RS58854B1 - Muteini interleukina-2 za ekspanziju t-regulatornih ćelija - Google Patents

Description

Opis

Unakrsno-pozivanje na srodne prijave

[0001] Ova prijava ima prioritet privremene SAD prijave serijski br.61/784,669, koja je podneta 14.3.2013.

Pozivanje na listing sekvenci

[0002] Predmetna prijava je podneta zajedno sa listingom sekvenci u elektronskom formatu preko EFS-Web. Listing sekvenci je obezbeđen kao tekst dokument pod naslovom A-1826-WO-PCT_ST25.txt, generisan 25.2.2014., čija je veličina 40,849 bajta. Informacija u elektronskom formatu Listinga sekvence je obuhvaćena ovde preko reference u njenoj celini.

Osnova pronalaska

[0003] IL-2 se vezuje za tri subjedinice transmembranskog receptora: IL-2Rβ i IL-2Rγ koje zajedno aktiviraju intracelularne signalne događaje po vezivanju IL-2, i CD25 (IL-2Rα) koja služi da stabilizuje interakciju između IL-2 i IL-2Rβγ. Signali koje dostavlja IL-2Rβγ uključuju signalne puteve PI3-kinaze, Ras-MAP-kinaze i STAT5.

[0004] T-ćelije zahtevaju ekspresiju CD25 da bi odgovorile na niske koncentracije IL-2 koje obično postoje u tkivima. T-ćelije koje eksprimiraju CD25 uključuju i FOXP3+ regulatorne T-ćelije (Treg ćelije), koje su neophodne za suzbijanje autoimunske upale, i FOXP3- T-ćelije koje su bile aktivirane da eksprimiraju CD25. FOXP3- CD25+ T efektorske ćelije (Teff) mogu da budu CD4+ ili CD8+ ćelije, od kojih obe vrste mogu da doprinesu upali, autoimunosti, odbacivanju transplanta organa, ili bolesti „transplanta protiv domaćina“. Signalni put STAT5 stimulisan sa IL-2 je od suštinskog značaja za normalan rast i preživljavanje T-reg ćelija i za visoku ekspresiju FOXP3.

[0005] U suvlasničkoj prijavi WO 2010/085495, opisujemo upotrebu muteina IL-2 za preferencijalnu ekspanziju ili stimulaciju Treg ćelija. Pri davanju subjektu, dejstvo na Treg ćelije je korisno za lečenje inflamatornih i autoimunskih bolesti. Iako su muteini IL-2 koji su opisani u tom tekstu korisni za ekspanziju ćelija Treg u odnosu na ćelije Teff in vivo, bilo je poželjno stvoriti muteine IL-2 koji imaju optimalna svojstva kao terapeutska sredstva za ljude.

[0006] WO2009/061853 se odnosi na mutantne IL-2 polipeptide koji deluju kao antagonisti receptora. Mutantni IL-2 polipeptidi vezuju CD25, ali zapravo ne aktiviraju IL2 receptor.

Rezime

[0007] U ovom tekstu su opisani muteini IL-2 koji su pogodni za proizvodnju sa visokim prinosom i imaju optimizovanu farmakološku aktivnost. U nastojanju da se dobije model humanog terapeutika na bazi muteina IL-2, došlo se do neočekivanih i nepredvidivih zapažanja. Ovde opisani muteini IL-2 su rezultat tog napora.

[0008] Muteini IL-2 opisani u ovom tekstu imaju minimalan broj izmena u IL-2, čime se smanjuje verovatnoća nastajanja imunskog odgovora protiv muteina IL-2 i/ili endogenog IL-2, uz istovremeno očuvanje preferencijalne ekspanzije i aktivacije ćelija Treg. Osim toga, u određenim objavama mutein IL-2 je fuzionisan sa molekulom, npr. Fc antitela, čime se produžava njegov poluživot u serumu nakon davanja subjektu. Muteini IL-2 imaju kratak poluživot u serumu (3 do 5 časova kod subkutane injekcije). Fuzije Fc-mutein IL-2 koje su kao primer opisane u ovom tekstu imaju poluživot u organizmu čoveka od najmanje 1 dana, najmanje 3 dana, najmanje 5 dana, najmanje 10 dana, najmanje 15 dana, najmanje 20 dana, ili najmanje 25 dana. Ovo dejstvo na farmakokinetiku muteina IL-2 omogućava sniženo ili manje učestalo doziranje terapeutika na bazi muteina IL-2.

[0009] Osim toga, pri stvaranju velikog farmaceutskog molekula, treba voditi računa o mogućnosti proizvodnje tog velikog molekula u velikim količinama, uz smanjenje agregacije i povećanje stabilnosti molekula. Fuzioni molekuli Fc-mutein IL-2 pokazuju takve osobine.

[0010] Specifično pronalazak daje prvi aspekt Fc-fuzionog proteina koji sadrži Fc i mutein humanog interleukina-2 (IL-2) koji sadrži V91K supstituciju i aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:1, pri čemu navedeni mutein IL-2 stimuliše T regulatorne ćelije.

[0011] Fc može biti Fc humanog IgG1 ili Fc humanjog IgG1 koji sadrži jednu ili više mutacija koje menjaju efektorsku funkciju navedenog Fc kao što je supstitucija na N297 i/ili supstitucija ili delecija C-terminalnog lizina navedenog Fc humanog IgG.

[0012] Fc-fuzioni protein, koji može da obuhvata linker za vezivanje Fc i humanih IL-2 muteinskih delova navedenog proteina kao što su GGGGS (SEQ ID NO: 5), GGNGT (SEQ ID NO:6) ili YGNGT (SEQ ID NO:7), takođe je uključen.

[0013] Fc-fuzioni protein u kome mutein IL-2 koji može dalje da sadrži aminokiselinsku adiciju, supstituciju ili deleciju koja menja glikozilaciju navedenog Fc-fuzionog proteina kada je eksprimiran u sisarskim ćelijama, takođe je uključen. Fc-fuzioni protein koji može da sadrži Fc dimer od dva IL-2 muteina ili jednog IL-2 muteina, takođe je uključen. Fc fuzioni protein prvog aspekta koji ima sekvencu prema SEQ ID NO:18, takođe je uključen u pronalazak.

[0014] Pronalazak takođe obuhvata izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira Fc-fuzioni protein prvog aspekta. Fc može biti Fc humanog IgG1.

[0015] Ćelija domaćin koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu je takođe obezbeđena i navedena ćelija domaćin može biti prokariotska ćelija kao što je E.coli ili eukariotska ćelija kao što je sisarska ćelija uključujući, ali bez ograničenja na ćelijsku liniju jajnika kineskog hrčka (CHO).

[0016] Takođe je obezbeđen postupak za pripremu Fc-fuzionog proteina koji sadrži kultivaciju ćelije domaćina prema pronalasku i sakupljanje Fc-fuzionog proteina iz navedene kulture. Pronalazak takođe obezbeđuje humani IL-2 mutein koji sadrži V91K supstituciju i aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:1 ili Fc-fuzioni protein za upotrebu u in vivo postupku za lečenje subjekta sa inflamatornom ili autoimunom bolešću.

[0017] Takođe je obezbeđen IL-2 mutein prema pronalasku ili Fc-fuzioni protein prema pronalasku za upotrebu u in vivo postupku za lečenje subjekta sa inflamatornom ili autoimunom bolešću kao što je atopijska bolest, paraneoplastična autoimuna bolest, inflamacija hrskavice, artritis, reumatoidni artritis, juvenilni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, pauciartikularni juvenilni reumatoidni artritis, poliartikularni juvenilni reumatoidni artritis, juvenilni reumatoidni artritis sa sistemskim početkom, juvenilni ankilozni spondilitis, juvenilni enteropatski artritis, juvenilni reaktivni artritis, juvenilni Reiter-ov sindrom, SEA sindrom (sindrom seronegativnosti, entezopatije, artropatije), juvenilni dermatomiozitis, juvenilni psorijatički artritis, juvenilna skleroderma, juvenilni sistemski lupus eritematozus, juvenilni vaskulitis, pauciartikularni reumatoidni artritis, poliartikularni reumatoidni artritis, reumatoidni artritis sa sistemskim početkom, ankilozni spondilitis, enteropatski artritis, reaktivni artritis, Reiter-ov sindrom, SEA sindrom (sindrom seronegativnosti, entezopatije, artropatije), dermatomiozitis, psorijatički artritis, skleroderma, vaskulitis, miolitis, polimiolitis, dermatomiolitis, poliarteritis nodoza, Wegener-ova granulomatoza, arteritis, ploimijalgija reumatika, sarkoidoza, skleroza, primarna bilijarna skleroza, sklerotizujući holangitis, Sjogren-ov sindrom, psorijaza, psorijaza sa plakovima, kapljična psorijaza, inverzna psorijaza, pustularna psorijaza, eritrodermna psorijaza, dermatitis, atopijski dermatitis, ateroskleroza, lupus, Still-ova bolest, sistemski lupus eritematozus (SLE), mijastenija gravis, bolest transplanta protiv domaćina, vaskulitis indukovan hepatitisom C, dijabetes tipa 1, multipla skleroza, spontani gubitak trudnoće, atopijske bolesti, inflamatorne bolesti creva, Crohn-ova bolest, ulcerozni kolitis, celijačna bolest, astma, COPD, rinosinuzitis, rinosinuzitis sa polipima, eozinofilni ezofagitis, eozinofilni bronhitis, Guillain-Barre-ova bolest, tiroiditis (npr., Graves-ova bolest), Addison-ova bolest, Raynaud-ov fenomen, autoimuni hepatitis, odbacivanje transplanta ili oštećenje bubrega.

[0018] Pored toga, u određenim primerima izvođenja, fuzioni protein Fc-muteina IL-2 sadrži Fc region IgG1. Kada je poželjno ukinuti efektorske funkcije IgG1 (npr., aktivnost ADCC), nađeno je da je mutacija asparagina na položaju 297 u glicin (N297G; EU šema numeracije) dala veoma poboljšanu efikasnost prečišćavanja i biofizičke osobine u odnosu na druge mutacije koje dovode do aglikozilacije Fc IgG1. U poželjnim objavama, cisteini su konstruisani u Fc tako da se omoguće disulfidne veze, koje su povećale stabilnost molekula koji sadrži aglikozilovani Fc. Korist od aglikozilovanog Fc prevazilazi kontekst fuzije Fc-muteina IL-2. Na taj način, ovde su dati molekuli koji sadrže Fc, Fc-fuzije i antitela, koji sadrže N297G supstituciju i izborno supstituciju jednog ili više dodatnih ostataka u cistein.

[0019] Sledeći aspekt pronalaska obuhvata glikozilovane peptidne linkere. Poželjni linker peptidi koji su podložni N-glikozilaciji obuhvataju GGNGT (SEQ ID NO:6) ili YGNGT (SEQ ID NO:7).

[0020] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje mutein humanog interleukina-2 (IL-2) mutein koji sadrži V91K supstituciju i aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:1, pri čemu navedeni IL-2 mutein poželjno stimuliše T regulatorne ćelije. Humani IL-2 mutein može da sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 95% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:1. Navedeni mutein može da sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:1. Položaj 125 može biti alanine. U sledećem položaj 125 može biti cistein.

[0021] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje Fc-fuzioni protein koji sadrži Fc i mutein humanog IL-2. U jednom primeru izvođenja, Fc je Fc humanog IgG1. U sledećem primeru izvođenja, Fc humanog IgG1 sadrži jednu ili više mutacija koje menjaju efektorsku funkciju navedenog Fc. U sledećem primeru izvođenja, humani IgG1 sadrži supstituciju na N297. Supstitucija na N297 može biti N297G. Fc-fuzioni protein može da sadrži supstituciju ili deleciju C-terminalnog lizina navedenog Fc humanog IgG. C-terminalni lizin navedenog Fc humanog IgG može biti deletiran. U sledećem primeru izvođenja, linker povezuje Fc i delove muteina humanog IL-2 navedenog proteina. U sledećem primeru izvođenja, linker je GGGGS, GGNGT ili YGNGT. U sledećem primeru izvođenja, linker je GGGGS. U sledećem primeru izvođenja, mutein IL-2 dalje sadrži aminokiselinsku adiciju, supstituciju ili deleciju koja menja glikozilaciju navedenog Fc-fuzionog proteina kada je eksprimiran u sisarskim ćelijama. Mutein IL-2 može da sadrži T3 supstituciju, kao što je T3N ili T3A supstitucija. Mutein IL-2 može dalje da sadrži S5 mutaciju, kao što je S5T mutacija. U sledećem primeru izvođenja, Fc-fuzioni protein sadrži Fc dimer od dva muteina IL-2 ili navedeni Fc-fuzioni protein sadrži jedan mutein IL-2.

[0022] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak invention daje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira humani IL-2 mutein ili Fc deo antitela i muteine humanog IL-2. Navedeni Fc deo antitela i mutein humanog IL-2 mogu biti kodirani unutar jednog otvorenog okvira čitanja. U sledećem primeru izvođenja, Fc je Fc humanog IgG1. U sledećem primeru izvođenja, Fc humanog IgG1 sadrži jednu ili više mutacija koje menjaju efektorsku funkciju navedenog Fc. U sledećem primeru izvođenja, humani IgG1 sadrži supstituciju na N297. Supstitucija na N297 može biti N297G. U sledećem primeru izvođenja, Fc humanog IgG1 sadrži supstituciju ili deleciju C-terminalnog lizina. U sledećem primeru izvođenja, C-terminalni lizin navedenog Fc humanog IgG je deletiran. U sledećem primeru izvođenja, nukleinska kiselina dalje kodira linker koji povezuje Fc deo antitela i mutein humanog IL-2. U sledećem primeru izvođenja, linker je GGGGS, GGNGT ili YGNGT. U sledećem primeru izvođenja, linker je GGGGS. U sledećem primeru izvođenja, mutein IL-2 dalje sadrži aminokiselinsku adiciju, supstituciju ili deleciju koja menja glikozilaciju proteina koji sadrži navedeni mutein IL-2 mutein kada je eksprimiran u sisarskim ćelijama. Mutein IL-2 može da sadrži T3 supstituciju, kao što je T3N ili T3A supstitucija. Mutein IL-2 može dalje da sadrži S5 mutaciju kao što je S5T mutacija.

[0023] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu kao što je opisana u prethodnom tekstu operativno vezan za promotor.

[0024] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje ćeliju domaćina koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu kao što je opisana u prethodnom tekstu. U jednoj objavi, izolovana nukleinska kiselina je operativno vezana za promotor. U sledećem primeru izvođenja, navedena ćelija domaćin je prokariotska ćelija. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin je E. coli. U sledećem primeru izvođenja, navedena ćelija domaćin je eukariotska ćelija. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin je sisarska ćelija. U sledećem primeru izvođenja, ćelija domaćin je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO).

[0025] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje postupak za pripremu muteina humanog IL-2, koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina kao što je opisano u prethodnom tekstu pod uslovima u kojima je navedeni promotor eksprimiran i sakupljanje muteina humanog IL-2 iz navedene kulture. U jednom primeru izvođenja, postupak sadrži kultivisanje ćelije domaćina kao što je opisano u prethodnom tekstu pod uslovima u kojima je navedeni promotor eksprimiran i sakupljanje Fc-fuzionog proteina iz navedene kulture.

[0026] U sledećoj objavi, predmetni pronalazak daje postupak za povećanje odnosa regulatornih T ćelija (Tregs) prema neregulatornim T ćelijama unutar populacije T ćelija, koji sadrži dovođenje u kontakt populacije T ćelija sa efikasnom količinom humanog IL-2 muteina opisanom u prethodnom tekstu. U jednom primeru izvođenja, odnos CD3+FoxP3+ ćelija prema CD3+FoxP3- se povećava, kao što je za najmanje 50%.

[0027] U sledećoj objavi, predmetni pronalazak daje postupak za povećanje odnosa regulatornih T ćelija (Tregs) prema neregulatornim T ćelijama unutar populacije T ćelija, koji sadrži dovođenje u kontakt populacije T ćelija sa efikasnom količinom Fc-fuzionog proteina opisanog u prethodnom tekstu. U jednom primeru izvođenja, odnos CD3+FoxP3+ ćelija prema CD3+FoxP3- se povećava, kao što je za najmanje 50%.

[0028] U sledećoj objavi, predmetni pronalazak daje postupak za povećanje odnosa regulatornih T ćelija (Tregs) prema neregulatornim T ćelijama unutar periferne krvi subjekta, koji sadrži primenu efikasne količine humanog IL-2 muteina opisanog u prethodnom tekstu. U jednom primeru izvođenja, odnos CD3+FoxP3+ ćelija prema CD3+FoxP3- se povećava, kao što je za najmanje 50%.

[0029] U sledećoj objavi, predmetni pronalazak daje postupak za povećanje odnosa regulatornih T ćelija (Tregs) prema neregulatornim T ćelijama unutar periferne krvi subjekta, koji sadrži primenu efikasne količine Fc-fuzionog proteina koji je opisan u prethodnom tekstu. U jednom primeru izvođenja, odnos CD3+FoxP3+ ćelija prema CD3+FoxP3- se povećava, kao što je za najmanje 50%.

[0030] U sledećoj objavi, predmetni pronalazak daje postupak za povećanje odnosa regulatornih T ćelija (Tregs) prema ćelijama prirodnim ubicama (NK) unutar periferne krvi subjekta, koji sadrži primenu efikasne količine muteina humanog IL-2 koji je opisan u prethodnom tekstu. U jednoj objavi, odnos CD3+FoxP3+ ćelija prema CD3-CD19- limfocitima koji eksprimiraju CD56 i/ili CD16 se povećava, kao što je za najmanje 50%.

[0031] U sledećoj objavi, predmetni pronalazak daje postupak za povećanje odnosa regulatornih T ćelija (Tregs) prema ćelijama prirodnim ubicama (NK) unutar periferne krvi subjekta, koji sadrži primenu efikasne količine Fc-fuzionog proteina opisanog u prethodnom tekstu. U jednoj objavi, odnos CD3+FoxP3+ ćelija prema CD3-CD19- limfocitima koji eksprimiraju CD56 i/ili CD16 se povećava, kao što je za najmanje 50%.

[0032] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje mutein IL-2 ili Fc fuzioni protein prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje subjekta sa inflamatornom ili autoimunom bolešću, pri čemu navedeni postupak sadrži primenu na navedenog subjekta terapeutski efikasne količine muteina IL-2 opisanog u prethodnom tekstu.

[0033] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje mutein IL-2 ili Fc fuzioni protein prema pronalasku za upotrebu u postupku za lečenje subjekta sa inflamatornom ili autoimunom bolešću, pri čemu navedeni postupak sadrži primenu na navedenog subjekta terapeutski efikasne količine Fc-fuzionog proteina koji je opisan u prethodnom tekstu. U jednoj objavi, primena izaziva smanjenje najmanje jednog simptoma bolesti. U sledećoj objavi, odnos regulatornih T ćelija (Tregs) prema neregulatornim T ćelijama unutar periferne krvi subjekta povećava se posle primene. U sledećoj objavi, odnos regulatornih T ćelija (Tregs) prema neregulatornim T ćelijama unutar periferne krvi subjekta ostaje esencijalno isti posle primene. U sledećem primeru izvođenja, inflamatorna ili autoimuna bolest je lupus, bolest transplanta protiv domaćina, vaskulitis indukovan hepatitisom C, dijabetes tipa I, multipla skleroza, spontani gubitak trudnoće, atopijske bolesti ili inflamatorne bolesti creva.

[0034] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje Fc region humanog IgG1 antitela gde navedeni Fc region sadrži N297G mutaciju i navedeni Fc region humanog IgG1 sadrži najmanje 90% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:3. U jednoj objavi, Fc region humanog IgG1 sadrži najmanje 95% identičnosti sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:3. U sledećoj objavi, Fc region humanog IgG1 sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:3. U sledećoj objavi, Fc region humanog IgG1 dalje sadrži jednu ili više mutacija za stabilizaciju polipeptida. U sledećoj objavi, jedna ili više aminokiselina navedenih u SEQ ID NO:3 supstituisane su sa cisteinom. U sledećoj objavi, V259, A287, R292, V302, L306, V323, ili 1332 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:3 je supstituisan sa cisteinom. U sledećoj objavi, Fc region sadrži A287C i L306C supstituciju unutar aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:3. U sledećoj objavi, Fc region sadrži V259C i L306C supstituciju unutar aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:3. U sledećoj objavi, Fc region sadrži R292C i V302C supstituciju unutar aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:3. U sledećoj objavi, Fc region sadrži V323C i I332C supstituciju unutar aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:3.

[0035] U sledećoj objavi, predmetni pronalazak daje antitelo koje sadrži Fc region opisan u prethodnom tekstu.

[0036] U sledećoj objavi, predmetni pronalazak daje Fc-fuzioni protein koji sadrži Fc region opisan u prethodnom tekstu.

[0037] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje polipeptid koji sadrži linker, pri čemu, linker je GGNGT ili YGNGT. Linker može da sadrži N-glikozilaciju. Linker može biti inseriran u ili menja petlju u polipeptidnoj strukturi.

[0038] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje postupak za pripremu aglikozilovanog molekula IgG1 koji sadrži Fc, pri čemu navedeni postupak sadrži ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira polipeptid opisan u prethodnom tekstu u kulturi sisarskih ćelija i sakupljanje aglikozilovanog molekula IgG1 koji sadrži Fc iz navedene kulture.

[0039] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje postupak za pripremu IgG1 molekula koji sadrži Fc aglikozilovanog kada je eksprimiran u sisarskim ćelijama, pri čemu navedeni postupak sadrži korak mutacije kodona za N297 u Fc regionu u glicin kodon.

[0040] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje Fc-fuzioni protein koji se sastoji od sekvence prema SEQ ID NO:18 ili SEQ ID NO:20. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje nukleinsku kiselinu koja kodira Fc-fuziju. U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje ćeliju koja sadrži nuleinsku kiselinu. U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje postupak za pripremu Fc-fuzionog proteina koji sadrži inkubaciju ćelije pod uslovima koji mogućavaju da ona eksprimira navedeni Fc-fuzioni protein. U sledećem primeru izvođenja, predmetni pronalazak daje Fc-fuzioni protein za upotrebu u lečenju inflamatornog ili autoimunog stanja. U sledećem primeru izvođenja, inflamatorno ili autoimuno stanje je bolest transplanta protiv domaćina.

