RS58018B1 - Antitelo na c-met - Google Patents

Antitelo na c-met

Info

Publication number
RS58018B1
RS58018B1 RS20181344A RSP20181344A RS58018B1 RS 58018 B1 RS58018 B1 RS 58018B1 RS 20181344 A RS20181344 A RS 20181344A RS P20181344 A RSP20181344 A RS P20181344A RS 58018 B1 RS58018 B1 RS 58018B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
functional fragment
met
Prior art date
Application number
RS20181344A
Other languages
English (en)
Inventor
Liliane Goetsch
Thierry Wurch
Cédric Bes
Original Assignee
Pf Medicament
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=41693124&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58018(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/IB2008/055663 external-priority patent/WO2010064089A1/en
Application filed by Pf Medicament filed Critical Pf Medicament
Publication of RS58018B1 publication Critical patent/RS58018B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/53—Hinge
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Connection Of Motors, Electrical Generators, Mechanical Devices, And The Like (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis
UVOD
[0001] Ovde je dato novo dvovalentno antitelo, sposobno da se specifično veže za humani c-Met receptor i/ili sposobno da specifično inhibira dejstvo tirozin kinaze navedenog receptora, kao i na sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina koje kodiraju antitelo. Konkretnije, ovo antitelo je sposobno da inhibira c-Met dimerizaciju. Pored toga, opisana je upotreba navedenog antitela kao leka za profilaktički i/ili terapijski treatman kancera ili bilo koje patologije koja je vezana za prekomernu ekspresiju navedenog receptora, kao i u postupcima ili kompletima za dijagnozu oboljenja vezanih za prekomernu ekspresiju c-Met. Dati su i proizvodi i/ili sastavi koji obuhvataju takvo antitelo u kombinaciji sa drugim antitelima i/ili hemijskim jedinjenjima namenjenim drugim faktorima rasta uključenim u napredovanje ili metastazu tumora i/ili jedinjenjima i/ili agensima protiv kancera ili agensima konjugovanim sa toksinima i njihovu upotrebu za sprečavanje i/ili lečenje određenih kancera.
[0002] Agensi koji gađaju receptor tirozin kinaze (RTK), kao što su inhibitori trastuzumab, cetuksimab, bevacizumab, imatinib i gefitinib ilustruju interes gađanja ove klase proteina u lečenju odabranih kancera.
[0003] c-Met je prototipičan član podfamilije RTK koja uključuje i RON i SEA. c-Met RTK familija je strukturno različita od ostalih RTK familija i jedini je poznat receptor visokog afiniteta za faktor rasta hepatocita (HGF), koji se još zove faktor rasejanja (scatter factor, SF) [D.P. Bottaro et al., Science 1991, 251:802-804; L. Naldini et al., Eur. Mol. Biol. Org. J.
1991, 10:2867-2878]. c-Met i HGF se naširoko eksprimiraju u raznim tkivima i njihova ekspresija je normalno ograničena na ćelije epitelnog i mezenhimnog porekla [respektivno, M.F. Di Renzo et al., Oncogene 1991, 6:1997-2003; E. Sonnenberg et al., J. Cell. Biol.1993, 123:223-235]. Oba su potrebna za normalan razvoj sisara i pokazano je da su naročito važna u migraciji ćelija, morfogenoj diferencijaciji i organizaciji trodimenzionalnih tubularnih struktura, kao i u rastu i angiogenezi [F. Baldt et al., Nature 1995, 376:768-771; C. Schmidt et al., Nature.1995:373:699-702; Tsarfaty et al., Science 1994, 263:98-101]. Pokazano je da dok je kontrolisana regulacija c-Met i HGF važna u sisarskom razvoju, održavanju i popravljanju tkiva [Nagayama T., Nagayama M., Kohara S., Kamiguchi H., Shibuya M., Katoh Y., Itoh J., Shinohara Y., Brain Res.2004, 5;999(2):155-66; Tahara Y., Ido A., Yamamoto S., Miyata Y., Uto H., Hori T., Hayashi K., Tsubouchi H., J Pharmacol Exp Ther. 2003, 307(1):146-51], njihova disregulacija je uključena u napredovanje kancera.
[0004] Aberantna signalizacija vođena neodgovarajućom aktivacijom c-Met je jedna od najčešćih promena viđenih u humanim kancerima i igra suštinsku ulogu u tumorogenezi i metastazi [Birchmeier et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2003, 4:915-925; L. Trusolino and Comoglio P. M., Nat Rev. Cancer.2002, 2(4):289-300].
[0005] Neodgovarajuća aktivacija c-Met može da nastane mehanizimima i zavisnim i nezavisnim od liganda, koji uključuju prekomernu ekspresiju c-Met i/ili parakrinom ili autokrinom aktivacijom, ili nagomilavanjem funkcionalnih mutacija [J.G. Christensen, Burrows J. and Salgia R., Cancer Letters. 2005, 226:1-26]. Međutim, potrebna je oligomerizacija c-Met receptora, u prisustvu ili odsustvu liganda, za regulaciju afiniteta i kinetike vezivanja kinaze za ATP i peptidne supstrate koji sadrže tirozin [Hays JL, Watowich SJ, Biochemistry, 2004 Aug 17, 43:10570-8]. Aktiviran c-Met regrutuje signalne efektore do svog mesta višestrukog vezivanja (multidocking site) lociranog u domenu citoplazme, što dovodi do aktivacije nekoliko ključnih signalnih puteva, uključujući Ras-MAPK, PI3K, Src i Stat3 [Gao CF, Vande Woude GF, Cell Res. 2005, 15(1):49-51; Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene. 2000, 19(49):5582-9]. Ovi putevi su suštinski za proliferaciju, invaziju i angiogenezu tumorskih ćelija i za izbegavanje apoptoze [Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF, Oncogene, 2000, 19(49):5582-9; Gu H., Neel BG, Trends Cell Biol.2003 Mar, 13(3):122-30; Fan S., Ma YX, Wang JA, Yuan RQ, Meng Q., Cao Y., Laterra JJ, Goldberg ID, Rosen EM, Oncogene. 2000 Apr 27, 19(18):2212-23]. Pored toga, jedinstvena odlika c-Met signalizacije u odnosu na ostale RTK je njegova nađena interakcija sa kompleksima za fokalnu adheziju i sa “partnerima” za vezivanjekoji nisu kinaze, kao što su α6β4 integrini [Trusolino L., Bertotti A., Comoglio PM, Cell. 2001, 107:643-54], CD44v6 [Van der Voort R., Taher TE, Wielenga VJ, Spaargaren M., Prevo R., Smit L., David G., Hartmann G., Gherardi E., Pals ST, J. Biol. Chem. 1999, 274(10):6499-506], pleksin B1 ili semaforini [Giordano S., Corso S., Conrotto P., Artigiani S., Gilestro G., Barberis D., Tamagnone L., Comoglio PM, Nat Cell Biol. 2002, 4(9):720-4; Conrotto P., Valdembri D., Corso S. Serini G., Tamagnone L., Comoglio PM, Bussolino F., Giordano S., Blood. 2005, 105(11):4321-9; Conrotto P., Corso S., Gamberini S., Comoglio PM, Giordano S., Oncogene.
2004, 23:5131-7] koji mogu dalje da dodaju kompleksnosti regulacije ćelijske funkcije preko ovog receptora. Konačno, nedavni podaci demonstriraju da bi c-Met mogao da bude uključen u otpornost tumora na gefitinib ili erlotinib, što sugeriše da bi kombinacija jedinjenja koja gađaju i EGFR i c-Met mogla da bude od velikog interesa [Engelman JA et al., Science, 2007, 316:1039-43].
[0006] U prethodnih nekoliko godina, razvijeno je mnogo različitih strategija da se smanji c-Met signalizacija u ćelijskim linijama kancera. Ove strategije uključuju i) neutralizovanje antitela na c-Met ili HGF/SF [Cao B., Su Y., Oskarsson M., Zhao P., Kort EJ, Fisher RJ, Wang LM, Vande Woude GF, Proc Natl Acad Sci USA. 2001, 98(13):7443-8; Martens T., Schmidt NO, Eckerich C., Fillbrandt R., Merchant M., Schwall R., Westphal M., Lamszus K., Clin Cancer Res. 2006, 12(20):6144-52] ili upotrebu HGF/SF antagonista NK4 za sprečavanje vezivanja liganda za c-Met [Kuba K., Matsumoto K., Date K., Shimura H., Tanaka M., Nakamura T., Cancer Res., 2000, 60:6737-43], ii) male inhibitore mesta vezivanja ATP na c-Met koji blokiraju aktivnost kinaze [Christensen JG, Schreck R., Burrows J., Kuruganti P., Chan E, Le P., Chen J., Wang X., Ruslim L., Blake R., Lipson KE, Ramphal J., Do S., Cui JJ, Cherrington JM, Mendel DB, Cancer Res. 2003, 63:7345-55], iii) inženjerisani polipeptid SH2 domena koji interferira sa pristupom mestu višestrukog vezivanja i RNKi ili ribozimom koji smanjuje ekspresiju receptora ili liganda. Većina ovih pristupa ispoljava selektivnu inhibiciju c-Met, što dovodi do inhibicije tumora i pokazuje da bi c-Met mogao da bude od interesa za terapijsku intervenciju u kanceru.
[0007] Unutar molekula generisanih za gađanje c-Met, neki su antitela. Najopsežnije opisano je antitelo na c-Met 5D5, koje je napravio Genentech [WO 96/38557], koje se ponaša kao potentan agonist kad se samo doda u različite modele i kao antagonist kad se koristi kao Fab fragment. Monovalentan inženjerisan oblik ovog antitela, opisan kao jednokraki 5D5 (OA5D5) i proizveden kao rekombinantan protein u E. Coli, je takođe predmet patentne prijave [WO 2006/015371] Genentech-a. Međutim, ovaj molekul, koji ne bi mogao da se smatra antitelom zbog svoje naročite strukture, takođe ispoljava mutacije koje bi mogle da budu imunogene u ljudima. U terminima aktivnosti, ovaj neglikozilovan molekul je lišen efektorskih funkcija i konačno, nema jasnih podataka koji bi pokazali da OA5D5 inhibira dimerizaciju c-Met. Štaviše, kad je testiran u G55 in vivo modelu, ćelijskoj liniji glioblastoma koja eksprimira c-Met ali ne i HGF mRNK i protein i koja raste nezavisno od liganda, jednokraki anti-c-Met nije imao značajan efekat na rast G55 tumora, sugerišući da OA5D5 primarno deluje blokiranjem vezivanja HGF i nije u stanju da gađa tumore aktivirane nezavisno od HGF [Martens T. et al, Clin. Cancer Res., 2006, 12(20):6144-6152]. Još jedno antitelo koje gađa c-Met je opisao Pfizer kao antitelo koje deluje "prvenstveno kao antagonist c-Met-a, a u nekim slučajevima kao agonist c-Met-a" [WO 2005/016382]. U ovoj prijavi nisu opisani nikakvi podaci koji pokazuju bilo kakav efekat Pfizerovih antitela na dimerizaciju c-Met.
[0008] Patentna prijava WO2007/126799 A2 (Novartis, 8-11-2007) opisuje antagonistička humana antitela na c-Met u IgG1 i IgG4 formatu, dok prijava WO2009/007427 A2 (Pierre Fabre Medicament, 15-1-2009) opisuje dvovalentna mišja antitela na c-Met koja imaju antagonističko dejstvo na c-Met.
KRATAK PRIKAZ PRONALASKA
[0009] Predmetni pronalazak se odnosi na monoklonsko antitelo ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment, sposobno da inhibira dimerizaciju c-Met, pri čemu navedeno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment, obuhvata težak lanac koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sa odgovarajućim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID Nos. 1, 2 i 3; i lak lanac koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sa odgovarajućim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID Nos. 5, 6 i 7, pri čemu je navedeno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment, dalje naznačeno time što:
i) navedeno antitelo ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment sadrži i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28 i
ii) navedeno antitelo ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment je hemijski kuplovan sa citoksičnim agensom.
[0010] Ovde je izloženo monoklonsko antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, sposobno da inhibira dimerizaciju c-Met, pri čemu navedeno antitelo obuhvata težak lanac koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sa odgovarajućim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID Nos. 1, 2 i 3; i lak lanac koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sa odgovarajućim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID Nos. 5, 6 i 7, pri čemu se je navedeno antitelo dalje naznačeno time što ono sadrži i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.21.
[0011] Poželjno je da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što navedeni zglobni region sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos.22 do 28.
[0012] Mada samo ona antitela i njihovi dvovalentni funkcionalni fragmenti koji imaju zglobni region sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28 ulaze u okvir pronalaska.
[0013] Poželjno je da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što se sastoji od himernog antitela.
[0014] Poželjno je da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što se sastoji od humanog antitela.
[0015] Poželjno je da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što se sastoji od humanizovanog antitela.
[0016] Još je poželjnije da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što obuhvata varijabilan domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4 i varijabilan domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.8, 9 ili 10.
[0017] Još je poželjnije da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što obuhvata varijabilan domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4, varijabilan domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 8 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.22.
[0018] Još je poželjnije da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što obuhvata varijabilan domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4, varijabilan domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 9 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.22.
[0019] Još je poželjnije da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što obuhvata varijabilan domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4, varijabilan domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 10 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.22.
[0020] Još je poželjnije da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što obuhvata varijabilan domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4, varijabilan domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 8 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28.
[0021] Još je poželjnije da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što obuhvata varijabilan domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4, varijabilan domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 9 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28.
[0022] Još je poželjnije da se ovo antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, odlikuje time što obuhvata varijabilan domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4, varijabilan domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 10 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28.
[0023] U jednom drugom aspektu, predmetna prijava se odnosi i na izolovanu nukleinsku kiselinu, koja se odlikuje time što je odabrana od sledećih nukleinskih kiselina:
a) nukleinska kiselina, DNK ili RNK, koja kodira antitelo ili njegov funkcionalan fragment ili derivat, kao što je opisano gore;
b) nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu DNK koja sadrži sekvence SEQ ID No. 11, SEQ ID No.12, SEQ ID No.13 i sekvence SEQ ID No.15, SEQ ID No.16 i SEQ ID No.
17;
c) nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu DNK koja sadrži sekvence SEQ ID No. 14 i SEQ ID No.18, 19 ili 20;
d) nukleinske kiseline RNK koje odgovaraju nukleinskim kiselinama DNK kao što su definisane u b) ili c);
e) nukleinske kiseline komplementarne nukleinskim kiselinama kao što su definisane u a), b) i c);
f) nukleinska kiselina od bar 18 nukleotida sposobna da hibridizuje u uslovima visoke strogosti sa bar jednim od CDR-ova sekvence SEQ ID Nos.11 do 13 i 15 do 17.
[0024] U jednom drugom aspektu, izložen je i vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu kao što je opisana gore.
[0025] U još jednom aspektu, izložena je i ćelija domaćin koja sadrži vektor opisan gore.
[0026] U još jednom aspektu, izložena je i transgena životinja, sa izuzeztkom čoveka, koja sadrži bar jednu ćeliju transformisanu vektorom opisanim gore.
[0027] U još jednom aspektu, izložen je i postupak za proizvodnju antitela, ili njegovog dvovalentnog funkcionalnog fragmenta ili derivata, opisanih gore, gde navedeni postupak obuhvata sledeće stadijume:
a) kultivisanje u medijumu i odgovarajuće uslove za kultivisanje ćelije domaćina kao što je opisano gore i
b) sakupljanje navedenog antitela, ili njegovog dvovalentnog funkcionalnog fragmenta ili derivata, ovako proizvedenog počev od medijuma za kulture ili navedenih gajenih ćelija.
[0028] U još jednom aspektu, izloženo je i antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, koje može da se dobije postupkom opisanim gore.
[0029] U još jednom aspektu, izložena je i upotreba antitela opisanog gore kao lek.
[0030] U još jednom aspektu, izložen je i sastav koji kao aktivan princip sadrži jedinjenje koje se sastoji od antitela ili njegovog dvovalentnog funkcionalnog fragmenta ili derivata, opisanih gore.
[0031] Poželjno je da se sastav odlikuje time što, štaviše, kao kombinaciju proizvoda za simultanu, odvojenu ili sukcesivnu upotrebu, sadrži antitelo na tumor.
[0032] Poželjno je da se sastav odlikuje time što, štaviše, kao kombinaciju proizvoda za simultanu, odvojenu ili sukcesivnu upotrebu, sadrži citotoksičan/citostatički agens.
[0033] Poželjno je da se sastav odlikuje time što je bar jedno od navedenih antitela, ili njihovih dvovalentnih funkcionalnih fragmenata ili derivata, konjugovano sa ćelijskim toksinom i/ili radioaktivnim elementom.
[0034] Poželjno je da se sastav odlikuje time što je navedeni citotoksičan/citostatički agens ili navedeni toksin i/ili radioaktivni element hemijski kuplovan sa bar jednim od elemenata navedenog sastava za simultanu upotrebu.
[0035] U jednom drugom aspektu, izložena je i upotreba sastava opisanog gore kao lek.
[0036] U još jednom aspektu, izložena je i upotreba antitela, ili njegovog dvovalentnog funkcionalnog fragmenta ili derivata, ili sastava opisanog gore za dobijanje leka namenjenog da inhibira rast i/ili proliferaciju tumorskih ćelija.
[0037] U još jednom aspektu, izložena je i upotreba antitela, ili njegovog dvovalentnog funkcionalnog fragmenta ili derivata, ili sastava opisanog gore, ili gornja upotreba, za dobijanje leka namenjenog za sprečavanje ili za lečenje kancera.
[0038] Poželjno je da se navedena upotreba odlikuje time što je navedeni kancer odabran od kancera prostate, osteosarkoma, kancera pluća, kancera dojke, kancera endometrijuma, glioblastoma ili kancera kolona.
[0039] Poželjno je da se navedena upotreba odlikuje time što je navedeni kancer zavisan od HGF, a nezavisan od aktivacije Met.
[0040] U jednom drugom aspektu, izložen je i metod in vitro dijagnostikovanja bolesti indukovanih prekomernom ekspresijom receptora c-Met, počev od biološkog uzorka u kom se sumnja na abnormalno prisustvo receptora c-Met, gde navedeni metod sadrži korak u kom se navedeni biološki uzorak dovodi u kontakt sa antitelom iz zahteva 1 do 12, 18 ili 19 i gde je moguće, po potrebi, da navedeno antitelo bude obeleženo.
DETALJAN OPIS
[0041] Jedan od inovativnih aspekata predmetnog pronalaska je pravljenje himernog i/ili humanizovanog monoklonskog antitela bez intrinsične agonističke aktivnosti i inhibiranja dimerizacije c-Met. Konkretnije, inovativan aspekt ovog pronalaska je pravljenje himernog i/ili humanizovanog monoklonskog antitela sa antagonističkom aktivnošću i inhibiranjem dimerizacije c-Met.
