RS58982B1 - Lečenje hbv - Google Patents

Description

Opis pronalska

Oblast tehnike na koju se pronalazak odnosi

[0001] Ovaj pronalazak je usmeren na agens za RNK interferenciju (RNKi) i upotrebu tog RNKi agensa za lečenje hepatitis B infekcije kod pojedinaca, kao i farmaceutske kompozicije koje sadrže RNKi agense pronalaska.

Poznato stanje tehnike

[0002] Hepatitis je opšti termin koji označava 'upalu jetre' i ima brojne uzroke. Virusni uzroci su među najčešćim i mogu biti prouzrokovan virusom hepatitisa A, B, C, D ili E. Virusni hepatitis B (HBV) je posebno ozbilјna i česta infektivna bolest jetre koja pogađa milione lјudi širom sveta.

[0003] HBV je hepatotrofni DNK virus koji pripada familiji Hepadnaviridae. Celokupna dužina virusnog genoma je oko 3,2 kb i sa četiri je otvorena okvira čitanja (ORF) koja uključuju površinski antigen ("S gen"), centralni antigen ("C gen"), gen za DNK polimerazu ("P gen ") i gen neodređene funkcije označen kao "X gen".

[0004] Trenutno, više od 2,000 miliona lјudi je bilo zaraženo HBV-om u nekom trenutku svog života i od toga je oko 350 miliona ostalo hronično zaraženo i postalo nosilac virusa. HBV infekcija može prouzrokovati akutni i hronični hepatitis tipa B i može dovesti do razvoja hronične insuficijencije jetre, ciroze i hepatocelularnog karcinoma. Pored toga, nosioci HBV mogu prenositi bolest dugi niz godina.

[0005] HBV se prenosi perkutanim ili parenteralnim kontaktom sa zaraženim telesnim tečnostima ili krvlјu. Najčešći način infekcije je vertikalna transmisija sa majke na njenu bebu, a kod odraslih putem seksualnog odnosa ili deljenjem intravenskih igala ili opreme za bušenje ušiju. Mnogi slučajevi akutne HBV infekcije se javlјaju bez traga o načinu infekcije.

[0006] Osobe sa hroničnom HBV infekcijom ("nosioci" - širom sveta oko 350-400 miliona lјudi) imaju 12-300x veći rizik razvoja hepatocelularnog karcinoma nego osobe koje nisu nosioci, a na globalnom nivou, HBV je uzrok 60-80% primarnih karcinoma jetre u svetu. Svake godine oko 25% od preko 4 miliona akutnih kliničkih slučajeva (tj. 1 milion lјudi širom sveta) umire od hroničnog aktivnog hepatitisa, ciroze ili kancera jetre indukovanih HBV-om. Posledica je da HBV zauzima drugo mesto kao poznati humani karcinogen, odmah nakon duvana. Iako je vakcina za HBV-a u širokoj upotrebi nekoliko decenija, stopa prevalencije HBV u populaciji je i dalјe visoka. Postojeće terapije za hroničnu HBV infekciju imaju samo ograničen inhibitorni efekat na ekspresiju i replikaciju virusnih gena kod većine hronično inficiranih pacijenata. Lamivudin, na primer, suprimira replikaciju HBV kod nosilaca, ali je efekat reverzibilan ukoliko se terapija prekine. Štaviše, glavno ograničenje hronične terapije Lamivudinom je razvoj virusne rezistencije, koja se obično razvija nakon 6 meseci lečenja. Rezistencija je obično povezana sa mutacijama u visoko evolutivno očuvanom katalitičkom regionu gena za HBV polimerazu.

[0007] Iz navedenih razloga, ostaje potreba za novim terapijskim agensom za lečenje HBV infekcije. Ovaj pronalazak je usmeren na agens RNK interferencije (RNKi) i upotrebu tog RNKi agensa za lečenje hepatitis B infekcije kod pojedinaca.

[0008] Put RNKi započinje enzimom Dicer, koji cepa molekule dvolančane RNK (dsRNK) u kratke fragmente (obično označene kao siRNK) od -20-25 nukleotida. Jedan od dva lanca svakog fragmenta, poznat kao vodeći lanac ili aktivan lanac, se potom ugrađuje u utišavajući kompleks indukovan sa RNK (RISC), vezivanjem za člana porodice tzv. argonaut proteina. Nakon ugradnje u RISC, baze vodećeg lanca se sparuju sa njegovom ciljnom iRNK i smatra se da se ili inhibira ciljni molekul inhibicijom translacije (odugovlačenjem mehanizma translacije) i/ili indukcijom cepanja iRNK, čime se spreča da se ona upotrebi kao matrica za translaciju.

[0009] Iako su fragmenti proizvedeni od strane Dicer enzima dvolančani, samo vodeći lanas vodi utišavanju gena. Drugi lanac nasuprot vodećem, koji se obično označava kao prateći lanac, lanac nosač ili *, često se razgrađuje tokom aktivacije RISC (Gregori R, Chendrimada T, Cooch N, Shiekhattar R (2005). "Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing". Cell 123 (4): 631-40). Smatra se da je udruživanje u RISC pod nadzorom enzima koji odabira koji deo dsRNK Dicer proizvoda se ugrađuje u RISC. Ovaj lanac je obično onaj čiji je 5’ kraj manje čvrsto uparen sa njegovim komplementom, a izgleda i da postoji jasna pristrasnost za A na 5' poziciji, i u manjoj meri za U, koja olakšava vezivanje za neke argonaut proteine (Schwarz DS, Hutvagner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD (2003). "Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex". Cell 115 (2): Frank F, Sonenberg N, Nagar (2010) "Structural basis for 5’-nucleotide base-specific recognition of guide RNA by human AGO2". Nature.465 (7299): 818-22).

[0010] Pokazana je inhibicija replikacije i ekspresije gena HBV-a, upotrebom AAV vektora za istovremenu isporuku dve ili tri kratke RNK sa strukturama ukosnice, koje ciljano deluju na različite gene HBV-a, posebno na HBV gene S i X (Zhi Li, Ming-Liang He, Hong Yao, Qing-Ming Dong, Yang-Chao Chen, Chu-Yan Chan, Bo-Jian Zheng, Kwok-Yung Yuen, Ying Peng, Qiang Sun, Xiao Yang, Marie C Lin, Joseph J.Y. Sung, Hsiang-Fu Kung (2009). "Inhibition of HBV replication in vitro and in vivo with expressed long hairpin RNA" BMB Reports 42(1):59-64). Pokazana je i specifična inhibicija HBV replikacije sa eksprimiranom dugom RNK strukture ukosnice koja ciljano deluje na evolutivno očuvani HBx otvorenog okvira čitanja HBV-a (Weinberg, M.S., Ely, A., Barichievy, S., Crowther, C., Mufamadi, S., Carmona, S., Arbuthnot, P. (2007) Molecular Therapy 15: 534-541).

[0011] Upućivanje na bilo koje prethodno stanje tehnike u specifikaciji nije, i ne bi se trebalo smatrati, potvrdom ili bilo kojim oblikom sugestije da ovo prethodno stanje tehnike predstavlјa deo uobičajenog opšteg znanja u Australiji ili bilo kojoj drugoj nadležnosti ili da je razumno očekivati da će stučnjaci prethodno stanje tehnike konstatovati, razumeti i smatrati relevantnim.

Izlaganje suštine pronalaska

[0012] Predmetni pronalazači su otkrili da jedinstvene sekvence unutar genoma virusa hepatitisa B (HBV) mogu biti ciljna mesta inhibicije virusa. Cilјanim dejstvom na specifične regione jednog ili više gena, ekspresija ovih gena se inhibira, čime se efektivno "utišava" gen. Navedeno predstavlјa novu priliku za ciljano dejstvo na ekspresiju HBV u ćelijama u cilju lečenja HBV infekcije.

[0013] Opisan je agens za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi, od engl. DNA-directed RNA interference) (pri čemu je agens RNK molekul), kao i ekspresiona kaseta ili konstrukt za ekspresiju navedenog agensa u ćeliji (uklјučujući in vivo), u svrhu inhibicije ekspresije najmanje jednog gena virusa hepatitisa B (HBV), pri čemu agens sadrži efektorsku sekvencu (opisanu dodatno u nastavku teksta) dužine od najmanje 17 nukleotida, koja je komplementarna ili suštinski (tj. najmanje 85%) komplementarna predviđenoj sekvenci koja se transkribuje sa cilјnog regiona, pri čemu je cilјni region izabran iz grupe koja se sastoji od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 1-19. U alternativnom primeru izvođenja, cilјni region je sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 20-27. U ddRNKi agensu pronalaska, najmanje jedna efektorska sekvenca sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida iz sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

[0014] Efektorska sekvenca je usmerena na cilјni region cilјne sekvence RNK, pri čemu cilјna sekvenca predstavlja transkript cilјnog gena. Stoga, efektorska sekvenca je "usmerena na" cilјni region time što ima sekvencu koja je dovolјno komplementarna transkriptu cilјnog gena koji sadrži cilјni region. RNKi agens, kao što je ddRNKi agens, koji predstavlja dvolančani deo koji sadrži efektorsku sekvencu, može stoga "inhibirati ekspresiju cilјne genske sekvence" zahvaljujući tome što cilјna genska sekvenca sadrži cilјni region. Shodno tome, unutar ćelije inficirane sa HBV, RNKi agens je sposoban da inhibira ekspresiju cilјne genske sekvence, pošto je sekvenca efektora ("efektor" je definisan ispod) suštinski komplementarna (barem) regionu predviđene cilјne sekvence iRNK cilјnog gena. Ovo se može ilustrovati kratkim sekvencama koje slede:

5'ATTGCG3’ - cilјna sekvenca gena u DNK

5'AUUGCG3’ - iRNK cilјnog regiona/sekvenca nakon transkripcije gena

3'UAACGC5’ - efektorska sekvenca - koja je suštinski komplementarna regionu predviđene cilјne sekvence iRNK.

[0015] Cilјni region je obično region iRNK gena za koji je predviđeno da bude utišan ili da se smanji njegova ekspresija (na nivou transkripcije ili translacije).

[0016] Agens je dizajniran tako da sadrži i efektoru komplementnu sekvencu, tj. sekvencu koja je suštinski komplementarna efektorskoj sekvenci tako da će ona težiti da se spari i time obrazuje dvolančani segment RNK - stepen komplementarnosti koji je potreban je preciznije objašnjen u nastavku teksta. Štaviše, obično će jedan kraj dvolančanog segmenta biti povezan sa sekvencom petlјe tako da se obrazuje struktura oblika "ukosnice". Ovo je takođe poznato kao struktura "prekinutog invertovanog ponovka", pošto DNK koja kodira takvu RNK sekvencu sadrži invertovani ponavak regiona ciljnog gena koji se transkribuje u efektorsku sekvencu, prekinut tzv. nabijenom (engl. staffer) ili spejser sekvencom koja kodira petlјu.

[0017] U pronalasku, agens sadrži više od jedne efektorske sekvence. Višestruki efektori mogu ciljano delovati na isti region HBV gena, na različite (moguće preklapajuće) regione istog gena i/ili na različite HBV gene. RNKi agensi kao što su ddRNKi agensi, mogu sadržavati 2 ili 3 različite efektorske sekvence. Kao što je prethodno objašnjeno, ddRNKi agens sadrži efektoru komplementnu sekvencu za svaku efektorsku sekvencu, obrazujući tako parove tipa efektor - komplement efektora (tj. parove prvi efektor - komplement prvog efektora, drugi efektor – kompelment drugog efektora itd). Ovakvi parovi mogu, ali ne moraju, biti susedni jedni drugima, sve dok RNKi agens može da se uvije tako da se dozvoli svakom paru da se spari. Razna druga razmatranja ukazuju na jedan ili drugi redosled efektora i efektorskih komplemenata ukupnom dužinom RNKi agensa. Stoga, primeri izvođenja opisa i pronalaska uklјučuju jedno ili više od sledećih:

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvu efektorsku sekvencu; drugu efektorsku sekvencu; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora;

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3, prvu efektorsku sekvencu; drugu efektorsku sekvencu; treću efektorsku sekvencu; sekvencu komplementa trećeg efektora; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora;

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvi efektor; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu; i sekvencu komplementa drugog efektora;

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvu efektorsku sekvencu; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu; sekvencu komplementa drugog efektora; treću efektorsku sekvencu; i sekvencu komplementa trećeg efektora;

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvu efektorsku sekvencu; drugu efektorsku sekvencu; sekvencu od 2 do 100 nukletida koji nisu sebi komplementarni; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora;

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvu efektorsku sekvencu; sekvencu od 2 do 100 nukletida koji nisu sebi komplementarni; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu; sekvencu od 2 do 100 nukletida koji nisu sebi komplementarni; i sekvencu komplementa drugog efektora.

[0018] U primerima izvođenja pronalaska, kao što je navedeno u patentnim zahtevima, ddRNKi agens sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

(i) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora; ili

(ii) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; i sekvencu komplementa drugog efektora;

[0019] pri čemu je svaka efektorska sekvenca najmanje 85% komplementarna predviđenom transkriptu cilјne sekvence i najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida iz sekvence navedene u SEQ ID NO: 9

[0020] Kao što će stručnjak iz oblasti lako razumeti, i kao što je ilustrovano na Slikama, bilo koja određena efektorska sekvenca može biti zamenjena u poziciji sa svojim komplementom u agensu. U određenim oblicima svakog od primera izvođenja koji su prethodno opisani, svaka efektorska sekvenca je dužine od najmanje 17 nukleotida i sadrži nukleotidnu sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida iz sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 1 -19 ili SEQ ID NO: 20-27. Efektorske sekvence mogu sve biti iste, ili sve mogu biti različite, ili mogu biti kombinacija, npr. 2 efektorske sekvence od najmanje 10 susednih nukleotida iz SEQ ID NO: 1 i jedne efektorske sekvence od najmanje 10 susednih nukleotida iz SEQ ID NO: 4. U primerima izvođenja pronalaska, kao što je navedeno u patentnim zahtevima, prva i druga efektorska sekvenca su dužine od najmanje 17 nukleotida i najmanje jedna efektorska sekvenca sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida iz sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

[0021] Opisani su takođe agensi u kojima je efektorska sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od bilo kojih susednih 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nukleotida unutar bilo koje od SEQ ID NO: 1-19 ili SEQ ID NO: 20-27, a najpoželјnije 17 ili više susednih nukleotida unutar bilo koje od SEQ ID NO: 1-19 ili SEQ ID NO: 20-27. Efektorski komplement će obično biti iste dužine ili približno iste dužine (tj. ± 15% dužine nukleotida) kao odgovarajuća efektorska sekvenca.

[0022] U alternativnim primerima izvođenja, dsRNK se sastoji od 2 zasebna RNK lanca koja su sparena tako da obrazuju dupleks. ddRNKi agensi mogu biti eksprimirani sa ekspresione kasete tipa DNK koja je insertovana u bilo koji pogodan vektor ili ddRNKi konstrukt. Shodno navedenom, ddRNKi ekspresione kasete sadrže:

● jednu ili više promotorskih sekvenci

● jednu ili više sekvenci DNK, poželјno sekvenci koje kodiraju bilo kojih 10 ili više, a poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz bilo koje od SEQ ID NO: 1-19 ili SEQ ID NO: 20-27,

● jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju jednu ili više sekvenci efektorskog komplementa;

● jednu ili više terminatorskih sekvenci

i opciono

● jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju sekvence petlјi; a

● opisana je jedna ili više sekvenci pojačivača.

[0023] Pronalazak obezbeđuje ddRNKi ekspresionu kasetu koja eksprimira ddRNKi agens za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u jednom ili više HBV gena, ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

(iii) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora; ili

(iv) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; i sekvencu komplementa drugog efektora;

pri čemu je svaka efektorska sekvenca najmanje 85% komplementarna predviđenom transkriptu cilјne sekvence i najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida iz sekvence navedene u SEQ ID NO: 9, dok ekspresiona kaseta sadrži jednu ili više promotorskih sekvenci, jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju jednu ili više efektorskih sekvenci ddRNKi agenasa, jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju jednu ili više sekvenci efektorskog komplementa ddRNKi agensa, jednu ili više terminatorskih sekvenci; i opciono jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju sekvence petlјi i jednu ili više sekvenci pojačivača.

[0024] U pojedinim primerima izvođenja, jedan promotor je operativno povezan sa regionima koji kodiraju višestruke efektore tako da može pokrenuti njihovu ekspresiju, dok je u drugim primerima izvođenja, svaki region koji kodira efektor operativno povezan sa svojim sopstvenim promotorom. U konstruktima gde su prisutni višestruki promotori, oni mogu biti svi isti ili različiti. Poželјni promotori su U6 i H1.

[0025] Takođe su obezbeđeni ddRNKi ekspresioni konstrukti, u koje su insertovane ddRNKi ekspresione kasete za ekspresiju. Pored toga, kada je okosnica vektora u konstruktu kompatibilna sa sistemom za isporuku, ddRNKi ekspresioni konstrukti su takođe konstrukti za isporuku.

[0026] Opisani su i siRNK agensi koji sadrže sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida, izabranu iz grupe koja se sastoji od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 1-19 ili SEQ ID NO: 20-27, kao i sekvenci komplementa sa kojim sekvenca obrazuje dupleks, agensi koji su sposobni da inhibiraju ekspresiju HBV gena.

[0027] Opisani su dalje postupci lečenja akutne ili hronične HBV infekcije kod subjekta, smanjenja HBV virusnog opterećenja kod subjekta, smanjenja ozbilјnosti simptoma udruženih sa HBV infekcijom kod subjekta i smanjenja infektivnosti HBV, postupci koji obuhvataju primenu terapijski efektivne količine ddRNKi konstrukta, ddRNKi agensa ili siRNK agensa, kao što je ovde opisano, pri čemu ddRNKi konstrukt, ddRNKi agens ili siRNK agens inhibira ekspresiju jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), poželјno barem gen za polimerazu HBV. Pronalazak obezbeđuje ddRNKi agens ili ddRNKi ekspresioni konstrukt pronalaska za upotrebu u lečenju akutne ili hronične HBV infekcije kod subjekta, za upotrebu u smanjenju virusnog opterećenja HBV-om kod subjekta, za upotrebu u smanjenju ozbilјnosti simptoma udruženih sa HBV infekcijom kod subjekta ili za upotrebu u smanjenju infektivnosti HBV-a.

[0028] Takođe su opisane farmaceutske kompozicije koje sadrže ddRNKi agens, ddRNKi ekspresionu kasetu, ddRNKi konstrukt ili siRNK agens pronalaska i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač. Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži ddRNKi agens, ddRNKi ekspresionu kasetu ili ddRNKi konstrukt pronalaska i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač.

Kratak opis nacrta / Slike

[0029]

Slika 1A-F ilustruje neke od struktura ddRNKi agenasa pronalaska.

