RS59193B1 - Modifikovani polipeptidi relaksina i njihova primena - Google Patents

Modifikovani polipeptidi relaksina i njihova primena

Info

Publication number
RS59193B1
RS59193B1 RSP20191125A RS59193B1 RS 59193 B1 RS59193 B1 RS 59193B1 RS P20191125 A RSP20191125 A RS P20191125A RS 59193 B1 RS59193 B1 RS 59193B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
relaxin
amino acid
polypeptide
substituted
group
Prior art date
Application number
Other languages
English (en)
Inventor
Vadim Kraynov
Nick Knudsen
Amha Hewet
Dios Kristine De
Jason Pinkstaff
Lorraine Sullivan
Original Assignee
Ambrx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45594542&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS59193(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ambrx Inc filed Critical Ambrx Inc
Publication of RS59193B1 publication Critical patent/RS59193B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/2221—Relaxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/12—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for climacteric disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/64—Relaxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE PRONALASKA
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na polipeptide relaksina modifikovane sa najmanje jednom ne-prirodno kodiranom aminokiselinom.
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
[0002] Zreli humani relaksin je hormonski peptid od približno 6000 daltona za koji je poznato da je odgovoran za preoblikovanje reproduktivnog trakta pre porođaja, čime se olakšava proces rađanja. Čini se da ovaj protein modulira restrukturiranje vezivnih tkiva u ciljnim organima kako bi se postigle potrebne promene u strukturi organa tokom trudnoće i porođaja. Videti, Hisaw, F. L., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 23: 661-663 (1926); Schwabe, C., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 75: 503-570 (1977); James, R. et al., Nature, 267: 544-546 (1977). Koncizan prikaz relaksina je obezbeđen od strane Sherwood, D. u The Physiology of Reproduction, poglavlje 16, "Relaxin", Knobil, E. and Neill, J., et al. (eds.), (Raven Press Ltd., Njujork), str. 585-673 (1988). Cirkulišući nivoi relaksina su povišeni tokom celih devet meseci trudnoće i brzo opadaju nakon porođaja.
[0003] Iako je pretežno hormon trudnoće, relaksin je takođe otkriven kod žena koje nisu trudne kao i kod muškaraca. Bryant-Greenwood, G. D., Endocrine Reviews, 3: 62-90 (1982) i Weiss, G., Ann. Rev. Physiol., 46:43-52 (1984) i najskorije je ustanovljeno da je koristan u lečenju srčane insuficijencije.
[0004] Srčana insuficijencija je definisana kao nesposobnost srčane pumpe da pokreće krv kako bi se obezbedile metaboličke potrebe tkiva tela. Smanjenja u sposobnosti pumpanja nastaju najčešće zbog gubitka ili oštećenja tkiva miokarda. Kao rezultat, ventrikularno pražnjenje je suzbijeno što dovodi do povećanja u pritisku ventrikularnog punjenja i naprezanju ventrikularnog zida, i smanjenja u srčanom minutnom volumenu. Kao fiziološki odgovor na smanjenje u srčanom minutnom volumenu, aktiviraju se brojni neuroendokrini refleksi koji uzrokuju sistemsku vazokonstrikciju, simpatičku stimulaciju srca i zadržavanje tečnosti. Iako ovi refleksni odgovori imaju tendenciju da poboljšaju minutni volumen srca inicijalno, oni su dugoročno štetni. Rezultujuća povećanja perifernog otpora povećavaju predopterećenje srca i povećanja volumena krvi dodatno povećavaju pritisak ventrikularnog punjenja. Ove promene, zajedno sa povećanom simpatičkom stimulacijom srca, dovode do daljih i često dekompenzujućih potražnji na preostalom funkcionalnom miokardu.
[0005] Kongestivna srčana insuficijencija, koja je zajednička krajnja tačka za mnoge kardiovaskularne poremećaje, nastaje kada srce nije u stanju da adekvatno perfuzira periferna tkiva. Prema skorijim procenama, kod oko 4 miliona ljudi u Sjedinjenim državama je dijagnostikovana ova bolest, i više od 50% ovih slučajeva je fatalno unutar 5 godina od dijagnoze [Taylor, M. D. et al., Annual Reports in Med. Chem.22, 85-94 (1987)].
[0006] Sadašnja terapija za srčanu insuficijencija, uključujući kongestivnu srčanu insuficijenciju, fokusira se na povećanje minutnog volumena srca bez uzrokovanja nepotrebnih potražnji na miokardu. Kako bi se postigli ovi završeci, razne kombinacije diuretika, vazodilatatora i inotropnih agenasa su korišćene da se smanji volumen krvi, da se smanji periferni otpor, i da se poveća snaga srčane kontrakcije. Sadašnja terapija stoga zavisi od uravnoteženja efekata više lekova kako bi se postigle kliničke potrebe pojedinačnih pacijenata, i ometana je neželjenim reakcijama na primenjene lekove.
[0007] Na primer, diuretici smanjuju koncentracije kalijuma i magnezijuma u plazmi i povećavaju učestalost aritmija kod pacijenata koji primaju digitalis. Diuretici mogu pojačati cirkulatorne efekte nitrata kroz smanjenje volumena i voditi do smanjenja u pritisku punjenja srca, minutnog volumena srca i sistemskog arterijskog pritiska.
[0008] Alfa adrenergički antagonisti mogu da dovedu do značajnih padova u sistemskom arterijskom pritisku koji kompromituju koronarnu perfuziju.
[0009] Inhibitori angiotenzin konvertujućeg enzima mogu imati slične efekte na arterijski pritisak i dodatno dovode do prekomernih povećanja koncentracija kalijuma u plazmi.
[0010] Lekovi koji dovode do pozitivne inotropije, kao što su digitalis i beta adrenergični antagonisti, imaju potencijal da izazovu aritmije. Pored toga, digitalis ima uski terapijski indeks i analozi kateholamina svi imaju tendenciju da brzo gube svoju efikasnost, zbog negativne regulacije receptora.
[0011] Prema tome postoji potreba za terapijskim agensima koji dovode do fiziološki integrisanih odgovora arterijske i venske vazodilatacije i srčane inotropije, i koji su lišeni nedostataka terapijskih agenasa koji se trenutno koriste.
[0012] Relaksin je prečišćen iz raznih vrsta uključujući svinjski, murinski, konjski, ajkulin, tigrov, pacovski, od morskog psa i humani, i pokazuje barem primarnu i sekundarnu strukturnu homologiju insulinu i insulinu-sličnom faktoru rasta, međutim homologija između vrsta može biti prilično niska. Kod čoveka, relaksin je pronađen u najvećoj zastupljenosti u žutom telu (CL-corpora lutea) trudnica. Međutim, specifična jezgra u mozgu imaju receptore relaksina i druga jezgra sadrže informacionu RNK za relaksin. Nekoliko jezgara sa ćelijama koje nose receptore relaksina je pronađeno u području hipotalamusa.
[0013] Dva oblika humanog gena su identifikovana, (H1) i (H2). Hudson, P., et al., Nature, 301: 628-631 (1983); Hudson, P., et al, The EMBO Journal, 3: 2333-2339 (1984); i američki patenti sa brojevima 4,758,516 i 4,871,670. Za samo jedan (H2) od oblika gena je utvrđeno da se transkribuje u CL. Ostaje nejasno da li je (H1) oblik eksprimiran na drugom mestu tkiva, ili on predstavlja pseudo-gen. Kada su sintetski humani relaksin (H2) i određeni analozi humanog relaksina testirani za biološku aktivnost, testovi su otkrili jezgro relaksina neophodno za biološku aktivnost kao i određene aminokiselinske supstitucije za metionin da nisu uticale na biološku aktivnost. Johnston, et al., u Peptides: Structure and Function, Proc. Ninth American Peptide Symposium, Deber, C. M., et al. (eds.) (Pierce Chem. Co. 1985).
[0014] Metode proizvodnje relaksina su takođe opisane u američkom patentu br.4,835,251 i u američkim prijavama sa ser. brojevima 07/908,766 (PCT US90/02085) i 08/080,354 (PCT US94/0699) koje su u procesu obrade. Metode primene relaksina u kardiovaskularnoj terapiji i u lečenju neurodegenerativnih bolesti su opisane u američkom patentu br.
5,166,191 i u američkoj prijavi sa ser. br. 07/902,637 (PCT US92/06927). Određene formulacije humanog relaksina su opisane u odobrenoj američkoj prijavi sa ser. br.
08/050,745.
[0015] US2007004619 A1 opisuje pripremu analoga relaksina nazvanog “cRlx” koji ima dve supstitucije cisteinom na poziciji 3 i 25 B lanca. cRlx analog relaksina je testiran za vezivanje za dva receptora, LGR7 i LGR8. WO2008077079 A1 se uopšteno odnosi na supstituciju sa ne-prirodno kodiranim aminokiselinama u peptidima od interesa i spominje relaksin kao jednog člana opsežne liste od približno 175 polipeptida i klasa polipeptida, uključujući klase široko definisane kao "antitelo" i "citokin". US2005170404 opisuje kovalentno vezivanje PEG-a za proteine.
[0016] Rekombinantni humani relaksin (H2) u trenutno u Fazi I kliničkih ispitivanja na ljudima kod pacijenata sa sklerodermom. Skleroderma je bolest koja uključuje neravnotežu u reformiranju tkiva što dovodi do prekomerne proizvodnje kolagena, i na kraju dovodi do oticanja i otvrdnjavanja kože (i zahvaćenih organa). Trenutni tretmani koji isporučuju relaksin zahtevaju ponavljane i produžene infuzije.
REZIME PRONALASKA
[0017] Pronalazak se odnosi na modifikovani polipeptid relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu, gde:
(a) polipeptid relaksina sadrži polipeptid A lanca relaksina sa SEQ ID NO (SEK ID BR): 4 i polipeptid B lanca relaksina sa SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 6 supstituisan sa neprirodno kodiranom aminokiselinom na poziciji odabranoj od grupe koja se sastoji od: ostatka 1 lanca A, ostatka 5 lanca A, ostatka 13 lanca A, ostatka 18 lanca A, i ostatka 7 lanca B; i
(b) ne-prirodno kodirana aminokiselina je para-acetil-fenilalanin koji je po izboru vezan za veznik, polimer, polimer rastvorljiv u vodi, ili biološki aktivni molekul.
[0018] Pronalazak prema tome obezbeđuje polipeptide relaksina modifikovane sa najmanje jednom ne-prirodno kodiranom aminokiselinom.
[0019] U jednom aspektu predmetnog pronalaska, polipeptidi relaksina sa najmanje jednom ne-prirodno kodiranom aminokiselinom su vezani za najmanje jedan polimer rastvorljiv u vodi.
[0020] Pronalazak se takođe odnosi na modifikovane polipeptide relaksina za primenu kao leka, naročito za primenu u, ili primenu navedenih modifikovanih relaksina u proizvodnji leka za, lečenje subjekta koji pati od ateroskleroze; dijabetesa tipa 1; dijabetesa tipa 2; koronarne arterijske bolesti; skleroderme; moždanog udara; dijastolne disfunkcije; porodične hiperholesterolemije; izolovane sistolne hipertenzije; primarne hipertenzije; sekundarne hipertenzije; hipertrofije leve komore; arterijske krutosti povezane sa dugotrajnim pušenjem duvana; arterijske krutosti povezane sa gojaznošću; arterijske krutosti povezane sa godinama; sistemskog eritematoznog lupusa; preeklampsije; hiperholesterolemije; ili za primenu u povećanju arterijske komplijanse kod žena u perimenopauzi, menopauzi, i post-menopauzi koje su u riziku od gore pomenutih poremećaja; ili da se modulira vazokonstrikcija, proizvodnja NO, ili agregacija trombocita; ili za primenu u lečenju angiotenzinom-II (Angll)-posrednovane vazokonstrikcije ili endotelinom-1 (ET-1)-posredovane vazokonstrikcije; ili za primenu u lečenju srčane insuficijencije, kongestivne srčane insuficijencije, gubitka ili oštećenja tkiva miokarda, povećanja pritiska ventikularnog punjenja, naprezanja ventikularnog zida, ili oštećene integracije arterijske ili venske vazodilatacije.
[0021] U jednom tehničkom rešenju pronalaska, relaksin pronalaska je za primenu u metodi povećanja arterijske komplijanse kod subjekta, pri čemu navedena metoda obuhvata merenje globalne arterijske komplijanse kod navedenog subjekta; određivanje da navedena globalna arterijska komplijansa je smanjena kod navedenog subjekta u odnosu na globalnu arterijsku komplijansu kod zdravog subjekta; i administriranje navedenom subjektu farmaceutske formulacije koja sadrži relaksin da bi se povećala arterijska komplijansa kod navedenog subjekta. Globalna arterijska komplijansa može se meriti, u jednom tehničkom rešenju, iz dijastolnog pada talasnog oblika aortnog pritiska korišćenjem metode područja. U drugom tehničkom rešenju, globalna arterijska komplijansa može se izračunati kao odnos udarni volumen-prema-pulsni pritisak, gde je udarni volumen definisan kao odnos minutnog volumena srca prema srčanoj frekvenciji.
[0022] U srodnim tehničkim rešenjima, lokalna arterijska komplijansa ili regionalna arterijska komplijansa subjekta može se meriti dodatno ili kao alternativa merenju globalne arterijske komplijanse i, ako je lokalna ili regionalna arterijska komplijansa smanjena u odnosu na lokalnu ili regionalnu arterijsku komplijansu koja je očekivana za sličnog zdravog pojedinca, relaksin se može administrirati da bi se povećala arterijska komplijansa kod tog pojedinca.
[0023] U daljim tehničkim rešenjima, subjekat kojem je administriran relaksin pati od jednog ili više od sledećih poremećaja: ateroskleroze, dijabetesa tipa 1, dijabetesa tipa 2, koronarne arterijske bolesti, skleroderme, moždanog udara, dijastolne disfunkcije, porodične hiperholesterolemije, izolovane sistolne hipertenzije, primarne hipertenzije, sekundarne hipertenzije, hipertrofije leve komore, arterijske krutosti povezane sa dugotrajnim pušenjem duvana, arterijske krutosti povezane sa gojaznošću, arterijske krutosti povezane sa godinama, sistemskog eritematoznog lupusa, preeklampsije, i hiperholesterolemije. U srodnim tehničkim rešenjima, pronalazak obezbeđuje metode povećanja arterijske komplijanse kod žena u perimenopauzi, menopauzi, i post-menopauzi i pojedinaca koji su u riziku od jednog od gore pomenutih poremećaja.
[0024] U dodatnom tehničkom rešenju pronalaska, administriacija relaksina povećava arterijsku komplijansu za najmanje 10%, 15%, 20% ili više, u odnosu na izmerenu arterijsku komplijansu pre administracije. U daljim tehničkim rešenjima, pronalazak obezbeđuje administraciju relaksina pojedincima sa smanjenom arterijskom komplijansom pri prethodno određenoj brzini tako da se održi koncentracija relaksina u serumu od 0.5 do 80 ng/ml. U jednom tehničkom rešenju, relaksin je rekombinantni humani relaksin sa jednom ne-prirodno kodiranom aminokiselinom. U još jednom tehničkom rešenju, relaksin je relaksin sa više od jedne ne-prirodno kodirane aminokiseline. U još jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, relaksin ima ne-prirodno kodiranu aminokiselinu vezanu za polimer rastvorljiv u vodi. U srodnim tehničkim rešenjima, relaksin se može administrirati dnevno, u injekcionoj formulaciji, kao formulacija sa produženim oslobođanjem, ili kao kontinuirana infuzija.
