ova prenose antigen-vezujuću specifičnost na antitelo. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koja sadrži samo tri CDR-ova specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja antigena, mada sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.

[0045] Fab fragment sadrži varijabilne domene teškog i lakog lanca, a takođe sadrži konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab' fragmenti se razlikuju od fragmenata Faba dodavanjem nekoliko ostataka na karboksi terminusu CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona šarnira antitela. Fab'-SH je oznaka ovde za Fab' u kojoj ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiol grupu. F(ab')2 fragmenti antitela prvobitno su proizvedeni kao parovi fragmenata Fab-a koji imaju između njih priključke cisteina. Takođe su poznati i drugi hemijski sklopovi fragmenata antitela.

[0046] "Jednolančani Fv" ili "scFv" fragmenti antitela sadrže VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, scFv polipeptid dalje sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena koji omogućava scFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled scFv pogledajte Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).

[0047] Termin "diatela" odnosi se na male fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena, gde fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) koji je povezan sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Korišćenjem prekidača koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se uparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i kreiraju dva mesta za vezivanje antigena. Diabodi mogu biti dvovalentni ili bispecifični. Diatela su detaljnije opisana u, na primer EP 404,097; WO93/1161; Hudson i dr. (2003) Nat. Med. 9:129-134; and Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triatela i tetratela su takođe opisana Hudson i dr. (2003) Nat. Med 9:129-134.

[0048] Termin "monoklonsko antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije u suštinski homogenim antitelima, tj. pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična osim kod mogućih mutacija, npr. prirodnih mutacija, koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Tako modifikator "monoklonalni" označava karakter antitela kao da nije mešavina diskretnih antitela. U određenim otelotvorenjima takvo monoklonsko antitelo tipično obuhvata antitelo koje sadrži polipeptidnu sekvencu koja se vezuje za metu, pri čemu se sekvenca polipeptidne sekvence koja se vezuje dobila procesom koji uključuje selekciju jedinične polipeptidne sekvence koja povezuje jedan cilj iz mnoštva polipeptidnih sekvenci. Na primer, proces selekcije može biti izbor jedinstvenog klona iz mnoštva klonova, kao što je bazen klonova hibridoma, fage klonova ili rekombinantnih DNK klonova. Treba podrazumevati da se selektovana sekvenca vezivanja može dalje promeniti, na primer, da se poboljša afinitet za cilj, da se humanizuje ciljna sekvenca vezivanja, da se poboljša njegova proizvodnja u ćelijskoj kulturi, da se smanji njegova imunogenost in vivo, da bi se stvorilo multispecifično antitelo, itd., i da antitelo koje sadrži izmenjenu sekvencu vezivanja cilja takođe je monoklonsko antitelo. Za razliku od preparata poliklonskih antitela koji obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonalno antitelo pripreme monoklonalnog antitela usmereno je protiv jedne odrednice na antigenu. Pored njihove specifičnosti, preparati monoklonskih antitela su povoljni u tome što oni obično nisu kontaminirani drugim imunoglobulinama.

[0049] Modifikator "monoklonal" označava karakter antitela kao dobijen od suštinski homogene populacije antitela i ne treba tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojom posebnom metodom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste u skladu sa ovim pronalaskom mogu se izraditi različitim tehnikama, uključujući, na primer, metod hibridoma (npr. Kohler i dr., Nature, 256: 495 (1975); Harlow i dr., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling i dr., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), metode rekombinantne DNK (videti, npr.,. patent SAD br.4,816,567), tehnologije za fag prikaz (pogledajte, npr., Clackson i dr., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks i dr., J. Mol. Biol 222: 581-597 (1992); Sidhu i dr., J Mol. Biol.338(2): 299-310 (2004); Lee i dr., J. Mol. Biol.340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee i dr., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) i tehnologije za proizvodnju ljudskih ili humanih antitela kod životinja koje imaju delove ili sve humane imunoglobulinske lezije ili gene koji kodiraju sekvence humanog imunoglobulina (videti, na primer, WO98/24893; WO96/34096; WO96/33735; WO91/10741; Jakobovits i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits i dr., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann i dr., Year in Immunol. 7:33 (1993); U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016; Marks i dr., Bio. Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg i dr., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild i dr., Nature Biolechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996) and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93 (1995).

[0050] Monoklonska antitela ovde posebno uključuju "himerna" antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz određene vrste ili koje pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok ostatak lanca (a) je identičan ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz druge vrste ili pripadaju drugoj klasi ili podklasi antitela, kao i fragmentima takvih antitela, dokle god oni pokazuju željenu biološku aktivnost (U.S. Patent No. 4,816,567; and Morrison etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

[0051] "Humanizovani" oblici nehumanih (npr., murinskih) antitela su himerna antitela koja sadrže minimalnu sekvencu dobijenu od nehumanog imunoglobulina. U jednom otelotvorenju, humanizovano antitelo je humani imunoglobulin (primajuće antitelo) u kome ostaci iz hipervarijabilnog regiona primaoca zamenjuju ostaci iz hipervarijabilnog regiona neljudske vrste (antitelo donatora) kao što su miš, pacov, zec ili nehumanog primata koji ima željenu specifičnost, afinitet i/ili kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci okvira regiona (FR) humanog imunoglobulina zamjenjuju se odgovarajućim neljudskim ostacima. Pored toga, humanizovana antitela mogu sadržati ostatke koji nisu pronađeni u prijemnom antitelu ili u antitelu donatora. Ove modifikacije se mogu učiniti kako bi se dalje poboljšala performanse antitela. Uopšteno govoreći, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve bar jedan i tipično dva varijabilna domena, u kojima sve ili u suštini sve hipervarijebilne petlje odgovaraju onima kao kod nehumanog imunoglobulina, a svi ili u suštini svi FR su oni u sekvenci humanog imunoglobuline. Humanizovano antitelo opciono će takođe sadržati barem deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onog čovečijeg imunoglobulina. Za dalje detalje, pogledajte Jones i dr., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann i dr., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Pogledajte i sledeće članke i preporuke za pregled: Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol.1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994).

[0052] "Ljudsko antitelo" je ono koje poseduje sekvencu aminokiselina koja odgovara onom antitelu proizvedenom od strane čoveka i/ili je napravljen pomoću bilo koje od tehnika za stvaranje ljudskih antitela kako je ovde obelodanjeno. Ova definicija humanog antitela specifično isključuje humanizovano antitelo koje sadrži ostatak koji nehumani antigen vezuju.

[0053] U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, imunoglobulini mogu biti dodeljeni različitim klasama. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko od njih mogu se dalje podeliti na podklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2.

[0054] Antitelo "zrelog afiniteta" je ono sa jednom ili više izmena u jednom ili više HVR-ova, što rezultira poboljšanjem afiniteta antitela za antigen, u poređenju sa izvornim antitelom koji ne poseduje te promene. U jednom otelotvorenju, antitelo zrelog afiniteta ima nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete za ciljani antigen. Antitela zrelog afiniteta mogu biti proizvedena postupcima poznatim u struci. Marks i dr. Bio/Technology 10:779-783 (1992) opisuje sazrevanje afiniteta pomoću VII i VL domena. Slučajna mutageneza HVR i/ili okvirnih ostataka opisuje: Barbas i dr. Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier i dr. Gene 169:147-155 (1995); Yelton i dr. J. Immunol.155:1994-2004 (1995); Jackson i dr., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).

[0055] "Blokiranje" antitela, "neutralizujuće" antitelo ili "antagonist" antitelo je onaj koji inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena koji se vezuje. Takva antitela mogu u suštini ili u potpunosti inhibirati biološku aktivnost antigena.

[0056] "Agonistično antitelo", kako se ovde koristi, je antitelo koje delimično ili potpuno emitira biološku aktivnost polipeptida od interesa.

[0057] Antitela "efektorske funkcije" odnose se na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu (Fc region sa prirodnom sekvencom ili varijantu Fc regiona varijante aminokiselina) antitela i variraju sa izotipom antitela. Primeri funkcija efektorskih antitela uključuju: vezivanje Clq i citotoksičnost zavisna od komplementa; vezivanje Fc receptora; citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC); fagocitoza; regulacija nivoa receptora na površini ćelija (npr. B ćelijski receptor); i aktivacija B ćelija.

[0058] "Vezujući afinitet" se uglavnom odnosi na jačinu ukupnog broja nekovalentnih interakcija između jednog vezujućeg mesta molekula (npr., antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr., antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, "afinitet vezivanja" odnosi se na inherentni afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr., antitela i antigena). Afinitet molekula X za svog partnera Y generalno može biti predstavljen konstantom disociacije (Kd). Afinitet se može izmeriti zajedničkim metodama poznatim u struci, uključujući one koje su ovde opisane. Antitela sa niskim afinitetom uglavnom se spajaju sa antigenom i teže da se lako disociraju, dok antitela sa visokim afinitetom uglavnom vezuju antigen brže i imaju tendenciju da ostanu vezana duže. Različiti postupci za merenje afiniteta vezivanja su poznati u struci, od kojih se može koristiti bilo koji od njih. Specifični ilustrativni pristupi su opisani u nastavku.

[0059] U jednom pristupu, vrednost "Kd" ili "Kd" se meri pomoću radio-obeleženog testa vezivanja antigena (RIA) izvedenog sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovog antigena, kao što je opisano u sledećem testu. Afinitet vezivanja rastvora Fab-a za antigen se meri izjednačavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom (<125>I) označenog antigena u prisustvu titracione serije neoznačenog antigena, a zatim uzimanje vezanog antigena sa pločicom obloženom anti-Fab antitelom (Chen, i dr., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881). Da bi se uspostavili uslovi za ispitivanje, mikrotitarske ploče (Dynex) su premazivane preko noći sa 5 mg/ml antitela za zauzimanje anti-Fab antitela (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9,6), a zatim blokirani sa 2% (w/v) goveđeg seruma albumina u PBS u trajanju od dva do pet sati na sobnoj temperaturi (približno 23°C). U ne-adsorbentnoj ploči (Nunc # 269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigen se pomešaju sa serijskim razblaženjima Fab od interesa (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, in Presta i dr., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab od interesa se onda inkubira preko noći; međutim, inkubacija se može nastaviti duže (npr. oko 65 sati) kako bi se osiguralo postizanje ravnoteže. Posle toga smeše se prenose na ploču za hvatanje za inkubaciju na sobnoj temperaturi (npr., na jedan sat). Rastvor se zatim uklanja i ploča se ispere osam puta sa 0.1% Tween-20 u PBS. Kada se ploče osuše, doda se 150 ml/otvoru scintilanta (MicroScint-20; Packard), a ploče se postavljaju na brojač Topcount (Packard) na deset minuta. Koncentracije svakog Fab-a koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja su odabrane za upotrebu u konkurentnim vezivnim testovima.

[0060] Prema drugom pristupu, vrednost Kd ili Kd se meri pomoću površinskog plazmonskog rezonantnog testa pomoću BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa imobilizovanim antigenom CM5 čipovima na ~10 jedinica odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilirani dekstranski biosenzorski čipovi (CM5, BIAcore Inc.) se aktiviraju sa N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimid (NHS) prema uputstvima dobavljača. Antigen se razblaži sa 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 mg/ml (~ 0,2 mM) pre injektiranja s brzinom protoka od 5 ml/min, kako bi se postiglo približno 10 jedinica odgovora (RU) spojenog proteina. Posle injekcije antigena, 1 M etanolamina se ubrizgava u blokadu neizlečenih grupa. Za kinetička merenja, dvostruko serijsko razblaženje Fab (0.78 nM do 500 nM) se ubrizgava u PBS sa 0,05% Tween 20 (PBST) na 25°C sa brzinom protoka od približno 25 ml/min. Stopa udruživanja (kon) i stope disocijacije (koff) se izračunavaju koristeći jednostavni vezni model Langmuir (BIAcore Evaluation Software version 3.2) sa istovremenim prilagođavanjem asocijacija i disosionih senzora. Konstanta ravnotežne disociacije (Kd) izračunava se kao odnos koff/ kon. Vidite, na primer, Chen, Y., i dr., (1999) J. Mol. Biol. 293:865-881. Ako brzina prelazi 106 M-1 s-1 pomoću površinskog plazmonskog rezonantnog testa iznad, onda se brzina može odrediti korišćenjem fluorescentne tehnike gašenja koja meri povećanje ili smanjenje intenziteta emisije fluorescencije (pobuđivanje = 295 nm, emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25°C antitela od 20 nM protiv antigena (Fab oblika) u PBS, pH 7.2, u prisustvu povećanih koncentracija antigena izmerenih u spektrometru, kao što je spektrofotometar opremljen zaustavnim protokom (Aviv Instruments) ili 8000-series SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa mešanom kivetom.

[0061] "Brzina", "stopa udruživanja", "stopa pridruživanja" ili "kon"na"takođe se može odrediti kako je gore opisano pomoću BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 sistema (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).

[0062] "Izolovano" antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili se obnavlja iz komponente njegove prirodne sredine. Komponente zagađivača njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičke ili terapeutske primene za antitelo i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske supstance. U poželjnim otelotvorenjima, antitelo će biti prečišćeno (1) do više od 95% masenog procenta antitela, kako je određeno metodom Lovri, a najpoželjnije više od 99% po težini, (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminala ili interne aminokiselinske sekvence pomoću sekvencatora za spinovanje šalice ili (3) homogenosti pomoću SDS-PAGE u uslovima smanjenja ili ne-smanjivanja korišćenjem Komasi plave ili poželjno, srebrne mrlje. Izolovano antitelo obuhvata antitelo in situ u rekombinantnim ćelijama jer barem jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovano antitelo će se pripremiti najmanje jednim korakom prečišćavanja.

[0063] Reč "etiketa" kada se ovde upotrebljava odnosi se na detektabilno jedinjenje ili sastav koji je konjugovan direktno ili indirektno u molekul (kao što je nukleinska kiselina, polipeptid ili antitelo) tako da se generiše "označeni" molekul. Etiketa može biti detektovana sama po sebi (npr. etikete za radioizotop ili fluorescentne etikete) ili, u slučaju enzimske etikete, može katalizirati hemijsku promenu supstratnog jedinjenja ili sastava, što rezultira detektabilnim proizvodom.

[0064] Pod pojmom "čvrsta faza" podrazumeva se ne-vodena matrica u koju se može pridržavati molekula (poput nukleinske kiseline, polipeptida ili antitela). Primeri čvrste faze obuhvaćene ovde obuhvataju one formirane delimično ili u potpunosti od stakla (npr. kontrolno porozno staklo), polisaharidi (npr. agaroza), poliakrilamidi, polistiren, polivinil alkohol i silikoni. U određenim otelotvorenjima, u zavisnosti od konteksta, čvrsta faza može sadržati ploče sa otvorima za testiranje; u drugima to je prečišćavajuća kolona (npr. kolona afinitetne hromatografije). Ovaj pojam takođe uključuje diskontinuirajuću čvrstu fazu diskretnih čestica, kao što su one opisane u patentu SAD br.

4,275,149.

[0065] "Lipozom" je mala vezikula sastavljena od različitih tipova lipida, fosfolipida i/ili površinskog sredstva koji je koristan za isporuku leka (kao što je nukleinska kiselina, polipeptid, antitelo, agonist ili antagonist) sisaru. Komponente lipozoma obično su postavljene u dvoslojnoj formaciji, slično lipidnom rasporedu bioloških membrana.

[0066] "Mali molekul" ili "mali organski molekul" je ovde definisan kao organski molekul koji ima molekulsku težinu ispod oko 500 daltonova.

[0067] "Oligopeptid" koji se vezuje za ciljni polipeptid je oligopeptid koji je sposoban da vezuje ciljani polipeptid sa dovoljnim afinitetom tako da je oligopeptid koristan kao dijagnostički i/ili terapeutski agens u ciljanju na polipeptid. U određenim otelotvorenjima, stepen vezivanja oligopeptida na nepovezanog, ne-ciljnog polipeptida je manji od oko 10% vezivanja oligopeptida do ciljnog polipeptida, kao što je mereno, na primer, pomoću površinskog plazmonskog rezonantnog testa. U određenim otelotvorenjima, oligopeptid bendira ciljnom polipeptidu sa konstantom disociacije (Kd) od ≤ 1mM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM ili ≤ 0.1 nM.

[0068] "Organski molekul" koji se vezuje za ciljni polipeptid je organski molekul, različit od oligopeptida ili antitela kako je ovde definisano, koji je sposoban da vezuje ciljani polipeptid sa dovoljnim afinitetom tako da je organski molekul koristan kao dijagnostički i/ili terapeutski agens u ciljanju na polipeptid. U određenim otelotvorenjima, stepen vezivanja organskog molekula na nepovezanog, ne-ciljnog polipeptida je manji od oko 10% vezivanja organskog molekula sa ciljnim polipeptidom, kao što je mereno, na primer, pomoću površinskog plazmonskog rezonantnog testa. U određenim otelotvorenjima, organski molekul se vezuje za ciljni polipeptid sa konstantom disociacije (Kd) od ≤ 1mM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM ili ≤ 0.1 nM.

[0069] "Biološki sistem" je in vitro, ex vivo ili in vivo sistem koji sadrži ćelije sisara koji dele zajednički put signalizacije.

[0070] "Mikrobiološki poremećaj" odnosi se na bolest ili stanje u kojem mikrobiološki patogen uzrokuje, posreduje ili na drugi način doprinosi morbiditetu bolesti ili stanja. Takođe su obuhvaćene bolesti u kojima stimulacija ili intervencija antimikrobnog odgovora ima poboljšani efekat na progresiju bolesti. Uključeni u ovaj termin su zarazne bolesti ili uslovi, i oportunističke bolesti koje su rezultat primarne infekcije mikrobnim patogenom. Primeri takve zarazne bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na, dijareju prouzrokovanu EHEC i EPEC, inflamatornom bolesti creva (IBD) i, naročito, ulcerativni kolitis (UC) i Crohnova bolest (CD).

[0071] Termin "bolest posredovana ćelijama T" označava bolest u kojoj T ćelije direktno ili indirektno posreduju ili na neki drugi način doprinose morbiditetu kod sisara. Bolest posredovana ćelijama T može biti povezana sa efektima posredovanim ćelijama, efektima posredovanim limfokinom itd., I čak efekata povezanih sa B-ćelijama ako su B-ćelije stimulisane, na primer, od limfokina koje sekretuju T-ćelije.

[0072] "Autoimuni poremećaj" ili "autoimunitet" odnose se na bilo koji uslov u kojem je humoralni ili ćelijski posredovani imuni odgovor postavljen na sopstveno tkivo tela. "Autoimuni poremećaj posredovan sa IL-23" je bilo koji autoimuno poremećaj koji je izazvan, održava ili pogoršava aktivnost IL-23.

[0073] "Inflamacija" se odnosi na akumulaciju leukocita i dilataciju krvnih sudova na mestu povrede ili infekcije, obično izazivajući bol, oticanje i crvenilo.

[0074] "Hronična inflamacija" odnosi se na zapaljenje u kojem uzrok zapaljenja traje i teško ga je ili nemoguće ukloniti.

[0075] "Autoimuna inflamacija" odnosi se na zapaljenje povezano sa autoimunim poremećajem.

[0076] "Artritična inflamacija" se odnosi na zapaljenje povezano sa artritisom.

[0077] "Inflamatorna bolest creva" ili "IBD" odnosi se na hronični poremećaj koji se karakteriše zapaljenjem gastrointestinalnog trakta. IBD obuhvata ulcerozni kolitis, koji utiče na debelo crevo i/ili rektum i Crohnovu bolest, koja može uticati na ceo sistem gastrointestinalnog sistema, ali češće utiče na tanko crevo (ileum) i verovatno i debelo crevo.

[0078] Termin "efektivna količina" je koncentracija ili količina molekula (npr., nukleinske kiseline, polipeptida, agonista ili antagonista) što rezultira postizanjem određene namere. "Efektivna količina" može se odrediti empirijski. "Terapeutski efikasna količina" je koncentracija ili količina molekula koji je efikasan za postizanje navedenog terapeutskog efekta. Ova količina se takođe može odrediti empirijski.

[0079] Izraz "citotoksični agens" koji se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili izaziva uništenje ćelija. Izraz je namenjen uključivanju radioaktivnih izotopa (npr., I, I, Y i Re186), hemoterapeutski agensi i toksini kao što su enzimatski aktivni toksini bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porijekla ili njihovi fragmenti.

[0080] "Sredstvo za inhibiranje rasta", kada se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje ili sastav koji inhibira rast ćelije, posebno ćelije koja prekomerno ekspresira bilo koji od gena ili in vitro ili in vivo. Prema tome, sredstvo za inhibiranje rasta je ono koje značajno smanjuje procenat ćelija koja prekomerno eksprimira takve gene u fazi S. Primeri sredstava koja inhibiraju rast uključuju sredstva koja blokiraju progresiju ćelijskog ciklusa (na mestu koje nije S faza), kao što su agensi koji indukuju G1 sprečavanje i M-fazno sprečavanje. Klasični blokatori M faze uključuju vinkas (vinkristin i vinblastin), taksol i topo II inhibitore kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etopozid i bleomicin. Ovi agensi koji sprečavaju G1 takođe prelaze u sprečavanje S-faze, na primer, sredstva za alkiliranje DNK, kao što su tamoksifen, prednizon, dakarbazin, mekloretamine, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil i ara-C. Dodatne informacije možete pronaći u The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" by Murakami i dr. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), posebno str.13.

[0081] Termin "citokin" je generički izraz za proteine koji se izdaju od strane jedne ćelijske populacije koja deluje na drugu ćelijsku populaciju kao intercelularni medijatori. Primeri takvih citokina su limfokini, monokini i tradicionalni polipeptidni hormoni. Uključeni među citokine su hormon rasta, kao što su ljudski hormon rasta, N-metionil ljudski hormon rasta i hormon rasta goveda; paratiroidni hormon; tiroksin; insulin; proinsulin; relakin; prorelakin; glikoproteinski hormoni kao što je folikle stimulišućeg hormona (FSH), stimulativni hormon štitaste žlezde (TSH) i luteinizacijski hormon (LH); faktor rasta jetre; faktor rasta fibroblasta; prolaktin; placentalni laktogen; faktor tumorske nekroze-α i -β; limfotoksin-α i -β, supstanca koja inhibira muler; miš gonadotropin-pridruženi peptid; inhibin; aktivin; vaskularni endotelijalni faktor rasta; integrin; trombopoetin (TPO); faktori rasta nerva kao što su NGF-β; faktor rasta trombocita; transformišući faktore rasta (TGF) kao što su TGF-α i TGA-β; faktor rasta-I i –II nalik insulinu; eritropoetin (EPO); osteoinduktivni faktori; interferoni kao što su interferonα, -β, i -γ; faktori koji stimulišu kolonije (CSF) kao što je makrofag-CSF (M-CSF); granulocitmakrofag-CSF (GM-CSF); i granulocit-CSF (G-CSF); IL-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-IL-11, IL-12, IL-6, IL-17, IL-18, IL-22, 1L-23; faktor tumorske nekroze, kao što je TNF-α ili TNF-β; i druge polipeptidne faktore uključujući LIF i kit ligand (KL). Kao što je ovde korišćeno, termin citokin uključuje proteine iz prirodnih izvora ili iz rekombinantne ćelijske kulture i biološki aktivne ekvivalente citokina sa nativnom sekvencom.

[0082] Kao što je ovde korišćeno, termin "inflamatorne ćelije" označava ćelije koje poboljšavaju inflamatorni odgovor kao što su mononuklearne ćelije, eozinofili, makrofagi i polimorfonuklearni neutrofili (PMN).

II. Sastavi i metode

A. Antimikrobni polipeptidi (AMP) i njegovi modulatori

[0083] Antimikrobni polipeptidi (AMPs) su polipeptidi koji posreduju ili na drugi način efektuju antimikrobni imuno odgovor na mikrobiološki patogen. AMP uključuju, ali nisu ograničeni na, LT, IL-6, IL-22, IL-23 (uključujući npr. IL-23 p19 ili IL-23 p40), i Reg ili Reg-vezane proteine kodirane genomom Reg super porodica. Super super porodica obuhvata Reg i Reg-genove čoveka, pacova i miša i grupisane su u četiri podklase, tipovi I, II, III i IV. Na primer, tip I uključuje ljudsko REG Iα, ljudsko REG Iβ, pacov RegI, i miš RegI; tip II uključuje miš RegII-, tip III obuhvata humani REG III, čovek HIP/PAP (gen izražen u hepatocelularnom karcinome-creva-pankreasu/gen koji kodira pankreatitispridruženi protein), pacov PAP/Peptide23, pacov RegIII/PAPII, pacov PAP III, miš REGIII, REGIII, REGIII, miš RegIIIδ, i hrčak INGAP (otok vezan za neogenezu). Tip IV sadrži čoveka REG IV. Pored toga, ljudska regulaciona sekvenca (RS) je navodno pseudogen. U jednom primeru REG proteina je kodirana od strane člana genske REG gene porodice koja uključuje, ali bez ograničenja, REG Ia, REG Iβ, HIP/PAP, REG III, REG IV i Reg-vezana sekvenca (RS).

[0084] U nekim otelotvorenjima, aminokiselinska sekvenca AMP sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz sledeće grupe: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54 i SEQ ID NO: 56.

[0085] U drugim otelotvorenjima sekvenca nukleinske kiseline koja kodira AMP sadrži sekvencu nukleinske kiseline izabranu iz sledeće grupe: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: SEQ ID N0: 15, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53 i SEQ ID NO: 55.

[0086] Aktivnost AMP može se povećati ili smanjiti i/ili diferencijalno regulisati u odnosu na aktivnost drugog AMP-a ili istog AMP-a. Primeri aktivnosti AMP uključuju, ali se ne ograničavaju na, AMP izraz, transdukciju signala, vezivanje za vezujućeg partnera, antimikrobni odgovor ili drugu biološku ili imunološku aktivnost od njih.

[0087] Povećanje aktivnosti jednog ili više AMP-ova rezultira poboljšanim ili anti-mikrobnim indukovanim imunološkim odgovorom kod subjekta.

[0088] AMP uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide koji direktno ili indirektno interakciju sa IL-22, npr. Polipeptidi koji su uzvodno ili nizvodno od IL-22 puteva prenosa signala koji posreduju mikrobiološkom patogenu (npr. bakterije ili viruse). Primeri takvih AMP uključuju, ali nisu ograničeni na, LT, IL-6, IL-18 i IL-23 (uključujući npr. IL-23 p19 ili IL-23 p40).

