RS57439B1 - Optimizovani sistem sa endosomolitičkim agensima za in vivo primenu konjugata nukleinskih kiselina - Google Patents

Optimizovani sistem sa endosomolitičkim agensima za in vivo primenu konjugata nukleinskih kiselina

Info

Publication number
RS57439B1
RS57439B1 RS20180764A RSP20180764A RS57439B1 RS 57439 B1 RS57439 B1 RS 57439B1 RS 20180764 A RS20180764 A RS 20180764A RS P20180764 A RSP20180764 A RS P20180764A RS 57439 B1 RS57439 B1 RS 57439B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nucleic acid
dna
cancer
molecules
lmamca
Prior art date
Application number
RS20180764A
Other languages
English (en)
Inventor
Jian-Sheng Sun
Marie Dutreix
Maria Quanz-Schoeffel
Original Assignee
Onxeo
Inst Curie
Centre Nat Rech Scient
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Onxeo, Inst Curie, Centre Nat Rech Scient filed Critical Onxeo
Publication of RS57439B1 publication Critical patent/RS57439B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4706—4-Aminoquinolines; 8-Aminoquinolines, e.g. chloroquine, primaquine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug
    • A61K47/551—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug one of the codrug's components being a vitamin, e.g. niacinamide, vitamin B3, cobalamin, vitamin B12, folate, vitamin A or retinoic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/554—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being a steroid plant sterol, glycyrrhetic acid, enoxolone or bile acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis
Tehnički problem
[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na oblast medicine, posebno onkologije.
Stanje tehnike
[0002] Lečenje karcinoma uglavnom se sastoji od hirurškog zahvata kad god je to moguće, primene citotoksičnih lekova kao što je hemoterapija, kao i radioterapije. Molekularna terapija karcinoma pojavila se u protekloj deceniji, na primer: monoklonalna antitela usmerena na receptore ćelijskih membrana, inhibitori receptora tiroksin kinaze ili drugih kinaza koji su usmereni na transdukciju signala uključenih u umnožavanje ćelija, njenu smrt i preživljavanje. Kao citostatički lekovi, njihova primena u režimu monoterapije često nema dovoljnu kliničku prednost. Sinergistički ishodi se često dobijaju kombinacijom sa citotoksičnim lekovima, ali su ograničeni njihovim kumulativnim nuspojavama.
[0003] Većina lekova za lečenje karcinoma izaziva, direktno ili indirektno, oštećenje DNK tretiranih umnožavajućih tumorskih ćelija, što na kraju dovodi do njihove smrti. Međutim, neke urođene ili stečene rezistencije tumora na te lekove javljaju se, bar delimično, usled efikasnih aktivnosti reparacije DNK. Sada se dobro zna da je reparacija DNK važan cilj u terapiji karcinoma (Helleday i sar. Nat. Rev. Cancer, 2008, 8:193-204). Najnapredniji lekovi u ovoj oblasti su inhibitori PARP.
[0004] Pošto je reparacija DNK neophodan proces preživljavanja u celokupnom živom svetu, on ima višestruke specijalizovane puteve obnavljanja, ali ima i neke rezervne koji čine proces izdržljivim kada neki put nedostaje ili je blokiran terapijskim lekom kao što je inhibitor DNK. Prema tome, umesto da se usmeri na neki ključan gen/protein u procesu obnove DNK, bez obzira na njegov biološki i klinički značaj, inovativna molekularna terapija se, zajedno sa konvencionalnim lekovima, mora baviti jednim ili nekolikim ključnim putevima kako bi se došlo do najefikasnije terapije karcinoma.
[0005] Zamišljeno je da se, u načelu, cilja na puteve detekcije, signalizacije i reparacije DNK oštećenja kako bi se onemogućila odbrana karcinoma od postojećih lekova. Jedna strategija se sastoji od uvođenja u ćelije kratkih modifikovanih molekula DNK, pod nazivom lek mamac (Dbait), koji imitiraju oštećenje u oba lanca (DSB), tako da bi tada mogli da efikasno obnavljaju DNK i tako učine da te ćelije prežive. Antitumorska efikasnost ovog mamca u kombinaciji sa radioterapijom (RT) ili hemoterapijom (CT) objašnjava se činjenicom da Dbait molekuli hvataju inicijalne komplekse za detekciju DSB, zatim blokiraju signale za reparaciju, nakon čega pokvare sve sisteme za popravljanje DSB (kako puteve za nehomologno sastavljanje krajeva, tako i puteve za homolognu rekombinaciju) i, na kraju, sprečavaju (inhibišu) reparaciju DSB (WO2005/040378; WO2008/034866; Quanz i sar., 2009, Clinical Cancer Research 15:1308 ; Quanz i sar., 2009, PLoS ONE 4:e6298; Dutreix i sar., 2010, Mut. Res. 704:182). Na kraju, ćelije karcinoma ne mogu da se odupru smrti. Takođe je nađeno da Dbait molekuli mogu biti delotvorni i ako se primene sami, bez radioterapije (RT) ili hemoterapije (CT) (WO2008/084087).
[0006] Međutim, kada se identifikuju aktivni agensi od kliničkog interesa, uvek se javlja problem kako pronaći najbolji način za primenu aktivnih agenasa, posebno onih za nukleinsku kiselinu. Razvoj i optimizacija efikasnih ne-virusnih sistema za primenu DNK/RNK mora da se pozabavi pitanjima toksičnosti, „tkivima i sistemskim barijerama“ kao što su degradacija, opsonizacija čestica naelektrisanim komponentama seruma, brzo izbacivanje i akumulacija u tkivima koja nisu cilj, a kada se te aktivna supstanca primenjuje na sistemski način, „ćelijskim preprekama“ njihovoj primeni kao što je slabo preuzimanje u citoplazmatskoj membrani, neodgovarajuće oslobađanje molekula DNK u aktivnom celularnom odeljku, kao i nedostatak nukleusnog usmerenja (potrebnog za gensku terapiju).
[0007] Zapravo, da bi bili delotvorni, većinu ovih aktivnih supstanci moraju preuzeti ćelije i moraju stići do citoplazme i/ili jezgra. Kada se aktivne supstance, uključujući i nukleinske kiseline, primenjuju u svom „slobodnom“ ili nezaštićenom obliku, one se često raspadnu pre i nakon što ih ciljne ćelije uzmu. Unutar ćelija, do tog raspadanja uglavnom dolazi usled činjenice da nukleinske kiseline ulaze u ćelije endocitozom, da se izdvajaju u ćelijske endozome koji na kraju evoluiraju u lizozome u kojima je hemijska i enzimska degradacija veoma efikasna.
[0008] Postojeća situacija je takva da su aktivni agensi konjugovani u različite nosače i ubačeni u lipozome, nucele i nanočestice gde su zaštićeni od raspadanja u serumu. Stanje tehnike takođe koristi razne hemijske postupke za kovalentno vezivanje nukleinskih kiselina i drugih aktivnih agenasa za molekulske nosače koji sadrže polimere kao što su dekstrani ili PEG ili molekuli čiji je cilj da smanje klirens, mosači uključujući transferin, lipofilni molekuli kao što je holesterol vezan za siRNK da ubrza ćelijsko preuzimanje (Chen i sar., 2010, J. Controlled Release 144:227). Ovi nosači mogu da imaju ciljajuća mesta kao što su antitela, polipeptidi, nukleinske kiseline i druge supstance za usmeravanje tih aktivnih agenasa ka odabranim ciljnim ćelijama. Stanje tehnike još obalodanjuje molekule koji poboljšavaju endocitozu za upotrebu farmaceutskoj formulaciji (US2008/0194540).
[0009] Međutim, kada ćelije preuzmu aktivne DNK/RNK agense procesom endocitoze, ti agensi se često izdvoje u endozome odakle ne mogu da izađu, čime se u znatnoj meri smanjuje njihov terapijski potencijal. Na primer, Zimmermann i sar., su pokazali na miševima da je konjugat holesterola i siRNK (ApoB-1) oko 1000 puta slabiji od njegove lipozomalne formulacije (SNALP vektor): 100mg/kg holesterol-siApoB-1 ekvivalentno je 0,1mg/kg SNALPApoB-1 (Zimmermann i sar. Nature, 2006, 441:111-114, dopunska slika 1).
[0010] Što se tiče nukleinske kiseline, stanje tehnike je pokušalo da reši ovaj problem upotrebom katjonskih polimera kao što su polietilenimin (PEI) (WO96/02655) ili lipozomi sa fuzogenskim lipidima ili peptidi kao što je SNALP vektor. PEI je u stanju da destabilizuje endozome dobro opisanim proton sunđer efektom i tako olakša oslobađanje nukleinske kiseline. Međutim, upotreba PEI često je ograničena njegovom citotoksičnošću, te za sada nije odobren za upotrebu kod ljudi. Lipozomalna formulacija takođe ispoljava toksičnost i ograničenu kapsulaciju nukleinske kiseline (obično u opsegu od 1-2mg /mL) što možda nije pogodno za primenu koja zahteva veliku korisnu nosivost agenasa nukleinske kiseline.
[0011] Poznato je da „endozomolitički“ lekovi kao što su hlorokvini takođe ubrzavaju transfekciju nukleinskih kiselina olakšavanjem njihovog oslobađanja iz endozoma u citoplazmu ćelijske kulture. Međutim, primena hlorokvina ograničena je na in vitro primenu i retko je procenjivan u pogledu pomoćnika za in vivo primenu nukleinske kiseline. To je možda zbog izveštaja u struci koja se bavi nukleinskom kiselinom koja ne savetuje njegovu upotrebu in vivo znog toksičnosti.
[0012] Benns, i sar (2000, Bioconj. Chem. 11: 637) su napisali da „Mada je dokazano da hlorokvin pomaže u oslobađanju plazmidne DNK u citoplazmu, nađeno je da je toksičan i zato se ne sme upotrebljavati in vivo“. Ovaj problem je nastao delimično zbog činjenice da su relativno visoke koncentracije slobodnog hlorokvina potrebne da dođu do istog mesta kao i nukleinska kiselina (tj. plazmidna DNK) u endozomu. Slično tome Zhang i sar. (2003, J Gene Med 5:209) su proučavali in vivo upotrebu hlorokvina u dostavljanju gena u jetru. U ovom članku, oni su koristili plazmid zajedno sa peptisom (polilizin/molosin) kao DNK vektor. Oni su zaključili da, mada je hlorokvin delotvoran kao promoter primene gena u jetri, potrebno je ponovljeno doziranje, a njegova upotreba je ograničena sistemskom toksičnošću. Zaista, oni su dokazali da akutna sistemska toksičnost hlorokvina ograničava in vivo primenu do nivoa koji je znatno ispod nivoa potrebnog za optimalnu primenu gena. Lokalna primena hlorokvina takođe je ograničena lokalnom toksičnošću hlorokvina i njegovim širenjem od mesta primene. Na kraju, oni nisu zapazili primenu gena ili veoma malu količinu u slučaju upotrebe nezaštićene DNK.
[0013] U ovom kontekstu, WO2007/040469 tvrdi da se problem neophodne visoke koncentracije hlorokvina može rešiti i prevazići kovalentnim vezivanjem hlorokvina za aktivni agens, čime se smanjuje ukupna potrebna doza. WO2009/126933 predlaže da se kovalentno veže nukleinska kiselina da se tako dostavi kako endosmolitičkom agensu, tako i ciljajućem ligandu.
[0014] Hlorokvin i njegovi derivati kao što je hidroksihlorokvin koriste se za lečenje i prevenciju malarija. Proučavan je još i za primenu u kombinaciji sa radioterapijom i/ili hemoterapijom karcinoma (Sotelo i sar., 2006, Ann Intern Med 144:337-342; NCT01023477 i NCT00969306). Hipoteza je da hlorokvin/hidroksihlorokvin ometa autofagocitozu, što je normalni proces ćelijske odbrane, izbacivanjem terapijskih agenasa u lizozome gde se razlažu.
[0015] U zaključku, optimizacija terapija na bazi nukleinske kiseline zahteva dalje proučavanje efikasnosti i citotoksičnosti sistema za primenu sintetske DNK.
Zaključak
[0016] Obim ovog pronalaska definiše se zahtevima, a informacije koje nisu obuhvaćene zahtevima date su u informativne svrhe.
[0017] Ovaj opis se odnosi na novi efikasni postupak za in vivo primenu nukleinskih kiselina od terapijskog značaja na bazi kovalentne konjugacije nukleinskih kiselina od terapijskog značaja molekulom koji olakšava endocitozu. Konkretno, ovaj sistem za in vivo primenu koristi se za molekule leka mamca.
[0018] Konkretnije, taj molekul konjugovane nukleinske kiseline ima jednu od sledećih formula:
pri čemu se podvučeni nukleotid odnosi na nukleotid koji ima ili nema fosforotioat ili metilfosfonatni oslonac, L’ se bira iz grupe koja sadrži heksaetilenglikol, tetraoksitimidilat (T4) i 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-okso-nonadekan; i/ili m je 1, a L je karboksamidooligoetilen glikol; i/ili C se bira iz grupe koja sadrži dioleoil, oktadecil, folnu kiselinu i holesterol. Poželjnije je da je C holesterol.
[0019] U jednoj vrlo specifičnoj realizaciji, molekul konjugovane nukleinske kiseline je
gde se podvučeni nukleotid odnosi na nukleotid koji ima fosforoioatni oslonac.
[0020] U drugoj realizaciji pronalaska, molekul konjugovane nukleinske kiseline ima sledeću formulu
Kratak opis crteža
[0021]
Slika 1: Ćelijsko preuzimanje formulisanog Lmamca. (A) Mikroskopska analiza kompleksa Lmamaca sa PEI11k (a). (B) Analiza protočnom citometrijom ćelijskog preuzimanja izvršena je 5 sati posle početka tretmana različitih stanja transfekcije. Lmamac-ci3 primenom superfekta, 2 µg/ml koLmamac-ci3 tretiran ili netretiran hlorokvinom pre transfekcije, 25 µg/ml koLmamac-cy3 sa ili bez CQ.
Slika 2: Aktivnost formulisanog Lmamca. (A) DNK-PK aktivacija merena je nakon dodavanja 50 u prečišćenog enzimskog kompleksa u DNK, 0,25 µg Lmamca ili 0,25 µg koLmamca, (B) Imuno detekcija γ-H2AX u ćelijama 24 sata posle tretmana primenom 1,6 µg/ml Lmamca (levo), 1,6 µg/ml Lmamca/PEI11K (sredina), 16 µg/ml koLmamca sa CQ. skala: 20 µm. (C) Kvantifikacija γ-H2AX, 5 sati (crno) i 24 sata (sivo) posle tretmana različitim formulacijama Lmamca. Sve transfekcije su vršene primenom 1,6 µg/mL Lmamca ili 16 µg/mL koLmamca. Kada je bilo indikovano, pre transfekcije dodavan je CQ.
Slika 3: Fenotipovi 24 sata posle injektovanja Lmamca u ekstracelularni prostor embriona zebrice u ćelijskoj fazi 1K. (A-C) Lateralni izgled napred prema levo embriona zebrice 24 sata posle injektovanja Lmamca-ci3 PEI (2-5 nl) u životinjski pol embriona zebrice u ćelijskoj fazi 1K: gornji panel, svetlo polje; donji panel, uvećanje 2x oblasti glave sa epifluorescentnim premazom koji prikazuje Lmamac-ci3 u crvenoj boji. (A) Fenotip tipa 1 neraspoznatljiv u odnosu na onaj koji nije injektovan (nije prikazan). (B) Blagi fenotip tipa 2 sa izraženom ćelijskom smrti u predelu glave. (C) Jaka teratogeneza i rasprostanjena ćelijska smrt tipa 3. (D) Histogram procentualno prikazuje tri klase fenotipova u zavisnosti od adjuvanta. Analizirano je više od 100 embriona za svaki uslov. NA: Injektovan je samo Lmamac; Sup: Superfekt; 25k, 22k, 11k PEI odgovarajuće veličine; hloro: hlorokvin; Lut: Lutrol.