[0025] U drugom aspektu, relaksin pronalaska je za primenu u lečenju infekcija ili ishemijskih rana administriranjem terapijski efikasne količine relaksina. U naročito poželjnom tehničkom rešenju, infekcija ili ishemijska rana je ona gde je povreda nastala zbog nedostatka kiseonika usled slabe cirkulacije.
[0026] U još jednom aspektu pronalaska, relaksin pronalaska je za primenu u lečenju infekcije ili ishemijske rane, ili za podsticanje angiogeneze. U drugom aspektu, relaksin predmetnog pronalaska je za primenu u lečenju osteodegenerativne disfunkcije zgloba, i u drugom aspektu lečenje osteodegenerativne disfunkcije zgloba obuhvata hR2 pored jednog ili više pomoćnih sredstava, uključujući ali ne ograničeno na glukozamin. U drugom aspektu, relaksin predmetnog pronalaska je za primenu u lečenju alchajmerove bolesti, a u drugom aspektu lečenje alchajmerove bolesti obuhvata hR2 pored jednog ili više pomoćnih sredstava, uključujući ali ne ograničeno na estrogen. U drugom tehničkom rešenju, relaksin ovog pronalaska je za primenu u metodi za modulaciju reprodukovane fiziologije sisara koja obuhvata administraciju sisaru terapijski efikasne količine pomenute kompozicije.
[0027] Relaksin pronalaska dalje je za primenu u metodama za lečenje angiotenzinom- II (AngII)-posredovane vazokonstrikcije. Ove metode uopšteno obuhvataju administriranje formulacije koja sadrži količinu relaksina efikasnu da preokrene, inhibira, ili redukuje vazokonstrikcione efekte od AngII.
[0028] Relaksin pronalaska dalje je za primenu u metodama za lečenje endotelinom-1 (ET-1)-posredovane vazokonstrikcije. Ove metode uopšteno obuhvataju administriranje formulacije koja sadrži količinu relaksina efikasnu da preokrene, inhibira, ili redukuje vazokonstrikcione efekte od ET-1. U nekim tehničkim rešenjima, metode obuhvataju povećanje aktivacije endotelinskog receptora tipa B u ćeliji u krvnom sudu administriranjem relaksina pojedincu.
[0029] Relaksin pronalaska dalje je za primenu u metodama za lečenje ishemijskog stanja, koje uopšteno obuhvataju administriranje formulacije koja sadrži količinu relaksina efikasnu da se stimuliše ili promoviše angiogeneza i/ili vazodilacija, time lečeći ishemijsko stanje. Metode su korisne u lečenju raznih ishemijskih stanja. U nekim tehničkim rešenjima, metode su obezbeđene za lečenje ishemijskog stanja koje nastaje kao rezultat infarkta miokarda. U drugom tehničkim rešenjima, metode su obezbeđene za lečenje ishemijskog stanja povezanog sa ranom. Prema tome, pronalazak dalje obezbeđuje metode za podsticanje zarastanja rane.
[0030] Relaksin pronalaska dalje je za primenu u metodama za stimulisanje ekspresije angiogenih i/ili vazodilatornih citokina koje generalno obuhvataju administriranje formulacije koja sadrži količinu relaksina efikasnu da se izazove vazodilatacija krvnih sudova i/ili stimuliše ili podstakne proizvodnju angiogenog citokina. U nekim tehničkim rešenjima, metode obezbeđuju stimulaciju ekspresije baznog faktora rasta fibroblasta (bFGF - basic fibroblast growth factor) i/ili faktora rasta ćelija vaskularnog endotela (VEGF - vascular endothelial cell growth factor). Takve metode su korisne u lečenju širokog spektra bolesti koje se mogu lečiti povećanjem protoka krvi na ili blizu mesta bolesti.
[0031] Relaksin pronalaska dalje je za primenu u metodi povećanja renalne vazodilatacije i hiperfiltracije, koja uopšteno obuhvata administriranje formulacije koja sadrži količinu relaksina. Ove metode su korisne u lečenju raznih bubrežnih patologija. Shodno tome, pronalazak dalje obezbeđuje metode lečenja patologije bubrega povezane sa vazokonstrikcijom.
[0032] Relaksin pronalaska dalje je za primenu u metodi smanjenja plućne hipertenzije, koja uopšteno obuhvata administriranje formulacije koja sadrži količinu relaksina.
[0033] U patentima čiji je vlasnik Connetics Corporation i BAS Medical, In.c, američki patenti sa brojevima 6,211,147 i 6,780,836 redom, metode podsticanja angiogeneze koje primenjuju relaksin su stavljene na uvid javnosti. U patentu čiji je vlasnik Genentech, Inc., broj patenta 5,759,807, proces za prokariotsku proizvodnju relaksina od prorelaksina je stavljen na uvid javnosti. Yue američki patent 6,251,863 stavlja na uvid javnosti metode lečenja osteodegenerativne disfunkcije zgloba i metode lečenja Alchajmera administriranjem lekova na bazi relaksina koji dalje sadrže glkozamin sulfat i estrogen, odgovarajuće za svako od stanja.
[0034] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži jednu ili više posttranslacionih modifikacija. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina je vezan za veznik, polimer, ili biološki aktivan molekul. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina je vezan za bifunkcionalni polimer, bifunkcionalni veznik, ili najmanje jedan dodatni polipeptid relaksina.
[0035] U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina je vezana za polimer rastvorljiv u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, polimer rastvorljiv u vodi sadrži poli(etilen glikol) segment. U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina se vezuje za polimer rastvorljiv u vodi sa veznikom ili je povezana sa polimerom rastvorljivim u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, poli(etilen glikol) molekul je bifunkcionalni polimer. U nekim tehničkim rešenjima, bifunkcionalni polimer se vezuje za drugi polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, drugi polipeptid je polipeptid relaksina.
[0036] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži najmanje dve aminokiseline vezane za polimer rastvorljiv u vodi koji sadrži poli(etilen glikol) segment, gde najmanje jedna aminokiselina je ne-prirodno kodirana aminokiselina.
[0037] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži najmanje dve aminokiseline vezane za polimer rastvorljiv u vodi koji sadrži poli(etilen glikol) segment, gde najmanje jedna aminokiselina je ne-prirodno kodirana aminokiselina.
[0038] U nekim tehničkim rešenjima ne-prirodno kodirana aminokiselina je inkorporirana u A lanac na aminokiselinskom položaju 1 (SEQ ID NO:4). U nekim tehničkim rešenjima ne-prirodno kodirana aminokiselina je inkorporirana u A lanac na aminokiselinskom položaju 5 (SEQ ID NO:4). U nekim tehničkim rešenjima ne-prirodno kodirana aminokiselina je inkorporirana u B lanac na aminokiselinskom položaju 7 (SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 6). U nekim tehničkim rešenjima ne- prirodno kodirana aminokiselina je inkorporirana u A lanac na aminokiselinskom položaju 13 (SEQ ID NO:4). U nekim tehničkim rešenjimaa ne-prirodno kodirana aminokiselina je inkorporirana u A lanac na aminokiselinskom položaju 18. U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane u jedan od sledećih položaja u polipeptidima relaksina: u A lanac na aminokiselinskom položaju 1, 5, 13, 18 (SEQ ID NO: 4 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ili druge poznate sekvence relaksina). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane u jedan od sledećih položaja u polipeptidima relaksina: u A lanac na aminokiselinskom položaju 1, 5, 13 (SEQ ID NO: 4 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ili druge poznate sekvence relaksina). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane u jedan od sledećih položaja u polipeptidima relaksina: u A lanac na aminokiselinskom položaju 1, 5 (SEQ ID NO: 4 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ili druge poznate sekvence relaksina). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane u jedan od sledećih položaja u polipeptidima relaksina: u A lanac na aminokiselinskom položaju 5 (SEQ ID NO: 4 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, ili druge poznate sekvence relaksina).
[0039] U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirane aminokiseline je inkorporirana u jedan od sledećih položaja u polipeptidima relaksina: u B lanac na aminokiselinskom položaju 7 (SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 6, ili odgovarajući položaji aminokiseline u SEQ ID NOojevima: 1, 2, ili 3). U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina je inkorporirana na položaju 7 u B lancu (SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 6, ili odgovarajući aminokiselinski položaji u SEQ ID NOojevima: 1, 2, ili 3). U jednim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirane aminokiseline je inkorporirana u jedan od sledećih položaja u polipeptidima relaksina: u A lancu na aminokiselinskim položajima 1, 5, 13, 18 (SEQ ID NO: 4 ili odgovarajući položaji aminokiseline u SEQ ID NO.1, 2, 3), u B lancu na aminokiselinskim položajima 7 (SEQ ID NO: 5 ili 6, ili odgovarajući aminokiselinski položaji u SEQ ID NO: 1, 2, 3). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane u jedan od sledećih položaja u polipeptidima relaksina: u A lancu na aminokiselinskim položajima 1, 5, 13, 18 (SEQ ID NO: 4 ili odgovarajući aminokiselinski položaji u SEQ ID NO. 1, 2, 3), u B lancu na aminokiselinskim položajima 7 (SEQ ID NO: 5 ili 6, ili odgovarajući aminokiselinski položaji u SEQ ID NO: 1, 2, 3).
[0040] U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina na jednom ili više od ovih položaja je vezana za polimer rastvorljiv u vodi, uključujući ali ne ograničeno na: u A lancu 1, 5, 13, 18 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u poznatim sekvencama relaksina). U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselin na jednom ili više od ovih položaja je vezana za polimer rastvorljiv u vodi, uključujući ali ne ograničeno na: u A lancu 1, 5 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u poznatim sekvencama relaksina). U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina na jednom ili više od ovih položaja je vezana za polimer rastvorljiv u vodi, uključujući ali ne ograničeno na: u A lancu 5 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u poznatim sekvencama relaksina). U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina na jednom ili više od ovih položaja je vezana za polimer rastvorljiv u vodi, uključujući ali ne ograničeno na: u A lancu 5, 13, 18 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u poznatim sekvencama relaksina). U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina na jednom ili više od ovih položaja je vezana za polimer rastvorljiv u vodi, uključujući ali ne ograničeno na: u B lancu 7 (SEQ ID NO: 5 ili 6 ili odgovarajući aminokiselinski položaji u SEQ ID NOojevima: 1, 2, 3). U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina na položaju 7 u B lancu (SEQ ID NO: 5 ili 6 ili odgovarajući aminokiselinski položaji u SEQ ID NOojevima: 1, 2, 3) je vezana za polimer rastvorljiv u vodi
[0041] U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane u jedan ili više od sledećih položaja u bilo kojim polipeptidima relaksina ili prorelaksina: položaji 7 B lanca (SEQ ID NO: 5 ili 6 ili odgovarajući aminokiselinski položaji u SEQ ID NOojevima: 1, 2, 3) i položaji 1, 5, 13, 18 A lanca (SEQ ID NO: 4 ili odgovarajući aminokiselinski položaji u SEQ ID NOojevima: 1, 2, 3). U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane u jedan ili više od sledećih položaja u bilo kojim polipeptidima relaksina ili prorelaksina: položaji 7 B lanca (SEQ ID NO: 5 ili 6 ili odgovarajući aminokiselinski položaji u SEQ ID NOojevima: 1, 2, 3) i položaji 1, 5, 13, 18 A lanca (SEQ ID NO: 4 ili odgovarajući aminokiselinski položaji u SEQ ID NOojevima: 1, 2, 3) i ne-prirodno kodirana aminokiselina je vezana za polimer rastvorljiv u vodi.
[0042] Metode predmetnog pronalaska se mogu primeniti za promovisanje angiogeneze, promovisanje vazodilacije, promovisanje ne-hipotenzivne vazodilacije, za lečenje hipertenzije, uključujući ali ne ograničeno na renalnu hipertenziju, pulmonalnu hipertenziju, i srčanu hipertenziju (američki patent sa Br.ojevima 6,723,702; i 6,780,836).
Formulacije
[0043] U širokoj praksi predmetnog pronalaska, takođe je smatrano da formulacija može da sadrži smešu dva ili više od relaksina, dimera relaksina, analoga relaksina, acilovanog relaksina, ili analoga acilovanog relaksina sa najmanje jednom od komponenti smeše koja sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu. U drugom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska , formulacije koje sadrže smešu dva ili više od relaksina, analoga relaksina, acilovanog relaksina, ili analoga acilovanog relaksina sa najmanje jednom od komponenti smeše koja sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu takođe uključuju najmanje jedan polimer rastvorljiv u vodi vezan za najmanje jednu od ne-prirodno kodiranih aminokiselina.
[0044] Predmetni pronalazak takođe obuhvata heterogene smeše u kojima polipeptidi relaksina i analozi relaksina se pripremaju pomoću metoda stavljenim na uvid javnosti u ovom pronalasku i zatim se mešaju tako da se formulacija može administrirati pacijentu kojem je potrebna. Sve različite smeše sa različitim procentualnim količinama polipeptidnih varijanti relaksina gde polipeptidi relaksina obuhvataju varijetet (1) sa PEG-ima različitih dimenzija, ili (2) PEG-i su obuhvaćeni na različitim položajima u sekvenci. Ovo je namenjeno kao primer i ne treba se tumačiti kao ograničavajuće za formulacije koja su omogućene predmetnim pronalaskom i biće očigledno prosečnim poznavaocima iz oblasti. U dodatnom tehničkom rešenju, polipeptidne varijante relaksina koje treba obuhvatiti u formulacionu smešu će biti izabrane prema njihovim različitim vremenima disocijacije tako da formulacija može da obezbedi produženo oslobađanje relaksina kod pacijenta kojem je potrebna.
[0045] Formulacije predmetnog pronalaska mogu obuhvatati glukagon.
Druga tehnička rešenja predmetnog pronalaska uključujući formulaciju za inhalaciju
[0046] U dodatnom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, moguće je primeniti tehnologiju koja je ovde stavljena na uvid javnosti za proizvodnju analoga relaksina sa povećanim farmakokinetičkim i farakodinamičkim svojstvima za primenu kod pacijenata putem administracije do pluća, rezultujući u povišenim nivoima relaksina u krvi koji se održavaju tokom najmanje 6 sati, i tipičnije tokom najmanje 8, 10, 12, 14, 18, 24 sata ili više nakon administracije. Drugo tehničko rešenje predmetnog pronalaska omogućava povoljne smeše analoga relaksina pogodne za terapijske formulacije formulisane da se administriraju pacijentima kao inhalant.
[0047] U nekim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska, sledeća mesta u nativnom molekulu relaksina mogu biti supstituisana sa ne-prirodno kodiranim aminokiselinama i po izboru dalje modifikovana kovalentnim vezivanjem polimera rastvorljivog u vodi, kao što je PEG: 2 C-krajevi A i B lanaca, Arg22B, His10B, His5A, Glu4A, Glu17A, Glu13B, i Glu21B.
