RS63591B1

RS63591B1 - Anti-lag3 antitela

Info

Publication number: RS63591B1
Application number: RS20220858A
Authority: RS
Inventors: Deak Laura Codarri; Stefan Dengl; Jens Fischer; Christian Klein; Stefan Seeber; Patrick Alexander Aaron Weber; Adrian Zwick
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2017-04-05
Filing date: 2018-04-03
Publication date: 2022-10-31
Also published as: JP7260586B2; MA49034B1; LT3606954T; SG11201909344SA; IL268620B2; RU2019134231A3; CN110392698B; TW201841940A; AU2018247797A1; US20240002506A1; EP4112644A1; CO2019009365A2; JP2021118708A; CR20190434A; CN110392698A; DK3606954T3; TWI707871B; AR111207A1; CL2019002824A1; CA3053360A1

Description

OPIS

OBLAST PRONALASKA

Predmetni pronalazak se odnosi na anti-LAG3 antitela, postupke za proizvodnju ovih molekula i postupke za primenu istih.

OSNOVA

Gen-3 za aktivaciju limfocita (LAG3 ili CD223) prvobitno je otkriven u eksperimentu dizajniranom da selektivno izoluje molekule eksprimirane u IL-2 zavisnoj NK ćelijskoj liniji (Triebel F et al., Cancer Lett. 235 (2006), 147-153). LAG-3 je jedinstveni transmembranski protein sa strukturnom homologijom sa CD4 sa četiri ekstracelularna domena nalik superfamiliji imunoglobulina (D1-D4). IgG domen distalan u odnosu na membranu sadrži kratku sekvencu aminokiselina, takozvanu ekstra petlju koja se ne nalazi u drugim proteinima superfamilije IgG. Intracelularni domen sadrži jedinstvenu aminokiselinsku sekvencu (KIEELE) koja je potrebna da LAG-3 ima negativan učinak na funkciju T ćelija. LAG-3 se može otcepiti na povezujućem peptidu (CP) metaloproteazama kako bi se stvorio rastvorljivi oblik, koji se može detektovati u serumu. Poput CD4, protein LAG3 se vezuje za molekule MHC klase II, međutim sa većim afinitetom i na različitim mestima od CD4 (Huard et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 5744-5749). LAG3 se eksprimira u T ćelijama, B ćelijama, NK ćelijama i plazmacitoidnim dendritskim ćelijama (pDC) i pojačava se nakon aktivacije T ćelija. On modulira funkciju T ćelija kao i homeostazu T ćelija. Podskupovi konvencionalnih T ćelija koje su anergične ili pokazuju oštećene funkcije eksprimiraju LAG3. LAG3<+>T ćelije su obogaćene na mestima tumora i tokom hroničnih virusnih infekcija (Sierro et al Expert Opin. Ther. Targets 15 (2011), 91-101). Pokazalo se da LAG3 igra ulogu u iscrpljivanju CD8 T ćelija (Blackburn et al. Nature Immunol.10 (2009), 29-37). Tako, postoji potreba za antitelima koja antagonizuju aktivnost LAG3 i mogu da se koriste za stvaranje i obnavljanje imunološkog odgovora na tumore.

Monoklonska antitela na LAG3 su opisana, na primer, u WO 2004/078928 gde je u patentnim zahtevima opisana kompozicija koja sadrži antitela koja se specifično vezuju za CD223 i vakcina protiv raka. WO 2010/019570 otkriva ljudska antitela koja vezuju LAG3, na primer antitela 25F7 i 26H10. US 2011/070238 se odnosi na citotoksično anti-LAG3 antitelo korisno u lečenju ili prevenciji odbacivanja presađenog organa i autoimune bolesti. WO 2014/008218 opisuje LAG3 antitela sa optimizovanim funkcionalnim svojstvima (tj. smanjenim mestima deamidacije) u poređenju sa antitelom 25F7. Nadalje, LAG3 antitela su otkrivena u WO 2015/138920 (na primer BAP050), WO 2014/140180, WO 2015/116539, WO 2016/028672, WO 2016/126858, WO 2016/200782 i WO 2017/015560.

REZIME

Pronalazak je definisan u priloženim patentnim zahtevima, i svi drugi aspekti koji su ovde izloženi, a ne spadaju u opseg patentnih zahteva, samo su informativni.

Pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje se vezuje za humani LAG3, pri čemu antitelo sadrži

(a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:3, i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6.

Pronalazak dalje obezbeđuje izolovano antitelo koje se vezuje za humani LAG3, pri čemu antitelo

sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:7 i VL sekvencu SEQ ID NO:8.

U jednom otelotvorenju pronalaska, takvo izolovano antitelo koje se vezuje za humani LAG3:

i) takmiči se u vezivanju za LAG3 sa anti-LAG3 antitelom koje sadrži VH sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:7 i VL sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8, i/ili

ii) vezuje se za ljudski i cinomolgus LAG3; i/ili

iii) inhibira vezivanje MHC-II eksprimiranog na ljudskim A375 tumorskim ćelijama; i/ili

iv) pojačava oslobađanje granzima B ili IL-2 u testu mešane limfocitne reakcije (mMLR).

U jednom otelotvorenju, anti-LAG3 antitelo prema pronalasku je monoklonsko antitelo.

U jednom otelotvorenju, anti-LAG3 antitelo prema pronalasku je humano, humanizovano ili himerno antitelo.

Pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira takvo izolovano antitelo koje se vezuje za ljudski LAG3.

Pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu.

Pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju antitela, uključujući uzgajanje ćelije domaćina, tako da se proizvodi antitelo.

Pronalazak obezbeđuje takav postupak za proizvodnju antitela, koji se dalje sastoji od rekuperovanja antitela iz ćelije domaćina.

Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja sadrži antitelo kao što je ovde opisano i farmaceutski prihvatljiv nosač.

Pronalazak obezbeđuje ovde opisana antitela za upotrebu u lečenju kancera.

Antitela iz predmetnog pronalaska pokazuju vredna svojstva indukcije oslobađanja granzima B, oslobađanja IFN-γ i izlučivanja IL-2 od strane humanih CD4 T ćelija i stoga mogu da stimulišu imunski odgovor preko T ćelija (pojačane efektorske funkcije T ćelija specifičnih za tumor-antigen) bilo samostalno ili u kombinaciji sa PD1 inhibitorima.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1: Efekat anti-LAG-3 antitela na citotoksično oslobađanje granzima B i izlučivanje IL-2 od strane humanih CD4 T ćelija koje su uzgajane zajedno sa alogenim zrelim dendritskim ćelijama

Sl. 1A: Izlučivanje granzima B

Sl. 1B: Izlučivanje IL-2

Slika 2: Uticaj anti-LAG-3 antitela na citotoksično oslobađanje granzima B od strane humanih CD4 T ćelija koje su uzgajane zajedno sa B ćelijskom limfoblatoidnom ćelijskom linijom (ARH77).

Slika 3: Uticaj anti-LAG-3 antitela na supresiju Treg granzima B i oslobađanja IFN-γ od strane humanih CD4 T ćelija koje su uzgajane zajedno sa ozračenim alogenim PBMC.

Sl. 3 A: Oslobađanje granzima B

Sl. 3B: Oslobađanje IFN-γ

DETALJAN OPIS PRONALASKA

„Humani akceptorski okvir“ je za ovde navedene svrhe okvir koji sadrži aminokiselinsku sekvencu okvira varijabilnog domena lakog lanca (VL) ili okvira varijabilnog domena teškog lanca (VH) dobijenog od okvira humanog imunoglobulina ili okvira humanog konsenzusa, kao što je definisano u nastavku. Humani akceptorski okvir „dobijen od“ okvira humanog imunoglobulina ili humanog okvira konsenzusa može da sadrži istu aminokiselinsku sekvencu kao i ova dva okvira, ili može da sadrži izmene u aminokiselinskoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, broj aminokiselinskih izmena je 10 ili manje, 9 ili manje, 8 ili manje, 7 ili manje, 6 ili manje, 5 ili manje, 4 ili manje, 3 ili manje, ili 2 ili manje. U nekim otelotvorenjima, VL humani akceptorski okvir je po sekvenci identičan sekvenci VL okvira humanog imunoglobulina ili humanog okvira konsenzusa.

„Afinitet“ se odnosi na snagu zbira ukupnih nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog partnera u vezivanju (npr. antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kao što je ovde upotrebljeno, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema svom partneru Y može generalno da se predstavi putem konstante disocijacije (Kd). Afinitet može da se izmeri uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one opisane u ovom dokumentu. Specifična otelotvorenja data kao ilustracija i primer za merenje afiniteta vezivanja opisana su u nastavku.

Termin „afinitetno zrelo“ antitelo se odnosi na antitelo sa jednom ili više izmena u jednom ili više hipervarijabilnih regiona (HVR), u poređenju sa matičnim antitelom koje nema takve izmene, pri čemu takve izmene dovode do poboljšanja afiniteta antitela prema antigenu.

Termin „LAG3“, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki nativni LAG3 koji potiče od bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare, kao što su primati (npr. ljudi) i glodari (npr. miševi i pacovi), ako nije drugačije naglašeno. Termin obuhvata neobrađen LAG3, „kompletne dužine“, kao i svaki oblik LAG3 koji je rezultat obrade u ćeliji. Termin takođe obuhvata prirodno postojeće varijante LAG3, npr. splajsovane ili alelne varijante. U jednom poželjnom otelotvorenju, izraz „LAG3“ se odnosi na ljudski LAG3. Sekvenca aminokiselina primera obrađenog LAG3 (bez signalnih sekvenci) prikazana je u SEQ ID NO: 54. Sekvenca aminokiselina primera ekstracelularnih domena (ECD) LAG3 prikazana je u SEQ ID NO: 55.

Izraz „anti-LAG3 antitelo” i „antitelo koje se vezuje za LAG3” se odnosi na antitelo koje je sposobno da veže LAG3 sa dovoljnim afinitetom, na takav način da antitelo bude korisno kao dijagnostički i/ili terapeutski agens za ciljanje LAG3. U jednom otelotvorenju, obim vezivanja anti-LAG3 antitela za nepovezani protein koji nije LAG3 je manji od oko 10% od vezivanja antitela za LAG3, kao što je izmereno, npr. radioimunotestom (RIA). U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za LAG3 ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M). U određenim aspektima, anti-LAG3 antitelo se vezuje za epitop LAG3 koji je konzerviran između LAG3 različitih vrsta. U jednom poželjnom otelotvorenju, „anti-LAG3 antitelo“, „antitelo koje se specifično vezuje za humani LAG3“ i „antitelo koje se vezuje za humani LAG3“ se odnosi na antitelo koje se specifično vezuje za humani LAG3 antigen ili njegov ekstracelularni domen (ECD) sa afinitetom vezivanja vrednosti KDod 1,0 x 10<-8>mol/l ili manje, u jednom otelotvorenju vrednosti KDod 1,0 x 10<-9>mol/l ili manje, u jednom otelotvorenju vrednosti KDod 1,0 x 10<-9>mol/l do 1,0 x 10<-13>mol/l. U ovom kontekstu, afinitet vezivanja se utvrđuje standardnim testom vezivanja, kao što je tehnika površinske plazmonske rezonance (BIAcore®, GE-Healthcare Uppsala, Švedska) npr. korišćenjem ekstracelularnog domena LAG3.

Termin „antitelo“ ovde je upotrebljen u najširem smislu i obuhvata različite strukture antitela uključujući, bez ograničenja, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i fragmente antitela, dokle god oni pokazuju željenu aktivnost vezivanja za antigen.

„Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje vezuje antigen za koji se vezuje netaknuto antitelo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na Fv, Fab, Fab', Fab’-SH,F(ab')2; dijatela, linearna antitela, molekule antitela sa jednim lancem (npr. scFv) i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela.

Termin „epitop“ označava mesto na antigenu, bilo proteinskom ili neproteinskom, za koje se vezuje anti-LAG3 antitelo. Epitopi se mogu formirati i od susednih aminokiselinskih deonica (linearni epitop) ili mogu da sadrže nesusedne aminokiseline (konformacioni epitop), npr. dolaze u prostornu blizinu zbog presavijanja antigena, odnosno tercijarnog presavijanja proteinskog antigena. Linearni epitopi su tipično još uvek vezani anti-LAG3 antitelom nakon izlaganja proteinskog antigena denaturišućim agensima, dok se konformacioni epitopi tipično uništavaju nakon tretmana denaturišućim agensima. Epitop sadrži najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5, najmanje 6, najmanje 7 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.

Skrining za antitela koja se vezuju za određeni epitop (tj. ona koja se vezuju za isti epitop) može se obaviti korišćenjem rutinskih metoda u struci, kao što su, bez ograničenja, skeniranje alaninom, peptidni blotovi (videti Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463), analiza cepanja peptida, ekscizija epitopa, ekstrakcija epitopa, hemijska modifikacija antigena (videti Prot. Sci.9 (2000) 487-496) i unakrsno blokiranje (videti "Antibodies," Harlow i Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY).

Profilisanje antitela zasnovano na strukturi antigena (ASAP), takođe poznato kao profilisanje uz pomoć modifikacije (MAP), omogućava da se grupiše mnoštvo monoklonskih antitela koja se specifično vezuju za LAG3 na osnovu profila vezivanja svakog od antitela iz mnoštva sa hemijski ili enzimski modifikovanom površinom antigena (videti, npr. US 2004/0101920). Antitela u svakom binu se vezuju za isti epitop koji može biti jedinstveni epitop, koji je ili izrazito različit ili se delimično preklapa sa epitopom predstavljenim drugim binom.

Takođe, kompetitivno vezivanje može da se koristi lako odredi da li se antitelo vezuje za isti epitop LAG3 kao referentno anti-LAG3 antitelo, ili se sa njim takmiči u vezivanju. Na primer, „antitelo koje se vezuje za isti epitop” kao referentno anti-LAG3 antitelo odnosi se na antitelo koje blokira vezivanje referentnog anti-LAG3 antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više, i obrnuto, referentno antitelo blokira vezivanje antitela za njegov antigen u kompetitivnom testu za 50% ili više. Takođe, na primer, da bi se utvrdilo da li se antitelo vezuje za isti epitop kao referentno anti-LAG3 antitelo, referentnom antitelu je dozvoljeno da se veže za LAG3 u uslovima zasićenja. Nakon uklanjanja viška referentnog anti-LAG3 antitela, procenjuje se sposobnost dotičnog anti-LAG3 antitela da se veže za LAG3. Ako anti-LAG3 antitelo može da se vezuje za LAG3 nakon vezivanja referentnog anti-LAG3 antitela u uslovima zasićenja, može se zaključiti da se dotično anti-LAG3 antitelo vezuje za različiti epitop od referentnog anti-LAG3 antitela. Ali, ako dotično anti-LAG3 antitelo nije u stanju da se veže za LAG3 nakon vezivanja referentnog anti-LAG3 antitela u uslovima zasićenja, tada dotično anti-LAG3 antitelo može da se vezuje za isti epitop kao epitop koji se vezuje referentnim anti-LAG3 antitelom. Da bi se potvrdilo da li se dotično antitelo vezuje za isti epitop ili ga samo u vezivanju ometaju sterii razlozi, mogu da se koriste rutinski eksperimenti (npr. mutacija peptida i analize vezivanja pomoću ELISA, RIA, površinske plazmonske rezonance, protočne citometrije ili bilo kojeg drugog kvantitativnog ili kvalitativnog testa vezivanja antitela dostupnog u struci). Ovaj test treba izvesti u dva podešavanja, tj. sa oba antitela kao zasićena antitela. Ako je u oba podešavanja samo prvo (zasićeno) antitelo sposobno da se veže za LAG3, onda se može zaključiti da se dotično anti-LAG3 antitelo i referentno anti-LAG3 antitelo takmiče u vezivanju za LAG3.

U nekim otelotvorenjima, smatra se da se dva antitela vezuju za isti ili preklapajući epitop ako 1-, 5-, 10-, 20- ili 100-struki višak jednog antitela inhibira vezivanje drugog za najmanje 50%, najmanje 75%, najmanje 90% ili čak 99% ili više, izmereno u kompetitivnom testu vezivanja (videti, npr. Junghans et al., Cancer Res.50 (1990) 1495-1502).

U nekim otelotvorenjima, smatra se da se dva antitela vezuju za isti epitop ako u suštini sve aminokiselinske mutacije u antigenu koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela takođe smanjuju ili eliminišu vezivanje drugog. Smatra se da dva antitela imaju „preklapajuće epitope“ ako samo podskup aminokiselinskih mutacija koje smanjuju ili eliminišu vezivanje jednog antitela smanjuje ili eliminiše vezivanje drugog.

Termin „himerno“ antitelo ukazuje na antitelo kod koga je deo teškog i/ili lakog lanca dobijen od posebnog izvora ili vrste, dok je ostatak teškog i/ili lakog lanca dobijen od različitog izvora ili vrste.

„Klasa“ antitela ukazuje na vrstu konstantnog domena ili konstantnog regiona koju ima njegov teški lanac. Postoji pet glavnih klasa antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se dele na potklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. U određenim otelotvorenjima, antitelo je izotipa IgG4 sa mutacijom S228P u regionu šarke radi poboljšanja stabilnosti IgG4 antitela. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina zovu se α, δ, ε, γ, odnosno μ.

Izraz „citotoksični agens”, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na supstancu koja inhibira ili sprečava ćelijsku funkciju i/ili izaziva smrt ili uništenje ćelije. Citotoksični agensi uključuju, ali se ne ograničavaju na, radioaktivne izotope (npr. At<211>, I<131>, I<125>, Y<90>, Re<186>, Re<188>, Sm<153>, Bi<212>, P<32>, Pb<212>i radioaktivne izotope Lu); hemoterapeutske agense ili lekove (npr. metotreksat, adriamicin, vinka alkaloide (vinkristin, vinblastin, etopozid), doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin ili druge interkalirajuće agense); agense za inhibiciju rasta; enzime i njihove fragmente, kao što su nukleolitički enzimi; antibiotike; toksine, kao što su toksini malog molekula ili enzimski aktivni toksini bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, uključujući njihove fragmente i/ili varijante, kao i različite antitumorske ili antikancerogene agense koji su objavljeni dole.

Izraz „efektorske funkcije“ se odnosi na one biološke aktivnosti koje se mogu pripisati Fc regionu antitela, koje variraju u zavisnosti od izotipa antitela. Primeri efektorskih funkcija antitela uključuju: vezivanje C1q i komplement-zavisnu citotoksičnost (CDC); Fc receptorsko vezivanje; ćelijski posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodno regulisanje površinskih ćelijskih receptora (npr. B-ćelijski receptor), i aktivaciju B ćelija.

„Delotvorna količina“ agensa, npr. neke farmaceutske formulacije, odnosi se na količinu koja je u potrebnim dozama i vremenskim periodima delotvorna za postizanje željenog terapeutskog ili profilaktičkog rezultata.

