RS57667B1 - Anti-cd28 humanizovana antitela - Google Patents

Anti-cd28 humanizovana antitela

Info

Publication number
RS57667B1
RS57667B1 RS20180994A RSP20180994A RS57667B1 RS 57667 B1 RS57667 B1 RS 57667B1 RS 20180994 A RS20180994 A RS 20180994A RS P20180994 A RSP20180994 A RS P20180994A RS 57667 B1 RS57667 B1 RS 57667B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
sequence
variable domain
fab
Prior art date
Application number
RS20180994A
Other languages
English (en)
Inventor
Caroline Mary
Nicolas Poirier
Bernard Vanhove
Original Assignee
Ose Immunotherapeutics
Inst Nat Sante Rech Med
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP10290080A external-priority patent/EP2361935A1/en
Application filed by Ose Immunotherapeutics, Inst Nat Sante Rech Med filed Critical Ose Immunotherapeutics
Publication of RS57667B1 publication Critical patent/RS57667B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na humanizovana antitela koja se vezuju za CD28, na njihove monovalentne fragmente, i na njihove terapeutske upotrebe, posebno u kontekstu regulacije aktivnosti T ćelija.
[0002] Abnormalna aktivacija T ćelija je uključena u patogenezu mnogih autoimunskih bolesti, i takođe u pojavu odbacivanja transplanta, što može da prouzrokuje razvijanje imunskog odgovora koji je usmeren prema transplantiranom organu.
[0003] Jedan od najvažnijih sistema za regulaciju aktivnosti T limfocita je molekulski sistem B7/CD28/CTLA4. Ovaj sistem igra, na primer, esencijalnu ulogu u mehanizmima odbacivanja transplanta (WOODWARD et al., Transplantation, 66, 14-20, 1998). Molekuli B7.1 (CD80) i B7.2 (CD86) koje nose APC-e mogu da aktiviraju receptor CD28 i takođe receptor CTLA4 na limfocitima. Aktivacija CD28 prenosi T limfocitu pozitivni signal koji stimuliše ćeliju; sa druge strane, aktivacija CTLA4 prenosi negativni signal koji prouzrokuje ne-reponsivnost (anergiju) (FALLARINO et al., J. Exp. Med., 188, 205-210, 1998).
[0004] Mirujući T limfociti eksprimiraju veliku količinu CD28 i sasvim malo CTLA4. Kada se upostavi prvi kontakt prepoznavanja između APC i T limfocita, favorizuje se CD28/B7 interakcija, koja dovodi do aktivacije ćelije. Samo nekoliko časova nakon inicijacije aktivacije, zbog povećanja u ekspresiji CTLA4 na membrani, afinitet koji je za B75 do 10 puta veći u odnosu na CD28, interakcija B7/CD28 se pomera u korist B7/CTLA4 interakcije.
[0005] Regulatorni T limfociti eksprimiraju veliku količinu CD28 i CTLA4 koji sprečava ili omogućava, redom, supresivnu aktivnost regulatornih T limfocita. U prisustvu APC koje eksprimiraju visok nivo B7, CD28/B7 interakcija sprečava supresivnu aktivnost regulatornih T limfocita (Sansom et al., Trends Immunol.24, 314-319, 2003).
[0006] Selektivna inhibicija signala agonista koji se daje T ćeliji pomoću CD28, ostavljajući sitem antagonista koji se sastoji od para CTLA4/B7 intaktnim, pomoću specifičnog blokiranja CD28/B7 interakcije, bi omogućio prevenciju aktivacije T limfocita i promovisanje imunske supresije pomoću regulatornih T limfocita. Takvo specifično blokiranje CD28/B7 interakcije može da se dobije korišćenjem nekih antitela koja su usmerena prema, specifična za CD28.
[0007] Takva antitela su namenjena za korišćenje u monovalentnom obliku (na primer kao Fab ili scFv fragmenti), s obzirom na to kada se koriste u prirodnom divalentnom obliku, njihovo vezivanje za CD28 dovodi do dimerizacije i aktivacije ovog receptora. Svaki od Fab fragmenta sadrži laki lanac i prvu polovinu teškog lanca; scFv fragmenti se sastoje od varijabilnih porcija teških i lakih lanaca roditeljskog antitela, koji su jedan za drugi vezani pomoću fleksibilne grupe za povezivanje (CLACKSON et al., Nature, 352, 624-628, 1991), prema tome obrazuju jednolanačani protein.
[0008] Jedno takvo antitelo je antitelo CD28.3, proizvedeno od strane linije ćelijskog hibridoma CNCM I-2582, i prikazano u PCT prijavi WO 02/051871. Ovo antitelo, kada se koristi u monovalentnom obliku kao što su scFv fragmenti, može in vitro da blokira CD28 receptor bez njegovog aktiviranja (PCT WO 02/051871; VANHOVE et al., Blood, 102, 564-70, 2003), i takođe je pokazana njegova efikasnost in vivo u modelima transplantacije organa kod miševa i kod primata (POIRIER et al., World Transplant Congress, Sydney, Australia. August 16-21, 2008; POIRIER et al, Sci Trans Med, 2:17, pl7ral0, 2010).
[0009] Nedostatak svih monoklonskih antitela koji se dobijaju iz mišjih izvora, je njihova imunogenost kada se daju humanim subjektima. Oni prouzrokuju anti-mišji imunski odgovor, što dovodi do slabije efikasnosti tretmana, posebno kada se zahteva ponavljanje davanja.
[0010] Ovaj nedostatak može, u osnovi, da se izbegne upotrebom humanizovanih antitela. Cilj humanizacije je da se dobije rekombinovano antitelo koje ima slična svojstva za vezivanje antigena kao mišje monoklonsko antitelo iz koga se dobijaju sekvence regiona koji određuju komplementarnost (CDRs), i koje je značajno manje imunogeno kod ljudi.
[0011] CDR-i su porcije varijabilnih domena antitela koje se nalaze u direktnom kontaktu sa antigenom i određuju specifičnost vezivanja antigena; okvirni regioni (FR-i) koji se nalaze između CDR-i u varijabilnim domenima nisu u direktnom kontaktu sa antigenom, ali služe kao skele za održavanje globalne strukture varijabilnih domena.
[0012] Prijavljeno je nekoliko pristupa za humanizaciju antitela. U široj uporebi se zasnivaju na "graftingu CDRa", koji uključuje transplantaciju CDR-a iz mišjeg antitela u odgovarajuće humane FR. Međutim, u mnogim antitelima, neki FR ostaci su važni za vezivanje antigena, zbog toga što imaju uticaj na konfomaciju CDR-a i prema tome na njihova svojstva za vezivanje antigena, posebno na afinitet vezivanja. Gubitak u afinitetu vezivanja je posebno štetan u slučaju antitela koje je namenjeno da se koristi u monovalnetnom obliku koji generalno ispoljava manji afinitet prema antigenu u odnosu na prirodno divalentno antitelo. Prema tome, u većini slučajeva, dalje je neophodno, da bi se obezbedio dovoljan afinitet vezivanja, da se ponovo uvede jedan ili nedoliko okvirnih ostataka iz mišjeg antitela u humane FR-e, uz rizik istovremenog vraćanja nepoželjne imunogenosti.
[0013] Drugi pristup za humanizaciju antitela, koji je poznat pod imenom "de-imunizacija", uključuje identifikaciju unutar FR regiona antitela, B-ćelijskih i T-ćelijskih epitopa koj su prepoznati kao "strani" i prema tome potencijalno imunogeni kod ljudi, i njihovo uklanjanje odgovarajućim supstitucijama aminokiselina. Ovaj pristup, međutim, takođe podrazumeva rizik da su uklonjeni FR ostaci koji su važni za vezivanje antigena. Osim toga, neki imunogeni epitopi mogu da se nalaze unutar CDRa i pokušaj njihovog uklanjanja uključuje visok rizik narušavanja ne samo afiniteta vezivanja antigena već takođe i specifičnosti antitela za vezivanje antigena.
[0014] Prema tome, glavno pitanje u humanizaciji antitela je odrediti koji ostaci aminokiselina su kritični za zadržavanje svojstva za vezivanje antigena. Predloženi u različiti postupci za predviđanje više odgovarajućih mesta za supstituciju u FR regionima. Iako oni obezbeđuju generalne principe koji mogu da budu od neke pomoći u prvim kracima za humanizaciju, konačan rezultat se značajno razlikuje od antitela do drugog. Prema tome, za dato antitelo, jako je teško predvideti koje će supstitucije obezbediti željeni rezultat. U slučaju gde su potrebne ne samo supstitucije FRa, već takođe i CDRa za odgovarajuće smanjenje imunogenosti kod ljudi, konačan rezultat postaje u potpunosti nepredvidiv.