[0048] Predmetni pronalazak obezbeđuje za ne-nativne polipeptide relaksina i analoge relaksina koji imaju jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina supstituisanih ili umetnutih u signalnu sekvencu da takođe mogu da obezbede mesto za inkorporaciju jednog ili više polimera rastvorljivih u vodi, kao što je PEG. Ovo tehničko rešenje pronalaska je naročito korisno za uvođenje dodatnih, prilagođenih mesta za pegilaciju unutar molekula relaksina, na primer, za formiranje PEG-relaksina koji ima poboljšanu otpornost na enzimsku degradaciju. Takav pristup obezbeđuje veću fleksibilnost u formulisanju optimalnog konjugata relaksina koji ima željeni balans aktivnosti, stabilnosti, rastvorljivosti, i farmakoloških svojstava. Mutacije se mogu izvesti, tj., mutagenezom specifičnom za mesto, na bilo kojem broju položaja unutar molekula relaksina. PEG-i za primenu u predmetnom pronalasku mogu imati različite strukture: linearnu, rašljastu, razgranatu, i u obliku tega, i slično. Obično, PEG se aktivira pomoću odgovarajuće aktivirajuće grupe pogodne za kuplovanje poželjnog ili poželjnih mesta na molekulu relaksina. Aktivirani PEG će imati reaktivnu grupu na kraju za reakciju sa relaksinom. Reprezentativni aktivirani PEG derivati i metode za konjugaciju ovih agenasa sa lekom kao što je relaksin su poznate u oblasti i dalje opisane u Zalipsky, S., et al., "Use of Funkcionalizovan Poly(Ethylene Glycols) for Modification of Polipeptids" u Polietilen glikol Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, Njujork (1992), i u Advanced Drug Reviews, 16:157-182 (1995).
[0049] U jednom posebnom tehničkom rešenju pronalaska , PEG deo konjugata je odsutna jedna ili više lipofilnih grupa efikasnih da značajno modifikuju vodo-rastvorljivu prirodu polimera ili polimer-relaksin konjugata. Drugim rečima, polimerni ili ne-relaksinski deo konjugata pronalaska može sadržati grupu atoma koji se smatraju više lipofilnim nego hidrofilnim (npr., ugljenični lanac koji ima od oko 2 do 8-12 atoma ugljenika), međutim, ako prisustvo takve grupe ili grupa nije efikasno da značajno promeni hidrofilnu prirodu polimera ili konjugata, tada takav segment može biti sadržan u konjugatima pronalaska. Drugim rečima, kroz mesto-specifične mutacije relaksina, polipeptida relaksina, i analoga relaksina, konjugat relaksina pronalaska može ispoljiti hidrofilno, pre nego lipofilno ili amfifilno. U određenim tehničkim rešenjima pronalaska gde lipofilni segment može biti prisutan, segment poželjno nije pozicioniran na kraju PEG lanca.
[0050] Razgranati PEG-i za primenu u konjugatima pronalaska uključuje one opisane u međunarodnoj objavi prijave patenta WO 96/21469. Obično, razgranati PEG-i mogu biti predstavljeni formulom R(PEG--OH).sub.n, gde R predstavlja centralni "jezgro" molekul a .sub.n predstavlja broj krakova. Razgranati PEG-i imaju centralno jezgro od kojeg se protežu 2 ili više "PEG" grana. U razgranatoj konfiguraciji, razgranat polimerno jezgro ima jedno reaktivno mesto za vezivanje na relaksin. Razgranati PEG-i za primenu u predmetnom pronalasku će obično sadržati manje od 4 PEG grane, i poželjnije, će sadržati manje od 3 PEG grana. Razgranati PEG-i imaju prednost da imaju jedno reaktivno mesto, spojeno sa većim, gušćim oblakom polimera nego njihovi linearni PEG duplikati. Jedan poseban tip razgranatog PEG može biti predstavljen kao (MeO-PEG-).sub.p R--X, gde je p jednako 2 ili 3, R je centralna struktura jezgra kao što je lizin ili glicerol koji imaju 2 ili 3 PEG grane vezane za njega, i X predstavlja bilo koju pogodnu funkcionalnu grupu koja je ili koja može aktivirana za spajanje sa relaksinom. Jedan posebno poželjan razgranat PEG je mPEG2-NHS (Shearwater Corporation, Alabama) koji ima strukturu mPEG2-lizinsukcinimida.
[0051] U još jednoj razgranatoj izgradnji, "viseći PEG" ima reaktivne grupe za spajanje proteina smeštene duž PEG osnove pre nego na kraju PEG lanaca. Reaktivne grupe koje se protežu od PEG osnove za spajanje sa relaksinom mogu biti iste ili različite. Viseće PEG strukture mogu biti korisne ali su obično manje poželjne, posebo za kompozicije za inhalaciju.
[0052] Alternativno, PEG-deo PEG-relaksin konjugata može posedovati rašljastu strukturu koja ima razgranatu sekciju na jednom kraju polimernog lanca i dve slobodne reaktivne grupe (ili bilo koje više od 2) povezan sa razgranatim segmentom radi vezivanja za relaksin. Rašljasti PEG-i koji su uzeti kao primer
su opisani u međunarodnoj objavi prijave patenta br. WO 99/45964. Rašljasti polietilen glikol može po izboru da uključuje alkil ili "R" grupu na suprotnom kraju polimernog lanca. Konkretnije, rašljasti PEG-relaksin konjugat u skladu sa pronalaskom
ima formulu: R-PEG-L(Y-relaksin)n gde R je alkil, L je hidrolitički stabilna tačka grananja a Y je vezujuća grupa koja obezbeđuje hemijsko povezivanje rašljastog polimera za relaksin, a n je više od 2. L može da predstavlja pojedinačnu "jezgro" grupu, kao što je "--CH--", ili može da sadrži duži lanac atoma. Primeri L grupa uključuju lizin, glicerol, pentaeritritol, ili sorbitol. Tipično, poseban atom grane unutar segmenta za grananje je ugljenik.
[0053] U jednom posebnom tehničkom rešenju pronalaska, povezivanje rašljastog PEG sa molekulom relaksina, (Y), je hidrolitički stabilno. U poželjnom tehničkom rešenju, n je 2. Pogodni Y segmenti, pre konjugacije sa reaktivnim mestom na relaksinu, uključuju ali nisu ograničeni na aktivne estre, aktivne karbonate, aldehide, izocijanate, izotiocijanate, epokside, alkohole, maleimide, vinilsulfone, hidrazide, ditiopiridine, i jodacetamide. Izbor pogodne aktivirajuće grupe će zavisiti od predviđenog mesta vezivanja na molekulu relaksina i može lako biti određeno od strane prosečnog poznavaoca u oblasti. Odgovarajuća Y grupa u rezultujućem PEG-relaksin konjugatu je ona koja je rezultat reakcije aktiviranog rašljastog polimera sa pogodnim reaktivnim mestom na relaksinu. Specifičan identitet takvog konačnog povezivanja će biti očigledan prosečnom poznavaocu u oblasti tehnike. Na primer, ako reaktivni rašljasti PEG sadrži aktivirani estar, kao što je sukcinimid ili maleimid estar, konjugacija preko mesta amina na relaksinu će rezultirati u formiranju odgovarajućeg amid povezivanja. Ovi posebni rašljasti polimeri su posebno atraktivni pošto obezbeđuju konjugate koji imaju molarni odnos relaksina prema PEG od 2:1 ili više. Takvi konjugati će verovatno manje da blokiraju receptorska mesta relaksina, dok još uvek obezbeđuju fleksibilnost u dizajnu da zaštite relaksin od enzimske degradacije, npr., enzimom za degradaciju relaksina.
[0054] U srodnom tehničkom rešenju, rašljasti PEG-relaksin konjugat se može primeniti u predmetnom pronalasku, predstavljen formulom: R-[PEG-L(Y-relaksin)2]n. U ovom slučaju R predstavlja ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja ima vezan najmanje jedan PEG-di-relaksin konjugat. Konkretno, poželjni rašljasti polimeri u skladu sa ovim aspektom pronalaska su oni gde je n odabrano iz grupe koja se sastoji od 1,2,3,4,5, i 6. U alternativnom tehničkom rešenju, hemijsko povezivanje između ne-prirodne aminokiseline unutar relaksina, polipeptida relaksina, ili analoga relaksina i tačke grane polimera može biti razgradivo (tj., hidrolitički nestabilno). Alternativno, jedno ili više razgradivog povezivanja može biti sadržano u osnovi polimera da bi se omogućilo generisanje in vivo PEG-relaksin konjugata koji ima manji PEG lanac nego u početno administriranom konjugatu. Na primer, velik i relativno inertan konjugat (tj., koji ima jedan ili više PEG lanaca sa višom molekulskom masom vezan na njega, npr., jedan ili više PEG lanaca koji imaju molekulsku masu veću od oko 10,000, pri čemu konjugat u suštini nema bioaktivnost) može se administrirati, koji potom ili u plućima ili u krvotoku, se hidrolizuje da se generiše bioaktivni konjugat koji ima deo originalno postojećeg PEG lanca. Nakon in-vivo cepanja hidrolitički razgradivog povezivanja, ili slobodni relaksin (u zavisnosti od položaja degradabilnog povezivanja) ili relaksin koja ima malu polietilensku oznaku vezanu na njega, se zatim oslobađa i lakše apsorbuje kroz pluća i/ili cirkuliše u krv.
[0055] U jednoj karakteristici ovog tehničkog rešenja pronalaska, čitav polimer-konjugat, pre hidrolize, je minimalno degradiran nakon administracije, tako da je hidroliza veze koja se cepa efikasna u regulisanju spore brzine oslobađanja aktivnog relaksina u krvotok, za razliku od enzimske degradacije relaksina pre njegovog oslobađanja u sistemsku cirkulaciju.
[0056] Odgovarajuća fiziološka cepajuća povezivanja uključuju ali nisu ograničena na estar, karbonatne estar, karbamat, sulfat, fosfat, aciloksialkil etar, acetal, i ketal. Takvi konjugati treba da poseduju fiziološki cepajuću vezu koja je stabilna nakon skladištenja i nakon administracije. Na primer, konjugat PEG-cepajućeg povezivanja i relaksina treba da zadrži svoj integritet nakon proizvodnje konačne farmaceutske kompozicije, nakon rastvaranja u odgovarajućem transporteru za isporuku, ako se koristi, i nakon administracije bez obzira na put.
[0057] Prema tome, u sledećem tehničkom rešenju predmetng pronalaska, jedna ili više neprirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane u jedan lanac relaksina ili jedan lanac analoga relaksina.
[0058] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid pronalaska sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje jedne ili više ne-prirodno kodirane aminokiseline u signalnoj sekvenci. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid pronalaska sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje jedne ili više ne-prirodno kodirane aminokiseline u signalnoj sekvenci relaksina ili bilo koji od analoga relaksina ili polipeptida stavljenih na uvid javnosti u ovoj specifikaciji. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid pronalaska sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje jedne ili više prirodno kodiranih aminokiselina u signalnoj sekvenci kao i zamene, dodavanja, ili brisanja jedne ili više prirodno kodiranih aminokiselina u signalnoj sekvenci za relaksin ili bilo koje analoge relaksina ili polipeptide stavljene na uvid javnosti u ovoj specifikaciji. U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više ne-prirodnih aminokiselina su inkorporirane u vodeću ili signalnu sekvencu za relaksin ili bilo koje analoge relaksina ili polipeptida stavljene na uvid javnosti u ovoj specifikaciji.
[0059] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje ili brisanje koje modulira afinitet polipeptida relaksina prema receptoru polipeptida relaksina ili vezujućem partneru, uključujući ali nije ograničeno na, protein, polipeptid, mali molekul, ili nukleinska kiselina. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje povećava stabilnost polipeptida relaksina kada se poredi sa stabilnošću odgovarajućeg relaksina bez supstitucije, dodavanja, ili brisanja. Stabilnost i/ili rastvorljivost može se meriti korišćenjem niza različitih ispitivanja poznatim prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Takva ispitivanja uključuje ali nisu ograničena na SE-HPLC i RP-HPLC. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje modulira imunogenost polipeptida relaksina kada se poredi sa imunogenosti odgovarajućeg relaksina bez supstitucije, dodavanja, ili brisanja. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje modulira poluživot u serumu ili vreme cirkulacije polipeptida relaksina u poređenju sa poluživotom u serumu ili vreme cirkulacije odgovarajućeg relaksina bez supstitucije, dodavanja, ili brisanja.
[0060] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje povećava rastvorljivost u vodi polipeptida relaksina u poređenju sa rastvorljivosti u vodi odgovarajućajućeg relaksina bez supstitucije, dodavanja, ili brisanja. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje povećava rastvorljivost polipeptida relaksina proizvedenog u ćeliji domaćina kada se poredi sa rastvorljivosti odgovarajućeg relaksina bez supstitucije, dodavanja, ili brisanja. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje povećava eksprimiranje polipeptida relaksina u ćelija domaćina ili povećava sintezu in vitro u poređenju sa eksprimiranjem ili sintezom odgovarajućeg relaksina bez supstituciju, dodavanje, ili brisanje. Polipeptid relaksina koji sadrži ovu supstituciju zadržava agonističku aktivnost i zadržava ili poboljšava nivoe eksprimiranja u ćeliji domaćinu. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje povećava otpornost na proteazu polipeptida relaksina kada se poredi sa otpornošću na proteazu odgovarajućeg relaksina bez supstitucije, dodavanja, ili brisanja. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje modulira aktivnost transdukcije signala receptora relaksina kada se poredi sa aktivnošću receptora nakon interakcije sa odgovarajućim polipeptidom relaksina bez supstitucije, dodavanje, ili brisanja. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje modulira njegovo vezivanje na drugi molekul kao što je receptor kada se poredi sa vezivanjem odgovarajućeg polipeptida relaksina bez supstitucije, dodavanja, ili brisanja. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje modulira njegovu anti-virusnu aktivnost u poređenju sa anti-virusnom aktivnošću odgovarajućeg polipeptida relaksina bez supstitucije, dodavanja, ili brisanja. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koji poboljšavaju njegovu aktivnost metabolizma glukoze u poređenju sa aktivnosti metabolizma glukoze odgovarajućeg polipeptida relaksina bez supstitucije, dodavanja, ili brisanja.
[0061] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina sadrži supstituciju, dodavanje, ili brisanje koje povećava kompatibilnost polipeptida relaksina sa farmaceutskim konzervansima (npr., m-krezolom, fenolom, benzil alkoholom) u poređenju sa kompatibilnosti odgovarajućeg relaksina bez supstitucije, dodavanja, ili brisanja. Ova povećana kompatibilnost bi omogućila pripremu farmaceutske formulacije sa očuvanim svojstvima koja zadržava fiziohemijska svojstva i biološka aktivnost proteina tokom skladištenja.
[0062] U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više veza proizvedenih inženjeringom su kreirane sa jednom ili više ne-prirodnaih aminokiselina. Intramolekulska veza se može kreirati na mnogo načina, uključujući ali nije ograničeno na, reakciju između dve aminokiseline u proteinu pod pogodnim uslovima (jedne ili obe aminokiseline mogu biti ne-prirodne aminokiseline); reakciju sa dve aminokiseline, od kojih svaka može biti prirodno kodirana ili ne-prirodno kodirana, sa veznikom, polimerom, ili drugim molekul om pod pogodnim uslovima; itd.
[0063] U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više supstitucija sa aminokiselinom u polipeptidu relaksina može biti sa jednom ili više aminokiselina koje se javljaju u prirodi ili ne-prirodno kodiranim aminokiselinama. U nekim tehničkim rešenjima supstitucije aminokiselinom u polipeptidu relaksina mogu biti sa aminokiselinama koje se javljaju u prirodi ili ne-prirodno kodiranim aminokiselinama, pod uslovom da najmanje jedna supstitucija je sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom. U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više supstitucija sa aminokiselinom u polipeptidu relaksina može biti sa jednom ili više kiselina koje se javljaju u prirodi, i dodatno najmanje jedna supstitucija je sa neprirodno kodiranom aminokiselinom.
[0064] U skladu sa pronalaskom, ne-prirodno kodirana aminokiselina na položaju odabranom iz grupe koja se sastoji od: ostatka 1 lanca A, ostatka 5 lanca A, ostatka 13 lanca A, ostatka 18 lanca A, a ostatak 7 lanca B je para-acetil-fenilalanin.
