RS58188B2 - Postupci za tretiranje osteogeneze imperfekta - Google Patents

Postupci za tretiranje osteogeneze imperfekta

Info

Publication number
RS58188B2
RS58188B2 RS20181438A RSP20181438A RS58188B2 RS 58188 B2 RS58188 B2 RS 58188B2 RS 20181438 A RS20181438 A RS 20181438A RS P20181438 A RSP20181438 A RS P20181438A RS 58188 B2 RS58188 B2 RS 58188B2
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
tgfβ
bone
antigen
binding fragment
Prior art date
Application number
RS20181438A
Other languages
English (en)
Inventor
Brendan Lee
Kuber T Sampath
Original Assignee
Genzyme Corp
Baylor College Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50483613&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS58188(B2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genzyme Corp, Baylor College Medicine filed Critical Genzyme Corp
Publication of RS58188B1 publication Critical patent/RS58188B1/sr
Publication of RS58188B2 publication Critical patent/RS58188B2/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/42—Phosphorus; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Compounds Of Unknown Constitution (AREA)

Description

Opis
[0001] Ovaj pronalazak je otkriven sa podrškom vlade pod P01 HD070394, P01 HD22657& R01 DE01771 i nagrađen od strane Nacionalnih instituta za zdravlje. Vlada Sjedinjenijih Država ima određena prava u ovom pronalasku.
OBLAST PRONALASKA
[0002] Predmetni pronalazak odnosi se na postupke za tretiranje osteogeneze imperfekta (OI). Preciznije, pronalazak se odnosi na postupke za tretiranje OI upotrebom vezujućeg proteina, npr., antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, koji se specifično vezuju za ljudski transformacioni faktor rasta beta (TGFβ) ili njegove izoforme.
POZADINA
[0003] Osteogeneza imperfekta (OI), takođe poznata kao „bolest krhkih kostiju“ ili Lobsteinov sindrom je bolest slabljena i retka urođena bolest koja pogađa oko jedne na svakih 15,000 osoba. Iako fenotipovi mogu varirati među OI tipovima, uobičajeni simptomi obuhvataju nepotpuno okoštavanje kostiju i zuba, smanjenu masu kostiju, krhke kosti i patološke prelome. Ovi uobičajeni simptomi QI smatraju se da su izazvani genskom mutacijom što se ispoljava u nedostatku kolagena tipa-I ili drugih proteina uključenih u taloženje koštanog matriksa ili homeostaze. Kao rezultat ovih simptoma i sklonosti za fatalne prelome kostiju i komplikacije, očekivani životni vek za pacijente sa QI je smanjen u poređenju sa opštom populacijom. U skladu sa time, jasno postoji hitna potreba u stanju tehnike za razvijanjem delotvornog tretiranja za OI. Osteoblasti kod OI pacijenata imaju povišeni broj površinskih ćelijskih receptora za TGF-β (videti Gebken i dr., Pathobiology (2000), izd.68 n° 3 strane 106-112). Uticaji ubrizgavanja transformacionog faktora rasta beta u ćelije izvedene iz pacijenata sa OI su ispitivani (videti Mörike i dr., Journal of Orthopaedic Research (1993), izd.11, n°4, strane 564-572) i dali su različite rezultate kod pacijenata. Pokazano je da miševi sa prekomernim ispoljavanjem TGF-β1 razvijaju izmene slične sa dentinogenesis imperfekta (videti Opsahl i dr., Archives of Oral Biology (2005), izd.50, n°1, strane 279-286). Ispoljavanje normalnih miševa anti-TGFb antitelu 1D11 je pokazano na povećava masu kostiju (videti Edwards i dr., Journal of Bone and Mineral Research (2010), izd. 25, n°11, strane 2419-2426). OI može biti tretirana sa bisfosfonatima kao što je obelodanjeno od strane Glorieux i dr, Pediatrics (2007) vol.119 Supplement 2, strane S163-S165).
KRATAK OPIS SLIKA
[0004]
Slike 1A (Western blot) i 1B-1F (grafici) pokazaće da je TGFβ signaliziranje povećano kod kostiju Crtap<-/->miševa u poređenju sa kontrolama divljeg tipa.
Slike 2A (luminiscentna slika) i 2B-C (grafici) prikazuju da su Crtap<-/->miševi pomešani sa TGFβ reporter miševima ispoljili veću TGFβ aktivnost u poređenju sa kontrolama divljeg tipa.
Slika 3 je µCT slika pršljena Crtap<-/->miša tretiranog sa mišijim pan-specifičnim anti-TGFβ antitelom 1D11.
Slika 4 je grafik koji sadrži kvantitativna merenja pršljenova kod Crtap<-/->miševa tretiranih sa mišijim pan-specifičnim anti-TGFβ antitelom 1D11.
Slika 5 je histomorfometrijska analiza pršljena od Crtap<-/->miša tretiranog sa mišijim pan-specifičnim anti-TGFβ antitelom 1D11.
Slika 6A i 6B su grafici koji pokazuju biomehanička svojstva (Slika 6A - maksimalno opterećenje, i Slika 6B - krutost) bedrene kosti Crtap<-/->miševa tretiranih sa mišijim pan-specifičnim anti-TGFβ antitelom 1D11, kao što je određeno sa testom savijanja na tri tačke.
Slika 7A i 7B (mikrografske slike) i 7C (grafik) pokazuju fenotip pluća Crtap<-/->miševa tretiranih sa mišijim pan-specifičnim anti-TGFβ antitelom 1D11.
Slika 8 su mikrografske slike Crtap<-/->i WT pluća obeležene sa anti-dekorin antitelom.
Slika 9 je grafik koji prikazuje probu vezivanja dekorina.
Slika 10 je grupa grafika, fotografija i slika koje prikazuju povećanu TGFβ signaliziranje kod Crtap<-/->miševa. Slika 10A je niz od tri grafika koji prikazuje rezultate kvantitativnog RT-PCR TGFβ ciljanih gena p21, PAI-1, i Col1a1. Grafici ukazuju na povećano TGFβ signaliziranje u lobanji P3 WT i Crtap<-/->miševa. Rezultati su prikazani kao broj puta koliko je srednja vrednost povećana za WT grupu±SD; n=5 po grupi, *p<0.05. Slika 10B je fotografija Western blot analize P3 ekstrakta proteina u lobanji, što prikazuje količine aktiviranog Smad2 (pSmad2) relativno u odnosu na ukupni Smad2 protein kod Crtap<-/->u poređenju sa WT miševima, što predlaže povećano TGFβ -signaliziranje; n=3 po grupi. Slika 10C je grafik koji prikazuje kvantifikaciju Western blot prikazanog na Slici 10B. Rezultati su prikazani kao broj puta koliko je srednja vrednost povećana za WT grupu, *p<0.05. Slika 10D je slika koja prikazuje povećanu bioluminiscenciju u regionima koji se preklapaju sa skeletnim strukturama kod Crtap<-/->u poređenju sa WT miševima koji su međusobno pomešani sa TGFβ reporter miševima (SBE-Luc miševi). Reprezentativna slika 3 legla pri P10 je prikazana. Kod 3 legla Crtap<-/->miševi su pokazali srednje 2.86 povećanje (SD±0.34) signala bioluminiscencije u glavi/lobanji u poređenju sa WT miševima(razmera=1cm). Slika 10E je grafik koji prikazuje da je, upotrebom TGFβ reporter ćelijske linije, TGFβ aktivnost procenjena u održavanoj podlozi od WT i Crtap<-/->ćelija strominog tkiva koštane srži kultivisane pod osteogenim uslovima u trajanju od 3 dana, što pokazuje veću TGFβ aktivnost u poređenju sa podlogom od WT ćelija. Rezultati su prikazani kao broj puta koliko je srednja vrednost povećana za WT grupu±SD; n=5 po grupi, *p<0.05. Slika 10F su dve slike koje prikazuju imunološko obeležavanje pluća (P10) za pSmad2, koje prikazuju povećano unutarćelijsko obeležavanje kod WT i Crtap<-/->miševa (40X uvećanje). reprezentativne slike n=3 miševa po grupi su prikazane (razmera=20µm).
Slika 11 je grupa fotografija i grafika koji prikazuju fenotipsku korekciju Crtap<-/->miševa nakon tretiranja sa TGFβ neutrališućim antitelom 1D11. Slika 11A je niz od tri MicroCT slike L4 tela pršljenova od divljeg 16 nedelja starog (WT), Crtap<-/->, tretiranih sa kontrolnim antitelom i 1D11-tretiranih Crtap<-/->miševa nakon tretiranja u trajanju od 8 nedelja. Slika 11B je grupa od tri grafika koji prikazuju rezultate MicroCT L4 tela pršljena, koji prikazuju povećan volumen kosti/ukupni volumen (BV/TV), broj koštanih gredica (Tb.N), i debljinu (Tb.Th) kod WT, kontrolnih Crtap<-/->i 1D11 tretiranih Crtap<-/->miševa. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ±SD, n=8 po grupi, *p<0.05 zaCrtap<-/->1D11 u poređenju sa Crtap<-/->kontrolom, p<0.05 za Crtap<-/->u poređenju sa WT. Slika 11C je grupa od tri grafika koji prikazuju rezultate histomorfometrijske analize L4 pršljena, koji prikazuju povećane brojeve osteoklasta (N.Oc/BS) i osteoblasta (N.Ob/BS) po površini kosti kod Crtap<-/->miševa u poređenju sa WT. Smanjeni broj osteoblasta i osteoklasta nakon tretiranja sa 1D11 ukazuje na delotvorno suzbijanje ubrzanog remodeliranja kosti kod Crtap<-/->miševa. Povećani broj osteocita po površini kosti (N.Ot/B.Ar) kod Crtap<-/->miševa smanjen je na WT nivo nakon 1D11 tretiranja. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ±SDs, n=6 po grupi, *p<0.05 zaCrtap<-l->1D11 u poređenju sa kontrolom, p<0.05 za Crtap<-l->u poređenju sa WT. Slika 11D je niz od tri slike koje prikazuju obeležavanje sa hematoksilinom/eozinom naduvanih pluća 16 nedelja starih miševa divljeg tipa (WT), kontrolnih Crtap<-/->, i 1D11-tretiranih Crtap<-/->miševa nakon tretiranja u trajanju od 8 nedelja. Crtap<-/->kontrolni miševi pokazali su povećanje u distalnom prostoru disajnog puta u poređenju sa WT miševima. Nakon tretiranja sa 1D11, postojalo je smanjenje u distalnom prečniku disajnih puteva u poređenju sa kontrolnim Crtap<-l->miševima. Reprezentativne slike n=8 miševa po grupi su prikazane (razmera=100 µm). Slika 11E je grafik koji prikazuje kvantifikaciju rastojanja između alveolarnih struktura putem postupka srednjeg-linearnog-presecanja (MLI), što je pokazalo značajno smanjenje distalnog prostora disajnih puteva kod 1D11-tretiranih Crtap<-/->miševa u poređenju sa kontrolnim tretiranim sa antitelom Crtap<-l->i WT miševa. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti±SDs, n=8 miševa po grupi, 10 slika je analizirano po mišu, *p<0.05 za Crtap<-/->1D11 u poređenju sa Crtap<-l->kontrolnim, p<0.05 za Crtap<-/->u poređenju sa WT.
Slika 12 je niz grafika koji prikazuju da vezivanje dekorina za tip I kolagen preklapa p986 3Hyp mesto i da je smanjeno kod tipa I kolagena za Crtap<-/->miševe. Slika 12A je grupa od tri grafika koji prikazuju rezultate kvantitativnog RT-PCR za lobanju P3 miševa, što takođe nije pokazalo razliku u RNK ispoljavanju malih leucin-bogatih proteoglikan dekorina (Dcn), biglikana (Bgn) i asporina (Aspn) u lobanji Crtap<-/->miševa u poređenju sa WT. Rezultati su prikazani kao broj puta koliko je srednja vrednost povećana za WT grupu±SD; n=5 po grupi. Slika 12B je grafik koji prikazuje rezultate analize površinske rezonance plazmona, što ukazuje da je vezivanje rekombinantnog dekorin izvornog proteina za tip I kolagen Crtap<-l->miševa približno 45% manje u poređenju sa tipom I kolagena za WT. Tri nezavisna eksperimenta upotrebom 3, 5, i 12 µM dekorina su izvršeni. Jedinice odgovora (RU) ukupne količine vezanog dokorina normalizovane do tipa I kolagena imobilisane na čipu su prikazane. Srednje smanjenje vezivanja dekorina za Crtap<-/->tip I kolagena je 44.6 ± 7.9 %.
Slika 13 je niz grafika i slika koji prikazuju da suzbijanje povećanog TGFβ signaliziranje poboljšava fenotip kosti kod mišijeg modela dominantne OI što se dobija iz G610C mutacije u Col1a2 genu (Col1α2<tm1.1Mcbr>). Slika 13A su dva grafika koja prikazuju rezultate kvantitativnog RT-PCR za TGFβ ciljane gene p21 i PAI-1, što ukazuje povećano TGFβ signaliziranje u lobanji P3 WT i Col1α2<tm1.1Mcbr>miševa. Rezultati su prikazani kao broj puta koliko je srednja vrednost povećana za WT grupu±SD; n=3 po grupi, *p<0.05. Slika 13B je fotografija rezultata Western blot analize, koja povećava povišene nivoe aktiviranog Smad2 (pSmad2) relativno u odnosu na ukupne nivoe Smad2 proteina u P3 lobanji WT i Col1α2<tm1.1Mcbr>miševa u poređenju sa WT, što predlaže povećano TGFβ-signaliziranje; n=3 po grupi. Slika 13C je grafik koji prikazuje kvantifikaciju Western blot prikazanog na Slici 13B. Rezultati su prikazani kao broj puta koliko je srednja vrednost povećana za WT grupu±SD; *p<0.05. Slika 13D je niz fotografija MicroCT slika L4 tela pršljenova 16 nedelja starih divljeg tipa (WT), kontrolnih tretiranih sa antitelom Col1α2<tm1.1Mcbr>i 1D11-tretiranih Col1α2<tm1.1Mcbr>miševa nakon tretiranja u trajanju od 8 nedelja. Slika 13E je niz grafika podataka od MicroCT L4 tela pršljenova, što pokazuje povećani volumen kosti/ukupni volumen (BV/TV), broj koštanih gredica (Tb.N) i debljinu (Tb.Th) kod Col1α2<tm1.1Mcbr>miševa nakon tretiranja sa 1D11. Rezultati su prikazani kao srednje vrednosti ±SDs, n=6 po grupi, *p<0.05 za Col1α2<tm1.1Mcbr>1D11 u poređenju sa Col1α2<tm1.1Mcbr>kontrolnim, p<0.05 za Col1α2<tm1.1Mcbr>u poređenju sa WT.
Slika 14 slika je grafik krive težine koja prikazuje smanjenu težinu Crtap<-/->miševa u poređenju sa WT za vreme perioda ispitivanja (p<0.05 za sve vremenske tačke, srednje vrednosti ±SE su prikazane). Nikakva statistički značajna razlika u težini nije primećena kod 1D11-tretiranih Crtap<-l->miševa u poređenju sa kontrolnim Crtap<-/->miševima.
Slika 15 je niz grafika i tabela koje pokazuju da ne postoji uticaj TGFβ suzbijanja na nenormalnu tipa I kolagen post-translatornu modifikaciju kod Crtap<-/->miševa. Slika 15A je niz od tri grafika koji prikazuju par masene spektrometrije izvađenog tipa I kolagena iz golenjače WT, kontrolnih Crtap<-/->, i 1D11- tretiranih Crtap<-/->miševa (16 nedelja stari miševi, nakon tretiranja u periodu od 8 nedelja). Sekvenca u gornjem grafiku je SEQ ID NO: 19, sekvenca u srednjem grafiku je SEQ ID NO: 20, i sekvenca u donjem grafiku je SEQ ID NO: 21. Slika 15B je tabela koja prikazuje rezime para analize masene spektrometrije.1D11 tretiranje nije značajno uticalo na status 3-hidroksilacije kolagen ostatka Pro9861(1) u uzorcima kosti. Srednji procenat 3-hidroksilisanih ostataka (±SD) je prikazan, n=5 po grupi. Slika 15C grupa od tri grafika koji prikazuju tip I kolagen kosti kontrolnih Crtap<-/->i 1D11- tretiranih Crtap<-/->miševa koji pokazuju izmene u nivoima hidroksilizil piridinolin (HP) i lizil piridinolin unakrsnih veza (LP) i povećani HP/LP odnos u poređenju sa WT miševima. 1D11 tretiranje Crtap<-/->miševa nije značajno uticalo na ove parametre u poređenju sa kontrolnim Crtap<-/->miševima. Rezultati su dati kao srednje vrednosti±SD, n=4 miševa po grupi, p<0.05 za Crtap<-/->u poređenju sa WT.
Slika 16 je niz grafika koji prikazuje markere pregradnje kosti u serumu osteokalcin (OCN) i C-terminalnih unakrsno povezano telopeptid kolagena kosti (CTX) na početku (Slika 16A = 8 nedelja starosti) i na kraju ispitivanja sa tretiranjem (Slika 16B = 16 nedelja starosti). Slika 16A su dva grafika koja prikazuju povećane OCN i CTX nivoe u serumu kod 8 nedelja starih Crtap<-/->u poređenju sa WT miševima na početku ispitivanja što ukazuje na povećanu pregradnju kosti kod Crtap<-/->miševa. Rezultati su dati kao srednje vrednosti ±SDs, n=8 za WT, n=14 za Crtap<-/->miševe, p<0.05 za Crtap<-/->u poređenju sa WT. Slika 16B su dva grafika koji prikazuju da pri starosti od 16 nedelja 1D11-tretirani Crtap<-/->miševi pokazuju težnju prema smanjenom OCN u serumu i značajno smanjenim CTX nivoima u serumu u poređenju sa kontrolnim Crtap<-/->miševima, što ukazuje na suzbijanje povećane pregradnje kosti suzbijanjem TGFβ. Rezultati su dati kao srednje vrednosti±SD, n=8 za WT, n=7 po Crtap<-l->grupi; *p<0.05 za Crtap<-l->1D11 u poređenju sa Crtap<-/->kontrolnim, p<0.05 za Crtap<-/->u poređenju sa WT.
Slika 17 je tabela koja prikazuje rezultate MicroCT analize tela pršljena L4 za WT, kontrolnih Crtap<-/->, i 1D11 tretiranih Crtap<-/->miševa (16 nedelja starih miševa, nakon tretiranja u trajanju od 8 nedelja). Srednje vrednosti±SD prikazane su za volumen kosti/volumen tkiva (BV/TV), broj koštanih gredica (Tb.N), debljinu koštanih gredica (Tb.Th), odvajanje koštanih gredica (Tb.Sp), i mineralnu gustinu kosti volumena kosti (BMD BV); n=8 po grupi, ukazuje Kruskal-Wallis jednosmerni ANOVA na rangovima gde test jednake varijanse nije uspeo. n.s.=nije statistički značajno.
Slika 18 je tabela koja prikazuje rezultate MicroCT analize koštane gredice u blizini bedrene kosti za WT, kontrolne Crtap<-/->, i 1D11- tretirane Crtap<-/->miševe (16 nedelja stari miševi, nakon tretiranja u trajanju od 8 nedelja). Srednje vrednosti±SD prikazane su za volumen kosti/volumen tkiva (BV/TV), broj koštanih gredica (Tb.N), debljinu koštanih gredica (Tb.Th), odvajanje koštanih gredica (Tb.Sp), i mineralnu gustinu kosti volumena kosti (BMD BV); n=8 po grupi. ukazuje Kruskal-Wallis jednosmerni ANOVA na rangovima gde test jednake varijanse nije uspeo. n.s.=nije statistički značajno.
Slika 19 je tabela koja prikazuje rezultate MicroCT analize kortikalne kosti kod sredine bedrene kosti za WT, kontrolne Crtap<-/->, i 1D11- tretirane Crtap<-/->miševe (16 nedelja stari miševi, nakon tretiranja u trajanju od 8 nedelja). Srednje vrednosti±SD prikazane su kortikalnu debljinu, mineralnu gustinu kosti volumena kosti (BMD BV), zadnji-prednji (a.p.) prečnik, poprečni presek (CSA) i poprečni moment inercije (CSMI) za mediolateralnu (m.l.) i prednju-zadnju (a.p.) osu; n=8 po grupi. n.s.=nije statistički značajno.
Slika 20 je tabela koja prikazuje rezultate biomehaničkog testiranja bedrene kosti savijanjem sa 3 tačke (16 nedelja stari miševi, nakon tretiranja od 8 nedelja). U poređenju sa WT miševima, kontrolni Crtap<-/->miševi pokazali su značajno smanjene biomehaničke parametre osim elastičnih modula i elastičnih pomeranja. Anti TGFβtretiranje sa 1D11 ispoljilo se u značajnom poboljšanjima maksimalnog opterećenja i ukupne otpornosti kod bedrene kosti Crtap<-/->što ukazuje na povećanu otpornost celih kostiju i tkiva. Međutim, nikakve značajne izmene u pomeranju nakon granice elastičnosti nisu primećene što ukazuje da 1D11 nije uticalo na povećanu krhkost OI kosti. N=6 za WT, n=4 kontrolne Crtap<-/->i n=3 za 1D11 tretirane Crtap<-/->miševe. n.s.=nije statistički značajno.
Slika 21 je tabela koja prikazuje rezultate histomorfometrijske analize tela pršljena L4 za WT, kontrolnih Crtap<-/->, i 1D11 tretiranih Crtap<-/->miševa (16 nedelja starih miševa, nakon tretiranja u trajanju od 8 nedelja). Srednje vrednosti±SD prikazane su za volumen kosti/volumen tkiva (BV/TV), broj koštanih gredica (Tb.N), debljinu koštanih gredica (Tb.Th), odvajanje koštanih gredica (Tb.Sp), broj osteoklasta/površina kosti (N.Oc/BS), površina osteoklasta/površina kosti (Oc.S/BS), broj osteoblasta/površina kosti (N.Ob/BS), površina osteoblasta/površina kosti (Oc.S/BS) i broj osteocita/površina kosti (N.Ot/B.Ar); n=6 po grupi. ukazuje Kruskal-Wallis jednosmerni ANOVA na rangovima gde test jednake varijanse nije uspeo. n.s.=nije statistički značajno.
Slika 22 je tabela koja prikazuje rezultate MicroCT analize tela pršljena L4 WT, kontrolnih Col1α2<tm1.1Mcbr>i 1D11 tretiranih Col1α2<tm1.1Mcbr>miševa (16 nedelja stari miševi nakon tretiranja u trajanju od 8 nedelja). Srednje vrednosti±SD prikazane su za volumen kosti/volumen tkiva (BV/TV), broj koštanih gredica (Tb.N), debljinu koštanih gredica (Tb.Th), odvajanje koštanih gredica (Tb.Sp), i mineralnu gustinu kosti volumena kosti (BMD BV); n=6 po grupi, n.s.=nije statistički značajno.
Slika 23 je grafik koji prikazuje analizu površinske plazmonske rezonance koja je merila vezivanje rekombinantnog dekorin izvornog proteina za tip I kolagen WT i Crtap<-l->miševa. Tri tehnička replikata pri svakoj ukazanoj koncentraciji dekorina izvršena su iz dva nezavisna biološka replikata (◆ replikat 1, ▲ replikat 2). Rezultati su prikazani kao procenat srednje vrednosti WT (kolone predstavljaju srednju vrednost po grupi).
Slika 24 (mikrografske slike) prikazuju imunološko obeležavanje za dekorin u distalnoj metafizi bedrene kosti kod WT i Crtap<-/->miševa pri 20X, n=3 po genotipu, razmera=100µm (Slike 24A-24C) i 40X uvećanje, n=3 po genotipu, razmera=50µm (Slike 24D-24F). Kontrolne bedrene kosti inkubirane su samo u sekundarnom antitelu.
Slika 25 (mikrografske slike) prikazuju imunološko obeležavanje za TGFβ1 u distalnoj metafizi bedrene kosti kod WT i Crtap<-/->miševa pri 20X, n=3 po genotipu, razmera=100µm (Slike 25A-25C) i 40X uvećanje, n=3 po genotipu, razmera=50µm (Slike 25D-25F). Kontrolne bedrene kosti inkubirane su samo u sekundarnom antitelu.
Slika 26 (mikrografske slike) prikazuju imunološko obeležavanje za TGFβ1 u distalnoj metafizi bedrene kosti kod WT i Col1α2<tm1.1Mcbr>miševa pri 20X, n=3 po genotipu, razmera=100µm (Slike 26A-26C) i 40X uvećanje, n=3 po genotipu, razmera=50µm (Slike 26D-26F). Kontrolne bedrene kosti inkubirane su samo u sekundarnom antitelu.
REZIME PRONALASKA
[0005] Predmetni pronalazak odnosi se na antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje i neutrališe ljudske TGFβ1, TGFβ2, i TGFβ3 za upotrebu u lečenju osteogeneze imperfecta (OI) kod subjekta kome je to potrebno i koji sadrži varijabilni region teškog lanca koji se sastoji od tri regiona koji determinišu komplementarnost (CDR) koji imaju sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 4, 5 i 6; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži tri CDR-a koji imaju sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 7, 8 i 9.
[0006] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrže varijabilni region od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10, i varijabilni region od lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11.
[0007] U jednom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrže ljudski IgG4 konstantni region. U jednom otelotvorenju, ljudski IgG4 konstantni region sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12. U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen dalje sadrže ljudski κ konstantni region od lakog lanca. U drugom otelotvorenju, ljudski κ konstantni region od lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13. U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrže ljudski IgG4 konstantni region i ljudski κ konstanti region od lakog lanca.
