RS57266B1 - Mešavine i postupci za inhibiranje masp-1 i/ili masp-3 u lečenju paroksizmalne noćne hemoglobinurije - Google Patents

Description

Opis

POZADINA

[0001] Sistem komplementa obezbeđuje mehanizam ranog delovanja radi započinjanja, pojača i upravlja imunim odgovorom na mikrobiološku infekciju i druge akutne napade (M.K. Liszewski i J.P. Atkinson, 1993, u Fundamental Immunology, Treće izdanje, dopunjenood strane W.E. Paul, Raven Press, Ltd., Nju Jork), kod ljudi i ostalih kičmenjaka. Dok aktivacija komplementa obezbeđuje značajnu prvu liniju odbrane protiv potencijalnih patogena, aktivnosti komplementa koje promovišu zaštitini imuni odgovor takođe mogu da predstavljaju potencijalnu opasnost za domaćina (K.R. Kalli, et al., Springer Semin. Immunopathol.15:417-431, 1994; B.P. Morgan, Eur. J. Clinical Investig.24:219-228, 1994). Na primer, C3 i C5 proteolitički proizvodi upošljava i aktivira neutofile. Dok su neophodni u odbrani domaćina, aktivirani neutofili su neselektivni u njihovom oslobađanju destruktivnih enzima i mogu da izazovu oštećenje organa. Pored toga, aktivacija komplementa može da izazove taloženje komponenata litičkog komplementa na obližnjim ćelijama domaćina kao i na mikrobnim metama, što rezultira kao ćelijska lizija.

[0002] Sistem komplementa takođe je upleten u patogenezu brojnih akutnih i hroničnih stanja, koja uključuju: infarkt miokarda, šlog, ARDS, reperfuziona povreda, septički šok, kapilarno curenje praćeno termalne opektoine, postkardiopulmonarno zapaljene bajpasa, odbacivanje translpantata, reumatoidni artritis, multipla skleroza, mijastenija gravis, i Alchajmerova bolest. U gotovo svim pomenutim stanjima, komplement nij uzrok ali je jedan od nekoliko faktora uključenih u patogenezi. I pored toga, aktivacija komplementa može biti glavni patološki mehanizam i predstavlja efektivnu tačku za kliničku kontrolu u mnogim od ovih stanja bolesti. Sve veće priznanje važnosti komplementom-posredovane povrede tkiva u raznim stanjima bolesti podvlači potrebu za efektivnim komplement inhibitornim lekovima. Do danas, Ekulizumab (Solaris®), antitelo protiv C5, predstavlja jedini komplement-ciljni lek koji je odobren za upotrebu kod ljudi. Međutim, C5 je jedan od nekoliko efektorskih molekula smešten "nizvodno" u sistemu komplementa, a blokiranje C5 ne inhibira aktivaciju sistema komplementa. Prema tome, inhibitor početnih faza aktivacije komplementa imao bi značajnu prednost u odnosu na inhibitor "nizvodnog" komplementa.

[0003] Trenutno, široko je prihvaćeno da sistem komplementa može biti aktiviran kroz tri različita puta: klasični put, lektinski put, i alternativni put. Klasični put obično je izazvan kompleksom sastavljenim od antitela domaćina povezanih sa stranom česticom (tj., antigen) i prema tome zahteva prethodno izlaganje antigenu kako bi se obrazovao specifičan odgovor antitela. Kako aktivacija klasičnog puta zavisi od prethodno adaptivnog imunog odgovora domaćina, klasični put je deo stečenog is part imunog sistema. Nasuprot tome, i lektinski i alternativni putevi zavisni su od adaptivni imunitet i predstavljaju deo urođenog imunog sistema.

[0004] Aktivacija sistema komplementa rezultati in the sequential aktivacija of serinska proteaza zimogens. Prva faza u aktivaciji klasičnog puta je vezivanje molekula specifičnog prepoznavanja, C1q, za antigenom-povezane IgG i IgM molekule. C1q je povezan sa C1r i C1s proenzimima serinske proteaze kao kompleks koji se zove C1. Nakon vezivanja C1q za imuni kompleks, autoproteolitičko cepanje Arg-Ile mesta C1r praćeno je sa Clr-posredovanim cepanjem i aktivacijom C1s, čime se stiče sposobnost cepanja C4 i C2. C4 cepa se na dva fragmenta, označeni C4a i C4b, i, na sličan način, C2 cepa se na C2a i C2b. C4b fragmenti mogu da obrazuju kovalentne veze sa susednim hidroksil ili amino grupama i generišu C3 konvertazu (C4b2a) nekovalentnom interakcijom sa C2a fragmentom aktiviranog C2. C3 konvertaza (C4b2a) aktivira C3 proteolitičkim cepanjem na C3a i C3b podkomponente što vodi ka generisanju C5 konvertaze (C4b2a3b), koja, cepanjem C5 vodi ka obrazovanju kompleksa membranskog napada (C5b kombinovan sa C6, C7, C8 i C-9, koji se takođe naziva "MAC") koji može da prekine ćelijske membrane što rezultira kao ćelijska lizija. Aktivirani oblici C3 i C4 (C3b i C4b) kovalentno se talože na stranim ciljanim površinama, koje receptori komplementa prepoznaju na višestrukim fagocitima.

[0005] Nezavisno od toga, prva faza u aktivaciji sistema komplementa kroz lektinski put takođe je vezivanje molekula specifičnog prepoznavanja, koje je praćeno aktivacijom povezanih proenzima serinske proteaze. Međutim, umesto vezivanja imunih kompleksa sa C1q, molekuli prepoznavanja u lektinskom putu obuhvataju grupu ugljeni hidrat-vezujućih proteina (manan-vezujući lektin (MBL), H-fikolin, M-fikolin, L-fikolin i C-tip lektin CL-11), zajedno nazivaju lektini. Videti J. Lu et al., Biochim.

Biophys. Acta 1572:387-400, (2002); Holmskov et al., Annu. Rev. Immunol.21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000)). Takođe videti J. Luet et al., Biochim Biophys Acta 1572:387-400 (2002); Holmskov et al, Annu Rev Immunol 21:547-578 (2003); Teh et al., Immunology 101:225-232 (2000); Hansen et al, J. Immunol 185(10):6096-6104 (2010).

[0006] Ikeda et al. prvi pokazuju da, poput C1q, MBL može aktivirati sistem komplementa nakon vezivanja sa mananom-obloženi eritrociti kvasca na C4-zavisan način (Ikeda et al., J. Biol. Chem.

262:7451-7454, (1987)). MBL, član kolektin proteinske porodice, je kalcijum-zavisan lektin koji vezuje ugljene hidrate sa 3- i 4-hidroksi grupama orijentisanim u ekvatorijalnoj ravni prstena piranoze. Istaknuti ligandi za MBL tako su D-manoza i N-acetil-D-glukozamin, dok ugljeni hidrati koji se ne uklapaju u ovaj prostorni zahtev imaju nedetektabilni afinitet ka MBL (Weis et al., Nature 360:127-134, (1992)).

Interakcija između MBL i monovalentnih šećera veoma je slaba, sa konstantama disocijacije obično u jednocifrenom milimolarnom opsegu. MBL postiže tesno, specifično vezivanje sa glikan ligandima teženjem, tj., simultanom interakcijom sa više monosaharidnim ostacima smeštenim u međusobnoj blizini (Lee et al., Archiv. Biochem. Biophys.299:129-136, (1992)). MBL prepoznaje obrasce ugljenih hidrata koji uobičajeno dekorišu mikroorganizme kao što su bakterija, kvasac, paraziti i određeni virusi. Nasuprot tome, MBL ne prepoznaje D-galaktozu i sialnu kiselinu, pretposlednje i poslednje šećere koji uobičajeno krase „zrele“ glikokonjugate kompleks prisutne u plazmi sisara i glikoproteinima ćelijke površine. Ova specifičnost vezivanja smatra se da promoviše prepoznavanje "stranih" površina i pomaže u zaštiti od "samo-aktivacije." Međutim, MBL se ne vezuje sa visokim afinitetom za klastere visokamanoza "prekursorskih" glikana na N-povezanim glikoproteinima i glikolipidima odvojeni u endoplazmatskom retikulumu i Golgi ćelija sisara (Maynard et al., J. Biol. Chem.257:3788-3794, (1982)). Pored toga, pokazano je da MBL mogu da vežu polinukleotide, DNK i RNK, koji mogu biti izloženi na nekrotičnim i apoptotskim ćelijama (Palaniyar et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1010:467-470 (2003);

Nakamura et al., J. Leuk. Biol.86:737-748 (2009)). Prema tome, oštećene ćelije potencijalno su ciljevi za aktivaciju lektinskog puta putem MBL vezivanja.

[0007] Fikolini poseduju različitu vrstu lektinskog domen od MBL, koji se naziva fibrinogen-nalik domen. Fikolini vezuje ostatke šećera na Ca<++>-nezavisan način. Kod ljudi, identifikovano je tri vrste fikolina (L-fikolin, M-fikolin i H-fikolin). Dva serumska fikolina, L-fikolin i H-fikolin, imaju zajedničko specifičnost za N-acetil-D-glukozamin; međutim, H-fikolin se takođe vezuje za N-acetil-D-galaktozamin. Razlika u specifičnosti šečera L-fikolina, H-fikolina, CL-11, i MBL znači da različiti lektini mogu biti komplementarno i ciljno različiti, iako se preklapaju, glikokonjugati. Ovaj koncept podržan je nedavnim otkrićem da se, od poznatih lektina u lektinskom putu, L-fikolin vezuje specifično za lipoteičnu kiselinu, glikokonjugat ćelijskog zida pronađen na svim Gram-pozitivnim bakterijama (Lynch et al., J. Immunol. 172:1198-1202, (2004)). Pored acetilovanih grupa šećera, fikolini se takođe mogu vezati za acetilovane aminokiseline i polipeptide (Thomsen et al., Mol. Immunol.48(4):369-81 (2011)). Kolektini (tj., MBL) i fikolini ne nose nikakvu značajnu sličnost u aminokiselinoj sekvenci. Međutim, ove dve grupe proteina imaju sličan domenske organizacije i, poput C1q, sastavljaju se u oligomerne strukture, koje maksimiziraju mogućnost vezivanja na više mesta.

[0008] Koncentracije u serumu za MBL veoma su promenljive u zdravoj populaciji, a to se genetski kontroliše polimorfizmom/mutacijama u promovišućim i kodirajućim regionima MBL gena. Kao protein akutne faze, eksprimiranje MBL dalje je regulisano na gore tokom zapaljenja. L-fikolin prisutan je u serumu pri koncentracijama sličnim onima MBL. Prema tome, L-fikolin grana lektinskog puta potencijalno se može porediti sa MBL krakom po snazi. MBL i fikolini takođe mogu da funkcionišu kao opsonini, koji omogućavaju fagocitima da ciljaju MBL- i fikolin-ukrašene površine (videti Jack et al., J Leukoc Biol., 77(3):328-36 (2004), Matsushita i Fujita, Immunobiology, 205(4-5):490-7 (2002), Aoyagi et al., J Immunol, 174(1):418-25(2005). Ova opsonizacija zahteva interakciju ovih proteina sa receptorima fagocita (Kuhlman et al., J. Exp. Med.169:1733, (1989); Matsushita et al., J. Biol. Chem.271:2448-54, (1996)), čiji identitet nije još uvek utvrđen.

[0009] Humani MBL obrazuje specifičnu i visoko-afinitetnu interakciju putem svog kolagen-nalik domena sa jedinstvenim C1r/C1s-nalik serinska proteazama, nazvane MBL-povezane serinske proteaze (MASP-e). Do danas, opisane su tri MASP-e. Prva, jedan enzim "MASP" identifikovan je i okarakterisan kao enzim odgovoran za započinjanje kaskade komplementa (tj., cepanje C2 i C4) (Matsushita et al., JExp Med 176(6):1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol.150:571-578, (1993)). Naknadno je određeno da je zapravo aktivnost MASP mešavina dve proteaze: MASP-1 i MASP-2 (Thiel et al., Nature 386:506-510, (1997)). Međutim, pokazano je da je MBL-MASP-2 kompleks sam dovoljan za aktivaciju komplementa (Vorup-Jensen et al., J. Immunol.165:2093-2100, (2000)). Pored toga, samo MASP-2 je pocepan na C2 i C4 pri velikim brzinama (Ambrus et al., J. Immunol.170:1374-1382, (2003)). Prema tome, MASP-2 je proteaza odgovorna za aktiviranje C4 i C2 kako bi se generisala C3 konvertaza, C4b2a. Ovo je značajna činjenica u odnosu na C1 kompleks klasičnog puta, u kojem koordinisana aktivnost dve specifične serinske proteaze (C1r i C1s) vodi ka aktivaciji sistema komplementa. Pored toga, izolovana je treća nova proteaza, MASP-3 (Dahl, M.R., et al., Immunity 15:127-35, 2001). MASP-1 i MASP-3 predstavljaju alternativno sojene proizvodr istog gena.

[0010] MASP-e dele identične domenske organizacije sa onim C1r i C1s, enzimskim komponentama C1 kompleksa (Sim et al., Biochem. Soc. Trans.28:545, (2000)). Ovi domeni uključuju N-terminalni domen C1r/C1s/morskog ježa VEGF/morfogenog proteina kosti (CUB), epidermalni faktor rasta-nalik domen, drugi CUB domen, domene tandem komplement kontrolnih proteina, i domen serinske proteaze. Kao i kod C1 proteaza, aktivacija MASP-2 javlja se putem cepanja Arg-I1e veze blizu domena serinske proteaze, koja deli enzim na disulfid-povezane A i B lance, od kojih se poslednji sastoje od domena serinske proteaze.

[0011] MBL takođe može biti povezan sa alternativno spojenim oblikom MASP-2, poznat kao MBL-povezani protein 19 kDa (MAp19) ili mali MBL-povezani protein (sMAP), kome nedostaje katalitička aktivnost MASP-2. (Stover, J. Immunol.162:3481-90, (1999); Takahashi et al., Int. Immunol.11:859-863, (1999)). MAp19 obuhvata prva dva domena MASP-2, praćeno dodatnom sekvencom četiri jedinstvene aminokiseline. Funkcija Map19 je nejasna (Degn et al., J Immunol. Postupci, 2011). MASP-1 i MASP-2 geni smešteni su na humanim hromozomoma 3 i 1, respektivno (Schwaeble et al., Immunobiology 205:455-466, (2002)).

[0012] Nekoliko linija dokaza sugeriše da postoje različiti MBL-MASP kompleksi i velika frakcija MASP-a u serumu nije kompleksovana sa MBL (Thiel,et al., J. Immunol.165:878-887, (2000)). I H- i L-fikolin vezuju se za sve MASP-e i aktiviraju lektinski komplementni put, kao i MBL (Dahl et al., Immunity 15:127-35, (2001); Matsushita et al., J. Immunol.168:3502-3506, (2002)). I lektin i klasični putevi obrazuju zajedničku C3 konvertazu (C4b2a), a ova dva puta se spajaju u ovoj fazi.

[0013] Smatralo se naširoko da lektinski put ima glavnu ulogu odbrani domaćina protiv infekcije u naivnom domaćinu. Snažan dokaz za uključenje MBL u odbrani domaćina dolazi iz analize pacijenata pacijenata sa sniženim nivoima u serumu funkcionalnog MBL (Kilpatrick, Biochim. Biophys. Acta 1572:401-413, (2002)). Takvi pacijenti podložni su vraćanju bakterijskih i gljivičnih infekcija. Ovi simptomi obično se primećuju u ranoj životnoj dobi, tokom očiglednog prozora ranjivosti tokom kojeg opada titar antitela prenetog od majke, ali pre nego što se razvije potpun spektar odgovora antitela. Ovaj sindrom često se rezultat mutacija na nekoliko mesta u kolagenskom delu MBL, koji utiče na pravilno obrazovanje MBL oligomera. Međutim, kako MBL može da funkcioniše kao opsonin nezavisan od komplementa, nije poznato do koje mere osetljivosti na infekciju leži u oslabljenoj aktivaciji komplementa.

[0014] Nasuprot klasičnim i lektinskim putevima, prethodno nisu pronađeni inicijatori alternativnog puta koji bi ispunili funkcije prepoznavanja koje C1q i lektini izvode u druga dva puta. Trenutno je prihvaćeno u širokoj meri da alternativni put spontano prolazi kroz nizak nivo aktivacije preokretanja, koja se lako može pojačati na stranim ili abnormalnim površinama (bakterija, kvasac, virusno zaražene ćelije, ili oštećeno tkivo) kojima nedostaju pravilni moleklulski elementi koji održavaju u redu sponatnu aktivaciju komplementa. Postoji četiri proteina plazme koji su direktno uključeni u aktivaciju alternativnog puta: C3, faktori B i D, i properdin.

[0015] Iako postoji opširan dokaz koji uključuje i klasične i alternativne puteve komplementa u patogenezu ne-infektivnih humanih bolesti, uloga lektinskog puta tek počinje da se procenjuje.

Medavna ispitivanja obezbedila su dokaz da aktivacija lektinskog puta može biti odgovorna za aktivaciju komplementa i povezanog zapaljenje u ishemijskoj/reperfuzionoj povredi. Collard et al. (2000) prijavljuju da se uzgajane endotelijalne ćelije podvrgnute oksidativnom stresu vezuju za MBL i pokazuju taloženje C3 nakon izlaganja humanom serumu (Collard et al., Am. J. Pathol.156:1549-1556, (2000)). Pored toga, lečenje humanog seruma blokirajućim anti-MBL monoklonalnim antitelima inhibira MBL vezivanje i aktivaciju komplementa. Ova saznanja proširena su na pacovski model mijokardijalne ishemija-reperfuzija u kojoj pacovi tretirani blokirajućim antitelom usmerenim protiv pacovskog MBL pokazuju značajno manje mijokardijalno oštećenje nakon začepljenja koronarne arterije u odnosu na pacove tretirane kontrolnim antitelom (Jordan et al., Circulation 104:1413-1418, (2001)). Nejasan je molekulski mehanizam MBL vezivanja za vaskularni endotelijum nakon oksidativnog stresa; nedavno ispitivanje sugeriše da aktivacija lektinskog puta nakon oksidativnog stresa može biti posredovana MBL vezivanjem za vaskularne endotelijalne citokeratine, a ne za glikokonjugate (Collard et al., Am. J. Pathol.

159:1045-1054, (2001)). Druga ispitivanja upliću klasične i alternativne puteve u patogenezu ishemijske/reperfuzione povrede, a uloga lektinskog puta u ovoj bolesti ostaje sporna (Riedermann, N.C., et al., Am. J. Pathol.162:363-367, 2003).

[0016] Nedavna ispitivanja su pokazala da MASP-1 i MASP-3 konvertuju enzimski faktor D alternativnog puta aktivacija iz njegovog zimogenog oblika u njegov enzimski akzivan oblik (videti Takahashi M. et al., J Exp Med 207(1):29-37 (2010); Iwaki et al., J. Immunol.187:3751-58 (2011)). Fiziološki značaj ovog procesa podvučen je odsustvom funkcionalne aktivnosti alternativnog puta u plazmi MASP-1/3-deficijentnih miševa. Proteolitičko generisanje C3b iz nativnog C3 neophodno je za funkcionisanje alternativnog puta. Kako konvertaza C3 alternativnog puta (C3bBb) sadrži C3b kao suštinsku podjedinicu, pitanje porekla prvog C3b kroz alternativni put predstavlja zagonetan problem i stimuliše značajno ispitivanje.

[0017] C3 pripada porodici proteina (zajedno sa C4 i α-2 makroglobulinom) koji sadrži retku posttranslatornu modifikaciju poznatu kao tioestarska veza. Tioestarska grupa sastavljena je od glutamina čija terminalna karbonil grupa obrazuje kovalentnu tioestarsku vezu sa sulfhidrilnom grupom udaljenom za cistein tri aminokiseline. Ova veza je nestabilna, a elektrofilni glutamil-tioestar može da reaguje sa nukleofilnim grupama kao što su hidroksil ili amino grupe i tako da obrazuje kovalentnu vezu sa drugim molekulima. Tioestarska veza umereno je stabilna kada je izdvojena unutar hidrofobnog džepa intaktnutog C3. Međutim, proteolitičko cepanje C3 na C3a i C3b rezultira izlaganjem veoma reaktivne tioestarske veze na C3b i, nakon nukleofilnog napada susedne grupe koja obuhvata hidroksil ili amino grupe, C3b postaje kovalentno vezan za cilj. Pored njegove dobro utvrđene uloge u kovalentnom pričvršćivanju C3b za komplementne ciljeve, smatra se da C3 tioestar takođe ima ključnu ulogu u izazivanju alternativnog puta. U skladu sa široko prihvaćenom "teorijom praznog hoda", alternativni put inicira se generisanjem tečno-fazne konvertaze, iC3Bb, koja se obrazuje iz C3 hidrolizovanim tioestrom (iC3; C3(H2O)) i faktorom B (Lachmann, P.J., et al., Springer Semin. Immunopathol.7:143-162, (1984)). C3b-nalik C3(H2O) generiše se iz nativng C3 sporom spontanom hidrolizom unutrašnjeg tioestra u proteinu (Pangburn, M.K., et al., J. Exp. Med.154:856-867, 1981). Kroz aktivnost C3(H2O)Bb konvertaze, C3b molekuli talože se na ciljanu površinu čime iniciraju alternativni put.

[0018] Pre ovde opisanog otkrića, veoma malo se znalo o inicijatorima aktivacije alternativnog puta. Smatralo se da aktivatori uključuju ćelijske zidove kvasca (zimosan), mnoge čiste polisaharide, zečije eritrocite, određene imunoglobuline, viruse, gljive, bakterije, životinjske tumorske ćelije, parazite, i oštećene ćelije. Jedina karakteristika zajednička ovim aktivatorima je prisustvo ugljenog hidrata, ali je zbog kompleksnosti i raznolikosti strukture ugljenih hidrata teško utvrditi zajedničke molekulske determinante koje su prepoznate. Široko je prihvaćeno da se aktivacija alternativnog puta kontroliše putem finog balansiranja između inhibitornih regulatornih komponenti ovog puta, kao što je faktor H, faktor I, DAF, i CR1, i properdin, pri čemu poslednji predstavlja jedini pozitivni regulator alternativnog puta (videti Schwaeble W.J. i Reid K.B., Immunol Today 20(1):17-21 (1999)).

[0019] Pored očigledno neregulisanog ovde opisanog mehanizma aktivacije, alternativni put takođe može da obezbedi snažnu amplifikacionu petlju za C3 konvertazu lektinskog/klasičnog puta (C4b2a) budući da bilo koji C3b koji se generiše može da učestvuje sa faktorom B u obrazovanju dodatne C3 konvertaze alternativnog puta (C3bBb). C3 konvertaza alternativnog puta stabilizuje se vezivanjem properdina. Properdin produžava polu-život C3 konvertaze alternativnog puta šest do deset puta. Dodavanje C3b u C3 konvertazu alternativnog puta vodi ka obrazovanju C5 konvertaze alternativnog puta.

[0020] Smatralo se da sva tri puta (tj., klasični, lektinski i alternativni) konvergiraju na C5, koji se cepa radi obrazovanja proizvoda sa višestrukim prozapaljenskim efektima. Konvergovani put naziva se terminalni put komplementa. C5a je najpotentniji anafilatoksin, koji indukuje izmene u glatkim mišićima i vaskularnom tonu, kao i vaskularnoj propustljivosti. Takođe je snažan hemotaksin i aktivator i neutofila i monocita. C5a-posredovana ćelijska aktivacija može značajno da pojača zapaljenske odgovore indukovanjem oslobađanja više dodatnih zapaljenskih medijatora, koji uključuju citokine, hidrolitičke enzime, metabolite arahidonske kiseline, i reaktivne vrste kiseonika. C5 cepanje vodi ka obrazovanju C5b-9, koji je takođe poznat kao kompleks membranskog napada (MAC). Sada postoji snažan dokaz da sublitičko MAC taloženje može da igra važnu ulogu u zapaljenju pored njegove uloge litički kompleksa formiranja pora.

[0021] Jiang et al., Journal Exp Med vol 194 (11):1609-1616,2001, opisuju Komplement 1 inhibitor alternativnog puta komplementa. Wong et al., Mol Immunol vol 36(13/14):853-861, 1999, opisuju regulaciju MBL-povezane serinske proteaze. Frikis-Hareli et al., Blood vol 118 (17):4705-4713, 2011; Risitano et al., Molekulski Immunology vol 47(13):2215, 2010; i Holers et al. (WO2011/057158) opisuju C3/C5 konvertaza inhibitor TT30 za lečenje bolesti posredovanih povezanim putem komplementa. Pored njegove suštinske uloge u imunoj odbrani, sistem komplementa doprinosi oštećenju tkiva u mnogim kliničkim stanjima. Tako, postoji velika potreba za razvojem terapeutski efektivnih inhibitora komplementa u cilju sprečavanja ovih štetnih efekata.

SUŠTINA

[0022] Ovaj opis obezbeđuje postupak inhibiranja MASP-3-zavisne aktivacije komplementa kod subjekta koji boluje od paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH). Postupak uključuje fazu davanja subjketu mešavine koja obuhvata količinu MASP-3 inhibitornog agensa efektivnu da inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa. U nekim slučajevima, postupak dalje obuhvata davanje subjektu mešavine koja obuhvata MASP-2 inhibitorni agens.

[0023] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje mešavinu koja obuhvata količinu MASP-3 inhibitornog agensa efektivnu da inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa za upotrebu u lečenju subjekta koji boluje od paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH), pri čemu pomenuti MASP-3 inhibitorni agens je MASP-3 monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za deo humane MASP-3 (SEQ ID NO:8).

[0024] U još jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje mešavinu koja obuhvata količinu MASP-3 inhibitornog agensa efektivnu da poveća preživljavanje crvenih krvnih zrnaca kod subjekta koji boluje od paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH) za upotrebu u lečenju subjekta koji boluje od PNH pri čemu pomenuti MASP-3 inhibitorni agens je MASP-3 monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za deo humani MASP-3 (SEQ ID NO:8).

[0025] Ovaj opis obezbeđuje farmaceutsku mešavina koja obuhvata najmanje jedinhibitorni agens, u kojoj najmanje jedinhibitorni agens obuhvata MASP-2 inhibitorni agens i MASP-3 inhibitorni agens i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0026] Ovaj opis obezbeđuje farmaceutsku mešavinu koja obuhvata MASP-3 inhibitorni agens koji se vezuje za deo MASP-1 (SEQ ID NO: 10: pune dužine) i koji se takođe vezuje za deo MASP-3 (SEQ ID NO:8) i farmaceutsku nosač.

[0027] Ovaj opis obezbeđuje farmaceutsku mešavinu koja obuhvata MASP-3 inhibitorni agens koji se vezuje za deo MASP-2 (SEQ ID NO: 5: pune dužine) i koji se takođe vezuje za deo MASP-3 (SEQ ID NO:8) i farmaceutsku nosač.

[0028] Ovaj opis obezbeđuje farmaceutsku mešavinu koja obuhvata MASP-3 inhibitorni agens koji se vezuje za deo MASP-1 (SEQ ID NO: 10: pune dužine) i koji se takođe vezuje za deo MASP-2 (SEQ ID NO:5) i farmaceutsku nosač.

[0029] Ovaj opis obezbeđuje farmaceutsku mešavinu koja obuhvata MASP-3 inhibitorni agens koji se vezuje za deo MASP-1 (SEQ ID NO: 10 pune dužine), koji se vezuje za deo MASP-2 (SEQ ID NO: 5: pune dužine) i koji se takođe vezuje za deo MASP-3 (SEQ ID NO:8) i farmaceutsku nosač.

[0030] Kako je ovde opisano, farmaceutske mešavine ovog opisa mogu se primeniti u skladu sa postupcima ovog opisa.

[0031] Ovde opisano otkriće postaće jasno pozivanjem na detaljan i crteže koji slede.

OPIS CRTEŽA

[0032] Ovo otkriće postaće prihvaćenije kada postane razumljivije pozivajući se na detaljan opis koji sledi, sa pozivanjem na prateće crteže, na kojima:

FIG.1 prikazuje novo razumevanje lektinskih i alternativnih puteva;

FIG.2 prikazuje šematski dijagram adaptiran od strane Schwaeble et al., Immunobiol 205:455-466 (2002), modifikovan od strane Yongqing et al., BBA 1824:253 (2012), koji prikazuje MASP-2 i MAp19 proteinske domene i eksone koji ih kodiraju;

FIG.3 prikazuje šematski dijagram adaptiran od strane Schwaeble et al., Immunobiol 205:455-466 (2002), modifikovan od strane Yongqing et al., BBA 1824:253 (2012), koji prikazuje MASP-1, MASP-3 i MAp44 proteinske domene i eksone koji ih kodiraju;

FIG.4 prikazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci MASP-1, MASP-2 i MASP-3 proteina i ukazuje na konsenzus regione između njih;

FIG.5 prikazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci MASP-1, MASP-2 i MASP-3 Alfa lanaca;

FIG.6 prikazuje poravnanje aminokiselinskih sekvenci MASP-1, MASP-2 i MASP-3 Beta Lanaca;

FIG.7A prikazuje poravnanje po parovima aminokiselinskih sekvenci MASP-1 i MASP-2 Domena proteaza (Beta-lanci);

FIG.7B prikazuje poravnanje po parovima aminokiselinskih sekvenci MASP-1 i MASP-3 Domena proteaza (Beta-lanci);

1

FIG.7C prikazuje poravnanje po parovima aminokiselinskih sekvenci MASP-2 i MASP-3 Domena proteaza (Beta-lanci);

FIG.8 grafički prikazuje Kaplan-Majerov grafikon koji prikazuje procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon davanja infektivne doze od 2.6 x 10<7>cfu N. meningitidis serogrupe A Z2491, pokazujući da su MASP-2 miševi zaštićeni od N. meningitidis indukovane smrti, kako je opisano u Primeru 1;

FIG.9 grafički prikazuje Kaplan-Majerov grafikon koji prikazuje procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon davanja infektivne doze od 6 x 10<6>cfu N. meningitidis serogrupae B soj MC58, pokazujući da su MASP-2 miševi zaštićeni od N. meningitidis indukovane smrti, kako je opisano u Primeru 1;

FIG.10 grafički prikazuje log cfu/mL N. meningitidis serogrupe B soj MC58 po mL krvi izolovane iz MASP-2 KO i WT miševa u različitim vremenskim tačkama nakon i.p. infekcije sa 6x10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soj MC58 (n=3 u različitim vremenskim tačkama za obe grupe miševa), što pokazuje da iako su MASP-2 KO miševi inficirani istom dozom N. meningitidis serogrupe B soj MC58 kao i WT miševi, MASP-2 KO miševi imaju pojačan klirens bakteremije u poređenju sa WT, kako je opisano u Primeru 1;

FIG.11 grafički prikazuje srednju ocenu bolesti MASP-2 KO i WT miševa 3, 6, 12 i 24 sata nakon infekcije sa 6x10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soj MC58, pokazujući da MASP-2-deficijentni miševi pokazuju znatno niže ocene bolesti 6 sati, 12 sati, i 24 sata nakon infekcije, u poređenju sa WT miševima, kako je opisano u Primeru 1;

FIG.12 grafički prikazuje Kaplan-Majerov grafikon koji prikazuje procenat preživljavanja miševa nakon davanja infektivne doze od 4x10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soj MC58, praćeno davanjem 3 sata nakon infekcije ili inhibitornog MASP-2 antitela (1 mg/kg) ili kontrolnog izotipnog antitela, pokazujući da je MASP-2 antitelo efektivno za lečenje i da poboljšava preživljavanje kod subjekata inficiranih sa N. meningitidis, kako je opisano u Primeru 2;

FIG.13 grafički prikazuje log cfu/mL vijabilnih brojanja N. meningitidis serogrupe B soj MC58 izolovan u različitim vremenskim tačkama u uzorcima ljudskog seruma prikazanim u TABELI 5 uzeti u različitim vremenskim tačkama nakon inkubacije sa N. meningitidis serogrupom B soj MC58, kako je opisano u Primeru 3;

FIG.14 grafički prikazuje log cfu/mL vijabilnih brojanja N. meningitidis serogrupe B-MC58 izolovan u različitim vremenskim tačkama u uzorcima ljudskog seruma prikazanim u TABELI 7, pokazujući da je komplementom-zavisno ubijanje N. meningitidis u humanom 20vol.% serumu MASP-3 i MBL-zavisno, kako je opisano u Primeru 3;

FIG.15 grafički prikazuje log cfu/mL vijabilnih brojanja N. meningitidis serogrupe B-MC58 izolovan u različitim vremenskim tačkama u uzorcima mišjeg seruma prikazanim u TABELI 9, pokazujući da MASP-2 -/- nokaut mišji (nazvan "MASP-2 -/-") serum ima više nivoe baktericidne aktivnosti ka N. meningitidis u odnosu na serum WT miševa, dok nasuprot tome, MASP-1/3 -/- mišji serum nema baktericidnu aktivnost, kako je opisano u Primeru 3;

FIG.16 grafički prikazuje kinetike C3 aktivacije pod uslovima specifičnim za lektinski put (1% plazma) u WT, C4-/-, MASP-1/3-/-, Faktor B-/- i MASP-2-/- mišjem serumu, kako je opisano u Primeru 4;

FIG.17 grafički prikazuje nivo alternativnim putem vođenog (AP-vođeno) C3b taloženja na zimosanomobloženim mikrotitarskim pločama pod “uobičajenim” uslovima specifičnim za alternativni put (AP-specifični) (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma dobijeni od MASP-3-deficijentnih, C4-deficijentnih i MBL-deficijentnih humani subjekti, kako je opisano u Primeru 4;

FIG.18 grafički prikazuje nivo AP-vođenog C3b taloženja na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama pod “uobičajenim” AP-specifičnim uslovima (tj., BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) kao funkcija vremena u 10% uzorcima humanog seruma dobijenim od MASP-3-deficijentnih, C4-deficijentnih i MBL-deficijentnih humanih subjektata, kako je opisano u Primeru 4;

FIG.19A grafički prikazuje nivo C3b taloženja na mananom-obloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma dobijenim od WT, MASP-2-deficijentnih, i MASP-1/3-deficijentnih miševa pod “uobičajenim” AP-specifičnim uslovima (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju i lektinski put i alternativni put (AP) da funkcionišu (BBS/Mg<++>/Ca<++>), kako je opisano u Primeru 4;

FIG.19B grafički prikazuje nivo C3b taloženja na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma dobijenim od WT, MASP-2-deficijentnih, i MASP-1/3-deficijentnih miševa pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/Mg<++>/Ca<++>), kako je opisano u Primeru 4;

FIG.19C grafički prikazuje nivo C3b taloženja na S. pneumoniae D39-obloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma dobijenim od WT, MASP-2-deficijentnih, i MASP-1/3-deficijentnih miševa pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/Mg<++>/Ca<++>), kako je opisano u Primeru 4;

FIG.20A grafički prikazuje rezultate ispitivanja C3b taloženja u veoma razblaženom serumu izveden na mananom-obloženim mikrotitarskim pločama pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (tj.

BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/Mg<++>/Ca<++>), upotrebom koncentracije u serumu koja se kreće od 0 % do 1.25%, kako je opisano u Primeru 4;

FIG.20B grafički prikazuje rezultate ispitivanja C3b taloženja izvedeno na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/Mg<++>/Ca<++>), upotrebom koncentracije u serumu koja se kreće od 0 % do 1.25%, kako je opisano u Primeru 4;

FIG.20C grafički prikazuje rezultate ispitivanja C3b taloženja izvedeno na S. pneumoniae D39-obloženim mikrotitarskim pločama pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/Mg<++>/Ca<++>), upotrebom koncentracije u serumu koja se kreće od 0 % do 1.25%, kako je opisano u Primeru 4;

FIG.21 grafički prikazuje nivo hemolize (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih mišjih eritrocita (Crry/C3-/-) u supernatantu izmereno fotometrijom) mananom-obloženih mišjih eritrocita humanim serumom pod fiziološkim uslovima (tj., u prisustvu Ca<++>) u opsegu serumskih razblaženja u serumu iz MASP-3-/-, toplotom inaktiviranog normalnog humanog seruma (HI NHS), MBL-/-, NHS MASP-2 monoklonalnog antitela i NHS kontrole, kako je opisano u Primeru 5;

FIG.22 grafički prikazuje nivo hemolize (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih mišjih eritrocita (Crry/C3-/-) u supernatantu izmereno fotometrijom) mananom-obloženih mišjih eritrocita humanim serumom pod fiziološkim uslovima (tj., u prisustvu Ca<++>) u opsegu koncentracije u serumu u serumu iz MASP-3-/-, toplotom inaktiviranog (HI) NHS, MBL-/-, NHS MASP-2 monoklonalnog antitela i NHS kontrole, kako je opisano u Primeru 5;

FIG.23 grafički prikazuje nivo hemolize (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih eritrocita WT miševa u supernatantu izmereno fotometrijom) neobloženih mišjih eritrocita humanim serumom pod fiziološkim uslovima (tj., u prisustvu Ca<++>) u opsegu serumskih koncentracija u serumu iz 3MC (MASP-3-/-), toplotom inaktiviranog (HI) NHS, MBL-/-, NHS MASP-2 monoklonalnog antitela i NHS kontrole, kako je opisano u Primeru 5;

FIG.24 grafički prikazuje hemolizu (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih mišjih eritrocita (CD55/59-/-) u supernatantu izmereno fotometrijom) neobloženih mišjih eritrocita humanim serumom pod fiziološkim uslovima (tj., u prisustvu Ca<++>) u opsegu serumskih koncentracija u serumu iz toplotom inaktiviranog (HI) NHS, MBL-/-, NHS MASP-2 monoklonalnog antitela i NHS kontrole, kako je opisano u Primeru 5;

FIG.25 grafički prikazuje hemolizu (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih zečijih eritrocita u supernatantu izmereno fotometrijom) mananom-obloženih zečijih eritrocita MASP-1/3-/-mišjim serumom i WT kontrolnim mišjim serumom pod fiziološkim uslovima (tj., u prisustvu Ca<++>) u opsegu serumskih koncentracija, kako je opisano u Primeru 6;

FIG.26 grafički prikazuje nivo C3b taloženja (OD 405 nm) na zimosanom-obloženoj mikrotitarskoj ploči kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma iz faktora D-/-, MASP-2-/- i WT mišji serum u ogledu C3 taloženja izveden pod AP-specifičnim uslovima, kako je opisano u Primeru 7;

1

FIG.27 grafički prikazuje nivo C3b taloženja (OD 405 nm) na zimosanom-obloženoj mikrotitarskoj ploči kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma iz faktora D-/-; MASP-2-/- i WT mišji serum u ogledu C3 taloženja izveden pod fiziološkim uslovima (u prisustvu Ca<++>), kako je opisano u Primeru 7; FIG.28 grafički prikazuje nivo C3b taloženja (OD 405 nm) na zimosanom-obloženoj mikrotitarskoj ploči u funkciji inkubacionog vremena seruma (minuti) u mišjim uzorcima seruma dobijenim od faktora D-/-; faktora B-/-; plus i minus MASP-2 monoklonalno antitelo u ogledu C3b taloženja izveden pod fiziološkim uslovima (u prisustvu Ca<++>), kako je opisano u Primeru 7;

FIG.29A grafički prikazuje specifično C4b taloženje lektinskim putem na zimosanom-obloženoj mikrotitarskoj ploči, izmereno ex vivo u nerazblaženim uzorcima seruma uzetim od miševa (n=3 miševi/grupa) u različitim vremenskim tačkama nakon subkutanim doziranja ili 0.3 mg/kg ili 1.0 mg/kg mišjeg MASP-2 MoAb, kako je opisano u Primeru 13;

FIG.29B grafički prikazuje vremenski tok izolovanja lektinskog puta tokom tri nedelje nakon jednog intraperitonealnog davanja mišjeg MASP-2 MoAb na 0.6 mg/kg kod miševa, kako je opisano u Primeru 13;

FIG.30A je FACS histogram MASP-3 antigen/antitelo vezivanja za klon M3J5, kako je opisano u Primeru 15;

FIG.30B je FACS histogram MASP-3 antigen/antitelo vezivanja za klon M3M1, kako je opisano u Primeru 15;

FIG.31 grafički prikazuje krivu zasićenja vezivanja klona M3J5 (Klon 5) za MASP-3 antigen, kako je opisano u Primeru 15;

FIG.32A je poravnanje aminokiselinskih sekvenci VH regiona M3J5, M3M1, D14 i 1E10 za pileću DT40 VH sekvencu, u kojoj tačke predstavljaju aminokiselinski identitet sa DT40 sekvencom , a crtice ukazuju na razmake uvedene da maksimiziraju poravnanje, kako je opisano u Primeru 15;

FIG.32B je poravnanje aminokiselinskih sekvenci VL regiona M3J5, M3M1, D14 i 1E10 za pileću DT40 VL sekvencu, u kojoj tačke predstavljaju aminokiselinski identitet sa DT40 sekvencom , a crtice ukazuju na razmake uvedene da maksimiziraju poravnanje, kako je opisano u Primeru 15;

FIG.33 je grafikon koji prikazuje inhibitornu aktivnost mAb1E10 u Wieslab Complement System Skrining, MBL Put u poređenju sa pozitivnim serumom obezbeđen sa ispitnim kompletom, kao i izotipno kontrolno antitelo, pokazujući da mAb1E10 delimično inhibira LEA-2-zavisnu aktivaciju, (putem inhibicije MASP-1-zavisne aktivacije MASP-2), dok izotipno kontrolno antitelo to ne čini, kako je opisano u Primeru 15;

FIG.34 grafički prikazuje nivo C3b taloženja za 1% normalni humani serum plus izotipna kontrola, SGMI-1Fc ili SGMI-2Fc preko koncentracionog opsega od 0.15 do 1000 nM, pokazujući da su oba SGMI-1Fc i SGMI-2Fc inibirala C3b taloženje iz normalnog seruma u mananom-obloženim ELISA bazenčićima, sa IC50vrednostima od približno 27nM i 300nM, respektivno, kako je opisano u Primeru 16;

FIG.35A obezbeđuje rezultate analize protočne citometrije za C3b taloženje na toplotom-ubijenim S Staphylococcus aureus, pokazujući da u normalnom humanom serumu u prisustvu EDTA, koji je poznat da inaktivira lektinske i alternativne puteve, nije primećeno C3b taloženje (panel 1), u normalnom humanom serumu tretiranom sa Mg<++>/EGTA, primećeno je alternativnim putem-vođeno C3b taloženje (panel 2), i kako je prikazano na panelu 3, 4 i 5, u faktor B-osiromašenom, faktor D-osiromašenom i properdin (faktor P)-osiromašenom serumu, respektivno, nije primećeno alternativnim putem-vođeno C3b taloženje, kako je opisano u Primeru 17;

FIG.35B obezbeđuje rezultate analize protočne citometrije za C3b taloženje na toplotom-ubijenim S. aureus, pokazujući da, kao i u EDTA-tretiranom normalnom serumu (panel 1), AP-vođeno C3b taloženje odsutno je u 3MC serumu u prisustvu Mg<++>/EGTA (panel 3), dok paneli 4 i 5 prikazuju da aktivna pune dužine rMASP-3 (panel 4) i aktivna rMASP-3 (CCP1-CCP2-SP) (panel 5) obe obnavljaju AP-vođeno C3b taloženje u 3MC serumu do nivoa primećenih normalnom serumu tretiranom sa Mg<++>/EGTA (panel 2), a niti neaktivan rMASP-3 (S679A) (panel 6) niti divlji tip rMASP-1 (panel 7) mogu da obnove AP-vođeno C3b taloženje u 3MC serumu, kako je opisano u Primeru 17;

FIG.36 prikazuje rezultate Western blot analize za određivanje cepanje faktora B u odgovoru na S. aureus u 3MC serumu u prisustvu ili odsustvu rMASP-3, pokazujući da normalni humani serum u prisustvu EDTA (negativna kontrola, traka 1) pokazuje veoma malo cepanje faktora B u odnosu na normalni humani serum u prisustvu Mg<++>/EGTA, pikazano na traci 2 (pozitivna kontrola), kako je dalje pikazano na traci 3, 3MC serum pokazuje veoma malo cepanje faktora B u prisustvu Mg<++>/EGTA.

Međutim, kako je prikazano na traci 4, cepanje faktora B obnovljeno je dodavanjem i predinkubacijom pune dužine, rekombinantnog MASP-3 proteina u 3MC serumu, kako je opisano u Primeru 17;

FIG.37 prikazuje Kumasi bojenje proteinskog gela u kojem je analizirano cepanje faktora B, pokazujući da je cepanje faktora B najoptimalnije u prisustvu C3, MASP-3 i pro-faktora D (traka 1), i kako je prikazano na trakama 4 i 5, ili MASP-3 ili pro-faktor D sami sposobni su da posreduju cepanje faktora B, dokle god je prisutan C3, kako je opisano u Primeru 17;

FIG.38 grafički prikazuje srednje intezitete fluorescencije (MFI) C3b bojenja za S. aureus dobijena iz mAbD14 (koje vezuje MASP-3), mAb1A5 (antitelo negativne kontrole) i izotipno kontrolno antitelo prikazano kao funkcija mAb koncentracije u 3MC serumu u prisustvu rMASP-3, pokazujući da mAbD14 inhibira MASP-3-zavisno C3b taloženje na način zavisan od koncentracije, kako je opisano u Primeru 17; FIG.39 prikazuje Western blot analizu cepanja supstrata pro-faktora D, u kojoj se u poređenju sa samim pro-faktorom D (traka 1) ili neaktivnim rekombinantnim MASP-3 pune dužine (S679A; traka 3) ili MASP-1 (S646A; traka 4), divljim tipom rekombinantnim MASP-3 pune dužine (traka2) i MASP-1 (traka 5) ili potpuno ili delimično cepa pro-faktor D kako bi se generisao zreli faktor D, kako je opisano u Primeru 18; FIG.40 je Western blot koji prikazuje inhibitornu aktivnost MASP-3 vezujućih mAb-ova D14 (traka 2) i M3M1 (traka 3) na MASP-3-zavisno cepanje pro-faktora D u poređenju sa kontrolnom reakcijom koja

1

sadrži samo MASP-3 i pro-faktor D (bez mAb-a, traka 1), kao i kontrolnom reakcijom koja sadži mAb dobijeno iz DTLacO biblioteke koja vezuje MASP-1, ali ne MASP-3 (traka 4), kako je opisano u Primeru 18;

FIG.41 grafički prikazuje nivo AP-vođenog C3b taloženja na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma dobijenim od MASP-3-deficijentnih (3MC), C4-deficijentnih i MBL-deficijentnih subjekata, pokazujući da MASP-3-deficijentni serumi od Pacijenta 2 i Pacijenta 3 imaju preostalu AP aktivnost pri visokim koncentracijama u serumu (25%, 12.5%, 6.25% koncentracije u serumu), ali značajno viši AP50(tj., 8.2% i 12.3% seruma potrebnog da se postigne 50% maksimalnog C3 taloženja), kako je opisano u Primeru 19;

FIG.42 grafički prikazuje nivo AP-vođenog C3b taloženja na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama pod “uobičajenim” AP-specifičnim uslovima (tj., BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) kao funkcija vremena u 10% uzorcima humanog seruma dobijenim od MASP-3 deficijentnih, C4-deficijentnih i MBL-deficijentnih humanih subjekata, kako je opisano u Primeru 19;

FIG.43 grafički prikazuje procenat hemolize (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih zečijih eritrocita u supernatantu izmereno fotometrijom) mananom-obloženih zečijih eritrocita u opsegu serumskih koncentracija u serumu od dva normala humana subjekta (NHS) i od dva 3MC pacijenta (Pacijent 2 i Pacijent 3), izmereno u odsustvu Ca<++>, pokazujući da MASP-3 deficijencija redukuje procenat komplementom-posredovanog liziranja mananom-obloženih eritrocita u poređenju sa normalnim humanim serumom, kako je opisano u Primeru 19;

FIG.44 grafički prikazuje nivo AP-vođenog C3b taloženja na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncetracije rekombinantnog MASP-3 proteina pune dužine dodatog uzorcima seruma dobijenim od humanog 3MC Pacijenta 2 (MASP-3<-/->), pokazujući da, u poređenju sa negativnom kontrolom neaktivan rekombinantni MASP-3 (MASP-3A; S679A), aktivan rekombinantni MASP-3 protein rekonstruiše AP-vođeno C3b taloženje na zimosanom-obloženim pločama na način zavisan od koncentracije, kako je opisano u Primeru 19;

FIG.45 grafički prikazuje procenat hemolize (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih zečijih eritrocita u supernatantu izmereno fotometrijom) mananom-obloženih zečijih eritrocita u opsegu serumskih koncentracija in (1) normalni humani serum (NHS); (2) serum 3MC pacijenta; (3) serum 3MC pacijenta plus aktivan rekombinantan MASP-3 pune dužine (20 µg/ml); i (4) toplotom-inaktiviran humani serum (HIS), izmereno u odsustvu Ca<++>, pokazujući da je procenat liziranja zečijih eritrocita značajno povećan u 3MC serumu koji sadrži rMASP-3 u poređenju sa procentom liziranja u 3MC serumu bez rekombinantnog MASP-3 (p=0.0006), kako je opisano u Primeru 19;

FIG.46 grafički prikazuje procenat liziranja žečijih eritrocita u 7% humanom serumu iz 3MC Pacijent 2 i iz 3MC Pacijenta 3 koji sadrže aktivan rekombinantan MASP-3 pri koncentracionom opsegu od 0 do 110

1

µg/ml (in BBS/ Mg<++>/EGTA, pokazujući da se procenat liziranja zečijeg eritrocita povećava sa količinom rekombinantnog MASP-3 na način zavisan od koncentracije, kako je opisano u Primeru 19; i

FIG.47 grafički prikazuje nivo LEA-2-vođenog C3b taloženja na mananom-obloženim ELISA pločama kao funkcija koncetracije humanog seruma razblaženog u BBS puferu, za serum iz normalnog humanog subjekta (NHS), od dva 3MC pacijenta (Pacijent 2 i Pacijent 3), od roditelja pacijenta 3 i od MBL-deficijentnog subjekta.

OPIS LISTE SEKVENCI

[0033]

SEQ ID NO:1 humana MAp19 cDNK

SEQ ID NO:2 humani MAp19 protein (sa vodećom)

SEQ ID NO:3 humani MAp19 protein (zreli)

SEQ ID NO:4 humana MASP-2 cDNK

SEQ ID NO:5 humani MASP-2 protein (sa vodećom)

SEQ ID NO:6 humani MASP-2 protein (zreli)

SEQ ID NO:7 humana MASP-3 cDNK

SEQ ID NO:8 humani MASP-3 protein (sa vodećom)

SEQ ID NO:9 humana MASP-1 cDNK

SEQ ID NO:10 humani MASP-1 protein (sa vodećom)

SEQ ID NO:11 humani MAp44 protein (sa vodećom)

SEQ ID NO: 12 MASP-2 cDNK pacova

SEQ ID NO: 13 MASP-2 protein pacova (sa vodećom)

SEQ ID NO:14 DNK koja kodira 17D20_dc35VH21N11VL (OMS646) varijabilni region teškog lanca (VH) (bez signalnog peptida)

SEQ ID NO:1517D20_dc35VH21N11VL (OMS646) polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca (VH) SEQ ID NO: 1617N16mc polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca (VH)

SEQ ID NO:1717D20_dc21N11VL (OMS644) polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca (VL)

SEQ ID NO:18 DNK koja kodira 17N16_dc17N9 (OMS641) varijabilni region lakog lanca (VL) (bez signalnog peptida)

SEQ ID NO:1917N16_dc17N9 (OMS641) polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca (VL)

SEQ ID NO:20: scFv klon ćerka 17N16m_d17N9 polipeptid pune dužine

SEQ ID NO:21: scFv klon ćerka 17D20m_d3521N11 polipeptid pune dužine

SEQ ID NO:22: scFv klon ćerka 17N16m_d17N9 DNK koji kodira polipeptid pune dužine (bez signalnog peptida)

1

SEQ ID NO:23: scFv klon ćerka 17D20m_d3521N11 DNK koji kodira polipeptid pune dužine (bez signalnog peptida)

SEQ ID NO:24: roditeljski DTLacO polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca (VH) SEQ ID NO:25: MASP-3 specifični klon M3J5 polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca (VH)

SEQ ID NO:26: MASP-3 specifični klon M3M1 polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca (VH)

SEQ ID NO:27: roditeljski DTLacO polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca (VL)

SEQ ID NO:28: MASP-3 specifični klon M3J5 polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca (VL)

SEQ ID NO:29: MASP-3 specifični klon M3M1 polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca (VL)

SEQ ID NO:30: MASP-3 klon D14 polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca (VH)

SEQ ID NO:31: MASP-3 klon D14 polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca (VL)

SEQ ID NO:32: MASP-1 klon 1E10 polipeptid varijabilnog regiona teškog lanca (VH)

SEQ ID NO:33: MASP-1 klon 1E10 polipeptid varijabilnog regiona lakog lanca (VL)

SEQ ID NO:34 SGMI-1 peptid

SEQ ID NO:35 SGMI-2 peptid

SEQ ID NO:36 human IgG1-Fc polipeptid;

SEQ ID NO:37 peptidni linker #1 (12aa);

SEQ ID NO:38: peptidni linker #2 (10aa);

SEQ ID NO:39: nukleinska kiselina koja kodira polipeptidnu fuziju koja obuhvata humanu IL-2-signalnu sekvencu, SGMI-1, linker#1, i humani IgG1-Fc;

SEQ ID NO:40: zrela polipeptidna fuziju koja obuhvata SGMI-1, linker#1 i humani IgG1-Fc (SGMI-1Fc); SEQ ID NO:41: nukleinska kiselina koja kodira polipeptidnu fuziju koja obuhvata humanu IL-2-signalnu sekvencu, SGMI-2, linker#1 i humani IgG1-Fc;

SEQ ID NO:42: zrela polipeptidna fuziju koja obuhvata SGMI-2, linker#1 i humani IgG1-Fc (SGMI-2Fc).

DETALJAN OPIS

I. DEFINICIJE

[0034] Ukoliko nije specifično naznačeno, svi ovde korišćeni izrazi imaju isto značenje koje stručnjaci iz oblasti ovog pronalaska uobičajeno podrazumevaju. Definicije koje slede obezbeđene su kako bi dalo razjašnjenje izraza kakvi se koriste u opisu i patentnim zahtevima radi opisivanja ovog pronalaska.

[0035] Kako se ovde koristi, efektorski krak 1 lektinskog puta ("LEA-1") odnosi se na lektin-zavisnu aktivaciju faktora B i faktora D pomoću MASP-3.

[0036] Kako se ovde koristi, efektorski krak 2 lektinskog puta ("LEA-2") odnosi se na MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa.

1

[0037] Kako se ovde koristi, izraz "MASP-3-zavisna aktivacija komplementa" obuhvata dve komponente: (i) lektin MASP-3-zavisna aktivacija faktora B i faktora D, obuhvaćeni u LEA-1-posredovanoj aktivaciji komplementa, odvija se u prisustvu Ca<++>, što uobičajeno vodi ka konverziji C3bB u C3bBb i pro-faktora D u faktor D; i (ii) lektin-nezavisna konverzija faktora B i faktora D, koja se može odvijati u odsustvu Ca<++>, koja uobičajeno vodi ka konverziji C3bB u C3bBb i pro-faktora D u faktor D. Određeno je da LEA-1-posredovana aktivacija komplementa i lektin-nezavisna konverzija faktora B i faktora D izaziva opsonizaciju i/ili liziranje. Bez želje da se vezuje za bilo koju teoriju, smatra se da samo kada je više C3b molekula povezano i vezuje se u velikoj blizini, C3bBb C3 konvertaza menja svoju supstratnu specifičnost i cepa C5 kao alternativni put C5 konvertaza koja se naziva C3bBb(C3b)n.

[0038] Kako se ovde koristi, izraz "MASP-2-zavisna aktivacija komplementa", ovde se takođe odnosi i na LEA-2-posredovanu aktivaciju komplementa, obuhvata MASP-2 lektin-zavisnu aktivaciju, koja se odvija u prisustvu Ca<++>, koja vodi ka obrazovanju C3 konvertaze C4b2a lektinskog puta i nakon akumuliranja proizvoda C3 cepanja C3b odmah posle C5 konvertaze C4b2a(C3b)n, za koju je određeno da izaziva opsonizaciju i/ili liziranje.

[0039] Kako se ovde koristi, izraz "uobičajeno shvatanje alternativnog puta" koji se takođe naziva "uobičajeni alternativni put" odnosi se na alternativni put pre ovde opisanog otkrića, tj., aktivacija komplementa koja je izazvana, na primer, zimosanom iz ćelijskih zidova gljiva i kvasca, lipopolisaharid (LPS) iz Gram negativnih spoljnih membrana, i zečijih eritrocita, kao i iz mnogih čistih polisaharida, virusa, bakterija, životinjskih tumor ćelija, parazita i oštećenih ćelija, i za koje se uobičajeno smatralo da proizilaze iz spontanog proteolitičkog generisanja C3b iz komplementnog faktor C3. Kako se ovde koristi, aktivacija "uobičajenog alternativnog puta", koja se ovde takođe odnosi i na "alternativni put", meri se u Mg<++>/EGTA puferu (tj., u odsustvu Ca<++>).

[0040] Kako se ovde koristi, izraz "lektinski put" odnosi se na aktivaciju komplementa koja se odvija putem specifičnog vezivanja serumskih i ne-serumskih ugljeni hidrat-vezujućih proteina koji uključuju manan-vezujući lektin (MBL), CL-11 i fikoline (H-fikolin, M-fikolin, ili L-fikolin). Kako je ovde opisano, pronađeno je da je lektinski put vođen pomoću dva efektorska kraka, efektorski krak 1 lektinskog puta (LEA-1), koji je sada poznato MASP-3-zavisan, i efektorski krak 2 lektinskog puta (LEA-2), koji je MASP-2-zavisan. Kako se ovde koristi, aktivacija lektinskih puteva određuje se primenom pufera kloji sadrže Ca<++>.

