RS57636B1 - Humanizovani anti-beta7 antagonisti i njihova upotreba - Google Patents

Humanizovani anti-beta7 antagonisti i njihova upotreba

Info

Publication number
RS57636B1
RS57636B1 RS20181006A RSP20181006A RS57636B1 RS 57636 B1 RS57636 B1 RS 57636B1 RS 20181006 A RS20181006 A RS 20181006A RS P20181006 A RSP20181006 A RS P20181006A RS 57636 B1 RS57636 B1 RS 57636B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
hvr
seq
human
sequence
Prior art date
Application number
RS20181006A
Other languages
English (en)
Inventor
Mark S Dennis
Sherman Fong
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of RS57636B1 publication Critical patent/RS57636B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKI PODACI
[0001] Dati pronalazak se generalno odnosi na polje molekularne biologije i regulaciju faktora rasta. Bliže, pronalazak se bavi modulatorima biološke aktivnosti integrina koji sadrže beta7 subjedinicu, i primenama datih modulatora.
POZADINA
[0002] Integrini su α/β heterodimerni receptori na površini ćelije uključeni u brojne ćelijske procese od ćelijske adhezije do regulacije gena (Hynes, R.O., Cell, 1992, 69:11-25; i Hemler, M.E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8: 365-368). Nekoliko integrina je povezano sa procesima u bolestima i samim tim su postali interesantni kao potencijalne mete u otkriću lekova (Sharar, S.R. i sar., Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:359-378). U imunom sistemu, intergrini su uključeni u promet leukocita, adheziju i infiltraciju tokom inflamatornih procesa (Nakajima, H. i sar., J. Exp. Med., 1994, 179:1145-1154). Diferencijalna ekspresija integrina reguliše adhezivne karakteristike ćelije i različiti integrini su uključeni u različite inflamatorne odgovore (Butcher, E.C. i sar., Science, 1996, 272:60-66). Beta7 integrini (tj. alfa4beta7 (α4β7) and alfaEbeta7 (αEβ7)) su pre svega eksprimirani na monocitima, limfocitima, eozinofilima, bazofilima, i makrofagima ali ne na neutrofilima (Elices, M.J. i sar., Cell, 1990, 60:577-584). Primarni ligandi za α4β7 integrin su endotelijalni površinski proteini, mukozni adresin ćelijski molekul (MAdCAM) i vaskularni ćelijski adhezioni molekul (VCAM-1) (Makarem, R. i sar., J. Biol. Chem., 1994, 269: 4005-4011). Vezivanje α4β7 za MAdCAM i/ili VCAM, eksprimiranih na venulama sa visokim endotelom (HEV) na mestu inflamacije, rezultuje jakom adhezijom leukocita na endotelu praćeno ekstravazacijom u upaljeno tkivo (Chuluyan, H.E. i sar., Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:391-404). Primarni ligand za αEβ7 integrin je površinski protein intra-epitelniog limfocita (IEL), E-kadherin, koji olakšava prianjanje ćelije sa αEβ7 za epitelne limfocite. Pokazano je da su monoklonska antitela na αEβ7, MAdCAM ili VCAM, u animalnim modelima efikasni modulatori hroničnih inflamatornih bolesti kao što su astma (Laberge, S. i sar., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1995, 151:822-829.), reumatoidni artritis (RA; Barbadillo, C. i sar., Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16:375-379), colitis (Viney et al, J. Immunol., 1996, 157: 2488-2497) i inflamatorna bolest creva (IBD; Podalski, D.K., N. Eng. J. Med., 1991, 325:928-937; Powrie, F. i sar., Ther. Immunol., 1995, 2:115-123). Pokazano je da monoklonska antitela na beta7 subjedinicu vezuju subjedinicu integrina (Tidswell, M. et al. (1997) J. Immunol. 159:1497-1505) ali im kao ne-humanim ili ne-humanizovanim antitelima, nedostaje klinička korisnost.
[0003] Humanizovana monoklonska antitela ili antigen vezujući fragmenti koji inhibiraju adheziju leukocita koji eksprimiraju integrin sa β7 lancem su predložena u WO96/24673.
[0004] Postoji potreba za visoko specifičnim jedinjenjima, kao što su humanizovana antitela ili vezujući fragmenti koji inhibiraju interakciju između alfa4beta7 integrina i njegovih liganada MAdCAM i/ili VCAM kao i interakciju između alfaEbeta7 integrina i njegovog liganda E-kadherina. Ova jedinjenja su korisna u tretmanu hroničnih inflamatornih bolesti kao što su astma, Kronova bolest, ulcerativni kolitis, dijabetes, komplikacije nakon transplatacije organa i poremećaji vezani za alograft.
SUŠTINA PRONALASKA
[0005] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima i odnosi se na antitela, nukleinsku kiselinu koja kodira antitela prema pronalasku, vektore, ćelije domaćina i postupke proizvodnje navedenih antitela.
[0006] Pronalazak je delom baziran na identifikaciji različitih antagonist bioloških puteva koji uključuju integrine sa beta7 subjedinicom, generalno su važni biološki/ćelijski procesi i pogodan terapeutski cilj. Takvi biološki putevi obuhvataju, bez ograničenja, naročito hronične inflamatorne poremećaje kao što su astma, alergija, IBD, dijabetes, transplatacije i bolesti vezane za presađivanje tkiva. Pronalazak pruža preparate i metode bazirane na beta7 integrin posredovanom ćelijskom adhezijom i/ili regrutacijom, uključujući ali se ne ograničavajući na interakciju sa MAdCAM and VCAM-1 vezivanjem za vanćelijski deo alfa4beta7 integrina i interakciju E-kadherin sa alfaEbeta7 integrinom. Antagonisti ovog pronalaska, kao što je ovde opisano, predstavljaju važne terapeutske i dijagnostičke agense u patološkim stanjima povezanim sa abnormalnom ili neželjenom signalizacijom preko beta7 integrina. Shodno tome, otkriće pruža metode, sastave, komplete i predmete proizvodnje vezane za modulaciju beta7 integrinom posredovanih puteva, uključujući modulaciju MAdCAM-alfa4beta7 vezivanja i regrutacije leukocita na gastrointestinalni epitelijum, vezivanje i alergiju, astmu, IBD (kao što je Kronova bolest i ulcerativni kolitis), dijabetes, inflamacije vezane za transplataciju, bolesti vezane za presađivanje tkiva i/ili poremećaje vezane za alograft i druge biološke/fiziološke aktivnosti posredovane beta7 integrinom.
[0007] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na anti-beta7 terapeutski agens pogodan za terapeutsko korišćenje i sposoban da utiče različitim stepenom na ometanje beta7 integrin-posredovanog puta. Na primer, otkriće pruža humanizovano anti-beta7 antitelo gde antitelo u vidu Fab fragmenta ima suštinski isti vezujući afinitet za humani beta7 kao i mišji Fab fragment koji obuhvata, sastoji se, ili se suštinski sastoji, od sekvence varijabilnog domena lakog lanca i teškog lanca kao što je prikazano na Slikama 1A i 1B ili Slikama 9A i 9B. Takođe je ovde opisano, ali ne kao deo zahtevanog pronalaska, humanizovano anti-beta7 antitelo gde antitelo kao Fab fragment ima vezujući afinitet za humani beta7 koji je niži, na primer najmanje 3, najmanje 5, najmanje 7, ili najmanje 10 puta niži, nego mišji ili pacovski Fab fragment koji obuhvata, sastoji se, ili se suštinski sastoji, od sekvence varijabilnog domena lakog lanca i teškog lanca kao što je opisano u Slikama 1A i 1B ili sekvenci varijabilnog domena opisane u Slikama 9A i 9B. Alternativno, humanizovano anti-beta7 antitelo, ili njegov beta7 vezujući fragment, pronalaska ispoljava monovalentan afinitet ka humanom beta7, čiji je afinitet suštinski isti ili veći od monovalentnog afiniteta ka humanom beta7 antitela koje obuhvata varijabilne sekvence lakog i teškog lanca prikazane na Slici 1A (SEQ ID NO:10) i/ili Slici 1B (SEQ ID NO:11), ili Slici 9A (SEQ ID NO:12) i/ili Slici 9B (SEQ ID NO:13). Antitelo ili njegov vezujući fragment koji ima veći afinitet ka humanom beta7 ispoljava afinitet koji je najmanje 2 puta, najmanje 5 puta, najmanje 10 puta, najmanje 50 puta, najmanje 100 puta, najmanje 500 puta, najmanje 1000 puta, najmanje 5000 puta, ili najmanje 10,000 puta veći nego antitela koje obuhvata sekvence lakog lanca i teškog lanca prikazane na Slici 1A (SEQ ID NO:10) i/ili Slici 1B (SEQ ID NO:11), ili Slici 9A (SEQ ID NO:12) i/ili Slici 9B (SEQ ID NO:13).
[0008] U drugom aspektu, pronalazak pruža anti-beta7 humanizovano antitelo gde antitelo u vidu Fab fragmenta ima afinitet vezivanja za humani beta7 koji je veći, za na primer najmanje 3, najmanje 5, najmanje 7, najmanje 9, najmanje 10, najmanje 15, najmanje 20, ili najmanje 100 puta veći od onog kod glodara (kao što su pacov ili miš) Fab fragment koji obuhvata, sastoji se ili se suštinski sastoji od sekvence varijabilnog domena lakog lanca i teškog lanca kao što je prikazano na Slici 1A i Slici 1B, respektivno. U jednom aspektu, pomenuti glodarski Fab fragment, ima afinitet vezivanja Fab fragmenta koji obuhvata sekvence varijabilnih domena pacovskog antitela označenog kao FIB504.64 produkovanog od strane ćelijske linije hibridoma deponovane pod American Type Culture Collection Accession Number ATCC HB-293. U daljem aspektu, humanizovan Fab fragment pronalaska ima afinitet vezivanja Fab fragmenta koji obuhvata sekvence varijabilnog domena antitela produkovanog od strane bilo koga, humanizovanih anti-beta7 antitela pronalaska. Kao što je dobro uspostavljeno u oblasti, afinitet vezivanja liganda za svoj receptor se može utvrditi korišćenjem različitih eseja, i izraziti različitim kvantitativnim vrednostima. Shodno tome, u jednom aspektu, afinitet vezivanja je izražen u vidu Kd vrednosti i označava intrinzički afinitet vezivanja (npr., sa minimalnim efektom aviditeta). Generalno i poželjno, afinitet vezivanja je meren in vitro, bilo u vidu postavke sa ćelijama ili bez ćelija. Kao što je detaljno opisano ovde, razlika u afinitetu vezivanja se može kvantifikovati u vidu odnosa vrednosti afiniteta vezivanja humanizovanog antitela u Fab formi i vrednosti afiniteta vezivanja referentnog/onog sa kojim se poredi Fab antitela (npr., mišje antitelo koje ima donorsku sekvencu hipervarijabilnog regiona), gde su vrednosti afiniteta vezivanja određene u sličnim uslovima eseja. Stoga, u jednom aspektu, razlika u afinitetu vezivanja je određena kao odnos između Kd vrednosti humanizovanog antitela u Fab formi i pomenutog referentnog/onog sa kojim se poredi Fab antitela. Bilo koji od brojnih eseja poznatih u oblasi, uključujući i one opisane ovde, mogu se koristiti kako bi se dobila merenja afiniteta vezivanja, uključujući, na primer, Biacore® (Biacore International Ab, Uppsala, Sweden) i ELISA.
[0009] Opisano ovde, ali ne kao deo pronalaska uako se zahteva, je antitelo koje obuhvata anti beta7 antitelo ili beta7 vezujući fragment koji obuhvata:
(a) najmanje jedne, dve, tri, četiri ili pet sekvenci hipervarijabilnih regiona (HVR) odabrana iz grupe koju čin:
(i) HVR-L1 koji obuhvata sekvencu A1-A11, gde je A1-A11 RASESVDTYLH (SEQ ID NO:1)
(ii) HVR-L2 koji obuhvata sekvencu B1-B8, gde je B1-B8 KYASQSIS (SEQ ID NO:2)
(iii) HVR-L3 koji obuhvata sekvencu C1-C9, gde je C1-C9 QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3)
(iv) HVR-H1 koji obuhvata sekvencu D1-D10, gde je DL-D10 GFFTINNYWG (SEQ ID NO:4)
(v) HVR-H2 koji obuhvata sekvencu E1-E17, gde je E1-E17 GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5); i
(vi) HVR-H3 koji obuhvata sekvencu F2-F11, gde je F2-F11 is MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6).
[0010] Takođe opisan ovde je polipeptid ili antitelo koje obuhvata najmanje jednu varijantu HVR, gde varijanta sekvence HRV obuhvata modifikacije najmanje jednog ostatka najmanje jedne od sekvenci opisanih u SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, i 9. Takođe ovde opisano je i anti-beta7 antitelo ili beta7 vezujući fragment koji obuhvata jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) odabranih iz grupe koja se sastoji od HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1. HVR-H2, i HVR-H3, gde:
(i) HVR-L1 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu RASESVDTYLH (SEQ ID NO:1); RASESVDSLLH (SEQ ID NO:7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO:8), ili RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9);
(ii) HVR-L2 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu KYASQSIS (SEQ ID NO:2), RYASQSIS (SEQ ID NO:67, ili XYASQSIS (SEQ ID NO:68, gde X predstavlja bilo koju aminokiselinu),
(iii) HVR-L3 obuhvata QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3),
(iv) HVR-H1 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4),
(v) HVR-H2 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5), i
(vi) HVR-H3 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6) ili RTGSSGYFDF (SEQ ID NO:66) za okvirne pozicije F2-F11; ili obuhvata amino-kiselinsku sekvencu F1-F11, gde je F1-F11 AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO:63), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO:64), ili AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO:65).
[0011] Takođe opisano ovde je anti-beta7 antitelo ili beta7 vezujući fragment koji obuhvata jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest hipervarijabilnih regiona (HVR) odabranih iz grupe koja se sastoji od HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde:
(i) HVR-L1 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu A1-A11, gde je A1-A11 RASESVDTYLH (SEQ ID NO:1); RASES- VDSLLH (SEQ ID NO:7), RASESVDTLLH (SEQ ID NO:8), ili RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9) ili varijanta SEQ ID NOs:1, 7, 8 ili 9 gde je aminokiselina A2 odabrana iz grupe koja se sastoji od A, G, S, T, i V i/ili aminokiselina A3 odabrana iz grupe koja se sastoji od S, G, I, K, N, P, Q, R, i T, i/ili A4 odabrana iz grupe koja se sastoji od E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N, i R, i/ili aminokiselina A5 odabrana iz grupe koja se sastoji od S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, i V, i/ili aminokiselina A6 odabrana iz grupe koja se sastoji od V, R, I, A, G, K, L, M, i Q, i/ili aminokiselina A7 odabrana iz grupe koja se sastoji od D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, i T, i/ili aminokiselina A8 odabrana iz grupe koja se sastoji od D, G, N, E, T, P i S, i/ili aminokiselina A9 odabrana iz grupe koja se sastoji od L, Y, I i M, i/ili aminokiselina A10 odabrana iz grupe koja se sastoji od L, A, I, M, i V i/ili aminokiselina A11 odabrana iz grupe koja se sastoji od H, Y, F, i S;
(ii) HVR-L2 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu B1-B8, gde je B1-B8 is KYASQSIS (SEQ ID NO:2), RYASQSIS (SEQ ID NO:67, ili XYASQSIS (SEQ ID NO:68, gde X predstavlja bilo koju aminokiselinu) ili varijantu SEQ ID NOs:2, 67 ili 68 gde je aminokiselina B1 odabrana iz grupe koja se sastoji od K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y i X (gde X predstavlja bilo koju aminokiselinu), i/ili aminokiselina B4 odabrana iz grupe koja se sastoji od S i D, i/ili aminokiselina B5 odabrana iz grupe koja se sastoji od Q i S, i/ili aminokiselina B6 odabrana iz grupe koja se sastoji od S, D, L, i R, i/ili aminokiselina B7 odabrana iz grupe koja se sastoji od I, V, E, i K;
(iii) HVR-L3 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu C1-C9, gde je C1-C9 QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3) ili varijanta SEQ ID NO:3 gde je aminokiselina C8 odabrana iz grupe koja se sastoji od N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L, M, i Y;
(iv) HVR-H1 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu D1-D10 gde je D1-D10 GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4),
(v) HVR-H2 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu E1-E17 gde je E1-E17 GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5), ili varijanta SEQ ID NO:5 gde je aminokiselina E2 odabrana iz grupe koja se sastoji od Y, F, V, i D, i/ili aminokiselina E6 odabrana iz grupe koja se sastoji od S i G, i/ili aminokiselina E10 odabrana iz grupe koja se sastoji od S i Y, i/ili aminokiselina E12 odabrana iz grupe koja se sastoji od N, T, A, i D, i/ili aminokiselina 13 odabrana iz grupe koja se sastoji od P, H, D, i A, i/ili aminokiselina E15 odabrana iz grupe koja se sastoji od L i V, i/ili aminokiselina E17 odabrana iz grupe koja se sastoji od S i G, i
(vi) HVR-H3 obuhvata amino-kiselinsku sekvencu F2-F11 gde je F2 -F11 MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6) ili RTGSS- GYFDF (SEQ ID NO:66); ili obuhvata amino-kiselinsku sekvencu F1-F11 gde je F1-F11 AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO:63), ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO:64), ili AQTGSSGYFDF (SEQ ID NO:65), ili varijanta SEQ ID Nos: 6, 63, 64, 65, ili 66 gde je F2 aminokiselina R, M, A, E, G, Q, S, i/ili aminokiselina F11 odabrana iz grupe koja se sastoji od F i Y.
[0012] U jednom od antitela obelodanjenja amino kiselina u okviru teškog lanca na poziciji 71 (prema Kabat sistemu obeležavanja) odabrana je iz grupe koja se sastoji od R, A i T, i/ili aminokiselina u okviru teškog lanca na poziciji 73 (Kabat sistem obeležavanja), odabrana je iz grupe koja se sastoji od N i T, i/ili aminokiselina u okviru teškog lanca na poziciji 78 (Kabat sistem obeležavanja), odabrana je iz grupe koja se sastoji od F, A, i L.
[0013] Kod nekih antitela opisanih ovde, HVR-L1 antitela datog pronalaska se sastoje od sekvence SEQ ID NO:1. U jednom primeru, HVR-L2 antitela datog pronalaska se sastoje od sekvence SEQ ID NO:2. U jednom primeru, HVR-L3 antitela datog pronalaska se sastoje od sekvence SEQ ID NO:3. U jednom primeru, HVR-H1 antitela datog pronalaska se sastoje od sekvence SEQ ID NO:4. U jednom primeru, HVR-H2 antitela datog pronalaska se sastoje od sekvence SEQ ID NO:5. U jednom primeru, HVR-H3 antitela datog pronalaska se sastoje od sekvence SEQ ID NOs:6 ili 66 za okvirne pozicije F2-F11 ili SEQ ID Nos:63, 64 ili 65, za okvirne pozicije F1-F11. U jednom primeru HVR-L1 obuhvata RASESVDSLLH (SEQ ID NO: 7). U jednom primeru HVR-L1 obuhvata RASESVDTLLH (SEQ ID NO: 8). U jednom primeru HVR-L1 obuhvata RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9). Opciono, antitela obelodanjenja koja obuhvataju date sekvence (u kombinacijama opisanim ovde) su humanizovana ili humana.
[0014] U jednom aspektu, obelodanjenje pruža antitelu koje obuhvata jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest HVR, gde svaki HVR obuhvata, sastoji se ili se u osnovi sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 i 9, i gde SEQ ID NO: 1, 7, 8 ili 9 odgovara HVR-L1, SEQ ID NO:2 odgovara HVR-L2, SEQ ID NO:3 odgovara HVR-L3, SEQ ID NO:4 odgovara HVR-H1, SEQ ID NO:5 odgovara HVR-H2, i SEQ ID NOs:6 odgovara HVR-H3. U jednom aspektu, antitelo datog obelodanjenja obuhvata HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki, redom, obuhvata SEQ ID NO:7, 2, 3, 4, 5 i 6. U jednom aspektu, antitelo datog obelodanjenja obuhvata HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki, redom, obuhvata SEQ ID NO:8, 2, 3, 4, 5 i 6. U jednom aspektu, antitelo datog obelodanjenja obuhvata HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki, redom, obuhvata SEQ ID NO:9, 2, 3, 4, 5 i 6. U jednom aspektu, antitelo datog obelodanjenja obuhvata HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki, redom, obuhvata SEQ ID NO:9, 2, 3, 4, 5 i 66, ili SEQ ID NO:9,2, 3,4, 5, 63 ili SEQ ID NO:9,2,3,4, 5 i 6. U jednom aspektu antitelo obelodanjenja obuhvata HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, pri čemu svaki, redom, sadrži SEQ ID NO: 9, 3, 4, 5 i 66 ili SEQ ID NO: 9, 2, 3, 4, 5, 63 ili SEQ ID NO: 9, 2, 3, 4, 5, 64 ili SEQ ID NO: 9, 2, 3 , 4, 5 i 65 ili SEQ ID NO: 9, 67, 3, 4, 5, 64 ili SEQ ID NO: 9, 68, 3, 4, 5, 64.
[0015] Opisana ovde su antitela kod kojih postoji modifikacija HVR i/ili okvira uključujući one gde je A8 u varijanti HVR-L1 S, D ili T i A9 je L.
[0016] Kod nekih antitela, shodno obelodanjenju, najmanje deo okvira sekvence je humana konsenzus sekvenca.
[0017] Opisano ovde, ali ne kao deo traženog pronalaska, je antitelo gde je: HVR-L1 varijanta koja se sastoji od 1-10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10) zamena u ma kojoj kombinaciji na sledećim pozicijama: A2 (G, S, T, ili V); A3 (G, I, K, N, P, Q, R, ili T), A4 (A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R, ili V), A5 ( A, D, G, H, I. K, N, P, R, T, V, ili Y), A6 (A, G, I, K, L, M, Q, ili R), A7 (A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T, ili V), A8 (S, D, E, G, P, ili N) i A9 (L, I, ili M), A10 (A, I, M, ili V), i A11 (F, S, ili Y); ili
HVR-L2 varijanta koja se sastoji od 1-4 (1, 2, 3, ili 4) zamena u ma kojoj kombinaciji na sledećim pozicijama: B1 (N), B5 (S), B6 (R ili L), i B7 (T, E, K, ili V); ili
HVR-L3 varijanta koja se sastoji od najmanje jedne zamene na poziciji C8 (W, Y, R, S, A, F, H, I, L, M, N, T, ili V); ili
Gde se HVR-H2 varijanta sastoji od 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7) zamena u ma kojoj kombinaciji na sledećim pozicijama: E2 (V, D, ili F), E6 (G), E10 (Y), E12 (A, D, ili T), E13 (D, A, ili H), E15 (V), E17 (G); ili HVR-H3 varijanta koja se sastoji od na 1 ili 2 zamena u ma kojoj kombinaciji na sledećim pozicijama: F2 (A, E, G, Q, R, ili S), i F11 (Y).
[0018] Ovde je takođe opisano antitelo koje obuhvata HVR-L1 sa sekvencom SEQ m NO:7;
HVR-L1 sa sekvencom SEQ ID NO:8; ili
HVR-L1 sa sekvencom SEQ ID NO:9.
[0019] Shodno obelodanjenju, neka antitela obuhvataju težak lanac konsenzus sekvence teškog lanca humane podgrupe III koji obuhvata zamene na poziciji 71, 73 i/ili 78.
[0020] Zamene mogu biti R71A, N73T i/ili N78A.
[0021] Shodno obelodanjenju, neka antitela obuhvataju HVR-L3 sa sekvencom SEQ ID NO:3.
[0022] Kod nekih antitela, shodno obelodanjenju, A8 u HVR-L1 je S.
[0023] Kod drugih, A8 u HVR-L1 je D.
[0024] Kod nekih antitela, shodno obelodanjenju, A9 u HVR-L1 je L.
[0025] Opisana ovde, su antitela gde je okvir sekvence između sekvence E1-E17 i F1-F11 HFR3-1-HFR3-31 i gde je HFR3-6 A ili R, HFR3-8 je N ili T, i HFR3-13 je L ili A ili F.
[0026] Za neka antitela, shodno pronalasku, monovalentan afinitet antitela za humani beta7 je suštinski isti kao monovalentan afinitet antitela pacova koji je sastoji od lakog lanca i varijabilne sekvence teškog lanca kao što je prikazano na Slici 9.
[0027] Za neka antitela, shodno pronalasku, monovalentan afinitet antitela za humani beta7 je najmanje 3 puta veći u odnosu na monovalentan afinitet antitela pacova koji je sastoji od lakog lanca i varijabilne sekvence teškog lanca kao što je prikazano na Slici 9.
[0028] Pacovsko antitelo može biti proizvedeno preko ćelijske linije hibridoma deponovane pod American Type Culture Collection Accession Number ATCC sa oznakom HB-293.
[0029] Afinitet vezivanja može biti predstavljen u vidu Kd vrednosti.
[0030] Afinitet vezivanja može se odrediti preko Biacore™ ili radioimunoesejima.
[0031] Antitelo obelodanjenja može obuhvatati laki lanac konsenzus sekvence humane κ subgrupe 1.
[0032] Antitelo obelodanjenja može obuhvatati težak lanac konsenzus sekvence teškog lanca humane podgrupe III.
[0033] Antitelo obelodanjenja može obuhvatati okvir sekvence koji obuhvata zamenu na poziciji 71, 73 i/ili 78.
[0034] Zamene mogu biti R71A, N73T i/ili N78A ili gde je zamenjena aminokiselina na poziciji 71 R ili A, i/ili zamena aminokiselina na poziciji 78 je N ili T, i/ili zamena aminokiselina na poziciji 78 je L ili A ili F.
[0035] Zamena može biti L78F ili A78F ili A78L ili L78A.
[0036] Otkriće pruža metod inhibiranja interakcije subjedinice humanog beta7 integrina sa drugom subjedinicom integrina i/ili liganda kontaktom antitela sa drugom subjedinice integrina i/ili liganda.
[0037] Druga subjedinica integrina može biti alfa4 subjedinica integrina, i ligand je MAdCAM, VCAM ili fibronektin.
[0038] Alfa4 integrin podjedinice može biti human.
[0039] Ligand može biti humani.
[0040] Druga subjedinica integrina alfaE subjedinica integrina, i ligand E-kadherin.
[0041] AlfaE subjedinica integrina može biti humana.
[0042] Ligand može biti humani.
[0043] Neka ovde omogućena antitela su za korišćenje u inhibiciji koja smanjuje ili ublažava simptome poremećaja kao što su inflamacija, astma, inflamatorna bolest creva, Kronova bolest, ulcerativni kolitis, dijabetes, inflamacije kao rezultat transplatacije organa, poremećaje vezane za presađivanje tkiva, i inflamacije vezane za alograft poremećaje .
[0044] U obelodanjenju HVR-L1 može biti SEQ ID NO: 1, 7, 8, ili 9. Takođe opisan ovde je HVR-L1 varijanta SEQ ID NO:1, 7, 8, ili 9 koji obuhvata 1-10 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10) zamena na okvirnim pozicijama A1-A11, u ma kojoj kombinaciji sledećih pozicija: A2 (A, G, S, T, ili V); A3 (S, G, I, K, N, P, Q, R, ili T), A4 (E, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R, ili V), A5 (S,A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V, ili Y), A6 (V, A, G, I, K, L, M, Q, ili R), A7 (D, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T, ili V), A8 (T, S, D, E, G, P, ili N) i A9 (Y, L, I, ili M), A10 (L, A, I, M, ili V), i A11 (H, F, S, ili Y). HVR-L2 može biti SEQ ID NO:2, 67, ili 68 ili HVR-L2 varijanta SEQ ID NO:2, 67, ili 68 gde se HVR-L2 varijanta sastoji od 1-4 (1, 2, 3, 4, 4 ili 5) zamena na okvirnim pozicijama B1-B8, u ma kojoj kombinaciji sledećih pozicija: B1 (K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y ili X (gde X predstavlja bilo koju aminokiselinu), B4 (S), B5 (Q ili S), B6 (S, R ili L), i B7 (I, T, E, K, ili V). HVR- L3 je SEQ II DNO:3 ili HVR-L3 varijanta SEQ ID NO:3 može obuhvatati najmanje jednu zamenu na okvirnim pozicijama C1-C8, kao što je na poziciji C8 (W, Y, R, S, A, F, H, I, L, M, N, T, ili V). HVR-H1 može biti SEQ ID NO:4.HVR-H2 je SEQ ID NO:5. Takođe ovde opisan je HVR-H2 varijanta SEQ ID NO:5 gde se HVR-H2 varijanta sastoji od 1-7 (1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 zamena na okvirnim pozicijama E1-E17 u ma kojoj kombinaciji sledećih pozicija: E2 (Y, V, D, ili F), E6 (S ili G), E10 (S ili Y), E12 (N, A, D, ili T), E13 (P, D, A, ili H), E15 (L ili V), E17 (S ili G).HVR-H3 može biti SEQ ID NOs:6, 63, 64 ili 66. HVR-H3 varijanta SEQ ID Nos:6, 63, 64, 65, ili 66 može obuhvatati na okvirnim pozicijama F1-F11 za SEQ ID NOs:63, 64, i 65 ili na okvirnim pozicijama F2-F11 za SEQ ID NOs:6 i 66, 1 ili 2 zamene u ma kojoj kombinaciji na sledećim pozicijama: F2 (M, A, E, G, Q, R, ili S), i F11 (F ili Y). Slovo/slova u zagradama nakon svake pozicije ilustrativno ukazuje na zamenu (tj. supstituciju) aminokiselina za konsenzus ili drugu aminokiselinu što je očigledno stručnjaku u oblasti, pogodnost druge aminokiselina kao zamene amino kiselini u ovde opisanom kontekstu može se rutinski oceniti korišćenjem poznatih tehnika u oblasti i/ili opisanim ovde.
[0045] Takođe opisan ovde je HVR-L1 koji obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 1. A8 u varijanti HVR-L1 može biti D. ili S. A9 u varijanti HVR-L1 može biti L. U nekim slučajevima A8 u varijanti HVR-L1 je D i A9 u varijanti HVR-L1 je L. U drugim slučajevima A8 u varijanti HVR-L1 je S i A9 u varijanti HVR-L1 je L. Antitelo može obuhvatati ove varijacije u HVR-L1 i HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3 obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, i 6. HVR-H3 može obuhvatati ili se sastojati ili se u suštini sastojati od SEQ ID NO:6 ili 66 (za okvirne pozicije F2-F11) ili SEQ ID NO:63 ili 64 ili 65 (za okvirne pozicije F1-F11).
[0046] Kod nekih antitela opisanim ovde A8 u varijanti HVR-L1 je I i A9 u varijanti HVR-L1 je L; potonja varijanta još sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, i 6.
[0047] Kod drugih A8, A9, i A10 u varijanti HVR-L1 su D, L, i V, respektivno; potonja varijanta još sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:2.3, 4, 5, i 6.
[0048] Kod drugih A8 i A9 u varijanti HVR-L1 su N i L, respektivno; potonja varijanta još sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, i 6.
[0049] Kod drugih A8 i A9 u varijanti HVR-L1 su P i L, respektivno, i B6 i B7 u varijanti HVR-L2 su R i T, respektivno; potonja varijanta još sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO: 3, 4, 5, i 6.
[0050] Kod drugih A2, A4, A8, A9, i A10 u varijanti HVR-L1 su S, D, S, L, i V, respektivno; potonja varijanta još sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, i 6.
[0051] Kod drugih A5 i A9 u varijanti HVR-L1 su D i T, respektivno; potonja varijanta još sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, i 6.
[0052] Kod drugih, A5 i A9 u varijanti HVR-L1 su N i L, respektivno; potonja varijanta još sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, i 6.
[0053] Kod drugih A9 u varijanti HVR-L1 je L; potonja varijanta još sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:2, 3, 4, 5, i 6.
[0054] Neka antitela datog obelodanjenja obuhvataju HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki HVR obuhvatajući, sastojati se, ili se u suštini sastojati od, redom, SEQ ID NO: 9, 2, 3, 4, 5, i 64. Alternativno, svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:9, 67, 3, 4, 5, i 64. Alternativno, svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:9, 68, 3, 4, 5, i 64. Alternativno, svaki HVR obuhvata, ili se sastoji, ili se u suštini sastoji od, redom, SEQ ID NO:9, 2 ili 67 ili 68, 3, 4, 5, i 66.
[0055] Takođe ovde opisane su varijante HVR-L1 antitela koje dalje sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaki obuhvata, redom, sekvencu opisanu u SEQ ID NOs:23, 4, 5, i 6. Tamo gde se varijanta antitela sastoji od HVR-L1 A8(P) i A9(L) i HVR-L2 B6(R) i B7(T), data HVR-L1, HVR-L2 varijanta dalje obuhvata HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2, i HVR-H3, gde svaka obuhvata, redom, sekvencu opisanu u SEQ ID NOs:3, 4, 5, i 6.
[0056] U nekim aspektima ta antitela dalje obuhvataju konsenzus sekvencu teškog lanca humane podgrupe III. U jednom aspektu ovih antitela, okvir konsenzus sekvence sadrži zamenu na poziciji 71, 73 i/ili 78. U nekim aspektima ovih antitela, pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. U jednom aspektu ovih antitela, ova antitela dalje sadrže okvir konsenzus sekvence humanog lakog lanca κI.
[0057] U jednom aspektu, antitelo obelodanjenja sadrži HVR-L1 koji sadrži SEQ ID NO: 1. U jednom aspektu, varijanta antitelo obelodanjenja sadrži varijantu HVR-L1 gde A10 je V. U jednom aspektu, navedeno varijantno antitelo dalje sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, pri čemu svaki sadrži redosled prikazan u SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5 i 6. U nekim aspektima ova antitela dalje sadrže okvirnu konsenzusnu sekvencu teškog lanca ljudske podgrupe III. U jednom aspektu ovih antitela, okvirna konsenzusna sekvenca sadrži supstituciju na poziciji 71, 73 i/ili 78. U nekim aspektima ovih antitela položaj 71 je A, 73 je T i / ili 78 je A. U jednom aspektu ovih antitela, ova antitela dalje obuhvataju humanu laku lančanu konzistentnu sekvencu.
[0058] U jednom aspektu, antitelo obelodanjenja sadrži HVR-L3 obuhvatajući SEQ ID NO:3. Takođe je opisana varijanta HVR-L3 gde C8 je L. Varijanta antitela dalje može sadržati HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, gde svaki obuhvata, redom, sekvencu opisanu u SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5 i 6. U jednom aspektu antitelo obelodanjenja obuhvata varijantu HVR-L3 gde je C8 W. U jednom aspektu navedena varijanta antitela dalje sadrži HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, gde svaki obuhvata, redom, sekvencu opisanu u SEQ ID NOs:1, 2, 4, 5 i 6. U jednom aspektu HVR-L1 obuhvata SEQ ID NO:7, 8, ili 9. U nekim aspektima, ova antitela dalje obuhvataju konsenzus sekvencu teškog lanca humane podgrupe III. U jednom aspektu ovih antitela, okvir konsenzus sekvence obuhvata zamenu na poziciji 71, 73 i/ili 78. U nekim aspektima ovih antitela, pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. U jednom aspektu ovih antitela, ova antitela dalje obuhvataju okvir konsenzus sekvence humanog lakog lanca κI.
[0059] U jednom primeru, antitelo obelodanjenja obuhvata a HVR-H3 obuhvatajući SEQ ID NO:6. Takođe u drugim primerima varijanta navedenog antitela obuhvata varijantu HVR-H3 gde je F1 is Q. U drugim primerima navedena varijanta antitela dalje sadrži HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 i HVR-H2, gde svaki obuhvata, redom, sekvencu opisanu u SEQ ID NOs:1, 2, 3, 4, i 5. U drugim primerima antitelo obelodanjenja obuhvata varijantu HVR-H3 gde je F1 is R. U drugim primerima varijanta antitela dalje može sadržati HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 i HVR-H2, gde svaki obuhvata, redom, sekvencu opisanu u SEQ ID NOs:1, 2, 3, 4, i 5. U drugim primerima HVR-L1 obuhvata SEQ ID NO:7, 8, ili 9. U nekim aspektima, ova antitela dalje obuhvataju konsenzus sekvencu teškog lanca humane podgrupe III. U nekim primerima ovih antitela okvir konsenzus sekvence obuhvata zamenu na poziciji 71, 73 i/ili 78. U nekim aspektima ovih antitela pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. U drugim primerima ovih antitela ova antitela dalje sadrže okvir konsenzus sekvence humanog lakog lanca κI.
[0060] Antitelo može sadržati HVR-L1 koji sadrži SEK ID NO: 1. U nekim primerima, antitelo sadrži varijantu HVR-L1 pri čemu A4 je K. U nekim primerima navedeno varijantno antitelo dalje sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, gde svako sadrži redom, sekvenca opisanu u SEK ID NOs: 2, 3, 4, 5 i 6. Antitelo obelodanjivanja može sadržati varijantu HVR-L1 pri čemu A6 je I. U nekim primerima, navedeno varijantno antitelo dalje sadrži HVR- L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, gde svaki sadrži redom, sekvencu opisanu u SEK ID NOs: 2, 3, 4, 5 i 6. U drugim primerima, antitelo obelodanjenja obuhvata varijantu HVR-L1 gde A7 je S. U nekim primerima navedeno varijantno antitelo dalje sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, gde svako sadrži redom, sekvenca opisanu u SEK ID NOs: 2, 3, 4, 5 i 6. U drugim primerima, antitelo obelodanjenja sadrži varijantu HVR-L1 gde A8 je D ili N. U nekim primerima, varijantno antitelo dalje sadrži HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H 2 i HVR-H3, gde svako sadrži redom, sekvenca opisanu u SEK ID NO: 2, 3, 4, 5 i 6. U nekim primerima, ova antitela dalje sadrže okvirnu konsenzus sekvencu teškog lanca ljudske podgrupe III. U nekim primerima okvirna konsenzus sekvenca sadrži supstituciju na poziciji 71, 73 i/ili 78. U nekim primerima ovih antitela pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. U nekim primerima ova antitela dalje obuhvataju okvir konsenzus sekvence humanog lakog lanca κI.
[0061] Antitelo obelodanjenja može sadržati HVR-L2 koji sadrži SEQ ID NO:2. Antitelo može sadržati varijantu HVR-L2 gde B1 je N, B5 je S, ili gde B6 je L, ili gde B7 je V, i/ili B7 je E ili K. Neke varijante antitela dalje sadrže HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, gde svaki obuhvata, redom, sekvencu opisanu u SEQ ID NOs:1, 3, 4, 5, i 6. HVR-L1 sadrži SEQ ID NO:7, 8, ili 9. Neka antitela dalje obuhvataju konsenzus sekvencu teškog lanca humane podgrupe III. U nekim od ovih antitela, okvir konsenzus sekvence obuhvata zamenu na poziciji 71, 73 i/ili 78. U nekim od ovih antitela, pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. U nekim od ovih antitela, ova antitela dalje obuhvataju okvir konsenzus sekvence humanog lakog lanca κI.
[0062] Antitelo obelodanjenja može sadržati HVR-L3 obuhvatajući SEQ ID NO:3. Antitelo obelodanjenja može sadržati varijantu HVR-L3 gde C8 je W, Y, R, ili S. Navedena varijanta antitela opciono dalje obuhvata HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 i HVR-H3, gde svaki obuhvata, redom, sekvencu opisanu u SEQ ID NOs: 1, 2, 4, 5, i 6. U nekim otelotvorenjima HVR-L1 obuhvata SEQ ID NO: 7, 8, ili 9. Opciono, ova antitela dalje obuhvataju konsenzus sekvencu teškog lanca humane podgrupe III. Opciono, okvir konsenzus sekvence obuhvata zamenu na poziciji 71, 73 i/ili 78. U nekim slučajevima pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. Ova antitela dalje obuhvataju okvir konsenzus sekvence humanog lakog lanca κI.
[0063] Antitelo obelodanjenja može sadržati HVR-H2 obuhvatajući SEQ ID NO:5. Opisana ovde je varijanta HVR-H2 gde E2 je F ili gde E2 je V ili D ili gde E6 je G, ili gde E10 je Y, ili gde E12 je A, D, ili T, ili gde E13 je D, A, ili N, ili gde E15 je V, i/ili E17 je G. Navedena varijanta antitela dalje sadrži HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 i HVR-H3, gde svaki obuhvata, redom, sekvencu opisanu u SEQ ID NOs:1, 2, 3, 4, i 6. U nekim slučajevima HVR-L1 sadrži SEQ ID NO:7, 8, ili 9. Ova antitela mogu dalje obuhvatati konsenzus sekvencu teškog lanca humane podgrupe III. Okvir konsenzus sekvence može obuhvatati zamenu na poziciji 71, 73 i/ili 78. U nekim aspektima ovih antitela, pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. Neka od ovih antitela dalje obuhvataju okvir konsenzus sekvence humanog lakog lanca κI.
[0064] Antitelo obelodanjenja može sadržati HVR-H3 koji obuhvata SEQ ID NO:6. Opisana ovde je varijanta HVR-H3 gde F11 je Y. Navedena varijanta antitela dalje sadrži HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 i HVR-H3, gde svaki obuhvata, redom, sekvencu opisanu u SEQ ID NOs:1, 2, 3, 4, i 6. U nekim slučajevima HVR-L1 obuhvata SEQ ID NO:7, 8, ili 9. Neka od ovih antitela dalje obuhvataju konsenzus sekvencu teškog lanca humane podgrupe III. Okvir konsenzus sekvence opciono obuhvata zamenu na poziciji 71, 73 i/ili 78. U nekim aspektima ovih antitela, pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. Neka od ovih antitela dalje obuhvataju okvir konsenzus sekvence humanog lakog lanca κI.
[0065] Ova antitela dalje mogu da obuhvataju konsenzus sekvencu teškog lanca humane podgrupe III. Okvir konsenzus sekvence može da obuhvata zamenu na poziciji 71, 73 i/ili 78. U nekim aspektima ovih antitela, pozicija 71 je A, 73 je T i/ili 78 je A. Neka od ovih antitela dalje obuhvataju okvir konsenzus sekvence humanog lakog lanca κI.
[0066] Poželjno je da, terapeutski agens predviđen za korišćenje na subjektu-domaćinu, izaziva malo ili nimalo imunogenog odgovora u datom subjektu. U jednom aspektu, pronalazak pruža takav agens. Na primer, u jednom aspektu, pronalazak pruža humanizovano antitelo koje izaziva i/ili se očekuje da izazove humani anti-glodarski odgovor (kao što su anti-mišji ili anti-pacovski odgovor) ili humani anti-humani odgovor na bitno smanjenom nivou u poređenju sa antitelom koje obuhvata sekvencu koja sadrži SEQ ID NOs: 10 i/ili 11 (Slike 1A i 1B) ili SEQ ID NOs: 12 i/ili 13 (Slike 9A i 9B opisujući pacov anti-mišju Fib504 amino kiselinsku sekvencu) u subjektu-domaćinu. U drugom primeru, pronalazak pruža humanizovano antitelo koje ne izaziva i/ili se očekuje da ne izazove humani anti-pacovski (kao što je humani anti-mišji (HAMA) ili humani anti-mišji) ili humani odgovor na anti-humano antitelo (HAHA).
[0067] Humanizovano antitelo može obuhvatati jednu ili više humanih i/ili humanih konsenzus sekvenci nehipervarijabilnih regiona (npr., okvir) u svom varijalbilnom domenu teškog i/ili lakog lanca. Može biti prisutna jedna ili više dodatna modifikacija u okviru humanih i/ili humanih konsenzus sekvenci nehipervarijabilnih regiona. Varijabilni domen teškog lanca antitela opciono obuhvata okvir humane konsenzus sekvence, koji je u jednom aspektu okvir konsenzus sekvence podgrupe III. Antitelo opciono obuhvata varijantu okvira konsenzus sekvence podgrupe III modifikovane na najmanje jednoj aminokiselinskoj poziciji. Na primer, varijanta okvira konsenzus sekvence podgrupe III može sadržati zamenu na jednoj ili više pozicija 71, 73, 78 i/ili 94. Na primer, pomenuta zamena je R71A, N73T, L78A, i/ili R94M, u ma kojoj kombinaciji.
[0068] Kao što je pozanto u stanju tehnike, i kako je detaljno opisano ovde, amino kiselinska pozicija/granica koja opisuje hipervarijabilni region antitela može varirati, u zavisnosti od konteksta i različitih definicija poznatim u oblasti (kao što je ispod opisano). Neke pozicije u okviru varijabilnog domena mogu biti posmatrane kao hibridne hipervarijabilne pozicije gde se za date pozicije može smatrati da su u okviru hipervarijabilnog regiona pod jednim setom kriterijuma dok se smatra da su van hipervarijabilnog regiona pod drugim setom kriterijuma. Jedna ili više ovih pozicija mogu takođe biti pronađene u produženim hipervarijabilnim regionima (kao što je nadalje definisano). Obelodanjenje omogućava antitela koja obuhvataju modifikacije ovih hibridnih hipervarijabilnih pozicija. U jednom aspektu, ove hibridne hipervarijabilne pozicije uključuju jednu ili više od pozicija 26-30, 33-35B, 47-49, 49, 57-65, 93, 94 i 102 u varijabilnom domenu teškog lanca. U jednom aspektu, ove hibridne hipervarijabilne pozicije uključuju jednu ili više od pozicija 24-29, 35-36, 46-49, 49, 56 i 97 u varijabilnom domenu lakog lanca. Antitelo obelodanjenja ože sadržati varijantu okvira konsenzus sekvence humane podgrupe modifikovano na jednoj
1
ili više hibridnih hipervarijabilnih pozicija, na primer, obuhvata varijabilni domen teškog lanca koji obuhvata varijantu okvira konsenzus sekvence humane podgrupe III, modifikovane na jednoj ili više pozicija 28-35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58-61, 63, 65, 94 i 102. Antitelo može sadržati T28F, F29I, S30T, S31N, Y32N, A33Y, M34W, i S35G zamene. U jednom slučaju antitelo obuhvata S49G zamenu, V50F ili V50D ili V50Y zamenu, G53Y zamenu, G54S zamenu, Y58S zamenu, A60N ili A60D ili A60T zamenu, D61P ili D61A ili D61H zamenu, V63L zamenu, G65S zamenu, R94M zamenu, R94A ili R94E ili R94G ili R94Q ili R94S zamenu, ili G95T zamenu. Takođe je ovde obelodanjeno antitelo koje obuhvata jednu ili više zamena na pozicijama 28-35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58-61, 63, 65, 94 i 102 i i dalje obuhvata jednu ili više zamena na pozicijama R71A ili N73T ili L78A ili L78F. Antitelo može da sadrži Y102F zamenu. Može se videti u referenci datoj na Slici 1B da su ove zamene u HVR-H1, HVR-H2, i/ili HVR-H3 teškog lanca.
[0069] Antitelo obelodanjenja može sadržati varijabilni domen lakog lanca koji uključuje okvir konsenzus sekvence varijante humane podgrupe I, modifikovane na jednoj ili više pozicija 27, 29-31, 33, 34, 49, 50, 53-55, 91 i 96. Antitelo može sadržati Q27E zamenu, ili I29V zamenu, ili S30D zamenu, ili N31T ili N31S ili N31D zamenu, ili Y32L, ili A34H zamenu, ili Y49K zamenu, ili A50Y zamenu, ili S53Q zamenu, ili L54S zamenu, ili E55I ili E55V zamenu, iliY91G zamenu, ili W96N ili W96L zamenu, ili A25S zamenu. Takođe je ovde obelodanjeno antitelo koje obuhvata A25 to G, S, T, ili V zamenu Takođe je ovde obelodanjeno antitelo koje obuhvata modifikacije odabrane od jedne ili više sledećih grupa zamena. Na primer, antitelo obuhvata S26 do G, I, K, N, P, Q, ili T zamene, ili Q27 do E, A,D, G, H, I, K, L, N, Q, R, ili V zamene, ili S28 do A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V, ili Y zamene, ili I29 to V, A, G, K, L, M, Q ili R zamene, ili S30 do D, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T ili V zamene, ili N31 do D, T, E, ili G zamene, ili Y32 do L, I ili M zamene, ili L33 do A, I, M ili V zamene, ili A34 do H, F, Y ili S zamene, ili Y49 do K ili N zamene, ili A50Y zamenu, ili S53Q zamenu, ili L54S zamenu, ili E55 do V, I ili K zamene, ili Y91G zamenu, ili W96 do N, L, W, Y, R, S, A, F, H, I, M, N, R, S, T, V ili Y zamene. Može se videti u referenci datoj na Slici 1B da su ove zamene u HVR-L1, HVR-L2, i/ili HVR-L3 lakog lanca.
[0070] Antitelo obelodanjenja može obuhvatati ma koji odgovarajući humani ili humani okvir konsenzus sekvence lakog lanca, pružajući antitelo koje ima željene biološke karakteristike (npr. željeni afinitet vezivanja). U jednom primeru antitelo obuhvata najmanje deo (ili ceo) okvira sekvence humanog κ lakog lanca. U jednom primeru antitelo obuhvata najmanje deo (ili ceo) okvira konsenzus sekvence humane podgrupe κ.
[0071] Ovde je takođe opisano antitelo koje obuhvata varijabilni domen teškog i/ili lakog lanca koji obuhvata okvir sekvence SEQ ID NOS: 34-41 prikazane na Slikama 1, 7 i 8, dajući pozicije 49 lakog lanca i 94 teškog lanca koje su uključene u produženim HVR-ima, i gde je data pozicija 49 kao K i data pozicija 94, poželjno ali ne obavezno, kao M i moguće kao R.
[0072] Antagonisti obelodanjenja mogu biti korišćeni u modulaciji jednog ili više aspekata beta7 asociranih efekata, uključujući ali ne ograničavajući se na asocijaciju sa alfa4 subjedinicom integrina, asocijaciju sa alfaE subjedinicom integrina, vezivanje alfa4beta7 integrina za MAdCAM, VCAM-1 ili fibronektin i vezivanje alfaEbeta7 integrina za E-kaderin. Ovi efekti mogu biti modulisani relevantnim mehanizmom, uključujući remećenje vezivanja liganda za beta7 subjedinicu ili za alfa4beta7 ili alfaEbeta dimerni integrin, i/ili remećenjem asocijacije između alfa i beta subjedinica integrina na taj način da je formiranje dimera integrina sprečeno. Shodno tome, obelodanjenje pruža na beta7 antagonist antitelo koje sprečava vezavanje alfa4 za beta7. Takođe je dat beta7 antagonist antitelo koji remeti vezivanje alfa4beta7 za MAdCAM ili beta7 antagonist antitelo pronalaska remeti vezivanje alfa4beta7 za VCAM-1, ili remeti beta7 antagonist antitelo pronalaska remeti vezivanje alfa4beta7 za fibronektin, ili remeti beta7 antagonist antitelo pronalaska remeti vezivanje beta7 za alfaE, ili beta7 antagonist antitelo pronalaska remeti vezivanje alfaEbeta7 integrina za E-adherin. Posredovanje može biti direktno ili indirektno. Na primer, beta7 antagonist antitelo može da se veže za beta7 u okviru sekvence alfa4beta7 ili alfaEbeta7 regiona dimerizacije, i tako da spreči interakciju između subjedinica integrina i formaciju dimera integrina. U daljem primeru, beta7 antagonist antitelo može da se veže za sekvencu u okviru ligand-vezujućeg domena beta7 subjedinice i tako da spreči interakciju pomenutog vezanog domena sa njegovim vezujućim partnerom (kao što je fibronektin, VCAM, i/ili MAdCAM za alfa4beta7 integrin; ili E-kadherin za alfaEbeta7 integrin). U drugom primeru, beta7 antagonist antitelo može da se veže za sekvencu koja se ne nalazi u okviru domena dimerizacije subjedinice integrina ili ligand vezujućeg domena, ali gde vezivanje pomenutog beta7 antagonist antitela rezultuje remećenjem sposobnosti beta7 domena da interaguje za svojim vezujućim partnerom (kao što je alfa4 ili alfaE subjedinica integrina i/ili ligand kao što je fibronektin, VCAM, MAdCAM, ili E-kadherin). Antagonist antitelo obelodanjenja vezuje se za beta7 (na primer, za vanćelijski domen) tako da se remeti beta7 dimerizacija sa alfa4 ili alfaE subjedinicom. Takođe je ovde dato antagonist antitelo koje vezuje se za beta7 tako da remeti sposobnost beta7 i/ili alfa4beta7 i/ili alfaEbeta7 integrina da se veže sa odgovarajući ligand ili ligande. Na primer, obelodanjenje pruža antagonist antitelo koje nakon vezivanja za beta7 molekul inhibira dimerizaciju datog molekula. Beta7 antagonist antitelo može specifično da veže sekvencu ligand-vezujućeg domena beta7. Beta7 antagonist antitelo pronalaska može specifično da veže sekvencu ligand-vezujućeg domena beta7 tako da je vezivanje liganda (tj., fibronektina, VCAM-a, i/ili MAdCAM-a) za alfa4beta7 integrin poremećeno. Beta7 antagonist antitelo može specifično da veže sekvencu ligand-vezujućeg domena beta7 tako da je vezivanje liganda (tj., E-kadherina) za alfaEbeta7 integrin poremećeno.
