RS58831B1 - Humanizovano anti kalikrein-2 antitelo - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na oblast terapeutskih i dijagnostičkih sredstava i njihove medicinske upotrebe, posebno u oblasti kancera prostate.

Stanje tehnike

[0002] Kancer prostate je do sada najviše zastupljeni oblik kancera kod muškaraca. Prostata je žlezda veličine oraha kod muškaraca koja proizvodi tečnost koja čini komponentu semene tečnosti. Prostata ima dva ili više lobusa, ili delova, koji su zatvoreni spoljašnjim slojem tkiva. Prostata se nalazi ispred rektuma i tačno ispod mokraćne bešike, i okružuje uretru.

[0003] Pojava kancera prostate je najveća u severozapadnom delu Evrope i u Sjedinjenim Državama. Tumorski rast je obično proces koji se odvija tokom dugog vremenskog perioda. Kancer prostate je normalno blaži oblik kancera. Zapravo, većina muškaraca kojima je dijagnoziran kancer prostate preživi i oporavi se, sa samo manjim brojem muškaraca koji se susreću sa agresivnijim oblikom kancera prostate, koji metastazira u ranijem stadijumu. Ovaj agresivni oblik kancera prostate može da bude izlečiv samo ako se dijagnostikuje u ranoj fazi, pre nego što se kancer proširi do ekstrakapsularnog tkiva.

[0004] Danas, dijagnoza i praćenje kancera prostate se obično izvodi merenjem koncentracije antigena koji je specifičan za prostatu (PSA) u krvi pacijenta. Ukoliko je koncentracija PSA izrazito visoka kroz nekoliko uzastopnih merenja, izvedenih u različitim vremenskim tačkama, procenjuje se da postoji verovatnoća raka prostate. U tom trenutku može se izvesti biopsija kako bi se potvrdio kancer prostate.

[0005] PSA (takođe poznat pod imenom kalikrein III) je protein, sastavljen od jednog lanca od 237 aminokiselina, koji se proizvodi u sekretornim ćelijama prostate. Ove sekretorne ćelije mogu da se nađu u celoj žlezdi prostate. PSA je dobro uspostavljeni i temeljno istraženi marker u pogledu raka prostate. U poređenju sa zdravim ćelijama, proizvodnja PSA je niža kod malignih ćelija i veća je kod hiperplastičnih ćelija. Prilično je kontradiktorno da je koncentracija PSA veća u krvi muškaraca koji imaju kancer prostate. Međutim, jedno objašnjenje može da bude da maligne ćelije imaju pogoršanu ćelijsku strukturu, i stoga su više propusne za PSA.

[0006] Druga važna serin proteaza koja je pogodna kao meta za terapiju kancera prostate je humani glandularni kalikrein 2 (hK2). Gen koji kodira hK2 se nalazi na hromozomu 19, zajedno sa genom koji kodira za PSA. hK2 se uglavnom eksprimira u tkivu prostate, isto kao PSA. U prostati, PSA se nalazi u neaktivnom pro-obliku i aktivira se delovanjem peptidaze na hK2. Imunohistohemijsko ispitivanje u odnosu na hK2 je pokazalo da je hK2 eksprimiran prema nivou diferencijacije. Ovo znači da se hK2 eksprimira u većem prinosu u manje difrenciranim tkivima, kao što je tkivo izloženo kanceru prostate, i u nižem prinosu u više diferenciranom tkivu, kao što je tkivo izloženo hiperplaziji prostate (BPH) koji je drugi uobičajeni problem u vezi sa prostatom.

[0007] Današnje terapije kancera prostate su operacija (npr., radikalna prostatektomija), terapija zračenjem (uključujući, brahiterapiju i terapiju spoljašnjim zračenjem, fokusiranim ultrazvukom visokog intenziteta (HIFU), hemoterapiju, oralne hemoterapeutske lekove, kriooperaciju (zamrzavanje tumora), hormonalnu terapiju (kao što je terapija antiandrogenima), kastraciju ili kombinacije gore navedenog.

[0008] Većina ovih terapija (operacija i terapija spoljašnjim zračenjem) su, međutim, samo (ili primarno) korisne za lečenje primarnih tumora i velikih metastaza. Hemoterapija se koristi za kancer koji se širi ali za većinu ovih pacijenata, predstavlja palijativni efekat i/ili produženo preživljavanje. Prema tome, potrebni su drugi ili komplementarni modaliteti lečenja da bi se postigla značajna poboljšanja proširenih malignih bolesti, posebno u slučajevima mikrometastaza.

[0009] WO 2013/061083 (Fredax AB) prikazuje sredstva koja obuhvataju ili se sastoje iz vezujućeg ostatka sa specifičnošću za protein kalikrein (na primer, PSA ili hK2) za upotrebu u lečenju kancera prostate, i postupka za lečenje kancera prostate kod pacijenta.

[0010] Fisher et al. (2002) Prostate 51;153-165 prikazuje dobijanje hK2-specifičnih monoklonskih antitela.

[0011] Terapija, kao što je terapija ili radioimunoterapija, korišćenjem ciljnih molekula kao što su antitela i fragmenti može da daje mogućnost terapije bolesti koja se raširila.

[0012] Prema tome, postoji potreba za novim terapeutskim sredstvima i medicinskim upotrebama za ciljanje i dijagnostiku raka prostate.

Suština pronalaska

[0013] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima koji se ovde navode.

[0014] Prema tome, predmetni pronalazak nastoji da ublaži, ublaži ili eliminiše jedan ili više od gore identifikovanih nedostataka u oblasti tehnike i nedostataka pojedinačno ili u bilo kojoj kombinaciji i rešava najmanje gore pomenute probleme obezbeđivanjem terapeutskih sredstava i medicinskih upotreba prema priloženim patentnim zahtevima.

[0015] Prvi aspekt predmetnog pronalaska obezbeđuje polipeptid antitela sa specifičnošću vezivanja za humani kalikrein-2 (hK2), pri čemu polipeptid antitela obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata ili se sastoji iz sekvence aminokiselina SEQ ID NO:8 i varijabilni region teškog lanca koji obuhvata ili se sastoji iz aminokiseline SEQ ID NO:9, i pri čemu varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca sadrže region okvir sekvenci aminokiselina iz jednog ili više humanih antitela.

[0016] Prema tome, polipeptidi antitela iz pronalaska obuhvataju:

(a) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata sekvence aminokiselina SEQ ID NO:1 i SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3

CDRH1: SDYAWN SEQ ID NO: 1

CDRH2: YISYSGSTTYNPSLKS SEQ ID NO: 2

CDRH3: GYYYGSGF SEQ ID NO: 3

i

(b) varijabilni region lakog lanca koji obuhvata sekvence aminokiselina SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6

CDRL1: KASESVEYFGTSLMH SEQ ID NO: 4

CDRL2: AASNRES SEQ ID NO: 5

CDRL3: QQTRKVPYT SEQ ID NO: 6

pri čemu varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca obuhvataju okvir sekvenci aminokiselina iz jednog ili više humanih antitela.

[0017] Gore navedenih šest sekvenci aminokiselina predstavljaju regione koji određuju komplementarnost (CDRs) polipeptida antitela iz pronalaska, kao što se definiše prema Kabat et al., (1991) Sequences of Immunological Interest, 5th edition, NIH, Bethesda, MD.

[0018] Pod "polipeptid antitela" mi uključujemo u suštini intaktne molekule antitela, jednolančana antitela, diantitela, bispecifična antitela, teške lance antitela, lake lance antitela, homodimere i heterodimere teških i/ili lakih lanaca antitela, kao i fragmente vezivanja antitela i derivate istog.

[0019] Termin "aminokiselina" kao što se ovde koristi uključuje standardnih dvadeset aminokiselina kodiranih genima i njihove odgovarajuće stereoizomere u ’D’ obliku (u poređenju sa prirodnim ’L’ oblikom), omega-aminokiselinama i drugim aminokiselinama koje se nalaze u prirodi, nekonvencionalnim aminokiselinama (npr. α,α-disupstituisanim aminokiselinama, N-alkil aminokiselinama, itd.) i hemijski derivatizovanim aminokiselinama (videti ispod).

[0020] Kada je aminokiselina specifično obeležena, kao što je "alanin" ili "Ala" ili "A", termin se odnosi i na L-alanin i D-alanin osim ukoliko nije izričito drugačije navedeno. Druge nekonvencionalne aminokiseline mogu takođe da budu pogodne komponente za polipeptide iz predmetnog ponalaska, sve dok polipeptid zadržava željeno funkcionalno svojstvo. Za prikazane peptide, svaki kodirani ostatak aminokiseline, gde je potrebno, se predstavlja oznakom od jednog slova, koja odgovara trivijalnom imenu konvencionlane aminokiseline.

[0021] U jednom izvođenju, polipeptidi kao što je ovde definisano obuhvataju ili se sastoje iz L-amino kiselina.

[0022] Polipeptidi antitela iz pronalaska ispoljavaju specifičnost za hK2.

[0023] Primer hK2 sekvence je opisan kao Transkript: KLK2-201 (ENST00000325321), proizvod gena ENSG00000167751, kao što je navedeno u grupnoj bazi podataka koja se može naći na sledećoj internet adresi: ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Sequence_Protein?g=ENSG00000167751; r=19:51376689-51383822;t=ENST00000325321 i ima sledeću sekvencu:

(pri čemu je podvučena sekvenca zrelog, aktivnog hK2 proteina, koja prethodi njegovom N-kraju signalnim peptidom i propeptidnom sekvencom).

[0024] Većina hK2 koji se nalazi u semenoj plazmi je u inaktivnom obliku i nalazi se u kompleksu sa proteinom C inhibitorom (PCI). Takođe je moguće da hK2 obrazuje komplekse sa drugim vanćelijskim proteaznim inhibitorima. In vitro ispitivanja pokazuju da hK2 može da se veže za α2-antiplazmin (α2-AP), ACT, AMG, anti-trombin III (ATIII), C1-inaktivator i inhibitor-1 aktivator plazminogena (PAI-1).

[0025] U jednom izvođenju, polipeptid antitela je specifičan za slobodnu (to jeste, ne nalazi se u kompleksu sa) izoobliku hK2 u poređenju sa izooblikom hK2 u koji se nalazi u kompleksu. Ostaci vezivanja sa specifičnošću za slobodni izooblik hK2 može da ima specifičnost vezivanja za epitop koja je izložena na slobodnom izoobliku hK2, ali nije izložen na kompleksnom izoobliku hK2, i može da bude linearni ili konformacionalni (koji je, ne-linearni) epitop. Na primer, polipeptid antitela može da ima specifičnost za epitop koja uključuje jedan ili više ostataka aminokiselina koji su deo katalitičkog procepa u hK2 koji je izložen u slobodnom hK2 i nije izložen u kompleksnom izoobliku, kao što je oblik koji se nalazi u semenoj tečnosti kada se hK2 nalazi u kompleksu sa PCI. Mapiranje epitopa hK2 se opisuje u Väisänen et al, Clinical Chemistry 50:9, 1607-1617 (2004).