[0041] Kako se ovde koristi, izraz "klasični put" odnosi se na aktivaciju komplementa koja je izazvana antitelom vezanim za stranu česticu i zahteva vezivanje prepoznavajućeg molekula C1q.

1

[0042] Kako se ovde koristi, izraz "HTRA-1" odnosi se na serinsku peptidazu serinsku proteazu A1 koja zahteva visoke temperature.

[0043] Kako se ovde koristi, izraz "MASP-3 inhibitorni agens" odnosi se na bilo koji agens koji direktno ili indirektno inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa, koji uključuju agense koji se vezuju za ili direktno ulaze u reakciju sa MASP-3, koji uključuju MASP-3 antitela i njegove MASP-3 vezujuće fragmente, prirodne i sintetičke peptide, kompetitivne supstrate, male-molekule, ekspresione inhibitore i izolovane prirodne inhibitore, i i takođe obuhvata peptide koji ulaze u kompeticiju sa MASP-3 za vezivanje sa još jednim molekulom prepoznavanja (npr., MBL, CL-11, H-fikolin, M-fikolin, ili L-fikolin) u lektinskom putu. U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens je specifičan za MASP-3, i ne vezuje se za MASP-1 ili MASP-2. Inhibitorni agens koji direktno inhibira MASP-3 može se nazvati direktan MASP-3 inhibitorni agens (npr., MASP-3 antitelo), dok inhibitorni agens koji indirektno inhibira MASP-3 može se nazvati indirektan MASP-3 inhibitorni agens (npr., MASP-1 antitelo koje inhibira MASP-3 aktivaciju). Primer direktnog MASP-3 inhibitornog agensa je MASP-3 specifični inhibitorni agens, kao što je MASP-3 inhibitorni agens koji se specifično vezuje za deo MASP-3 (SEQ ID NO:8) sa afinitetom vezivanja od najmanje 10 puta većim u odnosu na druge komponente u sistemu komplementa. U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens indirektno inhibira MASP-3 aktivnost, kao što je, na primer, inhibitor MASP-3 aktivacije, koji uključuje inhibitor MASP-1-posredovane MASP-3 aktivacije (npr., MASP-1 antitelo ili njegov MASP-1 vezujući fragmenti, prirodne i sintetičke peptide, male-molekule, ekspresione inhibitore i izolovane prirodni inhibitore, a takođe obuhvata peptide koji ulaze u kompeticiju sa MASP-1 za vezivanje za MASP-3). U još jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens inhibira MASP-3-posredovano sazrevanje faktora D. U još jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens inhibira MASP-3-posredovanu aktivaciju faktora B. MASP-3 inhibitorni agensi korisni u postupku ovog otkrića mogu redukovati MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa za više od 10%, kao što je više od 20%, više od 50%, ili više od 90%. U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens redukuje MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa za više od 90% (tj., rezultuje kao MASP-3 aktivacija komplementa od samo 10% ili manje). Očekuje se da MASP-3 inhibicija blokira, potpuno ili delimično, i LEA-1-povezano liziranje i opsonizaciju i lektin-nezavisnu konverziju faktor B i faktora D-povezanog liziranja i opsonizacije.

[0044] Kako se ovde koristi, izraz "MASP-1 inhibitorni agens" odnosi se na bilo koji agens koji se vezuje za ili direktno ulazi u reakciju sa MASP-1 i inhibira najmanje jedan od (i) MASP-3-zavisne aktivacije komplementa i/ili (ii) MASP-2-zavisne aktivacije komplementa i/ili (iii) lektin-nezavisnog ili lektinzavisnog MASP-1-posredovanog sazrevanja faktora D, u kojoj lektin-zavisno MASP-1 sazrevanje faktora D uključuje direktnu aktivaciju faktora D, koji uključuje MASP-1 antitela i njegove MASP-1 vezujuće

2

fragmente, prirodne i sintetičke peptide, male-molekule, ekspresione inhibitore i izolovane prirodne inhibitore, i takođe obuhvata peptide koji ulaze u kompeticiju sa MASP-1 za vezivanje sa još jednim molekulom prepoznavanja (npr., MBL, CL-11, H-fikolin, M-fikolin, ili L-fikolin) u lektinskom putu. MASP-1 inhibitorni agensi korisni u postupku ovog otkrića redukuju MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa za više od 10%, kao što je više od 20%, više od 50%, ili više od 90%. MASP-1 inhibitorni agens redukuje MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa za više od 90% (tj., rezultuje kao MASP-3 aktivacija komplementa od samo 10% ili manje). U još jednom slučaju, MASP-1 inhibitorni agensi korisni u postupku ovog otkrića redukuju MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa za više od 10%, kao što je više od 20%, više od 50%, ili više od 90%. U jednom slučaju, MASP-1 inhibitorni agens redukuje MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa za više od 90% (tj., rezultuje kao MASP-2 aktivacija komplementa od samo 10% ili manje).

[0045] MASP-1 inhibitorni agensi korisni u postupku ovog otkrića redukuju i MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa (LEA-1), lektin-nezavisnu konverziju faktora B i faktora D, i MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa (LEA-2) za više od 10%, kao što je više od 20%, više od 50%, ili više od 90%. MASP-1 inhibitorni agens redukuje MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa (LEA-1), lektin-nezavisnu konverziju faktora B i faktora D, i MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa (LEA-2) za više od 90% (tj., rezultuje kao MASP-3 aktivacija komplementa od samo 10% ili manje i MASP-2 aktivacija komplementa od samo 10% ili manje).

[0046] Primer direktnog MASP-1 inhibitornog agensa je MASP-1-specifični inhibitorni agens, kao što je MASP-1 inhibitorni agens koji se specifično vezuje za deo MASP-1 (SEQ ID NO:10) sa afinitetom vezivanja od najmanje 10 puta većim u odnosu na druge komponente u sistemu komplementa. U mnogim slučajevima, uzimajći u obzir da MASP-1 može da aktivira MASP-3, i uzimajući u obzir da MASP-1 može da aktivira MASP-2, može se očekivati da inhibicija MASP-1 bude efektivna u inhibiranju MASP-3 i/ili MASP-2. U nekim slučajevima, međutim, inhibicija ili MASP-1 ili MASP-3 ili MASP-2 mogu biti poželjan slučaj u odnosu na inhibiciju drugih MASP ciljeva. Na primer, u postavkama Staphylococcus aureus (S. aureus) infekcije, pokazalo se da je MASP-3 aktiviran i da je odgovoran za S. aureus opsonizaciju u odsustvu MASP-1 (videti Iwaki D. et al., J Immunol 187(7):3751-8 (2011)). Prema tome, u lečenju paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH), na primer, može biti poželjno da se direktno inhibira MASP-1 pre nego MASP-3, čime se redukuje potencijalna čime reducing the potential podložnost na S. aureus tokom LEA-1-inhibitornog lečenja PNH.

[0047] Kako se ovde koristi, izraz "MASP-2 inhibitorni agens" odnosi se na bilo koji agens koji se vezuje za ili direktno ulazi u reakciju sa MASP-2 i inhibira najmanje jedan od (i) MASP-2-zavisne aktivacije komplementa i/ili (ii) MASP-1-zavisne aktivacije komplementa, koji uključuju MASP-2 antitela i njegov MASP-2 vezujuće fragmente, prirodne i sintetičke peptide, male-molekule, ekspresione inhibitore i izolovane prirodne inhibitore, i takođe obuhvata peptide koji ulaze u kompeticiju sa MASP-2 za vezivanje sa još jednim molekulom prepoznavanja (npr., MBL, CL-11, H-fikolin, M-fikolin, ili L-fikolin) u lektinskom putu. MASP-2 inhibitorni agensi korisni u postupku ovog otkrića mogu redukovati MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa za više od 10%, kao što je više od 20%, više od 50%, ili više od 90%. U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorni agens redukuje MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa za više od 90% (tj., rezultuje kao MASP-2 aktivacija komplementa od samo 10% ili manje). Primer direktnog MASP-2 inhibitornog agensa je MASP-2-specifični inhibitorni agens, kao što je MASP-2 inhibitorni agens koji se specifično vezuje za deo MASP-2 (SEQ ID NO:5) sa afinitetom vezivanja od najmanje 10 puta većim u odnosu na druge komponente u sistemu komplementa.

[0048] Kako se ovde koristi, izraz "antitelo" obuhvata antitela i njegove fragmente antitela, izvedene iz bilo kog sisara koji proizvodi antitela (npr., miš, pavoc, zec, i primat uključujujući čoveka), ili iz hibridoma, odabirom faga, rekombinantnom ekspresijom ili transgenim životinjama (ili drugim postupcima za proizvodnju antitela ili fragmenata antitela“), koje se specifično vezuju za ciljani polipeptid, kao što su, na primer, MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 polipeptidi ili ili njihovi delovi. Nije namenjeno da izraz "antitelo" bude ograničavajuć u smislu izvora antitela ili načina na koje je obrazovano (npr., hobridomom, odabirom faga, rekombinantnom ekspresijom, transgenom životinjom, peptidnom sintezom, itd). Primerna antitela uključuju poliklonalna, monoklonalna i rekombinantna antitela; pan-specifična, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela, trispecifična antitela); humanizovana antitela; mišja antitela; himerna, mišja-humana, mišja-primatna, primatna-humana monoklonalna antitela; i anti-idiotip antitela, i mogu biti bilo koje netaknuto antitelo ili njegov fragment. Kako se ovde koristi, izraz "antitelo" obuhvata ne samo intaktna poliklonalna ili monoklonalna antitela, već i njegove fragmente (kao što je dAb, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jedno-lančana (ScFv), njihove sintetičke varijante, prirodno javljajuće varijante, fuzione proteine koji obuhvataju deo antitelo sa antigenvezujućim fragmentom tražene specifičnosti, humanizovana antitela, himerna antitela, i bilo koja druga modifikovana konfiguracija imunoglobulinskog molekula koji obuhvata antigen-vezujuće mesto ili fragment (mesto prepoznavanja epitopa) tražene specifičnosti.

[0049] "Monoklonalno antitelo" odnosi se na homogenu populaciju antitela u kojoj je monoklonalno antitelo sačinjeno od aminokiselina (prirodno javljajuće i ne-prirodno javljajuće) koje su uključene u selektivno vezivanje epitopa. Monoklonalna antitela veoma su specifična za ciljani antigen. Izraz "monoklonalno antitelo" obuhvata ne samo intaktna monoklonalna antitela i monoklonalna antitela pune dužine, već i njihove fragmente (kao što je Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jedno-lančana (ScFv), njihove varijante, fuzione proteine koji obuhvataju antigen-vezujući deo, humanizovana monoklonalna antitela, himerna monoklonalna antitela, i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju imunoglobulinskog molekula koji obuhvata antigen-vezujući fragment (mesto prepoznavanja epitopa) tražene specifičnosti i spodobnost da se veže za epitop. Nije namenjeno ogranučavanje u smislu izvora antitela ili načina na koji se obrazuje (npr., hibridomom, odabirom faga, rekombinantnom ekspresijom, transgenim životinjama, itd.). Izraz uključuje cele imunoglobuline kao i fragmente itd. prethodno opisani pod definicijom "antitelo".

[0050] Kako se ovde koristi, izraz "fragment anititela" odnosi se na deo izveden iz ili u vezi sa antitelom pune dužine, kao što je, na primer, MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 antitelo, koje generalno uključuje antigen vezivanje ili njegov varijabilni region. Ilustrativni primeri fragmenata anititela uključuju Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2i Fv fragmente, scFv fragmente, dijatela, linearna antitela, jedno-lančane molekuli antitela i multispecifična antitela obrazovana od fragmenata anititela.

[0051] Kako se ovde koristi, "jedno-lančani Fv" ili "scFv" fragment anititela obuhvata VHi VLdomene antitela, u kojima su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. Generalno, Fv polipeptid dalje obuhvata polipeptidni linker između VHi VLdomena, koji omogućava da scFv obrazuje željenu strukturu za antigen vezivanje.

[0052] Kako se ovde koristi, "himerno antitelo" je rekombinantni protein koji sadrži varijabilne domene i komplementarnost-određujući regioni izvedeni iz ne-humanih vrsta (npr., glodari) antitela, dok je ostatak molekula antitela izvedene iz humanog antitela.

[0053] Kako se ovde koristi, "humanizovano antitelo" je himerno antitelo koje obuhvata minimalnu sekvencu koja je u skladu sa specifičnim komplementarnost-određujućim regionima izvedenim iz nehumanog imunoglobulina koji je transplantiran u okvir humanog antitela. Humanizovana antitela uobičajeno su rekombinantni proteini u kojima su samo komplementarnost-određujući regioni antitelo ne-humanog porekla (koji uključuju antitela generisana iz prikaza faga ili kvasca).

[0054] Kako se ovde koristi, izraz "manan-vezujući lektin" ("MBL") ekvivalentan je manan-vezujući protein ("MBP").

[0055] Kako se ovde koristi, "kompleks membranskog napada" ("MAC") odnosi se na kompleks terminalnih pet komplement komponenata (C5b kombinovan sa C6, C7, C8 i C9) koji se umeće u i prekida membrane (koji se takođe naziva C5b-9).

2

[0056] Kako se ovde koristi, " subjekat" uključuje sve sisare, koji uključuju bez lograničavanja ljude, nehumane primate, pse, mačke, konje, ovce, koze, krave, zečeve, svinje i glodare.

[0057] Kako se ovde koristi, aminokiselinski ostaci skraćeni su kako sledi: alanin (Ala;A), asparagin (Asn;N), asparaginska kiselina (Asp;D), arginin (Arg;R), cistein (Cys;C), glutaminska kiselina (Glu;E), glutamin (Gln;Q), glicin (Gly;G), histidin (His;H), izoleucin (Ile;I), leucin (Leu;L), lizin (Lys;K), metionin (Met;M), fenilalanin (Phe;F), prolin (Pro;P), serin (Ser;S), treonin (Thr;T), triptofan (Trp;W), tirozin (Tyr;Y), i valin (Val;V).

[0058] U najširem smislu, prirodno javljajuće aminokiseline mogu se podeliti na grupe bazirane na osnovu hemijskih karakteristike bočnog lanca respektivnih aminokiselina. Pod "hidrofobna" aminokiselina misli se ili na Ile, Leu, Met, Phe, Trp, Tyr, Val, Ala, Cys ili Pro. Pod "hidrofolna" aminokiselina misli se ili na Gly, Asn, Gln, Ser, Thr, Asp, Glu, Lys, Arg ili His. Ovo grupisanje aminokiselina dalje može biti podklasirano kako sledi. Pod "nenaelektirsana hidrofilnac" aminokiselina misli se ili na Ser, Thr, Asn ili Gln. Pod "kisela" aminokiselina misli se ili na Glu ili Asp. od "bazna" aminokiselina misli se ili na Lys, Arg ili His.

[0059] Kako se ovde koristi izraz "konzervativna aminokiselinska supstitucija" ilustrovana je supstitucijom među aminokiselinama unutar svake od sledećih grupa: (1) glicin, alanin, valin, leucin, i izoleucin, (2) fenilalanin, tirozin, i triptofan, (3) serin i treonin, (4) aspartat i glutamat, (5) glutamin i asparagin, i (6) lizin, arginin i histidin.

[0060] Izraz "oligonukleotid" kako se ovde koristi odnosi se na oligomer ili polimer ribonukleinske kiseline (RNK) ili deoksiribonukleinske kiseline (DNK) ili njihovih mimetika. Ovaj izraz takođe pokriva one oligonukleobaze sačinjene od prirodno-javljajućih nukleotida, šećera i kovalentnih internukleozidnih (okosnica) veza kao i oligonukleotida koji imaju ne-prirodno-javljajuć modifikacije.

[0061] Kako se ovde koristi, "epitop" odnosi se na mesto na proteinu (npr., humani MASP-3 protein) koje je vezano antitelom. "Preklapajući epitopi" uključuju najmanje jedan (npr., dva, tri, četiri, pet, ili šest) zajednički aminokiselinski ostatak(ke), koji uključuju linearne i ne-linearne epitope.

[0062] Kako se ovde koristi, izrazi "polipeptid," "peptid," i "protein" koriste se naizmenično i označavaju bilo koji peptidom-povezani aminokiselinski lanac, bez obzira na dužinu ili post-translacionu modifikaciju. MASP proteini (MASP-1, MASP-2 ili MASP-3) opisani ovde mogu da sadrže ili da budu divljitip proteina ili mogu biti varijante koje nemaju više od 50 (npr., ne više od jedne, dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, ili 50) konzervativnih aminokiselinskih supstitucija. Konzervativne supstitucije obično uključuju supstitucije unutar sledećih grupa: glicin i alanin; valin, izoleucin, i leucin; asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; asparagin, glutamin, serin i treonin; lizin, histidin i arginin; i fenilalanin i tirozin.

[0063] Humani MASP-1 protein (naveden kao SEQ ID NO:10), humani MASP-2 protein (naveden kao SEQ ID NO:5) i humani MASP-3 protein (naveden kao SEQ ID NO:8) opisani ovde takođe uključuju "peptidne fragmente" tih proteina, koji su kraći od MASP proteina pune dužine i/ili nezrelih (pre-pro), koji uključuju peptidne fragmente MASP proteina koji uključuje terminalne kao i interne delecione varijante proteina. Delecione varijante može da nedostaje jedan, dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 aminokiselinskih segmenata (dve ili više aminokiselina) ili nesusednih pojedinačnih aminokiselina. Humani MASP-1 protein može imati aminokiselinsku sekvencu koja je, ili ili je više od, 70 (npr., 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100) % identična humanom MASP-1 proteinu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 10.

[0064] Humani MASP-3 protein može imati aminokiselinsku sekvencu koja je, ili ili je više od, 70 (npr., 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100) % identična humanom MASP-3 proteinu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 8.

[0065] U nekim slučajevima, humani MASP-2 protein može imati aminokiselinsku sekvencu koja je, ili ili je više od, 70 (npr., 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ili 100) % identična humanom MASP-2 proteinu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 5.

[0066] U nekim slučajevima, peptidni fragmenti mogu biti najmanje 6 (npr., najmanje 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, ili 600 ili više) aminokiselinskih ostataka u dužini (npr., najmanje 6 susednih aminokiselinskih ostataka u bilo kojoj iz SEQ ID NOS: 5, 8 ili 10). U nekim slučajevima, antigenski peptidni fragment humanog MASP proteina manji je od 500 (npr., manji od 450, 400, 350, 325, 300, 275, 250, 225, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28,

2

27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, ili 6) aminokiselinskih ostataka u dužini (npr., manji od 500 susednih aminokiselinskih ostataka u bilo kojoj iz SEQ ID NOS: 5, 8 ili 10).

[0067] U nekim slučajevima, u kontekstu generisanja antitela koje vezuje MASP-1, MASP-2 i/ili MASP-3, peptidni fragmenti su antigenski i zadržavaju najmanje 10% (npr., najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 35%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, najmanje 99.5%, ili 100% ili više) sposobnosti proteina pune dužine da indukuje antigenski odgovor kod nekog sisara (videti ispod pod "Postupci za proizvodnju antitela").

[0068] Procenat (%) aminokiselinskog sekvencionog identiteta definisan je kao procenat aminokiseline u sekvenci kandidatu koja je identična aminokiselinama u referentnoj sekvenci, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ukoliko je potrebno, kako bi se postigao maksimalana procenat sekvencionog identiteta. Poravnanje u cilju određivanja procenta sekvencionog identiteta može se postići na razne načine koji su unutar veština stručnjaka iz ove oblasti, primera radi, upotrebom javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ili Megalign (DNASTAR) softver. Poželjni parametri za merenje poravnanja, koji uključuju bilo koje algoritme potrebne da se postigne maksimalno poravnanje preko pune dužine sekvenci koje se porede mogu se odrediti poznatim postupcima.

[0069] Humani MASP-1 protein (SEQ ID NO:10) kodiran je cDNK sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:9; humani MASP-2 protein (SEQ ID NO:5) kodiran je cDNK sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:4; i humani MASP-3 protein (SEQ ID NO:8) kodiran je cDNK sekvencom navedenom kao SEQ ID NO:7.

Stručnjacima je jasno da cDNK sekvence opisane u SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:7 predstavljaju jednu alelu humanih MASP-1, MASP-2 i MASP-3, respektivno, i da se očekuje pojava alelne varijacije i alternativnog spajanja. Alelne varijante nukleotidnih sekvenci prikazane u SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:7, koje uključuju koje uključuju one koje sadrže tihe mutacije i one koje rezultuju kao promene aminokiselinskih sekvenci, nalaze se u okviru ovog opisa. Alelne varijante MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 sekvenca mogu biti klonirane ispitivanjem cDNK ili genomskih biblioteka od različitih pojedinaca u skladu sa standardnim procedurama, ili se mogu identifikovati pretraživanjem poređenja homologije (npr., BLAST pretraživanje) baza podataka koje sadrže takvu informaciju.

II. LEKTINSKI PUT: NOVO SHVATANJE

i. Pregled: lektinski put je redefinisan

2

[0070] Kako je ovde opisano, pronalazači su došli do neočekivanog otkrića da lektinski put komplementa ima dva efektorska kraka za aktivaciju komplementa, oba vođena aktivacijom kompleksa lektinskog puta obrazovani od komponenata koje prepoznaju ugljene hidrate (MBL, CL-11 i fikolini): i) efektorski krak obrazovan lektinski put-povezanim serinskim proteazama MASP-1 i MASP-3, ovde je označen kao "efektorski krak 1 lektinskog puta" ili "LEA-1"; i (ii) efektorski krak MASP-2 vođene aktivacije, ovde je označen kao "efektorski krak 2 lektinskog puta", ili "LEA-2". I LEA-1 i LEA-2 mogu da utiču na liziranje i/ili opsonizaciju.

[0071] Takođe je određeno da lektin-nezavisna konverzija faktora B pomoću MASP-3 i lektin-nezavisna konverzija faktora D pomoću HTRA-1, MASP-1 i MASP-3, koje se obe odvojaju u odsustvu Ca<++>, uobičajeno vode ka konverziji C3bB u C3bBb i pro-faktora D u faktor D. Prema tome, inhibiranje MASP-3 može inhibirati obe LEA-1 i lektin-nezavisne aktivacije faktora B i/ili faktora D, što može rezultovati kao inhibicija liziranja i/ili opsonizacije.

[0072] FIG.1 prikazuje ovo novo shvatanje puteva aktivacije komplementa. Kako je prikazano na FIG.1, LEA-1 is vođeno lektin-vezanim MASP-3, koji može da aktivira zimogen faktora D za njegov aktivan oblik i/ili pocepa C3b- ili C3b(H20)-vezan faktor B, što vodi ka konverziji C3bB zimogen kompleksa u njegov enzimski aktivan oblik C3bBb. Aktivirani faktor D, generisan pomoću MASP-3, takođe može konvertovati C3bB ili C3b(H20) zimogen kompleksa u njihove enzimski aktivni oblik. MASP-1 je sposoban za brzu samo-aktivaciju, dok MASP-3 nijue. U mnogim slučajevima, MASP-1 je aktivator za MASP-3.

[0073] Dok u mnogim primerima lektini (tj., MBL, CL-11 ili fikolini) mogu da utiču na ćelijske površine, FIG.1 takođe ističe lektin-nezavisne funkcije MASP-3, MASP-1, i HTRA-1 u aktivaciji faktora B i/ili sazrevanju faktora D. Kao i sa lektin-povezanim oblikom MASP-3 u LEA-1, lektin-nezavisan oblik MASP-3 sposoban je da posreduje konverziju C3bB ili C3b(H20) u C3bBb (takođe videti FIG.36 i 37) i pro-faktor D u faktor D (videti FIG.39). MASP-1 (takođe videti FIG.39) i ne-MASP-povezani protein HTRA-1 takođe mogu da aktiviraju faktor D (Stanton et al., Proof That the HTRA1 Interactome Influences Susceptibility to Age-Related Macular Degeneration, presented at The Association for Research in Vision and Ophthalmology 2011 conference on May 4, 2011) na način na koji nije potrebna lektinska komponenta.

[0074] Tako, MASP-1 (putem LEA-1 i lektin-nezavisnih oblika), MASP-3 (putem LEA-1 i lektin-nezavisnih oblika), i HTRA-1 (samo lektin-nezavisan) sposobni su bilo za direktnu ili indirektnu aktivaciju na jednoj ili više tačaka duž MASP-3 - faktor D - faktor B ose. Kako bi se to uradilo, oni generišu C3bBb, C3 konvertazu alternativnog puta, i stimulišu proizvodnju i taloženje C3b na mikrobnim površinama. C3b taloženje igra važnu ulogu u opsonizaciji, obeležavajući površine mikroba za uništavanje od strane

2

fagocitnih ćelija domaćina, kao što su makrofage. Kako je ovde dato kao primer (FIG.35), MASP-3 je kritičan za opsonizaciju of S. aureus. C3b taloženje odvija se brzo na S. aureus izložena humanom serumu na MASP-3-zavisan način (FIG.35).

[0075] Međutim, doprinosi LEA-1 i lektin-nezavisne funkcije MASP-3, MASP-1, ili HTRA-1 nisu ograničeni na opsonizaciju. Kako je prikazano na FIG.1, ove tri komponente mogu takođe da izazovu ćelijsku liziju indirektnom ili direktnom aktivacijom faktora B, i proizvodnjom C3b. Ove komponente obrazuju kompleks koji generiše alternativni put C5 konvertaza, C3bBb(C3b)n. Kako je dalje opisano, potreba za MASP-3 i MBL, ali ne i za MASP-2 (a, prema tome, ne i za LEA-2 u ovom Primeru), u liziranju N. meningitidis (videti FIG.13, 14 i 15) pokazuje ulogu LEA-1 u liziranju. Ukratko, rezultati opsonizacije dobijeni iz S. aureus ispitivanja i rezultati liziranja primećeni u N. meningitidis ispitivanjima podržavaju uloge LEA-1 u oba procesa (kako je prikazano na FIG.1). Pored toga, ova ispitivanja pokazuju da i opsonizacija i liziranje mogu da rezultuju iz konverzije C3bB ili C3b(H20) i/ili pro-faktora D u faktor D; prema tome, oba procesa mogu proizići iz lektin-nezavisnih uloga MASP-3, MASP-1, ili HTRA-1. Tako, model razvijen od strane pronalazača sa FIG.1 podržava upotrebu inhibitora principijelno MASP-3, ali i MASP-1 i/ili HTRA-1, radi blokiranja opsonizacije i/ili liziranja i radi lečenja patologija izazvane disregulacijom ovih procesa.

1. Efektorski krak lektinskog puta (LEA-1)

[0076] Prvi efektorski krak lektinskog puta, LEA-1, obrazovan je lektinski put-povezanim serinskim proteazama MASP-1 i MASP-3. Kako je ovde opisano, pronalazači su pokazali sa, u odsustvu MASP-3 i u prisustvu MASP-1, alternativni put nije efektivno aktiviran na površinskim strukturama. Ovi rezultati pokazuju da MASP-3 igra prethodno neopisanu ulogu u započinjanju alternativnog puta, a to je potvrđeno primenom MASP-3-deficijentnog 3MC seruma dobijenog od pacijenata sa retkim 3MC autozomnim recesivnim poremećajem (Rooryck C, et al., Nat Genet.43(3):197-203 (2011)) sa mutacijama koje daju domen serinske proteaze MASP-3 disfunkcionalnog. Na osnovu ovih novih saznanja, očekuje se da aktivacija komplementa koja uključuje alternativni put, kako je uobičajeno definisana, MASP-3-zavisna. Zapravo, MASP-3, i njegova aktivacija LEA-1, može da predstavlja do sada neuhvatljivog inicijatora alternativnog puta.

[0077] Kako je dalje opisano u Primerima 1-4, u MASP-2-deficijentnim serumima, pronalazači su zapazili višu aktivnost aktivacije lektin-zavisnog alternativnog puta koja rezultuje kao viša baktericidna aktivnost (tj., litička aktivnost) protiv N. meningitidis. Bez želje da se vezuje za bilo koju teoriju, smatra se da se u odsustvu MASP-2, kompleksi prepoznavanja MASP-1-nosećih ugljenih hidrata najverovatnije vezuju blizu kompleksa prepoznavanja MASP-3-nosećih ugljenih hidrata radi aktiviranja MASP-3. Poznato je da,

2

u mnogim slučajevima, aktivacija MASP-3 je zavisna od MASP-1 aktivnosta, kako MASP-3 nije autoaktivirajući enzim i veoma često zahteva aktivnost MASP-1 kako bi se konvertovao iz svog zimogen oblika u njegov enzimski aktivan oblik. MASP-1 (like MASP-2)je auto-aktivirajući enzim, dok MASP-3 nije auto-aktivirajuć i, u mnogim slučajevima, ima potrebu za enzimskom aktivnopću MASP-1 kako bi se konvertovao u njegov enzimski aktivan oblik. Videti, Zundel S, et al., J Immunol., 172(7):4342-50 (2004). U odsustvu MASP-2, u sve komplekse prepoznavanja lektinskog puta, uvedeni su ili MASP-1 ili MASP-3. Prema tome, odsustvo MASP-2 olakšava MASP-1-posredovanu konverziju MASP-3 u njegov enzimski aktivan oblik. Kada se jednom aktivira MASP-3, aktiviran MASP-3 inicira aktivaciju alternativnog puta, koja se dada naziva "LEA-1" aktivacija, putem MASP-3-posredovane konverzije C3bB u C3bBb i/ili konverzije pro-faktora D u faktor D. C3bBb, koji se takođe naziva C3 konvertaza alternativnog puta, cepa dodatne C3 molekule dajući taloženje opsoničnih C3b molekula. Ukoliko se nekoliko C3b fragmenata veže u velikoj blizini C3bBb kompleksa konvertaze, to za rezultat ima obrazovanje C5 konvertaze alternativnog puta C3bBb(C3b)n, koja promoviše obrazovanje MAC. Dodatno, C3b molekuli istaloženi na površini obrazuju nova mesta za vezivanje faktora B, koji sada može biti pocepan faktorom D i/ili MASP-3 radi obrazovanja dodatnih mesta u kojima se mogu obrazovati kompleksi koncertaze C3 i C5 alternativnog puta. Taj proces potreban je za efektivno liziranje i ne zahteva lektine u trenutku kada dođe do inicijalnog C3b taloženja. Skorije objave (Iwaki D. et al., J Immunol 187(7):3751-8 (2011)) kao i podaci generisani od strane pronalazača (FIG.37) pokazuju da se C3 konvertaza zimogen kompleksa C3bB alternativnog puta konvertuje u njegov enzimski aktivan oblik aktiviranjem MASP-3. Pronalazači zatim otkrivaju da MASP-3-posredovano cepanje faktora B predstavlja podkomponentu novo opisanog LEA-1, which promoiše lektin-zavisno obrazovanje C3 konvertaze alternativnog puta C3bBb.

2. Efektorski krak lektinskog puta (LEA-2)

[0078] Drugi efektorski krak lektinskog puta, LEA-2, obrazovan je lektinski put-povezanom serinskom proteazom MASP-2. MASP-2 je aktiviran nakon vezivanja komponenti prepoznavanja za njihove odgovarajuće obrazce, i takođe mogu biti aktivirane sa MASP-1, i naknadno pocepati komplement komponente C4 u C4a i C4b. Nakon vezivanja cepanja proizvoda C4b za plazmu C2, C4b-vezan C2 postaje supstrat druge faze MASP-2-posredovanog cepanja koja konvertuje C4b-vezan C2 u enzimski aktivan kompleks C4bC2a i mali C2b cepajući fragment. C4b2a je C3-konvertujuća C3 konvertaza lektinskog puta, koja konvertuje plazma komponentu u izobilju C3 u C3a i C3b. C3b se vezuje za bilo koju površinu u blizini putem tioestarske veze. Ukoliko se nekoliko C3b fragmenata veže u velikoj blizini sa C3 konvertaza kompleksom C4b2a, ta konvertaza menja svoju specifičnost radi konvertovanja C5 u C5b i C5a, obrazujući C5 konvertaza kompleks C4b2a(C3b)n. Dok ova C5 konvertaza može da inicira obrazovanje MAC, ovaj proces se smetra nedovoljno efektivnom da sam po sebi promoviše liziranje. Utoliko pre, inicijalni C3b opsonini proizvedeni od strane LEA-2 obrazuju jezgro za obrazovanje novih

2

mesta C3 konvertaze i C5 konvertaze alternativnog puta, koje na kraju vode ka izobilju MAC obrazovanja i liziranja. Poslednje pomenuta posreduje se faktor D aktivacijom faktora B povezanom sa LEA-2-obrazovanim C3b, i prema tome zavisna je od LEA-1 zahvaljujući suštinskoj ulozi za MASP-1 u sazrevanju faktora D. Takođe postoji MASP-2-zavisni C4-bajpas aktivacioni put za aktiviranje C3 u odsustvu C4, koji igra važnu ulogu u patofiziologiji ishemijsko-reperfuzione povreda, budući da C4-deficijentni miševi nisu zaštićeni od ishemijsko-reperfuzione povrede dok MASP-2-deficijentni miševi jesu (Schwaeble et al., PNAS, 2011 supra). LEA-2 je takođe povezan sa koagulacionim putem, koji uključuje cepanje protrombina na trombin (zajednički put) i takođe cepanje faktora XII (Hageman faktor) radi konvertovanja u njegov enzimski aktivan oblik XIIa. Faktor XIIa sa druge strne cepa faktor XI u XIa (unutrašnji put). Aktivacija unutrašnjeg puta zgrušavanja kaskada vodi ka obrazovanju fibrina, koji je bitnog značaja za obrazovanje tromba.

[0079] FIG.1 prikazuje novo shvatanje lektinskog puta i alternativni put baziran na ovde obezbeđenim rezultatima. FIG.1 ocrtava ulogu LEA-2 i u opsonizaciji i u liziranju. Dok je MASP-2 inicijator "nizvodnog" C3b taloženja (i rezultujuće opsonizacije) u višestrukim lektin-zavisnim uslovima fiziološki (FIG.20A, 20B, 20C), on takođe igra ulogu u liziranju serum-osetljivih bakterija. Kako je prikazano na FIG.1, predloženi molekulski mehanizam odgovoran za povećanu baktericidnu aktivnost MASP-2-deficijentnog ili MASP-2-osiromašenog seruma/plazme za serum-osetljiv patogen kao što je N. meningitidis je takav da, za liziranje bakterija, lektinski put prepoznavanje kompleksa povezan sa MASP-1 i MASP-3 treba da se vežu u međusobnoj blizini na bakterijskog površini, čime se omogućava da MASP-1 pocepa MASP-3. Nasuprot tome što MASP-1 i MASP-2, MASP-3 nije auto-aktivirajući enzim, već, u mnogim slučajevima, zahteva aktivaciju/cepanje od strane MASP-1 da bi se konvertovao u njegov enzimski aktivan oblik.

[0080] Kako je dalje prikazano na FIG.1, aktiviran MASP-3 može zatim da pocepa C3b-vezan faktor B na površini patogena radi započinjanja alternativne aktivaciona kaskada obrazovanjem enzimski aktivnih C3 i C5 konvertaza alternativnog puta C3bBb i C3bBb(C3b)n, respektivno. MASP-2-noseći lektinski-put aktivacioni kompleksi nemaju udeo u aktivaciji MASP-3, i, u odsustvu ili nakon trošenja MASP-2, svilektinski-put aktivacioni kompleksi uvedeni su ili u MASP-1 ili MASP-3. Prema tome, u odsustvu MASP-2, znatno je povećana verovatnoća da se na mikrobnoj površini MASP-1- i MASP-3-noseći lektinski-put aktivacioni kompleksi smeštaju u međusobnoj blizini, što vodi ka više aktiviranja MASP-3 i što time vodi ka većoj brzini MASP-3-posredovanog cepanja C3b-vezanog faktor B kako bi se obrazovale C3 i C5 konvertaze alternativnog puta C3bBb i C3bBb(C3b)n na mikrobnoj površini. To vodi ka aktivaciji terminalnih aktivacija kaskada C5b-C9 koja obrazuje kompleks membranskog napada, sačinjen od površinski-vezanog C5b povezanog sa C6, C5bC6 povezanog sa C7, C5bC6C7 povezanog sa C8, i C5bC6C7C8, što vodi ka polimerizaciji C9 koji se umeće u bakterijsku površinsku strukturu i oblikuje pore u bakterijskom zidu, što vodi ka osmolitičkom ubijanju komplement-ciljane bakterije.

[0081] Jezgro ovog inovativnog koncepta je takvo da ovde obezbeđeni podaci jasno pokazuju da aktivacija kompleksa lektinskog puta vodi dva sledeća distinktivna puta aktivacije, kako je prikazano na FIG.1:

i) LEA-1: MASP-3-zavisan put aktivacije koji započinje i vodi aktivaciju komplementa generisanjem konvertaze alternativnog puta C3bBb inicijalnim cepanjem i aktivacijom faktora B na aktivatorskoj površini, koji zatim katalizuje C3b taloženje i obrazovanje konvertaza alternativnog puta C3bBb. MASP-3-vođeni put aktivacije igra glavnu ulogu u opsonizaciji i liziranju mikroba i vodi alternativni put na površini bakterije, što vodi ka optimalnim brzinama aktivacije kako bi se generisao kompleksi membranskog napada; i

ii) LEA-2: MASP-2-zavisan put aktivacije koji vodi ka obrazovanju C3 konvertaza lektinskog puta C4b2a i, nakon akumuliranja proizvoda C3 cepanja C3b, naknadno ka C5 konvertazi C4b2a(C3b)n. U odsustvu komplementa C4, MASP-2 može da obrazuje alternativni C3 konvertaza kompleks koji uključuje C2 i faktor XI zgrušavanja.

[0082] Pored svoje uloge u liziranju, MASP-2-vođeni put aktivacije igra važnu ulogu u bakterijskoj opsonizaciji što vodi mikrobima koji su obloženi kovalentno vezanim C3b i njihovim proizvodima cepanja (tj., iC3b i C3dg), koji se mogu ciljati za preuzimanje i ubijanje pomoću C3 receptor-nosećim fagocitima, kao što su granulociti, makrofage, monociti, ćelije mikroglie i retikuloendotelijalni sistem. Ovo je najefektivniji put klirensa bakterija i mikroorganizama koje su rezistentni na liziranje komplementom. Oni uključuju većinu gram-pozitivnih bakterija.

[0083] Pored LEA-1 i LEA-2, postoji potencijal za lektin-nezavisnu aktivaciju faktora D pomoću MASP-3, MASP-1 i/ili HTRA-1, i takođe postoji potencijal za lektin-nezavisnu aktivaciju faktora B pomoću MASP-3.

[0084] Bez želje da se vezuje za bilo koju teoriju, smatra se da svaki od (i) LEA-1, (ii) LEA-2 i (iii) lektinnezavisne aktivacije faktora B i/ili faktora D vodi ka opsonizaciji i/ili obrazovanju MAC sa rezultujućim liziranjem.

ii. Pozadina MASP-1, MASP-2 i MASP-3

[0085] Trenutno je poznato da su tri manan-vezujuće lektin-povezane serinske proteaze (MASP-1, MASP-2 i MASP-3) povezane u humanom serum sa manan-vezujućim lektinom (MBL). Manan-vezujući lektin takođe se naziva 'manoza-vezujući protein' ili 'manoza-vezujući lektin' u novijoj literaturi. MBL-

1

MASP kompleks igra važnu ulogu u urođenom imunitetu zahvaljujući vezivanju MBL za strukture ugljenih hidrata prisutne kod širokog spektra mikroorganizama. Interakcija MBL sa specifičnim nizovima strukture ugljenih hidrata dovodi do aktivacije MASP proenzima koji, sa druge strane, aktiviraju komplement cepanjem komplement komponenti C4 i C2 radi obrazovanja C3 konvertaze C4b2b (Kawasaki et al., J. Biochem 106:483-489 (1989); Matsushita & Fujita, J. Exp Med.176:1497-1502 (1992); Ji et al., J. Immunol 150:571-578 (1993)).

[0086] Do nedavno je smatrano da MBL-MASP proenzim kompleks sadrži samo jednu vrstu proteaze (MASP-1), ali je sada jasno da postoje dve druge dinstiktivne proteaze (tj., MASP-2 i MASP-3) povezane sa MBL (Thiel et al., Nature 386:506-510 (1997); Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001)), kao i dodatni serumski protein 19 kDa, koji se naziva "MAp19" ili "sMAP" (Stover et al., J. Immunol 162:3481-3490 (1999); Stover et al., J. Immunol 163:6848-6859 (1999); Takahashi et al., Int. Immunol 11:859-63 (1999)).

MAp19 je alternativno spojeni genski proizvod strukturnog gena za MASP-2 i nedostaju mu četiri C-terminalna domena MASP-2, koji uključuju serinski endopeptidaza domen. Obilno eksprimirani skraćeni mRNK transkript koji kodira MAp19 generisan je alternativnim spajanjem/polidenilacijom MASP-2 gena. Sličnim mehanizmima, MASP-1/3 gen daje porast tri glavna genska proizvoda, dve serinske proteaze MASP-1 i MASP-3 i skraćenog genskog proizvoda 44 kDa koji se naziva "MAp44" (Degn et al., J. Immunol 183(11):7371-8 (2009); Skjoedt et al., JBiol Chem 285:8234-43 (2010)).

[0087] MASP-1 je prvo opisan kao komponenta P-100 proteaze serumskog Ra-reaktivnog faktora, koja se sada smatra kompleksom sačinjenom od MBL plus MASP (Matsushita et al., Collectins and Innate Immunity, (1996); Ji et al., J Immunol 150:571-578 (1993). Sposobnost MBL-povezane endopeptidaze unutar MBL-MASP kompleksa da deluje na komponente C4 i C2 komplementa na način jasno identičan onom od C1s enzima unutar C1q-(C1r)2-(C1s)2kompleksa klasičnog puta komplementa sugeriše da postoji MBL-MASP kompleks koji je funkcijalno analogan C1q-(C1r)2-(C1s)2kompleksu. C1q-(C1r)2-(C1s)2kompleks aktiviran je interakcijom C1q sa Fc regionima antitela IgG ili IgM prisutnim u imunom kompleksu. To dovodi do autoaktivacije C1r proenzima koji, sa druge strane, aktivira C1s proenzim koji zatim deluje na komponente C4 i C2 komplementa.

[0088] Stehiometrija MBL-MASP kompleksa razlikuje se od onog pronađenog za C1q-(C1r)2-(C1s)2kompleks u tome što se čini da su različiti MBL oligomeri povezani sa različitim prodelovima MASP-1/MAp19 ili MASP-2/MASP-3 (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001). Većina MASP-a i MAp19 pronađenih u serumu nisu kompleksovani sa MBL (Thiel et al., J Immunol 165:878-887 (2000)) i mogu biti povezani delom sa fikolinma, nedavno opisanom grupom lektina sa fibrinogen-nalik domenom

2

sposobnim da se veže sa N-acetilglukozamin ostacima na mikrobnim površinama (Le et al., FEBS Lett 425:367 (1998); Sugimoto et al., J. Biol Chem 273:20721 (1998)). Među njima, humani L-fikolin, H-fikolin i M-fikolin povezani su sa MASP-a kao i sa MAp19 i mogu aktivirati lektinski put nakon vezivanja za specifične ugljeno hidratne strukture prepoznate od strane fikolina (Matsushita et al., J Immunol 164:2281-2284 (2000); Matsushita et al., J Immunol 168:3502-3506 (2002)). Pored fikolina i MBL, MBL-nalik lektinski kolektin, nazvan CL-11, identifikovan je kao molekul prepoznavanja lektinskog puta (Hansen et al. J Immunol 185:6096-6104 (2010); Schwaeble et al. PNAS 108:7523-7528 (2011)). Postoji preovlađujući dokaz koji leži ispod fiziološkog značaja ovih alternativnih molekula prepoznavanja ugljenih hidrata, te je prema tome važno shvatiti da MBL nije samo komponenta prepoznavanja aktivacije lektinskog puta i da MBL deficijencija ne sme da se pogrešno shvati kao deficijencija lektinskog puta. Postojanje mogućeg niza alternativnog ugljeni hidrat-prepoznavajućeg kompleksa strukturno u vezi sa MBL može proširiti spektar mikrobne strukture koja inicira direktan odgovor urođenog imunog sistema putem aktivacije komplementa.

[0089] Svi molekuli prepoznavanja lektinskog puta okarakterisani su specifičnim MASP-vezujućim motivom unutar njhovog kolagen-homologna stabiljka regiona (Wallis et al. J. Biol Chem 279:14065-14073 (2004)). MASP-vezujuće mesto u MBLs, CL-11 i fikolini okarakterisani su sa dva distinktivna motiva unutar ovog domena: Hyp-Gly-Lys-Xaa-Gly-Pro, pri čemu je Hyp hidroksiprolin, a Xaa generalno je alifatičan ostatak. Tačkaste mutacije u ovoj sekvenci sprečavaju MASP vezivanje.

1. Respektivne strukture, sekvence, hromozomalna lokalizacija i varijante upletanja

[0090] FIG.2 prikazuje šematski dijagram koji prikazuje domensku strukturu MASP-2 polipeptida (SEQ ID NO:5) i MAp19 polipeptida (SEQ ID NO:2) i eksone koji ih kodiraju. FIG.3 prikazuje šematski dijagram koji prikazuje domensku strukturu MASP-1 polipeptida (SEQ ID NO:10), MASP-3 polipeptida (SEQ ID NO:8) i MAp44 polipeptida (SEQ ID NO: 11) i eksone koji ih kodiraju. Kako je prikazano na FIG.2 i 3, serinske proteaze MASP-1, MASP-2 i MASP-3 sastoje se od šest dinstiktivnih domena raspoređeni kako je pronađeno u C1r i C1s; tj., (I) N-terminalni domen C1r/C1s/morskog ježa VEGF/morfogeni protein kosti (ili CUBI); (II) domen nalik epidermalnom faktoru rasta (EGF); (III) drugi CUB domen (CUBII); (IV i V) dpmeni dva komplement kontrolna proteina (CCP1 i CCP2); i (VI) domen serinske proteaze (SP).

[0091] cDNK-izvedene aminokiselinske sekvence humanog i mišjeg MASP-1 (Sato et al., Int Immunol 6:665-669 (1994); Takada et al., Biochem Biophys Res Commun 196:1003-1009 (1993); Takayama et al., J. Immunol 152:2308-2316 (1994)), humanog, mišjeg, i pacovskog MASP-2 (Thiel et al., Nature 386:506-510 (1997); Endo et al., J Immunol 161:4924-30 (1998); Stover et al., J. Immunol 162:3481-3490 (1999); Stover et al., J. Immunol 163:6848-6859 (1999)), kao i humanog MASP-3 (Dahl et al., Immunity 15:127135 (2001)) ukazuju da su ove proteaze serinske peptidaze sa katakterističnom trijadom His, Asp i Ser ostacima unutar njihovih pretpostavljenih katalitičkih domena (Genbank pristupni brojevi: humani MASP-1: BAA04477.1; mišji MASP-1: BAA03944; pacovski MASP-1: AJ457084; humani MASP-3:AAK84071; mišji MASP-3: AB049755, određeno od strane Genbank 2/15/2012).

[0092] Kako je dalje prikazano na FIG.2 i 3, nakon konverzije zimogena u aktivan oblik, teški lanac (alfa, ili A lanac) i laki lanac (beta, ili B lanac) dele se kako bi dali disulfid-povezani A-lanac i a manji B-lanac koji predstavljaju domen serinske proteaze. Jedno-lančani proenzim MASP-1 aktiviran je (poput proenzima C1r i C1s) cepanjem Arg-Ile veze smeštene između drugog CCP domena (domen V) i domena serinske proteaze (domen VI). Proenzimi MASP-2 i MASP-3 smatraju se aktiviranim na sličan način poput MASP-1. Svaki MASP protein obrazuje homodimere i pojedinačno je povezan sa MBL i fikolinima na Ca<++>-zavisan način.

2. MASP-1/3

[0093] Humani MASP-1 polipeptid (SEQ ID NO:10) i MASP-3 polipeptid (SEQ ID NO:8) proizilaze iz jednom strukturnog gena (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001), koji je mapiran za 3q27-28 region dugog kraka hromozoma 3 (Takada et al., Genomics 25:757-759 (1995)). MASP-3 i MASP-1 mRNK transkripti generisani su iz primarnog transkripta procesom alternativnog spajanja/polidenilacije. MASP-3 translacioni proizvod sačinjen je od alfa lanca, koji je zajednički za oba MASP-1 i MASP-3, i beta lanac (domen serinske proteaze), koji je jedinstev za MASP-3. Kako je prikazano na FIG.3, humani MASP-1 gen obuhvata 18 eksona. cDNK humanog MASP-1 (navedena kao SEQ ID NO:9) kodirana je eksonima 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17 i 18. Kako je dalje prikazano na FIG.3, humani MASP 3 gen obuhvata dvanaest eksona. cDNK humanog MASP-3 (navedena kao SEQ ID NO:7) kodirana je eksonima 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 11 i 12. Alternativni rezultati spajanja u proteinu označenom kao MBL-povezani protein 44 ("MAp44)," (naveden kao SEQ ID NO:11), proizilazi iz eksona 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 i 9.

[0094] Humani MASP-1 polipeptid (SEQ ID NO: 10 iz Genbank BAA04477.1) ima 699 aminokiselinskih ostataka, koji uključuje vodeći peptid 19 ostataka. Kada je vodeći peptid izostavljen, izračunata molekulska masa MASP-1 iznosi 76,976 Da. Kako je prikazano na FIG.3, MASP-1 aminokiselinska sekvenca sadrži četiri N-povezana glikozilaciona mesta. Domeni humanog MASP-1 proteina (uz pozivanje na SEQ ID NO:10) prikazani su na FIG.3 i uključuju N-terminalni domen C1r/C1s/morskog ježa VEFG/morfogeni protein kosti (CUBI) (aa 25-137 iz SEQ ID NO:10), domen nalik epidermalnom faktoru rasta (aa 139-181 iz SEQ ID NO:10), drugi CUB domen (CUBII) (aa 185-296 iz SEQ ID NO:10), kao i tandem domene komplement kontrolnog proteina (CCP1 aa 301-363 i CCP2 aa 367-432 iz SEQ ID NO:10) i domen serinske proteaze (aa 449-694 iz SEQ ID NO:10).

4

[0095] Humani MASP-3 polipeptid (SEQ ID NO:8, iz Genbank AAK84071) ima 728 aminokiselinskih ostataka, koji uključuje vodeći peptid 19 ostataka. Kada su vodeći peptidi izostavljeni, izračunata molekulska masa MASP-3 iznosi 81,873 Da. Kako je prikazano na FIG.3, postoji sedam N -povezanih glikozilacionih mesta u MASP-3. Domeni humanog MASP-3 proteina (uz pozivanje na SEQ ID NO:8) prikazani su na FIG.3 i uključuju N-terminalni domen C1r/C1s/morskog ježa VEGF/morfogenog proteina kosti (CUBI) (aa 25-137 iz SEQ ID NO:8), domen nalik epidermalnom faktoru rasta (aa 139-181 iz SEQ ID NO:8), drugi CUB domen (CUBII) (aa 185-296 iz SEQ ID NO:8), kao i tandem domene komplement kontrolnih proteina (CCP1 aa 301-363 i CCP2 aa 367-432 iz SEQ ID NO:8) i domen serinske proteaze (aa 450-711 iz SEQ ID NO:8).

[0096] MASP-3 proizvod translacije sačinjen je id alfa lanca (teškog lanca), koji sadrži CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2 domene (alfa lanac: aa 1-448 iz SEQ ID NO:8) koji je zajednički i za MASP-1 i MASP-3, i laki lanac (beta lanac: aa 449-728 iz SEQ ID NO:8), koji sadrži domen serinske proteaze, koji je jedinstven za MASP-3 i MASP-1.

3. MASP-2

[0097] Humani MASP-2 smešten je na hromozomu 1p36.3-2 (Stover et al., Cytogenet and Cell Genet 84:148-149 (1999) i obuhvata dvanaest eksona, kako je prikazano na FIG.2. MASP-2 (SEQ ID NO:5) i MAp19 (SEQ ID NO:2) enkodirani su transkriptima jednog strukturnog gena generisanog alternativnim spajanjem/polidenilacijom (Stover et al., Genes i Immunity 2:119-127 (2001)). cDNK humanog MASP-2 (SEQ ID NO:4) kodirana je eksonima 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 i 12.20 kDa protein nazvan MBL-povezani protein 19 ("MAp19", koji se takođe naziva "sMAP") (SEQ ID NO:2), enkdoran sa (SEQ ID NO:1) proizilazi iz eksona 2, 3, 4 i 5. MAp19 je ne-enzimski protein koji sadrži N-terminalni CUB1-EGF region MASP-2 sa četiri dodatna ostatka (EQSL) izvedena iz eksona 5 kako je prikazano na FIG.2.

[0098] MASP-2 polipeptid (SEQ ID NO:5) ima 686 aminokiselinskih ostataka, koji uključuju vodeći peptid 15 ostataka koji se cepaju nakon lučenja, što rezultuje kao zreli oblik humanog MASP-2 (SEQ ID NO:6). Kako je prikazano na FIG.2, MASP-2 aminokiselinska sekvenca ne sadrži bilo koja N-povezana glikozilaciona mesta. MASP-2 polipeptid eksprimira molekulsku strukturu sličnu MASP-1, MASP-3, i C1r i C1s, proteaza C1 sistema komplementa. Domeni humanog MASP-2 proteina (nabrojani uz pozivanje na SEQ ID NO:5) prikazani su na FIG.2 i uključuju N-terminalni domen C1r/C1s/morskog ježa VEGF/morfogenog proteina kosti (CUBI) (aa 24-136 iz SEQ ID NO:5), domen nalik epidermalnom faktoru rasta (aa 138-180 iz SEQ ID NO:5), drugi CUB domen (CUBII) (aa 184-295 iz SEQ ID NO:5), kao i tandem domene komplement kontrolnog proteina (CCP1 aa 300-359 i CCP2 aa 364-431 iz SEQ ID NO:5) i domen serinske proteaze (aa 445-682 iz SEQ ID NO:5).

[0099] Kako je prikazano na FIG.2, MASP-2 polipeptid ima alfa lanac (teški lanac) koji sadrži CUB-1-EGF-CUB-2-CCP-1-CCP-2 domene (alfa lanac: aa 1-443 iz SEQ ID NO:5) i beta lanac (laki lanac) koji sadrži domen serinske proteaze (beta lanac: aa 444-686). CUB-1, EGF i CUB-2 domeni su neophodni za dimerizaciju, a CUB-1, EGF, CUB-2 i CCP-1 domeni sadrže mesto vezivanja za MBP. Kako je opisano u Wallis et al., J. Biol Chem 279:14065-14073 (2004), svaki MASP-2 dimer vezuje se za dve MBL podjedinice.

4. Poređenje MASP-1, MASP-2 i MASP-3 aminokiselinskih sekvenci

[0100] FIG.4 je aminokiselinsko poravnanje proteina sekvence MASP-1 (SEQ ID NO:10), MASP-2 (SEQ ID NO:6) i MASP-3 (SEQ ID NO:8), koje prikazuje CUBI, EGF, CUBII, CCP1, CCP2 domene i sačuvane ostatke katalitičke triade (H, D, S) u domenima serinske proteaze (SP). Simbol "." ukazuje na identične aminokiselinske sekvence.

[0101] FIG.5 je aminokiselinsko poravnanje sekvecnu alfa lanca, koje uključuje CUBI-EGF-CUBII-CCP1-CCP2, za MASP-1 (alfa lanac: aa 1-447 iz SEQ ID NO:10) MASP-2 (alfa lanac: aa 1-443 iz SEQ ID NO:5) i MASP-3 (alfa lanac: aa 1-448 iz SEQ ID NO:8). Postoje mnogobrojne zakrpe identiteta u CUBI, EGF, i CUBII domenima, kako je ukazano tačkastim kućicama na FIG.5. CCP2 i CCP2 domeni označeni su tamno sivim kućicama. Ukupan procentualni identiteta između alfa lanaca humanog MASP1/3 i humanog MASP-2 dat je u nastavku u TABELI 1.

[0102] FIG.6 je aminokiselinsko poravnanje sekvence beta lanca (koja uključuju domene serinske proteaze) za MASP-1 (beta lanac: aa 448-699 iz SEQ ID NO: 10), MASP-2 (beta lanac: aa 444-686 iz SEQ ID NO:5) i MASP-3 (beta lanac: aa 449-728 iz SEQ ID NO:8). FIG.7A prikazuje poravnanje po parovima aminokiselina između sekvenci beta lanaca za MASP-1 (beta lanac: aa 448-699 iz SEQ ID NO: 10) i MASP-2 (beta lanac: aa 444-686 iz SEQ ID NO:5). FIG.7B prikazuje poravnanje po parovima aminokiselina između sekvenci beta lanaca za MASP-1 (beta lanac: aa 448-699 iz SEQ ID NO: 10) i MASP-3 (beta lanac: aa 449-728 iz SEQ ID NO:8). FIG.7C prikazuje poravnanje po parovima aminokiselina između sekvenci beta lanaca za MASP-2 (beta lanac: aa 444-686 iz SEQ ID NO:5) i MASP-3 (beta lanac: aa 449-728 iz SEQ ID NO:8). Regioni identiteta na FIG.5-7 prikazani su kao tačkaste kućice okružene identičnim aminokiselinama (prikazano sa "." simbolom).

[0103] Procentualni identitet između alfa i beta lanaca humanih MASP-1, MASP-2 i MASP-3 proteina dato je u TABELI 1 ispod.

TABELA 1: Procentualni identitet između humanih MASP proteina

[0104] Pozivanjem na alfa lance (teški lanci), kako je označeno u gornjoj TABELI 1, MASP-1 i MASP-3 alfa lanci su identični (osim za 15 aminokiselinsku sekvencu na 3' kraju). Ukupan % identiteta između MASP-2 i MASP-3 alfa lanca je 45.4%, sa mnogim zakrpama identiteta u CUBI-EGF-CUBII domenima, kako je prikazano na FIG.5.