[0042] Pored ciljanja tumora zavisnih od liganda, ovaj pristup će narušiti i ligand-nezavisna aktiviranja c-Met, nastala zbog njegove prekomerne ekspresije ili zbog mutacija unutarćelijskih domena, koja su ostala zavisna od oligomerizacije za signalizaciju. Još jedan aspekt aktivnosti ovog antitela bi mogle biti sterne smetnje za interakciju c-Met sa njegovim partnerima koje će dovesti do narušavanja funkcija c-Met. Ovo antitelo je humanizovano i inženjerisano poželjno, ali bez ograničenja, kao humani IgG1 da bi se dobile efektorske funkcije kao što su ADCC i CDC, kao dodatak funkcijama vezanim za specifičnu blokadu c-Met receptora.
[0043] Iznenađujuće, po prvi put, pronalazači su uspeli da generišu himerno i/ili humanizovano monoklonsko antagonističko antitelo, sposobno da se veže za c-Met, ali sposobno i da inhibira dimerizaciju c-Met, gde je navedeno monoklonsko antitelo dvovalentno, za razliku od postojećih antagonističkih antitela usmerenih protiv c-Met. Ako je istina da je ranije u struci ponekad bilo sugerisano da bi antitelo sposobno da inhibira dimerizaciju c-Met sa njegovim partnerima moglo da bude interesantno, nikad nije opisano, niti jasno predloženo antitelo sposobno da to radi. Štaviše, što se tiče specifičnosti antitela, uopšte nije bilo očigledno da će se uspeti u pravljenju takvog aktivnog dvovalentnog antitela.
[0044] Kao što je ranije objašnjeno, inhibicija dimerizacije c-Met je kapitalni aspekt pronalaska, jer će takva antitela predstavljati pravi interes za veću populaciju pacijenata. Ne samo kancer zavisan od ligandom aktiviranog c-Met, kao što je bio slučaj do ovog pronalaska, nego i kancer gde je c-Met aktiviran nezavisno od liganda bi mogao da bude lečen antitelima generisanim postupkom iz ovog pronalaska.
[0045] Antitela su evaluirana BRET analizom na ćelijama koje eksprimiraju oba c-Met-RLuc/c-Met-YFP i odabrana po svojoj sposobnosti da inhibiraju bar 40 %, poželjno 45 %, 50 %, 55 % i najpoželjnije 60 % BRET signala.
[0046] BRET tehnologija je poznata kao reprezentativna za dimerizaciju proteina [Angers et al., PNAS, 2000, 97:3684-89].
///
[0047] BRET tehnologija je dobro poznata stručnjaku i biće data detaljnije u sledećim primerima. Konkretnije, BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer, tj., prenos energije bioluminiscentnom rezonancom) je prenos energije bez zračenja koji se javlja između bioluminiscentnog donora (Renilla Luciferase (Rluc)) i fluorescentnog akceptora, mutanta GFP (Green Fluorescent Protein, zeleni fluorescentni protein) ili YFP (Yellow fluorescent protein, žuti fluorescentni protein). U ovom slučaju je korišćen EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein, pojačan žuti fluorescentni protein). Efikasnost prenosa zavisi od orijentacije i rastojanja između donora i akceptora. Zatim, prenos energije se može javiti samo ako su ova dva molekula na malom rastojanju (1-10 nm). Ova osobina se koristi za pravljenje testova interakcije protein-protein. Zaista, da bi se proučavala interakcija između dva partnera, prvi je genetski fuzionisan sa Renila luciferazom, a drugi sa žutim mutantom GFP. Fuzioni proteini su uopšteno, ali ne obavezno, eksprimirani u sisarskim ćelijama. U prisustvu svog supstrata za koji je membrana propustljiva (koelenterazin), Rluc emituje plavu svetlost. Ako je GFP mutant bliže od 10 nm od Rluc, može doći do prenosa energije i može se detektovati dodatni žuti signal. BRET signal se meri kao odnos između svetlosti koju emituje akceptor i svetlosti koju emituje donor. Tako će se BRET signal pojačati kad se dva fuziona proteina dovedu u susedstvo ili ako konformaciona promena približi Rluc i GFP mutant.
[0048] Ako je u poželjnom izvođenju sadržana BRET analiza, bilo koji metod poznat stručnjaku se može koristiti za merenje dimerizacije c-Met. Bez ograničenja, mogu se pomenuti sledeće tehnologije: FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer, tj. prenos energije fluorescentnom rezonancom), HTRF (Homogenous Time resolved Fluorescence, tj. homogena vremenski razdvojena fluorescentna rezonanca), FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, tj. snimanje poluvremena života fluorescencije) ili SW-FCCS (single wavelength fluorescence cross-correlation spectroscopy, tj. fluorescentna kroskorelaciona spektroskopija na jednoj talasnoj dužini).
[0049] Druge klasične tehnologije se takođe mogu koristiti, kao što je koimunoprecipitacija, alfa skrining, hemijsko unakrsno vezivanje, dupli hibrid, afinitetna hromatografija, ELISA ili Far western blot.
[0050] Termini "antitelo", "antitela" ili "imunoglobulin" se ekvivalentno koriste u najširem smislu i uključuju monoklonska antitela (npr., cela ili intaktna monoklonska antitela), poliklonska antitela, multivalentna antitela ili multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela dok god ispoljavaju željenu biološku aktivnost).
[0051] Konkretnije, takav molekul se sastoji od glikoproteina koji sadrži bar dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno spojena disulfidnim vezama. Svaki težak lanac se sastoji od varijabilnog regiona (ili domena) teškog lanca (ovde skraćenog kao HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki lak lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćenog kao LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VH i VL regioni se dalje mogu podeliti na regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR), prožete regionima koji su više konzervisani, koji se nazivaju okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FR, poređanih od amino-kraja do karboksi-kraja po sledećem redu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (npr., efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog komplementnog sistema.
[0052] Teški lanci imunoglobulina se mogu podeliti na tri funkcionalna regiona: Fd region, zglobni region i Fc region (kristalizabilan fragment). Fd region sadrži VH i CH1 domene i, u kombinaciji sa lakim lancem, formira Fab - fragment koji vezuje antigen. Fc fragment je odgovoran za efektorske funkcije imunoglobulina, koje uključuju, na primer, fiksiranje komplementa i vezivanje za srodne Fc receptore efektorskih ćelija. Zglobni region, nađen u IgG, IgA, i IgD klasama imunoglobulina, se ponaša kao fleksibilan umetak (spacer) koji dozvoljava Fab delu da se slobodno kreće u prostoru u odnosu na Fc region. Zglobni domeni su strukturno različiti, varirajući i u sekvenci i u dužini među imunoglobulinskim klasama i podklasama.
[0053] Prema kristalografskim studijama, imunoglobulinski zglobni region se dalje može strukturno i funkcionalno podeiliti na tri regiona: gornji zglob, jezgro i donji zglob (Shin et al., Immunological Reviews 130:87, 1992). Gornji zglob uključuje aminokiseline sa karboksil kraja CH1 do prvog ostatka u zglobu koji ograničava kretanje, najčešće prvi cisteinski ostatak koji formira disulfidnu vezu između dva teška lanca. Dužina gornjeg zglobnog regiona korelira sa segmentnom fleksibilnošću antitela. Jezgarni zglobni region sadrži disulfidne mostove između teških lanaca. Niži zglobni region spaja amino-kraj i uključuje ostatke u CH2 domenu. Jezgarni zglobni region humanih IgG1 sadrži sekvencu Cys-Pro-Pro-Cys koja, kad dimerizuje formiranjem disulfidnih veza, daje cikličan oktapeptid za koji se veruje da deluje kao osovina, time doprinoseći fleksibilnosti. Konformacione promene koje dozvoljava struktura i fleksibilnost polipeptidne sekvence imunoglobulinskog zglobnog regiona mogu da utiču na efektorske funkcije Fc dela antitela.
[0054] Termin «monoklonsko antitelo» se koristi u skladu sa svojim običnim značenjem da označi antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja čine populaciju su identična osim mogućih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Drugim rečima, monoklonsko antitelo se sastoji od homogenog antitela koje se dobija proliferacijom jednog jedinog klona ćelija (npr., ćelije hibridoma, eukariotske ćelije domaćini transfektovane pomoću DNK koja kodira homogeno antitelo, prokariotske ćelije domaćini transformisane pomoću DNK koja kodira homogeno antitelo, itd.) i koje obično karakteriše težak lanac jedne klase i podklase i lak lanac jednog tipa. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena protiv jednog jedinog antigena. Dalje, nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koja tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti ili epitopa, svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne jedine determinante na antigenu.
[0055] U ovom opisu, termini polipeptidi, polipeptidne sekvence, aminokiselinske sekvence, peptidi i proteini zakačeni za jedinjenja antitela ili za njihove sekvence su međusobno zamenljivi.
[0056] Pronalazak se odnosi na monoklonsko antitelo, ili njegov dvovalentni funkcionalni fragment, sposoban da inhibira dimerizaciju c-Met, gde navedeno antitelo ili njegov dvovalentni fragment, sadrže težak lanac koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sa odgovarajućim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID Nos. 1, 2 i 3 i lak lanac koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sa odgovarajućim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID Nos.
5, 6 i 7, gde se navedeno antitelo, ili njegov dvovalentni fragment, dalje odlikuje time što:
i) navedeno antitelo, ili njegov dvovalentni fragment, sadrži i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28 i
ii) navedeno antitelo, ili njegov dvovalentni fragment, je hemijski kuplovan sa citotoksičnim sredstvom.
[0057] Izloženo je monoklonsko antitelo, ili njegov dvovalentni funkcionalni fragment ili derivat, sposoban da inhibira dimerizaciju c-Met i koji sadrži težak lanac koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sa odgovarajućim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID Nos.1, 2 i 3 ili sekvencom koja ima bar 80 % identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencama SEQ ID Nos. 1, 2 i 3; i lak lanac koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sa odgovarajućim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID Nos. 5, 6 i 7 ili sekvencom koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencama SEQ ID Nos. 5, 6 ili 7, gde se navedeno antitelo dalje odlikuje time što sadrži i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.21.
[0058] Izraz "funkcionalni fragmenti i derivati" će biti detaljno definisan kasnije u ovoj specifikaciji.
[0059] Pod CDR regioni ili CDR-ovi se podrazumevaju hipervarijabilni regioni teškog i lakog lanca imunoglobulina kao što je definisano u IMGT.
[0060] Jedinstvena numeracija IMGT je definisana za poređenje varijabilnih domena koji god da je antigenski receptor, tip lanca ili vrsta [Lefranc M.-P., Immunology Today 18, 509 (1997); Lefranc M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P., Pommié, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]. U jedinstvenoj numeraciji IMGT, konzervisane aminokiseline uvek imaju istu poziciju, na primer, cistein 23 (1st-CYS), triptofan 41 (CONSERVED-TRP), hidrofobna aminokiselina 89, cistein 104 (2nd-CYS), fenilalanin ili triptofan 118 (J-PHE ili J-TRP). Jedinstvena numeracija IMGT obezbeđuje standardizovano razgraničenje okvirnih regiona (FR1-IMGT: pozicije 1 do 26, FR2-IMGT: 39 do 55, FR3-IMGT: 66 do 104 i FR4-IMGT: 118 do 128) i regiona koji određuju komplementarnost: CDR1-IMGT: 27 do 38, CDR2-IMGT: 56 do 65 i CDR3-IMGT: 105 do 117. Pošto jazovi (gaps) predstavljaju neokupirane pozicije, dužine CDR-IMGT (pokazane u zagradama i razdvojene tačkama, npr. [8.8.13]) postaju krucijalne informacije. Jedinstvena numeracija IMGT se koristi u 2D grafičkim reprezentacijama, označena kao IMGT Colliers de Perles
1
[Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., Immunogenetics, 53, 857-883 (2002); Kaas, Q. and Lefranc, M.-P., Current Bioinformatics, 2, 21-30 (2007)], i u 3D strukturama u IMGT/3D struktura-DB [Kaas, Q., Ruiz, M. and Lefranc, M.-P., T cell receptor and MHC structural data. Nucl. Acids. Res., 32, D208-D210 (2004)].
[0061] Postoje tri CDR teškog lanca i 3 CDR lakog lanca. Termin CDR ili CDR-ovi se ovde koristi da označi, u zavisnosti od slučaja, jedan od ovih regiona ili nekoliko, ili čak sve ove regione koji sadrže većinu aminokiselinskih ostataka odgovornih za vezivanje antitela po afinitetu za antigen ili epitop koji ono prepoznaje.
[0062] Pod "procenat identičnosti" dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina u smislu ovog pronalaska, podrazumeva se procenat nukleotida ili identičnih aminokiselinskih ostataka između dve sekvence koje se porede, dobijen posle najboljeg poravnanja (optimalnog poravnanja), gde je ovaj procenat čisto statistički i gde su razlike između dve sekvence raspoređene nasumično i duž cele dužine.
[0063] Poređenja dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina se tradicionalno sprovode poređenjem ovih sekvenci posle njihovog poravnanja na optimalan način, gde se navedeno poređenje može izvoditi na nivou segmenata ili pomoću "prozora poređenja". Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje se može izvoditi, pored manuelnog, pomoću algoritma lokalne homologije Smith-a i Waterman-a (1981) [Ad. App. Math.2:482], pomoću algoritma lokalne homologije Neddleman-a i Wunsch-a (1970) [J. Mol. Biol. 48: 443], metodom traženja sličnosti Pearson-a i Lipman-a), kompjuterskim softverom koji koristi ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u paketu Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ili pomoću BLAST N ili BLAST P softvera za poređenje).
[0064] Procenat identičnosti dve sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina se određuje poređenjem ove dve sekvence poravnate na optimalan način i u kom sekvence nukleinskih kiselina ili aminokiselina koje se porede mogu da sadrže adicije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu za optimalno poravnanje ove dve sekvence. Procenat identičnosti se računa određivanjem broja identičnih pozicija na kojima je nukleotid ili aminokiselina identična u ove dve sekvence, deljenjem ovog broja identičnih pozicija ukupnim brojem pozicija u prozoru poređenja i množenjem dobijenog rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti ove dve sekvence.
[0065] Na primer, može se koristiti BLAST program, "BLAST 2 sekvence" (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nukleotid sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) available on the site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/bl2.html, gde se koriste parametri koji su dati po obrascu (konkretno, za parametre "kazna za otvaranje jaza": 5 i "kazna za produženje jaza": 2; gde je izabrana matrica, na primer, matrica "BLOSUM 62" koju predlaže program), a procenat identičnosti dve sekvence koje se porede direktno računa program.
[0066] Za aminokiselinske sekvence koje imaju bar 80 %, poželjno 85 %, 90 %, 95 % i 98 % identičnosti sa referentnom aminokiselinskom sekvencom, poželjne su one koje imaju, u odnosu na odgovarajuću referentnu sekvencu, određene modifikacije, konkretno deleciju, adiciju ili supstituciju bar jedne aminokiseline, poželjne su trunkacija ili elongacija. U slučaju supstitucije, jedne ili više uzastopnih ili neuzastopnih aminokiselina, poželjne su supstitucije u kojima su supstituisane aminokiseline zamenjene "ekvivalentnim" aminokiselinama. Izraz "ekvivalentne aminokiseline" je namenjen da označi bilo koju aminokiselinu koja se može supstituisati jednom od aminokiselina bazične strukture, a da se biološke aktivnosti odgovarajućih antitela suštinski ne modifikuju i biće definisan kasnije, naročito u primerima. Ove ekvivalentne aminokiseline se mogu odrediti bilo oslanjajući se na njihovu strukturnu homologiju sa aminokiselinama koje zamenjuju, bilo na rezultate komparativnih ispitivanja biološke aktivnosti različitih antitela koja je moguće sprovesti.
[0067] Kao primer, pomenute su mogućnosti supstitucije koja može da se izvede a da ne dovede do ozbiljnih modifikacija biološke aktivnosti odgovarajućeg modifikovanog antitela.
[0068] Kao neograničavajući primer, sledeća tabela 1 daje mogućnosti izvodljivih supstitucija uz očuvanje biološke aktivnosti modifikovanog antitela. Obrnute supstitucije su takođe, naravno, moguće u istim uslovima.
Tabela 1
[0069] Mora se shvatiti ovde da se pronalazak ne odnosi na antitela u prirodnom obliku, odnosno, ona nisu u svom prirodnom okruženju, nego su mogla biti izolovana ili dobijena prečišćavanjem iz prirodnih izvora, ili dobijena genetičkom rekombinacijom, ili hemijskom sintezom i da onda mogu da sadrže neprirodne aminokiseline, kao što će kasnije biti opisano.
[0070] Mora se shvatiti i da se, kao što je prethodno pomenuto, pronalazak konkretnije odnosi na himerno i/ili humanizovano dvovalentno antitelo, ili bilo koji njegov dvovalentan funkcionalni fragment ili derivat, sa antagonističkom aktivnošću. Dvovalentna antitela od ranije su agonisti ili parcijalni agonisti. Monoklonsko antitelo iz pronalaska, uključujući modifikovan zglob kao što je prethodno opisano, tj. uključujući zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 21, je nov i predstavlja posebnost time što ima poboljšano antagonističko dejstvo u poređenju sa himernim ili humanizovanim antitelom 224G11 koje nema takav modifikovan zglob, kao što će se videti iz sledećih primera.
[0071] Nasuprot prethodnom znanju u struci, pronalazači su dobili poboljšanu antagonističku aktivnost bez modifikovanja formata antitela. U stvari, po poslednjem znanju, predstavljenom antitelom 5D5, bilo je neophodno da se razvije monovalentan fragment antitela da bi se generisala antagonistička aktivnost. U predmetnojoj prijavi, upotrebom zgloba iz pronalaska, po prvi put je moguće da se dobije celo dvovalentno antitelo sa povećanom antagonističkom aktivnošću, i to nasuprot opštem znanju.
[0072] U jednom poželjnom izvođenju, antitelo sadrži zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos. 22 do 28 ili sekvencu koja ima bar 80 % identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencama SEQ ID Nos. 22 do 28.
[0073] Radi veće jasnoće, sledeća tabela 2 regrupiše aminokiselinske i nukleotidne sekvence različitih poželjnih zglobova.
Tabela 2
[0074] Prema prvom pristupu, antitelo će biti definisano sekvencom svog teškog lanca. Konkretnije, antitelo, ili jedan od njegovih funkcionalnih fragmenata ili derivata, se odlikuje time što sadrži težak lanac koji sadrži bar jedan CDR odabran od CDR-ova koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID Nos.1 do 3.
[0075] Pomenute sekvence su sledeće:
- SEQ ID No.1: GYIFTAYT
- SEQ ID No.2: IKPNNGLA
- SEQ ID No.3: ARSEITTEFDY
[0076] Prema jednom poželjnom aspektu, antitelo, ili jedan od njegovih funkcionalnih fragmenata ili derivata, sadrži težak lanac koji sadrži bar jedan, poželjno dva, a najpoželjnije tri, CDR-a odabrana od CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3, gde:
- CDR-H1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.1,
1
- CDR-H2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.2,
- CDR-H3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.3.