[0089] Modulatori uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptide i molekule nukleinske kiseline (npr., Molekul DNK ili molekula RNK) koji direktno ili indirektno moduliraju aktivnost AMP-a. Primeri takve modulacije uključuju, ali nisu ograničeni na, povećanje, smanjenje, indukciju ili aktivaciju, inhibiciju ili regulaciju (npr. regulisanje gore ili dole) aktivnosti AMP-a.

[0090] U određenom otelotvorenju, modulator indirektno modulira aktivnost IL-22 smanjenjem ili inhibicijom aktivnosti vezivanja proteina IL-22 (BP) i time povećanjem aktivnosti IL-22. U daljem otelotvorenju modulator smanjuje ili inhibira vezivanje IL-22 BP na IL-22 i time povećava aktivnost IL-22.

[0091] Modulator može biti polipeptid, npr., polipeptid koji se vezuje ili na drugi način interaguje sa AMP-om kako bi povećao, indukovao ili regulirao aktivnost AMP-a. U jednom pristupu, modulator je fuzioni polipeptid koji modulira aktivnost AMP-a.

[0092] U jednom pristupu, modulator je antitelo koje se vezuje za AMP. U određenom pristupu, antitelo je monoklonsko antitelo. U drugom pristupu, antitelo je fragment antitela izabran iz Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ili (Fab')2 fragment. U drugom pristupu, antitelo je fuzioni polipeptid (npr. Fc fuzioni polipeptid). U drugom pristupu, antitelo je himerno antitelo. U određenom pristupu, antitelo je humanizirano. U još jednom otelotvorenju, antitelo je humano antitelo. U drugom pristupu, antitelo se vezuje za isti epitop kao antitelo odabrano od ljudskog primata ili drugih sisara (npr. svinje, ovaca, zeca, marmota, pacova ili miša).

[0093] Kod određenog pristupa, modulator je rekombinantni AMP ili molekul nukleinske kiseline koji kodira AMP (npr., molekul DNK ili RNK).

[0094] U jednom posebnom pristupu, modulator je rekombinantni AMP ili molekul nukleinske kiseline koji kodira AMP (npr. molekul DNK ili RNK) koji se može izraziti u ćeliji.

[0095] AMP obuhvata domaće AMP-ove sa punim dužinama ili zrele, kao i njihove varijante. Varijante AMP mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih promena nukleotida u DNK koja kodira AMP i/ili sintezom željenog antimikrobnog polipeptida. Stručnjaci u ovoj oblasti će ceniti da promene aminokiselina mogu promeniti post-translacijsku obradu polipeptida, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije ili promena karakteristika sidrenja membrane.

[0096] Varijacije u prirodnom AMP-u ili u različitim domenima AMP-a, kako je ovde opisano, mogu se napraviti, na primer, korišćenjem bilo koje tehnike i smernica za konzervativne i nekonzervativne mutacije navedene u, na primer, u patentu SAD br.5,364,934. Varijacije mogu biti zamena, brisanje ili ubacivanje jednog ili više kodona koji kodiraju AMP koji dovodi do promene u aminokiselinskoj sekvenci AMP-a u poređenju sa AMP-ovom prirodnom sekvencom. Opciono, varijacija je supstitucijom najmanje jedne aminokiseline sa bilo kojom drugom aminokiselinom u jednom ili više domena AMP-a. Uputstvo u određivanju koji aminokiselinski ostatak može biti ubačen, supstituisan ili izbrisan bez adekvatnog uticaja na željenu aktivnost može se naći s upoređivanjem serije AMP sa onom kod homolognih poznatih molekula proteina i minimiziranjem broja promena aminokiselinske sekvence napravljene u područjima visoke homologije. Zamene aminokiselina mogu biti rezultat zamene jedne aminokiseline sa drugom aminokiselinom koja ima slična strukturalna i/ili hemijska svojstva, kao što je zamena leucina sa serinom, tj. konzervativne zamene aminokiselina. Ubacivanje ili brisanje može opciono biti u opsegu od oko 1 do 5 aminokiselina. Dopuštena varijacija može se odrediti sistematskim pravljenjem umetanja, brisanja ili supstitucije aminokiselina u sekvenci i ispitivanjem rezultujućih varijanti za aktivnost koja se pokazuje u punoj dužini ili zrelom prirodnom nizu.

[0097] U konkretnim otelotvorenjima, konzervativne supstitucije od interesa su prikazane u Tabeli 3 pod naslovom poželjne supstitucija. Ukoliko takve zamene rezultiraju promenom biološke aktivnosti, onda se uvode i znatnije promene, naznačene primerne zamene u Tabeli 6 ili kao što je dalje opisano u daljem tekstu u odnosu na klase aminokiselina, a proizvodi pregledani.

Tabela 3

Originalni ostatak Primerne supstitucije Poželjne supstitucije

Ala (A) val; leu; ile val

Arg (R) lys; gln; asn lys

Asn (N) gln; his; lys; arg gln

Asp (D) glu glu

Cys (C) ser ser

Gln (Q) asn asn

Glu (E) asp asp

Gly (G) pro; ala ala

His (H) asn; gln; lys; arg arg

Ile (I) leu; val; met; ala; phe; norleucine leu

Leu (L) norleucine; ile; val; met; ala; phe ile

Lys (K) arg; gln; asn arg

Met (M) leu; phe; ile leu

Phe (F) leu; val; ile; ala; tyr leu

Pro (P) ala ala

Ser (S) thr thr

Thr (T) ser ser

Trp (W) tyr; phe tyr

Tyr (Y) trp; phe; thr; ser phe

Val (V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine leu

[0098] Modifikovanje supstancijalnosti u funkcionalnom ili imunološkom identitetu AMP polipeptida postiže se odabirom supstanci koje se značajno razlikuju u njihovom efektu na održavanje (a) strukture polipeptidnog magneta u oblasti supstitucije, na primer, u obliku lista ili spiralne konformacije, (b) punjenje ili hidrofobičnost molekula na ciljnoj lokaciji, ili (c) najveći deo bočnog lanca. Ostaci koji se prirodno pojavljuju podeljeni su u grupe na osnovu zajedničkih osobina bočnih lanaca:

(1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile;

(2) neutralni hidrofilni: cis, ser, thr;

(3) kiselina: asp, glu;

(4) osnovni: asn, glin, njegov, liz, arg;

(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gli, pro; i

(6) aromatični: trp, tir, phe.

[0099] Nekonzervativne zamene će podrazumevati razmenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu. Takvi zamenjeni ostaci takođe mogu biti uvedeni u konzervativne supstitucione lokacije ili, poželjnije, u preostala (ne konzervirane) mesta.

[0100] Varijacije mogu biti izvedene korišćenjem postupaka poznatih u stanju tehnike kao što su mutageneza posredovana sa oligonukleotidima, skeniranje alaninom i mutagena PCR. Mutageneza usmerena mestom [Carter i dr., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller i dr., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)], kasetna mutageneza [Vells i dr., Gene, 34: 315 (1985)], mutageneza selekcije restrikcija [Vells i dr., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)] ili druge poznate tehnike mogu se izvesti na kloniranoj DNK kako bi se proizvela DNK koja kodira varijantu AMP.

[0101] Ovde su takođe navedeni fragmenti AMP ili drugih polipeptida. Takvi fragmenti mogu biti skraćeni na N-terminusu ili C-terminusu, ili mu možda nedostaju unutrašnji ostaci, na primer, u poređenju sa prirodnim proteinom u punoj dužini. Određeni fragmenti nemaju aminokiselinske ostatke koji nisu esencijalni za željenu biološku aktivnost AMP-a ili polipeptida. Shodno tome, u određenim otelotvorenjima, fragment AMP ili drugog polipeptida je biološki aktivan. U određenim otelotvorenjima, fragmentu pune dužine AMP nedostaje N-terminal signalni peptidni niz. U određenim otelotvorenjima, fragment AMP pune dužine je rastvorljiv oblik membranskog AMP-a. Na primer, u rastvorljivom obliku AMP-a može nedostajati sve ili značajan deo transmembranskog domena.

[0102] Kovalentne modifikacije AMP-ova ili drugih polipeptida uključene su u okviru ovog pronalaska. Jedna vrsta kovalentne modifikacije uključuje reakciju ciljanih aminokiselinskih ostataka polipeptida sa organskim sredstvom za derivatizaciju koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili N-ili C-terminalnim ostacima polipeptida. Derivatizacija sa bifunkcionalnim agensima je korisna, na primer, za ukrštanje polipeptida na ne-rastvorljivu vodu matricu ili površinu za upotrebu u postupku za prečišćavanje antitela na polipeptid i obratno. Najčešće korišćena sredstva za ukrštanje uključuju npr.

1,1-bis(diazoacetil)-2-fenilethane, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimid estre, na primer, estri sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalni imidoestri, uključujući disukcinimidil estre kao što je 3,3 '-ditiobis(sukcinimidilpropionat), bifunkcionalni maleimidi kao što su bis-N-maleimido-1,8-oktan i agensi kao što je metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidat.

[0103] Druge modifikacije uključuju deamidaciju glutaminil i asparaginilnih ostataka u odgovarajuće glutamil i aspartilne ostatke, odnosno hidroksilaciju proline i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa seril ili treonil ostataka, metilovanje α-amino grupa lizina, arginina i histidinske strane lanci [T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)], acetilacija N-teninalnog amina i amidacija bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0104] Druga vrsta kovalentne modifikacije polipeptida obuhvata promenu matičnog modela glikozilacije polipeptida. "Promena matičnog glikozilacionog šablona" je namenjena za svrhe u ovom smislu značenje brisanja jednog ili više ugljenohidratnih delova pronađenih u prirodnoj sekvenci polipeptida (bilo uklanjanjem osnovnog glikozilacionog mesta ili brisanjem glikozilacije hemijskim i/ili enzimskim sredstvima), i/ili dodavanje jedne ili više mesta glikozilacije koji nisu prisutni u prirodnoj sekvenci polipeptida. Pored toga, fraza uključuje i kvalitativne promene u glikozilaciji prirodnih proteina, uključujući promenu prirode i proporcije prisutnih različitih delova ugljenih hidrata.

[0105] Polipeptid se takođe može modifikovati na način da se formiraju himerni molekuli koji sadrže polipeptid koji je spojen sa drugim, heterolognim polipeptidom ili aminokiselinskom sekvencom. U jednom otelotvorenju, himerni molekul obuhvata fuziju polipeptida sa polipeptidom oznake, koji daje epitop na koji se antitelo za anti-tag može selektivno vezati. Etiketa epitopa je uglavnom postavljena na amino- ili karboksil-terminus polipeptida. Prisustvo takvih epitopskih formi polipeptida može se detektovati koristeći antitelo protiv označenog polipeptida. Takođe, obezbeđivanje oznake epitopa omogućava AMP da se lako prečisti afinitetnim prečišćavanjem pomoću antitela protiv tagova ili druge vrste afinitetne matrice koja se vezuje za oznaku epitopa. Različiti polipeptidi tagova i njihova odgovarajuća antitela su dobro poznati u tehnici. Primeri uključuju poli-histidin (poli-he) ili polihistidin-glicin (poli-his-gli) oznake; polipeptid HA tag i njegov antitelo 12CA5 [Field i dr., Mol. Mobilni. Biol., 8, str. 2159-2165 (1988)]; c-mic tag i antitela 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10 na njih [Evan i sar., Molekularna i ćelijska biologija, 5: 3610-3616 (1985)]; i oznaka glikoproteina D (gD) Herpes Simplek virusa i njegovog antitela [Paborski i sar., Protein Engineering, 3 (6): 547-553 (1990)]. Ostali tag polipeptidi uključuju Flag-peptid [Hopp i dr., BioTechnologi, 6: 1204-1210 (1988)]; KT3 epitopni peptid [Martin i dr., Science, 255: 192-194 (1992)]; alfa-tubulinski epitop peptid [Skinner i dr., J. Biol. Chem., 266: 15163-15166 (1991)]; i T7 gene 10 protein peptid tag [Lutz-Freiermuth i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6393-6397 (1990)].

[0106] U još jednom otelotvorenju, himerni molekul može sadržati fuziju polipeptida sa imunoglobulinom ili određenim regionom imunoglobulina. Za bivalentni oblik himernog molekula (takođe nazvan "imunoadhesin") takva fuzija može biti u Fc regionu molekula IgG. Ig fuzije poželjno uključuju supstituciju rastvorljivog oblika polipeptida (na primer, AMP ili njegovog polipeptidnog modulatora) umesto najmanje jednog varijabilnog regiona unutar Ig molekule. U posebno poželjnom otelotvorenju, fuzija imunoglobulina obuhvata šarku, CH2 i CH3, ili šarke, CH1, CH2 i CH3 regione molekula IgG1. Za proizvodnju fuzija imunoglobulina pogledajte takođe patent SAD br.5,428,130 izdat 27. juna, 1995.

1. Priprema polipeptida

[0107] Polipeptidi koji se koriste u ovom pronalasku mogu se pripremiti rutinskim rekombinantnim postupcima, npr., ćelije kultivisanja transformisane ili transfektovane vektrom koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira AMP ili njegov modulator polipeptida. Takođe su obezbeđene ćelije domaćina koje sadrže bilo koji takav vektor. Kao primer, ćelije domaćina mogu biti CHO ćelije, E. coli, ili kvasca. Dalji postupak za proizvodnju bilo kog od ovde opisanih polipeptida je dat i obuhvata kultivisanje ćelija domaćina pod uslovima pogodnim za ekspresiju željenog polipeptida i rekuperaciju željenog polipeptida iz ćelijske kulture.

[0108] Alternativne metode, koje su dobro poznate u stanju tehnike, mogu se koristiti za pripremu polipeptida. Na primer, sekvenca koja kodira polipeptid ili njegov deo, može se proizvesti direktnom sintezom peptida koristeći tehnike čvrste faze [videti, na primer, Stewart i dr., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. In vitro sinteza proteina se može izvesti pomoću ručnih tehnika ili automatizacije. Automatizovana sinteza može se postići, na primer, koristeći primenjeni biosistemski peptidni sintetizator (Foster City, CA) koristeći uputstva proizvođača. Različiti delovi polipeptida ili njegovog dela mogu biti hemijski sintetisani odvojeno i kombinovani pomoću hemijskih ili enzimskih metoda za proizvodnju polipeptida u punoj dužini ili njenog dela.

[0109] Rekombinantno eksprimirani polipeptidi mogu se regenerisati iz medija kulture ili iz lizata ćelija domaćina. Sledeće procedure su primeri odgovarajućih postupaka prečišćavanja: frakcionisanjem na koloni za razmenu jona; precipitacija etanola; reverzna faza HPLC; hromatografija na silicijum dioksidu ili na katijonski izmenjivoj smoli kao što je DEAE; hromatofokusiranje; SDS-PAGE; precipitacija amonijum sulfata; gelska filtracija koristeći, na primer, Sephadex G-75; proteini A Sepharoza kolone za uklanjanje zagađivača kao što je IgG; i metalcelirajuće kolone za vezivanje epitopno označenih oblika polipeptida. Mogu se koristiti različiti postupci prečišćavanja proteina i takve metode su poznate u struci i opisane su na primer u Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). Postupci prečišćavanja biće zavisni, na primer, od prirode proizvodnog procesa koji se koristi i određenog polipeptida. LT polipeptidi mogu biti prečišćeni izražavanjem označenog LT polipeptida kao što je, na primer, LTα-označeni polipeptid (SEQ ID NO: 61).

2. Detekcija ekspresije gena

[0110] Izražavanje gena koji kodira polipeptid može se detektovati različitim metodama u struci, npr. detektovanjem ekspresije mRNK koja kodira polipeptid. Kao što se ovde koristi, termin "detektovanje" obuhvata kvantitativno ili kvalitativno detektovanje. Detektovanjem ekspresije gena polipeptida, može se identifikovati, na primer, ona tkiva koja izražavaju ovaj gen. Izražavanje gena se može izmeriti korišćenjem određenih metoda poznatih stručnjacima, npr. Northem blotting, (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 [1980]); kvantitativni PCR; ili in situ hibridizaciju, koristeći odgovarajuću oznaku sonde, zasnovanu na sekvencama koje su ovde navedene. Alternativno, ekspresija gena može se meriti imunološkim metodama, kao što su imunohistohemijska obojenost tkiva i ispitivanje ćelijske kulture ili telesnih tečnosti, da se direktno kvantituje ekspresija genskog proizvoda. Antitela korisna za imunohistohemijsko bojenje i/ili ispitivanje uzoraka tečnosti obuhvataju bilo koje od antitela koja su ovde navedena. Pogodno, antitela mogu biti pripremljena protiv izvorne sekvence koja kodira npr. AMP protiv sintetičkog peptida koji sadrži fragment AMP sekvence; ili protiv egzogene sekvence spojene sa AMP polipeptidom ili njegovim fragmentom (uključujući sintetički peptid).

B. Antitela

[0111] Opisana su antitela koja se vezuju za bilo koji od gorenavedenih ili ispod opisanih polipeptida. U jednom aspektu, izolovano antitelo koje se vezuje za AMP i na taj način moduliše AMP aktivnost, npr. povećava aktivnost AMP-a. Primerna antitela uključuju poliklonalna, monoklonalna, humanizovana, ljudska, bispecifična i heterokonjugatna antitela. Antitelo može biti fragment antitela, npr. Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ili (Fab')2 fragment. U jednom otelotvorenju se koristi izolovano antitelo koje se vezuje za IL-22.

[0112] Primerna monoklonska antitela koja se vezuju za AMP su ovde opisana. Ova antitela uključuju antitela protiv IL-22 naznačenih 3F11.3 ("3F11"), 11H4.4 ("11H4") i 8E11.9 ("8E11") i anti-IL-22R antitela označena kao 7E9. 10.8 ("7E9"), 8A12.32 ("8A12"), 8H11.32.28 ("8H11") i 12H5, takođe monoklonska antitela koja se takmiče sa 3F11.3, 11H4.4 ili 8E11.9 za vezivanje za IL -22, monoklonska antitela koja se vezuju za isti epitop kao 3F11.3, 11H4.4 ili 8E11.9, monoklonska antitela koja se takmiče sa 7E9, 8A12, 8H11 ili 12H5 za vezivanje za IL-22R i monoklonska antitela koja vezuju na isti epitop kao 7E9, 8A12, 8H11 ili 12H5. Razna otelotvorenja antitela su data u nastavku:

1. Poliklonalna antitela

[0113] Antitela mogu obuhvatati poliklonska antitela. Metode pripreme poliklonskih antitela su poznate stručnjacima. Poliklonska antitela mogu se podići kod sisara, na primer, jednom ili više injekcija imunizujućeg sredstva i, ako je poželjno, adjuvansa. Tipično, imuno agens i/ili adjuvans će biti injektirani kod sisara višestrukim subkutanim ili intraperitonealnim injekcijama. Sredstvo za imunizaciju može obuhvatiti polipeptid od interesa ili njegov fuzioni protein. Može biti korisno da konjuguje imunizioni agens sa proteinom za koji se zna da je imunogen kod sisara koji je imuniziran. Primeri takvih imunogenih proteina uključuju, ali se ne ograničavaju na, hemocijanin, serumski albumin, goveđi tiroglobulin i inhibitor sojinog tripsina. Primeri adjuvansa koji mogu biti korišćeni uključuju Freundov kompletni adjuvans i MPL-TDM adjuvans (monofosforil lipid A, sintetički dihoronikolat trehaloze). Protokol za imunizaciju može izabrati stručnjak u struci bez nepotrebnog eksperimentisanja.

2. Monoklonalna antitela

[0114] Antitela mogu alternativno biti monoklonska antitela. Monoklonska antitela mogu biti pripremljena korišćenjem metoda hibridoma, kao što su one opisane od strane Kohler i Milstein, Nature, 256: 495 (1975). U postupku hibridoma, miš, hrčak ili druga odgovarajuća životinjska vrsta, obično se imunizuje imunizacionim sredstvom za izazivanje limfocita koji proizvode ili su sposobni da proizvodu antitela koja će se specifično vezati za imunizujući agens. Alternativno, limfociti mogu biti imunizirani in vitro.

[0115] Sredstvo za imunizaciju tipično sadrži polipeptid koji je od interesa ili njegov fuzioni protein. Uopšteno se koriste limfociti periferne krvi ("PBLs") ako se žele ćelije ljudskog porekla, ili se koriste ćelije slezine ili ćelije limfnih čvorova ako su poželjni izvori izvan čoveka. Limfociti se zatim spajaju sa imortalizovanom ćelijskom linijom koristeći pogodan fuzioni agens, kao što je polietilen glikol, da bi se formirala hibridoma ćelija [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103]. Imortalizovane ćelijske linije obično se transformišu sisarskim ćelijama, posebno ćelijama mijeloma glodara, goveđeg i ljudskog porekla. Obično se primenjuju ćelijske linije miševa pacova ili čoveka. Hibridoma ćelije mogu biti kultivisane u odgovarajućem medijumu za kulturu, koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje neutvrđenih, besmrtnih ćelija. Na primer, ako roditeljske ćelije nemaju enzim hipoksantin gvaninfosforibozil transferaze (HGPRT ili HPRT), medijum kulture za hibridom tipično će uključivati hipoksantin, aminopterin i timidin ("HAT medijum"), koji supstance sprečavaju rast HGPRT-deficijentne ćelije.

[0116] Poželjne emocionalizovane ćelijske linije su one koje efikasno rastvaraju, podržavaju stabilnu visoku ekspresiju antitela kod izabranih ćelija za proizvodnju antitela i osetljive su na medijum kao što je HAT medijum. Više poželjne besmrtonosne ćelijske linije su linije mišića mieloma, koje se mogu dobiti, na primer, iz Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Ćelijske linije humanog mijeloma i miševa i ljudske heteromijeloma takođe su opisane za proizvodnju ljudskih monoklonskih antitela [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur i dr., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63].

[0117] Kulturni medijum u kome su ćelije hibridoma kultivisane, onda se može analizirati za prisustvo monoklonskih antitela koja se vezuju za polipeptid koji je od interesa. Poželjno, vezivna specifičnost monoklonskih antitela proizvedenih od ćelija hibridoma se određuje imunoprecipitacijom ili pomoću in vitro vezujućeg testa, kao što je radioimuni test (RIA) ili test enzima imunoabsorbent (ELISA). Takve tehnike i analize su poznate u struci. Vezni afinitet monoklonskih antitela može, na primer, biti određen od strane Scatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

[0118] Nakon što se identifikuju željene ćelije hibridoma, klonovi mogu biti subklonirani ograničavajućim procedurama za razblaženje i gajene standardnim metodama [Goding, supra].

Odgovarajući medijumi za kulturu u ovu svrhu uključuju, na primer, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium and RPMI-1640 medijum. Alternativno, ćelije hibridoma mogu se uzgajati in vivo kao ascitesi kod sisara.

[0119] Monoklonska antitela koja se izlučuju podklonima mogu se izolovati ili prečistiti iz medijuma za kulturu ili tečnosti ascitesa putem konvencionalnih postupaka prečišćavanja imunoglobulina, kao što su, na primer, protein A-Sepharose, hromatografija hidroksilapatita, elektroforeza gela, dijaliza ili afinitetna hromatografija.

[0120] Monoklonska antitela se mogu napraviti korišćenjem kombinatornih biblioteka da bi se antitela prikazala sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Na primer, u stanju tehnike su poznate različite metode za generisanje biblioteka faga prikaza i skeniranje takvih biblioteka za antitela koja poseduju -željene karakteristike vezivanja. Takve metode su generalno opisane u Hoogenboom i dr. (2001) in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien i dr., ed., Human Press, Totowa, NJ), and in certain embodiments, in Lee i dr. (2004) J. Mol. Biol.340:1073-1093.

[0121] U principu, klonovi sintetičkih antitela se biraju skriningom faga bibliotekama koje sadrže fag koje prikazuju različite fragmente varijabilnog regiona antitela (Fv) spojenog sa proteinom fagovog premaza. Takve fage biblioteke paniraju pomoću afinitetne hromatografije protiv željenog antigena. Klonovi koji eksprimiraju fragmente Fv koji se mogu vezati za željeni antigen se adsorbuju na antigen i time se odvoje od neobavezujućih klonova u biblioteci. Vezujući klonovi se zatim eluiraju iz antigena i mogu se dodatno obogatiti dodatnim ciklusima adsorpcije/elucije antigena. Bilo koje od antitela se može dobiti tako što se projektuje odgovarajuća procedura za selekcioniranje antigena za odabir za klon fage klonova praćene izgradnjom klona antitela celog dijela koristeći Fv sekvence iz fagovog klona interesa i odgovarajućih sekvenci konstantnog regiona (Fc) u Kabat i dr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols.1-3.

[0122] Monoklonska antitela mogu takođe biti izvedena metodama rekombinantne DNK, kao što su one opisane u patentu SAD br. 4,816,567. DNK koja kodira monoklonska antitela može se lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih procedura (npr. pomoću oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance mišijih antitela). Ćelije hibridoma služe kao poželjni izvor takve DNK. Jednom izolovana, DNK se može staviti u vektore ekspresije, koji se onda transfektiraju u ćelije domaćina kao što su simian COS ćelije, ćelije kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, kako bi se dobila sinteza monoklonalnih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćina. DNK se takođe može modifikovati, na primer, zamenom kodirajuće sekvence za konstantne domene humanog teškog i lakog lanca umesto homolognih murinskih sekvenci [patent SAD br. 4,816,567; Morrison i dr., supra] ili kovalentno spajanje na sekvencu kodiranja imunoglobulina cele ili dela kodirajuće sekvence za neimunoglobulinski polipeptid. Takav ne-imunoglobulinski polipeptid može biti supstituisan za konstantne domene antitela ili može biti zamenjen varijabilnim domenima jednog antigenkombinacionog mesta antitela da bi se stvorilo himerno bivalentno antitelo.

3. Monovalentna antitela

[0123] Takođe su obezbeđena monovalentna antitela. Postupci za pripremu monovalentnih antitela su dobro poznata u stanju tehnike. Na primer, jedan metod uključuje rekombinantnu ekspresiju lakog lanca imunoglobulina i modifikovanog teškog lanca. Teški lanac je uglavnom skraćen u bilo kojoj tački u regionu Fc, kako bi se sprečilo ubacivanje teškog lanca. Alternativno, relevantni ostaci cisteina su supstituisani sa drugim aminokiselinskim ostacima ili su izbrisani kako bi se sprečilo ukrštanje.