[0105] Pozivanjem na beta lance (laki lanci), ukupan procentualni identitet između tri beta lanca je nizak, u opegu od 27% do 28%. Međutim, iako je ukupan identitet između tri B-lanca nizak, postoje razne zakrpe identiteta, kako je prikazano na FIG.6. Kako je dalje prikazano na FIG.7A-C, identične zakrpe sekvence šire su distribuirane između MASP-2 i 3 u odnosu na između 1 i 2 ili 1 i 3.

[0106] Svi cisteinski ostaci prisutni u MASP-2, MASP-3, C1r i C1s poravnati su sa ekvivalentnim ostacima u MASP-1; međutim, MASP-1 ima dva cisteinska ostatka (na položajima 465 i 481 u L lancu) koja se ne mogu naći u MASP-2, MASP-3, C1r i C1s. Ova dva cisteinska ostatka u MASP-1 se u očekivanim položajima koriste za obrazovanje 'histidinska-petlja' disulfidni most kakav se može naći kod tripsina i himotripsina. To sugeriše da su se MASP-2, MASP-3, C1r, i C1s mogli razviti, genskom duplikacijom i divergencijom, od MASP-1 (Nonaka & Miyazawa, Genome Biology 3 Reviews 1001.1-1001.5 (2001)).

5. Respektivne biološke funkcije/aktivnosti, koje uključuju relevantne humane genetske podatke [0107] Uloga MBL/Fikolin-MASP kompleksa u urođenom imunitetu posredovano je putem kalcijumzavisnog vezivanja C-tip lektinskih domena (prisutni u MBL molekulu) ili putem vezivanja fibrinogennalik domena (prisutni u fikolin molekulu) za ugljeno hidratne strukture nađene na kvascu, bakterijama, virusima, i gljivama. Ova faza prepoznavanja dovodi do aktivacije proenzima MASP-2, koji zatim imitira aktivnost aktiviranog C1s unutar C1q-(C1r)2-(C1s)2kompleksa cepanjem C4 i C2 radi obrazovanja C3 konvertaze C4b2b. Ovo omogućava taloženje C4b i C3b na ciljanom patogenu i tako promoviše ubijanje i klirens putem fagocitoze.

[0108] Dokaz u skorijoj literaturi sugeriše da kompleks aktivacije lektinskog puta zahteva samo aktivnost MASP-2 da pocepa C4 i C2: i) rekonstrukcija minimalnog kompleksa aktivacije lektinskog puta upotrebom rekombinantnog MBL i rekombinantno izraženog MASP-2 čini se dovoljan za efektivno cepanje oba i C4 i C2 in vitro (Vorup-Jensen et al., J. Immunol 165:2093-2100 (2000); Rossi et al., J Biol Chem 276:40880-40887 (2001); Ambrus et al., J Immunol 170:1374-1382 (2003); Gál et al, J Biol Chem 280:33435-33444 (2005)); dok ii) serum miševa sa gen-ciljanom deficijencijom MASP-2 lišen je bilo koje funkcionalne aktivnosti lektinskog puta (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)). Trenutno je opiasna genetski određena deficijencija MASP-2 (Stengaard-Pedersen et al., New Eng. J. Med.349:554-560, (2003)). Mutacija jednog nukleotida vodi ka Asp-Gly izmeni u CUB1 domenu i daje MASP-2 nesposoban za vezivanje sa MBL.

[0109] Pored toga, funkcionalna karakterizacija seruma miševa deficijentnih i od MASP-1 i MASP-3 prikazuje da je aktivnost lektinskog puta sporija, ali ne odustna u poređenju sa serumima divljeg tipa i MASP-1/MASP-3 nokaut (MASP-1/3<-/->) miševa pod fiziološkim uslovima (Takahashi et al., J. Immunol 180:6132-6138 (2008); Schwaeble et al., PNAS (2011)). Ova ispitivanja sugerišu da nasuprot efektorskoj endopeptidazi C1s klasičnog puta, aktivacija MASP-2 suštinski ne uključuje ili zahteva aktivnost bilo kog od drugog MBL-povezanih serinskih endopeptidaza (tj., MASP-1 ili MASP-3) i da proteolitička aktivnost MASP-2 biva dovoljna da translatuje vezivanje ugljeno hidratnih molekula prepoznavanja lektinskog puta (tj., MBL, fikolini ili CL-11) u aktivaciji komplementa. Međutim, skorija ispitivanja pokazuju da dok MASP-2 nema kapacitet za autoaktivaciju, katalitička brzina MASP-1 aktivacije MASP-2 zimogena prelazi onu MASP-2 cepanja svog zimogen oblika za oko 85,000 puta (Héja et al., PNAS 106:10498-503 (2011); Megyeri et al., J. Biol. Chem.288(13):8922-34 (2013)). Prema tome, veoma je verovatno da je primarni aktivator MASP-2 u fiziološkim podešavanjima MASP-1. Ako je suditi po veličini fragmenata generisanog C4, i aktivnosti generisane funkcionalne C3 konvertaze, čini se da aktivirani MASP-2 cepa C4 i C2 na identičan način kao onaj izveden aktiviranim C1s, tj., na jednoj arginil vezi (Arg76 Ala77) unutar alfalanca C4 i na jednoj arginil vezi (Arg223 Lys224) unutar proenzimskog lanca C2. Takođe je prijavljeno da mišji MASP (i obliku mišjeg MBL-MASP kompleksa označeni Ra-reaktivan faktor) može, za razliku od C1s, da pocepa komponente komplementa C3 alfa-lanca kako bi se dobili biološki aktivni fragmenti C3a i C3b (Ogata et al, J. Immunol 154:2351-2357 (1995)). Ukoliko bi se ovo odigravalo u humanom sistemu, zahtevalo bi cepanje jedne arginil veze (Arg77 Ser78) unutar alfa-lanca C3. Aktiviran MASP-2, kao aktiviran C1s, nij sposoban da pocepa komponentu C5 komplementa. Proteolitičke aktivnosti MASP-1 i MASP-2 inhibirane su C1-Inhibitorom (Matsushita et al., J Immunol 165:2637-2642 (2000) dok C1-Inhibitor ne reaguje sa MASP-3 (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001); Zundel et al., J Immunol 172:4342-4350 (2004)).

[0110] Biološke funkcije MASP-1 i MASP-3 sporo se pojavljuju. Specifičnost supstrata i fiziološka uloga MASP-1 predmet je diskusije još od otkrivanja. Brojni potencijalni supstrati identifikovani su tokom skorijih godina. Predloženo je da MASP-1 može da pocepa nativni C3 polako, a ovo direktno cepanje C3 može da inicira kaskadu komplementa verovatno sa doprinosom alternativnog puta (Matsushita et al., J Immunol 165:2637-2642 (2000)). Kasnije je pokazano da rekombinantni MASP-1 cepa neaktivan (tioestarski hidrolizovani) oblik C3 koji je neproizvodiv u smislu iniciranja kaskada komplementa (Ambrus et al., J Immunol 170:1374-1382 (2003)). Manjak aktivnosti lektinskog puta u serumskim razblaženjima MASP-2-deficijentnih miševa nedvosmisleno dokazuju da MASP-1-vođeni C3-bajpas mehanizam ne postoji (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)). Komponente komplementa koje su pocepane sa MASP-1 sa značajnom efikašnoščću predstavljaju C2 (Rossi et al., J Biol Chem 276:40880-40887 (2001); Ambrus et al., J Immunol 170:1374-1382 (2003)) i zimogen oblik faktora D (Takahashi et al., J Exp Med 207:29-37 (2010)). Što se tiče sposobnosti MASP-1 u cepanju C2, verovatno je da MASP-1 može da poveća C3-konvertaza (C4b2a)-formirajuću sposobnost MASP-2 putem C2 cepanja. Ova sugestija podržana je opservacijom da je aktivnost lektinskog puta smanjena u MASP-1-osiromašenom humanom serumu i u serumu MASP-1/3-deficijentnih miševa (Takahashi et al., J Immunol 180:6132-6138 (2008)), koja opservacija sugeriše da MASP-1 ima ulogu u aktiviranju MASP-2. Štaviše, dok svaki C4b istaložen od strane MBL-MASP kompleks može da obrazuje C4b2a konvertazu, samo jedan od četiri C4b istaložena od strane C1 kompleks klasičnog puta može da učini isto (Rawal et al., J Biol Chem 283 (12):7853-63 (2008)).

[0111] MASP-1 takođe cepa MASP-2 i MASP-3 (Megyeri M., et al, J Biol Chem.2013 Mar 29;288(13):8922-34). Nedavni eksperimenti sugerišu da iako se MASP-2 može autoaktivirati, MASP-1 primarno je aktivator zimogen MASP-2. Aktivacija MASP-2 odlaže se u serumu MASP-1 nokaut miševa (Takahashi et al., J Immunol 180: 6132-6138 (2008)), a sličan rezultat dobijen je kada je aktivnost MASP-1 blokirana specifičnim inhibitorom u normalnom humanom serumu (Kocsis et al., J Immunol 185(7):4169-78 (2010)). Štaviše, Degn et al. (J. Immunol.189(8): 3957-69 (2012)) otkrivaju da je MASP-1 kritičan za MASP-2 aktivaciju i naknadno C4 cepanje u humanom serumu. Katalitička brzina za konverziju zimogen MASP-2 u aktivan MASP-2 je više od 85,000-puta veća od brzine kojom se MASP-2 može autoaktivirati (Megyeri et al., J. Biol. Chem.288:8922-8934 (2013); Héja et al., J. Biol. Chem.

287(24):20290-300 (2012); Héja et al., PNAS 109:10498-503 (2012)).

[0112] Nedavna otkrića takođe su povezala MASP-1 za alternativni put. MASP-1 može konvertovati zimogen faktor D u njegov enzimski aktivan oblik (FIG.39; Takahashi et al., J Exp Med 207:29-37 (2010)). Pored toga, MASP-1 aktivira zimogen oblik MASP-3 (Megyeri et al., J. Biol. Chem.288:8922-8934 (2013); Degn et al. J. Immunol.189(8): 3957-69 (2012)), koji sam po sebi može da aktivira zimogen faktor D (FIG.

39) kao i pocepa faktor B, još jednu esencijalnu komponentu alternativnog puta, za njegov aktivan oblik (Iwaki et al., J. Immunol.187:3751-58 (2011)). Konverzija pro-faktora D i pro-faktora B, međutim, is verovatno je nezavisna od stanja aktivacije LEA-2 i može se javiti putem ne-kompleks-vezanog MASP-1.

[0113] Nekoliko linija dokaza ukazuje da je MASP-1 enzim nalik trombinu i da je važan u aktivaciji koagulacionog puta. MASP-1 može da pocepa nekoliko supstrata trombina koji uključuju fibrinogen (Hajela K. et al., Immunobiology 205(4-5):467-75 (2002)), faktor XIII (Krarup et al., Biochim Biophys Acta 1784(9):1294-1300 (2008)) i proteaza-aktiviran receptor 4 (PAR4) (Megyeri et al., J Immunol 183(5):3409-16 (2009)). Štaviše, antitrombin u prisustvu heparina efikasniji je inhibitor MASP-1 od C1-inhibitora (Dobó et al., J Immunol 183:1207-1214 (2009)). Veza između komplementa i koagulacionog puta je takođe podvučena zapažanjem da je MASP-2 sposoban da aktivira protrombin (Krarup A. et al., PLoS One 2(7):e623 (2007)). Ograničena koagulacija predstavlja prastaru vrstu urođenog imuniteta kada se širenje napadajućih patogena sprečava zgrušavanjem fibrina. Oslobađanje fibrinopeptida B ima prozapaljensku aktivnost. MASP-1-posredovano cepanje PAR4 aktivira zapaljsnku reakciju koja inicira endotelijalne ćelije (Megyeri et al., J Immunol 183(5):3409-16 (2009)).

[0114] MASP-3 nema proteolitičku aktivnost ka C4, C2 ili C3 supstratu. Nasuprot tome, prijavljeno je da MASP-3 deluje kao inhibitor lektinskog puta (Dahl et al., Immunity 15:127-135 (2001)). Ovaj zaključak je možda donet jer za razliku od MASP-1 i MASP-2, MASP-3 nije autoaktivirajući enzim (Zundel S. et al., J Immunol 172:4342-4350 (2004); Megyeri et al., J. Biol. Chem.288:8922-8934 (2013).

[0115] Nedavno, dokaz za moguće fiziološke funkcije MASP-1 i MASP-3 proizilazi iz ispitivanja transgenih miševa primenom mišjeg soja sa kombinovanim MASP-1 i MASP-3 deficijencijama. Dok MASP-1/3-nokaut miševi imaju funkcionalni lektinski put (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)), oni pokazuju nedostatak aktivnosti alternativnog puta (Takahashi et al., JEM 207(1):29-37 (2010)). Nedostatak aktivnosti alternativnog puta čini se da je zbog proceisonog defekta komplementa faktora D, koji je neophodan za aktivnost alternativnog puta. Kod MASP-1/3 nokaut miševa, sav faktor D cirkuliše kao proteolitički neaktivan pro-oblik, pri čemu u serumu normalih miševa, suštinski sav faktor D nalazi se u aktivnom obliku. Biohemijsko analiziranje sugeriše da MASP-1 može konvertovati komplement faktor D iz njegovog zimogen oblika u njegov enzimski aktivan oblik (FIG.39; Takahashi et

4

al., JEM 207(1):29-37 (2010)). MASP-3 takođe cepa zimogen pro-faktor D i proizvodi aktivan faktor D in vitro (FIG.39; Takahashi et al., JEM 207(1):29-37 (2010)). Faktor D prisutan je kao aktivan enzim u cirkulaciji kod normalnih pojedinaca, a MASP-1 i MASP-3, kao i HTRA-1, mogu biti odgovorni za ovu aktivaciju. Pored toga, miševi sa kombinovanim MBL i fikolin deficijencijama i dalje proizvode normalne nivoe faktora D i imaju potpuno funkcionalan alternativni put. Prema tome, ove fiziološke funkcije MASP-1 i MASP-3 ne uključuju nužno lektine, i tako nisu povezani sa lektinskim putem. Rekombinantno mišji i humani MASP-3 takođe cepa faktor B i podržava C3 taloženje na S. aureus in vitro (FIG.36; Iwaki D. et al., J Immunol 187(7):3751-8 (2011)).

[0116] Neočekivana fiziološka uloga za MASP-3 proizilazi iz nedavnih ispitivanja pacijenata sa 3MC sindromom (prethodno označeni kao Carnevale, Mingarelli, Malpuech, i Michels sindrom; OMIM # 257920). Ovi pacijenti pokazuju težak razvoj abnormalnosti, koji uključuju rascep nepca, rascep usne, kranijalne malformacije i mentalnu retardaciju. Genetsko analiziranje indetifikovalo je 3MC pacijente koji su homozigotni disfunkcionalisanje MASP-3 gena (Rooryck et al., Nat Genet.43(3):197-203 (2011)). Druga grupa 3MC pacijenata bila je homozigotna na mutaciju u MASP-1 genu koji vodi ka odsustvu funkcionalnih MASP-1 i MASP-3 proteina. Još jednoj grupi 3MC pacijenata nedostaje funkcionalni CL-11 gen. (Rooryck et al., Nat Genet.43(3):197-203 (2011)). Tako, čini se da CL-11 MASP-3 osa igra ulogu tokom embrionskog razvoja. Molekulski mehanizmi ovog razvojnog puta su nejasni. Međutim nemoguće ih je posredovati uobičajenim komplement-vođenim procesom budući da pojedinci sa deficijencijama zajedničke komplement komponente C3 ne razvijaju ovaj sindrom. Tako, pre ovog otkrića, kako je ovde opisano, funkcionalna uloga MASP-3 u lektin-zavisnoj aktivaciji komplementa prethodno nije utvrđena.

[0117] Strukture katalitičkih fragmenata MASP-1 i MASP-2 određena je kristalografijom X-zraka.

Strukturalno poređenje domena MASP-1 proteaza sa drugim komplement proteazama otkriva bazu njegove opuštene specifičnosti supstrata (Dobó et al., J. Immunol 183:1207-1214 (2009)). Dok je pristupačnost vezujućeg žleba supstrata za MASP-2 ograničena površinskim petljama (Harmat et al., J Mol Biol 342:1533-1546 (2004)), MASP-1 ima otvoren vezujući džep supstrata koji pre podseća na ona tripsina u odnosu na druge komplement proteaze. Osobina MASP-1 strukture nalik trombinu je neobično velika 60 aminokiselinska petlja (petlja B) koja može da reaguje sa supstratom. Još jedna interesantna karakterisitika MASP-1 strukture je interni most soli između S1 Asp189 i Arg224. Slični most soli može se naći u vezujućem džepu supstrata faktora D, koji može da reguliše njegovu aktivnost proteaze. C1s i MASP-2 imaju gotovo identične specifičnosti supstrata. Začuđujuće, neki od osam površinskih petlji MASP-2, koje određuju specifičnosti supstrata, imaju veoma različite konformacije u poređenju sa onima C1s. To znači da ova dva funkcionalno povezana enzima reaguju sa istim supstratom na različit način. Struktura zimogen MASP-2 prikazuje domen neaktivne proteaze sa prekinutim oksianion otvorom i vezujućim džepom supstrata (Gál et al., J Biol Chem 280:33435-33444 (2005)). Začuđujuće, zimogen MASP-2 prikazuje značajnu aktivnost na supstratu velikog protein, C4. Verovatno je da je struktura zimogena MASP-2 veoma fleksibilna, čime se omogućava tranzicija između neaktivnih i aktivnih oblika. Ta fleksibilnost, koja se reflektuje u strukturi, može da igra ulogu u procesu autoaktivacije.

[0118] Northern blot analiziranje ukazuje da je jetra glavni izvor MASP-1 i MASP-2 mRNK. Primenom 5' specifične cDNK sonde za MASP-1, primećen je glavni MASP-1 transkript na 4.8 kb i manji na približno 3.4 kb, oba prisutna i u humanoj i mišjoj jetri (Stover et al., Genes Immunity 4:374-84 (2003)). MASP-2 mRNK (2.6 kb) i MAp19 mRNK (1.0 kb) su obilno eksprimirani u tkivu jetre. MASP-3 je eksprimiran u jetri, ali i u mnogim drugim tkivima, koji uključuju neuronsko tkivo (Lynch N. J. et al., J Immunol 174:4998-5006 (2005)).

[0119] Smatra se da pacijent sa istorijom infekcije i hronične zapaljenske bolesti ima mutirani oblik MASP-2 koji ne uspeva da obrazuje aktivan MBL-MASP kompleks (Stengaard-Pedersen et al., N Engl J Med 349:554-560 (2003)). Neki ispitivači su odredili da deficijencija MBL vodi ka tendenciji ka čestim infekcijama u detinjstvu (Super et al., Lancet 2:1236-1239 (1989); Garred et al., Lancet 346:941-943 (1995) i smanjenoj rezistenciji na HIV infekciju (Nielsen et al., Clin Exp Immunol 100:219-222 (1995); Garred et al., Mol Immunol 33 (suppl 1):8 (1996)). Međutim, druga ispitivanja nisu pokazala značajnu korelaciju niskih MBL nivoa sa povećanim infekcijama (Egli et al., PLoS One.8(1):e51983(2013);

Ruskamp et al., J Infect Dis.198(11):1707-13 (2008); Israëls et al., Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 95(6):F452-61 (2010)). Dok je literatura pomešana, deficijencija, ili ne-utilizacija, MASP može imati štetne efekte na sposobnost pojedinca da postavi neposrednu, ne-antitelo-zavisnu odbranu protiv određenih patogena.

iii. Podržavajući podaci za novo shvatanje, podvučeni uobičajeni uslovi ispitivanja koji su lišeni Ca<++>i rezultati dobijeni primenom više fiziološkog skupa uslova koji uključuju Ca<++>.

[0120] Nekoliko nezavisnih linija snažnog eksperimentalnog dokaza ovde su obezbeđene kako bi se ukazalo na zaključak da lektinski put aktivacije putanje komplementa aktivira komplement putem dva nezavisna efektorska mehanizma: i) LEA-2: MASP-2-vođeni put koji posreduje komplement-vođenu opsonizaciju, hemotaksu (Schwaeble et al., PNAS 108:7523-7528 (2011)), i ćelijsku liziju, i ii) LEA-1: novi MASP-3-zavisni put aktivacije koji započinje aktivaciju komplementa generisanjem konvertaze alternativnog puta C3bBb cepanjem i aktivacijom faktora B na aktivatorskoj površini, koji zatim katalizuje C3b taloženje i obrazovanje konvertaza alternativnog puta C3bBb, koji može da rezultira kao ćelijska lizija kao i mikrobna opsonizacija. Pored toga, kako je ovde opisano, odvojena lektin-nezavisna aktivacija faktora B i/ili faktora D pomoću MASP-1, MASP-3, ili HTRA-1, ili kombinacija bilo kog od ta tri, takođe može da vodi ka aktivaciji komplementa putem alternativnog puta.

[0121] Lektinski put-zavisna MASP-3-vođena aktivacija alternativnog puta čini se da doprinosi dobro ustanovljenom faktor D-posredovanom cepanju C3b-vezanog faktora B kako bi se postigle optimalne brzine aktivacije za komplement-zavisno liziranje putem terminalne aktivacione kaskade radi liziranja bakterijskih ćelija putem obrazovanja C5b-9 kompleksa membranskog napada (MAC) na ćelijskoj površini (FIG.14-15). Ovaj brzinom ogrančen događaj čini se da zahteva optimalnu koordinaciju budući da je defektan u odsustvu MASP-3 funkcionalne aktivnosti, kao i u odsustvu faktor D funkcionalne aktivnosti. Kako je opisano u Primerima 1-4, pronalazači su otkrili ovu aktivaciju MASP-3-zavisnog lektinskog puta kada su ispitivali fenotip MASP-2 deficijencije i MASP-2 inhibicije u eksperimentalnim mišjim modelima N. menigitidis infekcije. Gen-ciljani, MASP-2-deficijentni miševi i divlji-tip miševi tretirani sa antitelo-baziranim MASP-2 inhibitorima bili su veoma otporni na eksperimentalnu N. meningitidis infekciju (videti FIG.8-12). Kada je infektivna doza podešena da izazove približno 60% smrtnosti u leglu divljeg-tipa, svi MASP-2-deficijentni ili MASP-2-osiromašeni miševi uspeli su da se odbace infekciju i prežive (videti FIG.8 i FIG.12). Ovaj veoma visok stepen rezistencije ogleda se u značajnom povećanju serum baktericidne aktivnosti u MASP-2-deficijentnom ili MASP-2-osiromašenom mišjem serumu. Dalji eksperimenti pokazali su da je ova baktericidna aktivnost zavisna od alternativnim putem-vođenog bakterijskog liziranja. Mišji serum deficijentan od faktora B, ili faktora D, ili C3 nije pokazao baktericidnu aktivnost prema N. meningitidis, što ukazuje da je alternativni put od suštinske važnosti za vođenje terminalne aktivacione kaskade. Iznenađujuć rezultat ogledao se u tome što su mišji serumi deficijentni od MBL-A i MBL-C (pri čemu su oba molekuli prepoznavanja lektinsg puta koji prepoznaju N. meningitidis) kao i mišji serumi deficijentni od lektinski put-povezane serinske proteaze MASP-1 i MASP-3 imali gubitak svih bakteriolitičkih aktivnosti ka N. meningitidis (FIG.15). Nedavni dokument (Takahashi M. et al., JEM 207: 29-37 (2010)) i rad predstavljen u njemu (FIG.39) pokazuju da MASP-1 može konvertovati zimogen oblik faktora D u njegov enzimski aktivan oblik i može delom objasniti gubitak litičke aktivnosti putem odsustva enzimski aktivnog faktora D u ovim serumima. Ovo ne objašnjava nedostatak baktericidne aktivnosti kod MBL-deficijentnih miševa budući da ovi miševi imaju normalni enzimski aktivan faktor D (Banda et al., Mol Imunol 49(1-2):281-9 (2011)). Začudžujuće, kada su ispitivani humani serumi pacijenata sa retkim 3MC autozomnim recesivnim poremećajem (Rooryck C, et al., Nat Genet.43(3):197-203) sa mutacijama koje daju domen serinske proteaze MASP-3 disfunkcionalan, nisu primećene baktericidne aktivnosti protiv N. meningitidis (n.b.: Ovi serumi imaju MASP-1 i faktor D, ali ne i MASP-3).

[0122] Hipoteza takva da humani serum zahteva lektinski put-posredovanu MASP-3-zavisnu aktivnost

4

kako bi razvio baktericidnu aktivnost i dalje je podržan zapažanjem da MBL-deficijentni humani serumi takođe ne uspevaju da liziraju N. meningitidis (FIG.13-14). MBL predstavlja jedini humani molekul prepoznavanja lektinskog puta koji se vezuje za ovaj patogen. Kako se MASP-3 ne auto-aktivira, pronalazači pretpostavljaju da se viša bacteriolitička aktivnost u MASP-2-deficijentnim serumima može objasniti poželjnom aktivacijom MASP-3 putem MASP-1 budući da se, u odsustvu MASP-2, u sve aktivacione komplekse lektinskog puta koji se vezuju za bakterijsku površinu uvode ili MASP-1 ili MASP-3. Kako aktiviran MASP-3 cepa i faktor D (FIG.39) i faktor B radi generisanja njihovih respektivnih enzimski aktivnih oblika in vitro (FIG.37 i Iwaki D., et al., J. Immunol.187(7):3751-3758 (2011)), najverovatnije je funkcija MASP-3 da olakša obrazovanje C3 konvertaze alternativnog puta (tj., C3bBb).

[0123] Dok podaci za lektin-zavisnu ulogu nisu ubedljivi, višestruki eksperimenti sugerišu da MASP-3 i MASP-1 nisu nužno obavezni da funkcionišu u kompleksu sa molekulima lektina. Eksperimenti kao što je onaj prikazan na FIG.35B pokazuju sposobnost MASP-3 za aktiviranje alternativnog puta (kako je pokazano C3b taloženjem na S. aureus) pod uslovima (tj., u prisustvu EGTA) u kojem kompleks sa lektinom ne bi bio prisutan. FIG.35A pokazuje da taloženje pod ovim uslovima je zavisno od faktora B, faktora D, i faktora P, sve kritične komponente alternativnog puta. Dodatno, faktor D aktivacija pomoću MASP-3 i MASP-1 (FIG.39), i faktor B aktivacija pomoću MASP-3 (FIG.37) može se desiti in vitro u odsustvu lektina. Konačno, hemoliza ispitivanja mišjih eritrocita u prisustvu humanog seruma pokazuje jasnu ulogu i za MBL i MASP-3 u ćelijskoj liziji. Međutim, deficijencija MBL ne reprodukuje u potpunosti ozbiljnost deficijencije MASP-3, nasuprot onome što se može očekivati ukoliko su svi funkcionalni MASP-3 kompleksovani sa MBL. Tako, pronalazači ne žele da budu ograničeni utiskom da se sve ovde pokazane uloge za MASP-3 (i MASP-1) mogu pripisati isključivo da funkcionišu povezano sa lektinom.

[0124] Identifikacija dva efektorska kraka lektinskog puta, kao i moguće lektin-nezavisne funkcije MASP-1, MASP-3, i HTRA-1, predstavljaju nove prilike za terapeutske intevencije za efektivno lečenje definisanih humanih patologija izazvanih prekomernom aktivacijom komplementa u prisustvu mikrobnih patogena ili izmenjenih ćelija domaćina ili metaboličkih depozita. Kako je ovde opisano, pronalazači su otkrili da u odsustvu MASP-3 i u prisustvu MASP-1, alternativni put nije aktiviran na površinskim strukturama (videti FIG.17-18, 35B, 41-42, 45-46). Kako je alternativni put važan u vođenju brzinom ograničenih događaja što vodi ka bakterijskom liziranju kao i ćelijskoj liziji (Mathieson PW, et al., J Exp Med 177(6):1827-3 (1993)), naši rezultati pokazuju da aktiviran MASP-3 igra važnu ulogu u litičkoj aktivnosti komplementa. Kako je prikazano na FIG.14-15, 21-23, 43-44, i 46-47, u serumu 3MC pacijenata kojima nedostaje MASP-3, ali ne i MASP-1, litički terminalna aktivaciona kaskada komplementa je defektivna. Podaci prikazani na FIG.14 i 15 pokazuju gubitak bakteriolitičke aktivnost u odsustvu MASP-3 i/ili MASP-1/MASP-3 funkcionalne aktivnosti. Isto ako, gubitak hemolitičke aktivnosti u MASP-3-deficijentnom humanom serumu (FIG.21-23, 43-44 i 46-47), kuplovano sa sposobnošću da rekonstituiše hemolizu dodavanjem rekombinantnog MASP-3 (FIG.46-47), snažno podržava zaključak da aktivacija alternativnog puta na ciljane površine (koja je suštinska za vođenje komplementomposredovanog liziranja) zavisi od prisutva aktiviranog MASP-3. Na osnovu ovde opisanog novog shvatanja lektinskog puta, aktivacija alternativnog puta ciljane površine tako je zavisna od LEA-1, i/ili lektin-nezavisna aktivacija faktora B i/ili faktora D, koja je takođe posredovana pomoću MASP-3, i prema tome, agensi koji blokiraju MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa sprečavaju aktivaciju alternativnog puta na ciljane površine.

[0125] Opis suštinske uloge MASP-3-zavisne iicijacije alternativnog puta aktivacije nagovetava da alternativni put nije nezavisan, samostojeći put aktivacije komplementa kako je opisano u suštinski svim trenutnim medicnksim priručnicima i nedavnim pregledima koji se tiču komplementa. Sadašnji i široki naučni stav je takav da alternativni put je aktiviran na površini određenih ciljeva (mikroba, zimosana, i zečijih eritrocita) putem amplifikacije spontane "praznog hoda" C3 aktivacije. Međutim, odsustvo bilo koje aktivacije alternativnog puta u serumima MASP-1 i MASP-3 dvostruko-deficijentnih miševa i humanom 3MC pacijent serumu i na zimosanom-obloženim pločama i dve različite bakterije (N. meningitidis i S. aureus), i redukcija hemolize eritrocita u MASP-3-deficijentnim serumima iz čoveka i miševa ukazuje da inicijacija aktivacije alternativnog puta na ovim površinama zajteva funkcionalni MASP-3. Zahtevana uloga za MASP-3 može biti ili lektin-zavisna ili -nezavisna, i vodi ka obrazovanju kompleksa C3 konvertaza i C5 konvertaza alternativnog puta, tj. C3bBb i C3bBb(C3b)n, respektivno. Tako, pronalazači su ove opisali postojanje prethodno nedostižnih puteva inicijacije za alternativni put. Ovaj put inicijacije zavisan je od (i) LEA-1, novo otkrivenog kraka aktivacije lektinskog puta, i/ili (ii) lektinnezavisnih uloga proteina MASP-3, MASP-1, i HTRA-1.

III. ULOGA MASP-2 i MASP-3 U PAROKSIZMALNOJ NOĆNOJ HEMOGLOBINURIJI i TERAPEUTSKI POSTUPCI KOJI KORISTE MASP-2 i MASP-3 INHIBITOREI AGENSE

i. Pregled PNH

[0126] Paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH), koja se ponekad takođe naziva Marchiafava-Micheli sindrom, je stečena, potencijalno životno ugrožavajuća bolest krvi. PNH se može razviti sama od sebe, kada se naziva "primarna PNH" ili u kontekstu drugih poremećaja koštane srži kao što je aplastična anemija, kada se naziva "sekundarna PNH." Većina slučajeva je primarna PNH. PNH je okarakterisan komplement-indukovanim uništavanjem crvenih krvnih zrnaca (hemoliza), malim brojem crvenih krvnih zrnaca (anemija), trombozom i otkazivanjem koštane srži. Laboratorijska saznanja u PNH pokazuju promene konzistentne sa intravaskularnom hemolitičkom anemijom: nizak hemoglobin, povišena laktatna dehidrogenaza, povišeni broj retikulocita (nezrele crvene ćelije oslobođene od strane koštane

4

srži kako bi se zamenile uništene ćelije), povišeni bilirubin (proizvod razgradnje hemoglobina), u odsustvu autoreaktivnih RBC-vezujućih antitela kao mogućeg uzroka.

[0127] Znak PNH je hronična komplementom-posredovana hemoliza izazvana neregulisanom aktivacijom terminalnih komplement komponenti, koje uključuju kompleks membranskog napada, na površini cirkulisanja RBC-a. PNH RBC-a su predmet nekontrolisane aktivacije komplementa i hemolize usled odsustva komplement regulatora CD55 i CD59 na njihovim površinama (Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11):2283-91 (2010), Risitano, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011)). CD55 i CD59 su obimno eksprimirani na normalnim RBC-a i kontrolišu aktivaciju komplementa. CD55 deluje kao negativan regulator alternativnog puta, inhibiranjem sklopa kompleksa C3 konvertaze alternativnog puta (C3bBb) i ubrzavajući raspadanje izvedene konvertaze, čime se blokira obrazovanje kompleksa membranskog napada (MAC). CD59 inhibira komplement kompleks membranskog napada direktno vezivanjem C5b678 kompleksa i sprečavanjem C9 od vezivanje i polimerizovanja.

[0128] Dok su hemoliza i anemija dominantne kliničke karakteristike PNH, bolest je kompleks hematološkog poremećaja koji dalje uključuje trombozu i otkazivanje koštane srži kao deo kliničkog saznanja (Risitano et al, Mini Reviews in Med Chem11:528-535 (2011)). Na molekulskom nivou, PNH je izazvana abnormalnom klonalnom ekspanzijom hematopoetičnih matičnih ćelija kojima nedostaje funkcionalni PIG A gen. PIG A je X-povezani gen koji kodira glikozil-fosfatidil inozitol transferazu potrebna za stabilnu površinsku eskpresiju GPI-pričvršćene klase A glikoproteina, koji uključuju CD55 i CD59. Iz razloga koji su trenutno pod ispitivanjem, hematopoetične matične ćelije sa disfunkcionalnim PIG A genom koji proizilazi kao rezultat spontanih somatskih mutacija može proći klonalnu ekspanziju do tačke gde se njihovo potomstvo sastoji od značajnog dela perifernog hematopoetičnog ćelijskog skupa. I dok potomstvu kako eritrocita tako i limfocita klona mutantnih matičnih ćelija nedostaju CD55 i CD59, samo RBC-a prolaze kroz otvoreno liziranje nakon ulaska u cirkulaciju.

[0129] Trenutno lečenje za PNH uključuju transfuziju krvi za anemiju, antikoagulaciju za trombozu i i upotrebu monoklonalnog antitela ekulizumab (Soliris®), koje štiti krvne ćelije protiv imunog uništavanja inhibiranjem sistem komplementa (Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med.350(6):552-559 (2004)).

Ekulizumab (Soliris®) je humanizovano monoklonalno antitelo koje cilja komponentu C5 komplementa, blokirajući njegovo cepanje C5 konvertazama, čime se sprečava proizvodnja C5a i sastavljanje MAC. Lečenje PNH pacijenata ekulizumabom rezultuje u redukciji intravaskularne hemolize, kako je izmereno laktatnom dehidrogenazom (LDH), što vodi ka hemoglobinskoj stabilizaciji i transfuzionoj nezavisnosti kod polovine pacijenata (Risitano et al, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11(6) (2011)). Dok gotovo svi pacijenti koji su pod terapijom ekulizumaba postižu normalne ili skoro normalne LDH nivoe (zbog

4

kontrolisanja intravaskularne hemolize), samo oko trećine pacijenata dostigne vrednost hemoglobina od oko 11gr/dL, a preostali pacijenti ekulizumaba nastavljaju da pokazuju umerenu do ozbiljne (tj., transfusion-zavisne) anemije, u približno jednakim razmerama (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). Kako je opisano u Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011), pokazano je da PNH pacijenti ekulizumabu sadrže velike količine C3 fragmenata vezanih za njihove PNH eritrocite (dok netretirani pacijenti ne). Ovo otkriće vodi ka prepoznavanjeu da kod Solirisom tretiranih PNH pacijenata, PNH RBC-a koje se više ne hemolizuju zbog C5 blokiranja sada mogu da akumuliraju obilne količine membrana-vezanih C3 fragmenata, koji funkcionišu kao opsonini, što rezultuje kao njihovo zarobljavanje u retikuloendotelijalnim ćelijama putem specifičnih C3 receptora i naknadne extravaskularne hemolize. Tako, sprečavajući intravaskularnu hemolizu i rezultujuću posledicu, ekulizumab terapija jednostavno preusmerava raspored ovih RBC-a iz intravaskularne u ekstravaskularnu hemolizu, što rezultuje kao suštinski preostala netretirana anemija kod mnogih pacijenata (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). Prema tome, terapeutske strategije pored upotrebe ekulizumaba potrebne su za one pacijente kod kojih se razvija C3-fragment-posredovana extravaskularna hemoliza, jer su im i dalje neophodne transfuzije crvenih krvnih zrnaca. Takvi C3 fragment ciljajući pristupi pokazuju upotrebljivost u eksperimentalnim sistemima (Lindorfer et al., Blood 115:2283-91, 2010).

ii. Komplement-inicirajući mehanizmi kod PNH

[0130] Uzročna veza između defektivne površinske ekspresije negativnih komplement regulatora CD55 i CD59 u PNH, kombinovana sa efektivnošću ekulizumaba u sprečavanju intravaskularne hemolize, jasno definiše PNH kao stanje posredovano sistemom komplementa. Dok je ova paradigma široko prihvaćena, priroda ovih događaja koji iniciraju aktivaciju komplementa, i aktivacija puta(eva) komplementa koja je uključena ostaju nerazrešeni. Zbog činjenice da CD55 i CD59 negativno regulišu faze terminalne amplifikacije u kaskadi komplementa zajedničkoj za sve komplement inicijacione puteve, deficijencija ovih molekula vodi ka preteranom obrazovanju i membranskoj integraciji kompleksa membranskog napada, bez obzira na to da li je aktivacija komplementa inicirana lektinskim putem, klasičnim putem ili spontanim preokretom alternativnog puta. Tako, kod PNH pacijenata, bilo koji događaj aktivacije komplementa koji vodi ka C3b taloženju na RBC površini može da izazove naknadnu amplifikaciju i patološku hemolizu (intravaskularna i/ili extravaskularna) i istaloži hemolitičku krizu. Jasno mehanično razumevanje molekulskih događaja koji izazivaju hemolitičku krizu kod kod PNH pacijenata ostaje nerazrešena. Kako ni jedan komplement inicirajući događaj nije otvoreno očigledan kod PNH pacijenata koji prolaze hemolitičku krizu, preovlađujući izgled je takav da aktivacija komplementa kod PNH može da se odvije sponatno zahvaljujući niskom nivou "praznog hoda" aktivacije alternativnog puta, koji je

4

naknadno uvećan nepravilnom kontrolom terminalne aktivacije komplementa zbog nedostatka CD55 i CD59.

[0131] Međutim, važno je zapaziti da u svojoj prirodnoj istoriji, PNH obično se razvija ili je pogoršana nakon određenih događaja, kao što je infekcija ili povreda (Risitano, Biologics 2:205-222 (2008)), za koje je pokazano dainiciraju aktivaciju komplementa. Ovaj odgovor na aktivaciju komplementa nije zavisan na prethdnom imunitetu domaćina ka podsticanju patogena, te prema tome verovatno ne uključuje klasični put. Pre, čini se da ovaj odgovor na aktivaciju komplementa se inicira vezivanjem lektina sa stranim ili „izmenjenim“ ugljeno hidratnim šablonima na površini mikrobnih agenasa ili oštećenom tkivu domaćina. Tako, događaji koji ubrzavaju hemolitičku krizu kod PNH tesno su povezani sa aktivacijom komplementa iniciran putem lektina. Ovo čini veoma verovatno da lektinski aktivacioni putevi obezbede inicirajuće izazivanje koje na kraju vodi ka hemolizi kod PNH pacijenata.

[0132] Upotrebom dobro definisanih patogena koji aktiviraju komplement putem lektina kao eksperimentalni modeli za isecanje aktivacionih kaskada na molekulskom nivou, pokazano je da, u zavisnosti od inicirajućeg mikrova, aktivacija komplementa može biti inicirana ili LEA-2 ili LEA-1, što vodi ka opsonizaciji i/ili liziranju. Isti princip dvostrukih odgovora (tj., opsonizacija i/ili liziranje) na lektin inicijacione događaje takođe se verovatno može primeniti na druge vrste infektivnih agenasa, ili na aktivaciju komplementa lektinima nakon povrede tkiva domaćina, ili drugim lektin-vođenim događajima aktivacije komplementa koji mogu ubrzati PNH. Na bazi ove dvostrukosti u lektinskom putu, zaključuje se da LEA-2- i/ili LEA-1-inicirana aktivacija komplementa kod PNH pacijenata promoviše opsonizaciju i/ili liziranje RBC-a sa C3b i naknadnu ekstravaskularnu i intravaskularnu hemolizu. Prema tome, u postavkama PNH, inhibicija oba LEA-1 i LEA-2 može se očekivati da izazove i intravaskularnu i ekstravaskularni hemolizu, obezbeđujući značajnu prednost u odnosu na C5 inhibitor ekulizumab.

[0133] Određeno je da izlaganje S. pneumoniae prvenstveno inicira lektin-zavisnu aktivaciju LEA-2, koja vodi ka opsonizaciji ovog mikroba sa C3b. Kako je S. pneumonia rezistentna na MAC-posredovano liziranje, njen klirens iz cirkulacije izvodi se putem opsonizacije sa C3b. Ova opsonizacija i naknadno uklanjanje iz cirkulacije je LEA-2-zavisno, što je indikovano kompromitovanom bakterijskom kontrolom kod MASP-2-deficijentnih miševa i kod miševa tretiranih MASP-2 monoklonalnim antitelima (PLOS Pathog., 8: e1002793. (2012)).

[0134] U istraživanju uloge LEA-2 u uorođenim odgovorima domaćina na mikrobne agense, testirani su dodatni patogeni. Dramatično različit ishod primećen je kada je Neisseria meningitidis ispitivana kao model organizma. N. meningitidis takođe lako aktivira komplement putem lektina, a aktivacija

4

komplementa je neophodna za zadržavanje N. meningitidis infekcije kod naivnog domaćina. Međutim, LEA-2 ne igra nikakvu funkcionalnu ulogu u zaštiti domaćina u ovom odgovoru: Kako je prikazano na FIG.

8 i 9, blokiranje LEA-2 putem genetske ablacije MASP-2 ne redukuje preživljavanje nakon infekcije sa N. meningitidis. Nasuprot tome, LEA-2 blokiranje MASP-2 ablacijom značajno poboljšava preživljavanje (FIG.8 i 9) kao i ocene bolesti (FIG.11) u ovim ispitivanjima. LEA-2 blokiranje davanjem MASP-2 antitela daje isti rezultat (FIG.12), eliminišući sekundarne ili kompenzatorske efekte u nokaut-mišjem soju kao mogućem uzroku. Ovi pogodni ishodi kod LEA-2-ablacioniranih životinja povezani su sa bržom eliminacijom N. meningitidis iz krvi (FIG.10). Takođe, kako je ovde opisano, inkubacija N. Meningitidisa sa normalnim humanim serumom ubija N. meningitidis (FIG.13). Dodavanje funkcionalnog monoklonalnog antitela specifičnog za humani MASP-2 koji blokira LEA-2, ali ne i davanje izotipnog kontrolnog monoklonalnog antitela, može pojačati ovaj ubijajući odgovor. Ipak, ovaj proces zavisi od lektina i najmanje delimično funkcionalnog sistema komplementa, MBL-deficijentni humani serum ili toplotom-inaktivirani humani serum nije bio sposoban da ubije N. meningitidis (FIG.13). Zajedno, ova nova saznanja sugeišu da su N. meningitidis infekcije u prisustvu funkcionalnog sistema komplementa kontrolisane lektin-zavisnim ali ne LEA-2-nezavisnim putem aktivacije komplementa.

[0135] Hipoteza takav da LEA-1 može biti komplement put odgovoran za lektin-zavisno ubijanje N. meningitidis testirana je upotrebom serumskih vrsta iz 3MC pacijenta. Ovaj pacijent je homozigotni ne senzualnu mutaciju u eksonu 12 MASP-1/3 gena. Kao rezultat, ovom pacijentu nedostaje funkcionalni MASP-3 protein, ali je osim toga bio komplement dovoljan (ekson 12 je specifičan za MASP-3 transkript; ta mutacija nema efekat na MASP-1 funkciju ili ekspresione nivoe) (videti Nat Genet 43(3):197-203 (2011)). Normalni humani serum efikasno ubija N. meningitidis, ali toplotom-inaktivirani serum deficijentni u MBL (jedan od molekula prepoznavanja za lektinski put) i MASP-3-deficijentni serum nisu mogli da ubiju kill N. meningitidis (FIG.14). Tako, čini se da LEA-1 posreduje N. meningitidis ubijanje. Ovo otkriće potvrđeno je upotrebom uzoraka seruma iz nokaut mišjih sojeva. Dok komplement koji sadrži normalni mišji serum lako ubija N. meningitidis, MBL-deficijentni ili MASP-1/3-deficijentni mišji serum je neefektivan kao toplotom-inaktiviran serum kome nedostaje funkcionalni komplement (FIG.

15). Nasuprot tome, MASP-2-deficijentni serum pokazuje efikasno ubijanje N. meningitidis .

[0136] Ova saznanja obezbeđuju dokaz za do sada nepoznatu dvostrukost u lektinskom putu oslobađanjem postojanja odvojenih LEA-2 i LEA-1 puteva lektin-zavisne aktivacije komplementa. U dole naznačenim primerima, LEA-2 i LEA-1 su ne-redundanti i posreduju dinstiktivne, funkcionalne ishode. Ti podaci sugerišu da određene vrste aktivatora lektinskog puta (koji uključuju, ali nisu ograničeni na S. pneumonia) preferenciono iniciraju aktivaciju komplementa putem LEA-2 što vodi ka opsonizacije, dok drugi (predstavljenio sa N. meningitidis) preferenciono iniciraju aktivaciju komplementa putem LEA-1 i

4

promovišu citolitičke procese. Međutim, ti podaci ne ograničavaju nužno LEA-2 na opsonizaciju, a LEA-1 na citolitičke procese, budući da oba puta u drugim uslovima mogu da posreduju opsonizaciju i/ili liziranje.

[0137] U kontekstu lektin-zavisne aktivacije komplementa putem N. meningitidis, čini se da LEA-2 i LEA-1 kraci ulaze u međusobnu kompeticiju, budući da blokiranje LEA-2 pojačava LEA-1-zavisno litičko uništavanje organizma in vitro (FIG.15). Kako je ovde detaljnije opisano, ovo otkriće može se objasniti povećanom verovatnoćom lektin MASP-1 kompleksa koji boravi u blizini lektin MASP-3 kompleksa u odsustvu MASP-2, što ojačava LEA-1 aktivaciju i tako promoviše efektivnije liziranje N. meningitides. Kako je liziranje N. meningitidis glavni zaštitini mehanizam kod naivnog domaćina, blokiranje LEA-2 in vivo povećava N. meningitidis klirens i vodi ka pojačanom ubijanju.

[0138] Dok prethodno opisani primeri pokazuju suprotsavljajuće efekte LEA-2 i LEA-1 u odnosu na ishode nakon infekcije sa N. meningitidis, mogu postojati drugi uslovi u kojima se i LEA-2 i LEA-1 mogu sinergovati radi proizvodnje određenog ishoda. Kako je datljnije objašnjeno u nastavku, u drugim situacijama patološke aktivacije komplementa putem lektina kao što su oni prisutni u PNH, LEA-2- i LEA-1-vođenoj aktivaciji komplementa mogu sarađivati na sinergistički način kako bi se doprinelo ukupnoj patologiji PNH. Pored toga, kako je ovde opisano, MASP-3 takođe doprinosi lektin-nezavisnoj konverziji faktora B i faktora D, koja se može odvijati u odsustvu Ca<++>, koja uobičajeno vodi ka konverziji C3bB u C3bBb i pro-faktora D u faktor D, što može dalje da doprinese patologiji PNH.

iii. Biologija i očekivana funkcionalna aktivnost u PNH

[0139] Ovaj odeljak opisuje inhibitorne efekte LEA-2 i LEA-1 blokiranja na hemolizu u in vitro modelu PNH. Ta saznanja podržavaju upotrebljivost LEA-2-blokirajućih agenasa (koji uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela koja se vezuju za i blokiraju funkciju MASP-2) i LEA-1-blokirajući agensi (koji uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela koja se vezuju i blokiraju funkciju MASP-1-posredovane aktivacija MASP-3, MASP-3, ili oba) radi lečenja subjekata koji boluju od jednog ili više aspekata PNH, i takođe upotrebu inhibitora LEA-2 i/ili LEA-1, i/ili MASP-3-zavisne, lektin-nezavisne aktivacije komplementa (koji uključuju MASP-2 inhibitore, MASP-3 inhibitore, i dvostruko- ili bispecifične MASP-2/MASP-3 ili MASP-1/MASP-2 inhibitore, i pan-specifične MASP-1/MASP-2/MASP-3 inhibitore) radi ublažavanja efekata C3-fragmentposredovane ekstravaskularne hemolize kod PNH pacijenata koji prolaze kroz terapiju sa C5-inhibitorom kao što je ekulizumab.

iv. MASP-2 inhibitori za blokiranje opsonizacije i ekstravaskularne hemolize PNH RBC-a putem retikuloendotelijalnih sistema

[0140] Kako je ovde detaljnije opisano, PNH pacijenti postaju anemični zahvaljujući ova dva dinstiktivna mehanizma RBC klirensa iz cirkulacije: intravaskularna hemoliza putem aktivacije kompleksa membranskog napada (MAC), i ekstravaskularna hemoliza nakon opsonizacije sa C3b i naknadni klirens nakon komplement receptorskog vezivanja i preuzimanja retikuloendotelijalnim sistemom.

Intravaskularna hemoliza je sprečena u velikoj meri kada se pacijent leči ekulizumabom. Zbog toga što ekulizumab blokira terminalni litički efektorski mehanizam koji se odvija nizvodno od oba pojave komplement-inicirajuće aktivacije kao i posledične opsonizacije, ekulizumab ne blokira ekstravaskularnu hemolizu (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). Umesto toga, RBC-a koja bi imala tekuću hemolizu kod netretiranih PNH pacijenata sada može da akumulira aktivirane C3b proteine na njihovoj površini, koja povećava preuzimanje od strane retikuloendotelijalnog sistema i ojačava njihovu ekstravaskularnu hemolizu. Tako, ekulizumab lečenje efektivno pomera RBC položaj iz intravaskularne hemolize u potencijalnu ekstravaskularnu hemolizu. Kao rezultat, neki ekulizumab-tretirani PNH pacijenti ostaju anemični. Sledi da agensi koji blokiraju gornji tok aktivacije komplementa i sorečavaju opsonizaciju PNH RBC-a mogu biti naročito pogodni da blokiraju ekstravaskularnu hemolizu koja se povremeno mopže videti sa ekulizumab.

[0141] Mikrobni podaci predstavljeni ovde sugerišu da je LEA-2 često dominantan put za lektin-zavisnu opsonizaciju. Pored toga, kada je lektin-zavisna opsonizacija (izmerena kao C3b taloženje) procenjeni na tri prototipne lektinske aktivacione površine (manan, FIG.19A; zimosan, FIG.19B, i S. pneumonia; FIG.

19C), čini se da je LEA-2 dominantni put za lektin-zavisnu opsonizaciju pod fiziološkim uslovima (tj., u prisustvu Ca<++>u kojem su svi komplement putevi operativni). Pod ovim eksperimentalnim uslovima, MASP-2-deficijentni serum (kojem nedostaje LEA-2) suštinski je bez efekta u opsonizaciji test površina u odnosu na WT serum. MASP-1/3-deficijentni serum (kome nedostaje LEA-1) takođe je obuhvaćen, iako je ovaj efekat znatno naglašeniji u poređenju sa serumom kojem nedostaje LEA-2. Relativna veličina doprinosa LEA-2 i LEA-1 ka lektin-vođenoj opsonizaciji dalje je prikazana na FIG.20A - 20C. Dok je kod alternativnog puta komplementa prijavljeno da podržava opsonizaciju lektin aktivirajućih površina u odsustvu lektinskog puta ili klasičnog puta (Selander et al., J Clin Invest 116(5): 1425-1434 (2006)), čini se da je alternativni put u izolaciji (izmereno u ispitnim uslovima bez Ca<++>) suštinski manje efektivan od LEA-2- i LEA-1-iniciranih procesa opisanih ovde. Ekstrapolacijom, ovi podaci sugerišu da opsonizacija PNH RBC-a može biti preferenciono inicirana sa LEA-2 i, u manjoj meri, sa LEA-1 (moguće pojačan amplifikacionom petljom alternativnog puta), pre nego rezultat lektin-nezavisn aktivacije alternativnog puta. Prema tome, može se očekivati da LEA-2 inhibitori mogu biti najefektivniji u ograničavanju opsonizacije i sprečavanju ekstravaskularne hemolize u PNH. Međutim, prepoznavanje činjenice da se lektini različiti od MBL, kao što su fikolini, vezuju za ne-ugljeno hidratne strukture kao što su acetilovani proteini, i da je MASP-3 preferenciono povezan sa H-fikolinom (Skjoedt et al., Immunobiol.215:921-931,

1

2010), ostavlja otvorenu mogućnost značajne uloge za LEA-1 u PNH-povezanoj RBC opsonizaciji kao takvoj. Prema tome, očekuje se da LEA-1 inhibitori imaju dodatne anti-opsonizacione efekte, i očekuje se da kombinacija LEA-1 i LEA-2 inhibitora bude optimalna i da posreduje najkrupniju dobrobit lečenja u ograničavanju opsonizacije i ekstravaskularne hemolize kod PNH pacijenata. Ovaj koncept dalje je podržan poacima opsonizacije prikazanim na FIG.28: serum faktor D-deficijentnih miševa (kojima nedostaje sposobnost za aktiviranje alternativnog puta u tečnoj fazi, ali koji imaju funkcionalni klasični put kao i funkcionalni LEA-1 i LEA-2 putevi) ne pokazuje deficit u opsonizaciji u poređenju sa WT serumom. Faktor B-deficijentni serum, kojima nedostaje LEA-1, prikazuje redukovanu opsonizaciju dok faktor D-deficijentni serum tretiran sa MASP-2 monoklonalnim antitelom radi blokiranja LEA-2-posredovane aktivacije komplementa daje obimniju supresiju opsonizacije (FIG.28). Značajno, dodavanje MASP-2 monoklonalnog antitela faktor B-deficijentnom serumu suzbija opsonizaciju efektivnije od ili MASP-2 blokiranja ili samog faktor D blokiranjea. Tako, LEA-2 i LEA-1 deluju dopunsko ili sinergistički radi promovisanja opsonizacije, a unakrsno reaktivan ili bispecifičan LEA-1/LEA-2 inhibitor očekuje se da je najefektiniji u blokiranju opsonizacije i ekstravaskularne hemolize u PNH.

v. Uloga MASP-3 inhibitora u PNH

[0142] Upotrebom in vitro modela PNH, pokazano je da su aktivacija komplementa i rezultujuća hemoliza u PNH zaista inicirani LEA-2 i/ili LEA-1 aktivacijom, i da ona nije nezavisna funkcija alternativnog puta. Ova ispitivanja koristila su manan-senzitizovana RBC-a raznih mišjih mrlja, koje uključuju RBC-a iz Crry-deficijentnih miševa (važan negativan regulator terminalnog komplement puta kod miševa) kao i RBC-a od CD55/CD59-deficijentnih miševa, kojima nedostaju isti komplement regulatora koji je odsutan kod PNH pacijenata). Kada se manan-senzitizovana Crry-deficijentna RBC-a izlože komplement-dovoljnom humanom serumu, RBC-a efektivno hemolizirana pri serumskim koncentracijama od 3% (FIG.21 i 22) dok komplement-deficijentni serum (HI: toplotom-inaktiviran) nije hemolitički. Začudžujuće, komplement-dovoljan serum u kojem je LEA-2 blokiran dodavanjem MASP-2 antitela ima redukovanu hemolitičku aktivnost, a 6% serum bio je potreban za efektivnu hemolizu. Slične opservacije izvedene su kada su ispitivana CD55/CD59-deficijentna RBC-a (FIG.24). Komplementdovoljan humani serum dopunjen sa MASP-2 monoklonalnim antitelom (tj., serum u kojem je suzbijen LEA-2) bio je oko dva-puta manje efektivan u odnosu na netretirani serum u podržavajućoj hemolizi. Pored toga, više koncentracije LEA-2-blokiranog seruma (tj., tretiranog sa antiMASP-2 monoklonalnim antiteloom) bile su potrebne za promovisanje efektivne hemolize netretiranih WT RBC-a u poređenju sa netretiranim serumom (FIG.23).

[0143] Još više začuđujuće, serum iz 3MC pacijenta homozigotnog za disfunkcionalni MASP-3 protein (te prema tome kome nedostaje LEA-1) bio je potpuno nesposoban da hemolizuje manan-senzitizovana

2

Crry-deficijentna RBC-a (FIG.22 i FIG.23). Sličan ishod primećenen je kada su korišćena nesenzitizovana normalna RBC-a: Kako je prikazano na FIG.23, LEA-1-defektivni serum izolovan iz 3MC pacijenta bio je potpuno neefektivan u posredovanju hemolize. Zajedno, ovi podaci ukazuju da dok LEA-2 značajno doprinosi intravaskularnom hemolitičkom odgovoru, LEA-1 je predominantni komplement-inicirajući put koji vodi ka hemolizi. Tako, dok se očekuje da LEA-2 blokirajući agensi značajno redukuju intravaskularnu hemoliza RBC-a kod PNH pacijenata, očekuje se da LEA-1 blokirajući agensi imaju dublji efekat i da više eleminišu komplement-vođenu hemolizu.