[0015] Tan et al. Blood 96:11, 31A, 2000 prikazuje postupak za proizvodnju funkcionalnog humanizovanog anti-CD28 antitela,
[0016] Saldanha: "Chapter 6: Molecular Engineering I: Humanization" In: Stephan Duebel: "Handbook of Therapeutic Antibodies", Wiley-VCH, 119-144, 2007 prikazuje postupke humanizacije antitela.
[0017] WO 2010/009391 prikazuje domen antitela koji se sastoji od ili sadrži jedan varijabilni imunoglobulinski domen koji se specifično vezuje i antagonizuje aktivnost CD28.
[0018] WO 2010/082136 prikazuje rekombinovana monovalentna antitela koja su heterodimeri prvog proteinskog lanca koji sadrži varijabilni domen teškog lanca antitela od interesa i CH2 i CH3 domene IgG imunoglobulina i drugog proteinskog lanca koji sadrži varijabilni domen lakog lanca pomenutog imunoglobulina od interesa i CH2 i CH3 domene pomenutog IgG imunoglobulina.
[0019] WO 2010/070047 prikazuje rastvorljive CD47 vezujuće polipeptide, za upotrebu kao sredstvo za lečenje, posebno za prevenciju ili lečenje autoimunskih i zapaljenskih poremećaja.
[0020] Pronalazači su uspeli u proizvodnji humanizovanog CD28.3 (koji se ovde takođe naziva hCD28.3), koji ima nisku imunogenost, i koji, iako ima nekoliko supstitucija aminokiselina uključuje ne-konzervativnu K→Q supstituciju u CDR2 od teškog lanca, zadržava svojstva vezivanja CD28 roditeljskog mišjeg CD28.3. Kada se koristi u monovalentnom obliku, hCD28.3 pronalaska takođe zadržava svojstva vezivanja CD28 roditeljskog mišjeg CD28.3.Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CD28 antitelo koje ima mesto vezivanja za CD28 koje se sastoji od:
- prvog varijabilnog domena (koji se ovde takođe naziva "varijabilni domen teškog lanca") koji se definiše sledećom sekvencom:
VQLQQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYIIHWIKLRSGQGLEWI GWFYPGSNDIQYNAQFKGKATLTADKSSSTVYMELTGLTPEDSAVYFCARRDDFSG YDALPYWGQGTLVTVSA
(SEQ ID NO: 1), gde pomenuti varijabilni domen može opciono dalje da sadrži Q ostatak na njegovom N-terminalnom kraju;
- drugog varijabilnog domena (koji se ovde takođe naziva "varijabilni domen lakog lanca") koji se definiše sledećom sekvencom:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTNENIYSNLAWYQQKDGKSPQLL
IYAATHLVEGVPSRFSGSGSGTQYSLTISSLQPEDFGNYYCQHFWGTPXTFGGGTKLEI KR, gde X= C ili A.
[0021] Ovde je takođe prikazano antitelo koje ima CD28-mesto vezivanja koje se sastoji od:
- prvog varijabilnog domena koji ima CDR-e varijabilnog domena SEQ ID NO: 1;
- drugog varijabilnog domena koji ima CDR-e varijabilnog domena SEQ ID NO: 2.
[0022] Termin "anti-CD28 antitelo" ovde se odnosi na bil koji protein za vezivanje antigena koji ima najmanje jedno mesto za vezivanje antigena (koje se sastoji iz varijabilnih domena lakog lanca i iz teškog lanca) koji može specifično da se veže za humani CD28. Obuhvata antitela u divalentnom obliku (kao što su prirodni imunoglobulinski molekuli ili F(ab)’2 fragmenti) sa dva CD28-mesta vezivanja, kao i antitela u monovalentnom obliku koja imaju jedno CD28-mesto vezivanja, (na primer Fab, Fab’, Fv i scFv fragmente). U većini slučajeva, poželjnija su antitela u monovalentnom obliku.
[0023] Posebno uključuje rekombinovana antitela koja sadrže CD28-mesto vezivanja koje je povezano sa jednim ili više heterolognih polipeptid(a).
[0024] Kao primer, antitelo predmetnog prikaza može da bude rekombinovani Fab ili Fab’ fragment koji sadrži konstantni domen CH1 humanog imunoglobulina koji je kombinovan na C-terminalnom kraju varijabilnog domena SEQ ID NO: 1, i konstantni domen CL humanog imunoglobulina koji je kombinovan na C-terminalnom kraju varijabilnog domena SEQ ID NO: 2. Primer takvog rekombinovanog Fab fragmenta je Fab fragment sa teškim lancem koji ima sekvencu aminokiselina 21-251 SEQ ID NO: 4 i laki lanac koji ima sekvencu aminokiselina 21-234 SEQ ID NO: 6.
[0025] Takođe, hCD28.3 antitelo može da sadrži, osim varijabilnih domena SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2, koji su definisaniu tekstu iznad, jednu ili više od sledećih komponenti:
- humani konstantni region (Fc). Ovaj konstantni region može da se odabere od konstantih regiona iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog izotipa, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Poželjni konstantni regioni se biraju iz konstantnih domena lgG, posebno IgG4. - protein koji omogućava produženje polu-života u plazmi kada se daje in vivo u monovalnetnom obliku kao što je na primer prikazano u PCT WO 02/051871; u poželjnom izvođenju, pomenuti protein je CH2-CH3 domena od IgG molekula, ka što je prikazano u PCT/IB/2010/000196; u skladu sa pomenutim izvođenjem, hCD28.3 monovalentno antitelo od:
- prvog proteinskog lanca koji se esencijalno sastoji od, njegovog N-kraja do njegovog C-kraja:
* regiona A koji ima sekvencu SEQ ID NO: 1;
* regiona B koji se sastoji iz peptidne grupe za povezivanje i CH2 i CH3 domena IgG imunoglobulina;
- drugog proteinskog lanca koji se esencijalno sastoji od, njegovog N-kraja do njegovog C-kraja:
* regiona A’ koji ima sekvencu SEQ ID NO: 2;
* regiona B koji je identičan sa regionom B prvog polipeptida.
[0026] Poželjno, peptidne grupa za povezivanje je region zgloba humanih IgG 1 imunoglobulina koji ima sekvencu EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 7), i CH2 i CH3 domeni su oni koji pripadaju subklasi lgG4 imunoglobulina. Takođe može da se koristi kraća verzija pomenutog regiona zgloba, koji ima sekvencu DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 8).
[0027] Prema poželjnom izvođenju, polipeptidna sekvenca prvog proteinskog lanca je sekvenca aminokiselina 21-368 od SEQ ID NO: 10, i polipeptidna sekvenca drugog proteinskog lanca je sekvenca aminokiselina 21-355 od SEQ ID NO: 12. Prema drugom poželjnom izvođenju, polipeptidna sekvenca prvog proteinskog lanca je sekvenca aminokiselina 21-373 od SEQ ID NO: 14, i polipeptidna sekvenca drugog proteinskog lanca je sekvenca aminokiselina 21-360 od SEQ ID NO: 16.
[0028] Opciono, hCD28.3 antitelo pronalaska može dalje da sadrži jednu ili više od sledećih komponenti:
- protein koji ima farmakološku aktivnost (na primer toksin);
- jedan ili više „tag“ polipeptid(a).
[0029] Alternativno, da bi se produživo polu-život u plazmi, posebno kada se nalaze u obliku Fab fragmenata, antitela pronalaska mogu da budu konjugovana sa polimerima koji su rastvorljivi u vodi kao što je polietilen glikol (PEGilacija). PEGilacija je klasičan put za pojačanje framakokinetičkih svojstava terapeutskih polipeptida, i može da se postigne upotrebom postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike.
[0030] U tom pogledu, pronalazači su pronašli da zamenom originalnog ostatka cisteina na položaju 96 varijabilnog domena u prirodnom CD 28.3 sa ostatkom alanina ili asparagina (što se dobija antitelo koje ima laki lanac koji sadrži varijabilni domen SEQ ID NO: 2 gde X = A ili N) omogućava bolju efikasnost u pegilaciji antitela upotrebom maleimidom-aktiviranog polietilen glikola (koji cilja reaktivne cisteinske ostatke), bez suštinske modifikacije njegove vezujuće aktivnosti, iako cistein-96 se nalazi u CDR3 lakog lanca antitela. Korist zamene originalnog cisteinskog ostatka na položaju 96 varijabilnog domena uglavnom se sastoji u specifičnom grananju polietilen glikola na C-terminalni ostatak cisteina u teškom lancu. Bez zamene originalnog ostatka cisteina na položaju 96 varijabilnog domena prirodnog CD 28.3, maleimidom-aktivirani polietilen glikol može da se veže za cisteinski ostatak i umanjuju aktivnost vezivanja Fab molekula. Pronalazači su takođe pronašli da dodavanje dialaninskog produžetka nakon C- terminalnog cisteina teškog lanca takođe dovodi do bolje efikasnosti pegilacije.