[0073] Ovde je takođe opisano antagonist antitelo koje remeti beta7 dimerizaciju koja obuhvata heterodimerizaciju (tj., beta7 dimerizaciju sa alfa4 ili alfaE molekulom subjedinice integrina).
[0074] Ovde je takođe opisano antagonist antitelo koje se vezuje za epitop na beta7 subjedinici integrina koji odgovara aminokiselinama 176-237, i antagonist antitelo koje se vezuje za isti epitop na beta7 integrinu koji se suštinski isti kao epitop Fib504.64 (ATCC HB-293). Određivanje vezivanja epitopa vrši se standardnim tehnikama uključujući analize vezivanja bez limitirajuće kompeticije.
[0075] Ovde je takođe opisano antitelo koje obuhvata kombinacije jednog, dva, tri, četiri, pet ili svih HVR sekvenci opisanih u tabeli aminokiselinskih zamena u Slici 13.
[0076] Poželjno je da, terapeutski agens predviđen za korišćenje na subjektu-domaćinu, izaziva malo ili nimalo imunogenog odgovora u datom subjektu. U jednom aspektu, pronalazak pruža takav agens. Na primer, u jednom aspektu, pronalazak pruža humanizovano antitelo koje izaziva i/ili se očekuje da izazove humani anti-pacovski ili humani anti-mišji ili humani anti-humani odgovor na bitno smanjenom nivou u poređenju sa antitelom koje obuhvata sekvencu SEQ ID NOS: 10, 11, 12 i/ili SEQ ID NO: 13 (rat anti-mouse Fib504 (ATCC HB-293), Slike 1 i 9) u subjektu-domaćinu. U drugom primeru, pronalazak pruža humanizovano antitelo koje ne izaziva i/ili se očekuje da ne izazove humani anti-mišji, humani anti-pacovski ili humani anti-mišji ili humani anti-humani odgovor.
[0077] Humanizovano antitelo obelodanjenja može sadržati jednu ili više humanih i/ili humane konsenzus sekvence ne-hipervarijabilnog regiona (npr. okvir) u svom varijabilnom domenu teškog i/ili lakog lanca. U nekim aspektima, jedna ili više dodatnih modifikacija su prisutne u okviru humanih i/ili humane konsenzus sekvence ne-hipervarijabilnog regiona. U jednom aspektu, t varijabilni domen teškog lanca antitela obelodanjenja obuhvata humani okvir konsenzus sekvence, koji je u jednom aspektu okvir konsenzus sekvence podgrupe III. Antitelo može da obuhvata varijantu okvira konsenzus sekvence podgrupe III modifikovanu na najmanje jednoj aminokiselinskoj poziciji. Na primer, u jednom aspektu, varijanta okvira konsenzus sekvence podgrupe III može obuhvatati zamenu na jednoj ili više pozicija 71, 73, 78 i/ili 94, iako je pozicija 94 deo proširenog hipervarijabilnog regiona H3 teškog lanca datog pronalaska. Data zamena može biti R71A, N73T, N78A, i/ili R94M, ili ma koja njihova kombinacija.
[0078] Antitelo obelodanjenja može obuhvatati bilo koji odgovarajući humani ili humani okvir konsenzus sekvence lakog lanca, dajući antitelo koje ima željene biološke karakteristike (npr., željeni afinitet vezivanja). U nekim slučajevima, antitelo datog pronalaska obuhvata najmanje jedan deo (ili ceo) okvira sekvence humanog κ lakog lanca. U nekim slučajevima, antitelo datog pronalaska obuhvata najmanje deo (ili ceo) okvira konsenzus sekvence humane κ podgrupe I.
[0079] Antagonisti obelodanjenja se mogu koristiti u modulaciji jednog ili više aspekata efekata asociranih sa beta7. Na primer, beta7 antagonist antitelo se može vezati za beta7 u okviru sekvence alfa4beta7 ili alfaEbeta7 dimerizacionog regiona, i tako sprečiti interakciju subjedinica integrina i formiranje integrinskog dimera. U daljem primeru, beta7 antagonist antitelo se može vezati za sekvencu u okviru ligand-vezujućeg domena beta7 subjedinice i tako sprečiti interakciju datog vezanog domena sa svojim vezujućim partnerom (kao što je fibronektin, VCAM, i/ili MadCAM za alfa4beta7 integrin; ili E-kadherin za alfaEbeta7 integrin). U drugom primeru, beta7 antagonist antitelo se može vezati za sekvencu koja se ne nalazi u okviru domena dimerizacije subjedinice integrina ili ligand vezujućeg domena, ali gde vezivanje pomenutog beta7 antagonist antitela rezultuje remećenjem sposobnosti beta7 domena da interaguje za svojim vezujućim partnerom (kao što je alfa4 ili alfaE subjedinica integrina i/ili ligand kao što je fibronektin, VCAM, MAdCAM, ili E-kadherin). U nekim slučajevima, antagonist antitelo obelodanjenja vezuje se za beta7 (na primer, za vanćelijski domen) tako da se remeti beta7 dimerizacija sa alfa4 ili alfaE subjedinicom. U nekim slučajevima, antagonist antitelo obelodanjenja vezuje se za beta7 tako da remeti sposobnost beta7 i/ili alfa4beta7 i/ili alfaEbeta7 integrina da se veže sa odgovarajući ligand ili ligande. Na primer, u nekim slučajevima, obelodanjenja pruža antagonist antitelo koje nakon vezivanja za beta7 molekul inhibira dimerizaciju datog molekula. U nekim slučajevima, beta7 antagonist antitelo obelodanjenja se specifično vezuje za sekvencu ligand-vezujućeg domena beta7. U nekim slučajevima u, beta7 antagonist antitelo obelodanjenja se specifično vezuje za sekvencu ligand-vezujućeg domena beta7 tako da je vezivanje liganda (tj., fibronektina, VCAM-a, i/ili MAdCAM-a) za alfa4beta7 integrin poremećeno. U nekim slučajevima, beta7 antagonist antitelo obelodanjenja se specifično vezuje za sekvencu ligand-vezujućeg domena beta7 tako da je vezivanje liganda (tj., E-kadherina) za alfaEbeta7 integrin poremećeno.
[0080] U nekim slučajevima, antagonist antitelo obelodanjenja remeti beta7 dimerizaciju koja obuhvata heterodimerizaciju (tj., beta7 dimerizaciju sa alfa4 ili alfaE molekulom subjedinice integrina).
[0081] U nekim slučajevima, beta7 antagonist antitelo koje ne posreduje u vezivanju liganda (kao što je fibronektin, VCAM, MAdCAM, ili alfaE) za beta7 subjedinicu kao dela integrina ili za alfa4beta7 integrin ili alfaEbeta7 integrin u vidu dimera, može biti prednost. Shodno tome, obelodanjenje pruža antitelo koje ne vezuje fibronektin, VCAM, MAdCAM, ili E-kadherin vezujuće mesto na beta7 ali, umesto toga, sprečava interakciju između beta7 i alfa subjedinice (kao što je alfa4 ili alfaE integrin subjedinica) tako da formiranje biološki aktivnog integrina biva sprečeno. U jednom primeru, antagonist antitelo obelodanjenja može se koristiti zajedno sa jednim ili više antagonista, gde su antagonisti ciljani u različitim procesima i/ili funkcijama u okviru beta7 integrin ose. Prema tome, u nekim slučajevima, beta7 antagonist antitelo obeldanjenja se vezuje za epitop na beta7 drugačijem od epitopa vezanog od strane drugog beta7 ili alfa/beta integrin antagonista (kao što je alfa4beta7 antitelo), uključujući monoklonsko antitelo ili antitelo, kao što je humanizovano antitelo ili monoklonsko antitelo poreklom od i/ili koje ima iste ili efektivno iste vezujuće karakteristike ili specifičnost kao antitelo poreklom od murinskog (potporodica mišolikih glodara) antitela.
[0082] Obelodanjenje dalje pruža beta7 antagonist antitelo koje remeti beta7-alfa4 ili alfaE multimerizaciju u odgovarajući integrin kao i vezivanje liganda. Na primer, antagonist antitelo koji remeti beta7 dimerizaciju sa alfa4 ili alfaE subjedinicom integrina dalje može biti u kompeticiji sa ligandom za vezivanje sa beta7 ili dimerom intregrina dimer (npr., može posredovati u vezivanju fibronektina, VCAM-a, i/ili MAdCAM-a za beta7 i/ili alfa4beta7; ili može posredovati u vezivanju E-kadherina za beta7 ili alfa4beta7)
[0083] U nekim slučajevima beta7 vezivanje antagonista za beta7 sprečava ćelijsku adheziju posredovanu vezivanjem liganda. U drugom aspektu beta7 antagonist antitela obelodanjenja, vezivanje antagonista za beta7 u ćeliji sprečava regrutaciju ćelija ka ćelijama i/ili tkivu u kojima je eksprimiran integrin koji sadrži beta7.
[0084] Ovde je takođe obelodanjen beta7 antagonist antitelo koje specifično vezuje najmanje deo aminokiselina od 176-250 (opciono aminokiselina od 176-237) vanćelijskog domena beta7 (videti Tidswell, M. i sar. (1997) J. Immunol. 159:1497-1505) ili varijantu ovoga, i smanjuje ili blokira vezivanje liganada MAdCAM, VCAM-1, fibronektina, i/ili E-kadherina.
[0085] Takvo blokiranje vezivanja liganda, može ometati, smanjili i/ili sprečavati adheziju ćelija koje eksprimiraju ligand sa ćelijama koje eksprimiraju ligand koji sadrži beta7. U nekim slučajevima, antagonist antitelo obelodanjenja specifično vezuje aminokiselinsku sekvencu beta7 koja obuhvata ostatke od 176-237. U nekim slučajevima, antagonist antitelo obelodanjenja specifično vezuje konformacione epitome formirane delom ili u celini od najmanje jedne od sekvenci odabranih iz grupe koja se sastoji od ostataka 176-237 beta7. U nekim slučajevima, antagonist antitelo obelodanjenja specifično vezuje aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99% identičnih sekvenci ili sličnosti sa aminokiselinskom sekvencom ostataka 176-237 ili ostataka 176-250 humanog beta7. U nekim slučajevima, antagonist anti-beta7 antitela obelodanjenja vezuje se za isti epitop kao i anti-beta7 antitelo Fib504 produkovano iz hibridoma ATCC HB-293.
1
[0086] Ovde je opisan sastav koji obuhvata jedno ili više sastava antagonist antitela pronalaska i nosač. Opciono, nosač je farmaceutski prihvatljiv.
[0087] U jednom aspektu pronalazak omogućava nukleinsku kiselinu koja kodira za beta7 antagonist antitelo pronalaska.
[0088] U jednom aspektu pronalazak omogućava vektore koji sadrže nukleinsku kiselinu pronalaska.
[0089] U jednom aspektu pronalazak omogućava ćelije domaćina koje sadrže nukleinsku kiselinu ili vektor prema pronalasku. Vektor može biti bilo koji po tipu, na primer rekombinantni vektor kao što je ekspresioni vektor. Bilo koja od mnogih ćelija domaćina može biti korišćena. U jednom aspektu, ćelija domaćin je prokariotska ćelija, na primer, E. coli. U jednom aspektu, ćelija domaćin je eukariotska ćelija na primer sisarska ćelija kao što je jajnik kinskog hrčka (CHO).
[0090] U jednom aspektu pronalazak omogućava metode pripremanja antagonista pronalaska. Na primer, pronalazak pruža metod pripreme beta7 antagonist antitela (koji, kao što je ovde definisano uključuje punu dužinu i njegove fragmente), gde pomenuti metod obuhvata ekspresiju rekombinantnog vektora pronalaska u odgovarajućoj ćeliji domaćinu, koji kodira dato antitelo (ili fragment), i nadoknađuje dato antitelo.
[0091] Opisan ovde je članak o proizvodnji koji obuhvata kontejner, i preparat sadržan u kontejneru, gde preparat sadrži jedno ili više beta7 antagonist antitela pronalaska. U jednom aspektu, preparat sadrži nukleinsku kiselinu pronalaska. U jednom aspektu, preparat sadrži antagonist antitelo koje dalje sadrži nosač, koji je u nekim aspektima farmaceutski prihvatljiv. U jednom aspektu, članak o proizvodnji pronalaska dalje sadrži instrukcije za primenu preparata (na primer, antagonist antitela) subjektu.
[0092] Opisan ovde je komplet koji sadrži prvo kontejner sa preparatom koji obuhvata jedno ili više beta7 antagonist antitela pronalaska, i drugi kontejner koji sadrži pufer. U jednom aspektu, pufer je farmaceutski prihvatljiv. U jednom aspektu, preparat koji sadrži antagonist antitelo dalje sadrži nosač, koji je u nekim aspektima farmaceutski prihvatljiv. U jednom aspektu, komplet dalje sadrži instrukcije za primenu preparata (na primer, antagonist antitela) subjektu. Beta7 integrini i njihovi ligandi su eksprimirani u stanjima bolesti. Ekspresija [MadCAM-1 na endotelijumu creva je povećana na mestima inflamacije mukoze kod pacijenata sa inflamatornom bolešću creva (UC i CD) i lamina propria kolona kod UC i CD pacijenata takođe pokazuje povećanje u ekspresiji CD3+ i a4b7+ ćelija u poređenju sa IBS kontrolama (videti Souza H., i sar., Gut 45:856 (1999)). Primećeno je da je MAdCAM-1 ekspresija u vezi sa inflamacijom portalnog trakta kod bolesti jetre i može biti važan u regrutaciji alfa4beta7+ limfocita u jetru tokom inflamacije (Hillan, K., i sar., Liver. 19(6):509-18 (1999)). MAdCAM-1na krvnim sudovima jetre pomaže adheziju a4b7+ limfocita pacijenata sa IBD i primarnim sklerotičnim holangitisom. Adhezija je sprečena sa anti-MAdCAM-1, antialfa4beta7, ili auti-alfa4 antitelima (Grant AJ. i sar., Hepatology. 33(5):1065-72 (2001)). MAdCAM-1, VCAM-1 i E-kadherin su eksprimirani na endotelnim ćelijama mozga i/ili malim krvnim sudovima centralnog nervnog sistema pod upalom. Beta7 integrini doprinose demijelinizaciji CNS-a (Kanwar i sar., J. Neuroimmunology 103, 146 (2000)). Ekspresija alfa4beta7 je značajno povećana u LPL kod CD u poređenju sa kontrolama i pacijentima sa UC (Oshitani, N. i sar., International Journal of Molecule Medicin 12, 715-719 (2003)). IEL-ovi CD pacijenata mogu biti hronično stimulisani i regrutovani sa periferije (Meresse, B., i sar., Human Immunology, 62, 694-700 (2001)). Kod bolesti jetre kod ljudi, alfaEbeta7 T ćelije (CD4+ i CD8+) se prvenstveno akumuliraju u jetri ljudi tamo gde je E-kadherin eksprimiran na hepatocitima i epitelu žučnih kanala (Shimizu, Y., i sar., Journal of Hepatology 39, 918-924 (2003)). Kod hroničnog pankreatitisa CD8+CD103+ T ćelije se, analogno intraepitelnim limfocitima creva, infiltriraju u pankreas (Mattias, P., i sar., Am J Gastroenterol 93:2141-2147 (1998)). Povećanje alfaEbeta7 je nađeno kod pacijenata sa sistemskim eritemskim lupusom sa specifičnim učešćem epitela (Pang i sar., Arthritis & Rheumatism 41: 1456-1463 (1993)). Kod Sjorgren sindroma, CD8+ alfaEbeta7+ T ćelije prijanjaju za i ubijaju acinarne epitelne ćelije indukujući apoptozu (Kronld i sar., Scand J Rheumatol 27:215-218, 1998). Integrin alfa4beta7 i alfaEbeta7 igraju ulogu u T ćelijskom epitropizmu tokom upale kože i doprinose odbacivanju alografta kože (Sun i sar., Transplantation 74, 1202, 2002). Teraki i Shiohara su pokazali preferencijalnu ekspresiju aEb7 integrina na CD8+ T ćelijama u psorijatičnom epidermisu (Teraki i Shiohara, Br. J. Dermatology 147, 1118, 2002). T limfociti sputuma su aktivirani IEL-ovi (CD69+ CD 103+) u astmi, COPD-u, i normalnim subjektima (Leckie et. al., Thorax 58, 23, 2003). CD103+ (aEb7+) CTL se akumuliraju u epitalu grafta tokom kliničkog bubrežnog odbacivanja alografta (Hadley i sar., Transplantation 72, 1548, 2001)]. Stoga, u jednom aspektu, pronalazak pruža upotrebu beta7 antagonist antitelo pronalaska u sprečavanju beta7 integrin-ligand interakcije kako bi se smanjila ili ublažilabolest, kao što je jedno ili više iznad opisanih bolestima uzrokovanih stanja. U jednom aspektu, antitelo pronalaska se upotrebljava u pripremi leka za terapeutski i/ili profilaktički tretman bolesti, kao što je inflamatorna bolest uključujući, bez ograničenja, inflamatornu bolest creva (kao što su Kronova bolest i ulcerativni kolitis), inflamatornu bolest jetre, inflamaciju CNS-a, hronični pankreatitis, sistemski eritemski lupus, Sjogrenov sindrom, psorijazu i upalu kože, astmu, hroničnu opstruktivnu bolest pluća (COPD), intersticijalnu bolest pluća, autoimunu bolest, odbacivanje bubrežnog grafta, bolesti vezane za presađivanje tkiva, dijabetes i kancer.
[0093] Ovde je opisana i upotreba nukleinskih kiselina u pripremi lekova za terapeutske i/ili profilaktičke tretmane bolesti, kao što je imuni (kao što su autoimuni ili inflamatorni) poremećaj uključujući bez ograničenja, inflamatornu bolest creva (kao što su Kronova bolest i ulcerativni kolitis) i alergijske reakcije (kao što su poremećaji respiratornog sistema, kože, zglobova, alergijske astme i drugih organa pogođenih alergijskom reakcijom posredovanom integrinom koji sadrži beta7).
[0094] Takođe je opisana i upotreba ekspresionog vektora pronalaska u pripremi leka za za terapeutske i/ili profilaktičke tretmane bolesti, kao što je imunski (kao što su autoimuni ili inflamatorni) poremećaj uključujući bez ograničenja, inflamatornu bolest creva (kao što su Kronova bolest i ulcerativni kolitis) i alergijske reakcije (kao što su poremećaji respiratornog sistema, kože, zglobova i drugih organa pogođenih alergijskom reakcijom posredovanom integrinom koji sadrži beta7).
[0095] Takođe je opisana i upotreba ćelije domaćina pronalaska u pripremi leka za terapeutske i/ili profilaktičke tretmane bolesti, kao što je imunski (kao što su autoimuni ili inflamatorni) poremećaj uključujući bez ograničenja, inflamatornu bolest creva (kao što su Kronova bolest i ulcerativni kolitis) i alergijske reakcije (kao što su poremećaji respiratornog sistema, kože, zglobova i drugih organa pogođenih alergijskom reakcijom posredovanom integrinom koji sadrži beta7).
[0096] Ovde je takođe opisana i upotreba članka o proizvodnji pripreme leka za terapeutske i/ili profilaktičke tretmane bolesti, kao što je imunski (kao što su autoimuni ili inflamatorni) poremećaj uključujući bez ograničenja, inflamatornu bolest creva (kao što su Kronova bolest i ulcerativni kolitis) i alergijske reakcije (kao što su poremećaji respiratornog sistema, kože, zglobova i drugih organa pogođenih alergijskom reakcijom posredovanom integrinom koji sadrži beta7).
[0097] Ovde je takođe opisana i upotreba kompleta u pripremi leka za terapeutske i/ili profilaktičke tretmane bolesti, kao što je imunski (kao što su autoimuni ili inflamatorni) poremećaj uključujući bez ograničenja, inflamatornu bolest creva (kao što su Kronova bolest i ulcerativni kolitis) i alergijske reakcije (kao što su poremećaji respiratornog sistema, kože, zglobova i drugih organa pogođenih alergijskom reakcijom posredovanom integrinom koji sadrži beta7).
[0098] Ovde su takođe opisani metodi i sastavi korisni za modulaciju bolesnih stanja povezanih sa disregulacijom interakcije beta7 integrina posredovanog ćelija-ćelija procesom. Beta7 integrini su uključeni u višestruke biološke i fiziološke funkcije, uključujući, na primer, inflamatorne poremećaje i alergijske reakcije.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0099]
Slike 1A i 1B prikazuju svrstavanje sekvenci varijabilnih lakih i teških lanaca za sledeće: konsenzus sekvencu lakog lanca humane podgrupe kappa I (Slika 1A, SEQ ID NO:23), konsenzus sekvencu teškog lanca humane podgrupe III (Slika 1B, SEQ ID NO:24), pacov anti-miš beta7 antitelo (Fib504) varijabilni laki lanac (Slika 1A, SEQ ID NO: 10), pacov anti-miš beta7 antitelo (Fib504) varijabilni teški lanac (Slika 1B, SEQ ID NO:11), i humanizovane varijante antitela: Humanizovani hu504K graft varijabilni laki lanac (Slika 1A, SEQ ID NO:25), humanizovani hu504K graft varijabilni teški lanac (Slika 1B, SEQ ID NO:26), varijantu hu504.5 (aminokiselinske varijacije humanizovanog hu504K grafta su navedeni u Slika 1A (laki lanac) i Slika 1B (teški lanac) za varijante hu504.5, hu504.16, i hu504.32. Dodatne aminokiselinske zamene u HVR-H1 i HVR-H2 hu504K grafta koje rezultuju beta7 vezivanjem antitelima prikazane su na Slici 1C.
1
Slike 2A i 2B prikazuju punu dužinu sekvence humane konsenzus sekvence podrupe III lakog lanca (Slika 2A, SEQ ID NO:27) i teškog lanca (Slika 2B, SEQ ID NO:28). HVR-ovi su podvučeni. Slike 3A i 3B prikazuju punu dužinu sekvence humanizovanog 504 grafta koji sadrži pacovske Fib504 hipervarijabilne regione (kao što je ovde opisano) ukalemljene u humanu konsenzus sekvencu kappa I lakog lanca (Slika 3A, SEQ ID NO: 29) i u humanu konsenzus sekvencu podgrupe III teškog lanca podrupe III (Slika 3B, SEQ ID NO:30). HVR-ovi su podvučeni.
Slike 4A i 4B prikazuju punu dužinu sekvence humanizovanog 504K grafta u kojem je pozicija 49 lakog lanca hu504 grafta zamenjena sa Y49K. Hu504K graft lakog lanca je opisan u SEQ ID NO:31 i hu504K graft teškog lanca je opisan u SEQ ID NO:30. HVR-ovi su podvučeni.
Slike 5A i 5B prikazuju punu dužinu sekvence hu504K-RF grafta u kojem su pozicije 71 i 78 teškog lanca hu504 grafta zamenjene sa A71R i A78F iz hu504K graft sekvence. Hu504K-RF graft lakog lanca je opisan u SEQ ID NO:31 i hu504K-RF graft teškog lanca je opisan u SEQ ID NO:32. HVR-ovi su podvučeni.
Slike 6A i 6B prikazuju punu dužinu sekvence hu504.32 varijante koja obuhvata teški lanac hu504K-RF grafta (SEQ ID NO:32) i T31D i Y32L zamene u lakom lancu hu504K grafta (SEQ ID NO:33). HVR-ovi su podvučeni.
Slike 7A - Slika 7B i Slika 8A - Slika 8B prikazuju primere akceptora humanog okvira konsenzus sekvenci za primenu u praktikovanju instant pronalaska sa sledećim identifikatorima sekvence:
Varijabilni laki (VL) konsenzus okviri (Slike 7A,B)
humani konsenzus okvir VL kappa podgrupe I (SEQ ID NO:14)
humani konsenzus okvir VL kappa podgrupe I minus proširenje HVR-L2 (SEQ ID NO: 15) humani konsenzus okvir VL kappa podgrupe II (SEQ ID NO:16)
humani konsenzus okvir VL kappa podgrupe III (SEQ ID NO:17)
humani konsenzus okvir VL kappa podgrupe IV (SEQ ID NO:18)
Osenčeni regioni predstavljaju HVR-ove lakog lanca (označene kao L1, L2, i L3).
Varijabilni teški (VH) konsenzus okviri (Slike 8A, B)
humani konsenzus okvir VH podgrupe I minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO:19) humani konsenzus okvir VH podgrupe I minus prošireni hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:20-22)
humani konsenzus okvir VH podgrupe II minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO:48) humani konsenzus okvir VH podgrupe II minus prošireni hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:49-51)
humani konsenzus okvir VH podgrupe III minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO:52) humani konsenzus okvir VH podgrupe III minus prošireni hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:53-55)
humani VH akceptor okvira minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO:56)
humani VH akceptor okvira minus prošireni hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:57-58) humani VH akceptor okvira 2 minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO:59)
humani VH akceptor okvira 2 minus prošireni hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:60-62)
1
Slike 9A i 9B prikazuju aminokiselinski sekvencu varijabilnih lanaca pacov anti-mišjeg integrin beta7 Fib504 antitela produkovanih hibridomom ATCC HB-293. HVR-ovi su podvučeni. Varijabilni laki lanac je prikazan na Slici 9A (SEQ ID NO:12) i varijabilni teški lanac je prikazan na Slici 9B (SEQ ID NO:13).
Slika 10A prikazuje aminokiselinske pozicije u različitim konsenzus sekvencama teškog (hu podrupa I-III). Konsenzus sekvenca korišćena u stvaranju Herceptin® anti-HER2 antitela, pacovskog Fib504, i hu504-RL i hu504-RF okvira su opisane u Primerima. Slika 10B je bar-grafik koji prikazuje relativna vezivanja alfa4beta7 za hu504 graft antitelo i hu504K graft antitelo kao funkciju od "RL" ili "RF" okvira modifikacija kao što je opisano u Primeru 1.
Slike 11A-11C. Slika 11A svrstava HVR promene koje su rezultat sazrevanja afiniteta izvedenog nuđenjem ograničenog opsega aminokiselinskih zamena u hu504.16 varijanti. Rezultati su iz biblioteka sa zasebno modifikovanim HVR-ovima u hu504.16 varijanti kao što je opisano u Primeru 2. Aminokiselinske skraćenice u poljima su aminokiselina koje se češće nalaze u beta7-vezujućim antitelima (fag-selektovana antitela). Slike 11B i 11C su bar-grafici rezultata u Slici 11A koje ukazuju na broj i tip aminokiselinskih zamena u hu504.16 varijanti (laki lanac, Slika 11B; teški lanac, Slika 11C) detektibilnih mutagenezom i selekcionim metodama Primera 2.
Slika 12 prikazuje rezultate sazrevanja afiniteta izvedenog nuđenjem širokog opsega aminokiselinskih zamena u HVR-ovima hu504.32 varijante kao što je opisano u Primeru 2. Osenčena polja ukazuju na amino kiseline koje su detektovane češće u antitelima detektovanim mutagenezom i selekcionim metodama Primera 2 kao beta7-vezujuća antitela.
Slika 13 prikazuje HVR sekvence pacov anti-mišjeg Fib504 (ATCC-293), i humani konsenzus (leve kolon). Primeri aminokiselinskih zamena za svaku HVR poziciju (ne znači da su ograničene) esejima opisanim u Primerima (aminokiselinske zamene opažene blagom aminokiselinskom randomizacijom, skeniranjem širokih aminokiselinskih zamena, i skeniranjem ograničenih aminokiselinskih zamena) su prikazani desno, (koristan metod modifikacije HVR-ova za humanizaciju, primenljivu na varijantama datog pronalaska, se nalazi u SAD prijavi pod serijskim brojem 60/545,840, podnet februara 19, 2004).
Slika 14 je primer grafičke prezentacije Fib504 i varijante antitela koje se vezuje za MAdCAM kao funkcija koncentracije antitela kako je opisano u Primeru 3. Određene su IC50 i IC90 vrednosti za antitela.
Slika 15 prikazuje aminokiselinske sekvence lakog i teškog lanca za 504.32R anti-beta7 antitelo u pogledu na poziciju shodno Kabat sistemu obeležavanja i relativnom sistemu obeležavanja (A-F) za šest HVR-ova antitela. Aminokiselina na pozicijama 71, 73, i 78 FR3 regiona teškog lanca su takođe opisane. Korisne aminokiselinske zamene su takođe navedene za mnoge pozicije u HVR-ovima ili FR3 regionu teškog lanca.
Slika 16 prikazuje bar-grafike relativne sposobnosti 504.32M i 504.32R antitela da blokiraju regrutaciju radio-obeleženih T ćelija u kolonu miševa sa inflamatornom bolešću creva.
MODALITETI ZA SPROVOĐENJE PRONALASKA
Opšte tehnike
[0100] Primena datog pronalaska podrazumeva korišćenje, sem ako nije drugačije navedeno, konvencionalne tehnike molekularne biologije (uključujući rekombinantne tehnike), mikrobiologije, ćelijske biologije, biohemije i imunologije, koje su u okviru veština iz oblasti. Takve tehnike su objašnjene u potpunosti u literaturi, kao što su, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", drugo izdanje (Sambrook i sar., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods u Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols u Molecular Biology" (F. M. Ausubel i sar., izdanje 1987, i periodična ažuriranja); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis i sar., izd., 1994); "A Practical Guide to Molecular Cloning" (Perbal Bernard V., 1988); "Phage Display: A Laboratory Manual" (Barbas i sar., 2001).
1
Definicije
[0101] Pod "beta7 subjedinicom" ili "β7 subjedinicom" misli se na humanu subjedinicu β7 integrin subunit (Erle i sar., (1991) J. Biol. Chem. 266:11009-11016). Beta7 subjedinica se vezuje za alfa4 subjedinicu integrina, kao što je humana a4 subjedinica (Kilger i Holzmann (1995) J. Mol. Biol.73:347-354). Alfa4beta7 integrin je eksprimiran na većini zrelih limfocita, kao i na maloj populaciji timocita, ćelija kostne srži i mastocitima (Kilshaw i Murant (1991) Eur. J. Immunol. 21:2591-2597; Gurish i sar., (1992) 149: 1964-1972; i Shaw, S.K. i Brenner, M.B. (1995) Semin. Immunol.7:335). Beta7 subjedinica se takođe vezuje za alfaE subjedinicu, kao što je humana alfaE subjedinica integrina (Cepek, K.L, i sar. (1993) J. Immunol.
150:3459). AlfaEbeta7 integrin je eksprimiran na intra-intestinalnim epitelnim limfocitima (iIELs) (Cepek, K.L. (1993) supra). Beta7 subjedinica koja se vezuje za humanizovano anti-beta7 antitelo pronalaska može se naći u prirodi i može biti solubilna ili lokalizovana na površini ćelije.
[0102] Pod "alfaE subjedinicom" ili "alfaE subjedinicom integrina" ili "αE subjedinicom" ili "αE subjedinicom integrina" ili "CD103" misli se na subjedinicu integrina asociranu sa beta7 integrinom na intraepitelnim limfocitima, gde potonji alfaEbeta7 integrin posreduje u vezivanju iEL-a za crevni epitel koji eksprimira E-kadherin (Cepek, K.L. i sar. (1993) J. Immunol.150: 3459; Shaw, S.K. i Brenner, M.B. (1995) Semin. Immunol.7:335).
[0103] "MAdCAM" ili "MAdCAM-1" se koriste naizmenično u kontekstu datog pronalaska i odnose se na protein adhezioni molekul-1 mukoznih adresin ćelija, koji je jednolančani polipeptid koji sadrži kratak citoplazmatični rep, transmembranski region i vanćelijsku sekvencu koju čin tri imunoglobulnu slična domena. Kloniranesu cDNK za MAdCAM-1 pacova, miša, čoveka i makakija (Briskin, et al, (1993) Nature, 363:461-464; Shyjan i sar., (1996) J. Immunol.156:2851-2857)..
[0104] "VCAM-1" ili "vaskularni ćelijski adhezioni molekul-1" "CD106" odnosi se na ligand za alfa4beta7 i alfa4betal, eksprimiran na aktiviranom endotelu i važan je u interakcijama između endotela i leukocita kao što su vezivanje i transmigracija leukocita tokom inflamacije.
[0105] "E-kadherin" se odnosi na člana familije kadherina, gde je E-kadherin eksprimiran na ćelijama epitela. E-kadherin je ligand za alfaEbeta7 integrin i posreduje u vezivanju iEL koje eksprimiraju alfaEbeta7 za crevni epitel, iako je njegova funkcija u regrutaciji limfocita nejasna. Ekspresija E-kadherina je povećana posredstvom TGF-beta1.
[0106] "Fibronektin" se odnosi na Fibronektin koji je uključen u reparaciju tkiva, embriogenezu, zgrušavanje krvi i ćelijsku migraciju/adheziju. On služi kao veza u ECM-u (vanćelijskom matriksu) i kao dimer nađen u plazmi (plazma fibrinktin). Plazma forma je sintetisana od strane hepatocita, dok je ECM forma poreklom od fibroblasta, hodrocita, ednotelnih ćelija, makrofaga, kao i nekih epitelnih ćelija. U ovom kontekstu, on interaguje sa alfa4beta7 integrinom i tako posreduje u aspektima regrutacije limfocita ili adhezije. ECM forma fibronektina služi kao generalni ćelijski adhezioni molekul usidravanjem ćelija za kolagen ili proteoglikanse supstrate. Fibronektin takođe služi u organizaciji ćelijske interakcije sa ECM-om vezivanjem za različite komponente vanćelijskog matriksa i za membranske fibronektinske receptora na površini ćelija. Konačno, fibronektin je važan u događajima u migraciji ćelija tokom embriogeneze.
[0107] "Gastrointestinalni inflamatorni poremećaji" su grupa hroničnih poremećaja koji uzrokuju inflamaciju i/ili ulceraciju mukozne membrane. Ovi poremećaju uključuju, na primer, inflamatornu bolest creva (npr. Kronovu bolest, uclerativni kolitis, neodređeni kolitis i infektivni kolitis), mukozitis (npr., oralni mukozitis, gastrointestinalni mukozitis i proktitis), nekrozni enterokolitis i ezofagitis.
[0108] "Inflamatorna bolest creva" ili "IBD" se naizmenično koristi u odnosu na bolesti creva koja izazivaju inflamaciju i/ili ulceraciju i uključuju bez ograničenja Kronovu bolest i ulcerativni kolitis.
[0109] "Kronova bolest (CD)" ili "ulcerativni kolitis (UC)" su hronične inlfamatorne bolesti creva nepoznat etiologije. Kronova bolest, za razliku od ulcerativnog kolitisa, može da pogodi bilo koji deo creva. Najprepoznatljivija karakteristika Kronove bolesti je granularno, crveno na bordo edematozno zadebljanje zida creva. Sa razvojem inflamacije, ovi granulomi često izgube svoje granice i integrišu sa okolnim tkivom. Dijareja i opstrukcije creva su predominantne u kliničkoj slici. Kao i kod ulcerativnog kolitisa, tok Kronove bolesti takođe može biti kontunialan ili sa relapsima, blag ili težak, ali za razliku od ulcerativnog kolitisa,
1
Kronova bolest nije izlečiva resekcijom obolelog segmenta creva. Većina pacijenata sa Kronovom bolešću mora biti operisano u nekom trenutku, ali čest je sledstveni relaps i kontinuiran medicinski tretman je uobičajen.
[0110] Kronova bolest može obuhvatiti bilo koji deo alimentarnog trakta od usta do anusa, iako se tipično pojavljuje u ileokoličnom, regionu tankog creva ili kolono-anorektalnom regionu. Histopatološki, bolest se manifestuje diskontinualnim granulomatozama, kriptičnim apcesima, fisurama i aftoidnim ulcerima. Inflamatorni infiltrat je mešovit, sačinjavajući se od limfocita (i T i B ćelija), plazma ćelija, makrofaga i neutrofila. Postoji disproporcionalno povećanje u IgM- i IgG-sekretujućim plazma ćelijama, makrofagima i neutrofilima.
[0111] Anti-inflamatorni lekovi kao što su sulfasalazin i 5-aminosalicilna kiselina (5-ASA) su korisni za tretiranje blagog oblika Kronove bolesti kolona i uobičajeno se prepisuju kako bi se bolest održala u remisiji. Metroidazol i ciprofloksacin imaju sličan efekat kao sulfasalazin i čini se da su posebno korisni u tretiranja perianalne bolesti. U težim slučajevima, kortikosteroidi su efkisani u tretiranju aktivnih egzarcebacija i mogu čak održati remisiju. Azatioprin i 6-merkaptopurin su takođe uspešni kod pacijenata kod kojih neophodna hronična primena kortikosteroida. Takođe je moguće da ovi lekovi imaju ulogu u dugotrajnoj profilaksi. Na nesreću, kod nekih pacijenata može da postoji dugo odlaganje (do šest meseci) početka akcije.
[0112] Lekovi protiv dijareje takođe mogu pružiti simptomatično olakšanje kod nekih pacijenata. Nutriciona terapija ili elementalna dijeta mogu poboljšati nutritvni status pacijenta i indukovati simptomatično poboljšanje akutne bolesti, ali ne i održivu kliničku remisiju. Antibiotici se koriste u tretmanu sekundarnih bakterijskih prerastanja u tankom crevu i u tretmanu piogenih komplikacija.
[0113] "Ulcerativni kolitis (UC)" pogađa debelo crevo. Tok bolesti može biti kontinualan ili sa relapsima, blag ili težak. Najranija lezija je inflamatorni infiltrat sa formacijom apcesa u bazi Liberkunovih kripti. Srastanje ovih naduvenih i oštećenih kripti odvaja mukozni sloj iznad od krvotoka, i vodi ulceraciji. Simptomi bolesti uključuju grčeve, bol u donjem abdomenu, rektalno krvarenje, i učestale, retke stolice koje se uglavnom sastoje od krvi, gnoja i mukusa sa oskudnim delovima fekalija. Totalna kolektomija može biti neophodna za akutni, težak ili hroničan, uporan ulcerativni kolitis.
[0114] Klinička slika UC je vrlo različita, i početak bolesti može biti podmukao ili nagao, i može obuhvatiti dijareju, tenezmus i rektalno krvarenje u navratima. Sa munjevitim širenjem na ceo kolon, toksični megakolon, može se doći u životnu opasnost. Ekstraintestinalne manifestacije mogu uključiti artritis, piodermnu gangrenu, uveitis i eritemu nodosum.
[0115] Tretman UC obuhvata sulfasalazin i srodne lekove koji sadrže salicilate za blage oblike bolesti i kortikosteroidne lekove za teške oblike. Topikalna primena bilo salicilata ili kortikosteroida je ponekad efikasna, posebno ka je bolest ograničena na distalno crevo, i asocirana sa smanjenim neželjenim efektima u poređenju sa sistemskom primenom. Pomoćne mere kao što su davanje gvožđa ili agenasa protiv dijareje su ponekad indikovane. Azatioprin, 6-merkaptopurin i metotreksat su takođe nekad prepisani kod upornih kortikosteroid-zavisnih slučajevima.
[0116] “Modifikacija” aminokiselinskog ostatka/pozicije, kako se ovde koristi, odnosi se na promenu primarne aminokiselinske sekvence u poređenju sa početnom aminokiselinskom sekvencom, gde je promena rezultat zamene sekvence datog ostatka/pozicije. Na primer, tipična modifikacija uključuje zamenu ostatka (ili na datoj poziciji) drugom aminokiselinom (npr., konzervativna ili ne-konzervativna zamena), ubacivanje jedne ili više (generalno manje od 5 ili 3) aminokiselina pored datog ostatka/pozicije, i uklanjanje datog ostatka/pozicije. “Aminokiselinska zamena”, ili njena varijanta, odnosi se na zamenu postojećeg aminokiselinskog ostatka u predeterminisanoj (početnoj) aminokiselinskoj sekvenci za drugim aminokiselinskim ostatkom. Generalno i poželjno, modifikacija rezultuje promenom u najmanje jednoj fizičko-biohemijskoj aktivnosti varijante polipeptida u poređenju sa polipeptidom sa početnom (ili “wild type”, “divljim tipom”) aminokiselinskom sekvencom. Na primer, u slučaju antitela, fizičko-hemijske aktivnosti koje su izmenjene mogu biti afinitet vezivanja, kapacitet vezivanja, i/ili efekat vezivanja na ciljni molekul.
[0117] Termin “aminokiselina” u okviru datog pronalaska se koristi u najširem smislu i obuhvata L αaminokiselina ili ostatke koji se nalaze u prirodi. Uobičajeno korišćene skraćenice od jednog i tri slova za
1
aminokiselina koje se nalaze u prirodi se koriste i ovde herein (Lehninger, A.L., Biochemistry, 2-ga izd., pp.
71-92, (Worth Publishers, New York, New York, 1975). Terminom su obuhvaćene i D-aminokiselina kao i hemijski modifikovane aminokiselina kao što su aminokiselinski analozi, aminokiselina koje se nalaze u prirodi ali ne u sastavu proteina kao što je norleucin, i hemijski sintetisana jedinjenja koja imaju osobin za koje se u oblasti zna da su karakteristične za aminokiselinu. Na primer, analozi ili mimetici fenilalanina ili prolina, koji omogućavaju istu konformacionu restrikciju peptidnih jedinjenja kao prirodni Phe ili Pro su obuhvaćeni definicijom aminokiseline. Takvi analozi i mimetici se ovde označavaju kao “funkcionalni ekvivalenti” aminokiseline. Drugi primeri aminokiselina su dati u Roberts i Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross i Meiehofer, Eds., Vol.5, p.341 (Academic Press, Inc., New York, New York, 1983). Tamo gde je jedno slovo korišćeno u određivanju aminokiselina koja se nalazi u prirodi, odrednice se uobičajeno nalaze u literaturi (videti, na primer, Alberts, B. i sar. Molecular Biology of the Cell, 3rd ed., Garland Publishing, Inc.1994, page 57).
[0118] “Izolovano” antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili izdvojeno iz komponente njegovog prirodnog okruženja. Kontaminirajuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičke ili terapeutske upotrebe antitela, i mogu obuhvatati enzime, hormone, i druge proteinske i ne-proteinske rastvore. U poželjnim aspektima, antitelo će biti prečišćeno (1) do više od 95% po težini antitela kako je determinisano metodom po Lowry-ju, i najpoželjnije više od 99% po težini antitela, (2) do stepena kad je moguće odrediti najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence korišćenjem “spinning cup” sekvenatora, ili (3) homogenosti na SDS-PAGE pod redukujućim ili ne-redkujućim uslovima korišćenjem Coomassie plavog ili, poželjno srebrnog bojenja. Izolovano antitelo obuhvata antitelo u situ u rekombinantnoj ćeliji pošto najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Obično, ipak, izolovano antitelo će biti pripremljeno u najmanje jednom koraku prečišćavanja.
[0119] Termin “obeležavanje ostatka varijabilnog domena po Kabat-u” ili “obeležavanje pozicija aminokiselinskih pozicija po Kabat-u”, i varijacija s tim u vezi, odnosi se na sistem obeležavanja kompilacije antitela po Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca. Korišćenje ovog sistema obeležavanja, data linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili više aminokiselina u skladu sa skraćivanjem, ili dodavanjem u FR ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može obuhvatati jedan aminokiselinski dodatak (ostatak 52a shodno Kabat-u) nakon ostatka 52 u H2 i dodatog ostatka (npr. ostataka 82a, 82b, i 82c, itd shodno Kabat-u) posle FR ostatka 82 teškog lanca. Obeležavanje ostataka po Kabat-u može biti određeno za dato antitelo shodno svrstavanju sekvence antitela po homolognim regionima sa “standardnom” Kabat obeleženom sekvencom.
[0120] Fraza “suštinski sličan”, ili “suštinski isti”, kako se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen sličnosti između dve numeričke vrednosti (generalno jedne asocirane sa antitelom pronalaska i druge asocirane sa referentnim/onim s kojim se upoređuje antitelom) tako da stručnjak u oblasti smatra da je razlika između dve vrednosti od male ili ne-biološke i/ili statističke značajnosti u okviru konteksta biološke karakteristike koja se meri datim vrednostima (npr., Kd vrednostima). Razlika između date dve vrednosti je poželjno manja od oko 50%, poželjno manja od oko 40%, poželjno manja od oko 30%, poželjno manja od oko 20%, poželjno manja od oko 10% u funkciji vrednosti referentnog/onog sa kojim se upoređuje antitelom.
[0121] “Vezujući afinitet” se generalno odnosi na jačinu zbir ukupnih ne-kovalentnih interakcija između jednog vezivnog mesta molekula (npr., antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr., antigena). Ukoliko nije drugačije napomenuto, kao što se ovde koristi, “vezujući afinitet” se odnosi na unutrašnji vezujući afinitet koji reflektuje 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (npr., antitelo i antigen). Afinitet molekula X za njegovog partnera Y generalno se može predstaviti konstantnom disocijacije (Kd). Afinitet se može izmeriti uobičajenim metodama u oblasti, uključujući one opisane ovde. Antitela niskim afiniteta generalno vezuju antigen sporo i imaju tendenciju da disociraju brzo, dok antitela sa visokim afinitetom generalno vezuju antigen brže i imaju tendenciju da ostanu vezana duže. Brojne metode za merenje afiniteta vezivanja su poznat u oblasti, i bilo koja se može koristiti za svrhu datog pronalaska. Specifični ilustrativni aspekti su opisani u daljem toku.
2
[0122] U jednom aspektu, "Kd" ili "Kd vrednost" shodno pronalasku je merena radio-obeleženim antigenvezujućim esejem (RIA) izvedenim sa Fab verzijom antitela od interesa i njegovim antigenom kako je opisano u sledstvenom eseju koji meri vezujuću aktivnost Fab-ova u rastvoru za antigen ekvilibrišući Fab sa minimalnom koncentracijom (125I)-obeleženog antigena u prisustvu titracione serije neobeleženih antigena, i potom zauzetim vezanim antigenom sa pločom presvučenom sa anti-Fab antitelom (Chen, i sar., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Kako bi se uspostavili uslovi za esej, mikrotitar ploče (Dynex) su presvučene preko noći sa ug/ml vezujućim anti-Fab antitelom (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9.6), i zatim blokirane sa 2% (w/v) goveđim serum albuminom u PBS-u tokom dav do pet sati na sobnoj temperaturi (otprilike 23°C). u neadsorbujućoj ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [125I]-antigena su pomešane sa serijskim razblaženjima Fab-a od interesa (npr., u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta i sar., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab od interesa je potom inkubiran preko noći; ipak, inkubacija se može nastaviti tokom duže perioda (npr., 65 sati) kako bi se osiguralo uspostavljanje ravnoteže. Posle toga, smeše su prebačene na ploču za prihvatanje i inkubirane na sobnoj temperaturi (npr., tokom jednog sata). Rastvor je potom uklonjen i ploča je isprana osam puta sa 0.1% Tween-20 u PBS-u. Kada su ploče osušene, 150 ul/bunariću scintilanta (MicroScint-20; Packard) je dodato, i ploče su očitan na Topcount gama čitaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab-a koje daju manje od ili isto kao 20% maksimalnog vezivanja su odabrane za kompetitivni vezujući esej. Shodno drugom aspektu Kd ili Kd vrednost je određena korišćenjem površinskog plasmon rezonantnog eseja korišćenjem BIAcore™-2000 ili a BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa imobiliziranim antigen CM5 čipovima na ~10 jediničnih odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilovani dekstranski biosenzor čipovi (CM5, BIAcore Inc.) su aktivirani sa N-etil-N’- (3-dimetilaminopropil)-karbodiimide hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) shodno instrukcijama dobavljača. Antigen je razblažen sa 10mM natrijum acetatom, pH 4.8, u 5ug/ml (~0.2uM) pre ubrizgavanja pri protoku od 5ul/minutu kako bi se postiglo najmanje 10 jediničnih odgovora (RU) spojenog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, 1M etanolamin je ubrizgan kako bi se blokirane grupe koje nisu izreagovale. Za merenje kintike, dvostruka serijska razblaženja Fab-a (0.78 nM do 500 nM) su ubrizgana u PBS-u sa 0.05% Tween 20 (PBST) na 25°C priprotoku od otprilike 25ul/min. Stope asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) su računat korišćenjem jednostavnog jedan-na-jedan Langmuir vezujućeg modela (BIAcore Evaluation Software version 3.2) simultanim podešavanjem asocijacionog i disocijasionog senzograma. Konstanta disocijacione ravnoteže (Kd) je računata kao odnos koff/kon. Videti, npr., Chen, Y., i sar., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Ako brzina vezivanja (on-rate) premaši 106 M-1 S-1 po pomenutom površinskom plasmon rezonantnom eseju, onda se brzina vezivanja može odrediti korišćenjem tehnike gašenja fluorescentne kojom se meri povećanje ili smanjenje inteziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm filter) na 25°C od 20nM antiantigen antitela (Fab forme) u PBS-u, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena kao što je izmereno spektrofotometrom, kao što je spektrofotometar sa prekidom protoka (Aviv Instruments) ili 8000-series SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa mešajućom crvenom kivetom.
[0123] Brzina vezivanja ili “brzina asocijacije” ili “asocijaciona brzina” ili “kon” shodno datom pronalasku takođe može biti određena sa istim površinskim plasmon rezonantnim esejem opisanim iznad korišćenjem BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25C sa imobilisanim antigen CM5 čipovima na ∼10 jediničnih odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilovani dekstranski biosenzor čipovi (CM5, BIAcore Inc.) su aktivirani sa with N-etil-N’- (3-dimetilaminopropil)-karbodiimide hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) shodno instrukcijama dobavljača. Antigen je razblažen sa 10mM natrijum acetatom, pH 4.8, u 5ug/ml (∼0.2uM) pre ubrizgavanja pri protoku od 5ul/minutu kako bi se postiglo najmanje 10 jediničnih odgovora (RU) spojenog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, 1M etanolamin je ubrizgan kako bi se blokirane grupe koje nisu izreagovale. Za merenje kintike, dvostruka serijska razblaženja Fab-a (0.78 nM do 500 nM) su ubrizgana u PBS-u sa 0.05% Tween 20 (PBST) na 25°C priprotoku od otprilike 25ul/min. Stope asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) su računat korišćenjem jednostavnog jedan-na-jedan Langmuir vezujućeg modela (BIAcore Evaluation Software version 3.2) simultanim podešavanjem asocijacionog i disocijasionog senzograma. Konstanta disocijacione ravnoteže (Kd) je računata kao odnos koff/kon. Videti, npr., Chen, Y., i sar., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Ipak, ako brzina vezivanja (on-rate) premaši 106 M-1 S-1 po pomenutom površinskom plasmon rezonantnom eseju, onda se brzina vezivanja može odrediti korišćenjem tehnike gašenja fluorescentne kojom se meri povećanje ili smanjenje inteziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm filter) na 25°C od 20nM antiantigen antitela (Fab forme) u PBS-u, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena kao što je izmereno spektrofotometrom, kao što je spektrofotometar sa prekidom protoka (Aviv Instruments) ili 8000-series SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa promešanom kivetom. “Kd” ili “Kd vrednost” shodno datog pronalaska u jednom aspektu je meren radio-obeleženim antigen vezujućim esejem (RIA) izvedenog sa Fab verzijom antitela i antigen molekulom kako je opisano sa sledstvenim esejem koji meri vezujuću aktivnost Fab-ova u rastvoru za antigen ekvilibrišući Fab sa minimalnom koncentracijom (125I)-obeleženog antigena u prisustvu titracione serije neobeleženih antigena, i potom zauzetim vezanim antigenom sa pločom presvučenom sa anti-Fab antitelom (Chen, i sar., (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Kako bi se uspostavili uslovi za esej, mikrotitar ploče (Dynex) su presvučene preko noći sa ug/ml vezujućim anti-Fab antitelom (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonatu (pH 9.6), i zatim blokirane sa 2% (w/v) goveđim serum albuminom u PBS-u tokom dav do pet sati na sobnoj temperaturi (otprilike 23°C). U neabsorbujućoj ploči (Nunc #269620), 100 pM ili 26 pM [125I]-antigena su pomešane sa serijskim razblaženjima Fab-a od interesa (u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12, u Presta i sar., (1997) Cancer Res. 57:4593-4599). Fab od interesa je potom inkubiran preko noći; ipak, inkubacija se može nastaviti tokom duže perioda (npr., 65 sati) kako bi se osiguralo uspostavljanje ravnoteže. Posle toga, smeše su prebačene na ploču za prihvatanje i inkubirane na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Rastvor je potom uklonjen i ploča je isprana osam puta sa 0.1% Tween-20 u PBS-u. Kada su ploče osušene, 150 ul/bunariću scintilanta (MicroScint-20; Packard) je dodato, i ploče su očitan na Topcount gama čitaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab-a koje daju manje od ili isto kao 20% maksimalnog vezivanja su odabrane za kompetitivni vezujući esej. Shodno drugom aspektu Kd ili Kd vrednost je određena korišćenjem površinskog plasmon rezonantnog eseja korišćenjem BIAcore™-2000 ili a BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25°C sa imobiliziranim antigen CM5 čipovima na ~10 jediničnih odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilovani dekstranski biosenzor čipovi (CM5, BIAcore Inc.) su aktivirani sa N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimide hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) shodno instrukcijama dobavljača. Antigen je razblažen sa 10mM natrijum acetatom, pH 4.8, u 5ug/ml (~0.2uM) pre ubrizgavanja pri protoku od 5ul/minutu kako bi se postiglo najmanje 10 jediničnih odgovora (RU) spojenog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, 1M etanolamin je ubrizgan kako bi se blokirane grupe koje nisu izreagovale. Za merenje kintike, dvostruka serijska razblaženja Fab-a (0.78 nM do 500 nM) su ubrizgana u PBS-u sa 0.05% Tween 20 (PBST) na 25°C priprotoku od otprilike 25ul/min. Stope asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) su računat korišćenjem jednostavnog jedan-na-jedan Langmuir vezujućeg modela (BIAcore Evaluation Software version 3.2) simultanim podešavanjem asocijacionog i disocijasionog senzograma. Konstanta disocijacione ravnoteže (Kd) je računata kao odnos koff/kon. Videti, npr., Chen, Y., i sar., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Ako brzina vezivanja (on-rate) premaši 106 M-1 S-1 po pomenutom površinskom plasmon rezonantnom eseju, onda se brzina vezivanja može odrediti korišćenjem tehnike gašenja fluorescentne kojom se meri povećanje ili smanjenje inteziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm filter) na 25°C od 20nM antiantigen antitela (Fab forme) u PBS-u, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena kao što je izmereno spektrofotometrom, kao što je spektrofotometar sa prekidom protoka (Aviv Instruments) ili 8000-series SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa mešajućom crvenom kivetom.