[0026] Dalji primeri hK2 proteina su identifikovani pomoću sledećih pristupnih brojeva:

(a) GenBank: AAF08277.1;

(b) GenBank: AAF08275.1; i

(c) UniProtKB/Swiss-Prot: P20151.1

[0027] Proizvodnja rekombinovanog hK2 se opisuje u Lovgren et al., 1999, Eur. J. Biochem.266:1050-5.

[0028] Pod "specifičnosti" smatramo da je polipeptid antitela sposoban za vezivanje sa hK2 in vivo, tj. pod fiziološkim uslovima u kojima hK2 postoji u humanom telu. Poželjno, polipeptid antitela se ne vezuje za bilo koji drugi protein in vivo.

[0029] Takva specifičnost vezivanja može da se odredi postupcima koji su dobro poznati u oblasti tehnike, kao što je ELISA, imunohistohemija, imunoprecipitacija, Western blotovi i protočna citometrija upotrebom transfektovanih ćelija koje eksprimiraju hK2. Povoljno, polipeptid antitela može selektivno da se vezuje za hK2, tj. vezuje se najmanje 10-puta jače za hK2 u odnosu na druge proteine (posebno, drugi kalikreini kao što je antigen specifičan za prostatu ili PSA). Poželjno, polipeptid antigena se ne vezuje za PSA in vivo.

[0030] U oblasti tehnike su poznata mišja antitela koja su specifična za hK2. Na primer, Väisänen et al., 2004, Clinical Chemistry 50(9):1607-1617 opisuje proizvodnju monoklonskih antitela u miševima koji su specifični za hK2. Navedeno je da su dva antitela, koja su naznačena sa "11B6" i "7D7", selektivna za hK2.

[0031] Sekvence aminokiselina komponenti teških i lakih lanaca mišjeg antitela 11B6 su prikazane u međunarodnoj prijavi patenta. WO 2013/061083); videti, u tome posebno, SEQ ID NOs: 4 i 5.

[0032] Polipeptidi antitela iz predmetnog pronalaska su zasnovani na humanizovanoj verziji 11B6 antitela, koja ispoljava neočekivana korisna svojstva.

[0033] Posebno, humanizovana antitela iz pronalaska ispoljavaju unapređeni terapeutski odnos 11B6 antitela (m11B6) od koga su izvedene njegove CDR sekvence (videti Primer 6).

[0034] Pod "poboljšani terapeutski odnos" mislimo na polipeptid antitela iz pronalaska (humanizovani oblik 11B6 antitela), kada se daje pacijentu sa tumorom prostate, obezbeđuje veći odnos apsorbovane doze tumora prema (zdravoj) kostne srži apsorbovane doze u odnosu na roditeljsko 11B6 antitelo (u poređenju sa istom radioaktivnosti i načinom davanja). Odnos apsorbovanih doza tumora u odnosu na kostnu srž može da se izračuna korišćenjem postupka koji se opisuju u Primeru 6.

[0035] Neočekivano bolji terapeutski profil antitela iz pronalaska dozvoljava veće doze zračenja (apsorbovane doze) koje treba da se koriste, što vodi do veće efikasnosti u lečenju kancera prostate bez povećanja nepoželjnih efekata ili ’korateralne štete’ prema zdravim tkivima i organima.

[0036] Humanizacija (takođe poznata pod imenom preoblikovanje ili CDR-grafting) je postupak kojim se smanjuje imunogenogenost monoklonskih antitela iz ksenogenih izvora (uobičajeno, iz glodara kao što su miševi) i za poboljšanje njihove aktivacije humanog imunskog sistema (videti revijski pregled Almagro & Fransson, 2008, Frontiers in Bioscience 13:1619-1633). Postoji nekoliko humanizovanih monoklonskih antitela u kliničkim ispitivanjima i nekolicina je dobila odobrenje za korišćenje kao lekovi. Iako, relativno jednostavnim mehanikama za proizvodnju modifikovanog monoklonskog antitela korišćenjem postupaka molekularne biologije, jednostavni grafting regiona koji određuju komplementarnost poreklom iz glodara (CDRs) u humane okvirne regione ne rekonstituiše uvek afinitet vezivanja i specifičnost originalnog monoklonskog antitela. Da bi se antitelo humanizovalo, dizajn humanizovanog antitela je kritični korak u reprodukovanju funkcije originalnog molekula.

[0037] Dizajn humanizovanog antitela uključuje nekoliko ključnih izvora, uključujući obim CDR-e koji treba da se koriste i humani okvirni regioni koji treba da se koriste. Međutim, da bi se zadržala specifičnost roditeljskog antitela, može da bude kritično da se jedan ili više ostataka substituišu sa jednim ili više ostataka iz glodarskog mAt u humanim okvirnim regionima (takozvane „backmutations“). Identifikovanje položaja neophodnih mutacija koje dovode do reverzije zahteva detaljnu analizu sekvence/strukturnu analizu. Nedavno, biblioteke fagova se koriste za razlikovanje aminokiselina . Slično, korišćeni su mnogi pristupi za odabir najpogodnijih humanih okvirnih regiona u kojima se prenosi graft glodarskih CDRs. Rani eksperimenti su koristili ograničeni podset dobro karakterisanih humanih monoklonskih antitela (često gde je struktura dostupna), bez obzira na identičnost sekvence sa glodarskim monoklonskim antitelom (takozvani pristup fiksnih okvira). Neke grupe koriste varijabilne regione sa visokom identičnosti aminokiselina sa varijabilnim regionima glodara (podudaranje homologije ili najbolje uklapanje); drugi koriste konsenzusne ili germinativne sekvence dok još drugi selektuju fragmente iz okvirnih sekvenci unutar varijabilnog regiona svakog lakog ili teškog lanca iz nekoliko različitih humanih monoklonskih antitela. Postoje takođe razvijeni pristupi za humanizaciju koji zamenjuju površinske glodarske ostatke sa najviše zatupljenim ostacima koji se nalaze u humanim monoklonskim antitelima ( engl. "resurfacing" ili "veneering") i oni koji koriste različite definicije iz obima čitavih CDRs.

[0038] Međutim, pored ekstenzivnog ispitivanja humanizacije antitela, neka glodarska monoklonska antitela su se pokazala teškim za humanizaciju.

[0039] Razvijanje antitela polipeptida iz pronalaska zahteva reverzne mutacije ne samo u regionima okvira ali takođe u nekim od CDRs (videti Primer 1 ispod). Prema tome, šest CDR sekvenci predstavljenih gore u SEQ ID NOS: 1 do 6 u izvedeni iz mišjeg anti-hK2 antitela 11B6, ali sadrže mutacije u CDRH2 (SEQ ID NO: 2) i CDRL1 (SEQ ID NO: 4) odnosu na mišje roditeljsko antitelo. Ove mutacije u CDRs su napravljene da bi se potvrdila optimalna specifičnost i stabilnost na humanizovanoj verziji 11B6.

[0040] U jednom izvođenju, polipeptidi antitela iz pronalaska vezuju hK2 sa KDvećom od 0.1 x 10<-9>M.

[0041] Postupci za merenje sveukupnog afiniteta (KD) i brzine asocijacije (ka) i brzine disocijacije (kd) interakcije (kao što je interakcija između antitela i liganda) su dobro poznati u oblasti tehnike. Primeri in vitro postupaka su opisani u Primeru 3 u tekstu ispod. Takođe je moguće koristiti postupke koji se zasnivaju na protočnoj citometriji (Sklar et al., 2002, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 31:97-119.

[0042] Što predstavlja prednost, polipeptid antitela iz pronalaska ima afinitet (KD) za hK2 niži od 1.0 x10<-10>M, na primer KDniži od 9.0 x10<-11>M, 8.0 x10<-11>M, 7.0 x10<-11>M, 6.0 x10<-11>M, 5.0 x10<-11>M, 4.0 x10<-11>M, 3.0 x10<-11>M, 2.0 x10<-11>M ili niži od 1.0 x10<-11>M.

[0043] Stručnjacima iz oblasti tehnike će biti jasno da polipeptidi antitela iz pronalaska mogu da sadrže teške lance antitela, lake lance antitela, homodimere i heterodimere teških i/ili lakih lanaca antitela, i fragmente koji se vezuju za antigen i derivate istog.

[0044] U jednom izvođenju, polipepid antitela obuhvata ili se sastoji od intaktnog (tj. kompletnog) antitela, kao što je IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM molekul.

[0045] Što predstavlja prednost, polipeptid antitela obuhvata ili se sastoji iz intaktnog IgG molekula, ili fragment za vezivanje antigena ili derivata istog.

[0046] Molekul IgG može da bude bilo kog poznatog podtipa, na primer IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.

[0047] Pod "antigen-vezujući fragmenti i derivati" antitela mi uključujemo Fv fragmente (npr. jednolančani Fv i disulfidom vezani Fv), Fab-slični fragmenti (npr. Fab fragmenti, Fab’ fragmenti i F(ab)2fragmenti) i antitela domena (npr. pojedinačni VHvarijabilni domeni ili VLvarijabilni domeni).

[0048] Na primer, polipeptid antitela može da obuhvati ili da se sastoji iz scFv ili Fab fragmenta.

[0049] Dalja karakteristika koja odlikuje polipeptide antitela iz predmetnog pronalaska je prisustvo sekvenci aminokiselina regiona okvira i jednog ili više humanih antitela u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca.

[0050] Pod "sekvence regiona okvira" mi uključujemo regione varijabilnih domena teškog i lakog lanca koji nisu CDRs. Obično, svaki varijabilni domen će sadržati četiri regiona okvira, koji su naznačeni sa FR1 do FR4, unutar kojih se CDR sekvence nalaze:

FR1 ----CDR1 ----FR2 ----CDR2 ----FR3 ----CDR3 ----FR4

[0051] Razume se da sekvence aminokiselina iz regiona okvira mogu da budu u potpunosti humane ili mogu da sadrže jednu ili više reverznih mutacija (tj. sekvenca aminokiseline koja se nalazi u humanom regionu okvira može da bude supstituisana sa aminokiselinom koja se nalazi na odgovarajućem položaju unutar roditeljskog varijabilnog domena od koga su dobijeni CDRs). Stoga, sekvence FR1, FR2, FR3 i/ili FR4 varijabilnih domena teškog i/ili lakog lanca polipeptida antitela iz pronalaska mogu da se ne nalaze u prirodi.