[0065] Ovde stavljene na uvid su takođe ne-prirodno kodirane aminokiseline koje sadrže karbonil grupu, acetil grupu, aminooksi grupu, hidrazin grupu, hidrazid grupu, semikarbazid grupu, azid grupu, ili alkin grupu.
[0066] U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana aminokiselina sadrži karbonil grupu. U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana aminokiselina ima strukturu:
[0067] gde je n 0-10; R1 je alkil, aril, supstituisani alkil, ili supstituisani aril; R2 je H, alkil, aril, supstituisani alkil, i supstituisani aril; a R3 je H, aminokiselina, polipeptid, ili amino terminus modifikujuća grupa, a R4 je H, aminokiselina, polipeptid, ili karboksi terminus modifikujuća grupa.
[0068] U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana aminokiselina sadrži aminooksi grupu. U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana aminokiselina sadrži hidrazid grupu. U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana aminokiselina sadrži hidrazin grupu. U nekim slučajevima, ostatak ne-prirodno kodirane aminokiseline sadrži semikarbazid grupu.
[0069] U nekim slučajevima, ostatak ne-prirodno kodirane aminokiselinei sadrži azid grupu. U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana aminokiselina ima strukturu:
gde je n 0-10; R1 je alkil, aril, supstituisani alkil, supstituisani aril ili nije prisutna; X je O, N, S ili nije prisutana; m je 0-10; R2 je H, aminokiselina, polipeptid, ili amino terminus modifikujuća grupa, a R3 je H, aminokiselina, polipeptid, ili karboksi terminus modifikujuća grupa.
[0070] U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana aminokiselina sadrži alkin grupu. U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana aminokiselina ima strukturu:
gde je n 0-10; R1 je alkil, aril, supstituisani alkil, ili supstituisani aril; X je O, N, S ili nije prisutana; m je 0-10, R2 je H, aminokiselina, polipeptid, ili amino terminus modifikujuća grupa, a R3 je H, aminokiselina, polipeptid, ili karboksi terminus modifikujuća grupa.
[0071] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid je polipeptidni agonist relaksina, delimični agonist, antagonist, delimični antagonist, ili inverzni agonist. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptidni agonist relaksina, delimični agonist, antagonist, delimični antagonist, ili inverzni agonist sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu povezanu sa polimerom rastvorljivim u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, polimer rastvorljiv u vodi sadrži poli(etilen glikol) segment. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptidni agonist relaksina, delimični agonist, antagonist, delimični antagonist, ili inverzni agonist sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu i jednu ili više posttranslacionih modifikacija, veznik, polimer, ili biološki aktivni molekul.
[0072] Predmetni pronalazak takođe stavlja na uvid javnosti izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji hibridizuje pod strogim uslovima nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptide relaksina sa SEQ ID Nos (SEK ID Brojevi): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, i 12. Predmetni pronalazak takođe stavlja na uvid javnosti izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji hibridizuje pod strogim uslovima nukleinske kiseline koja kodira polipeptide relaksina sa SEQ ID NOs: 1 i 2. Predmetni pronalazak takođe stavlja na uvid javnosti izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid ili polinukleotide koji hidridizuju pod strogim uslovima u polinukleotide koji kodiraju polipeptide prikazane kao SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, i 12 gde polinukleotid sadrži najmanje jedan selektor kodon. Predmetni pronalazak takođe stavlja na uvid javnosti izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid ili polinukleotide koji hibridizuju pod strogim uslovima u polinukleotide koji kodiraju polipeptide prikazane kao SEQ ID NOs: 1 i 2 gde polinukleotid sadrži najmanje jedan selektor kodon. Predmetni pronalazak stavlja na uvid javnosti izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji kodira polipeptide prikazane kao SEQ ID NOs.: 1 i 2. Predmetni pronalazak takođe stavlja na uvid javnosti izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji kodira polipeptide prikazane SEQ ID NOs.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, i 12. Predmetni pronalazak stavlja na uvid javnosti izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji kodira polipeptide prikazane kao SEQ ID NOs.: 1 i 2 sa jednom ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina. Predmetni pronalazak takođe stavlja na uvid javnosti izolovane nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotid koji kodira polipeptide prikazane kao SEQ ID NOs.: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, i 12 sa jednom ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina. Prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike je očigledno da veliki broj različitih polinukleotida može da kodira bilo koji polipeptid predmetnog pronalaska.
[0073] U nekim tehničkim rešenjima, selektor kodon je odabran iz grupe koja se sastoji od ćilibar (amber) kodona, oker (ochre) kodona, opal kodona, jedinstvenog kodon, retkog kodon, petobaznog kodona, i četvorobaznog kodona.
[0074] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metode pravljenja polipeptida relaksina povezanim sa polimerom rastvorljivim u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, metoda sadrži kontakt izolovanog polipeptida relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu sa polimerom rastvorljivim u vodi koji sadrži segment koji reaguje sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom. U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina inkorporirana u polipeptid relaksina je reaktivna prema polimeru rastvorljivom u vodi koji je inače nije reaktivan u odnosu na bilo koju od 20 uobičajenih aminokiselina. U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina inkorporirana u polipeptid relaksina je reaktivna prema vezniku, polimeru, ili biološki aktivnom molekulu koji inače nije reaktivna u odnosu na bilo koju od 20 uobičajenih aminokiselina.
[0075] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina povezan sa polimerom rastvorljivim u vodi je napravljen reagovanjem polipeptida relaksina koji sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil sa molekulom poli(etilen glikola) koji sadrži aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazid grupu. U nekim tehničkim rešenjima, aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazid grupa je povezana sa molekulom poli(etilen glikola) preko amid povezivanja. U nekim tehničkim rešenjima, aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazid grupa je povezan sa molekulom poli(etilen glikola) preko karbamat povezivanja.
[0076] U nekim slučajevima, polipeptid relaksina povezan sa polimerom rastvorljivim u vodi je napravljen reagovanjem molekula poli(etilen glikola) koji sadrži karbonil grupu sa polipeptidom koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazid grupu.
[0077] U nekim slučajevima, polipeptid relaksina povezan sa polimerom rastvorljivim u vodi je napravljen reagovanjem polipeptida relaksina koji sadrži aminokiselinu koja sadrži alkin sa molekulom poli(etilen glikola) koji sadrži azid segment. U nekim tehničkim rešenjima, azid ili alkin grupa je povezana sa molekulom poli(etilen glikola) preko amid povezivanja.
[0078] U nekim slučajevima, polipeptid relaksina povezan sa polimerom rastvorljivim u vodi je napravljen reagovanjem polipeptida relaksina koji sadrži aminokiselinu koja sadrži azid sa molekulom poli(etilen glikola) koji sadrži alkin segment. U nekim slučajevima, azid ili alkin grupa je povezan sa molekulom poli(etilen glikola) preko amidnog povezivanja.
[0079] U nekim tehničkim rešenjima, molekul poli(etilen glikola) ima molekulsku masu od između oko 0.1 kDa i oko 100 kDa. U nekim tehničkim rešenjima, molekul poli(etilen glikola) ima molekulsku masu od između 0.1 kDa i 50 kDa.
[0080] U nekim tehničkim rešenjima, molekul poli(etilen glikola) je razgranat polimer. U nekim tehničkim rešenjima, svaka grana poli(etilen glikol) razgranatog polimera ima molekulsku masu od između 1 kDa i 100 kDa, ili između 1 kDa i 50 kDa.
[0081] U nekim tehničkim rešenjima, polimer rastvorljiv u vodi povezan sa polipeptidom relaksina sadrži polialkilen glikol segment. U nekim tehničkim rešenjima, ostatak neprirodno kodirane aminokiseline inkorporiran u polipeptid relaksina sadrži karbonil segment a polimer rastvorljiv u vodi sadrži aminooksi, hidrazid, hidrazin, ili semikarbazid segment.
[0082] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje sadrže polipeptid relaksina pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim tehničkim rešenjima, neprirodno kodirana aminokiselina je povezana sa polimerom rastvorljivim u vodi.
[0083] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje ćelije koje sadrže polinukleotid koji kodira polipeptid relaksina koji sadrži selektor kodon. U nekim tehničkim rešenjima, ćelije sadrže ortogonalnu RNK sintetazu i/ili ortogonalnu tRNK za supstituciju ne-prirodno kodirane aminokiseline u polipeptidu relaksina.
[0084] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metode za pravljenje polipeptida relaksina pronalaska. U nekim tehničkim rešenjima, metode sadrže kultivisanje ćelija koje sadrže polinukleotid ili polinukleotide koji kodiraju polipeptid relaksina, ortogonalnu RNK sintetazu i/ili ortogonalnu tRNK pod uslovima koji omogućavaju eksprimiranje polipeptida relaksina; i prečišćavanje polipeptida relaksina iz ćelija i/ili medijuma kulture.
[0085] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metode za povećanje terapijskog poluživota, poluživota u serumu ili vremena cirkulacije polipeptida relaksina. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje metode modulacije imunogenosti polipeptida relaksina. U nekim tehničkim rešenjima, metode sadrže supstituciju ne-prirodno kodirane aminokiseline za bilo koju jednu ili više aminokiselina u polipeptidima relaksina koji se javljaju u prirodi i/ili povezivanje polipeptida relaksina sa veznikom, polimerom, polimerom rastvorljivim u vodi, ili biološki aktivnim molekulom.
[0086] Na uvid javnosti su stavljene metode lečenja pacijenta kojem je potreban takvo lečenje sa efikasnom količinom molekula relaksina predmetnog pronalaska. U nekim slučajevima, metode sadrže administriranje pacijentu terapijski-efikasne količine farmaceutske kompozicije koja sadrži polipeptid relaksina koji sadrži ne-prirodno-kodiranu aminokiselinu i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina je povezana sa polimerom rastvorljivim u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina je glikozilovan. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid relaksina nije glikozilovan.
[0087] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje polipeptide relaksina koji sadrže sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1 i2, ili bilo kojoj drugoj sekvenci polipeptida relaksina (neograničavajući primer njih bi bio SEQ ID NOs: 3 do 12) osim što je najmanje jedna aminokiselina supstituisana ne-prirodno kodiranom aminokiselinom. U nekim tehničkim rešenjima, ne-prirodno kodirana aminokiselina je povezana sa polimerom rastvorljivim u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, polimer rastvorljiv u vodi sadrži poli(etilen glikol) segment.
[0088] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač i polipeptid relaksina koji sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NOs: 1 do12, ili bilo koju drugu sekvencu polipeptida relaksina, gde najmanje jedna aminokiselina je supstituisana pomoću ne-prirodno kodirane aminokiseline. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač i polipeptid relaksina koji sadrži A i B lanac (npr. SEQ ID NO: 1, 2, i 3; SEQ ID NOs: 4 i 5 ili 4 i 6 bi činile relaksin, itd.), ili bilo koju drugu sekvencu polipeptida relaksina, gde najmanje jedna aminokiselina je supstituisana pomoću ne-prirodno kodirane aminokiseline. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač i polipeptid relaksina koji sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1, 2, i/ili 3. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač i polipeptid relaksina koji sadrži sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1-3. U nekim tehničkim rešenjima, polimer rastvorljiv u vodi je povezan sa polipeptidom pomoću saharid segmenta. U nekim tehničkim rešenjima, veznik, polimer, oili biološki aktivni molekul je povezan sa polipeptidom relaksina pomoću saharid segmenta.
[0089] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid relaksina koji sadrži polimer rastvorljiv u vodi povezan pomoću kovalentne veze sa polipeptidom relaksina na jednoj aminokiselini. U nekim tehničkim rešenjima, polimer rastvorljiv u vodi sadrži poli(etilen glikol) segment. U nekim tehničkim rešenjima, aminokiselina kovalentno povezana sa polimerom rastvorljivim u vodi je ne-prirodno kodirana aminokiselina prisutna u polipeptidu.
[0090] Predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid relaksina koji sadrži najmanje jedan veznik, polimer, ili biološki aktivni molekul, gde navedeni veznik, polimer, ili biološki aktivni molekul je vezan za polipeptid preko funkcionalne grupa ne-prirodno kodirane aminokiseline ribozomalno inkorporirane u polipeptid. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid je monoPEGilovan. Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje polipeptid relaksina koji sadrži veznik, polimer, ili biološki aktivni molekul koji je vezan za jedan ili više ne-prirodno kodiranu aminokiselinu gde navedena ne-prirodno kodirana aminokiselina je ribozomalno inkorporirana u polipeptid na unapred odabranim mestima.
[0091] Uključeno u obim ovog pronalaska je vodeća ili signalna sekvenca relaksina čiji primer se može biti proinulin. Odabrana heterogena vodeća ili signalna sekvenca bi trebalo da bude ona koja je prepoznata i obrađena, npr. pomoću sistema za izlučivanje ćelije domaćina da se izdvoji i verovatno cepa signalnom peptidazom, pomoću ćelije domaćina. Metoda lečenja stanja ili poremećaja sa relaksinom ili polipeptidom relaksina ili analoga predmetnog pronalaska označava da podrazumeva lečenje sa relaksinom sa ili bez signalnog ili vodećeg peptida.
[0092] Predmetni pronalazak takođe stavlja na uvid javnosti metode indukovanja povećanja metabolizma glukoze, pri čemu navedena metoda sadrži administriranje relaksina navedenim ćelijama u količini efikasnoj da indukuje povećanje aktivnosti metabolizma glukoze.
[0093] U sledećem tehničkom rešenju, konjugacija polipeptida relaksina koji sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselinasa drugim molekulom, uključujući ali nije ograničeno na PEG, obezbeđuje suštinski prečišćen relaksin usled jedinstvene hemijske reakcije koja je korišćena za konjugaciju sa ne-prirodnom aminokiselinom. Konjugacija relaksina koji sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina sa drugim molekulom, kao što je PEG, može se izvesti drugim tehnikama za prečišćavanje koje su izvedne pre ili nakon koraka konjugacije da se obezbedi suštinski čist relaksin.
KRATAK OPIS SLIKA
[0094]
Slika 1 je model kristalne strukture relaksina prikazanog zajedno sa nekim položajima ostataka aminokiselina odabranim za supstituciju.
Slika 2 je model kristalne strukture relaksina prikazanog zajedno sa nekim položajima ostataka aminokiselina odabranim za supstituciju.
Slika 3 je model kristalne strukture relaksina prikazanog zajedno sa nekim položajima ostataka aminokiselina odabranim za supstituciju.
Slika 4 je slika strukture A i B lanaca humanog relaksina.
Slika 5 prikazuje SDS-PAGE gel prorelaksina proizvedenog ovim metodama sa lancem B1 amimokiseline kao Ala i para-acetil fenilalaninom u 13. položaju aminokiseline A lanca, supstituisanog valinom.
Slika 6(A) prikazuje SDS-PAGE gel nePEGilovanog relaksina V13pAF zajedno sa markerom molekulske mase u traci 1 i rekombinantnog i ne-rekombinantnog WT relaksina u trakama 3 i 7 (ne-redukovan (NR) i redukovan (R)). Slika 6(B) prikazuje SDS-PAGE gel PEGilovanog relaksina V13pAF u trakama 3 i 4(ne-redukovan (NR) i redukovan (R)) pored markera molekulske mase u traci 1.
Slika 7 prikazuje grafik koncentracije relaksina u serumu SD pacova u ng/mL tokom vremena za različito PEGilovan AV13 i divlji tip (wild type) polipeptida relaksina.