[0124] U jednom aspektu, ”brzina vezivanja” ili “brzina asocijacije” ili “asocijaciona brzina” ili “kon” shodno datom pronalasku takođe može biti određena sa istim površinskim plasmon rezonantnim esejem opisanim iznad korišćenjem BIAcore™-2000 ili BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) na 25C sa imobilisanim antigen CM5 čipovima na ∼10 jediničnih odgovora (RU). Ukratko, karboksimetilovani dekstranski biosenzor čipovi (CM5, BIAcore Inc.) su aktivirani sa with N-etil-N’- (3-dimetilaminopropil)-karbodiimide hidrohloridom (EDC) i N-hidroksisukcinimidom (NHS) shodno instrukcijama dobavljača. Antigen je razblažen sa IOmM natrijum acetatom, pH 4.8, u 5ug/ml (0.2uM) pre ubrizgavanja pri protoku od 5ul/minutu kako bi se postiglo najmanje 10 jediničnih odgovora (RU) spojenog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, 1M etanolamin je ubrizgan kako bi se blokirane grupe koje nisu izreagovale. Za merenje kintike, dvostruka serijska razblaženja Fab-a (0.78 nM do 500 nM) su ubrizgana u PBS-u sa 0.05% Tween 20 (PBST) na 25°C pri protoku od otprilike 25ul/min. Stope asocijacije (kon) i stope disocijacije (koff) su računat korišćenjem jednostavnog jedan-na-jedan Langmuir vezujućeg modela (BIAcore Evaluation Software version 3.2) simultanim podešavanjem asocijacionog i disocijasionog senzograma. Konstanta disocijacione ravnoteže (Kd) je računata kao odnos koff/kon. Videti, npr., Chen, Y., i sar., (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Ipak, ako brzina vezivanja (on-rate) premaši 106 M-1 S-1 po pomenutom površinskom plasmon rezonantnom eseju, onda se brzina vezivanja može odrediti korišćenjem tehnike gašenja fluorescentne kojom se meri povećanje ili smanjenje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm filter) na 25°C od 20nM antiantigen antitela (Fab forme) u PBS-u, pH 7.2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena kao što je izmereno spektrofotometrom, kao što je spektrofotometar sa prekidom protoka (Aviv Instruments) ili 8000-series SLM-Aminco spektrofotometar (ThermoSpectronic) sa promešanom kivetom.
[0125] Fraza "bitno smanjen," ili "bitno različit", kako se ovde koristi, označava dovoljno visok stepen razlike između dve numeričke vrednosti (generalno jedne asocirane sa antitelom pronalaska i druge asocirane sa referentnim/onim s kojim se upoređuje antitelom) tako da stručnjak u oblasti smatra da je razlika između dve vrednosti od male ili ne-biološke i/ili statističke značajnosti u okviru konteksta biološke karakteristike koja se meri datim vrednostima (npr., Kd vrednostima, HAMA odgovorom). Razlika između date dve vrednosti je poželjno manja od oko 50%, poželjno manja od oko 40%, poželjno manja od oko 30%, poželjno manja od oko 20%, poželjno manja od oko 10% u funkciji vrednosti referentnog/onog sa kojim se upoređuje antitelom.
[0126] "Procenat (%) istovetnosti aminokiselinske sekvence" uzimajući u obzir peptidnu ili polipeptidnu sekvencu se definiše kao procenat aminokiselinskih ostataka kandidat-sekvence koji je identičan sa aminokiselinskom sekvencom specifičnoj sekvenci peptida ili polipeptida, nakon svrstavanja sekvenci i uvođenjem pukotina, ukoliko je potrebno, kako bi se postigao maksimalan procenat istovetnosti sekvence, i ne uzimajući u obzir bilo kakvu konzervativnu zamenu kao deo identiteta sekvence. Svrstavanje u svrhu određivanja procenta istovetnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite način u oblasti, na primer, korišćenjem javno dostupnih kompjuterskih softvera kao što su BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softveri. Stručnjaci u oblasti mogu da utvrde odgovarajuće parametre za određivanje svrstavanja, uključujući ma koje algoritme potrebne da bi se postigao maksimum svrstavanja po punoj dužini sekvence koja se poredi. Za potrebe ovde, međutim, % istovetnosti aminokiselinske sekvence se postiže korišćenjem kompjuterskog programa za poređenje sekvenci ALIGN-2, dok je kompletan izvorni kod za ALIGN-2 program priložen u Tabeli A ispod. ALIGN-2 kompjuterski program za poređenje sekvenci je pod autorstvom Genentech, Inc. i izvorni kod prikazan Tabelom A ispod je zaveden sa dokumentacijom korisnika u U.S. Copiright Office, Washington D.C., 20559, gde je registrovan pod SAD registracionim brojem sa autorskim pravom TXU510087. ALIGN-2 program je dostupan javnosti putem Genentech, Inc., South San Francisco, California (Južni San Francisko, Kalifornija) ili može biti kompajliran iz izvornog koda prikazanim na Slici 8 dole. ALIGN-2 program treba biti kompajliran za korišćenje u UNIX operativnom sistemu, poželjno digitalnom UNIX V4.0D. Svi parametri za poređenje sekvence su namešteni ALIGN-2 programom i ne variraju.
[0127] U situacijama kada se ALIGN- koristi za upoređivanje aminokiselinskih sekvenci, % istovetnosti aminokiselinske sekvence date aminokiselinske sekvence A prema, sa ili protiv date aminokiselinske sekvence B (što se alternativno može reći kao data aminokiselinska sekvenca A koja ima ili obuhvata izvestan % istovetnosti aminokiselinske sekvence prema, sa ili protiv date aminokiselinske sekvence B) računa se na sledeći način:
100 puta frakcija X/Y
gde je X broj aminokiselinskih ostataka dobijen kao broj identičnih parova sa programom za svrstavanje sekvenci ALIGN-2 u tog programa svrstavanju A i B, i gde je Y ukupan broj aminokiselinskih ostataka u B. Treba znati da tamo gde dužina aminokiselinske sekvence A nije jednaka dužini aminokiselinske sekvence B, % istovetnosti aminokiselinske sekvence A prema B neće biti jednak % istovetnosti aminokiselinske sekvence B prema A.
[0128] Ukoliko nije specifično navedeno drugačije, sve % vrednosti istovetnosti aminokiselinskih sekvenci koje su korišćene ovde su dobijene kako je opisano u paragrafu koji neposredno prethodi ovom korišćenjem ALIGN-2 kompjuterskog programa.
Tabela A
2
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
[0129] Termin “vektor”, kako se ovde koristi, namenjen da se odnosi na molekul nukleinske kiseline sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je vezan. Jedan tip vektora je “plazmid”, što se odnosi na kružni fag vektor. Drugi tip vektora je virusni vektor, gde dodatni segmenti DNK mogu biti vezani u okviru virusnog genoma. Neki vektori su sposobni da se samostalno replikuju u ćeliji-domaćinu u koju su uvedeni (npr., bakterijski vektori koji imaju bakterijsko poreklo replikacije i epizomalni sisarski vektori). Drugi vektori (npr., ne-epizomalni sisarski vektori) mogu biti integrisani u genom ćelije-domaćina nakon uvođenja u ćeliju-domaćina, gde se replikuju zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, neki vektori su sposobni da usmeravaju ekspresiju gena za koje su operativno vezani. Takvi vektori su označeni ovde kao “rekombinanti ekspresioni vektori” (ili jednostavno, “rekombinanti vektori”). Generalno, korisni ekspresioni vektori u tehnikama rekombinantne DNK su često u formi plazmida. I datoj specifikaciji, “plazmid” i “vektor” se mogu koristiti naizmenično jer je plazmid najčešće korišćena forma vektora.
[0130] “Polinukleotid”, ili “nukleinska kiselina” kako se ovde naizmenično koriste, odnose se na polimere nukleotida bilo koje dužine, i obuhvataju DNK i RNK. Nukleotidi mogu biti deoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze, i/ili njihovi analozi, ili bilo koji supstrat koji se može umetnuti u polimer DNK ili RNK polimerazom, ili sintetičkom reakcijom. Polinukleotid može obuhvatati modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi. Ukoliko je pristuna, modifikacija nukleotidne strukture može biti načinjena pre ili nakon sklapanja polimera. Sekvenca nukleotida može biti prekinuta ne-nukleotidnim komponentama. Polinukleotid može biti dalje modifikovan nakon sinteze, recimo konjugacijom sa oznakom. Ostali tipovi modifikacija uključuju, na primer, “kape”, zamene jednog ili više nukleotida iz prirode sa analogom, internukletidne modifikacije kao što su, na primer, one sa ne-naelektrisanim vezama (npr., metil fosfonati, fosfotriestri, fosfoamidati, karbamati, itd.) i sa naelektrisanim vezama (npr., fosforotioati, fosforoditioati, itd.), i one koje sadrže ostatke drugih molekula, kao što su, na primer, proteini (npr,. nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, poli-L-lizin, itd.), one sa interkalatorima (npr., akridin, psoralen, itd.), one koje sadrže helatore (npr., metale, radioaktivne metale,
4
boron, oksidativne metale, itd.), one koje sadrže alkilatore, one sa modifikovanim vezama (npr., alfa anomerne nukleinske kiseline, itd.), kao i nemodifikovane forme polinukleotida. Dalje, bilo koja od hidroksilnih grupa obično prisutnih u šećerima mogu biti zamenjene, na primer, fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, zaštićene standardnim protektivnim grupama, ili aktivirane kako bi omogućile dodatne veze za dodatne nukleotide, ili mogu biti konjugovane sa čvrstim ili polu-čvrstim podrškama. 5’ i 3’ terminale OH mogu biti fosforilisane ili zamenjen sa aminima ili organskim delovima kapa-grupa od 1 do 20 ugljenikovih atoma. Druge hidroksi grupe takođe mogu biti izvedene do standardnih protektivnih grupa. Polnukleotidi takođe mogu sadržati analoge forme šećera riboze ili deoksiriboze koji su generalno poznati u oblasti, uključujući, na primer, 2’-O-metil-, 2’-O-alil, 2’-fluoro- ili 2’-azido-ribozu, karbociklične šećerne analoge, alfa-anomerne šećere, epimerne šećere kao što je arabinoza, ksiloza ili liksoza, piranozne šećere, furanozne šećere, sedoheptuloze, aciklične analoge i abazične nukleozidne analoge kao što je metil ribozid. Jedna ili više fosfodiestarskih veza mogu biti zamenjene alternativnim vezujućim grupama. Ove alternativne vezujuće grupe uključuju, ali nisu ograničene na, aspekte gde je fosfat zamenjen sa P(O)S ("tioat"), P(S)S ("ditioat"), "(O)NR.sub.2 ("amidat"), P(O)R, P(O)OR’, CO ili CH.sub.2 ("formacetal"), u kojima je svako R ili R’ nezavisno H ili zamenjeni ili nezamenjeni alkil (1-20 C) opciono sadržeći etar (-O-) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Ne moraju sve veze u polinukleotidu da budu identične. Prethodni opis se odnosi na sve polinukleotide ovde, uključujući RNK i DNK.
[0131] "Oligonukleotid," kako se ovde koristi, generalno se odnosi na kratke, generalno jednolančane, generalno sintetičke polinukleotide koji su generalno, ali ne nužno, manji od 200 nukleotida. Termini "oligonukleotid" i "polinukleotid" nisu međusobno isključivi. Opis iznad za polinukleotide je jednako i u potpunosti primenljiv na oligonukleotide.
[0132] Termini "antitelo" i "imunoglobulin" se koriste naizmenično u najširem smislu i obuhvataju monoklonska antitela (na primer, monoklonska antitela pune dužin ili intaktna), poliklonska antitela, multivalentna antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela dok god ispoljavaju željene bioločke aktivnosti) i mogu takođe obuhvatati neke fragmente antitela (kao što je ovde detaljno opisano). Antitelo može biti humano, humanizovano i/ili sazrelog afiniteta.
[0133] "Fragmenti antitela" obuhvataju samo deo intaktnog antitela, gde deo poželjno zadržava najmanje jednu, poželjno većinu ili sve, od funkcija normalno asociranih sa tim delom kada je prisutan u intaktnom antitelu. U jednom aspektu, fragment antitela sadrži antigen-vezujuće mesto intaktnog antitela i stoga zadržava sposobnost da veže antigen. U drugom aspektu, fragment antitela, na primer onaj koji sadrži Fc region, zadržava najmanje jednu od bioloških funkcija normalno asociranih sa Fc regionom kada je prisutan u intaktnom antitelu, kao što je vezivanje FcRn, modulaciju polu-života antitela, ADCC funkciju i komplemetarno vezivanje. U jednom aspektu, fragment antitela je monovalentann antitelo koje u vivo ima polu-život suštinski sličan intaktnom antitelu. Na primer, takav fragment antitela može sadržati antigenvezujuće mesto vezano za Fc sekvencu sposobnu da doprinese u vivo stabilnosti fragmenta.
[0134] Termin "monoklonsko antitelo" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj., individualna antitela sadržana u populaciji su identična osim u slučaju mogućih mutacija koje se prirodno dešavaju koje mogu biti prisutne i zanemarljivim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, za jedan antigen. Štaviše, u poređenju sa preparatima poliklonskih antitela koji tipično sadrže različita antitela na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo je specifično za jednu determinantu antigena.
[0135] Monoklonska antitela ovde specifično uključuju “himerična” antitela u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan ili homolog sa odgovarajućom sekvencom antitela dobijenih iz određenih vrsta ili onih koja pripadaju drugoj klasi antitela ili podklasi, kao i sa fragmentima takvih antitela, dok god ispoljavaju željenu biološku aktivnost (SAD patent Br.4,816,567; i Morrison i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).
[0136] "Humanizovane" forme ne-humanih (npr., mišjih ili pacovskih) antitela su himerična antitela koja sadrže minimum sekvence poreklom od ne-humanog imunoglobulina. Najvećim delom, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitela primaoca) u kojima ostaci iz hipervarijabilnih regiona primaoca bivaju zamenjena ostacima iz hipervarijabilnih regiona ne-humanih vrsta (donora antitela) kao što su miš, pacov, zec ili ne-humani primati koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet. U nekim slučajevima, ostaci regiona okvira (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni odgovarajućim ne-humanim ostacima. Štaviše, humanizovana antitela mogu obuhvatati ostatke koji se ne nalaze kod antitela primaoca ili antitela donora. Ove modifikacije su stvorene kako bi se dalje oblikovao učinak antitela. Generalno, humanizovano antitelo će sadržati suštinske sve od najmanje jednog, i tipično dva, varijabilna domena, u kojem sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onoj u ne-humanom imunoglobulinu i svi ili suštinski svi FR-ovi su od sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo će opciono takođe sadržati najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipičnog za humani imunoglobulin. Za dalje detalje, videti Jones i sar., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann i sar., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Videti takođe sledeće revijske članke i reference u njima citirane: Vaswani i Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle i Gross, Curr. Op. Biotech.5:428-433 (1994).
[0137] “Antigen” je predeterminisani antigen za koji se antitelo selektivno vezuje. Ciljani antigen može biti polipeptid, karbohidrat, nikleinska kiselina, lipid, hapten ili drugo jedinjenje koje se javlja u prirodi ili sintetičko jedinjenje. Poželjno, ciljani antigen je polipeptid. “Humani akceptor okvir” za ovdašnje svrhe je okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu VL ili VH okvira izvedenog iz okvira humanog imunoglobulina, ili humanog konsenzus okvira. Humani akceptor okvir “izveden iz” okvira humanog imunoglobulina ili humanog konsenzus okvira može sadržati isti aminokiselinsku sekvencu, ili može sadržati prethodno postojeće promene aminokiselinske sekvence. Kada je prisutna prethodno postojeća aminokiselinska sekvenca, poželjno je da je prisutno ne više od 5 i poželjno 4 ili manje, ili 3 ili manje, prethodno postojećih aminokiselinskih sekvenci. Kada je prisutna prethodno postojeća aminokiselinska sekvenca u VH, poželjno je da su te promene samo tri, dve ili samo jedna na pozicijama 71H, 73H i 78H; na primer, aminokiselinski ostaci na tim pozicijama mogu biti 71A, 73T i/ili 78A. U jednom aspektu, VL humani akceptor okvir je identičan u sekvenci sa VL sekvencom okvira humanog imunoglobulina ili sekvencom humanog konsenzus okvira.
[0138] “Humani konsenzus okvir” je okvir koji predstavlja najčešće prisutan aminokiselinski ostatak u odabiru sekvenci okvira humanog imunoglobulina VL ili VH. Generalno, odabir sekvenci okvira humanog imunoglobulina VL ili VH je iz podgrupe sekvenci varijabilnih domena. Generalno, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat i sar. U jednom aspektu, za VL, podgrupa je podgrupa kappa I kao u Kabat i sar. U jednom aspektu, za VH, podgrupa je podgrupa III kao u Kabat i sar.
[0139] “Konsenzus okvir VL podgrupe I” obuhvata konsenzus sekvence dobijene iz aminokiselinskih sekvenci u varijabilnoj lakoj kappa podgrupi I u Kabat i saradnici. U jednom aspektu, aminokiselinska sekvenca konsenzus okvira VL podgrupe I obuhvata najmanje deo ili celu od svake od sledećih sekvenci:
[0140] “Konsenzus okvir VH podgrupe III” obuhvata konsenzus sekvence dobijene iz aminokiselinskih sekvenci u varijabilnoj teškoj podgrupi III u Kabat i saradnici. U jednom aspektu, aminokiselinska sekvenca konsenzus okvira VH podgrupe III obuhvata najmanje deo ili celu od svake od sledećih sekvenci: EVQLVESG-GGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:38)-H1-WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:39)-H2-RFTISRDNSKNT-LYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:40)-H3-WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41).
[0141] “Nemodifikovan humani okvir” je humani okvir koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao i humani akceptor okvir, npr. bez humanih do ne-humanih aminokiselinske zamene/zamena u humanom akceptor okviru.
[0142] “Izmenjen hipervarijabilni region” za ovdašnje svrhe je hipervarijabilni region koji sadrži jednu ili više (npr. jednu do otprilike 16) aminokiselinskih zamena.
1
[0143] “Nemodifikovani hipervarijabilni region” za ovdašnje svrhe je hipervarijabilni region koji sadrži istu aminokiselinsku sekvencu kao ne-humano antitelo od kojeg je izveden, tj. jednu kojoj nedostaje jedna ili više aminokiselinskih zamena.
[0144] Termin "hipervarijabilni region", "HVR", ili "HV", kada se ovde koristi odnosi se na regione varijabilnog domena antitela koji je hipervarijabilan u sekvenci i/ili formira strukturno definisane petlje. Generalno, antitela sadrže šest hiperverijabilnih regiona; tri u VH (H1, H2, H3), i tri u VL (L1, L2, L3). Brojni hipervarijabilni regioni se koriste i obuhvaćeni su ovde. Kabat Complementarity Determining Regions (CDRovi) su bazirani na varijabilnosti sekvence i najčešće su korišćeni (Kabat i sar., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chotia umesto toga upućuje na lokaciju strukturnih petlji (Chotia i Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). AbM hipervarijabilni regioni predstavljaju kompromis između KABAT CDR-ova i Chotia strukturnih petlji, i koristi ih Oxford Molecular’s AbM antitelo modelirajući softver. “Kontakt” hipervarijabilnih regiona je baziran na analizi dostupnih kompleksnih kristalnih struktura. Ostaci svkog od ovih hipervarijabilnih regiona su dati ispod.
Tabela 1
[0145] Hipervarijabilni regioni mogu sadržati "produžene hipervarijabilne regione" kao što sledi: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 49-56 ili 50-56 ili 52-56 (L2) i 89-97 (L3) u VL i 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (H3) u VH. Ostaci varijabilnog domena su obeleženi u skladu sa Kabat i sar., supra za svaku od ovih definicija.
[0146] Ostaci "okvira" ili "FR" su ostaci onih varijabilnih regiona koji nisu ostaci hipervarijabilnih regiona kako je ovde definisano.
[0147] “Humano antitelo” je ono koje sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara onoj kod antitela produkovanog od strane čoveka i/ili napravljenog korišćenjem bilo koje tehnike za pravljenje humanih antitela kako je ovde dato. Ova definicija humanog antitela specifično izostavlja humanizovano antitelo koje obuhvata ne-humane antigen-vezujuće ostatke.
[0148] Antitelo “sazrelog afiniteta” je ono sa jednom ili više izmena u jednom ili više CDR-ova koji rezultuje poboljšanjem u afinitetu antitela za antigen, u poređenju sa roditeljskim antitelo koje ne poseduje ovu izmenu/izmene. Favorizovana antitela zrelog afiniteta će imati nanomolarne ili čak pikomolarne afinitete za ciljani antigen. Antitela sazrelog afiniteta su produkovana od strane proizvođača poznatih u oblasti. Marks i sar. Bio/Technology 10:779-783 (1992) opisuje sazrevanje afiniteta mešanjem VH i VL domena. Nasumična mutageneza CDR-oca i /ili ostataka okvira je opisana od strane: Barbas i sar. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier i sar. Gene 169:147-155 (1995); Yelton i sar. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson i sar., J. Immunol.154(7):3310-9 (1995); i Hawkins et al, J. Mol. Biol.226:889-896 (1992).
[0149] “Blokirajuće” antitelo ili “antagonist” antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnosti antigena kojeg vezuje. Favorizovana blokirajuća antitela ili antagonist antitela bitno ili u potpunosti inhibiraju biološku aktivnost antigena.
2
[0150] "Agonist antitelo", kako se ovde koristi, je antitelo koje oponaša najmanje jednu od funkcionalnih aktivnosti polipeptida od interesa.
[0151] “Poremećaj” je bilo koje stanje koje će imati dobit od tretmana supstancom/molekulom ili metodom pronalaska. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju sisara poremećaju u pitanju. Neograničavajući primeri poremećaja koji se mogu tretirati ovd uključuju maligne i benigne tumore; ne-leukemije i limfoidne malignitete; neuronalne, glijske, astrocitne, hipotalamične i druge žlezdane, makrofagne, epitelne, stromalne u blastokoelične poremećaje; i inflamatorne, imunološke i druge poremećaje vezane za angiogenezu.
[0152] Termin "imuno-vezane bolesti" znači bolest u kojoj komponenta imunskog sistema sisara izaziva, posreduje u ili na drugi način doprinosi morbiditetu sisara. Takođe obuhvaćene su bolesti u kojima stimulacija ili intervencija imunskog odgovora ima efekat poboljšanja progresije bolesti. Obuhvaćene terminom su imunski-posredovane inflamatorne bolesti, ne-imunski-posrednovane inflamatorne bolesti, infektivne bolesti, bolesti imunodeficijencije, neoplazije, itd.
[0153] Primeri imuno-vezanih i inflamatornih bolesti, od kojih su neke imunske ili T ćelijama posredovane, koje se mogu tretirati u skladu sa pronalaskom obuhvataju sistemski eritemski lupus, reumatoidni artritis, juvenilnsi hronični artritis, spondiloartbropatije, sistemsku sklerozu (sklerodermu), idiopatske inflamatorne miopatije (dermatomiozitis, polimiozitis), Sjogrenov sindrom, sistemski vaskulitis, sarkoidozu, antoimunu hemolitičku anemiju (imunu pancitopeniju, paroksizonalnu nokturalnu hemoglobinuriju), autoimunu trombocitopeniju (idiopatsku trombocitopeničnu purpuru, imuno-posredovanu trombocitopeniju), tireoiditis (Grejvova bolest, Hašimotov tireoiditis, juvenilni limfocitični tireoiditis, atrofični tireoiditis), dijabetes melitus, imuno-posredovana bubrežna bolest (glomerulonefritis, tubulointersticijalni nefritis), demijelinizacione bolesti centralnog i perifernog nervnog sistema kao što su multipla skleroza, idiopatska demijelinizirajuća polinuropatija ili Žilijan-Bar sindrom, i hronične inflamatorne demijelinizirajuće polinuropatije, hepatobilijarne bolesti kao što su infektivni hepatitis (hepatitis A, B, C, D, E i drugi nehepatotropni virusi), autoimuni hronični aktivni hepatitis, primarna bilijarna ciroza, granulomatozni hepatitis, i sklerozni holangitis, inflamatorna bolest creva (ulcerativni kolitis, Kronova bolest), glutensenzitivna enteropatija, i Viplova bolest, autoimune ili imuno-posredovane bolesti kože uključujući bulozne bolesti kože, eritema multiforma i kontaktni dermatisis, psorijaza, alergijske bolesti kao što su astma, alergijski rinitis, atopični dermatitis, hipersenzitivnost na hranu i utrikarija, imonološke bolesti pluća kao što su eozinofilična pneumonija, idiopatska pulmonarna fibroza i hipersenzitivni pneumonitis, transplatacijomvezane bolesti uključujući odbacivanje grafta i bolesti vezane za presađivanje tkiva. Infektivne bolesti uključujući virusne bolesti kao što je AIDS (HIV infekcija), hepatitis A, B, C, D, i E, herpes, itd., bakterijske infekcije, gljivične infekcije, protozomalne infekcije i parazitske infekcije.
[0154] “Autoimuni poremećaj” ili “autoimuna bolest” kako se ovde naizmenično koristi je ne-maligna bolest ili poremećaj koja proizilazi iz i usmerena je protiv sopstvenog tkiva individue. Autoimune bolesti opisane ovde specifično isključuju maligne ili kancerogene bolesti ili stanja, posebno isključujući B ćelijski limfom, akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), leukemiju dlakavih ćelija, i hroničnu mijeloblastnu leukemiju. Primeri autoimunih bolesti ili poremećaja uključuju, ali nisu ograničeni na, inflamatorne odgovore kao što su inflamatorne bolesti uključujuči psorijazu i dermatitis (na primer, atopični dermatitis); sistemsku sklerodermu i sklerozu; odgovore asocirane sa inflamatornom bolešću creva (kao što su Kronova bolest i ulcerativni kolitis); respiratorni distres sindrom (uključujuči adultni respiratorni distres sindrom; ARDS); dermatitis; meningitis; encefalitis; uveitis; kolitis; glomerulonefritis; alergijska stanja kao što su ekcemi i astma i druga stanja koja uključuju infiltraciju T ćelija i hronične inflamatorne odgovore; aterosklerozu; leukocitnu adhezionu deficijenciju; reumatoidni artritis; sistemski eritemski lupus (SLE); dijabetes melitus (npr., Tip I dijabetes melitusa ili insulin-zavisni dijabetes melitus); multiplu sklerozu; Rajnadov sindrom; autoimuni tireoiditis; alergijski encefalomijelitis; Sjogrenov sindrom; juvenilni onset dijabetes; i imune odgovore asocirane sa akutnom i odloženom hipersenzitivnošću posredovanom sitokinima i T limfocitima tipičnim u tuberkulozi, sarkoidozi, polimiozitisu, granulomatozi i vaskulitisu; pernicioznoj anemiji (Adisonova bolest); bolesti koje uključuju leukocitnu diapedezu; inflamatorne poremećaje centralnog nervnog sistema (CNS); sindrom povrede više organa; hemolitičku anemiju (uključujući, ali se ne ograničavajući na krioglobinmiju ili Kombsovu pozitivnu anemiju); mijasteniju gravis; antigen-antitelo kompleksom posredovane bolesti; bolest anti-glomerularne baze membrane; antifosfolipidni sindrom; alergijski neuritis; Grejvsova bolest; Lambert-Itonov mijastenijski sindrom; pemfigoidne bule, pemfigus; autoimune poliendokrinopatije; Rajterovu bolest; sindrom krutog čoveka; Beketovu bolest; artritis gigantskih ćelija; nefritis imunog kompleksa; IgA nefropatiju; IgM polinuropatije; imunsku trombocitepenijsku purpuru (ITP) ili autoimunu trombocitopeniju itd.
[0155] Termin “gastrointestinalni inflamatorni poremećaji” odnosi se na grupu hroničnih poremećaja koji izazivaju inflamaciju i/ili ulceraciju u mukoznoj membrani. Kao takav, terminom su obuhvaćene inflamatorna bolest creva )npr., Kronova bolest, ucerativni kolitis, nedeterminisani kolitis i infektivni kolitis), mukozitis (npr., oralni mukozitis, gastrointestinalni mukozitis, nazalni mukozitis i proktitis),nekrozirajući enterokolitis i ezofagitis.
[0156] Termini "ćelijski proliferativni poremećaj” i “proliferativni poremećaj” odnosi se na poremećaje koji su asocirani u nekom stepenu sa abnormalnom ćelijskom proliferacijom. U jednom aspektu, ćelijski proliferativni poremećaj je kancer.
[0157] "Tumor", kako se ovde koristi, odnosi se na neoplastični rast ćelija i proliferaciju, bilo malignu ili benignu, i sva pre-kancerozne i kancerozne ćelije i tkiva. Termini “kancer”, “kancerozni”, “ćelijski proliferativni poremećaj”, “proliferativni poremećaj” i “tumor” ovde nisu međusobno isključujući.
[0158] Termini "kancer" i "kancerozni" odnose se na ili opisuju fiziološko stanje kod sisara koje je tipično karakterisano sa neregulisanim blastomo, sarkomom i leukemijom. Specifičniji primeri takvih kancera uključuju kancer skvamoznih ćelija, sitnoćelijski kancer pluća, ne-stinoćelijski kancer pluća, adenokarcinom pluća, skvamozni karcinom pluća, kancer peritoneuma, hepatocelularni kancer, gastrointestinalni kancer, pankreatični kancer, glioblastom, cervikalni kancer, kancer ovarijuma, kancer jetre, kancer bešike, hepatom, kancer dojki, kancer kolona, kolonorektalni kancer, karcinom endometrijuma ili uterusa, karcinom pljuvačnih žlezda, kancer bubrega, kancer jetre, kancer prostate, vulvalni kancer, tireoidni kancer, hepatični karcinom i različite tipove kancera glave i vrata.
[0159] Disregulacija angiogeneze može voditi mnogim poremećajima koji mogu biti tretirani preparatima i metodama pronalaska. Ovi poremećaji obuhvataju i ne-neoplastična i neoplastična stanja. Neoplastična stanja obuhvataju ali nisu ograničena na ona opisana iznad. Ne-neoplastični poremećaji obuhvataju ali nisu ograničeni na neželjenu ili aberantnu hipertrofiju, artritis, reumatoidni artritis (RA), psorijazu, psorijatične plake, sarkoidozu, aterosklerosu, aterosklerotične plake, dijabetes i druge proliferativne retinopatije uključujući retinopatiju nedonoščadi, retrolentalnu fibroplaziju, neovaskularni glaukom, starosno-vezanu makularnu degeneraciju, dijabetični makularni edem, konrealnu neovaskularizaciju, korenalnu graft neovaskularizaciju, odbacivanje kornealnog grafta, retinalnu/horoidalnu neovaskularizaciju, neovaskularizaciju ugla (rubeozu), okularnu neovaskularnu bolest, arteriovenozne malformacije (AVM), meningiom, hemangiom, angiofibrom, tireoidne hiperplazije (uključujući Grejvsovu bolest), kornealne i transplantacije drugih tkiva, hronične inflamacije, inflamacije pluća, akutnu povredu pluća/ARDS, sepsu, primarnu pulmonarnu hipertenziju, maligne pulmonarne efuzije, cerebralni edem (npr., asociran sa akutnim moždanim udarom/zatvorenom povredom glave/traumom), sinovijalna inflamacija, formiranje izraslin/panusa u RA, miozitis osifikans, formiranje hipertropičnih kostiju, osteoartritis (OA), refraktorni ascites, bolest policističnih jajnika, endometriozu, bolesti akumuliranja tečnosti u trećem prostoru (pankreatitis, sindrom kompartmana, bums, bolest creva), fibroide materice, preuranjeni porođaj, hroničnu inflamaciju kao što je IBD (Kronova bolest i ulcerativni kolitis), odbacivanje bubrežnog grafta, inflamatornu bolest creva, nefrotični sindrom, neželjeni ili aberantni rast tkivne mase (ne-kancerogene), hemofilične zglobove, hipertrofične ožiljke, inhibiciju rasta kose, Osler-Veberov sindrom, piogeni granulom , retrolentalne fibroplazije, sklerodermu, trahom, vaskularne adhezije, sinovitis, dermatitis, preeklampsiju, ascitese, perikardijalne efuzije (kao što su one u vezi sa perikarditisom), i pleuralne efuzije.
[0160] Kako se ovde koristi, "tretman" se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se poboljšaju prirodni putevi individue ili ćelije koja se tretira, i može se sprovoditi ili za profilaksu ili tokom toka kliničke patologije. Željeni efekti tretmana uključuju prevenciju pojave ili vraćanja bolesti, ublaženje simptoma, umanjenje bilo direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, prevenciju metastaza, smanjenje toka progresije bolesti, poboljšanje ili prikrivanje stadijuma bolesti, i remisiju ili bolju prognozu. U nekim aspektima, antitela pronalaska se koriste kako bi se odložio razvoj bolesti ili poremećaja.
4
[0161] "Efektivna količina" se odnosi na količinu koja je efektivna, u potrebnim dozama i tokom perioda vremena, kako bi se postigli željeni terapeutski ili profilaktički rezultati.
[0162] “Terapeutski efektivna količina” supstance/molekula pronalaska, agonista ili antagonista može da varira shodno faktorima kao što su stadijum bolesti, godine, pol i težina individue, i sposobnosti supstance/molekula, agonista ili antagonista da izazove željeni odgovor kod individue. Terapeutski efektivna količina je takođe ona pri kojoj bilo koji toksični ili štetni efekti supstance/molekula, agonista ili antagonista su manji od terapeutski korisnih efekata. “Profilaktički efektivna količina” odnosi se na količinu koja je efektivna, u potrebnim dozama i tokom perioda vremena, kako bi se postigli željeni profilaktički rezultati. Tipično ali ne i obavezno, s obzirom da se profilaktična doza daje subjektu pre ili u ranom stadijumu bolesti, profilaktički efektivna količina će biti manja od terapeutski efektivne količin.
[0163] Termin "citotoksični agens" kako se ovde koristi odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili izaziva destrukciju ćelija. Termin treba da uključi radioaktivne izotope (npr., At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>i radioaktivne izotope Lu), hematerapeutske agense kao što su metotreksat, adriamicin, vinca (Vinca sp.) alkaloide (vinkristin, vinblastin, etoposid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense, enzime i njihove fragmente kao što su nukleolitički enzimi, antibiotici, i toksini u vidu malih molekula toksina ili enzimski aktivnih toksina poreklom od bakterija, gljiva, biljaka ili životinja, uključujući fragmente i/ili njihove varijante, i različite anti-tumorske i anti-kancerogene agense date ispod. Drugi citotoksični agensi su opisani ispod. Tumorocidalni agensi vode destrukciji ćelija tumora.
[0164] “Hemoterapeutski agens” je hemijsko jedinjenje korisno u tretmanu kancera. Primeri hemoterapeutskih agenasa uključuju alkilujuće agense kao što je tiotepa i CYTOXAN® ciklosfosfamid; alkil sulfonati kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridini kao što su benzodopa, karbokuon, meturedopa, i uredopa; etilenimin i metilamelamin uključujući altretamin, trietilenemelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; acetogenini (posebno bulatacin i bulatacinon); delta-9-tetrahidrokanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapahon; lapahol; kolhicini; betulinska kiselina; kamptotecin (uključujući sintetički analog topotekan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotekan, CAMPTOSAR®), acetilkamptotecin, skopolektin, i 9-aminokamptotecin); briostatin; kalistatin; CC-1065 (uključujući njegov adozelesin, karzelesin i bizelesin sintetičke analoge); podofilotoksin; podofiliničnu kiselinu; teniposid; kriptoficin (posebno kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin; duokarmicin (including the synthetic analogues, KW-2189 i CB1-TM1); eleuterobin; pancratistatin; a sarkodictyin; spongistatin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlornaphazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembichin, fensterin, prednimustin, trofosfamid, uracil iperit; nitrozouree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, i ranimustin; antibiotike kao što su enedinski antibiotici (npr., kalihearnicin, posebno kaliheamicin gamma1I i kaliheamicin gama1I (videti, npr., Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinmicin, uključujući dinmicin A; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodan hromoprotein enedin antibiotski hromofori), aklacinomysins, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicins, caktinomicin, karabicin, karminomicin, karzinophilin, hromomicinis, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, ADRIAMYCIN® doksorubicin (including morpholino-doksorubicin, cyanomorpholinodoksorubicin, 2-pirolino-doksorubicin i deoksidoksorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicin kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicin, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne kiselin kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinske analoge kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; androgene kao što su calusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adrenalne kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; izvori folne kiseline kao što su frolinična kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aniinolevulinska kiseline; eniluracil; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demecolcin; diazikuon; elfomitin; eliptinium acetat; epotilon; etoglucid; galium nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidainin; maitansinoidi kao što su maitansin i ansamitocini; mitoguazon; mitoksantron; mopidanmol; nitraerin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; 2-etilhidrazide; prokarbazin; PSK® polisaharidni kompleks (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoksan; rhizoksin; sizofiran; spirogermanium; tenuazonic acid; triazikuon; 2,2’,2"- trihlorotetilamin; trihoteceni (posebno T-2 toksin, verakurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin (ELDISINE®, FILDESIN®); dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitosin; arabinosid ("Ara-C"); tiotepa; taksoids, npr., TAXOL® paclitaksel (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ Cremophor-free, albumin-projektovana formulacija nanopartikula u vidu paklitaksela (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), i TAXOTERE® doksetaksel (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); hloranbucil; gemcitabin (GEMZAR®); 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin (VELBAN®); platina; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vincristin (ONCOVIN®); oksaliplatin; leucovovin; vinorelbin (NAVELBINE®); novantron; edatreksat; daunomicin; aminopterin; ibandronat; topoisomerase inhibitor RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoidi kao što je retinoična kiselina; kapecitabin (XELODA®); farmaceutski prihvaljtive soli, kiseline ili derivativi bilo od ma čega pomenutog; kao i kombinacije dva ili više leka kao što je CHOP, skraćenica za kombinovanu terapiju ciklofosfamid, doksorubicin, vincristin, i prednisolon, i FOLFOX, skraćenica za režim tretmana sa oksaliplatinom (ELOXATIN™) kombinovanim sa 5-FU i leukovovinom.
[0165] Takođe obuhvaćeni ovom definicijom su anti-hormonalni agensi koji regulišu, smanjuju, blokiraju ili inhibiraju efekte hormona koji mogu da promovišu rast kancera, i često su u formi sistemskih, ili tretmanu celog tela. Mogu i sami biti hormoni. Primeri obuhvataju antiestrogene i selektivne modulatore estrogenskih receptora (SERM), uključujući, na primer, tamoksifen (obuhvatajući NOLVADEX® tamoksifen), EVISTA® raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston, i FARESTON® toremifen; anti-progesterone; nishodne regulatore estrogenskih receptora (ERD); agense koji funkcionišu kako bi suzbili ili “ugasili” ovarijume, na primer, leutinizirajuće hormon-otpuštajuće hormone (LHRH) agoniste kao što su LUPRON® i ELIGARD® leuprolid acetat, goserelin acetat, buserelin acetat i tripterelin; druge antiandrogene kao što su flutamid, nilutamid i bicalutamid; i inhibitore aromataze koji inhibiraju enzim aromatazu, koji reguliše produkciju estrogena u adrenalnim žlezdama, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, MEGASE® megestrol acetat, AROMASIN® eksemestan, formestani, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, i ARIMIDEX® anastrozol. Dodatno, takva definicija hemoterapeutskih agenasa obuhvata bisfosfonate kao što su klodronat (na primer, BONEFOS® ili OSTAC®), DIDROCAL® etidronat, NE-58095, ZOMETA® zoledronična kiselina/zoledronat, FOSAMAX® alendronat, AREDIA® pamidronat, SKELID® tiludronat, ili ACTONEL® risedronat; kao i troksacitabin (1,3-dioksolan analog nukleozida citozina); antisens oligonukleotide, posebno one koji inhibiraju ekspresiju gena u signalnom putu koji je upleten u nenormalnu proliferaciju ćelija, kao što su, na primer PKC-alfa, Raf, H-Ras, i receptor epidermalnog faktora rasta (EGF-R); vakcine kao što su THERATOPE® vakcina i vakcine genske terapije, na primer, ALLOVECTIN® vakcina, LEUVECT1N® vakcina, i VAXID® vakcina; LURTOTECAN® inhibitor topoizomeraze 1; ABARELIX® rmRH; lapatinib ditosilat (ErbB-2 i EGFR malo-molekulski inhibitor dualne tirozin kinaze takođe poznat kao GW572016); farmaceutski prihvaljtive soli, kiseline ili derivativi bilo od ma čega pomenutog.
[0166] “Inhibitorni agens rasta” kada se koristi ovde, odnosi se na jedinjenje ili preparat koji inhibira rast ćelija čiji je rast zavistan od beta7 aktivice bilo u vitro ili u vivo. Stoga, inhibitorni agens rasta može biti onaj koji značajno smanjuje procenat beta7-zavisnih ćelija u S fazi. Primeri inhibitornih agenasa rasta obuhvataju agense koji blokiraju progresiju ćelijskog ciklusa (na mestu različitom od S faze), kao što su agensi koji indukuju G1 zaustavljanje i zaustavljanje M faze. Klasični blokatori M-faze obuhvataju derivate vince (vincristin i vinblastin), taksane, i inhibitore topoisomeraze II kao što su doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposide, i bleomicin. Ti agensi koji zaustavljaju G1 takođe prelaze u sprečavanje S-faze, na primer DNK alkilirajući agensi kao što su tamoksifen, prednison, dakarbazin, mehloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluorouracil, i ara-C. Dalje informacije se mogu naći u The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn i Israel, eds., Chapter 1, pod naslovom "Cell cycle regulation, oncogenes, i antineoplastic drugs" od Murakami i sar. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), posebno p.13. Taksani (paclitaksel i docetaksel) su antikancer lekovi izvedeni iz drveta tise. Docetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), izveden iz evropske tise, je semisintetički analog paclitaksela (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaksel i docetaksel promovišu sklapanje mikrotubula od dimera tubulina i stabilizuju mikrotubule sprečavanjem depolimerizacije, koja rezultuje inhibicijom mitoze u ćelijama.
[0167] "Doksorubicin" je antraciklični antibiotik. Puno hemijsko ime doksorubicina je (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoksi-α-L-likso-heksapiranozil)oksi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroksi-8-(hidroksiacetil)-1-metoksi-5,12- naftacenedion.
[0168] Jedinjenja korisna u kombinovanoj terapiji sa antagonistom anti-beta7 antitelom obelodanjenja obuhvataju antitela (uključujući bez ograničenja druga anti-beta7 antagonist antitela (Fib 21, 22, 27, 30 (Tidswell, M. (1997) supra) ili njegove humanizovane derivate), anti-alfa4 antitela (kao što je ANTIGEN®), anti-TNF (REMICADE®) ili ne-proteinska jedinjenja uključujući bez ograničenja 5-ASA jedinjenja ASACOL®, PENTASA™, ROWASA™, COLAZAL™, i druga jedinjenja kao što je Purintol i steroide kao što je prednizon. U jednom aspektu, obelodanjenje obuhvata metod tretiranja pacijenta, kao što je humani pacijent, sa antagonistom anti-beta7 antitela obelodanjenja samim ili u kombinaciji sa drugim jedinjenjem koje je takođe korisno u tretiranju inflamacije. U jednom aspektu drugo jedinjenje odabrano je iz grupe koja se sastoji od Fib 21, 22, 27, 30, ili njegovih humanizovanih derivata, anti-alfa4 antitela, ANTEGEN®, anti-TNF, REMICADE®, 5-ASA jedinjenja, ASACOL®, PENTASA™, ROWASA™, COLAZAL™, Purintola, steroida, i prednizona. U jednom aspektu obelodanjenja, davanje antagonista anti-beta7 antitela obelodanjenja bitno smanjuje dozu drugog jedinjenja. U jednom aspektu, pomenuto smanjenje u dozi drugog jedinjenja je najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%. U jednom aspektu obelodanjenja, kombinacija antitela obelodanjenja i smanjene doze drugog jedinjenja oslobađa pacijenta simptoma do suštinski istog nivoa ili bolje nego kada se drugo jedinjenje daje samo.
Generisanje različitih antitela vodi izlaganju smanjenog ili odsustvu HAMA odgovora.
[0169] Redukcija ili eliminacija HAMA (humani anti-mišji (takođe primenljivo na humani anti-pacovski ili humani antihumani) odgovor je značajan aspekt kliničkog razvoja pogodnih terapeutskih agenasa, Videti, npr., Khaxzaeli i sar., J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80:937; Jaffers i sar., Transplantation (1986), 41:572; Shawler i sar., J. Immunol. (1985), 135:1530; Sears i sar., J. Biol. Response Mod. (1984), 3:138; Miller i sar., Blood (1983), 62:988; Hakimi i sar., J. Immunol. (1991), 147:1352; Reichmann i sar., Nature (1988), 332:323; Junghans i sar., Cancer Res. (1990), 50:1495.
[0170] Ovde su data antitela koja su humanizovana tako da je HAMA odgovor smanjen ili eliminisan. Varijante ovih antitela dalje mogu biti dobijene korišćenjem rutinskih metoda u oblasti, od kojih su neke opisane ispod.
[0171] Na primer, aminokiselinska sekvenca antitela kako je opisano ovde može poslužiti kao početna (matična) sekvenca za diversifikaciju okvira i/ili hipervarijabilne sekvence/sekvenci. Odabrana sekvenca okvira za koju je početna hipervarijabilna sekvenca vezana se ovde naziva humanim akceptor okvirom. Dok humani akceptor okvir može biti od, ili izveden od, gumanog imunoglobulina (njegovih VL i/ili VH regiona), poželjno je da su humani akceptor okviri od, ili izvedeni od, sekvence humanog konsenzus okvira jer je pokazano da takvi okviri imaju minimum, ili ni malo, imunogeničnosti u humanim pacijentima.
[0172] Tamo gde je akceptor izveden iz humanof imunoglobulina, može se opciono odabrati sekvenca humanog okvira koja je izabrana na osnovu svoje homologije sa donorskom sekvencom okvira svrstavanjem donorske sekvence okvira sa različitim sekvencama humanog okvira u kolekciji sekvenci humanog okvira, i kao akceptor odabrana je najhomologija sekvenca okvira.