[0031] Pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira antitelo pronalaska.
[0032] Takođe je prikazan polinukleotid koji se bira od:
a) polinukleotid koji kodira polipeptid koji ima CDR-e od SEQ ID NO: 1, posebno polinukleotid koji kodira polipeptid sa SEQ ID NO: 1;
b) polinukleotid koji kodira polipeptid koji ima CDR-e sa SEQ ID NO: 2, posebno polinukleotid koji kodira polipeptid sa SEQ ID NO: 2;
c) polinukleotid koji kodira hCD28.3 antitelo pronalaska, kao što se definiše u tekstu iznad.
[0033] Polinukleotidi pronalaska generalno takođe sadrže dodatne sekvence: na primer oni mogu povoljno da sadrže sekvencu koja kodira vodeću sekvencu ili signalni peptid koji omogućava sekreciju pomenutog proteinskog lanca.
[0034] Predmetni prikaz takođe obuhvata rekombinovane vektore, posebno ekspresione vektore, koji sadrže polinukleotid pronalaska, koji je uvezi sa elementima koji kontrolišu transkripciju i translaciju koji su aktivni u odabranoj ćeliji domaćinu. Vektori koji mogu da se koriste za dobijanje ekspresionih vektora u skladu sa prikazom su poznati sami po sebi, i posebno se biraju kao funkcija ćelije domaćina koja se namerava koristiti.
[0035] Predmetni prikaz takođe obuhvata ćelije domaćina koje su transformisane sa polinukleotidom pronalaska. Poželjno, pomenuta ćelija domaćina je transformisana sa a polinukleotidom koji sadrži sekvencu koja kodira teški lanac hCD28.3 antitela pronalaska i polinukleotid koji sadrži sekvencu koja kodira laki lanac hCD28.3 antitela pronalaska, i eksprimira pomenuto antitelo. Pomenuti polinukleotidi mogu da se insertuju u isti ekspresioni vektor, ili u dva odvojena ekspresiona vektora.
[0036] Ćelije domaćina koje mogu da se koriste u kontekstu predmetnog pronalaska mogu da budu prokariotske ili eukariotske ćelije. Kod eukariotskih ćelija koje mogu da se koriste, posebno će biti prikazane ćelije biljaka, ćelije iz kvasca, kao što je Saccharomyces, ćelije insekata, kao što su ćelije poreklom iz Drosophila ili Spodoptera, i sisarskae ćelije kao što su HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, itd., ćelije.
[0037] Konstrukcija ekspresionih vektora prikaza i transformacija ćelija domaćina može da se izvede korišćenjem konvencionalnih postupaka molekularne biologije.
[0038] Još drugi predmet prikaza je postupak za dobijanje hCD28.3 antitela pronalaska. Pomenuti postupak obuhvata gajenje u kulturi ćelije domaćina koja je transformisana sa polinukleotidom koji sadrži sekvencu koja kodira teški lanac hCD28.3 antitela pronalaska i polinukleotid koji obuhvata sekvencu koja kodira laki lanac hCD28.3 antitela pronalaska i dobijanje takvog antitela iz pomenute kulture.
[0039] Ukoliko antitelo sekretuje ćelija domaćina, može direktno da se dobije iz medijuma kulture; ukoliko ne, prethodno se obavlja liza ćelija. Antitelo zatim može da se prečisti iz medijuma kulture ili iz ćelijskog lizata, korišćenjem konvencionalnih postupaka, koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike, na primer frakcionim taloženjem, posebno taloženjem sa amonijum sulfatom, elektroforezom, gel filtracijom, afinitetnom hromatografijom, itd.
[0040] hCD28.3 antitela pronalaska mogu da se koriste za dobijanje medicinskih proizvoda. Ovi medicinski proizvodi su takođe deo predmeta pronalaska.
[0041] Predmetni pronalazak takođe sadrži terapeutsku kompoziciju koja obuhvata hCD28.3 antitelo pronalaska, zajedno sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.
[0042] Poželjno, pomenuta kompozicija je kompozicija za parenteralno davanje, formulisanja da se omogući davanje doze od oko 0,5 do 20 mg/Kg, povoljno od oko 5 do 10 mg/Kg hCD28.3 antitela pronalaska. Način davanja kompozicije injekcijom može poželjno da bude subkutani ili intravenozni.
[0043] Na primer, hCD28.3 antitela pronalaska mogu da se koriste za dobijanje imunosupresivnih medicinskih proizvoda koji selektivno blokiraju fenomen aktivacije T ćelija koji uključuje CD28 receptor. Takvi imunosupresivni medicinski proizvodi koji deluju selektivnim blokiranjem CD28 imaju primene u svim patološkim stanjima koja zavise od T limfcita, posebno uključujući odbacivanje transplanta, bolesti grafta protiv domaćina, autoimunske bolesti koje su posredovane sa T limfocitima, kao što je dijabetes tipa I, reumatoidni artritis ili multiple skleroza, i reakcija preosetljivosti tipa IV, koja je uključena u alergijski fenomen i takođe u patogenezu hroničnih inflamatornih bolesti, posebno nakon infekcije sa patogeni agensom (posebno lepra, tuberkuloza, leišmanioza, listerioza, itd.)
[0044] Predmetni pronalazak će biti jasniji iz daljeg opisa koji sledi, koji se odnosi na primere koji ne ograničavaju dobijanje i svojstva hCD28.3 antitela u skladu sa pronalaskom.
[0045] Konstrukcija ekspresionih vektora prikaza i transformacija ćelija domaćina može da se dobije standardnim postupcima molekularne biologije.
[0046] hCD28.3 antitelo pronalaska može da se dobije gajenjem u kulturi ćelije domaćina koja sadrži ekspresioni vektor koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira dato antitelo, pod uslovima koji su pogodni za njegovu ekspresiju, i preuzimanja datog antitela iz kulture ćelija domaćina.
[0047] Predmetni pronalazak se dalje ilustruje sledećim dodatnim opisom, koji se odnosi na primere koji prikazuju svojstva hCD28.3 antitela pronalaska. Međutim, treba razumeti da su ovi primeri dati samo kao način ilustovanja pronalaska i na na koji način ne predstavljaju njegovo ograničenje.
LEEGENDE SLIKA
[0048]
Slika 1: Nukleotidne i sekvence aminokiselina konstrukcije Signal-VH-hCHl. Masna slova: vodeća sekvenca; Podvučeno: položaji CDR-a roditeljskog CD28.3 antitela. Italici: humani CHI region; Istaknuti i dvostruko podvučeni: supstitucije koje su napravljene u VH regionu CD28.3 antitela.
Slika 2: Nukleotidne i sekvence aminokiselina konstrukcije Signal-VL-hCK. Masna slova: vodeća sekvenca; Podvučeno: položaji CDR-a roditeljskog CD28.3 antitela. Italici: humani c kapa region; Istaknuti i dvostruko podvučeni: supstitucije koje su napravljene u VL regionu CD28.3 antitela.
Slika 3: A) optička gustina na 405 nm za rastuće koncentracije FR104, hCD28.3 Fab ili CD28.3 Fab u ELISA testu vezivanja; B) računanje za krive regersije, što omogućava određivanje komparativnih AC50 vrednosti.
Slika 4: Nukleotidne i sekvence aminokiselina hVHCD28.3-kratki zglobγ1-hγ4CH2CH3 konstrukcije. Masna slova: vodeća sekvenca. Podvučeno: CDR-i. Dvostruko podvučen: region zgloba. Podvučeno sa prekidima: CH2-CH3 domeni humanog IgG4.
Slika 5: Nukleotidne i sekvence aminokiselina hVLCD28.3-kratki zglob γ1-hγ4CH2CH3 konstrukcije. Masna slova: vodeća sekvenca. Podvučeno: CDR-i. Dvostruko podvučeno: region zgloba. Podvučeno sa prekidima: CH2-CH3 domeni humanog IgG4.
Slika 6: Nukleotidne i sekvence aminokiselina hVHCD28.3-puni zglobγ1-hγ4CH2CH3 konstrukcije. Masna slova: vodeća sekvenca. Podvučeno: CDR-i. Dvostruko podvučeni: region zgloba. Podvučeno sa prekidima: CH2-CH3 domeni humanog IgG1.
