RS57372B1 - 11-hidroksil-6-supstituisani-derivati žučnih kiselina i njihovi aminokiselinski konjugati kao modulatori receptora za farnezoid x - Google Patents

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

[0001] FXR je član jedarne receptorne familije ligandom-aktiviranih transkripcionih faktora koja obuhvata receptore za steroidne, retinoidne i tiroidne hormone (D.J. Mangelsdorf, et al., Cell 83:841-850 (1995)). Northern i in situ analiza pokazuju da je FXR najčešće eksprimiran u jetri, crevima, bubregu i nadbubrežnoj žlezdi (B.M. Forman, et al., Cell 81:687-693 (1995) and W. Seol, et al., Mol. Endocrinnol. 9:72-85 (1995)). FXR se vezuje za DNK kao heterodimer sa receptorom za 9-cis retinoinsku kiselinu (RXR). Pacovski FXR je aktiviran mikromolarnim koncentracijama farnezoida kao što su farnezol i juvenilni hormon (B.M. Forman, et al., Cell 81:687-693 (1995)). Međutim, ova jedinjenja nisu uspela da aktiviraju mišji i humani FXR, ostavljajući pod sumnjom prirodu endogenih FXR liganada. Nekoliko prirodnih žučnih kiselina (npr., henodeoksiholna kiselina (CDCA), deoksiholna kiselina (DCA), litoholna kiselina (LCA) i njihovi konjugati sa taurinom i glicinom) služe kao FXR ligandi i vezuju se za i aktiviraju FXR na fiziološkim koncentracijama (WO-A-00/37077), kao i 6.alfa.-etil derivat CDCA (obetiholna kiselina – videti na primer J. Med. Chem. Vol 47(18) pp 4559 - 4569, (2004), jedinjenje 7). Žučne kiseline su metaboliti holesterola koji su formirani u jetri i izlučuju se u dvanaestopalačno crevo, gde imaju važne uloge u solubilizaciji i aspsorpciji hranljivih lipida i vitamina. Većina žučnih kiselina (~95%) su zatim reapsorbovane u ileumu i vraćene u jetru preko enterohepatičnog cirkulatornog sistema. Prevođenje holesterola u žučne kiseline u jetri je pod regulacijom povratne sprege: žučne kiseline nishodno regulišu transkripciju citohroma P4507a (CYP7a), koji kodira enzim koji katalizuje korak ograničenja brzine u bisointezi žučnih kiselina. Predloženo je da je FXR uključen u suzbijanje ekspresije CYP7a pomoću žučnih kiselina (D.W. Russell, Cell 97:539-542 (1999)). U ileumu, žučne kiseline indukuju ekspresiju crevnog proteina koji se vezuje za žučnu kiselinu (IBABP), koji vezuje žučne kiseline sa visokim afinitetom i može biti uključen u njihovu ćelijsku apsorpciju i prenos. Pokazano je da žučne kiseline posreduju svoje efekte na ekspresiju IBABP preko aktivacije FXR, koji se vezuje za element odgovora tipa IR-1 koji je očuvan u promotorima humanog, pacovskog i mišjeg IBABP gena. Na taj način, FXR je uključen u stimulaciju (IBABP) i suzbijanje (CYP7a) ciljnih gena uključenih u homeostazu žučne kiseline i holesterola. Prema tome, postoji potreba za modulatorima FXR pogodnim za razvoj leka. Predmetni pronalazak se bavi ovom potrebom.

REZIME PRONALASKA

[0002] Pronalazak daje jedinjenja i postupke za pripremu ovih jedinjenja. Specifično, pronalazak daje jedinjenje formule I:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat, gde R1 , R2 , R3, R4 , R5 i R6 su kao što su opisani ovde. Jedinjenja prema pronalasku su korisna za lečenje i prevenciju bolesti i stanja.

[0003] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat, i farmaceutski prihvatljiv nosač ili ekscipijens.

[0004] Pronalazak takođe daje gore navedena jedinjenja za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti ili stanja, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, bolest ili stanje je posredovano preko FXR.

[0005] Pronalazak takođe obezbeđuje za proizvodnju lek za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja (npr., bolesti ili stanja posredovanog preko FXR), pri čemu lek sadrži jedinjenje prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat.

[0006] Pronalazak takođe daje kompoziciju za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja (npr., bolesti ili stanja posredovanog preko FXR), pri čemu kompozicija sadrži jedinjenje prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat.

[0007] Osim ukoliko su drugačije definisani, svi tehnički i naučni termini koji su ovde korišćeni imaju isto značenje kao što uobičajeno razumeju stručnjaci iz date oblasti tehnike kojoj ovaj pronalazak pripada. U specifikaciji, oblici u jednini takođe obuhvataju množinu, osim ukoliko kontekst jasno ne diktira drugačije. Iako postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu biti korišćeni u izvođenju ili testiranju predmetnog pronalaska, pogodni postupci i materijali su opisani u daljem tekstu. U slučaju konflikta, predmetna specifikacija, uključujući definicije, će imati prednost. Pored toga, materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nisu određeni tako da budu ograničavajući.

[0008] Ostale karakteristike i prednosti pronalaska će biti jasni iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0009]

Slika 1 je grafikon koji prikazuje aktivnost jedinjenja prema pronalasku i poređenje jedinjenja u analizi transaktivacije u HEK293T ćelijama.

Slika 2 je serija grafikona koji prikazuju nedostatak aktivnosti TGR5 jedinjenja prema pronalasku u humanim enteroendokrinim ćelijama koje eksprimiraju TGR5 na fiziološkom nivou (A) i u humanim ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) koje prekomerno eksprimiraju TGR5 (B).

Slika 3 je serija grafikona koji prikazuju aktivnost jedinjenja prema pronalasku i drugih jedinjenja za poređenje u regulaciji ekspresije OSTα (A), OSTβ (B), BSEP (C), MRP2 (D), CYP7A1 (E), SHP (F), FGF-19 (G) i UGT2B4 (H).

Slika 4 je serija grafikona koji prikazuju aktivnost jedinjenja prema pronalasku i drugih jedinjenja za poređenje u regulaciji PLTP uključenom u metabolizam lipida (A), SREBP-1C (B), APOCII (C) i PPARγ (D).

Slika 5 je grafikon koji prikazuje regulaciju jedinjenja prema pronalasku i drugih jedinjenja za poređenje na gen PEPCK.

Slika 6 je grafikon koji prikazuje merenje ATP-a u HepG2 ćelijama, tretiranim naznačenim koncentracijama jedinjenja prema pronalasku u trajanju od 4 časa.

Slika 7 je serija grafikona koji prikazuju holeretički efekat jedinjenja 100 za id i iv primenu (A), sekreciju jedinjenja 100 tokom vremena za id i iv primenu (B) i koncentraciju jedinjenja 100 u plazmi tokom vremena (C).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Jedinjenja prema pronalasku

[0010] Predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat, gde:

R1 je hidroksil;

R2 je vodonik, hidroksil, alkil ili halogen, pri čemu je navedeni alkil nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više R<a>;

R3 je vodonik, hidroksil, alkil ili halogen, pri čemu je navedeni alkil nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više R<b>;

R4 je alkil, alkenil, alkinil ili halogen, pri čemu je navedeni alkil nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više R<c>;

Ra, Rb i Rc su svaki nezavisno halogen ili hidroksil;

R5 je hidroksil, OSO3H, OSO3-, OCOCH 2

3, OPO3H2, OPO3-, ili vodonik; i

R6 je hidroksil, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H2, OPO 2

3-, ili vodonik;

ili uzeti zajedno R5 i R6 sa atomom ugljenika za koji su vezani formiraju karbonil.

[0011] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule II:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat.

[0012] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule III:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat.

[0013] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule IV:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat.

[0014] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, pri čemu, jedinjenje je jedinjenje (npr., nativno jedinjenje ili jedinjenje u obliku ne-soli, nesolvatiranom i nekonjugovanom obliku).

[0015] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, pri čemu jedinjenje je farmaceutski prihvatljiva so.

[0016] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, pri čemu jedinjenje je aminokiselinski konjugat. U jednom aspektu, aminokiselinski konjugat je glicinski konjugat. U jednom aspektu, aminokiselinski konjugat je taurinski konjugat.

[0017] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, pri čemu, jedan od R2 ili R3 je hidroksil ili halogen i preostali R2 ili R3 je vodonik ili nesupstituisani alkil. U jednom aspektu, jedan od R2 ili R3 je hidroksil i preostali R2 ili R3 je vodonik.

[0018] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, pri čemu jedan od R5 ili R6 je hidroksil i preostali R5 ili R6 je vodonik.

[0019] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, gde R2 je hidroksil ili halogen. U jednom aspektu, R2 je hidroksil. U sledećem aspektu, R<2>je halogen.

[0020] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, gde R3 je vodonik ili nesupstituisani alkil. U jednom aspektu, R3 je vodonik. U sledećem aspektu, R3 je metil.

[0021] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, gde R2 je hidroksi i R3 je vodonik.

[0022] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, gde R5 je hidroksil.

[0023] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, gde R6 je vodonik.

[0024] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, gde R2 i R5 su svaki hidroksil i R3 i R6 su svaki vodonik.

[0025] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, gde R4 je alkil. U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, gde R4 je nesupstituisani alkil. U jednom aspektu, R4 je metil, etil, propil ili butil. U jednom aspektu, R4 je metil ili etil. U jednom aspektu, R4 je metil. U jednom aspektu, R4 je etil.

[0026] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat.

[0027] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, pri čemu, jedinjenje je agonist FXR. U jednom aspektu, jedinjenje prema pronalasku je visoko potentni agonist FXR. Na primer, jedinjenje prema pronalasku aktivira FXR na koncentraciji ispod 1 μM, ispod 0.8 μM, ispod 0.6 μM, ispod 0.4 μM ili ispod 0.2 μM (npr., kao što je mereno pomoću AlphaScreen analize), u poređenju sa 15 μM za CDCA. Na primer, jedinjenje prema pronalasku aktivira FXR u koncentraciji ispod 0.2 μM (npr., kao što je mereno pomoću AlphaScreen analize). Na primer, jedinjenje prema pronalasku aktivira FXR sa EC50ispod 1 μM, ispod 0.8 μM, ispod 0.6 μM, ispod 0.4 μM ili ispod 0.2 μM (npr., kao što je mereno pomoću AlphaScreen analize), u poređenju sa 8.9 μM za CDCA. Na primer, jedinjenje prema pronalasku aktivira FXR sa EC50ispod 0.2 μM (npr., kao što je mereno pomoću AlphaScreen analize).

[0028] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, pri čemu jedinjenje nije aktivno protiv drugih jedarnih receptora. U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, pri čemu jedinjenje ne aktivira TGR5 (npr., kao što je mereno pomoću HTR-FRET TGR5 analize, gde je TGR5 eksprimiran na fiziološkom nivou ili prekomerno eksprimiran).

[0029] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, pri čemu jedinjenje indukuje apoptozu.

[0030] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, pri čemu jedinjenje ne pokazuje citotoksična efekat na humane ćelije jetre HepG2 (npr., kao što je mereno pomoću analize oslobađanja LDH ili analize intracelularnog ATP-a).

[0031] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, pri čemu jedinjenje ne inhibira jednu ili više CYP450 izoformi izabranih od CYP1A2, CYP3A4 (zeleni supstrat), CYP3A4 (plavi supstrat), CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 i CYP2E1. Na primer, jedinjenja prema pronalasku imaju IC50veću od 10 μM kao što je mereno pomoću analize inhibicije CPY450.

[0032] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenje formule I, II, III ili IV, pri čemu jedinjenje ne inhibira humani ERG kalijumov kanal.

[0033] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za sintezu jedinjenja prema pronalasku, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata.