Izraz „Fc region“ u ovom dokumentu se koristi da definiše C-terminalni region teškog lanca imunoglobulina koji sadrži najmanje deo konstantnog regiona. Ovaj izraz podrazumeva nativne sekvence Fc regiona i varijante Fc regiona. U jednom otelotvorenju, Fc region teškog lanca humanog IgG pruža se od Cys226, ili od Pro230, do karboksilnog terminusa teškog lanca. Međutim, na C-terminalnom kraju Fc regiona lizin (Lys447) može, ali ne mora da bude prisutan. U jednom otelotvorenju, anti-Lag3 antitelo kao što je ovde opisano je izotipa IgG1 i sadrži konstantni domen teškog lanca SEQ ID NO: 51 ili SEQ ID NO: 52. U jednom otelotvorenju, ono sadrži dodatni C-terminalni lizin (Lys447). U jednom otelotvorenju, anti-Lag3 antitelo kao što je ovde opisano je izotipa IgG4 i sadrži konstantni domen teškog lanca SEQ ID NO: 53. U jednom otelotvorenju, ono sadrži dodatni C-terminalni lizin (Lys447). Ako ovde nije drugačije naznačeno, numeracija aminokiselinskih ostataka u Fc regionu ili konstantnom regionu je prema EU sistemu numeracije, koji se zove i EU indeks, kao što je opisano u: Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

„Okvir“ ili „FR“ se odnosi na ostatke varijabilnog domena koji nisu ostaci hipervarijabilnog regiona (HVR). FR varijabilnog domena generalno se sastoji od četiri FR domena: FR1, FR2, FR3 i FR4. Shodno tome, HVR i FR sekvence generalno se pojavljuju u sledećem redosledu u VH (ili VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3 (L3)-FR4.

Izrazi „antitelo pune dužine”, „netaknuto antitelo” i „kompletno antitelo” u ovom dokumentu se koriste kao sinonimi, i odnose se na antitelo koje ima suštinski sličnu strukturu strukturi nativnog antitela, ili koje ima teške lance koji sadrže Fc region, kao što je u ovom dokumentu definisano.

Izrazi „ćelija domaćin”, „ćelijska linija domaćina” i „kultura ćelije domaćina” koriste se kao sinonimi i ukazuju na ćelije u koje je uvedena egzogena nukleinska kiselina, uključujući potomstvo takvih ćelija. Ćelije domaćini uključuju „transformante“ i „transformisane ćelije“, u koje spadaju primarne transformisane ćelije i potomstvo dobijeno od njih, bez obzira na broj presejavanja. Potomstvo ne mora biti po sadržaju nukleinskih kiselina sasvim istovetno matičnoj ćeliji, već može da sadrži mutacije. Ovde se uključuje mutantno potomstvo koje ima istu funkciju ili biološku aktivnost kakva je ispitana ili odabrana u originalno transformisanoj ćeliji.

„Humano antitelo“ je ono koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinskoj sekvenci antitela koju proizvodi čovek ili humana ćelija, ili ono dobijeno iz nehumanog izvora koji koristi humani repertoar antitela ili druge sekvence za kodiranje humanog antitela. Ova definicija humanog antitela posebno isključuje humanizovano antitelo koje sadrži antigen vezujuće ostatke koji nisu ljudskog porekla. U određenim otelotvorenjima, humano antitelo je izvedeno od nehumanog transgenog sisara, na primer miša, pacova ili zeca. U određenim otelotvorenjima, humano antitelo je izvedeno iz ćelijske linije hibridoma.

„Okvir humanog konsenzusa“ je okvir koji predstavlja najčešće aminokiselinske ostatke u izboru okvirnih sekvenci VL ili VH humanog imunoglobulina. Po pravilu, izbor VL ili VH sekvenci humanog imunoglobulina je iz podgrupe sekvenci varijabilnog domena. Po pravilu, podgrupa sekvenci je podgrupa kao u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), tom 1-3. U jednom otelotvorenju, za VL, podgrupa je podgrupa kapa I, kao u Kabat et al., gore navedeno. U jednom otelotvorenju, za VH, podgrupa je podgrupa III, kao u Kabat et al., gore navedeno.

„Humanizovano“ antitelo se odnosi na himerno antitelo koje sadrži aminokiselinske ostatke nehumanih HVR-ova i aminokiselinske ostatke humanih FR-ova. U određenim otelotvorenjima, humanizovano antitelo će sadržati u suštini sve, ili najmanje jedan, a tipično dva varijabilna domena, u kojima svi, ili suštinski svi HVR-ovi (npr. CDR), odgovaraju onima iz nehumanog antitela, a svi, ili suštinski svi FR-ovi, odgovaraju onima iz humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono može da sadrži najmanje deo konstantnog regiona antitela dobijenog od humanog antitela. „Humanizovani oblik“ antitela, npr. nehumanog antitela, odnosi se na antitelo koje je pretrpelo humanizaciju.

Izraz „hipervarijabilni region” ili „HVR”, u smislu ovog dokumenta, ukazuje na svaki od regiona varijabilnog domena antitela koji su hipervarijabilni u sekvenci („regioni koji određuju komplementarnost” ili „CDR”) i/ili formiraju strukturno definisane petlje („hipervarijabilne petlje”) i/ili sadrže ostatke u kontaktu sa antigenom („antigen kontakti”). U suštini, antitela sadrže šest HVR: tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3). U ovom dokumentu, primeri za HVR uključuju:

(a) hipervarijabilne petlje koje se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), i 96-101 (H3) (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.

196:901-917 (1987));

(b) CDR koji se pojavljuju na aminokiselinskim ostacima 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), i 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. izd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(c) kontakte antigena koji se javljaju na ostacima aminokiselina 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) i 93-101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol.262: 732-745 (1996)); i

(d) kombinacije (a), (b) i/ili (c), uključujući aminokiselinske ostatke HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) i 94-102 (H3).

U jednom otelotvorenju, ostaci HVR obuhvataju one identifikovane u Opisu aminokiselinskih sekvenci u nastavku.

Ako nije drugačije naznačeno, HVR ostaci i drugi ostaci u varijabilnom domenu (npr. FR ostaci) ovde su numerisani prema radu Kabat et al, supra.

„Imunokonjugat“ je antitelo konjugovano sa jednim ili više heterolognih molekula, uključujući, ali bez ograničenja, citotoksični agens.

„Pojedinac“ ili „ispitanik“ je sisar. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domaće životinje (npr. krave, ovce, mačke, pse i konje), primate (npr. ljude i nehumane primate, poput majmuna), zečeve i glodare (npr. miševi i pacovi). U određenim otelotvorenjima, pojedinac ili ispitanik je čovek.

„Izolovano“ antitelo je ono koje je odvojeno od komponente svog prirodnog okruženja. U nekim otelotvorenjima, antitelo se prečišćava do čistoće veće od 95% ili 99%, što je određeno, na primer, elektroforezom (npr., SDS-PAGE, izoelektričnim fokusiranjem (IEF), kapilarnom elektroforezom) ili hromatografski (npr. jonskom izmenom ili reversno faznom HPLC). Za pregled metoda za procenu čistoće antitela, pogledajte npr. Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

„Izolovana“ nukleinska kiselina se odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenata svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline koji se nalazi u ćelijama koje uobičajeno sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan ekstrahromozomski, ili na hromozomskoj lokaciji koja se razlikuje od njegove prirodne hromozomske lokacije.

„Izolovana nukleinska kiselina koja kodira anti-LAG3 antitelo” ukazuje na jedan molekul ili više molekula nukleinske kiseline koji kodiraju teške i lake lance antitela (ili njihove fragmente), uključujući takve molekule nukleinske kiseline u jednom vektoru ili odvojenim vektorima, i takve molekule nukleinske kiseline prisutne na jednoj lokaciji ili više lokacija u ćeliji domaćinu.

Termin „monoklonsko antitelo“, u smislu ovog dokumenta, odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja sadrže ovu populaciju su identična i/ili se vezuju za isti epitop, sa izuzetkom mogućih varijanti antitela, npr. koje sadrže mutacije koje postoje u prirodi ili se mogu razviti tokom stvaranja preparata monoklonskog antitela, a takve varijante su tipično prisutne u neznatnim količinama. Nasuprot preparatima poliklonskih antitela, koji tipično uključuju različita antitela, usmerena na različite determinante (epitope), svako monoklonsko antitelo iz preparata monoklonskog antitela je usmereno na pojedinačnu determinantu na antigenu. Stoga reč „monoklonsko“ ukazuje na karakter antitela, da je dobijeno iz suštinski homogene populacije antitela, i ne bi je trebalo tumačiti kao da podrazumeva zahtev za proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom mogu se dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na metodu hibridoma, postupke rekombinantne DNK, postupke displeja faga i postupke u kojima se koriste transgene životinje koje sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihove delove, i ovde su opisani takvi postupci i primeri drugih postupaka za dobijanje monoklonskih antitela.

"Golo antitelo" označava antitelo koje nije konjugovano sa heterolognim delom (npr. citotoksičnim delom) ili radiološkom oznakom. Golo antitelo može da bude prisutno u farmaceutskoj formulaciji.

„Nativna antitela“ se odnose na molekule imunoglobulina koji se sreću u prirodi, sa različitim strukturama. Na primer, nativna IgG antitela su heterotetramerni glikoproteini od oko 150.000 daltona, sastavljeni od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki teški lanac ima varijabilni region (VH), koji se takođe zove varijabilni teški domen ili varijabilni domen teškog lanca, za kojim slede tri konstantna domena (CH1, CH2 i CH3). Slično tome, od N-terminalnog do C-terminalnog kraja, svaki laki lanac ima varijabilni region (VL), koji se takođe zove varijabilni laki domen ili varijabilni domen lakog lanca, za kojim sledi konstantni laki (CL) domen. Laki lanac antitela može se svrstati u jedan od dva tipa, koji se zovu kapa (<Κ>) i lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence svog konstantnog domena.

Termin „uputstvo za upotrebu“ koristi se da se ukaže na uputstvo koje se tipično nalazi u komercijalnim pakovanjima terapeutskih proizvoda, koje sadrži informacije o indikacijama, upotrebi, doziranju, primeni, kombinovanoj terapiji, kontraindikacijama i/ili upozorenjima u vezi sa upotrebom takvog terapeutskog proizvoda.

„Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence“ u odnosu na sekvencu referentnog polipeptida definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidatu koji su identični sa aminokiselinskim ostacima u sekvenci referentnog polipeptida, nakon poravnavanja sekvenci i uvođenja praznina, ako je potrebno, da bi se postigao maksimalni procenat identičnosti sekvence. Poravnavanje radi određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na različite načine koji su poznati u okviru struke, na primer, pomoću javno dostupnog kompjuterskog softvera, kao što je softver BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) ili FASTA programski paket. Stručna lica iz ove oblasti mogu da odrede odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve potrebne algoritme za postizanje maksimalnog poravnavanja u kompletnoj dužini sekvenci koje se porede. Međutim, za ovde navedene svrhe, vrednosti % identičnosti aminokiselinske sekvence se generišu pomoću programa ggsearch iz FASTA paketa verzije 36.3.8c ili novije sa BLOSUM50 matricom za poređenje. Autori programskog paketa FASTA su W. R. Pearson i D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227-258; i Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36 i javno je dostupan na http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. Alternativno, javni server dostupan na http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi može se koristiti za upoređivanje sekvenci, koristeći program ggsearch (globalni protein:protein) i zadate opcije (BLOSUM50; praznina: -10; ekst: -2; Ktup = 2) kako bi se osiguralo da se izvrši globalno, a ne lokalno poravnanje. Procenat identičnosti aminokiselina dat je u zaglavlju izlaznog poravnanja.

Termin „farmaceutska formulacija“ se odnosi na preparat koji je u takvom obliku da omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka koji se u njoj nalazi i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za ispitanika na kome će formulacija biti primenjena.

„Farmaceutski prihvatljiv nosač“ se odnosi na sastojak farmaceutske formulacije koji nije aktivni sastojak, i koji je netoksičan za ispitanika. Farmaceutski prihvatljiv nosač uključuje, ali nije ograničen na pufer, ekscipijens, stabilizator ili konzervans.

U smislu ovog dokumenta, „lečenje“ (i gramatički oblici ove reči, kao što je „lečiti“) se odnosi na kliničku intervenciju u pokušaju da se izmeni prirodni tok bolesti kod pojedinca koji se leči, i može se primenjivati radi profilakse ili tokom kliničke patologije. Poželjni efekti lečenja uključuju, bez ograničenja, sprečavanje pojave ili recidiva bolesti, ublažavanje simptoma, smanjenje svih direktnih ili indirektnih patoloških posledica bolesti, sprečavanje metastaze, usporavanje stope napredovanja bolesti, poboljšavanje ili ublažavanje stanja bolesti, i remisiju ili poboljšanu prognozu. U nekim otelotvorenjima, antitela predmetnog pronalaska se primenjuju da odlože razvoj bolesti ili da uspore napredovanje bolesti.

Izrazi „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnose se na domen teškog ili lakog lanca antitela, koji učestvuje u vezivanju antitela za antigen. Varijabilni domeni teškog lanca i lakog lanca (VH odnosno VL) nativnog antitela tipično imaju slične strukture, pri čemu svaki domen sadrži četiri očuvana okvirna regiona (FR) i tri hipervarijabilna regiona (HVR). (Videti npr. Kindt et al. Kuby Immunology, 6. izd, W.H. Freeman and Co., str.91 (2007).) Jedan VH ili VL domen može biti dovoljan za dodeljivanje antigen vezujuće specifičnosti. Nadalje, antitela koja vezuju određeni antigen mogu se izolovati pomoću VH ili VL domena iz antitela koje vezuje antigen radi pregledanja biblioteke komplementarnih VL odnosno VH domena. Videti npr. Portolano et al., J. Immunol.150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

Termin „vektor“, kako se ovde koristi, ukazuje na molekul nukleinske kiseline koji može da propagira drugu nukleinsku kiselinu za koju je vezan. Ovaj termin obuhvata vektor kao samoumnožavajuću strukturu nukleinske kiseline, kao i vektor ugrađen u genom ćelije domaćina u koju je uveden. Pojedini vektori mogu da upravljaju ekspresijom nukleinskih kiselina za koje su operativno vezani. U ovom dokumentu, takvi vektori se pominju kao „ekspresioni vektori”.

I. SMEŠE I POSTUPCI

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovana antitela koja se vezuju za LAG3. U nekim otelotvorenjima, obezbeđena su antitela koja se vezuju za humani LAG3. Antitela prema pronalasku su korisna, npr. za dijagnozu ili lečenje kancera, za lečenje ili odlaganje progresije bolesti povezanih sa imunitetom, kao što je imunitet na tumor, ili za stimulaciju imunološkog odgovora ili funkcije, kao što je aktivnost T ćelija; ili za upotrebu kao imunostimulišućeg sredstva/ili za stimulaciju izlučivanja/oslobađanja granzima B (GrzB), interferona-gama (IFN-gama) i/ili interleukina 2 (IL-2).

A. Primeri za anti-LAG3 antitela

U nekim otelotvorenjima, obezbeđen je anti-LAG3, pri čemu antitelo:

i) takmiči se u vezivanju za LAG3 sa anti-LAG3 antitelom (koje sadrži VH i VL aLAG3(0414)) koje sadrži VH sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:7 i VL sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:8, i/ili

ii) vezuje se za ljudski i cinomolgus LAG3; i/ili

iv) pojačava oslobađanje granzima B ili IL-2 u testu mešovite limfocitne reakcije (mMLR) (kao što je prikazano u Primeru 3).

U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-LAG3 antitelo koje sadrži šest HVR-ova odabranih od (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6.

U drugom aspektu, antitelo iz pronalaska sadrži (a) VH domen koji sadrži sve tri sekvence VH HVR izabrane od (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 3, i (b) VL domen koji sadrži sve tri sekvence VL HVR izabrane od (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i (c) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6.

U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo koje sadrži (a) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1; (b) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (e) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5; i (f) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 6.

U svim gore pomenutim otelotvorenjima, anti-LAG3 antitelo je humano ili humanizovano. U jednom otelotvorenju, anti-LAG3 antitelo sadrži HVR-ove kao u bilo kom od prethodnih otelotvorenja, i dodatno sadrži akceptorski humani okvir, npr. humani imunoglobulinski ili humani konsenzusni okvir.

U jednom otelotvorenju, antitelo sadrži VH i VL sekvence u ID BR. SEKV.: 7 i ID BR. SEKV.: 8, datim redosledom, uključujući posttranslacione modifikacije tih sekvenci.

U daljem aspektu pronalaska, anti-LAG3 antitelo prema bilo kom od gornjih otelotvorenja je monoklonsko antitelo, uključujući himerno, humanizovano ili humano antitelo. U jednom otelotvorenju, anti-LAG3 antitelo je fragment antitela, npr. Fv, Fab, Fab’, scFv, dijatelo, ili F(ab’)2fragment. U drugom otelotvorenju, antitelo je antitelo pune dužine, na primer, sa supstitucijama L234A, L235A i P329G (LALA-PG) u Fc regionu izvedenom iz ljudskog IgG1 Fc regiona. (Videti, npr. WO 2012/130831 A1).

U daljem aspektu, anti-LAG3 antitelo prema bilo kom od gornjih otelotvorenja može da uključi bilo koju karakteristiku, samu ili u kombinaciji, kao što je opisano u poglavljima 1-7 u nastavku:

1. Afinitet antitela

U nekim otelotvorenjima, ovde dato antitelo ima konstantu disocijacije (Kd) ≤1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ili ≤ 0,001 nM (npr.10<-8>M ili manje, npr. od 10<-8>M do 10<-13>M, npr. od 10<-9>M do 10<-13>M).

U jednom otelotvorenju, Kd se meri testom vezivanja radioaktivno označenog antigena (RIA). U jednom otelotvorenju, RIA se izvodi sa Fab verzijom željenog antitela i njegovog antigena. Na primer, afinitet vezivanja Fab u rastvoru za antigen meri se uravnotežavanjem Fab sa minimalnom koncentracijom antigena obeleženog sa (<125>I) u prisustvu titracionih serija neobeleženog antigena, a zatim hvatanjem vezanog antigena pomoću ploče prevučene anti-Fab antitelom (videti npr., Chen et al. J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Radi utvrđivanja uslova za test, MICROTITER<®>ploče sa većim brojem bunarčića (Thermo Scientific) preko noći se oblažu sa 5 μg/ml anti-Fab antitela koje služi za hvatanje (Cappel Labs) u 50 mM natrijum karbonata (pH 9,6), a zatim se blokiraju pomoću 2% (m/V) albumina goveđeg seruma u PBS-u, tokom dva do pet sati na sobnoj temperaturi (oko 23 °C). Na neadsorbujućoj ploči (Nunc br.

269620), 100 pM ili 26 pM [<125>I]-antigena je pomešano sa serijskim razblaženjima željenog Fab (npr. u skladu sa procenom anti-VEGF antitela, Fab-12 u radu Presta et al., Cancer Res.

57:4593-4599 (1997)). Željeni Fab je zatim inkubiran tokom noći; međutim, inkubacija može da se nastavi u dužem periodu (npr. oko 65 sati) kako bi se obezbedilo uspostavljanje ravnoteže. Nakon toga, smeše su prenete na ploču za hvatanje i inkubirane su na sobnoj temperaturi (npr. tokom jednog sata). Rastvor se zatim uklanja, a ploča se ispira osam puta pomoću 0,1% polisorbata 20 (TWEEN-20<®>) u PBS-u. Kada su se ploče osušile, dodato je 150 μl scintilansa po bunarčiću (MICROSCINT-20™; Packard), a zatim su ploče merene na TOPCOUNT™ gama brojaču (Packard) tokom deset minuta. Koncentracije svakog Fab koje daju manje ili jednako 20% maksimalnog vezivanja odabrane su za primenu u testovima kompetitivnog vezivanja.