[0008] U drugom otelotvorenju, ljudski IgG4 konstantni region sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12, i ljudski κ konstantni region od lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13. U drugom otelotvorenju, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14. U drugom otelotvorenju, antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15. U drugom otelotvorenju, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15.
[0009] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen poboljšava parametar kosti izabran iz grupe koju čine frakcija volumena kosti (BV/TV), ukupna koštana površina (BS), odnos koštane površine i volumena (BS/BV), broj koštanih gredica (Tb.N), debljina koštanih gredica (Tb.Th) razdvojenost koštanih gredica (Tb.Sp) i ukupni volumen (Desn TV).
[0010] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen suzbijaju resorpciju kosti.
[0011] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen smanjuju biomarker u serumu resorpcije kosti izabran iz grupe koju čine urinarni hidroksiprolin, urinarni ukupni piridinolin (PYD), urinarni slobodni dezoksipiridinolin (DPD), urinarni kolagen tipa-I unakrsno povezani N-telopepid (NTX), urinarni ili serumski tipa-I unakrsno povezani C-telopeptid (CTX), sialoprotein kosti (BSP), osteopontin (OPN) i tartrat-otporna kisela fosfataza 5b (TRAP).
1
[0012] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen povećava biomarker u serumu koštane depozicije zabran iz grupe koju čine ukupna alkalna fosfataza, alkalna fosfataza specifična za kosti, osteokalcin i tip-I prokolagen (C-terminalni/N-terminalni).
[0013] U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen suzbijaju resorpciju kosti. U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen pospešuju koštanu depoziciju. U drugom otelotvorenju, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen poboljšava funkciju ne-skeletnog organa pogođenog sa OI izabranu iz grupe koju čine funkcija sluha, funkcija pluća i funkcija bubrega.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
A. Definicije
[0014] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je uobičajeno prihvaćeno od strane stručnjaka u ovoj oblasti.
[0015] Ovde je napomenuto da kao što je korišćeno u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici jednine članova „a“, „an“ i „the“ takođe obuhvataju referencu na množinu, ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije.
[0016] Termin „oko“ ili „približno“ označavaju unutar 10%, a još poželjnije unutar 5% (ili 1% ili manje), date vrednosti ili opsega.
[0017] Termini „davati“ ili „davanje“ odnose se na čin ubrizgavanja ili na drugačiji način fizičko isporučivanje supstance kako postoji van tela (npr., antitelo) pacijentu, kao što je isporučivanje preko sluzokože, u kožu, u venu, potkožno, u mišić i/ili bilo koji postupak fizičke isporuke koji je ovde opisan ili je poznat u struci. Kada se bolest, ili njen simptom, tretiraju, davanje supstance obično se vrši nakon ispoljavanja bolesti ili njenih simptoma. Kada se bolest, ili njeni simptomi, sprečavaju, davanje supstance obično se vrši nakon ispoljavanja bolesti ili njenih simptoma.
[0018] „Antagonist“ ili „inhibitor“ TGFβ odnose se na molekul koji je u stanju da suzbije ili na drugačiji način smanji jednu ili više bioloških aktivnosti TGFβ, kao što je ćelijsko ispoljavanje TGFβ ili ćelijsko ispoljavanje TGFβ liganda ili ispoljavanje TGFβ receptora. U određenim primernim otelotvorenjima, antitela prema pronalasku su antitela antagonisti koja suzbijaju ili na drugačiji način smanjuju aktivnost TGFβ u ćeliji koja ima ispoljeni TGFβ receptor na ćelijskoj površini (npr., TGFβ receptor 1, 2 ili 3) kada se navedeno antitelo dovede u dodir sa navedenom ćelijom. U nekim otelotvorenjima, antagonist TGFβ (npr., antitelo prema pronalasku) može, na primer, delovati suzbijanjem ili na drugačiji način smanjivanjem aktiviranja i/ili puteva ćelijskog signaliziranja kod ćelije koja ispoljava TGFβ receptor, time suzbijajući TGFβ posredovanu biološku aktivnost ćelije relativno u odnosu na TGFβ posredovanu aktivnost u odsustvu antagonista. U određenim otelotvorenjima prema pronalasku, anti-TGFβ antitela su antagonistička anti-TGFβ antitela, poželjno potpuno ljudska, monoklonska, antagonistička anti-TGFβ antitela.
[0019] Termini „antitelo“, „imunoglobulin“ ili „Ig“ mogu se ovde koristiti naizmenično. Termin antitelo obuhvata, ali nije ograničen na, sintetička antitela, monoklonska antitela, rekombinantno proizvedena antitela, multispecifična antitela (uključujući bispecifična antitela), ljudska antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, intratela, jednolančani Fv (scFV) (npr., uključujući monospecifični, bispecifični, itd.), kamilizovana antitela, Fav fragmenti, F(ab’) fragmenti, disulfidno povezani Fv (sdFv), antiidiotipska (anti-Id) antitela i epitop-vezujući fragmenti bilo kog od iznad. Naročito, antitela obuhvataju molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina, npr., antigen vezujuće domene ili molekule koji sadrže mesto vezivanja antigena koji se specifično vezuju za TGFβ antigen(npr., jedan ili više regiona koji determinišu komplementarnost (CDR) anti-TGFβ antitela). Anti-TGFβ antitela mogu biti bilo kog tipa (npr., IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, i IgY), bilo koje klase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2) ili bilo koje pod klase (npr., IgG2a i IgG2b) molekula imunoglobulina. U određenim otelotvorenjima, anti-TGFβ antitela su humanizovana, kao što su humanizovana monoklonska anti-TGFβ antitela. U drugim otelotvorenjima, anti-TGFβ antitela su potpuno ljudska, kao što su potpuno ljudska monoklonska anti-TGFβ antitela. U poželjnim otelotvorenjima, anti-TGFβ antitela su IgG antitela, kao što su IgG4 antitela.
[0020] Termini „sastav“ i „formulacija“ namenjeni su da obuhvate proizvod koji sadrži naznačene sastojke (npr., anti-TGFβ antitelo) u, opciono, naznačenim količinama, kao i bilo koji proizvod koji se dobija, neposredno ili posredno, iz kombinovanja naznačenih sastojaka u, opciono, naznačenim količinama.
[0021] Termini „konstantni region“ ili „konstantni domen“ odnose se na karboksi terminalni deo lakog i teškog lanca koji nije direktno umešan u vezivanje antitela za antigen ali pokazuje različite efektorske funkcije, kao što je međudejstvo sa Fc receptorom. Termini se odnose na deo molekula imunoglobulina koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je više sačuvana relativno u odnosu na druge delove imunoglobulina, varijabilnog domena, koja sadrži mesto vezivanja antigena. Konstantni domen sadrži CH1, CH2 i CH3 domene teškog lanca i CHL domen lakog lanca.
[0022] Termin „epitop“ odnosi se na lokalizovani region na površini antigena, kao što je TGFβ polipeptid ili fragment TGFβ polipeptida, koji je u stanju da se veže za jedan ili više od regiona vezivanja antigena antitela i koji ima antigensku ili imunogensku aktivnost kod životinje, poželjno sisara a najpoželjnije kod ljudi, koji je u stanju da izazove imunski odgovor. Epitop koji ima imunogensku aktivnost je deo polipeptida koji izaziva odgovor antitela u životinji. Epitop koji ima antigensku aktivnost je deo polipeptida za koji se antitelo specifično vezuje, kao što je određeno sa bilo kojim postupkom dobro poznatim u struci, na primer, kao što je imunološka proba. Antigenski epitopi ne moraju nužno biti imunogenski. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula, kao što su amino kiseline ili bočni lanci šećera i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Region polipeptida koji doprinosi epitopu može biti susedan sa amino kiselinama polipeptida ili epitop može nastati iz dva ili više regiona polipeptida koji nisu susedni. Epitop može ili ne mora biti trodimenzionalno površinsko svojstvo antigena. U određenim otelotvorenjima, TGFβ epitop je trodimenzionalno površinsko svojstvo TGFβ polipeptida (npr., u trimernom obliku TGFβ polipeptida). U drugim otelotvorenjima, TGFβ epitop je linearno svojstvo TGFβ polipeptida (npr., u dimernom obliku ili monomernom obliku TGFβ polipeptida). Anti-TGFβ antitela se mogu specifično vezati za epitop monomernog oblika TGFβ, epitop dimernog oblika TGFβ ili oba, monomernog oblika i dimernog oblika TGFβ.
[0023] Termin „ekscipijensi“ odnosi se na inertne supstance koje se obično koriste kao razblaživači, sredstva za prenošenje, konzervansi, veznici, sredstva za stabilizaciju, itd. kod lekova i obuhvataju, ali nije ograničeni na, proteini (npr., serum albumin, itd.), amino kiseline (npr., asparginova kiselina, glutaminska kiselina, lizin, arginin, glicin, histidin, itd.) masne kiseline i fosfolipide (npr., alkil sulfonati, kaprilat, itd.), surfaktante (npr., SDS, polisorbat, nejonski surfaktanti, itd.) saharide (npr., sukroza, maltoza, trehaloza, itd.) i poliole (npr.,
1
manitol, sorbitol, itd.) Videti, takođe, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, Pa.
[0024] U kontekstu peptida ili polipeptida, termin „fragment“ odnosi se na peptid ili polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu manju od pune dužine. Takvi fragmenti mogu se pojaviti, na primer, iz skraćenja na amino terminusu, skraćenja na karboksi terminusu i/ili unutrašnjeg brisanja ostataka iz aminokiselinske sekvence. Fragmenti se, na primer, mogu dobiti iz alternativnog deljenja RNK ili iz in vivo aktivnosti proteaze. U određenim otelotvorenjima, TGFβ fragmenti obuhvataju polipeptide koji sadrže aminokiselinsku sekvencu od bar 50, bar 100 aminokiselinskih ostataka, bar 125 neprekidnih aminokiselinskih ostataka, bar 150 neprekidnih aminokiselinskih ostataka, bar 175 neprekidnih aminokiselinskih ostataka, bar 200 neprekidnih aminokiselinskih ostataka ili bar 250 neprekidnih aminokiselinskih ostataka aminokiselinske sekvence TGFβ peptida. U specifičnom otelotvorenju, fragment TGFβ peptida ili antitelo koje se specifično vezuje za TGFβ antigen zadržava bar 1, bar 2 ili bar 3 funkcije polipeptida pune dužine ili antitela.
[0025] Termini „potpuno ljudsko antitelo“ ili „ljudsko antitelo“ ovde se koriste naizmenično i odnose se na antitelo koje obuhvata ljudski varijabilni region i najpoželjnije ljudski konstantni region. U specifičnim otelotvorenjima, termini se odnose na antitelo koje sadrži varijabilni region i konstantni region ljudskog porekla. „Potpuno ljudska“ anti-TGFβ antitela, u određenim otelotvorenjima, mogu takođe obuhvatati antitela koja se vezuju za TGFβ polipeptide i kodirana su sa sekvencama nukleinske kiseline koje su somatske varijante koje se prirodno pojavljuju ljudske germinalne imunoglobulinske sekvence nukleinske kiseline. U specifičnom otelotvorenju, anti-TGFβ antitela su potpuno ljudska antitela. Termin „potpuno ljudsko antitela“ obuhvata antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji odgovaraju ljudskim germinalnim imunoglobulinskim sekvencama kao što je opisano u Kabat i dr. (VidetiKabat i dr. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Peto izdanje, SAD Department of Health and Human Services, NIH Objava br.91-3242). Postupci za proizvodnju potpuno ljudskih antitela su poznati u struci.
[0026] Izraz „rekombinantno ljudsko antitelo“ obuhvata ljudska antitela koja su pripremljena, ispoljena, stvorena ili izolovana sa rekombinantnim sredstvima, kao što su antitela ispoljena upotrebom rekombinantnog ekspresionog vektora prenetog u ćeliju domaćina, antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke ljudskih antitela, antitela izolovana iz životinje (npr., miš ili krava) koje je transgensko ili transhromozomno za ljudske imunoglobulinske gene (videti, npr., Taylor, L. D. i dr. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) ili antitela pripremljena, ispoljena, stvorena ili izolovana sa bilo kojim drugim sredstvima koja obuhvataju deljenje ljudskog imunoglobulinske genske sekvence na druge DNK sekvence. Takva rekombinantna ljudska antitela mogu imati varijabilne i konstantne regione izvedene iz ljudskih germinalnih imunoglobulinskih sekvenci (Videti Kabat, E. A. i dr. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Peto izdanje, SAD Department of Health and Human Services, NIH Objava br.91-3242). U određenim otelotvorenjima, međutim, takva rekombinantna ljudska antitela izložena su in vitro mutagenezi (ili, kada se koriste životinjske transgenske sekvence za ljudske, in vivo somatska mutageneza) i stoga aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, dok su izvedene iz i povezane sa ljudskim germinalnim VH i VL sekvencama, ne moraju prirodno postojati u germinalnom repertoaru ljudskog antitela in vivo.
[0027] Termin „teški lanac“ kada se koristi u vezi sa antitelom odnosi se na pet različitih tipova, koji se nazivaju alfa (α), delta (Δ), epsilon (ε), gama (γ) i mi (µ), na osnovu aminokiselinske sekvence teškog lanca konstantnog domena. Ovi različiti tipovi teških lanaca dobro su poznati u struci i uzrokuju pet klasa antitela, IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, respektivno, uključujući četiri podklase IgG, naime, IgG1, IgG1, IgG3, i IgG4. Poželjno teški lanac je ljudski teški lanac.
[0028] „Izolovano“ ili „prečišćeno“ antitelo je suštinski slobodno od ćelijskog materijala ili drugih zagađujućih proteina iz ćelijskog ili izvora tkiva iz kojeg je antitelo izvedeno, ili je suštinski slobodno od početnih hemijskih materijala ili drugih hemikalija kada je hemijski sintetisano. Govor „suštinski slobodno od ćelijskog materijala“ obuhvata pripremanja antitela u kojima je antitelo odvojeno od ćelijskih komponenti ćelija iz kojeg je izolovano ili rekombinantno proizvedeno. Stoga, antitelo koje je suštinski slobodno od ćelijskog materijala obuhvata pripremanja antitela koje ima manje od oko 30%, 20%, 10% ili 5% (po suvoj masi) heterolognog proteina (takođe se ovde naziva kao „zagađujući protein“). Kada je antitelo rekombinantno proizvedeno, poželjno je suštinski slobodno od podloge za kultivisanje, tj., podloga za kultivisanje predstavlja manje od oko 20%, 10% ili 5% zapremine pripremanja proteina. Kada je antitelo proizvedeno sa hemijskom sintezom, poželjno je suštinski slobodno od početnog hemijskog materijala ili drugih hemikalija, tj., odvojeno je od početnog hemijskog materijala ili drugih hemikalija koje su umešane u sintezu proteina. U skladu sa
1
time, takva pripremanja antitela imaju manje od oko 30%, 20%, 10%, 5% (po suvoj masi) početnog hemijskog materijala ili jedinjenja različitih od antitela od interesa. U poželjnom otelotvorenju, anti-TGFβ antitela su izolovana ili prečišćena.
[0029] Termini „Kabat numerisanje“ i slični termini prepoznati su u struci i odnose se na sistem numerisanja aminokiselinskih ostataka koji su varijabilniji (tj. hipervarijabilniji) od drugih aminokiselinskih ostataka u teškom i lakom lancu varijabilnih regiona antitela ili njegovog dela koji se vezuje za antigen (Kabat i dr. (1971) Ann. NY Acad. Sci.190:382-391 i, Kabat i dr. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Peto izdanje, SAD Department of Health and Human Services, NIH Objava br.91-3242). Za region od lakog lanca, hipervarijabilni region je obično u rasponu od aminokiselinskih pozicija 31 do 35 za CDR1, aminokiselinskih pozicija 50 do 65 za CDR2 i aminokiselinskih pozicija 95 do 102 za CDR3. Za region od lakog lanca, hipervarijabilni region je obično u rasponu od aminokiselinskih pozicija 24 do 34 za CDR1, aminokiselinskih pozicija 50 do 56 za CDR2 i aminokiselinskih pozicija 89 do 97 za CDR3.
[0030] Termin „laki lanac“ kada se koristi u vezi sa antitelom odnosi se na dva različita tipa, koji se nazivaju kapa (κ) ili lambda (λ), na osnovu aminokiselinske sekvence konstantnih domena. Aminokiselinske sekvence lakog lanca dobro su poznate u struci. U poželjnim otelotvorenjima, laki lanac je ljudski laki lanac.
[0031] Termini „upravlja“, „upravljati“, i „upravljanje“ odnose se na korisna dejstva koja ispitanik dobija iz terapije (npr., profilaktičko ili terapeutsko sredstvo), koja se ne ispoljavaju u lečenju bolesti ili poremećaja. U određenim otelotvorenjima, ispitaniku se daje više od jedne terapije (npr., profilaktička ili terapeutska sredstva) za „upravljanje“ TGFβposredovane bolesti (npr., OI) ili jedan ili više njenih simptoma, tako da se sprečava napredovanje ili pogoršanje bolesti.
[0032] Termin „monoklonsko antitelo“ odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije homogenih ili suštinski homogenih antitela i svako monoklonsko antitelo će obično prepoznati pojedinačni epitop na antigenu. U poželjnim antitelima, "monoklonsko antitelo" je antitelo proizvedeno od strane pojedinačnog hibridoma ili druge ćelije. Termin „monoklonsko“ nije ograničen na naročiti postupak za pravljenje antitela. Na primer, monoklonska antitela mogu biti napravljena sa hibridoma postupkom kao što je opisano u
1
Kohler i dr.; Nature, 256:495 (1975) ili mogu biti izolovana iz biblioteka faga. Drugi postupci za pripremanje klonskih ćelijskih linija i monoklonskih antitela tu izraženih su dobro poznati u struci (videti, na primer, Odeljak 11 u: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5. Izd.; Ausubel i dr., ured., John Wiley i Sons, New York).
[0033] Termin „farmaceutski prihvatljiv“ označava da je odobreno od strane regulatorne agencije Federalne ili Državne vlade ili je navedeno u Farmakopeji SAD, Evropskoj Farmakopeji ili drugim opšte prepoznatim Farmakopejama za upotrebu kod životinja a naročito kod ljudi.
[0034] Termin „farmaceutski prihvatljiv ekscipijens“ predstavlja inertnu supstancu koja je kombinovana sa aktivnim molekulom, kao što je monoklonsko antitelo, za pripremanje prihvatljivog ili pogodnog oblika za doziranje. „Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens“ je ekscipijens koji nije toksičan za primaoce pri upotrebljenim dozama i koncentracijama i kompatibilan je sa drugim sastojcima formulacije koja sadrži monoklonsko antitelo.
[0035] Termini „spreči“, „sprečava“ i „sprečavanje“ odnose se na ukupno ili delimično suzbijanje razvoja, ponovnog pojavljivanja, ispoljavanja ili širenja TGFβ-posredovane bolesti i/ili povezanog simptoma, koje se dobija iz davanja terapije ili kombinacije terapija koje su ovde date (npr., kombinacija profilaktičkih ili terapeutskih sredstava).
[0036] Termin „TGFβ antigen“ odnosi se na deo TGFβ polipeptida za koji se antitelo specifično vezuje. TGFβ antigen takođe se odnosi na analog ili derivat TGFβ polipeptida ili njegovog fragmenta za koji se antitelo specifično vezuje. U nekim otelotvorenjima, TGFβ antigen je monomerni TGFβ antigen ili dimerni TGFβ antigen. Region TGFβ polipeptida koji doprinosi epitopu može biti susedan sa amino kiselinama polipeptida ili epitop može nastati iz dva ili više regiona polipeptida koji nisu susedni. Epitop može ili ne mora biti trodimenzionalno površinsko svojstvo antigena. Lokalizovani region na površini TGFβ antigena koji je u stanju da izazove imunski odgovor je TGFβ epitop. Epitop može ili ne mora biti trodimenzionalno površinsko svojstvo antigena. Kao što se ovde koristi, „analog“ TGFβ antigena odnosi se na polipeptid koji poseduje sličnu ili identičnu funkciju kao TGFβ polipeptid, fragment TGFβ polipeptida ili TGFβ epitopa ovde opisanih. Na primer, analog može sadržati sekvencu koja je bar 80%, bar 85%, bar 90%, bar 95% ili bar 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom TGFβ polipeptida (npr., SEQ ID NO: 1, 2, ili 3), fragmenta
1
TGFβ polipeptida, TGFβ epitopa ili anti-TGFβ antitela ovde opisanih. Dodatno ili alternativno, polipeptid je kodiran sa nukleotidnom sekvencom koja se hibridizuje pod strogim uslovima u nukleotidnu sekvencu koja kodira TGFβ polipeptid, fragment TGFβ polipeptida ili TGFβ epitop ovde opisane.
[0037] Termin „ljudski TGFβ“, „hTGFβ“ ili „hTGFβ polipeptid“ i slični termini odnose se na polipeptide („polipeptidi“, „peptidi“ i „proteini“ se ovde naizmenično koriste) koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 1, 2, ili 3 i povezane polipeptide uključujući njihove SNP varijante. Povezani polipeptidi obuhvataju alelske varijante (npr., SNP varijante); varijante splajsa; fragmente derivate; varijante zamene, brisanja i unošenja; fuzione polipeptide; i homologe između vrsta, poželjno koji zadržavaju TGFβ aktivnost i/ili su dovoljni da stvore anti-TGFβ imunski odgovor. Takođe su obuhvaćeni rastvorljivi oblici TGFβ koji su dovoljni za stvaranje anti-TGFβ imunološkog odgovora. Kao što će stručni u ovoj oblasti uvažiti, anti-TGFβ antitelo se može vezati za TGFβ polipeptid, fragment polipeptida, antigen i/ili epitop, kako je epitop deo većeg antigena, koji je deo većeg fragmenta polipeptida, koji je, zauzvrat, deo većeg polipeptida. hTGFβ može postojati u dimernom ili monomernom obliku.
[0038] Termini „TGFβ-posredovana bolest“ i „TGFβ-posredovani poremećaj“ koriste se naizmenično i odnose se na bilo koju bolest ili poremećaj koji je potpuno ili delimično izazvan ili je posledica TGFβ, npr., hTGFβ. U određenim otelotvorenjima, TGFβ se nenormalno ispoljava. U nekim otelotvorenjima, TGFβ može biti nenormalno regulisan na gore u određenom tipu ćelije. U drugim otelotvorenjima, normalno, nenormalno ili prekomerno ćelijsko signaliziranje izazvano je vezivanjem TGFβ za TGFβ receptor. U određenim otelotvorenjima, TGFβ receptor (npr., TGFβ receptor 1, 2 ili 3) je ispoljen na površini ćelije, kao što je osteoblast, osteoklast ili ćelije strominog tkiva koštane srži. U određenim otelotvorenjima, TGFβ posredovana bolest je degenerativna bolest kosti, kao što je osteogeneza imperfekta.
[0039] Termini „specifično vezuje“ ili „specifično vezivanje“ označavaju specifično vezivanje za antigen ili njegov fragment (npr., TGFβ) a ne specifično vezivanje za druge antigene. Antitelo koje se specifično vezuje za antigen može se vezati za druge peptide ili polipeptide sa nižim afinitetom, kao što je određeno sa npr., radioimunološkim metodama (RIA), imuno enzimskim probama (ELISA), BIACORE ili drugim ogledima poznatim u
1
struci. U određenim otelotvorenjima, anti-TGFβ antitelo prema pronalasku može se specifično vezati za TGFβ (npr., hTGFβ), sa više od dva puta većim afinitetom od različitog antigena koji nije TGFβ. Antitela ili varijante ili njegovi fragmenti koji se specifično vezuju za antigen mogu biti unakrsno reaktivno sa povezanim antigenima. Na primer, u određenim otelotvorenjima anti-TGFβ antitelo može unakrsno reagovati sa hTGFβ i drugim TGFβ antigenom (npr., TGFβ antitelo od glodara ili primata koji nije čovek). Poželjno, antitela ili varijante ili njegovi fragmenti koji se specifično vezuju za antigen mogu nisu unakrsno reaktivni sa drugim antigenima koji nisu TGFβ. Antitelo ili varijanta ili njegov fragment koji se specifično vezuje za TGFβ antigen može biti identifikovan, na primer, sa imunološkim probama, BIAcore ili drugim tehnikama poznatim stručnima u oblasti. Obično, specifična ili selektivna reakcija će imati bar dva puta veći pozadinski signal ili šum a obično i više od 10 puta. U nekim otelotvorenjima, vezujući protein ili antitelo će se vezati sa svoj antigen, npr., TGFβ, sa konstantom disocijacije između 1x10<-6>M i 1x10<-7>. U drugim otelotvorenjima, konstanta disocijacije je između 1x10<-6>M i 1x10<-8>. Videti, npr., Paul, izd., 1989, Fundamental Immunology drugo izdanje, Raven Press, New York na stranama 332-336 za razmatranje koje se odnosi na specifičnost antitela.
[0040] Termini „ispitanik“ i „pacijent“ koriste se naizmenično. Kao što se ovde koristi, ispitanik je poželjno sisar, kao što je sisar koji nije primat (npr., krave, svinje, konji, mačke, psi, pacovi, itd.) ili koji jeste primat (npr., majmun ili čovek), najpoželjnije čovek. U jednom otelotvorenju, ispitanik je sisar, poželjno čovek koji ima TGFβ posredovanu bolest. U jednom otelotvorenju, ispitanik je sisar, poželjno čovek, koji je pri riziku od razvijanja TGFβ posredovane bolesti.
[0041] Termin „terapeutsko sredstvo“ odnosi se na bilo koje sredstvo koje se može koristiti pri tretiranju, upravljanju ili poboljšavanju TGFβ posredovane bolesti i/ili simptoma povezanog sa njom. U određenim otelotvorenjima, termin „terapeutsko sredstvo“ odnosi se na TGFβ antitelo. U određenim otelotvorenjima, termin „terapeutsko sredstvo“ odnosi se na sredstvo koje nije TGFβ antitelo. Poželjno, terapeutsko sredstvo je sredstvo koje je poznato da je korisno za, ili je bilo, ili se trenutno koristi za tretiranje, upravljanje ili ublažavanje TGFβ posredovane bolesti, ili jednog ili više simptoma povezanu za nju.
[0042] Termin „terapija“ odnosi se na bilo koji protokol, postupak i/ili sredstvo koje se može koristiti pri sprečavanju, upravljanju, tretiranju i/ili poboljšavanju TGFβ posredovane bolesti
1
(npr., OI). U određenim otelotvorenjima, termini „terapije“ i „terapija“ odnose se na biološku terapiju, dodatnu terapiju i/ili terapije koje su od koristi pri sprečavanju, upravljanju, tretiranju i/ili poboljšavanju TGFβ posredovane bolesti poznate stručnom u ovoj oblasti, kao što je medicinsko osoblje.
[0043] Termini „tretirati“, „tretiranje“ i „tretira“ odnose se na smanjenje ili poboljšanje napredovanja, ozbiljnosti i/ili trajanja TGFβ posredovane bolesti (npr., OI) što se ispoljava iz davanja jedne ili više terapija (uključujući, ali ne ograničavajući se na, davanje jednog ili više profilaktičkih ili terapeutskih sredstava). u specifičnim otelotvorenjima, takvi termini odnose se na smanjenje ili suzbijanje vezivanja TGFβ za TGFβ receptor, smanjenje suzbijanja proizvodnje ili lučenja TGFβ iz ćelije koja ispoljava TGFβ receptor kod ispitanika, smanjenje ili suzbijanje proizvodnje ili lučenja TGFβ iz ćelije koja ne ispoljava TGFβ receptor kod ispitanika i/ili suzbijanje ili smanjenje jednog ili više simptoma povezanih sa TGFβ posredovanom bolešću, kao što je OI.
[0044] Termini „varijabilni region“ ili „varijabilni domen“ odnose se na deo lakih i teških lanaca, obično oko amino-terminala 120 do 130 amino kiselina u teškom lancu i oko 100 do 110 amino kiselina u lakom lancu, što se značajno razlikuje kod sekvence kod antitela koja se koriste za vezivanje specifičnosti za svako naročito antitelo za svoj naročit antigen.
Varijabilnost u sekvenci koncentrovana je u onim regionima koji se nazivaju regionima koji determinišu komplementarnost (CDR), dok se više konzervisani regioni u varijabilnom domenu nazivaju regionima okvira čitanja (FR). CDR lakog i teškog lanca su prevashodno odgovorni za međudejstvo antitela sa antigenom. Numerisanje pozicija amino kiselina je u skladu sa EU indeksom, kao u Kabat i dr. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. (U.S. Department of Health and Human Services, Washington D.C.) 5. izd. ("Kabat i dr."). U poželjnim otelotvorenjima, varijabilni region je ljudski varijabilni region.
B. Osteogeneza imperfekta (OI)
[0045] OI obuhvata grupu uređenih bolesti kosti okarakterisanu sa nedostacima jednog ili više proteina koji učestvuje u depoziciji koštanog matriksa ili homeostazi. Postoji osam tipova OI koji su definisani sa svojom specifičnom genskom mutacijom i ispoljavaju nedostatak proteina i fenotip pogođenog pojedinca. Iako fenotipovi mogu varirati među OI tipovima, uobičajeni simptomi obuhvataju nepotpuno okoštavanje kostiju i zuba, smanjenu masu kostiju, krhke kosti i patološke prelome.
2
[0046] Tip-I kolagen je jedan od obilnijih proteina vezivnog tkiva u oba, koštanom i nekoštanom tkivu. Tačna sinteza, post-translatorna modifikacija i lučenje tipa-I kolagena neophodni su za ispravno razvijanje tkiva, održavanje i popravljanje. Većina mutacija identifikovanih kod pojedinaca sa OI ispoljava se u smanjenoj sintezi tipa-I kolagena ili neispravnoj sintezi i/ili obrađivanju tipa-I kolagena.
[0047] Dodatno mutacijama gena tipa-I kolagena, druge mutacije u genima koji učestvuju u unutarćelijskoj razmeni i obradi kolagena identifikovane su kod pojedinaca pogođenih sa OI. Ovi geni obuhvataju pratioce, kao što su FK506 vezujući protein 10 (FKBP10) i protein toplotnog šoka 47 (HSP47) (Alanay i dr., 2010; Christiansen i dr., 2010; Kelley i dr., 2011). Dodatne mutacije identifikovane su u unutarmolekulskim unakrsno-vezujućim genima kolagena, kao što su prokolagen-lizin, 2-oksoglutarat 5-dioksigenaza 2 (PLOD2) i u članovima porodice gena kolagen prolil hidroksilaze, uključujući leucin prolin-obogaćeni proteoglikan (leprekan) (LEPRE 1), peptidilpropil izomeraza B (ciklofilin B) (CYPB), i proteinima povezanim sa hrskavicom (CRTAP) (Morello i dr., 2006; Cabral i dr, 2007;
Baldridge i dr, 2008; van Dijk i dr., 2009; Choi i dr., 2009; Barnes i dr., 2010; Pyott i dr., 2011). Pored mutacija, proteini kao što su koštani morfogenetski protein (BMP) i transformacioni faktor rasta β (TGFβ) i njihovi odgovarajući receptori smatraju se da učestvuju u različitim fenotipovima OI ali tačni mehanizmi njihovog delovanja su nepoznati (Gebken i dr., 2000).
[0048] U otelotvorenju, ispoljavanje TGFβ regulisano je sa molekulima koji vezuju tip-I i tip-II kolagen. U određenim otelotvorenjima, mali leucin bogat sa proteoglikanom (SLRP) reguliše TGFβ ispoljavanje. U specifičnom otelotvorenju, dekorin reguliše TGFβ sintezu. U određenom otelotvorenju, dekorin ne vezuje tip-I ili tip-II kolagen u kom je 3-hidroksiprolin mesto odsutno na poziciji 986 molekula tipa-I i/ili tipa-II kolagena.
C. Biologija kosti
[0049] Skeletni sistem kičmenjaka sačinjen je od kostiju, koje su živo, koštano tkivo koje pruža strukturu, nosivost, zaštitu i izvor minerala za regulisanje prenosa jona. Kost je specijalizovano vezivno tkivo koje je sačinjeno od oba, ćelijskih i komponenti koje nisu ćelijske. Nećelijski vanćelijski matriks (ECM) obuhvata oba, kolagene i ne-kolagene proteine, gde oba učestvuju u procesu okoštavanja. Ispravno lučeni i poravnati ECM je suštinski za ispravno formiranje kostiju. Rezultati patologije bilo kojih ECM proteine su odsutni, malformisani ili neporavnati, kao što je dokazano u osteogenezi imperfekta.
[0050] Termin „kortikalna kost“ ili „kompaktna kost“ odnosi se na spoljašnji sloj kosti, koji je gust, krut i žilav. Termin „trabekularna kost“ ili „spongiozna kost“ je sunđerasti unutrašnji sloj kosti, koji je lakši i ima manju gustinu od kortikalne kosti. Termin „koštana gredica“ odnosi se na mikroskopsku strukturnu jedinicu spongiozne kosti, koja je oblika nalik štapu i od kolagenog sastava.
[0051] Kost je dinamičko tkivo koje je izloženo neprekidnom prepravljanju. Termin „osteoblast“ odnosi se na terminalno-diferenciranu ćeliju koja formira kost koja vrši depoziciju osteoida. Termin „osteoid“ odnosi se na nezrelu, nemineralizovanu kosti koja je prevashodno sačinjena od tipa-I kolagena. Termin „pre-osteoblast“ odnosi se na nezreli osteoblast koji se razmnožava i koji nije potpuno diferenciran. Termin „osteoprogenitor“ odnosi se na pluripotentne ćelije koje uzrokuju nekoliko tipova ćelija strominog tkiva, uključujući osteoblaste. Osteoprogenitor ćelije, koje se obično nazivaju kao „mezenhimalne matične ćelije“ javljaju se u koštanoj srži i mogu biti izolovane u malom broju iz cirkulišuće krvi. Termin „osteoklast“ odnosi se na terminalno-diferenciranu ćeliju koja vrši resorpciju kosti koja je dobijena iz monocita koštane srži. Osteoklasti mogu biti identifikovani svojim ispoljavanjem tartrat-otporne kisele fosfataze (TRAP).
[0052] Pod normalnim uslovima homeostaze, osteoblasti i osteoklasti funkcionišu u saglasnosti kako bi se održala integritet kostiju. Patologija se ispoljava kada koštana depozicija i koštana resorpcija postanu neusklađene. Na primer, osteopetroza je bolesti kosti okarakterisana sa prekomerno gustim, teškim kostima što je rezultat neresorptivnih osteoklasta, dok je osteoporoza bolesti kosti okarakterisana sa krhkih, poroznih kostiju koja se može ispoljiti iz povećane aktivnosti osteoklasta. Dokazu ukazuju da aktivnost osteoklasta može biti povećana kod osteogeneze imperfekta, što predlaže da su ovi tipovi ćelija potencijalna meta za terapeutske intervencije. Predmetno obelodanjivanje obuhvata postupke za suzbijanje osteoklasta sa TGFβ antitelom.
[0053] Nekoliko postupaka može biti korišćeno za merenje i okarakterisanje strukture, gustine i kvaliteta kosti, uključujući histologiju i histomorfometriju, mikroskopiju atomskih sila, kofokalnu Raman mikroskopiju, nanoindentaciju, test savijanja sa tri tačke, dobijanje slika sa rendgenskim zracima i mikro kompjuterizovane tomografije (µ-CT). U primernom otelotvorenju, kosti su merene i okarakterisane bar sa jednim od ovih postupaka.
[0054] Termin „frakcija volumena kosti“ odnosi se na frakciju date zapremine kosti (ukupna zapremina ili TV) koja je sačinjena od kalcifikovane materije (zapremina kosti ili BV). Prema tome, frakcija volumena kosti računa se kao BV/TV i izražava se u procentima. Termin „specifična površina kosti“ odnosi se na ukupnu koštanu površinu (BS) po datoj zapremini kosti. Prema tome, specifična površina kosti računa se kao BS/TV. Druge uobičajene mere kosti obuhvataju: površinu kosti (B.Ar), broj koštanih gredica (Tb.N); razdvojenost koštanih gredica (Tb.Sp); N.Oc (broj osteoklasta); Oc.S (površina osteoklasta); Oc.S/BS broj osteoblasta (N.Ob), površina osteoblasta (Ob.S), obim osteoblasta (Ob.Pm) i derivate bilo koje navedene mere. Veći Oc.S/BS je ukazatelj povećane resorpcije kosti sa osteoklastima.
D. Transformacioni faktor rasta beta (TGFβ)
[0055] TGFβs su multifunkcionalni citokini koji su uključeni u proliferaciju ćelija i diferencijaciju, razvijanje embriona, formiranje vanćelijskog matriksa, razvijanja kosti, zaceljivanje rana, hematopoezu i imunske i inflamatorne odgovore (Roberts i dr., 1981;
Border i dr., 1995a). Izlučeni TGFβ proteini podeljeni su na latentno asocirani peptid (LAP) i zreli TGFβ peptid, i nalaze se u latentnim i aktivnim oblicima. Zreli TGFβ peptid formira oba, homodimere i heterodimere sa drugim članovima TGFβ porodice. TGFβ može biti prečišćen iz bilo kog prirodnog izvora ili može biti sintetički proizveden (npr., upotrebom tehnologije rekombinantne DNK). Poželjno, TGFβ molekul je od čoveka, ovde poznat kao „hTGF“.
[0056] Postoje tri ljudske TGFβ izoforme: TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 (Swiss Prot pristupni brojevi P01137, P08112 i P10600, respektivno) što su, u njihovom biološki aktivnom stanju, 25 kDa homodimeri koji sadrže dva monomera 112 amino kiseline spojena sa disulfidnim mostom unutar lanca. TGFβ1 razlikuje se od TGFβ2 za 27, i od TGFβ za 22, pretežno konzervativne izmene amino kiseline. Ove razlike mapirane su na 3D strukturi TGFβ određenoj sa rendgenskom kristalografijom (Schlunegger i dr., 1992; Peer i dr., 1996) i oblasti vezivanja receptora su definisane (Griffith i dr., 1996; Qian i dr., 1996).
2
[0057] Postoje tri TGFβ receptora kod ljudi, TGFβ receptor 1, 2 i 3 koji mogu biti razlikovani na osnovu svojih strukturnih i funkcionalnih svojstava, uključujući afinitet za članove porodice TGFβ proteina. Vezivanje TGFβ proteina za homodimerni ili heterodimerni kompleks TGFβ receptora transmembrane aktivira kanonični TGFβ signalni put posredovan sa unutarćelijskim SMAD proteinima.
[0058] Deregulacija TGFβ dovodi do patoloških procesa koji su, kod ljudi, uključeni u brojna stanja, kao što su kongenitalne anomalije, rak, hronične inflamatorne autoimune bolesti i fibrozne bolesti (Border i dr., 1994; Border i dr., 1995b).
[0059] Ljudski TGFβ veoma su slični sa mišijim TGFβ: ljudski TGFβ1 ima samo jedno aminokiselinsku razliku od mišijeg TGFβ1; ljudski TGFβ2 ima samo tri aminokiselinske razlike od mišijeg TGFβ2; i ljudski TGFβ3 je identičan sa TGFβ3.
E. Molekuli koji se vezuju za transformacioni faktor rasta beta (TGFβ)
[0060] U pronalasku, antitelo koje se vezuje za TGFβ sadrži varijabilni region od teškog lanca koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4, 5 i 6 i varijabilni region od lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7, 8, i 9.
[0061] U specifičnom otelotvorenju, antitelo koje se vezuje za TGFβ sadrži varijabilni region od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10:
[0062] U drugom specifičnom otelotvorenju, antitelo koje se vezuje za TGFβ sadrži varijabilni region od lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11:
[0063] U još više specifičnom otelotvorenju, antitelo koje se vezuje za TGFβ sadrži varijabilni region od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10, i varijabilni region od lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11.
2
[0064] U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za TGFβ dalje sadrži konstantni region, npr., ljudski IgG konstantni region. U nekim otelotvorenjima, konstantni region je ljudski IgG4 konstantni region. U dodatnim otelotvorenjima, konstantni region je modifikovani ljudski IgG4 konstantni region. Poželjno, ljudski IgG4 konstantni region sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12:
[0065] U drugim otelotvorenjima, konstantni region je ljudski CK konstantni region.
Poželjno, CK konstantni region sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13:
[0066] U specifičnim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za TGFβ sadrži varijabilni region od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14:
2
[0067] U drugim specifičnim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za TGFβ sadrži varijabilni region od lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15:
[0068] U daljim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za TGFβ sadrži varijabilni region od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15.
[0069] U nekim otelotvorenjima, antitelo koje se vezuje za TGFβ ispoljeno je od strane ćelija domaćina kako sadrži vodeće sekvence. Vodeće sekvence poželjno sadrže aminokiselinsku sekvencu od 1-30 amino kiselina u dužini, poželjnije 25-25 amino kiselina i najpoželjnije 19 amino kiselina. Teški lanac, laki lanac ili oba, teški i laki lanac mogu sadržati vodeću sekvencu.
[0070] Na primer, vodeća sekvenca lakog ili teškog lanca može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16: MGWSCIILFL VATATGVHS (SEQ ID NO: 16). U skladu sa time, ćelija domaćina koja ispoljava neobrađeni teški lanac može sadržati aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 17:
2
gde
[0071] U drugim primernim otelotvorenjima, ćelija domaćina koja ispoljava neobrađeni teški lanac može sadržati aminokiselinsku SEQ ID NO: 18:
gde
[0072] U primernom otelotvorenju prema pronalasku, antitelo koje se vezuje za TGFβ je humanizovano ili potpuno ljudsko antitelo. Primeri izotipova humanizovanog ili potpuno ljudskog antitela uključuju IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Poželjno, anti-TGFβ antitelo je IgG antitelo. Postoje četiri oblika IgG. Poželjno, anti-TGFβ antitelo je IgG4 antitelo. U jednom otelotvorenju prema pronalasku, anti-TGFβ antitelo je humanizovano IgG4 antitelo. U drugom otelotvorenju prema pronalasku, anti-TGFβ antitelo je humanizovano IgG4 antitelo.
[0073] U najpoželjnijem otelotvorenju prema pronalasku, anti-TGFβ antitelo je IgG4 anti-TGFβ antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15. U alternativnom najpoželjnijem otelotvorenju prema pronalasku, anti-TGFβ antitelo je IgG4 anti-TGFβ
2
antitelo koje sadrži varijabilni region od teškog lanca i varijabilni region od lakog lanca, varijabilni region od teškog lanca sadrži 3 regiona koji determinišu komplementarnost (CDR) koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4, 5 i 6 i varijabilni region od lakog lanca koji sadrži 3 CDR koji sadrži aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7, 8, i 9.
Identifikovanje, izolovanje, pripremanje i karakterizacija anti-TGFβ antitela, uključujući anti-TGFβ antitela koja sadrže aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 14, i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja sadrži SEQ ID NO: 15 i CDR sekvence koje odgovaraju SEQ ID NO: 4-9 je opisano detaljno u patentu SAD br.7,723,486, i patentu SAD br. 8,383,780. U skladu sa pronalasku, antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen je „pan-specifično“ i vezuje se za TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 i ponaša se kao antagonist. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen vezuje se za ljudski TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3 i neutrališe ljudski TGFβ1, TGFβ2 i TGFβ3. Primerna pan-specifična anti-TGFβ monoklonska antitela (mAbs) pogodna za upotrebu u postupcima prema pronalasku opisana su u patentima SAD br.7,723,476 i 8,383,780.
[0074] 1D11.16 je primerno mišije pan-specifično anti-TGFβ antitelo koje neutrališe ljudski i mišiji TGFβ1, TGFβ2, i TGFβ3 u širokom opsegu in vitro proba (Dasch i dr., 1989; Dasch i dr., 1996; R&D System product sheet for MAB1835) i efikasno je u ispitivanjima dokazivanja principa kod životinjskih modela za fibrozu (Ling i dr., 2003; Miyajima i dr., 2000; Schneider i dr., 1999; Khanna i dr., 1999; Shenkar i dr., 1994). Međutim, kako je 1D11.16 mišije monoklonsko antitelo (Dasch i dr., 1989; Dasch i dr., 1996) nije poželjno za terapeutske upotrebe kod ljudi. U skladu sa time, u određenim otelotvorenjima, varijante derivata 1D11.16 antitela su iskorišćene u postupcima prema pronalasku.
[0075] Kao što je ukazano iznad, određena otelotvorenja prema pronalasku takođe obuhvataju varijante ili derivate anti-TGFβ antitela. Naročito, pronalazak može obuhvatati varijante anti-TGFβ antitelo koje je IgG4 anti-TGFβ antitelo koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15. U drugom otelotvorenju, pronalazak pruža varijante ili derivate 1D11.16 antitela. Varijante anti-TGFβ antitela mogu imati slična fizikohemijska svojstva zasnovana na svojoj visokoj sličnosti i stoga su obuhvaćena u okviru pronalaska. Varijante su definisano kao antitela sa aminokiselinskom sekvencom koja je bar 80%, bar 90%, bar 95% ili bar 97%, npr., bar 98% ili 99% homologna sa anti-TGFβ antitelom koje je ovde opisano, i u stanju je za završi vezivanje za TGFβ polipeptid, fragment TGFβ polipeptida ili TGFβ
2
epitop. Poželjno, varijante će poboljšati, neutralisati ili na drugačiji način suzbiti vezivanje TGFβ sa svojim receptorima i TGFβ biološku aktivnost (npr., unutarćelijsko SMAD signaliziranje posredovano sa TGFβ receptorom i prateća ćelijska aktivnost). Određivanje konkurencije za vezivanje za cilj može se izvršiti rutinskim postupcima poznatim stručnoj osobi u struci. Poželjno varijante su ljudska antitela i poželjno su IgG4 molekuli. U poželjnim otelotvorenjima, varijanta je bar 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična u aminokiselinskoj sekvenci sa IgG4 anti-TGFβ antitelom koje sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15. Termin „varijanta“ odnosi se na antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je izmenjen sa jednom ili više amino kiselina u poređenju sa aminokiselinskim sekvencama anti-TGFβ antitela. Varijante mogu imati izmene konzervativne sekvence, uključujući aminokiselinske zamene, izmene, dodavanja i brisanja.
[0076] Primeri izmena obuhvataju, ali nisu ograničeni na, glikozilaciju, acetilaciju, pegilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivaciju sa poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičko deljenje i vezivanje za ćelijski ligand ili drugi protein. Aminokiselinske izmene mogu biti uvedene sa standardnim tehnikama poznatim u struci, kao što su mutageneza usmerena na mestu, molekulsko kloniranje, mutageneza usmerena na oligonukleotidu i nasumična PCR-posredovana mutageneza i nukleinska kiselina koja kodira antitela.
Konzervativne aminokiselinske zamene obuhvataju one kod kojih je aminokiselinski ostatak zamenjen sa aminokiselinskim ostatkom koji ima slična strukturna ili hemijska svojstva. Porodice aminokiselinskih ostataka koje imaju slične bočne lance definisane su u struci. Ove familije obuhvataju amino kiseline sa osnovnim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr., asparginova kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr., asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr., glicin, alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-granatim bočnim lancima (npr., tireonin, valin, izoleucin), i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan). Biće jasno stručnjaku da se klasifikacija porodica aminokiselinskih ostataka koja se razlikuje od one korišćene iznad može takođe upotrebiti. U nastavku, varijanta može imati ne-konzervativne aminokiselinske zamene, npr., zamene amino kiseline sa aminokiselinskim ostatkom koji ima drugačije strukurna ili hemijska svojstva. Slične manje varijacije mogu takođe obuhvatati aminokiselinska brisanja ili uvođenja, ili oba. Smernice pri određivanju koji aminokiselinski ostaci mogu biti zamenjeni, izmenjeni, uvedeni ili izbrisani bez ukidanja imunološke aktivnosti mogu biti pronađena upotrebom računarskih programa dobro poznatih u struci. Računarski algoritmi, kao što su inter alia, Gap ili Bestfit, koji su poznati osobi koja je stručna u oblasti, mogu biti korišćeni za optimalno poravnanje aminokiselinskih sekvenci koje se porede i definišu kao slične ili identične sa aminokiselinskim ostacima. Varijante mogu imati sličan ili različit, ili veći ili manje, afinitet vezivanja u poređenju sa anti-TGFβ antitelom, ali su i dalje u stanju da se specifično vežu za TGFβ , i mogu imati istu, manju ili veću, biološku aktivnost kao anti-TGFβ antitelo.
[0077] Otelotvorenja prema pronalasku takođe obuhvataju fragmente koji se vezuju za antigen anti-TGFβ antitela. Termin „domen koji se vezuje za antigen“, „region koji se vezuje za antigen“, „fragment koji se vezuje za antigen“ i slični termini odnose se na onaj deo antitela koji sadrži aminokiselinske ostatke koji međusobno deluju sa antigenom i dodeljuju na sredstvu za vezivanje specifičnost i afinitet za antigen(npr., region koji determiniše komplementarnost (CDR)). Region koji se vezuje za antigen, može biti izveden iz bilo koje životinjske vrste, kao što su glodari (npr., zec, pacov ili hrčak) i ljudi. Poželjno, region koji se vezuje za antigen biće ljudskog porekla. Neograničavajući primeri, fragmenta koji se vezuje za antigen obuhvataju: Fab fragmente, F(ab')2 fragmente, Fd gragmente, Fv fragmente, jednolančane Fv (scFv) molekule, dAb fragmente i minimalne jedinice za prepoznavanje koje se sastoje od aminokiselinskih ostataka koji oponašanju hipervarijabilni region antitela.
F. Terapeutsko davanje
[0078] Ovde opisani postupci obuhvataju davanje terapeutski delotvorne količine antitela koje se vezuje za TGFβ kod ispitanika. Kao što se ovde koristi, fraza „terapeutski delotvorna količina“ označava dozu antitela koje se vezuje za TGFβ što se ispoljava u poboljšanju jednog ili više simptoma koje se može uočiti povezanih sa OI ili koje izaziva biološko dejstvo (npr., smanjenje nivoa određenog biomarkera) koje je povezano sa osnovnim patološkim mehanizmima koji uzrokuju stanje ili simptome osteogeneze imperfekta. Na primer, doza antitela koje se vezuje za TGFβ koje izaziva porast u mineralnoj gustini kosti povećava masu kosti i/ili otpornost kosti, smanjuje lomove kosti i/ili zuba i/ili poboljšava bilo koja dijagnostička merenja OI smatra se terapeutski delotvornom količinom.
[0079] U otelotvorenju, mineralna gustina kosti, masa kosti i/ili otpornost kosti povećani su za oko 5% do oko 200% nakon tretiranja sa antitelom koje se vezuje za TGFβ. U određenim otelotvorenjima, mineralna gustina kosti, masa kosti i/ili otpornost kosti povećavaju se za oko
1
5% do oko 10%, 10% do oko 15%, 15% do oko 20%, 20% do oko 25%, 25% do oko 30%, 30% do oko 35%, 35% do oko 40%, 40% do oko 45%, 45% do oko 50%, 50% do oko 55%, 55% do oko 60%, 60% do oko 65%, 65% do oko 70%, 70% do oko 75%, 75% do oko 80%, 80% do oko 85%, 85% do oko 90%, 90% do oko 95%, 95% do oko 100%, 100% do oko 105%, 105% do oko 110%, 110% do oko 115%, 115% do oko 120%, 120% do oko 125%, 125% do oko 130%, 130% do oko 135%, 135% do oko 140%, 140% do oko 145%, 145% do oko 150%, 150% do oko 155%, 155% do oko 160%, 160% do oko 165%, 165% do oko 170%, 170% do oko 175%, 175% do oko 180%, 180% do oko 185%, 185% do oko 190%, 190% do oko 195%, ili 195% do oko 200% , nakon tretiranja sa antitelom koje se vezuje za TGFβ.
[0080] U određenim otelotvorenjima, doza antitela koja smanjuje biomarker u serumu resorpcije kosti kao što su urinarni hidroksiprolin, urinarni ukupni piridinolin (PYD), urinarni slobodni dezoksipiridinolin (DPD), urinarni kolagen tipa-I unakrsno povezani N-telopepid (NTX), urinarni ili serumski tipa-I unakrsno povezani C-telopeptid (CTX), sialoprotein kosti (BSP), osteopontin (OPN) i tartrat-otporna kisela fosfataza 5b (TRAP), smatra se terapeutski delotvornom količinom. U otelotvorenju, biomarkeri u serumu resorpcije kosti smanjeni su za oko 5% do oko 200% nakon tretiranja sa antitelom koje se vezuje za TGFβ
[0081] U otelotvorenju, biomarkeri u serumu resorpcije kosti, kao što su urinarni hidroksiprolin, urinarni ukupni piridinolin (PYD), urinarni slobodni dezoksipiridinolin (DPD), urinarni kolagen tipa-I unakrsno povezani N-telopepid (NTX), urinarni ili serumski tipa-I unakrsno povezani C-telopeptid (CTX), sialoprotein kosti (BSP), osteopontin (OPN) i tartrat-otporna kisela fosfataza 5b (TRAP), smanjeni su za oko 5% do oko 10%, 10% do oko 15%, 15% do oko 20%, 20% do oko 25%, 25% do oko 30%, 30% do oko 35%, 35% do oko 40%, 40% do oko 45%, 45% do oko 50%, 50% do oko 55%, 55% do oko 60%, 60% do oko 65%, 65% do oko 70%, 70% do oko 75%, 75% do oko 80%, 80% do oko 85%, 85% do oko 90%, 90% do oko 95%, 95% do oko 100%, 100% do oko 105%, 105% do oko 110%, 110% do oko 115%, 115% do oko 120%, 120% do oko 125%, 125% do oko 130%, 130% do oko 135%, 135% do oko 140%, 140% do oko 145%, 145% do oko 150%, 150% do oko 155%, 155% do oko 160%, 160% do oko 165%, 165% do oko 170%, 170% do oko 175%, 175% do oko 180%, 180% do oko 185%, 185% do oko 190%, 190% do oko 195%, ili 195% do oko 200% , nakon tretiranja sa antitelom koje se vezuje za TGFβ.
2
[0082] U određenim otelotvorenjima, doza antitela koja povećava biomarkere u serumu koštane depozicije, kao što su ukupna alkalna fosfataza, alkalna fosfataza specifična za kosti, osteokalcin i tip-I prokolagen (C-terminalni/N-terminalni), smatra se terapeutski delotvornom količinom. U otelotvorenju, biomarkeri u serumu koštane depozicije smanjeni su za oko 5% do oko 200% nakon tretiranja sa antitelom koje se vezuje za TGFβ
[0083] U određenim otelotvorenjima, biomarkeri seruma koštane depozicije, kao što su ukupna alkalna fosfataza, alkalna fosfataza specifična za kosti, osteokalcin i tip-I prokolagen (C-terminalni/N-terminalni), povećani su za oko 5% do oko 10%, 10% do oko 15%, 15% do oko 20%, 20% do oko 25%, 25% do oko 30%, 30% do oko 35%, 35% do oko 40%, 40% do oko 45%, 45% do oko 50%, 50% do oko 55%, 55% do oko 60%, 60% do oko 65%, 65% do oko 70%, 70% do oko 75%, 75% do oko 80%, 80% do oko 85%, 85% do oko 90%, 90% do oko 95%, 95% do oko 100%, 100% do oko 105%, 105% do oko 110%, 110% do oko 115%, 115% do oko 120%, 120% do oko 125%, 125% do oko 130%, 130% do oko 135%, 135% do oko 140%, 140% do oko 145%, 145% do oko 150%, 150% do oko 155%, 155% do oko 160%, 160% do oko 165%, 165% do oko 170%, 170% do oko 175%, 175% do oko 180%, 180% do oko 185%, 185% do oko 190%, 190% do oko 195%, ili 195% do oko 200%, nakon tretiranja sa antitelom koje se vezuje za TGFβ.
[0084] Druga otelotvorenja obuhvataju davanje terapeutski delotvorne doze antitela koja poboljšava funkciju ne-skeletnih organa pogođenih sa OI. Na primer, doza antitela koje se vezuje za TGFβ koja poboljšava sluh, pluća i/ili funkciju bubrega smatra se terapeutski delotvornom količinom.
[0085] U skladu sa postupcima prema predmetnom pronalasku, terapeutski delotvorna količina antitela koje se vezuje za TGFβ koja se daje ispitaniku zavisiće u zavisnosti od starosti i veličine (npr., telesna težina ili površina tela) ispitanika, kao i načina davanja i drugih faktora dobro poznatih onima koji su stručni u ovoj oblasti.
[0086] U određenim primernim otelotvorenjima, anti-TGFβ antitelo daje se ispitaniku kao potkožna doza. Drugi primerni režimi davanja obuhvataju ali nisu ograničeni na davanje u kožu, u mišić, u peritoneum, u venu, nazalno, epiduralno i oralno davanje. Sastav može biti dat na bilo koji pogodan način, na primer sa infuzijom ili bolusnom injekcijom, adsorpcijom preko epitela i sluzokože (npr., oralna sluzokoža, rektalna i crevna sluzokoža itd.) i može biti dat zajedno sa drugim biološki aktivnim sredstvima. Davanje može biti sistemsko ili lokalno. TGFβ antitelo može biti dato parenteralno ili potkožno.
[0087] Različiti sistemi za isporuku su poznati i mogu se koristiti za davanje farmaceutskog sastava, npr., obuhvatanjem u kapsuli sa lipozomima, mikročestice, mikrokapsule, endocitoza posredovana sa receptorom (videti, npr., Wu i dr. (1987) J. Biol. Chem.262:4429-4432). Terapeutski sastava će biti dati sa pogodnim nosačima, ekscipijensima i drugim sredstvima koja su uključena u formulacije kako bi se pružilo poboljšano prenošenje, isporuka, tolerancija i slično. Mnogo odgovarajućih formulacija može se pronaći u formularu poznatom svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Ove formulacije obuhvataju, na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, lipide, sredstvom za prenošenje koja sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je LIPOFECTIN™), DNK konjugate, bezvodne apsorpcione paste, emulzije ulje u vodu i voda u ulju, emulzione karbovoskove (polietilen glikoli različitih molekulskih masa), polučvrste gelove i polu-čvrste mešavine koje sadrže karbovoskove. Videti takođe Powell i dr. „Compendium of excipients for parenteral formulations“ PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
[0088] Farmaceutski sastavi mogu biti pripremljeni u oblicima za doziranje u jediničnoj dozi prilagođeno da se poklopi sa dozom aktivnih sastojaka. Takvi oblici za doziranje u jediničnoj dozi obuhvataju, na primer, tablete, pilule, kapsule, injekcije (ampule), supozitorije, itd.
[0089] Farmaceutski sastavi takođe mogu biti dati ispitaniku upotrebom bilo kog prihvatljivog uređaja ili mehanizma. Na primer, davanje se može ostvariti upotrebom šprica i igle ili sa olovkom koja se može opet iskoristiti i/ili uređajem za automatsku isporuku injektiranjem. Postupci prema predmetnom pronalasku obuhvataju upotrebu olovke koja se može opet iskoristiti i/ili uređaje za automatsku isporuku injektiranjem kako bi se dalo TGFβ sredstvo za vezivanje (ili farmaceutska formulacija koja sadrži sredstvo za vezivanje).
Primeri takvih uređaja obuhvataju, ali nisu ograničeni na AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, UK), DISETRONIC™ olovku (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Švajcarska), HUMALOG MIX 75/25™ olovku, HUMALOG™ olovku, HUMALIN 70/30™ olovku (Eli Lilly i Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II i III (Novo Nordisk, Copenhagen, Danska), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Danska), BD™ olovku (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN
4
STARLET™, i OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Nemačka), kako bi se samo navelo nekoliko. Primeri olovke koja se može ukloniti i/ili uređaja za automatsku isporuku injektiranjem koji imaju primene u potkožnoj isporuci farmaceutskog sastava obuhvataju ali nisu ograničeni na SOLOSTAR™ olovku (sanofi-aventis), FLEXPEN™ (Novo Nordisk), i KWIKPEN™ (Eli Lilly), SURECLICKTM automatski injektor (Amgen, Thousand Oaks, CA), PENLETTM (Haselmeier, Stuttgart, Nemačka), EPIPEN (Dey, L.P.), i HUMIRATM olovku (Abbott Labs, Abbott Park, IL), kako bi se samo navelo nekoliko.
[0090] Upotreba mikroinfuzora za isporuku TGFβ sredstva za vezivanje (ili farmaceutske formulacije koja sadrži sredstvo za vezivanje) ispitaniku takođe je ovde razmatrana. Kao što se ovde koristi, termin „mikroinfuzor“ označava uređaj za potkožnu isporuku dizajniran da polako daje velike zapremine (npr., do oko 2.5 mL ili više) terapeutske formulacije za vreme produženog vremenskog perioda (npr., oko 10, 15, 20, 25, 30 ili više). Videti, npr., U.S. 6,629,949; US 6,659,982; i Meehan i dr., J. Controlled Release 46:107-116 (1996).
Mikroinfuzori su naročito od koristi za isporuku velikih doza terapeutskih proteina koji su sadržani u velikoj koncentraciji (npr., oko 100, 125, 150, 175, 200 ili više mg/mL) ili više viskoznih rastvora.
G. Kombinovane terapije
[0091] U određenim aspektima, pronalazak pruža postupke za tretiranje OI koji obuhvataju davanje ispitaniku koji ima potrebu za takvim tretiranjem antitelo koje se vezuje za TGFβ u kombinaciji sa bar jednim dodatnim terapeutskim sredstvom. Primeri dodatnih terapeutskih sredstava mogu biti dati u kombinaciji sa anti-TGFβ antitelom upotrebom postupaka prema predmetnom pronalasku obuhvataju ali nisu ograničeni na bifosfonate, kalcitonin, teriparatid i bilo koje drugo jedinjenje koje je poznato da tretira, sprečava ili poboljšava osteogenezu imperfekta kod ispitanika. U predmetnim postupcima, dodatno terapeutsko sredstvo može biti dato u konkurenciji ili nakon antitela koje se vezuje za TGFβ. Na primer, za konkurentno davanje, farmaceutskih formulacija može biti napravljena da sadrži oba, antitelo koje se vezuje za TGFβ i bar jedno dodatno terapeutsko sredstvo. U otelotvorenju, antitelo koje se vezuje za TGFβ daje se u kombinaciji sa farmaceutskih bifosfonatima (npr., Etidronat, Klodronat, Tiludronat, Pamidronat, Neridronat, Olpadronat, Alendronat, Ibandronat, Zoledronat, i Risedronat,). U drugom otelotvorenju, antitelo koje se vezuje za TGFβ daje se u kombinaciji sa lekom koji stimuliše formiranje kosti, kao što su analozi hormona paraštitne žlezde i kalcitonin. U još jednom otelotvorenju, antitelo koje se vezuje za TGFβ daje se u kombinaciji sa selektivnim modulatorom estrogenih receptora (SERM). Količina dodatnog terapeutskog sredstva koje se daje u kombinaciji sa antitelom koje se vezuje za TGFβ upotrebom postupaka prema predmetnom pronalasku može se lako odrediti upotrebom rutinskih postupaka koji su poznati i lako dostupni u struci.
PRIMERI
[0092] OI je generalizovana bolest vezivnog tkiva u kojoj pogođeni pojedinci pokazuju abnormalnost pri formiranju fibrila tipa-I kolagena usled mutacija u primarnoj sekvenci alfa 1 ili alfa 2 lanca tipa-I kolagena, kao i abnormalnost pri post-translatornoj modifikaciji tipa-I kolagena i proteina koji se vezuju za fibrile tipa-I kolagena. CRTAP kodira protein koji se naziva protein asociran sa hrskavičavim tkivom, član kompleksa prolil-3-hidroksilacije čija je uloga da pomaže ispravnom množenju, post-translatornoj modifikaciji i lučenju tipa-I kolagena. Mutacije CRTAP odgovorne su za tip VII osteogeneze imperfekta. Miševi koji nemaju Crtap gen (Crtap<-/->) pokazuju fenotip koji oponaša osteogenezu imperfekta i korišćeni su kao model za ovu bolest (Morello i dr., 2006). Crtap<-/->miševi i iste starosti divljeg tipa (WT) kontrole iz istog legla korišćeni su u sledećim primerima.
Materijali i postupci
Životinje, anti-TGFβ tretiranje i sakupljanje tkiva
[0093] Crtap<-/->miševi stvoreni su i održavani su u pomešanoj C57Black/6J /129Sv genetskoj pozadini. Miševi koji nose G610C mutaciju u Col1a2 genu (Col1α2<tm1.1Mcbr>) dobijeni su i odgajeni do divljeg tipa C57B1/6J miševa. Miševi koji su bili heterozigotni za Col1α2<tm1.1Mcbr>alel korišćeni su za eksperimente. TGFβ-reporter miševi koji ispoljavaju luciferazu kao odgovor na Smad2/3 zavisni TGFβ signalni put (SBE-Luc miševi) dobijeni su i odgajeni do Crtap<+/->miševa 2 generacije kako bi se stvorili Crtap<-/->miševi i divlji tipovi iz istog legla koji ispoljavaju reporter transgen. Svi miševi su smešteni u vivarijum i eksperimenti nad životinjama su izvršeni nakon odobrenog protokola od Odbora za brigu i upotrebu životinja (IACUC).
[0094] Za analizu proteina i RNK, lobanja P3 miševa je izolovana, očišćena od ekstraskeletnog tkiva, i brzo smrznuta u tečnom azotu. Za imunološko obeležavanje pluća Crtap<-/->P10 miševa, pluća svakog miša jednako su naduvana odmah nakon žrtvovanja gravitacijom sa 4% paraformaldehida pri konstantnom pritisku od 25cm H2O i zatim zatvorenim šavom kod dušnika. Pluća su zatim polako secirana od grudnog koša i držana u 4% paraformaldehidu preko noći.
[0095] Osam nedelja stare ženke Crtap<-/->i Col1α2<tm1.1Mcbr>miševa tretirane su sa pan-TGFβ neutrališućim antitelom 1D11 u trajanju od 8 nedelja (10 mg/kg telesna težina, I.P. injekcije 3 puta svake nedelje). Kontrolni Crtap<-/->, Col1α2<tm1.1Mcbr>, i WT miševi primili su kontrolno antitelo (13C4) istog IgG1 izotipa. Nakon tretiranja, miševi su žrtvovani i lumbalne kičme i bedrene kosti su sakupljene i držane u 10% formalinu za microCT i histomorfometriju kosti. Kontralateralne bedrene kosti Crtap<-/->miševa skladištene su pri -20°C obmotane u gazi natopljenoj sa slanim rastvorom dok nije biomehaničko testiranje izvršeno. Pluća ovih Crtap<-/->miševa jednako su naduvena, sakupljena i držana kao što je opisano za P10 miševe.
Nikakvo vezivanje nije bilo moguće za vreme trajanja tretiranja, zato što su 1D11 ili kontrolno antitelo injektirani u skladu sa izdvajanjem grupe. U svim kasnijim analizama istraživači nisu imali znanje o genotipu i grupama za tretiranje.
Imunološko blotovanje
[0096] Protein je izvađen iz brzo smrznutih P3 uzoraka lobanje, prenet je u 300 µl pufera za lizu (0.0625 M Tris-HCl pH 7.5, 2% SDS, 5 mM NaF, 2 mM Na3VO4i RocheComplete inhibitor proteinaze) i homogenizovan u trajanju od 1 minuta, što je praćeno inkubiranjem pri 95°C u trajanju od 40 minuta. Supernatant je prenet u Centrifugal Filter Units/Amicon Ultra 3K (Millipore) i izložen je centrifugiranju do koncentrovanja proteina. Ukupna koncentracija proteina lizata izmerena je upotrebom Micro BCA reagensa (Pierce) praćenjem smernica proizvođača. 40 µg ekstrakta proteina lobanje suspendovano je u laemilijevom puferu koji je sadržao 5% β-merkaptoetanol i razdvojeno je na Mini Protean TGX SDS-PAGE gelovima (gradijent 4-20%; Bio-Rad) i preneto na PVDF membrane za wester blot analize. PVDF membrane inkubirane su sa pSmad2 monoklonskim antitelom (ćelijsko signaliziranje #3108, 1:750 u TBST koji je sadržao 5% BSA preko noći), što je praćeno sa sekundarnim HRP-povezanim anti-zec antitelom (GE, 1:5000 u TBST koji je sadržao 5% BSA u trajanju od 2 sata), tretiranim sa ECL Plus detekcionim sistemom Western blotiranja (GE) i izložen rendgenskom filmu. Posle toga, antitelima su uklonjene membrane upotrebom ReBlot Plus reagensa (Millipore) i inkubirana su sa Smad2 monoklonskim antitelom (ćelijsko signaliziranje #5339, 1:2000 u TBST koji je sadržao 5% BSA preko noći),što je praćeno sa sličnom sekundarnom inkubacijom antitela i ECL posredovanom vizualizacijom. Rendgenski filmovi skenirani su i gustina svake trake je kvantifikovana upotrebom ImageJ softvera (National Institutes of Health).
Kvantitativna PCR u realnom vremenu
[0097] Ukupna RNK izvađena je iz brzo smrznute P3 mišije lobanje upotrebom Trizol reagensa (Invtrogen). Superskript III RT sistem (Invitrogen) korišćen je za sintetisanje cDNK iz ukupne RNK u skladu sa protokolom proizvođača. Kvantitativni RT-PCR izvršen je na Light Cycler.v 1.5 (Roche) upotrebom primera specifičnih za gen i SYBR Green I reagensa (Roche). β2-Mikroglobulin je korišćen kao referentni gen za normalizaciju cDNK koncentracija.
In vivo bioluminiscentno dobijanje slika