[0144] Treba napomenuti da serum LEA-1-deficijentnog 3MC pacijenta koji je korišćen u ovom ispitivanju poseduje umanjeni ali funkcionalni alternativni put kada je testiran pod konvencionalnim ispitnim uslovima za alternativni put (FIG.17). Ovo otkriće sugeriše da LEA-1 ima veći doprinos na hemolizu odnosu na aktivnost alternativnog puta kako je konvencionalno definisano u ovoj eksperimentalnoj postavci PNH. Zaključivanjem, podrazumeva se da su LEA-1-blokirajući agensi najmanje efektivni kao i agensi koji blokiraju druge aspekte alternativnog puta u preveniranju ili lečenju intravaskularne hemolize kod PNH pacijenata.

vi. Uloga MASP-2 inhibitora u PNH

[0145] Podaci predstavljeni ovde sugerišu sledeće patogene mehanizme za anemiju u PNH: intravaskularna hemoliza zbog neregulisane aktivacije terminalne komplement komponente i liziranje RBC obrazovanjem MAC, koji je iniciran predominantno, ali ne i ekskluzivno, putem LEA-1, i ekstravaskularna hemoliza izazvana opsonizacijom RBC-a putem C3b, što se pokazalo da inicira predominantno putem LEA-2. Dok je otkrivena uloga za LEA-2 u inicirajućoj aktivaciji komplementa i promovisanju MAC obrazovanja i hemolize očigledan, ovaj proces čini se suštinski manje feketivan od LEA-1-inicirane aktivacije komplementa što vodi ka hemolizi. Tako, očekuje se da LEA-2-blokirajući agensi značajno redukuju intravaskularnu hemolizu kod PNH pacijenata, iako se ova terapeutska aktivnost samo delimično očekuje. Poređenjem, suštinskija redukcija u intravaskularnoj hemolizi kod PNH pacijenata očekuje se za LEA-1-blokirajuće agense.

[0146] Ekstravaskularna hemoliza, manje dramatičan, ali jednako značajan mehanizam RBC uništavanja koji vodi ka anemiji u PNH, primarno je rezultat opsonizacije putem C3b, što se čini da je prevashodno posredovano sa LEA-2. Tako, može se očekivati da LEA-2-blokirajući agensi preferenciono blokiraju RBC opsonizaciju i posledičnu ekstravaskularnu hemolizu u PNH. Ova jedinstvena terapeutska aktivnost LEA-2-blokirajućih agenasa očekuje se da obezbeđuje značajnu dobrobit lečenja svim PNH pacijentima budući da trenutno ne postoji lečenje za one PNH pacijente koji proživljavaju ovaj patogeni proces.

vii. LEA-2 inhibitori kao dopunsko lečenje LEA-1 inhibitorima ili terminalni komplement blokirajući agensi

[0147] Podaci predstavljeni ovde određuju dva patogena mehanizma za RBC klirens i anemiju u PNH koja mogu biti ciljani, odvojeno ili u kombinaciji, distinktivnim klasama terapeutskih agenasa: intravaskularna hemoliza inicirana prevashodno, ali ne ekskluzivno, putem LEA-1 i tako očekivano sprečena putem LEA-1-blokirajućeg agensa, i ekstravaskularna hemoliza zbog C3b opsonizacije vođene prevashodno putem LEA-2, i tako efektivno sprečena putem LEA-2-blokirajućeg agensa.

[0148] Dobro je dokumentovano da i intravaskularni i ekstravaskularni mehanizmi hemolize vode ka anemija kod PNH pacijenata (Risitano et al., Blood 113:4094-4100 (2009)). Prema tome, očekuje se da će LEA-1-blokirajući agens koji sprečava intravaskularnu hemolizu u kombinaciji sa LEA-2 blokirajućim agensom koji primarno sprečava ekstravaskularnu hemolizu biti efektivniji od bilo kog agensa samo u sprečavanju anemije koja se razvija kod PNH pacijenata. Zapravo, kombinacija LEA-1- i LEA-2-blokirajućih agenasa očekuje se da sprečava sve relevantne mehanizme iniciranja komplementa u PNH i i tako blokira sve simptome anemije u PNH.

[0149] Takođe je poznato da C5-blokirajući agensi (kao što je ekulizumab) efektivno blokiraju intravaskularnu hemolizu ali se ne mešaju sa opsonizacijom. To ostavlja neke anti-C5-tretirane PNH pacijente sa suštinski upornom anemijom zbog ekstravaskularne hemolize posredovane putem LEA-2 koji ostaje netretiran. Prema tome, očekuje se da će C5-blokirajući agens (kao što je ekulizumab) koji sprečava intravaskularnu hemolizu u kombinaciji sa LEA-2 blokirajućim agensom da redukuje ekstravaskularnu hemolizu biti efektivniji od bilo kog agensa samo u sprečavanju anemije koja se razvija kod PNH pacijenata.

[0150] Drugi agensi koji blokiraju terminalnupetlju amplifikacije sistema komplementa što vodi ka C5 aktivaciji i MAC taloženju (koji uključuju, ali nisu ograničeni na agense koji blokiraju properdin, faktor B ili faktor D ili pojačavaju inhibitornu aktivnost faktora I, faktora H ili drugih komplement inhibitornih faktora) takođe se očekuje da inhibiraju intravaskularnu hemolizu. Međutim, ne očekuje se za ove agense da utiču na LEA-2-posredovanu opsonizaciju kod PNH pacijenata. To ostavlja neke PNH pacijente tretirane sa takvium agensima sa suštinski upornom anemijom zbog ekstravaskularne hemolize posredovane putem LEA-2 koji ostaje netretiran. Prema tome, očekuje se da će lečenje takvim agensima koji sprečavaju intravaskularnu hemolizu u kombinaciji sa LEA-2-blokirajućim agensom koji minimizira ekstravaskularnu hemolizu biti efektivnije od bilo kog agens samo u sprečavanju anemije koja se razvija kod PNH pacijenata. Zapravo, kombinacija takvih agenasa i LEA-2 blokirajućeg agensa očekuje se da sprečava sve relevantne mehanizme RBC uništavanja u PNH i tako blokira sve simptome anemije u PNH.

4

viii. Use of LEA-1 i LEA-2 multiple, bispecifičan ili pan-specifičan antitela u lečenju PNH

[0151] Kako je ovde detaljnije opisano, upotreba kombinacije farmakoloških agenasa koji pojedinačno blokiraju LEA-1 i LEA-2, i te perma tome kombinacije koje blokiraju sve događaje aktivacije komplementa koji posreduju intravaskularnu kao i ekstravaskularnu hemolizu, smatra se da obezbeđuje najbolji klinički ishod za PNH pacijente. Ovaj ishod može se postići na primer, kombinovanim davanjem antitela koja imaju LEA-1-blokirajući aktivnost zajedno sa antitelima koja imaju LEA-2-blokirajuću aktivnost. U nekim slučajevima, LEA-1- i LEA-2-blokirajuće aktivnosti kombinuju se u jedan molekulski entitet, a tako da takav entite sa kombinovanim LEA-1- i LEA-2-blokirajućim aktivnostima efektivno blokiraju intravaskularnu kao i ekstravaskularnu hemolizu i sprečavaju anemiju u PNH. Takav entite može da obuhvata ili da se sastoji od bispecifičnog antitela u kojem jedno antigen-kombinovano mesto specifično prepoznaje MASP-1 i blokira LEA-1 i umanjuje LEA-2, a drugo antigen-kombinovano mesto specifično prepoznaje MASP-2 i dalje blokira LEA-2. Alternativno, takav entitet može se sastojati od bispecifičnog monoklonalnog antitela u kojem jedno antigen-kombinovano mesto specifično prepoznaje MASP-3 i tako blokira LEA-1, a drugo antigen-kombinovano mesto specifično prepoznaje MASP-2 i blokira LEA-2. Takav entitet opciono može da se sastoji od bispecifičnog monoklonalnog antitela u kojem jedno antigen-kombinovano mesto specifično prepoznaje oba i MASP-1 i MASP-3 i tako blokira LEA-1 i umanjuje LEA-2 dok drugo antigen-kombinovano mesto specifično prepoznaje MASP-2 i dalje blokira LEA-2. na osnovu sličnosti u ukupnoj proteinskoj sekvenci i arhitekturi, može se zamisliti da koncencionalno antitelo sa dva identična mesta vezivanja može se razviti a koja se specifično vezuju za MASP-1 i za MASP-2 i za MASP-3 na funkcionalan način, čime se postiže funkcionalno blokiranje LEA-1 i LEA-2. Takvo antitelo sa pan-MASP inhibitornom aktivnošću očekuje se da blokira i intravaskularnu kao i ekstravaskularnu hemolizu i tako efektivno leči anemiju kod PNH pacijenata.

IV. MASP INHIBITORNI AGENSI

[0152] U prepoznavanju da je lektinski put komplementa sačinjen od dva glavna kraka aktivacije komplementa, LEA-1 i LEA-2, i da tu takođe postoji krak lektin-nezavisne aktivacije komplementa, dolazi dop realizacije da bi bilo veoma poželjno da se inhibira jedan ili više ovih efektorskih kraka koji izazivaju patologiju povezanu sa PNH bez potpunog gašenja sposobnosti imune odbrane komplementa (tj., ostavljajući klasični put intaktan). To bi ostavilo C1q-zavisnu aktivaciju sistema komplementa intaktnu radi upravljanja imunim kompleksom koji se obrađuje i radi pomoći u odbrani domaćina protiv infekcije.

i. Mešavine za inhibiranje LEA-1-posredovane aktivacija komplementa

[0153] Kako je ovde opisano, pronalazači su neočekivano otkrili da aktivacija LEA-1, koja vodi ka liziranju, je MASP-3-zavisna. Kako je ovde dalje opisano, pod fiziološkim uslovima, MASP-3-zavisna LEA-1 aktivacija takođe doprinosi opsonizaciji, čime se obezbeđuje dodatan efekat sa LEA-2-posredovanom aktivacijom komplementa. Kako je pokazano u Primeru 7, u prisustvu Ca<++>, faktor D nije neophodan, budući da MASP-3 može da vode aktivaciju LEA-1 u faktor D<-/->serumima. MASP-3, MASP-1, i HTRA-1 sposobni su da konvertuju pro-faktor D u aktivan faktor D. Isto tako, čini se da je MASP-3 aktivacija, u mnogim slučajevima, zavisna od MASP-1, budući da MASP-3 (nasuprot MASP-1 i MASP-2) nije autoaktivirajući enzim i nije sposoban da se konvertuje u njegov aktivan oblik bez pomoći MASP-1 (Zundel, S. et al., J.Immunol.172: 4342-4350 (2004); Megyeri et al., J. Biol. Chem.288:8922-8934 (2013). Kako se MASP-3 ne auto-aktivira i, u mnogim slučajevima, zahteva aktivnost MASP-1 da bi se konvertovao u njegov enzimski aktivan oblik, MASP-3-posredovanu aktivaciju alternativnog puta C3 konvertaza C3Bb mogu ili biti inhibirane ciljajućim MASP-3 zimogenom ili već-aktiviranim MASP-3, ili ciljanjem MASP-1-posredovane aktivacije MASP-3, ili oba, budući da, u mnogim slučajevima, u odsustvu MASP-1 funkcionalne aktivnose, MASP-3 ostaje u svom zimogen obliku i nije sposoban za vođenje LEA-1 putem direktne formacije C3 konvertaze alternativnog puta (C3bBb).

[0154] Poželjna proteinska komponenta za ciljanje u razvoju terapeutskih agenasa radi specifičnog inhibiranja LEA-1 je inhibitor MASP-3 (koji uključuje inhibitore MASP-1-posredovane MASP-3 aktivacije (npr., MASP-1 inhibitor koji inhibira MASP-3 aktivaciju)).

[0155] U skladu sa prethodno pomenutim, opis obezbeđuje postupke za inhibiranje štetnih efekata LEA-1 (tj., hemoliza i opsonizacija) kod subjekta koji boluje od PNH, ili koji je u riziku od razvijanja PNH, koja obuhvata davanje subjektu farmaceutske mešavine koja obuhvata količinu MASP-3 inhibitornog agensa efektivnu da inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0156] MASP-3 inhibitorni agensi daju se u količini efektivnoj da inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa kod subjekta koji boluje od, ili koji je u riziku od razvijanja, PNH. Reprezentativni MASP-3 inhibitorni agensi uključuju: molekule koji inhibiraju biološku aktivnost MASP-3, koji uključuju molekule koji inhibiraju najmanje jedan ili više od sledećih: lektin MASP-3-zavisna aktivacija faktora B, lektin MASP-3-zavisna aktivacija pro-faktora D, MASP-3-zavisna, lektin-nezavisna aktivacija faktora B, i MASP-3-zavisna, lektin-nezavisna aktivacija pro-faktora D (kao što su inhibitori malog molekula, MASP-3 antitela i njihovi fragmenti, ili blokirajući peptidi koji ulaze u reakciju sa MASP-3 ili se mešaju sa proteinprotein interakcijom), i molekuli koji smanjuju ekspresiju MASP-3 (kao što su molekuli MASP-3 antisens nukleinske kiseline, MASP-3 specifiain RNKi molekuli i MASP-3 ribozomi). MASP-3 inhibitorni agens može efektivno da blokira MASP-3 protein-prema-proteinu interakcije, utiče na MASP-3 dimerizaciju ili sklapanje, blokira Ca<++>vezivanje, utiče na aktivno mesto MASP-3 serinske proteaze, ili redukuje MASP-3 proteinsku ekspresiju, čime sprečava MASP-3 od aktivirajuće LEA-1-posredovane, ili lektin-nezavisne, aktivacije komplementa. MASP-3 inhibitorni agensi mogu se primeniti samo kao primarna terapija ili u kombinaciji sa drugim terapeuticima kao dopunska terapija za pojačavanje terapeutskih dobrobiti drugog medicinskog lečenja, kako je ovde dalje opisano.

[0157] U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens se specifično vezuje za deo MASP-3 (SEQ ID NO:8) sa afinitetom vezivanja od najmanje 10 puta većim u odnosu na druge komponente u sistemu komplementa. U još jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens specifično se vezuje za deo MASP-3 (SEQ ID NO:8) sa afinitetom vezivanja od najmanje 100 puta većim u odnosu na druge komponente u sistemu komplementa. U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens specifično se vezuje za domen serinske proteaze MASP-3 (aa 450-711 iz SEQ ID NO:8) i inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa, pod uslovom da se inhibitorni agens ne vezuje za domen serinske proteaze MASP-1 (SEQ ID NO:10), i da se ne vezuje za domen serinske proteaze MASP-2 (SEQ ID NO:5). U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens je MASP-3 monoklonalno antitelo, ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za MASP-3.

[0158] U još jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens specifično se vezuje za deo MASP-1 (SEQ ID NO:10) sa afinitetom vezivanja od najmanje 10 puta većim u odnosu na druge komponente u sistemu komplementa, i inhibira MASP-1-posredovanu aktivaciju MASP-3. U još jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens specifično se vezuje za deo MASP-1 (SEQ ID NO:10) sa afinitetom vezivanja od najmanje 100 puta većim u odnosu na druge komponente (tj., polipeptidi, ili njihovi fragmenti) u sistemu komplementa, i inhibira MASP-1-posredovanu aktivaciju MASP-3. U nekim slučajevima, MASP-3 inhibitorni agens specifično se vezuje za domen serinske proteaze MASP-1 (aa 449-694 iz SEQ ID NO:10) i inhibira MASP-1-posredovanu aktivaciju MASP-3, pod uslovom da se inhibitorni agens ne vezuje za domen serinske proteaze MASP-2 (SEQ ID NO:5), i da se ne vezuje za domen serinske proteaze MASP-3 (SEQ ID NO:8). U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens je MASP-1 monoklonalno antitelo, ili njegov fragment, koji se specifično vezuje za MASP-1 i inhibira MASP-1-posredovanu aktivaciju MASP-3. U nekim slučajevima, MASP-3 inhibitorni agens koji se vezuje za MASP-1 inhibira MASP-1-posredovanu aktivaciju MASP-3 i dalje inhibira MASP-1-posredovano sazrevanje faktora D.

[0159] U još jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens vezuje za deo MASP-3 (SEQ ID ON:8) i also vezuje za deo MASP-1 (SEQ ID NO:10), pod uslovom da se inhibitorni agens ne vezuje za MASP-2 (SEQ ID NO:5), ili MAp19 (SEQ ID NO:3). U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens vezuje za deo MASP-3 (SEQ ID ON:8) i takođe se vezuje za deo MASP-1 (SEQ ID NO: 10), pod uslovom da se inhibitorni agens ne vezuje se za MASP-2 (SEQ ID NO:5) ili MAp19 (SEQ ID NO:3). U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens vezuje za deo MASP-3 (SEQ ID ON:8) i takođe se vezuje za deo MASP-1 (SEQ ID NO:10), pod uslovom da se inhibitorni agens ne vezuje za MASP-2 (SEQ ID NO:5), MAp19 (SEQ ID NO:3), ili MAp44 (SEQ ID NO:11), čime se obezbeđuje niža efektivna doza za inhibiranje MASP-3-zavisne aktivacije komplementa zbog nedostatka vezivanja za MAp44, koji je prisutan u velikim koncetracijama u humanom serum.

[0160] U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens je MASP-1/MASP-3 dvostruki inhibitorni agens koji se vezuje za epitop unutar aminokiselinskog regiona koji je sačuvan između MASP-1 i MASP-3, kao što je CUBI-CCP2 domen (aa 25-432 iz SEQ ID NO:10), kako je prikazano na FIG.3-5. U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens je MASP-1/MASP-3 dvostruki inhibitorni agens koji se vezuje za epitop unutar aminokiselinskog regiona koji je sačuvan između MASP-1 i MASP-3, pod uslovom da se inhibitorni agens ne vezuje se MAp44, kao što je CCP domen (aa 367-432 iz SEQ ID NO:10). U još jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens je bispecifični inhibitorni agens, kao što je bispecifično monoklonalno antitelo, koji se specifično vezuje za epitop na MASP-3 proteinu (SEQ ID NO:8) i epitop na MASP-1 proteinu (SEQ ID NO:10). U nekim slučajevima, MASP-3 inhibitorni agens je bispecifično monoklonalno antitelo koje se vezuje za domen serinske proteaze MASP-1 (aa 449-694 iz SEQ ID NO: 10), a takođe se vezuje za domen u serinskoj proteazi MASP-3 (aa 450-711 iz SEQ ID NO:8).

[0161] Afinitet vezivanja MASP-3 inhibitornih agenasa može se odrediti upotrebom pogodnog ogleda vezivanja.

[0162] Inhibicija MASP-3-zavisne aktivacije komplementa okarakterisana je najmanje jednim od sledećih promena u komponenti sistema komplementa koja se događa kao rezultat davanja MASP-3 inhibitornog agensa u skladu sa postupcima ovog otkrića: inhibicija LEA-1-posredovane aktivacije komplementa (inhibicija hemolize i/ili opsonizacije); inhibicija lektin-nezavisne konverzije faktora B; inhibicija lektin-nezavisne konverzije faktora D, inhibicija MASP-3 serinska proteaza supstrat-specifičnog cepanja, redukcija hemolize (izmereno, na primer kako je opisano u Primeru 5) ili redukcija C3 cepanja i C3b taloženja (izmereno, na primer, kako je opisano u Primeru 4 i Primer 11).

[0163] U nekim slučajevima, MASP-3 inhibitorni agensi selektivno inhibiraju MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa (tj., LEA-1-posredovanu aktivaciju komplementa i/ili lektin-nezavisnu konverziju faktora B i/ili lektin-nezavisnu konverziju faktora D), ostavljajući Sistem C1q-zavisne aktivacije komplementa funkcionalno intaktan.

[0164] U nekim slučajevima, MASP-3 inhibitorni agensi su antitela, ili njihovi fragmenti, koji uključuju MASP-3 antitela i njihove MASP-3 vezujuće fragmente, MASP-1 antitela i njihove fragmenti, prirodne i sintetičke peptide, ili male-molekule. U nekim slučajevima, MASP-3 inhibitorni agensi su proteaza inhibitori malog-molekula koji su selektivni za MASP-1, ili selektivni za MASP-3, ili selektivni za MASP-1 i MASP-3.

ii. Mešavine za inhibiranje aktivacija of LEA-2

[0165] Kako je ovde opisano, LEA-2-posredovana aktivacija komplementa je MASP-2-zavisna, što vodi ka opsonizaciji i/ili liziranju. Prema tome, poželjna protein komponenta za ciljanje u razvoju terapeutskih agenasa za specifično inhibiranje LEA-2 lektin-zavisnog sistema komplementa je MASP-2. Pokazano je da se nekoliko proteina vezuje za, ili reaguje sa MASP-2 putem protein-prema-proteinu interakcije. Na primer, poznato je da se MASP-2 vezuje za, i obrazuje kalcijum-zavisan kompleks sa, lektin proteinima MBL, H-fikolinom i L-fikolinom i kolektin-11. Ma Y., et al., J Urođeni Immun. Epub Dec 4 (2012).

Pokazano je da svaki MASP-2/lektin kompleks aktivira komplement putem MASP-2-zavisnog cepanja proteina C4 i C2 (Ikeda, K., et al., J. Biol. Chem.262:7451-7454, (1987); Matsushita, M., et al., J. Exp. Med.176:1497-2284, (2000); Matsushita, M., et al., J. Immunol.168:3502-3506, (2002)). Ispitivanja su pokazala da su CUB1-EGF domeni MASP-2 suštinski za spajanje MASP-2 sa MBL (Thielens, N.M., et al., J. Immunol.166:5068, (2001)). Pokazano je da CUB1EGFCUBII domeni posreduju dimerizaciju MASP-2, koja je neophodna za obrazovanje aktivnog MBL kompleksa (Wallis, R., et al., J. Biol. Chem.275:30962-30969, 2000). Prema tome, MASP-2 inhibitorni agensi mogu se indetifikovati kao koji se vezuju ili utiču na MASP-2 ciljani regioni poznat kao značajan za MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa.

[0166] U skladu sa prethodnim, ovaj opis obezbeđuje postupke za inhibiranje štetnih efekata LEA-2-posredovane aktivacije komplementa kod subjekta koji boluje od PNH, ili koji je u riziku od razvijanja PNH, koji obuhvataju davanje subjektu farmaceutske mešavine koja obuhvata količinu MASP-2 inhibitornog agensa efektivnu da inhibira MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0167] MASP-2 inhibitorni agensi daju se u količini efektivnoj da inhibira MASP-2-zavisan LEA-2 kod subjekta koji boluje od, ili koji je u riziku od razvijanja PNH. Reprezentativni MASP-2 inhibitorni agensi uključuju: molekule koji inhibiraju biološku aktivnost MASP-2 (kao što su inhibitori malog molekula, MASP-2 antitela ili blokirajući peptid koji reaguje sa MASP-2 ili se meša sa protein-protein interakcijom), i molekuli koji smanjuju ekspresiju MASP-2 (kao što su molekuli MASP-2 antisens nukleinske kiseline, MASP-2 specifičan RNKi molekuli i MASP-2 ribozomi), čime sprečava MASP-2 aktivirajuće LEA-2.

[0168] MASP-2 inhibitorni agens može efektivno da blokira MASP-2 protein-prema-proteinu interakcije, utiče na MASP-2 dimerizaciju ili sklapanje, blokira Ca<++>vezivanje, utiče na aktivno mesto MASP-2 serinske proteaze, ili može redukovati MASP-2 protein ekspresiju, čime se sprečava da MASP-2 aktivira LEA-2. MASP-2 inhibitorni agensi mogu se primeniti samo kao primarna terapija ili u kombinaciji sa drugim terapeuticima kao dopunska terapija za pojačavanje terapeutskih dobrobiti drugog medicinskog lečenja, kako je ovde dalje opisano.

[0169] U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorni agens specifično se vezuje za deo MASP-2 (SEQ ID NO:5) sa afinitetom vezivanja od najmanje 10 puta većim u odnosu na druge antigene u sistemu komplementa. U još jednom slučaju, MASP-2 inhibitorni agens specifično se vezuje za deo MASP-2 (SEQ ID NO:5) sa afinitetom vezivanja od najmanje 100 puta većim u odnosu na druge antigene u sistemu komplementa. U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorni agens specifično vezuje za najmanje jedan od (i) CCP1-CCP2 domena (aa 300-431 iz SEQ ID NO:5) ili domena serinske proteaze MASP-2 (aa 445-682 iz SEQ ID NO:5) i inhibira MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa, pod uslovom da se inhibitorni agens ne vezuje za domen serinske proteaze MASP-1 (SEQ ID NO:10), i da se ne vezuje za domen serinske proteaze MASP-3 (SEQ ID NO:8). U jednom slučaju, MASP-2 inhibitorni agens je MASP-2 monoklonalno antitelo, ili njegov fragment koji se specifično vezuje za MASP-2.

[0170] Afinitet vezivanja MASP-2 inhibitornog agensa može se odrediti upotrebom pogodnog ogleda vezivanja.

[0171] Inhibicija MASP-2-zavisnu aktivacije komplementa okarakterisana je najmanje jednim od sledećih promena u komponenti sistema komplementa koja se događa kao rezultat davanja MASP-2 inhibitornog agensa u skladu sa postupcima ovog otkrića: inhibicija generisanja ili proizvodnje proizvoda MASP-2-zavisnog komplement-aktivacionog-sistema C4b, C3a, C5a i/ili C5b-9 (MAC) (izmereno, na primer, kako je opisano u Primeru 2 prema US Patentu Br.7,919,094), redukcija C4 cepanja i C4b taloženja (izmereno, na primer kako je opisano u Primeru 8 ili Primer 9), ili redukcija C3 cepanja i C3b taloženja (izmereno, na primer, kako je opisano u Primeru 11).

[0172] U nekim slučajevima, MASP-2 inhibitorni agensi selektivno inhibiraju MASP-2 aktivaciju komplementa (tj., LEA-2), ostavljajući sistem C1q-zavisne aktivacije komplementa funkcionalno intaktan.

[0173] U nekim slučajevima, MASP-2 inhibitorni agensi su antitela, ili njihovi fragmenti, koji uključuju MASP-2 antitela i njihove MASP-2 vezujuće fragmente, prirodni i sintetički peptid, ili male-molekule. U nekim slučajevima, MASP-2 inhibitorni agensi su proteaza inhibitori malog mnolekula koji su selektivni za MASP-2.

iii. Mešavine za inhibiranje LEA-1-posredovane aktivacije komplementa i LEA-2-posredovane aktivacije komplementa

[0174] U još jednom aspektu, ovaj opis obezbeđuje postupke za inhibiranje štetnih efekata LEA-1 i inhibiranje štetnih efekata LEA-2 kod subjekta koji boluje od jednog ili više aspekata PNH, ili koji je u riziku od razvijanja PNH.

[0175] U jednom slučaju, aspekat ovog otkrića usmeren je na postupak povećavanja preživljavanja crvenih krvnih zrnaca kod subjekta koji boluje od PNH, koja obuhvata davanje subjektu mešavine koja obuhvata količinu od najmanje jednog od MASP-1 inhibitornog agensa i/ili MASP-3 inhibitornog agensa efektivan da poveća preživljavanje crvenih krvnih zrnaca.

[0176] U jednom slučaju, mešavina obuhvata MASP-1 inhibitorni agens. U jednom slučaju, MASP-1 inhibitorni agens inhibira MASP-3-posredovanu aktivaciju komplementa i takođe inhibira MASP-2-posredovanu aktivaciju komplementa.

[0177] U jednom slučaju, mešavina obuhvata MASP-3 inhibitorni agens. U jednom slučaju, MASP-3 inhibitorni agens inhibira najmanje jedan od: lektin MASP-3-zavisna aktivacija faktora B; lektin MASP-3-zavisna aktivacija faktora D; MASP-3-zavisna, lektin-nezavisna aktivacija faktora B; i/ili MASP-3-zavisna, lektin-nezavisna, aktivacija faktora D.

[0178] U jednom slučaju, mešavina obuhvata MASP-1 inhibitorni agens i MASP-3 inhibitorni agens.

[0179] U nekim slučajevima, postupak dalje obuhvata davanje subjektu mešavine koja obuhvata MASP-2 inhibitorni agens.

[0180] U još jednom slučaju, aspekt ovog otkrića obuhvata davanje subjektu koji boluje od PNH farmaceutsku mešavinu koja obuhvata količinu MASP-2 inhibitornog agensa efektivnu da inhibira MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa i količinu MASP-3 inhibitornog agensa efektivnu da inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0181] U nekim slučajevima, mešavina obuhvata jednan agens koji inhibira oba LEA-1 i LEA-2 (tj., dvostruki MASP-2/MASP-3 inhibitorni agens, dvostruki MASP-1/MASP-2 inhibitorni agens, bispecifičan MASP-2/MASP-3 inhibitorni agens, bispecifičan MASP-1/MASP-2 inhibitorni agens, ili pan-MASP-1/2/3 inhibitorni agens ili trispecifičan MASP-1/2/3 inhibitorni agens). U nekim slučajevima, mešavina obuhvata kombinaciju LEA-1 i LEA-2 inhibitornih agenasa, na primer, kombinaciju dvostrukih

1

inhibitornih agenasa plus jedan inhibitorni agens, kombinaciju bispecifičnih inhibitornih agenasa plus jedan inhibitorni agens, ili kombinaciju bilo kog od MASP-1, MASP-2 i/ili MASP-3 inhibitornih agenasa kako je ovde opisano koji u kombinaciji inhibiraju oba LEA-1 i LEA-2, kako je ovde dalje opisano.

[0182] U jednom slučaju obezbeđena je farmaceutska mešavina za inhibiranje oba LEA-1 i LEA-2, koja obuhvata najmanje jedan MASP-3 inhibitorni agens i najmanje jedan MASP-2 inhibitorni agens i farmaceutski prihvatljiv nosač. Farmaceutska mešavina obuhvata kombinaciju prvog molekula koji je MASP-3 inhibitorni agens i drugog molekula koji je MASP-2 inhibitorni agens. U još jednom slučaju, farmaceutska mešavina obuhvata jedan molekulski entitet koji uključuje aktivnost kao MASP-3 inhibitorni agens i aktivnost kao MASP-2 inhibitorni agens (tj., inhibitorni agens koji inhibira obe MASP-2-posredovanu LEA-2 aktivaciju i MASP-3-posredovanu LEA-1 aktivaciju). U jednom slučaju, inhibitorni agens je MASP-2/MASP-3 dvostruki inhibitorni agens koji se vezuje za epitop unutar aminokiselinskog regiona koji je sačuvan između MASP-2 (SEQ ID NO:5) i MASP-3 (SEQ ID NO:8), kao što je domen serinske proteaze, na primer N-terminalni region beta lanca (npr., prvi 150 aa N-terminalnog regiona beta lanca iz SEQ ID NO5 i SEQ ID NO:8:), kako je prikazano na FIG.4, 6 i 7C. U jednom slučaju, inhibitorni agens je bispecifični inhibitorni agens, kao što je bispecifično monoklonalno antitelo, koje se specifično vezuje za epitop na MASP-2 protein (SEQ ID NO:5) i epitop na MASP-3 protein (SEQ ID NO:8). U nekim slučajevima, inhibitorni agens je bispecifično monoklonalno antitelo koje se vezuje za najmanje jedan od CCP1-CCP2 domena MASP-2 (aa 300-431 iz SEQ ID NO:5) ili domen serinske proteaze MASP-2 (aa 445-682 iz SEQ ID NO:5) i takođe se vezuje za epitop u serinskoj proteazi MASP-3 (aa 450-711 iz SEQ ID NO:8).

[0183] U još jednom slučaju, ovaj opis obezbeđuje mešavinu za inhibiranje oba LEA-1 i LEA-2, koja obuhvata inhibitorni agens koji inhibira obe MASP-2-posredovanu LEA-2 aktivaciju i MASP-1-posredovanu aktivaciju MASP-3, čime se inhibira MASP-3-posredovana LEA-1 aktivacija (i opciono takođe i inhibiranje MASP-1-posredovanog sazrevanja faktora D). U jednom slučaju, inhibitorni agens je MASP-1/MASP-2 dvostruki inhibitorni agens koji se vezuje za epitop unutar aminokiselinskog regiona koji je sačuvan između MASP-1 (SEQ ID NO:10) i MASP-2 (SEQ ID NO:5), kao što je domen serinske proteaze, kako je prikazano na FIG.4, 6 i 7A. U jednom slučaju, inhibitorni agens je bispecifični inhibitorni agens, kao što je bispecifično monoklonalno antitelo, koji se specifično vezuje za epitop na MASP-1 proteinu (SEQ ID NO:10) i epitop na MASP-2 proteinu (SEQ ID NO:5). U nekim slučajevima, inhibitorni agens je bispecifično monoklonalno antitelo koji se vezuje za domen serinske proteaze MASP-1 (aa 449-694 iz SEQ ID NO: 10) i takođe se vezuje za najmanje jedan od CCP1-CCP2 domena MASP-2 (aa 300-431 iz SEQ ID NO:5) ili domen serinske proteaze MASP-2 (aa 445-682 iz SEQ ID NO:5).

2

[0184] U još jednom slučaju, ovaj opis obezbeđuje mešavinu za inhibiranje oba LEA-1 i LEA-2, koja obuhvata inhibitorni agens koji inhibira MASP-2-posredovanu LEA-2 aktivaciju, MASP-3-posredovanu LEA-1 aktivaciju direktnim vezivanjem za MASP-3 i takođe inhibira MASP-1-posredovanu aktivaciju MASP-3, čime se inhibira MASP-3-posredovana LEA-1 aktivacija (i opciono takođe i inhibira MASP-1-posredovano sazrevanje faktora D). U jednom slučaju, inhibitorni agens je pan-MASP inhibitor koji se vezuje za an aminokiselinski region koja je sačuvan između MASP-1 (SEQ ID NO:10), MASP-2 (SEQ ID NO:5) i MASP-3 (SEQ ID NO:8), na primer sačuvani region u CUBI-EGF-CUB2 domenu, kako je prikazano na FIG.4 i 5. Kako je prikazano na FIG.4 i 5, postoje brojne zakrpe identiteta podeljene između MASP-1, MASP-2 i MASP-3 u CUBI-EGF-CUBII domenima, čime se omogućava generisanje pan-specifičnog MASP antitela. U nekim slučajevima, pan-specifično MASP antitelo može se vezati za epitop unutar CUB2 domena MASP-1 (aa 185-296 iz SEQ ID NO:10), MASP-2 (aa 184-295 iz SEQ ID NO:5) i MASP-3 (aa 185-296 iz SEQ ID NO:8). Napomenuto je da pan-specifičan MASP inhibitor koji se vezuje za CUBI-EGF MASP-1, MASP-2 i MASP-3 takođe bi mogao da se veže za MAp19 i MAp44, prema tome efektivna terapeutska doza takvog inhibitora trebalo bi da se podesi na viši nivo kako bi se kompenzovalo ovo vezivanje.Dalje je napomenuto da bi pan-specifičan MASP inhibitor koji se vezuje za CUBII domen MASP-1, MASP-2 i MASP-3 takođe mogao da se veže za MAp44, prema tome efektivna terapeutska doza takvog inhibitora trebalo bi da se podesi na viši nivo kako bi se kompenzovalo ovo vezivanje.

[0185] U jednom slučaju, inhibitorni agens je trispecifičan MASP-1/2/3 inhibitor koji se vezuje za epitop na MASP-1 proteinu (SEQ ID NO:10), epitope na MASP-2 proteinu (SEQ ID NO:5) i epitop na MASP-3 proteinu (SEQ ID NO:8). U nekim slučajevima, inhibitorni agens je trispecifično monoklonalno antitelo koje se vezuje za domen serinske proteaze MASP-1 (aa 449-694 iz SEQ ID NO:10), vezuje za najmanje jedan od CCP1-CCP2 domena MASP-2 (aa 300-431 iz SEQ ID NO:5) ili domen serinske proteaze MASP-2 (aa 445-682 iz SEQ ID NO:5) i takođe vezuje za epitop u serinskoj proteaze MASP-3 (aa 450-711 iz SEQ ID NO:8).

[0186] Primerni inhibitorni agensi za inhibiranje LEA-1, LEA-2 ili LEA-1 i LEA-2 opisani su ispod u TABELI 2.

TABELA 2: MASP Inhibitorni agensi

Vrsta MASP Inhibitor vezujući Unakrsna Ispitivanje na inhibitornu Terapeutska inhibitora domen(i) reaktivnost* aktivnost korisnost

MASP-3 MASP-3 domen Vezuje se za Inhibicija MASP-3 serinska Inhibiraju LEA-1-specifičan serinske proteaze (aa MASP-3; ne za proteaza supstrat- posredovanu

MASP-2 MASP-2 CCP1-CCP2 Vezuje se za Inhibicija MASP-2- Inhibiraju LEA-2-specifičan domen (aa 300-431 iz MASP-2; ne za specifična proteaza posredovanu SEQ ID NO:5); ili MASP-1; supstrat-specifičnog aktivaciju MASP-2 domen MASP-3; MAP cepanja, LEA-2 inhibicija komplementa

MASP-1 MASP-1 domen Vezuje se za Inhibicija MASP-1- Inhibiraju LEA-1 i specifičan serinske proteaze MASP-1; ne za specifična proteaza LEA-2mediated (aa449-694 iz SEQ ID MASP-2, supstrat-specifičnog aktivacija NO: 10) MASP-3, cepanja; LEA-1 i LEA2 komplementa MAp44 ili inhibicija, Ispitivanje na (inhibiraju MAp19 inhibiciju faktor D liziranje i/ili aktivacije; ispitivanje na opsonizaciju) povraćaj AP-1 aktivnosti u

faktor D osiromašenom

serum dopunjenom sa

pro-faktorom D

MASP-2/MASP- Region domena Vezuje MASP-2 Ispitivanje na MASP-2- i Inhibiraju LEA-1 i 3 dvostruki serinske proteaze i MASP-3; ne MASP-3 proteaza LEA-2-inhibitor (jedno sačuvan između MASP-1, supstrat-specifično posredovanu antitelo vezuje MAp44, ili cepanje, inhibicija aktivaciju

ta

)

4

[0187] U nekim slučajevima, mešavina obuhvata kombinaciju LEA-1 i LEA-2 inhibitornih agenasa, na primer, kombinacija pojedinačnih inhibitornih agenasa kako je prethodno opisano i prikazano u TABELI 2. Na primer, mešavina obuhvata kombinaciju MASP-1 antitela i MASP-2 antitela. U jednom slučaju, mešavina obuhvata kombinaciju MASP-1 antitela i MASP-3 antitela. U jednom slučaju, mešavina obuhvata kombinaciju MASP-2 antitela i MASP-3 antitela. U jednom slučaju, mešavina obuhvata kombinaciju MASP-1, i MASP-2 i MASP-3 antitela. U nekim slučajevima, postupci ovog otkrića obuhvataju davanje jedne mešavine koja obuhvata kombinaciju inhibitornih agenasa. U drugim slučajevima, postupci ovog otkrića obuhvataju zajedničko davanje odvojenih mešavina.

[0188] U nekim slučajevima, mešavine obuhvataju kombinaciju dvostrukog inhibitornog agensa plus jednog inhibitornog agensa (tj., MASP-2/3 dvostruki inhibitor plus MASP-1 inhibitor; MASP-1/3 dvostruki inhibitor plus MASP-2 inhibitor; ili MASP-1/2 dvostruki inhibitor plus MASP-3 inhibitor). Postupci ovog otkrića obuhvataju zajedničko davanje odvojenih mešavina koje obuhvataju dvostruki inhibitor i jedan inhibitor.

[0189] U nekim slučajevima, mešavine obuhvataju kombinaciju bispecifičnog inhibitornog agensa plus jednog inhibitornog agensa (tj., MASP-2/3 bispecifičan inhibitor plus MASP-1 inhibitor; MASP-1/3 bispecifičan inhibitor plus MASP-2 inhibitor; ili MASP-1/2 bispecifičan inhibitor plus MASP-3 inhibitor).

Postupci ovog otkrića obuhvataju zajedničko davanje odvojenih mešavina koje obuhvataju bispecifičan inhibitor i jedan inhibitor.

[0190] Napomenuto je da MASP-3 inhibitorni agensi i/ili MASP-2 inhibitorni agensi i/ili MASP-1 inhibitorni agensi mogu da se koriste da očiste ciljani protein iz plazme u poređenju sa C5 antitelom koje mora biti lokaliziovano na mesto delovanja.

V. MASP ANTITELA

[0191] MASP inhibitorni agens obuhvata MASP antitelo (npr., MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 antitelo) koje inhibira najmanje jedan od LEA-1 i/ili LEA-2 puteva aktivacije komplementa. MASP antitela korisna u aspektu ovog otkrića uključuju poliklonalna, monoklonalna ili rekombinantna antitela izvedena iz bilo kog antitelo- proizvodećeg sisara i mogu biti multispecifična (tj., bispecifična ili trispecifična), himerna, humanizovana, potpuno humana, anti-idiotipna, i fragmenti tih anititela. Fragmenti anititela uključuju Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv fragmente, scFv fragmente i jedno-lančana antitela kako je ovde dalje opisano.

[0192] MASP antitela mogu se podvrgnuti skriningu na sposobnost da inhibiraju LEA-1 ili LEA-2-zavisnu aktivaciju sistema komplementa upotrebom ovde opisanih ispitivanja. Nekoliko MASP-1, MASP-2 i MASP-3 antitela opisana su u literaturi, a neka su novije generisana, od kojih su neka navedena u donjoj TABELI 3. Ova primerna MASP antitela mogu se podvrgnuti skriningu na sposobnost da inhibiraju LEA-1-i/ili LEA-2-zavisnu aktivaciju sistema komplementa upotrebom ovde opisanih ispitivanja. Na primer, kako je opisano u Primerima 11-13, anti-pacovska MASP-2 Fab2 antitela indetifikovana su da blokiraju MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa. Kako je dalje opisano u Primeru 14, potpuno humana MASP-2 scFv antitela indetifikovana su da blokiraju MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa. Kako je dalje opisano u Primeru 15, generisana su MASP-3 antitela. Kada se MASP antitelo jednom indetifikuje da ima funkcije kao inhibitor LEA-1 ili LEA-2, ono se može primeniti u farmaceutskoj mešavini kakva je ovde opisanas, i takođe se može primeniti kako bi se generisali bispecifični i trispecifični inhibitorni agensi, kakvi su navedeni u TABELI 2 i dalje opisani ovde (videti npr., Primer 8).

TABELA 3: MASP-1, MASP-2 i MASP-3 SPECIFIČNA ANTITELA

i. MASP antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom

[0193] U nekim slučajevima, MASP antitela opisana ovde imaju redukovanu efektorsku funkciju kako bi redukovala zapaljenje koje može proizaći iz aktivacije klasičnog puta komplementa. Sposobnost IgG molekula da izazove klasični put komplementa pokazana je da ostaje unutar Fc dela molekula (Duncan, A.R., et al., Nature 332:738-740 (1988)). IgG molekuli u kojem je Fc deo molekula uklonjen enzimskim cepanjem lišeni su ove efektorske funkcije (videti Harlow, Antitela: A Laboratorijska Manual, Cold Spring Harbor Laboratorijska, New York, 1988). Shodno tome, antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom mogu se generisati kao rezultat nedostatka Fc dela molekula tako što se genetski konstruiše Fc sekvenca koja minimizira efektorsku funkciju, ili koja je ili human IgG2ili IgG4izotip.

[0194] Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom mogu se proizvesti standardnom molekulskom biološkom manipulacijom Fc dela IgG teških lanaca kako je opisano u Jolliffe et al., Int'l Rev. Immunol.

10:241-250, (1993), i Rodrigues et al., J. Immunol.151:6954-6961, (1998). Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom takođe uključuju humane IgG2 i IgG4 izotipove koji imaju redukujuću sposobnost za aktiviranje komplementa i/ili reaguju sa Fc receptorima (Ravitdh, J.V., et al., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, (1991); Isaacs, J.D., et al., J. Immunol.148:3062-3071, 1992; van de Winkel, J.G., et al., Immunol. Today 14:215-221, (1993)). Humanizovano ili potpuno humana antitela specifična za humani MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 (koja uključuju dvostruka, pan, bispecifična ili trispecifična antitela) sačinjeni od IgG2 ili IgG4 izotipova mogu se proizvesti jednim od nekoliko postupaka poznatim stručnjaku iz ove oblasti, kako je opisano u Vaughan, T.J., et al., Nature Biotechnical 16:535-539, (1998).

ii. Proizvodnja MASP antitela

[0195] MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 antitela mogu se proizvesti upotrebom MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 polipeptida (npr., pune dužine MASP-1, MASP-1 ili MASP-3) ili upotrebom antigenskih MASP-1, 2 ili 3 epitop-noseći peptida (npr., deo MASP-2 polipeptida). Imunogeni peptid može biti mali poput pet aminokiselinskih ostataka. Na primer, MASP-2 polipeptid koji uključuje celu aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID NO:5 mogže se primeniti da indukuje MASP-2 antitela korisna u postupku ovog otkrića. Naročiti MASP domeni poznati da su umešani u protein-protein interakcije, kao što je CUBI, i CUBI-EGF domeni, kao i region koji obuhvata serin-proteaza aktivno mesto, na primer, kako je navedeno u TABELI 2, mogu biti eksprimirani kao rekombinantni polipeptidi upotrebom postupaka dobro poznatim u struci i mogu se koristiti kao antigeni. Pored toga, peptidi koji obuhvataju deo od najmanje 6 aminokiselina MASP-1 polipeptida (SEQ ID NO:10), ili MASP-2 polipeptida (SEQ ID NO:5) ili MASP-3 polipeptida (SEQ ID NO:8) takođe su koristan u indukovanju MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 antitela, respektivno. MASP peptidi i polipeptidi koji se koriste za uzgoj antitela mogu biti izolovana kao prirodni polipeptidi, ili rekombinantni ili sintetički peptidi i katalitički neaktivni rekombinantni polipeptidi. Antigens korisni za proizvodnju MASP antitela takođe uključuju fuzione polipeptide, kao što su fuzije MASP polipeptida ili njegov deo sa imunoglobulinskim polipeptidom ili sa maltoza-vezujućim proteinom. Polipeptidni imunogen može biti molekul pune dužine ili njegov deo. Ukoliko je polipeptidni deo nalik haptenu, takav deo može biti poželjno spojen sa i povezan sa makromolekulskim nosačem (kao što je keyhole limpet hemocyanin (KLH), goveđi serumski albumin (BSA) ili tetanus toxoid) for immunization.

iii. Poliklonalna antitela

[0196] Poliklonalna antitela protiv MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 mogu se pripremiti imunizovanjem neke životinje sa MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 polipeptidom ili njihovim imunogenim delom upotrebom

1

postupaka dobro poznatim stručnjacima iz ove oblasti. Videti, na primer, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera," in Immunochemical Protocols (Manson, ed.). Imunogeničnost MASP polipeptida može se povećati upotrebom adjuvansa, koji uključuju mineralne gelove, kao što je aluminijum hidroksid ili Fraundov adjuvans (kompletan ili nekompletan), površinski aktivne supstance kao što je lizolektin, pluronski polioli, polianioni, uljne emulzije, KLH i dinitrofenol. Poliklonalna antitela uobičajeno se uzgajaju kod životinja kao što su konji, krave, psi, piliću, pacovi, miševi, zečevi, morsko prase, koze, ili ovce. Alternativno, MASP antitelo korisno u ovom pronalasku takođe može biti izvedeno iz podhumanog primata. Opšte tehnike za uzgajanje dijagnostički i terapeutski korisnih antitela u babunima mogu se naći, na primer, u Goldenberg et al., Međunarodna patentna objava br. WO 91/11465, i u Losman, M.J., et al., Int. J. Cancer 46:310, (1990). Serumi koji sadrže imunološki aktivna antitela zatim se proizvode iz krvi takvih imunizovanih životinja upotrebom standardnih procedura dobro poznatih u struci.

iv. Monoklonalna antitela

[0197] U nekim slučajevima, LEA-2 inhibitorni agens je MASP-2 monoklonalno antitelo i/ili LEA-1 inhibitorni agens je MASP-3 monoklonalno antitelo ili MASP-1 monoklonalno antitelo. Kako je prethodno opisano, u nekim slučajevima, MASP-1, MASP-2 i MASP-3 monoklonalna antitela veoma su specifična, tako što su usmerena protiv jednog MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 epitopa. Kako se ovde koristi, modifikujuće "monoklonalno" ukazuje na karakter antitela koje je dobijeno od suštinski homogene populacije antitela, i ne konstruiše se zahtevanjem proizvodnje antitela bilo kojim naročitim postupkom. Monoklonalna antitela mogu se dobiti upotrebom bilo koje tehnike koja obezbeđuje proizvodnju molekula antitela kontinulanom ćelijskom linijom u kulturi, kao što je hibridoma postupak opisan od strane Kohler, G., et al., Nature 256:495, (1975), ili mogu biti izrađena rekombinantnim DNK postupcima (videti, npr., U.S. Patent Br.4,816,567 to Cabilly). Monoklonalna antitela takođe mogu biti izolovana iz biblioteka faga antitela upotrebom tehnika opisanih u Clackson, T., et al., Nature 352:624-628, (1991), i Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol.222:581-597, (1991). Takva antitela mogu biti bilo koje imunoglobulinske klase koja uključuje IgG, IgM, IgE, IgA, IgD i bilo koju njenu podklasu.

[0198] Na primer, monoklonalna antitela mogu se dobiti injektovanjem u pogodnog sisara (npr., BALB/c miševi) mešavine koja obuhvata MASP-1 polipeptid, MASP-2 polipeptid ili MASP-3 polipeptid, ili njihov deo. Nakon prethodno određenog vremenskog perioda, splenociti se uklanjaju iz miševa i suspenduju u podlozi za rast ćelijske kulture. Splenociti se zatim spajaju sa besmrtnom ćelijskom linijom radi obrazovanja hibridoma. Obrazovani hibridomi uzgajaju se u ćelijskoj kulturi i povrgavaju skriningu na njihovu sposobnost da proizvedu monoklonalno antitelo protiv MASP-1, MASP-2 ili MASP-3. (Takođe videti Current Protocols in Immunology, Vol.1., John Wiley & Sons, pages 2.5.1-2.6.7, 1991.)

2

[0199] Humana monoklonalna antitela mogu se dobiti upotrebom transgenih miševa koji su konstruisani da proizvode specifična humana antitela u odgovoru na antigenski čelendž. U ovoj tehnici, elementi himanih imunoglobulinskih lokusa teških i lakih lanaca uvedeni su u sojeve miševa izvedenih iz embrionske linije matičnih ćelija koje sadrže ciljane prekide endogenih imunoglobulinskih lokusa teškog lanca i lakog lanca. Transgeni miševi mogu da sintetizuju humana antitela specifična za humane antigene, kao što su ovde opisani MASP-2 antigeni, i ovi miševi se mogu upotrebiti za proizvodnju humanih MASP-2 antitelo-sekretujućih hibridoma fuzijom B-ćelija iz takvih životinja u pogodne mijeloma ćelijske linije upotrebom konvencionalne Kohler-Milstein tehnologije. Postupci za dobijanje humanih antitela iz transgenih miševa opisani su, na primer, od strane Green, L.L., et al., Nature Genet.7:13, 1994; Lonberg, N., et al., Nature 368:856, 1994; i Taylor, L.D., et al., Int. Immun.6:579, 1994.

[0200] Monoklonalna antitela mogu se izolovati i prečistiti iz hibridoma kultura raznim dobro utvrđenim tehnikama. Takve tehnike izolovanja uključuju afinitetnu hromatografiju sa Protein-A safarozom, ekskluzionu hromatografiju po veličini, i jono-izmenjivačku hromatografiju (videti, na primer, Coligan na stranama 2.7.1-2.7.12 i stranama 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," u Methods in Molecular Biology, The Humana Press, Inc., Vol.10, stranice 79-104, 1992).

[0201] Kada se jednom proizvedu, poliklonalna, monoklonalna ili faga-izvedena antitela prvo se testiraju na specifično MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 vezivanje ili, kada je poželjno, dvostruko MASP-1/3, MASP-2/3 ili MASP-1/2 vezivanje. Postupci za određivanje da li se antitelo vezuje za proteinski antigen i/ili afinitet za antitelu ka protein antigenu poznati su u struci. Na primer, vezivanja antitela za proteinski antigen može se detektovati i/ili kvantifikovati upotrebom raznih tehnika kao što je, ali nisu ograničene na, Western blot, dot blot, postupak plazmonske površinske rezonance (npr., BIAcore sistem; Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden i Piscataway, NJ), ili enzim-povezana imunosorbentna ispitivanja (ELISA). Videti, npr., Harlow i Traka (1988) " Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.; Benny K. C. Lo (2004) "Antibody Engineering:

Methods and Protocols," Humana Press (ISBN: 1588290921); Borrebaek (1992) "Antibody Engineering, A Practical Guide," W.H. Freeman and Co., NY; Borrebaek (1995) "Antibody Engineering," 2nd Edition, Oxford University Press, NY, Oxford; Johne et al. (1993), Immunol. Meth.160:191-198; Jonsson et al. (1993) Ann. Biol. Clin.51: 19-26; and Jonsson et al. (1991) Biotehnike 11:620-627. See also, U.S. Patent Br.6,355,245.

[0202] Afinitet MASP monoklonalnih antitela može se lako odrediti od strane stručnjaka iz ove oblasti (videti, npr., Scatchard, A., NY Acad. Sci.51:660-672, 1949). MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 monoklonalna antitela korisna za postupke ovog otkrića vezuju se za MASP-1, MASP-2, ili MASP-3 sa afinitetom vezivanja od <100 nM, poželjno <10 nM i najpoželjnije <2 nM.

[0203] Kada je identifikovano da se antitela specifično vezuju za MASP-1, MASP-2 ili MASP-3, MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 antitela testiraju se na sposobnost da funkcionišu kao LEA-1 inhibitorni agens ili LEA-2 inhibitorni agens u jednom od nekoliko funkcionalnih ispitivanja, na primer kako je opisano u TABELI 2. Na primer, antitela koja su indetifikovana da se specifično vezuju za MASP-2 testiraju se na sposobnost da funkcionišu kao LEA-2 inhibitorni agens u jednom od nekoliko ispitivanja, kao što je, na primer, kako je opisano u TABELI 2 (npr., ispitivanje lektin-specifičnog C4 cepanja (kao što je ispitivanje opiasno u Primeru 8 ili Primeru 9), ili ispitivanje C3b taloženja (kao što je ispitivanje opisano u Primeru 4 ili Primeru 11)). Kako je dalje opisano, indetifikovana antitela koja se specifično vezuju sa MASP-1 ili MASP-3 testirana su na sposobnost da funkcionišu kao LEA-1 inhibitorni agens u jednom od nekoliko ispitivanja, kao što je, na primer, kako je opisano u TABELI 2 (npr., redukcija hemolize, izmereno, na primer kako je opisano u Primeru 5, ili redukcija C3 cepanja i C3b taloženja, izmereno, na primer, kako je opisano u Primeru 4 i Primer 11).

v. Himerna/humanizovana antitela

[0204] Monoklonalna antitela korisna u postupku ovog otkrića uključuju himerna antitela u kojem je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz naročite vrste ili koja pripadaju naročitoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca(aca) identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima izvedenim iz još jedne vrste ili koja pripada nekoj drugo klasi ili podklasi antitela, kao i fragmenti takvih antiotela (U.S. Patent Br.4,816,567, to Cabilly; i Morrison, S.L., et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851-6855, (1984)).

[0205] Jedan oblik himernog antitela korisno u ovom opisu je humanizovano monoklonalno MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 antitelo. Humanizovani oblici ne-humanih (npr., mišjih) antitela su himerna antitela, koja sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanih imunoglobulina. Humanizovana monoklonalna antitela proizvode se trensferovanjem ne-humanih (npr., mišjih) komplementarnost-određujućih regiona (CDR), iz mišjih imunoglobulina sa teškim i lakim varijabilnim lancimna u humani varijabilni domen. Obično, ostaci humanih antitela zatim se supstituišu u okviru regiona ne-humanih kontradelova. Pored toga, humanizovana antitela mogu da obuhvataju ostatke koji nisu nađeni kod antitela primaoca ili antitela donora. Ove modifikacije izvode se da dalje oplemene performanse antitela. Generalno, humanizovano antitelo obuhvataju suštinski sve od najmanje jednog, i obično dva, varijabilna domena u kojem svi ili suštinski svi od hipervarijabilnih petlji odgovaraju onima od ne-humanih imunoglobulina i svi ili suštinski svi iz regiona Fv okvira su oni od humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano

4

antitelo opciono takođe obuhvataju najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), obično koji su humani imunoglobulini. Da dalje detalje, videti Jones, P.T., et al., Nature 321:522-525, (1986); Reichmann, L., et al., Nature 332:323-329, (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596, (1992).

[0206] Humanizovana antitela korisna u ovom opisu uključuju humana monoklonalna antitela koja uključuju najmanje MASP-1, MASP-2, ili MASP-3 vezujući CDR3 region. Pored toga, Fc delovi mogu biti zamenjeni tako da proizvode IgA ili IgM kao i humana IgG antitela. Takva humanizovana antitela naročito će imati kliničku upotrebljivost jer specifično prepoznaju humane MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 ali ne pobuđuju imuni odgovor kod ljudi protiv samog antitela. Shodno tome, ona više odgovaraju za in vivo davanje ljudima, naročito kada je potrebno ponovljeno ili dugoročno davanje.