[0041] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak daje postupak za praćenje odgovora subjekta na tretman muteinom humanog interleukina-2 (IL-2) opisanom u prethodnom tekstu ili Fcfuzionim proteinom koji je opisan u prethodnom tekstu, koji sadrži detekciju promene kod navedenog subjekta, pri čemu je navedena promena povećanje u telesnoj temperaturi, povećanje u CRP u perifernoj krvi navedenog subjekta, smanjenje trombocita u perifernoj krvi navedenog subjekta, smanjenje u neutrofilima u perifernoj krvi navedenog subjekta ili smanjenje u albuminu u perifernoj krvi navedenog subjekta, pri čemu navedeni tretman je završen, suspendovan, smanjena je učestalost doziranja, ili je smanjena dozirajuća količina posle detekcije navedene promene. U jednom primeru izvođenja, navedena promena sadrži povećanje u telesnoj temperaturi od najmanje 0.5°C, povećanje u CRP u perifernoj krvi navedenog subjekta od najmanje 0.2 mg/mL, smanjenje u trombocitima u perifernoj krvi navedenog subjekta od najmanje 0.8-puta, smanjenje u neutrofilima u perifernoj krvi navedenog subjekta od najmanje 0.8-puta, ili smanjenje u albuminu u perifernoj krvi navedenog subjekta od najmanje 0.4-puta.

Kratak opis crteža

[0042]

SL. 1 U testu kratkotrajne stimulacije, homodimerizacija fuzijom sa C-terminalnim krajem IgG-Fc ne menja aktivnost muteina IL-2 sa smanjenom jačinom i sa visokim afinitetom za CD25.

SL. 2A i SL. 2B Ispitivana je sposobnost muteina IL-2 sa naznačenim mutacijama i fuzionisanih sa C-terminalnim krajem jedne strane Fc-heterodimera da stimulišu fosforilaciju STAT5 u T-ćelijama. Ovi muteini su takođe sadržali tri mutacije koje obezbeđuju visok afinitet prema CD25 (V69A, N71R, Q74P). Njihova aktivnost je upoređena sa tri oblika IL-2 bez Fc-fuzije (prazni simboli): WT IL-2, HaWT (visok afinitet za CD25) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P), i HaD (visok afinitet za CD25 i redukovana signalna aktivnost) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P, N88D). Odgovori fosfo-STAT5 su prikazani za T-ćelije razdvojene na FOXP3+CD4+ i FOXP3-CD4+ postavljanjem granica za selektovanje.

SL. 3 Proliferacija podsetova T ćelija kao odgovor na titracije muteina IL-2 fuzionisanih sa Fc-heterodimerom. Aktivnost fuzionih proteina upoređena je sa tri oblika IL-2 bez Fc fuzije (prazni simboli): WT IL-2, HaWT (visok afinitet za CD25) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P), i HaD (visok afinitet za CD25 i redukovana signalna aktivnost) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P, N88D)

SL. 4 Proliferacija NK ćelija kao odgovor na titracije muteina IL-2 fuzionisanih sa Fcheterodimerom. Aktivnost fuzionih proteina upoređena je sa tri oblika IL-2 bez Fc fuzije (prazni simboli): WT IL-2, HaWT (visok afinitet za CD25) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P), i HaD (visok afinitet za CD25 i redukovana signalna aktivnost) (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P, N88D)

SL. 5 Proliferacija podsetova T ćelija kao odgovor na titracije muteina IL-2 fuzionisanih sa Fc-homodimerom N297G. Aktivnost Fc-muteina upoređena je sa WT IL-2 (prazni krugovi) i Fc.WT (ispunjeni krugovi). Mutacije koje obezbeđuju visok afinitet za CD25 (HaMut1) bile su V69A i Q74P.

SL. 6 Proliferacija NK ćelija kao odgovor na titracije muteina IL-2 fuzionisanih sa Fchomodimerom N297G. Aktivnost Fc.muteina upoređena je sa WT IL-2 (prazni krugovi) i Fc.WT (ispunjeni krugovi).

SL. 7A i SL. 7B Fc.IL-2 muteini bez mutacija koje obezbeđuju visok afinitet za CD25 podstiču ekspresiju Treg i ushodnu regulaciju FOXP3 kod humanizovanih miševa.

SL. 8 Niske nedeljne doze (0.5 µg po životinji) Fc.IL-2 muteina podstiču ekspresiju Treg i ushodnu regulaciju FOXP3 kod humanizovanih miševa, pri čemu je bolja aktivnost zapažena za Fc.V91K u odnosu na Fc.N88D i Fc.WT.

SL. 9A Fc.V91K i Fc.N88D opstaju na površini aktiviranih T-ćelija kroz udruživanje sa CD25.

SL. 9B Opstajanje IL-2R prenosa signala sa Fc.V91K i Fc.N88D u odnosu na Fc.WT.

SL. 10A i B Poređenje dvonedeljnih i četvoronedeljnih intervala doziranja Fc.V91K kod makaki majmuna, i poređenje IV i SC puteva doziranja.

SL. 11A-F Kinetika ćelijskih odgovora, telesne temperature i CRP u serumu kod makaki majmuna tretiranih različitim režimima doziranja PROLEUKIN®, Fc.V91K, i Fc.N88D. SL. 12A Efekat rastućih doza PROLEUKIN®, Fc.V91K ili Fc.N88D na nivoe Treg ćelija, NK ćelija, CD4+FOXP3-T ćelija i CD8+FOXP3- T ćelija kod makaki majmuna. Svaka tačka predstavlja odgovore prosečnog pika kod četiri životinje.

SL. 12B Efekat rastućih doza PROLEUKIN®, Fc.V91K ili Fc.N88D na nivoe Treg ćelija i eozinofila kod makaki majmuna. Svaka tačka predstavlja odgovore prosečnog pika četiri životinje.

1

SL. 12C Efekat rastućih doza PROLEUKIN®, Fc.V91K, ili Fc.N88D na nivoe Treg ćelija i iCRP na telesnu temperaturu kod makaki majmuna. Svaka tačka predstavlja odgovore prosečnog pika četiri životinje.

SL. 12D Efekat rastućih doza PROLEUKIN®, Fc.V91K, ili Fc.N88D na nivoe Treg ćelija, trombocita, neutrofila i albumina kod makaki majmuna. Svaka tačka predstavlja odgovore prosečnog pika četiri životinje. Desne y-ose su obrnute da daju višestruko smanjenje u trombocitima, neutrofilima ili albuminu u odnosu na uzorke pre doziranja.

SL. 13 Kinetika razvoja antitela protiv leka (ADA) kod makaki majmuna tretiranih sa Fc.V91K.

Detaljan opis

[0043] Naslovi poglavlja koji se ovde koriste služe samo u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje opisanog predmeta.

[0044] Za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, kulturu i transformaciju tkiva, prečišćavanje proteina, itd., mogu da se koriste standardne tehnike. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu da se izvedu prema uputstvima proizvođača, ili na način na koji se to uobičajeno radi u ovoj oblasti, ili kao što je opisano u ovom tekstu. Sledeće procedure i tehnike mogu se generalno izvoditi u skladu sa konvencionalnim metodama koje su dobro poznate u stanju tehnike, i kao što je opisano u raznim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i razmotrene u specifikaciji. Videti, npr., Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 3. izd., Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, N.Y. Osim ako nisu date specifične definicije, nomenklatura korišćena u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hemije, organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije opisane u ovom tekstu su one koje su dobro poznate i uobičajeno se koriste u ovoj oblasti. Standardne tehnike mogu da se koriste za hemijsku sintezu, hemijske analize, farmaceutsku preparaciju, formulaciju, i isporuku i lečenje pacijenata.

IL-2

[0045] Muteini IL-2 opisani u ovom tekstu predstavljaju varijante "divljeg tipa" humanog IL-2. U značenju koje je ovde primenjeno, "divlji tip humanog IL-2", "divlji tip IL-2", ili "WT IL-2" označava polipeptid sledeće aminokiselinske sekvence:

gde X predstavlja C, S, V, ili A (SEQ ID NO:2).

[0046] Varijante mogu da sadrže jednu ili više supstitucija, delecija ili insercija, u okviru aminokiselinske sekvence divljeg tipa IL-2. U ovom tekstu rezidue su označene aminokiselinskim kodom od jednog slova praćenim aminokiselinskom pozicijom u IL-2, npr., K35 je rezidua lizina na poziciji 35 u SEQ ID NO:2. Supstitucije su u ovom tekstu označene aminokiselinskim kodom od jednog slova praćenim aminokiselinskom pozicijom u IL-2 praćenom zamenskim kodom od jednog slova., npr., K35A označava supstituciju lizinske rezidue na poziciji 35 u SEQ ID NO:2 alaninskom reziduom.

Muteini IL-2

[0047] U ovom dokumentu dati su humani muteini IL-2 koji preferencijalno stimulišu T-regulatorne (Treg) ćelije. U značenju koje je ovde primenjeno "preferencijalno stimuliše T-regulatorne ćelije" znači da mutein podstiče proliferaciju, preživljavanje, aktivaciju i/ili funkciju CD3+FoxP3+ T-ćelija u odnosu na CD3+FoxP3- T-ćelije. Sposobnost preferencijalne stimulacije Treg može da se meri pomoću protočne citometrije leukocita periferne krvi, u kojima postoji zapaženo povećanje procenta FOXP3+CD4+ T-ćelija među ukupnim CD4+ T-ćelijama, povećanje procenta FOXP3+CD8+ T-ćelija među ukupnim CD8+ T-ćelijama, povećanje procenta FOXP3+ T-ćelija u odnosu na NK ćelije, i/ili veće povećanje nivoa ekspresije CD25 na površini FOXP3+ T-ćelija u odnosu na povećanje ekspresije CD25 na drugim T-ćelijama. Preferencijalni rast Treg ćelija može da se detektuje i kao povećana zastupljenost demetilovane DNK promotora FOXP3 (tj. demetilovani region specifičan za Treg, ili TSDR) u odnosu na demetilovane gene za CD3 u DNK ekstrahovanoj iz pune krvi, detektovano sekvenciranjem proizvoda reakcije lančane polimeraze (PCR) iz bisulfitom obrađene genomske DNK (J. Sehouli, et al.2011. Epigenetics 6:2, 236-246).

[0048] Muteini IL-2 koji preferencijalno stimulišu Treg ćelije povećavaju odnos CD3+FoxP3+ T-ćelija prema CD3+FoxP3- T-ćelijama kod subjekta, ili u uzorku periferne krvi najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 100%, najmanje 150%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, najmanje 600%, najmanje 700%, najmanje 800%, najmanje 900%, ili najmanje 1000%.

[0049] Poželjni muteini IL-2 uključuju, ali nisu ograničeni na, muteine IL-2 koji sadrže supstituciju V91K ili N88D u aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:2. Primer muuteina IL-2 naveden je u SEQ ID NO:1. Posebno je poželjna aminokiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO:1 koja sadrži supstituciju C125A. Mada smanjenje broja dodatnih mutacija u divljem tipu IL-2 sekvence može da bude korisno, pronalazak uključuje muteine IL-2 koji imaju skraćenja molekula ili dodatne insercije, delecije, ili supstitucije pored supstitucija V91K ili N88D, pod uslovom da navedeni muteini zadržavaju aktivnost preferencijalne simulacije Treg ćelija. Prema tome, objava uključuje muteine IL-2 koji preferencijalno stimulišu Treg ćelije i sadrže aminokiselinsku sekvencu koja ima V91K ili N88D, koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:2. U posebno poželjnoj objavi, takvi muteini IL-2 sadrže aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:2.

[0050] Za aminokiselinske sekvence, identičnost i/ili sličnost sekvence se određuje upotrebom standardnih tehnika poznatih u ovoj oblasti, uključujući, ali bez ograničenja, algoritam lokalne identičnosti sekvenci autora Smith i Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, algoritam za poravnanje za utvrđivanje identičnosti sekvenci autora Needleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

48:443, metod traženja sličnosti autora Pearson i Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.

85:2444, kompjuterizovane primene ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u programskom paketu Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), program Best Fit sequence opisan kod Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, po mogućstvu upotrebom podrazumevanih podešavanja, ili prema uvidu. Poželjno, procenat identičnosti se izračunava pomoću FastDB na osnovu sledećih parametara: kazneni poeni za pogrešno sparivanje od 1; kazneni poeni za prazninu od 1; kazneni poeni za veličinu praznine od 0.33; i kazneni poeni za spajanje od 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0051] Primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP stvara poravnanje višestrukih sekvenci iz grupe srodnih sekvenci korišćenjem progresivnih poravnanja u parovima. Takođe može da iscrta stablo koje prikazuje odnose klastera koji se koriste za kreiranje poravnanja. PILEUP koristi pojednostavljenje metode progresivnog poravnanja autora Feng i Doolittle, 1987, J. Mol. Evol.

35:351-360; metod je sličan onom opisanom kod autora Higgins i Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Korisni parametri za PILEUP uključuju podrazumevane kaznene poene za prazninu od 3.00, podrazumevane kaznene poene za dužinu praznine od 0.10, i ocenjivanje praznine na krajevima.

[0052] Još jedan primer korisnog algoritma je algoritam BLAST, opisan u: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol.215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402; i Karin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787. Posebno koristan BLAST program je WU-BLAST-2 program izveden iz Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara pretrage, od kojih je većina podešena na podrazumevane

1

vrednosti. Podesivi parametri se podešavaju na sledeće vrednosti: raspon preklapanja=1, frakcija preklapanja=0.125, prag reči (T)=II. Parametri HSP S i HSP S2 su dinamičke vrednosti i program ih sam uspostavlja u zavisnosti od sastava konkretne sekvence i sastava određene baze podataka u kojoj se sekvenca od interesa pretražuje; međutim, vrednosti mogu da se prilagode da bi se povećala osetljivost.

[0053] Dodatni koristan algoritam je BLAST koji dozvoljava razmake prikazan kod Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402. BLAST koji dozvoljava razmake koristi bodovanje supstitucija BLOSUM-62; parametar praga T podešen je na 9; metod dvostrukog pogotka sa uslovom ekstenzije bez razmaka dodeljuje kaznene poene za dužinu praznine od k u iznosu od 10+k; Xu je podešeno na 16, i Xg je podešeno na 40 za fazu pretraživanja baze podataka i na 67 za izlaznu fazu algoritama. Poravnanja sa razmacima su uslovljena rezultatom koji odgovara približno 22 bita.

[0054] Dok mesto ili region za uvođenje varijacije aminokiselinske sekvence može da bude unapred određeno, mutacija po sebi ne mora da bude unapred određena. Na primer, u cilju optimizacije performanse mutacije na datom mestu, nasumična mutageneza može da bude sprovedena na ciljnom kodonu ili regionu i eksprimirani mutein IL-2 podvrgnut skriningu za optimalnu kombinaciju željene aktivnosti. Tehnike za pravljenje supstitucionih mutacija na unapred određenim mestima u DNK koje imaju poznatu sekvencu su dobro poznate, na primer, mutageneza sa prajmerom M13 i PCR mutageneza. Skrining mutanata može da se izvede upotrebom testova opisanih u ovom tekstu, na primer.

[0055] Aminokiselinske supstitucije obično su zamene pojedinačne rezidue; insercije će obično biti reda veličine od oko jedne (1) do oko dvadeset (20) aminokiselinskih rezidua, mada i znatno veće insercije mogu da se tolerišu. Delecije su u opsegu od oko jedne (1) do oko dvadeset (20) aminokiselinskih rezidua, mada u nekim slučajevima delecije mogu da budu mnogo veće.

[0056] Supstitucije, delecije, insercije ili bilo koja njihova kombinacija mogu da se koriste da bi se dobio finalni derivat ili varijanta. Uopšteno, ove promene se izvode na nekoliko aminokiselina da bi se promena molekula svela na najmanju meru, naročito imunogenost i specifičnost antigenvezujućeg proteina. Međutim, pod određenim okolnostima mogu da se tolerišu veće promene. Konzervativne supstitucije obično se sprovode u skladu sa sledećim podacima prikazanim u vidu TABELE 1.

Tabela 1

Originalna rezidua Primeri supstitucija

Ala Ser

Arg Lys

Asn Gln, His

Asp Glu

Cys Ser, Ala

Gln Asn

Glu Asp

Gly Pro

His Asn, Gln

Ile Leu, Val

Leu Ile, Val

Lys Arg, Gln, Glu

Met Leu, Ile

Phe Met, Leu, Tyr, Trp

Ser Thr

Thr Ser

Trp Tyr, Phe

Tyr Trp, Phe

Val Ile, Leu

[0057] Suštinske promene u funkciji ili imunološkom identitetu sprovode se izborom supstitucija koje su manje konzervativne od onih prikazanih u TABELI 1. Na primer, mogu da budu sprovedene supstitucije koje značajno utiču na: strukturu lanca polipeptida na mestu promene, na primer, na strukturu alfa-heliksa ili beta-naborane ploče; naelektrisanje ili hidrofobnost molekula na ciljnom mestu; ili veličinu bočnog lanca. Supstitucije za koje se uopšteno očekuje da proizvedu najveće promene u svojstvima polipeptida su one u kojima (a) hidrofilna rezidua, npr., seril ili treonil, je zamena za (ili je zamenjena) hidrofobnom reziduom, npr., leucil, izoleucil, fenilalanil, valil ili alanil; (b) cistein ili prolin je zamena za (ili je zamenjen) bilo kojom drugom reziduom; (c) rezidua koja ima elektropozitivan bočni lanac, npr., lizil, arginil, ili histidil, je zamena za (ili je zamenjena) elektronegativnom reziduom, npr., glutamil ili aspartil; ili (d) rezidua koja ima glomazan bočni lanac, npr., fenilalanil, je zamena za (ili je zamenjena) nekom koja nema bočni lanac, npr., glicinom.

[0058] Varijante tipično ispoljavaju istu kvalitativnu biološku aktivnost i izazvaće isti imunski odgovor kao prirodni analog, mada se varijante takođe selektuju tako da modifikuju svojstva muteina IL-2 prema potrebi. Alternativno, varijanta može da bude konstruisana tako da biološka aktivnost muteina IL-2 bude izmenjena. Na primer, mesta glikozilacije mogu da budu izmenjena ili uklonjena kao što je razmatrano u ovom dokumentu.

Muteini IL-2 sa produženim poluživotom u serumu

[0059] Budući da muteini IL-2 dati u ovom tekstu preferencijalno dovode do ekspanzije Treg ćelija u odnosu na, na primer Teff ili NK ćelije, očekuje se da će se bezbednosni profil pri davanju pacijentu razlikovati od profila divljeg tipa IL-2 ili PROLEUKIN® (aldesleukin; Novartis, Basel, Switzerland). Sporedna dejstva povezana sa divljim tipom IL-2 ili PROLEUKIN® uključuju simptome slične gripu, drhtavicu/ukočenost mišića, bol u zglobovima,

1

groznicu, osip, svrab, reakcije na mestu injekcije, hipotenziju, dijareju, mučninu, anksioznost, konfuziju i depresiju. Muteini IL-2 dati u ovom tekstu mogu da budu izmenjeni tako da uključuju ili da budu fuzionisani sa molekulima koji produžavaju poluživot u serumu muteina bez povećanja rizika da će takvo produžavanje poluživota povećati verovatnoću ili intenzitet sporednih efekata ili neželjenih događaja kod pacijenta. Subkutano doziranje takvog muteina sa produženim poluživotom u serumu može da omogući produženu pokrivenost cilja sa nižom sistemskom maksimalnom izloženošću leku (Cmax). Produženi poluživot u serumu može da omogući niži ili ređi režim doziranja muteina.

[0060] Poluživot u serumu muteina IL-2 datih u ovom tekstu može da se produži suštinski bilo kojim postupkom poznatim u stanju tehnike. Takvi postupci uključuju izmenu sekvence muteina IL-2 tako da uključi peptid koji se vezuje za neonatalni receptor Fcγ ili se vezuje za protein koji ima produženi poluživot u serumu, npr., IgG ili humani serumski albumin. U drugim primerima izvođenja, mutein IL-2 može da bude fuzionisan sa polipeptidom koji fuzionom molekulu pruža produženi poluživot. Takvi polipeptidi uključuju Fc IgG ili druge polipeptide koji se vezuju za neonatalni receptor Fcγ, humani serumski albumin, ili polipeptide koji se vezuju za protein koji ima produžen poluživot u serumu. U poželjnim primerima izvođenja, mutein IL-2 je fuzionisan sa molekulom Fc IgG.

[0061] Mutein IL-2 može da bude fuzionisan sa N-terminalnim krajem ili C-terminalnim krajem Fc regiona IgG. Ko što je prikazano u primerima, fuzija sa C-terminalnim krajem Fc regiona IgG održava aktivnost muteina IL-2 u većem stepenu nego kada je fuzionisan sa N-terminalnim krajem Fc IgG.

[0062] Jedan primer izvođenja predmetnog pronalaska je usmeren na dimer koji sadrži dva Fcfuziona polipeptida stvorena fuzijom muteina IL-2 sa Fc regionom antitela. Dimer može da se napravi, na primer, insertovanjem genske fuzije koja kodira fuzioni protein u odgovarajući ekspresioni vektor, eksprimiranjem genske fuzije u ćelijama-domaćinima transformisanim rekombinantnim ekspresionim vektorom, i omogućavanjem eksprimiranom fuzionom proteinu da se sklopi slično molekulima antitela, nakon čega se između fragmenata Fc formiraju interlančane veze da bi se dobio dimer.