Prema drugom otelotvorenju, Kd se meri pomoću testa površinske plazmonske rezonance BIACORE<®>. Na primer, analiza pomoću uređaja BIACORE<®>-2000 ili BIACORE<®>-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) obavljena je na 25 °C sa CM5 čipovima sa imobilisanim antigenom uz ~10 jedinica odgovora (response units, RU). U jednom otelotvorenju, biosenzorski čipovi sa karboksimetilovanim dekstranom (CM5, BIACORE, Inc.) aktivirani su pomoću N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimid hidrohlorida (EDC) i N-hidroksisukcinimida (NHS) prema uputstvu dobavljača. Antigen se razblažuje 10 mM natrijum acetatom, pH 4,8, do 5 µg/ml (~0,2 µM) pre injektovanja pri protoku od 5 µl/minutu da bi se postiglo oko 10 jedinica odgovora (RU) kuplovanog proteina. Nakon ubrizgavanja antigena, injektuje se 1 M etanolamin da bi se blokirale grupe koje nisu reagovale. Za kinetička merenja, dvostruko serijsko razblaženje Fab (0,78 nM do 500 nM) injektuje se u PBS sa 0,05% polisorbata 20 (TWEEN-20™) surfaktanta (PBST) na 25 °C pri protoku od oko 25 µl/min. Brzine asocijacije (kon) i brzine disocijacije (koff) izračunate su pomoću jednostavnog jedan prema jedan Lengmirovog modela vezivanja (BIACORE<®>Evaluation Software, verzija 3.2), simultanim podešavanjem senzorgrama asocijacje i disocijacije. Ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) izračunata je kao odnos koff/kon. Pogledajte npr. Chen et al., J. Mol. Biol.

293:865-881 (1999). Ako brzina asocijacije prevazilazi 106 M-1 s-1 prema testu površinske plazmonske rezonance datom gore, tada brzina asocijacije može da se odredi korišćenjem tehnike fluorescentnog prigušivanja koja meri porast ili opadanje intenziteta fluorescentne emisije (ekscitacija = 295 nm; emisija = 340 nm, 16 nm širina trake) na 25 °C iz 20 nM antiantigen antitela (Fab oblik) u PBS-u, pH 7,2, u prisustvu rastućih koncentracija antigena, kako je izmereno na spektrometru, kao što je spektrofometar sa zaustavljanjem protoka (Aviv Instruments) ili SLM-Aminco™ spektrofotometar serije 8000 (ThermoSpectronic) koji ima kivetu sa mešanjem.

2. Fragmenti antitela

U određenim otelotvorenjima, antitelo koje je ovde dato je fragment antitela. Termin „Fragment antitela“ ukazuje na molekul koji nije netaknuto antitelo, a koji sadrži deo netaknutog antitela koje zadržava mogućnost specifičnog vezivanja za antigen. Fragmenti antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, jednolančani Fab (scFab); jednolančane varijabilne fragmente (scFv) i jednodomenska antitela (dAb). Za pregled određenih fragmenata antitela, pogledajte Holliger i Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005).

U jednom otelotvorenju, fragment antitela je Fab, Fab', Fab'-SH ili F(ab')2fragment, posebno Fab fragment. Digestijom netaknutih antitela papainom dobijaju se dva identična antigen vezujuća fragmenta, koji se nazivaju „Fab“ fragmenti, od kojih svaki sadrži varijabilne domene teškog i lakog lanca, a takođe i konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Termin „Fab fragment“ stoga se odnosi na fragment antitela koji obuhvata fragment lakog lanca koji sadrži VL domen i konstantni domen lakog lanca (CL), i VH domen i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab’ fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata dodavanjem ostataka na karboksi terminusu CH1 domena teškog lanca, uključujući jedan ili više cisteina iz regiona šarke antitela. Fab’-SH su Fab’ fragmenti u kojima ostatak cisteina konstantnih domena nosi slobodnu tiolnu grupu. Tretiranje pepsinom daje F(ab')2fragment koji ima dva mesta za kombinovanje antigena (dva Fab fragmenta) i deo Fc regiona. Raspravu o Fab i F(ab')2fragmentima koji sadrže regenerisane ostatke receptorski vezujućih epitopa i koji imaju produžen poluživot in vivo pogledajte u U.S. Patentu br.5,869,046.

U drugom otelotvorenju, fragment antitela je dijatelo, trijatelo ili tetratelo. Dijatela su fragmenti antitela sa dva mesta za vezivanje antigena koja mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Pogledajte, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.

9:129-134 (2003) i Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su takođe opisana u članku Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003).

U daljem otelotvorenju, fragment antitela je jednolančani fragment Fab. „Jednolančani fragment Fab“ ili „scFab“ je polipeptid koji se sastoji od varijabilnog domena teškog lanca antitela (VH), konstantnog domena 1 antitela (CH1), varijabilnog domena lakog lanca antitela (VL), konstantnog domena lakog lanca antitela (CL) i linkera, pri čemu pomenuti domeni antitela i pomenuti linker imaju jedan od sledećih redosleda u smeru od N-kraja do C-kraja: a) VH-CH1-linker-VL-CL, b) VL-CL-linker-VH-CH1, c) VH-CL-linker-VL-CH1 ili d) VL-CH1-linker-VH-CL. Konkretno, pomenuti linker je polipeptid od najmanje 30 aminokiselina, poželjno između 32 i 50 aminokiselina. Navedeni jednolančani fragmenti Fab se stabilizuju prirodnom disulfidnom vezom između CL domena i CH1 domena. Pored toga, ovi jednolančani molekuli Fab se mogu dalje stabilizovati stvaranjem međulančanih disulfidnih veza insercijom cisteinskih ostataka (npr. pozicija 44 u varijabilnom teškom lancu i pozicija 100 u varijabilnom lakom lancu prema Kabatovoj numeraciji).

U drugom otelotvorenju, fragment antitela je jednolančani varijabilni fragment (scFv). „Jednolančani varijabilni fragment (scFv)“ je fuzioni protein varijabilnih regiona teškog (VH) i lakog lanca (VL) antitela, povezan putem linkera. Konkretno, linker je kratak polipeptid od 10 do 25 aminokiselina i tipično je bogat glicinom za fleksibilnost, kao i serinom ili treoninom za rastvorljivost, i može povezivati N-kraj VHsa C-krajem VL, ili obrnuto. Ovaj protein zadržava specifičnost originalnog antitela, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju linkera. Pregled scFv fragmenata potražite npr. u: Pluckthün, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore izd., (Springer-Verlag, New York), str. 269-315 (1994); pogledajte takođe WO 93/16185; i U.S. Patent br.5,571,894 i 5,587,458.

U drugom otelotvorenju, fragment antitela je antitelo sa jednim domenom. Antitela sa jednim domenom su fragmenti antitela koji sadrže kompletan varijabilni domen teškog lanca antitela ili njegov deo, ili kompletan varijabilni domen lakog lanca antitela ili njegov deo. U pojedinim otelotvorenjima, antitelo sa jednim domenom je humano antitelo sa jednim domenom (Domantis, Inc., Waltham, MA; pogledajte, npr. U.S. Patent br.6,248,516 B1).

Fragmenti antitela se mogu dobiti različitim tehnikama, uključujući, ali se ne ograničavajući na proteolitičku digestiju netaknutog antitela, kao i proizvodnju pomoću rekombinantnih ćelija domaćina (npr. E. coli ili faga), kao što je ovde opisano.

3. Himerna i humanizovana antitela

U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je himerno antitelo. Pojedina himerna antitela su opisana npr. u U.S. Patentu br. 4,816,567; i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). U jednom primeru, himerno antitelo sadrži nehumani varijabilni region (npr. varijabilni region dobijen od miša, pacova, hrčka, zeca ili nehumanog primata, kao što je majmun) i humani konstantni region. U drugom primeru, himerno antitelo je antitelo „sa zamenjenom klasom“, kod koga je klasa ili potklasa zamenjena klasom ili potklasom matičnog antitela. Himerna antitela obuhvataju njihove antigen-vezujuće fragmente.

U određenim otelotvorenjima, himerno antitelo je humanizovano antitelo. Najčešće, nehumano antitelo je humanizovano da bi se smanjila imunogenost za ljude, pri čemu zadržava specifičnost i afinitet matičnog nehumanog antitela. Po pravilu, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena kod kojih su HVR-ovi, npr. CDR-ovi (ili njihovi delovi) dobijeni od nehumanog antitela, a FR-ovi (ili njihovi delovi) su dobijeni od sekvenci humanog antitela. Humanizovano antitelo opciono takođe sadrži najmanje deo humanog konstantnog regiona. U nekim otelotvorenjima, neki FR ostaci u humanizovanom antitelu su supstituisani odgovarajućim ostacima nehumanog antitela (npr. antitela sa koga su dobijeni HVR ostaci), npr. da bi se povratila ili poboljšala specifičnost antitela ili njegov afinitet.

Pregled humanizovanih antitela i metoda za njihovo dobijanje daje se npr. u Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), a dodatno su opisani npr. u Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US patentima br.5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 i 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (gde se opisuje graftovanje regiona koji određuje specifičnost (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (gde se opisuje „preuređivanje površine“); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (gde se opisuje „mešanje FR“); i Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) i Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (gde se opisuje pristup „vođene selekcije“ kod mešanja FR).

Humani okvirni regioni koji mogu da se koriste za humanizaciju uključuju, ali se ne ograničavaju na: okvirne regione izabrane metodom „najboljeg slaganja“" (pogledajte, npr. Sims et al. J. imunol. 151:2296 (1993)); okvirne regione dobijene od konsenzusne sekvence humanih antitela konkretne podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca (videti npr. Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); i Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); humane zrele (somatski mutirane) okvirne regione ili okvirne regione humane germinativne linije (videti, npr. Almagro i Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); i okvirne regione dobijene pregledanjem FR biblioteka (videti npr. Baca et al., J. Biol. Chem.

272:10678-10684 (1997) i Rosok et al., J. Biol. Chem.271:22611-22618 (1996)).

4. Humana antitela

U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je humano antitelo. Humana antitela se mogu dobiti primenom različitih tehnika poznatih u struci. Humana antitela su opisana u van Dijk i van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) i u Lonberg, Curr. Opin.

Immunol. 20:450-459 (2008).

Humana antitela se mogu dobiti primenom imunogena na transgenu životinju koja je modifikovana da proizvodi netaknuta humana antitela ili netaknuta antitela sa humanim varijabilnim regionima kao odgovor na antigenski izazov. Takve životinje tipično sadrže kompletne lokuse humanog imunoglobulina ili njihov deo, koji zamenjuju lokuse endogenog imunoglobulina, ili koji su prisutni ekstrahromozomski ili su nasumično integrisani u životinjske hromozome. U takvim transgenim miševima, lokusi endogenog imunoglobulina su po pravilu inaktivirani. Pogledajte pregled metoda za dobijanje humanih antitela od transgenih životinja u Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Pogledajte takođe, npr. U.S. Patent br. 6,075,181 i 6,150,584 koji opisuju tehnologiju XENOMOUSE™; U.S. Patent br.5,770,429 koji opisuje tehnologiju H<U>M<AB>®; U.S. Patent br. 7,041,870 koji opisuje tehnologiju K-M MOUSE®, i U.S. publikaciju patentne prijave br. US 2007/0061900, koja opisuje tehnologiju V<ELOCI>M<OUSE>®). Humani varijabilni regioni netaknutih antitela koje stvaraju takve životinje mogu se dalje modifikovati, npr. kombinovanjem sa različitim humanim konstantnim regionom.

Humana antitela se mogu takođe dobiti postupcima na bazi hibridoma. Opisane su ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma za proizvodnju humanih monoklonskih antitela. (Pogledajte, npr. Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, str. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); i Boerner et al. J. Immunol., 147: 86 (1991).) Humana antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma humanih B-ćelija takođe su opisana u Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Dodatni postupci uključuju one opisane, na primer, u U.S. Patentu br.7,189,826 (opisuje proizvodnju monoklonskih humanih IgM antitela iz ćelijskih linija hibridoma) i Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (opisuje humanohumane hibridome). Tehnologija humanih hibridoma (tehnologija trioma) takođe je opisana u Vollmers i Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i u Vollmers i Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).

Humana antitela takođe mogu da se proizvedu izolovanjem sekvenci varijabilnog domena Fv klona izabranih iz biblioteka displeja faga humanog porekla. Takve sekvence varijabilnog domena mogu onda da se kombinuju sa željenim humanim konstantnim domenom. Tehnike za izbor humanih antitela iz biblioteka antitela su opisane u nastavku.

5. Antitela dobijena iz biblioteka

Antitela iz predmetnog pronalaska mogu da se izoluju pretraživanjem kombinatornih biblioteka u potrazi za antitelima sa željenom aktivnošću ili aktivnostima. Pregled postupaka za skrining kombinatornih biblioteka je dat, npr. u Lerner et al. u Nature Reviews 16:498-508 (2016). Na primer, u struci je poznat veliki broj metoda za stvaranje biblioteka prikaza faga i pretraživanje takvih biblioteka za antitela koja imaju željene karakteristike vezivanja. Pregled takvih postupaka je dat, npr. u Frenzel et al. u mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. u Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) i Zhao et al. u Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016) kao i u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) i u Marks i Bradbury u Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003).

Kod pojedinih metoda displeja faga, repertoari VH i VL gena su odvojeno klonirani putem lančane reakcije polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u bibliotekama faga, koje zatim mogu da se pretražuju prema antigen-vezujućem fagu, kao što opisuju Winter et al., u Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994). Fagi tipično vrše displej fragmenata antitela, bilo kao jednolančani Fv (scFv) fragmenti ili kao Fab fragmenti. Biblioteke iz imunizovanih izvora daju antitela velikog afiniteta prema imunogenu, ne zahtevajući konstruisanje hibridoma. Alternativno, naivni repertoar može biti kloniran (npr. od ljudi) da bi se dobio jedan izvor antitela za širok spektar nesvojstvenih, kao i svojstvenih antigena bez ikakve imunizacije, kao što opisuju Griffiths et al., u EMBO Journal, 12: 725-734 (1993). Najzad, naivne biblioteke mogu takođe da se naprave sintetički, kloniranjem nepreuređenih segmenata V-gena iz matičnih ćelija, i upotrebom PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje veoma varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje premeštanja in vitro, kao što opisuju Hoogenboom i Winter, Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992). Patentne publikacije koje opisuju biblioteke faga humanih antitela su, na primer, sledeće: US patenti br. 5,750,373; 7,985,840; 7,785,903 i 8,679,490, kao i US patentne publikacije br.

2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 i 2007/0292936.

Dalji primeri metoda poznatih u struci za skrining kombinatornih biblioteka na antitela sa željenom aktivnošću ili aktivnostima uključuju prikaz ribozoma i iRNK, kao i postupke za prikaz i selekciju antitela na bakterijama, ćelijama sisara, ćelijama insekata ili ćelijama kvasca. Postupci za prikaz na površini kvasca su pregledani, npr. u Scholler et al. u Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) i u Cherf et al. u Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015) kao i u Zhao et al. i Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012). Postupci za prikaz ribozoma su opisani, npr. u He et al. u Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) i u Hanes et al. u PNAS 94:4937-4942 (1997).

Antitela ili fragmenti antitela izolovani iz biblioteka humanih antitela se ovde smatraju humanim antitelima ili fragmentima humanih antitela.

6. Multispecifična antitela

U pojedinim otelotvorenjima, ovde dato antitelo je multispecifično antitelo, npr. bispecifično antitelo. Multispecifična antitela su monoklonska antitela koja imaju specifičnosti vezivanja za najmanje dva različita mesta, tj. različite epitope na različitim antigenima ili različite epitope na istom antigenu. U određenim otelotvorenjima, multispecifično antitelo ima tri ili više specifičnosti vezivanja. U određenim otelotvorenjima, jedna od specifičnosti vezivanja je za LAG3, a druga (dve ili više) specifičnost je za bilo koji drugi antigen. U određenim otelotvorenjima, bispecifična antitela mogu da se vežu za dva različita epitopa (ili više) LAG3. Multispecifična (npr. bispecifična) antitela mogu takođe da se upotrebe za lokalizaciju citotoksičnih agensa na ćelijama koje eksprimiraju LAG3. Multispecifična antitela se mogu pripremiti kao kompletna antitela ili kao fragmenti antitela.

Tehnike za dobijanje multispecifičnih antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, rekombinantnu koekspresiju dva imunoglobulinska para teški lanac-laki lanac koji imaju različite specifičnosti (pogledajte Milstein i Cuello, Nature 305: 537 (1983)) i inženjering „dugme u rupici“ (pogledajte npr. US patent br.5,731,168 i Atwell et al., J.Mol. Biol.270:26 (1997)). Multispecifična antitela mogu takođe da se dobiju kreiranjem efekata elektrostatičkog upravljanja za dobijanje Fc-heterodimernih molekula antitela (videti, npr. WO 2009/089004); ukrštanja dva ili više antitela ili fragmenata (videti, npr. US Patent br.4,676,980, i Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); upotrebom leucinskih zatvarača za proizvodnju bispecifičnih antitela (videti npr. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992) i WO 2011/034605); korišćenjem uobičajene tehnologije lakog lanca za zaobilaženje problema pogrešnog uparivanja lakog lanca (videti, npr. WO 98/50431); koristeći tehnologiju „dijatela“ za pravljenje fragmenata bispecifičnih antitela (vidite, npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); i korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera (videti, npr. Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); i pripremom trispecifičnih antitela kao što je opisano, npr. u Tutt et al. J. imunol.147: 60 (1991).

Ovde su takođe obuhvaćena konstruisana antitela sa tri ili više mesta vezivanja antigena, uključujući, na primer, „antitela hobotnice“ ili DVD-Ig (videti, npr. WO 2001/77342 i WO 2008/024715). Drugi primeri multispecifičnih antitela sa tri ili više mesta za vezivanje antigena mogu se naći u WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 i WO 2013/026831. Bispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen takođe uključuje „dvojno delujuće FAb“ ili „DAF“, koje sadrži mesto vezivanja antigena koje se vezuje za LAG3, kao i za drugi različit antigen, ili dva različita epitopa LAG3 (videti npr.

US 2008/0069820 i WO 2015/095539).

Multispecifična antitela se takođe mogu obezbediti u asimetričnom obliku sa ukrštanjem domena u jednom ili više vezujućih krakova iste specifičnosti antigena, tj. razmenom VH/VL domena (videti npr. WO 2009/080252 i WO 2015/150447), CH1/CL domena (videti npr. WO 2009/080253) ili kompletnih krakova Fab (videti npr. WO 2009/080251, WO 2016/016299, takođe videti Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 i Klein et al., MAbs 8 (2016) 1010-20). U jednom otelotvorenju, multispecifično antitelo sadrži unakrsni Fab fragment. Termin „unakrsni Fab fragment“ ili „xFab fragment“ ili „krosover Fab fragment“ se odnosi na Fab fragment, pri čemu su ili varijabilni regioni ili konstantni regioni teškog i lakog lanca razmenjeni. Unakrsni Fab fragment sadrži polipeptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona teškog lanca (CH1), i polipeptidni lanac sastavljen od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Asimetrični kraci Fab se takođe mogu konstruisati uvođenjem naelektrisanih ili nenaelektrisanih aminokiselinskih mutacija u međupovršine domena kako bi se usmerilo ispravno Fab uparivanje. Videti npr. WO 2016/172485.