Slika 2 prikazuje raspodelu 642 siRNK klona dobijena duž gena za polimerazu HBV-a, pri čemu linije označavaju regione koji odgovaraju pojedinačnim klonovima sa celokupnim siRNK ciljnim mestom (EsT).

Slika 3 je poređenje efikasnosti RNKi iz siRNK ekspresione kasete (SEC) sa njihovim odgovarajućim sintetskim siRNK, na nivoe iRNK HBV polimeraze u cilju potvrde početnih rezultata skrininga koji su dobijeni SEC inhibicijom ekspresije3 HBV polimeraze.

Slika 4 je rezultat skrininga na inhibiciju HBV polimeraze za 501 siRNK sekvencu izvedenu iz EsT biblioteke.

Slika 5A je ilustracija raspodele prvih 100 najefikasnijih siRNK sekvenci (identifikovanih skriningom velikog obima prikazanog na Slici 4) duž gena za HBV polimerazu. Slika 5B ilustruje kako se bilo koja navedena sekvenca može mapirati u genu HBV polimeraze. Prikazane su oblasti na kojima se zasnivaju SEQ ID NO: 1 do 3.

Slika 6 je šema 5 pojedinačnih ekspresionih kaseta i RNKi agenasa koje one kodiraju, zajedno sa efektorskom sekvencom nakon obrade enzimom Dicer. Ekspresione kasete su zasnovane na SEQ ID NO: 3, 9, 12, 13 i 23.

Slika 7 je šema ekspresione kasete sa višestrukim efektorskim sekvencama koja sadrži (a) efektorske sekvence od kojih je svaka operativno povezana sa zasebnim promotorom i terminatorskom sekvencom da bi se eksprimirali pojedinačni RNKi agensi u obliku kratkih RNKi agenasa sa strukturama ukosnice (shRNKi), (Slika 7A); ili (b) prvu efektorsku sekvencu koja je operativno povezana sa promotorom i treću efektorsku sekvencu operativno povezanu za terminatorskom sekvencom tako da se eksprimira jedan RNKi agens sa višestrukim strukutrama petlјe. Ekspresione kasete se zasnivaju SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 6.

Slika 8 je šema ekspresione kasete sa višestrukim efektorskim sekvencama koje se zasnivaju na SEQ ID NO: 1, 4 i 6 i daju jedinstveni dugi RNKi agens strukture ukosnice.

Slika 9 ilustruje efikasnost smanjenja ekspresije gena (engl. knockdown) za SEQ ID NO: 1 do 14 i 20 do 27 nakon transfekcije u HepG22.2.15 ćelije. Efikasnost smanjenja ekspresije gena je određena qRT-PCR analizom iRNK polimeraze. siNC je negativna kontrola, koja predstavlja siRNK bez poznatih cilјnih sekvenci u HBV; sa “normalan” je označen nivo iRNK za polimerazu u netransfektovanim ćelijama, standardizovan na nivo od 1.

Slike 10A i B pokazuju aktivnosti luciferaze (+/- SD; n=4) u ćelijama koje su transfektovane varijabilnim količinama hemijski sintetisanih siRNK23 (A) ili shRNK23 ekspresionih konstrukata (B) koji ciljano deluju na pGL3-23, upotrebom uslova navedenih u Tabelama 3 i 4. Na slici 10A, siNC je upotrebljavan i kao negativna kontrola i da bi se podesile ukupne količine siRNK koje su dodate ćelijama i izbegli mogući artefakti usled nejednake transfekcije; siRNK GL3 je upotrebljena kao pozitivna kontrola, tj. siRNK koja ciljano deluje na gen luciferaze. Na slici 10B, pUC57 je korišćen i kao negativna kontrola i za podešavanje ukupnih količina plazmidnih DNK koje su dodate ćelijama, da bi se izbegli mogući artefakti usled nejednake transfekcije. Plazmid koji eksprimira luciferaznu shRNK zasnovanu na GL3 siRNK, upotrebljen je kao pozitivna kontrola

Detalјan opis primera izvođenja

Definicije

[0030] Kako se ovde upotrebljava, osim gde kontekst zahteva drugačije, namera termina "sadrži" i varijacije termina, poput "sadržava" i "sadržan", nije da se isključe dodatni aditivi, komponente, celi brojevi ili koraci.

[0031] Termin "RNK interferencija " ili "RNKi" se generalno odnosi na proces utišavanja gena koji je zavisan od RNK i inicira se molekulom dvolančane RNK (dsRNK) u citoplazmi ćelije. dsRNK smanjuje ekspresiju cilјne sekvence nukleinske kiseline koja može biti tipa DNK i čiji se RNK ekspresioni proizvodi smanjuju ili tipa RNK sa kojom je molekul dsRNK suštinski ili potpuno homolog.

[0032] Pod "dvolančanom RNK" ili "dsRNK" se podrazumeva molekul dvolančane RNK koji je sposoban da inhibira ekspresiju cilјne sekvence nukleinske kiseline sa kojom deli homologiju. U pojedinim primerima izvođenja, dsRNK je strukture ukosnice ili petlje, sa regionom dupleksa koji je opciono povezan sa najmanje 1 nukleotidom i označen kao "RNK oblika ukosnice" ili "agens za RNKi u vidu kratke RNK strukture ukosnice" ili "shRNK". Dupleks se obrazuje između efektorske sekvence i sekvence komplementarne efektorskoj sekvenci koja se ovde označava kao "efektorski komplement". Efektorski komplement će obično biti iste dužine kao njegova odgovarajuća efektorska sekvenca. Kao što će biti objašnjeno u nastavku teksta, efektorska sekvenca je komplementarna cilјnoj sekvenci nukleinske kiseline.

[0033] "Efektorska sekvenca" je nukleotidna sekvenca koja se, kada je deo RISC kompleksa, vezuje za cilјnu nukleotidnu sekvencu HBV-a i ciljano deluje tako da se ta sekvenca uništi od strane ćelije. Navedeno je analogno "vodećem" lancu koji je razmatran u opisu poznatog stanja tehnike. Efektorska sekvenca je "usmerena na" cilјni region time što je njena sekvenca komplementarna ili suštinski komplementarna transkriptu sa cilјnog regiona, a na taj način RNK agens sa dvolančanim delom koji sadrži efektorsku sekvencu inhibira ekspresiju cilјne genske sekvence.

[0034] "Efektorski komplement", koji je analogan pretećem lancu razmatranom u opisu poznatog stanja tehnike i dovoljno je komplementaran efektoru tako da se sparuje sa efektorskom sekvencom. Verovatno je da će efektorski komplement biti slične sekvence kao cilјna genska sekvenca, ali to ne mora nužno biti slučaj.

[0035] Termin "RNKi agens" se odnosi na dsRNK sekvencu koja inicira RNKi. Ovaj termin se može koristiti naizmenično sa "mala interferirajuća RNK" (siRNK agensi) i malom RNK strukture ukosnice (shRNKi ili hpRNKi agensi).

[0036] Dvolančani ili dupleksni region RNKi agensa je dug najmanje 17 parova baza i obično je u opsegu od 17 do 30 baznih parova. RNKi agensi mogu biti sintetisani hemijski ili enzimski izvan ćelija i potom biti isporučeni u ćelije, ili se mogu eksprimirati in vivo odgovarajućim vektorom u ćelijama (pogledati, npr. U.S. Pat. No.6,573,099, WO 2004/106517 i WO99/49029.

[0037] Termin "RNKi agens usmeren sa DNK" ili "ddRNKi agens", odnosi se na RNKi agens koji je transkribovan sa DNK ekspresione kasete ("ddRNKi ekspresiona kaseta"). Ovakav ddRNKi agens koji se transkribuje sa ekspresione kasete, može biti transkribovan kao jedna RNK koja je sposobna da se spari sama sa sobom u strukturu ukosnice, sa regionom dupleksa povezanim sa najmanje 2 nukleotida, ili kao pojedinačna RNK sa više shRNK domena, ili može biti u vidu višestrukih transkripata od svaki je sposoban da se uvije kao jedna shRNK.

[0038] ddRNKi ekspresiona kaseta može biti vezana ligacijom u vektore koji se označavaju kao ddRNKi vektori ili ddRNKi konstrukti. Vektori mogu obezbediti sekvence koje specifično određuju transkripciju ddRNKi ekspresione kasete in vivo ili in vitro. Vektor može dodatno služiti kao nosač za isporuku ddRNKi ekspresione kasete. Vektori na bazi virusa će, na primer, generisati ddRNKi konstrukt koji je koristan za ekspresiju ddRNKi ekspresione kasete, a može biti i kompatibilan sa isporukom virusa.

[0039] Ćelija je "transformisana", "transdukovana" ili "transfektovana" egzogenom ili heterolognom nukleinskom kiselinom ili vektorom kada se takva nukleinska kiselina uvodi u ćeliju. Transformišuća DNK može ili ne mora biti ugrađena (kovalentno vezana) u genom ćelije. Kod eukariotskih ćelija, stabilno transformisana ćelija je ona u kojoj se transformišuća DNK ugrađuje u hromozom ćelije domaćina ili se održava van materijala hromozoma (epizomalno), tako da transformišuću DNK nasleđuje ćerka ćelija tokom replikacije. U nereplikujućim, diferenciranim ćelijama, transformišuća DNK može perzistirati kao epizom.

[0040] "Ekspresija gena" se može odnositi na jedno ili na oba od transkripcije ili translacije.

[0041] "Inhibicija ekspresije" se odnosi na odsustvo ili vidlјivo smanjenje u nivou proteinskog i/ili iRNK proizvoda cilјnog gena. Inhibicija ne mora biti apsolutna, već može biti delimična inhibicija, dovolјna da rezultat primene RNKi ili ddRNKi agensa ili siRNK agensa ili ddRNKi konstrukta pronalaska bude detektabilna ili uočlјiva promena. Inhibicija može biti izmerena određivanjem smanjenja u nivou iRNK i/ili proteinskog proizvoda cilјne nukleinske kiseline u odnosu na ćeliju kojoj nedostaje ddRNKi agens ili konstrukt, a može biti mala kao što je 1%, 5% ili 10%, ili može biti apsolutna tj. inhibicija od 100%. Efekti inhibicije mogu biti određeni ispitivanjima spoljnih osobina, tj. kvantitativnog i/ili kvalitativnog fenotipa ćelije ili organizma i može takođe podrazumevati procenu opterećenja virusima nakon primene ddRNKi agensa ili konstrukta pronalaska.

[0042] Kako se ovde upotrebljava, "kvantitativna fenotipska osobina" se odnosi na osobinu koja je udružena sa molekulskom ekspresijom nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu i stoga može uklјučivati količinu RNK molekula koji je transkribovan ili umnožen replikacijom, količinu post-transkripciono modifikovanih RNK molekula, količinu prevedenih peptida ili proteina ili aktivnost takvih peptida ili proteina.

[0043] Smanjenje fenotipske ekspresije nukleinske kiseline, gde je fenotip kvalitativna osobina, označava da u prisustvu RNKi agensa pronalaska, fenotipska osobina prelazi u drugo stanje u poređenju sa situacijom u kojoj RNKi agens nije prisutan. Smanjenje fenotipske ekspresije nukleinske kiseline može stoga biti izmereno smanjenjem stabilnih nivoa (dela) te nukleinske kiseline, smanjenjem u translaciji (dela) te nukleinske kiseline ili smanjenjem efekta koje prisustvo transkribovane(ih) RNK ili prevedenog(ih) polipeptida ima na eukariotsku ćeliju ili organizam, a što će na kraju voditi izmeni fenotipskih osobina. Jasno je da smanjenje fenotipske ekspresije nukleinske kiseline od interesa može biti praćeno ili korelisano sa uočlјivom promenom u fenotipu. Procena može biti vršena putem biohemijskih tehnika kao što su Northern hibridizacija, kvantitativne PCR analize u realnom vremenu, analize ekspresije gena, vezivanje antitela, ELISA, RIA, imunoblotovanje i druge analize i tehnike poznate u stanju tehnike.

[0044] "Cilјne nukleinske kiseline" mogu biti bilo RNK ili DNK na čije se transkripcione proizvode ciljano deluje, i mogu biti kodirajuća ili nekodirajuća sekvenca, endogena ili egzogena. U poželјnom primeru izvođenja, ciljano se deluje na gen za polimerazu (P) DNK virusa hepatitisa B sa ciljem inhibicije. Shodno tome, u ovom primeru izvođenja, cilјna nukleinska kiselina je barem RNK transkript gena za polimerazu.

[0045] Efektorska sekvenca za ciljano mesto je komplementarna ili suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena. Pod "suštinski komplementarnim" se podrazumeva da sekvence mogu hibridizovati ili se spariti. Suštinski komplementarno podrazumeva komplementarnost sa delom cilјnog gena od poželјno oko 85%. Još poželјnije, sekvenca je najmanje 85-90% komplementarna, a najpoželјnije najmanje 95, 96, 97, 98 99 ili 100% komplementarna. Značajna komplementarnost stoga uklјučuje komplementarnost od 100%, ali se, u tekstu specifikacije, komplementarnost od 100% može takođe označiti kao "komplementarna" ili "je komplementarna".

[0046] Sekvenca komplementarna ili suštinski komplementarna regionu cilјnog gena podrazumeva stepen komplementarnosti sekvenci duž niza cilјne sekvence. Uopšteno posmatrajući, dvolančani RNK region pronalaska može biti podvrgnut mutagenezi da bi se proizvela pojedinačna ili nekoliko nukleotidnih supstitucija, delecija ili adicija.

[0047] "Terapijska kompozicija" ili "farmaceutska kompozicija" ili "kompozicija za lečenje HBV infekcije" se odnosi na kompoziciju koja uklјučuje ddRNKi agens, ddRNKi ekspresionu kasetu, ddRNKi konstrukt ili siRNK agens.

[0048] Reči "lečiti" ili "lečenje" se odnose na terapijski tretman gde je cilј da se uspori (smanji) neželјena fiziološka promena ili poremećaj. U svrhu ovog pronalaska, korisni ili želјeni klinički rezultati uklјučuju, ali nisu ograničeni na, ublažavanje simptoma HBV infekcije, smanjenje infektivnosti HBV-a, umanjenje obima bolesti, stabilizaciju (tj. da nije pogoršanje) stanja bolesti, odlaganje ili usporavanje progresije bolesti, ublažavanje ili palijaciju stanja bolesti i remisiju (bilo delimičnu ili potpunu), bez obzira da li je ona detektabilna ili ne. "Lečenje" takođe može označavati produženje preživlјavanja u poređenju sa očekivanim preživlјavanjem bez primanja tretmana. Lečenje ne mora nužno rezultovati u potpunom uklanjanju HBV infekcije, ali može smanjiti ili svesti na minimum komplikacije i sporedne efekte infekcija, kao i progresiju infekcije.

[0049] Fraza "terapijski efektivna količina" označava količinu jedinjenja predmetnog pronalaska koja (i) leči određeno oboljenje, stanje ili poremećaj, (ii) ublažava, umanjuje ili eliminiše jedan ili više simptoma određenog oboljenja, stanja ili poremećaja ili (iii) odlaže početak jednog ili više simptoma određenog oboljenja, stanja ili poremećaja koji su ovde opisani.

Detalјan opis pronalaska

[0050] Predmetni pronalazak obezbeđuje novi RNKi agens i upotrebu RNKi agensa za ciljano dejstvo na HBV kod inficiranih osoba. Lečenje HBV je usmereno na:

(i) eliminaciju infektivnosti da bi se sprečio prenos i širenje HBV-a sa jedne osobe na drugu; i (ii) umanjenje ukupne progresije bolesti jetre kod zaraženog pojedinca do minimuma. ddRNKi agens

[0051] RNKi agensi eksprimirani sa ddRNKi ekspresionih kaseta zasnovanih na DNK, označavaju se kao RNKi agensi usmereni sa DNK ili ddRNKi agensi. Oni mogu direktno ciljano delovati na aktivnost gena uz minimum dejstva van ciljnog mesta. Pod "dejstvom van ciljnog mesta" se podrazumeva da ekspresija nukleinskih kiselina drugačijih od ciljnih nije inhibirana sa RNKi ili ddRNKi agensima. U slučaju HBV infekcije, navedeno predstavlja jedinstvenu priliku za rešavanje nezadovolјenih potreba kliničkih tretmana za HBV. Prema tome, opisan je agens za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV) posredovan RNK interferencijom usmerenom sa DNK (ddRNKi), ddRNKi agens koji sadrži najmanje:

prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; i

sekvencu komplementa prvog efektora;

pri čemu je prva efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0052] Prva efektorska sekvenca obično obrazuje dvolančani region sa sekvencomu komplementa prvog efektora.

[0053] Sekvence opisanih ddRNKi agenasa imaju dovolјnu komplementarnost sa regionom HBV gena da bi se usmerila cilјno specifična RNKi. Pod "suštinski komplementarnim" se podrazumeva da sekvence mogu hibridizovati ili se spariti i bilo koje od:

● sekvenca prve efektorske sekvence je najmanje oko 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 ili 90% komplementarna sa najmanje 17 ili više susednih nukleotida cilјne sekvence, a poželјnije najmanje oko 90, 91, 92, 92, 94 ili 95% komplementarna, i još poželјnije najmanje oko 95, 96, 97, 98 ili 99% komplementarna ili apsolutno komplementarna (tj.100%) sa 17 ili više susednih nukleotida cilјne sekvence; ili

● efektorska sekvenca ima najmanje 10 ili više susednih nukleotida koji su 100% komplementarni sa ciljnom sekvencom i poželјno manje od 6 nukleotida koji ne mogu spariti baze sa cilјnom sekvencom. Prva efektorska sekvenca može stoga imati 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida koji neće upariti G-C/A-U baze sa cilјnom sekvencom. Veruje se da ovakav nivo razlike neće negativno uticati na sposobnost ddRNKi agenasa da bude u stanju da inhibira ekspresiju cilјne sekvence.

[0054] Kada prva efektorska sekvenca sadrži 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida koji neće upariti GC/AU baze sa cilјnom sekvencom, poželјno je da su te razlike prisutne u prvih ili poslednjih 5 nukleotida prve efektorske sekvence, sa samo 1 ili 2 nukleotidne promene u centralnom delu efektorske sekvence.

[0055] Agens za ddRNKi može takođe sadržavati prvu efektorsku sekvencu koja se sastoji od 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida u dužini, pri čemu je efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena. Agrens za ddRNKi, prema ovom primeru izvođenja opisa, ima stoga maksimalnu dužinu koja je određena dužinom i brojem efektorske/efektorskih sekvenci, tj. svaka efektorska sekvenca nije sadržana unutar duže sekvence.

[0056] Kao što je prethodno navedeno, značajna komplementarnost treba da podrazumeva da sekvence mogu hibridizovati ili se spariti. Termini "hibridizujuće" i "sparivanje" (i gramatički ekvivalenti) se koriste naizmenično u ovoj specifikaciji u pogledu nukleotidnih sekvenci i odnose se na nukleotidne sekvence koje su sposobne da obrazuju bazne parove po Watsom-Crick-ovom modelu usled njihove komplementarnosti. Poželјno je da su suštinski komplementarne sekvence u stanju da hibridizuju pod srednje ili visoko strogim uslovima:

● visoko strogi uslovi: 0,1xSSPE (ili 0,1xSSC), 0,1% SDS, 65°C

● srednje strogi uslovi: 0.2xSSPE (ili 1,0xSSC), 0,1% SDS, 50°C. Alternativno, stručnjaku iz oblasti će biti jasno da "suštinski komplementaran" takođe uključuje sparivanja baza koja nisu po Watson-Crick-ovom modelu, posebno u kontekstu RNK sekvenci, kao što je takozvano "kolebajuće (engl. wobble) sparivanje" koji se može obrazovati između ostatak guanozina i uracila u RNK. "Komplementarno" se ovde upotrebljava na svoj uobičajen način da se označi sparivanje baza po Watson-Crick-ovom modelu, a "nekomplementarno" se upotrebljava da označi sparivanje baza koje nije po Watson-Crick-ovom modelu, čak iako takve nekomplementarne sekvence mogu obrazovati kolebajuće parove ili druge interakcije. U kontekstu predmetnog pronalaska, pozivanje na "nesparujuće" sekvence se specifično odnosi na sekvence između kojih se ne obrazuju parovi baza po Watson-Crick-ovom modelu.

[0057] Prva efektorska sekvenca je duga najmanje 17 nukleotida, poželјno 17 do 50 nukleotida i najpoželјnije 17 do 30 nukleotida. Ona može biti dužine 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida. Kada je prva efektorska sekvenca duža od 17 nukleotida, poželјno je da najmanje 17 susednih nukleotida prve efektorske sekvence obrazuje dvolančani region sa komplementarnim lancem.

[0058] Pronalazak obezbeđuje ddRNKi agens za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u jednom ili više HBV gena, ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

(i) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora; ili

(ii) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; i sekvencu komplementa drugog efektora;

pri čemu je svaka efektorska sekvenca najmanje 85% komplementarna predviđenom transkriptu cilјne sekvence i pri čemu najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9. ddRNKi agensi pronalaska, kao što je opisano, inhibiraju ekspresiju sekvenci nukleinske kiseline HBV-a. Poželјno je da je HBV cilјni gen zapravo sekvenca nukleinske kiseline koja se eksprimira, kao što je gen za polimerazu (P). Prema tome, u jednom primeru izvođenja pronalaska ili opisa, ddRNKi agens pronalaska ili opisa, inhibira ekspresiju jedne ili više cilјnih sekvenci u genu za polimerazu virusa hepatitisa B (HBV). Genom HBV-a ima otvorene okvire čitanja koji se preklapaju. Tako, ciljanim dejstvom na određene sekvence gena za polimerazu takođe će ciljano delovati na iste sekvence u preklapajućem genu. Agensi pronalaska i opisa su stoga sposobni da ciljano deluju na više gena sa jednom efektorskom sekvencom. U svakom poželјnom primeru izvođenja, međutim, ciljano se deluje najmanje na gen za polimerazu.

[0059] U ddRNKi agensima pronalaska najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9. U opisanim primerima izvođenja, prva efektorska sekvenca je izabrana od bilo kojih 10 ili više i poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar bilo koje od ddRNKi efektorskih sekvenci SEQ ID NO: 1-19, ili SEQ ID NO: 20-27 za HBV polimerazu, a koje su navedene ispod. Radi jednostavnosti, SEQ ID NO: će zajednički biti označeni kao SEQ ID NO: 1 do 27.

Tabela 1: RNKi efektorske sekvence

[0060] Kao što je objašnjeno u poglavlju opisa stanja tehnike, oba lanca dsRNK imaju potencijal da budu efektorska sekvenca. Ipak, postoje dokazi da određene karakteristike sekvence mogu favorizovati jedan lanac za ulazak u RISC, dok se drugi razgrađuje. Postoje dokazi i da protein Argonaut 2 (AGO2) RISC kompleksa ispoljava preferencu ka sekvencama sa 5’ A, i u manjoj meri ka 5' U. Pored toga, izgleda da se RNK sekvence sa većim sadržajem AU u 5’ regionima preferencijalno ugrađuju u RISC komplekse, zahvaljujući mehanizmu koji "oseća" termodinamičku stabilnost duž RNK dupleksa i favorizuje ugradnju sekvenci sa manje stabilnog kraja dupleksa. Ovakve preference sekvenci su uzete u obzir u poželјnim primerima izvođenja, ali nisu od suštinskog značaja.

[0061] Na primer, u jednom primeru izvođenja ovog aspekta opisa, obezbeđen je agens za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi) za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži najmanje:

prvu efektorsku sekvencu od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar GAUUGACGAUAAGGGAGA (SEQ ID NO: 1); i

sekvencu komplementa prvog efektora.

[0062] Prva efektorska sekvenca je suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0063] Poželјno je da prva efektorska sekvenca predstavlja najmanje 17 ili više susednih nukleotida unutar GAUUGACGAUAAGGGAGA (SEQ ID NO: 1).

[0064] Kada prva efektorska sekvenca ima 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida različitih od SEQ ID NO: 1, poželjno je da su razlike prisutne u prvih i/ili poslednjih 5 nukleotida i da je najmanje 10 centralnih nukleotida 100% komplementarno predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0065] U alternativnim primerima izvođenja opisa, ddRNKi agens sadrži prvu efektorsku sekvencu sa bilo kojih 10 ili više, poželјno bilo koje 17 ili više, susednih nukleotida unutar SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 i SEQ ID NO: 27.

[0066] U posebno poželјnim primerima izvođenja, ddRNKi agens sadrži prvu efektorsku sekvencu sa bilo kojih 10 ili više, poželјno bilo kojih 17 ili više, susednih nukleotida unutar sekvenci sposobnih da inhibiraju ekspresiju cilјnog regiona gena za najmanje 70%. Poželјno, u ovom primeru izvođenja, prvi efektor je izabran od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23.

[0067] Prva efektorska sekvenca može sadržavati sekvencu izabranu od bilo kojih 10 ili više, a poželјno od bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27, ili alternativno, svaka efektorska sekvenca može biti varijanta SEQ ID NO: 1-27, sa 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotidnih varijacija. U još jednom primeru izvođenja, svaka efektorska sekvenca se može sastojati od 22 nukleotida, od kojih su 17, 18, 19, 20, 21 ili svih 22 nukleotida susedni nukleotidi iz sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27.

ddRNKi agensi sa dejstvom na više ciljnih mesta

[0068] U poželјnom primeru izvođenja opisa i u ddRNKi agensima pronalaska, ddRNKi agens sadrži dve ili više efektorskih sekvenci, da bi se omogućilo ciljano dejstvo na više od jedne cilјne sekvence HBV genoma. Višestruke cilјne sekvence mogu biti u istom regionu HBV gena. Na primer, region od 17 do 30 nukleotida karakterišu prirodna varijacija u sekvenci između sojeva ili polimorfizmi pojedinačnih nukleotida nastali da bi se stekla rezistencija na lekove. Alternativno, cilјne sekvence mogu biti u različitim regionima jednog cilјnog gena.

[0069] Da bi se obezbedila veća specifičnost, ddRNKi agent sadrži sledeće (bez posebnog reda):

● prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

● drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

● sekvencu komplementa prvog efektora; i

● sekvencu komplementa drugog efektora;

[0070] U primerima izvođenja pronalaska, kao što je navedeno u patentnim zahtevima, ddRNKi agens sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

(i) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora; ili

(ii) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; i sekvencu komplementa drugog efektora.

[0071] Prva i druga efektorska sekvenca višestruko delujućeg ddRNKi agensa obrazuju dvolančani region sa svojim odgovarajućim efektorskim komplementima. Poželјno, prva i druga efektorska sekvenca su dužine od 17 do 30 nukleotida. Još poželјnije, prva i druga efektorska sekvenca su izabrane od bilo kojih od 10 ili više, a poželјno od 17 ili više susednih nukleotida unutar bilo kojoj od sekvenci prethodno navedenih u Tabeli 1, ili su sekvence sa 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida različita od onih sekvenci koje su navedene u Tabeli 1.

[0072] U jednom primeru izvođenja, prva efektorska sekvenca je izabrana od bilo kojih 10 ili više, a poželјno je bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od bilo koje SEQ ID NO: 1-27, i druga efektorska sekvenca je izabrana iz bilo kojih 10 ili više i poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz bilo koje grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27. Prva i druga efektorska sekvenca mogu biti iste sekvence ili, alternativno, mogu biti različite sekvence.

[0073] Svaka od prve i druge efektorske sekvence može sadržavati sekvencu izabranu od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27, ili alternativno, svaka efektorska sekvenca može takođe biti varijanta SEQ ID NO: 1-27, sa 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotidnih varijacija. U još jednom primeru izvođenja, svaka efektorska sekvenca može da se sastoji od 22 nukleotida, od kojih 17, 18, 19, 20, 21 ili svih 22 nukleotida su susedni nukleotidi iz sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27. Kada postoje dve ili više efektorskih sekvenci, one mogu predstavlјati kombinaciju 3 od tipova koji su prethodno opisani.

[0074] U naročito poželјnim primerima izvođenja, prva i druga efektorska sekvenca sadrže bilo kojih 10 ili više, poželјno bilo kojih 17 ili više, susednih nukleotida unutar sekvenci sposobnih da inhibiraju ekspresiju cilјnog regiona gena za najmanje 70%. Poželјno je, u ovom primeru izvođenja, da je svaka efektorska sekvenca izabrana od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23.

[0075] U primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

[0076] Upotreba ddRNKi agenasa sa višestrukim efektorskim sekvencama ima prednost ograničavanja i pojave mutanata koji izbegavaju ciljano dejstvo, što je problem mnogih današnjih antivirusnih terapija. Jedan aspekt predmetnog pronalaska i opisa neutrališe mutante koji izbegavaju ciljano dejstvo, sa ddRNKi agensom koji sadrži RNKi sekvence zasnovane genetičkoj sekvenci ciljnog gena i dodatne sekvence sa tačkastim mutacijama koje nastaju kao posledica rezistencije na RNKi tretman.

[0077] Slično navedenom, ddRNKi agensi sa višestrukim efektorskim sekvencama imaju prednost da mogu da ciljano deluju na niz sekvenci koje se nalaze u različitim virusnim genotipovima ili kvazivrstama, kao i prednost aditivnih ili sinergističkih efekata koji se postižu višestrukim efektorskim sekvencama, nasuprot pojedinačnim efektorskim sekvencama.

[0078] Kao što je, međutim, prethodno pomenuto, pojedinačne efektorske sekvence mogu postići višestruko ciljano dejstvo kada je cilјna sekvenca ista u 2 ili više gena. HBV sadrži brojne preklapajuće okvire za čitanje, tako da će ciljano dejstvo na sekvence u preklapajućim regionima inhibirati ekspresiju oba gena koji sadrže tu sekvencu.

Duge verzije sa strukturom ukosnice

[0079] Kada ddRNKi agens sadrži više od jedne efektorske sekvence i ddRNKi agens se eksprimira kao jednolančana RNK, on će se uvijati tako da obrazuje različite strukture, u zavisnosti od redosleda efektorskih sekvenci i sekvenci koje su komplementarne efektorskim sekvencama. U jednom primeru izvođenja, obezbeđen je agens za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi) za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, najmanje:

prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

sekvencu komplementa drugog efektora; i

sekvencu komplementa prvog efektora

pri čemu je svaka efektorska sekvenca suštinski (tj. najmanje 85%) komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena i pri čemu najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9. Navedeno će rezultirati u ddRNKi agensu sa strukturom kao što je prikazana na Slici 1A. Pogledati takođe WO2004/106517.

[0080] Alternativno, najmanje jedan efektor, a poželјno obe efektorske sekvence, 100% su komplementarne predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0081] Poželјno je da su i prva i druga efektorska sekvenca izabrane iz grupe koja se sastoji od bilo kojih 10 ili više i poželјno bilo koje 17 ili više susednih nukleotida unutar bilo koje od SEQ ID NO: 1-27. Na primer, u jednom primeru izvođenja, obezbeđen je agens za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi) za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, najmanje:

prvu efektorsku sekvencu sa bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar GAUUGACGAUAAGGGAGA (SEQ ID NO: 1);

drugu efektorsku sekvencu sa bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar UUGAAGUCCCAAUCUGGAU (SEQ ID NO: 2) ili GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC (SEQ ID NO: 3);

sekvencu komplementa drugog efektora; i

sekvencu komplementa prvog efektora.

[0082] Svaka efektorska sekvenca je suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0083] Alternativno, najmanje jedan efektor, a poželјno je obe efektorske sekvence, 100% su komplementarne predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0084] U naročito poželјnim primerima izvođenja, prva i druga efektorska sekvenca sadrže bilo kojih 10 ili više, poželјno bilo kojig 17 ili više, susednih nukleotida unutar sekvenci sposobnih da inhibiraju ekspresiju cilјnog regiona gena za najmanje 70%. Poželјno je, u ovom primeru izvođenja, da asvaka efektorska sekvenca bude izabrana između SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23.

[0085] U primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

[0086] U još jednom primeru izvođenja, budući da je primer izvođenja gde ddRNKi agens ima 3 efektorske sekvence, obezbeđen je agens za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi) i inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu za virus hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, najmanje:

prvu efektorsku sekvencu sa bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar GAUUGACGAUAAGGGAGA (SEQ ID NO: 1);

drugu efektorsku sekvencu sa bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar UUGAAGUCCCAAUCUGGAU (SEQ ID NO: 2);

treću efektorsku sekvencu sa bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC (SEQ ID NO: 3);

sekvencu komplementa trećeg efektora;

sekvencu komplementa drugog efektora; i

sekvencu komplementa prvog efektora.

[0087] Svaka efektorska sekvenca je suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0088] Alternativno, najmanje jedan efektor, a opciono 2 od 3 ili sva 3 efektora, 100% su komplementarni predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0089] U posebno poželјnim primerima izvođenja, prva, druga i treća efektorska sekvenca sadrže bilo kojih 10 ili više, poželјno bilo kojih 17 ili više, susednih nukleotida unutar sekvenci sposobnih da inhibiraju ekspresiju cilјnog regiona gena za najmanje 70%. Poželјno, u ovom primeru izvođenja, svaka efektorska sekvenca je izabrana od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23.

[0090] U primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

[0091] Stručnjaku će takođe biti jasno da redosled efektora i efektorskih komplemenata može biti izmenjen, pod uslovom da se jedna, duga struktura ukosnice obrzuje sparivanjem efektorske sekvence sa njenim efektorskim komplementom da bi se obrazovala dsRNK. Na primer, u 2-efektorskoj sekvenci ddRNKi agensa, sekvence mogu biti raspoređene u primerima redosleda u smeru od 5’ ka 3’ koji slede:

● prvi efektor - drugi efektor - komplement drugog efektora - komplement prvog efektora;

● prvi efektor - komplement drugog efektora - drugi efektor - komplement prvog efektora;

● komplement prvog efektora - komplement drugog efektora - drugi efektor - prvi efektor;

● komplement prvog efektora - drugi efektor - komplement drugog efektora - prvi efektor.

[0092] U ddRNKi agensu sa tri efektorske sekvence, sekvence mogu biti raspoređene u sledećim primerima redosleda u smeru od 5’ ka 3’:

● prvi efektor - drugi efektor - treći efektor - komplement trećeg efektora - komplement drugog efektora - komplement prvog efektora

● prvi efektor - komplement drugog efektora - treći efektor - komplement trećeg efektora - drugi efektor - komplement prvog efektora;

● prvi efektor - drugi efektor - komplement trećeg efektora - treći efektor - komplement drugog efektora - komplement prvog efektora

● komplement prvog efektora - komplement drugog efektora - komplement trećeg efektora - treći efektor - drugi efektor - komplement prvog efektora

● komplement prvog efektora - komplement drugog efektora - treći efektor - komplement trećeg efektora - drugi efektor - prvi efektor.

[0093] U još dalјim primerima izvođenja, prva efektorska sekvenca može biti izabrana od bilo kojih 10 ili više, a poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27; druga efektorska sekvenca može biti izabrana od bilo kojih 10 ili više, a poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27; treća efektorska sekvenca može biti izabrana od bilo kojih 10 ili više, a poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27; i bilo koje sledeće efektorske sekvence mogu biti izabrane od bilo kojih 10 ili više i poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27. Alternativno, svaka efektorska sekvenca može takođe biti varijanta SEQ ID NO: 1-27, sa 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotidnih varijacija. Poželјno, razlike su prisutne u prvih i/ili poslednjih 5 nukleotida, dok je najmanje centralnih 11-12 nukleotida 100% komplementarno predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena. Ovakvi primeri izvođenja su posevno korisni za ciljano dejstvo na mutante HBV koji izbegavaju ciljano dejstvo, kao i na različite virusne genotipove ili kvazi-vrste. U primerima izvođenja ovog pronalaska, ddRNKi agens sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

(i) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora; ili

(ii) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; i sekvencu komplementa drugog efektora;

pri čemu je svaka efektorska sekvenca najmanje 85% komplementarna predviđenom transkriptu cilјne sekvence i pri čemu najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9. Svaka od prve, druge i treće efektorkse sekvence može sadržavati sekvencu izabranu od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27, ili alternativno, svaka efektorsku sekvencu može takođe biti varijanta SEQ ID NO: 1-27, sa 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotidnih varijacija. U još jednom primeru izvođenja, svaka efektorska sekvenca se može sastojati od 22 nukleotida, od kojih su 17, 18, 19, 20, 21 ili svih 22 nukleotida susedni nukleotidi iz sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27. Kada postoji više efektorskih sekvenci, one mogu predstavlјati kombinaciju 3 tipa koji su prethodno opisani. U primerima izvođenja ovog pronalaska, ddRNKi agens se sastoji u smeru od 5’ ka 3’:

(i) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora; ili

(ii) prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; i sekvencu komplementa drugog efektora;

pri čemu je svaka efektorska sekvenca najmanje 85% komplementarna predviđenom transkriptu cilјne sekvence, i pri čemu najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida iz sekvence koja je navedene u SEQ ID NO: 9.