[0077] U drugom pristupu, antitelo će biti definisano sekvencom svog lakog lanca. Konkretnije, prema drugom konkretnom aspektu, antitelo, ili jedan od njegovih funkcionalnih fragmenata ili derivata, se odlikuje time što sadrži lak lanac koji sadrži bar jedan CDR odabran od CDR-ova koji sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID Nos.5 do 7.
[0078] Pomenute sekvence su sledeće:
SEQ ID No.5: ESVDSYANSF
SEQ ID No.6: RAS
SEQ ID No.7: QQSKEDPLT
[0079] Prema jednom poželjnom aspektu, antitelo, ili jedan od njegovih funkcionalnih fragmenata ili derivata, sadrži lak lanac koji sadrži bar jedan, poželjno dva, a najpoželjnije tri, CDR-a odabrana od CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3, gde:
- CDR-L1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.5,
- CDR-L2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.6,
- CDR-L3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.7.
[0080] Mišji hibridom sposoban da sekretuje monoklonska antitela opisana ovde, naročito hibridom mišjeg porekla, je deponovan u CNCM (Institut Pasteur, Paris, France), 14.03.2007., pod brojem CNCM I-3731.
[0081] U predmetnoj prijavi, poželjno je da IgG1 dobiju efektorske funkcije, najpoželjnije ADCC i CDC.
[0082] Stručnjak u ovoj oblasti će prepoznati da efektorske funkcije uključuju, na primer, vezivanje C1q; citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; i nishodnu regulaciju receptora na ćelijskoj površini (npr. B-ćelijski receptor; BCR).
[0083] Poželjno je da antitela prema ovom pronalasku budu specifična monoklonska antitela, naročito mišja, himernog ili humanizovanog porekla, koja se mogu dobiti u skladu sa standardnim metodima dobro poznatim stručnjaku u ovoj oblasti.
[0084] Uopšteno, za dobijanje monoklonskih antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata ili derivata, naročito mišjeg porekla, moguće je koristiti tehnike koje su posebno opisane u priručniku "Antitela" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 726, 1988) ili tehniku dobijanja iz hibridoma koju su opisali Kohler i Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).
[0085] Monoklonska antitela opisana ovde se mogu dobiti, na primer, iz životinjske ćelije imunizovane na c-Met, ili na jedan od njegovih fragmenata koji sadrže epitop koji specifično prepoznaju navedena monoklonska antitela. Navedeni c-Met, ili jedan od njegovih navedenih fragmenata, se naročito mogu proizvesti uobičajenim metodima rada, genetskim rekombinovanjem počev od sekvence nukleinske kiseline koja se sadrži u cDNK sekvenci koja kodira c-Met ili sintezom peptida počev od sekvence aminokiselina koja je sadržana u peptidnoj sekvenci c-Met.
[0086] Monoklonska antitela opisana ovde mogu, na primer, da se prečišćavaju na afinitetnoj koloni na kojoj je prethodno imobilisan c-Met ili jedan od njegovih fragmenata koji sadrži epitop koji specifično prepoznaju navedena monoklonska antitela prema pronalasku. Konkretnije, navedena monoklonska antitela mogu da se prečišćavaju hromatografijom na proteinu A i/ili G, iza koje može i ne mora da sledi jonoizmenjivačka hromatografija sa ciljem da se eliminišu zaostala proteinska zagađenja, kao i DNK i LPS, koja je sa svoje strane praćena ili ne ekskluzionom hromatografijom na Sepharose™ gelu da bi se eliminisali potencijalni agregati nastali zbog prisustva dimera ili drugih multimera. U čak još poželjnijem maniru, sve ove tehnike se mogu koristiti simultano ili sukcesivno.
[0087] Predmetno antitelo, ili njegov dvovalentni funkcionalni fragment ili derivat, se poželjno sastoji od himernog antitela.
[0088] Pod himernim antitelom se podrazumeva antitelo koje sadrži prirodan varijabilni region (lakog lanca i teškog lanca) izveden iz antitela date vrste u kombinaciji sa konstantnim regionima lakog lanca i teškog lanca antitela vrste koja je heterologna navedenoj datoj vrsti (npr. miš, konj, zec, pas, krava, kokoška, itd.).
[0089] Antitela ili njihovi fragmenti himernog tipa opisani ovde se mogu praviti korišćenjem tehnika genetičkog rekombinovanja. Na primer, himerno antitelo se može proizvoditi kloniranjem rekombinantne DNK koja sadrži promotor i sekvencu koja kodira varijabilni region ne-humanog, naročito mišjeg, monoklonskog antitela i sekvencu koja kodira konstantan region humanog antitela. Himerno antitelo koje kodira takav rekombinantan gen će biti, na primer, mišje-čovečja himera, gde specifičnost ovog antitela određuje varijabilni region izveden iz mišje DNK, a njegov izotip određuje konstantan region izveden iz humane DNK. Za metode dobijanja himernih antitela, moguće je, na primer, referisati na dokumente Verhoeyn et al. (BioEssays, 8:74, 1988), Morrison et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6851-6855, 1984) ili US 4,816,567.
[0090] Konkretnije, navedeno antitelo, ili njegov funkcionalni fragment ili derivat, sadrži himeran varijabilni domen teškog lanca sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 46 ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.46.
[0091] Konkretnije, navedeno antitelo, ili njegov funkcionalni fragment ili derivat, sadrži himeran varijabilni region lakog lanca sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 47 ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.47.
1
[0092] Konkretnije, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment ili derivat, koje je nazvano [224G11] [IgG2chim], sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 46, varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 47 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.22.
[0093] U jednom drugom aspektu, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment ili derivat, koje je nazvano [224G11] [TH7chim], sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 46, varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 47 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28.
[0094] U jednom drugom aspektu, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment ili derivat, koje je nazvano [224G11] [MHchim], sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 46, varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 47 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.23.
[0095] U jednom drugom aspektu, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment ili derivat, koje je nazvano [224G11] [MUP9Hchim], sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 46, varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 47 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.26.
[0096] U jednom drugom aspektu, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment ili derivat, koje je nazvano [224G11] [MMCHchim], sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 46, varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 47 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.24.
[0097] Predmetno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment ili derivat, se poželjno sastoji od humanog antitela.
[0098] Termin "humano antitelo" uključuje sva antitela koja imaju jedan ili više varijabilnih i konstantnih regiona izvedenih iz sekvence humanog imunoglobulina. U jednom poželjnom izvođenju, svi varijabilni i konstantni domeni (ili regioni) su izvedeni iz sekvence humanog imunoglobulina (potpuno humano antitelo). Drugim rečima, on uključuje svako antitelo koje ima varijabilne i konstantne regione (ako ih ima) izvedene iz humane embrionske imunoglobulinske sekvence, tj. koje poseduje aminokiselinsku sekvencu koja odgovara onoj antitela koje je napravio čovek i/ili je napravljena upotrebom bilo koje od tehnika za pravljenje humanih antitela, poznate stručnjaku.
[0099] U jednom rešenju, humana monoklonska antitela proizvodi hibridom koji uključuje B ćeliju dobijenu iz transgene ne-humane životinje, npr., transgenog miša, koji ima genom koji sadrži humani transgen teškog lanca i transgen lakog lanca fuzionisane u imortalizovanoj ćeliji.
[0100] Kao primer takvog transgenog miša, može se pomenuti XENOMOUSE™ koji je inženjerisani soj miša koji sadrži velike fragmente humanih imunoglobulinskih lokusa i deficijentan je u proizvodnji mišjih antitela (Green at al., 1994, Nature Genetics, 7:13-21).
1
XENOMOUSE™ proizvodi repertoar potpuno humanih antitela odraslog čoveka i generiše antigen-specifična humana monoklonska antitela. Druga generacija XENOMOUSE™ sadrži probližno 80% repertoara humanih antitela (Green & Jakobovits, 1998, J. Exp. Med., 188:483-495).
[0101] Svaka druga tehnika koja je poznata stručnjacima u ovoj oblasti, kao što je tehnika ispoljavanja na fazima, može biti korišćena za pravljenje humanog antitela prema pronalasku.
[0102] Antitelo iz pronalaska, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment ili derivat, se poželjno sastoji od humanizovanog antitela.
[0103] Pod izrazom "humanizovano antitelo", podrazumeva se antitelo koje sadrži CDR regione izvedene iz antitela koja nisu humanog porekla, a ostali delovi molekula antitela su izvedeni iz jednog (ili iz nekoliko) humanog antitela. Štaviše, neki od ostataka segmenata skeletona (zvani FR) se mogu modifikovati da bi se sačuvao afinitet vezivanja (Jones et al., Nature, 321:522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332:323-327, 1988).
[0104] Humanizovana antitela prema pronalasku ili njihovi fragmenti se mogu dobijati tehnikama poznatim stručnjaku (kakve su, na primer, one opisane u dokumentima Singer et al., J. Immun. 150:2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; ili Bebbington et al., Bio/Technology, 10:169-175, 1992).
[0105] Drugi metodi humanizacije su poznati stručnjaku u ovoj oblasti, na primer, metod "CDR kalemljenja" koji je opisao Protein Design Lab (PDL) u patentnim prijavama EP 0451 261, EP 0 682 040, EP 0 939 127, EP 0 566 647 ili US 5,530,101, US 6,180,370, US 5,585,089 and US 5,693,761. Mogu se pomenuti i sledeće patentne prijave: US 5,639,641; US 6,054,297; US 5,886,152 i US 5,877,293.
[0106] Konkretnije, navedeno antitelo, ili njegov funkcionalan fragment ili derivat, sadrži humanizovan varijabilni domen teškog lanca sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4 ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.4.
[0107] Konkretnije, navedeno antitelo, ili njegov funkcionalani fragment ili derivat, sadrži humanizovan varijabilni domen lakog lanca sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 8, 9 ili 10 ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.8, 9 ili 10.
1
[0108] Konkretnije, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment ili derivat, koje je nazvano [224G11] [IgG2Hz1], sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4, varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 8 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.22.
[0109] U jednom drugom aspektu, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, koje je nazvano [224G11] [IgG2Hz2], sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.4, varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 9 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.22.
[0110] U jednom drugom aspektu, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, koje je nazvano [224G11] [IgG2Hz3], sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.4, varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 10 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.22.
[0111] U jednom drugom aspektu, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, koje je nazvano [224G11] [TH7Hz1], sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.4, varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 8 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28.
[0112] U jednom drugom aspektu, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment ili derivat, koje je nazvano [224G11] [TH7z2], sadrži varijabilni domen teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.4, varijabilni domen lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 9 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28.
[0113] U jednom drugom aspektu, poželjno antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalan fragment, prema pronalasku, koje je nazvano [224G11] [TH7Hz3], sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4, varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 10 i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28.
[0114] U jednom drugom aspektu, antitela iz pronalaska mogu da se opišu preko svojih kompletnih teških i lakih lanaca, respektivno.
[0115] Kao primer, antitelo [224G11] [IgG2chim] sadrži kompletan težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 50, ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No. 50 i kompletan lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 52, ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.52.
[0116] Kao još jedan primer, antitelo [224G11] [TH7chim] sadrži kompletan težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 51, ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No. 51 i kompletan lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 52, ili sekvencu koja ima bar 80 % identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.52.
1
[0117] Kao još jedan primer, antitelo [224G11] [IgG2Hz1] sadrži kompletan težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.36, ili sekvencu koja ima bar 80 % identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No. 36 i kompletan lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 38, ili sekvencu koja ima bar 80 % identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.38.
[0118] Kao još jedan primer, antitelo [224G11] [IgG2Hz2] sadrži kompletan težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 36, ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No. 36 i kompletan lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 39, ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.39.
[0119] Kao još jedan primer, antitelo [224G11] [IgG2Hz3] sadrži kompletan težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 36, ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No. 36 i kompletan lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 40, ili sekvencu koja ima bar 80 % identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.40.
[0120] Kao još jedan primer, antitelo [224G11] [TH7Hz1] sadrži kompletan težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 37, ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No. 37 i kompletan lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 38, ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.38.
[0121] Kao još jedan primer, antitelo [224G11] [TH7Hz2] sadrži kompletan težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 37, ili sekvencu koja ima bar 80% identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No. 37 i kompletan lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 39, ili sekvencu koja ima bar 80 % identičnosti posle optimalnog poravnanja sa sekvencom SEQ ID No.39.
[0122] Antitelo [224G11] [TH7Hz3] iz pronalaska sadrži kompletan težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 37 i kompletan lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.40.
[0123] Pod "funkcionalan fragment" antitela podrazumeva se naročito fragment antitela, kao što je Fv, scFv (sc za jedan jedini lanac), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc fragmenti ili dijatela, ili bilo koji fragment čije bi vreme poluživota bilo produženo hemijskom modifikacijom, kao što je adicija poli(alkilen) glikola kao što je poli(etilen) glikol ("PEGilacija") (pegilovani fragmenti se zovu Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')2-PEG ili Fab'-PEG) ("PEG" za poli(etilen) glikol), ili ugradnjom u lipozom, gde navedeni fragmenti imaju bar jedan od karakterističnih CDR-ova sekvence SEQ ID Nos. 1 do 3 i 5 do 7, a naročito da je sposoban da ispolji na opšti način makar delimičnu aktivnost antitela iz kog je potekao, kao što je konkretno kapacitet da prepozna i da se veže za c-Met, i, ako je potrebno, da inhibira aktivnost c-Met.
[0124] Poželjno, navedeni funkcionalni fragmenti će biti sačinjeni od ili će sadržati deo sekvence teškog ili lakog varijabilnog lanca antitela iz kog su izvedeni, gde je navedeni deo sekvence dovoljan da zadrži istu specifičnost vezivanja kao antitelo iz kog je potekao i dovoljan afinitet, poželjno bar 1/100, u poželjnijem vidu 1/10, onoga antitela iz kog je
1
potekao, u odnosu na c-Met. Takav funkcionalni fragment će sadržati najmanje 5 aminokiselina, poželjno 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 25, 50 i 100 konsekutivnih aminokiselina sekvence antitela iz kog je potekao.
[0125] Poželjno, ovi funkcionalni fragmenti će biti fragmenti tipa Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc ili dijatela, koji uopšteno imaju istu specifičnost vezivanja kao antitelo iz kog su potekli. Poželjnije, ovi fragmenti su odabrani od dvovalentnih fragmenata kao što su F(ab')2fragmenti. Fragmenti antitela se mogu dobiti počev od antitela kao što su ona opisana gore, metodima kao što je digestija enzimima, kakav je pepsin ili papain i/ili cepanjem disulfidnih mostova hemijskom redukcijom. Na drugi način, fragmenti antitela se mogu dobiti tehnikama genetskog rekombinovanja takođe poznatim stručnjaku ili, drukčije, sintezom peptida pomoću, na primer, automatskih sintesajzera peptida kakvi su oni koje obezbeđuje kompanija Applied Biosystems, itd.
[0126] Pod "dvovalentan fragment" moraju se podrazumevati svi fragmenti antitela koji sadrže dva kraka a, konkretnije, F(ab')2fragmenti.
[0127] Pod "derivati" antitela podrazumeva se vezujući protein koji sadrži proteinsku strukturu (“skelu”) i bar jedan od CDR-ova odabranih iz originalnog antitela da bi se zadržao kapacitet vezivanja. Takva jedinjenja su dobro poznata stručnjaku i biće opisana detaljnije u sledećoj specifikaciji.
[0128] Konkretnije, antitelo, ili jedan od njegovih funkcionalnih fragmenata ili derivata, opisano ovde, se odlikuje time što se navedeni derivat sastoji od vezujućeg proteina koji sadrži “skelu” (scaffold) na koju je nakalemljen bar jedan CDR za očuvanje osobina prepoznavanja preko paratopa originalnog antitela.
[0129] Jedna ili nekoliko sekvenci od 6 CDR sekvenci opisanih u pronalasku se može predstaviti na proteinskoj “skeli”. U tom slučaju, proteinska “skela” reprodukuje “kičmu” proteina sa odgovarajućim savijanjima kalemljenog(-ih) CDR(-ova), time mu (ili im) omogućujući da održi svoje paratopske osobine prepoznavanja antigena.
[0130] Stručnjak zna kako da izabere proteinsku skelu na koju se može nakalemiti bar jedan CDR odabran iz originalnog antitela. Konkretnije, poznato je, da bi bila izabrana, takva skela bi trebalo da ispolji sledećih nekoliko osobina (Skerra A., J., Mol. Recogn., 13, 2000, 167-187):
- filogenetski dobra konzervacija,
- robustna arhitektura sa dobro poznatom trodimenzionalnom molekulskom organizacijom (kao što je, na primer, kristalografija ili NMR),
- mala veličina,
- nimalo ili samo nizak stepen posttranslacionih modifikacija,
- laka za proizvodnju, ekpresiju i prečišćavanje.
[0131] Takva proteinska skela može biti, ali bez ograničenja, struktura izabrana iz grupe koja se sastoji od fibronektina, i to poželjno desetog domena fibronektina tipa III (FNfn10), lipokalina, antikalina (Skerra A., J. Biotechnol., 2001, 74(4):257-75), derivata proteina Z iz domena B stafilokoknog proteina A, tioredoksina A ili bilo kog proteina sa ponovljenim domenom kao što je "ankirinski ponovak" (Kohl et al., PNAS, 2003, vol. 100, No.4, 1700-1705), "armadilski ponovak", "ponovak bogat leucinom" ili "tetratrikopeptidni ponovak".
2
[0132] Mogao bi se pomenuti i derivat skele iz toksina (kakav je, na primer toksin škorpije, insekta, biljni ili mekušca) ili inhibitori proteina neuronske azot oksid sintaze (PIN).
[0133] Kao neograničavajući primer takvih hibridnih konstrukcija, može se pomenuti insercija CDR-H1 (težak lanac) antitela na CD4, tj. 13B8.2 antitela, u jednu od eksponiranih petlji PIN-a. Osobine vezivanja dobijenog vezujućeg proteina ostaju slične originalnom antitelu (Bes et al., BBRC 343, 2006, 334-344). Može se pomenuti i kalemljenje CDR-H3 (težak lanac) VHH antitela na lizozim na petlju neokarcinostatina (Nicaise et al., 2004).
[0134] Kao što je gore pomenuto, takva proteinska skela može da sadrži od 1 do 6 CDR-ova iz originalnog antitela. U jednom poželjnom izvođenju, ali bez ikakvog ograničenja, stručnjak bi odabrao bar jedan CDR iz teškog lanca, gde je navedeni težak lanac poznat po tome što igra posebnu ulogu u specifičnosti antitela. Selekcija CDR(-ova) od interesa će biti očigledna stručnjaku poznatim metodom (BES et al., FEBS letters 508, 2001, 67-74).
[0135] Kao dokaz, ovi primeri nisu ograničavajući i svaka druga poznata ili opisana struktura (skela) mora biti uključena u ovaj opis.
[0136] Prema jednom drugom aspektu, ovde je obezbeđena izolovana nukleinska kiselina, gde je navedena nukleinska kiselina odabrana od sledećih nukleinskih kiselina:
a) nukleinska kiselina, DNK ili RNK, koja kodira antitelo ili jedan od njegovih funkcionalnih fragmenata ili derivata, opisanih ovde;
b) sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži sekvence SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No.13 i sekvence SEQ ID No.15, SEQ ID No.16 i SEQ ID No.17;
c) sekvenca nukleinske kiseline koja sadrži sekvence SEQ ID No.14 i SEQ ID No.18, 19 ili 20;
d) nukleinske kiseline RNK koje odgovaraju nukleinskim kiselinama kao što su definisane u b) ili c); i
e) nukleinske kiseline komplementarne nukleinskim kiselinama kao što je definisano u a), b) i c); i
f) nukleinska kiselina od bar 18 nukleotida sposobna da hibridizuje u uslovima visoke strogosti sa bar jednim od CDR-ova sekvenci SEQ ID Nos.11 do 13 i 15 do 17.
[0137] Pod terminima nukleinska kiselina, nukleinska sekvenca ili sekvenca nukleinske kiseline, polinukleotid, oligonukleotid, polinukleotidna sekvenca, nukleotidna sekvenca, koji će se ovde ekvivalentno koristiti, podrazumeva se precizna povezanost nukleotida, koji su modifikovani ili nemodifikovani, dozvoljavajući da fragment ili region nukleinske kiseline bude definisan, da sadrži ili ne sadrži veštačke nukleotide i da bude u stanju da jednako dobro odgovara dvolančanoj DNK, jednolančanoj DNK, kao i proizvodima transkripcije navedenih DNK.
[0138] Ovde se mora podrazumevati i da se ovaj pronalazak ne odnosi na nukleotidne sekvence u njihovom prirodnom hromozomskom okruženju, odnosno, u prirodnom stanju. Odnosi se na sekvence koje su izolovane i/ili prečišćene, odnosno, koje su odabrane direktno ili indirektno, na primer kopiranjem, gde je njihovo okruženje bar delimično modifikovano. On se, dakle, odnosi i na izolovane nukleinske kiseline dobijene genetičkom rekombinacijom posredstvom, na primer, ćelija domaćina ili dobijene hemijskom sintezom.
[0139] Hibridizacija u uslovima velike strogosti znači da su temperaturni uslovi i uslovi jonske jačine odabrani na takav način da dozvoljavaju održavanje hibridizacije dva fragmenta komplementarne DNK. Radi ilustracije, poželjno je da uslovi velike strogosti koraka hibridizacije u svrhu definisanja polinukleotidnih fragmenata opisanih gore budu sledeći.
[0140] DNK-DNK ili DNK-RNK hibridizacija se odvija u dva koraka: (1) predhibridizacija na 42°C 3 sata u fosfatnom puferu (20 mM, pH 7,5) koji sadrži 5 x SSC (1 x SSC odgovara rastvoru 0,15 M NaCl 0,015 M natrijum citrata), 50 % formamid, 7 % natrijum dodecil sulfat (SDS), 10 x Denhardt-ov rastvor, 5 % dekstran sulfat i 1 % DNK iz sperme lososa; (2) prava hibridizacija 20 sati na temperaturi koja zavisi od veličine probe (tj.: 42°C, za probu veličine > 100 nukleotida) iza koje slede 2 pranja od po 20 minuta na 20°C u 2 x SSC 2% SDS, 1 pranje od 20 minuta na 20°C u 0,1 x SSC 0,1 % SDS. Poslednje pranje se odvija u 0,1 x SSC 0,1 % SDS 30 minuta na 60°C za veličinu probe > 100 nukleotida. Uslove hibridizacije velike strogosti opisane gore za polinukleotid definisane veličine stručnjak može adaptirati za oligonukleotide veće ili manje veličine, prema uputstvu iz Sambrook et al. (1989, Molecular cloning: a laboratory manual.2nd Ed. Cold Spring Harbor).
[0141] Pronalazak se odnosi i na vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu kao što je opisana ovde.
[0142] Pronalazak je naročito usmeren na kloniranje i/ili ekspresiju vektora koji sadrže nukleotidnu sekvencu kao što je opisana ovde.
[0143] Predmetni vektori poželjno sadrže elemente koji dozvoljavaju ekspresiju i/ili sekreciju transliranih nukleotidnih sekvenci u određenu ćeliju domaćina. Vektor, prema tome, mora da sadrži promotor, signale za započinjanje i završavanje translacije, kao i odgovarajuće regione za regulaciju transkripcije. On mora da može da bude održavan na stabilan način u ćeliji domaćinu i može opciono da ima određene signale koji specifikuju sekreciju transliranog proteina. Ovi različiti elementi su odabrani i optimizovani od strane stručnjaka kao funkcija korišćene ćelije domaćina. U tom smislu, nukleotidne sekvence opisane ovde se mogu ubacivati u autonomne replikacione vektore u izabranom domaćinu, ili biti integrativni vektori izabranog domaćina.
[0144] Takvi vektori se dobijaju metodima koji se trenutno koriste u struci i dobijeni klonovi se mogu uvoditi u odgovarajućeg domaćina standardnim metodima, kao što su lipofekcija, elektroporacija, termički šok ili hemijski metodi.
[0145] Vektori opisani ovde su, na primer, vektori plazmidskog ili virusnog porekla. Korisni su za transformisanje ćelija domaćina da bi se klonirale ili eksprimirale nukleotidne sekvence opisane ovde.
[0146] Obezbeđene su i ćelije domaćini transformisane vektorom ili koje sadrže vektor opisan ovde.
[0147] Ćelija domaćin se može izabrati iz prokariotskog ili eukariotskog sistema, na primer, iz bakterijskih ćelija, ali i iz ćelija kvasca ili životinjskih ćelija, naročito sisarskih ćelija. Takođe je moguće koristiti ćelije insekata ili bijlne ćelije.
[0148] Obezbeđene su i životinje, osim čoveka, koje sadrže bar jednu ćeliju transformisanu kao što je opisano ovde.
[0149] Jedan drugi aspekt se odnosi na postupak proizvodnje antitela, ili jednog od njegovih funkcionalnih fragmenata opisanih ovde, koji se odlikuje time što obuhvata sledeće stupnjeve:
a) kultivisanje u medijumu i odgovarajućim uslovima za kultivisanje ćelije domaćina opisanim ovde i
b) sakupljanje navedenih antitela, ili jednog od njegovih funkcionalnih fragmenata, ovako proizvedenih počev od medijuma za kulture ili navedenih gajenih ćelija.
[0150] Ćelije transformisane kao što je opisano ovde se mogu koristiti u postupcima za dobijanje rekombinantnih polipeptida. Postupci za dobijanje polipeptida opisanih ovde u rekombinantnom vidu, koji se odlikuju time što koriste vektor i/ili ćeliju transformisanu vektorom opisanim ovde, su i sami obuhvaćeni predmetnim pronalaskom. Poželjno, ćelija transformisana vektorom opisanim ovde je gajena u uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju navedenog polipeptida i navedeni rekombinovani peptid se sakuplja.
[0151] Kao što je rečeno, ćelija domaćin može biti odabrana iz prokariotskog ili eukariotskog sistema. Konkretno, moguće je identifikovati nukleotidne sekvence koje olakšavaju sekreciju u takvom prokariotskom ili eukariotskom sistemu. Vektor koji nosi takvu sekvencu se, prema tome, može pogodno koristiti za proizvodnju rekombinantnih proteina, čija se sekrecija želi. Praktično, prečišćavanje ovih rekombinantnih proteina od interesa će biti olakšano činjenicom da su oni prisutni u supernatantu ćelijske kulture više nego u unutrašnjosti ćelija domaćina.
[0152] Takođe je moguće dobijati polipeptide opisane ovde hemijskom sintezom. Takav postupak dobijanja je takođe predmet ovog pronalaska. Stručnjak poznaje postupke hemijske sinteze, na primer, tehnike koje koriste čvrste faze [Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2nd ed., (1984)] ili tehnike koje koriste parcijalne čvrste faze, kondenzacijom fragmenata ili klasičnom sintezom u rastvoru. Polipeptidi dobijeni hemijskom sintezom i koji su u stanju da sadrže odgovarajuće veštačke aminokiseline su takođe obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.
[0153] Antitela, ili neki od njihovih funkcionalnih fragmenata ili derivata, koji mogu da se dobiju postupkom opisanim ovde su takođe obuhvaćeni predmetnim pronalaskom.
[0154] Pronalazak se takođe odnosi na antitelo iz pronalaska kao lek.
[0155] Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži kao aktivan princip jedinjenje koje se sastoji od antitela, ili jednog od njegovih funkcionalnih fragmenata opisanih ovde, poželjno pomešanih sa ekscipijentom i/ili farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0156] Jedno drugo rešenje pronalaska se sastoji od sastava kao što je opisan gore, koji sadrži, štaviše, kao kombinovani proizvod za simultanu, odvojenu ili konsekutivnu upotrebu, antitumorsko antitelo.
[0157] Najpoželjnije, navedeno drugo antitumorsko antitelo bi moglo da se odabere od anti-IGF-IR, anti-EGFR, anti-HER2/neu, anti-VEGFR, anti-VEGF, itd. antitela ili da bude bilo koje drugo antitumorsko antitelo poznato stručnjaku. Očigledno je da je upotreba funkcionalnih fragmenata ili derivata gore pomenutih antitela, kao drugog antitela, deo pronalaska.
2
[0158] Kao najpoželjnije antitelo, odabrana su antitela na EGFR, kao, na primer, antitelo C225 (Erbitux).
[0159] "Simultana upotreba" se podrazumeva da znači administraciju dva jedinjenja iz sastava, opisanih ovde, u jednoj jedinoj farmaceutskoj formi.
[0160] "Odvojena upotreba" se podrazumeva da znači administraciju, u isto vreme, dva jedinjenja iz sastava, opisanih ovde, u zasebnim farmaceutskim formama.
[0161] "Konsekutivna upotreba" se podrazumeva da znači sukcesivnu administraciju dva jedinjenja iz sastava, opisanih ovde, gde je svako u zasebnoj farmaceutskoj formi.
[0162] Uopšteno, sastav znatno povećava efikasnost lečenja kancera. Drugim rečima, terapijski efekat antitela na c-Met je pojačan na neočekivan način administracijom citotoksičnog sredstva. Još jedna posledična ogromna prednost koju pravi navedeni sastav se tiče mogućnosti korišćenja manjih efikasnih doza aktivnog principa, koje omogućuju da se izbegnu ili smanje rizici od pojave sekundarnih efekata, posebno efekata citotoksičnog sredstva.
[0163] Pored toga, ovaj sastav bi omogućio da se očekivani terapijski efekat dostigne brže.
[0164] Ovaj sastav se takođe može odlikovati i time što on sadrži, štaviše, kao kombinovani proizvod za simultanu, odvojenu ili konsekutivnu upotrebu, citotoksično/citostatičko sredstvo.
[0165] Pod "antikancerska terapijska sredstva" ili "citotoksična/citostatička sredstva", misli se na supstancu koja, kad se administrira subjektu, leči ili sprečava razvoj kancera u telu subjekta. Kao neograničavajući primer takvih sredstava, mogu se pomenuti sredstva za alkilovanje, antimetaboliti, antitumorski antibiotici, inhibitori mitoze, inhibitori hromatinskih funkcija, sredstva protiv angiogeneze, antiestrogeni, antiandrogeni ili imunomodulatori.
[0166] Takva sredstva su, na primer, navedena u izdanju VIDAL 2001., na strani posvećenoj jedinjenjima vezanim za članak iz kancerologije i hematologije "Citotoksici", gde su ova citotoksična jedinjenja, navedena sa referencom na taj dokument, navedena ovde kao poželjna citotoksična sredstva.
[0167] Konkretnije, poželjna su sledeća sredstva.
[0168] "Sredstvo za alkilovanje" se odnosi na svaku supstancu koja može unakrsno da veže ili da alkiluje bilo koji molekul, poželjno nukleinsku kiselinu (npr., DNK), unutar ćelije. Primeri sredstava za alkilovanje uključuju azotni iperit kao što je mehloretamin, hlorambukol, melfalen, hloridrat, pipobromen, prednimustin, dinatrijum fosfat ili estramustin; oksazoforine kao što je ciklofosfamid, altretamin, trofosfamid, sulfofosfamid ili ifosfamid; aziridin ili iminetilene kao što je tiotepa, trietilenamin ili altetramin; nitrozoureu kao što je karmustin, streptozocin, fotemustin ili lomustin; alkil-sulfonate kao što je busulfan, treosulfan ili improsulfan; triazene kao što je dakarbazin; ili komplekse platine kao što je cisplatina, oksaliplatin i karboplatin.
[0169] "Antimetaboliti" se odnose na supstance koje blokiraju rast i/ili metabolizam ćelije ometajući određene aktivnosti, obično, sintezu DNK. Primeri antimetabolita uključuju metotreksat, 5-fluoruracil, floksuridin, 5-fluorodezoksiuridin, kapecitabin, citarabin, fludarabin, citozin arabinozid, 6-merkaptopurin (6-MP), 6-tioguanin (6-TG), hlorodezoksiadenozin, 5-azacitidin, gemcitabin, kladribin, dezoksikoformicin i pentostatin.
[0170] "Antitumorski antibiotici" se odnose na jedinjenja koja mogu da spreče ili da inhibiraju sintezu DNK, RNK i/ili proteina. Primeri antitumorskih antibiotika uključuju doksorubicin, daunorubicin, idarubicin, valrubicin, mitoksantron, dactinomycin, mitramicin, plikamicin, mitomicin C, bleomicini i prokarbazin.
[0171] "Inhibitori mitoze" sprečavaju normalno odvijanje ćelijskog ciklusa i mitoze. Uopšteno, inhibitori mikrotubula ili taksoidi kakav je paklitaksel i docetaksel su u stanju da inhibiraju mitozu. Vinka alkaloid kakvi su vinblastin, vinkristin, vindezin i vinorelbin su takođe u stanju da inhibiraju mitozu.
[0172] "Inhibitori hromatinskih funkcija" ili "inhibitori topoizomeraze" se odnose na supstance koje inhibiraju normalno funkcionisanje proteina koji modeluju hromatin kao što je topoizomeraza I ili topoizomeraza II. Primeri inhibitora hromatinskih funkcija uključuju, za topoizomerazu I, kamptotecin i njegove derivate kao što je topotekan ili irinotekan, i, za topoizomerazu II, etopozid, etopozid fosfat i tenipozid.
[0173] "Sredstvo protiv angiogeneze" se odnosi na bilo koji lek, jedinjenje, supstancu ili agens koji inhibira rast krvnih sudova. Primeri sredstava protiv angiogeneze uključuju, ali ni na koji način nisu ograničeni na, razoksin, marimastat, batimastat, prinomastat, tanomastat, ilomastat, CGS-27023A, halofuginon, COL-3, neovastat, BMS-275291, talidomid, CDC 501, DMXAA, L-651582, skvalamin, endostatin, SU5416, SU6668, interferon-alfa, EMD121974, interleukin-12, IM862, angiostatin i vitaksin.
[0174] "Antiestrogen" ili "sredstvo protiv estrogena" se odnosi na bilo koju supstancu koja smanjuje, antagonizuje ili inhibira dejstvo estrogena. Primeri sredstava protiv estrogena su tamoksifen, toremifen, raloksifen, droloksifen, iodoksifen, anastrozol, letrozol i eksemestan.
[0175] "Antiandrogeni" ili "sredstva protiv androgena" se odnosi na bilo koju supstancu koja smanjuje, antagonizuje ili inhibira dejstvo androgena. Primeri antiandrogena su flutamid, nilutamid, bikalutamid, sprironolakton, ciproteron acetat, finasterid i cimitidin.
[0176] "Imunomodulatori" su supstance koje stimulišu imuni sistem.
[0177] Primeri imunomodulatora uključuju interferon, interleukin kao što je aldesleukin, OCT-43, denileukin diflitoks i interleukin-2, faktore nekroze tumora kao što je tasonermin ili druge imunomodulatore kao što je lentinan, sizofiran, rokvinimeks, pidotimod, pegademaza, timopentin, poli I:C ili levamisol u konjunkciji sa 5-fluorouracilom.
[0178] Za više detalja, stručnjak bi mogao da se obrati priručniku koji je izdala "Association Française des Enseignants de Chimie Thérapeutique", pod naslovom "Traité de chimie thérapeutique", vol. 6, Médicaments antitumoraux et perspectives dans le traitement des kancers, izdanje TEC & DOC, 2003.
[0179] Takođe treba pomenuti kao hemijska sredstva ili citotoksična sredstva, sve inhibitore kinaze kao što je, na primer, gefitinib ili erlotinib.
2
[0180] U jednom naročito poželjnom izvođenju, navedeni sastav kao kombinovani proizvod prema pronalasku se odlikuje time što je navedeno citotoksično sredstvo hemijski kuplovano sa navedenim antitelom za simultanu upotrebu.
[0181] Da bi se olakšalo kuplovanje navedenog citotoksičnog sredstva i navedenog antitela prema pronalasku, specijalno je omogućeno da se uvedu spejser molekuli između dva jedinjenja koja se kupluju, kao što su poli(alkilen) glikoli kao poletilen glikol, ili aminokiseline, ili, u jednom drugom izvođenju, da se koriste aktivni derivati navedenih citotoksičnih sredstava u koje su uvedene funkcionalne grupe sposobne da reaguju sa navedenim antitelom prema pronalasku. Ove tehnike kuplovanja su dobro poznate stručnjaku i neće se zadržavati na njima u ovom opisu.
[0182] Pronalazak se odnosi, u jednom drugom aspektu, na sastav koji se odlikuje time što je bar jedno od navedenih antitela, ili jedan od njihovih funkcionalnih fragmenata ili derivata, konjugovan sa ćelijskim toksinom i/ili radioaktivnim elementom.
[0183] Poželjno je da navedeni toksin ili navedeni radioaktivni element bude u stanju da inhibira bar jednu ćelijsku aktivnost ćelija koje eksprimiraju c-Met, u poželjnijem vidu, da bude u stanju da spreči rast ili proliferaciju navedenih ćelija, a naročito da potpuno inaktivira navedene ćelija.
[0184] Poželjno je, takođe, da navedeni toksin bude enterobakterijski toksin, naročito Pseudomonas egzotoksin A.
[0185] Radioaktivni elementi (ili radioizotopi) koji su poželjno konjugovani sa antitelima koja se koriste u terapiji su radioizotopi koji emituju gama zrake i to su poželjno jod<131>, itrijum<90>, zlato<199>, paladijum<100>, bakar<67>, bizmut<217>i antimon<211>. Radioizotopi koji emituju beta i alfa zrake se takođe mogu koristiti u terapiji.
[0186] Pod toksin ili radioaktivni element konjugovan sa bar jednim antitelom, ili jednim od njegovih funkcionalnih fragmenata prema pronalasku, se misli na bilo koje sredstvo koje omogućava navedenom toksinu ili navedenom radioaktivnom elementu da se veže za bar jedno navedeno antitelo, naročito kovalentnim kuplovanjem dva jedinjenja, sa ili bez uvođenja vezujućeg molekula.