Slika 7: Nukleotidne i sekvence aminokiselina hVLCD28.3-puni zglobγ1-hγ4CH2CH3 konstrukcije. Masna slova: vodeća sekvenca. Podvučeno: CDR-i. Dvostruko podvučeni: region zgloba. Podvučeno sa prekidima: CH2-CH3 domeni humanog IgG1.
Slika 8: Svojstva vezivanja anti-CD28 hVH/VL CD28.3 monovalentnih antitela. Izvršena je kotransfekcija COS ćelija sa 2 µg (svaki) pSignal-hVH-kratki zglobyl-hy4CH2-CH3 i pSignal-hVL-kratki zglobγ1-hγ4CH2-CH3, ili ko-transfekcija sa 2 µg (svaki) pSignal-hVH-puni zglobγ1-hγ4CH2-CH3 i pSignal-hVL-puni zglobγ1-hγ4CH2-CH3. Nakon 6 dana, supernatanti su sakupljeni i monovalentna antitela su dozirana upotrebom prvog testa sendvič ELISA. Supernatanti su takođe ispitani sa vezujućom ELISA na imobilizovanim CD28 ciljnim molekulima i vezana monovalentna anti-CD28 antitela su otkrivena sa anti-humanim Fc antitelima obeleženim sa peroksidazom. A: Dobijena optička gustina sa naznačenim molekulima prema njihovoj koncentraciji. B: tabela sa regresionim krivama i izračunatim ED50 (efikasna doza 50), koncentracije koja je neophodna da se dostigne 50% aktivnost vezivanja u ovom testu.
Slika 9: hVH/VL CD28.3 monovalentna antitela inhibiraju sekreciju IL-2 aktiviranih T ćelija. Jurkat T ćelije su stimulisane sa SEE superantigenom i Raji antigen-prezentujuće ćelije tokom 48h, u prisustvu navedenih koncentracija prečišćenog hVH/VL-kratkog zgloba γ1-hγ4CH2-CH3 monovalentnih antitela. Supernatanti su sakupljeni i IL-2 je izmeren pomoću ELISA testa.
Slika 10: SP sefarozna HP-hromatografija (levo) i SDS-PAGE (desno) u neredukujućim uslovima nakon pegilacije C96-Fab-ova iz humanizovanog CD28.3 antitela. Traka 1: marker; traka 2:punjenje; traka 3: Maksimum 1; traka 4: Maksimum 2; traka 5: Maksimum 3.
Slika 11: Svojstva vezivanja CD28 za rekombinovane hCD28.3 Fab-e sa ili bez C96 mutacijama. Grafik pokazuje aktivnost vezivanja (Y osa) prema koncentraciji Fab (X osa).
Slika 12: SP sefarozna HP-hromatografija (levo) i SDS-PAGE (desno) u neredukujućim uslovima posle pegilacije C96A-Fab-a iz humanizovanog CD28.3 antitela. Traka 1: MW markeri; traka 2: Prehromatografija pegilovanih proteina; traka 3: maksimum 1 koji sadrži monopegilovani Fab, koji predstavlja 41% polaznog materijala.
Slika 13: SP sefarozna HP-hromatografija (levo) i SDS-PAGE (desno) u neredukujućim uslovima posle pegilacije C96A-Fab-a iz humanizovanog CD28.3 antitela sa CAA C-terminalnom sekvencom u teškom lancu. Traka 1: MW markeri; traka 2: Pre-hromatografija pegilovanih proteina; traka 3: maksimum.
PRIMER 1: KONSTRUKCIJA I EUKARIOTSKA EKSPRESIJA hCD28.3 MONOVALENTNOG ANTITELA (Fab FRAGMENT)
Teški lanac
[0049] Sekvenca koja kodira VH region hCD28.3 (SEQ ID NO: 1) koja je spojena sa sekvencom koja kodira humani CH1 region (NCBI Pristuponi broj AAF03881) i sa sekvencom koja kodira vodeći peptid teškog lanca prirodnog mišjeg CD28.3 antitela, sintetiše se hemijski, i uvodi u vektor za kloniranje pGA18 (Geneart) za umnožavanje. Sekvenca se zatim iseca digestijom sa KpnI/BamHI restrikcionim enzimima i subklonira u KpnI/BamHI mesta plazmida pcDNA3.1-hygro (Invitrogen). Pozitivni klonovi se umnožavaju i prečišćavaju pomoću Midiprep-oslobođenog od toksina (Macherey-Nagel) za korak transfekcije.
[0050] Dobijeni plazmid je naznačen pSignal-VH-hCH1. Obuhvata konstrukt koji sadrži sekvencu koja kodira VH region hCD28.3 između sekvence koja kodira vodeći peptid teškog lanca CD28.3 i sekvencu koja kodira CH1 region (NCBI Pristupni broj AAF03881). Nukleotidne i sekvence aminokiselina ovog konstrukta su prikazane na Slici 1. Takođe su predstavljene kao SEQ ID NO: 3 i SEQ ID NO: 4 u prikazanoj listi sekvenci.
Laki lanac
[0051] Sekvenca koja kodira VL region hCD28.3 (SEQ ID NO: 2) koja je spojena sa sekvencom koja kodira humani c kapa region (NCBI pristupni broj BAC01725) i sa sekvencom koja kodira vodeći peptid lakog lanca prirodnog mišjeg CD28.3 antitela, sintetiše se hemijski, i uvodi u vektor za kloniranje pGA18 (Geneart) za umnožavanje. Sekvenca se zatim iseca digestijom sa KpnI/BamHI restrikcionim enzimima i subklonira u KpnI/BamHI mesta plazmida pcDNA3.A-hygro (Invitrogen). Pozitivni klonovi se umnožavaju i prečišćavaju pomoću Midiprep-oslobođenog od toksina (Macherey-Nagel) za korak transfekcije.
[0052] Dobijeni plazmid je naznačen pSignal-VL-hCκ. Obuhvata konstrukt koji sadrži sekvencu koja kodira VL region hCD28.3 između sekvence koja kodira signalni peptid lakog lanca CD28.3 i sekvencu koja kodira humani c kapa region (NCBI pristupni broj BAC01725). Nukleotidne i sekvence aminokiselina ovog konstrukta su prikazane na Slici 2. Takođe su predstavljene kao SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6 u prikazanoj listi sekvenci.
Eukariotska ekspresija
[0053] COS ćelije su ko-transfektovane sa 2 µg (svaka) pSignal-VL-hCHl i pSignal-VH-hCH1 upotrebom Fugene lipofection kita za spajanje (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) prema uputstvima proizvođača. Kulture su održavane 3 dana na 37°C, podeljene na jednu trećinu, i vraćene nazad u kulturu na dodatnih 3 dana, zatim su sakupljeni supernatanti ćelija.
[0054] Aktivnost hCD28.3 monovalentnog antitela se procenjuje direktno u supernatantu pomoću ELISA testa, kao što je opisano u Primeru 2 u tekstu ispod.
PRIMER 2: DETEKCIJA AKTIVNOSTI VEZIVANJA hCD28.3 Fab FRAGMENTA POMOĆU ELISA TESTA
[0055] Svojstva vezivanja Fab fragmenta hCD28.3 se porede sa onim koja se dobijaju nakon transfekcije Cos ćelija sa plazmidima koji kodiraju za CD28.3 Fab (ne-humanizovanim), korišćenjem dva ELISA testa
* Prvi (Sendvič ELISA), koncentracije hCD28.3 i CD28.3 Fab fragmenata u kulturi supernatanta transfektovanih COS ćelija su određene upotrebom sendvič ELISA. Ukratko, anti-CD28 Fab koji se nalaze u supernatantima se prvo hvataju sa zečjim poliklonskim antitelom, specifično za lake i teške varijabilne domene CD28.3 (dobijeni nakon imunizacije zečeva sa jedno-lančanim-Fv koji sadrži teške i lake varijabilne domene prirodnog CD28.3, i prečišćene imunoadsorpcijom na CD28.3 Fab-Sefarozi) . Uhvaćeni proteini se zatim otkrivaju sa mišjim monoklonskim antitelom koje je usmereno prema kapa lancu humanog IgG, nakon čega se dodaje poliklonsko kozje antimišje antitelo obeleženo sa peroksidazom. Vezano antitelo se otkriva kolorimetrijom korišćenjem TMB supstrata, i očitava se na 405 nm. OD koji odgovaraju različitim razblaženjima supernatanta se zatim porede sa standardnom krivom koja se dobija korišećenjem poznatih količina CD28.3 Fab, nazvanog FR104, prečišćenog iz supernatanta kulture transformisanih CHO ćelija sa standardnim postupcima hromatografije, i doziranih sa BCA (bisinhronska kiselina) testom. FR104 sadrži prirodne (ne humanizovane), VH i VL regione CD28.3 antitela. Prema tome, možemo da procenimo količinu Fab proteina koja se nalazi u ćelijskim supernatantima.