[0098] P10 Crtap<-/->miševi i divljeg tipa miševi iz istog legla koji su ispoljili TGFβ-reporter transgen (SBE-Luc miševi) ubrizgani su sa D-luciferinom (Goldbio, 150 mg/kg, IP), anestezirani su sa izofluranom, i dobijene su slike 10 minuta nakon svake injekcije upotrebom bioluminiscentnog sistema za dobijanje slika (Xenogen).
Primarna osteoblast kultura, TGFβ-reporter ćelija
[0099] Ćelije koštane srži izolovane su iz golenjače i bedrene kosti približno 2 meseca starih Crtap<-/->i divljeg tipa miševa i kultivisane su u α-MEM dopunjenom sa 10% FBS, 100 U/mL penicilinom i 100 ug/mL streptomicinom. Podloga je izmenjena svakog drugog dana i nepovezane ćelije su uklonjene. Nakon 7 dana, povezane ćelije, definisane kao ćelije strominog tkiva koštane srži (BMSC) su ponovo posejane u ploče sa 24 udubljenja pri 2.5 x 10<4>ćelija po cm<2>i kultivisane u osteogenskoj podlozi (α-MEM, 10% FBS, 500 µM askorbinska kiselina, i 10 mM β-glicerofosfat) u trajanju od 3 dana. Održavana podloga sakupljena je i inkubirana sa PAI-luciferaza reporter epitelnih ćelija pluća vizona. Nakon 24 sata, ćelijski lizati sakupljeni su za probu aktivnosti luciferaze, koji su mereni upotrebom Dual-Luciferase Reporter sistema (Promega). Rezultati su normalizovani do ukupne količine proteina kvantifikovane upotrebom Micro BCA reagensa (Pierce).
MicroCT, histomorfometrija kosti
[0100] Lumbalni pršljenovi i bedrene kosti skenirane su upotrebom Scanco µCT-40 microCT za kvantifikaciju parametara koštanih gredica i kortikalne kosti. Parametri pršljenova i bedrenih koštanih gredica analizirani su upotrebom Scanco softvera za analizu ručnim konturisanjem koštanih gredica tela pršljena L4 kao i distalnog metafiznog dela bedrene kosti. Parametri kortikalne kosti u sredini bedrene kosti kvantifikovani su upotrebom automatizovanog algoritma sa pragom koji je obuhvaćen u softveru.
[0101] Skenirani nedekalcifikovani uzorci kičme Crtap<-/->miševa su zatim obuhvaćeni u plastici za seciranje. Toluidin plavo obeležavanje i TRAP obeležavanje izvršeno je upotrebom standardnih protokola za vizualizaciju i kvantifikaciju Ob's i Oc's, respektivno, upotrebom Bioquant Osteo sistema za analizu slika.
Imunološko obeležavanje i histologija
[0102] Za imunohistohemiju, zadnji udovi P5 miševa su sakupljeni, držani preko noći u 4% paraformaldehidu i postavljeni u parafin. Nakon deparafinizacije i ponovne hidracije, toplotom uzrokovano vraćanje antigena je izvršeno (Dako, S1700) što je praćeno tretiranjem sa hialuronidazom u trajanju od 30 min (2mg/ml; Sigma). Endogena peroksidaza blokirana je upotrebom 3% vodonik peroksida u trajanju od 10 minuta. Nakon inkubiranja sa rastvorom za blokiranje (3% normalni kozji serum, 0.1% BSA, 0.1% Triton X-100 u PBS), delovi su inkubirani u antitelima za TGFβ1 (G1221, Promega) i dekorin (LF-113, ljubazno dat od Larry Fisher-a, National Institute of Dental and Craniofacial Research, Bethesda, MD, USA) u trajanju od 60 min (1:25 razblaženje svaki u PBS, kontrolni uzorci su inkubirani samo u PBS) pri 37C i posle toga inkubirani sa sekundarnim antitelom (SuperPicTure Ploymer Detection kit, Invitrogen). DAB podoga je dodata u skladu sa preporukama proizvođača i uzorci su dehidrirani i postavljeni upotrebom Cytoseal XYL ksilen bazirane podloge za postavljanje (Thermo Scientific). Delovi WT i mutiranih miševa iz istog legla procesirani su u isto vreme. Slike koštanih gredica napravljene su sa svetlosnim mikroskopom(Axioplan 2, Zeiss) upotrebom identičnih vremena ekspozicije za WT i mutirane miševe iz istog legla.
[0103] Pluća P10 i 16 nedelja stari Crtap<-/->miševi su jednako naduveni za vreme sakupljanja tkiva, postavljeni u 4% paraformaldehidu i postavljeni u parafin. Pluća miševa P10 Crtap<-/->i divljeg tipa korišćeni su za imunološko obeležavanje za pSmad2. Ukratko, parafinski delovi tretirani su sa ksilenom, ponovo su hidratisani i zagrevani u trajanju od 20 minuta za vraćanje antigena (pH 6; Dako). Delovi su zatim inkubirani u rastvor za blokiranje (3% normalni serum magarca, 0.1% BSA, 0.1% Triton X-100 u PBS), i zatim su inkubirani sa zečijim antipSmad2 antitelo (1:500) (ćelijsko signaliziranje, #3108), magarac anti-zečije sekundarno antitelo konjugovano za Alexa brašno 594 (1:600) (Invitrogen), i postavljeni sa Prolong Gold reagensom protiv bledenja sa DAPI (Invitrogen). Fluorescentne slike iz ovih delova napravljene su upotrebom Zeiss mikroskopa (Axiovision softver) upotrebom identičnih vremena ekspozicije.
[0104] Za histologiju i morfometriju pluća miševa starih 16 nedelja, paralelni delovi su obeleženi upotrebom standardnog protokola za Hematoksilin i Eosin obeležavanje. Postupak srednjeg linearnog presecanja (MLI) korišćen je za kvantifikovanje razdaljine između alveolarnih struktura. Ukratko, 10 histoloških polja zahvaćeno je po mišu pri 20X uvećanju od svih režanja oba pluća upotrebom svetlosnog mikroskopa (Axioplan 2, Zeiss). MLI je meren upotrebom modifikovanog ImageJ softvera (National Institutes of Health, modified by Paul Thompson). Nakon ručnog uklanjanja krvnih sudova, velikih disajnih puteva i drugih ne-alveolarnih struktura, softver automatski postavlja pragove za alveolarno tkivo na svakoj slici i postavlja linijsku mrežu koja se sastoji od 1,353 linija gde svaka linija meri 21 piksel na slici. Broj linije koji je presekao alveolarne strukture korišćen je za računanje MLI.
Biomehaničko testiranje savijanjem sa 3 tačke
[0105] Crtap<-/->i WT bedrene kosti testirane su savijanjem sa tri tačke upotrebom raspona od 6 mm sa Instron 5848 uređaja (Instron Inc., Norwood MA). Sve bedrene kosti testirane su na sobnoj temperaturi. Prethodno su opterećene u IN pri brzini od 0.05 N/s u trajanju od 5 sekundi. Nakon prethodno opterećene, bedrene kosti su opterećene do loma pri brzini od 0.
1mm/sec. Podaci opterećenja i pomeranja zabeleženi su pri frekvenci od 40Hz upotrebom softvera BLUHILL (Instron 5848).
[0106] Za određivanje tačke granice elastičnosti, region je identifikovan nakon prethodnog opterećenja i pre maksimalnog opterećenja na krivi opterećenje pomeranje. Region je podeljen na 5 segmenata iz kojih je uklopljena linija segmenta sa najvećim nagibom uzeta. Nakon toga, 0.012mm pomeraj je implementiran na liniji. Tačna preseka između pomerene linije i krive opterećenje-pomeranje je 0.012 pomerena tačka granice elastičnosti. Ova tačka granice elastičnosti odgovarala je bliže 0.2% pomeraju naprezanja, što se obično bira u literaturi. Elastični region identifikovan je kao region od završetka prethodnog opterećenja do tačke granice elastičnosti. Region tačke granice elastičnosti identifikovan je kao region od tačke granice elastičnosti do tačke pri kojoj je promena u opterećenju prešla -IN, ukazujući na lom. Elastično pomeranje je pomeranje za čije vreme je uzorak ostao u elastičnom regionu. Pomeranje nakon granice elastičnosti je pomeranje za čije vreme je uzorak ostao u regionu
4
nakon granice elastičnosti. Ukupno pomeranje izračunato je kao suma elastičnog pomeranja i pomeranja nakon granice elastičnosti. Upotreba trapezoidnog postupka numeričke integracije, energija do loma izračunata je kao površina ispod krive opterećenje-pomeranje. Maksimalno opterećenje određeno je pronalaženjem najveće vrednosti opterećenja koja je zabeležena od strane BLUEHILL, pre loma uzorka. Za računanje krutosti, metoda najmanjih kvadrata je upotrebljena na segment sa najvećim nagibom elastičnog regiona na krivi opterećenjepomeranje. Krutost je nagib linije sa najmanjim kvadratom. Geometrijski podaci (prečnik i moment inercije) dobijeni iz microCT analize srednjeg dela bedrene kosti iskorišćeni su za računanje unutrašnjih svojstva materijala: ukupne otpornosti, žilavosti do loma i elastičnih modula.
Markeri pregradnje kosti u serumu
[0107] Osteokalcin u serumu (OCN) kvantifikovan je upotrebom mišijeg osteokalcina EIA kompleta od Biomedical Technologies Inc. C-terminalni unakrsno povezani telopeptid kolagena kosti (CTX) kvantifikovan je upotrebom RatLaps™ EIA kompleta od Immunodiagnostic Systems Ltd. Obe analize izvršene su u skladu sa protokolima proizvođača.
SDS-PAGE kolagena, masena spektrometrija i analiza unakrsnih veza
[0108] Za masenu spektrometriju, tip I kolagen pripremljen je iz golenjače Crtap<-/->i divljih tipova. Mast je uklonjena sa kostiju sa hloroformom/metanolom (3:1 v/v) i uklonjeni su minerali u 0.5 M EDTA, 0.05 M Tris-HCl, pH 7.5, svi koraci su bili pri 4°C. Kost je fino samlevena i kolagen je rastvoren denaturacijom sa toplotom (90°C) u SDS-PAGE uzorku pufera. α-lanci kolagena isečeni su iz DS-PAGE gelova i izloženi trispinskog razgradnji u gelu. Elektrosprej MS je izvšren na triptičnim peptidima upotrebom LCQ Deca XP za hvatanje jona masenog spektrometra opremljenog sa tečnom hromatografijom u liniji (LC) (ThermoFinnigan) upotrebom C8 kapilarne kolone (300 µm x 150 mm; Grace Vydac 208 MS5.315) eluirane pri 4.5µl min. Sequest search softver (ThermoFinnigan) korišćen je za identifikovanje peptida upotrebom NCBI proteinske baze podataka.
[0109] Unakrsne piridinolin veze (HP i LP) kvantifikovane su sa HPLC nakon hidrolizovanja demineralizovane kosti u 6N HCl.
Analiza površinske plazmonske rezonance
[0110] Eksperimenti površinske plazmonske rezonance izvršeni su upotrebu BIACore X instrumenta (GE Healthcare Bio-Science Corp.). Prečišćeni izvorni tip I kolagen iz tetive miša od miševa divljeg tipa i Crtap<-/->imobilisan je na CM5 senzorskom čipu sa amidnim spajanjem pri koncentraciji od oko 0.05 ng/mm<2>(500 RU) i 0.08 ng/mm<2>(800 RU), respektivno. Eksperimenti su sprovedeni pri protoku od 10 µl/min i 20 °C u HBS-P puferu (10 mM Hepes pufer , pH 7.4, sadrži 150 mM NaCl i 0.005 % surfaktant P20).
Rekombinantni ljudski dekorin izvorni protein (R&D systems) je ubrizgan na oba tipa I CM5 čipa. Koncentracija štok rastvora ljudskog dekorina određena je sa analizom amino kiseline. Odgovor na vezivanje dekorina za tip I kolagen miševa divljeg tipa i Crtap<-/->normalizovan je sa količinama imobilizovanog tipa I kolagena na CM5 senzorskim čipovima. Tri koncentracije dekorina su korišćene (3, 5 i 12 µM), za svaku koncentraciju analia je ponovljena tri puta. Eksperiment je izvršen dva puta sa kolagenom izolovanim iz različitih miševa svaki put.
Statistički postupci
[0111] Poređenje između dve grupe izvršeno je upotrebom neuparenog, studentskog t-testa sa dva repa. Za poređenje između 3 grupe, jednostrana analiza varijanse (ANOVA) izvršena je ukoliko su jednake varijanse grupa potvrđene, što je praćeno sa uparenim višestrukim poređenjem upotrebom Holm-Sidak postupka. Ukoliko test jednake varijanse nije uspeo, Kruskal-Wallis jednostrani ANOVA na rangovima je izvršen, što je praćeno sa uparenim višestrukim poređenjem upotrebom Tukey testa. P vrednost manja od 0.05 smatra se statistički značajnom za studentski t-test, ANOVA i Kruskal-Wallis jednostrani ANOVA na rangovima. Za naknadna uparena višestruka poređenja, svaka P vrednost upoređena je sa kritičnim nivoom u zavisnosti od ranga P vrednosti i ukupnog broja poređenja izvršenog radi određivanja ukoliko su razlike između grupa značajne. Sigma Plot VI 1.0 (Systat Software Inc.) je korišćen za statističke analize.
[0112] Uticaji 1D11 na kosti i pluća OI miševa bili su nepoznati na početku ispitivanja. Kako bi se izračunala početna veličina uzorka po grupi miševa izračunali smo da bi se uočila minimalna razlika od 20% u masi kosti (BV/TV) sa MicroCT između 1D11 i kontrolom tretiranih OI miševa sa 90% otpornosti, potrebna je bila veličina grupe od 8 miševa.
Primer 1: Izmenjeno TGFβ signaliziranje kod Crtap<-/->lobanje
[0113] Crtap<-/->miševi i njihovi kontrolni miševi iste starosti iz istog legla divljeg tipa (WT) analizirani su za ispoljavanje aktiviranog pSmad 2, člana TGFβ signalnog puta, kao i drugih nizvodnih ciljeva TGFβ. Izrezane su kosti lobanje i RNK i proteini su izvađeni i analizirani sa PCR u realnom vremenu i Wester blot, respektivno. kao što se može videti na Slici 1A i 1B, Crtap<-/->miševi su imali 100% veći odnos aktiviranog pSmad2 i Smad2 u poređenju sa WT miševima, kao što je mereno sa Western blot i kvantifikovano denzitometrijom, što ukazuje da je TGFβ signaliziranje povećano kod Crtap<-/->miševa. Transkripcioni ciljevi TGFβ, kao što su Col1a1 i p21, bili su povišeni u poređenju sa WT kontrolama, kao što je mereno sa RT-PCR i pokazano na Slici 1C i Slici 1D, respektivno. Faktor rasta vezivnog tkiva (CTGF) ECM proteina koji promoviše fibrozu mereno je i pronađeno je da je približno 50% veće kod Crtap<-/->miševa u poređenju sa WT kontrolama, kao što je određeno sa RT-PCR i pokazano na Slici 1E. Kao što je prikazano na Slici 1F, RT-PCR analiza je otkrila da ispoljavanje inhibitora kinaze p27 zavisnog od ciklina nije bilo izmenjeno kod oba Crtap<-/->ili WT miševa.
Primer 2: Povećana TGFb aktivnost kod Crtap<-/->miševa in vivo i u crtap<-/>-osteoblastima [0114] Crtap<-/->miševi ukršeni su sa TGFβ reporter miševima koji pokazuju luciferazu kao odgovor na aktiviranje TGFβ signaliziranja (Jackson Laboratory; B6.Cg-Tg(SBE/TK-luc)7Twc/J). P9 miševi ubrizgani su sa podlogom D-Luciferin (150 mg/kg) 10 minuta pre pravljenja slika (Xenogen; IVIS sistem kamere). Kao što je prikazano na Slici 2A, Crtap<-/->miševi su imali značajno veću luminiscenciju u svojim repovima, dugim kostima i lobanji u poređenju sa WT kontrolama, što ukazuje na povećanu TGFb aktivnost kod crtap<-/->miševa.
Slika 2B, kvantifikacija aktivnost luciferaze u lobanji.
[0115] Ćelije strominog tkiva koštane srži (BMSC) izolovane su iz Crtap<-/->miševa i WT miševa, kultivisane pod osteogenskim uslovima ex vivo, i održavana podloga za kultivisanje analizirana je za TGFβ aktivnost upotrebom ćelijske linije koja ispoljava luciferazu kao odgovor na aktiviranje TGFβ signaliziranja. Kao što je prikazano na Slici 2C, održavana podloga kod Crtap<-/->BMSC ispoljila se u skoro dva puta većoj aktivnosti luciferaze reporter ćelijske linije u poređenju sa BMSC kod WT miševa. Kada se uzmu zajedno, ovi podaci ukazuju da je lučenje TGFβ i aktivnost povišena u kostima i osteoblastima Crtap<-/->miševa.
Primer 3: µCT analiza pršljena Crtap<-/->
4
[0116] Odraslim 8 nedelja starim Crtap<-/->miševima (N = 6 po grupi) dat je 1D11 (10mg/kg, I.P., 3 puta/nedeljno, 8 nedelja ukupno), mišija zamena za pan-specifično antitelo koje se vezuje za TGFβ koji sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15. Nepovezano 13C4 antitelo dato je različitim grupama Crtap<-/->miševa i WT miševima kao kontrola (N = 6). Tela pršljena L416 nedelja starih miševa (tretirani od nedelje 8-16) snimljena su sa µ-CT.
MicroCT podaci tela pršljena L48 nedelja starih Crtap<-/->miševa(n=6 po grupi) koji su tretirani sa TGFβ neutrališućim antitelom 1D11 (Genzim; 10mg/kg, I.P., 3 puta/nedeljno) u trajanju od 8 nedelja i miševi divljeg tipa (WT) i kontrolni Crtap<-/->koji su tretirani sa kontrolnim antitelom (13C4 placebo) prikazani su na Slici 3. kao što je prikazano na Slici 3, Crtap<-/->pršljenovi su bili kavenozni u poređenju sa kontrolnim pršljenovima od WT.
Međutim, 1D11 tretiranje ispoljilo se u skeletnom fenotipu koji je bio uporediv sa stanjem WT.
[0117] Podaci sa Slike 3 kvantifikovani su na Slici 4, tretiranje sa pan-specifičnim anti-TGFβ antitelom spasilo je skeletni fenotip Crtap<-/->miševa. Pršljenovi tretiranih Crtap<-/->miševa bili su statistički slično sa WT kontrolnim miševa u merenim parametrima uključujući frakciju volumena kosti (BV/TV), ukupnu koštanu površinu (BS), odnos koštane površine i volumena (BS/BV), broj koštanih gredica (Tb.N), debljinu koštanih gredica (Tb.Th), razdvojenost koštanih gredica (Tb.Sp) i ukupni volumen (Dens TV).
Primer 4: Histomorfometrija anti-TGFβ tretiranog pršljena Crtap<-/->[0118] Dodatno µ-CT, kosti pršljenova tretiranih sa antitelom, tretiranih sa placebom i WT miševi analizirani su sa histomorfometrijom. Kao što je prikazano na Slici 5A i 5B, µ-CT rezultati potvrđeni su od strane histomorfometrijske analize. Dodatno, delovi tkiva obeleženi su za ispoljavanje oznake osteoklasta TRAP. Analiza je otkrila da postoji više osteoklasta koji pokrivaju veću koštanu površinu kod Crtap<-/->miševa u poređenju sa WT kontrolama (N.Oc/BS i Oc.S/BS), što ukazuje na povišenu aktivnost osteoklasta. Tretiranje sa 1D11 anti-TGFβ smanjilo je sve parametre specifične za osteoklaste na vrednosti ispod onih za WT. Stoga, osteoklasti identifikovani su kao potencijalni cilj za TGFβ antitela, i preciznije, panspecifična anti-TGFβ antitela.
Primer 5: Test savijanja sa tri tačke bedrene kosti Crtap<-/->tretirane sa anti-TGFβ
[0119] Biomehaničko testiranje izvršeno je na izrezanim bedrenim kostima 16 nedelja starih miševa (nakon tretiranja od nedelje 8-16) upotrebom standardnog testa savijanja sa tri tačke sa uređajem Instron 5848 (Instron Inc., Norwood MA) sa 6mm rasponom, prethodno opterećenim do IN pri brzini od 1N/s u trajanju od 5 sekundi. Nakon prethodnog opterećenja, bedrene kosti su opterećene do loma pri brzini od 0.1 mm/sec. Podaci opterećenja i pomeranja zabeleženi su pri frekvenci od 40Hz upotrebom softvera BLUHILL (Instron 5848).
[0120] Kao što je pokazano na Slici 6, bedrene kosi Crtap<-l->miševa bile su manje krute i bile su u stanju da izdrže značajno manje maksimalno opterećenje u poređenju sa WT kontrolnim miševima. Bedrene kosti 1D11 tretiranih Crtap<-/->miševa pokazale su značajno poboljšanje maksimalnog opterećenja, i težnju ka povišenoj krutosti u poređenju sa kontrolnim crtap<-/->miševima.
[0121] Stoga, tretiranje sa 1D11 pan-specifičnim anti-TGFβ antitelom kvantitativno, kvalitativno i biomehanički vratilo je skeletni fenotip kod Crtap<-/->miševa.
Primer 6: Suzbijanje TGFβ signaliziranja sa 1D11 poboljšava fenotip pluća
[0122] Crtap<-/->miševi imaju generalizovanu bolest vezivnog tkiva koja se ispoljava sa niskom masom kostiju, glomerulosklerozom i pulmonarnom diplazijom (Baldridge i dr.; PLoSone, 5(5):e10560 (2010)). Povišeno ispoljavanje TGFβ primećeno je u plućima Crtap<-/->miševa, kao što je dokazano sa pozitivnim imunološkim obeležavanjem za pSmad2 i pokazano na Slici 7A. Histološki, Crtap<-/->miševi pokazali su povećani distalni prostor disajnih puteva u poređenju sa WT miševima, kao što je prikazano na Slici 7B.1D11 tretiranje (10mg/kg, IP, 3x/nedeljno u trajanju od 8 nedelja) smanjilo je pSmad2 ispoljavanje kod Crtap<-/->miševa i smanjilo je distalni prostor disajnih puteva i poboljšalo fenotip pluća, kao što je pokazano na Slici 7A i Slici 7B i kvantifikovano na Slici 7C (*P<0.05 u poređenju sa kontrolnim Crtap<-/->; 10 slika je analizirano po mišu, n=8 miševa po grupi).
Primer 7: Ispoljavanje dekorina u plućima Crtap<-/->[0123] Transdermalni regulatori ispoljavanja TGFβ istraživani su u cilju shvatanja osnove disregulisanog TGFβ signaliziranja u kostima i plućima Crtap<-/->miševa. Glavna klasa vanćelijskih proteina koji mogu regulisati TGFβ kod ECM obuhvataju male proteoglikane bogate sa leucinom (SLRP), kao što je dekorin. Imunološko obeležavanje otkrilo je povećano
4
ispoljavanje dekorina u plućima Crtap<-/->u poređenju sa plućima kontrolnih WT, kao što je prikazano na Slici 8.
[0124] Kako je dekorin regulator zrelih TGFβ, ovo pronalaženje predlaže da izmenjene posttranslatorne modifikacije kolagena, kao što se javlja kod OI, menjaju interakcije ECM proteina, uključujući SLRP. Dekorin se vezuje za mesta hidroksiprolina, kao što je ono koje se nalazi na aminokiselinskom ostatku 396 tipa-I i tipa-II kolagena, koja su odsutna kod Crtap<-/->miševa. Proba vezivanja dekorina izvršena je radi određivanja da li se vezivanje dekorina može izmeniti kod OI, i da li ovo može bar delom biti odgovorno za fenotipove primećene kod Crtap<-/->kostiju i miševa. Kao što je prikazano na Slici 9, vezivanje dekorina za polipeptide 3-hidroksilisanog kolagena (kao kod tipa I i II kolagena) bilo je veće nego kod peptida kolagena bez 3-hidroksilacije (kao kod tipa III kolagena).
Primer 8: Povećano TGFβ signaliziranje je uobičajeni mehanizam kod osteogeneze imperfekta
[0125] OI je okarakterisana sa krhkim kostima, niskom koštanom masom, deformitetima kosti i lomovima. Dodatno, ekstraskeletne manifestacije uključujući abnormalnosti u plućima suštinski doprinose morbiditetu i mortalitetu. Većina slučajeva OI izazvane autosomalnim dominantnim mutacijama u genima koji kodiraju tip I kolagen (COL1A1 i COL1A2). U poslednjih nekoliko godina, mutacije u dodatnim genima koji kodiraju proteine umešane u post-translatornu modifikaciju kolagena identifikovani su da izazivaju recesivne oblike OI. Prvo je bio opisan protein povezan sa hrskavicom (CRTAP), član kompleksa prolil-3-hidroksilaze koji je odgovoran za 3-hidroksilaciju prolin ostatka 986 α1(I) kod tipa I kolagena. Hipomorfne CRTAP mutacije dovele su do delimičnog gubitka 3-hidroksiprolina (3Hyp) kod fibrilarnog kolagena kao i nadmodifikacije drugih ostataka kao rezultat recesivne OI tipa VII, što se klinički preklapa sa dominantnim oblicima ozbiljne OI. Fiziološka funkcija 3Hyp nije potpuno shvaćena, ali biohemijska ispitivanja predlažu da može biti umešan u interakcije između kolagena i proteina pre nego u negativno uticanje na stabilnost kolagena.
