BRPI0515602B1 - Anticorpo anti-beta7 humanizado, método de inibição da interação de subunidade de integrina beta7 humana, composição e uso de um anticorpo - Google Patents

Anticorpo anti-beta7 humanizado, método de inibição da interação de subunidade de integrina beta7 humana, composição e uso de um anticorpo Download PDF

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Abstract

anticorpo ou polipeptídeo de ligação anti-beta7, anticorpo anti-beta7 humanizado, método de inibição da interação de subunidade de integrina beta7 humana, método de modulação do recrutamento e/ou adesão celular, composição, artigo industrializado, anticorpo anti-integrina beta-7, uso de um anticorpo e uso do polipeotídeo ou do anticorpo. a presente invenção fornece anticorpos anti-beta7 terapêuticos, composições que os compreendem e métodos de uso desses anticorpos.

Description

[001] O presente é pedido não provisório depositado com base em 37 CFR § 1.53 (b) (1), que reivindica prioridade com base em 35 U. S. C. § 119 (e) do Pedido Provisório Norte-Americano com número de série 60/607.377, depositado em três de setembro de 2004, cujo relatório descritivo é integralmente incorporado ao presente como referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] A presente invenção refere-se, de forma geral, aos campos de biologia molecular e regulagem de fator de crescimento. Mais especificamente, a presente invenção refere-se a moduladores da atividade biológica de integrinas que contêm a subunidade beta7 e usos dos mencionados moduladores.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] As integrinas são receptores da superfície de células heterodiméricas α/β envolvidos em numerosos processos celulares da adesão celular à regulagem genética (Hynes, R. O., Cell, 1992, 69: 11-25; e Hemler, M. E., Annu. Rev. Immunol., 1990, 8: 365-368). Várias integrinas foram relacionadas a processos de doenças e geraram amplo interesse como potenciais alvos para a descoberta de drogas (Sharar, S. R. et al, Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16: 359-378). No sistema imunológico, as integrinas estão envolvidas no tráfego, adesão e infiltração de leucócitos durante processos inflamatórios (Nakajima, H. et al, J. Exp. Med., 1994, 179: 1145-1154). A expressão diferencial de integrinas regula as propriedades adesivas de células e diferentes integrinas estão envolvidas em diferentes reações inflamatórias. Butcher, E. C. et al, Science, 1996, 272: 60-66. As integrinas beta7 (ou seja, alfa4beta7 (α4β7) e alfaEbeta7 (αEβ7)) são expressas principalmente sobre monócitos, linfócitos, eosinófilos, basófilos e macrófagos, mas não sobre neutrófilos. Elices, M. J. et al, Cell, 1990, 60: 577584. Os ligantes primários para integrina α4β7 são as proteínas da superfície endotelial molécula de adesão de células de adressina da mucosa (MAdCAM) e molécula de adesão das células vasculares (VCAM-1) (Makarem, R. et al, J. Biol. Chem., 1994, 269: 4005-4011). A ligação da α4β7 a MAdCAM e/ou VCAM expressa sobre vênulas endoteliais altas (HEVs) em locais de inflamação resulta na firme adesão do leucócito ao endotélio, seguida por extravasamento para o tecido inflamado (Chuluyan, H. E. et al, Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16: 391-404). Ligante primário para integrina αEβ7 é a proteína da superfície dos linfócitos intra-epiteliais (IEL) E-cadereína, que facilita a aderência da célula portadora de αEβ7 a linfócitos epiteliais. Demonstrou-se que os anticorpos monoclonais dirigidos contra α4β7, MAdCAM ou VCAM são moduladores eficazes em modelos animais de doenças inflamatórias crônicas, tais como asma (Laberge, S. et al, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1995, 151: 822-829), artrite reumatóide (RA; Barbadillo, C. et al, Springer Semin. Immunopathol., 1995, 16: 375-379), colite (Viney et al, J. Immunol., 1996, 157: 2488-2497) e doenças intestinais inflamatórias (IBD; Podalski, D. K., N. Eng. J. Med., 1991, 325: 928-937; Powrie, F. et al, Ther. Immunol., 1995, 2: 115-123). Demonstrou-se que anticorpos monoclonais dirigidos contra a subunidade beta7 ligam a subunidade de integrina (Tidswell, M. et al (1997), J. Immunol. 159: 1497-1505) mas como anticorpos não humanos ou não humanizados, eles não possuem utilidade clínica.
[004] Existe a necessidade de compostos altamente específicos, tais como anticorpos humanizados ou seus fragmentos de ligação que inibem a interação entre a integrina alfa4beta7 e seus ligantes MAdCAM e/ou VCAM, bem como a interação entre a integrina alfaEbeta7e seu ligante E-caderina. Estes compostos são úteis para o tratamento de doenças inflamatórias crônicas tais como asma, mal de Crohn, colite ulcerativa, diabetes, complicações de transplantes de órgãos e disfunções relativas a aloenxertos.
[005] Todas as referências mencionadas no presente, incluindo pedidos de patentes e publicações, são integralmente incorporadas como referência.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[006] A presente invenção baseia-se, em parte, na identificação de uma série de antagonistas de processos biológicos que envolvem integrinas que contêm beta7, que são geralmente processos biológicos/celulares que apresentam importante e vantajoso alvo terapêutico. Esses processos biológicos incluem, sem limitação, inflamações, particularmente disfunções de inflamações crônicas tais como asma, alergia, IBD, diabetes, transplante e doenças de enxerto contra hospedeiro. A presente invenção fornece composições e métodos com base na interferência com o recrutamento e/ou adesão mediada por integrina beta7, incluindo mas sem limitar-se a interferência com a ligação de MAdCAM e VCAM-1 à parte extracelular de integrina alfa4beta7e interação de E-caderina com a interação de integrina alfaEbeta7. Os antagonistas de acordo com a presente invenção, conforme descrito no presente, fornecem importantes agentes terapêuticos e de diagnóstico para uso no direcionamento de condições patológicas associadas a sinalização anormal ou indesejada por meio de integrina beta7. Conseqüentemente, a presente invenção fornece métodos, composições, kits e artigos industrializados referentes a processos de modulação mediados por integrina beta7, que incluem a modulação da ligação de MAdCAM e alfa4beta7 e recrutamento de leucócitos para epitélio gastrointestinal, ligação e alergia, asma, IBD (tal como mal de Crohn e colite ulcerativa), diabetes, inflamação associada a transplantes, disfunção de enxerto contra hospedeiro e/ou disfunções de aloenxertos e outras atividades biológicas/fisiológicas mediadas por integrina beta7.
[007] Em um aspecto, a presente invenção fornece agentes terapêuticos anti-beta7 apropriados para uso terapêutico e capazes de efetuar vários graus de rompimento de processo mediado por integrina beta7. Em uma realização, por exemplo, a presente invenção fornece anticorpo anti-beta7 humanizado, em que o anticorpo como fragmento de Fab possui substancialmente a mesma afinidade de ligação de beta7 humano de fragmento de Fab murino que compreende, consiste ou consiste essencialmente de seqüência de domínio variável de cadeia leve e de cadeia pesada, conforme ilustrado nas Figs. 1A e 1B ou nas Figs. 9A e 9B. Em outra realização, a presente invenção fornece anticorpo anti-beta7 humanizado em que o anticorpo, na forma de fragmento de Fab, possui afinidade de ligação a beta7 humano que é mais baixa, tal como pelo menos 3, pelo menos 5, pelo menos 7ou pelo menos 10 vezes mais baixa que a de fragmento de Fab de rato ou murino que compreende, consiste ou consiste essencialmente de seqüência de domínio variável de cadeia leve e de cadeia pesada, conforme ilustrado nas Figs. 1A e 1B, ou as seqüências de domínio variável ilustradas nas Figs. 9A e 9B. Alternativamente, anticorpo anti-beta7 humanizado ou seu fragmento de ligação a beta7, de acordo com a presente invenção, exibe afinidade monovalente para beta7 humano, que é substancialmente idêntica ou maior que a afinidade monovalente de beta7 humano de anticorpo que compreende seqüências variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada, conforme ilustrado na Fig. 1A (SEQ ID N° 10) e/ou na Fig. 1B (SEQ ID N° 11) ou na Fig. 9A (SEQ ID N° 10) e/ou na Fig. 9B (SEQ ID N° 13). O anticorpo ou seu fragmento de ligação que possui grande afinidade para beta7 humano exibe afinidade que é pelo menos duas vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos dez vezes, pelo menos cinqüenta vezes, pelo menos cem vezes, pelo menos quinhentas vezes, pelo menos mil vezes, pelo menos cinco mil vezes ou pelo menos dez mil vezes maior que anticorpo que compreende as seqüências de cadeia leve e cadeia pesada ilustradas na Fig. 1A (SEQ ID N° 10) e/ou na Fig. 1B (SEQ ID N° 11) ou na Fig. 9A (SEQ ID N° 12) e/ou na Fig. 9B (SEQ ID N° 13).
[008] Em outra realização, a presente invenção fornece anticorpo anti-beta7 humanizado em que o anticorpo, na forma de fragmento de Fab, possui afinidade de ligação a beta7 humano que é maior, tal como pelo menos três, pelo menos cinco, pelo menos sete, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos quinze, pelo menos vinte ou pelo menos cem vezes maior que a de fragmento de Fab de roedor (tal como rato ou murino) que compreende, consiste ou consiste essencialmente de seqüência de domínio variável de cadeia leve e cadeia pesada, conforme ilustrado na Fig. 1A e Fig. 1B, respectivamente. Em uma realização, o mencionado fragmento de Fab de roedor possui a afinidade de ligação de fragmento de Fab que compreende seqüências de domínio variável de anticorpo de rato denominado FIB504.64 produzido pela linhagem de células de hibridoma depositada na Coleção Norte- Americana de Cultura de Tipos n° ATCC HB-293. Em uma realização adicional, fragmento de Fab humanizado de acordo com a presente invenção possui a afinidade de ligação de fragmento de Fab que compreende seqüências de domínio variável de anticorpo produzido por qualquer dos anticorpos anti-beta7 humanizados de acordo com a presente invenção. Como é bem estabelecido na técnica, a afinidade de ligação de ligante ao seu receptor pode ser determinada utilizando qualquer dentre uma série de testes e expressa em termos de uma série de valores quantitativos. Conseqüentemente, em uma realização, a afinidade de ligação é expressa na forma de valores Kd e reflete a afinidade de ligação intrínseca (tal como com efeitos de avidez minimizados). Geral e preferencialmente, a afinidade de ligação é medida in vitro, seja em ambiente livre de células ou associado a células. Conforme descrito com mais detalhes no presente, a diferença em vezes na afinidade de ligação pode ser quantificada em termos da razão entre o valor de afinidade de ligação de anticorpo humanizado em forma de Fab e o valor de afinidade de ligação de anticorpo de Fab comparativo/de referência (tal como anticorpo murino que contém seqüências de região hipervariável doadoras), em que os valores de afinidade de ligação são determinados sob condições de teste similares. Desta forma, em uma realização, a diferença em vezes de afinidade de ligação é determinada como a razão entre os valores Kd do anticorpo humanizado em forma de Fab e o mencionado anticorpo de Fab comparativo/de referência. Qualquer dentre uma série de testes conhecidos na técnica, que incluem os descritos no presente, pode ser utilizado para a obtenção de medidas de afinidade de ligação, que incluem, por exemplo, Biacore® (Biacore International Ab, Uppsala, Suécia) e ELISA.
[009] Nos seus vários aspectos e realizações, o anticorpo antagonista de beta7 de acordo com a presente invenção refere-se ao conjunto de reivindicações potenciais para o presente pedido a seguir: Anticorpo que compreende anticorpo anti-beta7 ou seu fragmento de ligação de beta7 que compreende: (a) pelo menos uma, duas, três, quatro ou cinco seqüências de regiões hipervariáveis (HVR) selecionadas a partir do grupo que consiste em: (i) HVR-L1 que compreende a seqüência A1-A11, em que A1-A11 é RASESVDTYLH (SEQ ID N° 1); (ii) HVR-L2 que compreende a seqüência B1-B8, em que B1-B8 é KYASQSIS (SEQ ID N° 2); (iii) HVR-L3 que compreende a seqüência C1-C9, em que C1-C9 é QQGNSLPNT (SEQ ID N° 3); (iv) HVR-H1 que compreende a seqüência D1-D10, em que D1D10 é GFFITNNYWG (SEQ ID N° 4); (v) HVR-H2 que compreende a seqüência E1-E17, em que E1- E17 é GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID N° 5); e (vi) HVR-H3 que compreende seqüência F2-F11, em que F2-F11 é MTGSSGYFDF (SEQ ID N° 6).
[010] Em uma realização do polipeptídeo ou anticorpo de acordo com a reivindicação 1, o polipeptídeo ou anticorpo compreende pelo menos uma HVR variante, em que a seqüência de HVR variante compreende modificação de pelo menos um resíduo de qualquer das seqüências ilustradas em SEQ ID N° 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9. Em outra realização de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, a presente invenção compreende anticorpo anti-beta7 ou seu fragmento de ligação de beta7 que compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVRs) selecionadas a partir do grupo que consiste em HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que: (i) HVR-L1 compreende a seqüência de aminoácidos RASESVDTYLH (SEQ ID N° 1); RASESVDSLLH (SEQ ID N° 7), RASESVDTLLH (SEQ ID N° 8) ou RASESVDDLLH (SEQ ID N° 9); (ii) HVR-L2 compreende a seqüência de aminoácidos KYASQSIS (SEQ ID N° 2), RYASQSIS (SEQ ID N° 67) ou XYASQSIS (SEQ ID N° 68, em que X representa qualquer aminoácido); (iii) HVR-L3 compreende QQGNSLPNT (SEQ ID N° 3); (iv) HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos GFFITNNYWG (SEQ ID Nº 4); (v) HVR-H2 compreende a seqüência de aminoácidos GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID Nº 5); e (vi) HVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidos MTGSSGYFDF (SEQ ID Nº 6) ou RTGSSGYFDF (SEQ ID Nº 66) para as posições relativas F2-F11; ou compreende a seqüência de aminoácidos F1- F11, em que F1-F11 é AMTGSSGYFDF (SEQ ID N° 63), ARTGSSGYFDF (SEQ ID N° 64) ou AQTGSSGYFDF (SEQ ID N° 65).
[011] Em ainda outra realização de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer das realizações, a presente invenção compreende anticorpo anti- beta7 ou seu fragmento de ligação de beta7 que compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis regiões hipervariáveis (HVRs) selecionadas a partir do grupo que consiste em HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR- H3, em que: (i) HVR-L1 compreende a seqüência de aminoácidos A1-A11, em que A1-A11 é RASESVDTYLH (SEQ ID N° 1); RASESVDSLLH (SEQ ID N° 7), RASESVDTLLH (SEQ ID N° 8) ou RASESVDDLLH (SEQ ID N° 9) ou variante de SEQ ID N° 1, 7, 8 ou 9 em que o aminoácido A2 é selecionado a partir do grupo que consiste em A, G, S, T e V e/ou o aminoácido A3 é selecionado a partir do grupo que consiste em S, G, I, K, N, P, Q, R e T e/ou A4 é selecionado a partir do grupo que consiste em E, V, Q, A, D, G, H, I, K, L, N e R e/ou o aminoácido A5 é selecionado a partir do grupo que consiste em S, Y, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T e V e/ou o aminoácido A6 é selecionado a partir do grupo que consiste em V, R, I, A, G, K, L, M e Q e/ou o aminoácido A7 é selecionado a partir do grupo que consiste em D, V, S, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S e T e/ou o aminoácido A8 é selecionado a partir do grupo que consiste em D, G, N, E, T, P e S e/ou o aminoácido A9 é selecionado a partir do grupo que consiste em L, Y, I e M e/ou o aminoácido A10 é selecionado a partir do grupo que consiste em L, A, I, M e V e/ou o aminoácido A11 é selecionado a partir do grupo que consiste em H, Y, F e S; (ii) HVR-L2 compreende a seqüência de aminoácidos B1-B8, em que B1-B8 é KYASQSIS (SEQ ID N° 2), RYASQSIS (SEQ ID N° 67) ou XYASQSIS (SEQ ID N° 68), em que X representa qualquer aminoácido) ou variante de SEQ ID N° 2, 67 ou 68, em que o aminoácido B1 é selecionado a partir do grupo que consiste em K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y e X (em que X representa qualquer aminoácido) e/ou o aminoácido B4 é selecionado a partir do grupo que consiste em S e D e/ou o aminoácido B5 é selecionado a partir do grupo que consiste em Q e S, e/ou o aminoácido B6 é selecionado a partir do grupo que consiste em S, D, L e R, e/ou o aminoácido B7 é selecionado a partir do grupo que consiste em I, V, E e K; (iii) HVR-L3 compreende a seqüência de aminoácidos C1-C9, em que C1-C9 é QQGNSLPNT (SEQ ID N° 3) ou variante de SEQ ID N° 3, em que o aminoácido C8 é selecionado a partir do grupo que consiste em N, V, W, Y, R, S, T, A, F, H, I, L, M e Y; (iv) HVR-H1 compreende a seqüência de aminoácidos D1-D10, em que D1-D10 é GFFITNNYWG (SEQ ID N° 4); (v) HVR-H2 compreende a seqüência de aminoácidos E1-E17, em que E1-E17 é GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID N° 5) ou uma variante de SEQ ID N° 5 em que o aminoácido E2 é selecionado a partir do grupo que consiste em Y, F, V e D, e/ou o aminoácido E6 é selecionado a partir do grupo que consiste em S e G, e/ou o aminoácido E10 é selecionado a partir do grupo que consiste em S e Y, e/ou o aminoácido E12 é selecionado a partir do grupo que consiste em N, T, A e D e/ou o aminoácido 13 é selecionado a partir do grupo que consiste em P, H, D e A e/ou o aminoácido E15 é selecionado a partir do grupo que consiste em L e V, e/ou o aminoácido E17 é selecionado a partir do grupo que consiste em S e G; e (vi) HVR-H3 compreende a seqüência de aminoácidos F2-F11, em que F2-F11 é MTGSSGYFDF (SEQ ID N° 6) ou RTGSSGYFDF (SEQ ID N° 66); ou compreende a seqüência de aminoácidos F1-F11, em que F1-F11 é AMTGSSGYFDF (SEQ ID N° 63), ARTGSSGYFDF (SEQ ID N° 64) ou AQTGSSGYFDF (SEQ ID N° 65), ou uma variante de SEQ ID N° 6, 63, 64, 65 ou 66, em que o aminoácido F2 é R, M, A, E, G, Q, S e/ou o aminoácido F11 é selecionado a partir do grupo que consiste em F e Y.
[012] Em uma realização de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer dos anticorpos de acordo com a presente invenção, o aminoácido em posição de estrutura de cadeia pesada 71 (de acordo com o sistema de numeração de Kabat) é selecionado a partir do grupo que consiste em R, A e T e/ou o aminoácido na posição de estrutura de cadeia pesada 73 (sistema de numeração de Kabat) é selecionado a partir do grupo que consiste em N e T e/ou o aminoácido na posição de estrutura de cadeia pesada 78 (sistema de numeração de Kabat) é selecionado a partir do grupo que consiste em F, A e L.
[013] Em uma realização de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer dos anticorpos de acordo com a presente invenção, HVR-L1 de um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID N° 1. Em uma realização, HVR-L2 de um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID N° 2. Em uma realização, HVR-L3 de um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID N° 3. Em uma realização, HVR-H1 de um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID N° 4. Em uma realização, HVR-H2 de um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID N° 5. Em uma realização, HVR-H3 de um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende a seqüência de SEQ ID N° 6 ou 66 para as posições relativas F2 a F11 ou SEQ ID N° 63, 64 ou 65 para as posições relativas F1 a F11. Em uma realização, HVR-L1 compreende RASESVDSLLH (SEQ ID N° 7). Em uma realização, HVR-L1 compreende RASESVDTLLH (SEQ ID N° 8). Em uma realização, HVR-L1 compreende RASESVDDLLH (SEQ ID N° 9). Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção que compreende estas seqüências (em combinações conforme descrito no presente) é humanizado ou humano.
[014] Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo que compreende uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente de uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 9, e em que SEQ ID N° 1, 7, 8 ou 9 corresponde a HVR-L1, SEQ ID N° 2 corresponde a HVR-L2, SEQ ID N° 3 corresponde a HVR-L3, SEQ ID N° 4 corresponde a HVR-H1, SEQ ID N° 5 corresponde a HVR-H2, e SEQ ID N° 6 corresponde a HVR-H3. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que, nesta ordem, cada qual compreende SEQ ID N° 1, 2, 3, 4, 5 e 6. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada um, nesta ordem, compreende SEQ ID N° 7, 2, 3, 4, 5 e 6. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada um, nesta ordem, compreende SEQ ID N° 8, 2, 3, 4, 5 e 6. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual, na ordem, compreende SEQ ID N° 9, 2, 3, 4, 5 e 6. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR- H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual, nesta ordem, compreende SEQ ID N° 9, 2, 3, 4, 5 e 66, ou SEQ ID N° 9, 2, 3, 4, 5, 63 ou SEQ ID N° 9, 2, 3, 4, 5, 64 ou SEQ ID N° 9, 2, 3, 4, 5 e 65 ou SEQ ID N° 9, 67, 3, 4, 5, 64 ou SEQ ID N° 9, 68, 3, 4, 5, 64.
[015] HVRs variantes em um anticorpo de acordo com a presente invenção podem conter modificações de um ou mais resíduos na HVR e as HVRs e/ou regiões de estrutura podem ser humanizadas. Realizações de acordo com a presente invenção nas quais existe HVR e/ou modificação de estrutura incluem, sem limitação, as potenciais reivindicações a seguir para o presente pedido: 2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que A8 em HVR-L1 variante é S, D ou T e A9 é L. 3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que o anticorpo é humanizado. 4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que pelo menos uma parte da seqüência de estrutura é seqüência de estrutura de consenso humano. 5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que a mencionada modificação é substituição, inserção ou deleção. 6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que variante de HVR-L1 compreende de uma a dez (uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) substituições em qualquer combinação das posições a seguir: A2 (G, S, T ou V); A3 (G, I, K, N, P, Q, R ou T), A4 (A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R ou V), A5 (A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V ou Y), A6 (A, G, I, K, L, M, Q ou R), A7 (A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T ou V), A8 (S, D, E, G, P ou N), A9 (L, I ou M), A10 (A, I, M ou V) e A11 (F, S ou Y). 7. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que a variante de HVR-L2 compreende de uma a quatro (uma, duas, três ou quatro) substituições em qualquer combinação das posições a seguir: B1 (N), B5 (S), B6 (R ou L) e B7 (T, E, K ou V). 8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que a variante de HVR-L3 compreende pelo menos uma substituição na posição C8 (W, Y, R, S, A, F, H, I, L, M, N, T ou V). 9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que a variante de HVR-H2 compreende de uma a sete (uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou sete) substituições em qualquer combinação das posições a seguir: E2 (V, D ou F), E6 (G), E10 (Y), E12 (A, D ou T), E13 (D, A ou H), E15 (V), E17 (G). 10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que variante de HVR-H3 compreende uma ou duas substituições em qualquer combinação das posições a seguir: F2 (A, E, G, Q, R ou S) e F11 (Y). 11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer das suas realizações, que compreende HVR-L1 que contém a seqüência de SEQ ID N° 7. 12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer das suas realizações, que compreende HVR-L1 que contém a seqüência de SEQ ID N° 8. 13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer das suas realizações, que compreende HVR-L1 que contém a seqüência de SEQ ID N° 9. 14. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 13, que compreende seqüência de estrutura de consenso de cadeia pesada subgrupo III humano de cadeia pesada que compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. 15. Anticorpo de acordo com a reivindicação 14, em que a substituição é R71A, N73T e/ou N78A. 16. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer das suas realizações, que compreende uma HVR-L3 que contém a seqüência de SEQ ID N° 3. 17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que A8 em uma HVR-L1 variante é S. 18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que A8 em uma HVR-L1 variante é D. 19. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que A9 em uma HVR-L1 variante é L. 20. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou qualquer de suas realizações, em que uma seqüência de estrutura entre a seqüência E1- E17 e F1-F11 é HFR3-1-HFR3-31 e em que HFR3-6 é A ou R, HFR3-8 é N ou T e HFR3-13 é L, A ou F. 21. Anticorpo anti-beta7 humanizado, em que a afinidade monovalente do anticorpo a beta7 humano é substancialmente idêntica à afinidade monovalente de anticorpo de rato que compreende seqüências variáveis de cadeia leve e cadeia pesada, conforme ilustrado na Fig. 9. 22. Anticorpo anti-beta7 humanizado, em que a afinidade monovalente do anticorpo a beta7 humano é pelo menos três vezes maior que a afinidade monovalente de anticorpo de rato que compreende seqüência variável de cadeia leve e cadeia pesada, conforme ilustrado na Fig. 9. 23. Anticorpo humanizado de acordo com qualquer das reivindicações 21 ou 22, em que o anticorpo de rato é produzido por linhagem de células de hibridoma depositada na Coleção Norte-Americana de Cultura de Tipos, ATCC com designação HB-293. 24. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 23, em que a afinidade de ligação é expressa na forma de valor Kd. 25. Anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 24, em que a afinidade de ligação é medida por Biacore® ou radioimunoensaio. 26. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que compreende seqüência de estrutura consenso de cadeia leve de subgrupo K1 humano. 27. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, que compreende seqüência de estrutura consenso de cadeia pesada de subgrupo III humano. 28. Anticorpo de acordo com a reivindicação 27, em que a seqüência de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. 29. Anticorpo de acordo com a reivindicação 28, em que a mencionada substituição é R71A, N73T e/ou N78A ou em que o aminoácido substituído na posição 71 é R ou A e/ou a substituição de aminoácido na posição 73 é N ou T, e/ou a substituição de aminoácido na posição 78 é L, A ou F. 30. Anticorpo de acordo com a reivindicação 28, em que a mencionada substituição é L78F, A78F, A78L ou L78A. 31. Método de inibição da interação de subunidade de integrina beta7 humana com uma segunda subunidade de integrina e/ou ligante por meio de contato do anticorpo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 30 com a segunda subunidade integrina e/ou o ligante. 32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que a segunda subunidade de integrina é subunidade integrina alfa4 e em que o ligante é MAdCAM, VCAM ou fibronectina. 33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a subunidade integrina alfa4 é de humano. 34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o ligante é de humano. 35. Método de acordo com a reivindicação 32, em que a segunda subunidade de integrina é subunidade de integrina alfaE e em que o ligante é E-cadereína. 36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que a subunidade de integrina alfaE é de humano. 37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que o ligante é de humano. 38. Método de acordo com a reivindicação 31, em que a inibição reduz ou alivia os sintomas de disfunção selecionada a partir de inflamação, asma, doença intestinal inflamatória, mal de Crohn, colite ulcerativa, diabetes, inflamações resultantes de transplante de órgãos, disfunção de enxerto contra hospedeiro e inflamações associadas a disfunções de aloenxertos.
[016] Realizações adicionais da presente invenção incluem, sem limitação, as seguintes.
[017] Em uma realização, HVR-L1 é SEQ ID N° 1, 7, 8 ou 9 ou variante HVR-L1 de SEQ ID N° 1, 7, 8 ou 9, que compreende de uma a dez (uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez) substituições nas posições relativas A1 a A11, em qualquer combinação das posições a seguir: A2 (A, G, S, T ou V); A3 (S, G, I, K, N, P, Q, R ou T), A4 (E, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R ou V), A5 (S, A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V ou Y), A6 (V, A, G, I, K, L, M, Q ou R), A7 (D, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T ou V), A8 (T, S, D, E, G, P ou N), A9 (Y, L, I ou M), A10 (L, A, I, M ou V) e A11 (H, F, S ou Y). Em uma realização, HVR-L2 é SEQ ID N° 2, 67, 68 ou variante HVR-L2 de SEQ ID N° 2, 67 ou 68, em que HVR-L2 compreende de uma a quatro (uma, duas, três, quatro, quatro ou cinco) substituições nas posições relativas B1 a B8, em qualquer combinação das posições a seguir: B1 (K, R, N, V, A, F, Q, H, P, I, L, Y ou X (em que X representa qualquer aminoácido), B4 (S), B5 (Q ou S), B6 (S, R ou L) e B7 (I, T, E, K ou V). Em uma realização, HVR-L3 é SEQ ID N° 3 ou variante HVR-L3 de SEQ ID N° 3, que compreende pelo menos uma substituição nas posições relativas C1 a C8, tal como na posição C8 (W, Y, R, S, A, F, H, I, L, M, N, T ou V). Em uma realização, HVR-H1 é SEQ ID N° 4. Em uma realização, HVR-H2 é SEQ ID N° 5 ou variante HVR-H2 de SEQ ID N° 5, em que a variante de HVR-H2 compreende de uma a sete (uma, duas, três, quatro, cinco, seis ou sete) substituições nas posições relativas E1 a E17, em qualquer combinação das posições a seguir: E2 (Y, V, D ou F), E6 (S ou G), E10 (S ou Y), E12 (N, A, D ou T), E13 (P, D, A ou H), E15 (L ou V) e E17 (S ou G). Em uma realização, HVR-H3 é SEQ ID N° 6, 63, 64, 65 ou 66 ou variante HVR-H3 de SEQ ID N° 6, 63, 64, 65 ou 66, que compreende em posições relativas F1 a F11 para SEQ ID N° 63, 64 e 65 ou nas posições relativas F2 a F11 para SEQ ID N° 6 e 66, uma ou duas substituições em qualquer combinação das posições a seguir: F2 (M, A, E, G, Q, R ou S) e F11 (F ou Y). A(s) letra(s) entre parênteses após cada posição indica(m) substituição ilustrativa (ou seja, substituição) de aminoácido por consenso ou outro aminoácido, como seria evidente para os técnicos no assunto, adequação de outros aminoácidos pois aminoácidos de substituição no contexto descrito no presente podem ser determinados rotineiramente utilizando métodos conhecidos na técnica e/ou descritos no presente.
[018] Em uma realização, HVR-L1 compreende a seqüência de SEQ ID N° 1. Em uma realização, A8 em uma variante HVR-L1 é D. Em uma realização, A8 em uma variante HVR-L1 é S. Em uma realização, A9 em uma variante HVR-L1 é L. Em uma realização, A8 em uma variante HVR-L1 é D e A9 em uma variante HVR-L1 é L. Em uma realização, A8 em uma variante HVR-L1 é S e A9 em uma variante HVR-L1 é L. Em algumas realizações da presente invenção, compreendem-se essas variações em HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 compreendem, consistem ou consistem essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6. Em algumas realizações, HVR-H3 compreende, consiste ou consiste essencialmente de SEQ ID N° 6 ou 66 (para as posições relativas F2 a F11) ou SEQ ID N° 63, 64 ou 65 (para as posições relativas F1 a F11).
[019] Em uma realização, A8 em uma variante HVR-L1 é I e A9 em uma variante HVR-L1 é L, variante esta que compreende adicionalmente HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6.
[020] Em uma realização, A8, A9 e A10 em uma variante HVR-L1 são D, L e V, respectivamente, variante esta que compreende adicionalmente HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6.
[021] Em uma realização, A8 e A9 em uma variante HVR-L1 são N e L, respectivamente, variante esta que compreende adicionalmente HVR- L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6.
[022] Em uma realização, A8 e A9 em uma variante HVR-L1 são P e L, respectivamente, e B6 e B7 em uma variante HVR-L2 são R e T, respectivamente, variante esta que compreende adicionalmente HVR-L2, HVR- L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 3, 4, 5 e 6.
[023] Em uma realização, A2, A4, A8, A9 e A10 em uma variante HVR-L1 são S, D, S, L e V, respectivamente, variante esta que compreende adicionalmente HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3 em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6.
[024] Em uma realização, A5 e A9 em uma variante HVR-L1 são D e T, respectivamente, variante esta que compreende adicionalmente HVR- L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6.
[025] Em uma realização, A5 e A9 em uma variante HVR-L1 são N e L, respectivamente, variante esta que compreende adicionalmente HVR- L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6.
[026] Em uma realização, A9 em uma variante HVR-L1 é L, variante esta que compreende adicionalmente HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6.
[027] Em uma realização, o anticorpo ou polipeptídeo de ligação anti-beta7 de acordo com a presente invenção compreende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 9, 2, 3, 4, 5 e 64. Em outra realização, cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 9, 67, 3, 4, 5 e 64. Em outra realização, cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 9, 68, 3, 4, 5 e 64. Em outra realização, cada HVR compreende, consiste ou consiste essencialmente, nesta ordem, de SEQ ID N° 9, 2 ou 67 ou 68, 3, 4, 5 e 66.
[028] Em algumas realizações as mencionadas variantes de anticorpo HVR-L1 compreendem adicionalmente HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada um compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6. Quando a variante de anticorpo compreender HVR-L1 A8 (P) e A9 (L) e HVR-L2 B6 (R) e B7 (T), em algumas realizações a mencionada variante de HVR-L1, HVR-L2 compreende adicionalmente HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 3, 4, 5 e 6.
[029] Em algumas realizações, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma seqüência de consenso de estrutura de cadeia pesada de subgrupo III humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência de consenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma seqüência de consenso de estrutura de cadeia leve K1 humana.
[030] Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma HVR-L1 que compreende SEQ ID N° 1. Em uma realização, um anticorpo variante de acordo com a presente invenção compreende HVR-L1 variante em que A10 é V. Em uma realização, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR- H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6. Em algumas realizações, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência de consenso de estrutura de cadeia pesada subgrupo III humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência de consenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência de consenso de estrutura de cadeia leve K1 humana.
[031] Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-L3 que compreende SEQ ID N° 3. Em uma realização, um anticorpo variante de acordo com a presente invenção compreende HVR-L3 variante em que C8 é L. Em uma realização, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 1, 2, 4, 5 e 6. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-L3 variante em que C8 é W. Em uma realização, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 1, 2, 4, 5 e 6. Em algumas realizações, HVR-L1 compreende SEQ ID N° 7, 8 ou 9. Em algumas realizações, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma seqüência consenso de estrutura de cadeia pesada subgrupo III humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência de consenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma seqüência de consenso de estrutura de cadeia leve K1 humana.
[032] Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-H3 que compreende SEQ ID N° 6. Em uma realização, variante do mencionado anticorpo compreende HVR-H3 variante em que F1 é Q. Em uma realização, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H2, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 e 5. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-H3 variante em que F1 é R. Em uma realização, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H2, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 e 5. Em uma realização, HVR-L1 compreende SEQ ID N° 7, 8 ou 9. Em algumas realizações, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência de consenso de estrutura de cadeia pesada subgrupo III humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência de consenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência de consenso de estrutura de cadeia leve K1 humana.