Različiti dalji molekulski formati za multispecifična antitela su poznati u struci i uključeni su ovde (videti npr. Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

7. Varijante antitela

U pojedinim otelotvorenjima, razmatrane su varijante aminokiselinskih sekvenci antitela koja su ovde data. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druga biološka svojstva antitela. Varijante aminokiselinskih sekvenci antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih modifikacija u sekvencu nukleotida koja kodira antitelo ili putem sinteze peptida. Takve modifikacije uključuju, na primer, uklanjanje, i/ili umetanje, i/ili supstituciju ostataka u aminokiselinskim sekvencama antitela. Bilo koja kombinacija uklanjanja, ubacivanja i supstitucije može se napraviti da se dođe do finalnog konstrukta, pod uslovom da finalni konstrukt ima željene karakteristike, npr. antigen vezujuće karakteristike.

a) Varijante supstitucije, ubacivanja i uklanjanja

U pojedinim otelotvorenjima, date su varijante antitela koja imaju jednu ili više supstitucija aminokiselina. Mesta od interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju HVR-ove i FR-ove. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom „poželjne supstitucije”. Konkretnije izmene su date u Tabeli 1 pod naslovom „primeri supstitucija“ i, kako je opisano u nastavku, prema klasama bočnih nizova aminokiselina. Aminokiselinske supstitucije mogu biti uvedene u željeno antitelo i proizvode ispitane na željenu aktivnost, npr. zadržano/poboljšano vezivanje antigena, smanjena imunogenost, ili poboljšan ADCC ili CDC.

TABELA 1

Aminokiseline mogu da se grupišu prema zajedničkim osobinama bočnog lanca: (1) hidrofobne: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) neutralne hidrofilne: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) kisele: Asp, Glu;

(4) bazne: His, Lys, Arg;

(5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro;

(6) aromatične: Trp, Tyr, Phe.

Nekonzervativne supstitucije zahtevaju zamenu člana jedne od ovih klasa drugom klasom.

Jedna vrsta supstitucionih varijanti uključuje supstituciju jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona matičnog antitela (npr. humanizovanog ili humanog antitela). Po pravilu, nastale varijante izabrane za dalje ispitivanje će imati modifikacije (npr. poboljšanja) izvesnih bioloških osobina (npr. povećan afinitet, smanjenu imunogenost) u odnosu na matično antitelo i/ili će imati suštinski zadržane izvesne biološke osobine matičnog antitela. Primer supstitucione varijante je afinitetno zrelo antitelo, koje može biti stvoreno na pogodan način, npr. korišćenjem tehnika afinitetnog sazrevanja na osnovu displeja faga, kao što su one ovde opisane. Ukratko, jedan ili više HVR ostataka su mutirani, i varijantna antitela su izložena na fagu i ispitana u pogledu određene biološke aktivnosti (npr. afiniteta vezivanja).

Izmene (npr. supstitucije) mogu se napraviti u HVR-ima, npr. radi poboljšanja afiniteta antitela. Takve izmene mogu biti napravljene na „žarišnim tačkama“ HVR-a, tj. na ostacima koji su kodirani kodonima koji učestalo trpe mutaciju tokom procesa somatskog sazrevanja (videti npr. Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), i/ili ostacima koji su u kontaktu sa antigenom, pri čemu se nastala varijanta VH ili VL ispituje na afinitet vezivanja. Afinitetno sazrevanje putem konstruisanja i ponovnog izbora iz sekundarnih biblioteka opisano je, npr., u Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al. izd., Human Press, Totowa, NJ, (2001).) U nekim otelotvorenjima afinitetnog sazrevanja, raznovrsnost se uvodi u varijabilne gene izabrane za sazrevanje putem bilo koje od raznovrsnih metoda (npr. PCR koji favorizuje greške, mešanje lanaca ili mutageneza kontrolisana oligonukleotidima). Zatim se kreira sekundarna biblioteka. Biblioteka se zatim pretražuje radi identifikovanja varijanti antitela sa željenim afinitetom. Drugi postupak za uvođenje raznovrsnosti uključuje pristup usmeren na HVR, gde je nekoliko HVR ostataka randomizovano (npr. 4-6 ostataka istovremeno). HVR ostaci uključeni u vezivanje antigena mogu biti specifično identifikovani, npr. primenom skenirajuće mutageneze sa alaninom ili modelovanja. Posebno su često ciljani CDR-H3 i CDR-L3.

U pojedinim otelotvorenjima, supstitucije, umetanja ili izbacivanja se mogu desiti u jednom ili više HVR regiona, dokle god takve izmene u značajnoj meri ne umanjuju sposobnost antitela da vezuje antigen. Na primer, u HVR regionima se mogu načiniti konzervativne izmene (npr. konzervativne supstitucije kao što su ovde date) koje znatno ne umanjuju afinitet vezivanja. Takve izmene mogu, na primer, biti izvan ostataka koji ostvaruju kontakt sa antigenom u HVR-ima. U pojedinim otelotvorenjima varijantnih sekvenci VH i VL datih iznad, svaki HVR je ili neizmenjen, ili sadrži najviše jednu, dve ili tri supstitucije aminokiselina.

Korisni postupak za identifikaciju ostataka ili regiona antitela koji mogu biti ciljani za mutagenezu zove se „ciljana mutageneza sa alaninom”, a opisan je u radu Cunningham i Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Prema ovoj metodi, ostatak ili grupa ciljnih ostataka (npr. naelektrisani ostaci, kao što su arg, asp, his, lys i glu) identifikuje se i zamenjuje neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr. alaninom ili polialaninom) da bi se odredilo da li to utiče na interakciju antitela sa antigenom. Dalje supstitucije mogu biti uvedene na lokacijama aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na inicijalne supstitucije. Alternativno, ili dodatno, kristalna struktura kompleksa antigen-antitelo služi za identifikovanje tačaka kontakta antitela sa antigenom. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci mogu biti ciljani, ili eliminisani kao kandidati za supstituciju. Varijante se mogu pregledati da bi se odredilo da li imaju željena svojstva.

Ubacivanja aminokiselinskih sekvenci obuhvataju spajanje amino- i/ili karboksiterminalnog kraja, pri čemu se dužina kreće od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže sto ili više ostataka, kao i ubacivanje u sekvencu jednog aminokiselinskog ostatka, ili većeg broja. Primeri terminalnih umetanja uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom. Druge varijante molekula antitela sa ubacivanjem obuhvataju spajanje sa N-terminalnim ili C-terminalnim krajem antitela sa enzimom (npr. za ADEPT) ili polipeptid, što povećava poluživot antitela u serumu.

b) Varijante glikozilacije

U određenim otelotvorenjima, antitelo koje je ovde dato izmenjeno je da bi se povećao ili smanjio stepen do kog je antitelo glikozilovano. Dodavanje ili uklanjanje mesta glikozilacije na antitelu može se pogodno postići izmenom aminokiselinske sekvence, tako da se jedno ili više mesta glikozilacije dodaju ili uklone.

Kada antitelo sadrži Fc region, može biti izmenjen oligosaharid vezan za njega. Nativna antitela koja proizvode ćelije sisara tipično sadrže razgranati, biantenarni oligosaharid koji je tipično vezan N-vezom za Asn297 CH2 domena Fc regiona. Videti npr. Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaharid može da obuhvata različite ugljene hidrate, npr. manozu, N-acetil glukozamin (GlcNAc), galaktozu i sijalinsku kiselinu, kao i fukozu vezanu za GlcNAc na „bazi“ biantenarne oligosaharidne strukture. U nekim otelotvorenjima, modifikacije oligosaharida u antitelu iz predmetnog pronalaska mogu biti načinjene da bi se dobile varijante antitela sa određenim poboljšanim svojstvima.

U jednom otelotvorenju, date su varijante antitela koje imaju nefukozilovani oligosaharid, tj. oligosaharidnu strukturu kojoj nedostaje fukoza vezana (direktno ili indirektno) za Fc region. Takav nefukozilovani oligosaharid (takođe nazvan „afukozilovani“ oligosaharid) posebno je N-vezani oligosaharid kojem nedostaje ostatak fukoze vezan za prvi GlcNAc u stablu biantenarne strukture oligosaharida. U jednom aspektu, date su varijante antitela koje imaju povećani udeo nefukozilovanih oligosaharida u Fc regionu u poređenju sa prirodnim ili matičnim antitelima. Na primer, udeo nefukozilovanih oligosaharida može biti najmanje oko 20%, najmanje oko 40%, najmanje oko 60%, najmanje oko 80%, ili čak oko 100% (tj. nema prisutnih fukozilovanih oligosaharida). Procenat nefukozilovanih oligosaharida je (prosečna) količina oligosaharida bez ostataka fukoze, u odnosu na zbir svih oligosaharida vezanih za Asn 297 (npr. kompleksne, hibridne i strukture sa visokim sadržajem manoze) mereno pomoću MALDI-TOF masene spektrometrije, kao što je, na primer, opisano u WO 2006/082515. Asn297 se odnosi na asparaginski ostatak koji se nalazi oko položaja 297 u Fc regionu (prema EU numeraciji ostataka Fc regiona); međutim, Asn297 takođe može da se nalazi oko ± 3 aminokiseline više ili niže od položaja 297, tj. između položaja 294 i 300, usled manjih varijacija sekvenci kod antitela. Takva antitela koja imaju povećan udeo nefukozilovanih oligosaharida u Fc regionu mogu imati poboljšano vezivanje FcγRIIIa receptora i/ili poboljšanu efektorsku funkciju, posebno poboljšanu ADCC funkciju. Vidite, npr. US2003/0157108; US2004/0093621.

Primeri ćelijskih linija sposobnih da proizvode antitela sa smanjenom fukozilacijom uključuju Lec13 CHO ćelije sa nedostatkom fukozilacije proteina (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108; i WO 2004/056312, naročito u primeru 11), i nokaut ćelijske linije, poput gena alfa-1,6-fukoziltransferaze, FUT8, nokaut CHO ćelije (videti npr. Yamane-Ohnuki, et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); i W02003/085107), ili ćelije sa smanjenom ili ukinutom aktivnošću sinteze GDP-fukoze ili proteina transportera (videti, npr. US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282).

U daljem otelotvorenju, varijante antitela su obezbeđene sa prepolovljenim oligosaharidima, npr. kod kojih je biantenarni oligosaharid vezan za Fc region antitela bisektovan pomoću GlcNAc. Takve varijante antitela mogu da imaju smanjenu fukozilaciju i/ili poboljšanu ADCC funkciju kao što je opisano iznad. Primeri takvih varijanti antitela su opisani, npr. u Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878.

Takođe se obezbeđuju i varijante antitela sa najmanje jednim ostatkom galaktoze u oligosaharidu vezanom za Fc region. Takve varijante antitela mogu da imaju poboljšanu CDC funkciju. Takve varijante antitela su opisane, npr. u WO1997/30087, WO1998/58964 i WO1999/22764.

c) Varijante Fc regiona

U određenim otelotvorenjima, jedna ili više modifikacija aminokiselina može biti uvedena u Fc region antitela iz ovog dokumenta, time stvarajući varijantu Fc regiona. Varijanta Fc regiona može da sadrži sekvencu humanog Fc regiona (npr. Fc region humanog IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4) koji sadrži modifikaciju aminokiseline (npr. supstituciju) na jednom ili više aminokiselinskih položaja.

U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak razmatra varijantu antitela koje ima neke, ali ne sve efektorske funkcije, što ga čini pogodnim kandidatom za primene kod kojih je poluživot antitela in vivo važan, ali su pojedine efektorske funkcije (kao što je komplementna i ADCC) nepotrebne ili štetne. In vitro i/ili in vivo testovi citotoksičnosti se mogu sprovesti radi potvrde smanjenja/sniženja CDC i/ili ADCC aktivnosti. Na primer, testovi vezivanja Fc receptora (FcR) mogu se sprovesti kako bi se obezbedilo da antitelo nema vezivanje FcgamaR (stoga, verovatno nema ADCC aktivnost), ali zadržava sposobnost vezivanja FcRn. Primarne ćelije za posredovanje ADCC, NK ćelije, eksprimiraju samo FcgamaRIII, dok monociti eksprimiraju FcgamaRI, FcgamaRII i FcgamaRIII ekspresija FcR na hematopoetskim ćelijama sumirana je u Tabeli 3 na strani 464 Ravetch i Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Neograničavajući primeri in vitro testova za određivanje ADCC aktivnosti željenog molekula opisani su u U.S. Patentu br. 5,500,362 (pogledajte, npr. Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) i Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (videti Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternativno, mogu biti korišćeni neradioaktivni postupci analize (videti, npr., ACTI™ neradioaktivni test citotoksičnosti za protočnu citometriju (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; i CytoTox 96<®>neradioaktivni test citotoksičnosti (Promega, Madison, WI). U korisne efektorske ćelije za takve testove spadaju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost željenog molekula može se odrediti in vivo, npr. na životinjskom modelu, kao što je onaj koji su objavili Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Testovi vezivanja C1q mogu takođe da se izvedu kako bi se potvrdilo da antitelo ne može da veže C1q i da, stoga, nema CDC aktivnost. Videti, npr., ELISA test vezivanja C1q i C3c u WO2006/029879 i WO2005/100402. Da bi se odredila komplementarna aktivacija, može da se obavi CDC test (pogledajte, npr. Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); i Cragg, M.S. i M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn vezivanje i in vivo određivanje klirensa/poluživota može takođe da se izvrši pomoću postupaka poznatih u struci (pogledajte, npr. Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006); WO 2013/120929 A1).

Antitela sa redukovanom efektorskom funkcijom uključuju ona sa supstitucijom jednog ili više ostataka Fc regiona 238, 265, 269, 270, 297, 327 i 329 (U.S. Patent br. 6,737,056). Takvi Fc mutanti obuhvataju Fc mutante sa supstitucijama na dva ili više položaja aminokiselina 265, 269, 270, 297 i 327, uključujući takozvani „DANA” Fc mutant sa supstitucijom ostataka 265 i 297 alaninom (US Patent br.7,332,581).

Opisane su pojedine varijante antitela sa poboljšanim ili smanjenim vezivanjem za FcR. (Pogledajte, npr. US patent br.6,737,056; WO2004/056312 i Shields et al., J. Biol. Chem.9(2): 6591-6604 (2001).)

U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje poboljšavaju ADCC, npr. supstitucije na položajima 298, 333 i/ili 334 Fc regiona (EU numeracija ostataka).

U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje povećavaju vezivanje FcRn, npr. supstitucije na položajima 252 i/ili 254 i/ili 256 Fc regiona (EU numeracija ostataka). U određenim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama 252, 254 i 256. U jednom otelotvorenju supstitucije su M252Y, S254T i T256E u Fc regionu koji potiče od Fc regiona ljudskog IgG1.

U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa supstitucijama aminokiselina koje smanjuju vezivanje FcγR, npr. supstitucije na položajima 234 i 235 Fc regiona (EU numeracija ostataka). U jednom otelotvorenju, supstitucije su L234A i L235A (LALA). U određenim otelotvorenjima, varijanta antitela dalje sadrži D265A i/ili P329G u Fc regionu izvedenom iz Fc regiona ljudskog IgG1. U jednom otelotvorenju, supstitucije su L234A, L235A i P329G (LALA-PG) u Fc regionu koji potiče iz Fc regiona ljudskog IgG1. (Videti, npr. WO 2012/130831 A1). U drugom otelotvorenju, supstitucije su L234A, L235A i D265A (LALA-DA) u Fc regionu koji potiče iz Fc regiona ljudskog IgG1.

U nekim otelotvorenjima, napravljene su izmene u Fc regionu koje imaju za rezultat izmenjeno (tj. poboljšano ili smanjeno) vezivanje C1q i/ili komplementno zavisnu citotoksičnost (CDC), npr. kao što opisuje US Patent br.6,194,551, WO99/51642, i Idusogie et al. J. imunol.164: 4178-4184 (2000).

Antitela sa povećanim poluživotom i poboljšanim vezivanjem za neonatalni Fc receptor (FcRn), koji je odgovoran za transfer IgG-ova majke na fetus (Guyer et al., J. Immunol.117:587 (1976) i Kim et al., J. Immunol.24:249 (1994)), opisana su u US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Ta antitela sadrže Fc region sa jednom ili više supstitucija koje poboljšavaju vezivanje Fc regiona za FcRn. Takve Fc varijante uključuju one sa supstitucijom na jednom ili više ostataka Fc regiona: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ili 434, npr. supstitucija ostatka Fc regiona 434 (videti npr. US patent br.7,371,826; Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem.281 (2006) 23514-23524).

Ostaci Fc regiona koji su ključni za interakciju mišjeg Fc sa mišjim FcRn identifikovani su mutagenezom usmerenom na mesto (videti npr. Dall’Acqua, W.F. et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180). Ostaci I253, H310, H433, N434 i H435 (EU numeracija prema Kabatu) uključeni su u interakciju (Medesan, C., et al., Eur. J. imunol.26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., et al., Eur. J. imunol.24 (1994) 542). Otkriveno je da su ostaci I253, H310 i H435 ključni za interakciju humanog Fc sa mišjim FcRn (Kim, J.K. et al., Eur. J. imunol.29 (1999) 2819). Studije ljudskog Fc-humanog FcRn kompleksa su pokazale da su ostaci I253, S254, H435 i Y436 ključni za interakciju (Firan, M., et al., Int. Immunol.13 (2001) 993; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem.276 (2001) 6591-6604). Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667--7671) objavili su i ispitali različite mutante ostataka 248 do 259 i 301 do 317 i 376 do 382 i 424 do 437.

U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje smanjuju FcRn, npr. supstitucije na položajima 253 i/ili 310 i/ili 435 Fc regiona (EU numeracija ostataka). U određenim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama 253, 310 i 435. U jednom otelotvorenju supstitucije su I253A, H310A i H435A u Fc regionu koji potiče od Fc regiona ljudskog IgG1. Videti npr. Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.

U pojedinim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa jednom ili više supstitucija aminokiselina koje smanjuju vezivanje FcRn, npr. supstitucije na položajima 310 i/ili 433 i/ili 436 Fc regiona (EU numeracija ostataka). U određenim otelotvorenjima, varijanta antitela sadrži Fc region sa supstitucijama aminokiselina na pozicijama 310, 433 i 436. U jednom otelotvorenju supstitucije su H310A, H433A i Y436A u Fc regionu koji potiče od Fc regiona ljudskog IgG1. (Videti, npr. WO 2014/177460 A1).

Pogledajte takođe Duncan i Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. Patent br.

5,648,260; U.S. Patent br. 5,624,821; i WO94/29351 koji se tiču drugih primera za varijante Fc regiona.

B. Rekombinantni postupci i kompozicije

Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih postupaka i kompozicija, npr., kao što je opisano u US4,816,567. Za ove postupke je obezbeđena jedna ili više izolovanih nukleinskih kiselina koje kodiraju antitelo.

U slučaju nativnog antitela ili fragmenta nativnog antitela potrebne su dve nukleinske kiseline, jedna za laki lanac ili njegov fragment i jedna za teški lanac ili njegov fragment. Takva nukleinska kiselina može kodirati aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela (npr. laki i/ili teški lanac antitela). Ove nukleinske kiseline mogu biti na istom ekspresionom vektoru ili na različitim ekspresionim vektorima.