[0207] Tehnike za proizvodnju humanizovanih monoklonalnih antitela takođe su opisana, na primer, od strane Jones, P.T., et al., Mature 321:522, (1986); Carter, P., et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 89:4285, (1992); Sandhu, J.S., Crit. Rev. Biotech.12:437, (1992); Singer, I.I., et al., J. Immun.150:2844, (1993); Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Inc., (1995); Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies," in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., pages 399-434, (1996); and by U.S. Patent Br.5,693,762, to Queen, 1997. Pored toga, postoje komercijalni entiteti koji sintetizuju humanizovana antitela fiz specifičnih regiona mišjih antitela, kao što je Protein Design Labs (Mountain View, CA).

vi. Rekombinantna antitela

[0208] MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 antitela takođe se mogu izraditi upotrebom rekombinantnih postupaka. Na primer, humana antitela mogu biti izrađena upotrebom humanih imunoglobulinskih ekspresionih biblioteka (dostupne na primer, od Stratagene, Corp., La Jolla, CA) radi proizvodnje fragmenata humanih antitela (VH, VL, Fv, Faktor D, Fab ili F(ab')2). Ovi fragmenti zatim se koriste da konstruišu cela humana antitela upotrebom tehnike slične onim za proizvodnju himernog antitela.

vii. Anti-idiotipna antitela

[0209] Kada se identifikuje da MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 antitela imaju željenu inhibitornu aktivnost, ova antitela mogu se koristiti kako bi se generisala anti-idiotipna antitela koja liče na deo MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 upotrebom tehnika koja su dobro poznate u struci. Videti, npr., Greenspan, N.S., et al., FASEB J.7:437, (1993). Na primer, antitela koja se vezuju za MASP-2 i kompetitivno inhibiraju interakciju MASP-2 proteina potrebnu za aktivaciju komplementa mogu se koristiti kako bi se generisali anti-idiotipovi koji liče na MBL vezujuće mesto na MASP-2 proteinu i prema tome vezuje i neutralizuje vezivanje liganda MASP-2 kao što je, na primer, MBL.

viii. Imunoglobulinski fragmenti

[0210] MASP-2 i MASP-3 inhibitorni agensi korisni u postupku ovog otkrića obuhvataju ne samo intaktne imunoglobulinske molekule već i dobro poznate fragmente koji uključuju Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2i Fv fragmente, scFv fragmente, dijatela, linearna antitela, molekule jedno-lančanih antitela i multispecifična (npr., bispecifična i trispecifična) antitela obrazovana od fragmenata anititela.

[0211] Dobro je poznato u struci da samo mali deo molekula antitela, paratop, uključen je u vezivanja antitela za njegov epitop (videti, npr., Clark, W.R., The Experimental Foundations of Modern Immunology,Wiley & Sons, Inc., NY, 1986). pFc' i Fc regioni antitela su efektori klasičnog puta komplementa ali nisu uključeni u vezivanje antigena. Antitelo od kojih je pFc' region enzimski pocepan, ili koji je proizveden bez pFc' regiona, označeni je kao F(ab')2fragment i zadržava oba antigen vezujuća mesta intaktnog antitela. Izolovan F(ab')2fragment naziva se bivalentni monoklonalni fragment zbog svoja dva antigen vezujuća mesta. Na sličan način, antitelo od kojih je Fc region enzimski pocepan, ili koji proizveden bez Fc regiona, označen je kao Fab fragment, i zadržava jedan antigen vezujućih mesta intaktnih molekula antitela.

[0212] Fragmenti anititela mogu se dobiti proteolitičkim hidroliziranjem, kao što je pepsin ili papain digestijom celih antitela konvencionalnim postupcima. Na primer, fragmenti anititela mogu se proizvesti enzimskim cepanjem antitela pepsinom kako bi se obezbedio 5S fragment označen kao F(ab')2. Ovaj fragment biti dalje pocepan upotrebom tiol redukujućeg agensa da bi se proizveli 3.5S Fab' monovalentni fragmenti. Opciono, reakcija cepanja može se izvesti upotrebom blokirajuće grupe za sulfhidril grupe koje rezultuju iz cepanja disulfidnih veza. Kao alternativa, enzimsko cepanje upotrebom pepsina proizvodi dva monovalentna Fab fragmenta i Fc fragment direktno. Ovi postupci su opisani, na primer, u U.S. Patentu Br.4,331,647 za Goldenberg; Nisonoff, A., et al., Arch. Biochem. Biophys.89:230, (1960); Porter, R.R., Biochem. J.73:119, (1959); Edelman, et al., in Methods in Enzymology 1:422, Academic Press, (1967); i by Coligan at pages 2.8.1-2.8.10 i 2.10.-2.10.4.

[0213] U nekim slučajevima, upotreba fragmenata anititela kojima nedostaje Fc region poželjni su za zaobilaženje aktivacije klasičnog puta komplementa koji je pokrenut nakon vezivanja Fc za Fcγ receptor. Postoji nekoliko postupaka kojima se može proizvesti monoklonalno antitelo koje zaobilazi Fcγ receptor interakcije. Na primer, Fc region monoklonalnog antitela može se ukloniti hemijski upotrebom delimične digestije proteolitičkim enzimima (kao što je digestija ficinom), čime se generišu, na primer, antigenvezujući fragmenti anititela kao što su Fab ili F(ab)2fragmenti (Mariani, M., et al., Mol. Immunol.28:69-71, (1991)). Alternativno, humani γ4 IgG izotip, koji se ne vezuje sa Fcγ receptorima, mogu se koristiti tokom konstruisanja humanizovanog antitela kako je ovde opisano. Antitela, jedno-lančana antitela i antigen-vezujući domeni kojima nedostaje Fc domen takođe mogu biti konstruisani upotrebom rekombinantnih tehnika opisanih ovde.

ix. Jedno-lančani fragmenti anititela

[0214] Alternativno, mogu se stvoriti molekuli vezivanja jednostrukog peptidnog lanca, koji su specifični za MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 u kojem su Fv regioni teškog i lakog lanca povezani. Fv fragmenti mogu biti povezani peptidnim linkerom radi obrazovanja jedno lančanog antigen vezujuće proteina (scFv). Ovi jedno lančani antigen vezujući proteini pripremljeni su konstruisanjem strukturnog gena koji obuhvata DNK sekvence koje kodiraju VHi VLdomene koji su povezani oligonukleotidom. Strukturni gen se umeće u ekspresioni vektor, koji se naknadno uvodi u ćeliju domaćina, kao što je E. coli. Rekombinantne ćelije domaćina sintetizuju jednostuki polipeptidni lanac linker peptidom povezujući dva V domena. Postupci za proizvodnju scFvs opisani su na primer, od strane Whitlow, et al., " Methods: A Companion to Methods in Enzymology" 2:97, (1991); Bird, et al., Science 242:423, (1988); U.S. Patent Br.4,946,778, to Ladner; Pack, P., et al., Bio/Technology 11:1271, (1993).

[0215] Kao ilustrativni primer, MASP-3-specifični scFv mogu se dobiti izlaganjem limfocita MASP-3 polipeptidu in vitro i biranjem biblioteka prikaza antitela u fagama ili sličnim vektorima (na primer, upotrebom imobilisanog ili obeleženog MASP-3 proteina ili peptida). Geni koji kodiraju polipeptide sa potencijalnim MASP-3 polipeptidnim vezujućim domenima mogu se dobiti skriningom nasumičnih peptidnih biblioteka prikazanih na fagama ili na bakteriji kao što je E. coli. Ove nasumične biblioteke prikaza peptida možgu se koristiti za skrining peptida koji ulaze u reakciju sa MASP-3. Tehnike za pripremu i skrining takvih nasumičnih peptidnih biblioteka prikaza dobro su poznate u struci (U.S. Patent Br.5,223,409, Lardner; U.S. Patent Br.4,946,778, Ladner; U.S. Patent Br.5,403,484, Lardner; U.S. Patent Br.5,571,698, Lardner; i Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins Academic Press, Inc., 1996) and random peptide display libraries and kits for skriningom such libraries are available commercially, for instance from CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, Calif.), Invitrogen Inc. (San Diego, Calif.), New England Biolabs, Inc. (Beverly, Mass.), and Pharmacia LKB Biotechnology Inc.

(Piscataway, N.J.).

[0216] Još jedan oblik MASP-3 fragment anititela korisan u aspektu ovog otkrića je peptid koji kodira jedan komplementarnost-određujući region (CDR) koji se vezuje za epitop na MASP-3 antigenu i inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa (tj., LEA-1). Još jedan oblik MASP-1 fragmenta anititela korisan u aspektu ovog otkrića je peptid koji kodira jedan komplementarnost-određujući region (CDR) koji se vezuje za epitop na MASP-1 antigenu i inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa (tj., LEA-1). Još jedan oblik MASP-2 fragment anititela korisan u aspektu ovog otkrića je peptid koji kodira jedan komplementarnost-određujući region (CDR) koji se vezuje za epitop na MASP-2 antigen i inhibira MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa (tj., LEA-2).

[0217] CDR peptidi ("minimalne jedinice za prepoznavanje") mogu se dobiti konstruisanjem gena koji kodiraju CDR antitela od interesa. Takvi geni se pripremaju, na primer, upotrebom lančana reakcija polimeraze radi sintetizovanja varijabilnog regiona iz RNK antitelo-proizvodećih ćelija (videti, na primer, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, (1991); Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, (1995); i Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al. (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc., 1995).

[0218] MASP antitela opisana ovde daju se subjektu kome je to potrebno da inhibiraju LEA-1, LEA-2 ili kombinaciju LEA-1 i LEA-2 aktivacije komplementa. U nekim slučajevima, MASP inhibitorni agens je visoko afinitetno humano ili humanizovano monoklonalno MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 antitelo sa redukovanom efektorskom funkcijom.

x. Bispecifična antitela

[0219] MASP-2 i MASP-3 inhibitorni agensi korisni u postupku ovog otkrića obuhvataju multispecifična (tj., bispecifična i trispecifična) antitela. Bispecifična antitela su monoklonalna, poželjno humana ili humanizovana, antitela koja imaju specifičnost vezivanja za najmanje dva različita antigena. Kako je prethodno opisano i prikazano u TABELI 2, u jednom slučaju, postupak obuhvata upotrebu bispecifičnog antitela koje obuhvata specifičnost vezivanja za MASP-2 (npr., vezivanje za najmanje jedan od CCP1-CCP2 ili domen serinske proteaze od MASP-2) i specifičnost vezivanja za MASP-3 (npr., vezivanje za domen serinske proteaze od MASP-3). U još jednom slučaju, postupak obuhvata upotrebu bispecifičnog antitela koje obuhvata specifičnost vezivanja za MASP-1 (npr., vezivanje za domen serinske proteaze MASP-1) i specifičnost vezivanja za MASP-2 (npr., vezivanje za najmanje jedan od CCP1-CCP2 ili domen serinske proteaze MASP-2). U još jednom slučaju, postupak obuhvata upotrebu bispecifičnog antitelo koje obuhvata specifičnost vezivanja za MASP-1 (npr., vezivanje za domen serinske proteaze MASP-1) i specifičnost vezivanja za MASP-3 (npr., vezivanje za domen serinske proteaze MASP-3). U još jednom slučaju, postupak obuhvata upotrebu trispecifičnog antitela koje obuhvata specifičnost vezivanja za MASP-1 (npr., vezivanje za domen serinske proteaze MASP-1), specifičnost vezivanja za MASP-2 (npr., vezivanje za najmanje jedan od CCP1-CCP2 ili domen serinske proteaze MASP-2) i specifičnost vezivanja za MASP-3 (npr., vezivanje za domen serinske proteaze MASP-3).

[0220] Postupci za izradu bispecifičnog antitela su u okviru nadležnosti stručnjaka iz ove oblasti.

Uobičajeno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela bazirana je na ko-ekspresiji dva imunoglobulinski teški-lanac/laki-lanac para, pri čemu ta dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Milstein i Cuello, Nature 305:537-539 (1983)). Varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (antitelo-antigen mesta kombinovanja) mogu biti fuzionisani za imunoglobulinsku sekvencu konstantnog domena. Fuzija je poželjno sa imunoglobulinskim konstantnim domenom teškog lanca, koji ugljučuje najmanje deo zgloba, CH2, i CH3 regiona. DNK koje kodiraju imunoglobulinske fuzije teškog lanca i, ukoliko je poželjno, imunoglobuline lakog lanca, uvedene su u odvojene ekspresione vektore, i ko-transfektovane u pogodan organizam domaćin. Za detalje ilustrativnih trenutno poznatih postupaka generisanja bispecifičnih antitela videti, npr., Suresh et al., Methods in Enzymology 121:210 (1986); WO96/27011; Brennan et al., Science 229:81 (1985); Shalaby et al., J. Exp. Med.175:217-225 (1992); Kostelny et al., J. Immunol.148(5):1547-1553 (1992); Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 (1993); Gruber et al., J. Immunol.152:5368 (1994); and Tutt et al., J. Immunol.147:60 (1991). Bispecifična antitela takođe uključuju umrežena ili heterokonjugatna antitela. Heterokonjugatna antitela mogu se izraditi bilo kojim uobičajenim postupcima umrežavanja. Pogodni agensi umrežavanja dobro su poznati u struci, i opisani su u U.S. Pat. Br.4,676,980, zajedno sa brojnim tehnikama za umrežavanje.

[0221] Takođe su opisane razne tehnike za izradu i izolovanje bispecifičnih fragmenata anititela direktno od rekombinantnih ćelijskih kultura. Na primer, bispecifičan antitela proizvedena su upotrebom leucin zatvarača. (Videti, npr., Kostelny et al. J.Immunol.148(5):1547-1553 (1992)).

Tehnologija "dijatela" opisana od strane Hollinger et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:6444-6448 (1993), obezbeđuje alternativni mehanizam za izradu bispecifičnih fragmenata anititela. Fragmenti obuhvataju varijabilni domen teškog lanca (VH) povezan za varijabilni domen lakog lanca (VL) linkerom koji je prekratak da omogući uparivanje između dva domena na istom lancu. Shodno tome, VH i VL domeni jednog fragmenta silom su upareni sa komplementarnim VL i VH domenima još jednog fragmenta, čime se obrazuju dva antigen-vezujuća mesta. Bispecifična dijatela, nasuprot bispecifičnim celim antitelima, mogu biti naročito korisna jer se ona mogu lako konstruisati i eksprimirati u E. coli. Dijatela (i mnogi drugi polipeptidi kao što su fragmenti anititela) pogodnih vezujućih specifičnosti mogu se lako odabrati upotrebom prikaza faga (WO94/13804) iz biblioteka. Ukoliko jedan krak treba da ostane konsantan, primera radi, sa specifičnosti usmerenom protiv antigena X, tada biblioteka može biti izrađena tamo gde se drugi krak razlikuje i bira se antitelo poželjne specifičnosti.

[0222] Takođe je prijavljena još jedna strategija za pripremu bispecifičnih fragmenata anititela upotrebom jedno-lančanih Fv (scFv) dimera. (Videti, npr., Gruber et al. J. Immunol., 152:5368 (1994)).

Alternativno, antitela mogu biti "linearna antitela" kako je opisano u, npr., Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995). Ukratko opisano, ova antitela obuhvataju par tandema Faktor D segmenata (VH-CHI-VH-CHI) koji obrazuju par antigen vezujućih regiona. Linearna antitela mogu biti bispecifična ili monospecifična. Postupci ovog otkrića takođe obuhvataju upotrebu raznih oblika bispecifičnih antitela kao što su molekuli tetravalentnog imunoglobulina dvostrukog varijabilnog domena (DVD-Ig) opisani u Wu et al., Nat Biotechnol 25:1290-1297 (2007). DVD-Ig molekuli su dizajnirani tako da su dva različita varijabilna domena lakog lanca (VL) iz dva različita roditeljska antitela povezana u tandemu direktno ili putem kratkih veznika rekombinantnim DNK tehnikama, praćeno konstantnim domenom lakog lanca. Postupci generisanja DVD-Ig molekula iz dva roditeljska antitela dalje su opisana u, npr., WO08/024188 i WO07/024715.

VI. NE-PEPTIDNI INHIBITORI

[0223] U nekim slučajevima, MASP-3 ili MASP-2 inhibitorni agens je MASP-3 ili MASP-2 ili MASP-1 inhibitorni peptidni ili ne-peptidni inhibitor MASP-3, ili MASP-2 ili MASP-1. Ne-peptidni MASP inhibitorni agensi mogu se dati subjektu sistemski, kao što je intra-arterijalnim, intravenoznim, intramuskularnim, subkutanim ili drugim parenteralnim davanjem, ili oralnim davanjem. MASP inhibitorni agens može se davati periodično tokom produženog vremenskog perioda za lečenje ili kontrolu hroničnog stanja, ili se mogu davati jednom ili više puta u periodu pre, tokom ili nakon akutne traume ili povrede.

VII. FARMACEUTSKU MEŠAVINE I POSTUPCI DOSTAVE

Doziranje

[0224] U još jednom aspektu, ovaj opis obezbeđuje mešavine za inhibiranje štetnih efekata MASP-3-zavisne aktivacije komplementa kod subjekta koji boluje od hemolitičke bolesti, kao što je PNH, koja obuhvata davanje subjektu mešavine koja obuhvata količinu MASP-3 inhibitornog agensa efektivnu da inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim slučajevima, postupak dalje obuhvata davanje mešavine koja obuhvata MASP-2 inhibitorni agens. MASP-3 i MASP-2 inhibitorni agensi mogu se dati subjektu kome je to potrebno, pri terapeutski efektivnim dozama za lečenje ili ublažavanje stanja povezanih sa MASP-3-zavisnom aktivacijom komplementa (LEA-1), i opciono i MASP-2-zavisnom aktivacijom komplementa (LEA-2). Terapeutski efektivna doza odnosi se na količinu MASP-3 inhibitornog agensa, ili kombinacije MASP-3 inhibitornog agensa i MASP-2 inhibitornog agensa, dovoljna da rezultuje u ublažavanju simptoma tog stanja.

[0225] Toksičnost i terapeutska efikasnost MASP-3 i MASP-2 inhibitornih agenasa može se odrediti standardnim farmaceutskim procedurama koje upošljavaju eksperimentalne životinjske modele.

Upotrebom takvih životinjskih modela, NOAEL (bez opaženog nivoa neželjenog efekta) i the MED (minimalno efikasna doza) mogu se odrediti upotrebom standardnih postupaka. Dozni odnos između NOAEL i MED utiče na terapeutski odnos, koji je izražen kao odnos NOAEL/MED. MASP-3 inhibitorni agensi i MASP-2 inhibitorni agensi koji eksprimiraju velike terapeutske odnose ili indekse su najpoželjniji. Podaci dobijeni iz ipsitivanja na ćelijskim kulturama ili životinjsih ispitivanja mogu se koristiti za formulisanje opsega doza za upotrebu kod ljudi. Doza MASP-3 inhibitornog agensa i MASP-2 inhibitornog agensa poželjno leži unutar opsega cirkulišućih koncentracija koji uključuju MED sa malo ili ni malo toskičnosti. Doza može varirati unutar ovog opsega u zavisnosti od doznog oblika koji se upošljava i od puta davanja koji se sprovodi.

[0226] Za bilo koju formulaciju jedinjenja, terapeutski efektivna doza može se proceniti upotrebom životinjskih modela. Na primer, doza može biti formulisana u životinjskom modelu da bi se postigao opseg cirkulišuće plazma koncentracije koji uključuje MED. Kvantitativni nivoi MASP-3 inhibitornog agensa ili MASP-2 inhibitornog agensa u plazmi takođe se mogu izmeriti, na primer, tečnom hromatografijom visokih perfomansi.

[0227] Pored ispitivanja toksičnosti, efektivno doziranje takođe se može proceniti na osnovu količine ciljanog MASP proteina prisutnog kod subjekta i afiniteta vezivanja MASP-3 ili MASP-2 inhibitornog agensa.

[0228] Prijavljeno je da su MASP-1 nivoi kod normalnih humanih subjekata prisutni u serumu pri nivoima u opsegu od 1.48 do 12.83 µg/mL (Terai I. et al, Clin Exp Immunol 110:317-323 (1997); Theil et al., Clin. Exp. Immunol.169:38 (2012)). Srednje MASP-3 koncentracije u serumu kod normalnih humanih subjekata prijavljeno je da su u opsegu od oko 2.0 do 12.9 µg/mL (Skjoedt M et al., Immunobiology 215(11):921-31 (2010); Degn et al., J. Immunol Methods, 361-37 (2010); Csuka et al., Mol. Immunol. 54:271 (2013). Pokazano je da su MASP-2 nivoi kod normalnih humanih subjekata prisutni u serumu pri niskim nivoima u opsegu od 500 ng/mL, a MASP-2 nivoi kod određenog subjekta može se odrediti upotrebom kvantitativnog ispitivanja na MASP-2 opisano u Moller-Kristensen M., et al., J. Immunol. Methods 282:159-167 (2003) i Csuka et al., Mol. Immunol.54:271 (2013).

[0229] Generalno, doziranje datih mešavina koje obuhvatju MASP-3 inhibitorne agense ili MASP-2 inhibitorne agense varira u zavisnosti od takvih faktora kao što su gdine, težina, visina, pol, opšte medicinsko stanje subjekta, i prethodna medicinska istorija. Kao ilustracija, MASP-3 inhibitorni agensi ili MASP-2 inhibitorni agensi (kao što su MASP-3 antitela, MASP-1 antitela ili MASP-2 antitela), mogu se davati u doznim opsezima od oko 0.010 do 100.0 mg/kg, poželjno 0.010 do 10 mg/kg, poželjno 0.010 do 1.0 mg/kg, poželjnije 0.010 do 0.1 mg/kg telesne težine subjekta. U nekim slučajevima, MASP-2

1

inhibitorni agensi (kao što su MASP-2 antitela) daju se u doznim opsezima od oko poželjno 0.010 do 10 mg/kg, poželjno 0.010 do 1.0 mg/kg, poželjnije 0.010 do 0.1 mg/kg telesne težine subjekta. U nekim slučajevima, MASP-1 inhibitorni agensi (kao što su MASP-1 antitela) ili MASP-3 inhibitorni agensi (kao što su MASP-3 antitela) daju se u doznim opsezima od oko 0.010 to 100.0 mg/kg, poželjno 0.010 do 10 mg/kg, poželjno 0.010 do 1.0 mg/kg, poželjnije 0.010 do 0.1 mg/kg telesne težine subjekta.

[0230] Terapeutska efikasnost MASP-3 inhibitornih mešavina, opciono u kombinaciji sa MASP-2 inhibitornim mešavinama, ili MASP-1 inhibitornih mešavina, opciono u kombinaciji sa MASP-2 inhibitornim mešavinama, i postupci ovog opisa u datom subjektu, i pogodna doziranja, mogu se odrediti u skladu sa komplement ispitivanjima dbro poznatim stručnjacima iz ove oblasti. Komplement generiše brojne specifične proizvode. Tokom poslednje dekade, razvijena su osetljiva i specifična ispitivanja i dostupna su komercijalno za većinu ovih aktivacionih proizvoda, koji uključuju male aktivacione fragmente C3a, C4a, i C5a i velike aktivacione fragmente iC3b, C4d, Bb, i sC5b-9. Mnoga od ovih ispitivanja koriste monoklonalna antitela koja reaguju sa novim antigenima (neoantigenima) izloženim na tim fragmentima, ali ne na nativnnim proteinima od kojih su obrazovani, čineći ova ispitivanja veoma jednostavna i specifična. Većina se oslanja na ELISA tehnologiju, iako se radioimunoispitivanje i dalje ponekad koristi za C3a i C5a. Ova poslednja ispitivanja mere i neobrađene fragmente i njihove 'desArg' fragmente, koji su glavni oblici pronađeni u cirkulaciji. Neobrađeni fragmenti i C5adesArgrapidno se čiste vezivanjem za receptore ćelijske površine i te su prema tome prisutni pri veoma niskim koncentracijama, dok se C3adesArgne vezuje za ćelije i akumulira se u plazmi. Merenje C3a obezbeđuje osetljiv, pokazatelj nezavisan od puta, aktivacije komplementa. Aktivacija alternativnog puta može se odrediti merenjem Bb fragmenta i/ili merenjem faktor D aktivacije.

Detektovanje tečno-faznog proizvoda aktivacionog puta membranskog napada, sC5b-9, obezbeđuje dokaz da je komplement aktiviran do završetka. Kako i lektinski i klasični putevi generišu iste aktivacione proizvode, C4a i C4d, merenje ova dva fragmenta ne obezbeđuje bilo koju informaciju o tome koji od ova dva puta generišu aktivacione proizvode.

[0231] Inhibicija MASP-3-zavisne aktivacije komplementa okarakterisana je najmanje jednim od sledećih promena u komponenti sistema komplementa koja se događa kao rezultat davanja MASP-3 inhibitornog agensa u skladu sa postupcima ovog otkrića: inhibicija LEA-1-posredovane aktivacije komplementa (inhibicija hemolize i opsonizacije); inhibicija MASP-3 serinska proteaza supstratspecifičnog cepanja, redukcija hemolize (izmereno, na primer kako je opisano u Primeru 5) ili redukcija C3 cepanja i C3b taloženja (izmereno, na primer, kako je opisano u Primeru 4 ili Primer 11).

[0232] Inhibicija MASP-2-zavisne aktivacije komplementa okarakterisana je najmanje jednim od

2

sledećih promena u komponenti sistema komplementa koja se događa kao rezultat davanja MASP-2 inhibitornog agensa u skladu sa postupcima ovog otkrića: inhibicija generisanja ili proizvodnje proizvoda MASP-2-zavisne aktivacije sistema komplementa C4b, C3a, C5a i/ili C5b-9 (MAC) (izmereno, na primer, kako je opisano u izmereno, na primer, kako je opisano u Primeru 2 US Patenta Br.7,919,094), redukcija C4 cepanja i C4b taloženja (izmereno, na primer kako je opisano u Primeru 8 ili Primer 9), ili redukcija C3 cepanja i C3b taloženja (izmereno, na primer, kako je opisano u Primeru 11).

i. Farmaceutski nosači i nosači za dostavu

[0233] Generalno, mešavine MASP-3 inhibitornog agensa i mešavine MASP-2 inhibitornog agensa prema ovom opisu, ili mešavine koje obuhvataju kombinaciju MASP-2 i MASP-3 inhibitornih agenasa, mogu se kombinovati sa bilo kojim drugim odabranim terapeutskim agensima, koji su pogodno sadržani u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Nosač je netoksičan, biokompatibilan i odabran tako da ne utiče štetno na biološku aktivnost MASP-3 inhibitornog agensa ili MASP-2 inhibitornog agensa (i bilo koje druge terapeutske agense koji se sa njima kombinuju). Primerni farmaceutski prihvatljiv nosači za peptide opisani su u U.S. Patentu Br.5,211,657 Yamada. MASP antitela korisna u ovom pronalasku, kako je ovde opisano, mogu biti formulisana u preparatima u čvrstim, polu-čvrstim, gel, tečnim ili gasovitim oblicima kao što su tablete, kapsule, praškovi, granule, masti, rastvori, depozitorije, inhalanti i injekcije za oralnu, parenteralnu ili hiruršku primenu. Ovaj opis takođe razmatra lokalno davanje mešavine oblagajućim medicinskim uređajima i slično.

[0234] Pogodni nosači za parenteralnu dostavu putem injektabilne, infuzione ili irigacione i tipokalne dostave uključuju destilovanu vodu, fiziološki fosfat-puferovan slani rastvor, normalan ili laktiran Ringerov rastvor, rastvor dekstroze, Hankov rastvor, ili propanediol. Pored toga, sterilna, fixirana ulja mogu se uposliti kao rastvarač ili podloga za suspendovanje. Iz ovog razloga bilo koje biokompatibilno ulje može biti uključeno a koje uključuje sintetičke mono- ili digliceride. Pored toga, masne kiseline kao što je oleinska kiselina nalaze upotrebu u pripremanju injekcija. Nosač i agens mogu biti kompozirani kao tečnost, suspenzija, polimerizabilan ili ne- polimerizabilan gel, pasta ili melem.

[0235] Nosač takođe može da obuhvata nosač dostave radi održavanja (tj., produžetka, odlaganja ili regulisanja) dostave agensa(asa) ili kako bi ojačala dostavu, preuzimanje, stabilnost ili farmakokinetike terapeutskog agensa(asa). Takvo vozilo dostave može da uključuje, kao neograničavajući primer, mikročestice, mikrosfere, nanosfere ili nanočestice sačinjene od proteina, lipozoma, ugljenih hidrata, sintetičkih organskih jedinjenja, neorganskih jedinjenja, polimernih ili kopolimernih hidrogelova i polimernih micela. Pogodan hidrogel i micelarni sistemi dostave uključuju PEO:PHB:PEO kopolimere i kopolimer/ciklodekstrin komplekse opisane u WO 2004/009664 A2 i PEO i PEO/ciklodekstrin kompleks opisan u U.S. Publikaciji patentne prijave Br.2002/0019369 A1. Takvi hidrogelovi mogu biti injektovani na mesto namenjene akcije, ili subkutano ili intramuskularno kako bi se obrazovo depo za održivu dostavu.

[0236] Mešavine ovog pronalaska mogu biti formulisane za dostavu subkutano, intramuskularno, intravenozno, intraarterijalno ili u obliku inhalanta.

[0237] Za intra-artikularnu dostavu, MASP-3 inhibitorni agens ili MASP-2 inhibitorni agens mogu biti izvedeni u gore opisanim tečnim ili gel nosačima koji su injektabilni, gore opisanim nosačima za dostavu sa održivim oslobađanjem koji su injektabilni, ili hijaluronskoj kiselini ili derivatu hijalurosnke kiseline.

[0238] Za oralno davanje ne-peptidergičnih agenasa, MASP-3 inhibitorni agens ili MASP-2 inhibitorni agens mogu se izvesti kao inertni punilac ili razblaživač kao što je saharoza, kukuruzni skrob, ili celuloza.

[0239] Za topikalno davanje, MASP-3 inhibitorni agens ili MASP-2 inhibitorni agens mogu se izvesti kao mast, losion, krema, gel, kapi, supozitorije, sprej, tečnost ili prah, ili u gel ili mikrokapsularnim sistemima dostave transdermalnim flasterima.

[0240] Razni nazalni i pulmonarni sistemi za dostavu, koji uključuju aerosole, inhalatore za prethodno odmerenim dozama, inhalatore sa suvim prahom, i nebulizatore, razvijeni su i mogu se pogodno adaptirati za dostavu ovog pronalaska kao aerosol, inhalant, ili nosač za dostavu preko nebulizatora, respektivno.

[0241] Za intratekalnu (IT) ili intracerebroventrikularnu (ICV) dostavu, pogodni sterilni sistemi za dostavu (npr., tečnosti; gelovi, suspenzije, itd.) mogu se koristiti za davanje prema ovom opisu.

[0242] Mešavine ovog opisa takođe mogu da uključuju biokompatibilne ekscipijense, kao što su agensi za dispergovanje ili vlaženje, agense za suspendovanje, razblaživače, pufere, pojačivače prodiranja, emulzifikatori, veziva, zgušnjivače, agense da davanje arome (za oralno davanje).

ii. Farmaceutsku nosači za antitela i peptide

[0243] Određenije u odnosu na MASP antitela, kako je ovde opisano, primerne formulacije mogu se parenteralno davati kao injektabilna doziranja rastvora ili suspenzije jedinjenja u fiziološki prihvatljivom razblaživaču sa farmaceutskim nosačem koji može biti sterilna tečnost kao što je voda, ulja, slani rastvor, glicerol ili etanol. Dodatno, pomoćne supstance kao što su agensi za vlaženje i emulzifikovanje,

4

surfaktanti, pH puferujuće supstance i slično mogu biti prisutne u mešavinama koje obuhvatju MASP antitela. Dodatne komponente farmaceutske mešavine uključuju petroleum (kao što je životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla), na primer, sojino ulje i mineralno ulje. Generalno, glikoli kao što je propilen glikol ili polietilen glikol poželjni su tečni nosači za injektabilne rastvore.

[0244] MASP antitela takođe se mogu davati u obliku depo injekcija ili implantantnih preparata koji mogu bto formulisani na takav način da se omogući održivo ili pulsno oslobađanje aktivnih agenasa.

VIII. NAČINI DAVANJA

[0245] Farmaceutske mešavine koje obuhvataju MASP-3 inhibitorne agense ili MASP-2 inhibitorne agense mogu se davati na brojne načine u zavisnosti od toga da li je lokalni ili sistemski način davanja najpoželjniji za stanje koje se tretira. Dalje, mešavine ovog opisa mogu se dostaviti oblaganjem ili inkorporiranjem mešavine na ili u implantabilni medicinski uređaj.

i. Sistemska dostava

[0246] Kako se ovde koristi, izrazi "sistemski dostava" i "sistemsko davanje" namenjeni su da uključe, ali nisu ograničeni na oralni i parenteraln put koji uključuje intramuskularni (IM), subkutani, intravenozni (IV), intraarterijalni, inhalacioni, podjezični, bukalni, topikalni, transdermalni, nazalni, rektalni, vaginalni i druge puteve davanja koji efektivno rezultuju u dispergovanju dostavljenog agensa na jedno ili više mesta namenjene terapeutske aktivnosti. Poželjni putevi sistemske dostave za ove mešavine uključuju intravenozni, intramuskularni, subkutani, intraarterijalni i inhalacioni. Treba imati na umu da se precizan put za sistemsko davanje za odabrane upotrebljene agense određuje delimično u odnosu na podložnost agensa na metaboličke transformacione puteve povezane datim putem davanja. Na primer, peptidergični agensi mogu se najpoželjnije davati putevima koji nisu oralni.

[0247] MASP inhibitorna antitela, kako je ovde opisano, mogu se dostaviti subjektu kome je to potrebno bilo kojim pogodnim načinom. Postupci dostave MASP antitela i polipeptida uključuju davanje oralnim, pulmonarnim, parenteralnim (npr., intramuskularnim, intraperitonealnim, intravenoznim (IV) ili subkutanim injekcijama), inhalacionim (kao što je putem formulacije finog praha), transdermalnim, nazalnim, vaginalim, rektalnim, ili podjezičnim putevima davanja, i mogu biti formulisani u dozne oblike koji su pogodni za svaki put davanja.

[0248] Purem reprezentativnog primera, MASP inhibitorna antitela i peptidi mogu se uvesti u živo telo nanošenjem na telesnu membranu sposobnu da apsorbuje polipeptide, na primer nazalnu, gastrointestinalnu i rektalnu membranu. Polipeptidi se uobičajeno nanose na apsorptivne membrane u konjukciji sa pojačivačima prodiranja. (Videti, npr., Lee, V.H.L., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Sys.5:69, (1988); Lee, V.H.L., J. Controlled Release 13:213, (1990); Lee, V.H.L., Ed., Peptide and Protein Drug Delivers, Marcel Dekker, New York (1991); DeBoer, A.G., et al., J. Controller Release 13:241, (1990). Na primer, STDHF je sintetički derivativ fuzidinske kiseline, steroidni surfaktant koji je sličan po strukturi sa žučnim solima, i koji se koristi kao pojačivač prodiranja za nazalnu dostavu. (Lee, W.A., Biopharm.22, Nov./Dec.1990.)

[0249] MASP inhibitorna antitela kakva su ovde opisana mogu se uvsti zajedno sa još jednim molekulom, kao što je lipid, kako bi se zaštitili polipeptidi od enzimske degradacije. Na primer, kovalentno pričvršćivanje polimera, naročito polietilen glikola (PEG), korišćeno je da zaštiti određene proteini od enzimskog hidroliziranja u telu i tako produži polu-život (Fuertges, F., et al., J. Controller Release 11:139, (1990)). Mnogi polimerni sistemi prijavljeni su za proteinsku dostavu (Bae, Y.H., et al., J. Controlled Release 9:271, (1989); Hori, R., et al., Pharm. Res.6:813, (1989); Yamakawa, I., et al., J.

Pharm. Sci.79:505, (1990); Yoshihiro, I., et al., J. Controlled Release 10:195, (1989); Asano, M., et al., J. Controlled Release 9:111, (1989); Rosenblatt, J., et al., J. Controlled Release 9:195, (1989); Makino, K., J. Controlled Release 12:235, (1990); Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci.78:117, (1989); Takakura, Y., et al., J. Pharm. Sci.78:219, (1989)).

[0250] Nedavno, lipozomi su razvijeni sa poboljšanom stabilnošću u serumu i cirkulacionim poluvremenima (videti, npr., U.S. Patent Br.5,741,516, Webb). Pored toga, razmatrani su razni postupci pripremanja lipozoma i preparata nalik lipozomima kao potencijalnih nosača leka (videti, npr., U.S. Patent Br.5,567,434, Szoka; U.S. Patent Br.5,552,157, Yagi; U.S. Patent Br.5,565,213, Nakamori; U.S. Patent Br.5,738,868, Shinkarenko; i U.S. Patent Br.5,795,587, Gao).

[0251] Za transdermalne primene, MASP inhibitorna antitela, kakva su ovde opisana, mogu biti kombinovana sa drugim pogodnim sastojcima, kao što su nosači i/ili adjuvansi. Ne postoje ograničenja u prirodi takvih drugih sastojaka, osim što moraju biti farmaceutski prihvatljivi za njihovo namenjeno davanje, i ne smeju degradirati aktivnost aktivnih sastojaka mešavine. Primeri pogodnih nosila uključuju masti, kreme, gelove, ili suspenzije, sa ili bez prečišćenog kolagena. MASP inhibitorna antitela takođe se mogu impregnirati u transdermalne zakrpe, plastere, i bandažere, poželjno u tečnom ili polu-tečnom obliku.

[0252] Mešavine ovog pronalaska mogu se sistemski davati na periodičnoj bazi u intervalima određenim da održe željeni nivo terapeutskog efekta. Na primer, mešavine se mogu davati, kao što je subkutanom ijnekcijom, svake dve do četiri nedelje ili u manje čestim intervalima. Dozni režimi biće određeni od strane lekara koji uzima u obzir razne faktore koji mogu da utiču na aktivnost kombinovanih agenasa. Ovi faktori uključuju stepen progresa stanja koje se tretira, godine, pol i težinu subjekta, i druge kliničke faktore. Doziranje za svaki pojedinačni agens variraće kao funkcija MASP-3 inhibitornog agensa ili MASP-2 inhibitornog agensa koji je uključen u mešavinu, kao i prisustvo i priroda bilo kog nosača za dostavu leka (npr., nosač za održivu dostavu). Pored toga, količina doziranja može se podesiti u odnosu na varijaciju u frekvenciji davanja i farmakokinetičko ponašanje dostavljenog agensa(asa).

ii. Lokalna dostava

[0253] Kako se ovde koristi, izraz "lokalni" obuhvata primenu leka na ili oko mesta namenjene lokalizovane aktivnosti, i mogu na primer da uključuju topikalnu dostavu na kožu ili druga pogođena tkiva, oftalmološku dostavu, intratekalno (IT), intracerebroventrikularno (ICV), intra-artikularno, intrakavitarno, intrakranijalno ili intravezikularno davanje, smeštanje ili irigaciju. Lokalno davanje može biti poželjno kako bi se omogućilo davanje nižih doza, radi zaobilaženja sistemskih sporednih efekata, i za precizniju kontrolu tajminga dostave i koncentracije aktivnih agenasa na mestu lokalne dostave. Lokalno davanje obezbeđuje poznatu koncentraciju na ciljanom mestu, bez obzira na različitost u metabolizmu između pacijenata, krvnog toka, itd. Poboljšana kontrola doziranja takođe je obezbeđena direktnim načinom dostave.

[0254] Lokalna dostava MASP-3 inhibitornog agensa ili MASP-2 inhibitornog agensa može se postići u kontekstu hirurških postupak za lečenje bolesti ili stanja, kao što je na primer tokom procedura kao što su hirurška ugradnja arterijalnog bajpasa, aterektomija, laserske procedure, ultrazvučne procedure, balon angioplastika i ugradnja stenta. Na primer, MASP-3 inhibitorni agens ili MASP-2 inhibitorni agens mogu se davati subjektu u konjukciji sa postupkom balon angioplastike. Postupak balon angioplastike uključuje umetanje katetera sa ispumpanim balonom u arteriju. Ispumpani balon se smešta u blizini aterosklerotičnog plaka i naduvava tako da se plak pritiska ka vaskularnom zidu. Kao rezultat, površina balona je u kontaktu sa slojem vaskularnih endotelijalnih ćelija na površini krvnog suda. MASP-3 inhibitorni agens ili MASP-2 inhibitorni agens mogu biti prikačeni za kateter balon angioplastike na način koji omogućava oslobađanje agensa na mesto aterosklerotičnog plaka. Taj agens može biti prikačen za balonski kateter u skladu sa standardnim procedurama poznatim u ovoj oblasti. Na primer, agens može biti smešten u odeljak balonskog katetera dok se balon ne naduva, u kom trenutku se oslobađa u lokalno okruženje. Alternativno, taj agens može biti impregniran na površinu balona, tako da dolazi u kontakt sa ćelijama arterijalnog zida kako se balon naduvava. Taj agens takođe može biti dostavljen u perforiranom balonskom kateteru kao što su oni opisani u Flugelman, M.Y., et al., Circulation 85:1110-1117, (1992). Takođe videti objavljenu PCT Prijavu WO 95/23161 za primernu proceduru pričvršćivanja terapeutskog proteina za kateter balon angioplastike. Isto tako, MASP-3 inhibitorni agens ili MASP-2 inhibitorni agens mogu biti uključeni gel ili polimernu oblogu nanesenu na stent, ili mogu biti inkorporirani u materijal stenta, tako da eluira MASP-3 inhibitorni agens ili MASP-2 inhibitorni agens nakon vaskularnog smeštanja.

[0255] MASP-3 inhibitorni agensi ili MASP-2 inhibitorni agensi koji se koriste u lečenju artritisa i muskuloskeletnih poremećaja mogu biti lokalno dostavljeni intra-artikularnom injekcijom. Takve mešavine poželjno mogu da uključuju nosač za dostavu za održivo oslobađanje. Kao dodatni primer slučajeva u kojima može biti poželjna lokalna isporuka, MASP-2 inhibitorni mešavine ukoje se koriste u lečenju urogenitalnih stanja mogu se poželjno instalirati intravezikularno ili unutar još jedne urogenitalne strukture.

IX. REŽIMI LEČENJA

[0256] U profilaktičkim primenama, farmaceutske mešavine daju se subjektu koji je podložan, ili na drugačiji način u riziku od, PNH u količini dovoljnoj da eliminišu ili redukuju rizik od razvoja simptoma tog stanja. U terapeutskim primenama, farmaceutske mešavine daju se subjektu za kojeg se sumnja da, ili koji je već oboleo od, PNH u terapeutski efektivnoj količini dovoljno da ublaže, ili najmanje delimično redukuju, simptome tog stanja.

[0257] U jednom slučaju, crvena krvna zrnca subjekta su opsonizovana fragmentima C3 u odsustvu mešavine, a davanje mešavine subjektu povećava preživljavanje crvenih krvnih zrnaca kod tog subjektat. U jednom slučaju, subjekat pokazuje jedan ili više simptoma u odsustvu mešavine odabranih iz grupe koju čine (i) nivoi hemoglobina ispod normale, (ii) nivoi trombocita ispod normale; (iii) nivoi retikulocita iznad normale, i (iv) nivoi bilirubina iznad normale, a davanje mešavine subjektu poboljšava najmanje jedan ili više simptoma, što rezultuje kao (i) povećani, normalni ili približno normalni nivoi hemoglobina (ii) povećani, normalni ili približno normalni nivoi trombocita, (iii) sniženi, normalni ili približno normalni nivoi of retikulocita, i/ili (iv) sniženi, normalni ili približno normalni nivoi bilirubina.

[0258] I u profilaktičkim i u terapeutskim režimima, mešavine koje obuhvataju MASP-3 inhibitorne agense i opciono MASP-2 inhibitorni agensi mogu se davati u nekoliko doziranja sv dok se ne postigne dovoljan terapeutski ishod kod subjekta. MASP-3 i/ili MASP-2 inhibitorni agens obuhvata MASP-1 antitelo, MASP-2 antitelo ili MASP-3 antitelo, koja se pogodno mogu davati odraslom pacijentu (npr., prosečna težina odrasle osobe od 70 kg) u dozi od 0.1 mg do 10,000 mg, poželjnije od 1.0 mg do 5,000 mg, poželjnije 10.0 mg do 2,000 mg, poželjnije 10.0 mg do 1,000 mg i još poželjnije od 50.0 mg do 500 mg, ili 10 do 200 mg. Za pedijatrijske pacijente, doziranje može biti podešen u odnosu na težinu pacijenta.

[0259] Primena MASP-3 inhibitornih mešavina i opciono MASP-2 inhibitornih mešavina ovog opisa mogu biti izvedene jednim davanjem mešavine (npr., jedna mešavina koja obuhvata MASP-2 i MASP-3 inhibitorne agense, ili bispecifične ili dvostruke inhibitorne agense, ili zajedničko davanje odvojenih mešavina), ili ograničene sekvence davanja, za lečenje PNH. Alternativno, mešavina se može davati u periodičnim intervalima kao što je dnevno, dvonedeljno, nedeljno, dvake druge nedelje, mesečno ili dvomesečno tokom produženog perioda za lečenje PNH.

[0260] U nekim slučajevima, prva mešavina koja obuhvata najmanje jedan MASP-3 inhibitorni agens i druga mešavina koja obuhvata najmanje jedan MASP-2 inhibitorni agens daju se subjektu koji boluje od PNH. U jednom slučaju, prva mešavina koja obuhvata najmanje jedan MASP-3 inhibitorni agens i druga mešavina koja obuhvata najmanje jedan MASP-2 inhibitorni agens daju se jdnovremeno (tj., unutar vremenskog razmaka od ne više od oko 15 minuta ili manje, kao što je ne više od 10, 5 ili 1 minuta). U jednom slučaju, prva mešavina koja obuhvata najmanje jedan MASP-3 inhibitorni agens i druga mešavina koja obuhvata najmanje jedan MASP-2 inhibitorni agens daju se uzastopno (tj., prva mešavina daje se ili pre ili nakon davanja druge mešavine, pri čemu je vremenski razmak davanja veći od 15 minuta). U nekim slučajevima, prva mešavina koja obuhvata najmanje jedan MASP-3 inhibitorni agens i druga mešavina koja obuhvata najmanje jedan MASP-2 inhibitorni agens daju se konkurentno (tj., period davanja prve mešavine preklapa se sa davanjem druge mešavine). Na primer, u nekim slučajevima, prva mešavina i/ili druga mešavina daju se tokom perioda od najmanje jedne, dve, tri ili četiri nedelje ili duže. U jednom slučaju, najmanje jedan MASP-3 inhibitorni agens i najmanje jedan MASP-2 inhibitorni agens kombinovani su u jediničnom doznom obliku. U jednom slučaju, prva mešavina koja obuhvata najmanje jedan MASP-3 inhibitorni agens i druga mešavina koja obuhvata najmanje jedan MASP-2 inhibitorni agens spakovane su zajedno u kompletu za upotrebu u lečenju PNH.

[0261] U nekim slučajevima, subjekat koji boluje od PNH je prethodno lečen, ili se trenutno leči terminalnim inhibitorom komplemenata koji inhibira cepanje proteina C5 komplementa. U nekim slučajevima, postupak obuhvata davanje subjektu mešavine ovog pronalaska koja obuhvata MASP-3 i opciono MASP-2 inhibitor i dalje davanje subjektu terminalnog inhibitora komplemenata koji inhibira cepanje proteina C5 komplementa. U nekim slučajevima, terminalni inhibitor komplemenata je humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim slučajevima, terminalni inhibitor komplemenata je ekulizumab.

X. PRIMERI

[0262] Primeri koji slede samo ilustruju najbolji način trenutno razmatran za izvođenje ovog opisa.

PRIMER 1

[0263] Ovaj Primer pokazuje da su MASP-2 deficijentni miševi zaštićeni od Neisseria meningitidis indukovane smrti nakon infekcije sa N. meningitidis serogrupom A ili N. meningitidis serogrupom B.

Postupci:

[0264] MASP-2 nokaut miševi (MASP-2 KO miševi) generisani su kako je opisano u Primeru 1 iz US 7,919,094.10-nedelja-stari MASP-2 KO miševi (n=10) i divlji-tip (WT) C57/BL6 miševi (n=10) inokulisani su intraperitonealnom (i.p.) injekcijom sa dozom od 2.6 x 10<7>CFU N. meningitidis serogrupe A Z2491 u zapremini od 100 µl. Infektivna doza data je miševima u konjukciji sa gvožđe dekstranom pri konačnoj koncentraciji od 400 mg/kg. Preživljavanje miševa nakon infekcije praćeno je tokom 72-časovnog vremenskog perioda.

[0265] U odvojenom eksperimentu, 10-nedelja-stari MASP-2 KO miševi (n=10) i WT C57/BL6 miševi (n=10) inokulisani su i.p. injekcijom sa dozom od 6 x 10<6>CFU N. meningitidis serogrupe B soja MC58 u zapremini od 100 µl. Infektivna doza data je miševima u konjukciji sa gvožđe dekstranom pri konačnoj dozi od 400 mg/kg. Preživljavanje miševa nakon infekcije praćeno je tokom 72-časovnog vremenskog perioda. Rezultat bolesti takođe je određen za WT i MASP-2 KO miševe tokom the 72-časovnog vremenskog perioda nakon infekcije, bazirano na parametrima ocenjivanja bolesti opisanih u TABELI 4, koje je bazirano na šemi po Fransen et al. (2010) uz manje modifikacije.

TABELA 4: Ocenjivanje bolesti povezano sa kliničkim znacima kod incifiranih miševa

[0266] Krvni uzorci sakupljeni su od miševa u satnim intervalima nakon infekcije i analizirani za određivanje serumskog nivoa (log cfu/mL) N. meningitidis-a kako bi se verifikovala infekcija i odredila brzina klirensa bakterije iz seruma.

Rezultati:

[0267] FIG.8 grafički prikazuje Kaplan-Majerov grafikon koji prikazuje procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon davanja infektivne doze od 2.6 x 10<7>cfu N. meningitidis serogrupe A Z2491. Kako je prikazano na FIG.8, 100% MASP-2 KO miševa preživelo je tokom 72-časovnog perioda nakon infekcije. Nasuprot tome, samo 80% WT miševa (p=0.012) bilo je i dalje živo 24 sata nakon infekcije, a samo 50% WT miševa bilo je i dalje živo 72 sata nakon infekcije. Ovi rezultati pokazuju da su MASP-2-deficijentni miševi zaštićeni od N. meningitidis serogrupom A Z2491-indukovane smrti.

[0268] FIG.9 grafički prikazuje Kaplan-Majerov grafikon koji prikazuje procenat preživljavanja MASP-2 KO i WT miševa nakon davanja infektivne doze od 6 x 10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soja MC58. Kako je prikazano na FIG.9, 90% MASP-2 KO miševa preživelo je tokom 72-časovnog perioda nakon infekcije. Nasuprot tome, samo 20% WT miševa (p=0.0022) bilo je i dalje živo 24 sata nakon infekcije. Ovi rezultati pokazuju da su MASP-2-deficijentni miševi zaštićeni od N. meningitidis serogrupa B soj MC58-indukovane smrti.

[0269] FIG.10 grafički prikazuje log cfu/mL N. meningitidis serogrupe B soja MC58 izolovan u različitim vremenskim tačkama u krvnim uzorcima uzetim od MASP-2 KO i WT miševa nakon i.p. infekcije sa 6x10<6>cfu N. meningitidis serogrupom B soja MC58 (n=3 u različitim vremenskim tačkama za obe grupe miševa). Rezultati su izraženi kao Srednja vrednost±SEM. Kako je prikazano na FIG.10, kod WT miševa nivo N. meningitidisa u krvi dostiže pik od oko 6.0 log cfu/mL at 24 sata nakon infekcije i opada do oko 4.0 log cfu/mL by 36 sati nakon infekcije. Nasuprot tome, kod MASP-2 KO miševa, nivo N. meningitidis dostiže pik od oko 4.0 log cfu/mL 12 sati nakon infekcije i opada do oko 1.0 log cfu/mL 36 sati nakon infekcije (simbol "*" ukazuje na p<0.05; simbol "**" ukazuje na p=0.0043). Ovi rezultati pokazuju da iako su MASP-2 KO miševi inficirani istom dozom N. meningitidis serogrupe B soja MC58 kao i WT miševi, MASP-2 KO miševi su imalu pojačan klirens bakteriemije u poređenju sa WT.

[0270] FIG.11 grafički prikazuje srednju ocenu bolesti MASP-2 KO i WT miševa 3, 6, 12 i 24 sata nakon infekcije sa 6x10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soja MC58. Kako je prikazano na FIG.11, MASP-2-deficijentni miševi pokazuju veliku otpornost na infekciju, sa znatni nižim rezultatima bolesti 6 sati (simbol "*" ukazuje na p=0.0411), 12 sati (simbol "**" ukazuje na p=0.0049) i 24 sata (simbol "***" ukazuje na p=0.0049) nakon infekcije, u poređenju sa WT miševima. Rezultati sa FIG.11 izraženi su kao Srednja vrednost±SEM.

[0271] Ukratko, rezultati u ovom Primeru pokazuju da su MASP-2-deficijentni miševi zaštićeni od N.

1

meningitides-indukovane smrti nakon infekcije sa N. meningitidis serogrupom A ili N. meningitidis serogrupom B.

PRIMER 2

[0272] Ovaj Primer pokazuje that davanje MASP-2 antitela nakon infekcije sa N. meningitidis povećava preživljavanje miševa inficiranih sa N. meningitidis.

Pozadina/Obrazloženje:

[0273] Kako je opisano u Primeru 24 iz US patenta 7,919,094, pacovski MASP-2 protein korišćen je za sušenje Fab biblioteke prikaza faga, iz koje Fab2 #11 je identifikovan kao funkcionalno aktivno antitelo. Antitela pune dužine pacovskih IgG2c i mišjih IgG2a izotipova generisani su iz Fab2 #11. MASP-2 antitelo pune dužine mišjeg IgG2a izotipa okarakterisano je za farmakodinamičke parametre (kako je opisano u Primeru 38 iz US patenta 7,919,094).

[0274] U ovom Primeru, mišje MASP-2 antitelo pune dužine izvedeno iz Fab2 #11 analizirano je u mišjem modelu N. meningitidis infekcije.

Postupci:

[0275] Mišji IgG2a izotip MASP-2 antitela pune dužine izveden iz Fab2 #11, generisan kako je prethodno opisano, ispitano je u mišjem modelu N. meningitidis infekcije kako sledi.

1. Davanje mišjih-MASP-2 monoklonalnih antitela (MoAb) nakon infekcije

[0276] 9-nedelja-stari C57/BL6 Charles River miševi tretirani su inhibitornim mišjem MASP-2 antitelom (1.0 mg/kg) (n=12) ili kontrolnim izotipnim antitelom (n=10) 3 sata nakon i.p. injekcije velike doze (4x10<6>cfu) N. meningitidisa serogrupe B soja MC58.

Rezultati:

[0277] FIG.12 grafički prikazuje Kaplan-Majerov grafikon koji prikazuje procenat preživljavanja miševa nakon davanja infektivne doze od 4x10<6>cfu N. meningitidis serogrupe B soja MC58, praćeno davanjem 3 sata nakon infekcije ili inhibitornog MASP-2 antitela (1.0 mg/kg) ili kontrolnog izotipnog antitela. Kako je prikazano na FIG.12, 90% miševa tretiranih sa MASP-2 antitelo preživelo je tokom 72-časovnog perioda nakon infekcije. Nasuprot tome, samo 50% miševa tretiranih sa izotipnim kontrolnim antitelom preživelo je tokom 72-časovnog perioda nakon infekcije. Simbol "*" ukazuje na p=0.0301, kako je određeno poređenjem dve krive preživljavanja.

2

[0278] Ovi rezultati pokazuju da je davanje MASP-2 antitela efektivno za lečenje i da poboljšava preživljavanje kod subjekata inficiranih sa N. meningitidis.

[0279] Kako je ovde pokazano, upotreba MASP-2 antitela u lečenju subjekata inficiranih sa N. meningitidis je efektivno kada se daje unutar 3 sata nakon infekcije, i očekuje se da bude efektivno unutar 24 sata do 48 sati nakon infekcije. Meningokokni bolest (ili meningokokemija ili meningitis) je medicinska nužnost, i terapija se obično odmah pokreće ukoliko se sumnja na Meningokokni bolest (tj., pre nego što je N. meningitidis pozitivno indetifikovan kao etiološki agens).

[0280] U pogledu rezultata kod MASP-2 KO miševa prikazanih u Primeru 1, smatra se da bi davanje MASP-2 antitela pre infekcije sa N. meningitidis takođe moglo da bude efektivno da spreči ili ublaži težinu infekcije.

PRIMER 3

[0281] Ovaj Primer pokazuje da je komplementom-zavisno ubijanje N. meningitidisa u humanim serumima MASP-3-zavisan.

Obrazloženje:

[0282] Pacijenti sa sniženim nivoima u serumu funkcionalnog MBL display increased podložnost na retrenutno bakterijal i fungal infekcije (Kilpatrick et al., Biochim Biophys Acta 1572:401-413 (2002)). Poznato je da se N. meningitidis prepoznaje od strane MBL, a pokazano je da MBL-deficijentni serumi ne liziraju N. meningitidis.

[0283] U pogledu rezultata opisanih u Primerima 1 i 2, izvedene su serije eksperimenata za određivanje efikasnosti davanja MASP-2 antitela u lečenju N. meningitidis infekcije u komplement-deficijentnim i kontrolnim humanim serumima. Eksperimenti su izvedeni pri visokoj koncentrciji seruma (20%) kako bi se očuvao komplement put.

Postupci:

1. Serum baktericidna aktivnost u raznim komplement-deficijentnim humanim serumima i u humanim serumima tretiranim sa humanim MASP-2 antitelo

[0284] Sledeći komplement-deficijentni humani serumi i kontrolni humani serumi korišćeni su u ovom eksperimentu:

TABELA 5: Uzorci testiranog humanog seruma (kako je prikazano na FIG.13)

[0285] Rekombinantno antitelo protiv humanog MASP-2 izolovano je iz kombinatorne Biblioteke Antitela (Knappik, A., et al., J. Mol. Biol.296:57-86 (2000)), upotrebom rekombinantnog humanog MASP-2A kao antigen (Chen, C.B. i Wallis, J. Biol. Chem.276:25894-25902 (2001)). Anti-humani scFv fragment koji potentno inhibira lektinski put-posredovanu aktivaciju C4 i C3 u humanoj plazmi (IC50∼20 nM) identifikovan je i konvertovan u humano IgG4 antitelo pune dužine.

