ES2896149T3 - Anticuerpos humanizados anti-CD28 - Google Patents

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Caroline Mary
Nicolas Poirier
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Abstract

Un anticuerpo anti-CD28 que tiene un sitio de unión a CD28 que consiste de: - un primer dominio variable definido por la siguiente secuencia: VQLQQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYIIHWIKLRSGQGLEWIGWFYPGSNDIQYNA QFKGKATLTADKSSSTVYMELTGLTPEDSAVYFCARRDDFSGYDALPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 1), en donde dicho dominio variable puede comprender además opcionalmente un residuo Q en su extremo N- terminal; - un segundo dominio variable definido por la siguiente secuencia: - DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTNENIYSNLAWYQQKDGKSPQLIYAATHLVEGVPSRFS - GSGSGTQYSLTISSLQPEDFGNYYCQHFWGTPXTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 2), en donde X=N.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos humanizados anti-CD28
La presente divulgación se refiere a anticuerpos humanizados que se enlazan con CD28, y fragmentos monovalentes de los mismos, y sus usos terapéuticos, en particular en el contexto de regulación de activación de célula T.
La activación anormal de células T está implicada en la patogénesis de muchas enfermedades autoinmunes, y también en el fenómeno de rechazo de trasplante, donde provocan una respuesta inmune dirigida contra el órgano trasplantado que se desarrollará.
Una de los sistemas más importantes para regular la activación de linfocito T es el sistema molecular B7/CD28/CTLA4. Este sistema juega, por ejemplo, un papel esencial en los mecanismos de rechazo de trasplante (WOODWARD et al., Transaplante, 55, 14-20, 1998). Las moléculas B7.1 (CDE80) y B7.22 (CD86) cargadas por APCs pueden activar el receptor CD28 y también el receptor CTLA4 de linfocitos T. La activación de CD28 envía al linfocito T una señal positiva que estimula a la célula; por otro lado, la activación de CTLA4 envía una señal negativa que lleva a una no respuesta (anergia) (FALLARINO et al., J. Exp. Med., 188, 205-210, 1998).
Los linfocitos T en reposo expresan una gran cantidad de CD28 y muy poco CTLA4. Cuando hay un primer contacto cognitivo entre un APC y un linfocito T, la interacción CD28/B7 se favorece, lo que activa la célula. Es solamente varias horas después del inicio de la activación que, debido al aumento en la expresión de membrana de CTLA4, cuya afinidad para B7 es de 5 a 10 veces mayor que la de CD28, la interacción B7/CD28 se desplaza en favor de una interacción B7/CTLA4.
Los linfocitos T reguladores expresan una gran cantidad de CD28 y de CTLA4 que previenen o permiten, respectivamente, la actividad supresora de linfocitos T reguladores. En presencia de un APC que expresa un alto nivel de B7, la interacción CD28/B7 previene la actividad supresora de linfocitos T reguladores (Sansom, et al, Immunol. 24, 314-319, 2003).
La inhibición selectiva de la señal agonista dada para la célula T por CD28, que deja el sistema antagonista consistente en el par CTLA4/B7 intacto, por medio de bloqueo específico de la interacción CD28/B7, hará posible prevenir la activación de linfocito T y promover la supresión inmune mediante linfocitos T reguladores. Tal bloqueo específico de la interacción CD28/B7 puede obtenerse usando algunos anticuerpos dirigidos contra CD28.
Estos anticuerpos se usarán en una forma monovalente (por ejemplo, como fragmentos Fab o scFV), ya que cuando se usan en su forma nativa divalente, su enlace con CD28 provoca la dimerización y la activación de su receptor. Los fragmentos Fab contienen, cada uno, una cadena ligera y la primera mitad de una cadena pesada; los fragmentos scFv consisten en porciones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo matriz, conectadas entre sí por medio de un conector variables (CLACKSON, et al., Nature, 352, 624-628, 1991), formando así una proteína de cadena única.
Un anticuerpo así es el anticuerpo CD28.3, producido por la línea celular de hibridoma CNCM I-2582, y desvelado en la solicitud PCT WO 02/051871. Este anticuerpo, cuando se usa en forma monovalente como los fragmentos scFV, es capaz de bloquear in vitro al receptor c D28 sin activarlo (PCT WO 02/051871; VANHOVE et al., Blood, 102, 564-70, 2003), y también ha demostrado su eficacia in vivo en modelos de trasplante de órganos en ratones y en primates (POIRIER et al., Congreso Mundial de Transplantes, Sidney, Australia, Agosto 16-21, 2008; POIRIER et al., Sci Trans Med., 2:17, p17ra10, 2010).
Un inconveniente de todos los anticuerpos monoclonales derivados de fuentes murinas es su inmunogenicidad cuando se administran a sujetos humanos. Provocan una respuesta inmune anti-ratón que da como resultado una menor eficacia del tratamiento, en particular cuando se requiere una administración repetida.
Este inconveniente puede evitarse, en principio, mediante el uso de anticuerpos humanizados. El objetivo de la humanización es obtener un anticuerpo recombinante que tenga propiedades de enlace con antígeno similares a las del anticuerpo monoclonal de ratón del cual se derivaron las regiones determinantes de complementariedad (RDC), y que es mucho menos inmunogénico en humanos.
Las RDC son las porciones de los dominios variables de un anticuerpo que contactan directamente con el antígeno y determinan la especificidad de enlace con antígeno; las regiones del armazón (RA) que están situadas entre RDC en los dominios variables no contactan directamente con el antígeno, pero sirven como un andamio para mantener la estructura global de los dominios variables.
Se han presentado varias técnicas para humanización de anticuerpos. Las más usadas se basan en “injerto RDC”, que implica el trasplante de las RDC de un anticuerpo murino a RA humanas apropiadas. Sin embrago, en muchos anticuerpos, algunos residuos de RA son importantes para el enlace de antígeno, porque influyen en la conformación de RDC y por lo tanto en sus propiedades de enlace con antígeno, en particular la afinidad de enlace. Una pérdida en la afinidad de enlace es particularmente negativa en el caso de que se pretenda usar el anticuerpo en una forma monovalente que generalmente muestra menos afinidad para el antígeno que el anticuerpo divalente nativo. Así, en la mayoría de los casos, es además necesario, con el fin de obtener una suficiente afinidad de enlace, reintroducir uno o más residuos de armazón del anticuerpo humano en las RA humanas, con el riesgo de que vuelva a aparecer de manera simultánea inmunogenicidad no deseada.
