RS59159B1 - Cd47 antitela i postupci za njihovu upotrebu - Google Patents

Cd47 antitela i postupci za njihovu upotrebu

Info

Publication number
RS59159B1
RS59159B1 RSP20191071A RS59159B1 RS 59159 B1 RS59159 B1 RS 59159B1 RS P20191071 A RSP20191071 A RS P20191071A RS 59159 B1 RS59159 B1 RS 59159B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
sequence given
antibody
antibodies
given
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Brendan Eckelman
John Timmer
Amir Razai
Quinn Deveraux
Kyle Jones
Peter L Nguy
Original Assignee
Inhibrx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=48947976&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59159(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Inhibrx Inc filed Critical Inhibrx Inc
Publication of RS59159B1 publication Critical patent/RS59159B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se generalno odnosi na monoklonska antitela koja prepoznaju CD47, specifičnije na CD47 antitela koja ne izazivaju značajan nivo hemaglutinacije humanih crvenih krvnih ćelija, na postupke za stvaranje ovih antitela, i na ova monoklonska antitela za upotrebu kao terapeutika.
OSNOVA PRONALASKA
[0002] CD47, takođe poznat kao integrin-povezani protein (IΛP), antigen kancera jajnika OA3, Rh-srodni antigen i MER6, je višestruki transmembranski receptor koji pripada superfamiliji imunoglobulina. CD47 ekspresija i/ili aktivnost je implicirana u brojnim bolestima i poremećajima. Shodno tome, postoji potreba za terapijama koje ciljano deluju na CD47.
[0003] Babic et al. koristi anti-CD47 antitelo (mIAP301) za istraživanje da li je CD47 imao ulogu u agregaciji SHPS-1-eksprimirajućih Ba/F3 ćelija (The Journal of Immunology, 2000, 164: 3652-3658). Majeti et al. otkriva nekoliko anti-CD47 antitela (Cell, 2009, 138:286-299). Chao et al. istražuje ulogu anti-CD47 antitela u tretiranju humane akutne limfoblastne leukemije (Cancer Res.2011, 71:1374-1384).
REZIME PRONALASKA
[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment koji se vezuje za humani CD47, naznačeno time da se antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment vezuje za diskontinuirani epitop na CD47, naznačeno time da diskontinuirani epitop sadrži aminokiselinske ostatke Y37, K39, K41, K43, G44, R45, D46, D51, H90, N93, E97, T99, E104, i E106 iz CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147, i naznačeno time da antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sprečava CD47 od interakcije sa signalnim-regulatornim proteinom α (SIRPα) i ne izaziva značajan nivo aglutinacije ćelija nakon primene.
[0005] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je himerni ili humanizovani.
[0006] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment promoviše makrofag- fagocitozu CD47-eksprimirajuće ćelije posredovanu makrofagom.
[0007] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je IgG izotip izabran iz grupe koja se sastoji IgG 1 izotipa, IgG2 izotipa, IgG3 izotipa, i IgG4 izotipa.
[0008] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je IgG izotip izabran od IgG4P i IgG4PE.
[0009] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sadrži:
(i) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 72,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 71, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(ii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(iii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 67,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 69, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(iv) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 67,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 70, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(v) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(vi) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 72, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(vii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 72, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 71, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(viii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 76, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(ix) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 76, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 71, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55
(x) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 77, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(xi) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 57,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(xii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 60,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(xiii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 61,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55; ili
(xiv) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 62,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55.
[0010] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sadrži:
(i) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 5, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 31;
(ii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 5, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 32;
(iii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 33;
(iv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 34;
(v) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(vi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 36;
(vii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 37;
(viii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 38;
(ix) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 39;
(x) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 43;
(xi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 8, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 39;
(xii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 42;
(xiii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 43;
(xiv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 44;
(xv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 47;
(xvi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 15, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 43;
(xvii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 15, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 44;
(xviii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 16, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xix) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 17, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xx) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 20, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xxi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 21, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xxii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 22, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xxiii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 27, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xiv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 28, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 29, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35 ; ili
(xvi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 30, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35.
[0011] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema pronalasku i nosač.
[0012] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema pronalasku za upotrebu u postupku ublažavanja simptoma kancera ili drugog neoplastičnog stanja kod subjekta.
[0013] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, subjekat je čovek.
[0014] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, postupak dodatno sadrži primenu hemoterapije.
[0015] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, postupak dodatno sadrži primenu radioterapije.
[0016] Predmetni pronalazak obezbeđuje monoklonska antitela koja prepoznaju i vezuju se za CD47, naročito humani CD47. Antitela prema pronalasku su sposobna za modulaciju, npr., blokiranje, inhibiciju, smanjenje, antagonizovanje, neutralisanje ili na drugi način uticaj na CD47 ekspresiju, aktivnost i/ili signalizaciju, i ova antitela ne izazivaju značajan nivo hemaglutinacije humanih crvenih krvnih ćelija, takođe ovde označenih kao eritrociti. Međutim, sposobnost antitela prema predmetnom pronalasku da se vezuju za CD47 na ćelijskoj površini i ne izazivaju fenomen slepljivanja ćelija nije ograničen na crvene krvne ćelije. Antitela prema predmetnom pronalasku jedinstveno se vezuju za CD47 na način koji ne promoviše slepljivanje CD47 pozitivnih ćelija. Antitela prema pronalasku i njihovi derivati su sposobna za modulaciju, npr., blokiranje, inhibiciju, smanjenje, antagonizovanje, neutralisanje ili na drugi način uticaj na interakciju između CD47 i SIRPα (signalniregulatorni-protein α), i ova antitela ne izazivaju značajan nivo hemaglutincije humanih crvenih krvnih ćelija. Antitela obezbeđena ovde se zajedno označavaju kao "CD47 antitela." CD47 antitela prema pronalasku predstavljaju značajno poboljšanje u odnosu na postojeća CD47 antitela koja izazivaju hemaglutinaciju humanih crvenih krvnih ćelija (Videti, npr., Kikuchi Y, Uno S, Yoshimura Y et al. bivalent singlechain Fv fragment against CD47 induces apoptosis for leukemic cells. Biochem Biophys Res Commun 2004; 315: 912-8). Na primer, CD47 antitela prema pronalasku su značajno poboljšanje u odnosu na postojeća CD47 antitela B6II12, BRIC126, i CC2C6, od kojih svako blokira SIRPα, ali izaziva hemaglutinaciju RBCs, kao što je detaljno opisano u nastavku. Cela IgG CD47 antitela prema predmetnom pronalasku (npr., 2A1 i njegovi humanizovani derivati uključujući one obezbeđene u Tabli 1) ne vrše aglutinaciju ćelija u značajnom nivou. Na primer, CD47 antitela prema pronalasku ne hemaglutiniraju crvene krvne ćelije (RBCs). Ovde su opisana prva CD47 antitela u celom IgG formatu koja blokiraju SIRPα i ne izazivaju značajan nivo hemaglutinacije.
[0017] CD47 antitela prema pronalasku pokazuju brojne poželjne karakteristike, kao što su, putem neograničavajućeg primera, potentno blokiranje interakcije između CD47 i njegovog liganda SIRPα, bez izazivanja značajnog nivoa hemaglutinacije eritrocita, kao i potentna antitumorska aktivnost. Na primer, CD47 antitela prema pronalasku blokiraju najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 95%, ili najmanje 99% interakcije između CD47 i SIRPα u poređenju sa nivoom interakcije između CD47 i SIRPα u odsustvu CD47 antitela opisanog ovde.
[0018] CD47 antitela prema pronalasku ne izazivaju značajan nivo aglutinacije ćelija, npr., CD47 antitela prema pronalasku ne izazivaju značajan nivo hemaglutinacije crvenih krvnih ćelija. U nekim slučajevima, značajan nivo aglutinacije ćelija odnosi se na aglutinaciju u prisustvu postojećih CD47 antitela. U jednom aspektu, nivo aglutinacije u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku je smanjen najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 99% u poređenju sa nivoom aglutinacije u prisustvu postojećih CD47 antitela. U nekim primerima izvođenja, CD47 antitela prema pronalasku ne izazivaju značajan nivo aglutinacije ukoliko je nivo aglutinacije u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku je smanjen najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 99% u poređenju sa nivoom aglutinacije u prisustvu postojećih CD47 antitela. U drugim primerima izvođenja, CD47 antitela prema pronalasku ne izazivaju značajan nivo aglutinacije ukoiko je nivo aglutinacije u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku je smanjen najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 99% u poređenju sa nivoom aglutinacije u prisustvu CD47 antitela, 1B4, koej sadrži sekvencu varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca obezbeđenu u SEQ ID NO: 80 i SEQ ID NO: 81, respektivno. Poželjno, CD47 antitela prema pronalasku ne izaizivaju značajan nivo aglutinacije ćelija na koncentraciji antitela između 10 pM i 10 µM, npr., na koncentraciji antitela od 50 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 1 µM, ili 5 µM.
[0019] Antitela prema predmetnom pronalasku su takođe značajno potentnija u modelima tumora u poređenju sa antitelima poznatim u tehnici. Na primer, sposobnost makrofaga da fagocitira ćelije tumora u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku je povećana najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 99% u poređenju sa sposobnošću makrofaga da fagocitiraju ćelije tumora u prisustvu postojećih CD47 antitela.
[0020] Stručnjaci će prepoznati da je moguće kvantifikovati, bez nepotrebnog eksperimentisanja, nivo aglutinacije, npr., nivo hemaglutinacije RBCs. Na primer, stručnjaci će prepoznati da nivo hemaglutinacije je porcenjen merenjem površine tačke RBC nakon izvođenja analize hemaglutinacije u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku, kao što je opisano u Primerima u nastavku. U nekim slučajevima, površina RBC tačke u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku je poređena sa površinom RBC tačke u odsustvu CD47 antitela, tj., u prisustvu nulte hemaglutinacije. Na ovaj način, hemaglutinacija je kvantifikovana u odnosu na bazalnu kontrolu. Veća površina RBC tačke odgovara većem nivou hemaglutinacije. Alternativno, može se takođe koristiti denzitometrija RBC tačke da bi se kvantifikovala hemaglutinacija.
[0021] CD47 antitela opisana ovde korisna su za tretiranje, odlaganje napredovanja, prevenciju relapsa ili ublažavanje simptoma kancera ili drugog neoplastičnog stanja. Na primer, CD47 antitela opisana ovde su korisna za tretiranje hemtoloških maligniteta i/ili tumora, npr., hematoloških maligniteta i/ili tumora. Na primer, CD47 antitela opisana ovde su korisna za tretiranje CD47+ tumora. Putem neograničavajućeg primera, CD47 antitela opisana ovde su korisna za tretiranje ne-Hodgkin limfoma (NHL), akutne limfocitne leukemije (ALL), akutne mijeloidne leukemije (AML), hronične limfocitne leukemije (CLL), hronične mijelogene leukemije (CML), multipnog mijeloma (MM), kancera dojke, kancera jajnika, kancera glave i vrata, kancera bešika, melanoma, kolorektalnog kancera, kancera pankreasa, kancera pluća, leiomioma, leiomiosarkoma, glioma, glioblastoma, i tako dalje. Solidni tumori uključuju, npr., tumore dojke, tumore jajnika, tumore pluća, tumore pankreasa, tumore prostate, melanom tumore, kolorektalne tumore, tumore pluća, tumore glave i vrata, tumore bešike, tumore jednjaka, tumore jetre, i tumore bubrega.
[0022] Kao što je ovde korišćeno, "hematološki kancer" odnosi se na kancer krvi, i uključuje između ostalog leukemiju, limfom i mijelom. "Leukemija" se odnosi na kancer krvi u kojem je proizvedeno previše belih krvnih ćelija koje su neefikasne u borbi protiv infekcije, čime se zagušuju drugi delovi koji čine krv, kao što su trombociti i crvene krvne ćelije. Podrazumeva se da su slučajevi leukemije klasifikovani kao akutni ili hronični. Određeni oblici leukemije uključuju, putem neograničavajućeg primera, akutnu limfocitnu leukemiju (ALL); akutnu mijeloidnu leukemiju (AML); hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL); hroničnu mijelogenu leukemiju (CML); mijeloproliferativni poremećaj/neoplazmu (MPDS); i sindom mijelodisplazije. "Limfom" se može odnositi na Hodgkin limfom, i indolentni i agresivni ne-Hodgkin limfom, Burkitt limfom, i folikularni limfom (sitnoćelijski i nesitnoćelijski), između ostalih. Mijeloma se može odnositi na multipni mijelom (MM), mijelom džinovskih ćelija, mijelom teškog lanca, i lakog lanca ili Bence-Jones mijelom.
[0023] Primeri monoklonskih antitela prema pronalasku uključuju, na primer, antitela opisana ovde. Primeri antitela uključuju antitela koja imaju varijabilni teški lanac izabrana od SEQ ID NOs: 5-30 i varijabilni laki lanac izabran od SEQ ID NOs: 31-47. Antitela takođe uključuju antitela koja imaju varijabilni teški lanac koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičan sa sekvencom datom u najmanje jednoj od SEQ ID NOs: 5-30 i varijabilni laki lanac koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičan sa sekvencom datom u najmanje jednoj od SEQ ID NOs: 31-47. Poželjno, antitela prepoznaju i vezuju humani CD47 i ne izazivaju značajan nivo hemaglutinacije humanih crvenih krvnih ćelija. Ova antitela su respektivno označena ovde kao CD47 antitela. CD47 antitela uključuju potpuno humana monoklonska antitela, kao i humanizovana monoklonska antitela i himerna antitela. Ova antitela pokazuju specifičnost za humani CD47, i pokazano je da moduliraju, npr., blokiraju, inhibiraju, redukuju, antagonizuju, neutrališu ili na drugi način utiču na CD47 ekspresiju, aktivnost i/ili signalizaciju bez izazivanja značajnog nivoa hemaglutinacije crvenih krvnih ćelija.
[0024] CD47 antitela obezbeđena ovde pokazuju inhibitornu aktivnost, na primer inhibicijom CD47 ekspresije (npr., inhibicijom ekspresiju CD47 na površini ćelije), aktivnosti, i/ili signalizacije, ili uticajem na interakciju između CD47 i SIRPα. Antitela obezbeđena ovde kompletno ili delimično smanjuju ili na drugi način moduliraju CD47 ekspresiju ili aktivnost nakon vezivanja za, ili na drugi način interaguju sa, CD47, npr., humanim CD47. Smanjenje modulacije biološke funkcije CD47 je kompletna, značajna, ili delimična nakon interakcije između antitela i humanog CD47 polipeptida i/ili peptida. Smatra se da antitela kompletno
1
inhibiraju CD47 ekspresiju ili aktivnost kada je nivo CD47 ekspresije ili aktivnosti u prisustvu antitela smanjen najmanje 95%, npr., 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% u poređenju sa nivoom CD47 ekspresije ili aktivnosti u odsustvu interakcije, npr., vezivanja, sa antitelom opisanim ovde. Smatra se da CD47 antitela značajno inhibiraju CD47 ekspresiju ili aktivnost kada je nivo CD47 ekspresije ili aktivnosti u prisustvu CD47 antitela smanjen najmanje 50%, npr., 55%, 60%, 75%, 80%, 85% ili 90% u poređenju sa nivoom CD47 ekspresije ili aktivnosti u odsustvu vezivanja sa CD47 antitelom opisanim ovde. Smatra se da antitela delimično inhibiraju CD47 ekspresiju ili aktivnost kada je nivo CD47 ekspresije ili aktivnosti u prisustvu antitela smanjen manje od 95%, npr., 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% ili 90% u poređenju sa nivoom CD47 ekspresije ili aktivnosti u odsustvu interakcije, npr., vezivanja, sa antitelom opisanim ovde.
[0025] Antitela prema pronalasku takođe uključuju monoklonska antitela koja specifično vezuju CD47, naznačeno time da antitelo ne izaziva značajan nivo aglutinacije, npr., hemaglutinaciju crvenih krvnih ćelija ("RBC hemaglutinaciju"). Antitela prema predmetnom pronalasku jedinstveno vezuju CD47 na način koji ne promoviše slepljivanje CD47 pozitivnih ćelija; međutim, sposobnost antitela prema predmetnom pronalasku da vezuju CD47 na ćelijskoj površini i ne izazivaju fenomen slepljivanja ćelija nije ograničen na crvene krvne ćelije.
[0026] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu uključivati antitelo prema pronalasku i nosač. Ove faramceutske kompozicije mogu biti u kompletima, kao što su, na primer, dijagnostički kompleti.
[0027] Pronalazak obezbeđuje mnoklonska antitela koja se vezuju za CD47 ili njihov imunološki aktivan fragment, naznačeno time da antitelo ne izaziva značajan nivo aglutinacije ćelija nakon primene, npr., antitelo ne izaziva značajan nivo hemaglutinacije crvenih krvnih ćelija nakon primene. U nekim primerima izvođenja, antitelo je himerno, humanizovano, ili potpuno humano. U nekim primerima izvođenja, antitela se vezuju za humani CD47. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sprečava da CD47 interaguje sa SIRPα. Smatra se da antitela kompletno inhibiraju interakciju CD47 i SIRPα kada je nivo CD47/SIRPα interakcije u prisustvu antitela smanjen najmanje 95%, npr., 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% u poređenju sa nivoom CD47/SIRPα interakcije u odsustvu interakcije sa antitelom, npr., vezivanjem sa antitelom. Smatra se da antitelo delimično inhibira CD47/SIRPα interakciju kada je nivo CD47/SIRPα interakcije u prisustvu antitela smanje manje od 95%, npr., 10%, 20%, 25%, 30%.40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% ili 90% u poređenju sa nivoom CD47/SIRPα interakcije u odsustvu interakcije sa antitelom, npr., vezivanjem sa antitelom.
[0028] Količina antitela dovoljna za tretiranje ili prevenciju kancera kod subjekta je, na primer, količina koja je dovoljna da redukuje CD47 signalizaciju (Videti, npr., Yamauchi et al., 2013 Blood, Jan 4. [Epub ahead of print]; Soto-Pantoja et al., 2013 Expert Opin Ther Targets, 17: 89-103; Irandoust et al., 2013 PLoS One, Epub Jan 8; Chao et al., 2012 Curr Opin Immunol, 24 :225-32; Theocharides et al., 2012 J Exp Med, 209(10): 1883-99; Csányi et al., 2012 Arterioscler Thromb Vasc Biol, 32: 2966-73; Maxhimer et al., 2009 Sci Transl Med, 1: 3ra7; Sarfati et al., 2008 Curr Drug Targets, 9: 842-850; Miyashita et al., 2004 Mol Biol Ćelija, 15: 3950-3963; E.J. Brown and W.A. Frazier, 2001 Trends Ćelija Biol, 11: 130-135; Oldenborg et al., 2001 J Exp Med, 193: 855-862; Blazar et al., 2001 J Exp Med, 194: 541-549; Oldenborg et al., 2000 Science, 288: 2051-2054; and Gao et al., 1996 J Biol Chem, 271: 21-24). Na primer, količina antitela dovoljna za tretiranje ili prevenciju kancera kod subjekta je količina koja je dovoljna da se smanji inhibitorni signal za fagocitozu kod makrofaga generisan CD47/SIRPα interakcijom u CD47/SIRPα signalnoj osovini, tj., antitelo prema pronalasku promoviše makrofag-posredovanu fagocitozu CD47-eksprimirajućih ćelija. Kao što je ovde korišćeno, termin "smanjen" odnosi se na smanjenu CD47 signalizaciju u prisustvu antitela prema pronalasku. CD47 posredovana signalizacija je smanjena kada je nivo CD47 signalizacije u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku veći ili jednak 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99%, ili 100% manji od kontrolnog nivoa CD47 signalizacije (tj., nivoa CD47 signalizacije u odsustvu antitela). Nivo CD47 signalizacije se meri korišćenjem bilo koje od različitih standardnih tehnika, kao što su, putem neograničavajućeg primera, merenje aktivacije nishodnog gena, i/ili luciferaza reporter analiza koja odgovara na CD47 aktivaciju. Stručnjacima će biti jasno da se nivo CD47 signalizacije može meriti korišćenjem različitih analiza, uključujući, na primer, komercijalno dostupne komplete.
[0029] U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je IgG izotip. U nekim primerima izvođenja, konstantni region antitela je humani IgG1 izotip, koji ima aminokiselinsku sekvencu:
[0030] U nekim primerima izvođenja, humani IgG1 konstantni region je modifikovan na aminokiselini Asn297 (obeleženo pravougaonikom, Kabat numerisanje) da bi se sprečila glikozilacija antitela, na primer Asn297Ala (N297A). U nekim primerima izvođenja, konstantni region antitela je modifikovan na aminokiselini Leu235 (Kabat numerisanje) da bi se izmenile interakcije Fc receptora, na primer Leu235Glu (L235E) ili Leu235Ala (L235A). U nekim primerima izvođenja, konstantni region antitela je modifikovan na aminokiselini Leu234 (Kabat numerisanje) da bi se izmenile interakcije Fc receptora, npr., Leu234Ala (L234A). U nekim primerima izvođenja, konstantni region antitela je izmenjen na obe aminokiseline 234 i 235, na primer Leu234Ala i Leu235Ala (L234A/L235A) (EU indeks od Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
[0031] U nekim primerima izvođenja, konstantni region antitela je humani IgG2 izotip, koji ima aminokiselinsku sekvencu:
[0032] U nekim primerima izvođenja, konstantni region humanog IgG2 je modifikovan na aminokiselini Asn297 (obeleženo pravougaonikom, Kabat numerisanje) da bi se sprečila glikozilacija antitela, npr., Asn297Ala (N297A).
[0033] U nekim primerima izvođenja, konstantni region antitela je humani IgG3 izotip, koji ima aminokiselinsku sekvencu:
1
[0034] U nekim primerima izvođenja, konstantni region humanog IgG3 je modifikovan na aminokiselini Asn297 (obeleženo pravougaonikom, Kabat numerisanje) da bi se sprečila glikozilacija antitela, npr., Asn297Ala (N297A). U nekim primerima izvođenja, humani IgG3 konstantni region je modifikovan na aminokiselini 435 da bi se produžio polu-život, npr., Arg435His (R435H) (EU indeks od Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
[0035] U nekim primerima izvođenja, konstantni region antitela je humanog IgG4 izotipa, koji ima aminokiselinsku sekvencu:
[0036] U nekim primerima izvođenja, humani IgG4 konstantni region je modifikovan unutar regiona zgloba da bi se sprečila ili smanjila razmena između lanaca, npr., Ser228Pro (S228P). U drugim primerima izvođenja, humani IgG4 konstantni region je modifikovan na aminokiselini 235 da bi se izmenile interakcije Fc receptora, npr., Leu235Glu (L235E). U nekim primerima izvođenja, humani IgG4 konstantni region je modifikovan unutar regiona zgloba i na aminokiselini 235, npr., Ser228Pro i Leu235Glu (S228P/L235E). U nekim primerima izvođenja, humani IgG4 konstantni region je modifikovan na aminokiselini Asn297 (Kabat numerisanje) da bi se sprečila glikozilacija antitela, npr., Asn297Ala (N297A). (EU indeks od Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest).
[0037] U nekim primerima izvođenja, humani IgG konstantni region je modifikovan da bi se poboljšalo FcRn vezivanje. Primeri Fc mutacija koje poboljšavaju vezivanje za FcRn su Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu (M252Y, S254T, T256E, respektivno) (Kabat numerisanje, Dall’Acqua et al 2006, J. Biol Chem Vol 281(33) 23514-23524), ili Met428Leu and Asn434Ser (M428L, N434S) (Zalevsky et al 2010 Nature Biotech, Vol 28(2) 157-159). (EU indeks od Kabat et al 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest). U nekim primerima izvođenja, humani IgG konstantni region je modifikovan da bi se izmenila antitelozavisna citotoksičnost (ADCC) i/ili komplemet-zavisna citotoksičnost (CDC), npr., modifikacije aminokiselina opisane u Natsume et al., 2008 Kancera Res, 68(10): 3863-72; Idusogie et al., 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5; Moore et al., 2010 mAbs, 2(2): 181-189; Lazar et al., 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010, Shields et al., 2001 JBC, 276(9): 6591-6604; Stavenhagen et al., 2007 Kancera Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen et al., 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre et al, 1992 J Immunol, 148: 3461-3468; Pregledno dato u Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1-11.
[0038] U nekim primerima izvođenja, humani IgG konstantni region je modifikovan da bi se indukovala heterodimerizacija. Na primer, postojanje aminokiselinske modifikacije unutar CH3 domena na Thr366, koja kada je zamenjena sa masivnijom aminokiselinom, npr., Try (T366W), je sposobna da se preferencijalno uparuje sa drugim CH3 domenom koji ima aminokiselinske modifikacije u manje masivne aminokiseline na položajima Thr366, Leu368, i Tyr407, npr., Ser, Ala i Val, respektivno (T366S/L368A/Y407V). Heterodimerizacija preko CH3 modifikacija može se dodatno stabilizovati introdukcijom disulfidne veze, na primer promenom Ser354 u Cys (S354C) i Y349 u Cys (Y349C) na naspramnim CH3 domenima (Preglodno dato u Carter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15).
[0039] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje uključuju jedno ili više monoklonskih antitela koja se vezuju za CD47 ili njihov imunološki aktivni fragment, naznačeno time da antitelo ne izaziva značajan nivo hemaglutinacije crvenih krvnih ćelija nakon primene.
[0040] Hemaglutinacija je primer homotipske interakcije, naznačeno time da dve ćelije koje eksprimiraju CD47 su izazvane da prave agregat ili grudve kada se tretiraju sa bivalentnim CD47 vezujućim entitetom. Sposobnost antitela prema predmetnom pronalasku da se vezuju za CD47 na površini ćelije i ne izazovu fenomen stvaranja agregata ćelija nije ograničen na crvene krvne ćelije. Uočeno je da antitela prema predmetnom pronalasku jedinstveno vezuju CD47 na način koji ne promoviše agregaciju CD47 pozitivnih ćelijskih linija, npr., Daudi ćelije.
[0041] U nekim slučajevima, antitelo sadrži varijabilni region teškog (VH) lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5-30. Antitelo izborno sadrži varijabilni region lakog (VL) lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 31-47. U nekim slučajevima, antitelo sadrži VH region lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 5-30 i VL region lanca izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 31-47. Antitela prema pronalasku takođe uključuju antitela koja imaju varijabilni teški lanac koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičan sa sekvencom datom u najmanje jednoj od SEQ ID NOs: 5-30 i varijabilni laki lanac koji je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičan sa sekvencom datom u najmanje jednoj od SEQ ID NOs: 31-47. U drugim aspektima, antitelo sadrži VH region obezbeđen u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 11, 15-17, 20-22, i 27-30 uparen sa VL regionom obezbeđenim u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 31-39, 42, 43, 44, i 47. U sledećem
1
primeru izvođenja, antitelo sadrži VH region obezbeđen u bilo koojoj od SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 11, 12, 15-17, 20-22, i 27-30 uparen sa VL regionom obezbeđenim u bilo kojoj od SEQ ID NOs: 31, 32, 35, 40, 41, 42, 43, 44, i 47. U sledećem primeru izvođenja pronalaska, antitelo sadrži kombinaciju regiona VH lanca i regiona VL lanca izabranu od kombinacija navedenih u Tabeli 1.
[0042] U nekim primerima izvođenja, CD47 antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sadrži sekvencu VH regiona koji određuje komplementarnost 1 (CDR1) datu u SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, ili SEQ ID NO: 66, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, ili SEQ ID NO: 76, VIICDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 77, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 67, ili SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, ili SEQ ID NO: 71 i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55. Na primer, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sadrži VII CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VII CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55. U sledećem primeru, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sadrži VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 72, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 71, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55.
[0043] U jednom primeru izvođenja, antitela prema predmetnom pronalasku se vezuju za CD47 u orijentaciji glava ka boku koja pozicionira teški lanac blizu membrane ćelije koja eksprimira CD47, dok laki lanac zaklanja SIRPα vezujuće mesto na CD47. U sledećem primeru izvođenja, antitela prema predmetnom pronalasku vezuju se za CD47 u orijentaciji glava ka boku koja pozicionira laki lanac blizu membrane ćelije koja eksprimira CD47, dok teški lanac zaklanja SIRPα vezujuće mesto na CD47.
[0044] CD47 antitela vezuju se za epitop koji uključuje bilo koji od aminokiselinskih ostataka 1-116 od CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147 (tj., SEQ ID NO: 48 isključujući signalnu sekvencu (aminokiseline 1-18)). Na primer, antitela se mogu vezivati za epitop koji uključuje jedan ili više aminokiselinskih ostataka Q31, N32, T33, T34, E35, V36, Y37, V38, K39, W40, K41, F42, K43, G44, R45, D46, 147, Y48, T49, F50, D51, G52, A53, L54, N55, K56, S57, T58, V59, P60, T61, D62, F63, S64, S65, A66, K67, 168, E69, V70, S71, Q72, L73, L74, K75, G76, D77, A78, S79, L80, K81, M82, D83, K84, S85, D86, A87, V88, S89, H90, T91, G92, N93, Y94, T95, C96, E97, V98, T99, E100, L101, T102, R103,
1
E104, G105, E106, T107, I108, I109, i E110 of CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147.
[0045] U nekim slučajevima, antitela se mogu vezivati za diskontinuirani epitop koji uključuje jedan ili više aminokiselinskih ostataka Y37, V38, K39, W40, K41, F42, K43, G44, R45, D46, I47, Y48, T49, F50, i D51 of CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147. Na primer, antitela prema predmetnom pronalasku vezuju se za diskontinuirani epitop koji sadrži aminokiselinske ostatke Y37, K39, K41, K43, G44, R45, D46, D51, H90, N93, E97, T99, E104, ili E106 CD47 kad su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147. Na primer, antitela se mogu vezivati za diskontinuirani epitop koji uključuje najmanje ostatke KGRD (SEQ ID NO: 56) petlju (ostaci 43-46) CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147. Na primer, antitela prema predmetnom pronalasku se vezuju za diskontinuirani epitop koji uključuje najmanje ostatke Y37, K39, K41, KGRD (SEQ ID NO: 56) petlju (ostaci 43-46), D51, H90, N93, E97, T99, E104, i E106 CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147. Na primer, antitela prema predmetnom pronalasku vezuju se za diskontinuirani epitop koji uključuje aminokiselinske ostatke Y37, K39, K41, the KGRD (SEQ ID NO: 56) petlju (ostaci 43-46), D51, H90, N93, E97, T99, E104, i E106 CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147.
[0046] VH region CD47 antitela opisan ovde je primarno uključen u vezivanje za KGRD (SEQ ID NO: 56) petlju CD47. Stoga, jedinstveni epitop za koji se antitela prema predmetnom pronalasku vezuju je na bočnoj strani CD47. Za razliku od postojećih CD47 antitela poznatih u tehnici, orijentacija VH domena CD47 antitela opisana ovde u proksimalnom položaju u odnosu na membranu je kritična osobina ovih antitela koja sprečava ćelijsku agregaciju, npr., hemaglutinaciju crvenih krvnih ćelija, ograničavajući antitela tako da ne mogu napraviti most do CD47 molekula na susednim ćelijama. Dodatno, kako VK domen CD47 antitela opisan ovde interaguje sa apikalnim ostacima kao što su Y37, T102, i E104, koji su uključeni u SIRPα vezivanje, primarno VK domen fizički sprečava SIRPα vezivanje za CD47.