[033] Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma HVR-L1 que compreende SEQ ID N° 1. Em uma realização, o anticorpo compreende HVR-L1 variante em que A4 é Q. Em uma realização, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR- L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-L1 variante em que A6 é I. Em uma realização, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma HVR-L1 variante em que A7 é S. Em uma realização, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR- L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-L1 variante em que A8 é D ou N. Em uma realização, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 2, 3, 4, 5 e 6. Em algumas realizações, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma seqüência de consenso de estrutura de cadeia pesada subgrupo III humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência de consenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma seqüência consenso de estrutura de cadeia leve K1 humana.
[034] Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-L2 que compreende SEQ ID N° 2. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma HVR-L2 variante em que B1 é N. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção é uma HVR-L2 variante em que B5 é S. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção é uma HVR- L2 variante em que B6 é L. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção é uma HVR-L2 variante em que B7 é V. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção é uma HVR-L2 variante em que B7 é E ou K. Em algumas realizações, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 1,3, 4, 5 e 6. Em algumas realizações, HVR-L1 compreende SEQ ID N° 7, 8 ou 9. Em algumas realizações, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma seqüência consenso de estrutura de cadeia pesada subgrupo III humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência consenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência consenso de estrutura de cadeia leve K1 humana.
[035] Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma HVR-L3 que compreende SEQ ID N° 3. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma HVR-L3 variante em que C8 é W, Y, R ou S. Em algumas realizações, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 1, 2, 4, 5 e 6. Em algumas realizações, HVR-L1 compreende SEQ ID N° 7, 8 ou 9. Em algumas realizações, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma seqüência de consenso de estrutura de cadeia pesada subgrupo III humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência de consenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência de consenso de estrutura de cadeia leve K1 humana.
[036] Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-H2 que compreende SEQ ID N° 5. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-H2 variante em que E2 é F. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção é HVR-H2 variante em que E2 é V ou D. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção é HVR-H2 variante em que E6 é G. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção é HVR-H2 variante em que E10 é Y. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção é HVR-H2 variante em que E12 é A, D ou T. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção é HVR- H2 variante em que E13 é D, A ou N. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção é uma HVR-H2 variante em que E15 é V. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção é uma HVR- H2 variante em que E17 é G. Em algumas realizações, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 e 6. Em algumas realizações, HVR-L1 compreende SEQ ID N° 7, 8 ou 9. Em algumas realizações, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência consenso de estrutura de cadeia pesada subgrupo III humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência consenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência consenso de estrutura de cadeia leve K1 humana.
[037] Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende HVR-H3 que compreende SEQ ID N° 6. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma HVR-H3 variante em que F11 é Y. Em algumas realizações, o mencionado anticorpo variante compreende adicionalmente HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1 e HVR-H3, em que cada qual compreende, nesta ordem, a seqüência ilustrada em SEQ ID N° 1, 2, 3, 4 e 6. Em algumas realizações, HVR-L1 compreende SEQ ID N° 7, 8 ou 9. Em algumas realizações, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência consenso de estrutura de cadeia pesada subgrupo III humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência consenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência consenso de estrutura de cadeia leve K1 humana.
[038] Em algumas realizações, estes anticorpos compreendem adicionalmente uma seqüência consenso de estrutura de cadeia pesada de subgrupo III humano. Em uma realização desses anticorpos, a seqüência consenso de estrutura compreende substituição na posição 71, 73 e/ou 78. Em algumas realizações destes anticorpos, a posição 71 é A, 73 é T e/ou 78 é A. Em uma realização destes anticorpos, estes anticorpos compreendem adicionalmente seqüência consenso de estrutura de cadeia leve K1 humana.
[039] Um agente terapêutico para uso em paciente hospedeiro permite preferencialmente pouca a nenhuma reação imunogênica contra o agente no mencionado paciente. Em uma realização, a presente invenção fornece esse agente. Em uma realização, por exemplo, a presente invenção fornece anticorpo humanizado que permite e/ou espera-se que permita reação de anticorpo anti-roedor humano (tal como reação anti-camundongo ou antirato) ou reação anti-humana humana em nível substancialmente reduzido em comparação com anticorpo que compreende a seqüência que compreende SEQ ID N° 10 e/ou 11 (Figs. 1A e 1B) ou SEQ ID N° 12 e/ou 13 (Figs. 9A e 9B que ilustram seqüências de aminoácidos anti-Fib504 de camundongo de ratos) em paciente hospedeiro. Em outro exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado que permite e/ou espera-se que permita ausência de reação de anticorpo anti-roedor humano (tal como anti-camundongo humano (HAMA) ou anti-camundongo humano) ou anti-humano humano (HAHA).
[040] Um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou mais seqüências de região não hipervariável (tal como estrutura) consenso humano e/ou humana no seu domínio variável de cadeia leve e/ou pesada. Em algumas realizações, uma ou mais modificações adicionais estão presentes nas seqüências de região não hipervariável consenso humano e/ou humana. Em uma realização, o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo de acordo com a presente invenção compreende um seqüência de estrutura consenso humana, que em uma realização é a seqüência de estrutura consenso do subgrupo III. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma seqüência de estrutura consenso de subgrupo III variante modificada em pelo menos uma posição de aminoácido. Em uma realização, por exemplo, uma seqüência de estrutura consenso do subgrupo III variante pode compreender uma substituição em uma ou mais das posições 71, 73, 78 e/ou 94. Em uma realização, a mencionada substituição é R71A, N73T, L78A e/ou R94M, em qualquer de suas combinações.
[041] Como se sabe na técnica e conforme descrito em mais detalhes abaixo no presente, a fronteira/posição de aminoácido que delineia região hipervariável de anticorpo pode variar, dependendo do contexto e das diversas definições conhecidas na técnica (conforme descrito abaixo). Algumas posições dentro de domínio variável podem ser observadas como posições hipervariáveis híbridas, pelo fato de que estas posições podem ser consideradas como estando dentro de região hipervariável sob um conjunto de critérios enquanto são considerados fora de região hipervariável sob conjunto de critérios diferente. Uma ou mais destas posições podem também ser encontradas em regiões hipervariáveis estendidas (conforme definido adicionalmente abaixo). A presente invenção fornece anticorpos que compreendem modificações nessas posições hipervariáveis híbridas. Em uma realização, estas posições hipervariáveis híbridas incluem uma ou mais dentre as posições 26 a 30, 33 a 35B, 47 a 49, 49, 57 a 65, 93, 94 e 102 em domínio variável de cadeia pesada. Em uma realização, estas posições hipervariáveis híbridas incluem uma ou mais dentre as posições 24 a 29, 35 a 36, 46 a 49, 49, 56 e 97 em domínio variável de cadeia leve. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende seqüência de estrutura de consenso de subgrupo humano variante modificada em pelo uma ou mais posições hipervariáveis híbridas. Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende domínio variável de cadeia pesada que compreende seqüência de estrutura de consenso de subgrupo III humano variante modificada em uma ou mais das posições 28 a 35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58 a 61, 63, 65, 94 e 102. Em uma realização, o anticorpo compreende substituição T28F, F29I, S30T, S31N, Y32N, A33Y, M34W e S35G. Em uma realização, o anticorpo compreende substituição S49G. Em uma realização, o anticorpo compreende substituição V50F, V50D ou V50Y. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição G53Y. Em uma realização, o anticorpo compreende um substituição G54S. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição Y58S. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição A60N, A60D ou A60T. Em uma realização, o anticorpo compreende um substituição D61P, D61A ou D61H. Em uma realização, o anticorpo compreende um substituição V63L. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição G65S. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição R94M. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição R94A, R94E, R94G, R94Q ou R94S. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição G95T. Em uma realização, o anticorpo compreende uma ou mais das substituições nas posições 28 a 35, 49, 50, 52a, 53, 54, 58 a 61, 63, 65, 94 e 102 e compreende adicionalmente uma ou mais das substituições nas posições R71A, N73T, L78A ou L78F. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição Y102F. Pode-se observar por meio de referência à Fig. 1B que estas substituições encontram-se em HVR- H1, HVR-H2 e/ou HVR-H3 da cadeia pesada.
[042] Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende domínio variável de cadeia leve que compreende seqüência de estrutura consenso de subgrupo I humano variante modificada em uma ou mais das posições 27, 29 a 31, 33, 34, 49, 50, 53 a 55, 91 e 96. Em uma realização, o anticorpo compreende substituição Q27E. Em uma realização, o anticorpo compreende substituição I29V. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição S30D. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição N31T, N31S ou N31D. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição Y32L. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição A34H. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição Y49K. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição A50Y. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição S53Q. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição L54S. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição E55I ou E55V. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição Y91G. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição W96N ou W96L. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição A25S. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição A25 para G, S, T ou V. Em uma realização, o anticorpo compreende uma modificação selecionada a partir de um ou mais dos grupos de substituições a seguir. Em uma realização, por exemplo, o anticorpo compreende uma substituição S26 para G, I, K, N, P, Q ou T. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição Q27 para E, A, D, G, H, I, K, L, N, Q, R ou V. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição S28 para A, D, G, H, I, K, N, P, R, T, V ou Y. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição I29 para V, A, G, K, L, M, Q ou R. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição S30 para D, A, E, G, H, I, K, L, N, P, S, T ou V. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição N31 para D, T, E ou G. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição Y32 para L, I ou M. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição L33 para A, I, M ou V. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição A34 para H, F, Y ou S. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição Y49 para K ou N. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição A50Y. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição S53Q. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição L54S. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição E55 para V, I ou K. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição Y91G. Em uma realização, o anticorpo compreende uma substituição W96 para N, L, W, Y, R, S, A, F, H, I, M, N, R, S, T, V ou Y. Pode-se observar por meio de referência à Fig. 1A que estas substituições encontram-se em HVR-L1, HVR-L2 e/ou HVR- L3 da cadeia leve.
[043] Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode compreender quaisquer seqüências de estrutura de cadeia leve consenso humano ou humanas, desde que o anticorpo exiba as características biológicas desejadas (tais como afinidade de ligação desejada). Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos uma parte da seqüência de estrutura de cadeia leve K humana (ou toda). Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos uma parte da seqüência de consenso de estrutura de subgrupo I k humana (ou toda).
[044] Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende domínio variável de cadeia leve e/ou pesada que compreende seqüências de estrutura ilustradas como SEQ ID N° 34 a 41 e nas Figs. 1, 7 e 8, desde que as posições 49 da cadeia leve e 94 da cadeia pesada sejam incluídas nas HVRs estendidas e desde que a mencionada posição 49 seja K e a mencionada posição 94 seja preferencial mas não necessariamente M e pode ser R.
[045] Os antagonistas de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para modular um ou mais aspectos de efeitos associados a beta7, que incluem, mas sem limitar-se a associação com subunidade de integrina alfa4, associação com subunidade de integrina alfaE, ligação de integrina alfa4beta7 a MAdCAM, VCAM-1 ou fibronectina e ligação de integrina alfaEbeta7a E-caderina. Estes efeitos podem ser modulados por meio de qualquer mecanismo biologicamente relevante, que inclui o rompimento da ligação de ligante a subunidade beta7 ou à integrina dimérica alfa4beta7 ou alfaEbeta e/ou por meio de rompimento da associação entre as subunidades de integrina alfa e beta, de forma a inibir a formação da integrina dimérica. Conseqüentemente, em uma realização, a presente invenção fornece um anticorpo antagonista beta7 que inibe a ligação de alfa4 a beta7. Em uma realização, um anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção rompe a ligação de alfa4beta7 a MAdCAM. Em uma realização, um anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção rompe a ligação de alfa4beta7 a VCAM-1. Em uma realização, um anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção rompe a ligação de alfa4beta7 a fibronectina. Em uma realização, anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção rompe a ligação de beta7 a alfaE. Em uma realização, anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção rompe a ligação de integrina alphaEbeta7a E-caderina. A interferência pode ser direta ou indireta. Um anticorpo antagonista beta7, por exemplo, pode ligar-se a beta7 em seqüência da região de dimerização de alfa4beta7 ou alfaEbeta7 e, desta forma, inibir a interação das subunidades de integrina e a formação de dímero de integrina. Em exemplo adicional, anticorpo antagonista de beta7 pode ligar- se a uma seqüência no domínio de ligação de ligante da subunidade beta7 e, desta forma, inibir a interação do mencionado domínio ligado ao seu parceiro de ligação (tal como fibronectina, VCAM e/ou MAdCAM para a integrina alfa4beta7; ou E-caderina para a integrina alfaEbeta7). Em outro exemplo, anticorpo antagonista de beta7 pode ligar-se a seqüência que não se encontra no domínio de dimerização de subunidade de integrina ou domínio de ligação de ligante, mas em que a mencionada ligação de anticorpo antagonista beta7 resulta no rompimento da capacidade do domínio beta7 de interagir com o seu parceiro de ligação (tal como subunidade integrina alfa4 ou alfaE e/ou ligante tal como fibronectina, VCAM, MAdCAM ou E-cadereina). Em uma realização, anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção liga-se a beta7 (tal como o domínio extracelular), de tal forma que a dimerização de beta7 com a subunidade alfa4 ou alfaE seja rompida. Em uma realização, anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção liga-se a beta7, de tal forma que a capacidade de integrina beta7 e/ou alfa4beta7 e/ou alfaEbeta7 de ligar- se ao(s) seu(s) ligante(s) correspondente(s) seja rompida. Em uma realização, a presente invenção fornece, por exemplo, anticorpo antagonista que, mediante ligação a molécula beta7, inibe a dimerização da mencionada molécula. Em uma realização, anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção liga especificamente uma seqüência no domínio de ligação de ligantes de beta7. Em uma realização, anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção liga uma seqüência no domínio de ligação de ligantes de beta7, de tal forma que a ligação de ligante (ou seja, fibronectina, VCAM e/ou MAdCAM) à integrina alfa4beta7seja rompida. Em uma realização, anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção liga especificamente uma seqüência no domínio de ligação de ligantes de beta7 de tal forma que a ligação de ligante (ou seja, E-caderina) à integrina alfaEbeta7seja rompida.
[046] Em uma realização, anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção rompe a dimerização de beta7 que compreende heterodimerização (ou seja, dimerização de beta7 com molécula de subunidade de integrina alfa4 ou alfaE).
[047] Em uma realização, um anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção liga-se a um epítopo sobre a subunidade de integrina beta7 que mapeia para os aminoácidos 176 a 237. Em outra realização, um anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção liga-se ao mesmo epítopo sobre a integrina beta7 que é substancialmente o mesmo epítopo de Fib504.64 (ATCC HB-293). A determinação da ligação de epítopos ocorre por meio de métodos padrão que incluem, sem limitações, análise de ligação de competição.
[048] Em um aspecto, a presente invenção fornece anticorpo que compreende combinação de uma, duas, três, quatro, cinco ou todas as seqüências HVR ilustradas na tabela de substituições de aminoácidos da Fig. 13.
[049] Um agente terapêutico para uso em paciente hospedeiro permite preferencialmente pouca a nenhuma reação imunogênica contra o agente no mencionado paciente. Em uma realização, a presente invenção fornece esse agente. Em uma realização, por exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado que permite e/ou espera-se que permita reação de anticorpo anti-rato humano, anti-roedor humano ou anti-humano humano em nível substancialmente reduzido em comparação com um anticorpo que compreende a seqüência de SEQ ID N° 10, 11, 12 e/ou SEQ ID N° 13 (Fib504 anti-camundongo de rato (ATCC HB-293), Figs. 1 e 9) em paciente hospedeiro. Em outro exemplo, a presente invenção fornece um anticorpo humanizado que permite e/ou espera-se que permita ausência de reação de anticorpo anti-camundongo humano, anti-rato humano ou anti- humano humano.
[050] Um anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou mais seqüências de região não hipervariável (tal como estrutura) consenso humano e/ou humana no seu domínio variável de cadeia leve e/ou pesada. Em algumas realizações, uma ou mais modificações adicionais estão presentes nas seqüências de região não hipervariável de consenso humano e/ou humana. Em uma realização, o domínio variável de cadeia pesada de anticorpo de acordo com a presente invenção compreende seqüência de estrutura consenso humano, que em uma realização é a seqüência de estrutura consenso do subgrupo III. Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção compreende seqüência de estrutura de consenso de subgrupo III variante modificada em pelo menos uma posição de aminoácido. Em uma realização, por exemplo, seqüência de estrutura consenso do subgrupo III variante pode compreender substituição em uma ou mais das posições 71, 73, 78 e/ou 94, embora a posição 94 seja parte de região hipervariável H3 de cadeia pesada estendida de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a mencionada substituição é R71A, N73T, N78A e/ou R94M em qualquer de suas combinações.
[051] Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode compreender quaisquer seqüências de estrutura de cadeia leve consenso humano ou humanas, desde que o anticorpo exiba as características biológicas desejadas (tais como afinidade de ligação desejada). Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos uma parte da seqüência de estrutura de cadeia leve K humana (ou toda). Em uma realização, anticorpo de acordo com a presente invenção compreende pelo menos uma parte da seqüência consenso de estrutura de subgrupo I k humana (ou toda).
[052] Os antagonistas de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para modular um ou mais aspectos de efeitos associados a beta7. Um anticorpo antagonista beta7, por exemplo, pode ligar-se a beta7 em seqüência da região de dimerização de alfa4beta7 ou alfaEbeta7 e, desta forma, inibir a interação das subunidades de integrina e a formação de dímero de integrina. Em exemplo adicional, anticorpo antagonista de beta7 pode ligar- se a uma seqüência no domínio de ligação de ligante da subunidade beta7 e, desta forma, inibir a interação do mencionado domínio ligado ao seu parceiro de ligação (tal como fibronectina, VCAM e/ou MAdCAM para a integrina alfa4beta7; ou E-caderina para a integrina alfaEbeta7). Em outro exemplo, anticorpo antagonista de beta7 pode ligar-se a seqüência que não se encontra no domínio de dimerização de subunidade de integrina ou domínio de ligação de ligante, mas em que a mencionada ligação de anticorpo antagonista beta7 resulta no rompimento da capacidade do domínio beta7 de interagir com o seu parceiro de ligação (tal como subunidade de integrina alfa4 ou alfaE e/ou ligante tal como fibronectina, VCAM, MAdCAM ou E-caderina). Em uma realização, anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção liga-se a beta7 (tal como o domínio extracelular), de tal forma que a dimerização de beta7 com a subunidade alfa4 ou alfaE seja rompida. Em uma realização, anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção liga-se a beta7, de tal forma que a capacidade de integrina beta7 e/ou alfa4beta7 e/ou alfaEbeta7 de ligar-se ao(s) seu(s) ligante(s) correspondente(s) seja rompida. Em uma realização, a presente invenção fornece, por exemplo, anticorpo antagonista que, mediante ligação a molécula beta7, inibe a dimerização da mencionada molécula. Em uma realização, anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção liga especificamente uma seqüência no domínio de ligação de ligantes de beta7. Em uma realização, anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção liga especificamente seqüência no domínio de ligação de ligantes de beta7, de tal forma que a ligação de ligante (ou seja, fibronectina, VCAM e/ou MAdCAM) à integrina alfa4beta7 seja rompida. Em uma realização, anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção liga especificamente seqüência no domínio de ligação de ligantes de beta7 de tal forma que a ligação de ligante (ou seja, E-caderina) à integrina alfaEbeta7 seja rompida.
[053] Em uma realização, um anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção rompe a dimerização de beta7 que compreende heterodimerização (ou seja, dimerização de beta7 com molécula de subunidade de integrina alfa4 ou alfaE).
[054] Em alguns casos, pode ser vantajoso ter anticorpo antagonista beta7 que não interfere com a ligação de ligante (tal como fibronectina, VCAM, MAdCAM ou alfaE) à subunidade beta7 como parte de integrina ou a integrina alfa4beta7 ou integrina alfaEbeta7 como dímero. Conseqüentemente, em uma realização, a presente invenção fornece anticorpo que não liga sítio de ligação de fibronectina, VCAM, MAdCAM ou E-caderina sobre beta7 mas, por outro lado, inibe a interação entre a subunidade beta7 e subunidade alfa (tal como subunidade de integrina alfa4 ou alfaE), de forma a evitar a formação de integrina biologicamente ativa. Em um exemplo, anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção pode ser utilizado em conjunto com um ou mais antagonistas diferentes, em que os antagonistas são dirigidos em processos e/ou funções diferentes no eixo integrina beta7. Desta forma, em uma realização, anticorpo antagonistas beta7 de acordo com a presente invenção liga-se a epítopo sobre beta7 distinto de epítopo ligado por outro antagonista beta7 ou integrina alfa/beta (tal como anticorpo alfa4beta7, incluindo anticorpo monoclonal ou anticorpo, tal como anticorpo humanizado ou anticorpo monoclonal derivado e/ou que possui as mesmas ou efetivamente as mesmas características de ligação ou especificidade de anticorpo derivado de anticorpo murino.
[055] Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpo antagonista beta7 que rompe a multimerização de beta7-alfa4 ou alfaE na integrina correspondente, bem como a ligação de ligante. Anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção que inibe a dimerização de beta7 com subunidade de integrina alfa4 ou alfaE pode compreender adicionalmente capacidade de concorrer com ligante pela ligação a beta7 ou o dímero de integrina (pode interferir, por exemplo, com a ligação de fibronectina, VCAM e/ou MAdCAM a beta7 e/ou alfa4beta7; ou pode interferir com a ligação de E- caderina a beta7 ou alfaEbeta7).
[056] Em uma realização de anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção, a ligação do antagonista a beta7 inibe a adesão celular ativada pela ligação de ligante. Em outra realização de anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção, a ligação do antagonista a beta7 em célula inibe o recrutamento da célula às células e/ou tecido em que é expressa a integrina que contém beta7.
[057] Em uma realização, anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção liga especificamente pelo menos uma parte dos aminoácidos 176 a 250 (opcionalmente aminoácidos 176 a 237) do domínio extracelular beta7 (vide Tidswell, M. et al, (1997), J. Immunol. 159: 1497-1505) ou sua variante e reduz ou bloqueia a ligação de ligantes MAdCAM, VCAM-1, fibronectina e/ou E-caderina. Em uma realização, esse bloqueio de ligação de ligante rompe, reduz e/ou evita a adesão de célula que expressa o ligante a uma célula que expressa o ligante que contém beta7. Em uma realização, anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção liga especificamente seqüência de aminoácidos de beta7 que compreende os resíduos 176 a 237. Em uma realização, anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção liga especificamente epítopo de conformação formado, no todo ou em parte, por pelo menos uma das seqüências selecionadas a partir do grupo que consiste em resíduos 176 a 237 de beta7. Em uma realização, anticorpo antagonista de acordo com a presente invenção liga especificamente seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade ou similaridade de seqüências com a seqüência de aminoácidos dos resíduos 176 a 237 ou resíduos 176 a 250 de beta7 humano. Em uma realização, o anticorpo anti-beta7 antagonista de acordo com a presente invenção liga o mesmo epítopo do anticorpo anti-beta7 Fib504 produzido pelo hibridoma ATCC HB-293.
[058] Em um aspecto, a presente invenção fornece composições que compreendem um ou mais anticorpos antagonistas de acordo com a presente invenção e um veículo. Em uma realização, o veículo é farmaceuticamente aceitável.
[059] Em um aspecto, a presente invenção fornece ácidos nucléicos que codificam um anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção.
[060] Em um aspecto, a presente invenção fornece vetores que compreendem ácido nucléico de acordo com a presente invenção.
[061] Em um aspecto, a presente invenção fornece células hospedeiras que compreendem ácido nucléico ou vetor de acordo com a presente invenção. Um vetor pode ser de qualquer tipo, tal como vetor recombinante, como vetor de expressão. Pode-se utilizar qualquer dentre uma série de células hospedeiras. Em uma realização, célula hospedeira é célula procariótica, tal como E. coli. Em uma realização, uma célula hospedeira é uma célula eucariótica, tal como célula de mamífero tal como célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO).
[062] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de elaboração de antagonista de acordo com a presente invenção. A presente invenção fornece, por exemplo, um método de elaboração de anticorpo antagonista beta7 (que, conforme definido no presente, inclui comprimento total e seus fragmentos), em que o mencionado método compreende a expressão em célula hospedeira apropriada de vetor recombinante de acordo com a presente invenção que codifica o mencionado anticorpo (ou seu fragmento) e recuperação do mencionado anticorpo.
[063] Em um aspecto, a presente invenção fornece artigos industrializados que compreendem um recipiente e uma composição no interior do recipiente, em que a composição compreende um ou mais anticorpos antagonistas beta7 de acordo com a presente invenção. Em uma realização, a composição compreende um ácido nucléico de acordo com a presente invenção. Em uma realização, composição que compreende um anticorpo antagonista compreende ainda um veículo que, em algumas realizações, é farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, um artigo industrializado de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente instruções de administração da composição (tal como o anticorpo antagonista) a paciente.
[064] Em um aspecto, a presente invenção fornece um kit que compreende um primeiro recipiente que compreende uma composição que compreende um ou mais anticorpos antagonistas beta7 de acordo com a presente invenção; e segundo recipiente que compreende tampão. Em uma realização, o tampão é farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, composição que compreende anticorpo antagonista compreende ainda veículo que, em algumas realizações, é farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, um kit compreende adicionalmente instruções de administração da composição (tal como o anticorpo antagonista) a paciente.
[065] Integrinas Beta7 e seus ligantes são expressos de formas variadas em estados doentios. [A expressão de MAdCAM-1 sobre endotélio intestinal aumenta em locais de inflamação das mucosas em pacientes com doença intestinal inflamatória (UC e CD) e lâmina própria do cólon de pacientes com UC e CD também exibe aumento das células CD3+ e a4b7+ em comparação com controles IBS (vide Souza, H. et al, Gut 45: 856 (1999)). Observou-se que a expressão de MAdCAM-1 é associada a inflamações de trato portal em doenças do fígado e pode ser importante no recrutamento de linfócitos alfa4beta7+ para o fígado durante inflamações (Hillan, K. et al, Liver. 19 (6): 509-18 (1999)). MAdCAM-1 sobre vasos hepáticos sustenta a adesão de linfócitos a4b7+ de pacientes com IBD e colangite esclerosante primária. A adesão foi inibida por anticorpos anti-MAdCAM-1, anti-alfa4beta7 ou anti-alfa4 (Grant, A. J. et al, Hepatology, 33 (5): 1065-72 (2001)). MAdCAM-1, VCAM-1 e E-caderina são expressos em células endoteliais do cérebro e/ou sobre microvasos no sistema nervoso central inflamado. Integrinas Beta7 contribuem para doença demielinante do SNC (Kanwar et al, J. Neuroimmunology 103, 146 (2000)). A expressão de alfa4beta7 foi significativamente mais alta no LPL de CD que em controles e pacientes com UC (Oshitani, N. et al, International Journal of Molecule Medicine 12, 715-719 (2003)). IELs de pacientes CD podem ser estimulados cronicamente e recrutados a partir da periferia (Meresse, B. et al, Human Immunology, 62, 694-700 (2001)). Em doença do fígado humano, células T alfaEbeta7 (CD4+ e CD8+) são preferencialmente acumulados em fígados humanos nos quais E-caderina é expressa sobre hepatócitos e epitélio do duto biliar (Shimizu, Y. et al, Journal of Hepatology 39, 918-924 (2003)). Em pancreatite crônica, células T CD8+ CD103+, análogas a linfócitos intraepiteliais intestinais, infiltram-se no pâncreas em pancreatite crônica (Matthias, P. et al, Am. J. Gastroenterol. 93: 2141-2147 (1998)). O aumento de alfaEbeta7 é encontrada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico com envolvimento epitelial específico (Pang et al, Arthritis & Rheumatism 41: 1456-1463 (1998)). Em Síndrome de Sjogren, células T CD8+ alfaEbeta7+ aderem-se a células epiteliais acinares e as matam por meio da indução de apoptose (Kroneld et al, Scand. J. Rheumatol. 27: 215-218, 1998). Integrina alfa4beta7 e alfaEbeta7 desempenham papel em epidermotropismo de células T durante a inflamação da pele e contribuem com a rejeição de aloenxertos da pele (Sun et al, Transplantation 74, 1202, 2002). Teraki e Shiohara exibiram expressão preferencial de integrina aEb7 sobre células T CD8+ em epiderme psoriática (Teraki e Shiohara, Br. J. Dermatology 147, 1118, 2002). Linfócitos T de saliva são IELs ativados (CD69+ CD103+) em pacientes com asma, COPD e normais (Leckie et al, Thorax 58, 23, 2003). CD103+ (aEb7+) CTL acumulam com epitélio de enxerto durante rejeição de aloenxertos renais clínicos (Hadley et al, Transplantation 72, 1548, 2001).] Desta forma, em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de anticorpo antagonista beta7 de acordo com a presente invenção para inibir a interação entre integrina beta7 e ligante para reduzir ou aliviar a doença, tal como um ou mais dos estados doentios descritos acima. Em uma realização, o anticorpo de acordo com a presente invenção é utilizado na preparação de medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doença, tal como doença inflamatória que inclui, sem limitações, doença intestinal inflamatória (tal como mal de Crohn e colite ulcerativa), doença inflamatória do fígado, inflamação do SNC, pancreatite crônica, eritematose do lúpus sistêmico, síndrome de Sjogren, psoríase e inflamação da pele, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), doença pulmonar intersticial, alergia, doença autoimune, rejeição a transplantes, rejeição de enxertos renais, doença de enxerto contra hospedeiro, diabetes e câncer.
[066] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um ácido nucléico de acordo com a presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doença, tal como disfunção imunológica (como autoimune ou inflamatória), que inclui, sem limitações, doença intestinal inflamatória (tal como mal de Crohn ou colite ulcerativa) e reação alérgica (tal como disfunções do sistema respiratório, pele, juntas, asma alérgica e outros órgãos afetados por reação alérgica mediada por integrina que contém beta7).
[067] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um vetor de expressão de acordo com a presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doença, tal como disfunção imunológica (como autoimune ou inflamatória), que inclui, sem limitações, doença intestinal inflamatória (tal como mal de Crohn ou colite ulcerativa) e reação alérgica (tal como disfunções do sistema respiratório, pele, juntas e outros órgãos afetados por reação alérgica mediada por integrina que contém beta7).
[068] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de célula hospedeira de acordo com a presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doença, tal como disfunção imunológica (como autoimune ou inflamatória), que inclui, sem limitações, doença intestinal inflamatória (tal como mal de Crohn ou colite ulcerativa) e reação alérgica (tal como disfunções do sistema respiratório, pele, juntas e outros órgãos afetados por reação alérgica mediada por integrina que contém beta7).
[069] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um artigo industrializado de acordo com a presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como disfunção imunológica (tal como autoimune ou inflamatória), que inclui, sem limitações, doença intestinal inflamatória (tal como mal de Crohn ou colite ulcerativa) e reação alérgica (tal como disfunções do sistema respiratório, pele, juntas e outros órgãos afetados por reação alérgica mediada por integrina que contém beta7).
[070] Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um kit de acordo com a presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma doença, tal como disfunção imunológica (como autoimune ou inflamatória), que inclui, sem limitações, doença intestinal inflamatória (tal como mal de Crohn ou colite ulcerativa) e reação alérgica (tal como disfunções do sistema respiratório, pele, juntas e outros órgãos afetados por reação alérgica mediada por integrina que contém beta7).
[071] A presente invenção fornece métodos e composições úteis para a modulação de estados doentios associados à desregulagem do processo de interação entre células mediado por integrina beta7. As integrinas beta7 estão envolvidas em diversas funções biológicas e fisiológicas, que incluem, por exemplo, disfunções inflamatórias e reações alérgicas. Desta forma, em um aspecto, a presente invenção fornece método que compreende a administração a paciente de anticorpo de acordo com a presente invenção.
[072] Em um aspecto, a presente invenção fornece método de inibição de inflamações mediadas por integrina beta7, em que o mencionado método compreende o contato de uma célula ou tecido com quantidade eficaz de anticorpo de acordo com a presente invenção, por meio do quê inibe-se a interação de células B ou linfócitos e ligação a célula que expressa integrina beta7.
[073] Em um aspecto, a presente invenção fornece método de tratamento de condição patológica associada à desregulagem da ligação de integrina beta7 em pacientes, em que o mencionado método compreende a administração ao paciente de quantidade eficaz de anticorpo de acordo com a presente invenção, por meio do quê a mencionada condição é tratada.
[074] Em um aspecto, a presente invenção fornece método de inibição da ligação de linfócito que expressa ligante integrina beta7 (tal como célula que expressa MAdCAM, VCAM, E-cadereina ou fibronectina) a célula que expressa integrina beta7 (tal como integrinas alfa4beta7 ou alfaEbeta7), em que o mencionado método compreende o contato da mencionada célula com anticorpo de acordo com a presente invenção, de forma a inibir ou evitar a adesão das células e causar redução da reação inflamatória.
[075] Em um aspecto, a presente invenção fornece método de tratamento de disfunção inflamatória associada ao aumento da expressão ou atividade de integrina beta7 ou aumento da interação entre integrina beta7 sobre uma célula e receptor integrina beta7 sobre outra célula, em que o mencionado método compreende a administração a paciente necessitado desse tratamento de quantidade eficaz de anticorpo de acordo com a presente invenção, de forma a tratar ou evitar efetivamente a mencionada disfunção inflamatória. Em uma realização, a mencionada disfunção inflamatória é doença intestinal inflamatória (IBD). Em outra realização, a mencionada disfunção inflamatória é reação alérgica.
[076] Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para afetar qualquer estado patológico apropriado, tal como células e/ou tecidos associados à desregulagem do processo de ligação de integrina beta7. Integrinas Beta7 são expressas principalmente sobre leucócitos (Tidswell, M. et al (1997) acima). Em uma realização, um leucócito é dirigido em um método de acordo com a presente invenção e evita-se a sua ligação a célula que expressa ligante da integrina beta7. Evita-se, por exemplo, que linfócito intraepitelial que expressa E-caderina, de acordo com a presente invenção, una-se a célula que expressa alfaEbeta7 por anticorpo anti-beta7 antagonista. Anticorpo anti-beta7 antagonista de acordo com a presente invenção evita que células que expressam MAdCAM, VCAM-1 ou fibronectina liguem-se a leucócito que expressa alfa4beta7.
[077] Os métodos de acordo com a presente invenção podem também compreender etapas de tratamento adicionais. Em uma realização, por exemplo, um método compreende adicionalmente uma etapa em que célula e/ou tecido dirigido (tal como célula endotelial do forro intestinal) é exposta a um anticorpo anti-TNF ou agente terapêutico de moléculas pequenas que inclui, sem limitação, compostos 5-ASA (incluindo, sem limitação).