[0173] U jednom aspektu, humani konsenzus okvir ovde je od, ili izvede od, sekvenci konsenzus okvira VH podgrupe III i/ili VL kappa podgrupe I.
[0174] Stoga VH humani akceptor okvir može sadržati jednu, dve, tri ili sve od sledećih sekvenci okvira:
FR1 obuhvatajući EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:38),
FR2 obuhvatajući WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:39),
FR3 obuhvatajući FR3 obuhvata RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:42), gde je X1 A ili R, X2 T ili N, i X3 A, L; ili F,
FR4 obuhvatajući WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41).
Primeri VH konsenzus okvira uključuju:
[0175]
humani konsenzus okvir VH podgrupe I minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID N0:19);
humani konsenzus okvir VH podgrupe I minus prošireni hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:20-22);
humani konsenzus okvir VH podgrupe II minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO:48);
humani konsenzus okvir VH podgrupe II minus prošireni hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:49-51);
humani konsenzus okvir VH podgrupe III minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO:52);
humani konsenzus okvir VH podgrupe III minus prošireni hipervarijabilni regioni (SEQ ID NO:53-55);
humani VH akceptor okvira minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO:56);
humani VH akceptor okvira minus prošireni hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:57-58); humani VH akceptor okvira 2 minus Kabat CDR-ovi (SEQ ID NO:59); or
humani VH akceptor okvira 2 minus prošireni hipervarijabilni regioni (SEQ ID NOs:60-62).
[0176] U jednom aspektu, VH humani akceptor okvir sadrži jednu, dve, tri ili sve od sledećih sekvenci okvira:
FR1 obuhvatajući EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:38),
FR2 obuhvatajući WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID NO:39),
FR3 obuhvatajući FR3 obuhvata RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:43), RFTISRDTSKN-TAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:44), RFTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:45), RFTTSADTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID NO:46),
FR4 obuhvatajući WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:41).
[0177] VL humani akceptor okvir sadrži jednu, dve, tri ili sve od sledećih sekvenci okvira:
FR1 obuhvatajući DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:34),
FR2 obuhvatajući WYQQKPGKAPKLLI (SEQ ID NO:35),
FR3 obuhvatajući GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:36),
FR4 obuhvatajući FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:37).
Primeri VL konsenzus okvira uključuju:
[0178]
humani konsenzus okvir VL kappa podgrupe I (SEQ ID NO:14);
humani konsenzus okvir VL kappa podgrupe I (produžen HVR-L2) (SEQ ID NO: 15); humani konsenzus okvir VL kappa podgrupe II (SEQ ID NO:16);
humani konsenzus okvir VL kappa podgrupe III (SEQ ID NO:17); ili
humani konsenzus okvir VL kappa podgrupe IV (SEQ ID NO:18)
[0179] Dok akceptor može biti identičan u sekvenci humanog okvira koji je odabran, bilo da je od humanog imunoglobulina ili humanog konsenzus okvira, datim pronalaskom se smatra da sekvenca akceptora može sadržati prethodno postojeće aminokiselinske zamene u vezi sa humanom imunoglobulinskom sekvencom ili sekvencom humanog konsenzus okvira. Ove prethodno postojeće zamene su poželjno minimalne; obično četiri, tri, dve ili jedna aminokiselinska razlika samo u vezi sa imunoglobulinskom sekvencom ili sekvencom konsenzus okvira.
[0180] Ostaci hipervarijabilnog regiona ne-humanog antitela su inkorporisani u VL i/ili VH humani akceptor okvir. Na primer, ostaci se mogu inkorporisati u skladu sa Kabat CDR ostacija, Chothia ostacima hipervarijabilne petlje, ostaci Abm, i/ili kontaktni ostaci. Opciono, ostaci produženog hipervarijabilnog regiona su inkorporisani kako sledi: 24-34 (L1), 49-56 (L2) i 89-97 (L3), 26-35 (H1), 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102, ili 95-102 (H3).
[0181] Dok se ovde diskutuje “inkorporisanje” ostataka hipervarijabilnog regiona, ceniće se to što se ono može postići na različite načine, na primer, nukleinske kiseline koja kodira željenu aminokiselinsku sekvencu može se generisati mutacijom nukleinske kiseline koja kodira za mišju sekvencu varijabilnog domena tako da se ostaci okvira menjaju u ostatke humanog akceptor okvira, ili mutiranjem nukleinske kiseline koja kodira sekvencu humanog varijabilnog domena tako da se ostaci hipervarijabilnog domena menjaju u ostatke ne-humanog, ili sintetisanjem nukleinske kiseline koja kodira željenu sekvencu, itd.
[0182] U primerima ovde, kalemljene varijante hipervarijabilnih regiona su generisane Kunkel-ovom mutagenezom nukleinske kiseline koja kodira sekvence humanog akceptora, korišćenjem zasebnog oligonukleotida za svaki hipervarijabilni region. Kunkel i sar., Methods Enzynol. 154:367-382 (1987). Odgovarajuće promene mogu biti uvede u okvir i/ili hipervarijabilni region, korišćenjem rutinskih tehnika, kako bi se ispravile i ponovo uspostavile odgovarajuće interakcije između hipervarijabilnog regiona i antigena.
[0183] Fag(mid) displej (ovde takođe nazivana kao fag displej u nekim kontekstima) se može koristiti kao pogodan i brz metod za generisanje i skrining mnogo različitih potencijalnih varijanti antitela u biblioteci generisanoj randomizacijom (nasumičnim odabirom) sekvenci. Ipak, druge metode za pravljenje i skrining izmenjenih antitela su dostupne obučenom licu.
[0184] Fag(mid) displej tehnologija je pružila moćan alat za generisanje i selekciju novih proteina koji se vezuju za ligand, kao što je antigen. Korišćenjem fag(mid) displej tehnike mogu se generisati velike biblioteke varijanti proteina koji se mogu brzo sortirati po onim sekvencama koje se sa visokim afinitetom vezuju za ciljani molekul. Nukleinske kiseline koje kodiraju varijante polipeptida generalno se spajaju sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira virusni protein omotača, kao što su protein gena III ili protein gena VIII. Monovalentni fagmid displej sistemi su razvijeni tamo gde sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein ili polipeptid je spojena sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira deo proteina gena III. . (Bass, S., Proteins, 8:309 (1990); Lowman i Wells, Methods: A Companion to Methods u Enzymology, 3:205 (1991)). U monovalentannom fagmid displej sistemu, spojeni gen se eksprimira na niskim nivoima i “wild type”/”divlji” proteini gena III se takođe eksprimiraju tako da se infektivnost partikula zadržava. Metode za generisanje biblioteka peptida i skrininga tih biblioteka su date mnogim patentima (npr., SAD patent Br. 5,723,236, SAD patent Br. 5,432, 018, SAD patent Br. 5,580,717, SAD patent Br. 5,427,908 i SAD patent Br.5,498,530).
[0185] Biblioteke antitela ili antigen vezujućih polipeptida su pripremljene na više načina uključujući i one kojima su menjani pojedinačni geni ubacivanjem nasumičnih sekvenci DNK, ili kloniranjem familija srodnih gena. Metode za prikazivanje antitela ili antigen vezujućih fragmenta korišćenjem Fag(mid) displeja su opisani u SAD patentima Br.5,750,373, 5,733,743, 5,837,242, 5,969,108, 6,172,197, 5,580,717, i 5,658,727. Biblioteka se zatim skenira u potrazi za antitelima ili antigen vezujućim proteinima željenih karakteristika.
[0186] Metode zamene izabrane amino kiseline u šablonsku nukleinsku kiselinu su dobro poznate oblasti, od kojih su neke ovde opisane. Na primer, ostaci hipervarijabilnih regiona mogu se zameniti korišćenjem Kunkel-ovog metod. Pogledajte primer, Kunkel i sar., Methods Enzymol.154:367-382 (1987).
[0187] Sekvenca oligonukleotida uključuje jedan ili više dizajniranih setova kodona kojima se menjaju ostaci hipervarijabilnih regiona. Kodonski set je skup različitih tripleta nukleotida koji se koristi za šifrovanje željenih varijanti amino kiselina. Kodonski setovi mogu da se prikazuju korišćenjem simbola za određene nukleotide ili mešavine nukelotida iste molarnosti, kao što je prikazano ispod, shodno IUB kodu.
IUB kodovi
[0188]
G Guanin
A Adenin
T Timin
C Citozin
R (A ili G)
Y (C ili T)
M (A ili C)
K (G iliT)
S (C ili G)
W (A ili T)
H (A ili C ili T)
B (Cili Gili T)
V (A ili C ili G)
D (A ili G ili T) H
N (A ili C ili Gili T)
[0189] Na primer, u kodonskom setu DVK, D može da bude nukleotid A ili G ili T, V može da bude A ili G ili C, i K može da bude G ili T. Ovaj kodonski set može da prezentuje 18 različitih kodona i može da kodira aminokiseline Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly i Cys.
[0190] Oligonukleotidi ili setovi prajmera mogu se sintetisati korišćenjem standardnih metoda. Oligonukleotidni set se može sintetisati, na primer, sintezom čvrste faze, koja podrazumeva sekvence koje predstavljaju sve moguće kombinacije tripleta nukleotida koje obezbeđuje kodonski set i koje će šifrirati željene grupe aminokiselina. Sinteza oligonukeotida sa izabranom nukleotidnom „degeneracijom“ (izrođivanjem) na određenim pozicijama je dobro poznata u oblasti. Takvi setovi nukleotida koji imaju određen kodonski set se mogu sintetisati korišćenjem komercijalnih nukleinskih kiselina (dostupni na primer kod AppliedBiosystems, FosterCity, CA), ili se mogu naručiti komercijalno (na pr., kod LifeTechnologies, Rockville, MD). Dakle, komplet oligonukleotida sintetisanih da imaju određen kodonski set obično obuhvata mnoštvo oligonukleotida sa različitim sekvencama, a ta različitost je ustanovljena kodonskim setom u celoj sekvenci. Oligonukleotidi, ako se koriste u skladu sa pronalaskom, imaju sekvence koje dozvoljavaju hibridizaciju sa varijabilnom domenom šablona nukleinske kiseline, a isto tako mogu da uključuju mesta za restriktivne enzime u svrhu kloniranja.
[0191] Po jednoj metodi, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju različite aminokiseline mogu da se proizvedu pomoću mutageneze posredovane oligonukleotidima. Ova tehnika je dobro poznata, a opisana je od strane Zolleri i saradnika, Nucleic Acids Res. 10:6487-6504 (1987). Ukratko, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju različite aminokiseline se stvaraju hibridizacijom oligonukleotidnog seta koji kodira željeni kodonski set sa DNK šablonom, gde je šablon jednolančani oblik plazmida koji sadrži varijabilni region sekvence šablona nukleinske kiseline. Posle hibridizacije, DNK polimeraza se koristi za sintezu drugog celog komplementarnog lanca šablona koji će tako ugraditi oligonukleotdni prajmer, i sadržati kodonske setove obezbeđene oligonukleotidnim setom.
[0192] Obično se koriste oligonukleotidi od barem 25 nukleotida u nizu. Optimalni oligonukleotidi imaju 12 do 15 nukleotida koji su potpuno komplementerni nukleotidima na bilo kojoj strani šablona, a koji kodiraju mutaciju. Ovo osigurava da će oligonukleotidi ispravno hibridizovati u jednolančani molekul DNK. Oligonukleotidi mogu da se sintetišu korišćenjem poznatih metoda koje su opisane od strane Crea i saradnika., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA, 75:5765 (1978).
[0193] DNK šablon se proizvodi pomoću vektora koji su ili izvedeni iz bakteriofagnog M13 vektora (pogodni su vektori M13mp18 i M13mp19 koji mogu komercijalno da se nabave), ili od vektora koji sadrže jednolančani fagni izvor replikacije opisano od Viera i sar., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Tako, DNK koja treba da se mutira može da bude ubačena u jedan od tih vektora kao bi se formirao jednolančani šablon. Proizvodnja jednolančanog šablona je opisana u odeljcima 4.21-4.41 Sambrook i sar.
[0194] Da bi se izmenila nativna DNK sekvenca, oligonukleotid se hibridizuje u jednolančani šablon u pogodnim uslovima hibridizacije. DNK polimerizacijski enzim, obično T7 DNK polimeraza ili Klenov fragment DNK polimeraza I, se nakon toga dodaje za sintetizu kompelemtarnog lanca šablona koristeći oligonukleotid kao prajmer za sintezu. Tako se formira heterodupleksni molekul, gde jedan lanac DNK kodira mutacionu formu gena 1, dok drugi lanac (originalni šablon) kodira nativnu, nepromenjenu sekvencu gena 1. Ovaj heterodupeksni molekul zatim se transformiše u prikladnu ćeliju domaćina, obično prokariota kao što je E. Coli JM101. Kada ćelije porastu, sade se na agarozne ploče i skeniraju pomoću oligonukletidnih prajmera koji su radioaktivno obeleženi sa 32-Fosfatom da bi se identifikovale bakterijske kolonije koje sadrže mutiranu DNK.
[0195] Opisani metod u prethodnom pasusu može da bude modifikovan tako da se homodupleksni molekul proizvodi kada oba lanca plazmida sadže mutaciju(e). Modifikacije idu sledećim redosledom: jednolančani oligonukleotid se ubacuje u jednolančani šablon kao što je već gore opisano. Mešavina tri dezoksiribonukleotida, dezoksiribo-adenozin (dATP), dezoksiribo-guanozin (dGTP) i dezoksiribo-timidin (dTT), kombinuje se sa modifikovanim tiodezoksiribo-citozinom nazvanim još i dCTP-(aS) (koji može da se dobije od Amersham-a). Ova mešavina se dodaje šablon-oligonukleotidnom kompleksu. Posle dodavanja DNK polimeraze u ovu mešavinu, proizvodi se lanac DNK koji je identičan šablonu, osim mutiranih baza. Ovaj novi DNK lanac sadžaće dCTP-(aS) umesto dCTP, koji ga štiti od resteriktivne endonukleazne digestije. Nakon što se šablonski lanac dvolančanog heterodupleksa razdvoji odgovarajućim restriktivnim enzimom, taj se šablonski lanac može svariti (razgraditi) sa ExoIII nukleazom ili nekom drugom odgovarajućom nukleazom pored regiona koji sadrži mesto(a) mutageneze. Reakcija se zatim zaustavlja da bi se oslobodio molekul koji je samo delimično jednolančan. Zatim se formira kompletni dvolančani DNK homodupleks korišćenjem DNK polimeraze u prisustvu sva 4 dezoksiribonukleotid trifosfata, ATP-a, i DNK ligaze. Ovaj homodupleksni molekul može zatim da bude transformisan u odgovarajuću ćeliju domaćina.
[0196] Kao što je prethodno napisano, sekvenca oligonukleotidnog seta ima dovoljnu dužinu da bude hibridizovana u šablon nukleinske kiseline, a može takođe, iako nije neophodno, da sadrži restrikciona mesta. DNK šablon može da bude proizveden korišćenjem vektora koji su prethodno izvedeni od bakteriofagnih M13 vektora ili vektora koji sadrže jednolančanu fagnu tačku replikacije opisanu od Viera i sar., Meth. Enzymol., 153:3 (1987). Tako, DNK koja treba da mutira mora da bude ubačena u jedan od tih vektora da bi se dobio jednolančani šablon. Proizvodnja jednolančanog šablona je opisan u sekcijama 4.21-4.41 Sambrook i sar., supra.
[0197] Prema drugoj metodi, biblioteka može da bude stvorena obezbeđivanjem ushodnih i nishodnih oligonukleotidnih setova, gde svaki set ima mnoštvo oligonukleotida sa različitim sekvencama, različite sekvence su ustanovljene setovima kodona, koji se sadrže u sekvencama oligonukleotida. Ushodni i nishodni setovi oligonukleotida, zajedno sa varijabilnim domenom šablona sekvence nukleinske kiseline, mogu se koristiti u polimeraznoj lančanoj reakciji da bi se generisala „biblioteka“ PCR produkata. PCR produkti mogu se definisati kao „kasete nukleinskih kiselina“, jer oni mogu biti spojeni sa drugim srodnim ili nesrodnim sekvencama nukleinskih kiselina, kao što su na primer, proteini virusne kapsule i dimerizacjiski domeni, koristeći se poznatim tehnikama u molekularnoj biologiji.
[0198] Sekvence PCR prajmera uključuju jedan ili više označenih kodonskih setova pristupačnih rastvaračima i veoma različite pozicije u hipervarijabilnom regionu. Kao što gore opisano, kodonski set je mnoštvo različitih sekvenci nukleotidnih tripleta, koji kodiraju željeni tip aminokisleine.
[0199] Primerci antitela koji ispunjavaju željene kriterijume, a koji su izabrani odgovarajućim skriningom i selektivnim koracima, mogu se izolovati i klonirati pomoću standardnih rekombinantnih tehnika.
Vektori, ćelije domaćini i rekombinantne metode
[0200] Za rekombinantnu proizvodnju antitela u pronalasku, nukleinska kiselina koja ga kodira izoluje se i ubacuje u replikacijski vektor za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. DNK koja kodira antitelo se odmah izoluje i sekvencira korišćenjem konvencionalnih procedura (t.j. korišćenjem oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške ili lake lance
1
antitela). Dostupno je mnogo vektora. Izbor vektora zavisi delimično od ćelije domaćina koja se koristi. Uobičajeno je da se najčešće koriste ćelije koji imaju ili prokariotsko ili eukariotsko (obično sisarsko) poreklo.
Dobijanje antitela korišćenjem prokariotskih ćelija domaćina
Konstrukcija vektora
[0201] Polinukleotidne sekvence koje kodiraju polipeptidne komponente antitela u pronalasku mogu da se dobiju korišćenjem standardnih rekombinantnih tehnika. Željene polinukleotidne sekvence mogu biti izolovane i sekvencirane iz ćelija koje proizvode antitelo, kao što su hibridoma ćelije. Alternativno, polinukleotidi mogu biti sintetisani koristeći nukleotidne sintetizatore ili PCR tehnike. Kad se jednom dobiju, sekvence koje kodiraju polipeptide se ubacuju u rekombinantni vektor koji je sposoban da replikuje i eksprimira heterologne polinukleotide u prokariotskog domaćina. Za namenu ovog pronalaska moguće je koristitii mnoštvo već poznatih vektora. Odabir pogodnog vektora najviše će zavisiti od veličine nukleinskih kiselina koje treba da budu ubačene u vektor, kao i od određene ćelije-domaćina koja treba da bude izmenjena ovim vektorom. Svaki vektor sadrži različite komponente, u zavisnosti od svoje funkcije (amplifikacija ili ekspresija heterolognog polinukleotida, ili obe) i od svoje kompatibilnosti sa određenom ćelijom-domaćinom u kojoj boravi. Komponente vektora obično sadrže, ali nisu ograničene na: mesto replikacije, izabrani marker gen, promoter, ribozomsku vezivnu tačku (PBS), signalnu sekvencu, heterologni insert nukleinske kiseline i transkripcionu terminacionu sekvencu.
[0202] Uglavnom, plazmidni vektori koji sadrže replikon i kontrolnu sekvencu koji potiču od vrsta koje su kompatibilne sa ćelijom-domaćinom, koriste se u vezi sa tim domaćinima. Vektor obično sadrži replikacionu tačku, kao i sekvencu za markiranje koje su sposobne da obezbede fenotipsku selekciju u transformisanoj ćelliji. Na primer, E. Coli se obično transformiše korišćenjem pBR322, plazmida koji potiče iz E. Coli soja. pBR322 sadrži gene koji kodiraju otpornost na ampicilin (Amp) i tetraciklin (Tet), što obezbećuje laku identifikaciju transformisanih ćelija. PBR322, njegovi derivati, ili ostali mikrobni plazmidi ili bakteriofagi mogu da sadrže, ili mogu da budu modifikovani da sadrže, promotere koji mogu da se koriste od strane mikroorganizama za ekspresiju endogenih proteina. Primeri derivata pBR322 koji se koriste za ekspresiju određenih antitela prikazani su detaljno u Carter i sar., SAD patent Br.5,645,237.
[0203] Takođe, fagni vektori koji sadrže replikon i kontrolne sekvence koje su kompatibilne sa mikroorganizmom domaćinom, mogu da se koriste kao transformacijski vektori u vezi sa ovim domaćinima. Na primer, bakteriofag, kao što je λGEM.TM.-11 može da se koristi u stvaranju rekombinantnog vektora koji može da se upotrebi za transformaciju podložne ćelije-domaćina kao što je E. Coli LE392.
[0204] Ekspresioni vektor prema pronalasku može da uključi dva ili više cistron-promoterskih parova, kodirajući svaku od polipeptidnih komponenti. Promoter je neprevedena regulatorna sekvenca locirana ushodno (5’) od cistrona koja moduliše njegovu ekspresiju. Prokariotski promoteri se obično svrstavaju u dve klase, inducibilni i konstitutivni. Inducibilni promoter je promoter koji inicira povećanje nivoa transkripcije cistrona koji je pod njegovom kontrolom, kao odgovor na promene uslova u kojima je kultura, t.j. prisustvo ili nedostatak hrane ili promene u temperaturi.
[0205] Poznat je veliki broj promotera koje prepoznaju različite ćelije-domaćini. Izabrani promoter može operativno da bude povezan sa cistronom DNK koji kodira laki ili teški lanac, uklanjanjem promotera iz izvora DNK resterikcionom enzimskom digestijom i ubacivanjem izolovane promoterska sekvence u vektor u pronalasku. I nativna promoterska sekvenca i mnogo heterolognih promotera mogu se koristiti da upravljaju amplifikacijom i/ili ekspresijom ciljanih gena. U nekim aspektima, upotrebljavaju se heterologni promoteri, jer oni obično dozvoljavaju veću transkripciju i veće prinose eksprimiranih ciljanih gena u poređenju sa prirodnim polipeptidnim promoterima.
[0206] Promoteri koji su pogodni za korišćenje u prokariotskim domaćinima su PhoA promoter, βgalaktamazni i laktozni promoterski sistemi, triptofan (trp) promoterski sistem i hibridni promoteri kao što su tac ili trc promoter. Ostali promoteri koji si funkcionalni u bakterijama (kao što su drugi bakterijski ili fagni promoteri) takođe su pogodni. Njihove nukleotidne sekvence su objavljene, čime se omogućava obučenom radniku da ih veže za za cistrone koji kodiraju ciljane lake i teške lance (Siebenlist i sar. (1980) Cell 20: 269), koristeći povezivače i adaptere da bi obezbedili bilo koje neophodno resterikciono mesto.
2
[0207] U jednom aspektu ovog pronalaska, svaki cistron u rekombinantnom vektoru obuhvata sekretornu komponentu signalne sekvence koja upravlja translokacijom eksprimiranih polipeptida kroz membranu. U celini, signalna sekvenca može da bude komponenta vektora, ili može da bude deo ciljanog polipeptida DNK koji je ubačen u vektor. Signalna sekvenca koja je izabrana za pronalazak, treba da bude ona koja je prepoznata i obrađena (t.j. razdvojena pomoću signalne peptidaze) od strane ćelije-domaćina. U prokariotskim ćelijama-domaćinima koje ne prepoznaju i ne obrađuju nativnu signalnu sekvencu za heterologne polipeptide, signalna sekvenca se zamenjuje sa prokariotskom signalnom sekvencom, koja je na primer, selektirana iz grupe koja sadrži alkalnu fosfataze, penicilinaze, Ipp, ili toplotno stabilni vodeći enterotoksin II (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA i MBP. U jednom aspektu ovog pronalaska, signalne sekvence koe su korišćene u oba cistrona ekspresionog sistema su STII signalne sekvence ili varijante istih.
[0208] U drugom aspektu, proizvodnja imunoglobulina, prema pronalasku, može da se izvrši u citoplazmi ćelije-domaćina, i tako ne zahteva prisustvo sekretornih signalnih sekvenci u svakom cistronu. U tom pogledu, laki i teški lanci imunoglobulina su eksprimirani, presavijeni i složeni da bi formirali funkcionalne imunoglobuline u citoplazmi. Neki sojevi domaćina (na pr. E.coli trxB-sojevi) obezbeđuju uslove u citoplazmi koji su povoljni za formiranje disulfidnih veza, i na taj način omogučavaju pravilno sklapanje i montažu eksprimiranih proteinskih sub jedinica. Proba i Pluckthun Gene, 159:203 (1995).
[0209] Ovaj pronalazak daje ekspresioni sistem, u kome kvantitivni odnos eksprimiranih polipeptidnih komponenata može da bude modulisan da bi se povećao prinos izlučenih i pravilno složenih antitela. Ovakva modulacija, je barem delimično, omogućena simultanom modulacijom translacionih jačina za polipeptidne komponente.
[0210] Jedna tehnika za modulaciju translacione jačine je pokazana u Simmons i sar., SAD patent Br.
5,840,523. Ona koristi varijante inicijalnih regiona translacije (TIR) u cistronu. Za zadati TIR, mogu da budu stvorene serije aminokiselina ili varijante sekvenci nukleinskih kiselina u opsegu translacionih snaga, čime se obezbeđuju pogodna sredstva kojima se ovaj faktor prilagođava za željeni ekspresioni nivo određenog lanca. TIR varijante mogu da budu proizvedene pomoću konvencionalnih mutagenih tehnika koje imaju za rezultat promene kodona, koji mogu da promene sekvence aminokiselina, iako su poželjnije tihe promene u nukleotidnom nizu. Promene u TIR mogu da uključuju, na primer, promene u broju ili razmeštaju Shine-Dalgarno sekvenci, zajedno sa promenama u signalnoj sekvenci. Jedan od metoda za stvaranje mutiranih signalnih sekvenci je stvaranje „kodonske banke“ na početku kodonskog niza koji ne menja aminoskislinsku sekvencu u signalnoj sekvenci (t.j. promene su tihe). Ovo može da bude postignuto sa promenom nukleotida na trećoj poziciji u svakom kodonu; dodatno, neke aminokiseline, kao na pr., leucin, serin, i arginin, imaju višestruke prve i druge pozicije koje mogu da doprinesu kompleksnosti u nastajanju banke. Ovaj metod mutanogeneze je opisan detaljno u Yansura i sar. (1992) METHODS: A Companion to Methods in Enzymol.
4:151-158.
[0211] Poželjno je da se stvori skup vektora u opsegu TIR snaga za svaki cistron. Ovaj ograničeni set omogućava poređenje nivoa ekspresije svakog lanca, kao i prinos željenih antitela produkata pod različitim kombinacijama TIR snaga. Snage TIR-a mogu biti određene kvantifikovanjem nivoa ekspresije reporter gena, što je detaljno opisano u Simmons i sar. SAD patent Br. 5, 840,523. Na osnovu upoređivanja translacione snage, željeni individualni TIR-evi se biraju da bi se kombinovali u ekspresione vektorske konstrukte u pronalasku.
[0212] Prokariotske ćelije-domaćini pogodne za ekspresiju antitela u pronalasku uključuju Arhebakterije i Eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-positivni organizmi. Primeri korisnih bakterija uključuju Ešerihiju (t.j., E. coli), Bacil (t.j., B. subtilis), Enterobakteriju, Pseudomonas vrste (t.j., P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, ili Paracoccus. U jednom aspektu korišćene su gram-negativne ćelije. U pronalasku, u jednom aspektu kao domaćini su korišćene ćelije E.coli. Primeri sojeva E.coli uključuju soj W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol.2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), pp. 1190-1219; ATCC Deposit No.27,325), i njene derivate, kao što je soj 33D3 koji ima genotip W3110 A/7tMA (∆tonA) ptr3 lac Iq lacL8 ∆ompT∆(nmpc-fepE) degP41 kanR (SAD patent Br. 5,639,635). Ostali sojevi i derivati istih, kao što je E. coli 294 (ATCC 31,446), E. coli B, E. coli λ 1776 (ATCC 31,537) i E. coli RV308 (ATCC 31,608) su isto tako prikladni. Ovi primeri su više ilustrativni nego ograničavajući. Metodi za konstrukciju derivata sa definisanim genotipovima bilo koje od gore-navedenih bakterija, su dobro poznati i opisani, na primer u Bass i sar., Proteins, 8:309-314 (1990). Obično, je potrebno izabrati odgovarajuću bakteriju imajući u vidu mogućnost replikacije replikona u ćeliji bakterije. Na primer, sojevi E. coli, Serratia-e, ili Salmonellae, mogu da budu upotrebljeni kao pogodni domaćini, ako se kao snabdevači replikona koriste dobro poznati plazmidi pBR322, pBR325, pACYC177, ili pKN410. Tipično, ćelija-domaćin treba da luči minimalne količine proteolitičkih enzima, dodatni proteazni inhibitori mogu po želji da budu dodati u kulturu ćelija.
Proizvidnja antitela
[0213] Ćelije domaćina su transformisane sa gore opisanim ekspresionim vektorima i kultivisani su u konvencionalni hranljivi medijum, koji je modifikovan da odgovara potrebi indukcije promotera, selektovanja transformanta ili amplifikacije gena koji kodiraju željene sekvence.
[0214] Transformacija znači uvođenje DNK u prokariotskog domaćina, tako da DNK ostaje replikabilna, ili kao ekstrahromozomski element ili kao integrisani deo hromozoma. U zavisnosti od ćelije koja je domaćin, transformacija se sprovodi korišćenjem standardnih tehnika prikladnih za te ćelije. Kalcijumski tretman u kome se upotrebljava kalcijum hlorid, obično se koristi za bakterijske ćelije koje imaju čvrste barijere u ćelijskm zidu. Druga metoda za transformaciju upotrebljava polietilen glikol/DMSO. Još jedna tehnika je elektroporacija.
[0215] Prokariotske ćelije koje se koriste za proizvodnju polipeptida u pronalasku, se gaje u poznatim medijumima koji su pogodni za kulturu odabranih ćelija domaćina. Primeri pogodnih medijuma sadrže luria čorbu (LB) u koju su dodati potrebni hranljivi dodaci. U nekim aspektima, medijum takođe sadrži odabrani agens, koji je baziran na konstrukciji ekspresionog vektora, da bi selektivno dozvolio rast prokariotskih ćelija koje sadrže ekspresioni vektor. Na primer, ampicilin se dodaje medijumu da bi stimulisao rast ćelija koje eksprimiraju gene otporne na ampicilin.
[0216] Ostali neophodni dodaci, osim ugljenika, azota, i neorganskih izvora fosfata, isto tako mogu da budu uključeni u odgovarajućoj koncentraciji, dodati sami, ili kao deo smeše sa ostalim dodacima ili kao medijum kao što su kompleksni azotni izvori. Opcionalno, medijum kulture može da sadrži jedan ili više ograničavajućih agensa selektovanih iz grupe koja sadrži glutation, cistein, cistamin, tioglikolat, ditioeritritol i ditiotreitol.
[0217] Prokariotske ćelije-domaćini su kultivisane na odgovarajućim temepraturama. Za rast E.coli, na primer, najpovoljnije su temperature koje variraju od 20°C do 39°C, ili još bolje od 25°C do 37°C, ili najbolje oko 30°C. pH medijuma može biti bilo koji pH koji se kreće od 5 do 9, u zavisnosti od organizma domaćina. Za E.coli, najpoželjniji nivo pH je od 6,8 do 7,4, a najbolji oko 7,0.
[0218] Ako se koristi inducibilni promoter u ekspresionom vektoru u pronalasku, proteinska ekspresija je indukovana u uslovima povoljnim za aktivaciju promotera. U jednom aspektu pronalaska, PhoA promoteri se koriste za kontrolu transkripcije polipeptida. Prema tome, transformisane ćelije-domaćini su kultivisane u indukcionom medijumu lišenom fosfata. Najpoželjniji medijum lišen fosfata je C.R.A.P medijum (vidi, za primer, Simmons i sar., J. Immumol. Methods (2002), 263:133-147). Može se koristiti mnoštvo drugih induktora, u zavisnosti od upotrebljene vektorske konstrukcije, kao što je dobro poznato u oblasti.
[0219] U jednom aspektu, ekspresioni polipeptidi u ovom pronalasku su sekretuju u, i dobijaju natrag iz, periplazme ćelija-domaćina. Obično povratak proteina uključuje povredu mikroorganizma, takvim sredstvima kao što je osmotski šok, sonifikacija ili razlaganje. Kada je ćelija narušena, delovi ili cela ćelija mogu da se odstrane centrifugiranjem ili filtracijom. Proteini se mogu dalje prečistiti, na primer, korišćenjem afinitetne hromatografe na smoli. Alternativno, proteini mogu da se transportuju u medijum kulture i tamo izoluju. Ćelije mogu da se uklone iz kulture, a supernatant se filtrira i koncentriše za dalje prećišćavanje proizvedenih proteina. Eksprimirani polipeptidi mogu dalje da se izoluju i identifikuju korišćenjem poznatih metoda kao što su elektroforeze na poliakrilamidnom gelu (PAGE), ili Western blot esejem.
[0220] U jednom aspektu pronalaska, proizvodnja antitela je izvedena u velikoj količini procesom fermentacije. Dostupne su različite fermentacijske procedure u posudama velikih razmera za proizvodnju rekombinantnih proteina. Fermentacije velikih razmera imaju kapacitet od barem 1000 litara, najbolje od 1000 do 100000 litara. Ovi posude za fermentaciju koriste mešalice za distribuciju kiseonika i hranljivih
4
materija, posebno glukoze (koja je najbolji izvor ugljenika i energije). Fermentacije malih razmera obično podrazumevaju fermentacije u posudama čiji volumenski kapacitet nije veći od 100 litara, i obično se kreću od 1 litra do 100 litara.
[0221] U procesu fermentacije, indukcija ekspresije proteina obično se inicira pošto su ćelije bile gajene pod pogodnim uslovima do željene gustine, na pr. OD550 ili oko 180-220, gde su ćelije u ranoj stacionarnoj fazi. Može da se koristi više različitih induktora, u zavisnosti od upotrebljene vektorske konstrukcije, kao što je poznato u oblasti i opisano u gornjim pasusima teksta. Ćelije mogu da se gaje u kraćim vremenskim periodima pre indukcije. Ćelije se obično indukuju 12-50 sati, iako može da se koristi kraće ili duže indukciono vreme.
[0222] Da bi se poboljšao prinos proizvodnje kao i kvalitet polipeptida u pronalasku, razni uslovi fermentacije mogu da se menjaju. Na primer, da bi se poboljšalo pravilno sklapanje i savijanje izlučenih polipeptida antitela, mogu se koristiti dodatni vektori koji više eksprimiraju (šaperon) proteine pratioce, kao što su Dsb proteini (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD i/ili DsbG) ili FkpA (peptidilprolil cis, trans-izomeraze sa pratilačkom (šaperon) aktivnošću), a koji pomažu u ko-transformaciji prokariotskih ćelija-domaćina. Za (šaperon) proteine pratioce je pokazano da olakšavaju pravilno savijanje i rastvorljivost heterolognih proteina proizvedenih u bakterijskim ćelijama domaćinima. Chen i sar. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou i sar., SAD patent Br. 6,083,715; Georgiou i sar., SAD patent Br. 6,027,888; Bothmann and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm and Pluckthun (2000) J. Biol. Chem.
275:17106-17113; Arie i sar. (2001) Mol. Microbiol.39:199-210.
[0223] Da bi se smanjila proteoliza eksprimiranih heterolognih proteina (posebno onih koji su proteolitički senzitivni), u ovom pronalasku kao domaćini mogu se koristiti određeni sojevi koji nemaju proteolitičke enzime. Na primer, sojevi ćelija-domaćina mogu da se modifikuju tako da utiču na genetsku mutaciju/mutacije u genima koji kodiraju poznate bakterijske proteaze kao što su Proteaza III, OmpT, DegP, Tsp, Proteaza I, Proteaza Mi, Proteav V, Proteaza VI i njihove kombinacije. Neki sojevi E.coli sa nedostatkom proteaza su dostupni i opisani u, na primer, Joly i sar. (1998), supra; Georgiou i sar., SAD patent Br. 5,264,365; Georgiou i sar., SAD patent Br. 5,508,192; Hara i sar., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).
[0224] U jednom aspektu, sojevi E. coli sa nedostatkom proteolitičkih enzima, transformisani sa plazmidima koji povećano eksprimiraju jedan ili više šaperon proteina (pratioca), su korišćeni kao ćelije-domaćini u ekspresionom sistemu pronalaska.
Prečišćavanje antitela
[0225] U jednom aspektu, ovde proizvedeni protein antitela se dalje prečišćava da bi se dobili preparati koji su značajno homogeni za dalje eseje i upotrebe. Upotrebljavaju se dobro poznati i standardni metodi za prečišćavanje proteina. Navedene procedure su primer pogodnih procedura za prečišćavanje: imunoafinitetno frakcionisanje ili jono-izmenjivačke kolone, taloženje etanolom, HPLC na obrnutim fazama, hromatografija na silicijum-dioksidu ili smoli koja koristi razmenu katjona, kao što je DEAE, hromatofokusiranje, SDS-PAGE, taloženje amonijum sulfatom, gel filtracija, gde se koristi, na primer Sephadex G-75.
[0226] U jednom aspektu u pronalasku, koristi se Protein A koji je imobilisan na čvrstoj fazi, za imunoafiniteno prečišćavanje produkata antitela u punoj dužini. Protein A je 41kD protein iz ćelijskog zida Staphylococcus aureas, koji se veže sa velikim afinitetom za Fc region antitela, Lindmark i sar (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. Poželjno je da čvrsta faza za koju se Protein A imobiliše bude kolona čija je površina sačinjena od stakla ili silicijum dioksida, još poželjnije je da to bude kolona sa kontrolisanim poroznim staklom ili kolona sa silikatnom kiselinom. U nekim aplikacijama, kolona je obložena reagensom, kao što je glicerol, u pokušaju da se spreči nespecifično prijanjanje zagađivača.
[0227] U prvom koraku prečišćavanja, preparat dobijen iz kulture ćelija, kao što je opisano u gornjem tekstu, se nanosi na imoblisanu čvrstu fazu Proteina A, da bi se omogućilo specifično vezivanje antitela od interesa za Protein A. Čvrsta faza se zatim ispira da bi se odstranila kontaminacija koja je ne-specifično vezanana za čvrstu fazu. Konačno, antitelo od interesa se izvlači iz čvrste faze (ispiranjem) elucijom.
Proizvodnja antitela upotrebom ekariotskih ćelija-domaćina
[0228] Komponente vektora obično se sastoje od, ali nisu ograničene na, jedan ili više sledećih elemenata: signalna sekvenca, mesto replikacije, jednog ili više marker gena, pojačavačkog element, promoter-a, i sekvence za zaustavljanje transkripcije.
(i) Komponenta signalne sekvence
[0229] Vektor koji se koristi u eukariotskoj ćeliji – domaćinu, može da sadrži signalnu sekvencu ili neki drugi polipeptid koji ima specifičnu tačku razdvajanja na N-terminusu (kraju) zrelog proteina ili polipeptida od interesa. Izabrana željena heterologna signalna sekvenca je ona koja se prepoznaje i procesira (t.j., razdvojena pomoću signalne peptidaze) od strane ćelije domaćina. Kod sisara su dostupni: ćelijska ekspresija, sisarske signalne sekvence kao i virusni sekretorni lideri, na primer, herpes simpleks gD signal.
[0230] DNK iz takvog prekursorskog regiona je vezana za okvir čitanja DNK koja kodira antitelo
(ii) Izvor (mesto) replikacije
[0231] Generalno, izvor replikacijske komponente nije potreban za sisarsku ekspresiju vektora. Na primer, SV40 izvor može se obično koristiti samo zato što sadrži rani promoter.
(iii) Selektivna genska komponenta
[0232] Ekspresioni i klonirajući vektori mogu da sadrže selektivni gen, koji se još naziva i izborni marker. Tipični selektivni geni kodiraju proteine koji (a) imaju rezistenciju na antibiotike ili duge toksine, kao na pr., ampicilin, neomicin, metotreksat, ili tetraciklin, (b) dopunjuju auksotrofične nedostatke, kada su oni bitni, ili (c) obezbeđuju kritične hranljive meterije kojih nema u kompleksnim medijumima.
[0233] Jedan primer odabrane šeme koristi lek da bi se zaustavio rast ćelije-domaćina. Te ćelije koje su uspešno transformisane heterolognim genom, proizvode protein koji nosi rezistenciju na lek, i tako preživljavaju režim selekcije. Primeri ovakve dominantne selekcije koriste lekove: neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin.
[0234] Još jedan primer odgovarajućih selekcionih markera za sisarske ćelije su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelijskih komponenti koje preuzimaju nukleinsku kiselinu antitela, kao na pr. DHFR, timidin kinaza, metalotionein-I i -II, željeni primatski metalotionein geni, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza, itd.
[0335] Na primer, ćelije transformirane pomoću DHFR selekcionog gena su prvi put identifikovane kultivisanjem svih transformanata u medijumu kulture koji sadrži metotreksat (Mtx), koji je kompeticijski antagonist DHFR. Kao pogodna ćelija domaćin za divlji tip DHFR, koristi se jajna ćelija kineskog hrčka (CHO) ćelijska linija koja ne poseduje DHFR aktivnost (npr. ATCC CRL-9096).
[0236] Alternativno, ćelije domaćini (posebno divlji tipovi domaćina koji sadrže endogeni DHFR) koje su transfromisane ili ko-transformisane pomoću DNK sekvenci koje kodiraju antitelo, divlji tip DHFR proteina, i još jedan izabrani marker kao npr. aminoglikozid 3’-fosfotransferaze (APH) mogu se selektovati gajenjem ćelija u medijumu koji sadrži selekcioni agens za izabrani marker kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr. kanamicin, neomicin, ili G418. Vidi SAD patent Br.4,965,199.
(iv) Promoterska komponenta
[0237] Ekspresioni ili klonirajući vektori obično sadrže promoter koji je prepoznat od strane organizma domaćina i operativno je povezan sa nukleinskom kiselinom polipeptida antitela. Za eukariote su poznate promoterske sekvence. Praktično, svi eukariotski geni imaju region bogat AT bazama, koji je smešten oko 25 do 30 baza ushodno od mesta gde počinje transkripcija. Druga sekvenca pronađena 70 do 80 baza ushodno od početka transkripcije mnogih gena je CNCAAT region gde N može da bude bilo koji nukleotid. Na 3’ kraju većine eukariotskih gena se nalazi AATAAA sekvenca koja može da bude signal za dodavanje poli A repa na 3’ kraj kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence se lako ubacuju u eukariotske ekspresione vektore.
[0238] Transkripcija polipeptida antitela iz vektora u sisarskim ćelijama domaćinima je kontrolisana, na primer, promoterima dobijenim iz genoma virusa kao što su virus polioma, virus varičela, adenovirusi (kao na primer Adenovirus 2), virus goveđeg papiloma, virus ptičje sarkome, citomegalovirus, retrovirus, hepatitis-B virus i Simian Virus 40 (SV40), iz heterolognih sisarskih promotera, tj. aktin promotera ili imunoglobulinskog promotera, iz toplotno šokiranih promotera, dobijanje ovakvih promotera je kompatibilno sa sistemima ćelija-domaćina.
[0239] Rani i kasni promoteri iz SV40 virusa se jednostavno dobijaju kao SV40 restrikcioni fragment koj isto tako sadrži SV40 virusno mesto replikacije. Neposredni rani promoter humanog citomegalovirusa se jednostavno dobija kao HindIII E resterikcioni fragment. Sistem za ekspresiju DNK u sisarskim domaćinima koji koristi goveđi papiloma virus kao vektor je obelodanjen u SAD patent Br.4,419,446. Modifikacija ovog sistema je opisan u SAD patent Br. 4,601,978. Videti takođe u Reyes i sar., Nature 297:598-601 (1982) o eksperesiji kDNK za humani β-interferon u ćelijama miša pod kontrolom timidin kinaznog promotera iz herpes simpleks virusa. Alternativno, kao promoter može biti korišćen i dugi krajnji ponovak Rous sarcoma virusa.
(v) Komponenta elementa pojačivača
[0240] Transkripcija DNK koja kodira polipeptide antitela u ovom pronalasku u višim eukariotama, često je pojačana ubacivanjem sekvence pojačavača u vektor. Danas su poznate mnoge pojačavačke sekvence iz gena sisara (globin, elastaze, albumin, α-fetoprotein i insulin). Međutim obično se koristiti pojačavač iz eukariotske ćelije virusa. Primeri uključuju: SV40 pojačavač na kasnoj strani replikacionog izvora (bp 100-270), citomegalovirus-ni rani promoterski pojačavač, polioma pojačavač na kasnoj strani replikacionog izvora, i adenovirusni pojačavači. Pogledati takođe Yaniv, Nature 297:17-18 (1982), o elementima pojačavača za aktiviranje eukariotskih promotera. Pojačavač može da se uveže u vektor na poziciji 5’ ili 3’ kodirajuće sekvence za polipeptid antitela, no najbolje je ako je lociran na 5’ poziciji od promotera.
(vi) Komponenta prekida transkripcije
[0241] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćinima obično će sadržati i sekvencu neophodnu za prekidanje transkripcije i za stabilizaciju iRNK. Ovakve sekvence obično su prisutne od 5’ i, povremeno od 3’ neprevedenih regiona eukariotske ili virusne DNK ili kDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente prevedene u poliadenilatidne fragmente u neprevedenim delovima iRNK koje kodiraju antitelo. Jedna korisna terminacijska komponenta je poliadenilatidni region u goveđeg hormona rasta. Pogledaj WO94/11026 i ekspresionivektor opisan tamo.
(vii) Selekcija i transformacija ćelije domaćina
[0242] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNK u vektore uključuju više eukariotske ćelije opisane ovde, uključujući i ćelije domaćine kičmenjaka. Razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) je postala rutinska procedura. Primeri korisnih sisarskih ćelijskih linija-domaćina su: CV1 linija iz majmunskih bubrega, koja je transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionalna linija iz bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi, Graham i sar., J. Gen Virol.36:59 (1977)); ćelije bubrega mladunaca hrčka (BHK, ATCC CCL 10); jajne ćelije kineskog hrčka /-DHFR (CHO, Urlaub i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); Sertoli mišje ćelije TM4, Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna(CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega Afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); humane ćelije raka grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije pasjih bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre Bafalo pacova BRL 3A, ATCC CRL 1442); humane plućne ćelije (W138, ATCC CCL 75); humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065); tumor mlečnih žlezdi kod miša MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i sar., Annals N.Y. Acad. Sci.383: 44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i humana hepatoma linija (Hep G2).
[0243] Ćelije domaćini se transformišu gore opisanim ekspresionim ili klonirajućim vektorima za proizvodnju antitela i kultivišu se u konvencionalnim hranljivim medujumima koji su modifikovani da budu pogodni za indukciju promotera, selekciju transformanata, ili za amplifikaciju gena koji kodiraju željene sekvence.
(viii) Kultivisanje ćelije domaćina
[0244] Ćelije domaćini koji se koriste za produkciju antitela u ovom pronalasku, mogu se kultivisati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni medijumi kao što su Ham’s F10 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Minimal Essential Medium (minimalni osnovni medijum) ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), i Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium ((DMEM), Sigma) su prikladni za kultivisanje ćelija domaćina. Pored toga, svaki od medijuma opisanih u Ham i sar., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes i sar., Anal. Biochem.102:255 (1980), U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; or 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; or U.S. Patent Re.30,985 mogu da se koriste kao medijumi za kulturu ćelija domaćina. Svaki od ovih medijuma, ako je to potrebno, može da bude obogaćen hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin, ili epidermalni faktor rasta), solima (kao na pr., natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum, fosfati), puferi (kao HEPES), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je lek GENTAMICIN<TM>), elementi u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja obično prisutni u finalnoj koncentraciji mikromolarnog opsega), i glukoza ili neki ekvivalentni energetski izvor. Ostali neophodni dodaci mogu isto tako biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH, i slično, su isti kao prethodno korišćeni za ćelije domaćina izabrane za ekspresiju, i očigledne su za prosečno obučenu osobu.
(ix) Prečišćavanje antitela
[0245] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitela mogu da se proizvode intracelularno, ili da se direktno izluče u medijum. Ako se antitela proizvede intracelularno, prvi korak je da se čestice ostataka, koje potiču ili od ćelija domaćina, ili od liziranih fragmenata, otklone, na primer centrigugiranjem ili ultrafiltracijom. Ako je antitelo izlučeno u medijum, supernatanti iz takvog sistema ekspresije obično se prvo koncentrišu pomoću komercijalno dostupnih proteinskih koncentracionih filtera, na primer, Amikon ili ultrafiltraciskom jedinicom Millipore Pellicon. Proteazni inhibitor kao PMSF može da bude uključen u bilo koji od ovih koraka da bi inhibirao proteolize, a antibiotici mogu da budu uključeni da bi zaustavili rast slučajnih zagađivača.
[0246] Kompozicija antitela koja je proizvedena iz ćelija može da bude prečišćena pomoću, na pr., hromatografije na hidroksilapatitu, elektroforeze na gelu, dijalize, afinitetne hromatografije, gde se afinitetna hromatografija smatra najboljom tehnikom. Pogodnost proteina A kao vezujućeg liganda zavisi od vrsta i izotopa bilo kog imunoglobulinskog Fc domena koji je prisutan u antitelu. Protien A može da se koristi za prečišćavanje antitela koja su bazirana na humanim γ1, γ2, ili γ4 teškim lancima (Lindmark i sar., J. Immunol. Meth.62:1-13 (1983)). Protein G se preporučuje za sve mišije izotope kao i za humani γ3 (Guss i sar., EMBO J. 5:15671575 (1986)). Podloga na kom je vezujući ligand vezan je najčešće agaroza, ali dostupne su i druge podloge. Mehaničko stabilne podloge kao što je kontrolno porozno staklo ili poli(stirenedivinil)benzen dozvoljavaju brži protok i kraća vremena obrade za razliku od agaroze. Tamo gde antitelo obuhvata CH3 domen, Bakerbond ABX™ smola (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) je podesna za prećiščavanje. Ostale tehnike za proteinsko prećiščavanje kao što je frakcionisanje na jono-izmenjivačkoj koloni, taloženje etanolom, HPLC na obrnutim fazama, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE<TM>, hromatografija na anjon ili katjon izmjenivačkoj smoli (kao što je kolona sa poliaspartičnom kiselinom), hromatofokusiranje, SDS-PAGE, i taloženje amonijum sulfatom, su isto tako moguće u zavisnosti od antitela koje treba da se proizvede.