* Druga (Vezujuća ELISA), za ispitivanje aktivnosti vezivanja hCD28.3 Fab fragmenata u poređenju sa CD28.3 Fab, himernim humanim CD28/Fc (R&D Systems, Abingdon, United Kingdom) se koristi u 2 µg/ml karbonatnom puferu 0,05M pH 9.2 za oblaganje bunarića (50 µL/bunariću) mikrotitarskih ploča (Nunc Immunoplates) preko noći na 4°C. Ovi imobilizovani CD28 ciljni molekuli će vezivati samo imunoreaktivne molekule sa anti-CD28 aktivnosti.
[0056] Bunarići se zatim ispiraju 3 puta redom sa 200 µL PBS-0,05% Tween, i zasićuju sa 100µL PBS Tween 0,1% BSA 1% 2 sata na 37°C.
[0057] Zatim, nakon 3 ispiranja sa 200 µL PBS-0.05%Tween, supernatanti koji sadrže poznate koncentracije CD28.3 ili hCD28.3 Fab fragmenata se dodaju (50 µL/bunariću) u različitim razblaženjima u PBS-0.1% Tween i inkubiraju 2 sata na 37°C. Nakon 3 ispiranja sa 200 µL PBS-0.05%Tween, mišje monoklonsko antitelo usmeren prema kapa lancu humanog IgG, (1/10000 razblaženje) se dodaje (1 sat, 37°C), zatim se dodaju kozja anti-mišja antitela kojugovana sa peroksidazom (1/2000 razblaženje), nakon čega sledi kolorimetrijsko otkrivanje korišćenjem TMB supstrata i očitavanjem na 405 nm.
[0058] Zatim se rezultati predstavljaju kao apsorbanca (Y osa), koja se meri sa vezujućim ELISA testom, prema Fab koncentraciji (X osa), koja se meri sendvič ELISA testom. AC50 (Koncentracija antitela 50) se određuje nakon računanja nagiba krive u njegovom linernom opsegu kao koncentracija anti-CD28 Fab koja je neophodna da se dostigne 50% od maksimalne optičke gustine (OD) u testu vezivanja.
[0059] Rezultati su prikazani na Slici 3 i Tabeli I.
[0060] Slika 3A pokazuje optičku gustinu na 405 nm za rastuće koncentracije FR104, hCD28.3 Fab ili CD28.3 Fab u vezujućoj ELISA.
[0061] Slika 3B pokazuje računanje za regresione krive, što omogućava određivanje komparativnih AC50 vrednosti.
[0062] Tabela I ispod daje pregled OD50, jednačine, i AC50 za standard FR104, i Fab fragmente VH-divljeg tipa VL-divljeg tipa i Fab hCD28.3
Tabela I
, y , ( ) ,
[0063] Ovi rezultati pokazuju da 50% aktivnosti vezivanja a CD28 može da se postigne na koncentraciji koja je slična za Fab fragmente VH- divljeg tipa VL- divljeg tipa (CD28.3 Fab) i hCD28.3 Fab. Koncentracija je nešto niža za standard, verovatno zbog toga što je prečišćen pre testa. Prema tome hCD28.3 zadržava CD28-svojstva vezivanja VH i VL sekvenci divljeg tipa CD28.
PRIMER 3: KONSTRUKCIJA I EUKARIOTSKA EKSPRESIJA hCD28.3 MONOVALENTNOG ANTITELA (FVFC FRAGMENT) SA KRATKIM γ1 ZGLOBOM I γ 4 CH2-CH3 DOMENOM
Teški lanac
[0064] Sekvenca koja kodira VH region hCD28.3 (SEQ ID NO: 1) u C-terminalnom spajanju sa sekvencom koja kodira porciju regiona zgloba humanog IgG1 (SEQ ID NO: 8), sa CH2-CH3 domenima humanog IgG4 (nukleotidi 787 do 1440 sekvence NCBI koja ima pristupni broj BC025985) i u N-terminalnom položaju sa sekvencom koja kodira vodeći peptid teškog lanca nativnog mišjeg CD28.3 antitela, koja je hemijski sintetisana, i uvedena u vektor za kloniranje pMA (Geneart) za umnožavanje. Sekvenca se zatim iseca digestijom sa NheI/EcoRI restrikcionim enzimima i subklonira u NheI/EcoRI mesta plazmida pCIneo (Promega). Nakon transformacije E. coli ćelija, pozitivni klonovi se umožavaju i ekstrahovani plazmidi se prečišćuju pomoću Midiprep-kolona koje su oslobođene od toksina (Macherey-Nagel).
[0065] Dobijeni plazmid je naznačen pSignal-hVH-kratkizglobγ1-hγ4CH2-CH3. Obuhvata konstrukt koji sadrži sekvencu koja kodira VH region hCD28.3 između sekvence koja kodira signalni peptid teškog lanca CD28.3 i sekvencu koja kodira deo humanog γ1 regiona zgloba i humanih γ4 CH2-CH3 domena. Nukleotidne i sekvence aminokiselina ovog konstrukta su prikazane na Slici 4. Takođe su predstavljene kao SEQ ID NO: 9 i SEQ ID NO: 10 u prikazanoj listi sekvenci.
Laki lanac
[0066] Sekvenca koja kodira VL region hCD28.3 (SEQ ID NO: 2) u kombinaciji sa sekvencom koja kodira porciju regiona zgloba humanog IgG1 (SEQ ID NO: 8), sa CH2-CH3 domenima humanog IgG4 (nucleotidi 787 do 1440 sekvence sa NCBI pristupnim brojem BC025985) i u N-terminalnom položaju sa sekvencom koja kodira vodeći peptid teškog lanca nativnog mišjeg CD28.3 antitela, koja je hemijski sintetisana, i uvedena u vektor za kloniranje pMA (Geneart) za umnožavanje. Sekvenca se zatim iseca digestijom sa NheI/EcoRI restrikcionim enzimima i subklonira u NheI/EcoRI mesta plazmida pCINeo (Promega). Nakon transformacije ćelija E. coli, pozitivni klonovi se umnožavaju i ekstrahovani plazmidi se prečišćuju pomoću Midiprep- kolona koje su oslobođene od toksina (Macherey-Nagel).
[0067] Dobijeni plazmid je naznačen pSignal-hVL-kratkizglobγ1-hγ4CH2-CH3. Obuhvata konstrukt koji sadrži sekvencu koja kodira VL region hCD28.3 između sekvence koja kodira signalni peptid CD28.3 lakog lanca i sekvencu koja kodira deo humanog γ1 regiona zgloba i humane γ4 CH2-CH3 domene. Nukleotidne i sekvence aminokiselina ovog konstrukta su prikazane na Slici 5. Takođe su predstavljene kao SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12 u prikazanoj listi sekvenci.
Eukariotska ekspresija
[0068] COS ćelije su ko-transfektovane sa 1 µg (svaka) pSignal-hVL-kratkizglobγ1-hγ4CH2-CH3 i pSignal-hVHkratkizglobγ1-hγ4CH2-CH3, upotrebom Lipofectamine lipofection kita (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Kulture se održavaju 3 dana na 37°C, nakon čega se supernatanti ćelija sakupljaju. Aktivnost monovalentnog antitela se ispituje direktno u supernatantu pomoću ELISA testa, kao što se opisuje u Primeru 5 u tekstu ispod.
PRIMER 4: KONSTRUKCIJA I EUKARIOTSKA EKSPRESIJA hCD28.3 MONOVALENTNOG ANTITELA (FVFC FRAGMENT) SA ZGLOBOM γ1 PUNE DUŽINE I y 4 CH2-CH3 DOMENOM
Teški lanac
[0069] Sekvenca koja kodira VH region hCD28.3 (SEQ ID NO: 1) u C-terminalnom spajanju sa sekvencom koja kodira region zgloba pune dužine humanog IgG1 (SEQ ID NO: 7), sa CH2-CH3 domenom humanog IgG4 (nukleotidi 787 do 1440 sekvence sa NCBI pristupnim brojem BC025985) i u N-terminalnom položaju sa sekvencom koja kodira vodeći peptid teškog lanca nativnog mišjeg CD28.3 antitela, koja je hemijski sintetisana, i uvedena u vektor za kloniranje pMA (Geneart) za umnožavanje. Sekvenca se zatim iseca digestijom sa NheI/EcoRI restrikcionim enzimima i subklonira u NheI/EcoRI mesta plazmida pCIneo (Promega). Nakon transformacije ćelija E. coli, pozitivni klonovi se umnožavaju i ekstrahovani plazmidi prečišćuju pomoću Midiprep- kolona koje su oslobođene od toksina (Macherey-Nagel).