Otra técnica para humanización de anticuerpos, llamada “desinmunizacino” implica la identificación dentro de las regiones RA del anticuerpo, de célula B y epítopes de célula T reconocidos como “extraños” y por lo tanto potencialmente inmunogénicos en humanos, y retirarlos mediante sustituciones apropiadas de inmunoácidos. Esta técnica, sin embargo, también conlleva el riesgo de que se eliminen residuos de MA importantes para el enlace de antígeno. Además, algunos epítopes inmunogénicos pueden estar situados en las RDC e intentar retirarlos implica un riesgo muy alto de destruir no solamente la afinidad enlace con antígeno sino también la especificidad de enlace con antígeno del anticuerpo.
Por lo tanto, una principal preocupación en la humanización de anticuerpos es determinar qué residuos de aminoácidos son cruciales para retener las propiedades de enlace con antígeno. Se han propuesto varios métodos para predecir los sitios más apropiados para sustitución en las regiones RA. Aunque proporcionan principios generales que pueden ser de alguna ayuda en las primeras etapas de humanización, el resultado final varía en gran medida de un anticuerpo a otro. Así, para un anticuerpo dado, el muy difícil predecir qué sustituciones proporcionarán el resultado deseado. En el caso donde no sólo hay sustituciones en RA, sino también en RDC, será necesario disminuir satisfactoriamente la inmunogenicidad en humanos, el resultado final se vuelve totalmente impredecible.
Los inventores han tenido éxito en la producción de CD28.3 humanizado (a partir de ahora referidos como hCD28.3), con una baja inmunogenididad, y que, aunque tiene varias sustituciones de aminoácidos que incluyen la sustitución no conservadora K^-Q en CDR2 de la cadena pesada, conserva las propiedades de enlace con CD28 del ratón matriz CD28.3. Cuando se usa en una forma monovalente, el hCD28.3 de la invención también retiene las propiedades de enlace con CD28 del ratón matriz CD28.3.
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-CD28 que tiene un sitio de enlace con CD28 consistente de:
- un primer dominio variable definido por la siguiente secuencia:
VQLQQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYIIHWIKLRSGQGLEWIGWFYPGSND IQYNAQFKGKATLTADKSSSTVYMELTGLTPEDSAVYFCARRDDFSGYDALPYWGQGTL VTVSA (SEQ ID NO: 1), en donde dicho dominio variable también puede comprender además opcionalmente un residuo Q en su extremo N-terminal;
- un segundo dominio variable definido por la siguiente secuencia:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTNENIYSNLAWYQQKDGKSPQLIY AATHL VEG VPSRFSGSGSGTQYSLTISSLQPEDFGNYYCQHFWGTPXTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 2) en donde X = N.
La presente invención también proporciona un polinucleótido que codifica un anticuerpo de la presente invención.
La presente invención también proporciona una composición terapéutica que comprende un anticuerpo de la invención, que opcionalmente comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención también proporciona un anticuerpo de la invención, para tratar una condición patológica seleccionada del grupo que consiste de rechazo de trasplante, vasculopatía crónica del injerto, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T, hipertensión, fenómenos alérgicos y enfermedades inflamatorias crónicas.
La presente invención también proporciona un vector que comprende un polinucleótido de la presente invención.
La presente invención también proporciona una célula huésped transformada con un polinucleótido de la presente invención.
La presente invención también proporciona un método para preparar un anticuerpo de la presente invención, que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la invención y recuperar dicho anticuerpo de dicho cultivo.
La presente invención proporciona un anticuerpo anti-CD28, caracterizado porque es:
un anticuerpo que tiene un sitio de unión a CD28 que consiste de:
- un primer dominio variable (también definido en la presente como el "dominio variable de cadena pesada") definido por la siguiente secuencia: VQLQQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYIIHWIKLRSGQGLEWI GWFYPGSNDIQYNAQFKGKATLTADKSSSTVYMELTGLTPEDSAVYFCARRDDFSG YDALPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 1), en donde dicho dominio variable puede comprender además opcionalmente un residuo Q en su extremo N-terminal;
- un segundo dominio variable (también definido en la presente como el "dominio variable de cadena ligera") definido por la siguiente secuencia:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTNENIYSNLAWYQQKDGKSPQLL IYAATHLVEGVPSRFSGSGSGTQYSLTISSLQPEDFGNYYCQHFWGTPXTFGGGTKLEI KR (SEQ ID NO: 2), en donde X=N.
La presente divulgación también se refiere a un anticuerpo que tiene un sitio de unión a CD28 que consiste de:
- un primer dominio variable que tiene las CDR del dominio variable de la SEQ ID NO: 1;
- un segundo dominio variable que tiene las CDR del dominio variable de la SEQD NO: 2.
El término “anticuerpo anti-CD28” aquí se refiere a cualquier proteína de enlace con antígeno que tiene al menos un sitio de enlace con antígeno (consistente en los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada) capaces de enlazarse específicamente con CD28. Abarca anticuerpos en una forma divalente (como moléculas nativas de inmunoglobulina o fragmentos F(ab)'2) con dos sitios de enlace con CD28, así como anticuerpos en una forma monovalente que tienen un único sitio de enlace con CD28 (por ejemplo, fragmentos Fab, Fab', Fv y scFv). En la mayoría de los casos, se preferirán los anticuerpos en una forma monovalente.
Incluye anticuerpos recombinantes particulares que comprenden un sitio de enlace con CD28 asociado con uno o más polipéptidos heterólogos.
A modo de ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ser un fragmento Fab o Fab' recombinante que contiene el dominio constante de CH1 de una inmunoglobulina humana fusionado en el extremo C-terminal del domino variable de la SEQ ID NO: 1, y el dominio constante CL de una inmunoglobulina humana fusionado en el extremo C-terminal del dominio variable de la SEQ ID NO: 2. Un ejemplo de tal fragmento Fab recombinante es un fragmento Fab con una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos 21-251 de la SEQ ID NO: 4 y una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos 21-234 e la SEQ ID NO: 6.