[0052] U jednom izvođenju, sekvence okvira regiona polipeptida antitela dele najmanje 70% identiteta sekvence sa regionima okvira iz jednog ili više humanih antitela, na primer najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više. Prema tome, polipeptid antitela može da sadrži FR1 region teškog lanca koji deli najmanje 70% identiteta sekvence sa FR1 regionom humanog antitela. Treba imati u vidu, međutim, da teški i laki lanci polipeptida antitela mogu da dele identitet sekvence sa regionima okvira različitih humanih antitela.

[0053] Procenat identiteta, na primer, LALIGN program (Huang and Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357) i Expasy facility site (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN-form.html) upotrebom parametara za opciju globalnog poravnanja, matrice bodovanja BLOSUM62, „opening gap penalty“ 14, „extending gap penalty“ -4. Alternativno, procenat identiteta sekvence između dva polipeptida može da se odredi korišćenjem odgovarajućih kompjuterskih programa, na primer GAP programa od University of Wisconsin Genetic Computing Group i treba razumeti da se procenat identičnosti računa u odnosu na polipeptide čije su sekvence optimalno poravnate.

[0054] Poravnanje može alterativno da se izvede korišćenjem Clustal W programa (kao što je opisano u Thompson et al., 1994, Nucl. Acid Res. 22:4673-4680). Korišćeni parameri mogu da budu prema sledećem:

-Brzi ’pair-wise’ parametri poravnanja: K-tuple(reč) veličina; 1, veličina prozora; 5, gap penalty; 3, broj gornjih dijagonala; 5. Postupak bodovanja: x procenta.

-Multipli parametri bodovanja: ’gap open penalty’; 10, ’gap extension penalty’; 0.05.

-Matrica bodovanja: BLOSUM.

[0055] Alternativno, BESTFIT program može da se koristi za određivanje poravnanja lokalne sekvence.

[0056] U jednom izvođenju, sekvence regiona okvira varijabilnog regiona teškog lanca polipeptida antitela iz pronalaska su kodirane genskom familijom humanog imunoglobulina VH4.

[0057] Na primer, sekvence regiona okvira mogu da budu kodirane, najmanje delom, pomoću VH4-28 germinativnog gena (npr. FR1, FR2 i FR3 mogu da budu kodirane pomoću VH4-28 i FR4 mogu da budu kodirane pomoću JH1).

[0058] Polipeptid antitela iz predmetnog pronalaska obuhvata varijabilni region teškog lanca koji obuhvata ili se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO:8:

i varijabilnog regiona lakog lanca koji obuhvata ili se sastoji iz sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 9:

[0059] U jednom izvođenju, sekvence okvira varijabilnog regiona lakog lanca polipeptida antitela iz pronalaska su kodirane genskom familijom humanog imunoglobulin Kapa V4.

[0060] Na primer, sekvence regiona okvira mogu da budu kodirane, najmanje delom, pomoću IgkV4-B3 germinativnog gena (npr. FR1, FR2 i FR3 može da bude kodiran pomoću IgkV4-B3 i FR4 može da bude kodiran pomoću JK2).

[0061] Pod "najmanje delom" mi uključujemo da sekvence regiona okvira sadrže najmanje deset susednih aminokiselina kodiranih referentnim genom, na primer najmanje 20 susednih aminokiselina. Mi takođe uključujemo da jedan ili više, ali ne sve, regione FR su kodirani referentnim genom (na primer, FR1 i FR2 mogu da budu kodirani referentnim genom, ali ne FR3).

[0062] Opciono, polipeptid antitela iz pronalaska dalje obuhvata konstantni region teškog lanca, ili njegov deo.

[0063] U jednom izvođenju, polipeptid antitela obuhvata CH1, CH2 i/ili CH3 region od IgG teškog lanca (kao što je teški lanac IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4). Prema tome, polipeptid antitela može da sadrži deo ili sve od konstantnih regiona iz teškog lanca IgG1. Na primer, polipeptid antitela može da bude Fab fragment koji obuhvata konstantne regione CH1 i CL.

[0064] U jednom izvođenju, polipeptid antitela može da sadrži Fc-region antitela. Stručnjaku iz oblasti tehnike će biti jasno da Fc porcija može da bude od IgG antitela, ili od različite klase antitela (kao što je IgM, IgA, IgD ili IgE). U jednom izvođenju, Fc region je iz IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 antitela.

[0065] Fc region može da se nalazi u prirodi (npr. deo endogeno proizvedenog antitela) ili može da bude veštačko (npr. da se sastoji iz jedne ili više tačkastih mutacija u odnosu na Fc region koji se nalazi u prirodi i/ili modifikacijama ostataka ugljenih hidrata unutar CH2 domena). Fc-regioni sa tačkastim mutacijama koje unapređuju njihovu sposobnost vezivanja za FcR može da bude prednost, npr. menjanjem polu-života seruma ili modulacijom (tj. povećanjem ili smanjenjem) vezivanja za Fcγ receptore (FcγR) uključene u ADCC i CDC.

[0066] Što predstavlja prednost, polipeptid antitela može da sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 10, ili njegov deo:

[0067] Opciono, polipeptid antitela iz pronalaska dalje obuhvata konstantni region lakog lanca, ili njegov deo.

[0068] U jednom izvođenju, polipeptid antitela obuhvata CL region lakog lanca IgG (kao što je kapa ili lamba laki lanac).

[0069] Na primer, polipeptid antitela može da obuhvata sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 11, ili njegov deo:

[0070] Što predstavlja prednost, polipeptid antitela obuhvata konstantni region teškog lanca koji obuhvata ili sadrži sekvencu aminokiseline SEQ ID NO: 10 i konstantni region lakog lanca koji obuvata ili sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 11.

[0071] U jednom poželjno izvođenju, polipeptid antitela iz pronalaska obuhvata:

(a) teški lanac koji obuhvata ili se sastoji iz sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 12 (pri čemu je varijabilni region napisan masnim slovima i CDR sekvence su uokvirene boksom i italik)

i/ili

(b) laki lanac koji obuhvata ili se sastoji iz sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 13 (pri čemu je varijabilni region obeležen masnim slovima i CDR sekvence su uokvirene boksom i italik)

1

[0072] Na primer, polipeptid antitela može da obuhvati ili da se sastoji iz dva laka lanca SEQ ID NO: 12 i dva laka lanca SEQ ID NO: 13, spojena zajedno disulfidnim mostovima da bi se obrazovala uobičajena struktura IgG antitela.

[0073] Polipeptidi antitela iz pronalaska mogu da sadrže ili da se sastoje iz jedne ili više aminokiselina koje su modifikovane ili derivatizovane.

[0074] Hemijski derivati jedne ili više aminokiselina mogu da se postignu reagovanjem sa funkcionalnom bočnom grupom. Takvi derivatizovani molekuli uključuju, na primer, molekule kod kojih su slobodne amino grupe derivatizovane da bi se obrazovali amin hlorovodonici, p-toluen sulfonil grupe, karboksibenzoksi grupe, t-butiloksikarbonil grupe, hloroacetil grupe ili formil grupe. Slobodne karboksilne grupe mogu da budu derivatizovane da bi se obrazovale soli, metil i etil estri ili drugi tipovi estara i hidrazidi. Slobodne hidroksilne grupe mogu da budu derivatizovane da se obrazuju O-acil ili O-alkil derivati. Takođe uključeni kao hemijski derivati su oni peptidi koji sadrže derivate aminokiselina koje se nalaze u prirodi koje pripadaju standardnim dvadeset aminokiselina. Na primer: 4-hidroksiprolin može da bude supstituisan prolinom; 5-hidroksilizin može da bude supstituisan lizinom; 3-metilhistidin može da bude supstituisan histidinom; homoserin može da bude supstituisan serinom i ornitin lizinom. Derivati takođe uključuju peptide koji sadrže jednu ili više adicija ili delecija sve dok se održava neopodna aktivnost. Druge uključene modifikacije su, amino terminalna acilacija (npr. acetilation ili amidacija tioglikolne kiseline), terminalna karboksilamidacija (npr. sa amonijakom ili metilaminom), i slične terminalne modifikacije.

[0075] Stručnjaku iz oblasti tehnike će dalje biti jasno da takođe mogu da budu korisna peptidno mimetička jedinjenja. Termin ’peptidomimetički’ se odnosi na jedinjenje koje imitira konformaciju i poželjne karakteristike određenog peptida kao terapeutskog sredstva.

[0076] Na primer, pomenuti polipeptid uključuje ne samo molekule u kojima su ostaci aminokiseline spojeni peptidnim vezama (-CO-NH-) već takođe molekuli u kojima je peptidna veza obrnuta. Takvi retro-inverzo peptidomimetici mogu da se naprave korišćenjem, na primer kao što su oni koji se opisuju u Meziere et al. (1997) J. Immunol.159, 3230-3237. Ovaj pristup uključuje pravljenje pseudopeptida koji sadrže naelektrisanje koje uključuje bočni lanac, i ne orijentaciju bočnih lanaca. Retroinverzni peptidi, koji sadrže NH-CO veze umesto CO-NH peptidnih veza, su mnogo više rezistentni na proteolizu. Alternativno, pomenuti polipeptid može da bude peptidomimetičko jedinjenje pri čemu su jedan ili više ostataka aminokiselina povezani sa -y(CH2NH)-vezom umesto konvencionalne amidne veze.

[0077] U daljoj alternativi, peptidna veza može u potpunosti da se izostavi pod uslovom da je korišćena odgovarajuća grupa za povezivanje koja zadržava razmak između ugljenikovih atoma; može da predstavlja prednost za ostatak za povezivanje da u suštini ima istu distribuciju naelektrisanja i u suštini istu planarnost kao peptidna veza.

[0078] Razume se da pomenuti polipeptid može pogodno da bude blokiran na njegovom N-ili C-kraju tako da pomogne da se smanji podložnost egzo-proteolitičkoj digestiji.

[0079] Različite ne-kodirane ili modifikovane aminokiseline kao što su D-aminokiseline i N-metil aminokiseline su takođe korišćene za modifikovanje sisarskih peptida. Dodatno, pretpostavljena bioaktivna konformacija može da se stabilizuje kovalentnom modifikacijom, kao što je ciklizacija ili uključivanjem laktama ili drugih tipova mostova, za primer videti Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636 and Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm.111:166.

[0080] Stručnjacima iz oblasti tehnike će dalje biti jasno da polipeptidi antitela iz pronalaska mogu da budu uvećani sa funkcionalnim ostatkom da se olakša njihova namenjena upotreba, na primer kao in vivo sredstvo za snimanje ili terapeutsko sredstvo.