[0034] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na komplet koji sadrži jedno ili više jedinjenja prema pronalasku, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, komplet dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv sastojak.

[0035] U jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0036] Jedan tehnički problem koji se rešava predmetnim pronalaskom je identifikacija novih jedinjenja koja su agonisti receptora jedarnog hormona farnezoida X (FXR), koji predstavlja privlaćno ciljno mesto za lečenje metaboličkih i hroničnih bolesti jetre. Dobro je poznato da prirodne žučne kiseline moduliraju ne samo nekoliko receptora jedarnog hormona, već takođe agoniste za G protein-spojeni receptor (GPCR) TGR5. Selektivnost može biti problem za jedinjenja leka usmerena na modulaciju receptora jedarnog hormona. Prema tome cilj predmetnog pronalaska je obezbediti jedinjenje koje je specifičan agonist FXR, na primer, jedinjenje koje ne pokazuje aktivnost protiv drugih jedarnih receptora ili jedinjenje koje ne aktivira GPCR TGR5 žučne kiseline. Drugi problemi u razvoju jedinjenja leka obuhvataju nepogodan farmakokinetički profil, probleme sa bezbednošću kao što je toksičnost (npr., jetra) i neželjene interakcije lek-lek. Prema tome, dodatni ciljevi predmetnog pronalaska su obezbediti jedinjenja koja ne pate od gore navedenih tehničkih problema, tj., jedinjenje koje ima pogodan farmakokinetički profil, jedinjenje koje ne ispoljava citotoksični efekat na ćelije, jedinjenje koje ne inhibira citohrom P450 enzime, i/ili jedinjenje koje ne inhibira hERG.

[0037] Patentna i naučna literatura koja se ovde pominje ustanovljava znanje koje je dostupno stručnjacima iz date oblasti tehnike. U slučaju nedoslednosti, predmetni pronalazak će imati prednost.

[0038] Za svrhe predmetnog pronalaska, biće korišćene sledeće definicije (osim ukoliko nije izričito drugačije naznačeno).

[0039] Opšti hemijski termini korišćeni ovde imaju svoja uobičajena značenja. Na primer, termin alkil označava granatu ili negranatu zasićenu ugljovodoničnu grupu. Termin "n-alkil" označava negranatu alkil grupu. Termin "Cx-Cyalkil" označava alkil grupu koja ima između x i y atoma ugljenika, uključujući navedene vrednosti, u granatoj ili negranatoj ugljovodoničnoj grupi. Kao ilustracija, ali bez ograničenja, termin "C1-C8alkil" označava pravolančanu ili granatu ugljovodoničnu grupu koja ima 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 atoma ugljenika. "C1-C6" označava pravolančanu ili granatu ugljovodoničnu grupu koja ima 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 atoma ugljenika. "C1-C4alkil" označava pravolančanu ili granatu ugljovodoničnu grupu koja ima 1, 2, 3 ili 4 atoma ugljenika, uključujući metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sek-butil i terc-butil. Termin "C1-C4n-alkil" označava pravolančane ugljovodonične grupe koje imaju od 1, 2, 3 ili 4 atoma ugljenika uključujući metil, etil, n-propil i n-butil. Termin "C3-C6cikloalkil" označava ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil i cikloheksil. Termin "C3-C7cikloalkil" takođe obuhvata cikloheptil. Termin "C3-C8cikloalkil" takođe obuhvata ciklooktil. Cikloalkilalkil označava cikloalkil grupe vezane preko alkil linker lanca, kao na primer, ali bez ograničenja, ciklopropilmetil, ciklopropiletil, ciklopropilpropil, ciklopropilbutil, ciklobutilmetil, ciklobutiletil, ciklobutilpropil, ciklopentilmetil, ciklopentiletil, ciklopentilpropil, cikloheksilmetil, cikloheksiletil i cikloheksilpropil. Svaka alkil, cikloalkil i cikloalkilalkil grupa može biti izborno supstituisana kao što je ovde naznačeno.

[0040] Termin "C4-C8cikloalkenil" označava ciklobutenil, ciklopentil, cikloheksenil, cikloheptenil i ciklooktenil prstenove koji imaju jedno ili više mesta nezasićenja, npr., jednu ili više dvogubih veza.

[0041] Termin "halogen" označava fluoro, hloro, bromo ili jodo.

[0042] Termin "hidroksil" označava OH.

[0043] Biće jasno da "supstitucija" ili "supstituisan sa" obuhvata implicitan uslov da je takva supstitucija u skladu sa dozvoljenom valencom supstituisanog atoma i supstituenta, i da supstitucija rezultuje u stabilnom jedinjenju, npr., koje spontano ne podleže tranformaciji kao što je preko preuređivanja, ciklizacije, eliminacije, itd. Kao što je ovde korišćen, termin "supstituisan" je predviđeno da obuhvata sve dozvoljene supstituente organskih jedinjenja osim ukoliko je drugačije naznačeno. U širokom aspektu, dozvoljeni supstituenti obuhvataju aciklične i ciklične, granate i negranate, karbociklične i heterociklične, aromatične i nearomatične supstituente organskih jedinjenja. Dozvoljeni supstituenti mogu biti jedan ili više istih ili različitih za odgovarajuća organska jedinjenja. Za svrhe ovog pronalaska, heteroatomi kao što je azot može imati supstituente vodonika i/ili bilo koje dozvoljene supstituente organskih jedinjenja koji su opisani ovde koji zadovoljavaju valence heteroatoma. Ovaj pronalazak nije namenjen da bude ograničen ni na koji način dozvoljenim supstituentima organskih jedinjenja.

[0044] Termin "farmaceutski" ili "farmaceutski prihvatljiv" kada je ovde korišćen kao pridev, označava značajno netoksičan i značajno bez štetnosti za primaoca.

[0045] "Farmaceutska formulacija" dalje označava da nosač, rastvarač, ekscipijens i so moraju biti kompatibilni sa aktivnim sastojkom formulacije (npr., jedinjenjem prema pronalasku). Stručnjaci iz date oblasti tehnike razumeju da termini "farmaceutska formulacija" i "farmaceutska kompozicija" su generalno naizmenični, i oni su tako korišćeni za svrhe ove prijave.

[0046] Pogodne farmaceutski prihvatljive soli prema pronalasku biće lako određene od strane stručnjaka iz date oblasti tehnike i obuhvataće, na primer, bazne soli kao što su soli alkalnih i zemnoalkalnih metala napravljene od aluminijuma, kalcijuma, litijuma, magnezijuma, kalijuma, natrijuma i cinka i organske soli napravljene od N,N’-dibenziletilendiamina, hlorprokaina, holina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metilglukamina) i prokaina. Takođe mogu biti korišćene soli sa farmaceutski prihvatljivim aminima kao što su lizin, arginin, trometamin, trietilamin i slično. Takve soli jedinjenja prema pronalasku mogu biti pripremljene upotrebom uobičajenih tehnika, od jedinjenja prema pronalasku reakcijom, na primer, odgovarajuće baze sa jedinjenjem prema pronalasku.

[0047] Kada su korišćene u medicini, soli jedinjenja prema pronalasku bi trebalo da su farmaceutski prihvatljive, ali farmaceutski neprihvatljive soli mogu biti pogodno korišćene za pripremu odgovarajuće slobodne baze ili njenihfarmaceutski prihvatljivih soli.

1

[0048] Kao što je ovde korišćen, termin "aminokiselinski konjugat" označava konjugat jedinjenja prema pronalasku sa bilo kojom pogodnom aminokiselinom. U jednom aspektu, takav pogodan aminokiselinski konjugat jedinjenja prema pronalasku imaće dodatnu prednost pojačane celovitosti u žučnim ili crevnim tečnostima. Predmetni pronalazak obuhvata konjugate glicina i taurina bilo kog od jedinjenja prema pronalasku. Na primer, konjugati glicina i taurina jedinjenja formule I imaju sledeću formulu:

(g ) ( )

[0049] U jednom aspektu, konjugati glicina i taurina i jedinjenja prema pronalasku mogu biti njegova farmaceutski prihvatljiva so. Aminokiselinski konjugati jedinjenja prema pronalasku mogu biti pripremljeni prema postupcima poznatim u stanju tehnike. Na primer, slobodna kiselina može biti kuplovana sa aminokiselinom glicinom ili taurinom upotrebom standardnih reakcija peptidnog kuplovanja.

[0050] U jednom aspektu, natrijumova so konjugata taurina i jedinjenja 100 može biti pripremljena na sledeći način.

j j j g j j j

[0051] Jedinjenje 100 je tretirano bazom (npr., Et3N) i taurinom u polarnom protičnom rastvaraču (npr., EtOH). Dobijena smeša može biti tretirana kuplujućim reagensom (npr., DMT-MM (4-(4,6-Dimetoksi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinijum hlorid)). Reakciona smeša može biti koncentrovana i rastvorena u bazi (npr., 3% tež./zapr. vodeni rastvor NaOH). Dobijena reakciona smeša može biti ekstrahovana sa organskim rastvaračem (npr., AcOEt). Vodena faza može biti koncentrovana i filtrirana na čepu od silike, eluiranjem prvo sa, npr., H2O (do neutralne pH) i zatim sa, npr., H2O/MeOH 80:20 zapr./zapr. da bi se dobio konjugat taurina i jedinjenja 100. Pogodne aminokiseline obuhvataju, ali bez ograničenja na glicin i taurin.

[0052] Neka od jedinjenja predmetnog pronalaska mogu da postoje u nesolvatiranim kao i u solvatiranim oblicima kao što su, na primer, hidrati.

[0053] Predmetni pronalazak daje postupke za sintezu jedinjenja prema pronalasku koji su ovde opisani. Predmetni pronalazak takođe daje detaljne postupke za sintezu različitih otkrivenih jedinjenja prema pronalasku prema sledećim šemama kao što je prikazano u primerima.

[0054] Sintetički postupci prema pronalasku mogu da tolerišu široki niz različitih funkcionalnih grupa, prema tome mogu se koristiti različiti supstituisani početni materijali. Postupci generalno daju željeno krajnje jedinjenje na ili blizu kraja ukupnog postupka, iako može biti poželjno u određenim slučajevima dalje prevesti jedinjenje u njegovu farmaceutski prihvatljivu so, estar ili prolek.

[0055] Jedinjenja prema pronalasku mogu biti pripremljena na različite načine upotrebom komercijalno dostupnih početnih materijala, jedinjenja poznatih u literaturi, ili od lako pripremljenih intermedijera, upotrebom standardnih sintetičkih metoda i postupaka bilo poznatih stručnjacima iz date oblasti tehnike ili koji će biti očigledni iskusnom stručnjaku u svetlu navoda koji su ovde dati. Standardne sintetičke metode i postupci za pripremu organskih molekula i transformacije i manipulacije funkcionalne grupe mogu se dobiti iz relevantne naučne literature ili iz standardnih udžbenika iz date oblasti. Iako nisu ograničeni na bilo koji ili nekoliko izvora, klasični tekstovi kao što su Smith, M. B., March, J., March’s Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, 5th edition, John Wiley & Sons: New York, 2001; i Greene, T.W., Wuts, P.G. M., Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd edition, John Wiley & Sons: New York, 1999, su korisni i priznati referentni udžbenici organske sinteze poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike. Sledeći opisi sintetičkih postupaka su dizajnirani za ilustraciju, ali ne za ograničenje, opštih postupaka za pripremu jedinjenja prema predmetnom pronalasku.

[0056] Sve skraćenice korišćene u ovoj prijavi se nalaze u "Protective Groups in Organic Synthesis" by John Wiley & Sons, Inc, ili MERCK INDEX by MERCK & Co., Inc, ili drugim hemijskim knjigama ili hemijskim katalozima od hemijskog prodavca kao što je Aldrich, ili prema upotrebi poznatoj u stanju tehnike.