[0063] Izraz "Fc polipeptid"ili "Fc region" u značenju koje je ovde primenjeno uključuje nativne i muteinske forme polipeptida dobijenih od Fc regiona antitela. Skraćeni oblici takvih polipeptida koji sadrže region zgloba koji podstiče dimerizaciju takođe su uključeni. U izvesnim objavama, Fc region sadrži CH2 i CH3 domen antitela. Uporedo sa produženim poluživotom u serumu, fuzioni proteini koji sadrže Fc fragmente (i oligomere obrazovane od njih) nude prednost lakog prečišćavanja afinitetnom hromatografijom na koloni Protein A ili Protein G. Fc regioni prema pronalasku potiču od humanog IgG1. Poželjni Fc regioni su poreklom od

1

humanog IgG, koji obuhvata IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U ovom dokumentu, specifične rezidue u Fc su identifikovane prema poziciji. Sve pozicije Fc zasnivaju se na EU šemi numeracije.

[0064] Jedna od funkcija Fc dela antitela je komunikacija sa imunskim sistemom kada se antitelo vezuje za svoje ciljno mesto. Ovo se smatra "efektorskom funkcijom". Komunikacija vodi ćelijskoj citotoksičnosti zavisnoj od antitela (ADCC), ćelijskoj fagocitozi zavisnoj od antitela (ADCP), i/ili citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC). ADCC i ADCP su posredovane vezivanjem Fc za receptore za Fc na površini ćelija imunskog sistema. CDC je posredovana vezivanjem Fc sa proteinima sistema komplementa, npr., C1q.

[0065] Potklase IgG variraju po svojoj sposobnosti da posreduju u efektorskim funkcijama. Na primer, IgG1 je superiorniji od IgG2 i IgG4 u posredovanju ADCC i CDC. Na taj način, tamo gde je efektorna funkcija nepoželjna, bio bi poželjan IgG2 Fc. IgG2 molekuli koji sadrže Fc, međutim, poznati su kao teži za proizvodnju i imaju manje priblačne biofizičke osobine, kao što su kraći polu-život, u poređenju sa molekulima IgG2 koji sadrže Fc.

[0066] Efektorska funkcija antitela može da se poveća, ili smanji, uvođenjem jedne ili više mutacija u Fc. Primeri izvođenja prema pronalasku su obuhvataju fuzione proteine Fc-mutein IL-2 koji imaju Fc konstruisan tako da poveća efektorsku funkciju (U.S. 7,317,091 i Strohl, Curr. Opin. Biotech., 20:685-691, 2009). Primeri molekula Fc IgG1 koji imaju povećanu efektorsku funkciju uključuju one koji imaju sledeće supstitucije:

S239D/I332E

S239D/A330S/I332E

S239D/A330L/I332E

S298A/D333A/K334A

P247I/A339D

P247I/A339Q

D280H/K290S

D280H/K290S/S298D

D280H/K290S/S298V

F243L/R292P/Y300L

F243L/R292P/Y300L/P396L

F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L

G236A/S239D/I332E

K326A/E333A

K326W/E333S

K290E/S298G/T299A

1

K290N/S298G/T299A

K290E/S298G/T299A/K326E

K290N/S298G/T299A/K326E

[0067] Još jedan postupak za povećanje efektorske funkcije proteina koji sadrže Fc IgG podrazumeva smanjenje fukozilacije Fc. Uklanjanje fukoze iz jezgra kompleksnih oligosaharida sa dve grane vezanih za Fc snažno je povećalo ADCC efektorsku funkciju bez izmene vezivanja antigena ili CDC efektorske funkcije. Poznato je nekoliko načina za smanjenje ili ukidanje fukozilacije molekula koji sadrže Fc fragment, npr., antitela. Oni uključuju rekombinantnu ekspresiju u određenim sisarskim ćelijskim linijama uključujući ćelijsku liniju sa isključenim FUT8, varijantu CHO linije Lec13, ćelijsku liniju hibridoma pacova YB2/0, ćelijsku liniju koja sadrži malu interferirajuću RNK specifično protiv gena FUT8, i ćelijsku liniju koja koeksprimira β-1,4-N-acetilglukozaminiltransferazu III i α-manozidazu II Goldži kompleksa. Alternativno, molekul koji sadrži Fc može da bude eksprimiran u ćeliji koja nije sisarska kao što je biljna ćelija, kvasac, ili prokariotska ćelija, npr., E. coli.

[0068] U poželjnim primerima izvođenja prema pronalasku fuzioni proteini Fc-mutein IL-2 sadrže Fc konstruisan tako da snizi efektorsku funkciju. Primeri Fc molekula koji imaju sniženu efektorsku funkciju uključuju one koji imaju sledeće supstitucije:

N297A ili N297Q (IgG1)

L234A/L235A (IgG1)

V234A/G237A (IgG2)

L235A/G237A/E318A (IgG4)

H268Q/V309L/A330S/A331S (IgG2)

C220S/C226S/C229S/P238S (IgG1)

C226S/C229S/E233P/L234V/L235A (IgG1)

L234F/L235E/P331S (IgG1)

S267E/L328F (IgG1)

[0069] Poznato je da humani IgG1 ima mesto glikozilacije na N297 (EU sistem numerisanja) i glikozilacija doprinosi efektorskoj funkciji antitela IgG1. Primer sekvence IgG1 dat je u SEQ ID NO:3. U nastojanju da se naprave neglikozilisana antitela mutiran je N297. Mutacije su fokusirane na zamenu N297 aminokiselinama koje liče na asparagin po fizikohemijskoj prirodi, kao što je glutamin (N297K) ili alaninom (N297A) koji oponaša asparagin bez polarnih grupa.

[0070] U značenju koje je ovde primenjeno, "neglikozilisano antitelo" ili "neglikozilisani Fc" odnosi se na status glikozilacije rezidue na poziciji 297 u Fc. Antitelo ili drugi molekul može da

1

sadrži glikozilaciju na jednoj ili više drugih lokacija, ali se može i dalje smatrati neglikozilisanim antitelom ili neglikozilisanim Fc-fuzionim proteinom.

[0071] U naporu da napravimo Fc IgG1 bez efektorske funkcije, objavljeno je da mutacija aminokiseline N297 humanog IgG1 u glicin, tj., N297G, donosi daleko superiorniju efikasnost prečišćavanja i biofizička svojstva u odnosu na druge aminokiselinske supstitucije na toj rezidui. Videti primer 8. Dakle, u poželjnim primerima izvođenja fuzioni protein Fc-mutein IL-2 sadrži Fc humanog IgG1 koji ima supstituciju N297G. Fc koji sadrži supstituciju N297G koristan je u kontekstu u kome molekul sadrži Fc humanog IgG1, i nije ograničen na upotrebu u kontekstu fuzije Fc-mutein IL-2. Antitelo može sadrži Fc koji ima supstituciju N297G.

[0072] Fc koji sadrži Fc humanog IgG1 koji ima mutaciju N297G može takođe da sadrži dodatne insercije, delecije i supstitucije. Fc humanog IgG1 može da sadrži supstituciju N297G i najmanje je 90% identičan, najmanje 91% identičan, najmanje 92% identičan, najmanje 93% identičan, najmanje 94% identičan, najmanje 95% identičan, najmanje 96% identičan, najmanje 97% identičan, najmanje 98% identičan, ili najmanje 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:3. U posebno poželjnom primeru izvođenja, C-terminalna lizinska rezidua je supstituisana ili deletirana. Aminokiselinska sekvenca humanog IgG1 koja sadrži supstituciju N297G i deleciju C-terminalnog lizina navedena je u SEQ ID NO:4.

[0073] Pokazano je da su molekuli koji sadrže neglikozilisani Fc IgG1 manje stabilni od molekula koji sadrže glikozilisani Fc IgG1. Fc region može biti dalje konstruisan da poveća stabilnost neglikozilisanog molekula. U nekim objavama jedna ili više aminokiselina su supstituisane cisteinom tako da obrazuju disulfidne veze u dimernom stanju. Rezidue V259, A287, R292, V302, L306, V323, ili I332 aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:3 mogu da budu supstituisane cisteinom. U poželjnim objavama specifični parovi rezidua su supstitucija tako da preferencijalno obrazuju disulfidnu vezu jedni sa drugima, na taj način ograničavajući ili sprečavajući preplitanje disulfidnih veza. Poželjni parovi obuhvataju. eli bez ograničenja na A287C i L306C, V259C i L306C, R292C i V302C, i V323C i I332C.

[0074] Ovde su obezbeđeni molekuli koji sadrže Fc fragment u kome su jedna ili više rezidua V259, A287, R292, V302, L306, V323, ili I332 supstituisane cisteinom. Poželjni molekuli koji sadrže Fc obuhvataju one koji sadrže supstitucije A287C i L306C, V259C i L306C, R292C i V302C, ili V323C i I332C.

[0075] Dodatne mutacije koje mogu da budu napravljene u Fc IgG1 uključuju one koje olakšavaju obrazovanje heterodimera između polipeptida koji sadrže Fc. U nekim objavama, Fc region je konstruisan da stvara "ispupčenja" i "udubljenja" koja olakšavaju obrazovanje heterodimera dva različita polipeptidna lanca koja sadrže Fc kada se koeksprimiraju u ćeliji. U.S.

7,695,963. U drugim objavama, Fc region je izmenjen tako da koristi elektrostatičko upravljanje

1

da bi se podstaklo formiranje heterodimera, dok se ometa formiranje homodimera dva različita polipeptida koji sadrže Fc kada se koeksprimiraju u ćeliji. WO 09/089,004, koji je u celini uključen u ovaj dokument po referenci. Poželjni heterodimerni Fc uključuju one u kojima jedan lanac Fc sadrži supstitucije D399K i E356K, a drugi lanac Fc sadrži supstitucije K409D i K392D. U drugim objavama jedan lanac Fc sadrži supstitucije D399K, E356K, i E357K, a drugi lanac Fc da sadrži supstitucije K409D, K392D, i K370D.

[0076] U određenim primerima izvođenja, za fuzioni protein Fc-mutein IL-2 može da predstavlja prednost da bude monomeran, tj., da sadrži samo jedan molekul muteina IL-2. Fc-region fuzionog proteina može da sadrži jednu ili više mutacija koje olakšavaju obrazovanje heterodimera. Fuzioni protein se koeksprimira sa Fc-regionom koji ima recipročne mutacije onima u fuzionom polipeptidu Fc-mutein IL-2, ali bez muteina IL-2. Kada se obrazuje heterodimer dva polipeptida koji sadrže Fc, rezultujući protein sadrži samo jedan mutein IL-2.

[0077] Drugi postupak za stvaranje monomernog fuzionog proteina Fc-mutein IL-2 je fuzionisanje muteina IL-2 sa monomernim Fc, tj., Fc regionom koji ne dimerizuje. Stabilni monomerni Fc sadrže mutacije koje ometaju dimerizaciju i koje stabilizuju molekul u monomernom obliku. Poželjni monomerni Fc opisani su u WO 2011/063348. Fuzioni proteini Fc-mutein IL-2 sadrži Fc koji sadrži negativno naelektrisane aminokiseline na pozicijama 392 i 409 zajedno sa supstitucijom treoninom na Y349, L351, L368, V397, L398, F405, ili Y407.

[0078] U određenim primerima izvođenja, fuzioni protein Fc-mutein IL-2 sadrži linker između Fc i muteina IL-2. Mnogi različiti linkerski polipeptidi su poznati u stanju tehnike i mogu da se koriste u kontekstu fuzionog proteina Fc-mutein IL-2. U poželjnim primerima izvođenja, fuzioni protein Fc-mutein IL-2 sadrži jednu ili više kopija peptida koji se sastoji od GGGGS (SEQ ID NO:5), GGNGT (SEQ ID NO:6), ili YGNGT (SEQ ID NO:7) između Fc i muteina IL-2. U nekim primerima izvođenja, polipeptidni region između Fc regiona i regiona muteina IL-2 može sadrži jednu kopiju GGGGS (SEQ ID NO:5), GGNGT (SEQ ID NO:6), ili YGNGT (SEQ ID NO:7). Kao što je ovde pokazano, linkeri GGNGT (SEQ ID NO:6) ili YGNGT (SEQ ID NO:7) su glikozilisani kada se eksprimiraju u odgovarajućim ćelijama i takva glikozilacija može da pomogne u stabilizaciji proteina u rastvoru i/ili kada se primeni in vivo. Prema tome, u određenim primerima izvođenja, fuzioni protein muteina IL-2 sadrži glikozilisani linker između Fc regiona i regiona muteina IL-2.

[0079] Smatra se da glikozilisani linker može da bude koristan kada je smešten u kontekstu polipeptida. Ovde su obezbeđeni polipeptidi koji sadrže GGNGT (SEQ ID NO:6) ili YGNGT (SEQ ID NO:7) umetnute u aminokiselinsku sekvencu polipeptida, ili koji zamenjuju jednu ili više aminokiselina u aminokiselinskoj sekvenci polipeptida. U poželjnim objavama, GGNGT (SEQ ID NO:6) ili YGNGT (SEQ ID NO:7) su insertovani u petlju tercijarne strukture

2

polipeptida. U drugim objavama, jedna ili više aminokiselina petlje zamenjene su sa GGNGT (SEQ ID NO:6) ili YGNGT (SEQ ID NO:7).

[0080] C-terminalni deo Fc i/ili amino terminalni deo muteina IL-2 može da sadrži jednu ili više mutacija koje menjaju glikozilacioni profil fuzionog proteina Fc-mutein IL-2 kada se eksprimira u sisarskim ćelijama. U određenim objavama, mutein IL-2 dodatno sadrži T3 supstituciju, npr., T3N ili T3A. Mutein IL-2 može dalje da sadrži S5 supstituciju, kao što je S5T.

[0081] Kovalentne modifikacije muteina IL-2 i fuzionih proteina Fc-mutein IL-2 su uključene u obim ovog pronalaska, i uopšteno se, ali ne uvek, izvode posle translacije. Na primer, nekoliko vrsta kovalentnih modifikacija muteina IL-2 ili fuzionog proteina Fc-mutein IL-2 uvedene su u molekul reakcijom specifične aminokiselinske rezidue muteina IL-2 ili fuzionog proteina Fcmutein IL-2 sa organskim sredstvom za derivatizaciju koje može da reaguje sa izabranim bočnim lancima ili N- ili C-terminalnim reziduama.

[0082] Cisteinil rezidue najčešće reaguju sa α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), kao što je hloroacetatna kiselina ili hloroacetamid, dajući karboksimetil ili karboksiamidometil derivate. Derivati cisteinil rezidua takođe se mogu dobiti reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, α-bromoβ-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfidom, metil 2-piridil disulfidom, p-hloromerkuribenzoatom, 2-hloromerkuri-4-nitrofenolom, ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom.

[0083] Derivati histidil rezidua mogu da se dobiju reakcijom sa dietilpirokarbonatom na pH 5.5-7.0 jer je ovo sredstvo relativno specifično za bočni lanac histidila. Može da se koristi i parabromofenacil bromid; pri čemu se reakcija poželjno sprovodi u 0.1 M natrijum kakodilatu na pH 6.0.

[0084] Lizinil rezidue i amino-terminalne rezidue reaguju sa sukcinskim, ili sa anhidridima drugih karboksilnih kiselina. Modifikovanje ovim sredstvima ima dejstvo promene naelektrisanja lizinil rezidua. Drugi pogodni reagensi za modifikovanje rezidua koje sadrže alfaamino grupu uključuju imidoestre kao što su metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hloroborohidrid; trinitrobenzensulfonsku kiselinu; O-metilizourea; 2,4-pentandion; i reakciju sa glioksilatom katalizovana transaminazom.

[0085] Arginil rezidue se modifikuju reakcijom sa jednim ili nekoliko uobičajenih reagenasa, među kojima su fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion i ninhidrin. Dobijanje derivata argininskih rezidua zahteva da se reakcija izvede u alkalnim uslovima zbog visokog pKa guanidinske funkcionalne grupe. Osim toga, ovi reagensi mogu da reaguju sa grupama lizina kao i epsilon-amino grupom arginina.

[0086] Specifična modifikacija tirozil rezidua može da se napravi, sa posebnom interesom za uvođenje spektralnih oznaka u tirozil rezidue reakcijom sa aromatičnim diazonijumskim jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće se koriste N-acetilimidizol i tetranitrometan da bi se obrazovale O-acetil tirozilne vrste odnosno 3-nitro derivati. Tirozil rezidue se jodiraju upotrebom 125I ili<131>I da bi se pripremili obeleženi proteini za upotrebu u radioimunoeseju, pri čemu je pogodan postupak sa hloraminom T koji je opisan u tekstu iznad.

[0087] Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) se selektivno modifikuju reakcijom sa karbodiimidima (R’-N=C=N-R’), u kojoj su R i R’ opciono različite alkil grupe, kao što su 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil) karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonija-4,4-dimetilpentil) karbodiimid. Osim toga, aspartil i glutamil rezidue se pretvaraju u asparaginil i glutaminil rezidue reakcijom sa amonijumovim jonima.

[0088] Derivatizacija sa bifunkcionalnim sredstvima je korisna za unakrsno vezivanje antigenvezujućih proteina za potpornu matricu nerastvorljivu u vodi ili za površinu za upotrebu u različitim postupcima. Uobičajeno korišćena unakrsno vezujuća sredstva uključuju, npr., 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, estre N-hidroksisukcinimida, na primer, estre sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidoestre, uključujući disukcinimidil estre kao što je 3,3’-ditiobis(sukcinimidilpropionat), i bifunkcionalne maleimide kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan. Sredstva za derivatizaciju kao što je metil-3-[(p-azidofenil)ditio] propioimidat daju fotoaktivne intermedijere koji su sposobni da formiraju unakrsne veze u prisustvu svetlosti. Alternativno, reaktivne matrice nerastvorljive u vodi kao što su ugljeni hidrati aktivirani cijanogen bromidom i reaktivni supstrati opisani u SAD pat. br. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440 koriste se za imobilizaciju proteina.

[0089] Glutaminil i asparaginil rezidue se često deamidiraju u odgovarajuće glutamil odnosno aspartil rezidue. Alternativno, ove rezidue se deamidiraju u blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih rezidua pripada obimu ovog pronalaska.

[0090] Druge modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksil grupa seril ili treonil rezidua, metilaciju α-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina i histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetilaciju N-terminalnog amina, i amidaciju bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0091] Druga vrsta kovalentne modifikacije muteina IL-2 ili fuzionog proteina Fc-mutein IL-2 obuhvaćena obimom ovog pronalaska sadrži izmenu obrasca glikozilacije proteina. Kao što je poznato u ovoj oblasti, obrasci glikozilacije mogu da zavise i od sekvence proteina (npr., prisustva ili odsustva određenih glikozilacionih aminokiselinskih rezidua, razmatranih u nastavku), ili ćelije-domaćina ili organizma u kome se proizvodi protein. Konkretni ekspresioni sistemi se razmatraju u tekstu ispod.

[0092] Glikozilacija polipeptida je obično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezivanje se odnosi na vezivanje ugljenohidratne grupe za bočni lanac asparaginske rezidue. Tropeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, u kojima je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenohidratne grupe za bočni lanac asparagina. Na taj način, prisustvo bilo koje od ovih tropeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija odnosi se na vezivanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze, za hidroksiaminokiselinu, najčešće serin ili treonin, mada mogu da se upotrebe i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0093] Dodavanje glikozilacionih mesta u mutein IL-2 ili fuzioni protein Fc-mutein IL-2 može da bude pogodno izvršeno promenom aminokiselinske sekvence tako da sadrži jednu ili više gore opisanih tropeptidnih sekvenci (za N-vezana glikozilaciona mesta). Izmena takođe može da se izvede dodatkom, ili supstitucijom jedne ili više serinskih ili treoninskih rezidua u polaznoj sekvenci (za O-vezana glikozilaciona mesta). Zbog jednostavnosti, aminokiselinska sekvenca muteina IL-2 ili fuzionog proteina Fc-mutein IL-2 je poželjno izmenjena putem promena na nivou DNK, posebno mutiranjem DNK koja kodira ciljni polipeptid na unapred odabranim bazama tako da se stvore kodoni koji će se translatirati u željene aminokiseline.

[0094] Drugi način povećanja broja ugljenohidratnih fragmenata u muteinu IL-2 ili fuzionom proteinu Fc-mutein IL-2 je pomoću hemijskog ili enzimskog kuplovanja glikozida sa proteinom. Ovi postupci su pogodni po tome što ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji-domaćinu koja ima sposobnost glikozilacije za N- i O-vezanu glikozilaciju. U zavisnosti od korišćenog načina kuplovanja, šećer/šećeri mogu da budu povezani sa (a) argininom i histidinom, (b) slobodnim karboksilnim grupama, (c) slobodnim sulfhidrilnim grupama kao što su one u cisteinu, (d) slobodnim hidroksilnim grupama kao što su one u serinu, treoninu, ili hidroksiprolinu, (e) aromatičnim reziduama kao što su one u fenilalaninu, tirozinu, ili triptofanu, ili (f) amidnom grupom glutamina. Ovi postupci su opisani u WO 87/05330 objavljenoj 11. septembra 1987, i kod Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp.259-306.

[0095] Uklanjanje ugljenohidratnih fragmenata prisutnih u polaznom muteinu IL-2 ili fuzionom proteinu Fc-mutein IL-2 može da se postigne hemijski ili enzimski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluorometansulfonskoj kiselini, ili ekvivalentnom jedinjenju. Ova obrada rezultuje isecanjem većine ili svih šećera osim povezujućih šećera (N-acetilglukozamina ili N-acetilgalaktozamina), dok polipeptid ostaje nedirnut. Hemijska deglikozilacija opisana je kod Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 i kod Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. Enzimsko isecanje ugljenohidratnih fragmenata u polipeptidima može da se postigne upotrebom različitih endo- i egzo-glikozidaza kao što je opisano kod Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350. Glikozilacija na potencijalnim

2

glikozilacionim mestima može da bude sprečena upotrebom jedinjenja tunikamicina kao što je opisano kod Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. Tunikamicin blokira obrazovanje protein-N-glikozidnih veza.