También, un anticuerpo de hCD28.3 de la invención puede comprender, además de los dominios variables de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, definidas anteriormente, uno o más de los siguientes componentes:
-una región constante humana (Fc). Esta región constante puede seleccionarse entre dominios constantes de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, incluyendo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Las regiones constantes preferentes se seleccionan entre dominios constantes de IgG, en particular IgG4.
- una proteína que hace posible prolongar la vida media del plasma cuando se administra in vivo bajo formas monovalentes como se desvela, por ejemplo, en PCT WO 02/051871; en una realización preferente, dicha proteína es los dominios CH2-CH3 de una molécula IgG, como se desvela en PCT/IB/2010/000196; de acuerdo con esta realización, un anticuerpo monovalente hCD28.3 es un heterodímero de:
- una primera cadena de proteínas consistente esencialmente, desde su terminal N a su terminal C, en:
*una región A que tienen la SEQ ID NO: 1;
*una región B consistente en un conector peptídico y los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina IgG; - una segunda cadena de proteínas consistente, esencialmente, desde su terminal N a su terminal C, en:
*una región A' que tienen la SEQ ID NO: 2;
*una región B idéntica a la región B del primer polipéptido.
Preferentemente, el conector peptídico es la región bisagra de inmunoglobulina IgG1 humana que tiene la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 7), y los dominios CH2 y CH3 son aquellos de una inmunoglobulina de la subclase IgG4.También se puede usar una versión acortada de dicha región bisagra, que tiene la secuencia DKTHTCPPCP (SEQ ID No: 8):
De acuerdo con una realización preferente, la secuencia de polipéptido de la primera cadena de proteínas es la secuencia de aminoácidos 21-368 de SEQ ID NO: 10, y la secuencia de polipéptido de la segunda cadena de proteínas es la secuencia de aminoácidos 21-355 de SEQ ID NO: 12. De acuerdo con otra realización preferente, la secuencia de polipéptido de la primera cadena de proteínas es la secuencia de aminoácidos 21-373 de SEQ ID NO: 14, y la secuencia de polipéptido de la segunda cadena de proteínas es la secuencia de aminoácidos 21-360 de SEQ ID NO: 16.
Opcionalmente, un anticuerpo h CD28.3 de la invención puede además comprender uno o más de los siguientes componentes
- una proteína que tiene actividad farmacológica (por ejemplo, una toxina);
- uno o más polipéptidos de etiqueta.
Alternativamente, para prolongar la vida media del plasma, en particular cuando están bajo la forma de fragmentos Fab, los anticuerpos de la invención pueden conjugarse con polímeros solubles en agua como glicol de polietileno (PEGilación). La pegilación es una manera clásica para mejorar las propiedades farmacocinéticas de polipéptidos terapéuticos, y puede conseguirse mediante técnicas conocidas.
A este respecto, los inventores descubrieron que la sustitución del residuo de cisteína original en la posición 96 del dominio variables del CD 28.3 nativo por un residuo de alanina o asparraguina (dando como resultado un anticuerpo que tiene una cadena ligera que contiene un dominio variables de SEQ ID NO: 2 donde X = A o N) permitió una mejor eficacia en la pegilación del anticuerpo usando glicol de polietileno activado con maleimida (residuo de cisteína reactiva objetivo), sin modificar sustancialmente su actividad de enlace, aunque la cisteína-96 está comprendido en el CDR3 de la cadena ligera del anticuerpos. El beneficio de la sustitución del residuo original de cisteína en la posición 96 del dominio variables consiste en una ramificación específica del glicol de polietileno en el residuo de cisteína C-terminal de la cadena pesada. Sin sustitución del residuo de cisteína original en la posición 96 del dominio variables del CD28.3 nativo, el glicol de polietileno activado con maleimida puede enlazarse con el residuo de cisteína y alterar la actividad de enlace de la molécula Fab.
Los inventores también descubrieron que la adición de una extensión de di-alanina después de la cisteína C-terminal de la cadena pesada también dio como resultado una mejor eficacia de pegilación.
La divulgación también abarca un polinucleótido seleccionado entre:
a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene las RDC de SEQ ID NO: 1, en particular un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 1;
b) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene las RDC de SEQ ID NO: 2, en particular un polinucleótido que codifica un polipéptido de SEQ ID NO: 2;
La invención también abarca un polinucleótido que codifica un anticuerpo hCD28.3 de la invención, como se ha definido anteriormente.
Los polinucleótidos de la invención también comprenden generalmente secuencias adicionales: por ejemplo, pueden comprender ventajosamente una secuencia que codifica una secuencia líder o péptido señal que permite la secreción de dicha cadena de proteínas.
La presente invención también abarca vectores recombinantes, en particular vectores de expresión, que comprenden un polinucléotido de la invención, asociados con elementos que controlan la transcripción y traslación que están activos en la célula huésped elegida. Los vectores que pueden usarse para construir vectores de expresión de acuerdo con la divulgación son conocidos por sí mismos, y se elegirán en particular como una función de la célula huésped que se pretenda usar.
La presente invención también abarca células huéspedes transformadas con un polinucleótido de la invención. Preferentemente, dicha células huésped se transforma con un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora de la cadena pesada de un anticuerpo hCD28.3 de la invención y un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora de la cadena ligera de un anticuerpo hCD28.3 de la invención, y expresa dicho anticuerpo. Dichos polinucleótidos pueden insertarse en el mismo vector de expresión, o en dos vectores separados de expresión.
Las células huéspedes que pueden usares en el contexto de la presente invención pueden ser células procarióticas o eucarióticas. Entre las células eucarióticas que pueden usarse, se hará mención particular a las células de plantas, células de levadura, como Saccharomyces, células de insectos, como células de Drosophila o Spodoptera, y células de mamífero como células HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc.
La construcción de vectores de expresión de la divulgación y la transformación de las células huéspedes puede realizarse mediante técnicas convencionales de biología molecular.