Slika 8(A) prikazuje grafik poređenja srednje vrednosti koncentracije u serumu grupe u odnosu na vreme za sve PEG-RLX grupe dozirane subkutano u Primeru 40. Injekcija jedne doze je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi. Simboli označavaju srednju vrednost ± SD grupisanih koncentracija u serumu u odnosu na vreme.
Slika 8(B) prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane subkutano sa 0.5 mg/kg 20KPEG-AQ1-RLX. Pojedinačna, subkutana doza je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi.
Slika 9(A) prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane subkutano sa 0.5 mg/kg PEG20-AA5-RLX. Pojedinačna, subkutana doza je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi.
Slika 9(B) prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane subkutano sa 0.5 mg/kg PEG20-AR18-RLX Pojedinačna, subkutana doza je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi.
Slika 10(A) prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane intravenski sa 0.5 mg/kg PEG20-BV7-RLX. Pojedinačna, intravenska doza je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi.
Slika 10(B) prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane intravenski sa 0.5 mg/kg PEG20-BW28-RLX. Pojedinačna, intravenska doza je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi.
Slika 11 prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane intravenski sa 0.5 mg/kg PEG20-AV13-RLX. Pojedinačna, intravenska doza je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi.
Slika 12(A) prikazuje grafik poređenja grupne srednje vrednosti koncentracije u serumu u odnosu na vreme za wt rhRelaksin doziran subkutano. Injekcija pojedinačne doze je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi.
Slika 12(B) prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane intravenski sa 0.5 mg/kg wt rhRelaksina. Pojedinačna, intravenska doza je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi.
Slika 13(A) prikazuje poređenje srednje vrednosti koncentracije u serumu grupe u odnosu na vreme za sve PEG-RLX grupe dozirane subkutano ili intravenski. Injekcija pojedninačne doze je administrirana svakoj životinji. N=3-5 životinja po grupi.
Slika 13(B) prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane intravenski sa 0.25 mg/kg 20KPEG-AQ1-RLX. Pojedinačna, intravenska doza je administrirana svakoj životinji. N=4 životinja po grupi.
Slika 14(A) prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane subkutano sa 0.5 mg/kg PEG20-AQ1-RLX. Pojedinačna, subkutana doza je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi.
Slika 14(B) prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane subkutano sa 0.25 mg/kg PEG20-AQ1-RLX. Pojedinačna, subkutana doza je administrirana svakoj životinji. N=3 životinja po grupi.
Slika 15 prikazuje grafik kriva pojedinačne koncentracije u serumu životinja u odnosu na vreme za SD pacove dozirane intravenski sa 0.125 mg/kg PEG20-AQ1-RLX. Pojedinačna, intravenska doza je administrirana svakoj životinji. N=5 životinja po grupi.
Slika 16(A) prikazuje grafik srednje vrednosti terminalnog poluživota PEG-Relaksina u odnosu na dozu; linije greške (error bars) =SD. Slika 16(B) prikazuje grafik srednje vrednosti AUCinfPEG-Relaksina u odnosu na dozu; linije greške =SD.
Slika 17(A) prikazuje grafik srednje vrednosti Cmax PEG-Relaksina u odnosu na dozu; linije greške =SD.
Slika 17(B) prikazuje grafik srednje vrednosti Klirensa PEG-Relaksina u odnosu na dozu; linije greške =SD.
Slika 18(A) prikazuje grafik srednje vrednosti Volumena distribucije PEG-Relaksina u odnosu na dozu; linije greške =SD. Slika 18(B) prikazuje grafik poređenja koncentracije u serumu u odnosu na vreme nakon pojedinačne intravenske ili subkutane injekcije 0.25 mg/kg 20KPEG-AQ1 Relaksina.
Slika 19, delovi (A) - (F) prikazuju podatke iz Faze I Primera 43. Slika 19(A) prikazuje efekat IV infuzije sa divljim-tipom relaksina na unos vode i izlučivanje urina. Slika 19 (B) prikazuje osnovnu liniju za svaku grupu Long-Evans pacova od -16 sata do 0 Faze I za izlučivanje urina. Slika 19(C) prikazuje efekat IV infuzije sa divljim-tipom relaksina na hematokrit. Slika 19(D) prikazuje efekat IV infuzije sa divljim-tipom relaksina na plazmu BUN kod ženki Long-Evans pacova. Slika 19(E) prikazuje unos vode za svaku grupu Long-Evans pacova od 0 do 6 sata Faze I. Slika 19(F) prikazuje izlučivanje urina za svaku grupu Long-Evans pacova od 0 do 6 sata Faze I.
Slika 20, delovi (A) - (I) pokazuju podatke iz Faze II nakon administracije transportera (kontrolna grupa) i test grupe sa 0.1X, 0,3X i 1X administracijom 20K PEG-Relaksina varijante sa supstitucijom A lanca na položaju 1 sa pAF vezanim za PEG iz Primera 43. Slika 20(A) prikazuje efekat na unos vode i izlučivanje urina. Slika 20 (B) prikazuje efekat na nivoe natrijuma u plazmi za svaku grupu Long-Evans pacova nakon injekcije. Slika 20 (C) prikazuje efekat na nivoe promene natrijuma u plazmi za svaku grupu Long-Evans pacova nakon injekcije, Slika 20(D) prikazuje efekat PEG-Relaksina na osmolarnost plazme. Slika 20(E) prikazuje efekat IV infuzije sa PEG-Relaksinom na promene osmolarnosti plazme. Slika 20(F) prikazuje efekat administracije PEG-Relaksina na BUN nivoe. Slika 20(G) prikazuje efekat administracije PEG-relaksina na unos vode za svaku grupu Long-Evans pacova od 0 do 6 sata Faze II. Slika 20(H) prikazuje izlučivanje osnovnog urina za svaku grupu Long-Evans pacova od -16 do 0 sata Faza II. Slika 20(I) prikazuje efekat administracije PEG-relaksina na izlučivanje urina za svaku grupu Long-Evans pacova od 0 do 6 sata Faze II.
DEFINICIJE
[0095] Treba shvatiti da ovaj pronalazak nije ograničen na određenu metodologiju, protokole, ćelijske linije, konstrukte i reagense opisane ovde i kao takvi mogu varirati. Takođe treba razumeti da se terminologija korišćena ovde je samo u svrhu opisivanja posebnih tehničkih rešenja, i nije predviđena da ograniči opseg predmetnog pronalaska, koji će biti ograničen samo priloženim patentnim zahtevima.
[0096] Kao što je korišćeno ovde i u priloženim patentnim zahtevima, oblici u jednini engleskih članova "a," "an," i "the" uključuju upućivanje na množinu ukoliko kontekst jasno ne navodi drugačije. Prema tome, na primer, referenca na "relaksin" ili "polipeptid relaksina" i razne hifenirane i nehifenirane oblike je referenca na jedan ili više takvih proteina i uključuje ekvivalente istih poznatih prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike, i tako dalje.
[0097] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini korišćeni ovde imaju isto značenje kao što je uobičajeno poznato prosečnom stručnjaku u oblasti kojoj pripada ovaj pronalazak. Iako se bilo koje metode, uređaji, i materijali slični ili ekvivalentni onima opisanim ovde mogu se koristiti u izvršavanju i testiranju pronalaska, poželjne metode, uređaji i materijali su sada opisani.
[0098] Sve objave i patenti pomenuti ovde su navedeni u svrhu opisivanja i stavljanja na uvid javnosti, na primer, konstrukati i metodologije koji su opisani u objavama, koji mogu biti korišćeni u vezi sa trenutno opisanim pronalaskom. Objave koje su ovde diskutovane su obezbeđene jedino radi njihovog stavljanja na uvid javnosti pre datuma podnošenja predmetne prijave. Ništa se ovde ne može tumačiti kao priznanje da pronalazači nemaju pravo da omoguće takvo stavljanje na uvid javnosti na osnovu prethodnog pronalaska ili iz bilo kojeg drugog razloga.
[0099] Termin "suštinski prečišćen" se podnosi na polipeptid relaksina koji može biti suštinski ili u osnovi slobodan od komponenata koje inače prate ili uzajamno deluju sa proteinom kao što se može naći u svom prirodnom okruženju, tj. nativne ćelije, ili ćelije domaćina u slučaju rekombinantno proizvedenog polipeptida relaksina. Polipeptid relaksina koji može biti suštinski slobodan od ćelijskog materijala uključuje preparate proteina koji imaju manje od oko 30%, manje od oko 25%, manje od oko 20%, manje od oko 15%, manje od oko 10%, manje od oko 5%, manje od oko 4%, manje od oko 3%, manje od oko 2%, ili manje od oko 1% (po suvoj masi) kontaminirajućeg proteina. Kada polipeptid relaksina ili varijanta istog je rekombinantno proizvedena od strane ćelije domaćina, protein može biti prisutan sa oko 30%, oko 25%, oko 20%, oko 15%, oko 10%, oko 5%, oko 4%, oko 3%, oko 2%, ili oko 1% ili manje od suve mase ćelije. Kada je polipeptid relaksina ili njegova varijanta rekombinantno proizvedena od ćelije domaćina, protein može biti prisutan u medijumu kulture sa oko 5g/L, oko 4g/L, oko 3g/L, oko 2g/L, oko 1g/L, oko 750mg/L, oko 500mg/L, oko 250mg/L, oko 100mg/L, oko 50mg/L, oko 10mg/L, ili oko 1mg/L ili manje od suve mase ćelije. Prema tome, "suštinski prečišćen" polipeptid relaksina proizveden metodama predmetnog pronalaska može imati nivo čistoće od najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, Konkretno, nivo čistoće od najmanje oko 75%, 80%, 85%, i konkretnije, nivo čistoće od najmanje oko 90%, nivo čistoće od najmanje oko 95%, nivo čistoće od najmanje oko 99% ili veće određeno pogodnim metodama kao što su SDS/PAGE analiza, RP-HPLC, SEC, i kapilarna elektroforeza.
[0100] "Rekombinantna ćelija domaćina" ili "ćelija domaćina" se odnosi na ćeliju koja uključuje egzogeni polinukleotid, bez obzira od metode koja je korišćena za umetanje, na primer, direktno preuzimanje, transdukcija, f-parenje, ili druge metode poznate u oblasti tehnike da se kreiraju ćelije domaćina. Egzogeni polinukleotid se može održavati kao neintegrisani vektor, na primer, plazmid, ili alternativno, može se integrisati u genom domaćina.
[0101] Kao što je korišćeno ovde, termin "medijum" ili "medij" uključuje bilo koji medijum kulture, rastvor, čvrstu supstancu, polu-čvrstu supstancu, ili kruti nosač koji može podržati ili sadržati bilo koju ćeliju domaćina, uključujući ćelije bakterije domaćina, ćelije kvasca domaćina kvasca, ćelije insekta domaćina, ćelije biljke domaćina, ćelije eukariotskog domaćina, ćelije sisara domaćina, CHO ćelije, ćelije prokariotskog domaćina, E. coli, ili Pseudomonas ćelije domaćina, i sadržaje ćelije. Prema tome, termin može obuhvatati medijum u kojem ćelija domaćina je uzgojena, npr., medijum u kojem je polipeptid relaksina je izlučen, uključujući medijum bilo pre ili posle koraka proliferacije. Termin takođe može obuhvatati pufere ili reagense koji sadrže lizate ćelije domaćina, kao što je u slučaju gde je polipeptid relaksina proizveden unutar ćelije i ćelije domaćina su lizirane ili podvrgnute disrupciji da se oslobodi polipeptid relaksina.
[0102] "Redukciono sredstvo", kao što je korišćeno ovde u odnosu na ponovno savijanje proteina, je definisano kao bilo koje jedinjenje ili materijal koji održava sulfhidril grupe u redukovanom stanju i redukuje intra- ili intermolekulske disulfidne veze. Pogodna redukciona sredstva uključuje, ali nisu ograničena na, ditiotreitol (DTT), 2-merkaptoetanol, ditioeritritol, cistein, cisteamin (2-aminoetanetiol), i redukovan glutation. Lako je očigledno prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike da širok spektar redukcionih sredstava je pogodan za primenu u metodama i kompozicijama predmetnog pronalaska.
[0103] "Oksidaciono sredstvo", kao što je korišćeno ovde u odnosu na ponovno savijanje proteina, je definisano kao bilo koje jedinjenje ili materijal koji je sposoban da ukloni elektron iz jedinjenja koje se oksiduje. Pogodna oksidaciona sredstva uključuje, ali nisu ograničena na, oksidovan glutation, cistin, cistamin, oksidovan ditiotreitol, oksidovan eritreitol, i kiseonik. Lako je očigledno prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike da širok spektar oksidacionih sredstava je pogodan za primenu u metodama predmetnog pronalaska.
[0104] "Agens za denaturaciju" ili "denaturant", kao što je korišćeno ovde, je definisan kao bilo koje jedinjenje ili materijal koje će izazvati reverziblno razvijanje proteina. Jačina agensa za denaturaciju ili denaturanta će se odrediti i svojstvima i koncentracijom specifičnog agensa za denaturaciju ili denaturanta. Pogodni agensi za denaturaciju ili denaturanti mogu biti haotropi, deterdženti, organski rastvarači, rastvarači koji se mešaju sa vodom, fosfolipidi, ili kombinacija dva ili više takvih agensasa. Pogodni haotropi uključuje, ali nisu ograničeni na, ureu, guanidin, i natrijum tiocijanat. Korisni deterdženti mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, jake deterdžente kao što je natrijum dodecil sulfat, ili polioksietilen etri (npr. Tween ili Triton deterdženti), Sarkozil, blagi ne-jonski deterdženti (npr., digitonin), blagi katjonski deterdženti kao što je N->2,3-(Dioleioksi)-propil-N,N,N-trimetilamonijum, blagi jonski deterdženti (npr. natrijum holat ili natrijum deoksiholat) ili cviterjonski deterdženti uključujući, ali nije ograničeno na, sulfobetaine (Zwittergent), 3-(3-hlolamidopropil)dimetilamonio-1-propan sulfat (CHAPS), i 3-(3-hlolamidopropil)dimetilamonio-2-hidroksi-1-propan sulfonat (CHAPSO). Organski, rastvarači koji se mešaju sa vodom kao što je acetonitril, niži alkanoli (posebno C2 - C4 alkanoli kao što je etanol ili izopropanol), ili niži alkandioli (posebno C2 - C4 alkandioli kao što je etilen-glikol) mogu se koristiti kao denaturanti. Fosfolipidi korisni u predmetnom pronalasku mogu biti fosfolipidi koji se javljaju u prirodi kao što je fosfatidiletanolamin, fosfatidilholin, fosfatidilserin, i fosfatidilinozitol ili sintetski derivati fosfolipida ili varijante kao što je diheksanoilfosfatidilholin ili diheptanoilfosfatidilholin.
[0105] "Ponovno savijanje", kao što je korišćeno ovde opisuje bilo koji proces, reakciju ili metodu koja transformiše disulfidnu vezu koju sadrže polipeptidi od nepravilno savijenog ili razvijenog stanja u prirodno ili pravilno savijenu konformaciju u odnosu na disulfide veze.
[0106] "Kosavijanje", kao što je korišćeno ovde, se konkretno odnosi na procese ponovnog savijanja, reakcije, ili metode koji koriste najmanje dva polipeptida koji uzajamno reaguju jedan sa drugim i rezultuju u transformaciji razvijenog ili nepravilno savijenog polipeptida u prirodno, pravilno savijene polipeptide.