[0081] Prema tome, u jednom izvođenju, polipeptid anititela je vezan, direktno ili indirektno za, terapeutski ostatak.

[0082] Može da se koristi bilo koji pogodni terapeutski ostatak. Pogodni terapeutski ostatak je onaj koji je sposoban za smanjenje ili inhibiranje rata, ili posebno ubijanje, ćelije kancera prostate. Na primer, terapeutsko sredstvo može da bude citotoksični ostatak. Citotokični ostatak može da sadrži ili da se sastoji iz jednog ili više radioizotopa. Na primer, jedan ili više radioizotopa mogu svaki nezavisno da budu izabrani iz grupe koja se sastoji iz beta-emitera, Auger-emitera, konverzije elektronskih emitera, alfa-emitera, i emitera niske energije fotona. Može biti poželjno da jedan ili više radioizotopa svaki nezavisno ima obrazac emisije lokalno apsorbovane energije koja kreira visoku apsorbovanu dozu u bliini redstva. Primeri radioizotopa mogu da uključe beta emitere dugog opsega, kao što su<90>Y,<32>P,<186>Re/<188>Re;<166>Ho,<76>As/<77>As,<89>Sr,<153>Sm; beta emitere srednjeg opsega, kao što su<131>I,<177>Lu,<67>Cu,<161>Tb,<105>Rh; beta emitere niske energije, kao što su<45>Ca or<35>S; konverzijske ili Auger-emitere, kao što su<51>Cr,<67>Ga,<99>Tc<m>,<111>In,<114m>In,<123>I,<125>I,<201>Tl; i alfa-emitere, kao što su<212>Bi,<213>Bi,<223>Ac,<225>Ac,<212>Pb,<255>Fm,<223>Ra,<149>Tb i<221>At. Dostupni su drugi radionuklidi i biće odgovorni za upotrebu u terapiji.

[0083] U drugom izvođenju, može biti poželjno da terapeutski ostatak ili citotoksični ostatak nije ostatak kako je prikazano kao "tragaču" u WO 2006/087374 A1, i posebno na strani 11, linijama 7-15 njihovih lekova, na primer, citostatički lek; anti-androgeni lek; kortizon i njegovi derivati; fosfonat; inhibitor testosteron-5-α-reduktaze; dodati bor; citokin; tapsigargin i njegovi metabiliti; toksin (kao što je saporin ili kaliceamicin); hemoterapeutsko sredstvo (kao što je antimetabolit); ili bilo koji drugi terapeutski ili citotoksični lek koji je koristan u lečenju karcinoma prostate.

[0084] U jednom poželjnom izvođenju, polipeptid antitela je povezan sa (ili na drugi način obeležen sa) radioizotopom<177>Lu.

[0085] Alternativno, terapeutski ostatak može da obuhvata ili da se sastoji iz jednog ili više terapeutskih (kao što su citotoksični) lekova, na primer, citostatski lek; anti-androgeni lek; kortizon i njegovi derivati; fosfonat; inhibitor testosteron- 5-α-reduktaze; dodati bor; citokin; tapsigargin i njegovi metaboliti; toksin (kao što je saporin ili kaliheamicin); hemoterapeutsko sredstvo (kao što je antimetabolit); ili bilo koji drugi terapeutski ili citotoksični lek koji je koristan u lečenju karcinoma prostate.

[0086] Primeri terapeutskih/citotoksičnih lekova mogu, na primer, da uključe:

• Citostatike, posebno one sa dozno ograničenim nepoželjnim efektima, uključujući ali bez ograničenja ciklofosamid, hlorambucil, ifosfamid, busulfan, lomustin, taksane, estramustin fosfat i druge azotne iperite, antibiotike (uključujući doksorubicin, caliceamicini i esperamicin), vinka alkaloidi, azaridini, jedinjenja koja sadrže platinu, endostatin, alkil sulfonati, nitrozouree, triazene, analoge folne kiseline, analoge pirimidina, analoge purina, enzime, substituisana urea, derivati metil-hidrazina, daunorubicin, amfipatični amini,

• Anti-androgeni kao što su flutamid i bikalutamid i njihovi metaboliti;

• Kortizon i njihovi derivati;

• Fosfonati kao što su difosfonat i bufosfonat;

• Testosteron-5-α-reduktazni inhibitori;

• Dodaci bora;

• Citokini;

• Tapsigargin i njegovi metaboliti;

• Druga sredstva koja se koriste u tretmanu karcinoma prostate.

[0087] Alternativno, citotoksični ostatak može da obuhvati ili da se sastoji iz jednog ili više ostataka pogodnih za upotrebu u aktivacionoj terapiji, kao što je fotonska aktivaciona terapija, neutronska aktivaciona terapija, neutronska indukovana Auger elektronska terapija, sinhrotrona terapija zračenjem ili nisko energetska fotonska terapija aktivacijom X-zračenja.

[0088] Na primer, sa polipeptidima antitela iz pronalaska će biti potencijal za upotrebu sinhrotronog zračenja (ili nisko energetskih X-zraka) za unapređenje radioterapije, primarno fokusirajući se na takozvanu foto-aktivacionu radioterapiju (PAT), u kojoj lokalno deponovanje energije iz spoljašnjeg zračenja X-zracima je pojačano u tkivu kancera interakcijom sa prethodno ordiniranim, visokim-Z tumorskim-ciljnim sredstvom.

[0089] Modalitet PAT tretmana koristi monohromatska X-zračenja iz sinhrotronog izvora, kao što je obezbeđeno od strane ID17 biomedicinskog beamline na European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) u Grenoblu, i kako je predviđeno da bude dostupno u drugim objektima u bubućnosti kao što je novi Švedski sinhrotroni objekat, Max-IV.

[0090] Kao dalji potencijal modaliteta za lečenje, istraživanje na "indukovanoj Auger elektronskoj terapiji tumora" je dolazak European Spallation Source (ESS) u Lundu, i nadamo se medicinska eksperimentalna stanica. Reaktor-proizvedeni termalni i polu-termalni neutroni su duže vreme korišćeni za Bor-Neutron-Capture-Therapy, BNCT, oba za pre-kliničke eksperimente i za lečenje tumora mozga sa indukovanim alfa-česticama i jezgro uzmaka (<7>L) koji daju visoku lokalno apsorbovanu energiju. Slični pristup je upotreba neutrona i pogodnih molekula koji ciljaju tumor koji su obeleženi sa stabilnim jedrima sa visokim poprečnim presekom za neutrone. Antitela ili peptidi mogu na primer da budu obeleženi sa stabilnim Gadolinijumom (<157>Gd) i da deluju kao ciljni molekuli za neutrone koji su uhvaćeni od strane Gd-nukleusa, takozvanom Gadolinijum Neutronskom Terapijom Hvatanja (GdNCT). Pomoću Monte Carlo postupaka, distribucija doze u tumoru i tkivima u okruženju se računa kako se dobija iz γ-fotona, neutrona, nuklearnih (jezgara) uzmaka, kao i karakterističnih x-zrakova, internalne konverzije i Auger-elektrona iz gadolinijuma ili drugih potencijalnih elemenata.

[0091] Kao što se razmatra gore u tekstu, terapeutski ostatak (kao što je radioizotop, citotoksični ostatak ili slično) mogu da budu vezani direktno, ili indirektno, za vezujući ostatak (kao što je antitelo ili njegov fragment). U oblasti tehnike su poznate pogodne grupe za povezivanje i uključuju, na primer, prostetičke grupe, ne-fenolne grupe za povezivanje (derivati N-sukcimidil-benzoata; dodekaborat), helirajuće ostatke od oba, makrocikličnih i acikličnih helatora, kao što su derivati 1,4,7,10-tetraazaciklododekan-1,4,7,10,tetrasirćetne kiseline (DOTA), deferoksamin (DFO), derivati dietilentriaminpentasirćetne kiseline (DTPA), derivati S-2-(4-izotiocijanatobenzil)-1,4,7-triazaciklononan-1,4,7-trisirćetne kiseline (NOTA) i derivati 1,4,8,11-tetraazaciklododekan-1,4,8,11-tetrasirćetne kiseline (TETA), derivati 3,6,9,15-Tetraazabiciklo[9.3.1]-pentadeka-1(15),11,13-trien-4-(S)-(4-izotiocijanatobenzil)-3,6,9-trisirćetne kiseline (PCTA), derivati 5-S-(4-Aminobenzil)1-oksa-4,7,10-triazaciklododekan-4,7,10-tris(sirćetna kiselina) (DO3A) i drugi helirajući ostaci. Upotreba takvih grupa za povezivanje može posebno da bude odgovarajuća u slučajevima gde sredstvo obuhvata ili se sastoji iz antitela ili njegovog fragmenta kao ostatka za vezivanje koji je povezan, preko grupe za povezivanje, za radioizotop kao terapeutskim ostatkom.

1

[0092] Jedna poželjna grupa za povezivanje je DTPA, na primer kao što je korišćeno u<177>Lu-DTPA-[polipeptid antitela iz pronalaska].

[0093] Dalje, poželjna grupa za povezivanje je deferoksamin, DFO, na primer kao što se koristi u<89>Zr-DFO-[polipeptid antitela iz pronalaska].

[0094] Opciono, polipeptid antitela iz pronalaska može (ili ne mora) dalje da obuhvata ostatak koji može da se detektuje. Na primer, ostatak koji se može detektovati može da obuhvata ili da se sastoji od radioizotopa, kao što je radioizotop odabran iz grupe koja obuhvata<99m>Tc,<111>In,<67>Ga,<68>Ga,<72>As,<89>Zr,<123>I i<201>Tl Opciono, sredstvo može da obuhvata par detektabilnih i citotoksičnih radionuklida, kao što su<86>Y/<91>Y ili<124>I/<211>At. Alternativno, sredstvo može da obuhvati radioizotop koji može istovremeno da deluje na višemodalni način kao ostatak koji može da se detektuje i takođe kao citotoksični ostatak da bi se obezbedili takozvani "Multimodality theragnostics". Vezujući ostaci mogu, prema tome da budu spojeni sa nanočesticama koje imaju sposobnost multi-snimanja (na primer, SPECT, PET,MRI, optički, ili ultrazvučno) zajedno sa terapeutskim sposobnostima upotrebom citotoksičnih lekova, kao što su radionuklidi ili hemoterapeutska sredstva. U predmetni pronalazak je takođe uključena mogućnost lečenja hipertermijom korišćenjem visoko frekventnih naizmeničnih magnetnih polja i pratećeg ultrazvučnog snimanja.

[0095] Alternativno, ostatak koji može da se detektuje može da obuhvati ili da se sastoji od paramagnetskog izotopa, kao što je paramagnetski izotop koji je izabran iz grupe koja obuhvata<157>Gd,<55>Mn,<162>Dy,<52>Cr i<56>Fe.

