TARFNAME T-REGÜLATÖR HÜCRELERIN GENISLETILMESINE YÖNELIK INTERLÖKIN-2 MUTEINLERI Bu basvuru, 14 Mart 2013'te basvurusu yapilan U.S. Provizyonel Basvuru Seri No. 61/784,669'un rüçhanini talep eder. Dizi Listesine Referans Mevcut basvuru, EFS-Web vasitasiyla elektronik formatta bir Dizi Listesi ile birlikte olusturulan, A-1826-WO-PCT_ST25.txt baslikli bir metin dosyasi olarak saglanir. Dizi Listesinin elektronik formatindaki bilgi, buraya tamamen referans olarak eklenmistir. Altyapi intraselüler sinyalleme olaylarini aktive eden IL-2Rß ve IL-2Ry ve IL-2 ve IL-2Rßy arasindaki etkilesimi stabilize etme görevi gören CD25 (IL-2Rci). lL-2Rßy tarafindan aktarilan sinyaller PI3-kinazi, Ras-MAP-kinazi ve STAT5 yollarininkileri içerir. T hücreleri, dokularda tipik olarak var olan IL-2'nin düsük konsantrasyonlarina yanitta CD25'in ekspresyonunu gerektirir. CD25'i eksprese eden T hücreleri hem otoimmün inflamasyonu baskilama için esansiyel olan FOXP3+ regülatör T hücrelerini (Treg hücrelerini) hem de CD25'i eksprese etmesi için aktive edilmis olan FOXP3- T hücrelerini içerir. FOXP3- CD25+ T efektör hücreleri (Teff), her ikisi de inflamasyona, otoimmüniteye, organ greft reddine veya graft-versus-host hastaligina katki saglayabilen CD4+ veya CD8+ hücreleri olabilir. IL-2-stimüle edilmis STAT5 sinyallemesi normal T-reg hücresi büyümesi ve sag kalimi için ve yüksek FOXP3 ekspresyonu için elzemdir. genisletmek veya stimüle etmek için IL-2 muteinlerinin kullanimini tarif ediyoruz. Bir süjeye uygulandiginda, Treg hücreleri üzerindeki etki inflamatuar ve otoimmün hastaliklari tedavi etmek için yararlidir. Orada tarif edilen IL-2 muteinlerinin in vivo Teff hücrelerine kiyasla Treg'i genisletmek için yararli olmasina ragmen, bir insan terapötigi için optimal özelliklere sahip olan lL-2 muteinleri olusturmak arzu edilmistir. ilgilidir. Mutant IL-2 polipeptitleri, CD25`i baglar, ancak gerçekte lL2 reseptörünü aktive Kisa Açiklama Yüksek-verimli üretilebilirlige uygun olan ve optimize edilmis farmakolojik aktiviteye sahip olan IL-2 muteinleri burada tarif edilir. Bir emsal IL-2 muteini-temelli insan terapötigi üretmeye yönelik çabada, çok sayida beklenmedik ve tahmin edilemeyen gözlemler gerçeklesmistir. Burada tarif edilen IL-2 muteinleri bu çabanin sonucudur. Burada tarif edilen lL-2 muteinleri IL-2'ye bir minimal sayida degisime sahiptir böylece azaltir, yine de Treg tercihli genislemesini ve aktivasyonunu idame ettirir. Dahasi, bazi açiklamalarda, lI-2 muteini, bir süjeye uygulandiginda serum yari-ömrünü arttiran bir moleküle, örn., bir antikor Fc'sine, kaynastirilir. IL-2 muteinleri bir kisa serum yari- ömrüne (subkütan enjeksiyon için 3 ila 5 sa) sahiptir. Burada tarif edilen emsal IL-2 muteini FC füzyonlari insanlarda en az 1 gün, en az 3 gün, en az 5 gün, en az 10 gün, en az 15 gün, en az 20 gün veya en az 25 gün olan bir yari-ömre sahiptir. IL-2 muteinlerinin farmakokinetigi üzerindeki bu etkisi IL-2 muteini terapötiginin azaltilmis veya daha az sik dozlamina olanak saglar. Dahasi, bir farmasötik büyük molekül olustururken; molekülün agregasyonunu minimuma indirirken ve kararliligini maksimuma çikarirken, büyük molekülü büyük miktarlarda üretme yetisi göz önünde bulundurulmalidir. II-2 muteini Fc-füzyon molekülleri bu tarz özellikleri gösterir. Spesifik olarak, bulus birinci açida, bir V91K sübstitüsyonunu ve SEO ID NO:1'de verilen amino asit dizisine en az %90 benzer bir amino asit dizisini içeren bir FC ve bir insan interlökin-2 (IL-2) muteinini içeren bir Fc-füzyon proteinini saglar, burada söz konusu IL-2 muteini, T regülatör hücreleri uyarir. Fc, N2977deki bir sübstitüsyon ve/veya söz konusu insan IgG Fc'nin C-terminal Iizininin sübstitüsyonu veya delesyonu gibi söz konusu Fc'nin efektör fonksiyonunu degistiren bir veya daha fazla mutasyonu içeren bir insan IgG1 Fc veya bir insan IgG1 Fc olabilir. GGGGS (SEQ ID NO: 5), GGNGT (SEQ ID No:6), veya YGNGT (SEQ ID No:7) gibi söz konusu proteinin Pc ve insan IL-2 muteini kisimlarini baglamak üzere bir baglayici içerebilen Fc-füzyon proteini de dahil edilir. glikosilasyonunu degistiren bir amino asit eklemesi, substitüsyonu veya delesyonunu içerebilen Fc-füzyon proteini de dahil edilir. Iki IL-2 muteininin veya tek bir IL-2 muteininin bir Fc dimerini içerebilen Fc-füzyon proteini de dahil edilir. SEQ ID NO:18'in dizisine sahip birinci açinin FC füzyon proteini de bulusa dahil edilir. Bulus ayrica birinci yönün Fc-füzyon proteinini kodlayan bir izole nükleik asit saglar. Fc, bir insan IgG1 Fc olabilir. izole nükleik asit içeren bir konakçi hücre de saglanir ve söz konusu konakçi hücre, E.coli gibi bir prokaryotik hücre veya bunlarla sinirli olmamak üzere, Çin hamsteri yumurtalik (CHO) hücre hatti dahil olmak üzere bir memeli hücre gibi bir ökaryotik hücre olabilir. Ayrica, bulusun bir konakçi hücresinin kültürlenmesini ve söz konusu kültürden Fc- füzyon proteininin hasat edilmesini içeren Fc-füzyon proteini yapma yöntemi saglar. Bulus ayrica bir inflamatuar veya otoimmün hastaligi olan bir öznenin tedavi edilmesine yönelik bir in vivo yönteminde kullanilmaya yönelik, bir V91K sübstitüsyonu ve SEO ID NO:1,de verilen amino asit dizisine en az %90 benzer bir amino asit dizisini ve Fc- füzyon proteini içeren bir insan IL-2 muteinini saglar. Ayrica, atopik hastalik, paraneoplastik otoimmün hastalik, kikirdak inflamasyonu, artrit, romatoid artrit, jüvenil artrit, jüvenil romatoid artrit, pausiartiküler jüvenil romatoid artrit, poliartiküler jüvenil romatoid artrit, sistemik baslangiçli jüvenil romatoid artrit, jüvenil ankilozan spondilit, jüvenil enteropatik artrit, jüvenil reaktif artrit, jüvenil Reiter Sendromu, SEA Sendromu (Seronegativite, Entezopati, Artropati Sendromu), jüvenil dermatomiyozit, jüvenil psöriyatik artrit, jüvenil skleroderma, jüvenil sistemik Iupus eritematozus, jüvenil vaskülit, pausiartiküler romatoid artrit, poliartiküler romatoid artrit, sistemik baslangiçli romatoid artrit, ankilozan spondilit, enteropatik artrit, reaktif artrit, Reiter Sendromu, SEA Sendromu (Seronegativite, Entezopati, Artropati Sendromu), dermatomiyozit, psöriyatik artrit, skleroderma, vaskülit, miyolit, polimiyolit, dermatomiyolit, poliarteritis nodoza, Wegener granülomatözü, arterit, romatizmal polimiyalji, sarkoidoz, skleroz, primer biliyer skleroz, sklerozan kolanjit, Sjogren sendromu, psöriyazis, plak psöriyazis, guttate psöriyazis, invers psöriyazis, pustular psöriyazis, eritrodermik psöriyazis, dermatit, atopik dermatit, ateroskleroz, lupus, Still hastaligi, Sistemik Lupus Eritematozus (SLE), miyastenya gravis, graft-versus-host hastaligi, hepatit C-indüklü vaskülit, Tip 1 diyabet, multipl skleroz, spontan gebelik kaybi, atopik hastaliklar, inflamatuar bagirsak hastaliklari, Crohn hastaligi, ülseratif kolit, çölyak hastaligi, astim, COPD, rinosinüzit, polipli rinosinüzit, eozinofilik özofajit, eozinofilik bronsit, Guillain-Barre hastaligi, tiroid (örnegin, Graves hastaligi), Addison hastaligi, Raynaud fenomeni, otoimmün hepatit, transplantasyon reddi veya böbrek hasari gibi bir inflamatuar veya otoimmün hastaligi olan bir öznenin tedavi edilmesine yönelik bir i'n vivo yöntemde kullanilmaya yönelik bulusun bir IL-2 muteini veya bulusun Fc-füzyon proteini saglanir. Ek olarak, bazi uygulamalarda, IL-2 muteini Fc-füzyon proteini bir IgG1 Fc bölgesi içerir. IgG1'in efektör fonksiyonlarini (örn., ADCC aktivitesini) feshetmek arzu edildiginde, 297. pozisyondaki asparajinin glisine mutasyonunun (N2978'nin; EU numaralandirma semasi) bir aglikosilasyon IgG1 Fc'sine yol açan baska mutasyonlara kiyasla büyük ölçüde iyilestirilmis saflastirma etkililikleri ve biyofiziksel özellikler sagladigi bulunmustur. Tercih edilen açiklamalarda sisteinler, aglikosile edilmis FC- içeren molekülün kararliligini arttiran, disülfit baglarina olanak saglayacak sekilde Fc'ye mühendislik ile uygulanir. Aglikosile edilmis Fc'nin yararliligi IL-2 muteini Fc-füzyonu baglaminin ötesine geçer. Dolayisiyla, bir N297G sübstitüsyonu ve istege bagli olarak bir veya daha fazla ilave rezidülerin sisteine sübstitüsyonunu içeren Fc-içeren moleküller, Fc-füzyonlari ve antikorlar burada saglanir. Bulusun bir diger açisi, glikosile peptit baglayicilarini içerir. N-glikosilasyondan sorumlu tercih edilen baglayici peptitler GGNGT (SEQ ID No:6) veya YGNGT'ti (SEQ ID No:7) Bir diger açida, mevcut bulus bir V91K sübstitüsyonu ve SEO ID NO:1'de verilen amino asit dizisine en az %90 benzer bir amino asit dizisini içeren bir insan interlökin-2 (iL-2) muteinini saglar, burada söz konusu IL-2 muteini tercihen T regülatör hücreleri uyarir. Insan lL-2 muteini, SEO ID NO:1'de verilen amino asit dizisine en az %95 benzer bir amino asit dizisini içerebilir. Söz konusu mutein, SEQ ID NO:1"de verilen amino asit dizisini içerebilir. Pozisyon 125 bir alanin olabilir. Bir digerinde, Pozisyon 125 bir sistein olabilir. Bir diger açida, mevcut bulus bir Fc ve bir insan IL-2 muteinini içeren bir Fc-füzyon proteinini saglar. Bir düzenlemede, Fc bir insan IgG1 Fc'dir. Bir diger düzenlemede, insan IgG1 Fc söz konusu Fc'nin efektör fonksiyonunu degistiren bir veya daha fazla mutasyon içerir. Bir diger düzenlemede, insan IgG1 N297'deki bir sübstitüsyonu içerir. N297'deki sübstitüsyon N297G olabilir. Fc-füzyon proteini, söz konusu insan lgG Fc'nin C-terminal Iizininin bir sübstitüsyonunu veya delesyonunu içerebilir. Söz konusu insan proteinin Fc ve insan lL-2 muteini kisimlarini baglar. Bir diger düzenlemede, baglayici GGGGS, GGNGT, veya YGNGTidir. Bir diger düzenlemede, baglayici GGGGS'dir. Bir diger düzenlemede, IL-2 muteini memeli hücrelerde ifade edildiginde, söz konusu Fc- füzyon proteininin glikosilasyonunu degistiren bir amino asit eklemesi, sübstitüsyonu veya delesyonunu içerir. IL-2 muteini bir T3 sübstitüsyonunu, örnegin T3N veya T3A sübstitüsyonunu içerir. IL-2 mutein ayrica bir 85 mutasyonunu, örnegin bir SST mutasyonunu içerebilir. Bir diger düzenlemede, Fc-füzyon proteini iki lL-2 muteininin bir Fc dimerin içerir veya söz konusu Fc-füzyon proteini tek bir lL-2 muteinini içerir. Bir diger açida, mevcut bulus bir insan IL-2 muteinini veya bir antikorun ve bir insan IL- 2 muteininin bir Fc kismini kodlayan bir izole nükleik asit saglar. Bir antikorun ve bir insan IL-2 muteininin söz konusu Fc kismi, tek bir açik okuma çerçevesinde kodlanabilir. Bir diger düzenlemede, FC bir insan IgG1 Fc'dir. Bir diger düzenlemede, insan lgG1 Fc söz konusu Fc`nin efektör fonksiyonunu degistiren bir veya daha fazla mutasyon içerir. Bir diger düzenlemede, insan lgG1 N297'deki bir sübstitüsyonu içerir. N297'deki sübstitüsyon N297G olabilir. Bir diger düzenlemede, insan IgG1 Fc C- terminal Iizininin bir sübstitüsyonunu veya delesyonunu içerir. Bir diger düzenlemede, söz konusu insan IgG Fc'nin C-terminal lizini silinir. Bir diger düzenlemede, nükleik asit ayrica bir antikorun ve bir insan IL-2 muteininin Fc kismini baglayan bir baglayiciyi kodlar. Bir diger düzenlemede, baglayici GGGGS, GGNGT, veya YGNGT'dir. Bir diger düzenlemede, baglayici GGGGSldir. Bir diger düzenlemede, lL-2 mutein ayrica memeli hücrelerde ifade edildiginde söz konusu lL-2 muteinini içeren bir proteinin glikosilasyonunu degistiren bir amino asit eklemesi, sübstitüsyonu veya delesyonu içerir. IL-2 mutein bir T3 sübstitüsyonunu, örnegin bir T3N veya T3A sübstitüsyonunu içerebilir. IL-2 mutein ayrica bir 85 mutasyonunu örnegin bir SST mutasyonunu içerebilir. Bir diger açida, mevcut bulus bir promotöre islevsel olarak baglanan, yukarida açiklandigi üzere bir izole nükleik asidi içeren bir ifade vektörünü saglar. Bir diger açida, mevcut bulus yukarida açiklandigi üzere bir izole nükleik asidi içeren bir konakçi hücreyi saglar. Bir tarifnamede, izole nükleik asit bir promotöre islevsel olarak baglanir. Bir diger düzenlemede, söz konusu konakçi hücre bir prokaryotik hücredir. Bir diger düzenlemede, konakçi hücre E. Coli'dir. Bir diger düzenlemede, söz konusu konakçi hücre bir ökaryotik hücredir. Bir diger düzenlemede, konakçi hücre bir memeli hücresidir. Bir diger düzenlemede, konakçi hücre bir Çin hamsteri yumurtalik (CHO) hücresi hattidir. Bir diger açida, mevcut bulus söz konusu promotörün ifade edildigi kosullar altinda yukarida açiklandigi üzere bir konakçi hücrenin kültürlenmesini ve söz konusu kültürden insan lL-2 muteininin hasat edilmesini içeren bir insan lL-2 muteini yapma yöntemini saglar. Bir düzenlemede, yöntem söz konusu promotörün ifade edildigi kosullar altinda yukarida açiklandigi üzere bir konakçi hücrenin kültürlenmesini ve söz konusu kültürden Fc-füzyon proteininin hasat edilmesini içerir. Bir diger tarifnamede, mevcut bulus yukarida açiklanan bir insan lL-2 muteininin etkili bir miktari ile T hücrelerinin popülasyonunun temas ettirilmesini içeren, T hücrelerinin bir popülasyonunda regülatör T hücrelerinin (Treg'ler) regülatör olmayan T hücrelerine oranini arttirma yöntemini saglar. Bir düzenlemede, CD3+FoxP3+ hücrelerinin CD3+FoxP3-"ye orani örnegin en az %50'ye kadar artar. Bir diger tarifnamede, mevcut bulus yukarida açiklanan bir Fc-füzyon proteininin etkili bir miktari ile T hücrelerinin popülasyonunun temas ettirilmesini içeren, T hücrelerinin bir popülasyonunda regülatör T hücrelerinin (Treg'ler) regülatör olmayan T hücrelerine oranini arttirma yöntemini saglar. Bir düzenlemede, CD3+FoxP3+ hücrelerinin CD3+FoxP3-'ye orani örnegin en az %50iye kadar artar. Bir diger tarifnamede, mevcut bulus yukarida açiklanan bir insan lL-2 muteininin etkili bir miktarinin uygulanmasini içeren, bir öznenin periferik kanindaki regülatör T hücrelerinin (Treg'ler) regülatör olmayan T hücrelerine oranini arttirma yöntemini saglar. Bir düzenlemede, CD3+FoxP3+ hücrelerinin CD3+F0xP3-'ye orani örnegin en az %50'ye kadar artar. Bir diger tarifnamede, mevcut bulus mevcut bulus yukarida açiklanan bir Fc-füzyon proteininin etkili bir miktarinin uygulanmasini içeren, bir öznenin periferik kanindaki regülatör T hücrelerinin (Treg'ler) regülatör olmayan T hücrelerine oranini arttirma yöntemini saglar. Bir düzenlemede, CD3+FOXP3+ hücrelerinin CD3+FoxP3-'ye orani örnegin en az %50*ye kadar artar. Bir diger tarifnamede, mevcut bulus yukarida açiklanan bir insan lL-2 muteininin etkili bir miktarinin uygulanmasini içeren, bir öznenin periferik kanindaki regülatör T hücrelerinin (Treg'ler) dogal öldürücü (NK) hücrelere oranini arttirma yöntemini saglar. Bir tarifnamede, CD56 ve/veya CD16'yi ifade eden CD3+FOXP3+ hücrelerinin CD3- CD19- lenfositlerine orani örnegin en az %50'ye kadar artar. Bir diger tarifnamede, mevcut bulus yukarida açiklanan bir Fc-füzyon proteininin etkili bir miktarinin uygulanmasini içeren, bir öznenin periferik kanindaki regülatör T hücrelerinin (Tregller) dogal öldürücü (NK) hücrelere oranini arttirma yöntemini saglar. Bir tarifnamede, CD56 ve/veya CD16'yi ifade eden CD3+F0xP3+ hücrelerinin CD3- CD19- lenfositlerine orani örnegin en az %50'ye kadar artar. Bir diger açida, mevcut bulus bir inflamatuar veya otoimmün hastaligi olan bir öznenin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanilmaya yönelik bulusun IL-2 muteinini veya Fc füzyon proteinini saglar, söz konusu yöntem yukarida açiklanan bir lL-2 muteininin terapötik olarak etkili bir miktarinin söz konusu özneye uygulanmasini içerir. Bir diger açida, mevcut bulus bir inflamatuar veya otoimmün hastaligi olan bir öznenin tedavi edilmesine yönelik bir yöntemde kullanilmaya yönelik bulusun lL-2 muteinini veya Fc füzyon proteinini saglar, söz konusu yöntem yukarida açiklanan bir Fc-füzyon proteininin terapötik olarak etkili bir miktarinin söz konusu özneye uygulanmasini içerir. Bir tarifnamede, uygulama hastaligin en az bir semptomunun azalmasina neden olur. Bir diger tarifnamede, bir öznenin periferik kanindaki regülatör T hücrelerinin (Treg'ler) regülatör olmayan T hücrelerine orani uygulamadan sonra artar. Bir diger tarifnamede, bir öznenin periferik kanindaki regülatör T hücrelerinin (TregSIer) regülatör olmayan T hücrelerine orani uygulamadan sonra büyük ölçüde ayni kalir. Bir diger düzenlemede, inflamatuar veya otoimmün hastalik lupus, graft-versus-host hastaligi, hepatit C-indüklü vaskülit, Tip I diyabet, multipl skleroz, spontan gebelik kaybi, atopik hastaliklar, veya inflamatuar bagirsak hastaliklaridir. Bir diger açida, mevcut bulus bir insan IgG1 antikorunun bir FC bölgesini saglar, burada söz konusu FC bölgesi, bir N297G mutasyonunu içerir ve bir insan IgG1'in söz konusu Fc bölgesi SEQ ID NO:3'te verilen amino asit dizisine en az %90 benzerlik içerir. Bir tarifnamede, bir insan lgG1*in Fc bölgesi SEQ ID NO:3'te verilen amino asit dizisine en az %95 benzerlik içerir. Bir diger tarifnamede, bir insan IgG1`in FC bölgesi SEQ ID bölgesi ayrica polipeptidi stabilize etmek üzere bir veya daha fazla mutasyonunu içerir. Bir diger tarifnamede, SEQ ID NO:3,te verilen bir veya daha fazla amino asit sistein ile sübstitüe edilir. Bir diger tarifnamede, SEQ ID NO:3'te verilen amino asit dizisine ait tarifnamede, Fc bölgesi SEQ ID NO:3'te verilen amino asit dizisinde bir A287C ve LSOGC sübstitüsyonunu içerir. Bir diger tarifnamede, Fc bölgesi SEO ID NO:3'te verilen amino asit dizisinde bir V2590 ve L3060 sübstitüsyonunu içerir. Bir diger tarifnamede, Fc bölgesi SEQ ID NO:3'te verilen amino asit dizisinde bir R2920 ve V302C sübstitüsyonunu içerir. Bir diger tarifnamede, Fc bölgesi SEQ ID NO:3'te verilen amino asit dizisinde bir V32SC ve I332C sübstitüsyonunu içerir. Bir diger tarifnamede, mevcut bulus yukarida açiklanan bir FC bölgesini içeren bir antikoru saglar. Bir diger tarifnamede, mevcut bulus yukarida açiklanan bir Fc bölgesini içeren bir Fc- füzyon proteinini saglar. Bir diger açida, mevcut bulus bir baglayici içeren bir polipeptidi saglar, burada baglayici GGNGT veya YGNGT'dir. Baglayici N-glikosilasyon içerebilir. Baglayici polipeptit yapisindaki bir ilmege yerlestirilebilir veya bunu degistirir. Bir diger açida, mevcut bulus bir aglikosile IgG1 Fc-içeren molekül yapma yöntemini saglar, söz konusu yöntem bir memeli hücre kültüründe yukarida açiklanan bir polipeptidi kodlayan bir nükleik asidin ifade edilmesini ve söz konusu kültürden aglikosile IgG1 Fc-içeren molekülün hasat edilmesini içerir. Bir diger açida, mevcut bulus memeli hücrelerde ifade edildiginde aglikosile olan bir N297'ye yönelik bir kodonun bir glisin kodonuna mutasyon adimini içerir. Bir diger açida, mevcut bulus SEQ ID NO:18 veya SEQ ID NO:20'nin dizisinden olusan bir Fc-füzyon proteinini saglar. Bir düzenlemede, mevcut bulus Fc-füzyonunu kodlayan bir nükleik