Verzija višestrukih ukosnica

[0094] U alternativnom primeru izvođenja, obezbeđen je agens za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi) za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, najmanje:

prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

sekvencu komplementa prvog efektora;

drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; i

sekvencu komplementa prvog efektora

pri čemu je svaka efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0095] Alternativno, najmanje jedan efektor, a poželјno obe efektorske sekvence, 100% su komplementarane predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0096] Navedeno će rezultovati u ddRNKi agensu sa strukturom kao što je prikazano na Slici 1B ili C, a u zavisnosti od tipa ekspresione kasete koja se koristi za ekspresiju (pogledati u nastavku teksta specifikacije). Takođe pogledati WO2005/087926 i WO2006/084209.

[0097] Poželјno je da su i prva i druga efektorska sekvenca izabrane od bilo kojih 10 ili više, poželјno od 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27. Na primer, u jednom primeru izvođenja, obezbeđen je agens za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi) za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, najmanje:

prvu efektorsku sekvencu sa bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar GAUUGACGAUAAGGGAGA (SEQ ID NO: 1);

sekvencu komplementa prvog efektora;

drugu efektorsku sekvencu sa bilo 10 ili više susednih nukleotida unutar UUGAAGUCCCAAUCUGGAU (SEQ ID NO: 2) ili GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC (SEQ ID NO: 3); i

sekvencu komplementa drugog efektora.

[0098] Svaka efektorska sekvenca je suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0099] Alternativno, najmanje jedan efektor, a poželјno obe efektorske sekvence, 100% su komplementarne predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0100] U naročito poželјnim primerima izvođenja, prva i druga efektorska sekvenca sadrže bilo kojih 10 ili više, poželјno bilo kojih 17 ili više, susednih nukleotida unutar sekvenci sposobnih da inhibiraju ekspresiju cilјnog regiona gena za najmanje 70%. Poželјno, u ovom primeru izvođenja, svaka efektorska sekvenca je izabrana od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23.

[0101] U primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

[0102] U jednom primeru izvođenja gde ddRNKi agens sadrži 3 efektorske sekvence, obezbeđen je agens za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi) za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens sadrži u smeru od 5’ ka 3’, najmanje:

prvu efektorsku sekvencu od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar GAUUGACGAUAAGGGAGA (SEQ ID NO: 1);

sekvencu komplementa prvog efektora;

drugu efektorsku sekvencu od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar UUGAAGUCCCAAUCUGGAU (SEQ ID NO: 2);

sekvencu komplementa drugog efektora;

treću efektorsku sekvencu od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar GCCGGGCAACGGGGUAAAGGUUC (SEQ ID NO: 3); i

sekvencu komplementa trećeg efektora.

[0103] Svaka efektorska sekvenca je suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0104] Alternativno, najmanje jedan efektor, i opciono 2 od 3 ili sva 3 efektora, 100% su komplementarani predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0105] U posebno poželјnim primerima izvođenja, prva, druga i treća efektorska sekvenca sadrže bilo kojih 10 ili više, poželјno bilo kojih 17 ili više, susednih nukleotida unutar sekvenci sposobnih da inhibiraju ekspresiju cilјnog regiona gena za najmanje 70%. Poželјno, u ovom primeru izvođenja, svaka efektorska sekvenca je izabrana od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23.

[0106] U primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

[0107] U još dalјim primerima izvođenja, prva efektorska sekvenca može biti bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27; druga efektorska sekvenca može biti bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27; treća efektorska sekvenca može biti bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence izabrane iz grupe koja sadrži SEQ ID NO: 1-27; i bilo koja dodatna efektorska sekvenca može biti bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27. Poželјno je da svaku efektorsku sekvencu čini najmanje 17 susednih nukleotida.

[0108] Svaka efektorska sekvenca može takođe biti varijanta SEQ ID NO: 1-27, koja sadrži 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotidnih varijacija. Poželјno, razlike su prisutne u prvih i/ili poslednjih 5 nukleotida, a najmanje 10-12 centralnih nukleotida je 100% komplementarno predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena. Ovakvi primeri izvođenja su naročito korisni za ciljano dejstvo na izbegavajuće mutante HBV-a, kao i različite virusne genotipove ili kvazi-vrstea. U primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9, a prvu i drugu efektorsku sekvencu čini najmanje 17 nukleotida u dužini.

[0109] Svaka od prve, druge ili treće efektorske sekvence može sadržavati sekvencu izabranu od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27, ili alternativno, svaka efektorska sekvenca može takođe biti varijanta SEQ ID NO: 1-27, koja sadrži 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotidnih varijacija. U još jednom primeru izvođenja, svaka efektorska sekvenca se može sastojati od 22 nukleotida, od kojih su 17, 18, 19, 20, 21 ili svih 22 nukleotida susedni nukleotidi iz sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27. U primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9. Kada postoji više efektorskih sekvenci, one mogu predstavlјati kombinaciju 3 od predhodno opisanih tipova. Štaviše, dugi ddRNKi agens sa strukturom ukosnice ili sa višestrukim strukturama ukosnice može uklјučivati dodatne efektorske sekvence i odgovarajuće komplementarne sekvence prema jednoj od sledećih formula:

Duga struktura ukosnice:

● [efektorska sekvenca]1-10[sekvenca efektorskog komplementa]1-10

Višestruke strukture ukosnice

● [efektorska sekvenca – sekvenca efektorskog komplementa]1-10

[0110] Poželјno je da je u formuli za dugi ddRNKi sa strukturom ukosnice, broj efektorskih sekvenci jednak broju sekvenci efektorskih komplemenata. Obično postoje 2, 3, 4 ili 5 efektorskih sekvenci, i prema tome, 2, 3, 4 ili 5 sekvenci efektorskog komplementa.

[0111] Kada ddRNKi agens sadrži više od jedne efektorske sekvence, efektorske sekvence mogu biti iste ili različite. Na primer, ukoliko ddRNKi agens sadži 3 efektorske sekvence, 2 efektorske sekvence mogu imati istu sekvencu, dok je 1 različita. Alternativno, sve 3 efektorske sekvence mogu biti različite. Poželјno je da efektorske sekvence predstavljaju bilo kojih 10 ili više i poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27 ili varijanti sekvenci SEQ ID NO: 1-27 sa 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotidnih varijacija. Poželјno je takođe da su razlike prisutne u prvih i/ili poslednjih 5 nukleotida i da je najmanje 10-12 centralnih nukleotida 100% komplementarno predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0112] Kada se ciljano deluje na jedan region cilјne sekvence koja ima varijante koje se javlјaju prirodi (npr. različiti genotipovi ili kvazi-vrste), izbegavajuće mutante ili polimorfizme pojedinčnih nukleotida (SNP), poželјno je da se najmanje jedna efektorska sekvenca odabere između bilo kojih od 10 ili više i poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27, dok su druge efektorske sekvence varijante te odabrane sekvence. Na primer, prva efektorska sekvenca može sadržavati 20 nukleotida SEQ ID NO: 1; druga efektorska sekvenca bi dakle trebala da bude varijanta SEQ ID NO: 1.

[0113] U svim slučajevima, u primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9, a prva i druga efektorska sekvenca su dužine od najmanje 17 nukleotida.

Strukture ukosnice

[0114] U prethodno navedenim primerima izvođenja, efektorska sekvenca hibridizuje sa svojom odgovarajućom sekvencom efektorskog komplementa da bi obrazovala ukosnicu. Na kraju strukutre ukosnice, dva ili više nevezana nukleotida formiraju "zglob" ili "petlјu". U jednom primeru izvođenja, nevezani nukleotidi su deo efektorske sekvence i sekvence efektorskog komplementa, tako da će samo deo od najmanje 17 nukleotida efektorske sekvence obrazovati dupleks sa svojom odgovarajućom sekvencom efektorskog komplementa. Na primer, kada su i efektorska sekvenca i njen komplement dužine 22 nukleotida, 19 od nukleotida može biti spareno da bi se obrazovao dvolančani region, ostavlјajući ukupno 6 nukleotida (3 iz svakog lanca) za obrazovanje jednolančane petlјe koja je između i spaja efektorsku sekvencu i njenu sekvencu efektorskog komplementa.

[0115] U alternativnom primeru izvođenja, dodatna sekvenca koja nije komplementarna samoj sebi, cilјna sekvenca, efektorska sekvenca ili sekvenca komplementarna efektorskoj sekvenci mogu biti uklјučeni u ddRNKi. Tako, u još jednom primeru izvođenja pronalaska, ddRNKi agens dodatno uklјučuje sekvencu od 2 do 100 nesparenih nukleotida sposobnih da obrazuju petlјu, još poželјnije, 2 do 10 nesparenih nukleotida. U poželјnom primeru izvođenja, struktura petlјe uklјučuje nukleotidne sekvence AA, UU, UUA, UUAG, UUACAA, CAAGAGA ili N1AAN2, gde su N1i N2bilo koji od C, G, U i A i mogu biti isti ili različiti.

[0116] Može postojati jedna ili više strukturi petlјe, u zavisnosti od strukture ddRNKi agensa. Kada je ddRNKi agens dug i sa strukturom ukosnice zasnovanoj na formuli [efektorska sekvenca]1-10[sekvenca efektorskog komplementa]1-10, dodatna sekvenca koja nije komplementarna samoj sebi i obrazuje jednu strukturu petlje, nalazi se između poslednje efektorske sekvence i sekvence efektorskog komplementa poslednje efektorske sekvence, kao što je ilustrovano na Slici 1D. U ovom primeru izvođenja, obezbeđen je, dakle, agens za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi) za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’ , najmanje:

prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

sekvencu od 2 do 100 nukleotida koji nisu komplementarni sami sebi;

sekvencu komplementa drugog efektora; i

sekvenca komplementa prvog efektora

pri čemu je svaka efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena. U svim primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

[0117] Kada ddRNKi agens ima višestruke strukture ukosnice i zasnovan je na formuli [efektorska sekvenca- sekvenca efektorskog komplementa]1-10dodatna sekvenca koja nije komplementarna samoj sebi se nalazi između svake efektorske sekvence i njene komplementarne sekvence da bi se obrazovala struktura petlјe, kao što je ilustrovano na Slici 1E i F (u zavisnosti od tipa ekspresione kasete koja se upotrebljvava za njegovu ekspresiju (pogledati kasnije u specifikaciji) U ovom primeru izvođenja, obezbeđen je agens za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi) za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, najmanje:

prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

sekvencu od 2 do 100 nukleotida koji nisu sami sebi komplementarni;

sekvencu komplementa prvog efektora;

drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

sekvencu od 2 do 100 nukleotida koji nisu sami sebi komplementarni; i

sekvencu komplementa drugog efektora

pri čemu je svaka efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0118] U ovom primeru izvođenja gde postoji više od dva efektora i dve sekvenca efektorskog komplementa, a prema tome više od dve strukture ukosnice, dužina dodatne sekvence koja nije sama sebi komplementarna i obrazuje svaku od strukture petlje, ne mora biti ista. Na primer, jedna struktura petlјe može imati 5 nukleotida, dok druga struktura petlјe može imati 9 nukleotida. U svim primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

Dvolančani ddRNKi agensi

[0119] Kao što će stručnjasti iz oblasti razumeti, nije neophodno da se celokupan ddRNKi agens eksprimira kao jedna sekvenca. Na primer, takođe je opisano da se prva efektorska sekvenca može proizvesti (npr. transkripcijom sa jedne DNK sekvence), kao i da se može proizvesti komplement prve efektorske sekvence (npr. trankripcijom sa zasebne DNK sekvence). Opciono, sekvenca petlјe može biti vezana bilo sa transkriptom ili delom petlјe koji je vezan za 3’ kraj jednog transkripta i 5' kraj drugog transkripta. Unutar ćelije, dva transkripta zatim formiraju ddRNKi agens, hibridizacijom putem sparivanja između efektorske(ih) sekvence(i) i njihovog(ih) komplemen(a)ta.

In vitro eksprimirani ddRNKi agensi ili hemijski sintetisani agensi siRNK

[0120] Iako je predviđeno da će za efikasno lečenje hronične HBV infekcije biti neophodno da se ddRNKi agensi eksprimiraju in vivo sa ddRNKi konstrukata (kao što će biti prikazano u nastavku tekstu), mogu postojati okolnosti u kojima je poželјno da se primene ddRNKi agense koji su eksprimirani in vitro ili da se primene siRNK koje su hemijski sintetisane, tako da deluju više kao tranzijentna terapija. Akutna HBV infekcija, na primer, može imati koristi od kratkotrajnog tretmana sa siRNK koji se ne integrišu i umnožavaju replikacijom u ćelijama.

[0121] Agensi za ddRNKi pronalasku mogu stoga biti eksprimirani in vitro i zatim isporučuni cilјnim ćelijama. Alternativno, siRNK mogu biti hemijski sintetisane i zatim isporučene cilјnim ćelijama. U svetlu navedenog, agens tipa malih interferirajućih RNKi (siRNK agens) za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), siRNK sadrži

prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; i

sekvencu komplementa prvog efektora;

pri čemu je efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0122] Slično ddRNKi agensima koji su prethodno opisani, siRNK agens može takođe uklјučivati više od jedne efektorske sekvence za višestruko ciljano delovanje. Efektorske sekvence poželјno ciljano deluju gen za HBV polimerazu, i najpoželјnije, izabrane su od bilo kojih 10 ili više, a poželјno 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27.

[0123] Značajna fleksibilnost je moguća u dizajnu siRNK. siRNK se obično sastoji od molekula dsRNK sa 5'-fosfatnim i 3'-hidroksilnim ostacima, a dužine lanaca mogu varirati od 21-29 nukleotida i opciono mogu biti dizajnirane tako da uklјučuju 2 nukleotidna 3’ ispusta. U nekim primerima izvođenja, svaki lanac se može sintetsati kao N19-27TT (gde TT može biti deoksiribonukleotid). siRNK se mogu lako dizajnirati na osnovu regiona SEQ ID NO: 1-27, kao što je prethodno opisano, i mogu biti upotrebljene za terapiju kao pojedinačne sekvence ili u bilo kojoj kombinaciji. Alternativno, siRNK agensi se mogu sastojati od pojedinačnih RNK molekula koji sadrže efektorske i sekvence efektorskih komplemenata slične ili identične onima koje se eksprimiraju sa ddRNKi ekspresionih kaseta. Ovakve sekvence mogu biti zasnovane na SEQ ID NO: 1-27 i mogu biti upotrebljene terapijski kao pojedinačne sekvence ili u bilo kojoj kombinaciji. siRNK mogu biti hemijski sintetiase upotrebom odgovarajućih zaštićenih ribonukleozidnih fosforamidita i konvencionalnih sintetizera i na taj način su široko komercijalno dostupni i mogu biti dizajnirani i sintetisani praćenjem rutinskih postupaka u stanju tehnike. U poželјnim primerima izvođenja, siRNK imaju sekvence od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence jedne ili više od SEQ ID NO: 1-27.

[0124] Za isporuku siRNK u različite ćelijske linije upotrebljavani su brojni reagensi za transfekciju. Lipofektamin 2000 i Oligofektamin se rutinski koriste za isporuku siRNK. “Gole” siRNK su takođe bile isporučivane postupcima hidrodinamičke transfekcije. Drugi postupci isporuke će biti poznati stručnjaku.

Ekspresione kasete ddRNKi agensa

[0125] Kao što je prethodno objašnjeno, ddRNKi agensi pronalasku i kao što je opisano, eksprimiraju se sa DNK ekspresionih kaseta insertovanih u bilo koji pogodni vektor ili ddRNKi konstrukt. ddRNKi ekspresione kasete sadrže (bez određenog reda):

● jednu ili više promotorskih sekvenci

● jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju jednu ili više efektorskih sekvenci

● jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju jednu ili više sekvenci efektorskog komplementa;

● jednu ili više terminatorskih sekvenci

i opciono

● jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju sekvence petlјi

● jednu ili više sekvenci pojačivača.

[0126] U jednom opisanom primeru izvođenja, obezbeđena je ekspresiona kaseta za RNK interferenciju usmerenu sa DNK (ddRNKi) za ekspresiju ddRNKi agensa, pri čemu ddRNKi agens inhibira ekspresiju jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi ekspresiona kaseta koja sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

promotorsku sekvencu

sekvencu DNK koja kodira prvu efektorsku sekvencu

opciono sekvencu koja kodira sekvencu sposobnu da obrazuje petlјu

sekvencu DNK koja kodira komplement prvog efektora; i

sekvencu terminatora.

[0127] DNK sekvenca koja kodira prvu efektorsku sekvencu je poželјno DNK koja kodira 10 ili više, poželјno 17 ili više, susednih nukleotida unutar sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 1-27. U posebno poželјnom primeru izvođenja, prva efektorska sekvenca sadrži bilo kojih 10 ili više, poželјno bilo kojih 17 ili više, susednih nukleotida unutar sekvenci sposobnih da inhibiraju ekspresiju cilјnog regiona gena za najmanje 70%. Poželјno, u ovom primeru izvođenja, prva efektorska sekvenca je izabrana od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23.

[0128] Alternativno, kao što je prethodno navedeno u vezi sa samim ddRNKi agensom, sekvenca koja kodira efektorsku sekvencu može kodirati efektorsku sekvencu koja ima varijaciju u 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida iz SEQ ID NO: 1-27 bez uticaja na sposobnost efektorske sekvence koja je kodirana da se bazama spari sa cilјnom sekvencom i inhibira ekspresiju cilјne sekvence. U primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

[0129] Stručnjaku je ipak potrebno napomenuti da je sekvenca DNK koja kodira bilo koju datu RNK sekvencu ista sekvenca kao RNK, ali da sadrži timinske (T) baze umesto baza uracila (U).

[0130] Ekspresione kasete za ddRNKi opisa i pronalaska koje kodiraju ddRNKi agense sa više od jedne efektorske sekvence tipa duge strukture ukosnice, sadrže, u smeru od 5’ ka 3’:

sekvencu promotora;

sekvencu DNK koja kodira prvu efektorsku sekvencu;

sekvencu DNK koja kodira drugu efektorsku sekvencu;

opciono, sekvencu koja kodira za sekvencu sposobnu da obrazuje petlјu;

sekvencu DNK koja kodira komplement drugog efektora;

sekvencu DNK koja kodira komplement prvog efektora; i

terminatorsku sekvencu.

[0131] Poželјno je da su sekvence DNK kodiraju prvu i drugu efektorsku sekvencu izabrane od bilo kojih 10 ili više i poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27. Poželјno, prva i druga sekvenca efektora su izabrane od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23. Alternativno, sekvence DNK kodiraju efektorsku sekvencu koja varira u odnosu na SEQ ID NO: 1-27 sa 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida, bez uticaja na sposobnost efektorske sekvence koja je kodirana, da se spari bazama sa cilјnom sekvencom i inhibira ekspresiju cilјne sekvence. U primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9, a prva i druga efektorska sekvenca su dužine od najmanje 17 nukleotida.