[0247] Nakon preliminarnih koraka prečišćavanja, mešavina koja se sastoji od željenih antitela i zagađivača može biti izložena hromatografiji zasnovanoj na hidrofobnim interakcijama na niskim pH, koristeći elucioni pufer gde je pH između 2,5-4,5, u uslovima niskih koncentracija soli (pr., od 0-0,25M soli).
Eseji aktivnosti
[0248] Antitela u ovom pronalasku mogu da budu okarakterisana po njihovim fizičko/hemijskim osobinama i biološkim funkcijama pomoću različitih poznatih eseja.
[0249] Prečišćeni imunoglobulini dalje se karakterišu serijom eseja uključujući, ali ne ograničavajući se, na N-terminalno sekvenciranje, aminokiselinske analize, nezavisnu od veličine i ne-denaturišuća tečnu hromotografiju pod visokim pritiskom (HPLC), masenu spektrometriju, jonoizmjenjivačku hromatografiju i papaja digestiju.
[0250] U određenim aspektima ovog pronalaska, ovde proizvedeni imounoglobulini su analizirani na njihovu biološku aktivnost. U nekim manifestacijima, imunoglobulini u ovom pronalasku su testirani na njihovu antigen vezujuću aktivnost. Antigen vezujući eseji koji su poznati u oblasti i koji se ovde mogu upotrebljavati uključuju bez ograničenja bilo koje direktne ili kompetativne vezujuće eseje koristeći tehnike ako što su Western blotovi, radioimunoeseji, ELISA (enzim vezujući imunski esej), „sendvič“ imunoeseji, imunopercipitacioni eseji, fluorescentni imunoeseji, i protien A imunoeseji. Ilustracija antigen vezujućeg eseja je prikazana dole u sekciji Primeri.
[0251] U jednom aspektu, ovaj pronalazak razmatra izmenjeno antitelo koje poseduje neke, ali ne sve, efektorske funcije, što ga čini poželjnim kandidatom za mnoge aplikacije u kojima je polu život antitela in vivo važan, ali su određene efektorske funkcije (kao što je dopuna i ADCC) nepotrebne ili štetne. U nekim aspektima, Fc aktivnosti proizvedenog imunoglobulina su merene da bi se osigurale i održale samo poželjne osobine. In vitro i/ili in vivo citotoksični eseji upotrebljavaju se da bi se potvrdila redukcija/iscrpljivanje CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, Fc receptor (FcR) vezujući eseji mogu se upotrebiti da osiguraju da antitelo ne vezuje FcyR (otuda verovatno nedostaje ADCC aktivnost), ali da zadrži FcRn vezivnu sposobnost. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcγRIII, dok monociti eksprimiraju FcγRI, FcγRII i FcγRIII. FcR ekspresija na hematopoetskim ćelijama je sumirana u tabeli 3 na str.464 u Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Primer in vitro eseja koji procenjuje ADCC aktivnost molekula koji nas zanima je opisan u US Patent No. 5,500,362 or 5,821,337. Korisne efektoske ćelije za takve eseje su: periferne krvne mononuklearne ćelije (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može da se proceni in vivo, t.j. u životinjskom modelu kao što je opisano u Clynes i sar al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). C1q vezivni eseji mogu takođe da se izvrše da bi se potvrdilo da je antitelo nesposobno da veže C1q, tako da mu nedostaje CDC aktivnost. Da bi se procenila aktivacija komplementa, na primer može da se izvede CDC esej, koji je opisan u Gazzano-Santoro i sar., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota isto tako mogu biti izvedeni koristeći poznate metode, na primer one koje su opisane u sekciji Primeri.
Humanizovana antitela
[0252] Ovaj pronalazak obuhvata i humizovana antitela. Poznato je dosta metoda za humanizaciju nehumanih antitela. Na primer, humizovano antitelo može da ima jedan ili više aminokiselinskih ostataka ubačenih u njega iz ne-humanog izvora. Ovi ne-humani aminokiselinski ostaci često su nazvani i “uvozni” ostaci, i obično su uzeti sa “uvoznih” varijabilnih domena. Humanizacija u suštini može da bude obavljena koristeći metod Wintera i njegovih saradnika (Jones i sar. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann i sar. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen i sar. (1988) Science 239:1534-1536), gde se hipervarijabilne regionalne sekvence zamenjuju sa odgovarajućim sekvencama humanog antitela. Shodno tome, takva „humanizovana“ antitela su himerna antitela (SAD patent Br.4,816,567), gde se znatno manje od netaknutog humanog varijabilnog domena zamenjuje odgovarajućom sekvencom ne-humane vrste. U praksi, humanizovana antitela su tipična humana antitela u kojima su neki hipervarijabilni reginonalni ostaci, kao i, verovatno neki FR ostaci, zamenjeni sa ostacima iz analognih mesta u glodarskim antitelima.
[0253] Izbor humanih varijabilnih domena, i lakih i teških, koji se koriste u proizvodnji humanizovanih antitela, je veoma važan kako bi se redukovala antigenost. Prema takozvanoj „best-fit“ metodi, sekvenca varijabilnog domena iz glodarskog antela je skenirana u odnosu na celu biblioteku poznatih humanih sekvenci varijabilnih domena. Humana sekvenca koja je najsličnija glodarskoj se onda prihvata kao humani okvir za humanizaciju antitela (Sims i sar. (1993) J. Immunol.151:2296; Chothia i sar. (1987) J. Mol. Biol.
196:901. Druga metoda koristi specifičan okvir koji je izveden iz konsenzusne sekvence svih humanih antitela posebne podgrupe lakih ili teških lanaca. Isti taj okvir može da se koristi za više različitih humaniziranih antitela (Carter i sar. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285; Presta i sar. (1993) J. Immunol., 151:2623.
[0254] Posebno je važno da antitela budu humanizovana a da je zadržan visoki afinitet za antigen i ostale povoljnie biološke osobine. Da bi se ovo ostvarilo, prema jednoj metodi, humanizovana antitela su pripremljena kroz proces analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih proizvoda koristeći tro-dimenzionalne modele roditeljskih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su pristupačni i dobro poznati obučenim stručnjacima u ovoj oblasti. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacijske strukture odabranih kandidata imunoglobulinskih sekvenci. Ispitivanje ovih prikaza dozvoljava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidata imunoglobulinskih sekvenci, odnosno, analizu ostataka koji utiču na sposobnost imunoglobulinskih kandidata da vežu svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu da budu selektovani i kombinovani između primaoca i uvoznih sekvenci, tako da su željene karakteristike antitela, kao što je povećani afinitet za ciljane antigene, postignute. Generalno, hipervarijabilni regionalni ostaci su direktno i veoma značajno uključeni i utiču na antigensko vezivanje.
Varijante antitela
[0255] Obelodanjenje omogućava da fragment antitela obuhvata modifikacije u interfejsu Fc polipeptida koji uključuje Fc region, pri čemu modifikacije olakšavaju i/ili promovišu heterodimerizaciju. Ove modifikacije obuhvataju uvođenje protuberance (ispupčenje) u prvom Fc polipeptidu i šupljine (udubljenja) u drugom Fc polipeptidu, gde protuberanca može da bude smeštena u šupljinu tako da promoviše usložnjavanje prvih i drugih Fc polipeptida. Metode stvaranja antitela sa ovim modifikacijama su dobro poznati, na primer, kao što je opisano u SAD patent Br.5,731,168.
[0256] U nekim aspektima, razmatraju se ovde opisane modifikacije aminokiselinske sekvence antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke karakteristike antitela. Varijante aminokiselinske sekvence antitela su pripremljene uvođenjem odgovarajućih promena nukleotida u nukleinskim kiselinama antitela, ili sa peptidnom sintezom. Takve modifikacije uključuju, na primer, brisanje iz, i/ili ubacivanje i/ili zamene u ostacima aminokiselinskih sekvenci antitela. Bilo koja kombinacija brisanja, ubacivanja i zamenjivanja je napravljena da bi se došlo do konačne konstrukcije, i obezbeđivanja da ta konstrukcija poseduje željene karakteristike. Promene u aminokiselinama mogu biti uvedene u sekvence aminokiselina antitela u vreme kada se takva sekvenca pravi.
[0257] Koristan metod za identifikaciju pojedinih ostataka ili regiona antitela koji su poželjna mesta za mutagenezu se naziva „alanin skenirajuća mutageneza“ kao što je opisana od strane Cunningham i Wells (1989) Science, 244: 1081-1085. Ovde su ostatak ili grupa ciljanih ostatka identifikovani (na primer, naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys, i glu) i zamenjeni sa neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alaninom ili polialaninom) da bi uticalo na interakciju aminokiselina sa antigenom. Te lokacije aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na substitucije onda se prečišćavaju uvođenjem novih ili drugih varijanti na ili za mesta zamene. Tako, dok je mesto za uviđenje varijacije sekvence aminokiselina unapred određeno, priroda mutacije sama po sebi ne mora da bude predodređena. Na primer, da bi se analizirao učinak mutacije na zadatom mestu, vrši se ala skeniranje ili nasumična mutageneza na ciljni kodon ili region, a eksprimirani imunoglobulini se proveravaju za željenu aktivnost.
[0258] Ubacivanje aminokiselinskih sekvenci uključuje amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije čija je dužina u rasponu od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotinu i više ostataka, kao i ubacivanje intrasekvenci od jednog ili više aminokiselinskih ostataka. Primeri terminalnih insertacija uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom ili antitelo fuzionisano sa citotoksičnim polipeptidom. Druge insertovane varijante molekula antitela uključuju i fuziju N- ili C-terminusa antitela sa enzimom (na pr. za ADEPT) ili sa polipeptidom koji povećava serumski poluživot antitela.
[0259] Drugi tip varijante je aminokiselinska supstituciona varijanta. Ove varijante imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u molekulu antitela koji je zamenjen sa drugim ostatkom. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionalne mutageneze uključuju hipervarijabilne ragione, ali se FR promene isto tako uzetmaju u obzir. Konzervativne zamene su prikazane u tabeli 2 pod nazivom „poželjne zamene“. Ako takve zamene za poseledicu imaju promenu u biološkoj aktivnosti, onda još značajnije promene, koje su u Tabeli 2 nazvane „primeri supstitucija“, ili kao što su dalje opisane u nastavku vezano za aminokiselinske klase, mogu biti uvedene i proizvodi skenirani.
TABELA 2
[0260] Značajne modifikacije u biološkim osobinama antitela postižu se izborom substitucija koje se značajno razlikuju u njihovom uticaju na održavanje (a) strukture polipeptidnog oslonca u oblasti zamene, na primer, kao pločastu ili spiralnu konformaciju (b) naelektrisanosti ili hidrofobnosti molekula na ciljanom mestu (c) najvećeg dela bočnog lanca. Aminokiseline mogu da budu grupisane prema sličnostima u osobinama njihovih bočnih lanaca (u A. L. Lehninger, u Biochemistry, drugo izd., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)):
(1) ne-polarni: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) ne-naelektrisani polarni: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) kiselinski: Asp (D), Glu (E)
(4) bazni: Lys (K), Arg (R), His(H)
[0261] Alternativno, prirodni ostaci mogu biti podeljeni u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnih lanaca.
(1) hidrofobni: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) kiselinski: Asp, Glu;
(4) bazni: His, Lys, Arg;
(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;
(6) aromatični: Trp, Tyr, Phe.
[0262] Nekonzervativne supstitucije mogu da zahtevaju razmenu člana jedne od ovih klasa sa drugom klasom. Takvi substituisani ostaci takođe mogu da budu uvedeni u konzervativna substituciona mesta, ili po mogućnosti, u preostala (nekonzervativna) mesta.
1
[0263] Jedan od tipova substitucijske varijante obuhvata zamenu jednog ili više hipervarijabilnih regionalanih ostataka iz roditeljskog antitela (npr., humanizovano ili humano antitelo). Generalno, varijante koje su selektovane za daljni razvoj, imaće poboljšane biološke osobine u odnosu na roditeljska antitela iz kojih su nastala. Pogodan način za generisanje takvih supstitucijskih varijanti uključuje afiniteno sazrevanje gde se upotrebom fagnog displeja. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilnih regiona (na p.r.6-7 mesta) se mutiraju da bi se stvorile sve moguće aminokiselinske zamene na svakom mestu. Antitela koji su ovako stvorena se izlažu filamentoznim (vlaknastim) fag česticama, kao fuzije gen III produkta M13 upakovanog u svakoj čestici. Ovako prikazane fagne varijante se zatim skeniraju na njihovu biološku aktivnost (npr. afinitet za vezivanje) kao što je ovde prikazano. U cilju identifikacije kandidata hipervarijabilnog regionalnog mesta za modifikaciju, vrši se alanin skrining mutageneza da bi se identifikovali hipervarijabilni regionalni ostaci koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, to može da bude korisno za analizu kristalne strukture antigen-antitelo kompleksa da bi se identifikovale kontaktne tačke između antitela i antigena. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za zamenu u skladu sa tehnikama koje su ovde razrađene. Jednom kade se takve varijante stvore, panel varijanti se skenira na način već opisan ovde, i antitela sa superiornim osobinama pomoću jednog ili više relevantnih eseja mogu biti izabrani za dalji razvoj.
[0264] Molekuli nukleinskih kiselina koji kodiraju varijante aminokiselinske sekvence antitela su pripremljeni pomoću različitih poznatih metoda. Ove metode uključuju, ali nisu ograničeni na, izolaciju iz prirodnih izvora (u slučaju prirodno dobijenih varijanti aminokiselinskih sekvenci), ili pripremu pomoću oligonukleotid posredovane (ili lokacijski-usmerene) mutageneze, PCR mutageneze, i kasetne mutageneze ranije pripremljenih varijanti ili ne-varijanti verzije antitela.
[0265] Može biti poželjno da se uvede jedna ili više amino-kiselinskih modifikacija u Fc regionu imunoglobulinskih polipeptida u ovom pronalasku, čime se stvara varijanta Fc region. Varijanta Fc regiona može da sadrži humanu Fc regionalnu sekvencu (na pr., humani IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 Fc region) koja obuhvata aminokiselinsku modifikaciju (t.j. substituciju) na jedno ili više aminokiselinskih mesta uključujući i zglobnu vezu cisteina.
[0266] U skladu sa opisom i učenjem u ovoj oblasti nauke, u nekim aspektima je razmotrena mogućnost da antitela koja su korišećena u metododima mogu da sadrže jednu ili više izmena u odnosu na divlji tip odgovarajućeg antitela, na primer u Fc regionu. Ova antitela bi ipak zadržala suštinski iste karakteristike potrebne za terapijsku upotrebu u poređenju sa njihovim divljim tipom odgovarajućih antitela. Na primer, smatra se da određene alternacije mogu da budu izvedene u Fc regionu što će rezultovati u izmenjenim (t.j. ili poboljšati ili umanjiti) C1q vezivanjima i/ili komplemenarno zavisnoj citotoksičnost (CDC), kao što je na primer opisano u WO99/51642. Isto tako u Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); US Patent No.
5,648,260; US Patent No.5,624,821; i WO94/29351 koji se odnosi na druge primere varijanti Fc regiona.
Imunokonjugat
[0267] Obelodanjenje se isto tako odnosi na imunokonjugate, ili antitela-lek konjugate (ADC), koja čine antitela konjugovana sa citotoksičnim agensom kao što je hemoterapiski agens, lek, agens za inhibiciju rasta, toksin (na pr., enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili fragmenti istog), ili radioaktivni izotop (t.j., radiokonjugacija).
[0268] Upotreba antitelo-lek konjugata za lokalnu isporuku citotoksičnih ili citostatičnih agensa, odnosno lekova koji ubijaju ili inhabiraju ćelije tumora u lečenju raka, (Syrigos i Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz i Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172; U.S. patent 4,975,278) teorijski dozvoljava ciljanu isporuku komponente leka do tumora ili intraćelijsku akumulaciju u njemu, gde sistemska primena ovih nekonjugovanih lekova-agensa može dovesti do neprihvatljivih nivoa toksičnosti u normalnim ćelijama kao i u tumorskim ćelijama koje treba da budu eliminisane (Baldwin i sar., (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera i sar. (ed.s), pp.475-506). Traži se maksimalna efkasnost sa minimalnom toksičnošću. Obljavljeno je da su i poliklonska i monoklonska antitela korisna u ovim strategijama (Rowland i sar., (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21: 183-87). Lekovi koji se koriste u ovim metodama uključuju daunomicin, doksorubicin, metotreksat, i vindezin (Rowland i sar., (1986) supra). Toksini koji se koriste u antitelo-toksin
2
konjugatima uključuju bakterijske toksine kao što su: toksin difterije, biljne toksine kao ricin, mali molekulski toksini kao npr., geldanamicin (Mandler i sar (2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst.92(19): 1573-1581; Mandler i sar (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler i sar (2002) Bioconjugate Chem.13:786-791), maitansinoidi (EP 1391213; Liu isar., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623), i kalihemicin (Lode isar (1998) Cancer Res. 58:2928; Hinman isarl (1993) Cancer Res.
53:3336-3342). Toksini mogu uticati na njihovu citotoksične i citostatičke efekte pomoću sledećih mehanizama: vezivanje tubulina, vezivanje DNK, ili inhibicija topoizomeraze. Neki citotoksični lekovi imaju tendeciju da budu neaktivni ili manje aktivni kada konjuguju sa velikim antitelima ili ligandima proteinskog receptora.
[0269] ZEVALIN® (ibritumomab tiuksetan, Biogen/Idec) je antitelo-radioizotop konjugat sastavljen od mišjeg IgG1 kapa monoklonskog antitela usmerenog na CD20 antigen koji je nađen na površini normalnih i malignih B limfocita i 111In ili 90Y radioizotopa vezanog za tiourea linker-helator (Wiseman i sar. (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77; Wiseman i sar (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig i sar. (2002) J. Clin. Oncol.20(10):2453-63; Witzig i sar (2002) J. Clin. Oncol.20(15):3262-69). Iako ZEVALIN pokazuje aktivnost protiv B-ćelija ne-Hočkinovog Limfoma (NHL), upotreba dovodi do teške i produžene citopenije kod većine pacijenata. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals), je antitelo-lek konjugat sastavljen od huCD33 antitela vezanog za kalihemicin, odobren 2000. za tretman akutne mijeloidne leukemije korišćenjem injekcije (Drugs of the Future (2000) 25(7): 686; US Patent Nos.4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Kantuzumab mertanzin (Immunogen, Inc.), antitelo-lek konjugat sastavljen od huC242 antitela vezanog preko disulfidnog linkera SPP za maitansinoidnu komponentu leka, DM1, prelazi u Fazu II ispitivanja za tretman kancera koji eksprimiraju CanAg, kao što su debelocrevni, pankreasni, želudačni i drugi. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), antitelo-lek konjugat sastavljen od monoklonskog antitela specifičnog na antigen membrane prostate (PSMA) koje je povezano sa maitansinoidnom komponentom leka, DM1, razvija se za potencijalni tretman tumora prostate. Auristatin peptidi, auristatin E (AE), monometilauristatin E (MMAE), i sintetički analozi dolastatina koji su konjugovani sa himernim monoklonskim antitelom cBR96 (specifično za Lewis Y u karcinomima) i cAC10 (specifično za CD30 u hematološkim malignitetima) (Doronina i sar. (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784; i Francisco i sar. (2003) Blood, 102, 1458-1465) su u terapijskom razvoju. Druga jedinjenja koja se koriste kao citotoksični agensi u lek konjugatima uključuju bez ograničenja auristatin E (AE), MMAF (varijanta auristatina E (MMAE) sa fenilalaninom na C-terminusu leka), i AEVB (auristatin E valeril benzilhidrazon, labilni kiselinski linker u C-terminusu AE-a). Korisni konjugatski linkeri za vezivanje leka za antitelo uključuju bez ograničenja MC (maleimidokaproil), Val Cit (valin-citrulin, dipeptidno mesto u proteaznoj šupljini linkera), Citruline (2-amino-5-ureido pentanoična kiselina), PAB (p-aminobenzilkarbamoil, "samo-žrtvujući" deo linkera), Me (N-metil-valin citrulin, gde je linker peptidna veza modifikovana kako bi se sprečilo njeno raskidanje pomoću katepsina B), MC(PEG)6-OH (maleimidokaproil-polietilen glikol, vezan za cisteine antitela), SPP (N-Sukcinimidil 4-(2-piridiltio) pentanoat), i SMCC (N-Sukcinimidil 4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1 karboksilat). Ovi, kao i drugi korisni lek konjugati i njihovi preparati, opisani, na primer, u Doronina, S.O. i sar., Nature Biotechnology 21:778-794 (2003). Posebno poželjni linker molekuli su na primer N-sukcinimidil 3-(2-piridilditio)propionat (SPDP) (vidi, e.g., Carlsson i sar., Biochem. J., 173, 723-737 (1978)), N-sukcinimidil 4-(2-piridildithio)butanoat (SPDB) (vidi, npr., SAD patent Br. 4,563,304), N-sukcinimidil4-(2-piridilditio)pentanoat (SPP) (pogledaj, npr., CAS Registry, broj 341498-08-6), N-sukcinimidil 4-(N-maleimidometil)cihloheksan-1-karboksilat (SM-CC) (vidi, npr., Yoshitake i sar., Eur. J. Biochem., 101, 395-399 (1979)), i N-sukcinimidil 4-metil-4-[2-(5-nitropiridil)-- ditio]pentanoat (SMNP) (pogledaj, npr., SAD patent Br.4,563,304).
[0270] Hemoterapijski agensi koji su korisni za stvaranje ovakvih imunokonjugata su opisani u gornjem tekstu. Enzimski aktivni toskini i njihovi fragmenti koji se mogu upotrebiti uključuju: difterija A lanac, nevezani aktivni fragment difterija toksina, egzotoksin A lanac (iz Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modekcin A lanac, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, diantin proteini, proteini Phytolaca americana (PAPI, PAPII, i PAP-S), inhibitor momordica charantia, curcin, krotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, resteriktocin, fenomicin, enomicin, i trihoteceni (tricothecenes). Veliki broj radionukleotida su dostupni za proizvodnju radiokonjugacijskih antitela. Primeri uključuju 212Bi, 131I, 131In, 90Y, i 186Re. Konjugati antitela i citotoskičnog agensa se proizvede korišćenjem različitih bifunkcionalnih proteina kuplovanih sa agensima kao: N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT). bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), activni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (pazidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonium derivati (kao što je bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluene 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin može da se pripremi kao što je opisano u Vitetta i sar., Science, 238: 1098 (1987). Obeleženi Ugljenik-14 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpenta-sirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Pogledaj WO94/11026.
[0271] Konjugacije antitela sa jednim ili više malih molekula toksina, kao što su kalihemicin, maitansinoidi, trihotecen, i CC1065, i derivati ovih toksina koji imaju toksičnu aktivnost, su ovde isto tako razmatrani.
Maitansin i maitansinoidi
[0272] Antitela (celom dužinom ili u fragmentima) u pronalasku, mogu biti konjugovana sa jednim ili više maitansinoidnih molekula.
[0273] Majtansinoidi su mitotički inhibitori koji deluju tako što inhibiraju tubulinsku polimerizaciju. Majtansin je prvi put izolovan iz Istočno afričkog grma Maytenus serrata (SAD patent Br.3,896,111). Nakon toga, otkriveno je da i neki mikrobi proizvode maitansinoide, kao što su maitansinol i C-3 maitansinol estri (SAD patent Br. 4,151,042). Sintetički maitansinol, derivati i analozi su opisani, na primer, u SAD patent Brs. 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,321; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; i 4,371,533.
Majtansinoid-antitelo konjugati
[0274] U pokušaju da se poboljša njihov terapijski indeks, maitansin i maitansoidi su konjugovani za antitela koja se specifično vezuju za antigene na tumorskim ćelijama. Imunokonjugati koji sadrže maitansoide kao i njihova terapijska upotreba opisana je npr. u SAD patent Brs.5,208,020, 5,416,064; a Evropski Patent EP 0 425 235 B1. Liu i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) opisuje imunokonjugate koje sačinjavaju maitansinoidi sa određenim DM1 vezanim za monoklonsko antitelo C242 usmereno prema humanom kolonorektalnom kanceru. Otkriveno je da je konjugat veoma citotoksičan za kultivisane ćelije raka debelog creva, i da pokazuje antitumorsko dejstvo na rast tumora u in-vivo esejima. Chari i sar., Cancer Research 52:127-131 (1992) opisuju imunokonjugate u kojima je maitansinoid konjugovan preko disulfidnog linkera sa mišijim antitelom A7 koje se vezuje za antigen na humanim ćelijskim linijama kancera debelog creva, ili sa drugim mišijim monoklonskim antitelom TA.1 koje se vezuje za HER-2/neu oncogen. Citotoksičnost TA1-mejtansinoid konjugata je testirana in vitro na humanoj ćelijskoj liniji raka dojke SK-BR-3, koja eksprimira 3 x 10<5>HER-2 površinskih antigena po ćeliji. Lek konjugat postiže stepen citotoskičnosti sličan slobodnom maitansinodnom leku, a koji može biti uvećan povećanjem broja maitansinoidnih molekula po molekulu antitela. A7-maitansinoid konjugat pokazuje malu sistemsku citotoksičnost kod miševa.
Antitelo-maitansinoid konjugati (imunokonjugati)
[0275] Antitelo-maitansinoid konjugati se stvaraju hemijskim povezivanjem antitela za maitansinoidni molekul bez značajnijeg smanjivanja biološke aktivnosti bilo antitela bilo maitansinoidnog molekula. Prosečno 3-4 maitansinoidnih molekula konjugovanih sa jednim molekulom antitela, pokazuju efikasnost u poboljšanju citotoksičnosti na ciljane ćelije bez negativnog uticaja na funkciju ili rastvorljivost antitela, iako bi se očekivalo da čak i jedan molekul toksin/antitelo poveća citotoksičnost nad upotrebom samog antitela. Maitansinoidi su dobro poznati u nauci i mogu da se sintetišu poznatim tehnikama ili mogu da se izoluju iz prirodnih izvora. Pogodni maitansinoidi su opisani, na primer, u SAD patent Br. 5,208,020 kao i u drugim patentima i ne-patentnim publikacijama navedenim u gornjim pasusima. Željeni maitansinoidi su maitansinol i maitansinol analozi modifikovani u aromatičnom prstenu ili na drugim pozicijama u molekulu maitansinola, kao što su razni maitansinol estri.
4
[0276] U oblasti postoje mnoge poznate vezane grupe za stvaranje antitelo-maitansinoid konjugata, uključujući, na primer, one koje su opisane u SAD patent Br.5,208,020 ili EP Patent 0425235 B1, i Chari i sar., Cancer Research 52:127-131 (1992). Vezane grupe uključuju disulfidne grupe, tioetarske grupe, labilne kiselinske grupe, fotolabilne grupe, peptidazne labilne grupe, ili estarzne labilne grupe, kao što je opisano u gore spomenutim patentima, disulfidne i tioetarske grupe su poželjnije.
[0277] Konjugati antitela i maitansinoida mogu da se proizvedu korišćenjem različitih bifunkcionalnih proteinskih kuplovanih agenasa kao na pr., N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat3 (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikoloheksan-1-karboksilat, iminotiolan (IT), bi-funkcinalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), derivati bisdiazoniuma (kao što je bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), dizocijanati (kao što je toluen 2,6-diisocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Posebno poželjni kuplovani agensi uključuju N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP) (Carlsson i sar., Biochem. J.
173:723-737 [1978]) i N-sukcinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoat (SPP) koji omogućavaju disulfidne veze.
[0278] Linker može biti vezan za maitansinoidni molekul na različitim pozicijama, u zavisnosti od tipa veze. Na primer, estarska veza može biti formirana reakcijom sa hidroksilnom grupom korišćenjem konvencionalnih tehnika kuplovanja. Reakcija se može desiti na C-3 poziciji koja ima hidroksilnu grupu, na C-14 poziciji koja je modifikovana hidroksimetilom, na C-15 poziciji koja je modifikovana hidroksilnom grupom, i na C-20 poziciji koja ima hidroksilnu grupu. Poželjna je modifikacija u kojoj se veza formira na C-3 poziciji maitansinola ili analoga maitansinola.
Kalihemicin
[0279] Još jedan važan imunokonjugat se sastoji od antitela konjugovanog sa jednim ili više molekula kalihemicina. Antibiotici iz familije kalihemicina su sposobni za stvaranje prekida na dvolančanim DNK u sub-pikomolarnim kncentracijama. Za pripremanje konjugata iz familije kalihemicina, pogledati U.S. Patents 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (svi su vlasništvo American Cyanamid Company). Struktirni analozi kalihemicina koji mogu da se koriste, ali nisu ograničeni samo na te, su: γ1<I>, α2<I>, α3<I>, N-acetil-γ1<I>, PSAG iθ<I>I, (Hinman i sar., Cancer Research 53:3336-3342 (1993), Lode i sar., Cancer Research 58:2925-2928 (1998) i navedeni patenti American Cyanamid-a). Još jedan anti-tumorski lek sa kojim antetelo može da bude konjugovano je QFA koji je antifolat. I kalihemicin i QFA imaju intracelularna mesta akcije i ne prolaze lako kroz plazmu membranu. Znači, ćelijsko preuzimanje ovih agensa putem internalizacije posredovane antitelom u velikoj meri poboljšava njihove citotoksične efekte.
Ostali citotoksični agensi
[0280] Ostali antitumorski agensi koji mogu da se konjuguju sa antitelima u pronalasku uključuju BCNU, streptozoicin, vinkristin i 5-fluorouracil, familiju agenasa kolektivno pozanatu kao LL-E33288 kompleks opisano u U.S. Patents 5,053,394, 5,770,710, kao i esperamicine (U.S. patent 5,877,296).
[0281] Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu koristiti uključuju difterija A lanac, nevezujuće aktivne fragmente difterija toksina, egzotoksin A lanac (iz Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modekcin A lanac, alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, diantin proteini, proteini Phytolaca americana (PAPI, PAPII, ili PAP-S), inhibitor momordica charantia (gorka tikva), curcin, crotin, inhibitor sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, resteriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecenze. Videti, na primer, WO 93/21232 objavljeno Octobra 28, 1993.
[0282] Ovao obelodanjenje dalje razmatra imunokonjugate formirane između antitela i jedinjenja sa nukleolitičkom aktivnošću (npr., ribonukleaze ili DNK endonukleaze kao što je dezoksiribonukleaze; DNaze).
[0283] Za selektivno uništavanje tumora antitela mogu da sadrže visoko-radioaktivne atome. Dostupno je više radioaktivnih izotopa za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope lutecijuma (Lu). Kada se konjugat koristi za detekciju, može sadržati radioaktivni atom za ispitivanja na scintigrafiji, na primer tc99m ili I 123, ili obeleženi spin koji se koristi u snimanju nuklearnom magnetnom rezonancom (NMR) (poznata i kao snimanje manetnom rezonancom, MRI), kao što je jod-123, jod-131, indijum-111, fluor-19, ugljenik-13, azot-15, kiseonik-17, gadolinijum, magnezijum ili gvožđe.
[0284] Radio- ili ostali obeleživači mogu se uključiti u konjugate na poznate načine. Na primer, peptidi mogu biti bio-sintetisani ili mogu da biti sintetisani pomoću hemijskih aminokiselina koristeći pogodne aminokiselinske prekursore, koji uključuju, na primer, fluor-19 na mestu vodonika. Obeleživači kao tc99m ili I123,.Re186, Re188 i In111 mogu se vezati za peptid putem cisteinskog ostatka. Itrijum-90 se može dodati pomoću lizinskog ostatka. IODOGEN metod (Fraker i sar. (1978) Biochem Biophys. Res. Commun.80: 49-57 može se koristiti da bi se pripojio Jod-123. Ostale metode su detaljno opisane u "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal,CRC Press 1989).
[0285] Konjugati antitela i citotoksičnog agensa mogu biti proizvedeni korišćenjem različitih bifunkcionalnih proteinskih kuplovanih agensa kao na pr., N-sukcinimidil-3-(2-piridilditio) propionat (SPDP), sukcinimidil-4-(N-maleimidometil) cikloheksan-1-karboksilat, iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao dimetil adipimidat HCl), aktivni estri (kao disukcinimidil suberat), aldehidi (kao glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, imunotoksin ricin može se proizvesti kao što je opisano u Vitetta i sar., Science 238:1098 (1987). Ugljenik-14-obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilenska triaminpenta-sirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatnog agensa za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. Videti WO94/11026. Kao linker može da posluži „razdvojni linker“ koji olakšava oslobađanje citotoksičnog leka u ćeliju. Na primer, mogu da se koriste sledeći linkeri: linker obeležen kiselinom, peptidazno senzitivni linker, fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari i sar., Cancer Research 52:127-131 (1992); U.S. Patent No.5,208,020).
[0286] Jedinjenja obelodanjenja izričito sadrže, ali nisu ograničena samo na nabrojane, ADC-ove pripremljene sa kros-linker reagensima: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, i sulfo-SMPB, i SVSB (sukcinimidil-(4-vinilsulfon)benzoat), a koji su komercijalno dostupni (npr., Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A). Vidi stranice 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
Priprema antitelo-lek konjugata
[0287] U antitelo-lek konjugatima (ADC), antitelo (Ab) je konjugovano za jednu ili više komponenti leka (D), npr., 1 ili 20 komponenti leka na jedno antitelo, preko linkera (L). ADC iz Formule 1 mogu se pripremiti na nekoliko načina, koristeći reakcije organiske hemije, uslove i reagense poznate stručnjacima u oblasti, uključujući: (1) reakciju nukleofilne grupe antitela sa bivalentnim linker reagensom, kako bi se formiralo Ab-L, preko kovalentne veze, posle koje sledi rekacija sa komponentom leka D; i (2) reakciju nukleofilne grupe komponente leka sa bivalentnim linker reagensom, gde se formira D-L, preko kovalentne veze, posle koja sledi reakcija sa nukleofilnom grupom antitela.
[0288] Nukleofilne grupe antitela uključuju, ali nisu ograničene samo na: (i) N-terminalne amino grupe, (ii) amino grupe bočnih lanaca, npr. lizin; (iii) tiolne grupe bočnih lanaca, na pr., cisteine, i (iv) šećerne hidroksilne ili amino grupe gde je antitelo glikozilovano. Amino, tiolne i hidroksilne grupe su nukleofilne i sposobne su da formiraju kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na linker komponentama i linker reagensima koji uključuju: (i) aktivne estre kao NHS estre, HOBt estre, haloformate i kiselinske halide; (ii) alkil i benzil halide, kao što su haloacetamidi; (iii) aldehide, ketone, karboksilne i maleimidne grupe. Određena antitela imaju redukcione disulfide između lanaca, t.j. cisteinske mostove. Antitela mogu biti napravljena tako da budu reaktivna za konjugaciju sa linker reagensima, pomoću tretmana sa redukcionim agensom kao što je DTT (ditiotreitol). Svaki cisteinski most će tako teoretski formirati dva reaktivna tiol nukleofila. Dodatne nukleofilne grupe mogu da budu ubačene u antitela preko reakcije lizina sa 2-iminotiolanom (Trautov reagens) što rezultuje u konverziji amina u tiol.
[0289] Antitelo lek konjugata mogu da se proizvodu modifikacijom antitela unošenjem elektrofilnih komponenti, koje mogu da reaguju sa nukleofilnim zamenama na liker regansu ili leku. Šećeri glikozilovanih antitela mogu da se oksidišu, na pr., sa periodičnim oksidišućim reagensima, kako bi formirali aldehidne ili ketonske grupe koje mogu da reaguju sa amino grupom linker reagenasa ili komponentama leka. Dobijene imin Schiff bazne grupe mogu da formiraju stablinu vezu, ili mogu da budu smanjene, na pr., pomoću borohidrid reagenasa tako da grade stabilne amino veze. U jednoj manifestaciji, reakcija karbohidratnog dela glikozilovanog antitela sa, ili galaktoznom oksidazom, ili sa natrijum meta-perjodatom može dati prinos karbonil (aldehidnih ili ketonskih) grupa u proteinu, koje zatim mogu da reaguju sa odgovarajućim grupama na leku (Hermanson, Bioconjugate Techniques). U drugoj manifestaciji, proteini koji sadrže N-terminalni serinske ili treoninske ostatke mogu da reaguju sa natrijum meta-perjodatom, rezultujući u proizvodnji aldehida na mestu prve aminokiseline Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; US 5362852). Ovaj aldehid može da reaguje sa komponentom leka ili nukleofilom linkera.
[0290] Isto tako, nukleofilne grupe na komponenti leka sadrže, iako nisu ograničene samo na: aminske, tiolne, hidroksilne, hidrazidne, oksimske, hidrazinske, tiosemikarbazonske, hidrazin karboksilatne i arilhidrazidne grupe, koje su sposobne da stvore kovalentne veze sa elektrofilnim grupama na linker komponentama i linker reagensima, uključujći: (i) aktivne estre kao što su NHS estri, HOBt estre, haloformate, i kiselinske halide; (ii) alkilne i benzilne halide kao što su haloacetamidi; (iii) aldehidne, ketonske, karboksilne i maleimidne grupe.
[0291] Alternativno, fuzioni protein koji se sastoji od antitela i citotoksičnog agensa može da bude napravljen, npr., rekombinantnim tehnikama ili peptidnim sintezama. Dužina DNK može da obuhvata odgovarajuće regione koji kodiraju dva dela konjugata, koji su ili susedni ili mogu da budu razdvojeni sa regionom koji kodira linker peptida, a koji ne uništava željene osobine konjugata.
[0292] Antitelo može da bude konjugovano sa „receptorom“ (kao što je streptavidin) koji se koristi za preciljanje tumora gde se antitelo-receptor konjugat daje pacijentu, nakon čega sledi uklanjanje nevezanih konjugata iz cirkulacije korišćenjem agensa za čišćenje, a zatim se daje „liganid“ (napr., avidin) koji je konjugiovan sa citotoksičnim agensom (napr., radionukleotid).
Derivati antitela
[0293] Antitela u ovom pronalasku mogu dalje da budu modifikovana tako da sadrže dodatne ne-proteinske komponente koje su poznate u oblasti i koje su lako dostupne. Poželjno je da komponente pogodne za derivitizaciju antitela budu polimeri rastvorljivi u vodi. Primeri polimera koji su rastvorljivi u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na: polietilen glikol (PEG), kopolimeri etilen glikol/propilen glikol, karboksimetilcelulozu, dekstran, polivinil alkohol, polivinil pirolidon, poli-1, 3-dioksolan, poli-1,3,6-trioksan, etilen/maleični anhidridni kopolimer, poliaminokiseline (ili homopolimeri ili nasumični kopolimeri), i dekstran ili poli(n-vinil pirolidon) polietilen glikol, propropilen glikol homopolimeri, prolipropilen oksid/etilene oksid ko-polimeri, polioksietilatidni polioli (npr., glicerol), polivinil alkohol, i njihove mešavine. Polietilen glikol propionaldehid može imati prednosti pri proizvodnji zahvaljujući svojoj stabilnosti u vodi. Polimer može biti bilo koje molekulske težine, i može da biti razgranat ili nerazgranat. Broj polimera koji su vezani za antitelo može da varira, a ako je vezano više od jednog polimera, oni mogu biti isti ili različiti molekuli. Generalno, broj i/ili tip polimera koji se koriste za derivatizaciju može da bude određen na osnovu razmatranja koja uključuju, ali nisu ograničena samo na: posebne osobine ili funkcije antitela koje bi trebalo poboljšati; to da li će derivati antitela da se koriste u terapiji pod posebnim uslovima, itd.
Farmaceutske formulacije
[0294] Terapijske formulacije koje sadrže antitela pronalaska, pripremljene su za skladištenje mešanjem antitela koje ima željeni nivo čistoće sa opcionalnim fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijentima ili stabilizatorima (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), u vidu vodenih rastvora, liofilizovanih ili ostalih suvih formulacije. Prihvatljivi nosači, ekscipjienti ili stabilizatori su netoksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju pufere kao što su fosfati, citrati, histidin i druge organske kiseline; antioksidante koji uključuju askorbinsku kiselinu i metionin; prezervative (kao što su, oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske težine (manje od 10 ostataka); proteine, kao što su, serum albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao polivinilpirolidon; amino kiseline kao glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharide, disaharide i druge karbohidrate uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense kao EDTA; šećere kao saharozu, manitol, trehalozu ili sorbitol; kontra-jone koji formiraju soli, kao natrijum; metalne komplekse (napr., Zn-protein kompleksi); i/ili ne-jonske surfaktante kao TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).
[0295] Formulacija ovde može da sadrži i više od jednog aktivnog sastojka ako je neophodno da se tretira neka određena indikacija, najbolje one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jednu na drugu. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinacijama u količinama koje su efikasne za nameravanu svrhu.
[0296] Aktivni sastojci mogu da budu zarobljeni u pripremljene mikrokapsule, na primer, koacervativnim tehnikama ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulosa ili želatin-mikrokapsula i poli-(metil-metacilat) mikrokapsula, respektivno, u koloidnim sistemima za isporučivanje leka (na primer, lipozomi, albumin mikrosfere, mikroemulzije, nano-čestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Ove tehnike su prikazane u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
[0297] Formulacije koje se koriste za in vivo administraciju moraju da budu sterilne. To se lako postiže filtracijom kroz sterilne filter membrane.
[0298] Mogu se napraviti preparati čije je oslobađanje vremenski zavisno (Sustained-release). Pogodni primeri za ove preparate uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže imunoglobulin pronalaska, gde su ove matrice u formi oblikovanih članaka t.j. filmova ili mikrokaspule. Primeri (sustained-release) matrica sa vremenski zavisnim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (SAD patent Br. 3,773,919), kopolimere L-glutamatske kiseline i γ etil-L-glutamata, ne-razgradve etilen-vinil acetate, razgradve mlečne acidoglikolitičke kisele kopolimere kao što je LUPRON DEPOT™ (mikrosfere sastavljene od mlečnog acidoglikoltičkog kiselog kopolimera i leuprolid acetata, koje se mogu uneti injekcijom), i poli-D-(-)-3-hidroksibutiričke kiseline. Dok polimeri kao što su etilen-vinil acetat i mlečna acidoglikolitička kiselina omogućavaju oslobađanje molekula više od 100 dana, neki hidrogelovi oslobađaju proteine u kraćim vremenskim periodima. Kada inkapsulirani imunoglobulini ostanu u telu duže vreme, oni mogu da se denaturišu ili da se nagomilaju, kao rezultat izlaganja vlazi na 37°C, što dovodi do gubitka biološke aktivnosti i mogućih promena u imunogenosti. Mogu se razviti racionalne strategije za stabilizaciju u zavisnosti od mehanizma koji je uključen. Na primer, ako je otkriveno da je mehanizam agregacije formiranje intermolekulske S-S veze preko tio-disulfidne petlje, stabilizacija može da se postigne modifikacijom sulfhidrilnih ostataka, liofilizacijom iz kiselih rastvora, kontrolom nivoa vlage, korišćenjem odgovarujućih aditiva i razvijanjem specifičnih polimernih jedinjenja matriksa.
Upotreba
[0299] Antitelo u ovom pronalasku može da se koristi na primer u in vitro, eks vivo i in vivo terapijskim metodama. Antitela u ovom pronalasku mogu da se koriste kao antagonisti, tako da delimično ili u potpunosti blokiraju specifičnu antigensku aktivnost in vitro, eks vivo i/ili in vivo. Osim toga, barem neka antitela u pronalasku mogu da neutrališu antigensku aktivnost drugih vrsta. Shodno tome, antitela u pronalasku mogu se koristiti da inhibiraju specifičnu antigensku aktivnost, na pr, u kulturi ćelija koje sadrže antigen, u humanim subjektima ili u drugim sisarskim subjektima koji imaju antigen sa kojima antitelo u izumu krosreaguje (primer, šimpanza, babun, marmozet, cinomolgus i rezus, svinja ili miš). U jednoj manifestaciji, antitelo u pronalasku može da bude korišćeno za inhibiciju antigenske aktivnosti spajanjem antitela sa antigenom čija se antigenska aktivnost inhibira. Poželjno je da antigen bude humani proteinski molekul.
[0300] U jednoj manifestaciji, antitelo iz pronalaska može da bude korišćeno u metodi gde se inhibira antigen u subjektu koji pati od poremećaja u kojem je antigenska aktivnost štetna, i obuhvata primenu antitela ovog pronalaska u subjektu, tako da je antigenska aktivnost u subjektu inhibirana. Poželjno je da je antigen humani protienski molekul, a da je subjekt humani subjekt. Alternativno, subjekt može da bude sisar koji eksprimira antigen za koji se antitelo pronalaska vezuje. Ipak, subjekt može da bude sisar u koji je antigen uveden (na pr., administracijom antigena ili ekspresijom antigenskog transgena). Antitelo u pronalasku može da se primenjuje na humanom subjektu za terapijske ciljeve. Osim toga, antitelo u pronalasku može da se primenjuje na ne-humanim sisarima koji eksprimiraju antigen sa kojima imunoglobulin kros-reaguje (na pr., primati, svinje ili miševi) u veterinarske svrhe ili kao životinjski model ljudske bolesti. Što se tiče ovog drugog, ti životinjski modeli mogu biti korisni za procenu terapijske efikasnosti antitela u pronalasku (npr., testiranje doza i vremena upotrebe). Blokirajuća antitela u pronalasku koja su korisna u terapiji uključuju na primer, anti-HER2, anti-VEGF, anti-IgE, anti-CD11, anti-interferon i anti-tkivni faktor antitela (ovo nisu svi primeri). Antitela u pronalasku mogu da budu korišćena za tretman, inhibiciju, odlaganje progresije, prevenciju/odlaganje relapsa, poboljšanje, ili prevenciju bolesti, poremećaja ili stanja koja su povezana sa abnormalnom ekspresijom i/ili aktivnošću jednog ili više molekula antigena, uključujući, ali i ne ograničavajući se na maligne i benigne tumore; ne-leukemijske i limfoidne malignitetie; neuronalne glijske, astrocitne, hipotalamične i ostale žlezdane, makrofagne, epitalijalne, stromalne i blastične poremećaje; kao i inflamaciju, angiogenezu i imunološke poremećaje.
[0301] U jednom aspektu, blokirajuće antitelo obelodanjenja je specifično za ligand antigen, i sprečava aktivnost antigena blokirajući ili posredujući u ligand-receptor interakciju koja uključuje ligand antigen, i tako inhibirajući odgovarajući signalni put i druge molekularne ili ćelijske događaje. Obelodanjenje takođe ima receptor-specifična antitela koja nužno ne sprečavaju vezivanje liganda ali posreduju u aktivaciji receptora, i tako inhibiraju bilo kakav odgovor koji bi normalno bio iniciran vezivanjem liganda. Obelodanjenja su takođe obuhvaćena antitela koja se ili pre ili isključivo vezuju za ligand-receptor komplekse. Antitelo obelodanjenja takođe se može ponašati kao agonist određenog antigen receptora, tako omogućavajući, pojačavajući ili aktivirajući ili sve ili delimične aktivnosti ligand-posredovane aktivacije receptora.