Slika 4: Difuzija i aktivnost u tumorima. Tumori su injektovani sa 1,6 µg Lmamca-ci 5,5/PEI ili 16 µg koLmamaca 5.5 (cdLmamac obeležen sa 1/10 ci5,5 9/10 neobeležen coLmamac da bi se održao sličan intenzitet fluorescencije) i distribucija fluorescencije i aktivnost DNK-PK analizirane su sledećeg dana. Difuzija fluorescentnog Lmamca posle dva tipa injekcija: jedne intratumoralne i dve supkutane.
Slika 5: Preživljavanje 5 grupa golih miševa sa ksenograftom SK28 melanoma: 1) netretirani (n=16); 2) zračeni (IR, n=12); 3) zračeni i dobili intraperitonealno 1 mg hlorokvina (CQ, IR, n= =10); 4) tretirani intratumoralnom injekcijom sa 0,6 mg DT01 (još zvanog koLmamac) i zračeni 5 sati kasnije (DT01, IR, n=11) i 5) prethodno tretirani intraperitonealnom injekcijom 1mg hlorokvina 2 sata pre intratumorske injekcije 0,6mg DT01 (još zvanog koLmamac) i zračeni 5 sati kasnije (DT01, CQ, IR, n=13).
Slika 6. Studija rasta melanoma SK28 graftovanog na gole miševe. Gore: terapijski protokol: 4 tretmana sa DT01 (još zvanog KoLmamac) u kombinaciji sa 4 zračenja (RT) tokom dve nedelje. Supkutano je injektovano 4 mg DT01 u dva suprotna mesta udaljena 5 mm od ivice tumora. Životinje su pre početka tretmana i za vreme primene DT01+RT dobijale 1 mg hlorokvina (CQ) dva puta nedeljno kroz usta (p.o.)*. Sredina: Srednja vrednost tumorskog rasta kod različitih životinjskih grupa: Netretirani ili CQ: netretirani ili su samo primali CQ (n=11); RT ili CQ+RT: zračeni uz primenu hlorokvina ili bez nje (n=16); DT01+RT: tretirani sa DT01 ili zračenjem (n10); DT01+CQ+RT: tretirani sa DT01 uz hlorokvin i zračenje (n=12). Dole: Podaci o grupama DT01+RT i DT01+CQ+RT. Svaka kriva odgovara jednom tumorskom rastu.
Slika 7: Aktivnost DNK-PK pomoću sistema SignaTECT DNA-dependent Protein Kinase Assay (Promega, Madison, WI, USA). Biotinilizovana peptidna podloga, 50 J. DNK-PK (Promega, Madison, WI, USA) i 500 nM raznih molekula Lmamca inkubirani su tokom 5 min na 30°C sa (γ-32P)ATP prema uputstvima proizvođača. Biotinilizovana podloga je prebačena na streptavidin membranu, oprana i prebrojana u scintilacionom brojaču. Procenat fosforilacije izračunat je deljenjem vezane radioaktivnosti ukupnim brojem (γ-32P)ATP po uzorku. Lmamac32Hc je nekonjugovani molekul Lmamca. 0813, 0815, 0902, 0903, 0904 i 0905 su konjugovani molekuli Lmamaca (v. Tabele "Alternativnih konjugovanih molekula Lmamca"). Lmamac8H je kratak (8-bp) Lmamac korišćen kao negativna kontrola aktivnosti DNK-PK.
Slika 8: Aktivnost molekula Lmamca merena fosforilacijom H2AX. Imunodetekcija γ-H2AX u MRC5 ćelijskoj liniji 24 sata nakon transfekcije raznih molekula konjugovanog Lmamca (v. Tabele "Alternativnih konjugovanih molekula Lmamca") sa ili bez prethodne primene 50 µM hlorokvina. Lmamac formulisan kao polietilen amin (PEI) bio je korišćen kao pozitivna kontrola.
Detaljni opis pronalaska
[0022] Uvođenje malih molekula DNK (Lmamac) ometa oporavak oštećenih hromozoma i predstavlja efikasan postupak za poboljšanje efikasnosti radioterapije ili hemoterapije tumora, posebno rezistentnih tumora. Međutim, detektorska aktivnost molekula Lmamca zavisi od efikasnosti njihovog ubacivanja u tumorske ćelije.
[0023] Prema tome, pronalazači su upoređivali različite strategije za poboljšanje ovog ključnog koraka. U cilju testiranja strategija, oni su razvili niz analiza: (i) molekularna analiza kompleksa formiranih sa molekulima Lmamca, (ii) ćelijski testovi preuzimanja i aktivnosti Lmamca, (iii) konfokalna mikroskopija živih zebrica u cilju praćenja in vivo distribucije i biološke aktivnosti formulisanih molekula. To je omogućilo selekciju najefikasnijih formulacija i protokola primene pre ispitivanja ksenograftovanih tumora na miševima. Upoređivane su dve klase formulacija: polikatjonski polimeri sa lineranim ili razgranatim polietilen aminom (PEI), i kovalentno priključen holesterol (koLmamac). Linearni PEI kompleksi bili su najefikasniji u transfekciji Lmamca in vitro i in vivo, ali su pokazali veliku toksičnost. Tako su bile potrebne 10 puta veće doze koLmamca primenjenog zajedno sa 1 mg hlorokvina (prema alometrijskoj konverziji, ekvivalenento profilaktičkoj dozi kod ljudi) da se dobije isto antitumorsko dejstvo na ksenograftovani melanom nego kada je Lmamac formulisan sa PEI. Međutim, nađeno je da ispitivane doze koLmamca primenjenog sa hlorokvinom nisu toksične.
[0024] Prema tome, sadašnji pronalazak opisuje kombinaciju i protokol primene konjugata holesteronukleinske kiseline i sistemski primenjenog hlorokvina u klinički značajnoj dozi, posebno primenu konjugata holesterol-Lmamac uz profilaktičku dozu hlorokvina (alometrijskom konverzijom na životinje), bez primetne toksičnosti. Pronalazači su pokazali da 10 puta veća količina (10x) holesterol-Lmamca ima sličnu aktivnost kao 1x Lmamac vektorizovan neviralnim vektorskim sistemom kod miševa, umesto 1000 puta bez upotrebe hlorokvina kao što je opisano u stanju tehnike. Ovim konjugacija terapijskih nukleinskih kiselina u lipofilni ili celularni ciljajući agens postaje bezbedan i ekonomičan sistem za primenu.
[0025] Prema tome, uprkos potrebi za višim dozama Lmamca, pronalazači su iznenada pronašli da:
1) Kombinacija koLmamca i hlorokvina pokazuje malu ili nikakvu toksičnost in vivo.
Time se poboljšava terapijski indeks (odnos efikasne doze/toksične doze) od skoro 1 za Lmamac/PEI do >20 za koLmamac; odsustvo toksičnosti primećeno je posle intravenske, supkutane, pa čak i posle intracerebralne injekcije kod miša, pacova, kunića i majmuna;
2) Kombinacija koLmamca i hlorokvina daje odloženu i kontrolisanu aktivaciju DNK-PK (glavni cilj Lmamca) i omogućava produženo terapijsko dejstvo. Konkretnije, zapaženo je povećanje aktivnosti tokom tog vremenskog perioda;
3) Iznenađujuće je što je difuzija koLmamca u tumoru/tkivu dobra u poređenju sa Lmamcem/PEI.
4) Pronalazač je prvi put zapazio da hlorokvin omogućava povećanje celularnog preuzimanja Lmamca, dok je ovaj efekat manje izražen kod holesterola konjugovanog sa siRNK molekulima.
Na osnovu ovih opažanja, ovaj opis odnosi se na
- farmaceutsku formulaciju koja sadrži molekul Lmamca ili molekul ukosnice nukleinske kiseline kao što je opisano u nastavku i, neobavezno b) antitumorski agens koji oštećuje DNK, kao i farmaceutski prihvaljivi nosač, posebno za primenu u lečenju karcinoma;
- proizvod ili komplet koji sadrži (a) konjugovani molekul Lmamca ili molekul ukosnice nukleinske kiseline kao što je obelodanjeno u nastavku, kao i neobavezno b) antumorski agens koji oštećuje DNK, kao kombinovani preparat za istovremenu, zasebnu ili sekvencijalnu primenu, posebno u lečenju karcinoma;
- farmaceutsku formulaciju koja sadrži konjugovani molekul Lmamca ili molekul ukosnice nukleinske kiseline kao što je obelodanjeno u nastavku, za primenu u lečenju karcinoma u kombinaciji sa radioterapijom i/ili antitumorskim agensom koji oštećuje DNK;
- upotrebu farmaceutske formulacije koja sadrži konjugovani molekul Lmamca ili molekul ukosnice nukleinske kiseline kao što je obelodanjeno u nastavku, za proizvodnju medikamenta za lečenje karcinoma u kombinaciji sa radioterapijom i/ili antitumorskim agensom koji oštećuje DNK ili za povećanje efikasnosti lečenja karcinoma radioterapijom i/ili antitumorskim agensom koji oštećuje DNK ili za jačanje osetljivosti tumora na radioterapiju i/ili lečenje antitumorskim agensom koji oštećuje DNK.
[0026] Izraz „komplet“, „proizvod“ ili „kombinovani preparat“, kako je ovde upotrebljen, definiše posebno „komplet delova“ u smislu da se kombinacioni partneri (a) i (b), i neobavezno (c), kako su prethodno definisani mogu dozirati pojedinačno ili primenom različitih fiksnih kombinacija sa različitim količinama kombinacionih partnera (a) i (b), i neobavezno (c), tj. istovremeno ili u različito vreme. Delovi ovog kompleta delova se zatim mogu, npr., primenjivati istovremeno ili po hronološkom rasporedu, to jest, u različita vremena u jednakim ili različitim vremenskim intervalima. Odnos ukupnih količina kombinacionih partnera (a) prema kombinacionom partneru (b), i neobavezno (c), koje će se primeniti u kombinovanom preparatu mogu biti različite. Kombinacioni partneri a) i (b), i neobavezno (c), mogu se primenjivati na isti ili različite načine.
[0027] U kontekstu pronalaska, izraz terapija označava kurativnu, simptomatsku i preventivnu terapiju. Farmaceutske formulacije, kompleti, proizvodi i kombinovani preparati iz pronalaska mogu se primenjivati kod ljudi sa postojećim karcinomom ili tumorom, uključujući i karcinom u ranom ili kasnom stadijumu progresije. Farmaceutske formulacije, kompleti, proizvodi i kombinovani preparati iz pronalaska neće nužno izlečiti pacijenta koji ima karcinom, ali će odložiti ili usporiti progresiju ili sprečiti dalju progresiju bolesti i na ta j način poboljšati stanje pacijenta. Posebno, farmaceutske formulacije, kompleti, proizvodi i kombinovani preparati iz pronalaska, smanjuju razvoj tumora, redukuju tumorsko opterećenje, dovode do regresije tumora kod sisara i/ili sprečavaju pojavu metastaza i recidiv karcinoma. Za lečenje karcinoma, farmaceutska formulacija iz pronalaska primenjuje se u terapijski delotvornoj količini.
[0028] Pod „delotvornom količinom“ misli se na količinu farmaceutske formulacije iz pronalaska koja sprečava, uklanja ili smanjuje pogobna dejstva karcinoma kod sisara, uključujući i ljude, bilo da se primenjuje sama ili u kombinaciji sa drugim aktivnim sastojcima te farmaceutske formulacije, kompleta, proizvoda ili kombinovanog preparata. Smatra se da primenjenu dozu stručnjaci mogu prilagođavati prema pacijentu, patologiji ili načinu primene itd.
[0029] Kada se negde u ovom opisu pomene „lečenje karcinoma“ ili slično sa pozivom na farmaceutsku formulaciju iz pronalaska, misli se na: a) postupak lečenja karcinoma, pri čemu se navedeni postupak sastoji od primene farmaceutske formulacije iz pronalaska ispitaniku kome je potrebna takva terapija; b) primenu farmaceutske formulacije iz pronalaska za lečenje karcinoma; c) primenu farmaceutske formulacije iz pronalaska u proizvodnji medikamenta za lečenje karcinoma; i/ili d) farmaceutsku formulaciju iz pronalaska za primenu u lečenju karcinoma.
Molekuli Lmamca
[0030] Molekuli Lmamca podrobno su opisani u PCT patentnim prijavama WO2005/040378,
WO2008/034866 i WO2008/084087.
[0031] Molekuli Lmamca mogu se definisati izvesnim brojem karakteristika neophodnih za njihovo terapijsko dejstvo, na primer, njihova minimalna dužina, prisustvo najmanje jednog slobodnog kraja, kao i prisustvo dvostruko uvijenog dela, poželjno, deo dvostruko uvijene DNK. Kao što će se videti u nastavku teksta, važno je napomenuti da precizna sekvenca nukleotida u molekulima Lmamca nema uticaja na njihovu aktivnost. Osim toga, molekuli Lmamca mogu da sadrže izmenjenu i/ili ne-prirodnu kičmu.
[0032] Poželjno je da molekuli Lmamca budu ne-humanog porekla (tj., sekvenca njihovih nukleotida i/ili potvrda (npr., ukosnica) ne postoji kao takva u ljudskoj ćeliji), a najpoželjnije je da budu sintetskog porekla. Pošto sekvenca molekula Lmamca igra malu ili nikakvu ulogu, molekuli Lmamca poželjno nemaju značajnu homologiju ili identitet sekvence prema poznatim genima, promoterma, pojačivačima, 5’- ili 3’- prethodnim sekvencama, egzonima, kao i intronima. Drugim rečima, molekuli Lmamca imaju manje od 80% ili 70%, čak manje od 60% ili 50% identiteta sekvenci prema bilo kojem genu u humanom genomu. Metode određivanja identiteta sekvence dobro su poznate u struci i uključuju, npr., BLASTN 2.2.25. Po ljudskom genomu, poželjno je da se on razmatra za određivanje procenta identiteta humanog genoma Buiild 37 (referenca GRCh37.p2 i alternativni sklopovi). Molekuli Lmamca ne hibridizuju se, pod strogim uslovima, sa humanom genomskom DNK. Tipični strogi uslovi su takvi da omogućavaju razlikovanje poptuno komplementarnih nukleinskih kiselina od delimično komplementarnih nukleinskih kiselina.
[0033] Osim toga, sekvenca molekula Lmamca je poželjno lišena CpG kako bi se sprečile poznate Toll-slične receptor-posredovane imunološke reakcije.
[0034] Dužina molekula Lmamca može biti različita, toliko duga koliko je dovoljno da se omogući odgovarajuće vezivanje Ku proteinskog kompleksa koji sadrži Ku i DNK-PKc proteine. Pokazano je dužina molekula Lmamca mora biti veća od 20 pb, poželjno oko 32 pb, kako bi se osiguralo vezivanje takvog Ku kompleksa i omogućila aktivacija DNK-PKc. Poželjno je da molekuli Lmamca sadrže između 20 i 200 bp, poželjnije 24-200 bp, još poželjnije 26-100, a najpoželjnije 32-100 bp. Na primer, molekuli Lmamca sadrže između 24-160, 26-150, 28-140, 30-120 ili 32-100 bp. Pod izrazom „bp“ misli se da molekul sadrži dvostruko uvijeni deo indikovane dužine.