[0132] Kada ddRNKi agens čini više od jedne efektorske sekvence i višestruke strukture ukosnice zasnovane na formuli [efektorska sekvenca-sekvenca efektorskog komplementa]1-10, ekspresija svakog para [efektorska sekvenca-sekvenca efektorskog komplementa] može biti kontrolisana jednim promotorom, ili alternativno, zasebnim promotorom. Kada se razmatraju zasebni promotori, ddRNKi ekspresiona kaseta sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

promotorsku sekvencu

sekvencu DNK koja kodira prvu efektorsku sekvencu

sekvencu DNK koja kodira komplement prvog efektora;

opciono, terminatorsku sekvencu;

promotorsku sekvencu;

sekvencu DNK koja kodira drugu efektorsku sekvencu;

sekvencu DNK koja kodira komplement drugog efektora; i

terminatorsku sekvencu.

[0133] Kada se razmatra pojedinačni promotor, ddRNKi ekspresiona kaseta sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

promotorsku sekvencu

sekvencu DNK koja kodira prvu efektorsku sekvencu

sekvencu DNK koja kodira sekvencu komplementa efektora do prve efektorske sekvence;

sekvencu DNK koja kodira drugu efektorsku sekvencu;

sekvenca DNK koja kodira sekvencu komplementa efektora do druge efektorske sekvence; i

terminatorsku sekvencu.

[0134] Slično prethodno navedenim primerima izvođenja, sekvence DNK poželјno kodiraju prvu i drugu efektorsku sekvencu izabranu od bilo kojih 10 ili više i poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27 ili efektorsku sekvencu koje se razlikuje u sekvenci od SEQ ID NO: 1-27 za 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida. Poželјno, prva i druga efektorska sekvenca su izabrane od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23.

[0135] U primerima izvođenja pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9, a prva i druga efektorska sekvenca su dužine od najmanje 17 nukleotida.

[0136] Ekspresiona kaseta ddRNKi može alternativno biti opisana u odnosu na ukupnu dužinu eksprimiranog ddRNKi agensa, koja je proizvod ukupne dužine sekvence između promotora i terminatorske sekvence. Na primer, kada se dužina efektorske sekvence u jednom efektoru ddRNKi predstavja kao niz 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida, ddRNKi ekspresiona kaseta će biti dužine od 34 do 60 nukleotida između promotora i terminatorske sekvence. Navedena dužina može dodatno uklјučivati 2 do 100 nukleotida sekvence "petlјe" ili "zgloba", što rezultuje dužinom od između 36 i 160 nukleotida. Za ddRNKi agense koji imaju višestruke efektorske sekvence, gde se svaka efektorska sekvenca sastoji od 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ili 30 nukleotida, ukupna dužina se proporcionalno povećava.

[0137] Jedan od korisnih načina dizajniranja ddRNKi ekspresionih kaseta pronalaska je da se pretpostavi da su mesta isecanja Dicer enzimom na svakih 22 nukleotida (označno i kao fazost od 22 nukleotida), kao i da obrada počinje od osnove shRNK. Sekvence DNK koje kodiraju efektorske sekvence mogu stoga biti dizajnirane da kodiraju bilo kojih 10 ili više, a poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27, zajedno sa odgovarajućim spejserima i drugim zahtevima sekvence za odgovarajući promotor. Na primer, pojedine sekvence navedene u SEQ ID NO: 1-27 su veće od 22 nukleotida; u ovim slučajevima, potrebno je da samo deo sekvence bude operativno povezan sa promotorom.

[0138] Agensi koji ciljano deluju na različita mesta iRNK su pogodni za konstrukciju shRNK, pošto oni mogu izbeći uticaj sekundarnih struktura iRNK i na taj način nezavisno obavlјati svoje funkcije.

[0139] Kada se upotrebljava U6 promotor, poželјno je da sekvenca DNK koja je operativno povezana sa promotorom počinje sa guaninskom (G) bazom; kada se upotrebljava H1 promotor, poželјno je da sekvenca DNK koja je operativno povezana sa promotorom počinje sa adeninskom (A) bazom. Efektorska kodirajuća sekvenca se stoga može modifikovati u skladu sa time. Za neke sekvence iz SEQ ID NO: 1-27, efektorske sekvence su kraće od 22 nukleotida; u ovim slučajevima, poželјno je uklјučiti HBV sekvence koje su susedne HBV cilјnim mestima. Navedeno bi služilo da se maksimalno poveža homologija efektorskih sekvenci sa HBV iRNK i može takođe dozvoliti uklјučivanje A ili G ostataka da bi se omogućila efikasna inicijaciju transkripcije od U6 ili H1 promotora, kao što je prethodno opisano.

Štaviše, naročito za US transkripciju, poželjno je da je efektorska sekvenca postavlјena 3’ u odnosu na strukturu petlje da bi se izbegao 5' G neophodan za efikasnu transkripciju U6.

[0140] U nekim slučajevima, može biti poželјno da se izbegne DNK sekvenca TTTT unutar efektora, efektorskog komplementa ili sekvence petlјe pošto ona može delovati kao transkripcioni terminator u ekspresionim konstruktima koji koriste promotore Pol III poput U6 ili H1. Dizajn shRNK bi takođe trebao da uzme u obzir da se očekuje da će terminacija U6 dovesti do dodavanja UU na 3’ kraj shRNK. Kada se dizajniraju duge RNK sa strukturom ukosnice, ponekada je prednost modifikovati precizan izbor efektorskih sekvenci (ili upotrebom sekvenci iz ili susednih sa SEQ ID NO: 1-27) da bi se maksimalno povećala verovatnoća da će efektorske sekvence obrađene sa Dicer uklјučiti 5'U ili A, čime se podstiče ugrađivanje u AGO2.

[0141] Izbor da li da se kontroliše ekspresija svakog para [efektorska sekvenca-efektorski komplement] zavisi od više faktora. Jedan promotor može biti korišćen da smanji do minimuma interferenciju između promotora. ddRNKi konstrukt sa samo jednim promotorom je takođe manji po veličini, što može biti važno u pojedinim slučajevima za stabilnost konstrukta, kako tokom proizvodnje (npr. replikacije u E.coli) tako i isporuke. Dodatno, upotreba jednog promotora izbegava mogućnost bilo kakve homologne rekombinacije između promotora.

[0142] U okolnostima kada je ipak potreban stepen regulacije ekspresije svake efektorske sekvence ili komplementa, prednost je dizajnirati ddRNKi konstrukt koji ima višestruke promotore, čime je ekspresija svakog para [efektorska sekvenca – sekvenca komplementa efektora] kontrolisana od strane zasebnog promotora. U okolnostima gde su efektorske sekvence različite sekvence, priroda sekvence može značiti da se jedna sekvenca eksprimira sa većim nivoom ekspresije. Kada je poželјno da se osiguraju više jednaki nivoi ekspresije svake efektorske sekvence, više eksprimirana efektorska sekvenca može biti uparena sa slabijim promotorom i obrnuto. Štaviše, efikasnija ekspresija se može postići pošto je dužina bilo koje sekvence koja će biti transkribovana kraća. Kada se koriste višestruki promotori, poželјno je da nisu svi promotori isti da bi se do minimum smanjio rizik bilo koje homologne rekombinacije između njih. U slučaju 2 promotora, svaki je poželјno različit. U slučaju 3 promotora, najmanje 2 i opciono sva 3 su različiti jedan od drugog.

[0143] Sekvenca DNK koja kodira efektorsku sekvencu je operativno povezana sa promotorskom sekvencom. Sekvenca je "operativno vezana" za drugu nukleotidnu sekvencu kada je postavlјena u funkcionalni odnos sa drugom nukleotidnom sekvencom. Na primer, ukoliko je kodirajuća sekvenca operativno povezana za promotorsku sekvencu, to obično znači da promotor dovodi do transkripcije kodirajuće sekvence. Operativno povezano označava da su sekvence DNK koje su povezane obično susedne i, gde je neophodno spojiti dva kodirajuća reigona proteina, susedne i u okviru čitanja. Ipak, pošto pojačivači mogu funkcionisati kada su odvojeni od promotora za nekoliko kilobaza i intronske sekvence mogu biti promenlјive dužine, pojedine nukleotidne sekvence mogu biti operativno povezane, ali ne i susedne.

[0144] "Promotor" ili "promotorska sekvenca" ili "promotorski element", u principu je regulatorni region DNK sposoban da vezuje RNK polimerazu u ćeliji i da inicira transkripciju polinukleotidne ili polipeptidne kodirajuće sekvence kao što je iRNK ili bilo koja vrsta RNK koja se transkribuje bilo kojom klasom bilo koje RNK polimeraze. Promotor i terminator mogu biti uzeti iz različitih gena, ali su obično međusobno usklađeni jedan sa drugim; preciznije, promotorske i terminatorske sekvence ili elementi se uzimaju iz istog gena u kome se javlјaju u prirodi. Promotori takođe mogu ili ne moraju biti modifikovani korišćenjem molekularnih tehnika, ili na drugi način, npr. mutacijom regulatornih elemenata kao što su pojačivači, da bi se postigli viši ili niži nivoi transkripcije.

[0145] Termin "konstitutivni" kada se odnosi na promotor, označava da je promotor sposoban da usmeri transkripciju operativno povezane sekvence nukleinske kiseline u prisustvu ili odsustvu specifičnog stimulusa (npr. toplotnog šoka, hemikalija, svetlosti itd.).

[0146] Konstitutivni promotori su obično sposobni da usmeravaju ekspresiju kodirajuće sekvence u suštinski bilo koju ćeliju i bilo koje tkivo. Promotori upotrebljeni u ekspresionim kasetama za transkribciju ddRNKi agenasa poželјno su konstitutivni promotori, kao što su promotori za gen ubikvitina, CMV, β-aktina, histona H4, EF-1alfa ili pgk, čija je ekspresija pod kontrolom vezivanja RNK polimeraze II za promotor ili promotorske elemente za koje se vezuje RNK polimeraza I. U drugim primerima izvođenja, upotrebljava se Pol II promotor kao što je promotor CMV, SV40, hAAT, U1, βaktina ili hibridni Pol II promotor. U drugim primerima izvođenja, koriste se promotorski elementi povezani RNK polimerazom III, kao što su U6 promotori (npr. U6-1, U6-8, U6-9), H1 promotor, 7SL promotor, humani Y promotori (hY1, hY3, hY4 (pogledati Maraia i saradnici, Nucleic Acids Res 22(15):3045-52 (1994)) i hY5 (pogledati Maraia i saradnici, Nucleic Acids Res 24 (18):3552-59 (1994)), humani MRP-7-2 promotor, adenovirusni VA1 promotor, promotori humanih tRNK, promotori 5S ribozomalne RNK, kao i funkcionalni hibridi i kombinacije bilo kojih od ovih promotora. Varijante ovih promotora takođe mogu biti upotrebljene, pri čemu je promotor modifikovan da smanji ili poveća svoju aktivnost. Na primer, ukoliko jak promotor prouzrokuje preteranu ekspresiju sekvence koja je sa njime povezana, to može biti modifikovano smanjenjem njegove aktivnosti.

[0147] Kada se upotrebljava U6 promotor, poželјno je da sekvenca DNK koja je operativno povezana sa promotorom počinje sa guaninskom (G) bazom; kada se upotrebljava H1 promotor, poželјno je da sekvenca DNK koja je operativno povezana sa promotorom počinje sa adeninskom (A) bazom. Sekvence nukleinskih kiselina mogu stoga favorizovati upotrebu jednog promotora u odnosu na drugi.

[0148] Alternativno, u pojedinim primerima izvođenja može biti optimalno da se izaberu promotori koji dozvoljavaju inducibilnu ekspresiju višestrukih ddRNKi agenasa koji se eksprimiraju sa ddRNKi konstrukta. Brojni sistemi za inducibilnu ekspresiju upotrebom takvih promotora su poznati u stanju tehnike, uklјučujući, ali se ne ograničavajući na, sistem odgovora na tetraciklin i lac sistem operatorrepresor (pogledati WO 03/022052 A1 publikaciju; i U.S. Patent Publication 2002/0162126 A1), ekdizonom regulisani sistem ili promotore regulisane glukokortikoidima, progestinima, estrogenom, sa RU-486, steroidima, tiroidnim hormonima, cikličnim AMP-om, citokinima, regulatorima kalciferolske familije ili metalotioneinski promotor (regulisan neorganskim metalima).

[0149] Promotori korisni u nekim primerima izvođenja pronalaska, mogu biti specifični za tkivo ili ćelije. Termin "specifičan za tkivo", kako se primenjuje za promotor, odnosi se na promotor koji je sposoban da usmeri selektivnu ekspresiju nukleotidne sekvence od interesa na specifičan tip tkiva sa relativnim odsustvom ekspresije iste nukleotidne sekvence od interesa u različitom tipu tkiva (npr. mozgu). Termin "ćelijski specifičan", kako se primenjuje za promotor, odnosi se na promotor koji je sposoban da usmeri selektivnu ekspresiju nukleotidne sekvence od interesa u specifičnom tipu ćelije sa relativnim odsustvom ekspresije iste nukleotidne sekvence od interesa u različitom tipu ćelije unutar istog tkiva. Termin "ćelijski specifičan", kada se primenjuje za promotor, takođe označava promotor sposoban da proizvede selektivnu ekspresiju nukleotidne sekvence od interesa u regionu unutar jednog tkiva. Alternativno, promotori mogu biti konstitutivni ili regulisani. Dodatno, promotori mogu biti modifikovani tako da poseduju različite specifičnosti.

[0150] U slučaju HBV infekcije, mogu se koristiti promotori specifični za jetru. Primeri promotora specifičnih za jetru su humani antitripsinski promotor (hAAT), promotor apolipoproteina H (ApoH) i promotor lecitin holesterol acetil transferaze (LCAT). Alternativno, transtiretin ili TTR promotor može biti upotrebljen. TTR promotor je izveden iz mišjeg prealbuminskog gena i takođe se označava kao prealbumin. TTR promotor pune dužine normalno kontroliše ekspresiju serumskog proteina koji vezuje tiroksin koji se sintetiše od strane hepatocita i epitela horoidnog pleksusa kod odraslih. U jednom primeru izvođenja, poželјni TTR promotor je TTR promotor u kome je deletiran region koja kontroliše ekspresiju u horioidnom pleksusu, ali je zadržan region koji pokreće ekspresiju specifičnu za jetru. Pogledati na primer WO2007/120533 i US20060189561.

[0151] Kao što je prethodno navedeno, elementi pojačivača su opciono uklјučeni u ddRNKi konstrukte pronalaska. Jedan poželјni element pojačivača je za ApoE. Element pojačivača ApoE se sastoji od približno 155 bp izvedenih iz apolipoproteina E (ApoE). ApoE posreduje u vezivanju, internalizaciji i katabolizmu lipoproteinskih čestica i predstavlјa ligand za receptor lipoproteina niske gustine (ApoB/E) i za ApoE receptor tkiva jetre. Genetički pojačivač povezan sa ApoE genom je eukariotski kontrolni element koji može povećati transkripciju nukleinske kiseline specifično u jetri. ApoE pojačivač može biti lociran do 2000 nukleotida uzvodno ili nizvodno od specifičnog promotora jetre i može biti prisutan u više od jedne kopije. ApoE/hAAT je poželјna kombinacija pojačivača/promotora.

[0152] Alternativno, može biti upotrebljen sintetski pojačivač (SinEnh), kao što je onaj opisan u US20060189561.

[0153] Kada ddRNKi ekspresiona kaseta ili konstrukt sadrži više od jedne terminatorske sekvence ili elementa, terminatorske sekvence ili elementi mogu biti isti ili različiti, ili mogu biti kombinacija terminacionih elemenata predstavlјenih samo jednom ili terminacionih elemenata predstavlјenih dva puta ili više u okviru bilo koje kasete. Koje god terminatorske sekvence ili elementi da su upotrebljavaju, oni treba da budu izabrane tako da se osigura da će raditi na odgovarajući način sa upotreblјenim promotorom koji je specifičan za jetru. U slučajevima gde se koriste Pol I, Pol III ili Pol III promotori, treba koristiti odgovarajuće terminatorske sekvence. Elementi terminacije koji su korisni u predmetnom pronalasku uklјučuju U1 terminacionu sekvencu (U1 boks), sintetski poli terminator i takozvani minimalni PoliA terminator. Mesta pauze transkripcije, kao što su MAZ1 i MAZ2 (pogledati Ashfield i saradnici, EMBO J 1994 Vol13 No 23 str 5656 i Yonaha i Proudfoot, EMBO J. 200017.jul; 19(14):3770-7), mogu biti insertovana uzvodno od poliA terminatora da bi potpomogla kuplovanje završetka transkripcije i poliadenilacije. Za Pol III promotore, sekvence TTTT, TTTTT ili TTTTTT se obično upotrebljavaju kao terminatori. U ovim slučajevima, transkripti se obično završavaju sekvencom UU.

Isporuka ddRNKi konstrukata – ddRNK konstrukti na bazi virusa

[0154] Izazov u razvijanju bilo kog HBV terapeutika je da su praktično svi hepatociti u pacijenima inficirani. U takvom slučaju je potreban način za postizanje efikasne i ravnomerne transdukcije svih ćelija jetre sa ddRNKi agensom pronalaska, da bi se obezbedila efektivna genska terapija za hroničnu HBV infekciju. Štaviše, za efektivno in vivo lečenje HBV infekcije, ddRNKi ekspresiona kaseta pronalaska mora biti u stanju da bude transfektovana u primarne ćelije, matične ćelije i ćelije koje se ne dele.

[0155] Da bi se prevazišlo ovo ograničenje, ddRNKi ekspresione kasete pronalaska su uvedene u vektor za isporuku, poželјno izveden iz virusa da bi se obezbedila kompatibilnost sa virusnom isporukom i da bi se proizveli ddRNKi konstrukti. Kao što je ranije navedeno, okosnica vektora može poslužiti dvostrukoj svrsi, da bude ekspresioni vektor, kao i vektor za isporuku. Stvaranje konstrukta se može postići upotrebom bilo koje pogodne tehnike genetičkog inženjerstva koja je dobro poznata u stanju tehnike, uklјučujući, bez ograničenja, standardne tehnike PCR-a, sintezu oligonukleotida, sintezu DNK, digestiju restrikcionim endonukleazama, ligaciju, transformaciju, prečišćavanje plazmida i sekvenciranje DNK. Konstrukt poželјno sadrži, na primer, sekvence neophodne za pakovanje ddRNKi konstrukta u virusne čestice i/ili sekvence koje omogućavaju integraciju ddRNKi konstrukta u genom cilјne ćelije. Virusni konstrukt takođe može da sadrži gene koji dozvolјavaju replikaciju i umnožavanje virusa, iako će u poželјnim primerima izvođenja takvi geni biti dostavlјeni na trans način. Dodatno, ddRNKi konstrukt može sadržavati gene ili genetičke sekvence iz genoma bilo kog poznatog organizma ugrađenog u prirodni oblik ili modifikovanog. Na primer, poželјni virusni konstrukt sadrži sekvence korisne za replikaciju konstrukta u bakterijama.