[0096] Druga vrsta kovalentnih modifikacija muteina IL-2 ili fuzionog proteina Fc-mutein IL-2 obuhvata vezivanje muteina IL-2 ili fuzionog proteina Fc-mutein IL-2 za različite neproteinske polimere, uključujući, ali bez ograničenja, različite poliole kao što su polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkileni, na način koji je naveden u SAD pat. br. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337. Dodatno, aminokiselinske supstitucije mogu da budu izvedene na različitim pozicijama u muteinu IL-2 ili fuzionom proteinu Fc-mutein IL-2 da olakšaju dodavanje polimera kao što je PEG. Na taj način, primeri izvođenja prema pronalasku obuhvataju PEG-ilovane muteine IL-2 i fuzione proteine Fc-mutein IL-2. Takvi PEG-ilovani proteini mogu da imaju produženi poluživot i/ili redukovanu imunogenost u odnosu na proteine koji nisu PEG-ilovani.

Polinukleotidi koji kodiraju muteine IL-2 i fuzione proteine Fc-mutein IL-2

[0097] Obuhvaćene unutar pronalaska su nukleinske kiseline koje kodiraju IL-2 muteine i fuzione proteine Fc-mutein IL-2. Aspekti prema pronalasku mogu da uključuju polinukleotidne varijante (npr., zbog degeneracije) koje kodiraju aminokiselinske sekvence opisane u ovom tekstu. Polipeptid koji je kodiran izolovanom nukleinskom kiselinom može biti komponenta fuzionog proteina Fc-mutein IL-2.

[0098] Nukleotidne sekvence koje odgovaraju aminokiselinskim sekvencama opisanim u ovom tekstu, za korišćenje kao probe ili prajmeri za izolovanje nukleinskih kiselina ili kao ispitujuće sekvence za pretraživanje baze podataka, mogu da se dobiju "povratnom translacijom" iz aminokiselinskih sekvenci. Dobro poznati postupak reakcije lančane polimeraze (PCR) može da se koristi za izolovanje i umnožavanje DNK sekvence koja kodira muteine IL-2 i fuzioni protein Fc-mutein IL-2. Oligonukleotidi koji definišu željene krajeve kombinacije DNK fragmenata koriste se kao 5’ i 3’ prajmeri. Oligonukleotidi mogu dodatno da sadrže mesta prepoznavanja za restrikcione endonukleaze, za olakšavanje insercije amplifikovane kombinacije DNK fragmenata u ekspresioni vektor. PCR tehnike su opisane kod Saiki et al., Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp.

189-196; i PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990).

[0099] Molekuli nukleinske kiseline prema pronalasku uključuju DNK i RNK i u jednolančanom i u dvolančanom obliku, kao i odgovarajuće komplementarne sekvence. "Izolovana nukleinska kiselina" je nukleinska kiselina koja je razdvojena od susednih genetskih sekvenci prisutnih u genomu organizma iz koga je nukleinska kiselina izolovana, u slučaju kada su nukleinske kiseline izolovane iz prirodnih izvora. U slučaju nukleinskih kiselina koje su enzimski sintetisane sa šablona ili hemijski sintetisane, kao što su proizvodi PCR reakcije, molekuli cDNK, ili oligonukleotidi na primer, jasno je da su nukleinske kiseline koje su rezultat takvih postupaka izolovane nukleinske kiseline. Izolovani molekul nukleinske kiseline odnosi se na molekul nukleinske kiseline u obliku odvojenog fragmenta ili na komponentu većeg konstrukta nukleinske kiseline. U jednoj poželjnoj objavi, nukleinske kiseline su suštinski bez kontaminirajućeg endogenog materijala. Molekul nukleinske kiseline poželjno potiče od DNK ili RNK koja je izolovana najmanje jednom u suštinski čistom obliku i u količini ili koncentraciji koja omogućava identifikaciju, manipulaciju i izdvajanje njegove komponente nukleotidnih sekvenci standardnim biohemijskim metodama (kao što su one navedene u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Takve sekvence su poželjno obezbeđene i/ili konstruisane u obliku otvorenog okvira čitanja koji nije prekinut unutrašnjim netranslatiranim sekvencama, ili intronima, koje su obično prisutne u eukariotskim genima. Sekvence netranslatirane DNK mogu da budu prisutne 5’ ili 3’ od otvorenog okvira čitanja, gde one ne ometaju manipulaciju ili ekspresiju kodirajućeg regiona.

[0100] Varijante prema pronalasku se obično pripremaju usmerenom mutagenezom nukleotida u DNK koja kodira IL-2 mutein ili fuzioni protein Fc-mutein IL-2, upotrebom kasete ili PCR mutagenezom ili drugim tehnikama koje su dobro poznate u ovoj oblasti, da bi se proizvela DNK koja kodira varijantu, i nakon toga eksprimiranjem rekombinantne DNK u ćelijskoj kulturi kao što je ovde navedeno. Međutim, IL-2 muteini i fuzioni Fc-mutein IL-2 može da bude pripremljen in vitro sintezom korišćenjem uspostavljenih tehnika. Varijante tipično ispoljavaju istu kvalitativnu biološku aktivnost kao prirodni analog, npr., ekspanziju Treg, mada mogu da budu odabrane i varijante koje imaju modifikovana svojstva kao što će biti potpunije navedeno u tekstu ispod.

[0101] Kao što će stručnjaku u oblasti biti jasno, zbog degeneracije genetskog koda, može da se napravi izuzetno veliki broj nukleinskih kiselina, od kojih sve kodiraju IL-2 muteine i fuzione proteine Fc-mutein IL-2 prema ovom pronalasku. Na taj način, kada su identifikovali konkretnu aminokiselinsku sekvencu, stručnjaci u ovoj oblasti bi mogli da naprave bilo koji broj različitih nukleinskih kiselina, jednostavnom modifikacijom sekvence jednog ili više kodona na način koji ne menja aminokiselinsku sekvencu kodiranog proteina.

[0102] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ekspresione sisteme i konstrukte u obliku plazmida, ekspresionih vektora, transkripcionih ili ekspresionih kaseta koje sadrže najmanje

2

jedan polinukleotid kao gore. Pored toga, pronalazak obezbeđuje ćelije-domaćine koje sadrže takve ekspresione sisteme ili konstrukte.

[0103] Tipično, ekspresioni vektori koji se koriste u bilo kojoj od ćelija-domaćina sadržaće sekvence za održavanje plazmida i za kloniranje i ekspresiju egzogene nukleotidne sekvence. Takve sekvence, zajednički označene kao "granične sekvence" u određenim objavama će tipično uključivati jednu ili više od sledećih nukleotidnih sekvenci: promotor, jednu ili više sekvenci pojačivača, oridžin replikacije, sekvencu za završetak transkripcije, kompletnu intronsku sekvencu koja sadrži donorsko i akceptorsko mesto splajsovanja, sekvencu koja kodira lidersku sekvencu za izlučivanje polipeptida, mesto vezivanja ribozoma, poliadenilacionu sekvencu, polilinkerski region za inserciju nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji treba da se eksprimira, i element selektabilnog markera. Svaka od ovih sekvenci razmatra se u tekstu ispod.

[0104] Opciono, vektor može da sadrži sekvencu koja kodira "oznaku", tj., oligonukleotidni molekul smešten na 5’ ili 3’ kraju sekvence koja kodira muteine IL-2 ili fuzioni protein Fcmutein IL-2; oligonukleotidnu sekvencu koja kodira poliHis (kao što je heksaHis (SEQ ID NO:21)), ili drugu "oznaku" kao što je FLAG, HA (hemaglutinin virusa influence), ili myc, za koji postoje komercijalno dostupna antitela. Ova oznaka se tipično fuzioniše sa polipeptidom po ekspresiji polipeptida, i može da služi kao sredstvo za afinitetno prečišćavanje ili detekciju muteina IL-2 iz ćelije-domaćina. Afinitetno prečišćavanje može da se postigne, na primer, hromatografijom na koloni upotrebom antitela protiv oznake kao afinitetne matrice. Opciono, oznaka može zatim da se ukloni sa prečišćenih muteina IL-2 i fuzionih proteina Fc-mutein IL-2 na različite načine kao što je upotreba određenih peptidaza za isecanje.

[0105] Granične sekvence mogu da budu homologe (tj., iz iste vrste i/ili soja kao ćelijadomaćin), heterologe (tj., iz vrste različite od vrste ili soja ćelije-domaćina), hibridne (tj., kombinacija graničnih sekvenci iz više od jednog izvora), sintetske ili nativne. Tako, izvor graničnih sekvenci može da bude bilo koji prokariotski ili eukariotski organizam, bilo koji organizam kičmenjaka ili beskičmenjaka, ili bilo koja biljka, pod uslovom da je granična sekvenca funkcionalna u, i može da se aktivira ćelijskim aparatom domaćina.

[0106] Granične sekvence korisne u vektorima prema pronalasku mogu da se dobiju bilo kojom od nekoliko metoda poznatih u stanju tehnike. Po pravilu, granične sekvence koje su ovde korisne prethodno se identifikuju mapiranjem i/ili digestijom restrikcionim endonukleazama, tako da mogu da budu izolovane iz odgovarajućeg izvora u vidu tkiva upotrebom odgovarajućih restrikcionih endonukleaza. U nekim slučajevima, potpuna nukleotidna sekvenca granične sekvence može da bude poznata. U ovom dokumentu, granična sekvenca može da bude sintetisana upotrebom postupaka koji su opisani u ovom tekstu za sintezu ili kloniranje nukleinskih kiselina.

2

[0107] Bilo da je cela ili samo deo granične sekvence poznat, ona može da se dobije upotrebom lančane reakcije polimeraze (PCR) i/ili skriningom genomske biblioteke sa pogodnom probom kao što je oligonukleotid i/ili fragment granične sekvence iz iste ili druge vrste. Kada granična sekvenca nije poznata, fragment DNK koji sadrži graničnu sekvencu može da bude izolovan iz većeg dela DNK koji može da sadrži, na primer, kodirajuću sekvencu ili čak još jedan gen ili gene. Izolacija može da bude obavljena digestijom restrikcionim endonukleazama da bi se proizveo pravi DNK fragment, praćenom izolovanjem korišćenjem prečišćavanja agaroznim gelom, hromatografijom na koloni Qiagen® (Chatsworth, CA), ili drugim metodama poznatim stručnjaku u datoj oblasti. Izbor pogodnih enzima za ovu svrhu biće sasvim očigledan stručnjaku u ovoj oblasti.

[0108] Oridžin replikacije je tipično deo komercijalno nabavljenih prokariotskih ekspresionih vektora, i oridžin replikacije pomaže pri amplifikaciji vektora u ćeliji-domaćinu. Ako izabrani vektor ne sadrži oridžin replikacije, on može da bude hemijski sintetisan na osnovu poznate sekvence, i ligiran u vektor. Na primer, oridžin replikacije iz plazmida pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) pogodan je za većinu gram-negativnih bakterija, a različiti virusni oridžini (npr., SV40, polioma, adenovirus, virus vezikularnog stomatitisa (VSV), ili papilomavirusi kao što su HPV ili BPV) su korisni za kloniranje vektora u sisarske ćelije. Uopšteno, komponenta oridžina replikacije nije potrebna za sisarske ekspresione vektore (na primer, oridžin SV40 se često koristi samo zato što sadrži i rani virusni promotor).

[0109] Sekvenca za završetak transkripcije je tipično smeštena 3’ u odnosu na kraj regiona koji kodira polipeptid i služi da okonča transkripciju. Obično, sekvenca za završetak transkripcije u prokariotskim ćelijama je fragment bogat G-C parovima praćen poli-T sekvencom. Iako se sekvenca lako klonira iz biblioteke ili čak nabavlja komercijalno kao deo vektora, može lako i da se sintetiše upotrebom postupaka za sintezu nukleinske kiseline kao što su oni opisani u ovom tekstu.

[0110] Gen za selektabilni marker kodira protein neophodan za preživljavanje i rast ćelijedomaćina koja raste u selektivnom medijumu za kulturu. Tipični geni za selekcione markere kodiraju proteine koji (a) obezbeđuju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, tetraciklin, ili kanamicin za prokariotske ćelije-domaćine; (b) dopunjavaju auksotrofne nedostatke ćelije; ili (c) obezbeđuju kritične nutrijente koji nisu dostupni u složenom ili definisanom medijumu. Specifični selektabilni markeri su gen za rezistenciju na kanamicin, gen za rezistenciju na ampicilin i gen za rezistenciju na tetraciklin. Pogodno, gen za rezistenciju na neomicin može da se koristi za selekciju i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijamadomaćinima.

2

[0111] Drugi selektabilni geni mogu da budu korišćeni za amplifikovanje gena koji će se eksprimirati. Amplifikacija je postupak u kome se geni koji su potrebni za proizvodnju proteina kritičnog za rast ili preživljavanje ćelija ponavljaju u tandemu u hromozomima uzastopnih generacija rekombinantnih ćelija. Primeri pogodnih selektabilnih markera za sisarske ćelije uključuju gene za dihidrofolat reduktazu (DHFR) i gene za timidin kinazu bez promotora. Transformisane sisarske ćelije se izlažu selekcionom pritisku pri čemu su samo transformisane ćelije jedinstveno adaptirane da prežive na osnovu selektabilnog gena prisutnog u vektoru. Selekcioni pritisak se nameće kultivacijom transformisanih ćelija u uslovima u kojima se koncentracija selekcionog agensa u medijumu sukcesivno povećava, što vodi amplifikaciji i selektabilnog gena i DNK koja kodira drugi gen, kao što je mutein IL-2 ili fuzioni protein Fcmutein IL-2. Kao rezultat, sa amplifikovane DNK sintetišu se povećane količine polipeptida kao što je mutein IL-2 ili fuzioni protein Fc-mutein IL-2.

[0112] Mesto vezivanja ribozoma je obično neophodno za inicijaciju translacije iRNK i odlikuje se sekvencom ShineDalgarno (prokarioti) ili sekvencom Kozak (eukarioti). Element je tipično smešten 3’ u odnosu na promotor i 5’ u odnosu na kodirajuću sekvencu polipeptida koji treba da se eksprimira. U određenim objavama, jedan ili više kodirajućih regiona mogu da budu funkcionalno vezan za unutrašnje mesto vezivanja ribozoma (IRES), omogućavajući translaciju dva otvorena okvira čitanja sa jednog transkripta RNK.

[0113] U nekim slučajevima, kao kada je glikozilacija poželjna u ekspresionom sistemu eukariotske ćelije-domaćina, moguće je manipulisati različitim pre- ili pro-sekvencama da bi se poboljšala glikozilacija ili prinos. Na primer, može da se izmeni mesto sečenja peptidazom određenog signalnog peptida, ili da se doda pro-sekvenca, što može da utiče na glikozilaciju. Finalni proteinski proizvod može da ima, na poziciji -1 (u odnosu na prvu aminokiselinu zrelog proteina) jednu ili više dodatnih aminokiselina povezanih sa ekspresijom, koje možda nisu potpuno uklonjene. Na primer, finalni proteinski proizvod može da ima jednu ili dve aminokiselinske rezidue koje se nalaze na mestu sečenja peptidazom, vezane za aminoterminalni kraj. Alternativno, upotreba nekih mesta sečenja enzimima može da rezultuje blago skraćenim oblikom željenog polipeptida, ako enzim seče u toj oblasti u zrelom polipeptidu.

[0114] Ekspresioni vektori i vektori za kloniranje prema pronalasku će tipično sadržati promotor koji prepoznaje organizam domaćina i koji je funkcionalno vezan a molekul koji kodira mutein IL-2 ili fuzioni protein Fc-mutein IL-2. Promotori su netranskribujuće sekvence smeštene ushodno (tj., 5’) od start kodona strukturnog gena (uopšteno unutar oko 100 do 1000 bp) koje kontrolišu transkripciju strukturnog gena. Promotori su uobičajeno grupisani u jednu od dve klase: inducibilni promotori i konstitutivni promotori. Inducibilni promotori iniciraju povišene nivoe transkripcije sa DNK koja je pod njihovom kontrolom kao odgovor na neku promenu u

2

uslovima kultivacije, kao što je prisustvo ili odsustvo nutrijenta ili promena temperature. Konstitutivni promotori, sa druge strane, ravnomerno transkribuju gen za koji su funkcionalno vezani, što znači, sa malo ili bez kontrole nad genskom ekspresijom. Dobro je poznat veliki broj promotora, koje prepoznaju različite potencijalne ćelije-domaćini.

[0115] Pogodni promotori za upotrebu sa kvascima kao domaćinima su takođe dobro poznati u stanju tehnike. Pojačivači iz kvasca se pogodno koriste sa promotorima iz kvasca. Pogodni promotori za upotrebu sa sisarskim ćelijama-domaćinima su dobro poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, one dobijene iz genoma virusa kao što je polioma virus, virus boginja živine, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, ptičji sarkoma virus, citomegalovirus, retrovirusi, virus hepatitisa B i najpoželjnije Simian virus 40 (SV40). Drugi pogodni sisarski promotori uključuju heterologe sisarske promotore, na primer, promotore toplotnog šoka i aktinski promotor.

[0116] Dodatni promotori koji mogu da budu od interesa uključuju, ali nisu ograničeni na: rani promotor SV40 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310); promotor CMV (Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663); promotor sadržan u 3’ dugom terminalnom ponovku Rous sarkoma virusa (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); promotor timidin kinaze herpes virusa (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445); promotor i regulatorne sekvence gena metalotionina (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); i prokariotski promotori kao što je promotor beta-laktamaze (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731); ili promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). Od interesa su i sledeći životinjski transkripcioni kontrolni regioni, koji ispoljavaju tkivnu specifičnost i korišćeni su u transgenim životinjama: kontrolni region gena elastaze I koji je aktivan u acinarnim ćelijama pankreasa (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); kontrolni region insulinskog gena koji je aktivan u beta ćelijama pankreasa (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); kontrolni region imunoglobulinskog gena koji je aktivan u limfoidnim ćelijama (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); kontrolni region virusa tumora mlečne žlezde miša koji je aktivan u ćelijama testisa, dojke, limfoidnim i mast ćelijama (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); kontrolni region albuminskog gena koji je aktivan u jetri (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel.1 :268-276); kontrolni region alfa-feto-proteinskog gena koji je aktivan u jetri (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); kontrolni region gena alfa 1antitripsina koji je aktivan u jetri (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel.1:161-171); kontrolni region beta-globinskog gena koji je aktivan u mijeloidnim ćelijama (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell

2

46:89-94); kontrolni region gena mijelinskog baznog proteina koji je aktivan u oligodendrocitnim ćelijama u mozgu (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); kontrolni region gena lakog lanca-2 miozina koji je aktivan u skeletnim mišićima (Sani, 1985, Nature 314:283-286); i kontrolni region gena gonadotropnog oslobađajućeg hormona koji je aktivan u hipotalamusu (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

[0117] Sekvenca pojačivača može da bude insertovana u vektor da bi povećala transkripciju kod viših eukariota. Pojačivači su elementi DNK koji deluju u cis-konfiguraciji, obično dužine 10-300 bp, koji deluju na promotor da bi povećali transkripciju. Pojačivači su relativno nezavisni od orjentacije i položaja, koji se nalaze na pozicijama i 5’ i 3’ u odnosu na transkripcionu jedinicu. Poznate su sekvence nekoliko pojačivača dostupnih iz sisarskih gena (npr., globina, elastaze, albumina, alfa-feto-proteina i insulina). Tipično se, međutim, koristi pojačivač iz virusa. Pojačivač SV40, pojačivač ranog promotora citomegalovirusa, pojačivač polioma virusa, i pojačivači adenovirusa poznati u stanju tehnike su primeri pojačivača za aktivaciju eukariotskih promotora. Iako pojačivač može da bude smešten u vektoru bilo 5’ ili 3’ u odnosu na kodirajuću sekvencu, tipično je smešten na mestu 5’ od promotora. Sekvenca koji kodira odgovarajuću nativnu ili heterologu signalnu sekvencu (lidersku sekvencu ili signalni peptid) može da bude ugrađena u ekspresioni vektor, da bi podstakla vanćelijsko izlučivanje muteina IL-2 ili fuzionog proteina Fc-mutein IL-2. Izbor signalnog peptida ili liderske sekvence zavisi od vrste ćelijadomaćina u kojima protein treba da se proizvodi, i heterologa signalna sekvenca može da zameni nativnu signalnu sekvencu. Primeri signalnih peptida koji su funkcionalni u sisarskim ćelijamadomaćinima uključuju sledeće: signalnu sekvencu za interleukin-7 (IL-7) opisanu u SAD patentu br. 4,965,195; signalnu sekvencu za receptor interleukina-2 opisanu kod Cosman et al., 1984, Nature 312:768; signalni peptid receptora interleukina-4 opisan u EP patentu br. 0367 566; signalni peptid receptora tipa I interleukina-1 opisan u SAD patentu br. 4,968,607; signalni peptid receptora tipa II interleukina-1 opisan u EP patentu br.0 460 846.

[0118] Vektor može da sadrži jedan ili više elemenata koji olakšavaju ekspresiju kada se vektor integriše u genom ćelije-domaćina. Primeri uključuju element EASE (Aldrich et al. 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38) i region vezivanja za matriks (MAR). MAR posreduje u strukturnoj organizaciji hromatina i može da izoluje integrisani vektor od "pozicionog" efekta. Tako, MAR su posebno korisni kada se vektor koristi za stvaranje stabilnih transfektanata. U stanju tehnike su poznate su brojne prirodne i sintetske nukleinske kiseline koje sadrže MAR, npr., SAD patenti br. 6,239,328; 7,326,567; 6,177,612; 6,388,066; 6,245,974; 7,259,010; 6,037,525; 7,422,874; 7,129,062.

[0119] Ekspresioni vektori prema pronalasku mogu da budu konstruisani od polaznog vektora kao što je komercijalno dostupan vektor. Takvi vektori mogu ali ne moraju da sadrže sve željene granične sekvence. Kada jedna ili više od graničnih sekvenci opisanih u ovom tekstu nije prisutna u vektoru, one mogu pojedinačno da se dobiju i ligiraju u vektor. Stručnjaku u ovoj oblasti su dobro poznati postupci koji se koriste za dobijanje svake od graničnih sekvenci.