[0187] Među sredstvima koja omogućavaju vezivanje na hemijski (covalent), elektrostatički ili nekovalentan način svih ili dela komponenata konjugata, naročito treba pomenuti benzokinon, karbodiimid, a pogotovo EDC (1-etil-3-[3-dimetil-aminopropil]-karbodiimid hidrohlorid), dimaleimid, ditiobis-nitrobenzojevu kiselinu (DTNB), N-sukcinimidil S-acetil tio-acetat (SATA), agense za premošćavanje koji imaju jednu ili više fenilazidnih grupa koje reaguju sa ultraljubičastom svetlošću (U.V.) i poželjno N-[-4-(azidosalicilamino)butil]-3'-(2'-piridilditio)-propionamid (APDP), N-sukcinimid-il 3-(2-piridilditio)propionat (SPDP), 6-hidrazino-nikotinamid (HYNIC).
[0188] Još jedan vid kuplovanja, naročito za radioaktivne elementee, se može sastojati od upotrebe bifunkcionalnog jonskog helatora.
[0189] Među ovim helatima, mogu se pomenuti helati izvedeni iz EDTA (etilendiamintetrasirćetna kiselina) ili iz DTPA (dietilentriaminpentasirćetna kiselina) koji su razvijeni za vezivanje metala, posebno radioaktivnih metala i imunoglobulina. Prema tome,
2
DTPA i njegovi derivati se mogu supstituisati različitim grupama na ugljenikovom lancu da bi se povećala stabilnost i krutost kompleksa ligand-metal (Krejcarek et al. (1977); Brechbiel et al. (1991); Gansow (1991); US patent 4,831,175).
[0190] Na primer, dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA) i njeni derivati, koji se široko koriste u medicini i biologiji već dugo vreme, bilo u slobodnom obliku, bilo u obliku kompleksa sa jonom metala, imaju izvanrednu osobinu da formiraju stabilne helate sa jonima metala i da se kupluju sa proteinima od terapijskog ili dijagnostičkog interesa, kao što su antitela, za razvoj radioimunokonjugata u terapiji kancera (Meases et al., 1984; Gansow et al., 1990).
[0191] Takođe je poželjno da bar jedno navedeno antitelo koje formira navedeni konjugat prema pronalasku bude odabrano od njegovih funkcionalnih fragmenata, naročito fragmenata kojima je odsečena njihova Fc komponenta kakvi su scFv fragmenti.
[0192] Kao što je već pomenuto, u jednom poželjnom izvođenju pronalaska, navedeno citotoksično/citostatičko sredstvo ili navedeni toksin i/ili radioaktivni element je hemijski kuplovan sa bar jednim od elemenata navedenog sastava za simultanu upotrebu.
[0193] Ovaj pronalazak obuhvata opisani sastav kao lek.
[0194] Ovaj pronalazak obuhvata i upotrebu sastava prema pronalasku za dobijanje leka.
[0195] U jednom drugom aspektu, pronalazak se bavi upotrebom antitela, ili jednog od njegovih funkcionalnih fragmenata ili derivata, i/ili sastava, kao što je gore opisan, za dobijanje leka namenjenog da inhibira rast i/ili proliferaciju tumorskih ćelija.
[0196] Još jedan aspekt pronalaska se sastoji u upotebi antitela, ili jednog od njegovih funkcionalnih fragmenata ili derivata i/ili sastava, kao što je gore opisan, ili gore pomenutoj upotebi, za dobijanje leka namenjenog za sprečavanje ili lečenje kancera.
[0197] Predmetni pronalazak takođe obuhvata metod namenjen da inhibira rast i/ili proliferaciju tumorskih ćelija u pacijentu, koji obuhvata administraciju pacijentu kome je potrebno antitelo ili jedan od njegovih funkcionalnih fragmenata ili derivata prema pronalasku, antitela proizvedena od strane hibridoma prema pronalasku ili sastava prema pronalasku. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje metod za sprečavanje ilil lečenje kancera u pacijentu kome je to potrebno, koji obuhvata administraciju pacijentu antitela ili jednog od njegovih funkcionalnih fragmenata ili derivata opisanih ovde, antitela proizvedena od strane hibridoma prema pronalasku ili sastava opisanog ovde.
[0198] U jednom posebnom poželjnom aspektu, navedeni kancer je kancer odabran od kancera prostate, osteosarkoma, kancera pluća, kancera dojke, kancera endometrijuma, glioblastoma ili kancera kolona.
[0199] Kao što je ranije objašnjeno, prednost pronalaska je što omogućava tretman kancera koji su vezani za HGF-zavisnu i nezavisnu aktivaciju Met.
[0200] Ovaj pronalazak, u još jednom aspektu, obuhvata metod in vitro dijagnostikovanja bolesti indukovanih prekomernom ekspresijom ili nedovoljnom ekspresijom receptora c-Met, počev od biološkog uzorka u kom se sumnja na abnormalno prisustvo receptora c-Met, gde se
2
navedeni metod odlikuje time što sadrži korak u kom se navedeni biološki uzorak dovodi u kontakt sa antitelom opisanim ovde i gde je moguće, potrebi, da navedeno antitelo bude obeleženo.
[0201] Poželjno je da navedene bolesti, povezane sa abnormalnim prisustvom receptora c-Met u navedenom dijagnostičkom metodu, budu kanceri.
[0202] Navedeno antitelo, ili jedan od njegovih funkcionalnih fragmenata, može biti prisutno u formi imunokonjugata ili obeleženog antitela tako da se dobije detektabilan i/ili kvantifikabilan signal.
[0203] Оbeležena аntitela ili njihovi funkcionalni fragmenti uključuju, na primer, antitela koja se nazivaju imunokonjugati koji mogu biti konjugovani, na primer, sa enzimima kao što je peroksidaza, alkalna fosfataza, beta-D-galaktozidaza, glukozna oksidaza, glukozna amilaza, karbonska anhidraza, acetilholinesteraza, lizozim, malat dehidrogenaza ili glukozna 6-fosfat dehidrogenaza ili sa molekulom kakav je biotin, digoksigenin ili 5-bromodezoksiuridin. Fluorescentni obeleživači takođe mogu biti konjugovani sa antitelima ili sa njihovim funkcionalnim fragmentima opisanim ovde i posebno uključuju fluorescein i njegove derivate, fluorohrom, rodamin i njegove derivate, GFP (GFP za "Green Fluorescent Protein", zeleni fluorescentni protein), danzil, umbeliferon, itd. U takvim konjugatima, antitela iz pronalaska ili njihovi funkcionalni fragmenti se mogu dobijati metodima poznatim stručnjaku. Oni se mogu kuplovati sa enzimima ili sa fluorescentnim obeleživačima direktno ili preko intermedijera spejser grupe ili vezujuće grupe kao što je polialdehid, kao glutaraldehid, etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA), dietilentriaminpentasirćetna kiselina (DPTA), ili u prisustvu sredstava za kuplovanje kao što su oni pomenuti gore za terapijske konjugate. Konjugati koji sadrže obeleživače fluoresceinskog tipa se mogu dobijati reakcijom sa izotiocijanatom.
[0204] Drugi konjugati takođe mogu da uključuju hemiluminiscentne obeleživače kao što su luminol i dioksetani, bioluminiscentne obeleživače kao što su luciferaza i luciferin, ili radioaktivne obeleživače kao što su jod<123>, jod<125>, jod<126>, jod<133>, brom<77>, tehnicijum<99m>, indijum<111>, indijum<113m>, galijum<67>, galijum<68>, rutenijum<95>, rutenijum<97>, rutenijum<103>, rutenijum<105>, živa<107>, živa<203>, renijum<99m>, renijum<101>, renijum<105>, skandijum<47>, telur<121m>, telur<122m>, telur<125>, tulijum<165>, tulijum<167>, tulijum<168>, fluor<18>, itrijum<199>, jod<131>. Metodi poznati stručnjaku koji postoje za kuplovanje terapijskih radioizotopa sa antitelima bilo direktno, bilo preko sredstava za heliranje, kakva su EDTA, DTPA pomenuti gore, mogu se koristiti za radioaktivne elementee koji se mogu koristiti za dijagnozu. Takođe se može pomenuti obeležavanje Na[I<125>] hloraminskim T metodom [Hunter W.M. and Greenwood F.C. (1962) Nature 194:495] ili tehnicijumom<99m>pomoću tehnike Crockford-a et al. (US patent 4,424,200) ili spojeni preko DTPA kao što je opisao Hnatowich (US patent 4,479,930).
[0205] Prema tome, antitelo ili njegov funkcionalni fragment ili derivat, opisan ovde, se može koristiti u postupku za detekciju i/ili kvantifikaciju prekomerne ekspresije ili nedovoljne ekspresije, poželjno prekomerne ekspresije, receptora c-Met u biološkom uzorku, koji se odlikuje time što obuhvata sledeće korake:
a) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa antitelom ili njegovim funkcionalnim fragmentom ili derivatom, opisanim ovde i
b) demonstracija moguće formiranog kompleksa c-Met/antitelo.
2
[0206] U jednom posebnom izvođenju, antitelo ili njegov funkcionalni fragment ili derivat, opisan ovde, može se koristiti u postupku za detekciju i/ili kvantifikaciju receptora c-Met u biološkom uzorku, za praćenje efikasnosti profilaktičkog i/ili terapijskog tretmana kancera koji zavisi od c-Met.
[0207] Opštije, antitelo ili njegov funkcionalni fragment ili derivat, opisan ovde, može se pogodno koristiti u bilo kojoj situaciji gde se ekspresija receptora c-Met mora posmatrati na kvalitativan i/ili kvantitativan način. Poželjno je da se biološki uzorak formira iz biološke tečnosti, kao što je serum, cela krv, ćelije, uzorak tkiva ili biopsije humanog porekla.
[0208] Može se koristiti bilo koja procedura ili konvencionalan test da bi se sprovela takva detekcija i/ili doziranje. Navedeni test može biti test kompeticije ili sendvič test, ili bilo koji test poznat stručnjaku koji zavisi od formiranja imunog kompleksa tipa antitelo-antigen. Sledeći prijave opisane ovde, antitelo ili njegov funkcionalni fragment ili derivat se može imobilisati ili obeležiti. Ova imobilizacija se može sprovoditi na brojnim podlogama poznatim stručnjaku. Ove podloge posebno mogu da uključe staklo, polistiren, polipropilen, polietilen, dekstran, najlon, ili prirodne ili modifikovane ćelije. Ove podloge mogu da budu ili rastvorljive ili nerastvorljive.
[0209] Kao primer, poželjan metod dovodi u igru imunoenzimske procese u skladu sa ELISA tehnikom, pomoću imunofluorescencije, ili tehnike radioimunoeseja (RIA) ili ekvivalenta.
[0210] Prema tome, ovaj pronalazak takođe sadrži komplete ili setove neophodne za sprovođenje metoda dijagnoze bolesti indukovanih prekomernom ekspresijom ili nedovoljnom ekspresijom c-Met receptora ili za sprovođenje postupka za detekciju i/ili kvantifikaciju prekomerne ekspresije ili nedovoljne ekspresije c-Met receptora u biološkom uzorku, poželjno prekomerne ekspresije navedenog receptora, koji se odlikuje time što navedeni komplet ili set sadrži sledeće elemente:
a) antitelo, ili njegov funkcionalni fragment ili derivat, opisan ovde;
b) opciono, reagense za formiranje medijuma pogodnog za imunološku reakciju;
c) opciono, reagense koji omogućuju demonstraciju kompleksa c-Met/antitelo proizvedenih u imunološkoj reakciji.
[0211] Predmet pronalaska je takođe upotreba antitela ili sastava prema pronalasku za dobijanje leka namenjenog za specifično dovođenje biološki aktivnog jedinjenja do ćelija koje eksprimiraju ili prekomerno eksprimiraju c-Met receptor.
[0212] Ovde se pod biološki aktivnim jedinjenjem podrazumeva svako jedinjenje sposobno da moduliše, naročito da inhibira, aktivnost ćelija, naročito njihov rast, njihovu proliferaciju, transkripciju ili gensku translaciju.
[0213] Ovde je obezbeđen i in vivo dijagnostički reagens koji sadrži antitelo prema pronalasku, ili njegov funkcionalni fragment ili derivat, poželjno obeleženo, naročito radioaktivno obeleženo, i njegova upotreba u medicinskom imidžingu, naročito za detekciju kancera povezanog sa ekspresijom ili prekomernom ekspresijom c-Met receptora u ćeliji.
[0214] Pronalazak se takođe odnosi na sastav kao kombinovani proizvod ili na konjugat antic-Met/toksin ili radioaktivni element, prema pronalasku, kao lek.
2
[0215] Poželjno, navedeni sastav kao kombinovani proizvod ili navedeni konjugat prema pronalasku će biti pomešan sa ekscipijentom i/ili farmaceutski prihvatljivim nosačem.
[0216] U predmetnom opisu, farmaceutski prihvatljiv nosač označava jedinjenje ili kombinaciju jedinjenja koja ulaze u farmaceutski sastav ne izazivajući sekundarne reakcije i koji omogućuje, na primer, facilitaciju administracije aktivnog(-ih) jedinjenja, povećanje njegovog života i/ili njegove efikasnosti u telu, povećanje njegove rastvorljivosti u rastvoru ili poboljšanje njegove konzervacije. Ovi farmaceutski prihvatljivi nosači su dobro poznati i stručnjak će ih prilagoditi kao funkciju prirode i načina administracije odabranog (-ih) aktivnog(-ih) jedinjenja.
[0217] Poželjno, ova jedinjenja će biti administrirana sistemskim putem, naročito intravenskim putem, intramuskularnim, intradermalnim, intraperitonealnim ili subkutanim putem, ili oralnim putem. U jednom poželjnijem vidu, sastav koji sadrži antitela opisana ovde će biti administriran nekoliko puta, na konsekutivan način.
[0218] Njihovi načini administracije, doze i optimalne farmaceutske forme se mogu odrediti prema kriterijumima koji se uopšteno uzimaju u obzir u ustanovljavanju tretmana adaptiranog za pacijenta kao što su, na primer, starost ili telesna težina pacijenta, ozbiljnost njegovog/njenog opšteg stanja, tolerancija na tretman i zabeleženi sekundarni efekti.
[0219] Ostale osobine i prednosti su prikazane u nastavku opisa sa primerima i slikama.
OPIS SLIKA
[0220]
Slika 1: Efekat irelevantnih IgG1 Mab mišjeg i humanog porekla i PBS na fosforilaciju c-Met receptora na A549 ćelijama.
Slike 2A i 2B: Efekat mišjih i humanizovanih 224G11 Mab proizvedenih kao humani IgG1/kapa izotip na fosforilaciju c-Met receptora na A549 ćelijama.
Slika 2A: Agonistički efekat izračunat kao procenat u odnosu na maksimalnu stimulaciju fosforilacije c-Met pomoću HGF [100 ng/ml].
Slika 2B: Antagonistički efekat izračunat kao procenat inhibicije maksimalne stimulacije fosforilacije c-Met pomoću HGF [100 ng/ml].
Slike 3A i 3B: Poređenje efekata mišjeg 224G11 Mab i himernog 224G11 Mab, koji sadrže različite inženjerisane zglobne regione, na fosforilaciju c-Met receptora na A549 ćelijama.
Slika 3A: agonistički efekat izračunat kao procenat maksimalne stimulacije fosforilacije c-Met HGF-om [100 ng/ml].
Slika 3B: antagonistički efekat izračunat kao procenat inhibicije maksimalne stimulacije fosforilacije c-Met HGF-om [100 ng/ml].
Slike 4A i 4B: Poređenje efekata mišjeg 224G11 Mab i himernih i humanizovanih 224G11 Mab-ova, proizvedenih kao humani IgG2//kapa izotip, na fosforilaciju c-Met receptora na A549 ćelijama.
Slika 4A: agonistički efekat izračunat kao procenat maksimalne stimulacije fosforilacije c-Met HGF-om [100 ng/ml].
Slika 4B: antagonistički efekat izračunat kao procenat inhibicije maksimalne stimulacije fosforilacije c-Met HGF-om [100 ng/ml].
Slike 5A i 5B: Poređenje efekata mišjeg 224G11 Mab i himernih i humanizovanih 224G11 Mab-ova, proizvedenih kao inženjerisani zglobni mutant TH7IgG1/kapa, na fosforilaciju c-Met receptora na A549 ćelijama.
Slika 5A: agonistički efekat izračunat kao procenat maksimalne stimulacije fosforilacije c-Met HGF-om [100 ng/ml].
Slika 5B: antagonistički efekat izračunat kao procenat inhibicije maksimalne stimulacije fosforilacije c-Met HGF-om [100 ng/ml].
Slike 6A i 6B, Slike 7A i 7B, Slike 8A i 8B, Slike 9A i 9B, Slike 10A i 10B: BRET modeli sa slikama A: model dimerizacije c-Met i slikama B: model aktivacije c-Met.
Slika 11: prepoznavanje c-Met od strane himerne i humanizovane 224G11 forme.
Slika 12: Efekat mišjeg i himernog antitela na proliferaciju indukovanu HGF-om NCI-H441 ćelija in vitro. NCI-H441 ćelije su stavljene na ploče u medijum bez seruma.24 sata posle stavljanja na ploče, m224G11 i [224G11]chim su dodati bilo u odsustvu, bilo u prisustvu HGF. Crne strelice označavaju ležišta pokrivena samim ćelijama bilo u odsustvu ↙, bilo u prisustvu ↘ HGF. Mišje IgG1 (mlgG1) je uvedeno kao izotipska kontrola.
Slika 13: In vivo poređenje mišjeg i IgG1 himernog 224G11 Mabs u NCI-H441 modelu ksenografta.
Slike 14A i 14B: Efekat mišjeg 224G11 Mab i raznih himernih i humanizovanih verzija ovog antitela na proliferaciju NCI-H441 ćelija indukovanu HGF-om in vitro. NCI-H441 ćelije su stavljene na ploče u medijum bez seruma. 24 sata posle stavljanja na ploče, testirano antitelo je dodato bilo u odsustvu, bilo u prisustvu HGF. Na panelu su pokazani (Slika 14A), mišje m224G11, himerna IgG1 [224G11]chim, humanizovane IgG1 [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2], [224G11] [Hz3] verzije. Na panelu su predstavljeni (Slika 14B), mišje m224G11 i razne himerne IgG1 forme ([224G11] chim, [224G11] [MH chim], [224G11] [MUP9H chim], [224G11] [MMCH chim], [224G11] [TH7 chim]). Crne strelice označavaju ležišta pokrivena samim ćelijama bilo u odsustvu ↙, bilo u prisustvu ↘ HGF. Mišji IgG1 je uveden kao negativna kontrola za agonističku aktivnost. m5D5 je korišćen kao potpuna agonistička kontrola zavisna od doze.
Slika 15: Efekat mišjeg 224G11 Mab i raznih himernih i humanizovanih verzija ovog antitela na proliferaciju NCI-H441 ćelija indukovanu HGF-om in vitro. NCI-H441 ćelije su stavljene na ploče u medijum bez seruma. 24 sata posle stavljanja na ploče, testirano antitelo je dodato bilo u odsustvu, bilo u prisustvu HGF. Predstavljeni su mišje m224G11,
1
[224G11] chim, [224G11] [TH7 chim]), IgG1 himerne forme i [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz3],). Crne strelice označavaju ležišta pokrivena samim ćelijama bilo u odsustvu ↙,bilo u prisustvu ↘ HGF. Mišje IgG1 je uvedeno kao negativna kontrola za agonističku aktivnost. m5D5 je korišćen kao potpuna agonistička kontrola zavisna od doze.