[0107] Termin "proinsulin" kao što je korišćeno ovde je pravilno ukršteni protein formule:
B-C-A
gde:
A je A lanac relaksina ili funkcionalni derivat istog;
B je B lanac relaksina ili funkcionalni derivat istog koji ima .epsilon.-amino grupu; i
C je vezni peptid proinsulina. Poželjno, proinsulin je A lanac humanog relaksina, B lanac humanog relaksina, i C je prirodnih veznih peptid. Kada je proinsulin u prirodnoj sekvenci, proinsulin ima tri slobodne amino grupe: Fenilalanin(1) (.alfa.-amino grupa), Lizin(29) (.epsilon.-amino grupa) i Lizin(64) (.epsilon.-amino grupa).
[0108] Termin "analog relaksina" kao što je korišćeno ovde je pravilno ukršteni protein koji pokazuje aktivnost relaksina formule:
A-B
gde:
A je A lanac relaksina ili funkcionalni derivat relaksina A lanca; i
B je B lanac relaksina ili funkcionalni derivat relaksina B lanca koji ima .epsilon.-amino grupu i najmanje jedna od A ili B sadrži modifikaciju aminokiseline iz prirodne sekvence.
[0109] U predmetnoj specifikaciji, kada god se termin relaksin koristi u množini ili generičkom smislu namenjeno je da obuhvati i insuline koji se javljaju u prirodi i analoge relaksina i derivate istih. Sa "polipeptidom relaksina" kao što je korišćeno ovde je označeno jedinjenje koje ima molekulsku strukturu koja je slična onoj humanog relaksina uključujući disulfidne mostove između Cys.sup.A7 i Cys.sup.B7 i između Cys.sup.A20 i Cys.sup.B19 i unutrašnji disulfidni most između Cys.sup.A6 i Cys.sup.A11, i koje ima aktivnost relaksina.
[0110] Termin "relaksin" kao što je korišćeno ovde, se odnosi na humani relaksin, čija aminokiselinska sekvenca i prostorna struktura su dobro poznate. Humani relaksin sadrži A-lanac od dvadeset-jedne aminokiseline i B-lanac od trideset aminokiselina koje su umrežene pomoću disulfidih veza. Pravilno umrežen relaksin sadrži tri disulfidna mosta: jedan između pozicije 7 A-lanca i pozicije 7 B-lanca, drugi između pozicije 20 A-lanca i pozicije 19 B-lanca, i treći između pozicija 6 i 11 A-lanca [Nicol, D. S. H. W. i Smith, L. F., Nature, 187, 483-485 (1960)].
[0111] Peptidi relaksina uključujući, ali ne ograničeno na, relaksin, humani; relaksin, svinjski; IGF-I, humani; relaksinu-sličan faktor rasta II (69-84); pro-relaksinu-sličan faktor rasta II (68-102), humani; pro-relaksinu-sličan faktor rasta II (105-128), humani;
[AspB28]-relaksin, humani; [LysB28]-relaksin, humani; [LeuB28]-relaksin, human;i [ValB28]-relaksin, humani; [AlaB28]-relaksin, humani; [AspB28, ProB29]-relaksin, humani; [LysB28, ProB29]-relaksin, humani; [LeuB28, ProB29]-relaksin, humani;
[ValB28, ProB29]-relaksin, humani; [AlaB28, ProB29]-relaksin, humani; [GlyA21]-relaksin, humani; [GlyA21 GlnB3]-relaksin, humani; [AlaA21]-relaksin, humani; [AlaA21 Gln.sup.B3] relaksin, humani; [GlnB3]-relaksin, humani; [GlnB30]-relaksin, humani;
[GlyA21 GluB30]-relaksin, humani; [GlyA21 GlnB3 GluB30]-relaksin, humani; [GlnB3 GluB30]-relaksin, humani; B22-B30 relaksin, humani; B23-B30 relaksin, humani; B25-B30 relaksin, humani; B26-B30 relaksin, humani; B27-B30 relaksin, humani; B29-B30 relaksin, humani; A lanac humanog relaksina, i B lanac humanog relaksina.
[0112] Termin "analog relaksina" označava protein koji ima A-lanac i B-lanac koji suštinski imaju iste aminokiselinske sekvence kao A-lanac i/ili B-lanac humanog relaksina, redom, ali se razlikuje od A-lanca i B-lanca humanog relaksina tako što imaju jedno ili više brisanja aminokiseline, jedno ili više zamena aminokiseline, i/ili jedno ili više dodavanja aminokiseline koja ne uništavaju aktivnost analoga relaksina. Analog relaksina koji ima izoelektričnu tačku koja je "viša od" izoelektrične tačke relaksina je jedan tip analoga relaksina. Drugi tip analoga relaksina je "monomerni analog relaksina".
[0113] "Monomerni analog relaksina" je brzo-delujući analog humanog relaksina, uključujući, na primer, humani relaksin gde Pro na položaju B28 je supstituisan sa Asp, Lys, Leu, Val, ili Ala, i gde Lys na položaju B29 je Lys ili je supstituisan sa Pro. Drugi monomerni analog relaksina, takođe poznat kao des(B27) humani relaksin, je humani relaksin gde je Thr na položaju 27 B-lanca obrisan. Monomerni analozi relaksina su stavljeni na uvid javnosti u Chance, R. E., et al., američki patent br. 5,514,646, izdat 7. maja, 1996; Brems, D. N., et al. Protein Engineering, 5, 527-533 (1992); Brange, J. J. V., et al., objava EPO-a (Evropskog zavoda za patente) br. 214,826 (objavljena 18. marta 1987); i Brange, J. J. V., et al., Current Opinion in Structural Biology, 1, 934-940 (1991). Monomerni analozi relaksina upotrebljeni u predmetnim formulacijama su pravilno umreženi na istim pozicijama kao u humanom relaksinu.
[0114] Peptidi relaksina uključujući, ali nije ograničeno na, relaksin, humani; relaksin, svinjski; IGF-I, humani; relaksinu-sličan faktor rasta II (69-84); pro-relaksinu-sličan faktor rasta II (68-102), humani; pro-relaksinu-sličan faktor rasta II (105-128), humani;
[AspB28]-relaksin, humani; [LysB28]-relaksin, humani; [LeuB28]-relaksin, humani;
[ValB28]-relaksin, humani; [AlaB28]-relaksin, humani; [AspB28, ProB29]-relaksin, humani; [LysB28, ProB29]-relaksin, humani; [LeuB28, ProB29]-relaksin, humani;
[ValB28, ProB29]-relaksin, humani; [AlaB28, ProB29]-relaksin, humani; [GlyA21]-relaksin, humani; [GlyA21 GlnB3]-relaksin, humani; [AlaA21]-relaksin, humani; [AlaA21 Gln.sup.B3] relaksin, humani; [GlnB3]-relaksin, humani; [GlnB30]-relaksin, humani;
[GlyA21 GluB30]-relaksin, humani; [GlyA21 GlnB3 GluB30]-relaksin, humani; [GlnB3 GluB30]-relaksin, humani; B22-B30 relaksin, humani; B23-B30 relaksin, humani; B25-B30 relaksin, humani; B26-B30 relaksin, humani; B27-B30 relaksin, humani; B29-B30 relaksin, humani; A lanac humanog relaksina, i B lanac humanog relaksina.
[0115] U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje rekombinantne nukleinske kiseline koje kodiraju varijante proteine, ekspresione vektore koji sadrže varijante nukleinske kiseline, ćelije domaćina koje sadrže varijante nukleinske kiseline i/ili ekspresione vektore, i metode za proizvodnju različitih proteina. U dodatnom aspektu, pronalazak obezbeđuje lečenje poremećaja osetljivih na relaksin administriranjem pacijentu varijantnog proteina, obično sa farmaceutskim nosačem, u terapijski efikasnoj količini. U sledećem aspektu, pronalazak obezbeđuje metode za moduliranje imunogenosti (posebno redukovanje imunogenosti) polipeptida relaksina menjanjem epitopa MHC klase II.
[0116] Termin "polipeptid relaksina" takođe uključuje farmaceutski prihvatljive soli i prolekove, i prolekove soli, polimorfe, hidrate, solvate, biološki-aktivne fragmente, biološki aktivne varijante i stereoizomere relaksina koji se javlja u prirodi kao i agonist, mimetik, i varijante antagonista relaksina koji se javlja u prirodi i fuzije polipeptida istih. Fuzije koje sadrže dodatne aminokiseline na amino terminusa, karboksil terminusu, ili na oba, su obuhvaćene terminom "polipeptid relaksina." Primeri fuzija uključuju, ali nisu ograničeni na, npr., metionil relaksin u kojem je metionin povezan sa N-terminusom relaksina koji rezultuje iz rekombinantnog eksprimiranja zrelog oblika relaksina kojem nedostaje vodeći ili signalni peptid ili njegov deo (metionin je povezan sa N-terminusom relaksina koji rezultuje iz rekombinantnog eksprimiranja), fuzije u svrhu prečišćavanja (uključujući, ali nije ograničeno na, na poli-histidin ili epitope sa afinitetom), fuzije sa peptidima koji veruju serumski albumin i fuzije sa serumskim proteinima kao što je serumski albumin. Američki patent br. 5,750,373 opisuje metodu za selekciju novih proteina kao što je hormon rasta i varijante fragmenata antitela koje imaju izmenjena svojstva za vezivanje za svoje odgovarajuće molekule receptora. Metoda sadrži fuziju gena koji kodira protein od interesa za karboksi terminalni domen gena III za protein omotač vlaknastog faga M13. Himerni molekuli sadrži relaksin i jedan ili više drugih molekula. Himerni molekul može da sadrži specifične regione ili fragmente jednog ili oba relaksina i drugog(ih) molekula. Bilo koji takvi fragmenti mogu se pripremiti od proteina standardnim biohemijskim metodama, ili eksprimiranjem polinukleotida koji kodira fragment. Relaksin, ili njegov fragment, može se proizvesti kao fuzioni protein koji sadrže humani serumski albumin (HSA), Fc, ili njegov deo. Takvi fuzioni konstrukti su pogodni za poboljšanje eksprimiranja relaksina, ili njegovog fragmenta, u ćeliji eukariotskog domaćina. Primer HSA delova uključuje N-terminalni polipeptid (aminokiseline 1-369, 1-419, i srednje dužine koje počinju sa aminokiselinom 1), kao što je stavljeno na uvid javnosti u američkom patentu br.5,766,883, i objavi WO 97/24445. Drugi himerni polipeptidi mogu da uključe HSA protein sa relaksinom, ili njegove fragmenti, vezane za svaki od C- i N-terminusa HSA. Takvi HSA konstrukti su stavljeni na uvid javnosti u američkom patentu br. 5,876,969. Druge fuzije mogu se kreirati fuzijom relaksina sa a) Fc delom imunoglobulina; b) analogom Fc dela imunoglobulina; i c) fragmentima Fc dela imunoglobulina.
[0117] Razne reference stavljaju na uvid javnosti modifikacije polipeptida pomoću konjugacije polimerima ili glikozilacijom. Termin "polipeptid relaksina" uključuje polipeptide konjugovane sa polimerom kao što je PEG i mogu se sastojati od jedne ili više dodatnih derivitizacija cisteina, lizina, ili drugi ostaci. Pored toga, polipeptid relaksina može da sadrži veznik ili polimer, pri čemu aminokiselina za koju je veznik ili polimer konjugovan može biti ne-prirodna aminokiselina u skladu sa predmetnim pronalaskom, ili može biti konjugovana sa prirodno kodiranom aminokiselinom korišćenjem tehnika poznatim u oblasti tehnike kao što je spajanje sa lizinom ili cisteinom.
[0118] Termin "polipeptid relaksina" takođe uključuje glikozilovan relaksin, kao što je ali nije ograničeno na, polipeptide glikozilovane na bilo kojem aminokiselinskom položaju, N-povezan sa ili O-povezan sa glikozilovanim oblicima polipeptida. Varijante koje sadrže pojedinačne nukleotidne promene se takođe smatraju kao biološki aktivne varijante polipeptida relaksina. Dodatno, splajs varijante su takođe uključene. Termin "polipeptid relaksina" takođe uključuje heterodimere polipeptida relaksina, homodimere, heteromultimere, ili homomultimere bilo kog jednog ili više polipeptida relaksina ili bilo kog drugog polipeptida, proteina, karbohidrata, polimera, malog molekula, veznika, liganda, ili drugog biološki aktivnog molekula bilo kog tipa, povezanim hemijskim sredstvima ili eksprimiranim kao fuzioni protein, kao i analoge polipeptida koji sadrže, na primer, specifična brisanja ili druge modifikacije koje ipak održavaju biološku aktivnost.
[0119] Termin "polipeptid relaksina" ili "relaksin" obuhvata polipeptide relaksina koji sadrže jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, dodavanja ili brisanja. Polipeptidi relaksina predmetnog pronalaska mogu da sadrže modifikacije sa jednom ili više prirodnih aminokiselina u konjugaciji sa jedan ili više ne-prirodnih aminokiselinskih modifikacija. Primeri supstitucija u velikom broju aminokiselinskih položaja u polipeptidima relaksina koji se javljaju u prirodi je opisana, uključujući ali nije ograničeno na supstitucije koje moduliraju farmaceutsku stabilnost, koje moduliraju jednu ili više bioloških aktivnosti polipeptida relaksina, kao što je ali nije ograničeno na, povećavanje aktivnosti agonista, povećavanje rastvorljivosti polipeptida, smanjenje uspešnosti na proteazu, pretvaraju polipeptid u antagonist, itd. i obuhvaćene su terminom" polipeptid relaksina". U nekim tehničkim rešenjima, antagonist relaksina sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu povezanu sa polimerom rastvorljivim u vodi koji je prisutan u regionu za vezivanje receptora molekula relaksina.
[0120] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptidi relaksina dalje sadrže dodavanje, supstituciju ili brisanje koji moduliraju biološku aktivnost polipeptida relaksina. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptidi relaksina dalje sadrže dodavanje, supstituciju ili brisanje koji moduliraju anti-virusnu aktivnost polipeptida relaksina. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptidi relaksina dalje sadrže dodavanje, supstituciju ili brisanje koji poboljšavaju antivirusnu aktivnost polipeptida relaksina. Na primer, dodavanja, supstitucije ili brisanja mogu da moduliraju jedno ili više svojstava ili aktivnosti relaksina. Na primer, dodavanja, supstitucije ili brisanja mogu da moduliraju afinitet za receptor relaksina, moduliraju poluživot u cirkulaciji, moduliraju terapijski poluživot, moduliraju stabilnost polipeptida, moduliraju cepanje pomoću proteaza, moduliraju dozu, moduliraju oslobađanje ili bioraspoloživost, olakšavaju prečišćavanje, ili poboljšaju ili manjaju određen put administracije. Slično, polipeptidi relaksina mogu da sadrže sekvence cepane proteazom, reaktivne grupe, antitelo-vezujuće domene (uključujući ali nije ograničeno na, FLAG ili poli-His) ili druge sekvence zasnovane na afinitetu (uključujući ali nije ograničeno na, FLAG, poli-His, GST, itd.) ili povezane sa molekulima (uključujući ali nije ograničeno na, biotin) koje poboljšavaju detekciju (uključujući ali nije ograničeno na, GFP), prečišćavanje ili druge osobine polipeptida.