[0156] Okosnica virusnog vektora može biti izabrana od lentivirusnog, adenovirusnog (Adv) i adenoasociranog virusnog (AAV) vektora. Neintegrišući virusni vektori mogu biti upotrebljeni za tranzijentnu ekspresiju ddRNKi agenasa pronalaska u ćelijama koje se dele ili za dugoročno stabilnu ekspresiju ćelijama koje se ne dele. Integrišući virusni vektori, kao što su lentivirusni vektori, posreduju stabilnu, dugoročnu ekspresiju i u ćelijama koje dele i u onima koje se ne dele.

[0157] Alternativno, miniplazmidi, kao što su oni opisani u US20040214329, mogu biti upotrebljeni za isporuku ddRNKi ekspresionih kaseta. Miniplazmidi obezbjeđuju trajno visoke nivoe transkripcije nukleinske kiseline i karakteriše ih lišenost bakterijskih sekvenci koje utišavaju ekspresiju.

[0158] Vektori AAV su nepatogeni i manje imunogeni u poređenju sa drugim virusnim vektorima. Sposobnost AAV vektora da inficiraju i ćelije koje se dele i ćelije koje se ne dele, kao i da usmeravaju dugoročnu ekspresiju gena u ovim tkivima, čini ih korisnim nosačima za gensku terapiju. Štaviše, AAV ima niz pseudotipova sa različitim tropizmima ka tkivima. Poželјni AAV vektor je dvolančani AAV pseudotip 8 (dsAAV8).

[0159] Genom AAV obično sadrži samo dva gena. Gen "rep" kodira najmanje četiri zasebna proteina koji se koriste u replikaciji DNK. Proizvod "cap" gena se različito obrađuje da bi se proizvela tri proteina koja čine kapsid virusa. Kada se genom pakuje u nascentan virus, samo su invertovani terminalni ponoci (ITR) obavezne sekvence; rep i cap mogu biti deletirani iz genoma i zamenjeni heterolognim sekvencama po izboru. Međutim, da bi se proizveli proteini potrebni za replikaciju i pakovanje heterolognog konstrukta zasnovanog na AAV u nascentni virion, rep i cap proteini moraju biti obezbeđeni na trans način. Pomoćne funkcije koje se obično obezbeđuju koinfekcijom sa helper virusom, kao što je adenovirus ili herpesvirus, takođe mogu biti obezbeđene na trans način, u obliku jednog ili više ekspresionih DNK plazmida. Pošto genom normalno kodira samo dva gena, nije iznenađujuće da je AAV kao nosač isporuke ograničenog kapaciteta od 4,5 jednolančanih kilobaza (kb). Ipak, iako ovakva restrikcija u veličini može ograničiti gene koji se mogu isporučiti u genskim terapijama zamene, navedeno ne utiče negativno na pakovanje i ekspresiju kraćih sekvenci kao što su ddRNKi vektori.

[0160] Shodno navedenom, drugi aspekt pronalaska obezbeđuje ddRNKi konstrukt koji sadrži virusni vektor u koji je umetnuta ddRNKi ekspresiona kaseta pronalaska. Poželјno je da ekspresiona kaseta kodira višestruke RNKi agense, bilo u vidu dugih RNK strukture ukosnice ili višestrukih struktura ukosnice. U jednom primeru izvođenja, virusni vektor je AAV vektor.

[0161] Nakon proizvodnje ddRNKi konstrukta na bazi virusa, konstrukt se pakuje u virusne čestice. Bilo koji postupak poznat u stanju tehnike, može biti upotrebljen za proizvodnju infektivnih virusnih čestica čiji genom sadrži kopiju virusnog ddRNKi konstrukta. Jedan od postupaka upotrebljava ćelije za pakovanje koje stabilno eksprimiraju virusne proteina potrebne za ugradnju virusnog ddRNKi konstrukta u virusne čestice na trans način, kao i druge sekvence koje su neophodne ili poželјne za određeni virusni sistem za isporuku (na primer, sekvence potrebne za replikaciju, strukturne proteine i sklapanje virusa) i bilo virusne ili veštačke ligande za ulazak u tkivo. Nakon transfekcije virusnog ddRNKi konstrukta u ćelije za pakovanje, ćelije za pakovanje zatim obavljaju replikaciju virusnih sekvenci, ekspresiju virusnih proteina i pakovanje ddRNKi ekspresionih konstruata u infektivne virusne čestice. Linija ćelija za pakovanje može biti bilo koja ćelijska linija koja je sposobna da eksprimira virusne proteine, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, 293, HeLa, A549, PerC6, D17, MDCK, BHK, bing cherry, phoenix, Cf2Th ili bilo koju drugu liniju koja je poznata ili razvijena od strane stručnjaka iz oblasti. Jedna linija ćelija za pakovanje je opisana, na primer, u U.S. Pat. No.6,218,181.

[0162] Alternativno, ćelijska linija koja ne eksprimira stabilno virusne proteine koji su potrebni, može biti ko-transfektovana sa jednim ili sa više konstrukata da bi se postigla efikasna proizvodnja funkcionalnih čestica. Jedan od konstrukata je ddRNKi konstrukt na bazi virusa; drugi konstrukt sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju proteine neophodne da se omogući ćelijama da proizvode funkcionalni virus, kao i druge helperske funkcije.

[0163] Linija ćelija za pakovanje ili konstrukt za replikaciju i pakovanje ne mora eksprimirati genske proizvode omotača. U ovim primerima izvođenja, gen koji kodira gen omotača može biti obezbeđen na posebnom konstruktu koji je ko-transfektovan sa ddRNKi konstruktom zasnovanom na virusu. Kako je protein omotača odgovoran, delom, za opseg virusnih čestica domaćina, virusi mogu biti pseudotipizovani. Kako je prethodno opisano, "pseudotipski" virus je virusna čestica koja sadrži protein omotača koji se obrazuje od virusa različitog od virusa iz koga je izveden genom. Osoba sa iskustvom u oblasti, može izabrati odgovarajući pseudotip za korišćeni sistem za isporuku virusa i ćeliju na koju se ciljano deluje. Pored toga što određuje opseg specifičnih domaćina, izabrani pseudotip može dozvoliti da se virus koncentriše do vrlo visokog titra. Virusi alternativno mogu biti pseudotipizovani sa proteinima ekotropičnih omotača koji ograničavaju infekciju na specifičnu vrstu (npr. ekotropični omotači dozvoljavaju infekciju, na primer, samo mišjih ćelija, dok amfotropni omotači dozvolјavaju infekciju, npr. i humanih i mišjih ćelija). Dodatno, ligandi koji su genetički modifikovani mogu biti upotrebljeni za ciljano dejstvo na specifične ćelije, kao što su asijaloglikoprotein za hepatocite ili transferin za vezivanje posredovano receptorom.

[0164] Nakon proizvodnje u ćelijskoj liniji za pakovanje, virusne čestice koje sadrže ddRNKi ekspresione kasete se prečišćavaju i kvantifikuju (titriraju). Strategije prečišćavanja obuhvataju centrifugiranje u gradijentu gustine ili, poželјno, hromatografske postupke na kolonama.

Postupci lečenja

[0165] Primena ddRNKi agenasa, ddRNKi konstrukata ili siRNK agenasa pronalaska inhibira ekspresiju HBV gena eksprimiranih u ćeliji inficiranoj sa HBV-om. Shodno tome, opisan je postupak lečenja HBV infekcije kod subjekta koji obuhvata obezbeđivanje terapijski efektivne količine ddRNKi agensa pacijentu kome je tretman potreban, gde ddRNKi agens inhibira ekspresiju jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV) poželјno gen za polimerazu HBV-a. Agens za ddRNKi koji se daje pacijentu može biti jedan ili više od:

● ddRNKi agens koji sadrži prvu efektorsku sekvencu; i sekvencu komplementa prvog efektora; pri čemu je efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvu efektorsku sekvencu; drugu efektorsku sekvencu; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora, pri čemu je svaka efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvu efektorsku sekvencu; drugu efektorsku sekvencu; treću efektorsku sekvencu; sekvencu komplementa trećeg efektora; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora, pri čemu je svaka efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvu efektorsku sekvencu; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu; i sekvencu komplementa drugog efektora, pri čemu je svaka efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvu efektorsku sekvencu; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu; sekvencu komplementa drugog efektora; treću efektorsku sekvencu; i sekvencu komplementa trećeg efektora; pri čemu je svaka efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvu efektorsku sekvencu; sekvencu komplementa prvog efektora; sekvencu od 2 do 100 nukleotida koji nisu sami sebi komplementarni; sekvencu komplementa drugog efektora; i sekvencu komplementa prvog efektora, pri čemu je svaka efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena

● ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’, prvu efektorsku sekvencu; sekvencu od 2 do 100 nukleotida koji nisu sami sebi komplementarni; sekvencu komplementa prvog efektora; drugu efektorsku sekvencu; sekvencu od 2 do 100 nukleotida koji nisu sami sebi komplementarni; i sekvencu komplementa drugog efektora, pri čemu je svaka efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena.

[0166] Kao što će stručnjak podrazumevati, i kao što je ilustrovano na slikama, bilo koja određena efektorska sekvenca može biti u agensu zamenjena u poziciji sa njenim komplementom. U posebnim oblicima svakog od prethodno opisanih primera izvođenja, svaka efektorska sekvenca je dužine od najmanje 17 nukleotida i izabrana iz grupe koja se sastoji od bilo kojih 10 ili više, a poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence bilo koje od SEQ ID NO: 1-27. Efektorske sekvence mogu sve biti iste, ili sve mogu biti različite, ili mogu predstavljati kombinaciju npr. 2 efektorske sekvence od najmanje 10 susednih nukleotida iz SEQ ID NO: 1 i 1 efektorske sekvence od najmanje 10 susednih nukleotida iz SEQ ID NO: 4.

[0167] Poželјno je da je efektorska sekvenca izabrana iz grupe koja se sastoji od bilo kojih susednih 11, 12, 13, 14, 15 ili 16 nukleotida unutar bilo koje od SEQ ID NO: 1-27, a najpoželјnije 17 ili više susednih nukleotida unutar bilo koje od SEQ ID NO: 1-27. Efektorski komplement će obično biti iste dužine ili približno iste dužine (tj. ± 15% dužine nukleotida) kao odgovarajuća efektorska sekvenca.

[0168] Pronalazak obezbeđuje ddRNKi agens, ili ddRNKi ekspresioni konstrukt pronalaska, za upotrebu u lečenju akutne ili hronične HBV infekcije kod subjekta, za upotrebu u smanjenju HBV virusnog opterećenja kod subjekta, za upotrebu u smanjenju ozbilјnosti simptoma udruženih sa HBV infekcijom kod subjekta ili za upotrebu u smanjenju infektivnosti HBV-a.

[0169] Svaki od ddRNKi agenasa pronalaska, kao što je opisano, može biti primenje putem ddRNKi ekspresione kasete u ddRNKi konstruktu, kao što je opisano u ranijim odelјcima specifikacije. Višestruko ciljano dejstvo se može postići isporukom dve ili više ddRNKi ekspresionih kaseta ili konstrukata od kojih je svaki sposoban da eksprimira jedan ddRNKi agens ili, alternativno, isporukom jedne ili više ddRNKi ekspresionih kaseta ili konstrukata od kojih je svaki sposoban da eksprimira više od jednog ddRNKi agensa.

[0170] U alternativnim primerima izvođenja, svaka od efektorskih sekvenci može biti 100% komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena ili može varirati u odnosu na nju sa samo 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida.

[0171] Postupak lečenja HBV infekcije može opciono uklјučiti preliminarni korak identifikacije pojedinca koji ima HBV infekciju, uklјučujući identifikaciju serotipa izolata HBV-a.

[0172] Za dugoročno ili stabilno obezbeđivanje ddRNKi agenasa pronalaska, kao što je opisano, ili se ddRNKi agens obezbeđuje preko ddRNKi konstrukta pronalaska ili, kao što je opisano, tj. in vivo ekspresijom ddRNKi agensa sa ddRNKi ekspresione kasete insertovane u pogodan vektor koji se isporučuje u ćeliju. ddRNKi ekspresiona kaseta sadrži:

● jednu ili više promotorskih sekvenci

● jednu ili više sekvenci DNK izabranih iz grupe koja se sastoji od sekvenci koje kodiraju bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz SEQ ID NO: 1-27;

● jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju jednu ili više sekvenci efektorskog komplementa;

● jednu ili više terminatorskih sekvenci

● i opciono

● jednu ili više sekvenci DNK koje kodiraju sekvence petlјi

● jednu ili više sekvenci pojačivača.

[0173] Ekspresione kasete pronalaska kodiraju ddRNKi agense pronalaska.

[0174] Kao što je ranije navedeno u specifikaciji, ove komponente ddRNKi ekspresione kasete mogu imati različite redoslede od 5’ ka 3’ kraju, od kojih su sve pogodne za upotrebu u postupcima pronalaska.

[0175] U opisanim postupcima, HBV cilјni gen je najmanje gen za polimerazu (P), a potencijalno površinski antigen ili X gen, kada se cilјna sekvenca nalazi unutar preklapajućih otvorenih okvira čitanja, a ddRNKi agens sadrži ddRNKi efektorske sekvence od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz SEQ ID NO: 1-27 koje su navedene u Tabeli 1. Alternativno, kao što je detalјno opisano ranije, sekvenca koja kodira efektorsku sekvencu ili sekvencu komplementarnu prvoj efektor sekvenci, može varirati od SEQ ID NO: 1-27 u 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida, bez uticaja na sposobnost kodirane sekvence da spari baze sa cilјnom sekvencom i inhibira ekspresiju cilјne sekvence HBV-a.

[0176] Svaka efektorska sekvenca obično obrazuje dvolančani region sa odgovarajućom sekvencom efektorskog komplementa.

[0177] U alternativnom primeru izvođenja, postupak lečenja HBV infekcije kod pojedinca obuhvata primenu terapijski efektivne količine ddRNKi konstrukta koji kodira ddRNKi agens koji dalje sadrži više od jedne efektorske sekvence, kao što su one koje su prethodno navedene.

[0178] HBV infekcija koju treba lečiti može biti hronična HBV infekcija. Pod "hroničnim" se označava da je HBV infekcija dugotrajna ili trajna. Termin hronično opisuje tok bolesti ili brzinu početka i razvoja. Kada se leči hronična HBV infekcija, poželјno je da se ddRNKi konstrukt primenjuje i bilo stabilno održava ili integriše u cilјnu ćeliju, da bi se obezbedila dugoročnija ekspresija ddRNKi agenasa. Kao što je prethodno detalјno opisano, navedeno se može postići upotrebom ddRNKi konstrukata sa okosnicom virusnog vektora. U skladu sa time, oprisan je postupak lečenja hronične HBV infekcije kod pojedinca koji se sastoji od davanja terapijski efektivne količine ddRNKi konstrukta, kao što je opisano, pacijentu kome je lečenje potrebno. ddRNKi konstrukt pronalaska za lečenje hronične HBV infekcije čini deo pronalaska.

[0179] Lečenje hronične HBV infekcije ima za cilј smanjenje infektivnosti virusa, interferiranjem sa replikacijom virusa. Navedeno zauzvrat smanjuje rizik prenosa i širenja HBV. Opisan je stoga postupak smanjenja infektivnosti HBV-a kod pojedinca inficiranog sa HBV-om, koji se sastoji od davanja pojedinačnih ddRNKi konstrukata pronalaska zarad ciljanog dejstva na gen HBV-a, poželјno gen za polimerazu. Krajnje kliničke tačke koje se koriste u terapiji hroničnog hepatitisa B će se razlikovati između pacijenata sa kompenzovanim hepatitisom B (gde su klјučni krajnji cilјevi održanje supresije virusa, serološkog odgovora, histološkog pobolјšanja, normalizacija testova funkcije jetre i nekliničke progresije) i onih sa dekompenzovanim hepatitisom B. Kod pacijenata sa dekompenzovanom bolešću, jetra je u velikoj meri sa ožiljcima i fibrozna, a prevencija/oporavak od oštećenja jetre i prevencija progresije bolesti, kao i otklanjanje mogućnosti potrebe za transplantacijom jetre su glavni cilјevi terapije. Krajnje tačke za kompenzovani hepatitis B su smanjenje virusnog opterećenja sa serološkim i biohemijskim pobolјšanjem, histološkim pobolјšanjem, merama otkazivanja jetre i završnog stadijuma oboljenja jetre, komplikacijama, transplantacijom i mortalitetom.

[0180] U još jednom primeru izvođenja, opisan je postupak smanjenja progresije bolesti jetre kod subjekta koja je rezultat HBV infekcije do minimuma, koji se sastoji od primene ddRNKi konstrukta pronalaska pojedincu da bi se ciljano delovalo na gen HBV-a, poželјno gen za polimerazu.

[0181] U još jednom primera izvođenja pronalaska, opisan je postupak smanjenja simptoma povezanih sa HBV infekcijom kod subjekta do minimuma, koji obuhvata davanje pojedincu ddRNKi konstrukta pronalaska da bi se ciljano delovalo na gen HBV-a, poželјno gen za polimerazu.

[0182] Status ili težina kliničke slike HBV infekcije kod pojedinca može biti procenjena određivanjem njegovog virusnog opterećenja. Pod "virusnim opterećenjem" se podrazumeva količina virusa u zahvaćenoj telesnoj tečnosti. Na primer, on može biti naveden u vidu broja kopija RNK po mililitru krvne plazme. Smatra se da osobe sa visokim virusnim opterećenjem imaju jaču HBV infekciju. Alternativno, virusno opterećenje je pokazatelј reakcije pojedinca na određeni tretman. Ukoliko lečenje radi i održava nivo virusa na niskom nivou, to ukazuje na uspešan tretman. Cilј tretmana je stoga da se smanji virusno opterećenje kod pojedinca. Shodno tome, opisan je i postupak snižavanja virusnog opterećenja kod pojedinca sa HBV infekcijom, koji se sastoji od davanja pojedincu ddRNKi konstrukta pronalaska koji ciljano deluje na gen HBV-a, poželјno gena za polimerazu. Naknadno praćenje virusnog opterećenja kod pojedinca koji je primio tretman sa ddRNKi konstruktom pronalaska je stoga fenotipski indikator efektivnosti ddRNKi konstrukta i ddRNKi agensa pronalaska.

[0183] Alternativno, tretman akutne HBV infekcije možda neće zahtevati dugotrajno liječenje, a u stvari može biti poželјno da se oslanja na tranzijentno prisustvo ddRNKi agensa ili siRNK agensa za razliku od dugoročne ekspresije ddRNKi agensa sa integrisanih ili stabilno održavanih ddRNKi konstrukata. Pod "akutnim" se podrazumeva da HBV infekcija ima brz početak i/ili kratko trajanje.