[078] Da forma descrita no presente, integrinas beta7 mediam processos biológicos importantes cuja desregulagem gera numerosas condições patológicas. Conseqüentemente, em uma realização dos métodos de acordo com a presente invenção, uma célula que é direcionada (tal como célula endotelial) é aquela em que a adesão de célula que expressa ligante integrina beta7 de integrina beta7 (em que a célula pode ser, sem limitações, linfócito e o ligante pode ser MAdCAM, VCAM ou E-caderina) é rompida, inibida ou evitada em comparação com as células na ausência do anticorpo antagonista anti-beta7 de acordo com a presente invenção. Em uma realização, método de acordo com a presente invenção inibe o abrigo de linfócitos, de forma a inibir inflamações no sítio de expressão de integrina beta7. O contato com antagonista de acordo com a presente invenção pode resultar, por exemplo, na incapacidade da célula de aderir-se a célula que expressa ligante de integrina beta7.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[079] As Figs. 1A e 1B ilustram alinhamento de seqüências de cadeias leve e pesada variáveis para os seguintes: seqüência consenso de subgrupo kappa I humano de cadeia leve (Fig. 1A, SEQ ID N° 23), seqüência consenso de subgrupo III humano de cadeia pesada (Fig. 1B, SEQ ID N° 24), cadeia leve variável de anticorpo beta7 anti-camundongo de rato (Fib504) (Fig. 1A, SEQ ID N° 10), cadeia pesada variável de anticorpo beta7 anti- camundongo de rato (Fib504) (Fig. 1B, SEQ ID N° 11) e variantes de anticorpos humanizados: domínio de cadeia leve variável de enxerto hu504K humanizado (Fig. 1A, SEQ ID N° 25), cadeia pesada variável de enxerto hu504K humanizado (Fig. 1B, SEQ ID N° 26), hu504.5 variante (variações de aminoácidos de enxerto hu504K humanizado são indicadas na Fig. 1A (cadeia leve) e Fig. 1B (cadeia pesada) para as variantes hu504.5, hu504.16 e hu504.32. Substituições de aminoácidos adicionais em HVR-H1 e HVR-H2 do enxerto hu504K que resultaram em anticorpos de ligação de beta7 são indicadas na Fig. 1C.
[080] As Figs. 2A e 2B ilustram a seqüência de comprimento total da cadeia leve de seqüência de subgrupo III consenso humano (Fig. 2A, SEQ ID N° 27) e cadeia pesada (Fig. 2B, SEQ ID N° 28). HVRs encontram-se sublinhadas.
[081] As Figs. 3A e 3B ilustram a seqüência de comprimento total do enxerto 504 humanizado que contém regiões hipervariáveis de Fib504 de ratos (conforme descrito no presente) enxertadas na cadeia leve de seqüência consenso kappa I humano (Fig. 3A, SEQ ID N° 29) e na cadeia pesada de seqüência de consenso de subgrupo III humano (Fig. 3B, SEQ ID N° 30). HVRs encontram-se sublinhadas.
[082] As Figs. 4A e 4B ilustram a seqüência de comprimento total do enxerto 504K humanizado no qual a posição 49 da cadeia leve do enxerto hu504 é substituição Y49K. A cadeia leve de enxerto hu504K é ilustrada por SEQ ID N° 31 e a cadeia pesada de enxerto hu504K é ilustrada por SEQ ID N° 30. HVRs encontram-se sublinhadas.
[083] As Figs. 5A e 5B ilustram a seqüência de comprimento total do enxerto hu504K-RF no qual as posições 71 e 78 da cadeia pesada do enxerto hu504 são substituição A71R e substituição A78F da seqüência de enxerto hu504K. A cadeia leve de enxerto hu504K-RF é ilustrada por SEQ ID N° 31 e a cadeia pesada de enxerto hu504K-RF é ilustrada por SEQ ID N° 32. HVRs encontram-se sublinhadas.
[084] As Figs. 6A e 6B ilustram a seqüência de comprimento total da variante hu504.32 que compreende a cadeia pesada do enxerto hu504K-RF (SEQ ID N° 32) e substituições T31D e Y32L na cadeia leve do enxerto hu504K (SEQ ID N° 33). HVRs encontram-se sublinhadas.
[085] A Fig. 7A-Fig. 7B e a Fig. 8A-Fig. 8B ilustram exemplos de seqüências de estrutura de consenso humano receptoras para uso na prática da presente invenção com identificadores de seqüências conforme segue. ESTRUTURAS CONSENSO LEVE VARIÁVEL (VL) (FIG. 7A, B) - Estrutura consenso de subgrupo I capa VL humano (SEQ ID N° 14) - Estrutura consenso de subgrupo I capa VL humano menos HVR- L2 estendida (SEQ ID N° 15) - Estrutura consenso de subgrupo II capa VL humano (SEQ ID N° 16) - Estrutura consenso de subgrupo III capa VL humano (SEQ ID N° 17) - Estrutura consenso de subgrupo IV capa VL humano (SEQ ID N° 18)
[086] As regiões sombreadas representam HVRs de cadeia leve (indicadas como L1, L2 e L3). ESTRUTURAS CONSENSO PESADO VARIÁVEL (VH) (FIG. 8A, B) - Estrutura consenso de subgrupo I VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 19) - Estrutura consenso de subgrupo I VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 20 a 22) - Estrutura consenso de subgrupo II VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 48) - Estrutura consenso de subgrupo II VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 49 a 51) - Estrutura consenso de subgrupo III VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 52) - Estrutura consenso de subgrupo III VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 53 a 55) - Estrutura receptora de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 56) - Estrutura receptora de VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 57 a 58) - Estrutura 2 receptora de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 59) - Estrutura 2 receptora de VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 60 a 62)
[087] As Figs. 9A e 9B ilustram seqüência de aminoácidos das cadeias variáveis de anticorpo integrina beta7 Fib504 anti-camundongo de rato produzida pelo ATCC HB-293 de hibridoma. HVRs são sublinhadas. Cadeia leve variável é ilustrada na Fig. 9A (SEQ ID N° 12) e cadeia pesada variável é ilustrada na Fig. 9B (SEQ ID N° 13).
[088] A Fig. 10A ilustra posições de aminoácidos na cadeia pesada de várias seqüências consenso (subgrupos hu I-III). A seqüência consenso utilizada para o desenvolvimento do anticorpo anti-HER2 Herceptin®, Fib504 de rato e estruturas hu504-RL e hu504-RF são descritas nos Exemplos do presente. A Fig. 10B é gráfico de barras que exibe a ligação relativa de alfa4beta7 a anticorpo de enxerto hu504 e anticorpo de enxerto de hu504K em função de modificações de estrutura “RL” ou “RF”, conforme descrito no Exemplo 1.
[089] Fig. 11A -11C. A Fig. 11A tabula as alterações de HVR resultantes de amadurecimento por afinidade realizado por meio de oferta de série limitada de substituições de aminoácidos na variante hu504.16. Os resultados são de bibliotecas com HVRs modificadas individualmente na variante hu504.16, conforme descrito no Exemplo 2 do presente. As abreviações de aminoácidos em caixas são aminoácidos encontrados mais freqüentemente nos anticorpos de ligação de beta7 (anticorpos selecionados por fagos). As Figs. 11B e 11C são gráficos de barra dos resultados na Fig. 11A que indicam o número e o tipo de substituições de aminoácidos na variante hu504.16 (cadeia leve, Fig. 11B); cadeia pesada, Fig. 11C) detectáveis por meio dos métodos de seleção e mutagênese do Exemplo 2.
[090] A Fig. 12 tabula os resultados de amadurecimento por afinidade realizado por meio do oferecimento de ampla faixa de possíveis substituições de aminoácidos nas HVRs de variante hu504.32 conforme descrito no Exemplo 2. As caixas sombreadas indicam o aminoácido que foi detectado mais freqüentemente em anticorpos detectados como anticorpos de ligação de beta7 por meio dos métodos de seleção e mutagênese do Exemplo 2.
[091] As Figs. 13A e 13B ilustram seqüências de HVR de Fib504 anti-camundongo de rato (ATCC-293) e o consenso humano (colunas da esquerda). Exemplos de substituições de aminoácidos observadas para cada posição de HVR (sem destinar a limitar-se) pelos testes descritos nos Exemplos (substituições de aminoácidos observadas por meio de aleatorização de aminoácidos frágeis, varredura de substituições de aminoácidos amplos e varredura de substituições de aminoácidos limitados) são exibidos à direita (método útil de modificação de HVRs para humanização, aplicável a variantes de acordo com a presente invenção, é encontrado no Pedido Norte-Americano com Número de Série 60/545.840, depositado em 19 de fevereiro de 2004).
[092] A Fig. 14 é um exemplo de representação gráfica de Fib504 e ligação de anticorpo variante a MAdCAM em função de concentração de anticorpo conforme descrito no Exemplo 3. Foram determinados os valores IC50 e IC90 para os anticorpos.
[093] As Figs. 15A e 15B ilustram as seqüências de aminoácidos de HVR de cadeia leve e pesada para o anticorpo anti-beta7 504.32R com relação à posição de acordo com o sistema de numeração de Kabat e sistema de numeração relativa (A-F) para as seis HVRs do anticorpo. Também são ilustrados os aminoácidos nas posições 71, 73 e 78 da região FR3 de cadeia pesada. Substituições de aminoácidos úteis também são relacionadas para muitas das posições nas HVRs ou na região FR3 de cadeia pesada.
[094] A Fig. 16 exibe gráficos de barras da capacidade relativa dos anticorpos 504.32M e 504.32R de bloquear o abrigo de células T radiomarcadas para o cólon de camundongos que experimentam doenças intestinais inflamatórias.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[095] A presente invenção fornece métodos, composições, kits e artigos industrializados para identificação e/ou uso de inibidores do processo de sinalização beta7.
[096] Detalhes destes métodos, composições, kits e artigos industrializados são fornecidos no presente.
MÉTODOS GERAIS
[097] A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que se encontram dentro do conhecimento da técnica. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (Sambrook et al, 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed., 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, e atualizações periódicas); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al, ed., 1994); A Practical Guide to Molecular Cloning (Perbal Bernard V., 1988); Phage Display: A Laboratory Manual (Barbas et al, 2001).
DEFINIÇÕES
[098] Por “subunidade beta7” ou “subunidade β7”, indica-se a subunidade β7 integrina humana (Erle et al (1991), J. Biol. Chem. 266: 11009- 11016). A subunidade beta7 associa-se à subunidade de integrina alfa 4, tal como a subunidade a4 humana (Kilger e Holzmann (1995), J. Mol. Biol. 73: 347-354). A integrina alfa4beta7 é expressa sobre uma série de linfócitos maduros, bem como pequena população de timócitos, células da medula óssea e células mastro. (Kilshaw e Murant (1991), Eur. J. Immunol. 21: 2591-2597; Gurish et al (1992), 149: 1964-1972; e Shaw, S. K. e Brenner, M. B. (1995), Semin. Immunol. 7: 335). A subunidade beta7 também se associa à subunidade alfaE, tal como a subunidade de integrina alfaE humana (Cepek, K. L. et al (1993), J. Immunol. 150: 3459). A integrina alfaEbeta7é expressa sobre linfócitos epiteliais intra-intestinais (iIELs) (Cepek, K. L. (1993), acima). A subunidade beta7 que se liga ao anticorpo anti-beta7 humanizado de acordo com a presente invenção pode ser de ocorrência natural e pode ser solúvel ou localizada para a superfície de célula.
[099] Por “subunidade alfaE” ou “subunidade de integrina alfaE” ou “subunidade aE” ou "subunidade aE integrina”, ou “CD103”, indica-se subunidade de integrina considerada associada a integrina beta7 sobre linfócitos intraepiteliais, em que essa integrina alfaEbeta7 media a ligação dos iELs ao epitélio intestinal que expressa E-caderina (Cepek, K. L. et al (1993), J. Immunol. 150: 3459; Shaw, S. K. e Brenner, M. B. (1995), Semin. Immunol. 7: 335).
[0100] “MAdCAM” ou “MAdCAM-1” são utilizados de forma intercambiável no contexto da presente invenção e designam a molécula de adesão a células de adressina da mucosa de proteína 1, que é polipeptídeo de cadeia isolada que compreende curta cauda citoplasmática, região transmembrana e seqüência extracelular composta de três domínios similares a imunoglobulina. Os cDNAs para MAdCAM-1 murino, humano e de macaco foram clonados (Briskin et al (1993), Nature, 363: 461-464; Shyjan et al (1996), J. Immunol. 156: 2851-2857).
[0101] “VCAM-1” ou “molécula de adesão a células vasculares 1”, “CD106”, designa um ligante de alfa4beta7 e alfa4beta1, expresso sobre endotélio ativado e importante em interações entre endotélios e leucócitos, tais como ligação e transmigração de leucócitos durante inflamações.
[0102] “E-caderina” indica membro da família de caderinas, em que E-caderina é expressa em células epiteliais. E-caderina é ligante da integrina alfaEbeta7 e media a ligação de alfaEbeta7 expressa por iEL a epitélio intestinal, embora sua função em abrigo de linfócitos seja incerta. A expressão de E-caderina é aumentada por TGF-beta1.
[0103] “Fibronectina” designa Fibronectina que é envolvida em reparo de tecidos, embriogênese, coágulos sangüíneos e migração/adesão celular. Ela serve de ligante na ECM (matriz extracelular) e como dímero encontrado no plasma (fibronectina plasmática). A forma plasmática é sintetizada por hepatócitos, enquanto a forma ECM é elaborada por fibroblastas, condrócitos, células endoteliais, macrófagos, bem como certas células epiteliais. Neste contexto, ela interage com a integrina alfa4beta7 para mediar aspectos de adesão ou abrigo de linfócitos. A forma de ECM de fibronectina serve de molécula de adesão celular geral por meio de ancoramento de células a substratos de colágeno ou proteoglicano. Fibronectina pode também servir para organizar a interação celular com a ECM por meio de ligação a diferentes componentes da matriz extracelular e a receptores de fibronectina ligados por membranas sobre superfícies celulares. Por fim, a fibronectina é importante em eventos de migração celular durante a embriogênese.
[0104] “Disfunções inflamatórias gastrointestinais” são grupo de disfunções crônicas que causam inflamação e/ou ulceração na membrana mucosa. Estas disfunções incluem, por exemplo, doença intestinal inflamatória (tal como mal de Crohn, colite ulcerativa, colite indeterminada e colite infecciosa), mucosite (tal como mucosite oral, mucosite gastrointestinal, mucosite nasal e proctite), enterocolite necrotizante e esofagite.
[0105] “Doença Intestinal Inflamatória” ou “IBD” é utilizada de forma intercambiável no presente para designar doenças do intestino que causam inflamação e/ou ulceração e inclui, sem limitação, mal de Crohn e colite ulcerativa.
[0106] “Mal de Crohn (CD)” ou “colite ulcerativa (UC)” são doenças intestinais inflamatórias crônicas de etiologia desconhecida. Mal de Crohn, ao contrário de colite ulcerativa, pode afetar qualquer parte do intestino. A característica mais proeminente do mal de Crohn é o espessamento edematoso púrpura avermelhado granular da parede do intestino. Com o desenvolvimento de inflamações, estes granulomas freqüentemente perdem as suas fronteiras circunscritas e integram-se ao tecido circunvizinho. Diarréia e obstrução do intestino são as características clínicas predominantes. Como ocorre com colite ulcerativa, o curso do mal de Crohn pode ser contínuo ou reincidente, suave ou severo, mas, ao contrário de colite ulcerativa, o mal de Crohn não é curável por meio de ressecção do segmento de intestino envolvido. A maior parte dos pacientes com mal de Crohn necessita de cirurgia em algum momento, mas reincidência subseqüente é comum e o tratamento médico contínuo é habitual.
[0107] Mal de Crohn pode envolver qualquer parte do trato alimentar da boca até o ânus, embora apareça tipicamente nas regiões ileocólicas, do intestino delgado ou colônicas-anorretais. Histopatologicamente, a doença manifesta-se por meio de granulomatomas descontínuos, abscessos dos folículos, fissuras e úlceras aftosas. O infiltrado inflamatório é misturado e consiste em linfócitos (tanto células T quanto B), células do plasma, macrófagos e neutrófilos. Existe aumento desproporcional de células do plasma que secretam IgM e IgG, macrófagos e neutrófilos.
[0108] Drogas antiinflamatórias sulfassalazina e ácido 5- aminossalissílico (5-ASA) são úteis para o tratamento de mal de Crohn colônico suavemente ativo e são comumente receitadas para manter a remissão da doença. Metroidazol e ciprofloxacina possuem eficácia similar a sulfassalazina e aparentemente são particularmente úteis para o tratamento de doenças perianais. Em casos mais severos, corticoesteróides são eficazes no tratamento de exacerbações ativas e podem até manter a remissão. Azatioprina e 6-mercaptopurina também exibiram sucesso em pacientes que necessitam da administração crônica de corticoesteróides. Também é possível que estas drogas possam desempenhar papel na profilaxia a longo prazo. Infelizmente, pode haver atraso muito longo (até seis meses) antes do início da ação em alguns pacientes.
[0109] Drogas antidiarreicas podem também fornecer alívio dos sintomas em alguns pacientes. Terapia nutricional ou dieta elementar pode melhorar a situação nutricional de pacientes e induzir a melhora sintomática de doença aguda, mas não inclui remissões clínicas sustentadas. Antibióticos são utilizados no tratamento de crescimento excessivo bacteriano do intestino delgado secundário e no tratamento de complicações piogênicas.
[0110] “Colite ulcerativa (UC)” aflige o intestino grosso. O curso da doença pode ser contínuo ou reincidente, suave ou severo. A primeira lesão é infiltração inflamatória com formação de abscessos na base dos folículos de Lieberkühn. A coalescência desses folículos distendidos e rompidos tende a separar a mucosa sobreposta do seu fornecimento de sangue, gerando ulceração. Os sintomas da doença incluem constrições, dor abdominal inferior, sangramento retal e descargas soltas freqüentes que consistem principalmente de sangue, pus e muco com escassas partículas fecais. Colectomia total pode ser necessária para colite ulcerativa aguda, severa ou crônica, sem remissões.
[0111] As características clínicas de UC são altamente variáveis e a instalação pode ser insidiosa ou abrupta, e pode incluir diarréia, tenesmo e sangramento retal recorrente. Com envolvimento fulminante de todo o cólon, pode ocorrer megacólon tóxico, emergência mortal. Manifestações extraintestinais incluem artrite, pioderma grangrenoso, uveíte e eritema nodoso.
[0112] O tratamento de UC inclui sulfassalazina e drogas que contêm salicilato relacionadas para casos suaves e drogas corticoesteróides em casos severos. Administração local de salicilatos ou corticoesteróides às vezes é eficaz, particularmente quando a doença está limitada ao intestino distante, e é associada à redução de efeitos colaterais em comparação com uso sistêmico. Medidas de suporte, tais como a administração de ferro e agentes antidiarréicos, às vezes são indicadas. Azatioprina, 6-mercaptopurina e metotrexato às vezes são indicados para uso em casos dependentes de corticoesteróide refratários.
[0113] “Modificação” de posição/resíduo de aminoácido, da forma utilizada no presente, indica alteração de seqüência de aminoácidos primária em comparação com seqüência de aminoácidos inicial, em que a alteração resulta de alteração de seqüências que envolve as mencionadas posições/resíduo de aminoácidos. Modificações típicas incluem, por exemplo, substituição do resíduo (ou na mencionada posição) com outro aminoácido (tal como substituição conservadora ou não conservadora), inserção de um ou mais (geralmente menos de cinco ou três) aminoácidos ao lado do mencionado resíduo/posição e exclusão do mencionado resíduo/posição. “Substituição de aminoácido” ou sua variação indica a substituição de resíduo de aminoácido existente em seqüência de aminoácidos previamente determinada (inicial) com resíduo de aminoácido diferente. Geral e preferencialmente, a modificação resulta na alteração em pelo menos uma atividade físico-bioquímica do polipeptídeo variante em comparação com polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácidos inicial (ou “do tipo selvagem”). No caso de anticorpo, por exemplo, atividade físico-bioquímica que é alterada pode ser afinidade de ligação, capacidade de ligação e/ou efeito de ligação sobre molécula alvo.
[0114] O termo “aminoácido”, dentro do escopo da presente invenção, é utilizado no seu sentido mais amplo e destina-se a incluir os L a- aminoácidos ou resíduos de ocorrência natural. As abreviações de uma e três letras comumente utilizadas para aminoácidos de ocorrência natural são utilizadas no presente (Lehninger, A. L., Biochemistry, segunda edição, págs. 71 a 92 (Worth Publishers, Nova Iorque, Nova Iorque, 1975). O termo inclui D- aminoácidos, bem como aminoácidos quimicamente modificados, tais como análogos de aminoácidos, aminoácidos de ocorrência natural que não são normalmente incorporados a proteínas tais como norleucina e compostos quimicamente sintetizados que possuem propriedades conhecidas na técnica como sendo características de aminoácido. Análogos ou miméticos de fenilalanina ou prolina, que permitem a mesma restrição conformacional dos compostos de peptídeos de Phe ou Pro natural, são incluídos na definição de aminoácido. Esses análogos e miméticos são indicados no presente como “equivalentes funcionais” de aminoácido. Outros exemplos de aminoácidos são relacionados por Roberts e Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Gross e Meiehofer, Eds., Vol. 5, pág. 341 (Academic Press, Inc., Nova Iorque NY, 1983), que é incorporado ao presente como referência. Quando uma única letra for utilizada para designar um dos aminoácidos de ocorrência natural, as designações são conforme comumente encontradas na literatura relevante (vide, por exemplo, Alberts, B. et al, Molecular Biology of the Cell, terceira edição, Garland Publishing, Inc. 1994, pág. 57).
[0115] Anticorpo “isolado” é aquele que tenha sido identificado, separado e/ou recuperado a partir de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que interfeririam com utilizações em diagnóstico ou terapêuticas para o anticorpo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) até mais de 95% em peso de anticorpo, conforme determinado por meio do método de Lowry, e, de maior preferência, mais de 99% em peso; (2) até grau suficiente para a obtenção de pelo menos quinze resíduos de seqüência de aminoácidos interna ou N-terminal, utilizando seqüenciador de xícara de centrifugação; ou (3) até a homogeneidade, por meio de SDS-PAGE, sob condições redutoras ou não redutoras, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, manchas de prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, entretanto, o anticorpo isolado será preparado por meio de pelo menos uma etapa de purificação.
[0116] A expressão “numeração de resíduos de domínio variável como em Kabat” ou “numeração de posição de aminoácidos como em Kabat” e suas variações designa o sistema de numeração utilizado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da compilação de anticorpos em Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991). Utilizando este sistema de numeração, a seqüência de aminoácidos linear real pode conter menos aminoácidos ou adicionais correspondentes à redução ou inserção em FR ou CDR do domínio variável. Domínio variável de cadeia pesada pode incluir, por exemplo, um único inserto de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de H2 e resíduos inseridos (tais como resíduos 82a, 82b e 82c etc. de acordo com Kabat) após o resíduo de FR de cadeia pesada 82. A numeração de resíduos de Kabat pode ser determinada para um dado anticorpo por meio de alinhamento em regiões de homologia da seqüência do anticorpo com seqüência numerada de Kabat “padrão”.
[0117] A expressão “substancialmente similar" ou "substancialmente idêntico", da forma utilizada no presente, indica grau suficientemente alto de similaridade entre dois valores numéricos (geralmente um associado a um anticorpo de acordo com a presente invenção e o outro associado a anticorpo de referência/comparativo), de tal forma que os técnicos no assunto considerariam a diferença entre os dois valores como sendo de pouco ou nenhum significado biológico e/ou estatístico dentro do contexto da característica biológica medida pelos mencionados valores (tais como valores Kd). A diferença entre os mencionados dois valores é preferencialmente de menos de cerca de 50%, preferencialmente menos de cerca de 40%, preferencialmente menos de cerca de 30%, preferencialmente menos de cerca de 20%, preferencialmente menos de cerca de 10% em função do valor para o anticorpo comparativo/de referência.
[0118] “Afinidade de ligação” geralmente designa a resistência da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de molécula (tal como anticorpo) e seu parceiro de ligação (tal como antígeno). A menos que indicado em contrário, da forma utilizada no presente, “afinidade de ligação” designa afinidade de ligação intrínseca que reflete interação 1:1 entre membros de par de ligação (tais como anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X pelo seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por meio de métodos comuns na técnica, que incluem os descritos no presente. Anticorpos de baixa afinidade geralmente ligam um antígeno lentamente e tendem a dissociar-se rapidamente, enquanto anticorpos de alta afinidade ligam um antígeno mais rapidamente e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Uma série de métodos de medição da afinidade de ligação é conhecida na técnica, qualquer dos quais pode ser utilizado para os propósitos da presente invenção. Realizaçõs ilustrativas específicas são descritas a seguir.
[0119] Em uma realização, “Kd” ou “valor Kd” de acordo com a presente invenção é medido por meio de teste de ligação de antígenos radiomarcados (RIA) realizado com a versão Fab de anticorpo de interesse e o seu antígeno conforme descrito por meio do teste a seguir, que mede a afinidade de ligação de solução de Fabs para antígeno por meio de equilíbrio de Fab com concentração mínima de antígeno marcado com 125I na presença de série de titulação de antígeno não marcado e captura em seguida de antígeno ligado com placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881). Para estabelecer condições para o teste, placas de microtítulos (Dynex) são revestidas por uma noite com 5 μg/ml de anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e bloqueadas em seguida com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em placa não adsorvente (Nunc n° 269620), 100 pM ou 26 pM de [125I]-antígeno são misturados com diluições em série de Fab de interesse (tal como consistente com a determinação de anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al (1997), Cancer Res. 57: 4593-4599). O Fab de interesse é incubado por uma noite em seguida; entretanto, a incubação pode prosseguir por período mais longo (tal como 65 horas) para garantir que o equilíbrio é atingido. Em seguida, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (tal como por uma hora). A solução é removida em seguida e a placa é lavada por oito vezes com 0,1% Tween 20 em PBS. Após a secagem das placas, adiciona-se 150 μl/cavidade de cintilante (MicroScint-20; Packard) e as placas são contadas em contador gama Topcount (Packard) por dez minutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de ligação máxima são selecionadas para uso em testes de ligação competitiva. De acordo com outra realização, o Kd ou valor Kd é medido utilizando testes de ressonância plasmática de superfície utilizando BIAcore® 2000 ou BIAcore® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas de antígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N- hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml (cerca de 0,2 μM) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μl/minuto para atingir cerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sob velocidade de fluxo de cerca de 25 μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas utilizando modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea do sensograma de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881. Caso a taxa de associação exceda 106 M-1 S-1 por meio do teste de ressonância plasmática de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada utilizando método de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 °C de 20 nM de anticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, tal como espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou espectrofotômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com cubeta vermelha de agitação.
[0120] “Taxa de associação”, “taxa ligado” ou “kon” de acordo com a presente invenção pode também ser determinada com o mesmo método de ressonância plasmática de superfície descrito acima utilizando BIAcore® 2000 ou BIAcore® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas de antígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N’-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml (cerca de 0,2 μM) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μl/minuto para atingir cerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Em seguida, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sob velocidade de fluxo de cerca de 25 μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas utilizando modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea do sensograma de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881. Caso a taxa de associação exceda 106 M-1 S-1 por meio do teste de ressonância plasmática de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada utilizando método de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 °C de 20 nM de anticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, tal como espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou espectrofotômetro SLM-Aminco série 800 (ThermoSpectronic) com cubeta agitada. Em uma realização, “Kd” ou “valor Kd” de acordo com a presente invenção é medido em uma realização por meio de teste de ligação de antígenos radiomarcados (RIA) realizado com a versão Fab de anticorpo e molécula de antígeno, conforme descrito por meio do teste a seguir, que mede a afinidade de ligação de solução de Fabs para antígeno por meio de equilíbrio de Fab com concentração mínima de antígeno marcado com 125I na presença de série de titulação de antígeno não marcado e captura em seguida de antígeno ligado com placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881). Para estabelecer condições para o teste, placas de microtítulos (Dynex) são revestidas por uma noite com 5 μg/ml de anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6) e bloqueadas em seguida com albumina de soro bovino a 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (cerca de 23 °C). Em placa não adsorvente (Nunc n° 269620), 100 pM ou 26 pM de [125I]-antígeno são misturados com diluições em série de Fab de interesse (consistente com a determinação de anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al (1997), Cancer Res. 57: 4593-4599). O Fab de interesse é incubado em seguida por uma noite; entretanto, a incubação pode prosseguir por período mais longo (tal como 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja atingido. Em seguida, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente por uma hora. A solução é removida em seguida e a placa é lavada por oito vezes com 0,1% Tween 20 em PBS. Após a secagem das placas, adiciona-se 150 μl/cavidade de cintilante (MicroScint-20; Packard) e as placas são contadas em contador gama Topcount (Packard) por dez minutos. Concentrações de cada Fab que geram 20% ou menos de ligação máxima são selecionadas para uso em testes de ligação competitiva. De acordo com outra realização, o Kd ou valor Kd é medido utilizando testes de ressonância plasmática de superfície utilizando BIAcore® 2000 ou BIAcore® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas de antígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N- hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml (cerca de 0,2 μM) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μl/minuto para atingir cerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sob velocidade de fluxo de cerca de 25 μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas utilizando modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea do sensograma de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) é calculada como razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881. Caso a taxa de associação exceda 106 M-1 S-1 por meio do teste de ressonância plasmática de superfície acima, a taxa de associação pode ser determinada em seguida utilizando método de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 °C de 20 nM de anticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, tal como espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou espectrofotômetro SLM-Aminco série 800 (ThermoSpectronic) com cubeta vermelha de agitação.
[0121] Em uma realização, “taxa de associação”, “taxa ligado” ou “kon” de acordo com a presente invenção é determinada com o mesmo método de ressonância plasmática de superfície descrito acima utilizando BIAcore® 2000 ou BIAcore® 3000 (BIAcore, Inc., Piscataway NJ) a 25 °C com lascas de antígeno CM5 imobilizado a cerca de dez unidades de resposta (RU). Resumidamente, lascas de biossensores de dextran carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) são ativadas com cloridrato de N-etil-N’-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. Antígeno é diluído com 10 mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 μg/ml (cerca de 0,2 μM) antes da injeção em velocidade de fluxo de 5 μl/minuto para atingir cerca de dez unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, 1 M de etanolamina é injetado para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições seriais em duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) a 25 °C sob velocidade de fluxo de cerca de 25 μl/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas utilizando modelo de ligação Langmuir um a um simples (Software de Avaliação BIAcore versão 3.2) por meio de configuração simultânea do sensograma de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (Kd) foi calculada como razão koff/kon. Vide, por exemplo, Chen, Y. et al (1999), J. Mol. Biol. 293: 865-881. Caso a taxa de associação exceda 106 M-1 S-1 por meio do teste de ressonância plasmática de superfície acima, a taxa de associação é preferencialmente determinada utilizando método de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou a redução da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passagem de faixa de 16 nm) a 25 °C de 20 nM de anticorpo anti-antígeno (forma de Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em espectrômetro, tal como espectrômetro equipado com fluxo de parada (Aviv Instruments) ou espectrofotômetro SLM-Aminco série 800 (ThermoSpectronic) com cubeta agitada.
[0122] A expressão “substancialmente reduzido” ou “substancialmente diferente”, da forma utilizada no presente, indica grau suficientemente alto de diferença entre dois valores numéricos (geralmente um associado a um anticorpo de acordo com a presente invenção e o outro associado ao seu anticorpo comparativo/de referência), de tal forma que os técnicos no assunto considerariam a diferença entre os dois valores como sendo de significação estatística dentro do contexto da característica biológica medida pelos mencionados valores (tais como valores Kd e reação HAMA). A diferença entre os mencionados dois valores é preferencialmente de mais de cerca de 10%, preferencialmente mais de cerca de 20%, preferencialmente mais de cerca de 30%, preferencialmente mais de cerca de 40%, preferencialmente mais de cerca de 50% em função do valor para o anticorpo comparativo/de referência.
[0123] “Percentual (%) de identidade de seqüência de aminoácidos”, com relação à seqüência de peptídeos ou polipeptídeos, é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos em possível seqüência que são idênticos aos resíduos de aminoácidos na seqüência de peptídeo ou polipeptídeo específica, após o alinhamento das seqüências e introdução de intervalos, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de seqüências, sem considerar nenhuma substituição conservadora como parte da identidade de seqüências. O alinhamento para propósitos de determinação do percentual de identidade de seqüências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento da técnica, utilizando, por exemplo, software de computador disponível ao público, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das seqüências sendo comparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, valores de percentual de identidade de seqüência de aminoácidos são gerados utilizando o programa de computador de comparação de seqüências ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela A abaixo. O programa de computador de comparação de seqüências ALIGN-2 foi elaborado pela Genentech, Inc. e o código fonte exibido na Tabela A abaixo foi depositado com documentação de usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 é disponível ao público por meio da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte fornecido na Figura 8 abaixo. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para uso em sistema operativo UNIX, preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de seqüências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[0124] Em situações em que ALIGN-2 é empregado para comparações de seqüências de aminoácidos, o percentual de identidade de seqüências de aminoácidos de uma dada seqüência de aminoácidos A para, com ou contra uma dada seqüência de aminoácidos B (que pode ser alternativamente expressa como dada seqüência de aminoácidos A que possui ou compreende certo percentual de identidade de seqüências de aminoácidos para, com ou contra uma dada seqüência de aminoácidos B) é calculado conforme segue: 100 vezes a fração X/Y em que X é a quantidade de resíduos de aminoácidos avaliados como coincidências idênticas pelo programa de alinhamento de seqüências ALIGN-2 no alinhamento de A e B naquele programa e em que Y é a quantidade total de resíduos de aminoácidos em B. Apreciar-se-á que, quando o comprimento da seqüência de aminoácidos A não for igual ao comprimento da seqüência de aminoácidos B, o percentual de identidade de seqüências de aminoácidos de A para B não será igual ao percentual de identidade de seqüências de aminoácidos de B para A.
[0125] A menos que especificado especificamente em contrário, todos os valores percentuais de identidade de seqüências de aminoácidos utilizados no presente são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior, utilizando o programa de computador ALIGN-2.
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[0126] O termo “vetor”, da forma utilizada no presente, destina-se a designar uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual tenha se ligado. Um tipo de vetor é “plasmídeo”, que designa circuito de DNA de fita dupla circular no qual podem ser ligados segmentos de DNA adicionais. Outro tipo de vetor é vetor de fago. Outro tipo de vetor é vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de reprodução autônoma em célula hospedeira na qual são introduzidos (vetores bacterianos, por exemplo, que possuem origem bacteriana de reprodução e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores (tais como vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados ao genoma de célula hospedeira mediante introdução na célula hospedeira e, portanto, são reproduzidos junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais são ligados operativamente. Esses vetores são denominados no presente “vetores de expressão recombinante” (ou simplesmente “vetores recombinantes”). De forma geral, os vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinantes encontram-se freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório descritivo, “plasmídeo” e “vetor” podem ser utilizados de forma intercambiável, pois o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada.