[0286] N. meningitidis serogrupa B-MC58 inkubisana je različitim serumima prikazanim u TABELI 5, svaki pri serumskim koncentracijama od 20%, sa ili bez dodavanja inhibitornog humanog MASP-2 antitela (3 µg u 100 µl ukupne zapremine) na 37°C uz protresanje. Uzorci su sakupljani u sledećim vremenskim tačkama: 0-, 30-, 60- i 90-minutni intervali, postavljeni na ploču i zatim su određena vijabilna brojanja. Toplotom-inaktivirani humani serum korišćen je kao negativna kontrola.

Rezultati:

[0287] FIG.13 grafički prikazuje log cfu/mL vijabilnih brojanja N. meningitidisa serogrupe B-MC58 izolovana u različitim vremenskim tačkama u uzorcima ljudskog seruma prikazanim u TABELI 5. TABELA 6 obezbeđuje rezultate Studentovog testa za FIG.13.

TABELA 6: Rezultati Studentovog testa za FIG.13 (vremenska tačka 60 minuta)

4

[0288] Kako je prikazano na FIG.13 i TABELI 6, komplementom-zavisno ubijanje N. meningitidisa u humanom 20% serumu značajno je pojačano dodavanjem humanog MASP-2 inhibitornog antitela.

2. Serum baktericidna aktivnost u raznim komplement deficijentnim humanim serumima

[0289] Sledeći komplement-deficijentni humani serumi i kontrolni humani serumi korišćeni su u ovom eksperimentu:

TABELA 7: Uzorci testiranog humanog seruma (kako je prikazano na FIG.14)

[0290] N. meningitidis serogrupa B-MC58 inkubisana je sa različitim komplement-deficijentnim humanim serumima, svaki pri serumskoj koncentraciji od20%, na 37°C uz protresanje. Uzorci su sakupljani u sledećim vremenskim tačkama: 0-, 15-, 30-, 45-, 60-, 90- i 120-minutnim intervalima, postavljeni na ploču i zatim su određena vijabilna brojanja. Toplotom-inaktiviran humani serum korišćen je kao negativna kontrola.

Rezultati:

[0291] FIG.14 grafički prikazuje log cfu/mL vijabilnih brojanja N. meningitidisa serogrupe B-MC58 izolovana u različitim vremenskim tačkama u uzorcima ljudskog seruma prikazanim u TABELI 7. Kako je prikazano na FIG.14, WT (NHS) serum ima najviši nivo baktericidne aktivnosti ka N. meningitidisu. Nasuprot tome, MBL -/- i MASP-3 -/- (koji je MASP-1-dovoljan) humani serumi nemaju bilo kakvu baktericidnu aktivnost. Ovi rezultati ukazuju da komplementom-zavisno ubijanje N. meningitidisa u humanom 20vol.% serumu je MASP-3- i MBL-zavisno. TABELA 8 obezbeđuje Rezultate Studentovog testa za FIG.14.

TABELA 8: Rezultati Studentovog testa za FIG.14

[0292] Ukratko, rezultati prikazani na FIG.14 i TABELI 8 pokazuju da je komplementom-zavisno ubijanje N. meningitidisu u 20% humanom serumu MASP-3- i MBL-zavisno.

3. Komplementom-zavisno ubijanje N. meningitidisa u 20vol.% mišjem serumu deficijentno od MASP-2, MASP-1/3 ili MBL A/C.

[0293] Sledeći komplement-deficijentni mišji serum i kontrola mišjeg seruma korišćeni su u ovom eksperimentu:

TABELA 9: Mišji uzorci testiranog seruma (kako je prikazano na FIG.15)

[0294] N. meningitidis serogrupa B-MC58 inkubisana je različitim komplement-deficijentnim mišjim serumom, svaki pri serumskoj koncentraciji od20%, na 37°C uz protresanje. Uzorci su sakupljeni su na sledećim vremenskim tačkama: 0-, 15-, 30-, 60-, 90- i 120-minutni intervali, postavljeni na ploču i zatim su određena vijabilna brojanja. Toplotom-inaktiviran humani serum korišćen je kao negativna kontrola.

Rezultati:

[0295] FIG.15 grafički prikazuje log cfu/mL vijabilnih brojanja N. meningitidis serogrupe B-MC58 izolovane u različitim vremenskim tačkama u mišjim uzorcima seruma prikazanim u TABELI 9. Kako je prikazano na FIG.15, MASP-2 -/- mišji serum ima viši nivo baktericidne aktivnosti ka N. meningitidis od WT mišjeg seruma. Nasuprot tome, MASP-1/3 -/- mišji serum nije imao bilo kakvu baktericidnu aktivnost. Simbol "**" ukazuje na p=0.0058, simbol "***" ukazuje na p=0.001. TABELA 10 obezbeđuje Rezultate Studentovog testa za FIG.15.

TABELA 10: Rezultati Studentovog testa za FIG.15

[0296] Ukratko, rezultati u ovom Primeru pokazuju da MASP-2 -/- serum ima više nivoe baktericidne aktivnosti ka N. meningitidis u odnosu na WT serum i da je komplementom-zavisno ubijanje N. meningitidisa u 20% serumu MASP-3- i MBL-zavisno.

PRIMER 4

[0297] Ovaj Primer opisuje serije eksperimenata koji su izvedeni za određivanje mehanizma MASP-3-zavisne otpornosti na N. meningitidis infekciju primećenu kod MASP-2 KO miševa, kako je opisano u Primerima 1-3.

Obrazloženje:

[0298] Kako bi se odredio mehanizam MASP-3-zavisne rezstencije na N. meningitidis infekciju primećenu kod MASP-2 KO miševa (opisano u Primerima 1-3 gore), izvedene su serije eksperimenata kako sledi.

1. MASP-1/3-deficijentnim miševima ne nedostaje funkcionalna aktivnost lektinskog puta (koja se takođe naziva "LEA-2")

Postupci:

[0299] Kako bi se odredilo da li MASP-1/3-deficijentnim miševima nedostaje funkcionalna aktivnost lektinskog puta (koji se takođe naziva LEA-2), izvedeno je ispitivanje kako bi se izmerile kinetike C3 konvertaza aktivnosti u plazmi iz razni komplement-deficijentnih mišjih sojeva testiranih pod ispitnim uslovima specifičnim za lektinsku aktivaciju puta (1% plazma), kako je opisano u Schwaeble W. et al., PNAS vol 108(18):7523-7528 (2011).

[0300] Plazma je ispitana iz WT, C4-/-, MASP-1/3-/-; Faktor B-/-, i MASP-2-/- miševa kako sledi.

[0301] Kako bi se izmerila C3 aktivacija, mikrotitarske ploče obložene su mananom (1 µg/bazenčić), zimosanom (1 µg/bazenčić) u puferu za oblaganje (15 mM Na2Co3, 35 mM NaHCO3), ili imunom kompleksu, generisan in situ oblaganjem sa 1% humanim serumskim albuminom (HSA) u puferu za oblaganje zatim dodavanjem ovčijeg anti-HAS seruma (2 µg/mL) u TBS (10mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7.4) sa 0.05% Tween 20 i 5 mM Ca<++>. Ploče su blokirane sa 0.1% HSA u TBS i oprane tri puta sa TBS/Tween20/ Ca<++>. Plazma uzorci razblaženi su u 4 mM barbitalu, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4, dodati u ploče i inkubisani tokom 1.5 h na 37°C. Nakon pranja, povezan C3b detektovan je upotrebom zečijeg anti-humanog C3c (Dako), praćeno alkalna fosfataza-konjugovanim kozjim antizečijim IgG i p-nitrofenil fosfatom.

Rezultati:

[0302] Kinetike C3 aktivacije (kako je izmereno C3b taloženjem na mananom-obloženim pločama sa 1% serumom) pod uslovima specifičnim za lektinski put prikazane su na FIG.16. Nije primećeno C3 cepanje u MASP-2-/- plazmi. Faktor B-/- (Faktor B -/-) plazma je pocepala C3 na pola brzine WT plazme, verovatno zbog gubitka amplifikacione petlje. Značajno odlaganje lektinski put-zavisnoj konverziji C3 u C3b primećeno je u C4-/- (T1/2=33min) kao i u MASP-1/3-/- deficijentnoj plazmi (T1/2=49 min). Ovo odlaganje C3 aktivacije u MASP-1/3 -/- plazmi pokazano je da je MASP-1- pre nego MASP-3-zavisno. (Videti Takahashi M. et al., J Immunol 180:6132-6138 (2008)). Ovi rezultati pokazuju da MASP-1/3-deficijentnim miševima ne nedostaje funkcionalna aktivnost lektinskog puta (koja se takođe naziva "LEA-2").

2. Efekat nasledne MASP-3 deficijencije na aktivaciju alternativnog puta.

Obrazloženje:

[0303] Efekat nasledne MASP-3 deficijencije na aktivaciju alternativnog puta određeno je sa ispitivanjem seruma MASP-3-deficijentnog pacijenta sa 3MC sindromom izazvanim mutacijom pomeranja okvira u eksonu koji kodira serinsku proteazu MASP-3.3MC sindrom je objedinjujući izraz za preklapajuće Carneavale, Mingarelli, Malpuech i Michels sindrome. Ovi retki autozomni recesivni poremećaji ispoljavaju spektar razvojnih karakteristika, koje uključuju karakteristike dismorfizma lica, rascepljene usne i/ili nepca, kraniosinostoze, invalidnost u učenju i genitalne, limbalne i vezikorenalne abnormalnosti. Rooryck et al., Zreli Genetskis 43:197-203 (2011) ispitivali su 11 familija sa 3MC sindromom i indetifikovali dva mutirana gena, COLEC11 i MASP-1. Te mutacije u MASP-1 genu dale su ekson koji kodira domen serinske proteaze MASP-3, ali ne i eksone koji kodiraju serinsku proteazu MASP-1, disfunkcionalnog. Prema tome, 3MC pacijentima sa mutacijama u eksonu koji kodira serinsku proteazu MASP-3 nedostaje MASP-3 ali imaju dovoljno MASP-1.

Postupci:

[0304] MASP-3-deficijentni serum dobijen je od 3MC pacijenta, majke i oca 3MC pacijenta (oba heterozigoti za alele koje nose mutaciju koja daje ekson koji kodira MASP-3 domen serinske proteaze disfunkcionalnog), kao i od C4-deficijentnog pacijenta (deficijentan sa oba humana C4 gena) i MBL-deficijentni subjekat. Ispitivanje alternativnog puta izvedeno je pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (BBS/ Mg<++>/EGTA, bez Ca<++>, u kojoj BBS = barbital puferovan slani rastvor koji sadrži saharozu), kako je opisano u Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981)), na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama pri koncentracijama u serumu koje se kreću od 0.5 do 25% a C3b taloženje je izmereno tokom vremena.

Rezultati:

[0305] FIG.17 grafički prikazuje nivo alternativnim putem vođenog C3b taloženja na zimosanomobloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma dobijenim od MASP-3-deficijentnih, C4-deficijentnih i MBL-deficijentnih subjekata. Kako je prikazano na FIG.17, serum MASP-3-deficijentnog pacijenta imao je višak aktivnosti alternativnog puta (AP) pri visokim koncentracijama u serumu (25%, 12.5%, 6.25% koncentracije u serumu), ali značajno viša AP50(tj..9.8% seruma potrebna je da bi se postiglo 50% maksimalnog C3 taloženja).

[0306] FIG.18 grafički prikazuje nivo alternativnim putem vođenog C3b taloženje na zimosanomobloženim mikrotitarskim pločama pod “uobičajenim” uslovima specifičnim za alternativni put (AP-specifični) (tj., BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) kao funkcija vremena u 10% uzorcima humanog seruma dobijenim od MASP-3-deficijentnih, C4-deficijentnih i MBL-deficijentnih humanih subjekata.

[0307] TABELA 11 ispod sumira AP50rezultate prikazane na FIG.17 i polu-vremena za C3b taloženje prikazani na FIG.18.

TABELA 11: Rezime rezultata prikazanih na FIG.17 i 18

[0308] Bez želje da se vezuje za bilo koju teoriju, smatra se da niža aktivnost alternativnog puta primećena u MASP-3-deficijentnom serumu izaziva da 3MC pacijent ima aktivan faktor D u svom serumu, a kako taj pacijent i dalje izražava MASP-1 i HTRA1, konverzija pro-faktora D je i dalje moguća u u odsustvu MASP-3, iako pri nižem niovu

3. Merenje C3b taloženja na mananu, zimosanu i S. pneumonia D39 u mišjem serumu kojem nedostaje MASP-2 ili MASP-1/3.

Postupci:

[0309] C3b taloženje je izmereno na mananom, zimosanom i S. pneumonia D39-obloženim mikrotitarskim pločama upotrebom koncentracije mišjeg seruma koja se kreće od 0% do 20% dobijen od MASP-2-/-, MASP-1/3-/- i WT miševa. Ispitivanja C3b taloženja izvedena su ili pod "uobičajenim" uslovima specifičnim za alternativni put (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>), ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju fukcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (tj., BBS/Mg<++>/Ca<++>).

Rezultati:

[0310] FIG.19A grafički prikazuje nivo C3b taloženja na mananom-obloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma dobijenim od WT, MASP-2-deficijentnih, i MASP-1/3-deficijentnih miševa pod uslovima uobičajenim za alternativni put (tj., BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>), ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/Mg<++>/Ca<++>). FIG.19B grafički prikazuje nivo C3b taloženja na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma iz WT, MASP-2-deficijentnih, i MASP-1/3-deficijentnih miševa pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (tj., BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>), ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/Mg<++>/Ca<++>). FIG.19C grafički prikazuje nivo C3b taloženja na S. pneumoniae D39-obloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma iz WT, MASP-2-deficijentnih, i MASP-1/3-deficijentnih miševa pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (tj.,

1

BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>), ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/Mg<++>/Ca<++>).

[0311] FIG.20A grafički prikazuje rezultate ispitivanja C3b taloženja u veoma razblaženom serumu izvedeno na mananom-obloženim mikrotitarskim pločama pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/Mg<++>/Ca<++>), upotrebom koncentracije u serumu koja se kreće od 0 % do 1.25%.

FIG.20B grafički prikazuje rezultate ispitivanja C3b taloženja izvedeno na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/EGTA/Mg<++>/Ca<++>), upotrebom koncentracije u serumu koja se kreće od 0 % do 1.25%. FIG.20C grafički prikazuje rezultate ispitivanja C3b taloženja izvedeno na S. pneumoniae D39-obloženim mikrotitarskim pločama pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/EGTA/Mg<++>/Ca<++>), upotrebom koncentracije u serumu koja se kreće od 0 % do 1.25%.

[0312] Kako je prikazano na FIG.20A-C, Ispitivanja C3b taloženja takođe su izvedena pod uslovima uobičajenim za alternativni put (tj. BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) ili pod fiziološkim uslovima koji omogućavaju funkcionisanje i lektinskog puta i alternativnog puta (BBS/Mg<++>/Ca<++>), upotrebom više razblaženja koja se kreću od 0 % do 1.25% seruma na mananom-obloženim pločama (FIG.20A);

zimosanom-obloženim pločama (FIG.20B) i S. pneumoniae D39-obloženim pločama (FIG.20C).

Alternativni put opada ispod više serumskih razblaženja, tako da aktivnost primećena u MASP-1/3-deficijentnom serumu u prisustvu Ca<++>predstavlja MASP-2-posredovanu LP aktivnost, a aktivnost u MASP-2-deficijentnom serumu u prisustvu Ca<++>predstavlja MASP-1/3-posredovanu preostalu aktivaciju AP.

Diskusija:

[0313] Rezultati opisani u ovom Primeru pokazuju da MASP-2 inhibitor (ili MASP-2 KO) obezbeđuje značajnu zaštitu od N. meningitidis infekcije promovisanjem MASP-3-vođene aktivacije alternativnog puta. Rezultati ispitivanja bakteriolize mišjeg seruma i ispitivanja bakteriolize humanog seruma dalje pokazuju, praćenjem serumske baktericidne aktivnosti protiv N. meningitidisa, da je baktericidna aktivnost protiv N. meningitidis odsutna u onim MBL-deficijentnim (mišji MBL A i MBL C dvostrukodeficijentni i humani MBL-deficijentni serumi).

[0314] FIG.1 prikazuje novo shvatanje lektinskog puta i alternativni put baziran na rezultatima

1 1

obezbeđenim ovde. FIG.1 ocrtava ulogu LEA-2 i u opsonizaciji i u liziranju. Dok je MASP-2 inicijator "nizvodnog" C3b taloženja (i rezultujuće opsonizacije) u višestrukim lektin-zavisnim uslovima fiziološki (FIG.20A, 20B, 20C), on takođe igra ulogu u liziranju serum-osetljivih bakterija. Kako je prikazano na FIG.1, predloženi molekulski mehanizam odgovoran za povećanu baktericidnu aktivnost MASP-2-deficijentnog ili MASP-2-osiromašenog seruma/plazme za serum-osetljiv patogen kao što je N. meningitidis je takav da, za liziranje bakterija, kompleksi prepoznavanja lektinskog puta povezan sa MASP-1 i MASP-3 treba da se vežu u međusobnoj blizini na bakterijskog površini, čime se omogućava da MASP-1 pocepa MASP-3. Nasuprot MASP-1 i MASP-2, MASP-3 nije auto-aktivirajući enzim, već, u mnogim slučajevima, zahteva aktivaciju/cepanje od strane MASP-1 da bi se konvertovao u njegov enzimski aktivan oblik.

[0315] Kako je dalje prikazano na FIG.1, aktiviran MASP-3 može zatim da pocepa C3b-vezan faktor B na površini patogena radi započinjanja aktivacije kaskada alternativnog puta obrazovanjem enzimski aktivnih C3 i C5 konvertaza alternativnog puta C3bBb i C3bBb(C3b)n, respektivno. MASP-2-noseći lektinski-put aktivacioni kompleksi nemaju udeo u aktivaciji MASP-3, i, u odsustvu ili nakon trošenja MASP-2, svi-lektinski-put aktivacioni kompleksi uvedeni su ili u MASP-1 ili MASP-3. Prema tome, u odsustvu MASP-2, znatno je povećana verovatnoća da se na mikrobnoj površini MASP-1 i MASP-3-noseći lektinski-put aktivacioni kompleksi smeštaju u međusobnoj blizini, što vodi ka više aktiviranja MASP-3 i što time vodi ka većoj brzini MASP-3-posredovanog cepanja C3b-vezanog faktora B kako bi se obrazovale C3 i C5 konvertaze alternativnog puta C3bBb i C3bBb(C3b)n na mikrobnoj površini. To vodi ka aktivaciji terminalnih aktivacija kaskada C5b-C9 koje obrazuju kompleks membranskog napada, sačinjen od površinski-vezanog C5b povezanog sa C6, C5bC6 povezanog sa C7, C5bC6C7 povezanog sa C8, i C5bC6C7C8, što vodi ka polimerizaciji C9 koji se umeće u bakterijsku površinsku strukturu i oblikuje pore u bakterijskom zidu, što vodi ka osmolitičkom ubijanju komplement-ciljane bakterije.

[0316] Jezgro ovog inovativnog koncepta je takvo da ovde obezbeđeni podaci jasno pokazuju da kompleksa aktivacije lektinskog puta vodi dva sledeća distinktivna puta aktivacije, kako je prikazano na FIG.1:

PRIMER 5

[0317] Ovaj Primer pokazuje inhibitorni efekat MASP-2 deficijencije i/ili MASP-3 deficijencije na liziranje crvenih krvnih zrnaca oz krvnih uzoraka dobijenih iz mišjeg modela paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH).

Pozadina/Obrazloženje:

1 2

[0318] Paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH), koja se takođe naziva Marchiafava-Micheli sindrom, je stečena, potencijalno životno ugrožavajuća bolest krvi, okarakterisana komplementindukovanom intravaskularnom hemolitičkom anemijom. Znak PNH je hronična komplementomposredovana intravaskularna hemoliza koja je posledica neregulisane aktivacija alternativnog puta komplementa zbog odsustva komplement regulatora CD55 i CD59 na PNH eritrocitima, sa naknadnom hemoglobinurijom i anemijom. Lindorfer, M.A., et al., Blood 115(11) (2010), Risitano, A.M, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 11:528-535 (2011). Anemija kod PNH je zbog uništavanja crvenih krvnih zrnaca u krvnom toku. Simptomi PNH uključuju crveni urin, zbog pojave hemoglobina u urinu, bol u donjim leđima, zamor, kratkoća daha i tromboza. PNH se može razviti sama od sebe, kada se naziva "primarna PNH" ili u kontekstu drugih poremećaja koštane srži kao što je aplastična anemija, kada se naziva "sekundarna PNH." Lečenje za PNH uključuje transfuziju krvi za anemiju, antikoagulaciju za trombozu i upotrebu monoklonalnog antitela ekulizumab (Soliris®), koje štiti krvne ćelije od imunog uništavanja inhibiranjem sistem komplementa (Hillmen P. et al., N. Engl. J. Med.350(6):552-9 (2004)). Ekulizumab (Soliris®) je humanizovano monoklonalno antitelo koje cilja komponentu C5 komplementa, blokirajući njegovo cepanje C5 konvertazama, čime se sprečava proizvodnja C5a i sastavljanje MAC. Lečenje PNH pacijenata ekulizumabom rezultuje u redukciji intravaskularne hemolize, kako je izmereno laktatnom dehidrogenazom (LDH), što vodi ka hemoglobinskoj stabilizaciji i transfuzionoj nezavisnosti kod polovine pacijenata (Hillmen P, et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, vol 11(6) (2011)). Dok gotovo svi pacijenti koji su pod terapijom ekulizumaba postižu normalne ili skoro normalne LDH nivoe (zbog kontrolisanja intravaskularne hemolize), samo oko trećina pacijenata dostigne vrednost hemoglobina od oko 11gr/dL, a preostali pacijenti ekulizumaba nastavljaju da pokazuju umerenu do ozbiljne (tj., transfusion-zavisne) anemije, u približno jednakim razmerama (Risitano A.M. et al., Blood 113:4094-100 (2009)). Kako je opisano u Risitano et al., Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 11:528-535 (2011), pokazano je da PNH pacijenti na ekulizumabu imaju C3 fragmente vezane za suštinski deo njihovih PNH eritrocita (dok netretirani pacijenti ne), što vodi ka zaključku da membranom-vezani C3 fragmenti koji deluju kao opsonini na PNH eritrocitima, rezultuju kao njihova zamka u retikuloendotelijalnim ćelijama putem specifičnih C3 receptora i naknadnom ekstravaskularnom hemolizom. Prema tome, terapeutske strategije pored upotrebe ekulizumaba potrebne su za one pacijente kod kojih se razvija C3 fragmentposredovana ekstravaskularna hemoliza jer su im i dalje neophodne transfuzije crvenih krvnih zrnaca.

[0319] Ovaj Primer opisuje postupci za procenu efekta MASP-2- i MASP-3-deficijentnog seruma na liziranje crvenih krvnih zrnaca iz krvnih uzoraka dobijenih od mišjeg modela PNH i pokazuje efikasnost MASP-2 inhibicije i/ili MASP-3 inhibicije radi lečenja subjekata koji boluju od PNH, a takođe podržava upotrebu inhibitora MASP-2 i/ili inhibitora MASP-3 (koji uključuju dvostruke ili bispecifične MASP-

1

2/MASP-3 inhibitore) radi ublažavanja efekata C3 fragment-posredovane ekstravaskularne hemoliza kod PNH subjekata koji prolaze kroz terapiju sa C5 inhibitorom kao što je ekulizumab.

Postupci:

PNH životinjski model:

[0320] Krvni uzorci dobijeni su od gen-ciljanih miševa sa deficijencijaa Crry i C3 (Crry/C3-/-) i CD55/CD59-deficijentnih miševa. Ovim miševima nedostaju respektivni površinski komplement regulatori na njihovim eritrocitima, a ovi eritrociti su, prema tome, podložni spontanom komplement autoliziranju budući da su PNH humane krvne ćelije.

[0321] Kako bi se sensitizovali ovi eritrociti još više, ove ćelije korišćene su sa i bez oblaganja mananom, a zatim su testirana na hemolizu u WT C56/BL6 plazmi, MBL null plazmi, MASP-2 -/- plazmi, MASP-1/3 -/- plazmi, humanoj NHS, humanoj MBL -/plazmi, i NHS tretiranom sa humanim MASP-2 antitelom.

1. Hemolitičko ispitivanje Crry/C3 i CD55/CD59 dvostruko-deficijentnih mišjih eritrocita u MASP-2-deficijentnim/osiromašenim serumima i kontrolama

Dan 1. Pripremanje mišjaih RBC (±oblaganje mananom).

[0322] Uključeni materijali: sveža mišja krv, BBS/Mg<++/>Ca<++>(4.4 mM barbiturna kiselina, 1.8 mM natrijum barbiton, 145 mM NaCl, pH 7.4, 5mM Mg<++>, 5mM Ca<++>), hrom hlorid, CrCl3·6H2O (0.5mg/mL u BBS/Mg<++>/ Ca<++>) i manan, 100 µg/mL in BBS/Mg<++>/Ca<++>.

[0323] Puna krv (2 mL) rotirana je tokom 1-2 min pri 2000xg u rashlađenoj centrifugi na 4°C. Plazma i proziran sloj se odstranjuju usisavanjem. Uzorak je zatim opran 3x re-suspendovanjem RBC peleta u 2 mL ledeno-hladnog BBS/želatin/Mg<++>/Ca<++>i ponavljanjem centrifugiranja. Nakon trećeg pranja, pelet je re-suspendovan u 4 mL BBS/Mg<++>/Ca<++>.2 mL alikvota RBC ostavljeno je sa strane kao neobložena kontrola. U preostalih 2 mL, dodati su 2 mL CrCl3 i 2 mL manana i uzorak je inkubisan nežnim mešanjem na ST tokom 5min. Reakcija je prekinuta dodavanjem 7.5 mL BBS/želatin/Mg<++>/Ca<++>. Uzorak je rotiran kako je ranije navedeno, re-suspendovana u 2 mL BBS/želatin/Mg<++>/Ca<++>i opran dodatno dva puta kao i prethodno, zatim odložen na 4°C.

Dan 2. Ispitivanje hemolize

[0324] Uključeni materijali BBS/želatin/Mg<++>/Ca<++>(kao i malopre), test serumi, ploče sa 96 bazenčića okruglog dna i ravnog dna i spektrofotometar koji čita ploče sa 96 bazenčića pri 410-414 nm.

[0325] Koncentracija RBC prvo je određena, a zatim su ćelije podešene na 10<9>/mL, i odložene pri ovoj

1 4

koncentraciji. Pre upotrebe, ćelije su razblažene u ispitnom puferu na 10<8>/mL, a zatim je korišćeno 100 ul po bazenčiću. Hemoliza je izmerena na 410-414 nm (omogućavajući veću osetljivost nego 541nm). Razblaženja test seruma prupremljena su u ledeno-hladnom BBS/želatin/Mg<++>/Ca<++>.100µl svakog serumskog razblaženja pipetirano je u ploču okruglog dna.100 µl pogodno razblaženih RBC proizvoda dodato je (tj., 10<8>/mL), inkubisano na 37°C tokom oko 1 sata, i posmatrano na liziranje. (Ploče mogu biti fotografisane u ovom trenutkut.) Ploča je zatim rotirana pri maksimalnoj brzini tokom 5 minuta.100 µl fluidne faze je uklonjeno usisavanjem, transferovano u ploče sa ravnim dnom, i OD je beležen na 410-414 nm. RBC peleti su zadržani (oni može biti naknadno lizirani vodom kako bi se dobio inverzni rezultat).

Eksperiment #1

[0326] Sveža krv dobijena je od CD55/CD59 dvostruko-deficijentnih miševa, a krv Crry/C3 dvostrukodeficijentnih miševa i eritrociti prupremljeni su kako je opisano detaljno u gornjem protokolu. Ćelije su podeljene, a polovina ćelija obložena je mananom, a druga polovina ostavljena je netretirana, podešavajući konačnu koncentraciju na 10<8>/mL, od kojih je 100 µl korišćeno u ispitivanju hemolize, koje je izvedeno kako je prethodno opisano.

Rezultati Eksperimenta #1: Lektinski put je uključen u liziju eritrocita u PNH životinjskom modelu [0327] U inicijalnom eksperimentu, odgređeno je da ne-obloženi WT mišji eritrociti nisu lizirani ni u jednom mišjem serumu. Dalje je određeno da su mananom-obloženi Crry-/- mišji eritrociti polako lizirani (više od 3 sata na 37 stepeni) u WT mišjem serumu, ali da nisu lizirani u MBL null serumu. (Podaci nisu prikazani).

[0328] Određeno je da su mananom-obloženi Crry-/- mišji eritrociti rapidno lizirani u humanom serum , ali ne i u toplotom-inaktiviranom NHS. Značajno, mananom-obloženi Crry-/- mišji eritrociti lizirani su u NHS razblaženom do 1/640 (tj., 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 i 1/640 razblaženja sva lizirana). (Podaci nisu prikazani). U ovom razblaženju, alternativni put ne funkcioniše (AP funkcionalna aktivnost je značajno redukovana ispod 8% serumskih koncentracija).

Zaključci iz Eksperimenta #1

[0329] Mananom-obloženi Crry-/- mišji eritrociti veoma dobro su lizirani u veoma razblaženom humanom serumu sa MBL, ali ne i u onom bez MBL. Efikasno liziranje u svakoj serumskoj koncentraciji koja je testirana ukazuje da alternativni put nije uključen ili potreban za ovo liziranje. Nemogućnost MBL-deficijentnog mišjeg seruma i humanog seruma da liziraju mananom-obložene Crry-/- mišje

1

eritrocite ukazuje na to da klasični put takođe nema ništa sa primećenom lizijom. Kako su potrebni molekuli prepoznavanja lektinskog puta (tj., MBL), ovo liziranje posredovano je lektinskim putem.

Eksperiment #2

[0330] Sveža krv dobijena je od Crry/C3 i CD55/CD59 dvostruko-deficijentnih miševa i mananomobloženi Crry-/- mišji eritrociti analizirani su u ispitivanju haemolize kako je prethodno opisano u prisustvu sledeći humanih seruma: MASP-3 -/-; MBL null; WT; NHS pretretirano sa humanim MASP-2 antitelo; i toplotom-inaktiviran NHS kao kontrola.

Rezultati Eksperimenta #2: MAST-2 inhibitori i MASP-3 deficijencija sprečava liziju eritrocita u PNH životinjskom modelu

[0331] Sa mananom-obloženim Crry-/- mišjim eritrocitima, NHS je inkubisan u razblaženju razblaženom do 1/640 (tj., 1/40, 1/80, 1/160, 1/320 i 1/640), humanom MBL-/- serumu, humanom MASP-3-deficijentnom serumu (od 3MC pacijenta), i NHS pretretiranom sa MASP-2 mAb, i toplotominaktiviranom NHS kao kontrola.

[0332] ELISA mikrotitarska ploča rotirana je i ne-lizirani eritrociti sakupljeni su na dnu ploče sa okruglim bazenčićima. Supernatant svakog bazenčića sakupljen je, a količina hemoglobina oslobođena od liziranih eritrocita izmerena je čitanjem OD415 nm u ELISA čitaču.

[0333] Primećeno je da MASP-3-/- serum uopšte ne lizira mananom-obložene mišje eritrocite. U kontrolnom toplotom-inaktiviranom NHS (negativna kontrola), kako je i očekivano, nije primećeno liziranje. MBL-/- humani serum lizirao je mananom-obložene mišje eritrocite pri 1/8 i 1/16 razblaženjima. MASP-2-antitelo-pretretirano NHS lizirao je mananom-obložene mišje eritrocite pri 1/8 i 1/16 razblaženjima dok je WT humani serum lizirao mananom-obložene mišje eritrocite do razblaženja od 1/32.

[0334] FIG.21 grafički prikazuje hemolizu (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih mišjih eritrocita (Crry/C3-/-) u supernatantu izmereno fotometrijom) mananom-obloženih mišjih eritrocita humanim serumom u opsegu serumskih razblaženja u serumu iz MASP-3-/-, toplotom-inaktiviranom (HI) NHS, MBL-/-, NHS pretretiranom sa MASP-2 antitelom, i NHS kontroli.

[0335] FIG.22 grafički prikazuje hemolizu (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih mišjih eritrocita (Crry/C3-/-) u supernatantu izmereno fotometrijom) mananom-obloženih mišjih eritrocita

1

humanim serumom u opsegu koncentracije u serumu u serumu iz MASP-3-/-, toplotom-inaktiviranom (HI) NHS, MBL-/-, NHS pretretiranom sa MASP-2 antitelom, i NHS kontroli.

[0336] Iz rezultata prikazanim na FIG.21 i 22, pokazano je da inhibiranje MASP-3 sprečava bilo koje komplementom-posredovano liziranje senzitizovanih eritrocita sa deficijentnom zaštitom od autologne aktivacije komplementa. MASP-2 inhibicija sa MASP-2 antitelom značajno pomera CH50i zaštitina je do neke mere, ali MASP-3 inhibicija je efektivnija.

Eksperiment #3

[0337] Ne-obloženi Crry-/- mišji eritrociti dobijeni od sveže krvi iz Crry/C3 i CD55/CD59 dvostrukodeficijentni miševi analizirani su u ispitivanju hemolize kako je prethodno opisano u prisustvu sledećih seruma: MASP-3-/-; MBL-/-; WT; NHS pretretiran sa humanim MASP-2 antitelom, i toplotom-inaktiviran NHS kao kontrola.

Rezultati:

[0338] FIG.23 grafički prikazuje hemolizu (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih eritrocita WT miševa u supernatantu izmereno fotometrijom) neobloženih mišjih eritrocita u opsegu serumskih koncentracija u humanim serumima od 3MC (MASP-3-/-) pacijenta, toplotom inaktiviranom (HI) NHS, MBL-/-, NHS pretretiranom sa MASP-2 antitelom, i NHS kontroli. Kako je prikazano na FIG.23 i sumirano u TABELI 12, pokazano je da inhibiranje MASP-3 inhibira komplementom-posredovano liziranje ne-senzitizovanih WT mišjih eritrocita.

[0339] FIG.24 grafički prikazuje hemolizu (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih mišjih eritrocita (CD55/59 -/-) u supernatantu izmereno fotometrijom) neobloženih mišjih eritrocita humanim serumom u opsegu serumskih koncentracija u humanim serumima iz toplotom-inaktiviranog (HI) NHS, MBL-/-, NHS pretretiranog sa MASP-2 antitelom, i NHS kontrole. Kako je prikazano na FIG.24 i sumirano u TABELI 12, pokazano je da je inhibiranje MASP-2 zaštitno do ograničene mere.

TABELA 12: CH50vrednosti izražene kao koncentracije u serumu

1

[0340] Ukratko, rezultati u ovom Primeru pokazuju da inhibiranje MASP-3 sprečava bilo kakvo komplement liziranje senzitizovanih i ne-senzitizovanih eritrocita sa deficijentnom zaštitom iz autologne aktivacije komplementa. MASP-2 inhibicija takođe je zaštitina do neke mere. Prema tome, MASP-2 i MASP-3 inhibitori sami ili u kombinaciji (tj., dati jednovremeno, dati sekvencijalno) ili MASP-2/MASP-3 bispecifični ili dvostruki inhibitori mogu se primeniti radi lečenja subjekata koji boluje od PNH, i takođe se mogu primeniti da ublaže (tj., inhibiraju, spreče ili redukuju ozbiljnost) ekstravaskularne hemolize kod PNH pacijenata koji prolaze kroz lečenje sa C5 inhibitorom kao što je ekulizumab (Soliris®).

PRIMER 6

[0341] Ovaj Primer opisuje ogledno ispitivanje hemolize mananom-obloženih zečijih eritrocita na liziranje u prisustvu WT ili MASP-1/3-/- mišjeg seruma.

Postupci:

1. Ispitivanje hemolize zečijeg RBC (mananom obložena) u mišjim MASP-1/3-deficijentnim serumima i WT kontrolnim serumima

Dan 1. Pripremanje zečijih RBC.

[0342] Uključeni materijali: sveža zečija krv, BBS/ Mg<++>/Ca<++>(4.4 mM barbiturna kiselina, 1.8 mM natrijum barbiton, 145 mM NaCl, pH 7.4, 5 mM Mg<++>, 5 mM Ca<++>), BBS/ Mg<++>/Ca<++>sa 0.1% želatinom, hrom hlorid sadržan u puferu; tj., CrCl3.6 H2O (0.5 mg /mL in BBS/ Mg<++>/Ca<++>) i manan, 100 µg/mL in BBS/ Mg<++>/Ca<++>.

1. Zečijeg Puna krv (2 mL) podeljena je u dve 1.5 mL ependorf epruvete i centrifugirana tokom 3 minuta na 8000 o/min (približno 5.9 rcf) u rashlađenoj ependorf centrifugi na 4°C. RBC pelet opran je tri puta nakon re-suspendovanja u ledeno-hladnom BBS/Mg<++>/Ca<++>. Nakon trećeg pranja, pelet je re-suspendovan u 4 mL BBS/Mg<++>/Ca<++>. Dva mL ovog alikvota dodato je u 15-mL falkon epruvertu da bi upotrebilo kao neobložena kontrola. Preostalih 2 mL RBC alikvota razblaženo je u 2 mL CrCl3puferu, 2 mL rastvora manana dodato je, a suspenzija inkubisana na sobnoj temperaturi tokom 5 minuta uz nežno umešavanje. Reakcija je prekinuta dodavanjem 7.5 mL of BBS/0.1% želatina/Mg<++>/Ca<++>u mešavinu. Eritrociti su peletirani, a RBC-a oprana dvaputa sa BBS/0.1% želatin/Mg<++>/Ca<++>kako je prethodno opisano. RBC-a suspenzija odložena je u BBS/0.1% želatin/ Mg<++>/Ca<++>at 4°C.

1

2. 100 µl suspendovanih RBC-a razblaženi su sa 1.4 mL vode i rotiranai na 8000 o/min (približno 5.9 rcf) tokom 3 minuta, a OD supenatanta podešeno je na 0.7 na 541nm (OD od 0.7 na 541nm odgovara približno 10<9>eritrociti/mL).

3. Re-suspendovana RBC-a razblažena su sa BBS/0.1% želatin/Mg<++>/Ca<++>do koncentracije od 10<8>/mL.

4. Razblaženja ispitnih seruma prupremljeni su u ledeno-hladnom BBS/želatin/ Mg<++>/Ca<++>i 100 µl svakog serumskog razblaženja pipetirano je u odgovarajući bazenčić ploče sa okruglim dnom.100 µl pogodno razblaženih RBC (108/mL) dodati su u svaki bazenčić. Kao kontrola za kompletno liziranje, prečišćena voda (100 µL) umešana je sa razblaženim RBC (100 µL) kako bi se izazvalo 100% liziranje, dok je BBS/0.1% želatin/ Mg<++>/Ca<++>bez seruma (100 µL) korišćen kao negativna kontrola. Ploča je zatim inkubisana tokom 1 sata na 37°C.

5. Ploča sa okruglim dnom centrifugirana je na 3250 o/min tokom 5 minuta. Supernatant iz svakog bazenčića (100 µL) transferovan je u odgovarajuće bazenčiće ploče sa ravnim dnom i OD je očitana u ELISA čitaču na 415-490nm. Rezultati su prijavljeni kao odnos OD na 415 nm prema onim na 490nm.

Rezultati:

[0343] FIG.25 grafički prikazuje hemolizu (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih zečijih eritrocita u supernatantu izmereno fotometrijom) mananom-obloženih zečijih eritrocita mišjim serumom u opsegu serumskih koncentracija u serumu iz MASP-1/3-/- i WT kontrole. Kako je prikazano na FIG.25, pokazano je da inhibiranje MASP-3 sprečava komplementom-posredovano liziranje mananom-obloženih WT zečijih eritrocita. Ovi rezultati dalje podržavaju upotrebu MASP-3 inhibitora za lečenje jednog ili više aspekata PNH kako je opisano u Primeru 5.

PRIMER 7

[0344] Ovaj Primer pokazuje da se alternativni put aktivira u faktor D-deficijentnom serum u prisustvu Ca<++>.

Eksperiment #1: Ispitivanje C3b taloženja pod pod uslovima specifičnim za alternativni put Postupci:

[0345] Ispitivanje C3b taloženja na zimosanom-obloženoj mikrotitarskoj ploči izvedeno je pod uslovima specifičnim za alternativni put (BBS/EGTA/Mg<++>, no Ca<++>) upotrebom povećavajućih razblaženja sledećih mišjih seruma: faktor D-/-; MASP- -/-; i WT.

Rezultati:

[0346] FIG.26 grafički prikazuje nivo C3b taloženja (OD 405 nm) kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma iz faktora D-/-, MASP-2 -/-; i WT mišjim serumima u ogledu C3 taloženja izveden pod

1

uslovima specifičnim za alternativni put. Kako je prikazano na FIG.26, pod ovim uslovima, faktor D -/-mišji serum ne aktivira C3 uopšte i alternativni put ne funkcioniše. MASP-2-/- serum prikazuje aktivaciju alternativnog puta pri slipčnim brzinama kao i WT serum. Ovi rezultati potvrđuju da, u odsustvu Ca<++>, faktor D je potreban za C3b taloženje. Ovo se slaže sa dokazom da MASP-3 ne može biti konvertovan u njegov enzimski aktivan oblik pod ovim uslovima zato što su interakcije MASP-1, MASP-3 aktivirajućeg enzima, i MASP-3 sa njihovim respektivnim komponentama za prepoznavanje ugljenih hidrata Ca<++>-zavisne.

Eksperiment #2: Ispitivanje C3b taloženja pod fiziološkim uslovima Postupci:

[0347] Ispitivanje C3b taloženja izvedeno je pod fiziološkim uslovima (BBS/Ca<++>/Mg<++>) (koji omogućavaju rad oba i LP i AP) upotrebom povećavajućih razblaženja od sledećih mišjih seruma: faktor D -/-; MASP-2 -/-; i WT.

Rezultati:

[0348] FIG.27 grafički prikazuje nivo C3b taloženja (OD 405 nm) kao funkcija koncentracije u serumu upotrebom uzoraka seruma iz faktora D-/-; MASP-2-/-; i WT miševa u ogledu C3b taloženja izvedenom pod fiziološkim uslovima (u prisustvu Ca<++>). Kako je prikazano na FIG.27, faktor D-/- mišji serum aktivira C3 putem i lektinskog i alternativnog puta bez razlike u poređenju sa WT serumom putem indikovanih serumskih razblaženja. MASP- -/- serum prikazuje preokret C3 u nižim serumskim razblaženjima samo putem alternativnog puta (tj., MASP-3-vođena aktivacija alternativnog puta). Ovi rezultati ukazuju da u prisustvu Ca<++>, faktor D nije neophodan uzimajći u obzir da MASP-3 može da pokreće aktivnost alternativnog puta.

Eksperiment #3: Ispitivanje C3b taloženja upotrebom mišjeg seruma deficijentnog u faktoru B ili faktoru D u prisustvu ili odsustvu MASP-2 mAb

Postupci:

[0349] Ispitivanje C3b taloženja izvedeno je pod fiziološkim uslovima (BBS/Ca<++>/Mg<++>) na manan obloženim mikrotitarskim pločama kako sledi:

1. Mikro-titarske ELISA ploče obložene su tokom noći na 4°C sa mananom (1 µg/mL) u puferu za oblaganje (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCo3, 0.02% natrijum azid, pH 9.6).

2. Sledeći dan, preostala mesta vezivanja proteina blokirana su tokom 2 sata na sobnoj temperaturi sa 250 µl/bazenčić sa 0.1 % HSA u BBS (4 mM barbital, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4).

3. Ploče su oprane tri puta sa puferom za pranje (TBS sa 0.05% Tween 20 i 5 mM CaCl2).

11

4. 1:10 razblaženi uzorci seruma u BBS dodati su u bazenčiće u spesificiranim vremenskim tačkama. Bazenčići koji su primili samo pufer korišćeni su ka negativna kontrola. Ploča je inkubisana na 37°C tokom do 40 minuta.

5. Ploče su zatim oprane 3 puta sa puferom za pranje.

6. Zatim je 100 µl zečijeg anti-humanog C3c (Dako) razblažen kao 1:5000 u puferu za pranje dodato je u bazenčiće i ploče su inkubisane tokom 90 minuta na 37°C.

7. Nakon pranja tokom tri puta puferom za pranje, 100 µl alkalnom fosfataza-konjugovanog antizečijeg razblažeja 1:5000 u puferu za pranje dodato je u bazenčiće praćeno inkubacijom tokom 90 minuta na sobnoj temperaturi.

8. Nakon pranja, alkalna fosfataza detektovana je dodavanjem 100 µl supstracionog rastvora.

9. Nakon inkubacije tokom 15 minuta, optička gustina izmerena je na OD 405 nm.

Rezultati:

[0350] FIG.28 grafički prikazuje nivo C3b taloženja (OD 405 nm) u funkciji inkubacionog vremena seruma (minuti) u mišjim uzorcima seruma dobijenim od faktor D-/- ili faktor B-/- miševa u prisustvu ili odsustvu MASP-2 mAb u ogledu C3b taloženja izveden pod fiziološkim uslovima (u prisustvu Ca<++>). Kako je prikazano na FIG.28, ne postoji razlika u količini C3b taloženja u WT i faktor D/- serumu, čime se jasno potvrđuje zaključak da MASP-3 može da inicira aktivaciju alternativnog puta, čak i u odsustvu faktora D. Primećeni signal je prema tome i zbog aktivacije lektinskog puta i alternativnog puta. Kako je dalje prikazano na FIG.28, faktor D-/- plus MASP-2 mAb prikazuje samo MASP-3-posredovanu aktivaciju alternativnog puta. Faktor B-/- plus MASP-2 mAb je samo u pozadini (podaci nisu prikazani). Toplotominaktiviran serum korišćen je kao vrednost pozadinske kontrole, koja je bila identična faktoru D-/- i faktor B-/- sa MASP-2 (podaci nisu prikazani).

[0351] Ukratko, rezultati u ovom Primeru pokazuju da je faktor D od suštinskog značaja samo pod nefiziološkim uslovima (tj. kada se ispituje na aktivaciju alternativnog puta u BBS/EGTA/ Mg<++>u odsustvu Ca<++>). Nasuprot tome, kada se ispituje na aktivaciju alternativnog puta pod fiziološkim uslovima (u prisustvu Ca<++>), što omogućava da alternativni put bude aktiviran putem MASP-3, faktor D-deficijentni serum uopšte nije deficijentan u aktivnosti alternativnog puta u poređenju sa WT kontrolom. Prema tome, pod fiziološkim uslovima, faktor D je suvišan, u tome što je započinjanje aktivacije alternativnog puta vođeno pomoću MASP-3. Ovi rezultati podržavaju zaključak da lektinski put upravlja AP aktivaciju putem MASP-3-zavisne aktivacije.

PRIMER 8

[0352] Ovaj Primer opisuje primerne postupke za proizvodnju mišjih monoklonalnih antitela protiv humanih MASP-1, MASP-2 ili MASP-3 polipeptida, i za generisanje dvostrukih, bispecifičnih ili panspecifičnih MASP antitela.

1. Postupci za generisanje MASP antitela

[0353] Mužijaci A/J miševa (Harlan, Houston, Tex.), 8 do 12 nedelja stari, injektovani su subkutano sa 100 µg humanim polipeptidima pune dužine: rMASP-1 (SEQ ID NO:10), rMASP-2 (SEQ ID NO:5) ili rMASP-3 (SEQ ID NO:8), ili njihovim antigen fragmentima, na primer kako je navedeno u TABELI 2, u kompletanom Freund-ovom adjuvansu (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) u 200 µl fosfatnog puferovanog slanog rastvora (PBS) pH 7.4. Dve nedelje kasnije, miševi su injektovani subkutano sa 50 µg istih humanih polipeptida u nekompletnom Freund-ovom adjuvansu. Šest nedelja kasnije, miševi su injektovani sa 50 µg istog humanog polipeptida u PBS i fuzionisani 4 dana kasnije.

[0354] Za svakufuziju, jedno ćelijske suspenzije pripremljene su iz jetri imunizovanih miševa i primenjeni za fuzionisanje sa Sp2/0 mijeloma ćelijama.5x10<8>Sp2/0 i 5x10<8>ćelija jetre fuzionisane su u podloži koja sadrži 50% polietiln glikola (M.W.1450) (Kodak, Rochester, N.Y.) i 5% dimetilsulfoksida (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). Ćelije su zatim podešene do koncentracije od 1.5x10<5>ćelija jetre po 200 µl suspenzije u Iscove-oj podlozi (Gibco, Grand Island, N.Y.), dopunjena sa 10% fetalnim goveđim serumom, 100 jedinica/mL penicilina, 100 µg/mL streptomicina, 0.1 mM hipoksantinom, 0.4 µM aminopterinom i 16 µM timidinom. Dve hiljade mikrolitara ćelijske suspenzije dodato je u svaki bazenčić koji su sadržani grubo u dvadeset ploča mikrokulture sa 96 bazenčića. Nakon oko deset dana, supernatanti kulture su povučeni zbog posmatranja na reaktivnost sa ciljem prečišćavanja antigena (MASP-1, MASP-2 ili MASP-3, ili fragmenta antigena iz TABELE 2) u ELISA ispitivanju.

[0355] ELISA Ispitivanje (opisano uz pozivanje na MASP-2): Bazenčići Immulon 2 (Dynatech Laboratories, Chantilly, Va.) mikrotest ploča obloženo dodavanjem 50 µl prečišćenog hMASP-2 na 50 ng/mL tokom noći na sobnoj temperaturi. Niska koncentracija MASP-2 koja se koristi za oblaganje omogućava odabir visoko-afinitetnih antitela. Nakon uklanjanja rastvora za oblaganje udaranjem ploče, 200 µl BLOTTO (ne-masno suvo mleko) u PBS dodato je u svaki bazenčić tokom jednog sata radi blokiranja ne-specifičnog mesta. Sat kasnije, bazenčići su zatim oprani sa puferom PBST (PBS koji sadrži 0.05% Tween 20). Supernatanti kulture iz svakog fuzionog bazenčića (50 uL) umešani su sa 50 µl BLOTTO i zatim dodati u pojedinačne MASP-2-obložene bazenčićie mikrotest ploča. Nakon jednog sata inkubacije, bazenčići su oprani sa PBST i detektovano je vezivanje antitela za MASP-2 dodavanjem peroksidazom rena (HRP)-konjugovanog kozjeg anti-mišjeg IgG (Fc specifičan) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pa.). HRP-konjugovano anti-mišje IgG razblaženo je pogodno u BLOTTO kako bi se obezbedio pogodan signal odnosu šuma, i dodati u svaki bazenčić koji sadrži uzorke. Nakon pranja, povezano HRP-konjugovano antitelo primećeno je sa rastvorom supstrata peroksidaze. Rastvor supstrata peroksidaze koji sadrži 0.1% 3,3,5,5 tetrametil benzidin (Sigma, St. Louis, Mo.) i 0.0003% hidrogen peroksid (Sigma) dodati su u bazenčiće za razvoj boje tokom 30 minuta. Reakcija je prekinuta dodavanjem 50 µl 2M H2SO4po bazenčiću, a optička gustina na 450 nm reakcione mešavine izmerena je sa BioTek ELISA Čitačem (BioTek Instruments, Winooski, Vt.).

[0356] Ogled vezivanja (opisano uz pozivanje na MASP-2):

Supernatanti kulture koji su test pozitivni u prethodno opisanom MASP-2 ELISA ispitivanju mogu se ispitati u ogledu vezivanja za određivanje afinitet vezivanja koji MASP-2 inhibitorni agensi imaju za MASP-2. Slično ispitivanje takođe se može primeniti za određivanje ukoliko se inhibitorni agensi vežu za druge antigene u sistemu komplementa.

[0357] Bazenčići polistirenske mikrotitarske ploče (pliče sa medijumom za vezivanje sa 96 bazenčića, Coming Costar, Cambridge, MA) obloženi su sa MASP-2 (20 ng/100 µl/bazenčić, Advanced Research Technology, San Diego, CA) u fosfat-puferovanom slanom rastvoru (PBS) pH 7.4 tokom noći na 4°C. Nakon uklanjanja usisavanjem MASP-2 rastvora, bazenčići su blokirani sa PBS koji sadrži 1% goveđi serumski albumin (BSA; Sigma Chemical) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Bazenčići bez MASP-2 oblaganja služili su kao pozadinska kontrola. Alikvoti supernatanata hibridoma ili prečišćeni MASP-2 MoAb-a, pri različitim koncentracijama u BSA PBS blokirajućem rastvoru, dodati su u bazenčiće. Nakon dvo-časovne inkubacije na sobnoj temperaturi, bazenčići su detaljno isprani sa PBS. MASP-2-vezano MASP-2 MoAb detektovano je dodavanjem peroksidaza-konjugovanog kozjeg anti-mišjeg IgG (Sigma Chemical) u blokirajući rastvor, koji koji je ostavljhen da se inkubira tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploča je ponovo detaljo isprana sa PBS, i dodato je 100 µl 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB) supstrata (Kirkegaard i Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Reakcija TMB ugašena je dodavanjem 100 µl 1M fosforne kiseline, a ploča je očitana na 450 nm u čitaču mikroploča (SPECTRA MAX 250, Molekulski Devices, Sunnyvale, CA).

[0358] Supernatanti kulture iz pozitivnih bazenčića zatim su testirani na sposobnost da inhibiraju aktivaciju komplementa u funkcionalnom ispitivanju kao što je ispitivanje C4 cepanja kako je ovde opisano (Primer 9). Ćelije u pozitivnim bazenčićima su zatim klonirane ograničenim razblaživanjem. MoAb-a su ponovo ispitana na reaktivnost sa hMASP-2 u ELISA ispitivanju kako je prethodno opisano. Odabrani hibridomi uzgajani su u bočicama za rotaciju, a utrošeni supernatatni kulture sakupljeni su za prečišćavanje antitela afinitetnom hromatografijom prema proteinu A.

11

[0359] MASP-2 antitela mogu se ispitati na LEA-2 inhibitornu aktivnost u ispitivanju C4 cepanja, na primer kako je opisano u Primeru 9.

[0360] Dok su ELISA i Ogled vezivanja opisani uz pozivanje na MASP-2, strućnjacima će biti jasno da se ista ELISA i ogledi vezivanja mogu izvesti upotrebom MASP-1 ili MASP-3 polipeptida i njihovih antigen fragmenata (npr., kako je opisano u TABELI 2). MASP-3 antitela se mogu ispitati na inhibiciju MASP-3 serinska proteaza cepanja MASP-3 supstrata i na LEA-1 inhibitornu aktivnost u ogledu C3b taloženja, na primer kako je opisano u Primeru 4, u ispitivanju hemolize kako je opisano u Primeru 5. MASP-1 antitela mogu se ispitati na inhibiciju MASP-1 serinska proteaza cepanja MASP-1 supstrata, na inhibiciju MASP-3 aktivacije, i na LEA-1 inhibitornu aktivnost u ogledu C3b taloženja, na primer kako je opisano u Primeru 4, i u ispitivanju hemolize kako je opisano u Primeru 5.

2. Postupci za generisanje dvostrukih-MASP antitela

[0361] MASP-2/3 dvostruka inhibitorna antitela: Kako je prikazano na FIG.4, 6 i 7C, postoje regioni sačuvani između MASP-2 i MASP-3 u domenu serinske proteaze, kodirani beta lancem iz SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:8. Prema tome, dvostruko MASP-2/3 antitelo može biti generisano upotrebom antigena koji obuhvata ili koji se sastoji od domena serinske proteaze MASP-2 (ili MASP-3), kao što je beta lanac iz SEQ ID NO:5 (ili SEQ ID NO:8) kako bi se generisalo monoklonalno antitelo kako je prethodno opisano, ili alternativno, ovaj antigen(i) može se primeniti za snimanje biblioteke faga za klonove koji se specifično vezuju za ovaj antigen(e), praćeno skriningom na dvostruko vezivanje za MASP-3 (ili MASP-1). Dvostruka MASP-2/3 antitela zatim su snimljena na inhibitornu aktivnost u funkcionalnom ispitivanju, na primer kako je opisano u TABELI 2.

[0362] MASP-1/3 dvostruka inhibitorna antitela: Kako je prikazano na FIG.3-5, MASP-1 i MASP-3 dele identični sačuvan region u CUBI-CCP2 domenu (aa 25-432 iz SEQ ID NO:10), koji takođe deli i MAp44. Kako je prikazano na FIG.3, MAp44 ne sadrži CCP2 domen. Prema tome, dvostruko MASP-1/3 antitelo koje uključuje MAp44 generisano je upotrebom antigena koji obuhvata ili sastoji se od CUBI-CCP-2 domena MASP-1 (ili MASP-3) kako bi se generisalo monoklonalno antitelo kako je prethodno opisano, ili alternativno, ovaj antigen koristi se za snimanje biblioteke faga za klonove koji se specifično vezuju za ovaj antigen, praćeno skriningom na dvostruko vezivanje sa MASP-3 (ili MASP-1). Dvostruko MASP-1/3 antitelo bez MAp44 generisano je na sličan način, upotrebom antigena koji obuhvata ili sastoji se od CCP2 domena MASP-1 (ili MASP-3). Dvostruka MASP-1/3 antitela zatim su snimljena na inhibitornu aktivnost u funkcionalnom ispitivanju, na primer kako je opisano u TABELI 2.

[0363] MASP-1/2 dvostruka inhibitorna antitela: Kako je prikazano na FIG.4, 6 i 7A, domen serinske proteaze MASP-1 i MASP-2 sadrži regione koji su sačuvani. Prema tome, dvostruko MASP-1/2 antitelo generisano je upotrebom antigena koji obuhvata ili sastoji se od domena serinske proteaze MASP-1 (ili MASP-2) kako bi se generisalo monoklonalno antitelo kako je prethodno opisano, ili alternativno, ovaj antigen koristi se za snimanje biblioteke faga za klonove koji se specifično vezuju za ovaj antigen, praćeno skriningom na dvostruko vezivanje sa MASP-2 (ili MASP-1). Dvostruka MASP-1/2 antitela zatim su snimljena na inhibitornu aktivnost u funkcionalnom ispitivanju, na primer kako je opisano u TABELI 2.