[0302] U nekim aspektima, imunokonjugat obuhvatajući antitelo konjugovano sa citotoksičnim agensom se daje pacijentu. U nekim aspektima, imunokonjugat i/ili antigen za koji je vezan je/su internalizovani od strane ćelije, rezultujući povećanom terapeutskom efikasnošću imunokonjugata u ciljnoj ćeliji za koju se vezuje. U jednom aspektu, citotoksični agens cilja ili interreaguje sa nukleinskom kiselnom u ciljnoj ćeliji. Primeri takvih citotoksičnih agenasa uključuju bilo koji od hemoterapeutskih agenasa opisanih ovde (kao što su maitansinoid ili kaliheamicin), radioaktivni izotop, ili ribonukleazu ili DNK endonukleazu.
[0303] Antitela pronalaska se mogu koristiti sama ili u kombinaciji sa drugim preparatima u terapiji. Na primer, antitelo pronalaska može biti davano sa drugim antitelom, hemoterapeutskim agensom/agensima (uključujući koktele hemoterapeutskih agenasa), drugim citotoksičnim agensima, anti-angiogenim agensima, citokinima, i/ili inhibitornim agensima rasta. Tamo gde antitelo pronalaska inhibira rast tumora, može biti posebno favorizovano kombinovanje sa jednim ili više terapeutskih agenasa koji takođe inhibiraju rast tumora. Na prmer antitelo pronalaska može biti kombinovano sa anti-VEGF antitelom (npr., AVASTIN) i/ili anti-ErbB antitelima (npr. HERCEPTIN® anti-HER2 antitelo) u šemi tretmana, npr. u tretiranju bilo koje od bolesti opisanih ovde, uključujući kolorektalni kancer, metastatski kacer dojke i kancer bubrega. Alternativno, ili dodatno, pacijent može da primi kombinovanu terapiju zračenjem (npr. eksterno zračenje snopom ili terapija radioaktivno-obeleženim agensom, kao što je antitelo). Takve kombinovane terapije pomenute iznad obuhvataju kombinovano davanje (gde su dva ili više agenasa obuhvaćeni istom ili odvojenom formulacijom), i odvojeno davanje, u kom slučaju, davanje antitela pronalaska se može desiti pre, i/ili nakon, davanja dodatne terapije ili terapija.
[0304] Antitelo pronalaska (i dodatni terapeutski agens) se daje na bilo koji pogodan način, uključujući parenteralno, subkutano, intraperitonealno, intrapulmonarno i intranazalno, i, ukoliko se želi za lokalni tretman, intrazionalno davanje. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularno, intravenozo, intrarterijalne, intraperitonealno, ili subkutano davanje. Dodatno, antitelo je pogodno za davanje pulsnom infuzijom, posebno sa opadajućim dozama antitela. Doziranje može biti na bilo koji pogodan način, na primer injekcijom, kao što su intravenozne ili subkutane injekcije, u zavisnosti delom od toga da li je davanje kratko ili hronično.
[0305] Preparat antitela pronalaska će biti formulisan, doziran i primenjen na način dosledan dobroj medicinskoj praksi. Faktori koje u ovom kontekstu treba uzeti u obzir obuhvataju određeni poremećaj koji se tretira, određenog sisara koji se tretira, kliničko stanje individualnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto delovanja agensa, metod primene, raspored primene, i druge faktore poznate medicinskom osoblju. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno koriste u prevenciji ili tretmanu poremećaja u pitanju. Efektivna količina takvog drugog agensa zavisi od količine antitela pronalaska prisutnog u formulaciji, tipa poremećaja ili tretmana, i drugih faktora pomenutih iznad. Ove se generalno koriste u istim dozama i istim načinima primene kao što je gore navedeno ili otprilike od 1 do 99% od ranije davanih doza.
[0306] Za prevenciju ili tretman bolesti, odgovarajuća doza antitela pronalaska (kada se koristi samo ili u kombinaciji sa drugim agensima kao što su hemoterapeutski agensi) će zavisiti od tipa bolesti koja se tretira, tipa antitela, težine i toka bolesti, da li se antitelo daje u preventivne ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, i odluke odgovornog lekara. Antitelo se može davati pacijentu jednom ili serijom tretmana. U zavisnosti od tipa i težine bolesti, otprilike 1 Pg/kg do 15 mg/kg (npr. 0.1mg/kg-10mg/kg) antitela je inicijalna kandidat-doza za davanje pacijentu, bilo, na primer, jednom ili više odvojenih primena, ili kontinualnom infuzijom. Jedna tipična dnevna doza može se kretati od otprilike Pg/kg do 100 mg/kg ili duže, u zavisnosti od faktora pomenutih iznad. Za ponovljeno davanje tokom više dana ili duže, u zavisnosti od stanja, tretman se ne prekida dok se ne postigne željena supresija simptoma bolesti. Jedan primer doziranja antitela bi bio u rangu od otprilike 0.05mg/kg do otprilike 10mg/kg. stoga, jedna ili više doza od otprilike 0.5mg/kg, 2.0mg/kg, 4.0mg/kg ili 10mg/kg (ili ma koje njihove kombinacije) može se dati pacijentu. Takve doze mogu biti date naizmenično, npr. svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od otprilike dve do otprilike dvadeset, npr. otprilike šest doza antitela). Inicijalno visoka prva doza, praćena jednom ili više manjih doza, može biti primenjena. Primer režima doziranja obuhvata davanje inicijalne prve doze od otprilike 4 mg/kg, praćeno nedeljnim održavanjem doze od otprilike 2 mg/kg antitela. Ipak, drugi režimi doziranja mogu biti korisni. Progres ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama i esejima.
Predmeti proizvodnje
[0307] Opisan je predmet proizvodnje koji obuhvata materijale korisne u tretmanu, prevenciju i/ili dijagnozi poremećaja opisanih ovde. Predmet proizvodnje obuhvata kontejner i etiketu ili cedulju na ili u kontejneru. Pogodni kontejneri obuhvataju, na primer, flaše, bočice, špriceve, itd. Kontejneri mogu biti napravljeni od različitih materijala kao što su staklo ili plastika. Kontejner sadrži preparat koji je sam ili u kombinaciji sa drugim preparatom efektivnim u tretmanu, prevenciji i/ili dijagnostici stanja i može imati sterilni ulaz (na primer kontejner može biti kesa sa intravenoznim rastvorom ili bočica sa čepom koji je moguće probušiti sa hipodermnom iglom injekcije). Najmanje jedan aktivni agens preparata je antitelo pronalaska. Etiketa ili cedulja ukazuje da se preparat koristi u tretmanu stanja po izboru, kao što je kancer. Dalje, predmet proizvodnje može sadržati (a) prvi kontejner sa preparatom u njemu, gde preparat sadrži antitelo pronalaska; (b) drugi kontejner sa preparatom u njemu, gde preparat sadrži dodatni citotoksični agens. Predmet prozvodnje u ovom aspektu pronalazak može dalje obuhvatati cedulju koja ukazuje da se prvi i drugi preparat antitela mogu koristiti u tretmanu određenog stanja, na primer kancera. Alternativno, ili dodatno, predmet proizvodnje može dalje obuhvatiti drugi (ili treći) kontejner koji sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fosfatni pufer, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Dalje može da obuhvati druge materijale poželjne sa komercijalne i tačke gledišta korisnika, uključujući druge pufere, rastvarače, filtere, igle i špriceve.
[0308] Slede primeri metoda i preparata pronalaska. Podrazumeva se da različiti drugi aspekti mogu biti praktikovani, imajući u vidu opšti opis dat iznad.
PRIMERI
[0309] Primeri ovde opisuju dobijanje humanizovanih anti-beta7 antitela iz pacov anti-mišjeg antitela koje vezuje beta7 subjedinicu alfa4beta7 integrina.
Primer 1: Humanizacija beta7 antagonist antitela
Materijal i metode
[0310] Brojevi ostataka su dati shodno Kabat (Kabat i sar., Sequences of proteins of immunological interest, 5<th>Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). Korišćena su pojedinačna slova aminokiselinskih skraćenica. DNK izrođenosti (degenerativnosti) su predstavljene IUB kodom (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H=A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).
[0311] Direktni kalemi hipervarijabilnog regiona na humani konsenzus akceptor okvir – Fagmid korišćen u ovom delu, pVO350-2b, monovalentan Fab-g3 displej vektor sa 2 otvorena okvira čitanja pod kontrolom phoA promotera, u suštini kako je opisano u Lee i sar., J. Mol. Biol. (2004), 340(5):1073-93. Prvi otvoreni okvir čitanja se sastoji od stII signalne sekvence spojene sa VL i CH1 domenima akceptora lakog lanca i i drugi se sastoji od stII signalne sekvence spojene sa VH i CH1 domenima akceptora teškog lanca praćeno odsečenom formon manjeg proteina omotača faga P3 (Lowman, H. i sar. (1990) Biochemistry 30:10832).
[0312] VL i VH domeni poreklom od pacova Fib504 (antitelo FIB504.64 produkovano iz hibridoma ATCC HB-293, American Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, USA) su svrstani sa humanim konsenzus kappa I (huKI) i humanim konsenzus VH podgrupe III (huIII) domenima. Da bi se napravili kalemi hipervarijabilnog regiona (HVR), sledeći okviri su korišćeni: HuKI je korišćen za okvir varijabilnog domena lakog lanca (videti Sliku 1A i 7). Za okvir varijabilnog domena teškog lanca, akceptor VH okvir, modifikovani humani konsenzus VH podgrupe III (humIII) domen koji se razlikuje od humIII sekvence na 3 pozicije: R71A, N73T, i L78A mogu biti korišćene (videti Carter i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)) (videti Sliku 1B). U pravljenju antitela datog pronalaska, 504K-RF kalem je takođe pripremljen od modifikovanog humanog konsenzus VH domena podgrupe pravljenjem sledećih aminokiselinskih zamena: A71R i A78F.
[0313] Hipervarijabilni regioni poreklom od pacovskog Fib504 (produkovani iz hibridoma ATCC HB-293) antitela su spojeni sa akceptorom humanog konsenzus VH okvira podgrupe III kako bi se dobio direktHVR kalem (Fib504 kalem) (videti Sliku 1B). u VL domenu sledećih regiona pacovskog Fib504 su kalemljeni na humani konsenzus akceptor, huKI: pozicije 24-34 (L1), 50-56 (L2) i 89-97 (L3) (Slika 1A). U VH domenu, pozicije 26-35 (H1), 49-65 (H2) i 94-102 (H3) su kalemljene (Slika 1B). Dodatno drugi HVR kalem, Fib504K kalem, je konstruisan tako da uključuje u okviru HVR, VL poziciju 49, shodno produženoj definiciji za L2 (videti MacCallum i sar. J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996)). MacCallum i sar. su analizirali kristalnu strukturu kompleksa antitelo i antigen i pronašli da su pozicija 49 lakog lanca i pozicije 49 i 94 teškog lanca deo kontaktnog regiona antigena, stoga su ove pozicije uključene u definicije HVR-L2, HVR-H2 i HVR-H3 za humanizovana anti-beta7 antitela objavljena ovde.
[0314] Direktne kalem varijante su generisane Kunkel-ovom mutagenezom (Kunkel i sar. (1987) supra) korišćenjem zasebnih oligonukleotida za svaki hipervarijabilni region. Ispravni klonovi su procenjeni DNK sekvenciranjem.
Meka (soft) randomizacija hipervarijabilnih regiona: -
[0315] Proces “meke (soft) randomizacije (videti SAD prijavi pod serijskim brojem 60/545,840) se odnosi na proceduru favorizovane mutageneze odabrane proteinske sekvence, kao što je hipervarijabilni region antitela. Metoda održava sklonost ka mišjim, pacovskim ili drugim početnim sekvencama hipervarijabilnih regiona, dok se uvodi otprilike 10-50 procenata mutacija na svakoj odabranoj poziciji. Ova tehnika povećava kapacitet skrininga biblioteke koji se koristi i izbegava promene u epitopu antigena prepoznatog antitelom. Shodno ovoj tehnici meke randomizacije, uvodi se diverzitet sekvence u svaki hipervarijabilni region korišćenjem strategije koja održava sklonost ka mišjim i pacovskim sekvencama hipervarijabilnog regiona. Ovo je postignuto korišćenjem strategije otrovne sinteze oligonukleotida prvobitno opisane od strane Gallop i sar., J. Med. Chem. 37:1233-1251 (1994). Ipak, druge metode održavanja sklonosti prema ne-humanim ostacima hipervarijabilnog regiona su dostupne, kao što je greškama sklon PCR, DNK mešanje (DNA shuffling), itd.
[0316] Shodno metodama korišćenim ovde, za datu poziciju u okviru hipervarijabilnog regiona koju treba mutirati, kodon koji kodira “wild-type” (“divlju”) aminokiselinu je otrovan sa smešom (npr. 70-10-10-10 smeša) nukleotida što rezultuje u otprilike 50 procenta stope mutacija na svakoj odabranoj poziciji hipervarijabilnog regiona. Kako bi se ovo postiglo, kodon koji kodira “wild-type” (“divlji”) aminokiselinski
1
hipervarijabilni region koji treba mutirati je sintetisan sa niskim nivoom kontaminirajuće smeše ostala tri nukleotida, kao što je 70-10-10-10 smeša nukleotida. Stoga, kao primer, meka randomizacija PRO (CCG), prva pozicija koja je sintetisana je smeša od 70% C, i 10% svakog od G, T i A; druga pozicija je smeša 70% C, i 10% svakog od A, G, i T; i treća pozicija je smeša 70% G, i 10% svakog od A, C i T. Podrazumeva se da se sklonost može podesiti da bude viša ili niža u zavisnosti od kodona koji se sintetiše na datoj poziciji, broja kodona koji kodiraju dati aminokiselinu, i stepena do kojeg je oligonukleotidna sinteza otrovana preparatom nukleotida iz smeše sa sintezu.
[0317] Meko randomizirani (nasumično odabrani) oligonukleotidi mogu biti načinjeni po uzoru na mišje, pacovske ili druge početne sekvence hipervarijabilnih regiona i mogu obuhvatiti iste regione definisane direktnim kalemima hipervarijabilnog regiona. Opciono, dve pozicije, aminokiseline na početku H2 i H3 u VH domenu , mogu biti ograničene u svom diverzitetu: kodon RGC može biti korišćen za poziciju 49 koja kodira A, G, S ili T i na poziciji 94, kodon AKG može biti korišćen u kodiranju M ili R.
[0318] Generisanje fag biblioteka – Nasumično odabrani skupovi oligonukleotida dizajnirani za svaki hipervarijabilni region su odvojeno fosforilisani u šest reakcija od 20 μl sa 660 ng oligonukleotida, 50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 20 mM DTT, i 5 U polinukleotid kinazom tokom 1 h na 37<0>C. Šest fosforilisanih oligonukleotidnih skupina je potom kombinovano sa 20 μg Kunkel-ovog šablona (templejt) u 50 mM Tris pH 7.5, 10 mM MgCl2u finalnom volumenu od 500 μl rezultujući u odnosu 3 oligonukleotida prema šablonu. Smeša je stavljena na 90<0>C tokom 4 min, 50<0>C tokom 5 min i potom ohlađena na ledu. Višak oligonukleotida je uklonjen sa QIAQUICK™ PCR paketom za prečišćavanje (Qiagen kit 28106, Qiagen, Valencia, CA) korišćenjem modifikovanog protokola kako bi se sprečila preterana denaturacija kaljene (anneal) DNK. U 500 μl kaljene smeše, 150 μl Qiagen pufera PB je dodato, i smeša je podeljena između 2 silika kolone. Nakon ispiranja svake kolone sa 750 μl Qiagen pufera PE i ekstra centrifugiranju kako bi se osušile kolone, svaka kolona je eluirana sa 110 μl 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8. Kaljen i prečišćen šablon (220 μl) je potom dopunjen dodatkom 1 μl 10OmM ATP, 10 μl 25mM dNTPs (25mM svakog od dATP, dCTP, dGTP i dTTP), 15 μl 10OmM DTT, 25 μl 1OX TM pufera (0.5 M Tris pH 7.5, 0.1 M MgCl2), 2400 U T4 ligaze, i 30 U T7 polimeraze tokom 3 h na sobnoj temperaturi.
[0319] Popunjen produkt je potom analiziran na Tris-Acetat-EDTA/agaroznim gelovima (Sidhu i sar., Methods u Enzymology 328:333-363 (2000)). Obično su uočljive tri trake: donja traka je ispravno popunjen i vezan produkt, srednja traka je popunjen ali nije vezan i gornja traka je izmeštena traka. Gornja traka je produkovana intrinzičnom sporednom aktivnošću T7 polimeraze i teško ju je izbeći (Lechner i sar., J. Biol. Chem.258:11174-11184 (1983)); ipak, ova traka se transformiše 30 puta manje efikasno u odnosu na donju traku i uglavnom malo doprinosi biblioteci. Srednja traka nastaje zbog nedostatka 5’ fosfata za finalnu reakciju vezivanja; ova traka se transformiše efikasno i uglavnom daje sekvencu divljeg tipa (“wild type”).
[0320] Popunjen produkt je potom prečišćen i elektroporiran u SS320 ćelije i propagiran u prisustvu M13/KO7 pomoćnog faga kao što je opisano od strane Sidhu i sar., Methods u Enzymology 328:333-363 (2000). Veličine biblioteke rangiraju od 1 - 2 x 109 nezavisnih klonova. Nasumični klonovi iz inicijalnih biblioteka su sekvencirani kako bi se postigao kvalitet biblioteke.
[0321] Selekcija faga - Humani integrin alfa4beta7 pune dužine je eksprimiran u 293 ćelijama (Graham i sar., J. Gen Virol. 36:59 (1977)), prečišćen Fib504 afinitetnom hromatografijom i korišćen kao ciljani molekul u selekciji faga. Za imobilizaciju na MaxiSorp™ mikrotitar pločama (Nalge Nunc, Rochester, NY), 100 μl humanog alfa4beta7 integrina je presvučeno na 5 μg/ml u 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7.5, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2i 2 mM MnCl2(TBSM), preko noći na 4 stepena C. Bunarići su blokirani tokom 1h korišćenjem TBSM koji je sadržao 1 % BSA. Za prvi krug selekcije, 8 bunarića je presvučeno sa ciljnim molekulom koji smo koristili; jedan presvučeni bunarić je korišćen za sukcesivne krugove selekcije. Fag je skupljen iz supernatanta kulture i suspendovan u TBSM sa 1 % BSA i 0.05 % TWEEN™ 20 (TBSMBT). Nakon vezivanja za bunariće tokom 2 h, fag koji se nije vezano je uklonjen obimnim ispiranjem sa TBS-om sa 0.05 % TWEEN 20 (TBST). Vezani fag je eluiran inkubacijom bunarića sa 100 mM HCl tokom 30 min. Fag je umnožen korišćenjem ToplO ćelija i M13/KO7 pomoćnog faga i ostavljen da raste preko noći na 37<0>C u 2YT, 50 μg/ml karbanacillina. Titri faga eluiranih sa ciljnih presvučenih bunarića su upoređeni sa titrima faga iz ne-ciljnog presvučenog bunarića kako bi se postiglo obogaćenje. Nakon četiri kruga selekcije, nasumični klonovi su odabrani tokom analize sekvenci.
2
[0322] Fab produkcija i određivanje afiniteta – Kako bi se eksprimirao Fab protein tokom merenja afiniteta, stop kodon je dodat između teškog lanca i g3 u fag displej vektoru. Klonovi su prebačeni u E. coli 34B8 ćelije i ostavljeni da rastu u AP5 medijumu na 30 C (Presta, L. i sar., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Ćelije su pokupljene centrifugiranjem, suspendovane u 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8 i razbijene korišćenjem mikrofluidizera. Fab je prečišćen na Protein G afinitetnoj hromatografiji.
[0323] Određivanje afiniteta je učinjeno sa površinskom plasmon rezonancom korišćenjem BIAcore™-3000 (Biacore, Pis- cataway, NJ). Humanizovane Fib504 Fab varijante su imobilisane u 10mM acetat pH 4.5 (u rasponu od 250 do 1500 jediničnih odgovora (RU)) na CM5 senzor čipu i injektovane su 2 puta razblažene humanog alfa4beta7 integrina (1.5 to 770 nM) u TBSM-u koji sadrži 2% n-oktilglukozida. Svaki uzorak je analiziran sa petominutnom asocijacionim i 5 do 60 minuta disocijacionim vremenima. Nakon svake injekcije, čip je regenerisan korišćenjem tri jednominutne injekcije 8M uree. Vezujući odgovor je ispravljen oduzimanjem RU od blanka ćelijskog protoka. Languir-ov model 1:1 simultanog fitinga koni koffje korišćen tokom kinetičke analize.
Rezultati i diskusija
[0324] Humanizacija pacovskog Fib504 – Humani akceptor okvir korišćen tokom humanizacije je zasnovan na okviru korišćenom tokom HERCEPTIN® i sadrži konsenzus humani kappa I (huKI) VL domen i varijantu humanog konsenzusa VH domena podgrupe III (humIII). Ova varijanta VH domena ima 3 promene od humanog konsenzusa: R71A, N73T i L78A. VL i VH domeni pacovskog Fib504 su svrstani sa humanim domenima podgrupe I i podgrupe III; svaki hipervarijabilni region (HVR) je identifikovan i kalemljen na humani akceptor okvir kako bi se dobio HVR kalem (504 kalem) koji može biti prikazan kao Fab na fagu (Slike 1A i 1B).
[0325] Zasnovano na analizi kristalnih struktura dostupnog antitela i antigen kompleksa MacCallum i sar. (MacCallum i sar. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)) su predložili HVR definicije bazirane na ostacima varijabilnog domena koji je često u kontaktu sa antigenima. Stoga su pozicije 49G i 94M teškog lanca uključene u HVR kalem Fib504 (Slika 1B). Dodatno, drugi HVR kalem, Fib504K kalem, koji je takođe generisan, obuhvata poziciju 49K lakog lanca, zato što je ova pozicija takođe u okvriu definicije kontakta HVR-L2 i može poslužiti kao antigen kontakt (Slika 1A). Kada su bilo Fib504 ili Fib504K kalemi prikazani na fagu i testirani na vezivanja za imobilisani alfa4beta7, nije primećeno vezivanje.
[0326] Biblioteke su generisane korišćenjem oba Fib504 i Fib504-K HVR kalema u kojem su svaki od HVR regiona simultano meko radnomizirani. Svaka biblioteka HVR kalema je ispirana sa imobilisanim alfa4beta7 tokom 4 kruga selekcije. Nije primećeno obogaćivanje i klonovi su odabrani tokom analize sekvence DNK prikazali su samo nasumične promene sekvence ciljane na 6 HVR regiona.
[0327] Dve dodatne sekvence VH okvira, "RL" i "RF" su ispitivane kao akceptor okviri i sadržale su promene na pozicijama 71 i 78. Pozicija 71 je promenjena u arginin kao u humanom konsenzusu podgrupe III, i pozicija 78 je promenjena u leucin kao u humanom konsenzusu podgrupe III (“RL” akceptor okvir) ili fenilalanin kao u humanom konsenzusu podgrupe II i pacovskom Fib504 okviru (“RF” akceptor okvir) (Slika 10A). Kada je prikazan bilo Fib504 ili Fib504K kalem u "RL" (Fib504-RL i Fib504K-RL) ili "RF’ (Fib504-RF i Fib504K-RF) akceptor okvirima na fagu, testiran je na vezivanje za imobilisani alfa4beta7. Specifično vezivanje faga je primećeno samo za Fib504K kalem korišćenjem “RF” okvir (Slika 10B). Umereno vezivanje faga sa prikazanim Fib504-RF kalemom relativno u odnosu na druge kaleme kojima nedostaje Y49K (laki lanac) i L78F (teški lanac) ukazuje na važnost ovih pozicija u selekciji korisnih akceptor okvira.
[0328] Biblioteke su generisane kao i ranije, korišćenjem strategije blage randomizacije simultano na svakom od 6HVR-ova za Fib504K-RL i Fib504K-RF kaleme i sortirane na imobilisanom alfa4beta7 tokom 4 kruga selekcije kako je opisano iznad. Obogaćenje je primećeno samo za biblioteku baziranu na Fib504K-RF kalemu. Klonovi iz 4 kruga Fib504K-RF biblioteke su odabrani za analizu sekvence i otkrili aminokiselinske promene usmerene na HVR-L1. Većina klonova je sadržalo promenu Y32L; dodatno pozicija 31 je često menjana u D, S, P ili N (Slika 1C). Dodatno, na početni kalem, Fib504K-RF, 3 klona su eksprimirana i prečišćena kao Fab protein i dalje analizirana na Biacore kako je iznad opisano. Klonovi hu504-5, hu504-16 i hu504-32 (varijante SEQ ID NO:1 obuhvatajući zamene T31S plus Y32L (varijanta hu504.5), Y32L (varijanta hu504.16), ili T31D plus Y32L (varijanta hu504.32); videti Sliku 1C), pokazali su odlično vezivanje za alfa4beta7 u odnosu na Fib504K-RF kalem i isti ili povećan afinitet himeričnog Fib504 Fab tokom vezivanja alfa4beta7. Rezultati Biacore analize su prikazani u Tabeli 3, ispod, i ukazuju da su odabrane varijacije u HVR-ovima i/ili regionima okvira, objavljenim ovde, generisale antagonist antitela na alfa4beta7 sa poboljšanim afinitetom u odnosu na početno antitelo. Rezultati u Tabeli 3, ukazuju na to da humanizovana varijanta 504.32pokazaju najveći porast afiniteta u odnosu na početno pacovsko antitelo vezujući se za alfa4beta73 puta jače.
Tabela 3
[0329] Rezultati u Tabeli 3 takođe ukazuju na to da je re-dizajn HVR-L1 bio važan za obnavljanje visokog afiniteta za vezivanje antigena. Posebno, mutacija Y32L je bila najčešća među različitim klonovima. Druge promene na poziciji 31 i brojnim drugim zamenama kroz HVR-H1 izgleda da su dobro tolerisane i mogu pružiti dodatna poboljšanja. Iz ovih rezultata je jasno da postoje mnogostruke promene sekvence koje mogu poboljšati afinitet kalemljenog Fib504 na humani okvir kako bi se generisali afiniteti koji su isti ili prevazilaze one inicijalnog pacovskog antitela.
[0330] Stoga, počevši od kalemljenja 6 pacovskih Fib504 HVR-ova u pomoćni humani akceptor, ekspanzija HVR-L2 da se uključi pozicija 49 (lizin), ekspanzija HVR-H2 da se uključi pozicija 49 (glicin), i ekspanzija HVR-94 da se uključi pozicija 94 (metionin) kao i aminokiselinske promene na poziciji 32 u VRH-L1 (gde L ili I menjaju Y) i, opciono, na poziciji 31 u VHR-L1 (gde je T zamenjeno sa D ili S, na primer). Korisne promene aminokiselinskog okvira napravljene su na pozicijama 71 (A71R) i 78 (L78F) u VH domenu. Takve aminokiselinske promene vode celokupno ljudskom antitelu, varijanti hu504.32, na primer, sa 3 puta poboljšanim afinitetom vezivanja za alfa4beta7 integrin. Sem toga, odabrana humanizovana antitela opisana ovde su određena da imaju najmanje uporedivu biološku aktivnost kao roditeljsko pacovsko Fib504 antitelo (videti Primer 3 ovde).
Primer 2: Dodatne humanizovane Fib504 HVR varijante
[0331] HVR aminokiselinske sekvence humanizovane varijante Fib504.32 dalje su modifikovane kako bi se generisale dodatne varijante sposobne za antagonizam aktivnosti integrinske subjedinice beta7 i/ili integrina koji sadrži beta7 subjedinicu.
[0332] Stvaranje široke aminokiselinske skenirane biblioteke – Biblioteka za sekniranje odabranih HVR pozicija za druge aminokiselinske ostatke sposobne za generisanje beta7-vezujućih varijanti varijante hu504.32 je napravljena korišćenjem 3 oligonukleotida: 504-L1, dizajniran da blago randomizira deo HVR-L1 sklonim za hu504.32 HVR-L1 sekvencu (npr. sekvenca ASESVDDLLH (SEQ ID NO:47, za relativne pozicije A2-A11) je blago randomizirana kao što je iznad opisano); i HVR-L3504-N96 i HVR-H3504-M94 koje uvode NNS na pozicije HVR-L3 pozicije 96 u lakom lancu i HVR-H3 poziciju 94 u teškom lancu, tako dopuštajući svim 20 aminokiselinama da se nađu na ovim pozicijama. Sa ova tri oligonukleotida, široka aminokiselinska skenirana biblioteka je stvorena kao što je iznad opisano korišćenjem šablona koji sadrži tri stop kodona u lakom lancu (pozicije 31 i 32 u HVR-L1 i pozicija 96 u HVR-L3) i 1 stop kodona u teškom lancu (pozicija 94 u HVR-H3).
Široki aminokiselinski sken hu504-32 – Kako bi se potpunije istražile favorizovane sekvence dozvoljene u HVR-L1 i povećala stabilnost 504-32, dizajnirali smo fag biblioteku koja a) je blago randomizirala HVR-L1504-32 u regionu gde su primećene promene (npr. ASESVDDLLH (SEQ ID NO:47, za relativne pozicije A2-A11) tokom humanizacije (Slika 1C), i b) dopustila sve moguće aminokiseline na N96 u HVR-L3 i M94 u HVR-H3. Nakon 4 kruga selekcije sa imobilisanim humanim integrinom alfa4beta7 pune dužine kako je opisano iznad, 96 nasumičnih klonova je odabrano za analizu sekvence. Učestalost kojom su aminokiseline
4
nalažene na svakoj poziciji u širokoj aminokiselinskoj skeniranoj biblioteci ukazuju da su HVR-L1 sekvenca prisutna u hu504-32 i metionin na poziciji 94 teškog lanca optimalni za vezivanje sa visokim afinitetom (Slika 12). Najpoželjnije aminokiseline dobijene selekcijom počevši od varijante 504.32 (Slika 12) prikazane su u žutoj boji. Nasuprot tome, iako je asparagin prisutan na poziciji 96 u lakom lancu hu504-32, visoka učestalost leucina primećena na ovoj poziciji u širokom aminokiselinskom skeniranju ukazuje da bi mutacija N96L dalje mogla poboljšati afinitet humanizovanih Fib504 varijanti za alfa4beta7 i takođe eliminisati bilo kakve potencijalne probleme deamidacije na ovoj poziciji. Informacija na Slici 12 takođe ukazuje na to da se brojne aminokiselinske zamene verovatno mogu tolerisati na većini pozicija bez suštinskog gubitka u afinitetu. Na primer, da bi se eliminisala oksidacija M94 u HVR-H3, glutamin ili arginin se verovatno mogu zameniti.
[0333] Stvaranje ograničenih aminokiselinskih skeniranih biblioteka – Šest biblioteka za ograničeni aminokiselinsko skeniranje iskoristilo je šest različitih Kunkel-ovih šablona, od kojih svaki sadrži jedan stop kodon lociran u okviru jednog od šest HVR-ova. Svaka biblioteka je stvorena korišćenjem jednog oligonukleotida koji kodira za jedHVR i korišćenjem kodona izlistanih u Slika 11A (“kodon” kolona) kako bi se izmenili aminokiselinski ostaci za naredno testiranje vezivanja za beta7 ili alfa4beta7. Iste procedure su korišćene kako bi se izmenili aminokiselinski ostaci anti-beta7 antitela i testirali na vezivanje za alfaEbeta7 integrine.
[0334] Ograničeno skeniranje aminokiselina hu504-32 – Ograničeno skeniranje aminokiselina hu504-32 je dizajnirano kako bi se napravio hu504-16 još više nalik humanoj konsenzus sekvenci lakog i teškog lanca i u procesu identifikovao minimum elemenata sekvence pacovskog Fib504 koje su neophodne za vezivanje. Šest biblioteka je napravljeno i ciljano na svaki HVR na pozicijama koje su se razlikovale između hu504-16 i humanih konsenzus kappa I lakog ili podgrupe II teškog lanca (Slike 1A i 1B); bilo pacovska ili humana aminokiselina je stavljena na ovim pozicijama u biblioteci (Slika 11A). Kako bi se prilagodilo kodiranje za obe aminokiseline tokom sinteze i mutageneze oligonukleotida, dodatne aminokiseline su ubačene u nekim slučajevima (videti kodirane aminokiseline, Slika 11A). Ograničene aminokiselinske skenirane biblioteke su odabrane za imobilisani humani integrin alfa4beta7 pune dužine kako je opisano iznad i otprilike 32 nasumična klona su sekvencirana iz svake biblioteke nakon kruga 3. Učestalost svake aminokiseline nađene na svakoj poziciji je prikazano na Slikama 11B i 11C.
[0335] Kao i široko aminokiselinsko skeniranje, i ograničeno aminokiselinsko skeniranje takođe daje informacije o tome kakve promene su tolerisane na mnogim pozicijama u humanizovanom Fib504. Za razliku od širokog aminokiselinskog skeniranja, ipak, diverzitet dozvoljen na svakoj randomiziranoj poziciji u ograničenom aminokiselinskom skeniranju je ograničeno na par aminokiselina. Stoga manjak primećenih zamena na datim pozicijama ne znači da dati ostatak ne može biti promenjen niti da visoka učestalost bilo koje aminokiseline na datoj poziciji nužno ukazuje da je to najbolje rešenje za visok afinitet.
[0336] Na nekim pozicijama (pozicije 27, 29, 30, 53, 54 lakog lanca i 50, 54, 58, 60, 61, i 65 teškog lanca) humana konsenzus aminokiselina je odabrana prilično često ukazujući da povratna mutacija humanog konsenzusa ne bi dramatično povećala vezivanje za humani alfa4beta7. U stvari, na poziciji 54 lakog lanca (u HVR-L2), humana konsenzus aminokiselina je odabrana češće nego aminokiselina iz pacova Fib504 ukazujući da je ova promena na 504-32 pruža korisno beta7 vezujuće antitelo.
[0337] Dalje, kao rezultat dizajna biblioteke, aminokiseline koji ne vode poreklo bilo od humanog konsenzusa ili pacovskog Fib504 su birane češće na nekim pozicijama i daju potencijalne zamene za poboljšanje afiniteta humanizovanih Fib504 varijanti. Ove obuhvataju, bez ograničenja, D30A i I55V u lakom lancu i Y50F u teškom lancu. Rezultati iz ove 2 biblioteke ukazuju da mnogo HVR pozicija toleriše druge aminokiselinske zamene i i dalje zadržavaju uporedivu biološku aktivnost.
[0338] Sažeci posmatranih aminokiselinskih promena su prikazani na Slikama 13 i 15. Slika 15 sumira različite aminokiseline korisne na svakoj od pozicija u CDR-ovima varijanti antitela pronalaska na pozicijama obeleženim shodno Kabat obeležavanju ili relativnom sistemu obeležavanja. Svako od dodatnih antitela obuhvaćeni varijantama prikazanim na Slikama 13 i 15 je aspekt pronalaska.
Primer 3: Eseji ćelijske adhezije
[0339] Sposobnost nekih humanizovanih Fib504 varijanti pronalaska da vežu ligande eksprimirane na površini ćelije je testirana esejima ćelijske adhezije. Vezivanje za alfa4beta7 i drugi beta7 integrin, alfaEbeta7 je testirano preko sposobnosti humanizovanih Fib504 varijanti da poremete vezivanje integrina za svoj prirodni receptor. Vezivanje humanizovanih Fib504 varijanti za samu beta7 subjedinicu eksprimiranu na površini ćelije je slično testirano. Procedure i rezultati su opisani ispod.
[0340] IgG produkcija – Humanizovane Fib504 IgG varijante su eksprimirana prolazno u 293 ćelije (Graham i sar. (1977) supra) korišćenjem odvojenih vektora za lake i teške lance. Vektori su konstruisani podkloniranjem lakih ili teških varijabilnih domena u odgovarajuće ekspresione vektore za svaki od lakih i teških lanaca. Supernatant iz 1.1 L CHO ćelijske kulture humanizovanih Fib504 varijanti je filtriran kroz 0.45 um filter i stavljen na novu 1 mL HiTrap Protein A HP kolonu (Amersham/Pharmacia) ekvilibrisanu u Puferu A (10 mM tris pH 7.5, 150 mM NaCl). Uzorci su stavljeni na 0.8 mL/min, preko noći, 4 stepena C. Svaka kolona je potom isprana i ekvilibrisana sa 30 mL Pufera A. Eluiranje antitela je postignuto na hromatografiji na sobnoj temperaturi na FPLC (Amersham/Pharmacia) korišćenjem linearnog gradijenta od 14 min na 1 mL/min od 0 do 100% Pufera B (100 mM Glycin, pH 3.0). Rezultujuće 1 mL frakcije su odmah neutralisane dodatkom 75 uL 1 M tris, pH 8. Eluirani protein je detektovan apsorpcijom na 280 nm, i frakcije šiljkova su spojene i rasoljene u PBS-u na PD10 G-25 sephadex dimenzionisanim kolonama za jednokratku upotrebu (Amersham/Pharmacia). Protein je detektovan na OD280 i frakcije šiljka su spojene. Antitelo u PBS-u je filtrirano kroz 0.22 um i stavljeno na 4 stepena C. aminokiselinska analiza je korišćena kako bi se kvantifikovale koncentracije ovako prečišćenih antitela, i vrednosti su dodeljene od prosečne od dva zasebna određivanja.
BCECF obeležavanje:
[0341] U svakom od eseja prisutnih u ovom Primeru 3, ćelije su obeležene u skladu sa sledećom procedurom. Sve ćelije koje su korišćene u adhezionim esejima su obeležene sa 2’,7’-bis-(2-karboksiletil)-5-(and-6)-karboksifluoresceinom, acetoksimetil estrom (BCECF) na 10 uM u RPMI1640 medijumu sa 10%FBS za RPMI8866 ćelije i 38C13 ćelije transfekovane sa beta7 subjedinicom (38C13 beta7 ćelije) i u F-12:DMEM miksu (50:50) sa 10% FBS za alfaEbeta7- transfekovane 293 ćelije (alfaEbeta7 293 ćelije). Ćelije su obeležene tokom 30 minuta i isprane dva puta sa medijumom za esej. Gustina ćelija je podešena na 3x106 ćelija po ml za RPMI8866 i 38C13beta7 ćelije i 2.2 x 106 ćelija per ml za alfaEbeta7293 ćelije.
Humanizovane Fib504 varijante ometaju alfa4beta7 vezivanje za MAdCAM
[0342] RPMI8866/MAdCAM-1-Ig ćelijska adhezija: RPMI8866 ćelije eksprimiraju alfa4beta7 na svojoj površini (Roswell Park Memorial Institute, Buffalo, NY). Humanizovane Fib504 varijante (hu504 varijante) dovedene su u kontakt sa smešom RMPI8866 ćelija i MAdCAM spojenim sa IgG presvučenim preko čvrste podloge. Koncentracije humanizovane Fib504 varijante kao rezultat 50% inhibicije (IC50) vezivanja RPMI8866 ćelije za MAdCAM-1 su merene presvlačenjem Nunc Maxisorp™ ploče od 96 bunarića sa 2 Pg/ml u PBS-u, 100 Pl/bunariću MAdCAM-1-Ig (Genentech, Inc., gde se Ig odnosi na spoj MAdCAM-1 za Fc region) preko noći na 4 °C. Nakon blokiranja ploče sa 200 ul/bunariću od 5 mg/ml BSA tokom jednog sata na sobnoj temperaturi, 50 Pl humanizovanih Fib504 varijanti u medijumu za esej (RPMI 1640 medijum, Hyclone®, Logan Utah, USA, sa 5 mg/mL BSA) je dodato u svaki bunarić i 150,000 BCECF-obeleženih ćelija (BCECF, Molecular Probes, Eugene, OR) u 50 Pl medijuma za esej je dodato u svaki bunarić i inkubirano tokom 15 minuta na 37 °C. Bunarići su isprani dva puta sa 150 Pl medijuma za esej kako bi se uklonile ćelije koje se nisu vezale. Vezane ćelije su rastvorene sa 100 Pl of 0.1% SDS u 50 mM Tris/HCl pH7.5. Količina fluorescentne koja se otpusti iz liziranih ćelija je merena na SPECTRAmax GEMINT™ (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) na talasnim dužinama 485 nm za ekscitaciju i 530 nm za emisiju. Vrednosti fluorescentne su analizirane kao funkcija koncentracije humanizovanih Fib504 varijanti dodatih u svaki esej, korišćenjem četvoro-parametarski ne-linearni sklop najmanjih kvadrata, kako bi se dobile IC50 vrednosti za svaku humanizovanu Fib504 varijantu u eseju. IC50 i IC90 vrednosti su određene četvoroparametarskim sklopom. Slika 14 je primer nacrta rezultata. IC50 i IC90 vrednosti za svaku od testiranih varijanti su prikazane ispod u Tabeli 4.
Tabela 4
Vezivanje antitela za humani MadCAM-1
Ometanje alfa4beta7 vezivanja za VCAM humanizovanom Fib504 varijantom
[0343] RPM18866/7dVCAM-1 ćelijska adhezija: RPMI8866/7dVCAM- esej je sličnog formata kao RPMI8866/MAd-CAM-1-Ig osim što je 7VCAM-1 (ADP5, R&D Systems, Minneapolis, MN) korišćen sa 2 ug/ml kako bi prekrio ploče. Rezultati su analizirani kao što je ispod opisano za MAdCAM eksperimente vezivanja. IC50 vrednosti za svaku od testiranih varijanti su prikazane ispod u Tabeli 5.
Tabela 5
Vezivanje antitela za humani VCAM
Ometanje alfaEbeta7 vezivanja za humani E-kadherin humanizovanom Fib504 varijantom
[0344] AlphaEbeta7 293/huE-Kadherin ćelijska adhezija: 293 ćelije (Graham i sar. (1977) supra) su transfekovane sa alfaE i beta7 (Genentech, Inc.). Esej je sličnog formata kao RPMI8866/MAdCAM-1-Ig osim što je huE-Kadherin (648-EC, R&D Systems, Minneapolis, MN) korišćen sa 2 Pg/ml kako bi prekrio ploče. Ploče su potom blokirane sa 5 mg/ml BSA kako je pomenuto iznad i 50 Pl od FIB504 varijanti u medijumu za esej (F-12:DMEM (50:50) sa 5 mg/ml BSA) je dodat u svaki bunarić i 110,000 BCECF obeleženih ćelija u 50 ul medijuma za esej je dodato u svaki bunarić i inkubirano tokom 15 minuta na 37 °C. bunarići su isprani dva puta sa 150 Pl medijuma za esej i količina oslobođene fluorescentne od strane liziranih ćelija je merena i analizirana kako je iznad opisano. Rezultati eseja iz tri eksperimenta su prikazani u Tabeli 6.
Tabela 6
Vezivanje antitela za humani E-Kadherin
Ometanje beta7 vezivanja za MAdCAM humanizovanom Fib504 varijantom
[0345] 38C13beta7/muMAdCAM-1-Ig ćelijski adhezioni test: 38C13beta7/muMAdCAM-1-Ig esej je sličnog formata kao RPMI8866/MAdCAM-1-Ig osim što je muMAdCAM-1-Ig (Genentech, Inc.) korišćen sa 2 Pg/ml kako bi prekrio ploče.38C13 alfa4+ mišje ćelije ćelije limfoma (Crowe, D.T. i sar., J. Biol. Chem.
269:14411-14418 (1994)) su transfekovane sa DNK koja kodira integrin beta7 tako da je alfa4beta7 eksprimiran na površini ćelija. Sposobnost varijanti antitela da poremete interakciju između alfa4beta7 asociranog sa ćelijskom membranom i MAdCAM je ispitana kao iznad. Rezultati eseja su prikazani u Tabeli 7. (IC50 i IC90 vrednosti za 2 eksperimenta su prikazane).
Tabela 7
Aktivnost hu504 varijante antitela u 38C13-beta7 eksprimirajućim ćelijama u vezivanju za mišji MadCAM
Ometanje beta7 vezivanja za mišji VCAM humanizovanom Fib504 varijantom
[0346] 38C13beta7/muVCAM-1-Ig ćelijski adhezioni test: The 38C13beta7/muVCAM-1-Ig esej je urađen shodno mišjem MAdCAM-1-Ig/RPMI8866 ćelijskom eseju vezivanja iznad, osim što je muVCAM-1-Ig (Genentech, Inc.) korišćen sa 2 Pg/ml kako bi prekrio ploče. Rezultati eseja su prikazani u Tabeli 8. (IC50 i IC90 vrednosti za 2 eksperimenta su prikazane).
Tabela 8
Aktivnost hu504 varijante antitela u 38C13-beta7 eksprimirajućim ćelijama u vezivanju za mišji VCAM-1-Ig
[0347] Rezultati studija vezivanja humanizovane Fib504 varijante demonstriraju da humanizovano antitelo pronalaska vezuje ciljnu subjedinicu integrina beta7 kao i alfa4beta7 i alfaEbeta7 integrin sa otprilike afinitetom početnog pacovskog antitela i, u nekim aspektima, sa većim afinitetom. Stoga, humanizovano anti-beta7 antitelo shodno pronalasku ima svrhu u anti-beta7 integrinskim terapijama, posebno humanim terapijama.
Relativna aktivnost hu504.32 varijanti pronalaska
[0348] Različite aminokiselinske varijante hu504.32 antitela su testirane u humanim i mišjim ćelijskim adhezionim esejima na njihovu sposobnost da inhibiraju vezivanje receptora koji sadrži beta7 za svoj ligand shodno metodama ćelijskih adhezionih eseja objavljenim ovde. RPMI8866/MAdCAM-1-Fc esej je urađen kako je opisano iznad. AlfaEbeta7-293/hu E-kadherin esej je modifikovan korišćenjem humanog E-kadherin-Fc kao liganda (humani E-kadherin-Fc, 648-EC, R&D Systems, Minneapolis, MN). Relativna sposobnost hu504.32 varijanti da inhibiraju interakcije humanog fibronektina (huFN40) sa humanim alfa4beta7 receptorom na PRMI8866 ćelijama je takođe ispitana. RPMI8866/hu Fibronektin (huFN40) esej korišćen tokom ovih studija je sličnog formata sa RPMI8866/MAdCAM-1-Ig esejom objavljenim ovde osim što je humani fibronektin alfa-himotriptični fragment 40 kDa (F1903, Chemicon International, Temecula, CA) korišćen sa 2 Pg/ml kako bi prekrio ploču.
[0349] Sposobnost hu504.32 varijanti da inhibiraju interakciju mišjeg receptora koji sadrži beta7 sa mišjim MAdCAM-1 ili mišjim VCAM-1 je ispitana. Mišji MAdCAM-1-Fc i mišji VCAM-1-Fc su inhibirani u interakciji sa mišjim limfoma alfa4+ ćelijama koje eksprimiraju mišji beta7 (38C13beta7 ćelije) sa hu504.32 varijantama. Mišji MAdCAM-1-Fc i VCAM-1-Fc ćelijski adhezioni eseji su urađeni slično onima opisanim iznad za humani MAdCAM i VCAM. Tamo gde su se ligandi vezali za Fc regione, Fc receptori na ćelijama su blokirani sa 0.5 Pg anti-CD16/32 antitelom (anti-Fcgamma III/II receptor antitelo, katalog No. 553142, BD Biosciences, San Jose, CA) po 1 milion ćelija tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi.150,000 obeleženih ćelija u 50 Pl medijuma za esej su dodate u svaki bunarić i inkubirane tokom 13 minuta na 37 °C. Bunarići su isprani i količina fluorescentne oslobođene iz liziranih ćelija je merena kako je objavljeno ovde. Kontrolno antitelo za humani ćelijski adhezioni esej bilo je mišje monoklonsko antitelo na humani serum albumin, 6B11 (Catalog No. ab10244, Novus Biologicals, Littleton, CO, USA). Kontrolno antitelo za mišji ćelijski adhezioni esej bilo je pacovsko anti-mišje integrin beta7 antitelo, M293 (BD Biosciences, San Jose, CA), koje nije u kompeticiji sa ligandom ili sa Fib504 za vezivanje za integrin beta7.
[0350] Rezultati eseja u triplikatu za humani i mišji ćelijski adhezioni esej dati su u Tabelama 9 i 10, respektivno.
Tabela 9
Aktivnost hu504.32 varijanti antitela u humanom ćelijskom adhezionom eseju
Tabela 10
Aktivnost hu504.32 varijanti antitela u mišjem ćelijskom adhezionom eseju
[0351] Hu504.32 antitelo ima metionin na poziciji 94 teškog lanca CDR3. Varijante M94Q (ili hu504.32Q) i M94R (ili hu504.32R) imaju glutamin ili arginin, respektivno, na poziciji 94 hu504.32 varijante antitela. Hu504.32M, Q, i R antitela bitno smanjuju interakciju integrin beta7 receptor-ligand u svakom od eseja i, stoga su potentni inhibitori beta7-posredovane ćelijske adhezije.
Aktivnosti hu504.32R antitela in vivo
[0352] Hu504.32R varijanta antitela je testirana in vivo za njegovu sposobnost da smanji interakciju integrin beta7 receptor-ligand i smanji regrutaciju limfocita u upaljeni kolon u in vivo mišjem modelu inflamatorne bolesti creva. BALB/c miševi i CB 17 SCID miševi su dobijeni iz Charles River Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA, USA). Rekonstruisani SCID kolitični miševi sa puno CD4+CD45Rb T ćelija su pripremljeni izolovanjem CD4+CD45Rb T ćelija iz donora BALB/c miševa i transfekcijom 3x105 ćelije u 100 Pl PBS intravenozno. Kontrolni SCID miševi nisu primili CD4+CD45Rb T ćelije. Rekonstruisani CD4+ miševi koji su ispunjavali kriterijume za tretiranu grupu i nisu imali više od 10% gubitka telesne težine od početne ili 15% od maksimalne težine u nedelji 4 smatrano su da imaju inflamatornu bolest creva i odabrani su za tretman.
[0353] Na dan tretmana sa test antitelima, ćelije mezenteričnog limfnog čvora (MLN) donorskih BALB/c miševa su izolovane i radio-obeležene sa Cr51. Tretman je obuhvatio prvo davanje anti-GP120 antitela, hu504.32 antibeta7 antitela, hu504.32R anti-beta7 antitela, ili bez davanja antitela (kontrola) intravenozno, 200 Pg/100 Pl PBS. Trideset minuta nakon što je dato antitelo, injektovane su Cr51-obeležene MLN ćelije, 4x106 ćelija/100 Pl. Jedan sat posle injekcije obeleženih ćelija, miševi su eutanizirani i uzeti su slezina, kolon i Pejerove ploče, premerene, i ukupna Cr51 radioaktivnost po organu je određena. Slika 16 je bargrafik rezultata ovih testova i pokazuje relativnu sposobnost antitela da blokiraju regrutaciju radioobeleženih T ćelija u kolon miševa sa inflamatornom bolešću creva. Regrutacija T ćelija u upaljeni kolon je inhibirana sa hu504.32 i hu504.32R anti-beta7 antitelima u odnosu na negativnu kontrolu, anti-GP120 antitelo. Distribucija u slezini je bila slična za sva antitela. Stoga, hu504.32 i hu504.32R anti-beta7 antitela efikasno inhibiraju regrutaciju T ćelija na mestu upale u kolonu in vivo.
[0354] Glikacija antitela ne utiče na sposobnost hu504.32R varijante da blokira vezivanje MAdCAM-1 za alfa4beta7 receptor.
[0355] Glikacija, ne-enzimska glikozilacija proteina, može da utiče na antitelo-ligand interakcije (videti, na primer, Kennedy, D.M. i sar., Clin Exp Immunol. 98(2):245-51 (1994). Glikacija lizina lakog lanca na poziciji 49 hu504.32R varijante (HVR-L2 relativna pozicija B1) je primećena ali nije imala značajnog uticaja na sposobnost varijante antitela da blokira vezivanje MAdCAM-1 za alfa4beta7 receptor- eksprimirajućih RPMI8866 ćelija. Određivanje glikacije i nivoa glikacije je urađeno korišćenjem standardne elektrosprej jonizujuće masene spektroskopije (ESI-MS) i boronat-afinitetnom hromatografijom. Boronat-afinitetne HPLC metode korisne za testiranje glikacije mogu se naći u, na primer, Quan C.P. i sar., Analytical Chemistry 71(20):4445-4454 (1999) i Li Y.C. i sar., J. Chromatografi A, 909:137-145 (2001). Ćelijski adhezioni esej je urađen shodno RPMI8866/MAdCAM-1-Fc ćelijskom adhezionom eseju objavljenom ovde.
[0356] U alternativnim aspektima pronalaska, glikacija na poziciji 49 je smanjena ili eliminisana kad pozicija 49 sadrži aminokiselinu koja nije lizin. Polipeptid ili antitelo pronalaska obuhvata kao aminokiselinu na poziciji 49 (HVR-L2 relativna pozicija B1) bilo koju od aminokiselina A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W, ili Y, gde se svako slovo odnosi na aminokiselinu u skladu sa standardnim obeleđavanjem aminokiseline jednim slovom. Alternativno, aminokiselina na poziciji 49 lakog lanca 504.32R varijante (ili druge 504 varijante) odabrana je iz grupe koja se sastoji od R, N, V, A, F, Q, H, P, I, ili L. Aminokiselina korisna na poziciji 49 je odabrana, na primer, prikazivanjem (prirpemom fag biblioteke) hu504.32R Fab na fagu (varijante) i zamenjivanjem odvojeno, kodona za poziciju 49, kodonom za svaku od aminokiselina koje se javljaju u prirodi. Fag koji eskprimira hu504.32R varijante izmenjen je na poziciji 49 je testiran na vezivanje za integrin beta7 i/ili za receptor obuhvatajući integrin beta7, kao što su alfa4beta7 ili alfaEbeta7 receptori. Te varijante koje se vezuju za beta7 integrin ili alfa4beta7 ili alfaEbeta7 receptore su dalje ispitivane na sposobnost da inhibiraju intergrin beta7 receptor-ligand vezivanje i in vivo efikasnost kako je opisano ovde. Alternativno, aminokiseline koje se javljaju ili ne javljaju u prirodi mogu biti zamenjene na poziciji 49 standardnim tehnikama mutageneze i testirane u in vivo ćelijskim adhezionim esejima opisanim ovde. Alternativno, aminokiselina na poziciji 49 lakog lanca je aminokiselina koja nije lizin (K), i aminokiselina na bilo kom drugom HVR-u ili poziciji okvira ili pozicijama u lakom lancu i/ili teškom lancu je izmenjena kako bi se odabrala varijanta anti-beta7 vezujućeg polipeptida koji ispoljava afinitet vezivanja, in vitro i in vivo biološku aktivnost, farmakokinetiku, klirens leka i imunogenost korisnu za redukciju inflamacije smanjenjem biološke aktivnosti beta7 integrina. Mutageneza i selekcija takvog polipeptida ili varijante antitela je postignuta kako je ovde objavljeno i shodno drugim standardnim tehnikama. Takva varijanta anti-beta7 vezujućeg polipeptida ili antitela ispoljava integrin beta-7 vezujući afinitet u okviru 10,000 puta, 1000 puta, alternativno u okviru 10 puta, alternativno u okviru 5 puta, alternativno u okviru 2 puta afiniteta vezivanja koji ispoljava bilo koja humanizovana Fib504 varijanta objavljena ovde.
Spisak sekvenci
1
2
4
1
11
��
1
14
�
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11