[0070] Dobijeni plazmid je označen pSignal-hVH-punzglobγ1-hγ4CH2-CH3. Obuhvata konstrukt koji sadrži sekvencu koja kodira VH region hCD28.3 između sekvence koja kodira signalni peptid CD28.3 teškog lanca i sekvencu koja kodira deo humanog γ1 regiona zgloba i humane γ4 CH2-CH3 domene. Nukleotidne i sekvence aminokiselina ovog konstrukta su prikazane na Slici 6. Takođe su predstavljene kao SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 14 u prikazanoj listi sekvenci.
Laki lanac
[0071] Sekvenca koja kodira VL region hCD28.3 (SEQ ID NO: 2) u kombinaciji sa sekvencom koja kodira region zgloba pune dužine humanog IgG1 (SEQ ID NO: 7), sa CH2-CH3 domena humanog IgG4 (nukleotidi 787 do 1440 sekvence sa NCBI pristupnim brojem BC025985) i u N-terminalnom položaju sa sekvencom koja kodira vodeći peptid teškog lanca nativnog mišjeg CD28.3 antitela, koja je hemijski sintetisana, i uvedena u vektor za kloniranje pMA (Geneart) za umnožavanje. Sekvenca se zatim iseca digestijom sa NheI/EcoRI restrikcionim enzimima i subklonira u NheI/EcoRI mesta plazmida pCIneo (Promega). nakon transformacije ćelija E. coli, pozitivni klonovi se umnožavaju i ekstrahovani plazmidi prečišćuju pomoću Midiprep- kolona koje su oslobođene od toksina (Macherey-Nagel).
[0072] Dobijeni plazmid je naznačen pSignal-hVL-punzglobγ1-hγ4CH2-CH3. Obuhvata konstrukt koji sadrži sekvencu koja kodira VL region hCD28.3 između sekvence koja kodira signalni peptid CD28.3 lakog lanca i sekvencu koja kodira humani γ1 region zgloba pune dužine i humane γ4 CH2-CH3 domene. Nukleotidne i sekvence aminokiselina ovog konstrukta su prikazane na Slici 7. Takođe su predstavljene kao SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 16 u prikazanoj listi sekvenci.
Eukariotska ekspresija
[0073] COS ćelije su ko-transfektovane sa 1 µg (svaka) pSignal-hVH-punzglobγ1-hγ4CH2-CH3 i pSignal-hVLpunzglobγ1-hγ4CH2-CH3 plazmide upotrebom Lipofectamine lipofection kita (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Kulture se održavaju 3 dana na 37°C, nakon čega se supernatanti ćelija sakupljaju.
[0074] Aktivnost hCD28.3 monovalentnog antitela se procenjuje direktno u supernatantu pomoću ELISA testa, kao što se opisuje u Primeru 5 u tekstu ispod.
PRIMER 5: PROCENJIVANJE VEZUJUĆE AKTIVNOSTI HCD28.3-PUNE DUŽINE γ1 ZGLOB- y4CH2-CH3 DOMENI I HCD28.3-KRATKI γ1 ZGLOB-γ 4CH2-CH3 DOMENI MONOVALENTNIH ANTITELA POMOĆU ELISA
[0075] Svojstva vezivanja hCD28.3 monovalentnih antitela hCD28.3-pun γ1 zglob- γ4CH2-CH3 domeni i hCD28.3-kratki γ1 zglob- γ 4CH2-CH3 domeni koji su proizvedeni transfekcijom COS ćelija su analizirana upotrebom dva ELISA testa.
* Prve (Sendvič ELISA), koncentracije hCD28.3 monovalentnih antitela u supernatantima kulture transfektovanih COS ćelija su određene korišćenjem sendvič ELISA testa. Ukratko, monovalentna antitela koja se nalaze u supernatantima su prvo uhvaćena kozjim poliklonskim antitelom koje je usmereno prema humanom IgG. Uhvaćeni proteini su zatim otkriveni sa biotinizovanim kozjim poliklonskim antihumanim IgG, Fc specifičnim, antitelom, zatim, preoksidazom konjugovanim streptavidinom. Vezano antitelo se otkriva kolorimetrija upotrebom TMB supstrata, i očitava na 405 nm. OD koji odgovaraju različitim razblaženjima supernatanta se zatim porede sa standardnom krivom koja se dobija sa poznatim količinama hCD28.3 monovalentnih antitela, prečišćenih iz supernatanta kulture transformisanih CHO ćelija standardnim postupcima hromatografije, i doziranih sa BCA (bisinhronska kiselina) testom.
* Druga (Vezujuća ELISA), za ispitivanje aktivnosti vezivanja hCD28.3 monovalentnih antitela, himernog humanog CD28/Fc (R&D Systems, Abingdon, United Kingdom) se koristi na 2 µg/ml u karbonatnom puferu 0,05M pH 9.2 za oblaganje bunarića (50 µL/bunariću) mikrotitarskih ploča (Nunc Immunoplates) preko noći na 4°C. Ovi imobilizovani CD28 ciljani molekuli će vezati samo imunoreaktivne molekule sa anti-CD28 aktivnosti.
[0076] Bunarići su zatim isprani redom 3 puta sa 200 µL PBS-0.05% Tween, i saturisani sa 100µL PBS Tween 0,1% BSA 1% u trajanju od 2 sata na 37°C.
[0077] Zatim, nakon 3 ispiranja sa 200 µL PBS-0.05%Tween, supernatanti koji sadrže poznate koncentracije monovalentnih antitela koji treba da se ispituju se dodaju (50 µL/bunariću) u različitim razblaženjima u PBS-0.1% Tween i inkubiraju 2 sata na 37°C. Nakon 3 ispiranja sa 200 µL PBS-0.05%Tween, dodali smo (1/500 razblaženje; 1 sat, 37°C) zečji poliklonski antiserum, koji je specifičan za teške i lake varijabilne domene CD28.3 (dobijene nakon imunizacije zečeva sa jednolančanim-Fv koji sadrži teške i lake varijabilnog domena nativnog CD28.3, i prečišćene imunoapsorpcijom na CD28.3 Fab-Sefarozi). Zatim sledi peroksidazom konjugovana magareća anti-zečja antitela (1/2000 razblaženje), zatim sledi kolorimetrijsko otkrivanje sa TMB supstratom i očitavanje na 405 nm.
[0078] Zatim se rezultati predstavljaju kao aprobanca (Y osa), merena sa vezujućom ELISA, prema koncetraciji monovalentnog antitela (X osa), mereno sendvič ELISA testom. AC50 (Koncentracija antitela 50) je određena nakon računanja nagiba krive u njegovom linearnom opsegu kao koncentracija monoklonskog antitela neophodna da se dostigne 50% maksimalne opsitčke gustine (OD) u testu vezivanja.
[0079] Slika 8 poredi aktivnosti vezivanja hCD28.3-punog IgG1 zgloba-IgG4CH2-CH3 domena sa hCD28.3-kratkim IgG1 zglobom-IgG4CH2-CH3 domenima monovalentnih antitela u vezujućoj ELISA (Slika 8A).
[0080] Slika 8B daje pregled jednačine, regresionog faktora i AC50 za moovalentna antitela.
[0081] Ovi rezultati pokazuju da 50% od aktivnosti vezivanja za CD28 može da se dostigne na koncentraciji koja je slična za hCD28.3-pun γ1 zglob- γ4CH2-CH3 domeni ili hCD28.3-kratki γ1 zglob- γ 4CH2-CH3 domeni monovalentnih antitela.
PRIMER 6: hCD28.3 MONOVALENTNA ANTITELA SPREČAVAJU AKTIVACIJU T ĆELIJA
[0082] Da bi se verifikovalo da hCD28.3 monovalentno antitelo blokira CD28-zavisnu aktivaciju T ćelija, stimulisali smo humane T ćelije (Jurkat ćelije) sa SEE superantigenom koji je predstavljen Raji B ćelijskoj liniji. Endotoksin SEE, kada se prezentuje klasi II-pozitivnoj B ćelijskoj limfoblastoidnoj liniji Raji, aktivira T ćelijsku liniju Jurkat koja eksprimira Vβ8 da sekretuje IL-2 (Herman et al, 1990, J. Exp. Med. 172:709). S ozirom da Jurkat ćelije eksprimiraju visok nivo CD28 i Raji ćelije ekprimiraju CD80/86, ova reakcija delom zavisi od CD28. Merili smo sintezu interleukina-2 u ovom testu pomoću ELISA (ELISA MaxTM Set Deluxe Human IL-2 Kit; Biolegend #431805) nakon 48h, u prisustvu rastućih koncentracija hVH/VL CD28.3-kratkog γ1 zglob- γ4CH2-CH3 domena.