3. Postupci za generisanje Pan-specifičnih MASP antitela:

[0364] Alfa lanac: Brojne zakrpe identiteta između MASP-2 i MASP-1/3 sugerišu da je moguće generisati monoklonalna antitela koja vezuju MASP-1/3 i MASP-2. Određenije, veći deo identiteta leži unutar CUB1-EGF-CUB2 domena, kako je prikazano na FIG.5. Razni domeni prikazani na FIG.5 identifikovani su prema Yongqing, et al., Biochemica et Biophysica Acta 1824:253-262(2012); Teillet et al., J. Biol. Chem.

283:25715-25724 (2008); i Marchler-Bauer et al., Nucleic acids Res.39:D225-229(2011).

[0365] Beta lanac: Brojne zakrpe identiteta između MASP-2 i MASP-1/3, kako je prikazano na FIG.6, mogle bi da omoguće generisanje pan-specifičnog MASP-1/2/3 inhibitora.

Postupci:

[0366] Pan-specifična MASP inhibitorna antitela (tj., antitela koja inhibiraju MASP-1, 2 i 3 aktivnost) generisana su kako sledi:

1. Skrining biblioteke protiv MASP-1/3 i MASP-2 Alfa-lanac CUB1-EGF-CUB2 domena i biraju se klonovi koji unakrno reaguju i sa MASP-1/3 i MASP-2.

2. Skrining klonova na sposobnost da inhibiraju funkcionalnu aktivnost, na primer kako je opisano u TABELI 2.

3. Upotreba tehnologije DTLacO afinitetnog/funkcionalnog sazrevanja (Yabuki et al., PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012)) radi optimizacije oba vezivanja za sva tri proteina i inhibitorne funkcije.

4. Kako je opisano u TABELI 2, pan-MASP inhibitori mogu se primeniti da inhibiraju LEA-1- i LEA-2-posredovanu aktivaciju komplementa.

4. Postupci za generisanje bispecifičnih MASP-2/3 antitela

[0367] Bispecifična MASP-2/3 inhibitorna antitela generisana su kako sledi:

1. Indetifikovana su primerna MASP-2 specifična inhibitorna antitela koja vezuju CCP1 domen i inhibiraju MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa, kako je opisano u Primerima 11-14.

11

2. MASP-3 specifična inhibitorna antitela generisana su skriningom biblioteka protiv MASP-3 polipeptida i identifikovanje MASP-3 antitela, kako je opisano u Primeru 15, praćeno ispitivanjem antitela na LEA-1 inhibitorni aktivnost u funkcionalnom ispitivanju, na primer kako je opisano u TABELI 2. Primerna MASP-3 antitela opisana su Primeru 15.

3. Antigen vezujući region specifični za MASP-2 i MASP-3 klonirani su u okviru kako bi se generisalo bi-specifično antitelo. Opisani su brojni formati bispecifičnog antitela, koji uključuju imunoglobulinske G-nalik formate kao i razne konfiguracije fuzionih proteina i jedno-lančanog varijabilnog fragmenta (Holmes, Nature Reviews, Drug Discovery 10:798-800 (2011), Müller i Kontermann, Biodrugs 24:89-98 (2010)). u jednom primeru, bispecifična antitela mogu se generisati upotrebom dva hibridoma koji ispoljavaju antitela protiv dva dinstiktivna antigena, što rezultuje kao razno uparivanje teških i lakih lanaca, čiji procenat obuhvata teški i laki lanac specifičan za jedan antigen uparen sa teškim i lakim lancem specifičan za drugi antigen (Milstein i Cuello, Zreli 305:537-539 (1983)). Slično bispecifično antitelo može se generisati rekombinantno, zajedničkim ispoljavanjem dva imunoglobulinska para teški-lanac/laki-lanac, u kojem dva teška lanca imaju antitela sa varijabilnim domenom različite specifičnosti sa željenim specifičnostima vezivanja (antitelo-antigen mesta kombinovanja) (npr. MASP-2 antitela kako je opisano u Primerima 11-14, MASP-3 antitela kako je opisano u Primeru 15) mogu biti fuzionisana za imunoglobulinsku sekvencu konstantnog domena. Fuzija je poželjno sa imunoglobulinskim konstantnim domenom teškog lanca, koji ugljučuje najmanje deo zgloba, CH2, i CH3 regiona. DNK koje kodiraju imunoglobulinske fuzije teškog lanca i, ukoliko je poželjno, imunoglobuline lakog lanca, uvedene su u odvojene ekspresione vektore, i ko-transfektovane u pogodan organizam domaćin.

[0368] Pored uparenih imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, povezivanje jedno-lančanih varijabilnih fragmenata specifičnih za dva različita cilja dato je kao primer u Kipriyanov et al., J. Mol. Biol.293:41 (1999)). U ovom Primeru, jedan polinukleotidni ekspresioni konstrukt dizajniran je da kodira dva para varijabilnih regiona teškog i lakog lanca odvojeni linkerom peptidom, sa svakim parom koji solabljuje specifičnost na dinstiktivni proteinski cilj. Nakon ekspresije, polipeptidi se sastavljaju u konfiguraciju u kojoj teški i laki lanac par specifičan za jedan cilj oblikuje jedan antigen-vezujući površinski protein, a drugi par oblikuje odvojenu antigen-vezujuću površinu, stvarajući molekul koji se naziva jednolančano dijatelo. U zavisnosti od linkera između centralnog para varijabilnih regiona teškog i lakog lanca, polipeptid takođe može biti prisiljen da se dimerizuje, što rezultuje kao obrazovanje tandem dijatela.

[0369] Na primer, DNK koja kodira sledeće imunoglobulinske polipeptidi može se umetnuti u jedan ili više vektora i izraziti u pogodnom organizmu domaćinu kako bi se generisali sledeći ilustrativni, neograničavajući primeri bi-specifičnih antitela.

11

MASP-2/3 bispecifična antitela

[0370] U jednom slučaju, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje vezuje humani MASP-2 i humani MASP-3 i obuhvata:

(I) MASP-2 region specifičnog vezivanja koji obuhvata najmanje jedan ili više od sledećih:a) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: i) CDR1 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 31-35 iz SEQ ID NO:21; i ii) CDR2 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 50-65 iz SEQ ID NO:21; i iii) CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 95-102 iz SEQ ID NO:21; i/ili najmanje jedan ili više od sledećih:b) varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: i) CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 24-34 ili SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i ii) CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 50-56 ili SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i iii) CDR3 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 89-97 ili SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i

(II) MASP-3 region specifičnog vezivanja, opciono MASP-3 region specifičnog vezivanja koji obuhvata najmanje jedan od a) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: i) CDR1 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 31-35 iz SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:26; i ii) CDR2 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 50-65 iz SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:26; i iii) CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 95-102 iz SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:26; i b) varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: i) CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 24-34 ili SEQ ID NO:28 ili SEQ ID NO:29; i ii) CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 50-56 ili SEQ ID NO:28 ili SEQ ID NO:29; i iii) CDR3 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 89-97 ili SEQ ID NO:28 ili SEQ ID NO:29.

MASP-1/2 bispecifična antitela

[0371] U jednom slučaju, obezbeđeno je bispecifično antitelo koje vezuje humani MASP-1 i humani MASP-2 i obuhvata:

(I) MASP-2 region specifičnog vezivanja koji obuhvata najmanje jedan ili više od sledećih:a) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: i) CDR1 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 31-35 iz SEQ ID NO:21; i ii) CDR2 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 50-65 iz SEQ ID NO:21; i iii) CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 95-102 iz SEQ ID NO:21; i/ili najmanje jedan ili više od sledećih:b) varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: i) CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 24-34 ili SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i ii) CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 50-56 ili SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i iii) CDR3 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 89-97 ili SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i

11

(II) MASP-1 region specifičnog vezivanja.

4. Izvodi se ispitivanje na funkcionalnu inhibitornu aktivnost protiv MASP-2 i/ili MASP-3, na primer kako je opisano u TABELI 2, i kako je ovde dalje opisano.

PRIMER 9

[0372] Ovaj Primer opisuje ispitivanje in vitro C4 cepanja koje se koristi kao funkcionalni skrining za identifikovanje MASP-2 inhibitornih agenasa sposobnih za blokiranje MASP-2-zavisne aktivacije komplementa putem L-fikolina/P35, H-fikolina, M-fikolina ili manana.

[0373] Ispitivanje C4 Cepanja: Ispitivanje C4 Cepanja opisano je od strane Petersen, S.V., et al., J. Immunol. Methods 257:107, 2001, koje meri aktivaciju lektinskog puta koja je rezultat lipoteične kiseline (LTA) na S. aureus, koja se vezuje za L-fikolin.

[0374] Reagensi: Formalin-fiksirana S. aureus (DSM20233) pripremljena je kako sledi: bakterija je uzgajana tokom noći na 37°C u krvnoj podlozi triptične soje, oprana tri puta sa PBS, zatim fiksirana tokom tokom 1 sata na sobnoj temperaturi u PBS/0.5% formalinu, i oprana dalje tri puta sa PBS, pre resuspendovanja u puferu za oblaganje (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3, pH 9.6).

[0375] Ispitivanje: Bazenčići Nunc MaxiSorb mikrotitarske ploče (Nalgene Nunc International, Rochester, NY) obloženi su sa: 100 µl formalin-fiksirane S. aureus DSM20233 (OD550= 0.5) u puferu za oblaganje sa 1 µg L-fikolina u puferu za oblaganje. Nakon preko-noćne inkubacije, bazenčići su blokirani sa 0.1% humanim serumom albuminom (HSA) u TBS (10 mM Tris-HCl, 140 mM NaCl, pH 7.4), zatim oprani sa TBS koji sadrži 0.05% Tween 20 i 5 mM CaCl2(puferom za pranje). Uzorci humanog seruma razblaženi su u 20 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton X-100, 0.1% HSA, pH 7.4, koji sprečavaju aktivaciju endogenog C4 i odvaja C1 kompleks (sastavljen od C1q, C1r i C1s). MASP-2 inhibitorni agensi, koji uključuju MASP-2 MoAb-a, dodati su u uzorke seruma pri raznim koncentracijama. Razblaženi uzorci dodati su u ploču i inkubisani tokom noći na 4°C. Nakon 24 sata, ploče su oprane detaljno puferom za pranje, zatim su 0.1 µg prečišćenog humanog C4 (dobijen kako je opisano u Dodds, A.W., Methods Enzymol.223:46, 1993) u 100 µl 4 mM barbitala, 145 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7.4 dodati u svaki bazenčić. Nakon 1.5 sata na 37°C, ploče su oprane ponovo i C4b taloženje je detektovano upotrebom alkalna fosfataza-konjugovanog pile

eg anti-humanog C4c (dobijen od Immunsistem, Uppsala, Sweden) i izmereno upotrebom kolorimetričnog supstrat p-nitrofenil fosfata.

[0376] C4 Ispitivanje na mananu: Prethodno opisano ispitivanje prilagođeno je kako bi se izmerila

11

aktivacija lektinskog puta putem MBL oblaganja ploča sa LSP i mananom pre dodavanja sruma umešanog sa raznim MASP-2 inhibitornim agensima.

[0377] C4 ispitivanje na H-fikolinu (Hakata Ag): T Prethodno opisano ispitivanje prilagođeno je kako bi se izmerila aktivacija lektinskog puta putem H-fikolin oblaganja ploča sa LPS i H-fikolinom pre dodavanja seruma umešanog sa raznim MASP-2 inhibitornim agensima.

PRIMER 10

[0378] Sledeće ispitivanje upotrebljeno je da se ispita da li MASP inhibitorni agens blokira klasični put analiziranjem efekta MASP inhibitornog agensa pod uslovima u kojem je klasični put pokrenut imunim kompleksom.

[0379] Postupci: Kako bi se ispitao efekat MASP inhibitornog agensa na uslovima aktivacije komplementa u kojima je klasični put pokrenut imunim kompleksom, triplikat 50 µl uzoraka koji sadrži 90% NHS inkubisano je na 37°C u prisustvu 10 µg/mL imunog kompleksa ili PBS, a paralelni triplikat uzorci (+/- imuni kompleks) takođe su uključeni sadržavajući 200 nM anti-properdin monoklonalno antitelo tokom 37°C inkubacije. Nakon dv-časovne inkubacije na 37°C, 13 mM EDTA je dodata svim uzorcima kako bi se zaustavila dalja aktivacija komplementa, a uzorci su odmah ohlađeni na 5°C. Uzorci su zatim odloženi na -70°C pre ispitivanja na proizvode aktivacije komplementa (C3a i sC5b-9) upotrebom ELISA kompleta (Quidel, Catalog Nos. A015 i A009) prateći instrukcije proizvođača.

PRIMER 11

[0380] Ovaj Primer opisuje identifikaciju visoko afinitetnih MASP-2 Fab2 fragmenata anititela koji blokiraju MASP-2 aktivnost.

[0381] Pozadina i obrazloženje: MASP-2 je kompleksni protein sa mnogim odvojenim funkcionalnim domenima, koji uključuju: mesto(a) vezivanja za MBL i fikoline, mesto katalize serinske proteaze, mesto vezivanja za proteolitički supstrat C2, mesto vezivanja za proteolitički supstrat C4, MASP-2 mesto cepanje za autoaktivaciju MASP-2 zimogena, i dva Ca<++>mesta vezivanja. Identifikovani su Fab2 fragmenti anititela koji se vezuju sa visokim afinitetom za MASP-2, a identifikovani Fab2 fragmenti ispitani su u funkcionalnom ispitivanju za određivanje da li mogu da blokiraju MASP-2 funkcionalnu aktivnost.

[0382] Da bi blokirali MASP-2 funkcionalnu aktivnost, antitelo ili Fab2 fragment anititela mora se vezati i umešati u strukturni epitop na MASP-2 koji je potreban za MASP-2 funkcionalnu aktivnost. Prema tome, mnogi ili svi visoko-afinitetni vezujući MASP-2 Fab2s ne moraju da inhibiraju MASP-2 funkcionalnu

11

aktivnost ukoliko se vezuju za strukturne epitope na MASP-2 koji su direktno uključeni u MASP-2 funkcionalnu aktivnost.

[0383] Funkcionalno ispitivanje koje meri inhibiciju obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta korišćeno je da proceni "blokirajuću aktivnost" MASP-2 Fab2s. Poznato je da je primarna fiziološka uloga MASP-2 u lektinskom putu da se generiše sledeća funkcionalna komponenta lektin-posredovanog komplementnog puta, određenije C3 konvertaza lektinskog puta. C3 konvertaza lektinskog puta je kritični enzimski kompleks (C4bC2a) koji proteolitički cepa C3 u C3a i C3b. MASP-2 nije strukturna komponenta C3 konvertaze lektinskog puta (C4bC2a); međutim, MASP-2 funkcionalna aktivnost je neophodna kako bi se generisale dve proteinske komponente (C4b, C2a) koje obuhvataju C3 konvertazu lektinskog puta. Pored toga, sve odvojene funkcionalne aktivnosti MASP-2 navedene gore čini se da su neophodne kako bi MASP-2 generisao C3 konvertazu lektinskog puta. Iz ovih razloga, poželjno ispitivanje koje bi se koristilo u proceni "blokirajuće aktivnosti" MASP-2 Fab2s smatra se da je funkcionalno ispitivanje koje meri inhibiciju formiranja C3 konvertaze lektinskog puta.

[0384] Generisanje visoko afinitetnih Fab2s: Biblioteke prikaza faga humanih sekvenci antitela varijabilnih lakih i teških lanaca i automatizovana tehnologija za odabir antitela za identifikovanje Fab2s koji reaguju sa odabranim ligandima od interesa korišćene su da se kreiraju visoko-afinitetni Fab2s za pacovski MASP-2 protein (SEQ ID NO: 13). Poznata količina pacovskog MASP-2 (∼1 mg, >85% čist) protein korišćen je za skrining antitela. Tri kriga amplifikacije kroišćeno je za odabir antitela sa najboljim afinitetom. Približno 250 različitih naznaka koje ispoljavaju fragmenti anititela pokupljene su za ELISA skrining. Visoko afinitetne naznake naknadno su sekvencionisane za određivanje jedinstvenosti različitih antitela.

[0385] Pedeset jedinstvenih MASP-2 antitela prečišćeno je i 250 µg svakog prečišćenog Fab2 antitela korišćeno je za karakterizaciju MASP-2 afiniteta vezivanja i funkcionalnog ispitivanja puta komplementa, kako je detaljnije opisano u nastavku.

Ispitivanja primenjena za procenu inhibitorne (blokirajuće) aktivnosti MASP-2 Fab2s

1. Ispitivanje u cilju merenja inhibicije obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta:

[0386] Pozadina: C3 konvertaza lektinskog puta je enzimski kompleks (C4bC2a) koji proteolitički cepa C3 u dva potentna prozapaljenska fragmenta, anafilatoksin C3a i opsonični C3b. Obrazovanje C3 konvertaze čini se da je ključni korak u lektinskom putu u smilsu da posreduje zapaljenje. MASP-2 nije strukturna komponenta C3 konvertaze lektinskog puta (C4bC2a); prema tome MASP-2 antitela (ili Fab2) ne inhibiraju direktno aktivnost prethodno postojeće C3 konvertaze. Međutim, aktivnost MASP-2

12

serinske proteaze potrebna je kako bi se generisale dve proteinske komponente (C4b, C2a) koje obuhvataju C3 konvertazu lektinskog puta. Prema tome, MASP-2 Fab2, koji inhibira MASP-2 funkcionalnu aktivnost (tj., koji blokira MASP-2 Fab2) inhibira de novo obrazovanje C3 konvertaze lektinskog puta. C3 sadrži neobično i veoma reaktivnu tioestar grupu kao deo njegove strukture. Nakon cepanja C3 putem C3 konvertaze u ovom ispitivanju, tioestar grupa na C3b može da obrazuje kovalentnu vezu sa hidroksil ili amino grupama na makromolekulima imobilisanim na dnu plastičnih bazenčića putem estar ili amidnog povezivanja, čime se olakšava detektovanje C3b u ELISA ispitivanju.

[0387] Manan kvasca poznat je aktivator lektinskog puta. U sledećem postupku kako bi se izmerilo obrazovanje C3 konvertaze, plastični bazenčići obloženi mananom inkubisani su tokom 30 minuta na 37°C sa razblaženim pacovskim serumom za aktiviranje lektinskog puta. Bazenčići su zatim oprani i ispitani na C3b imobilisan na bazenčićima upotrebom standardih ELISA postupaka. Količina C3b generisanog u ovom ispitivanju je direktan odraz de novo obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta. MASP-2 Fab2s pri odabranim koncentracijama testirani su u ovom ispitivanju na njihovu sposobnost da inhibiraju obrazovanje C3 konvertaze i posledično generisanje C3b.

Postupci:

[0388] Costar ploče sa umerenim vezivanjem sa 96 bazenčića inkubisane su tokom noći na 5°C mananu razblaženom u 50 mM karbonatnom puferu, pH 9.5 pri 1 µg/50 µl/bazenčić. Nakon preko noćne inkubacije, svaki bazenčić je opran tri puta sa 200 µl PBS. Bazenčići su zatim blokirani sa 100 µl/bazenčić 1% goveđeg serumskog albumina u PBS i inkubisani tokom jednog sata na sobnoj temperaturi uz nežno umešavanje. Svaki bazenčić zatim je opran tri puta sa 200 µl PBS. MASP-2 Fab2 uzorci razblaženi su do odabranih koncentracija u Ca<++>i Mg<++>koji sadrži GVB pufer (4.0 mM barbital, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% želatin, pH 7.4) na 5°C. A 0.5% pacovski serum dodat je u u gornje uzorke na 5°C i 100 µl transferovan je u svaki bazenčić. Ploče su prekrivene i inkubisane tokom 30 minuta na 37°C vodenom kupatilu kako bi se omogućila aktivacija komplementa. Reakcija je zaustavljena transferovanjem ploča iz 37°C vodenog kupatila u kontejner koji sadrži ledeno vodenu mešavinu. Svaki bazenčić opran je pet puta sa 200 µl sa PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20 u PBS), zatim oprani dva puta sa 200 µl PBS.100 µl/bazenčić 1:10,000 razblaženja primarnog antitela (zečiji anti-humani C3c, DAKO A0062) dodato je u PBS koji sadrži 2.0 mg/mL goveđeg serumskog albumina i inkubisano 1 sat na sobnoj temperaturi uz nežno umešavanje. Svaki bazenčić opran je 5 puta sa 200 µl PBS.100 µl/bazenčić 1:10,000 razblaženja sekundarnog antitela (peroksidaza-konjugovano kozje anti-zečije IgG, American Qualex A102PU) dodato je u PBS koji sadrži 2.0 mg/mL goveđeg serumskog albumina i inkubisano tokom jednog sata na sobnoj temperaturi na mešaču uz nežno umešavanje. Svaki bazenčić opran je pet puta sa 200 µl sa PBS.100 µl/bazenčić peroksidaza supstrata TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) dodato je i inkubisano na sobnoj temperaturi 10 minuta. Peroksidaza reakcija zaustavljena je dodavanjem 100 Tl/bazenčić 1.0 M H3PO4i izmerena je OD450.

2. Ispitivanje kako bi se izmerila Inhibicija MASP-2-zavisnog C4 Cepanja

[0389] Pozadina: Serinska proteaza aktivnost MASP-2 veoma je specifična i samo dva proteinska supstrate za MASP-2 su indetifikovana; C2 i C4. Cepanje C4 generiše C4a i C4b. MASP-2 Fab2 može se vezati za strukturne epitope na MASP-2 koji su direktno uključeni u C4 cepanje (npr., MASP-2 mesto vezivanja za C4; katalitičko mesto MASP-2 serinske proteaze) i čime inhibiraju C4 cepanje funkcionalne aktivnosti MASP-2.

[0390] Manan kvasca je poznat aktivator lektinskog puta. U sledećem postupku kako bi se izmerila aktivnost C4 cepanja za MASP-2, plastični bazenčići obložen mananom su inkubisani tokom 30 minuta na 37°C sa razblaženim pacovskim serumom za aktiviranje lektinskog puta. Kako primarno antitelo korišćeno u ovom ELISA ispitivanju prepoznaje samo humani C4, razblaženi pacovski serum takođe je dopunjen sa humanim C4 (1.0 µg/mL). Bazenčići su zatim oprani i ispitani na humani C4b imobilisan na bazenčićima upotrebom standardnih ELISA postupaka. Količina C4b generisanog u ovom ispitivanju je mera ativnosti MASP-2-zavisnog C4 cepanja. MASP-2 Fab2 pri odabranim koncentracijama ispitan je u ovom ispitivanju na sposobnost da inhibira C4 cepanje.

[0391] Postupci: Costar ploče sa umerenim vezivanjem sa 96 bazenčića inkubisane su tokom noći na 5°C mananom razblaženom u 50 mM karbonatnom puferu, pH 9.5 na 1.0 Tg/50 µl/bazenčić. Svaki bazenčić opran je 3 puta sa 200 µl PBS. Bazenčići su zatim blokirani sa 100 µl/bazenčić 1% goveđeg serumskog albumina u PBS i inkubisani tokom jednog sata na sobnoj temperaturi uz nežno umešavanje. Svaki bazenčić opran je 3 puta sa 200 µl PBS. MASP-2 Fab2 uzorci razblaženi su do odabranih koncentracija u Ca<++>i Mg<++>koji sadrži GVB pufer (4.0 mM barbital, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% želatin, pH 7.4) na 5°C.1.0 µg/mL humani C4 (Quidel) takođe je uključen u ove uzorke.0.5% pacovski serum dodat je u gornje uzorke na 5°C i 100 µl transferovan u svaki bazenčić. Ploče su prekrivene i inkubisane tokom 30 minuta na 37°C vodenom kupatilu kako bi se omogućila aktivacija komplementa. Reakcija je zaustavljena transferovanjem ploča iz 37°C vodenog kupatila u kontejner koji sadrži ledeno vodenu mešavinu. Svaki bazenčić opran je 5 puta sa 200 µl sa PBS-Tween 20 (0.05% Tween 20 u PBS), zatim je svaki bazenčić opran 2 puta sa 200 µl PBS.100 µl/bazenčić 1:700 razblaženje biotin-konjugovanog pilećeg anti-humanog C4c (Immunsistem AB, Uppsala, Sweden) dodato je u PBS koji sadrži 2.0 mg/mL goveđeg serumskog albumina (BSA) i inkubisano jedan sat na sobnoj temperaturi uz nežno umešavanje. Svaki bazenčić opran je 5 puta sa 200 µl PBS.100 µl/bazenčić 0.1 µg/mL peroksidaza-konjugovanog streptavidina (Pierce Chemical #21126) dodato je u PBS koji sadrži 2.0 mg/mL BSA i inkubisano tokom jednog sata na sobnoj temperaturi na mešaču uz nežno umešavanje. Svaki bazenčić opran je 5 x 200 µl sa PBS.100 µl/bazenčić peroksidaza supstrata TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) dodato je i inkubisano na sobnoj temperaturi 16 min. Peroksidaza reakcija zaustavljena je dodavanjem 100 µl/bazenčić 1.0 M H3PO4i i izmerena je OD450.

3. Ogled vezivanja antipacovskog MASP-2 Fab2 za 'Nativni' pacovski MASP-2

[0392] Pozadina: MASP-2 je obično prisutan u plazmi kao MASP-2 dimer kompleks koji takođe uključuje specifične lektin molekule (manoza-vezujući protein (MBL) i fikolini). Prema tome, Ukoliko postoji potreba da se ispituje vezivanje MASP-2 Fab2 za fiziološki relevant oblik MASP-2, važno je da se razvije ogled vezivanja u kojem se koristi interakcija između Fab2 i 'nativni' MASP-2 u plazmi, pre nego prečišćeni rekombinantni MASP-2. U ovom ogledu vezivanja, 'nativni' MASP-2-MBL kompleks iz 10% pacovskog seruma prvo je imobilisan na mananom-obloženim bazenčićima. Afinitet vezivanja raznih MASP-2 Fab2s za imobilisan 'nativni' MASP-2 zatim je ispitano upotrebom standardog ELISA postupka.

[0393] Postupci: Costar ploče sa visokim vezivanjem sa 96 bazenčića inkubisane su tokom noći na 5°C mananom razblaženom u 50 mM karbonatnom puferu, pH 9.5 na 1 µg/50 µl/bazenčić. Svaki bazenčić opran je 3 puta sa 200 µl PBS. Bazenčići su blokirani sa 100 µl/bazenčić 0.5% nemasnim suvim mlekom u PBST (PBS sa 0.05% Tween 20) i inkubisani tokom jednog sata na sobnoj temperaturi uz nežno umešavanje. Svaki bazenčić opran je 3 puta sa 200 µl of TBS/Tween/Ca<++>Pufer za pranje (Trispuferovanim slanim rastvorom, 0.05% Tween 20, koji sadrži 5.0 mM CaCl2, pH 7.4.10% pacovski serum u veoma slanom vezujućem puferu (20 mM Tris, 1.0 M NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Triton-X100, 0.1% (w/v) goveđi serumski albumin, pH 7.4) pripremljen je na ledu.100 µl/bazenčić dodato je i inkubisano tokom noći na 5°C. Bazenčići su oprani 3 puta sa 200 µl TBS/Tween/Ca<++>Puferom za pranje. Bazenčići su zatim oprani 2 puta sa 200 µl PBS.100 µl/bazenčić odabrane koncentracije MASP-2 Fab2 razblaženog u Ca<++>i Mg<++>koji sadrži GVB Pufer (4.0 mM barbital, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% želatin, pH 7.4) dodato je i inkubisano tokom jednog sata na sobnoj temperaturi uz nežno umešavanje. Svaki bazenčić opran je 5 puta sa 200 µl PBS.100 µl/bazenčić HRP-konjugovanog kozjeg anti-Fab2 (Biogenesis Cat No 0500-0099) razblažen 1:5000 u 2.0 mg/mL goveđeg serumskog albumina u PBS dodato je i inkubisano tokom jednog sata na sobnoj temperaturi uz nežno umešavanje. Svaki bazenčić opran je 5 puta sa 200 µl PBS.100 µl/bazenčić peroksidaze supstrata TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories) dodato je i inkubisano na sobnoj temperaturi 70 minuta. Reakcija peroksidaze zaustavljena je dodavanjem 100 µl/bazenčić 1.0 M H3PO4i OD450je izmereno.

REZULTATI:

12

[0394] Približno 250 različitih Fab2s koji reaguju sa visokim afinitetom sa pacovskim MASP-2 proteinom uzeti su za ELISA skrining. Ovi visoko-afinitetni Fab2s sekvencionirani su za određivanje jedinstvenosti različitih antitela, i 50 jedinstvenih MASP-2 antitela prečišćena su za dalje analiziranje.250 ug svakog prečišćenog Fab2 antitela korišćeno je za karakterizaciju MASP-2 afinitet vezivanja i funkcionalnog ispitivanja puta komplementa. Rezultati ovog analiziranja prikazani su ispod u TABELI 13.

TABELA 13: MASP-2 FAB2 KOJI BLOKIRA AKTIVACIJA LEKTINSKOG PUTA KOMPLEMENTA

[0395] Kako je prikazano gore u TABELI 13, od testiranih 50 MASP-2 Fab2s, 17 je identifikovano kao MASP-2-blokirajući Fab2s koji potentno inhibiraju Obrazovanje C3 konvertaze sa IC50jednakim ili manjim od 10 nM Fab2s ( 34% pozitivna stopa pogotka). Osam od 17 Fab2s identifikovano je da iamju IC50s u podnormalnom opsegu. Pored toga, svih sedamnaest MASP-2 blokirajućih Fab2s prikazanih u TABELI 13 dali su suštinski kompletnu inhibiciju obrazovanja C3 konvertaze u ispitivanju C3 konvertaze lektinskog puta. Ovo predstavlja značajno pitanje, budući da je teoretski moguće da "blokirajući" Fab2 mogu samo frakciono da inhibiraju MASP-2 funkciju čak i kada je svaki MASP-2 molekul povezan putem Fab2.

[0396] Iako je manan poznat aktivator lektinskog puta, teoretski je moguće da prisustvo anti-manan antitela u pacovskom serumu mogu takođe da aktiviraju klasični put i generišu C3b putem C3 konvertaze klasičnog puta. Međutim, svaki od sedamnaest blokirajućih MASP-2 Fab2s navedeni u ovom Primeru potentno inhibiraju C3b generisanje (>95 %), čime se demonstrira specifičnost ovog ispitivanja na C3 konvertazu lektinskog puta.

[0397] Ogledi vezivanja takođe su izvedeni sa svih sedamnaest blokirajućih Fab2s kako bi se izračunala očigledna Kdza svaki. Rezultati ogleda vezivanja antipacovskog MASP-2 Fab2s za nativni pacovski MASP-2 za šest blokirajućih Fab2s takođe su prikazani u TABELI 13. Slični ogledi vezivanja takođe su izvedeni za druge Fab2s, koji rezultati su prikazani u TABELI 13. Generalno, očigledne Kds dobijene za vezivanje svakog od šest Fab2s za 'nativni' MASP-2 odgovara razumno IC50za Fab2 u u funkcionalnom ispitivanju C3 konvertaze. To je dokaz da MASP-2 prolazi konformacionu promenu od 'neaktivnog' u 'aktivan' oblik nakon aktivacije njihovih proteaza aktivnosti (Feinberg et al., EMBO J 22:2348-59 (2003); Gal et al., J. Biol. Chem.280:33435-44 (2005)). U normalnoj pacovskoj plazmi koja se koristi u ispitivanju obrazovanja C3 konvertaze, MASP-2 je prisutan primarno u 'neaktivnoj' zimogen konformaciji. Nasuprot tome, u ogledu vezivanja, MASP-2 je prisutan kao deo kompleksa sa MBL povezanim za imobilisan manan; prema tome, MASP-2 bi bio u 'aktivnoj' konformaciji (Petersen et al., J. Immunol Methods 257:107-16, 2001). Shodno tome, može se očelivati tačna korenspodencija između IC50i Kdza svaki od sedamnaest blokirajućih Fab2 testiranih u ova dva funkcionalna ispitivanja jer, u svakom ispitivanju, Fab2 bi vezivao različit konformacioni oblik MASP-2. Ipak, sa izuzetkom od Fab2 #88, čini se da postoji veoma bliska korenspondecija između IC50i očiglednog Kdza svaki od ostalih šesnaest Fab2 testiranih u dva ispitivanja (videti TABELU 13).

[0398] Nekoliko blokirajućih Fab2s procenjeni su na inhibiciju MASP-2-posredovanog cepanja C4. Kako je prikazano u TABELI 13, pronađeno je da svi testirani Fab2s inhibiraju C4 cepanje sa IC50s sličnim onima dobijenim u ispitivanju C3 konvertaze.

[0399] Iako je manan poznat aktivator lektinskog puta, teoretski je moguće da prisustvo anti-manan antitela u pacovskom serumu može takođe da aktivira klasični put i čime generiše C4b putem C1sposredovanog cepanja C4. Međutim, identifikovano je da nekoliko MASP-2 Fab2s potentno inhibiraju C4b generisanje (>95 %), čime se demonstrira specifičnost ovog ispitivanja na MASP-2-posredovano C4

12

cepanje. C4, poput C3, sadrži neobičnu i veoma reaktivnu tioestar grupu kao deo njegove strukture. Nakon cepanja C4 putem MASP-2 u ovom ispitivanju, tioestar grupa na C4b može da obrazuje kovalentnu vezu sa hidroksil ili amino grupama na makromolekulima imobilisanim na dnu plastičnih bazenčića putem estarskog ili amidnog povezivanja, čime se olakšava detektovanje C4b u ELISA ispitivanju.

[0400] Ova ispitivanja jasno pokazuju kreiranje visoko afinitetnih FAB2s za pacovski MASP-2 protein koji funkcionalno blokiraju obe i C4 i C3 konvertaza aktivnosti, čime se sprečava aktivacija lektinskog puta.

PRIMER 12

[0401] Ovaj Primer opisuje epitopno mapiranje za nekoliko blokirajućih anti-pacovskih MASP-2 Fab2 antitela koja su generisana kako je opisano u Primeru 11.

Postupci:

[0402] Sledeći proteini, svi sa N-terminalnim 6X His oznakama izraženi su u CHO ćelijama upotrebom pED4 vektora:

pacovski MASP-2A, MASP-2 protein pune dužine, inaktiviran menjanjem serina na aktivnom centru u alanin (S613A);

pacovski MASP-2K, MASP-2 protein pune dužine izmenjen da redukuje autoaktivaciju (R424K);

CUBI-11, N-terminalni fragment pacovskog MASP-2 koji sadrži samo CUBI, EGF-nalik i CUBII domeni; i CUBI/EGF-nalik, N-terminalni fragment pacovskog MASP-2 koji sadrži samo CUBI i EGF-nalik domene.

[0403] Ovi proteini prečišćeni su iz supernatanata kulture nikl-afinitetnom hromatografijom, kako je prethodno opisano (Chen et al., J. Biol. Chem.276:25894-02 (2001)).

[0404] C-terminalni polipeptid (CCPII-SP), koji sadrži CCPII i domen serinske proteaze pacovskog MASP-2, izraženi su u E. coli kao tioredoksin fuzioni protein upotrebom pTrxFus (Invitrogen). Protein je prečišćen od ćelijskih lizata upotrebom Thiobond afinitetne smole. Tioredoksin fuszioni partner izražen je iz praznog pTrxFus kao negativna kontrola.

[0405] Svi rekombinantni proteini dijalizovani su u TBS puferu, a njihove koncentracije određene merenjem OD na 280 nm.

Dot-blot analiza:

12

[0406] Serijska razblaženja pet rekombinantnih MASP-2 polipeptida prethodno opisanih (i tioredoksin polipeptid kao negativna kontrola za polipeptid CCPII-serinske proteaze) primećeni su na nitrocelularnoj membrani. Količina proteina primećena kreće se od 100 ng do 6.4 pg, u petostrukim koracima. U poslednjim eksperimentima, količina primećenog proteina kretala se od 50 ng do 16 pg, ponovo u petostrukim koracima. Membrane su blokirane sa 5% obranim mlekom u prahu u TBS (blokirajući pufer) zatim inkubisane sa 1.0 µg/mL MASP-2 Fab2s u blokirajućem pufer (koji sadrži 5.0 mM Ca<++>). Povezani Fab2s primećeni su upotrebom HRP-konjugovanog anti-human Fab (AbD/Serotec; razblažen 1/10,000) i ECL detekcionim kompletom (Amersham). Jedna membrana inkubisana je sa poliklonalnim zečijim-anti humanim MASP-2 Ab (opisano in Stover et al., J Immunol 163:6848-59 (1999)) kao pozitivna kontrola. U ovom slučaju, povezano Ab detektovano je upotrebom HRP-konjugovanog kozjeg anti-zečijeg IgG (Dako; razblaženje 1/2,000).

MASP-2 Ogled vezivanja:

[0407] ELISA ploče obložene su sa 1.0 µg/bazenčić rekombinantnog MASP-2A ili CUBI-II polipeptida u karbonatnom puferu (pH 9.0) tokom noći na 4°C. Bazenčići su blokirani sa 1% BSA u TBS, zatim su serijska razblaženja MASP-2 Fab2s dodata u TBS koji sadrži 5.0 mM Ca<++>. Ploče su inkubisane tokom jednog sata na ST. Nakon pranja tri puta sa TBS/tween/Ca<++>, HRP-konjugovani anti-humani Fab (AbD/Serotec) razblažen 1/10,000 u TBS/Ca<++>dodat je i ploče su inkubisan tokom dodatnog sata na sobnoj temperaturi. Povezano antitelo detektovano je upotrebom TMB peroksidaza supstcionog kompleta (Biorad).

Rezultati:

[0408] Rezultati dot-blot analize koja pokazuje reaktivnost Fab2s sa raznim MASP-2 polipeptidima obezbeđeni su u donjoj TABELI 14. Numeričke vrednosti obezbeđene u TABELI 14 ukazuju na količinu primećenog proteina potrebnog da približno da polu-maksimalnu jačinu signala. Kako je prikazano, svi polipeptidi (sa izuzetkom od samog tioredoksin fuzionog partnera) prepoznati su od strane pozitivnog kontrolog Ab (poliklonalni anti-humani MASP-2 serumi, pokrenuti u zečevima).

TABELA 14: REAKTIVNOST SA RAZNIM REKOMBINANTNIM PACOVSKIM MASP-2 POLIPEPTIDIMA U DOT BLOT-ovima

12

[0409] Svi Fab2s su reagovali sa MASP-2A kao i MASP-2K (podaci nisu prikazani). Veći deo Fab2s prepoznao je CCPII-SP polipeptid, ali ne i N-terminalne fragmente. Dva izuzetka su Fab2 #60 i Fab2 #57. Fab2 #60 prepoznaje MASP-2A i CUBI-II fragment, ali ne i CUBI/EGF-nalik polipeptid ili CCPII-SP polipeptid, sugerišući da se vezuje za epitop u CUBII, ili obuhvatajući CUBII i EGF-nalik domen. Fab2 # 57 prepoznaje MASP-2A ali ni jedan od testiranih MASP-2 fragmenata, što verovatno ukazuje da ovaj Fab2 prepoznaje epitop u CCP1. Fab2 #40 i #49 povezani su samo za kompletan MASP-2A. U ELISA ogledu vezivanja, Fab2 #60 je takođe povezan zaCUBI-II polipeptid, iako je očigledan nešto niži afinitet (podaci nisu prikazani).

[0410] Ovi nalazi pokazuju identifikaciju jedinstvenih blokirajućih Fab2s u višestrukim regionima MASP-2 proteina.

PRIMER 13

12

[0411] Ovaj Primer opisuje farmakodinamička analiziranje reprezentativnih visoko-afinitetnih MASP-2 Fab2 antitela koja su identifikovana kako je opisano u Primeru 11.

Pozadina/Obrazloženje:

[0412] Kako je opisano u Primeru 11, kako bi se identifikovala visoko-afinitet antitela koja blokiraju pacovski lektinski put, pacovski MASP-2 protein korišćen je za sušenje biblioteke prikaza faga. Ova biblioteka dizajnirana je kako bi se obezbedila visoka imunološka različitost i konstruisan je upotrebom potpuno humane imunoglobulinske genske sekvence. Kako je prikazano u Primeru 11, približno 250 pojedinačnih klonova faga identifikovano je da su povezani sa visokim afinitetom sa pacovskim MASP-2 proteinom ELISA skriningom. Sekvencionisanje ovih klonova identifikovano je sa 50 jedinstvenih MASP-2 antitelo-kodirajućih faga. Fab2 protein izražen je iz ovih klonova, prečišćen i analiziran na MASP-2 afinitet vezivanja i funkcionalnu inhibiciju komplementa lektinskog puta.

[0413] Kako je prikazano u TABELI 13 Primera 11, 17 MASP-2 Fab2s sa funkcionalnom blokirajućom aktivnosti identifikovani su kao rezultat ove analize ( 34% stopa pogotka za blokirajuća antitela).

Funkcionalna inhibicija komplementa lektinskog puta putem Fab2s očigledna je nanivou C4 taloženja, koje direktno meri C4 cepanja putem MASP-2. Značajno, inhibicija je jednako evidentna kada je procenjivana aktivnost C3 konvertaze, što pokazuje funkcionalno blokiranje komplementa lektinskog puta. 17 MASP-2 blokirajući Fab2s identifikovani su da kako je opisano u Primeru 11 potentno inhibiraju obrazovanje C3 konvertaze sa IC50vrednostima jednakim ili manjim od 10 nM. Osam od 17 Fab2s identifikovano je da imaju IC50vrednosti u pod-nanomolarnom opsegu. Pored toga, svih 17 MASP-2 blokirajućih Fab2s dali su suštinski kompletnu inhibiciju obrazovanja C3 konvertaze u u ispitivanju C3 konvertaze lektinskog puta, kako je sumirano u TABELI 13 Primera 11. Štaviše, svaki od 17 blokirajućih MASP-2 Fab2s prikazanih u TABELI 13 potentno inhibiraju C3b generisanje (>95%), čime se demonstrira specifičnost ovog ispitivanja na C3 konvertazu lektinskog puta.

[0414] Izotipne varijante pacovskog IgG2c i mišjeg IgG2a antitela pune dužine izvedene su iz Fab2 #11. Ovaj Primer opisuje in vivo karakterizaciju ovih izotipova za farmakodinamičke parametre.

Postupci:

[0415] Kako je opisano u Primeru 11, pacovski MASP-2 protein korišćen je za sušenje Fab biblioteke prikaza faga, iz koje Fab2 #11 je identifikovan. Izotipne varijante pacovskog IgG2c i mišjeg IgG2a antitela pune dužine izvedene su iz Fab2 #11. Oba izotipa i pacovsko IgG2c i mišje IgG2a antitelo pune dužine okarakterisani su in vivo na farmakodinamičke parametre kako sledi.

12

In vivo ispitivanje kod miševa:

[0416] Farmakodinamičko ispitivanje izvedeno je na miševima kako bi se ispitao efekat doziranja MASP-2 antitela na plazma aktivnost lektinskog puta in vivo. U ovom ispitivanju, C4 taloženje je izmereno ex vivo u ispitivanju lektinskog puta u različitim vremenskim tačkama nakon subkutanog (sc) i intraperitonealnog (ip) davanja 0.3 mg/kg ili 1.0 mg/kg mišjeg MASP-2 MoAb (izotip mišjeg IgG2a antitela pune dužine izveden iz Fab2#11).

[0417] FIG.29A grafički prikazuje specifično C4b taloženje lektinskim putem na zimosanom-obloženoj mikrotitarskoj ploči, izmereno ex vivo u nerazblaženim uzorcima seruma uzetim od miševa (n=3 miševi/grupa) u različitim vremenskim tačkama nakon subkutanog doziranja ili 0.3 mg/kg ili 1.0 mg/kg mišjeg MASP-2 MoAb. Uzorci seruma iz miševa sakupljeni su doziranja antitela koje je služilo kao negativna kontrola (100% aktivnost), dok je serum dopunjena in vitro sa 100 nM istog blokirajućeg MASP-2 antitela korišćen kao pozitivna kontrola (0% aktivnost).

[0418] Rezultati prikazani na FIG.29A pokazuju rapidnu i kompletnu inhibiciju C4b taloženja nakon subkutanog davanja 1.0 mg/kg doze mišjeg MASP-2 MoAb. Delimična inhibicija C4b taloženja primećena je nakon subkutanog davanja doze od 0.3 mg/kg mišjeg MASP-2 MoAb.

[0419] Vremenski tok izolovanja lektinskog puta praćen je tokom tri nedelje nakon jednog ip davanja mišjeg MASP-2 MoAb pri 0.6 mg/kg kod miševa. Kako je prikazano na FIG.29B, nagli pad u aktivnosti lektinskog puta javlja se nakon doziranja antitela praćeno kompletnom inhibicijom lektinskog puta koja je trajala tokom oko 7 dana nakon i.p. davanja. Spor povraćaj aktivnosti lektinskog puta primećen je tokom druge i treće nedelje, sa kompletnim povraćajem lektinskog puta kodmiševa 17 dana nakon MASP-2 MoAb davanja.

[0420] Ovi rezultati pokazuju da mišje MASP-2 Moab izvedeno iz Fab2 #11 inhibira lektinski put miševa na dozno-zavisan način kada se dostavlja sistemski.

PRIMER 14

[0421] Ovaj Primer opisuje identifikaciju, upotrebom prikaz faga, potpuno humanih scFv antitela koja se vezuju MASP-2 i inhibiraju lektin-posredovanu aktivaciju komplementa (LEA-2) ostavljajući klasični (C1qzavisan) put komponenata imunog sistema intaktnim.

Pregled:

1

[0422] Potpuno humana, visoko-afinitetna MASP-2 antitela identifikovana su skriningom biblioteke prikaza faga. Varijabilni fragmenti lakog i teškog lanca antitela izolovani su u oba i scFv formatu i u IgG formatu pune dužine. Humana MASP-2 antitela korisna su za inhibiranje ćelijske povrede povezane sa lektinski put-posredovanom aktivacijom komplementa alternativnog puta ostavljajući klasični (C1qzavisan) put komponente imunog sistema intaktnim. U nekim slučajevima, predmetna MASP-2 inhibitorna antitela imaju sledeće karakteristike: (a) visoki afinitet za humani MASP-2 (npr., KD10 nM ili manje), i (b) inhibiraju MASP-2-zavisnu komplement aktivnost u 90% humanom serumu sa IC5030 nM ili manje.

Postupci:

Ekspresija katalitički neaktivnog MASP-2 pune dužine:

[0423] cDNK sekvenca pune dužine humanog MASP-2 (SEQ ID NO: 4), koja kodira humani MASP-2 polipeptid sa vodećom sekvencom (SEQ ID NO:5) podkloniran je u sisarski ekspresioni vektor pCI-Neo (Promega), koji vodi eukariotsku ekspresiju pod kontrolom CMV pojačivačkog/promoterskog regiona (opisano u Kaufman R.J. et al., Nucleic acids Research 19:4485-90, 1991; Kaufman, Methods in Enzymology,185:537-66 (1991)).

Kako bi se generisao katalitički neaktivan humani MASP-2A protein, mestom-usmerena mutageneza izvedena je kako je opisano u US2007/0172483. PCR proizvodi prečišćeni su nakon elektroforeze na agaroza gelu i trakastom preparatu, a jednostruka adenozin preklapanja generisana su upotrebom standardne procedure zatvaranja. Adenozinom zatvoren MASP-2A zatim je kloniran u pGEM-T lakiu vektor i transformisan u E. coli. Humani MASP-2A dalje je podkloniran u bilo koji od sisarskih ekspresionih vektora pED ili pCI-Neo.

[0424] Prethodno opisani MASP-2A ekspresioni konstrukt transfektovan je u DXB1 ćelijama upotrebom standardnom procedurom kalcijum fosfatne transfekcije (Maniatis et al., 1989). MASP-2A je proizveden u podlozi bez seruma kako bi se obezbedili preparati koji nisu kontaminirani drugim serumskim proteinima. Podloga je sakupljena iz konfluentnih ćelija svaki drugi dan (četiri puta ukupno). Nivo rekombinantnog MASP-2A uprosečen je na 1.5 mg/litra podloge za rast. MASP-2A (Ser-Ala mutant prethodno opisani) prečišćen je afinitetnom hromatografijom na MBP-A-agaroza kolonama

MASP-2A ELISA na ScFv kandidatnim klonovima identifikovan je paniranjem/scFv konverzijom i filter skriningom

[0425] Biblioteke prikaza faga humane imunoglobulinske sekvence varijabilnog regiona lakog- i teškoglanca podvrgnute su antigen paniranju praćeno automatizovanim antitelo skriningom i odabirom za identifikovanje visoko-afinitetnih scFv antitela prema humanom MASP-2 proteinu. Izvedena su tri kruga

1 1

paniranja scFv biblioteke faga protiv HIS-označen ili biotin-označen MASP-2A. Treći krug paniranja e eluiran prvo sa MBL, a zatim sa TEA (alkalnom). Kako bi se pratilo specifično obogaćenje faga koji prikazuju scFv fragmente protiv cilja MASP-2A, izvedena je poliklonalne faga ELISA protiv imobilisanog MASP-2A. scFv geni iz kruga 3 paniranja klonirani su u pHOG ekspresioni vektor i pokrenuti kroz skrining filterom male skale kako bi se potražili specifični klonovi protiv MASP-2A.

[0426] Bakterijske kolonije koje sadrže plazmide koji kodiraju scFv fragmente iz trećeg kruga su pokupljene, raspoređene na nitroceluloznu membranu i uzgajane tokom noći na ne-indukujućoj podlozi kako bi se proizvele master ploče. Ukupno 18,000 kolonija pokupljeno je i analizirano iz trećeg kruga paniranja, pola iz kompetitivnog eluiranja i pola naknadnog TEA eluiranja. Paniranje scFv biblioteke fagemida protiv MASP-2A praćeno scFv konverzijom i filter skriningom dalo je 137 pozitivnih klonova.

108/137 klonova bili su pozitivni u ELISA ispitivanju MASP-2 vezivanja (podaci nisu prikazani), od kojih je 45 klonova dalje analizirano na sposobnost da blokira MASP-2 aktivnost u normalnom humanom serumu.

Ispitivanje u cilju merenja Inhibicije obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta

[0427] Funkcionalno ispitivanje koje meri inhibiciju obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta korišćeno je za procenu "blokirajuće aktivnosti" MASP-2 scFv kandidatnih klonova. Aktivnost MASP-2 serinske proteaze potrebna je kako bi se generisale dve proteinske komponente (C4b, C2a) koje obuhvataju C3 konvertazu lektinskog puta. Prema tome, MASP-2 scFv koji inhibira MASP-2 funkcionalnu aktivnost (tj., koji blokira MASP-2 scFv), inhibira de novo obrazovanje C3 konvertaza lektinskog puta. C3 sadrži neobično i veoma reaktivnu tioestar grupu kao deo njene strukture. Nakon cepanja C3 putem C3 konvertaze u ovom ispitivanju, tioestar grupa na C3b može da obrazuje kovalentnu vezu sa hidroksil ili amino grupama na makromolekulima imobilisanim na dnu plastičnih bazenčića putem estarskog ili amidnog povezivanja, čime se olakšava detektovanje C3b u ELISA ispitivanju.

[0428] Manan kvasca je poznat aktivator lektinskog puta. U sledećem postupku kako bi se izmerilo obrazovanje C3 konvertaze, plastični bazenčići obloženi mananom inkubisani su razblaženim humanim serumom za aktiviranje lektinskog puta. Bazenčići su zatim oprani i ispitani na C3b imobilisan na bazenčićima upotrebom standardnih ELISA postupaka. Količina C3b generisana u ovom ispitivanju direktan je odraz de novo obrazovanja C3 konvertaze lektinskog puta. MASP-2 scFv klonovi pri odabranim koncentracijama ispitani su na njihovu sposobnost da inhibiraju obrazovanje C3 konvertaze i posledično C3b generisanje.

Postupci:

1 2

[0429] 45 kandidatnih klonova identifikovanih kako je prethodno opisano izraženi su, prečišćeni i razblaženi do iste koncentracije zaliha, koja je ponovo razblažena u Ca<++>i Mg<++>koji sadrži GVB pufer (4.0 mM barbital, 141 mM NaCl, 1.0 mM MgCl2, 2.0 mM CaCl2, 0.1% želatin, pH 7.4) kako bi se osiguralo da svi klonovi imaju istu količinu pufera. scFv klonovi bili su svi testirani u triplikatu u koncentraciji 2 µg/mL. Pozitivna kontrola bila je OMS100 Fab2 i ispitana je na 0.4 µg/mL. C3c obrazovanje praćeno je u prisustvu i odsustvu scFv/IgG klonova.

[0430] Manan je razblažen do koncentracije od 20 µg/mL (1 µg/bazenčić) u 50mM karbonatnom puferu (15mM Na2CO3+ 35mM NaHCO3+ 1.5 mM NaN3), pH 9.5 i obložen na ELISA ploči tokom noći na 4°C. Sledeći dan, mananom-obložene ploče oprane su 3 puta sa 200 µl PBS.100 µl 1% HSA blokirajućeg rastvora zatim je dodato u bazenčiće i inkubisano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su oprane 3 puta sa 200 µl PBS, i odložene na led sa 200 µl PBS do dodavanje uzoraka.

[0431] Normalni humani serum je razblažen do 0.5% u CaMgGVB puferu, i scFv klonovi ili OMS100 Fab2 pozitivna kontrola dodati su u triplikatu na 0.01 µg/mL; 1 µg/mL (samo OMS100 kontrola) i 10 µg/mL u ovaj pufer i preinkubisano 45 minuta na ledu pre dodavanja u blokiranu ELISA ploču. Reakcija je pokrenuta inkubacijom tokom jednog sata na 37°C i zaustavljena trensferovanjem ploča u ledenu kupku. C3b taloženje detektovan je sa zečijim α-Mišjim C3c antitelom praćeno Kozjim α-Zečijim HRP. Negativna kontrola puferovana je bez antitela (bez antitela = maksimalno C3b taloženje), a pozitivna kontrola puferovana je sa EDTA (bez C3b taloženje). Pozadina je određena izvođenjem istog ispitivanja osim što su bazenčiće bili bez manana. Pozadinski signal protiv ploče bez manana oduzete su od signala u manansadržavajućim bazenčićima. Kriterijum isključivanja podešen je na polovinu aktivnosti nerelevantnog scFv klona (VZV) i samog pufera.

[0432] Rezultati: Bazirano na kriterijumu isključivanja, ukupno 13 klonova pronađeno je da blokiraju aktivnost MASP-2. Svh 13 klonova koji proizvode > 50% supresije puta dabrani su i sekvencionisani, dajući 10 jedinstvenih klonova. Svih deset klonova pronađeno je da imaju istu podklasu lakog lanca, λ3, ali tri različit podklase teškog lanca: VH2, VH3 i VH6. U funkcionalnom ispitivanju, pet od deset kandidatnih scFv klonova dalo je IC50nM vrednosti manje od 25 nM ciljanog kriterijuma upotrebom 0.5% humanog seruma.

[0433] Za identifikovanje antitela sa poboljšanom potencijom, tri majke scFv klonova, identifikovanih kako je prethodno opisano, podvrgnute su umešavanju lakih lanaca. Ovaj proces uključuje generisanje kombinatorne biblioteke koja se sastoji od VH svakog klona-majke uparenog sa bibliotekom naivnog,

1

humanog lambda lakog lanca (VL) izvedena iz šest zdravih donora. Ova biblioteka zatim je podvrgnuta skriningu na scFv klonove sa poboljšanim afinitetom vezivanja i/ili funkcionalnošću.

TABELA 15: Poređenje funkcionalne potencije u IC50(nM) ćerki vodećeg klona i njihovih respektivnih majka klonova (svi u scFv formatu)

[0434] U nastavku su prikazane sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH) za majka klonove i ćerku klonve kako je prikazano gore u TABELI 15, i navedeno ispod u TABELAMA 16A-F.

[0435] Kabat CDR-ovi (31-35 (H1), 50-65 (H2) i 95-102 (H3)) su podebljani; a Chothia CDR-ovi (26-32 (H1), 52-56 (H2) i 95-101 (H3)) su podvučeni.

17D20 35VH-21N11VL varijabilni region teškog lanca (VH) (SEQ ID NO:15, kodirana putem SEQ ID NO: 14)

[0436]

d17N9 varijabilni region teškog lanca (VH) (SEQ ID NO: 16)

[0437]

Varijabilni region teškog lanca

1 4

1

[0439] U nastavku su prikazane sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL) za majka klonove i ćerka klonove navedene ispod u TABELAMA 17A-F.

[0440] Kabat CDR-ovi (24-34 (L1); 50-56 (L2); i 89-97 (L3) su podebljani; a Chothia CDR-ovi (24-34 (L1); 50-56 (L2) i 89-97 (L3) su podvučeni. Ovi regioni su isti bilo da označeni Kabat ili Chothia sistemom.

17D20m d3521N11 varijabilni region lakog lanca (VL) (SEQ ID NO:17)

[0441]

17N16m d17N9 varijabilni region lakog lanca (VL) (SEQ ID NO:19, kodirana putem SEQ ID NO:18) [0442]

1

�

[0443] MASP-2 antitela OMS100 i MoAb_d3521N11VL, koja su se oba pokazala da se vezuju za humani MASP-2 sa visokim afinitetom i imaju sposobnost da blokiraju funkcionalnu komplement aktivnost, analizirana su pozivanjem na epitop vezivanje putem dot-blot analize. Rezultat pokazuju da su d3521N11 i OMS100 antitela veoma specifična zar MASP-2 i da se ne vezuju za MASP-1/3. Niti se antitelo povezalo sa MAp19 niti sa MASP-2 fragmentima koji ne sadrže CCP1 domen MASP-2, što vodi ka zaključku da mesta vezivanja obuhvataju CCP1.