Claims (11)

Patenti zahtevi
1. Anti-beta7 antitelo
koje obuhvata varijabilni okvir sekvencijalnog teškog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence prikazane kao SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45 i SEQ ID N0: 41, varijabilni okvir sekvencijalnog lakog lanca, aminokiselinske ostatke 1-23, 24-37, 38-69 i 70 do poslednjeg ostatka aminokiselinske sekvence koja je navedena kao SEQ ID NO: 15, i HVR-Ll, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 (SEQ ID N0: 2), QQGNSLPNT (SEQ ID NO: 3), GFFITNNYWG (SEQ ID NO: 4), HVR-H2 i HVR-H3, gde svaki redom sadrži RASESVDDLLH , GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 5) i RTGSSGYFDF (SEQ ID NO: 66).
2. Anti-beta7 antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje sadrži laki lanac koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33.
3. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-beta7 antitelo prema patentnim zahtevima 1 ili 2.
4. Vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 3.
5. Ćelija domaćina koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 4.
6. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 5, gde je ćelija domaćin prokariotska ćelija.
7. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 6, gde je ćelija domaćin E. coli.
8. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 5, gde je ćelija domaćina eukariotska ćelija.
9. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 8, gde je ćelija domaćin sisarska ćelija.
10. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 9, gde je ćelija domaćin jajna ćelija kineskog hrčka.
11. Postupak pripreme anti-beta7 antitela, gde navedeni postupak obuhvata ekspresiju u ćeliji domaćinu prema bilo kom od patentnih zahteva od 5 do 10 rekombinantnog vektora prema patentnom zahtevu 4 i obnavljanje navedenog antitela.
RS20181006A 2004-09-03 2005-09-02 Humanizovani anti-beta7 antagonisti i njihova upotreba RS57636B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US60737704P 2004-09-03 2004-09-03
EP15185749.7A EP2990422B1 (en) 2004-09-03 2005-09-02 Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57636B1 true RS57636B1 (sr) 2018-11-30