U slučaju bispecifičnog antitela sa heterodimernim teškim lancima potrebne su četiri nukleinske kiseline, jedna za prvi laki lanac, jedna za drugi laki lanac koji sadrži prvi polipeptid heteromonomernog Fc-regiona, jedna za drugi laki lanac i jedna za drugi teški lanac koji sadrži drugi polipeptid heteromonomernog Fc-regiona. Četiri nukleinske kiseline mogu biti sadržane u jednom ili više molekula nukleinskih kiselina ili ekspresionih vektora. Takva nukleinska kiselina kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži prvi VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži prvi VH uključujući prvi heteromonomerni Fc-region i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži drugi VL i/ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži drugi VH uključujući drugi heteromonomerni Fc-region antitela (npr. prvi i/ili drugi laki i/ili prvi i/ili drugi teški lanci antitela). Ove nukleinske kiseline mogu biti na istom ekspresionom vektoru ili na različitim ekspresionim vektorima, normalno se ove nukleinske kiseline nalaze na dva ili tri ekspresiona vektora, tj. jedan vektor može da sadrži više od jedne od ovih nukleinskih kiselina. Primeri ovih bispecifičnih antitela su CrossMab i bispecifična T-ćelijska (videti, npr. Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191). Na primer, jedan od heteromonomernih teških lanaca sadrži takozvane „mutacije dugmeta“ (T366W i opciono jednu od S354C ili Y349C), a drugi sadrži takozvane „mutacije rupice“ (T366S, L368A i Y407V i opciono Y349C ili S354C) (videti, npr. Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73).

U jednom otelotvorenju, date su izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo koje se koristi u metodama koje su ovde navedene.

U sledećem otelotvorenju, obezbeđen je jedan ili više vektora (npr. ekspresionih vektora) koji sadrže takvu nukleinsku kiselinu(e).

U sledećem otelotvorenju, obezbeđena je ćelija domaćin koja sadrži takvu nukleinsku kiselinu (kiseline).

U jednom takvom otelotvorenju, ćelija domaćin sadrži (npr., transformisana je sa): - u slučaju antitela sastavljenog od dva identična laka lanca i dva identična teška lanca koji su vezani disulfidnom vezom ili VH i VL koji sadrže njihov fragment:

(1) vektor koji sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela i aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela, ili

(2) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VL antitela i drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži VH antitela.

- u slučaju bispecifičnog antitela sa heterodimernim teškim lancima:

(1) prvi vektor koji sadrži prvi par nukleinskih kiselina koje kodiraju aminokiselinske sekvence pri čemu jedna od njih sadrži prvi VL, a druga sadrži prvi VH antitela i drugi vektor koji sadrži drugi par nukleinskih kiselina koje kodiraju aminokiselinske sekvence od kojih jedna sadrži drugi VL i druga sadrži drugi VH antitela, ili

(2) prvi vektor koji sadrži prvu nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži jedan od varijabilnih domena (poželjno varijabilni domen lakog lanca), drugi vektor koji sadrži par nukleinskih kiselina koje kodiraju aminokiselinske sekvence, a jedna od njih sadrži varijabilni domen lakog lanca, a druga sadrži prvi varijabilni domen teškog lanca, i treći vektor koji sadrži par nukleinskih kiselina koje kodiraju aminokiselinske sekvence, jedna od njih sadrži odgovarajući drugi varijabilni domen lakog lanca kao u drugom vektoru, a druga sadrži drugi varijabilni domen teškog lanca, ili

(3) prvi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži prvi VL antitela, drugi vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži prvi VH antitela, treći vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja sadrži drugi VL antitela, i četvrti vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselisnku sekvencu koja sadrži drugi VH antitela.

U jednom otelotvorenju, ćelija domaćin je eukariotska, npr. ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili limfoidna ćelija (npr., Y0, NS0, Sp20 ćelija). U jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za proizvodnju anti-LAG3 antitela, pri čemu postupak obuhvata uzgajanje ćelije domaćina koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo, kako je dato gore, u uslovima koji su pogodni za ekspresiju antitela i, eventualno, izolovanje antitela iz ćelije domaćina (ili medijuma za uzgajanje ćelija domaćina).

Za rekombinantnu proizvodnju anti-LAG3 antitela, nukleinske kiseline koje kodiraju antitelo, npr. kako je gore opisano, izoluju se i ubacuju u jedan ili više vektora radi daljeg kloniranja i/ili ekspresije u ćeliji domaćina. Takve nukleinske kiseline mogu biti lako izolovane i sekvencirane korišćenjem klasičnih postupaka (npr. korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se selektivno vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela) ili proizvedene rekombinantnom metodom ili dobijene hemijskom sintezom.

Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo uključuju prokariotske ili eukariotske ćelije, ovde opisane. Na primer, antitela se mogu proizvesti u bakteriji, naročito kada nije neophodna glikozilacija niti Fc efektorska funkcija. Za ekspresiju fragmenata antitela i polipeptida u bakterijama, videti npr., US5,648,237, US5,789,199 i US5,840,523. (Videti takođe Charlton, KA, u: Methods in Molecular Biology, sveska 248, Lo, B.K.C. (izd.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), str.245-254, gde je opisana ekspresija fragmenata antitela u E. coli.) Nakon ekspresije, antitelo može da se izoluje iz paste bakterijskih ćelija u rastvorljivoj frakciji, i može dalje da se prečišćava.

Osim prokariota, eukariotski mikrobi, kao što su filamentozne gljivice ili kvasci, pogodni su domaćini za kloniranje ili ekspresiju vektora koji kodiraju antitelo, uključujući sojeve gljivica i kvasaca čiji su putevi glikozilacije „humanizovani“, što dovodi do stvaranja antitela sa delimično ili potpuno humanim obrascem glikozilacije. Vidite Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; i Li, H. et al., Nat. Biotech.24 (2006) 210-215.

Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su takođe izvedene od višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni sojevi bakulovirusa koji mogu da se koriste zajedno sa ćelijama insekata, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

Kulture biljnih ćelija se takođe mogu koristiti kao domaćini. Videti npr. US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 i US 6,417,429 (opisuju PLANTIBODIESTM tehnologiju za proizvodnju antitela u transgenim biljkama).

Ćelije kičmenjaka se, slično tome, mogu upotrebiti kao domaćini. Na primer, mogu se koristiti ćelijske linije sisara koje su adaptirane za rast u suspenziji. Drugi primeri ćelijskih linija sisara koje se koriste kao domaćini su: CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7); bubrežna linija humanog embriona (293 ili 293 ćelije su opisane, npr. u Graham, F.L. et al. J. Gen Virol.36 (1977) 59-74); bubrežne ćelije bebe hrčka (BHK); mišje sertolijeve ćelije (TM4 ćelije su opisane, npr., u Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); ćelije bubrega majmuna (CV1); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76); ćelije humanog karcinoma cerviksa (HELA); bubrežne ćelije psa (MDCK; ćelije jetre bufalo pacova (BRL3A); ćelije pluća čoveka (W138); ćelije jetre čoveka (Hep G2); mišji tumor dojke (MMT060562); TRI ćelije, kako su opisane, npr. u Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci.

383 (1982) 44-68; MRC5 ćelije; i FS4 ćelije. Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR-CHO ćelije (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA77 (1980) 4216-4220); i ćelijske linije mijeloma poput Y0, NS0 i Sp2/0. Za pregled izvesnih ćelijskih linija domaćina sisara, pogodnih za proizvodnju antitela, vidite, npr. Yazaki, P. i Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, sveska 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp.255-268.

C. Testovi

Ovde obezbeđena anti-LAG3 antitela se mogu identifikovati, pregledati ili okarakterisati prema fizičkim/hemijskim svojstvima i/ili biološkoj aktivnosti, različitim testovima poznatim u struci.

1. Testovi vezivanja i drugi testovi

U jednom aspektu, antitelo prema pronalasku se testira na vezivanje za antigen, na primer, poznatim posupcima kao što su ELISA, vestern blot, itd.

U drugom aspektu, mogu se koristiti kompetitivni testovi za identifikovanje antitela koje se takmiči sa aLAG3(0414) u vezivanju za LAG3. U određenim otelotvorenjima, takvo konkurentsko antitelo se vezuje za isti epitop (npr. linearni ili konformacioni epitop) za koji se vezalo aLAG3(0414). Detaljni primeri postupaka za mapiranje epitopa za koji se vezuje antitelo dati su u: Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols,” u Methods in Molecular Biology vol.66 (Humana Press, Totowa, NJ).

U primeru za kompetitivni test, imobilisani LAG3 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo obeleženo antitelo, koje se vezuje za LAG3 (npr. aLAG3(0414)), i drugo neobeleženo antitelo, čija sposobnost da se takmiči sa prvim antitelom u vezivanju za LAG3 se ispituje. Drugo antitelo može da se nalazi u supernatantu hibridoma. Kao kontrola, imobilisani LAG3 je inkubiran u rastvoru koji sadrži prvo, obeleženo antitelo, ali ne i drugo, neobeleženo antitelo. Nakon inkubacije, u uslovima koji dopuštaju vezivanje prvog antitela za LAG3, višak nevezanog antitela se uklanja i meri se količina obeleživača vezanog za imobilisano LAG3. Ako je količina obeleživača vezanog za imobilisani LAG3 u ispitivanom uzorku značajno smanjena u odnosu na kontrolni uzorak, to ukazuje da se drugo antitelo takmiči sa prvim antitelom u pogledu vezivanja za LAG3. Pogledajte Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual poglavlje 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. Testovi za merenje aktivnosti

U jednom aspektu, dati su testovi za identifikaciju ovih anti-LAG3 antitela koja imaju biološku aktivnost. Biološka aktivnost može uključivati, npr. učinak anti-LAG3 antitela (samih ili u kombinaciji sa anti-PDL1 antitelima) na citotoksično oslobađanje granzima B i lučenje IL-2 od strane humanih CD4 T ćelija u mešovitoj reakciji limfocita (mMLR) ili učinak anti-LAG-3 antitela na Treg supresiju oslobađanja granzima B i IFN-γ od strane humanih CD4 T ćelija; ili inhibiciju LAG-3 vezivanja za MHC-II eksprimiran na ljudskim A375 tumorskim ćelijama anti-LAG3 antitelima. Antitela koja imaju takvu biološku aktivnost in vivo i/ili in vitro takođe su obezbeđena.

U pojedinim realizacijama, antitelo iz predmetnog pronalaska je ispitano na takvu biološku aktivnost. Za više detalja, pogledajte primere 2 i 3 ispod.

D. Postupci i kompozicije za dijagnostiku i detektovanje

U pojedinim otelotvorenjima, svako od anti-LAG3 antitela koja su ovde data korisno je za detektovanje LAG3 u biološkim uzorcima. Termin „detekcija“, kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U pojedinim otelotvorenjima, biološki uzorak uključuje ćeliju ili tkivo, kao što je tkivo tumora.

U jednom otelotvorenju, dato je anti-LAG3 antitelo za upotrebu u postupcima za dijagnozu ili detekciju. U sledećem aspektu, obezbeđen je postupak za detekciju prisustva LAG3 u biološkom uzorku. U pojedinim otelotvorenjima, postupak obuhvata kontakt biološkog uzorka sa anti-LAG3 antitelom kao što je ovde opisano, pod uslovima koji dopuštaju vezivanje anti-LAG3 antitela sa LAG3, i detektovanje nastajanja kompleksa između anti-LAG3 antitela i LAG3. Takav postupak može biti in vitro ili in vivo postupak. U jednom otelotvorenju, anti-LAG3 antitelo je upotrebljeno da se izabere ispitanik podoban za terapiju anti-LAG3 antitelom, npr. kada je LAG3 biomarker za izbor pacijenata.

Primeri poremećaja koji se mogu dijagnostikovati pomoću antitela iz ovog pronalaska uključuju rak u različitim oblicima kao što je hronična limfocitna leukemija (CLL), rak dojke itd. (videti takođe listu kancera ispod)

U pojedinim otelotvorenjima, data su obeležena anti-LAG3 antitela. Oznake uključuju, ali nisu ograničene na, oznake ili ostatke koji se detektuju direktno (kao što su fluorescentne, hromoforne, elektronski nepropusne, hemiluminescentne i radioaktivne oznake), kao i funkcionalne ostatke, kao što su enzimi ili ligandi, koji se detektuju indirektno, npr. putem enzimske reakcije ili molekulske interakcije. Primeri oznaka uključuju, ali se ne ograničavaju na radioizotope<32>P,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I, fluorofore, kao što su helati retkih zemalja ili fluorescein i njegovi derivati, rodamin i njegovi derivati, dansil, umbeliferon, luceriferaze, npr. luciferaza svica i bakterijska luciferaza (U.S. Patent br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazindione, peroksidazu rena (HRP), alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu, glukoamilazu, lizozim, saharid oksidaze, npr. glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza, heterociklične oksidaze, kao što je urikaza i ksantin oksidaza, vezane sa enzimom koji koristi vodonik peroksid za oksidaciju prekursora boje, kao što je HRP, laktoperoksidazu ili mikroperoksidazu, biotin/avidin, spin oznake, oznake bakteriofaga, stabilne slobodne radikale, i slično.

E. Farmaceutske formulacije

Farmaceutske formulacije anti-LAG3 antitela kako su ovde opisane pripremaju se mešanjem takvog antitela koje ima željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoca u primenjenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali se ne ograničavaju na: pufere, kao što je fosfatni, citratni, i puferi drugih organskih kiselina; antioksidanse, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide male molekulske mase (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere, kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline, kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense, kao što je EDTA; šećere, kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji grade soli, kao što je natrijum; metalne komplekse (npr. komplekse Zn-protein); i/ili nejonske surfaktante, kao što je polietilen glikol (PEG). Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača, iz ovog dokumenta, dalje uključuju agense za intersticijalnu disperziju lekova, kao što su rastvorni neutralno aktivni glikoproteini hijaluronidaze (sHASEGP), na primer, humani rastvorljivi PH-20 glikoproteini hijaluronidaze, kao što je rHuPH20 (HYLENEX<®>, Baxter International, Inc.). Pojedini primeri za sHASEGP i postupke primene, uključujući rHuPH20, opisani su u US Patent Publication br. 2005/0260186 i 2006/0104968. U jednom aspektu, sHASEGP se kombinuje sa jednom ili više dodatnih glikozaminoglikanaza, kao što je hondroitinaza.

Primeri liofilizovanih formulacija antitela opisani su u US Patentu br. 6,267,958. Vodene formulacije antitela obuhvataju one opisane u US Patentu br. 6,171,586 i WO2006/044908, pri čemu ove druge formulacije uključuju histidin-acetatni pufer.

Formulacija ovde može takođe da sadrži više od jednog aktivnog sastojka, kao što je neophodno za naročitu indikaciju koja se leči, poželjno one sa komplementarnim aktivnostima koje ne utiču negativno jedna na drugu. Na primer, može biti poželjno da se dalje obezbede anti-PD1 ili anti PDL1 antitela, ili anti TIM3 antitela. Takvi aktivni sastojci su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasne za nameravane svrhe.

Aktivni sastojci mogu biti zarobljeni u pripremljenim mikrokapsulama, na primer, tehnikom koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloze, odnosno želatinskih mikrokapsula, odnosno poli-(metilmetakrilat) mikrokapsula, u koloidnim sistemima za isporuku lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su objavljene u Remington’s Pharmaceutical Sciences 16. izdanje, Osol, A. Ed. (1980).

Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koje sadrže antitelo, pri čemu su matrice uobličeni proizvodi, npr. filmovi ili mikrokapsule.

Formulacije za primenu in vivo generalno su sterilne. Sterilnost se može lako postići, npr. filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.

F. Postupci lečenja i preparati

Svako od anti-LAG3 antitela koja su ovde data može biti upotrebljeno u postupcima lečenja.

U jednom aspektu, dato je anti-LAG3 antitelo da se koristi kao lek. U daljim aspektima, dato je anti-LAG3 antitelo ili upotreba u lečenju kancera. U pojedinim otelotvorenjima, dato je anti-LAG3 antitelo za upotrebu u postupku lečenja. U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak daje anti-LAG3 antitelo za upotrebu u postupku lečenja pojedinca koji ima kancer, što obuhvata davanje pojedincu efikasne količine anti-LAG3 antitela. U jednom otelotvorenju, antitelo služi za upotrebu u lečenju ili odlaganju progresije bolesti povezane sa imunitetom, kao što je imunitet na tumore. U jednom otelotvorenju, antitelo služi za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora ili funkcije, kao što je aktivnost T ćelija.

U sledećim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-LAG3 antitelo za upotrebu kao imunostimulišući agens/ili agens za stimulisanje lučenja/oslobađanja granzima B (GrzB), interferona gama (IFN gama) i/ili interleukina 2 (IL-2). U pojedinim otelotvorenjima, pronalazak obezbeđuje anti-LAG3 antitelo za upotrebu u postupku izlučivanja/oslobađanja granzima B (GrzB), interferona gama (IFN-gama) i/ili interleukina 2 (IL-2) kod pojedinca, uključujući davanje pojedincu efikasnog anti-LAG3 antitela za izlučivanje/oslobađanje granzima B (GrzB), interferona gama (IFN-gamma) i interleukina 2 (IL-2).

„Pojedinac” prema svakom od navedenih otelotvorenja je poželjno čovek. U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-LAG3 antitela u proizvodnji ili pripremi leka. U jednom otelotvorenju, radi se o leku za lečenje raka. U jednom drugom otelotvorenju, radi se o leku koji se koristi u metodi za lečenje raka, koja se sastoji od davanje efikasne količine leka pojedincu koji ima rak. U daljem otelotvorenju, lek je za indukovanje ćelijski posredovane lize ćelija kancera. U sledećem otelotvorenju, lek se koristi za postupak indukovanja ćelijski posredovane lize ćelija kancera kod pojedinca koji boluje od kancera, uključujući davanje pojedincu određene efikasne količine leka za indukciju apoptoze u ćeliji kancera/ili za inhibiranje proliferacije ćelija kancera. „Pojedinac“ prema bilo kom od gore navedenih otelotvorenja može biti čovek.

Termin „kancer“, kao što se ovde koristi, može, na primer, biti kancer pluća, nemikrocelularni karcinom pluća (NSCL), bronhioalveolarni ćelijski kancer pluća, kancer kostiju, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, kutani ili intraokularni melanom, kancer uterusa, kancer ovarijuma, rektalni kancer, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer želuca, kancer kolona, kancer dojke, kancer uterusa, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom cerviksa, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodžkinova bolest, kancer ezofagusa, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer tiroidne žlezde, kancer paratiroidne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer uretre, kancer penisa, kancer prostate, kancer bešike, kancer bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, mezoteliom, hepatocelularni kancer, kancer žučnih puteva, neoplazme centralnog nervnog sistema (CNS), tumori kičmenog stuba, gliom moždanog stabla, glioblastoma multiforme, astrocitomi, švanomi, ependimoni, meduloblastomi, meningiomi, karcinomi skvamoznih ćelija, adenom hipofize, limfom, limfocitna leukemija, uključujući refraktorne verzije svih gorenavedenih kancera, ili kombinaciju jednog ili više gorenavedenih kancera. U jednom poželjnom otelotvorenju, takav kancer je kancer dojke, kolorektalni kancer, melanom, kancer glave i vrata, kancer pluća ili kancer prostate. U jednom poželjnom otelotvorenju, takav kancer je kancer dojke, kancer jajnika, rak grlića maternice, rak pluća ili rak prostate. U još jednom poželjnom otelotvorenju, takav kancer je kancer dojke, kancer pluća, kancer kolona, kancer jajnika, melanomski kancer, kancer mokraćne bešike, renalni kancer, kancer bubrega, kancer jetre, kancer glave i vrata, kolorektalni kancer, kancer pankreasa, karcinom želuca, kancer jednjaka, mezoteliom, kancer prostate, leukemija, limfom, mijelomi. U jednom poželjnom otelotvorenju, takvi kanceri su dalje okarakterisani ekspresijom ili prekomernom ekspresijom LAG3.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih anti-LAG3 antitela, npr. za upotrebu u bilo kom od gornjih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-LAG3 antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže bilo koje od ovde datih anti-LAG3 antitela, npr. za upotrebu u bilo kom od gornjih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-LAG3 antitela i farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugom otelotvorenju, farmaceutska formulacija uključuje bilo koje od ovde datih anti-LAG3 antitela, i najmanje jedno dodatno lekovito sredstvo, npr. kao što je dole opisano.