PRIMERI
Primer 1: Generisanje antitela na c-Met
[0221] Da bi se napravila antitela na c-Met, 8 nedelja stari BALB/c miševi su imunizovani bilo 3 do 5 puta subkutano ćelijskom linijom transfektovanom CHO-om, koja eksprimira c-Met na svojoj plazma membrani (20x10<6>ćelija/doza/miš), bilo 2 do 3 puta fuzionim proteinom vanćelijskog domena c-Met (10-15 µg/doza/miš) (R&D Systems, Catalog # 358MT), bilo fragmentima ovog rekombinovanog proteina pomešanim sa kompletnim Freund-ovim adjuvantom za prvu imunizaciju i nekompletnim Freund-ovim adjuvantom za sledeće. Mešani protokoli u kojima su miševi dobili i CHO-cMet ćelije i rekombinovane proteine su takođe izvođeni. Tri dana pre fuzije ćelija, miševima je dat i.p. ili i.v. rekombinovan protein ili fragmenti. Zatim su slezine miševa sakupljene i fuzionisane sa SP2/0-Ag14 mijeloma ćelijama (ATCC) i podvrgnute HAT selekciji. Izvedene su četiri fuzije. Uopšteno, za dobijanje monoklonskih antitela ili njihovih funkcionalnih fragmenata, naročito mišjeg porekla, moguće je koristiti tehnike koje su naročito opisane u priručniku "Antitela" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, pp. 726, 1988) ili tehnike dobijanja hibridoma koje su opisali Kohler i Milstein (Nature, 256:495-497, 1975).
[0222] Dobijeni hibridomi su početno pregledani ELISA-om za c-Met rekombinantni protein, a zatim FACS analizom za ćelijske linije A549 NSCLC, BxPC3 pankreasa i U87-MG glioblastoma da bi se osiguralo da će proizvedena antitela biti u stanju da prepoznaju i nativni receptor na tumorskim ćelijama. Oni koji su pozitivno reagovali na ova 2 testa su amplifikovani, klonirani i skup hibridoma je sakupljen, prečišćen i pregledan za sposobnost da inhibira in vitro ćelijsku proliferaciju u BxPC3 modelu.
[0223] U tu svrhu, 50000 BxPC3 ćelija je stavljeno na ploče sa 96 ležišta u RPMI medijum, 2 mM L. glutamina, bez SVF.24 sata posle stavljanja na ploče, antitela koja će biti testirana su dodata u konačnoj koncentraciji u opsegu od 0,0097 do 40 µg/ml 60 min pre dodavanja 100 ng/ml hHGF. Posle 3 dana, ćelijama su puštani pulsevi sa 0,5 µCi [<3>H]timidina 16 sati. Količina [<3>H]timidina ugrađenog u DNK nerastvorljivu u trihlorsirćetnoj kiselini je kvantifikovana tečnim scintilacionim brojačem. Rezultati su izraženi kao sirovi podaci da bi se realno procenio intrinsični agonistički efekat svakog Mab.
[0224] Zatim su antitela koja inhibiraju bar 50% proliferacije ćelija procenjena za dejstvo na dimerizaciju c-Met i aktivaciju BRET analizom na transfektovanim ćelijama. Aktivnost c-Met receptora je kvantifikovana merenjem regrutovanja Gab1 signalizacionih molekula za aktiviran c-Met. U tu svrhu, generisane su CHO stabilne ćelijske linije koje eksprimiraju C-Met-Rluc ili C-Met-Rluc i C-Met-K1100A-YFP za dimerizaciju c-Met ili C-Met-Rluc i mutirana forma Gab1 [Maroun et al., Mol. Cell. Biol., 1999, 19:1784-1799] fuzionisana sa YFP za aktivaciju c-Met. Ćelije su raspodeljene u mikroploče sa 96 ležišta u 5 % DMEM-F12/FBS medijum za kulture jedan ili dva dana pre BRET eksperimenata. Ćelije su prvo gajene na 37°C sa 5 % CO2da bi se omogućilo ćelijama da se vežu za ploče. Ćelije su zatim
2
izgladnjivane u 200 µl DMEM/ležište preko noći. Neposredno pred eksperiment, DMEM je uklonjen i ćelije su brzo oprane PBS-om. Ćelije su inkubirane u PBS u prisustvu ili odsustvu antitela koja se testiraju ili referentnih jedinjenja, 10 min na 37°C pred dodavanje koelenterazina sa ili bez HGF u konačnoj zapremini od 50 µl. Posle inkubacije od još 10 minuta na 37°C, emisija svetlosti na 485 nm i 530 nm je merena pomoću Mithras luminometra (Berthold) (1s/talasna dužina/ležište ponovljeno 15 puta).
[0225] Odnos BRET je prethodno definisan [Angers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:3684-3689] kao: [(emisija na 530 nm) - (emisija na 485 nm) X Cf] / (emisija na 485 nm), gde Cf odgovara odnosu (emisija na 530 nm) / (emisija na 485 nm) za ćelije koje eksprimiraju sam Rluc fuzioni protein u istim eksperimentalnim uslovima. Uprošćavanje ove jednačine pokazuje da odnos BRET odgovara odnosu 530/485 nm, dobijenom kad su dva partnera bila prisutna, korigovanom za odnos 530/485 nm dobijenom pod istim eksperimentalnim uslovima, kad je samo partner fuzionisan sa R. reniformis luciferazom bio prisutan u testu. Zbog lakšeg čitanja, rezultati su izraženi u jedinicama milliBRET (mBU); mBU odgovara odnosu BRET pomnoženom sa 1000.
[0226] Posle ovog drugog in vitro testa, izabrano je antitelo 224G11 i) bez intrinsične aktivnosti kao ceo molekul u funkcionalnom testu proliferacije, ii) koje značajno inhibira proliferaciju BxPC3 i iii) koje inhibira dimerizaciju c-Met. U eksperimentima, 5D5 Mab, koje je generisao Genentech i koje je dostupno od ATCC, je dodato kao kontrola za intrinsičnu agonističku aktivnost.
Primer 2: Postupak humanizacije mišjeg 224G11 Mab kalemljenjem CDR
1°) Humanizacija varijabilnog domena lakog lanca (VL)
[0227] Kao preliminaran korak, nukleotidna sekvenca 224G11 VL je upoređena sa mišjom embrionskom genskom sekvencom uključenom u IMGT bazu podataka (http://imgt.cines.fr). Identifikovani su mišji IGKV3-5*01 i IGKJ4*01 embrionski geni koji imaju sekvencnu identičnost od 99,31 % za V region i 94,28 % za J region, respektivno. U pogledu ovih visokih homologija, 224G11VL nukleotidna sekvenca je korišćena direktno za traženje humanih homologija umesto odgovarajućih mišjih embrionskih.
[0228] U drugom koraku, tražen je humani embrionski gen koji ispoljava najveću identičnost sa 224G11VL da bi se identifikovao najbolji humani kandidat za CDR kalemljenje. Za optimizaciju selekcije, urađena su poravnanja aminokiselinskih sekvenci. Humani IGKV4-1*01 embrionski gen je dao sekvencu identičnosti od 67,30 %, ali je pokazao različitu dužinu za CDR1 (10 aminokiselina u 224G11 VL i 12 aminokiselina u IGKV4-1*01). Za J region, odabran je humani IGKJ4*02 embrionski gen (sekvencna identičnost od 77,14 %).
[0229] U sledećem koraku, mišji 224G11 VL CDR regioni su nakalemljeni na gore odabranu humanu okvirnu sekvencu. Svaka aminokiselinska pozicija je analizirana po nekoliko kriterijuma, kao što su učešće u VH/VL interfejsu, u vezivanju antigena ili u strukturi CDR, lokalizacija ostatka u 3D strukturi varijabilnog domena, CDR sidra, ostaci koji pripadaju Vernier-ovoj zoni. Konstruisane su tri humanizovane verzije, koje odgovaraju SEQ ID No. 8, SEQ ID No.9 i SEQ ID No.10 i koje sadrže respektivno četiri (4, 39, 40, 84), dva (39, 40) ili jedan (40) mišji ostatak u svojim FR regionima i CDR-ove koji odgovaraju mišjem 224G11 VL.
2°) Humanizacija varijabilnog domena teškog lanca (VH)
[0230] Kao preliminaran korak, nukleotidna sekvenca 224G11 VH je upoređena sa mišjom embrionskom genskom sekvencom uključenom u IMGT bazu podataka (http://imgt.cines.fr).
[0231] Identifikovani su mišji IGHV1-18*01, IGHD2-4*01 i IGHJ2*01 embrionski geni koji imaju sekvencnu identičnost od 92,70 % za V region, 75,00 % za D region i 89,36 % za J region, respektivno. U pogledu ovih visokih homologija, odlučeno je da se koriste direktno 224G11VH nukleotidne sekvence za traženje humanih homologija umesto odgovarajućih mišjih embrionskih.
[0232] U drugom koraku, tražen je humani embrionski gen koji ispoljava najveću identičnost sa 224G11 VH da bi se identifikovao najbolji humani kandidat za CDR kalemljenje. U tom cilju, nukleotidna sekvenca 224G11 VH je poravnata sa humanom embrionskom genskom sekvencom koja pripada IMGT bazi podataka. Humana IGHV1-2*02 V sekvenca je ispoljila sekvencnu identičnost od 75,00 % na nivou nukleotida i 64,30 % na nivou aminokiselina. Traženje homologija za J region je dovelo do identifikacije humanog IGHJ4*04 embrionskog gena sa sekvencnom identičnošću od 78,72 %.
[0233] U sledećem koraku, mišji 224G11 VH CDR regioni su nakalemljeni na gore odabranu humanu okvirnu sekvencu.. Svaka aminokiselinska pozicija je analizirana po nekoliko kriterijuma, kao što su su učešće u VH/VL interfejsu, u vezivanju antigena ili u strukturi CDR, lokalizacija ostatka u 3D strukturi varijabilnog domena, CDR sidra, ostaci koji pripadaju Vernier-ovoj zoni. Konstruisana je jedna potpuno humanizovana forma, koja odgovara SEQ ID 4; ona sadrži isključivo humane ostatke u svojim FR regionima i CDR-ove koji odgovaraju mišjem 224G11 VH.
Primer 3: Inženjerisanje poboljšanih zglobnih mutanata
[0234] Stručnjaku je dobro poznato da zglobni region silno učestvuje u fleksibilnosti varijabilnog domena imunoglobulina (videti Brekke et al., 1995; Roux et al., 1997). Tokom procesa himerizacije 224G11 Mab, mišji konstantni domen IGHG1 se zamenjuje ekvivalentnim delom IGHG1 humanog porekla. Pošto su aminokiselinske sekvence zglobnog regiona bile jako divergentne, "mišizacija" zglobnog regiona je urađena da bi se održala njegova dužina i krutost. Pošto humani IGHG2 zglobni region odgovara najbližem homologu mišjeg IGHG1 zgloba, ova sekvenca je takođe razmatrana. Konstruisan je niz od 7 različitih zglobnih sekvenci (SEQ ID No.21, SEQ ID No.22, SEQ ID No.23, SEQ ID No.24, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 27) ugrađivanjem delova mišjih IGHG1 i humanih IGHG2 zglobova u humani IGHG1 zglobni deo.
Primer 4: Proizvodnja humanizovanog 224G11 Mab i inženjerisanih zglobnih Mab formata
[0235] Sve gore opisane Mab forme koje sadrže ili himerne, humanizovane i/ili inženjerisane zglobne regione su proizvedene po tranzijentnoj transfekciji i upotrebom HEK293/EBNA sistema sa pCEP4 ekspresionim vektorom (InVitrogen, US).
[0236] Celokupna nukleotidna sekvenca koja odgovara humanizovanim verzijama varijabilnog domena lakog (SEQ ID No.18, SEQ ID No.19 i SEQ ID No.20) i teškog (SEQ ID No. 14) lanca 224G11 Mab je sintetisana globalnom genskom sintezom (Genecust,
4
Luxembourg). Oni su subklonirani u pCEP4 vektor (InVitrogen, US), noseći celokupnu kodirajuću sekvencu konstantnog domena [CH1-zglob-CH2-CH3] humanog IgG1 ili IgG2 imunoglobulina. Modifikacija zglobnog regiona je izvedena zamenom {Nhe1I-Bcl1} restrikcionog fragmenta ekvivalentnim delom koji nosi željene modifikacije, gde je svaki odgovarajući {Nhe1-Bcl1} fragment sintetisan globalnom genskom sintezom (Genecust, LU). Svi koraci kloniranja su izvedeni u skladu sa konvencionalnim tehnikama molekularne biologije kao što je opisano u Laboratorijskom priručniku (Sambrook and Russel, 2001) ili prema instrukcijama dobavljača. Svaki genetički konstrukt je potpuno validiran nukleotidnim sekvenciranjem pomoću kompleta za sekvenciranje Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied Biosystems, US) i analiziran pomoću 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, US).
[0237] HEK293 EBNA ćelije (InVitrogen, US), adaptirane na suspenziju, su rutinski gajene u balonima od 250 ml u 50 ml medijuma bez seruma, Excell 293 (SAFC Biosciences), obogaćenog 6 mM glutaminom na orbitalnoj mešalici (brzina rotacije 110 rpm). Tranzijentna transfekcija je izvedena sa 2x10<6>ćelija/ml pomoću linearnog 25 kDa polietilenimina (PEI) (Polysciences) pripremljenog u vodi u konačnoj koncentraciji od 1 mg/ml i plazmidnom DNK (konačna koncentracija od 1,25 µg/ml za plazmidni odnos 1:1 težak : lak lanac). 4 sata posle transfekcije, kultura je razblažena jednom zapreminom svežeg medijuma za kulturu da bi se dobila konačna gustina ćelija od 10<6>ćelija/ml. Postupak kultivacije je praćen na osnovu vijabilnosti ćelija i proizvodnje Mab. Tipično, kulture su održavane 4 do 5 dana. Mab-ovi su prečišćeni konvencionalnim hromatografskim pristupom na Protein A smoli (GE Healthcare, US).
[0238] Svi različiti oblici Mab su proizvedeni u količinama pogodnim za funkcionalne evaluacije. Nivoi produktivnosti su se tipično kretali između 15 i 30 mg/l prečišćenih Mab.
Primer 5: Evaluacija statusa fosforilacije c-Met ELISA testom specifičnim za fosfo-c-Met
[0239] Ovaj funkcionalni test omogućava da se prati modulacija statusa fosforilacije c-Met bilo preko samih Mab, bilo u prisustvu HGF.
[0240] A549 ćelije su zasejane na 12MW ploču u kompletnom medijumu za rast [F12K 10 % FCS]. Ćelije su izgladnjivane 16 sati pre stimulacije pomoću HGF [100 ng/ml] i svako Mab koje se testira je dodato u svojoj konačnoj koncentraciji od 30 µg/ml, 15 minuta pred stimulaciju ligandom. Ledeni pufer za lizu je dodat 15 minuta posle dodavanja HGF da bi se zaustavila reakcija fosforilacije. Ćelije su mehanički sastrugane i ćelijski lizati su pokupljeni centrifugiranjem na 13000 rpm 10 min. na 4°C i odgovaraju fazi supernatanta. Sadržaj proteina je kvantifikovan pomoću kompleta BCA (Pierce) i čuvan na -20°C do upotrebe. Status fosforilacije c-Met je kvantifikovan ELISA-om. Kozje anti-c-Met Mab (R&D, ref AF276) je korišćeno kao antitelo hvatač (premazivanje preko noći na 4°C) i posle koraka saturacije sa TBS-BSA 5% puferom (1 sat na sobnoj temperaturi (RT)), 25 µg proteinskih lizata je dodato u svako ležište premazane 96MW ploče. Posle 90 minuta inkubacije na RT, ploče su oprane četiri puta i dodato je antitelo za detekciju (anti-fosfo-c-Met Mab, usmereno protiv fosforilisanih Tyr ostataka na pozicijama 1230, 1234 i 1235). Posle još 1 sata, inkubacije i 4 pranja, dodato je anti-zečje antitelo kuplovano sa HRP (Biosource) na 1 sat na RT i urađena je detekcija luminiscencije dodavanjem Luminola. Čitanja luminiscencije su bila na multimodalnom čitaču ploča Mithras LB920 (Berthold).
[0241] I bazični nivo i onaj indukovan HGF-om [100 ng/ml] fosforilacije c-Met receptora nisu bili pogođeni ni tretmanom PBS-om, ni dodavanjem mišjih ili humanih Mab koji ne ciljaju humani c-Met receptor (Slika 1). S druge strane, mišji (m) 224G11 Mab jako inhibira fosforilaciju c-Met receptora indukovanu HGF-om [100 ng/ml] (Slika 2B) a da ne menja fosforilaciju receptora (Slika 2A). Iznenađujuće, himerna forma 224G11 Mab (224G11chim/IgG1), što znači varijabilni domen (VH+VL) iz m224G11 kombinovan sa humanim konstantnim domenom IgG1/kapa, je dala jaku (17 % maksimalnog efekta HGF, Slika 2A) agonističku aktivnost povezanu sa smanjenom antagonističkom efikasnošću (54 % inhibicije maksimalnog efekta HGF u poređenju sa m224G11 koji daje 75% inhibicije maksimalnog efekta HGF, Slika 2B). Tri humanizovane forme 224G11 Mab, [224G11]Hz1/IgG1, [224G11]Hz2/IgG1 i [224G11]Hz3/IgG1, takođe konstruisane na humanoj IgG1/kapa okosnici, su takođe dale smanjenu antagonističku efikasnost i značajnu agonističku aktivnost (11 do 24 % maksimalnog nivoa HGF) u poređenju sa mišjim 224G11 (Slike 2A i 2B). Niz inženjerisanih verzija zglobnog domena teškog lanca je konstruisan i testiran u testu za fosforilaciju c-Met receptora. Kao što je pokazano na Slici 3A, važno smanjenje agonističkog efekta vezano za hIgG1/kapa izotip je uočeno i za konstrukt zasnovan na IgG2 i za konstrukte sa inženjerisanim IgG1/kapa [MH, MUP9H i TH7]. Dobijeno je i istovremeno povećanje antagonističke efikasnosti. TH7 zglobni mutant zasnovan na hIgG1/kapa sa “najhumanijom” sekvencom, je odabran da završi postupak humanizacije. U sldećem koraku, tri humanizovane verzije varijabilnog domena 224G11 Mab su generisane kombinacijom bilo sa humanim IgG2/kapa, bilo sa TH7 inženjerisanim zglobnim konstantnim domenom na osnovu IgG1/kapa. Za hIgG2/kapa humanizovane konstrukte, humanizovana verzija Hz3 je pokazala jak agonizam (Slika 4A), a za sve tri humanizovane verzije, antagonistička efikasnost je bila ispod one nađene za mišje 224G11 Mab i uporediva sa himernim na osnovu hIgG1 Mab (56-57 % inhibicija efekta HGF, Slika 4B). S druge strane, kombinacija tri humanizovane verzije Hz1, Hz2 ili Hz3 sa inženjerisanim IgG1/TH7 mutantom je skoro potpuno obnovila osobine mišjeg 224G11 Mab u smislu slabe agonističke aktivnosti (5-6 % efekta HGF) i jake antagonističke efikasnosti (68 do 72 % inhibicije efekta HGF) fosforilacije c-Met receptora (Slike 5A i 5B). Ove varijante su mnogo poboljšane u poređenju sa himernim na osnovu IgG1 224G11 Mab, ali i sa humanizovanim formama na osnovu IgG2.