[0047] Takođe je obezbeđeno izolovano antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment koji je u kompeticiji sa CD47 antitelima opisanim ovde u odnosu na sprečavanje CD47 interakcije sa SIRPα.
[0048] Ovde je dodatno otkriven polipeptid koji sadrži aminokiselinske ostatke Y37, K39, K41, K43, G44, R45, D46, D51, H90, N93, E97, T99, E104, i E106 CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147. Takođe je otkriven polipeptid koji sadrži bilo koji od aminokiselinskih ostataka 1-116 CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147. Na primer, polipeptid sadrži jedan ili više aminokiselinskih ostataka Q31, N32, T33, T34,
1
E35, V36, Y37, V38, K39, W40, K41, F42, K43, G44, R45, D46, 147, Y48, T49, F50, D51, G52, A53, L54, N55, K56, S57, T58, V59, P60, T61, D62, F63, S64, S65, A66, K67, I68, E69, V70, S71, Q72, L73, L74, K75, G76, D77, A78, S79, L80, K81, M82, D83, K84, S85, D86, A87, V88, S89, H90, T91, G92, N93, Y94, T95, C96, E97, V98, T99, E100, L101, T102, R103, E104, G105, E106, T107, I108, I109, i E110 CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147. Takođe su otkriveni postupci za upotrebu ovog polipeptida kao antigena, npr., antigena koji vezuje CD47 antitelo.
[0049] Pronalazak takođe obezbeđuje antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema pronalasku za upotrebu u postupcima oblažavanja simptoma kancera ili drugog neoplastičnog stanja primenom na subjekta kome je to potrebnon jednog ili više monoklonskih antitela koji se vezuju za CD47 ili za njegov imunološki aktivni fragment, naznačeno time da antitelo ne izaziva značajan nivo hemaglutinacije crvenih krvnih ćelija nakon primene. Antitelo je primenjeno u količini koja je dovoljna da se ublaži simptom kancera ili drugog neoplastičnog stanja kod subjekta. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek. U nekim primerima izvođenja, antitelo je himerno, humanizovano, ili potpuno humano. U nekim primerima izvođenja, antitelo se vezuje za humani CD47. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sprečava CD47 iterakciju sa SIRPα. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je IgG izotip izabran iz grupe koja se sastoji od IgG1 izotipa, IgG2 izotipa, IgG3 izotipa, i IgG4 izotipa. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je IgG izotip izabran od IgG4P i IgG4PE.
[0050] U nekim primerima izvođenja, CD47 antitela opisana ovde korišćena su zajedno sa jednim ili više dodatnih sredstava ili kombinacijom dodatnih sredstava. Pogodna dodatna sredstva uključuju savremene farmaceutske i/ili hirurške terapije za nameravanu primenu, kao što je, na primer, kancer. Na primer, CD47 antitela se mogu koristiti zajedno sa jednim ili više dodatnih hemoterapeutskih ili anti-neoplastičnih sredstava. Alternativno, dodatno hemoterapeutsko sredstvo je radioterapija. U nekim primerima izvođenja, hemoterapeutsko sredstvo je sredstvo koje izaziva smrt ćelije. U nekim primerima izvođenja, hemoterapeutsko sredstvo indukuje gubitak fosfolipidne asimetrije kroz plazma membranu, na primer izaziva izlaganje fosfatidilserina (PS) na površini ćelije. U nekim primerima izvođenja, hemoterapeutsko sredstvo uključuje stres endoplazmatičnog retikuluma (ER). U nekim primerima izvođenja, hemoterapeutsko sredstvo je proteazom inhibitor. U nekim primerima izvođenja, hemoterapeutsko sredstvo indukuje translokaciju ER proteina na površinu ćelije. U nekim primerima izvođenja, hemoterapeutsko sredstvo indukuje translokaciju i izlaganje kalretikulina na površini ćelije.
1
[0051] U nekim primerima izvođenja, CD47 antitelo i dodatno sredstvo su formulisani u jednu terapeutsku kompoziciju, i CD47 antitelo i dodatno sredsstvo su primenjeni istovremeno. Alternativno, CD47 antitelo i dodatno sredstvo su međusobno razdvojeni, npr., svaki je formulisan u zasebnoj terapeutskoj kompoziciji, i CD47 antitelo i dodatno sredstvo su primenjeni istovremeno, ili CD47 antitelo i dodatno sredstvo su primenjeni u različita vremena tokom režima tretmana. Na primer, CD47 antitelo je primenjeno pre primene dodatnog sredstva, CD47 antitelo je primenjeno posle primene dodatnog sredstva, ili CD47 antitelo i dodatno sredstvo su primenjeni naizmenično. Kao što je ovde opisano, CD47 antitelo i dodatno sredstvo su primenjeni u pojedinačnim dozama ili u višestrukim dozama.
[0052] Stručnjaku će biti jasno da antitela prema pronalasku imaju različite upotrebe. Na primer, antitela prema pronalasku se upotrebljavaju kao terapeutska sredstva, kao reagensi u dijagnostičkim kompletima ili kao dijagnostički alati, ili kao reagensi u kompetitivnim analizama da bi se generisali terapeutski reagensi.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0053]
Slika 1A je grafik koji predstavlja vezivanje CD47 na Daudi ćelijama od strane antitela u supernatantima hibridoma kao što je procenjeno protočnom citometrijom. Slika 1B je grafik koji pokazuje sposobnost nekih CD47 antitela unutar supernatanta hibridoma da blokiraju vezivanje rekombinantnog humanog SIRPα za rekombinantni humani CD47, kao što je određeno sa ELISA.
Slika 2 je serija grafika koji prikazuje (A) vezivanje prečišćenog mišjeg CD47 antitela za Raji ćelije, kultivisanu liniju limfoblastoidnih ćelija izvedenih iz Burkitt limfoma, i (B) CCRF-CEM ćelijama, CD47 pozitivna T ćelijska linija slična limfoblastu, kao što je analizirano protočnom citometrijom. Ovaj eksperiment poredi vezivanje mišjeg antitela prema predmetnom pronalasku sa komercijalno dostupnim CD47 antitelima, B6H12 i 2D3.
Slika 3 je serija grafika koji prikazuju kapacitet CD47 antitela da blokiraju SIRPα vezivanje korišćenjem (A) ELISA sa rekombinantnim humanim proteinom, ili (B) protočne citometrije korišćenjem CCRF-CEM ćelija i rekombinantnog humanog SIRPα proteina.
Slika 4 je serija fotografija, grafika, i tabela koje prikazuju RBC hemaglutinaciju sa CD47 antitelima. RBC hemaglutinacija je dokazana pojavom zamućenja u bunarčiću, dok neaglutinirane RBC izgledaju kao punktat.
1
Slika 4A pokazuje da 2A1 antitelo ne pokazuje hemaglutinaciju na svim testiranim koncentracijama. Hemaglutinacioni indeks je prikazan na grafiku. Slika 4B pokazuje da 2A1 je retko u odnosu na mnoga druga CD47 antitela po svojoj nesposobnosti da izazove aglutinaciju RBCs. Takođe je pokazan nedostatak aglutinacione aktivnosti od strane humane himerne verzije 2A1 (2A1-xi).
Slika 4C prikazuje da CD47 monoklonsko antitelo 2D3, koje ne blokira SIRPα, ne izaziva hemaglutinaciju.
Slika 4D pokazuje visok opseg koncentracija CD47 antitela u analizi hemaglutinacije i demonstrira pro-zonski efekat. Hemaglutinacioni indeks je prikazan na grafiku. Slika 4E pokazuje uži opseg koncentracija za hemaglutinaciju od strane CD47 antitela, 1B4, dok je ovaj efekat odsutan po vezivanju 2A1. Slika 4F prikazuje da 2A1, himerno 2A1 (2A1-xi), i humanizovane varijante ne izazivaju hemaglutinaciju. U većini eksperimenata 9E4 antitelo i komercijalno B6H12 antitelo su korišćeni kao pozitivne kontrole za hemaglutinaciju. Druga komercijalno dostupna antitela korišćena u ovim analizama bila su SIRPα blokirajuća antitela, BRIC126 i CC2C6, i ne-SIRPα blokirajuće antitelo, 2D3.
Slika 5 je grafik koji prikazuje 2A1 i B6H12 vezivanje za B i Raji ćelije makaki (cyno) majmuna, kao što je procenjeno protočnom citometrijom. 2A1 vezuje humani i cyno CD47 sa jednakim afinitetom, kao i B6H12, ali sa nižim afinitetom i za humani i za cyno CD47 od 2A1.
Slika 6 je grafik koji prikazuje vezivanje 2A1, 2A1-xi, i B6H12 za Raji ćelije, kao što je procenjeno protočnom citometrijom. Važno je da grafik pokazuje da su sekvence varjabilnog regiona teških (VH) i lakih (VL) lanaca bili korektno razjašnjenje u himernoj verziji 2A1. Slika 7A-7J je serija grafika koji pokazuju vezivanje humanizovanih varijanti 2A1 za Raji ćelije. 2A1-xi je korišćeno kao interna kontrola na većini grafika. Testirane su brojne kombinacije teških i lakih lanaca kao što je opisano u Primeru 8.
Slika 8A je slika traga iz ekskluzione hromatografije korišćenjem AKTA FLPC sa superdex200 kolonom. Pokazane su IgG1, IgG4P, i IgG4PE varijante AB6.12 antitela. Sve tri varijante su preko 97% monomerne. Slika 8B je fotografija komasi plavo obojenog SDS-PAGE gela brojnih humanizovanih varijanti 2A1 pod redukujućim (R) i ne-redukujućim (NR) uslovima.
Slika 9 je serija grafika koji prikazuju sposobnost CD47 antitela da prmovišu fagocitozu ćelijskih linija humanog tumora sa makrofagama izverdenim iz humanih monocita (MDM). Slika 9A je grafik koji prikazuje fagocitozni indeks, naznačeno time da su korišćena antitela bila komercijalno antitelo B6H12, mišje 2A1 antitelo, humanizovana varijanta AB2.05 antitela, i ne-blokirajuće komercijalno antitelo 2D3. Slika 9B je grafik koji prikazuje
2
fagocitozni indeks, naznačeno time da su korišćena antitela bila komercijalno antitelo B6H12, humanizovano antitelo AB2.05 (humani IgG1), i IgG1, IgG4P, i IgG4PE varijante humanizovanog antitela AB6.12. CCRF-CEM ćelije su korišćene kao CD47 target ćelijska linija u ovim eksperimentima.
Slika 10 je serija grafika koji pokazuju anti-tumorske efekte CD47 antitela u modelu Raji tumora. Slika 10A je grafik koji pokazuje efikasnost mišjeg antitela 9E4, 1B4, 2A1, i komercijalnog antitela B6H12.
Slika 10B je grafik koji pokazuje efikasnost IgG1, IgG4P, i IgG4PE izotipova humanizovanog antitela AB6.12, zajednosa mišjim 2A1 antitelom. U oba modela, miševi su tretirani sa 200 µg dozom antitela tri puta nedeljno.
Slika 11 je grafički prikaz ko-kristalnih kompleksa CD47-IgV sa SIRPα-IgV domenom (A, (Protein Data Bank (PDB) Reference No.2JJS), B6H12 (B), i 2A1 (C).2A1 i B6H12 vezanih u veoma različitim orijantacijama i distinktnim epitopima na CD47, od kojih se oba preklapaju sa mestom vezivanja SIRPα.2A1 antitelo vezuje se u orijentaciji glava ka boku na CD47 proteinu.
DETALJAN OPIS
[0054] Predmetni pronalazak obezbeđuje monoklonska antitela koja specifično vezuju CD47, uključujući humani CD47. Ova antitela se kolektivno označvaju ovde kao CD47 antitela.
[0055] CD47, višestruki transmembranski receptor koji pripada superfamiliji imunoglobulina, interaguje sa SIRPα (signalnim-regulatornim-proteinom α) na makrofagama i time zaustavlja fagocitozu. Ćelije kancera koje ko-optiraju ovaj put izbegavaju fagocitozu. Kao što je detaljo opisano u nastavku, ovo je novi mehanizam imunog izbegavanja od strane tumora, i terapeutski targeting CD47 ima široku primenu u brojnim kancerima.
[0056] Ekspresija CD47 je u korelaciji sa najgorim kliničkim ishodima u mnogim distinktnim malignitetima uključujući ne-Hodgkin limfom (NHL), akutnu limfocitnu leukemiju (ALL), akutnu mijelogenu leukemiju (AML), kancer ovarijuma, gliom, glioblastom, itd. Dodatno, CD47 je identifikovan kao marker matičnih ćelija kancera i kod leukemija i kod solidnih tumora (Jaiswal et al., 2009 Ćelija, 138(2): 271-85; Chan et al., 2009 Proc Natl Acad Sci USA, 106(33): 14016-21; Chan et al., 2010 Curr Opin Urol, 20(5): 393-7; Majeti R et al., 2011 Oncogen, 30(9): 1009-19).
[0057] CD47 blokirajuća antitela su pokazala anti-tumorsku aktivnost u više in vivo modela tumora. Dodatno, pokazano je da su ova antitela u sinergiji sa drugim terapeutskim antitelima uključujući Rituxan® i Herceptin® u modelima tumora. Blokiranje interakcije CD47 sa SIRPα je sposobno da promoviše fagocitozu ćelija koje eksprimiraju CD47 od strane makrofaga (pregledno dato u Chao et al., 2012 Curr Opin Immunol, 24(2): 225-32). Miševi kojima nedostaje CD47 su izrazito rezistentni na terapiju zračenjem, što sugeriše ulogu za targeting CD47 u kombinaciji sa radioterapijom (Isenberg et al., 2008 Am J Pathol, 173(4): 1100-1112; Maxhimer et al., 2009 Sci Transl Med, 1(3): 3ra7). Dodatno, singenički modeli tumora kod ovih miševa pokazuju smanjene metastaze kostiju u poređenju sa miševima divljeg tipa (Uluçkan et al., 2009 Cancer Res, 69(7): 3196-204).
[0058] Važno je da je objavljeno da većina CD47 antitela izaziva hemaglutinaciju humanih eritrocita. Hemaglutinacija je primer homotipske interakcije, gde dve ćelije koje eksprimiraju CD47 agregiraju ili stvaraju grudve kada su tretirane sa bivalentnim CD47 vezujućim entitetom. Na primer, objavljeno je da CD47 antitelo, MABL, kao potpuni IgG ili F(ab’)2, izaziva hemaglutinaciju eritrocita, i, samo kada je MABL izmenjen u scFv ili bivalentni scFv, ovaj efekat je smanjen. (Videti npr., Uno S, Kinoshita Y, Azuma Y et al. Antitumor activity of monoclonal antibody against CD47 in xenograft models of human leukemia. Oncol Rep 2007; 17: 1189-94; Kikuchi Y, Uno S, Yoshimura Y et al. bivalent single-chain Fv fragment against CD47 induces apoptosis for leukemic cells. Biochem Biophys Res Commun 2004; 315: 912-8). Druga poznata CD47 antitela uključujući B6H12, BRIC126, i CC2C6 takođe izazivaju hemaglutinaciju RBCs, kao što je detaljno opisano u nastavku. Stoga, agregacija ćelija predstavlja glavno ograničenje terapeutskog targetinga CD47 sa postojećim potpunim IgG antitelima.
[0059] Dodatno, važna karakteristika CD47 antitela je sposobnost da blokira interakciju CD47 i SIRPα da bi se promovisala fagocitoza ćelija koje eksprimiraju CD47 sa makrofagama. Mnoga postojeća CD47 antitela blokiraju SIRPα; međutim, pre pronalaska opisanog ovde, postojeća antitela koja su blokirala SIRPα izazivala su sporedne efekte hemaglutinacije, koja, kao što je prethodno opisano, je nepoželjna. Druga postojeća antitela, kao što je 2D3, na izazivaju hemaglutinaciju; međutim, ova antitela takođe ne blokiraju SIRPα, čineći ih neefikasnim u prmovisanju fagocitoze. Stoga, pre pronalaska opisanog ovde, postojala je značajna potreba da se identifikuju CD47 antitela koja su blokirala SIRPα bez izazivanja agregacije ćelija.
[0060] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment koji se vezuje za humani CD47, naznačeno time da se antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment vezuje za diskontinuirani epitop na CD47, naznačeno time da diskontinuorani epitop sadrži aminokiselinske ostatke Y37, K39, K41, K43, G44, R45, D46, D51, H90, N93, E97, T99, E104, i E106 od CD47 kada su numerisani u skladu sa SEQ ID NO: 147, i naznačeno time da antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sprečava interakciju CD47 sa signalnim-regulatornim proteinom α (SIRPα) i ne izaziva značajan nivo aglutinacije ćelija nakon primene.
[0061] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je himerni ili humanizovani.
[0062] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment promoviše fagocitozu CD47-eksprimirajuće ćelije posredovanu makrofagom.
[0063] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je IgG izotip izabran iz grupe koja se sastoji od IgG 1 izotipa, IgG2 izotipa, IgG3 izotipa, i IgG4 izotipa.
[0064] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je IgG izotip izabran od IgG4P i IgG4PE.
[0065] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sadrži:
(i) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 72,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 71, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(ii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(iii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 67,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 69, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(iv) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
2
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 67, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 70, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(v) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(vi) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 72, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(vii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 72, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 71, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(viii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 76, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(ix) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 76, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 71, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55
(x) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 77,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(xi) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 57,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(xii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 60,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(xiii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 61,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55 ; ili
(xiv) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 62,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55.
[0066] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sadrži:
(i) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 5, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 31;
(ii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 5, i
2
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 32;
(iii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 33;
(iv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 34;
(v) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(vi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 36;
(vii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 37;
(viii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 38;
(ix) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 39;
(x) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 43;
(xi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 8, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 39;
(xii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 42;
(xiii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 43;
(xiv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 44;
(xv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 47;
(xvi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 15, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 43;
(xvii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 15, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 44;
(xviii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 16, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xix) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 17, i VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
2 (xx) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 20, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xxi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 21, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xxii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 22, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xxiii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 27, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xiv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 28, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 29, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35 ; ili
(xvi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 30, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35.
[0067] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema pronalasku i nosač.
[0068] Predmetni pronalazak dodatno obezbeđuje antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema pronalasku za upotrebu u postupku ublažavanja simptoma kancera ili drugog neoplastičnog stanja kod subjekta.
[0069] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, subjekat je čovek.
[0070] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, postupak dodatno sadrži primenu hemoterapije.
[0071] Prema nekim primerima izvođenja pronalaska, postupak dodatno sadrži primenu radioterapije.
[0072] CD47 antitela prema predmetnom pronalasku izbegavaju neželjeni efekat hemaglutinacije, čime se povećava efikasnost terapeutskog targetinga CD47, i zadržavaju sposobnost da blokiraju interakciju CD47 sa SIRPα, čime se promoviše fagocitoza CD47 eksprimirajućih ćelija. Specifično, potpuna IgG CD47 antitela prema predmetnom pronalasku (npr., 2A1 i njegovi humanizovani derivati uključujući one obezbeđene u Tabeli 1) ne aglutiniraju ćelije u značajnom nivou. Na primer, CD47 antitela prema pronalasku ne hemaglutiniraju RBCs na značajnom nivou. Ovde su opisana prva CD47 antitela u potpunom IgG formatu koja blokiraju SIRPα i ne izazivaju značajan nivo hemaglutinacije. Uzeti zajedno, antitela prema pronalasku (npr., the 2A1 antitelo i njegovi humanizovani derivativi)
2
su jedinstveni među postojećim CD47 antitelima po njihovoj sposobnosti da blokiraju SIRPα, ali ne izazivaju značajan nivo hemaglutinacije.
[0073] CD47 antitela prema pronalasku pokazuju brojne poželjne karakteristike, kao što su, putem neograničavajućeg primera, potentno blokiranje interakcije između CD47 i njegovog liganda SIRPα, bez izazivanja značajnog nivoa ili na drugi način modulirajući hemaglutinaciju eritrocita, kao i potentnu anti-tumorsku aktivnost. Na primer, CD47 antitela prema pronalasku blokiraju najmanje 40%, najmanje 45%, najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 95%, ili najmanje 99% interakcije između CD47 i SIRPα u poređenju sa nivoom interakcije između CD47 i SIRPα u odsustvu CD47 antitela opisanog ovde. CD47 antitela prema pronalasku ne izazivaju značajan nivo aglutinacije ćelija, npr., CD47 antitela prema pronalasku ne izazivaju značajan nivo hemaglutinacije crvenih krvnih ćelija. Na primer, nivo aglutinacije u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku je smanjen najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 99% u poređenju sa nivoom aglutinacije u prisustvu postojećih CD47 antitela. U nekim primerima izvođenja, CD47 antitela prema pronalasku ne izazivaju značajan nivo aglutinacije ukoliko je nivo aglutinacije u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku smanjen najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 99% u poređenju sa nivoom aglutinacije u prisustvu CD47 antitela, 1B4, koje sadrži sekvencu varijabilnog teškog i varijabilnog lakog lanca obezbeđenu u SEQ ID NO: 80 i SEQ ID NO: 81, respektivno. Antitela prema predmetnom pronalasku su takođe značajno potentnija u modelima tumora u poređenju sa antitelima poznatim u tehnici. Na primer, sposobnost makrofaga da fagocitiraju tumorske ćelije u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku je povećana najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili najmanje 99% u poređenju sa sposobnošću makrofaga da fagocitiraju tumorske ćelije u prisustvu postojećih CD47 antitela.
[0074] Stručnjaci će prepoznati da je moguće kvantifikovati, bez nepotrebnog eksperimentisanja, nivo aglutinacije, npr., nivo hemaglutinacije RBCs. Na primer, stručnjaci će prepoznati da nivo hemaglutinacije je procenjen merenjem površine RBC tačke nakon izvođenja analize hemaglutinacije u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku, kao što je opisano u Primerima u nastavku. U nekim slučajevima, površina RBC tačke u prisustvu CD47 antitela prema pronalasku je poređena sa površinom RBC tačke u odsustvu CD47 antitela, tj., u prisustvu nulte hemaglutinacije. Na taj način, hemaglutinacija je kvantifikovana u odnosu
2
na bazlanu vrednost. Veća površina RBC tačke odgovara većem nivou hemaglutinacije. Alternativno, denzitometrija RBC tačke može se takoše koristiti da se kvantifikuje hemaglutinacija.
[0075] CD47 antitela prema pronalasku se vezuju za humani CD47 i blokiraju njegovu interakciju sa SIRPα (Slike 1B, 3, i 7J). Ova antitela ne izazivaju značajan nivo hemaglutinacije humanih eritrocita (Slika 4). Ova antitela su sposobna da promovišu fagocitozu ćelija tumora od strane makrofaga (Slika 9). Dodatno, CD47 antitela pokazuju potentnu anti-tumorsku aktivnost u mišjem modelu humanog limfoma (Slika 10). Stoga, CD47 antitela prema pronalasku prevazilaze glavni ograničavajući faktor za terapeutski targeting CD47. Shodno tome, CD47 antitela prema pronalasku su od velikog značaja u tretmanu velikog broja kancera.
[0076] Antitela prema pronalasku koja se specifino vezuju za humani CD47, blokiraju, inhibiraju, remete ili na drugi način moduliraju interakciju između humanog CD47 i humanog SIRPα, bez izazivanja značajnog nivoa ili drugačijeg moduliranja hemaglutinacije eritrocita.
[0077] Antitela prema predmetnom pronalasku se vezuju za CD47 epitop sa ravnotežnom konstantnom vezivanja (Kd) od ≤ 1 µM, npr., ≤ 100 nM, poželjno ≤ 10 nM, i poželjnije ≤ 1 nM. Na primer, CD47 antitela obezbeđena ovde pokazuju Kdu opsegu približno između ≤ 1 nM do oko 1 pM.
[0078] CD47 antitela prema pronalasku služe za moduliranje, blokiranje, inhibiranje, redukovanje, antagonizovanje, neutralisanje ili na rugi način uticaj na funkcionalnu aktvnost široko rasprostranjenog CD47. Funkcionalne aktivnosti CD47 uključuju na primer, signalizaciju preko interakcije sa SIRPα, modulaciju, npr., povećanje, intracelularnu koncentraciju kalcijuma naokn adhezije ćelija za ekstracelularni matriks, interakciju sa C-terminalnim ćelijskim vezujućim domenom trombospondiny, interakciju sa fibrinogenom, i inetrakciju sa različitim integrinima. Na primer, CD47 antitela kompletno ili potpuno inhibiraju CD47 funkcionalnu aktivnost preko delimične ili potpune modulacije, blokiranja, inhibicije, smanjenja, antagonizovanja, neutralisanja, ili na drugi način uticaja na vezivanje CD47 sa SIRPα.
[0079] Smatra se da CD47 antitela kompletno moduliraju, blokiraju, inhibiraju, smanjuju, antagonizuju, neutrališu ili na drugi način utiču na CD47 funkcionalnu aktivnost kada je nivo CD47 funkcionalne aktivnosti u prisustvu CD47 antitela smanjen najmanje 95%, npr., 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% u poređenju sa nivoom CD47 funkcionalne aktivnosti u odsustvu vezivanja sa CD47 antitelom opisanim ovde. Smatra se da CD47 antitela značajno blokiraju, inhibiraju, smanjuju, antagonizuju, neutrališu ili na drugi način utiču na CD47 funkcionalnu aktivnost kada je nivo CD47 aktivnosti u prisustvu CD47 antitela smanjen najmanje 50%,
2
npr., 55%, 60%, 75%, 80%, 85% ili 90% u poređenju sa nivoom CD47 aktivnosti u odsusutvu vezivanja sa CD47 antitelom opisanim ovde. Smatra se da CD47 antitela delimično moduliraju, blokiraju, inhibiraju, smanjuju, antagonizuju, neutralizuju ili na drugi način utiču na CD47 funkcionalnu aktivnost kada je nivo CD47 aktivnosti u prisutvu CD47 antitela smanjen manje od 95%, npr., 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% ili 90% u poređenju sa nivoom CD47 aktivnosti u odsustvu vezivanja sa CD47 antitelom opisanim ovde.
Definicije
[0080] Ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini korišćeni u vezi sa predmetnim pronalaskom imaće značenja koja se uobičajeno podrazumevaju od strane stručnjaka. Dodatno, ukoliko nije zahtevano drugačije od strane konteksta, termini u jednini uključivaće množinu i termini u množini uključivaće jedninu. Generalno, nomenklature korišćene u vezi sa, i tehnikama, kulture ćelija i tkiva, molekularnom biologijom, i hemijom i hibridizacijom proteina i oligo- ili polinukleotida opisanim ovde su ine dobro poznate i uobičajeno korišćene u tehnici. Standardne tehnike su korišćene za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, i kulturu tkiva i transformaciju (npr., elektroporaciju, lipofekciju). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja su izvedene u skladu sa specifikacijama proizviđača ili kao što se uobičajeno postiže u tehnici ili kao što je ovde opisano. Prethodne tehnike i procedure su generalno izvedene u skladu sa konvencionalnim postupcima dobro poznatim u tehnici i kao što su opisane u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i razmatrane u predmetnoj specifikaciji. Videti npr., Sambrook et al. Molecular Cloning: Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Nomenklature korišćene u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetičke organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije opisane ovde su one dobro poznate i uobičajeno korišćene u tehnici. Standardne tehnike su korišćene za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku pripremu, formulaciju, i isporuku, i tretman pacijenata.
[0081] Kao što je korišćeno u skladu sa predmetnim otkrićem, sledeći termini, ukoliko nije drugačije naznačeno, podrazumevaće sledeća značenja:
[0082] Kao što je ovde korišćeno, termini CD47, integrin-povezani protein (IAP), antigen kancera jajnika OA3, Rh-srodni antigen i MER6 su sinonimi i mogu se koristiti naizmenično.
[0083] Termin crvena krvna ćelija (ćelije) i eritrocit(i) su sinonimi i ovde su korišćeni naizmenično.
[0084] Termin aglutinacija odnosi se na agregaciju ćelija, dok se termin hemaglutinacija odnosi na agregaciju specifičnog subseta ćelija, tj., crvenih krvnih ćelija. Stoga, hemaglutinacija je tip aglutinacije.
[0085] Kao što je ovde korišćeno, termin "antitelo" se odnosi na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina (Ig), tj., molekule koji sadrže antigen vezujuće mesto koje specifično vezuje (imuno reaguje sa) antigenom. Pod "specifično vezuje" ili "imunoreaguje sa" "ili usmereno protiv" znači da antitelo reaguje sa jednom ili više antigenih determinanti željenog antigena i ne reaguje sa drugim polipeptidima ili se vezuje sa mnogo manjim afinitetom (Kd> 10<-6>). Antitela uključuju, ali nisu ograničena na, poliklonska, monoklonska, himerna, dAb (domen antitelo), jednolančana, Fab, Fab i F(ab’)2fragmente, Fv, scFvs, i Fab ekspresionu biblioteku.
[0086] Poznato je da osnovna strukturna jedinica antitela sadrži tetramer. Svaki tetramer je sastavljen od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina primarno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region primarno odgovoran za efektorsku funkciju. Generalno, molekuli antitela dobijeni od ljudi odnose se na bilo koju od klasa IgG, IgM, IgA, IgE i IgD, koje se međusobno razlikuju po prirodi teškog lanca prisutnog u molekulu. Određene klase imaju takođe potklase, kao što su IgG1, IgG2, i druge. Dodatno, kod ljudi, laki lanac može biti kapa lanac ili lambda lanac.
[0087] Termin "monoklonsko antitelo" (MAb) ili "kompozicija monoklonskog antitela", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na populaciju molekula antitela koja sadrži samo jednu molekulsku vrstu molekula antitela koja se sastoji od jedinstvenog genskog proizvoda lakog lanca i jedinstvenog genskog proizvoda teškog lanca. Naročito, regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) monoklonskog antitela su identični u svim molekulima u populaciji. MAbs koji sadrže antigen vezujuće mesto sposobno za imunoreakciju sa specifičnim epitopom antigena karakterisano jedinstvenim afinitetom vezivanja za njega.
[0088] Generalno, molekuli antitela dobijeni od ljudi odnose se na bilo koju od klasa IgG, IgM, IgA, IgE i IgD, koje se međusobno razlikuju po prirodi teškog lanca prisutnog u molekulu. Određene klase imaju takođe potklase, kao što su IgG1, IgG2, i druge. Dodatno, kod ljudi, laki lanac može biti kapa lanac ili lambda lanac.