asidi saglar. Bir diger düzenlemede, mevcut bulus nükleik asidi içeren bir hücreyi saglar. Bir diger düzenlemede, mevcut bulus söz konusu Fc-füzyon proteinini ifade etmesini saplayan kosullar altinda hücrenin inkübe edilmesini içeren, Fc-füzyon proteini yapma yöntemini saglar. Bir diger düzenlemede, mevcut bulus bir inflamatuar veya otoimmün durumun tedavisinde kullanilmaya yönelik Fc-füzyon proteinini saglar. Bir diger düzenlemede, inflamatuar veya otoimmün durum graft versus host hastaligidir. Bir diger açida, mevcut bulus, söz konusu öznede bir degisimin tespit edilmesini içeren, yukarida açiklanan bir insan interlökin-2 (IL-2) muteini veya yukarida açiklanan bir Fc- füzyon proteini ile tedaviye biz öznenin yanitinin izlenmesi yöntemini saglar, söz konusu degisim, vücut sicakligindaki bir artis, söz konusu öznenin periferik kaninda CRP artisi, söz konusu öznenin periferik kaninda platelet azalmasi, söz konusu öznenin periferik kaninda nötrofil azalmasi veya söz konusu öznenin periferik kaninda albümin azalmasidir, burada söz konusu tedavi sonlandirilir, askiya alinir, doz sikligi bakimindan azaltilir veya söz konusu degisim tespit edildikten sonra doz miktari bakimindan azaltilir. Bir düzenlemede, söz konusu degisim vücut sicakliginda en az O.5°C artis, söz konusu öznenin periferik kaninda en az 0.2 mg/mL CRP artisi, söz konusu öznenin periferik kaninda en az 0.8-kat platelet azalmasi, söz konusu öznenin periferik kaninda en az 0.8-kat nötrofil azalmasi veya söz konusu öznenin periferik kaninda en az 0.4-kat albümin azalmasini içerir. Sekillerin Kisa Açiklamasi SEKIL 1, bir kisa süreli stimülasyon analizinde, IgG-Fc'sinin C-ucuna füzyon ile homodimerizasyon CD25 için azaltilmis potensi olan ve yüksek afinitesi olan lL-2 muteinlerinin aktivitesini degistirmez. SEKIL 2A ve SEKIL 28, gösterilen mutasyonlari olan ve bir Fc-heterodimerinin bir tarafinin C-ucuna kaynastirilmis IL-2 muteinleri bunlarin T hücrelerinde STATS fosforilasyonunu stimüle etme yetisi için test edilmistir. Bu muteinler ayrica, CD25 için yüksek afinite saglayan üç mutasyon içermistir (V69A, N71 R, Q74P). Bunlarin aktivitesi Fc füzyonu olmayan IL-2'nin üç formu (içi bos semboller) ile karsilastirilmistir: WT IL-2, Q74P) ve HaD (CD25 için yüksek afinite ve azaltilmis sinyalleme aktivitesi) (N29S, kapilanmis FOXP3+CD4+ ve FOXP3-CD4+ T hücreleri için gösterilir. SEKIL 3, Fc-heterodimerine kaynastirilmis lL-2 muteinlerinin titrasyonlarina yanitta T hücresi alt-kümelerinin proliferasyonu. Füzyon proteinlerinin aktivitesi Fc füzyonu olmayan IL-2'nin üç formu (içi bos semboller) ile karsilastirilmistir: WT lL-2, HaWT HaD (CD25 için yüksek afinite ve azaltilmis sinyalleme aktivitesi) (N298, Y31H, K35R, SEKIL 4, Fc-heterodimerine kaynastirilmis IL-2 muteinlerinin titrasyonlarina yanitta NK hücrelerinin proliferasyonu. Füzyon proteinlerinin aktivitesi Fc füzyonu olmayan lL-2'nin üç formu (içi bos semboller) ile karsilastirilmistir: WT IL-2, HaWT (CD25 için yüksek V69A, N71 R, Q74P, N88D). SEKIL 5, Fc-homodimeri N297G'ye kaynastirilmis lL-2 muteinlerinin titrasyonlarina yanitta T hücresi alt-kümelerinin proliferasyonu. Fc.muteinlerinin aktivitesi WT IL-2 (içi bos çemberler) ve Fc.WT (içi dolu daireler) ile karsilastirilmistir. CD25 için yüksek afinite saglayan mutasyonlar (HaMut1) V69A'dir ve Q74P'dir. SEKIL 6, Fc-homodimeri N297G'ye kaynastirilmis lL-2 muteinlerinin titrasyonlarina yanitta NK hücrelerinin proliferasyonu. Fc.muteinlerinin aktivitesi WT IL-2 (içi bos çemberler) ve Fc.WT (içi dolu daireler) ile karsilastirilmistir. SEKIL ?A ve SEKIL YB, CD25 için yüksek afinite saglayan mutasyonlari olmayan bir Fc.lL-2 muteinleri beserilestirilmis farelerde Treg genislemesini ve FOXP3 yukari dogru regülasyonunu tesvik eder. SEKIL 8, Fc.lL-2 muteinlerinin düsük haftalik dozlari (her bir hayvan için 0,5 ug), FC.N88D'ye ve Fc.WT'ye kiyasla Fc.V91K için gözlemlenen daha iyi aktivite ile, beserilestirilmis farelerde Treg genislemesini ve FOXP3 yukari dogru regülasyonunu tesvik eder. SEKIL 9A, Fc.V91K ve FC.N88D CD25 ile birlesme yoluyla aktive edilmis T hücrelerinin yüzeyi üzerinde devamlilik gösterir. SEKIL QB, Fc.WT'ye göre Fc.V91 K ve FC.N88D ile lL-2R sinyalinin sürekliligini gösterir. SEKIL 10A ve B, sinomolgus maymunlarinda iki haftalik ve dört haftalik Fc.V91K doz araliklarinin karsilastirmasini ve IV ve SC doz yollarinin karsilastirmasini gösterir. SEKIL 11A-F, PROLEUKIN®, Fc.V91 K, ve FC.N88D`nin farkli doz rejimleri ile tedavi edilen sinomolgus maymunlarinda hücresel yanit, vücut sicakligi ve serum CRP kinetiklerini gösterir. SEKIL 12A, sinomolgus maymunlarinda Treg hücrelerinin, NK hücrelerinin, CD4*FOXP3'T hücrelerinin, ve CD8*FOXP3' T hücrelerinin seviyeleri üzerinde artan PROLEUKIN®, Fc.V91K, veya FC.N88D dozajlarinin etkisini gösterir. Her bir veri noktasi, dört hayvanin ortalama pik yanitlarini gösterir. SEKIL 128, sinomolgus maymunlarinda Treg hücrelerinin ve eozinofillerin seviyeleri üzerinde artan PROLEUKIN®, Fc.V91K, veya Fc.N88D dozajlarinin etkisini gösterir. Her bir veri noktasi, dört hayvanin ortalama pik yanitlarini gösterir. SEKIL 120, sinomolgus maymunlarinda Treg hücrelerinin seviyesi ve CRP ve vücut sicakligi üzerinde artan PROLEUKIN®, Fc.V91K, veya Fc.N88D dozajlarinin etkisini gösterir. Her bir veri noktasi, dört hayvanin ortalama pik yanitlarini gösterir. SEKIL 12D, sinomolgus maymunlarinda Treg hücreleri, plateletler, nötrofiller ve albümin seviyesi üzerinde artan PROLEUKIN®, Fc.V91K, veya Fc.N88D dozajlarinin etkisini gösterir. Her bir veri noktasi, dört hayvanin ortalama pik yanitlarini gösterir. Sag y-eksenleri, ön doz numunelerine göre plateletler, nötrofiller veya albüminde bir kat degisimi azalmasina yol açmak üzere ters çevrilir. SEKIL 13, Fc.V91K ile tedavi edilen sinomolgus maymunlarinda anti-ilaç antikorlarinin (ADA) gelisiminin kinetiklerini gösterir. Detayli Açiklama Burada kullanilan bölüm basliklari yalnizca organizasyonel amaçlidir ve tarif edilen konuyu sinirlandigi seklinde anlamli çikarilmaz. Standart teknikler rekombinant DNA, oligonükleotid sentezi, doku kültürü ve transformasyonu, protein saflastirmasi, vb. için kullanilabilir. Enzimatik reaksiyonlar ve saflastirma teknikler üreticinin spesifikasyonlarina göre veya teknikte yaygin bir sekilde yapildigi üzere veya burada tarif edildigi üzere gerçeklestirilebilir. Asagidaki prosedürler ve teknikler genel olarak teknikte iyi bilinen geleneksel yöntemlere göre ve spesifikasyon boyunca alinti yapilan ve tartisilan çesitli genel ve daha spesifik referanslarda tarif edildigi üzere gerçeklestirilebilir. Bakiniz, örn., Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, N.Y. Spesifik tanimlar saglanmadikça, burada tarif edilen analitik kimya, organik kimya ve tibbi ve farmasötik kimya ile baglantili olarak kullanilan adlandirma ve bunlarin laboratuvar prosedürleri ve teknikleri teknikte iyi bilinen ve yaygin bir sekilde kullanilanlardir. Standart teknikler kimyasal sentez, kimyasal analizler, farmasötik preparasyon, formülasyon ve aktarim ve hastalarin tedavisi için kullanilabilir. Burada tarif edilen IL-2 muteinleri dogal-tip insan IL-2'sinin varyantlaridir. Burada kullanildigi sekliyle, "dogal-tip insan IL-2'si", "dogal-tip IL-2" veya "WT IL-2" asagidaki amino asit dizisine sahip olan polipeptit anlamina gelmelidir: APTSR'ÃTKkTQl :1 :Mi 1 l DiQMii Nt'ith'r'lNFPil'Fin-HT"F"'lv1F'tiIîi'iTF.H-l Qiîi FFFl KF'I FF'v'i NlM'iüliNFHl F: viiiri sniikuwvituüâi› i›r`ii:'H'Ai:i›i:.iwww-winHiiisiiâiii burada X, C'dir, S'dir, V`dir veya A'dir (SEQ ID NO: 2). silinme veya içeri yerlestirme içerebilir. Rezidüeler burada tek harfli amino asit kodu akabinde IL-2 amino asit pozisyonu ile gösterilir, örn., K35, SEQ ID NO: 2'nin 35. pozisyonunda Iizin rezidüsüdür. Sübstitüsyonlar burada tek harfli amino asit kodu akabinde IL-2 amino asit pozisyonu akabinde sübstitüe eden tek harfli amino asit kodu ile gösterilir, örn., K35A, SEQ lD NO: 2'nin 35. pozisyonundaki Iizin rezidüsünün bir alanin rezidüsü ile bir sübstitüsyonudur. lL-2 Muteinleri T regülatör (Treg) hücreleri tercihli bir sekilde stimüle eden insan IL-2 muteinleri burada saglanir. Burada kullanildigi sekliyle, "T regülatör hücreleri tercihli bir sekilde stimüle eder" muteinin CD3+FoxP3- T hücrelerine kiyasla CD3+FoxP3+ T hücrelerinin proliferasyonunu, sag kalimini, aktivasyonunu ve/veya fonksiyonunu tesvik ettigi anlamina gelir. Treg'leri Tercihli bir sekilde stimüle etme yetisini ölçme yöntemleri periferik kan lökositlerinin akis sitometrisi ile ölçülebilir, burada toplam CD4+ T hücreleri arasinda FOXP3+CD4+ T hücrelerinin yüzdesinde bir gözlemlenen artis, toplam CD8+ T hücreleri arasinda FOXP3+CD8+ T hücrelerinin yüzdesinde bir artis, NK hücrelerine kiyasla FOXP3+ T hücrelerinin yüzdesinde bir artis ve/veya baska T hücreleri üzerindeki CD25 ekspresyonu artisina kiyasla FOXP3+ T hücrelerinin yüzeyi üzerindeki CD25 ekspresyon düzeyinde bir daha büyük artis vardir. Treg hücrelerinin tercihli büyümesi ayrica, bisülfit ile muamele edilmis genomik DNA'dan elde edilen polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürünlerinin dizilenmesi ile saptandigi üzere, tam kandan ekstrakte edilmis DNA'daki demetillenmis CD3 genlerine kiyasla demetillenmis FOXP3 promotörü DNA'sinin (yani, Treg-spesifik demetillenmis bölgenin veya TSDR'nin) arttirilmis temsili ile de saptanabilir (J. Sehouli, et al., 2011. Epigenetics 622, 236-246). Treg hücrelerini tercih bir sekilde stimüle eden IL-2 muteinleri bir süjede veya bir periferik kan Örneginde CD3+F0xP3- T hücrelerine kiyasla CD3+FOXP3+ T hücrelerinin Tercih edilen IL-2 muteinleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, SEQ ID NO: 2'de izah edilen amino asit dizisinde V91K veya N88D sübstitüsyonunu içeren IL-2 muteinlerini, içerir. Örnek niteligindeki bir IL-2 muteini SEQ ID NO: 1`de izah edilir. Bir C125A sübstitüsyonu içeren SEQ ID NO: 1'de izah edilen amino asit dizisi özel olarak tercih edilir. Dogal-tip IL-2 dizisine ilave mutasyonlarin sayisini azaltmanin avantajli olabilmesine ragmen, bulus, söz konusu muteinlerin Treg'leri tercihli bir sekilde stimüle etme aktivitesini idame ettirmesi kaydiyla, V91K ve N88D sübstitüsyonuna ek olarak kirpilmalara veya ilave Içeri yerlestirmelere, silinmelere veya sübstitüsyonlara sahip olan lL-2 muteinlerini içerir. Dolayisiyla, açiklamalar Treg hücrelerini tercihli bir sekilde stimüle eden ve SEO lD NO: 2'de izah edilen amino asit dizisine en az %90, en az dizisi içeren IL-2 muteinlerini içerir. Özel olarak tercih edilen açiklamada, bu tarz IL-2 muteinleri SEQ ID NO: 2'de izah edilen amino asit dizisine en az %90, en az %91, en en az %99 özdes olan bir amino asit dizisi içerir. Amino asit dizileri için, dizi özdesligi ve/veya benzerligi, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 22482, lokal dizi özdesligi algoritmasi, Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, dizi özdesligi hizalama algoritmasi, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444, benzerlik arama yöntemi, bu algoritmalarin bilgisayarli uygulamalari (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis., içindeki GAP, BESTFIT, FASTA ve TFASTA), Devereux et al., olmak üzere, teknikte bilinen standart teknikler kullanilarak, tercihen varsayilan parametreler kullanilarak veya görsel inceleme ile, belirlenir. Tercihen, özdeslik yüzdesi asagidaki parametrelere göre FastDB ile hesaplanir: 1'Iik yanlis-eslesme kaybi; 1'Iik bosluk kaybi; 0,33'Iük bosluk boyut kaybi ve 30'Iuk birlestirme kaybi, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Bir kullanisli algoritmanin bir örnegi PILEUP'tir. PILEUP progresif, ikili hizalamalar kullanarak ilgili dizilerin bir grubundan bir çok sayida dizi hizalamasi olusturur. Bu ayrica, hizalamayi olusturmak için kullanilan kümeleme iliskilerini gösteren bir agaç da yönteminin bir basitlestirilmis halini kullanir; yöntem Higgins and Sharp, 1989, CABIOS bir varsayilan bosluk agirligini, 0,10'Iuk bir varsayilan bosluk uzunlugu agirligini ve ölçülen uç bosluklarini içerir. Bir kullanisli algoritmanin bir baska örnegi, asagidaki kaynaklarda tarif edilen, BLAST BLAST-2, çogu varsayilan degerlere ayarlanan, bir kaç arama parametresini kullanir. Ayarlanabilen parametreler asagidaki degerler ile ayarlanir: kesisen uzunluk=1, kesisen fraksiy0n=0,125, sözcük esik-degeri (T)=Il. HSP S ve HSP 82 parametreleri dinamik degerlerdir ve özel dizinin bilesimine ve söz konusu dizinin buna karsi arastirilmakta oldugu özel veri tabaninin bilesimine bagli olarak programin kendisi tarafindan belirlenir; bununla birlikte, degerler duyarliligi arttiracak sekilde ayarlanabilir. tarafindan bildirildigi üzere bosluklu BLAST'tir. Bosluklu BLAST BLOSUM-62 sübstitüsyon skorlarini; 9'a ayarlanmis esik-degeri T parametresini; bosluklandirilmamis uzamalari tetiklemek için iki-isabetli yöntemi, 10+k'nin k maliyetinin yüklendigi bosluk uzunluklarini; 16'ya ayarlanmis Xu'yu ve veri tabani arama evresi için 40'a ve algoritmalarin çikti evresi için 67'ye ayarlanmis Xg'yi kullanir. Bosluklu hizalamalar yaklasik 22 bite karsilik gelen bir skor tarafindan tetiklenir. Bir amino asit dizisi varyasyonunu uygulama için yer veya bölge önceden- belirlenebilirken, basli basina mutasyonun önceden-belirlenmis olmasi gerekmez. Örnegin, bir verilen yerde bir mutasyonun performansini optimize etmek amaciyla, rastgele mutajenez hedef kodonda veya bölgede gerçeklestirilebilir ve eksprese edilmis diziye sahip olan DNA'da önceden-belirlenmis yerlerde sübstitüsyon mutasyonlari yapmak için teknikler, örnegin, M13 primer mutajenezi ve PCR mutajenezi, iyi bilinir. Mutantlarin taranmasi, örnegin, burada tarif edilen analizler kullanilarak yapilabilir. Amino asit sübstitüsyonlari tipik olarak tek rezidülüktür; kayda deger ölçüde daha büyük içeri yerlestirmelerin tolere edilebilmesine ragmen, içeri yerlestirmeler genel olarak yaklasik bir (1) ila yaklasik yirmi (20) amino asit rezidülük mertebede olacaktir. Bazi durumlarda, silinmelerin çok daha büyük olabilmesine ragmen, silinmeler yaklasik bir (1) ila yaklasik yirmi (20) amino asit rezidülük araliktadir. Sübstitüsyonlar, silinmeler, içeri yerlestirmeler veya bunlarin herhangi bir kombinasyonu bir nihai türeve veya varyanta varmak için kullanilabilir. Genel olarak, bu degisimler molekülün degisimini, özel olarak antijen baglama proteininin immünojenisitesini ve özgüllügünü, minimuma etmek için bir kaç amino asit üzerinde yapilir. Bununla birlikte, daha büyük degisimler belirli durumlarda tolere edilebilir. Konservatif Sübstitüsyonlar genel olarak TABLO 1 olarak gösterilen asagidaki çizelgeye uygun sekilde yapilabilir. Orijinal Rezidü Emsal Sübstitüsyonlar Asn Gln, His Cys Ser, Ala Orijinal Rezidü Emsal Sübstitüsyonlar His Asn, Gln Leu Ile, Val Lys Arg, Gln, Glu Met Leu, Ile Phe Met, Leu, Tyr, Trp Trp Tyr, Phe Tyr Trp, Phe Val Ile, Leu Fonksiyondaki veya immünolojik benzerlikteki kayda deger degisimler TABLO 1'de gösterilenlere kiyasla daha az konservatif olan sübstitüsyonlari seçme ile yapilir. Örnegin, asagidakileri daha anlamli bir sekilde etkileyen sübstitüsyonlar yapilabilir: degisim alaninda polipeptit omurgasinin yapisi, örnegin, alfa-helikal veya beta-yaprak yapi, hedef yerde molekülün yükü veya hidrofobisitesi veya yan zincirin yigini. Genel olarak polipeptidin özelliklerinde en büyük degisikleri üretmesi beklenen sübstitüsyonlar, burada (a) bir hidrofilik rezidünün, örn., serilin veya treonilin, bir hidrofobik rezidü, Örn., Iösil, izolösik, fenilalanil, vaIiI veya alanil için (veya bunlar ile) sübstitüe edildikleridir; (b) bir sisteinin veya prolinin herhangi bir baska rezidü için (veya bunlar ile) sübstitüe edildikleridir; (0) bir elektro-pozitif yari zincire sahip olan bir rezidünün, örn., lizilin, arjinilin veya histidilin, bir elektro-negatif rezidü, örn., glutamil veya aspartil, için (veya bunlar ile) sübstitüe edildikleridir veya (d) bir yigintili yari zincire sahip olan bir rezidünün, örn., fenilalaninin, bir yan zincire sahip olmayan, örn., glisin, için (veya bunlar ile) sübstitüe edildikleridir. Varyantlarin ayrica gerektiginde lL-2 muteininin karakteristiklerini modifiye edecek sekilde de seçilmesine ragmen, varyantlar tipik olarak dogal-olusumlu analogu ile ayni kalitatif biyolojik aktiviteyi gösterir ve ayni immün yaniti meydana getirecektir. Alternatif olarak, varyant lL-2 muteininin biyolojik aktivitesinin degistirildigi sekilde tasarlanabilir. Örnegin, glikosilasyon yerleri burada tartisildigi üzere degistirilebilir veya uzaklastirilabilir. Burada saglanan IL-2 muteinleri, örnegin, Teff veya NK hücrelerine, kiyasla Treg'leri tercihli bir sekilde genislettiginden, bir hastaya uygulandiginda güvenlik profilinin dogal- tip IL-2'ninkinden veya PROLEUKIN® (aldeslökin: Novartis, Basel, Switzerland) ürünününkinden farklilik gösterecek olmasi beklenir. Dogal-tip IL-2 veya PROLEUKIN® ile iliskilendirilmis yan-etkiler grip-benzeri semptomlari, üsümeleri/rigoru, artraljiyi, atesi, rasi, pruritusu, enjeksiyon yeri reaksiyonlarini, hipotansiyonu, diyareyi, bulantiyi, anksiyeteyi, konfüzyonu ve depresyonu içerir. Burada saglanan lL-2 muteinleri, bu tarz yari-ömür uzatmasinin bir hastada bir yan-etkinin veya advers olayin olasiligini veya yogunlugunu arttiracak olma riskini arttirmadan muteinin serum yari-ömrünü uzatan molekülleri içerecek sekilde degistirilebilir veya bu moleküllere kaynastirilabilir. Bu tarz bir uzatilmis serum yari-ömürlü muteinin subkütan dozlami daha düsük sistemik maksimal maruziyet (Cmaks) ile uzatilmis hedef kapsamaya olanak saglar. Uzatilmis serum yari-ömrü muteinin bir daha düsük veya daha az sik dozlam rejimine olanak saglayabilir. Burada saglanan lL-2 muteinlerinin serum yari-ömrü esasen teknikte bilinen herhangi bir yöntem ile uzatilabilir. Bu tarz yöntemler IL-2 muteininin dizisini neonatal Fcv reseptörünü baglayan bir peptidi içerecek veya uzatilmis serum yari-ömrüne sahip olan bir proteini, örn., IgG'yi veybir insan serum albüminini, baglayacak sekilde degistirmeyi içerir. Baska uygulamalarda, lL-2 muteini füzyon molekülüne uzatilmis yari-ömür saglayan bir polipeptide kaynastirilir. Bu tarz polipeptitler bir lgG Fc'sini veya neonatal Fcy reseptörünü, insan serum albüminini baglayan baska polipeptitleri veya uzatilmis serum yari-ömrüne sahip olan bir proteini baglayan polipeptitleri içerir. Tercih edilen uygulamalarda, IL-2 muteini bir IgG Fc molekülüne kaynastirilir. gösterildigi üzere, IgG Fc bölgesinin C-ucuna füzyon IL-2 muteini aktivitesini, IgG Fc'sinin N-ucuna kaynastirilmasina