[0083] Rezultati su prikazani na Slici 9. Oni pokazuju da hCD28.3 monovalentna antitela redukuju IL-2 sintezu od strane T ćelije na dozno-zavisna način.
PRIMER 7: DOBIJANJE PEGILOVANOG hCD28.3 MONOVALENTNOG ANTITELA
[0084] hCD28.3 Fab fragment koji se dobija kao što se opisuje u Primeru 1 se pegiluje sa maleimidaktiviranim 40Kda PEG korišćenjem standardnih uslova za redukciju i PEGilaciju.
[0085] Ukratko, fragmenti Fab antitela se koncentruju do 1 µg/mL i zatim dijafiltriraju prema 20 mM natrijum fosfata, 2 mM EDTA, i pH 7.0. Fab’ fragmenti antitela se zatim redukuju dodavanjem cisteamin hlorida u molarnom odnosu ekvivalenta = 30:1 na sobnoj temperaturi. Nakon 5 sati, rastvor se primenjuje na kolonu za uklanjanje soli. Polietilen glikol (PEG) (Sunbright GL2400MA, NOF Corporation) se rastvara u 20 mM fosfatu, 2 mM EDTA, pH 7,0 da se dobije 9% (mas/mas) rastvor. Fab rastvor bez soli i PEG se mešaju u molarnom ekvivalentnom odnosu = 1:1.5 i inkubiraju na sobnoj temperaturi 3 h. Nakon PEGilacije Fab-peg se prečišćava hromatografijom upotrebom SP Sefaroznog HP medijuma. Ciljni protein se ispira uporebom gradijenta soli od 0 do 1 M NaCl. Eluirani maksimumi vrednosti se analiziraju upotrebom SDSPage. Maksimum 1 predstavlja monopegilovani materijal, maksimum 2 nepegilovani materijal i maksimum 3 polipegilovani materijal.
[0086] Rezultati su prikazani na Slici 10.
[0087] Ovi rezultati pokazuju da značajan deo Fab proteina iz CD28.3 mAb predstavlja poremećeni profil pegilacije koji dovodi do prinosa monpegilovanih Fab-a od oko samo 5% (maksimum 1).
[0088] CD28.3 mAb sadrži ostatak cisteina (C96) koji se ne koristi u intra ili inter-lančanim disulfidnim mostovima, na položaju 96 varijabilnog domena lakog lanca. Cistein u slobodnom obliku sadrži veću reaktivnost nego ostaci citeina koji su uključeni u disulfidne mostove i prema tome, poželjno će biti mete maleimidom-aktivirnih pegova. Zbog toga je verovatno da se druga, nepoželjna pegilacija dešava na ovom ostatku.
[0089] Da bi se taj problem rešio izvedeno je ispitivanje VL- C96 mutacije da se odredi da li je moguće izvršiti supstituciju C96 ostatka sa drugom aminokiselinom bez modifikovanja svojstva vezivanja antitela.
[0090] Kodiranje plazmida za humanizovane anti-CD28.3 Fab-e sa nemodifikovanim C96 u lakom lancu, iil sa C96 u A, G, S, V, T, N ili R mutacijama su napravljani i transfektovani u Cos ćelije upotrebom lipofeckije, kao što je prikazano u Primeru 1. Supernatanti ćelija su prvo analizirani sendvič ELISA testom da bi se odredila ukupna Fab koncentracija, kao što je prikazano u Primeru 2. Zatim su supernatanti analizirani sa ELISA testom da bi se odredila aktivnost vezivanja na imobilizovanom rekombinantnom CD28, kao što je prikazano u Primeru 2.
[0091] Rezultati su prikazani na Slici 11. Ovi rezultati pokazuju, da za razliku od svih drugih ispitanih supstitucija, C96A supstitucija dovodi do potpuno aktivnog antitela i da C96N supstitucija dovodi do umerenog smanjenja aktivnosti.
[0092] C96A varijanta Fab fragmenta je pegilovana i prečišćena hromatografijom kao što se opisuje u tekstu iznad. Pegilovani proteini pre-hromatografije i elucioni maksimumi se analiziraju sa SDS-Page. Rezultati su prikazani na Slici 12. Maksimum 1 predstavlja monopegilovani materijal.
[0093] Ovi rezultati pokazuju da C96A fragment Fab može da bude pegilovan sa efikasnošću koja dostiže 41% (Slika 12).
[0094] Prednos CAA C-terminalnog kraja teškog lanca. Neposredno molekulsko okruženje slobodnog cisteina može da modifikuje njegovu pristupačnost maleimidnoj-pegilaciji i prema tome da modifikuje prinos u reakciji pegilacije. Jedna moguća opcija za C-terminalni citein jeste da bude poslednja aminokiselina teškog lanca. Druga opcija je dodavanje "stvari aminokiselina" na C-terminalnom položaju, posle poslednjeg cisteina. Mi smo prema tome poredili efikasnost pegilacije Fab’ molekula iz C96A varijante humanizovanog CD28.3 Mab sa poslednjim C-terminalnim cisteinom koji je poslednja aminokiselina u teškom lancu (C varijanta; podaci prikazani na Slici 12) sa sličnim molekulom sa poslednjim C-terminalnim citeinom koga prate dva alalnina (CAA varijanta). Naši podaci su jasni i reproduktivno pokazali da CAA varijanta može da bude pegilovana sa 20% većom efikasnosti (Slika 13). Zaista, prinos pegilancije koji je 41% za C96A-C varijantu dostiže 52% za C96A-CAA varijantu.
LISTA SEKVENCI

Claims (8)

Patentni zahtevi
1. Anti-CD28 antitelo koje ima CD28-mesto vezivanja koje se sastoji od:
- prvog varijabilnog domena (koji se ovde takođe definiše "varijabilni domen teškog lanca") koji je definisan sledećom sekvencom:
VQLQQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYIIHWIKLRSGQGLEWIGWFYP
GSNDIQYNAQFKGKATLTADKSSSTVYMELTGLTPEDSAVYFCARRDDFSGY DALPYWGQGTLVTVSA
(SEQ ID NO:1), gde pomenuti varijabilni domen može opciono dalje sadrži Q ostatak na njegovom N-terminalnom kraju;
- drugi varijabilni domen (koji se ovde takođe definiše "varijabilni domen lakog lanca") koji je definisan sledećom sekvencom:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTNENIYSNLAWYQQKDGKSPQLLIYAATH LVEGVPSRFSGSGSGTQYSLTISSLQPEDFGNYYCQHFWGTPXTFGGGTKLEI KR, gde X = C ili A.
2. Antitelo prema zahtevu 1, što je monovalentno antitelo.
3. Monovalentno antitelo prema zahtevu 2, što je heterodimer od:
- prvog proteinskog lanca koji ima sekvencu aminokiselina 21-251 od SEQ ID NO:4
- drugog proteinskog lanca koji ima sekvence aminokiselina 21-234 od SEQ ID NO:6.
4. Monovalentno antitelo prema zahtevu 3, gde drugi proteinski lanac sadrži varijabilni domen od SEQ ID NO: 2 gde X predstavlja ostatak alanina.
5. Monovalentno antitelo prema zahtevu 4, koje je pegilovano.
6. Polinukleotid koji kodira antitelo prema bilo kojim od zahteva 1 do 4.
7. Terapeutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kojim od zahteva 1 do 5.
8. Antitelo prema bilo kojim od zahteva 1 do 5, za upotrebu u lečenju patološkog stanja koje se bira iz grupe koja se sastoji od odbacivanja transplanta, hronične vaskulopatije alografta, bolesti grafta protiv domaćina, autoimunskih bolesti koje su posredovane sa T limfocima, hipertenzije, fenomena alergija i hroničnih inflamatornih bolesti.