[0089] Termin "antigen-vezujuće mesto" ili "vezujući deo" odnosi se na deo molekula imunoglobulina koji učestvuje u vezivanju antigena. Mesto vezivanja antigena se formira od aminokiselinskih ostataka N-terminalnih varijabilnih ("V") regiona teških ("H") i lakih ("L") lanaca. Tri veoma divergentna lanca unutar V regiona teških i lakih lanaca, označeni kao
1
"hipervarijabilni regioni," su umetnuti između konzervativniijh lanaca poznatih kao "okvirni regioni," ili "FRs". Stoga, termin "FR" se odnosi na aminokiselinske sekvence koje se prirodno nalaze između, i susedne, hipervarijabilnim regionima u imunoglobulinima. U molekulu antitela, tri hipervarijabilna regiona lakog lanca i tri hipervarijabilna regiona teškog lanca su međusobno nagnuti u trodimenzionalnom prostoru da bi se formirala antigenvezujuća površina. Antigen-vezujuća površina je komplementarna trodimenzionalnoj površini vezanog antigena, i tri hipervarijabilna regiona svakog od teških i lakih lanaca su označeni kao "regioni koji određuju komplementarnost," ili "CDRs." Dodeljivanje aminokiselina svakom domenu je u skladu sa definicijama Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk J. Mol. Biol.196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
[0090] Kao što je ovde korišćeno, termin "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu koja je sposobna da se specifično veže za imunoglobulin ili njegov fragment, ili T-ćelijski receptor. Termin "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu za specifično vezivanje za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. Epitopske determinante se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimezionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Kaže se da antitelo specifično vezuje antigen kada je konstanta disocijacije ≤ 1 μM; npr., ≤ 100 nM, poželjno ≤ 10 nM i poželjnije ≤ 1 nM.
[0091] Kao što je ovde korišćeno, termini "imunološko vezivanje," i "osobine imunološkog vezivanja" odnose se na nekovalentne interakcije tipa koji se dešava između molekula imunoglobulina i antigena za koji je imunoglobulin specifičan. Snaga, ili afinitet imunoloških interakcija vezivanja može se eksprimirati u odnosu na konstantu disocijacije (Kd) interakcije, naznačeno time da manja Kdpredstavlja veći afinitet. Osobine imunološkog vezivanja izabranih polipeptida mogu se kvantifikovati korišćenjem postupaka dobro poznatih u tehnici. Jedan takav postupak obuhvata merenja stope formiranja i disocijacije antigen-vezujućeg mesta/antigen kompleksa, naznačeno time da ove stope zavise od koncetracije partnera u kompleksu, afiniteta interakcije, i geometrijskih parametara koji jednako utiču na stopu u oba pravca. Stoga, oba "konstanta asocijacije" (kon) i "konstanta disocijacije" (koff) može se odrediti izračunavanjem koncentracija i stvarnih stopa asocijacije i disocijacije. (Videti Nature 361:186-87 (1993)). Odnos koff/konomogućava poništavanje svih parametara koje nisu povezane sa afinitetom, i jednak je konstanti disocijacije Kd. (Videti, generalno, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Kaže se da se antitelo prema predmetnom pronalasku specifično vezuje za CD47, kada je ravnotežna konstanta vezivanja (Kd) je ≤ 1 μM, poželjno ≤ 100 nM, poželjnije ≤ 10 nM, i najpoželjnije ≤ 100 pM do oko 1 pM, kao što
2
je mereno analizama kao što su analize vezivanja radioliganada, rezonanca površinskog plamona (SPR), analiza vezivanja sa protočnom citometrijom, ili slične analize poznate stručnjacima.
[0092] Termin "izolovani polinukleotid" kao što je ovde korišćeno označavaće polinukleotid genomske, cDNK, ili sintetičkog porekla ili neka njihova kombinacija, koja usled svog porekla "izolovani polinukleotid" (1) nije povezan sa celim ili delom polinukleotida u kojem se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi, (2) je operativno vezan za polinukleotid sa kojim nije vezan u prirodi, ili (3) se ne pojavljuje u prirodi kao deo veće sekvence.
[0093] Termin "izolovani protein" ovde se odnosi na protein cDNK, rekombinatne RNK, ili sintetičkog porekla ili neka njihova kombinacija, koja zbog svog porekla, ili izvorom iz koga je izvedena, "izolovani protein" (1) nije povezan sa proteinima koji se nalaze u prirodi, (2) je bez drugih proteina iz istog izvora, npr., bez morskih proteina, (3) je eksprimiran od strane ćelije različite vrste, ili (4) ne postoji u prirodi.
[0094] Termin "polipeptid" je ovde korišćen kao genrički termin koji se odnosi na nativni protein, fragmente, ili analoge polipeptidne sekvenvce. Stoga, fragmenti nativnog proteina, i analozi su vrste roda polipeptida.
[0095] Termin "koji postoji u prirodi" kao što je ovde korišćeno primenjeno na objekat odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, sekvenca polipeptida ili polinukleotida koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja se može izolovati iz izvora u prirodi i koja nije namerno modifikovana od strane čoveka u laboratoriji ili na drugi način se nalazi u prirodi.
[0096] Termin "operativno vezan" kao što je ovde korišćeno odnosi se na tako opisane položaje komponenti da su u vezi koja im omogućava da funkcionišu na njihov nameravani način. Kontrolna sekvenca "operativno vezana" za kodirajuću sekvencu je vezana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa kontrolnim sekvencama.
[0097] Termin "kontrolna sekvenca" kao što je ovde korišćeno odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne da utiču na ekspresiju i obradu kodirajućih sekvenci za koje su vezani. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina u prokariotima, i takve kontrolne sekvence generalno uključuju promotor, ribozomalno mesto vezivanja, i sekvencu za terminaciju transkripcije kod eukariota, generalno, takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za terminaciju transkripcije. Namera je da termin "kontrolne sekvence" uključuju, najmanje, sve komponente čije je prisustvo esencijalno za ekspresiju i obradu, i može takođe uključiti dodatne komponente čije je prisustvo prednost, na primer, vodeće sekvence i sekvence fuzionog partnera. Termin "polinukleotid," kao što je ovde označeno, odnosi se na polimerne nukleotide od najmanje dužine od 10 baza, bilo ribonukleotida ili dezoksinukleoida ili modifikovanog oblika bilo kog tipa nukleotida. Termin uključuje jednolančane i dvolančane oblike DNK.
[0098] Termin "oligonukleotid" pomenut ovde uključuje prirodne, i modifikovane nukleotide povezane zajedno sa prirodnim, i oligonukleotidnim vezama koje se ne javljaju u prirodi. Oligonukleotidi su subset polinukleotida koji generalno sadrži dužinu od 200 baza ili manje. Poželjno oligonukleotidi su 10 do 60 baza dužine i najpoželjnije 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 baza dužine. Oligonukleotidi su obično jednolančani, npr., za probe, iako oligonukleotidi mogu biti dvolančani, npr., za upotrebu u konstruisanju genskog mutanta. Oligonukleotidi prema pronalasku su ili sense ili antisens oligonukleotidi.
[0099] Termin "prirodni nukleotidi" pomenut ovde uključuje dezoksiribonukleotide i ribonukleotide. Termin "modifikovani nukleotidi" pomenut ovde uključuje nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim grupama šećera i slično. Termin "oligonukleotidne veze" pomenut ovde uključuje oligonukleotidne veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat, fosforonmidat, i slično. Videti npr., LaPlanche et al. Nucl. Kiselinas Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Kiselinas Res.16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. SAD patent br.. 5,151,510; Uhlmann i Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Oligonukleotid može uključiti obeleživač za detekciju, ukoliko je poželjno.
[0100] Termin "selektivno hibridizuje" pomenut ovde označava detektabilno i specifično vezivanje. Polinukleotidi, oligonukleotidi i njihovi fragmenti u skladu sa pronalaskom selektivno hibridizuju sa lancima nukleinske kiseline pod uslovima hibridizacije i ispiranja koji minimizuju merljive količine detektabilnog vezivanja sa nespecifičnim nukleinskim kiselinama. Visoko stringentni uslovi mogu se koristiti da se postignu selektivni hibridizacioni uslovi kao što je poznato u tehnici i razmatrano ovde. Generalno, homologija sekvence nukleinske kiseline između polinukleotida, oligonukleotida, i fragmenata prema pronalasku i sekvence nukleinske kiseline od interesa biće najmanje 80%, i tipičnije sa poželjnim povećanjem homologije najmanje 85%, 90%, 95%, 99%, i 100%. Dve aminokiselinske sekvence su homologe ukoliko postoji delimična ili potpuna identičnost između njihovih sekvenci. Na primer, 85% homologije znači da 85% aminokiselina je identično kada su dve sekvence poravnate za maksimalno podudaranje. Praznine (u bilo kojoj od dve sekvence koje se podudaraju) su dozvoljene za maksimizovanje dužina praznina za podudaranje od 5 ili manje su poželjne sa 2 ili manje poželjnije. Alterantivno i poželjno, dve
4
proteinske sekvence (ili polipeptidne sekvence izvedene iz njih od najmanje dužine 30 aminokiselina) su homologe, kao što je ovaj termin korišćen ovde, ukoliko imaju rezultat poravnanja više od 5 (u jedinicama standardne devijacije) korišćenjem programa ALIGN sa mutacionom matricom za podatke i penalima za praznine od 6 ili veće. Videti Dayhoff, M.O., u Atlas of Protein Sekvenca i Structure, pp. 101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) i Supplement 2 ovom tomu, pp. 1-10. Dve sekvence ili njihovi delovi su poželjnije homologi ukoliko su njihove aminokiseline veće od ili jednake 50% identične kada su optimalno poravnate korišćenjem ALIGN programa. Termin "odgovara" je ovde korišćen sa značenjem da polinukleotidna sekvenca je homologa (tj., identična, ne striktno evolutivno srodna) celoj ili delu referentne polinukleotidne sekvence, ili da je polipeptidna sekvenca identična referentnoj polipeptidnoj sekvenci. Za razliku od toga, termin "komplementarna" je ovde korišćen sa značenjem da je komplementarna sekvenca homologa celoj ili delu referentne polinukleotidne sekvence. Za ilustraciju, nukleotidna sekvenca "TATAC" odgovara referentnoj sekvenci "TATAC" i komplementarna je referentnoj sekvenci "GTATA".
[0101] Sledeći termini su korišćeni za opis odnosa sekvence između dve ili više polinukleotidnih ili aminokiselinskih sekvenci: "referentna sekvenca", "prozor poređenja", "identičnost sekvence", "procenat identičnosti sekvence", i "značajna identičnost". "Referentna sekvenca" je definisana sekvenca korišćena kao osnova za poređenje sekvence. Referentna sekvenca može biti subset veće sekvence, na primer, kao segment cDNK ili sekvence gena pune dužine data u listingu sekvenci ili može sadržati kompletnu cDNK ili sekvencu gena. Generalno, referentna sekvenca je najmanje dužine 18 nukleotida ili 6 aminokiselina, često dužine najmanje 24 nukleotidi ili 8 aminokiselina, i često dužine najmanje 48 nukleotida ili 16 aminokiselina. Kako dve polinukleotidne ili aminokiselinske sekvence mogu svaka (1) sadržati sekvencu (tj., deo kompletne polinukleotidne ili aminokiselinske sekvence) to je slično između dva molekula, i (2) može dodatno sadržati sekvencu koja je divergentna između dve polinukleotidne ili aminokiselinske sekvence, poređenje sekvence između dva (ili više) molekula su tipično izvedena poređenjem sekvenci dva molekula unutar "prozora poređenja" da bi se identifikovali i poredili lokalni regioni sličnosti sekvence. "Prozor poređenja", kao što je ovde korišćeno, odnosi se na konceptualni segment od najmanje 18 neprekidnih nukleotidnih položaja ili 6 aminokiselina naznačeno time da polinukleotidna sekvenca ili aminokiselinska sekvenca se može porediti sa referentnom sekvencom od najmanje 18 neprekidnih nukleotida ili 6 aminokiselinskih sekvenci i naznačeno time da deo polinukleotidne sekvence u prozoru poređenja može sadržati adicije, delecije, supstitucije, i slično (tj., praznine) od 20 procenata ili manje u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži adicije ili delecije) za optimalno poravnanje dve sekvence. Optimalno poravnanje sekvenci za prozor poređenja za poravnanje može se izvesti algoritmom za lokalnu homologiju od Smith i Waterman Adv. Appl. Math.
2:482 (1981), preko algoritma za homologo poravnanje od Needleman i Wunsch J. Mol. Biol.
48:443 (1970), postupkom pretrage sličnosti od Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988), kompjuterizovanim implementacijama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u Wisconsin Gentics Software Package Release 7.0, (Gentics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Genworks, ili MacVektor softverkim paketima), ili je izabran pregled, i najbolje poravnanje (tj., koje rezultuje u najvećem procentu homologije unutar prozora poređenja) generisan različitim postupcima.
[0102] Termin "identičnost sekvence" oznavača da dve polinukleotidne ili aminokiselinske sekvence su identične (tj., na osnovi nukleotid-po-nukleotid ili ostatak-po-ostatak) unutar prozora poređenja. Termin "procenat identičnosti sekvence" je izračunat poređenjem dve optimalno poravnate sekvence unutar prozora poređenja, određujući broj položaja na kojima se nalaze identične baze nukleinske kiseline (npr., A, T, C, G, U ili I) ili ostaci u obe sekvence da bi se dobio broj podudarnih položaja, deljenjem broja podudarnih položaja sa ukupnim brojem položaja u prozoru poređenja (tj., veličinom prozora), i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvence. Termini "značajan identitet" kao što je ovde korišćeno označava karakteristike sekvence polinukleotida ili aminokiselina, naznačeno time da polinukleotid ili aminokiselina sadrži sekvencu koja ima najmanje 85 procenata identičnosti sekvence, poželjno najmanje 90 do 95 procenata identičnosti sekvence, češće najmanje 99 procenata identičnosti sekvence u poređenju sa referentnom sekvencom unutar prozora poređenja od najmanje 18 nukleotidnih (6 aminokiselinskih) položaja, često unutar prozora od najmanje 24-48 nukleotidnih (8-16 aminokiselinskih) položaja, naznačeno time da procenat identičnosti sekvence je izračunat poređenjem referentne sekvence sa sekvencom koja može uključivati delecije ili adicije sa ukupno 20 procenata ili manje referentne sekvence unutar prozora poređenja. Referentna sekvenca može biti subset veće sekvence.
[0103] Kao što je ovde korišćeno, dvadeset konvencionalnih aminokiselina i njihove skraćenice prate konvencionalnu upotrebu. Videti Immunology - Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub i D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) od dvadeset konvencionalnih aminokiselina, neprirodnih aminokiselina kao što su α-, α-disupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiseline, mlečna kiselina, i druge nekonvencionalne aminokiseline mogu takođe biti pogodne komponente polipeptida prema predmetnom pronalasku. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju: 4 hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, Nacetilserine, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i imino kiseline (npr., 4- hidroksiprolin). U polipeptidnoj notaciji korišćenoj ovde, u levi smer je amino terminalni smer i desni smer je karboksi-terminalni smer, u skaldu sa standardnom upotrebom i konvencijom.
[0104] Slično, ukoliko nije drugačije naznačeno, leva strana jednolančane polinukleotidne sekvence je 5’ kraj, levi smer dvolančanih polinukleotidnih sekvenci je označen kao 5’ smer. Smer od 5’ do 3’ adicije nascentnih RNK transkripata je obeležen kao regioni sekvence za smer transkripcije na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 5’ u odnosu na 5’ kraj RNK transkripta su obeleženi kao "ushodne sekvence", regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 3’ u odnosu na 3’ kraj RNK transkripta su označeni kao "nishodne sekvence".
[0105] Kao što se primenjuje na polipeptide, termini "značajna identičnost" znači da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što je sa programima GAP ili BESTFIT korišćenjem podrazumevanih težina za praznine, imaju najmanje 80 procenata identičnosti sekvence, poželjno najmanje 90 procenata identičnosti sekvence, poželjnije najmanje 95 procenata identičnosti sekvence, i najpoželjnije najmanje 99 procenata identičnosti sekvence.
[0106] Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični razlikuju se po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.
[0107] Konzervativne aminokiselinske supstitucije odnose se na međusobnu zamenljivost ostataka koji imaju slične bočne lance. Na primer, grupa aminokiselina koja ima alifatične bočne lance je slicin, alanin, valin, leucin, i izoleucin; grupa aminokiselina koja ima alifatičnihidroksilne bočne lance je serin i treonin; grupa aminokiselina koja ima bočne lance koje sadrže amid je asparagin i glutamin; grupa aminokiselina koja ima aromatične bočne lance je fenilalanin, tirozin, i triptofan; grupa aminokiselina koja ima bazne bočne lance je lizin, arginin, i histidin; i grupa aminokiselina koja ima bočne lance koji sadrže sumpor je cistein i metionin. Poželjne konzervativne aminokiselinske supstitucione grupe su: valin-leucinizoleucin, fenilalanin-tirozin, lizin-arginin, alanin-valin, glutaminska kiselina – asparaginska kiselina, i asparagin-glutamin.
[0108] Kao što je ovde razmatrano, minorne varijacije u aminokiselinskim sekvencama antitela ili molekulima imunoglobulina su predviđene kao obuhvaćene predmetnim pronalaskom, uz uslov da varijacije u aminokiselinskoj sekvenci zadržavaju najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, 90%, 95%, i najpoželjnije 99%. Naročito, konzervativne zamene aminokiselina su predviđene. Konzervativne zamene su one koje se odigravaju unutar familije aminokiselina koje su srodne po svojim bočnim lancima. Gentički kodirane aminokiseline su generalno podeljene u familije: (1) kisele aminokiseline su aspartat, glutamat; (2) bazne aminokiseline su lizin, arginin, histidin; (3) nepolarne aminokiseline su alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan, i (4) nenaelektrisane polarne aminokiseline su glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Hidrofilne aminokiseline uključuju arginin, asparagin, aspartat, glutamin, glutamat, histidin, lizin, serin, i treonin. Hidrofobne aminokiseline uključuju alanin, cistein, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, prolin, triptofan, tirozin i valin. Druge familije aminokiselina uključuju (i) serin i treonin, koji su alifatična-hidroksi familija; (ii) asparagin i glutamin, koji su familja koja sadrži amid; (iii) alanin, valin, leucin i izoleucin, koji su alifatična familija; i (iv) fenilalanin, triptofan, i tirozin, koji su aromatična familija. Na primer, razumno je očekivati da izolovana zamena leucina sa izoleucinom ili valinom, aspartata sa glutamatom, treonina sa serinom, ili slična zamena aminokiseline sa strukturno srodnom aminokiselinom neće imati veliki efekat na vezivanje ili osobine rezultujućeg molekula, naročito ukoliko zamena ne uključuje aminokiselinu unutar okvirnog mesta. DA li će aminokiselinska promena rezultovati u funkcionalnom peptidu može se lako odrediti analizom specifične aktivnosti polipeptidnog derivata. Analize su ovde detaljno opisane. Fragmenti ili analozi antitela ili molekula imunoglobulina mogu se lako pripremiti od strane stručnjaka. Poželjni amino- i karboksi-terminusi fragmenata ili analoga nalaze se blizu granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni mogu se identifikovati poređenjem podataka nukleotidne i/ili aminokiselinske sekvence sa javnim ili privatnim bazma podataka sekvenci. Poželjno, postupci kompjuterizovanog poređenja su korišćeni da se identifikuju motivi sekvence ili predvide konformacije proteinskih domena koji se javljaju u drugim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Poznati su postupci za identifikaciju proteinskih sekvenci koji se savijaju u poznate trodimezionalne strukture. Bowie et al. Science 253:164 (1991). Stoga, prethodni primeri poakzuju da stručnjaci mogu prepoznati motive sekvenci i strukturne konformacije koje se mogu koristiti da se dešinišu strukturni i funkcionalni domeni u skladu sa pronalaskom.
[0109] Poželjne aminokiselinske supstitucije su one koje: (1) smanjuju susceptibilnost protelizi, (2) smanjuju susceptibilnost oksidaciji, (3) menjaju afinitet vezivanja za formiranje kompleksa proteina, (4) menjaju afinitet vezivanja, i (4) daju ili modifikuju druge fizičkohemijske osobine takvih analoga. Analozi mogu uključivati različite muteine sekvence različite od prirodne peptidne sekvence. Na primer, jedna ili više aminokiselinskih supstitucija (poželjno konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu se napraviti u prirodnoj sekvenci (poželjno u delu polipeptida van domena (ili više njih) koji formiraju intermolekulske kontakte. Konzervativna aminokiselinska supstitucija ne sme da značajno menja strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr., zamena aminokiselina ne treba da ima tendenciju da prekida heliks koji se nalazi u roditeljskoj sekvenci, ili remeti druge tipove sekundarne strukture koje karakterišu roditeljsku sekvencu). Primeri sekundarnih i tercijarnih struktura polipeptida prepoznatih u tehnici su opisani u Proteins, Structures i Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman i Compbilo koj, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden i J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton et al. Nature 354:105 (1991).
[0110] Termin "fragment polipeptida" kao što je ovde korišćeno odnosi se na polipeptid koji ima amino terminalnu i/ili karboksi-terminalnu deleciju, ali gde je preostala aminokiselinska sekvenca identična odgovarajućim položajima u prirodnoj sekvenci izvedenoj, na primer, iz cDNK sekvence pune dužine. Fragmenti su tipično najmanje 5, 6, 8 ili 10 aminokiselina dužine, poželjno najmanje 14 aminokiselina dužine, poželjnije najmanje 20 aminokiselina dužine, obično najmanje 50 aminokiselina dužine, i još poželjnije najmanje 70 aminokiselina dužine. Termin "analog" kao što je ovde korišćeno odnosi se na polipeptide koji se sastoje od segmenta od najmanje 25 aminokiselina koji ima značajnu identičnost sa delom izvedene aminokiselinske sekvence i koji ima specifično vezivanje za CD47, pod odgovarajućim uslovima za vezivanje. Tipično, analozi polipeptida sadrže konzervativne aminokiselinske supstitucije (ili adicije ili delecije) u odnosu na prirodnu sekvencu. Analozi su tipično najmanje 20 aminokiseline dužine, poželjno najmanje 50 aminokiselina dužine ili duži, i često mogu biti dugački kao prirodni polipeptid pune dužine.
[0111] Peptidni analozi su uobičajeno korišćeni u farmaceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa osobinama analognim onima peptida šablona. Ovi tipovi ne-peptidnog jedinjenja su nazvani "peptidni mimetici" ili "peptidomimetici". Fauchere, J. Adv. Drug Res.15:29 (1986), Veber i Freidinger TINS p.392 (1985); i Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229 (1987). Takva jedinjenja se često razvijaju uz pomoć kompjuterizovanog molekularnog modelinga. Peptidni mimetici koji su strukturno slični terapeutski korisnim peptidima mogu se koristiti da proizvedu ekvivalentni terapeutski ili rpofilaktički efekat. Generalno, peptidomimetici su strukturno slični polipeptidu koji je uzet kao paradigma (tj., polipeptid koji ima biohemijsku osobinu ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali mu je jedna ili više peptidnih veza izborno zamenjena vezom izabranom iz grupe koja se sastoji od: --CH2NH--, --CH2S-, --CH2-CH2--, --CH=CH--(cis i trans), --COCH2--, CH(OH)CH2--, i -CH2SO--, postupcima dobro poznatim u tehnici. Sistemska supstitucija jedne ili više aminokiselina konsenzus sekvence sa D-aminokiselinom istog tipa (npr., D-lizin umesto L-lizin) može se koristiti za stvaranje stabilnijih peptida. Dodatno, neprirodni peptidi koji sadrže konsenzus sekvencu ili značajno identičnu varijaciju konsenzus sekvence mogu se stvoriti postupcima poznatim u tehnici (Rizo i Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)); na primer, dodavanjem internih cisteinskih ostataka sposobnih da formiraju intramolekulske disulfidne mostove koji ciklizuju peptid.
[0112] Termin "sredstvo" je ovde korišćeno za obeležavanje hemijskog jedinjenja, smeše hemijskih jedinjenja, biološkog makromolekula, ili ekstrakta stvorenog od bioloških materijala.
[0113] Kao što je ovde korišćeno, termini "obeleživač" ili "obeleženo" odnose se na inkorporaciju detektabilnog markera, npr., inkorporaciju radioobeležene aminokiseline ili veze za polipeptid biotinil delova koji se mogu detektovati obeleženim avidin (npr., streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kalorimetrijskim postupcima). U određenim situacijama, obeleživač ili marker može takođe biti terapeutik. Različiti postupci za obeležavanje polipeptida i glikoproteina su poznati u tehnici i mogu se koristiti. Primeri obeleživača za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotopi ili radionuklidi (npr.,<3>II,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentni obeleživači (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfori), enzimski obeleživači (npr., peroksidaza rena, p-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentne, biotinil grupe, predeterminisani polipeptidni epitopi prepoznati od strane sekundarnog reportera (npr., para leucine zatvarač sekvenci, vezujućih mesta za sekundarna antitela, metal vezujući domeni, epitop tagovi). U nekim primerima izvođenja, obeleživači su vezani za ruke spejsera različite dužine da bi se smanjilo potencijalno steričko ometanje. Termin "farmaceutsko sredstvo ili lek" kao što je ovde korišćeno odnosi se na hemijsko jedinjenje ili kompoziciju koja je sposobna da indukuje željeni terapeutski efekat kada je ispravno primenjena na pacijenta.
[0114] Termin "antineoplastično sredstvo" je ovde korišćeno da se odnosi na sredstva koja imaju funkcionalnu osobinu inhibiranja razvoja ili napredovanja neoplazme kod čoveka, naročito maligne (kancerozne) lezije, kao što je karcinom, sarkom, limfom, ili leukemija. Inhibicija metastaze je često osobina antineoplastičnih sredstava.
[0115] Drugi hemijski termini ovde su korišćeni u skladu sa konvencionalnom upotrebom u tehnici, kao što je dato primerima u The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
[0116] Kao što je ovde korišćeno, "značajno čist" znači da je vrsta objekta preovlađujuća prisutna vrsta (tj., na molarnoj osnovi je zastupljenija od bilo koje druge pojedinačne vrste u kompoziciji), i poželjno značajno prečišćena frakcija je kompozicija naznačeno time da vrsta objekta sadrži najmanje oko 50 procenata (na molarnoj osnovi) svih prisutnih makromolekulskih vrsta.
4
[0117] Generalno, značajno čista kompozicija će sadržati više od oko 80 procenata svih makromolekulskih vrsta prisutnih u kompoziciji, poželjnije više od oko 85%, 90%, 95%, i 99%. Najpoželjnije, vrsta objekta je prečišćena do suštinske homogenosti (vrste kontaminanata ne mogu se detektovati u kompoziciji konvencionalnim postupcima za detekciju) naznačeno time da se kompozicija suštinski sastoji od jedne makromolekulske vrste.
CD47 antitela
[0118] Monoklonska antitela prema pronalasku imaju sposobnost da vežu CD47, inhibiraju vezivanje SIRPα sa CD47, smanje CD47-SIRPα-posredovanu signalizaciju, promovišu fagocitozu, i inhibiraju rast i/ili migraciju tumora. Inhibicija je određena, na primer, korišćenjem ćelijske analize opisane ovde u Primerima.
[0119] Primeri antitela prema pronalasku uključuju 2A1 antitelo, himernu verziju 2A1, i humanizovane varijante 2A1. Primeri antitela prema pronalasku uključuju antitelo koje ima varijabilni teški (VH) lanac izabran od SEQ ID NOs: 5-30, i ima varijabilni laki lanac (VL) chain izabran od SEQ ID NOs: 31-47. Specifično, primeri antitela uključuju one obezbeđene u Tabeli 1.
Tabela 1.
[0120] U pronalazak su takođe uključena antitela koja se vezuju za isti epitop kao CD47 antitela opisana ovde. Na primer, antitela se mogu specifično vezivati za epitop koji uključuje jedan ili više aminokiselinskih ostataka na humanom CD47 (videti npr., GenBank Accession No. Q08722.1).
[0121] Aminokiselinska sekvenca primera humanog CD47 je obezbeđena u nastavku (GenBank Accession No. Q08722.1 (GI:1171879). Signalna sekvenca (aminokiseline 1-18) je podvučena.
[0122] U cilju jasnoće, aminokiselinska sekvenca primera humanog CD47 bez signalne sekvence je obezbeđena u nastavku.
[0123] aminokiselinska sekvenca primera humanog CD47-IgV domena je obezbeđena u nastavku:
[0124] Primeri monoklonskih antitela prema pronalasku uključuju, na primer, humanizovana antitela koja imaju varijabilni region teškog lanca (VH) i/ili varijabilni region lakog lanca (VL) prikazan u sekvencama u nastavku.
[0125] Varijabilni regioni teškog lanca (VII) CD47 antitela su obezbeđeni u nastavku. Regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) VII lanca CD47 antitela su naznačeni u nastavku. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca VH CDR1 je GFNIKDYYLH (SEQ ID) NO: 50), GYTFTYYYLH (SEQ ID NO: 57), GFTFTYYYLH (SEQ ID NO: 58), GYNFTYYYLH (SEQ ID NO: 59), GYTITYYYLH (SEQ ID NO: 60), GYTFKYYYLH (SEQ ID NO: 61), GYTFTDYYLH (SEQ ID NO: 62), GFTFTDYYLH (SEQ ID NO: 63), GFTITYYLH (SEQ ID NO: 64), GYTFKDYYLH (SEQ ID NO: 65), ili GFTFKDYYLH (SEQ ID NO: 66). U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca VH CDR2 je WIDPDNGDTE (SEQ ID NO: 51), WIDPDQGDTE (SEQ ID NO: 72), WIDPDYGDTE (SEQ ID NO: 73), WIDPDSGDTE (SEQ ID NO: 74), WIDPDNKDTE (SEQ ID NO: 75), ili WIDPDNTDTE (SEQ ID NO: 76). U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca VII CDR3 je NAAYGSSSYPMDY (SEQ ID NO: 52) ili NAAYGSSPYPMDY (SEQ ID NO: 77).
4
[0126] Varijabilni regioni lakog lanca (VL) CD47 antitela su obezbeđeni u nastavku. CDRs VL lanca CD47 antitela su naglašeni u nastavku. U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca VL CDR1 je KASQDIIIRYLS (SEQ ID NO: 53), RASQDIIIRYLA (SEQ ID NO: 67), ili RARQGIIIRYLS (SEQ ID NO: 68). U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca VL CDR2 je RANRLVD (SEQ ID NO: 54), RANRLQS (SEQ ID NO: 69), RANRRAT (SEQ ID NO: 70), ili RANRLVS (SEQ ID NO: 71). U nekim primerima izvođenja, aminokiselinska sekvenca VL CDR3 is LQYDEFPYT (SEQ ID NO: 55).
4
[0127] U nekim slučajevima, CD47 antitela opisana ovde sadrže varijabilni region teškog lanca izabran od SEQ ID NOs: 5-30 i varijabilni region lakog lanca izabran od SEQ ID NOs: 31-47. Primer CD47 antitela sadrži varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 5 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 31; varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 35; varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 11 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 42, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 5 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 32, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 33, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 34, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 36, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 37, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 38, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 29 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 35, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 30 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 35, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 43, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 11 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 43, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 11 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 47, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 15 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 43, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 15 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 44, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 11 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 44, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 22 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 35, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 39, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 8 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 39, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 16 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 35, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 20 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 35, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 21 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 35, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 17 i varijabilni region lakog lanca dat u
4
SEQ ID NO: 35, varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 28 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 35, ili varijabilni region teškog lanca dat u SEQ ID NO: 27 i varijabilni region lakog lanca dat u SEQ ID NO: 35.