[0126] ECM je bitan rezervoar za signaliziranje molekula i njihovih regulatora. U kosti, TGFβ ima ulogu kao centralni koordinator remodeliranja kosti spajanjem lokalizovane aktivnost ponovne apsorpcije osteoklasta kosti i osteoblasta koji formiraju kosti. TGFβ se obilnije proizvodi od strane osteoblasta, luči se prevashodno u neaktivnim latentnim oblicima i taloži se u koštanom matriksu. Ovde, može biti oslobođen ili aktiviran za vreme trajanja
4
resorpcije kosti od strane osteoklasta. Kako dodatni nivo regulacije, aktivni TGFβ mogu biti vezani sa proteoglikanima, koji moduliraju njegovu biološku aktivnost u vezi sa fibrilima kolagena. Zato što je tip I kolagen najobilnija komponenta ECM u kostima, ovo podiže intrigantnu hipotezu da izmenjivanje strukture kolagena primećene kod OI ne samo povećava lomljivost kostiju već takođe utiče na funkciju rezervoara signaliziranja koštanog matriksa. Zanimljivo, Crtap<-/->miševi pokazuju fenotipsko preklapanje sa životinjskim modelima povećanog TGFβ signaliziranja. Na primer, prekomerno ispoljavanje TGFβ ispoljava se u niskoj koštanoj masi. Dodatno, Crtap<-/->miševi su pokazali povećanje prostora alveolarnog disajnog puta u plućima, što je slično onome što je primećeno kod mišijeg modela Marfanovog sindroma, gde je povećano TGFβ signaliziranje pokazano da je glavni uzročnik patologije pluća. Prema tome, status TGFβ signaliziranja ispitivan je u Crtap<-/->mišijem modelu recesivne OI.
[0127] Za procenjivanja statusa TGFβ signaliziranja u kostima, nivoi ispoljavanja TGFβ ciljanih gena u lobanji Crtap<-/->su procenjeni. U poređenju za uzorcima divljeg tipa (WT), kosti Crtap<-/->pokazale su povećano ispoljavanje nizvodnih ciljeva TGFβ p21 (inhibitor kinaze zavistan od ciklina 1), PAI-1 (plazminogen aktivator inhibitor-1), i Col1a1, što je konzistentno sa povišenom TGFβ aktivnošću (Slika 10A). Za potvrđivanje povišene aktivnosti unutarćelijskog TGFβ signalnog puta, status Smad2, unutarćelijski drugi protein za prenošenje informacija, koji postaje fosforilisan nakon aktiviranja TGFβ receptora, je povišen. U skladu sa ispoljavanjem ciljanog gena, imunoblot analize pokazale su viši odnos fosforilisanog Smad2 (pSmad2) i ukupnog Smad2 u uzorcima kostiju Crtap<-/->miševa, što ukazuje na povišeno TGFβ signaliziranje (Slike 10B i 10C).
[0128] Za određivanje da li ova statička merenja oslikavaju povišenu TGFβ aktivnost in vivo, Crtap<-/->miševi su ukršteni sa TOPPβ-reporter miševima koji ispoljavaju luciferazu pod kontrolom TGFβ-responzivnih Smad vezujućih elemenata (SBE-Luc miševi). U poređenju sa WT/SBE-Luc miševima iz istog legla, Crtap<-l->/SBE-Luc miševi pokazali su povećanje u bioluminiscenci površina duž skeletne strukture, što ukazuje na povišenu TgFβ aktivnost in vivo (Slika 10D). Kod 3 legla Crtap<-/->miševi su pokazali srednje 2.86 povećanje (SD±0.34) signala bioluminiscencije u glavi/lobanji u poređenju sa WT miševima. Pored toga, u cilju testiranja toga da li je povišeno TGFβ/Smad signaliziranje povezano sa gubitkom Crtap prirodno za kosti, tj., autonomno tkivo, ćelije strominog tkiva koštane srži (BMSC) su diferencirane do osteoblasta in vitro. Upotrebom TGFβ reporter ćelijske linije, pronađeno je
4
da je održavana podloga kod Crtap<-/->BMSC ispoljila veću TGFβ aktivnost u poređenju sa podlogom kod WT BMSCs (Slika 10E). Kada se uzmu zajedno, ova saznanja ukazuju da gubitak Crtap poboljšava TGFβ signaliziranje u kostima u tkivu na autonomni način.
[0129] Pacijenti sa ozbiljnom OI takođe mogu pokazati unutrašnje abnormalnosti pluća i respiratorni neuspeh je jedan od glavnih uzročnika smrti kod ovih pojedinaca. Zanimljivo, Crtap<-/->miševi su pokazali difuzno povećanje u prostoru alveolarnog disajnog puta, svojstvo povezano sa povišenim TGFβ signaliziranjem u drugim modelima za razvijanje. U skladu sa time, pluća Crtap<-/->miševa pokazala su povišeno unutarćelijsko obeležavanje za pSmad2 u alveolarnim ćelijama, što ukazuje da je povišena TGFβ aktivnost takođe prisutna u ekstraskeletnom tkivu (Slika 10F).
[0130] Za razumevanje da li povišeno TGFβ signaliziranje predstavlja uobičajeni mehanizam koji doprinosi fenotipovima kostiju i pluća kod Crtap<-/->miševa, eksperiment izbavljanja izvršen je sa pan-TGFβ neutrališućim antitelom (1D11). Osam nedelja stari Crtap<-/->miševi tretirani su sa 1D11 u trajanju od 8 nedelja; kontrolni Crtap<-/->i WT miševi primili su nespecifično kontrolno antitelo (13C4).1D11 nije značajno promenilo telesnu težinu tretiranih Crtap<-/->miševa, što ukazuje da inhibiranje TGFβ nije pogodilo opšti nutritivni status (Slika 14). Dodatno, masena spektrometrja i analiza unakrsnih veza pokazali su da 1D11 nije značajno izmenio status tipa I kolagena P9863-hidroksilacije ili unakrsnih veza kolagena kod Crtap<-/->miševa, što predlaže da je disregulisano TGFβ signaliziranje posledica izmenjene molekularne strukture kolagena i da nije neposredno umešano u unutarćelijsko procesiranje kolagena ili vanćelijskog sklopa fibrila (Slika 15). Crtap<-/->miševi pokazali su smanjenu koštanu masu i abnormalne parametre koštanih gredica (Slika 11A i 11B). Analiza dobijanja slika MicroCT pršljenova pokazala je da u poređenju sa kontrolnim Crtap<-/->miševima, inhibiranje TGFβ značajno poboljšalo parametre koštanih gredica, uključujući volumen kosti/ukupni volumen, broj koštanih gredica i debljinu koštanih gredica do blizu nivoa za WT (Slika 11A i 11B, i Slika 17). Slični korisni efekti primećeni su kod bedrenih koštanih gredica Crtap<-/->miševa, gde je suzbijanje TGFβ značajno poboljšalo parametre koštanih gredica (Slika 18). Uticaji suzbijanja TGFβ na skeletu sa 1D11 zabeleženi su prethodno kod WT miševa i kod Esl-1<-/->mišijeva11, model sa povišenom TGFβ aktivnošću usled defekta u normalnom sazrevanju TGFβ. Dok je 1D11 umereno povećao BV/TV koštanih gredica sa 33% u kičmi kod WT miševa, Esl-1<-/->miševi ispoljili su 106% povećanje u BV/TV. Ovo predlaže da bi ciljanje TGFβ u patofizikološkim situacijama gde je povećano u skeletu,
4
moglo dovesti do relativno izraženijeg pozitivnog uticaja. U predmetnom ispitivanju, 1D11 povećao je BV/TV koštanih gredica u kičmi za 235% kod Crtap<-/->miševa, što podržava da disregulisano TGFβ signaliziranje značajno doprinosi niskoj koštanoj masi kod Crtap<-/->miševa. U srednjem delu bedrene kosti, parametri kortikalne arhitekture uključujući kortikalnu debljinu, poprečnih, površinu poprečnog preseka i momente inercije poprečnog preseka kod Crtap<-/->miševa značajno su smanjeni u poređenju sa WT miševima. Nakon 1D11 tretiranja, ovi parametri nisu više bili značajno različiti od WT miševa (Slika 19). Za testiranje toga da li se izmene u kortikalnoj kosti i koštanim gredicama prevedenim u poboljšanu koštanu otpornost, biomehaničko testiranje bedrenih kosti savijanjem sa tri tačke je izvršeno. Pronađeno je da je suzbijanje TGFβ bilo u stanju da poveća maksimalno opterećenje i ukupnu otpornost kod tretiranih Crtap<-/->miševa, što ukazuje na poboljšanu otpornost celih kostiju i tkiva i poboljšanu otpornost na lom. Međutim, 1D11 tretiranje nije imalo uticaj na povišenu krhkost OI kostiju, kao što je ukazano sa sniženim pomeranjem posle granice elastičnosti kod oba, kontrolnih i 1D11 tretiranih Crtap<-/->miševa (Slika 20). Ovo verovatno oslikava naslednu abnormalnu mineralizaciju povezano sa izmenjenom strukturom kolagena. Kada se uzmu zajedno, ova saznanja ukazuju da je povišeno TGFβ signaliziranje glavni uzročnik fenotipa kostiju u recesivnoj OI što se ispoljava iz Crtap nedostataka i da suzbijanje disregulisanog TGFβ signaliziranja vraća koštanu masu, mikrostrukturne parametre i poboljšava ukupnu otpornost kostiju.
[0131] Za razumevanje uticaja suzbijanja TGFβ kod Crtap<-/->miševa na ćelijskom nivou, histomorfometrijska analiza je izvršena na tretiranim miševima. U delovima tela pršljenova u ovom ispitivanju pronađen je povišen broj osteoklasta (Oc) i osteoblasta (Ob) po površini kosti kod kontrolnih Crtap<-/->u poređenju sa WT miševima, što je ukazalo na povišeno remodeliranje kostiju u kičmi (Slika 11C i Slika 21). Dosledno tome, markeri pregradnje kosti u serumu oteokalcin (OCN) i C-terminalni unakrsno povezani telopeptid kolagena kosti (CTX) su povišeni kod 8 nedelja starih (OCN i CTX) i 16 nedelja starih (samo CTX) kontrolnih Crtap<-l->miševa(Slika 19). Slične izmene u ćelijskom sastavu kosti opisane su kod pacijenata sa diminantom i recesivnom OI, što je pokazalo povišene Oc i Ob brojeve što je dosledno povećanom broju pregradnje kostiju. Zanimljivo, mišiji modeli povišenog TGFβ signaliziranja takođe su pokazali nisku koštanu masu sa povećanom resorpcijom kosti osteoklasta i abnormalnim remodeliranjem kosti. Većina izveštaja uticaja TGFβ na ćelije kostiju su u skladu sa modelom gde TGFβ može stimulisati regrutaciju i početnu diferencijaciju Oc i Ob prekursora na mestu popravljanja kostiju, što je praćeno sa
4
diferencijacijom posredovanom sa faktorom rasta nalik insulinu 1 (IGF-1). Međutim, pri uporno visokim dozama, TGFβ može suzbiti Ob diferencijaciju predstavljanjem faktora diferencijacije RUNX2. Uz date ključne uticaje na interakciju Oc/Ob, fino obrtanje TGFβ aktivnosti je ključni faktor za lokalno spajanje resorpcije kosti sa formiranjem za vreme trajanja remodeliranja kosti i ta neravnoteža može dovesti do značajne patologije kosti.
[0132] U suprotnosti sa saznanjima kod kontrolnih Crtap<-/->miševa, delovi kostiju Crtap<-/->miševa tretiranih sa 1D11 otkrili su smanjeni broj Oc i Ob, koji je bio još manji kada su vrednosti merene kod WT miševa, što ukazuje na suprafiziološko suzbijanje i disregulisano remodeliranje kao rezultat TGFβ suzbijanja pri dozi 1D11 korišćenoj u eksperimentu (Slika 11C). Dosledno prethodnim izveštajima, posmatranja sniženih Oc i Ob ispod nivoa WT takođe podvlači fiziološke potrebe lokalnih količina TGFβ kako bi se normalno upravljalo sa Oc i Ob za vreme procesa remodeliranja kostiju. Naša saznanja različita su od prethodnih ispitivanja kod WT miševa, gde je 1D11 tretiranje smanjilo Oc brojeve ali je povećalo Ob brojeve. Ovo može oslikati različite ćelijske uticaje TGFβ suzbijanja patofiziološke situacije sa povećanim TGFβ signaliziranjem i povećanim remodeliranjem kostiju u poređenju sa normalnim kostima kod WT miševa. TGFβ je pokazao da suzbija diferencijaciju prekursor osteoblast ćelija i povećano TGFβ signaliziranje bi time moglo dovesti do većih proporcija nezrelih ćelija linije osteoblasta. Sa druge strane, povišeni broj ili veća proporcija nezrelih Ob na koštanoj površini moglo bi se ispoljiti u povišenoj količini izlučenih TGFβ od strane ovih ćelija. Saznanja da TGFβ suzbijanje sa 1D11 značajno smanjuje povišeni broj Ob kod Crtap<-/->miševa predlaže da povišeno TGFβ signaliziranje rutinski doprinosi povišenju u ćelijama linije osteoblasta.
[0133] Dodatno saznanjima koja se odnose na brojeve Oc i Ob, veći broj osteocita (Ot) po koštanoj površini kod kontrolnih Crtap<-/->miševa je primećen, što je sniženo do nivoa uporedivih sa onim kod WT miševa kod 1D11 tretiranih Crtap<-/->miševa (Slika 11C i Slika 21). Kod OI pacijenata, povišena gustina Ot primećena je kod pojedinaca sa više od jednog ozbiljnog oblika bolesti, što najverovatnije oslikava prisustvo nezrele primarne kosti usled defekta u fiziološkom sazrevanje kod OI kosti. Dosledno sa našom hipotezom da povišeno TGFβ signaliziranje doprinosi patologiji kostiju kod OI, prekomerno ispoljavanje TGFβ kod WT miševa ispoljava se na sličan način u povišenoj gustini Ot. Kao moguće objašnjenje, TGFβ može suzbiti Ob apoptozu za vreme prelaza Ob u Ot i time dovesti do povišene gustine Ot. Kao posledica, ova saznanja ukazuju da povišeno TGFβ signaliziranje doprinosi statusu veće pregradnje kosti i neuparenog sazrevanja kosti kod Crtap<-/->miševa i da suzbijanje disregulisanog TGFβ signaliziranja vraća ove ćelijske izmene.
[0134] Uz date ključne uticaje na interakciju Oc/Ob, fino obrtanje TGFβ aktivnosti je ključni faktor za lokalno spajanje resorpcije kosti sa formiranjem za vreme trajanja remodeliranja kosti i ta neravnoteža može dovesti do značajne patologije kosti. Naša saznanja ukazuju da suzbijanje disregulisanog TGFβ signaliziranja kod Crtap<-/->miševa vraća koštanu masu kao i mikrostrukturne parametre, poboljšava ukupnu otpornost kosti, i vraća ćelijske izmene primećene kod Crtap<-/->miševa. Stoga, disregulacija TGFβ signaliziranja značajno doprinosi fenotipu kostiju u ovom mišijem modelu recesivne OI.
[0135] Takođe smo bili zainteresovano za to da li TGFβ suzbijanje utiče na fenotip pluća kod Crtap<-/->miševa. Pluća kontrolnih Crtap<-/->miševa pokazuju povišeni distalni prostor disajnih puteva u poređenju sa WT miševima (Slika 11D). Zanimljivo, pluća Crtap<-/->miševa tretiranih sa TGFβ neutrališućim antitelom pokazalo je poboljšanje od 60% u rastojanju između alveolarnih struktura (Slike 11D i 11E). Ova saznanja ukazuju da prekomerno TGFβ signaliziranje takođe značajno doprinosi abnormalnostima u plućima prisutnim kod Crtap<-/->miševa. Povišeno TGFβ signaliziranje je povezano sa abnormalnostima pluća u razvoju kao i sa bolestima kod zrelih pluća. Na primer, prekomerno ispoljavanje TGFβ u plućima ispoljava se u neuparenom razvijanju pluća sa površinama uvećanih prostora disajnih puteva i povećano TGFβ signaliziranje doprinosi patomehanizmu u abnormalnosti pluća u Marfanovom sindromu kao i razvijanju emfizema i bronhijalne astme. Naši rezultati ukazuju da prekomerno TgFβ signaliziranje značajno patogenski doprinosi abnormalnostima u plućima prisutnim kod Crtap<-/->miševa. Kada se uzme delimično čuvanje fenotipa pluća sa 1D11 kod Crtap<-/->miševa, moguće je da disregulisano TGFβ signaliziranje utiče na razvijanje tkiva u plućima kada se anatomske strukture uspostave, dodatno održavanju tkiva pluća u kasnijim stadijumima kada je suzbijanje TGFβ bilo u stanju da ublaži fenotip.
[0136] Sledeće pitanje koje se postavlja je kako se izmene u kolagenu usled gubitka kod (što dovodi do gubitka 3Hyp kod P986 i post-translatorne nadmodifikacije kolagena) ispoljavaju u disregulisanom TGFβ signaliziranju. Biohemijske analize ukazuju da prolil-3-hidroksilacija ne utiče suštinski na stabilnost molekula kolagena, već može uticati na interakcije kolagena i proteina. Privlačna hipoteza je da bi gubitak 3Hyp mogao uticati na interakciju kolagena sa malim leucin-bogatim proteoglikanima (SLRP). SLRP su poznati da vezuju oba, tip I kolagen
1
kao i TGFβ, i time moduliraju aktivnost TGFβ. Na primer, SLRP dekorin je u stanju da suzbije različite uticaje TGFβ u ćelijama osteosarkoma dok pojačava aktivnost TGFβ u ćelijama preosteoblasta. Region za vezivanje dekorina za tip I kolagen predlaže se da je centriran kod ostataka 961/962 trostrukog spiralnog domena, koji se nalazi u blizini P986 ostatka, koji nije hidroksilisan u OI usled Crtap deficijencije. Prema tome, moguće je da položaj P9863Hyp označava mesto interakcije za vezivanje dekorina za tip I kolagen, tipe posredujući sekvestraciju zrelog TGFβ za kolagen.
[0137] Stoga, postavljena je hipoteza da je vezivanje dekorina za kolagen ključno za regulaciju TGFβ i da je ovo vezivanje prekinuto nakon izmenjivanja strukture kolagena, na primer gubitkom postranslatorne modifikacije 3-prolil-hidroksilacije P986 u α1 lancu tipa I kolagena u slučaju recesivne OI. Identifikovano je da iako gubitak kod Crtap nije izmenio ispoljavanje RNK dekorina i drugih SLRP u lobanji (Slika 12A), niti kvalitativnu zastupljenost dekorina u koštanim gredicama (Slika 24), da je smanjio vezivanje rekombinantnog dekorin izvornog proteina za tip I kolagen izolovanog iz Crtap<-/->miševa u poređenju sa WT miševima (Slika 12B). Merenja analize površinske plazmonske rezonance vezivanja rekombinantnog dekorin izvornog proteina za tip I kolagen WT i Crtap<-/->miševa pokazala je vezivanje kod Crtap<-/->miševa u tri testirane koncentracije (Slika 23). Tri tehnička replikata pri svakoj ukazanoj koncentraciji dekorina izvršena su iz dva nezavisna biološka replikata (◆ replikat 1, ▲ replikat 2). Rezultati su prikazani kao procenat srednje vrednosti WT (kolone predstavljaju srednju vrednost po grupi). Srednja sniženja vezivanja dekorina za Crtap<-/->tip I kolagen pri 3, 5 i 12 µM dekorina su bila 28.5%, 33.5% i 38.1%, respektivno.
[0138] Ovo saznanje predlaže da izmene interakcija kolagena sa proteoglikanom mogu doprineti disregulisanom TGFβ signaliziranju u kostima i drugim tkivima bogatim sa kolagenom u OI. Na osnovu zabeleženih potreba dekorin-kolagen vezivanja da bi dekorin efektivno smanjio biološku aktivnost TGFβ, moguće je da defekti u OI kolagenu dovode do izmenjenog vezivanja dekorina, i stoga, njegova sposobnost da izoluje TGFβ u matriksu i izmeni TGFβ funkcije. Stoga, izmenjene proteoglikan-kolagen interakcije mogu dovesti do disregulisnog signaliziranja u kostima i drugim tkivima bogatim sa kolagenom u OI, čak i ako nisu prisutne veće izmene u ukupnim nivoima TGFβ (Slika 24 i Slika 25). Ovo zapažanje podržano je sa saznanjem da COL1A1 i COL1A2 mutacije u ozbiljnijim oblicima dominantog OI klastera u specifičnim regionima se vezuju za proteoglikane, dalje podržava fiziološku relevantnog proteoglikan-kolagen interakcija za normalnu homeostazu kostiju.
2
Ovo bi takođe predlagalo da drugi proteoglikani koji su u konkurenciji sa dekorinom za mesto vezivanja kolagena takođe doprinose disregulisanoj TGFβ aktivnosti i da dodatni signalni putevi mogu biti izmenjeni.
[0139] Zbog kliničkog preklapanja nekih recesivnih i dominantnih oblika OI gde defektivne strukture vlakana kolagena dovode do krhkih kostiju i ekstraskeletnih manifestacija, moguće je da je disregulacija TGFβ signaliziranja uobičajeni patofiziološki mehanizma bolesti.
Odnoseći se na ovu hipotezu, status TGFβ signaliziranja u mišijem modelu dominantne OI je istraživan. Knock-in miš koji nosi G610C mutaciju u Col1a2 genu (Col1α2<tm1.1Mcbr>) fenokopija koja se dominantno nasleđuje, ublaženi oblik OI koje je originalno identifikovan u populaciji Amiša. U uzorcima kostiju Col1α2<tm1.1Mcbr>miševa, povišeno ispoljavanje TGFβ ciljanih gena p21 i PAI-1 pronađeno je, što ukazuje na regulaciju na gore TGFβ signaliziranja (Slika 13A). Dosledno tome, imunoblot analiza ekstrakta kostiju od Col1α2<tm1.1Mcbr>miševa takođe je pokazala povišeni odnos aktiviranog pSmad2/ukupnog Smad2, slično našem posmatranju kod Crtap<-/->miševa (Slike 13B i 13C).
[0140] Za testiranje povišenog TGFβ signaliziranja u ovom modelu domintne OI koja takođe predstavlja uobičajeni mehanizam, 8 nedelja stari Col1α2<tm1.1Mcbr>miševi tretirani su sa TGFβneutrališućim antitelom 1D11 u trajanju od 8 nedelja 8; kontrolni Col1α2<tm1.1Mcbr>i WT miševi tretirani su sa kontrolnim antitelom 13C4. Slično saznanjima kod Crtap<-/->miševa, 1D11-tretiranje vratilo je parametre koštanih gredica u kičmi do nivoa kao kod WT (Slike 13D, 13E, i 22). Kada se uzmu zajedno, ova saznanja ukazuju da disregulacija TGFβ signaliziranja takođe značajno doprinosi patogenezi dominantnih oblika OI, i da anti-TGFβ terapija ispravlja fenotip kostiju kod dominantne OI.
[0141] Iz kliničke-translatorne perspektivne, potencijalni negativni uticaji sistemskog suzbijanja TGFβ kod OI moraju se uzeti u obzir. Dok su TGF-β<-/->miševi razvili ozbiljnu multifokalnu inflamatornu bolest i disregulaciju imunog sistema u prvih pet nedelja života, kod oba, Crtap<-/->i Col1α2<tm1.1Mcbr>miševa tretiranih sa 1D11 nismo primetili očigledne negativne uticaje na opšte zdravlje, ponašanje ili rast, što predlaže da su uticaji delimičnog farmakološkog suzbijanja TGFβ liganda kod odraslih miševa različiti od potpunog gubitka TGFβ1 za vreme razvijanja. Kod ljudi, Fresolimumab (GC1008, Genzyme), koji je sličan sa 1D11 u svom afinitetu i specifičnosti za 3 izoforme TGFβ, korišćen je u fazi I istraživanja kod pacijenata saprimarnom fokalnom segmentnom glomerulosklerozom otpornom na tretiranje, idiopatskom plumonarnom fibrozom i malignim melanomom ili karcinomom bubrežnih ćelija. U ovim istraživanjima, Fresolimumab je generalno dobro tolerisan, sa mogućim štetnim događajima povezanim sa dozom uključujući osipe po koži ili lezije, epistaksu, gingivalno krvarenje i umor.
[0142] Molekularni mehanizmi OI su nepotpuno shvaćeni. Kao posledica, trenutne opcije tretiranja pacijenata sa OI pretežno su ograničene na anti-resorptivne terapije kao što je korišćeno pri tretiranju osteoporoze. Zanimljivo, nedavno nasumično postavljena, placebo kontrolisana proba anaboličkog sredstva teriparatida kod odraslih osoba sa OI pokazala je da su ozbiljne OI tipa III/IV dale drugačiji odgovor od onih kod umerene OI tipa I (Orwoll i dr., 2014). Ovo predlaže genotipske razlike u odgovoru na terapije ciljane da modifikuju ćelijsko signaliziranje i da tretiranje ciljano na TGFβ može biti obećavajuća opcija za dalje istraživanje kod ozbiljnih OI usled genskih mutacija kolagena i post-translatornih modifikacija kolagena. Ukupno, naši podaci podržavaju koncept disregulisanog matriksćelijskog signaliziranja kao mehanizma u patogenezi različitih genetski naslednih oblika blesti krhkih kostiju i ukazuju na strategiju zasnovanu na mehanizmu specifičnom za bolest za tretiranje OI neutralisanjem prekomerno aktivne TGFβ aktivnosti u skeletnom i ekstraskelentom tkivu.
4
1
2
�
1
2