[0184] Postupak lečenja akutne HBV infekcije kod pojedinca podrazumeva primenu terapijski efektivne količine ddRNKi agensa koji je in vitro sintetisan ili hemijski sintetisan pacijentu kome je lečenje potrebno, za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u genu virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži najmanje:

prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida izabranih od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27; i

sekvencu komplementa prvog efektora;

pri čemu je opisana efektorska sekvenca suštinski komplementarna predviđenom transkriptu regiona cilјnog gena. U ovom opisanom primeru izvođenja, proizvodi se ddRNKi agens pronalaska in vitro ili se hemijski sintetiše i obezbeđuje se ćeliji.

[0185] Bilo koji od siRNK agenasa ili ddRNKi agenasa, kao što je opisano u pronalasku ili tekstu specifikacije, je pogodan za in vitro ekspresiju i isporuku ćeliji.

[0186] Poželјno, HBV cilјni gen je najmanje gen za polimerazu (P), a potencijalno površinski antigen, cetralni antigen ili X gen, kada je cilјna sekvenca sadržana unutar preklapajućih otvorenih okvira čitanja. Shodno navedenom, u jednom opisanom primeru izvođenja, ddRNKi agens inhibira ekspresiju jedne ili više cilјnih sekvenci u genu za polimerazu virusa hepatitisa B (HBV). Prva efektorska sekvenca je poželјno izabrana od bilo kojih 10 ili više, a poželјno od 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz efektorskih sekvenci SEQ ID NO: 1-27 navedenih u Tabeli 1. Alternativno, efektorska sekvenca može varirati u odnosu na SEQ ID NO: 1-27 za 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida, bez uticaja na sposobnost efektorske sekvence da sparuje baze sa cilјnom sekvencom i da inhibira ekspresiju gena za polimerazu HBV-a.

[0187] U alternativno opisanom primeru izvođenja, može se primeniti siRNK agens. Poželјno je da siRNK agensi, slično ddRNKi agensu, ciljano deluju na gen za polimerazu HBV-a, a mogu imati sekvencu izabranu od bilo kojih 10 ili više, a poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1- 27 ili može varirati u odnosu na SEQ ID NO: 1-27 sa 1, 2, 3, 4 ili 5 nukleotida, bez uticaja na sposobnost efektorske sekvence da sparuje baze sa cilјnom sekvencom i da inhibira ekspresiju gena za polimerazu HBV-a.

[0188] Primena ddRNKi agenasa ili siRNK, kao što je opisano, ili pronalaska, na osobe sa akutnom HBV infekcijom takođe može smanjiti virusno opterećenje, smanjiti ozbilјnost simptoma povezanih sa akutnom infekcijom i smanjiti infektivnost HBV-a.

[0189] Opisana je i upotreba ddRNKi konstrukata, ddRNKi agenasa ili siRNK agenasa pronalaska u pripremi lekova za lečenje HBV infekcije, poželјno hronične HBV infekcije, kao i smanjenja HBV virusnog opterećenja, smanjenja ozbilјnosti simptoma povezanih sa HBV infekcijom i smanjenja infektivnosti HBV-a.

[0190] Pronalazak obezbeđuje ddRNKi konstrukte ili ddRNKi agense za upotrebu lečenju HBV infekcije, poželјno akutne ili hronične HBV infekcije, smanjenju virusnog opterećenja HBV-om, smanjenju ozbilјnosti simptoma povezanih sa HBV infekcijom i smanjenju infektivnosti HBV-a.

[0191] U sledećem aspektu pronalaska obezbeđena je kompozicija koja sadrži ddRNKi konstrukte ili ddRNKi agense kao aktivni sastojak za lečenje HBV infekcije, poželјno akutne ili hronične HBV infekcije, za smanjenje virusnog opterećenja HBV-om, smanjenje ozbilјnosti simptoma povezanih sa HBV infekcijom i za smanjenje infektivnosti HBV.

[0192] Jedna ili više efektorskih sekvenci ddRNKi konstrukata, ddRNKi agensa ili siRNK agenasa korišćenih u postupcima koji su opisani podrazumevaju bilo kojih 10 ili više, poželјno bilo kojih 17 ili više, susednih nukleotida unutar sekvenci sposobnih da inhibiraju ekspresiju HBV cilјnog regiona gena za najmanje 70%. Poželјno, jedna ili više efektorskih sekvenci je izabrana od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23. U ddRNKi konstruktima i agensima pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

Farmaceutske kompozicije

[0193] Agensi za ddRNKi, siRNK agensi ili vektori koji sadrže ddRNKi ekspresione kasete, kao što je opisano ili prema pronalasku, mogu biti formulisani u farmaceutske kompozicije kombinacijom sa odgovarajućim, farmaceutski prihvatlјivim nosačima ili razblaživačima. Shodno navedenom, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži ddRNKi agens, ddRNKi ekspresionu kasetu, ddRNKi konstrukt pronalaska i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač.

[0194] U farmaceutskim doznim oblicima, agensi ili vektori koji sadrže ddRNKi ekspresione kasete mogu biti primenjeni samostalno ili u vezi ili kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim jedinjenjima. Oni koji su sa iskustvom u oblasti tehnike će lako razumeti da će nivoi doza za agense ili vektore koji sadrže ddRNKi ekspresione kasete varirati u zavisnosti od prirode nosača za isporuku, relativne lakoće transdukcije cilјnih ćelija, nivoa ekspresije RNKi agensa u cilјnim ćelijama i sličnog.

[0195] Agensi za ddRNKi ili vektori koji sadrže ddRNKi ekspresione kasete pronalaska mogu biti formulisani u preparate za injekcije ili primenjeni njihovim rastvaranjem, resuspendovanjem ili emulgovanjem u vodenom ili nevodenom rastvaraču, kao što su ulјa, sintetski gliceridi alifatične kiseline, esteri viših alifatičnih kiselina ili propilen glikol; i, ukoliko je poželјno, uz dodavanje konvencionalnih aditiva kao što su solubilizatori, izotonični agensi, agensi za resuspendovanje, emulgatori, stabilizatori i konzervansi.

[0196] Farmaceutski prihvatlјivi nosači ili razblaživači predviđeni ovim pronalaskom uklјučuju bilo koje razblaživače, nosače, ekscipijense i stabilizatore koji su netoksični za primaoce u upotreblјenim dozama i koncentracijama i uklјučuju pufere kao što su fosfatni, citratni i sa drugim organskim kiselinama; antioksidanse, uklјučujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što su metil ili propil paraben; katehol; rezorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide niske molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin plazme, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge uglјene hidrate uklјučujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatorne agense kao što je EDTA; šećere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; kontrajone koji obrazuju soli, kao što je natrijum; komplekse metala (npr. proteinske komplekse sa Zn); i/ili nejonske surfaktante kao što su TVWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0197] Farmaceutska kompozicija može biti pripremlјena za različite puteve i načine primene. U principu, formulacije se pripremaju ravnomernim i bliskim dovođenjem aktivnih sastojaka u vezu, u tečnom nosačima ili fino usitnjenim čvrstim nosačima ili u oba, a ukoliko je potrebno, i oblikovanjem proizvoda. Formulacija može biti pripremljena mešanjem na sobnoj temperaturi na odgovarajućem pH, kao i sa želјenim stepenom čistoće, sa fiziološki prihvatlјivim nosačima, tj. nosačima koji su netoksični za primaoce u upotreblјenim dozama i koncentracijama.

[0198] Jedna ili više efektorskih sekvenci ddRNKi konstrukata, ddRNKi agenasa ili siRNK agenasa upotreljenih u kompozicijama koje su prethodno opisane, sadrže bilo kojih 10 ili više, poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvenci sposobnih da inhibiraju ekspresiju cilјnog regiona gena HBV-a za najmanje 70%. Poželјno je da je jedna ili više efektorskih sekvenci izabrana od SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 i SEQ ID NO: 23. U ddRNKi konstruktima i agensima pronalaska, najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

PRIMERI

[0199] Primeri koji slede su ilustrativne prirode i bez namere su da budu ograničavajući na bilo koji način.

Primer 1: Proizvodnja biblioteke ukupnih ciljanih mesta za siRNK (EsT)

[0200] Gen RNK-zavisne DNK polimeraze pune dužine HBV-a iz HBV Adr-1 (pristupni broj M38454) je sub-kloniran i upotrebljen za proizvodnju biblioteke ukupnih siRNK ciljnih mesta (EsT). Sekvencirano je 5000 klonova, od kojih je za 642 identifikovano da sadrže neponavljajuće sekvence u opsegu od 19-23 bp. Sekvence koje predstavlјaju potencijalne ciljna mesta za ddRNKi agense pronalaska, distribuirane su duž cilјnog gena (Slika 2).

Primer 2: Rezultati skrininga velikog obima upotrebom SEC sa smanjenjem ekspresije (engl. knockdown) ≥ 50%

[0201] Da bi se identifikovale najefikasnije siRNK sekvence koje bi zatim mogle biti upotrebljene za pripremu ddRNKi agenasa pronalaska, siRNK ekspresione kasete (SEC) amplifikovane PCR-om su transfektovane u HepG22.2.15 ćelije. Određeni su dalje efekti na nivoe ekspresije iRNK polimeraze HBV-a da bi se identifikovale funkcionalne siRNK sekvence.

[0202] 40 siRNK koje su odgovarale prvim selektovanim SEC, hemijski su sintetisane i transfektovane u HepG22.2.15 ćelije da bi se potvrdili prvobitni nivoi smanjenja ekspresije (engl. knockdown) iRNK polimeraze. HepG2 2.2.15 je stabilna ćelijska linija koja sadrži integrisani tandemski dimer HBV genoma (pristupni broju u Genebank: U95551) i koja može stabilno eksprimirati HBV antigene i Dane (infektivne) čestice HBV-a. Rezultati korelacije su prikazani na Slici 3.

[0203] Kao što se može videti na Slici 3, kada je SEC inhibicija ekspresije polimeraze bila veća od 50%, većina odgovarajućih sintetskih siRNK sekvenci je dovela do smanjenja ekspresije HBV iRNK od oko 70%, dok je samo 2/23 sekvenci dovela do smanjenja nivoa ekspresije ispod 50%. Nasuprot tome, u slučaju SEC sa efektom utišavanja manjim od 50%, samo 18% (3/17) odgovarajućih sintetskih siRNK je proizvelo smanjenje ekspresije veće od 70% (p<0.05 - Pearsonov hi-kvadrat test, |t Stat| = 4,29>1,68). Štaviše, sintetska siRNK (potrebno objašnjenje navedenog) koja je proizvela smanjenje ekspresije veće od 90%, odgovarala je SEC klonu koji je doveo do smanjenja ekspresije veće od 65%. Iz navedenog je zaklјučeno da je postojala razumna korelacija između smanjenja ekspresije HBV iRNK sa siRNK iz SEC-a, kao i onog proizvedenog od strane sintetskih siRNK, do granične vrednosti od ≥50% smanjenja ekspresije sa SEC-ovima. Ova granična vrednost je upotrebljavana za ostatak skriniga sa SEC.

Primer 3: Skrining mesta dejstva upotrebom siRNK ekspresionih kaseta (SEC).

[0204] Slika 4 prikazuje rezultate in vitro skrininga velikog obima na inhibiciju akumulacije iRNK HBV-a (za 501 neponavljajućih siRNK agenasa). Od sekvenci koje su bile uključene u skrining, 100 siRNK sekvenci je bilo efektivno u smanjenju ekpresije HBV iRNK za ≥50%, od kojih je 14 rezultovalo smanjenjem >70% (Tabela 2). Distribucija najboljih 100 cilјnih sekvenci u genu za polimerazu HBV-a za siRNK je prikazana na Slici 5A; bilo koja sekvenca može biti mapirana na polimerazi. Slika 5B, na primer, mapira prve 3 sekvence.

Tabela 2:

[0205] Relativna ekspresija iRNK je određena (kvantitativnim RT-PCR postupkom u jednom koraku, upotrebom SensiMix SYBR One-Step komercijalnog kompleta (Bioline, USA) prema uputstvima proizvođača) u transfektovanim HepG2 2.2.15 ćelijama, u odnosu na nivo u kontroli sa praznim vektorom kome je proizvoljno dodeljena vrednost 1,0. Specifični prajmeri za gen polimeraze HBV-a su bili, za uzvodni prajmer, 5'-TGTGGTTATCCTGCGTTAATG-3’, i nizvodni prajmer, 5'-GCGTCAGCAAACACTTGG-3', a PCR produkt je bio dužine 158bp. Kao unutrašnja kontrola je korišćena U6 snRNK (uzvodni prajmer 5'-CTCGCTTCGGCAGCACA -3’, nizvodni prajmer 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'), pri čemu je PCR produkt bio dužine od 94bp. Relativan nivo ekspresije gena za polimerazu je normalizovan upotrebom 2<-ΔΔCt>postupka analize. Eksperimenti su rađeni upotrebom četvorostrukih nezavisnih transdukcija.

Primer 4: Potvrda aktivnosti upotrebom sintetisanih siRNK

[0206] U prvom krugu skrininga je korišćen vektor sa opozitnim promotorima (pU6H1-GFP). U shRNK ekspresionim konstruktima, shRNK je bila pod kontrolom jednog promotora. Stoga, da bi se potvrdila efikasnost prvih 14 siRNK sekvenci prikazanih u Tabeli 2, pre razvoja shRNK ekspresionih konstrukata koji bi se na njima zasnivali, HepG22.2.15 ćelije su transfektovane sa svakom od siRNK i određena je inhibicija HBV replikacije da bi se odredili nivoi iRNK za HBV polimerazu.

[0207] Hemijski je sintetisano 14 siRNK sa dTdT 3’ ispustom. 5'-FAM obeležena siRNK-GL3 (pGL3 luciferazni reporterski vektor sa nesrodnom siRNK sekvencom) je služio kao negativna kontrola. siRNK su rastvorene u koncentraciji od 100 µM, u vodi tretiranoj sa DEPC-om, pa su alikvotirane i čuvane na -20°C. Pored toga, SEQ ID NO: 4, duga 29 bp, redizajnirana je u 8 siRNK (SEQ ID NO: 20 do 27), pri čemu je svakih 22 bp bilo sa preklapajućim sekvencama iz SEQ ID NO: 4 (Tabela 3 ispod):

Tabela 3:

[0208] Optimizacija transfekcije je urađena variranjem 5’ siRNK-GL3 obeleženih sa FAM-om, kao i Lipofektamina 2000 (Invitrogen). Ćelije su gajene u DMEM (GIBCO, USA) dopunjenom sa 10% PBS (Excellbio, Kina) i sa 200 µg/mL G418 (Sangon, Kina) na 37°C, 5% CO2.

[0209] Ćelije HepG22.2.15 su transfektovane sa siRNK upotrebom optimizovanog protokola, pa su prikupljene 72h nakon transfekcije. Ukupna RNK je izolovana upotrebom Trizol reagensa (Invitrogen) i zatim je kvantifikovana kvantitativnim RT-PCR postupkom u jednom koraku upotrebom SensiMix SYBR One-Step komercijalnog kompleta (Bioline, USA) prema uputstvima proizvođača, a kao što je već detalјno opisano u Primeru 3.

Rezultati

[0210] Rezultati su predstavljeni kao srednja vrednost ± STDV (Tabela 4 i Slika 9).

[0211] Sve testirane siRNK, njih 22, ispoljile su inhibiciju od najmanje oko 50%, a većina je pokazala inibiciju reda veličine 60 do 70%. Uprkos visokoj sličnosti sekvenci između varijanti od 22bp u SEQ ID NO: 20 do 27, za SEQ ID NO: 4 je sposobnost da inhibira ekspresiju njihovih sekvenci varirala od 50 do 71%. Na osnovu ovih rezultata, SEQ ID NO: 3, 9, 12, 13 i 23 su izabrani za dalјi dizajn agenasa. Dok sve navedene SEQ ID NO ciljano deluju na gen za polimerazu, ove sekvence su takođe izabrane na osnovu njihove raširenosti duž iRNK gena za polimerazu (pogledati kolonu "ciljna mesta u HBV " u Tabeli 1).

Primer 5: Dizajn i kontrukcija shRNK

Korak 1 - dizajn efektorske sekvence

[0212] Ekspresioni konstrukti za shRNK su dizajnirani na osnovu SEQ ID NO: 3.9, 12, 13 i 23. Konstrukti mogu biti lako sintetisani upotrebom raznih promotora, uključujući različite verzije humanih U6 promotora sa različitim intrinzičkim aktivnostima (Domitrovich, AM i Kunkel, GR (2003) Multiple, dispersed human U6 small nuclear RNA genes with varied transcriptional efficiencies. Nucleic Acids Research 31: 2344-2352) ili razne promotore pol II. Pri dizajniranju ovih konstrukata, uzete su u obzir sledeća razmatranja:

● Dicer enzim počinje obradu od osnove shRNK

● obrada Dicer enzimom je neprecizna, ali se očekuje da će isecanje predominantno biti na svaka 22 nukleotida

● očekuje se da će se terminacijom sa U6 dodati UU na 3’ kraj shRNK

● poželјno je da obrađena efektorska sekvenca sadrži 5’ U ili A da bi se olakšalo efikasnije opterećenje Ago 2.

● efektorska sekvenca je pozicionirana 3’ u odnosu na strukturu petlјe da bi se izbegao 5' G koji je poželjan za za maksimalnu transkripciju sa U6

● 5' A ili U ostaci mogu biti ugrađeni u shRNK efektorske sekvence, ugradnjom sekvenci od 2 ili 3 nukleotida uzvodno ili nizvodno od sekvenci na koje RNKi agens ciljano deluje; ovo se označava "kliznim" sekvencama 1, 2 ili 3 nukleotida, tj. efektorska sekvenca za shRNK može biti zasnovana na sekvencama od 1, 2 ili 3 nukleotida na 5’ ili 3' kraju u odnosu na 5’ kraj siRNK efektorske sekvence.

[0213] Kada se primenjuje na 5 siRNK zasnovanu na SEQ ID NO: 3.9, 12, 13 i 23:

i) za shRNK zasnovanu na SEQ ID NO: 3: gccgggcaacgggguaaagguucTT

"najbolja" shRNK efektorska sekvenca (minimiziranje 5’ GC sekvenci, korak “naniže” od 3 nukleotida) GGGCAACGGGGUAAAGGUUCuu (uu iz regiona terminacije pol III)

ii) za shRNK zasnovanu na SEQ ID NO: 9: gggaaagcccuacgaacacacTTT

"najbolja" shRNK efektorska sekvenca (minimiziranje 5’ Gs, korak “naniže” od 3 nukleotida do 5' A, dodavanje GA na 3’ (iz HBV genoma kako bi se povećala homologija)

AAAGCCCUACGAACCACUGAuu

iii) za shRNK zasnovanu na SEQ ID NO: 12: gcccacucccauaggaauuuuccTTT

"najbolja" shRNK efektorska sekvenca se pomera za 2 nukleotida da bi se izbeglo UUUU (prouzrokovaće preranu terminaciju) na antisense lancu, dodavanje AG iz HBV sekvence, koja ugrađuje 5’ A po principu slučajnosti.