[0096] U slučaju da polipeptid antitela obuhvata ostatak koji može da se detektuje, onda ostatak koji može da se detektuje može da se detektuje postupkom snimanja kao što je SPECT, PET, MRI, optičko ili ultrazvučno snimanje.

[0097] Terapeutski i ostaci koji mogu da se detektuju mogu da budu konjugovani ili na drugi način kombinovani sa polipeptidom antitela pomoću postupaka koji su dobro poznati iz oblasti tehnike (na primer, postojeća terapija imunokonjugatima, gemtuzumab ozogamicin [poznat pod imenom: Mylotarg®], obuhvata monoklonsko antitelo koje je povezano sa citotoksinom kaliceamicinom).

[0098] Dalje, u izvođenju, polipeptid antitela iz pronalaska se koristi za lečenje kancera prostate u obliku formulacije koja obuhvata populaciju molekula polipeptidnih antitela. U jednoj opciji, svi (ili suštini svi, kao što je veće od 90%, 95%, 99%, 99.9% ili više, u odnosu na težinu) molekula peptida iz antitela u populaciji obuhvataju isti terapeutski ostatak. U drugoj opciji, populacija obuhvata smešu drugih sredstava sa različitim terapeutskim ostacima. Ova opcija će dati mogućnosti da se pojačaju efekti ciljane radionuklidne terapije upotrebom različitih sredstava kao što su hemoterapeutska sredstva, sredstva hormonske terapije ili druga kombinacija terapija u kojima ciljno sredstvo ne samo da isporučuje terapeutski aktivne radionuklide u antigene koji su pridruženi tumoru već takođe istovremenom radiosenzibiliše ciljne tumorske ćelije modulacijom (npr. pokretanjem ili blokiranjem) unutarćelijske signalne kaskade. Ova opcija je takođe korisna u lečenju kancera prostate sa smešom citotoksičnih sredstava, na primer, upotrebom koktela alfa-i različitih opsega beta-emitera, ili koktela radionuklida sa različitim opsegom, LET (linearnim transferom energije) i RBE (relativnim biološkim efektom), za konbinovani tretman velikih tumora, mikrometastaza, i pojedinačnih tumorskih ćelija. U jednom izvođenju, emiteri dugog opsega mogu da budu korisni za lečenje velikih tumora, i emiteri kratkih opsega mogu da budu korisni za lečenje manjih tumora kao što su mikrometastaze, i pojedinačne tumorske ćelije.

[0099] Opciono, polipeptid antitela iz predmetnog pronalaska može (ili ne mora) dalje da obuhvata ostatak za povećavanje in vivo polu-života sredstva. Primeri ostataka za povećanje in vivo polu-života sredstva mogu da uključe polietilen glikol (PEG), human serum albumin, grupe za glikozilaciju, masne kiseline i dekstran. PEG se može posebno razmatrati.

[0100] Treba imati u vidu da polipeptidi iz pronalaska mogu da budu liofilizovani za skladištenje rekonstituisani u pogodnom nosaču pre upotrebe, npr. kroz sušenje zamrzavanjem, sušenje raspršivanjem, hlađenje raspršivanjem, ili kroz upotrebu obrazovanja čestica (taloženjem) iz superkritičnog ugljen dioksida. Bilo koji pogodan postupak za liofilizaciju (npr. zamrzavanje isušivanjem, sušenje raspršivanjem, sušenje kolača) i/ili mogu da se koriste postupci za rekonstituciju. Stručnjaci iz oblasti tehnike će imati u vidu da liofilizacija i rekonstitucija može da dovede do različitih stepeni gubitka aktivnosti i ti nivoi upotrebe mogu da se podese da bi se nadoknadili. Poželjno, liofilizovani (osušeni zamrzavanjem) polipeptid gubi ne više od 1% njegove aktivnosti (pre liofilizacije) kada je rehidriran, ili ne više od 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, ili ne više od oko 50% njegove aktivnosti (pre liofilizacije) kada je rehidriran.

[0101] Postupci za proizvodnju polipeptida iz pronalaska su dobro poznati u oblasti tehnike.

[0102] Pogodno, polipeptid je ili obuhvata rekombinovani polipeptid. U oblasti tehnike su poznati pogodni postupci za proizvodnju takvih rekombinovanih polipeptida, kao što je ekspresija u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćina (na primer, videtiSambrook & Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor, New York).

[0103] Polipeptidi antitela iz pronalaska mogu takođe da budu proizvedeni upotrebom komercijalno dostupnog in vitro sistema za translaciju, kao što je lizat zečjih retikulocita ili lizat pšenične klice (dostupan od Promega). Poželjno, sistem za translaciju je lizat zečjeg retikulocita. Pogodno, sistem za translaciju može da bude povezan sa sistemom za transkripciju, kao što je TNT transkripcionitranslacioni sistem (Promega). Ovaj sistem ima prednost proizvodnje pogodnog transkripta iRNK sa kodirajućeg polinukleotida DNK u istoj reakciji kao translacija.

[0104] Stručnjacima iz oblasti tehnike će biti jasno da polipeptidi iz pronalaska mogu alternativno da se veštački sintetišu, na primer korišćenjem dobro poznatih postupaka sinteze na tečnoj-fazni ili čvrstoj-fazi (kao što je t-Boc ili Fmoc čvrsto fazna peptidna sinteza).

[0105] Drugi aspekt iz pronalaska obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid antitela iz pronalaska, ili njegovu komponentu polipeptidnog lanca. Pod "molekul nukleinske kiseline" mi uključujemo DNK (npr. genomska DNK ili komplemetarna DNK) i molekuli iRNK, koji mogu da budu jedno ili dvo-lančani.

[0106] U jednom izvođenju, molekul nukleinske kiseline je molekul cDNK.

[0107] Stručnjacima iz oblasti tehnike će biti jasno da molekul nukleinske kiseline može da bude opimizovan kodonom za ekspresiju polipeptida antitela u određenoj ćeliji domaćinu, npr. za ekspresiju u humanim ćelijama (na primer, videi Angov, 2011, Biotechnol. J.6(6):650-659).

[0108] U poželjnom izvođenju, molekul nukleinske kiseline iz pronalaska obuhvata

(a) nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 14

1

[SEQ ID NO: 14]

i/ili

(b) nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 15

[SEQ ID NO: 15]

[0109] Takođe je sledeće prikazano:

(a) vektor (kao što je ekspresioni vektor) koji obuhvata molekul nukleinske kiseline prema drugom aspektu iz pronalaska;

(b) ćelija domaćina (kao što je sisarska ćelija, npr. humana ćelija) koja obuhvata molekul nukleinske kiseline prema drugom aspektu iz pronalaska ili vektor kao što je gore prikazano; i

(c) postupak za dobijanje polipeptida antitela prema prvom aspektu pronalaska koji obuhvata gajenje populacija ćelija domaćina u kulturi kao što je gore prikazano pod uslovima u kojima je pomenuti polipeptid eksprimiran, i izolovanje polipeptida.

[0110] Treći aspekt pronalaska obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata farmaceutski efikasnu količinu polipeptida antitela iz prvog aspekta pronalaska i farmaceutski prihvatljivi rastvarač, nosač ili ekscipijent.

[0111] Dodatna jedinjenja mogu takođe da budu uključena u farmaceutske kompozicije, uključujući, helirajuća sredstva kao što su EDTA, citrat, EGTA ili glutation.

[0112] Farmaceutske kompozicije mogu da se pripreme na način koji je poznat u oblasti tehnike koji je dovoljno stabilan za skladištenje i pogodan za ordiniranje ljudima i životinjama. Na primer, farmaceutske kompozicije mogu da budu liofilizovane, npr., kroz sušenje zamrzavanjem, sušenje

1

raspršivanjem, hlađenje raspršivanjem, ili kroz upotrebu obrazovanja čestice iz superkritičnog obrazovanja čestice.

[0113] Pod "farmaceutski prihvatljiv" mi označavamo ne-tokični materijal koji ne smanjuje efikasnost kalikrein protein-vezujuće aktivnosti sredstva iz pronalaska. Takvi farmaceutski prihvatljivi puferi, nosači ili ekscipijenti su dobro poznati u oblasti tehnike (videti Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) i Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed ., Pharmaceutical Press (2000).

[0114] Termin "pufer" je namenjen da označi vodeni rastvor koji sadrži kiselinsko-baznu smešu sa svrhom stabilizovanja pH. Primeri pufera su Trizma, Bicin, Tricin, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfat, karbonat, acetat, citrat, glikolat, laktat, borat, ACES, ADA, tartrat, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, kakodilat, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamin, glicin, HEPPSO, imidazol, imidazolmlečnu kiselinu, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO i TES.

[0115] Termin "rastvarač" je namenjen da označi vodeni ili ne-vodeni rastvor sa svrhom razblaživanja sredstva u farmaceutskom preparatu. Rastvarač može da bude jedan ili više od slanog rastvora, voda, polietilnol glikol, propilen glikol, etanol ili ulja (kao što je suncokretovo ulje, ulje kukuruza, ulje kikirikija, ulje lana ili susamovo ulje ).

[0116] Termin "adjuvans" je namenjen da označi bilo koje jedinjenje koje se dodaje u formulaciju da se poveća biološki efekat sredstva iz pronalaska. Adjuvans može da bude jedan ili više od cinka, bakra ili soli srebra sa različitim anjonima, na primer, ali bez ograničenja na fluorid, hlorid, bromid, jodid, tiocijanat, sulfit, hidroksid, fosfat, karbonat, laktat, glikolat, citrat, borat, tartrat, i acetate različitih acilnih kompozicija. Adjuvansi mogu takođe da budu katjonski polimeri kao što su katjonski etri celuloze, katjonski estri celuloze, deacetilovana hijaluronska kiselina, hitozan, katjonski dendrimeri, katjonski sintetički polimeri kao što su poli(vinil imidazol), i katjonski polipeptidi kao što je polihistidin, polilizin, poliarginin, i peptide koji sadrže ove aminokiseline.