[0120] Nakon što je vektor konstruisan i molekul nukleinske kiseline koja kodira mutein IL-2 ili fuzioni protein Fc-mutein IL-2 insertovan na odgovarajuće mesto u vektoru, gotov vektor može da bude insertovan u pogodnu ćeliju-domaćina za amplifikaciju i/ili ekspresiju polipeptida. Transformacija ekspresionog vektora u odabranu ćeliju-domaćina može da bude postignuta dobro poznatim postupcima uključujući transfekciju, infekciju, koprecipitaciju kalcijum fosfatom, elektroporaciju, mikroinjekciju, lipofekciju, transfekciju posredovanu DEAE-dekstranom, ili druge poznate tehnike. Odabrani metod će delimično zavisiti od vrste ćelijedomaćina koja se koristi. Ovi postupci i drugi pogodni postupci su dobro poznati stručnjaku u ovoj oblasti, i prikazani su, na primer, kod Sambrook et al., 2001, iznad.

[0121] Ćelija-domaćin, kada se kultiviše pod pogodnim uslovima, sintetiše mutein IL-2 ili fuzioni protein Fc-mutein IL-2 koji zatim može da se sakupi iz medijuma kulture (ako ga ćelijadomaćin izlučuje u medijum) ili direktno iz ćelije-domaćina koja ga proizvodi (ako se ne izlučuje). Izbor odgovarajuće ćelije-domaćina zavisiće od različitih faktora, kao što su željeni nivoi ekspresije, modifikacije polipeptida koje su poželjne ili neophodne za aktivnost (kao što je glikozilacija ili fosforilacija) i lakoća sklapanja u biološki aktivan molekul. Ćelija-domaćin može da bude eukariotska ili prokariotska.

[0122] Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u stanju tehnike i uključuju, ali nisu ograničene na, imortalizovane ćelijske linije dostupne iz američke kolekcije kultura sojeva (ATCC) i bilo koje ćelijske linije koje se koriste u ekspresionom sistemu poznate u stanju tehnike mogu da se koriste za pravljenje rekombinantnih polipeptida prema pronalasku. Uopšteno, ćelije-domaćini se transformišu rekombinantnim ekspresionim vektorom koji sadrži DNK koja kodira željeni mutein IL-2 ili fuziju Fc-mutein IL-2. Među ćelijamadomaćinima koje mogu da se koriste su prokarioti, kvasac ili ćelije viših eukariota. Prokarioti uključuju gram negativne ili gram pozitivne organizme, na primer E. coli ili bacile. Ćelije viših eukariota uključuju insekatske ćelije i uspostavljene ćelijske linije sisarskog porekla. Primeri pogodnih sisarskih ćelijskih linija-domaćina uključuju liniju COS-7 ćelija majmunskog bubrega (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), L ćelije, 293 ćelije, C127 ćelije, 3T3 ćelije (ATCC CCL 163), ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ili njihove derivate kao što su Veggie CHO i srodne ćelijske linije koje rastu u medijumu bez seruma (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31), HeLa ćelije, BHK (ATCC CRL 10) ćelijske linije, i ćelijsku liniju CVI/EBNA dobijenu od ćelijske linije bubrega afričkog zelenog majmuna CVI (ATCC CCL 70) ka što je opisao McMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821, ćelije bubrega humanog embriona

1

kao što su 293, 293 EBNA ili MSR 293, humane epidermalne ćelije A431, humane ćelije Colo205, druge transformisane ćelijske linije primata, normalne diploidne ćelije, ćelijske sojeve dobijene iz in vitro kulture primarnog tkiva, primarne eksplante, HL-60, U937, HaK ili JurkaT-ćelije. Izborno, sisarske ćelijske linije kao što su HepG2/3B, KB, NIH 3T3 ili S49, na primer, mogu da se koriste za ekspresiju polipeptida kada je poželjno koristiti polipeptid u različitim signalnim transdukcijama ili reporterskim esejima.

[0123] Alternativno, moguće je proizvesti polipeptid u nižim eukariotima kao što je kvasac ili u prokariotima kao što su bakterije. Pogodni kvasci uključuju Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, sojeve roda Kluyveromyces, Candida, ili bilo koji soj kvasca sposoban da eksprimira heterologe polipeptide. Pogodni bakterijski sojevi uključuju Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, ili bilo koji bakterijski soj sposoban da eksprimira heterologe polipeptide. Ako je polipeptid napravljen u kvascu ili bakteriji, može da bude poželjno modifikovati polipeptid proizveden u njima, na primer fosforilacijom ili glikozilacijom odgovarajućih mesta, da bi se dobio funkcionalni polipeptid. Takva kovalentna povezivanja mogu da se ostvare upotrebom poznatih hemijskih ili enzimskih metoda.

[0124] Polipeptid može da se proizvede i operativnim povezivanjem izolovane nukleinske kiseline prema pronalasku za pogodne kontrolne sekvence u jednom ili više insekatskih ekspresionih vektora, i korišćenjem insekatskog ekspresionog sistema. Materijali i metode za ekspresione sisteme na bazi bakulovirusa/insekatske ćelije su komercijalno dostupni u obliku kompleta kod proizvođača, npr., Invitrogen, San Diego, Calif., SAD (komplet MaxBac®), i takvi metodi su dobro poznati u stanju tehnike, kao što je opisano kod Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), i Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Translacioni sistemi bez ćelija mogu takođe da se koriste za proizvodnju polipeptida upotrebom RNK dobijenih od konstrukata nukleinskih kiselina koji su opisani u ovom dokumentu. Odgovarajući vektori za kloniranje i ekspresiju za upotrebu sa ćelijama-domaćinima poreklom od bakterija, gljiva, kvasca i sisara su opisani kod Pouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985). Ćelija-domaćin koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema pronalasku, poželjno funkcionalno vezanu za najmanje jednu sekvencu za kontrolu ekspresije, predstavlja "rekombinantnu ćeliju-domaćina".

[0125] U određenim aspektima, pronalazak obuhvata izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira humani mutein IL-2 koji preferencijalno stimuliše T-regulatorne ćelije i sadrži V91K supstituciju i aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identičnu aminokiselinskoj sekvenci navedenoj u SEQ ID NO:1. Izolovana nukleinska kiselina može da kodira bilo koji od muteina IL-2 koji su ovde dati kao primer.

2

[0126] Uključene su i izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od primera IL-2 mutein Fc-fuzionih proteina opisanih u ovom tekstu. U objavi, deo koji čini Fc u antitelu i humani mutein IL-2 su kodirani unutar jednog otvorenog okvira čitanja, po izboru sa linkerom kodiranim između Fc regiona i muteina IL-2.

[0127] U sledećoj objavi, ovde su dati ekspresioni vektori koji sadrže gore navedene nukleinske kiseline koje kodiraju IL-2 mutein ili IL-2 Fc-fuzioni protein funkcionalno vezan za promotor.

[0128] U sledećem aspektu, ovde su obezbeđene ćelije-domaćini koje sadrže izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju gore navedene IL-2 muteine ili IL-2 mutein Fc-fuzione proteine. Ćelija-domaćin može da bude prokariotska ćelija, kao što je E. coli, ili može da bude eukariotska ćelija, kao što je sisarska ćelija. U određenim primerima izvođenja, ćelija-domaćin je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO).

[0129] U sledećem aspektu, ovde su dati postupci za pripremu humanog muteina IL-2. Postupci obuhvataju kultivisanje ćelije-domaćina pod uslovima u kojima se promotor funkcionalno vezan za humani mutein IL-2 eksprimira. Nakon toga, humani mutein IL-2 se sakuplja iz navedene kulture. Mutein IL-2 može da bude sakupljen iz medijuma kulture i/ili iz lizata ćelija-domaćina.

[0130] U sledećem aspektu, ovde su obezbeđeni postupci za pripremu humanog IL-2 mutein Fcfuzionog proteina. Postupci obuhvataju kultivisanje ćelije-domaćina pod uslovima u kojima se eksprimira promotor funkcionalno vezan za Fc-fuzioni protein humanog muteina IL-2. Nakon toga, Fc-fuzioni protein humanog muteina IL-2 se sakuplja iz navedene kulture. Fc-fuzioni protein humanog muteina IL-2 može da bude sakupljen iz medijuma kulture i/ili iz lizata ćelijadomaćina.

Farmaceutske kompozicije

[0131] U nekim objavama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapijski efikasnu količinu muteina IL-2 zajedno sa farmaceutski efikasnim razblaživačima, nosačem, sredstvom za povećanje rastvorljivosti, emulgatorom, konzervansom, i/ili adjuvansom. U određenim primerima izvođenja, mutein IL-2 je u kontekstu fuzionog proteina Fc-mutein IL-2. Farmaceutske kompozicije pronalaska uključuju, ali nisu ograničene na, tečne, zamrznute i liofilizovane kompozicije.

[0132] Poželjno, materijali za formulaciju su netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama. U specifičnim objavama, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje sadrže terapijski efikasnu količinu terapijskog molekula koji sadrži mutein IL-2, npr, Fc-fuzije muteina IL-2.

[0133] U određenim objavama, farmaceutska kompozicija može da sadrži materijale za formulaciju za modifikovanje, održavanje ili konzervisanje, na primer, pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili prodiranja kompozicije. U takvim objavama, pogodni materijali za formulaciju uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što je glicin, glutamin, asparagin, arginin, prolin, ili lizin); antimikrobna sredstva; antioksidanse (kao što je askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen-sulfit); pufere (kao što je borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline); sredstva za punjenje (kao što je manitol ili glicin); helirajuća sredstva (kao što je etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)); sredstva za kompleksiranje (kao što je kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-betaciklodekstrin); punioce; monosaharide; disaharide; i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, manoza ili dekstrini); proteine (kao što je serumski albumin, želatin ili imunoglobulini); sredstva za bojenje, davanje arome i razblaživanje; emulgatore; hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide niske molekulske težine; protiv-jone koji obrazuju soli (kao što je natrijum); konzeravanse (kao što je benzalkonijum hlorid, benzoeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol ili polietilen glikol); šećerne alkohole (kao što je manitol ili sorbitol); sredstva za suspendovanje; surfaktante ili sredstva za kvašenje (kao što su pluronici, PEG, sorbitan estri, polisorbati kao što je polisorbat 20, polisorbat, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); sredstva za poboljšanje stabilnosti (kao što je saharoza ili sorbitol); sredstva za poboljšanje toničnosti (kao što su halidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol); vehikulume za isporuku; razblaživače; ekscipijense i/ili farmaceutske adjuvanse. Videti, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

[0134] U određenim objavama, stručnjak u oblasti će odrediti optimalnu farmaceutsku kompoziciju u zavisnosti od, na primer, predviđenog puta primene, formata isporuke i željenog doziranja. Videti, na primer, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, gore. U određenim primerima izvođenja, takve kompozicije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobađanja in vivo i brzinu klirensa in vivo antigen-vezujućih proteina prema pronalasku. U određenim objavama, primarni vehikulum ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može da bude ili vodene ili nevodene prirode. Na primer, pogodan vehikulum ili nosač može da bude voda za injekcije, fiziološki rastvor soli ili veštačka cerebrospinalna tečnost, eventualno obogaćena drugim materijama uobičajenim za kompozicije za parenteralnu primenu. Neutralni puferisani rastvor soli ili rastvor soli pomešan sa serumskim albuminom su sledeći primeri vehikuluma. U određenim objavama, farmaceutske kompozicije sadrže Tris pufer od oko pH 7.0-8.5, ili acetatni pufer od oko pH 4.0-5.5, i mogu dodatno da uključuju sorbitol ili njegovu pogodnu zamenu. U

4

određenim objavama pronalaska, kompozicije muteina Il-2 mogu da se pripreme za skladištenje mešanjem odabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim sredstvima za formulaciju (REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, gore) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim primerima izvođenja, proizvod muteina IL-2 može da bude formulisan kao liofilizat upotrebom odgovarajućih ekscipijenasa kao što je saharoza.

[0135] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu da budu odabrane za parenteralnu isporuku. Alternativno, kompozicije mogu da budu odabrane za inhalaciju ili za isporuku preko digestivnog trakta, kao što je oralno. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je u okviru struke. Komponente formulacije su prisutne poželjno u koncentracijama koje su prihvatljive na mestu primene. U određenim objavama, koriste se puferi za održavanje kompozicije na fiziološkom pH ili na neznatno nižem pH, tipično u opsegu pH od oko 5 do oko 8.

[0136] Kada se razmatra parenteralna primena, terapijske kompozicije za upotrebu u ovom pronalasku mogu da budu obezbeđene u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena koji sadrži željenu kompoziciju muteina IL-2 u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Posebno pogodan vehikulum za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je kompozicija muteina IL-2 formulisana kao sterilan, izotonični rastvor, pravilno konzervisan. U određenim objavama, preparat može da uključuje formulaciju željenog molekula sa sredstvom, kao što su injektabilne mikrosfere, bioerodibilne čestice, polimerna jedinjenja (kao što je polilaktična kiselina ili poliglikolna kiselina), kuglice ili lipozomi, koji mogu da obezbede kontrolisano ili neprekidno oslobađanje proizvoda koji se može isporučiti putem depo injekcije. U određenim objavama, hijaluronska kiselina može takođe da se koristi, budući da podstiče produženo trajanje u cirkulaciji. U određenim objavama, implantabilni uređaji za isporuku leka mogu da koriste za uvođenje kompozicije muteina IL-2.

[0137] Dodatne farmaceutske kompozicije biće očigledne stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući formulacije koje uključuju kompozicije muteina IL-2 u formulacijama sa neprekidnom ili kontrolisanom isporukom. Tehnike formulisanja raznih drugih sredstava za neprekidnu ili kontrolisanu isporuku, kao što su lipozomski nosači, bioerodibilne mikročestice ili porozne kuglice i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, na primer, međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/US93/00829, koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija. Preparati sa neprekidnim oslobađanjem mogu da uključuju polupropustljive polimerne matrice u vidu oblikovanih artikala, npr., filmova, ili mikrokapsula. Matrice sa neprekidnim oslobađanjem mogu da uključuju poliestre, hidrogelove, polilaktide (kao što je opisano u SAD pat. br.

3,773,919 i objavi evropske patentne prijave br. EP 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroksietilmetakrilat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res.15:167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech.

12:98-105), etilen vinil acetat (Langer et al., 1981, supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (objava evropske patentne prijave br. EP 133,988). Kompozicije sa neprekidnim oslobađanjem mogu takođe da uključuju lipozome koji mogu da se pripreme bilo kojim od nekoliko postupaka poznatih u stanju tehnike. Videti, npr., Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

82:3688-3692; objave evropskih patentnih prijava br. EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0138] Farmaceutske kompozicije koje se koriste za primenu in vivo tipično su obezbeđene kao sterilni preparati. Sterilizacija može da se obavi filtracijom kroz membrane za sterilnu filtraciju. Kada se kompozicija liofilizuje, sterilizacija upotrebom ovog postupka može da se izvede ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicije za parenteralnu primenu mogu da se skladište u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralne kompozicije se uopšteno smeštaju u kontejner koji ima sterilni ulazni otvor, na primer, kesa za intravenski rastvor ili bočica sa zatvaračem koji može da se probode hipodermalnom injekcionom iglom.

[0139] Objave prema pronalasku uključuje samo-puferisane formulacije muteina IL-2, koje mogu da se koriste kao farmaceutske kompozicije, kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 06138181A2 (PCT/US2006/022599).

[0140] Kao što je gore razmatrano, određene objave obezbeđuju kompozicije muteina IL-2, posebno farmaceutske fuzione proteine Fc-mutein Il-2, koje sadrže, pored kompozicije muteina IL-2, jedan ili više ekscipijenasa kao što su oni koji su ilustrativno opisani u ovom odeljku i na nekom drugom mestu u ovom dokumentu. Ekscipijensi u tom pogledu mogu da se koristite u pronalasku za široku lepezu namena, kao što je podešavanje fizičkih, hemijskih, ili bioloških svojstava formulacija, kao što je podešavanje viskoznosti, ili postupaka prema pronalasku radi poboljšanja efikasnosti i/ili za stabilizaciju takvih formulacija i postupaka koji sprečavaju degradaciju i kvarenje nastalo zbog, na primer, stresnih uslova koji se javljaju tokom proizvodnje, transporta, skladištenja, pripreme pre upotrebe, primene, i posle toga.

[0141] Dostupno je mnoštvo izlaganja o stabilizaciji proteina i materijalima za formulaciju i postupcima koji su korisni u tom smislu, kao što je Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," in: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), i Randolph et al., "Surfactant-protein interactions," Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), posebno u delovima koji se odnose na ekscipijense i postupke u vezi sa njima za formulacije proteina koje imaju sposobnost održavanja pH u skladu sa ovim pronalaskom, naročito kada se radi o proteinskim farmaceutskim proizvodima i postupcima za veterinarske i/ili humane medicinske upotrebe.

[0142] Prema određenim objavama pronalaska, mogu da se upotrebe soli za, na primer, podešavanje jonske jačine i/ili izotoničnosti formulacije i/ili za poboljšanje rastvorljivosti i/ili fizičke stabilnosti proteina ili drugog sastojka kompozicije u skladu sa pronalaskom.

[0143] Kao što je dobro poznato, joni mogu da stabilizuju nativno stanje proteina vezivanjem za naelektrisane rezidue na površini proteina i zaštitom naelektrisanih i polarnih grupa u proteinu i smanjivanjem jačine njihovih elektrostatičkih interakcija, privlačnih i odbojnih interakcija. Joni takođe mogu da stabilizuju denaturisano stanje proteina vezivanjem, posebno za denaturisane peptidne veze (--CONH) u proteinu. Osim toga, jonske interakcije sa naelektrisanim i polarnim grupama u proteinu takođe mogu da smanje međumolekulske elektrostatičke interakcije i, time, spreče ili smanje agregaciju i nerastvorljivost proteina.

[0144] Jonske vrste se značajno razlikuju po svojim dejstvima na proteine. Razvijen je niz rangiranja u kategorije jona i njihovih efekata na proteine koji se mogu koristiti u formulisanju farmaceutskih kompozicija u skladu sa ovim pronalaskom. Jedan od primera je Hofmeister-ova serija, koja rangira jonske i polarne nejonske rastvore prema njihovom dejstvu na konformacionu stabilnost proteina u rastvoru. Stabilizujući rastvori su označeni kao "kosmotropi". Destabilizujući rastvori označeni su kao "haotropi". Kosmotropi se obično koriste u visokim koncentracijama (npr., >1 molarni amonijum sulfat) za taloženje proteina iz rastvora ("isoljavanje"). Haotropi se obično koriste za denturaciju i/ili za solubilizaciju proteina ("zasoljavanje"). Relativna efikasnost jona u "zasoljavanju" i "isoljavanju" definiše njihov položaj u Hofmeister-ovoj seriji.

[0145] Slobodne aminokiseline mogu da se koriste u formulacijama muteina IL-2 u skladu sa različitim primerima izvođenja prema pronalasku kao sredstva za punjenje, stabilizatori i antioksidansi, kao i za druge standardne upotrebe. Lizin, prolin, serin i alanin mogu da se koriste za stabilizaciju proteina u formulaciji. Glicin je koristan u liofilizaciji za osiguravanje ispravne strukture i svojstava kolača. Arginin može da bude koristan za sprečavanje agregacije proteina, i u tečnim i u liofilizovanim formulacijama. Metionin je koristan kao antioksidans.

[0146] Polioli uključuju šećere, npr., manitol, saharozu i sorbitol i polihidoksilne alkohole kao što su, na primer, glicerol i propilen glikol, i, u svrhu ove diskusije, polietilen glikol (PEG) i srodne supstance. Polioli su kosmotropi. Oni su korisna sredstva za stabilizaciju i u tečnim i u liofilizovanim formulacijama za zaštitu proteina od procesa fizičke i hemijske degradacije. Polioli su takođe korisni za podešavanje toničnosti formulacija.

[0147] Među poliolima koji su korisni u odabranim objavama pronalaska je manitol, koji se obično koristi da obezbedi strukturnu stabilnost kolača u liofilizovanim formulacijama. On obezbeđuje strukturnu stabilnost kolača. Uopšteno se koristi sa lioprotektantom, npr., saharozom. Sorbitol i saharoza su među poželjnim sredstvima za podešavanje toničnosti i kao stabilizatori za zaštitu protiv stresa izazvanog zamrzavanjem-otapanjem tokom transporta ili pripreme balkova tokom proizvodnog postupka. Redukujući šećeri (koji sadrže slobodne aldehidne ili ketonske grupe), kao što su glukoza i laktoza, mogu da izvrše glikaciju površinskih lizinskih i argininskih rezidua. Stoga, oni uopšteno nisu među poželjnim poliolima za upotrebu u skladu sa pronalaskom. Pored toga, šećeri koji obrazuju takve reaktivne vrste, kao što je saharoza, koja hidrolizuje na fruktozu i glukozu pod kiselim uslovima, i posledično izaziva glikaciju, takođe nije među poželjnim poliolima prema pronalasku u tom pogledu. PEG je koristan da stabilizuje proteine i kao krioprotektant i može da se koristi u pronalasku u tom pogledu.

[0148] Objave formulacija muteina IL-2 dodatno sadrže surfaktante. Proteinski molekuli mogu da budu podložni adsorpciji na površine i denaturaciji i posledičnoj agregaciji na dodirnim površinama vazduh-tečnost, čvrsto-tečnost, i tečnost-tečnost. Ova dejstva se uopšteno odnose inverzno prema koncentraciji proteina. Ove štetne interakcije se uopšteno odnose inverzno prema koncentraciji proteina i tipično se pogoršavaju fizičkim mućkanjem, kao što je ono koje nastaje tokom transporta i rukovanja proizvodom.

[0149] Surfaktanti se rutinski koriste za sprečavanje, svođenje na najmanju meru ili smanjenje površinske adsorpcije. Surfaktanti koji su u tom pogledu korisni u ovom pronalasku uključuju polisorbat 20, polisorbat 80, druge estre masnih kiselina sorbitan polietoksilata i poloksamer 188.

[0150] Surfaktanti se takođe uobičajeno koriste za kontrolu konformacione stabilnosti proteina. Upotreba surfaktanata u tom pogledu je protein-specifična budući da će bilo koji dati surfaktant tipično stabilizovati neke proteine i destabilizovati druge.

[0151] Polisorbati su podložni oksidativnoj degradaciji i često, u trenutku isporuke, sadrže dovoljne količine peroksida da izazovu oksidaciju bočnih lanaca proteinskih ostataka, naročito metionina. Posledično, polisorbati treba da se koriste oprezno, i kada se koriste, treba ih koristiti u najnižoj efikasnoj koncentraciji. U tom pogledu, polisorbati ilustruju opšte pravilo da ekscipijensi treba da se koriste u najnižim efikasnim koncentracijama.

[0152] Dodatne objave formulacije muteina IL-2 dodatno sadrže jedan ili više antioksidanasa. Do neke mere štetna oksidacija proteina u farmaceutskim formulacijama može da se spreči održavanjem ispravnih nivoa kiseonika i temperature okruženja i izbegavanjem izlaganja svetlu. Antioksidantni ekscipijensi mogu da se koriste i za sprečavanje oksidativne degradacije proteina. Među korisnim antioksidansima u tom pogledu su redukujuća sredstva, hvatači kiseonika/slobodnih radikala i helirajuća sredstva. Antioksidansi za upotrebu u terapijskim formulacijama proteina u skladu sa pronalaskom poželjno su rastvorljivi u vodi i održavaju svoju aktivnost tokom roka trajanja proizvoda. EDTA je poželjni antioksidans u skladu sa pronalaskom u tom pogledu.

[0153] Antioksidansi mogu da oštete proteine. Na primer, redukujuća sredstva, kao što je konkretno glutation, mogu da poremete intramolekuske disulfidne veze. Tako, antioksidansi za upotrebu u pronalasku su odabrani tako da, između ostalog, eliminišu ili dovoljno smanje mogućnost da oni sami oštete proteine u formulaciji.

[0154] Formulacije u skladu sa pronalaskom mogu da uključuju metalne jone koji su proteinski kofaktori i koji su neophodni da obrazuju proteinske koordinacione komplekse, kao što je cink neophodan da obrazuje određene insulinske suspenzije. Metalni joni mogu takođe da inhibiraju neke procese koji razgrađuju proteine. Međutim, metalni joni takođe katalizuju fizičke i hemijske procese koji razgrađuju proteine.

[0155] Joni magnezijuma (10-120 mM) mogu da se koriste da inhibiraju izomerizaciju asparaginske kiseline u izoasparaginsku kiselinu. Joni Ca+2 (do 100 mM) mogu da povećaju stabilnost humane deoksiribonukleaze. Mg+2 , Mn+2 i Zn<+2>, međutim, mogu da destabilizuju rhDNazu. Slično, Ca<+2>i Sr<+2>mogu da stabilizuju faktor VIII, on može da bude destabilizovan jonima Mg+2 , Mn+2 i Zn+2 , Cu+2 i Fe+2 , i njegova agregacija može da bude povećana jonima Al<+3>.

[0156] Objave formulacija muteina IL-2 dodatno sadrže jedan ili više konzervansa. Konzervansi su neophodni pri razvoju multidoznih parenteralnih formulacija koje uključuju više od jednog izvlačenja formulacije iz istog kontejnera. Njihova primarna funkcija je da inhibiraju rast mikroorganizama i osiguraju sterilnost proizvoda tokom roka trajanja ili roka upotrebe leka. Uobičajeno korišćeni konzervansi uključuju benzil alkohol, fenol i m-krezol. Iako konzervansi imaju dugu istoriju upotrebe sa niskomolekularnim parenteralnim preparatima, razvoj proteinskih formulacija koje uključuju konzervansi može da predstavlja izazov. Konzervansi gotovo uvek imaju destabilišuće dejstvo (agregacija) na proteine, i ovo je postao glavni ograničavajući faktor za njihovu upotrebu u multidoznim proteinskim formulacijama. Do danas, većina proteinskih lekova formulisana je samo za jednokratnu upotrebu. Međutim, kada su multidozne formulacije moguće, one imaju dodatnu prednost u smislu omogućavanja praktičnosti za pacijenta i povećanja tržišnih mogućnosti. Dobar primer je onaj za humani hormon rasta (hGH) kod koga je razvoj konzervisanih formulacija vodio komercijalizaciji pogodnijeg oblika za primenu, injekcione olovke za višekratnu upotrebu. Najmanje četiri takve olovke koje sadrže konzervisane formulacije hGH su trenutno dostupne na tržištu. Norditropin (tečni, Novo Nordisk), Nutropin AQ (tečni, Genentech) i Genotropin (liofilizovani-kaseta sa dve komore, Pharmacia & Upjohn) sadrže fenol, dok je Somatrope (Eli Lilly) formulisan sa mkrezolom.

[0157] U jednoj objavi, IL-2 mutein ili Fc-fuzija muteina IL-2, kao što je, na primer, Fc.IL-2(V91K) ili Fc.IL-2(N88D), je formulisan do 10 mg/mL u 10 mM L-glutaminskoj kiselini, 3.0% (tež./zapr.) L-prolina, na pH 5.2. U sledećem primeru izvođenja, IL-2 mutein ili Fc-fuzija IL-2 muteina, kao što je, na primer, Fc.IL-2(V91K) ili Fc.IL-2(N88D), je formulisan/formulisana u 10 mM KPi, 161 mM L-arginina, na pH 7.6.

[0158] Tokom formulacije i razvoja konzervisanih doznih oblika treba razmotriti nekoliko objava. Efikasna koncentracija konzervansa u leku mora da se optimizuje. Ovo zahteva ispitivanje datog konzervansa u doznom obliku sa opsezima koncentracije koji daju antimikrobnu efikasnost bez ugrožavanja stabilnosti proteina.

[0159] U sledećoj objavi, predmetni pronalazak daje muteine IL-2 ili Fc-fuzije muteina IL-2 u liofilizovanim formulacijama. Proizvodi koji se suše zamrzavanjem mogu da budu liofilizovani bez konzervansa i rekonstituisani razblaživačem koji sadrži konzervans u vreme upotrebe. Ovo skraćuje vreme tokom koga je konzervans u kontaktu sa proteinom, značajno smanjujući povezane rizike po stabilnost. Kod tečnih formulacija, efikasnost konzervansa i stabilnost treba da se održavaju tokom celog roka trajanja proizvoda (oko 18 do 24 meseca). Važno je zapaziti da efikasnost konzervansa treba da bude pokazana u finalnoj formulaciji koja sadrži aktivan lek i sve komponente ekscipijensa.

[0160] Formulacije muteina IL-2 uopšteno će biti namenjene za specifične puteve i načine primene, za specifične doze za primenu i učestalosti primene, za specifične tretmane specifičnih bolesti, sa nizom bioloških raspoloživosti i perzistentnosti, između ostalog. Formulacije prema ovom pronalasku stoga mogu da budu namenjene za isporuku bilo kojim pogodnim putem, uključujući ali bez ograničenja oralnu, putem uha, oka, rektalnu i vaginalnu primenu, i parenteralnim putevima, uključujući intravensku i intraarterijalnu injekciju, intramuskularnu injekciju i subkutanu injekciju.

[0161] Jednom kada je farmaceutska kompozicija formulisana, ona može da bude skladištena u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca, kristal, ili kao dehidratisani ili liofilizovani prah. Takve formulacije mogu da budu skladištene u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr., liofilizovanom) koji se rekonstituiše pre primene. Pronalazak takođe obezbeđuje komplete za proizvodnju jednodozne jedinice za primenu leka. Svaki komplet prema pronalasku može da sadrži prvi kontejner koji ima osušeni protein i drugi kontejner koji ima vodenu formulaciju. U određenim primerima izvođenja prema ovom pronalasku, obezbeđeni su kompleti koji sadrže unapred napunjene špriceve sa jednom ili više komora (npr., špriceve sa tečnošću i liofilizatom).

[0162] Terapijski efikasna količina farmaceutske kompozicije koja sadrži mutein IL-2 koja će se koristiti zavisiće, na primer, od terapijskog konteksta i ciljeva. Stručnjak u oblasti će znati da će

4

odgovarajući nivoi doza za lečenje varirati u zavisnosti, delimično, od molekula koji se isporučuje, indikacije za koju se mutein IL-2 koristi, puta primene, i veličine (telesne težine, površine tela ili veličine organa) i/ili stanja (starost i opšte zdravlje) pacijenta. U određenim objavama, kliničar može da titrira dozu i modifikuje put primene da bi dobio optimalno terapijsko dejstvo. Tipična doza može da varira od oko 0.1 µg/kg do oko 1 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. U specifičnim primerima izvođenja, doza može da varira od 0.5 µg/kg do oko 100 µg/kg, opciono od 2.5 µg/kg do oko 50 µg/kg.

[0163] Terapijski efikasna količina muteina IL-2 poželjno rezultuje smanjenjem ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanjem učestalosti ili trajanja perioda bez simptoma bolesti, ili prevencijom oštećenja ili invalidnosti zbog bolesti.

[0164] Farmaceutske kompozicije mogu da se primene upotrebom medicinskog uređaja. Primeri medicinskih uređaja za primenu farmaceutskih kompozicija opisani su u SAD patentima br.

4,475,196; 4,439,196; 4,447,224; 4,447, 233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,312,335; 5,383,851; i 5,399,163.

Tretman autoimunih ili inflamatornih poremećaja

[0165] U određenim primerima izvođenja, mutein IL-2 prema pronalasku koristi se za lečenje autoimunskog ili zapaljenskog poremećaja. U poželjnim primerima izvođenja, koristi se fuzioni protein Fc-mutein IL-2.

[0166] Poremećaji koji su posebno pogodni za lečenje muteinom IL-2 opisanim u ovom dokumentu uključuju, ali nisu ograničeni na, zapaljenje, autoimunsku bolest, atopijske bolesti, paraneoplastične autoimunske bolesti, upalu hrskavice, artritis, reumatoidni artritis, juvenilni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, pauciartikularni juvenilni reumatoidni artritis, poliartikularni juvenilni reumatoidni artritis, sistemski oblik juvenilnog reumatoidnog artritisa, juvenilni ankilozirajući spondilitis, juvenilni enteropatski artritis, juvenilni reaktivni artritis, juvenilni Reiterov sindrom, SEA-sindrom (sindrom seronegativnosti, entezopatije, artropatije), juvenilni dermatomiozitis, juvenilni psorijazni artritis, juvenilnu sklerodermu, juvenilni sistemski eritematozni lupus, juvenilni vaskulitis, pauciartikularni reumatoidni artritis, poliartikularni reumatoidni artritis, sistemski oblik reumatoidnog artritisa, ankilozirajući spondilitis, enteropatski artritis, reaktivni artritis, Reiterov sindrom, SEA-sindrom (sindrom seronegativnosti, entezopatije, artropatije), dermatomiozitis, psorijazni artritis, sklerodermu, vaskulitis, miolitis, polimiolitis, dermatomiolitis, nodozni poliarteritis, Vegenerovu granulomatozu, arteritis, reumatsku polimialgiju, sarkoidozu, sklerozu, primarnu bilijarnu sklerozu, sklerozni holangitis, Sjogrenov sindrom, psorijazu, plak psorijazu, gutatnu psorijazu, inverznu psorijazu, pustularnu psorijazu, eritrodermijsku psorijazu, dermatitis, atopijski dermatitis, aterosklerozu, lupus, Stilovu bolest, sistemski eritematozni lupus (SLE), mijasteniju gravis, zapaljensku bolest creva (IBD), Kronovu bolest, ulcerozni kolitis, celijakiju, multiplu sklerozu (MS), astmu, COPD, rinosinuzitis, rinosinuzitis sa polipima, eozinofilni ezofagitis, eozinofilni bronhitis, Gilen-Bareovu bolest, dijabetes melitus tipa I, tiroiditis (npr., Gravesova bolest), Adisonovu bolest, Rejnoov fenomen, autoimunski hepatitis, GVHD, odbacivanje transplantacije, oštećenje bubrega, vaskulitis indukovan hepatitisom C, spontani gubitak trudnoće, i slično.

[0167] U poželjnim primerima izvođenja, autoimunski ili zapaljenski poremećaj je lupus, bolest transplanta protiv domaćina, vaskulitis indukovan hepatitisom C, dijabetes melitus tipa I, multipla skleroza, spontani gubitak trudnoće, atopijske bolesti i zapaljenske bolesti creva.

[0168] U sledećoj objavi, pacijent koji ima ili je u riziku od razvoja autoimunog ili inflamatornog poremećaja tretiran je muteinom IL-2 (na primer, mutein IL-2 koji je ovde objavljen, kao što je Fc-fuzija muteina IL-2 kao što je ovde objavljena ili drugi mutein IL-2 poznat u stanju tehnike ili IL-2 divljeg tipa, izborno kao deo Fc-fuzionog molekula tipa koji je ovde opisan) i praćen je odgovor pacijenta na tretman. Odgovor pacijenta koji je praćen može biti bilo koji detektabilni ili merljivi odgovor pacijenta na tretman, ili bilo koja kombinacija takvih odgovora. Na primer, odgovor može biti promena u fiziološkom stanju pacijenta, kao što je telesna temperatura ili groznica, povećanje apetita, znojenje, glavobolja, mučnina, umor, glad, žeđ, mentalna oštrina ili slično. Alternativno, odgovor može biti promena u količini ćelijskog tipa ili genskog proizvoda (na primer, proteina, peptida ili nukleinske kiseline), na primer, uuzorku periferne krvi uzetom od pacijenta. U jednom primeru izvođenja, režim tretmana pacijenta je promenjen ako pacijent ima detektabilan ili merljiv odgovor na tretman, ili ako takav odgovor prelazi određeni prag vrednosti. Promena može biti redukcija ili povećanje u učestalosti doziranja, ili redukcija ili povećanje u količini IL-2 muteina primenjenog po dozi, ili "odmor" od doziranja (tj., privremeni prekid tretmana, bilo tokom naznačenog vremenskog perioda, ili dok nadležni lekar ne utvrdi da bi tretman trebalo nastaviti, ili dok praćeni odgovor pacijenta ne pokaže da bi tretman trebalo ili da bi mogao da se nastavi), ili do završetka tretmana. U jednoj objavi, odgovor je promena u temperaturi pacijenta ili nivoima CRP-a. Na primer, odgovor može biti povećanje u telesnoj temperaturi pacijenta, ili povećanje nivoa CRP-a u uzorku periferne krvi, ili oba. U jednom posebnom primeru izvođenja, tretman pacijenta je redukovan, suspendovan, ili završen ako telesna temperatura pacijenta raste u toku tretmana za najmanje 0.1°, 0.2°, 0.3°, 0.4°, 0.5°, 0.7°, 1°, 1.5°, 2° ili 2.5°C. U sledećoj određenoj objavi, tretman pacijenta je redukovan, suspendovan ili završen ako se koncentracija CRP-a u uzorku periferne krvi pacijenta povećava u toku tretmana za najmanje 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.7, 1, 1.5 ili 2 mg/mL. Ostale reakcije pacijenata koje mogu biti praćene i korišćene u odlučivanju da li modifikovati, redukovati, suspendovati ili završiti tretman obuhvataju razvoj ili pogoršanje sindroma kapilarnog curenja (hipotenzija i kardiovaskularna nestabilnost), oštećenu funkciju neutrofila (na primer, koja rezultuje u ili je detektuje razvoj ili pogoršanje infekcije), trombocitopeniju, trombotičku angiopatiju, reakcije na mestu injekcije, vaskulitis (kao što je vaskulitis od virusa hepatitisa C), ili inflamatorne simptome ili bolesti. Dodatne reakcije pacijenta mogu biti praćene i korišćene u odlučivanju da li modifikovati, redukovati, povećati, suspendovati ili završiti tretman obuhvataju povećanje u broju NK ćelija, Treg ćelija, FOXP3-CD4 T ćelija, FOXP3+ CD4 T ćelija, FOXP3- CD8 T ćelija ili eozinofila. Povećanja ovih ćelijskih tipova mogu biti detektovana, na primer, kao povećanje u broju takvih ćelija po jedinici periferne krvi (na primer, izraženo kao povećanje u ćelijama po mililitru krvi) ili kao povećanje u procentu takvog ćelijskog tipa u poređenju sa drugim tipom ćelije ili ćelija u uzorku krvi. Sledeća reakcija koja može biti praćena je povećanje u količini IL-2 muteina vezanog za površinu ćelija na CD25+ ćelijama u uzorku periferne krvi pacijenta.

Postupci za ekspanziju ćelija Treg

[0169] Mutein IL-2 ili fuzioni proteini Fc-mutein IL-2 mogu da se koriste za ekspanziju Treg ćelija u subjektu ili uzorku. U ovom dokumentu obezbeđeni su postupci za povećanje odnosa ćelija Treg prema T-ćelijama koje nisu regulatorne. Postupak obuhvata dovođenje u kontakt populacije T-ćelija sa efikasnom količinom humanog muteina IL-2 ili fuzije Fc-mutein IL-2. Odnos može da bude izmeren određivanjem odnosa ćelija CD3+FOXP3+ prema ćelijama CD3+FOXP3- unutar populacije T-ćelija. Tipična učestalost Treg u ljudskoj krvi je 5-10% od ukupnih CD4+CD3+ T-ćelija, međutim, kod gore navedenih bolesti ovaj procenat može da bude niži ili viši. U poželjnim objavama, procenat Treg povećava se najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, najmanje 600%, najmanje 700%, najmanje 800%, najmanje 900%,ili najmanje 1000%. Maksimalni umnožak povećanja Treg može da varira kod određenih bolesti; međutim, maksimalna učestalost Treg koja može da se dobije putem lečenja muteinom IL-2 je 50% ili 60% od ukupnih CD4+CD3+T-ćelija. U određenim objavama, mutein IL-2 ili fuzioni protein Fcmutein IL-2 je primenjen na subjekta i odnos regulatornih T-ćelija (Treg) prema T-ćelijama koje nisu regulatorne u perifernoj krvi subjekta raste.

[0170] Budući da mutein IL-2 i fuzioni proteini Fc-mutein IL-2 preferencijalno ekspandiraju Treg ćelije u odnosu na druge tipove ćelija, oni su takođe korisni za povećanje odnosa regulatornih T-ćelija (Treg) u odnosu na ćelije prirodne ubice (NK) ćelije u perifernoj krvi

4

subjekta. Odnos može da se izmeri određivanjem odnosa ćelija CD3+FOXP3+ prema CD16+ i/ili CD56+ limfocitima koji su CD19- i CD3-.

[0171] Pretpostavlja se da muteini IL-2 ili fuzioni proteini Fc-mutein IL-2 mogu da imaju terapijsko dejstvo na bolest ili poremećaj kod pacijenta bez značajnog povećanja odnosa Treg ćelija prema neregulatornim T-ćelijama ili NK ćelijama u perifernoj krvi pacijenta. Terapijsko dejstvo može da bude prouzrokovano lokalizovanom aktivnošću muteina IL-2 ili fuzionog proteina Fc-mutein IL-2 na mestu zapaljenja ili autoimunosti.

PRIMERI

[0172] Sledeći primeri, i stvarni i predviđeni, obezbeđeni su za svrhu ilustracije specifičnih primera izvođenja ili karakteristika prema predmetnom pronalasku i nije bila namera da ograniče njegov obim.

Primer 1 – Smanjenje broja mutacija koje daju visok afinitet za CD25

[0173] Muteini IL-2 sa povišenim afinitetom za CD25 i redukovanom jačinom prenosa signala putem IL-2Rβγ preferencijalno podstiču rast i funkcionisanje Treg. Da bi se smanjila potencijalna imunogenost, tražen je minimalni broj mutacija potrebnih da se postigne visok afinitet za CD25. Kristalna struktura IL-2 u kompleksu sa njegova tri receptora (PDB kod -2B5I) pokazuje da su V69A i Q74P smeštene u heliksnoj strukturi koja interaguje sa CD25. Ovo može da objasni zašto su V69A i Q74P često bile izolovane u dva nezavisna skrininga mutageneze IL-2 za visok afinitet vezivanja za CD25 (Rao et al.2005; Thanos et al.2006). Ovaj primer istražuje koje od drugih mutacija u muteinu IL-2 "2-4", identifikovanih skriningom kod autora Rao et al., predstavljaju one najvažnije za povećanje afiniteta iznad onog koji je zapažen u slučaju kada su prisutne samo V69A i Q74P. Sledeći proteini su podvrgnuti skriningu protočnom citometrijom za vezivanje za CD25 na površini aktiviranih T-ćelija. Svi konstrukti su uključivali i FLAG na C-terminalnom kraju i oznaku poli-His za prečišćavanje i detekciju. Specifične mutacije su date u zagradama.

HaMut1D(V69A,Q74P,N88D,C125A) (SEQ ID NO:8)

HaMut2D (N30S,V69A,Q74P,N88D,C125A) (SEQ ID NO:9)

HaMut4D (T37A,V69A,Q74P,N88D,C125A) (SEQ ID NO:11)

HaMut6D (E68D,V69A,Q74P,N88D,C125A) (SEQ ID NO:13)

HaMut8D (K35R,K48E,E68D,N88D,C125A) (SEQ ID NO: 15)

[0174] HaMut7D vezuje CD25 sa gotovo istim afinitetom kao originalni izolat "2-4" (~200 pM), ukazujući na to da je mutacija N71R bila sposobna da značajno poveća afinitet iznad onog koji je zapažen kada su prisutne samo V69A, Q74P (HaMut1D, ~2 nM). Drugi konstrukti poseduju slične afinitete ili neznatno veće od HaMut1D, osim HaMut8D čiji afinitet je bio samo neznatno viši od onog kod WT IL-2.

Primer 2 - Muteini IL-2 fuzionisani sa domenima Fc IgG1 za poboljšano trajanje poluživota

[0175] U cilju smanjenja učestalosti doziranja potrebne za postizanje obogaćenja ćelijama Treg pomoću muteina IL-2, procenjivane su različite fuzije između IL-2 i domena Fc IgG1. Fc

4

domeni su sadržali tačkaste mutacije da bi se ukinule efektorske funkcije posredovane sa IgG1, kao što je liza ciljnih ćelija. Mutacije Fc efektorske funkcije koje su upotrebljene bile su A327Q, Ala Ala (L234A+L235A) ili N297G. Budući da Treg-selektivni muteini IL-2 imaju delimično smanjenu jačinu IL-2, važno je fuzionisati IL-2 za Fc na takav način koji ne utiče značajno na prenos signala IL-2R. Prema tome, kod muteina IL-2 ispitivana je aktivacija IL-2R, sa i bez fuzije sa Fc.