[0057] Reagensi i uslovi: a) 1) MeOH, p-TSA, ultrazvuk, 3 časa, kvantitativan; 2) Ac2O, NaHCO3THF, refluks 12 časova, 85%; b) PCC, CH2Cl2, 6 časova, 62%; c) Ac2O, Bi(OTf)3, CH2Cl2, 1 čas, 91%; d) Br2, Benzen, 30°C preko noći, 74%; e) NaBH4, NaOAc, Pir, sobna temperatura 2 dana, 80%; f) HI 57%, AcOH, sobna temperatura 30 min; g) CrO3, AcOH, sobna temperatura 45 min; h) Zn prah, NaOAc, refluks 20 min; i) NaOH 2M, MeOH, sobna temperatura preko noći, 65% od jedinjenja 5; 1) NaBH4, THF/H2O 4:1, 70%; m) Na(s), sek-BuOH, 50°C, 70%.

[0058] Sinteza je zasnovana na upotrebi 6α-etil-holne kiseline (6-ECA, 1) kao početnog materijala koji je pripremljen upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike. 6-ECA (1) je tretiran sa p-TSA u MeOH pod ultrazvučnim zračenjem da bi se dobio odgovarajući metil estar, koji je selektivno zaštićen na C3 položaju refluksovanjem sa Ac2O u prisustvu NaHCO3u THF da bi se dobilo jedinjenje 2. Tretman jedinjenja 2 sa PCC u CH2Cl2na sobnoj temperaturi, praćen tretmanom sa Ac2O, Bi(OTf)3u CH2Cl2na sobnoj temperaturi dao je

1

intermedijer metil 3α,7α-diacetoksi-12-okso-5β-holan-24-oat (jedinjenje 3; oko 48% od jedinjenja 2).

[0059] Tretman jedinjenja 3 sa Br2u benzenu u trajanju od npr., 12 časova proizveo je jedinjenje 4. Reakcija jedinjenja 4 sa NaBH4i NaOAc u sveže destilovanom piridinu dala je odgovarajući 11β-12β epoksid (jedinjenje 5), u prinosu od oko 59% posle prečišćavanja na silika gelu. Reakcija jedinjenja 5 sa HI u AcOH na sobnoj temperaturi dala je halohidrin intermedijer koji je zatim oksidovan na C11 položaju sa CrO3u AcOH da bi se generisalo jedinjenje 6. Reakcija jedinjenja 6 sa Zn u prahu u ključalom AcOH i alkalna hidroliza (NaOH/MeOH) dali su 3α,7α-hidroksi-12-keto-513-holan-24-oinsku kiselinu (jedinjenje 7; oko 65% prinos od jedinjenja 5).

[0060] Jedinjenje 7 je stereoselektivno redukovano na C11-karbonilu upotrebom NaBH4u smeši THF/H2O= (4:1, zapr./zapr.) da bi se dobila 3α,7α,11β-trihidroksi-6α-etil-5β-holan-24-oinska kiselina (jedinjenje 100; oko 27% od jedinjenja 3), posle hromatografskog prečišćavanja da bi se dobilo jedinjenje 100. Alternativno, jedinjenje 7 je redukovano sa natrijumom u sek-BuOH na 50°C da bi se dobilo jedinjenje 101 (oko 70% prinos), posle prečišćavanja.

[0061] "Solvat" označava oblik dodavanja rastvarača koji sadrži stehiometrijske ili nestehiometrijske količine rastvarača. Neka jedinjenja imaju tendenciju da uhvate fiksni molarni odnos molekula rastvarača u kristalnom čvrstom stanju, na taj način formirajući solvat. Ako je rastvarač voda formirani solvat je hidrat; kada je rastvarač alkohol, formirani solvat je alkoholat. Hidrati su formirani kombinacijom jednog ili više molekula vode sa jednom od supstanci u kojima voda ostaje u svom molekularnom stanju kao H2O, pri čemu je takva kombinacija sposobna da formira jedan ili više hidrata.

[0062] Termin "pogodan rastvarač" označava bilo koji rastvarač, ili smešu rastvarača, inertnih za tekuću reakciju koja dovoljno solubilizuje reaktante da bi se dobio medijum unutar koga se postiže željena reakcija.

[0063] Jedinjenja koja su ovde opisana imaju asimetrične centre. Jedinjenja predmetnog pronalaska koja sadrže bilo koji asimetrično supstituisani atom mogu biti izolovana u optički aktivnim ili racemskim oblicima. U stanju tehnike je dobro poznato kako pripremiti optički aktivne oblike, kao što je putem razdvajanja racemskih oblika ili putem sinteze od optički aktivnih početnih materijala. Mnogi geometrijski izomeri olefina, C=N dvogubih veza i slično, takođe mogu biti prisutni u jedinjenjima koja su ovde opisana, i svi takvi stabilni izomeri su razmatrani u predmetnom pronalasku. Cis i trans geometrijski izomeri jedinjenja predmetnog pronalaska su opisani i mogu biti izolovani kao smeša izomera ili kao posebni izomerni oblici. Svi hiralni, diastereomerni, racemski i geometrijski izomerni oblici strukture su obuhvaćeni, osim ukoliko je specifično naznačena specifična stereohemija ili izomerni oblik. Svi postupci korišćeni za pripremu jedinjenja predmetnog pronalaska i intermedijeri koji su tu napravljeni smatraju se delom predmetnog pronalaska. Svi tautomeri prikazanih ili opisanih jedinjenja se takođe smatraju delom predmetnog pronalaska. Pored toga, pronalazak takođe obuhvata metabolite jedinjenja koja su ovde opisana.

[0064] Pronalazak takođe obuhvata izotopski-obeležena jedinjenja, koja su identična onima navedenim u formulama prema pronalasku, ali zbog činjenice da su jedan ili više atoma zamenjeni atomom koji ima atomsku masu ili maseni broj različit od atomske mase ili masenog broja koji se najčešće nalazi u prirodi. Primeri izotopa koji mogu biti ugrađeni u jedinjenja prema pronalasku obuhvataju izotope vodonika, ugljenika, azota, fluora, kao što su 3H, 11C, 14C, 2H i 18F.

[0065] Jedinjenja prema predmetnom pronalasku i njihovi farmaceutski prihvatljive soli, solvati i aminokiselinski konjugati koji sadrže gore navedene izotope i/ili druge izotope drugih atoma su unutar obima predmetnog pronalaska. Izotopski-obeležena jedinjenja predmetnog pronalaska, na primer ona u koja su ugrađeni radioaktivni izotopi kao što su<3>H i 14C, su korisna u analizama raspodele leka i/ili supstrata u tkivu. Tricijum, tj., 3H, i ugljenik-14, tj., 14C, izotopi su naročito poželjni zbog njihove lake pripreme i detektabilnosti.<11>C i<18>F izotopi su naročito korisni u PET (pozitron emisiona tomografija). PET je korisna u imadžingu mozga. Pored toga, supstitucija sa težim izotopima kao što je deuterijum, tj.,<2>H, može da pruži određene terapeutske prednosti koje su rezultat veće metaboličke stabilnosti, na primer povećanog in vivo polu-života ili smanjenih potrebnih doza i, stoga, može biti poželjna u nekim slučajevima. Izotopski obeležena jedinjenja ovog pronalaska mogu generalno biti pripremljena preko tehnika poznatih u stanju tehnike, kao što je putem izvođenja postupaka otkrivenih u Šemama i/ili u Primerima u daljem tekstu, supstitucijom lako dostupnog izotopski obeleženog reagensa za neizotopski obeleženi reagens. U jednom primeru izvođenja, jedinjenja prema pronalasku, njihove soli, hidrati, solvati ili aminokiselinski konjugati nisu izotopski obeleženi.

[0066] Kada se bilo koja promenljiva (npr., Rx) javlja više od jednom u bilo kom gradivnom delu ili formuli za jedinjenje, njena definicija u svakom slučaju je nezavisna od njene definicije u svakom drugom slučaju. Na taj način, na primer, ako je pokazano da je grupa supstituisana sa jednom ili više R<x>grupa, tada je R<x>u svakom slučaju izabran nezavisno od definicije za Rx . Takođe, kombinacije supstituenata i/ili promenljivih su dozvoljene, ali samo

1

ako takve kombinacije rezultuju u stabilnim jedinjenjima unutar normalne valence naznačenog atoma.

[0067] Kao što je ovde korišćen, termin "tretirati," "lečiti," ili "tretman" označava smanjenje simptoma, markera i/ili bilo kojih negativnih efekata stanja u bilo kom merljivom stepenu kod subjekta koji trenutno ima stanje. U nekim primerima izvođenja, tretman može biti primenjivan na subjekta koji ispoljava samo rane znake stanja za svrhu smanjenja rizika od razvoja bolesti ili stanja.

[0068] Kao što je ovde korišćen, termin "sprečiti," "prevencija," ili "prevenirati" označava bilo koji postupak za delimično ili potpuno sprečavanje ili odlaganje početka jednog ili više simptoma ili karakteristika bolesti, poremećaja i/ili stanja. Prevencija može biti primenjivana na subjekta koji ne ispoljava znake bolesti ili stanja.

[0069] Kao što je ovde korišćen, "subjekat" označava čoveka ili životinju (u slučaju životinje, tipičnije sisara). U jednom aspektu, subjekat je čovek. Takav subjekat može se smatrati da ima potrebu za tretmanom sa agonistom FXR.

[0070] Kao što je ovde korišćen, "nezasićen" označava jedinjenja ili strukture koje imaju najmanje jedan stepen nezasićenja (npr., najmanje jednu dvogubu ili trogubu vezu).

[0071] Kao što je ovde korišćen, termin "jedinjenje prema pronalasku" obuhvata jedinjenje bilo koje od formula I, II, III ili IV, ili bilo kog jedinjenja koje je ovde izričito otkriveno.

[0072] Kao što je ovde korišćen, farnezoid X receptor ili FXR označava sve sisarske oblike takvog receptora uključujući, na primer, alternativne splajsne izoforme i prirodne izoforme (videti, npr., Huber et al., Gene 290:35-43 (2002)). Reprezentativne FXR vrste obuhvataju, bez ograničenja FXR pacova (Gen Bank pristupni br. NM_021745), FXR miša (Genbank pristupni br. NM_009108) i humani FXR (GenBank pristupni br. NM_005123).

[0073] Kao što je ovde korišćen, jedinjenje A je

koje je takođe poznato kao obetiholna kiselina, INT-747, 6ECDCA, 6-alfa-etil henodeoksiholna kiselina ili 6α-etil-3α,7α-dihidroksi-5β-holan-24-oinska kiselina.

[0074] Kao što je ovde korišćeno, jedinjenje B je

1

koje je takođe poznato kao INT-767 ili 6α-etil-3α,7α,23-trihidroksi-24-nor-5β-holan-23-sulfat natrijumova so.

[0075] Kao što je ovde korišćeno, jedinjenje C je

koje je takođe poznato kao INT-777 ili 6α-etil-23(S)-metil-3α,7α,12α trihidroksi-5β-holan-24-oinska kiselina.

[0076] Kao što je ovde korišćeno, jedinjenje D je

koje je takođe poznato kao 6α-etil-23(R)-metil henodeoksiholna kiselina i S-EMCDCA.

[0077] Kao što je ovde korišćeno, jedinjenje E je

1

[0078] Kao što je ovde korišćena, holna kiselina je

koja je takođe poznata kao CA.

[0079] Kao što je ovde korišćena, henodeoksiholna kiselina je

koja je takođe poznata kao CDCA.

[0080] Kao što je ovde korišćena, ursodeoksiholna kiselina je

koja je takođe poznata kao UDCA.