RS20180994A 2010-02-18 2011-02-16 Anti-cd28 humanizovana antitela RS57667B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10290080A EP2361935A1 (en) 2010-02-18 2010-02-18 Anti-CD28 humanized antibodies
EP10290389 2010-07-13
PCT/IB2011/050646 WO2011101791A1 (en) 2010-02-18 2011-02-16 Anti-cd28 humanized antibodies
EP11707918.6A EP2536764B1 (en) 2010-02-18 2011-02-16 Anti-cd28 humanized antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57667B1 true RS57667B1 (sr) 2018-11-30

Family

ID=44482493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20180994A RS57667B1 (sr) 2010-02-18 2011-02-16 Anti-cd28 humanizovana antitela

Country Status (17)

Country Link
US (3) US8785604B2 (sr)
EP (2) EP2536764B1 (sr)
JP (1) JP5992340B2 (sr)
CA (1) CA2788544C (sr)
CY (1) CY1120707T1 (sr)
DK (1) DK2536764T3 (sr)
ES (2) ES2680570T3 (sr)
HR (1) HRP20181360T1 (sr)
HU (1) HUE039677T2 (sr)
LT (1) LT2536764T (sr)
PL (1) PL2536764T3 (sr)
PT (1) PT2536764T (sr)
RS (1) RS57667B1 (sr)
SI (1) SI2536764T1 (sr)
SM (1) SMT201800462T1 (sr)
TR (1) TR201811185T4 (sr)
WO (1) WO2011101791A1 (sr)

Families Citing this family (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2210902A1 (en) * 2009-01-14 2010-07-28 TcL Pharma Recombinant monovalent antibodies
LT2536764T (lt) 2010-02-18 2018-10-25 Ose Immunotherapeutics Anti-cd28 humanizuoti antikūnai
WO2014120916A1 (en) * 2013-02-01 2014-08-07 Bristol-Myers Squibb Company Pegylated domain antibodies monovalent for cd28 binding and methods of use
EP3077415B1 (en) * 2013-12-06 2020-02-12 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Reduction of inflammatory disease symptoms by short peptides that inhibit signaling through cd28
ES2862395T3 (es) * 2015-12-15 2021-10-07 Ose Immunotherapeutics Anticuerpos humanizados anti-CD28 formulados para la administración a humanos
CN109689684B (zh) 2016-07-06 2022-09-23 细胞基因公司 具有低免疫原性的抗体及其用途
CN109789092A (zh) 2016-07-13 2019-05-21 哈佛学院院长等 抗原呈递细胞模拟支架及其制备和使用方法
WO2018106945A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
WO2018183929A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immune modulatory agent released using an ingestible device
US12269863B2 (en) 2018-05-23 2025-04-08 Manysmart Therapeutics, Inc. Bispecific T cell engager and uses thereof
KR20210035805A (ko) 2018-06-15 2021-04-01 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 세포후 신호전달 인자의 조절을 통한 면역 활성의 증가
WO2019246312A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with an immunomodulator
WO2019246317A1 (en) 2018-06-20 2019-12-26 Progenity, Inc. Treatment of a disease or condition in a tissue originating from the endoderm
EP3883635A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
WO2020227159A2 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Methods of modulating immune activity
CN115666704B (zh) 2019-12-13 2025-09-26 比特比德科有限责任公司 用于将治疗剂递送至胃肠道的可摄取装置
US20230114107A1 (en) 2019-12-17 2023-04-13 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Combination anti-cancer therapies with inducers of iron-dependent cellular disassembly
US20230355804A1 (en) 2020-06-29 2023-11-09 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Viruses engineered to promote thanotransmission and their use in treating cancer
CA3192204A1 (en) 2020-08-19 2022-02-24 Xencor, Inc. Anti-cd28 and/or anti-b7h3 compositions
EP4313109A1 (en) 2021-03-31 2024-02-07 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Thanotransmission polypeptides and their use in treating cancer
AU2022303363A1 (en) 2021-06-29 2024-01-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Immune cells engineered to promote thanotransmission and uses thereof
US20250101126A1 (en) 2021-08-05 2025-03-27 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
CN118354789A (zh) 2021-09-03 2024-07-16 Go医疗股份有限公司 抗糖-cMET抗体及其用途
EP4396232A1 (en) 2021-09-03 2024-07-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
AU2022378579A1 (en) 2021-10-28 2024-05-02 Lyell Immunopharma, Inc. Methods of generating cells
US20250052767A1 (en) * 2021-12-13 2025-02-13 BioLegend, Inc. Cd28 binding antibodies and antigen binding fragments thereof
US12365743B2 (en) 2022-02-23 2025-07-22 Xencor, Inc. Anti-CD28 x anti-PSMA antibodies
US12600801B2 (en) 2022-07-11 2026-04-14 Fred Hutchinson Cancer Center Single-domain antibodies that bind ROR1
WO2024040194A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Capstan Therapeutics, Inc. Conditioning for in vivo immune cell engineering
US20240174732A1 (en) 2022-10-05 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additional polypeptides and their use in treating cancer
WO2024077174A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing nr4a-deficient cells
US20240228620A1 (en) 2022-10-06 2024-07-11 Bicara Therapeutics Inc. Multispecific proteins and related methods
WO2024151687A1 (en) 2023-01-09 2024-07-18 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Genetic switches and their use in treating cancer
WO2024211211A1 (en) 2023-04-03 2024-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of improving transplant survival using il-2 receptor gamma chain antibodies
AU2024279278A1 (en) 2023-05-31 2025-12-18 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
US20250127728A1 (en) 2023-10-05 2025-04-24 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained Ionizable Cationic Lipids and Lipid Nanoparticles
US20250302763A1 (en) 2024-02-22 2025-10-02 Capstan Therapeutics, Inc. Immune engineering amplification
WO2025217398A1 (en) 2024-04-10 2025-10-16 Lyell Immunopharma, Inc. Methods for culturing cells with improved culture medium
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2026006604A1 (en) 2024-06-26 2026-01-02 Lyell Immunopharma, Inc. Feeder cell replacement
CN119735680B (zh) * 2024-12-12 2025-07-29 北京同立海源生物科技有限公司 一种抗cd28的单克隆抗体及细胞

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6776990B2 (en) * 1999-04-08 2004-08-17 Allergan, Inc. Methods and compositions for the treatment of pancreatitis
KR20040020866A (ko) * 2000-12-14 2004-03-09 후지사와 야꾸힝 고교 가부시키가이샤 사일런스 항-ｃｄ28 항체 및 그의 용도
DK1345969T3 (da) 2000-12-26 2010-11-29 Inst Nat Sante Rech Med Anti-CD28-antistof
US6900292B2 (en) * 2001-08-17 2005-05-31 Lee-Hwei K. Sun Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
TW200732350A (en) * 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
PE20110385A1 (es) * 2008-07-18 2011-06-22 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpo de dominio (dab) que se une a cd28 y no reacciona en forma cruzada con ctla4
WO2010070047A1 (en) * 2008-12-19 2010-06-24 Novartis Ag Soluble polypeptides for use in treating autoimmune and inflammatory disorders
EP2210902A1 (en) * 2009-01-14 2010-07-28 TcL Pharma Recombinant monovalent antibodies
LT2536764T (lt) * 2010-02-18 2018-10-25 Ose Immunotherapeutics Anti-cd28 humanizuoti antikūnai
ES2862395T3 (es) * 2015-12-15 2021-10-07 Ose Immunotherapeutics Anticuerpos humanizados anti-CD28 formulados para la administración a humanos

Also Published As

Publication number Publication date
US20170114136A1 (en) 2017-04-27
JP5992340B2 (ja) 2016-09-14
CA2788544C (en) 2019-03-05
US10364287B2 (en) 2019-07-30
DK2536764T3 (en) 2018-09-17
PT2536764T (pt) 2018-08-10
SMT201800462T1 (it) 2018-11-09
CA2788544A1 (en) 2011-08-25
ES2680570T3 (es) 2018-09-10
EP3428192A1 (en) 2019-01-16
US20150071916A1 (en) 2015-03-12
JP2013519389A (ja) 2013-05-30
PL2536764T3 (pl) 2018-12-31
HUE039677T2 (hu) 2019-01-28
EP2536764A1 (en) 2012-12-26
US9562098B2 (en) 2017-02-07
SI2536764T1 (sl) 2018-11-30
US20130078236A1 (en) 2013-03-28
US8785604B2 (en) 2014-07-22
LT2536764T (lt) 2018-10-25
HRP20181360T1 (hr) 2018-11-02
TR201811185T4 (tr) 2018-08-27
EP3428192B1 (en) 2021-08-11
EP2536764B1 (en) 2018-07-04
CY1120707T1 (el) 2019-12-11
WO2011101791A1 (en) 2011-08-25
ES2896149T3 (es) 2022-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10364287B2 (en) Anti-CD28 humanized antibodies
US20220135618A1 (en) Polypeptide modification method for purifying polypeptide multimers
JP7603578B2 (ja) 多価抗体
US10689444B2 (en) Recombinant monovalent antibodies
CA3004830A1 (en) Composition and methods for anti-tnfr2 antibodies
CA3255200A1 (en) ANTI-SERUM ALBUMIN NANOBODIES AND THEIR DERIVATIVES
WO2015136471A1 (en) Anti-laminin4 antibodies specific for lg1-3
US20240059794A1 (en) Gucy2c binding molecules and uses thereof
US20250034258A1 (en) Blocking and non-blocking single domain antibodies and uses thereof
US20250333516A1 (en) Klrb1 binding agents and methods of use thereof
EP2361935A1 (en) Anti-CD28 humanized antibodies