[0128] CD47 antitela opisana ovde sadrže bilo koji od VII regiona obezbeđenih u SEQ ID NOs: 5-30 uparen sa bilo kojim od VL regiona obezbeđenih u SEQ ID NOs: 31-47. Specifično, CD47 antitela opisana ovde sadrže bilo koji od VH regiona obezbeđenih u SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 11, 15-17, 20-22, i 27-30 uparen sa bilo kojim od VL regiona obezbeđenih u SEQ ID NOs: 31-39, 42, 43, 44, i 47.
[0129] CD47 antitela opisana ovde sadrže bilo koji od VH CDR1 regiona obezbeđenih u SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, i SEQ ID NO: 66, bilo koji od VII CDR2 regiona obezbeđenih u SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, i SEQ ID NO: 76, bilo koji od VII CDR3 regiona obezbeđenih u SEQ ID NO: 52 i SEQ ID NO: 77, bilo koji od VL CDR1 regiona obezbeđenih u SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 67, i SEQ ID NO: 68, bilo koji od VL CDR2 regiona obezbeđenih u SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, i SEQ ID NO: 71, i VL CDR3 region obezbeđen u SEQ ID NO: 55.
[0130] Stručnjaci će shvatiti da je moguće odrediti bez nepotrebnog eksperimentisanja, da li monoklonsko antitelo ima istu specifičnost kao monoklonsko antitelo prema pronalasku (npr., 2A1 antitelo, ili antitelo koje ima varijabilni teški lanac izabran od SEQ ID NOs: 5-31, i varijabilni laki lanac izabran od SEQ ID NOs: 31-47) procenjivanjem da li prethodno pomenuti sprečava poslednje pomenutog da se vezuje za CD47. Ukoliko je testirano monoklonsko antitelo u kompeticiji sa monoklonskim antitelom prema pronalasku, kao što je prikazano smanjenjem vezivanjem monoklonskog antitela prema pronalasku, onda dva moonklonska antitela se vezuju za isti, ili blisko srodni, epitop.
[0131] Alternativni postupak za određivanje da li monoklonsko antitelo ima specifičnost monoklonskog antitela prema pronalasku je pre-inkubacija monoklonskog antitela prema pronalasku sa rastvorljivim CD47 proteinom (sa koijm je normalno reaktivan), i zatim dodati testirano monoklonsko antitelo da bi se odredilo da li testirano monoklonsko antitelo je inhibirano u odnosu na svoju sposobnost da se vezuje za CD47. Ukoliko je testirano monoklonsko antitelo inhibirano, sva je verovatnoća, da ima istu, ili funkcionalno ekvivalentnu, epitopsku specifičnost kao monoklonsko antitelo prema pronalasku.
Antitela prema predmetnom pronalasku
4
[0132] Skrining monoklonskih antitela prema pronalasku, može se takođe izvesti, npr., merenjem CD47- i/ili CD47/SIRPα-posedovanom signalizacijom, i određivanjem da li je testirano monoklonsko antitelo sposobno da modulira, blokira, inhibira, redukuje, antagonizuje, neutrališe ili na drugi način utiče na CD47- i/ili CD47/SIRPα-posredovanu signalizaciju. Ove analize mogu uključivati analize kompetitivnog vezivanja. Dodatno, ove analize mogu meriti biloški podaci, na primer sposobnost promovisanja fagocitoze ćelija koje eksprimiraju CD47 od strane makrofaga, kao što je opisano u Primeru 9 (Slika 9).
[0133] Različite procedure poznate u known tehnici mogu se koristiti za proizvodnju monoklonskih antitela usmerenih protiv CD47, ili protiv njegovih derivata, fragmenata, analoag, homologa ili ortologa. (Videti, na primer, Antibodies: Laboratory Manual, Harlow E, i Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Potpuno humana antitela su molekuli antitela u kojima je celokupna sekvenca i lakog lanca i teškog lanca, uključujući CDRs, dobijena od humanih gena. Takva antitela su ovde nazvana "humana antitela" ili "potpuno humana antitela". Humana monoklonska antitela su pripremljena, na primer, korišćenjem procedura opisanih u Primerima obezbeđenim u nastavku. Humana monoklonska antitela mogu se takođe pripremiti korišćenjem tehnike trioma; tehnikom hibridoma humane B-ćelije (videti Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72); i EBV hibridoma tehnike da bi se proizvela humana monoklonska antitela (videti Cole, et al., 1985 u: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96). Humana monoklonska antitela se mogu koristiti i mogu se proizvesti korišćenjem humanih hibridoma (videti Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030) ili transformisanjem humanih B-ćelija sa Epstein Barr virusom in vitro (videti Cole, et al., 1985 u: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).
[0134] Antitela su prečišćena dobro poznatim tehnikama, kao što je afinitetna hromatografija korišćenjem proteina A ili proteina G, koji obezbeđuju primarno IgG frakciju imunog seruma. Nakon toga, ili alternativno, specifični antigen koji je target traženog imunoglobulina, ili njegov epitop, može biti imobilisan na koloni da bi se prečistilo imuno specifično antitelo sa imunoafinitetnom hromatografijom. Prečišćavanje imunoglobulina je razmatrano, na primer, od strane D. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol.
14, No.8 (April 17, 2000), pp.25-28).
[0135] CD47 antitela prema pronalasku su monoklonska antitela. Monoklonska antitela koja moduliraju, blokiraju, inhibiraju, smanjuju, antagonizuju, neutrališu ili na drugi način utiču na CD47- i/ili CD47/SIRPα-posredovanu ćelijsku signalizaciju su stvorena, npr., imunizovanjem životinje sa membranski vezanim i/ili rastvorljivim CD47, kao što je, na primer, humani
4
CD47 ili imunogeni fragment, derivat ili njegova varaijanta. Alternativno, životinja je imunizovana sa ćelijama transfektovanim sa vektorom koji sadrži molekul nukleinske kiseline koji kodira CD47 tako da je CD47 eksprimiran i povezan sa površinom transfektovanih ćelija. Alternativno, antitela su dobijena skriningom biblioteke koja sadrži sekvence antitela ili antigen vezujućeg domena za vezivanje za CD47. Ova biblioteka je pripremljena, npr., u bakteriofagu kao proteinske ili peptidne fuzije sa proteinom omotača bakteriofaga koji je eksprimiran na površini sastavljenih čestica faga i kodirajućih sekvenci DNK sadržanih unutar čestica faga (tj., "biblioteka fagnog prikaza"). Hibridomi koji rezultuju iz mijelom/B ćelijskih fuzija su zatim podvrgnuti skiningu u odnosu na reaktivnost sa CD47.
[0136] Monoklonska antitela su pripremljena, na primer, korišćenjem postupaka hibridoma, kao što su oni opisani od strane Kohler i Milstein, Nature, 256:495 (1975). U postupku hibridoma, miš, hrčak, ili druga odgovarajuća životinja domaćin, je tipično imunizovana sa imunizujućim sredstvom da bi se izazvali limfociti koji proizvode ili su sposobni da proizvedu antitela koja će se specifično vezati za imunizaciono sredstvo. Alternativno, limfociti mogu biti imunizovani in vitro.
[0137] Imunizaciono sredsstvo će tipično uključivati proteinski antigen, njegov fragment ili njegov fuzioni protein. Generalno, korišćeni su ili limfociti periferne krvi ukoliko su poželjne ćelije humanog porekla, ili ćelije slezine ili ćelije limfnog čvora ukoliko su poželjni nehumani sisarski izvori. Limfociti su zatim fuzionisani sa imortalizovanom ćelijskom linijom korišćenjem pogodnog sredstva za fuzionisanje, kao što je polietilen glikol, da bi se formirale ćelije hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles i Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Imortalizovane ćelijske linije su obično transformisane sisarske ćelije, naročito ćelije mijeloma poreklom od glodara, goveda i ljudi. Obično su korišćene ćelijske linije mijeloma pacova ili miša. Ćelije hibirdoma se mogu kultivisati u pogodnom medijumu kulture koji poželjno sadrži jednu ili više supstanci koje inhibiraju rast ili preživljavanje nefuzionisanih, imortalizovanih ćelija. Na primer, ukoliko roditeljskim ćelijama nedostaje enzim hipoksantin guanin fosforibozil transferaza (HGPRT ili HPRT), medijum kulture hibridoma će tipično uključivati hipoksantin, aminopterin, i timidin ("HAT medijum"), čije supstance sprečavaju rast HGPRT-deficijentnih ćelija.
[0138] Poželjne imortalizovane ćelijske linije su one koje se fuzionišu efikasno, podržavaju stabilnu ekspresiju visokog nivoa antitela od strane izabranih ćelija koje proizvode antitelo, i osetljive su na medijum kao što je HAT medijum. Poželjnije imortalizovane ćelijske linije su mišje mijeloma linije, koje se mogu dobiti, na primer, od Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California i the American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Ćelijske linije humanog mijeloma i mišjeg-humanog heteromijeloma takođe su opisane za
4
proizvodnju monoklonskih antitela. (Videti Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal antibody Production Techniques i Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63)).
[0139] Medijum kulture u kom su kultivisane ćelije hibridoma može zatim biti analiziran u odnosu na prisustvo monoklonskih antitela usmerenih protiv antigena. Poželjno, specifičnost vezivanja monoklonskih antitela proizvedenih od strane hibridoma ćelija je određena imunoprecipitacijom ili sa in vitro analizom vezivanja, kao što je radioimunoanaliza (RIA) ili imunoenzimska analiza (ELISA). Takve tehnike i analize su poznate u tehnici. Afinitet vezivanja monoklonskog antitela može, na primer, biti određen sa Scatchard analizom od Munson i Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980). Dodatno, u terapijskim primenama monoklonskih antitela, važno je identifikovati antitela koja imaju visok stepen specifičnosti i visok afinitet vezivanja za target antigen.
[0140] Nakon što su identifikovane željene ćelije hibridoma, klonovi mogu biti subkjlonirani procedutrama ograničenog razblaživanja i uzgajane standardnim postupcima. (videti Goding, Monoclonal antibodies: Principles i Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). Pogodan medikum za kulturu za ovu svrhu uključuje, na primer, Dulbecco modifikovani Eagle medijum i RPMI-1640 medijum. Alternativno, ćelije hibridoma mogu se uzgajati in vivo kao ascites kod sisara.
[0141] Monoklonska antitela izlučena od strane subklonova mogu se izolovati ili prečistiti iz medijuma kulture ili tečnosti ascitesa konencionalnim procedurama prečišćavanja imunoglobulina kao što su, na primer, protein A-Sefaroza, hidroksilapatit hromatografija, gel elektroforeza, dijaliza, ili afinitetna hromatografija.
[0142] Monoklonska antitela se takođe mogu napraviti postupcima rekombinantne DNK, kao što su oni opisani u SAD patent br..4,816,567. DNK koja kodira monoklonska antitela prema pronalasku može se lako izolovati i sekvencionirati korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., korišćenjem oligonukleotidnih proba koje su sposobne da se specifično vezuju za gen koji kodiraju teške i lake lance mišjih antitela). Ćelije hibridoma služe kao poželjni izvor takve DNK. Nakon izolacije, DNK se može staviti u ekspresione vektore, koij su zatim transfektovani u ćelije domaćine kao što su ćelije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), ćelije humanog embrionalnog bubrega (HEK) 293, simian COS ćelije, PER.C6®, NS0 ćelije, SP2/0, YB2/0, ili ćelije mijeloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, da bi se dobila sinteza monokloskih antitela u rekombinantnim ćelijama domaćinima. DNK takođe može biti modifikovana, na primer, supstitucijom kodirajuće sekvence za konstantne domene humanog teškog i lakog lanca umesto homologih mišjih sekvenci (videti SAD patent br.
4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) ili kovalentnim vezivanjem sa imunoglobulin kodirajućom sekvencom celom ili delom kodirajuće sekvence za neimunoglobulinski polipeptid. Takav ne-imunoglobulin polipeptid se može supstituisati sa konstantnim domenima antitela prema pronalasku, ili se može supstituisati sa varijabilnim domenima jednog antigen-kombinujućeg mesta antitela prema pronalasku da bi se stvorilo himerno bivalentno antitelo.
Humana antitela i humanizacija antitela
[0143] Monoklonska antitela prema pronalasku uključuju potpuno humana antitela ili humanizovana antitela. Ova antitela su pogodna za primenu na ljude bez ugrožavanja imunog odgovora od strane čoveka protiv primenjenog imunoglobulina.
[0144] CD47 antitelo je stvoreno, na primer, korišćenjem procedura opisanih u Primerima obezbeđenim u nastavku. Na primer, CD47 antitela prema pronalasku su identifikovana korišćenjem strategije modfikovane RIMMS (višestruka mesta ponovljene imunizacije) imunizacije kod miševa i nakon toga stvaranjem hibridoma.
[0145] U drugim, alternativnim postupcima, CD47 antitelo je razvijeno, na primer, korišćenjem postupaka fagnog prikaza korišćenjem antitela koja sadrže samo humane sekvence. Takvi pristupi su dobro poznati u tehnici, npr., u WO92/01047 i SAD pat. br.
6,521,404. U ovom pristupu, kombinatorna biblioteka faga kooji nosi randomizovane parove lakih i teških lanaca je podvrgnuta skriningu korišćenjem prirodnog ili rekombinantnog izvora cd47 ili njegovih fragmenata. U drugom pristupu, CD47 antitelo se može proizvesti procesom naznačenim time da najmanje jedan korak procesa uključuje imunizaciju transgen, nehumane životinje sa humanim CD47 proteinom. U ovom pristupu, neki od lokusa endogenog teškog i/ili kapa lakog lanca ove ksenogen ne-humane životinje su onesposobljeni i nisu sposobni za rearanžman neophodan da se stvore geni koji kodiraju imunoglobuline kao odgovor na antigen. Dodatno, najmanje jedan lokus humanog teškog lanca i najmanje jedan lokus humanog lakog lanca su stabilno transfektovani u životinju. Stoga, kao odgovor na primenjeni antigen, humani lokusi se rearanžiraju da bi se obezbedili geni koji kodiraju humane varijabilne regione imunospecifične za antigen. Nakon imunizacije, stoga, ksenomiš proizvodi B-ćelije koje izlučuju potpuno humane imunoglobuline.
[0146] Različite tehnike su dobro poznatre u tehnici za proizvodnju ksenogenih ne-humanih životinja. Na primer, videti SAD pat. br. 6,075,181 i No. 6,150,584. Ova generalna strategija je pokazana u vezi sa stvaranjem prvih XenoMouse™ sojeva kao što je objavljeno 1994. Videti Green et al. Nature Gentics 7:13-21 (1994). Videti takođe, SAD pat. br. 6,162,963; 6,150,584; 6,114,598; 6,075,181; i 5,939,598 i Japanski patentn br. 3068 180 B2, 3068 506
1
B2, i 3068 507 B2 i Evropski patent br., EP 0463 151 B1 i Međunarodne patentne prijave br. WO 94/02602, WO 96/34096, WO 98/24893, WO 00/76310 i srodne članove familije.
[0147] U alternativnom pristupu, drugi su koristitli "minilokus" pristup u kojem je egzogeni Ig lokus imitiran preko uključivanja delova (pojedinačnih gena) iz Ig lokusa. Stoga, jedan ili više VH gena, jedan ili više DHgena, jedan ili više JHgena, mu konstantni region, i drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) su formirani u konstrukt za inserciju životinju. Videti npr., SAD patent br. 5,545,806; 5,545,807; 5,591,669; 5,612,205;5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,643,763; 5,661,016; 5,721,367; 5,770,429; 5,789,215; 5,789,650; 5,814,318; 5,877; 397; 5,874,299; 6,023,010; i 6,255,458; i Evropski Patent br.0 546 073 B1; i Međunarodne patentne prijave br.. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884 i srodne članove familije.
[0148] Takođe je pokazano stvaranje humanih antitela od miševa u kojima su stvoreni veliki delovi hromozoma, ili čitavi hromozomi su introdukovani preko fuzije mikroćelije. Videti Evropska patentna prijava br.773 288 i 843961.
[0149] Odgovori humanog anti-mišje antitela (HAMA) su doveli industriju do toga da se pripreme himerna ili na drugi način humanizovana antitela. Dok himerna antitela imaju humani konstantni region i imuni varijabilni region, očekuje se da će biti uočeni određeni odgovori humanih anti-himernih antitela (HACA), naročito kod hroničnih ili primena antitela u više doza. Stoga, bilo bi poželjno da se obezbede potpuno humana antitela protiv CD47 da bi se otklonila ili na drugi način ublažila zabrinutost i/ili efekti HAMA ili HACA odgovora.
[0150] Proizvodnja antitela sa smanjenom imunogenošću je takođe postignuta preko humanizacije, himerizacije i tehnike prikaza korišćenjem odgovarajućih biblioteka. Shvatiće se da išja antitela ili antitela iz drugih vrsta mogu biti humanizovana ili primatizovana korišćenjem tehnika dobro poznatih u tehnici. Videti npr., Winter i Harris Immunol Today 14:43 46 (1993) i Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992). Antitelo od interesa može biti konstruisano tehnikama rekombinantne DNK da bi zamenili CH1, CH2, CH3, domene zgloba, i/ili okvirni domen sa odgovarajućom humanom sekvencom (videti WO 92102190 i SAD patent br. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,792;, 5,714,350; i 5,777,085). Takođe, upotreba Ig cDNK za konstrukciju himernog gena imunoglobulina je poznata u tehnici (Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) i J. Immunol. 139:3521 (1987)). iRNK je izolovani oblik hibridoma ili drugih ćelija koje proizvode antitelo i korišćene za proizvodnju cDNK. cDNK od interesa može se amplifikovati lančanom rekacijom polimeraze korišćenjem specifičnih prajmera (SAD patent br. 4,683,195 i 4,683,202). Alternativno, biblioteka je napravljena i izvršen je skrining da bi se izolovala sekvenca od interesa. DNK
2
sekvenca koja kodira varijabilni region antitela je zatim fuzionisana sa sekvencama humanog konstantnog regiona. Sekvence gena humanih konstantnih regiona mogu se naći u Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242. Geni humanog C regiona su lako dostupni iz poznatih klonova. Izbor izotipa će biti vođen željenim efektornim funkcijama, kao što je fiksacija komplementa, ili aktivnost u antitelo-zavisnoj ćelijskoj citotoksičnosti. Poželjni izotipovi su IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. Može se koristiti bilo koji od humanih konstantnih regiona lakog lanca, kapa ili lambda. Himerno, humanizovano antitelo je zatim eksprimirano konvencionalnim postupcima.
[0151] Fragmenti antitela, kao što su Fv, F(ab’)2i Fab mogu se pripremiti isecanjem intaktnog proteina, npr., proteazom ili hemijskim isecanjem. Alternativno, dizajniran je skraćeni gen. Na primer, himerni gen koji kodira deo F(ab’)2fragmenta uključivao bi DNK sekvence koje kodiraju CH1 domen i zglobni region II lanca, praćen sa translacionim stop kodonom da bi se dobio skraćeni molekul.
[0152] Konsenzus sekvence H i L J regiona mogu se koristiti za dizajn oligonukleotida za upotrebu kao prajmera da bi se introdukovala korisna restrikciona mesta u J region za naknadno povezivanje segmenta V regiona sa segmentima humanog C regiona. C region cDNK može se modifikovati mutagenezom usmerenom na mesto da bi se postavilo restrikciono mesto na analognom položaju u humanoj sekvenci.
[0153] Ekspresioni vektori uključuju plazmide, retroviruse, YACs, EBV izvedene epizome, i slično. Pogodan vektor je onaj koji kodira funkcionalno kompletnu humanu CH ili CL sekvencu imunoglobulina, sa konstruisanim odgovarajućim restrikcionim mestima tako da se bilo koja VII ili VL sekvenca može lako inserirati i eksprimirati. U takvim vektorima, splajsing se obično dešava između splajs mesta donora u inseriranom J regionu i splajs mesta akceptora koji prethodi humanom C regionu, i takođe na splajs regionima koji se nalaze unutar humanih CH egzona. Poliadenilacija i terminacija transkripcije se dešava na nativnim hromozomskim mestima nishodno od kodirajućih regiona. Rezultujuće himerno antitelo može se spojiti sa bilo kojim snažnim promotorom, uključujući retrovirusni LTRs, npr., SV-40 rani promotor, (Okayama et al. Mol. Cell Bio. 3:280 (1983)), Rous sarkom virus LTR (Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)), i virus mišje leukemije LTR (Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)). Takođe, što će biti jasno, mogu se koristiti nativni Ig promotori i slično.
[0154] Dodatno, humana antitela ili antitela iz drugih vrsta mogu se stvoriti preko tehnologija tipa prikaza, uključujući, bez ograničenja, fagni prikaz, retrovirusni prikaz, ribozomalni prikaz, i druge tehnike, koristeći tehnike dobro poznate u tehnici i rezultujući molekuli se mogu podvrgnuti dodatnom sazrevanju, kao što je afinitetno sazrevanje, jer su takve tehnike takođe poznate u tehnici. Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes i Plückthun PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (ribozomalni prikaz), Parmley i Smith Gen 73:305-318 (1988) (fagni prikaz), Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell i McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992), i SAD patent br.. 5,733,743. Ukoliko su tehnologije prikaza korišćene za proizvodnju antitela koja nisu humana, takva antitela mogu biti humanizovana kao što je prethodno opisano.
[0155] Korišćenjem ovih tehnika, mogu se stvoriti antitela protiv ćelija koje eksprimiraju CD47, rastvorljivih oblika CD47, njihovih epitopa ili peptida, i njihovih ekspresionih biblioteka (Videti npr., SAD patent br..5,703,057) koje zatim mogu biti podvrgnute skriningu kao što je prethodno opisano za aktivnosti opisane ovde.
[0156] CD47 antitela prema pronalasku mogu biti eksprimirana od strane vektora koji sadrži segment DNK koji kodira jednolančano antitelo opisano prethodno.
[0157] Ovi mogu uključivati vektore, lipozome, golu DNK, DNK sa ađuvantom, genski pištolj, katetere, itd. Vektori uključuju hemijske konjugate kao što su opisani u WO 93/64701, koji ima targeting deo (npr. ligand na receptor na popvršini ćelije), i deo koji vezuje nukleinsku kiselinu (npr. polilizin), virusni vektor (npr. DNK ili RNK virusni vektor), fuzioni proteini kao što su opisani u PCT/US95/02140 (WO 95/22618) koji je fuzioni protein koji sadrži target deo (npr. antitelo specifično za target ćeliju) i deo koji vezuje nukleinsku kiselinu (npr. protamin), plazmide, fag, itd. Vektori mogu biti hromozomski, ne-hromozomski ili sintetički.
[0158] Poželjni vektori uključuju virusne vektore, fuzione proteine i hemijske konjugate. Retrovirusni vektori uključuju viruse mišje leukemije. Poželjni su DNK virusni vektori. Ovi vektori uključuju poks vektore kao što su ortopoks ili avipoks vektori, herpesvirus vektori kao što je virus herpes simpleks I (HSV) vektor (videti Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87: 1149 (1990), adenovirnusni vektori (videti LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Gent 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol.69:2004 (1995) i adeno-povezani virusni vektori (videti Kaplitt, M. G., et al., Nat. Gent.8:148 (1994).
[0159] Poks virusni vektori introdukuju gen u citoplazmu ćelije. Avipoks virusni vektori rezultuju samo u kratkotrajnoj ekspresiji nukleinske kiseline. Adenovirusni vektori, adenopovezani virusni vektori i herpes simpleks virus (IISV) vektori su poželjni za introdukovanje nukleinskih kiselina u nervne ćelije. Adenovirusni vektor rezultuje u kratkotrajnijoj ekspresiji
4
(oko 2 meseca) od adeno-povezanog virusa (oko 4 meseca), koji je zauzvrat kratkotrajniji od HSV vektora.
Određeni izabrani vektor zavisiće od target ćelije i stanja koje se tretira. Introdukcija može biti standardnim tehnikama, npr. infekcija, transfekcija, transdukcija ili transformacija. Primeri načina transfera gena uključuju npr., golu DNK, CaPO4taloženje, DEAE dekstran, elektroporaciju, fuziju protoplasta, lipofekciju, mikroinjekciju ćelije, i virusne vektore.
[0160] Vektor se može upotrebiti da ciljano deluje suštinski na bilo koju željenu target ćeliju. Na primer, stereotaksična injekcija može se koristiti da usmeri vektore (npr. adenovirus, IISV) do željenog mesta. Dodatno, čestice se mogu isporučiti intracerebroventrikularnom (icv) infuzijom korišćenjem sistema minipumpe za infuziju, kao što je SynchroMed Infusion System. Postupak zasnovan na protoku u masi, označen kao konvekcija, takođe je pokazan kao efikasan za isporuku velikih molekula do udljanih delova mozga i može biti koristan za isporuku vektora do target ćelije. (videti Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)). Drugi postupci koji se mogu koristiti uključuju katetere, intravensku, parenteralnu, intraperitonealnu i potkožnu injekciju, i oralne ili druge poznate puteve primene.
[0161] Ovi vektori se mogu koristiti za ekspresiju velikih količina antitela koja se mogu koristiti na različite načine. Na primer, da bi se detektovalo prisustvo CD47 u uzorku. Antitelo se takođe može koristiti da bi se pokušalo vezivanje i disrupcija CD47- i/ili CD47/SIRPα interakcije i CD47/SIRPα-posredovane signalizacije.
[0162] Tehnike se mogu prilagoditi za proizvodnju jednolančanih antitela specifičnih za antigeni protein (videti npr., SAD patent br.. 4,946,778). Dodatno, postupci se mogu prilagoditi za konstruisanje Fab ekspresionih biblioteka (videti npr., Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281) da bi se omogućila rapidna i efikasna identifikacija monoklonskih Fab fragmenata sa željenom specifičnošću za protein ili njegove derivative, fragmente, analoge ili homologe. Fragmenti antitela koji sadrže idiotipove na protein antigen mogu se proizvesti tehnikama poznatim u tehnici uključujući, ali se ne ograničavajući na: (i) F(ab’)2fragment proizveden digestjom pepsinom molekula antitela; (ii) Fab fragment stvoren redukcijom disulfidnih mostova na F(ab’)2fragmentu; (iii) Fab fragment stvoren tretmanom molekula antitela sa papainom i redukujućim sredstvom i (iv) Fvfragmente.
[0163] Pronalazak takođe uključuje Fv, Fab, Fab’ i F(ab’)2CD47 fragmente, jednolančana CD47 antitela, antitela sa jednim domenom (npr., nanotela ili VIIII), bispecifična CD47 antitela, i heterokonjugat CD47 antitela.
[0164] Bispecifična antitela su antitela koja imaju vezujuće specifičnosti za najmanje dva različita antigena. U predmetnom slučaju, jedna od vezujućih specifičnosti je za CD47. Drugi vezujući target je bilo koji drugi antigen, i prednost se daje proteinu na ćelijskoj površini ili receptoru ili podjedinici receptora.
[0165] Postupci za stvaranje bispecifičnih antitela su poznati u tehnici. Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela je zasnovana na ko-ekspresiji dva imunoglobulinska teški-lanac/laki-lanac para, gde dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Milstein i Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). Zbog nasumičnog raspoređivanja imunoglobulinskih teških i lakih lanaca, ovi hibridomi (kvadromi) proiuzvode potencijalnu smešu deset različitih molekula antitela, od kojih samo jedan ima korektnu bispecifičnu strukturu. Prečišćavanje korektnog molekula je obično postignuto koracima afinitetne hromatografije. Slične procedure su otkrivene u WO 93/08829, objavljenoj 13 maja 1993, i u Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).
[0166] Varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (antitelo-antigen kombinovana mesta) mogu se fuionisati sa imunoglobulinskim sekvencama konstantnog domena. Fuzija je poželjno sa imunoglobulinskim konstantnim domenom teškog lanca, koja sadrži najmanje deo zgloba, CH2, i CH3 regione. Poželjno je imati prvi konstantni region teškog lanca (CH1) koij sadrži mesto neophodno za vezivanje lakog lanca prisutno u najmanje jednoj od fuzija. DNK koje kodiraju fuzije imunoglobulinskih teških lanaca i, ukoliko je poželjno, imunoglobulinski laki lanac, su umetnute u zasebne ekspresione vektore, i kotransfektovane su u pogodni organizam domaćin. Za dodatne detalje stvarnja bispecifičnih antitela videti, na primer, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986).
[0167] Prema sledećem pristupu opisanom u WO 96/27011, interfejs između para molekula antitela može se konstruisati tako da maksimizuje procenat heterodimera koij su rekuperovani iz kulture rekombinantne ćelije. Poželjni interfejs sadrži najmanje deo CH3 regiona konstantnog domena antitela. U ovom postupku, jedan ili više malih bočnih lanaca aminokiselina iz interfejsa prvog molekula antitela su zamenjeni sa većim bočnim lancima (npr. tirozin ili triptofan). Kompenzatorne "šupljine" identične ili slične veličine sa velikim bočnim lancem (lancima) stvorene su na interfejsu drugog molekula antitela zamenom velikih bočnih lanaca aminokiselina sa manjim (npr. alanin ili treonin). Ovo obezbeđuje mehanizam za povećanje prinosa heterodimera u odnosu na neželjene krajnje proizvode kao što su homodimeri.
[0168] Bispecifičn antitela se mogu pripremiti kao antitela pune dužine ili fragmenti antitela (npr. F(ab’)2bispecifična antitela). Tehnike za stvaranje bispecifičnih antitela od fragmenata antitela opisani su u literaturi. Na primer, bispecifična antitela se mogu pripremiti korišćenjem hemijskog vezivanja. Brennan et al., Science 229:81 (1985) opisuje proceduru naznačenu time da su intaktna antitela proteolitički isečena da se stvore F(ab’)2fragmenti. Ovi fragmenti su redukovani u prisustvu ditiol kompleksujućeg sredstva natrijum arsenita da bi se stabilizovali susedni ditioli i sprečilo formiranje intermolekulskih disulfida. Stvoreni Fab’ fragmenti su zatim konvertovani u tionitrobenzoat (TNB) derivate. Jedan od Fab’-TNB derivata je zatim ponovno konvertovan u Fab’-tiol redukcijom sa merkaptoetilaminom i pomešan je sa ekvimolarnom količinom drugog Fab’-TNB derivata da bi se formiralo bispecifično antitelo. Proizvedena bispecifična antitela mogu se koristiti kao sredstva za selektivnun imobilizaciju enzima.
[0169] Dodatno, Fab’ fragmenti se mogu direktno rekonvenrtovati iz E. coli i hemijski kuplovati da bi se formirala bispecifična antitela. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) opisuju proizvodnju molekula potpuno humanizovanog bispecifičnog antitela F(ab’)2. Svaki Fab’ fragment je zasebno izlučen iz E. coli i podvrgnut direktnom hemijskom kuplovanju in vitro da bi se formiralo bispecifično antitelo. Tako formirano bispecifično antitelo bilo je sposobno da veže ćelije koje prekomerno eksprimiraju ErbB2 receptor i normalne humane T ćelije, kao i da pokrene litičku aktivnost humanih citotoksičnih limfocita protiv targeta humanog tumora dojke.