Antitela iz pronalaska se mogu koristiti ili sama ili u kombinaciji sa drugim agensima u terapiji. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska može biti primenjeno uz najmanje jedan dodatni terapeutski agens. U određenim otelotvorenjima, dodatno terapeutsko sredstvo je anti-LAG3 ili anti PDL1 ili anti TIM3 antitelo.

Pored anti-LAG3 antitela, može se primeniti i hemoterapeutsko sredstvo. U jednom otelotvorenju, takvi dodatni hemoterapeutski agensi, koji se mogu primenjivati sa anti-LAG3 antitelom kao što je ovde opisano, uključuju, ali nisu ograničeni na antineoplastične agense, uključujući alkilujuće agense koji uključuju: azotne iperite, kao što je mehloretamin, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan i hlorambucil; nitrozoureje, kao što je karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), i semustin (metil-CCNU); Temodal(TM) (temozolamid), etilenimine/metilmelamin kao što je trietilenmelamin (TEM), trietilen, tiofosforamid (tiotepa), heksametilmelamin (HMM, altretamin); alkil sulfonate kao što je busulfan; triazine kao što je dakarbazin (DTIC); antimetabolite uključujući analoge folne kiseline kao što je metotreksat i trimetreksat, analoge pirimidina kao što je 5-fluoruracil (5FU), fluordezoksiuridin, gemcitabin, citozin arabinozid (AraC, citarabin), 5-azacitidin, 2,2'-difluordezoksicitidin, analoge purina kao što je 6-merkaptopurin, 6-tioguamin, azatioprin, T-deoksikoformicin (pentostatin), eritrohidroksinoniladenin (EHNA), fludarabin fosfat i 2-hlordeoksiadenozin (kladribin, 2-CdA); prirodne proizvode uključujući antimitotske lekove kao što je paklitaksel, vinka alkaloide uključujući vinblastin (VLB), vinkristin i vinorelbin, taksoter, estramustin i estramustin fosfat; pipodofilotoksine kao što je etopozid i tenipozid; antibiotike kao što je aktinomicin D, daunomicin (rubidomicin), doksorubicin, mitoksantron, idarubicin, bleomicini, plikamicin (mitramicin), mitomicin C i aktinomicin; enzime kao što je L-asparaginaza; modifikatore biološkog odgovora kao što je interferon-alfa, IL-2, G-CSF i GM-CSF; različite agense uključujući koordinacione komplekse platine kao što je oksaliplatin, cisplatin i karboplatin, antracendione kao što je mitoksantron, supstituisane uree kao što je hidroksiurea, derivate metilhidrazina uključujući N-metilhidrazin (MIH) i prokarbazin, adrenokortikalne supresive kao što je mitotan (o, p-DDD) i aminoglutetimid; hormone i antagoniste uključujući antagoniste adrenokortikosteroida kao što su prednizon i ekvivalenti, deksametazon i aminoglutetimid; Gemzar(TM) (gemcitabin), progestin kao što je hidroksiprogesteron kaproat, medroksiprogesteron acetat i megestrol acetat; estrogen kao što je dietilstilbestrol i ekvivalenti etinil estradiola; antiestrogen kao što je tamoksifen; androgene uključujući testosteron propionat i fluoksimesteron/ekvivalente; antiandrogene kao što je flutamid, analoge gonadotropin-otpuštajućeg hormona i leuprolid; i nesteroidne antiandrogene kao što je flutamid. Terapije koje ciljaju epigenetski mehanizam koje uključuju, ali nisu ograničene na, inhibitore histon deacetilaze, demetilujuće agense (npr. vidaza) i oslobađanje terapije transkripcione represije (ATRA), takođe se mogu kombinovati sa antigen vezujućim proteinima. U jednom otelotvorenju, hemoterapeutski agens je izabran iz grupe koja se sastoji od taksana (poput npr. paklitaksela (Taxol), docetaksela (Taxotere), modifikovanog paklitaksela (npr. Abraxane i Opaxio), doksorubicina, sunitiniba (Sutent), sorafeniba (Nexavar), i drugih inhibitora multikinaze, oksaliplatina, cisplatina i karboplatina, etopozida, gemcitabina i vinblastina. U jednom otelotvorenju, hemoterapeutski agens je izabran iz grupe koja se sastoji od taksana (kao što je npr. taksol (paklitaksel), docetaksel (Taxotere), modifikovani paklitaksel (npr. Abraxane i Opaxio). U jednom otelotvorenju, dodatni hemoterapeutski agens je izabran od 5-fluoruracila (5-FU), leukovorina, irinotekana ili oksaliplatina. U jednom otelotvorenju, hemoterapeutski agens je 5-fluoruracil, leukovorin i irinotekan (FOLFIRI). U jednom otelotvorenju, hemoterapeutski agens je 5-fluoruracil i oksaliplatin (FOLFOX).

Takve kombinovane terapije koje su gore pomenute obuhvataju kombinovanu primenu (gde su dva ili više terapeutskih agenasa obuhvaćeni istom formulacijom, ili različitim formulacijama), i odvojenu primenu, u kom slučaju primena antitela predmetnog pronalaska može da se odigra pre primene dodatnog terapeutskog agensa i/ili agenasa, istovremeno sa njim i/ili nakon njegove primene. U jednom otelotvorenju, primena anti-LAG3 antitela i primena dodatnog terapeutskog agensa se dešavaju približno u roku od jednog meseca, ili približno u roku od jedne, dve ili tri nedelje, ili približno u roku od jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest dana, jedna od druge. Antitela iz pronalaska mogu se takođe upotrebiti u kombinaciji sa radijacionom terapijom.

Antitelo iz predmetnog pronalaska (i svaki dodatni terapeutski agens) može biti primenjeno bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući parenteralnu, intrapulmonarnu i intranazalnu, i, ako se želi za lokalno lečenje, intralezionu primenu. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu ili supkutanu primenu. Doziranje može biti bilo kojim prikladnim načinom, npr. putem injekcija, kao što su intravenske ili supkutane injekcije, što delimično zavisi od toga da li je primena kratkotrajna ili hronična. Ovde su razmatrani različiti rasporedi doziranja uključujući, bez ograničenja, pojedinačnu ili višestruku primenu u različitim terminima, bolusnu primenu i pulsnu infuziju.

Antitela iz predmetnog pronalaska biće formulisana, dozirana i primenjena u skladu sa dobrom lekarskom praksom. U ovom kontekstu se mogu razmatrati faktori kao što su konkretni poremećaj koji se leči, konkretni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto na koje se agens daje, metod davanja, raspored davanja i drugi faktori poznati lekarima. Antitelo ne mora da bude, ali je opciono formulisano sa jednim ili više agenasa koji se trenutno primenjuju za sprečavanje ili lečenje poremećaja o kome se radi. Efikasna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, kao i drugih faktora koji su prethodno razmatrani. Oni se po pravilu koriste u istim dozama i sa istim načinom primene kao što je gore opisano, ili od oko 1 do 99% doza koje su ovde opisane, ili u bilo kojoj dozi i sa bilo kojim načinom primene za koje je empirijski/klinički dokazano da su odgovarajući.

Za prevenciju ili lečenje bolesti, odgovarajuća doza antitela iz predmetnog pronalaska (kada se koristi samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih dodatnih terapeutskih agensa) zavisiće od vrste bolesti koja se leči, vrste antitela, težine i toka bolesti, bilo da se antitelo primenjuje u preventivne ili terapeutske svrhe, kao i od prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i njegovog odgovora na antitelo, kao i odluke nadležnog lekara. Antitelo se pogodno primenjuje na pacijentu jednokratno, ili kao serija terapija. U zavisnosti od vrste i težine bolesti, oko 1 pg/kg do 15 mg/kg (npr.0,1mg/kg-10 mg/kg) antitela može biti kandidat za početnu dozu za primenu na pacijentu, na primer, putem jedna ili više odvojenih primena, ili kao kontinualna infuzija. Jedna tipična dnevna doza se može kretati u opsegu od oko 1 µg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gorepomenutih faktora. Kod ponovljene primene u trajanju od nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje će po pravilu biti nastavljeno sve do željenog suzbijanja simptoma bolesti. Doza antitela navedena kao primer bila bi u opsegu od oko 0,05 mg/kg do oko 10 mg/kg. Stoga se jedna ili više doza od oko 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ili 10 mg/kg (ili bilo koja njihova kombinacija) može dati pacijentu. Takve doze mogu se primenjivati povremeno, npr, svake nedelje ili svake tri nedelje (npr. tako da pacijent primi od oko dve do oko dvadeset, ili npr. oko šest doza antitela). Može se primeniti veća početna doza, a nakon toga jedna ili više manjih doza. Primer doznog režima obuhvata primenu. Međutim, mogu biti korisni i drugi dozni režimi. Napredak ove terapije jednostavno se prati klasičnim tehnikama i testovima.

Podrazumeva se da bilo koja od gorenavedenih formulacija ili terapeutskih postupaka može biti izvedena uz upotrebu imunokonjugata iz pronalaska umesto anti-LAG3 antitela ili kao njegovog dodatka.

G. Proizvodi

U drugom aspektu pronalaska, obezbeđen je proizvod koji sadrži materijale korisne u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju prethodno opisanih poremećaja. Proizvod uključuje pakovanje i etiketu ili uputstvo za upotrebu, na pakovanju ili uz njega. Pogodno pakovanje uključuje, na primer, boce, bočice, špriceve, kese za IV rastvor, itd. Pakovanje može biti izrađeno od različitih materijala, kao što je staklo ili plastika. Pakovanje sadrži preparat koji je sam po sebi ili u kombinaciji sa drugim preparatom efikasan u lečenju, prevenciji i/ili dijagnostikovanju stanja, i može imati priključak za sterilni pristup (na primer, pakovanje može biti kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zapušačem koji može da se probuši iglom za potkožnu injekciju). Najmanje jedan aktivni agens u kompoziciji je antitelo predmetnog pronalaska. Etiketa ili uputstvo za upotrebu ukazuje na to da se preparat koristi za lečenje stanja po izboru. Pored toga, proizvod može da sadrži (a) prvo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži antitelo iz pronalaska; i (b) drugo pakovanje sa kompozicijom koja se u njemu nalazi, pri čemu kompozicija sadrži dodatni citotoksični ili drugi terapeutski agens. Proizvod u ovom otelotvorenju predmetnog pronalaska može dodatno da sadrži uputstvo za upotrebu koje ukazuje da kompozicije mogu da se koriste za lečenje određenog stanja. Alternativno, ili dodatno, proizvod može dalje da sadrži drugo (ili treće) pakovanje koje sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je bakteriostatska voda za injekcije (BWFI), fiziološki rastvor sa fosfatnim puferom, Ringerov rastvor i rastvor dekstroze. Proizvod može dodatno da sadrži druge materijale poželjne sa komercijalnog aspekta i sa aspekta upotrebe, uključujući druge pufere, razblaživače, filtere, igle i špriceve.

Opis aminokiselinskih sekvenci i sekvenci nukleinskih kiselina

SEQ ID NO: 1 HVR-H1 teškog lanca, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 2 HVR-H2 teškog lanca, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 3 HVR-H3 teškog lanca, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 4 HVR-L1 lakog lanca, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 5 HVR-L2 lakog lanca, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 6 HVR-L3 lakog lanca, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 7 varijabilni domen teškog lanca VH, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 8 varijabilni domen lakog lanca VL, aLAG3(0414)

SEQ ID NO: 9 HVR-H1 teškog lanca, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 10 HVR-H2 teškog lanca, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 11 HVR-H3 teškog lanca, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 12 HVR-L1 lakog lanca, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 13 HVR-L2 lakog lanca, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 14 HVR-L3 lakog lanca, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 15 varijabilni domen teškog lanca VH, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 16 varijabilni domen lakog lanca VL, aLAG3(0403)

SEQ ID NO: 17 HVR-H1 teškog lanca, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 18 HVR-H2 teškog lanca, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 19 HVR-H3 teškog lanca, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 20 HVR-L1 lakog lanca, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 21 HVR-L2 lakog lanca, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 22 HVR-L3 lakog lanca, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 23 varijabilni domen teškog lanca VH, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 24 varijabilni domen lakog lanca VL, aLAG3(0411)

SEQ ID NO: 25 HVR-H1 teškog lanca, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 26 HVR-H2 teškog lanca, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 27 HVR-H3 teškog lanca, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 28 HVR-L1 lakog lanca, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 29 HVR-L2 lakog lanca, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 30 HVR-L3 lakog lanca, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 31 varijabilni domen teškog lanca VH, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 32 varijabilni domen lakog lanca VL, aLAG3(0417)

SEQ ID NO: 33 HVR-H1 teškog lanca, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 34 HVR-H2 teškog lanca, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 35 HVR-H3 teškog lanca, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 36 HVR-L1 lakog lanca, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 37 HVR-L2 lakog lanca, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 38 HVR-L3 lakog lanca, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 39 varijabilni domen teškog lanca VH, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 40 varijabilni domen lakog lanca VL, aLAG3(0416)

SEQ ID NO: 41 varijabilni domen teškog lanca VH, BMS-986016 (WO2014/008218 i US2016/0326248)

SEQ ID NO: 42 varijabilni domen lakog lanca VL BMS-986016 (WO2014/008218 i US2016/0326248)

SEQ ID NO: 43 varijabilni domen teškog lanca VH, MDX25F7 (25F7) (US2011/0150892 i WO2014/008218)

SEQ ID NO: 44 varijabilni domen lakog lanca VL, MDX25F7 (25F7) (US2011/0150892 i WO2014/008218)

SEQ ID NO: 45 varijabilni domen teškog lanca VH, humanizovani BAP050 (LAG525) (US2015/0259420)

SEQ ID NO: 46 varijabilni domen lakog lanca VL, humanizovani BAP050 (LAG525) (US2015/0259420)

SEQ ID NO: 47 varijabilni domen teškog lanca VH, MDX26H10 (26H10) (US 2011/0150892)

SEQ ID NO: 48 varijabilni domen lakog lanca VL, MDX26H10 (26H10) (US 2011/0150892)

SEQ ID NO: 49 humani konstantni region kapa lakog lanca

SEQ ID NO: 50 humani konstantni region lambda lakog lanca

SEQ ID NO: 51 humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG1

SEQ ID NO: 52 humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG1 sa mutacijama L234A, L235A i P329G

SEQ ID NO: 53 humani konstantni region teškog lanca dobijen od IgG4

SEQ ID NO: 54 primer humane LAG3 sekvence (bez signalne sekvence)

SEQ ID NO: 55 humani ekstracelularni domen (ECD) LAG3

SEQ ID NO: 56 prajmer rbHC.up

SEQ ID NO: 57 prajmer rbHCf.do

SEQ ID NO: 58 prajmer BcPCR_FHLC_leader.fw

SEQ ID NO: 59 prajmer BcPCR_huCkappa.rev

U nastavku su navedene aminokiselinske sekvence VH i VL domena uključujući označene HVR-ove (HVR-i sa podebljanim, podvučenim slovima) anti-LAG3 antitela:

1) aLAG3(0403)

SEQ ID NO 15: VH

SEQ ID NO 16: VL

2) aLAG3(0411)

SEQ ID NO 23: VH

SEQ ID NO 24: VL

3) aLAG3(0414)

SEQ ID NO 7: VH

SEQ ID NO 8: VL

4) aLAG3(0416)

SEQ ID NO 39: VH

SEQ ID NO 40: VL

5) aLAG3(0417)

SEQ ID NO 31: VH

SEQ ID NO 32: VL

III. PRIMERI

U nastavku su dati primeri za postupke i preparate iz pronalaska. Ne treba ih tumačiti kao ograničavanje pronalaska, što je definisano priloženim patentnim zahtevima.

Primer 1:

Generisanje anti-LAG3 antitela

Imunizacija zečeva

Roche vlasnički transgeni zečevi koji eksprimiraju repertoar humanizovanih antitela su imunizovani sa LAG3 koji eksprimira plazmidnu DNK.

Skup od 3 zeca je imunizovan genetski, koristeći plazmidni ekspresioni vektor koji kodira ljudski LAG3 pune dužine (15352_pIntronA_fl-hLag3_DNA-IMS), intradermalnom primenom 400 ug vektorske DNK, nakon čega sledi elektroporacija (5 kvadratnih impulsa od 750 V/cm, trajanje 10 ms, interval 1 s). Zečevi su primili 7 uzastopnih imunizacija 0, 14, 28, 49, 70, 98. i 126. dana. Krv (10% procenjene ukupne količine krvi) uzeta je 35, 77, 105. i 133. dana. Pripremljen je serum koji je korišćen za određivanje titra pomoću ELISA (pogledajte ispod), i izolovane su periferne mononuklearne ćelije koje su korišćene kao izvor antigenspecifičnih B ćelija u procesu kloniranja B ćelija u nastavku.

Određivanje titra u serumu (ELISA)

Ljudski rekombinantni LAG3 protein je imobilisan na NUNC Maxisorp ploči sa 96 bunarčića pri 2 ug/ml, 100 ul/bunarčiću, u PBS, nakon čega je usledilo: blokiranje ploče sa 2% kroteina C u PBS-u, 200 ul/bunarčiću; primena serijskih razblaženja antiseruma, u duplikatu, u 0,5% kroteinu C u PBS-u, 100 ul/bunarčiću; detekcija sa (1) HRP-konjugovanim magarećim antizečjim IgG antitelom (Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152; 1/16 000), ili (2) HRP-konjugovanim zečjim antihumanim IgG antitelom (Pierce/Thermo Scientific 31423; 1/5000), ili (3) biotinilovanim kozjim anti-humanim kapa antitelom (Southern Biotech/Biozol 2063-08, 1/5 000) i streptavidinom-HRP; svaki razblažen u 0,5% kroteinu C u PBS-u, 100 ul/bunarčiću. Za sve korake, ploče su inkubirane 1 h na 37 °C. Između svih koraka, ploče su isprane 3 puta sa 0,05% Tween 20 u PBS-u. Signal je razvijen dodavanjem rastvorljivog supstrata BM Blue POD (Roche), 100 ul/bunarčiću; i zaustavljen dodavanjem 1 M HCl, 100 ul/bunarčiću.

Apsorbanca je očitana na 450 nm, u odnosu na 690 nm kao referencu. Titar je definisan kao razblaženje antiseruma koje daje polumaksimalni signal.

Izolovanje mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) zeca

Uzeti su uzorci krvi imunizovanih transgenih zečeva. EDTA koji sadrži punu krv dvostruko je razblažen sa 1x PBS (PAA, Pasching, Austrija) pre gradijentnog centrifugiranja pomoću medijuma lympholyte za sisare (Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Kanada) prema specifikacijama proizvođača. PBMC su dva puta isprane sa 1x PBS.

EL-4 B5 medijum

Korišćen je RPMI 1640 (Pan Biotech, Aidenbach, Nemačka) dopunjen sa 10% FCS-a (Hyclone, Logan, UT, SAD), 2 mM glutaminom, 1% rastvorom penicilina/streptomicina (PAA, Pasching, Austrija), 2 mM natrijum piruvatom, 10 mM HEPES-om (PAN Biotech, Aidenbach, Nemačka) i 0,05 mM b-merkaptoetanolom (Gibco, Paisley, Škotska).