[0127] “Polinucleotídeo” ou “ácido nucléico”, utilizados de forma intercambiável no presente, designam polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos ou bases modificadas e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado a um polímero por DNA ou RNA polimerase, ou por reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Caso presente, modificação da estrutura de nucleotídeos pode ser proporcionada antes ou depois da montagem do polímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não de nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após a síntese, tal como por meio de conjugação com uma marca. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, “tampas”, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações de internucleotídeos tais como aquelas com ligações não carregadas (por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos etc.) e com ligações carregadas (tais como fosforotioatos, fosforoditioatos etc.), as que contêm porções pendentes, tais como proteínas (por exemplo, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos de sinal, pli-L-lisina etc.), aquelas com intercaladores (tais como acridina, psoralen etc.), as que contêm quelantes (tais como metais, metais radioativos, boro, metais oxidantes etc.), as que contêm alquilantes, as com ligações modificadas (tais como ácidos nucléicos alfa anoméricos etc.), bem como formas não modificadas do(s) polinucleotídeo(s). Além disso, qualquer dos grupos hidroxila normalmente presentes nos açúcares pode ser substituído, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos protetores padrão ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleotídeos adicionais, ou pode ser conjugado a suportes sólidos ou semi-sólidos. O OH 5’ e 3’ terminal pode ser fosforilado ou substituído com aminas ou porções de grupo de tampa orgânica de um a vinte átomos de carbono. Outros hidroxilas podem também ser derivados em grupos protetores padrão. Polinucleotídeos podem também conter formas análogas de açúcares de ribose ou desoxirribose que são conhecidos de forma geral na técnica, incluindo, por exemplo, 2’-O-metil, 2’-O- alil, 2’-fluoro ou 2’-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares alfa- anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares de piranose, açúcares de furanose, sedoheptuloses, análogos acíclicos e análogos de nucleotídeos abásicos tais como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações de fosfodiéster podem ser substituídas por grupos ligantes alternativos. Estes grupos ligantes alternativos incluem, mas sem limitar-se a realizações em que fosfato é substituído por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR.sub.2 (“amidato”), P(O)R, P(O)OR’, CO ou CH.sub.2 (“formacetal"), em que cada R ou R’ é independentemente H ou alquila substituído ou não substituído (1 a 20 °C), que contém opcionalmente uma ligação éter (-O-), arila, alquenila, cicloalquila, cicloalquenila ou araldila. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo necessitam ser idênticas. A descrição acima aplica-se a todos os polinucleotídeos indicados no presente, incluindo RNA e DNA.
[0128] “Oligonucleotídeo”, da forma utilizada no presente, designa de forma geral, polinucleotídeos curtos, geralmente de fita simples, geralmente sintéticos, que possuem geralmente, mas não necessariamente, menos de cerca de duzentos nucleotídeos de comprimento. Os termos “oligonucleotídeo” e “polinucleotídeo” não são mutuamente exclusivos. A descrição de polinucleotídeos acima é igual e totalmente aplicável a oligonucleotídeos.
[0129] Os termos “anticorpo” e “imunoglobulina” são utilizados de forma intercambiável no sentido mais amplo e incluem anticorpos monoclonais (tais como anticorpos monoclonais intactos ou de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos monovalentes, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (tais como anticorpos biespecíficos, desde que exibam a atividade biológica desejada) e podem também incluir certos fragmentos de anticorpos (conforme descrito com mais detalhes no presente). Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou amadurecido por afinidade.
[0130] “Fragmentos de anticorpos” compreendem somente uma parte de anticorpo intacto, em que a parte preferencialmente retém pelo menos uma, preferencialmente a maior parte ou todas as funções normalmente associadas àquela parte quando presente em anticorpo intacto. Em uma realização, fragmento de anticorpo compreende sítio de ligação de antígenos do anticorpo intacto e, desta forma, retém a capacidade de ligação de antígeno. Em outra realização, fragmento de anticorpo, tal como o que compreende a região Fc, retém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas à região Fc quando presente em anticorpo intacto, tal como ligação de FcRn, modulação da meia vida de anticorpos, função de ADCC e ligação de complemento. Em uma realização, fragmento de anticorpo é anticorpo monovalente que possui meia vida in vivo substancialmente similar a anticorpo intacto. Esse fragmento de anticorpo pode compreender, por exemplo, braço de ligação de antígenos ligado a seqüência de Fc capaz de conferir estabilidade in vivo ao fragmento.
[0131] A expressão “anticorpo monoclonal”, da forma utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos para um único antígeno. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é dirigido a um único determinante sobre o antígeno.
[0132] Os anticorpos monoclonais do presente incluem especificamente anticorpos “quiméricos”, nos quais uma parte da cadeia leve e/ou pesada é idêntica ou homóloga a seqüências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencentes a uma classe ou subclasse específica de anticorpos, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico ou homólogo a seqüências correspondentes de anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos desses anticorpos, desde que exibam a atividade biológica desejada (Patente Norte-Americana n° 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 81: 6851-6855 (1984)).
[0133] As formas “humanizadas” de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de região hipervariável do paciente são substituídos por resíduos de região hipervariável de espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os circuitos hipervariáveis correspondem aos de imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, vide Jones et al, Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332: 323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). Vide também os artigos de análise a seguir e as referências neles mencionadas: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23: 10351038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5: 428-433 (1994).
[0134] “Antígeno” é antígeno previamente determinado ao qual pode ligar-se seletivamente um anticorpo. O antígeno alvo pode ser polipeptídeo, carboidrato, ácido nucléico, lipídio, hapteno ou outro composto sintético ou de ocorrência natural. Preferencialmente, o antígeno alvo é um polipeptídeo. “Estrutura humana receptora” para os propósitos do presente é estrutura que compreende a seqüência de aminoácidos de estrutura VL ou VH derivada de estrutura de imunoglobulina humana, ou de estrutura de consenso humano. Estrutura humana receptora “derivada de” estrutura de imunoglobulina humana ou estrutura de consenso humano pode compreender a sua mesma seqüência de aminoácidos ou pode conter alterações de seqüência de aminoácidos previamente existentes. Quando alterações de aminoácidos previamente existentes estiverem presentes, preferencialmente não mais de cinco e preferencialmente quatro ou menos, ou três ou menos alterações de aminoácidos previamente existentes estão presentes. Quando alterações de aminoácidos previamente existentes estiverem presentes em VH, estas alterações encontram-se preferencialmente em apenas três, duas ou uma das posições 71H, 73H e 78H; os resíduos de aminoácidos nestas posições podem ser, por exemplo, 71A, 73T e/ou 78A. Em uma realização, a estrutura humana receptora VL possui seqüência idêntica à seqüência de estrutura de imunoglobulina humana VL ou seqüência de estrutura de consenso humano.
[0135] “Estrutura de consenso humano” é uma estrutura que representa o resíduo de aminoácido de ocorrência mais comum em seleção de seqüências de estrutura VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de seqüências VL ou VH de imunoglobulina humana é de subgrupo de seqüências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de seqüências é subgrupo como em Kabat et al. Em uma realização, para o VL, o subgrupo é subgrupo capa I como em Kabat et al. Em uma realização, para o VH, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat et al.
[0136] “Estrutura de consenso de subgrupo I VL” compreende a seqüência de consenso obtida a partir das seqüências de aminoácidos em subgrupo I capa leve variável de Kabat et al. Em uma realização, a seqüência de aminoácidos de estrutura de consenso de subgrupo I VL compreende pelo menos uma parte ou todas as seqüências a seguir: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID N° 34)-L1-WYQQKPGKAPKLLI (SEQ ID N° 35)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID N° 36)-L3-FGQGTKVEIKR (SEQ ID N° 37).
[0137] “Estrutura de consenso de subgrupo III VH” compreende a seqüência de consenso obtida a partir das seqüências de aminoácidos em subgrupo III pesado variável de Kabat et al. Em uma realização, a seqüência de aminoácidos de estrutura de consenso de subgrupo III VH compreende pelo menos uma parte ou todas as seqüências a seguir: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID N° 38)-H1- WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID N° 39)-H2- RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID N° 40)-H3- WGQGTLVTVSS (SEQ ID N° 41).
[0138] “Estrutura humana não modificada” é estrutura humana que contém a mesma seqüência de aminoácidos da estrutura humana receptora, tal como que não contém substituição(ões) de aminoácido(s) humano para não humano na estrutura humana receptora.
[0139] “Região hipervariável alterada” para os propósitos do presente é região hipervariável que compreende uma ou mais (tal como uma a cerca de dezesseis) substituições de aminoácidos no seu interior.
[0140] “Região hipervariável não modificada” para os propósitos do presente é região hipervariável que contém a mesma seqüência de aminoácidos de anticorpo não humano do qual foi derivada, ou seja, uma que não contenha uma ou mais substituições de aminoácidos no seu interior.
[0141] A expressão “região hipervariável”, “HVR” ou “HV”, da forma utilizada no presente, indica as regiões de domínio variável de anticorpo que são de seqüência hipervariável e/ou de circuitos definidos estruturalmente. Geralmente, os anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis; três em VH (H1, H2 e H3) e três em VL (L1, L2, L3). Uma série de delineações de regiões hipervariáveis encontra-se em uso e é englobada no presente. As Regiões de Determinação de Complementaridade (CDRs) de Kabat baseiam- se na variabilidade de seqüências e são as mais comumente utilizadas (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). Chothia refere-se, por sua vez, ao sítio dos circuitos estruturais (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). As regiões hipervariáveis de AbM representam compromisso entre CDRs de Kabat e circuitos estruturais de Chothia e são utilizadas pelo software de modelagem de anticorpos AbM da Oxford Molecular. As regiões hipervariáveis de “contato” baseiam-se em análise das estruturas de cristais complexas disponíveis. Os resíduos de cada uma destas regiões hipervariáveis são indicados abaixo. TABELA 1
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[0142] As regiões hipervariáveis podem compreender “regiões hipervariáveis estendidas” conforme segue: 24-36 ou 24-34 (L1), 46-56 ou 49- 56 ou 50-56 ou 52-56 (L2) e 89-97 (L3) em VL e 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3) em VH. Os resíduos de domínios variáveis são numerados de acordo com Kabat et al, acima, para cada uma dessas definições.
[0143] Resíduos de “estrutura” ou “FR” são os resíduos de domínios variáveis diferentes dos resíduos de região hipervariável conforme definido no presente.
[0144] “Anticorpo humano” é aquele que possui uma seqüência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por ser humano e/ou foi fabricado utilizando qualquer das técnicas de fabricação de anticorpos humanos descritas no presente. Esta definição de anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígenos não humanos.
[0145] Anticorpo “amadurecido por afinidade” é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais de suas CDRs, o que resulta em aumento da afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com anticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Os anticorpos amadurecidos por afinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos amadurecidos por afinidade são produzidos por meio de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al, Bio/Technology, 10: 779-783 (1992) descrevem amadurecimento por afinidade por meio de troca de domínios VH e VL. A mutagênese aleatória de resíduos de cadeia principal e/ou CDR é descrita por: Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sci, U. S. A. 91: 3809-3813 (1994); Schier et al, Gene 169: 147-155 (1995); Yelton et al, J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995); Jackson et al, J. Immunol. 154 (7): 3310-9 (1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226: 889-896 (1992).
[0146] Anticorpo “bloqueador” ou anticorpo “antagonista” é aquele que inibe ou reduz a atividade biológica do antígeno que liga. Anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancial ou completamente a atividade biológica do antígeno.
[0147] “Anticorpo agonista”, da forma utilizada no presente, é anticorpo que imita pelo menos uma das atividades funcionais de polipeptídeo de interesse.
[0148] “Disfunção” é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com substância/molécula ou método de acordo com a presente invenção. Isso inclui doenças ou disfunções agudas e crônicas que incluem as condições patológicas que predispõem o mamífero à disfunção em questão. Exemplos não limitadores de disfunções a serem tratadas no presente incluem tumores benignos e malignos; não leucemias e malignidades linfóides; disfunções neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicas e outras glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocoélicas; e disfunções inflamatórias, imunológicas e outras relativas à angiogênese.
[0149] A expressão “doença relativa à imunidade” indica doença em que um componente do sistema imunológico de mamífero causa, media ou contribui de outra forma com a morbidez no mamífero. Também são incluídas doenças nas quais o estímulo ou intervenção da reação imunológica possui efeito de melhoria sobre o andamento da doença. São incluídas nesta expressão doenças inflamatórias mediadas por imunidade, doenças inflamatórias não mediadas por imunidade, doenças infecciosas, doenças de imunodeficiência, neoplasia etc.
[0150] Exemplos de doenças inflamatórias e relativas à imunidade, algumas das quais são mediadas por células T ou imunes, que podem ser tratadas de acordo com a presente invenção incluem eritematose do lúpus sistêmico, artrite reumatóide, artrite crônica juvenil, espondiloartropatias, esclerose sistêmica (escleroderma), miopatias inflamatórias idiopáticas (dermatomiosite, polimiosite), síndrome de Sjogren, vasculite sistêmica, sarcoidose, anemia hemolítica autoimune (pancitopenia imune, hemoglobinúria noturna paroxismal), trombocitopenia autoimune (púrpura trombocitopênica idiopática, trombocitopenia mediada por imunidade), tireoidite (mal de Grave, tireoidite de Hashimoto, tireoidite linfocítica juvenil, tireoidite atrófica), diabetes mellitus, doença renal mediada por imunidade (glomerulonefrite, nefrite tubulointersticial), doenças desmielinizantes dos sistemas nervosos central e periférico, tais como esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante idiopática ou síndrome de Guillain-Barré e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, doenças hepatobiliares tais como hepatite infecciosa (hepatite A, B, C, D, E e outros vírus não hepatotrópicos), hepatite ativa crônica autoimune, cirrose biliar primária, hepatite granulomatosa e colangite esclerosante, doença intestinal inflamatória (colite ulcerativa: mal de Crohn), enteropatia sensível a glúten e mal de Whipple, doenças da pele autoimunes ou mediadas por imunidade, incluindo doenças da pele bolhosa, eritema multiforme e dermatite de contato, psoríase, doenças alérgicas tais como asma, rinite alérgica, dermatite atópica, hipersensibilidade alimentar e urticária, doenças imunológicas do pulmão, tais como pneumonias eosinofílicas, fibrose pulmonar idiopática e pneumonite de hipersensibilidade, doenças associadas a transplantes, incluindo rejeição de enxertos e doença de enxerto contra hospedeiro. As doenças infecciosas incluem doenças virais tais como AIDS (infecção por HIV), hepatite A, B, C, D e E, herpes etc., infecções bacterianas, infecções fúngicas, infecções protozoarianas e infecções parasíticas.
[0151] “Disfunção autoimune” ou “doença autoimune”, da forma utilizada de maneira intercambiável no presente, é doença ou disfunção não maligna que surge dos próprios tecidos do indivíduo e é dirigida contra eles. As doenças autoimunes descritas no presente excluem especificamente doenças ou condições malignas ou cancerosas, especialmente excluindo linfoma de células B, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia de células Hairy e leucemia mieloblástica crônica. Exemplos de doenças ou disfunções autoimunes incluem, mas sem limitar-se a reações inflamatórias, tais como doenças inflamatórias da pele, incluindo psoríase e dermatite (tal como dermatite atópica); escleroderma sistêmico e esclerose; reações associadas a doença inflamatória do intestino (tal como mal de Crohn e colite ulcerativa); síndrome de tensão respiratória (incluindo síndrome de tensão respiratória em adultos; ARDS); dermatite; meningite; encefalite; uveíte; colite; glomerulonefrite; condições alérgicas tais como eczema e asma e outras condições que envolvam a infiltração de células T e reações inflamatórias crônicas; arteriosclerose; deficiência de adesão de leucócitos; artrite reumatóide; eritematose do lúpus sistêmico (SLE); diabetes mellitus (tal como diabetes mellitus do tipo I ou diabetes mellitus dependente de insulina); esclerose múltipla; síndrome de Reynaud; tireoidite autoimune; encefalomielite alérgica; síndrome de Sjorgen; diabetes precoce juvenil; e reações imunológicas associadas à hipersensibilidade aguda e tardia mediada por citoquinas e linfócitos T tipicamente encontradas em tuberculose, sarcoidose, polimiosite, granulomatose e vasculite; anemia perniciosa (mal de Addison); doenças que envolvem diapedese de leucócitos; disfunções inflamatórias do sistema nervoso central (CNS); síndrome de lesões de múltiplos órgãos; anemia hemolítica (incluindo, mas sem limitar-se a crioglobinemia ou anemia positiva de Coombs); miastenia grave; doenças mediadas por complexo de anticorpos e antígenos; doença da membrana base anti-glomerular; síndrome antifosfolipídios; neurite alérgica; mal de Graves; síndrome miastênica de Lambert-Eaton; penfigóide bolhosa; pênfigo; poliendocrinopatias autoimunes; mal de Reiter; síndrome de homem rígido; mal de Behcet; artrite de células gigantes; nefrite complexa imune; nefropatia de IgA; polineuropatias de IgM; púrpura trombocitopênica imune (ITP) ou trombocitopenia autoimune etc.
[0152] A expressão “disfunções inflamatórias gastrointestinais” é grupo de disfunções crônicas que causam inflamação e/ou ulceração na membrana mucosa. Desta forma, a expressão inclui doença intestinal inflamatória (tal como mal de Crohn, colite ulcerativa, colite indeterminada e colite infecciosa), mucosite (tal como mucosite oral, mucosite gastrointestinal, mucosite nasal e proctite), enterocolite necrotizante e esofagite.
[0153] As expressões “disfunção proliferativa celular” e “disfunção proliferativa” designam disfunções que são associadas a algum grau de proliferação celular anormal. Em uma realização, a disfunção proliferativa celular é câncer.
[0154] “Tumor”, da forma utilizada no presente, indica toda proliferação e crescimento de células neoplásicas, seja maligna ou benigna, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. As expressões “câncer”, “canceroso”, “disfunção proliferativa celular”, “disfunção proliferativa” e “tumor” não são mutuamente exclusivas conforme indicado no presente.
[0155] Os termos “câncer” e “canceroso” designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pela proliferação/crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitar-se a carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem carcinoma de células escamosas, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão não de células pequenas, adenocarcinoma do pulmão, carcinoma escamoso do pulmão, câncer do peritôneo, câncer hepatocelular, câncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado, câncer da bexiga, hepatoma, câncer de mama, câncer do cólon, câncer colo-retal, carcinoma endométrico ou uterino, carcinoma das glândulas salivares, câncer dos rins, câncer do fígado, câncer da próstata, câncer da vulva, câncer da tireóide, carcinoma hepático e vários tipos de câncer da cabeça e do pescoço.
[0156] A desregulagem de angiogênese pode gerar muitas disfunções que podem ser tratadas por meio de composições e métodos de acordo com a presente invenção. Estas disfunções incluem condições neoplásicas e não neoplásicas. As neoplásicas incluem, mas sem limitar-se às descritas abaixo. As disfunções não neoplásicas incluem, mas sem limitar-se a hipertrofia indesejada ou aberrante, artite, artrite reumatóide (RA), psoríase, placas psoriáticas, sarcoidose, arteriosclerose, placas arterioscleróticas, retinopatias diabéticas e outras proliferativas, incluindo retinopatia de prematuros, fibroplasia retrolenta, glaucoma neovascular, degeneração macular relativa à idade, edema macular diabético, neovascularização da córnea, neovascularização de enxertos da córnea, rejeição de enxertos da córnea, neovascularização da retina/coroidal, neovascularização do ângulo (rubeose), doença neovascular ocular, restenose vascular, más formações arteriovenosas (AVM), meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias da tireóide (incluindo mal de Grave), transplante da córnea e de outros tecidos, inflamações crônicas, inflamações do pulmão, lesões agudas do pulmão/ARDS, sepsia, hipertensão pulmonar primária, efusões pulmonares malignas, edema cerebral (tal como associado a apoplexia aguda/lesões de cabeça fechada/trauma), inflamações sinoviais, formação de queratite vascular em RA, miosite ossificante, formação de ossos hipertrópicos, osteoartrite (OA), ascite refratária, doença de ovários policísticos, endometriose, terceiro espaçamento de doenças de fluidos (pancreatite, síndrome de compartimentos, queimações, doença intestinal), fibróides uterinos, trabalho prematuro, inflamações crônicas tais como IBD (mal de Crohn e colite ulcerativa), rejeição de aloenxertos renais, doença intestinal inflamatória, síndrome nefrótica, crescimento de massa de tecidos aberrante ou indesejada (não de câncer), juntas hemofílicas, cicatrizes hipertróficas, inibição do crescimento capilar, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogênico, fibroplasias retrolentas, escleroderma, tracoma, adesões vasculares, sinovite, dermatite, preeclampsia, ascite, efusão do pericárdio (tal como a associada a pericardite) e efusão plêurica.
[0157] Da forma utilizada no presente, “tratamento” indica intervenção clínica em tentativa de alterar o curso natural do indivíduo ou da célula sendo tratada e pode ser realizado para profilaxia ou durante o transcurso de patologia clínica. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem a prevenção da ocorrência ou reincidência da doença, alívio dos sintomas, redução de quaisquer conseqüências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, redução da velocidade de progresso da doença, melhoria ou redução do estado doentio e remissão ou melhor prognóstico. Em algumas realizações, os anticorpos de acordo com a presente invenção são utilizados para retardar o desenvolvimento de doença ou disfunção.
[0158] “Quantidade eficaz” designa quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado.
[0159] “Quantidade terapeuticamente eficaz” de substância/molécula de acordo com a presente invenção, agonista ou antagonista pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, bem como a capacidade da substância/molécula, agonista ou antagonista de permitir reação desejada no indivíduo. Quantidade terapeuticamente eficaz também é aquela em que qualquer efeito tóxico ou prejudicial da substância/molécula, agonista ou antagonista é superado pelos efeitos terapeuticamente benéficos. “Quantidade profilaticamente eficaz” designa quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, como a dose profilática é utilizada em pacientes antes ou em estado inicial da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor que a quantidade terapeuticamente eficaz.
[0160] A expressão “agente citotóxico”, da forma utilizada no presente, indica substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causa destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos (tais como At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos, tais como metotrexato, adriamicina, vinca alcalóides (vincristina, vinblastina, etoposida), doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorubicina ou outros agentes intercalantes, enzimas e seus fragmentos, tais como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas, tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem animal, vegetal, fúngica ou bacteriana, incluindo seus fragmentos e/ou variantes, e os diversos agentes antitumorosos ou anticancerígenos descritos abaixo. Outros agentes citotóxicos são descritos abaixo. Agente tumoricida causa a destruição de células tumorais.
[0161] “Agente quimioterápico” é composto químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9- tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapachona; lapachol; colchicinas; ácido betulínico; camptotecin (incluindo o análogo sintético topotecan (HYCAMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecin, escopolectin e 9-aminocamptotecin); briostatin; calistatin; CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesin, carzelesin e bizelesin); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatin; duocarmicin (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobin; pancratistatin; sarcodictiin; espongistatin; mostardas de nitrogênio tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalan, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosuréias tais como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos de enediina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gama 1I e caliqueamicina ômega I1 (vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl. 33: 183-186 (1994); dinemicin, incluindo dinemicin A; esperamicin; bem como neocarzinostatin cromoforo e cromoforos antibióticos de enediina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicin, autramicin, azaserina, bleomicinas, cactinomicin, carabicin, carminomicin, carzinofilin, cromomicinas, dactinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicin ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicin, cianomorfolino-doxorubicin, 2-pirrolino-doxorubicin e desoxidoxorubicin), epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicinas tais como mitomicin C, ácido micofenólico, nogalamicin, olivomicinas, peplomicin, potfiromicin, puromicin, quelamicin, rodorubicin, estreptonigrin, estreptozocin, tubercidin, ubenimex, zinostatin, zorubicin; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterin, metotrexato, pteropterin, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico, tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidainina; maitansinóides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitaerina; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexo de polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene OR); razoxano; rizoxin; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2’,2”- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida (“Ara-C”); tiotepa; taxóides, tais como paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton NJ), ABRAXANE® livre de Cremophor, formulação de nanopartículas de paclitaxel elaborada com albumina (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony, França); clorambucil; gemcitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatin; leucovovin; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicin; ibandronato; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides, tais como ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima; bem como combinações de dois ou mais dos acima tais como CHOP, abreviação de terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicin, vincristina e prednisolona e FOLFOX, abreviação de regime de tratamento com oxaliplatin (ELOXATIN®) combinado com 5-FU e leucovovin.
[0162] Também são incluídos nesta definição agentes anti- hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento do câncer e apresentam-se freqüentemente na forma de tratamento sistêmico ou do corpo todo. Eles podem ser os próprios hormônios. Exemplos incluem anti-estrógenos e moduladores de receptores de estrógenos seletivos (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifen (incluindo tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifen, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno FARESTON®; anti-progesteronas; reguladores de receptores de estrógenos (ERDs); agentes que funcionam para suprimir ou desconectar os ovários, tais como agonistas de hormônios liberadores de hormônios leutinizantes (LHRH) tais como acetato de leuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelin, acetato de buserelin e tripterelin; outros anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrógenos nas glândulas adrenais, tais como 4 (5)-imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA® e anastrozol ARIMIDEX®. Além disso, essa definição de agentes quimioterápicos inclui bifosfonatos tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrônico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID® ou risedronato ACTONEL®; bem como troxacitabina (análogo de 1,3-dioxolano nucleosídeo citosina); oligonucleotídeos sem sentido, particularmente os que inibem a expressão de genes em processos de sinalização implicados na proliferação de células aberrantes, tais como PKC-alfa, Raf, H-Ras e receptor de fator de crescimento epidérmico (EGF-R); vacinas tais como vacina THERATOPE® e vacinas de terapia genética, tais como vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN® e vacina VAXID®; inibidor da topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; ditosilato de lapatinib (inibidor de moléculas pequenas de tirosino quinase duplo ErbB-2 e EGFR também conhecido como GW572016); e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.
[0163] “Agente inibidor do crescimento”, da forma utilizada no presente, designa composto ou composição que inibe o crescimento de célula cujo crescimento seja dependente da ativação de beta7, seja in vitro ou in vivo. Desta forma, o agente inibidor do crescimento pode ser aquele que reduz significativamente o percentual de células dependentes de beta7 em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam o progresso do ciclo celular (em local diferente da fase S), tais como agentes que induzem a suspensão de G1 e a suspensão da fase M. Bloqueadores clássicos de fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores da topoisomerase II, tais como doxorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposida e bleomicin. Os agentes que prendem G1 também invadem a prisão da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA, tais como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatin, metotrexato, 5-fluorouracil e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and Antineoplastic Drugs de Murakami et al (WB Saunders: Filadélfia, 1995), especialmente pág. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são drogas anticancerígenas, ambas derivadas da árvore de teixo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhône-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é análogo semi-sintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a reunião de microtubos a partir de dímeros de tubulina e estabilizam microtubos ao evitarem a despolimerização, que resulta na inibição de mitose em células.
[0164] “Doxorubicin” é antibiótico de antraciclina. O nome químico completo de doxorubicin é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideóxi-a-L-lixo- hexapiranosil)óxi]-7,8,9,10-tetraidro-6,8,11-tri-hidróxi-8-(hidroxiacetil)-1-metóxi- 5,12-naftacenodiona.
[0165] Os compostos úteis em terapia de combinação com anticorpo anti-beta7 antagonista de acordo com a presente invenção incluem anticorpos (incluindo, sem limitação, outros anticorpos antagonistas anti- beta7 (Fib 21, 22, 27 e 30 (Tidswell, M. (1997), acima) ou seus derivados humanizados), anticorpos anti-alfa4 (tais como ANTEGEN®), compostos anti-TNF (REMICADE®) ou não de proteína que incluem, sem limitações, compostos 5-ASA ASACOL®, PENTASA®, ROWASA®, COLAZAL® e outros compostos, tais como Purinetol e esteróides tais como prednisona. Em uma realização, a presente invenção engloba método de tratamento de paciente, tal como paciente humano, com o anticorpo anti-beta7 antagonista de acordo com a presente invenção, isoladamente ou em combinação com segundo composto que também é útil no tratamento de inflamações. Em uma realização, o segundo composto é selecionado a partir do grupo que consiste em Fib 21, 22, 27, 30 ou seus derivados humanizados), anticorpos anti-alfa4, ANTEGEN®, anti-TNF, REMICADE®, compostos 5-ASA, ASACOL®, PENTASA®, ROWASA®, COLAZAL®, Purinetol, esteróides e prednisona. Em uma realização da presente invenção, a administração do anticorpo anti-beta7 antagonista de acordo com a presente invenção reduz substancialmente a dose do segundo composto. Em uma realização, a mencionada redução na dose do segundo composto é de pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95%. Em uma realização da presente invenção, a combinação do anticorpo de acordo com a presente invenção e a dose reduzida do segundo composto libera sintomas no paciente até substancialmente o mesmo grau ou melhor que a administração do segundo composto isoladamente.
GERAÇÃO DE ANTICORPOS VARIANTES QUE EXIBEM REDUÇÃO OU AUSÊNCIA DE RESPOSTA DE HAMA
[0166] A redução ou a eliminação de resposta de HAMA (anti- camundongo humano (também aplicável a anti-rato humano ou anti-humano humano) é aspecto significativo do desenvolvimento clínico de agentes terapêuticos apropriados. Vide, por exemplo, Khaxzaeli et al, J. Natl. Cancer Inst. (1988), 80: 937; Jaffers et al, Transplantation (1986), 41: 572; Shawler et al, J. Immunol. (1985), 135: 1530; Sears et al, J. Biol. Response Mod. (1984), 3: 138; Miller et al, Blood (1983), 62: 988; Hakimi et al, J. Immunol. (1991), 147: 1352; Reichmann et al, Nature (1988), 332: 323; Junghans et al, Cancer Res. (1990), 50: 1495. Conforme descrito no presente, a presente invenção fornece anticorpos que são humanizados de tal forma que a resposta de HAMA seja reduzida ou eliminada. Variantes destes anticorpos podem ser adicionalmente obtidas utilizando métodos rotineiros conhecidos na técnica, alguns dos quais são adicionalmente descritos abaixo.
[0167] Seqüência de aminoácidos de anticorpo conforme descrito no presente pode servir, por exemplo, de seqüência inicial (parental) para diversificação da(s) seqüência(s) hipervariável(is) e/ou de estrutura. Seqüência de estrutura selecionada à qual é ligada seqüência hipervariável inicial é denominada no presente estrutura humana receptora. Embora as estruturas humanas receptoras possam ser ou ser derivadas de imunoglobulina humana (as suas regiões VL e/ou VH), as estruturas humanas receptoras preferencialmente são ou são derivadas de seqüência de estrutura de consenso humano, pois demonstrou-se que essas estruturas possuem imunogenicidade mínima ou nenhuma em pacientes humanos.
[0168] Quando o receptor for derivado de imunoglobulina humana, pode-se selecionar opcionalmente seqüência de estrutura humana que é selecionada com base na sua homologia para a seqüência de estrutura do doador por meio de alinhamento da seqüência de estrutura doadora com várias seqüências de estrutura humana em coleção de seqüências de estrutura humana e selecionar a seqüência de estrutura com maior homologia como receptor.
[0169] Em uma realização, estruturas de consenso humano no presente são ou são derivadas de seqüências de estrutura de consenso de subgrupo I capa VL e/ou subgrupo III VH.
[0170] Desta forma, a estrutura humana receptora de VH pode compreender uma, duas, três ou todas as seqüências de estrutura a seguir: - FR1 que compreende EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID N° 38); - FR2 que compreende WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID N° 39); - FR3 que compreende RFTISX1DX2SKNTX3YLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID N° 42), em que X1 é A ou R, X2 é T ou N e X3 é A, L ou F; - FR4 que compreende WGQGTLVTVSS (SEQ ID N° 41). Exemplos de estruturas de consenso de VH incluem: - estrutura de consenso de subgrupo I VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 19); - estrutura de consenso de subgrupo I VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 20 a 22); - estrutura de consenso de subgrupo II VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 48); - estrutura de consenso de subgrupo II VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 49 a 51); - estrutura de consenso de subgrupo III VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 52); - estrutura de consenso de subgrupo III VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 53 a 55); - estrutura receptora de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 56); - estrutura receptora de VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 57 a 58); - estrutura 2 receptora de VH humano menos CDRs de Kabat (SEQ ID N° 59); ou - estrutura 2 receptora de VH humano menos regiões hipervariáveis estendidas (SEQ ID N° 60 a 62). Em uma realização, a estrutura humana receptora de VH compreende uma, duas, três ou todas as seqüências de estrutura a seguir: - FR1 que compreende EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID N° 38); - FR2 que compreende WVRQAPGKGLEWV (SEQ ID N° 39); - FR3 que compreende RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID N° 43), RFTISRDTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID N° 44), RFTISRDTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID N° 45), RFTISADTSKNTFYLQMNSLRAEDTAVYYCA (SEQ ID N° 46); - FR4 que compreende WGQGTLVTVSS (SEQ ID N° 41). A estrutura humana receptora de VL pode compreender uma, duas, três ou todas as seqüências de estrutura a seguir: - FR1 que compreende DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID N° 34); - FR2 que compreende WYQQKPGKAPKLLI (SEQ ID N° 35); - FR3 que compreende GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID N° 36); - FR4 que compreende FGQGTKVEIKR (SEQ ID N° 37). Exemplos de estruturas de consenso de VL incluem: - estrutura de consenso de subgrupo I capa VL humano (SEQ ID N° 14); - estrutura de consenso de subgrupo I capa VL humano (HVR-L2 estendido) (SEQ ID N° 15); - estrutura de consenso de subgrupo II capa VL humano (SEQ ID N° 16); - estrutura de consenso de subgrupo III capa VL humano (SEQ ID N° 17); ou - estrutura de consenso de subgrupo IV capa VL humano (SEQ ID N° 18).
[0171] Embora o receptor possa possuir seqüência idêntica à seqüência de estrutura humana selecionada, seja de imunoglobulina humana ou estrutura de consenso humano, a presente invenção contempla que a seqüência receptora pode compreender substituições de aminoácidos previamente existentes relativas à seqüência de imunoglobulina humana ou seqüência de estrutura de consenso humano. Estas substituições previamente existentes são preferencialmente mínimas; normalmente quatro, três, duas ou uma diferença de aminoácidos apenas com relação à seqüência de imunoglobulina humana ou seqüência de estrutura de consenso.