[0121] Termin "polipeptid relaksina" takođe obuhvata homodimere, heterodimere, homomultimere, i heteromultimere koji su povezani sa, uključujući ali nije ograničeno na one povezane direktno pomoću bočnih lanaca ne-prirodno kodirane aminokiseline, bilo za iste ili različite bočne lance ne-prirodno kodirane aminokiseline, bočne lance prirodnokodirane aminokiseline, ili indirektno pomoću veznika. Primeri veznika uključuju ali nisu ograničeni na, mala organska jedinjenja, polimere rastvorljive u vodi različite dužine kao što je poli(etilen glikol) ili polidekstran, ili polipeptidi različite dužine.
[0122] "Ne-prirodno kodirana aminokiselina" se odnosi na aminokiselinu koja nije jedna od 20 uobičajenih aminokiselina ili pirolizin ili selenocistein. Drugi termini koji se mogu koristiti kao sinonimi sa terminom "ne-prirodno kodirana aminokiselina" su "ne-prirodna aminokiselina," "neprirodna aminokiselina," aminokiselina koja se ne javlja u prirodi," i različite hifenirane i nehifenirane verzije istih. Termin "ne-prirodno kodirana aminokiselina" takođe uključuje, ali nije ograničena na, aminokiseline koje se dešavaju modifikacijom (npr. posttranslacione modifikacija) prirodno kodirane aminokiseline (uključujući ali nije ograničeno na, 20 uobičajenih aminokiselina ili pirolizin i selenocistein) ali one nisu same po sebi prirodno inkorporirane u rastući polipeptidni lanac od strane translacionog kompleksa. Primeri takvih aminokiselina koje se javljaju u prirodi uključuju, ali nisu ograničeni na, N-acetilglukozaminil-L-serin, N-acetilglukozaminil-L-treonin, i O-fosfotirozin.
[0123] "Amino terminus modifikujuća grupa" se odnosi na bilo koji molekul koji može biti vezan za amino terminus polipeptida. Slično, "karboksi terminus modifikujuća grupa" se odnosi na bilo koji molekul koji može biti vezan za karboksi terminus polipeptida. Terminus modifikujuće grupe uključuju, ali nije ograničeno na, razne polimere rastvorljive u vodi, peptide ili proteine kao što je serumski albumin, ili drugi segmenti koji povećavaju poluživot u serumu peptida.
[0124] Termini "funkcionalna grupa", "aktivni segment", "aktivirajuća grupa", "odlazeća grupa", "reaktivno mesto", "hemijski reaktivna grupa" i "hemijski reaktivan segment" su korišćeni u oblasti tehnike i ovde da se odnose na različite, odvojive delove ili jedinice molekula. Termini su donekle sinonimi u hemijskim oblastima i korišćeni su ovde da označe delovie molekula koji izvršavaju neku funkciju ili aktivnost i reaktivni su sa drugim molekulima.
[0125] Termin "povezivanje" ili "veznik" se ovde koristi za označavanje grupa ili veza koje su obično formirane kao rezultat hemijske reakcije i obično su kovalentna povezivanja. Hidrolitički stabilna povezivanja označavaju da su povezivanja suštinski stabilna u vodi i da ne reaguju sa vodom na pogodnim pH vrednostima, uključujući ali nije ograničeno na, pod fiziološkim uslovima za produženi period vremena, možda čak na neodređeno vreme. Hidrolitički nestabilna ili razgradiva povezivanja označavaju da su povezivanja razgradiva u vodi ili u vodenim rastvorima, uključujući na primer, krv. Enzimski nestabilna ili razgradiva povezivanja označavaju da se povezivanje može razgraditi pomoću jednog ili više enzima. Kao što se razume u oblasti tehnike, PEG i srodni polimeri mogu da uključe razgradiva povezivanja u osnovi polimera ili u grupi veznika između osnove polimera i jedne ili više termininalnih funkcionalnih grupa molekula polimera. Na primer, estar povezivanja formirana reakcijom PEG karboksilnih kiselina ili aktiviranih PEG karboksilnih kiselina sa alkoholnim grupama na biološki aktivnom agensu obično hidrolizuje pod fiziološkim uslovima da se oslobodi agens. Druga hidrolitički razgradiva povezivanja uključuju, ali nisu ograničena na, karbonatna povezivanja; povezivanja iminom rezultovana iz reakcije amina i aldehida; povezivanja fosfatnim estrom formirana reagovanjem alkohola sa fosfatnom grupom; povezivanja hidrazonom koja su reakcioni proizvod hidrazida i aldehida; povezivanja acetalom koja su reakcioni proizvod aldehida i alkohola; povezivanja ortoestrom koja su reakcioni proizvod formata i alkohola; peptidna povezivanja formirana pomoću aminske grupe, uključujući ali nije ograničeno na, na kraju polimera kao što je PEG, i karboksilne grupe peptida; i povezivanja oligonukleotidom formirana pomoću fosforamiditne grupe, uključujući ali nije ograničeno na, na kraju polimera, i 5' hidroksil grupe oligonukleotida.
[0126] Termin "biološki aktivni molekul", "biološki aktivni segment" ili "biološki aktivni agens" kada su korišćeni označava bilo koje substance koje mogu da imaju dejstvo na bilo koje fizička ili biohemijska svojstva biološkog sistema, puta, molekula, ili interakcija koje se odnose na organizam, uključujući ali nije ograničeno na, viruse, bakterije, bakteriofag, transpozon, prion, insekte, gljive, biljke, životinje, i ljude. Posebano, kao što je korišćeno ovde, biološki aktivni molekuli uključuji, ali nisu ograničeni na, bilo koja substance namenjenje za diagnozu, lečenje, ublažavanje, tretman, ili sprečavanje bolesti kod ljudi ili drugih životinja, ili da se na drugi način poboljša fizičko ili mentalno blagostanje ljudi ili životinja. Primeri biološki aktivnih molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, peptide, proteine, enzime, lekove sa malim molekulima, vakcine, imunogeni, tvrdi lekovi, meki lekovi, ksrbohidrati, neorganski atomi ili molekuli, boje, lipidi, nukleozidi, radionuklidi, oligonukleotidk, toksoidi, toksini, prokariotske i eukariotske ćelije, virusi, polisaharidi, nukleinske kiseline i njihovi delovi dobijeni ili izvedeni iz virusa, bakterija, insekata, životinja ili bilo koje druge ćelije ili ćelijskog tipa, lipozomi, mikročestice i micele. Polipeptidi relaksina mogu se dodati u micelarne formulacije; videti američki patent br.
5,833,948. Klase biološki aktivnih agensa koje su pogodne za primenu sa pronalaskom uključuju, ali nisu ograničene na, lekove, prolekove, radionuklide, agensi za snimanje polimere, antibiotike, fungicide, anti-virusne agense, antiinflamatorne agense, antitumorske agense, kardiovaskularne agense, anti-anksiozne agensie hormone, faktore rasta, steroidne agense, mikrobioločki izvedene toksine, i slično.
[0127] "Bifunkcionalni polimer" se odnosi na polimer koji sadrži dve diskretne funkcionalne grupe koje mogu da reaguju specifično sa drugim segmentima (uključujući ali nije ograničeno na, bočne grupe aminokiseline) da se formiraju kovalentna ili nekovalentna povezivanja. Bifunkcionalni veznik koji ima jednu funkcionalnu grupu reaktivnu sa grupom na određenoj biološki aktivnoj komponenta, i drugu grupu reaktivnu sa grupom na drugoj biološkoj komponenti, može se koristiti da se formira konjugat koji uključuje prvu biološki aktivnu komponentu, bifunkcionalni veznik i drugu biološki aktivnu komponentu. Mnoge procedure i molekuli za vezivanje raznih jedinjenja za peptide su poznati. Videti, npr., evropsku patentnu prijavu br. 188,256; američke patente sa brojevima 4,671,958, 4,659,839, 4,414,148, 4,699,784; 4,680,338; i4,569,789. "Multifunkcionalni polimer" se odnosi na polimer koji sadrže dve ili više diskretnih funkcionalnih grupa koje mogu specifično da reaguju sa drugim segmentom (uključujući ali nije ograničeno na, bočne grupe aminokiseline) da se formiraju kovalentna ili nekovalentna povezivanja. Bifunkcionalni polimer ili multifunkcionali polimer može biti bilo koje željene dužine ili molekulske mase, i može biti odabran da obezbedi posebno željeni razmak ili konformaciju između jednog ili više molekula povezanih sa relaksinom i njegovim receptorom ili relaksinom.
[0128] Gde su supstituentne grupe određene njihovim konvencionalnim hemijskim formulama, pisanim sa leva na desno, one jednako obuhvataju hemijski identične supstituente koji bi rezultirali pisanjem strukture sa desna na levo, na primer, struktura CH2O je ekvivalentna strukturi -OCH2.
[0129] Termin "supstituenti" uključuje ali nije ograničen na "supstituente koji ne ometaju". "Supstituenti koji ne ometaju" su one grupe koje daju stabilna jedinjenja. Pogodni supstituenti koji ne ometaju ili radikali uključuju, ali nisu ograničeni na, halo, C1 -C10 alkil, C2-C10 alkenil, C2-C10 alkinil, C1-C10 alkoksi, C1-C12 aralkil, C1-C12 alkaril, C3-C12 cikloalkil, C3-C12 cikloalkenil, fenil, supstituisani fenil, toluoil, ksilenil, bifenil, C2-C12 alkoksialkil, C2-C12 alkoksiaril, C7-C12 ariloksialkil, C7-C12 oksiaril, C1-C6 alkilsulfinil, C1-C10 alkilsulfonil, --(CH2)m --O--(C1-C10 alkil) gde je m od 1 do 8, aril, supstituisani aril, supstituisani alkoksi, fluoroalkil, heterociklični radikal, supstituisani heterociklični radikal, nitroalkil, --NO2, --CN, --NRC(O)--(C1-C10 alkil), --C(O)--(C1-C10 alkil), C2-C10 alkil tioalkil, --C(O)O--(C1-C10 alkil), --OH, --SO2, =S,-COOH, --NR2, karbonil, --C(O)--(C1-C10 alkil)-CF3, --C(O)--CF3, --C(O)NR2, --(C1-C10 aril)-S--(C6-C10 aril), --C(O)--(C1-C10 aril), --(CH2)m --O--(--(CH2)m--O--(C1-C10 alkil) gde je svako m od 1 do 8, --C(O)NR2, --C(S)NR2, -- SO2NR2, --NRC(O) NR2,-NRC(S) NR2, soli istih, i slično. Svaki R kao što je korišćeno ovde je H, alkil ili supstituisani alkil, aril ili supstituisani aril, aralkil, ili alkaril.
[0130] Termin "halogen" uključuje fluor, hlor, jod, i brom.
[0131] Termin "alkil," samostalno ili kao deo drugog supstituenta, označava, ukoliko nije drugačije navedeno, ravan ili razgranat lanac, ili ciklični ugljovodonični radikal, ili njihovu kombinaciju, koji mogu biti potpuno zasićeni, mono- ili polinezasićeni i mogu da uključuju di- i multivalentne radikale, koji imaju naznačen broj atoma ugljenika (tj. C1-C10 označava jedan do deset ugljenika). Primeri zasićenih ugljovodoničnih radikala uključuju, ali nisu ograničeni na, grupe kao što je metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, t-butil, izobutil, seebutil, cikloheksil, (cikloheksil)metil, ciklopropilmetil, homologe i izomere, na primer, npentil, n-heksil, n-heptil, n-oktil, i slično. Nezasićena alkil grupa je ona koja ima jednu ili više dvostrukih veza ili trostrukih veza. Primeri nezasićenih alkil grupa uključuju, ali nisu ograničene na, vinil, 2-propenil, krotil, 2-izopentil, 2-(butadienil), 2,4-pentadienil, 3-(1,4-pentadienil), etinil, 1- i 3-propinil, 3-butinil, i više homologe i izomere. Termin "alkil," ukoliko nije drugačije zabeleženo, je takođe nameravano da uključuje one derivate alkila definisane detaljnije ispod, kao što je "heteroalkil." Alkil grupe koje su ograničene na ugljovodonične grupe su označene terminom "homoalkil".
[0132] Termin "alkilen" samostalno ili kao deo drugog supstituenta označava divalentni radikal izveden iz alkana, kao što je prikazano, ali nije ograničeno na, pomoću struktura -CH2CH2- i -CH2CH2CH2CH2-, i dalje uključuje one grupe opisane ispod kao "heteroalkilen." Tipično, alkil (ili alkilen) grupa će imati od 1 do 24 atoma ugljenika, sa onim grupama koje imaju 10 ili manje atoma ugljenika koji su posebno tehničko rešenje metoda i kompozicija opisanih ovde. "Niži alkil" ILI "niži alkilen" je kraći lanac alkil ili alkilen grupe, obično koja ima osam ili manje atoma ugljenika.
[0133] Termini "alkoksi," "alkilamino" i "alkiltio" (ili tioalkoksi) su korišćeni u njihovom konvencionalnom smislu, i odnose se na one alkil grupe vezane za ostatak molekula pomoću atoma kiseonika, amino grupe, ili atoma sumpora, redom.
[0134] Termin "heteroalkil," samostalno ili u kombinaciji sa drugim terminom, označava, ukoliko nije drugačije naznačeno, stabilni ravan ili razgranat lanac, ili ciklični ugljovodonični radikal, ili njihove kombinacije, koje se sastoje od naznačenog broja atoma ugljenika i najmanje jednim heteroatomom odabranim iz grupe koje se sastoji od O, N, Si i S, i gde atomi azota i sumpora mogu po izboru biti oksidovani a heteroatom azota može po izboru bit kvaternizovan. Heteroatom(i) O, N i S i Si mogu biti smešteni na bilo kojoj unutrašnjoj poziciji heteroalkil grupe ili na poziciji na kojoj je alkil grupa vezana za ostatak molekula. Primeri uključuje, ali nisu ograničeni na, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2,-S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, i -CH=CH-N(CH3)-CH3. Do dva heteroatoma mogu biti uzastopna, kao što je, na primer, -CH2-NH-OCH3 i -CH2-O-Si(CH3)3. Slično, termin "heteroalkilen" samostalno ili kao deo drugog supstienta označava divalent radikal izveden iz heteroalkila, kao što je prikazano, ali nije ograničeno sa, -CH2-CH2-S-CH2 CH2- i -CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-. Za heteroalkilen grupe, isti ili različiti heteroatomi mogu takođe zauzeti jedan ili oba kraja lanca (uključujući ali nije ograničeno na, alkilenoksi, alkilendioksi, alkilenamino, alkilendiamino, aminooksialkilen, i slično). Još dalje, za alkilen i heteroalkilen vezujuće grupe, orjentacija vezujuće grupe nije podrazumevana pravcem u kojem je formula vezujuće grupe napisana. Na primer, formula C(O)2R' predstavlja obe
-C(O)2R' i -R'C(O)2.
[0135] Termini "cikloalkil" i "heterocikloalkil", samostalno ili u kombinacija sa drugim terminima, predstavlja, ukoliko nije drugačije naznačeno, ciklične verzije "alkila" i "heteroalkila", redom. Prema tome, cikloalkil ili heterocikloalkil uključuje zasićen, delimično nezasićen i potpuno nezasićena povezivanja prstenom. Pored toga, za heterocikloalkil, heteroatom može zauzeti poziciju na kojoj je heterocickl vezan za ostatak molekula. Primeri cikloalkila uključuje, ali nisu ograničeni na, ciklopentil, cikloheksil, 1-cikloheksenil, 3-cikloheksenil, cikloheptil, i slično. Primeri heterocikloalkila uključuju, ali nisu ograničeni na, 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridil), 1-piperidinil, 2-piperidinil, 3-piperidinil, 4-morfolinil, 3-morfolinil, tetrahidrofuran-2-il, tetrahidrofuran-3-il, tetrahidrotien-2-il, tetrahidrotien-3-il, 1-piperazinil, 2-piperazinil, i slično. Dodatno, termin obuhvata biciklične i triciklične prstenaste strukture. Slično, termin "heterocikloalkilen" samostalno ili kao deo drugog supstituenta označava divalentni radikal izveden od heterocikloalkila, a termin "cikloalkilen" samostalno ili kao deo drugog supstituenta označava divalentni radikal izveden iz cikloalkila.