[0170] Takođe su opisane različite tehnike za stvaranje i izolaciju fragmenata bispecifičnog antitela direktno od kulture recombinantnih ćelija. Na primer, bispecifična antitela su proizvedena korišćenjem leucinskih zatvarača. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992). Peptidi leucinskog zatvarača iz Fos i Jun proteina su povezani sa Fab’ delovima dva različita antitela fuzijom gena. Homodimeri antitela su redukovani u regionu zgloba da bi se formirali monomeri i zatim re-oksidovani da bi se formirali heterodimeri antitela. Ovaj postupak se takođe može koristiti za proizvodnju homodimera antitela. "Diatelo" tehnologija opisana od strane Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993) obezbedila je alternativni mehanizam za stvaranje fragmenata bispecifičnih antitela. Fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (VH) vezan sa varijabilnim regionom lakog lanca (VL) sa linkerom koji je prekratak da bi dozvolio uparivanje između dva domena na istom lancu. U skladu sa tim, VHi VLdomeni jednog fragmenta su naterani da se uparuju sa komplementarnim VLi VHdomenima drugog fragmenta, čime se formiraju dva mesta za vezivanje antigena. Sledeća strategija za stvaranje fragmenata bispecifičnih antitela korišćenjem jednolančanih Fv (sFv) dimera takođe je objavljena. Videti, Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994).
[0171] Antitela sa više od dve valence su predviđena. Na primer, trispecifična antitela se mogu pripremiti. Tutt et al., J. Immunol.147:60 (1991).
[0172] Primeri bispecifičnih antitela mogu vezati dva različita epitopa, od kojih najmanje je jedan poreklom od proteinskog antigena opisanog ovde. Alternativno, anti-antigena ruka imunoglobulinskog molekula može se kombinovati sa rukom koja vezuje molekul okidač na leukocitu kao što je molekul T-ćelijskog receptora (npr. CD2, CD3, CD28, ili B7), ili Fc receptori za IgG (FcγR), kao što su FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD 16) tako da bi se odbrambeni mehanizmi ćelije fokusirali na ćeliju koja eksprimira određeni antigen. Bispecifična antitela se takođe mogu koristiti za usmeravanje citotoksičnih sredstava do ćelija koje eksprimiraju određeni antigen. Ova antitela poseduju antigen-vezujuću ruku i ruku koja vezuje citotoksično sredstvo ili radionuklidni helator, kao što je EOTUBE, DPTA, DOTA, ili TETA. Drugo bispecifično antitelo od interesa vezuje se za proteinski antigen opisan ovde i dodatno vezuje tkivni faktor (TF).
[0173] Heterokonjugat antitela su ovde takođe otkrivena. Heterokonjugat antitela su sastavljena od dva kovalentno spojena antitela. Za takva antitela pretpostavljeno je da, na primer, ostvaruju ciljano delovanje ćelija imunog sistema na neželjene ćelije (videti SAD patent br. 4,676,980), i za tretman HIV infekcije (videti WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Predviđeno je da se antitela mogu pripremiti in vitro korišćenjem poznatih postupaka u sintetičkoj hemiji proteina, uključujući ona koja uključuju unakrsno vezujuća sredstva. Na primer, mogu se konstruisati imunotoksini korišćenjem reakcije razmene disulfida ili sa formiranjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagenasa za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutilimidat i one otkrivene, na primer, u SAD patent br..4,676,980.
[0174] Može biti poželjno modifikovati antitelo prema pronalasku u odnosu na efektonu funkciju, tako da poboljša, npr., efikasnost antitela u tretiranju bolesti i poremećaja povezanih sa aberantnom CD47 signalizacijom. Na primer, cisteinski ostatak (ostaci) može se introdukovati u Fc region, čime se omogućava formiranje interlančane disulfidne veze u ovom regionu. Homodimerno antitelo tako stvoreno može imati poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili povećano ćelijsko ubijanje posredovano komplementom i antitelo-zavisnu ćelijsku citotoksičnost (ADCC). (videti Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) i Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativno, antitelo može biti konstruisano tako da ima dvostruke Fc regione i može stoga imati poboljšane sposobnosti u odnosu na lizu komplementom i ADCC. (videti Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)).
[0175] Pronalazak se takođe odnosi na imunokonjugate koji sadrže antitelo konjugovano sa citotoksičnim sredstvom kao što je toksin (npr., enzimski aktivni toksin bakterijskog, fungalnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njegovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat).
[0176] Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu koristiti uključuju lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, lanac egzotoksina (iz Pseudomonas aeruginosa), ricin lanac, abrin lanac, modecin lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteine, diantin proteine, Phytolaca americana proteine (PAPI, PAPII, i PAP-S), Momordica charantia inhibitor, kurcin, krotin, Sapaonaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, i trikotecene. Različiti radionuklidi su dostupni za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y, i<186>Re.
[0177] Konjugati antitela i citotksičnog sredstva su napravljeni korišćenjem različitih bifunkcionalnih protein-kuplujućih sredstava kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridiltiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalne derivate imidoestara (kao što su dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehide (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksanediamin), bisdiazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanate (kao što je tolien 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin se može pripremiti kao što je opisano u Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Ugljenik-14-obeleženi 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primer helatirajućeg sredstva za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. (videti WO94/11026).
[0178] Stručnjaci će prepoznati da veoma različiti mogući delovi mogu biti kuplovani sa rezultujućim antitelima prema pronalasku. (Videti, na primer, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology i Immunology, J. M. Cruse i R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)).
[0179] Kuplovanje se može postići bilo kojom hemijskom reakcijom koja će vezati dva molekula sve dok antitelo i drugi deo zadržavaju njihove respektivne aktivnosti. Ova veza može takođe uključivati mnoge hemijske mehanizme, na primer kovalentno vezivanje, afinitetno vezivanje, interkalaciju, koordinatno vezivanje i kompleksovanje. Poželjno vezivanje je, međutim, kovalentno vezivanje. Kovalentno vezivanje se može postići ili direktnom okndenzacijom postojećih bočnih lanaca ili inkorporacijom spoljašnjih premošćujućih molekula. Mnoga bivalentna ili polivalentna sredstva za vezivanje su korisna u kuplovanju proteinskih molekula, kao što su antitela prema predmetnom pronalasku, sa drugim molekulima. Na primer, reprezentativna srdstva za kuplovanje mogu uključivati organska jedinjenja kao što su tioestri, karbodiimidi, sukcinimid estri, diizocijanati, glutaraldehid, diazobenzeni i heksametilen diamini. Nije namera da ovaj spisak iscrpi sve moguće od različitih klasa kuplujućih sredstava poznatih u tehnici već je pre primer češće korišćenih kuplujućih sredstava. (videti Killen i Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); i Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).
[0180] Poželjni linkeri su opisani u literaturu. (Videti, na primer, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984) koji opisuje korišćenje MBS (M-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimidnog estra). Videti takođe, SAD patetnt br.5,030,719, koji opisuje upotrebu halogenovani acetil hidrazid derivat kuplovan sa antitelom putem oligopeptidnog linkera. Naročito poželjni linkeri uključuju: (i) EDC (1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) karbodiimid hidrohlorid; (ii) SMPT (4-sukcinimidiloksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)-toluen (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (iii) SPDP (sukcinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido]heksanoat (Pierce Chem. Co., Cat #21651G); (iv) Sulfo-LCSPDP (sulfosukcinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamid] heksanoat (Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G); i (v) sulfo-NIIS (N-hidroksisulfo-sukcinimid: Pierce Chem. Co., Cat. #24510) konjugovani sa EDC.
[0181] Prehodno opisani linkeri sadrćže komponente koje imaju različite atribute, što vodi konjugatima sa različitim fizičko-hemijskim osobinama. Na primer, sulfo-NHS estri alkil karboksilata su stabilniji od sulfo-NHS estara aromatičnih karboksilata. NHS-estar koji sadrži linkere je manje rastvorljiv od sulfo-NHS estara. Dodatno, linker SMPT sadrži sterički zaklonjenu disulfidnu vezu, i može formirati konjugate sa povećanom stabilnošću. Disulfidne veze su, generalno, manje stabilne od drugih veza jer se disulfidna veza iseca in vitro, što rezultuje u manje dostupnog konjugata. Sulfo-NHS, naročito, može poboljšati stabilnost karbodimid kuplovanja. Karbodimid kuplovanja (kao što je EDC) kada su korišćena zajedno sa sulfo-NIIS, formira estre koji su rezistentniji na hidrolizu od same reakcije karbodimid kuplovanja.
[0182] Antitela otkrivena ovde mogu takođe biti formulisana kao imunolipozomi. Lipozomi koji sadrže antitelo su pripremljeni postupcima poznatim u tehnici, kao što je opisano u Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); i U.S. Pat. Nos.4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi sa poboljšanim vremenom u cirkulaciji su otrkiveni u SAD patent br..5,013,556.
[0183] Naročito korisni lipozomi mogu se stvoriti postupkom reverzno-fazne evaporacije sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol, i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi su ekstrudirani kroz filtere definisane veličine pore da bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom. Fab’ fragmenti antitela prema predmetnom pronalasku se mogu konjugovati sa lipozomima kao što je opisanou Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) preko reakcije razmene disulfida.
Upotreba antitela protiv CD47
[0184] Shvatiće se da primena terapeutskih entiteta u skladu sa pronalaskom biće zajedno sa pogodnim nosačima, ekscipijentima, i drugim sredstvima koja su inkorporisana u formulacije da bi se obezbedio poboljšani transfer, isporuka, tolerancija, i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija može se naći u knjizi poznatoj svim farmaceutima: Remington’s Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), naročito Poglavlje 87 od strane Blaug, Seymour. Ove formulacije uključuju, na primer, praškove, paste, masti, gelove, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipid (katjonski ili anjonski) (kao što je Lipofectin™), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, ulje-u-vodi i voda-u-ulju emulzije, carbowax emulzije (polietilen glikoli različitih molekulskih težina), polu-čvrste gelove, i polu-čvrste smeše koje sadrže carbowax. Bilo koja od prethodnih smeša može biti pogodna u tretmanima i terapijama u skladu sa predmetnim pronalaskom, uz uslov da aktivni sastojak u formulaciji nije inaktiviran formulacijom i formulacija je fiziološki kompatibilna i tolerabilna u odnosu na put primene. Videti takođe Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance." Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals." Int. J. Pharm. 203(1-2): 1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug deliverysome emerging concepts." J Pharm Sci. 89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) i citate u njima za dodatne informacije u vezi sa formulacijama, ekscipijentima i nosačima dobro poznatim farmaceutima.
[0185] U jednom primeru izvođenja, antitela prema pronalasku, koja uključuju monoklonsko antitelo prema pronalasku, mogu biti korišćena kao terapeutska sredstva. Takva sredstva će se generalno koristiti za dijagnozu, prognozu, monitoring, tretiranje, ublažavanje, i/ili sprečavanje bolesti ili patologije povezane sa aberantnom CD47 ekspresijom, aktivnošću i/ili signalizacijom kod subjekta. Terapeutski režim je izveden identifikovanjem subjekta, npr., humanog pacijenta koji pati od (ili je u riziku da razvije) bolest ili poremećaj povezan sa aberantnom CD47 ekspresijom, aktivnošću i/ili signalizacijom, npr., kancera ili drugog neoplastičnog poremećaja, korišćenjem standardnih postupaka. Preparat antitela, poželjno onog koje ima visoku specifičnost i visoki afinitet za njegov ciljani antigen, je primenjen na subjekta i generalno će imati efekat usled svog vezivanja sa targetom. Primena antitela poništiti ili inhibirati ili uticati na funkciju ekspresije, aktivnosti i/ili siganlizacije targeta (npr., CD47). Primena antitela može poništiti ili inhibirati ili uticati na vezivanje targeta (npr., CD47) sa endogenim ligandom (npr., SIRPα) za koji se normalno vezuje. Na primer, antitelo se vezuje za target i modulira, blokira, inhibira, redukuje, antagonizuje, neutrališe, ili na drugi način utiče na CD47 ekspresiju, aktivnost i/ili signalizaciju.
1
[0186] Bolesti ili poremećaji povezani sa aberantnom CD47 ekspresijom, aktivnošću i/ili signalizacijom uključuju, putem neograničavajućeg primera, hematološki kancer i/ili solidne tumore. Hematološki kanceri uključuju, npr., leukemiju, limfom i mijelom. Određeni oblici leukemije uključuju, putem neograničavajućeg primera, akutnu limfocitnu leukemiju (ALL); akutnu mijeloidnu leukemiju (AML); hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL); hroničnu mijelogenu leukemiju (CML); Mijeloproliferativni poremećaj/neoplazmu (MPDS); i sindrom miodisplazije. Određeni oblici limfoma uključuju, putem neograničavajućeg primera, Hodgkin limfom, i indolentni i agresivni ne-Hodgkin limfom, Burkitt limfom, i folikularni limfom (sitnoćelijski i nesitnoćelijski). Određeni oblici mijeloma uključuju, putem neograničavajućeg primera, multipni mijelom (MM), mijelom džinovskih ćelija, mijelom teškog lanca, i lakog lanca ili Bence-Jones mijelom. Solidni tumori uključuju, npr., tumor dojke, tumore jajnika, tumore pluća, tumore pankreasa, tumore prostate, melanom tumore, kolorektalne tumore, tumore pluća, tumore glave i vrata, tumore bešike, tumore jednjaka, tumore jetre, i tumore bubrega.
[0187] Simptomi povezani sa kancerima i drugim neoplastičnim poremećajima uključuju, na primer, inflamaciju, groznicu, generalnu malaksalost, groznicu, bol, često lokalizovan na inflamatornu oblast, gebitak apetita, gubitak težine, edem, glavobolju, umor, osip, anemiju, slabost mišića, zamor mišića i abdominalne simptome kao što su, na primer, abdominalni bol, dijareja ili zatvor.
[0188] Terapeutski efikasna količina antitela prema pronalasku generalno se odnosi na količinu koja je potrebna da se postigne terapeutski cilj. Kao što je napomenuto prethodno, ovo može biti interakcija između antitela i njegovog ciljanog antigen koja, u određenim slučajevima, utiče na funkcionisanje targeta. Količina neophodna da se primeni zavisiće dodatno od vezujućeg afiniteta antitela za njegov specifični antigen, i takođe će zavisiti od stope sa kojom se primenjeno antitelo depletira iz slobodne zapremine subjekta kome je primenjeno. Uobičajeni opsezi za terapeutski efikasno doziranje antitelo ili fragmenta antitela prema pronalasku mogu biti, putem neograničavajućeg primera, od oko 0.1 mg/kg telesne težine do oko 100 mg/kg telesne težine. Uobičajena učestalost doziranja može biti u opsegu od, na primer, dva puta dnevno do jednom nedeljno.
[0189] Efikasnost tretmana je određena bilo kojim poznatim postupkom za dijagnozu ili tretiranje određenog poremećaja povezanog sa inflamacijom. Ublažavanje jednog ili više simptoma poremećaja povezanog sa inflamacijom ukazuje da antitelo donosi kliničku korist.
[0190] Postupci za skrining antitela koja poseduju željenu specifičnost uključuju, ali nisu ograničeni na, imunoenzimsku analizu (ELISA) i druge imunološki posredovane tehnike pozante u tehnici.
2
[0191] U sledećem primeru izvođenja, antitela usemrena protiv CD47 mogu se koristiti u postupcima pozantim u tehnicima koji se odnose na lokalizaciju i/ili kvantifikaciju CD47 (npr., za upotrebu za merenje nivoa CD47 i/ili oba CD47 i SIRPα unutar odgovarajućih fizioloških uzoraka, za upotrebu u dijagnostičkim postupcima, za upotrebu u imidžingu proteina, i slično). U datom primeru izvođenja, antitela specifična za CD47, ili njegov derivatv, fragment, analog ili homolog, koji sadrže antigen vezujući domen izveden iz antitela, korišćeni su kao farmakološki aktivna jedinjenja (ovde nadalje označena kao "terapeutici").
[0192] U sledećem primeru izvođenja, antitelo specifično za CD47 može se koristiti za izlovanje CD47 polipeptida, standardnim tehnikama, kao što je imunoafinitet, hromatografija ili imunoprecipitacija. Antitela usmerena protiv CD47 proteina (ili njegovog fragmenta) može se koristiti dijagnostički da bi se pratili nivoi proteina u tkivu kao deo procedure kliničkog testiranja, npr., da se, na primer, odredi efikasnost datog režima tretmana. Detekcija može biti olakšana kuplovanjem (tj., fizičkim povezivanjem) antitela sa detektabilnom supstancom. Primeri detektabilnih supstanci uključuju različite enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale, i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, β-galaktozidazu, ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa prostetične grupe uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hloride ili fikoeritrin; primer luminescentnog materijala uključuje luminol; primeri bioluminescentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin, i ekvorin, i primeri pogodnih radioaktivnih materijala uključuju<125>I,<131>I,<35>S ili<3>H.
[0193] U sledećem primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku može se koristiti kao sredstvo za detektovanje prisustva CD47 i/ili oba i CD47 i SIRPα proteina (ili njegovog proteinskog fragmenta) u uzorku. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži detektabilni obeleživač. Antitela su poliklonska, ili poželjnije, monoklonska. Korišćeno je intaktno antitelo, ili njegov fragment (npr., Fab, scFv, ili F(ab’)2). Termin "obeležen", u odnosu na probu ili antitelo, obuhvata direktno obeležavanje probe ili antitela kuplovanjem (tj., fizičkim vezivanjem) detektabilne supstance za probu ili antitelo, kao i indirektno obeležavanje probe ili antitela reaktivnošću sa drugim reagensom koij je direktno obeležen. Primeri indirektnog obeležavanja uključuju detekciju primarno antitelo korišćenjem fluorescentno obeleženog sekundarnog antitela i obeležavanjem kraja DNK probe sa biotinom tako da se može detektovati sa fluorescentno obeleženim streptavidinom. Termin "biološki uzorak" uključuje tkiva, ćelije i biološke tečnosti izolovane iz subjekta, kao i tkiva, ćelije i tečnosti prisutne u subjektu. Unutar termina "biološki uzorak", uključena je stoga, krv i frakcija ili komponenta krvi uključujući krvni serum, krvnu plazmu, ili limfu. Odnosno, postupak detekcije prema pronalasku može se koristiti za detekciju analita iRNK, proteina, ili genomske DNK u biološkom uzorku in vitro kao i in vivo. Na primer, in vitro tehnike za detekciju analita iRNK uključuju Northern hibridizacije i in situ hibridizacije. In vitro tehnike za detekciju analita proteina uključuju imunoenzimsku analizu (ELISAs), Western blotove, imunoprecipitacije, i imunofluorescenciju. In vitro tehnike za detekciju analita genomske DNK uključuju Southern hibridizacije. Procedure za izovđenje imunoanaliza su opisane, na primer u "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis i T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; i "Practice i Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Dodatno, in vivo tehnike za detekciju analita proteina uključuju introdukciju obeleženog anti-analit proteina antitela u subjekta. Na primer, antitelo se može obeležiti sa radioaktivnim markerom čije prisustvo i lokacija u subjektu se mogu detektovati standardnim tehnikama vizuelizacije.
Terapeutska primena i formulacije CD47 antitela
[0194] Antitela prema pronalasku (ovde takođe označena kao "aktivna jedinjenja"), i njihovi derivati, fragmenti, analozi i homolozi, mogu se ugraditi u farmaceutske kompozicije pogodne za primenu. Principi i razmatranja uključena u pripremanje takvih kompozicija, kao i instrukcije u izboru komponenti su obezbeđeni u, na primer, Remington’s Pharmaceutical Sciences: The Science and Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, i Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; i Peptide and Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York.
[0195] Takve kompozicije tipično sadrže antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač. Tamo gde su korišćeni fragmenti antitela, najmanji inhibitorni fragment koji se specifično vezuje za vezujući domen target proteina je poželjan. Na primer, na osnovu sekvenci varijabilnog regiona antitela, mogu se dizajnirati peptidni molekuli koji zadržavaju sposobnost da se vezuju za target proteinsku sekvencu. Takvi peptidi se mogu sintetisati hemijski i/ili proizvesti tehnologijom rekombinantne DNK. (Videti, npr., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)).
4
[0196] Kao što je ovde korišćeno, termin "farmaceutski prihvatljiv nosač" uključuje bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonična i sredstva koja odlažu apsorpciju, i slično, kompatibilna sa farmaceutskom primenom. Pogodni nosači su opisani u najnovijem izdanju Remington’s Pharmaceutical Sciences, standardnog referentnog teksta u oblasti. Poželjni primeri takvih nosača ili razblaživača uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, fiziološki rastvor, Ringer rastvore, rastvor dekstroze, i 5% humani serum albumin. Lipozomi i ne-vodeni nosači kao što su neistarljiva ulja mogu se takođe koristiti. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u tehnici. Osim ukoliko bilo koji konvencionalni medijumi ili sredstva nije kompatibilan sa aktivnim jedinjenjem, predviđena je njihova upotreba u kompozicijama.
[0197] Formulacije koje će se koristiti za in vivo primenu moraju biti sterilne. Ovo se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
[0198] Farmaceutska kompozicija prema pronalasku je formulisana da bude kompatibilna sa nameravanim putem primene. Primeri puteva primene uključuju parenteralnu, npr., intravensku, intradermalnu, potkožnu, oralnu (npr., inhalacija), transdermalnu (tj., topikalnu), transmukozalnu, i rektalnu primenu. Rastvori ili suspenzije korišćeni za parenteralnu, intradermalnu, ili potkožnu primenu mogu uključivati sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što je voda za injekciju, fiziološki rastvor, neispraljiva ulja, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge sintetičke rastvarače; antibakterijska sredstva kao što je benzil alkohol ili metil parabeni; antioksidante kao što je askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helatirajuća sredstva kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA); puferi kao što su acetati, citrati ili fosfati, i sredstva za podešavanje toničnosti kao što je natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti sa kiselinama ili bazama, kao što je hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparat može biti zatvoren u ampule, potrošne špriceve ili vijalice sa više doza napravljene od stakla ili plastike.
[0199] Farmaceutske kompozicije pogodne za upotrebu injekcijom uključuju sterilne vodene rastvore (gde su rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za ekstemporalnu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija. Za intravensku primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatsku vodu, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) ili fosfatno puferovani fiziološki rastvor (PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i mora biti tečna do stepena da je laka upotreba špricem. Mora biti stabilna pod uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti sačuvana od kontaminirajućeg dejstva mikroorganizama kao što su bakterije i gljive. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži, na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Ispravna fluidnost se može održati, na primer, korišćenjem obloge kao što je lecitin, održavanjem neophodne veličine čestice u slučaju disperzije i korišćenjem surfaktanata. Prevencija dejstva mikroorganizama može se postići različitim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabeni, hlorobutanol, fenol, askorbinska kiselina, timerosal, i slično. U mnogim slučajevima, biće poželjno u kompoziciju uključiti izotonična sredstva, na primer, šećere, polialkohole kao što je manitol, sorbitol, natrijum hlorid. Produžena aporpcija injektabilnih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearat i želatin.
[0200] Sterilni injektabilni rastvori se mogu pripremiti inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u neophodnu količinu odgovarajućeg rastvarača sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih prethodno, po potrebi, nakon čega sledi sterilizacija filtriranjem. Generalno, disperzije su pripremljene inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni vehikulum koji sadrži osnovni disperzioni medijum i neophodne druge sastojke od onih prethodno nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, postupci pripreme su sušenje vakuumom i sušenje zamrzavnjame koje daje prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz njegovog prethodno sterilno filtriranog rastvora.
[0201] Oralne kompozicije generalno uključuju inertni razblaživač ili jestivi nosač. Mogu biti zatvorene u želatinske kapsule kompresovane u tablete. Za svrhe oralne terapeutske primene, aktivno jedinjenje može se inkorporisati sa ekscipijensima i koristiti se u obliku tableta, pastila, ili kapsula. Oralne kompozicije se takođe mogu pripremiti korišćenjem tečnog nosača za upotrebu kao vodice za usta, naznačeno time da je jedinjenje u tečnom nosaču primenjenon oralno i popijena i iskašnjana, ili progutana. Farmaceutski kompatibilna vezujuća sredstva, i/ili ađuvantni materijali mogu se uključiti kao deo kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, pastile i slično mogu sadržati bilo koji od sledećih sastojaka, ili jedinjenja slične prirode: vezujuće sredstvo kao što je mikrokristalna celuloza, tragant guma ili želatin; ekscipijens kao što je skrob ili laktoza, sredstvo za raspadanje kao što je alginska kiselina, Primogel, ili kukuruzni skrob; lubrikant kao što je magnezijum stearat ili Sterotes; klizajuće sredstvo kao što je koloidni silicijum dioksid; zaslađivač kao što je saharoza ili saharin; ili aromatizer kao što je pepermint, metil salicilat, ili aroma naradže.
[0202] Za primenu inhalacijom, jedinjenja su isporučena u obliku aerosol spreja iz spremnika pod pritiskom ili dispenzera koji sadrži odgovarajući propelant, npr., gas kao što je ugljne dioksid, ili nebulizatora.
[0203] Sistemska primena takođe može biti transmukozalna ili transdermalna. Za transmukozalnu ili transdermalnu primenu, u formulaciji se koriste penetranti koji su odgovarajući za barijeru koja treba da se pređe. Takvi penetranti su generalno poznati u tehnici, i uključuju, na primer, za transmukozalnu primenu, deterdžente, žučne soli, i derivate fuzidinske kiseline. Transmukozalna primena se može postići upotrebom nazalnih sprejeva ili supozitorija. Za transdermalnu primenu, aktivna jedinjenja su formulisana u masti, meleme, gelove, ili kreme kao što je generalno poznato u tehnici.
[0204] Jedinjenja se takođe mogu pripremiti u obliku supozitorija (npr., sa konvencionalnim osnovama za supozitorije kao što je kako puter i drugi gliceridi) ili klistiri za rektalnu isporuku.
[0205] U jednom primeru izvođenja, aktivna jedinjenja su pripremljena sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što su formulacije sa produženim/kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Biodegradabilni, biokompatibilni polimeri mogu se koristiti, kao što je etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri, i polilaktična kiselina. Postupci za pripremu takvih formulacija biže jasni stručnjacima.
[0206] Na primer, aktivni sastojci se mogu zarobiti u mikrokapsulama pripremljenim, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalne polimerizacije, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsule i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsule, respektivno, u sistemima za isporuku sa koloidnim lekom (na primer, lipozomima, albumin mikrosferama, mikroemulzijama, nano-česticama, i nanokapsulama) ili u makroemulzijama.
[0207] mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produćenim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrikse čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri čemu su matrice u obliku artikala, npr., filmova, ili mikrokapsula. Primeri matrica sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (SAD pat. br.
3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i y etil-L-glutamat, ne-degradabilni etilenvinil acetat, degradabilni kopolimeri mlečna kiselina-glikolna kiselina kao što je LUPRON DEPOT™ (injektabilne mikrosfere sastavljene od polimera mlečne kiseline-glikolne kiseline i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibuterne kiseline. Dok polimeri kao što je etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula preko 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine u kraćim vremenskim periodima.
[0208] Materijali se takođe mogu dobiti komercijalno od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomalne suspenzije (uključujući lipozome koji ciljano deluju na inficirane ćelije sa monoklonskim antitelima na virusne antigene) i mogu se takođe koristiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Ono se mogu pripremiti prema postupcima poznatim stručnjacima, na primer, kao što je opisano u SAD patent br.4,522,811.
[0209] Posebno je pogodno formulisati oralne ili parenteralne kompozicije u obliku jedinične doze za lakoću primene i uniformnosti doze. Jedinični dozni oblik kao što je ovde korišćeno odnosi se na fizički zasebne jedinice pripremljene kao jedinične doze za subjekta koji se tretira; pri čemu svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapeutski efekat zajedno sa neophodnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija za jedinične dozne oblike prema pronalasku su diktirane i direktno zavisne od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapeutskog efekta koji treba postići, i ograničenja inherentnih u tehnici pripreme takvog jedinjenja za tretman pojedinaca.
[0210] Farmaceutske kompozicije mogu se nalaziti u spremniku, paketu, ili dispenzeru zajedno sa upoutstvom za primenu.
[0211] Formulacija može takođe sadržati više od jednog aktivnog jedinjenja po potrebi za određenu indikaciju koja se tretira, poželjno ona sa komplementarnim aktivnostima koje nisu međusobno štetne. Alternativno, ili dodatno, kompozicija može sadržati sredstvo koje poboljšava njegovu funkciju, kao što je, na primer, citotoksično sredstvo, citokin, hemoterapeutsko sredstvo, ili sredstvo za inhibiciju rasta. Takvi molekuli su pogodno prisutni u kombinaciji u količinama koje su efikasnije za nameravanu upotrebu.
[0212] U jednom primeru izvođenja, aktivna jedinjejna su primenjena u kombinaciji sa kombinovanom terapijom, tj., kombinovani sa drugim sredstvima, npr., terapeutskim sredstvima, koja su korisna za tretiranje patoloških stanja ili poremećaja, kao što su različiti oblici kancera, autoimuni poremećaji i inflamatorne bolesti. Termin "u kombinaciji" u ovom kontekstu znači da su sredstvsa data značajno istovremeno, ili istovremeno ili sekvencijalno. Ukoliko su dati sekvencijalno, na početku primene drugog jedinjenja, prvo od dva jedinjenja je poželjno još uvek detektabilno u efikasnim koncentracijama na mestu tretmana.
[0213] Na primer, kombinovana terapija može uključivati jedno ili više antitela prema pronalasku koformuliasanih sa, i/ili ko-primenjenih sa, jednim ili više dodatnih terapeutskih sredstava, npr., jednim ili više citokina i inhibitora faktora rasta, imunosupresantima, antiinflamatornim sredstvima, metaboličkim inhibitorima, enzimskim inhibitorima, i/ili citotoksičnim ili citostatičkim sredstvima, kao što je opisano detaljnije u nastavku. Takve kombinovane terapije mogu pogodno koristiti niže doze primenjennih terapeutskih sredstava, čime se izbegavaju moguće toksičnosti ili komplikacije povezane sa različitim monoterapijama.
[0214] Poželjna terapeutska sredstva korišćena u kombinaciji sa antitelom prema pronalasku su ona sredstva koja utiču na različite stadijume inflamatornog odgovora. U jednom primeru izvođenja, jedno ili više antitela opisanih ovde mogu biti koformulisana, i/ili ko-primenjena sa, jednim ili više dodatnih sredstava kao što je drugi citokin ili antagonisti faktora rasta (npr., rastvorljivi receptori, peptidni inhibitori, mali molekuli, fuzije liganada); ili antitela ili njihovi antigen vezujući fragmenti koji se vezuju za druge targete (npr., antitela koja se vezuju za druge citokine ili faktore rasta, njihove recceptore, ili druge molekule na površini ćelije); i anti-inflamatornim citokinima ili njihovim agonistima.