kiyasla, bir daha büyük derecede idame ettirir. Mevcut bulusun bir uygulamasi, bir IL-2 muteinini bir antikorun Fc bölgesine kaynastirma ile olusturulan iki Fc-füzyon polipeptidi içeren bir dimer ile ilgilidir. Dimer, örnegin, füzyon proteinini sifreleyen bir gen füzyonunu bir uygun ekspresyon vektörüne yerlestirme, gen füzyonunu rekombinant ekspresyon vektörü ile transforme edilmis konak hücrelerde eksprese etme ve ek3prese edilmis füzyon proteininin antikor moleküllerine çok benzer sekilde birlesmesine izin verme ile, yapilabilir, bundan sonra dimeri üretmek için Fc kisimlari arasinda inter-zincir baglar olusur. Burada kullanildigi sekliyle, "Fc polipeptidi" veya "Fc bölgesi" terimi bir antikorun Fc bölgesinden türetilen polipeptitlerin natif ve mutein formlarini içerir. Dimerizasyonu tesvik eden mentese bölgesi içeren bu tarz polipeptitlerin kirpilmis formlari da dâhil edilir. Belirli açiklamalarda, Fc bölgesi bir antikor CH2 ve CH3 alani içerir. Uzatilmis serum yari-ömrü ile birlikte, Fc kisimlari (ve bunlardan olusturulmus oligomerler) içeren füzyon-proteinleri Protein A veya Protein G kolonlari üzerinde afinite kromatografisi ile kolay saflastirma avantaji sunar. Tercih edilen Fc bölgeleri lgG1, IgG2, IgG3, ve IgG4'ü içeren insan IgG'den türetilir. Burada, FC içindeki spesifik rezidüler pozisyon ile tanimlanir. Tüm Fc pozisyonlari EU numaralandirma semasina göredir. Bir antikorun Fc kisminin fonksiyonlarinin biri, antikor bunun hedefini bagladiginda immün sistem ile iletisim kurmaktir. Bu "efektör fonksiyon" olarak düsünülür. Iletisim antikora-bagimli hücresel sitotoksisiteye (ADCC'ye), antikora-bagimli hücresel fagositoza (ADCP'ye) ve/veya komplemana bagimli sitotoksisiteye (CDC'ye) yol açar. ADCC'ye ve ADCP'ye Fc'nin immün sistemin hücrelerinin yüzeyi üzerindeki Fc reseptörlerini baglamasi yoluyla aracilik edilir. CDC'ye Fc'nin kompleman sisteminin proteinlerini, örn., C1q'yu, baglamasi yoluyla aracilik edilir. gösterir. Örnegin, ADCC'ye ve CDC'ye aracilik etmede, lgG1 lgG2'ye ve IgG4'e çok üstündür. Bu nedenle, efektör fonksiyon istenmediginden, bir IgG2 Fc tercih edilir. Ancak lgG2 Fc-içeren moleküllerin, üretiminin daha zor oldugu bilinir ve lgG1 Fc-içeren moleküller ile karsilastirildiginda, daha kisa bir yarilanma ömrü gibi, daha az istenen biyofiziksel özelliklere sahiptir. Bir antikorun efektör fonksiyonu, Fc'ye bir veya birden fazla mutasyon uygulama ile arttirilabilir veya azaltilabilir. Bulusun uygulamalari efektör fonksiyonu arttiracak sekilde mühendislik uygulanmis bir Fo'ye sahip olan IL-2 muteini Fc füzyon proteinleri içerir fonksiyona sahip olan örnek niteligindeki IgGi Fc molekülleri asagidaki sübstitüsyonlara sahip olanlari içerir: 8239D/I332E P247I/A339D P247I/A339Q D280H/K2908 F243L/R292 P/Y300L K326A/E333A K326W/E3338 fükosilasyonunu azaltma iledir. Çekirdek fükozun Fc'ye tutturulmus Iki-antenli kompleks-tipi oligosakkaritlerden uzaklastirilmasi antijen baglamayi veya CDC efektör fonksiyonunu degistirmeden ADCC efektör fonksiyonunu büyük ölçüde arttirmistir. Fc- içeren moleküllerin, Örn., antikorlarin, fükosilasyonunu azaltmak veya feshetmek için bir kaç yol bilinir. Bunlar, bir FUT8 nakavt hücre hatti, varyant CHO hatti Lec13, siçan hibridom hücre hatti YBZ/O, spesifik olarak FUT8 genine karsi bir küçük interferans RNA içeren bir hücre hatti ve ß-1,4-N-asetilglikozaminiltransferaz IIl'ü ve Golgi 0t- mannosidaz lI'yi birlikte-eksprese eden bir hücre hatti dâhil olmak üzere belirli memeli hücre hatlarin rekombinant ekspresyonu içerir. Alternatif olarak, Fc-içeren molekül bir memeli-olmayan hücrede, örnegin, bir bitki hücresinde, mayada veya prokaryotik hücrede, öm., E. Gol/`de, eksprese edilebilir. Bulusun tercih edilen uygulamalarinda, IL-2 muteini Fc füzyon proteinleri efektör fonksiyonu azaltacak sekilde mühendislik uygulanmis bir Fc içerir. Azaltilmis efektör fonksiyona sahip olan örnek niteligindeki Fc molekülleri asagidaki sübstitüsyonlara sahip olanlari içerir: N297A veya N297Q (igei) L234A/L235A (lgG1) V234A/G237A (igoz) L234F/L235E/P331S (IgGl) 8267E/L328F (IgGl) Insan IgGl'inin N297'de (EU numaralandirma sistemi) bir glikosilasyon yerine sahip oldugu ve glikosilasyonun IgG1 antikorlarinin efektör fonksiyonuna katki sagladigi bilinir. Bir emsal IgG1 dizisi SEQ ID NO: 3'te saglanir. Gruplar aglikosile edilmis antikorlar yapmaya yönelik bir çabada mutasyona ugratilmis N297'ye sahiptir. Mutasyonlar N297'yi fizikokimyasal dogasinda asparajine benzeyen amino asitler, örnegin, glutamin (N297Q) ile veya polar gruplari olmayan asparajinleri taklit eden alanin (N297A) ile sübstitüe etmeye odaklanmistir. Burada kullanildigi sekliyle, "aglikosile edilmis antikor" veya "aglikosile edilmis fc" Fc'nin 297. pozisyondaki rezidüsünün glikosilasyon durumunu ifade eder. Bir antikor veya baska molekül bir veya birden fazla baska Iokasyonda glikosilasyon içerebilir ancak hâlâ bir aglikosile edilmis antikor veya aglikosile edilmis Fc-füzyon proteini olarak düsünülebilir. Bir efektör fonksiyonsuz IgGl Fc'si yapmaya yönelik çabada, insan IgG1'inin amino asidi N297'nin glisine mutasyonunun, yani', N297G'nin, bu rezidüdeki baska amino asit sübstitüsyonlarina kiyasla çok üstün saflastirma etkililikleri ve biyofiziksel özellikler sagladigi kesfedilmistir. Bakiniz, Örnek 8. Dolayisiyla, tercih edilen uygulamalarda, IL-2 muteini Fc-füzyon proteini bir N297G sübstitüsyonuna sahip olan bir insan lgGl Fc'si içerir. N297G sübstitüsyonu içeren Fc, burada bir molekülün bir insan IgG1 Fc'si içerdigi herhangi bir baglamda kullanislidir ve bir IL-2 muteini Fc-füzyonu baglaminda kullanim ile sinirlandirilmaz. Bir antikor bir N29YG sübstitüsyonuna sahip olan bir Fc'yi içerebilir. N297G mutasyonuna sahip olan bir insan IgGl Fc'si içeren bir Fc ayrica ilave içeri yerlestirmeler, silinmeler ve sübstitüsyonlar da içerebilir. Insan lgG1 Fc'si N297G sübstitüsyonu içerebilir ve SEO ID NO: 3'te izah edilen amino asit dizisine en az %90 özdestir, en az %91 özdestir, en az %92 özdestir, en az %93 özdestir, en az %94 özdestir, en az %95 özdestir, en az %96 özdestir, en az %97 özdestir, en az %98 özdestir veya en az %99 özdestir. Bir özel olarak tercih edilen uygulamada, C-ucu Iizin rezidüsü sübstitüe edilir veya silinir. N297G sübstitüsyonu ve C-ucu Iizininin silinmesini içeren insan IgG1'inin amino asit dizisi SEQ ID NO: 4'te izah edilir. Bir aglikosile edilmis lgG1 Fc'si-içeren moleküllerin glikosile edilmis lgG1 Fc'si-içeren moleküllere kiyasla daha az kararli oldugu gösterilmistir. Fc bölgesine ilaveten aglikosile edilmis molekülün kararliligini arttiracak sekilde mühendislik uygulanabilir. Bazi açiklamalarda, bir veya daha fazla amino asit böylece dimerik hâlde di-sülfit baglari olusturacak sekilde sisteine sübstitüe edilir. SEQ ID NO: 3'te izah edilen amino sübstitüe edilebilir. Tercih edilen açiklamalarda, rezidülerin spesifik çiftleri bunlarin bir digeri ile tercihli bir sekilde bir di-sülfit bagi olusturacagi böylece di-sülfit bagi karilmasini sinirlandiracagi veya önleyecegi sekilde sübstitüe edilir. Tercih edilen çiftler, bunlarla sinirli olmamak üzere, A287C ve LSOSC'dir, V259C ve L306C'dir, fazlasinin sistein ile sübstitüe edildigi Fc-içeren moleküller burada saglanir. Tercih veya V32SC ve I332C sübstitüsyonlari Içerenleri içerir. lgG1 Fc'ye yapilabilen ilave mutasyonlar, Fc-içeren polipeptitler arasinda heterodimer olusumunu kolaylastiranlari içerir. Bazi açiklamalarda, Fc bölgesine, bir hücre içinde birlikte-eksprese edildiginde iki farkli Fc-içeren polipeptit zincirinin heterodimer olusumunu kolaylastiran "topuzlar" ve "delikler" olusturacak sekilde mühendislik uygulanir. U.S. 7,695,963. Diger açiklamalarda, Fc bölgesi, bir hücre içinde birlikte- eksprese edildiginde iki farkli Fc-içeren polipeptidin homodimer olusumundan vazgeçirirken heterodimer olusumunu tesvik edecek sekilde elektrostatik yönlendirmeyi kullanacak sekilde degistirir. WO 09/089,004. Tercih edilen heterodimerik Fc, burada Fc'nin bir zincirinin D399K ve E356K sübstitüsyonlarini içerenlerini ve Fc'nin diger zincirinin K409D ve K392D sübstitüsyonlarini içerenlerini içerir. Diger açiklamalarda, Fc'nin bir zinciri D399K, E356K ve E357K sübstitüsyonlarini içerir ve Fc'nin diger zinciri K409D, K392D ve K37OD sübstitüsyonlarini içerir. Belirli uygulamalarda, IL-2 muteini Fc-füzyon proteininin monomerik olmasi, yani, yalnizca bir tek IL-2 muteini molekülü içermesi, avantajli olabilir. Füzyon proteininin Fc- bölgesi heterodimer olusumunu kolaylastiran bir veya birden fazla mutasyon içerebilir. Füzyon proteini IL-2 muteini Fc-füzyon polipeptidindekiler için karsilikli mutasyonlara sahip olan ancak bir IL-2 muteininden yoksun olan bir Fc-bölgesi ile birlikte-eksprese edilir. Iki Fc-içeren polipeptidin heterodimeri olustugunda, elde edilen protein yalnizca bir tek IL-2 muteini içerir. Bir monomerik IL-2 muteini Fc-füzyon proteini olusturmanin bir baska yöntemi, lL-2 muteinini bir monomerik Fc'ye, yani, dimerize olmayan bir FC bölgesine, kaynastirmadir. Kararli monomerik Fc'ler, dimerizasyondan vazgeçiren ve molekülü monomerik formda stabilize eden mutasyonlar içerir. Tercih edilen monomerik Fc'ler 392. ve 409. pozisyonlarda negatif yüklü amino asitler içeren bir Fc içerir. Belirli uygulamalarda, IL-2 muteini Fc-füzyon proteini Fc ve IL-2 muteini arasinda bir baglayici içerir. Çok sayida farkli baglayici polipeptit teknikte bilinir ve bir IL-2 muteini Fc-füzyon proteini baglaminda kullanilabilir. Tercih edilen uygulamalarda, IL-2 muteini Fc-füzyon proteini Fc ve IL-2 muteini arasinda GGGGS'den (SEQ lD NO: 5), GGNGT'den (SEQ ID NO: 6) veya YGNGT'den (SEQ ID NO: 7) olusan bir peptidin bir veya birden fazla kopyasini içerir. Bazi uygulamalarda, FC bölgesi ve IL-2 muteini bölgesi arasindaki polipeptit bölgesi GGGGS'nin (SEQ ID NO: 5), GGNGT'nin (SEQ lD NO: 6) veya YGNGT'nin (SEQ lD NO: 7) bir tek kopyasini içerir. Burada gösterildigi üzere, GGNGT (SEO ID NO: 6) veya YGNGT (SEQ ID NO: 7) baglayici uygun hücrelerde eksprese edildiginde glikosile edilir ve bu tarz glikosilasyon proteini çözelti içinde ve/veya in vivo uygulandiginda stabilize etmeye yardimci olabilir. Dolayisiyla, belirli uygulamalarda, bir IL-2 muteini füzyon proteini Fc bölgesi ve IL-2 muteini bölgesi arasinda bir glikosile edilmis baglayici içerir. Glikosile edilmis baglayicinin bir polipeptit baglamina yerlestirildiginde kullanisli olabildigi düsünülür. Polipeptidin amino asit dizisine yerlestirilmis GGNGT (SEO ID NO: 6) veya YGNGT (SEQ ID NO: 7) içeren ve polipeptidin amino asit dizisi içindeki bir veya birden fazla amino asidi degistiren polipeptitler burada saglanir. Tercih edilen açiklamalarda GGNGT (SEO ID NO: 6) veya YGNGT (SEQ ID NO: 7) polipeptitlerin tersiyer yapisinin bir kivrimina yerlestirilir. Baska açiklamalarda, bir kivrimin bir veya birden fazla amino asidi GGNGT (SEQ ID NO: 6) veya YGNGT (SEQ ID NO: 7) ile degistirilir. Fc'nin C-ucu kismi ve/veya lL-2 muteininin amino ucu kismi, memeli hücrelerinde eksprese edildiginde lL-2 muteini Fc-füzyon proteininin glikosilasyon profilini degistiren bir veya birden fazla mutasyon içerebilir. Belirli uygulamalarda, lL-2 muteini ilaveten bir T3 sübstitüsyonu, örn., T3N veya T3A, içerir. lL-2 muteini ilaveten bir 85 sübstitüsyonu, örnegin, SST, içerebilir. bulusun kapsamina dâhil edilir ve genel olarak, ancak her zaman degil. post- translasyonel olarak yapilir. Örnegin, IL-2 muteininin veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteininin kovalent modifikasyonlarinin bir kaç tipi, lL-2 muteininin veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteininin spesifik amino asit rezidülerini seçilmis yan zincirler veya N- veya C-ucu rezidüleri ile reaksiyona girebilen bir organik türevlendirme ajani ile reaksiyona sokma ile moleküle uygulanir. Sisteinil rezidüleri en yaygin olarak, karboksimetil veya karboksiamidometil türevlerini verecek sekilde a-haloasetatlar (ve karsilik gelen aminler), örnegin, kloroasetik asit veya kloroasetamid, ile reaksiyona sokulur. Sisteinil rezidüleri ayrica, bromotrifloroaseton, oi-bromo-ß-(5-imidozoil)pr0piyonik asit, kloroasetil fosfat, N- alkilmaleimidler, 3-nitr0-2-piridil disülfit, metil 2-piridil disülfit, p-kloromerküribenzoat, 2- kloromerküri-4-nitrofenol veya klor0-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazol ile reaksiyon ile de türevlendirilir. Histidil rezidüleri, bu ajan histidil yan zincirine görece spesifik oldugundan, pH 5,5- 7,0'da dietilpirokarbonat ile reaksiyon ile türevlendirilir. Para-bromofenasil bromür de kullanislidir; reaksiyon tercihen pH 6,0'da, 0,1 M'lik sodyum kakodilat içinde gerçeklestirilir. Lizinil ve amino ucu rezidüleri süksinik veya baska karboksilik asit anhidritler ile reaksiyona sokulur. Bu ajanlar ile türevlendirme Iizinil rezidülerinin yükünü tersine çevirme etkisine sahiptir. Alfa-amino-içeren rezidüleri türevlendirme için baska uygun reaktifler imidoesterleri, örnegin, metil pikolinimidati; piridoksal fosfati; piridoksali; kloroborohidriti; trinitrobenzensülfonik asidi; O-metilizoüreyi; 2,4-pentandi0nu ve glioksilat ile transaminaz-katalizli reaksiyonu içerir. Arjinil rezidüleri bir veya bir kaç geleneksel reaktif, bunlar arasinda, fenilglioksal, 2,3- bütandion, 1,2-sikl0hekzandi0n ve ninhidrin, ile reaksiyon ile modifiye edilir. Arjinin rezidülerinin türevlendirmesi, guanidin fonksiyonel grubunun yüksek pKa'sindan dolayi reaksiyonun alkali kosullarda gerçeklestirilmesini gerektirir. Dahasi, bu reaktifler Iizinin gruplari ayni zamanda arjinin epsilon-amino grubu ile reaksiyona sokulabilir. Tirozil rezidülerinin spesifik modifikasyonu, aromatik diazonyum bilesikleri veya tetranitrometan ile reaksiyon ile spektral etiketleri tirozil rezidülerine uygulama ile özel ilgi ile, yapilabilir. En yaygin olarak, N-asetilimidizol ve tetranitrometan, sirasiyla, O- asetil tirozil türleri ve 3-nitro türevleri olusturmak için kullanilir. Tirozil rezidüleri radyoimmünoanalizde kullanim için etiketlenmis proteinleri hazirlamak amaciyla 125I veya 131l kullanilarak iyotlanir, yukarida tarif edilen kloramin T yöntemi uygundur. Karboksil yan gruplari (aspartil veya glutamil) karbodiimidler (R'-N=C=N--R') ile reaksiyon ile selektif bir sekilde modifiye edilir, burada R ve R' opsiyonel olarak farkli alkil gruplaridir, örnegin, 1-siklohekziI-S-(Z-morfolinil-4-etil) karbodiimiddir veya 1-etiI-3- (4-azonya-4,4-dimetilpentil) karbodiimiddir. ilaveten, aspartil ve glutamil rezidüleri amonyum iyonlari ile reaksiyon ile asparajinil ve glutaminil rezidülerine dönüstürülür. Bifonksiyonel ajanlar ile türevlendirme çesitli yöntemlerde kullanim için antijen baglama proteinlerini bir suda-çözünmeyen destek matriksine veya yüzeye çapraz-baglama için kullanislidir. Yaygin bir sekilde kullanilan çapraz-baglama ajanlari, örn., 1,1- bis(diazoasetiI)-2-feniletani, glutaraldehiti, N-hidroksisüksinimid esterleri, örnegin, 4- azidosalisilik asitli esterleri, disüksinimidil esterler, örnegin, 3,3'- ditiyobis(süksinimidilpropiyonat), dâhil olmak üzere, homobifoksiyonel imidoesterleri ve bifonksiyonel maleimidleri, örnegin, bis-N-maleimid0-1,8-oktani, içerir. Türevlendirme ajanlari, örnegin, metiI-3-[(p-azidofenil)ditiyo]pr0piy0imidat, isik varliginda çapraz- baglar olusturabilen foto-aktive edilebilen ara-ürünler üretir. Altematif olarak, reaktif suda-çözünmeyen matrikslerden, örnegin, siyanojen bromür ile aktive edilmis 4,330,440 Numarali US Patentlerinde tarif edilen reaktif substratlardan protein immobilizasyonu için yararlanilir. Glutaminil ve asparajinil rezidüleri siklikla, sirasiyla, karsilik gelen glutamil ve aspartil rezidülerine deamide edilir. Alternatif olarak, bu rezidüler hafif-derecede asidik kosullar altinda deamide edilir. Bu rezidüleri her bir formu bu bulusun kapsami içinde kalir. Diger modifikasyonlar, prolinin ve Iizinin hidroksilasyonunu, seril veya treonil rezidülerinin hidroksil gruplarinin fosforilasyonunu, lizin, arjinin ve histidin yan zincirlerinin a-amino gruplarinin metilasyonunu (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), N- ucu aminin asetilasyonunu ve herhangi bir C-ucu karboksil grubunun amidasyonunu Bu bulusun kapsamina dâhil edilen lL-2 muteininin veya lL-2 muteini Fc-füzyon proteininin kovalent modifikasyonunun bir baska tipi, proteinin glikosilasyon paternini degistirmeyi içerir. Teknikte bilindigi üzere, glikosilasyon paternleri hem proteinin dizisine (öm, asagida tartisilan, özel glikosilasyon amino asit rezidülerinin varligina veya yokluguna) veya içinde proteinin üretildigi konak hücreye veya organizmaya bagli olabilir. Özel ekspresyon sistemleri asagida tartisilir. Polipeptitlerin glikosilasyonu tipik olarak, N-baglidir veya O-baglidir. N-bagli, karbonhidrat kisminin bir asparajin rezidüsünün yan zincirine tutturulmasini ifade eder. Üç-peptitli diziler asparajin-X-serin ve asparajin-X-treonin, burada X, prolin disindaki herhangi bir amino asittir, karbonhidrat kisminin asparajin yan zincirine enzimatik tutturulmasi için tanima dizileridir. Dolayisiyla, bir polipeptit içinde bu üç-peptitli dizilerin birinin varligi bir potansiyel glikosilasyon yeri olusturur. O-bagli glikosilasyon, 5- hidroksiprolinin veya 5-hidr0ksilizinin de kullanilabilmesine ragmen, N- asetilgalaktozamin, galaktoz veya ksiloz sekerlerinin birinin bir hidroksiamino aside, en yaygin olarak serine veya treonine, tutturulmasini ifade eder. Glikosilasyon yerlerinin lL-2 muteinine veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteinine eklenmesi amino asit dizisini (N-bagli glikosilasyon yerleri için) yukarida tarif edilen üç- peptitli dizilerin birini veya birden fazlasini içerecek sekilde degistirme ile kolaylikla yapilabilir. Degisim ayrica, (O-bagli glikosilasyon yerleri için) baslangiç dizisine bir veya birden fazla serin veya treonin rezidüsünün eklenmesi veya bunlar ile sübstitüsyon, ile de yapilabilir. Kolay olmasi için, IL-2 muteini veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteini amino asit dizisi tercihen DNA düzeyindeki degisimler yoluyla, özel olarak hedef polipeptidi sifreleyen DNA'yi önceden-seçilen bazlarda arzu edilen amino asitlere çevirecek olan kodonlarin üretilecegi sekilde mutasyona ugratma ile degistirilir. sayisinin arttirmanin bir baska araci glikositlerin proteine kimyasal veya enzimatik kuplaji iledir. Bu prosedürler, bunlarin N- ve O-bagli glikosilasyon için glikosilasyon kapasitelerine sahip olan bir konak hücrede proteinin üretimini gerektirmemesi açisindan avantajlidir. Kullanilan kuplaj moduna bagli olarak, seker (sekerler) (a) arjinine ve histidine, (b) serbest karboksil gruplarina, (G) serbest sülfidril gruplarina, örnegin, sisteininkilere, (d) serbest hidroksil gruplarina, örnegin, serininkilere, treonininkilere, hidroksiprolininkilere, (e) aromatil rezidülere, örnegin, fenilalanininkilere, tirozininkilere veya triptofaninkilere veya (f) glutaminin amid grubuna tutturulabilir. Bu Baslangiç IL-2 muteini veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteini üzerinde bulunan karbonhidrat kisimlarinin uzaklastirilmasi kimyasal olarak veya enzimatik olarak yapilabilir. Kimyasal deglikosilasyon proteinin triflorometansülfonik asit bilesigine veya bir es-deger bilesige maruziyetini gerektirir. Bu muamele baglama sekeri (N- asetilglukozamin veya N-asetilgalaktozamin) disinda çogu sekerin veya tüm sekerlerin klevaji ile sonuçlanirken, polipeptidi aynen birakir. Kimyasal deglikosilasyon Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 tarafindan ve Edge et al., tarafindan tarif edildigi üzere çesitli endo- ve ekzo-glikosidazlarin kullanimi ile yapilabilir. Potansiyel glikosilasyon yerlerindeki glikosilasyon Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 25713105, tarafindan tarif edildigi üzere tunikamisin bilesiginin kullanimi ile önlenebilir. Tunikamisin protein-N-glikosit baglantilarinin olusumunu bloke eder. baska tipi, lL-2 muteinini veya lL-2 muteini Fc-füzyon proteinini, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, çesitli polioller, örnegin, polietilen glikol, polipropilen glikol veya polioksialkilenler, dâhil olmak üzere, çesitli proteinöz-olmayan polimerlere 4,640,835; Patentlerinde izah edilen sekilde baglamayi içerir. Buna ek olarak, amino asit sübstitüsyonlari polimerlerin, örnegin, PEG'in, eklenmesini kolaylastirmak için lL-2 muteini veya lL-2 muteini Fc-füzyon proteini içinde çesitli pozisyonlarda yapilabilir. Böylece bulusun uygulamalari, PEGiIe edilmis lL-2 muteinleri ve IL-2 muteini Fc-füzyon proteinlerini içerebilir. Bu tarz PEGiIe edilmis proteinler PEGiIe-edilmemis proteinlere kiyasla arttirilmis yari-ömre ve/veya azaltilmis immünojenisiteye sahip olabilir. lL-2 Muteinleri ve lL-2 Muteini Fc-füzvon Proteinlerini Sifreleven Polinükleotidler dahil edilir. Bulusun yönleri burada tarif edilen amino asit dizilerini sifreleyen (örn., denejere olmadan dolayi) polinükleotid varyantlarini içerebilir. Izole edilmis nükleik asit tarafindan sifrelenen polipeptit bir IL-2 muteini Fc-füzyon proteininin bir bileseni olabilir. Nükleik asitlerin izolasyonu için problar veya primerler olarak veya veri tabani aramalari için sorgu dizileri olarak kullanilacak olan, burada tarif edilen amino asit dizilerine karsilik gelen nükleotid dizileri, amino asit dizilerinden "geri-translasyon" ile elde edilebilir. Iyi-bilinen polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) prosedürü lL-2 muteinlerini ve lL-2 muteini Fc-füzyon proteinini sifreleyen bir DNA dizisini izole etmek ve çogaltmak için kullanilabilir. DNA fragmanlarinin kombinasyonunun arzu edilen uçlarini tanimlayan oligonükleotidler 5' ve 3' primerler olarak kullanilir. Oligonükleotidler ilaveten, DNA fragmanlarinin çogaltilmis kombinasyonunun bir ekspresyon vektörüne yerlestirilmesini kolaylastirmak amaciyla restriksiyon endonükleazlar için tanima yerleri PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, lnnis et al., eds., Academic Press, Inc. (1990), kaynaklarinda tarif edilir. Bulusun nükleik asit molekülleri hem tek-sarmalli hem de çift-sarmalli formda DNA'yi ve RNA'yi ayni zamana karsilik gelen komplementer dizileri içerir. Bir "izole edilmis nükleik asit", dogal-olusumlu kaynaklardan izole edilmis nükleik asitler durumunda, nükleik asidin bundan izole edildigi organizmanin genomunda bulunan bitisik genetik dizilerden ayrilmis olan bir nükleik asittir. Bir sablondan enzimatik olarak veya kimyasal olarak sentezlenmis nükleik asitler, örnegin, PCR ürünleri, CDNA molekülleri veya oligonükleotidler, durumunda, mesela, bu tarz proseslerden elde edilen nükleik asitlerin izole edilmis nükleik asitler oldugu anlasilir. Bir izole edilmis nükleik asit molekülü bir ayri fragman formunda veya bir daha büyük nükleik asit yapisinin bir bileseni olarak bir nükleik asit molekülünü ifade eder. Tercih edilen bir açiklamada, nükleik asitler kontamine eden endojen malzemeden büyük ölçüde yoksun olur. Nükleik asit molekülü tercihen büyük ölçüde saflastirilmis formda ve standart biyokimyasal yöntemler (örnegin, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), kaynaginda genel hatlariyla özetlenenler) ile bunun bilesen nükleotid dizilerinin tanimlanmasina, manipülasyonuna ve geri-kazanilmasina firsat veren bir miktarda veya konsantrasyonda en azindan bir kez izole edilmis DNA'dan veya RNA'dan türetilmistir. Bu tarz diziler tercihen iç aktarilmamis diziler veya ökaryotik genlerde tipik olarak bulunan intronlar tarafindan kesintiye ugratilmamis bir açik okuma çerçevesi formunda saglanir ve/veya yapilir. Aktarilmamis DNA'nin dizileri bir açik okuma çerçevesinden 5' veya 3' bulunabilir, burada bu kodlama bölgesinin manipülasyonuna veya ekspresyonuna müdahale Bulusa göre varyantlar, varyanti sifreleyen DNA'yi üretmek için, lL-2 muteini veya lL-2 muteini Fc-füzyon proteinini sifreleyen DNA'daki nükleotidlerin, kaset veya PCR mutajenezi veya teknikte iyi bilinen baska teknikler kullanilarak, yer spesifik mutajenezi ve bundan sonra burada genel hatlariyla özetlendigi üzere rekombinant DNA'yi hücre kültürü içinde eksprese etme ile normal olarak hazirlanir. Bununla birlikte, IL-2 muteini veya lL-2 muteini Fc-füzyonu yerlesik teknikler kullanilarak in vitro sentez ile hazirlanabilir. Asagida daha tam olarak genel hatlariyla özetlenecegi üzere modifiye edilmis karakteristiklere sahip olan varyantlarin da seçilebilmesine ragmen, varyantlar tipik olarak dogal olusumlu analogu ile ayni kalitatif biyolojik aktivite, öm., Treg genislemesi, gösterir. Teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan anlasilacagi üzere, genetik kodun dejenere olmasindan dolayi, tümü mevcut bulusun lL-2 muteinleri veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteinlerini sifreleyen bir hayli fazla sayida nükleik asit yapilabilir. Dolayisiyla, bir özel amino asit dizisi tanimlandiginda, teknikte uzmanligi olan kisiler, bir veya birden fazla kodonun dizisini sifrelenen proteinin amino asit dizisini degistirmeyecek bir sekilde basitçe modifiye etme ile, çok sayida farkli nükleik asit yapabilir. Mevcut bulus ayrica, yukarida oldugu üzere en az bir polinükleotid içeren plazmidler, ekspresyon vektörleri, transkripsiyon veya ekspresyon kasetleri formunda ekspresyon sistemleri ve yapilari da saglar. Buna ek olarak, bulus bu tarz ekspresyon sistemlerini veya yapilarini içeren konak hücreler saglar. Tipik olarak, konak hücrelerin herhangi birine kullanilan ekspresyon vektörleri plazmid idamesi için ve ekzojen nükleotid dizilerinin klonlanmasi ve ekspresyonu için diziler içerecektir. Belirli açiklamalarda, topluca "iki yanda yer alan diziler" olarak ifade edilen bu tarz diziler tipik olarak asagidaki nükleotid dizilerinin birini veya birden fazlasini içerecektir: bir promotör, bir veya birden fazla hizlandirici dizisi, bir replikasyon orijini, bir transkripsiyonel sonlandirma dizisi, bir donör ve akseptör uç-birlestirme yeri içeren bir tam intron dizisi, polipeptit salgilamasi için bir ön-bilgi dizisini sifreleyen bir dizi, bir ribozom baglama yeri, bir poliadenilasyon dizisi, eksprese edilecek olan polipeptidi sifreleyen nükleik asidi içeri yerlestirmek için bir poIi-baglayici bölge ve bir seçilebilen belirteç elemani, Bu dizilerin her biri asagida tartisilir. Opsiyonel olarak, vektör bir "etiket"-sifreleyen dizi, yani', IL-2 muteinleri veya lL-2 muteini Fc-füzyon proteini kodlama dizisinin 5' veya 3' ucunda yer alan bir oligonükleotid molekülü; oligonükleotid dizisi poliHis'i (örnegin, hekzaHis'i (SEQ ID NO: 21'i)) sifreler veya bir baska "etiket", örnegin, FLAG, HA (hemaglutinin influenza virüsü) veya myc, bunlar için piyasada satilan antikorlar vardir, içerebilir. Bu etiket tipik olarak, polipeptidin ekspresyonu üzerine polipeptide kaynastirilir ve IL-2 muteininin konak hücrede afinite ile saflastirilmasi veya saptanmasi için bir araç görevi görebilir. Afinite ile saflastirma, örnegin, bir afinite matriksi olarak etikete karsi antikorlar kullanilarak kolon kromatografisi ile, yapilabilir. Opsiyonel olarak, etiket bunu takiben saflastirilmis klevaj için belirli peptidazlar kullanilarak, uzaklastirilabilir. Iki yanda yer alan diziler homolog (yani konak hücre ile ayni türden ve/veya sustan), heterolog (yani, konak hücre türünden veya susundan baska bir türden), hibrit (yani, birden fazla kaynaktan elde edilen iki yanda yer alan dizilerin bir kombinasyonu), sentetik veya natif olabilir. Dolayisiyla, bir iki yanda yer alan dizinin kaynagi, iki yanda yer alan dizinin konak hücre mekanizmasi içinde fonksiyonel olmasi ve konak hücre mekanizmasi tarafindan aktive edilebilmesi kaydiyla, herhangi bir prokaryotik veya ökaryotik organizma, herhangi bir omurgali veya omurgasiz organizma veya herhangi bir bitki olabilir. Bu bulusun vektörlerinde kullanisli olan iki yanda yer alan diziler teknikte iyi bilinen bir kaç yöntemin herhangi biri ile elde edilebilir. Tipik olarak, burada kullanisli olan iki yanda yer alan diziler haritalama ile ve/veya restriksiyon endonükleaz sindirimi ile önceden tanimlanmis olacaktir ve dolayisiyla uygun restriksiyon endonükleazlar kullanilarak uygun doku kaynagindan izole edilebilir. Bazi durumlarda, bir iki yanda yer alan dizinin tam nükleotid dizisi bilinebilir. Burada, iki yanda yer alan dizi nükleik asit sentezi veya klonlama için burada tarif edilen yöntemler kullanilarak sentezlenebilir. Iki yanda yer alan dizinin tümü veya yalnizca bir kismi bilindiginde, bu polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanilarak ve/veya bir genomik kütüphaneyi bir uygun prob, örnegin, ayni veya bir baska türden bir oligonükleotid ve/veya iki yanda yer alan dizi fragmani, ile tarama ile elde edilebilir. Iki yanda yer alan dizi bilinmediginde, bir iki yanda yer alan dizi içeren DNA'nin bir fragmani, örnegin, bir kodlama dizisi veya hatta bir baska gen veya genler, içerebilen bir daha büyük DNA parçasindan izole edilebilir. Izolasyon uygun DNA fragmanini üretmek için restriksiyon endonükleaz sindirimi akabinde agaroz jel saflastirma, Qiagen® kolon kromatografisi (Chatsworth, CA) veya uzmanligi olan kisi tarafindan bilinen baska yöntemler kullanilarak izolasyon ile yapilabilir. Bu amaci gerçeklestirmek için uygun enzimlerin seleksiyonu teknikte normal uzmanligi olan bir kisi için kolaylikla asikâr olacaktir. Bir replikasyon orijini tipik olarak piyasadan satin alinan prokaryotik ekspresyon vektörlerinin bir parçasidir ve orijin bir konak hücrede vektörün amplifikasyonuna yardimci olur. Vektör seçimi bir replikasyon orijini yeri içermediginde. biri bir bilinen diziye göre kimyasal olarak sentezlenebilir ve vektöre baglanabilir. Örnegin, pBR322 plazmidinden (New England Biolabs, Beverly, MA) replikasyon orijini çogu gram-negatif bakteri için uygundur ve çesitli viral orijinler (örn., SV40, polyom, adenovirüs, veziküler stomatit virüsü (VSV) veya papillom virüsleri, örnegin, HPV veya BPV) memeli hücrelerinde vektörleri klonlamak için kullanislidir. Genel olarak, replikasyon orijini bileseni memeli ekspresyon vektörleri için gerekli degildir (örnegin, bu ayni zamanda virüs erken promotörü de içerdiginden, SV4O orijini siklikla tek basina kullanilir). Bir transkripsiyon sonlandirma dizisi tipik olarak, bir polipeptit kodlama bölgesinin ucuna 3' konumlandirilir ve transkripsiyonu sonlandirma görevi görür. Genel olarak, prokaryotik hücrelerde bir transkripsiyon sonlandirma dizisi bir G-C açisindan zengin fragman akabinde bir poIi-T dizisidir. Dizi bir kütüphaneden kolaylikla klonlanirken veya hatta bir vektörün parçasi olarak piyasadan satin alinirken, bu ayrica nükleik asit sentezi için yöntemler, örnegin, burada tarif edilenler, kullanilarak da kolaylikla sentezlenebilir. Bir seçilebilen belirteç geni bir selektif kültür vasati içinde büyüyen bir konak hücrenin sag kalimi ve büyümesi için gerekli olan bir proteini sifreler. Tipik seleksiyon belirteci genleri (a) antibiyotiklere veya baska toksinlere direnç saglayan, örn., prokaryotik konak hücreler için ampisilin, tetrasiklin veya kanamisin; (b) hücrenin oksotrofik kusurlarini tamamlayan veya (0) kompleksten veya tanimlanmis vasatlardan erisilemeyen kritik besin maddelerini saglayan proteinleri sifreler. Spesifik seçilebilen belirteçler kanamisin direnç genidir, ampisilin direnç genidir ve tetrasiklin direnç genidir. Avantajli bir sekilde, bir neomisin direnç geni ayrica hem prokaryotik hem de ökaryotik konak hücrelerde seleksiyon için de kullanilabilir. Baska seçilebilen genler eksprese edilecek olan geni çogaltmak için kullanilabilir. Amplifikasyon, burada büyüme veya hücre sag kalimi için kritik olan bir proteinin üretimi için gerekli olan genlerin rekombinant hücrelerin ardisik nesillerinin kromozomlarinda tandem bir sekilde tekrar ettirildigi prosestir. Memeli hücreleri için uygun seçilebilen belirteçlerin örnekleri dihidrofolat redüktaz (DHFR) ve promotörsüz timidin kinaz genlerini içerir. Memeli hücresi transformantlari, burada yalnizca transformantlarin vektör içinde bulunan seçilebilen gen sayesinde sag kalmasi için essiz bir sekilde adapte edildigi seleksiyon baskisi altina yerlestirilir. Seleksiyon baskisi transforme edilmis hücreleri burada seleksiyon ajaninin vasat içindeki konsantrasyonunun arka arkaya arttirildigi böylece hem seçilebilen genin hem de bir baska geni, örnegin, bir IL-2 muteinini veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteinini, sifreleyen DNA'nin amlifikasyonuna yol açildigi kosullar altinda kültürleme ile empoze edilir. Sonuç olarak, bir polipeptidin, örnegin, bir lL-2 muteininin veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteininin, arttirilmis miktarlari çogaltilmis DNA'dan sentezlenir. Bir ribozom-baglama yeri genel olarak mRNA'nin translasyonunu baslatma için gereklidir ve bir Shine-Dalgarno dizisi (prokaryotlar) veya bir Kozak dizisi (Ökaryotlar) ile karakterize edilir. Eleman tipik olarak promotöre 3' ve eksprese edilecek olan polipeptidin kodlama dizisine 5' konumlandirilir. Belirli açiklamalarda, bir veya birden fazla kodlama bölgesi bir iç ribozom baglama yerine (IRES'e) operatif olarak baglanabilir bu bir tek RNA transkriptinden iki açik okuma çerçevesinin translasyonuna olanak saglar. Bazi, örnegin, glikosilasyonun bir ökaryotik konak hücre ekspresyon sisteminde arzu edildigi, durumlarda, bir kisi glikosilasyonu veya verimi iyilestirmek için çesitli pre- veya pro-dizileri manipüle edebilir. Örnegin, bir kisi bir özel sinyal peptidinin peptidaz klevaj yerini degistirebilir veya glikosilasyonu da etkileyebilen pro-diziler ekleyebilir. Nihai protein ürünü, (matür proteinin birinci amino asidine kiyasla) -1 pozisyonunda, tamamen uzaklastirilmamis olabilen, ekspresyona ait bir veya birden fazla ilave amino aside sahip olabilir. Örnegin, nihai protein ürünü, amino-ucuna tutturulmus peptidaz klevaj yerinde bulunan bir veya iki amino asit rezidüsüne sahip olabilir. Alternatif olarak, enzim matür polipeptit içinde bu tarz alandan kestiginde, bazi enzim klevaj yerlerinin kullanimi arzu edilen polipeptidin bir hafif derecede kirpilmis formu ile sonuçlanabilir. Bulusun ekspresyon ve klonlama vektörleri tipik olarak, konak organizma tarafindan taninan ve IL-2 muteinini veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteinini sifreleyen moleküle operatif olarak baglanmis bir promotör içerecektir. Promotörler yapisal genin transkripsiyonunu kontrol eden bir yapisal genin baslangiç kodonuna upstream (yani, ') (genel olarak yaklasik 100 ila 1000 bp içinde) konumlandirilmis aktarilmamis dizilerdir. Promotörler geleneksel olarak iki siniftan birinde gruplandirilir: indüklenebilen promotörler ve konstitütif promotörler. indüklenebilen promotörler kültür kosullarindaki bazi degisime, örnegin, bir besin maddesinin varliginda veya yokluguna veya sicakliktaki bir degisime yanitta bunlarin kontrolü altinda DNA'dan arttirilmis düzeylerde transkripsiyon baslatir. Diger taraftan, konstitütif promotörler bunlarin operatif olarak baglanmis oldugu geni tek düze bir sekilde, yani, gen ekspresyonu üzerinde çok az kontrol ile veya hiç kontrol olmadan, transkribe eder. Çesitli potansiyel konak hücreler tarafindan taninan, çok sayida promotör iyi bilinir. Maya konaklari ile kullanim için uygun promotörler de teknikte iyi bilinir. Maya hizlandiricilari maya promotörleri ile avantajli bir sekilde kullanilir. Memeli konak hücreleri ile kullanim için uygun promotörler iyi bilinir ve bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, virüslerin, örnegin, polyom virüsünün, kus çiçek virüsünün, adenovirüsün (örnegin, Adenovirüs 2'nin), bovin papillom virüsünün, kus sarkom virüsünün, sitomegalovirüsün, retrovirüslerin, hepatit-B virüsünün ve en tercihen Simian Virüsü 40'in (SV40'in), genomlarindan elde edilenleri, içerir. Baska uygun memeli promotörleri heterolog memeli promotörlerini, örnegin, isi-sok promotörlerini ve aktif promotörünü, Söz konusu olabilen ilave promotörler, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, asagidakileri virüsünün 3' uzun uç tekrarina dâhil edilen promotör (Yamamoto et al., 1980, Cell Ayrica, doku özgüllügü gösteren ve transgenik hayvanlarda yararlanilmakta olan asagida hayvan transkripsiyonel kontrol bölgeleri de söz konusudur: pankreatik asinar testiküler, meme, Ienfoid ve mast hücrelerinde aktif olan fare mamari tümör virüsü aktif olan alfa-feto-protein geni kontrol bölgesi (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. miyeloid hücrelerde aktif olan beta-globin geni kontrol bölgesi (Mogram et al., 1985, hücrelerinde aktif olan miyelin bazik protein geni kontrol bölgesi (Readhead et al., Bir baska hizlandirici dizi daha yüksek ökaryotlar tarafindan transkripsiyonu arttirmak için vektöre yerlestirilebilir. Hizlandiricilar, genel olarak yaklasik 10-300 bp uzunlugu olan, promotör üzerinde transkripsiyonu arttiracak sekilde etki eden, DNA'nin cls-etki eden elemanlaridir. Hizlandiricilar, transkripsiyon birimine hem 5' hem de 3' pozisyonlarda bulunmus olan, görece oryantasyondan ve pozisyondan bagimsizdir. Memeli genlerinden erisilebilen bir kaç hizlandirici dizi bilinir (öm., globin, elastaz, albümin, alfa-feto-protein ve insülin). Bununla