Otro objeto de la divulgación es un método para preparar un anticuerpo hCD28.3 de la invención. Dicho método comprende cultivar una célula huésped transformada con un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora de la cadena pesada de un anticuerpo hCD28.3 de la invención y un polinucleótido que comprende una secuencia codificadora de la cadena ligera de un anticuerpo hCD28.3 de la invención y recuperar dicho anticuerpo de dicho cultivo.
Si el anticuerpo se secreta por la célula huésped, puede recuperarse directamente del medio de cultivo; si no es así, se realiza una lisis celular de antemano. El anticuerpo puede después purificarse del medio de cultivo o del lisado celular mediante procedimientos convencionales conocidos por sí mismos por aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, precipitación fraccionada, en particular precipitación con sulfato de amonio, electroforesis, filtración en gel, cromatografía por afinidad, etc.
Los anticuerpos hCD28.3 de la invención pueden usarse para obtener productos medicinales. Estos productos medicinales también son parte del objeto de la invención.
La presente invención también comprende una composición terapéutica que comprende un anticuerpo hCD28.3 de la invención, junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Preferentemente, dicha composición es una composición para administración parenteral, formulada para permitir la administración de una dosis de desde 0,5 a 20 mg/Kg, ventajosamente de desde 5 a 10 mg/Kg de un anticuerpo hCD28.3 de la invención. La ruta de inyección de la composición puede ser preferentemente subcutánea o intravenosa.
Por ejemplo, anticuerpos hCD28.3 de la invención pueden usarse para obtener productos medicinales inmunosupresores que selectivamente bloquean el fenómeno de activación de célula T que implica el receptor CD28. Tales productos medicinales inmunosupresores que actúan mediante bloqueo selectivo de CD28 tienen aplicaciones en todas las condiciones patológicas dependientes de linfocito T, incluyendo en particular rechazo de trasplante, enfermedad injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes mediadas por linfocito T, como diabetes de tipo I, artritis reumatoide o esclerosis múltiples, e hipersensibilidad de tipo IV, que está incluida en fenómenos alérgicos y también en la patogénesis de enfermedades inflamatorias crónicas, en particular después de una infección con un agente patogénico (en particular, lepra, tuberculosis, leishmaniasis, listeriosis, etc.).
La presente invención se entenderá de manera más clara a partir de la siguiente descripción a continuación, que se refiere a ejemplos no limitativos de la preparación y propiedades de un anticuerpo hCD28.3 de acuerdo con la invención.
La construcción de vectores de expresión de la divulgación y la transformación de células huéspedes puede hacerse mediante técnicas estándares de biología molecular.
Un anticuerpo hCD28.3 de la invención puede obtenerse cultivando una célula huésped que contiene un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica dicho anticuerpo, bajo condiciones adecuadas para la expresión de los mismos, y recuperar dicho anticuerpo del cultivo de células huéspedes.
La presente invención se ilustrará además por la siguiente descripción adicional, que se refiere a ejemplos que ilustran las propiedades de anticuerpos hCD28.3 de la invención. Debería entenderse, sin embargo, que estos ejemplos se dan únicamente a modo de ilustración de la invención y no constituyen de ninguna manera una limitación de los mismos.
Leyendas de los dibujos
Figura 1: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción Señal-VH-hCH1. Negrita: secuencia líder; Subrayado: posiciones de RDC de anticuerpo CD28.3 matriz. Cursiva: región CHI humana; Marcado y con doble subrayado: sustituciones hechas en la región VH de anticuerpo CD28.3.
Figura 2: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción Señal-VL-hCK. Negrita: secuencia líder; Subrayado: posiciones de RDC de anticuerpo CD28.3 matriz. Cursiva: región kappa c humana; Marcado y con doble subrayado: sustituciones hechas en la región VL de anticuerpo CD28.
Figura 3: A) densidad óptica a 405 nm para mayores concentraciones de FR104, hCD28.3 Fab o CD28.3 Fab en el Enlace ELISA; B) cálculo de las curvas de regresión, lo que permite la determinación de valores comparativos AC50.
Figura 4: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción hVHCD28.3-bisagra corta y1hY4CH2CH3. Negrita: secuencia líder; Subrayado: RDC. Doble subrayado: región bisagra. Subrayado con puntos: dominios CH2-CH3 de IgG4 humano.
Figura 5: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción hVLCD28.3-bisagra corta y1-hY4CH2CH3. Negrita: secuencia líder; Subrayado: RDC. Doble subrayado: región bisagra. Subrayado con puntos: dominios CH2-CH3 de IgG4 humano.
Figura 6: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción hVHCD28.3-bisagra completa y1-hY4CH2CH3. Negrita: secuencia líder; Subrayado: RDC. Doble subrayado: región bisagra. Subrayado con puntos: dominios CH2-CH3 de IgG1 humano.
Figura 7: secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la construcción hVLCD28.3-bisagra completa y1-hY4CH2CH3. Negrita: secuencia líder; Subrayado: RDC. Doble subrayado: región bisagra. Subrayado con puntos: dominios CH2-CH3 de IgG1 humano.
Figura 8: propiedades de unión Anti-CD28 de anticuerpos monovalentes hVH/VL CD28.3. Se cotransfectaron Células COS con 2 |jg (cada una) de pSignal-hVH-bisagra corta Yl-hY4CH2CH3 y pSignal-hVL-bisagra corta Yl-hY4CH2CH3, o se cotranfectaron con 2 jg (cada una) de pSignal-hVH- bisagra completa y1-hY4CH2CH3 y pSeñal-hVL- bisagra completa Yl-hY4CH2CH3. Después de 6 días, los sobrenadantes se recogieron y los anticuerpos monovalentes se dosificaron usando un primer ELISA sándwich. Los sobrenadantes también se analizaron con un ELISA de enlace en moléculas diana c D28 inmovilizadas y unidas a anticuerpos monovalentes anti-CD28 se revelaron con anticuerpos Fc humanos etiquetados con peroxidasa. A: densidad óptica obtenida con moléculas indicadas de acuerdo con su concentración. B: tabla con curvas de regresión y el cálculo de ED50 (dosis efectiva 50), la concentración necesaria para alcanzar 50% de actividad de enlace en este ensayo.