[0215] Antitela se mogu koristiti kao ađuvanti za vakcinu protiv autoimunih bolesti, inflamatornih bolesti, itd. Kombinacija ađuvanata za tretman ovih tipova poremećaja su pogodni za korišćenje u kombinaciji sa raznovrsnim antigenima od targetiranih sopstvenih antigena, tj., autoantigena, uključenih u autoimunitet, npr., mijelin bazni protein; inflamatornih autoantigena, npr., amiloid peptid protein, ili antigene transplanta, npr., aloantigeni. Antigen može sadržati peptide ili polipeptide izvedene iz proteina, kao i fragmenata bilo čega od sledećeg: saharidi, proteini, polinukleotidi ili oligonukleotidi, autoantigeni, amiloid peptid protein, transplant antigeni, alergeni, ili druge makromolekulske komponente. U nekim slučajevima, više od jednog antigena je uključeno u antigenu kompoziciju.
Dizajn i stvaranje drugih terapeutika
[0216] U skladu sa predmetnim pronalaskom i na osnovu aktivnosti antitela koja su proizvedena i okarakterisana ovde u odnosu na CD47, dizajn drugih terapijskih modaliteta osim delova antitela je olakšan. Takvi modaliteti uključuju, bez ograničenja, napredne antitelo terapeutike, kao što su bispecifična antitela, imunotoksini, i radioobeleženi terapeutici, stvaranje peptidnih terapeutika, genskih terapija, naročito intratela, antisens terapeutika, i malih molekula.
[0217] Na primer, u vezi bispecifičnih antitela, mogu se stvoriti bispecifična antitela koja sadrže (i) dva antitela- jedno sa specifičnošću za CD47 i drugo za drugi molekul kojis u konjugovani zajedno, (ii) jedno antitelo koje ima jedan lanac specifičan za CD47 i drugi lanac specifičan za drugi molekul, ili (iii) jednolančano antitelo koje ima specifičnost za CD47 i drugi molekul. Takva bispecifična antitela su stvorena korišćenjem tehnika koje su dobro poznate, na primer, u vezi (i) i (ii) Videti npr., Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) i Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), i u vezi (iii) Videti npr., Traunecker et al. Int. J. Kancera (Suppl.) 7:51-52 (1992).
[0218] U vezi imunotoksina, antitela se mogu modifikovati tako da deluju kao imunotoksini korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u tehnici. Videti npr., Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). See also SAD patent br..5,194,594. U vezi pripreme radioobeleženih antitela, takva modifikovana antitela se takođe mogu lako pripremiti korišćenjem tehnika koje su dobro poznate u tehnici. Videti npr., Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Videti takođe SAD patent br.s. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471, i 5,697,902. Svaki od imunotoksina i radioobeleženih molekula verovatno će ubijati ćelije koje eksprimiraju CD47.
[0219] U vezi stvaranja terapeutskih peptida, preko korišćenja strukturne informacije povezane sa CD47 i antitela protiv njega, kao što su antitela prema pronalasku ili skrining peptidnih biblioteka, mogu se stvoriti terapeutski peptidi koji su usmereni protiv CD47. Dizajn i skrining peptidnih terapeutika je razmatran u vazi sa Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake i Litzi-Davis BioConjugate Chem.3:510-513 (1992). Imunotoksini i radioobleženi molekuli se mogu pripremiti, i na sličan način, u vezi sa peptidnim delovima kao što je prethodno razmatrano u vezi antitela. Uz pretpostavku da CD47 molekul (ili oblik, kao što je splajs varijanta ili alternativni oblik) je funkcionalno aktivan u procesu bolesti, takođe će biti moguće dizajnirati genske i antisens terapeutike na nnjega konvencionalnim tehnikama. Takvi modaliteti se mogu koristiti za moduliranje funkcije CD47. U vezi s tim antitela prema predmetnom pronalasku olakšavaju dizajn i upotrebu funkcionalnih analiza povezanih sa njima. Dizajn i strategija za antisens terapeutike je detaljno razmatrana u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 94/29444. Dizajn i strategije za gensku terapiju su dobro poznate. Međutim, naročito, upotreba genskih terapeutskih tehnika koje uključuju intratela mogla bi se pokazati kao naročito povoljna. Videti npr., Chen et al. Human Gen Therapy 5:595-601 (1994) i Marasco Gen Therapy 4:11-15 (1997). Genaralni dizajn i razmatranja povezana sa genskim terapeuticima je takođe razmatran u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 97/38137.
[0220] Znanje sakupljeno iz strukture CD47 molekula i njegovih interakcija sa drugim molekulima u skladu sa predmetnim pronalaskom, kao što je SIRPα i/ili antitela prema pronalasku, i drugih može se iskoristiti za racionalan dizajn dodatnih terapeutskih modaliteta. U ovom pogledu, tehnike racionalnog dizajna leka kao što je rendgenska kristalografija, molekularno modelovanje uz pomoć (ili asistenciju) kompjutera (CAMM), kvantitativni ili kvalitativni odnos strukture-aktivnosti (QSAR), i slične tehnologije mogu se koristiti da se fokusiraju napori oko otkrivanja leka. Racionalan dizajn omogućava proizvodnju proteina ili sintetičkih struktura koje mogu interagovati sa molekulima ili njihovim specifičnim oblicima koji se mogu koristiti za modifikaciju ili modulaciju aktivnosti IL-6Rc. Takve strukture se mogu sintetisati hemijski ili eksprimirati u biološkim sistemima. Ovaj pristup je pregledano dat u Capsey et al. Gentically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Dodatno, kombinatorne biblioteke se mogu dizajnirati i sintetisati i koristiti za skrining programe, kao što su skrinig visoke propusne moći.
Postupci srkininga
[0221] Ovde su otkriveni postupci (takođe označeni kao "skrining analize") za identifikovanje modulatora, tj., kandidata ili test jedinjenja ili sredstava (npr., peptidi, peptidomimetici, mal+i molekuli ili drugi lekovi) koji moduliraju ili na drugi način utiču na vezivanje CD47 sa SIRPα, ili kandidata ili test jedinjenja ili sredstava koja moduliraju ili na drugi način utiču na signalnu funkciju CD47 i/ili CD47-SIRPα. Takođe su obezbeđeni postupci identifikacije jedinjejna korisnih za tretiranje poremećaja povezanih sa aberantnim CD47 i/ili CD47-SIRPα ekspresijom, aktiovnošću i/ili signalizacijom. Postupci skrininga mogu uključivati one poznate ili korišćene u tehnici ili one opisane ovde. Na primer, CD47 može se imobilisati na mikrotitarskoj ploči i inkubirati sa kandidatom ili test jedinjenjem, npr., CD47 antitelom, u prisustvu SIRPα. Nakon toga, vezani SIRPα se može detektovati korišćenjem sekundarnog antitela, i apsorbanca se može detektovati na čitaču ploča.
[0222] Postupci za identifikaciju jedinjenja sposobnih za promovisanje fagocitoze ćelija tumora od strane makrofaga su takođe obezbeđeni. Ovi postupci mogu uključivati one poznate ili korišćene u tehnici ili one opisane ovde. Na primer, makrofage su inkubirane sa obeleženim tumorskim ćelijama u prisustvu kandidat jedinjenja, npr., CD47 antitelo. Nakon perioda vremena, makrofage se mogu uočiti u odnosu na internalizaciju obeleživača tumora da bi se identifikovala fagocitoza. Dodatni detalji koji se odnose na ove postupke, npr., analize blokiranja SIRPα i analize fagocitoze, obezbeđeni su u Primerima.
[0223] Jedinjenja identifikovana u analizama skrininga su opisane ovde.
[0224] Ovde su opisane analize skriniga kandidata ili test jedinjenja koja moduliraju signalnu funkciju CD47. Test jedinjenja se mogu dobiti korišćenjem bilo kog od brojnih pristupa u postupcima kombinatorne biblioteke poznatim u tehnici, uključujući: biološke biblioteke; prostorno adresabilne paralelne čvrste faze ili rastvorljive faze biblioteke; postupke sintetičke biblioteke koji zahtevaju dekonvoluciju; postupci "jedna-kuglica jedno-jedinjenje" bibilioteke; i postupci sintetičke biblioteke koji koriste selekciju afinitetnom hromatografijom. Pristup biološkom bibliotekom je ograničen na peptidne biblioteke, dok su druga četiri pristupa primenjiva na peptide, ne-peptidni oligomer ili biblioteke malih molekula jedinjenja. (Videti, npr., Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145).
1
[0225] "Mali molekul" kao što je ovde korišćeno, označava kompoziciju koja ima mlekulsku težinu manju od oko 5 kD i najpoželjnije manju od oko 4 kD. Mali kolekuli mogu biti, npr., nukleinske kiseline, peptidi, polipeptidi, peptidomimetici, ugljeni hidrati, lipidi ili drugi organski ili neorganski molekuli. B>iblioteke hemijskih i/ili bioloških smeša, kao što su fungalni, bakterijski, ili ekstrakti algi, poznati su u tehnici i mogu biti podvrgnuti skriningu sa bilo kojim analizama otkrivenim ovde.
[0226] Primeri postupaka za sintezu molekularnih biblioteka mogu se naći u tehnici, na primer u: DeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90: 6909; Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.91: 11422; Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678; Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; i Gallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233.
[0227] Biblioteke jedinjenja mogu se prezentovati u rastvoru (videti npr., Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421), ili na kuglicama (videti Lam, 1991. Nature 354: 82-84), na čipovima (videti Fodor, 1993. Nature 364: 555-556), bakterijama (videti SAD patent br.
5,223,409), sporama (videti SAD patent br. 5,233,409), plazmidima (videti Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869) ili na fagu (videti Scott i Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406; Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382; Felici, 1991. J. Mol. Biol.222: 301-310; i U.S. Patent No.5,233,409.).
[0228] Jedinjenje kandidat može s eintrodukovati u antitelo-antigen kompleks i odrediti da li kandidat jedinjenje remeti antitelo-antigen kompleks, naznačeno time da disrupcija ovog kompleksa označava da kandidat jedinjenje modulira signalnu funkciju CD47 i/ili interakciju između CD47 i SIRPα. U sledećem aspektu, rastvorljivi CD47 i/ili oba i CD47 i SIRPα protein su izloženi najmanje jednom neutrališućem monoklonskom antitelu. Formiranje antitelo-antigen kompleksa je detektovano, i jedno ili više kandidat jedinjenja su introdukovani u kompleks. Ukoliko je antitelo-antigen kompleks disruptovan nakon introdukcije jednog ili više kandidata jedinjenja, kandidat jedinjenja su korisna za tretiranje poremećaja povezanog sa aberantnom CD47 i/ili CD47-SIRPα signalizacijom.
[0229] Određivanje sposobnosti test jedinjenja da utiče na ili disruptuje antitelo-antigen kompleks može se postići, na primer, kuplovanjem test jedinjenja sa radioizotopom ili enzimatskim obeleživačem tako da se vezivanje test jedinjenja sa antigenom ili njegovim biološki aktivnim delom može odrediti detekcijom obeleženog jedinjenja u kompleksu. Na primer, test jedinjenja mogu biti obeležena sa<125>I,<35>S,<14>C, ili<3>H, ili direktno ili indirektno, i radioizotop detektovan direktnim brojanjem radioemisije ili scincilacionim brojanjem. Alternativno, test jedinjenja mogu biti enzimski obeležena sa, na primer, peroksidazom rena,
2
alkalnom fosfatazom, ili luciferazom, i enzimski obeleživač se može detektovati sa određivanjem konverzije odgovarajućeg supstrata u proizvod.
[0230] U jednom aspektu, analiza sadrži dovođenje u kontakt antitelo-antigen kompleksa sa test jedinjenjem, i određivanje sposobnosti test jedinjenja da interaguje sa antigenom ili na drugi način disruptuje postojeći antitelo-antigen kompleks. U ovom aspektu, određivasnje sposobnosti test jedinjenja da interaguje sa antigenom i/ili disruptuje antitelo-antigen kompleks sadrži određivanje sposobnosti test jedinjenja da se preferencijalno vezuje za antigen ili njegov biološki-aktivni deo, u poređenju sa antitelom.
[0231] U sledećem aspektu, analiza sadrži dovođenje u kontakt antitelo-antigen kompleks sa test jedinjenjem i određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira antitelo-antigen kompleks. Određivanje sposobnosti test jedinjenja da modulira antitelo-antigen kompleks može se postići, na primer, određivanjem sposobnosti antigena da se vezuje za ili interaguje sa antitelom, u prisustvu test jedinjenja.
[0232] Stručnjaci će prepoznati da, u bilo kojem od ovde opisanih postupaka skrininga, antitelo može biti neutrališuće antitelo, koje modulira na drugi način utiče na CD47 aktivnost i/ili signalizaciju.
[0233] Postupci skrininga opisani ovde mogu se izvesti kao analiza zasnovana naćeliji ili kao analiza bez ćelija. Analize bez ćelija su podložne korišćenju ili rastvorljivog oblika ili mebranski vezanog oblika CD47 i njegovih fragmenata. U slučaju analiza bez ćelija koja sadrži membranski vezani oblik CD47, može biti poželjno korišćenje sredstva koje poboljšava rastvorljivost tako da su membranski vezani oblici proteina zadržani u rastvoru. Primeri takvih sredstava za povećanje rastvorljivosti uključuju nejonske deterdžente kao što je noktilglukozid, n-dodecilglukozid, n-dodacilmaltozid, oktanoil-N-metilglukamid, dekanoil-N-metilglukamid, Triton® X-100, Triton® X-114, Thesit®, izotridecipoli(etilen glikol etar)n, N-dedecil--N,N-dimetil-3-amonio-l-propan sulfonat, 3-(3-holamidopropil) dimetilaminiol-1-propan sulfonat (CHAPS), ili 3-(3-holamidopropil)dimetilamminiol-2-hidroksi-1-propan sulfonat (CHAPSO).
[0234] U više od jednog primera, može biti poželjno imobilisati ili antitelo ili antigen da se olakša razdvajanje kompleksovanih od nekompleksovanih oblika jednog ili oba nakon introdukcije kandidat jedinjenja, kao i da se postigne automatizacija analize. Posmatranje antitelo-antigen kompleksa u prisustvu i odsustvu kandidat jedinjenja može se postići u bilo kojem sudu pogodnom za držanje reaktanata. Primeri takvih sudova uključuju mikrotitarske ploče, test epruvete, i epruvete za mikrocentrifugu. U jednom aspektu, može se obezbediti fuzioni protein koji dodaje domen koji omogućava da se jedan ili oba proteina vežu za matriks. Na primer, GST-antitelo fuzioni proteini ili GST-antigen fuzioni proteini mogu biti adsorbovani na glutation sefaroza kuglicama (Sigma Chemical, St. Louis, MO) ili glutation derivatizovanim mikrotitarskim pločama, koje su zatim kombinovane sa test jedinjenjem, i smeša je inkubirana pod uslovima pogodnim za formiranje kompleksa (npr., na fiziološkim uslovima za so i pH). Nakon inkubacije, kuglice ili bunarčići mikrotitarskih ploča su isprani da bi se uklonile bilo koje nevezane komponente, imobilisan matriks u slučaju kuglica, kompleks određen ili direktno ili indirektno. Alternativno, kompleksi se mogu disocirati sa matriksa, i nivo formiranja antitelo-antigen kompleksa može se odrediti korišćenjem standardnih tehnika.
[0235] Druge tehnike za imobilizaciju proteina na matriksima mogu se takođe koristiti u analizama skrininga. Na primer, ili antitelo (npr., 2 Λ1 antitelo, ili antitelo koje ima varijabilni teški lanac izabran od SEQ ID NO: 5-30 i varijabilni laki lanac izabran od SEQ ID NO: 31-47) ili antigen (npr. CD47 protein) može se imobilisati korišćenjem konjugacije biotina i streptavidina. Biotinilovani molekuli antitelo ili antigena mogu se pripremiti od biotin-NHS (N-hidroksi-sukcinimid) korišćenjem tehnika dobro poznatih u tehnici (npr., biotinilacioni komplet, Pierce Chemicals, Rockford, Ill.), i imobilisani u bunarčićima streptavidin-obloženih ploča sa 96 bunarčića (Pierce Chemical). Alternativno, druga antitela reaktivna sa antitelom ili antigenom od interesa, ali koja ne utiču na formiranje antitelo-antigen kompleksa od interesa, mogu se derivatizovati u bunarčićima ploče, i nevezano antitelo ili antigen zarobljen u bunarčićima sa konjugacijom antitela. Postupci za detekciju takvih kompleksa, dodatno onima prethodno opisanim za GST imobilisane komplekse, uključuju imunodetekciju kompleksa korišćenjem takvih drugih antitela reaktivnih sa antitelom ili antigenom.
[0236] Nova sredstva mogu se identifikovati bilo kojom prethodno pomenutom skrininga i mogu se koristiti za tretmane kao što je ovde opisano.
Dijagnostičke i profilaktičke formulacije
[0237] CD47 MAbs prema pronalasku su korišćena u dijagnostičkim i profilaktičkim formulacijama. U jednom primeru izvođenja, CD47 MAb prema pronalasku je primenjen na pacijente koji su u riziku od razvoja jedne ili više od prethodno pomenutih bolesti, kao što je na primer, bez ograničenja, kancer ili drugo neoplastično stanje. Predispozicija pacijenta ili organa za jednu ili više od prethodno pomenutih kancera ili drugih neoplastičnih stanja može se odrediti korišćenjem genotipskih, seroloških ili biohemijskih markera.
[0238] U sledećem primeru izvođenja prema pronalasku, CD47 antitelo je primenjeno na humane pojedince koji su dijagnostifikovani sa kliničkim indikacijama povezanim sa jednom ili više od prethodno pomenutih bolesti, kao što je na primer, bez ograničenja, kancer ili drugo
4
neoplastično stanje. Nakon dijagnoze, CD47 antitelo je primenjeno da bi se olakšali ili izvršila reverzija efekata kliničke indikacije povezane sa jednom ili više pomenutih bolesti.
[0239] Antitela prema pronalasku su takođe korisna za detekciju CD47 i/ili SIRPα u uzorcima od pacijenta i u skladu sa tim su korisna kao dijagnostika. Na primer, CD47 antitela prema pronalasku su korišćena u in vitro analizama, npr., ELISA, za detekciju CD47 i/ili SIRPα nivoa u uzorku od pacijenta.
[0240] U jednom primeru izvođenja, CD47 antitelo prema pronalasku je imobilisano na čvrstoj podlozi (npr., bunarčiću (bunarčićima) mikrotitarske ploče). Imobilisano antitelo služi kao antitelo za hvatanje za bilo koje CD47 i/ili SIRPα koji mogu biti prisutni u test uzorku. Pre dovođenja u kontakt imobilisanog antitela sa uzorkom od pacijenta, čvrsta podloga je isprana i tretirana sa blokirajućim sredstvom kao što je protein mleka ili albumin da bi se sprečila nespecifična adsorpcija analita.
[0241] Nakon toga bunarčići su tretirani sa test uzorkom za koji se sumnja da sadrži antigen, ili sa rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak je, npr., istaloženim uzorkom od subjekta za koga se sumnja da ima nivoe cirkulišućeg antigena za koje se smatra da su dijagnostički za patologiju. Nakon ispiranja test uzorka ili standarda, čvrsta podloga je tretirana sa drugim antitelom koje je detektabilno obeleženo. Obeleženo drugo antitelo služi kao detekciono antitelo. Nivo detektabilnog obeleživača je meren, i koncentracija CD47 i/ili SIRPα u test uzorku je određena poređenjem sa standardnom krivom dobijenom od standardnih uzoraka.
[0242] Shvatiće se da na osnovu rezultata dobijenih korišćenjem CD47 antitela prema pronalasku u in vitro dijagnostičkoj analizi, moguće je odrediti stadijum bolesti (npr., klinička indikacija povezna sa ishemijom, autoimuni ili inflamatorni poremećaj) kod subjekta na osnovu ekspresionih nivoa CD47 i/ili SIRPα. Za datu bolest, uzorci krvi su uzeti od subjekata kojima su dijagnostifikovani različiti stadijumi napredovanja bolesti, i/ili su na različitim tačkama terapeutskog tretmana bolesti. Korišćenjem populacije uzoraka koij obezbeđuju statistički značajne rezultate za svaki stadijum napredovanja ili terapiju, označen je opseg koncentracija antigena koji se može smatrati karakterističnim za svaki stadijum.
PRIMERI
[0243] Sledeći primeri, uključujući izvedene eksperimente i dobijene rezultate obezbeđeni su samo u ilustrativne svrhe i ne treba ih smatrati ograničavajućim u odnosu na predemtni pronalazak.
PRIMER 1: Stvaranje i selekcija CD47 antitela
[0244] CD47 antitela su stvorena imunizacijom miševa sa rekombinantnim proteinom koji predstavlja CD47-IgV (imunoglobin-slični varijabilni-tip), implementacijom modifikovane strategije rapidne imunizacije u više mesta (Kilpatrick et al. (1997) Rapid development of affinity matured monoklonskih antitela using RIMMS. Hybridoma 16, 381-389). Dodatno, polovina miševa u imunizovanoj grupi je primila jednu injekciju anti-mišjeg GITR agonist antitela, DTA-1. Nakon rasporeda imunizacije, sakupljeni su i disocirani limfni čvorovi iz svih miševa (DTA-1 tretirani i netretirani), čime se omogućava izolacija B-ćelija i naknadna fuzija sa ćelijskom linijom mišjeg mijeloma. Supernatanti hibridoma su skrinovani u odnosu na vezivanje CD47 sa ELISA i sa protočnom citometrijom na Daudi (ATCC# CCL-213) ćelijama (Slika 1A). Supernatanti hibridoma su takođe analizirani u odnosu na sposobnost da blokiraju CD47-SIRPα interakciju (Slika 1B). Rekombinantni CD47 je imobilisan na Medisorp (NUNC) mikrotitarskoj ploči i nakon toga inkubiran sa supernatantima hibridoma u prisustvu rekombinantnog humanog SIRPα-ECD fuzionisanog sa humanim IgG Fc domenom. Vezani SIRPα je detektovan korišćenjem HRP konjugovanog anti-humanog IgG Fc specifičnog sekundarnog antitela (Jackson Immuno Research), i apsorbance na 650 nm detektovane na čitaču ploča.
PRIMER 2: Karakterizacija CD47 antitela
[0245] Primeri mišjih CD47 antitela prema predmetnom pronalasku su prikazani na Slici 2. Rangiranje afiniteta SIRPα blokirajućih CD47 antitela je izvedeno protočnom citometrijom na Raji (ATCC# CCL-86) (Slika 2A) i CCRF-CEM (ATCC# CCL-119) ćelijama (Slika 2B). Vezana CD47 antitela su detektovana korišćenjem FITC konjugovanog anti-mišjeg IgG sekundarnog antitela (Jackson ImmunoResearch). CD47 antitelo poznato u tehnici, B6II12, je uključeno kao pozitivna kontrola (Videti, npr., SAD patent 5,057,604). Na Slici 2B, i B6H12 i 2D3, komercijalno dostupno ne-SIRPa blokirajuće antitelo, upoređeani su sa antitelima stvorenim ovde. Antitela prema predmetnom pronalasku prikazuju veći afinitet prema endogenom (površina ćelije) obliku CD47 u poređenju sa B6H12 i 2D3 antitelima.
PRIMER 3: SIRPα blokirajuća aktivnost CD47 antitela
[0246] Potencija SIRPα blokiranja sa CD47 antitelima je merena sa ELISA naznačeno time da je rekombinantni His tagovani-CD47-IgV imobilisan na Medisorp mikrotitarskoj ploči.
Vezivanje rekombinantnog SIRPα fuzionisanog sa Fc domenom humanog IgG je praćena u prisustvu rastućih količina CD47 antitela. Vezani SIRPα je određen korišćenjem HRP konjugovanog anti-humanog IgG (Fc specifičnog) sekundarnog antitela (Jackson ImmunoResearch). Antitela prema predmetnom pronalasku prikazuju poboljšanu potenciju SIRPα blokiranja u poređenju sa B6H12 antitelom. Slika 3A prikazuje reprezentativne podatke ELISA na osnovu analize bokiranja SIRPα.
[0247] CD47 antitela su analizirana protočnom citometrijom u odnosu na njihovu sposobnost da blokiraju vezivanje rekombinantnog SIRPα za CD47 na površini ćelije. CCRF-CEM (ATCC# CCL-119) ćelije su korišćene kao izvor CD47 u analizi i vezivanje rekombinantnog SIRPα fuzionisanog sa Fc domenom humanog IgG je praćeno u prisustvu rastućih količina CD47 antitela. Vezani SIRPα je određen korišćenjem APC konjugovanog anti-humanog IgG (Fc specifičnog) sekundarnog antitela (Jackson ImmunoResearch) (Slika 3B). B6II12 i komercijalno dostupni ne-SIRPα blokirajuće CD47 antitelo 2D3 korišćeni su kao pozitivne i negativne kontrole, respektivno.
PRIMER 4: CD47 antitelo-posredovane homotipske interakcije
[0248] SIRPα blokirajuća CD47 antitela su analizirana u odnosu na njihovu sposobnost da indukuju klasterovanje ćelija, što je poznato kao homotipske interakcije, između CD47 pozitivnih ćelija. Daudi i Raji ćelije su korišćene kao kandidat CD47 eksprimirajuće ćelijske linije. Između ispitivanih antitela, 2A1 antitelo prema predmetnom pronalasku bilo je jedino SIRPα blokirajuće antitelo koje nije promovisalo homotipske interakcije CD47 eksprimirajućih ćelija.
PRIMER 5: Hemaglutinaciona aktivnost CD47 antitela
[0249] Jedan primer homotipske interakcije je hemaglutinacija, što je pokazano RBC agregacijom. Izvršen je skrining CD47 antitela u odnosu na RBC aglutinaciju, kao što je uočeno preko sposobnosti antitela da spreči taloženje humanih RBC. Neočekivano, pronađeno je da je 2A1 antitelo jedinstveno među drugim CD47 antitelima u odnosu na svoju nesposobnost da promoviše hemaglutinaciju, dok ima visok afinitet i sposobnost da blokira SIRPα. Druga antitela koja su prikazivala smanjenu hemaglutinaciju nisu blokirala SIRPα vezivanje za CD47.
[0250] Da bi se procenio hemaglutinacioni kapacitet CD47 antitela, humane RBC su razblažene do 10% u PBS i inkubirane na 37°C 2-6 časova sa titracijom CD47 antitela u ploči sa okruglim dnom sa 96 bunarčića. Dokazi hemaglutinacije su dobijeni na osnovu prisustva neistaloženih RBCs, koji izgledaju kao blago zamućenje u poreženju sa punktiranom crvenom tačkom ne-hemaglutinaranih RBCs. Neočekivano, kao što je pokazano na Slici 4A, CD47 antitela prema pronalasku, naročito antitelo koje je ovde obeleženo kao 2A1, nije pokazalo hemaglutinacionu aktivnost. Grafik prikazuje kvantifikaciju hemaglutinacione analize assay, označene kao "hemaglutinacioni indeks" određen kvantifikacijom površine RBC peleta u prisustvu antitela, normalizovanu prema istoj u odsustvu antitela.
[0251] Mišje 9E4 antitelo izazvalo je najizrazitiju hemaglutinaciju na svim testiranim koncentracijama. Stoga, 9E4 antitelo vezuje CD47 i blokira CD47 interakciju sa SIRPα; međutim, 9E4 antitelo izaziva izrazitu hemaglutinaciju.
[0252] Region VH lanca 9E4 antitela je obezbeđen u nastavku.
[0253] Region VL lanca 9E4 antitela je obezbeđen u nastavku.
[0254] Kontrolno antitelo B6H12 izazvalo je hemaglutinaciju kao što je očekivano za SIRPα blokirajuća CD47 antitela.
[0255] Da bi se istražila jedinstvenost ne-hemaglulinacione aktivnosti 2A1 antitela, izvršen je skrining brojnih drugih CD47 antitela u analizi hemaglutinacije RBC (Slika 4B). U ovu analizu bila je uključena himerna verzija 2A1 antitela (2A 1-xi), koja se sastoji od mišjeg varijabilnog regiona teškog lanca 2A1, mišjeg varijabilnog regiona lakog lanca 2A1 modifikovanog na aminokiselini 106 (tj., M 1061), i konstantne regione humanog IgG1 i humanog Ig kapa. Sekvence VII i VL regiona 2A1 antitelo i 2A1-xi antitela su obezbeđene u Tabeli 1. Antitela su testirana na 12.5, 25, 50, i 100nM. Neočekivano, 2 Λ1 je retko među ispitivanim CD47 antitelima na Slici 4B, po tome što je jedino antitelo na Slici 4B sa odsustvom ili smanjenim hemaglutinacionom aktivnošću. Slika 4E prikazuje da 2A1, himerno 2A1 (2A1-xi), i humanizovane varijante ne izazivaju hemaglutinaciju.
[0256] Slika 4C prikazuje rezultate skrininga dodatnih CD47 antitela u analizi hemaglutinacije RBC. Kao što je prikazano na Slici 4C, komercijalno dostupno CD47 monoklonsko antitelo 2D3, koje ne blokira SIRPα, nije izazvalo hemaglutinaciju. Međutim, druga komercijalno dostupna CD47 antitela (npr., CC2C6, BRIC126, i B6H12) koja blokiraju SIRPα izazvala su hemaglutinaciju (Slika 4C). Stoga, pre pronalaska opisanog ovde, postojeća antitela koja su blokirala SIRPα izazivala su hemaglutinaciju, dok su postojeća antitela, kao što je 2D3, koja nisu blokirala SIRPα nisu izazivala hemaglutinaciju. Uzeto zajedno, antitela prema pronalasku (npr., 2A1 antitelo i njegovi humanizovani derivati) su jedinstveni među postsojećim CD47 antitelima po njihovoj sposobnosti da blokiraju SIRPα, ali ne izazivaju hemaglutinaciju.
[0257] Opseg visokih koncentracija izabranih CD47 antitela je ponovo testiran u analizi hemaglutinacije (Slika 4D). Ova analiza je otkrila pro-zonski efekat hemaglutinacije sa B6H12 i 9E4, naznačeno time da je hemaglutinacija smanjena na visokim i niskim krajevima testiranog opsega koncentracije. Grafik hemaglutinacionog indeksa takođe naglašava prozonski efekat. Pro-zonski efekat je takođe bio evidentan na Slikama 4C i 4E. Važno je napomenuti, da mišji 2 Λ1 i himerna 2 Λ1 CD47 antitela nisu imala hemaglutinacionu aktivnost na svim koncentracijama.
[0258] Kao što je prikazano na Slici 4E, mišje 1134 antitelo prikazivalo je uzak opseg hemaglutinacije.
[0259] Region VH lanca 1B4 antitela je obezbeđen u nastavku.
[0260] Region VL lanca 1B4 antitela je obezbeđen u nastavku.
[0261] Hemaglutinacioni kapacitet humanizovanog antitela izvedenog iz mišjeg 2A1 testiran je kao prethodno. Važno je napomenuti da, reprezentativno humanizovano antitelo AB6.12 u brojnim humanim IgG izotipovima (IgG1, IgG4-S228P, i IgG4-S228P/L235E) nije izazvalo bilo kakvu RBC hemaglutinaciju. 2A1 i 2A1-xi su uključena kao kontrola za nehemaglutinaciona antitela, dok su B6II12 i 9E4 uključena kao pozivina kontrola za hemaglutinaciju (Slika 4F).