[0176] Da bi se odredilo da li će dimerizacija IL-2 putem fuzije sa Fc povećati jačinu prenosa signala IL-2R zahvaljujući povećanom aviditetu za IL-2R, slabiji mutein IL-2 (haD5) (US20110274650) je fuzionisan sa amino terminalnim krajem Fc, razdvojen pomoću GGGGS (SEQ ID NO:5) linkerske sekvence. Ovaj mutein je imao 3 mutacije koje utiču na prenos signala IL-2R (E15Q, H16N, N88D), 8 mutacija koje daju visok afinitet za CD25 (N29S, Y31H, K35R, T37A, K48E, V69A, N71R, Q74P) (Rao et al. 2005), i C125S da bi se sprečilo pogrešno spajanje cisteina i agregacija. Ovakva fuzija sa Fc potpuno ukida biološku aktivnost haD5, dok je njihovo visoko-afinitetno vezivanje za CD25 na površini ćelije poboljšano, verovatno zbog povećanog aviditeta zbog dimerizacije.

[0177] Muteini IL-2 su takođe fuzioni sa N- ili C-terminalnim krajem Fc heterodimera, tako da samo jedan lanac Fc dimera nosi IL-2 domen. Heterodimerno sparivanje između dva asimetrična Fc lanca podstaknuto je elektrostatičkim interakcijama između uvedenih lizina u lancu Fc i uvedene asparaginske kiseline u drugom lancu Fc. Mutein IL-2 haD6 je fuzionisan sa N-terminalnim krajem jednog lanca Fc ili drugog, u slučaju da je poželjna jedna konfiguracija, rezultujući u dva proteinska konstrukta označena kao haD6.FcDD i haD6.FcKK. Mutein haMut7D je takođe fuzionisan sa C-terminalnim krajem Fc heterodimera sa jednim ili dva GGGGS (SEQ ID NO:5) linkera (FcKK(G4S)haMut7D, FcKK(G4S)2haMut7D). Fuzija muteina IL-2 haD6 sa N-terminalnim krajem Fc heterodimera rezultovala je delimičnim gubitkom aktivnosti u odnosu na slobodni haD6 kako u pSTAT5, tako i u eksperimentima proliferacije T ćelija. Nasuprot tome, fuzija haMut7D sa C-terminalnim krajem Fc heterodimera sa jednim ili dva linkera GGGGS (SEQ ID NO:5) nije izmenila jačinu haMut7D.

[0178] Ispitivana je i fuzija muteina IL-2 sa C-terminalnim krajem Fc homodimera. Ukupni PBMC su aktivirani u bocama za kulturu tkiva T75 pri gustini od 300 miliona ćelija na 100 ml sa 100 ng/ml anti-CD3 (OKT3). Trećeg dana kultivacije, ćelije su oprane 3 puta i ostavljene u svežem medijumu 3 dana. Ćelije su zatim stimulisane varijantama IL-2 pri titraciji desetostrukim dozama u opsegu od 1 pM do 10 nM u finalnoj zapremini od 50 µl. Nivo fosforilacije STAT5 meren je upotrebom kompleta pufera BD phosflow. Ukratko, dodat je 1 ml BD phosflow pufera za lizu/fiksiranje za zaustavljanje stimulacije. Ćelije su fiksirane 20 minuta na 37°C i

4

permeabilizovane 1x BD phosflow puferom za permeabilizaciju na ledu pre bojenja za CD4, CD25, FOXP3 i pSTAT5.

[0179] Kao što može da se vidi na SL. 1, biološka aktivnost muteina haMut1D i haMut7D nije izmenjena fuzijom sa C-terminalnim krajem Fc homodimera. Prema tome, fuzija između N-terminalnog kraja IL-2 i C-terminalnog kraja Fc nije ugrozila agonističku aktivnost muteina IL-2, čak ni u kontekstu homodimera Fc.IL-2. U ovim konstruktima, korišćena je C125A mutacija umesto C125S zbog poboljšanja proizvodnje.

Primer 3 – Podešavanje jačine muteina IL-2 da bi se postigao preferencijalni rast Treg

[0180] Početni panel muteina IL-2 sadržao je N88D pojedinačno, ili sa 1 ili 2 dodatne mutacije koje utiču na prenos signala IL-2R. Dizajniran je drugi panel muteina, svi sa pojedinačnim tačkastim mutacijama, sa ciljem identifikovanja muteina sa sličnim ili malo jačim agonizmom od onih kod serije N88D. Panel sa 24 mutacije prenosa signala identifikovan je na osnovu predviđenih aminokiselina koje interaguju sa IL-2Rβ (kristalna struktura, PDB kod - 2B5I). Konkretne supstitucije su odabrane na osnovu predviđenog smanjenja slobodne energije vezivanja između muteina i IL-2Rβ. Slobodna energija vezivanja je izračunata upotrebom računarskog algoritma EGAD (Handel laboratorija Kalifornijskog Univerziteta u San Dijegu, SAD). Slobodna energija vezivanja mutanta definisana je kao ΔΔGmut= µ (ΔGmut- ΔGwt). Gde, µ (=0.1, uopšteno) predstavlja faktor skaliranja koji se koristi za normalizaciju predviđenih promena u afinitetu vezivanja, tako da imaju nagib od 1 kada se uporede sa eksperimentalnim energijama (Pokala and Handel 2005). Slobodna energija disocijacije (ΔG) definisana je kao razlika energija između kompleksnog (ΔGbound) i slobodnog stanja (ΔGfree). Energija disocijacije ΔGmutizračunata je za svaku supstituciju.

[0181] Panel muteina IL-2 sa sledećim supstitucijama (H16E, H16Q, L19K, D20R, D20K, D20H, D20Y, M23H, D84K, D84H, S87Y, N88D, N88K, N88I, N88H, N88Y, V91N, V91K, V91H, V91R, I92H, E95K, E95R, ili E95I) izražen je kao C-terminalne fuzije sa Fc heterodimerom. Ovi konstrukti sadržali su i haMut7 mutacije za visok afinitet vezivanja CD25 (V69A, N71R, Q74P) i C125A za efikasno sklapanje.

[0182] Panel je podvrgnut skriningu na jačinu u testu fosforilacije STAT5 u T ćelijama prema primeru 2, i nađeno je da H16E, D84K, V91N, V91K, i V91R poseduju manju aktivnost od divljeg tipa IL-2 i veću od N88D (SL.2).

[0183] H16E, D84K, V91N, V91K, i V91R su imale manju aktivnost od divljeg tipa IL-2 i veću od N88D.

[0184] Odabrani muteini su takođe ispitivani u testovima za rast T ćelija i NK ćelija.

4

[0185] Za ispitivanje T-ćelija, ukupni PBMC su aktivirani pri gustini od 3 miliona/ml sa 100 ng OKT3. Drugog dana, ćelije su oprane 3 puta i ostavljene u svežem medijumu 5 dana. Ćelije su zatim obeležene sa CFSE i dalje kultivisane u ploči sa 24 bunarčića pri gustini od 0.5 miliona/bunarčiću u medijumu koji sadrži IL-2 tokom 7 dana pre FACS analize. Proliferacija podsetova T ćelija predstavljena je na SL. 3 kao razblaženje CFSE (srednja fluorescencija CFSE).

[0186] Za ispitivanje NK-ćelija, ćelije CD16+ NK sortirane pomoću MACS, kultivisane su u medijumu koji sadrži IL-2 tokom 3 dana pri gustini od 0.1 milion/bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića. U svaki bunarčić dodato je po 0.5 µCi<3>H-timidina tokom poslednjih 18 časova inkubacije. Rezultati su prikazani na SL.4.

[0187] Mutanti H16E, D84K, V91N, V91K, i V91R mutanti su sposobni da stimulišu rast Treg slično WT IL-2 ali su bili približno 10 puta manje aktivni prema drugim T-ćelijama (SL. 3), i približno 100 puta manje aktivni prema NK ćelijama (SL.4).

[0188] Dizajniran je poseban panel Fc.IL-2 fuzionih proteina u kome je rastojanje između Fc heterodimera i muteina haMut7 (V69A, N71R, Q74P, C125A) redukovano nizom pojedinačnih aminokiselinskih skraćivanja.

[0189] Trunc1-Trunc4 su posedovali aktivnost jednaku parentalnom konstruktu Fc.haMut7 cele dužine, mereno pomoću fosforilacije STATS i proliferacije T ćelija i NK ćelija kao što je opisano za SL.2, 3 i 4. Trunc5 i Trunc6 su stimulisali slabije odgovore, mada i dalje jače od onih stimulisanih mutacijom N88D (haD i haMut7D) i veoma slične onima stimulisanim sa V91K. Trunc7 je bio slabiji od N88D muteina, a Trunc8 je imao veoma malu aktivnost. Kada su ispitivani na NK ćelijama, međutim, Trunc5 i Trunc6 su bili jači agonisti nego V91K, ukazujući

4

na to da se selektivnost za Treg lakše postiže mutacijama signalnog puta nego sternim ometanjem proksimalnim domenom Fc.

Primer 4 – Mutacije visokog afiniteta za CD25 u kontekstu Fc homodimera

[0190] Mutacije koje daju visok afinitet vezivanja za CD25 smatrane su prednošću jer povećavaju tropizam za T-ćelije sa visokom ekspresijom CD25, i jer pospešuju dugotrajno povezivanje CD25::IL-2mutein i produženi prenos signala. Međutim, smanjenje broja mutacija može da smanji imunogeni potencijal. Muteini N88D ili V91K, sa ili bez haMut1 visokoafinitetne mutacije V69A i Q74P, eksprimirani su kao fuzije sa C-terminalnim krajem Fc homodimera i upoređena im je biološka aktivnost. U analizama stimulacije pSTAT5, homodimerizacija nije imala efekta na jačinu signala u odnosu na monomerni mutein. Reverzija visokoafinitetnih mutacija V69A i Q74P takođe nije uticala na prenos signala pSTAT5. U analizama rasta T ćelija, visokoafinitetne mutacije redukovale su aktivnost prema konvencionalnim CD4 T-ćelijama i CD8 T-ćelijama, ali ne i prema regulatornim T-ćelijama (SL.

5). Visokoafinitetne mutacije takođe nisu izmenile proliferativne odgovore u NK ćelijama (SL.

6).

[0191] Da bi smo odredili da li visokoafinitetne mutacije utiču na T-ćelijske odgovore in vivo, davane su doze fuzionih proteina Fc.mutein IL-2 humanizovanim miševima (NOD.SCID.Il2rgnull rekonstituisani sa humanim CD34+ hematopoeznim matičnim ćelijama) i pratili ekspresiju Treg. Sedam nedelja stari miševi NOD.SCID.Il2rg-null (NSG) (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) su ozračeni (180 rad) i rekonstituisani sa 94000 humanih hematopoeznih matičnih ćelija CD34+ fetalne jetre. U uzrastu od 21 nedelje, miševi su raspoređeni u 6 grupa na osnovu ravnomerne raspodele himerizma (određene protočnom citometrijom PBL) i dat im je subkutanom injekcijom 1 µg naznačenih fuzionih proteina Fc.mutein ili PBS na dan 0 i dan 7. Jedanaestog dana, učestalosti podsetova T ćelija u krvi su određene protočnom citometrijom. Pri niskoj dozi od 1 µg po životinji, visokoafinitetne mutacije nisu poboljšale ekspresiju Treg iznad one zapažene samo sa N88D ili V91K mutacijama (SL.7).

[0192] Ekspresija Treg bila je selektivna po tome što se zastupljenost FOXP3-CD4+ T-ćelija nije povećala u odnosu na ukupne leukocite periferne krvi (PBL) koji uključuju smešu humanih B i T-ćelija, i mišje mijeloidne ćelije. Osim toga, u višim dozama, visokoafinitetne mutacije podstakle su povećanje CD25+FOXP3- T-ćelija, smanjujući tako selektivnost za Treg. Prema tome, u kontekstu Fc homodimera, visokoafinitetne mutacije se ne smatraju neophodnim za podsticanje preferencijalnog rasta Treg ćelija.

Fc.WT IgG1Fc(N297G_delK)::G4S::huIL-2(C125A) (SEQ ID NO:16)

4

Fc.haMutlV91K IgG1Fc(N297G_delK)::G4S::huIL-2(V69A, Q74P, V91K, C125A) (SEQ ID NO:17)

Fc.V91K IgG1Fc(N297G_delK)::G4S::huIL-2(V91K, C125A) (SEQ ID NO:18)

Fc.haMutlN88D IgG1Fc(N297G_delK)::G4S::huIL-2(V69A, Q74P, N88D, C125A) (SEQ ID NO:19)

Fc.N88D IgG1Fc(N297G_delK)::G4S::huIL-2(N88D, C125A) (SEQ ID NO:20)

Primer 5 - Produženo udruživanje Fc.muteina IL-2 sa CD25 na površini ćelija

[0193] Neočekivani rezultat ispitivanja humanizovanih miševa bio je da su, uprkos njihovom redukovanom signalnom kapacitetu, muteini indukovali snažnije obogaćivanje ćelijama Treg u odnosu na Fc.WT IL-2. Veće obogaćivanje Treg ćelijama i ushodna regulacija FOXP3 u odnosu na onu koja se viđa kod Fc.WT zapažena je u dozi od 1 µg/mišu (slika 7) i u nižoj dozi od 0.5 µg/mišu (SL. 8). Ova povećana aktivnost in vivo može da bude rezultat redukovane potrošnje od strane T-ćelija, što čini više Fc.muteina IL-2 dostupnim za produženi prenos signala.

[0194] In vitro i in vivo PK studije, međutim, nisu uspele da pokažu značajno povećanu perzistenciju Fc.V91K ili Fc.N88D u odnosu na Fc.WT u supernatantima iz kultura aktiviranih T ćelija ili seruma miševa koji su primili doze. Budući da su fuzije Fc nosile dva domena muteina IL-2, povećano endozomalno recikliranje može da rezultuje produženim udruživanjem sa površinom ćelije zbog povećanog aviditeta za CD25. Zaista, nađeno je da su Fc.V91K i Fc.N88D perzistirali efikasnije od Fc.WT na površini prethodno aktiviranih T-ćelija nakon kratkog izlaganja fuzionim proteinima (SL.9A i 9B).

[0195] Primarni PBMC su bili prethodno stimulisani tokom dva dana sa 100 ng/ml OKT3. Ćelije su sakupljene, oprane četiri puta i ostavljene preko noći u medijumu. Ćelije su zatim senzibilisane sa 400 pM Fc.IL-2 tokom 30 minuta na 37°C. Posle senzibilizacije, ćelije su ili sakupljene za T0 posle jednog pranja, ili oprane dodatna tri puta u 12 ml toplog medijuma i kultivisane četiri časa. Za detekciju Fc.IL-2 udruženog sa ćelijama, ćelije su obojene antihumanim IgG-FITC (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) i anti-CD25-APC (FIG.9A).

[0196] Istrajnost IL-2R prenosa signala sa Fc.V91K i Fc.N88D u odnosu na Fc.WT je zabeleženo za intracelularnu imunodetekciju fosfo-STAT5 u istim vremenskim tačkama. Fosfo-STAT5 MFI za FOXP3+CD4+ T ćelije je prikazan (SL.9B).

Primer 6 – Optimizacija fuzione sekvence

[0197] U prekliničkim studijama na miševima, Fc.muteini IL-2 pokazali su diferencijalnu izloženost kada su koncentracije intaktnog molekula u serumu upoređene sa koncentracijama samo humanog dela Fc, što ukazuje na cirkulaciju humanog Fc katabolita. Radi optimizacije

1

stabilnost in vivo i farmakokinetiku Fc.muteina IL-2, okarakterisane su modifikacije fuzione sekvence prema njihovom uticaju na proteolitičku razgradnju Fc.muteina IL-2 u sistemskoj cirkulaciji i tokom recikliranja kroz retikuloendotelni sistem. Procenjivana je in vitro i in vivo proteolitička razgradnja sledećih konstrukata.

[0198] Stabilnost je merena kvantitativnim imunoesejima koji porede koncentracije tokom vremena ukupnog humanog Fc sa koncentracijama intaktnog Fc.muteina IL-2. Proteoliza Fc.muteina IL-2 potvrđena je western blot analizom upotrebom anti-IL-2 antitela i antitela protiv humanog Fc, praćenom imunološkim hvatanjem metabolita i karakterizacijom pomoću masene spektrometrije. Karakterizacija pomoću masene spektrometrije katabolita (Ala_Ala)_G4S iz in vitro i in vivo uzoraka identifikovala je C-terminalni Lys u Fc domenu kao mesto proteolitičkog cepanja. Delecija ili mutacija C-terminalnog lizina Fc domena ((N297G_delK)_G4S i (N297G_KtoA)_AAPT) rezultuje produženom in vitro stabilnošću u serumu miša na 37°C u poređenju sa Fc konstruktima sa C-terminalnim lizinom ((Ala_Ala)_G4S). Ova produžena in vitro serumska stabilnost prenosi se na veću izloženost kod miševa mereno površinom ispod krive serumske koncentracije Fc.muteina IL-2 naspram vremena (AUC). Ova produžena stabilnost Fc.muteina IL-2 kojima nedostaje C-terminalni Fc lizin takođe je zapažena in vitro u serumu Cynomolgus majmuna i ljudi. Mutacija Thr-3 u IL-2 u Ala ((N297G_KtoA)_AAPA) rezultovala je smanjenom in vitro stabilnošću na 37°C (u poređenju sa (N297G_KtoA)_AAPT) u serumu miša i u odvojenim inkubacijama sa rekombinantnim humanim katepsinom D i L. Ova smanjena serumska stabilnost in vitro prenosi se na nižu izloženost (AUC) kod miševa in vivo za (N297G_KtoA)_AAPA u poređenju sa (N297G_KtoA)_AAPT. Karakterizacija katabolita (N297G_KtoA)_AAPA iz in vitro i in vivo uzoraka pomoću masene spektrometrije identifikovala je Lys 8 i Lys 9 u domenu muteina IL-2 kao rezidue podložne proteolizi koja nije zapažena kod ekvivalentnih uzoraka (N297G_KtoA)_AAPT. Snižena stabilnost na 37°C uzorka (N297G_KtoA)_AAPA u odnosu na onu kod uzorka (N297G_KtoA)_AAPT takođe je primećena in vitro u serumu Cynomolgus majmuna i ljudi.

[0199] Zbog važnosti glikozilacije u ovoj oblasti, i zbog potencijalnog poboljšanja mogućnosti proizvodnje fuzionog proteina, fuzione sekvence su izmenjene tako da podstiču N-vezanu umesto O-vezane glikozilacije, kao što sledi.

Originalna

2

Primer 7 – Određivanje PK/PD kod majmuna Cynomolgus

[0200] Standardne imunostimulatorne terapije sa IL-2 zahtevaju dane odmora bez primene leka (bez izlaganja) između ciklusa doziranja da bi se izbegli neželjeni sporedni efekti. Nasuprot tome, ekspanzija Treg ili stimulatorne terapije mogu da zahtevaju produženo izlaganje uz održavanje minimalnih koncentracija leka (Cminu serumu) koje su dovoljne za stimulaciju Treg, ali sa maksimalnim izlaganjima leku (Cmaxu serumu) ispod nivoa leka koji dovode do aktivacije imunskog sistema. Ovaj primer pokazuje strategije doziranja muteina sa produženim poluživotom kod majmuna Cynomolgus za produženo pokrivanje cilja (Cminu serumu) uz održavanje maksimalnih izloženosti leku (Cmaxu serumu) ispod nivoa leka za koje se smatra da su neophodni za prozapaljensku aktivaciju imunog sistema.

[0201] Cynomolgus majmunima su date doze sa Fc.V91K (IgG1Fc(N297G_delK)::G4S::huIL-2(V91K, C125A) u četiri grupe (A-D), gde su tri grupe (A-C) dobile subkutane doze, a jedna grupa (D) je dozu primila intravenski. U svakoj grupi, četiri biološki naivna mužjaka Cynomolgus majmuna primila su doze prema strategiji doziranja koja je navedena u daljem tekstu. Subkutano doziranje muteina sa produženim polu-životom može da omogući veću limfatičku apsorpciju koja rezultuje nižim maksimalnim izlaganjem leku (Cmaxu serumu) i/ili snažnijim farmakološkim odgovorom (ekspanzija Treg). Strategija doziranja za grupu A sastoji se od tri uzastopne doze od 10 mikrograma po kilogramu date 0, 2, i 4. dana za ciklus 1 i 10 mikrograma po kilogramu 14. dana, omogućavajući produženo pokrivanje cilja slično kao viša početna doza od 50 mikrograma po kilogramu uz održavanje nižeg maksimalnog izlaganja leku (Cmax). Strategija doziranja za grupu B predstavlja 50 mikrograma po kilogramu doziranih 0. i 14. dana za poređenje sa grupom A. Strategija doziranja za grupu C predstavlja 50 mikrograma po kilogramu doziranih 0. i 28. dana, što omogućava da se odredi da li je potrebna potpuna pokrivenost u toku održavanja obogaćivanja ćelijama Treg, ili je period odmora bez leka koristan između ciklusa doziranja. Strategija doziranja za intravensko doziranje u grupi D predstavlja 50 mikrograma po kilogramu doziranih 0. dana, što omogućava poređenje maksimalnih izlaganja leku (Cmax) i razlika u obogaćivanju ćelijama Treg u odnosu na subkutano doziranje.

[0202] Farmakokinetika (kvantitativni imunoesej za intaktni molekul i ukupni humani Fc), antitela protiv leka, izlučeni rastvorljivi CD25 i serumski citokini (IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-10, IL-5, IL-4, i IL-13) su mereni u sledećim vremenskim tačkama za svaku navedenu doznu grupu:

Grupa A: pre primene doze (prvi ciklus; doza 1), 48 (pre primene doze u prvom ciklusu; doza 2), 96 (pre primene doze u prvom ciklusu; doza 3), 100, 104, 120, 168, 216, 264, 336 (pre primene doze u drugom ciklusu), 340, 344, 360, 408, 456, 504, 576, 672, 744, 840 i 1008 časova.