Figura 9: anticuerpos monovalentes hVH/VL CD28.3 inhiben la secreción IL-2 por células T activadas. Las células T Jurkat se estimularon con superantígeno SEE y células que presentan antígeno Raji durante 48 horas, en presencia de concentraciones indicadas de anticuerpos monovalentes purificados hVH/VL bisagra corta y1-hY4CH2CH3. Los sobrenadantes se recogieron e IL-2 se midió con ELISA.
Figura 10: Cromatografía HP Sepharose SP (izquierda) y SDS-PAGE (derecha) bajo condiciones no reducidas después de pegilación de C96-Fabs de anticuerpo humanizado CD28.3. Ruta 1: marcador; ruta 2: carga; ruta 3: pico 1; ruta 4: pico 2; ruta 5: pico 3.
Figura 11: Propiedades de enlace para CD28 de hCD28.3 Fabs recombinantes con o sin mutaciones C96. El gráfico muestra la actividad de enlace (eje Y) de acuerdo con la concentración de Fab (eje X).
Figura 12: Cromatografía HP Sepharose SP (izquierda) y SDS-PAGE (derecha) bajo condiciones no reducidas después de pegilación de C96A-Fabs de anticuerpo humanizado CD28.3. Ruta 1: marcadores MW; ruta 2: pre-cromatografía de proteínas pegiladas; ruta 3: pico 1 que contiene el Fab monopegilado, que representa el 41% del material de inicio.
Figura 13: Cromatografía HP Sepharose SP (izquierda) y SDS-PAGE (derecha) bajo condiciones no reducidas después de pegilación de C96A-Fabs de anticuerpo humanizado CD28.3 con una ecuencia de termina C CAA en la cadena pesada. Ruta 1: marcadores MW; ruta 2: pre-cromatografía de proteínas pegiladas; ruta 3: pico.
EJEMPLO 1: CONSTRUCCIÓN Y EXPRESIÓN EUCARIÓTICA DE UN ANTICUERPO MONOVALENTE hCD28.3 (FRAGMENTO FAB).
Cadena pesada:
La secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 (SEQ ID NO: 1) en fusión con la secuencia que codifica la región CH1 humana (Número de Acceso NCBI AAF03881) y con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pGA18 (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción KpnI/BamHI y se subclonaron en los sitios KpnI/BamHI del plásmido pcDNA3.1-hygro (Invitrogen). Los clones positivos se amplificaron y purificaron Midiprep libre de endotoxinas (Macherey-Nagel) para la etapa de transfección.
El plásmido resultante se designa pSeñal-VH-hCH1. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada de CD28.3 y la secuencia que codifica la región CH1 humana (Número de Acceso NCBI AAF03881). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura 1. También se representan como SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 en el listado secuencia adjunto.
Cadena ligera:
La secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 (SEQ ID NO: 2) en fusión con la secuencia que codifica la región kappa c humana (Número de Acceso NCBI BAC01725) y con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena ligera del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector donador pGA18 (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción KpnI/BamHI y se subclonaron en los sitios KpnI/BamHI del plásmido pcDNA3.1-hygro (Invitrogen). Los clones positivos se amplificaron y purificaron Midiprep libre de endotoxinas (Macherey-Nagel) para la etapa de transfección.
El plásmido resultante se designa pSeñal-VL-hCK. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena ligera de CD28.3 y la secuencia que codifica la región kappa c humana (Número de Acceso NCBI BAC01725). Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura 2. También se representan como SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 en el listado secuencia adjunto.
Expresión eucariótica
Las células COS se transfectaron con 2 |jg (cada una) pSeñal-VL-hCHI y pSeñal-VH-hCHI usando el kit de lipofección Fugene (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cultivos se mantuvieron durante 3 días a 37°C, dividieron en un tercio y se colocaron de vuelta en cultivo durante 3 días adicionales, después de lo cual los sobrenadantes celulares se recogieron.
La actividad del anticuerpo monovalente hCD28.3 se evalúa directamente en el sobrenadante mediante ELISA, como se describe en el ejemplo 2 más abajo.
EJEMPLO 2: DETECCIÓN DE ACTIVIDAD DE ENLACE CON FRAGMENTO hCD28.3 FAB MEDIANTE ELISA Las propiedades de enlace del fragmento hCD28.3 Fab se han comparado con aquellas obtenidas después de transfección de células Cos con plásmidos que codifican CD28.3 Fab (no humanizados) usando dos ensayos ELISA
*Primero (ELISA sándwich), las concentraciones de los fragmentos hCD28.3 y CD28.3 Fab en los sobrenadantes del cultivo de células COS transfectadas se han determinado usando un ELISA sándwich. En resumen, los anti-CD28 Fab contenidos en los sobrenadantes se capturan primero mediante un anticuerpo policlonal de conejo, específico para dominios variables pesados y ligeros de CD28.3 (obtenidos después de inmunización de conejos con una Fv de cadena sencilla que contiene los dominios variables pesados y ligeros del CD28.3 nativo, y purificaron mediante inmunoadsorción en CD28.3 Fab-Sepharose). Las proteínas capturadas después se revelan con un anticuerpo monoclonal murino dirigido a la cadena kappa de IgG humano, seguido por un anticuerop anti-ratón de cabra policlonal etiquetado. El anticuerpo unido se reveló mediante colorimetría usando el sustrato TMB, y se leyó en 405 m.
La DO correspondiente a diferentes diluciones del sobrenadante se compara después con una curva estándar obtenida con cantidades conocidas de un CD28.3 Fab, llamado FR104, purificado del sobrenadante del cultivo de células CHO transformadas con técnicas estándares de cromatografía, y dosificadas con un ensayo BAC (ácido bisincrónico). FR104 contiene regiones VH y VL nativas (no humanizadas) del anticuerpo CD28.3. Por lo tanto, se puede evaluar la cantidad de proteínas Fab presentes en sobrenadantes celulares.
'Segundo (ELISA de enlace), para analizar la actividad de enlace de fragmentos hCD28.3 Fab comparado con CD28.3 Faba, CD28/Fc humano quimérico (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) se usó en 2 jg/ml en amortiguador de carbonato 0,05M pH 9.2 para cubrir los pocillos (50 jl/pocillo) de placas con microtítulo (Nunc Immunoplates) durante la noche a 4°C. Estas moléculas CD28 diana inmovilizadas se enlazarán solamente con moléculas inmunorreactivas con actividad anti-CD28.
Los pocillos después se lavaron 3 veces sucesivamente con 200 jL PBS-0,05% Tween, y saturaron con 100 jL PBS Tween 0,1% BSA 1% durante 2 horas a 37°C.
A continuación, después de 3 lavados con 200 jL PBS-0,05% Tween, se añadieron los sobrenadantes que contenían las concentraciones conocidas de fragmentos de CD28.3 o hCD28.3 Fab ((50 jl/pocillo) a diferentes diluciones en PBS-0,1% Tween y se incubaron durante 2 horas a 37°C. Después de 3 lavados con 200 jL PBS-0,05% Tween, se añadió un anticuerpo monoclonal dirigido a la cadena kappa de IgG humano (1/10000 diluciones) (1 horas, 37°C), seguido de anticuerpos anti-ratón de cabra conjugados con peroxidasa (1/2000 diluciones), seugido de revelación colorimétrica usando el sustrato TMB y lectura a 405 nm.
Después, los resultados se muestran como la absorbancia (eje Y) medido con el ELISA de enlace, de acuerdo con la concentración de Fab (eje X), medido con el ELISA sándwich. Se determina un CA50 (Concentración de Anticuerpo 50) después de calcular la pendiente de cuerva en su rango lineal como la concentración de anti-CD28 Fab necesaria para alcanzar el 50% de la densidad óptica necesaria (DO) en el ensayo de enlace.
Los resultados se muestran en la Figura 3 y la Tabla I.
La Figura 3A muestra la densidad óptica en 405 nm para mayores concentraciones de FR104, hCD28.3 Faba o CD28.3 Fab en el ELISA de enlace.
La Figura 3B muestra el cálculo de curvas de regresión, lo que permite la determinación de valores comparativos CA50.
La Tabla I más abajo resume la DO50, la ecuación y la CA50 para FR104 estándar, y los fragmentos Fab VH-tipo salvaje VL-tipo salvaje y Fab hCD28.3.
Tabla 1
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Estos resultados muestran que el 50% de la actividad de enlace con CD28 podría alcanzarse a una concentración similar para fragmentos Fab VH-tipo salvaje VL-tipo salvaje (CD28.3 Fab) y hCD28.3 Fab. La concentración es ligeramente inferior para el estándar, probablemente porque se purifica antes del ensayo. Así, hCD28.3 retiene las propiedades enlace con CD28 de las secuencias de CD28 VH y VL de tipo salvaje.
EJEMPLO 3: CONSTRUCCIÓN Y EXPRESIÓN EUCARIOTICA DE UN ANTICUERPO MONOVALENTE hCD28.3 (FRAGMENTO FV-FC) CON UNA BISAGRA CORTA y1 Y UN DOMINIO y4 CH2-CH3
Cadena pesada:
La secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 (SEQ ID NO: 1) en fusión de terminal C con la secuencia que codifica una parte de la región bisagra de IgG1 humano (SEQ ID NO: 8), con dominios CH2-CH3 de IgG4 humano (nucleótidos 787 a 1440 de la secuencia Número de Acceso NCBI BC025985) y en la posición terminal N con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pMa (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción NheI/EcoRI
y se subclonaron en los sitios NheI/EcoRI del plásmido pCIneo (Promega). Después de transformación de células E. coli, los clones positivos se amplificaron y los plásmidos extraídos se purificaron mediante columnas Midiprep libres de endotoxinas (Macherey-Nagel).
El plásmido resultante se designa pSeñal-hVH-bisagra corta Yl-hY4CH2-CH3. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada de CD28.3 y la secuencia que codifica una parte de la región bisagra humana y1 y de los dominios humanos y4 CH2CH3. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura 4. También se representan como SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 en el listado secuencia adjunto.
Cadena ligera:
La secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 (SEQ ID NO: 2) en fusión con la secuencia que codifica una parte de la región bisagra de IgG1 humano (SEQ ID NO: 8), con dominios CH2-CH3 de IgG4 humano (nucleótidos 787 a 1440 de la secuencia Número de Acceso NCBI BC025985) y en la posición terminal N con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pMa (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción NheI/EcoRI y se subclonaron en los sitios NheI/EcoRI del plásmido pCIneo (Promega). Después de transformación de células E. coli, los clones positivos se amplificaron y los plásmidos extraídos se purificaron mediante columnas Midiprep libres de endotoxinas (Macherey-Nagel).
El plásmido resultante se designa pSeñal-hVL-bisagra corta Y1-hY4CH2-CH3. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena ligera de CD28.3 y la secuencia que codifica una parte de la región bisagra humana y1 y de los dominios humanos y4 CH2CH3. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura 5. También se representan como SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 en el listado secuencia adjunto.
Expresión eucariótica
Las células COS se transfectaron con 1 |jg (cada una) pSeñal-hVL- bisagra corta Yl-hY4CH2-CH3 y pSeñal-hVH- bisagra corta Y1-hY4CH2-CH3, usando el kit de lipofección Lipofectamine (Invitrongen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cultivos se mantuvieron durante 3 días a 37°C, tiempo después del cual los sobrenadantes celulares se recogieron. La actividad del anticuerpo monovalente se evalúa directamente en el sobrenadante mediante ELISA, como se describe en el ejemplo 5 más abajo.
EJEMPLO 4: CONSTRUCCIÓN Y EXPRESIÓN EUCARIOTICA DE UN ANTICUERPO MONOVALENTE hCD28.3 (FRAGMENTO FV-FC) CON UNA BISAGRA CORTA y1 DE LONGITUD COMPLETA Y UN DOMINIO y4 CH2-CH3 Cadena pesada:
La secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 (SEQ ID NO: 1) en fusión de terminal C con la secuencia que codifica una parte de la región bisagra de IgG1 humano (SEQ ID NO: 7), con dominios CH2-CH3 de IgG4 humano (nucleótidos 787 a 1440 de la secuencia Número de Acceso NCBI BC025985) y en la posición terminal N con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pMa (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción NheI/EcoRI
y se subclonaron en los sitios NheI/EcoRI del plásmido pCIneo (Promega). Después de transformación de células E. coli, los clones positivos se amplificaron y los plásmidos extraídos se purificaron mediante columnas Midiprep libres de endotoxinas (Macherey-Nagel).
El plásmido resultante se designa pSeñal-hVH-bisagra completa Yl-hY4CH2-CH3. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VH de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada de CD28.3 y la secuencia que codifica una parte de la región bisagra humana y1 y de los dominios humanos y4 CH2CH3. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura 6. También se representan como SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 en el listado secuencia adjunto.
Cadena ligera:
La secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 (SEQ ID NO: 2) en fusión con la secuencia que codifica una parte de la región bisagra de longitud completa de IgG1 humano (SEQ ID NO: 7), con dominios CH2-CH3 de IgG4 humano (nucleótidos 787 a 1440 de la secuencia Número de Acceso NCBI BC025985) y en la posición terminal N con una secuencia que codifica el péptido líder de la cadena pesada del anticuerpo nativo murino hCD28.3, se sintetizó químicamente e introdujo en el vector clonador pMa (Geneart) para amplificación. La secuencia después se extirpó mediante digestión con enzimas de restricción NheI/EcoRI y se subclonaron en los sitios NheI/EcoRI del plásmido pCIneo (Promega). Después de transformación de células E. coli, los clones positivos se amplificaron y los plásmidos extraídos se purificaron mediante columnas Midiprep libres de endotoxinas (Macherey-Nagel).
El plásmido resultante se designa pSeñal-hVL-bisagra completa Y1-hY4CH2-CH3. Comprende una construcción que contiene la secuencia que codifica la región VL de hCD28.3 entre la secuencia que codifica el péptido líder de la cadena ligera de CD28.3 y la secuencia que codifica la región bisagra de longitud completa humana y1 y de los dominios humanos y4 CH2CH3. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de esta construcción se muestran en la Figura 7. También se representan como SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 en el listado secuencia adjunto.
Expresión eucariótica
Las células COS se transfectaron con 1 jg (cada una) pSeñal-hVL- bisagra completa Y1-hY4CH2-CH3 y pSeñal-hVH- bisagra completa Y1-hY4CH2-CH3, usando el kit de lipofección Lipofectamine (Invitrongen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los cultivos se mantuvieron durante 3 días a 37°C, tiempo después del cual los sobrenadantes celulares se recogieron. La actividad del anticuerpo monovalente se evalúa directamente en el sobrenadante mediante ELISA, como se describe en el ejemplo 5 más abajo.
EJEMPLO 5: EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ENLACE DE ANTICUERPOS MONOVALENTES DE DOMINIOS HCD28.3-BISAGRA LONGITUD COMPLETA y1 Y4CH2-CH3 Y DOMINIOS HCD28.3-BISAGRA CORTA y1 Y4CH2-CH3 MEDIANTE ELISA
Las propiedades de enlace de los anticuerpos monovalentes hCD28.3 de dominios hCD28.3-bisagra completa y1 y4 CH2-CH3 y hCD28.3-bisagra corta y1 y4 CH2-CH3 producidos mediante células COS transfectadas se han analizado usando dos ensayos ELISA.
*Primero (ELISA sándwich), las concentraciones de los anticuerpos monovalentes hCD28.3 en los sobrenadantes del cultivo de células COS transfectadas se han determinado usando un ELISA sándwich. En resumen, los anticuerpos monovalentes contenidos en los sobrenadantes primero se capturan mediante un anticuerpo policlonal de cabra dirigido a IgG humano. Las proteínas capturadas después se revelan con un anticuerpo específico Fc, IgG anti-humano policlonal de cabra biotinilado, y después una estreptavidina conjugada con peroxidasa. El anticuerpo unido se reveló mediante colorimetría usando el sustrato TMB, y se leyó en 405 m.
La DO correspondiente a diferentes diluciones del sobrenadante se compara después con una curva estándar obtenida con cantidades conocidas de anticuerpos monovalentes hCD28.3, purificados del sobrenadante del cultivo de células CHO transformadas con técnicas estándares de cromatografía, y dosificadas con un ensayo BAC (ácido bisincrónico).
'Segundo (ELISA de enlace), para analizar la actividad de enlace de anticuerpos monovalentes hCD28.3, CD28/Fc humano quimérico (R&D Systems, Abingdon, Reino Unido) se usó en 2 pg/ml en amortiguador de carbonato 0,05M pH 9.2 para cubrir los pocillos (50 pl/pocillo) de placas con microtítulo (Nunc Immunoplates) durante la noche a 4°C. Estas moléculas CD28 diana inmovilizadas se enlazarán solamente con moléculas inmunorreactivas con actividad anti-CD28.
Los pocillos después se lavaron 3 veces sucesivamente con 200 pL PBS-0,05% Tween, y saturaron con 100 pL PBS Tween 0,1% BSA 1% durante 2 horas a 37°C.
A continuación, después de 3 lavados con 200 pL PBS-0,05% Tween, se añadieron los sobrenadantes que contenían las concentraciones conocidas de los anticuerpos monoclonales que se analizarán (50 pl/pocillo) en diferentes diluciones en PBS-0,1% Tween y se incubaron durante 2 horas a 37°C. Después de 3 lavados con 200 pL PBS-0,05% Tween, se añadió (1/500 diluciones; 1 hora, 37°C) un antisuero policlonal de conejo, específico para los dominios variables pesados y ligeros de CD28.3 (obtenido después de inmunización de conejos con una cadena Fv sencilla que contenía los dominios variables pesados y ligeros de CD28.3 nativo, y purificado mediante inmunoadsorción en CD28.3 Fab-Sepharose). Esto fue seguido de anticuerpos anti-conejo burro conjugados con peroxidasa (1/2000 diluciones) seguido de revelación colorimétrica usando el sustrato TMB y lectura a 405 nm.
Después, los resultados se muestran como la absorbancia (eje Y) medido con el ELISA de enlace, de acuerdo con la concentración del anticuerpo monovalente (eje X), medido con el ELISA sándwich. Se determina una CA50 (Concentración de Anticuerpo 50) después de calcular la pendiente de la curva en su rango lineal como la concentración de anticuerpo monoclonal necesaria para alcanzar el 50% de la densidad óptica necesaria (DO) en el ensayo de enlace.
La Figura 8 compara las actividades de enlace de anticuerpos monovalentes de dominios hCD28.3 bisagra completa IgG1 IgG4CH2-CH3 con dominios hCD28.3 bisagra corta IgG1 IgG4CH2-CH3 en el ELISA de enlace (Figura 8A).
La Figura 8B resume la ecuación, el factor de regresión y la CA50 para anticuerpos monovalentes.
Estos resultados muestran que el 50% de la actividad de enlace con CD28 podría alcanzarse a una concentración similar para anticuerpos monovalentes de dominios hCD28.3-bisagra completa y1 y4 CH2-CH3 o dominios hCD28.3-bisagra corta y1 y4 CH2-CH3.
EJEMPLO 6: ANTICUERPOS MONOVALENTES hCD28.3 PREVIENEN LA ACTIVACIÓN DE CÉLULA T
Para verificar que el anticuerpo monovalente hCD28.3 bloquea la activación de célula T dependiente de CD28, se estimularon células T humanas (células Jurkat) con superantígeno SEE presentado por la línea celular B Raji. La endotoxina SEE, cuando se presente a la línea RJI de linfoblastoide cleular B positivo clase II, activa la línea Jurkat de célula T que expresa Vp8 para secretar IL-2 (Herman et al., 1990, J. Exp. Med. 172:709). Ya que las células Jurkat expresan un alto nivel de CD28 y las células Raji expresan CD80/86, esta reacción es parcialmente dependietne de CD28. Cuando se mide la síntesis de interleuquina-2 en este ensayo mediante ELISA (kit ELISA MaxTM Set Deluxe Human IL-2; Biolegend #431805) después de 48 horas, en presencia de mayores concentraciones de dominios hVH/VL CD28.3-bisagra corta y1 Y4CH2-CH3.
Los resultados se muestran en la Figra 9. Revelan que los anticuerpos monovalentes hCD28.3 reducen la síntesis de IL-2 por células T de una manera dependiente de dosis.
EJEMPLO 7: PREPARACIÓN DE UN ANTICUERPO MONOVALENTE hCD28.3 PEGILADO
Un fragmento hCD28.3 Fab preparado como se ha descrito en el Ejemplo 1 se pegiló con PEG 40 KDa

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-CD28 que tiene un sitio de unión a CD28 que consiste de:
- un primer dominio variable definido por la siguiente secuencia:
VQLQQSGAELKKPGASVKVSCKASGYTFTEYIIHWIKLRSGQGLEWIGWFYPGSNDIQYNA
QFKGKATLTADKSSSTVYMELTGLTPEDSAVYFCARRDDFSGYDALPYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 1), en donde dicho dominio variable puede comprender además opcionalmente un residuo Q en su extremo N-terminal;
- un segundo dominio variable definido por la siguiente secuencia:
- DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKTNENIYSNLAWYQQKDGKSPQLIYAATHLVEGVPSRFS
- GSGSGTQYSLTISSLQPEDFGNYYCQHFWGTPXTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 2), en donde X=N.
2. Un anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo monovalente.
3. Un anticuerpo monovalente de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo monovalente es un fragmento Fab o Fab' recombinante que contiene el dominio constante CH1 de una inmunoglobulina humana fusionada en el extremo C-terminal del dominio variable de la SEQ ID NO: 1, y el dominio constante CL de una inmunoglobulina humana fusionada en el extremo C-terminal del dominio variable de la SEQ ID NO: 2.
4. Un anticuerpo monovalente de la reivindicación 2, que es un heterodímero de:
- una primera cadena proteica que consiste de, desde su extremo N-terminal hasta su extremo C-terminal:
* una región A que es el dominio variable de la cadena pesada de un anticuerpo de la reivindicación 1; * una región B que consiste de un conector peptídico y los dominios CH2 y CH3 de una inmunoglobulina de IgG;
- una segunda cadena proteica que consiste de, desde su extremo N-terminal hasta su extremo C-terminal:
* una región A' que es el dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo de la reivindicación 1; * una región B idéntica a la región B del primer polipéptido.
5. Un anticuerpo monovalente de la reivindicación 4, en donde el conector peptídico se selecciona entre:
- la región bisagra de las inmunoglobulinas de IgG1 humanas que tienen la secuencia EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 7);
- la región bisagra de las inmunoglobulinas de IgG1 humanas que tienen la secuencia DKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 8).
6. El anticuerpo monovalente de cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, en donde los dominios CH2 y CH3 son los de una inmunoglobulina de la subclase IgG4.
7. Un anticuerpo monovalente de acuerdo con la reivindicación 6, que se selecciona entre:
- un anticuerpo monovalente en donde la secuencia polipeptídica de la primera cadena proteica es la secuencia de los aminoácidos 21-368 de la SEQ ID NO: 10, y la secuencia polipeptídica de la segunda cadena proteica es la secuencia de los aminoácidos 21-355 de la SEQ ID NO: 12, en donde el residuo de cisteína original en la posición 96 del dominio variable de la cadena ligera está reemplazado por asparagina;
- un anticuerpo monovalente en donde la secuencia polipeptídica de la primera cadena proteica es la secuencia de los aminoácidos 21-373 de la SEQ ID NO: 14, y la secuencia polipeptídica de la segunda cadena proteica es la secuencia de los aminoácidos 21-360 de la SEQ ID NO: 16, en donde el residuo de cisteína original en la posición 96 del dominio variable de la cadena ligera está reemplazado por asparagina.
8. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Una composición terapéutica que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además opcionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable.
10. Un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para su uso en el tratamiento de una condición patológica seleccionada del grupo que consiste de rechazo de trasplante, vasculopatía crónica de aloinjerto, enfermedad de injerto contra huésped, enfermedades autoinmunes mediadas por linfocitos T, hipertensión, fenómenos alérgicos y enfermedades inflamatorias crónicas.
11. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.
12. Una célula huésped transformada con el polinucleótido de la reivindicación 8.
13. Un método para preparar el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 12 y recuperar dicho anticuerpo de dicho cultivo.
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