PRIMER 6: Vezivanje za CD47 makaki majmuna
[0262] Procenjena je sposobnost mišjeg 2A1 da se vezuje za CD47 makaki (cyno) majmuna. Ranije je objavljeno da je B6H12 antitelo unakrsno reaktivno sa cyno CD47 i korišćeno je kao pozitivna kontrola na cyno CD47 u analizi. Eksperiment za merenje vezivanja 2A1 za CD47 makaki majmuna je dizajniran za poređenje vezivanja 2A1 za CD47 na B-ćelijama makaki majmuna i humanim ćelijama, naznačeno time da je Raji ćelijska linija korišćena kao humana CD47 pozitivna ćelija. Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMCs) makaki majmuna su izolovani iz cele krvi makaki majmuna sa ficoll-paque gradijentom centrifugiranja. Mamaki i humane B-ćelije (Raji) su obeležene sa humanim CD20 antitelom ofatumumab (Arzerra) sa 10 µg/ml, i reagovane sa serijom razblaženja mišjeg CD47 antitela 2A1 ili B6H12. B-ćelije obeležene sa humanim CD20 antitelom su detektovane sa poliklonskim anti-humanim antitelom konjugovanim sa DyLite 649, dok su CD47 mišja antitela detektovana sa poliklonskim anti-mišjim antitelom konjugovanim sa DyLite 488. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom, prvo je mereno sa gejtom na živim ćelijama sa FSC i SSC, zatim na ćelijama pozitivnim za FL4 (CD20 pozitivnim), i na kraju medijalnim FL1 (CD47 pozitivnim). Podaci su normalizovani deljenjem signala na svakoj koncentraciji sa maksimalnim signalom za svako antitelo na svakoj populaciji ćelija. Normalizovani rezultati prikazani na Slici 5 otkrili su da 2A1 ne reaguje unakrsno sa cyno CD47 i ima identičan afinitet u poređenju sa humanim CD47. Konzistentno sa prethodno predstavljenim rezultatima, B6II12 je imalo niži afinitet za CD47 na površini ćelije i na Raji i na B-ćelijama makaki majmuna u poređenju sa antitelima prema predmetnom pronalasku.
PRIMER 7: Stvaranje himernog antitela
[0263] Da bi se identifikovale sekvence varijabilnih regiona teških (VH) i lakih (VL) lanaca mišjeg 2 Λ1 antitela, ribonukleinske kiseline (RNK) su izolovani iz hibridoma i korišćeni za lančanu reakciju polimeraze sa reverznom transkripcijom (RT-PCR) (Phusion RT-PCR Kit Thermo Scientific) da bi se stvorio prvi lanac cDNK. Set degenerativnih prajmera koji pokriva ceo repertoar lider sekvenci i VH i VL mišjeg antitela korišćen je u PCR naznačeno time da je prvi lanac cDNK služio kao templejt.
[0264] Forward prajmeri (mišji IgG lider) su obezbeđeni u nastavku.
Naziv Sekvenca
VH1-1 CACTGCAGGTRTCCACTCC (SEQ ID NO: 82)
VH1-2 CATAGCAGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 83)
VH1-3 CRCTACAGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 84)
VH1-4 GCYACAGMTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 85)
VH1-5 CACTGCAGGTGTCCWMTCC (SEQ ID NO: 86)
Naziv Sekvenca
VH1-6 CRCTRCAGGTGTKCACTCC (SEQ ID NO: 87)
VH1-7 GCTAWMGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 88)
VH1-8 CCTCAGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 89)
VH1-9 GCTACAGGTGCTCACTCC (SEQ ID NO: 90)
VH1-10 CACTGCAGGTGTCCTCTCT (SEQ ID NO: 91)
VH1-11 CAYTGCAGGTGTCCAYTGC (SEQ ID NO: 92)
VH1-12 GCTAMMGGTGTCCACTTC (SEQ ID NO: 93)
VH1-13 CTCCTGTCAKTAACTKCAGGT (SEQ ID NO: 94)
VH1-14 CAACTGCAGGTGTCTCTCT (SEQ ID NO: 95)
VH1-15 CRCTRCAGGYGTCCACTCT (SEQ ID NO: 96)
VH2-1 CCAAGCTGTATCCTTTCC (SEQ ID NO: 97)
VH2-2 CCAAGCTGTGTCCTRTCC (SEQ ID NO: 98)
VH3-1 CTTGACAGYCVTTCCKGGT (SEQ ID NO: 99)
VH3-2 CTTCACAGCCTTTCCTGGT (SEQ ID NO: 100)
VH4 CTTAAAAGGGGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 101)
VH5-1 CAYTTTAAAARGTGTCMAGTGT (SEQ ID NO: 102)
VH5-2 GTTTTAAAAGGTGTCCTGTG (SEQ ID NO: 103)
VH6 CTYTTAAAAGGKGTCCAGWG (SEQ ID NO: 104)
VH7-1 CYTTTAMATGGTATCCAGTGT (SEQ ID NO: 105)
VH7-2 CTTTTACATGGTTTCAAGTGT (SEQ ID NO: 106)
VH8 GTCCCTGCATATGTCYT (SEQ ID NO: 107)
VH9 GATGGCAGCWGCYCAAAG (SEQ ID NO: 108)
VH10 CTATCAAGGTGTGCATTGT (SEQ ID NO: 109)
VH11 CTTTTAAAAGWTGTCCAGKGT (SEQ ID NO: 110)
VH12 GTGACAGTCCTTCCTGGTAG (SEQ ID NO: 111)
VH14 CTTCCTGATGGCAGTGGTT (SEQ ID NO: 112)
VH15 GCTACAGGTATCCAATCC (SEQ ID NO: 113)
[0265] Reverzni prajmer (mišji IgG konstantni) je obezbeđen u nastavku.
Naziv Sekvenca GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC HC-Rev
(SEQ ID NO: 114)
1
[0266] Forward prajmeri (mišji Ig Kapa lider) su obezbeđeni u nastavku.
Naziv Sekvenca
VK1-1 CTGWTGTTCTGGATTCCTG (SEQ ID NO: 115) VK1-2 GGTCAGACAGTCAGCAGT (SEQ ID NO: 116)
VK2 GTGCTCTGGATTCGGGAA (SEQ ID NO: 117)
VK4/5-1 CAGCTTCYTGCTAATCAGTG (SEQ ID NO: 118) VK4/5-2 CTAATCAGTGCTTCAGGA (SEQ ID NO: 119)
VK8-1 GTGGGTATCTGGTRCSTGTG (SEQ ID NO: 120)
VK8-2 GGAAATTTAAAAGTACCTGTGGG (SEQ ID NO: 121)
VK9A/9B-1 GGTTTCMAGGTRCCAGATGT (SEQ ID NO: 122) VK9A/9B-2 CTCTGGTTYCCAGGTATC (SEQ ID NO: 123)
VK10 CTGTTTTCAAGGTRCCAGATGT (SEQ ID NO: 124)
VK11 GTTGTAATGTCCAGAGGA (SEQ ID NO: 125) VK12/13-1 CTTACAGGTGCCAGATGT (SEQ ID NO: 126) VK12/13-2 CTCAATTGTAGRTGCCAGATGT (SEQ ID NO: 127) VK12/13-3 CACAGTAGGTGTCAGATGT (SEQ ID NO: 128) VK12/13-4 GTCGTAGTTGTCAGATGT (SEQ ID NO: 129) VK12/13-5 CCTCCTTCTTGGCCAAGA (SEQ ID NO: 130) VK19/28-1 CTTATATGGAGCTGATGGG (SEQ ID NO: 131) VK19/28-2 GTGTCTGGTGCTCATGGG (SEQ ID NO: 132) VK19/28-3 CTSTGGTTGTCTGGTGTTGA (SEQ ID NO: 133) VK20 GTCTCTGATTCTAGGGCA (SEQ ID NO: 134) VK21-1 CTKCKCTGGGTTCCAG (SEQ ID NO: 135) VK21-2 GCAGGTGTTGACGGA (SEQ ID NO: 136) VK22-1 CAGGTGCCTCGTGCAC (SEQ ID NO: 137) VK22-2 CTCTGGTGCCTGTGCA (SEQ ID NO: 138)
VK23 CTGGAYTYCAGCCTCCAGA (SEQ ID NO: 139)
VK24/25-1 GWTCTCTRGAGTCAGTGGG (SEQ ID NO: 140) VK24/25-2 CTGGATCCCTGGAKCYACT (SEQ ID NO: 141) VK32 GTTCTGCTTTTTAGGTGTG (SEQ ID NO: 142) VK33/34 GATCCCAGGCATGATATGT (SEQ ID NO: 143) VK31/38C CTTCATGGTGCTCAGTGT (SEQ ID NO: 144)
VKRF CCATATCAGGTGCCCAGTGT (SEQ ID NO: 145)
2
[0267] Reverzni prajmer (mišji IgKapa konstantni) je obezbeđen u nastavku.
Naziv Sekvenca
LC -rev GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG (SEQ ID NO: 146)
[0268] Amplifikovani VH i VL su nakon toga klonirani u-okviru u vektore koji sadrže odgovarajuće sekvence za izlučivanje antitela i humane IgG1 i Igkapa konstantne regione, respektivno, da bi se stvorili mišji:humani himerni DNK konstrukti. Ovi konstrukti su kotransfektovani u 293Freestyle ćelije (Life Technologies) i rezultujuće antitelo je prečišćeno iz supernatanta ćelijske kulture sa Protein-A hromatografijom. Da bi se odredilo da su identifikovane korektne VH i VL sekvence, himerno 2A1 (označeno 2A1-xi) upoređeno je sa mišjim roditeljskim 2A1 antitelom i CD47 analizom vezivanja sa How citometrijom na Raji ćelijama (Slika 6). B6H12 je takođe uključeno kao pozitivna kontrola u ovoj analizi. Vezano 2A1-xi je detktovano korišćenjem FITC-konjugovanog anti-humanog IgG sekundarnog antitela. Vezano 2A1 i B6II12 su detektovani korišćenjem FITC-konjugovanog anti-mišjeg IgG sekundarnog antitela. Očigledni afiniteti su određeni nelinearnim fitovanjem (Prism Graphpad Software) medijana intenziteta fluorescencije na različitim koncentracijama antitela (Tabela 2). 2A1-xi antitelo je imalo slični afinitet vezivanja kao mišje 2A1 antitelo prema CD47 na ćelijskoj površini, demonstrirajući da su VH i VL sekvence ispravno identifikovane.
Tabela 2.
PRIMER 8: Humanizacija antitela
[0269] Mišje 2A1 CD47 antitelo je humanizovano da bi se smanjio potencijal za imunogenost pri primeni na humanog pacijenta. Sekvence VH i VL regiona 2A1 su poređene sa sekvencama humanog antitela u IMGT bazi podataka. Nakon toga, generisan je strukturni model 2A1 VII i VL regiona korišćenjem poznatih struktura najsrodnijih humanizovanih i humanih antitela u Protein Data Bank (PDB). 3 regiona koji određuju komplementarnost (CDR) i u teškim i u lakim lancima 2A1 antitela su fiksirani i mišji okvirni regioni su zamenjeni sa brojnim humanim okvirnim regionima koji su imali najveću verovatnoću da zadrže ispravnu orijentaciju CDRs. Konstrukti skoji su odgovarali svakoj humanizovanoj 2A1 varijanti generisani su genskom sintezom i klonirani u-okviru u vektore koji sadrže odgovarajuću sekretornu sekvencu i humane IgG1 i Igkapa konstantne regione. Različite kombinacije humanizovanih teških i lakih lanaca su ko-transfektovane u 293Freestyle ćelije (Life Technologies), i rezultujuća antitela su prečišćena iz supernatanta ćelijske kulture sa Protein-A hromatografijom.
[0270] Humanizovana antitela su testirana u odnosu na njihovu sposobnost da vezuju Raji ćelije preko protočne citometrije (Slika 7). 2A1-xi antitelo je korišćeno kao kontrola u većini ovih analiza da bi sepostavio benčmark za afinitet vezivanja. Humanizovana antitela su dodatno optimizovana da bi se poboljšala ekspresija i redukovala problematična mesta uključujući potencijalna mesta izomerizacije i deamidacije. Primer optimizovanog humanizovanog antitela izvedenog iz mišjeg 2A1 antitela je označen kao AB6.12 antitelo, koje pokazuje veoma sličan afinitet vezivanja kao 2A1-xi antitelo (Slika 7H; Tabela 3). Vidljivi afiniteti su određeni nelinearanim fitovanjem (Prism Graphpad Software) medijane intenziteta fluorescencije na različitim koncentracijama antitela.
Tabela 3
[0271] AB6.12 antitelo je naknadno konvertovano iz IgG1 u druge humane IgG izotipove zamenom konstantnog domena teškog lanca. Kao što je prikazano na Slici 7I, promena IgG izotipa u zglobno stabilizovanu verziju IgG4 (IgG4P: S228P), i redukovanu Fc receptor vezujuću varijantu zglobno stabilizovanog IgG4 (IgG4PE: S228P/L235E) nije izmenila afinitet vezivanja humanizovanog antitela prema CD47 na ćelijskoj površini (Slika 7I; Tabela 4). Vidljivi afiniteti su određeni nelineranim fitovanjem (Prism Graphpad Software) medijane intenziteta fluorescencije na različitim koncentracijama antitela.
Tabela 4
4
[0272] Tokom procesa humanizacije, CD47 antitela su testirana da bi se osiguralo da je SIRPα blokirajuća funkcionalnost intaktna. Kao što je prikazano na Slici 7J, više IgG izotipova humanizovanog antitela, AB6.12, blokiralo je SIRPα:CD47 interakciju, korišćenjem How citometrija-zasnovanog postupak opisanog prethodno u Primeru 3. Primer CD47 antitela i njihov odgovarajući VII region i VL region uključuju one obezbeđene u Tabeli 1.
[0273] Tokom procesa humanizacije, određeno je da u nekim primerima izvođenja, motiv aminokiselinske sekvence, "NA," na početku VII CDR3 (SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 77) je važan za vezivanje CD47 antitela opisanih ovde. U nekim primerima izvođenja, u odsustvu aminokiselinskih ostataka "NA" na početku VIICDR3 (SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 77), CD47 antitela prema pronalasku se nisu vezivala za njihov target ili su se vezivala za njihov target sa nižim afinitetom nego što bi to bilo u prisustvu aminokiselinskih ostataka "NA." Na primer, kada je "NA" motiv promenjen u više kanonijske motive "AR" ili "AT," vezivanje je značajano smanjeno (tj., više od deset puta). U drugim primerima izvođenja, u odsustvu aminoksielinskih ostataka "NA" na početku VH CDR3 (SEQ ID NO: 52 ili SEQ ID NO: 77), CD47 antitela prema pronalasku vezuju se za njihov target sa jednakim afinitetom u poređenju sa vezivanjem u prisustvu aminokiselinskih ostataka "NA."
[0274] Stručnjaci će prepoznati da je moguće odrediti, bez nepotrebnog eksperimentisanja, da li će aminokiselinska supstitucija u sekvencama CD47 antitela prema pronalasku rezultovati u antitelu sa značajno istom funkcijom, npr., CD47 antitelo sa sposobnošću da blokira SIRPα i ne izazove značajan nivo hemaglutinacije.
[0275] Slika traga iz ekskluzione hromatografije korišćenjem AKTA FLPC sa superdex200 kolonom je prikazna na Slici 8A. IgG1, IgG4P, i IgG4PE varijante AB6.12 antitela su prikazane. Sve tri varijante su preko 98% monomerne. Slika 8B je fotografija SDS-PAGE gela obojenog sa komasi plavim brojnih humanizovanih varijanti 2A1 pod redukujućim (R) i neredukujućim (NR) uslovima.
PRIMER 9: CD47 antitela promovišu fagocitozu ćelijskih linija tumora
[0276] CD47 je receptor na ćelijskoj površini koji je ushodno regulisan na ćelijama tumora i takođe se smatra da doprinosi imunog izbegavanju preko njegove interakcije sa prirodnim ligandom SIRPα. Ligacija CD47 sa SIRPα na makrofagama rezultuje u sniženoj fagocitoznoj aktivnosti. Kao što je detaljno opisano u nastavku, određeno je da CD47 vezujuća i SIRPα blokirajuća aktivnost 2A1 antitela, i njegovih varijanti, promoviše fagocitozu tumorskih ćelija u prisustvu humanih makrofaga.
[0277] PBMCs su izolovane iz humane krvi, i monociti su diferencirani u makrofage njihovomo inkubacijom u AIM-V medijumu (Life Technologies) 7 dana. Ovi makrofagi izvedeni iz monocita (MDMs) postaju adhezivni omogućavajući da se druge ćelije ispriraju. MDMs su sastrugane i ponovo postavljene u posude sa 12-bunarčića i omogućeno je da se zalepe 24 časa. Humana tumorska ćelijska linija CCRF-CFM j izabrana kao target ćelijski tip zbog svoje visoke CD47 ekspresije. CCRF-CEM ćelije su obeležene sa 0.3 μM CFSE na 37°C 15 minuta, zatim isprane i dodate u MDMs sa odnosom od 4:1 tumorskih ćelija po fagocitu, i CD47 antitelo je dodato na različitim koncentracijama. Fagocitoza target ćelijaomogućena je 3 časa. Nakon toga, nefagocitirane target ćelije su isprane sa PBS. Preostali fagociti su sastrugani, obojeni sa antitelom na makrofag markerom CD 14 konjugovanim sa DyLite 649 (Biolegend), i analizirani protočnom citometrijom. Fagocitoza je merena gejtovanjem na žive ćelije koje su bile FL4 pozitivne (CD14+), i zatim procenom procenta FL1 (CFSE+) pozitivnim ćelijama.
[0278] Slika 9 prikazuje da su CD47 antitelo 2A1 i njegove humanizovane varijante demonstrirale dozno zavisno povećanje u fagocitozi tumorskih ćelija od strane MDMs. Antitelo 2A1 i humanizovana varijanta A132.05 bili su jedinstveni po njihovoj sposobnosti da indukuju fagocitozu tumorskih ćelija na 66.7 pM, dok B6II12 nisu imale aktivnost na toj koncentraciji (Slika 9A). Slika 9B prikazuje kako 2A1, i humanizovane varijante AB2.05, AB6.12-IgG1, AB6.12-IgG4P, i AB6.12-IgG4PE svi indukuju maksimalnu fagocitozu na 0.3 µg/ml ili 2 nM, dok B6H12 zahteva više koncentracije. Ovi podaci pokazuju da CD47 antitelo, 2A1 (i humanizovane varijante izvedene iz njega), indukuju makrofag-posredovanu fagocitozu CD47 pozitivnih tumorskih ćelija. U ovom primeru, CCFR-CEM ćelije su korišćene kao CD47 pozitivna target ćelija.
Primer 10: Antitumorska aktivnost CD47 antitela
[0279] Anti-tumorska aktivnost mišjeg CD47 antitela je procenjivana u Raji modelu limfoma. Raji ćelije su implantirane potkožno u NOD/SCID miševe, i randomizovane u 5 grupa (10 miševa po grupi, dan 0). Grupa 1: Vehikulum (samo pufer); Grupa 2: B6H12 (pozitivna kontrola); Grupa 3: 1B4; Grupa 4: 2A1; i Grupa 5: 9E4. Tretman sa svakim antitelom ili vehikulumom (samo pufer) počeo je kada su tumori posatali palpabilni (50 mm<3>, dan 13) i miševi su eutanazirani kada su njihove zapremine tumora dostigle ∼1500 mm<3>. Zapremine tumora su merene 3 puta nedeljno. Antitela su dozirana intravenski (IV) sa 200 µg 3 puta nedeljno 3 nedelje (9 doza ukupno po mišu). Tretman je započet na dan 13 i završen na dan 32.
[0280] Kao što je prikazano na Slici 10A, CD47 antitela prema pronalasku, naročito 2A1 antitelo, pokazali su antitumorsku aktivnost u ovom životinjskom modelu limfoma. Da bi se dostigla zapremina tumora od 1500 mm<3>, Grupa 1 (samo vehikulum) zahtevala je ∼25 dana; Grupa 2 (B6H 12.2) zahtevala je ∼45 dana; Grupa 3 (1B4) zahtevala je ∼37 dana; Grupa 4 (2A1) zahtevala je ∼85 dana; i Grupa 5 (9E4) zahtevala je ∼40 dana da se dostigne zapremina tumora ∼1500 mm<3>. Ovi podaci ukazuju da je antitelo 2A1 značajno potentnije od svih testiranih CD47 vezujućih antitela, uključujući B6H12 za koje je bilo poznato da vezuje CD47, blokira CD47 interakciju sa SIRPα, i suprimira formiranje tumora u mišjim modelima humanih kancera. Neočekivano, supresivna aktivnost u odnosu na tumor ovih CD47 antitela nije bila u korelaciji sa njihovom potencijom za vezivanje CD47 ili blokiranje CD47 interakcije sa SIRPα, koja bi se očekivala na osnovu publikovanih podataka.
[0281] Kao što je opisano u Primerima 2 i 3, 2A1, 1B4, i 9E4 imali su sličan afinitet za CD47 i sličnu potenciju za blokiranje CD47 interakcije sa SIRPα. Dodatno, poboljšana efikasnost 2A1 ne može se objasniti razlikama u Fc domenu opisanog antitela jer sva antitela korišćena u ovoj studiji su bila sastavljena od identičnih mišjih IgGI domena. Stoga, dodatno jedinstvenoj kompoziciji materijla, 2A1 antitelo poseduje neočekivane i jedinstvene karakteristike uključujući nesposobnost da indukuje homotipske interakcije između CD47 eksprimirajućih ćečija, npr., crvenih krvnih ćelija, i poboljšanu aktivnost supresije tumora koji se ne mogu objasniti poboljšanim vezivanjem za CD47 ili poboljšanom sposobnošću da blokira CD47 interakciju sa SIRPα.
[0282] Da bi se potvrdilo da su humanizovana 2A1 antitela održala njihovu anti-tumorsku aktivnost, izvedena je slična studija na Raji tumoru. Dizajn studije bio je isti kao što je opisan prethodno. Raji ćelije su implantirane potkožno u NOD/SCID miševe i randomizovane u 5 grupa (10 miševa po grupi, dan 0). U ovoj studiji, antitela su dozirana intraperitonealno (IP) sa 200 µg 3 puta nedeljno 3 nedelje (9 doza ukupno po mišu), i zapremine tumora su merene 3 puta nedeljno. Međutim, za ovu studiju, mišje IgG1 2A1 antitelo (grupa 2) je poređeno sa humanizovanim derivatom, AB6.12. Za ovu studiju, AB6.12 je konstruisano (kao što je opisano u PRIMERU 8) u humanom IgG1 (Grupa 3), humanom IgG4P (Grupa 4) i humanom IgG4PE (Grupa 4). Stoga, ovaj eksperiment je dizajniran da se adresira uticaj 2A1 humanizacije na njegovu aktivnost supresije tumora i potencijalnu ulogu efektorne funkcije Fc domena za koji je poznato u tehnici da doprinosi antitumorskim aktivnostima mnogih antitela. Dobro je dokumentovano da humani IgG1 poseduje značajno veću efektornu funkciju u poređenju sa humanim IgG4P. IgG4PE je razvijen da bi se dodatno smanjila efektorna funkcija. Kao što se može videti na Slici 10B, humanizacija 2A1 nije umanjila antitumorsku aktivnost 2A1, i ustvari je poboljšala. AB6.12-hIgG1, AB6.12-hIgG4P, i AB6.12-hIgG4PH svi su pokazali sličnu anti-tumorsku aktivnost koja izgleda da je značajno veća od mišjeg 2A1 (2A1 mIgG). Ovaj rezultat je neočekivan jer 2A1mIgG1, AB6.12- hIgG1, AB6.12-hIgG4P i AB6.12-hIgG4PE imaju slično CD47 vezujuće i SIRPα blokirajuće aktivnosti. Dodatno, kako AB6.12-hIgG1, AB6.12-hIgG4P i AB6.l2-hIgG4PE imaju slične anti-tumorske aktivnosti, izgleda da efektorna funkcija igra ulogu u efikasnosti humanizovanog 2A1 antitela AB6.12.
Primer 11: Ko-kristalizacija CD47 antitela sa CD47
[0283] CD47 transmembranski protein sa 5 prolaza i jednim ekstracelularnim IgV (imunoglobin-slični varijabilni tip) domenom koji je visoko glikozilovan na 6 mesta. Struktura CD47-IgV domena je razrešena u kompleksu sa IgV domenom SIRPα, njegovim rpirodnim ligandom (Protein Data Bank (PDB) Reference No. 2JJS; Hatherley et al., 2008 Mol Cell, 25;31(2): 266-77 (Slika 11A)). Struktura prikazuje SIRPα-IgV vezivanje sa CD47-IgV na apikalnom epitopu uključujući N-terminalni piroglutamat CD47. Ova struktura dovoljno objašnjava kako oba transmembranska proteina na ćelijskoj površini mogu produktivno interagovati sa susednih ćelija u orijentaciji glava prema glavi. Kristalografska struktura CD47- IgV u kompleksu sa B6II12 Fab dobijena rendgenskim zracima je prikazana na Slici 11B. Zarad jasnoće, konstantni regioni Fab (CH1 i CL) su izostavljeni na Slici, i samo je predstavljen Fv (VII VL). Ovo je otkrilo apikalno vezujuće mesto, pozicionirajući ovo antitelo na površini ekstremno distalno u odnosu na ćelijsku membranu (Slika 11B). Mehanizam SIRPα blokiranja sa B6H12 je očigledan iz ove strukture. Relativna lokacija ćelijske membrane za svrhe orijentacije je prikazana kao isprekidana linija na Slici 11.
[0284] Da bi se odredio target epitop antitela prema predmetnom pronalasku, određena je kristalografksa struktura dobijena rendgenskim zracima ko-kompleksa f CD47-IgV domena i Fab 2A1-xi (himerno antitelo sa humanim CIII i CL domenima) (Slika 11C). Zarad jasnoće, konstantni regioni Fab (CHI i CL) su izostavljeni sa Slike, i samo je predstavljen Fv (VII i VL). Za razliku od prethodno određene strukture CD47 vezujućeg SIRPα u orijentaciji glava prema glavi (Slika 11A), i B6II12 antitela koje je postavljeno apikalno udaljeno od membrane (Slika 11B), struktura 2A1 u kompelksu sa CD47 otkrila je vezivanje antitela sa CD47 blizu membrane u neočekivanoj i jedinstvenoj glava prema boku orijentaciji (Slika 11C). 2A1 epitop na CD47 je diskontinuiran, i uključuje ostatke Y37, K39, K41, KGRD (SEQ ID NO: 56) petlju (ostaci 43-46), D51, H90, N93, E97, T99, E104, i F106 od CD47 kada je numerisano u skladu sa SEQ ID NO: 147 (tj., SEQ ID NO: 48 isključujući signalnu sekvencu (aminokiseline 1-18)). Struktura 2A1 vezana sa CD47 takođe otkriva da je VII primarno uključen u vezivanje sa KGRD (SEQ ID NO: 56) petlju CD47, dok VK domen interaguje sa apikalnim ostacima uključujući Y37, T102, i E104, koji su uključeni u SIRPα vezivanje. Stoga, primarno je da VK domen koji fizički sprečava SIRPα vezivanje sa CD47. Ove strukturne studije sugerišu da jedinstveni epitop za koji se 2A1 vezuje je na boku CD47. Za razliku od CD47 antitela poznatih u tehnici, orijentacija 2A1 VII regiona u membranski proksimalnom položaju je kritična osobina ovog antitela koja sprečava značajan nivo hemaglutinacije crvenih krvnih ćelija ograničavanjem antitela tako da ne može da napravi most do CD47 molekula na susednim ćelijama.

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Izolovano monoklonsko antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment koji se vezuje za humani CD47, naznačeno time da antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment se vezuje za diskontinuirani epitop na CD47, naznačeno time da diskontinuirani epitop sadrži aminokiselinske ostatke Y37, K39, K41, K43, G44, R45, D46, D51, H90, N93, E97,T99, E104, i E106 CD47 kada je numerisan u skladu sa SEQ ID NO: 147, i naznačeno time da antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sprečava CD47 interakciju sa signalnimregulatornim-proteinom α (SIRPα) i ne izaziva značajan nivo aglutinacije ćelija nakon primene.
2. Antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je himerni ili humanizovani.
3. Antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time da antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment promoviše makrofagposredovanu fagocitozu CD47-eksprimirajuće ćelije.
4. Antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time da antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je IgG izotip izabran iz grupe koja se sastoji od IgG 1 izotipa, IgG2 izotipa, IgG3 izotipa, i IgG4 izotipa.
5. Antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time da antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment je IgG izotip izabran od IgG4P i IgG4PE.
6. Antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time da antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sadrži:
(i) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 72,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 71, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(ii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(iii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 67, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 69, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(iv) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 67, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 70, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(v) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(vi) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 72, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(vii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 72, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 71, i
1 VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(viii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 76, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(ix) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 76, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 68, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 71, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55
(x) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 50, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 77, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(xi) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 57, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(xii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 60, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53, VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55;
(xiii) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 61, VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51, VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52, VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
2 VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55 ; ili
(xiv) VH CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 62,
VH CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 51,
VH CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 52,
VL CDR1 sekvencu datu u SEQ ID NO: 53,
VL CDR2 sekvencu datu u SEQ ID NO: 54, i
VL CDR3 sekvencu datu u SEQ ID NO: 55.
7. Antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time da antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment sadrži:
(i) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 5, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 31;
(ii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 5, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 32;
(iii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 33;
(iv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 34;
(v) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(vi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 36;
(vii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 37;
(viii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 38;
(ix) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 39;
(x) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 7, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 43;
(xi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 8, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 39;
(xii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 42;
(xiii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 43;
(xiv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 44;
(xv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 11, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 47;
(xvi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 15, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 43;
(xvii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 15, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 44;
(xviii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 16, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xix) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 17, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xx) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 20, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xxi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 21, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xxii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 22, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xxiii) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 27, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xiv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 28, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35;
(xv) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 29, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35 ; ili
(xvi) VH sekvencu datu u SEQ ID NO: 30, i
VL sekvencu datu u SEQ ID NO: 35.
8. farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 i nosač.
4
9. Antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment kao što je definisano prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7 za upotrebu u postupku olakšavanja simptoma kancera ili drugog neoplastičnog stanja u subjektu.
10. Antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 9, naznačeno time da subjekat je čovek.
11. Antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 ili 10, naznačeno time da postupak dodatno sadrži primenu hemoterapije.
12. Antitelo ili njegov imunološki aktivni fragment za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 ili 10, naznačeno time da postupak dodatno sadrži primenu radioterapije.