Claims (20)

Patentni zahtevi
1. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koji se specifično vezuje za i neutrališe ljudski TGFβ1, TGFβ2, i TGFβ3 za upotrebu pri tretiranju osteogeneze imperfekta (OI) kod ispitanika koji ima potrebu za time, gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region od teškog lanca koji sadrži tri regiona koji determinišu komplementarnost (CDR) koji imaju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4, 5, i 6; varijabilni region od lakog lanca koji sadrži tri CDR koji imaju aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 7, 8, i 9.
2. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10, i varijabilni region od lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11.
3. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen dalje sadrži ljudski IgG4 konstantni region.
4. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, gde ljudski IgG4 konstantni region sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12.
5. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen dalje sadrži ljudski κ konstantni region od lakog lanca.
6. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, gde ljudski κ konstantni region od lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13.
4
7. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 ili 2, gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen dalje sadrži ljudski IgG4 konstantni region i ljudski κ konstantni region od lakog lanca.
8. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, gde ljudski IgG4 konstantni region sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12, i ljudski κ konstantni region od lakog lanca sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13.
9. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14.
10. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15.
11. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, i laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15.
12. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen poboljšava parametar kosti izabran iz grupe koju čine frakcija volumena kosti (BV/TV), ukupna koštana površina (BS), odnos koštane površine i volumena (BS/BV), broj koštanih gredica (Tb.N), debljina koštanih gredica (Tb.Th) razdvojenost koštanih gredica (Tb.Sp) i ukupni volumen (Desn TV).
13. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo ili njegov fragment suzbija resorpciju kosti.
14. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen smanjuju biomarker u serumu resorpcije kosti izabran iz grupe koju čine urinarni hidroksiprolin, urinarni ukupni piridinolin (PYD), urinarni slobodni dezoksipiridinolin (DPD), urinarni kolagen tipa-I unakrsno povezani N-telopepid (NTX), urinarni ili serumski tipa-I unakrsno povezani C-telopeptid (CTX), sialoprotein kosti (BSP), osteopontin (OPN) i tartrat-otporna kisela fosfataza 5b (TRAP).
15. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen povećava biomarker u serumu koštane depozicije zabran iz grupe koju čine ukupna alkalna fosfataza, alkalna fosfataza specifična za kosti, osteokalcin i tip-I prokolagen (C-terminalni/N-terminalni).
16. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo ili njegov fragment pospešuju koštanu depoziciju.
17. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen poboljšava funkciju ne-skeletnog organa pogođenog sa OI izabranu iz grupe koju čine funkcija sluha, funkcija pluća i funkcija bubrega.
18. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, gde se navedeno antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen koristi u kombinaciji sa bar jednim terapeutskim sredstvom.
19. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 18, gde je bar jedno terapeutsko sredstvo izabrano iz grupe koju čine bifosfonat, analog hormona paraštitne žlezde koji stimuliše formiranje kostiju, kalcitonin i selektivni modulator estrogenih receptora (SERM).
20. Antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen za upotrebu prema patentnom zahtevu 18 ili 19, gde je bar jedno terapeutsko sredstvo analog hormona paraštitne žlezde koji stimuliše formiranje kostiju.
RS20181438A 2013-03-20 2014-03-20 Postupci za tretiranje osteogeneze imperfekta RS58188B2 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361803647P 2013-03-20 2013-03-20
US201361875399P 2013-09-09 2013-09-09
US201361883151P 2013-09-26 2013-09-26
PCT/US2014/031279 WO2014153435A1 (en) 2013-03-20 2014-03-20 Methods for treating osteogenesis imperfecta
EP14717386.8A EP2976359B2 (en) 2013-03-20 2014-03-20 Methods for treating osteogenesis imperfecta