[0035] U konkretnom aspektu, molekuli Lmamca sa dvostruko uvijenim delom od najmanje 32 pb, ili od oko 32 bp, sadrže istu sekvencu nukleotida kao Lmamac32 (SEQ ID br. 1), Lmamac32Ha (SEQ ID br. 2), Lmamac32Hb (SEQ ID br. 3), Lmamac32Hc (SEQ ID br. 4), ili Lmamac32Hd (SEQ ID br. 5). Opcionalno, molekuli Lmamca imaju isti nukleotidni sastav kao Lmamac32, Lmamac32Ha, Lmamac32Hb, Lmamac32Hc ili Lmamac32Hd, ali je njihova nukleotidna sekvenca različita. Zatim, molekuli Lmamca sadrže jednu nit dvostruko uvijenog dela sa 3 A, 6 C, 12 G i 11 T.
Poželjno, sekvenca molekula Lmamca ne sadrži nijedan CpG dinukleotid.
[0036] Alternativno, dvostruko uvijeni deo sadrži najmanje 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ili 32 konsekutivna nukleotida Lmamca32 (SEQ ID br. 1), Lmamca32Ha (SEQ ID No 2), Lmamca32Hb (SEQ ID No 3), Lmamca32Hc (SEQ ID No 4) ili Lmamca32Hd (SEQ ID No 5). U konkretnijem aspektu, taj dvostruko uvijeni deo sadrži 20, 22, 24, 26, 28, 30 ili 32 konsekutivna nukleotida Lmamca32 (SEQ No 1), Lmamca32Ha (SEQ No 2), Lmamca32Hb (SEQ No 3), Lmamca32Hc (SEQ No 4) ili Lmamca32Hd (SEQ No 5).
[0037] Lmamac mora imati najmanje jedan slobodan kraj, kao imitaciju DSB. Taj slobodni kraj može biti ili slobodni tupi kraj ili 5’-/3’- istureni kraj. Taj „slobodni kraj“ ovde se odnosi na molekul nukleinske kiseline, posebno na dvostruko uvijeni deo nukleinske kiseline koji ima i 5’ kraj, kao i 3’ kraj ili ima ili 3’kraj ili 5’ kraj. Opcionalno, jedan od ta dva kraja, 5’ ili 3’ kraj može se upotrebiti za konjugovanje molekula Lmamca ili se može vezati za blokirajuću grupu, na primer za 3’-3’nukleotidnu vezu.
[0038] U konkretnom aspektu, oni imaju dva slobodna kraja i mogu biti linearni. Prema tome, molekul Lmamca može biti i dvostruko uvijeni molekul sa dva slobodna kraja i nukleotidnom sekvencom Lmamac32 (SEQ ID br. 1), Lmamac32Ha (SEQ ID br. 2), Lmamac32Hb (SEQ ID br.3), Lmamac32Hc (SEQ ID br.4), ili Lmamac32Hd (SEQ ID br.5).
[0039] U drugom konkretnom aspektu, oni imaju samo jedan slobodan kraj. Poželjno je da su molekuli Lmamca sačinjeni od nukleinske kiseline ukosnice sa dvostruko uvijenim DNK stablom i petljom. Petlja može biti nukleinska kiselina ili neke druge hemijske grupe poznate licu iz struke ili njihova mešavina. Nukleotidni veznik može da sadrži od 2 do 10 nukleotida, poželjno 3, 4 ili 5 nukleotida. Ne-nukleotidni veznici sadrže, između ostalog, abazni nukleotid, polietar, poliamin, poliamid, peptid, ugljovodonik, lipid, poliugljovodonik ili neka druga polimerska jedinjenja (npr., oligoetilen glikola kao što su oni koji imaju između 2 i 10 etilen glikolnih jedinica, poželjno 4, 5, 6, 7 ili 8 etilen glikolnih jedinica). Poželjan veznik se bira iz grupe koja sadrži heksaetilen glikol, tetraoksitimidilat (T4) i druge veznike kao što je 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-okso-nonadekan. Prema tome, u konkretnom aspektu, molekuli Lmamca može biti molekul ukosnice sa dvostruko uvijenim delom ili stablom koje sadrži najmanje 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ili 32 konsekutivna nukleotida Lmamca32 (SEQ br. 1), Lmamca32Ha (SEQ br. 2), Lmamca32Hb (SEQ br. 3), Lmamca32Hc (SEQ br.4) ili Lmamca32Hd (SEQ br. 5) i petljom koja je heksaetilen glikolni veznik, tetradeoksitimidilat veznik (T4) ili 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-oksononadekan. U konkretnijem aspektu, ti molekuli Lmamca mogu imati dvostruko uvijeni deo koji se sastoji od 20, 22, 24, 26, 28, 30 ili 32 konsekutivna nukleotida Lmamca32 (SEQ br.
1), Lmamca32Ha (SEQ br. 2), Lmamca32Hb (SEQ br. 3), Lmamca32Hc (SEQ br. 4) ili Lmamca32Hd (SEQ br.5).
[0040] Molekuli Lmamca poželjno sadrže 2’-deoksinukleotidnu kičmu, a neobavezno sadrže jedan ili nekoliko (2, 3, 4, 5 ili 6) izmenjenih nukleotida i/ili nukleobaza koje nisu adenin, citozin, guanin i timin. Prema tome, molekuli Lmamca su u suštini struktura DNK. Konkretno, dvostruko upleten deo ili stablo molekula Lmamca sačinjen je od doksiribonukleotida.
[0041] Poželjni molekuli Lmamca sadrže jedan ili nekoliko hemijski izmenjenih nukleotida ili grupa na kraju jedne ili svake niti, posebno da bi ih zaštitili od raspadanja. U posebno poželjnom aspektu, taj slobodan kraj/slobodni krajevi molekula Lmamca je/su zaštićeni jednim, dve ili tri izmenjene fosfodiestarske kičme na kraju jedne ili svake niti. Poželjne hemijske grupe, posebno ta izmenjena fosfodiestarska kičma, sačinjavaju fosforotioate. Alternativno, poželjni Lmamac ima 3’- 3’ nukleotidnu vezu, ili nukleotide sa metilfosfonatnom kičmom. Ostale izmenjene kičme su dobro poznate u struci i sačinjavaju fosforoamidate, morfino nukleinsku kiselinu, 2’-0,4’-C metilen/etilen premošćenu zaključanu nukleinsku kiselinu, peptidnu nukleinsku kiselinu (PNA), kao i alkilne, ili cikloalkilne interšećerne veze kratkog lanca ili heteroatomske ili heterociklične interšećerne veze kratkog lanca, ili bilo koje izmenjene nukleotide poznate stručnjaku. U prvom poželjnom aspektu, molekuli Lmamca imaju slobodan kraj(eve) zaštićen jednim, dva ili tri izmenjena fosfodiesterskim skeletima na kraju jedne ili svake niti, poželjnije sa tri izmenjena fosfodiestarska skeleta (konkretno fosforotioat ili metilfosfonat) najmanje na kraju 3’, ali još je poželjnije i na 5’ i na 3’ kraju.
[0042] U najpoželjnijem aspektu, molekul Lmamca je molekul ukosnice nukleinske kiseline koji se sastoji od dela dvostruko upletene DNK ili stabla od 32 bp (npr., sa sekvencom koja se bira iz SEQ ID br. 1-5, posebno SEQ ID br. 4) i petlje koja povezuje dve niti tog dela dvostruko upletene DNK ili stabla koje sadrži ili se sastoji od veznika izabranog iz grupe: heksaetilen glikol, tetraoksitimidilat (T4) i 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9okso-nonadekan, slobodnih krajeva dela dvostruko upletene DNK ili stabla (tj. na suprotnom kraju od petlje) koje ima tri izmenjene fosfodiestarske kičme (posebno fosforotioat internukleotidne veze).
[0043] Navedeni molekuli Lmamca dobijaju se hemijskom sintezom, polubiosintezom ili biosintezom, bilo koji postupkom amplifikacije, nakon čega sledi bilo koji postupak ekstrakcije i pripreme i bilo koja hemijska izmena. Veznici služe za to da bi se mogli uneti standardnom hemijskom sintezom nukleinske kiseline.
[0044] Poželjnije je da se molekuli Lmamca proizvode specijalno dizajniranom konvergentnom sintezom uz unošenje odgovarajućeg prekursor veznika i nakon prečišćavanja, oni se kovalentno spajaju.
Konjugovani molekuli Lmamca
[0045] Ovaj opis se odnosi na molekule Lmamca konjugovane u molekule koji olakšavaju endocitozu ili celularno preuzimanje.
[0046] Konkretno, ti molekuli mogu biti lipofilni molekuli kao što je holesterol, masne kiseline jednostrukog ili dvostrukog lanca, ili ligandi koji ciljaju ćelijski receptor i tako omogućavaju receptor posredovanu endocitozu, kao što su folna kiselina i folatni derivati ili transferin (Goldstein i sar. Ann. Rev. Cell Biol.19851:1-39; Leamon & Lowe, Proc Natl Acad Sci USA.
1991, 88:5572-5576.). Masne kiseline mogu biti zasićene ili nezasićene i mogu biti u C4-C28, poželjno u C14-C22, još poželjnije u C18 kao što je oleinska ili stearinska kiselina. Konkretno, masne kiseline mogu biti oktadecil ili dioleoil. Masne kiseline se nalaze u obliku dvostrukog lanca vezanog odgovarajućim veznikom kao što su glicerol, fosfatidil holin ili etanol amin ili mogu biti vezane zajedno veznicima koji prijanjaju za molekul Lmamca. Izraz „folat“ je ovde upotrebljen da označi folat i folatne derivate, uključujući derivate i analoge pteroične kiseline. Ti analozi i derivati folne kiseline pogodne za primenu u sadašnjem opisu uključuju antifolate, dihidrofolate, tetrahidrofolate, folinsku kiselinu, pteropoliglutaminsku kiselinu, 1-deza, 3-deaza, 5-deaza, 8-deaza, 10-deaza, 1,5-deaza, 5,10 dideaza, 8,10-dideaza, i 5,8-dideaza folate, antifolate i derivate pteroične kiseline. Dodatni analozi folata opisani su u US2004/242582. Molekul koli olakšava endocitozu može biti tokoferol, šećer kao što je galaktoza i manoza i njihovi oligosaharidi, peptid kao što su RGD i bombezin, kao i proteini kao što je integrin. Prema tome, molekul koji olakšava endocitozu može se birati iz grupe koja sadrži masne kiseline jednostrukog ili dvostrukog lanca, folate i holesterol. Poželjnije je da se molekul koji olakšava endocitozu bira iz grupe koja sadrži dioleoil, oktadecil, folnu kiselinu i holesterol. U najpoželjnijoj realizaciji pronalaska, molekul Lmamca se konjuguje u holesterol.
[0047] Molekuli koji olakšavaju endocitozu se konjuguju u molekule Lmamca, poželjno preko veznika. Bilo koji veznik poznat u struci može se koristiti za kovalentno priključivanje molekula koji olakšava endocitozu za molekule Lmamca. Na primer, WO09/126933 donosi jedan širi pregled pogodnih veznika, strane 38-45. Veznik može biti, između ostalih, alifatski lanac, polietar, poliamin, poliamid, peptid, ugljeni hidrat, lipid, poliugljovodonik ili druga polimerna jedinjenja (npr., oligoetilen glikoli kao što su oni koji imaju između 2 i 10 etilen glikolnih jedinica, poželjno 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 etilen glikolnih jedinica, još poželjnije 6 etilen glikolnih jedinica), kao i unošenje veza koje se mogu razložiti hemijski ili enzimatski, na primer, disulfidna veza, zaštićena disulfidna veza, veza labilna u prisustvu kiseline (npr., hidrazonska veza), estarska veza, orto estarska veza, fosfonamidna veza, peptidna veza koja se može biološki cepati, azo veza ili aldehidna veza. Ovi veznici koji se mogu cepati detaljno su opisani u WO2007/040469 strane 12-14, u WO2008/022309 strane 22-28.
[0048] U jednom konkretnom aspektu, molekul Lmamca može biti vezan za jedan molekul koji olakšava endocitozu. Alternativno, nekoliko molekula koji olakšavaju endocitozu (npr., dva, tri ili četiri) mogu se prikačiti za jedan molekul Lmamca.
[0049] U jednom konkretnom aspektu, veznik između molekula koji olakšava endocitozu, konkretno holesterola, i molekula Lmamca je CO-NH-(CH2-CH2-O)n, gde je n ceo broj od 1 do 10, poželjno je da se n bira iz grupe koja se sastoji od 3, 4, 5 i 6. U jednom vrlo konkretnom aspektu, veznik je CO-NH-(CH2-CH2-O)4 (carboksamido trietilen glikol). Ovaj veznik se može vezati za molekule Lmamca na bilo kom pogodnom mestu koje ne menja aktivnost tih molekula Lmamca. Konkretno, ovaj veznik se može vezati za 5’ kraj, za 3’ kraj ili u petlji kada je taj molekul Lmamca ukosnica. Međutim, u slučaju kada je molekul Lmamca ukosnica, pronalazači su bili iznenađeni kada su otkrili da je holesterol vezan za molekul Lmamca preko veznika na njegovom 5’ kraju efikasniji od holesterola vezanog za molekul Lmamca preko veznika u petlji. Prema tome, u poželjnom aspektu, zamišljeni konjugovani molekul Lmamca je molekul Lmamca koji ima strukturu ukosnice i koji je konjugovan u molekul koji olakšava endocitozu, poželjno preko veznika na 5’ kraju.
[0050] U drugom konkretnom aspektu, taj veznik između molekula koji olakšava endocitozu, konkretno holesterola, i molekula Lmamca je dialkil disulfid {npr., (CH2)p-S-S-(CH2)q gde su p i q celi brojevi od 1 do 10, poželjno od 3 do 8, na primer 6}.
[0051] U najpoželjnijem aspektu, konjugovani molekul Lmamca je molekul ukosnice nukleinske kiseline koji sadrži deo dvostruko upletene DNK ili stablo od 32 bp (npr., uz sekvencu selektovanu iz grupe koja se sastoji SEQ ID br. 1-5, konkretno SEQ ID br. 4) i petlju koja povezuje dve niti tog dela dvostruko upletene DNK ili stablo koje sadrži ili se sastoji od veznika koji se bira iz grupe: heksaetilen glikol, tetradeoksitimidilat (T4) i 2,19bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-okso-nonadekan, pri čemu slobodni krajevi tog dela dvostruko upletene DNK ili stabla (tj. na suprotnom kraju petlje) imaju tri izmenjene fosfodiestarske kičme (konkretno, fosforotioat internukeotidne veze) a navedeni molekul Lmamca je konjugovan u holesteron na njegovom 5’ kraju, poželjno preko veznika (npr., karboksamidooliegoetilen glikol, poželjno karboksamidotrietilen glikol).
[0052] Ovaj konjugovani molekul Lmamca ili molekul ukosnice nukleinske kiseline može se još opisati i formulom:
gde je N nukleotid, n ceo broj veći od 14, podvučeno N se odnosi na nukleotid koji ima ili nema izmenjenu fosfodiestarsku kičmu, L’ je veznik, C je molekul koji olakšava endocitozu, L je veznik, m je ceo broj, 0 ili 1. Poželjno je da se podvučeno N odnosi na nukleotid koji ima izmenjenu fosfodiestarsku kičmu. U formuli (II), C je vezano za 5’ kraj, a Lm za 3’ kraj nukleotida. U formuli (II), C-Lm je poželjno vezano za L’ preko disulfidne veze (S-S).
[0053] U poželjnim aspektima, molekul iz formule (II) ima jednu ili nekoliko sledećih karakteristika:
- N je deoksinukleotid, poželjno selektovan iz grupe koja se sastoji od A (adenin), C (citozin), T (timin) i G (guanin) a izabran je tako da se izbegne javljanje CpG dinukleotida i da se dobije 80% ili 70%, čak 60% ili 50% manji identitet sekvence od bilo kog gena u humanom genomu; i/ili,
- n je ceo broj od 15 do 195, poželjno od 19 do 95, poželjnije od 21 do 95, još poželjnije od 27 do 95. U jednom konkretnom poželjnom aspektu, n je 27; i/ili,
- podvučeno N se odnosid na nukleotid koji ima fosforotioatnu ili metilfosfonatnu kičmu, poželjnije fosfotioatnu kičmu; i/ili,
- vezani L’ se selektuje iz grupe koja sadrži heksaetilen glikol, tetraoksitimidilat (T4) i 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-okso-nonadekan; i/ili,
- m je 1, a L je karboksamido oligoetilen glikol, poželjnije karboksamido trietilen glikol; i/ili, - C se bira iz grupe koja sadrži holesterol, masne kiseline jednostrukog ili dvostrukog lanca kao što su oleinska kiselina ili stearinska kiselina, ili veznik (uključujući peptid, protein, aptamer) koja cilja na ćelijski receptor kao što je folat, kao transferin, poželjno je holesterol, oktadecil, dioleoil ili folat, poželjnije holesterol.
[0054] Poželjno je da je C-Lm trietilen glikol veznik (10-O-[1-propil-3-N-karbamoilholesteril]-trietilen glikol radikal.
[0055] U jednom poželjnom aspektu, konjugovani molekul Lmamca ili molekul ukosnice nukleinske kiseline ima sledeću formulu:
sa istom definicijom kao i formula (II) N, podvučenog N, n, L, L’, C i m.
[0056] U poželjnom aspektu, NNNN-(N)n-N sadrži najmanje 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 ili 32 konsekutivnih nukleotida Lmamca32 (SEQ ID br. 1), Lmamca32Ha (SEQ ID br. 2), Lmamca32Hb (SEQ ID br.3), Lmamca32Hc (SEQ ID br. 4) ili Lmamca32Hd (SEQ ID br. 5) ili se sastoji od 20, 22, 24, 26, 28, 30 ili 32 konsekutivna nukleotida Lmamca32 (SEQ ID br 1), Lmamca32Ha (SEQ ID br.2), Lmamca32Hb (SEQ ID br.3), Lmamca32Hc (SEQ ID br 4) ili Lmamca32Hd (SEQ ID br. 5). U jednom konkretnom aspektu, NNNN-(N)n-N sadrži ili se sastoji od Lmamca32 (SEQ ID br.1), Lmamca32Ha (SEQ ID br.2), Lmamca32Hb (SEQ ID br. 3), Lmamca32Hc (SEQ ID br. 4) ili Lmamca32Hd (SEQ ID br. 5), poželjnije od Lmamca32Hc (SEQ ID br.4).
[0057] Prema tome, konjugovani molekul Lmamca ili molekul ukosnice nukleinske kiseline može se selektovati iz grupe koja se sastoji od:
sa NNNN-(N)n-N = SEQ ID br.1
sa NNNN-(N)n-N = SEQ ID br.2
sa NNNN-(N)n-N = SEQ ID br.3
sa NNNN-(N)n-N = SEQ ID br.4
sa istom definicijom kao formule (I), (II) i (III) za L, L’, C i m.
[0058] U poželjnim aspektima, molekul iz formula (IIa), (IIb (IIc), (IId), i (IIe) ima jednu ili više sledećih karakteristika:
- podvučeni nukleotid odnosi se na nukleotid koji ima ili nema fosforotioatnu ili metilfosfonatnu kičmu, poželjnije nukleotid koji ima fosforotioatnu ili metilfosfonatnu kičmu, još poželjnije nukleotid koji ima fosfotioatnu kičmu i/ili,
- vezani L’ se bira iz grupe koja se sastoji od heksaetilen glikola, tetradeoksitimidilata (T4) i 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-okso-nonadekana; i/ili,
- m je 1, a L je karboksamido oligoetulen glikol, poželjnije karboksamido trietilen glikol; i/ili - C se selektuje iz grupe koja sadrži holesterol, masne kiseline jednostrukog ili dvostrukog lanca kao što su oleinska ili staerinska kiselina, ili veznik (uključujući peptid, protein, aptamer) koja cilja na ćelijski receptor kao što je folat, kao transferin, poželjno je holesterol, oktadecil, dioleoil ili folat, poželjnije holesterol.
[0059] Ppželjno, C-Lm ije trietilen glikol veznik (10-O-[1-propil-3-N-karbamoilholesteril]-trietilen glikol radikal.
[0060] U jednom konkretnom aspektu molekula Lmamca ili molekula ukosnice nukleinske kiseline iz formula (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) i (IIe), poželjno je da se L’ bira iz grupe koja se sastoji od heksaetilen glikola, tetradeoksitimidilata (T4) i 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-okso-nonadekana.
[0061] U konkretnom aspektu molekula Lmamca ili molekula ukosnice nukleinske kiseline iz formula (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) i (IIe), pri čemu je C holesterol, a C-Lm radikal.
[0062] U jednom poželjnom aspektu, konjugovani molekul Lmamca ili molekul ukosnice nukleinske kiseline bira se iz grupe koja se sastoji od (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) i (IIe), pri čemu je C-Lm radikal.
I gde je poželjno da se L’ bira iz grupe koja se sastoji od heksaetilen glikola, tetradeoksitimidilata (T4) i 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-okso-nonadekana.
[0063] U jednoj vrlo specifičnoj realizaciji pronalaska, molekul Lmamca ili molekul ukosnice nukleinske kiseline ima sledeću formulu:
gde je C-L m radikal
gde je L’ 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-okso-nonadekan, a podvučeni nukleotidi imaju fosfotioatnu kičmu. Prema tome, ovaj molekul ima sledeću strukturu, a mi ćemo se u delu sa primerima na nju pozivati kao na „koLmamac“.
[0064] Jedan od konjugara holesteril-Lmamac, pod nazivom DT01, je 64-nt oligodeoksiribonukleotid koji se sastoji od 32-nt niti čija je komplementarna sekvenca konektovana preko 1,19-bis(fosfor)-8-hidraza-2-hidroksi-4-oksa-9-okso-nonadekan veznika, pri čemu se holesteril tetraetilen glikol nalazi na 5’ kraju, a 3 fosforotioat internukleotidne veze nalaze na i na 5’ i na 3’ krajevima. Dakle, taj molekul formira intramolekularni dvostruki heliks ukosnice od 32 bp. Ova dvostruko upletena (ds) struktura DNK je od esencijalne važnosti za njenu biološku aktivnost i predstavlja aktivnu farmaceutsku supstancu (API). Molekularna formula natrijumove soli: C678H820N244Na65O392P65S6; Molekulska težina natrijumove soli: 22359.2 Da; Molekulska težina slobodne kiseline: 20931.4 Da. Ovaj molekul se može predstaviti i ovako:
[0065] Jedan veoma iznenađujući aspekt sadašnjeg obelodanjenja molekula sa formulom (II), (IIa), (IIb), (IIc), (IId) ili (IIe) je da, mada je za delovanje molekula Lmamca potrebno prisustvo najmanje jednog slobodnog kraja, molekul koji olakšava endocitozu vezan za 5’ kraj ne smanjuje to delovanje.
[0066] Prema tome, ovaj pronalazak se još odnosi na konjugovani molekul Lmamca, kao što je obelodanjeno napred, farmaceutsku formulaciju koja ga sadrži kao i, neobavezno, farmaceutski prihvatljiv nosač, konjugovani molekul Lmamca prema napred datom opisu za primenu u lečenju karcinoma, primenjen individualno ili u kombinaciji sa radioterapijom i/ili hemoterapijom antitumorskog agensa koji oštećuje DNK, kao što će biti opisano u nastavku teksta.
Terapija koja oštećuje DNK
[0067] Osim konjugovanih molekula Lmamca i endosomolitičkog agensa, ova terapija još može da sadrži i antitumorsku terapiju, poželjno terapiju DNK oštećujućim agensom ili radioterapiju. DNK oštećujuća terapija može biti radioterapija ili hemoterapija primenom DNK oštećujućeg antitumorskog agensa, ili neka njihova kombinacija.
[0068] Prekid DNK niti može se postići jonizovanim zračenjem (radioterapijom). Radioterapija uključuje Y zrake, X zrake i/ili direktnu primenu radioizotoma na tumorske ćelije. Druge radioterapije uključuju mikrotalase i UV zračenje. Ostali pristupi radijacionoj terapiji takođe se razmatraju u ovom pronalasku.
[0069] Ovaj DNK oštećujući agens poželjno se bira iz grupe koja se sastoji od inhibitora topoizomeraze I ili II, DNK unakrsnog veznika, DNK alkalinizujućeg agensa, antimetaboličkog agensa i inhibitora deobenih vretena.
[0070] Inhibitori topizomeraze I i/ili II uključuju etopozid, topotekan, kamptotecin, itinotekan, amsakrin, intoplicin, antracikline kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin i mitoksantron. Inhibitori topoizomeraze I i II uključuju intoplecin.
[0071] DNK unakrsni veznici uključuju cisplatin, karboplatin i oksaliplatin.
[0072] Antimetabolički agensi blokiraju enzime zadužene za sintezu nukleinske kiseline ili postaju ugrađeni u DNK, čime se dobija netačan genetski kod i dolazi do apoptoze. Neki od primera toga uključuju, bez ograničenja, antagoniste folne kiseline, analoge pirimidina, analoge purina i inhibitore adenozin deaminaze, a konkretnije, metotreksat, floksuridin, citarabin, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, fludarabin fosfat, pentostatin, 5-fluorouracil, gemcitabin i kapecitabin.
[0073] DNK oštećujući antitumorski agens može biti alkilinirajući agens uključujući, bez ograničenja, azotni iperit, derivate etilen amina, alkil sulfonate, nitrozoureu, metalne soli i triazene. Neki od primera toga su uramustin, hlormetin, ciklofosfamid (CYTOXAN(R)), Ifosfamid, melfalen, hlorambucil, pipobroman, trietilenmelamin, trietilentiofosforamin, busulfan, karmustin, lomustin, fotemustin, cisplatin, karboplatin, oksaliplatin, tiotepa, streptozocin, dakarbazin, kao i temozolomid.
[0074] Inhibitori deobenih vretena uključuju paklitaksel, docetaksel, vinorelbin, larotaksel (još nazvan i XRP9881; Sanofi-Aventis), XRP6258 (Sanofi-Aventis), BMS-184476 (Bristol-Meyer-Squibb), BMS-188797 (Bristol-Meyer-Squibb), BMS-275183 (Bristol-Meyer-Squibb), ortataksel (još nazvan IDN 5109, BAY 59-8862 or SB-T-101131 ; Bristol-MeyerSquibb), RPR 109881A (Bristol-Meyer-Squibb), RPR 116258 (Bristol-Meyer-Squibb), NBT-287 (TAPESTRY), PG-paklitaksel (još nazvan CT-2103, PPX, paklitaksel poliglumeks, paklitaksel poliglutamat ili Xyotax™), ABRAXANE® (još nazvan Nab-Paclitaxel ; ABRAXIS BIOSCIENCE), tesetaksel (još nazvan DJ-927), IDN 5390 (INDENA), taksopreksin (još nazvan dokosaheksanoična kiselina - paklitaksel ; PROTARGA), DHA-paklitaksel (još nazvan Taxoprexin®), kao i MAC-321 (WYETH). Videti još i prikaz Hennenfent & Govindan (2006, Annals of Oncology, 17, 735-749).
Karcinom ili tumori koje treba lečiti
[0075] Farmaceutske formulacije i proizvodi, kompleti ili kombinovani preparat opisani u ovom delu mogu se primeniti za lečenje karcinoma kod ispitanika.
[0076] Termini „karcinom“, „kancerski“ ili „maligni“ odnose se na ili opisuju fiziološko stanje sisara koje se obično karakteriše neregulisanim ćelijskim rastom. Primeri karcinoma uključuju, na primer, leukemiju, limfom, blastom, karcinom epitelijalnih ćelija i sarkom. Konkretniji primeri tih karcinoma su hronična mijeloidna leukemija, akutna limfoblastna leukemija, akutna limfoblastna leukemija pozitivna na Filadelfija hromozom (Ph+ ALL), karcinom skvamoznih ćelija, sitnoćelijski karcinom pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, gliom, gastrointestinalni karcinom, karcinom bubrega, karcinom jajnika, karcinom jetre, kolorektalni karcinom, karcinom endometrijuma, karcinom bubrega, karcinom prostate, karcinom štitne žlezde, neuroblastom, karcinom pankreasa, glioblastoma multiforme, karcinom grlića materice, karcinom želuca, karcinom mokraćne bešike, hepatom, karcinom dojke, karcinom debelog creva, i karcinom glave i vrata, karcinom želuca, tumor germinativnih ćelija, sarkom kod dece, sinonazalni limfom, multipli mijelom, akutna mijelogena leukemija (AML), hronična limoficitna leukemija, mastocitoza i bilo koji simptom koji prati mastocitozu.
[0077] "Leukemija" se odnosi na progresivna maligna oboljenja organa koji stvaraju krv i obično se karakteriše iskrivljenom proliferacijom i razvojem leukocita i njihovih prekursora u krvi i koštanij srži. Leukemija se obično klinički klasifikuje na osnovu (1) trajanja i karaktera bolesti – akutna ili hronična; (2) tipa zahvaćenih ćelija; mijeloidna (mijelogena), limfoidna (limfogena) ili monocitna; kao i (3) povećanja ili nepovećanja broja abnormalnih ćelija u krvi – leukemična ili aleukemična (subleukemična). Leukemija uključuje, na primer, akutnu nelimfocitnu leukemiju, hroničnu limfocitnu leukemiju, akutnu granulocitnu leukemiju, hroničnu granulocitnu leukemiju, akutnu promijelocitnu leukemiju, leukemiju T ćelija kod odraslih, aleukemsku leukemiju, leukocitemičnu leukemiju, bazofilnu leukemiju, leukemiju blastnih ćelija, goveđu leukemiju, hroničnu mijelocitnu leukemiju, leukemiju cutis, embrionalnu leukemiju, eozinofilnu leukemiju, Gross leukemiju, leukemiju vlasastih ćelija, hemoblastnu leukemiju, hemocitoblastnu leukemiju, histiocitnu leukemiju, leukemiju matičnih ćelija, akutnu monocitnu leukemiju, leukopeničnu leukemiju, limfatičku leukemiju, limfoblastičnu leukemiju, limfocitnu leukemiju, limfogenu leukemiju, limfoidnu leukemiju, leukemiju ćelija limfosarkoma, mastocitnu leukemiju, megakariocitnu leukemiju, mikromijeloblastnu leukemiju, monocitnu leukemiju, mijeloblastnu leukemiju, mijelocitnu leukemiju, mijeloidno-granulocitnu leukemiju, mijelomonocitnu leukemiju, Naegeli leukemiju, leukemiju plazma ćelije, plazmocitnu leukemiju, promijelocitnu leukemiju, leukemiju Riederovih ćelija, Schillingovu leukemiju, leukemiju matičnih ćelija, subleukemičnu leukemiju, kao i akutnu nediferenciranu leukemiju. U određenim aspektima, ovaj pronalazak obezbeđuje terapiju hronične mijeloidne leukemije, akutne limfoblastne leukemije i/ili akutne limfoblastne leukemije pozitivne na Filadelfija hromozom (Ph+ ALL).
[0078] Različiti karcinomi su takođe obuhvaćeni ovim pronalaskom, uključujući sledeće: karcinome epitelijalnih ćelija uključujući karcinom epitelijalnih ćelija mokraćne bešike (uključujući karcinom mokraćne bešike ubrzanog rasta i metastatski karcinom mokraćne bešike), dojke, debelog creva (uključujući kolorektalni karcinom), bubrega, jetre, pluća (uključujući sitroćelijski i nesitnoćelijski karcinom pluća i adenokarcinom pluća), jajnika, prostate, testisa, urogenitalnog trakta, limfatičkog sistema, rektuma, larinksa, pankreasa (uključujući egzokrinog pankreasa), ezofagusa, želuca, žučne kese, grlića materice, štitne žlezde i kože (uključujući karcinom skvamoznih ćelija); hematopoetske tumore limfoidne linije uključujući leukemiju, akutnu limfoidnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, limfom B-ćelija, limfom T ćelija, Hočkinov limfom, neHočkinov limfom, limfom vlasastih ćelija, histiocitni limfom, kao i Burketov limfom; hematopoetske tumore mijeloidne linije uključujući akutne i hronične mijelogene leukemije, mijelodisplastični sindrom, mijeloidnu leukemiju, kao i promijelocitnu leukemiju; tumore centralnog i perifernog nervnog sistema uključujući astrocitom, neuroblastom, gliom, kao i švanom; tumore mezenhimalnog porekla uključujuć i fibrosarkom, rabdomiosarkom, kao i osteosarkom; ostale tumore uključujući melanom, ksenoderma pigmentosum, keratoaktantom, seminom, tirodni folikularni karcinom, kao i teratokarcinom; melanom, neresektibilni maligni melanom u stadijumu III ili IV, skvamozni karcinom pluća, sitnoćelijski karcinom pluća, nesitnoćelijski karcinom pluća, gliom, gastrointestinalni karcinom, renalni karcinom, karcinom jajnika, jetre, kolorektalni karcinom, endomterijalni karcinom, karcinom bubrega, prostate, štitne žlezde, neuroblastom, karcinom pankreasa, glioblastom multiforme, cervikalni karcinom, karcinom želuca, karcinom mokraćne bešike, hepatom, karcinom dojke, karcinom epitelijalnih ćelija debelog creva, kao i karcinom glave i vrata, retinoblastom, karcinom creva, tumor germinativnih ćelija, karcinom kosti, tumori kosti, maligni fibrozni histiocitom kosti kod odraslih; maligni fibrozni histiocitom kosti kod dece, sarkom, pedijatrijski sarkom, sinonazalni limfom, neoplazme, neoplazma plazmatskih ćelija; mijelodisplatični sindromi; neuroblastom; tumor germinativnih ćelija testisa, intraokularni melanom, mijelodisplatični sindromi; mijelodisplsatična/mijeloproliferativna bolest, sinvijalni sarkom. Osim toga, poremećaji uključuju urtikariju pigmentozu, mastocitoze kao što je difuzna kutana mastocitoza, solitarni mastocitom kod ljudi, kao i mastocitom kod pasa i neke retke podtipove kao što je bulozna, eritrodermalna i teleangiekstatska mastocitoza, mastocitoza sa pratećim hematološkim poremećajem, kao što je mijeloproliferativni ili mijelodisplastički sindrom, ili akutna leukemija, mijeloproliferativni poremećaj udružen sa mastocitozom, mastocitna leukemija, uz druge karcinome. Drugi karcinomi su takođe uključeni u obim poremećaja uključujući sledeće: karcinom epitelijalnih ćelija, karcinom epitelijalnih ćelija mokraćne bešike, urotelijalni karcinom, karcinom dojke, debelog creva, bubrega, jetre, pluća, jajnika, pankreasa, želuca, cerviksa, štitne žlezde, testisa, posebno testikularni seminom, kao i kože; uključujući karcinom skvamoznih ćelija; gastrointestinalne stromalne tumore ("GIST"); hematopoetske tumore limfoidne linije, uključujući leukemiju, akutnu limfocitnu leukemiju, akutnu limfoblastnu leukemiju, limfom B-ćelija, limfom T-ćelija, Hočkinov limfom, ne-Hočkinov limfom, limfom vlasastih ćelija i Burketov limfom; hematopoetične tumore mijeloidne linije, uključujući akutnu i hroničnu mijelogenu leukemiju i promijelocitnu leukemiju; tumore mezenhimalnog porekla, uključujući fibrosarkom i rabdomiosarkom; druge tumore uključujući melanom, seminom, teratokarcinom, neuroblastom i gliom; tumore centralnog i perifernog nervnog sistema, uključujući astrocitom, neuroblastom, gliom, kao i švanome; tumore mezenhimalnog porekla, uključujući fibrosarkom, rabdomiosarkom, kao i osteosarkom; i druge tumore, uključujući melanom, ksenoderma pigmentosum, keratoaktantom, seminom, tiroidni folikularni karcinom, teratokarcinom, hemoterapijske refrektorne ne-seminomatozne tumore germinativnih ćelija, kao i Kapoši sarkom i bilo koju njihovu metastazu.
[0079] U poželjnom aspektu, karcinom je solidni tumor. Termin „solidni tumor“ naročito označava karcinom dojke, jajnika, debelog creva i uopšte GI (gastrointestinalnog) trakta, cerviksa, pluća, posebno sitnoćelijski karcinom pluća, kao i nesitnoćelijski karcinom pluća, karcinom glave i vrata, mokraćne bešike, prostate i Kapoši sarkom.
[0080] Farmaceutske formulacije i proizvodi, kompleti ili kombinovani preparati opisani u ovom pronalasku mogu biti korisni u inhibiciji rasta solidnih tumora tako što smanjuju volumen tumora sprečavajući metastatsko širenje tumora i rast ili razvoj mikrometastaza. Farmaceutske formulacije i proizvodi, kompleti ili kombinovani preparati opisani u ovom pronalasku posebno su pogodni za lečenje pacijenata sa lošom dijagnozom ili radio i hemorezistentnih tumora.
[0081] Pronalazači su testirali veliki broj različitih tumorskih tipova svakog tumora (uključujući melanome, glioblastome, karcinome epitelijalnih ćelija) iz ćelijskih linija i materijala pacijenata uzetog biopsijom. Više od 80% njih je dobro reagovalo na terapiju. Efikasnost je posebno primećena kod sledećih tumorskih tipova: melanoma, glioblastoma, karcinoma dojke, debelog creva, jetre i karcinoma glave i vrata.
[0082] U poželjnom aspektu, karcinom se može birati iz grupe: melanom, glioblastom, karcinom dojke, karcinom debelog creva, gastrointestinalni karcinom, karcinom jetre i karcinom glave i vrata.
Režim, doziranje i načini primene
[0083] Delotvorna doza svakog od kombinacionih partnera upotrebljenih u kombinovanom preparatu iz pronalaska može da varira u zavisnosti od konkretnog jedinjenja ili farmaceutske formulacije, načina primene, stanja koje se leči, težine stanja koje se leči. Prema tome, dozni režim kombinovanog preparata iz pronalaska bira se u skladu sa brojem faktora uključujući način primene i status pacijenta. Lekar, kliničar ili veterinar normalne stručnosti može lako odrediti i propisati delotvornu količinu jednog aktivnog sastojka potrebnu za sprečavanje, napredovanje ili suprotstavljanje bolesti. Optimalna preciznost u dostizanju koncentracije aktivnih sastojaka u opsegu koji pruža efikasnost bez toksičnosti zahteva režim zasnovan na kinetici dostupnosti aktivnih sastojaka u ciljnim mestima.
[0084] Način primene konjugovanih molekula Lmamca može biti oralan, parenteralan, intravenski, intratumorski, supkutani, intrakranijalni, intraarterijski, površinski, rektalni, transdermalni, intradermalni, nazalni, intramuskularni, intraperitonealni, kao i intraosealni. U poželjnom aspektu, konjugovani molekuli Lmamca treba da se daju ili injektuju u blizini tumorskog/tumorskih mesta koje se leče.
[0085] Način primene DNK-oštećujućeg antitumorskog agensa može biti oralni, parenteralan, intravenski, intratumorski, supkutani, intrakranijalni, intraarterijski, površinski, rektalni, transdermalni, intradermalni, nazalni, intramuskularni, intraosealni.
[0086] Kada se započne lečenje radioterapijom ili DNK-oštećujućim antitumorskim agensom, lečenje konjugovanim molekulima Lmamca može se trajati koliko god traje lečenje radioterapijom ili primenom DNK-oštećujućim antitumorskim agensom. Alternativno, lečenje konjugovanim molekulima Lmamca može se i prekinuti.
[0087] Kod konjugovanih molekula Lmamca, delotvorna doza DNK-oštećujućeg antitumorskog agensa primenjenog u kombinovanom preparatu, kompletu ili proizvodu iz pronalaska može da varira u zavisnosti od načina primene, stanja koje se leči ili težine stanja koje se leči. Prema tome, dozni režim konjugovanim molekulima Lmamca bira se u skladu sa brojem faktora uključujući način primene i status pacijenta. Lekar, kliničar ili veterinar normalne stručnosti može lako odrediti i propisati delotvornu količinu konjugovanih molekula Lmamca potrebnu za sprečavanje, sprečavanje napredovanja ili suprotstavljanje karcinomu, posebno u kombinaciji sa izabranom DNK-oštećujućom terapijom.
[0088] Na primer, kod lokalne primene (npr., kada se koristi intratumorska ili supkutana primena), efikasna količina konjugovanih molekula Lmamca je najmanje 0,01 mg po 1 cm<3>tumora, poželjno 0,1 - 40 mg po 1cm<3>tumora, najpoželjnije 1-20 mg po 1 cm<3>tumora. Ova efikasna količina može se davati u dnevnom terapijskom protokolu (npr., 5 dana nedeljno tokom 3 do 6 uzastopnih nedelja ili 3 puta nedeljno tokom 3 do 6 uzastopnih nedelja). Alternativno, efikasna količina od najmanje 0,1 mg po 1 cm<3>tumora, poželjnije 0,1 - 40 mg po 1 cm<3>tumora, najpoželjnije 1-20 mg po 1 cm<3>tumora, može se primeniti u nedeljnom terapijskom protokolu tokom 3-6 uzastopnih nedelja, na primer. Kada se koriste drugi putevi primene, stručnjak može prilagoditi tu količinu da bi dobio efikasnu količinu konjugovanih molekula Lmamca u tumoru od najmanje 0,01 mg po 1 cm<3>tumora, poželjno 0,1 - 40 mg po 1 cm<3>tumora, najpoželjnije 1-20 mg po 1 cm<3>tumora, konkretno u dnevnom terapijskom protokolu u nedeljnom terapijskom protokolu. Na primer, kod sistemske primene, efikasna količina ili pojedinačna doza konjugovanih molekula Lmamca može biti 0,1 do 100 mg, poželjno 4 do 40 mg. Prema tome, kod sistemske primene, efikasna količina ili pojedinačna doza konjugovanih molekula Lmamca može biti 0,06 do 0,6 mg/kg pacijenta. Naravno, doza i režim se mogu prilagoditi od strane stručnjaka uz razmatranje režima hemoterapije i/ili radioterapije.
[0089] Kod radioterapije, može se primeniti bilo koji režim radioterapije poznat u struci, posebno stereostatsko zračenje (npr., 15 Gy) ili frakconisano zračenje. Primena frakcionisanog zračenja može biti posebno efikasna, na primer zračenje se može primenjivati svakog dana ili svakih 2-5 dana, poželjno svaka 3-4 dana, tokom perioda od jedne, dve, tri, četiri, pet ili šest nedelja. Zračenje može biti od 1 do 10 Gy, poželjno od 2 do 5 Gy, konrektno 2, 3, 4 ili 5 Gy. Na primer, može se razmišljati o frakcionisanom zračenju od 15x2Gy tokom 6 nedelja ili 4 do 6x5 Gy tokom dve nedelje. U poželjnom aspektu, razmatrana radioterapija je protokol sa 4 zračenja od po 5 Gy tokom dve nedelje. Ispitivani su i drugi režimi ili uslovi kombinovanih terapija karcinoma zračenjem i molekulima Lmamca i dokazano je da radiosenzibilizacija tumora primenom molekula Lmamca zavisi od doza molekula Lmamca, ali ne i od doza zračenja.
[0090] Kod hemoterapije, delotvorna doza DNK-oštećujućeg antitumorskog agensa upotrebljenog u kombinovanom preparatu, kompletu ili proizvodu iz pronalaska može varirati u zavisnosti od konkretnog primenjenog DNK-oštećujućeg antitumorskog agensa, načina primene, stanja koje se leči ili težine stanja koje se leči. Prema tome, dozni režim DNK-oštećujućim antitumorskim agensom bira se u skladu sa brojem faktora uključujući način primene i status pacijenta. Lekar, kliničar ili veterinar normalne stručnosti može lako odrediti i propisati delotvornu količinu DNK-oštećujućeg antitumorskog agensa potrebnu za sprečavanje, sprečavanje napredovanja ili suprotstavljanje karcinomu.
[0091] Terapija može da se sastoji od jednog ili nekoliko ciklusa, na primer, dva do deset ciklusa, konkretno, dva, tri, četiri ili pet ciklusa. Ti ciklusi mogu biti kontinualni ili razdvojeni. Na primer, svaki ciklus je razdvojen od drugog za jednom do osam nedelja, poželjno tri do četiri nedelje.
Primeri
Višeskalno poređenje distribucije i delovanja DNK (Lmamac) kombinovane sa polietileniminom (PEI) ili vezane za holesterol.
Karakterizacija kompleksa Lmamac/vektor i ćelijsko preuzimanje
[0092] Pokazano je da PEI može da formira ne-kovalentne interpolielektrolitske komplekse sa DNK, oligonukleotidima i RNK. Dugi lanci PEI su veoma uspešni u genskoj transfekciji, ali su citotoksičniji. Pronalazači su ispitali nekoliko polipleksa čestica PEI sa Lmamcem i uporedili njihovu aktivnost sa Lmamcem kovalentno vezanim za holesterol (nazvan koLmamac). Ovaj koLmamac je bio molekul Lmamca kovalentno vezan za masni lanac holesterola koji je korišćen bez dodatnog vektora. Za svaki ispitani vektor, glavni cilj pronalazača bio je da se razvije formulacija sa najhomogenijom distribucijom veličine čestice pri najvećoj koncentraciji Lmamca. Prečnik i površinski naboj tih čestica mereni su dinamičkim rasprostiranjem laserskog svetla (DLS). Primenom multimodalne analize, pronalazači su otkrili da je razgranata PEI (bPEI25K) sa prosečnom veličinom od 25Kd i linearna PEI sa 22Kd (PEI22K) ili 11Kd (PEI11K) formirala sa Lmamcem komplekse sličnih svojstava (Tabela 1).
Tabela 1. Fluorscentno i celularno preuzimanje formulisanog Lmamca
[0093] Ispitani su različiti odnosi PEI na Lmamcu. Najniži odnos koji je dao 100% kompleks Lmamca određen je gel šift probom. Odnos N/P od 6, 6 i 9 odnosio se na PEI11K, PEI22K, odnosno bPEI25K za dalje studije. Čestice kompleksa Lmamac/PEI bile su stabilne u vremenu od 1 sata u 10% saharoze. Visoko homogena morfologija sfernih čestica u ovoj populaciji (veličina varira od 125 do 140 nm) bila je potvrđena transmisionom elektronskom mikroskopijom (slika 1A). Prisustvo soli u puferu za rastvaranje koncentracije koja je prelazila 0,8 mg/mL, ili produženo čuvanje, dovelo je do nagomilavanja PEI kompleksa. Superfekt kompleksi (60 mg Superfekt/mg Lmamca) koji su dali veće i polidisperzne grudvice (>2 mm) upotrebljeni su kao pozitivna kontrola. Nepromenjeni amfifilni kopolimer Lutrol dije formirao stabilan interreagujući kompleks sa Lmamcem i korišćen je kao negativna kontrola u nekim eksperimentima.
[0094] Pronalazači su pratili celularno preuzimanje različitih kompleksa primenom fluorescentnog cy3-modifikovanog Lmamca. Početna fluorescencija od cy3-Lmamac kompleksa praćena je odmah nakon transfekcije. U PEI kompleksima, fluorescencija Lmamca bila je 2 do 3 puta smanjena, što ukazuje na to da bi sabijanje molekula sa PEI moglo da gasi fluorescenciju /Tabela 1). koLmamc je takođe bio manje fluorescentan od samog Lmamca, što ukazuje na to da bi holesterol mogao da stupi u interakciju sa cijaninom na samom molekulu. Superfekt ili Lutrol nisu uticali na fluorescenciju. Ćelijski sadržaj transfektovanih ćelija humanog fibroblasta meren je tečnom citometrijom. Distribucija fluorescencije u ćelijama tretiranim samo sa Lmamcem ili sa mešavinom Lmamac-Lutrol nije se razlikovala od netretirane kontrole, što ukazuje na to da molekuli Lmamca nisu spontano ulazili u ćelije. Elektroporacija je bila relativno neefikasna, a povećanje koncentracije Lmamca nije poboljšalo efikasnost transfekcije. Svi polikatjonski polimeri (PEI i superfekt) su promovisali efikasno ćelijsko preuzimanje, ali su linearni PEI pokazali širu distribuciju od kompleksa Lmamac/superfekt ili Lmamac/PEI25K. koLmamac je ulazio u ćeliju bez pomoći faktora transfekcije, ali uz 10 puta manju efikasnost od Lmamac/PEI. Povećanje koncentracije koLmamca za 10-15 puta omogućilo je efikasnu transfekciju (slika 1B).
[0095] Jedno ograničenje efikasnosti DNK transfera je retencija endozoma koja je sprečava da stupi u interakciju sa svojim ciljem ili da bude transkribovana. U ćeliji, DNK mora da pobegne od normalnih endozomalnih puteva, što dovodi do raspadanja. Prema tome, efikasnost isporuke DNK je u korelaciji ne samo sa ćelijskim preuzimanjem, već i sa destabilizacijom i begom od endozoma. Poznato je da PEI ima visok puferski kapacitet koji olakšava otpuštanje DNK sa endozoma i lizozoma („hipoteza protoskog sunđera“). Nasuprot tome, koLmamac će tražiti pomoć od fuzogenih agenasa kao što je hlorokvin (CQ) da bi se uspešno oslobodio sa endozoma. Sa ciljem poboljšanja efikasnosti transfekcije, mi smo dodali 100 µM CQ ćelijama pola sata pre transfekcije. CQ je povećao za 24 puta ćelijsko preuzimanje koLmamca (slika 1). Količina Lmamca oslobođenog u ćeliji praćena je aktivacijom DNK-PKcs kinaze podstaknutim svojim vezivanjem za molekule Lmamca (Quanz i sar., 2009, supra). Dodavanje holesterola nije uticalo na sposobnost Lmamca da aktivira prečišćeni DNK-PK (slika 2A). U ćeliji, aktivacija DNK-PKcs kinaze praćena je količinom H2AX fosforilacije za koju se pokazalo da strogo zavisi od DNK-PK. I Lmamac/PEI, kao i koLmamac su indukovali H2AX fosforilaciju u tretiranim ćelijama (slika 2B). Razgranati i linearni PEI/Lmamac kompleksi su brzo podsticali H2AX fosforilaciju (slika 2C) koja je dostigla maksimum 6 sati nakon početka transfekcije i trajala 24 sata nakon transfekcije. Lmamac-indukovana aktivnost kinaze bila je vrlo niska posle elektroporacije u bilo koje vreme (slika 2). Visoke koncentracije koLmamca nisu bile dovoljne fosforilisanom H2AX, tako da je trebalo najmanje 24 sata da se dostigne maksimalna vrednost. Dodavanje CQ za vreme transfekcije je povećalo aktivaciju DNA-PKcs u transfektovanim ćelijama koLmamca do aktivacije postignute sa 10 puta manje Lmamca/PEI (slika 2C). CQ nije povećao aktivnost transfektovanih ćelija Lmamac/PEI, što ukazuje na to da se Lmamac uspešno oslobađa iz endozoma kada je u kompleksu sa PEI. Pošto se ćelijsko preuzimanje Lmamca nije povećalo u periodu između 5 i 24 sata nakon transfekcije, spora aktivacija DNK-PK od strane koLmamca otkriva njegovo sporo oslobađanje iz endozoma.
Ćelijsko preuzimanje i ukupna toksičnost u mladim embronima zebrice
[0096] Analiza preuzimanja i aktivnosti Lmamca na ćelijske kulture ne omogućava zaključak o difuziji leka, ćelijskom preuzimanju i aktivnosti u celom organizmu. Pronalazači su proučavali ovo pitanje injektovanjem Lmamac-cy3 ili samog ili sa adjuvantom, u ćelijski prostor 1000 embriona zebrice u ćelijskoj fazi (faza 1K) (Kimmel i sar., 1995, Dev Dyn 203:253-310). Ovaj protokol je omogućavao in vivo posmatranje konfokalnim mikroskopom distribucije Lmamca-cy3 na ćelijskom i subćelijskom nivou, kaoi njegovu aktivnost na brzo deleće ćelije ranog embriona zebrice. Sam Lmamac-cy3 injektovan u životinjski pol embriona u stadijumu 1K brto se rasprostirao kroz ceo blastoderm i 15 minuta nakon injekcije nije se više mogao da detektuje. Dodavanjem Lutrola omogućeno je zadržavanje Lmamca u ekstracelularnom prostoru oko mesta injekcije, ali se nije olakšalo ćelijsko preuzimanje. U prisustvu Superfakt ili PEI, primećene su brojne fluorescentne mrlje unutar ćelija, što ukazuje na uspešno ćelijsko preuzimanje. KoLmamac cy3 je pokazao drugu vrstu ponašanja sa jakim i stalnim prebojavanjem plazmatske membrane zajedno sa mrljastom intracelularnom fluorescencijom. Inkubacija embriona sa CQ pre injektovanja pretvarala je te velike koLmamac fluorescentne mrlje u difuznu intracelularnu distribuciju.
[0097] Posmatranje fenotipskih efekata 20 sati posle injektovanja omogućilo je procenu aktivnosti Lmamca i tretiranje celokupne toksičnosti. Fluorescencija Lmamca detektovana je 24 sata nakon injekcije u ćelijama glave larvi (slike 3A-C), koja je, prema mapi razvoja zebrice (Woo i sar., 1995, Curr Opin Genet Dev 5:439-443) poticala od injektovanog prostora na životinjskom polu pregastrulacionog embriona. Injektovanje Lmamca bez adjuvanta (NA) ili u kombinaciji sa Lutrolom (Lu) nije pokazalo dejstvo na razvoj (slika 3D), što je u korelaciji sa lošim ćelijskim preuzimanjem Lmamca (kao što je gore opisano). Dodavanje adjuvanta dovelo je do ćelijske smrti u glavi i, u skladu sa injektovanom količinom, mogla se zapaziti ekstenzivna ćelijska smrt i teratogeneza. 24-časovni fenotipovi su kategorisani kao što je opisano (slika 3) omogućavajući kvantifikaciju toksičnosti injektovane mešavine. Za istu koncentraciju Lmamca, javile su se jasne razlike, u smislu ćelijske smrti i kasnijih razvojnih anomalija, u zavisnosti od adjuvanta. Dodavanje superfakta (sup) bilo je veoma toksično za ćelije embriona, a ekstenzivna ćelijska smrt u ranim fazama imala je za posledicu visoki procenat fenotipova tipa 2. Slično tome, dodavanje PEI (25K, 22K, 11K) se pokazalo toksičnim za blastomere zebrice. Mada manje efikasna od dodavanja PEI, injekcija koLmamca rezultovala je znatnom smrti ćelija. Prethodna inkubacija embriona sa CQ nije povećala toksičnost u značajnoj meri. Sve u svemu, ćelijska smrt ranih embriona i kasnije razvojne anomalije bili su brz i pouzdan protokol za procenu ukupne toksičnosti Lmamca+/- adjuvant za embrione zebrice. Korelacija ćelijske smrti uz ćelijsko preuzimanje ukazalo je na to da antitumorska aktivnost Lmamca na ćelije embriona može imati važnu ulogu u nastanku toksičnog efekta.
Lokalna i sistemska toksičnost kod miševa
[0098] Za procenu doslednosti ćelijske kulture, podataka za embrione zebrice i miševa, pronalazači su analizirali podnošljivost kože golih miševa na ponovljenu primenu Lmamca/PEI1K, Lmamca /PEI22K, Lmamca /bPEI25K, kao i ko Lmamca. Toksičnost različitih fomulacija Lmamca analizirana je 3 dana nakon supkutane (SC) injekcije. Svi Lmamac/PEI su pokazali visoku toksičnost u injekcijama koje su podnošene u koncentraciji od 3,75 mg/kg, ali se počelo sa 5 mg/kg da se pokrene lokalna inflamacija udružena sa nekrozom i ishemijom koja je brzo nestala sa prestankom tretmana. Toksičnost intravenske (IV) primene dala je slične rezultate: intravenska primena Lmamac/PEI bila je letalna u koncentraciji od 3 mg/kg, pri čemu je smrt nastupila za vreme injektovanja, verovatno zbog zgrušavanja krvi. Spora injekcija perfuzijom (0,4 ml/mn) povećala je podnošljivost Lmamca/PEI do 6 mg/kg (6 nmola/injekciji) potvrđujući da je IV toksičnost uglavnom nastala zbog lokalne koncentracije na mestu primene bolusa. koLmamac sa ili bez CQ nije pokazao bilo kakvu toksičnost u svim ispitanim dozama (do 800 mg/kg/injekciji; 800 nmola/injekciji) bez obzira na način primene: SC, IV bolus ili IV perfuzija.
Antitumorska aktivnost kod ksenograftovanih tumora
[0099] Antitumorsko dejstvo formulisanog Lmamca ispitivano je u kombinaciji sa radioterapijom na SK28 ksenograftovanim melanomima. Lmamac/vektor kompleksi su primenjivani 5 sati pre zračenja intratumorskom injekcijom.
[0100] Mada je primena intratumorskom injekcijom (IT) korišćena u mnogim ispitivanjima, za sada se savetuje da ovaj način primene izbegava u kliničkim procenama. Pronalazači su istraživali kako bi se Lmamac/PEI11k ili koLmamac mogli primenjivati supkutanom injekcijom (SC) u mesto u blizini tumora. U nekoliko kliničkih proba je uspešno primenjen ovaj način primene. Pronalazači su prvo uporedili difuziju molekula u tumorima tretiranim jednom intratumorskom injekcijom ili dvema supkutanim injekcijama datim na suprotnim stranama tumora (slika 4). Fluorescentni Lmamac u kompleksu sa PEI11k imao je tendenciju da formira grudvice na mestu injekcije i rogresivno se rasprostirao do ivice tumora. Nasuprot tome, koLmamac je pokazao ravnomerniju distribuciju oko injekcije, bez obzira da li je ona data u tumor ili u njegovoj blizini. SC injekcije Lmamca/PEI11k ili koLmamca bile su malo manje efikasne od IT injekcija u smislu kontrole tumorskog rasta (tabela 2). Međutim, povećanje broja mesta injekcije trebalo bi da znatno poboljša kontrolu rasta tumora bez dodatne lokalne toksičnosti.
Tabela 2. Preživljavanje ksenograftovanih miševa posle zračenja udruženog sa različit
[0101] Proučavano je preživljavanje pet grupa golih miševa koji su nosili ksenograft SK28 melanoma. Grupa 1) netretirani miševi (n=16); Grupa 2 zračeni miševi (IR, n=12); Grupa 3 zračeni miševi uz intraperitonealnu primenu 1 mg hlorokvina (CQ, IR n=10); Grupa 4 miševi tretirani intratumoralnom injekcijom od 0,6 mg DT01 (još zvanog i koLmamac) i zračeni 5 sati nakon toga (DT01, IR, n=11); i Grupa 5 miševi prethodno tretirani intraperitonealnom injekcijom od 1 mg hlorokvina 2 sata pre intratumoralne injekcije od 0,6 mg DT01 (još zvanog i voLmamac) i zračeni 5 sata kasnije (DT01, CQ, IR, n=13).
[0102] Rezultati su prikazani na slici 5.
[0103] Uz 0,6 mg koLmamca primenjenog intratumoralno, ovaj predtretman hlorokvinom znatno je radiosenzitizovao i produžio preživljavanje (grupa 5) u odnosu samo na radioterapiju (grupa 2), dok ni koLmamac (grupa 4), ni CQ (grupa 3) nisu pokazali radiosenzitizaciju. Stepen radiosenzitizacije grupe 5 bio je sličan onome kod miševa tretiranih primenom 0,06 mg Lmamca formulisanog sa polietileniminom (PEI) u odnosu N/P=6.
[0104] Režim primene zasnovan na supkutanoj injekciji koLmamca takođe je ispitan na golim miševima koji su nosili ksenograft SK28 melanoma. Ovaj režim je shematski prikazan na slici 6. Ukratko, ovaj režim uključuje četiri tretmana kombinovana sa koLmamcem i zračenjem tokom dve nedelje. Konkretno, 4 mg koLmamca je supkutano injektovano u dva suprotna mesta na rastojanju od 5 mm od granice tumora. Osim toga, životinje su bile predtretirane primenom 1 mg hlorokvina (CQ) i dalje tretirane sa CQ u istoj dozi uz istovremeni tretman koLmamcem i zračenjem. Tumorski rast je procenjivan posle režima primene i rezultati su prikazani na slici 6.
[0105] Primećeno je da je najmanji tumorski rast bio posle istovremene primene koLmamca i zračenja uz hlorokvin nakon predtretiranja hlorokvinom. Osim toga, grupa koja je uz to tretirana hlorokvinom imala je homogenije rezultate nego one koje nisu imale tretman hlorokvinom.
Zaključak
[0106] U ovoj studiji, pronalazači su primenili jedan niz proba za vođenje razvoja protokola primene i formulisanja leka. Te probe su omogućavale poređenje različitih formulacija Lmamca pre sprovođenja pretkliničkih proba na miševima. Eksperimenti na ćelijama i embrionima zebrice vršeni su radi procene efikasnosti ćelijskog preuzimanja Lmamca, što je bio prvi korak u antitumorskom dejstvu leka i preduslov za izbor najpogodnijih protokola i formulacija za pretkliničke studije na sisarima. Ukupna toksičnost kod embriona zebrice nije bila u korelaciji sa toksičnošću kože miša ili posle sistemske injekcije. Konkretno, visoka toksičnost koLmamca kod embriona zebrice ukazivala je na to da je većina ćelija u kontaktu sa lekom verovatno umrla, dok koža miša nije pokazivala bilo kakvu reakciju na injekciju visokih doza koLmamca. Ova razlika ukazuje na to da je toksičnost kod mladih embriona zebrice pokazatelj osetljivosti tumora, a ne osetljivosti zdravog tkiva. Zapravo, pokazano je da su molekuli Lmamca specifično toksični za tumore, ali ne i za normalnu kožu (Quanz i sar., 2009, supra). Lmamac/PEI (5 µM) i koLmamac (50 µM) CQ koji je pokrenuo uporedivu aktivaciju DNA-PKc u ćelijskoj kulturi imali su slićan toksičan efekat na embrione zebrice (slika 3D) i pokazali značajnu antitumorsku aktivnost na tumore kod miševa (Tabela 2, slike 5 i 6). Ovo zapažanje je konzistentno sa osetljivošću na antitumorsku aktivnost ćelija embriona zebrice koje imaju iste karakteristične osobine kao i tumorske ćelije uključujući mitotski indeks i biološke i fenotipske crte. U skladu sa ovom hipotezom, pronalazači su nedavno dokazali antiproliferativnu aktivnost Lmamca direktnom intracelularnom injekcijom samog Lmamca u blastomere zebrice u stadijum od 1 i 16 ćelija.
[0107] PEI polimeri su bili među ispitanim adjuvantnim molekulima najefikasniji u stvaranju kompleksa Lmamca. Njihova primena je, ipak, bila ograničena njihovom toksičnošću za tkiva, kao i krvi. Lokalna toksičnost je delimično prevaziđena sporom primenom (perfuzijom) i deljenjem doze na dve injekcije u različita mesta. Ali, kovalentna kombinacija holesterola i Lmamca bila je najbolja alternativa za primenu Lmamca u ćelije bez dodatka adjuvanta. Zapravo, nedostatak toksičnosti u opsegu ispitivanih doza ukazuje na to da bi se moglo dokazati da je ovaj molekul koristan uprkos tome što su potrebne visoke doze za ispoljavanje antitumorskog dejstva. Doze od 3 nmola Lmamca/PEI, odnosno 30 nmola koLmamca po injekciji udvostručile su odlaganje tumorskog rasta indukovano samo zračenjem. Toksičnost obe ove formulacije (6 nmola i >800nmola) dala je relativni odnos efikasne/toksične doze od 0,5 za Lmamac/PEI11k i < 0,037 za koLmamac što ukazuje da je koLmamac veoma dobar kandidat za kliničko ispitivanje.
Materijali i metode
Lmamac i formiranje čestica
[0108] Molekuli Lmamca i koLmamca dobijeni su automatizovanom sintezom oligonukleotida iz čvrste faze od kompanije Eurogentec (Seraing, Belgija) ili Agilent Technologies Nucleic Acid Solution Division (Boulder, SAD) kao što je ranije opisano (Quanz i sar., 2009, supra). Oni su prečišćeni denaturisanjem reverzne faze pomoćui HPLC i/ili HPLC-IEX. Neki derivati Lmamca bili su obeleženi fluorofornim Cy3 (λekscitacija= 540 nm; λemisija= 560 nm) ili Cy5.5 (λekscitacija= X nm; λemisija= X nm). Linearni PEI (11kDa i 22kDa) bili su od Polyplus-Transfection (Illkirch, Francuska) dobijeni kao već pripremljen rastvor sa sadržajem od 300 mM azota. Razgranati bPEI25k nabavljen je od SIGMA-Aldrich (Saint Quentin, Francuska). Lutrol je nabavljen od In Cell Art (Nantes, Francuska). Rastvori Lmamca i PEI (osnovni rastvor PEI) bili su razblaženi u 10% saharoze ili 150 mM NaCl (za in vitro eksperimente transfekcije) da se dobiju različiti odnosi vektora i Lmamca. Odnos PEI/Lmamac (ili dnos N/P) određen je na osnovu količine amin azota u PEI i fosfata u Lmamcu. Obično su za 300 µl kompleksa u koncentraciji od 0,6 mg/mL i N/P 6, Lmamac (180 µg, 0,54 mmol fosfata) i željena količina rastvora polimera (11,4 mL PEI osnovnog rastvora sadrži 0,3 mmol amin azota) bili, svaki od njih, rastvoreni u 150 µL (10% saharoze). Čestice Superfect/Lmamac bile su pripremljene prema uputstvima proizvođača (Qiagen, Courtaboeuf, Francuska) u odnosu 10 µl Superfect po µg DNK. Kompleksacija vektor/Lmamac analizirana je metodom elektroforeze na agar gelu. Uzorci (18 µL) bili su pomešani sa bromofenol plavim (1 µL), a zatim naneti na agar gel u komori za elektroforezu koja sadrži TAE pufer 1X (40mM Tris-acetat, pH 8,3, 1 mM EDTA). Gel je izložen struji od 100 volti tokom 30 minuta. Zatim je obojen etidijum bromisom (EtBr) tokom 15 minuta i trake su posmatrane pod UV svetlom.
Ćelijska kultura, molekuli Lmamca i transfekcija
[0109] Molekuli Lmamca dobijeni su automatizovanom sintezom oligonukeotida čvrste faze. Sekvenca je sledeća: 5’-GCTGTGCCCACAACCCAGCAAACAAGCCTAGA-(H)-TCTAGGCTTG TTTGCTGGGTTGTGGGCACAGC (SEQ ID br. 4), gde je H heksaetilen glikol veznik. Studije ćelija u kulturi vršene su primenom SV40 transformisanih fibroblasta MRC-5. Ćelije su gajene na 37°C u jednoslojnim kulturama u kompletnoj DMEM (Gibco, Cergy Pontoise, Francuska) uz 10% FCS i antibiotike (100 µg/mL streptomicina i 100 µg/mL penicilina) u uslovima 100% vlažnosti, 95% vazduha i 5% CO2. Ako nije drugačije definisano, transfekcije su vršene u 1,2mL MEM podloge bez seruma na pločama prečnika 60 mm. Transfekcija primenom jetPEI (Poliplus-transfekcija, Illkirch, Francuska) vršena je pri odnosu N/P od 6 u skladu sa uputstvima proizvođača. Ukratko, Lmamac je razblažen u 150 mM NaCl i blago mešan sa jednakom zapreminom PEI u 150mM NaCl i dodat u DMEM podlogu bez seruma. KoLmamac je direktno dodat u DMEM podlogu bez seruma. Transfekcija molekula Lmamca vršena je pomoću reagensa Superfect u 1,2 mL podloge DMEM sa serumom (u pločama prečnika 60 mm) tokom 5 sati, a zatim su ćelije ostavljene da se regenerišu tokom 1 sata, ukoliko se ne definiše drugačije. Za elektroporaciju je bilo transfektovano 1,2X10<6>ćelija sa 2 µg Lmamca pomoću Gene Pulser II (Bio-Rad, MarneslaCoquette, Francuska). Na kraju 5-časovne transfekcije (nulto vreme), podloga je zamenjena kompletnom podlogom i ćelije gajene tokom navedenog vremena nakon čega su analizirane. Hlorokvin (50 µM) je dodat 30 minuta pre transfekcije.
Protočna citometrija
[0110] Ćelije su transfektovane sa različitim kompleksom sa Lmamcem-cy3 tokom 5 sati i ostavljene da rastu 5 ili 24 sata, brzo oprane sa PBS. Ćelije su brzo analizirane protočnom citometrijom. Za detekciju imunofluorescencije protočnom citometrijom, ćelije su bile fiksirane u 2% paraformaldehida tokom 10 minuta pre imunodetekcije. Treba imati u vidu da je tretman permeavilizacije uklonio večinu Lmamca koji je ometao detekciju imunofluorescencije i detekciju Lmamca na istoj ćeliji. Ćelije su bile fiksirane tokom 15 minuta u 4% formaldehida, permeabilisane u 0,2% Triton X-100 tokom 1 sata, blokirane sa 2% BSA i inkubirane sa primernim antitelom tokom 2 sata na ledu sa mišjim monoklonalnim antitelima anti γ-H2AX (Upstate Biotechnology, Temecula, CA, SAD) i otkrivene sekundarnim antitelima konjugovanim sa Alexa-488 (Molecular Probes, Eugene, OR, SAD), Texas Red (Rockland, Gilbertsville, PA, SAD) u razblaženju od 1/200 tokom 30 min na sobnoj temperaturi. Ćelije su bile oprane sa PBS i resuspendovane u PBS sa 50 µg/mL jodid propidijumom, 25U/ml RNaseA. Ćelije su analizirane FACScalibur protočnim citometrom (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, SAD), a podaci analizirani primenom BD CellQuest Pro (BD Biosciences) i slobodnim WinMDI 2.8 (Scripps Research Institute, La Jolla, CA, SAD) softverom.
Galenje zebrica, uzimanje i tretiranje embriona
[0111] Jaja zebrice su dobijena prirodnim mređćenjem divljih ili transgeničnih (βactin:egfpras) ribljih linija.
Za injektovanje Lmamca u ćelijskom stadijumu 1K upotrebljen je Narishige (MN 153) mikromanipulator fiksiran za disekcioni mikroskop sa epifluorescentnim osvetljenjem (Leica MZ16F) i injektorom (Eppendorf FemtoJet). Stakleni kapilari (Harvard Apparatus GC100-10) bili su izvučeni pomoću KopF vertikalnog uređaja za izvlačenje pipete (KopF 720) da se dobiju injekcione igle. Količine od 2 do 5 nl rastvora Lmamca injektovane su u životinjski pol embriona u ćelijskom ciklusu 10 i odmah obrađeni snimanjem konfokaln im laserskim skenirajućim mikroskopom (vertikalni Leica SP2) sa 40x/0.8 NA sočivom za snimanje pod vodom. Snimanje je urađeno istovremenom ekscitacijom 480nm (eGFP) i 561 nm (cy3). Embrioni su dalje gajeni na 28,5°C do 24 h posle fertilizacije. Jednodnevne larve su posmatrane pod disekcionom stopom, a fenotipovi su kategorisani kao što je prikazano na slici 3. Tretman hlorokvinom pre injektovanja sastojao se od 2 sata inkubacije u embrionskoj podlozi (The Zebrafish Book) sa 50 µM hlorokvina. Lmamac (koLmamac)-cy3 50 µM je injektovan ili sam ili u kombinaciji sa PEI25K (odnos N/P=9), PEI11K(odnos N/P=6), Superfect (10 ml/1 µg Lmamca).
Lmamac i tretman zračenjem kod miševa
[0112] SK28 ili U87G ksenograft tumori dobijeni su injektovanjem 106 tumorskih ćelija u bok ženki golih miševa (Charles River soj; L’arbresle, Francuska). Životinje su bile smeštene u laboratoriji najmanje jednu nedelju pre početka eksperimenata. Bilo je 5-6 životinja po kavezu u kontrolisanom uslovima smenjivanja dana i noći (12h:12h), relativne vlažnosti (55%) i temperature (21°C). Hrana i česmena voda su bile ad libitum. Posle približno 12 dana, kada su supkutani tumori imali 150-200 mm3, miševi su razdvojeni u homogene grupe od po najviše 12 i primali različite tretmane. Zračenje je vršeno u jedinici<137>Cs (0,5 Gy/min) sa zaštitom projektovanom da zaštiti oko dve trećine tela životinje. Doze su kontrolisane termoluminescentnom dozimetrijom. Ukupna doza od 30 Gy primenjena je u 6 sesija u intervalima od 3 sesije od 5Gy nedeljno tokom dve nedelje. Molekuli Lmamca pripremljeni su u 100 µL 10% saharoze kao što je već opisano za in vitro studije, samo što je PEI mešavina bila bez NaCl (Polyplus Transfection, Strasbourg, Francuska). Mešavine Lmamca inkubirane su tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi pre injektovanja. KoLmamac je razblažen u 10% saharozi u potrebnoj koncentraciji. Intratumorske injekcije indikovane količine Lmamca date su 5 sati pre svake sesije zračenja. Kontrolne životinje su bile tretirane sa 100 µL 10% glukoze prema protokolu za odgovarajuće probe. Veličina tumora je merena mikrometarskim zavrtnjem svaka tri dana i veličina izračunavana formulom (2 x dužina x širina<2>). Miševi su mereni svake nedelje kada su slikani i njihovi tumori. Iz etičkih razloga, životinje su žrtvovane kada su njihovi tumori dostigli 2 000 mm3. Ovaj kriterijum je u analizama preživljavanja dan uginuća. Lokalni Etički odbor za eksperimente sa životinjama (Orsay, Francuska) je odobrio sve eksperimente.
Statistička analiza
[0113] Deskriptivna analiza tumorskog odgovora rađena je za svaki tretman i svaki tip tumora. Dan 1 bio je dan prve sesije tretmana. Sve životinje su praćene tokom najmanje 150 dana. Srednji životni vek utvrđivan je metodom Kaplan-Meier. Tumorski rast (TGD) izračunavan je oduzimanjem srednjeg volumena tumora koji je četvorostruko vreme kontrolne grupe od volumena tumora koji je četvorostruko vreme svakog miša u svakoj terapijskoj grupi. Srednji TGD je izračunavan za svaku tretiranu grupu pojedinačnim merenjima. Krive ukupnog preživljavanja procenjivane su Kaplan-Meier metodom i upoređivane primenom neparametarskog LogRank testa, jer podaci nisu pratili normalnu distribuciju. Analiza je sprovedena pomoću statEL softvera (ad Science, Paris, Francuska). Globalni LogRank je prvo sproveden za svaku grupu sa istim tipom tumora. Zatim su tretmani Lmamcem bili upoređivani sa kontrolom koja nije primala lek. Broj životinja (n) i relativni rizik (RR), kao i p vrednost su prikazani na tabeli 2. Svi testovi su smatrani značajnim na nivou značajnosti od 0,05.
Fizikohemijska svojstva formulisanih čestica Lmamca
[0114] Veličina čestice vektor/Lmamac određivana je dinamskim rasprostiranjem svetla (DLS) na Zetasizer iz nano serije, (Malvern instruments, Paris, Francuska) sa sledećim kriterijumima: srednji viskozitet: 1,150 cP, indeks refrakcije: 1,45, ugao rsaprostiranja: 90°, temperatura: 25°C. Podaci su srednje vrednosti od 3-5 merenja po uzorku, pri čemu je svako merenje obuhvatilo prosek podataka 10-15 subtestova. Podaci su analizirani softverom za multimodalnu distribuciju brojeva koji dolazi sa instrumentom. Za zeta-potenciono merenje, čestice au razblažene u 10% saharoze/10 µM NaCl da se dobije finalna koncentracija Lmamca od 0,1 mg/mL, a kriterijumi merenja su bili: 3 merenja, srednji viskozitet: 1,054 cP, srednja dielektrična konstanta: 79, temperatura: 25°C.
Transmisiona elektronska mikroskopija
[0115] Uzorci za transmisionu elektronsku mikroskopiju bili su pripremljeni negativnim bojenjem uranil acetatom. Jedna kap uzorka (10 µL) stavljena je rešetku (formvar/ugljenik na bakru od 200 meša, AGAR scientific) i ostavljena 3 minuta pre uklanjanja viška tečnosti upijajućom hartijom. Zatim su kompleksi bojeni sa 10 µL vodenog uranil acetata (2 %) tokom 2 min, a višak uklonjen upijajućom hartijom. Posmatrano je pod Jeol JEM-100S elektronskim mikroskopom.
Referentni primeri: Alternativni konjugovani molekuli Lmamca
[0116] Alternativni konjugovani molekuli Lmamca pripremljeni su i opisani na sledeći način:
Conjugovani molekuli iz formule (IIe)
[0117]
sa
Referentni primeri: Konjugovani molekuli iz formule (Ie)
[0118]
sa
[0119] Aktivnost ovih alternativnih konjugovanih molekula Lmamca merena je preko inhibicije DNK od strane inhibicije PK kao što je prikazano prethodno (slika 7). Zapaženo je da konjugovani molekuli zadržavaju svoju aktivnost. Konkretno, konjugacija raznih lipida i liganada bilo na 5’ kraju ili u petlji ima mali uticaj na sposobnost tih molekula da pokrenu DNK-PK aktivnost.
[0120] Osim toga, njihova aktivnost je merena i na ćelijskim linijama, uz hlorokvin ili bez njega, preko određivanja količine H2AX fosforilacije kao što je prethodno opisano (slika 8). Zapaženo je kod ispitivanih konjugovanih molekula Lmamca da je njihova aktivnost veća uz prethodni tretman hlorokvinom. Osim toga, treba napomenuti da konjugacija holesterola na 5’ kraju iznenađujuće dovodi do delotvornijih molekula nego konjugacija holesterola u petlji ukosnice (videti 0902 u poređenju sa 0813 i 0815).
Ćelijsko preuzimanje konjugovanih molekula Lmamca
[0121] Ćelijsko preuzimanje Lmamca konjugovanog u holesterol, konkretno koLmamac, u poređenju sa Lmamcem je mereno od strane pronalazača protočnom citometrijom.
[0122] Rezultati su prikazani na sledećoj tabeli.
[0123] Protočna citometrijska analiza ćelijskog preuzimanja MRC5 ćelijske linije sprovedena je 5 sati nakon početka tretmana različitih transfekcionih stanja kao što je prikazano na tabeli. Svi nukleotidi su bili obeleženi cijaninom 3 (Cy3): Lmamac (Lmamac-Cy3), holesterol-Lmamac (0813)(koLmamac-Cy3) i siRNK usmerena na H2AX sa cijaninom 3 i holesterolom na 5’ i 3’ sens niti (ko_siRNK_H2AX: Cy3-5’-CAACAAGAAGACGCGAAUCTT-3’-holesterol (SEQ D No 6); 5’-GAUUCGCGUCUUCUUGUUGTT-3’ (SEQ ID br. 7). Kada je bilo indikovano, pre transfekcije je dodat 50 µM hlorokvin (CQ).
LISTA SEKVENCI
[0124]

Claims (9)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugovani molekul nukleinske kiseline sledeće formule:
  2. 2. Konjugovani molekul nukleinske kiseline sa jednom od sledećih formula:
    naznačen time što se podvučeni nukleotid odnosi na nukleotid koji ima ili nema fosforotioatni ili metilfosfonatni kostur, vezano L’ se bira iz grupe koja sadrži heksaetilenglikol, tetradeoksitimidilat (T4) i 2,19-bis(fosfor)-8-hidraza-1-hidroksi-4-oksa-9-okso-nonadekan; m je 1, L je karboksamido oligoetilen glikol, a C se bira iz grupe koja sadrži dioleoil, oktadecil, folnu kiselinu, tokoferol i holesterol.
  3. 3. Konjugovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 2, naznačen time što se C bira iz grupe koja se sastoji od tokoferola i holesterola.
  4. 4. Konjugovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 2, naznačen time što je molekul
    i što se podvučeni nukleotid odnosi na nukleotid koji ima fosforotioatni kostur.
  5. 5. Farmaceutska formulacija koja sadrži konjugovani molekul nukleinske kiseline prema bilo kojem od zahteva 1, 2 i 4.
  6. 6. Farmaceutska formulacija iz zahteva 5, naznačena time što navedena formulacija dalje sadrži DNK-oštećujući antitumorski agens i farmaceutski prihvatljiv nosač.
  7. 7. Kit koji sadrži konjugovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 2 ili 4 i DNK-oštećujući antitumorski agens, kao kombinovani preparat za istovremenu, odvojenu ili sekvencijalnu primenu.
  8. 8. Konjugovani molekul nukleinske kiseline iz bilo kojeg od zahteva 1, 2 i 4 za primenu u lečenju karcinoma kod ispitanika kome je potreban.
  9. 9. Konjugovani molekul nukleinske kiseline za primenu prema zahtevu 8, u kombinaciji sa radioterapijom ili hemoterapijom, opcionalno sa DNK-oštećujućim antitumorskim agensom.
RS20180764A 2010-06-22 2011-06-21 Optimizovani sistem sa endosomolitičkim agensima za in vivo primenu konjugata nukleinskih kiselina RS57439B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10166936 2010-06-22
EP16183451.0A EP3135301B1 (en) 2010-06-22 2011-06-21 Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57439B1 true RS57439B1 (sr) 2018-09-28

Family

ID=42727428

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180764A RS57439B1 (sr) 2010-06-22 2011-06-21 Optimizovani sistem sa endosomolitičkim agensima za in vivo primenu konjugata nukleinskih kiselina

Country Status (21)

Country Link
US (5) US9205099B2 (sr)
EP (4) EP3135301B1 (sr)
JP (1) JP5860874B2 (sr)
CN (2) CN103025356B (sr)
AU (1) AU2011269041B2 (sr)
CA (1) CA2802463C (sr)
CY (1) CY1120560T1 (sr)
DK (2) DK3135301T3 (sr)
EA (2) EA032867B9 (sr)
ES (2) ES2784793T3 (sr)
HR (1) HRP20180934T1 (sr)
HU (1) HUE037926T2 (sr)
IL (2) IL223467A (sr)
LT (1) LT3135301T (sr)
PL (1) PL3135301T3 (sr)
PT (1) PT3135301T (sr)
RS (1) RS57439B1 (sr)
SI (1) SI3135301T1 (sr)
SM (1) SMT201800341T1 (sr)
TR (1) TR201807294T4 (sr)
WO (1) WO2011161075A1 (sr)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5860874B2 (ja) * 2010-06-22 2016-02-16 デエヌア・テラプーティックＤｎａｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ 核酸コンジュゲートのためのエンドソーム溶解剤を用いた最適化ｉｎｖｉｖｏ送達システム
EP2527440A1 (en) * 2011-05-27 2012-11-28 Institut Curie Cancer treatment by combining DNA molecules mimicking double strand breaks with hyperthermia
CN103550783A (zh) * 2013-04-27 2014-02-05 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 一种核酸类药物靶向递送系统及其制备方法
AU2016296905B2 (en) * 2015-07-23 2018-07-05 Centre National De La Recherche Scientifique Use of a combination of Dbait molecule and parp inhibitors to treat cancer
US20210052631A1 (en) * 2015-09-25 2021-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
KR102441432B1 (ko) * 2016-03-01 2022-09-07 옹쎄오 Ｄｂａｉｔ 분자의 전신 투여에 의한 암 치료법
WO2017186882A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Onxeo A method of predicting a response to an anti-tumor treatment by means of signal interfering dna molecules
JP7107503B2 (ja) 2016-12-01 2022-07-27 国立大学法人埼玉大学 薬物送達系用エンドサイトーシス増強剤
US11033572B2 (en) 2017-01-19 2021-06-15 Universiteit Gent Molecular adjuvants for enhanced cytosolic delivery of active agents
WO2018162439A1 (en) 2017-03-08 2018-09-13 Onxeo New predictive biomarker for the sensitivity to a treatment of cancer with a dbait molecule
WO2018175445A1 (en) * 2017-03-20 2018-09-27 Northwestern University Poly(lactic-co-glycolic acid) (plga) spherical nucleic acids
EP3461488A1 (en) 2017-09-27 2019-04-03 Onxeo Combination of a dbait molecule and a hdac inhibitor for treating cancer
CA3092779A1 (en) * 2018-03-13 2019-09-19 Onxeo A dbait molecule against acquired resistance in the treatment of cancer
CN117338800A (zh) 2018-11-01 2024-01-05 阿尔法陶医疗有限公司 肿瘤内α粒子-发射体辐射和针对细胞内病原体的细胞质传感器的激活
BR112021012066A2 (pt) * 2018-12-21 2021-11-03 Onxeo Novas moléculas de ácido nucleico conjugadas e seus usos
EP3934700A4 (en) * 2019-03-06 2022-12-14 Generation Bio Co. NON-ACTIVE LIPID NANOPARTICLES WITH CAPSID-FREE, NON-VIRAL DNA
EA202192575A1 (ru) 2019-03-21 2022-01-14 Онксео Соединения dbait в сочетании с ингибиторами киназ для лечения рака
WO2021148581A1 (en) 2020-01-22 2021-07-29 Onxeo Novel dbait molecule and its use
TW202210633A (zh) 2020-06-05 2022-03-16 法商昂席歐公司 用於治療癌症之dbait分子與kras抑制劑的組合
TW202214857A (zh) 2020-06-19 2022-04-16 法商昂席歐公司 新型結合核酸分子及其用途
KR20240133795A (ko) 2021-12-16 2024-09-04 발레리오 테라퓨틱스 신규한 컨쥬게이티드 핵산 분자 및 이의 용도
JP2025540052A (ja) * 2022-12-01 2025-12-11 イェール ユニバーシティー 細胞内ペイロード送達用刺激応答性トレースレス操作プラットフォーム

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7759291A (en) 1990-03-29 1991-10-21 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide-transport agent disulfide conjugates
US5843643A (en) * 1992-02-21 1998-12-01 Ratner; Paul L. Site-specific transfection of eukaryotic cells using polypeptide-linked recombinant nucleic acid
US5646042A (en) 1992-08-26 1997-07-08 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. C-myb targeted ribozymes
DE4418965A1 (de) 1994-05-31 1995-12-07 Boehringer Ingelheim Int Verfahren zum Einbringen von Nukleinsäure in höhere eukaryotische Zellen
PT765313E (pt) 1994-06-17 2003-11-28 Hoffmann La Roche Derivados de n,n'-bis(quinolin-4-il)-diamina a sua preparacao e a sua utilizacao como agentes anti-malaria
FR2722506B1 (fr) 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations
EP0831922A2 (en) * 1995-06-08 1998-04-01 Therexsys Limited Improved pharmaceutical compositions for gene therapy
AUPN741696A0 (en) 1996-01-05 1996-01-25 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Delivery of nucleic acids ii
CA2302316A1 (en) 1997-09-15 1999-03-25 Genetic Immunity, Llc. Method of delivering genes to antigen presenting cells of the skin
ATE427948T1 (de) 2001-04-24 2009-04-15 Purdue Research Foundation Folat-mimetika und deren folatrezeptorbindende konjugate
DE10310196A1 (de) 2003-03-06 2004-09-23 Rina-Netzwerk Rna Technologien Gmbh Verwendung eines trizyklischen Antidepressivums zur Förderung der Endozytose
EP1526177A1 (en) * 2003-10-24 2005-04-27 Institut Curie Nucleic acids useful for triggering tumor cell lethality
US7476729B2 (en) 2003-10-24 2009-01-13 Institut Curie Dbait and uses thereof
US20060051405A1 (en) 2004-07-19 2006-03-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof
WO2007040469A2 (en) 2005-09-15 2007-04-12 Kosak Ken M Chloroquine coupled compositions and methods for their synthesis
US20070293449A1 (en) 2006-06-20 2007-12-20 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Compositions and methods for delivery of double-stranded rna
CN101500548A (zh) 2006-08-18 2009-08-05 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于体内递送多核苷酸的多缀合物
EP1944369A1 (en) 2007-01-12 2008-07-16 The Centre National de la Recherche Scientifique Dbait and its standalone uses thereof
WO2009063998A1 (ja) * 2007-11-14 2009-05-22 Ribomic Inc. 疎水性物質付加核酸及びその使用
CA2721183C (en) 2008-04-11 2019-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2010053489A1 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Children's Hospital Medical Center Fusogenic properties of saposin c and related proteins and peptides for application to transmembrane drug delivery systems
TW201021852A (en) 2008-11-17 2010-06-16 Enzon Pharmaceuticals Inc Releasable fusogenic lipids for nucleic acids delivery systems
JP5860874B2 (ja) * 2010-06-22 2016-02-16 デエヌア・テラプーティックＤｎａｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ 核酸コンジュゲートのためのエンドソーム溶解剤を用いた最適化ｉｎｖｉｖｏ送達システム
EP2527440A1 (en) * 2011-05-27 2012-11-28 Institut Curie Cancer treatment by combining DNA molecules mimicking double strand breaks with hyperthermia

Also Published As

Publication number Publication date
EP3135301A1 (en) 2017-03-01
US20160339107A1 (en) 2016-11-24
EP3135301B1 (en) 2018-05-02
HUE037926T2 (hu) 2018-09-28
CN104788523B (zh) 2017-09-08
EA032867B1 (ru) 2019-07-31
US20130131155A1 (en) 2013-05-23
CN104788523A (zh) 2015-07-22
EP3372248B1 (en) 2020-03-11
AU2011269041A2 (en) 2013-07-11
US20170298089A1 (en) 2017-10-19
LT3135301T (lt) 2018-07-10
US9428538B2 (en) 2016-08-30
JP5860874B2 (ja) 2016-02-16
CY1120560T1 (el) 2019-07-10
US20190314511A1 (en) 2019-10-17
US9205099B2 (en) 2015-12-08
EP3689381A1 (en) 2020-08-05
EP3372248A1 (en) 2018-09-12
ES2784793T3 (es) 2020-09-30
IL252241A0 (en) 2017-08-31
EA032867B9 (ru) 2020-01-22
CA2802463A1 (en) 2011-12-29
EA201300039A1 (ru) 2013-05-30
EA023927B1 (ru) 2016-07-29
AU2011269041A1 (en) 2013-01-31
SI3135301T1 (en) 2018-08-31
US10363317B2 (en) 2019-07-30
PT3135301T (pt) 2018-07-16
SMT201800341T1 (it) 2018-09-13
DK3135301T3 (en) 2018-06-25
AU2011269041B2 (en) 2015-05-07
CA2802463C (en) 2019-02-26
TR201807294T4 (tr) 2018-06-21
EP2585113A1 (en) 2013-05-01
ES2674412T3 (es) 2018-06-29
US9687557B2 (en) 2017-06-27
IL223467A (en) 2017-09-28
US20160046662A1 (en) 2016-02-18
WO2011161075A1 (en) 2011-12-29
CN103025356B (zh) 2015-02-18
US10765758B2 (en) 2020-09-08
CN103025356A (zh) 2013-04-03
JP2013534521A (ja) 2013-09-05
HRP20180934T1 (hr) 2018-10-05
DK3372248T3 (da) 2020-04-06
EA201690782A1 (ru) 2016-08-31
PL3135301T3 (pl) 2018-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10765758B2 (en) Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates
KR102441432B1 (ko) Ｄｂａｉｔ 분자의 전신 투여에 의한 암 치료법
JP7534218B2 (ja) がんの治療における獲得耐性に対抗するｄｂａｉｔ分子
WO2014170441A1 (en) Inhibition of dna damage repair by artificial activation of parp with oligonucleotide molecules
AU2015202211B2 (en) Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates
HK1240814B (en) Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates
HK1240814A (en) Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates
HK1240814A1 (en) Optimized in vivo delivery system with endosomolytic agents for nucleic acid conjugates