[0117] Ekscipijent može da bude jedan ili više od ugljenih hidrata, polimera, lipida i minerala. Primeri ugljenih hidrata uključuju laktozu, glukozu, saharaozu, manitol, i ciklodekstrine, koji se dodaju u kompoziciju, npr., za olakšavanje liofilizacije. Primeri polimera su skrob, etri celuloze, celuloza karboksimetilceluloza, hidroksipropilmetil celuloza, hidroksietil celuloza, etilhidroksietil celuloza, alginati, karagenani, hijaluronska kiselina i njeni derivati, poliakrilna kiselina, polisulfonat, polietilenglikol/polietilen oksid, polietilenoksid/polipropilen oksid kopolimeri, polivinilalkohol/polivinilacetati različitog stepena hidrolize, i polivinilpirolidon, svi različite molekulske težine, koji se dodaju u kompoziciju, npr., za kontrolu viskoziteta, za postizanje bioadhezije, ili za zaštitu lipida od hemijskog i proteolitičkog razlaganja. Primeri lipida su masne kiseline, fosfolipidi, mono-, di-, i trigliceridi, ceramidi, sfingolipidi i glikolipidi, svi različite dužine i zasićenosti acilnog lanca, lecitin iz jaja, sojin lecitin, hidrogenovani lecitin jaja i soje, koji se dodaju u kompoziciju zbog razloga koji su slični onima za polimere. Primeri minerala su talk, magnezijumov oksid, cinkov oksid i titanijum oksid, koji se dodaju u kompoziciju da se dobiju korisni efekti kao što je smanjenje nakupljanja tečnosti ili povoljna svojstva pigmenta.

[0118] Polipeptidi antitela iz pronalaska mogu da budu formulisani u bilo koji tip farmaceutske kompozicije koji je u oblasti tehnike poznat kao pogodan za njegovu isporuku.

[0119] U jednom izvođenju, farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu da budu u obliku lipozoma u kome je kombinovan polipeptid antitela, pored drugih farmaceutski prihvtljivih nosača, sa amfipatičnim sredstvima kao što su lipidi, koji postoje u agregiranim oblicima kao micele, nerastvorljivim monoslojevima i tečnim kristalima. Pogodni lipidi za lipozomalnu formulaciju uključuju,

1

bez ograničenja, monogliceride, digliceride, sulfatide, lizolecitin, fosfolipide, saponin, žučne kiseline, i slično. Pogodni lipidi takođe uključuju gore navedene lipide modifikovane sa poli(etilen glikolom) u polarnoj glavnoj grupi za produžavanje vremena cirkulacije u krvotoku. Priprema takvih lipozomalnih formulacija može da se nađe u primeru US 4,235,871.

[0120] Farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu takođe da budu u obliku biodegradabilnih mikrosfera. Alifatični poliestri, kao što su poli(mlečna kiselina) (PLA), poli(glikolna kiselina) (PGA), kopolimeri PLA i PGA (PLGA) ili poli(karprolakton) (PCL), i polianhidridi su široko korišćeni kao biodegradabilni polimeri u proizvodnji mikrosfera. Pripreme takvih mikrosfera mogu da se nađu u US 5,851,451 i u EP 0213303.

[0121] U daljem izvođenju, farmaceutske kompozicije iz pronalaska su obezbeđene u obliku polimernih gelova, gde polimeri kao što su skrob, celulozni etri, celuloza karboksimetilceluloza, hidroksipropilmetil celuloza, hidroksietil celuloza, etilhidroksietil celuloza, alginati, karagenani, hijaluronska kiselina i njeni derivati, poliakrilna kiselina, polivinil imidazol, polisulfonat, polietilenglikol/polietilen oksid, polietilenoksid/polipropilen oksid kopolimeri, polivinilalkohol/polivinilacetat različitog stepena hidrolize, i polivinilpirolidon su korišćeni za zgušnjavanje rastvora koji sadrži sredstvo. Polimeri takođe mogu da obuhvate želatin ili kolagen.

[0122] Alternativno, polipeptidi antitela mogu jednostavno da budu rastvoreni u slanom rastvoru, vodi, polietilen glikolu, propilen glikolu, etanolu ili uljima (kao što je suncokretovo ulje, ulje kukuruza, ulje kikirikija, laneno ulje ili susamovo ulje), tragakant guma, i/ili različitim puferima.

[0123] Treba imati u vidu da farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu da uključe jone i određenu pH za potenciranje dejstva polipeptida aktivnog antitela. Dodatno, kompozicije mogu biti podvrgnute konvencionalnim farmaceutskim operacijama kao što su sterilizacija i/ili mogu da sadrže konvencionalne adjuvanse kao što su konzervansi, stabilizatori, sredstva za vlaženje, emulgujuća sredstva, puferi, sredstva za punjenje, itd.

[0124] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu da se ordiniraju pomoću bilo kog pogodnog načina koji je poznat stručnjacima iz oblasti tehnike. Prema tome, mogući načini ordiniranja uključuju parenteralni (intravenozni, subkutani, i intramuskularni), topikalni, okularni, nazalni, pulmonarni, bukalni, oralni, parenteralni, i rektalni. Takođe je moguća primena implantata. Infuzija može da bude poželjan način zbog potencijalno visoke citotoksičnosti sredstva koje se ordinira.

[0125] U jednom izvođenju, farmaceutske kompozicije se ordiniraju parenteralno, na primer, intravenozno, intracerebroventrikularno, intraartikularno, intraarterijalno, intraperitonealno, intratekalno, intraventrikularno, intrasternalno, intrakranijalno, intramuskularno ili subkutano, ili mogu da se ordiniraju pomoću postupaka infuzije. Oni se obično koriste u obliku sterilnih vodenih rastvora koji mogu da sadrže druge supstance, na primer, dovoljno soli ili glukoze da se rastvor napravi izotoničnim sa krvi. Vodeni rastvori treba da budu odgovarajuće puferovani (na primer, do pH od oko 3 do 9), ukoliko je potrebno. Priprema odgovarajućih parenteralnih formulacija pod sterilnim uslovima se brzo postiže upotrebom standardnih farmaceutskih postupaka koji su dobro poznati stručnjacima iz oblasti tehnike.

[0126] Formulacije koje su pogodne za ordiniranje uključuju vodene i ne-vodene sterilne rastvore za ubrizgavanje koji mogu da sadrže anti-oksidanse, pufere, bakteriostatike i rastvore koji zadržavaju formulaciju izotoničnom sa krvi namenjenog recipijenta; i vodene i ne-vodene sterilne suspenzije koje mogu da uključe sredstva za suspenziju i sredstva za zgrušnjavanje. Formulacije mogu da se nalaze u jediničnim doznim ili multi-doznim kontejnerima, na primer zatvorenim ampulama i bočicama, i mogu da budu skladištene u stanju koje je osušeno zamrzavanjem (liofilizovanom) koje zahteva samo

1

dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer vode za injekcije, neposredno pre upotrebe. Nepripremljeni rastvori i suspenzije za ubrizgavanje mogu da se pripreme iz sterilnih prahova, granulama i tabletama prethodno opisanih vrsta.

[0127] Prema tome, farmaceutske kompozicije iz pronalaska su posebno odgovarajuće za parenteralno, npr., intravenozno ordiniranje ili lokalno ordiniranje u tumoru kod pacijenta (na primer, intra-tumoralno ili peri-tumoralno).

[0128] Farmaceutske kompozicije će se ordinirati pacijentu u farmaceutski efikasnoj dozi, tj. terapeutski efikasnoj apsorbovanoj dozi terapeutskog radionuklida.

[0129] U kontekstu terapeutske upotrebe polipeptida antitela iz pronalaska, ’farmaceutski efikasna količina’, ili ’efikasna količina’, ili ’terapeutski efikasna’, kao što se ovde koristi, se odnosi na onu količinu koje obezbeđuje terapeutski efekat za dato stanje i režim ordiniranja. Ovo je prethodno određena količina aktivnog materijala koja je izračunata za proizvodi željeni terapeutski efekat zajedno sa željenim aditivom i rastvaračem, tj., nosačem ili nosačem za ordiniranje. Dalje, namenjeno je da se označi količina koja je dovoljna da se redukuje i/ili spreči, klinički značajni deficit u aktivnosti, funkciji i odgovoru domaćina. Alternativno, terapeutski efikasna količina je dovoljna da se uzrokuje poboljšanje u klinički značajnom stanju kod domaćina. Kao što će biti jasno stručnjacima iz oblasti tehnike, količina jedinjenja može da se razlikuje u zavisnosti od njegove specifične aktivnosti. Pogodne dozne količine mogu da sadrže prethodno odrešenu količinu aktivne kompozicije za koju je izračunato da proizvodi željeni terapeutski efekat zajedno sa željenim rastvaračem. U postupcima i upotrebi za dobijanju kompozicija iz pronalaska, obezbeđena je terapeutski efikasna količina aktivnog jedinjenja. Terapeutski efikasna količina može da se odredi od stane medicinskog radnika koji je stručnjak za datu oblast na osnovu karakteristika pacijenta, kao što je starosna dob, težina, pol, stanje, komplikacije, druge bolesti, itd., kao što je dobro poznato u oblasti tehnike (videti Primer 8 ispod). Ordiniranje farmaceutski efikasne doze može da se izvede i jednim ordiniranjem u obliku individualne dozne jedinice ili na drugi način nekoliko manjih doznih jedinica i takđe pomoću višestrukih ordiniranja podeljenih doza u specifičnim intervalima. Alternativno, doze mogu da budu obezbeđene kao kontinuirana infuzija tokom produženog vremena.

[0130] U kontekstu dijagnostičke upotrebe polipeptida antitela iz pronalaska, ’farmaceutski efikasna količina’, ili ’efikasna količina’, ili ’dijagnostički efikasna’, kao što se ovde koristi, se odnosi na onu količinu koja obezbeđuje detektabilni signal za svrhe in vivo snimanja.

[0131] Polipeptidi antitela iz pronalaska mogu da budu formulisani na različitim koncentracijama, u zavisnosti od efikasnosti/toksičnosti jedinjenja koje se koristi. Formulacija može da obuhvata polipeptid na kooncentraciji između 0.1 µM i 1 mM, između 1 µM i 500 µM, između 500 µM i 1 mM, između 300 µM i 700 µM, između 1 µM i 100 µM, između 100 µM i 200 µM, između 200 µM i 300 µM, između 300 µM i 400 µM, između 400 µM i 500 µM i oko 500 µM.

[0132] Obično, terapeutska doza polipeptida antitela (sa ili bez terapeutskog ostatka) kod humanog pacijenta će biti u opsegu od 100 µg do 700 mg po davanju (na osnovu telesne težine od 70kg). Na primer, maksimalna terapeutska doza može da bude u opsegu od 0.1 do 10 mg/kg po ordiniranju, npr. između 0.1 i 5 mg/kg ili između 1 i 5 mg/kg ili između 0.1 i 2 mg/kg. Treba imati u vidu da takva doza može da se ordinira u različitim intervalima, kao što se određuje od strane onkologa\lekara; na primer, doza može da se ordinira dnevno, dva puta nedeljno, nedeljno, dvo-nedeljno ili mesečno.