1

[0081] Kao što je ovde korišćena, taurohenodeoksiholna kiselina je

koja je takođe poznata kao TCDCA.

[0082] Kao što je ovde korišćena, tauroursodeoksiholna kiselina je

koja je takođe poznata kao TUDCA.

[0083] Kao što je ovde korišćena, lithoholna kiselina je

koja je takođe poznata kao LCA.

Postupci prema pronalasku

[0084] Jedinjenja prema pronalasku su korisna u terapiji kod subjekata kao što su sisari, uključujući ljude. Naročito, jedinjenja prema pronalasku su korisna u postupku za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja kod subjekta koji sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za efikasnom količinom jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, bolest ili stanje je

1

FXR-posredovano (npr., FXR ima ulogu u započinjanju ili napredovanju bolesti ili stanja). U jednom aspektu, bolest ili stanje je posredovano preko smanjene aktivnosti FXR. U jednom aspektu, bolest ili stanje je izabrano od kardiovaskularne bolesti, hronične bolesti jetre, poremećaja lipida, gastrointestinalne bolesti, bolesti bubrega, metaboličke bolesti, kancera i neurološke bolesti.

[0085] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji kardiovaskularne bolesti kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za lečenje kardiovaskularne bolesti. U jednom aspektu, pronalazak dse odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u prevenciji kardiovaskularne bolesti. U jednom aspektu, kardiovaskularna bolest izabrana od ateroskleroze, arterioskleroze, dislipidemije, hiperholesteremije, hiperlipidemije, hiperlipoproteinemije i hipertrigliceridemije.

[0086] Termin "hiperlipidemija" označava prisustvo abnormalno povišenog nivoa lipida u krvi. Hiperlipidemija može da se javi u najmanje tri oblika: (1) hiperholesterolemija, tj., povišeni nivo holesterola; (2) hipertrigliceridemija, tj., povišeni nivo triglicerida; i (3) kombinovana hiperlipidemija, tj., kombinacija hiperholesterolemije i hipertrigliceridemije.

[0087] Termin "dislipidemija" označava abnormalne nivoe lipoproteina u krvnoj plazmi uključujući snižene i/ili povišenbe nivoe lipoproteina (npr., povišene nivoe LDL, VLDL i snižene nivoe HDL).

[0088] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu izabranu od sniženja nivoa holesterola ili modulacije metabolizma holesterola, katabolizma, apsorpcije holesterola iz hrane i reverznog transporta holesterola kod subjekta, koji sadrže primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata.

[0089] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koja utiče na nivoe holesterola, triglicerida ili žučne kiseline kod subjekta, koji sadrže primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata.

[0090] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u postupku za snižavanje triglicerida kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta kod koga

2

postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata.

[0091] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povezane sa povišenim nivoom holesterola kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količne jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju bolesti povezane sa povišenim nivoom holesterola kod subjekta. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u prevenciji bolesti povezane sa povišenim nivoom holesterola kod subjekta. U jednom aspektu, bolest je izabrana od koronarne arterijske bolesti, angine pektoris, bolesti karotidne arterije, šlogova, cerebralne arterioskleroze i ksantoma.

[0092] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja lipida kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju poremećaja lipida. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za prevenciju poremećaja lipida.

[0093] Poremećaji lipida su termin za abnormalitete holesterola i triglicerida. Abnormaliteti lipida su povezani sa povećanim rizikom za vaskularnu bolest i naročito srčane napade i šlogove. Abnormaliteti u poremećajima lipida su kombinacija genetske predispozicije kao i prirode unosa hrane. Mnogi poremećaji lipida su povezani sa prekomernom težinom. Poremećaji lipida takođe mogu biti povezani sa drugim bolestima uključujući dijabetes, metabolički sindrom (nekada označen kao sindrom insulinske rezistencije), neaktivnu tiroidnu žlezdu ili rezultat određenih lekova (kao što su oni korišćeni za režime protiv odbacivanja transplanta kod ljudi koji su imali transplantaciju).

[0094] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji jednog ili više simptoma bolesti koja pogađa metabolizam lipida (tj., lipodistrofija) kod subjekta, koji sadrže primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju jednog ili više simptoma bolesti koja pogađa metabolizam lipida. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u prevenciji jednog ili više simptoma bolesti koja pogađa metabolizam lipida.

[0095] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u smanjenju akumulacije lipida kod subjekta, koja sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata.

[0096] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji hronične bolesti jetre kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju hronične bolesti jetre. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u prevenciji hronične bolesti jetre. U jednom aspektu, hronična bolest jetre je izabrana od primarne bilijarne ciroze (PBC), cerebrotendinozne ksantomatoze (CTX), primarnog sklerotizujućeg holangitisa (PSC), holestaze indukovane lekom, intrahepatične holestaze trudnoće, holestaze povezane sa parenteralnom ishranom (PNAC), prekomernog rasta bakterija ili holestaze povezane sa sepsom, autoimunog hepatitisa, hroničnog virusnog hepatitisa, alkoholne bolesti jetre, nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), bolesti transplanta protiv domaćina kod transplanta jetre, regeneracije jetre od živog donora, kongenitalne hepatičke fibroze, holedoholitiaze, granulomatozne bolesti jetre, intra- ili ekstrahepatičnog maligniteta, Sjogren-ovog sindroma, sarkoidoze, Wilson-ove bolesti, Gaucher-ove bolesti, hemohromatoze i deficijencije alfa 1-antitripsina.

[0097] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji jednog ili više simptoma holestaze, uključujući komplikacije holestaze kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju jednog ili više simptoma holestaze. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na prevenciju jednog ili više simptoma holestaze.

[0098] Holestaza je tipično uzrokovana faktorima unutar jetre (intrahepatičkim) ili uzvan jetre (ekstrahepatičkim) i dovodi do akumulacije žučnih kiselina, žučnog pigmenta bilirubina i lipida u krvotoku umesto njihove normalne eliminacije. Intrahepatička holestaza je okarakterisana široko raširenom blokadom malih kanala ili poremećajima, kao što je hepatitis, koji smanjuju sposobnost tela da eliminiše žuč. Intrahepatička holestaza takođe može biti uzrokovana alkoholnom bolesti jetre, primarnom bilijarnom cirozom, kancerom koji se raširio (metastazirao) sa drugog dela tela, primarnog sklerotizujućeg holangitisa, kamena u žuči, žučne kolike i akutnog holecistitisa. Ona takođe može da se javi kao komplikacija operacije, ozbiljne povrede, cistične fibroze, infekcije ili intravenske ishrane ili je indukovana lekom. Holestaza takođe može da se javi kao komplikacija trudnoće i često se razvija u toku drugo i trećeg tromesečja.

[0099] Ekstrahepatička holestaza je najčešće uzrokovana holedoholitiazom (kamen u žučnom kanalu), benignim žučnim strukturama (nekancerozno suženje zajedničkog kanala), holangiokarcinomom (duktalnim karcinomom) i karcinomom pankreasa. Ekstrahepatička holestaza može da se javi kao sporedni efekat mnogih lekova.

[0100] Jedinjenje prema pronalasku može biti korišćeno za lečenje ili prevenciju jednog ili više simptoma intrahepatičke ili ekstrahepatičke holestaze, uključujući bez ograničenja, bilijarnu arteziju, opstetričku holestazu, neonatalnu holestazu, holestazu indukovanu lekom, holestazu koja je rezultat infekcije hepatitisa C, hroničnu holestatičku bolest jetre kao što je primarna bilijarna ciroza (PBC) i primarni sklerotizujući holangitis (PSC).

[0101] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u pojačanju regeneracije jetre kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, postupak je pojačanje regeneracije jetre za transplantaciju jetre.

[0102] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji fibroze kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za time efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za lečenje fibroze. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u prevenciji fibroze.

[0103] Prema tome, kao što je ovde korišćen, termin fibroza se odnosi na sve priznate fibrotičke poremećaje, uključujući fibrozu kao posledicu patoloških stanja ili bolesti, fibrozu kao posledicu fizičke traume ("traumatska fibroza"), fibrozu kao posledicu oštećenja od zračenja i fibrozu kao posledicu izlaganja hemoterapeuticima. Kao što je ovde korišćen, termin "fibroza organa" obuhvata, ali bez ograničenja na, fibrozu jetre, fibrozu bubrega, fibrozu pluća i fibrozu creva. "Traumatska fibroza" obuhvata, ali bez ograničenja na, fibrozu sekundarnu posle operacije (hirurški ožiljak), slučajnu fizičku traumu, opekotine i hipertrofični ožiljak.

2

[0104] Kao što je ovde korišćena, "fibroza jetre" obuhvata fibrozu jetre kao posledicu bilo kog uzroka, uključujući, ali bez ograničenja na, virusom indukovanu fibrozu jetre kao što je ona koja je posledica virusa hepatitisa B ili C; izlaganja alkoholu (alkoholna bolest jetre), određenih farmaceutskih jedinjenja uključujući, ali bez ograničenja na metrotreksat, neka hemoterapeutska sredstva i hronično unošenje arsenika ili vitamina A u megadozama, oksidativni stres, terapiju zračenjem kancera ili određene industrijske hemikalije uključujući, ali bez ograničenja na, ugljen tetrahlorid i dimetilnitrozamin; i bolesti kao što su primarna bilijarna ciroza, primarni sklerotizujući holangitis, masna jetra, gojaznost, nealkoholni steatohepatitis, cistična fibroza, hemohromatoza, auto-imuni hepatitis i steatohepatitis. Trenutna terapija kod fibroze jetre je primena usmerena na uklanjanje uzročnog agensa, npr., uklanjanje viška gvožđa (npr., u slučaju hemohromatoze), smanjenje koncentracije virusa (npr., u slučaju hroničnog virusnog hepatitisa) ili eliminacija ili smanjenje izlaganja toksinima (npr., u slučaju alkoholne bolesti jetre). Anti-inflamatorni lekovi kao što su kortikosteroidi i kolhicin su takođe poznati za upotrebu u lečenju inflamacije koja može da vodi do fibroze jetre.

[0105] Kao što je poznato u stanju tehnike, fibroza jetre može biti klinički klasifikovana u pet stadijuma težine (S0, S1, S2, S3 i S4), obično zasnovanim na histološkom ispitivanju uzorka biopsije. S0 označava da nema fibroze, dok S4 označava cirozu. Dok postoje različiti kriterijumu za određivanje stadijuma težine fibroze jetre, generalno rani stadijumi fibroze su identifikovani preko posebnih, lokalizovanih oblasti ožiljka u jednom portalu (zoni) jetre, dok su kasniji stadijumi fibroze identifikovani premošćujućom fibrozom (ožiljak koji prelazi zone jetre).

[0106] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji fibroze organa kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenje prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, fibroza je fibroza jetre.

[0107] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji gastrointestinalne bolesti kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za lečenje gastrointestinalne bnolesti. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u prevenciji gastrointestinalne bolesti. U jednom aspektu, gastrointestinalna bolest je izabrana od inflamatorne bolesti creva (IBD), sindroma iritabilnog creva (IBS), prekomernog rasta bakterija, malapsorpcije, post-radijacionog kolitisa i mikroskopskog kolitisa. U jednom aspektu, inflamatorna bolest creva je izabrana od Kronove bolesti i ulceroznog kolitisa.

[0108] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti bubrega kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se donosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju bolesti bubrega. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za prevenciju bolesti bubrega. U jednom aspektu, bolest bubrega je izabrana od dijabetičke nefropatije, fokalne segmentalme glomeruloskleroze (FSGS), hipertenzivne nefroskleroze, hroničnog glomerulonefritisa, hronične glomerulopatije transplanta, hroničnog intersticijalnog nefritisa i policistične bolesti bubrega.