AGGCCCACUCCCAUAGGAAUU

iv) za shRNK zasnovanu na SEQ ID NO: 13: ggaucuugcagaguuuggTT

"najbolja" shRNK efektorska sekvenca (povećanje dužine do 20 nukleotida, pomeranje “naviše” za 2 nukleotida, dodavanje TG iz HBV sekvence, što rezultuje u 5’ T (tj. U)

TGGGAUCUUGCAGAGUUUGGuu

v) za shRNK zasnovanu na SEQ ID NO: 23: ugcgggagaggacaacagaguuTT

"najbolja" shRNK efektorska sekvenca smanjuje veličinu na 3’ kraju za 2 nukleotida

UGCGGGAGAGGACAACAGAGUU

Korak 2 - ekspresiona kaseta

[0214] U6 shRNK kasete (Genscript) zasnovane na efektorskim sekvencama dizajniranim u koraku (a) su pripremlјene i klonirane u pUC57.

[0215] Inserti ekspresionih kaseta, koje su uklјučivale pojedina bočna restrikciona mesta za kasniju manipulaciju, imali su sledeće sekvence:

U6.HBVshRNK 3

U6.HBVshRNK 9

U6.HBVshRNK 12

U6.HBVshRNK 13

U6.HBVshRNK 23

[0216] Odgovarajuća eksprimirana shRNK za svaku od ovih ekspresionih kaseta je prikazana na Slikama 6 (kao SEQ ID NO: 36 do 40). Simboli "Λ" i "V" označavaju potencijalna mesta obrade shRNK, koja su rezultat bilo inicijacije transkripcije/terminacije ili Dicer obrade sa faznošću od 22 nukleotida i 3’ ispustima od 2 nukleotida, a predviđena efektorska sekvenca za koju se pretpostavlja ovakva obrada je prikazana ispod.

Primer 6: Generisanje stabilnih ćelija koje eksprimiraju shRNK, upotrebom konstrukata sa višestrukim sekvencama

[0217] Kao što je prethodno naglašeno, jedan koristan način dizajniranja ddRNKi ekspresionih kaseta pronalaska je da se pretpostavi da Dicer iseca na svaka 22 nukleotida (označeno i kao faznost od 22 nukleotida). Sekvence DNK koje kodiraju efektorske sekvence mogu stoga biti dizajnirane da kodiraju bilo kojih 10 ili više, a poželјno bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida unutar sekvence iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-27, zajedno sa odgovarajućim spejserima i drugim neophodnim sekvencama za promotor i/ili terminator.

[0218] Konstrukti za ddRNKi će biti generisani sa sledećim strukturama (upotrebom neograničavajućih sekvenci za primer):

i) Jedinstvena ekspresiona kaseta sa strukturom ukosnice

Kao što je prethodno navedeno, Slika 6 ilustruje ekspresionu kasetu, ekspresimirani RNKi agens sa strukturom ukosnice i teorijsku efektorsku sekvencu koja bi nastala obradom sa Dicer (uz pretpostavku faznosti od 22 nukleotida) zasnovanu na SEQ ID NO: 3 (Slika 6A), SEQ ID NO: 9 (Slika 6B) SEQ ID NO: 12 (Slika 6C), SEQ ID NO: 13 (Slika 6D) i SEQ ID NO: 23 (Slika 6E). U kaseti sa Slike 6A i 6B, 20 susednih nukleotida SEQ ID NO: 3 i 9, tim redom, je kodirano; u kaseti sa slike 6C do 6E, 21 susedni nukleotidi iz SEQ ID NO: 12, 13 i 23, tim redom, je kodirano. Strelice na RNKi agensu sa strukturom ukosnice ukazuju na mesta gde se očekuje da Dicer iseca da bi se proizvela efektorska sekvenca prikazana ispod.

Sekvenca ekspresionih kaseta sa slika 6A do 6E je već prethodno navedena (SEQ ID NO: 28 do 32).

ii) Ekspresiona kaseta za višestruke strukture petlji

Slika 7 ilustruje ekspresionu kasetu, eksprimirani RNKi agens sa strukturom ukosnice (SEQ ID NO: 41 do 43 i teorijske efektorske sekvence koje bi nastale obradom sa Dicer (uz pretpostavku faznosti od 22 nukleotida) zasnovane na SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 6, kada bi bila unutar kasete, da bi se postigla ekspresija pojedinačnih RNKi agenasa sa strukturom ukosnice (Slika 7A) ili pojedinačne RNK koja sadrži 3 RNKi agensa sa strukturom ukosnice pre obrade (Slika 7B) SEQ ID NO: 1, 4 i 6 su iste kao što je prethodno opisanu za kasetu sa jednom RNKi sa strukturom ukosnice. Simboli "Λ" i "V" na RNKi agensu sa strukturom ukosnice ukazuju gde se očekuje da Dicer iseca da bi se proizvela efektorska sekvenca prikazana ispod.

Ekspresiona kaseta sa Slike 7A ima DNK sekvencu

U kaseti na Slici 7A, svaki efektorski komplement je operativno povezan za promotorsku sekvencu, a odgovarajuća efektorska sekvenca je operativno povezana sa terminacionim elementima ili sekvencama.

Nasuprot tome, u ekspresionoj kaseti sa Slike 7B komplement prvog efektora (efektor 1 kompl.) je operativno povezan sa promotorom i poslednji efektor (efektor 6) je operativno povezan sa terminatorskim elementom ili sekvencom, pri čemu strelice ukazuju na predviđena mesta za Dicer obradu. Ova kaseta je dizajnirana da eksprimira jedan molekul RNK (SEQ ID NO: 44) i ima DNK sekvencu

iii) Ekspresiona kaseta sa dugim RNKi sa višestrukim strukturama ukosnice

Slika 8 ilustruje ekspresionu kasetu, eksprimirani RNKi agens sa strukurom ukosnice (SEQ ID NO: 45) i teorijsku efektorsku sekvencu koja bi se obradila sa Dicer (uz pretpostavku faznosti od 22 nukleotida) zasnovanu na (u redosledu) SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 4. U kaseti sa slike 8, kodirano je 17 susednih nukleotida SEQ ID NO: 1 i 20 susednih nukleotida SEQ ID NO: 6, prema prethodno navedenim primerima, nasuprot kaseti sa Slika 7 i 8, gde je kodirano samo 18 susednih nukleotida iz SEQ ID NO: 4. Strelice na RNKi agensu sa strukturom ukosnice ukazuju na mesta gde se očekuje da Dicer iseca da bi se proizvela efektorska sekvenca prikazana ispod.

Ekspresiona kaseta sa Slike 8 ima DNK sekvencu

Primer 7: Ispitivanje efikasnosti ddRNKi agenasa in vitro

[0219] Da bi se ispitala efikasnost ddRNKi agenasa, odgovarajuće ćelije i ćelijske linije mogu biti transfektovane sa RNK agensima pronalaska, a dalje može biti ispitana inhibicija HBV replikacije

[0220] Da bi se ispitala efikasnost ddRNKi konstrukata pronalaska, konstruisane su plazmidne DNK zasnovane na pGL3 Luciferaznom reporterskom vektoru. Prvi, "pGL3 multi" sadrži pojedinačne kopije sekvence u 3’ netranslatirajućim regionima (UTR) plazmida pGL3 koji eksprimira luciferazu svica i kodira cilјna mesta za siRNK ili shRNK 3, 9, 12, 13 i 23, zasnovane na SEQ ID NO: 3.9, 12, 13 i 23. Drugi, "pGL3-23" sadrži trostruki ponovak shRNK 23, zasnovan na SEQ ID NO: 23. HBV cilјna mesta u ovim plazmidima odgovaraju sens sekvencama HBV-a koje bivaju prepoznate od strane određene siRNK ili shRNK i koje uključuju dodatnih 10 nukleotida HBV sekvence uzvodno i nizvodno od cilјnih mesta.

[0221] Informacije koje slede se odnose na eksperimente rađene upotrebom pGL3-23 konstrukta.

[0222] Radi lakšeg izbora, odlučili smo se za početno ispitivanje upotrebom testova tanzijentne ekspresije dvostruke luciferaze u HEK293 ćelijama. Ćelije su zasejane na ploče sa 96 bunarića (0,1 ml medijum/bunariću) da bi se pre transfekcije dostigla konfluentnost od oko 50%. Plazmidne DNK i hemijski sintetisane siRNK (ili shRNK vektori) su kotransfektovani u HEK293 ćelije upotrebom Lipofektamina™ 2000 prema protokolu proizvođača (Invitrogen). Isptivani konstrukti su korišćeni zajedno sa konstruktom koji eksprimira Renilla luciferazu (pRL-TK, Promega), koja služi kao unutrašnja kontrola za efikasnost transfekcije.

[0223] Ako su hemijski sintetisane siRNK ili shRNK eksprimirane sa vektora, efikasne u utišavanju cilјne sekvence, nivoi luciferaze u transfektovanim ćelijama će biti smanjeni, pošto su cilјne sekvence operativno povezane sa genom luciferaze.

[0224] Shodno navedenom, različite količine hemijski sintetsanih siRNK ili shRNK ekspresionih vektora su kotransfektovane sa konstantnim količinama pGL3-23 i kontrolnih plazmida (pogledati tabele ispod).

Tabela 5: Ispitivanje siRNK23 za pGL3-23

[0225] Ćelije su transfektovane sa naznačenim količinama pGL3-23 i kontrolnih (pRL-TK) plazmida, kao i različitim količinama siRNK zasnovanih na SEQ ID NO: 23 (HBV-siRNK23). Nesrodna siRNK, siNC, bez poznatih cilјnih sekvenci u HBV, je korišćena i kao negativna kontrola i za podešavanje ukupnih količina siRNK koje su dodate ćelijama da bi se izbegli potencijalni artefakti usled nejednake transfekcije. Kao pozitivna kontrola je korišćena siRNK GL3, tako da je siRNK ciljano delovala na gen luciferaze.

Tabela 6: Is itivane shRNK23 na GL3-23

[0226] Ćelije su transfektovane sa naznačenim količinama pGL3-23 i kontrolnim (pRL-TK) plazmidima, kao i različitim količinama ispitivanog plazmida na ekspresiju shRNK zasnovane na SEQ ID NO: 23 (HBV shRNK23). Korišćen je pUC57 i kao negativna kontrola i za podešavanje ukupnih količina plazmidnih DNK koje su dodate ćelijama da bi se izbegli potencijalni artefakti usled nejednake transfekcije. Plazmid koji eksprimira luciferaznu shRNK zasnovanu na GL3 siRNK je korišćen kao pozitivna kontrola.

[0227] Uzorci za ispitivanja su transfektovani u 4 pojedinačna bunarića i aktivnost luciferaze svica i Renilla luciferaze je određivana 48 h nakon transfekcije, upotrebom dualnog luciferaznog test sistema (Promega), kao i Sinergy™ 2 luminescentog čitača mikroploča (Biotek), prema protokolu odgovarajućeg proizvođača. Odnosi aktivnosti luciferaza svica/Renilla su određeni za svaki bunarić, a efikasnost inhibicije siRNK ili shRNK je izračunata normalizacijom na odgovarajuće kontrole.

Rezultati

[0228] Grafici na Slikama 10A i B prikazuju luciferaznu aktivnosti (+/- SD; n=4) u ćelijama koje su transfektovane različitim količinama hemijski sintetsanih siRNK23 (A) ili shRNK23 ekspresionih konstrukata (B), a koji ciljano deluju na pGL3-23, upotrebom uslova navedenih u Tabelama 5 i 6. Čak i pri najnižim koncentracijama, siRNK i shRNK zasnovane na SEQ ID NO: 23 su bile negarivni regulatori u odnosu na situaciju u negativnoj kontroli (siNC ili shNC - proizvolјno označene vrednošću 1).

[0229] Pozitivna kontrola luciferazne siRNK i shRNK takođe su smanjile nivoe ekspresije luciferaze sa pGL3-23.

Primer 8: Ispitivanje efektivnosti ddRNKi agenasa in vivo

[0230] Dostupni su mišji modeli za HBV, kao što su HBV inficirani NOD/SCID miševi (Yang i saradnici, 2002; Ketzinel-Gilad i saradnici, 2006), kao i transgene linije miša koje eksprimiraju HBV, od kojih se oba mogu koristiti za ove eksperimente.

[0231] Ubrizgavanje ddRNKi agenasa u repnu venu miša će biti upotrebljeno za isporuku agenasa u jetru. Inhibicija replikacije HBV može biti praćena u različitim vremenskim tačkama, upotrebom qRT-PCR testova, da bi se odredili nivoi HBV pol iRNK u tkivima jetre ili može biti urađena kvantifikacija nivoa cirkulišućih HBsAg i HBeAg kod životinja tretiranih sa ddRNKi agensima pronalaska u poređenju sa odgovarajućim kontrolnim životinjama kao što su miševi injecirani sa nasumično kodiranim sekvencama ili irelevantnim DNK, kao što je prethodno opisano.

[0232] Pogodni ekspresioni konstrukti za stabilnu ekspresiju ddRNKi agenasa uklјučuju lentivirusne vektore.

Primer 9: In vivo ispitivanje prekliničkog kandidata u normalnom modelu miša

[0233] Jedan sistem za isporuku koji je predviđen za in vivo ispitivanja prekliničkog kandidata u normalnom modelu miša je AAV. Za AAV, ddRNKi konstrukti će biti upakovani in vitro, upotrebom strategija koje su dobro poznate onima koji su upoznati sa stanjem tehnike, nakon čega će biti intravenski injecirane u NOD/SCID miševe inficirane sa HBV-om i/ili HBV transgene miševe. Inhibicija replikacije HBV-a će se pratiti kao što je prethodno opisano.

[0234] Podrazumeva se da pronalazak koji je opisan i definisan u ovoj specifikaciji obuhvata sve alternativne kombinacije dve ili više pojedinačnih karakteristika koje su pomenute ili očigledne iz teksta ili crteža. Sve ove različite kombinacije čine razne alternativne aspekte pronalaska.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Agens RNK interferencije usmerene sa DNK (ddRNKi), za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u jednom ili u više gena virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

sekvencu komplementa druge efektorske sekvence; i

sekvencu komplementa prve efektorske sekvence;

pri čemu je svaka efektorska sekvenca najmanje 85% komplementarna predviđenom transkriptu cilјne sekvence i pri čemu najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

2. Agens RNK interferencije usmerene sa DNK (ddRNKi) za inhibiciju ekspresije jedne ili više cilјnih sekvenci u jednom ili u više gena virusa hepatitisa B (HBV), ddRNKi agens koji sadrži, u smeru od 5’ ka 3’:

prvu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida;

sekvencu komplementa prve efektorske sekvence;

drugu efektorsku sekvencu dužine od najmanje 17 nukleotida; i

sekvencu komplementa druge efektorske sekvence;

pri čemu je svaka efektorska sekvenca najmanje 85% komplementarna predviđenom transkriptu cilјne sekvence i pri čemu najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

3. Agens za ddRNKi prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde najmanje jedna od efektorskih sekvenci sadrži bilo kojih 17 ili više susednih nukleotida sekvence navedene u SEQ ID NO: 9.

4. Agens za ddRNKi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, gde efektorska sekvenca koja sadrži bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida sekvence nevedne u SEQ ID NO: 9 je sekvenca navedena u SEQ ID NO: 9.

5. Agens za ddRNKi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 4, koji sadrži treću efektorsku sekvencu i sekvencu komplementa treće efektorske sekvence.

6. Agens za ddRNKi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1-5, gde je najmanje jedna od drugih efektorskih sekvenci izabrana iz grupe koja se sastoji od bilo kojih 10 ili više susednih nukleotida unutar sekvence navedene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1 do 8 ili 10 do 27.

7. Agens za ddRNKi prema patentnom zahtevu 6, gde najmanje jedna od drugih efektorskih sekvenci je sekvenca izabrana od sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 1 do 8 ili 10 do 27.

8. Agens za ddRNKi prema patentnom zahtevu 7, gde najmanje jedna od drugih efektorskih sekvenci je sekvenca izabrana od sekvenci navedenih u SEQ ID NO: 3, 12, 13 i 23.

9. Ekspresiona kaseta za ekspresiju ddRNKi agensa prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8, pri čemu ddRNKi ekspresiona kaseta sadrži:

jednu ili više promotorskih sekvenci;

jednu ili više DNK sekvenci koje kodiraju jednu ili više efektorskih sekvenci ddRNKi agensa prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8;

jednu ili više DNK sekvenci koje kodiraju jednu ili više sekvenci efektorskog komplementa ddRNKi agensa prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8;

jednu ili više terminatorskih sekvenci; i opciono

jednu ili više DNK sekvenci koje kodiraju sekvence petlјi; i opciono jednu ili više sekvenci pojačivača.

10. Ekspresioni konstrukt za ddRNKi agens koji sadrži ddRNKi ekspresionu kasetu prema patentnom zahtevu 9.

11. Agens za ddRNKi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8 ili ddRNKi ekspresiona kaseta prema patentnom zahtevu 9 ili ddRNKi ekspresioni konstrukt prema patentnom zahtevu 10, za upotrebu u lečenju akutne ili hronične HBV infekcije kod subjekta ili za upotrebu u smanjenju ozbilјnosti simptoma udruženih sa HBV infekcijom kod subjekta.

12. Agens za ddRNKi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8 ili ddRNKi ekspresiona kaseta prema patentnom zahtevu 9 ili ddRNKi ekspresioni konstrukt prema patentnom zahtevu 10, za upotrebu u smanjenju virusnog opterećenja HBV-om kod subjekta.

13. Agens za ddRNKi prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8 ili ddRNKi ekspresiona kaseta prema patentnom zahtevu 9 ili ddRNKi ekspresioni konstrukt prema patentnom zahtevu 10, za upotrebu u smanjenju infektivnosti HBV-a kod subjekta.

14. Agens za ddRNKi ili ddRNKi ekspresiona kaseta ili ddRNKi ekspresioni konstrukt za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 11 do 13, gde ddRNKi agens ili ddRNKi ekspresiona kaseta ili ddRNKi ekspresioni konstrukt inhibira ekspresiju najmanje gena za HBV polimerazu.

15. Farmaceutska kompozicija koja sadrži ddRNKi agens prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 8 ili ddRNK ekspresiona kaseta prema patentnom zahtevu 9 ili ddRNKi ekspresioni konstrukt prema patentnom zahtevu 10 i farmaceutski prihvatlјiv nosač ili razblaživač.