[0172] Resíduos de região hipervariável do anticorpo não humano são incorporados às estruturas humanas receptoras de VL e/ou VH. Pode-se incorporar, por exemplo, resíduos correspondentes aos resíduos de CDR de Kabat, aos resíduos de circuito hipervariável de Chothia, aos resíduos Abm e/ou resíduos de contato. Opcionalmente, são incorporados os resíduos de região hipervariável estendidos conforme segue: 24-34 (L1), 49-56 (L2) e 89-97 (L3), 26-35 (H1), 50-65 ou 49-65 (H2) e 93-102, 94-102 ou 95-102 (H3).
[0173] Embora a “incorporação” de resíduos de região hipervariável seja discutida no presente, apreciar-se-á que isso pode ser atingido de diversas formas; um ácido nucléico que codifica a seqüência de aminoácidos desejada, por exemplo, pode ser gerado por meio de mutação de ácido nucléico que codifica a seqüência de domínio variável de camundongo, de forma que os seus resíduos de estrutura sejam alterados para resíduos de estrutura humana receptores, ou por meio de mutação de ácido nucléico que codifica a seqüência de domínio variável humana, de tal forma que os resíduos de domíno hipervariável sejam alterados para resíduos não humanos, ou por meio de síntese de ácido nucléico que codifica a seqüência desejada etc.
[0174] Nos exemplos do presente, variantes enxertadas com região hipervariável foram geradas por meio de mutagênese de Kunkel de ácido nucléico que codifica as seqüências receptoras humanas, utilizando um oligonucleotídeo separado para cada região hipervariável. Kunkel et al, Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987). Alterações apropriadas podem ser introduzidas na região de estrutura e/ou hipervariável, utilizando métodos de rotina, para corrigir e restabelecer interações adequadas entre região hipervariável e antígeno.
[0175] Exibição de fago(mídeo) (também denominada no presente exibição de fagos em alguns contextos) pode ser utilizada como método rápido e conveniente de geração e seleção de muitos anticorpos variantes potenciais em biblioteca gerada por meio de aleatorização de seqüências. Outros métodos de elaboração e seleção de anticorpos alterados, entretanto, são disponíveis para os técnicos no assunto.
[0176] A tecnologia de exibição de fago(mídeo) forneceu ferramenta poderosa de geração e seleção de proteínas inovadoras que se ligam a ligante, tal como antígeno. O uso das técnicas de exibição de fago(mídeo) permite a geração de grandes bibliotecas de variantes de proteínas que podem ser rapidamente ordenadas para as seqüências que ligam molécula alvo com alta afinidade. Ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos variantes são geralmente fundidos a seqüência de ácidos nucléicos que codifica proteína de revestimento viral, tal como proteína gene III ou proteína gene VIII. Foram desenvolvidos sistemas de exibição de fagomídeos monovalentes em que a seqüência de ácido nucléico que codifica a proteína ou o polipeptídeo é fundida a seqüência de ácido nucléico que codifica uma parte da proteína gene III (Bass, S., Proteins, 8: 309 (1990); Lowman e Wells, Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 3: 205 (1991)). Em sistema de exibição de fagomídeos monovalente, a fusão genética é expressa em níveis baixos e proteínas de gene III do tipo selvagem também são expressas, de forma a reter a infectividade das partículas. Métodos de geração de bibliotecas de peptídeos e seleção dessas bibliotecas foram descritos em muitas patentes (tais como Patente Norte-Americana n° 5.723.286, Patente Norte-Americana n° 5.432.018, Patente Norte-Americana n° 5.580.717, Patente Norte-Americana n° 5,427,908 e Patente Norte-Americana n° 5.498.530).
[0177] Bibliotecas de anticorpos ou polipeptídeos de ligação de antígenos foram preparadas de uma série de formas, que incluem por meio de alteração de um único gene por meio de inserção de seqüências de DNA aleatórias ou por meio de clonagem de família de genes relacionados. Métodos de exibição de anticorpos ou fragmentos de ligação de antígenos utilizando exibição de fago(mídeos) foram descritos nas Patentes Norte-Americanas n° 5.750.373, 5.733.743, 5.837.242, 5.969.108, 6.172.197, 5.580.717 e 5.658.727. A biblioteca é selecionada em seguida para determinar a expressão de anticorpos ou proteínas de ligação de antígenos com as características desejadas.
[0178] Métodos de substituição de aminoácido selecionado em modelo de ácido nucléico são bem estabelecidos na técnica, alguns dos quais são descritos no presente. Resíduos de regiões hipervariáveis podem ser substituídos, por exemplo, utilizando o método de Kunkel. Vide, por exemplo, Kunkel et al, Methods Enzymol. 154: 367-382 (1987).
[0179] A seqüência de oligonucleotídeos inclui um ou mais dos conjuntos de códons designados para os resíduos de região hipervariável a serem alterados. Conjunto de códons é conjunto de diferentes seqüências de trios de nucleotídeos utilizadas para codificar aminoácidos variantes desejados. Conjuntos de códons podem ser representados utilizando símbolos para designar nucleotídeos específicos ou misturas equimolares de nucleotídeos, conforme exibido abaixo de acordo com o código IUB. CÓDIGOS IUB G Guanina A Adenina T Timina C Citosina R (A ou G) Y (C ou T) M (A ou C) K (G ou T) S (C ou G) W (A ou T) H (A, C ou T) B (C, G ou T) V (A, C ou G) D (A, G ou T) H N (A, C, G ou T)
[0180] No conjunto de códons DVK, por exemplo, D pode ser os nucleotídeos A, G ou T; V pode ser A, G ou C; e K pode ser G ou T. Este conjunto de códons pode apresentar dezoito códons diferentes e pode codificar os aminoácidos Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly e Cys.
[0181] Conjuntos de primers ou oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando métodos padrão. Conjunto de oligonucleotídeos pode ser sintetizado, por exemplo, por síntese de fase sólida, que contém seqüências que representam todas as combinações possíveis de trios de nucleotídeos fornecidos pelo conjunto de códons e que codificarão o grupo desejado de aminoácidos. A síntese de oligonucleotídeos com “degeneração” de nucleotídeos selecionada em certas posições é bem conhecida nessa técnica. Estes conjuntos de nucleotídeos que contêm certos conjuntos de códons podem ser sintetizados utilizando sintetizadores de ácido nucléico (disponíveis, por exemplo, por meio da Applied Biosystems, Foster City CA), ou podem ser obtidos comercialmente (por exemplo, por meio da Life Technologies, Rockville MD). Conjunto de oligonucleotídeos sintetizado que possui conjunto de códons específico incluirá tipicamente, portanto, uma série de oligonucleotídeos com seqüências diferentes, em que as diferenças são estabelecidas pelo conjunto de códons dentro da seqüência geral. Oligonucleotídeos, da forma utilizada de acordo com a presente invenção, possuem seqüências que permitem hibridização para modelo de ácido nucléico com domínio variável e podem também incluir sítios de enzimas de restrição para fins de clonagem.
[0182] Em um método, seqüências de ácido nucléico que codificam aminoácidos variantes podem ser criadas por meio de mutagênese mediada por oligonucleotídeos. Este método é bem conhecido na técnica, conforme descrito por Zoller et al, Nucleic Acids Res. 10: 6487-6504 (1987). Resumidamente, seqüências de ácido nucléico que codificam aminoácidos variantes são criadas por meio de hibridização de conjunto de oligonucleotídeos que codificam os conjuntos de códons para modelo de DNA, em que o modelo é a forma de fita simples do plasmídeo que contém seqüência modelo de ácido nucléico de região variável. Após a hibridização, DNA polimerase é utilizada para sintetizar segunda fita complementar do modelo que, desta forma, incorporará o primer de oligonucleotídeo e conterá os conjuntos de códons conforme fornecido pelo conjunto de oligonucleotídeos.
[0183] Geralmente, são utilizados oligonucleotídeos com pelo menos 25 nucleotídeos de comprimento. Oligonucleotídeo ideal conterá de doze a quinze nucleotídeos que são completamente complementares ao modelo em cada lado do(s) nucleotídeo(s) que codifica(m) a(s) mutação(ões). Isso garante que o oligonucleotídeo hibridize-se adequadamente na molécula modelo de DNA de fita simples. Os oligonucleotídeos são facilmente sintetizados utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como os descritos por Crea et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 75: 5765 (1978).
[0184] O modelo de DNA é gerado pelos vetores que são derivados de vetores M13 bacteriófagos (os vetores M13mp18 e M13mp19 disponíveis comercialmente são apropriados) ou pelos vetores que contêm origem de reprodução de fagos de fita simples conforme descrito por Viera et al, Meth. Enzymol., 153: 3 (1987). Desta forma, o DNA que deve sofrer mutação pode ser inserido em um desses vetores, a fim de gerar modelo de fita simples. A produção do modelo de fita simples é descrita nos capítulos 4.21 a 4.41 de Sambrook et al, acima.
[0185] Para alterar a seqüência de DNA nativa, o oligonucleotídeo é hibridizado no modelo de fita simples sob condições de hibridização apropriadas. Enzima polimerizadora de DNA, normalmente T7 DNA polimerase ou o fragmento de Klenow de DNA polimerase I, é adicionada em seguida para sintetizar a fita complementar do modelo, utilizando o oligonucleotídeo como primer para síntese. Molécula heteroduplex é formada desta maneira, de forma que uma fita de DNA codifique a forma que sofreu mutação do gene 1 e a outra fita (o modelo original) codifique a seqüência inalterada nativa do gene 1. Esta molécula heteroduplex é transformada em seguida em célula hospedeira apropriada, normalmente procarionte tal como E. coli JM101. Após a cultura das células, elas são colocadas em placas sobre placas de agarose e selecionadas utilizando o primer de oligonucleotídeo radiomarcado com 32-Fosfato para identificar as colônias bacterianas que contêm o DNA que sofreu mutação.
[0186] O método descrito imediatamente acima pode ser modificado de tal forma que seja criada molécula homoduplex, em que as duas fitas do plasmídeo contêm a(s) mutação(ões). As modificações são as seguintes: O oligonucleotídeo de fita simples é combinado com o modelo de fita simples conforme descrito acima. Mistura de três desoxirribonucleotídeos, desoxirriboadenosina (dATP), desoxirriboguanosina (dGTP) e desoxirribotimidina (dTT) é combinada com tiodesoxirribocitosina modificada denominada dCTP-(aS) (que pode ser obtida por meio da Amersham). Esta mistura é adicionada ao complexo de modelo e oligonucleotídeo. Mediante adição de DNA polimerase a esta mistura, é gerada fita de DNA idêntica ao modelo, exceto pelas bases que sofreram mutação. Além disso, esta nova fita de DNA conterá dCTP-(aS) em vez de dCTP, que serve para protegê-la de digestão de endonuclease de restrição. Após a mistura da fita modelo do heteroduplex de fita dupla com enzima de restrição apropriada, a fita modelo pode ser digerida com ExoIII nuclease ou outra nuclease apropriada após a região que contém o(s) sítio (s) a sofrer(em) mutagênese. A reação é suspensa em seguida para deixar molécula que possui fita simples apenas parcial. Homoduplex de DNA de fita dupla completo é formado em seguida utilizando DNA polimerase na presença de todos os quatro trifosfatos de desoxirribonucleotídeos, ATP e DNA ligase. Esta molécula homoduplex pode ser transformada em seguida em célula hospedeira apropriada.
[0187] Conforme indicado anteriormente, a seqüência do conjunto de oligonucleotídeos possui comprimento suficiente para hibridização no ácido nucléico modelo e pode também, mas não necessariamente, conter sítios de restrição. O modelo de DNA pode ser gerado pelos vetores que são derivados de vetores M13 bacteriófagos ou pelos vetores que contêm origem de reprodução de fagos de fita simples conforme descrito por Viera et al, Meth. Enzymol., 153: 33 (1987). Desta forma, o DNA que deve sofrer mutação necessita ser inserido em um desses vetores, a fim de gerar modelo de fita simples. A produção do modelo de fita simples é descrita nos capítulos 4.21 a 4.41 de Sambrook et al, acima.
[0188] Segundo outro método, pode-se gerar biblioteca por meio do fornecimento de conjuntos de oligonucleotídeos à jusante (downstream) e à montante (upstream), em que cada conjunto possui uma série de oligonucleotídeos com seqüências diferentes e as seqüências diferentes são estabelecidas pelos conjuntos de códons equipados com a seqüência dos oligonucleotídeos. Os conjuntos de oligonucleotídeos à jusante (downstream) e à montante (upstream), junto com seqüência de ácido nucléico modelo de domínio variável, podem ser utilizados em reação em cadeia de polimerase para gerar “biblioteca” de produtos de PCR. Os produtos de PCR podem ser denominados “conjuntos de ácido nucléico”, pois podem ser fundidos com outras seqüências de ácido nucléico relacionadas ou não relacionadas, tais como proteínas de revestimento viral e domínios de dimerização, utilizando métodos de biologia molecular estabelecidos.
[0189] A seqüência dos primers de PCR inclui um ou mais dos conjuntos de códons projetados para as posições acessíveis para o solvente e altamente diversas em região hipervariável. Conforme descrito acima, conjunto de códons é conjunto de diferentes seqüências de trios de nucleotídeos utilizadas para codificar aminoácidos variantes desejados.
[0190] Seletores de anticorpos que atendem aos critérios desejados, conforme selecionado por meio de etapas apropriadas de seleção, podem ser isolados e clonados utilizando métodos recombinantes padrão.
VETORES, CÉLULAS HOSPEDEIRAS E MÉTODOS RECOMBINANTES
[0191] Para a produção recombinante de anticorpo de acordo com a presente invenção, o ácido nucléico que o codifica é isolado e inserido em um vetor reproduzível para clonagem adicional (amplificação do DNA) ou para expressão. O DNA codificador do anticorpo é facilmente isolado e seqüenciado utilizando-se procedimentos convencionais (por meio, por exemplo, do uso de sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de ligar-se especificamente a genes codificadores das cadeias pesada e leve do anticorpo). Diversos vetores são disponíveis. O vetor selecionado depende em parte da célula hospedeira a ser utilizada. Geralmente, as células hospedeiras preferidas são de origem procariótica ou eucariótica (geralmente mamíferos).
GERAÇÃO DE ANTICORPOS UTILIZANDO CÉLULAS HOSPEDEIRAS PROCARIÓTICAS: CONSTRUÇÃO DE VETORES
[0192] As seqüências de polinucleotídeos que codificam componentes de polipeptídeos do anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser obtidas utilizando métodos recombinantes padrão. As seqüências de polinucleotídeos desejadas podem ser isoladas e seqüenciadas a partir de células produtoras de anticorpos, tais como células de hibridoma. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizados utilizando sintetizador de nucleotídeos ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as seqüências que codificam os polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de reproduzir e expressar polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procarióticos. Muitos vetores que são disponíveis e conhecidos na técnica podem ser utilizados para os propósitos da presente invenção. A seleção de vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucléicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira específica a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeo heterólogo, ou ambos) e sua compatibilidade com a célula hospedeira específica na qual reside. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas sem limitar-se a: origem de reprodução, gene marcador de seleção, promotor, sítio de ligação de ribossomos (RBS), seqüência de sinais, inserto de ácido nucléico heterólogo e seqüência de término de transcrição.
[0193] Geralmente, os vetores de plasmídeos que contêm seqüências de controle e replicon que são derivados de espécies compatíveis com a célula hospedeira são utilizados com relação a esses hospedeiros. O vetor normalmente conduz um sítio de reprodução, bem como seqüências de marcação que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. E. coli, por exemplo, é tipicamente transformado utilizando pBR322, plasmídeo derivado de espécie de E. coli. pBR322 contém genes que codificam resistência à ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e, desta fornece meios fáceis de identificação de células transformadas. pBR322, seus derivados ou outros plasmídeos microbianos ou bacteriófago podem também conter ou ser modificados para que contenham promotores que podem ser utilizados pelo organismo microbiano para a expressão de proteínas endógenas. Exemplos de derivados de pBR322 utilizados para a expressão de anticorpos específicos são descritos em detalhes em Carter et al, Patente Norte-Americana n° 5.648.237.
[0194] Além disso, vetores de fagos que contêm seqüências de controle e de replicon que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem ser utilizados como vetores de transformação em conexão com esses hospedeiros. Bacteriófago tal como XGEM.TM.-11, por exemplo, pode ser utilizado na fabricação de vetor recombinante que pode ser utilizado para transformar células hospedeiras suscetíveis tais como E. coli LE392.
[0195] O vetor de expressão de acordo com a presente invenção pode compreender dois ou mais pares de promotor e cistron, que codificam cada um dos componentes de polipeptídeos. Promotor é uma seqüência reguladora não traduzida localizada à montante (upstream) (5’) para um cistron que modula a sua expressão. Promotores procarióticos enquadram-se tipicamente em duas classes, indutível e constitutivo. O promotor indutível é promotor que inicia níveis mais altos de transcrição do cistron sob o seu controle em resposta a alterações das condições de cultura, tais como a presença ou ausência de nutriente ou mudança de temperatura.
[0196] É bem conhecida grande quantidade de promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais. O promotor selecionado pode ser ligado operativamente a DNA de cistron que codifica a cadeia leve ou pesada por meio de remoção do promotor do DNA fonte por meio de digestão de enzimas de restrição e inserção da seqüência promotora isolada no vetor de acordo com a presente invenção. Tanto a seqüência promotora nativa quanto muitos promotores heterólogos podem ser utilizados para dirigir a amplificação e/ou a expressão dos genes alvo. Em algumas realizações, são utilizados promotores heterólogos, pois eles geralmente permitem maior transcrição e rendimentos mais altos de gene alvo expresso em comparação com o promotor de polipeptídeo alvo nativo.
[0197] Os promotores apropriados para uso com hospedeiros procarióticos incluem o promotor phoA, sistemas promotores de lactose e β- galactamase, sistema promotor de triptofano (trp) e promotores híbridos, tais como o promotor tac ou trc. Entretanto, outros promotores que são funcionais em bactérias (tais como outros promotores de fagos ou bacterianos conhecidos) também são apropriados. Suas seqüências de nucleotídeos foram publicadas, de forma a permitir que os técnicos no assunto as liguem operativamente a cistrons que codificam as cadeias leve e pesada alvo (Siebenlist et al (1980), Cell 20: 269), utilizando ligantes ou adaptadores para fornecer qualquer sítio de restrição necessário.
[0198] Em um aspecto da presente invenção, cada cistron dentro do vetor recombinante compreende um componente de seqüência de sinal de secreção que dirige a translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. De forma geral, a seqüência de sinal pode ser componente do vetor ou pode ser uma parte do DNA de polipeptídeo alvo que é inserido no vetor. A seqüência de sinal selecionada para os propósitos da presente invenção deverá ser uma que seja reconhecida e processada (ou seja, dividida por peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam as seqüências de sinal nativas para os polipeptídeos heterólogos, a seqüência de sinal é substituída por uma seqüência de sinal procariótico selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste em fosfatase alcalina, penicilinase, lpp ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor (STII), LamB, PhoE, PelB, OmpA e MBP. Em uma realização da presente invenção, as seqüências de sinais utilizadas nos dois cistrons do sistema de expressão são seqüências de sinais de STII ou suas variantes.
[0199] Em outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a presente invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira e, portanto, não necessita da presença de seqüências de sinal de secreção em cada cistron. Neste particular, cadeias leve e pesada de imunoglobulina são expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais dentro do citoplasma. Certas linhagens hospedeiras (tais como as linhagens E. coli trxB-) fornecem condições de citoplasma que são favoráveis para a formação de ligações de dissulfeto, de forma a permitir dobra e montagem adequadas das subunidades de proteínas expressas. Proba e Pluckthun, Gene, 159: 203 (1995).
[0200] A presente invenção fornece sistema de expressão no qual a razão quantitativa entre componentes de polipeptídeos expressos pode ser modulada a fim de maximizar o rendimento de anticorpos secretados e adequadamente montados de acordo com a presente invenção. Essa modulação é atingida ao menos em parte por meio da modulação simultânea de resistências de tradução para os componentes de polipeptídeos.
[0201] Uma técnica de modulação da resistência de tradução é descrita em Simmons et al, Patente Norte-Americana n° 5.840.523. Ela utiliza variantes da região de início de tradução (TIR) em um cistron. Para uma dada TIR, uma série de variantes de seqüências de aminoácidos ou ácido nucléico pode ser criada com uma série de resistências de tradução, de forma a fornecer meio conveniente por meio do qual ajustar este fator para o nível de expressão desejado da cadeia específica. Variantes de TIR podem ser geradas por meio de técnicas de mutagênese convencionais que resultem em mudanças de códons que podem alterar a seqüência de aminoácidos, embora sejam preferidas mudanças silenciosas na seqüência de nucleotídeos. Alterações de TIR podem incluir, por exemplo, alterações do número ou espaçamento de seqüências Shine-Dalgarno, junto com alterações da seqüência de sinais. Um método de geração de seqüências de sinais mutantes é a geração de um “banco de códons” no início de seqüência de codificação que não altere a seqüência de aminoácidos da seqüência de sinais (ou seja, as mudanças são silenciosas). Isso pode ser conseguido alterando-se a terceira posição de nucleotídeo de cada códon; além disso, alguns aminoácidos, tais como leucina, serina e arginina, possuem diversas primeira e segunda posições que podem agregar complexidade na elaboração do banco. Este método de mutagênese é descrito em detalhes em Yansura et al (1992), METHODS: A Companion to Methods in Enzymol., 4: 151-158.
[0202] Preferencialmente, um conjunto de vetores é gerado com uma série de resistências de TIR para cada cistron nele contido. Este conjunto limitado fornece comparação de níveis de expressão de cada cadeia, bem como o rendimento dos produtos de anticorpos desejados sob várias combinações de resistência de TIR. Resistências de TIR podem ser determinadas por meio de quantificação do nível de expressão de gene relator, conforme descrito em detalhes em Simmons et al, Patente Norte-Americana n° 5.840.523. Com base na comparação de resistência de tradução, os TIRs individuais desejados são selecionados para combinação nas construções de vetor de expressão de acordo com a presente invenção.
[0203] As células hospedeiras procarióticas apropriadas para a expressão de anticorpos de acordo com a presente invenção incluem Arcaebactérias e Eubactérias, tais como organismos grama-negativos ou grama-positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (tal como E. coli), Bacilli (tal como B. subtilis), Enterobacteria, espécies de Pseudomonas (tais como P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebisella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla ou Paracoccus. Em uma realização, são utilizadas células grama-negativas. Em uma realização, células de E. coli são utilizadas como hospedeiros para a presente invenção. Exemplos de linhagens de E. coli incluem linhagem W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington DC: Sociedade Norte-Americana de Microbiologia, 1987), págs. 1190-1219; Depósito ATCC n° 27.325) e seus derivados, incluindo linhagem 33D3 que possui genótipo W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac lq lacL8 ΔompTΔ (nmpc-fepE) degP41 kanR (Patente Norte-Americana n° 5.639.635). Outras linhagens e seus derivados, tais como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli B, E. colix 1776 (ATCC 31.537) e E. coli RV308 (ATCC 31.608) também são apropriadas. Estes exemplos são ilustrativos e não limitadores. Métodos de construção de derivados de quaisquer das bactérias mencionadas acima que possuem genótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Bass et al, Proteins, 8: 309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar a bactéria apropriada considerando a capacidade de reprodução do replicon nas células de bactéria. Espécies de E. coli, Serratia ou Salmonella, por exemplo, podem ser adequadamente utilizadas como hospedeiro quando plasmídeos bem conhecidos, tais como pBR322, pBR325, pACYC177 ou pKN410, são utilizados para fornecer o replicon. Tipicamente, a célula hospedeira deverá secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas e inibidores de protease adicionais podem ser desejavelmente incorporados à cultura celular.
PRODUÇÃO DE ANTICORPOS
[0204] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão descritos acima e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformadores ou amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas.
[0205] Transformação indica a introdução de DNA no hospedeiro procariótico, de tal forma que o DNA seja reproduzível, seja na forma de elemento extracromossômico ou por integrante cromossômico. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada utilizando técnicas padrão apropriadas para essas células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio é geralmente utilizado para células bacterianas que contêm barreiras de parede celular substanciais. Outro método de transformação emprega polietileno glicol/DMSO. Ainda outro método utilizado é a eletroporação.
[0206] As células procarióticas utilizadas para produzir os polipeptídeos de acordo com a presente invenção são cultivadas em meios conhecidos na técnica e apropriados para cultura das células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios apropriados incluem caldo luria (LB) mais os suplementos nutrientes necessários. Em algumas realizações, os meios também contêm um agente de seleção, selecionado com base na construção do vetor de expressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procarióticas que contenham o vetor de expressão. Ampicilina é adicionada aos meios, por exemplo, para crescimento de células que expressem o gene resistente à ampicilina.
[0207] Quaisquer suplementos necessários além de fontes de carbono, nitrogênio e fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentrações apropriadas introduzidas isoladamente ou na forma de mistura com outro suplemento ou meio, tal como fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente, o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados a partir do grupo que consiste em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.
[0208] As células hospedeiras procarióticas são cultivadas sob temperaturas apropriadas. Para crescimento de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia de cerca de 20 °C a cerca de 39 °C, de maior preferência cerca de 25 °C a cerca de 37 °C, de preferência ainda maior cerca de 30 °C. O pH do meio pode ser qualquer pH que varie de cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para E. coli, o pH é preferencialmente de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, de maior preferência cerca de 7.0.
[0209] Caso seja utilizado promotor indutível no vetor de expressão de acordo com a presente invenção, a expressão de proteínas é induzida sob condições apropriadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da presente invenção, promotores de PhoA são utillizados para o controle da transcrição dos polipeptídeos. Conseqüentemente, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em meio limitador de fosfato para indução. Preferencialmente, o meio limitador de fosfato é o meio C. R. A. P. (vide, por exemplo, Simmons et al, J. Immunol. Methods (2002), 263: 133-147). Uma série de outros indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção de vetor empregada, como é conhecido na técnica.
[0210] Em uma realização, os polipeptídeos expressos de acordo com a presente invenção são secretados e recuperados do periplasma das células hospedeiras. A recuperação de proteína envolve tipicamente o rompimento do microorganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, sonicação ou lise. Após o rompimento das células, fragmentos celulares ou células inteiras podem ser removidas por meio de centrifugação ou filtragem. As proteínas podem ser adicionalmente purificadas, por exemplo, por cromatografia de resina de afinidade. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para o meio de cultura e nele isoladas. As células podem ser removidas do cultura e o sobrenadante de cultura filtrado e concentrado para purificação adicional das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressos podem ser adicionalmente isolados e identificados utilizando métodos comumente conhecidos, tais como eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) e teste Western Blot.
[0211] Em um aspecto da presente invenção, a produção de anticorpos é conduzida em grande quantidade por meio de processo de fermentação. Vários procedimentos de fermentação de alimentação de bateladas em larga escala são disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. As fermentações em larga escala possuem capacidade de pelo menos mil litros, preferencialmente 1000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores utilizam impulsionadores agitadores para distribuir oxigênio e nutrientes, especialmente glicose (a fonte de carbono e energia preferida). Fermentação em pequena escala refere-se geralmente a fermentação em fermentador que possui capacidade volumétrica de não mais de cerca de cem litros e pode variar de cerca de um litro a cerca de cem litros.
[0212] Em processo de fermentação, a indução da expressão de proteína é tipicamente iniciada após a cultura das células sob condições apropriadas até densidade desejada, tal como OD550 de cerca de 180 a 220, estágio em que as células encontram-se na fase estacionária inicial. Uma série de indutores pode ser utilizada, de acordo com a construção de vetor empregada, como é conhecido na técnica e descrito acima. As células podem ser cultivadas por períodos mais curtos antes da indução. As células são normalmente induzidas por cerca de 12 a 50 horas, embora possa ser utilizado tempo de indução mais longo ou mais curto.
[0213] Para aumentar o rendimento de produção e a qualidade dos polipeptídeos de acordo com a presente invenção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Para melhorar a reunião adequada e dobra dos polipeptídeos de anticorpos secretados, por exemplo, vetores adicionais que sobreexpressam proteínas chaperone, tais como proteínas Dsb (DsbA, DsbB, DsbC, DsbD e/ou DsbG) ou FkpA (peptidilprolil cis, transisomerase com atividade de chaperone), podem ser utilizados para cotransformar as células procarióticas hospedeiras. Demonstrou-se que as proteínas de chaperone facilitam a dobra e solubilidade adequadas de proteínas heterólogas produzidas em células hospedeiras bacterianas. Chen et al (1999), J. Bio. Chem. 274: 19601-19605; Georgiou et al, Patente Norte- Americana n° 6.083.715; Georgiou et al, Patente Norte-Americana n° 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000), J. Biol. Chem. 275: 17100-17105; Ramm e Pluckthun (2000), J. Biol. Chem. 275: 17106-17113; Arie et al (2001), Mol. Microbiol. 39: 199-210.
[0214] Para minimizar a proteólise de proteínas heterólogas expressas (especialmente as que são proteoliticamente sensíveis), certas linhagens hospedeiras com deficiência para enzimas proteolíticas podem ser utilizadas para a presente invenção. Linhagens de células hospedeiras podem ser modificadas, por exemplo, para efetuar mutação(ões) genética(s) nos genes que codificam proteases bacterianas conhecidas, tais como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease VI e suas combinações. Algumas linhagens com deficiência de protease de E. coli são disponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al (1998), acima; Georgiou et al, Patente Norte-Americana n° 5.264.365; Georgiou et al, Patente Norte-Americana n° 5.508.192; Hara et al, Microbial Drug Resistance, 2: 63-72 (1996).
[0215] Em uma realização, linhagens de E. coli com deficiência de enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos que sobreexpressam uma ou mais proteínas chaperone são utilizadas como células hospedeiras no sistema de expressão de acordo com a presente invenção.
PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS
[0216] Em uma realização, a proteína de anticorpo produzida no presente é adicionalmente purificada para obter preparações que são substancialmente homogêneas para testes e usos adicionais. Podem ser empregados métodos de purificação de proteínas padrão conhecidos na técnica. Os procedimentos a seguir são exemplos de procedimentos de purificação apropriados: fracionamento sobre imunoafinidade ou colunas de troca de íons; precipitação em etanol; HPLC de fase reversa; cromatografia sobre sílica ou sobre resina de troca de cátions, tal como DEAE; cromatoconcentração; SDS-PAGE, precipitação de sulfato de amônio e filtragem de gel utilizando, por exemplo, Sephadex G-75.
[0217] Em um aspecto, Proteína A imobilizada sobre fase sólida é utilizada para purificação de imunoafinidade dos produtos de anticorpos de comprimento total de acordo com a presente invenção. Proteína A é proteína de parede celular de 41 kD de Staphylococcus aureus que se liga com alta afinidade à região Fc de anticorpos. Lindmark et al (1983), J. Immunol. Meth. 62: 1-13. A fase sólida à qual a Proteína A é imobilizada é preferencialmente uma coluna que compreende superfície de vidro ou sílica, de maior preferência coluna de vidro com poros controlados ou coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna foi revestida com reagente, tal como glicerol, em tentativa de evitar a aderência não específica de contaminantes.
[0218] Como primeira etapa da purificação, a preparação derivada da cultura celular conforme descrito acima é aplicada sobre a fase sólida imobilizada com Proteína A para permitir a ligação específica do anticorpo de interesse à Proteína A. A fase sólida é lavada em seguida para remover contaminantes ligados não especificamente à fase sólida. Por fim, o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por meio de eluição.
GERAÇÃO DE ANTICORPOS UTILIZANDO CÉLULAS HOSPEDEIRAS EUCARIÓTICAS:
[0219] Os componentes do vetor incluem geralmente, mas sem limitar-se a um ou mais dos seguintes: seqüência de sinal, origem de reprodução, um ou mais genes marcadores, elemento amplificador, promotor e seqüência de término de transcrição.
(I) COMPONENTE DE SEQÜÊNCIA DE SINAL
[0220] Um vetor para uso em célula hospedeira eucariótica pode também conter seqüência de sinal ou outro polipeptídeo que possui sítio de divisão específico no terminal N da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A seqüência de sinal heterólogo preferencialmente selecionada é uma que é reconhecida e processada (ou seja, dividida por peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Em expressão de células de mamíferos, seqüências de sinal de mamíferos, bem como líderes de secreção viral, tais como o sinal simplex gD da herpes, são disponíveis.
[0221] O DNA para essa região precursora é ligado na estrutura de leitura a DNA que codifica o anticorpo.
(II) ORIGEM DE REPLICAÇÃO
[0222] Geralmente, um componente de origem de replicação não é necessário para vetores de expressão de mamíferos. A origem SV40, por exemplo, pode ser tipicamente utilizada somente porque contém o promotor inicial. (III) COMPONENTE DE GENE DE SELEÇÃO
[0223] Os vetores de clonagem e de expressão podem conter gene de seleção, também denominado marcador selecionável. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tais como ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina; (b) complementam deficiências auxotróficas, quando relevantes; ou (c) fornecem nutrientes fundamentais não disponíveis a partir de meios complexos.
[0224] Um exemplo de esquema de seleção utiliza droga para interromper o crescimento de célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com gene heterólogo produzem proteína que confere resistência a drogas e, desta forma, sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos dessa seleção dominante utilizam as drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina.
[0225] Outro exemplo de marcadores selecionáveis apropriados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes para absorver o ácido nucléico de anticorpo, tais como DHFR, timidino quinase, metalotioneína I e II, preferencialmente genes de metalotioneína de primatas, adenosino desaminase, ornitino descarboxilase etc.
[0226] Células transformadas com o gene de seleção de DHFR, por exemplo, são identificadas em primeiro lugar por meio da cultura de todos os transformadores em meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), antagonista concorrente de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada, ao empregar-se DHFR do tipo selvagem, é a linhagem de células de ovário de hamster chinês (CHO) com deficiência da atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).
[0227] Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente hospedeiros do tipo selvagem que contêm DHFR endógeno) transformadas ou cotransformadas com seqüências de DNA que codificam um anticorpo, proteína DHFR do tipo selvagem e outro marcador selecionável tal como aminoglicosídeo 3’-fosfotransferase (APH) podem ser selecionadas por meio de crescimento celular em meio que contém agente de seleção para o marcador selecionável tal como antibiótico aminoglicosídico, por exemplo canamicina, neomicina ou G418. Vide a Patente Norte-Americana n° 4.965.199.
(iv) COMPONENTE PROMOTOR
[0228] Os vetores de clonagem e de expressão normalmente contêm promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é ligado operativamente ao ácido nucléico do polipeptídeo de anticorpo. São conhecidas seqüências promotoras para eucariontes. Virtualmente, os genes aleucarióticos contêm região rica em AT localizada a cerca de 25 a 30 bases acima do sítio em que se inicia a transcrição. Outra seqüência encontrada a 70 até 80 bases acima do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, em que N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3’ da maior parte dos genes eucarióticos, encontra-se seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adição da extremidade póli A à extremidade 3’ da seqüência de codificação. Todas essas seqüências são inseridas adequadamente em vetores de expressão eucarióticos.