Oblaganje ploča proteinskim antigenom

Ploče za sterilnu ćelijsku kulturu sa 6 bunarčića su obložene humanim LAG3 ECD konjugovanim sa ljudskim Fc delom (2 µg/ml) u karbonatnom puferu (0,1 M natrijum bikarbonat, 34 mM dinatrijum hidrogenkarbonat, pH 9,55) preko noći na 4°C. Ploče su tri puta isprane u sterilnom PBS-u pre upotrebe.

Iscrpljivanje ćelija

(a) Sterilne ploče sa 6 bunarčića (klasa za ćelijsku kulturu) prekrivene konfluentnim monoslojem CHO ćelija korišćene su za iscrpljivanje makrofaga/monocita kroz nespecifičnu adheziju, kao i limfocite koji se nespecifično vezuju.

(b) Prazne sterilne ploče sa 6 bunarčića (klasa za ćelijsku kulturu) koriste se za iscrpljivanje makrofaga i monocita i drugih ćelija putem nespecifične adhezije.

Polovina uzorka PBMC korišćena je za (a) a polovina za (b).

Svaki bunarčić je napunjen sa maksimalno 4 ml medijuma i do 6x106 PBMC imunizovanog zeca i ostavljen je da se veže tokom 1 h na 37°C u inkubatoru. Ćelije u supernatantu (limfociti periferne krvi (PBL)) korišćene su u koraku ispiranja antigena.

Obogaćivanje B ćelija na LAG3 antigenu

Proteinski antigen

Ploče za kulturu tkiva sa 6 bunarčića obložene LAG3-ECD-huFc proteinom zasejane su sa do 6 x 10e6 PBL po 4 ml medijuma iz koraka iscrpljivanja koristeći praznu ploču sa 6 bunarčića i ostavljene su da se vežu 1 sat na 37°C u inkubatoru. Ćelije koje se nisu zalepile su uklonjene pažljivim ispiranjem bunarčića 1-2 puta 1x PBS-om. Preostale lepljive ćelije su odvojene tripsinom tokom 10 min na 37°C u inkubatoru. Delovanje tripsina je prekinuto pomoću medijuma EL-4 B5. Ćelije su čuvane na ledu sve do imunološkog fluorescentnog bojenja.

Antigen ćelijske površine

Ploče za kulturu tkiva sa 6 bunarčića prekrivene monoslojem humanih LAG3-pozitivnih CHO ćelija su zasejane sa do 6x106 PBL po 4 ml medijuma iz koraka iscrpljivanja koristeći ploču sa 6 bunarčića premazanu sa CHO i ostavljene su da se vežu 1 sat na 37°C u inkubatoru. Ćelije koje se nisu zalepile su uklonjene pažljivim ispiranjem bunarčića 1-2 puta 1x PBS-om. Preostale lepljive ćelije su odvojene tripsinom tokom 10 min na 37°C u inkubatoru. Delovanje tripsina je prekinuto pomoću medijuma EL-4 B5. Ćelije su čuvane na ledu sve do imunološkog fluorescentnog bojenja.

Imunološko fluorescentno bojenje i protočna citometrija

Anti-IgG FITC (AbD Serotec, Düsseldorf, Nemačka) i anti-huCk PE (Dianova, Hamburg, Nemačka) antitelo korišćeno je za sortiranje pojedinačnih ćelija. Za površinsko bojenje, ćelije iz koraka iscrpljivanja i obogaćivanja su inkubirane sa anti-IgG FITC i antihuCk PE antitelom u PBS-u i inkubirane tokom 45 min u mraku na 4°C. Nakon bojenja, PBMC su isprane dva puta ledeno hladnim PBS-om. Konačno, PBMC su ponovo suspendovane u ledeno hladnom PBS-u i smesta podvrgnute FACS analizama. Pre FACS analiza, dodat je propidijum jodid u koncentraciji od 5 µg/ml (BD Pharmingen, San Diego, CA, SAD) da bi se razlikovale mrtve i žive ćelije.

Becton Dickinson FACSAria opremljeni kompjuterom i softverom FACSDiva (BD Biosciences, SAD) korišćeni su za sortiranje pojedinačnih ćelija.

Uzgajanje B ćelija

Uzgajanje zečjih B ćelija izvršeno je postupkom koji opisuju Seeber et al. (S Seeber et al. PLoS One 9 (2), e86184. 2014 Feb 04). Ukratko, pojedinačno sortirane zečje B ćelije inkubirane su na pločama sa 96 bunarčića sa 200 µl/bunarčiću EL-4 B5 medijuma koji sadrži Pansorbin ćelije (1:100000) (Calbiochem (Merck), Darmstadt, Nemačka), 5% supernatantom timocita zeca (MicroCoat, Bernried, Nemačka) i gama-ozračenim EL-4 B5 ćelijama mišjeg timoma (5 x 10e5 ćelija/bunarčiću) tokom 7 dana na 37°C u inkubatoru. Supernatanti kultivacije B-ćelija su uklonjeni radi skrininga, a preostale ćelije su odmah sakupljene i zamrznute na -80°C u 100 µl RLT pufera (Qiagen, Hilden, Nemačka).

Izolacija V-domena LAG3 antitela

PCR amplifikacija V-domena

Ukupna RNK je pripremljena iz lizata B ćelija (resuspendovana u RLT puferu-Qiagenkat. br. 79216) pomoću NucleoSpin 8/96 RNK kompleta (Macherey&Nagel; 740709.4, 740698) prema protokolu proizvođača. RNK je eluirana sa 60 µl vode bez RNase. 6 µl RNK je korišćeno za stvaranje kDNK reakcijom reversne transkriptaze koristeći Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (Invitrogen 18080-400) i oligo dT-prajmer prema uputstvu proizvođača. Svi koraci su izvedeni na Hamilton ML Star sistemu. 4 μl kDNK je korišćeno za amplifikaciju varijabilnih regiona teškog i lakog lanca imunoglobulina (VH i VL) pomoću AccuPrime Supermix (Invitrogen 12344-040) u konačnoj zapremini od 50 µl pomoću prajmera rbHC.up i rbHC.do za teški lanac i BcPCR_FHLC_leader.fw i BcPCR_huCkappa.rev za laki lanac (Tabela 1.1). Svi prajmeri su bili specifični za signalni peptid (odnosno VH i VL), dok su reverzni prajmeri bili specifični za konstantne regione (odnosno VH i VL). PCR uslovi za RbVH bili su sledeći: vruće pokretanje na 94°C 5 min; 35 ciklusa od 20 s na 94°C, 20 s na 70°C, 45 s na 68°C, i konačno produženje na 68°C u trajanju od 7 min. PCR uslovi za HuVL bili su sledeći: vruć start na 94 °C tokom 5 min; 40 ciklusa od 20 s na 94 °C, 20 s na 52 °C, 45 s na 68 °C, i finalna ekstenzija na 68 °C tokom 7 min.

Tabela 1.1

8µl od 50µl PCR rastvora je naneto na 48 E-Gel 2 % (Invitrogen G8008-02). Pozitivne PCR reakcije su prečišćene korišćenjem kompleta NucleoSpin Extract II (Macherey&Nagel; 740609250) prema protokolu proizvođača i eluirane u 50 pl elucionog pufera. Svi koraci prečišćavanja su izvedeni na Hamilton ML Starlet sistemu.

Rekombinantna ekspresija monoklonskih dvovalentnih antitela zeca

Za rekombinantnu ekspresiju zečjih monoklonskih dvovalentnih antitela, PCR proizvodi koji kodiraju VH ili VL klonirani su kao kDNK u ekspresione vektore postupkom kloniranja „sa prepustom“ (RS Haun et al., Biotechniques (1992) 13, 515-518; MZ Li et al., Nature Methods (2007) 4, 251-256). Ekspresioni vektori su sadržavali kasetu za ekspresiju koja se sastojala od 5' CMV promotera uključujući intron A, i 3' BGH poliadenilacione sekvence. Pored ekspresione kasete, plazmidi su sadržali mesto početka replikacije izvedeno iz pUC18 i gen beta-laktamaze koji daje otpornost na ampicilin za amplifikaciju plazmida u E.coli. Korišćene su tri varijante osnovnog plazmida: jedan plazmid koji sadrži konstantni region zečjeg IgG dizajniran da prihvati VH regione, dok sadrži humani kapa LC konstantni region za prihvatanje VL regiona.

Linearizovani ekspresioni plazmidi koji kodiraju kapa ili gama konstantni region i VL/VH umetaka amplifikovani su pomoću PCR-a korišćenjem preklapajućih prajmera.

Prečišćeni PCR proizvodi su inkubirani sa T4 DNK-polimerazom što daje jednolančani prepust. Reakcija je prekinuta dodavanjem dCTP-a.

U sledećem koraku, plazmid i umetak su kombinovani i inkubirani sa recA što indukuje rekombinaciju specifičnu za mesto. Rekombinovani plazmidi su transformisani u E.coli. Sledećeg dana, uzgajane kolonije su uzete i testirane na ispravni rekombinovani plazmid putem preparacije plazmida, restrikcione analize i DNK sekvenciranja.

Za ekspresiju antitela, izolovani HC i LC plazmidi su prolazno kotransficirani u ćelije HEK293, a supernatanti su sakupljeni nakon 1 nedelje.

Primer 2:

Karakterizacija anti-LAG3 antitela

Tabela 2: Sažetak karakterizacije različitih anti-LAG3 antitela

ELISA za humani Lag3

Nunc maxisorp ploče (Nunc 464718) obložene su sa 25 µl/bunarčiću rekombinantnog humanog LAG-3 Fc himera proteina (R&D Systems, 2319-L3) u koncentraciji proteina od 800 ng/ml i inkubirane na 4°C preko noći ili 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST puferom) svaki bunarčić je inkubiran sa 90 µl pufera za blokiranje (PBS 2% BSA 0,05% Tween 20) 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST puferom) dodato je 25 µl anti-Lag3 uzoraka u koncentraciji od 1-9 µg/ml (razblaženje 1:3 u OSEP puferu) i inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST puferom) dodato je 25 µl/bunarčiću konjugata kozjeg anti-humanog Ig<K>lanac antitelo-HRP (Milipore, AP502P) u razblaženju 1:2000 i inkubirano na sobnoj temperaturi 1 sat. Nakon ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST puferom) dodato je 25 µl/bunarčiću TMB supstrata (Roche, 11835033001) i inkubirano 2-10 min. Merenje je obavljeno na Tecan Safire 2 instrumentu na 370/492 nm.

ELISA za vezivanje Lag3 na površini ćelije

25 µl/bunarčiću Lag3 ćelija (rekombinantne CHO ćelije koje eksprimiraju Lag3, 10000 ćelija/bunarčiću) zasejano je na ploče sa 384 bunarčića tretirane kulturom tkiva (Corning, 3701) i inkubirano na 37°C jedan ili dva dana. Sledećeg dana nakon uklanjanja medijuma, dodato je 25 µl anti-Lag3 uzoraka (razblaženja 1:3 u OSEP puferu, počevši od koncentracije od 6-40 nM) i inkubirano 2 sata na 4°C. Nakon ispiranja (1 x 90 µl u PBST-u) ćelije su fiksirane dodavanjem 30 µl/bunarčiću glutaraldehida do konačne koncentracije od 0,05% (Sigma kat. br: G5882), 10 min na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST puferom) dodato je 25 µl/bunarčiću konjugata kozjeg anti-humanog Ig<K>lanac antitelo-HRP (Milipore, AP502P) u razblaženju 1:1000 i inkubirano na sobnoj temperaturi 1 sat. Nakon ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST puferom) dodato je 25 µl/bunarčiću TMB supstrata (Roche, 11835033001) i inkubirano 6-10 min. Merenje je obavljeno na instrumentu Tecan Safire 2 na 370/492 nm.

SPR (Biacore) karakterizacija anti-LAG3 antitela

Test zasnovan na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR) korišćen je za određivanje kinetičkih parametara vezivanja između anti-Lag3 antitela kao jednovalentnih Fab fragmenata i ekstracelularnih domena (ECD) humanih Lag3 označenih humanim Fc na 25°C.

Stoga su dve protočne ćelije C1 biosenzorskog čipa pripremljene u Biacore T200 imobilizacijom neutravidina, razblaženog na 25 µg/ml u acetatnom puferu pH 4,5, pomoću „čarobnjaka za imobilizaciju“. Ovo je dovelo do nivoa imobilizacije od oko 1900 RU. Zatim je CaptureSelect™ biotin Anti-IgG-Fc (humani) konjugat vezan za neutravidin, koristeći razblaženje od 20 µg/ml u radnom puferu (HBS-EP+, GE Healthcare)

Sam postupak se sastojao od četiri komande po ciklusu. Prva komanda: hvatanje ~46 RU huLag3-Fc (20 s, 10 µl/min). Druga komanda: ubrizgavanje uzorka u trajanju od 120 s nakon čega sledi disocijacija u trajanju od 1200 s pri protoku od 30 µl/min. Treća i četvrta komanda: regeneracija ubrizgavanjem glicin-HCl pH 1,5 u trajanju od 30 sekundi.

Serija razblaženja (3,13 nM-200 nM, dvostruka razblaženja u radnom puferu) svakog Fab fragmenta antitela i dodatni prazni ciklusi su zatim izmereni korišćenjem prethodno opisanog postupka. Softver za procenu Biacore T200 je zatim korišćen za dobijanje kinetičkih vrednosti primenom Lengmirovog uklapanja 1:1 sa Rmax parametrom uklapanja postavljenim na „lokalni“ jer nivoi snimanja nisu bili savršeno ponovljivi. Rezultati su prikazani u Tabeli 2.

Test baziran na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR) korišćen je za određivanje očiglednih afiniteta interakcije između aLag3 vezivača u njihovom dvovalentnom formatu i humanih Lag3 ekstracelularnih domena (ECD) na 25°C.

Stoga je Biacore biosenzorski čip pripremljen u Biacore T200, imobilizacijom najmanje oko 800 RU antitela specifičnog za tačkastu mutaciju P329G, koristeći standardne uslove kuplovanja amina.

Zatim, u svakom ciklusu, uzorkovano antitelo je uhvaćeno i jedna koncentracija serije koncentracija huLag3 ECD (koja se sastoji od ukupno četiri koncentracije) naneta je na sistem tokom 200 s, nakon čega je usledila disocijacija u trajanju od 1200 s. Biosenzorski čip je zatim regenerisan.

Dobijeni eksperimentalni podaci su procenjeni korišćenjem funkcije „Interaction Map“ koju pruža softver Ridgeview Diagnostics TraceDrawer, kako bi se izračunao individualni prividni, afintetni doprinos vezivanju za svaki uzorak.

Rezultati su prikazani u Tabeli 2.

Mapiranje epitopa

Sortiranje epitopa je izvedeno pomoću testa zasnovanog na površinskoj plazmonskoj rezonanci (SPR). Stoga su aLag3 vezivači vezani za huLag3 na Biacore T200 instrumentu. Zatim je procenjena dostupnost drugih vezivača prethodno formiranom kompleksu aLag3 vezivača – huLag3.

Za izvođenje ovog testa korišćen je komplet SA CAP (GE Healthcare). Ako nije drugačije opisano, analiza je urađena prema priručniku za SA CAP komplet.

Izvođenje je uključivalo samo jedan tip ciklusa. Nakon hibridizacije, 10 nM razblaženje biotinilovanog, pomoću huFc-označenog huLag3 je ostavljeno da se veže za streptavidin na senzorskom čipu tokom 20 s pri protoku od 10 µl/min. Zatim je prvi uzorak od 200 nM razblažen u radnom puferu ubrizgan tokom 180 s pri protoku od 30 µl/min, a odmah nakon toga i drugi uzorak pod istim uslovima. Površina je zatim regenerisana.

Uzorci su zatim raspoređeni u različite grupe epitopa sa sličnim obrascima konkurencije. Urađena je prva gruba kategorizacija, zasnovana na relativnom odgovoru drugog ubrizgavanja koristeći prag od 6,1 RU, što je bilo malo iznad najveće vrednosti uočene kada je vezivač ubrizgan kao prvi i drugi uzorak. Sve vrednosti i odluke su konačno potvrđene vizuelnom inspekcijom senzorgrama.

Rezultati su prikazani u tabeli 2. Identifikovana su tri glavna uzorka epitopa (E1, E2 i E3). Budući da aLag3-0416 i humanizovani BAP050 dele istu grupu, ali se ne inhibiraju u potpunosti, svrstani su u podgrupe E2b i E2c.

Vezivanje anti-Lag3 antitela iz tg zečeva za rekombinantne cino Lag3 pozitivne HEK ćelije

Pored analize vezivanja korišćenjem HEK ćelija koje rekombinantno eksprimiraju humani Lag3 na površini, takođe je procenjeno vezivanje za Lag3-pozitivne HEK ćelije cinomolgusa. Za ovaj eksperiment, zamrznute HEK293F ćelije, prethodno prolazno transficirane pomoću cino-LAG-3, odmrznute su, centrifugirane i ponovo dodate u PBS/2% FBS. 1,5x10<5>ćelije/bunarčiću je zasejano na ploče sa 96 bunarčića. Anti-Lag3 antitela su dodata do konačne normalizovane koncentracije od 10 µg/ml. Za referencu i kao kontrole, antitela za autofluorescenciju i pozitivnu kontrolu (Medarex 25F7) kao i kontrolu izotipa (huIgG1 iz Sigme, kat. br. 15154, podaci nisu prikazani) pripremljena su i merena u eksperimentu. HEK ćelije su inkubirane sa naznačenim antitelima 45 minuta na ledu, isprane dva puta sa 200 µl ledeno hladnog PBS pufera koji je sadržao 2% FBS, pre dodavanja sekundarnog antitela (APC-označeno kozje anti-humano IgG-kapa, Invitrogen, kat. br. MH10515) (razblaženje 1:50 u FACS puferu/bunarčiću) i dalje inkubirane 30 minuta na ledu. Ćelije su ponovo dva puta isprane sa 200 µl ledeno hladnog PBS/2% FBS pufera pre nego što su uzorci konačno resuspendovani u 150 µl FACS pufera i vezivanje je mereno na modulu FACS CANTO-II HTS.

Rezultati

U tabeli ispod je prikazano vezivanje i unakrsna reaktivnost različitih anti-Lag3 antitela za HEK293 ćelije koje eksprimiraju cynoLAG3, vezivanje dato kao % pozitivnih ćelija ili geometrijska sredina intenziteta signala:

Vezivanje anti-Lag3 antitela iz tg zečeva za (aktivirane) cinomolgusove PBMC/T ćelije koje eksprimiraju Lag3

Nakon vezivanja za rekombinantni Lag3 protein i Lag3 eksprimiran rekombinantno na ćelijama sisara, procenjeno je/potvrđeno vezivanje za Lag3 eksprimiran na aktiviranim T ćelijama cinomolgusa.

Karakteristike vezivanja novonastalih anti-Lag3 antitela (izvedena iz Roche transgenih zečeva) za Lag3 eksprimirane na površini T ćelija ili PBMC cinomolgusa potvrđene su FACS analizom. Dok se Lag3 ne eksprimira na naivnim T ćelijama, on je ushodno regulisan nakon aktivacije i/ili na iscrpljenim T ćelijama. Tako su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) cinomolgusa pripremljene iz sveže krvi cinomolgusa i zatim su aktivirane predtretmanomCD3/CD28 (1 µg/ml) tokom 2-3 dana. Aktivirane ćelije su zatim analizirane na ekspresiju Lag3. Ukratko, 1-3x10<5>aktiviranih ćelija je obojeno 30-60 min na ledu sa naznačenim anti-Lag3 antitelima i odgovarajućim kontrolnim antitelima u konačnoj koncentraciji od 10 µg/ml. Vezana anti-Lag3 antitela su otkrivena preko fluorohromkonjugovanih anti-humanih IgG ili anti-zečjih IgG sekundarnih antitela. Nakon bojenja, ćelije su isprane dva puta pomoću PBS/2% FCS i analizirane na FACS Fortessa (BD).