birlikte, tipik olarak, bir virüsten elde edilen bir hizlandirici kullanilir. Teknikte bilinen SV4O hizlandirici, sitomegalovirüs erken promotör hizlandiricisi, polyom hizlandiricisi ve adenovirüs hizlandiricilari ökaryotik promotörlerin aktivasyonu için emsal hizlandirma elemanlaridir. Bir hizlandirici vektör içinde bir kodlama dizisine 5' veya 3' konumlandirilabilirken, bu tipik olarak promotörden 5' bir yere yerlestirilir. Bir uygun natif veya heterolog sinyal dizisini sifreleyen bir dizi (ön-bilgi dizisi veya sinyal peptidi) IL-2 muteininin veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteininin ekstraselüler salgilanmasini tesvik etmek için bir ekspresyon vektörüne katilabilir. Sinyal peptidinin veya ön-bilginin seçimi içinde proteinin üretilecegi konak hücrelerin tipine baglidir ve bir heterolog sinyal dizisi natif sinyal dizisinin yerini alabilir. Memeli konak hücrelerinde fonksiyonel olarak sinyal peptitlerinin örnekleri asagidakileri içerir: 4,965,195 Numarali US Patentinde tarif edilen interlökin-7 (IL-7) için reseptörü için sinyal dizisi; 0367 566 Numarali EP Patentinde tarif edilen interlökin-4 reseptörü sinyal peptidi; 4,968,607 Numarali US Patentinde tarif edilen tip I interlökin-1 reseptörü sinyal peptidi; 0 460 846 Numarali EP Patentinde tarif edilen tip II interlökin-1 reseptörü sinyal peptidi. Vektör, vektör konak hücre genomuna entegre edildiginde, ekspresyonu kolaylastiran bir veya birden fazla eleman içerebilir. Örnekler bir EASE elemanini (Aldrich et al., MAR'Iar, kromatinin yapisal organizasyonuna aracilik eder ve entegre edilmis vektörü olusturmak için kullanildiginda, özellikle kullanislidir. Çok sayida dogal ve sentetik Patentleri. Bulusun ekspresyon vektörleri bir baslangiç vektöründen, örnegin, piyasada satilan bir vektörden, yapilabilir. Bu tarz vektörler arzu edilen iki yanda yer alan dizilerin tümünü içerebilir veya içermeyebilir. Burada tarif edilen iki yanda yer alan dizilerin biri veya daha fazlasi vektör içinde hâlihazirda bulunmadiginda, bunlar münferit olarak elde edilebilir ve vektöre baglanabilir. Iki yanda yer alan dizilerin her birini elde etmek için kullanilan yöntemler teknikte uzmanligi olan bir kisi tarafindan iyi bilinir. Vektör yapildiktan ve bir IL-2 muteinini veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteinini sifreleyen bir nükleik asit molekülü vektörün uygun yerine yerlestirildikten sonra, tamamlanan vektör amplifikasyon ve/veya polipeptit ekspresyonu için bir uygun konak hücre içine yerlestirilebilir. Bir ekspresyon vektörünün bir seçilmis konak hücreye transformasyonu transfeksiyon, enfeksiyon, kalsiyum fosfat ko-presipitasyonu, elektroporasyon, mikro- enjeksiyon, lipofeksiyon, DEAE-dekstran aracili transfeksiyon veya baska bilinen teknikler dâhil olmak üzere iyi bilinen yöntemler ile yapilabilir. Seçilen yöntem, kismen, kullanilacak olan konak hücre tipinin bir fonksiyonu olacaktir. Bu yöntemler ve baska uygun yöntemler uzmanligi olan kisi tarafindan iyi bilinir ve, örnegin, Sambrook et al., 2001, supra, kaynaginda, izah edilir. Uygun kosullar altinda kültürlendiginde bir konak hücre, bunu takiben (konak hücre bunu vasata salgilandiginda) kültür vasatindan veya (salgilamadiginda) bunu üreten konak hücreden dogrudan toplanabilen bir IL-2 muteinini veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteinini sentezler. Bir uygun konak hücrenin seleksiyonu çesitli faktörlere, örnegin, arzu edilen ekspresyon düzeylerine, aktivite için arzu edilebilen veya gerekli olan polipeptit modifikasyonlarina (örnegin, glikosilasyona veya fosforilasyona) ve bir biyolojik olarak aktif moleküle katlanma kolayligina, bagli olacaktir. Bir konak hücre ökaryotik veya prokaryotik olabilir. Ekspresyon için konaklar olarak mevcut olan memeli hücre hatlari teknikte iyi bilinir ve, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu'ndan (ATCC'den) erisilebilen ölümsüz hâle getirilmis hücre hatlarini, içerir ve teknikte bilinen bir ekspresyon sisteminde kullanilan herhangi bir hücre hatti bulusun rekombinant polipeptitlerini yapmak için kullanilabilir. Genel olarak, konak hücreler bir arzu edilen IL- 2 muteini veya IL-2 muteini Fc-füzyonunu sifreleyen DNA içeren bir rekombinant ekspresyon vektörü ile transforme edilir. Prokaryotlar, mayalar veya daha yüksek ökaryotik hücreler kullanilabilen konak hücreler arasindadir. Prokaryotlar, gram negatif ve gram pozitif organizmalari, örnegin, E. coli'yi veya basilleri, içerir. Daha yüksek ökaryotik hücreler, böcek hücreleri ve memeli orijinli yerlesik hücre hatlarini içerir. Uygun memeli konak hücre hatlarinin örnekleri, maymun böbrek hücrelerinin COS-7 hücrelerini, C, Çin hamsteri over (CHO) hücrelerini veya bunlarin türevlerini, örnegin, serumsuz vasatta büyüyen Veggie CHO'yu ve ilgili hücre hatlarini (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31), HeLa hücrelerini, BHK (ATCC CRL 10) hücre hatlarini ve McMahan et al., 1991, EMBO J. : 2821, kaynaginda tarif edildigi üzere Afrika yesil maymunu böbrek hücre hatti CVI'dan (ATCC CCL 70) türetilmis CVI/EBNA hücre hattini, insan embriyonik böbrek hücrelerini, insan Col0205 hücrelerini, baska transforme edilmis primat hücre hatlarini, normal diploid hücreleri, primer dokunun, primer eksplantlarin in vitro kültüründen türetilmis hücre suslarini, HL-60, U937, HaK veya Jurkat hücrelerini, içerir. Çesitli sinyal iletim analizlerinde veya raportör analizlerde polipeptidi kullanmak arzu edilebilir oldugunda, opsiyonel olarak, memeli hücre hatlari, mesela, HepGZ/SB, KB, NlH 3T3 veya 849, örnegin, polipeptidin ekspresyonu için kullanilabilir. Alternatif olarak, polipeptitleri aha düsük ökaryotlarda, örnegin, mayalarda veya prokaryotlarda, örnegin, bakterilerde, üretmek mümkündür. Uygun mayalar Saccharomyces cerevisiae'yi, Schizosaccharomyces pombe'yi, Kluyveromyces suslarini, Candida'yi veya heterolog polipeptitleri eksprese edebilen herhangi bir maya susunu içerir. Uygun bakteriyel suslar Escherichia coli`yi, Baci'i'lus subtili's'i, Salmone/Ia typhimurium'u veya heterolog polipeptitleri eksprese edebilen herhangi bir bakteri susunu içerir. Polipeptit mayalarda veya bakterilerde yapildiginda, orada üretilen polipeptidi fonksiyonel polipeptidi elde etmek amaciyla, örnegin, uygun yerlerin fosforilasyonu veya glikosilasyonu ile, modifiye etmek arzu edilebilir. Bu tarz kovalent tutturulmalar bilinen kimyasal veya enzimatik yöntemler kullanilarak yapilabilir. Polipeptit ayrica, bulusun izole edilmis nükleik asidini bir veya birden fazla böcek ekspresyon vektörü içinde uygun kontrol dizilerine operatif olarak baglama ve bir böcek ekspresyon sistemini kullanma ile de üretilebilir. Bakulovirüs/böcek hücresi ekspresyon sistemleri için malzemeler ve yöntemler, örn., lnvitrogen, San Diego, Calif., U.S.A. (the MaxBac® kit), firmasi tarafindan kit formunda piyasada satilmaktadir ve bu tarz yöntemler, Summers ve Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 edildigi üzere, teknikte iyi bilinir. Buraa açiklanan nükleik asit yapilarindan türetilmis RNA'Iar kullanilarak polipeptitleri üretmek için hücresiz translasyon sistemleri de kullanilabilir. Bakteriyel, fungal, maya ve memeli hücresel konaklari ile kullanim için uygun klonlama ve ekspresyon vektörleri Pouwels et al., (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985), kaynaginda tarif edilir. Tercihen en az bir ekspresyon kontrol dizisine operatif olarak baglanmis, bulusun bir izole edilmis nükleik asidini içeren bir konak hücre bir "rekombinant konak hücre"dir. Belirli yönlerinde, bulus tercihli bir sekilde T regülatör hücrelerini stimüle eden ve bir V91K sübstitüsyonu ve SEO ID NO: 1'de izah edilen amino asit dizisine en az %90, en muteinini sifreleyen bir izole edilmis nükleik asidik asidi içerir. Izole edilmis nükleik asit burada saglanan emsal IL-2 muteinlerinin herhangi birini sifreleyebilir. Ayrica, burada tarif edilen emsal IL-2 muteini Fc-füzyon proteinlerinin herhangi birini sifreleyen izole edilmis nükleik asitler de dâhil edilir. Açiklamada bir antikorun Fc kismi ve insan IL-2 muteini, opsiyonel olarak Fc bölgesi ve IL-2 muteini arasinda sifrelenmis bir baglayici ile, bir tek açik-okuma çerçevesi içinde sifrelenir. Bir baska açiklamada, operatif olarak bir promotöre baglanmis yukaridaki IL-2 muteini veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteinini-sifreleyen nükleik asitleri içeren ekspresyon vektörleri burada saglanir. Bir baska yönünde, yukaridaki lL-2 muteinlerini veya lL-2 muteini Fc-füzyon proteinlerini sifreleyen izole edilmis nükleik asitleri içeren konak hücreler burada saglanir. Konak hücre bir prokaryotik hücre, örnegin, E. coli, olabilir veya bir ökaryotik hücre, örnegin, bir memeli hücresi, olabilir. Belirli uygulamalarda. konak hücre bir Çin hamsteri over (CHO) hücre hattidir. Bir diger yönde bir insan lL-2 muteini yapma yöntemleri burada saglanir. Yöntemler, bir konak hücreyi bir insan lL-2 muteinine operatif olarak baglanmis bir promotörün eksprese edildigi kosullar altinda kültürlemeyi içerir. Bunu takiben, insan IL-2 muteini söz konusu kültürden hasat edilir. IL-2 muteini kültür vasatlarindan ve/veya konak hücre lizatlarindan hasat edilebilir. Bir baska yönünde, bir insan IL-2 muteini Fc-füzyon proteini yapma yöntemleri burada saglanir. Yöntemler, bir konak hücreyi bir insan IL-2 muteini Fc-füzyon proteinine operatif olarak baglanmis bir promotörün eksprese edildigi kosullar altinda kültürlemeyi içerir. Bunu takiben, insan IL-2 muteini Fc-füzyon proteini söz konusu kültürden hasat edilir. insan IL-2 muteini Fc-füzyon proteini kültür vasatlarindan ve/veya konak hücre lizatlarindan hasat edilebilir. Farmasötik Bilesimler Bazi açiklamalarda, bulus bir farmasötik olarak etkili diluentler, tasiyici, çözündürücü, emülsifiye edici, koruyucu ve/veya adjuvan ile birlikte bir lL-2 muteininin bir terapötik olarak etkili miktarini içeren bir farmasötik bilesim saglar. Belirli uygulamalarda, lL-2 muteini bir lL-2 muteini Fc-füzyon proteini baglamindadir. Bulusun farmasötik bilesimleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, sivi, dondurulmus ve Iiyofilize edilmis bilesimleri, içerir. Tercihen, formülasyon malzemeleri kullanilan dozajlarda ve konsantrasyonlarda alicilar için toksik-degildir. Spesifik açiklamalarda, terapötik molekülü, örn., bir lL-2 muteini Fc- füzyonunu, içeren bir lL-2 muteininin bir terapötik olarak etkili miktarini içeren farmasötik bilesimler saglanir. Belirli açiklamalarda, farmasötik bilesim, örnegin, bilesimin pH'ini. ozmolaritesini, viskozitesini, berrakligini, rengini, izotonisitesini, kokusunu, sterilitesini, kararliligini, çözünme veya salim hizini, adsorpsiyonunu veya nüfuzunu, modifiye etmek, idame ettirmek veya korumak için formülasyon malzemeleri içerebilir. Bu tür açiklamalarda uygun formülasyon malzemeleri, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, amino asitleri (örnegin, glisini, glutamini, asparajini, arjinini, prolini veya Iizini): anti-mikrobiyalleri; antioksidanlari (örnegin, askorbik asidi, sodyum sülfiti veya sodyum hidrojen-sülfiti): tamponlari (örnegin, borati, bikarbonati, Tris-HCI'yi, sitratlari, fosfatlari veya baska organik asitleri); yiginlama ajanlarini (örnegin, mannitolü veya glisini); selatlama ajanlarini (örnegin, etilendiamin tetraasetik asidi (EDTA'yI)); kompleks hâline getirme ajanlarini (örnegin, kafeini, polivinilpirrolidonu, beta-siklodekstrini veya hidroksipropil- beta-siklodekstrini); dolgulari; monosakkaritleri; disakkaritleri ve baska karbohidratlari (örnegin, glikozu, mannozu veya dekstrinleri); proteinleri (örnegin, serum albüminini, jelatini veya immünoglobülinleri): renklendirme, aroma verme ve seyreltme ajanlarini; emülsifiye etme ajanlarini; hidrofilik polimerleri (örnegin, polivinilpirrolidonu); düsük moleküler agirlikli polipeptitleri; tuz-olusturan karsi-iyonlari (örnegin, sodyumu); koruyuculari (örnegin, benzalkonyum klorürü, benzoik asidi, salisilik asidi, timerosali, fenetil alkolü, metilparabeni, propilparabeni, klorheksidini, sorbik asidi veya hidrojen peroksidi); çözücüleri (örnegin, gliserini, propilen glikolü veya polietilen glikolü); seker alkollerini (örnegin, mannitolü veya sorbitolü); süspanse etme ajanlarini; sürfaktanlari veya islatma ajanlarini (örnegin, plüronikleri, PEG'i, sorbitan esterleri, polisorbatlari, örnegin, polisorbat 20'yi, polisorbati, tritonu, trometamini, Iesitini, kolesterolü, tiloksapali); kararlilik arttirma ajanlarini (örnegin, sükrozu veya sorbitolü); tonisite arttirma ajanlarini (örnegin, alkali metal halidlerini, tercihen sodyum veya potasyum klorürü, mannitolü, sorbitolü); aktarim vehiküllerini; diluentleri; eksipiyanlari ve/veya farmasötik adjuvanlari, içerir. Bakiniz, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Company. Açiklamanin belirli açiklamalarda, optimal farmasötik bilesim, örnegin, amaçlanan uygulama yoluna, aktarim formatina ve arzu edilen dozaja, bagli olarak teknikte uzmanligi olan bir kisi tarafindan belirlenecektir. Bakiniz, örnegin, supra, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES. Belirli uygulamalarda, bu tarz bilesimler bulusun antijen baglama proteinlerinin fiziksel hâlini, kararliligini, i'n vivo salim hizini ve in vivo klirens hizini etkileyebilir. Belirli açiklamalarda, farmasötik bilesim içindeki primer vehikül veya tasiyici dogada sulu olabilir veya sulu-olmayabilir. Örnegin, bir uygun vehikül veya tasiyici, büyük ihtimalle parenteral uygulama için bilesimlerde yaygin olan baska malzemeler ile takviye edilmis, enjeksiyonluk su, fizyolojik salin çözeltisi veya yapay beyin-omurilik sivisi olabilir. Nötral tamponlu salin veya serum albümini ile karistirilmis salin ilave emsal vehiküllerdir. Spesifik açiklamalarda, farmasötik bilesimler yaklasik pH 7,0-8,5'Iik Tris tamponu veya yaklasik pH 4,0-5,5'lik asetat tamponu içerir ve ilaveten sorbitol veya bunun için bir uygun sübstitüe içerebilir. Bulusun belirli açiklamalarinda, IL-2 muteini bilesimleri arzu edilen saflik derecesine sahip olan seçilmis bilesimi bir Iiyofilize edilmis kek veya bir sulu çözelti formunda opsiyonel formülasyon ajanlari (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra) ile karistirma ile saklama için hazirlanabilir. Ilaveten, belirli uygulamalarda, IL-2 muteini ürünü uygun eksipiyanlar, örnegin, sükroz, kullanilarak bir liyofilizat olarak formüle edilebilir. Bulusun farmasötik bilesimleri parenteral aktarim için seçilebilir. Alternatif olarak, bilesimler inhalasyon için veya sindirim yolu vasitasiyla, örnegin, oral olarak, aktarim için seçilebilir. Bu tarz farmasötik olarak kabul edilebilir bilesimlerin preparasyonu teknikteki uzmanligin içindedir. Formülasyon bilesenleri tercihen, uygulama yeri için kabul edilebilir olan konsantrasyonlarda bulunur. Belirli açiklamalarda, tamponlar bilesimi fizyolojik pH'ta veya bir hafif-derecede daha düsük pH'ta, tipik olarak yaklasik 5 ila yaklasik 8 olan bir pH araligi içinde, idame ettirmek için kullanilir. Parenteral uygulama düsünüldügünde, bu bulusun kullanim Için terapötik bilesimler bir farmasötik olarak kabul edilebilir vehikül içinde arzu edilen IL-2 muteini bilesimini içeren bir pirojensiz, parenteral olarak kabul edilebilir sulu çözelti formunda saglanabilir. Parenteral enjeksiyon için bir özel olarak uygun vehikül, içinde IL-2 muteini bilesiminin bir steril, izotonik çözelti olarak formüle edildigi, uygun sekilde korunmus, steril distile sudur. Belirli açiklamalarda, preparasyon, depo enjeksiyonu vasitasiyla aktarilabilen ürünün kontrollü veya sürdürülmüs salimini saglayabilen bir ajan, örnegin, enjektabl mikro-küreler, biyo-asinabilen parçaciklar, polimerik bilesikler (örnegin, polilaktik asit veya poliglikolik asit), bilyeler veya Iipozomlar, ile arzu edilen molekülün formülasyonunu içerebilir. Belirli açiklamalarda, dolasimda sürdürülmüs devam süresini tesvik etme etkisine sahip olan hiyalüronik asit de kullanilabilir. Belirli açiklamalarda, implante edilebilen ilaç aktarim cihazlari IL-2 muteini bilesimini uygulamak için kullanilabilir. Sürdürülmüs- veya kontrollü-salim formülasyonlari içinde lL-2 muteini bilesimlerini içeren formülasyonlar dâhil olmak üzere, ilave farmasötik bilesimler teknikte uzmanligi olan kisiler için asikâr olacaktir. Çesitli baska sürdürülmüs- veya kontrollü-aktarim araçlarini, örnegin, Iipozom tasiyicilari, biyo-asinabilen mikro-parçaciklari veya poröz bilyeleri ve depo enjeksiyonlari, formüle etmek için teknikler de teknikte uzmanligi olan kisiler tarafindan bilinir. Bakiniz, örnegin, farmasötik bilesimlerin aktarimi için poröz polimerik mikro-parçaciklarin kontrollü salimini tarif eden, PCT/U893/00829 Numarali Uluslararasi Patent Basvurusu. Sürdürülmüs-salimli preparasyonlar sekillendirilmis maddeler, örn., filmler veya mikro-kapsüller, formunda yari-geçirgen polimer matriksler içerebilir. Sürdürülmüs salimli matriksler, (3,773,919 Numarali US Patentinde ve EP 058481 Numarali Avrupa Patenti Basvuru Yayini'nda açiklandigi üzere) poliesterler, hidrojeller, polilaktidler, L-glutamik asidin ve gama etil-L-glutamatin ko-kopolimerlerini 105), etilen vinil asetat (Langer et al., 1981, supra) veya poli-D(-)-3-hidroksibütirik asit (EP 133,988 Numarali Avrupa Patenti Basvuru Yayini) içerebilir. Sürdürülmüs salimli bilesimler ayrica, teknikte bilinen bir kaç yöntemin herhangi biri ile hazirlanabilen Patenti Basvuru Yayinlari. In vivo uygulama için kullanilan farmasötik bilesimler tipik olarak steril preparasyonlar olarak saglanir. Sterilizasyon steril filtrasyon membranlari vasitasiyla filtrasyon ile yapilabilir. Bilesim liyofilize edildiginde, bu yöntemin kullanildigi sterilizasyon uygulama için bilesimler liyofilize edilmis formda veya bir çözelti içinde saklanabilir. Parenteral bilesimler genel olarak, bir steril erisim portuna sahip olan bir kap, örnegin, bir intravenöz çözelti torbasi veya bir hipodermik enjeksiyon ignesi ile delinebilen bir tapaya sahip olan viyal, içine yerlestirilir. Bu bulusun açiklamalari, WO Numarali Uluslararasi Patent Basvurusu'nda tarif edildigi üzere, farmasötik bilesimler olarak kullanilabilen kendi-tamponlayan IL-2 muteini formülasyonlarini içerir. Yukarida tartisildigi üzere, belirli açiklamalar, lL-2 muteini bilesimine ek olarak, bir veya birden fazla eksipiyan, örnegin, bu bölümde veya burada baska yerde açiklayici bir sekilde tarif edilenleri, içeren lL-2 muteini bilesimlerini, özel olarak farmasötik IL-2 muteini Fc-füzyon proteinlerini, saglar. Eksipiyanlar, çok çesitli amaçlar, örnegin, formülasyonlarin fiziksel, kimyasal veya