[0229] A transcrição de polipeptídeos de anticorpos a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir dos genomas de vírus tais como vírus de polioma, vírus da catapora, adenovírus (tal como Adenovírus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, tais como o promotor de actina ou promotor de imunoglobulina, de promotores de choque de calor, desde que esses promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.
[0230] Os promotores inicial e posterior do vírus SV40 são convenientemente obtidos na forma de fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem viral de reprodução de SV40. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é obtido convenientemente na forma de fragmento de restrição HindIII E. Um sistema de expressão de DNA em hospedeiros mamíferos, utilizando o vírus de papiloma bovino como vetor, é descrito na Patente Norte-Americana n° 4.419.446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente Norte-Americana n° 4.601.978. Vide também Reyes et al, Nature 297: 598-601 (1982) sobre a expressão de cDNA de β- interferona humana em células de camundongos sob o controle de promotor timidino quinase de vírus simplex da herpes. Alternativamente pode-se utilizar a repetição de terminal longo do Vírus Sarcoma de Rous como promotor.
(v) COMPONENTE ELEMENTO AMPLIFICADOR
[0231] A transcrição de DNA codificador do polipeptídeo de anticorpo de acordo com a presente invenção por eucariotes superiores é freqüentemente aumentada por meio da inserção de seqüência amplificadora no vetor. Muitas seqüências amplificadoras são agora conhecidas a partir de genes mamíferos (globina, elastase, albumina, a-fetoproteína e insulina). Tipicamente, entretanto, utilizar-se-á amplificador de vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o amplificador SV40 do lado posterior da origem de reprodução (bp 100-270), o amplificador promotor precoce de citomegalovírus, o amplificador de polioma do lado posterior da origem de reprodução e amplificadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297: 17-18 (1982) sobre elementos amplificadores para a ativação de promotores eucarióticos. O amplificador pode também ser dividido no vetor em posição 5’ ou 3’ para a seqüência codificadora de polipeptídeos de anticorpos, mas encontra-se localizado preferencialmente em local a 5’ do promotor.
(VI) COMPONENTE DE TÉRMINO DE TRANSCRIÇÃO
[0232] Vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas também conterão tipicamente seqüências necessárias para o término de transcrição e para a estabilização do mRNA. Essas seqüências são normalmente disponíveis a partir das regiões não traduzidas 5’ e, ocasionalmente, 3’ dos DNAs ou cDNAs virais ou eucarióticos. Essas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos na forma de fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do mRNA codificador de anticorpo. Um componente de término de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Vide WO 94/11026 e o vetor de expressão nela descrito.
(vii) SELEÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[0233] Células hospedeiras apropriadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores do presente incluem as células eucarióticas superiores descritas no presente, incluindo células hospedeiras de vertebrados. A propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou- se procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens celulares de hospedeiros mamíferos úteis são linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al, J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77: 4216 (1980)); células sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al, Annals N. Y. Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e linhagem de hepatoma humano (Hep G2).
[0234] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de clonagem ou de expressão descritos acima para a produção de anticorpos e cultivadas em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropriado para a indução de promotores, seleção de transformadores ou amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas.
(viii) CULTURA DAS CÉLULAS HOSPEDEIRAS
[0235] As células hospedeiras utilizadas para a produção de anticorpo de acordo com a presente invenção podem ser cultivadas em uma série de meios. Meios disponíveis comercialmente tais como F10 de Ham (Sigma-Aldrich, St. Louis MO, E. U. A.), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) e Meio Eagle Modificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma) são apropriados para a cultura das células hospedeiras. Além disso, qualquer dos meios descritos em Ham et al, Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al, Anal. Biochem. 102: 255 (1980), Patentes Norte-Americanas n° 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ou Patente Norte-Americana Ref. 30.985 podem ser utilizados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer desses meios pode ser suplementado conforme o necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como droga GENTAMYCIN®), elementos de traço (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar) e glicose ou fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário pode também ser incluído em concentrações apropriadas que seriam conhecidas dos técnicos no assunto. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e similares, são as utilizadas anteriormente com a célula hospedeira selecionada para expressão e serão evidentes para os técnicos comuns no assunto. (ix) PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO
[0236] Ao utilizar-se técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido de forma intracelular ou secretado diretamente para o meio. Caso o anticorpo seja produzido de forma intracelular, como primeira etapa, os fragmentos particulados, sejam eles células hospedeiras ou fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por meio de centrifugação ou ultrafiltragem. Quando o anticorpo for secretado para o meio, sobrenadantes desses sistemas de expressão são geralmente concentrados em primeiro lugar utilizando filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, tal como unidade de ultrafiltragem Amicon ou Millipore Pellicon. Inibidor de protease, tal como PMSF, pode ser incluído em qualquer das etapas acima para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para evitar o crescimento de contaminantes imprevistos.
[0237] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese de gel, diálise e cromatografia de afinidade, em que cromatografia de afinidade é a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do isotipo de qualquer domínio Fc de imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A Proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que se baseiem em cadeias pesadas y1, y2 ou y4 humanas (Lindmark et al, J. Immunol. Meth. 62: 1-13 (1983)). Recomenda-se Proteína G para todos os isotipos de camundongos e para y3 humano (Guss et al, EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)). A matriz à qual é ligado o ligante de afinidade é mais freqüentemente agarose, mas outras matrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tais como vidro de poros controlados ou póli(estirenodivinil)benzeno, permitem velocidades de fluxo mais altas e tempos de processamento mais curtos que o que pode ser atingido com agarose. Quando o anticorpo compreender domínio CH3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg NJ) é útil para purificação. Outras técnicas de purificação de proteínas, tais como o fracionamento sobre coluna de troca de íons, precipitação em etanol, HPLC de Fase Reversa, cromatografia sobre sílica, cromatografia sobre heparina SEPHAROSE®, cromatografia sobre resina de intercâmbio de ânions ou cátions (tal como coluna de ácido poliaspártico), cromatoconcentração, SDS-PAGE e precipitação de sulfato de amônia, também são disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.
[0238] Após qual(is)quer etapa(s) de purificação preliminar(es), a mistura que compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH, utilizando tampão de eluição sob pH de cerca de 2,5 a 4,5, preferencialmente realizada sob baixas concentrações de sais (por exemplo, cerca de 0 a 0,25 M de sal).
TESTES DE ATIVIDADE
[0239] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser caracterizados pelas suas propriedades físico-químicas e funções biológicas por meio de vários testes conhecidos na técnica.
[0240] As imunoglobulinas purificadas podem ser adicionalmente caracterizadas por uma série de testes que incluem, mas sem limitar-se a seqüenciamento N-terminal, análise de aminoácidos, cromatografia de líquidos sob alta pressão (HPLC) de exclusão de tamanho não desnaturante, espectrometria de massa, cromatografia de troca de íons e digestão de papaína.
[0241] Em certas realizações da presente invenção, as imunoglobulinas produzidas no presente são analisadas para determinar a sua atividade biológica. Em algumas realizações, as imunoglobulinas de acordo com a presente invenção são testadas para determinar a sua atividade de ligação de antígenos. Os testes de ligação de antígenos que são conhecidos na técnica e podem ser utilizados no presente incluem, sem limitação, quaisquer testes de ligação direta ou competitiva utilizando métodos tais como Western Blot, radioimunotestes, ELISA (teste imunoabsorvente ligado por enzimas), imunotestes de “sanduíche”, testes de imunoprecipitação, imunotestes fluorescentes e imunotestes de proteína A. Um teste de ligação de antígenos ilustrativo é fornecido abaixo no capítulo de Exemplos.
[0242] Em uma realização, a presente invenção contempla um anticorpo alterado que possui algumas mas não todas as funções efetoras, o que o torna candidato desejado para muitas aplicações nas quais a meia vida do anticorpo in vivo é importante, mas certas funções efetoras (tais como complemento e ADCC) são desnecessárias ou prejudiciais. Em certas realizações, as atividades de Fc da imunoglobulina produzida são medidas para garantir que somente as propriedades desejadas sejam mantidas. Testes de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/esgotamento das atividades de CDC e/ou ADCC. Testes de ligação de receptores Fc (FcR), por exemplo, podem ser conduzidos para garantir que o anticorpo não apresente ligação de FcyR (portanto, propenso a não apresentar atividade de ADCC), mas retenha a capacidade de ligação de FcRn. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam unicamente FcyRIII, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3 da página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Um exemplo de teste in vitro para determinar a atividade de ADCC de uma molécula de interesse é descrito na Patente Norte-Americana n° 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e células Matadoras Naturais (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, tal como em modelo animal como o descrito em Clynes et al, PNAS (U. S. A.) 95: 652-656 (1998). Testes de ligação de C1q podem também ser conduzidos para confirmar que o anticorpo é incapaz de ligar C1q e, desta forma, não apresenta atividade de CDC. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado teste de CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163 (1996). Determinações da ligação de FcRn e meia vida/liberação in vivo podem também ser realizadas utilizando métodos conhecidos na técnica, tais como os descritos no capítulo de Exemplos.
ANTICORPOS HUMANIZADOS
[0243] A presente invenção engloba anticorpos humanizados. Vários métodos de humanização de anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Um anticorpo humanizado pode conter, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentemente denominados resíduos “importados”, que são tomados tipicamente de domínio variável “importado”. A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al (1986), Nature 321: 522-525; Riechmann et al (1988), Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al (1988), Science 239: 1534-1536), por meio da substituição de seqüências de regiões hipervariáveis pelas seqüências correspondentes de anticorpo humano. Conseqüentemente, esses anticorpos “humanizados” são anticorpos quiméricos (Patente Norte-Americana n° 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.
[0244] A seleção de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem utilizados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o chamado método de “melhor adequação”, a seqüência do domínio variável de anticorpo de roedor é selecionada em comparação com toda a biblioteca de seqüências de domínio variável humanas conhecidas. A seqüência humana que é mais próxima da do roedor é aceita como a região de estrutura humana para o anticorpo humanizado (Sims et al (1993), J. Immunol. 151: 2296; Chothia et al (1987), J. Mol. Biol. 196: 901. Outro método utiliza estrutura específica derivada da seqüência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 89: 4285 (1992); Presta et al (1993), J. Immunol., 151: 2623.
[0245] É adicionalmente importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados por meio de processo de análise das seqüências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de possíveis seqüências de imunoglobulina selecionadas. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da possível seqüência de imunoglobulina, ou seja, a análise de resíduos que influenciam a capacidade da possível imunoglobulina de ligar o seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências receptora e importada para atingir a característica de anticorpo desejada, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) alvo. Geralmente, os resíduos da região hipervariável são direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos.
VARIANTES DE ANTICORPOS
[0246] Em um aspecto, a presente invenção fornece fragmentos de anticorpos que compreendem modificações na interface de polipeptídeos Fc que compreendem a região Fc, em que as modificações facilitam e/ou promovem a heterodimerização. Estas modificações compreendem a introdução de protuberância em primeiro polipeptídeo de Fc e cavidade em segundo polipeptídeo de Fc, em que a protuberância pode ser posicionada na cavidade de forma a promover a formação de complexos dos primeiro e segundo polipeptídeos de Fc. Métodos de geração de anticorpos com estas modificações são conhecidos na técnica, tais como os descritos na Patente Norte-Americana n° 5.731.168.
[0247] Em algumas realizações é (são) contemplada(s) modificação(ões) de seqüência de aminoácidos dos anticorpos descritos no presente. Pode ser desejável, por exemplo, aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Variantes de seqüências de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio da introdução de mudanças de nucleotídeos apropriadas no ácido nucléico do anticorpo, ou por meio da síntese de peptídeos. Essas modificações incluem, por exemplo, exclusões e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas seqüências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de exclusão, inserção e substituição é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações de aminoácidos podem ser introduzidas na seqüência de aminoácidos de anticorpos em referência no momento em que aquela seqüência é feita.
[0248] Método útil de identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são sítios preferidos para mutagênese é denominado “mutagênese de varredura de alanina”, conforme descrito por Cunningham e Wells (1989), Science, 244: 1081-1085. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos desejados é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys e glu) e substituído por aminoácido neutro ou negativamente carregado (de maior preferência alanina ou polialanina) para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno. Esses sítios de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições são refinados em seguida por meio da introdução de outras variantes ou adicionais nos sítios de substituição ou para estes. Desta forma, embora o sítio para introdução de variação de seqüência de aminoácidos seja previamente determinado, a natureza intrínseca da mutação não necessita ser previamente determinada. Para analisar o desempenho de mutação em um dado local, por exemplo, varredura de ala ou mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região desejada e as imunoglobulinas expressas são selecionadas em busca da atividade desejada.
[0249] As inserções de seqüências de aminoácidos incluem fusões de terminais carboxila e/ou amino que variam de comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contenham cem ou mais resíduos, bem como inserções intra- seqüenciais de resíduos de aminoácidos isolados ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem anticorpo com resíduo de metionila N-terminal ou o anticorpo fundido a polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou polipeptídeo que aumente a meia vida do anticorpo em soro.
[0250] Outro tipo de variante é variante de substituição de aminoácidos. Estas variantes contêm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo substituída por resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese de substituição incluem as regiões hipervariáveis, mas também são contempladas alterações de FR. Substituições conservadoras são exibidas na Tabela 2 sob o título “substituições preferidas”. Caso essas substituições resultem em mudança da atividade biológica, mudanças mais substanciais, denominadas “exemplos de substituições” na Tabela 2 ou conforme descrito adicionalmente abaixo com referência a classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos são selecionados. TABELA 2
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[0251] Modificações substanciais das propriedades biológicas do anticorpo são atingidas por meio da seleção de substituições que difiram significativamente de efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, tal como na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no local desejado; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as similaridades das propriedades das suas cadeias laterais (em A. L. Lehninger, Biochemistry, segunda edição, págs. 73-75, Worth Publishers, Nova Iorque (1975)): (1) não polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) polares não carregados: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His(H) Alternativamente, os resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbicos:Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeias: Gly, Pro; e (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[0252] Substituições não conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe. Esses resíduos substituídos podem também ser introduzidos nos sítios de substituição conservadores ou, de maior preferência, nos sítios restantes (não conservados).
[0253] Um tipo de variante de substituição envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de anticorpo parental (por exemplo, anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para desenvolvimento adicional terá(ão) propriedades biológicas aprimoradas com relação ao anticorpo parental do qual é (são) gerado(s). Uma forma conveniente de geração dessas variantes de substituição envolve a maturação por afinidade utilizando exibição de fagos. Resumidamente, diversos sítios de regiões hipervariáveis (por exemplo, seis a sete sítios) sofrem mutações para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cada sítio. Os anticorpos gerados desta forma são exibidos a partir de partículas de fagos filamentosos na forma de fusões para o produto de gene III de M13 embalado em cada partícula. As variantes exibidas por fago são selecionadas em seguida de acordo com a sua atividade biológica (tal como afinidade de ligação), da forma descrita no presente. A fim de identificar possíveis sítios de regiões hipervariáveis para modificação, mutagênese de varredura de alanina pode ser realizada para identificar resíduos de regiões hipervariáveis que contribuem significativamente para a ligação de antígenos. Alternativa ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar estrutura de cristal do complexo de antígeno e anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição de acordo com as técnicas elaboradas no presente. Após a geração dessas variantes, o quadro de variantes é submetido a seleção conforme descrito no presente e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais testes relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.
[0254] Moléculas de ácidos nucléicos que codificam variantes da seqüência de aminoácidos do anticorpo são preparadas por meio de uma série de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas sem limitar-se ao isolamento a partir de fonte natural (no caso de variantes de seqüências de aminoácidos de ocorrência natural) ou preparação por meio de mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou dirigida para local), mutagênese de PCR e mutagênese de conjunto de uma variante preparada anteriormente ou versão não variante do anticorpo.
[0255] Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de aminoácidos em região Fc dos polipeptídeos de imunoglobulina de acordo com a presente invenção, de forma a gerar variante de região Fc. A variante de região Fc pode compreender seqüência de região Fc humana (tal como região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende modificação de aminoácidos (tal como substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos, incluindo a de cisteína de articulação.
[0256] De acordo com o presente relatório descritivo e os ensinamentos da técnica, contempla-se que, em algumas realizações, um anticorpo utilizado em métodos de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou mais alterações em comparação com o anticorpo parceiro do tipo selvagem, por exemplo, na região Fc. Estes anticorpos, entretanto, reteriam substancialmente as mesmas características necessárias para utilidade terapêutica em comparação com o seu parceiro do tipo selvagem. Acredita-se, por exemplo, que podem ser realizadas certas alterações na região Fc que resultariam em ligação de C1q alterada (ou seja, aumentada ou reduzida) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), conforme descrito, por exemplo, em WO 99/51642. Vide também Duncan e Winter, Nature 322: 738-40 (1988); Patente Norte-Americana n° 5.648.260; Patente Norte-Americana n° 5.624.821; e WO 94/29351 com referência a outros exemplos de variantes de região Fc.
IMUNOCONJUGADOS
[0257] A presente invenção também se refere a imunoconjugados, ou conjugados de droga e anticorpo (ADC), que compreendem anticorpo conjugado a agente citotóxico tal como agente quimioterápico, droga, agente inibidor do crescimento, toxina (tal como toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou seus fragmentos) ou isótopo radioativo (ou seja, radioconjugado).
[0258] O uso de conjugados de droga e anticorpo para fornecimento local de agentes citotóxicos ou citostáticos, ou seja, drogas para matar ou inibir células tumorais no tratamento de câncer (Syrigos e Epenetos (1999), Anticancer Research 19: 605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997), Adv. Drg Del. Rev. 26: 151-172; Patente Norte-Americana n° 4.975.278) teoricamente permite o fornecimento dirigido da porção de droga a tumores e seu acúmulo intracelular, em que a administração sistêmica desses agentes de drogas não conjugados pode resultar em níveis inaceitáveis de toxicidade para células normais, bem como para as células tumorais que se busca eliminar (Baldwin et al (1986), Lancet, págs. (quinze de março de 1986): 603-05; Thorpe (1985), Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review em Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, A. Pinchera et al (eds.), págs. 475-506). Busca-se por este intermédio eficácia máxima com toxicidade mínima. Tanto anticorpos policlonais quanto anticorpos monoclonais foram relatados como sendo úteis nestas estratégias (Rowland et al (1986), Cancer Immunol. Immunother. 21: 183-87). As drogas utilizadas nestes métodos incluem daunomicina, doxorubicina, metotrexato e vindesina (Rowland et al (1986), acima). As toxinas utilizadas em conjugados de anticorpo e toxina incluem toxinas bacterianas tais como toxina de difteria, toxinas vegetais tais como rícino, toxinas de moléculas pequenas tais como geldanamicina (Mandler et al (2000), Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92 (19): 1573-1581; Mandler et al (2000), Bioorganic & Med. Chem. Letters 10: 1025-1028; Mandler et al (2002) Bioconjugate Chem. 13: 786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al (1996), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 8618-8623) e caliqueamicina (Lode et al (1998), Cancer Res. 58: 2928; Hinman et al (1993), Cancer Res. 53: 3336- 3342). As toxinas podem exercer seus efeitos citotóxicos e citostáticos por meio de mecanismos que incluem ligação de tubulina, ligação de DNA ou inibição da topoisomerase. Algumas drogas citotóxicas tendem a ser inativas ou menos ativas quando conjugadas a anticorpos grandes ou ligantes de receptores de proteínas.
[0259] ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec) é conjugado de anticorpo e radioisótopo composto de anticorpo monoclonal capa IgG1 murino dirigido contra o antígeno CD20 encontrado sobre a superfície de linfócitos B normais e malignos e radioisótopo 111In ou 90Y ligado por quelante- ligante de tioruéia (Wiseman et al (2000), Eur. Jour. Nucl. Med. 27 (7): 766-77; Wiseman et al (2002), Blood 99 (12): 4336-42; Witzig et al (2002), J. Clin. Oncol. 20 (10): 2453-63; Witzig et al (2002), J. Clin. Oncol. 20 (15): 3262-69). Embora ZEVALIN apresente atividade contra Linfoma não de Hodgkin (NHL) de células B, a administração resulta em citopenias severas e prolongadas na maior parte dos pacientes. MYLOTARG® (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals), conjugado de droga e anticorpo composto de anticorpo CD33 hu ligado a caliqueamicina, foi aprovado em 2000 para o tratamento de leucemia mielóide aguda por meio de injeção (Drugs of the Future (2000) 25 (7): 686; Patentes Norte-Americanas n° 4.970.198, 5.079.233, 5.585.089, 5.606.040, 5.693.762, 5.739.116, 5.767.285 e 5.773.001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), conjugado de droga e anticorpo composto do anticorpo huC242 ligado por meio do ligante de dissulfeto SPP à porção de droga maitansenóide, DM1, está avançando para testes de Fase II para o tratamento de cânceres que expressam CanAg, tais como cólon, pancreático, gástrico e outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), conjugado de droga e anticorpo composto do anticorpo monoclonal de antígeno de membrana específico anti-próstata (PSMA) ligado à porção de droga maitansinóide, DM1, encontra-se em desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores da próstata. Os peptídeos de auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMAE) e análogos sintéticos de dolastatina, foram conjugados a anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específicos para Lewis Y sobre carcinomas) e cAC10 (específicos para CD30 sobre malignidades hematológicas) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21 (7): 778-784; e Francisco et al (2003) Blood, 102, 1458-1465) e encontram-se em desenvolvimento terapêutico. Outros compostos para uso como agentes citotóxicos conjugados de drogas incluem, sem limitação, auristatina E (AE), MMAF (variante de auristatina E (MMAE) com fenilalanina no terminal C da droga) e AEVB (auristatina E valeril benzil hidrazona, ligante instável em ácido por meio do terminal C de AE). Ligantes conjugados úteis para fixar droga a anticorpo incluem, sem limitação, MC (maleimidocaproil), Val Cit (valino- citrulina, sítio de dipeptídeo em ligante divisível de protease), Citrulina (ácido 2- amino-5-ureido pentanóico), PAB (p-aminobenzilcarbamoil), parte “autoimolante” do ligante), Me (N-metil-valino citrulina, em que a ligação de peptídeo ligante foi modificada para evitar a sua divisão por catepsina B), MC(PEG)6-OH (maleimidocaproil-polietileno glicol, ligado a cisteínas de anticorpos), SPP (4-(2-piridiltio) pentanoato de N-succinimidila) e SMCC (4-(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidila). Estes e outros conjugados de drogas úteis e sua preparação são descritos, por exemplo, em Doronina, S. O. et al, Nature Biotechnology 21: 778-794 (2003), integralmente incorporado ao presente como referência. Moléculas ligantes particularmente preferidas incluem, por exemplo, 3-(2-piridiltio)propionato de N-succinimidila (SPDP) (vide, por exemplo, Carlsson et al, Biochem. J., 173, 723-737 (1978)), 4-(2-piridiltio)butanoato de N-succinimidila (SPDB) (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.563.304), 4-(2-piridilditio)pentanoato de N- succinimidila (SPP) (vide, por exemplo, Registro CAS n° 341498-08-6), 4-(N- maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato de N-succinimidila (SMCC) (vide, por exemplo, Yoshitake et al, Eur. J. Biochem., 101, 395-399 (1979)) e 4-metil-4-[2- (5-nitro-piridil)-ditio]pentanoato de N-succinimidila (SMNP) (vide, por exemplo, a Patente Norte-Americana n° 4.563.304).
[0260] Os agentes quimioterápicos úteis na geração desses imunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de ligação da toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Uma série de radionucletos é disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re. Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico são fabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como propionato de N-succinimidil-3-(2- piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6- diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro- 2,4-dinitrobenzeno). Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo, conforme descrito em Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO WO94/11026.
[0261] Os conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de moléculas pequenas, tais como caliqueamicina, maitansinóides, tricoteceno e CC1065, e os derivados dessas toxinas que apresentam atividade de toxina também são contemplados no presente.
MAITANSINA E MAITANSINÓIDES
[0262] Em uma realização, um anticorpo (comprimento total ou fragmentos) de acordo com a presente invenção é conjugado a uma ou mais moléculas de maitansinóide.
[0263] Maitansinóides são inibidores mitotóticos que agem por meio da inibição da polimerização de tubulina. Maitansina foi isolada pela primeira vez a partir do arbusto do leste africano Maytenus serrata (Patente Norte-Americana n° 3.896.111). Descobriu-se em seguida que certos micróbios também produzem maitansinóides, tais como maitansinol e ésteres C-3 maitansinol (Patente Norte-Americana n° 4.151.042). Maitansinol sintético, seus derivados e análogos são descritos, por exemplo, nas Patentes Norte- Americanas n° 4.137.230, 4.248.870, 4.256.746, 4.260.608, 4.265.814, 4.294.757, 4.307.016, 4.308.268, 4,308,269, 4.309.428, 4.313.946, 4.315.929, 4.317.821, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650, 4.364.866, 4.424.219, 4.450.254, 4.362.663 and 4.371.533, cujos relatórios descritivos são expressamente incorporados ao presente como referência.
CONJUGADOS DE ANTICORPO E MAITANSINÓIDE
[0264] Em tentativa de aumento do seu índice terapêutico, maitansina e maitansinóides foram conjugados a anticorpos que se ligam especificamente a antígenos de células tumorais. Imunoconjugados contendo maitansinóides e sua utilização terapêutica são descritos, por exemplo, nas Patentes Norte-Americanas n° 5.208.020, 5.416.064 e Patente Européia n° EP 0.425.235 B1, cujos relatórios descritivos são expressamente incorporados ao presente como referência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93: 86188623 (1993) descreveram imunoconjugados que compreendem maitansinóide denominado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 dirigido a câncer colo- retal humano. Concluiu-se que o conjugado é altamente citotóxico com direção a células cancerosas do cólon cultivadas e exibiu atividade antitumoral em teste de crescimento tumoral in vivo. Chari et al, Cancer Research 52: 127-131 (1992) descrevem imunoconjugados em que um maitansinóide foi conjugado, por meio de ligação de dissulfeto, ao anticorpo A7 murino que se liga a um antígeno sobre linhagens de células de câncer do cólon humano ou a outro anticorpo monoclonal murino TA.1 que liga o oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado de TA.1 e maitansinóide foi testada in vitro sobre a linhagem de células de câncer de mama humano SK-BR-3, que expressa 3 x 105 antígenos de superfície HER-2 por célula. O conjugado de drogas atingiu grau de citotoxicidade similar à droga de maitansinóide livre, que poderá ser aumentada por meio do aumento da quantidade de moléculas de maitansinóide por molécula de anticorpo. O conjugado de A7 e maitansinóide exibiu baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos.
CONJUGADOS DE MAITANSINÓIDE E ANTICORPO (IMUNOCONJUGADOS)
[0265] Os conjugados de maitansinóide e anticorpo são preparados por meio da ligação química de anticorpo a molécula de maitansinóide sem reduzir significativamente a atividade biológica do anticorpo ou da molécula de maitansinóide. Em média, três a quatro moléculas de maitansinóide conjugadas por molécula de anticorpo exibiram eficácia no aumento da citotoxicidade de células alvo sem afetar negativamente a função ou solubilidade do anticorpo, embora se esperasse que até uma molécula de toxina/anticorpo aumentasse a citotoxicidade sobre o uso de anticorpo puro. Maitansinóides são bem conhecidos na técnica e podem ser sintetizados por meio de técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais. Maitansinóides apropriados são descritos, por exemplo, na Patente Norte- Americana n° 5.208.020 e nas outras patentes e publicações não patenteadas descritas acima no presente. Os maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos de maitansinol modificados no anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tais como diversos ésteres de maitansinol.
[0266] Existem vários grupos de ligação conhecidos na técnica para a fabricação de conjugados de anticorpo e maitansinóide, que incluem, por exemplo, os descritos na Patente Norte-Americana n° 5.208.020 ou Patente EP 0.425.235 B1 e Chari et al, Cancer Research 52: 127-131 (1992). Os grupos de ligação incluem grupos de dissulfeto, grupos de tioéter, grupos instáveis ácidos, grupos fotoinstáveis, grupos instáveis de peptidase ou grupos instáveis de esterase, conforme descrito nas patentes identificadas acima, em que grupos de dissulfeto e tioéter são preferidos.
[0267] Os conjugados do anticorpo e maitansinóide podem ser fabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidila (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de di-succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)- etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Os agentes acopladores particularmente preferidos incluem propionato de N- succinimidil-3-(2-piridiltio) (SPDP) (Carlsson et al, Biochem. J. 173: 723-737 (1978)) e pentanoato de N-succinimidil-4-(2-piridiltio) (SPP) para proporcionar ligação de dissulfeto.
[0268] O ligante pode ser ligado à molécula de maitansinóide em diversas posições, dependendo do tipo da ligação. Ligação éster pode ser formada, por exemplo, por meio de reação com grupo hidroxila, utilizando-se técnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3 que contém um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 modificada com grupo hidroxila e na posição C-20 que contém grupo hidroxila. Em realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 de maitansinol ou análogo de maitansinol.
CALIQUEAMICINA
[0269] Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família caliqueamicina de antibióticos é capaz de produzir rupturas de DNA de fita dupla em concentrações subpicomolares. Para a preparação de conjugados da família de caliqueamicina, vide as Patentes Norte-Americanas n° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 e 5.877.296 (todas da American Cyanamid Company). Análogos estruturais de caliqueamicina que podem ser utilizados incluem, mas sem limitar-se a y1I, a2I, as’, N-acetil-y1I, PSAG e θ’1 (Hinman et al, Cancer Research, 53: 3336-3342 (1993), Lode et al, Cancer Research, 58: 2925-2928 (1998) e as Patentes Norte-Americanas da American Cyanamid mencionadas acima). Outra droga antitumoral à qual o anticorpo pode ser conjugado é QFA, que é antifolato. Tanto caliqueamicina quanto QFA contêm sítios intracelulares de ação e não cruzam facilmente a membrana plasmática. Portanto, a absorção celular desses agentes por meio de internalização mediada por anticorpos aumenta grandemente os seus efeitos citotóxicos. OUTROS AGENTES CITOTÓXICOS
[0270] Outros agentes anti-tumores que podem ser conjugados aos anticorpos de acordo com a presente invenção incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e 5-fluorouracil, família de agentes conhecida coletivamente como complexo LL-E33288, descrito nas Patentes Norte- Americanas n° 5.053.394 e 5.770.710, bem como esperamicinas (Patente Norte-Americana n° 5.877.296).
[0271] Toxinas enzimaticamente ativas e seus fragmentos que podem ser utilizados incluem cadeia de difteria A, fragmentos ativos não de ligação de toxina de difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia rícina A, cadeia de abrina A, cadeia modeccin A, alfa- sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcin, crotin, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogelin, restrictocin, fenomicin, enomicin e os tricotecenos. Vide, por exemplo, WO 93/21232, publicada em 28 de outubro de 1993.
[0272] A presente invenção contempla adicionalmente um imunoconjugado formado entre anticorpo e composto com atividade nucleolítica (por exemplo, ribonuclease ou endonuclease de DNA, tal como desoxirribonuclease; DNase).
[0273] Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo. Uma série de isótopos radioativos é disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado for utilizado para detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, tal como tc99m ou I123, ou marca de centrifugação para formação de imagens por meio de ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como formação de imagens por ressonância magnética, MRI), tal como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[0274] As rádio-marcas ou outras podem ser incorporadas ao conjugado de formas conhecidas. O peptídeo pode ser, por exemplo, biossintetizado ou pode ser sintetizado por meio de síntese química de aminoácidos, utilizando precursores de aminoácidos apropriados, envolvendo, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcas tais como tc99m, I123, Re186, Re188 e In111 podem ser ligadas por meio de resíduo de cisteína no peptídeo. Ítrio-90 pode ser ligado por meio de resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun. 80 (49-57) pode ser utilizado para incorporar iodo-123. Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press, 1989) descreve outros métodos em detalhes.
[0275] Os conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser fabricados utilizando uma série de agentes acopladores de proteínas bifuncionais, tais como 3-(2-piridilditiol)propionato de N-succinimidila (SPDP), ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4-(N-maleimidometila), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila HCl), ésteres ativos (tais como suberato de di- succinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos bis-azido (tais como bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados bis-diazônio (tais como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tais como 2,6-diisocianato de tolueno) e compostos de flúor bis-ativo (tais como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Imunotoxina rícina pode ser preparada, por exemplo, conforme descrito em Vitetta et al, Science 238: 1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentaacético marcado por carbono 14 (MX-DTPA) é exemplo de agente quelante para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante divisível” que possibilita a liberação da droga citotóxica na célula. Pode-se utilizar, por exemplo, ligante instável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante fotoinstável, ligante de dimetila ou ligante que contém dissulfeto (Chari et al, Cancer Research 52: 127-131 (1992); Patente Norte-Americana n° 5.208.020).
[0276] Os compostos de acordo com a presente invenção contemplam expressamente, mas sem limitar-se a ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo- KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (benzoato de succinimidil-(4-vinilsulfona)) que são disponíveis comercialmente (tal como por meio da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL, E. U. A.). Vide páginas 467 a 498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.
PREPARAÇÃO DE CONJUGADOS DE ANTICORPO E DROGA
[0277] Nos conjugados de anticorpo e droga (ADC) de acordo com a presente invenção, um anticorpo (Ab) é conjugado a uma ou mais porções de droga (D), tal como cerca de uma a cerca de vinte moléculas de droga por anticorpo, por meio de ligante (L). O ADC da Fórmula I pode ser preparado por vários caminhos, empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos dos técnicos no assunto, que incluem: (1) reação de grupo nucleofílico de anticorpo com reagente de ligante bivalente, para formar Ab-L, por meio de ligação covalente, seguida por reação com porção de droga D; e (2) reação de grupo nucleofílico de uma porção de droga com reagente ligante bivalente, para formar D-L, por meio de ligação covalente, seguida por reação com o grupo nucleofílico de anticorpo. Ab-(L-D)p I
[0278] Os grupos nucleofílicos sobre anticorpos incluem, mas sem limitar-se a: (i) grupos amina N-terminais, (ii) grupos amina de cadeia lateral, tais como lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, tais como cisteína, e (iv) grupos amino ou hidroxil açúcar em que o anticorpo é glicosilado. Amina, tiol e grupos hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos sobre porções ligantes e reagentes ligantes, que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida. Certos anticorpos possuem dissulfetos intercadeias redutíveis, ou seja, pontes de cisteína. Os anticorpos podem ser tornados reativos para conjugação com reagentes ligantes por meio de tratamento com agente redutor tal como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína formará, portanto, teoricamente, dois nucleófilos de tiol reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos em anticorpos por meio da reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut), o que resulta em conversão de amina em tiol.