RSP20191071 2012-02-06 2013-02-06 Cd47 antitela i postupci za njihovu upotrebu RS59159B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261595216P 2012-02-06 2012-02-06
US201261659752P 2012-06-14 2012-06-14
EP13746964.9A EP2812443B1 (en) 2012-02-06 2013-02-06 Cd47 antibodies and methods of use thereof
PCT/US2013/024995 WO2013119714A1 (en) 2012-02-06 2013-02-06 Cd47 antibodies and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59159B1 true RS59159B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=48947976

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RSP20191071 RS59159B1 (sr) 2012-02-06 2013-02-06 Cd47 antitela i postupci za njihovu upotrebu

Country Status (35)

Country Link
US (4) US9045541B2 (sr)
EP (2) EP2812443B1 (sr)
JP (1) JP6273212B2 (sr)
KR (2) KR102338833B1 (sr)
CN (2) CN111533804A (sr)
AU (1) AU2013217114B2 (sr)
BR (1) BR112014019331A2 (sr)
CA (1) CA2863834C (sr)
CL (1) CL2014002086A1 (sr)
CO (1) CO7111273A2 (sr)
CR (1) CR20140406A (sr)
CY (1) CY1121911T1 (sr)
DK (1) DK2812443T3 (sr)
EA (1) EA034778B1 (sr)
EC (1) ECSP14016994A (sr)
ES (1) ES2743203T3 (sr)
HR (1) HRP20191500T1 (sr)
HU (1) HUE13746964T2 (sr)
IL (1) IL233934B (sr)
LT (1) LT2812443T (sr)
ME (1) ME03512B (sr)
MX (1) MX360772B (sr)
MY (1) MY169341A (sr)
NZ (1) NZ628314A (sr)
PE (1) PE20141908A1 (sr)
PH (1) PH12014501758B1 (sr)
PL (1) PL2812443T3 (sr)
PT (1) PT2812443T (sr)
RS (1) RS59159B1 (sr)
SG (2) SG11201404638SA (sr)
SI (1) SI2812443T1 (sr)
SM (1) SMT201900453T1 (sr)
UA (1) UA116772C2 (sr)
WO (1) WO2013119714A1 (sr)
ZA (1) ZA201405864B (sr)

Families Citing this family (140)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2995315T3 (pl) 2009-05-15 2024-04-22 University Health Network Kompozycje i sposoby leczenia nowotworów hematologicznych celujące w oddziaływanie sirp alfa-cd47
DK3252076T3 (da) 2011-01-14 2019-12-02 Univ California Diagnostisk anvendelse af antistoffer mod ror-1-protein
KR102338833B1 (ko) 2012-02-06 2021-12-13 인히브릭스, 인크. Cd47 항체 및 그 사용 방법
US20140140989A1 (en) * 2012-02-06 2014-05-22 Inhibrx Llc Non-Platelet Depleting and Non-Red Blood Cell Depleting CD47 Antibodies and Methods of Use Thereof
CN105121467B (zh) 2012-12-03 2019-07-05 诺夫免疫股份有限公司 抗cd47抗体及其使用方法
MX2015007446A (es) 2012-12-12 2015-12-07 Vasculox Inc Anticuerpos terapeuticos para cd47.
US9221908B2 (en) 2012-12-12 2015-12-29 Vasculox, Inc. Therapeutic CD47 antibodies
ES2914814T3 (es) 2012-12-17 2022-06-16 Pf Argentum Ip Holdings Llc Tratamiento de células enfermas CD47+ con fusiones SIRP Alfa-Fc
CN105101997B (zh) * 2013-02-06 2018-11-09 印希彼有限合伙公司 不减少血小板和不减少血红细胞的cd47抗体及其使用方法
PT2970493T (pt) * 2013-03-15 2019-06-27 Univ Leland Stanford Junior Métodos para obter doses terapeuticamente eficazes de agentes anti-cd47
US11066467B2 (en) 2013-12-17 2021-07-20 Mhs Care-Innovation Llc Compositions and methods for treating ischemic heart disease
EP3828203B1 (en) * 2013-12-17 2024-04-24 MHS Care - Innovation LLC Compositions and methods for treating fatty tissue buildup
US10548951B2 (en) 2013-12-17 2020-02-04 Mhs Care-Innovation Llc Compositions and methods for treating obesity and hyperphagia
ES3012974T3 (en) * 2014-01-08 2025-04-10 Univ Leland Stanford Junior Targeted therapy for lung cancer
CA2967379A1 (en) 2014-11-18 2016-05-26 Janssen Pharmaceutica Nv Cd47 antibodies, methods, and uses
WO2016109415A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 Celgene Corporation Anti-cd47 antibodies and uses thereof
EP3247464B1 (en) * 2015-01-21 2019-09-18 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Use of tlr agonist and anti-cd47 agent to enhance phagocytosis of cancer cells
MA41463A (fr) 2015-02-03 2017-12-12 Anaptysbio Inc Anticorps dirigés contre le gène d'activation 3 des lymphocytes (lag-3)
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
TWI778518B (zh) * 2015-03-04 2022-09-21 美商索倫多醫療公司 結合cd47之抗體治療劑
CN104804093A (zh) * 2015-05-27 2015-07-29 江苏春申堂药业有限公司 一种针对cd47的单域抗体
BR112018005322A2 (pt) * 2015-09-18 2018-12-11 Arch Oncology, Inc. anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antígenos, composição farmacêutica, anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antígenos para uso, método de tratamento de lesão de isquemia-reperfusão, método de tratamento de câncer em um paciente humano, método de avaliação da expressão de cd47 em células tumorais e/ou imunes usando um anticorpo monoclonal ou seu fragmento de ligação a antígenos
NZ741324A (en) 2015-09-21 2021-09-24 Erasmus Univ Medical Center Anti-cd47 antibodies and methods of use
EP3747906A1 (en) 2016-01-11 2020-12-09 Forty Seven, Inc. Humanized, mouse or chimeric anti-cd47 monoclonal antibodies
AU2017250809B2 (en) 2016-04-15 2024-02-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for determining and achieving therapeutically effective doses of anti-CD47 agents in treatment of cancer
AR112048A1 (es) * 2016-05-09 2019-09-18 Celgene Corp Anticuerpos cd47 y métodos de uso de los mismos
CN106084052B (zh) * 2016-06-17 2019-12-27 长春金赛药业股份有限公司 抗cd47单克隆抗体及其应用
US12344669B2 (en) 2016-06-17 2025-07-01 Changchun Genescience Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-CD47 monoclonal antibody and use thereof
CN106117354B (zh) * 2016-06-24 2020-01-14 安徽未名细胞治疗有限公司 一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体及其应用
CN109689684B (zh) * 2016-07-06 2022-09-23 细胞基因公司 具有低免疫原性的抗体及其用途
JP7241677B2 (ja) 2016-07-19 2023-03-17 テバ・ファーマシューティカルズ・オーストラリア・ピーティワイ・リミテッド 抗ｃｄ４７併用療法
WO2018014068A1 (en) * 2016-07-19 2018-01-25 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Attenuated type i ifn cd47 combination therapy
CN107955071B (zh) * 2016-10-18 2021-03-26 上海赛远生物科技有限公司 人源抗人cd47抗体及其编码基因与应用
BR112019008010A2 (pt) * 2016-10-20 2019-07-09 I-Mab anticorpo monoclonal isolado ou fragmento imunologicamente ativo do mesmo, anticorpo monoclonal biespecífico isolado, composição farmacêutica, método para tratamento de uma doença em um sujeito humano em necessidade do mesmo, proteína de fusão, epítopo imunodominante codificado pelo gene cd47, e, molécula biológica
EP3529276A4 (en) * 2016-10-21 2020-06-17 Arch Oncology, Inc. CD47 THERAPEUTIC ANTIBODIES
EP3532497B1 (en) 2016-10-26 2024-07-24 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Modified immunoglobulin hinge regions to reduce hemagglutination
CA3042581A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Trillium Therapeutics Inc. Enhancement of cd47 blockade therapy by proteasome inhibitors
WO2018081898A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Trillium Therapeutics Inc. Improvements in cd47 blockade therapy by hdac inhibitors
WO2018095428A1 (zh) * 2016-11-28 2018-05-31 江苏恒瑞医药股份有限公司 Cd47抗体、其抗原结合片段及其医药用途
EP3574009A4 (en) * 2017-01-26 2020-11-25 Zlip Holding Limited CD47 ANTIGEN BINDING UNIT AND ITS USES
SG11201908602UA (en) * 2017-03-22 2019-10-30 Arch Oncology Inc Combination therapy for the treatment of solid and hematological cancers
AU2018250641B2 (en) 2017-04-11 2025-03-13 Inhibrx Biosciences, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained CD3 binding and methods of using the same
MX2019012295A (es) 2017-04-14 2020-02-07 Tollnine Inc Polinucleotidos inmunomoduladores, conjugados de anticuerpos de los mismos y metodos para su uso.
WO2018236904A1 (en) 2017-06-19 2018-12-27 Surface Oncology, Inc. COMBINATION OF ANTI-CD47 ANTIBODIES AND CELL DEATH INDUCING AGENTS, AND USES THEREOF
CN109096395B (zh) * 2017-06-20 2022-06-24 华兰生物工程股份有限公司 阻断型cd47纳米抗体及其用途
AU2018308191B2 (en) 2017-07-24 2023-12-21 Scenic Immunology B.V. Treating pathological conditions by direct and indirect targeting of SIRPa - CD47 interaction
JP7262440B2 (ja) * 2017-08-02 2023-04-21 フェインズ セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｃｄ４７抗体及びその使用
KR102631281B1 (ko) * 2017-08-10 2024-01-30 그리폴스 다이어그노스틱 솔루션즈 인크. 재조합 인간 cd38-세포외 도메인을 포함하는 조성물, 방법 및/또는 키트
EP3668897B1 (en) * 2017-08-18 2024-06-05 Centessa Pharmaceuticals (UK) Limited Binding agents
CN109422811A (zh) 2017-08-29 2019-03-05 信达生物制药(苏州)有限公司 抗cd47抗体及其用途
EA039662B1 (ru) 2017-10-03 2022-02-24 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Антитела, специфичные к cd47 и pd-l1
CN111417653A (zh) 2017-11-01 2020-07-14 蜂鸟生物科技控股私人有限公司 Cd47抗原结合分子
KR102366853B1 (ko) * 2017-11-10 2022-02-23 아이-맵 바이오파마 유에스 리미티드 Cd47 항체 및 사이토카인을 포함하는 융합 단백질
KR20200091901A (ko) 2017-12-01 2020-07-31 시애틀 지네틱스, 인크. 암을 치료하기 위한 cd47 항체 및 이의 용도
SG11202006877PA (en) * 2018-01-24 2020-08-28 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Anti-cd47 antibodies that do not cause significant red blood cell agglutination
CN110144009B (zh) * 2018-02-14 2020-01-21 上海洛启生物医药技术有限公司 Cd47单域抗体及其用途
GB201804860D0 (en) 2018-03-27 2018-05-09 Ultrahuman Two Ltd CD47 Binding agents
CN110305212A (zh) 2018-03-27 2019-10-08 信达生物制药(苏州)有限公司 抗cd47抗体及其用途
BR112020020604A2 (pt) 2018-04-11 2021-01-12 Inhibrx, Inc. Construções de polipeptídeo multiespecífico tendo ligação restrita de cd3 e métodos e usos relacionados
WO2019200357A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Surface Oncology, Inc. Biomarker for cd47 targeting therapeutics and uses therefor
CN110526972A (zh) * 2018-05-25 2019-12-03 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种抗cd47抗体在制备治疗淋巴瘤的药物中的用途
CN110577597B (zh) * 2018-06-11 2021-10-22 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体
CN112566662A (zh) * 2018-06-15 2021-03-26 阿库鲁斯生物科学公司 针对cd47的阻断抗体及其使用方法
CN110615841B (zh) * 2018-06-20 2022-01-04 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人cd47单克隆抗体及其应用
JP7579570B2 (ja) * 2018-06-29 2024-11-08 ノース・キャロライナ・ステイト・ユニヴァーシティ 術後治療用ｉｎ ｓｉｔｕ噴霧生体応答性免疫療法ゲル
WO2020009725A1 (en) * 2018-07-05 2020-01-09 Trican Biotechnology Co., Ltd Human anti-cd47 antibodies and uses thereof
TWI830774B (zh) * 2018-08-31 2024-02-01 大陸商南京聖和藥業股份有限公司 抗cd47抗體及其應用
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
SG11202104301SA (en) * 2018-10-31 2021-05-28 I Mab Biopharma Us Ltd Novel cd47 antibodies and methods of using same
EP3876977A1 (en) 2018-11-06 2021-09-15 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptors for phagocytosis
EP3892637A1 (en) * 2018-12-03 2021-10-13 Shanghai Pharmaexplorer Co., Ltd. Cd47 antibody, preparation method therefor and uses thereof
TW202045550A (zh) 2019-04-05 2020-12-16 美商西建公司 腫瘤選擇性結合cd47之抗體之工程
US11013764B2 (en) 2019-04-30 2021-05-25 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
CN110066336B (zh) * 2019-05-12 2021-11-09 杭州科兴生物科技有限公司 抗cd47单克隆抗体、片段及其医药用途
CN114206912B (zh) 2019-06-07 2025-02-11 Alx肿瘤生物技术公司 用于在血清学测定中减少结合cd47的药物的干扰的方法和试剂
EP3986935A4 (en) * 2019-06-19 2023-08-30 Lepu Biopharma Co., Ltd. Anti-cd47 antibodies and uses thereof
CN114761041A (zh) 2019-07-16 2022-07-15 吉利德科学公司 Hiv疫苗及其制备和使用方法
CN110256565B (zh) * 2019-08-02 2021-03-23 天津大学 抗cd47纳米抗体突变体及其应用
JP7831937B2 (ja) 2019-09-03 2026-03-17 クリエイト・メディシンズ，インコーポレーテッド ゲノム組込みのための方法および組成物
CN114786776B (zh) 2019-09-18 2026-03-24 拉姆卡普生物阿尔法股份公司 针对ceacam5和cd3的双特异性抗体
AU2020353182A1 (en) * 2019-09-27 2022-04-14 Beijing Starmab Biomed Technology Ltd Monospecific and multi-specific antibodies
CN114555123B (zh) 2019-10-18 2024-04-02 四十七公司 用于治疗骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的联合疗法
JP7520972B2 (ja) * 2019-10-25 2024-07-23 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 新規抗ｃｄ４７抗体及びその使用
KR20220091576A (ko) 2019-10-31 2022-06-30 포티 세븐, 인코포레이티드 혈액암의 항-cd47 및 항-cd20 기반 치료
GB201918230D0 (en) 2019-12-11 2020-01-22 Prec Therapeutics Ltd Antibodies and their uses
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
LT4081305T (lt) 2019-12-24 2024-11-25 Carna Biosciences, Inc. Diacilglicerolio kinazę moduliuojantys junginiai
KR20260017503A (ko) 2020-02-14 2026-02-05 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Ccr8에 결합하는 항체 및 융합 단백질, 및 이의 용도
BR112022017136A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-11 Tallac Therapeutics Inc Conjugação mediada por transglutaminase
TWI855236B (zh) 2020-02-28 2024-09-11 大陸商南京聖和藥業股份有限公司 抗cd47/抗pd-l1抗體及其應用
US12091681B2 (en) 2020-03-27 2024-09-17 Mendus B.V. Ex vivo use of modified cells of leukemic origin for enhancing the efficacy of adoptive cell therapy
CN116133679A (zh) 2020-06-30 2023-05-16 门德斯有限公司 白血病衍生细胞在卵巢癌疫苗中的用途
JP7789304B2 (ja) * 2020-07-31 2025-12-22 バイオ－テラ ソリュ－ションズ，エルティーディー． Ｃｄ４７抗体及びその応用
JP2023545983A (ja) 2020-10-07 2023-11-01 セルジーン コーポレイション リンパ系悪性腫瘍状態の二重特異性抗体治療
WO2022090556A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Hummingbird Bioscience Pte. Ltd. Bcma/taci antigen-binding molecules
CA3197423A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Daniel Getts Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof
WO2022120286A1 (en) 2020-12-06 2022-06-09 ALX Oncology Inc. Multimers for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
KR102757518B1 (ko) * 2020-12-07 2025-01-21 (주)이노베이션바이오 Cd47에 특이적인 항체 및 이의 용도
WO2022130016A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Instil Bio (Uk) Limited Tumor infiltrating lymphocytes and anti-cd47 therapeutics
EP4274853A4 (en) * 2021-01-05 2024-12-04 National Institute Of Biological Sciences, Beijing BISPECIFIC ANTIBODY TARGETING GPC3 AND CD47
KR20230157388A (ko) 2021-03-12 2023-11-16 멘두스 비.브이. 백신접종의 방법 및 cd47 차단의 용도
EP4308133A4 (en) 2021-03-17 2025-01-22 Myeloid Therapeutics, Inc. MANIPULATED CHIMERIC FUSION PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
AU2022272235A1 (en) 2021-05-11 2023-12-21 Create Medicines, Inc. Methods and compositions for genomic integration
WO2022271677A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2022271659A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
KR20240005901A (ko) 2021-06-23 2024-01-12 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 디아실글리세롤 키나제 조절 화합물
CA3222277A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2023277281A1 (ko) 2021-06-30 2023-01-05 (주)이노베이션바이오 Cd47에 특이적인 인간화 항체 및 이를 포함하는 cd47 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US20230183216A1 (en) 2021-10-28 2023-06-15 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
EP4422756A1 (en) 2021-10-29 2024-09-04 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
EP4452415B1 (en) 2021-12-22 2026-02-25 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
CN118488946A (zh) 2021-12-22 2024-08-13 吉利德科学公司 Ikaros锌指家族降解剂及其用途
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
WO2023154578A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
CA3253296A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Gilead Sciences, Inc. Zinc Finger Degradation Agents of the Ikaros Family and Their Uses
WO2023183313A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods
AU2023240346A1 (en) 2022-03-24 2024-09-19 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
TWI876305B (zh) 2022-04-05 2025-03-11 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
WO2023205719A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
US20240116928A1 (en) 2022-07-01 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
CN119677546A (zh) 2022-07-12 2025-03-21 吉利德科学公司 Hiv免疫原性多肽和疫苗及其用途
WO2024064668A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPα DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY
WO2024124107A2 (en) 2022-12-09 2024-06-13 Pfizer Inc. Cd47 blocking agent and anti-cd20 / anti-cd3 bispecific antibody combination therapy
CN120390653A (zh) 2022-12-09 2025-07-29 辉瑞大药厂 Cd47阻断剂及抗bcma/抗cd3双特异性抗体的组合疗法
CN118221812A (zh) * 2022-12-14 2024-06-21 上海迈石生物技术有限公司 一种靶向cd47的单克隆抗体及其应用
EP4638436A1 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2024177978A1 (en) * 2023-02-24 2024-08-29 The Regents Of The University Of California Lilrb3 engager cells
CN120882725A (zh) 2023-04-11 2025-10-31 吉利德科学公司 Kras调节化合物
WO2024220917A1 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
US20250042922A1 (en) 2023-06-30 2025-02-06 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
AU2024297978A1 (en) 2023-07-26 2026-02-05 Gilead Sciences, Inc. Parp7 inhibitors
US20250066328A1 (en) 2023-07-26 2025-02-27 Gilead Sciences, Inc. Parp7 inhibitors
AU2024337913A1 (en) 2023-09-08 2026-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine-containing polycyclic derivatives as kras g12d modulating compounds
WO2025054347A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
CN117004700A (zh) * 2023-10-07 2023-11-07 北京爱博生生物技术有限公司 单克隆抗体可变区基因高通量测序的方法及其所用组合物与试剂盒
US20250154172A1 (en) 2023-11-03 2025-05-15 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2025137640A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
US20250376484A1 (en) 2024-05-21 2025-12-11 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2026039365A1 (en) 2024-08-12 2026-02-19 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds

Family Cites Families (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
DE3788058T2 (de) 1986-08-28 1994-04-21 Teijin Ltd Zelltoxischer antikörperkomplex und verfahren zu seiner herstellung.
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
US5057604A (en) 1988-08-03 1991-10-15 Washington University Novel monoclonal antibodies
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
ES2096590T3 (es) 1989-06-29 1997-03-16 Medarex Inc Reactivos biespecificos para la terapia del sida.
CA2065299C (en) 1989-08-09 2001-07-24 Buck A. Rhodes Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6673986B1 (en) 1990-01-12 2004-01-06 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ATE352612T1 (de) 1990-08-29 2007-02-15 Pharming Intellectual Pty Bv Homologe rekombination in säugetier-zellen
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5194594A (en) 1990-09-07 1993-03-16 Techniclone, Inc. Modified antibodies
EP0586505A1 (en) 1991-05-14 1994-03-16 Repligen Corporation Heteroconjugate antibodies for treatment of hiv infection
WO1992022670A1 (en) 1991-06-12 1992-12-23 Genpharm International, Inc. Early detection of transgenic embryos
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
WO1993004169A1 (en) 1991-08-20 1993-03-04 Genpharm International, Inc. Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
CA2124967C (en) 1991-12-17 2008-04-08 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5777085A (en) 1991-12-20 1998-07-07 Protein Design Labs, Inc. Humanized antibodies reactive with GPIIB/IIIA
ATE208374T1 (de) 1992-02-18 2001-11-15 Otsuka Kagaku Kk Beta-laktam und cepham verbindungen und ihre herstellung
US5233409A (en) 1992-02-25 1993-08-03 Schwab Karl W Color analysis of organic constituents in sedimentary rocks for thermal maturity
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JPH07508410A (ja) 1992-06-18 1995-09-21 ジェンファーム　インターナショナル　インコーポレイテッド 酵母人工染色体を有するトランスジェニック非ヒト動物の製造方法
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
MD1367C2 (ro) 1992-11-13 2000-11-30 Idec Pharmaceuticals Corporation Metode de tratament al limfomului celulelor B, anticorpi anti-CD20, hibridom.
CA2161351C (en) 1993-04-26 2010-12-21 Nils Lonberg Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ATE235549T1 (de) 1993-04-30 2003-04-15 Biognostik Ges Antisense oligonukleotide zur behandlung von immunsuppressiven wirkungen von tgf-beta2
JPH10510700A (ja) 1993-06-04 1998-10-20 アメリカ合衆国 アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてカポジ肉腫を治療する方法
US5625825A (en) 1993-10-21 1997-04-29 Lsi Logic Corporation Random number generating apparatus for an interface unit of a carrier sense with multiple access and collision detect (CSMA/CD) ethernet data network
WO1995022618A1 (en) 1994-02-22 1995-08-24 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US5643763A (en) 1994-11-04 1997-07-01 Genpharm International, Inc. Method for making recombinant yeast artificial chromosomes by minimizing diploid doubling during mating
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5703057A (en) 1995-04-07 1997-12-30 Board Of Regents The University Of Texas System Expression library immunization
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
WO1997007671A1 (en) 1995-08-29 1997-03-06 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric animal and method for constructing the same
US6025130A (en) 1996-04-04 2000-02-15 Mercator Genetics, Inc. Hereditary hemochromatosis gene
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
WO1999012973A1 (en) * 1997-09-11 1999-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody inducing apoptosis
WO2000053634A1 (en) 1999-03-10 2000-09-14 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Single-stranded fv inducing apoptosis
US6833268B1 (en) 1999-06-10 2004-12-21 Abgenix, Inc. Transgenic animals for producing specific isotypes of human antibodies via non-cognate switch regions
AU2002315052A1 (en) * 2001-05-15 2002-11-25 Emory University Polynucleotides and polypeptides relating to the modulation of sirp alpha-cd47
KR100454414B1 (ko) 2001-06-25 2004-10-26 주식회사 진생사이언스 산소를 이용한 개량 홍삼의 제조 방법
WO2004014292A2 (en) 2002-05-10 2004-02-19 Purdue Research Foundation EphA2 AGONISTIC MONOCLONAL ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
AU2003273542A1 (en) 2002-05-31 2003-12-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods of identifying and isolating stem cells and cancer stem cells
US20100215640A1 (en) 2003-04-24 2010-08-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method for inhibiting cellular activation by insulin-like growth factor-1
US8613922B2 (en) 2003-04-24 2013-12-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods for inhibiting diabetic retinopathy with an antibody against integrin associated protein (IAP)
US20040213792A1 (en) 2003-04-24 2004-10-28 Clemmons David R. Method for inhibiting cellular activation by insulin-like growth factor-1
JP4637749B2 (ja) * 2003-11-11 2011-02-23 中外製薬株式会社 ヒト化抗ｃｄ４７抗体
JP4970948B2 (ja) 2003-12-05 2012-07-11 ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 癌幹細胞の同定、単離、および除去の方法
BRPI0417266B8 (pt) 2003-12-25 2021-05-25 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd anticorpo monoclonal, seu uso e composição farmacêutica
EP1720908A2 (en) * 2004-02-17 2006-11-15 Absalus, Inc. Super-humanized antibodies against respiratory syncytial virus
WO2005117936A2 (en) 2004-05-07 2005-12-15 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-i
US8187595B2 (en) 2004-05-07 2012-05-29 The University Of North Carolina At Chapel Hill Monoclonal antibodies for enhancing or inhibiting insulin-like growth factor-I
US7728880B2 (en) 2004-06-25 2010-06-01 Qualcomm Incorporated Automatic white balance method and apparatus
EP3190125A1 (en) 2005-08-31 2017-07-12 Merck Sharp & Dohme Corp. Engineered anti-il-23 antibodies
US7514229B2 (en) 2005-09-29 2009-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for diagnosing and evaluating treatment of blood disorders
US20090191202A1 (en) 2005-09-29 2009-07-30 Jamieson Catriona Helen M Methods for manipulating phagocytosis mediated by CD47
AU2007249709A1 (en) * 2006-05-15 2007-11-22 Viral Logic Systems Technology Corp. CD47 related compositions and methods for treating immunological diseases and disorders
NZ583019A (en) * 2007-07-31 2011-05-27 Regeneron Pharma Human antibodies to human cd20 and method of using thereof
AU2008328726B2 (en) 2007-11-30 2014-06-12 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
AU2009205665B2 (en) 2008-01-15 2013-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for manipulating phagocytosis mediated by CD47
CA2965198C (en) 2008-01-15 2021-02-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Markers of acute myeloid leukemia stem cells
KR100962704B1 (ko) 2008-07-02 2010-06-11 유상규 일측 단말의 제어로 타 단말의 주변장치를 이용하는 단말장치 및 그 인터페이스 방법
MY153074A (en) 2008-08-14 2014-12-31 Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd Anti-il-12/11-23 antibodies
KR20110084280A (ko) 2008-11-03 2011-07-21 알레시아 바이오쎄라퓨틱스 인코포레이티드 종양 항원의 생물 활성을 특이적으로 차단하는 항체
EP2477648B1 (en) * 2009-09-15 2022-07-20 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Synergistic anti-cd47 therapy for hematologic cancers
WO2011041453A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Isolation and use of melanoma cancer stem cells
WO2011059972A1 (en) 2009-11-10 2011-05-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Cell surface marker expression in hematopoietic stem cells and progenitors for the diagnosis, prognosis, and treatment of myelodysplastic syndromes
HRP20221260T1 (hr) 2010-05-14 2023-03-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Humanizirana i kimerna monoklonska protutijela za cd47
US20130281304A1 (en) 2010-08-13 2013-10-24 Andrew P. Feinberg Comprehensive Methylome Map of Myeloid and Lymphoid Commitment from Hematopoietic Proenitors
WO2012088309A1 (en) 2010-12-21 2012-06-28 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Therapeutic and diagnostic methods for manipulating phagocytosis through calreticulin and low density lipoprotein-related receptor
SI2804617T1 (sl) 2012-01-17 2020-10-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Visokoafinitetni SIRP-alfa reagenti
KR102338833B1 (ko) 2012-02-06 2021-12-13 인히브릭스, 인크. Cd47 항체 및 그 사용 방법
US20140140989A1 (en) * 2012-02-06 2014-05-22 Inhibrx Llc Non-Platelet Depleting and Non-Red Blood Cell Depleting CD47 Antibodies and Methods of Use Thereof
CN104768975A (zh) 2012-08-31 2015-07-08 北卡罗来纳大学教堂山分校 用于增强或抑制胰岛素-样生长因子1(igf-1)的单克隆抗体
CN105101997B (zh) 2013-02-06 2018-11-09 印希彼有限合伙公司 不减少血小板和不减少血红细胞的cd47抗体及其使用方法
US9111624B2 (en) 2013-03-22 2015-08-18 Katsuyuki Fujita Semiconductor memory device

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013217114B2 (en) 2017-03-30
US20160251435A1 (en) 2016-09-01
LT2812443T (lt) 2019-09-10
EP2812443B1 (en) 2019-05-29
HK1205195A1 (en) 2015-12-11
CL2014002086A1 (es) 2015-02-27
AU2013217114A1 (en) 2014-09-18
WO2013119714A1 (en) 2013-08-15
BR112014019331A8 (pt) 2018-01-16
KR102100388B1 (ko) 2020-04-13
ME03512B (me) 2020-04-20
EA034778B1 (ru) 2020-03-19
CN104271757B (zh) 2020-06-09
CA2863834A1 (en) 2013-08-15
EA201400875A1 (ru) 2015-01-30
SMT201900453T1 (it) 2019-11-13
MX2014009427A (es) 2015-05-11
NZ628314A (en) 2017-01-27
CR20140406A (es) 2014-12-10
ECSP14016994A (es) 2015-09-30
CY1121911T1 (el) 2020-10-14
ZA201405864B (en) 2015-11-25
SG10201700160RA (en) 2017-03-30
MY169341A (en) 2019-03-21
SI2812443T1 (sl) 2019-10-30
DK2812443T3 (da) 2019-08-26
US9663575B2 (en) 2017-05-30
US20210317205A1 (en) 2021-10-14
KR20200040897A (ko) 2020-04-20
EP3578569A1 (en) 2019-12-11
BR112014019331A2 (pt) 2022-07-12
KR102338833B1 (ko) 2021-12-13
CA2863834C (en) 2024-09-10
HRP20191500T1 (hr) 2019-11-29
HUE13746964T2 (hu) 2020-01-28
JP6273212B2 (ja) 2018-01-31
IL233934B (en) 2022-04-01
CN104271757A (zh) 2015-01-07
ES2743203T3 (es) 2020-02-18
US20130224188A1 (en) 2013-08-29
CN111533804A (zh) 2020-08-14
CO7111273A2 (es) 2014-11-10
US9045541B2 (en) 2015-06-02
IL233934A0 (en) 2014-09-30
SG11201404638SA (en) 2014-09-26
KR20150008049A (ko) 2015-01-21
PL2812443T3 (pl) 2020-01-31
JP2015508072A (ja) 2015-03-16
PT2812443T (pt) 2019-09-05
US20150238604A1 (en) 2015-08-27
PH12014501758A1 (en) 2014-11-10
PE20141908A1 (es) 2014-12-21
UA116772C2 (uk) 2018-05-10
PH12014501758B1 (en) 2019-03-06
MX360772B (es) 2018-11-15
EP2812443A4 (en) 2015-11-04
EP2812443A1 (en) 2014-12-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6726238B2 (ja) 血小板非減少性かつ赤血球非減少性ｃｄ４７抗体及びその使用方法
US20240166744A1 (en) Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting cd47 antibodies and methods of use thereof
US20210317205A1 (en) Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting cd47 antibodies and methods of use thereof
US20210371522A1 (en) Cd47 antibodies and methods of use thereof
HK40088423A (en) Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting cd47 antibodies and methods of use thereof
HK40018837A (en) Cd47 antibodies and methods of use thereof
HK1205195B (en) Cd47 antibodies and methods of use thereof
HK1218863B (en) Non-platelet depleting and non-red blood cell depleting cd47 antibodies and methods of use thereof