[0133] Stručnjaku iz oblasti tehnike će biti jasno da farmaceutske kompozicije iz pronalaska mogu zasebno da se ordiniraju ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvima koja se koriste u lečenju kancera postate, ili pre, posle ili u istom vremenu kao što je lečenje pacijenta sa drugim terapeutskim

1

modalitetima za lečenje kancera prostate, kao što su druga terapeutska antitela, operacija (npr., radikalna prostatektomija), radionuklidna terapija, brahiterapija, radioterapija spoljašnjim zračenjem, fokusiranim ultrazvukom visokog intenziteta (HIFU), hemoterapija, oralni hemoterapeutski lekovi, kriooperacija (zamrzavanje tumora), hormonalna terapija (kao što je terapija antiandrogenom), kastracija ili kombinacije gore navedenog.

[0134] Ovde je takođe prikazan kit koji obuhvata polipeptid antitela prema prvom aspektu iz pronalaska ili farmaceutsku kompoziciju prema trećem aspektu iz pronalaska, zajedno sa instrukcijama za upotrebu istog kao što je ovde opisano.

[0135] Četvrti aspekt pronalaska obezbeđuje polipeptid antitela prema prvom aspektu iz pronalaska za upotrebu u medicini.

[0136] Peti aspekt pronalaska obezbeđuje polipeptid antitela prema prvom aspektu iz pronalaska za upotrebu u lečenju i/ili dijagnozi kancera prostate.

[0137] Dalje je ovde prikazan postupak za lečenje kancera prostate kod subjekta, pri čemu postupak dalje obuhvata ordiniranje subjektu terapeutski efikasne količine polipeptida antitela prema prvom aspektu pronalaska.

[0138] Pod ’lečenje’ uključujemo oba, terapeutsko i profilaktičko lečenje pacijenta. Termin ’profilaktički’ se koristi da obuhvati upotrebu sredstva, njegovu formulaciju, kao što je ovde opisano koja ili sprečava ili smanjuje verovatnoću kancera prostate, ili širenje, diseminaciju, ili metastaze lokalizovanog kancera prostate kod pacijenta ili subjekta. Termin ’profilaktički’ takođe obuhvata upotrebu sredstva, ili njegovu formulaciju, kao što je ovde opisano da bi se sprečilo ponavljanje kancera prostate kod pacijenta koji se prethodno lečio od kancera prostate.

[0139] Ovde je takođe prikazan postupak dijagnoze knacera prostate kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata ordiniranje subjektu dijagnostički efikasne količine polipeptida antitela prema prvom aspektu pronalaska.

[0140] Pod "dijagnoza" uključujemo detekciju ćelija kancera prostate, ili in vivo (tj. u telu pacijenta) ili ex vivo (tj. u tkivu ili ćelijskom uzorku koji je uklonjen iz tela pacijenta).

[0141] Kancer prostate koji treba da se leči ili dijagnostikuje može da bude lokalizovan u prostati, ili može da bude ne-lokalizovan (to jest, diseminovan) kancer prostate. Kancer prostate koji je lokalizovan na prostati može, na primer, da se klasifikuje kao klinički T1 ili T2 kanceri prema TNM sistemu (skaćeno od Tumor/Nodusi/Metastaze) pri čemu nelokalizovani / diseminovani kancer prostate može, na primer, da se klasifikuje kao klinički T3 ili T4 kanceri.

[0142] Kancer prostate koji treba da se leči ili dijagnostikuje može da bude metastatski kancer prostate. Metastaza se odnosi na širenje kancera od njegovog mesta nastanka ka drugim mestima u telu. Na primer, metastatski kancer prostate koji treba da se leči ili dijagnostikuje može da bude u obliku metastaza koje se nalaze u limfnom sistemu; u kostima (uključujući kičmu, pršljenove, pelvis, rebra); metastaze u pelvisu, rektumu, bešici, ili uretri. Metastaze koje su prisutne na drugim manje uobičajenim mestima mogu takođe da se leče pomoću predmenog pronalaska. Metastaze mogu da budu mikrometastaze. Mikrometastaza je oblik metastaza u kojima su novo nastali tumori generalno mali da bi mogli da se detektuju, ili se detektuju sa poteškoćama. Na primer, predmetni pronalazak obezbeđuje stručnjaku sredstvo za lečenje pojedinačnih ćelija kancera prostate ili ćelijskim klasterima, čak iako nije moguće dijagnostikovati prisustvo takvih ćelija ili klastera ali postoji, na primer kao okultno disemiovana bolest.

2

[0143] Prema tome, očekuje se da je to posebno važna tehnička prednost tretmana koji je obezbeđen predmetnim pronalaskom u poređenju sa tretmanima kancera prostate iz stanja tehnike je pojačana efikasnost u lečenju diseminovanog i/ili metastatkog (uključujući mikrometastatskog) kancera prostate.

[0144] Prema tome, u jednom izvođenju, pronalazak obezbeđuje polipeptide antitela i njegove medicinske upotrebe za prevenciju ili lečenje metastaza primarnog tumora prostate.

[0145] Karcinom prostate ima tendenciju javljanja kod muškaraca koji imaju preko pedeset godina, uobičajeno kod muškaraca koji imaju preko 60, 65 ili 70 godina, i iako je jedan od najzastupljenijih tipova kancera kod muškaraca, mnogi nikada nemaju simpome, ne dobijaju terapiju, i na kraju umiru zbog drugih uzroka. To je zbog toga što je rak prostate, u većini slučajeva, sporo napredujući, bez simptoma, i s obzirom da su muškarci koji imaju ovo stanje stariji oni često umiru zbog uzroka koji nisu povezani sa kancerom prostate, kao što je bolest srca/krvotoka, pneumonija, druge nepovezane vrste raka, ili starosti. Oko dve trećine slučajeva kancera prostate su sporo napredujući, druga trećina su agresivniji i brzo se razvijaju.

[0146] Prema tome, razvoj efikasnih postupaka za lečenje i dijagnozu kancera prostate je naročito važno za upravljanje agresivnijim i oblicima kancera koji se brzo razvijaju, posebno kod mlađih pacijenata. Prema tome, u jednom izvođenju, pronalazak se odnosi na lečenje ili dijagnozu kancera prostate kod pacijeta koji ima manje od 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 godina u vremenu dijagnoze kancera prostate i/ili u vremenu lečenja.

[0147] Smatra se da muškarci koji imaju srodnike u prvom stepenu (oca ili brata) sa kancerom prostate imaju dva puta veći rizik za razvijanje kancera prostate, i smatra se da oni sa dva srodnika u prvom stepenu koji su pogođeni, imaju pet puta veći rizik u poređenju sa muškarcima bez porodične istorije. Prema tome, pronalazak može da se odnosi na lečenje ili dijagnozu kancera prostate kod pacijenta kod koga je karakteristično da je kod jednog, dva, ili više, članova familije, posebno članovima familije prvog stepena (kao što je otac ili brat), prethodno dijagnostikovan kancer prostate.

[0148] Pronalazak se takođe odnosi na lečenje ili dijagnozu kancera prostate kod pacijenta, pri čemu kancer prostate koji treba da se leči ima kancer prostate koji je otporan na kastraciju (CRPC). CRPC može da se karakteriše time što obično postaje refraktoran na hormonski tretman posle jedne do tri godine, i nastavlja sa rastom bez obzira na hormonsku terapije.

[0149] U medicinskim upotrebama pronalaska, polipeptid antitela se obično ubrizgava ili se daje infuzijom u telo pacijenta. In vivo, polipeptid antitela se zatim vezuje za tkiva koja proizvode ciljni antigen, hK2; primarno, ćelije kancera prostate i njihove metastaze. Posle vezivanja, polipeptid antitela može direktno da ispolji terapeutski efekat (npr. indukujući ćelijsku smrt preko ADCC, CDC ili na osnovu nošenja radioizotopa ili drugog citotoksičnog ostatka). Alternativno, vezani polipeptid antitela može da služi kao dijagnostičko sredstvo (za snimanje), koje može da usmeri izbor terapije ili da pomogne hirurškom uklanjanju ćelija kancera.

[0150] Stručnjacima iz oblasti tehnike je jasno da polipeptidi antitela iz pronalaska mogu da se koriste kombinovano sa drugim terapeutskim i/ili diagnostičkim sredstvima/tretmanom, kao što je spoljna radioterapija, hirurgija, citostatski i androgeni tretmani.

[0151] Prethodni opis se fokusira na izvođenja iz predmetnog pronalaska koja mogu da se primene na lečenje i dijagnozu kancera prostate. Međutim, treba razumeti da polipeptidi antitela iz pronalaska nisu ograničeni na takve primene ali mogu da budu korisne za ispitivanja posle operacije, i ispitivanja u toku ili posle zračenja, citostatskim, i androgenim tretmanima.

[0152] U drugom izvođenju RadioGuided Surgery (RGS) ili Image-Guided Surgery (IGS) mogu da se koriste da bi se identifikovali polipeptidi antitela iz pronalaska koji su obeležni markerima u toku i/ili pre operacije. Prema tome, polipeptid antitela koji obuhvata ostatak koji može da se detektuje kao što je gore razmotreno može da se ordinira tokom i/ili pre operacije. U ovom izvođenju polipeptidi antitela mogu prvo da se daju infuzijom. Posle toga, RGS/IGS može da se koristi da bi se identifikovalo tkivo koje proizvodi hK2 sa instrumentom za detekciju koji je osetljiv na ostatak koji se detektuje, u toku ili pre operacije. Ostatak koji se detektuje može, na primer, da bude detektabilni ostatak koji emituje zračenje ili je magnetno osetljiv; može, na primer, da bude emiter Čerenkovog zračenja i/ili Bremsstrahlung; može da bude fluorescentni obeleživač i/ili magnetni ili obleživač koji se može magnetizovati. Prema tome, RGS/IGS prema predmetnom pronalasku može, na primer, da bude postupak koji se zasniva na detekciji optičkog, Čerenkovog, Bremsstrahlung, ili beta zračenja; detekcija radionuklidnog obeleživača, i/ili može da uključi magnetometriju. RGS je stručnjaku iz oblasti tehnike dobro poznat kao hirurški postupak koji omogućava hirurgu da identifikuje tkiva "obeležena" detektabilnim ostatkom.

[0153] Dobijene vizuelizacije prema gore navedenim postupcima mogu da se kombinuju sa drugim radiološkim postupcima vizelizacije, kao što je SPECT/PET, kompjuterizovana tomografija (CT), ultrazvuk (US), i snimanje magnetnom rezonancijom (MRI).

[0154] Prema tome, ovde su takođe prikazani polipepidi za upotrebu u medicini ordiniranjem pacijentu sa kancerom prostate pre ili u toku operacije, kao što je RadioGuided ili Image-Guided Surgery.