biyolojik özelliklerini ayarlama, örnegin, viskozitenin ayarlanmasi, için bu baglamda bulusta ve/veya bu tarz formülasyonlarin etkililigini iyilestirmek ve/veya bu tarz formülasyonu stabilize etme için bulusun proseslerinde ve örnegin, üretim, nakliye, saklama, kullanim-öncesi preparasyon, uygulama sirasinda ve sonrasinda gerçeklesen streslerden, dolayi parçalanmaya ve bozulmaya karsi proseslerde kullanilabilir. Bu baglamda kullanisli olan protein stabilizasyon ve formülasyon malzemeleri ve yöntemleri hakkinda çesitli yorumlamalar mevcuttur, örnegin, Arakawa et al., "Solvent et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," in: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and bilhassa veteriner ve/veya beseri medikal kullanimlar için protein farmasötik ürünlere ve proseslere iliskin, mevcut bulusa uygun sekilde kendi-tamponlayan protein formülasyonu için bunlarin eksipiyanlari ve prosesleri ile ilgili olan kisimlar. Tuzlar, örnegin, bir formülasyonun iyonik gücünü ve/veya izotonisitesini ayarlamak için ve/veya bulusa uygun sekilde bir bilesimin bir proteininin veya baska içerik maddesinin çözünürlügünü ve/veya fiziksel kararliligini iyilestirmek için, bulusun belirli açiklamalarina uygun sekilde kullanilabilir. Iyi bilindigi üzere, iyonlar proteinin yüzeyi üzerindeki yüklü rezidüleri baglama ile ve protein içindeki yüklü ve polar gruplari kalkanlama ve bunlarin elektrostatik etkilesimlerinin, çekici ve itici etkilesimlerinin gücünü azaltma ile proteinlerin natif hâlini stabilize edebilir. iyonlar ayrica, özel olarak, proteinin denatüre edilmis peptit baglantilarini (--CONH), baglama ile bir proteinin denatüre edilmis hâlini stabilize edebilir. ilaveten, bir protein içindeki yüklü ve polar gruplar ile iyonik etkilesim ayrica, inter-moleküler elektrostatik etkilesimleri azaltabilir ve böylece protein agregasyonunu ve çözünmezligini de önleyebilir veya azaltabilir. Iyon türleri bunlarin proteinler üzerindeki etkileri açisindan anlamli bir sekilde farklilik gösterir. Bulusa uygun sekilde farmasötik bilesimleri formüle etmede kullanilabilen, iyonlarin çok sayida kategorik siralamasi ve bunlarin proteinler üzerindeki etkileri gelistirilmistir. Bir örnek, bunlarin çözelti içindeki proteinlerin konformasyonel kararliligi üzerindeki etkisi ile iyonik ve polar iyonik-olmayan çözünen maddeleri siralayan Hofmeister serisidir. Stabilize eden çözünen maddeler "kozmotropik" olarak ifade edilir. Destabilize eden çözünen maddeler "kaotropik" olarak Ifade edilir. Kozmotroplar yaygin olarak, çözeltiden proteinleri çökeltmek ("tuz ile çökeltme") için yüksek konsantrasyonlarda (öm, 1 molar amonyum sülfat) kullanilir. Kaotroplar yaygin olarak, proteinleri denatüre etmek için ve/veya çözündürmek için ("tuz içinde çözündürme") kullanilir. Iyonlarin "tuz içinde çözündürme" ve "tuz ile çökeltme" için bagil etkililikleri Hofmeister serisinde bunlarin pozisyonunu tanimlar. Serbest amino asitler bulusun çesitli uygulamlarina uygun sekilde IL-2 muteini formülasyonlari içinde yiginlama ajanlari, stabilazörler ve antioksidanlar, olarak ayni zamanda baska standart kullanimlarda kullanilabilir. Lizin, prolin, serin ve alanin bir formülasyon içinde stabilize eden proteinler için kullanilabilir. Glisin dogru kek yapisini ve özelliklerini garanti etmek için liyofilizasyon içinde yararlidir. Arjinin, hem sivi hem de olabilir. Metiyonin bir antioksidan olarak yararli olabilir. Polioller sekerleri, örn., mannitolü, sükrozu ve sorbitolü ve polihidrik alkolleri, örnegin, mesela, gliserolü ve propilen glikolü ve buradaki tartismanin amaçlari için, polietilen glikolü (PEG'i) ve ilgili maddeleri, içerir. Polioller kozmotropiktir. Bunlar, proteinleri fiziksel ve kimyasal parçalanma proseslerinden korumak için hem sivi hem de Iiyofilize edilmis formülasyonlar içinde yararli stabilize etme ajanlaridir. Polioller ayrica, formülasyonlarin tonisitesini ayarlamak için de yararlidir. Liyofilize edilmis formülasyonlarda kekin yapisal kararliligini garanti etmek için yaygin bir sekilde kullanilan, mannitol bulusun seçilmis açiklamalarinda yararli polioller arasindadir. Bu, kek için yapisal kararliligi garanti eder. Bu genel olarak, bir liyo- koruyucu, örn., sükroz, ile kullanilir. Sorbitol ve sükroz, tonisiteyi ayarlamak için ve tasima veya üretim prosesi sirasinda yiginlarin preparasyonu sirasinda dondurma- çözülme streslerine karsi korumak için stabilazörler olarak tercih edilen ajanlar arasindadir. (Serbest aldehit veya keton gruplari içeren) indirgeme sekerleri, örnegin, glikoz ve Iaktoz, yüzey lizin ve arjinin rezidülerini glikatlayabilir. Dolayisiyla, bunlar genel olarak bulusa uygun sekilde kullanim için tercih edilen polioller arasinda degildir. Buna ek olarak, bu tarz reaktif türleri, örnegin, sükrozu, olusturan, asidik kosullar altinda früktoza ve glikoza hidrolize edilen ve sonuç olarak glikasyonu meydana getiren seker de, bu baglamda bulusun tercih edilen poliolleri arasinda degildir. PEG, proteinleri stabilize etmek için ve bir kriyo-koruyucu olarak kullanislidir ve bu baglamda bulusta kullanilabilir. lL-2 muteini formülasyonlarinin açiklamalari ilaveten sürfaktanlar içerir. Protein molekülleri yüzeyler üzerinde adsorpsiyona ve denatürasyona ve sonuçta hava-sivi, kati-sivi ve sivi-sivi ara-yüzlerinde agregasyona yatkin olabilir. Bu etkiler genel olarak protein konsantrasyonu ile ters bir sekilde ölçeklenir. Bu zararli etkilesimler genel olarak, protein konsantrasyonu ile ters bir sekilde ölçeklenir ve tipik olarak, örnegin, bir ürünün nakliyesi ve idaresi sirasinda üretilmis fiziksel ajitasyon ile alevlendirilir. Sürfaktanlar rutin olarak yüzey adsorpsiyonunu önlemek, minimuma indirmek veya azaltmak için kullanilir. Bu baglamda bulustaki yararli sürfaktanlar polisorbat 20'yi, polisorbat 80'i, sorbitan polietoksilatlarin baska yag asidi esterlerini ve poloksamer 188'i Sürfaktanlar ayrica, protein konformasyonel kararliligini kontrol etmek için yaygin olarak kullanilir. Verilen herhangi bir sürfaktan tipik olarak bazi proteinleri stabilize edeceginden ve digerlerini destabilize edeceginden, bu baglamda sürfaktanlarin Polisorbatlar oksidatif parçalanmaya yatkindir ve siklikla, saglandigi sekilde, peroksitlerin protein rezidüsü yan-zincirlerinin, özellikle metiyoninin, oksidasyonuna neden olmaya yeten miktarlarini içerir. Sonuç olarak, polisorbatlar dikkatli bir sekilde kullanilmalidir ve kullanildiginda, bunlarin en düsük etkili konsantrasyonunda kullanilmalidir. Bu baglamda, polisorbatlar eksipiyanlarin bunlarin en düsük etkili konsantrasyonlarinda kullanilmasi gerektigi genel kuralini örneklendirir. lL-2 muteini formülasyonlarinin ilave açiklamalari ilaveten bir veya birden fazla antioksidan içerebilir. Bir dereceye kadar, proteinlerin zararli oksidasyonu ortam oksijeninin ve sicakliginin uygun düzeylerini idame ettirme ile ve isiga maruziyetten kaçinma ile farmasötik formülasyonlarda önlenebilir. Proteinlerin oksidatif parçalanmasini önlemek için antioksidan eksipiyanlar da kullanilabilir. Bu baglamda, indirgeme ajanlari, oksijen/serbest-radikal temizleyiciler ve selatlama ajanlari yararli antioksidanlar arasindadir. Bulusa uygun sekilde terapötik protein formülasyonlarinda kullanim için antioksidanlar tercihen suda-çözünebilir ve bir ürünün raf ömrü boyunca bunlarin aktivitesini idame ettirir. EDTA bu baglamda bulusa uygun sekilde bir tercih edilen antioksidandir. Antioksidanlar proteinlere zarar verebilir. Örnegin, indirgeme ajanlari, örnegin, özel olarak glutatyon, intra-moleküler disülfit baglantilarini bozabilir. Dolayisiyla, bunlarin formülasyonda proteinlere hasar verme olasiligini elimine etmek veya yeterli bir sekilde azaltmak amaciyla, diger seyler arasinda, bulusta kullanim için antioksidanlar seçilir. Bulusa uygun sekilde formülasyonlar, protein ko-faktörleri olan ve protein koordinasyon kompleksleri olusturmak için gerekli olan metal iyonlarini, örnegin, belirli insülin süspansiyonlari olusturmak için gerekli olan çinkoyu, içerebilir. Metal iyonlari ayrica proteinleri parçalayan bazi prosesleri de inhibe edebilir. Bununla birlikte, metal iyonlari ayrica, proteinleri parçalayan fiziksel ve kimyasal prosesleri de katalizleyebilir. Magnezyum iyonlari ( aspartik asidin izoaspartik aside izomerizasyonunu inhibe etmek için kullanilabilir. Ca+2 iyonlari (en fazla insan deoksiribonükleazinin kararliligini arttirabilir. Bununla birlikte, Mg", Mn+2 ve Zn", rhDNazi destabilize edebilir. Benzer sekilde, Ca*2 ve Sr*2, Faktör VlII'i stabilize edebilir, bu, Mg", Mn+2 ve Zn", Cu+2 ve Fe+2 tarafindan destabilize edilebilir ve bunun agregasyonu AI+3 iyonlari tarafindan arttirilabilir. içerir. Ayni kaptan birden fazla ekstraksiyon içeren çok-dozlu parenteral formülasyonlar gelistirirken gereklidir. Bunlarin primer fonksiyonu ilaç ürününün raf-ömrü veya kullanim süresi boyunca mikrobiyal büyümeyi inhibe etmektir ve ürün sterilitesini garanti etmektir. Yaygin bir sekilde kullanilan koruyucular, benzil alkolü, fenolü ve m-kresolü içerir. Koruyucularin küçük-moleküllü parenteraller ile bir uzun kullanim öyküsüne sahip olmasina ragmen, koruyucular içeren protein formülasyonlarinin gelistirilmesi zorlu olabilir. Koruyucular neredeyse her zaman proteinler üzerinde bir destabilize etme etkisine (agregasyona) sahiptir ve bu bunlarin çok-dozlu protein formülasyonlarinda kullanimini sinirlandirmada bir majör faktör hâline gelmistir. Bununla birlikte, çok-dozlu formülasyonlar mümkün oldugunda, bunlar hasta uyumuna ve arttirilmis pazarlanabilirlilige olanak saglayamaya yönelik eklenmis avantaja sahiptir. Bir iyi örnek, korunmus formülasyonlarin gelistirilmesinin daha uyumlu, çok-dozlu enjeksiyon kalemi sunumlarinin ticarilestirilmesine yol açan insan büyüme hormunununkidir (hGH'ninkidir). hGH'nin korunmus formülasyonlarini içeren en az dört bu tarz kalem cihazi pazarda güncel olarak mevcuttur. Norditropin (sivi, Novo Nordisk), Nutropin AQ (sivi, Genentech) & Genotropin (liyofilize edilmis--iki bölmeli kartus, Pharmacia & Upjohn) fenol içerirken Somatrope (Eli Lilly) m-kresol ile formüle edilir. Bir tarifnamede, bir IL-2 mutein veya bir lL-2 muteininin Fc-füzyonu, örnegin Fc.IL- içinde 10 mg/mL olarak formüle edilir. Bir diger düzenlemede, bir lL-2 mutein veya bir KPI, 161 mM L-arjinin içinde formüle edilir. Korunmus dozaj formlarinin formülasyonu ve gelistirilmesi sirasinda bir kaç açiklamanin düsünülmesi gerekir. Ilaç ürünündeki etkili koruyucu konsantrasyonu optimize edilmelidir. Bu, bir verilen koruyucuyu protein kararliligindan taviz vermeden antimikrobiyal etkililik saglayan konsantrasyon araliklarindaki dozaj formu içinde test etmeyi gerektirir. Bir baska tarifnamede, mevcut bulus, Iiyofilize edilmis formülasyonlar içindeki lL-2 muteinlerini veya IL-2 muteinlerinin Fc-füzyonlarini saglar. Dondurarak-kurutulmus ürünler koruyucu olmadan Iiyofilize edilebilir ve kullanim zamaninda bir koruyucu içeren diluent ile rekonstitüye edilebilir. Bu bir koruyucunun protein ile temas hâlinde oldugu süreyi kisaltir bu da iliskilendirilmis kararlilik risklerini anlamli bir sekilde minimuma indirir. Sivi formülasyonlar ile, koruyucu etkililigi ve kararlilik tüm ürün raf-ömrü (yaklasik 18 ila 24 ay) boyunca idame ettirilmelidir. Koruyucu etkililiginin aktif ilaci ve tüm eksipiyan bilesenleri içeren nihai formülasyonda gösterilmesi gerektigi bildirilmesi gereken önemli bir noktadir. lL-2 muteini formülasyonlari genel olarak, diger seyler arasinda, biyoyararlanim ve devamlilik araliklari içinde, spesifik uygulama yollari ve yöntemleri için, spesifik uygulama dozajlari ve uygulama sikliklari için, spesifik hastaliklarin spesifik tedavileri için tasarlanacaktir. Dolayisiyla, formülasyonlar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, oral olarak, aural olarak, oftalmik olarak, rektal olarak ve vajinal olarak ve intravenöz ve intraarteriyel enjeksiyon, intramüsküler enjeksiyon ve subkütan enjeksiyon dâhil olmak üzere parenteral yollar ile uygulama dâhil olmak üzere, herhangi bir uygun yol ile aktarim için bulusa uygun sekilde tasarlanabilir. Farmasötik bilesim formüle edildiginde, bu bir çözelti, süspansiyon, jel, emülsiyon, kati, kristal olarak veya bir dehidrate edilmis veya Iiyofilize edilmis pudra olarak steril viyaller içinde saklanabilir. Bu tarz formülasyonlar bir kullanima hazir formda veya uygulamadan önce rekonstitüye edilen bir (öm, Iiyofilize edilmis) formda saklanabilir. Bulus ayrica, bir tek-dozluk uygulama birimi üretmek için kitler de saglar. Bulusun kitlerinin her biri, hem bir kurutulmus proteine sahip olan bir birinci kabi hem de bir sulu formülasyona sahip olan bir ikinci kabi içerebilir. Bu bulusun belirli uygulamalarinda, tek veya çok-bölmeli önceden-doldurulmus siringalar (örn., sivi siringalari veya Iiyo- siringalar) içeren kitler saglanir. Kullanilacak olan bir lL-2 muteini-içeren farmasötik bilesimin terapötik olarak etkili miktari, örnegin, terapötik baglama ve amaçlara, bagi olacaktir. Teknikte uzmanligi olan bir kisi tedavi Için uygun dozaj düzeylerinin, kismen, türetilen moleküle, IL-2 muteininin bunun içinde kullanilmakta oldugu endikasyona, uygulama yoluna ve boyuta (vücut agirligina, vücut yüzeyine veya organ boyutuna) ve/veya hastanin durumuna (yasina ve genel sagligina), bagli olarak çesitlilik gösterecegini anlayacaktir. Belirli açiklamalarda, klinisyen optimal terapötik etkiyi elde edecek sekilde dozaji titre edebilir ve uygulama yolunu modifiye edebilir. Bir tipik dozaj yukarida bahsedilen faktörlere bagli olarak yaklasik 0,1 ug/kg ila en fazla yaklasik 1 mg/kg veya daha fazla araliginda olabilir. Spesifik uygulamalarda, dozaj 0,5 ug/kg en fazla yaklasik 100 tig/kg, opsiyonel olarak 2,5 ug/kg en fazla yaklasik 50 ug/kg, araliginda olabilir. Bir lL-2 muteininin bir terapötik etkili miktari tercihen, hastalik semptomlarinin siddetinde bir azalma, hastaligin semptomsuz periyotlarinin sikliginda veya süresinde bir artis veya hastalik istirabindan kaynaklanan bozulmanin veya engelliligin bir önlenmesi ile sonuçlanir. Farmasötik bilesimler bir tibbi cihaz kullanilarak uygulanabilir. Farmasötik bilesimleri Otoimmün veya Infamatuar Bozukluklarin Tedavisi Belirli uygulamalarda, bulusun bir lL-2 muteini bir otoimmün veya inflamatuar bozuklugu tedavi etmek için kullanilir. Tercih edilen uygulamalarda, bir IL-2 muteini Fc- füzyon proteini kullanilir. Burada açiklanan IL-2 muteini ile tedaviye özellikle uygun olan bozukluklar, bunlarla sinirli kalmamak kaydiyla, inflamasyonu, otoimmün hastaligi, atopik hastaliklari, paraneoplastik otoimmün hastaliklari, kikirdak inflamasyonunu, artriti, romatoid artriti, jüvenil artriti, jüvenil romatoid artriti, pausiartiküler jüvenil romatoid artriti, poliartiküler jüvenil romatoid artriti, sistemik baslangiçli jüvenil romatoid artriti, jüvenil ankilozan spondiliti, jüvenil enteropatik artriti, jüvenil reaktif artriti, jüvenil Reiter Sendromu'nu, SEA Sendromu'nu (Seronegativite'yi, Entezopati'yi, Artropati Sendromu'nu), jüvenil dermatomiyoziti, jüvenil psöriyatik artriti, jüvenil sklerodermayi, jüvenil sistemik Iupus eritematözü, jüvenil vasküliti, pausiartiküler romatoid artriti, poliartiküler romatoid artriti, sistemik baslangiçli romatoid artriti, ankilozan spondiliti, enteropatik artriti, reaktif artriti, Reiter Sendromu'nu, SEA Sendromu'nu (Seronegativite'yi, Entezopati'yi, Artropati Sendromu'nu), dermatomiyoziti, psöriyatik artriti, sklerodermayi, vasküliti, miyoliti, polimiyoliti, dermatomiyoliti, poliaiteritis nodozayi, Wegener granülomatözünü, arteriti, polimiyaljiya romatikayi, sarkoidozu, sklerozu, primer biliyer sklerozu, sklerozan kolanjiti, Sjogren sendromunu, psöriyazisi, plak psöriyazisi, guttate psöriyazisi, invers psöriyazisi, pustular psöriyazisi, eritrodermik psöriyazisi, dermatiti, atopik dermatiti, aterosklerozu, lupusu, Still hastaligini, Sistemik Lupus Eritematöz'ü (SLE'yi), miyastenya gravisi, inflamatuar bagirsak hastaligini (IBD), Crohn hastaligini, ülseratif koliti, çölyak hastaligini, multipl sklerozu (MS'i), astimi, COPD'yi, rinosinüziti, polipli rinosinüziti, eozinofilik özofajiti, eozinofilik bronsiti, Guillain-Barre hastaligini, Tip I diabetes mellitusu, tiroiditi (öm, Graves hastaligini), Addison hastaligini, Raynaud olgusunu, otoimmün hepatiti, GVHD'yi, transplantasyon reddini, böbrek hasarini, hepatit C-indüklü vasküliti, spontan gebelik kaybini ve benzerlerini, içerir. Tercih edilen uygulamalarda, otoimmün veya inflamatuar bozukluk lupustur, graft- versus-host hastaligidir, hepatit C-indüklü vaskülittir, Tip I diyabettir, multipl sklerozdur, spontan gebelik kaybidir, atopik hastaliklardir ve inflamatuar bagirsak hastaliklaridir. Bir diger tarifnamede, bir otoimmün veya inflamatuar bozuklugu olan veya bunu gelistirme riski olan bir hasta, bir IL-2 muteini (örnegin, burada açiklanan bir IL-2 muteini, örnegin burada açiklandigi üzere bir IL-2 muteini Fc-füzyonu, veya istege bagli olarak burada açiklanan tipte bir Fc-füzyon molekülünün bir parçasi olarak teknikte bilinen bir diger IL-2 muteini veya dogal sus IL-2) ile tedavi edilir ve hastanin tedaviye yaniti izlenir. Hastanin izlenen yaniti, hastanin tedaviye olan tespit edilebilir veya ölçülebilir herhangi bir yaniti veya bu tür yanitlarin herhangi bir kombinasyonu olabilir. Örnegin, yanit vücut sicakligi veya ates, istah, terleme, bas agrisi, bulanti, bitkinlik, açlik, susuzluk, mental duyarlilik, veya benzeri gibi hastanin fiziksel durumundaki bir degisiklik olabilir. Alternatif olarak yanit, örnegin hastadan alinan periferik kan numunesindeki bir hücre türünün veya gen ürününün (örnegin, bir protein, peptit, veya nükleik asit) miktarindaki bir degisiklik olabilir. Bir düzenlemede, hastanin tedaviye karsi tespit edilebilir veya ölçülebilir bir yanita sahip olmasi halinde veya bu tür bir yanitin belirli bir esigi geçmesi halinde, hastanin tedavi rejimi degistirilir. Alterasyon, dozlama sikligindaki bir azalma veya artis veya doz basina uygulanan IL-2 muteini miktarindaki bir azalma veya artis veya dozlama "tatili" (yani belirli bir zaman periyodunda veya takip eden doktor tedavinin devam etmesinin gerektigine karar verene kadar veya hastalanan izlenen yaniti tedavinin devam etmesi gerektigini veya devam edebilecegini gösterene kadar tedavisinin geçici olarak kesilmesi) veya tedavinin sonlandirilmasi olabilir. Bir tarifnamede, yanit hastanin sicakliginda veya CRP seviyelerindeki bir degisimdir. Örnegin, yanit hastanin vücut sicakligindaki bir artis veya periferik kan numunesindeki CRP seviyelerinin artisi veya her ikisi de