[0109] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji metaboličke bolesti kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju bolesti bubrega. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u prevenciji bolesti bubrega. U jednom aspektu, metabolička bolest je izabrana od insulinske rezistencije, hiperglikemije, dijabetes melitusa, dijabetesa i gojaznosti. U jednom aspektu, dijabetes melitus je dijabetes tipa I. U jednom aspektu, dijabetes melitus je dijabetes tipa II.

[0110] Dijabetes melitus, uobičajeno označen kao dijabetes, označava bolest ili stanje koje je generalno okarakterisano metaboličkim defektima u proizvodnji i korišćenju glukoze koje rezultuje u neuspehu u održavanju odgovarajućih nivoa šećera u krvi u telu.

[0111] U slučaju dijabetesa tipa II, bolest je okarakterisana insulinskom rezistencijom, kod koje insulin gubi svoju sposobnost da ispolji svoje biološke efekte preko širokog opsega koncentracija. Ova rezistencija na insulinsku responsivnost rezultuje u nedovoljnoj insulinskoj aktivaciji unosa glukoze, oksidacije i čuvanja u mišićima i neadekvatnom insulinskom suzbijanju lipolize u adipoznom tkivu i proizvodnje glukoze i izlučivanja u jetri. Rezultujuće stanje je povišena glukoza u krvi, koje je označeno kao "hiperglikemija". Nekontrolisana hiperglikemija je povezana sa povećanim i prevremenim mortalitetom kao posledica povećanog rizika od mikrovaskularnih i makrovaskularnih bolesti, uključujući retinopatiju (smanjenje ili gubitak vida kao posledica oštećenja krvnog suda u očima); neuropatiju (oštećenje nerva i problemi sa stopalom zbog oštećenja krvnog suda centralnog

2

nervnog sistema); i nefropatiju (bolest bubrega kao posledica oštećenja krvnog suda u burezima), hipertenziju, cerebrovaskularnu bolest i koronarnu bolest srca. Prema tome, kontrola homeostaze glukoze je kritički važan pristup za lečenje dijabetesa.

[0112] Postavljena je hipoteza da insulinska rezistencija ujedinjuje grupisanje hipertenzije, intolerancije glukoze, hiperinsulinemije, povećanih nivoa triglicerida i smanjenih nivoa HDL holesterola i centralnu i ukupnu gojaznost. Veza insulinske rezistencije sa intolerancijom glukoze, povećanjem koncentracije triglicerida u plazmi i smanjenjem koncentracija lipoproteina holesterola visoke gustine, hipertenzijom, hiperurikemijom, manjim gušćim česticama lipoproteina niske gustine i višim nivoima inhibitora 2 aktivatora plazminogena u cirkulaciji, označena je kao "sindrom X". Prema tome, obezbeđeni su postupci za lečenje ili prevenciju bilo kojih poremećaja povezanih sa insulinskom rezistencijom uključujući klaster bolesti, stanja ili poremećaja koji čine "sindrom X". U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za lečenje ili prevenciju metaboličkog sindroma kod subjekta, koji sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za lečenje metaboličkog sindroma. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za prevenciju metaboličkog sindroma.

[0113] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji kancera kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju kancera. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za prevenciju kancera. U jednom aspektu, kancer je koloretalni kancer.

[0114] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji kamena u žuči kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju kamena u žuči. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u prevenciji kamena u žuči.

[0115] Kamen u žuči je kristalna čvrsta masa formirana unutar žučne kese nagomilavanjem komponenti žuči. Ovi kalkuli su formirani u žučnoj kesi, ali mogu distalno da prođu u druge delove bilijarnog trakta kao što je cistični kanal, zajednički žučni kanal, pankreasni kanal ili

2

Vaterova ampula. Retko, u slučajevima teške inflamacije, kamenje u žuči može da erodira kroz žučnu kesu u prijanjajuće crevo izazivajući opstrukciju pod nazivom ileus uzrokovan žučnim kamenom. Prisustvo žučnog kamenja u žučnoj kesi može dovesti do akutnog holecistitisa, inflamatornog stanja okarakterisanog zadržavanjem žuči u žučnoj kesi i često sekundarnom infekcijom intestinalnim mikroorganizmima, pretežno sa Escherichia coli i vrstama Bacteroides. Prisustvo žučnih kamenova u drugim delovima bilijarnog trakta može da izazove opstrukciju žučnih kanala, što može dovesti do ozbiljnih stanja kao što su ascedentni holangitis ili pankreatitis.

[0116] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti holesterolskog kamena u žuči kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju bolesti holesterolskog žučnog kamena. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u prevenciji bolesti holesterolskog žučnog kamena.

[0117] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju ili prevenciji neurološke bolesti kod subjekta, koje sadrži primenu na subjekta kod koga postoji potreba za tim efikasne količine jedinjenja prema pronalasku ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, solvata ili aminokiselinskog konjugata. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u lečenju neurološke bolesti. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u prevenciji neurološke bolesti. U jednom aspektu, neurološka bolest je šlog.

[0118] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu kao što je ovde opisano i pored toga pri čemu, jedinjenje je primenjivano preko puta izabranog od oralnog, parenteralnog, intramuskularnog, intranazalnog, sublingvalnog, intratrahealnog, inhalacionog, okularnog, vaginalnog, rektalnog i intracerebroventrikularnog. U jednom aspektu, put je oralni.

[0119] U jednom aspektu, jedinjenje korišćeno u jednom ili više od postupaka opisanih ovde je agonist FXR. U jednom aspektu, jedinjenje je selektivni agonist FXR. U jednom aspektu, jedinjenje ne aktivira TGR5. U jednom aspektu, jedinjenje ne aktivira druge jedarne receptore uključene u metaboličke puteve (npr., kao što je mereno pomoću AlphaScreen analize). U jednom aspektu, takvi ostali jedarni receptori uključeni u metaboličke puteve su izabrani od LXRβ, PXR, CAR, PPARα, PPARδ, RARα, VDR, TR, PR, RXR, GR i ER. U jednom aspektu, jedinjenje indukuje apoptozu.

2

[0120] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u regulaciji nivoa ekspresije jednog ili više gena uključenih u homeostazu žučne kiseline.

[0121] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za nishodnu regulaciju nivoa ekspresije jednog ili više gena izabranih od CYP7α1 i SREBP-1C u ćeliji primenom na ćeliju jedinjenja prema pronalasku. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak ushodne regulacije nivoa ekspresije jednog ili više gena izabranih od OSTα, OSTβ, BSEP, SHP, UGT2B4, MRP2, FGF-19, PPARγ, PLTP, APOCII i PEPCK u ćeliji primenom na ćeliju jedinjenja prema pronalasku.

[0122] Pronalazak se takođe odnosi na proizvodnju leka za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja (npr., bolesti ili stanja posredovanih preko FXR), pri čemu lek sadrži jedinjenje prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminoksielinski konjugat. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na proizvodnju leka za lečenje ili prevenciju bilo koje od bolesti ili stanja opisanih ovde u prethodnom tekstu, pri čemu lek sadrži jedinjenje prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat.

[0123] Pronalazak se takođe odnosi na kompoziciju za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja (npr., bolesti ili stanja posredovanog preko FXR), pri čemu kompozicija sadrži jedinjenje prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat. U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na kompoziciju za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju bilo koje od bolesti ili stanja koji su opisani ovde u prethodnom tekstu, pri čemu kompozicija sadrži jedinjenje prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat.

Formulacije

[0124] Postupci prema pronalasku sadrže korak primene efikasne količine jedinjenja prema pronalasku. Kao što je ovde korišćen, termin "efikasna količina" označava količinu jedinjenja prema pronalasku koja je dovoljna da se postigne navedeni efekat. Prema tome, efikasna količina jedinjenja prema pronalasku korišćena u postupku za prevenciju ili lečenje bolesti ili stanja posredovanih preko FXR biće količina dovoljna za prevenciju ili lečenje bolesti ili stanja posrdovanog preko FXR.

[0125] Slično, efikasna količina jedinjenja prema pronalasku za upotrebu u postupku za prevenciju ili lečenje holestatske bolesti jetre ili povećanje protoka žuči biće količina koja je dovoljna da se poveća protok žuči ka crevima.

2

[0126] Količina jedinjenja prema pronalasku koja je potrebna da se postigne željeni biološki efekat biće zavisna od broja faktora kao što su upotreba za koju je namenjena, sredstva primene i primalac, i biće konačno prema mišljenju nadležnog lekara ili veterinara. Uopšteno, tipična dnevna doza za lečenje bolesti ili stanja posredovanog preko FXR, na primer, može se očekivati da leži u opsegu od oko 0.01 mg/kg do oko 100 mg/kg. Ova doza se može primenjivati kao jedna jedinična doza ili kao nekoliko posebnih jediničnih doza ili kao kontinuirana infuzija. Slične doze bi bile primenljive za lečenje drugih bolesti, stanja i terapčija uključujući prevenciju i lečenje holestatske bolesti jetre.

[0127] Na taj način, u dodatnom aspektu, predmetni pronalazak daje farmaceutske kompozicije koje sadrže, kao aktivni sastojak, jedinjenje prema pronalasku zajedno, i/ili u smeši, sa najmanje jednim farmaceutskim nosačem ili razblaživačem. Ove farmaceutske kompozicije mogu biti korišćene u prevencij ili lečenju gore navedenih bolesti ili stanja.

[0128] Noač mora biti farmaceutski prihvatljiv i mora biti kompatibilan sa, tj. da nema štetan efekat na, druge sastojke u kompoziciji. Nosač može biti čvrst ili tečan i poželjno je formulisan kao formulacija jedinične doze, na primer, tableta koja može da sadrži od 0.05 do 95 težinskih % aktivnog sastojka. Ako je poželjno, ostali fiziološki aktivni sastojci takođe mogu biti ugrađeni u farmaceutske kompozicije prema pronalasku.

[0129] Moguće formulacije obuhvataju one pogodne za oralnu, sublingvalnu, bukalnu, parenteralnu (na primer subkutanu, intramuskularnu ili intravensku), rektalnu, topikalnu uključujući transdermalnu, intranazalnu i inhalacionu primenu. Većina pogodnih sredstava za primenu za određenog pacijenta zavisiće od prirode i težine bolesti ili stanja koje se leči ili prirode terapije koja se koristi i od prirode aktivnog jedinjenja, ali gde je moguće, oralna primena je poželjna za prevenciju i lečenje bolesti i stanja posredovanih preko FXR. Formulacije pogodne za oralnu primenu mogu biti obezbeđene kao posebne jedinice, kao što su tablete, kapsule, skrobne kapsule, lozenge, od kojih svaka sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja; kao prah ili granule; kao rastvori ili suspenzije u vodenim ili nevodenim tečnostima; ili kao emulzije ulje-u-vodi ili voda-u-ulju.

[0130] Formulacije pogodne za sublingvalnu ili bukalnu primenu obuhvataju lozenge koje sadrže aktivno jedinjenje i, tipično aromatizovanu bazu, kao što je šećer i akacija ili tragant i pastile koje sadrže aktivno jedinjenje u inertnoj bazi, kao što je želatin i glicerin ili saharoza akacija.

[0131] Formulacije pogodne za parenteralnu primenu tipično sadrže sterilne vodene rastvore koji sadrže unapred određenu koncentraciju aktivnog jedinjenja; rastvor je poželjno izotoničan sa krvi nameravanog primaoca.

2

[0132] Dodatne formulacije pogodne za parenteralnu primenu obuhvataju formulacije koje sadrže fiziološki pogodne ko-rastvarače i/ili kompleksirajuća sredstva kao što su surfaktanti i ciklodekstrini. Emulzije ulje-u-vodi su takođe pogodne za formulacije za parenteralne formulacije. Iako se takvi rastvori poželjno primenjuju intravenski, oni takođe mogu biti primenjivani subkutanom ili intramuskularnom injekcijom.