[0124] In vitro metode su takođe pogodne za pripremu monovalentnih antitela. Digestiranje antitela za proizvodnju njihovih fragmenata, naročito Fab fragmenata, može se postići korišćenjem rutinskih tehnika poznatih u ovoj oblasti.

4. Fragmenti antitela

[0125] Takođe su obezbeđeni fragmenti antitela. Frakcije antitela mogu se generisati tradicionalnim sredstvima, kao što je enzimska digestija ili rekombinantne tehnike. U određenim okolnostima postoje prednosti korišćenja fragmenata antitela, a ne celih antitela. Manja veličina fragmenata omogućava brže čišćenje i može dovesti do poboljšanog pristupa čvrstim tumorima. Za pregled određenih fragmenata antitela, pogledajte Hudson i dr. (2003) Nat. Med.9:129-134.

[0126] Razvijene su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti su izvedeni putem proteolitičke digestije intaktnih antitela (videti, na primer, Morimoto i dr., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); and Brennan i dr., Science, 229:81 (1985)). Međutim, ovi fragmenti se sada mogu direktno proizvesti rekombinantnim ćelijama domaćina. Fab, Fv i ScFv fragmenti antitela mogu se svi izraziti i izlučiti od E. coli, omogućavajući tako laku proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. Fragmenti antitela mogu biti izolovani iz biblioteka faga antitela o kojima se govori gore. Alternativno, Fab'-SH fragmenti mogu se direktno dobiti od E. coli i hemijski spojeni tako da formiraju F(ab')2fragmente (Carter i dr., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Prema drugom pristupu, F (ab ')2fragmenti se mogu izolovati direktno iz rekombinantne ćelijske ćelije domaćina. Fab i F(ab')2fragmenti sa povišenim polu-život in vivo koji sadrži ostatke vezivnog receptora za receptore spasavanja opisane su u patentu SAD br. 5,869,046. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledne stručnom stručnjaku. U određenim otelotvorenjima, antitelo je fragment Fv sa jednim lancem (scFv). Videti WO 93/16185; patenti SAD br.5,571,894; i 5,587,458. Fv i scFv su jedine vrste sa netaknutim kombinacionim mestima koja su lišena konstantnih regiona; prema tome, mogu biti pogodni za smanjenje nespecifičnog vezivanja tokom in vivo upotrebe. scFv fuzioni proteini mogu biti konstruisani da bi se dobila fuzija efektorskog proteina na bilo koji amino ili karboksi terminusu skFv. Videti Antibody Engineering, ed. Borrebaeck, supra. Fragment antitela takođe može biti "linearno antitelo", npr., kako je opisano u patentu SAD br. 5,641,870, na primer. Takva linearna antitela mogu biti monospecifična ili bispecifična.

5. Humanizirana antitela

[0127] Takođe su obezbeđena humanizovana antitela. Različite metode za humaniziranje ne-humanih antitela poznate su u stanju tehnike. Na primer, humanizovano antitelo može imati jedan ili više aminokiselinskih ostataka koji se unose u njega iz izvora koji nije čovek. Ovi ne-humani ostaci aminokiselina se često nazivaju "uvoznim" ostacima, koji se obično uzimaju iz "uvoznog" varijabilnog domena. Humanizacija se u suštini može izvršiti po metodi Winter and co-workers (Jones i dr. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann i dr. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen i dr. (1988) Science 239:1534-1536), zamenjujući sekvence hipervarijabilnog regiona za odgovarajuće sekvence humanog antitela. Prema tome, takva "humanizovana" antitela su himerna antitela (patent SAD br.4,816,567) gde je značajno manje od intaktnog humanog varijabilnog domena zamenjen odgovarajućom sekvencom iz ne-ljudske vrste. U praksi, humanizovana antitela su uglavnom humana antitela u kojima su neki ostaci hipervarijalnog regiona i eventualno neki ostaci FR ostali supstrati sa analognih mesta u antitelima glodara.

[0128] Izbor ljudskih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji se koriste za izradu humanizovanih antitela, mogu biti važni za smanjenje antigeničnosti. Prema tzv. "Best-fit" metodi, sekvenca varijabilnog domena antitela za glodare se pregledana prema celoj biblioteci poznatih ljudskih sekvenci varijabilnog domena. Ljudska sekvenca koja je najbliža onoj kod glodara je onda prihvaćena kao ljudski okvir za humanizovano antitelo (Sims i dr. (1993) J. Immunol.151:2296; Chothia i dr. (1987) J. Mol. Biol. 196:901. Druga metoda koristi određeni okvir koji proizilazi iz konsenzusne sekvence svih ljudskih antitela određene podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti okvir se može koristiti za nekoliko različitih humanizovanih antitela (Carter i dr. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta i dr. (1993) J. Immunol., 151:2623.

[0129] Dalje je poželjno da se antitela humanizuju zadržavanjem visokog afiniteta za antigen i druga povoljna biološka svojstva. Da bi se postigao ovaj cilj, prema jednoj metodi, humanizovana antitela se pripremaju procesom analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda koristeći trodimenzionalne modele roditeljskih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni imunoglobulin modeli su često dostupni i poznati su stručnjacima u ovoj oblasti. Na raspolaganju su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacijske strukture odabranih kandidatskih imunoglobulinskih sekvenci. Pregled ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidatske imunoglobulinske sekvence, tj., analiza ostataka koji utiču na sposobnost kandidatskog imunoglobulina da se veže svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu biti odabrani i kombinovani kod primaoca i uvoznih sekvenci tako da se postigne željena karakteristika antitela, kao što je povećan afinitet za ciljani antigen(e). Generalno, ostaci hipervarijabilnog regiona su direktno i najosetljivije uključeni u uticaj na vezivanje antigena.

6. Ljudska antitela

[0130] Takođe su obezbeđena ljudska antitela. Ljudska antitela se mogu konstruisati kombinovanjem Fv klonova varijabilnih domena izabranih iz biblioteka s prikazanim ljudima sa poznatim ljudskim sekvencama konstantnog domena, kao što je gore opisano. Alternativno, humana monoklonska antitela mogu se napraviti metodom hibridoma. Ljudski mijelom i ćelijske linije miš-humanog heteromijeloma za proizvodnju ljudskih monoklonskih antitela opisani su, na primer, od strane Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur i dr., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.

51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner i dr., J. Immunol., 147: 86 (1991).

[0131] Sada je moguće proizvesti transgenske životinje (npr. miševe) koje su sposobne, nakon imunizacije, da proizvedu pun repertoar ljudskih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Na primer, opisano je da homozigotna brisanja gena za vezivanje regiona teškog lanca (JH) antitela u himernim mišićima i mutiranim mišićima dovodi do potpune inhibicije proizvodnje endogenih antitela. Prenos humane linije klica imunoglobulinskih gena u takvim mutantnim miševima bi rezultirao stvaranjem ljudskih antitela nakon izazivanja antigena. Vidite, na primer, Jakobovits i dr., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits i dr., Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann i dr., Year in Immunol., 7: 33 (1993).

[0132] Menjajući gen takođe se može koristiti za iznošenje humanih antitela od ne-ljudskih, npr. glodara, antitela, gde ljudsko antitelo ima slične afinitete i specifičnosti do početnog ne-humanog antitela. Prema ovom postupku, koji se takođe naziva "imprintovanje epitopa", ili varijabilni region teškog ili lakog lanca nehumanog fragmenta antitela koji je dobijen tehnikom fagnog prikaza kao što je ovde opisano zamenjen je repertoarom humanih gena domena V, stvarajući populacija ličnog/humanog lanca scFv ili Fab hibroma ličnog čoveka. Izbor sa antigenom rezultira izolovanjem ličnog lanca/ljudskog lanca himernog scFv ili Faba, pri čemu ljudski lanac obnavlja mesto vezivanja antigena uništeno nakon uklanjanja odgovarajućeg neljudskog lanca u klonu primarnog faga, tj. Epitop reguliše (otiske) izbora partnera u lancu lanca. Kada se proces ponovi kako bi se zamenio preostali nehumani lanac, dobijeno je ljudsko antitelo (videti PCT WO 93/06213 objavljen 1. Aprila 1993). Za razliku od tradicionalne humanizacije antitela bez čoveka pomoću CDR graftinga, ova tehnika obezbeđuje potpuna ljudska antitela, koja nemaju FR ili CDR ostatke nehumanog porekla.

7. Bispecifična antitela

[0133] Takođe su obezbeđena bispecifična antitela. Bispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita antigena. U određenim aspektima, bispecifična antitela su ljudska ili humanizovana antitela. U određenim otelotvorenjima jedna od vezivnih specifičnosti je za polipeptid koji je od interesa, a drugi za bilo koji drugi antigen. U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu se vezati za dva različita epitopa polipeptida od interesa. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za lokalizaciju citotoksičnih sredstava za ćelije koje eksprimiraju polipeptid koji je od interesa, takav polipeptid površine ćelije. Ova antitela poseduju TAT226 vezujuću ruku i ruku koja vezuje citotoksični agens, kao što su npr. Saporin, anti-interferon-α, vinca alkaloid, ricin A lanac, metotreksat ili radioaktivni izotop hapten. Bispecifična antitela mogu se pripremiti kao antitela u punoj dužini ili fragmenti antitela (npr. F(ab')2 bispecifična antitela).

[0134] Metode za izradu bispecifičnih antitela poznate su u stanju tehnike. Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela zasnovana je na koekspresiji dva para imunoglobulina teških lanaca u lakom lancu, gde dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Milstein and Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Zbog slučajnog asortimana teških i lakih lanaca imunoglobulina, ovi hibridomi (kvadromi) proizvode potencijalnu mešavinu od 10 različitih molekula antitela, od kojih samo jedna ima tačnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje tačnog molekula, koji se obično vrši pomoću afinitetnih hromatografskih koraka, prilično je teško i prinos proizvoda je nizak. Slične procedure su objavljene u WO 93/08829 objavljene 13. maja, 1993, a u Traunecker i dr., EMBO J., 10: 3655 (1991).

[0135] Prema drugačijem pristupu, varijabilni domeni antitela sa željenim vezivnim specifičnostima (mesta za kombinovanje antitela i antigena) su spojeni sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina. Fuzija, na primer, je sa konstantnim domenom težeg lanca imunoglobulina, koja sadrži bar deo šarke, CH2 i CH3 regiona. U nekim otelotvorenjima, prvi konstantni region težeg lanca (CH1), koji sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca, prisutan je u najmanje jednoj od fuzija. DNK koji kodiraju fuzije teških lanaca imunoglobulina i, ako je poželjno, laki lanac imunoglobulina, ubacuju se u odvojene vektore ekspresije i kotransfektiraju u odgovarajući organizam domaćina. Ovo obezbeđuje veliku fleksibilnost u prilagođavanju uzajamne proporcije tri polipeptidna fragmenta u izvođenjima kada nejednaki odnosi tri lanca polipeptida koji se koriste u konstrukciji pružaju optimalne prinose. Međutim, moguće je ubaciti kodirajuće sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jednom ekspresionom vektoru, kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima rezultira visokim prinosima ili kada su odnosi bez posebnog značaja.

[0136] U jednom aspektu ovog pristupa, bispecifična antitela sastoje se od hibridnog imunoglobulinog teškog lanca sa prvom vezivnom specifičnošću u jednoj ruci i parom težeg lanca teških lanaca teških lanaca hibridnog imunoglobulina (koji obezbeđuje drugu vezivnu specifičnost) u drugoj ruci. Utvrđeno je da ova asimetrična struktura olakšava odvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija imunoglobulinskih lanaca, pošto prisustvo lakog lanca imunoglobulina u samo jednoj polovini bispecifičnog molekula omogućava lakši način odvajanja. Ovaj pristup je objavljen u WO 94/04690. Za dalje detalje o stvaranju bispecifičnih antitela, videti, na primer, Suresh i dr., Methods in Enzimologi, 121:210 (1986).

[0137] Prema drugom pristupu, interfejs između par molekula antitela može se konstruisati da maksimizira procenat heterodimera koji se regenerišu iz rekombinantne ćelijske kulture. Interfejs sadrži bar jedan deo CH3 domen konstantnog domena antitela. U ovom postupku jedan ili više malih aminokiselinskih bočnih lanaca iz interfejsa prvog molekula antitela zamenjuju se većim bočnim lancima (na primer. tirozin ili triptofan). Kompenzirajuće "šupljine" identične ili slične veličine velikog bočnog lanca (s) stvorene su na interfejsu drugog molekula antitela zamenom velikih lanaca aminokiselina sa manjim (na primer. alanin ili treonin). Ovo obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na druge neželjene krajnje proizvode kao što su homodimeri.

[0138] Bispecifična antitela uključuju unakrsna ili "heterokonjugatna" antitela. Na primer, jedno od antitela u heterokonjugatu može se spojiti sa avidinom, a drugo sa biotinom. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju ćelije imunog sistema na neželjene ćelije (US Patent No.4,676,980), i za lečenje HIV infekcije (WO 91/00360, WO 92/00373, i EP 03089). Heterokonjugatna antitela mogu se napraviti koristeći bilo koji pogodan način unakrsne veze. Pogodni agensi za povezivanje su dobro poznati u struci i opisani su u US Patent No.4,676,980, zajedno sa brojnim tehnikama unakrsne veze.

[0139] Tehnike generisanja bispecifičnih antitela iz fragmenata antitela takođe su opisane u literaturi. Na primer, bispecifična antitela mogu biti pripremljena korišćenjem hemijske veze. Brennan et al, Science, 229:81 (1985) opisuje proceduru u kojoj se netaknuta antitela proteolitički odvajaju da generišu F(ab')2fragmenti. Ovi fragmenti su smanjeni u prisustvu natrijum arzenita agensa za kombinovanje ditiola, koji stabilizuje vicinalne ditiole i sprečava nastanak intermolekularnih disulfida. Generisani fragmenti Fab-a pretvaraju se u derivate tionitrobenzoata (TNB). Jedan od Fab'-TNB derivata se zatim pretvara u Fab'-tiol redukcijom sa merkaptoetilaminom i pomeša se sa ekvimolarnom količinom drugog Fab'-TNB derivata da bi se formiralo bispecifično antitelo. Bispecifična antitela proizvedena mogu se koristiti kao sredstva za selektivnu imobilizaciju enzima.

[0140] Nedavni napredak omogućio je direktan oporavak fragmenata Fab'-SH E. coli, koji se mogu hemijski spajati u obliku bispecifičnih antitela. Shalabi i sar., J. Ekp. Med.175: 217-225 (1992) opisuju proizvodnju potpuno humaniziranog bispecifičnog antitela F (ab ')2 molekula. Svaki fragment Faba je zasebno sekretirao E. coli i podvrgnuti usmerenom hemijskom spajanju in vitro da bi se formiralo bispecifično antitelo. Tako formirano bispecifično antitelo moglo se vezati za ćelije koje prekomerno eksprimiraju HER2 receptor i normalne humanih T ćelija, kao i pokretanje liticke aktivnosti humanih citotoksičnih limfocita protiv ciljanih tumora na grudima.

[0141] Takođe su opisane razne tehnike za izradu i izolaciju fragmenata bispecifičnih antitela direktno iz rekombinantne ćelijske kulture. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena korišćenjem leucinskih otvarača. Kostelny i dr.,J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Leucinski otvarači peptida iz proteina Fos i Jun su povezani sa delima Fab-a dva različita antitela fuzijom gena. Antitelo homodimcrsa je redukovano u predelu šarke kako bi se formirali monomeri i zatim ponovo oksidovane da bi se formiralo heterodimeri antitela. Ovaj metod se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. "Diabodi" tehnologiju opisuje Hollinger i dr., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 90:6444-6448 (1993) obezbedio je alternativni mehanizam za izradu fragmenata bispecifičnih antitela. Fragmenti sadrže varijabilni domen težeg lanca (VH) povezan sa varijabilnom domenom laka lanca (VL) pomoću linkera koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu. Shodno tome, VH i VL domeni jednog fragmenta prisiljavaju se upariti sa komplementarnim VL i VH domenima drugog fragmenta, čime se formiraju dva mesta za vezivanje antigena. Prijavljena je još jedna strategija za izradu bispecificnih fragmenata antitela korišćenjem jednolančnih Fv (sFv) dimera. Videti Gruber i dr., J. Immunol., 152:5368 (1994).

[0142] Antitela sa više od dve valence su razmatrane. Na primer, mogu se pripremiti trispecifična antitela. Tutt i dr. J. Immunol.147:60 (1991).

8. Multivalentna antitela

[0143] Takođe su obezbeđena i multivalentna antitela. Multivalentno antitelo može biti internalizovano (i/ili katabolizovano) brže od bivalentnog antitela ćelijom koja eksprimira antigen na kome se antitela vezuju. Antitela mogu biti multivalentna antitela (koja su različita od IgM klase) sa tri ili više mesta za vezivanje antigena (npr. tetravalentna antitela), koja se lako mogu dobiti rekombinantnom ekspresijom nukleinske kiseline koja kodira polipeptidne lance antitela. Multivalentno antitelo može da sadrži domen za dimerizaciju i tri ili više mesta za vezivanje antigena. U određenim otelotvorenjima, domen dimerizacije sadrži (ili se sastoji od) Fc regiona ili područja zgloba. U ovom slučaju, antitelo će sadržati Fc region i tri ili više antigen-vezujućih amino-terminala u regionu Fc. U određenim otelotvorenjima, multivalentno antitelo sadrži (ili sadrži) tri do oko osam antigen-vezujućih mesta. U jednom takvom otelotvorenju, multivalentno antitelo sadrži (ili sadrži) četiri mesta vezivanja antigena. Multivalentno antitelo sadrži najmanje jedan polipeptidni lanac (na primer, dva polipeptidna lanca), pri čemu polipeptidni lanci sadrže dva ili više varijabilnih domena. Na primer, polipeptidni lanac (i) može sadržati VD1- (X1) n -VD2- (X2) n -Fc, pri čemu je VD1 prvi varijabilni domen, VD2 je drugi varijabilni domen, Fc je jedan polipeptidni lanac Fc region, X1 i X2 predstavljaju aminokiselinu ili polipeptid, a n je 0 ili 1. Na primer, polipeptidni lanac može sadržati: VH-CH1-fleksibilan linker-VH-CH1-Fc lanac regiona; ili VH-CH1-VH-CH1-Fc lanac regiona. Multivalentno antitelo ovde može dalje obuhvatati najmanje dva (na primer, četiri) polipeptida varijabilnog domena lakog lanca. Multivalentno antitelo ovde, na primer, može sadržati od oko dva do oko osam polipeptida varijabilnog domena lakog lanca. Polipeptidi varijabilnog domena lakog lanca koji su ovde obuhvaćeni sadrže varijabilni domen lakog lanca i, opciono, dodatno obuhvataju CL domen.

9. Jednodomenska antitela

[0144] Takođe su obezbeđena antitela u jednom domenu. Jednodomensko antitelo je pojedinačni polipeptidni lanac koji sadrži sve ili deo varijabilnog domena teškog lanca ili sve ili deo varijabilnog domena laka lanca antitela. U određenim otelotvorenjima, jednodomensko antitelo je ljudsko jednodomensko antitelo (Domantis, Inc., Waltham, MA; videti, npr., patent SAD br.6,248,516 B1). U jednom aspektu, jednodomensko antitelo se sastoji od svih ili dela varijabilnog domena težeg lanca antitela.

10. Varijante antitela

[0145] U nekim otelotvorenjima su razmatrane modifikacije (i) aminokiselinske sekvence antitela opisanih ovde. Na primer, može biti poželjno poboljšati afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante antitela aminokiselinske sekvence antitela mogu se pripremiti uvođenjem odgovarajućih promena u nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo ili sintezom peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, brisanje iz i/ili umetanje u/i supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija brisanja, ubacivanja i supstitucije može se napraviti da dođe do konačnog konstrukta, pod uslovom da konačni konstrukt poseduje željene karakteristike. Aminokiselinske alteracije mogu biti uvedene u aminokiselinskoj sekvenci predmetnog antitela u trenutku kada se pravi sekvenca.

[0146] Koristan metod za identifikaciju određenih ostataka ili regiona antitela koji su poželjne lokacije za mutagenezu naziva se "mutageneza skeniranja alanina", kako je opisano u Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Ovde se identifikuje ostatak ili grupa ciljanih ostataka (npr., nabrojani ostaci kao što su arg, asp, his, lis i glu) i zamenjeni neutralnom ili negativno naelektrisanom amino kiselinom (npr., alaninom ili polialanom) da utiču na interakciju aminokiselina sa antigenom. Lokacije tih aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije zatim se prečišćavaju uvođenjem dodatnih ili drugih varijanti na ili za mesta supstitucije. Tako, iako je mesto za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence unapred određeno, priroda mutacije po sebi ne moraju biti unapred određeni. Na primer, da bi analizirali performanse mutacije na datoj lokaciji, ala skeniranje ili slučajna mutageneza se sprovodi na ciljnom kodonu ili regionu, a ekspresovani imunoglobulini se prikazuju za željenu aktivnost.

[0147] Uključenja aminokiselinske sekvence uključuju aminokiseline i/ili karboksil-terminalne fuzije dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrascvencija uvoda pojedinačnih ili višestrukih aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih umetaka uključuju antitelo sa N-terminalnim metionilnim ostatkom. Druge uvodne varijante molekula antitela uključuju fuziju na N- ili C-terminusu antitela u enzim (na primer. za ADEPT) ili polipeptid koji povećava poluživot seruma antitela.

[0148] U određenim otelotvorenjima, antitelo se menja da bi povećalo ili smanjilo stepen do kog je antitelo glikozilirano. Glikozilacija polipeptida je tipično N-vezana ili O-povezana. N-vezni odnosi se na vezivanje ugljovodonične grupe na bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenih hidrata u asparaginskom bočnom lancu. Tako prisustvo bilo koje od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-povezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-aceilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze u hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, iako se može koristiti 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0149] Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije u antitelu se pogodno vrši promenom aminokiselinske sekvence tako da se stvara ili ukloni jedna ili više gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-povezane glikozilatne lokacije). Promena se takođe može izvršiti dodavanjem, uklanjanjem ili supstitucijom jednog ili više ostataka serina ili treonina u sekvenci prvobitnog antitela (za O-vezane glikozilatne lokacije).

[0150] Kada antitelo obuhvata Fc region, ugljeni hidrat koji je povezan sa njim može se izmeniti. Na primer, antitela sa zrelom ugljovodoničnom strukturom koja nema fukozu vezanu za Fc region antitela opisana je u patentnoj prijavi SAD br. 2003/0157108 (Presta, L.). Takođe videti US 2004/0093621 (Kiova Hakko Kogio Co, Ltd). Antitela sa bisekcionim N-acetilglukozaminom (GlcNAc) u ugljenim hidratima vezanim za Fc region antitela navedeni su u WO 2003/011878, Jean-Mairet i dr. i patentu SAD br. 6,602,684, Umana i dr. Antitela sa najmanje jednim ostankom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region antitela su obelodanjeni u WO 1997/30087, Patel i dr. Takođe videti, WO 1998/58964 (Raju, S.) i WO 1999/22764 (Raju, S.) koja se odnosi na antitela sa izmenjenim ugljenim hidratima vezanim za njegov region Fc. Takođe videti US 2005/0123546 (Umana i dr.) za molekule koji vezuju antigen sa modifikovanim glikozilacijom.

[0151] U određenim otelotvorenjima, varijanta glikozilacije sadrži Fc region, pri čemu ugljovodonična struktura vezana za region Fc nema fukozu. Takve varijante su poboljšale ADCC funkciju. Opciono, Fc region dalje sadrži jednu ili više supstitucija aminokiselina u njima koja dalje poboljšavaju ADCC, na primer, zamene na pozicijama 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (Eu numerisanje ostataka). Primeri publikacija koji se odnose na "defukozilovane" ili "fukozna-defektna" antitela uključuju: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/01 10282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; Okazaki i dr. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et at. Biotech. Bioeng 87: 614 (2004). Primeri ćelijskih linija koji proizvode defukozilovana antitela uključuju Lec13 CHO ćelije deficirane u fukosilaciju proteina (Ripka i dr. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; and WO 2004/056312 A1, Adams i dr., posebno Primer 11), i nokaut ćelijske linije, kao što je gena alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (Yamane-Ohnuki i dr. Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)).

[0152] Druga vrsta tipova je varijanta supstitucije aminokiselina. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u molekulu antitela zamenjen različitim ostatkom. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione, ali takođe su zamišljene i FR izmene. Konzervativne supstitucije su prikazane u tabeli 3 iznad pod naslovom "poželjne supstitucije". Ukoliko takve zamene rezultiraju poželjnom promenom biološke aktivnosti, onda se mogu uvesti značajnije promene, naznačene "prmerne supstitucije" u tabeli 3 ili kao što je dalje opisano u vezi sa klasama aminokiselina, a rezultujuća antitela prikazana za željeno vezivanje propozicije.

[0153] Jedna vrsta supstitucionih varijanti podrazumeva zamenu jednog ili više hipervarijabilnih regiona ostataka roditeljskog antitela (npr. humanizovano ili ljudsko antitelo). Generalno, rezultujuća varijanta (i) odabrana za dalji razvoj će imati modifikovane (npr., poboljšane) biološke osobine u odnosu na roditeljsko antitelo iz kojeg se generišu. Pogodan način za stvaranje takvih supstitucionih varijanti podrazumeva sazrevanje afiniteta koristeći fag prikaz. Ukratko, nekoliko lokacija hipervarijabilnih regiona (na primer. 6-7 lokacija) mutiraju da generišu sve moguće zamene amino kiselina na svakoj lokaciji. Tako nastala antitela prikazana su kod filamentoznih faga čestica kao fuzije do najmanje jednog dela proteina fagovog premaza (npr., proizvod gena III M13) pakiranog unutar svake čestice. Fageprikazane varijante se zatim prikazuju za njihovu biološku aktivnost (npr. vezujući afinitet). Da bi se identifikovale lokacije hipervarijabilnog regiona za modifikaciju, skeniranje mutageneze (npr. skeniranje alaninom) može biti izvedeno da se identifikuju ostaci hipervarijabilnog regiona koji znatno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno da analizira kristalnu strukturu kompleksa antigena-antitela da bi identifikovale kontaktne tačke između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju u skladu sa tehnikama poznatim u stanju tehnike, uključujući i one koji su ovde razrađeni. Kada se takve varijante generišu, panel varijanti je podvrgnut skriningu korišćenjem tehnika poznatih u stanju tehnike, uključujući i one opisane ovde, a antitela sa superiornim osobinama u jednom ili više relevantnih testova mogu biti izabrana za dalji razvoj.