[0279] Os conjugados de drogas e anticorpos de acordo com a presente invenção podem também ser produzidos por meio de modificação do anticorpo para introduzir porções eletrofílicas, que podem reagir com substituintes nucleofílicos sobre o reagente ligante ou droga. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes oxidantes de periodato, para formar grupos cetona ou aldeído que podem reagir com o grupo amina de reagentes ligantes ou porções de drogas. Os grupos base Schiff imina resultantes podem formar ligação estável ou podem ser reduzidos, por exemplo, por reagentes de boroidreto para formar ligações de amina estáveis. Em uma realização, a reação da porção carboidrato de anticorpo glicosilado com galactose oxidase ou metaperiodato de sódio pode gerar grupos carbonila (aldeído e cetona) na proteína que podem reagir com grupos apropriados sobre a droga (Hermanson, Bioconjugate Techniques). Em outra realização, as proteínas que contêm resíduos de serina ou treonina N- terminais podem reagir com metaperiodato de sódio, resultando na produção de aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan e Stroh (1992), Bioconjugate Chem. 3: 138-146; US 5.362.852). Esse aldeído pode ser reagido com porção de droga ou nucleófilo ligante.
[0280] De forma similar, os grupos nucleofílicos sobre uma porção de droga incluem, mas sem limitar-se a: amina, tiol, hidroxila, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, carboxilato de hidrazina e grupos aril hidrazida capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos sobre porções ligantes e reagentes ligantes, que incluem: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos e haletos ácidos; (ii) haletos de alquila e benzila tais como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida.
[0281] Alternativamente, pode ser fabricada proteína de fusão que compreende o anticorpo e agente citotóxico, por exemplo, por meio de técnicas recombinantes ou síntese de peptídeos. O comprimento de DNA pode compreender regiões correspondentes codificadoras das duas partes do conjugado, sejam elas adjacentes entre si ou separadas por uma região codificadora de peptídeo de ligação que não destrua as propriedades desejadas do conjugado.
[0282] Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um “receptor” (tal como estreptavidina) para utilização em pré-direcionamento de tumores, em que o conjugado de anticorpo e receptor é administrado ao paciente, seguido pela remoção de conjugado desligado da circulação, utilizando agente limpante e, em seguida, administração de “ligante” (tal como avidina) que é conjugado a agente citotóxico (tal como radionucleotídeo).
DERIVADOS DE ANTICORPOS
[0283] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser adicionalmente modificados para que contenham porções não proteináceas adicionais que são conhecidas na técnica e facilmente disponíveis. Preferencialmente, as porções apropriadas para derivação do anticorpo são polímeros hidrossolúveis. Exemplos não limitadores de polímeros hidrossolúveis incluem, mas sem limitar-se a polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol e propileno glicol, carboximetilcelulose, dextran, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1, 3, 6-trioxano, copolímero de etileno e anidrido maleico, poliaminoácidos (homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextran ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de polipropileno e óxido de etileno, polióis polioxietilados (tais como glicerol), álcool polivinílico e suas misturas. Propionaldeído de polietileno glicol pode apresentar vantagens de fabricação devido à sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. A quantidade de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e, caso mais de um polímero seja ligado, eles podem ser moléculas idênticas ou diferentes. Geralmente, a quantidade e/ou o tipo de polímeros utilizados para derivação podem ser determinados com base em considerações que incluem, mas sem limitar-se às propriedades ou funções específicas do anticorpo a ser aprimorado, se o derivado de anticorpo será utilizado em terapia sob condições definidas etc.
FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[0284] Formulações terapêuticas que compreendem um anticorpo de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenagem por meio da mistura do anticorpo que possui o grau desejado de pureza com veículos, excipientes ou estabilizantes fisiologicamente aceitáveis opcionais (Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma de soluções aquosas, formulações liofilizadas ou outras secas. Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são atóxicos para pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos, antioxidantes que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquil parabens tais como metil ou propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol e m- cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de dez resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trehalose ou sorbitol; contraíons formadores de sais, tais como sódio; complexos metálicos (tais como complexos de Zn e proteína); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).
[0285] A formulação do presente pode também conter mais de um composto ativo conforme o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se prejudiquem entre si. Essas moléculas encontram-se adequadamente presentes em combinação, em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[0286] Os ingredientes ativos podem também ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por meio de técnicas de aglutinação ou por polimerização interfacial, tais como hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de póli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).
[0287] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isso é facilmente obtido por meio de filtragem através de membranas de filtragem estéreis.
[0288] Podem ser fabricadas preparações de liberação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de liberação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm a imunoglobulina de acordo com a presente invenção, matrizes estas que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes com liberação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli(2-hidroxietilmetacrilato) ou álcool (poli)vinílico, polilactídeos (Patente Norte-Americana n° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e y etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato não degradável, copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico degradáveis tais como o LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido póli-D-(-)-3- hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etileno-vinil acetato e ácido láctico- ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de cem dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Quando imunoglobulinas encapsuladas permanecerem no corpo por longo período, elas podem desnaturar-se ou agregar-se como resultado da exposição à umidade a 37 °C, o que resulta em perda da atividade biológica e possíveis mudanças de imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser idealizadas para estabilização, dependendo do mecanismo envolvido. Caso se descubra, por exemplo, que o mecanismo de agregação é a formação de ligação S-S intermolecular por meio de intercâmbio de tio-dissulfeto, pode-se atingir a estabilização por meio da modificação de resíduos sulfidrila, liofilização a partir de soluções ácidas, controle do teor de umidade, uso de aditivos apropriados e desenvolvimento de composições de matriz de polímeros específicas. USOS
[0289] Um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado, por exemplo, em métodos terapêuticos in vitro, ex vivo e in vivo. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados como antagonista para bloquear total ou parcialmente a atividade de antígenos específicos in vitro, ex vivo e/ou in vivo. Além disso, pelo menos alguns dos anticorpos de acordo com a presente invenção podem neutralizar a atividade de antígenos de outras espécies. Conseqüentemente, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para inibir atividade de antígenos específica, tal como em cultura celular que contém o antígeno, em pacientes humanos ou em outros pacientes mamíferos que contêm o antígeno com o qual um anticorpo de acordo com a presente invenção realiza reação cruzada (por exemplo, chimpanzé, babuíno, sagüi, cynomolgus e rhesus, porco ou camundongo). Em uma realização, o anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado para inibir atividades de antígenos por meio de contato do anticorpo com o antígeno, de tal forma que a atividade de antígeno seja inibida. Preferencialmente, o antígeno é molécula de proteína humana.
[0290] Em uma realização, um anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser utilizado em método para inibir antígeno em paciente que sofre de disfunção na qual a atividade de antígeno é prejudicial, que compreende a administração ao paciente de anticorpo de acordo com a presente invenção, de tal forma que a atividade do antígeno no paciente seja inibida. Preferencialmente, o antígeno é molécula de proteína humana e o paciente é paciente humano. Alternativamente, o paciente pode ser mamífero que expressa o antígeno ao qual se liga ao anticorpo de acordo com a presente invenção. Ainda adicionalmente, o paciente pode ser mamífero ao qual o antígeno tenha sido introduzido (por meio, por exemplo, da administração do antígeno ou por meio de expressão de transgene de antígeno). Anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser administrado a paciente humano para propósitos terapêuticos. Além disso, anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser administrado a mamífero não humano que expressa antígeno com o qual a imunoglobulina realiza reação cruzada (tal como primata, porco ou camundongo) para fins veterinários ou como modelo animal de doença humana. Com relação a este último, esses modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos de acordo com a presente invenção (tal como teste de dosagens e períodos de administração). Anticorpos bloqueadores de acordo com a presente invenção que são terapeuticamente úteis incluem, por exemplo, mas sem limitação, anticorpos anti-HER2, anti-VEGF, anti-IgE, anti-CD11, anti-interferona e anti-fator de tecido. Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para tratar, inibir, retardar o andamento, evitar/retardar a reincidência, melhorar ou evitar doenças, disfunções ou condições associadas à expressão e/ou atividade anormal de uma ou mais moléculas de antígenos, incluindo mas sem limitar-se a tumores malignos e benignos; malignidades linfóides e não de leucemias; disfunções neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicas e outras glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocoélicas; e disfunções inflamatórias, angiogênicas e imunológicas.
[0291] Em um aspecto, anticorpo bloqueador de acordo com a presente invenção é específico para antígeno ligante e inibe a atividade de antígeno por meio de bloqueio ou interferência com a interação entre ligante e receptor que envolve o antígeno ligante, de forma a inibir o trajeto de sinal correspondente e outros eventos celulares ou moleculares. A presente invenção também apresenta anticorpos específicos de receptores que não necessariamente evitam a ligação de ligantes, mas interferem com a ativação de receptores, de forma a inibir quaisquer reações que normalmente seriam iniciadas pela ligação de ligantes. A presente invenção também engloba anticorpos que se ligam preferencial ou exclusivamente a complexos de ligante e receptor. Anticorpo de acordo com a presente invenção pode também agir como agonista de receptor de antígeno específico, de forma a potencializar, amplificar ou ativar as atividades totais ou parciais da ativação de receptor mediada por ligante.
[0292] Em certas realizações, imunoconjugado que compreende um anticorpo conjugado a agente citotóxico é administrado ao paciente. Em algumas realizações, o imunoconjugado e/ou antígeno ao qual é ligado é (são) internalizado(s) pela célula, o que resulta em maior eficácia terapêutica do imunoconjugado para matar a célula alvo à qual se liga. Em uma realização, o agente citotóxico dirige-se ou interfere com o ácido nucléico na célula alvo. Exemplos desses agentes citotóxicos incluem quaisquer dos agentes quimioterápicos indicados no presente (tais como maitansinóide ou caliqueamicina), isótopo radioativo, ribonuclease ou DNA endonuclease.
[0293] Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com outras composições em terapia. Anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser coadministrado, por exemplo, com outro anticorpo, agente(s) quimioterápicos(s) (incluindo coquetéis de agentes quimioterápicos), outro(s) agente(s) citotóxico(s), agente(s) antiangiogênico(s), citoquinas e/ou agente(s) inibidor(es) do crescimento. Quando um anticorpo de acordo com a presente invenção inibir o crescimento de tumores, pode ser particularmente desejável combiná-lo com um ou mais agentes terapêuticos diferentes que também inibam o crescimento de tumores. Anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser combinado com anticorpo anti-VEGF (tal como AVASTIN) e/ou anticorpos anti-ErbB (por exemplo, anticorpo anti-HER2 HERCEPTIN®) em esquema de tratamento, tal como no tratamento de qualquer das doenças descritas no presente, incluindo câncer colo-retal, câncer de mama metastático e câncer dos rins. Alternativa ou adicionalmente, o paciente pode receber terapia de radiação combinada (tal como irradiação de feixes externos ou terapia com agente marcado radioativamente, tal como anticorpo). Essas terapias combinadas indicadas acima incluem administração combinada (em que os dois ou mais agentes são incluídos na mesma formulação ou em formulações separadas) e administração separada, caso em que a administração do anticorpo de acordo com a presente invenção pode ocorrer antes e/ou depois da administração da(s) terapia(s) adjunta(s).
[0294] O anticorpo de acordo com a presente invenção (e agente terapêutico adjunto) é (são) administrado(s) por qualquer meio apropriado, que inclui parenteral, subcutâneo, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal ou subcutânea. Além disso, o anticorpo é administrado adequadamente por meio de infusão de pulsos, particularmente com doses decrescentes do anticorpo. A dosagem pode ser fornecida por qualquer via apropriada, tal como por meio de injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo, em parte, de se a administração é rápida ou crônica.
[0295] A composição de anticorpo de acordo com a presente invenção será formulada, dosada e administrada de forma consistente com a boa prática médica. Fatores para consideração neste contexto incluem a disfunção específica sendo tratada, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa da disfunção, o local de fornecimento do agente, o método de administração, o cronograma de administração e outros fatores conhecidos dos praticantes da medicina. O anticorpo não necessita ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para evitar ou tratar a disfunção em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticorpos de acordo com a presente invenção presentes na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente empregados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme utilizado acima no presente ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até aqui.
[0296] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de anticorpo de acordo com a presente invenção (quando utilizado isoladamente ou em combinação com outros agentes tais como agentes quimioterápicos) dependerá do tipo de doença a ser tratado, do tipo de anticorpo, da severidade e do curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente e reação ao anticorpo e do critério do médico atendente. O anticorpo é administrado adequadamente ao paciente em uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (tal como 0,1mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo é possível dose inicial para administração ao paciente, seja, por exemplo, por meio de uma ou mais administrações separadas ou por meio de infusão contínua. Dosagem diária típica poderá variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até que ocorra supressão desejada de sintomas da doença. Um exemplo de dosagem do anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 1 0 mg/kg. Desta forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer de suas combinações) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, tal como semanalmente ou a cada três semanas (por exemplo, de tal forma que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte, tal como cerca de seis doses do anticorpo). Dose de carregamento mais alta inicial, seguida por uma ou mais doses mais baixas, pode ser administrada. Exemplo de regime de dosagem compreende a administração de dose de carregamento inicial de cerca de 4 mg/kg, seguida por dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O andamento desta terapia é facilmente monitorado por meio de técnicas e testes convencionais.
ARTIGOS INDUSTRIALIZADOS
[0297] Em outro aspecto da presente invenção, é fornecido artigo industrializado que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das disfunções descritas acima. O artigo industrializado compreende um recipiente e rótulo ou bula sobre o recipiente ou a ele associado. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas etc. Os recipientes podem ser formados com uma série de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém composição que, por si própria ou quando combinada com outra composição, é eficaz para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter porta de acesso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, saco de solução intravenosa ou ampola que contém tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo da composição é anticorpo de acordo com a presente invenção. O rótulo ou bula indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição específica, tal como câncer. Além disso, o artigo industrializado pode compreender (a) primeiro recipiente com composição nele contida, em que a composição compreende um anticorpo de acordo com a presente invenção; e (b) segundo recipiente com composição nele contida, em que a composição compreende agente citotóxico adicional. O artigo industrializado desta realização da presente invenção pode compreender adicionalmente uma bula que indica que as primeira e segunda composições de anticorpos podem ser utilizadas para o tratamento de condição específica, tal como câncer. Alternativa ou adicionalmente, o artigo industrializado pode compreender adicionalmente segundo (ou terceiro) recipiente que compreende tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, que incluem outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[0298] A seguir encontram-se exemplos dos métodos e composições de acordo com a presente invenção. Compreende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, dado o relatório descritivo geral fornecido acima.
EXEMPLOS
[0299] Os exemplos do presente descrevem a geração de anticorpos anti-beta7 humanizados de anticorpo anti-camundongo de rato que se liga à subunidade beta7 da integrina alfa4beta7.
EXEMPLO 1 HUMANIZAÇÃO DE ANTICORPO ANTAGONISTA BETA7 MATERIAIS E MÉTODOS
[0300] Os números dos resíduos estão de acordo com Kabat (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda MD (1991)). São utilizadas abreviações de aminoácidos de uma letra. Degenerações de DNA são representadas utilizando o código IUB (N = A/C/G/T, D = A/G/T, V = A/C/G, B= C/G/T, H= A/C/T, K = G/T, M = A/C, R = A/G, S = G/C, W= A/T, Y = C/T).
[0301] Enxertos de região hipervariável direta sobre a estrutura consenso humano receptora - o fagomídeo utilizado para este trabalho, pVO350-2b, foi vetor de exibição de Fab-g3 monovalente que possui dois quadros de leitura aberta sob o controle do promotor phoA, essencialmente conforme descrito em Lee et al, J. Mol. Biol. (2004), 340 (5): 1073-93. O primeiro quadro de leitura aberta consiste da seqüência de sinal stII fundido aos domínios VL e CH1 da cadeia leve receptora e o segundo consiste da seqüência de sinal stII fundida aos domínios VH e CH1 da cadeia pesada receptora seguida por forma truncada da proteína de revestimento de fago menor P3 (Lowman, H. et al (1990), Biochemistry 30: 10832).
[0302] Os domínios VL e VH de Fib504 de rato (anticorpo FIB504.64 produzido pelo hibridoma ATCC HB-293, Coleção Norte-Americana de Cultivos de Tipos (ATCC), P. O. Box 1549, Manassas VA 20108, E. U. A.) foram alinhados com os domínios capa I de consenso humano (huKI) e VH de consenso de subgrupo III humano (huIII). Para elaborar os enxertos de região hipervariável (HVR), foram utilizadas as estruturas a seguir: HuKI foi utilizado para a estrutura de domínio variável de cadeia leve (vide as Figs. 1A e 7). Para a estrutura de domínio variável de cadeia pesada, a estrutura de VH receptora, domínio VH de consenso de subgrupo III humano (humIII) modificado que difere da seqüência humIII em três posições: R71A, N73T e L78A pode ser utilizado (vide Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 4285 (1992)) (vide Fig. 1B). Na geração de anticorpos de acordo com a presente invenção, o enxerto 504K-RF também foi preparado a partir do domínio VH de consenso de subgrupo III humano realizando as substituições de aminoácidos a seguir: A71R e A78F.
[0303] Regiões hipervariáveis de anticorpo Fib504 de rato (produzidas por hibridoma ATCC HB-293) foram elaboradas na estrutura de VH de consenso de subgrupo III humano receptora para gerar enxerto de HVR direto (enxerto Fib504) (vide a Fig. 1B). No domínio VL, as regiões a seguir de Fib504 de rato foram enxertadas no receptor de consenso humano, huKI: posições 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) (Fig. 1A). No domínio VH, as posições 26 a 35 (H1), 49 a 65 (H2) e 94 a 102 (H3) foram enxertadas (Fig. 1B). Além disso, foi construído segundo enxerto de HVR, enxerto Fib504K, que também foi incluído na HVR, VL posição 49, com base em definição estendida para L2 (vide MacCallum et al, J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)). MacCallum et al analisaram estruturas de cristal de complexo de antígeno e anticorpo e encontraram a posição 49 da cadeia leve e as posições 49 e 94 da cadeia pesada são parte da região de contato de antígeno e, desta forma, estas posições foram incluídas nas definições de HVR-L2, HVR-H2 e HVR-H3 para anticorpos anti-beta7 humanizados descritos no presente.
[0304] As variantes de enxerto direto foram geradas por meio de mutagênese Kunkel (Kunkel et al (1987) acima) utilizando oligonucleotídeo separado para cada região hipervariável. Os clones corretos foram determinados por meio de seqüenciamento de DNA.
ALEATORIZAÇÃO FRÁGIL DAS REGIÕES HIPERVARIÁVEIS
[0305] O processo de “aleatorização frágil” (vide o Pedido Norte- Americano com Número de Série 60/545.840) designa procedimento de mutagênese orientada de seqüência de proteína selecionada, tal como região hipervariável de anticorpo. O método mantém orientação em direção à seqüência de região hipervariável murina, de rato ou outra inicial, ao mesmo tempo em que introduz mutação de cerca de 10 a 50% em cada posição selecionada. Este método aumenta a capacidade da seleção de biblioteca empregada e evita alteração do epítopo de antígeno reconhecido pelo anticorpo. De acordo com este método de aleatorização frágil, diversidade de seqüência é introduzida em cada região hipervariável utilizando estratégia que mantém orientação em direção à seqüência de região hipervariável murina. Isso foi obtido utilizando estratégia de síntese de oligonucleotídeos envenenada descrita em primeiro lugar por Gallop et al, J. Med. Chem. 37: 1233-1251 (1994). Outros métodos de manter orientação para o resíduo de região hipervariável não humana são disponíveis, entretanto, tais como PCR à prova de erros, troca de DNA etc.
[0306] De acordo com o método utilizado no presente, para dada posição em região hipervariável a sofrer mutação, o códon que codifica o aminoácido do tipo selvagem é envenenado com mistura (tal como mistura 7010-10-10) de nucleotídeos que resulta em cerca de 50% de taxa de mutação em cada posição de região hipervariável selecionada. Para atingir isso, o códon que codifica o aminoácido da região hipervariável do tipo selvagem a sofrer mutação é sintetizado com baixo nível de mistura contaminante dos outros três nucleotídeos, tal como mistura de nucleotídeos 70-10-10-10. Desta forma, por exemplo, para aleatorização frágil de PRO (CCG), a primeira posição sintetizada é mistura de 70% C e 10% cada de G, T e A; a segunda posição é mistura de 70% C e 10% cada de A, G e T; e a terceira posição é mistura de 70% G e 10% cada de A, C e T. Compreende-se que a orientação pode ser ajustada para cima ou para baixo, dependendo do códon sendo sintetizado em dada posição, do número de códons que codificam aminoácido específico e do grau em que a síntese de oligonucleotídeos é envenenada pela composição de nucleotídeos da mistura de síntese.
[0307] Oligonucleotídeos aleatorizados frágeis podem ser padronizados após as seqüências de região hipervariável iniciais murina, de ratos ou outra e englobam as mesmas regiões definidas pelos enxertos de região hipervariável direta. Opcionalmente, duas posições, aminoácidos no início de H2 e H3 no domínio VH podem ter sua diversidade limitada: o RGC do códon pode ser utilizado para a posição 49 que codifica A, G, S ou T e na posição 94, o códon AKG pode ser utilizado codificando M ou R.
[0308] Geração de bibliotecas de fagos - conjuntos de oligonucleotídeos aleatorizados projetados para cada região hipervariável foram fosforilados separadamente em seis reações de 20 μl contendo 660 ng de oligonucleotídeo, 50 mM de Tris, pH 7,5, 10 mM de MgCl2, 1 mM de ATP, 20 mM de DTT e 5 U de polinucleotídeo quinase por uma hora a 37 °C. Os seis conjuntos de oligonucleotídeos fosforilados foram combinados em seguida com 20 μg de modelo Kunkel em 50 mM de Tris, pH 7,5, 10 mM de MgCl2 em volume final de 500 μl, resultando em razão entre oligonucleotídeo e modelo de 3. A mistura foi combinada a 90 °C por quatro minutos, 50 °C por cinco minutos e resfriada em seguida sobre gelo. Oligonucleotídeo não combinado em excesso foi removido com kit de purificação de PCR QIAQUICK® (kit Qiagen 28106, Qiagen, Valencia CA) utilizando protocolo modificado para evitar a desnaturação excessiva do DNA combinado. Aos 500 μl de mistura combinada, foram adicionados 150 μl de tampão Qiagen PB e a mistura foi dividida entre duas colunas de sílica. Após lavagem de cada coluna com 750 μl de tampão Qiagen PE e centrifugação adicional para secar as colunas, cada coluna foi eluída com 110 μl de 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 8. O modelo combinado e limpo (220 μl) foi preenchido em seguida por meio da adição de 1 μl de 100 mM de ATP, 10 μl de 25 mM de dNTPs (25 mM cada de dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 15 μl de 100 mM de DTT, 25 μl de 10X tampão TM (0,5 M Tris, pH 7,5, 0,1 M MgCl2), 2400 U de T4 ligase e 30 U de T7 polimerase por três horas à temperatura ambiente.
[0309] O produto cheio foi analisado sobre Tris-Acetato- EDTA/géis de agarose (Sidhu et al, Methods in Enzymology 328: 333-363 (2000)). Normalmente são visíveis três faixas: a faixa inferior é produto corretamente cheio e ligado, a faixa intermediária é cheia mas não ligada e a faixa superior é deslocada na fita. A faixa superior é produzida por meio de atividade lateral intrínseca de T7 polimerase e é difícil de evitar (Lechner et al, J. Biol. Chem. 258: 11174-11184 (1983)); esta faixa transforma, entretanto, trinta vezes menos eficientemente que a faixa inferior e normalmente contribui pouco com a biblioteca. A faixa intermediária deve-se à ausência de fosfato 5’ para a reação de ligação final; esta faixa transforma-se eficientemente e gera principalmente seqüência do tipo selvagem.
[0310] O produto cheio foi limpo e eletroporado em seguida em células SS320 e propagado na presença de fago auxiliar M13/KO7 conforme descrito por Sidhu et al, Methods in Enzymology 328: 333-363 (2000). Os tamanhos das bibliotecas variaram de 1 a 2 x 109 clones independentes. Clones aleatórios das bibliotecas iniciais foram seqüenciados para determinar a qualidade da biblioteca.
[0311] Seleção de Fagos - integrina alfa4beta7 humana de comprimento total foi expressa em células 293 (Graham et al, J. Gen. Virol. 36: 59 (1977)), purificada por meio de cromatografia de afinidade Fib504 e utilizada como alvo para seleção de fagos. Para imobilização sobre placas de microtítulos MaxiSorp® (Nalge Nunc, Rochester NY), 100 μl de integrina alfa4beta7 humana foram revestidos a 5 μg/ml em 150 mM de NaCl, 50 mM de Tris pH 7,5, 2,5 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2 e 2 mM de MnCl2 (TBSM), por uma noite a 4 °C. Cavidades foram bloqueadas por uma hora utilizando TBSM contendo 1% BSA. Para a primeira rodada de seleção, oito cavidades revestidas com alvo foram utilizadas; uma única cavidade revestida alvo foi utilizada para rodadas sucessivas de seleção. Fago foi colhido do sobrenadante de cultura e suspenso em TBSM contendo 1% BSA e 0,05% TWEEN® 20 (TBSMBT). Após ligação às cavidades por duas horas, fago não ligado foi removido por meio de lavagens extensas com TBS contendo 0,05% TWEEN 20 (TBST). Fagos ligados foram eluídos por meio de incubação das cavidades com 100 mM de HCl por trinta minutos. Fagos foram amplificados utilizando células Top10 e fago auxiliar M13/KO7 e cultivados por uma noite a 37 °C em 2YT, 50 μg/ml de carbanacilina. Os títulos de fagos eluídos de cavidade revestida alvo foram comparados com títulos de fago recuperados de cavidade revestida não alvo para determinar o enriquecimento. Após a realização de quatro rodadas de seleção, clones aleatórios foram selecionados para análise de seqüências.
[0312] Produção de Fab e Determinação de Afinidade - para expressar proteína de Fab para medições de afinidade, códon de parada foi introduzido entre a cadeia pesada e g3 no vetor de exibição de fagos. Clones foram transformados em células 34B8 de E. coli e cultivadas em meios AP5 a 30 °C (Presta, L. et al, Cancer Res. 57: 4593-4599 (1997)). Células foram cultivadas por meio de centrifugação, suspensas em 10 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 8, e rompidas abertas utilizando microfluidificador. Fab foi purificado com cromatografia de afinidade de Proteína G.
[0313] Determinações de afinidade foram realizadas por meio de ressonância plasmática de superfície utilizando BIAcore® 3000 (Biacore, Piscataway NJ). Variantes de Fab Fib504 humanizadas foram imobilizadas em 10 mM de acetato a pH 4,5 (variando de 250 a 1500 unidades de resposta (RU)) em chip de sensor CM5 e foram injetadas diluições por duas vezes de integrina alfa4beta7 humana (1,5 a 770 nM) em TBSM contendo 2% de n- octilglicosídeo. Cada amostra foi analisada com tempos de associação de cinco minutos e de dissociação de cinco a sessenta minutos. Após cada injeção, os flocos foram regenerados utilizando três injeções de um minuto de 8 M uréia. Resposta de ligação foi corrigida por meio de subtração do RU de célula de fluxo padrão. Modelo Languir 1:1 de definição simultânea de kon e koff foi utilizado para análise cinética.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
[0314] Humanização de Fib504 de rato - a estrutura receptora humana utilizada para humanização baseia-se na estrutura utilizada para HERCEPTIN® e consiste do domínio VL capa I humano (huKI) de consenso e variante do domínio VH de consenso de subgrupo III humano (humIII). Este domínio VH variante contém três alterações do consenso humano: R71A, N73T e L78A. Os domínios VL e VH de Fib504 de rato foram alinhados com os domínios capa I e subgrupo III humanos; cada região hipervariável (HVR) foi identificada e enxertada na estrutura receptora humana para gerar enxerto de HVR (enxerto 504) que poderá ser exibido na forma de Fab sobre fago (Figs. 1A e 1B).
[0315] Com base na análise de estruturas de cristal de complexo de anticorpo e antígeno disponíveis, MacCallum et al (MacCallum et al, J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)) propuseram definições de HVR com base em resíduos de domínio variável que entram freqüentemente em contato com antígenos. Desta forma, as posições 49G e 49M da cadeia pesada foram incluídas no enxerto HVR de Fib504 (Fig. 1B). Além disso, também foi gerado segundo enxerto de HVR, enxerto Fib504K, que incluiu a posição 49K da cadeia leve, pois esta posição também se encontra dentro da definição de contato de HVR-L2 e pode servir de contato de antígeno (Fig. 1A). Quando os enxertos Fib504 ou Fib504K foram exibidos sobre fago e testados para determinar a ligação a alfa4beta7 imobilizado, nenhuma ligação foi observada.
[0316] Foram geradas bibliotecas utilizando os enxertos HVR Fib504 e Fib504-K nos quais cada uma das regiões HVR foi aleatorizada mole simultaneamente. Cada biblioteca de enxertos de HVR foi misturada contra alfa4beta7 imobilizado por quatro rodadas de seleção. Nenhum enriquecimento foi observado e clones tomados para análise de seqüências de DNA exibiram somente alterações de seqüências aleatórias dirigidas às seis regiões HVR.
[0317] Duas seqüências de estrutura de VH adicionais, “RL” e “RF”, foram pesquisadas como estruturas receptoras e continham alterações nas posições 71 e 78. A posição 71 foi alterada para Arginina como no consenso de subgrupo III humano e a posição 78 foi alterada para Leucina como no consenso de subgrupo III humano (estrutura receptora “RL”) ou fenilalanina como no consenso de subgrupo II humano e a estrutura VH de Fib504 de rato (estrutura receptora “RF”) (Fig. 10A). Quando o enxerto Fib504 ou Fib504K na estrutura receptora “RL” (Fib504-RL e Fib504K-RL) ou “RF” (Fib504-RF e Fib504K-RF) foi exibido sobre fago e testado para determinar a ligação a alfa4beta7 imobilizado. Ligação de fagos específica somente foi observada para o enxerto Fib504K utilizando a estrutura “RF” (Fig. 10B). A ligação modesta de fago que exibe o enxerto Fib504-RF com relação aos demais enxertos que não contêm Y49K (cadeia leve) e L78F (cadeia pesada) indica a importância destas posições na seleção de estrutura receptora útil.
[0318] Bibliotecas como anteriormente foram geradas utilizando estratégia de aleatorização mole simultaneamente em cada uma das seis HVRs para os enxertos Fib504K-RL e Fib504K-RF e ordenadas sobre alfa4beta7 imobilizado por quatro rodadas de seleção conforme descrito acima. Enriquecimento somente foi observado para a biblioteca com base no enxerto Fib504K-RF. Clones da rodada 4 da biblioteca de Fib504K-RF foram selecionados para determinar análise de seqüências e revelaram alterações de aminoácidos dirigidas para HVR-L1. A maior parte dos clones continha a alteração Y32L; além disso, a posição 31 foi freqüentemente alterada para D, S, P ou N (Fig. 1C). Além do enxerto inicial, Fib504K-RF, três clones foram expressos e purificados como proteína Fab e analisados adicionalmente por meio de Biacore conforme descrito acima. Os clones hu504-5, hu504-16 e hu504-32 (variantes de SEQ ID N° 1 contendo substituições T31S mais Y32L (variante hu504.5), Y32L (variante hu504.16) ou T31D mais Y32L (variante hu504.32); vide a Figura 1C) exibiram excelente ligação a alfa4beta7 com relação ao enxerto Fib504K-RF e atenderam ou excederam a afinidade do Fab Fib504 quimérico para ligação a alfa4beta7. Os resultados da análise Biacore são exibidos na Tabela 3 abaixo e indicam que variação selecionada das HVRs e/ou regiões de estrutura, descritas no presente, geraram anticorpos antagonistas para alfa4beta7 que possui maior afinidade com relação ao anticorpo inicial. Os resultados na Tabela 3 indicam que variante humanizada 504.32 exibiu maior aumento de afinidade com relação ao anticorpo de rato inicial por meio de ligação três vezes mais firme a alfa4beta7.
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[0319] Os resultados da Tabela 3 também indicam que o novo projeto de HVR-L1 era importante para a restauração de ligação de antígeno com alta afinidade. Particularmente, a mutação Y32L era mais freqüente entre os diversos clones. Outras alterações na posição 31 e numerosas outras substituições ao longo de HVR-H1 aparentemente são bem toleradas e podem fornecer aprimoramento adicional. A partir destes resultados, fica claro que existem diversas alterações de seqüências que podem aumentar a afinidade de Fib504 enxertado sobre estrutura humana para gerar afinidades que atendem ou excedem a do anticorpo de rato inicial.
[0320] Desta forma, a partir do enxerto das seis HVRs de Fib504 de rato na armação receptora humana, a expansão de HVR-L2 para incluir a posição 49 (Lisina), expansão de HVR-H2 para incluir a posição 49 (Glicina) e a expansão de HVR-94 para incluir a posição 94 (Metionina), bem como alterações de aminoácidos na posição 32 de VHR-L1 (em que L ou I substituem Y) e, opcionalmente, na posição 31 da VHR-L1 (em que T é substituído por D ou S, por exemplo). Alterações de aminoácidos de estrutura úteis foram realizadas nas posições 71 (A71R) e 78 (L78F) no domínio VH. Essas alterações de aminoácidos geram anticorpo totalmente humano, tal como variante hu504.32, com aumento de três vezes da afinidade de ligação para integrina alfa4beta7. Além disso, anticorpos humanizados selecionados descritos no presente foram determinados para que tenham atividade biológica ao menos comparável como anticorpo Fib504 de rato parental (vide Exemplo 3 do presente).
EXEMPLO 2 VARIANTES DE HVR FIB504 HUMANIZADA ADICIONAL
[0321] As seqüências de aminoácidos de HVR de variante Fib504.32 humanizada foram adicionalmente modificadas para gerar variantes adicionais capazes de antagonizar a atividade de subunidade de integrina beta7 e/ou integrinas que contêm a subunidade beta7.
[0322] Geração de biblioteca ampla de varredura de aminoácidos - biblioteca para varrer posições de HVR selecionadas para outros resíduos de aminoácidos capazes de gerar variantes de ligação de beta7 de variante hu504.32 foi gerada utilizando três oligonucleotídeos: 504-L1, projetado para aleatorizar mole uma parte de HVR-L1 com orientação para a seqüência de HVR-L1 hu504.32 (ou seja, a seqüência ASESVDDLLH (SEQ ID N° 47, para as posições relativas A2 a A11) foi aleatorizada mole conforme descrito acima); e HVR-L3 504-N96 e HVR-H3 504-M94 que introduzem NNS nas posições HVR- L3 posição 96 na cadeia leve e HVR-H3 posição 94 na cadeia pesada, de forma a permitir todos os vinte aminoácidos nestas posições. Com estes três oligonucleotídeos, a biblioteca de varredura de aminoácidos ampla foi gerada conforme descrito acima utilizando modelo que contém três códons de parada na cadeia leve (posições 31 e 32 em HVR-L1 e posição 96 em HVR-L3) e um códon de parada na cadeia pesada (posição 94 em HVR-H3).