Primer 6: BRET analiza
[0242] U prvom skupu eksperimenata, kontrola je bila da irelevantan mišji IgG1, humani IgG1 i humani IgG2 nisu imali nikakav efekat na BRET signal indukovan HGF-om u oba BRET modela (reprezentativan eksperiment od 12 nezavisnih eksperimenata; Slika 6). Ovi Mab-ovi su odmah navedeni kao kontrole.
[0243] Ocenjen je efekat IgG1 himerne forme mišjeg 224G11 Mab ([224G11]chim) i na dimerizaciju c-Met i na c-met aktivaciju BRET modela. Dok je mišji 224G11 Mab inhibirao 59,4% BRET signala indukovanog HGF-om u modelu dimerizacije c-Met, [224G11]chim Mab je inhibirao samo 28,9% (Slika 7A). [224G11]chim antitelo je bilo i manje efektivno u inhibiranju c-Met aktivacije indukovane HGF-om, jer su [224G11]chim i m224G11 antitela inhibirala respektivno 34,5% i 56,4% BRET signala indukovanog HGF-om (Slika 7B). Štaviše, sam m224G11 nije imao nikakav efekat na aktivaciju c-Met, dok je [224G11]chim imao delimičan agonistički efekat na aktivaciju c-Met, koji odgovara 32,9% signala indukovanog HGF-om. Ovaj delimičan agonistički efekat [224G11]chim je takođe viđen u BRET modelu dimerizacije c-Met, pošto je sam [224G11]chim indukovao povećanje BRET koje odgovara 46,6% signala indukovanog HGF-om prema 21,3% za m224G11 (Slika 7A).
[0244] Na Slikama 8A i 8B, zglobno mutirane himerne forme 224G11 antitela su pokazale veći inhibitorni efekat na BRET signal indukovan HGF-om nego [224G11]chim, jer su one pokazale 59,7%, 64,4%, 53,2% i 73,8% inhibicije aktivacije BRET signala indukovanog HGF-om (Slika 8B) i 61,8%, 64,4% 52,5% i 64,4% inhibicije BRET signala dimerizacije c-Met indukovane HGF-om (Slika 8A) za [224G11][MH chim], [224G11][MUP9H chim], [224G11][MMCH chim] i [224G11][TH7 chim], respektivno. Nasuprot [224G11]chim, koji je imao delimičan agonistički efekat na aktivaciju c-Met, zglobno mutirane himerne forme 224G11 antitela nisu pokazale nikakav značajan efekat na samu aktivaciju c-Met (5,1%, 7,6%, -2,0% i -6,9%, respektivno) kao što je viđeno za m224G11.
[0245] Na Slici 9B, kao [224G11] [TH7 chim], 3 humanizovane verzije 224G11 IgG1 antitela sa TH7 zglobom nije indukovao nikakvo značajno povećanje BRET signala u modelu aktivacije kad je testiran sam, a pokazao je jaku inhibiciju BRET signala indukovanog HGF-om: 59,9%, 41,8% i 57,9% za Hz1, Hz2 i Hz3 forme, respektivno. Štaviše, [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz2] i [224G11] [TH7 Hz3] su inhibirali BRET signal indukovan HGF-om u modelu dimerizacije, sa 52,2%, 35,8% i 49,4%, respektivno (slika 9A).
[0246] Nasuprot [224G11]chim, sama himerna forma 224G11 IgG2 antitela ([224G11] [IgG2 chim]) nije pokazala delimičan agonistički efekat i inhibirala je 66,3% efekta HGF na aktivaciju c-Met (Slika 10B). U modelu dimerizacije c-Met, [224G11] [IgG2 chim] je inhibirao 62,4% BRET signala indukovanog HGF-om (Slika 10A).
Primer 7: Prepoznavanje c-Met od strane himernih i humanizovanih 224G11 formi
[0247] Direktna ELISA je postavljena da se odredi sposobnost vezivanja različitih himernih i humanizovanih formi za rekombinantni c-Met. Ukratko, rekombinantni dimerni c-Met od R&D Systems je premazan pri 1,25 µg/ml Immunlon II ploče sa 96 ležišta. Posle inkubacije preko noći na 4°C, ležišta su zasićena 0,5% rastvorom želatin/PBS. Ploče su zatim inkubirane 1 sat na 37°C pre dodatka dvostrukog razblaženja testiranih antitela. Ploče su inkubirane još jedan sat pre dodatka HRP kozjeg anti-mišjeg IgG za detektovanje mišjeg antitela i HRP lakog lanca kozjeg anti-humanog Kapa za prepoznavanje himernog i humanizovanog antitela. Ploče su inkubirane for 1 sat i dodat je peroksidazni supstrat TMB Uptima 5 min pre neutralizacije 1M-nom H2SO4. Rezultati prikazani na Slici 11 pokazuju da su sve testirane forme bile uporedive u prepoznavanju c-Met.
Primer 8: Efekat mišjeg i himernog 224G11 na proliferaciju NCI-H441 ćelija indukovanu HGF-om in vitro
[0248] NCI-H441 ćelije iz ATCC su rutinski gajene u RPMI 1640 medijumu (Invitrogen Corporation, Scotland, UK), 10% FCS (Invitrogen Corporation), 1% L-glutaminu (Invitrogen corporation). Za testove proliferacije, ćelije su podeljene 3 dana pre upotrebe, tako da su bile u konfluentnoj fazi rasta pre postavljanja na ploče. NCI-H441 ćelije su stavljene na ploče za kulturu tkiva sa 96 ležišta u gustini od 3,75x10<4>ćelija/ležište u 200 µl medijuma bez seruma (RPMI 1640 medijum plus 1% L-glutamin). Dvadeset četiri sata posle stavljanja na ploče, testirana antitela su dodata u NCI-H441 i inkubirana na 37°C 30 minuta pre dodavanja HGF u konačnoj koncentraciji od 400 ng/ml (5 nM) na još 142 sata. Testiran opseg doze za svako antitelo je od 10 do 0,0097 µg/ml (konačna koncentracija u svakom ležištu). U ovom eksperimentu, mišje IgG1 Mab je dodato kao mišja izotipska kontrola i testirana antitela su bila sledeća: m224G11 i njegova humana IgG1 himerna forma identifikovana kao
[224G11]chim. Ležišta pokrivena ćelijama samim -/+ HGF su takođe bila uključena. Zatim su ćelijama puštani pulsevi sa 0,25 µCi [<3>H]timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) 7 sati i 30 minuta. Količina [<3>H]timidina ugrađena u DNK nerastvorljivu u trihlorsirćetnoj kiselini je kvantifikovana tečnim scintilacionim brojačem. Rezultati su izraženi kao netransformisani cpm podaci da bi se bolje procenila potencijalna intrinsična agonistička aktivnost koja bi mogla da se javi sa anti-c-Met Mab kad se dodaju sama tumorskim ćelijama.
[0249] Rezultati opisani na Slici 12 su demonstrirali da, kao što je očekivano, mišje antitelo m224G11 ne ispoljava agonistički efekat kad se doda samo ćelijama kancera, kolika god da je testirana doza. Nije viđena nikakva značajna inhibicija proliferacije indukovane HGF-om sa izotipskom kontrolom u odnosu na varijacije cpm viđene za ovo jedinjenje u ovom eksperimentu. Kad je dodato samo, m224G11 antitelo nije pokazalo nikakav agonistički efekat u poređenju sa izotipskom kontrolom mIgG1 Mab ili samim ćelijama. Antiproliferativne aktivnosti zavisne od doze koje dostižu 78% su viđene za m224G11 (računanje % inhibicije: 100-[(cpm ćelija+testirana Mab - srednji cpm pozadine mIgG1) x 100 / (srednji cpm ćelija HGF- srednji cpm samih ćelija)]). Iznenađujuće, himerna forma 224G11 Mab je indukovala značajan, agonistički efekat zavisan od doze kad se doda sama. Ovaj agonistički efekat je imao uticaj na in vitro inhibiciju proliferacije indukovane HGF-om koja se pomerila sa 78% za mišje 224G11 do 50% za njegovu himernu formu. Da bi se odredilo da li je takva "niža" in vitro intrinsična agonistička aktivnost kompatibilna sa nepromenjenim in vivo efektom, oba antitela m224G11 i [224G11]chim su napravljena za in vivo testiranje. Pošto je, u prethodnim studijama, doza od 30 µg/miš pokazala značajnu in vivo aktivnost, ta doza je odabrana za evaluaciju in vivo.
Primer 9: In vivo poređenje mišjeg i himernog 224G11 Mab u modelu NCI-H441 ksenografta
[0250] NCI-H441 je izvedena iz papilarnog adenokarcinoma pluća, eksprimira visoke nivoe c-Met i demonstrira konstitutivnu fosforilaciju c-Met RTK.
[0251] Da bi se procenio in vivo efekat antitela na NCI-H441 model ksenografta, šest do osam nedelja stari atimični miševi su gajeni u sterilisanim kavezima sa filterom u poklopcu, održavani u sterilnim uslovima i manipulisani prema francuskim i evropskim utstvima. Miševima je subkutano injektirano 9x10<6>ćelija. Zatim, šest dana posle implantacije ćelija, tumori su bili merljivi (približno 100 mm<3>), životinje su podeljene u grupe od po 6 miševa sa uporedivom veličinom tumora i tretirane prvo udarnom dozom od 60 µg antitela/miš, a zatim dvaput nedeljno dozom od 30 µg svakog testiranog antitela. Miševi su praćeni tako što im je posmatrana brzina rasta ksenografta. Zapremina tumora je izračunata po formuli: π (Pi)/6 X dužina X širina X visina. Rezultati opisani na Slici 13 demonstriraju da se mišji Mab-ovi lišeni agonističke aktivnosti in vivo ponašaju, kao što je očekivano, kao potentni antagonisti čak i u malim testiranim dozama. Za razliku od onog što je viđeno za mišji Mab, himerni je ispoljio kratkotrajnu in vivo aktivnost i tumor je potpuno izbegao tretman na D20 posle injekcije ćelija. Ovaj eksperiment jasno demonstrira da je povećanje in vitro agonističkog efekta koje je dovelo do smanjenja antagonističke aktivnosti takođe odgovorno za značajan in vivo gubitak antagonističke aktivnosti.
Primer 10: Efekat mišjeg 224G11 Mab i raznih himernih i humanizovanih verzija ovog antitela na proliferaciju NCI-H441 ćelija indukovanu HGF-om in vitro
[0252] NCI-H441 ćelije iz ATCC su rutinski gajene u RPMI 1640 medijumu (Invitrogen Corporation, Scotland, UK), 10% FCS (Invitrogen Corporation), 1% L-glutaminu (Invitrogen Corporation). Za testove proliferacije, ćelije su podeljene 3 dana pre upotrebe, tako da su bile u konfluentnoj fazi rasta pre postavljanja na ploče. NCI-H441 ćelije su stavljene na ploče za kulturu tkiva sa 96 ležišta u gustini od 3,75x10<4>ćelija/ležište u 200 µl medijuma bez seruma (RPMI 1640 medijum plus 1% L-glutamin). Dvadeset četiri sata posle stavljanja na ploče, testirana antitela su dodata u NCI-H441 i inkubirana na 37°C 30 minuta pre dodavanja HGF u konačnoj koncentraciji od 400 ng/ml (5 nM) na još 142 sata. Testiran opseg doze za svako antitelo je od 10 do 0,0097 µg/ml (konačna koncentracija u svakom ležištu). U ovom eksperimentu, mišje IgG1 Mab je dodato kao mišja izotipska kontrola i kao negativna kontrola agonista. Testirana antitela su bila sledeća: i) m224G11, ii) njegove himerne forme sa humanim IgG1 respektivno identifikovane kao [224G11] chim, [224G11] [MH chim], [224G11] [MUP9H chim], [224G11] [MMCH chim], [224G11] [TH7 chim] iii) njegove humanizovane IgG1 forme respektivno opisane kao [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2], [224G11] [Hz3]. Ležišta pokrivena ćelijama samim -/+ HGF su takođe bila uključena. Celo 5D5 antitelo od Genentech-a, komercijalno dostupno u ATCC kao ćelijska linija hibridoma je uvedeno kao potpuna pozitivna agonistička kontrola i nadalje se naziva m5D5. Zatim su ćelijama puštani pulsevi sa 0,25 µCi [<3>H]timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) 7 sati i 30 minuta. Količina [<3>H]timidina ugrađena u DNK nerastvorljivu u trihlorsirćetnoj kiselini je kvantifikovana tečnim scintilacionim brojačem. Rezultati su izraženi kao netransformisani cpm podaci da bi se bolje procenila potencijalna intrinsična agonistička aktivnost koja bi mogla da se javi sa anti-c-Met Mab kad se dodaju sama tumorskim ćelijama.
[0253] Rezultati opisani na Slici 14A demonstriraju da, kao što je očekivano, ni izotipska kontrola, ni m224G11 nisu pokazali nikakvu agonističku aktivnost na proliferaciju NCI-H441. Izotipska kontrola je bila bez efekta na proliferaciju ćelija indukovanu HGF-om, dok je m224G11 ispoljio 66% inhibicije kad je dodat u konačnoj koncentraciji od 10 µg/ml. m5D5, korišćen kao agonistička kontrola, je pokazao, kao što je očekivano, potpun agonistički efekat zavisan od doze kad je sam dodat ćelijama. Kao što je već primećeno, [224G11] chim Mab je pokazao značajan agonistički efekat zavisan od doze i primećena je smanjena inhibitorna aktivnost ove himerne forme: 19% umesto 66% za mišju formu. Kad je dodat sam, 3 IgG1 humanizovani Mab je demonstrirao agonističke efekte zavisne od doze u poređenju sa m224G11 formom. [224G11] [Hz1], [224G11] [Hz2] i [224G11] [Hz3] su imali uporediva antagonistčka dejstva, oko 46, 30 i 35%. Ova dejstva su značajno niža od onog viđenog za m224G11. Na Slici 14B, testirane su razne IgG1 himerne forme. U poređenju sa [224G11] chim formom, koja je pokazala agonistički efekat zavisan od doze kad se doda sama NCI-H441 ćelijama, [224G11] [MH chim], [224G11] [MUP9H chim], [224G11] [MMCH chim], [224G11] [TH7 chim] forme su bez značajnog intrinsičkog agonističkog efekta. Njihova antagonistička aktivnost je bila veća od one viđene za m224G11 Mab (57%) sa inhibicijama koje dostižu 79, 78, 84 i 93%, respektivno za [224G11] [MH chim], [224G11] [MUP9H chim], [224G11] [MMCH chim] i [224G11] [TH7 chim].
Primer 11: In vitro efekat raznih IgG1 humanizovanih formi 224G11 Mab
[0254] NCI-H441 ćelije iz ATCC su rutinski gajene u RPMI 1640 medijumu (Invitrogen Corporation, Scotland, UK), 10% FCS (Invitrogen Corporation), 1% L-glutaminu (Invitrogen Corporation). Za testove proliferacije, ćelije su podeljene 3 dana pre upotrebe, tako da su bile u konfluentnoj fazi rasta pre postavljanja na ploče. NCI-H441 ćelije su stavljene na ploče za kulturu tkiva sa 96 ležišta u gustini od 3,75x10<4>ćelija/ležište u 200 µl medijuma bez seruma (RPMI 1640 medijum plus 1% L-glutamin). Dvadeset četiri sata posle stavljanja na ploče, testirana antitela su dodata u NCI-H441 i inkubirana na 37°C 30 minuta pre dodavanja HGF u konačnoj koncentraciji od 400 ng/ml (5 nM) na još 142 sata. Testiran opseg doze za svako antitelo je bio od 10 do 0,0097 µg/ml (konačna koncentracija u svakom ležištu). U ovom eksperimentu, mišji IgG1 Mab je dodat kao pozadinska negativna kontrola za agonističku aktivnost i testirana antitela su bila sledeća: i) m224G11, ii) njegove himerne forme sa humanim IgG1 respektivno identifikovane kao [224G11] chim, [224G11] [TH7 chim] iii) njegove humanizovane IgG1 forme respektivno opisane kao [224G11] [TH7 Hz1], [224G11] [TH7 Hz3]. Ležišta pokrivena samim ćelijama -/+ HGF su takođe bila uključena. Celo 5D5 antitelo od Genentech-a, komercijalno dostupno u ATCC kao ćelijska linija hibridoma je uvedeno kao potpuna pozitivna agonistička kontrola i nadalje se naziva m5D5. Zatim su ćelijama puštani pulsevi sa 0,25 µCi [<3>H]timidina (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Sweden) 7 sati i 30 minuta. Količina [<3>H]timidina ugrađena u DNK nerastvorljivu u trihlorsirćetnoj kiselini je kvantifikovana tečnim scintilacionim brojačem. Rezultati su izraženi kao netransformisani cpm podaci da bi se bolje procenila potencijalna intrinsična agonistička aktivnost koja bi mogla da se javi sa anti-c-Met Mab kad se dodaju sama tumorskim ćelijama.
[0255] Slika 15 pokazuje da je m224G11 Mab ispoljio uobičajen inhibitorni efekat (74% inhibicija). Himerna IgG1 forma [224G11] chim je imala, kao što je očekivano, intrinsičan agonistički efekat zavisan od doze i niži antagonistički efekat u poređenju sa mišjom formom: 33% prema 74% inhibicije. [224G11] [TH7 chim] je imao vrlo slabu agonističku aktivnost u ovom eksperimentu. Međuitm, on je ispoljio visok inhibitoran efekat (81 %), blizu onog primećenog za mišji Mab. Dve humanizovane forme nisu imale intrinsičan agonistički efekat, a imale su antagonističku aktivnost blizu one primećene za mišji Mab ili [224G11] [TH7 chim] sa 67 i 76% inhibicije, respektivno, za [224G11] [TH7 Hz1] i [224G11] [TH7 Hz3].
4
4
4
4
4
4
4
1
�
4
1
2
4
1
2
4
1
2
�
�
2
�
�
11
��
�
14
�
1
1
�
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
��

Claims (1)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Monoklonsko antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment, sposobno da inhibira dimerizaciju c-Met, pri čemu navedeno antitelo ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment koji sadrži težak lanac koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 sa odgovarajućim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID Nos.1, 2 i 3; i lak lanac koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 sa odgovarajućim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID Nos. 5, 6 i 7, pri čemu je navedeno antitelo ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment dalje naznačeno time, što:
i) navedeno antitelo ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment sadrži i zglobni region koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.28 i
ii) navedeno antitelo ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment je hemijski kuplovan sa citotoksičnim sredstvom.
2. Antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment, iz zahteva 1, naznačeno time, što se sastoji od humanizovanog antitela.
3. Antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment iz zahteva 1 ili 2, naznačeno time, što sadrži varijabilni domen teškog lanca sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 4 i varijabilni domen lakog lanca sekvence koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.10.
4. Antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment iz zahteva 1 do 3, naznačeno time, što navedeno antitelo sadrži kompletan težak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No. 37 i kompletan lak lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.
40.
5. Antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment iz zahteva 1 do 4, naznačeno time, što je navedeno citotoksično sredstvo odabrano od sredstava za alkilovanje, antimetabolita, antitumorskih antibiotika, inhibitora mitoze, inhibitora hromatinskih funkcija, sredstava protiv angiogeneze, antiestrogenih sredstava, antiandrogenih sredstava, imunomodulatora ili inhibitora kinaze.
6. Antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment iz zahteva 1 do 4, naznačeno time, što je navedeno citotoksično sredstvo inhibitor mitoze.
7. Antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment iz zahteva 1 do 6, za upotrebu kao lek.
8. Sastav koji kao aktivan princip sadrži jedinjenje koje se sastoji od antitela, ili njegovog dvovalentnog funkcionalnog fragmenta, čija je zaštita tražena u jednom od zahteva 1 do 7.
9. Sastav iz zahteva 8 za upotrebu kao lek.
10. Antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment iz zahteva 1 do 7 ili sastav iz zahteva 8 za upotrebu u inhibiranju rasta i/ili proliferacije tumorskih ćelija.
11. Antitelo, ili njegov dvovalentan funkcionalni fragment iz zahteva 1 do 7 ili sastav iz zahteva 8 za upotrebu u sprečavanju ili lečenju kancera.
12. Antitelo ili sastav za upotrebu prema zahtevu 11, naznačeno time, što je navedeni kancer kancer odabran od kancera prostate, osteosarkoma, kancera pluća, kancera dojke, kancera endometrijuma, glioblastoma ili kancera kolona.
1 1
RS20181344A 2008-12-02 2009-12-02 Antitelo na c-met RS58018B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/IB2008/055663 WO2010064089A1 (en) 2008-12-02 2008-12-02 Novel anti-cmet antibody
US18450209P 2009-06-05 2009-06-05
EP16192250.5A EP3135691B1 (en) 2008-12-02 2009-12-02 Anti-cmet antibody

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS58018B1 true RS58018B1 (sr) 2019-02-28

Family

ID=41693124

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170671A RS56204B1 (sr) 2008-12-02 2009-12-02 Antitelo na cmet
RS20181344A RS58018B1 (sr) 2008-12-02 2009-12-02 Antitelo na c-met

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20170671A RS56204B1 (sr) 2008-12-02 2009-12-02 Antitelo na cmet

Country Status (38)

Country Link
US (4) US8741290B2 (sr)
EP (4) EP3431502B1 (sr)
JP (3) JP5863458B2 (sr)
KR (1) KR101838299B1 (sr)
CN (2) CN103351438B (sr)
AR (1) AR074439A1 (sr)
AU (3) AU2009328318C1 (sr)
BR (2) BR122019023930B1 (sr)
CA (1) CA2743433C (sr)
CL (2) CL2011001296A1 (sr)
CO (1) CO6382139A2 (sr)
CR (1) CR20110324A (sr)
CY (2) CY1119172T1 (sr)
DK (2) DK3135691T3 (sr)
EC (1) ECSP11011127A (sr)
ES (3) ES2827277T3 (sr)
GE (2) GEP20135930B (sr)
HR (2) HRP20171011T8 (sr)
HU (3) HUE040553T2 (sr)
IL (2) IL213273A0 (sr)
LT (2) LT2370468T (sr)
MA (1) MA32892B1 (sr)
MX (2) MX2011005677A (sr)
MY (2) MY185200A (sr)
NZ (1) NZ593853A (sr)
PE (1) PE20120343A1 (sr)
PH (1) PH12015501515A1 (sr)
PL (3) PL2370468T3 (sr)
PT (3) PT2370468T (sr)
RS (2) RS56204B1 (sr)
RU (2) RU2015127471A (sr)
SA (2) SA109300720B1 (sr)
SG (2) SG171851A1 (sr)
SI (3) SI3431502T1 (sr)
TN (1) TN2011000216A1 (sr)
TW (2) TWI523866B (sr)
WO (1) WO2010069765A1 (sr)
ZA (1) ZA201105164B (sr)

Families Citing this family (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2014681A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Pierre Fabre Medicament Novel antibodies inhibiting c-met dimerization, and uses thereof
US8545839B2 (en) * 2008-12-02 2013-10-01 Pierre Fabre Medicament Anti-c-Met antibody
EP2287197A1 (en) * 2009-08-21 2011-02-23 Pierre Fabre Medicament Anti-cMET antibody and its use for the detection and the diagnosis of cancer
PT3904391T (pt) 2010-03-10 2024-10-14 Genmab As Anticorpos monoclonais contra c-met
KR20140019284A (ko) 2010-09-03 2014-02-14 아카데미아 시니카 항-C-Met 항체 및 이의 이용 방법들
RU2608644C2 (ru) 2010-11-03 2017-01-23 арДЖЕН-ИКС Н.В. Антитела против белка рецептора с-мет
WO2012158818A2 (en) 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
KR20130036993A (ko) * 2011-10-05 2013-04-15 삼성전자주식회사 ｃ-Ｍｅｔ의 ＳＥＭＡ 도메인 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체
KR101865223B1 (ko) 2011-10-05 2018-06-08 삼성전자주식회사 항 ｃ-Ｍｅｔ 인간화 항체 및 그의 용도
US9926364B2 (en) 2011-11-03 2018-03-27 Argen-X N.V. Chimeric human-llama antigens and methods of use
KR101463098B1 (ko) * 2011-11-28 2014-11-27 한국생명공학연구원 ｃ-Ｍｅｔ에 대한 인간항체에 약물이 접합된 약물 복합체 및 이의 용도
US8900582B2 (en) 2011-12-22 2014-12-02 Samsung Electronics Co., Ltd. Deimmunized anti c-Met humanized antibodies and uses thereof
CN105050618B (zh) * 2012-06-21 2018-11-16 索伦托治疗有限公司 与c-Met结合的抗原结合蛋白
EP2708556B1 (en) 2012-09-12 2018-11-07 Samsung Electronics Co., Ltd Pharmaceutical composition for the use in a combination therapy for prevention or treatment of c-met or angiogenesis factor induced diseases
MX338711B (es) 2012-10-12 2016-04-28 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas.
MX362970B (es) 2013-03-13 2019-02-28 Medimmune Ltd Pirrolobenzodiazepinas y conjugados de las mismas.
KR102049990B1 (ko) * 2013-03-28 2019-12-03 삼성전자주식회사 c-Met 항체 및 VEGF 결합 단편이 연결된 융합 단백질
CN105452297B (zh) 2013-04-30 2019-10-11 新加坡科技研究局 mAb 2抗-Met抗体
US9567641B2 (en) * 2013-07-03 2017-02-14 Samsung Electronics Co., Ltd. Combination therapy for the treatment of cancer using an anti-C-met antibody
US9717715B2 (en) 2013-11-15 2017-08-01 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of combination therapy using an anti-C-Met antibody
EP3083697B1 (en) * 2013-12-20 2019-04-17 Development Center for Biotechnology Alpha-enolase specific antibodies and methods of uses in cancer therapy
EP3193940A1 (en) 2014-09-10 2017-07-26 Medimmune Limited Pyrrolobenzodiazepines and conjugates thereof
CN113150147A (zh) * 2015-03-16 2021-07-23 塞尔德克斯医疗公司 抗-met抗体及其使用方法
KR102476846B1 (ko) * 2016-02-05 2022-12-12 주식회사 헬릭스미스 항―ｃ―ＭＥＴ 항체 및 이의 용도
EP3430058A4 (en) 2016-03-15 2019-10-23 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. MULTISPECIFIC FAB FUSION PROTEINS AND USES THEREOF
SI3626273T1 (sl) 2016-05-17 2021-04-30 Abbvie Biotherapeutics Inc. Konjugati protitelesa proti CMET in zdravila ter postopki za njihovo uporabo
US10457726B2 (en) 2016-06-30 2019-10-29 University Of Connecticut Antibody and antigen-binding fragment compositions targeting cell surface antigens in tumors and methods of use thereof
EP3525829A1 (en) 2016-10-11 2019-08-21 Medimmune Limited Antibody-drug conjugates with immune-mediated therapy agents
WO2018088933A1 (en) * 2016-11-14 2018-05-17 Limited Liability Company "Panacela Labs" Anti-tumor effects of a viral vector encoding a toll-like receptor and a toll-like receptor agonist
TWI782930B (zh) 2016-11-16 2022-11-11 美商再生元醫藥公司 抗ｍｅｔ抗體，結合ｍｅｔ之雙特異性抗原結合分子及其使用方法
US20180230218A1 (en) * 2017-01-04 2018-08-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
CN109771642B (zh) * 2017-11-13 2022-09-20 同济大学苏州研究院 c-MET激动型抗体及其用途
GB201803892D0 (en) * 2018-03-12 2018-04-25 Ultrahuman Six Ltd C-met binding agents
CA3098103A1 (en) 2018-05-23 2019-11-28 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
KR102835308B1 (ko) * 2018-08-08 2025-07-21 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양 관련 항원에 결합하는 단백질
EP3847196A4 (en) 2018-09-07 2023-01-04 ITabMed (HK) Limited BISPECIFIC ANTIGEN BINDING PROTEINS AND USES THEREOF
CN109541221B (zh) * 2018-10-24 2022-03-22 益善生物技术股份有限公司 一种c-Met特异性抗体、组合物及试剂盒
KR102353568B1 (ko) 2018-11-14 2022-01-20 주식회사 헬릭스미스 안정성이 향상된 항 c-Met 항체 또는 그의 항원 결합 단편
WO2020132810A1 (en) 2018-12-24 2020-07-02 Generon (Shanghai) Corporation Ltd. Multispecific antigen binding proteins capable of binding cd19 and cd3, and use thereof
US20220169706A1 (en) * 2019-03-28 2022-06-02 Danisco Us Inc Engineered antibodies
AU2020349462A1 (en) 2019-09-16 2022-03-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Radiolabeled MET binding proteins for immuno-PET imaging
EP4129335A4 (en) 2020-09-01 2024-04-24 RemeGen Co., Ltd. ANTI C-MET DRUG-ANTIBODY CONJUGATE AND ITS APPLICATIONS
US20230372528A1 (en) 2020-10-16 2023-11-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Glycoconjugates
GB202102396D0 (en) 2021-02-19 2021-04-07 Adc Therapeutics Sa Molecular adjuvant
BR112023020562A2 (pt) 2021-04-06 2023-12-05 Abbvie Biotherapeutics Inc Métodos de tratamento de carcinoma pulmonar de células não pequenas com o uso de telisotuzumabe vedotina
BR112023020801A2 (pt) * 2021-04-08 2023-12-12 Byondis Bv Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, conjugado anticorpo-fármaco, composição farmacêutica, e, combinação de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, um conjugado anticorpo-fármaco ou uma composição farmacêutica
TW202547842A (zh) * 2021-04-29 2025-12-16 愛爾蘭商艾伯維製造管理無限公司 抗c-Met抗體藥物結合物
EP4426727A2 (en) 2021-11-03 2024-09-11 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Specific conjugation of an antibody
WO2023173109A1 (en) 2022-03-11 2023-09-14 Abbvie Biotherapeutics Inc. Methods of treatment of non-small-cell lung carcinoma using telisotuzumab vedotin and osimertinib
WO2024243450A1 (en) 2023-05-23 2024-11-28 Abbvie Inc. Methods of treatment using anti-c-met antibody drug conjugates
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4424200A (en) 1979-05-14 1984-01-03 Nuc Med Inc. Method for radiolabeling proteins with technetium-99m
US4479930A (en) 1982-07-26 1984-10-30 Trustees Of The University Of Massachusetts Amines coupled wth dicyclic dianhydrides capable of being radiolabeled product
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4831175A (en) 1986-09-05 1989-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Backbone polysubstituted chelates for forming a metal chelate-protein conjugate
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
GB8924581D0 (en) 1989-11-01 1989-12-20 Pa Consulting Services Bleaching of hair
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
JPH05244982A (ja) 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5686292A (en) * 1995-06-02 1997-11-11 Genentech, Inc. Hepatocyte growth factor receptor antagonist antibodies and uses thereof
KR100983997B1 (ko) * 2001-01-09 2010-09-28 메르크 파텐트 게엠베하 수용체 타이로신 키나아제 저해제 및 혈관형성 저해제를 사용하는 병용 요법
BRPI0407446A (pt) * 2003-02-13 2006-01-31 Pharmacia Corp Anticorpos para c-met para o tratamento de cânceres
HN2004000285A (es) 2003-08-04 2006-04-27 Pfizer Prod Inc ANTICUERPOS DIRIGIDOS A c-MET
CA2548282A1 (en) * 2003-12-11 2005-06-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for inhibiting c-met dimerization and activation
CA2575402A1 (en) 2004-08-05 2006-02-09 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
US8008443B2 (en) * 2005-04-26 2011-08-30 Medimmune, Llc Modulation of antibody effector function by hinge domain engineering
EP2397498A3 (en) * 2005-07-18 2013-11-27 Amgen, Inc Human anti-B7RP1 neutralizing antibodies
JP5457671B2 (ja) * 2005-07-28 2014-04-02 ノバルティス アーゲー Ｍ−ｃｓｆ特異的モノクローナル抗体およびその使用
US8101727B2 (en) * 2006-03-30 2012-01-24 Novartis Ag Compositions and methods of use for antibodies of c-Met
EP2014681A1 (en) * 2007-07-12 2009-01-14 Pierre Fabre Medicament Novel antibodies inhibiting c-met dimerization, and uses thereof
US8545839B2 (en) 2008-12-02 2013-10-01 Pierre Fabre Medicament Anti-c-Met antibody

Also Published As

Publication number Publication date
US8765128B2 (en) 2014-07-01
HK1162536A1 (zh) 2012-08-31
PT2370468T (pt) 2017-07-13
HUE035047T2 (en) 2018-05-02
US8747850B2 (en) 2014-06-10
US20110239316A1 (en) 2011-09-29
RU2011124751A (ru) 2013-01-10
SG187518A1 (en) 2013-02-28
US20130109844A1 (en) 2013-05-02
JP6074018B2 (ja) 2017-02-01
AU2016200725C1 (en) 2017-10-19
ES2827277T3 (es) 2021-05-20
EP3135691B1 (en) 2018-08-15
PL2370468T3 (pl) 2017-09-29
DK3135691T3 (en) 2018-11-19
CA2743433A1 (en) 2010-06-24
JP6309657B2 (ja) 2018-04-11
LT2370468T (lt) 2017-07-10
CN102227446B (zh) 2015-10-21
PL3135691T3 (pl) 2019-02-28
ES2697098T3 (es) 2019-01-22
BR122019023930B1 (pt) 2021-05-04
CL2014000181A1 (es) 2014-07-25
US8729249B2 (en) 2014-05-20
CA2743433C (en) 2019-06-11
BRPI0923231A2 (pt) 2016-01-26
JP5863458B2 (ja) 2016-02-16
PT3135691T (pt) 2018-11-27
JP2012510280A (ja) 2012-05-10
HRP20171011T8 (hr) 2019-01-25
IL213273A0 (en) 2011-07-31
JP2016117721A (ja) 2016-06-30
PE20120343A1 (es) 2012-04-16
US8741290B2 (en) 2014-06-03
TWI523866B (zh) 2016-03-01
AR074439A1 (es) 2011-01-19
TW201446805A (zh) 2014-12-16
US20130109841A1 (en) 2013-05-02
CY1121025T1 (el) 2019-12-11
MY185200A (en) 2021-04-30
DK2370468T3 (en) 2017-06-19
RU2015127471A (ru) 2018-12-21
HRP20171011T1 (hr) 2017-09-22
CN103351438B (zh) 2016-04-20
AU2009328318C1 (en) 2017-11-02
SI3431502T1 (sl) 2021-01-29
ECSP11011127A (es) 2011-07-29
TWI459964B (zh) 2014-11-11
MX341014B (es) 2016-08-03
CN102227446A (zh) 2011-10-26
AU2016200725A1 (en) 2016-02-25
SG171851A1 (en) 2011-07-28
TW201023892A (en) 2010-07-01
SI2370468T1 (sl) 2017-08-31
BRPI0923231B8 (pt) 2021-05-25
EP3431502A1 (en) 2019-01-23
TN2011000216A1 (en) 2012-12-17
CY1119172T1 (el) 2018-02-14
RU2560257C2 (ru) 2015-08-20
PT3431502T (pt) 2020-10-29
MX2011005677A (es) 2011-06-30
SA109300720B1 (ar) 2013-05-25
EP2370468A1 (en) 2011-10-05
EP3135691A1 (en) 2017-03-01
EP3757132A1 (en) 2020-12-30
LT3135691T (lt) 2018-11-12
KR20110097839A (ko) 2011-08-31
EP3431502B1 (en) 2020-07-22
CN103351438A (zh) 2013-10-16
AU2009328318B2 (en) 2015-11-05
AU2017203929A1 (en) 2017-07-06
ZA201105164B (en) 2012-03-28
GEP20135930B (en) 2013-10-10
HRP20181868T1 (hr) 2019-01-11
SI3135691T1 (sl) 2018-12-31
CL2011001296A1 (es) 2011-08-26
JP2017099392A (ja) 2017-06-08
WO2010069765A1 (en) 2010-06-24
PH12015501515A1 (en) 2015-12-14
GEP20146207B (en) 2014-12-10
HK1190414A1 (zh) 2014-07-04
HUE040553T2 (hu) 2019-03-28
RS56204B1 (sr) 2017-11-30
KR101838299B1 (ko) 2018-03-14
MY192567A (en) 2022-08-29
CO6382139A2 (es) 2012-02-15
ES2629855T3 (es) 2017-08-16
AU2017203929B2 (en) 2019-03-28
IL231525B (en) 2019-07-31
CR20110324A (es) 2011-07-28
PL3431502T3 (pl) 2020-12-28
BRPI0923231B1 (pt) 2020-04-28
US20130109840A1 (en) 2013-05-02
EP2370468B1 (en) 2017-04-05
AU2009328318A1 (en) 2011-07-28
AU2016200725B2 (en) 2017-05-25
SA112331005B1 (ar) 2015-09-13
MA32892B1 (fr) 2011-12-01
HUE051288T2 (hu) 2021-03-01
IL231525A0 (en) 2014-04-30
NZ593853A (en) 2013-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6309657B2 (ja) 新規な抗ｃＭＥＴ抗体
EP2575879B1 (en) Novel anti-cmet antibody
WO2010064089A1 (en) Novel anti-cmet antibody
US20170218071A1 (en) ANTI-cMET ANTIBODY
US20130216527A1 (en) Novel anti-cmet antibody
HK1162536B (en) Anti-cmet antibody