[0154] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante antitela aminokiselinske sekvence pripremljeni su raznim metodama poznatim u struci. Ove metode uključuju, ali nisu ograničene na, izolaciju iz prirodnog izvora (u slučaju prirodnih varijanti aminokiselinskih varijanti) ili pripreme putem mutageneze posredovane oligonukleotidom (ili usmerenom na mesto), mutagenezu PCR i kasetnom mutagenezom ranije pripremljene varijante ili ne-varijantne verzija antitela.

[0155] Može biti poželjno uvesti jednu ili više modifikacija aminokiselina u Fc regionu antitela čime se generiše varijanta Fc regiona. Varijanta Fc regiona može sadržati humanu sekvencu regiona Fc (na primer., humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koji sadrži modifikaciju aminokiselina (na primer. supstituciju) u jednoj ili više pozicija aminokiselina, uključujući i tečnost cisteina.

[0156] U skladu sa ovim opisom i učenjima iz stanja tehnike, predviđeno je da u nekim otelotvornjima antitelo može sadržati jednu ili više izmena u poređenju sa antitelom antitela protiv divljih vrsta, npr. u regionu Fc. Ova antitela bi ipak zadržala u suštini iste karakteristike koje su potrebne za terapijsku primenu u poređenju sa njihovim kolegama divljeg tipa. Na primer, smatra se da se u Fc regiji mogu izvršiti određene izmene koje bi mogle dovesti do promene (tj., bilo poboljšano ili umanjeno) C1q vezivanje i/ili citotoksičnost zavisno od komplementa (CDC), na primer, kao što je opisano u WO99/51642. Takođe videti Duncan & Vinter Nature 322: 738-40 (1988); patent SAD br.5,648,260; patent SAD br. 5,624,821; i WO94/29351 u vezi sa drugim primerima varijanti Fc regiona. WO00/42072 (Presta) i WO 2004/056312 (Lowman) opisuju varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem na FcR. Takođe videti, Shields i dr. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Antitela sa povišenim polu-životom i poboljšanim vezivanjem za Fc receptor neonatalnog porekla (FcRn), koji je odgovoran za prenošenje majčinih IgG na fetus (Guyer i dr., J. Immunol.117:587 (1976) and Kim i dr., J. Immunol.24:249 (1994)), su opisani u US2005/0014934A1 (Hinton i dr.). Ova antitela sadrže Fc region sa jednim ili više supstitucija u njima koji poboljšavaju vezivanje Fc regiona na FcRn. Polipeptidne varijante sa promenjenim aminokiselinskim sekvencama Fc regiona i povećanom ili smanjenom sposobnošću vezivanja C1q su opisane u patent SAD br. 6,194,551B1, WO99/51642. Takođe videti, Idusogie i dr. J. Immunol.164: 4178-4184 (2000).

[0157] U jednom otelotvorenju, pronalazak koristi antitela koja sadrže modifikacije u interfejsu Fc polipeptida koji sadrže region Fc, pri čemu modifikacije olakšavaju i/ili promovišu heterodimerizaciju. Ove modifikacije obuhvataju uvođenje protuberancije u prvi Fe polipeptid i šupljinu u drugi Fc polipeptid, pri čemu se izbočina može pozicionirati u šupljini tako da se promoviše kompleksiranje prvog i drugog Fc polipeptida. Metode generisanja antitela sa ovim modifikacijama su poznate u struci, npr., kako je opisano u patentu SAD br.5,731,168.

11. Derivati antitela

[0158] Antitela se mogu dalje modifikovati kako bi sadržale dodatne neproteinske čestice koje su poznate u struci i lako dostupne. Poželjno, delovi pogodni za derivatizaciju antitela su polimeri koji su rastvorljivi u vodi. Neograničavajući primeri polimera koji su rastvorljivi u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol (PEG), kopolimere etilen glikola/propilen glikola, karboksimetilceluloze, dekstrane, polivinil alkohole, polivinil pirolidona, poli-1, 3-dioksolana, 1,3,6-trioksan, kopolimer etilen/maleinskog anhidrid, poliaminokiseline (ili homopolimeri ili nasumični kopolimeri) i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon)polietilen glikol, homopolimeri propropilen glikola, kopolimeri prolipropilen oksida/etilen oksida, polioksietilirani polioli (npr. glicerol), polivinil alkohol i njihove smeše. Polietilenglikol propionaldehid može imati prednosti u proizvodnji zbog svoje stabilnosti u vodi. Polimer može biti od bilo koje molekulske težine, i može biti razgranat ili nerabljen. Broj polimera vezanih za antitelo može se razlikovati, a ako su vezani više polimera, mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili vrsta polimera koji se koriste za derivatizaciju mogu se odrediti na osnovu razmatranja uključujući, ali ne ograničavajući se na određena svojstva ili funkcije antitela koje treba poboljšati, da li se derivat antitela koristi u terapiji pod definisanim uslovima itd.

[0159] U još jednom otelotvorenju, obezbeđuju se konjugati antitela i neproteinskog dela koji se može selektivno zagrevati izloženost zračenja. U jednom aspektu, neproteinski deo je ugljenična nano-cev (Kam i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. 102: 11600-11605 (2005)). Radijacija može biti od bilo koje talasne dužine i uključuje, ali nije ograničena na, talasne dužine koje ne štete običnim ćelijama, ali koje zagrevaju neproteinsku grupu do temperature na kojoj se ubijaju ćelije proksimalne za antiteloneproteinski deo.

[0160] U određenim otelotvorenjima, antitelo može biti označeno i/ili može biti imobilisano na čvrstoj podlozi.

12. Heterokonjugatna antitela

[0161] Heterokonjugatna antitela su takođe obezbeđena. Heterokonjugatna antitela sastoje se od dva kovalentno spojena antitela. Takva antitela su, na primer, predložena da ciljaju ćelije imunog sistema na neželjene ćelije [patent SAD br. 4,676,980], i za lečenje HIV infekcije [WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]. Smatra se da se antitela mogu pripremiti in vitro korišćenjem poznatih metoda u hemijskoj proteinskoj sintezi, uključujući one koji uključuju sredstva za ukrštanje. Na primer, imunotoksini se mogu konstruisati koristeći reakciju disulfidne razmene ili formiranjem tioeterske veze. Primeri pogodnih reagensa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat i oni koji su otkriveni, na primer, u patent SAD br.4,676,980.

13. Efektorski funkcionalni inženjering

[0162] Može biti poželjno da se modifikuje antitelo u odnosu na efektorsku funkciju, kako bi se poboljšala, npr., efikasnost antitela u lečenju mikrobiološkog poremećaja. Na primer, ostatak (i) cisteina može biti uveden u region Fc, čime se omogućava formiranje međuproizvoda disulfidnih veza u ovom regionu. Homodimerna antitela sa poboljšanom anti-antimikrobnom aktivnošću mogu se takođe pripremati koristeći heterobifunkcionalne unakrsne linkere. Alternativno, antitelo može biti projektovano tako da ima dva Fc regiona i na taj način može imati poboljšanu aktivnost.

14. Vektori, ćelije domaćina i rekombinantne metode

[0163] Za rekombinantnu proizvodnju antitela, kod jednog pristupa nukleinska kiselina koja je kodira je izolovana i ubačena u replicirani vektor za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju.

DNK koja kodira antitelo se lako izoluje i sekvencira korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., koristeći oligonukleotidne sonde koje su sposobne da se specifično vezuju za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Mnogi vektori su dostupni. Izbor vektora delimično zavisi od ćelije domaćina koji se koristi. Generalno, ćelije domaćina imaju ili prokariotski ili eukariotički (uglavnom sisarsko) poreklo. Biće prihvaćeno da se u ovu svrhu mogu koristiti konstantni regioni bilo kog izotopa, uključujući IgG, IgM, IgA, IgD i IgE konstantne regione, te da se takvi konstantni regioni mogu dobiti od bilo koje ljudske ili životinjske vrste.

a) Generisanje antitela pomoću prokariotskih ćelija domaćina:

(1) Vector Construction

[0164] Polinukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptidne komponente antitela mogu se dobiti primenom standardnih rekombinantnih tehnika. Željene polinukleotidne sekvence mogu biti izolovane i sekvencirane od strane ćelija koje proizvode ćelije, kao što su ćelije hibridoma. Alternativno, polinukleotidi se mogu sintetisati koristeći sintetizator nukleotida ili PCR tehnike. Jednom dobijene, sekvence koje kodiraju polipeptide ubacuju se u rekombinantni vektor sposoban za replikaciju i ekspresiju heterolognih polinukleotida kod prokariotskih domaćina. Mnogi vektori koji su dostupni i poznati u struci mogu se koristiti u svrhe ovog pronalaska. Odabir odgovarajućeg vektora će zavisiti uglavnom od veličine nukleinskih kiselina koje treba ubaciti u vektor i određenu ćeliju domaćina koja se transformiše sa vektorom. Svaki vektor sadrži razne komponente, u zavisnosti od njegove funkcije (pojačavanje ili ekspresija heterolognog polinukleotida ili oboje) i njegovu kompatibilnost sa određenom ćelijom domaćina u kojoj boravi. Vektorske komponente uglavnom uključuju, ali se ne ograničavaju na: poreklo replikacije, gen markere selekcije, promoter, mesto vezivanja ribosoma (RBS), signalnu sekvencu, heterologni insert nukleinske kiseline i sekvencu završetka transkripcije.

[0165] Uopšte, plazmidni vektori koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koji su izvedeni iz vrsta kompatibilni sa ćelijom domaćina mogu se koristiti u vezi sa tim domaćinima. Vektor obično nosi mesto replikacije, kao i obeležavanje sekvenci koje su sposobne da obezbede fenotipsku selekciju u transformisanim ćelijama. Na primer, E. coli se tipično transformiše koristeći pBR322, plazmid izveden iz vrste E. coli. pBR322 sadrži gene koje kodiraju ampicilin (Amp) i tetraciklin (Tet) otpornost i time obezbeđuju lako sredstvo za identifikaciju transformisanih ćelija. pBR322, njegovi derivati ili drugi mikrobiološki plazmidi ili bakteriofag može takođe sadržati ili biti modifikovati da sadrže promotere koji mikrobni organizam može koristiti za ekspresiju endogenih proteina. Primeri pBR322 derivata koji se koriste za ekspresiju određenih antitela su detaljno opisani u Carter i dr., patent SAD br.5,648,237.

[0166] Pored toga, fag vektori koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koje su kompatibilne sa mikroorganizmom domaćina mogu se koristiti kao transformatorski vektori u vezi sa tim domaćinima. Na primer, bakteriofaga kao što je λGEM.TM.-11 može biti korišćena u pravljenju rekombinantnog vektora koji se može koristiti za transformaciju osetljivih ćelija domaćina kao što je E. coli LE392.

[0167] Vektor ekspresije može sadržati dva ili više promoter-cistronskih parova, koji kodiraju svaku od polipeptidnih komponenti. Promoter je neprevedena regulatorna sekvenca koja se nalazi uzvodno (5') do cistrona koji modulira svoj izraz. Prokariotski promoteri obično spadaju u dve klase, inducibilne i konstitutivne. Inducibilni promoter je promoter koji inicira povećane nivoe transkripcije cistrona pod njenom kontrolom u odgovoru na promene stanja kulture, npr. prisustvo ili odsustvo hranjivih materija ili promena temperature.

[0168] Veliki broj promotera prepoznatih od strane raznih potencijalnih ćelija domaćina su dobro poznati. Odabrani promoter može se operativno povezati sa cistron DNK koja kodira laki ili teški lanac uklanjanjem promotera iz izvorne DNK putem digestije restrikcionog enzima i umetanjem izolovanog promoterskog sekvenca u vektor. I izvorna prirodna promotorska sekvenca i mnogi heterologni promoteri mogu se koristiti za usmeravanje amplifikacije i/ili ekspresije ciljnih gena. U nekim otelotvorenjima koriste se heterologni promoteri, jer oni uglavnom omogućavaju veću transkripciju i veće prinose izraženog ciljnog gena u poređenju sa prirodnim promoterom ciljnog polipeptida.

[0169] Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariontskim domaćinima uključuju PhoA promoter, βgalaktamazu i sisteme promotora laktoze, promotorski sistem triptofana (trp) i hibridni promoteri kao što su tac ili trc promoter. Međutim, pogodni su i drugi promoteri koji su funkcionalni u bakterijama (kao što su drugi poznati bakterijski ili fagovodi). Njihove nukleotidne sekvence su objavljene, čime se omogućava kvalifikovanom radniku da operativno ligira na cistrone koji kodiraju ciljne lake i teške lance (Sicbenlist i dr. (1980) Cell 20: 269) koristeći linkere ili adaptere za snabdevanje bilo kojim potrebnim mestima restrikcije.

[0170] U jednom pristupu, svaki cistron u rekombinantnom vektoru sadrži komponentu sekrecijskog signala koji usmerava translokaciju izratenih polipeptida preko membrane. Generalno, signalna sekvenca može biti komponenta vektora, ili može biti deo ciljne polipeptidne DNK koja je ubačena u vektor. Signalna sekvenca izabrana za potrebe ovog pronalaska treba da bude ona koja je prepoznata i obrađena (tj. odsečena signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćine koje ne prepoznaju i procesiraju signalne sekvence izvorne heterolognim polipeptidima, signalna sekvenca se supstituiše sa izabranom prokariotskom signalnom sekvencom, na primer, iz grupe koja se sastoji od alkalne fosfataze, penicilinaze, Ipp ili toplotno- stabilni enterotoksin II (STII) lideri, LamB, PhoE, PelB, OmpA i MBP. U jednom pristupu, signalne sekvence koje se koriste u oba cistrona sistema ekspresije su STII signalne sekvence ili njihove varijante.

[0171] U drugom pristupu, proizvodnja imunoglobulina može se javiti u citoplazmi ćelije domaćina, te stoga ne zahteva prisustvo sekvencijalnih signalnih sekvenci unutar svakog cistrona. U tom smislu, imunoglobulinski laki i teški lanci su izraženi, savijeni i sastavljeni u obliku funkcionalnih imunoglobulina unutar citoplazme. Određeni sojevi domaćina (npr., E. coli trxB- sojevi) obezbeđuju uslove citoplazme koji su povoljni za formiranje disulfidnih veza, čime se omogućava pravilno sklapanje i sklapanje ekspresionih proteinskih podjedinica. Proba and Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

[0172] Antitela takođe mogu biti proizvedena korišćenjem sistema ekspresije u kojem se kvantitativni odnos izraženih polipeptidnih komponenti može modulisati kako bi se maksimizirao prinos izlučenih i pravilno sastavljenih antitela. Takva modulacija se postiže barem delom istovremeno modulacijom jačine translacije za polipeptidne komponente.

[0173] Jedna tehnika za modulaciju translacijske jačine je prikazana u Simmons i dr., patent SAD br.

5,840,523. Koristi varijante translacionog inicijacionog regiona (TIR) unutar cistrona. Za datu TIR mogu se kreirati serije varijanti aminokiseline ili nukleinske kiseline sa nizom translacionih jačina, čime se dobijaju pogodna sredstva pomoću kojih se ovaj faktor prilagođava željenom nivou ekspresije specifičnog lanca. Varijante TIR mogu se generisati konvencionalnim tehnikama mutageneze koje rezultiraju promenama kodona koje mogu da promene aminokiselinsku sekvencu. U određenim otelotvorenjima promene u nukleotidnoj sekvenci nemaju. Promene u TIR-u mogu uključivati, na primer, izmene u broju ili razmaku Shine-Dalgarno sekvenci, zajedno s promenama u signalnoj sekvenci. Jedna od metoda za generisanje sekvenci mutantnih signala je generisanje "kodonske banke" na početku kodirajuće sekvence koja ne menja aminokiselinsku sekvencu signalne sekvence (tj. promene su nečujne). Ovo se može postići promenom treće nukleotidne pozicije svakog kodona; Dodatno, neke aminokiseline, kao što su leucin, serin i arginin, imaju višestruke prve i druge pozicije koje mogu dodati složenost u pravljenju banke. Ova metoda mutageneze je detaljno opisana u Yansura i dr. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol.4:151-158.

[0174] U jednom aspektu, skup vektora generiše se s opsegom TIR snage za svaki cistron u njemu. Ovaj limitirani skup obezbeđuje poređenje nivoa ekspresije svakog lanca, kao i prinos željenih proizvoda antitela pod različitim kombinacijama čvrstoće TIR. Snage TIR se mogu odrediti kvantifikovanjem nivoa ekspresije reporter gena, kao što je detaljno opisano u Simmons i dr. patent SAD br.5, 840,523. Na osnovu jačine poređenja, odabrani željeni pojedinačni TIR su izabrani da se kombinuju u konstrukcijama ekspresionog vektora.

[0175] Prokariotske ćelije domaćina pogodne za izražavanje antitela uključuju Archacbacteria i Eubacteria, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi. Primeri korisnih bakterija uključuju Escherichia (npr. E. coli), Bacilli (npr. B. subtilis), Enterobacteria, Pseudomonas species (npr. P. aeruginosa), Salmonella tiphimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitroscilla, ili Paracokus. U jednom otelotvorenju koriste se gram-negativne ćelije. U jednom otelotvorenju, ćelije E. coli se koriste kao domaćini. Primeri sojeva E. coli uključuju soj V3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biologi, vol. 2 (Vashington, D.C.: Američko društvo za mikrobiologiju, 1987), str. 1190-1219; ATCC Deposit No. 27,325) i njihovi derivati, uključujući soj 33D3 koji imaju genotip V3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Ik IacL8 ΔompTΔ (nmpc-fepE) degP41 kanR (U.S. Pat. No. 5,639,635). Takođe su pogodni i drugi sojevi i njihovi derivati, kao što su E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coliel 1776 (ATCC 31,537) i E. coli RV308 (ATCC 31,608). Ovi primeri su ilustrativni a ne ograničavajući. Postupci za konstrukciju derivata bilo koje od gore pomenutih bakterija sa definisanim genotipovima su poznati u stanju tehnike i opisani su, na primer, Bass i dr., Proteins, 8: 309-314 (1990). Općenito je neophodno odabrati odgovarajuće bakterije uzimajući u obzir repliciranje replikona u ćelijama bakterije. Na primer, vrste E. coli, Serratia ili Salmonella mogu se pogodno koristiti kao domaćini kada se za snabdevanje replikona koriste poznati plazmidi kao što su pBR322, pBR325, pACIC177 ili pKN410. Tipično, ćelija domaćina treba da izdvoji minimalne količine proteolitičkih enzima, a dodatni proteazni inhibitori mogu poželjno biti inkorporirani u ćelijsku kulturu.

(2) Proizvodnja antitela

[0176] Ćelije domaćina se transformišu sa gore opisanim ekspresionim vektorima i kultivišu u konvencionalnom hranljivom medijumu, modifikovanom kako je odgovarajuće za induciranje promotera, selekciju transformanta ili amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence.

[0177] Transformacija znači uvođenje DNK u prokariotskog domaćina tako da se DNK može replicirati, bilo kao ekstrahromozomski element ili hromozomski integrant. U zavisnosti od korišćene ćelije domaćina, transformacija se vrši pomoću standardnih tehnika pogodnih za takve ćelije. Obrada kalcijuma koji koristi kalcijum hlorid se generalno koristi za bakterijske ćelije koje sadrže značajne barijere na ćelijskim zidovima. Još jedan metod za transformaciju koristi polietilen glikol/DMSO. Još jedna tehnika koja se koristi je elektroporacija.

[0178] Prokariotske ćelije koje se koriste za proizvodnju polipeptida uzgajaju se u medijima poznatim u struci i pogodni za kulturu izabranih ćelija domaćina. Primeri pogodnih medija uključuju juriju luria (LB) plus neophodne dodatke hranjivim supstancama. U nekim otelotvorenjima, medijum takođe sadrži sredstvo za selekciju, izabrano na osnovu konstrukcije ekspresionog vektora, da selektivno dozvoljava rast prokariotskih ćelija koje sadrže ekspresioni vektor. Na primer, ampicilin se dodaje medijumu za rast ćelija koji ekspresiraju geni otporni na ampicilin.

[0179] Svaki neophodni dodatak pored izvora ugljenika, azota i neorganskih fosfata može takođe biti uključen u odgovarajuće koncentracije uvedene same ili kao mešavina sa drugim dodatkom ili sredstvom kao što je složeni izvor azota. Opciono, medijum za kulturu može sadržati jedno ili više redukcionih sredstava izabranih iz grupe koja se sastoji od glutationa, cisteina, cistamina, tioglikolata, dioioeritritola i ditiotreitola.

[0180] Prokariotske ćelije domaćina se kultivišu na odgovarajućim temperaturama. U određenim otelotvorenjima, za rast E. coli, temperature rasta se kreću od oko 20°C do oko 39°C; od oko 25°C do oko 37°C; ili oko 30°C. PH medijuma može biti bilo koji pH u rasponu od oko 5 do oko 9, zavisno uglavnom od organizma domaćina. U određenim otelotvorenjima, za E. coli, pH je od oko 6.8 do oko 7.4 ili oko 7.0.

[0181] Ako se inducibilni promoter koristi u ekspresionom vektoru, ekspresija je indukovana pod uslovima pogodnim za aktivaciju promotera. U jednom pristupu, PhoA promoteri se koriste za kontrolu transkripcije polipeptida. Shodno tome, transformisane ćelije domaćina se kultivišu u fosfatograničavajućem medijumu za indukciju. U određenim izvođenjima, sredstvo za ograničavanje fosfata je C.R.A.P. srednje (vidi, npr., Simmons i dr., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Moguće je koristiti različite druge induktore, prema upotrebljenom vekturnom konstruktu, kako je poznato u tehnici.

[0182] U jednom pristupu, ekspresijski polipeptidi se sekretiraju i oporavljaju iz periplazma ćelija domaćina. Oporavak proteina obično podrazumeva poremećaj mikroorganizma, generalno sa sredstvima kao što su osmotski šok, ultrazvuk ili liza. Kada se ćelije poremete, ćelijski ostaci ili celije ćelije mogu biti uklonjeni centrifugiranjem ili filtriranjem. Proteini se mogu dalje prečišćavati, na primer, pomoću afinitetne smole hromatografije. Alternativno, proteini se mogu transportovati u kulturu i izolovati u njima. Ćelije se mogu ukloniti iz kulture i supernatant kulture se filtrira i koncentriše radi dalje prečišćavanja proizvedenih proteina. Izraženi polipeptidi mogu se dodatno izolovati i identifikovati koristeći najčešće poznate metode kao što su poliakrilamidna gel elektroforeza (PAGE) i Western blot analiza.

[0183] U jednom pristupu, proizvodnja antitela se vrši u velikoj količini fermentacionim postupkom. Za proizvodnju rekombinantnih proteina dostupne su različite procedure fermentacije fed-batch fermentacije. Velike fermentacije imaju najmanje 1000 litara kapaciteta, au određenim otelotvorenjima, oko 1.000 do 100.000 litara kapaciteta. Ovi fermentatori koriste radne kola za distribuciju kiseonika i hranljivih sastojaka, posebno glukoze (poželjni izvor ugljenika/energije). Fermentacija male skale se generalno odnosi na fermentaciju u fermentoru koja ne sadrži više od približno 100 litara u volumetrijskom kapacitetu i može se kretati od oko 1 litra do oko 100 litara.

[0184] U procesu fermentacije indukcija ekspresije proteina se obično započinje nakon što su ćelije uzgajane pod odgovarajućim uslovima do željene gustine, npr. OD550 od oko 180-220, u kojoj fazi ćelije su u ranoj stacionarnoj fazi. Moguće je koristiti različite induktore, prema upotrebljenom vekturnom konstruktu, kako je poznato u struci i opisano gore. Ćelije se mogu uzgajati za kraće periode pre indukcije. Ćelije se obično indukuju oko 12-50 sati, iako se može koristiti duže ili kraće vreme indukcije.

[0185] Za poboljšanje prinosa proizvodnje i kvaliteta polipeptida, različiti uslovi fermentacije mogu se modifikovati. Na primer, radi poboljšanja pravilnog sklapanja i preklapanja sekreciranih polipeptida antitela, dodatni vektori koji nadražuju proteine haperona, kao što su Dsb proteini (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD i DsbG) ili FkpA (peptidilprolil cis, trans-izomeraza sa haperonom aktivnost) može se koristiti za ko-transformaciju prokariotskih ćelija domaćina. Prikazani su proteini haperona da olakšaju pravilno preklapanje i rastvorljivost heterolognih proteina proizvedenih u bakterijskim ćelijama domaćina. Chen i dr. (1999) J. Biol. Chem.274:19601-19605; Georgiou i dr., U.S. Patent No.6,083,715; Georgiou i dr., U.S. Patent No. 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000). J. Biol. Chem.275:17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem.275:17106-17113; Arie i dr. (2001) Mol. Microbiol.39:199-210.

[0186] Da bi se minimizirala proteoliza izraženih heterolognih proteina (naročito onih koji su proteolitički osetljivi), mogu se koristiti određeni sastojci sojeva defektni za proteolitičke enzime. Na primer, sojevi ćelija domaćina mogu se modificirati kako bi se uticala genetska mutacija u genom koji kodira poznate bakterijske proteaze kao što su Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI i njihove kombinacije. Neki sildi-proteini sa E. coli su dostupni i opisani u, na primer, Joly i dr. (1998), supra; Georgiou i dr., U.S. Patent No.5,264,365; Georgiou i dr., U.S. Patent No.5,508,192; Hara i dr., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

[0187] U jednom pristupu E. coli sojevi koji su defektni za proteolitičke enzime i transformirani sa plazmidima koji prekomerno izražavaju jedan ili više proteina haperona koriste se kao ćelije domaćina u sistemu ekspresije.

(3) Pročišćavanje antitela

[0188] U jednom pristupu antitelo proizvedeno ovde dalje se prečišćava kako bi se dobijali preparati koji su suštinski homogeni za dalje testove i upotrebu. Standardne metode prečišćavanja proteina poznate u struci mogu se koristiti. Sledeće procedure su primeri odgovarajućih procedura prečišćavanja: frakcionisanje na imunoafinitet ili kolone za razmenu jona, precipitacija etanola, HPLC sa reverznom fazom, hromatografija na silika ili na katjonski izmenjivoj smoli kao što je DEAE, hromatofokusiranje, SDS-PAGE, precipitacija amonijum sulfata, i gel filtraciju koristeći, na primer, Sephadek G-75.