[0323] Varredura ampla de aminoácidos de hu504-32 - para explorar mais completamente as seqüências preferidas em HVR-L1 e aumentar a estabilidade de 504-32, projetamos biblioteca de fagos que a) aleatorizou fragilmente HVR-L1 de 504-32 na região onde foram observadas alterações (ou seja, ASESVDDLLH (SEQ ID N° 47, para as posições relativas A2 a A11) durante a humanização (Figura 1C) e b) permitiu todos os aminoácidos possíveis em N96 em HVR-L3 e M94 em HVR-H3. Após quatro rodadas de seleção contra integrina alfa4beta7 humana de comprimento total imobilizada conforme descrito acima, 96 clones aleatórios foram selecionados para análise de seqüências. A freqüência na qual os aminoácidos foram encontrados em cada posição na biblioteca de varredura de aminoácidos ampla sugere que a seqüência HVR-L1 presente em hu504-32 e a metionina na posição 94 na cadeia pesada são ideais para ligação de alta afinidade (Figura 12). Os aminoácidos de maior preferência obtidos por meio das seleções a partir da variante 504.32 (Fig. 12) são exibidos em amarelo. Por outro lado, embora asparagina esteja presente na posição 96 na cadeia leve de hu504-32, a alta freqüência de leucina observada nesta posição na varredura de aminoácidos ampla sugere que a mutação N96L poderá aumentar adicionalmente a afinidade de variantes Fib504 humanizadas para alfa4beta7 e também eliminar quaisquer problemas de desamidação potenciais nesta posição. As informações da Figura 12 também sugerem que uma série de aminoácidos de substituição é propensa a ser tolerada na maior parte das posições sem perda substancial de afinidade. Para eliminar a oxidação de M94 em HVR-H3, por exemplo, glutamina ou arginina poderão ser substituídas de maneira similar.
[0324] Geração das bibliotecas de varredura de aminoácidos limitadas - seis bibliotecas para varredura de aminoácidos limitadas utilizaram seis modelos Kunkel diferentes, em que cada uma contém um códon de parada localizado em uma das seis HVRs. Cada biblioteca foi gerada utilizando um único oligonucleotídeo que codifica uma única HVR e utilizando os códons relacionados na Fig. 11A (coluna de “códon”) para alterar resíduos de aminoácidos para testes subseqüentes para ligação a beta7 ou alfa4beta7. Os mesmos procedimentos são utilizados para alterar os resíduos de aminoácidos de anticorpos anti-beta7 e testá-los para determinar a ligação a integrinas alfaEbeta7.
[0325] Varredura de aminoácidos limitada de hu504-32 - a varredura de aminoácidos limitada de hu504-16 foi projetada para elaborar hu504-16 ainda mais similar à seqüência de consenso de cadeia leve e de cadeia pesada e no processo identificar os elementos de seqüência mínima de Fib504 de rato que são necessários para ligação. Seis bibliotecas foram geradas e dirigidas em cada HVR em posições que diferiram entre o hu504-16 e cadeias pesadas de subgrupo III ou leves capa I de consenso humano (Figura 1A e 1B); o aminoácido de rato ou humano foi mantido nestas posições na biblioteca (Figura 11A). A fim de acomodar a codificação dos dois aminoácidos durante a síntese de oligonucleotídeos e mutagênese, aminoácidos adicionais também foram introduzidos em alguns casos (vide os aminoácidos codificados, Figura 11A). As bibliotecas de varredura de aminoácidos limitada foram selecionadas contra integrina alfa4beta7 humana de comprimento total imobilizada conforme descrito acima e cerca de 32 clones aleatórios foram seqüenciados a partir de cada biblioteca após a terceira rodada. A freqüência de cada aminoácido encontrada em cada posição é exibida na Figura 11B e 11C.
[0326] Como a varredura de aminoácidos ampla, a varredura de aminoácidos limitada também fornece informações sobre quais alterações são toleradas em muitas posições em Fib504 humanizado. Ao contrário da varredura de aminoácidos ampla, entretanto, a diversidade permitida em cada posição aleatorizada na varredura de aminoácidos limitada foi restrita a um par de aminoácidos. Desta forma, a falta de qualquer substituição observada em uma dada posição não indica que resíduo específico não pode ser alterado nem a alta freqüência de qualquer aminoácido específico em dada posição indica necessariamente que é a melhor solução para alta afinidade.
[0327] Em algumas posições (posições 27, 29, 30, 53 e 54 da cadeia leve e 50, 54, 58, 60, 61 e 65 da cadeia pesada), o aminoácido consenso humano é selecionado muito freqüentemente, o que sugere que contramutação para consenso humano não alteraria dramaticamente a ligação a alfa4beta7 humano. De fato, na posição 54 da cadeia leve (em HVR-L2), o aminoácido consenso humano é selecionado mais freqüentemente que o aminoácido de Fib504 de rato, o que indica que esta alteração realizada em 504-32 fornece anticorpo de ligação beta7 útil.
[0328] Além disso, como resultado do projeto de biblioteca, aminoácidos que não são derivados do Fib504 de rato ou de consenso humano são selecionados mais freqüentemente em algumas posições e fornecem substituições potenciais para aumentar a afinidade de variantes de Fib504 humanizadas. Estes incluem, sem limitação, D30A e I55V na cadeia leve e Y50F na cadeia pesada. Os resultados destas duas bibliotecas indicam que muitas posições de HVR toleram outras substituições de aminoácidos e ainda retêm atividade biológica comparável.
[0329] Resumos de alterações de aminoácidos observadas são exibidos nas Figuras 13 e 15. A Figura 15 resume os diversos aminoácidos úteis em cada uma das posições nas CDRs das variantes de anticorpos de acordo com a presente invenção em posições numeradas de acordo com numeração de Kabat ou sistema de numeração relativo. Cada um dos anticorpos adicionais englobados pelas variantes ilustradas nas Figuras 13 e 15 é uma realização da presente invenção.
EXEMPLO 3 TESTES DE ADESÃO CELULAR
[0330] A capacidade de algumas das variantes de Fib504 humanizadas de acordo com a presente invenção para ligar ligantes expressos sobre superfície celular foi testada por meio de testes de adesão celular. A ligação a alfa4beta7 e outra integrina beta7, alfaEbeta7, foram testadas pela capacidade das variantes humanizadas de romper a ligação da integrina para o seu receptor natural. A ligação das variantes Fib504 humanizadas a subunidade beta7 isolada expressa sobre superfície celular foi testada de forma similar. Os procedimentos e os resultados são descritos abaixo.
[0331] Produção de IgG - variantes de IgG Fib 504 humanizadas foram expressas transitoriamente em células 293 (Graham et al (1977), acima) utilizando vetor separado para as cadeias leve e pesada. Os vetores foram construídos por meio de subclonagem dos domínios variáveis leve ou pesado em vetores de expressão apropriados para cada uma das cadeias leve e pesada. Sobrenadante de 1,1 l de cultura de células CHO de variante Fib504 humanizada foi filtrado através de filtro de 0,45 μm e aplicado a nova coluna de 1 ml de HiTrap Proteína A HP (Amersham/Pharmacia) equilibrada em Tampão A (10 mM de Tris pH 7,5, 150 mM de NaCl). Amostras foram aplicadas a 0,8 ml/min, por uma noite, a 4 °C. Cada coluna foi lavada em seguida e equilibrada com 30 ml de Tampão A. Eluição de anticorpo foi realizada por meio de cromatografia à temperatura ambiente sobre FPLC (Amersham/Pharmacia) utilizando gradiente linear de 14 min a 1 ml/min de 0 a 100% Tampão B (100 mM de Glicina, pH 3,0). Frações de 1 ml resultantes foram imediatamente neutralizadas por meio da adição de 75 μl de 1 M Tris, pH 8. Proteína eluída foi detectada por meio de absorção a 280 nm e frações de pico foram reunidas e dessalinizadas em PBS sobre colunas de dimensionamento descartáveis Sephadex PD10 G-25 (Amersham/Pharmacia). Proteína foi detectada por OD280 e frações de pico foram reunidas. O anticorpo em PBS foi filtrado a 0,22 μm e armazenado a 4 °C. Análise de aminoácidos foi utilizada para quantificar as concentrações destes anticorpos purificados e valores foram atribuídos a partir da média de duas determinações separadas.
MARCAÇÃO DE BCECF:
[0332] Em cada um dos testes apresentados neste Exemplo 3, células foram marcadas de acordo com o procedimento a seguir. Todas as células utilizadas nos testes de adesão foram marcadas com acetoximetil éster de 2’,7’-bis-(2-carboxiletil)-5-(e-6)-carboxifluoresceína (BCECF) a 10 μM em meios RPMI 1640 contendo FBS a 10% para células RPMI8866 e células 38C13 transfectadas com subunidade beta7 (células beta7 38C13) e em mistura F-12: DMEM (50:50) contendo 10% FBS para células 293 transfectadas com alfaEbeta7 (células 293 alfaEbeta7). Células foram marcadas por trinta minutos e lavadas por duas vezes com meio de teste. A densidade celular foi ajustada em 3 x 106 células por mililitro para RPMI8866 e células beta7 38C13 e 2,2 x 106 células por mililitro para células 293 alfaEbeta7. VARIANTES FIB504 HUMANIZADAS ROMPEM A LIGAÇÃO DE ALFA4BETA7 A MADCAM
[0333] Adesão de células RPMI8866/MAdCAM-1-Ig: Células RPMI8866 expressam alfa4beta7 sobre a sua superfície (Roswell Park Memorial Institute, Buffalo NY). Variantes Fib504 humanizadas (variantes hu504) foram colocadas em contato com mistura de células RPMI8866 e MAdCAM fundidas a IgG revestido sobre suporte sólido. Concentrações de variante Fib504 humanizada que resultam em inibição de 50% (IC50) da ligação de células RPMI8866 a MAdCAM-1 foram medidas por meio de revestimento de placas de 96 cavidades Nunc Maxisorp® com 2 μg/ml em PBS, 100 μl/cavidade de MAdCAM-1-Ig (Genentech, Inc., em que Ig designa a fusão de MAdCAM-1 a uma região Fc) por uma noite a 4 °C. Após o bloqueio das placas com 200 μl por cavidade de 5 mg/ml de BSA por uma hora à temperatura ambiente, 50 μl de variantes Fib504 humanizadas em meio de teste (meio RPMI 1640, Hyclone®, Logan Utah, Estados Unidos, suplementado com 5 mg/ml de BSA) foram adicionados a cada cavidade e 150.000 células marcadas com BCECF (BCECF, Molecular Probes, Eugene OR) em 50 μl de meios de teste foram adicionados a cada cavidade e incubados por quinze minutos a 37 °C. As cavidades foram lavadas por duas vezes com 150 μl de meios de teste para remover células não ligadas. As células ligadas foram solubilizadas com 100 μl de 0,1% SDS em 50 mM de Tris/HCl, pH 7,5. A quantidade de fluorescência liberada de células lisadas foi medida por meio de SPECTRAmax GEMINI® (Molecular Devices, Sunnyvale CA) em comprimentos de onda de emissão de 530 nm e excitação de 485 nm. Os valores de fluorescência foram analisados em função das concentrações das variantes de Fib504 humanizadas adicionadas em cada teste, utilizando método de mínimos quadrados não lineares de quatro parâmetros, para obter os valores IC50 de cada variante Fib504 humanizada no teste. Os valores IC50 e IC90 foram estimados a partir do ajuste de quatro parâmetros. A Fig. 14 é exemplo de plotagem dos resultados. Os valores IC90 e IC50 para cada uma das variantes testadas são exibidos abaixo na Tabela 4. TABELA 4 LIGAÇÃO DE ANTICORPO A MADCAM-1 HUMANO
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ROMPIMENTO DE VARIANTES FIB504 HUMANIZADAS DE LIGAÇÃO DE ALFA4BETA7 A VCAM
[0334] Adesão de células RPMI8866/7dVCAM-1: O teste de RPMI8866/7dVCAM-1 é formato similar ao RPMI8866/MAdCAM-1-Ig, exceto pelo uso de 7dVCAM-1 (ADP5, R&D Systems, Mineápolis MN) a 2 μg/ml para revestir as placas. Os resultados foram analisados conforme descrito acima para os experimentos de ligação de MAdCAM. Os valores IC50 para cada uma das variantes testadas são exibidos abaixo na Tabela 5. TABELA 5
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* Exp. 1/Exp. 2 designa os resultados de testes repetidos. ROMPIMENTO DE VARIANTES FIB504 HUMANIZADAS DE LIGAÇÃO DE ALFAEBETA7 A E- CADERINA HUMANA
[0335] Adesão de células AlfaEbeta7 293/huE-Caderina: Células 293 (Graham et al (1977), acima) foram transfectadas com alfaE e beta7 (Genentech, Inc.). O formato de teste é similar ao teste de RPMI8866/MAdCAM-1, exceto pelo fato de que huE-Caderina (648-EC, R&D Systems, Mineápolis MN) foi utilizada a 2 μg/ml para revestir as placas. As placas foram bloqueadas em seguida com 5 mg/ml de BSA conforme mencionado acima e 50 μl de variantes FIB504 em meios de teste (F-12: DMEM (50:50) suplementado com 5 mg/ml de BSA) foram adicionados a cada cavidade e 110.000 células marcadas com BCECF em 50 μl de meios de teste foram adicionados a cada cavidade e incubadas por quinze minutos a 37 °C. As cavidades foram lavadas por duas vezes com 150 μl de meios de teste e a quantidade de fluorescência liberada por células lisadas foi medida e analisada conforme descrito acima. Os resultados de teste de três experimentos são exibidos na Tabela 6. TABELA 6
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[0336] Teste de adesão de células 38C13beta7/muMAdCAM-1-Ig: O teste de 38C13beta7/muMAdCAM-1 foi formato similar ao RPMI8866/MAdCAM-1-Ig, exceto pelo uso de muMAdCAM-1-Ig (Genentech, Inc.) a 2 μg/ml para revestir as placas. Células de linfoma murino 38C13 alfa4+ (Crowe, D. T. et al, J. Biol. Chem. 269: 14411-14418 (1994)) foram transfectadas com DNA que codifica integrina beta7, de tal forma que alfa4beta7 fosse expresso sobre a superfície celular. A capacidade das variantes de anticorpos de romper a interação entre alfa4beta7 e MAdCAM associadas a membrana celular foi realizada conforme acima. Os resultados de testes são exibidos na Tabela 7 (são exibidos os valores IC50 e IC90 para dois experimentos).
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ROMPIMENTO DE VARIANTES FIB504 HUMANIZADAS DE LIGAÇÃO DE BETA7 A VCAM MURINO
[0337] Teste de adesão de células 38C13beta7/muVCAM-1-Ig: O teste de 38C13beta7/muVCAM-1-Ig foi realizado de acordo com o teste de ligação de células MAdCAM-1-Ig/RPMI8866 murinas acima, exceto pelo uso de muVCAM-1-Ig (Genentech, Inc.) a 2 μg/ml para revestir as placas. Os resultados do teste são exibidos na Tabela 8 (são exibidos os valores IC50 e IC90 para dois experimentos). TABELA 8 ATIVIDADE DE ANTICORPOS VARIANTES HU504 EM CÉLULAS QUE EXPRESSAM 38C13-BETA7 LIGAÇÃO A VCAM-1 -IG MURINO
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[0338] Os resultados dos estudos de ligação de variante Fib504 humanizada demonstram que o anticorpo humanizado de acordo com a presente invenção se liga a sua subunidade de integrina beta7 alvo, bem como a integrina alfa4beta7 e alfaEbeta7 com afinidade próxima do anticorpo de rato inicial e, em algumas realizações, com maior afinidade. Desta forma, anticorpo anti-beta7 humanizado de acordo com a presente invenção possui usos em terapias anti-integrina beta7, particularmente terapias humanas. ATIVIDADE RELATIVA DE VARIANTES HU504.32 DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO
[0339] Variantes de aminoácidos diferentes do anticorpo hu504.32 foram testadas em teste de adesão de células humanas e de camundongos para determinar a sua capacidade de inibição da ligação de receptor que contém beta7 ao seu ligante de acordo com os métodos de teste de adesão celular descritos no presente. O teste de RPMI8866/MAdCAM-1-Fc foi realizado conforme descrito acima no presente. O teste de alfaEbeta7-293/hu E-caderina foi modificado por meio do uso de E-caderina-Fc humana como ligante (E-caderina-Fc humano, 648-EC, R&D Systems, Mineápolis MN). A capacidade relativa de variantes hu504.32 de inibir a interação de fibronectina humana (huFN40) com receptor alfa4beta7 humano sobre células PRMI8866 também foi examinada. O teste de RPMI8866/hu Fibronectina (huFN40) utilizado para estes estudos apresentou formato similar ao teste RPMI8866/MAdCAM-1-Ig descrito no presente, exceto pelo uso de fragmento alfa-quimotríptico de fibronectina humana de 40 kDa (F1903, Chemicon International, Temecula CA) a 2 μg/ml para revestir as placas.
[0340] Foi examinada a capacidade das variantes hu504.32 de inibir a interação de receptores que contêm beta7 murino com MAdCAM-1 murino ou VCAM-1 murino. MAdCAM-1-Fc murino e VCAM-1-Fc murino foram inibidos a partir de interação com células alfa4+ de linfoma murino que expressam beta7 murino (células 38C13beta7) pelas variantes hu504.32. Os testes de adesão de células MAdCAM-1-Fc e VCAM-1-Fc murinas foram realizados de forma similar aos descritos acima no presente para MAdCAM e VCAM humano. Ao fundir-se ligantes a regiões Fc, os receptores de Fc sobre as células foram bloqueados com 0,5 μg de anticorpo anti-CD16/32 (anticorpo receptor anti-Fc gama III/II, catálogo n° 553142, BD Biosciences, San Jose CA) por milhão de células por cinco minutos à temperatura ambiente. 150.000 células marcadas em 50 μl de meio de teste foram adicionadas a cada cavidade e incubadas por treze minutos a 37 °C. As cavidades foram lavadas e a quantidade de fluorescência liberada de células lisadas foi medida conforme descrito acima no presente. O anticorpo controle para os testes de adesão celular humana foi o anticorpo monoclonal de camundongos para albumina de soro humano, 6B11 (Catálogo n° ab10244, Novus Biologicals, Littleton CO, Estados Unidos). O anticorpo controle para os testes de adesão celular de murinos foi o anticorpo integrina beta7 anti-camundongo de rato, M293 (BD Biosciences, San Jose CA), que não concorre com ligante ou com Fib504 para ligação a integrina beta7.
[0341] Os resultados de testes em três vias para os testes de adesão de células humanas e murinas são fornecidos nas Tabelas 9 e 10, respectivamente. TABELA 9 ATIVIDADE DE ANTICORPOS VARIANTES HU504.32 EM TESTES DE ADESÃO A CÉLULAS HUMANAS
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TABELA 10 ATIVIDADE DE ANTICORPOS VARIANTES HU504.32 EM TESTES DE ADESÃO A CÉLULAS MURINAS
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[0342] O anticorpo hu504.32 contém metionina na posição 94 da CDR3 de cadeia pesada. As variantes M94Q (ou hu504.32Q) e M94R (ou hu504.32R) contêm glutamina ou arginina, respectivamente, na posição 94 da variante de anticorpo hu504.32. Os anticorpos hu504.32M, Q e R reduziram substancialmente a interação entre ligante e receptor de integrina beta7 em cada um dos testes e são, portanto, potentes inibidores de adesão celular mediada por beta7.
ATIVIDADE DE ANTICORPO HU504.32R IN VIVO
[0343] A variante de anticorpo hu504.32R foi testada in vivo para determinar a sua capacidade de reudção da interação entre ligante e receptor de integrina beta7 e reduzir o recrutamento de linfócitos para cólon inflamado em modelo de doença intestinal inflamatória murina in vivo. Camundongos BALB/c e camundongos CB17 SCID foram obtidos por meio da Charles River Laboratories International, Inc. (Wilmington MA, Estados Unidos). Camundongos colíticos SCID reconstituídos com altas células T CD4+CD45Rb foram preparados por meio de isolamento de altas células T CD4+CD45Rb de camundongos BALB/c doadores e transferência de 3 x 105 células em 100 μl de PBS por via intravenosa. Camundongos SCID controle não receberam altas células T CD4+CD45Rb. Camundongos CD4+ reconstituídos que atendem aos critérios de inscrição no grupo de tratamento de 10% de perda em peso a partir da linha base ou 15% do pico de peso na semana 4 foram considerados como possuindo doença intestinal inflamatória induzida e foram selecionados para tratamento.
[0344] No dia de tratamento com anticorpos de teste, células de nódulos linfáticos mesentéricos (MLN) de camundongos BALB/c doadores foram colhidas e radiomarcadas com Cr51. O tratamento envolveu a administração anterior de anticorpo anti-GP120, anticorpo anti-beta7 hu504.32, anticorpo anti- beta7 hu504.32R ou sem anticorpo (controle) por via intravenosa, 200 μg/100 μl de PBS. Trinta minutos após a administração de anticorpos, células MLN marcadas com Cr51 foram injetadas, 4 x 106 células, 100 μl. Uma hora após a injeção de células marcadas, os camundongos sofreram eutanásia e o baço, cólon e placa de Peyer foram recolhidos, pesados e foi determinada a radioatividade de Cr51 total por órgão. A Figura 16 é gráfico de barras dos resultados destes testes que exibe a capacidade relativa dos anticorpos de bloquear o abrigo de células T radiomarcadas para o cólon de camundongos que experimentam doença intestinal inflamatória. O abrigo de células T para cólon inflamado foi inibido por anticorpos anti-beta7 hu504.32 e hu504.32R com relação ao controle negativo, anticorpo anti-GP120. A distribuição para o baço foi similar para todos os anticorpos. Desta forma, os anticorpos anti-beta7 hu504.32 e hu504.32R inibem efetivamente o abrigo de células T para cólon inflamado in vivo.
[0345] Glicação de anticorpos não afeta a capacidade de variante hu504.32R de bloquear a ligação de MAdCAM-1 a receptor alfa4beta7.
[0346] Glicação, a glicosilação não enzimática de proteínas, pode afetar interações entre ligante e anticorpo (vide, por exemplo, Kennedy, D. M. et al, Clin. Exp. Immunol. 98 (2): 245-51 (1994). Glicação de lisina na posição 49 da Glicação 504.32R da lisina na posição de cadeia leve 49 da variante hu504.32R (posição relativa a HVR-L2 B1) foi observada mas não apresentou efeito significativo sobre a capacidade da variante de anticorpo de bloquear a ligação de MAdCAM-1 a células RPMI8866 que expressam receptor de alfa4beta7. A determinação de glicação e dos níveis de glicação foi realizada utilizando espectroscopia de massa-ionização de eletropulverização (ESI-MS) padrão e por meio de cromatografia de afinidade de boronato. Os métodos de HPLC de afinidade de boronato úteis para testar a glicação são encontrados, por exemplo, em Quan, C. P. et al, Analytical Chemistry 71 (20): 4445-4454 (1999) e Li, Y. C. et al, J. Chromatography A, 909: 137-145 (2001). O teste de adesão celular foi realizado de acordo com o teste de adesão de células RPMI8866/MAdCAM-1-Fc descrito no presente.
[0347] Em realizações alternativas da presente invenção, a glicação na posição 49 é reduzida ou eliminada, em que a posição 49 compreende aminoácido diferente de lisina. O polipeptídeo ou anticorpo de acordo com a presente invenção engloba como aminoácido na posição 49 (HVR-L2 posição relativa B1) qualquer dos aminoácidos A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W ou Y, em que cada letra designa um aminoácido de acordo com a designação de aminoácidos de letra única padrão. Alternativamente, o aminoácido na posição 49 da cadeia leve de variante 504.32R (ou outra variante 504) é selecionado a partir do grupo que consiste em R, N, V, A, F, Q, H, P, I ou L. Aminoácido útil na posição 49 é selecionado, por exemplo, por meio de exibição (preparação de biblioteca de fagos) do Fab hu504.32R sobre fago (variante) e substituição separada, no códon para a posição 49, de códon para cada um dos vinte aminoácidos de ocorrência natural. Fago que expressa as variantes hu504.32R alteradas na posição 49 são testadas para determinar a ligação a integrina beta7 e/ou a receptor que compreende integrina beta7, tal como receptores alfa4beta7 ou alfaEbeta7. Estas variantes que se ligam a integrina beta7 ou aos receptores alfa4beta7 ou alfaEbeta7 são adicionalmente selecionadas para determinar a capacidade de inibição da ligação de ligante e receptor integrina beta7 e a eficácia in vivo conforme descrito no presente. Aminoácidos de ocorrência natural ou não natural alternativos podem ser substituídos na posição 49 por meio de métodos de mutagênese padrão e testados nos testes de adesão celular e in vivo descritos no presente. Alternativamente, o aminoácido na posição 49 da cadeia leve é aminoácido diferente de lisina (K) e aminoácidos em qual(is)quer outra(s) posição(ões) de estrutura ou HVR na cadeia leve e/ou cadeia pesada são alterados para selecionar anticorpo ou polipeptídeo de ligação anti-beta7 variante que exibe afinidade de ligação, atividade biológica in vitro e in vivo, farmacocinéticos, liberação de drogas e imunogenicidade úteis para a redução de inflamações por meio de redução da atividade biológica de integrina beta7. Mutagênese e seleção desse polipeptídeo ou variante de anticorpo são realizadas conforme descrito no presente e de acordo com outros métodos padrão. Esse anticorpo ou polipeptídeo de ligação anti-beta7 variante exibe afinidade de ligação de integrina beta7 de até dez mil vezes, mil vezes, alternativamente até cem vezes, alternativamente até dez vezes, alternativamente até cinco vezes, alternativamente até duas vezes a afinidade de ligação exibida por qualquer das variantes Fib504 humanizadas descritas no presente.
[0348] O relatório descritivo acima é considerado suficiente para permitir que os técnicos no assunto pratiquem a presente invenção. A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pela construção depositada, pois a realização depositada destina-se a ilustração isolada de certos aspectos da presente invenção e quaisquer construções que são funcionalmente equivalentes encontram-se dentro do escopo da presente invenção. O depósito de material do presente não constitui aceitação de que o relatório descritivo contido no presente é inadequado para permitir a prática de qualquer aspecto da presente invenção, incluindo o seu melhor modo, nem deve ser considerado limitador do escopo das reivindicações às ilustrações específicas que representa. Na realidade, várias modificações da presente invenção, além das exibidas e descritas no presente, tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima e se encontrarão dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (28)

1. ANTICORPO ANTI-BETA7 HUMANIZADO, caracterizado por compreender: (i) uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, em ordem, compreende RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9), KYASQSIS (SEQ ID NO:2), QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3), GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4), GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5), e ARTGSSGYFDF (SEQ ID NO:64); (ii) uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, em ordem, compreende RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9), KYASQSIS (SEQ ID NO:2), QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3), GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4), GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5), e MTGSSGYFDF (SEQ ID NO:6); (iii) uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, em ordem, compreende RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9), KYASQSIS (SEQ ID NO:2), QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3), GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4), GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5), e AMTGSSGYFDF (SEQ ID NO:63); (iv) uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, em ordem, compreende RASESVDDLLH (SEQ ID NO:9), KYASQSIS (SEQ ID NO:2), QQGNSLPNT (SEQ ID NO:3), GFFITNNYWG (SEQ ID NO:4), GYISYSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO:5), e RTGSSGYFDF (SEQ ID NO:66); (v) uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, em ordem, compreende RASESVDSLLH (SEQ ID NO:7), SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, e SEQ ID NO:64; (vi) uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR-H3, em que cada uma, em ordem, compreende RASESVDSLLH (SEQ ID NO:7), SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, e SEQ ID NO:6; (vii) uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR- H3, em que cada uma, em ordem, compreende RASESVDTLLH (SEQ ID NO:8), SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, e SEQ ID NO:64; ou (viii) uma HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 e HVR- H3, em que cada uma, em ordem, compreende RASESVDTLLH (SEQ ID NO:8), SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, e SEQ ID NO:6.
2. ANTICORPO ANTI-BETA7 HUMANIZADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma ou mais sequências de estrutura humana e/ou sequência consenso de estrutura humana.
3. ANTICORPO ANTI-BETA7 HUMANIZADO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender pelo menos uma porção ou a totalidade de uma sequência consenso de estrutura K do subgrupo I humana.
4. ANTICORPO ANTI-BETA7 HUMANIZADO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo domínio variável da cadeia pesada do anticorpo anti-beta7 compreender uma sequência consenso de estrutura do subgrupo III humana.
5. ANTICORPO ANTI-BETA7 HUMANIZADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo aminoácido na posição 71 da estrutura da cadeia pesada ser selecionada do grupo consistindo em R, A e T e/ou o aminoácido na posição 73 da estrutura da cadeia pesada ser selecionada do grupo consistindo em N e T e/ou o aminoácido na posição 78 da estutrura da cadeia pesada ser selacionada do grupo consistindo em F, A e L.
6. ANTICORPO ANTI-BETA7 HUMANIZADO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender uma sequência de estrutura consenso de cadeia pesada do subgrupo III humano de cadeia pesada variante que compreende uma substituição em uma ou mais das posições 71, 73, 78 e/ou 94.
7. ANTICORPO ANTI-BETA7 HUMANIZADO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pela substituição ser R71A, N73T, L78A, L78F e/ou R94M.
8. ANTICORPO ANTI-BETA7 HUMANIZADO ou seu fragmento de ligação a beta7, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela afinidade monovalente do anticorpo ou fragmento de ligação a beta7 humano ser substancialmente idêntica ou maior que a afinidade monovalente de um anticorpo que compreende sequências variáveis de cadeia leve e cadeia pesada, conforme ilustradas na SEQ ID N° 10 e/ou na SEQ ID N° 11 ou na SEQ ID N° 12 e/ou a SEQ ID N° 13.
9. ANTICORPO HUMANIZADO, ou seu fragmento de ligação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela afinidade ser pelo menos 2 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 10 vezes, pelo menos 50 vezes, pelo menos 100 vezes, pelo menos 500 vezes, pelo menos 1000 vezes, pelo menos 5.000 vezes ou pelo menos 10.000 vezes maior que um anticorpo que compreende sequências de cadeia leve e cadeia pesada ilustradas na SEQ ID N° 10 e na SEQ ID N° 11 ou na SEQ ID N° 12 e na SEQ ID N° 13.
10. ANTICORPO HUMANIZADO, ou seu fragmento de ligação, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela afinidade monovalente do anticorpo ao beta7 humano ser pelo menos 3 vezes maior que a afinidade monovalente de um anticorpo que compreende sequências de cadeia leve e cadeia pesada ilustradas na SEQ ID N° 10 e na SEQ ID N° 11 ou na SEQ ID N° 12 e na SEQ ID N° 13.
11. ANTICORPO HUMANIZADO, ou fragmento de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo anticorpo que compreende sequências de cadeia leve e cadeia pesada ilustradas na SEQ ID N° 10 e na SEQ ID N° 11 ou na SEQ ID N° 12 e na SEQ ID N° 13 ser produzido por linhagem de células de hibridoma depositada na Coleção Norte-Americana de Cultura de Tipos com número de acesso ATCC com designação HB-293.
12. ANTICORPO HUMANIZADO, ou fragmento de ligação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela afinidade de ligação ser expressa na forma de valor Kd.
13. ANTICORPO HUMANIZADO, ou fragmento de ligação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pela afinidade de ligação ser medida por ensaio de ressonância de plasmon de superfície ou radioimunoensaio.
14. ANTICORPO ANTI-BETA7 HUMANIZADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pela afinidade monovalente do anticorpo a beta7 humano ser substancialmente idêntica ou maior que a afinidade monovalente de um anticorpo que compreende sequências variáveis de cadeia leve e cadeia pesada, conforme ilustradas na SEQ ID N° 10 e/ou na SEQ ID N° 11 ou na SEQ ID N° 12 e/ou a SEQ ID N° 13.
15. MÉTODO DE INIBIÇÃO DA INTERAÇÃO DE SUBUNIDADE DE INTEGRINA BETA7 HUMANA, com uma segunda subunidade de integrina e/ou ligante in vitro, caracterizado por ser pelo contato do anticorpo anti-beta7, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 com a integrina beta7.
16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pela segunda subunidade de integrina ser subunidade de integrina alfa4 e em que o ligante é MAdCAM, VCAM ou fibronectina.
17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pela subunidade de integrina alfa4 ser de humano.
18. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo ligante ser de humano.
19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela segunda subunidade de integrina ser subunidade de integrina alfaE e em que o ligante é E-cadereína.
20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pela subunidade de integrina alfaE ser de humano.
21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo ligante ser de humano.
22. USO DE UM ANTICORPO ANTI-BETA7, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de doença intestinal inflamatória, mal de Crohn, colite ulcerativa, doença hepática inflamatória, inflamação do SNC, pancreatite crônica, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Sjorgen, psoríase e inflamação da pele, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença pulmonar intersticial, alergia, doença autoimune, rejeição de transplante, rejeição de enxerto renal, doença de enxerto contra hospedeiro, diabetes ou câncer.
23. USO DE UM ANTICORPO ANTI-BETA7, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por ser na preparação de um medicamento para inibir a interação de subunidade de integrina beta7 humana com uma segunda unidade de integrina e/ou ligante pelo contato com a integrina beta7, em que a inibição reduz ou alivia os sintomas de disfunção selecionada a partir do grupo que consiste em inflamação, asma, doença intestinal inflamatória, mal de Crohn, colite ulcerativa, diabetes, inflamações resultantes de transplante de órgãos, disfunção de enxerto contra hospedeiro e inflamações associadas a disfunções de aloenxertos.
24. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender um anticorpo anti-beta7 humanizado, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
25. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de ser para uso na modulação do recrutamento e/ou adesão celular mediada por integrina beta7, em um mamífero que experimenta uma disfunção; em que a disfunção é selecionada do grupo consistindo em inflamação, asma, doença intestinal inflamatória, mal de Crohn, colite ulcerativa, diabetes, inflamações resultantes de transplante de órgãos, disfunção de enxerto contra hospedeiro e inflamações associadas a disfunções de aloenxertos.
26. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo mamífero ser um humano.
27. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada por compreender adicionalmente um segundo agente biofarmacêutico ou agente quimioterápico.
28. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 27, caracterizado pela modulação inibir a integração de integrina beta7 com integrina alfa4, integrina alfaE, MAdCAM, VCAM, E- caderina e/ou fibronectina.
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