Grupa B: pre primene doze (prvi ciklus), 4, 8, 24, 72, 120, 168, 240, 336 (pre primene doze u drugom ciklusu), 340, 344, 360, 408, 456, 504, 576, 672, 744, 840 i 1008 časova.

Grupa C: pre primene doze (prvi ciklus), 4, 8, 24, 72, 120, 168, 240, 336, 408, 504, 672 (pre primene doze u drugom ciklusu), 676, 680, 696, 744, 792, 840, 912, 1008, 1080 i 1176 časova.

Grupa D: pre primene doze (prvi ciklus), 0.25, 1, 4, 8, 24, 72, 120, 168, 240, 336, 408, 504 i 672 časova.

[0203] Farmakodinamika (imunofeotipizacija i određivanje broja ćelija Treg u perifernoj krvi, neregulatornih CD4 i CD8 T-ćelija, i NK ćelija) je merena u sledećim vremenskim tačkama za svaku navedenu doznu grupu:

Grupa A: pre primene doze (prvi ciklus; doza 1), 96 (pre primene doze u prvom ciklusu; doza 3), 168, 336 (pre primene doze u drugom ciklusu), 456 i 576 časova.

Grupa B: pre primene doze (prvi ciklus), 120, 240, 336 (pre primene doze u drugom ciklusu), 456 i 576 časova.

Grupa C: pre primene doze (prvi ciklus), 120, 240, 672 (pre primene doze u drugom ciklusu), 792 i 912 časova.

Grupa D: pre primene doze (prvi ciklus), 120 i 240 časova.

[0204] Hematologija i klinička hemija su procenjene za sve životinje i dozne grupe pre primene doze i na 24 časa posle početne doze po doznoj grupi. Ocenjivani su sledeći parametri.

Hematologija:

[0205]

4

• broj leukocita (ukupni i apsolutni diferencijalni)

• broj eritrocita

• hemoglobin

• hematokrit

• srednji korpuskularni hemoglobin, srednji korpuskularni volumen, srednja korpuskularna koncentracija hemoglobina (izračunato)

• apsolutni retikulociti

• broj trombocita

• morfologija krvnih ćelija

• širina raspodele crvenih krvnih ćelija

• srednja zapremina trombocita

Klinička hemija:

[0206]

• alkalna fosfataza

• ukupni bilirubin (sa direktnim bilirubinom ako ukupni bilirubin prelazi 1 mg/dL)

• aspartat aminotransferaza

• alanin aminotransferaza

• gama glutamil transferaza

• azot uree

• kreatinin

• ukupni protein

• albumin

• globulin i odnos A/G (albumin/globulin) (izračunato)

• glukoza

• ukupni holesterol

• trigliceridi

• elektroliti (natrijum, kalijum, hlor)

• kalcijum

• fosfor

Primer 8 - Neglikozilisani Fc IgG1

[0207] Prirodna IgG antitela imaju mesto glikozilacije u konstantnom domenu 2 teškog lanca (CH2). Na primer, humana IgG1 antitela imaju mesto glikozilacije smešteno na poziciji Asn297 (EU numeracija). Do danas, strategije za pravljenje neglikozilisanih antitela uključuju zamenu rezidue Asn aminokiselinom koja liči na Asn u smislu fizikohemijskih svojstava (npr., Gln) ili reziduom Ala koja imitira bočni lanac Asn bez polarnih grupa. Ovaj primer pokazuje koristi od zamene Asn glicinom (N297G). N297G Fc su neglikozilisani molekuli sa boljim biofizičkim svojstvima i odlikama tokom proizvodnje (npr., ponovno izdvajanje tokom prečišćavanja).

[0208] Ispitivanje više poznatih kristalnih struktura Fc fragmenata i IgG antitela otkrilo je značajnu konformacionu fleksibilnost oko segmenta glikozilisane petlje, posebno na poziciji Asn297 koja je glikozilisana. U mnogim poznatim kristalnim strukturama, Asn297 prihvata pozitivne diedralne uglove lanca. Gly ima veliku sklonost da prihvati diedralne uglove lanca zbog nedostatka atoma bočnog lanca. Stoga, iz konformacionih i strukturnih razloga, Gly može da bude bolja zamena za Asn nego N297Q ili N297A.

[0209] Mutiranje Asn297 u Gly vodi neglikozilisanim molekulima sa znatno poboljšanim ponovnim izdvajanjem (ili efikasnošću) u postupku prečišćavanja i biofizičkim svojstvima. Na primer, procenat ponovnog izdvajanja (finalni prinos) iz pula proteina A bio je 82.6% za mutaciju N297G, u poređenju sa 45.6% za N297Q i 39.6% za N297A. Analiza na koloni SPHP otkrila je da je niži procenat ponovnog izdvajanja za mutante N297Q i N297A nastao zbog razvlačenja pika, što ukazuje na agregaciju visoke molekulske mase i/ili pogrešno sklopljene vrste. Ovaj rezultat je potvrđen u većem obimu proizvodnje, na 2L.

[0210] U biofarmaceutskoj industriji, kod molekula za koje postoji potencijalna potreba za proizvodnjom velikog obima, npr, potencijal da se prodaju kao lek, procenjuju se brojne odlike da bi se ublažio rizik od toga da molekul nije pogodan za proizvodnju i prečišćavanje velkog obima. Pri procenama pogodnosti za proizvodnju, N297G je pokazao otpornost na promene pH. Kod N297G nije postojao problem agregacije; dok su N297Q i N297A pokazali 20%, odnosno 10% povećanja agregacije. Mada je N297G imao bolje odlike kada je u pitanju pogodnost za proizvodnju, u svim funkcionalnim testovima u kojima je ispitivan, bio je sličan sa N297Q i N297A. Na primer, u testovima ADCC, citotoksičnost N297G je izostala, slično kao kod N297Q i N297A.

Primer 9 - Stabilizovani neglikozilisani Fc IgG1

[0211] Ovaj primer opisuje postupak za poboljšanje stabilnosti nosača antitela IgG uvođenjem konstruisane disulfidne veze/veza. Prirodna IgG antitela su stabilni molekuli. Međutim, za neke terapijske primene, može da bude potrebno uvođenje mutacija ili stvaranje neglikozilisanih molekula. Na primer, neglikozilisani IgG molekuli mogu da se koriste u terapijskim indikacijama u kojima treba izbeći ADCC i vezivanje za Fc-gama receptore. Međutim, neglikozilisani IgG1 ima mnogo nižu temperaturu topljenja (temperatura topljenja CH2 domena se snižava za oko 10°C; sa 70°C na 60°C) nego glikozilisani IgG1. Zapaženo smanjenje temperature topljenja negativno utiče na različita biofizička svojstva neglikozilisanog IgG1. Na primer, neglikozilisani IgG1 ima povećan nivo agregacije na niskom pH u poređenju sa glikozilisanim IgG1.

[0212] U cilju konstruisanja disulfidnih veza, postupak zasnovan na strukturi koji uključuje izračunavanje rastojanja između C-alfa atoma je inicijalno korišćen za identifikovanje 54 para rezidua u Fc regionu za mutaciju u Cys. Ova 54 mesta su dodatno sužena na 4 para rezidua (V259C-L306C, R292C-V302C, A287C-L306C, i V323C-I332C). Upotrebljeni kriterijum je uključivao (i) pozicije unutar CH2 domena, (ii) veću udaljenost od petlji, zavojnica i ugljenih hidrata, (iii) veću udaljenost od Fc-gama receptora i mesta interakcije FcRn, (iv) pristupačnost rastvarača (poželjne skrivene pozicije), itd.

[0213] Parne cisteinske supstitucije stvorene su u kontekstu neglikozilisanog N297G Fc. Analiza mapiranja neredukovanih peptida otkrila je da tri od četiri konstruisana mesta obrazuju disulfidnu vezu kao što je očekivano i nameravano u tom kontekstu. Mutacija V259C-L306C nije obrazovala disulfidne veze ispravno i dovela je do pogrešnog sparivanja sa nativnim disulfidom koji je već prisutan u CH2 domenu. Ostale tri konstrukcije R292C-V302C, A287C-L306C i V323C-I332C obrazovale su disulfidnu vezu ispravno, kao što je predviđeno i nameravano. Dodavanje disulfidne veze mutaciji N297G vodilo je poboljšanju od oko 15ºC u termičkoj stabilnosti u odnosu na samu mutaciju N297G. Od disulfidnih varijanti R292C-V302C, A287C-L306C i V323CI332C, R292C-V302C i A287C-L306C su imale dobru farmakokinetiku kada su primenjene kod pacova (t1/2od jedanaest dana odnosno devet dana). Ovo je suprotno farmakokinetičkom profilu koji smo zapazili kod pacova za prethodno objavljenu disulfidnu vezu L247C-K339C u CH2 domenu (Gong et al., J. Biol. Chem.2009 284: 14203-14210), koja je imala t1/2od pet dana.

[0214] Konstruisanje disulfidne veze u CH2 domenu poboljšava stabilnost neglikozilisanog molekula do istog nivoa kao kod glikozilisanih IgG1 molekula (poboljšanje od 10° do 15°C u temperaturi topljenja određeno pomoću diferencijalne skenirajuće kalorimetrije). Konstruisana mesta opisana u ovom tekstu ne dovode do preplitanja disulfida i disulfidi se obrazuju kao što je predviđeno u približno 100% populacije. Što je još važnije, za razliku od objavljenih mesta disulfidnih veza u CH2 domenu, disulfidne veze opisane u ovom tekstu ne utiču na PK kod pacova.

Primer 10

[0215] Efekti V91K i N88D mutacija na odgovore u T i NK ćelijama iz makaki majmuna i ljudi upoređivani su in vitro. U prisustvu CD25 (CD4+CD25+ razdvojene T ćelije u celoj krvi prilikom registracije pSTAT5 odgovora), efekat V91K mutacije na prenos signala IL-2R makaki majmuna bio je zanemarljiv u poređenju sa njegovom smanjenom aktivnošću na humani IL-2R. Međutim, u odsustvu CD25 (oba CD25- odvojene T ćelije u celoj krvi pri registraciji pSTAT5 odgovora i NK ćelijske proliferacije) V91K mutacija je značajno smanjila prenos signala IL-2R makaki majmuna. Nasuprot tome, Fc.N88D pokazuje smanjeni prenos signala u CD25+ T ćelijama u celoj krvi makaki majmuna što je sličnije efektu prenosa signala Fc.V91K u T ćelijama u humanoj celoj krvi. In vitro podaci rezimirani u Tabeli 2 sugerišu da će terapeutski prozor zabeležen sa slabijim agonistom, Fc.N88D, u makaki majmunima biti prediktivni za efekte Fc.V91K u humanim subjektima.

Tabela 2. Rezime efekata V91K ili N88D mutacija na in vitro odgovore humanih ćelija i ćelija makaki majmuna

Primer - 11

[0216] Dve in vivo studije su izvedene kod makaki majmuna. Prva studija na makaki majmunu je dizajnirana za poređenje intervala doziranja Fc.V91K od dve nedelje i četiri nedelje da bi se odredilo da li je potpuna ili delimična farmakokinetika (PK) i farmakodinamika (PD) do promenjene magnitude odgovora na drugu dozu (SL.10A i B). Korišćene su prva doza, za koju je predviđeno da daje snažan Treg odgovor (50 µg/kg), i druga doza, za istraživanje donjih granica terapeutskog prozora (10 µg/kg). Kako nije bilo poznato da li je 10 µg/kg bila previše niska, doze su davane na dane 1, 3 i 5 za povećanje verovatnoće odgovora. Ovaj režim doziranja je dao isto izlaganje sledećeg dana 5 kao što je postignuto sa jednom 50 µg/kg subkutanom (SC) dozom, ali sa nižim C-max. 50 µg/kg intravenska (IV) grupa je takođe uključena za ispitivanje potencijalnih razlika u PD u zavisnosti od višeg izlaganja leku u limfnim naspram krvnim odeljcima. Rezultati ove studije su ustanovili da su svaki od nivoa doze indukovali snažan odgovor Treg rasta bez štetnih događaja (AEs) ili rasta Teff ili NK, i da su odgovori na drugu dozu na dan 14 ili 28 bili ekvivalentni.

Tabela 3. Dizajn studije za prvu studiju na makaki majmunima

[0217] Druga studija na makaki majmunu je dizajnirana za ispitivanje margina terapeutskog prozora sa dozama Fc.V91K od 1, 3, 100, 200 µg/kg (SC) i poređenje ovoga sa slabijim agonistom Fc.N88D u dozama od 3, 10, 100, 200 µg/kg (SC) i PROLEUKIN® u 3, 10, 30, 100 µg/kg (SC QDx5). Doze PROLEUKIN® su izabrane na osnovu objavljenih studija na ljudima i nehumanim primatima (Hartemann et al., 2013, Lancet Diabetes Endocrin 1:295-305; Saadoun et al., 2011, NEJM 365:2067-77; Aoyama et al., 2012, Am J Transplantation 12:2532-37) i primenjene su QDx5 da bi imitirale klinička ispitivanja niske doze IL-2 kod HCV vaskulitisa i dijabetesa tipa 1 (T1D).

Tabela 4. Dizajn studije za drugu studiju na makaki majmunima

[0218] Na slikama 11A-F prikazani su kinetika ćelijskih odgovora, telesna temeperatura i CRP u serumu. Vremenska linija na x-osi počinje sa Danom 0 pre nego sa Danom 1 kao danom prve doze.

[0219] U kombinaciji, dve studje na makaki majmunina pokazale su da su muteini IL-2 indukovali veće obogaćenje Treg sa širim terapeutskim prozorom nego što je postignuto sa PROLEUKIN® (SL. 12A i B). Sa PROLEUKIN®, obogaćenje Treg paralelno je sa rastom NK i eozinofila. Bez vezivanja za bilo koju naročitu teoriju, rast eozinofila je dobro poznat odgovor na terapiju IL-2 i verovatno je rezultat IL-2-indukovanog IL-5 iz CD25+ urođenih limfoidnih ćelija. Rast CD4 i CD8 Teff se javio u dozama koje su povećale Tregs do 25-35% CD4 T ćelija. Nasuprot tome, Fc.V91K i Fc.N88D su indukovali rast Treg sa većom selektivnošću u odnosu na NK ćelije i eozinofile, i doze koje su stimulisale rast Teff bile su iznad onih koje su obogatile Treg do >40% CD4 T ćelija.

[0220] U kliničkim ispitivanjima niske doze IL-2 objavljenim u literaturi, prvi štetni događaji koji su se javili bili su simptomi slični gripu i groznica. Na taj način, pored poređenja terapeutskih prozora, cilj ove studije je bio otkriti biomarker koji prethodi groznici. Kao što je prikazano na SL. 12C, sa dve više doze PROLEUKIN®, nađeno je da su nivoi CRP-a bili paralelni sa telesnom temperaturom. Sa Fc.V91K, umereno povećanje u telesnoj temperaturi detektovano je na najvišoj dozi, i na sledećoj nižoj dozi zabeleženo je malo povećanje u CRP. Na taj način CRP može biti korišćen za praćenje odgovora subjekta na tretman molekulom prema predmetnom pronalasku i/ili za definisanje gornje granice rasta doze kod pacijenta.

[0221] Određene toksičnosti su takođe zabeležene kod životinja tretiranih PROLEUKIN®-om koje su bile manje izražene ili nisu bile prisutne kod životinja tretiranih sa Fc.V91K- ili Fc.N88D (SL. 12D). Nađeno je da su nivoi trombocita, neutrofila i albumina redukovani tretmanom sa PROLEUKIN®-om, dok su doze Fc.V91K ili Fc.N88D koje su rezultirale u sličnom ili većem Treg obogaćenju proizvele malo ili nimalo redukcija u ovim parametrima. Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da se očekuje da je terapeutski prozor za lečenje pacijenata sa Fc.V91K- ili Fc.N88D značajno veći nego sa PROLEUKIN®.

Primer - 12

[0222] Na izabranim vremenskim tačkama, serumi iz prve studije makaki majmuna iz Primera 11 su testirani za antitela protiv leka (ADA) (SL.13). Prikazani su podaci signala/šuma ADA za uzorke gde je Fc.V91K specifičnost potvrđena preko kompeticije. Vremenske tačke gde su testirani ADA prikazane su sa vertikalnim linijama iznad x-ose. U grupi 1, jedna životinja je generisala ADA najmanje petnaest dana posle poslednje doze, u grupi 2, nijedna životinja nije bila pozitivna u testu za ADA, i u grupi 3, ADA su se stalno javljali kod tri životinje penaest ili više dana posle prve doze. Posle ponovljenog doziranja grupa 1 i 2 sa 50 µg/kg na dan 162, nijedna dodatna životinja nije bila pozitivna u testu za ADA četiri nedelje kasnije (dan 190). Dve životinje u grupi 3 koje su generisale najjače ADA signale (210, 212) ispoljile su redukovani PD odgovor, u skladu sa redukovanim C-max zabeleženim posle druge doze kod ovih životinja. Nijenda životinja u četvrtoj grupi (50 µg/kg IV) nije bila pozitivna u testu za ADA. ADA su bili specifični za oba, IL-2 i Fc domene, što bi se moglo očekivati zbog osam aminokiselinskih razlika između IL-2 makaki majmuna i humanog IL-2(V91K,C125A). Neutralizujuća aktivnost ADA nije testirana.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Fc-fuzioni protein koji sadrži Fc i mutein humanog interleukina-2 (IL-2) koji sadrži V91K supstituciju i aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:1, pri čemu navedeni IL-2 mutein stimuliše T regulatorne ćelije.

2. Fc-fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što Fc je Fc humanog IgG1 ili Fc humanog IgG1 koji sadrži jednu ili više mutacija koje menjaju efektornu funkciju navedenog Fc kao što je supstitucija na N297 i/ili supstitucija ili delecija C-terminalnog lizina navedenog Fc humanog IgG.

3. Fc-fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačen time što linker povezuje delove Fc i mutein humanog IL-2 navedenog proteina kao što je GGGGS (SEQ ID NO: 5), GGNGT (SEQ ID NO:6) ili YGNGT (SEQ ID NO:7).

4. Fc-fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što mutein IL-2 dalje sadrži aminokiselinsku adiciju, supstituciju ili deleciju koja menja glikozilaciju navedenog Fcfuzionog proteina kada je eksprimiran u sisarskim ćelijama.

5. Fc-fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačen time što navedeni Fcfuzioni protein sadrži Fc dimer dva muteina IL-2 ili jednog muteina IL-2.

6. Fc fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1, koji ima sekvencu prema SEQ ID NO:18.

7. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira Fc-fuzioni protein prema patentnim zahtevima 1 do 6.

8. Izolovana nukleinska kiselina prema patentnom zahtevu 7, naznačena time što Fc je Fc humanog IgG1.

9. Ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8, operativno vezan za promotor.

10. Ćelija domaćin koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 7 ili patentnom zahtevu 8 naznačena time što navedena ćelija domaćin je prokariotska ćelija kao što je E. coli ili eukariotska ćelija kao što je sisarska ćelija uključujući, ali bez ograničenja na ćelijsku liniju jajnika kineskog hrčka (CHO).

11. Postupak za pripremu Fc-fuzionog proteina prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 koji sadrži kultivaciju ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 10 i sakupljanje Fc-fuzionog proteina iz navedene kulture.

12. Mutein humanog IL-2 koji sadrži V91K supstituciju i aminokiselinsku sekvencu najmanje 90% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:1 ili Fc-fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 za upotrebu u in vivo postupku za lečenje subjekta sa inflamatornom ili autoimunom bolešću.

13. Mutein IL-2 prema patentnom zahtevu 1 ili Fc-fuzioni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6 za upotrebu prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što bolest je atopijska bolest, paraneoplastična autoimuna bolest, inflamacija hrskavice, artritis, reumatoidni artritis, juvenilni artritis, juvenilni reumatoidni artritis, pauciartikularni juvenilni reumatoidni artritis, poliartikularni juvenilni reumatoidni artritis, juvenilni reumatoidni artritis sa sistemskim početkom, juvenilni ankilozni spondilitis, juvenilni enteropatski artritis, juvenilni reaktivni artritis, juvenilni Reiter-ov sindrom, SEA sindrom (sindrom seronegativnosti, entezopatije, artropatije), juvenilni dermatomiozitis, juvenilni psorijatički artritis, juvenilna skleroderma, juvenilni sistemski lupus eritematozus, juvenilni vaskulitis, pauciartikularni reumatoidni artritis, poliartikularni reumatoidni artritis, reumatoidni artritis sa sistemskim početkom, ankilozni spondilitis, enteropatski artritis, reaktivni artritis, Reiter-ov sindrom, SEA sindrom (sindrom seronegativnosti, entezopatije, artropatije), dermatomiozitis, psorijatički artritis, skleroderma, vaskulitis, miolitis, polimiolitis, dermatomiolitis, poliarteritis nodoza, Wegener-ov granulomatozis, arteritis, polimijalgija reumatika, sarkoidoza, skleroderma, primarna bilijarna skleroza, sklerotizujući holangitis, Sjogren-ov sindrom, psorijaza, psorijaza sa plakovima, kapljična psorijaza, inverzna psorijaza, pustularna psorijaza, eritrodermna psorijaza, dermatitis, atopijski dermatitis, ateroskleroza, lupus, Still-ova bolest, sistemski lupus eritematozus (SLE), mijastenija gravis, vaskulitis indukovan hepatitisom C, dijabetes melitus tipa 1, multipla skleroza, spontani gubitak trudnoće, atopijske bolesti, ili inflamatorne bolesti creva, Crohn-ova bolest, ulcerozni kolitis, celijačna bolest, astma, COPD, rinosinuzitis, rinosinuzitis sa polipima, eozinofilni ezofagitis, eozinofilni bronhitis, Guillain-Barreova bolest, tiroiditis (npr., Graves-ova bolest), Addison-ova bolest, Raynaud-ov fenomen, autoimuni hepatitis, bolest transplanta protiv domaćina, odbacivanje transplanta ili oštećenje bubrega.