[0189] U jednom pristupu, Protein A koji se imobilizuje na čvrstu fazu koristi se za imunoafinitetno prečišćavanje proizvoda antitela. Protein A je 41kD ćelijski zidni protein Staphylococcus aureas koji se vezuje sa visokim afinitetom na Fc region antitela. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth.62: 1-13. Čvrsta faza na koju je protein A imobilizovan može biti kolona koja sadrži površinu stakla ili silika, ili kontrolisanu staklenu kolonu ili silicijumsku kolonu. U nekim primenama, kolona je prevučena reagensima, kao što je glicerol, kako bi se sprečilo nespecifično pridržavanje zagađivača.

[0190] Kao prvi korak prečišćavanja, preparat koji se dobija iz ćelijske kulture kao što je prethodno opisano, može se primeniti na imobilizovanu čvrstu fazu proteina A kako bi se omogućilo specifično vezivanje antitela od interesa za Protein A. Čvrsta faza bi se onda ispirala da bi se uklonili kontaminanti nespecifično vezane za čvrstu fazu. Konačno, antitelo od interesa se dobija iz čvrste faze elucijom.

b) Generisanje antitela pomoću eukariotskih ćelija domaćina:

[0191] Vektor za upotrebu u eukariotskoj ćeliji domaćina obično uključuje jednu ili više od sledećih neograničavajućih komponenti: signalnu sekvencu, poreklo replikacije, jedan ili više markerskih gena, element poboljšača, promoter i sekvencu završetka transkripcije.

(1) Komponenta signalne sekvence

[0192] Vektor za upotrebu u eukariotskoj ćeliji domaćina može takođe sadržati signalnu sekvencu ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida od interesa. Odabrana heterologna signalna sekvenca može biti ona koja je prepoznata i obrađena (tj. Odsečena signalnom peptidazom) od strane ćelije domaćina. U ekspresiji ćelija sisara, dostupne su signalne sekvence sisara, kao i virusni sekreterni lideri, na primer herpes simplek gD signal. DNK za takav region prekursora je ligiran u čitajući okvir za DNK koja kodira antitelo.

(2) Poreklo replikacije

[0193] Generalno, poreklo komponente replikacije nije potrebno za vektore ekspresije sisara. Na primer, poreklo SV40 se obično može koristiti samo zato što sadrži rani promoter.

(3) Komponenta gena za selekciju

[0194] Vektori ekspresije i kloniranja mogu sadržati selekcioni gen, takođe nazvan selekcionim markerom. Tipični geni selekcije kodiraju proteine koji (a) pružaju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr. Ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) dopunjuju aukotrofne nedostatke, gde je to relevantno, ili (c) snabdevanje kritičnih hranljivih materija koje nisu dostupne iz kompleksnih medija.

[0195] Jedan primer selekcione sheme koristi lek za hapšenje rasta ćelije domaćina. Ove ćelije koje su uspešno transformisane heterolognim genom proizvode protein koji daje otpornost na lekove i na taj način preživi režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.

[0196] Još jedan primer odgovarajućih selektivnih markera za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija nadležnih za uzimanje nukleinske kiseline antitela, kao što su DHFR, timidinkinaza, metalotionein-I i -II, poželjno gena primata metalliotioneina, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza, itd.

[0197] Na primer, u nekim otelotvorenjima ćelije transformisane sa DHFR selekcionim genom se prvo identifikuju kultivacijom svih transformanti u medijumu za kulturu koji sadrži metotreksat (Mtk), konkurentski antagonist DHFR-a. U nekim otelotvorenjima, odgovarajuća ćelija domaćina kada se koristi divlji tip DHFR je ćelijska linija kineskog hrčka (CHO) koja je deficijentna u DHFR aktivnosti (npr., ACC CRL-9096).

[0198] Alternativno, ćelije domaćina (posebno domaćini divljih vrsta koji sadrže endogeni DHFR) transformisani su ili su transformisani sa DNK sekvencama koje kodiraju antitelo, DHFR proteina divljeg tipa i drugi selektivni marker kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH) rasta ćelija u medijumu koji sadrži sredstvo za selekciju za selektivni marker, kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr. kanamicin, neomicin ili G418. Videti patent SAD br.4,965,199.

(4) Promoter komponenta

[0199] Vektori ekspresije i kloniranja obično sadrže promoter koji je prepoznao organizam domaćina i operabilno je povezan sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid koji je od interesa (npr., Antitelo). Promotivne sekvence su poznate po eukariotima. Na primer, gotovo svi eukariotski geni imaju AT bogati region koji se nalazi približno 25 do 30 baza uzvodno od mesta gde se započinje transkripcija. Druga sekvenca koja je pronađena od 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može biti bilo koji nukleotid. Na 3 'kraju većine eukariotskih gena je AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje poli A repa na 3' kraj kodiranja sekvence. U određenim otelotvorenjima, bilo koja ili sve ove sekvence mogu biti pogodno ubačene u evkariotske ekspresijske vektore.

[0200] Transkripcija od vektora u ćelijama domaćina sisara kontrolisana je, na primer, promoterima dobijenim iz genoma virusa kao što su virus polioma, virus kukuruza, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), virus paprike goveda, avian sarkom virus, citomegalovirus, retrovirus, virus hepatitisa B i Simian Virus 40 (SV40), od heterolognih promotora sisara, npr. promotor aktina ili promotera imunoglobulina, od promotora toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.

[0201] Raniji i kasni promoteri SV40 virusa se pogodno dobijaju kao fragment za ograničavanje svrha SV40 koji takođe sadrži SV40 virusno poreklo replikacije. Neposredni rani promoter humanog citomegalovirusa se pogodno dobija kao HindIII E restrikcioni fragment. Sistem za ekspresiju DNK kod domaćina sisara koji koriste virus goveđe papiloma kao vektor opisan je u patentu SAD br.4,419,446. Modifikacija ovog sistema je opisana u patentu SAD br.4,601,978. Takođe videti Reies el al., Nature 297: 598-601 (1982), opisujući ekspresiju cDNA čoveka β-interferona u mišjim ćelijama pod kontrolom promotera timidin kinaze iz virusa herpes simpleksa. Alternativno, Rous Sarcoma Virus long term ponavljanje se može koristiti kao promoter.

(5) Komponenta elementa za poboljšanje

[0202] Transkripcija DNK koja kodira antitelo višim eukariotima često se povećava unošenjem sekvence poboljšača u vektor. Mnoge pojačivačne sekvence su sada poznate od sisara (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Međutim, tipično će se koristiti pojačivač iz eukariotskog ćelijskog virusa. Primeri uključuju SV40 pojačivač na kasnoj strani porekla replikacije (bp 100-270), unapređenje ranog promotora citomegalovirusa, pojačivač polioma na krajnjoj strani porekla replikacije i poboljšači adenovirusa. Takođe videti Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) opisuju elemente poboljšanja za aktivaciju eukariotskih promotera. Pojačivač može biti spojen u vektor na položaju 5 'ili 3' u sekvenci koja kodira polipeptid antitela, ali se generalno nalazi na mestu 5' kod promotora.

(6) Komponenta završetka transkripcije

[0203] Vektori ekspresije koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćina mogu takođe sadržati sekvence neophodne za završetak transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupne od 5 'i, povremeno 3', neprevedeni regioni eukariotskih ili virusnih DNK ili kDNA. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovane fragmente u neprevedenom delu mRNK koja kodira antitelo. Jedna korisna komponenta završetka transkripcije je oblast poliadenilacije hormona rasta. Vidiš WO94/11026 i vektor ekspresije koji su tamo otkriveni.

(7) Izbor i transformacija ćelija domaćina

[0204] Odgovarajuće ćelije domaćina za kloniranje ili ekspresiju DNK u vektori ovde obuhvataju veće ćelije eukariota koji su ovde opisani, uključujući ćelije domaćine ćelija vretenca. Propagacija ćelija vretenčarija u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinska procedura. Primeri korisnih linija domaćih ćelija sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana od strane SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionalna bubrežna linija (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenznoj kulturi, Graham i dr., J. Gen Virol.36:59 (1977)); ćelije bubrega za bebe hamster (BHK, ATCC CCL 10); Ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 77: 4216 (1980)); mouse sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); Afričke ćelije bubrega zelenih majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije karcinoma ljudskog grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega pseća (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre biljnog pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ljudske ćelije pluća (V138, ATCC CCL 75); ćelije ćelija jetre (Hep G2, HB 8065); tumor tumora miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i dr., Annals N.I. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i humanu liniju hepatoma (Hep G2).

[0205] Ćelije domaćina se transformišu sa gorenavedenim ekspresionim ili vektorima kloniranja za proizvodnju antitela i kultivišu se u konvencionalnim hranljivim sredstvima modifikovanim kao što je pogodno za induciranje promotera, selekciju transformanti ili amplifikovanje gena koji kodiraju željene sekvence.

(8) Kulturiranje ćelija domaćina

[0206] Ćelije domaćina koje se koriste za proizvodnju antitela mogu se kultivisati u različitim medijima. Komercijalno dostupni mediji kao što su Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium (MEM), Sigma, RPMI-1640 (Sigma) i Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Sigma su pogodni za kultivaciju ćelija domaćina. Pored toga, bilo koji od medija opisan u Ham i dr., Meth. Enz.58:44 (1979), Barnes i dr., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili U.S. Patent Re.30,985 mogu se koristiti kao kultivisani mediji za ćelije domaćina. Svaki od ovih medija može se dopuniti ako je potrebno sa hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), soli (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferi (kao što je HEPES ), nukleotidi (kao što su adenozin i timidin), antibiotici (kao što je lek GENTAMICIN™), elementi u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja obično prisutna u konačnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukoza ili ekvivalentni izvor energije. Bilo koji drugi dodatci mogu takođe biti uključeni u odgovarajuće koncentracije koje bi poznate stručnjacima. Kulturni uslovi, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćina izabranom za ekspresiju, i biće očigledna za obučenog stručnjaka.

(9) Prečišćavanje antitela

[0207] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo može biti proizvedeno intracelularno ili direktno sekretirano u medijum. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, kao prvi korak, ostaci čestica, ili ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, mogu se ukloniti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Kada se antitelo izluči u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema mogu se prvo koncentrirati koristeći komercijalno dostupni filter za koncentraciju proteina, na primer Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltraciona jedinica. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka kako bi se inhibirala proteoliza, a antibiotici mogu biti uključeni kako bi se sprečio rast najvećih zagađivača.

[0208] Sastav antitela, pripremljen od ćelija, može se prečišćavati primenom hromatografije hidroksilapatita, elektroforeze gela, dijalize i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija pogodna tehnika. Pogodnost proteina A kao afinitetnog liganda zavisi od vrste i izotipa bilo koje imunoglobulinske Fc domene koja je prisutna u antitelu. Protein A se može koristiti za prečišćavanje antitela koja se baziraju na humanim γ1, γ2 ili γ4 teškim lancima (Lindmark i dr., J. Immunol. Methods 62: 1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve izotipe miša i za humane γ3 (Guss i dr., EMBO J. 5: 15671575 (1986)). Matrica na koju je vezan ligand afiniteta može biti agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice poput kontrolisane staklenog stakla ili poli (stirenedivinil) benzena omogućavaju brže protoke i kraće vreme obrade nego što se može postići sa agarozom. Gde antitelo sadrži CH3 domen, Bakerbond ABKS™ smola (J. T. Baker, Phillipsburg, Nj) je korisna za prečišćavanje. Druge tehnike za pročišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na koloni za jonsku razmjenu, precipitacija etanola, HPLC reversna faza, hromatografija na silika, hromatografija na heparinskoj SEPHAROSE™ hromatografiji na anionskoj ili kationskoj izmenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliaspartične kiseline), hromatofokusiranje, SDS-PAGE i precipitacija amonijum sulfata su takođe dostupna u zavisnosti od antitela koji se treba oporaviti.

[0209] Prateći bilo koji preliminarni korak (i) prečišćavanja, smeša koja sadrži antitelo od interesa i zagađivača može biti podvrgnuta daljem prečišćavanju, na primer, pomoću hromatografije sa niskom pH hidrofobnom interakcijom koristeći pufer za eluiranje na pH od oko 2.5-4.5, poželjno izveden na niske koncentracije soli (npr. od oko 0-0.25M soli).

[0210] Generalno, razne metodologije za pripremu antitela za upotrebu u istraživanju, testiranju i kliničkoj upotrebi su dobro uspostavljene u stanju tehnike, u skladu sa gore opisanim metodologijama i/ili koje se smatra stručnim za stručnjake za određeno antitelo interes.

C. Agonisti i antagonisti

[0211] Polipeptid koji sadrži IL-22 ili IL-22 agonist koji povećava IL-22 aktivnost može biti korišćen u predmetnom pronalasku kao što je navedeno. Upućivanje na agonista AMP treba shodno tome tumačiti.

[0212] U jednom otelotvorenju, agonist AMP je antitelo, npr. I IL-22 antitelo ili anti-IL-22R antitelo. U nekim izvođenjima, anti-IL-22 antitelo je agonistično antitelo koje promoviše interakciju IL-22 sa IL-22R. U određenim otelotvorenjima, anti-IL-22R antitelo se vezuje za domen vezivanja ekstracelularnog liganda IL-22R. Na primer, anti-IL-22R antitelo može se vezati za vezujući domen vanćelijskog liganda humanog IL-22R, koji se nalazi u SEQ ID NO:3 od oko aminokiselina 18-228.

[0213] U određenom otelotvorenju, IL-22 agonist je antitelo koje vezuje IL-22BP i blokira ili inhibira vezivanje IL-22BP na IL-22 i na taj način indukuje ili povećava aktivnost IL-22 (npr. Vezivanje za IL-22R).

[0214] U još jednom otelotvorenju, agonist AMP je oligopeptid koji se vezuje za AMP. U jednom aspektu, oligopeptid se vezuje za domen vezivanja na ekstracelularni ligand IL-22R. Oligopeptidi mogu biti hemijski sintetizovani korišćenjem poznate metodologije sinteze oligopeptida ili mogu biti pripremljeni i prečišćeni korišćenjem rekombinantne tehnologije. Takvi oligopeptidi su obično najmanje oko 5 amino kiselina dužine, alternativno najmanje oko 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22232425262728 2930 31 3233 3435 36 3738 3940 41 4243 4445 46 4748 49 4951 5253 54 5557 5759 60 6162 6364 65 6667 6869 70 7172 7373 74 7677 7879 80 8182 83 8485 8687 8889 90 9192 9394 9596 97, 98, 99 ili 100 amino kiselina dužine. Takvi oligopeptidi mogu biti identifikovani bez nepotrebnog eksperimentisanja koristeći dobro poznate tehnike. U tom smislu, primećeno je da su tehnike za skrining biblioteke oligopeptida za oligopeptide koje su sposobne da se specifično vezuju za polipeptidnu mete dobro poznate u struci (videti, na primer, U.S. Patent Nos.

5,556,762, 5,750,373, 4,708,871, 4,833,092, 5,223,409, 5,403,484, 5,571,689, 5,663,143; PCT Publication Nos. WO 84/03506 and WO84/03564; Geysen i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:178-182 (1985); Geysen i dr., in Synthetic Peptides as Antigen, 130-149 (1986); Geysen i dr., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs i dr., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. i dr. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. i dr. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. i dr. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. i dr. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. i dr. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, and Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668).

U drugom opisanom pristupu, agonist AMP je organski molekul koji se vezuje za AMP, osim oligopeptida ili antitela kako je ovde opisano. Organski molekul može biti, na primer, mali molekul. U jednom aspektu, organski molekul se vezuje za ekstracelularni domen IL-22R. Organski molekul koji se vezuje za AMP može se identifikovati i hemijski sintetizirati koristeći poznatu metodologiju (videti, npr., PCT objava br. WO00/00823 i WO00/39585). Takvi organski molekuli su obično manji od oko 2000 daltona u veličini, alternativno manje od oko 1500, 750, 500, 250 ili 200 daltona u veličini, pri čemu takvi organski molekuli koji se mogu vezati za AMP mogu se identifikovati bez nepotrebnog eksperimenta koristeći dobro poznate tehnike. U tom pogledu, primećeno je da su tehnike za skeniranje biblioteka organskih molekula za molekule koji su sposobni za vezivanje za polipeptidnu metu dobro poznati u struci (videti, na primer, PCT patentne objave br. WO00/00823 i WO00/39585).

[0215] IL-22 agonist može biti organski molekul koji vezuje IL-22BP i blokira ili inhibira vezivanje IL-22BP na IL-22 i na taj način indukuje ili povećava aktivnost IL-22 (npr., vezivanje za IL-22R).

D. Farmaceutske formulacije

[0216] Farmaceutske formulacije se pripremaju za skladištenje mešanjem sredstva koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizatorima (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. [1980]), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijenti ili stabilizatori su netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama i uključuju puferove kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid, he:kametonijum hlorid, benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid, fenol, butil ili benzil alkohol, alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben, katehol, resorcinol, cikloheksanol, 3-pentanol i m-krezol); niske molekulske mase (manje od 10 ostataka) polipeptida; proteini, kao što su serumski albumini, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatirajući agensi kao što su EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontra-joni koji formiraju soli kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. kompleksi Zn-proteina); i/ili nejonske surfaktante kao što su TWEEN ™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0217] Lipofekcije ili lipozomi se takođe mogu koristiti za isporuku agensa u ćeliju. Gde je agens fragment antitela, najniži inhibitorni fragment koji se specifično vezuje za ciljni protein je poželjan. Na primer, na bazi varijabilne regionne sekvence antitela, mogu se projektovati peptidni molekuli koji zadržavaju sposobnost da se vezuju ciljne proteinske sekvence. Takvi peptidi mogu biti sintetizovani hemijski i/ili proizvedeni tehnologijom rekombinantne DNK (videti, na primer, Marasco i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 [1993]). Antitela opisana ovde mogu takođe biti formulisana kao imunolipozomi. Liposomi koji sadrže antitelo se pripremaju metodama poznatim u stanju tehnike, kao što je opisano u Epstein i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hvang i dr. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); i U.S. Pat. Nos. 4,485,045 i 4,544,545. Liposomi sa poboljšanim cirkulacijskim vremenom otkriveni su u U.S. Patent No.5,013,556. Posebno korisni lipozomi mogu se generisati postupkom isparavanja reverzne faze sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovan fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Liposomi se ekstrudiraju kroz filtere definisane veličine pora kako bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti antitela mogu biti konjugovani na lipozome kako je opisano u Martin i dr., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) putem reakcije disulfidne zamene. Hemoterapeutski agens (kao što je doksorubicin) opciono se nalazi u liposuima. Videti Gabizon i dr., J. National Cancer Inst., 81 (19): 1484 (1989).

[0218] Sredstvo takođe može biti upleteno u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikom koacervacije ili međusobnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozom ili mikrokapsulama želatina i mikrokapsulama poli (metilmetakilat), respektivno u koloidnim sistemima za dostavu lekova (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanocapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington's Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

[0219] Preparati za održavanje supstanca sa supstancom mogu biti pripremljeni. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže sredstvo, koje su matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr., Filmova ili mikrokapsula. Primeri matrica sa trajnim oslobađanjem uključuju poliestre, vodonike (na primer, poli (2-hidroksietilmetakrilat) ili poli (vinilalkohol)), polilaktidi (U.S. Pat. No. 3,773,919), kopolimeri L-glutaminske kiseline i γ-etil-L-glutamata, ne-razgradivog etilen-vinil acetata, kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline, kao što su LUPRON DEPOTTM (injektirajuće mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolida acetat), i poli-D-(-)-3-hidroksimetrija kiselina. Dok polimeri kao što su etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula više od 100 dana, određeni hidrogeli otpuštaju proteine u kraćim vremenskim periodima. Kada inkapsulirana antitela ostanu u telu dugo vremena, mogu denaturirati ili agregirati kao rezultat izlaganja vlagi na 37°C, što rezultira gubitkom biološke aktivnosti i mogućim promjenama imunogenosti. Racionalne strategije mogu biti osmišljene za stabilizaciju u zavisnosti od uključenog mehanizma. Na primer, ako se otkrije da je mehanizam agregacije intermolekularna formacija S-S veze kroz tio-disulfidnu izmenu, stabilizacija može biti postignuta modifikovanjem suifhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom sadržaja vlage, korišćenjem adekvatnih aditiva i razvojem specifičnih matriksnih kompozicija polimera.

[0220] Ovde farmaceutska formulacija može sadržati više od jednog aktivnog jedinjenja ako je potrebno za određenu indikaciju koja se tretira. Na primer, u jednom otelotvorenju farmaceutska formulacija koja sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja sadrži 1) najmanje jedan agonist IL-22, na primer, antitelo koje se vezuje za IL-22 i/ili antitelo koje se vezuje za IL-22R; i 2) najmanje jedno antitelo koje se vezuje za IL-6 ili IL-23 (gde bilo koji broj antitela navedenih u 2) može biti izabran u bilo kojoj kombinaciji). U drugom otelotvorenju, farmaceutska formulacija sadrži dva ili više aktivnih jedinjenja koja imaju komplementarne aktivnosti.

E. Metode lečenja

[0221] Obelodanjivanje se odnosi na metode lečenja mikrobiološkog poremećaja.

[0222] Pronalazak obezbeđuje zahtevanu medicinsku upotrebu i komplet.

[0223] Primeri mikrobiološkog patogena uključuju, ali nisu ograničeni na, bakterije ili viruse. U jednom aspektu, mikrobiološki patogen je bakterija, na primer, gram-negativna ili gram-pozitivna bakterija. U određenom otelotvorenju, bakterije su gram-negativne bakterije. U još jednom otelotvorenju, bakterije su bakterije koje se vezuju ili uklanjaju (A/E) i, naročito, enterohemoragijske Escherichia coli (EHEC) ili enteropatogene E. Coli (EPEC). U jednom aspektu, bakterija je enteropatogena E. coli (EHEC) je E. coli 0157: 1-7 ili E. coli 055:H7.

[0224] Terapeutske metode sadrže jednu ili više kompozicija ili farmaceutskih formulacija. Takvi postupci uključuju in vitro, ex vivo i in vivo terapeutske metode, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0225] U raznim otelotvorenjima, sadašnje obelodanjivanje obezbeđuje metode modulacije antimikrobnog imunološkog odgovora stimulacijom ili inhibicijom AMP posredovanog signalnog puta i/ili ThIL-17 ćelijska funkcija. Takve metode su korisne za lečenje mikrobnih poremećaja. Na primer, u jednom otelotvorenju, sadašnje obelodanjivanje obezbeđuje postupak poboljšanja antimikrobiološkog imuno odgovora stimulisanjem AMP posredovanog signalnog puta, na primer, i IL-22 i/ili IL-23 posredovanog signalnog puta. U još jednom otelotvorenju, prikazano otkrivanje obezbeđuje postupke modulacije antimikrobnog imunološkog odgovora stimulacijom ili inhibicijom signalnog puta posredovanog citokinom. Na primer, u jednom otelotvorenju, sadašnje obelodanjivanje obezbeđuje metode poboljšanja anti-mikrobiološkog imunološkog odgovora stimulacijom signalnog puta posredovanog preko citokina, npr. signalnog puta IL-22 i/ili IL-23. Štaviše, sadašnje obelodanjivanje obezbeđuje metode modulacije antimikrobnog imuno odgovora stimulacijom ili inhibicijom ThIL-17 ćelijska funkcija.

[0226] U jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje metod stimulacije AMP posredovanog signalnog puta u biološkom sistemu, pri čemu postupak sadrži obezbeđivanje AMN agonista za biološki sistem. Primeri takvog biološkog sistema obuhvataju, ali nisu ograničeni na, ćelije sisara u in vitro sistemu ćelijske kulture ili u organizmu in vivo. U još jednom izvođenju, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak inhibicije AMP posredovanog signalnog puta u biološkom sistemu, pri čemu postupak sadrži obezbeđivanje AMP antagonista biološkom sistemu.

[0227] U konkretnom rešenju, sadašnje obelodanjivanje obezbeđuje postupak poboljšanja antimikrobnog imuno odgovora u biološkom sistemu stimulisanjem IL-23 i/ili IL-22 signalnog puta signala u biološkom sistemu, pri čemu postupak sadrži obezbeđivanje IL- 22 ili IL-22 agonista u biološki sistem. U jednom otelotvorenju, IL-22 agonist je IL-22. U još jednom otelotvorenju, IL-22 agonist je antitelo koje se vezuje za IL-22.

[0228] U još jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak inhibicije IL-23 posredovanog signalnog puta u biološkom sistemu, postupak koji sadrži obezbeđivanje antagonista IL-22 biološkom sistemu. U jednom otelotvorenju, antagonist IL-22 je antitelo, npr., neutralizirajuće anti-IL-22 antitelo i/ili neutralizujuće anti-IL-22R antitelo.

[0229] U još jednom otelotvorenju, prikazano otkrivanje obezbeđuje metod stimulacije ThIL-17 ćelija, postupak koji sadrži ekspoziciju ThIL-17 ćelija agonistu AMP-a koji posreduje posredovanom signaliza signalnom putanjom IL-23 (npr., IL-23, IL-6 ili IL-22). Takve metode su korisne za lečenje mikrobnih poremećaja. U jednoj realizaciji, IL-22 agonist je IL-22. U još jednom otelotvorenju, IL-22 agonist je antitelo koje se vezuje za IL-22.

[0230] U još jednom otelotvorenju, postupak inhibicije ThIL-17 obezbeđuje se ćelijska funkcija, postupak koji obuhvata izlaganje ThIL-17 ćelija antagonistu AMP-a koja posreduje posredovanom signalnom putanjom sa IL-23 (npr., IL-23, IL-6 ili IL-22). U jednom otelotvorenju antagonist je anti-IL-22 antitelo, npr., neutralizirajuće anti-IL-22 antitelo.

[0231] Primera ThIL-17 ćelijske funkcije uključuju, ali se ne ograničavaju na, stimulaciju ćelijsko posredovanog imuniteta (odloženi tip hipersenzitivnosti); zapošljavanje urođenih imunih ćelija, kao što su mieloidne ćelije (npr., monociti i neutrofili) na mesta inflamacije; i stimulaciju inflamatorne ćelijske infiltracije u tkiva. U jednom aspektu, ThIL-17 ćelijska funkcija je posredovana IL-23 i/ili IL-22.

[0232] Sastavi se daju sisaru, poželjno čoveku, u skladu sa poznatim metodama, kao što je intravenozna primena kao bolus ili kontinualna infuzija tokom jednog vremenskog perioda, intramuskularnim, intraperitonealnim, intracerobrospinalnim, subkutanim, intraartikularnim, intrasinovskim, intratekalnim, oralne, topikalne ili inhalacijske (intranazalne, intrapulmonalne) puteve. Poželjno je intravenozno ili primanje udisanjem polipeptida i antitela.

[0233] Za lečenje ili smanjenje težine mikrobiološkog poremećaja, odgovarajuća doza sastava zavisiće od vrste poremećaja koji treba tretirati, kao što je gore definisano, težine i toka poremećaja, bilo da se sredstvo primenjuje za preventivno ili terapeutske svrhe, prethodnu terapiju, kliničku istoriju pacijenta i odgovor na jedinjenje i diskreciju lekara koji prisustvuje. Jedinjenje se odgovarajuće primenjuje kod pacijenta jednom ili u nizu tretmana.

[0234] Na primer, u zavisnosti od vrste i jačine poremećaja, oko 1 mg/kg do 15 mg/kg (na primer., 0.1-20 mg/kg) polipeptida ili antitela je inicijalna doza kandidata za primenu kod pacijenta, bilo da je, na primer, jedna ili više odvojenih administracija ili kontinualna infuzija. Tipična dnevna doza može se kretati od oko I mg/kg do 100 mg/kg ili više, zavisno od gore navedenih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se održava sve dok ne dođe do željene supresije simptoma bolesti. Međutim, drugi režimi doziranja mogu biti korisni. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i testovima.

F. Dijagnostičke metode i metode detekcije

[0235] Obelodanjivanje takođe obezbeđuje postupak otkrivanja prisustva AMP u biološkom uzorku, koji obuhvata kontaktiranje biološkog uzorka sa antitelom na AMP, pod uslovima koji su dozvoljeni za vezivanje antitela na AMP i otkrivanje da li je kompleks formiran između antitela i AMP.

[0236] U jednom izvođenju, obelodanjivanje obezbeđuje postupak praćenja tretmana mikrobijalnog poremećaja kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata detekciju nivoa ekspresije gena koji kodira AMP u test uzorku ćelija tkiva dobijenih od subjekta koji je potreban tretman, a detektovan je nivo ekspresije u uzorku testa. Detekcija može biti kvalitativna ili kvantitativna. U jednom otelotvorenju, uzorak testa sadrži krv ili serum. U jednom otelotvorenju, detektovanje nivoa ekspresije gena koji kodira AMP sadrži (a) kontaktiranje anti-AMP antitela sa uzorkom testa dobijenim od sisara, i (b) detektovanje formiranja kompleksa između antitela i AMP u test uzorku. Antitelo može biti povezano sa detekcionom etiketom. Kompleksna formacija se može pratiti, na primer, pomoću svetlosne mikroskopije, protočne citometrije, fluorimetrije ili drugih tehnika poznatih u stanju tehnike. Test uzorak se može dobiti od osobe za koju se sumnja da ima mikrobiološki poremećaj.

[0237] U jednom aspektu, detektovanje nivoa ekspresije gena koji kodira AMP polipeptid obuhvata detekciju nivoa transkripcije mRNK iz gena. Nivoi transkripcije mRNK mogu biti otkriveni, bilo kvantitativno ili kvalitativno, različitim metodama poznatim stručnjacima. Nivoi transkripcije mRNK mogu se takođe otkriti direktno ili indirektno otkrivanjem nivoa cDNK generisane iz mRNK. Primeri metoda za detekciju nivoa transkripcije mRNK-a uključuju, ali se ne ograničavaju, kvantitativne RT-PCR i hibridizacione analize u realnom vremenu, uključujući analize zasnovane na mikroorganizaciji i analize zasnovane na filteru, kao što su severni blotovi.

[0238] U drugom otelotvorenju, otkrivanje daje metod otkrivanja prisustva AMP u biološkom uzorku, koji obuhvata kontaktiranje biološkog uzorka sa antitelom na AMP, u uslovima dozvoljenim za vezivanje antitela na AMP i otkrivanje da li je kompleks se formira između antitela i AMP.

[0239] U još jednom otelotvorenju, obelodanjivanje se odnosi na dijagnostički komplet koji sadrži anti-AMP u odgovarajućoj ambalaži. Komplet po mogućnosti sadrži uputstva za upotrebu antitela za detekciju AMP-a. U jednom aspektu, dijagnostički komplet je za dijagnostikovanje mikrobiološkog poremećaja. U jednom aspektu, dijagnostički komplet je za dijagnostikovanje mikrobiološke infekcije.

[0240] U još jednom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje komplet koji sadrži jedan ili više AMP-ova i/ili modulatori istih. U još jednom otelotvorenju, otkrivanje obezbeđuje komplet koji sadrži jednu ili više jedne ili više farmaceutskih kompozicija od kojih svaka sadrži AMP ili modulator tog sredstva.

G. Analiza

1. Ćelijske analize i životinjske morlele

[0241] Analize bazirane na ćeliji i modeli životinja za imunološke bolesti su korisne u praksi određenih rešenja. Neke analize zasnovane na ćelijama koje su navedene u sledećim primerima su korisne, npr., za ispitivanje efikasnosti IL-22 antagonista ili agonista.

[0242] In vivo životinjski modeli su takođe korisni. Primeri životinjskih modela su takođe opisani u dole navedenim primerima. In vivo priroda takvih modela ih čini prediktivnim za odgovore kod ljudskih pacijenata. Životinjski modeli bolesti povezanih sa imunom uključuju i ne-rekombinantne i rekombinantne (transgene) životinje. Ne-rekombinantni modeli na životinjama uključuju, na primer, glodare, na primer., glodarski modeli. Takvi modeli mogu se generisati uvođenjem ćelija u sintezne miševe koristeći standardne tehnike, na primer., subkutana injekcija, injekcija repnog vena, implantacija slezine, intraperitonealna implantacija, implantacija ispod bubrežne kapsule, itd.

[0243] Modeli bolesti kalem protiv domaćina obezbeđuju sredstvo za procenu reaktivnosti T ćelija protiv MHC antigena i malih transplantnih antigena. Bolest graft-versus-host se javlja kada se imunokompetentne ćelije transplantiraju u imunosupresivane ili tolerantne pacijente. Donatorske ćelije prepoznaju i reaguju na antigene domaćina. Odziv se može razlikovati od opasnih po život, teške upale do blagih slučajeva dijareje i gubitka težine. Pogodna procedura za procenu bolesti kalem protiv domaćina je detaljno opisana u Aktuelnim protokolima u imunologiji, gore, jedinica 4.3.

[0244] Model životinja za odbacivanje alografta kože je sredstvo za testiranje sposobnosti T ćelija da posreduju in vivo uništavanje tkiva i mera njihove uloge u odbacivanju transplantata. Najčešći i prihvaćeni modeli koriste graftove muške repne kože. Ponovljeni eksperimenti su pokazali da je uklanjanje alografta kože posredovano T ćelijama, pomoćnim T ćelijama i T-ćelijama efektora ubice, a ne antitelima. Auchincloss, H. Jr. and Sachs, D. H., Fundamental Immunology, 2nd ed., W. E. Paul ed., Raven Press, NY, 1989, 889-992. Pogodna procedura je detaljno opisana u Current Protocols in Immunology, gore, jedinica 4.4. Drugi modeli odbacivanja transplantata koji se mogu koristiti za testiranje jedinjenja su alogeni modeli za transplantaciju srca opisani od strane Tanabe, M. et al, Transplantation (1994) 58:23 and Tinubu, S. A. et al, J. Immunol. (1994) 4330-4338.

[0245] Kontaktna preosetljivost je jednostavna in vivo test za ćelijsko posredovan imunološku funkciju (odložena vrsta preosjetljivosti). U ovom postupku, kožna ekspozicija eksogenim haptensima koja dovodi do reakcije preosetljivosti tipa preosetljivosti koja se meri i kvantifikuje. Osetljivost kontakta uključuje inicijalnu fazu senzibilizacije koju prati faza izlaganja. Faza izlaganja se javlja kada T limfociti susreću antigen kojem su imali prethodni kontakt. Pojavljuju se otok i upala, čineći ovo odličnim modelom alergijskih kontaktnih dermatitisa. Pogodna procedura je detaljno opisana u Current Protocols in Immunology, Eds. J. E. Cologan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, John Wiley & Sons, Inc., 1994, unit 4.2. See also Grabbe, S. and Schwarz, T, Immun. Today 19(1): 37-44 (1998).

[0246] Pored toga, sastavi se mogu testirati na modelima životinja za bolesti slične psoriasu. Na primer, sastavi se mogu testirati u modelu scid/scid miša koji opisuje Schon, M. P. i dr., Nat. Med. (1997) 3: 183, u kojima miševi pokazuju histopatološke lezije kože koje liče na psorijazu. Drugi pogodan model je humana koža/scid miša himera pripremljena kao što je opisano Nickoloff, B. J. i dr., Am. J. Path. (1995) 146:580. Drugi pogodan model je opisan u Boyman i dr., J Exp Med. (2004) 199(5):731-6, u kojoj je ljudska prepsoriatska koža presađena na miševe AGR129, što dovodi do razvoja psoriatičkih lezija kože.

[0247] Izvode se životinje koje mogu imati defektan ili izmenjen gen koji kodira polipeptid koji je ovde identifikovan, kao rezultat homologne rekombinacije između endogenog gena koji kodira polipeptid i molekul DNK u kome je taj gen izmenjen. Na primer, cDNA koja kodira određeni polipeptid može se koristiti za kloniranje genomske DNK koja kodira taj polipeptid u skladu sa utvrđenim tehnikama. Deo genomske DNK koji kodira određeni polipeptid može se izbrisati ili zameniti drugim genom, kao što je gen koji kodira selektivni marker koji se može koristiti za praćenje integracije. Tipično, nekoliko kilobaza nepromenjene bočne DNK (oba na 5 'i 3' krajeva) su uključene u vektor [videti npr. Thomas i Capecchi, Cell, 51: 503 (1987) za opis homolognih vektora rekombinacije]. Vektor je uveden u liniju embrionskih matičnih ćelija (na primer., elektroporacijom) i ćelije u kojima je uvedena DNK homologno rekombinovana sa endogenom DNK su odabrani [videti na primer., Li i dr., Cell, 69: 915 (1992)]. Odabrane ćelije se onda injektiraju u blastociste životinje (na primer., miša ili pacova) da bi se formirale hirme agregacije [videti na primer. Bradlei, Teratokarcirroma, s i embrionalne matične ćelije: praktičan pristup, E. J. Robertson, ed. (IRL, Okford, 1987), str. 113-152]. Himerni embrion se zatim može implantirati u odgovarajuću pseudopregnantu žensku hraniteljsku životinju, a embrion dočekati da bi stvorio "udari" životinje. Potomstvo koje sadrži homologno rekombinovanu DNK u svojim germinacijskim ćelijama može se identifikovati standardnim tehnikama i koristiti za uzgajanje životinja u kojima sve ćelije životinje sadrže homologno rekombinovanu DNK. Nekoliko životinja se mogu okarakterisati, na primer, zbog njihove sposobnosti da se odbrane od određenih patoloških stanja i zbog njihovog razvoja patoloških stanja usled odsustva polipeptida.

2. Ispitivanje testova za kandidate za lekove

[0248] Pregledni testovi za kandidate za lekove su dizajnirani da identifikuju jedinjenja koja se vezuju ili se formiraju polipeptidom koji je ovde identifikovan ili njegovim biološki aktivnim fragmentom ili na drugi način ometa interakciju polipeptida sa drugim ćelijskim proteinima. Ovakvi testovi skrininga će uključivati procese koji su podložni visokoj proporciji skrininga hemijskih biblioteka, čineći ih posebno pogodnim za identifikaciju kandidata za mali molekulski lek. Manji molekuli obuhvaćeni uključuju sintetička organska ili neorganska jedinjenja, uključujući peptide, poželjno rastvorljive peptide, fuzije (poli) peptid-imunoglobulina i, naročito, antitela koja uključuju, bez ograničenja, poli- i monoklonska antitela i fragmente antitela, anti-idiotipska antitela i himerne ili humanizovane verzije takvih antitela ili fragmenata, kao i ljudska antitela i fragmenti antitela. Analize se mogu izvoditi u različitim formatima, uključujući analize vezivanja proteina-proteina, biohemijske analize snimanja, imunoanalize i ćelijske analize, koje su dobro poznate u umetnosti. Svi testovi su uobičajeni u tome što pozivaju na kontakt test jedinjenja sa polipeptidom koji je ovde identifikovan pod uslovima i tokom dovoljnog vremena da bi se polipeptid mogao interagovati sa testiranim jedinjenjem.

[0249] U vezivnim analizama, interakcija je vezana i formirani kompleks može biti izolovan ili detektovan u reakcionoj mešavini. U konkretnom otelotvorenju, polipeptid ili testirano jedinjenje se imobiliše na čvrstu fazu, na primer., na mikrotitarskoj ploči, pomoću kovalentnih ili nekalentativnih priključaka. Nekovalentno vezivanje se generalno postiže premazom čvrste površine rastvorom polipeptida ili test jedinjenja i sušenja. Alternativno, imobilisano antitelo, na primer., monoklonsko antitelo specifično za polipeptid koji treba imobilizovati, može se koristiti za sidrenje polipeptida na čvrstu površinu. Analiza se vrši dodavanjem ne-imobilisane komponente, koja se može označiti nalepljivom etiketom, na imobilizovanu komponentu, na primer., premazana površina koja sadrži sidrenu komponentu. Kada je reakcija završena, ne-reagujuće komponente se uklanjaju npr. Pranjem i detektuju kompleksi zasidrani na čvrstoj površini. Kada originalno neimobilizovana komponenta nosi detektivnu etiketu, otkrivanje nalepnice koja imobilizira na površini ukazuje na to da je došlo do kompleksiranja. Tamo gde izvorno neimobilizovana komponenta ne nosi etiketu, složenost se može otkriti, na primer, korišćenjem označenog antitela koji specifično vezuje imobilizovani kompleks.

[0250] Ako testirano jedinjenje interaguje sa, ali se ne vezuje za određeni polipeptid koji je ovde identifikovan, njegova interakcija sa tom proteinom može se analizirati metodima poznatim za detekciju interakcija proteinskih proteina. Takvi testovi uključuju tradicionalne pristupe, kao što su unakrsno povezivanje, ko-imunoprecipitacija i ko-prečišćavanje kroz gradijente ili hromatografske kolone. Pored toga, interakcije proteina i proteina mogu se pratiti korišćenjem genetičkog sistema baziranog na kvascu koji su opisali Fields i saradnici [Fields and Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien i dr., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88, 9578-9582 (1991) kako je obelodanio Chevray and Nathans, Proc. Natl, Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991). Mnogi transkripcijski aktivatori, kao što je GAL4 kvasca, sastoje se od dva fizički diskretna modularna domena, jedan koji deluje kao DNK vezujući domen, dok drugi funkcioniše kao domen transkripcije. Sistem ekspresije kvasca opisan u prethodnim publikacijama (koji se obično naziva "dvobridni sistem") koristi ovu osobinu i koristi dva hibridna proteina, u kojoj je ciljni protein spojen sa DNK vezujući domen GAL4, a drugi, u kome su kandidati za aktiviranje proteina spojeni sa domenom aktivacije. Izraz GAL1-lacZ reporter gena pod kontrolom GAL4-aktiviranog promotera zavisi od rekonstitucije GAL4 aktivnosti preko interakcije proteina-proteina. Kolonije koje sadrže interaktivne polipeptide otkrivaju se pomoću hromogenog supstrata za β-galaktozidazu. Kompletan komplet (MATCHMAKER™) za identifikaciju protein-proteinskih interakcija između dva specifična proteina koji koriste tehniku dva hibrida je komercijalno dostupan od Clontech-a. Ovaj sistem se takođe može proširiti tako da mapira proteinske domene uključene u specifične interakcije proteina, kao i da odredi ostatke aminokiselina koji su ključni za ove interakcije.

[0251] Da bi se identifikovala jedinjenja koja ometaju interakciju polipeptida identifikovanog ovde i druge intra- ili ekstracelularne komponente, može se pripremiti reakciona smeša koja sadrži polipeptid i komponentu pod uslovima koji dozvoljavaju interakciju polipeptida sa komponentom. Da bi se testirala sposobnost test jedinjenja da inhibira interakciju, reakciona smeša se priprema u odsustvu i u prisustvu test jedinjenja. Ako postoji smanjenje interakcije polipeptida sa komponentom u prisustvu test jedinjenja, onda se kaže da testirano jedinjenje inhibira interakciju polipeptida sa komponentom.

[0252] U određenim otelotvorenjima, postupci za identifikaciju agonista ili antagonista AMP sadrže kontaktiranje AMP sa molekulom za agonist ili antagonist kandidata i merenje detektabilne promene u jednoj ili više bioloških aktivnosti koje su obično povezane sa AMP. Takve aktivnosti uključuju, ali nisu ograničene na, one opisane u dole navedenim primerima.

[0253] U jednom otelotvorenju, obelodanjivanje daje metode za identifikaciju agonista IL-22 polipeptida koji sadrže kontaktiranje IL-22 polipeptida sa molekulom agonista kandidata i merenjem detektabilne promene u jednoj ili više bioloških aktivnosti koje su obično povezane sa IL-22 polipeptidom. Takve aktivnosti uključuju, ali nisu ograničene na, one opisane u dole navedenim primerima.

3.Antitelski testovi vezivanja

[0254] Studije vezivanja za protitelesa mogu se izvesti u bilo kojoj poznatoj test analizi, kao što su testovi vezivanja za kompatibilnost, direktni i indirektni testovi sendviča i imunoprecipitacije. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 (CRC Press, Inc., 1987).

[0255] Konkurentni testovi vezivanja oslanjaju se na sposobnost označenog standarda da se takmiče sa analitom testiranog uzorka za vezivanje sa ograničenom količinom antitela. Količina ciljanog proteina u testiranom uzorku je obratno proporcionalna količini standarda koji se vezuje za antitela. Da bi se olakšalo određivanje količine standarda koji postaje vezan, antitela poželjno su nesolilizovana pre ili posle takmičenja, tako da se standard i analit koji su vezani za antitela mogu pogodno odvojiti od standardnog i analitnog materijala koji je i dalje nevezan.

[0256] Ispitivanje Sandwich uključuje upotrebu dva antitela, od kojih svaka može da se vezuje za različit imunogeni deo ili epitop proteina koji se detektuje. U testu Sandwich, analiza testiranog uzorka vezana je prvim antitelom koji se imobiliše na čvrstoj podlozi, a nakon toga se drugo antitelo vezuje za analit, čime se formira nerastvorljiv trodelni kompleks. Vidite, na primer., patent SAD br. 4,376,110. Drugo antitelo može se sama označiti detektabilnim delom (direktni sendvič test) ili se može meriti pomoću antitela protiv imunoglobulina koja je označena sa detektabilnim delom (indirektni sendvič test). Na primer, jedan tip Sandwich testa je ELISA test, u kom slučaju je detektabilni deo enzim.

[0257] Imunohistohemija se takođe može koristiti za određivanje ćelijske lokacije antigena na koje se antitelo vezuje. Za imunohistohemiju, uzorak tkiva može biti svež ili zamrznut ili može biti ugrađen u parafin i fiksiran sa konzervansom kao što je, na primer, formalinom. Objavljivanje artikala o proizvodnji.

[0258] U još jednom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje proizvodni proizvod koji sadrži kompozicije korisne za dijagnozu ili tretman poremećaja mikrobiola koji su ovde opisani. Članak proizvodnje sastoji se od kontejnera i uputstva. Pogodni kontejneri uključuju, na primer, bočice, bočice, špriceve i epruvete. Kontejneri mogu biti formirani iz raznih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner sadrži sastav koja je efikasna za dijagnosticiranje ili lečenje stanja i može imati sterilni pristupni port (na primer, kontejner može biti vreća za intravenoznu rastvor ili bočicu koja ima zatvarač koji može proći kroz iglu za injekciju pod hipodermijom). Aktivni agens u kompoziciji je obično polipeptid, antitelo, agonist ili antagonist. Uputstvo ili etiketa na ili povezana sa kontejnerom označava da se kompozicija koristi za dijagnosticiranje ili lečenje stanja izbora. Članak proizvodnje može dalje sadržati drugi kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je fiziološki rastvor sa fosfatom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Ona može dalje uključivati i druge materijale koje su poželjne sa komercijalnog i korisničkog stanovišta, uključujući i druge odbojnike, razblaživače, filtere, igle, špriceve i pakete sa uputstvima za upotrebu.

[0259] U jednom otelotvorenju, obelodanjivanje obezbeđuje proizvod proizvodnje, koji sadrži:

(a) sastav materije koji sadrži AMP ili njegov modulator (npr., IL-22 agonist);

(b) kontejner koji sadrži navedeni sastav; i

(c) etiketa pričvršćena na pomenutom kontejneru, ili uložak za pakovanje uključen u pomenuti kontejner, što se odnosi na upotrebu pomenutog agonista u lečenju mikrobiološkog poremećaja. Sastav može sadržati efikasnu količinu agonista.

PRIMERI

[0260] Slede primeri postupaka i kompozicija pronalaska i ovde su navedeni u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni da ograniče obim predmetnog pronalaska. Razumljivo je da se mogu primeniti različiti drugi oblici realizacije, s obzirom na opšti opis koji je ovde dat.

[0261] Komercijalno dostupni reagensi navedeni u primerima korišteni su prema uputstvima proizvođača, osim ako nije drugačije naznačeno. Izvor tih ćelija identifikovanih u sledećim primerima, i kroz specifikaciju, brojevi pristupa ATCC-u su američka kolekcija tipa kulture, Manassas, VA.

[0262] Podaci predstavljeni ovde pokazuju po prvi put da je IL-22 jedan od ključnih citokina koji premašuje adaptivni imuno odgovor i urođenu epitelnu odbranu tokom rane infekcije A/E bakterijskog patogena. Kao što je prikazano ovde, indukcija RegIIIβ i RegaIIIγ takođe ukazuje na to da IL-22 može imati šire funkcije u kontroli različitih bakterijskih infekcija. Podaci dalje podržavaju ulogu Th17 ćelija i njihovih efektorskih citokina kod zaraznih bolesti i autoimunih bolesti. Konačno, sadašnje studije pokazuju da IL-22 i njegovi nizvodni proizvodi, kao što su RegIIIβ i RegIIIγ, mogu biti korisni za lečenje određenih zaraznih bolesti.

PRIMER 1: IL-23 je od suštinskog značaja za regulaciju IL-22 tokom procesa zaraznih bolesti.

[0263] Podaci u ovom dokumentu pokazuju da je IL-23 neophodan za regulaciju IL-22 tokom procesa zaraznih bolesti.

[0264] Oba IL-22 receptora parova, IL-22R i IL-10Rβ lanci, su izraženi u GI traktu divlje tipove C57B1/6 miša (slika 1A). Njihov izraz u duodenumu, jejunumu, ileumu i debelom crevu su veći nego što su u koži, tkivo za koje je pokazano da IL-22 indukuje hiperplaziju. Odgovarajuće je da i epitelne ćelije i subepitijalna miofibroblasta konzistentno odgovaraju na IL-22. Tokom C. rodentium infekcija, IL-22 indukovana je u kolonu miševa divlje tipove (slika 1B), kao i citokini koji promovišu Th17 ćelijsku diferencijaciju, uključujući p19 i p40 podjedinicu IL-23 (Slika 1C-D) i IL-6 (Slika 1E). Svi ovi citokini su bili brzo indukovani, sa vrhunskim izrazom oko inokulacije danom 4 post. Nasuprot tome, indukcija IL-17 je imala sporiju kinetiku i dostigla svoj maksimalni nivo pri inokulaciji posle 12 dana (slika 1F).

[0265] Pošto IL-23 ili IL-6 promoviše IL-22 proizvodnju iz T ćelija in vitro, sadašnji pronalazači su pokušali prvo definisati svoju ulogu u regulaciji proizvodnje IL-22 tokom C. rodentium infekcija. Kada uporedimo stopu preživljavanja divljine, p19<-/->, p40<-/->, i 1L-6<-/->miševi posle C. rodentiurn infekcije, dosledno smo pronašli sve miševe sa p40<-/->grupa (Slika 1G) ili p19<-/->grupa (podaci nisu prikazani) umrli 10 dana nakon inokulacije. Zanimljivo je da je IL-6 zabeležen 60% mortaliteta<-/->grupa oko 12 dana (slika 1G), što ukazuje na to da je IL-6 u određenoj meri potreban za potpunu kontrolu C. rodentium infekcija. Zatim smo ispitali ekspresiju IL-22 i IL-17 u oba p19<-/->i IL-6<-/->miševi (slika 1H). Dok je ekspresija IL-17 nije izmenjena u p19<-/->miševi (15), indukcija IL-22 je smanjena u p19<-/->miševi u poređenju sa miševima na divljini. U IL-6<-/->miševi, međutim, dok je vrhunac IL-22 bio uporediv sa onom kod divljih miševa, njegova indukcija je značajno odložena (Fig. 1H). Dalje, u IL-6<-/->miševi, indukcija IL-17 je značajno smanjena, u skladu sa esencijalnom ulogom IL-6 za proizvodnju IL-17.

[0266] Direktno merenje IL-22/IL-17 proteina pomoću ELISA u ex vivo kulturama kolona od inficiranih miševa potvrdila je kinetiku proizvodnje IL-22/IL-17 i odsustvo indukcije IL-22 od p19<-/->miševi tokom C. rodentium infekcija (slika 11). Ovi podaci po prvi put pokazuju da je IL-23 neophodan za regulaciju IL-22 tokom procesa zaraznih bolesti.

[0267] Ovi podaci po prvi put pokazuju da je IL-23 neophodan za regulaciju IL-22 tokom procesa zaraznih bolesti.

Primer 2: IL-22 je ključni nizvodni efektorski citokin koji doprinosi biologiji IL-23 u kontroli mikrobne infekcije.