[0155] Dalje je ovde takođe prikazan in vitro postupak za detekciju ćelija tumora prostate u krvi subjekta, pri čemu postupak obuhvata:

(a) obezbeđivanje uzorka krvi iz subjekta koji treba da se testira;

(b) opciono, izolovanje i/ili prečišćavanje ćelija koje se nalaze u uzorku krvi;

(c) dovođenja u kontakt polipeptida antitela prema prvom aspektu pronalaska sa ćelijama iz uzorka krvi;

(d) određivanja (direktno ili indirektno) da li se polipeptid antitela vezuje za slobodni (tj. koji nije u kompleksu) hK2

gde vezivanje polipeptida antitela za slobodni hK2 je indikator prisustva ćelija tumora prostate u krvi subjekta.

[0156] Prema tome, postupak obuhvata izvođenje testa da bi se odredilo da li uzorak krvi sadrži hK2 u slobodnom obliku; prisustvo slobodnog hK2 je indikator prisustva ćelija tumora prostate u krvi subjekta.

[0157] Stručnjacima iz oblasti tehnike će biti jasno da postoje mnogi načini za izvođenje takvog testa. Na primer, imunotest može da bude ili homogen, poželjnije, heterogen. Test takođe treba da se izvodi u ili kompetitivnom ili, poželjnije, ne-kompetitivnom formatu.

[0158] U slučaju heterogenog, ne-kompetitivnog testa, primer protokola može da bude:

(a) obezbeđivanje uzorka krvi iz subjekta koji treba da se testira;

(b) opciono, izolovanje i/ili prečišćavanje ćelija koje se nalaze u uzorku krvi;

(c) dovođenje u kontakt polipeptida antitela imobilizovanog na čvrstoj fazi prema prvo aspektu pronalaska sa ćelijama koje se nalaze u uzorku krvi;

(d) ispiranje kako bi se uklonile rastvorljive komponente (koje se nisu vezale za čvrstu površinu); (e) dodavanje pratioca, tj. drugog anti-hK2 specifičnog antitela koje je obeleženo sa reporterskim molekulom/česticom;

(f) ispiranje kako bi se uklonilo prateće antitelo; i

(g) detektovanje signala iz pratećeg antitela

[0159] Između koraka b & c ili c & d, obično treba da postoji period inkubacije kako bi se ćelijama omogućilo da proizvedu rastvoljivi hK2, na osnovu čega mogu da se detekuju.

[0160] Ovde je takođe prikazan in vitro postupak za detekciju ćelija tumora prostate u krvi subjekta, pri čemu postupak obuhvata

(a) obezbeđivanje uzorka tkiva (kao što je histološki uzorka) iz subjekta koji treba da se ispita; (b) opciono, izolovanje i/ili prečišćavanje ćelija koje se nalaze u uzorku tkiva;

(c) dovođenja u kontakt polipeptida antitela prema prvom aspektu pronalaska sa ćelijama iz uzroka tkiva;

(d) određivanje (direktno ili indirektno) da li se polipeptid antitela vezuje za slobodni (tj. koji se ne nalazi u kompleksu) hK2

gde vezivanje polipeptida antitela za slobodni hK2 je indikator prisustva ćelija tumora prostate u tkivu subjekta.

[0161] U gore navedenim in vitro postupcima, korak (d) se izvodi pomoću ELISA. Međutim, bilo koji test koji je pogodan za detekciju interakcija antitelo-antigen in vitro može da se koristi.

[0162] Dodatno, postupak dalje obuhvata kvantifikovanje ćelija tumora prostate u uzorku.

[0163] Gore navedeni in vitro postupci mogu da se koriste za dijagnozu kancera prostate kod subjekta.

[0164] Upotreba reči za jedninu kada se koristi zajedno sa terminom "obuhvata" u zahtevima i/ili specifikaciji može da označi "jedan," ali je takođe u skladu sa značenjem "jedan ili više," "najmanje jedan," i "jedan ili više od jednog."

[0165] Nacrti koji slede obrazuju deo predmetne specifikacije i uključeni su da dalje prikažu određene aspekte predmetnog pronalaska. Pronalazak može bolje da se razume pozivanjem na referencu jedne ili više ovih nacrta kombinovano sa detaljnim opisom ovde predstavljenih specifičnih izvođenja. Slika 1: Sekvence varijabilnih regiona teškog i lakog lanca iz primera humanizovanog 11B6 Fab fragmenta iz pronalaska.

Slika 2: SDS-PAGE gel sa nativnim i redukovanim uzorcima mišji i humanizovanih 11B6 antitela.

Slika 3: Faze asocijacije nakon vezivanja testiranih 11B6 antitela za hK2 na čipu.

Slika 4: Faze disocijacije testiranih 11B6 antitela.

Slika 5: Biodistribucija<177>Lu-obeleženih humanizovanih 11B6 antitela.

Slika 6: Primer SPECT slike koja prikazuje vezivanje<177>Lu-obeleženog h11B6 za tumor prostate kod miševa.

Slika 7: Procenat preuzimanja<177>Lu-obeleženih h11B6 i m11B6 u tumoru i kostima.

Slika 8: Razmera procenta preuzimanja po gramu<177>Lu-obeleženog h11B6 i m11B6 u tumoru do kosti.

Slika 9: Kinetike (a) humanizovanog 11B6 antitela i (b) mišjeg 11B6 antitela.

2

Slika 10: Uklanjanje<177>Lu-obeleženog h11B6 i m11B6 iz krvi.

Slika 11: Prikazi fotografija veličine tumora pre (gornja slika) i posle (donja slika) tretmana sa<177>Lu-11B6.

Slika 12: Pregled efekta (a) pojedinačne količine radioaktivnosti ’D’ od<177>Lu-11B6, (b) duple količine radioaktivnosti ’2xD’ od<177>Lu-11B6 i (c) kontrolnog tretmana na veličinu tumora u LNCaP ksenograftima.

Slika 13: (a) podaci tumorskog rasta i (b) SPECT slika za jedne LNCaP ksenografte miša koji je tretiran sa jednom dozom<177>Lu-11B6.

Slika 14: Zapremina tumora kao funkcija dana posle ubrizgavanja za (a) životinje koje primaju<177>Luobeleženo h11B6 antitelo prema pronalasku, (b) životinje koje primaju<177>Lu-obeleženo ne-specifičnu IgG ’izotipska kontrola’ antitelo i (c) životinje koje primaju samo NaCl. Tretman je ordiniran u Danu 0. Životinje su prekinute u slučaju sledećih događaja: velike zapremine tumora (prečnik > 14 mm); veliki gubitak u težini (gubitak težine > 15% u poređenju sa početnom težinom); negativno pogođeno opšte stanje; ili kombinacija svih ovih tri parametara. (brojevi ka desnom su ID broj svake životinje)

Slika 15: Kaplan-Mejeova kriva za tri grupe koje primaju tretman prikazana na Slici 14. Puna linija:<177>Luh11B6; isprekidana linija:<177>Lu-obeleženo ne-specifično IgG ’izotipska kontrola’ antitelo; istačkana linija: NaCl.

[0166] Primeri koji slede su uključeni da prikažu posebna izvođenja iz pronalaska. Stručnjacima iz oblasti tehnike treba da bude jasno da postupci prikazani u primerima koji slede predstavljaju postupke koje je pronalazač otkrio da funkcionišu dobro u praksi pronalaska, i stoga se može smatrati da predstavljaju specifične načine za njegovu praksu.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid antitela sa specifičnošću vezivanja za humani kalikrein-2 (hK2), pri čemu polipeptid antitela obuhvata

(a) varijabilni region teškog lanca koji obuhvata ili se sastoji od sekvence aminokiseline SEQ ID NO:8; i

(b) varijabilni region lakog lanca koji obuhvata ili se sastoji od sekvenci aminokiselina SEQ ID NO:9.

2. Polipeptid antitela prema Zahtevu 1 koji sadrži ili se sastoji od intaktnog antitela ili fragmenta za vezivanje antigena koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz Fv fragmenata i fragmenata sličnih Fab.

3. Polipeptid antitela prema bilo kojim prethodnim zahtevima koji dalje obuhvata konstantni region teškog lanca, ili njegov deo, pri čemu je konstantni region teškog lanca podtip imunoglobulina koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4.

4. Polipeptid antitela prema bilo kojim prethodnim zahtevima koji dalje obuhvata konstanti region lakog lanca, ili njegov deo, pri čemu je konstantni region lakog lanca kapa ili lambda laki lanac.

5. Polipeptid antitela prema Zahtevu 3 ili 4 koji obuhvata konstantni region teškog lanca koji sadrži ili se sastoji iz sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 10 i/ili konstantni region lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 11.

6. Polipeptid antitela prema bilo kojim prethodnim zahtevima koji obuhvata teški lanac koji sadrži ili se sastoji iz sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 12 i/ili lakog lanca koji sadrži ili se sastoji iz sekvence aminokiselina SEQ ID NO: 13.

7. Polipeptid antitela prema bilo kojim prethodnim zahtevima pri čemu je polipeptid antitela povezan, direktno ili indirektno, sa terapeutskim ostatkom.

8. Polipeptid antitela prema bilo kojim prethodnim zahtevima pri čemu polipeptid antitela dalje obuhvata ostatak koji može da se detektuje.

9. Polipeptid antitela prema Zahtevu 7 ili 8 pri čemu terapeutski ostatak i/ili ostatak koji može da se detektuje je indirektno spojen sa polipeptidom antitela, preko grupe za povezivanje.

10. Polipeptid antitela prema Zahtevu 9, gde je grupa za povezivanje helator koji je izabran iz grupe koja se sastoji iz derivata 1,4,7,10-tetraaza-ciklododekan-1,4,7,10,tetrasirćetne kiseline (DOTA), deferoksamina (DFO), derivata dietilentriaminpentasirćetne kiseline (DTPA), derivata S-2-(4-izotiocijanatobenzil)-1,4,7-triazaciklononan-1,4,7-trisirćetne kiseline (NOTA) i derivata 1,4,8,11-tetraazaciklododekan-1,4,8,11-tetrasirćtne kiseline (TETA).

11. Izolovani molekul nukleinke kiseline koji kodira polipeptid antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva.

12. Molekul nukleinske kiseline prema Zahtevu 11 koji obuhvata nukleotidnu sekvencu SEQ ID NO: 14 i/ili SEQ ID NO: 15.

13. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata polipeptid antitela prema bilo kojim Zahtevima 1 do 10 i farmaceutski prihvatljivi ekscipijent, razblaživač ili nosač.

2

14. Polipeptid antitela prema bilo kojim Zahtevima 1 do 10 za upotrebu u medicini.

15. Polipeptid antitela prema bilo kojim Zahtevima 1 do 10 za upotrebu u lečenju i/ili dijagnozi kancera prostate.

,