[0133] Formulacije pogodne za rektalnu primenu su poželjno obezbeđene kao supozitorije jedinične doze koje sadrže aktivni sastojak u jednom ili više čvrstih nosača koji formiraju bazu supozitorije, na primer, kakao puter.

[0134] Formulacije pogodne za topikalnu ili intranazalnu primenu obuhvataju masti, kreme, losione, paste, gelove, sprejeve, aerosolove i ulja. Pogodni nosači za takve formulacije obuhvataju petrolej žele, lanolin, polietilenglikole, alkohole i njihove kombinacije.

[0135] Formulacije prema pronalasku mogu biti pripremljene pomoću bilo kog pogodnog postupka, tipično ujednačenim i bliskim mešanjem aktivnog jedinjenja sa tečnostima ili fino podeljenim čvrstim nosačima ili oba, u potrebnim proporcijama i zatim, ako je neophodno, oblikovanjem rezultujuće smeše u željeni oblik.

[0136] Na primer tableta može biti pripremljena presovanjem intimne smeše koja sadrži prah ili granule aktivnog sastojka i jedan ili više izbornih sastojaka, kao što je vezujuće sredstvo, lubrikant, inertni razblaživač ili površinski aktivno dispergujuće sredstvo, ili kalupljenjem intimne smeše aktivnog sastojka u prahu i inertnog tečnog razblaživača.

[0137] Pogodne formulacije za primenu putem inhalacije obuhvataju fine prahove ili magle čestica koje mogu biti generisane pomoću različitih tipova aerosolova, nebulizatora ili insuflatora pod pritiskom sa izmerenom dozom.

[0138] Za pulmonalnu primenu preko usta, veličina čestica praha ili kapi je tipično u opsegu 0.5-10 µm, poželjno 1-5 µm, da bi se osigurala isporuka u bronhijalno stablo. Za nazalnu primenu, veličina čestica u opsegu 10-500 µm je poželjna da bi se osiguralo zadržavanje u nazalnoj šupljini.

[0139] Inhalatori sa izmerenom dozom su dispenzeri aerosola pod pritiskom, koji tipično sadrže formulaciju suspenzije ili rastvora aktivnog sastojka u tečnom propelantu. U toku upotrebe, ovi uređaji oslobađaju formulaciju kroz ventil prilagođen da isporučuje izmerenu zapreminu, tipično od 10 do 150 µl, da bi se proizveo sprej finih čestica koji sadrži aktivni sastojak. Pogodni propelanti obuhvataju određena jedinjenja hlorofluorokarbona, na primer, dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluoroetan i njihove smeše. Formulacija može dodatno da sadrži jedan ili više ko-rastvarača, na primer, etanolske surfaktante, kao što je oelinska kiselina ili sorbitan trioleat, anti-oksidante i pogodna sredstva za poboljšanje ukusa.

[0140] Nebulizatori su komercijalno dostupni uređaji koji transformišu rastvore ili suspenzije aktivnog sastojka u terapeutsku maglu aerosola bilo pomoću ubrzanja gasa pod pritiskom tipično vazduha ili kiseonika, kroz uzak Venturijev otvor, ili pomoću ultrazvučnog uzburkavanja. Pogodne formulacije za upotrebu u nebulizatorima sastoje se od aktivnog sastojka u tečnom nosaču i sadrže do 40% tež./tež. formulacije, poželjno manje od 20% tež./tež. Nosač je tipično voda ili razblaženi vodeni alkoholni rastvor, poželjno napravljen izotoničnim sa telesnim tečnostima dodavanjem, na primer, natrijum hlorida. Izborni aditivi obuhvataju konzervanse ako formulacija nije pripremljena kao sterilna, na primer, metil hidroksi-benzoat, anti-oksidante, sredstva za poboljšanje ukusa, isparljiva ulja, puferujuća sredstva i surfaktante.

[0141] Pogodne formulacije za primenu insuflacijom obuhvataju fino usitnjene prahove koji mogu biti isporučeni pomoću insuflatora ili uneti u nazalnu šupljinu ušmrkavanjem. U insuflatoru, prah je sadržan u kapsulama ili kertridžima, tipično napravljenim od želatina ili plastike, koji su izbušeni ili otvoreni in situ i prah se isporučuje preko vazduha nošenog kroz uređaj posle inhalacije ili pomoću ručne pumpe. Prah korišćen u insuflatoru sastoji se bilo samo od aktivnog sastojka ili od mešavine u prahu koja sadrži aktivni sastojak, pogodan razblaživač u prahu, kao što je laktoza, i izborno surfaktant. Aktivni sastojak tipično sadrži od 0.1 do 100 tež./tež. formulacije.

[0142] Pored sastojaka specifično navedenih u prethodnom tekstu, formulacije predmetnog pronalaska mogu da obuhvataju druga sredstva poznata stručnjacima iz date oblasti tehnike farmacije, u vezi sa tipom dotične formulacije. Na primer, formulacije pogodne za oralnu primenu mogu da obuhvataju sredstva za poboljšanje ukusa i formulacije pogodne za intranazalnu primenu mogu da obuhvataju parfeme.

[0143] Sledeći Primeri su ilustrativni i ne bi ih trebalo tumačiti ni na koji način tako da ograničavaju obim pronalaska.

PRIMERI

[0144] Uopšteno, potencijal jedinjenja prema pronalasku kao kandidata leka može biti testiran upotrebom različitih analiza poznatih u stanju tehnike. Na primer, za in vitro validaciju za FXR: njegova aktivnost i selektivnost mogu biti procenjivani upotrebom AlphaScreen (biohemijske analize); ekspresija gena može biti procenjivana upotrebom RT-PCR (FXR

1

ciljni gen); i citotoksičnost (npr., HepG2) može biti procenjivana upotrebom sadržaja ATP-a, oslobađanja LDH i aktivacije kaspaze-3. Za in vitro potvrđivanje za TGR5: njegova aktivnost i selektivnost mogu biti procenjivani upotrebom HTR-FRET (analize na bazi ćelija); ekspresija gena može biti procenjivana upotrebom RT-PCR (TGR5 ciljni gen (tj., cFOS)); i citotoksičnost (npr., HepG2) može biti procenjivana upotrebom sadržaja ATP-a, oslobađanja LDH, i kativacije kaspaze-3. ADME (apsorpcija, raspodela, metabolizam i izlučivanje) /farmakokinetičke osobine i in vivo potvrda jedinjenja prema pronalasku takođe mogu biti ispitivani upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike.

Primer 1: Sinteza jedinjenja 100 i 101

[0145] Jedinjenja 100 i 101 su sintetisana prema šemi u daljem tekstu.

2

[0146] Reagensi i uslovi: a) 1) MeOH, p-TSA, ultrazvuk, 3 časa, kvantitativan; 2) Ac2O, NaHCO3THF, refluks 12 časova, 85%; b) PCC, CH2Cl2, 6 časova, 62%; c) Ac2O, Bi(OTf)3, CH2Cl2, 1 čas, 91%; d) Br2, benzen, 30°C preko noći, 74%; e) NaBH4, NaOAc, Pir, sobna temperatura 2 dana, 80%; f) HI 57%, AcOH, sobna temperatura 30 min; g) CrO3, AcOH, sobna temperatura 45 min; h) Zn prah, NaOAc, refluks 20 min; i) NaOH 2M, MeOH, sobna temperatura preko noći, 65% od jedinjenja 5; 1) NaBH4, THF/H2O 4:1, 70%; m) Na(s), sek-BuOH, 50°C, 70%.

[0147] Sinteza je zasnovana na upotrebi 6α-etil-holne kiseline (6-ECA, 1) kao početnog materijala koja je pripremljena upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike.6-ECA (1) je tretiran sa p-TSA u MeOH pod ultrazvučnim zračenjem da bi se dobio odgovarajući metil estar, koji je selektivno zaštićen na C3 položaju refluksovanjem sa Ac2O u prisustvu NaHCO3u THF da bi se dobilo jedinjenje 2. Tretman jedinjenja 2 sa PCC u CH2Cl2na sobnoj temperaturi praćen tretmanom sa Ac2O, Bi(OTf)3u CH2Cl2na sobnoj temperaturi dao je intermedijer metil 3α,7α-diacetoksi-12-okso-5β-holan-24-oat (jedinjene 3; oko 48% od jedinjenja 2).

[0148] Tretman jedinjenja 3 sa Br2u benzenu u trajanju od npr., 12 časova proizveo je jedinjenje 4. Reakcija jedinjenja 4 sa NaBH4i NaOAc u sveže destilovanom piridinu dala je odgovarajući 11β-12β epoksid (jedinjenje 5), u prinosu od oko 59% posle prečiščavanja na silika gelu. Reakcija jedinjenja 5 sa HI u AcOH na sobnoj temperaturi dala je halohidrin intermedijer koji je zatim oksidovan na C11 položaju sa CrO3u AcOH da bi se generisalo jedinjenje 6. Reakcija jedinjenja 6 sa Zn prahom u ključalom AcOH i alkalna hidroliza (NaOH/MeOH) dali su 3α,7α-hidroksi-12-keto-513-holan-24-oinsku kiselinu (jedinjenje 7; prinos oko 65% od jedinjenja 5).

[0149] Jedinjenje 7 je stereoselektivno redukovano na C11-karbonilu upotrebom NaBH4u smeši THF/H2O= (4:1, zapr./zapr.) da bi se dobila 3α,7α,11β-trihidroksi-6α-etil-5β-holan-24-oinska kiselina (jedinjenje 100; oko 27% od jedinjenja 3), posle hromatografskog prečišćavanja da bi se dobilo jedinjenje 100. Alternativno, jedinjenje 7 je redukovano sa natrijumom u sek-BuOH na 50°C da bi se dobilo jedinjenje 101 (prinos oko 70%), posle prečišćavanja.

Primer 2: Jedinjenje 100 je potentni, specifični agonist FXR

[0150] U jedru, jedarni receptori vezani za ligand (NRs) moduliraju inicijaciju transkripcije direktnom interakcijom sa bazalnom transkripcionom mašinerijom ili dovođenjem u kontakt premošćujućih faktora pod nazivom koaktivatori (Onate SA, et al., Science 1995; 270:1354-1357; Wang JC, et al., J Biol Chem 1998; 273:30847-30850; Zhu Y, et al., Gene Expr 1996; 6:185-195). Ligand-zavisna interakcija NRs sa njihovim koaktivatorima javlja se između aktivacione funkcionalne grupe 2 (AF-2), locirane u receptornom domenu koji se vezuje za ligand (LBD) i jedarnih receptornih boksova (NR boksova) lociranih na koaktivatorima (Nolte RT, et al., Nature 1998; 395:137-143). Nekoliko redova dokaza pokazali su da LXXLL peptidna sekvenca prisutna u NR boksu predstavlja motiv potpis koji olašava interakciju različitih proteina sa AF-2 regionom (Heery DM, et al., Nature 1997; 387:733-736; Torchia J, et al., Nature 1997; 387:677-684).

4

[0151] AlphaScreen je korišćen sa ciljem da se identifikuju novi modulatori korišćenjem prednosti biomolekularne interakcije koja preovladava između FXR i LXXLL motiva prisutnog u NR boksu koaktivatora 1 steroidnog receptora (SRC-1).

[0152] Humani FXR-LBD-GST je inkubiran sa rastućim koncentracijama naznačenih liganada u prisustvu biotinilovanog LXXLL SRC-1 peptida. AlphaScreen signal se povećava kada je formiran kompleks receptor-koaktivator. EC50vredosti su bile 8.9 µM za henodeoksiholnu kiselinu (CDCA; koja je pozitivna kontrola), 0.16 µM za jedinjenje A i 0.16 µM za jedinjenje 100. Ovi rezultati su srednja vrednost ± S.D. trostrukih uzoraka iz reprezentativnog eksperimenta od tri izvedena. AlphaScreen analiza je veoma robusna i ponovljiva analiza, kao što je pokazano preko Z’ faktora od 0.84 (Zhang JH, et al., J Biomol Screen 1999; 4:67-73). Na taj način, jedinjenje 100 je visoko potentni agonist FXR.

[0153] Pored toga, podaci u tabeli u daljem tekstu pokazuju da je jedinjenje 100 selektivno za humani FXR i nije aktivno za humani TGR5.

Tabela 1

[0154] Dodatno, upotrebom AlphaScreen analize, pokazano je da jedinjenje 100 specifično aktivira FXR i ne aktivira 13 drugih jedarnih receptora uključenih u metaboličke puteve.

Tabela 2

Vrednosti za jedinjenje B uzete su iz Rizzo G., et al., Mol. Pharm., 2010; 78: 617-630.

[0155] Aktivacija FXR jedinjenjem 100 je takođe testirana u analizama transaktivacije na bazi ćelija uz upotrebu HEK293T ćelijske linije prolazno transficirane sa Gal4-FXR-LBD himerom i (UAS)5-Luc sistemom (Slika 1). Aktivacija FXR jedinjenjem 100 bila je slična onoj indukovanoj jedinjenjem A što ukazuje na to da su ova jedinjenja potentni agonisti FXR u analizama na bazi ćelija. Slika 1 je grafikon koji prikazuje aktivnost jedinjenja 100 u poređenju sa jedinjenjem A u analizi transaktivacije u HEK293T ćelijama. NT su ćelije transficirane FXR vektorom bez izlaganja jedinjenju A ili jedinjenju 100. Vrednosti su predstavljene u µM.

[0156] Žučne kiseline (BAs) moduliraju ne samo nekoliko jedarnih receptora hormona, već su takođe agonisti za receptor spojen sa G proteinom (GPCR) TGR5 (Makishima M, et al., Science 1999; 284:1362-1365; Parks DJ, et al., Science 1999; 284:1365-1368; Maruyama T, et al., Biochem Biophys Res Commun 2002; 298:714-719; Kawamata Y, et al., J Biol Chem 2003; 278:9435-9440). Prenos signala preko FXR i TGR5 modulira nekoliko metaboličkih puteva, koji regulišu ne samo sintezu BA i enterohepatičnu recirkulaciju, već takođe homeostazu triglicerida, holesterola, glukoze i energije. Da bi se procenio kapacitet jedinjenja prema pronalasku da aktivira TGR5, jedinjenje 100 i druga uporedna jedinjenja su ispitivana za povećanje intracelularnog cAMP kao očitavanje za aktivaciju TGR5. Humane enteroendokrine NCIH716 ćelije koje konstitutivno eksprimiraju TGR5 izložene su rastućim koncentracijama jedinjenja 100, i intracelularni nivoi cAMP su mereni pomoću TR-FRET. Litoholna kiselina (LCA) je korišćena kao pozitivna kontrola.

[0157] Kao što je prikazano na slici 2A, jedinjenje 100 ne indukuje aktivnost TGR5 u ćelijama koje eksprimiraju receptor fiziološki kao da nije zabeležena promena u nivou intracelularnog cAMP. Da bi se dalje procenilo da li bi jedinjenje 100 moglo da veže TGR5, prekomerna ekspresija klonalne ćelijske linije TGR5 izložena je različitim koncentracijama jedinjenja 100. Rezultati ilustrovani na Slici 2B pokazuju da čak sa prekomernom ekspresijom TGR5 receptora, jedinjenje 100 nije imalo relevantan efekat. Slika 2A je grafik koji prikazuje TGR5 aktivnost jedinjenja 100 (bez aktivnosti) i LCA u humanim enteroendokrinim ćelijama koje eksprimiraju TGR5 na fiziološkom nivou. Rezultati su prikazani kao srednja vrednost ± S. D. troduplih uzoraka iz reprezentativnog eksperimenta od tri izvedena. Slika 2B je grafikon koji prikazuje TGR5 aktivnost jedinjenja 100 (bez aktivnosti) i LCA u humanim ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) koje prekomerno eksprimiraju TGR5.

Primer 3: FXR ciljni geni modulirani jedinjenjem 100

[0158] Da bi se procenio kapacitet jedinjenja 100 za modulaciju FXR ciljnih gena, izvedene su kvantitativne RT-PCR analize. HepG2 ćelije su izabrane kao relevantna ćelijska linija za određivanje da li jedinjenje prema pronalasku može da reguliše endogenu FXR genetičku mrežu. Sposobnost jedinjenja prema pronalasku da indukuje FXR ciljne gene je procenjivana izolacijom ukupne RNK iz ćelija tretiranih preko noći sa 1µM jedinjenja A, B i 100. Jedinjenje A je ustanovljeno kao potentni selektivni agonist FXR i jedinjenje B je ustanovljeno kao dvostruki potentni agonist FXR/TGR5. Profil genske aktivacije jedinjenja 100 u HepG2 ćelijama je upoređivan sa profilima jedinjenja A i B. (Pellicciari, R, et al., J Med Chem.2002; Aug 15; 45: 3569-72; Rizzo, G, et al., Mol. Pharm., 2010; 78: 617-630).

[0159] FXR reguliše ekspresiju nekoliko ciljnih gena uključenih u homeostazu BA. Ukratko, FXR ima centralnu ulogu u nekoliko metaboličkih puteva, uključujući tj., metabolizam lipida, metabolizam žučnih kiselina i metabolizam ugljenih hidrata. U vezi sa profilisanjem genske ekspresije, geni koji kodiraju proteine uključene u metabolizam lipida obuhvataju, npr., APOCII, APOE, APOAI, SREBP-1C, VLDL-R, PLTP i LPL; geni koji kodiraju proteine uključene u metabolizam žučnih kiselina obuhvataju, npr., OSTα/β, BSEP, MRP2, SHP, CYP7A1, FGF19, SULT2A1 i UGT2B4; i geni koji kodiraju proteine uključene u metabolizam ugljenih hidrata obuhvataju, npr., PGC1a, PEPCK i GLUT2.

[0160] Kao što je prikazano na Slikama 3A-3H, aktivacija FXR jedinjenjem 100 indirektno suprimira ekspresiju enzima CYP7A1 biosinteze BA povećanjem nivoa jedarnog receptora u jetri i crevima i povećanjem nivoa FGF19 (Goodwin, B, et al., Mol. Cell 2000; 6: 517-526). FXR aktiviran jedinjenjem 100 takođe pozitivno reguliše ekspresiju gena koji kodiraju proteine uključene u transport BA, uključujući, BSEP i OSTα i OSTβ. Novo sintetisani BAs su konjugovani sa taurinom ili glicinom i zatim aktivno izlučeni u žučnu kesu, FXR reguliše oba ova kritička procesa. Monoanjonski- i dianjonski-konjugovani BAs su zatim aktivno izlučeni u žučnu kesu pomoću BSEP i proteina 2 koji je vezan za više lekova (MRP2), respektivno. Ovi transporteri pripadaju familiji ABC transportera i oba su indukovana sa FXR na transkripcionom nivou. Regulacija ovih transportera ABC je od kritičnog značaja u cilju izbegavanja akumulacije BA u jetri i posledične hepatične povrede (Schinkel AH, et al., Mammalian drug efflux transporters of the ATP binding cassette (ABC) family: an overview. Adv Drug Deliv Rev.2012; Sep 13).

[0161] Slika 3 predstavlja seriju grafikona koji prikazuju aktivnost jedinjenja 100 i drugih uporednih jedinjenja u regulaciji ekspresije OSTα (A), OSTβ (B), BSEP (C), MRP2 (D), CYP7A1 (E), SHP (F), FGF-19 (G) i UGT2B4 (H). Zapaziti na Slikama 3A-3H, da y-osa prikazuje višestruku promenu u ekspresiji u odnosu na netretirane ćelije. Podaci su normalizovani u odnosu na B2M. Linije koje predstavljaju grešku prikazuju standardnu grešku tri kopije.

[0162] Aktivacija FXR doprinosi reverznom transportu holesterola, procesu koji rezultuje u isporuci holesterola iz perifernih tkiva do jetre za uklanjanja žuči i posledičnu fekalnu eliminaciju (Lambert, G, et al., J Biol Chem 2003; 278, 2563-70). U ovom metaboličkom scenariju, FXR reguliše ekspresiju proteina za transport fosfolipida (PLTP), odgovornu za transfer fosfolipida i holesterola od LDL do HDL, hepatičkih lipoproteina, kao što su ApoE, ApoCI, ApoC-IV, i receptora B1 za čišćenje (SRB1), koji je uključen u hepatični unos HDL.

[0163] FXR kontroliše metabolizam triglicerida (TG) regulacijom hepatične de novo lipogeneze i klirensa triglicerida. Posle aktivacije jedinjenjem 100, FXR nishodno reguliše ekspresiju SREBP-1c, transkripcionog faktora koji ima kritičnu ulogu u stimulaciji sninteze masnih kiselina i lipogenezi (Slike 4A-4D) (Landrier, JF, et al., J Clin Invest 2004; 113, 1408-18). Pored smanjenja de novo lipogeneze, aktivacija FXR takođe modulira klirens TG. Ovaj dodatni efekat FXR na sniženje TG je objašnjen na molekularnom nivou indukcijom ključnih gena, kao što su Apo-CI1 LPL i VDL receptor (Kast, HR, et al., Mol Endocrinol 2001; 15, 1720-8).

[0164] Slika 4 predstavlja seriju grafikona koji prikazuju aktivnost jedinjenja 100 i drugih uporednih jedinjenja u regulaciji PLTP uključenog u metabolizam lipida (A), SREBP-1C (B), APOCII (C) i PPARγ (D). Napomena: na slikama 4A-4D, y-osa prikazuje višestruku promenu u ekspresiji u odnosu na netretirane ćelije. Podaci su normalizovani u odnosu na B2M. Linije koje prikazuju greške ispoljavaju standardnu grešku tri ponavljanja.

[0165] FXR takođe može imati ulogu u metabolizmu ugljenih hidrata. (Ma K, et al., J Clin Invest. 2006; 116:1102-9). Regulacija gena PEPCK (Slika 5) je ispitivana upotrebom jedinjenja 100. Slika 5 je grafikon koji prikazuje regulaciju jedinjenja 100 i drugih uporednih jedinjenja na gen PEPCK. y-osa prikazuje višestruku promenu u ekspresiji u odnosu na netretirane ćelije. Podaci su normalizovani u odnosu na B2M. Linije za greške prikazuju standardnu grešku tri ponavljanja.

[0166] Studije ekspresije gena su zajedno pokazale da jedinjenje 100 modulira iste FXR ciljne gene kao jedinjenje A ili B (takođe videti Tabelu 3).

Tabela 3

Primer 4: Jedinjenje 100 ne ispoljava citotoksične efekte u HepG2 ćelijama.

[0167] Da bi se procenila in vitro citotoksičnost jedinjenja 100, korišćena su dva različita postupka analize. Analize su procenjivale ćelijsku vijabilnost merenjem nivoa ATP i citotoksičnost merenjem oslobađanja LDH. Adenozin trifosfat (ATP) nukleotid predstavlja izvor energije na osnovnom molekularnom nivou, jer je to multifunkcionalan molekul koji je korišćen u svakoj ćeliji kao koenzim i integralan je deo mitohondrijalne DNK (Kangas L, et al., Medical Biology, 1984; 62, 338-343; Crouch SPM, et al., J. lmmunol. Methods, 1993; 160, 81 - 88; Petty RD, et al., J. Biolumin. Chemilumin. 1995; 10, 29 - 34). On se označava kao "molekularna valuta" kada je u pitanju intracelularni transfer energije. Ovo je zbog toga da bi se osigurala važna uloga ATP-a u metabolizmu i pad u sadržaju ATP-a je prvi korak u otkrivanju ćelijskog oštećenja (Storer RD, et al., Mutation Research, 1996; 368, 59 - 101; Cree IA, Andreotti PE., Toxicology in Vitro, 1997; 11, 553 - 556).

[0168] Ćelijska vijabilnost je određena kao mera intracelularnog ATP-a u vezi sa vremenom izlaganja i koncetracijom test jedinjenja (Sussman, NL.; Promega Cell Notes, Issue 3.2002).

[0169] Slika 6 je grafikon koji prikazuje meru ATP-a u HepG2 ćelijama, tretiranim naznačenim koncentracijama jedinjenja u trajanju od 4 časa. Pokazano je da su sve ćelije u prisustvu različitih koncentracija jedinjenja 100 bile vijabilne kao ćelije tretirane samo vehikulumom, tj., sve ćelije tretirane jedinjenjem 100 ostaju vijabilne (100%). LCA, dobro poznata citotoksična žučna kiselina, je korišćena kao komparator i tamoksifen je korišćen kao pozitivna kontrola za analizu.

[0170] Dodatni postupak za određivanje vijabilnosti ćelija je detekcija celovitosti membrane koja definiše ćelijsku kompartmentalizaciju. Merenje curenja komponenti izvan citoplazme, u oštećenim ćelijskim membranama, ukazuje na gubitak celovitosti membrane, i oslobađanje LDH je postupak korišćen za određivanje opšte toksičnosti u ćelijama. HepG2 ćelije su tretirane jedinjenjem 100, izvedena su serijska razblaženja, razblaženja LCA su dodata u

4

ćelije u pločama kao kontrola analize zajedno bez ćelija i sa netretiranim ćelijama. Analiza je izvedena u tri ponavljanja za svaku koncentraciju test jedinjenja.

[0171] Rezultati pokazuju da jedinjenje 100 ne indukuje nikakav citotoksičan efekat na HepG2 ćelije. Litoholna kiselina povećala je oslobađanje LDH u 70 µM, dok je kontrolni tamoksifen je ispoljio citotoksične efekte u približno 25 µM (videti Tabelu 4).

Tabela 4

Primer 5: Jedinjenje 100 ne inhibira enzime citohroma P450.

[0172] Da bi se procenio potencijal jedinjenja 100 za interakcije lek-lek, ispitivano je šest glavnih izoformi CYP450 (CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP2E1, CYP3A4). (Obach, RS, et al., J Pharmcol Exp Ther, 2006; 316(1): p.336-48).

[0173] Da bi se odredila interakcija između jedinjenja 100 i enzima citohroma P450, jedinjenje 100 je analizirano preko njegovog kapaciteta da inhibira (ili ne) proizvodnju fluorescentnog signala, upotrebom rekombinantnih CYP450 proteina (bakulozoma; Invitrogen), supstrata i inhibitora (Bidstrup, TB, et al., Br J Clin Pharmacol, 2003; 56(3): p.

305-14). Kao pozitvna kontrola, selektivan inhibitor za svaku CYP450 izoformu je testiran u istoj ploči (Tabela 5).

Tabela 5

[0174] IC50> 10 µM označavaju da jedinjenje ne inhibira CYP450. Dobijeni rezultati pokazuju da jedinjenje 100, kao jedinjenja A i B, ne inhibiraju testirane enmzime citohroma P450, pokazujući da na jedinjenje 100 verovatno ne utiču efekti interakcije lek-lek. (Rizzo, G, et al., Mol Pharm, 2010; 78: 617-630).

Primer 6: Jedinjenje 100 ne inhibira humani ERG kalijumov kanal

[0175] Da bi se odredila funkcija jonskog kanala, Predictor™ hERG Fluorescence Polarization analiza je korišćena jer ona obezbeđuje efikasan postupak za početno određivanje sklonosti test jedinjenja da blokiraju hERG kanal (Dorn, A, et al. J Biomol Screen, 2005; 10(4): 339-47). Analiza je zasnovana na pretpostavci da aktivnost hERG kalijumovog kanala doprinosi potencijalu mirovanja membrane u permanentno transficiranim ćelijama, i na taj način blokada hERG kanala bi trebalo da rezultuje u depolariziji ćelijske membrane. Analiza je dizajnirana tako da se identifikuju potencijalni blokatori hERG kanala proizvodnjom podataka koji se tačno korelišu sa elektrofiziološkim „patch-clamp“ studijama. Rezultati iz Predictor analize pokazuju visoku korelaciju sa onima dobijenim iz tehnika „patch clamp“ (Tabela 6) (Dorn, A, et al. J Biomol Screen, 2005; 10(4): 339-47).

Tabela 6

[0176] Tabela 6 pokazuje poređenje IC50vrednosti generisanih sa Predictor™ hERG Fluorescence Polarization analizom sa objavljenim IC50vrednostima iz „patch-clamp“ analiza i analiza izmeštanja radioliganda.

[0177] Preparati membrane iz ćelija jajnika kineskog hrčka stabilno transficiranih sa hERG kalijumovim kanalom su korišćeni za procenu potencijalnog inhibitornog efekta jedinjenja 100 na ovaj kanal upotrebom Predictor fluorescentne polarizacione analize. Redukcija polarizacije membrane kao rezultat inhibicije hERG kalijumovog kanala je u direktnoj korelaciji sa redukcijom fluorescentne polarizacije (FP). Rezultati pokazuju da slično jedinjenjima A i B, jedinjenje 100 ne blokira ili inhibira hERG kalijumov kanal.

[0178] Analiza je izvedena u tri ponavljanja upotrebom doze-odgovora od 16 tačaka test jedinjenja i pozitivnih kontrola E-4031 i tamoksifena. Dobijeni su IC50od 15 nM (ΔmP = 163) za E-4031 i 1.4 µM (ΔmP = 183) za tamoksifen. Prozor analize od više od 100 mP (milipolarizacija) je smatran dobrim. Z’ vrednost je bila 0.78 koja ukazuje na odličnu analizu. Nelinearne regresione krive su dobijene pomoću GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.) analize, da bi se izračunale IC50vrednosti.

[0179] Ukratko, prenos signala preko FXR modulira različite metaboličke puteve, tako da su selektivni modulatori FXR privlačni kandidati za lečenje opsega hroničnih bolesti koje

4

pogađaju jetru, bubreg, kao i metaboličkih bolesti. Rezultati u primerima koji su ovde opisani karakterišu jedinjenje 100, kao potentan i specifičan agonist FXR.

[0180] Značajno, iako je ono potentno aktiviralo FXR, jedinjenje 100 nije pokazalo aktivnost protiv drugih jedarnih receptora i nije aktiviralo GPCR TGR5 žučne kiseline. Pored visoke selektivnosti jedarnog receptora, jedinjenje 100 poseduje farmakološki profil pogodan za kandidata leka. Jedinjenje 100 ne pokazuje citotoksičan efekat na humane HepG2 jetrene ćelije, što ukazuje na nedostatak toksičnosti za jetru, i ne inhibira nijedan od testiranih CYP450 enzima, što ukazuje na to da je jedinjenje 100 bez značajnog rizika od interakcije lek-lek. Pored toga, jedinjenje 100 ne inhibira humani ERG kalijumov kanal.

[0181] Kombinovana selektivnost i potencija jedinjenja 100 zajedno sa povoljnim osobinama sličnih leku, naročito odličan profil bezbednosti, čini jedinjenje 100 privlačnim kandidatom za lečenje i prevenciju bolesti.

Primer 7: fizičko-hemijske osobine jedinjenja 100

[0182] Fizičko-hemijske osobine jedinjenja 100 kao što su rastvorljivost u vodi, kritična micelularna koncentracija, površinski napon i LogPA su određeni upotrebom postupaka poznatih u stanju tehnike. Ove osobine jedinjenja 100 su upoređivane sa prirodnim i sintetičkim analozima (Tabela 7).

Tabela 7

Primer 8: Farmakokinetika i metabolizam pacova sa žučnom fistulom posle id i iv primene: in-vivo

[0183] In-vivo modeli, pacovi, su primili jednu dozu jedinjenja 100 u 1 µmol/min/Kg.1 čas (videti slike 7A, 7B i 7C). Slika 7A je grafik koji prikazuje holeretički efekat jedinjenja 100 za id i iv primenu. Slika 7B je grafikon koji prikazuje izlučivanje jedinjenja 100 tokom vremena za id i iv primenu. Slika 7C je grafikon koji prikazuje koncentraciju jedinjenja 100 u plazmi tokom vremena.

4

Claims (20)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule I:

   ili njegova farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat, naznačeno time što: R1 je hidroksil; R2 je vodonik, hidroksil, alkil ili halogen, pri čemu je navedeni alkil nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više R<a>; R3 je vodonik, hidroksil, alkil ili halogen, pri čemu je navedeni alkil nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više R<b>; R4 je alkil, alkenil, alkinil ili halogen, pri čemu je navedeni alkil nesupstituisan ili supstituisan sa jednim ili više R<c>; Ra, Rb i Rc su svaki nezavisno halogen ili hidroksil; R5 je hidroksil, OSO3H, OSO3-, OCOCH3, OPO3H2, OPO 2 3-, ili vodonik; i R6 je hidroksil, OSO3H, OSO3-, OCOCH , OPO 2 3 3H2, OPO3-, ili vodonik; ili uzeti zajedno R5 i R6 sa atomom ugljenika za koji su vezani formiraju karbonil.
2. 2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, koje ima formulu:

   ili 4

   ili farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili aminokiselinski konjugat bilo kog od njih.
3. 3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što jedan od R<2>ili R<3>je hidroksil ili halogen i preostali R2 ili R3 je vodonik ili nesupstituisani alkil.
4. 4. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što jedan od R<2>ili R<3>je hidroksil i preostali R2 ili R3 je vodonik.
5. 5. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačeno time što jedan od R<5>ili R<6>je hidroksil i preostali R5 ili R6 je vodonik.
6. 6. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, naznačeno time što R<2>je hidroksil ili halogen.
7. 7. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što R<3>je vodonik ili nesupstituisani alkil.
8. 8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 7, naznačeno time što R<3>je metil.
9. 9. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačeno time što R<2>je hidroksil i R<3>je vodonik.
10. 10. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačeno time što R<5>je hidroksil.
11. 11. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-10, naznačeno time što R<6>je vodonik. 4
12. 12. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7 i 9-11, naznačeno time što i R<2>i R<5>su hidroksil i R3 i R6 su vodonik.
13. 13. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačeno time što R<4>je alkil.
14. 14. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13, naznačeno time što R<4>je nesupstituisani alkil.
15. 15. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-14, naznačeno time što R<4>je etil.
16. 16. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 sledeće formule:

    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili aminokiselinski konjugat.
17. 17. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 sledeće formule:

    ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, solvat ili aminokiselinski konjugat.
18. 18. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-17 ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, solvat ili aminokiselinski konjugat, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens. 4
19. 19. Jedinjenje prema bilo kom od patentnih zahteva 1-17 za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti ili stanja posredovanog preko FXR kod subjekta.
20. 20. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 19, naznačeno time što navedena bolest ili stanje posredovano preko FXR je izabrano od kardiovaskularne bolesti, hronične bolesti jetre, poremećaja lipida, gastrointestinalne bolesti, bolesti bubrega, metaboličke bolesti, kancera i neurološke bolesti.