[0268] Promenjena regulacija IL-22 u IL-23 deficijentu i IL-6<-/->miševi su pokazali da IL-22 može igrati ključnu ulogu u odbrani domaćina C. rodentium infekcija. Da bi se dodatno ispitala uloga IL-22, IL-22<-/->miševi su inokulirani C. rodentium. Iako su divlje lišće smrtonosno izgubile težinu, ali su se u potpunosti oporavile posle 6 dana, IL-22<-/->miševi su nastavili da gube težinu C. rodentium infekcija (slika 2A). Oko 80% IL-22<-/->miševi su postali umorni ili su umrli 12 dana post C. rodentium inokulacija (slika 2A). Histološka analiza kolona iz zaraženog IL-22 iz 8. dana<-/->miševi su pokazali povećanu debljinu sluzokože u poređenju sa mišićima VT (slika 2B). Slučajno, došlo je i do povećane podmukosalne upale (Arrov, slika 2B). Pored toga, dok su u kontrolnim miševima, C. rodentium infekcija je bila pretežno površna, veliki broj bakterija penetrirao duboko u kolonijalne kriptove u IL-22<-/->miševi (strelice, slika 2C). FACS analiza sa antitelom anti-IL-22R (Slika 12) otkrila je da je IL-22R izražen pomoću E-kadherina pozitivnih epitijelnih ćelija primarnog mišja kolona, ali ne sa CD45+ intra-epitelne limfocite (IEL) ili mononuklearne ćelije lamina propria (LPMC) (Slika 12A). Slično tome, primarne ćelijske epitelne ćelijske ćelije takođe su izrazile IL-22R (Slika 12B). Ovi podaci ukazuju na to da su epitelne ćelije na kolonima direktno bile usmerene na IL-22.

[0269] Ovi podaci podržavaju važnost IL-22 u odbrani domaćina C. rodentium infekcije i ukazuju da IL-22 može biti jedan od ključnih nizvodnih efektorskih citokina koji doprinose biologiji IL-23 u kontroli mikrobnih infekcija.

Primer 3: putevi IL-17A i IL, -17F nisu potrebni za odbranu domaćina C. rodentium infekcija.

[0270] Delimično oštećenje odbrane domaćina u IL-6<-/->miševi protiv C. rodentium može se objasniti i odloženom indukcijom IL-22 kod ovih miševa (slika 1H, levi panel). Međutim, moguće je i da je letalnost u C. rodentium zaraženi IL-6<-/->miševi su mogli biti usled nemogućnosti upregulacije IL-17 (slika 1, desna ploča). Put IL-17 je presudan za kontrolu mnogih ekstracelularnih bakterijskih infekcija, kao što su Klebsiella prreumoniae. IL-17 signalizira preko IL-17R i IL-17RC (D. Toi i dr., J Immunol 177, 36 (1. jul, 2006)), i indukuje prointlamatorne reakcije mnogih vrsta ćelija, uključujući epitelne ćelije (J. Witowski, K. Ksiazek, A. Jorres, Cell Mol Life Sci 61, 567 (Mar, 2004)). Da analiziramo ulogu puta IL-17 tokom C. rodentium infekcija, IL-17RC<-/->miševi su generisani (slika 5). U poređenju sa divljim lišćarima, nije bilo očiglednog defekta u IL-17RC<-/->miševi u smislu razvoja ili sastava T ćelija, B ćelija i drugih imunih ćelija (podaci nisu prikazani). Međutim, fibroblasti nastali iz repnog konca (slika 5C) ili plućnog tkiva (podaci nisu prikazani) IL-17RC<-/->miševi su potpuno nesposobni za proizvodnju IL-6 kada su stimulisani sa IL-17A ili 1L-17F, što ukazuje da je IL-17RC esencijalni receptor za funkcije posredovanja IL-17A i IL-17F. Sledeći C. rodentium inokulacija, IL-17RC<-/->miševi i divlje supe su preživeli tok zaraze bez značajnog gubitka težine (slika 2D) ili bilo kakvih histoloških razlika u debelom crevu (podaci nisu prikazani).

[0271] Ovi rezultati ukazuju da putevi IL-17A i IL, -17F nisu potrebni za odbranu domaćina C. rodentium infekcija, direktno isključujući mogućnost da je defektna proizvodnja 1L-17 glavni uzrok posmatrane smrtnosti u IL-6<-/->miševi. Tako, odložena indukcija IL-22 primećena u IL-6<-/->miševi su možda bili razlog zašto su ovi miševi bili nesposobni za preživljavanje infekcije. Ipak, drugi faktori nizvodno od IL-6 mogu biti važni. Rezultati IL-6<-/->miševi ukazuju na to da rana indukcija IL-22 može biti kritična da domaćin ima dovoljno odgovora C. rodentium infekcije radi sprečavanja smrtnosti.

Primer 3: IL-22 igra ključnu ulogu u ranoj fazi bakterijske infekcije.

[0272] Da bi se utvrdilo da li je rana indukcija IL-22 kritična da domaćin ima dovoljno odgovora C. rodentium infekcija kako bi se sprečila smrtnost, anti-IL-22 neutralizirajuće antitelo se administriralo svakog drugog dana, počevši od dana 0 ili na dan 8 nakon inokulacije C. rodentium. Kao što se očekivalo, miševi koji su primali anti-IL-22 mAb istovremeno sa bakterijskom inokulacijom nastavili su da gube težinu, a svi su postali umorni ili umrli 12 dana nakon inokulacije. Nasuprot tome, preživele su sve tretirane životinje koje kontrolišu antitelo (Slika 2E). Miševi koji su primili anti-IL-22 mAb počevši od 8 dana nakon inokulacije imali su sličan ishod kao i miševi sa lečenjem izotipa mAb, uz potpun oporavak od infekcije.

[0273] Stoga, ovi podaci ukazuju da IL-22 igra ključnu ulogu u ranoj fazi C. rodentium ali ne igra ulogu u kasnijoj fazi odbrane domaćina kada se bakterije iskorišćavaju.

Primer 4: IL-19, IL-20 i IL-24 mogu se odbaciti za odbranu domaćina od bakterijske infekcije.

[0274] Ostali IL-10 familiji citokini, IL-19, IL-20 i IL-24, svi indukuju slične biološke funkcije kao i oni indukovani IL-22 u ljudskim epidermalnim keratinocitima (S. M. Sa i ostali, J Immunol 178, 2229 (15. februar, 2007).). IL-19, IL-20 i IL-24 su se tokom vremena regulisali u kolutu mišića divljine C. rodentium infekcija (slika 6). Stoga, oni mogu igrati sličnu ulogu kao i IL-22 tokom C. rodentium infekcija. IL-19 signalizira preko lanaca IL-20Rα i 1L-20Rβ. IL-20 i IL-24 mogu signalizirati kroz dva različita parova receptora, IL-20Rα/IL-20Rβ i IL-22R/IL-20Rβ (J.-C. Renauld, Nature Reviews Immunology 3, 667 (2003)). Prema tome, IL-20Rβ je zajednički lanac receptora za ove tri citokine. U GI traktu, ekspresija IL-20Rα i IL-20Rβ lanaca bila je značajno niža od ekspresije ovih lanaca u koži (slika 7).

[0275] Da kritički adresira ulogu ovih tri citokina u toku C. rodentium infekcija, IL-20Rβ<-/->miševi su generisani (slika 8). Ovi miševi su pokazali normalan razvoj sa sličnim sastavom limfocita i razvojem u svim glavnim limfoidnim organima u poređenju sa miševima sa divljinom (podaci nisu prikazani). Ušna koža ovih miševa nije uspela da reguliše S100 porodične proteine kada se tretira sa rekombinantnim IL-20, što ukazuje na defekt u signalizaciji IL-20 in vivo (Slika 8C).

[0276] IL-20Rβ<-/->miševi su preživeli C. rodentium (Slika 2F), pokazujući da IL-19, IL-20 i IL-24 mogu biti odbačeni za odbranu domaćina protiv C. rodentium.

Primer 5: Deficijencija IL-22 može ugroziti epitelni integritet tokom rane faze C. rodentium infekcija.

[0277] Sadašnji pronalazači su ispitali nizvodne mehanizme IL-22 tokom C. rodentium infekcija. Oba 1L-22<-/->miševi i miševi koji su bili tretirani anti-IL-22 mAb na dan 0 razvili su tešku krvavu prolivu i povećali incidencu prolapsa rektuma u poređenju sa kontrolnim mišem 8-dnevna inokulacija C. rodentitm (podaci nisu prikazani). Kolone iz IL-22<-/->miševi (podaci nisu prikazani) ili mišiće za lečenje anti-IL-22 mAb dnevno su zgušnute i skraćene 10 dana nakon inokulacije (Slika 3A), kao i imaju manju cecum u poređenju sa kontrolnim mišem. Histološka analiza dalje je otkrila povećano upalu u kolonama bez signalizacije IL-22 (slika 3B). Takođe su obilježena multifokalna ulceracija sluzokoža i višestruki žarište transmuralnog upala u oba IL-22<-/->i anti-IL-22 mAb tretiranih miševa (slika 3C i slika 9). Pored toga, bakterijska opterećenja u mezenteričnom limfnom čvoru, slezinu i jetri IL-22<-/->miševi su značajno povećani u poređenju sa onima kod divljih miševa. Interesantno je razlika u bakterijskim opterećenjima u kolonima miševa divljeg tipa i IL-22<-/->miševi su zanemarljivi (slika 3). U skladu sa ovim rezultatima, postojali su i dokazi o sistemskom širenju bakterija, naročito u jetri IL-22<-/->miševi, gde je očigledna multifokalna hepatocelularna nekroza sa emboličnom mikroabsestacijom (slika 3E).

[0278] U zaključku, ovi podaci ukazuju na to da je epitelni integritet kompromitovan u IL-22<-/->miševi u ranoj fazi C. rodentium infekcija.

Primer 6: deficijent IL-22 dovodi do smanjenja anti-bakterijskih titara IgG

[0279] Prethodne studije utvrdile su suštinsku ulogu anti-C. rodentium antitela u klirensu bakterija. Prenos seruma od miševa divlje tipove nakon infekcije potpuno spašen CD4<-/->miševi od smrti C. rodentium izazov (10). U našim istraživanjima, miševi sa deficijentnim IL-22 postali su umorni ili umrli počevši oko dana 8, kada odgovori antitela nisu bili potpuno razvijeni kod miševa sa divljim tipom (slika 3F). Na dan 8, anti-C. rodentium Titri antitela su 50 puta manji od onih na dan 16 u miševima divljine. Međutim, kada smo upoređivali titare anti- C. rodentium antitela na dan 8 od divljine i IL-22<-/->miševi, postojalo je neočekivano značajno smanjenje anti- C. rodentium IgG titer u IL-22<-/->miševi u poređenju sa onima kod miševa sa divljim tipom (slika 3). Nasuprot tome, nije bilo smanjenja ukupnog IgG, IgM, IgA ili anti-C. rodentium IgM i IgA titri u IL-22<-/->miševi (slika 10A i podaci nisu prikazani). Nadalje, analiza podtipa IgG otkrila je da, dok nije bilo anti-C. rodentium IgG1 ili u divljini ili IL-22<-/->miševi 8 dana nakon inokulacije, drugi anti- C. rodentium IgG podtipovi, uključujući IgG2a, IgG2b, IgG2c i IgG3, bili su značajno smanjeni u It-22<-/->miševi (Slika 10B). Nije bilo verovatno da su razlike u antibakterijskim specifičnim IgG doprinijele očuvanju C. rodentium od debelog creva u ovom trenutku, naročito zato što IgG nije ciljana na lumen mukoznog kolona i bakterijska opterećenja kolona u oba divljina i IL-22<-/->miševi su slični (slika 3). Moguće je, iako je to kružno anti-C. rodentium IgG može biti važan u kontroli penetracije C. rodentium preko crevne epitelne barijere i sprečavanja sistemskog širenja, s obzirom da nedavna studija pokazuje da je potreban cirkulišući IgG, ali ne sekretorni IgA ili IgM za sistemski klirens C. rodentium (C. Maaser i sar., Infect. Immun.72, 3315 (1. juna, 2004)). Kako IL-22 nedostatak dovodi do smanjenja anti-bakterijskih titara IgG je nejasan. Malo je verovatno da IL-22 direktno deluje na B ćelije, jer ekspresija IL-22R nije detektibilna na B ćelijama (S. Lecart i dr., Int. Immunol.14, 1351 (1. novembar, 2002)). Bez obzira na to, C. rodentium IgG može biti jedan od faktora koji doprinose neispravnom odgovoru odbrane domaćina u IL-22<-/->miševi tokom C. rodentium infekcija.

Primer 7: IL-22 je bio neophodan za indukciju antimikrobnih lektina, kao što su RegIIIβ i RegIIIγ, od epitijelnih ćelija kolona tokom infekcije bakterijama.

[0280] IL-22 tretman tkiva creva od neinficiranih miševa ek vivo upregulisali su mnoge antimikrobiološke proteine, uključujući S100A8, S100A9, RegIIIβ, RegIIIγ, haptoglobin, SAA3 i laktotransferrin analizom mikroorganizama (Sl.4A, 19 i 20). Indukcija ovih proteina potvrđena je RT-PCR u realnom vremenu (slika 4B i podaci nisu prikazani). U toku C. rodentium infekcije, međutim, samo S100A8, S100A9, RegIIIβ i RegIIIγ su diferencijalno izraženi u IL-22<-/->miševi u poređenju sa miševima sa divljim tipom (slika 4C). Svi ostali geni nisu bili indukovani ili nisu bili različiti u kolonima divljine protiv IL-22<-/->miševi (podaci nisu prikazani). Izrazi oba S100A8 i S100A9 bili su malo veći u kolonima IL-22<-/->miši nego što je to bilo u divjim kolonima dan 4. i 6. dan, što ukazuje na to da je diferencijalna ekspresija ovih proteina najverovatnije ne bila odgovorna za povećanu smrtnost koja je primećena u IL-22<-/->miševi tokom C. rodentium infekcija. Razlike nisu pronađene u ekspresiji defensina, proteina koji su važni u odbrani inficiranog epitela (T. Ganz, Science 286, 420 (October 15, 1999)), između divljine i iL-22<-/->miševi (podaci nisu prikazani). Zanimljivo je da je upregulacija RegIIIβ i RegIIIγ zabeležena kod miševa divljeg tipa potpuno ukinuta u IL-22<-/->posta miševa C. rodentium inokulacija (slika 4C), što ukazuje na to da ova dva proteina imaju potencijalne funkcije u kontroli C. rodentium infekcija. Oba RegIIIβ i RegIIIγ spadaju u porodicu sekretiranih proteina lektina C tipa (H. L. Cash, C. V. Whitham, L. V. Hooper, Protein Expression and Purification 48, 151 (2006)). RegIIIβ i RegIIIγ nivoi ekspresije dramatično se povećavaju u odgovoru na kolonizaciju bakterija, kao i nakon drugih inflamatornih stimulusa kod miševa (S. A. Keilbaugh i dr., Gut 54, 623 (May 1, 2005) H. Ogawa i dr., Inflammatory Bowel Diseases 9, 162 (2003) H. Ogawa, K. Fukushima, I. Sasaki, S. Matsuno, Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol 279, G492 (Sep, 2000)).

[0281] RegIIIβ ili RegIIIγ mogu sprečiti invaziju C. rodentium duboko u kriptografije kolona, jer ne vidimo razlike u bakterijskim opterećenjima od kolona IL-22<-/->protiv divljih miševa (slika 3). Alternativno, RegIIIβ ili RegIIIγ proteini mogu delovati kao autokrini faktori rasta koji igraju ulogu u epitelijalnom remontu i/ili zaštiti u postavljanju intestinalnog upale (H. Ogawa i dr., Inflammatory Bowel Diseases 9, 162 (2003); S. L. Pull, J. M. Doherty, J. C. Mills, J. I. Gordon, T. S. Stappenbeck, PNAS 102, 99 (January 4, 2005); V. Moucadel i dr., Eur J Cell Biol 80, 156 (Feb, 2001)).

Primer 8: Adaptivni imunitet nije od suštinskog značaja za zaštitu od ranog domaćina protiv IL-22 C. rodentium infekcija

[0282] Navedeni podaci su predložili uloge IL-22 u oba urođenog imuniteta i adaptivnog imuniteta. Zbog toga smo koristili rekombinaciju koja aktivira defektni gen 2 (Rag2<-/->) miševi da kritički ispitaju funkciju IL-22 u urođenom i adaptivnom imunitetu tokom C. rodentium infekcija. Rag2<-/->miševi su postepeno izgubili težinu i na kraju su postali umorni ili umrli oko 30 dana, zbog nedostatka B i T ćelija, a njihova posledična nesposobnost montiranja anti- C. rodentium odgovori antitela (slika 13A). Za razliku od p19<-/->ili IL-22<-/->miševi, nijedan od Rag2<-/->miševi su izgubili više od 10% telesne težine ili su umrli tokom prve dve nedelje infekcije. Nadalje, Rag<-/->miševi tretirani sa anti-IL-22 mAb veoma brzo su izgubili težinu (slika 13A), slično miševima VT tretiranim anti-IL-22 mAb (Slika 2E). All Rag<-/->miševi tretirani sa anti-IL-22 mAb postali su umorni ili umrli oko dana 10 (slika 13). Ovi podaci sugerišu da je put IL-22 i dalje aktivan u Rag2<-/->miševi i da je IL-22 neophodan da zaštiti miševe od smrti tokom rane faze C. rodentium infekcija u odsustvu adaptivnog imuniteta. Ovi podaci takođe ukazuju na smanjenje anti- C. rodentium Titri IgG-a nisu bili dovoljni uzroci za morbiditet i mortalitet primećeni u IL-2<-/->miševi sledeće C. rodentium infekcija, kao nedostatak proizvodnje antitela u Rag2<-/->sami miševi nisu uzrokovali brz gubitak težine i ranu smrt nakon infekcije.

[0283] IL-22 proizvodnja u Rag2<-/->miševi su uporedivi s mišićima VT sledeće C. rodentium infekcija (slika 13B). Nasuprot tome, indukcija IL-17A je značajno smanjena u Rag2<-/->miševi (slika 13B i C). T ćelije i B ćelije, dakle, nisu bili izvor IL-22 u ovom modelu. Imunohistokemijsko bojenje sa anti-IL-22 mAb (slika 15) otkrilo je IL-22 pozitivne ćelije u debelom crevu VT miševa inficiranih sa C. rodentium, ali ne u neinficiranom debelom crevu ili debelom crevu od inficiranih IL-22<-/->miševi. IL-22 pozitivne ćelije su prvenstveno koalicizovane sa CD11c+ klasteri ćelija u debelom crevu Rag2<-/->miši (slika 13D), ali ne sa F4/80, Gr-1 ili DKS5 pozitivnim ćelijama (podaci nisu prikazani). Pored toga, IL-23 indukuje IL-22 proizvodnju direktno iz CD11c+ DCs in vitro (Slika 13E). Uzeti zajedno, naši podaci pokazuju da su DC-ovi jedan od glavnih izvora proizvodnje IL-22 tokom C. rodentium infekcija, i da IL-23 može direktno promovisati IL-22 proizvodnju iz DC.

Primer 9: RegIII igra važnu ulogu tokom bakterijske infekcije.

[0284] Zanimljivo je da je uzlazni RegIIIβ i RegIIIγ zabeležen kod miševa divljeg tipa potpuno ukinut u IL-22<-/->miševi (slika 4C), kao i kod p19<-/->miševi, (slika 16) post C. rodentium inokulacija. RegIIIβ i RegIIIγ spadaju u porodicu sekretiranih proteina lektina C tipa. Utvrdili smo da su i drugi članovi porodice, uključujući RegI, RegII, RegIIIa i RegIIIδ (Slika 17), ali ne i RegIV (podaci nisu prikazani), takođe regulisani u C. rodentium inficiranih kolona i da je njihova indukcija potpuno ukinuta u IL-22<-/->miševi. Ekogenični RegIIIg fuzijski protein (rmRegIIIγ značajno je zaštićen IL-22<-/->miševi od gubitka težine izazvanih C. rodentium infekcija i oko 50% rmRegIIIγ tretiranih životinja iz fuzionog proteina preživelo je infekciju, dok je 100% kontrolisanog IL-22<-/->miševi su umirali ili umrli (Slika 14A). Ovi podaci podržavaju hipotezu da Reg proteinovi proteini, kao što je RegIIIγ, posreduju osnovnim funkcijama u kontroli C. rodentium infekcija nizvodno od IL-22.

[0285] Konačno, prisustvo IL-23/IL-22/Reg osi je takođe potvrđeno u ljudskom sistemu. Humani IL-23 indukuje hIL-22 proizvodnju iz humanih DC (slika 14B). Primarne epitelne ćelije čoveka (slika 12B) i epitelne ćelijske linije čoveka, HT29 i HCT15, eksprimiraju IL-22R (Slika 14C). In vitro, primarne ćelijske epitelne ćelijske epitelne ćelije porasle su polako i postepeno su izgubile ekspresiju IL-22R tokom ekspanzije (podaci nisu prikazani). Stoga smo koristili epitelne ćelijske linije kolona da testiramo njihov odgovor na humani IL-22. IL-22 indukovana STAT3 aktivacija u ovim epitelnim ćelijskim linijama kolona (slika 14D), i oba RegIIIβ i RegIIIγ su značajno indukovana IL-22 (slika 14E). Važno je da je humani RegIIIg fuzijski protein (rhRegIII), poput rmRegIIIγ fuzionog proteina, takođe smanjio smrtnost IL-22<-/->miševi, do 40% sledeće C. rodentium infekcija, u poređenju sa 100% mortalitetom kontrolisanog tretiranog IL-22<-/->miševi (slika 18). U zaključku, naši podaci podrazumevaju da put IL-22 može igrati ključnu ulogu u kontroli bakterijskih infekcija, posebno A/E bakterijskih infekcija, u ljudskom GI traktu.

Rezime

[0286] Sadašnji pronalazači ovde pokazuju da IL-22 igra neophodnu ulogu u ranoj odbrani domaćina od priklanjanja i uklanjanja (A/E) bakterijskih patogena.

[0287] Podaci pokazuju da IL-22 štiti integritet intestinalne epitelne barijere i sprečava invaziju bakterija sistemskim širenjem kroz dva mehanizma. Prvo, IL-22 je uključen u izazivanje ranih anti-bakterijskih IgG reakcija. Drugo, IL-22 je neophodan za indukciju antimikrobnih lektina, kao što su RegIIIβ i RegIIIγ, od epitijelnih ćelija kolona tokom bakterijske infekcije. Nedostatak oba ili oba ova mehanizma može doprineti kompromitovanom odgovoru odbrane domaćina sa povećanim sistemskim širenjem i mortalitetom IL-22<-/->miševi tokom C. rodentium infekcija.

[0288] Dok su adaptivni imuni odgovori neophodni za čišćenje ovih patogena (L. Bry, M. B. Brenner, J Immunol 172, 433 (January 1, 2004)), citokini kao što je IL-22 koji su proizvedeni od strane imunih ćelija u ranim stadijumima infekcije su takođe neophodni za intestinalne epitelne ćelije da izazovu potpun anti-mikrobiološki odgovor i reakciju zarastanja rana kako bi se sprečila sistemska invazija 'patogenih bakterija u host. Kao što je prikazano ovde, indukcija RegIIIβ i RegIIIγ takođe pokazuje da IL-22 može imati šire funkcije u kontroli različitih bakterijskih infekcija. Podaci dalje podržavaju ulogu Th17 ćelija i njihovih efektorskih citokina kod zaraznih bolesti i autoimunih bolesti. Konačno, sadašnje studije pokazuju da IL-22 i njegovi nizvodni proizvodi, kao što su RegIIIβ i RegIIIγ, mogu biti korisni za lečenje određenih zaraznih bolesti.

Materijali i metode

Miševi

[0289] C57B1/6, IL-12p40<-/->, i IL-6<-/->miševi su kupljeni iz laboratorije Jackson. IL-22<-/->miševi i IL-12p19<-/->su generisane kao što je ranije opisano (11, Sl.5). IL-17RC<-/->i IL-20Rβ<-/->miševi su generisani Lekicon Pharmaceuticals (The Voodlands, TKS) koristeći opisane strategije (Sl. 5 i Sl.8). Ukratko, noktirani miševi su napravljeni standardnom homolognom rekombinacijom pomoću prikazanih vektora ciljanja. Vektori ciljanja su elektroporirani u 129 ćelija ES ćelija i identificirani su ciljani kloni. Ciljani klonovi se mikrointektuju u blastociste domaćina da bi proizveli hime. Himeri se uzgajaju sa C57B1/6 životinjama za proizvodnju F1 heterozigota. Heterozigoti se prepletaju kako bi se proizveli F2 divlji tip, heterozigot i homozigotne kohorte. Miševi koji su korišćeni u ovim istraživanjima su genotipirani pomoću DNK repa preko PCR koristeći bazu sa tri prajmera. Primeri koji se koriste za amplifikaciju alela vild-tipe IL-20Rβ<-/->miševi su bili 5'GTG GAA GCT ACT TGA TGA GTA GGG-3 '(p1) i 5'-AGA TGC GAA AAT GGA GAT TAA AAG-3' (p2), što je dalo proizvod od 595 b.p. Primeri koji se koriste za mutantnu amelifikaciju alela IL-20Rβ<-/->miševi su bili 5'-CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AG-3 '(p3) i p2, što je dalo 351 bp produkt. Primeri koji se koriste za amplifikaciju alela vild-tipe IL-17RC<-/->miševi su bili 5'-GAG CCT GAA GAA GCT GGA AA-3 '(P3) i 5'-CAA GTG TTG GCA GAG ATG GA-3' (P2), što je rezultiralo proizvodom od 534 bp. Primeri koji se koriste za amplifikaciju mutantnog alela IL-17RC<-/->miševi su bili 5'-TCG CCT TCT TGA CGA GTT CT-3'(P1) i P2, što je dalo proizvod od 404 b.p.

Bakterijski sojevi i infekcija miševa

[0290] 6-8 nedelja starih miševa je postojao 8 sati pre oralne inokulacije sa 2x109 C. rodentium soj DBS100 (ATCC 51459; American Tipe Culture Collection) u ukupnoj zapremini od 200 μl po mišu. Dok su posti, životinje imale pristup vodi. Inokulacija i sve naknadne manipulacije su sprovedene u BL-2 biosafetnim ormarićima. Životinjama je omogućeno pristup prehrani nakon inokulacije. Bakterije su pripremljene inkubacijom sa stresanjem na 37°C preko noći u LB brodici. Relativna koncentracija bakterija je procenjena merenjem apsorbance na OD600, a svaka inokulacijska kultura je serijski razblažena i obložena kako bi se potvrdila primena CFU.

Zbirka tkiva, histologija i CFU broj

[0291] Kontrolni ili zaraženi miševi su inokulirani kako je opisano. U aseptičkim uslovima uklonjeni su uzorci cele krvi, slezine, jetre, mezenteričnog limfnog čvora i debelog creva. Debelo crevo je prosečeno u analni kanal, a terminalni 0,5 cm komad korišćen je za CFU analizu. Proksimalni segmenti bili su fiksirani u 10% neutralnom puferovanom formalinu. Sekcije su obojane pomoću H & E-a za procenu patološke tkiva. Mlijecana, jetra, mezenterični limfni čvor i debelo crevo su stečeni i homogenizovani. Homogenati su serijski razblaženi i pokriveni u triplikatima za MacConkei agar (Remel). C. rodentium Kolonije su identifikovane kao roze kolonije. Kolonije su prebrojane nakon 24 h inkubacije na 37°C da bi se odredio dnevnik 10 CFU po gramu tkiva.

Izolacija RNK i RT-PCR u realnom vremenu

[0292] RNeasi Mini Kit (Kiagen) je izolovan ćelijski i tkivni RNA u skladu sa pravcima proizvodnje. Real-time RT-PCR je sproveden na ABI 7500 u realnom vremenu PCR sistem (Applied Biosistems) sa prajmerima i sondama pomoću reaktora RT-PCR master-miksera u jednom koraku (Applied Biosistems). Sekvence za prajmere i sonde su sledeće: mIL-22, napred, 5'-TCC GAG GAG TCA GTG CTA AA-3 ', reverse, 5'-AGA ACG TCT TCC AGG GTG AA-3' i sonda, 5 '-TGA GCA CCT GCT TCA TCA GGT AGC A-3' (FAM, TAMRA); 5A-ACC TCA ACC GTT CCA CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC CGT CAC 3 '(FAM, TAMRA); miš RIBOSOMAL GENS RPE-19, napred, 5'-GCA TCC TCA TGG AGC ACA T-3 ', reverse, 5'-CTG GTC AGC CAG GAG CTT-3' i sonda, 5'-CTT GCG GGC CTT GTC TGC CTT-3 '(FAM, TAMRA); mIL-19, napred, 5'-AGC CTG GAT TGA CAG GAA TC-3 ', reverse, 5'-GAT AAT CAG ACG AGG CGT TTC-3', i sonda, 5'-TCT GGA AAC TCC TGC AGC CTG ACA C-3 '(FAM, n 5' TTT GGG AGA ACT AGG CAT TCT T-3 ', reverse, 5'-TCT TGG ACA GGA GTG TTC TCA-3 i sonda, 5'-CAG CCT CTC CAC TTT CAT CTA TAG CAT CTC C-3 '(FAM, TAMRA); mIL-24, napred, 5'-GCT CTC CAT GCC ATT TCA A-3 ', reverse, 5'-TGG CCA AGG GTC TGA AGT-3', i sonda, 5'-TGT ACA TCC CTG CTG TCC TCA AGG C -3 '(FAM, TAMRA); MIT-6, napred, 5'-TCC AAT GCT CTC CTA ACA GAT AAG-3 ', reverse, 5'-CAA GAT GAA TTG GAT GGT CTT G-3', i sonda, 5'-TCC TTA GCC ACT CCT TCT GTG ACT CCA-3 '(FAM, TAMRA); mS100A8, napred, 5'-TGT CCT CAG TTT GTG CAG AAT ATA AA-3 ', reverse, 5'-TCA CCA TCG CAA GGA ACT CC-3', i sonda 5'-CGA AAA CTT GTT CAG AGA ATT GGA CAT CAA TAG TGA-3 '(FAM, TAMRA); mS100A9, napred, 5'-GGT GGA AGC ACA GTT GGC A-3 ', reverse, 5'-GTG TCC AGG TCC TCC ATG ATC-3', i sonda, 5'-TGA AGA AAG AGA GAA ATG AAG CCC TCA TAA ATG-3 '(FAM, TAMRA); mRegIII, napred, 5'-ATG GCT CCT ATT GCT ATG CC-3 ', reverse, 5'-GAT GTC CTG AGG GCC TCT T-3' i sonda, 5'-TGG CAG GCC ATA TCT GCA TCA TAC C- 3 '(FAM, TAMRA); mPAP/HIP/RegIIIβ, napred, 5'- ATG GCT CCT ACT GCT ATG CC-3 ', reverse, 5'-GTG TCC TCC AGG CCT CTT T-3' i sonda, 5'-TGA TGC AGA ACT GGC CTG CCA-3 '(FAM, TAMRA); mIL-12p40, napred, 5'-ACA TCT ACC GAA GTC CAA TGC A-3 ', reverse, 5'-GGA ATT GTA ATA GCG ATC CTG AGC-3', i sonda, 5'-TGC ACG CAG ACA TTC CCG CCT-3 '(FAM, TAMRA); mIL-23p19, napred, 5'-GGT GGC TCA GGG AAA TGT-3 ', reverse, 5'-GAC AGA GCA GGC AGG TAC AG-3' i sonda, 5'-CAG ATG CAC AGT ACT CCA GAC AGC AGC -3 '(FAM, TAMRA); mIL-20Rβ, napred, 5'-CAG GTG CTT CCA GTC CGTCT-3 ', reverse, 5'-CTC TCC TGG AAT CCC CAA AGT-3', i sonda, 5'-CAG CAC AGA TGC CAA CGG CCT CAT- 3 '(FAM, TAMRA); 5A-TCT GCT GCT TCG GGA CGC-3 ', reverse, 5'-AAC CAC AGA AGA CAC AAG GAA CTG-3', i sonda, 5'-TCT GCT GCT GGC CGC TTC GG- 3 '(FAM, TAMRA); MIG-22R, napred, 5'-GCT GGA CTC CCT TGT GTG T-3 ', reverse, 5'-CAC ATG GCC TCA GTC TCA A-3', i sonda, 5'-CGC GGG ACC CTC ATC CTT TAG- 3 '(FAM, TAMRA); MIG-10Rβ, napred, 5'-TCC ACA GCA CCT GAA GGA GTT-3 ', reverse, 5'GGA GGG AAG GAG AAC AGC AGA-3', i sonda, 5'-TGG GCC ACC CCC ATC ACA GC- 3 '(FAM, TAMRA). Reakcije su se odvijale u duplikatima i uzorci su normalizovani u kontrolni kućni geni RPL-19 i prijavljeni u skladu sa metoda:

Ig ELISA

[0293] Analizi su izvedeni na serumu od sakupljene cele krvi kao što je ranije opisano (10). Ukratko, ELISA ploče (Nunc) su premazane toplotom C. rodentium ili sa kozom anti-mouse Ig capture Ab razređenim 1/1000 u PBS (SouthernBiotech). Obložene ploče su isprane u PBS plus 0,05% Tveen 20, blokirane 1 h sa 300 μl blokirajućeg pufera (PBS 0,5% BSA 10 PPM Proclin) i isprane pre dodavanja serijski razblaženih standarda (monoklonalni IgA IgG, IgG, IgG3, i IgM iz SouthernBiotech, IgG1, IgG2a i IgG2b izotipa iz Sigma-Aldrich-a, IgG2c miša dobijenog od Betil laboratorija) ili nepoznatih. Uzorci su inkubirani 4 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane pet puta i otkriveni su Igotipovi sa IgM IgM, IgM, IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c i IgG3 (SouthernBiotech) kozje anti-mišje konjugirane sa hrenom peroksidazom (HRP), razblažene 1/4.000 u razblaživaču (PBS 0,5% BSA 0,05% Tveen 20 10 PPM Proclin, pH 7,4) i inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle pranja, svaka bunar je dodata TMB peroksidazni supstrat i dopušteno je da se razvija 15 minuta, a zatim se za svaki bunar dodaje dodatni rastvor (1 M fosforna kiselina). Apsorbancija je očitana na 450 nm u molekularnim uređajima (Sunnivale, CA) čitač ploča na OD450.

In vitro kultura kolona

[0294] Kolone su uklonjeni sa C57Bl/6 miševa. Posle čišćenja sa hladnim PBS, kolone su urezane uzdužno. Koloni su stavljeni u 100-milimetarsku petrijevu posudu sa 10ml HBSS (Mediatech) puferom koji sadrži 2,5 mg/ml Fungizone-Amphotericin B, 10 μg/ml Gentamicin, 100 U/ml Penicilina i 100 mg/ml Streptomicin (svi iz GIBCO, Invitrogen). Koloni su nežno očišćeni da uklone sluz na ivici Petri jela i prebačeni su u novu Petri jelo sa svežim HBSS baferom. Kolone su sečene na 1-2 mm komada i prebačene u ploču sa 24 rupe i 50 mg kolona/1 ml/bunar u RPMI puferu, koji sadrži 10% toplotnoaktiviranog FCS (HiClone), 2,5 mg/ml Fungizone-Amphotericin B, 10 μg/ml gentamicina, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina i 100 μg/ml streptomicina. 10 mg/ml IL-22 (sistemi za istraživanje i razvoj) su dodati u kulturu i inkubirali u 37°C tokom 24 časa.

Analiza mikroorganizama

[0295] Količina i kvalitet ukupnih uzoraka RNK određen je pomoću spektrofotometra ND-1000 (Nanodrop Technologies) i Bioanalizer 2100 (Agilent Technologies), respektivno. Metod pripreme cRNA označene c-DNA i hibridizacija nizova obezbedio je Agilent Technologies. Ukratko, ukupni uzorak RNK pretvoren je u dvostruku cDNK, a potom u cIRNA označenu cIRNA sa pomoću Agilentovog Fluorescentnog linijskog amplifikacionog kompleta za uvođenje niske RNK. Označena cRNA je prečišćena pomoću RNeasi mini kit (Kiagen). prinos cRNK i inkorporacija Ci-die su određeni pomoću ND-1000 spektrofotometra. 750 ng označene cRNK je fragmentovano i hibridizovano do Agilentovog genoma Vhole Mouse Genoma kao što je opisano u kitu In-situ hibridizacije kit-plus. Svi uzorci su označeni sa Ci5 i hibridizovani sa oznakom univerzalne referencije miša sa Ci3 (Stratagene). Prateći hibridizaciju, nizovi su isprani, osušeni i skenirani na Agilentovom DNK skeneru mikro rama. Softver Agilent's Feature Ektraction 8.5 je korišćen za analizu stečenih slika u nizu. Za grupisanje podataka mikrostrukture (slika 20), podaci o ekspresiji su obrađeni u Agilent log-ratio podatke standardnim metodama. Odabrani geni su grupisani iterativnom aglomeracijom vektora koji su najviše povezani Pearsonovim koeficijentom korelacije, sa podacima za aglomerirane vektore sumirane srednjim vezama.

Fibroblastna kultura i stimulacija in vitro miša

[0296] Da se uspostavljaju fibroblasti repa (TTF), repi iz IL-17RC<-/->odrasli miševi i legla od divljih vrsta su oljušteni, mleveni na 1 cm komade, stavljeni na posude za kulturu i inkubirani u visokoj koncentraciji glukoze DMEM (sadrži 10% FCS, 2 nm glutamina, 100 U/ml penicilina i 100 μg/ml streptomicina) za 5 dana. Ćelije koje su migrirale iz delova grafta prebačene su na nove ploče (pasus 2) i održavaju se u istom mediju. TTF-ove smo koristili u pasusu 3 za stimulativne eksperimente. TTF-i su slepljeni u ploču sa 24 lima sa gustinom od 1.2k105 po bunaru. Dvadeset i četiri sata nakon zasejavanja, rekombinantni mišji IL-17A i IL-17F (sistemi za istraživanje i razvoj) su dodati u medijum za kulturu u različitim koncentracijama. Supernatant ćelijske kulture je sakupljen 24 sata nakon dodavanja citokina i nivoa murinskog IL-6 izmerenog pomoću enzimskog imunosorbentnog testa (ELISA) pomoću IL-6 ELISA seta (BD Biosciences) po uputstvima proizvođača.

Blokiranje mišjeg IL-22 in vivo

[0297] Blokiranje anti-mišeg IL-22 (Clone 8E11, izotipni miš IgG1) mAb (11) intraperitonealno ubrizgavana pre (Dan 0) ili 8 dana nakon (Dan 8) C. rodentium infekcije u dozi od 150 mg/miš svakog drugog dana. Određena kontrolna grupa je takođe primila izotipsku kontrolu IgG1 mAb.

Statistika

[0298] Statistički značaj izračunat je jednosmerno ili dvosmerno ANOVA koristeći softver Prism (GraphPad). Sve str vrednosti ≤ 0,05 smatraju se značajnim i indikativne su u tekstu. Ako nije drugačije naznačeno, sve studije za koje su predstavljeni podaci su reprezentativni za najmanje dva nezavisna eksperimenta.

[0299] Iako je prethodni pronalazak detaljno opisan ilustrovanjem i primerom radi jasnoće razumevanja, opisi i primeri ne treba tumačiti kao ograničavajući obim pronalaska.

Primer 10: LT putanje je posredovano IL-22 tokom Citrobacer rodentium infekcija.

[0300] Da bi se utvrdilo da li je IL-22 važan za mortalitet uzrokovanu LT blokadom, izvršili smo eksperimente za spasavanje u kojem smo istovremeno izlagali IL-22 u mišu pri lečenju LTbR-Fc. Metoda koju smo koristili za ekspresiju IL-22 bila je hidrodinamička dostava plazmidne DNK koja kodira miš IL-22. Ljudski LTbR-Ig je konstruisan na sledeći način: humani LTbR koji obuhvata ekstracelularni domen (pozicija 1 do položaja 224; SEQ ID NO: 57) je kloniran u modifikovanog vektora pRK5 koji kodira humani IgG1 Fc region (SEQ ID NO: 58) nizvodno LTbR sekvence. Proteini su prekomerno izraženi u CHO ćelijama i prečišćeni proteinskom afinitetnom hromatografijom. Murine LTbR.1g je konstruisan na sledeći način: murin LTbR koji obuhvata ekstracelularni domen (pozicija 1 do pozicije 222; SEQ ID NO: 59) je kloniran u modifikovani vektor pRK5 ekspresije koji kodira murinski IgG2a Fc region (SEQ ID NO: 60) nizvodno LTbR sekvence.

[0301] Na slici 21 nalazimo da LTbR-Fc proizvodi sličnu krivu gubitka težine (Slika 21 desnog panela) i krivu smrti (Slika 21 levi panel) do blokade IL-22 što nas je dovelo da ispitamo odnos između LT i IL-22. C. rodentium infekcija dovodi do ranog izražavanja IL-22 u debelom crevu.

[0302] Slika 21 prikazuje procenat preživljavanja miševa sa inokuliranim Citrobacter rodentium. 6-8 sedmično Balb/c miši su postli 8h pre oralne inokulacije sa 2x109 C. rodentium soj DBS100 (ATCC 51459; American Tipe Culture Collection) u ukupnoj zapremini od 200 μl po mišu. Dok su posti, životinje imale pristup vodi. Inokulacija i sve naknadne manipulacije su sprovedene u BL-2 biosafetnim ormarićima. Životinjama je omogućeno pristup prehrani nakon inokulacije. Bakterije su pripremljene inkubacijom sa stresanjem na 37°C preko noći u LB brodici. Relativna koncentracija bakterija je procenjena merenjem apsorbance na OD600, a svaka inokulacijska kultura je serijski razblažena i obložena kako bi se potvrdila primena CFU. Na dan inokulacije miševi su takođe injektirani sa 150g anti-gp120 mAb, anti-IL-228E11 mAb ili LTbR-Fc 3 puta nedeljno.

[0303] LT putanje reguliše višestruke uzvodne aspekte koji su važni za proizvodnju IL-22. Slika 22 prikazuje podatke o putu LT nakon infekcije C. rodentium. A, C, E. Koloni su uzimani u različitim vremenskim intervalima nakon infekcije C. rodentium. Miševi su injektirani sa 150g anti-gp120 ili LTbR-Fc svakog drugog dana. RNA je ekstrahovana pomoću Kiagen RNeasi Kit. Takmanova analiza je izvedena da bi se odredila ekspresija IL-22, RegIIg, p19 ili p40 u odnosu na vremenski period 0 dana. B. 4. dan nakon infekcije, kolone su sakupljene. Posle čišćenja sa hladnim PBS, kolone su urezane uzdužno. Kolone su postavljeni u 100-milimetričnu Petrijevu posudu sa 10 ml HBSS (Mediatech) pufera koji sadrži 2,5 mg/ml Fungizone-Amphotericin B, 10 μg/ml Gentamicin, 100 U/ml Penicilina i 100 mg/ml Streptomicin (svi iz GIBCO, Invitrogen). Koloni su nežno očišćeni da uklone sluz na ivici Petri jela i prebačeni su u novu Petri jelo sa svežim HBSS baferom. Kolone su sečene na komade 1-2 mm i prebačene u ploču sa 24 otvora sa 50 mg kolona/1 ml/bunar u RPMI puferu koji sadrži 10% toplotnoaktiviranog FCS (HiClone), 2,5 mg/ml Fungizone-Amphotericin B, 10 μg/ml gentamicina, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina i 100 μg/ml streptomicina. 10 ng/ml rmIL-22 (sistemi za istraživanje i razvoj) su dodati u kulturu i inkubirali u 37 ° C tokom 24 sata. Supernatanti su sakupljeni za IL-22 ELISA. D. ćelija lamina propria ćelija od 6 dana. DC određen CD11c+ i MHC II+. Kolone su sakupljene i isprane sa HBSS bez kalcijuma i magnezijuma (Invitrogen) sa 2% FBS i 10 mM HEPES-om. Kolone su bile produžene uzdužno, a zatim se presekle na komade od 2-4 cm, a komadi su premešteni na 10 cm posudu sa HBSS bez kalcijuma i magnezijuma, 2% FBS, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES i 1 mM DTT (Sigma-Aldrich). IEL frakcije se sakupljaju i odbacuju nakon 45 minuta inkubacije na 37°C dok se tresu na 200 obrtaja u minuti. Za izolaciju LPMC-a, preostali epitelni sloj je učvršćen, a delovi debelog creva bili su isečeni i stavljeni u RPMI koji sadrži 10% FCS, 20mM HEPES i 0,5 mg/ml kolagenaze/dispaze (Roche Diagnostics). Komadi komada su inkubirani tokom jednog sata na 37°C dok se tresu. Izolovane epitelne ćelije su isprane i korišćene za FACS analizu.

[0304] Na slici 22, utvrdili smo da je LTbR-Fc blokirao indukciju IL-22 kao i RegIIIg za koji se pokazalo da je indukovano IL-22 (Slika 22A-C). Dendritičke ćelije su prethodno pokazale da proizvode IL-22 i nađemo blago smanjenje DC brojeva u lamini proprii debelog creva 6 dana nakon infekcije (Slika 22D). Smanjenje IL-22 uzrokovane LTbR-Fc je najverovatnije zbog gubitka IL-23, s obzirom na to da su i p19 i p40 ekspresija inhibirani nakon lečenja LTbR-Fc tokom infekcije (slika 22E).

[0305] I L-22 delimično spašava defekte viđene kod lekova miševa koji tretiraju LTbR. Slika 23 daje podatke o efektu IL-22 na miševe tretirane LTbR-om. A. Test ekspresije IL-22 u serumu i RegIIIg u debelom crevu nakon injekcije plazmida IL-22. B. Spasavanje LTbRFc efekata sa plazmidom IL-22.

[0306] Na dan-1, životinje su stečene i grupisane, ekstra miševi su eutanizovani. Posle merenja, sve životinje su poste 14 h. Sledećeg jutra (dan 0) svi miševi su oralno inokulirani sa 2-4 Ks 10e9 CFU C. rodentijuma u 200 ul PBS. 150ug kontrolni mAb ili Fc fuzioni protein je injektiran i.p. u 200 pBS tri puta nedeljno dve nedelje počevši od istog dana kao i inokulacija bakterija. Hranu su zamenili istražitelji nakon inokulacije. Šest sati kasnije plazmidna DNK je ubrizgana repnom venom. Eksperimenti za injekciju vekne vene: 1) DNK konstrukt (pRK vektor ili pRK-mIL-22) je razblažen u Ringer-u do koncentracije kako bi se dobila konačna doza od 10 mikrograma/miš/injekcija.2) Svaki miš je injektiran intravenozno u vreću repa sa otprilike 1.6ml rastvora koji sadrži DNK u Ringerovom. 3) Doze su administrirane kao bolusna intravenska injekcija (repa vena) tokom perioda od 4-5 sekundi (maksimum 8 sekundi) za maksimalno uzimanje DNK. Miši su bez anestezije zadržavane u koiničnom akrilnom prekidaču sa grejnim elementom za povećanje telesne temperature i dilatiranje krvnih sudova. 4) Za svaku životinju koriste se jednokratni sterilni špricevi. Životinje su kontinuirano pratile sve dok nisu klinički normalni.5) Životinje su primećene za bilo koji neželjeni klinički znacaj za najmanje 20 minuta posle doze. Ako životinje nisu klinički normalne za 1 sat posle doze, oni su bili eutanizovani ili su nadgledani sve dok nisu klinički normalni. Životinje moribunde su eutanizovane. Sve manipulacije su izvedene u ormarićima za biosigurnost BL-2. Tokom infekcije, životinje umorne ili one koje pokazuju neadekvatan stres ili rektalni prolaps su eutanizovani.

[0307] Miševi su nadgledani 4 nedelje svakodnevno. Između 5 do 17 dana kada su miševi tretirani LTbR-Fc mogli postati umorni, miševi su nadgledani dva puta dnevno, uključujući i vikende. Fekalne pelete su sakupljene svake nedelje kako bi se merilo CFU od C. rodentium. Miševi su se merili jednom nedeljno tokom studije. Ako su miševi pokazali gubitak težine od 15% ili više, oni su se merili dnevno. Ako gubitak mase prelazi 20%, miševi su eutanizovani. Na kraju studije svi miševi su bili eutanizovani i slezeni, a kolona su sakupljena za histologiju, RNK ili FACS analizu.

[0308] Kao što je prikazano na slici 23A, možemo otkriti ekspresiju IL-22 u serumu miša koji počinje 2 sata posle injekcije, sa izrazom koji opada na 72 sata. Takođe možemo detektovati izraz RegIIIg u debelom crevu, što ukazuje na to da aktivni IL-22 može djelovati na debelo crevo kada se ispolji na ovaj način. IL-22 može delimično spasiti mortalitet i gubitak težine izazvanog lečenjem LTb-Fc tokom infekcije (slika 23B).

[0309] Lečenje miševa sa IL-22 mAb (8E11). Slika 24 pokazuje podatke koji pokazuju da tretman sa IL-22 mAb 8E11 dovodi do smanjenja folikula kolona, kompromitovanu organizaciju B/T ćelija i smanjenih brojeva ćelija DC, T ćelija i B ćelija. A. Šest dana nakon infekcije, kolone su se uzimali i rezali uzdužno. Posle 30 minuta inkubacije u HBSS bez kalcijuma i magnezijuma, 2% FBS, 1mM EDTA, 10mM HEPES i 1mM DTT, kolone su nežno očišćene da bi se uklonile epitelne ćelije. Folikuli su identifikovani kao bele, okrugle mase. Bilo je pet miševa po grupi i svaka kolona je brojana i plotirana kao ukupni nalazi folikula ili su pronađeni ukupni folikuli veći od 1mm. B. Šest dana nakon infekcije, kolone su isprane hladnim PBS i brzo zamrznute u OCT. Šest mikronske sekcije su sečene, osušene, a zatim fiksirane u acetonu. Sekcije su blokirane serumom od 10%, inkubirane sa anti-CD5 FITC i anti-B220 APC na 10 g/ml. Slike su snimljene na mikroskopu NIKON BKS61. C. Šest dana nakon infekcije ćelija lamina propria ćelija je izolovana na gore opisanom. FAC analiza je izvršena da bi se odredio broj dendritičnih ćelija, CD3 T ćelija i B ćelija nakon tretmana 8E11.

[0310] Kao što je prikazano na Slici 24, mi smo tretirali miševe sa IL-22 blokirajućim antitelom ili LTbR-Fc i prebrojali limfidne folikle u kolonu nakon šest dana nakon infekcije, kako bismo utvrdili da li IL-22 može imati ulogu u formiranju limfoidnih struktura debelog creva. Pronašli smo smanjenje folikula veću od 1mm, što ukazuje na to da IL-22 i LT mogu biti važni za povećanje veličine folikula nakon infekcije (slika 24A). Histološka analiza pokazuje da blokiranje IL-22 poremećaja T i B ćelijske zone folikla, dok LT blokada ima sličan efekat (slika 24B). Sledeće smo utvrdili da li blokada IL-22 dovodi do promene broja ćelija u lamini proprii kolona. Utvrdili smo da blokada IL-22 dovodi do smanjenja brojeva DC, T ćelija i B ćelija tokom infekcije. Zaključak je da je IL-22 važan za formiranje limfnog folikla i može biti važna nizvodna komponenta limfotoksinskog puta u debelom crevu.

Spisak sekvenci

[0311]

Claims (7)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid koji sadrži IL-22 za upotrebu u metodi lečenja mikrobiološkog poremećaja kod subjekta koja se sastoji iz davanja pomenutom subjektu efektivne količine polipeptida, gde je mikrobiološki poremećaj inflamatorna bolest creva (IBD).

2. IL-22 agonist koji povećava IL-22 aktivnost za upotrebu u metodi lečenja mikrobiološkog poremećaja kod subjekta koja se sastoji iz davanja pomenutom subjektu efektivne količine IL-22 agonista, gde je mikrobiološki poremećaj IBD I gde je IL-22 agonist izabran iz grupe: (a) IL-22-Fc fuzioni polipeptid;

(b) IL-22 nukleinska kiselina;

(c) IL-22 fuzioni polipeptid;

(d) antitelo ili njegov biološki aktivan fragment, gde se antitelo vezuje za IL-22, IL-22R ili IL-22BP;

(e) monoklonsko antitelo koje ze vezuje za IL-22, IL-22R ili IL-22BP; i

(f) humanizovano antitelo koje se vezuje za IL-22, IL-22R ili IL-22BP.

3. Polipeptid ili IL-22 agonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2 gde je davanje intravenozno kao bolus ili putem kontinualne infuzije tokom određenog perioda, intramuskularno, intraperitonealno, intracerobrospinalno, subkutano, intraartikularno, intrasinovsko, intratekalno, oralno, topično ili udisanjem.

4. Polipeptid ili IL-22 agonist za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde je davanje intravenozno kao bolus ili putem kontinualne infuzije tokom određenog perioda.

5. Polipeptid ili IL-22 agonist za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, gde pomenuta IBD je Kronova bolest.

6. Polipeptid ili IL-22 agonist za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, gde IBD je ulcerativni kolitis.

7. Komplet za upotrebu u postupku za tretman mikrobiološkog poremećaja kod subjekta, pri čemu komplet sadrži farmaceutski sastav koji sadrži IL-22 i gde je mikrobiološki poremećaj IBD.