[0444] Shodno tome, u jednom slučaju, MASP-2 inhibitorni agens za upotrebu u mešavinama i postupcima opisa definisanog patentnim zahtevima obuhvata humano antitelo koje vezuje polipeptid koji se sastoji od humanog MASP-2 (SEQ ID NO:3), u kojoj to antitelo obuhvata:

I)

a) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata: i) CDR1 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 31-35 iz SEQ ID NO:21; i ii) CDR2 teškog lanca koji obuhvata

1

aminokiselinsku sekvencu iz 50-65 iz SEQ ID NO:21; i iii) CDR3 teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 95-102 iz SEQ ID NO:21; i

b) varijabilni region lakog lanca koji obuhvata: i) CDR1 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 24-34 ili SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i ii) CDR2 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 50-56 ili SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; i iii) CDR3 lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz 89-97 ili SEQ ID NO:25 ili SEQ ID NO:27; ili II) njihovu varijantu koja je drugačije identična pomenutim varijabilnim domenima, osim za do kombinovanih ukupno 6 aminokiselinskih supstitucija unutar pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona teškog lanca i do kombinovanih ukupno 6 aminokiselinskih supstitucija unutar pomenutih CDR regiona pomenutog varijabilnog regiona lakog lanca, u kojoj antitelo ili njegova varijanta inhibira MASP-2-zavisnu aktivaciju komplementa.

PRIMER 15

[0445] Ovaj Primer opisuje generisanje MASP-1 i MASP-3 monoklonalnih antitela upotrebom in vitro sistema koji obuhvata modifikovanu DT40 ćelijsku liniju, DTLacO.

Pozadina/Obrazloženje:

[0446] Antitela protiv humanog MASP-1 i MASP-3 generisana su upotrebom in vitro sistema koji obuhvata modifikovanu DT40 ćelijsku liniju, DTLacO, koja omogućava reverzibilnu indukciju diverdiverzifikacije naročito polipeptida, kako je dalje opisano u WO2009029315 i US2010093033. DT40 je pileća B ćelijska linija koja je poznata da konstitutivno mutira svoje imunoglobulinske (Ig) gene teškog i lakog lanca u kluturi. Kao i druge B ćelije, ova konstitutivna mutageneza cilja mutacije na V regionu Ig gena, i tako, CDR-ove izraženih molekula antitela. Konstitutivna mutageneza u DT40 ćelijama izvodi se putem genske konverzije upotrebom kao donor sekvence niza ne-funkcionalnih V genskih segmenata (pseudo-V geni; ψV) smešteni uzvodno od svakog funkcionalnog V regiona. Delecija ψV regiona prethodno je prikazana da bi se izazvalo menjanje u mehanizam diverzifikacije iz genske konverzije u somatsku hipermutaciju, koji mehanizam uobičajeno je primećen u humanim B ćelijama. DT40 pileća B ćelijska limfoma linija pokazana je da je obećavajuća početna tačka za evoluciju antitela ex vivo (Cumbers, S.J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005)). DT40 ćelije proliferuju obimno u kulturi, sa 8-10 sati udvostručavanja vremena (u poređenju sa 20-24 sati za humanu B ćelijsku liniju), i podržavaju veoma efektivno ciljanje homolognih gena (Buerstedde, J.M. et al. Embo J 9, 921-927 (1990)). DT40 ćelije upravljaju enormno potencijalnim različitim V region sekvencama uzimajći u obzir da one mogu da pristupe dvaju dinstiktivna fiziološka puta za diverzaciju, gensku konverziju i somatsku hipermutaciju, koje stvaraju šablonske i nešablonske

1

mutacije, respektivno (Maizels, N. Annu Rev Genet 39, 23-46 (2005)). Raznovrsni imunoglobulini (Igs) teškog ili lakog lanca izraženi su u obliku IgM izraženih na ćelijskoj površini. Površina IgM ima bivalentni oblik, strukturalno sličan IgG molekul. Ćelije koje prikazuju IgM sa specifičnosti za naročiti antigen mogu se izolovati vezivanjem bilo imobilisanim rastvorljivim ili membrana prikazanim verzijama antigena. Međutim, upotrebljivost DT40 ćelijs za evoluciju antitela je ograničena u praksi zbog - kao iu drugim transformiranim B ćelijskim linijama - diversifikacija se odvija pri manjoj fiziološkoj brzini do 1%.

[0447] U sistemu koji se koristi u ovom Primeru, kako je opisano u WO2009029315 i US2010093033, DT40 ćelije konstruisane su da ubrzaju brzinu Ig genske diversifikacije bez žrtvovanja kapaciteta za dalju genetsku modifikaciju ili potencijalno i za gensku konverziju i somatsku hipermutaciju kako bi doprineli mutagenezi. Dve ključne modifikacije do DT40 izvedene su kako bi se povećala brzina diversifikacije i, shodno tome, kompleksnost specifičnosti vezivanja u predmetnoj biblioteci ćelija. Prvo, Ig genska diversifikacija stavljena je pod kontrolu potentne E. coli laktozno operatorske/represorsko regulatorne mreže. Multimeri koji se sastoje od približno 100 polimerizovanih ponavljanja potentnog E. coli laktoznog operatora (PolyLacO) uvedeni su uzvodno od reraspoređenih i izraženih Igλ i IgH gena homolognim genskim ciljanjem. Regulatorni faktori fuzionisani za laktoza represorski protein (LacI) zatim mogu biti teterovani za LacO regulatorne elemente kako bi se regulisala diversifikacija, uzimajući prednost visokog afiniteta (kD=10<-14>M) laktoznog represora za operator DNK. DT40 PolyLacO-λRćelije, u kojem je PolyLacO integrisan samo na Igλ, ispoljava 5-struko povećanje u brzini Ig genske diversifikacije u odnosu na roditeljske DT40 ćelije pri bilo kog konstruisanja (Cummings, W.J. et al. PLoS Biol 5, e246 (2007)). Diversifikacija je dalje podignuta u ćelijama konstruisanim da nose PolyLacO koji cilja oba i Igλ i IgH gene ("DTLacO"). DTLacO ćelije pokazuju da imaju brzine diversifikacije 2.5- to 9.2-puta povišene u odnosu na 2.8% karakteristike roditeljske DT40 PolyLacO-λRLacI-HP1 linije. Tako, ciljajući PolyLacO elemente oba gena i teškog i lakog lanca ubrzava se diversifikacija 21.7-puta u odnosu na DT40 roditeljsku ćelijsku liniju. Teterovanje regulatornih faktora u Ig lokusima ne samo da menja frekvenciju mutageneze, već može da promeni i put mutageneze stvarajući veću kolekciju jedinstvenih promena sekvence (Cummings et al.2007; Cummings et al.2008). Drugo, generiše se različita kolekcija početnih tački sekvence za teterovanu faktor-ubrzanu Ig gensku diversifikaciju. Ove različite početne tačke sekvence dodate su u DTLacO ciljanjem reraspoređenih Ig varijabilnih regiona teškog lanca, izolovani iz dva meseca starog pileta, u lokus teškog lanca. Dodavanje ovih varijabilnih regiona teškog lanca stvara repertoar od 10<7>novih početnih tačaka za diversifikaciju antitela. Građenje ovih novih početnih tačaka u DTLacO ćelijskoj liniji omogućava identifikaciju klonova koji vezuju određeni cilj, a zatim rapidni afinitet sazrevanja teterovanim faktorima. Nakon afinitetnog sazrevanja, pune dužine, rekombinantno himerno IgG kreirano je kloniranjem sazrelih, reraspoređenih varijabilnih sekvenci teškog- i lakog-lanca (VH i Vλ; koje se sastoji od regiona pilećeg okvira i komplementarnost-određujućih regiona ili CDR-ova) u

14

ekspresionim vektorima koji sadrže humano IgG1 i lambda konstantne regione. Ova rekombinantna mAb-a pogodna su za in vitro i in vivo primene, i mogu služiti kao početna tačka za humanizaciju.

Postupci:

Selekcija za MASP-1 i MASP-3 antigen vezivanje.

[0448] Inicijalne selekcije izvedene su vezivanjem DTLacO populacija diversifikovanih genskim ciljanjem za perlice kompleksovane sa humanim MASP-1 (SEQ ID NO:10) i MASP-3 antigenom (SEQ ID NO:8); i naknadno selekcijom putem FACS, upotrebom fluorescenciono obeleženog rastvorljivog antigena (Cumbers, S.J. et al. Nat Biotechnol 20, 1129-1134 (2002); Seo, H. et al. Nat Biotechnol 23, 731-735 (2005). Zbog sačuvane aminokiselinske sekvence u alfa lancu koja je zajednička između MASP-1 i MASP-3 (prikazano na FIG.5), i dinstiktivne sekvenci beta lanaca (prikazane na FIG.6), izveden je odvojen, paralelni skrining za veziva za MASP-1 i MASP-3 radi identifikovanja MASP-1 specifičnih mAb-ova, MASP-3 specifičnih mAb-ova i takođe mAb-ova sposobnih za vezivanje i za MASP-1 i MASP-3 (dvostrukospecifična). Dva oblika antigena korišćena su za selekciju i skrining veziva. Prvo, rekombinantni MASP-1 ili MASP-3, ili pune dužine ili fragment, fuzionisani za Fc domen povezani su sa Dynal magnetnim Protein G perlama ili upotrebljeni u selektovanju na bazi FACS upotrebom PECy5-obeleženog anti-humanog IgG(Fc) sekundarnog antitela. Alternativno, rekombinantne verzije MASP-1 ili MASP-3 proteina direktno su obeležene sa Dylight fluourom i upotrebljeni za selekcije i skrining.

Vezivanje i afinitet.

[0449] Rekombinantna antitela generisana su kloniranjem PCR-amplifikovanih V regiona u vektoru koji podržava ekspresije humanoh IgG1 u 293F ćelijama (Yabuki et al., PLoS ONE, 7(4):e36032 (2012)).

Kinetike saturacionog vezivanja određene su bojenjem DTLacO ćelija koje ispoljavaju antitelo koje se vezuje za MASP-1 ili MASP-3 sa raznim koncentracijama fluorescentno-obeleženog rastvorljivog agensa. Funkcionalna ispitivanja za MASP-3 specifičnu aktivnost koja uključuje MASP-3-zavisno C3b taloženje i MASP-3-zavisno cepanje faktora D, izvedena su kako je opisano u Primerima 17 i 18, respektivno.

Funkcionalno ispitivanje na MASP-1-specifičnu aktivnost, određenije inhibiciju MASP-1-zavisnog C3b taloženja, izvedeno je kako je opisano ispod.

Rezultati:

[0450] Brojna MASP-1 i MASP-3 vezujuća antitela generisana su upotrebom postupaka koji su prethodno opisani. Vezivanje, kako je pokazano FACS analizom, opisano je za reprezentativne klonove M3J5 i M3M1, koji su izolovani u skrininzima za MASP-3 veziva.

[0451] FIG.30A je FACS histogram MASP-3 antigen/antitelo vezivanja za DTLacO klon M3J5. FIG.30B je FACS histogram MASP-3 antigen/antitelo vezivanja za DTLacO klon M3M1. Na FIG.30A i 30B the sive popunjene krive su IgG1-obojena negativna kontrola, a debele crne krive su MASP-3-bojenje.

[0452] FIG.31 grafički prikazuje krivu zasićenja vezivanja klona M3J5 (Klon 5) za MASP-3 antigen. Kako je prikazano na FIG.31, očigledan afinitet vezivanja M3J5 antitela za MASP-3 je oko 31 nM.

[0453] Sekvenciono analiziranje identifikovanih klonova izvedeno je upotrebom standardnih postupaka. Svi klonovi su upoređeni sa zajedničkim (DT40) VH i VL sekvencama i jedan sa drugim. Sekvence za dva gore pomenuta klona, M3J5 i M3M1 obezbeđene su u poravnanju sa dva dodatna reprezentativna klona, D14 i 1E10, koji su identifikovani u skrininzima za CCP1-CCP2-SP fragmente MASP-1 i MASP-3, respektivno. D14 i 1E10 vezuju regione zajedničke za oba MASP-1 i MASP-3.

[0454] FIG.32A je poravnanje aminokiselinskih sekvenci VH regiona M3J5, M3M1, D14 i 1E10 za pileću DT40 VH sekvencu.

[0455] FIG.32B je poravnanje aminokiselinskih sekvenci VL regiona M3J5, M3M1, D14 i 1E10 za pileću DT40 VL sekvencu.

[0456] VH i VL aminokiselinska sekvenca svakog klona obezbeđen je ispod.

Sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (VH)

[0457] FIG.32A prikazuje aminokiselinsko poravnanje sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca (VH) za roditeljsku DTLacO (SEQ ID NO: 24), MASP-3-vezujuće klonove M3J5 (SEQ ID NO: 25), i M3M1 (SEQ ID NO: 26), i MASP-1/MASP-3 dvostruko vezivanje klonova D14 (SEQ ID NO:30), i 1E10.

[0458] Kabat CDR-ovi u VH sekvencama ispod smešteni su na sledećim aminokiselinskim položajima:: H1:aa 31-35; H2:aa 50-62; i H3:aa 95-102.

[0459] Chothia CDR-ovi u VH sekvencama ispod smešteni su na sledećim aminokiselinskim položajima: H1:aa 26-32; H2: aa 52-56; i H3: aa 95-101.

Roditeljska DTLacO VH (SEQ ID NO:24)

Klon M3J5 VH: (SEQ ID NO:25)

[0461]

Klon M3M1 VH: (SEQ ID NO:26)

[0462]

Klon D14 VH: (SEQ ID NO:30)

[0463]

Klon 1E10 VH: (SEQ ID NO:32)

[0464]

Sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (VL)

[0465] FIG.32B prikazuje aminokiselinsko poravnanje sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca (VL) za roditeljski DTLacO (SEQ ID NO:27) i MASP-3-vezujuće klonove M3J5 (SEQ ID NO:28), i M3M1 (SEQ ID NO:29), i MASP-1/MASP-3 dvostruko vezivanje klonova D14 (SEQ ID NO:31) i 1E10 (SEQ ID NO: 33).

Roditeljska DTLacO VL (SEQ ID NO:27):

14

Klon M3J5 VL (SEQ ID NO:28):

[0467]

Klon M3M1 VL (SEQ ID NO:29):

[0468]

Klon D14 VL: (SEQ ID NO:31)

[0469]

Klon 1E10 VL: (SEQ ID NO:33)

[0470]

LEA-2 (MASP-2-zavisan) funkcionalno ispitivanje

[0471] MASP-1 doprinosi LEA-2 putem njegove sposobnosti da aktivira MASP-2 (videti FIG.1).

Ispitivanje Wieslab® prikaza sistema komplementa MBL (Euro Diagnostica, Malmö, Sweden) meri C5b-C9 taloženje pod uslovima koji izoluju LEA-2-zavisnu aktivaciju (tj., uobičajenu aktivnost lektinskog puta). Ispitivanje je izvedeno je prema instrukcijama proizvođača sa reprezentativnim klonom 1E10 testiranim pri konačnoj koncentraciji od 400 nM.

[0472] FIG.33 je grafikon koji prikazuje inhibitornu aktivnost mAb 1E10 u poređenju sa pozitivnim serumom obezbeđenim sa kompletom za ispitivanje, kao i izotipno kontrolno antitelo. Kako je prikazano na FIG.33, mAb 1E10 pokazuje delimičnu inhibiciju LEA-2-zavisne aktivacije (putem inhibicije MASP-1-zavisne aktivacije MASP-2), dok izotipno kontrolno antitelo ne. Jača inhibicija trebalo bi da se postigne kontinuiranim afinitetom sazrevanje ovog antitela za MASP-1 vezivanje upotrebom teterovanih faktora u DTLacO sistemu.

[0473] LEA-1 (MASP-3-zavisan) funkcionalna ispitivanja za reprezentativne mAb-ove opisana su ispod u Primerima 17 i 18.

Rezime rezultata:

[0474] Gornji rezultati pokazuju da DTLacO platforma dopušta rapidno ex vivo otkrivanje MASP-1 i MASP-3 monoklonalnih antitela sa inhibitornim karakteristikama na LEA-1 (kako je prikazano ispod u Primerima 17 i 18) i na LEA-2 (kako je prikazano u ovom Primeru).

PRIMER 16

[0475] Ovaj Primer opisuje generisanje polipeptidnih inhibitora MASP-1 i MASP-2.

Obrazloženje:

[0476] Generisanje specifičnih inhibitora MASP-1 i MASP-2, označenih kao SGMI-1 i SGMI-2, respektivno, opisani u Heja et al., J Biol Chem 287:20290 (2012) i Heja et al., PNAS 109:10498 (2012). SGMI-1 i SGMI-2 su svaki 36 aminokiselinskih peptida koji su odabrani iz biblioteke faza varijante Schistocerca gregaria proteaza inhibitora 2 u kojima je šest od osam položaja vezujućih petljhi proteaza potpuno randomizirano. Naknadno in vitro evolucija daje mono-specifične inhibitore sa jednocifrenom nM KIvrednosti (Heja et al., J. Biol. Chem.287:20290, 2012). Strukturna ispitivanja otkrivaju da optimizovani vezujuća petlja proteaza oblikuje primarno mesto vezivanja koje definiše specifičnost dva inhibitora. Aminokiselinske sekvence proširenih sekundarnih i internih vezujućih regiona su zajedničke za dva inhibitora i doprinose kontaktnoj površini (Heja et al., 2012. J. Biol. Chem.287:20290). Mehanički, oba SGMI-1 i SGMI-2 blokiraju lektinski put aktivacije komplementa uticanja na klasični ili alternativni put (Heja et al., 2012. Proc. Natl. Acad. Sci.109:10498). Aminokiselinske sekvence SGMI-1 i SGMI-2 inhibitora navedene su u nastavku: SGMI-1-pune dužine: LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAFCTRKLCYQ (SEQ ID NO:34) SGMI-2-pune dužine: LEVTCEPGTTFKDKCNTCRCGSDGKSAVCTKLWCNQ (SEQ ID NO:35)

[0477] SGMI-1 i SGMI-2 veoma su specifični inhibitori MASP-1 i MASP-2, respektivno. Međutim, kao peptidi oni imaju ograničen potencijal za upotrebu u biološkim ispitivanjima. Kako bi se rešili ovi nedostaci, engraftirane su ove bioaktivne peptidne aminokiselinske sekvence na amino terminus humanog IgG1 Fc regiona kako bi se kreirao Fc-fuzioni protein,

Postupci:

14

[0478] Kako bi se izrazili SGMI-IgG1 Fc fuzioni proteini, polinukleotidi koja kodiraju SGMI-1 (SEQ ID NO:34) i SGMI-2 (SEQ ID NO:35) peptide sintetizovani su (DNK 2.0) i umetnuti u ekspresioni vektor pFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen) između nukleotidne sekvence koja kodira IL-2 signalnu sekvencu i humanog IgG1 Fc regiona (SEQ ID NO:36). Fleksibilan polipeptidni linker (npr., SEQ ID NO:37 ili SEQ ID NO:38) uključen je između SGMI peptida i IgG1 Fc regiona.

Fleksibilne polipeptidne linker sekvence:

[0479]

GTGGGSGSSSRS (SEQ ID NO:37)

GTGGGSGSSS (SEQ ID NO:38)

[0480] Dobijeni konstrukti opisani su kako sledi:

Polinukleotid koji kodira polipeptidnu fuziju koja obuhvata humanu IL-2 signalnu sekvencu, SGMI-1, linker i humani IgG1-Fc (pFUSE-SGMI-1Fc), naveden je kao SEQ ID NO:39, koji kodira zrelu polipeptidnu fuziju koja obuhvata SGMI-1 (podvučeno), linker region (nakrivljeno) i humani IgG1-Fc (koji se zajedno nazivaju "SGMI-1Fc"), koji je naveden kao SEQ ID NO:40.

SEQ ID NO:40

[0481]

[0482] Polinukleotid koji kodira polipeptidnu fuziju koja obuhvata humanu IL-2 signalnu sekvencu, SGMI-2, linker i humani IgG1-Fc (pFUSE-SGMI-2Fc), naveden je kao SEQ ID NO:41, koji kodira zrelu polipeptidnu fuziju koja obuhvata SGMI-2 (podvučeno), linker region (nakrivljeno) i humani IgG1-Fc (koji se zajedno nazivaju "SGMI-2Fc"), koji je naveden kao SEQ ID NO:42:

SEQ ID NO:42

14

Proizvodnja rekombinantnih proteina:

[0484] Freestyle 293-F ili Expi293F ćelije (Invitrogen) tranzijentno su transfektovane u skladu sa protokolom dobavljača sa jednim od ekspresiona plazmida (pFUSE-SGMI-1Fc (SEQ ID NO:39) i pFUSE-SGMI-2Fc (SEQ ID NO:41). Nakon četiri dana inkubacije na 37°C, sakupljene su podloge sa kulturuom. Fcfuzioni proteini prečišćeni su Protein A afinitetnom hromatografijom.

Ispitivanja koja mere aktivaciju lektinskog puta.

[0485] SGMI-1Fc i SGMI-2Fc fuzioni proteini ispitani su na sposobnost da inhibiraju taloženje C3b iz 1% seruma na mananom-obloženoj ploči sa 96 bazenčića, što je mera aktivnosti lektinskog puta. SGMI-1Fc i SGMI-2Fc su pre-inkubisani sa 1% normalnim humanim serumom tokom jednog sata na ledu pre dodavanja u bazenčiće obložene mananom (2 µg/bazenčić). C3b taloženje je izmereno putem ELISA kako je opisano u Schwaeble et al. PNAS 108:7523, 2011.

[0486] FIG.34 grafički prikazuje nivo C3b taloženja za 1% normalni humani serum plus izotipnu kontrolu, SGMI-1Fc ili SGMI-2Fc preko koncentracionog opsega od 0.15 do 1000 nM. Kako je prikazano na FIG.34, i SGMI-1Fc i SGMI-2Fc inhibiraju C3b taloženje iz normalnog seruma u mananom-obloženim ELISA bazenčićima, sa IC50vrednostima od približno 27nM i 300nM, respektivno.

[0487] Ovi rezultati pokazuju da su i MASP-1 i MASP-2 inhibitorne funkcije SGMI peptida zadržane u SGMI-1Fc i SGMI-2Fc fuzionim proteinima.

PRIMER 17

Analiziranje puta komplementa u 3MC serumu sa S. aureus

Pozadina/Obrazloženje:

[0488] Određeno je da MASP-3 nije aktiviran putem izlaganja ne-imobilisanog tečno-faznog manana, zimosana A ili N-acetil cisteina niti u prisustvu ili odsustvu normalnog humanog seruma. Međutim, određeno je da su rekombinantni i nativni MASP-3 aktivirani na površini toplotom-inaktiviranog S.

14

aureus u prisustvu i odsustvu normalnog humanog seruma (NHS) ili toplotom-inaktiviranog humanog seruma (HIS) (podaci nisu prikazani). Takođe je određeno da se C3b taloženje odvija na površini S. aureus u prisustvu normalnog humanog seruma, i da to taloženje može biti praćeno upotrebom protočnog citometra. Prema tome, odgovor alternativnog puta (AP) na S. aureus izmeren je kako je opisano u ovom Primeru kao sredstvo za procenu doprinosa MASP-3 na LEA-1.

Postupci:

[0489] Rekombinantni MASP-3: polinukleotidne sekvence koje kodiraju rekombinantni humani MASP-3 pune dužine, skraćena serinska proteaza (SP) aktivna verzija MASP-3 (CCP1-CCP2-SP), i SP-inaktiviran oblik MASP-3 (S679A) klonirani su u pTriEx7 sisarskom ekspresionom vektoru (Invivogen). Dobijeni ekspresioni konstrukti kodiraju MASP-3 pune dužine ili CCP1-CCP2-SP fragment sa amino-terminalnom Strepoznakom i karboksi-terminalnom His6oznakom. Ekspresioni konstrukti transfektovani su u Freestyle 293-F ili Expi293F ćelijama (Invitrogen) prema protokolima dostavljenim od strane proizvođača. Nakon tri do četiri dana uzgajanja u 5% CO2na 37°C, rekombinantni proteini prečišćeni su primenom Streptaktin afinitetne hromatografije.

[0490] Rekombinantni MASP-1: pune dužine ili skraćeni CCP1-CCP2-SP oblici rekombinantnog MASP-1 sa ili bez stabilišućeg R504Q (Dobo et al., J. Immunol 183:1207, 2009) ili SP inaktivirajuće (S646A) mutacije i noseća amino-terminalna Stepoznaka i karboksi-terminalna His6 oznaka generisani su kako je opisano za gornji rekombinantni MASP-3.

1. C3b taloženje i cepanje faktora B na S. aureus u 3MC (humanom) serumu

[0491] Prvobitni eksperiment izveden je da pokaže da je ogled protočne citomerije sposoban da detektuje prisustvo ili odsustvo AP-vođenog C3b taloženja (AP-C3b) kako sledi. Pet procenata sledećih seruma: normalni humani serum, faktor B (Faktor B)- osiromašeni humani serum, faktor D-osiromašeni humani serum i properdin-osiromašeni humani serum (dobijeni od Complement Technology, Tyler, Texas, USA) umešani su sa ispitnim antitelom ili u Mg<++>/EGTA puferu ili EDTA na 4°C tokom noći.

Toplotom-ubijene S. aureus (10<8>/reakcija) dodata je u svaku mešavinu do ukupne zapremine od 100 µL i rotirana na 37°C tokom 40 minuta. Bakterija su oprane su puferu za pranje, bakterijski peleti resuspendovani u puferu za pranje, a 80 µL alikvota svakog uzorka analizirani su za C3b taloženje na bakterijskog površini, koje je detektovana sa anti-humanim C3c (Dako, UK) upotrebom protočne citomerije.

[0492] Rezultati detektovanja C3b protočnom citometrijom prikazani su na FIG.35A. Kako je prikazano na FIG.35A, panel 1, normalni humani serum u prisustvu EDTA, koji je poznat da inaktivira AP, nije

14

primećeno C3b taloženje (negativna kontrola). U normalnom humanom serumu tretiranom sa Mg<++>/EGTA, samo lektin-nezavisni komplement putevi mogu da funkcionišu. U panelu 2, korišćen je Mg<++>/EGTA pufer, prema tome AP je aktivan, i primećeno je AP-vođeno C3b taloženje (pozitivna kontrola). Kako je prikazano na panelu 3, 4 i 5, u faktor B-osiromašenom, faktor D-osiromašenom i properdin-osiromašenom serumu, respektivno, nije primećeno alternativnim putem-vođeno C3b taloženje, kako se očekivalo. Ovi rezultati pokazuju da je ovaj ogled sposoban da detektuje AP-zavisno C3b taloženje.

[0493] Ispitivanje C3b taloženja na S. aureus izvedeno je kako je prethodno opisano radi procene sposobnosti rekombinantnog MASP-3 da rekonstituiše AP (LEA-1) u humanom 3MC serumu, koji je deficijentan u MASP-3 (Rooryck C, et al., Nat Genet.43(3):197-203 (2011)). Sledeće kombinacije reagenasa su testirane.

1. 5% normalni humani serum EDTA

2. 5% normalni humani serum Mg/EGTA

3. 5% humani 3MC (MASP-3<-/->) serum Mg<++/>EGTA

4. 5% humani 3MC (MASP-3<-/->) serum Mg<++>/EGTA plus aktivan rMASP-3 pune dužine

5. 5% humani 3MC (MASP-3<-/->) serum Mg<++>/EGTA plus skraćeni aktivan rMASP-3 (CCP1/CCP2/SP) 6. 5% humani 3MC (MASP-3<-/->) serum Mg<++>/EGTA plus neaktivan rMASP-3 (S679A)

7. 5% humani 3MC (MASP-3<-/->) serum Mg<++>/EGTA plus aktivan rMASP-1 pune dužine

[0494] Razne mešavine 5% seruma i rekombinantnih proteina (5 µg svakog) kako je prikazano gore inkubisani su u specificiranim puferskim uslovima (ili Mg<++>/EGTA pufer ili EDTA) na 4°C tokom noći. Nakon inkubacije tokom noći, 10<8>toplotom-ubijene S. aureus dodate su u svaku mešavinu u ukupnoj zapremini od 100 µL i rotirane na 37°C tokom 40 minuti. Bakterije su oprane i re-suspendovane u puferu za pranje, a 80 µl alikvota svakog uzorka analizirano je na C3b taloženje putem FACS. Preostalih 20 µL alikvota svakog uzorka korišćeno je kako bi se izmerilo cepanje faktora B putem Western blota upotrebom anti-faktor B antitela kako je opisano ispod.

[0495] Rezultati detektovanja C3b protočnom citometrijom prikazani su na FIG.35B. Brojevi panela odgovaraju brojevima označenim za svaku od kombinaciju reagensa koje su prethodno navedene. Negativna kontrola (panel 1) i pozitivna kontrola (panel 2) pokazuju odsustvo i prisustvo C3b taloženja, kako se i očekuje. Panel 3 prikazuje da je AP-vođeno C3b taloženje odsutno u 3MC serumu. Paneli 4 i 5 pokazuju da aktivan rMASP-3 pune dužine (panel 4) i aktivan rMASP-3 (CCP1-CCP2-SP) (panel 5) oba obnavljaju AP-vođeno C3b taloženje u 3MC serumu. Panel 6 prikazuje neaktivan rMASP-3 (S679A) ne

14

obnavlja AP-vođeno C3b taloženje u 3MC serumu. Panel 7 prikazuje da rMASP-1 ne obnavlja AP-vođeno C3b taloženje u 3MC serumu.

[0496] Sve zajedno, ovi rezultati pokazuju da je MASP-3 potreban za AP-vođeno C3b taloženje na S. aureus u humanom serumu.

2. MASP-3-zavisna aktivacija faktora B

[0497] Kako bi se analizirala MASP-3-zavisna aktivacija faktora B, razne mešavine 5% seruma (ili normalnog humanog seruma ili 3MC pacijent seruma) i rekombinantni proteini kavi su prikazani gore ispitani su kako je prethodno opisano. Iz svake reakcione mešavine, 20 µL uklonjeno je i dodato u pufer za uvođenje proteinskih uzoraka. Uzorci su zagrejani na 70°C tokom 10 minuta i uvedeni na SDS-PAGE gel. Western blot analiza izvedena je upotrebom Faktor B poliklonalnog antitela (R&D Sistemi).

Aktivacija faktora B očigledna je obrazovanjem dva proizvoda cepanja manje molekulske mase (Bb i Ba) izvedeni i pro-Faktor B proteina veće molekulske mase.

[0498] FIG.36 prikazuje rezultate Western blot analize za određivanje cepanje faktora B u odgovoru na S. aureus u 3MC serumu u prisustvu ili odsustvu rMASP-3. Kako je prikazano na traci 1, normalni humani serum u prisustvu EDTA (negativna kontrola) pokazuje veoma malo cepanje faktora B u odnosu na normalni humani serum u prisustvu Mg<++>/EGTA, pikazano na traci 2 (pozitivna kontrola). Kako je prikazano na traci 3, 3MC serum pokazuje veoma malo cepanje faktora B u prisustvu Mg<++>/EGTA.

Međutim, kako je prikazano na traci 4, cepanje faktora B obnovljeno je dodavanjem i pre-inkubacijom, rekombinantnog MASP-3 proteina pune dužine (5 µg) u 3MC serum.

3. Ispitivanje za određivanje efekta rMASP-3 na pro-faktor D u faktor B/C3(H2O) cepanju

[0499] Sledeće ispitivanje izvedeno je za određivanje minimalnog zahteva za MASP-3-zavisnu aktivaciju/cepanje faktora B.

[0500] C3(H2O) (200ng), prečišćeni plazma faktor B (20 µg), rekombinantni pro-faktor D (200 ng) i rekombinantni humani MASP-3 (200 ng) umešani su u raznim kombinacijama (kako je prikazano na FIG.

37), u ukupnim zapreminama od 100 µL u BBS/Ca<++>/Mg<++>i inkubisani na 30°C tokom 30 minuta. Reakcija je završena dodavanjem 25 uL SDS koji uvodi boju koja sadrži 5% 2-merkaptoetanol. Nakon kuvanja na 95°C tokom 10 minuta uz protresanje (300 o/min), mešavina je rotirana na 1400 o/min tokom 5 minuta i 20 uL supenatanta uvedeno je i odvojeno je na 10% SDS gelu. Gel je obojen sa Coomassie brilijant plavo.

Rezultati:

1

[0501] FIG.37 prikazuje Comassie-obojeni SDS-PAGE gel u kojem je analizirano cepanje faktora B. Kako je prikazano na traci 1, cepanje faktora B najoptimalnije je u prisustvu C3, MASP-3 i pro-faktora D. Kako je prikazano na traci 2, C3 je apsoultno potreban; međutim, kako je prikazano na trakama 4 i 5, ili MASP-3 ili pro-faktor D mogu da posreduju cepanje faktora B, dokle god je C3 prisutan.

4. Analiziranje sposobnosti MASP-3 mAb-ova da inhibiraju MASP-3-zavisno AP-vođeno C3b taloženje [0502] Kako je opisano u ovom Primeru pokazano je da je MASP-3 potreban za AP-vođeno C3b taloženje na S. aureus u humanom serumu. Prema tome, sledeće ispitivanje izvedeno je za određivanje da li reprezentativno MASP-3 mAb identifikovan kako je opisano u Primeru 15, može da inhibira aktivnost MASP-3. Aktivni, rekombinantni MASP-3 (CCP1-CCP2-SP) fragment protein (250 ng) predinkubisan je sa izotipnim kontrolim mAb, mAb1A5 (kontrola dobijena iz DTLacO platforme koja ne vezuje MASP-3 ili MASP-1), ili mAbD14 (vezuje MASP-3) u tri različite koncentracije (0.5, 2 i 4 µM) tokom 1 sata on ledu. Enzim-mAb mešavina izložena je 5% 3MC serumu (MASP-3 deficijentni) i 5x10<7>toplotomubijenim S. aureus u konačnoj reakcionoj zapremini od 50 µL. Reakcije su inkubisane na 37°C tokom 30 minuta, a zatim obojene za detektovanje C3b taloženja. Obojene bakterijske ćelije analizirane protočnom citometrijom.

[0503] FIG.38 grafički prikazuje srednje intezitete fluorescencije (MFI) C3b bojenja dobijene od tri antitela prikazani kao funkcija mAb koncentracije u 3MC serumu uz prisustvo rMASP-3. Kako je prikazano na FIG.38, mAbD14 pokazuje inhibiciju C3b taloženja na način zavisan od koncentracije. Nasuprot tome, ni jedno od kontrolnih mAb-a nisu inhibirale C3b taloženje. Ovi rezultati pokazuju da je mAbD14 sposoban da inhibira MASP-3-zavisno C3b taloženje. Poboljšana inhibitorna aktivnost za mAbD14 očekuje se nakon nastavljenog afiniteta sazrevanje ovog antitela za MASP-3 vezivanje upotrebom teterovanih faktora u DTLacO sistemu.

Rezime rezultata:

[0504] Ukratko, rezultati u ovom Primeru pokazuju jasan defekt AP u serumu deficijentnom za MASP-3. Tako, pokazano je da MASP-3 ima kritički doprinos AP, upotrebom faktor B aktivacije i C3b taloženja kao funkcionalnih krajnjih tačaka. Pored toga, dodavanje funkcionalnog, rekombinantnog MASP-3, koji uključuje katalitički-aktivan C-terminalni deo MASP-3 ispravlja defekt u faktor B aktivaciji i C3b taloženju u serumu 3MC pacijenta. Nasuprot tome, kako je dalje pokazano u ovom Primeru, dodavanje MASP-3 antitela (npr.,mAbD14) u 3MC serum sa rMASP-3 inhibira AP-vođeno C3b taloženje. Direktna uloga MASP-3 u Faktor B aktivaciji, i prema tome AP, pokazana je zapažanjem da rekombinantni MASP-3, zajedno sa C3, je dovoljan za aktiviranje rekombinantnog faktora B.

1 1

PRIMER 18

[0505] Ovaj Primer pokazuje da MASP-1 i MASP-3 aktiviraju faktor D.

Postupci:

[0506] Rekombinantni MASP-1 i MASP-3 testirani su na njihovu sposobnost da pocepaju dve različite rekombinantne verzije pro-faktora D. Prvoj verziji (pro-faktor D-His) nedostaje N-terminalna oznaka, ali ima C-terminalnu His oznaku. Tako, ova verzija pro-faktora D sadrži 5 aminokiselinski pro-peptid koji je uklonjen cepanjem tokom aktivacije. Druga verzija (ST-pro-faktor D-His) ima Strep-TagII sekvencu na N-terminusu, čime se povećava pocepani N-terminalni fragment na 15 aminokiselina. ST-pro-faktor D takođe sadrži His6oznaku na C-terminusu. Povećana dužina propeptida ST-pro-faktor D-His poboljšava razlaganje između pocepanih i nepocepanih oblika putem SDS-PAGE u poređenju sa razlaganjem mogućim sa pro-faktor D-HIS oblikom.

[0507] Rekombinantni MASP-1 ili MASP-3 proteini (2 µg) dodati su ili u pro-faktor D-His ili ST-pro-faktor D-His supstrat (100 ng) i inkubisani tokom 1 sata na 37°C. Reakcije su elektroforezirane na 12% Bis-Tris gelu kako bi rastvorile pro-faktor D i proizvod cepanja aktivnog faktora D. Rastvoreni proteini su transferovani u PVDF membranama i analizirani Western blotom detektovanjem sa biotinilovanim faktor D antitelom (R&D Sistemi).

Rezultati:

[0508] FIG.39 prikazuje Western blot analizu pro-faktor D supstratnog cepanja. Kako je prikazano na FIG.39, samo MASP-3 pune dužine (traka 2) i MASP-1 CCP1-CCP2-SP) fragment (traka 5) pocepan ST-pro-faktor D-His6. Katalitički-neaktivan MASP-3 pune dužine (S679A; traka 3) i MASP-1 (S646A; traka 3) ne uspevaju da pocepaju bilo koji supstrat. Identični rezultati dobijeni su sa pro-faktor D-His6polipeptidom (nije prikazano). Poređenje molarnog viška MASP-1 (CCP1-CCP2-SP) u odnosu na MASP-3 sugeriše da je MASP-3 efektivniji katalizator pro-faktor D cepanja od MASP-1, barem pod ovde opisanim uslovima.

[0509] Zaključci: Oba MASP-1 i MASP-3 sposobni su za cepanje i aktiviranje faktora D. Ova aktivnost direktno povezuje LEA-1 sa aktivacijom AP. Određenije, aktivacija faktora D putem MASP-1 ili MASP-3 vodi ka faktor B aktivaciji, C3b taloženju, i verovatnoj opsonizaciji i/ili liziranju.

1. Ispitivanje na inhibiciju MASP-3-zavisnog cepanja pro-faktora D sa MASP-3 antitelima

[0510] Ispitivanje je izvedeno za određivanje inhibitornog efekta reprezentativnih MASP-3 i MASP-1 mAb-ova, identifikovana je kako je opisano u Primeru 15, na MASP-3-zavisno faktor D cepanje kako

1 2

sledi. Aktivan, rekombinantan MASP-3 protein (80 ng) pred-inkubisan je sa 1 µg reprezentativnih mAb-a D14, M3M1 i kontrolim antitelom (koje se vezuje specifično za MASP-1, ali ne i za MASP-3) na sobnoj temperaturi tokom 15 minuta. Pro-faktor D sa N-terminalnom Strep-oznakom (ST-pro-faktor D-His, 70 ng) dodat je i mešavina je inkubisana na 37°C tokom 75 minuta. Reakcije su zatim elektroforezirane, blotovane i obojene anti-faktorom D kako je prethodno opisano.

[0511] FIG.40 je Western blot koji prikazuje delimičnu inhibitornu aktivnost mAb-a D14 i M3M1 u poređenju sa kontrolnom reakcijom koja sadrži samo MASP-3 i ST-pro-faktor D-His (bez mAb; traka 1), kao i kontrolna reakcija koja sadrži mAb dobijeno iz DTLacO biblioteke koja vezuje MASP-1, ali MASP-3 (traka 4). Kako je prikazano na FIG.40, u odsustvu inhibitornog antitela, MASP-3 cepa približno 50% profaktora D u faktor D (traka 1). Kontrolno MASP-1 specifično antitelo (traka 4) ne menja odnos profaktora D prema faktoru D. Nasuprot tome, kako je prikazano na trakama 2 i 3, oba mAb D14 i mAb M3M1 inhibiraju MASP-3-zavisno cepanje pro-faktora D u faktor D, što rezultuje kao redukcija u generisanju faktora D.

[0512] Zaključci: Ovi rezultati pokazuju da MASP-3 mAb-a D14 i M3M1 mogu da inhibiraju MASP-3-zavisno faktor D cepanje. Poboljšana inhibitorna aktivnost za mAbD14 i mAb M3M1 očekuje se nakon nastavljenog afiniteta sazrevanja ovih antitela za MASP-3 vezivanje upotrebom teterovanih faktora u DTLacO sistemu.

PRIMER 19

[0513] Ovaj Primer pokazuje da MASP-3 deficijencija sprečava komplementom-posredovano liziranje mananom-obloženih WT zečijih eritrocita.

Pozadina/Obrazloženje:

[0514] Kako je opisano u Primerima 5 i 6, efekat MASP-2- i MASP-3-deficijentnog seruma na liziranje crvenih krvnih zrnaca iz krvnih uzoraka dobijeni iz mišjeg modela PNH pokazuju efikasnost MASP-2 inhibicije i/ili MASP-3 inhibicije radi lečenja subjekata koji boluje od PNH, i takođe podržava upotrebu inhibitora MASP-2 i/ili inhibitora MASP-3 (koji uključuju dvostruke ili bi-specifične MASP-2/MASP-3 inhibitore) radi ublažavanja efekata C3 fragment-posredovane ekstravaskularne hemolize kod PNH subjekata koji prolaze kroz terapiju sa C5 inhibitorom kao što je ekulizumab.

[0515] Kako je opisano u ovom Primeru, eksperimenti C3b taloženja i eksperimenti hemolize su izvedeni u MASP-3 deficijentnom serumu za dodatne 3MC pacijente, čime se potvrđuju rezultati

1

dobijeni u Primerima 5 i 6. Pored toga, izvedeni su eksperimenti koji pokazuju da je dodavanje rMASP-3 u 3MC serum sposobno da rekonstituiše C3b taloženje i hemolitičku aktivnost.

Postupci:

[0516] MASP-3-deficijentni serum dobijen je od tri različita 3MC pacijenta kako sledi:

3MC Pacijent 1: sadrži alel koji nose mutaciju koja daje ekson koji kodira MASP-3 domen serinske proteaze disfunkcionalan, dostavljen zajedno sa majkom i ocem 3MC pacijenta (oba heterozigota za alel koji nosi mutaciju koja daje ekson koji kodira MASP-3 domen serinske proteaze disfunkcionalan), 3MC Pacijent 2: Ima C1489T (H497Y) mutaciju u eksonu 12 za MASP-1, ekson koji kodira domen serinske proteaze MASP-3, rezultuje kao nefunkcionalni MASP-3, ali funkcionalni MASP-1 proteini.

3MC Pacijent 3: Ima potvrđen defekt u MASP-1 genu, što rezultuje kao nefunkcionalni MASP-3 ali funkcionalni MASP-1 proteini.

Eksperiment #1: Ispitivanje C3b taloženja

[0517] AP ispitivanje izvedeno je pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (BBS/ Mg<++>/EGTA, bez Ca<++>, u kojoj BBS= barbital puferovan slani rastvor koji sadrži saharozu), kako je opisano u Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981)), na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama pri koncentracijama u serumu koje se kreću od 0.5 do 25% a C3b taloženje izmereno je tokom vremena.

Rezultati:

[0518] FIG.41 grafički prikazuje nivo AP-vođenog C3b taloženja na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncentracije u serumu u uzorcima seruma dobijenim od MASP-3-deficijentnih (3MC), C4-deficijentnih i MBL-deficijentnih subjekata. Kako je prikazano na FIG.41, i sumirano ispod u TABELI 18, serumi MASP-3-deficijentnog pacijenta iz Pacijenta 2 i Pacijenta 3 imaju višak AP aktivnosti pri visokim koncentracijama (25%, 12.5%, 6.25% koncentracije u serumu), ali značajno višu AP50(tj., 8.2% i 12.3% seruma potrebnog da bi se postiglo 50% maksimalnog C3 taloženje).

[0519] FIG.42 grafički prikazuje nivo AP-vođenog C3b taloženja na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama pod “uobičajenim” AP-specifičnim uslovima (tj., BBS/EGTA/Mg<++>bez Ca<++>) kao funkciju vremena u 10% uzorcima humanog seruma dobijenim od MASP-3 deficijentnih, C4-deficijentnih i MBL-deficijentnih humanih subjekata.

[0520] TABELA 18 ispod sumira AP50rezultate prikazane na FIG.41 i polu-vremena za C3b taloženje prikazano na FIG.42.

1 4

TABELA 18: Rezime rezultata prikazanih na FIG.41 i 42

Eksperiment #2: Ispitivanje testiranja hemolize mananom-obloženih zečijih eritrocita za liziranje u prisustvu humanog normalog ili 3MC seruma (u odsustvu Ca<++>)

Postupci:

Pripremanje zečijih RBC u odsustvu Ca<++>(tj., upotrebom EGTA)

[0521] Zečija puna krv (2 mL) podeljena je u dve 1.5 mL ependorf epruvete i centrifugirana tokom 3 minuta na 8000 o/min (približno 5.9 rcf) u rashlađenoj ependorf centrifugi na 4°C. RBC pelet opran je tri puta nakon re-suspendovanja u ledeno-hladnom BBS/ Mg<++>/Ca<++>(4.4 mM barbiturna kiselina, 1.8 mM natrijum barbiton, 145 mM NaCl, pH 7.4, 5 mM Mg<++>, 5 mM Ca<++>). Nakon trećeg pranja, pelet je resuspendovan u 4 mL BBS/ Mg<++>/Ca<++>. Eritrociti su peletirani, a RBC-a oprana sa BBS/0.1% želatin/Mg<++>/Ca<++>kako je prethodno opisano. RBC-a suspenzija odložena je u BBS/0.1% želatin/ Mg<++>/Ca<++>at 4°C. Zatim, 100 µL suspendovanih RBC-a razblaženi su sa 1.4 mL vode i rotirani na 8000 o/min (približno 5.9 rcf) tokom 3 minuta, a OD supenatanta podešena je na 0.7 pri 541nm (OD za 0.7 na 541nm odgovara približno 10<9>eritrociti/ml). Nakon toga, 1 mL resuspendovanih RBC-a na OD 0.7 dodati su u 9 ml BBS/Mg<++>/EGTA kako bi se postigla koncentracija od 10<8>eritrocita/ml. Razblaženja ispitnih seruma ili plazme prupremljena su u ledeno-hladnom BBS, Mg<++>, EGTA i 100 µL svakog serumskog ili plazma razblaženje pipetirano je u odgovarajuće bazenčiće ploče sa okruglim dnom.100 µL pogodno razblaženih RBC (10<8>eritrociti/ml) dodati su u svaki bazenčić. Nano-voda korišćena je da proizvede pozitivnu kontrolu (100% liziranje), dok su razblaženje sa BBS/Mg<++>/EGTA bez seruma ili plazma korišćeni kao negativna kontrola. Ploča je zatim inkubisana tokom 1 sata na 37°C. Ploča sa okruglim dnom rotirana je pri 3750 o/min tokom 5 minuta. Zatim, 100 µL supenatanta iz svakog bazenčića transferovano je u odgovarajući bazenčić ploče sa ravnim dnom i OD je očitana na 415-490 nm.

Rezultati:

1

[0522] FIG.43 grafički prikazuje procenat hemolize (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih zečijih eritrocita u supernatantu izmereno fotometrijom) mananom-obloženih zečijih eritrocita u opsegu serumskih koncentracija u serumu iz normalnih subjekata i iz dva 3MC pacijenta (Pacijent 2 i Pacijent 3), izmereno u odsustvu Ca<++>. Kako je prikazano na FIG.43, pokazano je da MASP-3 deficijencija redukuje procenat komplementom-posredovanog liziranje mananom-obloženih eritrocita u poređenju sa normalnim humanim serumom. Razlika između dve krive iz normalnih humanih seruma i dve krive iz 3MC pacijenata je značajna (p=0.013, Friedman test).

[0523] TABELA 19 ispod sumira AP50rezultate prikazane na FIG.43.

TABELA 19: Rezime rezultata prikazanih na FIG.43

[0524] Napomenuto je da kada su uzorci seruma prikazani u TABELI 19 grupisani, AP50vrednost za normalni humani serum = 7.9, a AP50vrednost za 3MC serum = 12.8 (p=0.031, Wilcox-ov test usaglašenih parova potpisanog ranga).

Eksperiment #3: Rekonstitucija humanog 3MC seruma rekombinantnim MASP-3 obnavlja AP-vođeno C3b taloženje na zimosan obloženim pločama

Postupci:

[0525] AP ispitivanje izvedeno je pod uobičajenim AP-specifičnim uslovima (BBS/Mg<++>/EGTA, bez Ca<++>, u kojoj BBS=barbital puferovan slani rastvor koji sadrži saharozu), kako je opisano u Bitter-Suermann et al., Eur. J. Immunol 11:291-295 (1981)), na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama u sledećim uzorcima seruma (1) 5% humani serum iz 3MC Pacijenta #2 sa punom dužinom aktivnog rMASP-3 dodat u opsegu od 0 do 20 µg/ml; (2) 10% humani serum iz 3MC Pacijenta #2 sa punom dužinom aktivnog rMASP-3 dodat u opsegu od 0 do 20 µg/ml; i (3) 5% humani serum iz 3MC Pacijenta #2 sa neaktivnim rMASP-3A (S679A) dodat u opsegu od 0 do 20 µg/ml.

Rezultati:

1

[0526] FIG.44 grafički prikazuje nivo AP-vođenog C3b taloženja na zimosanom-obloženim mikrotitarskim pločama kao funkcija koncetracije rMASP-3 proteina dodat uzorcima seruma dobijenim od humanog 3MC Pacijenta #2 (MASP-3-deficijentni). Kako je prikazano na FIG.44, aktivan rekombinantan MASP-3 protein rekonstituiše AP-vođeno C3b taloženje na zimosanom-obloženim pločama na način zavisan od koncentracije. Kako je dalje prikazano na FIG.44, nije primećeno C3b taloženje u 3MC serumu koji sadrži neaktivan rMASP-3 (S679A).

Eksperiment #4: Rekonstitucija humanog 3MC seruma rekombinantnim MASP-3 obnavljaj hemolitičku aktivnost u serumu 3MC pacijenta

Postupci:

[0527] Hemolitički ispitivanje izvedeno je upotrebom zečijih RBC upotrebom postupaka prethodno opisani Eksperimentu #2 sa sledećim ispitnim serumima u opsegu od 0 do 12% serum: (1) normalni humani serum ; (2) serum 3MC pacijenta; (3) serum 3MC pacijenta plus aktivan pune dužine rMASP-3 (20 µg/ml); i (4) toplotom-inaktiviran humani serum.

Rezultati:

[0528] FIG.45 grafički prikazuje procenat hemolize (kako je izmereno oslobađanjem hemoglobina liziranih zečijih eritrocita u supernatantu izmereno fotometrijom) mananom-obloženih zečijih eritrocita u opsegu serumskih koncentracija u (1) normalnom humanom serumu; (2) serumu 3MC pacijenta; (3) serumu 3MC pacijenta plus aktivan pune dužine rMASP-3 (20 µg/ml); i (4) toplotom-inaktiviranom humanom serumu, izmereno u odsustvu Ca<++>. Kako je prikazano na FIG.45, procenat liziranja zečijih RBC je značajno povećano u 3MC serumu koji uključuju rMASP-3 u poređenju sa procentom liziranje u 3MC serumu bez rMASP-3 (p=0.0006).

[0529] FIG.46 grafički prikazuje procenat liziranja zečijih eritrocita u 7% humanom serumu iz 3MC Pacijenta 2 i iz 3MC Pacijenta 3 koji sadrži aktivan rMASP-3 pri koncentracionom opsegu od 0 do 110 µg/ml u BBS/Mg<++>/EGTA. Kako je prikazano na FIG.46, procenat liziranja zečijih RBC obnovljen je sa količinom rMASP-3 na način zavisan od koncentracije do 100% aktivnost.

Eksperiment #5: Serum MASP-3 deficijentnog (CMC) pacijenta ima funkcionalni MASP-2 ukoliko je MBL prisutan

Postupci:

[0530] Ispitivanje C3b taloženja izvedeno je upotrebom mananom-obloženih ELISA ploča kako bi se ispitalo da li je 3MC serum deficijentan u LEA-2. Citrat plazma je razblažena u BBS puferu u serijskim razblaženjima (počevši od 1:80, 1:160, 1: 320, 1:640, 1:1280, 1:2560) i uvedena u mananom-obložene

1

ploče. Deponovan C3b detektovan je upotrebom ispitivanja pilećeg anti-humanog C3b. LEA-2 vođeno C3b taloženje (plazma razblaženja su previsoka da bi AP i LEA-1 funkcionisali) on mananom-obloženim ELISA pločama procenjeno je kao funkcija humanih serumskih koncentracija u serumu iz normalnog humanog subjekta (NHS), iz dva 3MC pacijenta (Pacijent 2 i Pacijent 3), iz roditelja pacijenta 3 i iz MBL-deficijentnog subjekta.

Rezultati:

[0531] FIG.47 grafički prikazuje nivo LEA-2-vođenog (tj., MASP-2-vođeno) C3b taloženja na mananomobloženim ELISA pločama kao funkcija koncetracije humanog seruma razblaženog u BBS puferu, za serum iz normalnog humanog subjekta (NHS), iz dva 3MC pacijenta (Pacijent 2 i Pacijent 3), iz roditelja pacijenta 3 i iz MBL-deficijentnog subjekta. Ovi podaci ukazuju da je Pacijent 2 ima dovoljno MBL. Međutim, Pacijent 3 i majka pacijenta 3 su MBL deficijentni, te prema tome njihov serum ne taloži C3b na manan putem LEA-2. Zamena MBL u ovim serumima obnavlja LEA-2 posredovano C3b taloženje u serumu pacijenta 3 (koji je homozigotni za SNP što vodi ka MASP-3 deficijenciji) i njegove majke (koja je heterozigotna za mutant MASP-3 alel) (podaci nisu prikazani). Ovo otkriće pokazuje 3MC serum nije deficijentan u LEA-2, već pokazuje da ima funkcionalan MASP-2 i funkcionalan MASP-1.

Ukupan rezime i zaključci:

[0532] Ovi rezultati pokazuju da MASP-3 deficijencija u humanom serumu rezultuje kao gubitak AP aktivnosti, što se manifestuje kao redukovano C3b taloženje na zimosanom-obloženim bazenčićima i redukovano lizija zečijih eritrocita. AP može se obnoviti u oba ispitivanja dopunjavanjem seruma sa funkcionalnim, rekombinantnim humanim MASP-3.

LISTA SEKVENCI

[0533]

1

1

1

11

12

1

��

1

�

�

1

�

1

11

��

1

��

1

�

�

1

1

1

11

��

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

�

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Mešavina koja obuhvata izvesnu količinu MASP-3 inhibitornog agensa, efektivnu da inhibira MASP-3-zavisnu aktivaciju komplementa za upotrebu u lečenju subjekta koji boluje od paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH), pri čemu je pomenuti MASP-3 inhibitorni agens MASP-3 monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za deo humane MASP-3 (SEQ ID NO:8).

2. Mešavina za upotrebu prema zahtevu 1, u kojem mešavina dalje obuhvata najmanje jedan od: MASP-1 inhibitorni agens, MASP-2 inhibitorni agens, kombinaciju MASP-1 inhibitornog agensa i MASP-2 inhibitornog agensa, i/ili terminalni inhibitor komplemenata koji inhibira cepanje proteina C5 komplementa.

3. Mešavina za upotrebu prema zahtevu 2, u kojoj MASP-1 inhibitorni agens predstavlja najmanje jedan od:

(i) MASP-1 monoklonalno antitelo, ili njegov fragment, koje se specifično vezuje za deo SEQ ID NO:10; (ii) MASP-1 inhibitorni agens koji se specifično vezuje za deo MASP-1 sa afinitetom od najmanje 10 puta većim u odnosu na vezivanje za MASP-3 (SEQ ID NO:8); i/ili

(iii) MASP-1 inhibitorni agens koji se specifično vezuje za domen serinske proteaze MASP-1 (aa 449-694 iz SEQ ID NO:10).

4. Mešavina za upotrebu prema zahtevu 2, u kojoj MASP-2 inhibitorni agens predstavlja MASP-2 monoklonalno antitelo, ili njegov fragment koji se specifično vezuje za deo SEQ ID NO:5.

5. Mešavina za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-4, u kojoj ta mešavina povećava preživljavanje crvenih krvnih zrnaca kod subjekta koji ispoljava jedan ili više simptoma odabranih iz grupe koju čine (i) nivoi hemoglobina ispod normale, (ii) nivoi trombocita ispod normale; (iii) nivoi retikulocita iznad normale, i (iv) nivoi bilirubina iznad normale; opciono kod koje je subjekat prethodno lečen, ili se trenutno leči terminalnim inhibitorom komplemenata koji inhibira cepanje proteina C5 komplementa.

6. Mešavina za upotrebu prema zahtevu 2, u kojoj terminalni inhibitor komplemenata predstavlja humanizovano anti-C5 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, ili u kojoj pomenuti inhibitor predstavlja ekulizumab.

2 4

7. Mešavina prema zahtevu 1 u kojoj je MASP-3 monoklonalno antitelo ili njegov fragment odabrano iz grupe koju čine rekombinantno antitelo, antitelo koje ima redukovanu efektorsku funkciju, himerno, i humanizovano ili humano antitelo.

8. Mešavina prema zahtevu 1, gde je ta mešavina formulisana za sistemsku dostavu, kao što je za dostavu subkutano, intramuskularno, intravenozno, intraarterijalno ili u obliku inhalanta.

9. Mešavina za upotrebu prema zahtevu 1, koja obuhvata izvesnu količinu MASP-3 inhibitornog agensa efektivnu da poveća preživljavanje crvenih krvnih zrnaca kod subjekta koji boluje od paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH).

10. Mešavina za upotrebu prema zahtevu 9, koja dalje obuhvata MASP-2 inhibitorni agens.