olabilir. Özel bir düzenlemede, hastanin vücut sicakliginin, tedavi süresince en az O.1°, 0.2°, azaltilir, askiya alinir veya sonlandirilir. Bir diger özel tarifnamede, hastanin periferik kan numunesindeki CRP konsantrasyonunun, tedavi süresince en az 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.7, 1, 1.5, veya 2 mg/mL kadar artmasi halinde, hastanin tedavisi azaltilir, askiya alinir veya sonlandirilir. Izlenebilen ve tedavinin modifiye edilmesine, azaltilmasina, askiya alinmasina veya sonlandirilmasina karar vermede kullanilabilen diger hasta reaksiyonlari, kapiler sizinti sendromunun (hipotansiyon ve kardiyovasküler instabilite), bozulmus nötrofil fonksiyonu (örnegin, bir enfeksiyonun gelismesi veya kötülesmesi ile sonuçlanan veya bunlarin tespit edilmesi), trombositopeninin, trombotik anjiyopatinin, enjeksiyon bölgesi reaksiyonlarinin, vaskülit (Hepatit C virüs vasküliti gibi), veya inflamatuar semptomlar veya hastaliklarin gelismesini veya kötülesmesini içerir. Izlenebilen ve tedavinin modifiye edilmesine, azaltilmasina, arttirilmasina, askiya alinmasina veya sonlandirilmasina karar vermede kullanilabilen diger hasta reaksiyonlari, NK hücrelerinin, Treg hücrelerinin, FOXP3' CD4 T hücrelerinin, FOXP3+ CD4 T hücrelerinin, FOXP3- CD8 T hücrelerinin, veya eozinofillerin sayisindaki bir artisi içerir. Bu hücre türlerinin artislari, örnegin periferik kan birimi basina hücre sayisindaki bir artis (örnegin kari mililitresi balina hücredeki bir artis olarak ifade edilen) olarak veya kan numunesindeki hücre veya hücrelerin diger türü ile karsilastirildiginda bu tür bir hücre türünün yüzdesindeki bir artis olarak saptanabilir. Izlenebilen bir diger hasta reaksiyonu, hastanin periferik kan numunesindeki CD25+ hücreleri üzerindeki hücre yüzeyine bagli IL-2 muteini miktarinda bir artistir. Treg Hücrelerini Genisletme Yöntemleri hücrelerini genisletmek için kullanilabilir. Treg'lerin regülatör-olmayan T hücrelerine oranini arttirmanin yöntemleri burada saglanir. Yöntem T hücrelerinin bir popülasyonunu bir insan IL-2 muteininin veya lL-2 muteini Fc-füzyonunun bir etkili miktari ile temas ettirmeyi içerir. Oran T hücrelerinin popülasyonu içinde CD3+FOXP3+ hücrelerinin CD3+FOXP3- hücrelerine oranini belirleme ile ölçülebilir. Insan kanindaki tipik Treg sikligi toplam CD4+CD3+ T hücrelerinin %5-10'udur, bununla birlikte, yukarida listelenen hastaliklarda, bu yüzde daha düsüktür veya daha yüksektir. Tercih edilen açiklamalarda, Treg'in yüzdesi en az %10, en az %20, en az %30, en az %40, çesitlilik gösterebilir; bununla birlikte, IL-2 muteini tedavisi yoluyla elde edilebilen bir maksimal Treg sikligi toplam CD4+CD3+T hücrelerinin %50'sidir veya %60'idir. Belirli açiklamalarda, IL-2 muteini veya IL-2 muteini Fc-füzyon proteini bir süjeye uygulanir ve bir süjenin periferik kanindaki regülatör T hücrelerinin (Treg'lerin) regülatör-olmayan T hücrelerine orani artar. tercihli bir sekilde genislettiginden, bunlar ayrica bir süjenin periferik kanindaki regülatör T hücrelerinin (Treg'lerin) dogal katil (NK) hücrelere oranini arttirmak için de kullanislidir. Oran CD3+FOXP3+ hücrelerinin CD19- ve CD3- olan CD16+ ve/veya CD56+ Ienfositlerine oranini belirleme ile ölçülebilir. kanindaki Treg'lerin regülatör-olmayan T hücrelerine veya NK hücrelerine oranini anlamli bir sekilde genisletmeden bir hastadaki bir hastalik veya bozukluk üzerinde bir terapötik etkiye sahip olabilecegi düsünülür. Terapötik etki, lL-2 muteininin veya IL-2 Fc-füzyon proteininin inflamasyon veya otoimmünite yerindeki lokalize aktivitesinden kaynaklanabilir. ÖRNEKLER Asagidaki örnekler, gerçek ve tahmini olanlar da dahil. mevcut bulusun spesifik düzenlemelerini veya özelliklerini gösterme amacina yönelik saglanir ve kapsami sinirlandirmasi amaçlanmaz. Örnek 1 -- CD25 için yüksek afinite saglayan mutasyonlarin sayisini azaltma CD25 için yükseltilmis afinitesi ve lL-2Rßy yoluyla azaltilmis sinyalleme gücü olan lL-2 muteinleri tercihli bir sekilde Treg büyümesini ve fonksiyonunu tesvik eder. Potansiyel immünojenisiteyi azaltmak amaciyla, CD25 için yüksek afinite saglamak için gerekli olan mutasyonlarin minimum sayisi arastirilmistir. Bunun üç reseptörü ile kompleks hâlindeki IL-2'nin kristal yapisi (PDB kodu - ZBSI), V69A'nin ve Q74P'nin CD25 ile etkilesime giren helikal yapi içinde yer aldigini gösterir Bu, yüksek CD25 baglama afinitesi için iki bagimsiz IL-2 mutajenezi taramasinda V69A'nin ve Q74P'nin neden siklikla izole edildigini açiklayabilir (Rao et al., 2005; Thanos et al., 2006). Bu Örnek, Rao et al.'larinin taramasinda tanimlanan IL-2 muteini "2-4" içindeki diger mutasyonlarin hangilerinin afiniteyi tek basina V69A ve Q74P ile gözlemlenenin üstüne çikarmak için en önemli oldugunu arastirir. Asagidaki proteinler aktive edilmis T hücrelerinin yüzeyi üzerindeki CD25'i baglama için akis sitometrisi ile taranmistir. Tüm yapilar ayrica, saflastirma ve saptama için bir C-ucu FLAG ve poII-His etiketi de içermistir. Spesifik mutasyonlar parantez içinde saglanir. HaMut1D(V69A,Q74P,N88D,C .._' _H`.I V'H'Ö'l "l I-'l'l "'ll"~"'|"'TF""' .4..1 --.Hata A_--.H..z?.r.›... .4 HaMutZD (NBOS, V69A ,,Q74P N88D,C HaMutBD (K35R, V69A ,,Q74P N88D,C HaMut4D (T37A, V69A, Q74P, N88D, C HaMut5D _(K48E V69A Q74P N88D HaMutGD (E68D, V69A Q,74P, N88D, C HaMut7D (N71R, V69A, Q74P, N88D ,C HaMut8D (K35R, K48E, E68D, N88D ,C HaMut7D, CD25'i orijinal izolat "2-4" ile neredeyse ayni afinite (~ ile baglamistir, bu N71R mutasyonunun afiniteyi tek basina V69A, Q74P (HaMut1 D, ~2 nM) ile gözlemlenenin üstüne büyük ölçüde çikarabildigini gösterir. Afinitesi WT IL- 2'ninkine kiyasla yalnizca hafif derecede daha yüksek olan HaMut8D disinda, diger yapilar, HaMut1D'ye benzer veya HaMut1D'ye kiyasla hafif derecede daha yüksek afinitelere sahiptir. Örnek 2 -- Iyilestirilmis yari-ömür için lgG1-Fe alanlarina kaynastirilmis IL-2 muteinleri Bir lL-2 muteini ile Treg zenginlestirmesi saglamak için gerekli olan dozlam sikligini azaltmak amaciyla, IL-2 ve lgG1-FC alanlari arasinda çesitli füzyonlar degerlendirilmistir. Fc alanlari lgG1 tarafindan aracilik edilen efektör fonksiyonlari, örnegin, hedef hücre Iizisini, feshetmek için nokta mutasyonlari içermistir. Yararlanilbir N297G'dir. Treg-selektif IL-2 muteinleri IL-2 potensinde kismi azalmaya sahip oldugundan, IL-2'yi Fc'ye IL-2R sinyallemesini anlamli bir sekilde etkilemeyecek sekilde kaynastirmak önemlidir. Dolayisiyla, IL-2 muteinleri Fc füzyonu ile ve F2 füzyonu olmadan IL-2R aktivasyonu için test edilmistir. Fc füzyonu tarafindan IL-2 dimerizasyonunun IL-2R için arttirilmis aviditeden dolayi IL- 2R sinyalleme gücünü arttirip arttirmayacagini belirlemek amaciyla, bir daha zayif IL-2 muteini (haD5) (U baglayici dizi ile ayrilmis, Fc'nin amino ucuna kaynastirilmistir. Bu mutein IL-2 sinyallemesini etkileyen yanlis-eslesmesini ve agregasyonu önlemek için 01258'ye sahiptir. Fc'ye bu sekilde füzyon haD5'in biyolojik aktivitesini tamamen ortadan kaldirirken, büyük olasilikla dimerizasyondan gelen arttirilmis aviditeden dolayi, bunun hücre yüzeyi CD25'i yüksek-afiniteli baglamasi arttirilmistir. zincirinin IL-2 alani tasiyacagi sekilde de kaynastirilmistir. Iki asimetrik Fc zinciri arasindaki heterodimerik eslesme bir Fc zinciri üzerindeki uygulanmis lizinler ve diger Fc zinciri üzerindeki uygulanmis aspartik asitler arasindaki elektrostatik etkilesimler ile tesvik edilmistir. IL-2 muteini haDö, bir konfigürasyonun tercih edildigi durumda, bir FC zincirinin veya digerinin N-ucuna kaynastirilmistir, bu haD6.FCDD ve haDö.FcKK olarak adlandirilan iki protein yapisi ile sonuçlanmistir. Ayrica, haMut7D muteinini bir veya iki GGGGS (SEQ ID NO: 5) baglayici ile Fc heterodimerinin C-ucuna kaynastirilmistir (FcKK(G4S)haMut7D, FCKK(G4S)2haMut7D). lL-2 muteini haD6'nin Fc heterodimerinin N-ucuna füzyonu hem pSTAT5 hem de T hücresi proliferasyon deneylerinde serbest haD6'ya kiyasla bir kismi aktivite kaybi ile sonuçlanmistir. Aksine, haMut7D bir veya iki GGGGS (SEQ ID NO: 5) baglayici ile Fc heterodimerinin C-ucuna füzyonu haMut7D'nin potensini degistirmemistir. Bir lL-2 muteininin bir Fc homodimerinin C-ucuna füzyonu da arastirilmistir. Toplam PBMC her bir 100 ml için 300 milyon hücre oraninda T75 doku kültürü flasklari içinde ile aktive edilmistir. Kültürün gün 3'ünde, hücreler 3 kere yikanmistir ve 3 gün boyunca taze vasat içinde dinlendirilmistir. Hücreler akabinde 50 pl olan bir nihai hacimde 1 pM ila 10 nM araliginda 10x doz titrasyonunda IL-2 varyantlari ile stimüle edilmistir. STAT5 fosforilasyonunun düzeyi BD phosflow tampon kiti kullanilarak ölçülmüstür. Özet olarak, 1 ml BD Iyse/fix phosflow tampon stimülasyonu durdurmak için eklenmistir. Hücreler 37°C'de 20 dk boyunca fikse edilmistir ve CD4, CD25, FOXP3 ve pSTATS için boyanmadan önce buz üzerinde 1x BD phosflow perm tamponu geçirgen hâle getirilmistir. SEKIL 1'de görülebildigi üzere, haMut1 D ve haMut7D muteinlerinin biyoaktivitesi bir FC homodimerinin C-ucuna füzyon ile degistirilmemistir. Dolayisiyla, IL-2'nin N-ucu ve Fc'nin C-ucu arasinda füzyon, bir Fc.IL-2 homodimeri baglaminda bile, lL-2 muteinlerinin agonist aktivitesinden taviz vermez. Bu yapilarda, C125A mutasyonu iyilestirilmis üretim için 01258 yerine kullanilmistir. Örnek 3 -- Tercihli Treg büyümesi saglamak için lL-2 muteini potensini ayarlama lL-2 muteinlerinin baslangiç paneli tek basina veya IL-2R sinyallemesini etkileyen 1 veya 2 ilave mutasyon ile N88D içermistir. N88D serisininkilere kiyasla benzer veya hafif derecede daha güçlü agonizmi olan muteinleri tanimlama amaciyla, tümünde tek nokta mutasyonlari olan, muteinlerin bir ikinci paneli tasarlanmistir. 24 sinyalleme mutasyonunun bir paneli, tahmin edilen lL-2Rß-etkilesime giren amino asitlerine (kristal yapi, PDB kodu - 2BSI) göre tanimlanmistir. Özel sübstitüsyonlar mutein ve IL-2Rß arasinda baglama serbest enerjisindeki tahmin edilen azalmaya göre seçilmistir. Baglama serbest enerjisi EGAD bilgisayar algoritmasi (Handel's Laboratory, University of California at San Diego, USA) kullanilarak hesaplanmistir. Bir mutantin baglama serbest enerjisi, AAGmut = u (AGmut - Ath) olarak tanimlanir. Burada, p (=0,1, genel olarak) deneysel enerjiler (Pokala ve Handel 2005) ile karsilastirildiginda baglama afinitesindeki tahmin edilen degisimleri 1'Iik bir egime sahip olacak sekilde normalize etmek için kullanilan ölçeklendirme faktörüdür. Ayrilmanin serbest enerjisi (AG), kompleks (AGbaglanmis) ve serbest hâller (AGserbesi) arasindaki enerji farki olarak tanimlanmistir. Ayrilma enerjisi AGmm her bir sübstitüsyon için hesaplanmistir. l92H, E95K, E95R veya E95l) tasiyan lL-2 muteinlerinin bir paneli Fc heterodimerine C-ucu füzyonlar olarak eksprese edilir. Bu yapilar ayrica, yüksek CD25 baglama da içermistir. Panel Örnek 2'nin T hücresi STAT5 fosforilasyon analizinde potens için taranmistir ve ve N88D'ye kiyasla daha fazla aktiviteye sahip oldugu bulunmustur (SEKIL 2). kiyasla daha fazla aktiviteye sahiptir. Seçilmis muteinler ayrica T hücresi ve NK büyüme analizlerinde de test edilmistir. T-hücresi analizi için, toplam PBMC'Ier 100 ng OKT3 ile 3 milyon/ml oraninda aktive edilmistir. Gün 2'de, hücreler 2 kere yikanmistir ve 5 gün boyunca taze vasat içinde dinlendirilmistir. Hücreler akabinde CFS ile etiketlenmistir ve FACS analizinden önce 7 gün boyunca IL-2 içeren vasat içinde 0,5 milyon/kuyucuk oraninda bir 24 kuyucuklu plaka içinde ilaveten kültürlenmistir. T hücresi alt-kümelerinin proliferasyonu CFSE seyreltmesi (medyan CFSE flüoresansi) olarak SEKIL 3'te sunulur. NK-hücresi analizi için, MACS ile ayrilmis CD16+ NK hücreleri 96 kuyucuklu plakalarda 0,1 milyon/hücre oraninda 3 gün boyunca lL-2 içeren vasatlarda kültürlenmistir. 0,5 uCi 3H-timidin inkübasyonun son 18 saati boyunca her bir kuyucuga eklenmistir. Sonuçlar SEKIL 4'te gösterilir. büyümesini stimüle edebilmistir ancak baska T hücreleri üzerinde yaklasik olarak 10x daha az güçlüdür (SEKIL 3) ve NK hücreleri üzerinde yaklasik olarak 100X daha az güçlüdür (SEKIL 4). bir dizi münferit amino asit kirpilmasi ile azaltilmis oldugu Fc.lL-2 füzyon proteinlerinin bir ayri paneli tasarlanmistir. Trunc1-Trunc4, SEKILLER 2, 3 ve 4 için tarif edildigi üzere STAT5 fosforilasyonu ile ve T hücresi ve NK hücresi proliferasyonu ile ölçüldügü üzere tam boy ana yapi Fc.haMut7'ye esit potense sahiptir. Trunc5 ve Trunc6, daha zayif yine de N88D mutasyonu ile stimüle edilmis olanlara (haD ve haMut7D) kiyasla daha güçlü ve V91K ile stimüle edilmis olanlara çok benzer yanitlar stimüle etmistir. Trunc7, N88D muteinlerine kiyasla daha zayiftir ve Trunc8, çok küçük aktiviteye sahiptir. Bununla birlikte, NK hücreleri üzerinde test edildiginde, TruncS ve Truncö, V91K'ya kiyasla daha güçlü agonistlerdir, bu Treg selektivitesinin bir proksimal Fc alani tarafindan sterik engellemeden daha ziyade sinyalleme mutasyonlari ile daha kolay bir sekilde saglanabilecegini gösterir. Örnek 4 -- Bir Fc homodimeri baglaminda Yüksek CD25 afinite mutasyonlari Yüksek CD25 baglama afinitesi saglayan mutasyonlarin, bunlar CD25-yüksek T hücreleri için tropizmi arttirdigindan ve bunlar uzun süreli CD25::lL-2muteini birlesmesini ve uzatilmis sinyallemeyi tesvik ettiginden, avantajli oldugu düsünülmüstür. Bununla birlikte, mutasyon sayisini azaltma immünojenisite potansiyelini düsürebilir. haMut1 yüksek afinite mutasyonlari V69A ve Q74P ile veya bunlar olmadan, N88D veya V91K muteinleri bir Fc homodimerinin C-ucuna füzyonlar olarak eksprese edilmistir ve biyoaktivite için karsilastirilmistir. pSTAT5 stimülasyon analizlerinde, homodimerizasyon monomerik muteine kiyasla sinyal gücü üzerinde herhangi bir etkiye sahip degildir. Yüksek afinite mutasyonlari V69A'nin ve Q74P'nin tersine çevrilmesi de pSTAT5 sinyallemesini etkilememistir. T hücresi büyüme analizlerinde, yüksek afinite mutasyonlari geleneksel CD4 T hücreleri ve CD8 T hücreleri üzerindeki aktiviteyi azaltmistir ancak regülatör T hücreleri üzerindeki aktiviteyi azaltmamistir (SEKIL 5). Yüksek afinite mutasyonlari ayrica, NK hücrelerindeki proliferatif yanitlari da degistirmemistir (SEKIL 6). Yüksek afinite mutasyonlarinin in vivo T hücresi yanitlarini etkileyip etkilemedigini belirlemek amaciyla, beserilestirilmis fareler (insan CD34+ hematopoietik kök hücreleri ile yeniden-yapilandirilmis NOD.SCID.II2rg-null farelerini) Fc.IL-2 muteini füzyon proteinleri ile dozlanmistir ve Treg genislemesini takip ettik. Yedi haftalik NOD.SCID.I12rg-null (NSG) fareleri (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) irradyasyona (180 rad) ugratilmistir ve 94.000 insan fetal karaciger CD34+ hematopoietik kök hücreleri ile yeniden-yapilandirilmistir. 21 haftada, fareler (PBL'nin akis sitometresi ile belirlenen) kimerizm yüzdesinin esit dagilimina göre 6 gruba dagitilmistir ve bunlara gün 0'da ve gün 7'de gösterilen Fc.muteini füzyon proteinlerinin veya PBS'nin 1 ug'lik subkütan enjeksiyonlari verilmistir. Gün 11'de, kandaki T hücresi alt-kümesi sikliklari akis sitometrisi ile belirlenmistir. Her bir hayvan için 1 ug'lik düsük dozda, yüksek afinite mutasyonlari Treg genislemesini tek basina N88D veya V91K mutasyonlari ile gözlemlenenin ötesine iyilestirmemistir (SEKIL 7). Treg genislemesi FOXP3'CD4+ T hücrelerinin insan B ve T hücrelerinin ve fare miyeloid hücrelerinin bir karisimini içeren toplam periferik kan Iökositlerine (PBL'ye) kiyasla bollugu arttirmamasi açisindan selektiftir. Dahasi, daha yüksek dozlarda, yüksek afinite mutasyonlari CD25*FOXP3` T hücrelerinde bir artisi tesvik etmistir dolayisiyla Treg selektivitesini azaltmistir. Böylelikle, Fc homodimeri baglaminda, yüksek afinite mutasyonlarinin tercihli Treg büyümesini tesvik etmek için gerekli oldugu düsünülmemistir. Fc.WT IgG1Fc(N (SEO ID NO:17) (SEO ID NO:18) -Ili - i- A r .. i - i. l i (SEO ID NO:19) (SEQ ID NO:20) i 4 _ - -› - - --_ _ii -iu, i Örnek 5 -- Fc.lL-2 muteinlerinin uzatilmis hücre yüzeyi CD25 birlesmesi Beserilestirilmis fare suslarindan elde edilen bir beklenmedik sonuç, bunlarin azaltilmis sinyalleme kapasitesine ragmen, muteinlerin Fc'ye kiyasla daha güçlü Treg zenginlestirmesini indüklemesidir. Fc.WT ile görülene kiyasla daha büyük Treg zenginlestirmesi ve FOXPS yukari dogru regülasyonu 1 pg/fare olan bir dozda (Sekil 7) ve 0,5 pg/fare olan bir daha düsük dozda (SEKIL 8) gözlemlenmistir. Bu arttirilmis potens in vivo T hücreleri tarafindan azaltilmis tüketimden kaynaklanmis olabilir, bu Fc.lL-2 muteini uzatilmis sinyalleme için erisilebilir hâle getirir. Bununla birlikte, in vitro ve in vivo PK çalismalari aktive edilmis T hücresi kültürlerinden elde edilen süpernatantlarda veya dozlanmis farelerden elde edilen serumda Fc.WT'ye kiyasla Fc.V91K'nin veya Fc.N88D'nin anlamli bir sekilde arttirilmis devamliligini gösterememistir. Fc füzyonlari iki IL-2 muteini alanini daralttigindan, arttirilmis endozomal geri-dönüsüm, CD25 için arttirilmis aviditeden dolayi uzatilmis hücre yüzeyi birlesmesi ile sonuçlanabilir. Gerçekte, Fc.V91K'nin ve Fc.N88D'nin füzyon proteinlerine bir kisa maruziyeti takiben önceden aktive edilmis T hücrelerinin yüzeyi üzerinde Fc.WT'ye kiyasla daha etkili bir sekilde devamlilik gösterdigi bulunmustur (SEKIL 9A ve B). Primer PBMC'Ier 100 ng/ml OKT3 ile iki gün boyunca ön-stimüle edilmistir. Hücreler hasat edilmistir, dört kere yikanmistir ve gece boyu vasat içinde dinlendirilmistir. Hücreler akabinde 37°C'de 30 dk boyunca 400 pM Fc.IL-2 ile darbelenmistir. Darbelenmeden sonra, hücreler ya bir yikamadan sonra TO için hasat edilmistir ya da 12 ml ilik vasat içinde bir ilave üç kere yikanmistir ve dört saat boyunca kültürlenmistir. Hücre ile iliskilendirilmis Fc-IL-2'yi saptamak için, hücreler anti-insan lgG-FITC (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) ve anti-CD25-APC ile boyanmistir (SEKIL Fc.WT'ye göre Fc.V91K ve Fc.N88D ile lL-2R sinyalinin sürekliligi, ayni zaman noktalarinda fosfo-STAT5'in hücre içi immün saptamasi yoluyla gözlenmistir. FOXP3+CD4+ T hücrelerine yönelik fosfo-STAT5 MFI gösterilir (SEKIL 98). Örnek 6 -- Füzyon dizisi optimizasyonu Farelerdeki preklinik çalismalarda, Fc.IL-2 muteinleri aynen molekülün serum konsantrasyonlari yalnizca Insbir Fc kismininki ile karsilastirildiginda, dolasimdaki insbir FC katabolitinin göstergesi olan, diferansiyel maruziyeti göstermistir. Fc.IL-2 muteinlerinin in Vivo kararliligini ve farmakokinetigini optimize etmek amaciyla, bunlarin sistemik dolasimda ve retiküloendotelyal sistem yoluyla geri-dönüsümü sirasinda Fc.IL- 2 muteinlerinin proteolitik parçalanmasi üzerindeki etkisi için füzyon dizisi modifikasyonlari karakterize edilmistir. Asagidaki yapilar in vitro ve in vivo proteolitik parçalanma için degerlendirilmistir. ihLQTC 'JL' l_ GLS iLL'QTGJ !O.I`tl_'lfk;'_ iPJ'?'i`(':_MciÂi_ßiß9A s; r -l' iti..'_r H' i '4i Kararlilik toplam insbir Fc'sinin zamanla konsantrasyonlarini aynen Fc.lL-2 muteinininki ile karsilastiran kantitatif immünoanalizler ile ölçülmüstür. Fc.lL-2 muteinlerinin proteolizi anti-IL-2 ve anti-insbir Fc antikorlarindan yararlanilan western blot analizi akabinde katabolitlerin immüno-yakalanmasi ve kütle spektrometrisi ile karakterizasyon ile dogrulanmistir. In vitro ve in vivo örneklerden (AIa_AIa)_G4S'nin katabolitlerinin kütle spektrometrisi ile karakterizasyonu FC alaninin C-ucu Lys'sini bir proteolitik klevaj yeri olarak tanimlamistir. FC alaninin C-ucu lizininin silinmesi veya mutasyonu ((N, C-ucu Iizini olan Fc yapilarina ((AIa_AIa)_G4S) kiyasla 37°C'de fare serumunda uzatilmis in vitro kararlilik ile sonuçlanmistir. Bu uzatilmis in vitro serum kararliligi zamana karsi Fc.lL-2 muteini serum konsantrasyonu egrisi altinda kalan alan (AUC) ile ölçüldügü üzere farelerde daha büyük maruziyete dönüsmüstür. C-ucu FC Iizininden yoksun olan Fc.lL-2 muteinlerinin bu uzatilmis kararliligi ayrica sinomolgus maymunlarindan ve insanlardan elde edilen serumda da in vitro gözlemlenmistir. IL-2'nin Thr-3'ünün Ala'ya mutasyonu ((N fare serumunda ve rekombinant insan katepsin D'si ve L'si ile ayri inkübasyonlarda ((N 37°C'de azaltilmis in vitro kararlilik ile sonuçlanmistir. Bu azaltilmis in vitro serum kararliligi (N_AAPA için farelerde in vivo daha düsük maruziyete (AUC) dönüsmüstür. In vitro ve in vivo örneklerden elde edilen (N297G_Kt0A)_AAPA'nin katabolitlerinin kütle spektrometrisi ile karakterizasyonu IL-2 muteini alaninin Lys 8'ini ve Lys 9'unu (N297G_Kt0A)_AAPT'nin es-deger örnekleri için gözlemlenmemis proteolize yatkin rezidüler olarak tanimlamistir. (N_AAPA'nin 37°C'deki azaltilmis kararliligi ayrica, sinomolgus maymunlarindan ve insanlardan elde edilen serumda da in vitro gözlemlenmistir. Bu bölgedeki glikosilasyonun öneminden dolayi ve füzyon proteininin üretilebilirligini potansiyel olarak iyilestirmek için, füzyon dizileri O-bagli glikosilasyondan daha ziyade N-bagli glikosilasyonu tesvik etmek için, asagida oldugu sekilde, degistirilmistir. Orijinal lamFrmîch-iolxy:Gamihuil-7ivâi (CUSAi PQYSLS.' SFGS: 71"" IT. 7:? i:~,i "ji ;- i:- ;- Deg'istirilmis Örnek 7 - Sinomolgus Maymunu PKIPD Belirlenmesi Standart IL-2 immün stimüle etme terapileri arzu edilmeyen yan etkilerden kaçinmak için dozlam sikluslari arasinda (herhangi bir maruziyetin olmadigi) ilaçsiz tatiller gerektirir. Aksine, Treg genislemesi veya stimülasyonu terapileri Treg stimülasyonu için yeterli olan sürdürülmüs dip ilaç düzeyleri (serum cm) ile ancak immün aktivasyona yol açan ilaç düzeyleri altinda olan maksimum maruziyetler (serum Cmaks) ile uzatilmis maruziyet gerektirebilir. Bu örnek, pro-inflamatuar immün aktivasyon için gerekli oldugu düsünülen ilaç düzeyleri altinda olan maksimal maruziyetleri (serum Cmaks) idame ettirirken uzatilmis hedef kapsama (serum Cmin) için Sinomolgus maymunlarina yari- ömrü uzatilmis muteinlerin dozlam stratejilerini gösterir. Sinomolgus maymunlari, üç grubun (A-C) subkütan olarak dozlanmasi ve bir grubun (D) intravenöz olarak dozlanmasi ile, dört grup (A-D) hâlinde FC.V91K asagida genel hatlariyla özetlenen dozlam stratejisinin her biri için dört biyolojik olarak naif erkek Sinomolgus maymunu dozlanir. Yari-ömrü uzatilmis muteinlerin subkütan dozlami daha düsük maksimal maruziyet (serum Cmaks) ve/veya bir daha güçlü farmakolojik yanit (Treg genislemesi) ile sonuçlanan daha fazla Ienfatik emilime olanak saglayabilir. Grup A için dozlam stratejisi siklus 1 için Gün 0'da, 2'de ve 4'te her bir kilogram için ardisik üç 10 mikrogramlik ve Gün 14'te her bir kilogram için 10 mikrogramlik dozdan olusur, bu bir daha düsük maksimal maruziyet (Cmaks) idame ettirirken her bir kilogram için 50 mikrogramlik bir daha yüksek baslangiç dozuna benzer uzatilmis hedef kapsamaya olanak saglar. Grup B için dozlam stratejisi, Grup A ile karsilastirma için Gün O'da ve 14'te dozlanan her bir kilogram için 50 mikrogramdir. Grup C için dozlam stratejisi, Gün 0'da ve 28'de dozlanan her bir kilogram için 50 mikrogramdir. Dip kapsamanin Treg zenginlestirmesini sürdürmek için gerekli olup olmadiginin ve dozlam sikluslari arasinda bir ilaçsiz tatilin yarari olup olmadiginin belirlenmesine olanak saglama. intravenöz dozlam kolu grup D için dozlam stratejisi Gün O'da dozlanan her bir kilogram için 50 mikrogramdir, bu maksimal maruziyetlerin (Cmaks) ve Treg zenginlestirme farkliliklarinin subkütan dozlaminkiler ile bir karsilastirmasina olanak saglar. Farmakokinetik (aynen molekül ve toplam insbir Fc'si için kantitatif immünoanaliz), anti- ilaç antikorlari, yayilan çözünebilen CD25 ve serum sitokinleri (IL-18, TNF-oi, IFN-y, IL- , lL-5, lL-4 ve lL-13), belirtilen her bir doz grubu için asagidaki zaman noktalarinda Grug A: doz-öncesi (birinci siklus; doz 1), 48 (doz-öncesi birinci siklus; doz 2), 96 (doz- ve 672 saat. Farmakodinamikler (periferik kan Treg'lerinin, regülatör-olmayan CD4 ve CD8 T hücrelerinin ve NK hücrelerinin immüno-fenotiplemesi ve sayilmasi)belirtilen her bir doz grubu için asagidaki zaman noktalarinda ölçülür: (doz-öncesi ikinci siklus), 456 ve 576 saat. Grup D: doz-öncesi (birinci siklus), 120 ve 240 saat. Hematoloji ve klinik kimya tüm hayvanlar ve her bir doz grubu için doz-öncesi ve ilk dozdan 24 saat sonra doz gruplari için degerlendirilir. Asagidaki parametreler degerlendirilir. Hematoloii: . lökosit sayimi (toplam ve mutlak diferansiyel) - eritrosit sayimi . hemoglobin . hematokrit . ortalama korpüsküler hemoglobin, ortalama korpüsküler hacim, ortalama korpüsküler hemoglobin konsantrasyonu (hesaplanan) . mutlak retikülositler . platelet sayimi . kan hücresi morfolojisi . kirmizi hücre dagilim genisligi . ortalama platelet hacmi Klinik Kimya: . alkalin fosfataz - toplam bilirubin (toplam bilirubin 1 mg/dL'yi astiginda direkt bilirubin ile) - aspartat aminotransferaz . alanin aminotransferaz . gama glutamil transferaz o üre nitrojen . kreatinin . toplam protein . albümin . globülin ve A/G (albümin/globülin) orani (hesaplanan) . glikoz . toplam kolesterol . trigliseritler - elektrolitler (sodyum, potasyum, klorür) - kalsiyum Örnek 8 - Aglikosile Edilmis lgG1 Fc Dogal olusumlu IgG antikorlari agir zincirin sabit alan 2'sinde (CH2'de) bir glikosilasyon yerine sahiptir. Örnegin, insan IgGl antikorlari Asn297 pozisyonunda (EU numaralandirmasi) yer alan bir glikosilasyon yerine sahiptir. Günümüze kadar, aglikosile edilmis antikorlar yapmak için stratejiler Asn rezidüsünü fiziko-kimyasal özellikler açisindan Asn'ye benzeyen bir amino asit (örn., Gln) ile veya polar gruplari olmayan Asn yan zincirini taklit eden Ala rezidüsü ile degistirmeyi içerir. Bu Örnek Asn'yi Glisin ile degistirmenin (N297G'nin) yararlarini gösterir. N297G Fc, daha iyi biyofiziksel özellikleri ve üretilebilirlik özellikleri (öm, saflastirma sirasinda geri- kazanim) olan aglikosile edilmis moleküllerdir. Fc fragmanlarinin ve IgG antikorlarinin bilinen çok sayida kristal yapisinin incelenmesi glikosile edilmis kivrim segmenti, özel olarak glikosile edilmis Asn297 pozisyonu, civarinda kayda deger konformasyonel esneklik ortaya çikarmistir. Bilinen kristal yapilarinin çogunda, Asn297 pozitif omurga dihedral açilari benimsemistir. Gly, yan zincir atomlarinin yoklugundan dolayi pozitif omurga dihedral açi benimsemeye yönelik yüksek egilime sahiptir. Dolayisiyla, bu konformasyon ve yapi nedenine dayanarak, Gly, N297Q'ya veya N297A'ya kiyasla Asn için bir daha iyi yer-degistirme olabilir. Asn297'yi Gly ile mutasyona ugratma, saflastirma prosesinde ve biyofiziksel özelliklerde çok iyilestirilmis geri-kazanimi (veya etkililigi) olan aglikosile edilmis moleküllere yol açar. Örnegin, protein A havuzundan geri-kazanimin (nihai verimin) kazanim yüzdesinin yüksek moleküler agirlikli agregasyonu ve/veya yanlis-katlanmis türleri gösteren bir kuyruk pikinden dolayi oldugunu ortaya çikarmistir. Bu sonuç bir daha büyük, 2 L'lik ölçekteki yürütmede yeniden-konfirme edilmistir. Biyofarmasötik endüstrisinde, büyük-ölçekte üretime potansiyel ihtiyaci, örn., bir ilaç olarak satilma potansiyeli, olan moleküller molekülü büyük-ölçekte üretim ve saflastirma için uygunsuz yapan riski azaltmak amaciyla çok sayida özellik için degerlendirilir. Üretilebilirlik degerlendirmelerinde, N297G pH degisimlerine dayanikliligi ortaya çikarmistir. N297G herhangi bir agregasyon problemine sahip N2976'nin daha iyi üretilebilirlik özelliklerine sahip olmasina ragmen, bu test edildigi fonksiyonel analizlerin tümünde N297Q'ya ve N297A'ya benzerdir. Örnegin, ADCC analizlerinde, N297G, N297Q'ya ve N297A'ya benzer sekilde sitotoksisiteden yoksundur. Örnek 9 - Stabilize edilmis aglikosile edilmis lgG1 Fc'si Bu Örnek, mühendislik uygulanmis disülfit bagi (baglari) uygulama ile lgG antikor iskelelerinin kararliligini iyilestirmenin bir yöntemini tarif eder. Dogal olusumlu lgG antikorlari kararli moleküllerdir. Bununla birlikte, bazi terapötik uygulamalar için, mutasyonlar yapmak veya aglikosile edilmis moleküller olusturmak gerekli olabilir. Örnegin, aglikosile edilmis lgG molekülleri ADCC'den kaçinmaya ve Fc-gama reseptörlerini baglamaya yönelik bir ihtiyacin oldugu terapötik endikasyonlarda kullanilabilir. Bununla birlikte, aglikosile edilmis lgG1, glikosile edilmis lgGi'e kiyasla çok daha düsük erime sicakligina sahiptir (CH2 alani erime sicakligi yaklasik 10°C; 70°C'den 60°C'ye, düser). Gözlemlenen daha düsük erime sicakligi aglikosile edilmis edilmis lgG1, glikosile edilmis IgG1'e kiyasla düsük pH'ta arttirilmis agregasyon düzeyine sahiptir. Disülfit baglarina mühendislik uygulamak amaciyla, C-alfa atomlari arasinda mesafe hesaplamayi içeren bir yapi temelli yöntem ilk olarak Fc bölgesi içinde 54 rezidü çiftini Cys'ye mutasyon için tanimlamak amaciyla kullanilmistir. Bu 54 yer ilaveten 4 rezidü Kullanilan kriterlere, (i) CH2 alani içindeki, (ii) kivrimlardan, dönüslerden ve karbonhidratlardan uzaktaki, (iii) Fc-gama reseptöründen ve FcRn etkilesim yerlerinden uzaktaki, (iv) çözücü erisilebilirlik (tercih edilen gömülmüs pozisyonlar), vb. pozisyonlari dâhil edilmistir. Eslestirilmis sistein sübstitüsyonlari aglikosile edilmis N297G Fc baglaminda olusturulmustur. Indirgenmemis peptit haritalama analizi, dört mühendislik uygulanmis yerin üçünün beklenildigi ve bu baglamda tasarlandigi üzere disülfit baglari olusturdugunu ortaya çikarmistir. V25QC-L3060 mutasyonu disülfit bagi dogru bir sekilde olusturmamistir ve hâlihazirda CH2 alaninda bulunan natif disülfit ile yanlis- N297G mutasyonuna disülfit bagi ekleme, tek basina N297G mutasyonuna kiyasla siçanlara uygulandiginda iyi farmakokinetige sahiptir (sirasiyla, on bir günlük ve dokuz günlük t1/2). Bu, bes günlük bir t1/2'ye sahip olan, önceden yayimlanmis CH2 alani disülfit bagi için siçanlarda gözlemledigimiz farmakokinetik profilinin tersidir (Gong et CH2 alanindaki bir disülfit bagina mühendislik uygulama, aglikosile edilmis molekülün kararliligini glikosile edilmis IgG1 molekülleri ile esit düzeyde iyilestirir (Diferansiyel Taramali Kalorimetri ile belirlendigi üzere erime sicakliginda 10 ila 15°C`Iik iyilestirme). Burada tarif edilen mühendislik uygulanmis terler, disülfit karilmasina yol açmaz ve disülfitler tahmin edildigi üzere popülasyonun yaklasik olarak %100'ünde olusturulur. Daha önemlisi, CH2 alanindaki yayimlanmis disülfit bagi yerinden farkli olarak, burada tarif edilen disülfit baglar siçan PK'sini etkilemez. Sinomolgus maymunlarindan ve insanlardan alinan T ve NK hücrelerindeki yanitlar üzerinde V91K ve N88D mutasyonlarinin etkileri in vitro karsilastirilmistir. CD25'in (tam kan pSTAT5 yanitlarindaki CD4*CDZS+ kapilanmis T hücreleri) varliginda, sinomolgus aktivitesi ile karsilastirildiginda göz ardi edilebilir. Ancak, CD25'in (tam kan pSTAT5 yanitlarindaki CD25' kapilanmis T hücreleri ve NK hücre proliferasyonu) yoklugunda, V91K mutasyonu sinomolgus IL-2R sinyalini büyük ölçüde azaltmistir. Bunun aksine, Fc.N88D insan tam kaninda T hücrelerindeki Fc.V91K'nin sinyal etkisine daha benzer olan sinomolgus tam kanda CD25+ T hücrelerinde azalmis sinyal gösterir. Tablo 2'de özetlenen in vitro veriler, sinomolgus maymunlarinda daha zayif agonist, Fc.N88D, ile gözlenen terapötik pencerenin, insan öznelerinde Fc.V91K'nin etkilerinin tahmini olacagini ileri sürer. Tablo 2. Insan ve sinomolgus hücrelerinin in vitro yanitlari üzerinde V91 K veya NBSD mutasyonlarinin etkilerinin özeti Tam kan pSTATS NK hücre CD25+ T CD25- hücreleri hücreleri proliferasyonu Sinomolg us üzerinde V91K i i Insan üzerinde V91K i li li Sinomolgus üzerinde Insan üzerinde N88D li li iii Iki in vivo çalisma, sinomolgus maymunlarinda gerçeklestirilmistir. Birinci sinomolgus maymunu çalismasi, tam veya kismi farmakokinetik (PK) ve farmakodinamik (PD) düsüsün, ikinci bir doza verilen yanitin büyüklügünü degistirip degistirmeyecegini belirlemek üzere Fc.V91K'nin iki haftalik veya dört haftalik dozlama araliklarini karsilastirmak üzere tasarlanir (SEKIL 10A ve B). Güçlü bir Treg yaniti (50 ug/kg) verdigi tahmin edilen bir birinci dozu ve terapötik pencerenin alt Iimitlerini (10 ug/kg) bulmak üzere ikinci bir doz kullanilmistir. 10 ug/kg'nin çok düsük olup olmadigi bilinmediginden, dozlar bir yanit olasiligini arttirmak üzere Günler 1, 3 ve 5'te verilmistir. Bu doz rejimleri, tek bir 50 ug/kg subkütanöz (SC) doz, ancak düsük bir C- maks degeri ile elde edildigi üzere Gün 5'i takiben ayni maruziyeti vermistir. 50 ug/kg intravenöz (IV) grubu, lenf ve kan kompartimanlarinda daha yüksek ilaç maruziyetine bagli olarak PDldeki potansiyel farkliliklari arastirmak üzere dahil edilmistir. Bu çalismanin sonuçlari, doz seviyelerinin her birinin olumsuz durumlar (AE'Ier) veya Teff veya NK büyümesi olmadan güçlü bir Treg büyüme yanitini indükledigini ve Gün 14 veya 28'deki ikinci doza verilen yanitlarin es deger oldugunu göstermistir. Tablo 3. Birinci Sinomolgus Maymunu Çalismasina Yönelik Çalisma Tasarimi Grup # hayvan Doz (gün) Doz Fc.V91 K 1 4 1,3,5, 15 10 ug/kg SC 2 4 1, 15 50 pg/kg SO 3 4 1, 29 50 iJg/kg sc 4 4 1 50 ug/kg IV terapötik pencerenin marjinlerini bulmak üzere ve 3, 10, 100, 200 tig/kg (SC) PROLEUKlN® ile bunu karsilastirmak üzere tasarlanmistir. PROLEUKlN® dozlari, yayinlanmis insan ve insan olmayan primat çalismalarina (Hartemann et al., 2013, vaskülit ve Tip 1 diyabette (T1 D) düsük dozlu IL-2 klinik deneylerini taklit etmek üzere QDXS uygulanmistir. Tablo 4. Ikinci Sinomolgus Maymunu Çalismasina Yönelik Çalisma Tasarimi Grup # Test Maddesi 1. döngü tedavisi Tedavi 2. döngü tedavisi Tedavi hayvan günü: Doz (SC) günü: Doz (SC) Sekiller 11A-F'de, hücresel yanitlarin, vücut sicakliginin ve serum CRP kinetiklerini gösterir. X-ekseni üzerindeki zaman çizelgesi, birinci doz günü gibi, Gün 1'den ziyade Gün 0 ile baslar. Kombinasyonda, iki sinomolgus maymunu çalismalari, IL-2 muteinlerinin, PROLEUKIN® ile edilene göre daha genis bir terapötik pencere ile Treg bakimindan daha büyük zenginlesmeyi indükledigini göstermistir (SEKIL 12A ve B). PROLEUKIN® ile Treg bakimindan zenginlesme, NK ve eozinofil büyümesi ile paralel hale gelmistir. Herhangi bir belirli teoriye bagli kalinmadan, eozinofil büyümesi, IL-2 terapisine verilen iyi bilinen bir yanittir ve CDZS+ dogal Ienfoid hücrelerinden lL-2-indüklü lL-5'in sonucudur. CD4 ve CD8 Teff büyümesi, Treg'leri CD4 T hücrelerinin %25-35'ine arttiran dozlarda ortaya çikmistir. Bunun aksine, Fc.V91K ve Fc.N88D, NK hücreleri ve eozinofilleri üzerinde daha büyük selektiflige sahip Treg büyümesini indüklemistir ve Teff büyümesini destekleyen dozlar, Treg'i CD4 T hücrelerinin %40'ina zenginlestiren yukaridaki dozlardir. Literatürde verilen düsük dozlu IL-2 klinik deneylerinde, meydana gelen birinci AE'Ier, grip benzer semptomlar ve atestir. Bu nedenle, terapötik pencerelerin karsilastirilmasina ek olarak, bu çalismanin hedefi, atesten önce gelen bir biyomarkörü kesfetmektir. SEKIL iZC'de gösterildigi üzere, iki yüksek PROLEUKIN® dozu ile CRP seviyelerinin, vücut sicakligina paralel oldugu bulunmustur. Fc.V91K ile vücut sicakligindaki orta dereceli bir artis en yüksek dozda tespit edilmistir ve bir sonraki düsük dozda CRP'de küçük bir artis gözlenmistir. Bu nedenle CRP, öznenin mevcut bulusun bir molekülü ile tedaviye verdigi yaniti izlemek ve/veya bir hastadaki doz artisinin üst limitini belirlemek üzere kullanilabilir. Fc.V91 K- veya Fc.N88D ile tedavi edilen hayvanlarda daha aza belirgin olan veya bulunmayan belirli toksisiteler ayrica PROLEUKIN® ile tedavi edilen hayvanlarda gözlenmistir (SEKIL 12D). Plateletlerin, nötrofillerin ve albüminin seviyelerinin, PROLEUKIN® ile tedavi yoluyla azaltildigi bulunurken, Treg bakimindan benzer veya daha büyük zenginlesme ile sonuçlanan Fc.V91K veya Fc.N88D dozlari, bu parametrelerde az veya sifir azalma üretmistir. Birlikte alindiginda, bu veriler, Fc.V91 K- veya Fc.N88D ile hastalarin tedavisine yönelik terapötik pencerenin, PROLEUKIN® ile olandan büyük ölçüde daha büyük olmasinin beklendigini gösterir. Seçilmis zaman noktalarinda, Örnek 11'in birinci sinomolgus çalismasindan elde edilen serumlar, anti-ilaç antikorlarina (ADA) yönelik test edilmistir (SEKIL 13). Fc.V91K spesifikliginin yarismali olarak dogrulandigi numunelere yönelik ADA sinyal/gürültü verileri gösterilmistir. ADA'Iarin test edildigi zaman noktalari, x ekseni üzerindeki dikey hatlar ile gösterilir. Grup 1`de, son dozdan en az on bes gün sonra bir hayvan ADA üretmistir, Grup 2'de, test edilen hiçbir hayvan ADA için pozitif degildir ve Grup 3'te, ADA birinci dozdan on bes veya daha fazla gün sonra üç hayvanda sürekli olarak görülmüstür. Gün 1632'de 50 pg/kg ile Gruplar 1 ve 2'nin tekrarlanarak dozlanmasi üzerine, test edilen ilave hayvanlarin hiç biri, dört hafta sonra (Gün 190) ADA için pozitif degildir. En güçlü ADA sinyallerini (210, 212) üreten Grup 3'teki iki hayvan, bu hayvanlarda ikinci dozdan sonra gözlenen azalmis C-maks ile uyumlu azalmis bir PD yaniti sergilemistir. Test edilen dördüncü gruptaki (50 Lig/kg IV) hiçbir hayvan ADA içinde pozitif degildir. ADA, IL-2 ve FC domenlerine yönelik spesifiktir, bu durum, sinomolgus IL-2 ve insan IL-2(V91K,C125A) arasindaki sekiz amino asit farkliligi nedeniyle beklenebilir. ADA'nin nötralize edici aktivitesi test edilmemistir. TR TR TR TR TR TR TR TR TR