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS58188B1 RS58188B1 (sr) 2019-03-29
RS58188B2 true RS58188B2 (sr) 2022-06-30

Family

ID=50483613

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191624A RS59673B1 (sr) 2013-03-20 2014-03-20 Postupci za tretiranje osteogeneze imperfekta
RS20181438A RS58188B2 (sr) 2013-03-20 2014-03-20 Postupci za tretiranje osteogeneze imperfekta

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191624A RS59673B1 (sr) 2013-03-20 2014-03-20 Postupci za tretiranje osteogeneze imperfekta

Country Status (26)

Country Link
US (4) US9598486B2 (sr)
EP (3) EP3312195B1 (sr)
JP (3) JP6483086B2 (sr)
KR (1) KR102257138B1 (sr)
CN (2) CN105229028B (sr)
AU (1) AU2014235933B2 (sr)
CA (1) CA2907422C (sr)
CL (1) CL2015002801A1 (sr)
DK (2) DK2976359T4 (sr)
EA (1) EA032327B1 (sr)
ES (2) ES2700238T5 (sr)
HR (2) HRP20181939T4 (sr)
HU (1) HUE046702T2 (sr)
IL (2) IL241461B (sr)
LT (2) LT3312195T (sr)
MX (2) MX389759B (sr)
MY (1) MY172324A (sr)
PH (2) PH12015501864B1 (sr)
PL (2) PL3312195T3 (sr)
PT (2) PT2976359T (sr)
RS (2) RS59673B1 (sr)
SG (2) SG10201701985YA (sr)
SI (2) SI2976359T2 (sr)
TW (1) TWI629995B (sr)
UY (1) UY35493A (sr)
WO (1) WO2014153435A1 (sr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20181939T4 (hr) * 2013-03-20 2022-05-13 Genzyme Corporation Postupci za liječenje osteogenesis imperfecta
TWI726870B (zh) 2015-03-04 2021-05-11 美商健臻公司 具有高親和性、結合性及專一性之結合轉形生長因子-β１的ｓｃＦｖ-Ｆｃ二聚體
TWI733661B (zh) * 2015-03-04 2021-07-21 美商健臻公司 以高親合性、結合性及特異性結合轉化生長因子－β１的經修飾ＩｇＧ抗體
AU2017310344A1 (en) * 2016-08-11 2019-03-07 Precithera, Inc. TGF-β antagonist conjugates
CN106755395B (zh) * 2016-12-16 2020-05-12 山东第一医科大学(山东省医学科学院) Xi型成骨不全致病基因fkbp10的突变位点及其应用
TWI787230B (zh) * 2017-01-20 2022-12-21 法商賽諾菲公司 抗ＴＧＦ-β抗體及其用途
EP3571227A1 (en) * 2017-01-20 2019-11-27 Sanofi Anti-tgf-beta antibodies and their use
AR110904A1 (es) * 2017-01-20 2019-05-15 Sanofi Sa ANTICUERPOS ANTI-TGF-b Y SU USO
TWI832600B (zh) * 2017-01-20 2024-02-11 美商健臻公司 骨靶向抗體
WO2019113123A1 (en) * 2017-12-04 2019-06-13 Precithera, Inc. TGF-ß RECEPTOR FUSION PROTEINS AND OTHER TGF-ß ANTAGONISTS FOR REDUCING TGF-ß SIGNALING
KR20210030411A (ko) 2018-07-10 2021-03-17 사노피 Cd38 및 tgf-베타를 표적으로 하는 암에 대한 병용 요법
CN119264211A (zh) 2018-08-27 2025-01-07 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
CN110916855A (zh) * 2018-09-20 2020-03-27 天津正天医疗器械有限公司 一种仿生多孔椎间植入物及其制造方法
WO2022087435A1 (en) * 2020-10-23 2022-04-28 Hq Han Bifunctional antagonists of tumor necrosis factor-alpha and transforming growth factor-beta and uses thereof
CA3219219A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Baylor College Of Medicine Treatment of moderate-to-severe osteogenesis imperfecta
CN113501879B (zh) * 2021-06-30 2022-09-06 拜盖特生物科技(上海)有限公司 一种解除肿瘤免疫微环境中免疫抑制的双功能抗体及其应用和制备方法
MX2024005344A (es) * 2021-11-01 2024-07-19 Genzyme Corp Tratamiento de la osteogenesis imperfecta.
CN120530142A (zh) * 2023-01-13 2025-08-22 上海凯今生物科技有限公司 多特异性多肽复合物
CN120290673A (zh) * 2025-04-02 2025-07-11 湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所 一种抗光老化胶原多肽的制备方法和应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL6716836A (sr) * 1967-12-11 1969-06-13
US7368111B2 (en) * 1995-10-06 2008-05-06 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies specific for TGFβ2
DE19742706B4 (de) 1997-09-26 2013-07-25 Pieris Proteolab Ag Lipocalinmuteine
WO2000028982A2 (en) * 1998-11-19 2000-05-25 The Board Of Trustees For The University Of Arkansas Increasing bone strength with selected bisphosphonates
ATE481487T1 (de) * 1998-11-27 2010-10-15 Ucb Sa Zusammensetzungen und verfahren zur erhöhung der knochenmineralisierung
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
US6492497B1 (en) * 1999-04-30 2002-12-10 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for TGFbeta1
CA2308532C (en) * 1999-05-12 2005-11-29 Gador S.A. Use of bisphosphonates for the treatment of osteogenesis imperfecta
US6659982B2 (en) 2000-05-08 2003-12-09 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
US6629949B1 (en) 2000-05-08 2003-10-07 Sterling Medivations, Inc. Micro infusion drug delivery device
TR201901929T4 (tr) 2005-02-08 2019-03-21 Genzyme Corp TGFBeta'ya antikorlar.
TW200714289A (en) * 2005-02-28 2007-04-16 Genentech Inc Treatment of bone disorders
US7592429B2 (en) * 2005-05-03 2009-09-22 Ucb Sa Sclerostin-binding antibody
EP1966243B1 (en) * 2005-12-23 2012-02-15 Eli Lilly And Company Tgf-beta binding antibodies
WO2008022182A1 (en) * 2006-08-16 2008-02-21 The Uab Research Foundation Methods for promoting coupling between bone formation and resorption
EA018221B1 (ru) 2007-02-09 2013-06-28 Акселерон Фарма Инк. АНТАГОНИСТЫ АКТИВИНА-ActRIIa И ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КОСТИ У БОЛЬНЫХ РАКОМ
US20100204053A1 (en) * 2007-04-26 2010-08-12 President And Fellows Of Harvard College Assays for the identification of compounds that modulate bone formation and mineralization
TWI489993B (zh) * 2007-10-12 2015-07-01 Novartis Ag 骨硬化素（ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ）抗體組合物及使用方法
US20090181020A1 (en) * 2008-01-15 2009-07-16 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Methods of Treating Bone-Loss Disorders Using a GM-CSF Antagonist
WO2010124276A2 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Vanderbilt Universtiy Anti-tgf-beta induction of bone cell function and bone growth
HRP20181939T4 (hr) * 2013-03-20 2022-05-13 Genzyme Corporation Postupci za liječenje osteogenesis imperfecta

Also Published As

Publication number Publication date
PT2976359T (pt) 2018-12-05
MX2019009122A (es) 2019-09-16
US20190389943A1 (en) 2019-12-26
KR20150132262A (ko) 2015-11-25
RS58188B1 (sr) 2019-03-29
DK2976359T3 (da) 2019-01-02
US12365725B2 (en) 2025-07-22
DK3312195T3 (da) 2020-01-06
PH12019500261B1 (en) 2021-03-26
JP2020109110A (ja) 2020-07-16
PH12015501864A1 (en) 2015-12-07
PH12019500261A1 (en) 2020-07-20
US10377819B2 (en) 2019-08-13
US11230595B2 (en) 2022-01-25
IL287915A (en) 2022-01-01
EP2976359A1 (en) 2016-01-27
LT3312195T (lt) 2020-01-10
US9598486B2 (en) 2017-03-21
MX389759B (es) 2025-03-20
MY172324A (en) 2019-11-21
BR112015023905A2 (pt) 2017-10-24
CL2015002801A1 (es) 2016-08-12
ES2700238T5 (es) 2022-05-20
AU2014235933B2 (en) 2019-01-24
SI2976359T1 (sl) 2019-03-29
HK1253717A1 (en) 2019-06-28
UY35493A (es) 2014-11-28
US20170247439A1 (en) 2017-08-31
TW201524515A (zh) 2015-07-01
TWI629995B (zh) 2018-07-21
PL2976359T5 (pl) 2022-07-18
CN105229028A (zh) 2016-01-06
JP2019089826A (ja) 2019-06-13
HK1213576A1 (en) 2016-07-08
CA2907422C (en) 2021-08-31
EP3312195A1 (en) 2018-04-25
HRP20181939T4 (hr) 2022-05-13
EP3640260A1 (en) 2020-04-22
SG10201701985YA (en) 2017-04-27
WO2014153435A1 (en) 2014-09-25
KR102257138B1 (ko) 2021-05-26
EP3312195B1 (en) 2019-10-09
HUE046702T2 (hu) 2020-03-30
HRP20192277T1 (hr) 2020-03-06
SI3312195T1 (sl) 2020-02-28
PL2976359T3 (pl) 2019-03-29
HRP20181939T1 (hr) 2019-01-25
EP2976359B2 (en) 2022-03-23
IL241461A0 (en) 2015-11-30
ES2700238T3 (es) 2019-02-14
PL3312195T3 (pl) 2020-04-30
ES2763869T3 (es) 2020-06-01
US20160031979A1 (en) 2016-02-04
MX2015013402A (es) 2016-01-08
EA201591843A1 (ru) 2016-01-29
DK2976359T4 (da) 2022-06-13
JP6483086B2 (ja) 2019-03-13
PH12015501864B1 (en) 2015-12-07
SG11201506683XA (en) 2015-09-29
CN105229028B (zh) 2019-11-08
SI2976359T2 (sl) 2022-05-31
PT3312195T (pt) 2019-12-23
JP6677837B2 (ja) 2020-04-08
US20220195025A1 (en) 2022-06-23
CN111000997A (zh) 2020-04-14
NZ712353A (en) 2021-04-30
LT2976359T (lt) 2018-12-27
EP2976359B1 (en) 2018-08-29
IL241461B (en) 2021-12-01
JP7016113B2 (ja) 2022-02-04
JP2016519093A (ja) 2016-06-30
CA2907422A1 (en) 2014-09-25
EA032327B1 (ru) 2019-05-31
RS59673B1 (sr) 2020-01-31
AU2014235933A1 (en) 2015-10-01
MX369360B (es) 2019-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12365725B2 (en) Methods for treating osteogenesis imperfecta
JP2014527040A (ja) 抗−線維化ペプチド並びに線維化を特徴とする疾患及び障害を治療するための方法における該抗−線維化ペプチドの使用
JP2024079697A (ja) 骨の疾患の治療に用いるためのトランスフェリン受容体２のアンタゴニスト及びアゴニスト
KR20220034176A (ko) 치아의 재생 치료를 위한 usag-1을 표적 분자로 한 중화 항체
HK1253717B (en) Methods for treating osteogenesis imperfecta
HK1213576B (en) Methods for treating osteogenesis imperfecta
NZ712353B2 (en) Methods for treating osteogenesis imperfecta
BR112015023905B1 (pt) Usos de um anticorpo ou de fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao fator de transformação de crescimento beta no tratamento de osteogênese imperfeita