Rezultati

Sledeća tabela rezimira procenat Lag3 pozitivnih ćelija u aktiviranim PBMC cinomolgusa:

Na aktiviranim T ćelijama cinomolgusa sva zečja anti-Lag3 antitela pokazala su značajno vezivanje za Lag3<+>ćelije. Time su sva novonastala antitela pokazala povećani procenat pozitivnih ćelija u poređenju sa ljudskim anti-Lag3 referentnim antitelima (npr. kao što su MDX25F7, BMS-986016).

Inhibicija vezivanja LAG-3 za MHC-II eksprimiran na ljudskim tumorskim ćelijama A375 (prema ELISA)

25 µl/bunarčiću A375 ćelija (10.000 ćelija/bunarčiću) zasejano je na ploče sa 384 bunarčića tretirane kulturom tkiva (Corning, 3701) i inkubirano na 37°C preko noći. Anti-Lag3 antitela su prethodno inkubirana 1 sat sa biotinilovanim Lag3 (250 ng/ml) u medijumu za ćelijsku kulturu u razblaženjima 1:3 počevši od koncentracije antitela od 3 µg/ml. Nakon uklanjanja medijuma iz bunarčića sa zasejanim ćelijama, 25 µl prethodno inkubiranih smeša antitelo-Lag3 prebačeno je u bunarčiće i inkubirano 2 sata na 4°C. Nakon ispiranja (1 x 90 µl u PBST-u) ćelije su fiksirane dodavanjem 30 µl/bunarčiću glutaraldehida do konačne koncentracije od 0,05% (Sigma kat. br: G5882), 10 min na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST puferom) dodato je 25 µl/bunarčiću Poly-HRP40-streptavidina (Fitzgerald, 65R-S104PHRPx) u razblaženju od 1:2000 ili 1:8000 i inkubirano na sobnoj temperaturi 1 sat. Nakon ispiranja (3x90 µl/bunarčiću PBST puferom) dodato je 25 µl/bunarčiću TMB supstrata (Roche, 11835033001) i inkubirano 2 do 10 min. Merenje je obavljeno na instrumentu Tecan Safire 2 na 370/492 nm.

Inhibicija vezivanja LAG-3 za MHC-II eksprimiran na humanim A375 tumorskim ćelijama (FACS analizom)

Princip ispitivanja

Za proučavanje antagonističke funkcije anti-Lag3 antitela, sproveden je kompetitivni test MHCII:Lag3. MHCII<+>ljudske A375 ćelije su obojene interno generisanim biotinilovanim fuzionim proteinom Lag3:Fc sa ili bez prethodne inkubacije sa anti-Lag3 antitelima. Ova analiza je proučavana u FACS eksperimentu takmičenja: A375 ćelije (ATCC, br. CRL-1619) uzgajane su sa 2-3 pasaža u EM Iglovom medijumu sa dodatkom EBSS (PAN, kat. br. P04-00509), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1x NEAA i 1x natrijum piruvat. Sva antitela su razblažena u FACS puferu do konačne koncentracije od 20 µg/ml u 25 µl (na pločama sa U-dnom od 96 bunarčića). 25 µl interno generisanog, biotinilovanog rekombinantnog fuzionog proteina LAG-3:Fc dodato je do konačne koncentracije od 10 µg/ml bilo u medijum ili anti-Lag3 antitela ili kontrole, i prethodno je inkubirano 30 minuta na sobnoj temperaturi. A375 ćelije su isprane pomoću PBS i podešene na 3x10<6>ćelija/ml u PBS-u. 100 µl je zasejano po bunarčiću u ploču sa V-dnom sa 96 bunarčića. Ploče su centrifugirane i supernatant je uklonjen.

Zatim je ćelijama dodata prethodno inkubirana mešavina LAG-3:Fc fuzionog proteina/antitela (50 µl/bunarčiću) i inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su isprane sa 200 µl FACS pufera. Za detekciju biotinilovanog proteina Lag3:Fc vezanog za ćelijski MHCII, korišćeno je APC-konjugovano kozje anti-biotin antitelo u količini od 3 µl/uzorku (Miltenyi Biotec, kat. br. 130-090-856) i inkubirano dodatnih 10-15 minuta. Nakon bojenja, ćelije su ponovo isprane i zatim prebačene u 150 µl FACS pufera (PBS/2% FBS) na ploču sa U-dnom i analizirane na FACS Canto-II pomoću HTS modula.

Dva anti-Lag3 antitela (klonovi 25F7 i 26H10; Medarex) poslužila su kao pozitivna kontrola i ljudski IgG1 (Sigma, kat. br.15154) kao odgovarajuća kontrola izotipa. Sva antitela su korišćena u konačnoj koncentraciji od 10 µg/ml.

Rezultati

U tabeli ispod je prikazan rezultat FACS analize koja pokazuje procenat inhibicije vezivanja Lag3 proteina za MHC-II na ćelijama (izračunato kao smanjeni signal vezivanja u odnosu na maksimalnu vrednost u odsustvu blokirajućeg antitela):

Ovi podaci podržavaju funkcionalnu interakciju sa Lag3 i blokadu ćelijske interakcije svih testiranih antitela.

Neutralizujuća moć novih anti-Lag3 antitela u standardnom bio/reporterskom testu LAG3 blokade

Da bi se testirala neutralizujuća moć novih anti-Lag3 antitela u obnavljanju potisnutog T ćelijskog odgovora in vitro, korišćen je komercijalno dostupan reporterski sistem. Ovaj sistem se sastoji od Lag3<+>NFAT Jurkatovih efektorskih ćelija (Promega, kat. br. CS194801), MHC-II<+>Radžijevih ćelija (ATCC, br. CLL-86) i super-antigena. Ukratko, reporterski sistem se zasniva na tri koraka: (1) aktivacija NFAT ćelija izazvana superantigenom, (2) inhibicija aktivacionog signala posredovana inhibirajućom interakcijom između MHCII (Radžijeve ćelije) i Lag3<+>NFAT Jurkatovih efektorskih ćelija, i (3) oporavak aktivacionog signala NFAT pomoću Lag3-antagonističkih/neutralizujućih aVH-Fc fuzionih konstrukata.

Za ovaj eksperiment, Radžijeve i Lag-3<+>Jurkatove/NFAT-luc2 efektorske T ćelije su uzgajane kako je opisao dobavljač. Serijska razblaženja (40 pg/ml-50 µg/ml) nekoliko anti-Lag3 i referentnih antitela pripremljena su u medijumu za analizu (RPMI 1640 (PAN Biotech, kat. br. P04-18047), 1% FCS) na ravnim pločama za uzgajanje sa 96 bunarčića sa belim dnom (Costar, kat. br. 3917). 1x10<5>Lag3 NFAT-Jurkatovih ćelija/bunarčiću) dodato je u rastvor antitela. Nakon ovog koraka, 2,5x10<4>Radžijevih ćelija/bunarčiću dodato je u mešavinu Jurkatovih ćelija/antitela, kao i 50 ng/ml konačne koncentracije SED super-antigena (Toxin technology, kat. br. DT303). Nakon inkubacije od šest sati na 37°C i 5% CO2, Bio-Glo supstrat (Promega, br. G7940) zagrejan je na sobnu temperaturu i dodato je 75 µl po bunarčiću, inkubirano 5-10 minuta pre nego što je ukupna luminiscencija izmerena na čitaču Tecan Infinite prema preporuci proizvođača kompleta.

Na dijagramima je prikazano obnavljanje MHCII/Lag3 posredovane supresije signala luciferaze NFAT različitim anti-Lag3 antitelima nakon SED stimulacije (dato kao vrednosti EC50):

n.t. molekuli koji nisu testirani u ovom eksperimentu

Primer 3: Biološka aktivnost u različitim testovima: efekat različitih anti-LAG3 antitela (samih ili u kombinaciji sa anti-PD1 antitelima)

Tabela 3: Sažetak biološke aktivnosti različitih anti-LAG3 antitela (samih ili u kombinaciji sa anti-PD1 antitelima)

Efekat blokade PD-1 i LAG3 na citotoksično oslobađanje granzima B i izlučivanje IL-2 humanim CD4 T ćelijama koje su uzgajane zajedno sa alogenim zrelim dendritskim ćelijama

Za skrining anti-LAG-3 blokirajućih antitela u kombinaciji sa anti-PD-1 u alogenom okruženju razvili smo test u kome se sveže prečišćene CD4 T ćelije zajedno uzgajaju tokom 5 dana u prisustvu alogenih zrelih dendritskih ćelija (mDC) dobijenih iz monocita. Monociti su izolovani iz svežih PBMC nedelju dana pre, plastičnom adhezijom, praćenom uklanjanjem neprilepljenih ćelija. Zatim smo generisali nezrele DC iz monocita kultivišući ih 5 dana u medijumima koji sadrže GM-CSF (50 ng/ml) i IL-4 (100 ng/ml). Da bismo podstakli sazrevanje iDC, dodali smo TNF-alfa, IL-lbeta i IL-6 (po 50 ng/ml) u podlogu za uzgajanje tokom dodatna 2 dana. Zatim smo procenili sazrevanje DC merenjem njihove površinske ekspresije glavnog kompleksa histokompatibilnosti klase II (MHCII), CD80, CD83 i CD86 pomoću protočne citometrije (LSRFortessa, BD Biosciences).

Na dan minimalne reakcije mešanih limfocita (mMLR), CD4 T ćelije su obogaćene pomoću kompleta mikroperlica (Miltenyi Biotec) od 108 PBMC dobijenih od nepovezanog donora. Pre uzgajanja, CD4 T ćelije su obeležene sa 5 µM karboksifluorescein sukcinimidil estra (CFSE).10<5>CD4 T ćelija je zatim zasejano na ploču sa 96 bunarčića zajedno sa zrelim alo-DC (5:1) u prisustvu ili odsustvu blokirajućeg anti-PD-1 antitela aPD1(0376) (= PD1-0103-0312, iz PCT aplikacije PCT/EP2016/073248) samostalno ili u kombinaciji sa himernim anti-LAG-3 antitelima (aLAG3(0403) do aLAG(0418) ((0403) do (0418)) ili referentnim antitelima (humanizovani BAP050 (LAG525) i BMS 986016) u koncentraciji od 10 µg/ml. DP47 je nevezujući humani IgG sa mutacijom LALA u Fc delu, kako bi se izbeglo prepoznavanje od strane FcγR, i korišćen je kao negativna kontrola.

Pet dana kasnije sakupili smo supernatante ćelijske kulture, koji su kasnije korišćeni za merenje nivoa IL-2 pomoću ELISA (R&D systems), i ostavili smo ćelije na 37 stepeni Celzijusa dodatnih 5 sati u prisustvu inhibitora Golgi Plug (Brefeldin A) i Golgi Stop (Monensin). Ćelije su zatim isprane, obojene na površini antihumanim CD4 antitelima i Live/Dead fiksirajućom bojom Aqua (Invitrogen) pre fiksiranja/permeabilizacije puferom za fiksiranje/permeabilizaciju (BD Bioscience). Izveli smo intracelularno bojenje za granzim B (BD Bioscience) i IFN-γ (eBioscience). Rezultati su prikazani na Slikama 1A i B.

Uticaj blokadePD-1 i LAG-3 na citotoksično oslobađanje granzima B od strane humanih CD4 T ćelija koje su uzgajane zajedno sa B ćelijskom limfoblatoidnom ćelijskom linijom (ARH77).

U funkcionalnim studijama, zajedno smo uzgajali CD4 T ćelije sa ćelijskom linijom tumora ARH77, limfoblastoidnom ćelijskom linijom B ćelija koja eksprimira niže nivoe PDL-1 od mDC, kako bismo bolje okarakterisali doprinos antagonizma LAG-3 blokadi PD-1. Ostatak eksperimentalnog podešavanja i očitavanja ostali su nepromenjeni u odnosu na mMLR. Naša anti-LAG-3 antitela (aLAG3(0414) i aLAG3(0416), izabrana na osnovu njihove sposobnosti da zajedno izlučuju IL-2 i granzim B u mMLR) u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelima pokazala su značajno povećanje lučenja granzima B od strane CD4 T ćelija u odnosu na referentna anti-LAG-3 antitela ((humanizovani BAP050 (LAG525) i BMS986016)) (P<0,05) i samo anti-PD-1 (P<0,01), slika 2.

Uticaj blokade PD-1 i LAG-3 na Treg supresiju oslobađanja granzima B i IFN-γ od strane humanih CD4 T ćelija koje su uzgajane zajedno sa ozračenim alogenim PBMC.

U funkcionalnim studijama koje su uključivale testove supresije regulatornih T ćelija (Treg), PBMC od istog donora su podeljene u dva uzorka: jedan je obogaćen CD4 T ćelijama, a drugi Treg definisanim kao CD4<+>CD25<visoko>CD127<nisko>T ćelije putem kompleta mikroperlica (Miltenyi Biotec). Kada su dve populacije prečišćene, CD4 T ćelije su označene pomoću 5 µM karboksi-fluorescein-sukcinimidil estra (CFSE), dok su Treg označeni sa 5 µM ljubičastih ćelijskih tragova (CTV) kako bi se kasnije mogle razlikovati u FACS-u.

I CD4 T ćelije (10<5>) i Treg (10<5>) su zatim zajedno uzgajane na ploči sa 96 bunarčića u odnosu 1:1 zajedno sa ozračenim PBMC (10<5>) od nepovezanog donora u prisustvu ili odsustvu naših anti-LAG-3 antitela (aLAG3(0414) i aLAG3(0416) ili referentnih anti-LAG-3 antitela (humanizovani BAP050 (LAG525) i BMS986016) u kombinaciji sa našim anti-PD-1 antitelom u koncentraciji od 10 µg/ml. Kao kontrola za procenu veličine supresije efektorskih funkcija CD4 T ćelija od strane Treg, CD4 T ćelije (10<5>) takođe su zajedno uzgajane sa ozračenim PBMC (10<5>) u odsustvu Treg.

Pet dana kasnije, sakupili smo supernatante ćelijske kulture, koji su kasnije korišćeni za merenje nivoa IFN-γ pomoću ELISA (R&D systems), i ostavili smo ćelije na 37 stepeni Celzijusa dodatnih 5 sati u prisustvu inhibitora Golgi Plug (Brefeldin A) i Golgi Stop (Monensin). Ćelije su zatim isprane, obojene na površini antihumanim CD4 antitelima i Live/Dead fiksirajućom bojom Aqua (Invitrogen) pre fiksiranja/permeabilizacije puferom za fiksiranje/permeabilizaciju (BD Bioscience). Izveli smo intracelularno bojenje za granzim B (BD Bioscience) i IFN-γ (eBioscience). Rezultati su prikazani na Slikama 3A i B.

Anti-LAG-3 antitela (aLAG3(0414) i aLAG3(0416), u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom aPD1(0376) (= PD1-0103-0312, iz PCT aplikacije PCT/EP2016/073248) izazvala su bežanje Tconv od stroge kontrole regulatornih T ćelija, što je pokazano lučenjem značajno veće količine granzima B od Tconv u prisustvu samo anti-PD-1 (P<0,05) ili u odsustvu inhibitora kontrolne tačke (P<0,001). Referentna anti-LAG-3 antitela (humanizovani BAP050 (LAG525) i BMS 986016) u kombinaciji sa anti-PD-1 nisu značajno spasila Tconv efektorske funkcije od supresije Treg. Slični rezultati su dobijeni za IFN-g čak i ako razlika nije dostigla statističku značajnost sa samo 4 donora.

Uticaj blokade PD-1 i LAG-3 na izlučivanje granzima B i IFN-gama od strane CD4 T ćelija iz PBMC pacijenata sa melanomom nakon opoziva sa imunogenim skupovima peptida melanom-antigen.

Prethodno je opisano da PBMC pacijenata sa melanomom sadrže detektabilne frekvencije T ćelija specifičnih za tumor-antigen. Stoga, za potrebe POC-a, testirali smo anti-LAG-3 antitelo (0414) plus anti-PD-1 u odnosu na isamo anti-PD-1 na PBMC pacijenata sa melanomom koje su ponovo stimulisane preko noći sa imunogenim skupovima peptida antigena povezanih sa melanomom.

10<5>do 10<6>PBMC pacijenata sa melanomom inkubirano je na sobnoj temperaturi u prisustvu ili odsustvu zasićenih koncentracija (10 µg/ml) samo anti-PD-1 (0376), u kombinaciji sa anti-LAG-3 (aLAG3(0414) = (0414), 10 µg/ml) antitela. T ćelije su zatim ponovo stimulisane preko noći skupom imunogenih antigena povezanih sa tumorom kao što su MAGEA1, MAGEA3, MAGEA4, Melan-A/MART-1, NYESO-1, melanocitni protein Pmel 17 gp100, tirozinaza, protein 2 povezan sa tirozinazom u prisustvu inhibitora transporta proteina Golgi Plug (Brefeldin A) i Golgi Stop (Monensin).

Ćelije su zatim isprane, obojene na površini antihumanim CD4 antitelima i Live/Dead fiksirajućom bojom Aqua (Invitrogen) pre fiksiranja/permeabilizacije puferom za fiksiranje/permeabilizaciju (BD Bioscience). Izveli smo intracelularno bojenje za granzim B (BD Bioscience) i IFN-γ (eBioscience).

Kombinacija anti-LAG-3 i anti-PD-1 antitela (P<0,01 i P<0,001) je značajno (P<0,01 i P<0,0001) poboljšala efektorske funkcije T ćelija specifičnih za tumor-antigen (tj. izlučivanje granzima B i IFN-γ) dok sama blokada PD-1 nije pokazala nikakav efekat (podaci nisu prikazani).

Analogno tome, stručnjak u ovoj oblasti mogao bi da proširi gore objavljeno pod primerom 3, studije uzgajanja ćelija/životinjske studije na postupke lečenja ljudi.

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Izolovano antitelo koje se vezuje za humani LAG3, pri čemu antitelo sadrži (a) VH domen koji sadrži (i) HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, (ii) HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, i (iii) HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:3; i (b) VL domen koji sadrži (i) HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4; (ii) HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 i (iii) HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6.

2. Antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži VH sekvencu SEQ ID NO:7 i VL sekvencu SEQ ID NO:8.

3. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, pri čemu antitelo:

ii) vezuje se za ljudski i cinomolgus LAG3; i/ili

4. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje je humano, humanizovano ili himerno antitelo.

5. Antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva, koje je IgGI antitelo pune dužine sa mutacijama L234A, L235A i P329G (numeracija prema Kabatovom EU indeksu).

6. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo prema bilo kom od prethodnih zahteva.

7. Ćelija domaćin koja obuhvata nukleinsku kiselinu iz zahteva 6.

8. Postupak za proizvodnju antitela, uključujući uzgajanje ćelije domaćina iz zahteva 7, tako da se proizvodi antitelo.

9. Postupak iz zahteva 8, koji dalje uključuje izolovanje antitela iz ćelije domaćina.

10. Farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo prema bilo kom od zahteva 1 do 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

11. Antitelo iz bilo kog od zahteva 1 do 5 za upotrebu u lečenju kancera.