Family

ID=36000753

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181006A RS57636B1 (sr) 2004-09-03 2005-09-02 Humanizovani anti-beta7 antagonisti i njihova upotreba
RS20120055A RS52213B (sr) 2004-09-03 2005-09-02 Humanizovani anti-beta7 antagonisti i njihove primene
RS20150775A RS54409B1 (sr) 2004-09-03 2005-09-02 Humanizovani anti-beta7 antagonisti i njihova upotreba

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20120055A RS52213B (sr) 2004-09-03 2005-09-02 Humanizovani anti-beta7 antagonisti i njihove primene
RS20150775A RS54409B1 (sr) 2004-09-03 2005-09-02 Humanizovani anti-beta7 antagonisti i njihova upotreba

Country Status (26)

Country Link
US (10) US7528236B2 (sr)
EP (4) EP3530673B1 (sr)
JP (2) JP5062887B2 (sr)
KR (2) KR101364276B1 (sr)
CN (3) CN104710532B (sr)
AT (1) ATE534668T1 (sr)
AU (1) AU2005279720B2 (sr)
BR (1) BRPI0515602B1 (sr)
CA (1) CA2577678C (sr)
CY (2) CY1112277T1 (sr)
DK (4) DK3530673T3 (sr)
ES (4) ES2690079T3 (sr)
HR (3) HRP20120171T1 (sr)
HU (3) HUE058817T2 (sr)
IL (3) IL181473A (sr)
LT (2) LT2990422T (sr)
MX (3) MX337423B (sr)
NO (3) NO341308B1 (sr)
NZ (2) NZ553328A (sr)
PL (4) PL3530673T3 (sr)
PT (3) PT1784426E (sr)
RS (3) RS57636B1 (sr)
RU (1) RU2453558C2 (sr)
SI (4) SI3530673T1 (sr)
WO (1) WO2006026759A2 (sr)
ZA (1) ZA200701575B (sr)

Families Citing this family (64)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW200515915A (en) * 2002-11-08 2005-05-16 Wackvom Ltd Extract of Trapa natans and methods of using the same
CA2478458A1 (en) * 2004-08-20 2006-02-20 Michael Panzara Treatment of pediatric multiple sclerosis
HUE058817T2 (hu) 2004-09-03 2022-09-28 Genentech Inc Humanizált anti-béta7 antagonisták és alkalmazásaik
WO2006055871A2 (en) * 2004-11-19 2006-05-26 Biogen Idec Ma Inc. Treatment for multiple sclerosis
WO2008036600A2 (en) * 2006-09-18 2008-03-27 Genentech, Inc. Methods of protein production
EP2109480B1 (en) 2006-12-07 2017-06-28 The Government of the United States of America as Represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services Use of antagonists of the interaction between hiv gp120 and alpha4beta7 integrin
CA2676790A1 (en) 2007-02-22 2008-08-28 Genentech, Inc. Methods for detecting inflammatory bowel disease
AR066476A1 (es) * 2007-05-08 2009-08-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-muc16 disenados con cisteina y conjugaods de anticuerpos y farmacos
JP5440179B2 (ja) 2008-01-11 2014-03-12 アステラス製薬株式会社 改良型ヒト化抗ヒトα９インテグリン抗体
US20100260668A1 (en) * 2008-04-29 2010-10-14 Abbott Laboratories Dual Variable Domain Immunoglobulins and Uses Thereof
JP5646457B2 (ja) * 2008-04-29 2014-12-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
WO2009140684A2 (en) * 2008-05-16 2009-11-19 Genentech, Inc. Use of biomarkers for assessing treatment of gastrointestinal inflammatory disorders with beta7integrin antagonists
JP2011523853A (ja) * 2008-06-03 2011-08-25 アボット・ラボラトリーズ 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
AR072000A1 (es) * 2008-06-03 2010-07-28 Abbott Lab Proteinas de union multivalentes con capacidad de unir dos o mas antigenos y usos de la misma
BRPI0915448A2 (pt) * 2008-07-08 2015-11-10 Abbott Lab imunoglobulinas de domínio variável duplo para prostaglandina e2 e usos das mesmas
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
WO2010121141A1 (en) * 2009-04-17 2010-10-21 Biogen Idec Ma Inc. Compositions and methods to treat acute myelogenous leukemia
US8399624B1 (en) * 2009-06-25 2013-03-19 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Acceptor framework for CDR grafting
UY32808A (es) * 2009-07-29 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas como dominio variable dual y usos de las mismas
KR20120060877A (ko) * 2009-09-01 2012-06-12 아보트 러보러터리즈 이원 가변 도메인 면역글로불린 및 이의 용도
TW201119676A (en) * 2009-10-15 2011-06-16 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
UY32979A (es) * 2009-10-28 2011-02-28 Abbott Lab Inmunoglobulinas con dominio variable dual y usos de las mismas
WO2011053665A1 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Pcsk9 immunoassay
CN110227154A (zh) * 2010-02-23 2019-09-13 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于治疗卵巢癌的抗血管发生疗法
JP2013523843A (ja) * 2010-04-15 2013-06-17 ベジェニクス ピーティーワイ リミテッド Ｖｅｇｆ−ｃ拮抗剤を用いた併用治療
HUE050858T2 (hu) 2010-04-16 2021-01-28 Biogen Ma Inc VLA-4 ellenes antitestek
EP3252072A3 (en) 2010-08-03 2018-03-14 AbbVie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
SG187938A1 (en) 2010-08-26 2013-04-30 Abbvie Inc Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2635694A4 (en) * 2010-11-02 2015-11-11 Abbott Lab VARIABLE DOUBLE DOMAIN IMMUNOGLOBULINS AND USES THEREOF
EP3412309A1 (en) * 2011-03-31 2018-12-12 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of administering beta7 integrin antagonists
US10040855B2 (en) 2011-05-02 2018-08-07 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Formulation for anti-α4β7 antibody
UA116189C2 (uk) 2011-05-02 2018-02-26 Мілленніум Фармасьютікалз, Інк. КОМПОЗИЦІЯ АНТИ-α4β7 АНТИТІЛА
CN104159920A (zh) 2011-12-30 2014-11-19 艾伯维公司 针对il-13和/或il-17的双重可变结构域免疫球蛋白
WO2013126595A1 (en) * 2012-02-21 2013-08-29 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Methods for treating corneal and conjunctival inflammation and inflammatory disorders
BR112014018964A2 (pt) 2012-03-13 2020-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticorpo anti-vegf e uso de um anticorpo anti-vegf
KR101796689B1 (ko) * 2012-08-22 2017-11-10 재단법인 목암생명과학연구소 안정화된 면역글로불린가변도메인 선별방법 및 선별된 도메인의 응용
HK1213522A1 (zh) 2012-10-05 2016-07-08 F. Hoffmann-La Roche Ag 用於诊断和治疗炎性肠病的方法
MY171664A (en) 2012-11-01 2019-10-22 Abbvie Inc Anti-dll4/vegf dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
JP2016522793A (ja) 2013-03-15 2016-08-04 アッヴィ・インコーポレイテッド ＩＬ−１βおよび／またはＩＬ−１７に対して指向された二重特異的結合タンパク質
CA2904095A1 (en) 2013-03-27 2014-10-02 Genentech, Inc. Use of biomarkers for assessing treatment of gastrointestinal inflammatory disorders with beta7 integrin antagonists
AU2015235986B2 (en) * 2014-03-27 2020-12-03 Genentech, Inc. Methods for diagnosing and treating inflammatory bowel disease
WO2016086147A1 (en) 2014-11-26 2016-06-02 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Vedolizumab for the treatment of fistulizing crohn's disease
WO2016094881A2 (en) 2014-12-11 2016-06-16 Abbvie Inc. Lrp-8 binding proteins
CA2972099A1 (en) * 2015-02-26 2016-09-01 Genentech, Inc. Integrin beta7 antagonists and methods of treating crohn's disease
MA41636A (fr) 2015-03-06 2018-01-09 Millennium Pharm Inc Méthode de traitement de la cholangite sclérosante primitive
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
EP3329276A2 (en) * 2015-07-27 2018-06-06 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods for diagnosing and treating inflammatory bowel disease
CA3017743A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Method of preventing graft versus host disease
WO2017160700A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating or preventing graft versus host disease
WO2017165742A1 (en) 2016-03-24 2017-09-28 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in anti-ctla4 anti-pd-1 combination treatments
US11760803B2 (en) 2016-03-24 2023-09-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of treating gastrointestinal immune-related adverse events in immune oncology treatments
SG10202001787QA (en) 2016-06-02 2020-04-29 Abbvie Inc Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
US11389533B2 (en) 2016-06-12 2022-07-19 Takeda Pharmaceutical Company Limited Method of treating inflammatory bowel disease
BR112019022268A2 (pt) 2017-04-28 2020-05-19 Millennium Pharmaceuticals, Inc. método para o tratamento de distúrbios pediátricos
CA3082356A1 (en) 2017-12-01 2019-06-06 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
EP3773573B1 (en) 2018-04-12 2026-03-18 Morphic Therapeutic, Inc. Antagonists of human integrin (alpha4)(beta7)
KR102848349B1 (ko) 2018-06-04 2025-08-21 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 감소된 효과기 기능을 갖는 항-ｖｌａ-4 항체
WO2020145669A1 (ko) * 2019-01-10 2020-07-16 에스지메디칼 주식회사 항 베타 1 인테그린 인간화 항체 및 이를 포함하는 암치료용 약학 조성물
JP7753105B2 (ja) * 2019-06-10 2025-10-14 武田薬品工業株式会社 抗体の精製方法及びその組成物
JP7437490B2 (ja) 2019-10-16 2024-02-22 モーフィック セラピューティック，インコーポレイテッド ヒトインテグリン（アルファ－４）（ベータ－７）の阻害
CA3190109A1 (en) 2020-07-31 2022-02-03 Genentech, Inc. Anti-integrin beta7 antibody formulations and devices
TW202330613A (zh) 2021-11-12 2023-08-01 美商建南德克公司 使用整聯蛋白β７拮抗劑治療克隆氏病之方法
TW202504919A (zh) 2023-05-30 2025-02-01 美商派拉岡醫療公司 α4β7整合素抗體組合物及使用方法
WO2024252368A2 (en) 2023-06-09 2024-12-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods and compositions for treating ulcerative colitis

Family Cites Families (92)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
US4308428A (en) * 1979-12-26 1981-12-29 Cbs Inc. System for electronically simulating radiation effects produced by a rotary loudspeaker
US4331348A (en) * 1980-01-09 1982-05-25 Raidel John E Vehicle suspension
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4419446A (en) 1980-12-31 1983-12-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4563304A (en) 1981-02-27 1986-01-07 Pharmacia Fine Chemicals Ab Pyridine compounds modifying proteins, polypeptides or polysaccharides
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
AU600575B2 (en) 1987-03-18 1990-08-16 Sb2, Inc. Altered antibodies
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
GB9022543D0 (en) 1990-10-17 1990-11-28 Wellcome Found Antibody production
US5508192A (en) 1990-11-09 1996-04-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Bacterial host strains for producing proteolytically sensitive polypeptides
US5264365A (en) 1990-11-09 1993-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Protease-deficient bacterial strains for production of proteolytically sensitive polypeptides
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
EP0604580A1 (en) 1991-09-19 1994-07-06 Genentech, Inc. EXPRESSION IN E. COLI OF ANTIBODY FRAGMENTS HAVING AT LEAST A CYSTEINE PRESENT AS A FREE THIOL, USE FOR THE PRODUCTION OF BIFUNCTIONAL F(ab') 2? ANTIBODIES
ATE181571T1 (de) * 1991-09-23 1999-07-15 Medical Res Council Methoden zur herstellung humanisierter antikörper
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP1005870B1 (en) 1992-11-13 2009-01-21 Biogen Idec Inc. Therapeutic application of chimeric antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5610281A (en) 1994-05-03 1997-03-11 Brigham & Women's Hospital, Inc. Antibodies for modulating heterotypic E-cadherin interactions with human T lymphocytes
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5639635A (en) 1994-11-03 1997-06-17 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US6551593B1 (en) 1995-02-10 2003-04-22 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Inflammatory bowel disease by inhibiting binding and/or signalling through α 4 β 7 and its ligands and madcam
JP4205162B2 (ja) * 1995-02-10 2009-01-07 ミレニアム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 粘膜血管アドレシンおよびその用途
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US6027888A (en) 1996-04-05 2000-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing soluble, biologically-active disulfide-bond containing eukaryotic proteins in bacterial cells
US7147851B1 (en) * 1996-08-15 2006-12-12 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Humanized immunoglobulin reactive with α4β7 integrin
US6037454A (en) * 1996-11-27 2000-03-14 Genentech, Inc. Humanized anti-CD11a antibodies
US6083715A (en) 1997-06-09 2000-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for producing heterologous disulfide bond-containing polypeptides in bacterial cells
DE69937291T2 (de) 1998-04-02 2008-07-10 Genentech, Inc., South San Francisco Antikörpervarianten und fragmente davon
WO2000030681A1 (en) 1998-11-25 2000-06-02 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antagonists of the alpha e beta 7 integrin as therapeutic agents for inflammatory diseases
WO2000040604A2 (en) * 1999-01-08 2000-07-13 The Brigham And Women's Hospital, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING CYTOKINE RELEASE BY αEβ7-EXPRESSING CELLS
US20010046496A1 (en) 2000-04-14 2001-11-29 Brettman Lee R. Method of administering an antibody
WO2003065948A1 (en) * 2002-02-06 2003-08-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Personal care system with a personal care device and a cooling device
EP1391213A1 (en) 2002-08-21 2004-02-25 Boehringer Ingelheim International GmbH Compositions and methods for treating cancer using maytansinoid CD44 antibody immunoconjugates and chemotherapeutic agents
SI2177537T1 (sl) 2004-01-09 2012-01-31 Pfizer Protitielesa proti MAdCAM
WO2005080432A2 (en) 2004-02-19 2005-09-01 Genentech, Inc. Cdr-repaired antibodies
HUE058817T2 (hu) 2004-09-03 2022-09-28 Genentech Inc Humanizált anti-béta7 antagonisták és alkalmazásaik
WO2008036600A2 (en) 2006-09-18 2008-03-27 Genentech, Inc. Methods of protein production
JP2007302676A (ja) 2007-05-29 2007-11-22 Genentech Inc ヒト化抗β７アンタゴニストおよびその使用

Also Published As

Publication number Publication date
US20060093601A1 (en) 2006-05-04
SI2990422T1 (sl) 2018-10-30
PT1784426E (pt) 2012-03-06
US20170210807A1 (en) 2017-07-27
SI3530673T1 (sl) 2022-08-31
JP2008512382A (ja) 2008-04-24
MX341370B (es) 2016-08-17
EP2990422B1 (en) 2018-07-11
CN101094868B (zh) 2013-07-10
HK1210977A1 (en) 2016-05-13
US20090226437A1 (en) 2009-09-10
HK1188798A1 (en) 2014-05-16
CA2577678C (en) 2014-12-02
MX2007002675A (es) 2007-06-11
IL181473A (en) 2013-07-31
ES2911482T3 (es) 2022-05-19
NO20071740L (no) 2007-06-01
IL226717A (en) 2016-04-21
EP2990422A1 (en) 2016-03-02
NO20171288A1 (no) 2007-06-01
US8835133B2 (en) 2014-09-16
IL244803A0 (en) 2016-04-21
CN103304667B (zh) 2015-04-08
KR101364276B1 (ko) 2014-02-20
US20080025971A1 (en) 2008-01-31
ZA200701575B (en) 2008-09-25
NZ553328A (en) 2010-06-25
HRP20160034T1 (hr) 2016-02-12
ES2555355T3 (es) 2015-12-30
HUE058817T2 (hu) 2022-09-28
US7528236B2 (en) 2009-05-05
AU2005279720B2 (en) 2011-07-28
HUE028441T2 (hu) 2016-12-28
EP2322556B1 (en) 2015-10-21
LT2990422T (lt) 2018-10-10
AU2005279720A1 (en) 2006-03-09
HK1156955A1 (en) 2012-06-22
US20130288302A1 (en) 2013-10-31
NZ585628A (en) 2012-01-12
DK3530673T3 (da) 2022-04-19
PL3530673T3 (pl) 2022-08-01
SI2322556T1 (sl) 2016-02-29
PL2990422T3 (pl) 2018-11-30
HK1221473A1 (en) 2017-06-02
CY1117124T1 (el) 2017-04-05
IL226717A0 (en) 2013-07-31
EP2322556A1 (en) 2011-05-18
CN104710532B (zh) 2019-01-18
HUE039591T2 (hu) 2019-01-28
CN104710532A (zh) 2015-06-17
US20150197560A1 (en) 2015-07-16
CN103304667A (zh) 2013-09-18
BRPI0515602B1 (pt) 2021-08-17
US8124082B2 (en) 2012-02-28
KR20120115587A (ko) 2012-10-18
CN101094868A (zh) 2007-12-26
EP3530673B1 (en) 2022-03-30
US8779100B2 (en) 2014-07-15
DK2990422T3 (en) 2018-09-17
IL244803B (en) 2018-02-28
EP3530673A1 (en) 2019-08-28
DK2322556T3 (en) 2016-01-25
MX337423B (es) 2016-03-04
NO342491B1 (no) 2018-06-04
PL2322556T3 (pl) 2016-04-29
LT3530673T (lt) 2022-06-10
HRP20120171T1 (hr) 2012-03-31
JP5062887B2 (ja) 2012-10-31
RU2007112102A (ru) 2008-10-10
KR101433494B1 (ko) 2014-08-22
NO342319B1 (no) 2018-05-07
PL1784426T3 (pl) 2012-04-30
NO341308B1 (no) 2017-10-02
US20200048354A1 (en) 2020-02-13
JP5255135B2 (ja) 2013-08-07
US7687605B2 (en) 2010-03-30
HK1112002A1 (en) 2008-08-22
US20170044261A1 (en) 2017-02-16
WO2006026759A9 (en) 2006-05-18
DK1784426T3 (da) 2012-03-12
ATE534668T1 (de) 2011-12-15
ES2690079T3 (es) 2018-11-19
KR20070050986A (ko) 2007-05-16
RS52213B (sr) 2012-10-31
NO20171287A1 (no) 2007-06-01
CY1112277T1 (el) 2015-12-09
EP1784426A2 (en) 2007-05-16
BRPI0515602A (pt) 2008-07-29
IL181473A0 (en) 2007-07-04
JP2012107050A (ja) 2012-06-07
RU2453558C2 (ru) 2012-06-20
PT2322556E (pt) 2016-02-15
EP1784426B1 (en) 2011-11-23
PT2990422T (pt) 2018-10-18
WO2006026759A3 (en) 2006-10-05
US20180291104A1 (en) 2018-10-11
SI1784426T1 (sl) 2012-03-30
WO2006026759A2 (en) 2006-03-09
US20120208984A1 (en) 2012-08-16
HRP20181459T1 (hr) 2018-10-19
CA2577678A1 (en) 2006-03-09
RS54409B1 (sr) 2016-04-28
ES2377979T3 (es) 2012-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1784426B1 (en) Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor
JP2007302676A (ja) ヒト化抗β７アンタゴニストおよびその使用
HK40013718A (en) Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor
HK40013718B (en) Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor
HK1221473B (en) Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor
HK1156955B (en) Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor
HK1210977B (zh) 人源化的抗-β7拮抗劑及其應用
HK1188798B (en) Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor