RS57864B1 - Postupci za sprečavanje agregacije virusnih komponenti - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za sprečavanje i/ili smanjenje agregacije virusnih komponenti. Pronalazak se prema tome odnosi na oblast proizvodnje i formulacije biofarmaceutika i na oblast vakcinologije.

Osnova pronalaska

[0002] Agregacija je dobro poznati problem u proizvodnji (bio-) farmaceutika, posebno proteina kao što su monoklonska antitela, i virusa. Više činjenica o agregaciji proteina može da se nađe u sledećem pregledu (Wei Wang, 2005). Agregacija može da bude povezana sa gubicima u pripremi/proizvodnji, nestabilnošću, smanjenim rokom trajanja, neželjenim dejstvima nakon primene, različitim imunogenim reakcijama, sve do razvoja bolesti (kao npr., Alchajmerova, Parkinsonova (Taylor et al. 2002), prionska encefalopatija i Hantingtonova bolest). Agregacija može da bude sprečena pažljivim izborom pufera ili medijuma koji se upotrebljavaju u proizvodnom postupku (Gu et al., 2003, Cromwell et al.2006). Poznato je da dodavanje jedinjenja kao što su urea ili soli guanidijuma povećava rastvorljivost proteina. Međutim, ova sredstva takođe utiču na strukturu i efikasnost proteina. Supresija ili sprečavanje agregacije nije uvek uspešno, i moraju da se načine kompromisi koji mogu da vode (relativno) velikim proizvodnim gubicima tokom proizvodnje, skladištenja ili gubitku efikasnosti tokom vremena.

[0003] Tokom proizvodnje virusnih komponenti kao što je npr. inaktivisani poliovirus na bazi Sejbinovih sojeva, takođe može da se dogodi neželjena agregacija, što može da dovede do velikih varijacija u oporavku proizvoda pri prečišćavanju proizvoda (prinosu) u virusološkoj proizvodnji /proizvodnji virusnih komponenti. Stoga postoji potreba za poboljšanim postupkom za proizvodnju virusnih komponenti.

[0004] Virusi su infektivni agensi koji mogu da se umnožavaju samo u živim ćelijama, a u zavisnosti od virusa, oni mogu da inficiraju različite tipove organizama, kao što su životinje, biljke, bakterije i arheje (Koonin EV et al. 2006). Virus se sastoji od dva, ili više odvojenih delova, genetskog materijala i virusnog proteinskog kapsida, ponekad uz dodatak lipidne dvoslojne membrane ili omotača. Virusni kapsid je sačinjen od većeg broja proteina, koji obrazuju veoma složenu kvaternarnu strukturu sa spiralnom, ikozaedralnom ili čak složenijom strukturom. Više činjenica o virusima može da se nađe u sledećoj referenci (Fields Virology, 2007).

[0005] U našem ispitivanju, mi smo se usredsredili na poliovirus i virus influence kao model za viruse bez omotača, odnosno sa omotačem. Poliovirus se obično koristi kao nespecifični model virusa za RNK viruse bez omotača u validacionim studijama uklanjanja virusa kao predstavnik pikornavirusa uopšteno (tehnička beleška Millipore: AN1650EN00, www.bioreliance.com/library/?id=90, http://www.criver.com/files/pdfs/bps/bp_r_viral_tseclearance_studies.aspx). Dalje, poliovirus je dobro ispitani virus o kome je dostupno mnogo naučne literature, što ga čini pogodnim kandidatom. Kao predstavnik virusa sa omotačem korišćeni su različiti sojevi virusa influence. Influenca je virus koji svake godine izaziva dosta zabrinutosti zbog svoje varijabilnosti (antigeni drift). Influenca se ispituje širom sveta i, zbog opasnosti od izazivanja bolesti, često predstavlja izabranu metu pri radu na bilo kakvom poboljšanju vakcina. Visoka varijabilnost čini influenca virus pogodnim predstavnikom za brzo ispitivanje mnogih varijacija ovog postupka za smanjenje i sprečavanje agregacije, čime pokazuje širok opseg mogućih korišćenja ove tehnike.

[0006] Poliomijelitis, takođe označen kao polio ili dečija paraliza, je infektivna virusna bolest koju izazivaju tri srodna serotipa virusa: poliovirus tipa 1, 2 i 3. Poliovirusi pripadaju rodu Enteroviruses u familiji Picornaviridae. kod ljudi, poliovirusi se uglavnom prenose fekalnooralnim ili oralno-oralnim putem. Posle infekcije, poliovirus se umnožava u gastrointestinalnom traktu, a iz njega može da uđe u centralni nervni sistem. Takva infekcija može da izazove paralizu. Polio ne može da se leči. Međutim, može da se spreči vakcinacijom. Trenutno, postoje dve bezbedne i efikasne polio vakcine dostupne na tržištu: oralna polio vakcina (OPV), i inaktivisana polio vakcina (IPV). OPV se zasniva na živim atenuisanim sojevima poliovirusa (takozvanim Sejbinovim sojevima, Albert Sabin je prvi razvio OPV), ova vakcina se primenjuje oralnim putem. Nasuprot tome, IPV, se zasniva na upotrebi prečišćenih sojeva poliovirusa divljeg tipa, koji su hemijski ubijeni i primenjuje se intramuskularno putem injekcije. IPV je prvo razvio Jonas Salk [ima nekoliko dostupnih pregleda o poliomijelitisu i polio vakcinama: Koch and Koch, 1985; Duchene et al., 1990; Kew et al.2005; Heinsbroek and Ruitenberg, 2010].

[0007] Obe dostupne polio vakcine (OPV i IPV) pružaju visoke nivoe zaštite od paralitičkog poliomijelitisa. OPV je do sada bila vakcina izbora za globalnu eradikaciju poliomijelitisa budući da ima nekoliko prednosti: lako se primenjuje i manje je skupa. Međutim, u nekim slučajevima OPV može da dovede do pojave paralitičkog poliomijelitisa povezanog sa vakcinom (VAPP) ili do pojave poliovirusa koji potiču iz vakcine (VDPV), i njena upotreba bi poželjno trebalo da prestane odmah po uspešnoj eradikaciji [Kew et al., 2005; Heymann et al., 2005 & 2006; Chumakov et al., 2007; Nathanson & Kew, 2010; Aylward and Tangermann, 2011]. Takođe nije isključena ni mogućnost da dođe do reverzije OPV u varijante divljeg tipa (Lee et al 2012). Stoga, potreba za novom, bezbednom i efikasnom polio vakcinom raste. Politika globalne vakcinacije nakon eradikacije poliomijelitisa zavisi od, između ostalog, dostupnosti i cene IPV [Heinsbroek and Ruitenberg, 2010; Thompson and Tebbens, 2012].

[0008] Da bi se prekinula upotreba OPV nakon eradikacije poliomijelitisa, i da bi se smanjili troškovi IPV po dozi, korišćeni su različiti pristupi. Između ostalog, ovi pristupi uključuju: a) IPV zasnovanu na atenuisanim Sejbinovim sojevima poliovirusa (Sabin-IPV) [Bakker et al., 2011; Hamidi & Bakker, 2012]; b) IPV zasnovanu na novokonstruisanim alternativnim sojevima izvora semena poliovirusa [Chumakov et al., 2008; Robinson HL 2008; Hamidi & Bakker, 2012]; c) IPV proizvedenu na alternativnim sisarskim ćelijama koje efikasno podržavaju replikaciju poliovirusa [Hamidi & Bakker, 2012; Sanders et al., 2012; Crucell, US0027317, 2011]. U svim takvim pristupima, mogućnosti za smanjenje cene mogu da se ostvare primenom poznatih postupaka u optimizaciji ushodnih i nishodnih proizvodnih postupaka (npr. efikasnija upotreba kapaciteta bioreaktora), i ukupnom modernizacijom (npr. upotrebom medijuma za kultivisanje ćelija i virusa bez životinjskih komponenti, filtera za jednokratnu upotrebu i slično).

[0009] Trenutno, IPV se najčešće zasniva na upotrebi tri virulentna soja divljeg tipa, Mahoney (tip 1 poliovirusa), MEF-1 (tip 2 poliovirusa) i Saukett (tip 3 poliovirusa). Ovi poliovirusi se gaje odvojeno u sisarskoj ćelijskoj kulturi. Zatim, nakon nekoliko koraka prečišćavanja, poliovirus se inaktiviše upotrebom formalina (formaldehida) nakon čega virusi mogu da se pomešaju u željenu finalnu formulaciju i napune u ambalažu.

[0010] Influenca virus izaziva akutnu respiratornu infekciju, sa znatnim morbiditetom i mortalitetom. Prevalenca je najviša kod školske dece. Mala deca, stariji, i osobe sa stanjima kao što je plućna i srčana bolest, dijabetes ili ozbiljna astma, imaju povećani rizik od teškog oblika influence. Klinički, influenca obuhvata akutnu febrilnu bolest sa mijalgijom, glavoboljom i kašljem.

[0011] Iako je influenca kao bolest poznata vekovima, agens koji je izaziva je dugo bio nepoznat. Prvi humani virus influence izolovan je 1933. godine.

[0012] Virus može da se umnožava na embrionisanim jajima (što je još uvek uobičajena praksa, kojoj je kasnije dodata mogućnost gajenja virusa na ćelijskim kulturama), što je značajno olakšalo mogućnost izučavanja virusa.

[0013] Virus influence je RNK virus familije Orthomyxoviridae i sastavljen je od lipidnog omotača koji se nalazi oko osam segmenata RNK. Na omotaču su prisutna dva glavna proteina (antigena): neuraminidaza (NA/N) i hemaglutinin (HA/H). Hemaglutinin je protein koji vezuje virus sa ćelijama respiratornog epitelijuma i zatim fuzioniše virusnu membranu sa membranom epitelijalne ćelije, čime se omogućava ulaženje virusa u ćeliju. Neuraminidaza je virusni enzim koji olakšava oslobađanje novo-obrazovanih virusnih čestica iz inficiranih ćelija.

[0014] Osim čoveka, virusi influence mogu da inficiraju širok opseg životinjskih vrsta, pri čemu su za čoveka najvažnije ptice i svinje, jer virusi ovih vrsta mogu uglavnom da inficiraju i ljude. Značajna osobina virusa influence je varijabilnost. Varijacija se pokreće imunskom selekcijom, što znači da će virus neprekidno pokušavati da izbegne imunitet domaćina. To može da postigne postepenom mutacijom svojih antigena poznatom kao antigeni drift, ili razmenom celih segmenata RNK koji kodiraju antigene sa srodnim sojevima, što je poznato kao antigeni šift. Imunska selekcija se odnosi na odgovore antitela na površinske antigene, i u manjem stepenu na T-ćelijske odgovore, koji su uglavnom usmereni protiv unutrašnjih proteina.

[0015] Zbog antigenog drifta, nove vakcine protiv sezonske influence moraju da se proizvode svake godine, da bi sadržale antigene eksprimirane na virusnim sojevima koji su u cirkulaciji u datoj sezoni. Antigeni šift, ili nizovi mutacija antigenog drifta, mogu da izazovu pandemiju. Zaštita od izbijanja pandemije čini neophodnom upotrebu novorazvijenih snažnih vakcina koje sadrže antigene koje eksprimira pandemijski virus.

[0016] Kao što je ovde objašnjeno, pronalazači su identifikovali poboljšani postupak za proizvodnju virusnih komponenti i poboljšanu kompoziciju koja sadrži takve virusne komponente, pri čemu je agregacija sprečena ili smanjena.

Kratak opis pronalaska

[0017] U prvom aspektu pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju kompozicije koja sadrži enterovirusne čestice, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake: a) proizvodnju medijuma koji sadrži enterovirusne čestice; b) prečišćavanje enterovirusnih čestica iz medijuma, pri čemu je tokom bar jednog dela prečišćavanja bazna aminokiselina ili njen derivat prisutan u finalnoj koncentraciji od najmanje 1 mM i dovoljan je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica; i, c) inaktivaciju enterovirusnih čestica; i, opciono d) formulaciju enterovirusnih čestica, pri čemu je bazna aminokiselina ili njen derivat izabran iz grupe koja se sastoji od: arginina, lizina, histidina, arginina-HCl, lizina-HCl, histidina-HCl, agmatina, dihidrohlorida etil estra L-arginina, traneksaminske kiseline, N-ε-formil-L-lizina, hidrohlorida DL-5-hidroksilizina, dihidrohlorida metil estra L-lizina, 3-metil-L-histidina, dihidrohlorida α-metil-DL-histidina, njihovih soli i njihovih kombinacija.

[0018] Poželjno, tokom koraka d), bazna aminokiselina ili njen derivat je prisutan u koncentraciji dovoljnoj da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica za formulaciju farmaceutske kompozicije koja sadrži enterovirusne čestice i opciono, baznu aminokiselinu ili njen derivat u koncentraciji dovoljnoj da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica.

[0019] Poželjnije, u postupku, poželjno, koncentracija bazne aminokiseline ili njenog derivata je u finalnoj koncentraciji od najmanje 1 mM, i dovoljna je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica i održava se tokom celokupnog trajanja najmanje jednog od koraka c) i d).

[0020] U postupku prema pronalasku, enterovirusne čestice su poželjno iz roda Enterovirus, odabrane iz grupe koja se sastoji od poliovirusa, koksaki A virusa, koksaki B virusa, ehovirusa i enterovirusa 68, 69, 70, 71 i 73. Poželjnije, enterovirusne čestice sadrže polioviruse serotipova 1, 2 i 3. U jednom primeru izvođenja, enterovirusne čestice poželjno su enterovirusne čestice slične virusu.

[0021] U postupku prema pronalasku kompozicija koja sadrži enterovirusne čestice poželjno je vakcina. Poželjnije, vakcina je inaktivisana polio vakcina (IPV).

[0022] Pronalazak se dalje odnosi na upotrebu bazne aminokiseline ili njenog derivata za sprečavanje ili smanjenje agregacije enterovirusnih čestica tokom prečišćavanja enterovirusnih čestica iz medijuma, pri čemu je tokom bar jednog dela prečišćavanja bazna aminokiselina ili njen derivat prisutan u finalnoj koncentraciji od najmanje 1 mM i dovoljan je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica, i pri čemu je bazna aminokiselina ili njen derivat izabran iz grupe koja se sastoji od: arginina, lizina, histidina, arginina-HCl, lizina-HCl, histidina-HCl, agmatina, dihidrohlorida etil estra L-arginina, traneksaminske kiseline, N-ε-formil-L-lizina, hidrohlorida DL-5-hidroksilizina, dihidrohlorida metil estra L-lizina, 3-metil-L-histidina, dihidrohlorida α-metil-DL-histidina, njihovih soli i njihovih kombinacija, gde su poželjno enterovirusne čestice iz roda Enterovirus, odabrane iz grupe koja se sastoji od poliovirusa, koksaki A virusa, koksaki B virusa, ehovirusa, rinovirusa i enterovirusa 68, 69, 70, 71 i 73, poželjnije, enterovirusne čestice su poliovirusi najmanje jednog od serotipova 1, 2 i 3, najpoželjnije, enterovirusne čestice su inaktivisana polio vakcina (IPV).

Opis pronalaska

[0023] Iznenađujuće smo pronašli da bazne aminokiseline (kao npr. arginin), i nekoliko njihovih derivata, mogu da se koriste za sprečavanje obrazovanja agregata, tokom obrade različitih virusa (sa omotačem (tj. influence) i bez omotača (tj. poliovirusa)) u proizvodnji vakcina. Ovi virusi potiču iz različitih sistema kultura (influenca iz embrionisanih jaja i poliovirus iz ćelijske kulture). Kao rezultat, postignuti su značajno viši prinosi virusnog proizvoda i/ili bolje uklanjanje kontaminanata uz očuvanje biološki aktivnog proizvoda. Ovi viši prinosi virusa, koji pružaju značajne ekonomske prednosti u odnosu na poznate postupke za prečišćavanje virusa, nisu bili predviđeni. Kao deo ovog opisa, bazne aminokiseline (kao npr. arginin), i nekoliko njihovih derivata, mogu da se koriste za solubilizaciju (rastvaranje / raspadanje) agregata koji su već formirani, tokom skladištenja virusnih (među) proizvoda.

[0024] Sprečavanje agregacije upotrebom baznih aminokiselina ranije je pokazano za monoklonska antitela (MAbs) (Arakawa T, et al, 2004; US2012264918) i proteine (Baynes BM, 2004 i 2005). Međutim, ono nije pokazano za vrlo složene kvaternarne proteinske strukture kao što su virusi. U slučaju toksoida klostridijuma (US 2011/0045025), arginin je čak olakšavao agregaciju.

[0025] Osim toga, dodatno je pokazano da bazne aminokiseline, kao arginin ima virucidne aktivnosti (Yamasaki H, et al, 2008; Utsunimoya H, et al, 2009; Arakawa T, et al, 2009) što ih čini neočekivanim sredstvima za upotrebu tokom obrade virusa i virusnih komponenti. US2012/273424 A1 se odnosi na postupke za pripremu kompozicije koja sadrži virusne čestice. US5618539A se odnosi na pripremu poliovirusne vakcine. Bräutigam et al. (1993, Virology, doi: 10.1006/viro.1993.1067) se odnosi na pripremu poliovirusu-sličnih čestica iz ćelija.

[0026] Načini za supresiju agregacije normalnih proteina upotrebom baznih aminokiselina su već identifikovani. US 2006/035364 A1 i WO 2009/035707 A1 i Baynes et al. (2005, Biochemistry, doi: 10.1021/BI047528R) se odnose na upotrebu aminokiselina za smanjenje agregacije polipeptida. U predmetnom pronalasku, mi smo otkrili da agregacija može da bude suprimirana, smanjena i/ili sprečena kod vrlo složenih struktura sačinjenih od nekoliko različitih proteinskih "blokova" (poliprotein/multi subjedinične strukture) koji obrazuju stabilnu kvaternarnu strukturu (kao u slučaju virusnih vakcina ili bioloških kompleksa). Stručnjak u odgovarajućoj oblasti razume da neki proteini sami obrazuju tercijarnu strukturu koja u nekim slučajevima može da bude stabilizovana pomoću bazne aminokiseline. Međutim, virusi se sastoje od više ovakvih (različitih) tercijarnih struktura zajedno i vezuju se/sklapaju da bi obrazovali (privremeno)/stabilan proizvod (kvaternarnu strukturu) sa spiralnom, ikozaedralnom ili čak složenijom strukturom. Jedan od virusa koji su ispitani u predmetnom pronalasku ima takvu vrstu složene strukture budući da se sastoji od membranskog omotača. Virusi se razlikuju od normalnih kompleksnih (bioloških) kvarternarnih proteinskih struktura u tom smislu što mogu da se repliciraju i umnožavaju/reprodukuju upotrebom ćelija-domaćina i mogu da evoluiraju pomoću prirodne selekcije (Holes EC 2007; Taylor DJ, et al 2013). Osim toga, neki virusi su pokazali sposobnost da obrazuju specijalizovane strukture za transport genomskog materijala u ćelijedomaćine (Sun L, et al 2014) ili da na njima parazitiraju drugi virusi, takozvani, virofagi (Pearson H, 2008; i Desnues, C, et al 2010).

[0027] Ulazak virusa sa omotačem, kao i bez omotača u ćeliju zahteva interakcije između ćelijskih receptora i virusnog kapsida ili omotača. Oni su specifični za određene ćelijedomaćine kao ključ i brava. Ova virusna kvaternarna struktura mora da se održava u ispravnoj konformaciji/strukturi (delimično obrazuje virusni kapsid) budući da je njena primarna funkcija zaštita (npr. od toplote, pH, UV, itd.) genoma pri prelasku između ćelija, i da se veže za osetljive ćelije-domaćine, ili interno unutar jednog organizma, ili pri ulasku iz spoljašnje sredine u organizam potpuno novog pojedinca/domaćina.

[0028] U pogledu složenosti, funkcionisanja i komplikovanosti strukture virusnih komponenti, stručnjak u odgovarajućoj oblasti ne bi mogao da predvidi da bi upotreba bazne aminokiseline mogla da spreči ili smanji agregaciju dok virusna struktura ostaje intaktna, a infektivnost, specifičnost i imunogenost ostaju očuvane.

[0029] Prema tome, u prvom aspektu, pronalazak se odnosi na postupak za proizvodnju kompozicije koja sadrži enterovirusne čestice, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake:

a) proizvodnju medijuma koji sadrži enterovirusne čestice;

b) prečišćavanje enterovirusnih čestica iz medijuma, pri čemu je tokom bar jednog dela prečišćavanja bazna aminokiselina ili njen derivat prisutan u finalnoj koncentraciji od najmanje 1 mM, i dovoljan je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica; i,

c) inaktivaciju enterovirusnih čestica;

pri čemu je bazna aminokiselina ili njen derivat izabran iz grupe koja se sastoji od: arginina, lizina, histidina, arginina-HCl, lizina-HCl, histidina-HCl, agmatina, dihidrohlorida etil estra L-arginina, traneksaminske kiseline, hidrohlorida DL-5-hidroksilizina, dihidrohlorida metil estra L-lizina, 3-metil-L-histidina, njihovih soli i njihovih kombinacija.

Bazna aminokiselina ili njen derivat

[0030] Bazna aminokiselina može da bude bilo koja D- ili L-aminokiselina koja je farmaceutski prihvatljiva. Bazna aminokiselina može da bude u obliku murijata (npr. vezana za jednu ili više hidrohloridnih soli) ili drugom kuplovanom hemijskom obliku. Takve aminokiseline uključuju 3 standardne „proteinogene“ ili „prirodne“ aminokiseline: histidin, arginin, lizin, kao i njihove derivate. Histidin, arginin i/ili lizin mogu da budu ili optički D- ili L-izomeri ili njihove mešavine, mada je/su aminokiselina/aminokiseline poželjno L-izomeri.

[0031] Derivat bazne aminokiseline može da bude bilo koji oblik njenog derivata koji bi mogao da sintetiše stručnjak u odgovarajućoj oblasti: videti na primer: www.sigmaaldrich.com/chemistry/chemistryproducts.html?TablePage=1625523 ili katalog proizvoda "Amino Acid Derivatives", Sigma Aldrich, ili bilo koji drugi komercijalni izvor.

[0032] Derivat bazne aminokiseline može da bude hiralni ili izomerni oblik histidina, arginina ili lizina. Derivat bazne aminokiseline može da bude metabolički proizvod histidina, arginina ili lizina. Poželjni derivati lizina su odabrani od: traneksaminske kiseline, N-ε-formil-L-lizina i mono ili dihidrohloridnih soli lizina kao hidrohlorid DL-5-hidroksilizina i dihidrohlorid metil estra L-lizina. Poželjni derivati arginina su odabrani od: N-α-acetil L-arginina, agmatina, agmatin sulfatne soli i mono ili dihidrohloridnih soli arginina kao dihidrohlorid etil estar L-arginina. Poželjni derivati histidina su odabrani od: 3-metil-L-histidina i mono ili dihidrohloridnih soli histidina kao dihidrohlorid α-metil-DL-histidina.

[0033] U poželjnom primeru izvođenja, bazna aminokiselina ili njen derivat izabran je iz grupe koja se sastoji od: L-arginina, D-arginina, L-lizina, L-histidina, hiralnih/izomernih/racemskih oblika arginina, lizina, histidina, arginina-HCl, lizina-HCl, histidina-HCl, agmatina, sulfatne soli agmatina, dihidrohlorid etil estra L-arginina, traneksaminske kiseline, monohidrohloridne soli lizina, monohidrohloridne soli histidina, monohidrohloridne soli arginina, dihidrohloridne soli lizina, dihidrohloridne soli histidina, dihidrohloridne soli arginina, hidrohlorida DL-5-hidroksilizina, dihidrohlorid metil estra L-lizina, 3-metil-L-histidina, arginin-glutamata, arginin-acetata, arginin-aspartata, argininsulfata, lizin-glutamata, lizin-acetata, histidin-acetata i L-arginin kokoata. Takođe je predviđeno da bazna aminokiselina ili njen derivat mogu da budu kombinovani u oblik soli kao što je arginin-glutaminska kiselina, arginin-acetatna kiselina, arginin-aspartatna kiselina itd. Kao deo opisa, bazna aminokiselina ili njen derivat izabran je iz grupe koja se sastoji od: metaboličkog proizvoda arginina, lizina, histidina, N-α-acetil L-arginina, N-ε-formil-L-lizina i dihidrohlorida α-metil-DL-histidina, butiroil-L-arginina, etil estra N-α-kokoil-L-arginina i hidrohlorida N-[3-alkil(12,14)oksi-2-hidroksipropil]-L-arginina.

[0034] Bazna aminokiselina ili njen derivat mogu da se dodaju kompoziciji ili rastvoru koji sadrži virusnu komponentu i njene agregate da bi se dobila finalna koncentracija od najmanje 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 81, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, ili 1000 mM i/ili manje od 1000 mM, 950, 900, 850, 800, 750, 700, 650, 600, 550, 500, 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 400, 390, 380, 370, 360, 350, 340, 330, 320, 310, 300, 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, ili 5 mM. Opisane su finalne koncentracije od manje od 1, 0.50, 0.45, 0.40, 0.35, 0.30, 0.25, 0.20, 0.15, 0.1, 0.05, 0.015 ili 0.01 mM, ili u opsegu od 0.01-1000 mM ili 0.015-1000 mM, ili najmanje 0.01, 0.015, 0.05, 0.10, 0.15, 0.20, 0.25, 0.30, 0.35, 0.40, 0.45, ili 0.5 mM. Ako je više od jedne posebne bazne aminokiseline ili njenog derivata prisutno u navedenoj kompoziciji ili rastvoru, kao što je ovde kasnije objašnjeno, gore navedena koncentracija se odnosi na ukupnu koncentraciju bazne aminokiseline ili njenih derivata. Ako je samo jedna bazna aminokiselina ili jedan njen derivat korišćen, ukupna koncentracija bazne aminokiseline ili njenog derivata je sinonim sa koncentracijom navedene aminokiseline. Podrazumeva se da bazna aminokiselina ili njen derivat mogu da se dodaju kao aditiv (označen i kao ekscipijens,

1

ko-rastvarač ili ko-rastvor), kao čvrsta supstanca (za rastvaranje u smeši), kao (koncentrovani) vodeni rastvor u vodi ili puferu, ili zamenjivanjem vode ili pufera onim koji sadrži navedenu baznu aminokiselinu putem npr. dijafiltracije, kompoziciji ili rastvoru koji sadrži virusnu komponentu i njene agregate.

[0035] U zavisnosti od identiteta virusa, stručnjak u odgovarajućoj oblasti može da prilagodi koncentraciju da bi postigao željeno dejstvo sprečavanja ili smanjenja agregacije. Na primer za poliovirus, koncentracija bazne aminokiseline ili njenog derivata poželjno nije veća od 100 mM ili nije veća od 150 mM.

[0036] Poželjna bazna aminokiselina je arginin, poželjnije L-arginin. Poželjna koncentracija L-arginina u navedenoj kompoziciji ili rastvoru koja sadrži virusnu komponentu i njene agregate je u opsegu od 1-1000 mM, 1-900 mM, 1-600 mM, 5-500 mM, 10-400 mM, 15-300 mM, 20-200 mM, 25-200 mM, 30-200 mM, 35-200 mM, 40-200 mM, 45-200 mM, 50-300 mM, ili 70-250 mM. Dobri rezultati su dobijeni sa 150 mM u slučaju poliovirusa i 350 mM u slučaju influenca virusa. Opisani opsezi koncentracija L-arginina su 0.01-1000 mM, 0.015-1000 mM, 0.05-1000 mM, 0.1-1000 mM, 0.5-1000 mM, 0.8-1000 mM, 0.1-900 mM, 0.8-900 mM, 0.1-800 mM, 0.8-800 mM, 0.1-700 mM i 0.5- 700 mM.

[0037] Poželjni derivat ili proizvod arginina je agmatin. Poželjna koncentracija agmatina u navedenoj kompoziciji ili rastvoru koji sadrži virusnu komponentu i njene agregate je u opsegu od 1-1000 mM, 1-900 mM, 1-600 mM, 5-500 mM, 10-400 mM, 15-300 mM, 20-200 mM, 25-200 mM, 30-200 mM, 35-200 mM, 40-200 mM, 45-200 mM, 50-300 mM ili 70-250 mM. Dobri rezultati su dobijeni sa 100 mM i sa 25 mM. Opisani opsezi koncentracija agmatina su 0.01-1000 mM, 0.015-1000 mM, 0.05-1000 mM, 0.1-1000 mM, 0.5-1000 mM, 0.8-1000 mM, 0.1-900 mM, 0.8-900 mM, 0.1-800 mM, 0.8-800 mM, 0.1-700 mM, i 0.5- 700 mM.

[0038] Još jedna poželjna bazna aminokiselina je lizin, poželjnije L-lizin. Poželjna koncentracija lizina u navedenoj kompoziciji ili rastvoru koji sadrži virusne komponente i njene agregate je u opsegu od 1-1000 mM, 1-900 mM, 1-600 mM, 5-500 mM, 10-400 mM, 15-300 mM, 20-200 mM, 25-200 mM, 30-200 mM, 35-200 mM, 40-200 mM, 45-200 mM, 50-300 mM ili 100-250 mM. Dobri rezultati su dobijeni sa 150 mM i sa 75 mM. Opisani opsezi koncentracija lizina su 0.01-1000 mM, 0.015-1000 mM, 0.05-1000 mM, 0.1-1000 mM, 0.5-1000 mM, 0.8-1000 mM, 0.1-900 mM, 0.8-900 mM, 0.1-800 mM, 0.8-800 mM, 0.1-700 mM, i 0.5- 700 mM,

[0039] Rastvor koji sadrži baznu aminokiselinu ili njen derivat poželjno ima neutralni pH, npr. pH u opsegu od 6.0 - 8.0, ili 6.5 - 7.5 ili pH od oko 7.0. Poželjnije, pH rastvora je ispod pI bazne aminokiseline koja se koristi. Ovaj rastvor poželjno obuhvata pufer za održavanje pH na označenim vrednostima. U principu bilo koji farmaceutski prihvatljiv pufer, koji poželjno ima efikasan kapacitet puferisanja u opsegu navedenih pH vrednosti, može da se koristi u rastvoru. Pufer je poželjno prisutan u koncentraciji u opsegu od 0.5 - 100 mM, poželjnije u opsegu od 1 - 75 mM i najpoželjnije u opsegu od 2 - 40 mM, kao 20 ili 40 mM.

[0040] Pogodni puferi za upotrebu u rastvoru uključuju, ali nisu ograničeni na McIlvaine pufer (smeša 0.1 M limunske kiseline i 0.2 M dinatrijum fosfata), citratni pufer, fosfatni pufer, HEPES pufer, PIPES pufer i histidinski pufer.

[0041] Poželjnije, svaka od baznih aminokiselina ili derivata koji se ovde koriste je poželjno puferisana na pH 7. Poželjnije pufer je fosfatni pufer u koncentraciji od 20 ili 40 mM.

[0042] Međutim, kontekstom pronalaska je obuhvaćeno i to da pufer nije potreban ili da pufer nije prisutan. U tom slučaju, kompozicija ili rastvor obuhvata, ili se sastoji od virusne komponente i bazne aminokiseline ili njenog derivata kao što je ovde definisano, bez dodatnog pufera. Poželjno, navedena kompozicija ili rastvor se sastoji od virusne komponente i bazne aminokiseline kao što je ovde definisano.

[0043] Kontekstom pronalaska je obuhvaćena upotreba više od jedne bazne aminokiseline i/ili više od jednog njenog derivata u postupku prema pronalasku za sprečavanje i/ili smanjenje agregacije virusnih komponenti. Poželjna kombinacija bazne aminokiseline je kombinacija koja sadrži arginin, lizin i histidin. Takođe je obuhvaćena upotreba date bazne aminokiseline ili njenog derivata u datom koraku postupka prema pronalasku (tj. u koracima ushodne obrade, koracima nishodne obrade, koraku inaktivacije i/ili koraku formulacije) i upotreba drugačije bazne aminokiseline ili njenog derivata u drugom koraku istog postupka. Na primer, u koncentrovani materijal može da se doda agmatin, dok tokom koraka u postupku nishodnog prečišćavanja, npr. tokom koraka hromatografije može da se koristi arginin.

[0044] Bazna aminokiselina je prisutna tokom koraka b), ali može da se doda ili da bude prisutna tokom bilo kog koraka postupka, i može, ali ne mora da bude prisutna tokom svih koraka postupka. Bazna aminokiselina može lako da se ukloni ili zameni, kada je potrebno, pomoću filtracije, hromatografije ili dijalize (videti primer 6).

Virusne komponente

[0045] Ovde se podrazumeva da se "virusna komponenta" odnosi na biološki agens, koji je fiziološki aktivan ili aktivira fiziološki odgovor kada se primeni kod sisara, posebno kada se primeni kod čoveka, poželjno u farmaceutski prihvatljivom obliku. Virusna komponenta može da se proizvede ili dobije iz organizma domaćina, kao što je životinja, biljka, bakterija ili gljiva. Virusna komponenta može da bude agens na bazi proteina, tj. agens koji sadrži proteinski materijal kao proteine, polipeptide i peptide. Virusna komponenta može dalje da sadrži ili da se sastoji od nukleinske kiseline, npr. DNK, RNK ili analoga nukleinske kiseline. Virusna komponenta može dalje da sadrži membranski lipid/lipide npr. OMV, lipozome, virozome.

[0046] Poželjna virusna komponenta obuhvata ili se sastoji od virusa ili viriona, poželjno virusa koji inficira sisare, poželjno virusa koji inficira ljude. Virus može da bude virus sa omotačem, ali poželjno je virus bez omotača. Ovde se pod pojmom "virus" ili "virusna komponenta", kako se ovde koristi, podrazumevaju virusi divljeg tipa, onako kako se javljaju u prirodi (npr. prirodni izolati), kao i atenuisani, mutantni, himerni, pseudo- i defektni virusi koje je napravio čovek. Pojam "virus" ili "virusna komponenta" uključuje i rekombinantne viruse, tj. viruse konstruisane upotrebom rekombinantne DNK tehnologije, kao što su defektni virusi kojima, npr. nedostaje (deo) jedan, više ili svi virusni geni i vektori za gensku terapiju u kojima je deo virusnog genoma zamenjen jednim ili više gena od interesa.

[0047] U poželjnom primeru izvođenja, virusna komponenta je virusna čestica. U kontekstu pronalaska podrazumeva se da pojam "virusna čestica" uključuje potpune virione, kao i čestice slične virusu koje imaju veličinu i/ili sastav kapsida identične ili slične kao kod odgovarajućeg viriona divljeg tipa, ali ne sadrže potpuni virusni genom ili ne sadrže nukleinske kiseline i/ili kojima nedostaju (potpuni komplement) proteini jezgra virusa (kao što su npr. nukleoproteini).

[0048] Virusne komponente koje mogu da se upotrebe u postupku ili kompoziciji prema pronalasku poželjno potiču od virusa odabranih iz grupe koja se sastoji od pikornavirusa i virusa sa negativnom jednolančanom RNK uključujući ortomiksoviruse i paramiksoviruse.

[0049] Poželjan pikornavirus je Enterovirus.

[0050] Enterovirusi su članovi familije Picornaviridae, velike i raznovrsne grupe malih RNK virusa koji se odlikuju pozitivnom jednolančanom RNK. Svi enterovirusi sadrže genom od približno 7 500 baza i poznato je da imaju visoku stopu mutacija zbog niske vernosti

1

replikacije i čestih rekombinacija. Posle infekcije ćelije-domaćina, genom se translatira na način nezavisan od „cap“ strukture u pojedinačni poliprotein, koji se zatim obrađuje proteazama koje su kodirane virusom u strukturne proteine kapsida i u nestrukturne proteine, koji su uglavnom uključeni u replikaciju virusa. Rod Enterovirus uključuje sledećih dvanaest vrsta: Enterovirus A (ranije humani enterovirus A), Enterovirus B (ranije humani enterovirus B), Enterovirus C (ranije humani enterovirus C), Enterovirus D (ranije humani enterovirus D), Enterovirus E (ranije enterovirus goveda grupe A), Enterovirus F (ranije enterovirus goveda grupe B), Enterovirus G (ranije enterovirus svinje B), Enterovirus H (ranije enterovirus majmuna A), Enterovirus J, Rhinovirus A (ranije humani rinovirus A), Rhinovirus B (ranije humani rinovirus B) i Rhinovirus C (ranije humani rinovirus C). Ovih dvanaest vrsta obuhvata serotipove:

Koksaki virusi:

- serotipovi CV-A2, CV-A3, CV-A4, CV-A5, CV-A6, CV-A7, CV-A8, CV-A10, CV-A12, CV-A14 i CV-A16 (pripadaju vrsti Enterovirus A).

- serotipovi CV-B1, CV-B2, CV-B3, CV-B4, CV-B5, CV-B6 i CV-A9 (pripadaju vrsti Enterovirus B).

- serotipovi CV-A1, CV-A11, CV-A13, CV-A17, CV-A19, CV-A20, CV-A21, CV-A22 i CV-A24 (pripadaju vrsti Enterovirus C).

Ehovirusi:

- serotipovi E-1, E-2, E-3, E-4, E-5, E-6, E-7, E-9, E-11, E-12, E-13, E-14, E-15, E-16, E-17, E-18, E-19, E-20, E-21, E-24, E-25, E-26, E-27, E-29, E-30, E-31, E-32, i E-33 (pripadaju vrsti Enterovirus B).

Enterovirusi:

- tipovi EV-A71, EV-A76, EV-A89, EV-A90, EV-A91, EV-A92, EV-A114, EV-A119, SV19, SV43, SV46 i BA13 (pripadaju vrsti Enterovirus A).

- tipovi EV-B69, EV-B73, EV-B74, EV-B75, EV-B77, EV-B78, EV-B79, EV-B80, EV-B81, EV-B82, EV-B83, EVB84, EV-B85, EV-B86, EV-B87, EV-B88, EV-B93, EV-B97, EV-B98, EV-B100, EV-B101, EV-B106, EV-B107, EV-B110 i SA5 (pripadaju vrsti: Enterovirus B).

- tipovi EV-C95, EV-C96, EV-C99, EV-C102, EV-C104, EV-C105, EV-C109, EV-C116, EV-C117 i EV-C118 (pripadaju vrsti Enterovirus C).

- tipovi EV-D68, EV-D70, EV-D94, EV-D111 i EV-D120 (pripadaju vrsti Enterovirus D). - tipovi: EV-H1 (pripadaju vrsti Enterovirus H). - tipovi: SV6, EV-J103, EV-J108, EV-J112, EV-J115 i EV-J121 (pripadaju vrsti Enterovirus J).

Humani rinovirusi:

- tipovi HRV-A1, HRV-A2, HRV-A7, HRV-A8, HRV-A9, HRV-A10, HRV-A11, HRV-A12, HRV-A13, HRV-A15, HRV-A16, HRV-A18, HRV-A19, HRV-A20, HRV-A21, HRV-A22, HRV-A23, HRV-A24, HRV-A25, HRV-A28, HRV-A29, HRV-A30, HRV-A31, HRV-A32, HRV-A33, HRV-A34, HRV-A36, HRV-A38, HRV-A39, HRV-A40, HRV-A41, HRV-A43, HRV-A44, HRV-A45, HRV-A46, HRV-A47, HRV-A49, HRV-A50, HRV-A51, HRV-A53, HRV-A54, HRV-A55, HRV-A56, HRV-A57, HRV-A58, HRV-A59, HRV-A60, HRV-A61, HRV-A62, HRV-A63, HRV-A64, HRV-A65, HRV-A66, HRV-A67, HRV-A68, HRV-A71, HRV-A73, HRV-A74, HRV-A75, HRV-A76, HRV-A77, HRV-A78, HRV-A80, HRV-A81, HRV-A82, HRV-A85, HRV-A88, HRV-A89, HRV-A90, HRV-A94, HRV-A95, HRV-A96, HRV-A98, HRV-A100, HRV-A101, HRV-A102 i HRV-A103 (pripadaju vrsti Rhinovirus A).

- tipovi HRV-B3, HRV-B4, HRV-B5, HRV-B6, HRV-B14, HRV-B17, HRV-B26, HRV-B27, HRV-B35, HRV-B37, HRV-B42, HRV-B48, HRV-B52, HRV-B69, HRV-B70, HRV-B72, HRV-B79, HRV-B83, HRV-B84, HRV-B86, HRV-B91, HRV-B92, HRV-B93, HRV-B97, i HRV-B99 (pripadaju vrsti Rhinovirus B).

- tipovi HRV-C1, HRV-C2, HRV-C3, HRV-C4, HRV-C5, HRV-C6, HRV-C7, HRV-C8, HRV-C9, HRV-C10, HRVC11, HRV-C12, HRV-C13, HRV-C14, HRV-C15, HRV-C16, HRV-C17, HRV-C18, HRV-C19, HRV-C20, HRVC21, HRV-C22, HRV-C23, HRV-C24, HRV-C25, HRV-C26, HRV-C27, HRV-C28, HRV-C29, HRV-C30, HRVC31, HRV-C32, HRV-C33, HRV-C34, HRV-C35, HRV-C36, HRV-C37, HRV-C38, HRV-C39, HRV-C40, HRVC41, HRV-C42, HRV-C43, HRV-C44, HRV-C45, HRV-C46, HRV-C47, HRV-C48, HRV-C49, HRV-C50 i HRV-C51 (pripadaju vrsti Rhinovirus C).

1

Poliovirusi:

- serotipovi PV-1, PV-2, i PV-3 (pripadaju vrsti: Enterovirus C).

[0051] Poželjni enterovirusi uključuju koksaki A virus, koksaki B virus, ehovirus i enteroviruse 68, 69, 70, 71 i 73 (npr. tipovi EV-D68, EV-B69, EV-D70, i EV-A71). Najpoželjnije virus je poliovirus. Virusna komponenta može da sadrži jedan ili više od serotipova poliovirusa 1, 2 i 3, ali poželjno virusna komponenti sadrži sva tri serotipa poliovirusa 1, 2 i 3. Pogodni sojevi serotipa 1 poliovirusa uključuju, ali nisu ograničeni na jedan ili više od Sabin 1, Mahoney, Brunenders, Brunhilde, CHAT i Cox sojeva. Pogodni sojevi serotipa 2 poliovirusa uključuju, ali nisu ograničeni na jedan ili više od Sabin 2, MEF-1 i Lansing sojeva. Pogodni sojevi serotipa 3 poliovirusa uključuju, ali nisu ograničeni na jedan ili više od Sabin 3, Saukett H i G, i Leon sojeva. U poželjnim primerima izvođenja virusna komponenta je, ili obuhvata, trovalentnu inaktivisanu polio vakcinu kao npr. Salk-IPV, koja sadrži inaktivisani poliovirusni soj Mahoney za tip 1, inaktivisani poliovirusni soj MEF-1 za tip 2 i inaktivisani poliovirusni soj Saukett za tip 3, ili sIPV, koja sadrži inaktivisane poliovirusne sojeve Sabin-1, -2 i -3 (van Wezel et al, 1978; Montagnon et al, 1983 & 1984). VLP (čestice slične virusu) su takođe obuhvaćene obimom pronalaska.

[0052] U drugom primeru izvođenja, virus je virus sa negativnom jednolančanom RNK (Mononegavirales). Virusi sa negativnom jednolančanom RNK uključuju sledeće viruse:

Bornaviridae:

Bornavirus virus Borna bolesti

Rhabdoviridae:

Vesiculovirus virus vezikularnog stomatitisa - Indiana

Lyssavirus virus besnila

Ephemerovirus virus efemerne groznica goveda

Novirhabdovirus virus infektivne hematopoetske nekroze

Filoviridae:

Marburgvirus marburgvirus jezera Viktorija

Ebolavirus zairski ebolavirus

1

Paramyxoviridae:

Paramyxovirinae:

Rubulavirus virus zauški

Avulavirus virus Njukasl bolesti

Respirovirus Sendai virus

Henipavirus Hendra virus

Morbillivirus virus malih boginja

Pneumovirinae:

Pneumovirus humani respiratorni sincicijalni virus

Metapneumovirus ptičji metapneumovirus

Orthomyxoviridae:

Influenzavirus A influenca A virus

Influenzavirus B influenca B virus

Influenzavirus C influenca C virus

Thogotovirus Thogoto virus

Isavirus virus zarazne anemije lososa

Bunyaviridae:

Orthobunyavirus Bunyamwera virus

Hantavirus Hantaan virus

Nairovirus Dugbe virus

Phlebovirus virus groznice doline Rift

Arenaviridae:

Arenavirus virus limfocitnog horiomeningitisa

[0053] Poželjan virus sa negativnom jednolančanom RNK je virus koji pripada familiji Paramyxoviridae ili Orthomyxoviridae. Poželjan virus familije Paramyxoviridae je virus kao što je gore navedeno koji pripada subfamiliji Paramyxovirinae ili Pneumovirinae. Pneumovirus je poželjno respiratorni sincicijalni virus (RSV), poželjnije humani ili goveđi RSV. Humani RSV može da pripada podgrupi A ili B virusa, i poželjno je klinički izolat,

1

poželjnije izolat koji nije intenzivno pasažiran in vitro (poželjno pasažiran manje od 10, 8, 6 ili 5 puta). Poželjno (humani ili goveđi) RSV virus je virus koji sadrži virusni genom koji ima deletirani ili inaktivisani gen za G-vezni protein, npr. koji ima mutaciju u virusnom genomu pri čemu virusni genom ne kodira funkcionalni G-vezni protein, kao npr. RSV ΔG i RSV ΔG+G virioni, kao što je opisano u WO 2005/061698 i kod Widjojoatmodjo et al. 2010. Poželjni virusi subfamilije Paramyxovirinae uključuju Rubulavirus (virus zauški) i Morbillivirus (virus malih boginja).

[0054] U drugim primerima izvođenja, virusna komponenta je virus ili virion familije Orthomyxoviridae. Poželjni virus familije Orthomyxoviridae je influenca virus. Influenca virus može da bude influenca virus roda Influenzavirus A, B ili C, od kojih je A najpoželjniji. Poželjni podtipovi Influenza A virusa uključuju H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3 i H10N7, uključujući svinjski influenca A (H1N1) virus (SOIV, ili H1N1v) koji je 2009. godine izazvao pandemiju.

[0055] Virusne komponente su poželjno prisutne u kompoziciji ili rastvoru u količini u opsegu od 1 x 100 do 7 x 1016 živih i/ili mrtvih ili inaktivisanih čestica po ml. Broj živih čestica može da se odredi na primer pomoću testa određivanja broja formiranih plaka, određivanja doze koja inficira 50% ćelijskih kultura ili kultura tkiva (CCID50ili TCID50) i drugih pogodnih virusoloških testova za određivanje titra virusne komponente. Broj mrtvih ili inaktivisanih čestica može da se odredi upotrebom testa koji kvantitativno određuje količinu antigena, kao npr. testova za određivanje proteina, ili testova za određivanje hemaglutinacionih jedinica ili jedinica polio D-antigena ili N-antigena. Poželjno virusne komponente su prisutne u navedenoj kompoziciji ili rastvoru u količini od najmanje 1 x 10<1>, 1 x 102 , 1 x 103, 1 x 103, 1 x 104 , 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109 ili 1 x 1010, 1 x 1011 , 1 x 1012 , 1 x 1013 živih i/ili mrtvih ili inaktivisanih čestica po ml i/ili u količini sve do 7 x 1016, 1 x 1016, 1 x 1015 živih i/ili mrtvih ili inaktivisanih čestica po ml.

[0056] Količina virusnih komponenti u navedenoj kompoziciji ili rastvoru može da se izrazi i kao težina navedenih virusnih komponenti po ml rastvora. Poželjno virusne komponente su prisutne u rastvoru u težini/ml u opsegu od 1 fg/ml do 10 g/ml. Poželjnije, virusne komponente su prisutne u navedenoj kompoziciji ili rastvoru u količini od najmanje 10<-15>, 10-14 , 10-13, 10-12 ,10-11 , 10-10, 10-9, 10-8, 10-7, 10-6, 10-5, 10-4 , g/ml i/ili u količini do 10<-3>, 10<-2>, 10<-1>, ili 100 g/ml. Težina navedenih virusnih komponenti u navedenoj kompoziciji ili rastvoru može da se odredi na načine koji su po sebi poznati u stanju tehnike, uključujući npr. testove

1

za određivanje proteina. Prethodno pomenute težine biofarmaceutskog sredstva mogu prema tome da se izraze i kao grami proteina po ml koji se određuju u pogodnom testu za određivanje proteina (npr. Bradfordov test; Zor and Selinger, 1996).

[0057] U poželjnom primeru izvođenja u kome virusne komponente prisutne u kompoziciji ili rastvoru predstavljaju ili sadrže poliovirus, količina poliovirusa u navedenoj kompoziciji ili rastvoru poželjno je najmanje 0.01, 0.1, 1.0, ili 10 DU/ml i do 10000, 1 000 ili 100 DU/ml, gde se 1 DU definiše kao što je opisano u preporukama SZO (TRS, N0980, Annex 2, 2014), Svetska zdravstvena organizacija, Serija tehničkih izvještaja SZO, Preporuke za proizvodnju i kontrolu vakcine protiv poliomijelitisa (inaktivisane) ili gde je 1 DU definisana i određena pomoću ELISA testa kao što je opisano kod Westdijk et al. 2011 ili Ten Have et al. 2012. U jednom primeru izvođenja u kome kompozicija ili rastvor koji sadrži navedene virusne komponente predstavlja ili sadrži vakcinu, poželjno gde je prisutan multivalentni poliovirus (vakcina), podrazumeva se da je svaki poliovirusni serotip prisutan u količini od najmanje 0.01, 0.1,1.0, ili 10 DU/ml i sve do 10000, 1000 ili 100 DU/ml.

[0058] U poželjnom primeru izvođenja, virusne komponente prisutne u kompoziciji ili rastvoru su, ili sadrže RSV. Poželjnije, količina RSV u navedenoj kompoziciji ili rastvoru je najmanje 1 x 101 , 1 x 102 , 1 x 103, 1 x 103, 1 x 104 TCID50/ml i do 7 x 1016, 1 x 1016, 1 x 1015, 1 x 1014 TCID50/ml, pri čemu se TCID50za RSV definiše i određuje kao što je opisano kod Widjojoatmodjo et al.2010.

Agregacija

[0059] U kontekstu pronalaska, agregacija označava interakciju između komponenti, u ovom slučaju između virusnih komponenti kao što su virusne čestice. Međutim, agregacija obuhvata i agregaciju virusnih čestica sa materijalom koji je prisutan u kompoziciji ili rastvoru kao nečistoće, kao što su proteini ćelija-domaćina. Takve interakcije mogu da budu kovalentne ili nekovalentne, rastvorljive ili nerastvorljive, reverzibilne ili ireverzibilne. Agregacija može da se dogodi tokom bilo kog koraka postupka za proizvodnju virusnih komponenti: tokom koraka kultivacije, koraka prečišćavanja, koraka inaktivacije i/ili formulacije. Agregacija može da se dogodi i kada su virusne komponente već proizvedene. Agregati koji su tako formirani prisutni su kao čestice, a aktuelne smernice ograničavaju broj čestica koje su dozvoljene u finalnoj seriji (bio)farmaceutika (SAD i evropska farmakopeja).

1

[0060] Virusne komponente u kompoziciji ili rastvoru mogu da budu prisutne kao solubilne čestice koje su žive, mrtve ili atenuisane kao što je gore naznačeno. Virusne komponente mogu takođe da budu prisutne kao agregati u navedenoj kompoziciji ili rastvoru. Obično takvi agregati virusnih komponenti treba de se uklone. Prisustvo agregata u kompoziciji ili rastvoru koji sadrži virusne komponente može direktno da se proceni kvantitativnim određivanjem svojstava refleksije ili transmisije u funkciji određenih talasnih dužina. Talasna dužina se nalazi u opsegu između 200 i 1000 nm. Obično se odabira 450 ili 590 nm. Optička gustina se poželjno procenjuje kao što je izvedeno u primeru 3. Smanjenje optičke gustine ukazuje na smanjenje rasipanja svetlosti što odgovara smanjenoj agregaciji.

[0061] Alternativno, prisustvo agregata u kompoziciji ili rastvoru koji sadrži virusne komponente može da se proceni merenjem turbiditeta (FTU/NTU), „field-flow“ frakcionisanjem, elektronskom mikroskopijom ili rasipanjem svetlosti kao DLS ili MALS. Dostupni su komercijalni kitovi, koji mogu da se prilagode specifičnim primenama (npr. ProteoStat od Enzo life science part# ENZ-51023-KP002).

[0062] Alternativno, prisustvo agregata u kompoziciji ili rastvoru koji sadrži virusne komponente može da se proceni upotrebom ekskluzione hromatografije ili gel-elektroforezom pod nedenaturišućim uslovima, u kojima se proizvod i agregat razdvajaju na koloni ili na ploči gela i kvantitativno određuju, ili kombinacijom navedenih tehnika (Li Y, 2009). Više podataka o analitičkim tehnikama za detekciju agregacije može da se nađe u sledećim pregledima Das TK 2012 i/ili Wei Wang, 2005.

[0063] Dostupnost funkcionalnih grupa može da se oceni na primer ELISA ili biosenzorskim testom, pri čemu porast izmerenih vrednosti odgovara smanjenju agregacije. Za polio virus, ranije je opisan brzi ELISA test zasnovan na epitopu D-antigena (ten Have et al. 2012). Povećanje količine D-antigena ukazuje na to da je više epitopa dostupno/pristupačno za merenje što ukazuje na smanjenje agregacije.

[0064] U tom kontekstu, opadanje ili sprečavanje ili smanjenje agregacije može da znači:

- smanjenje optičke gustine (na primer na 590 nm) od najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više, i/ili

- povećanje količine D-antigena od najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% ili više.

2

[0065] Navedeno smanjenje optičke gustine ili povećanje količine D-antigena se poželjno ocenjuje poređenjem sa količinom agregata prisutnih (preko procene na primer optičke gustine ili količine D-antigena) u kompoziciji ili rastvoru koji sadrži virusne komponente u kome:

- nije dodata bazna aminokiselina ili njen derivat, ili

- koji je proizveden, ili može da se dobije postupkom u kome bazna aminokiselina ili njen derivat nisu dodati, ili

- ukupna koncentracija bazne aminokiseline ili njenog derivata je manja od 0.01 mM.

[0066] Poželjno, kompozicija ili rastvor koji sadrži virusne komponente je optički ili vizuelno bistar, ukazujući na to da je većina materijala u rastvoru i da gotovo nimalo agregata nije prisutno. Poželjnije, navedena kompozicija ili rastvor koji sadrži virusne komponente je optički ili vizuelno bistar najmanje jedan, 2, 3 meseca.

[0067] Bazne aminokiseline mogu da se detektuju na načine koji su poznati u stanju tehnike, uključujući npr. fotometriju, fluorescenciju, HPLC, NMR i masenu spektometriju.

Postupci za proizvodnju kompozicije koja sadrži virusne komponente

[0068] U poželjnom primeru izvođenja postupka za sprečavanje i/ili smanjenje agregacije virusnih komponenti, postupak se primenjuje u, ili kao deo postupka za proizvodnju kompozicije koja sadrži virusne komponente. Prema tome, ovaj primer izvođenja se odnosi na postupak za proizvodnju kompozicije koja sadrži virusnu komponentu, pri čemu postupak obuhvata sledeće korake: a) proizvodnju medijuma koji sadrži virusnu komponentu; b) prečišćavanje virusne komponente od medijuma, pri čemu je tokom bar jednog dela prečišćavanja bazna aminokiselina ili njen derivat prisutan u finalnoj koncentraciji od najmanje 1 mM i dovoljan je da spreči ili smanji agregaciju virusne komponente; i, c) inaktivaciju virusne komponente; i, opciono d) formulaciju virusne komponente, pri čemu je bazna aminokiselina ili njen derivat kao što je ovde definisano u prethodnom tekstu.

[0069] U postupku, bazna aminokiselina ili njen derivat se održavaju u koncentraciji koja je dovoljna da spreči ili smanji agregaciju virusne komponente za vreme ili tokom celokupnog trajanja koraka b) prečišćavanja. Poželjnije, bazna aminokiselina ili njen derivat je takođe prisutan u koncentraciji koja je dovoljna da spreči ili smanji agregaciju virusne komponente tokom najmanje dela koraka c) i/ili koraka d). Još poželjnije, bazna aminokiselina ili njen derivat se održava u koncentraciji koja je dovoljna da spreči ili smanji agregaciju virusne komponente za vreme ili tokom celog trajanja koraka c) i/ili koraka d). Pogodne koncentracije bazne aminokiseline ili njenog derivata za sprečavanje ili smanjenje agregacije virusnih komponenti su kao što je gore navedeno.

[0070] Poželjno, u postupku, virusna komponenta je komponenta enterovirusa kao što je gore definisano. Poželjnije, virusna komponenta su enterovirusne čestice, tj. virusna čestica enterovirusa kao što je gore definisano, uključujući čestice slične virusu.

[0071] Virusne komponente i čestice kao što je ovde definisano se obično proizvode u višestepenim postupcima. Takav postupak može da obuhvata sledeće korake:

a) korak proizvodnje (sirovog) medijuma koji sadrži virusne komponente. Ovaj korak može da sadrži kultivisanje ćelija koje proizvode virusne komponente, ali može da obuhvata i korake u kojima se virusne komponente rekonstituišu, npr. za proizvodnju čestica sličnih virusu. Ovi koraci se mogu nazvati ushodnim koracima obrade (USP), kojima se proizvodi sirovi medijum ili kompozicija iz koje virusne komponente treba da se izdvoje i/ili prečiste; i

b) nishodnu obradu ili korak prečišćavanja (DSP).

[0072] Za proizvodnju IPV (videti sliku 1), korak inaktivacije se izvodi kao korak c) nakon koraka b). Korak (d) formulacije može takođe da se izvede na kraju koraka b) ili c).

[0073] Ovi postupci su poznati stručnjaku u odgovarajućoj oblasti i mogu da se prilagode u zavisnosti od identiteta virusne komponente koja se proizvodi.

[0074] Bazna aminokiselina ili njen derivat kao što je ovde definisano mogu da se dodaju tokom bilo kog koraka (a, b, c i/ili d) da bi pomogli u obradi proizvoda.

[0075] Na primer, u koraku a), pogodan organizam-domaćin koristi se za replikaciju virusne komponente. Takav korak kultivacije vodi proizvodnji kompozicije ili rastvora koji sadrži virusne komponente. Za proizvodnju IPV pogodne ćelije su poželjno sisarske ćelije. Nekoliko sisarskih ćelija je poznato kao pogodan supstrat za replikaciju poliovirusa za proizvodnju IPV. Prema evropskoj farmakopeji (6.0; 01/2008:0214), u ovu svrhu, virus može da se umnožava u humanim diploidnim ćelijskim linijama (npr. WI-38 ili MRC-5), kontinuiranim ćelijskim linijama (npr. Vero), ili u primarnim, sekundarnim, ili tercijarnim ćelijama majmunskih bubrega (MKC), ili u PerC6 ili u CAP ćelijama. Poliovirus može da se kultiviše u HeLa ćelijama. Najnovija dostignuća su opisana kod Hamidi et al 2012.

[0076] Ako je virus poliovirus, ćelijska linija je poželjno Vero. Za replikaciju poliovirusa, poželjna su sledeća tri virulentna soja divljeg tipa: Mahoney (tip 1 poliovirusa), MEF-1 (tip 2 poliovirusa) i Saukett (tip 3 poliovirusa). I drugi sojevi divljeg tipa, kao Brunhilde (tip 1 poliovirusa) mogu da se koriste u pripremi IPV. Alternativno, Sejbinovi sojevi poliovirusa se koriste za proizvodnju IPV (Verdijk et al., 2011). Poželjno, ćelije se kultivišu na mikronosačima kao što je opisano kod Van Wezel A.L., et al 1978. Poželjni mikronosač je Cytodex 1. Poželjan korak kultivacije za IPV opisan je u eksperimentalnom delu. Najnovija dostignuća su opisana kod Hamidi et al 2012, Widjojoamodjo et al 2010, Thomassen et al 2013a.

[0077] U koraku b), virusne komponente se prečišćavaju iz kompozicije ili rastvora koji ih sadrži kao obezbeđene, proizvedene ili dobijene u koraku a). Ima mnogo različitih načina za prečišćavanje virusne komponente u zavisnosti od identiteta virusa. Ovaj korak prečišćavanja može da se izvede klarifikacijom, centrifugiranjem, koncentrovanjem, dijafiltracijom, ekskluzionom hromatografijom (SEC) i/ili jonoizmenjivačkom hromatografijom (IEC). Poželjno za IPV, ovo prečišćavanje se izvodi klarifikacijom, praćenom koncentrovanjem, praćenim ekskluzionom hromatografijom (SEC) i praćenim jonoizmenjivačkom hromatografijom (IEC). Klarifikacija može da se izvede na smeši proizvedenoj u koraku a) upotrebom filtera. Koncentrovanje može da se sprovede upotrebom filtracije sa tangencijalnim protokom (TFF), poznate i kao filtracija sa unakrsnim protokom (CFF) ili ultrafiltracija (UF). Poželjan korak prečišćavanja za proizvodnju IPV je opisan u eksperimentalnom delu i kod Thomassen et al 2010 i 2013. Za RSV, obično klarifikacija može da bude praćena koncentrovanjem, centrifugiranjem u gradijentu gustine i zatim dijafiltracijom upotrebom stabilizatora. Za influencu, centrifugiranje može da bude praćeno filtracijom i koncentrovanjem/dijafiltracijom. Nakon toga, može da se izvede korak centrifugiranja u gradijentu gustine praćen inaktivacijom, i ponovljenim korakom dijafiltracije pre formulacije.

[0078] Postupak koji vodi dobijanju kompozicije ili rastvora koji sadrži virusne komponente može da se sastoji od dva koraka a) i b). Navedeni postupak može da obuhvata dodatni korak, nazvan inaktivacija, korak c), kako je objašnjeno u nastavku. U koraku c), posle nekoliko koraka prečišćavanja, virusne komponente se inaktiviraju. Postupci za inaktivaciju sojeva polio virusa za bezbednu upotrebu u vakcinama su dobro poznati u stanju tehnike i uključuju, ali nisu ograničeni na npr. inaktivaciju upotrebom formalina ili beta-propiolaktona (videti Jonges et al 2010). Navedeni postupak može da bude praćen korakom (d) formulacije.

2

[0079] Prema tome, postupak ili metod prema pronalasku je poželjno takav da virusne komponente mogu da se dobiju postupkom koji obuhvata korake ushodne obrade i nishodne obrade i opciono korak inaktivacije i/ili korak formulacije. Prema tome, bazna aminokiselina ili njen derivat mogu da se koriste tokom bilo kog od ovih koraka, poželjno tokom koraka nishodne obrade i/ili inaktivacije i/ili formulacije.

[0080] Poželjan proizvodni postupak za poliovirus opisan je u eksperimentalnom delu.

[0081] Metod prema pronalasku može da se primeni za sprečavanje agregacije virusnih komponenti. Bazna aminokiselina ili njen derivat može da se koristi u koraku a), koraku b) i/ili koraku c) i/ili koraku d). Poželjno, navedena bazna aminokiselina ili njen derivat se koristi u koraku b) i/ili koraku c). Poželjnije, navedena bazna aminokiselina ili njen derivat se koristi u koraku b). To znači da bazna aminokiselina ili njen derivat mogu da se koriste u bilo kojoj tehnici prečišćavanja korišćenoj u koraku b), u nekima od njih, u svim. Čak poželjnije, navedena bazna aminokiselina ili njen derivat se dodaju elucionom puferu za SEC i/ili elucionom puferu za IEC. Međutim, takođe je predviđeno korišćenje bazne aminokiseline ili njenog derivata u bilo kom koraku koji vodi proizvodnji kompozicije ili rastvora koji sadrži virusne čestice. Takvi koraci uključuju: korak sakupljanja, korak a), korak b), korak c), korak elucije u hromatografiji za hvatanje proizvoda, korak skladištenja intermedijera ili finalnog proizvoda, korak d) formulacije. Poželjne finalne koncentracije baznih aminokiselina ili derivata su ovde već opisane.

Upotreba bazne aminokiseline ili njenog derivata za sprečavanje agregacije virusnih komponenti

[0082] Postupak prema pronalasku može da se primeni za smanjenje agregacije virusnih komponenti. Poželjno, takve virusne komponente mogu da se dobiju postupkom koji obuhvata korake a), b) i c) i opciono d) kao što je gore opisano. U takvom postupku, bazna aminokiselina ili njen derivat se dodaju kompoziciji ili rastvoru koji sadrži virusne komponente. Prema tome, u jednom aspektu, pronalazak se odnosi na upotrebu bazne aminokiseline ili njenog derivata kao što je ovde definisano u tekstu gore, za sprečavanje ili smanjenje agregacije enterovirusnih čestica tokom prečišćavanja enterovirusnih čestica iz medijuma, pri čemu je tokom bar jednog dela prečišćavanja bazna aminokiselina ili njen derivat prisutan u finalnoj koncentraciji od najmanje 1 mM, i dovoljan je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica.

[0083] U kontekstu pronalaska, kaže se da je upotreba bazne aminokiseline ili njenog derivata sprečila ili smanjila ili snizila agregaciju virusnih komponenti u kompoziciji ili rastvoru kada upotreba takve bazne aminokiseline ili derivata vodi smanjenju ili snižavanju od najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100% količine agregata u navedenoj kompoziciji ili rastvoru, procenjeno merenjem OD na 590 nm ili upotrebom bilo kojih metoda koje su opisane ranije u ovom tekstu, u poređenju sa količinom agregata prisutnih, (na primer procenom optičke gustine i/ili količine D-antigena), u kompoziciji ili rastvoru koji sadrži virusne komponente kome:

- nije dodata bazna aminokiselina ili njen derivat, ili

- koji je proizveden ili može da se dobije postupkom u kome bazna aminokiselina ili njen derivat nije dodat, ili

- je ukupna koncentracija bazne aminokiseline ili njenog derivata manja od 0.01 mM.

[0084] U kontekstu pronalaska, kaže se da je upotreba bazne aminokiseline ili njenog derivata sprečila ili smanjila agregaciju virusnih komponenti u kompoziciji ili rastvoru kada upotreba takve bazne aminokiseline ili derivata vodi porastu titra živih ili mrtvih ili inaktivisanih čestica u rastvoru koji se povećao najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100% u poređenju sa titrom reprezentativnih živih ili mrtvih ili inaktivisanih čestica u rastvoru kada bazna aminokiselina ili njen derivat nije korišćen. Titar se procenjuje kao što je ranije opisano u ovom tekstu.

[0085] U kontekstu pronalaska, kaže se da je upotreba bazne aminokiseline ili njenog derivata sprečila ili smanjila agregaciju virusnih komponenti kao što je IPV u kompoziciji ili rastvoru kada upotreba takve bazne aminokiseline ili derivata vodi povećanju od najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 100% jedinica polio D-antigena u poređenju sa brojem jedinica polio D-antigena pre dodavanja navedene bazne aminokiseline ili njenog derivata.

Kompozicija koja sadrži virusne komponente

[0086] Kao deo opisa, obezbeđena je kompozicija ili rastvor koji sadrži virusne komponente. Podrazumeva se da "kompozicija koja sadrži virusne komponente" u skladu sa opisom uključuje rastvore, poželjno vodeni rastvor, u skladu sa opisom, koji sadrži virusne komponente. Kompozicija koja sadrži virusne komponente može da se dobije, ili je dobijena postupkom kao što je ranije definisano u ovom tekstu. Poželjna kompozicija koja sadrži

2

virusne komponente može da se dobije postupkom prema prvom aspektu kao što je ranije definisano u ovom tekstu. Međutim, kompozicije koje sadrže virusne komponente dobijene drugačijim postupcima nego što je ovaj prema predmetnom pronalasku su ode izričito uključene. Virusne komponente u kompoziciji poželjno su virusne komponente kao što je ovde definisano u prethodnom tekstu. Poželjne virusne komponente u kompoziciji opisa su komponente, poželjno čestice virusa sa negativnom jednolančanom RNK, uključujući viruse koji pripadaju familijama Paramyxoviridae ili Orthomyxoviridae. Poželjan virus familije Paramyxoviridae je virus (kao što je gore navedeno) koji pripada subfamiliji Paramyxovirinae ili Pneumovirinae. Poželjni virus subfamilije Pneumovirinae (pneumovirusi) je respiratorni sincicijalni virus (RSV), poželjnije humani ili goveđi RSV. Humani RSV može da pripada podgrupi A ili B virusa. Poželjni virusi subfamilije Paramyxovirinae uključuju Rubulavirus (virus zauški) i Morbillivirus (virus malih boginja). Kao deo opisa, virusne komponente u kompoziciji su komponente, poželjno čestice, virusa koji pripada familiji Orthomyxoviridae. Poželjan virus familije Orthomyxoviridae je influenca virus uključujući influenca viruse iz roda Influenzavirus A, B ili C, od kojih je A najpoželjniji. Poželjni podtipovi Influenza A virusa uključuju H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H7N7, H1N2, H9N2, H7N2, H7N3 i H10N7, uključujući svinjski influenca A (HINI) virus (SOIV, ili H1N1v) koji je izazvao pandemiju 2009. godine. Kao deo opisa, kompozicija koji sadrži virusne komponente obuhvata baznu aminokiselinu ili njen derivat, kao što je gore definisano, u ukupnoj koncentraciji kao što je ovde navedeno u prethodnom tekstu. Kao deo opisa, navedena kompozicija obuhvata baznu aminokiselinu ili njen derivat, kao što je gore definisano, u ukupnoj koncentraciji koja je veća od ukupne koncentracije bazne aminokiseline ili njenog derivata prisutnog u medijumu, poželjno u medijumu za kulturu. U ovom kontekstu, "viša" označava najmanje 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ili 100% višu ili 5, 10, 20, 50 ili 100 puta višu. Poželjan medijum za kulturu je M199, koji je upotrebljen u eksperimentalnom delu. Takav medijum ima ukupnu koncentraciju bazne aminokiseline ili njenog derivata od 0.81 mM: 0.33 mM L-arginina, 0.1 mM histidina i 0.38 mM L-lizina. Identitet i moguće koncentracije bazne aminokiseline ili njenog derivata u medijumu za kulturu mogu da variraju. Kompozicija ili rastvor prema opisu obuhvata baznu aminokiselinu ili njen derivat u ukupnoj koncentraciji koja je viša od 0.81 mM. Navedena ukupna koncentracija može da bude viša od 0.85 mM, 0.90 mM, 0.95 mM, 1 mM, 1.1 mM, 1.2 mM, 1.3 mM, 1.4 mM, 1.5 mM, 1.6 mM, ili viša od 1.7 mM. Takva kompozicija ili rastvor može da sadrži virusne komponente, baznu aminokiselinu ili njen derivat kao što je ranije ovde definisano i bilo koji drugi mogući

2

molekul obično prisutan u takvoj kompoziciji ili rastvoru. Takav molekul uključuje pufer kao što je ranije ovde definisano i/ili bilo koji drugi molekul koji je obično prisutan u medijumu za kulturu. Kao deo opisa, navedena kompozicija ili rastvor obuhvata baznu aminokiselinu ili njen derivat, virusne komponente kako su ovde definisane, i ne sadrži pufer kao što je ranije ovde definisano. Takav pufer je obično prisutan u medijumu za kulturu. Poželjna puferska komponenta koja nije sadržana u navedenoj kompoziciji ili rastvoru je fenol red. Kao deo opisa, obezbeđena je kompozicija ili rastvor koji se sastoji od, ili se suštinski sastoji od virusnih komponenti i bazne aminokiseline ili njenog derivata u ukupnoj koncentraciji od najmanje 0.01 mM. Poželjno, navedena kompozicija ili rastvor se sastoji od, ili se suštinski sastoji od virusnih komponenti i najmanje 0.02 mM, 0.025 mM, 0.03 mM, 0.04 mM, 0.05 mM, 0.06 mM, 0.07 mM, 0.08 mM, 0.09 mM, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.3 mM, 0.4 mM, 0.5 mM, 0.6 mM, 0.7 mM, 0.8 mM bazne aminokiseline ili njenog derivata. Identitet navedene bazne aminokiseline ili njenog derivata i virusne komponente prisutne u ovoj kompoziciji ili rastvoru je ovde već definisan. Takva kompozicija ili rastvor poželjno ne sadrži bilo koji drugi molekul osim onih koji su ovde konkretno definisani: virusnih komponenti, bazne aminokiseline ili njenog derivata i, opciono, vode. Kao deo opisa, u bilo kojoj od kompozicija ili rastvora koji su ovde identifikovani, obrazovanje virusnih agregata je smanjeno u odnosu na obrazovanje virusnih agregata u odgovarajućoj kompoziciji koja ne sadrži navedenu baznu aminokiselinu ili njen derivat. U ovom kontekstu, smanjeno znači smanjenje ili snižavanje od najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% količine virusnih agregata obrazovanih u poređenju sa količinom virusnih agregata u odgovarajućoj kompoziciji koja ne sadrži navedenu baznu aminokiselinu ili njen derivat. Ovo smanjenje može da bude zapaženo tokom perioda od najmanje 1 minuta, 1 časa, 6 časova, 24 časa, 48 časova, 72 časa, jednu nedelju ili duže.

[0087] Poželjno, bilo koja kompozicija ili rastvor, koji je ovde dat, je za upotrebu kao profilaktička ili terapijska supstanca/lek, poželjnije za indukciju imunskog odgovora kod pojedinca protiv navedene virusne komponente. Ova kompozicija može da bude dodatno formulisana i može da bude nazvana formulacija ili farmaceutska kompozicija, i za upotrebu je kao profilaktička ili terapijska supstanca/lek, poželjnije za indukciju imunskog odgovora kod pojedinca protiv navedene virusne komponente.

[0088] Za upotrebu kao profilaktička ili terapijska supstanca/lek, formulacija može da se koristi kao tečna formulacija (suspenzija), kao suva formulacija, ili može da bude rekonstituisana rastvaranjem suve formulacije, npr. upotrebom vode ili druge pogodne

2

tečnosti. Formulacija se poželjno rekonstituiše do svoje polazne zapremine, tj. zapremine pre sušenja. Poželjno, formulacija je formulacija za indukciju imunskog odgovora (kod pojedinca) protiv bolesti ili infektivne bolesti ili kancera. Podrazumeva se da pojedinac ili subjekat kod koga se formulacije ovog opisa primenjuju može da bude čovek, ali može da bude i životinja, kao životinja sa farme ili kućni ljubimac, uključujući npr. sisare (biljojede, mesojede i svaštojede), ptice, gmizavce, (kao životinje sa farme, živina, stoka, goveda, svinje, mačke). Poželjnije, formulacija je formulacija za vakcinaciju protiv (infektivnih) bolesti. Formulacija je, prema tome, poželjno, formulacija za sprečavanje ili lečenje infektivne bolesti. Opis se takođe odnosi na upotrebu formulacije koja može da se dobije ili je dobijena postupkom prema pronalasku, kao što je opisano gore u ovom tekstu, za proizvodnju leka za indukciju imunskog odgovora, za vakcinaciju, i/ili za sprečavanje ili lečenje infektivne bolesti. Opis se takođe odnosi na postupak za indukciju imunskog odgovora protiv infektivnog agensa primenom efikasne količine formulacije kod subjekta kome je to potrebno. Imunski odgovor se poželjno indukuje protiv antigena koji je prisutan u virusnim komponentama. Antigen je poželjno antigen patogena koji izaziva infektivnu bolest ili antigen koji indukuje imunski odgovor protiv patogena. Patogen je poželjno virus kao što je gore definisano. Formulacija prema opisu može da se primeni, sa ili bez rekonstitucije, intranazalnim, parenteralnim, intramuskularnim, subkutanim i/ili transdermalnim putevima.

[0089] U ovom dokumentu i njegovim patentnim zahtevima, glagol "sadržati" i njegovi oblici se koriste u njegovom neograničavajućem smislu da označe da su stavke koje slede posle reči uključene, ali da stavke koje nisu konkretno pomenute nisu isključene. Pored toga, pozivanje na neki element u jednini ne isključuje mogućnost da je više od jednog elementa prisutno, osim ako kontekst jasno ne nalaže da može biti samo jedan jedini element. Jednina prema tome obično označava "najmanje jedan".

[0090] Zbog jednostavnosti, pojam IPV u ovom dokumentu, koristi se tako da obuhvata i finalni proizvod kao i njegove (procesne) intermedijere, koji još nisu inaktivisani.

[0091] Primeri koji slede su dati samo u ilustrativne svrhe, i nisu namenjeni da ograniče obim predmetnog pronalaska na bilo koji način.

Opis slika

[0092]

2

Slika 1: Šematski prikaz proizvodnog postupka za inaktivisanu polio vakcinu. Tokom ushodne obrade, ćelije se umnožavaju upotrebom dva koraka predkultivacije pre kultivacije ćelija i kultivacije virusa. Nishodna obrada se sastoji od klarifikacije, koncentrovanja, ekskluzione hromatografije i jonoizmenjivačke hromatografije praćene inaktivacijom. Za dobijanje trovalentne polio vakcine, ovaj postupak se sprovodi za svaki tip polio virusa odvojeno pre mešanja za formulaciju krajnjeg proizvoda (Bakker, 2011).

Slika 2: Dejstvo dodavanja različitih baznih aminokiselina i derivata u rastvore koji sadrže agregirane viruse na raspadanje postojećih agregata. Pretpostavljeno je da kada nema dodavanja (0 mM), to rezultuje u najvećoj mogućoj agregaciji, što predstavlja vrednost od 100% agregiranih virusa. Prikazano je smanjenje za različita dodavanja baznih aminokiselina i njihovih derivata u različitim koncentracijama. Detekcija agregacije je izvedena upotrebom merenja apsorbance na 590 nm. Druge talasne dužine mogu takođe da se koriste, što vodi dobijanju različitih spektara. Eksperimenti izvedeni na slici 2(A) izvedeni su upotrebom polio virusa bez omotača, na slici 2(B) upotrebom influenca virusa sa omotačem. Slike 2C, 2D i 2E redom prikazuju dejstvo tri različite bazne aminokiseline (L-arginin, L-lizin i L-histidin) na agregaciju tri različita soja influenca virusa (Influenza A/Uruguay H3N2 (NIBSC) Influenza B/Florida/4/2006 (NIBSC) i Influenza A/PR/8/34 (NIBSC)). Na slikama 2F, 2G i 2H redom je prikazano dejstvo tri različite bazne aminokiseline (L-arginin, L-lizin i L-histidin) na agregaciju tri različita (Sejbinova) soja poliovirusa subtipova 1, 2 i 3.

Slika 3: Potentnost Sabin-IPV vakcine na pacovu (Albrecht P et al. 1984) upotrebom IPV dobijene regularnim proizvodnim procesom kao što je, npr. opisano kod Thomassen, 2013b, nasuprot optimizovanom postupku prema pronalasku. Salk-IPV se koristi kao referentni standard (dodeljena joj je vrednost 1). Sabin-IPV pripremljena upotrebom optimizovanog postupka, tj. upotrebom metoda za sprečavanje agregacije, koji je dao vakcinu sa uporedivom ili boljom imunogenošću kod pacova u poređenju sa Sabin-IPV pripremljenom kao što je opisano kod Thomassen 2013b. Salk-IPV se koristi kao interni referentni standard (dodeljena joj je vrednost 1).

Slika 4: Uklanjanje L-arginina dijafiltracijom iz poliovirusa (Sabin tip 2) u fazi proizvoda dobijenog pomoću SEC. Uklanjanje L-arginina dijafiltracijom iz poliovirusa (Sabin tip 2) u fazi proizvoda dobijenog pomoću SEC pokreće agregaciju virusa.

2

Određena količina L-arginina (kvadrati) se uklanja dijafiltracijom, posle deset zapremina sav L-arginin je bio uklonjen. Agregirani virus (rombovi) je izmeren upotrebom merenja apsorbance. Posle potpunog uklanjanja L-Arginina, agregati poliovirusa su se obrazovali na vremenski zavisni način. Prema tome, uklanjanje L-arginina, praćeno merenjima i promenom provodljivosti, rezultovalo je u povećanju rasipanja svetlosti (porast UV) izazvanog obrazovanjem virusnih agregata.

Slika 5: Dejstva različitih baznih aminokiselina i njihovih derivata na redukciju poliovirusnih agregata. Različita jedinjenja jasno pokazuju dejstva, zavisna od njihovog tipa i koncentracije. Na primer, kod agmatina, L-lizina i smeše 3 bazne aminokiseline, smanjenje je najizrazitije u donjem koncentracijskom opsegu sve do 50 mM. U svim slučajevima, smanjenje agregata iz polaznog materijala, mereno pomoću UV, je jasno vidljivo i zavisi od njihove koncentracije.

Primeri

Primer 1: Proizvodnja virusa

[0093] Ćelijska kultura u laboratorijskom obimu proizvodnje. Upotreba različitih sistema. Proizvodnja inaktivisanih atenuisanih sojeva poliovirusa u laboratorijskom obimu proizvodnje.

[0094] Postupak počinje kultivacijom Vero ćelija. VERO ćelijska linija potiče od ćelija bubrega afričkog zelenog majmuna (MKC) (ATCC CCL-81). Kulture su započete od ampule dobro okarakterisane zamrznute ćelijske banke. Da bi se dobila odgovarajuća količina ćelija za inokulaciju bioreaktora, niz za umnožavanje izvora semena sa jednoslojnim kulturama u TC-bocama započet je sa M199 medijumom koji sadrži 5% fetalnog goveđeg seruma. M199 medijum je takav kao što je opisano kod Morgan J.F. et al (1955) ili Morgan J.F. et al (1950). On sadrži količine baznih aminokiselina reda veličine mM: L-arginina 0.33 mM, L-histidina 0.1 mM, L-lizina 0.38 mM (http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/support/Proizvod-Technical-Resources/media formulacija.86.html).

[0095] Niz za umnožavanje izvora semena je nastavljen subkultivacijama u četiri T-boce, tri Hyper boce i tri ćelijske fabrike. Ćelijske fabrike imaju ukupnu površinu od 3*6320 cm<2>.

Ćelije se odvajaju od podloge tripsinizacijom. Celokupna kultivacija izvora semena traje oko 2 nedelje.

[0096] Kultivacija VERO ćelija (ranije su korišćene primarne MKC) u bioreaktorima se izvodi na mikronosačima (Cytodex 1 GE Healthcare, proizvod broj 17-0448-**). Ovu tehniku je razvio u RIVM u kasnim 1960-im godinama van Wezel (1978). Mikronosači obezbeđuju veliku površinu za pričvršćivanje Vero ćelija. Kultivacija na mikronosačima započinje u diskontinuiranom režimu u bioreaktoru od 5 L (litar) (radne zapremine 3 L). Bioreaktor od 5 L radi sa 3 L E-MEM medijuma za kultivaciju obogaćenog goveđim serumom (BS) (minimalni esencijalni medijum Igl, Sigma Aldrich, M4642). Bioreaktor je pripremljen sa 4 g/L Cytodex 1 mikronosača i E-MEM kultivacionim medijumom. Kada su uslovi za kultivaciju postali stabilni, bioreaktor je inokulisan ćelijama iz niza za umnožavanje izvora semena u inicijalnoj koncentraciji ćelija od 0.8*10<6>ćelija/ml. Kultivacija započinje u diskontinuiranom režimu tokom 1 dana, i nastavlja se u recirkulacionom režimu tokom 3 dana sa 12 L E-MEM medijuma u recirkulacionoj boci. U recirkulacionom režimu ćelije počinju da rastu u više slojeva. Na taj način u bioreaktoru od 5 L može da se dostigne koncentracija ćelija od 4.0 - 4.5*106 ćelije/ml.

[0097] Ćelije se odvajaju od mikronosača tripsinizacijom. Oslobođene ćelije se koriste za započinjanje ćelijske kulture u 20 L. Bioreaktor od 20 L se priprema sa 3 g/L mikronosača i E-MEM medijumom za kultivaciju obogaćenim sa BS. Finalna radna zapremina posle inokulacije je 16 L. Nivo inokulacije je 0.2*106 ćelija/ml. Bioreaktor od 20 L radi u diskontinuiranom režimu. Za kultivaciju je potrebno 3-4 dana u zavisnosti od lag faze posle prenošenja ćelija iz bioreaktora od 5 L u bioreaktor od 20 L. Metaboliti kao glukoza i glutamin se prate da bi se proverilo da li je neophodno napajanje glukozom ili glutaminom da bi se održali optimalni uslovi za rast.

[0098] Umnožavanje virusa se izvodi u bioreaktoru od 20 L. Promena medijuma iz E-MEM u M199 se sprovodi da bi se obezbedili pogodni uslovi za umnožavanje virusa. Temperatura se snižava sa 37°C na 32.5°C. Procenat rastvorenog kiseonika (DO%) se snižava sa 50% na 25%. Multiplicitet infekcije (MOI) iznosi 0.01. Propagacija virusa i liza traju 3-5 dana u zavisnosti od podtipa virusa. Propagacija virusa i liza se prate mikroskopskom proverom citopatogenog efekta (CPE). Kultivacija virusa je završena kada je CPE ≥90% i/ili kada je potrošnja kiseonika prestala i tada virus može da se sakupi za prečišćavanje (nishodna obrada, DSP).

1

[0099] Bioreaktor sadrži čelični mrežasti filter promera 75 µm da bi se mikronosači zadržali u reaktoru. Sakupljeni virus, koji sadrži ćelijski debris, klarifikuje se pomoću dva filtera za jednokratnu upotrebu u nizu. Kaseta za duboku filtraciju ima ugrađenu dijatomejsku zemlju (HC Pod Filter grade C0HC Millipore # MC0HC054H1). Završni filter je dvoslojni filter 0.5/0.2 µm (Millipore Express SHC opticap XL #KHGES015FF3).

[0100] Korak koncentrovanja u postupku proizvodnje poliovirusa sprovodi se filtracijom sa tangencijalnim protokom (TFF) (poznatom i kao filtracija sa unakrsnim protokom (CFF) ili ultrafiltracija (UF)). Ukupni faktor koncentrovanja je 700-800. Da bi se izbegli visoki gubici proizvoda u mrtvoj zapremini sistema za TFF, dva sistema se koriste uzastopno. Oba sistema koriste filter kasete sa ravnim sitom od 100 kD (0.2 m2 odnosno 50 cm2). Virusne čestice se zadržavaju, a mali molekuli dospevaju u filtrat i uklanjaju se.

[0101] Ekskluziona hromatografija (SEC) je tehnika prečišćavanja koja razdvaja čestice i molekule po veličini. Veliki molekuli se eluiraju brže nego mali molekuli. Kolona je spakovana sa CL6B proizvođača GE Healthcare. Prvi pik može da sadrži agregate i molekule velike molekulske težine kao proteini ćelije-domaćina (HCP). Drugi pik je pik proizvoda sa većinom poliovirusa. Tokom SEC, čestice poliovirusa se eluiraju fosfatnim puferom niske jonske snage (20 mM) pH 7.0±0.2.

[0102] Jonoizmenjivačka hromatografija (IEX) se poželjno izvodi sa matricom na bazi DEAE-liganda, Sephadex A50 proizvođača GE Healthcare. Ova konkretna smola se isporučuje se kao suvi prah od dobavljača i korisnik treba da je pripremi. To uključuje bubrenje i ispiranje smole, pakovanje i ekvilibraciju kolone. Cilj ovog pojedinačnog postupka je vezivanje negativno naelektrisane komponente za matricu. RNK/DNK/proteini ćelijedomaćina su glavne komponente koje se vezuju za matricu kolone. Poliovirus ima ograničenu interakciju sa matricom.

[0103] Prečišćeni virus dobijen jonoizmenjivačkom hromatografijom je stabilizovan i razblažen do specifične jačine (gde je primenljivo). Stabilizacija i razblaživanje se sprovodi medijumom M199. Potrebna koncentracija zavisi od tipa virusa.

[0104] Najzad se dodaje glicin u finalnoj koncentraciji od 5 g/L u pripremi inaktivacije.

[0105] Stabilizovan, razblažen i pripremljen prečišćeni virus se inaktiviše upotrebom formaldehida u finalnoj koncentraciji od 2-3 mM (ili 1:4000). Za inaktivaciju je potrebno 13

2

dana i izvodi se na temperaturi od 37°C. Posle 6-8 dana inaktivacije sprovodi se međufiltracija da bi se uklonili eventualni agregati.

[0106] Posle 13 dana inaktivacije sterilni monovalentni pul je spreman za skladištenje na 2-8°C. Na ovoj tački, dobijeni inaktivisani poliovirus se naziva monovalentni balk.

Mešanje/formulacija

[0107] Balk se priprema mešanjem potrebnih serotipova u unapred određenim koncentracijama. Ovo može da bude formulacija pojedinačne (tip 1, tip 2 ili tip 3), bi/divalentne (tip 1 i tip 2 ili tip 1 i tip 3 ili tip 2 i tip 3) ili trovalentne smeše (tip 1 i tip 2 i tip 3). Osim toga, formulacija može da se kombinuje sa drugim vakcinama kao što su vakcina protiv difterije, pertusisa, tetanusa, hepatitisa, hemofilusa, meningitisa, pneumokokna vakcina i/ili druge.

Optimizovani postupak

[0108] Optimizovani postupak prati istu proceduru kao što je gore navedeno sa sledećim odstupanjima:

• Korak klarifikacije se ispira medijumom, nakon završetka filtracije proizvoda

• U koraku koncentrovanja drugi filter nije kasetni filter površine 50cm<2>od 100kD, već se kao drugi filter od 100kD koristi filter sa šupljim vlaknima površine 115 cm<2>(Spectrum labs # D02-E100-05-N).

• Pufer tokom SEC je promenjen u fosfatni pufer obogaćen baznom aminokiselinom kao L-arginin na pH 7.0±0.2.

• Tokom jonoizmenjivačke hromatografije, pufer korišćen za pripremu matrice i eluiranje proizvoda promenjen je u fosfatni pufer obogaćen baznom aminokiselinom kao L-arginin na pH 7.0±0.2.

Poboljšani postupak daje viši prinos D-antigena (DU/ml) (sa uporedivom ili boljom imunogenošću što se može ispitati ogledom neutralizacije poliovirusa u ćelijskoj kulturi na serumu imunizovanih pacova (slika 3).

U tabeli 1 je dat oporavak proizvoda (procenti zasnovani na prinosu D-antigena) za aktuelni i optimizovani postupak (modifikacija dodavanjem bazne aminokiseline), kao i ukupni prinos postupka za tipove 1 i 2 poliovirusa. Antigenost polio virusa ili IPV proizvoda ispitana je upotrebom ELISA testa za polio D-antigen (ten Have et al.2012).

Tabela 1: Poređenje prinosa poliovirusa zapaženih u aktuelnom i poboljšanom postupku prečišćavanja:

Primer 2: Smanjenje nivoa agregata

[0109] Smanjenje agregacije virusa može da se postigne dodavanjem (koncentrovanog) rastvora bazne aminokiseline ili derivata. Bilo koji stručnjak u odgovarajućoj oblasti može da precizno podesi ovaj postupak prema svojim konkretnim potrebama. Videti slike 2A i 2B.

[0110] U sledećem eksperimentu, štok rastvori bazne aminokiseline su pripremljeni i dodati serijama koje sadrže različite viruse u agregiranom stanju. Rastvori su dodati u odnosu od 1:1. Agregacija je merena kao apsorbanca na 590 nm (Biowave DNA, WPA). Agregirani virus izmeren pre dodavanja bazne aminokiseline predstavljen je kao vrednost 100%. Dejstva dodavanja različitih koncentracija aminokiselina na procenat agregiranih virusa prikazana su na slikama 2C, 2D i 2E za dejstva tri različite bazne aminokiseline, L-arginina, L-lizina i L-histidina, respektivno) na tri različita soja influenca virusa (Influenza A/Uruguay H3N2 (NIBSC), Influenza B/Florida/4/2006 (NIBSC) i Influenza A/PR/8/34 (NIBSC)). Na slikama 2F, 2G i 2H, prikazani su redom rezultati dejstva tri različite bazne aminokiseline (L-arginina, L-lizina i L-histidina) na tri različita (Sejbinova) soja poliovirusa subtipova 1, 2 i 3.

Primer 3: Vanprocesni dodaci (rastvaranje postojećih agregata – referentni primer)

[0111] Virusni agregati su proizvedeni prema neznatno modifikovanom protokolu za proizvodnju Salk-IPV sa 20 mM fosfatnog pufera (serije Sejbinovih sojeva tipova 1, 2 i 3; frakcije međuproizvoda posle SEC i IEX). Dobijene virusne frakcije su zamrznute na -80°C do upotrebe. Zamrzavanje je olakšalo i/ili podstaklo dejstvo agregacije.

[0112] Virusi influence (sa agregatima) su proizvedeni upotrebom laboratorijskog postupka zasnovanog na jajima koji se sastoji od inokulacije embrionisanih jaja (soj: A/Uruguay/H3N2 (NIBSC)), inkubacije, hlađenja i zatim sakupljanja virusa centrifugiranjem u disk-centrifugi

4

praćenim dubokom filtracijom (GE Healthcare). Virus je prečišćen centrifugiranjem u gradijentu saharoze, praćenim inaktivacijom β-propiolaktonom sa filtracijom. Na kraju je izvedena dijafiltracija/koncentrovanje.

[0113] pH vrednost je merena upotrebom kalibrisanog pH-metra (Orion scientific), sa gelelektrodom (Mettler Toledo) i korigovana upotrebom sumporne kiseline ili natrijum hidroksida.

[0114] Optička gustina, kao mera agregacije, određena je upotrebom Biowave DNK spektrofotometra (WPA) na talasnim dužinama 450 i 590 nm u plastičnim kivetama za jednokratnu upotrebu (Greiner) ili u kvarcnim kivetama prečnika 10 mm.

[0115] ELISA-test; antigenost polio virusa ili IPV proizvoda ispitivana je upotrebom ELISA testa (ten Have et al. 2012).

[0116] Virusni proizvodi su upotrebljeni u vanprocesnom ispitivanju niza koncentracija različitih aditiva prema tabeli 2. Aditiv je odmeren u epruveti i dodato mu je 1 ili 2 ml proizvoda, rastvor i aditiv su pomešani. Kada su aditivi rastvoreni, izmerena je promena pH i korigovana (po potrebi) na početni pH proizvoda. Optička gustina je izmerena posle 1 časa.

Tabela 2: Aditivi čija je sposobnost da spreče nastajanje ili razbiju agregaciju virusa ispitivana

[0117] Vanprocesna dodavanja različitih aditiva imaju različite učinke na uklanjanje agregata pri različitim molaritetima i sa različitim proizvodima (slike 2A i 2B). Polazni proizvod virusnih agregata, izmeren bez dodataka, predstavljao je 100%, a čist puferski rastvor korišćen kao negativna kontrola npr., bez pojave agregacije, predstavljao je 0%.

[0118] Dodavanje M199 virusu moglo je da ukloni obrazovane agregate iz svih virusnih proizvoda, bilo da su skladišteni na -80°C ili sveže pripremljeni rastvori. Za poliovirus, ovo je rezultovalo u povećanju dostupnog epitopa D-antigena od 22% /-12 izmereno ELISA-testom (ten Have et al, 2012).

Primer 4: Brzo prečišćavanje influenca virusa (dokaz koncepta)

[0119] Influenca virus je prečišćen kao dokaz koncepta upotrebom arginina prema sledećem protokolu. Virusni materijal je pripremljen sakupljanjem iz 10 000 SPF (bez specifičnih patogena) embrionisanih kokošijih jaja, koja su inokulisana 11. dana influenca A/Uruguay H3N2 virusom (EID50/ml od 9.17) upotrebom polu-automatske mašine za inokulaciju smeštene u modulu pod vertikalnim laminarnim protokom sa HVAC filterima. Pre inokulacije, jaja i igle su dezinfikovane upotrebom 70% etanola. Jaja su inkubirana 72 časa tokom 3 dana na 35°C i zatim ohlađena preko noći do oko 4°C, sa temperaturom koja je bila efektivno ispod 8°C tokom približno 12 časova. Sakupljanje alantoisne tečnosti iz jaja kojima je uklonjena kalota urađeno je pomoću polu-automatske mašine za sakupljanje u modulu pod vertikalnim laminarnim protokom. Klarifikacija sirovog sakupljenog alantoisnog rastvora urađena je pomoću disk-centrifuge za kontinuirano razdvajanje Westfalia pri protoku od 65 L/h, sa povratnim pritiskom od 1 bar, 10 000 rpm, praćena filtracijom upotrebom dve paralelne kapsule za duboku filtraciju GE ULTA prime (GE Healthcare) veličine 25.4 cm sa veličinom pora od 2.0 µm.

[0120] Iz dobijene serije izdvojeno je približno 3 L za ispitivanje na manjem obimu proizvoda.

[0121] Ta 3 L su ponovo podeljena na 2 dela i svaki deo je koncentrovan približno 15 puta upotrebom filtera sa šupljim vlaknom (GE Healthcare #UFP-750-E-3X2MA) i podvrgnut dijafiltraciji, sa 10 zapremina, upotrebom ili PBS (GIBCO) ili PBS (GIBCO) obogaćenog sa 0.35 M L-arginina (Sigma-Aldrich).

[0122] Od tako dobijenog materijala koji je koncentrovan i obrađen dijafiltracijom, 10 ml je ispitano na koloni za ekskluzionu hromatografiju sa visinom stuba perli od 90 cm (kolona vl11/100 Millipore) koja sadrži matricu sa brzim protokom Sepharose 6 (GE Healthcare) upotrebom ili PBS ili PBS obogaćenog sa 0.35 M L-arginina pomoću hromatografskog sistema Akta explorer (GE Healthcare).

[0123] Svi uzorci su inaktivisani upotrebom formaldehida pre analize.

Analitički testovi

[0124] Test SRID (jednosmerna radijalna imunodifuzija) se zasniva na reakciji između antitela prisutnih u ravnom agaroznom gelu i antigena koji difunduje od mesta nanošenja na gelu. Kada se koncentracije antitela i antigena izjednače, dolazi do precipitacije u obliku prstena. Precipitat je obojen upotrebom komazi brilijantno plave boje i veličina prstena je korišćena kao mera koncentracije.

[0125] Koncentracija ovalbumina merena je upotrebom direktnog sendvič ELISA (enzimskog imunosorbentnog) eseja. Test je izveden prema uputstvima dobavljača ELISA kita (Serazym Ovalbumin ELISA: Cat. No. E041C, Seramun Diagnostica GmbH Wolzig). Kao uzorci su korišćeni nezavisni duplikati dva različita razblaženja. Uzorci koji sadrže antigen su pipetirani u bunarčiće ploče za ELISA test obložene poliklonskim anti-ovalbumin antitelima. Dodat je anti-ovalbumin vezan za peroksidazu rena, nakon čega su nevezane supstance oprane. Dodavanjem supstrata pokrenuto je razvijanje plave boje. Ovaj proces je zaustavljen dodavanjem sumporne kiseline; boja se promenila iz plave u žutu. Apsorpcija na 450 nm je predstavljala meru za količinu. Filter na 630 nm je korišćen kao referenca (čitač Biotek sa KC-jr i kompjuterskim programom KC4).

Rezultati

[0126] Materijal sakupljen izvođenjem hromatografije ispitan je SRID testom na sadržaj antigena hemaglutinina. Ispitivanje je pokazalo 8 procenata veći sadržaj antigena hemaglutinina u materijalu koji je obogaćen sa 0.35 m L-arginina.

[0127] Osim toga, materijal koji je koncentrovan i obrađen dijafiltracijom (UF/DF) pomoću filtera sa šupljim vlaknom koji je sadržao dodati L-arginin mono hidrohlorid sadržao je znatno manje (do 76%) ovalbumina prisutnog u uzorku, ukazujući na to da je dijafiltracija bila daleko efikasnija u uklanjanju nečistoća u prisustvu L-arginin mono hidrohlorida.

Primer 5: Dejstvo dodataka na hromatografiju poliovirusa

[0128] Raskidanje agregata nakon što su se formirali je jedan način rešavanja problema. Međutim, tokom proizvodnje važnije je sprečiti agregaciju od samog početka. Tokom obrade (polio) virusa, obrazovani agregati se uklanjaju tokom SEC i vezuju kao nečistoće za kolonu IEX (DEAE) što vodi visokim proizvodnim gubicima (do 70%).

[0129] Hromatografska razdvajanja su izvedena u različitim rastvorima prema tabeli 3. Polazni materijal je koncentrovani poliovirus koji potiče ili iz zamrzivača na -80°C, ili je sveže pripremljen. Tokom hromatografskih razdvajanja, pored kontrole, ispitivano je samo dodavanje L-arginin HCL u 20 mM fosfatni pufer.

[0130] Određivan je prinos (u smislu oporavka D-antigena), rezultati su dati u tabelama 4 i 5 (nd = nije urađeno).

Tabela 3: Dodaci za hromatografiju

Tabela 4: Rezultat oporavka proizvoda (procenat (%) na osnovu D-antigena po mililitru) posle SEC (ekskluzione hromatografije na koloni) sa različitim elucionim puferima

Tabela 5: Rezultat oporavka proizvoda (procenat (%) na osnovu D-antigena po mililitru) posle jonoizmenjivačke hromatografije na koloni sa različitim elucionim puferima

[0131] Dodavanje L-arginina elucionom puferu može da ima pozitivno dejstvo, koje se uglavnom zapaža tokom SEC za tipove 1 i 2, dok je za IEX posebno jasno za tip 2. Dodavanje alternative 1 (M199) se takođe čini korisnim, međutim tokom prečišćavanja pokazalo se da ovo jedinjenje smanjuje kapacitet IEC, ograničavajući značajno njenu upotrebu u poređenju sa alternativom 2.

[0132] U sledećem eksperimentu, proizvedena je proizvodna serija sa visokom gustinom ćelija (polu-diskontinuirana metodologija, Thomassen et al., 2014), inficirana Sejbinovim sojevima podtipa 2 i prečišćena prema Thomassen et al, 2013a, i optimizovanim postupkom iz primera 1, dok nije napravljena serija koja je koncentrovana 400 puta (sakupljanjem, filtracijom i ultrafiltracijom). Ovaj materijal je podeljen na alikvote i skladišten na -80°C. Ovaj materijal je odmrznut i prečišćen upotrebom ekskluzione hromatografije sa smolom Cl6B na sistemu Akta explorer (GE Healthcare) uz dodavanje različitih baznih aminokiselina u različitim koncentracijama u kontrolni 20 mM fosfatni pufer. Varijacije i rezultati su prikazani u tabeli 6 ispod. Koncentracija proizvoda (D-antigena) je prosečna vrednost triplikata [ten Have et al, 2012], porast koncentracije proizvoda je izračunat i dat kao procentualna razlika.

Tabela 6: Ekskluziona hromatografija Sejbinovog soja podtipa 2 uz dodavanje različitih baznih aminokiselina u različitim koncentracijama u kontrolni 20 mM fosfatni pufer

[0133] Iz tabele 6 očigledno je da različiti dodaci i različite koncentracije ispoljavaju dejstvo na oporavak proizvoda posle ekskluzione hromatografije. U svim slučajevima prinos proizvoda porastao je od umerenog (2%) do visokog (57%), jasno pokazujući poboljšanje do koga dolazi dodatkom baznih aminokiselina.

4

Primer 6: Uklanjanje L-arginina iz intermedijerno prečišćenog proizvoda (SEC) poliovirusa upotrebom dijafiltracije

[0134] Dodavanje baznih aminokiselina rastvoru koji sadrži virusne čestice rastvara i/ili sprečava obrazovanje agregata. Ponovnim uklanjanjem bazne aminokiseline, očekuje se da ponovo dođe do agregacije. Ovo je ilustrovano proizvodnjom serije poliovirusa (Sejbinovog soja tipa 2) pomoću ekskluzione hromatografije (C16B u xk26/80 koloni, oba GE Healthcare) upotrebom elucionog pufera koji sadrži L-arginin. Dobijeni rastvor virusnog proizvoda je zatim opran/dijafiltriran, kao što je poznato u stanju tehnike, upotrebom filtera sa šupljim vlaknom od 100 kD, sa sličnim puferskim rastvorom bez dodataka, pri istoj brzini uklanjanja filtrata, uz održavanje stalne zapremine retentata na taj način.

Apsorbanca, kao mera za količinu agregata, merena je vanprocesno upotrebom spektrofotometra (Biowave DNA, WPA), koncentracija L-arginina je merena upotrebom NMR. Pritisak i provodljivost su praćeni procesno upotrebom senzora za jednokratnu upotrebu Pendotech.

Jedna dijafiltraciona zapremina odgovara ukupnoj zapremini proizvoda virusa (75 ml) prisutnog u sistemu. Sistem je ostavljen da radi tokom 10 dijafiltracionih zapremina sa konstantnim fluksom i TMP (ukupno vreme 2.5 časa) i uzorci su uzimani za analizu (i zapremina je korigovana) posle svake izmene dijafiltracione zapremine.

[0135] Rezultati su prikazani na slici 4 i pokazuju da koncentracija L-arginina brzo opada ispod nivoa detekcije (1 mM) korišćene NMR metode posle 3 - 4 dijafiltracione zapremine. U skladu sa ovim smanjenjem koncentracije L-arginina, apsorbanca je porasla, ukazujući na agregaciju virusnih čestica. L-arginin može da se prati i indirektno preko provodljivosti. Provodljivost brzo opada paralelno sa uklanjanjem L-arginina do dostizanja finalne provodljivosti od 2.9 mS/cm što odgovara kontrolnom puferu, ukazujući na to da je aditiv uklonjen. Apsorbanca se više nego udvostručila nakon 10 dijafiltracionih zapremina u poređenju sa polaznom vrednošću kada je dostignuta ova vrednost provodljivosti. To jasno pokazuje da je dodavanje bazne aminokiseline bilo uzrok smanjenja agregacije (vizuelizovano pomoću UV) i da je proces povratan, tj., aditiv može da se ukloni, iako će se agregacija vratiti.

Primer 7: Prečišćavanje poliovirusa divljeg tipa u prisustvu ili odsustvu baznih aminokiselina

[0136] Divlji polio virus tipa 2 je proizveden i prečišćen do koraka hromatografije postupkom koji je opisan kod Thomassen et al (2013 a). Materijal je prečišćen upotrebom dve različite SEC kolone, u 40 mM fosfatnom (pH7.0 /-0.2) puferu. Jedan pufer je sadržao aditiv (150 mM L-arginina), a drugi pufer je bio bez aditiva. Oba dobijena proizvoda su zatim prečišćena pomoću IEX (DEAE Sepharose Fast Flow, GE Healthcare), ponovo upotrebom dva gore pomenuta pufera. Tabela 7 prikazuje rezultate kod IEX. Jasno je da je prisustvo aditiva rezultovalo u većem prinosu proizvoda gotovo udvostručavajući prinos proizvoda mereno ELISA testom (Ten Have R et al, 2012) i površinom pika. U oba slučaja, prečišćavanje je rezultovalo virusnim proizvodima dobre čistoće (zasnovano na UV odnosima kao što su odredili Koch and Koch 1985, podaci nisu prikazani).

Tabela 7: SEC i IEX prečišćavanje poliovirusa divljeg tipa u prisustvu ili odsustvu 150 mM L-arginina. Površina pika odgovara količinama poliovirusa. Izmereni D-antigen odgovara imunogenosti virusa.

[0137] U sledećem eksperimentu divlji polio virus tipa 3 ponovo je proizveden i prečišćen do koraka hromatografije postupkom koji su opisali Thomassen et al (2013a). Materijal je prečišćen upotrebom jedne SEC kolone u regularnom 40 mM fosfatnom puferu (pH 7.0 /-0.2). Dobijeni proizvod je podeljen na 2 dela jednakih količina. Jednom delu je dodat visoko koncentrovani pufer koji sadrži L-arginin da bi se dobila finalna koncentracija od 149 mM, dok je drugom delu dodata ista količina regularnog pufera da bi se kompenzovao efekat razblaživanja.

Oba proizvoda su zatim prečišćena na IEX (DEAE Sepharose Fast Flow, GE Healthcare), upotrebom 40 mM fosfatnog pufera, sa ili bez aditiva (150 mM L-arginina), u zavisnosti od dela koji treba da se prečisti. U tabeli 8 prikazani su rezultati za IEX. Ponovo je jasno da je aditiv rezultovao u prinosu proizvoda (na osnovu površine pika). U oba slučaja, prečišćavanje je rezultovalo virusnim proizvodima dobre čistoće (zasnovano na UV odnosima kao što su odredili Koch and Koch 1985, podaci nisu prikazani).

Tabela 8: IEX prečišćavanje divljeg poliovirusa tipa 3 u prisustvu ili odsustvu 150 mM L-arginina

[0138] Iz primera 7 je jasno da dodavanje može da se izvede na različite načine da bi bilo efikasno, bez obzira da li se dodaje direktno i ko-eluiranjem, ili posle toga kao visoko koncentrovano štok-jedinjenje. Proizvod koji sadrži aditiv, u svim slučajevima, ispoljio je viši prinos. Svi različiti oblici dodavanja, u vidu čvrste supstance, kroz dijafiltraciju, ili u vidu visoko koncentrovanog štoka, imaće kao rezultat veće prinose.

Primer 8: Prečišćavanje himernog poliovirusa u prisustvu ili odsustvu baznih aminokiselina

[0139] Dobijen je eksperimentalni poliovirus, koji predstavlja kombinaciju/himeru/hibrid divljeg tipa virusa (osnova IPV koju je razvio Salk) i atenuisanog virusa (Sejbinovi sojevi). Ovaj virus je zatim oštećen genetskom modifikacijom da bi se učinio manje biološki aktivnim kod sisara, kako bi se dalje sprečila bilo kakva ozbiljna bolest/reverzije. Ovaj eksperimentalni virus je proizveden upotrebom postojećeg proizvodnog postupka (Bakker et al, 2011 i Thomassen et al, 2013a) u laboratorijskom obimu da bi se procenio njegov potencijal. Za korak hromatografskog razdvajanja, korišćen je i čist 20 mM fosfatni pufer (kontrola) i 20 mM fosfatni pufer koji sadrži 150 mM L-arginina. Rezultati su prikazani u tabeli 9, koja prikazuje prinos funkcionisanja pojedinačnih jedinica (%) i funkcionisanja kombinovane hromatografske jedinice. Tabela 9 jasno pokazuje korisna dejstva aditiva L-arginina, jer su postignute više vrednosti ukupnih oporavaka proizvoda.

Tabela 9: Prinos himernog poliovirusa (%) za funkcionisanje pojedinačnih jedinica (SEC i IEX) i funkcionisanje kombinovane jedinice

Primer 9: Mešoviti režim/multimodalna hromatografija u prisustvu baznih aminokiselina

[0140] Upotreba aditiva u elucionom puferu otvara put za nove opcije prečišćavanja, kao što je upotreba mešovitog režima/multimodalnih hromatografskih razdvajanja, umesto regularne jonske izmene. Ovime se uključuju i elektrostatički i hidrofobni efekti kako bi se omogućilo

4

dvodimenzionalno odvajanje čestica, koje omogućava čak i blisko povezanim česticama, u odnosu na izoelektričnu tačku, da budu razdvojne.

Primer je dat u tabeli 10. Alifatična hromatografska smola HEA Hypercell (Pall Corporation) se koristi za prečišćavanje Sejbinovog soja tipa 2. Čistoća proizvoda se određuje na osnovu odnosa UV 260/280 prema Koch and Koch (1985), pri čemu je ciljni odnos za čist poliovirus u opsegu od 1.60-1.80. Bez prisustva L-arginina, virus prečišćen pomoću HEA ima odnos UV 260/280 od 0.98, dok virus prečišćen na koloni HEA u prisustvu 150mM L-arginina iznenada dostiže visoku čistoću što pokazuje odnos UV 260/280 od 1.76, tj. unutar ciljnog opsega.

Tabela 10: Čistoća proizvoda polio virusa na multimodalnoj hromatografskoj smoli

[0141] Upotreba novih i savremenijih smola stvara nove mogućnosti za prečišćavanje virusa.

Primer 10: Dejstva različitih baznih aminokiselina i njihovih derivata na smanjenje agregacije poliovirusa

[0142] Crna ploča sa 96 bunarčića u obliku dimnjaka, sa providnim dnom, korišćena je za skrining različitih jedinjenja i koncentracija na agregiranoj intermedijarno prečišćenoj seriji polio virusa (Sabin, tip 1, dobijenoj u koraku ekskluzione hromatografije u čistom fosfatnom puferu).

Štok rastvori različitih jedinjenja su pripremljeni u ploči sa 96 bunarčića mešanjem koncentrovanih štok rastvora sa puferom (oba pH 7.0 /- 0.2) do unapred određene molarnosti, nakon čega su dodati u crnu ploču sa 96 bunarčića u jednakim količinama sa ispitivanim preparatom virusa (1:1). Dobijena ploča je mešana na platformi mešalice i apsorbanca (590 nm) je merena posle 5 minuta. Rezultati su prikazani na slici 5.

Reference

[0143]

Albrecht P., Van Steenis G., Van Wezel AL., Salk J. Standardization of poliovirus neutralizing antibody tests. Rev Infect Dis, 6 (May-June (Suppl. 2)) (1984), pp. S540-S544.

Aylward B, Tangermann R. The global polio eradication initiative: Lessons learned and prospects for success. Vaccine 29(S4), D80-D85 (2011).

Arakawa, T., John S Philo, Kouhei Tsumoto, Ryosuke Yumioka, Daisuke Ejima. Elution of antibodies from a ProteinA column by aqueous arginine solutions. Protein Expression and Purification.2004 volume 36 (issue 2) Pages 244-248.

Arakawa, T.; Kita, Y.; Koyama, A.H. Synergistic virus inactivation effects of arginine. Biotechnol.J. 2009, 4, 174-178.

Bakker WA, Thomassen YE, van’t Oever AG, Westdijk J, van Oijen MG, Sundermann LC, van’t Veld P, Sleeman E, van Nimwegen FW, Hamidi A, Kersten GF, van den Heuvel N, Hendriks JT, van der Pol LA. Vaccine. 2011 Sep 22;29(41):7188-96.

Baynes BM, Trout BL. Rational design of solution additives for the prevention of protein aggregation. Biophys J.2004 Sep;87(3):1631-9.

Baynes BM, Wang DI, Trout BL. Role of arginine in the stabilization of proteins against aggregation. Biochemistry. 2005 Mar 29;44(12):4919-25.

Chumakov K, Ehrenfeld E, Wimmer E, Vadim I. Vaccination against polio should not be stopped. Nature Rev. Microbiol.5, 952-958 (2007).

Chumakov K, Ehrenfeld E, Plotkin S. New generation of inactivated poliovirus vaccines for universal immunization after eradication of poliomyelitis. Clin. Infect. Dis. 47(12), 1587-1592 (2008).

Cromwell MEM, Hilario E, Jacobson F. Protein aggregation and bioprocessing. The American Association of Pharmaceutical Scientists. 2006 September; 8(3): E572-E579.

Das TK. Protein particulate detection issues in biotherapeutics development - current status. AAPS PharmSciTech.2012 Jun;13(2):732-46.

Desnues, C., and D. Raoult. 2010. Inside the lifestyle of the virophage. Intervirology 53:293-303.

Duchene M, Peetermans, d’Hondt E, Harford N, Fabry L, Stephenne J. Production of poliovirus vaccines: past, present, and future. Viral Immunology 3(4), 243-272 (1990). Nathanson N, Kew OM. From Emergence to Eradication: The Epidemiology of Poliomyelitis Deconstructed. Am. J. Epidemiol. (2010) 172(11): 1213-1229.

Fields Virology, 5th edition, 2007; Bernard N. Fields, David Mahan Knipe, Peter M. Howley, Wolters Kluwer.

4

Gu Z et al. Inhibition of aggregation by media selection, sample loading and elution in size exclusion chromatographic refolding of denatured bovine carbonic anhydrase B.J. Biochem Biophys Methods.2003. 56(1-3):165-75).

Hamidi A, Bakker WAM. Innovative IPV from attenuated Sabin poliovirus or newly designed alternative seed strains. Pharmaceutical Patent Analyst (2012) 5(1):589-599. Heinsbroek E, Ruitenberg EJ. The global introduction of inactivated polio vaccine can circumvent the oral polio vaccine paradox. Vaccine 28(22), 3778-3783 (2010).

Heymann DL, Sutter RW, Aylward RB, A vision of a world without polio: The OPV cessation strategy. Biologicals 34(2), 75-79 (2006).

Heymann DL, Sutter RW, Aylward RB. A global call for new polio vaccines. Nature 434, 699-700 (2005).

Holmes EC. Viral evolution in the genomic age. PLoS Biol.2007;5(10):e278.

Jonges M, Liu WM, van der Vries E, Jacobi R, Pronk I, Boog C, Koopmans M, Meijer A, Soethout E.. Influenza virus inactivation for studies of antigenicity and phenotypic neuraminidase inhibitor resistance profiling. 2010, J. Clin. Microbiol.48:928-940.

Koonin EV, Senkevich TG, Dolja VV. The ancient Virus World and evolution of cells. Biol Direct. 2006 Sep 19;1:29. Kew OM, Sutter RW, de Gourville EM, Dowdle WR, Pallansch MA. Vaccine-derived polioviruses and the endgame strategy for global polio eradication. Ann. Rev. Microbiol.59, 587-635 (2005).

Koch and Koch. The molecular biology of poliovirus. 1985 Springer-Verlag Wien-New York ISBN 3-211-81763-8. Li Y, Weiss WF, Roberts CJ. Characterization of high-molecular-weight non native aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of pharmaceutical sciences 2009 vol 98 issue 11 p3997-4016.

Lee Sang-Won, Philip F. Markham, Mauricio J. C. Coppo, Alistair R. Legione, John F. Markham, Amir H. Noormohammadi, Glenn F. Browning, Nino Ficorilli, Carol A. Hartley, Joanne M. Devlin. Attenuated Vaccines Can Recombine to Form Virulent Field Viruses. Science 13 July 2012: 188.

Montagnon BJ, Fanget B, Vincent-Falquet JC. Industrial-scale production of inactivated poliovirus vaccine prepared by culture of Vero cells on microcarrier. Rev Infect Dis.1984 May-Jun;6 Suppl 2:S341-4.

Montagnon B, Vincent-Falquet JC, Fanget B. Thousand litre scale microcarrier culture of Vero cells for killed polio virus vaccine. Promising results. Dev Biol Stand.

1983;55:37-42.

4

Morgan, J.F. and Campbell, M.E. (1955) J. Natl. Cancer Inst., 16:557. Morgan, J.F., Morton, H.J. and Parker R.C. (1950) Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73:1.

Nathanson & Kew. From emergence to eradication: the epidemiology of poliomyelitis deconstructed. Am J Epidemiol.2010 Dec 1;172(11):1213-29.

Pearson, H.2008. ’Virophage’ suggests viruses are alive. Nature 454:677.

Robinson HL. Viral attenuation by design. Nature Biotechnology. 2008 Sep;26(9):1000-1.

Sanders P, Edo-Matas D, Custers JHHV, Koldijk MH, Klaren V, Turk M, Luitjens A, Bakker WAM, Uytdehaag F, Goudsmit J, Lewis JA, Schuitemaker H, PER.C6® cells as a serum-free suspension cell platform for the production of high titer poliovirus: A potential low cost of goods option for world supply of inactivated poliovirus vaccine. Vaccine. 2013 Jan 21;31(5):850-6.

Sun L, Young LN, Zhang X, Boudko SP, Fokine A, Zbornik E, Roznowski AP, Molineux IJ, Rossmann MG, Fane BA. Icosahedral bacteriophage ΦX174 forms a tail for DNA transport during infection. Nature.2014 Jan 16;505(7483):432-5.

Taylor, J. P.; Hardy, J.; Fischbeck; K. H. Toxic proteins in neurodegenerative disease. Science. 2002 Jun 14;296(5575):1991-5.

Taylor DJ, Ballinger MJ, Bowman SM, Bruenn J. Virus-host co-evolution under a modified nuclear genetic code. PeerJ 2013 March 5; 1e50.

Ten Have R, Thomassen YE, Hamzink MR, Bakker WA, Nijst OE, Kersten G, Zomer G. Development of a fast ELISA for quantifying polio D-antigen in in-process samples. Biologicals. 2012 Jan;40(1):84-7.

Thomassen YE, van Sprang EN, van der Pol LA, Bakker WA. Multivariate data analysis on historical IPV production data for better process understanding and future improvements.Biotechnology & Bioengineering 2010 Sep 1;107(1):96-104.

Thomassen YE, Rubingh O, Wijffels RH, van der Pol LA, Bakker WA, Vaccine.2014 May 19;32(24):2782-8. doi: 10.1016/j.vaccine.2014.02.022. Epub 2014 Feb 26.

Thomassen YE, van’t Oever AG, Vinke M, Spiekstra A, Wijffels RH, van der Pol LA, Bakker WA. Scale-down of the inactivated polio vaccine production process. Biotechnol Bioeng. 2013a May; 110(5):1354-65.

Thomassen, YE, van ’t Oever, AG, van Oijen MGCT, Wijffels, R.H., van der Pol, LA, Bakker, WAM. Next generation inactivated polio vaccine manufacturing to support post polio-eradication biosafety goals. PLOS One. 2013b Dec 12;8(12):e83374Thompson KM, Tebbens RJ. Current polio global eradication and

4

control policy options: perspectives from modeling and prerequisites for oral poliovirus vaccine cessation. Expert Review of Vaccines 11(4), 449-459 (2012).

Utsunimoya, H.; Ichinose, M.; Tsujimoto, K.; Katsuyama, Y.; Yamasaki, H.; Koyama, A.H.; Ejima, D.; Arakawa, T. Co-operative thermal inactivation of herpes simplex virus and influenza virus by arginine ans NaCl. Int. J. Pharm.2009, 366, 99-102.

Van Wezel AL, van Steenis G, Hannik CA, Cohen H. 1978. New approach to the production of concentrated and purified inactivated polio and rabies tissue culture vaccines. Develop, biol. Standard.41 : 159-168.

Verdijk P, Rots NY, Bakker WAM. Clinical development of a novel inactivated poliomyelitis vaccine based on attenuated Sabin poliovirus strains. Expert Review of Vaccines (2011) 10(5):635-644.

Wei Wang. Protein aggregation and its inhibition in biopharmaceuticals. International journal of pharmaceuticles 2005; 289: 1-30.

Westdijk, J., et al., Characterization and standardization of Sabin based inactivated polio vaccine: proposal for a new antigen unit for inactivated polio vaccines. Vaccine, 2011. 29(18): p.3390-7.

Widjojoatmodjo MN, Boes J, van Bers M, van Remmerden Y, Roholl PJ, Luytjes W. A highly attenuated recombinant human respiratory syncytial virus lacking the G protein induces long-lasting protection in cotton rats. Virol J.2010 Jun 2;7:114.

Yamasaki, H.; Tsujimoto, K.; Koyama, A.H.; Ejima, D.; Arakawa, T. Arginine facilitates inactivation of enveloped viruses. J. Pharm. Sci.2008, 97, 3063-3073.

Zor and Selinger, Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies. Anal Biochem. 1996 May 1;236(2):302-8.

Skraćenice

[0144]

AU - Jedinice apsorbance

CCID50 - Infektivna doza za 50% ćelija u kulturi

CFF - Filtracija sa unakrsnim protokom

cm - centimetar

CPE - Citopatogeni efekat

DEAE - Dietilaminoetanol

DF - Dijafiltracija

4

DLS - Dinamičko rasipanje svetlosti

DNK - Dezoksiribonukleinska kiselina

DO - Rastvoreni kiseonik

DSP - Nishodna obrada

DU - Jedinica D-antigena

EID50 - Infektivna doza za 50% jaja

ELISA - Enzimski imunosorbentni test

E-MEM - Iglov minimalni esencijalni medijum

FTU - Formazinska jedinica turbiditeta

HCP - Protein ćelije-domaćina

HEA - Heksilamin

HPV - Humani papilomavirus

HVAC - Zagrevanje, ventilacija i klimatizacija vazduha

IEC/IEX - Jonoizmenjivačka hromatografija

IPV - Inaktivisana polio vakcina

kD - kiloDalton

M199 - Medijum 199

MALS - Višeugaono rasipanje svetlosti

MKC - Ćelija majmunskog bubrega

mM - miliMolarni

MOI - multiplicitet infekcije

mS - mili-Simens

NIBSC - Nacionalni institut za biološke standarde i kontrolu nm - nanometar

NMR - nuklearna magnetna rezonanca

NTU - Nefelometrijska jedinica turbiditeta

OD - Optička gustina

OPV - Oralna polio vakcina

PBS - Fosfatno puferisani fiziološki rastvor

RIVM - Nacionalni institut za javno zdravlje i životnu sredinu RNK - Ribonukleinska kiselina

RSV - Respiratorni sincicijalni virus

SEC - Ekskluziona hromatografija

sIPV - Inaktivisana polio vakcina zasnovana na Sejbinovim sojevima

4

SPF - Bez specifičnih patogena

SRID - Jednosmerna radijalna imunodifuzija TCID50 - Infektivna doza za 50% ćelijskih kultura TFF - Filtracija sa tangencijalnim protokom

UF - Ultrafiltracija

USP - Ushodna obrada

UV - Ultraljubičasto zračenje

VAPP - Paralitički poliomijelitis povezan sa vakcinom VDPV - Poliovirus koji potiče iz vakcine

VLP - Čestica slična virusu

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Postupak za proizvodnju kompozicije koja sadrži enterovirusne čestice, naznačen time što postupak obuhvata korake:

a) proizvodnje medijuma koji sadrži enterovirusne čestice;

b) prečišćavanja enterovirusnih čestica iz medijuma, pri čemu je tokom bar jednog dela prečišćavanja bazna aminokiselina ili njen derivat prisutan u finalnoj koncentraciji od najmanje 1 mM i dovoljan je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica; i,

c) inaktivacije enterovirusnih čestica;

pri čemu je bazna aminokiselina ili njen derivat izabran iz grupe koja se sastoji od: arginina, lizina, histidina, arginina-HCl, lizina-HCl, histidina-HCl, agmatina, dihidrohlorida etil estra L-arginina, traneksaminske kiseline, hidrohlorida DL-5-hidroksilizina, dihidrohlorida metil estra L-lizina, 3-metil-L-histidina, njihovih soli i njihovih kombinacija.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, koji dalje obuhvata korak d) u kome se enterovirusne čestice formulišu.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što je bazna aminokiselina ili njen derivat prisutan u finalnoj koncentraciji od najmanje 1 mM, i dovoljan je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica tokom najmanje jednog dela koraka c).

4. Postupak prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što je i tokom koraka d) bazna aminokiselina ili njen derivat prisutan u finalnoj koncentraciji od najmanje 1 mM, i dovoljan je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica.

5. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 – 4, naznačen time što je koncentracija bazne aminokiseline ili njenog derivata najmanje 1 mM i dovoljna je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica i održava se tokom celokupnog trajanja najmanje jednog od koraka b), c) i d).

6. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 - 5, naznačen time što je finalna koncentracija bazne aminokiseline ili njenog derivata najmanje 5 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM ili 100 mM i dovoljna je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica.

7. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 - 6, naznačen time što enterovirusne čestice predstavljaju čestice slične virusu enterovirusa.

8. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 - 7, naznačen time što su enterovirusne čestice iz roda Enterovirus odabrane iz grupe koja se sastoji od poliovirusa, koksaki A virusa, koksaki B virusa, ehovirusa, rinovirusa i enterovirusa 68, 69, 70, 71 i 73.

9. Postupak prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što enterovirusne čestice sadrže polioviruse serotipova 1, 2 i 3.

10. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačen time što je kompozicija koja sadrži enterovirusne čestice vakcina.

11. Postupak prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što je vakcina inaktivisana polio vakcina (IPV).

12. Upotreba bazne aminokiseline ili njenog derivata za sprečavanje ili smanjenje agregacije enterovirusnih čestica tokom prečišćavanja enterovirusnih čestica iz medijuma, pri čemu je tokom bar jednog dela prečišćavanja bazna aminokiselina ili njen derivat prisutan u finalnoj koncentraciji od najmanje 1 mM, i dovoljan je da spreči ili smanji agregaciju enterovirusnih čestica, i pri čemu je bazna aminokiselina ili njen derivat izabran iz grupe koja se sastoji od: arginina, lizina, histidina, arginina-HCl, lizina-HCl, histidina-HCl, agmatina, dihidrohlorida etil estra L-arginina, traneksaminske kiseline, hidrohlorida DL-5-hidroksilizina, dihidrohlorida metil estra L-lizina, 3-metil-L-histidina, njihovih soli i njihovih kombinacija.

13. Upotreba prema patentnom zahtevu 12, naznačena time što su enterovirusne čestice iz roda Enterovirus odabrane iz grupe koja se sastoji od poliovirusa, koksaki A virusa, koksaki B virusa, ehovirusa, rinovirusa i enterovirusa 68, 69, 70, 71 i 73

14. Upotreba prema patentnom zahtevu 13, naznačena time što su enterovirusne čestice poliovirusi najmanje jednog od serotipova 1, 2 i 3.

15. Upotreba prema patentnom zahtevu 13, naznačena time što su enterovirusne čestice inaktivisana polio vakcina (IPV).