[0136] Kao što je korišćeno ovde, termin "polimer rastvorljiv u vodi" se odnosi na bilo koji polimer koji je rastvorljiv u vodenim rastvaračima. Povezivanje polimera rastvorljivih u vodi sa polipeptidima relaksina može da rezultuje u promenama uključujući, ali nije ograničeno na, povećan ili moduliran poluživot u serumu, ili povećan ili moduliran terapijski poluživot u odnosu na nemodifikovan oblik, moduliranu imunogenost, modulirane karakteristike fizičke asocijacije kao što je agregacija i formiranje multimera, izmenjeno vezivanje receptora, izmenjeno vezivanje na jedan ili više vezujućih partnera, i izmenjena dimerizacija ili multimerizacija receptora. Polimer rastvorljiv u vodi može ili ne mora da ima sopstvenu biološku aktivnost, i može se koristiti kao veznik za vezivanje relaksina za druge supstance, uključujući ali nije ograničeno na jedan ili više polipeptida relaksina, ili jedan ili više biološki aktivnih molekula. Pogodni polimeri uključuje, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol, polietilen glikol propionaldehid, mono C1-C10 alkoksi ili ariloksi derivate istih (opisani u američkom patentu br.5,252,714), monometoksi-polietilen glikol, polivinil pirolidon, polivinil alkohol, poliaminokiseline, diviniletar maleinski anhidrid, N-(2-Hidroksipropil)-metakrilamid, dekstran, derivati dekstrana uključujući dekstran sulfat, polipropilene glikol, koipolimer polipropilene oksida/etilen oksida, polioksietilovan poliol, heparin, fragmenti heparina, polisaharidi, oligosaharidi, glikani, celulozu i derivate celuloze, uključujući ali nije ograničeno na metilcelulozu i karboksimetil celulozu, skrob i derivate skroba, polipeptide, polialkilen glikol i derivate istih, kopolimere polialkilen glikola i njihove derivate, polivinil etil etre, i alfa-beta-poli[(2-hidroksietil)-DL-aspartamid, i slično, ili njihove smeše. Primeri takvih polimera rastvorljivih u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glikol i serumski albumin.
[0137] Kao što je korišćeno ovde, termin "polialkilen glikol" ili "poli(alken glikol)" se odnosi na polietilen glikol (poli(etilen glikol)), polipropilen glikol, polibutilen glikol, i njihove derivate. Termin "polialkilen glikol" obuhvata i linearne i razgranate polimere i prosečnih molekulskih masa između 0.1 kDa i 100 kDa. Drugi primeri tehničkih rešenja su navedeni, na primer, u katalozima komercijalnih dostavljača, kao što je Shearwater Corporation's katalog "Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications" (2001).
[0138] Termin "aril" označava, ukoliko nije drugačije naznačeno, polinezasićen, aromatični, ugljovodonični supstituent koji može biti pojedinačni prsten ili višestruki prstenovi (uključujući ali nije ograničeno na, od 1 do 3 prstena) koji su spojeni zajedno ili kovalentno povezani. Termin "heteroaril" se odnosi na aril grupe (ili prstene) koji sadrže od jedan do četiri heteroatoma odabrana od N, O, i S, pri čemu atomi azota i sumpora su po izboru oksidovani, a atom(i) azota su po izboru kvaternizovani. Heteroaril grupa može biti vezana za ostatak molekula preko heteroatoma. Neograničavajući primeri aril i heteroaril grupa uključuju fenil, 1-naftil, 2-naftil, 4-bifenil, 1-pirolil, 2-pirolil, 3-pirolil, 3-pirazolil, 2-imidazolil, 4-imidazolil, pirazinil, 2-oksazolil, 4-oksazolil, 2-fenil-4-oksazolil, 5-oksazolil, 3-isoksazolil, 4-isoksazolil, 5-izoksazolil, 2-tiazolil, 4-tiazolil, 5-tiazolil, 2-furil, 3-furil, 2-tienil, 3-tienil, 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, 2-pirimidil, 4-pirimidil, 5-benzotiazolil, purinil, 2-benzimidazolil, 5-indolil, 1-izohinolil, 5-izohinolil, 2-hinoksalinil, 5-hinoksalinil, 3-hinolil, i 6-hinolil. Supstituenti za svaki iznad navedeni aril i heteroaril prstenasti sistemi su odabrani iz grupe prihvatljivih supstituenata opisanih ispod.
[0139] Zbog sažetosti, termin "aril" kada je korišćen u kombinaciji sa drugim terminima (uključujući ali nije ograničeno na, ariloksi, ariltioksi, arilalkil) uključuje i aril i heteroaril prstene kao što je definisano iznad. Prema tome, termin "arilalkil" označava da uključuje one radikale u kojima aril grupa je vezana za alkil grupu (uključujući ali nije ograničeno na, benzil, fenetil, piridilmetil i slično) uključujući one alkil grupe u kojima atom ugljenika (uključujući ali nije ograničeno na, metilen grupu) je zamenjen sa, na primer, atomom kiseonika (uključujući ali nije ograničeno na, fenoksimetil, 2-piridiloksimetil, 3-(1-naftiloksi)propil, i slično).
[0140] Svaki od iznad navedenih termina (uključujući ali nije ograničeno na, "alkil," "heteroalkil," "aril" i "heteroaril") su namenjeni da uključuju i supstituisane i nesupstituisane oblike navedenog radikala. Primeri supstituenata za svaki tip radikala su obezbeđeni ispod.
[0141] Supstituenti za alkil i heteroalkil radikale (uključujući one grupe koje se često nazivaju kao alkilen, alkenil, heteroalkilen, heteroalkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikloalkil, cikloalkenil, i heterocikloalkenil) mogu biti jedan ili više raznih grupa odabranim od, ali nije ograničeno na: -OR', =O, =NR', =N-OR', -NR'R", -SR', -halogen, -SiR'R"R"', OC(O)R', -C(O)R', -CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', NR' C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', -NR-C(NR'R"R'")=NR"", NR C(NR'R")-NR"', -S(O)R',-S(O)2R', -S(O)2NR'R", NRSO2R', -CN i -NO2 u broju u rasponu od nule do (2m'+1), gde je m' ukupan broj atomi ugljenika u takvom radikalu. R', R", R"' i R"" svaki nezavisno označava vodonik, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil, supstituisani ili nesupstituisani aril, uključujući ali nije ograničeno na, aril supstituisan sa 1-3 halogena, supstituisani ili nesupstituisani alkil, alkoksi ili tioalkoksi grupe, ili arilalkil grupe. Kada jedinjenje pronalaska uključuje više od jedne R grupe, na primer, svaka od R grupa je nezavisno odabrana kao svaka R', R", R'" i R"" grupa kada više od jedne od ovih grupa je prisutno. Kada R' i R" su vezane za isti atom azota, mogu se kombinovati sa atomom azota da formiraju 5-,6-, ili 7-očlani prsten. Na primer, - NR'R" označava da uključuje, ali nije ograničeno na, 1-pirolidinil i 4-morfolinil. Iz gornje diskusijeo supstituentima, stručnjak iz oblasti tehnike že razumeti da termin "alkil" označava da uključuje grupe uključujući atome ugljenika vezane za grupe koje nisu vodonične grupe, kao što je haloalkil (uključujući ali nije ograničeno na, -CF3 i -CH2CF3) i acil (uključujući ali nije ograničeno na, -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, i slično).
[0142] Slični supstituentima opisanim za alkil radikal, supstituenti za aril i heteroaril grupe variraju i odabrane su od, ali nisu ograničeni na: halogen, OR', =O, =NR', -N-OR', -NR'R", -SR', -halogen, -SiR'R"R"', OC(O)R', -C(O)R', CO2R', -CONR'R", -OC(O)NR'R", -NR"C(O)R', NR' C(O)NR"R"', -NR"C(O)2R', NR-C(NR'R"R"')=NR"", NR C(NR'R")=NR"', -S(O)R', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", NRSO2R', -CN i -NO2, -R', -N3, -CH(Ph)2, fluor (C1-C4)alkoksi, i fluor(C1-C4)alkil, u broju u rasponu od nule do ukupnog broja otvorenih valenci na aromatičnom prstenastom sistemu; i gde R', R", R'" i R"" su nezavisno odabrani od vodonika, alkila, heteroalkila, arila i heteroarila. Kada jedinjenje pronalaska uključuje više od jedne R grupe, na primer, svaka R grupa je nezavisno odabrana kao svaka R', R", R'" i R"" grupa kada više od jedne od ovih grupa je prisutno.
[0143] Kao što je korišćeno ovde, termin "moduliran poluživot u serumu" označava pozitivnu ili negativnu promenu u poluživotu u cirkulaciji modifikovanog relaksina u odnosu na njegov nemodifikovan oblik. Poluživot u serumu je meren uzimanjem uzoraka krvi na različitim vremenskim tačkama nakon administracije relaksina, i određivanjem koncentracije tog molekula u svakom uzorku. Veza koncentracije u serumu sa vremenom dozvoljava izračunavanje poluživota u serumu. Poželjno je povećanje poluživota u serumu najmanje oko dvostruko, ali manje povećanje može biti korisno, na primer kada omogućava zadovoljavajući režim doziranja ili izbegava toksični efekat. U nekim tehničkim rešenjima, povećanje je najmanje oko trostruko, najmanje oko petostruko, ili najmanje oko desetrostruko.
[0144] Termin "modulirani terapijski poluživot" kao što je korišćeno ovde označava pozitivnu ili negativnu promenu u poluživotu terapijski efikasne količine relaksina, u odnosu na njegov nemodifikovan oblik. Terapijski poluživot je meren merenjem farmakokinetičkih i/ili farmakodinamičkih svojstava molekula na raznim vremenskim tačkama nakon administracije. Povećani terapijski poluživot poželjno omogućava poseban povoljan režim doziranja, posebnu povoljnu ukupnu dozu, ili izbegava neželjeni efekat. U nekim tehničkim rešenjima, povećani terapijski poluživot rezultuje usled povećane potencije, povećanog ili smanjenog vezivanja modifikovanog molekula za njegov cilj, povećanog ili smanjenog raspada molekula enzimima kao što su proteaze, ili povećanja ili smanjenja u drugim parametrima ili mehanizmu delovanja nemodifikovanog molekula ili povećanje ili smanjenje u klirensu molekula posredovanog receptorom.
[0145] Termin "izolovan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili protein, označava da su nukleinska kiselina ili protein slobodani od najmanje nekih ćelijskih komponenti sa kojima su povezani u prirodnom stanju, ili da su nukleinska kiselina ili protein bili koncentrovani do nivoa većeg od njihove koncentracije in vivo ili in vitro proizvodnji. Mogu biti u homogenom stanju. Izolovane supstance mogu biti ili u suvom ili polu-suvom stanju, ili u rastvoru, uključujući ali nije ograničeno na, vodeni rastvor. Mogu biti komponenta farmaceutske kompozicije koja sadrži dodatne farmaceutski prihvatljive nosače i/ili ekscipijense. Čistoća i homogenost su obično određene korišćenjem tehnika analitičke hemije kao što je poliacrilamidi gel elektroforeza ili tečna hromatografija visokih performansi. Protein koji je dominantna vrsta prisutna u preparatu je suštinski prečišćen. Posebno, izolovani gen je odvojen iz otvorenih okvira čitanja koji flankiraju gen i kodiraju protein koji nije gena od interesa. Termin "prečišćen" označava da nukleinska kiselina ili protein suštinski dovodi do jedne trake u elektroforetskom gelu. Naročito, može značiti da je nukleinska kiselina ili proten najmanje 85% čist, najmanje 90% čist, najmanje 95% čist, najmanje 99% ili više čist.
[0146] Termin "nukleinska kiselina" se odnosi na deoksiribonukleotide, deoksiribonukleozide, ribonukleozide, ili ribonukleotide i njihove polimere bilo u jednoili dvo-lančanom obliku. Ukoliko nije konkretno ograničen, termin obuhvata nukleinske kiseline koje sadrže poznate analoge prirodnih nukleotida koji imaju slična svojstva vezivanja kao referentna nukleinska kiselina i metabolizuju se na način sličan nukleotidima koji se javljaju u prirodi. Ukoliko nije konkretno ograničeno drugačije, termin se takođe odnosi na analoge oligonukleotida uključujući PNA (peptidonukleinska kiselina), analoge DNK koji se primenjuju u antisens tehnologiji (fosforotioati, fosforoamidati, i slično). Ukoliko nije drugačije naznačeno, posebna sekvenca nukleinske kiseline takođe implicitno obuhvata konzervativno modifikovane varijante iste (uključujući ali nije ograničeno na, degenerisane supstitucije kodona) i komplementarne sekvence kao i sekvencu eksplicitno navedenu. Konkretno, degenerisane supstitucije kodona mogu se postići generisanjem sekvenci u kojima treća pozicija jednog ili više odabranih (ili svih) kodona je supstituisana sa mešovitom-bazom i/ili ostacima deoksiinozina (Batzer et al., Nucleic Acid Res.19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
[0147] Termini "polipeptid," "peptid" i "protein" su ovde korišćeni naizmenično da označe polimer aminokiselinih ostataka. Odnosno, opis usmeren na polipeptid podjednako se odnosi na opis peptida i na protein i obrnuto. Termini se odnose na polimere aminokiselina koje se javljaju nu prirodi kao i polimere aminokiselina u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka ne-prirodno kodirana aminokiselina. Kao što je korišćeno ovde, termini obuhvataju aminokiselinske lance bilo koje dužine, uključujući proteine cele dužine, gde su aminokiselinski ostaci povezani sa kovalentnim peptidnim vezama.
[0148] Termin "aminokiselina" se odnosi na aminokiseline koje se javljaju u prirodi i koje se ne javljaju u prirodi, kao i analoge aminokiselina i mimetike aminokiselina koji funkcionišu na način sličan aminokiselinama koje se javljaju u prirodi. Prirodno kodirane aminokiseline su 20 uobičajenih aminokiselina (alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin) i pirolizin i selenocistein. Analozi aminokiselina se odnosi na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao aminokiselina koja se javlja u prirodi, tj., α ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksil grupu, amino grupu, i R grupu, kao što je, homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi imaju modifikovane R grupe (kao što je, norleucin) ili modifikovane peptidne osnove, ali zadršavaju istu osnovnu hemijsku strukturu aminokiselina koja se javlja u prirodi. Navođenje na aminokiselinu uključuje, na primer, proteogene L-aminokiseline koje se javljaju u prirodi; D-aminokiseline, hemijski modifikovane aminokiseline kao što su aminokiselinske varijante i derivati; ne-proteogene aminokiseline koje se javljaju u prirodi kao što su β-alanin, ornitin, itd.; i hemijski sintetisana jedinjenja koja imaju svojstva za koja je poznato u oblasti tehnike da su karakteristične za aminokiseline. Primeri aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi uključuju, ali nije ograničeno na, α-metil aminokiseline (npr., α -metil alanin), D-aminokiseline, aminokiseline slične histidinu (npr., 2-amino-histidin, β -hidroksi-histidin, homohistidin, α -fluorometil-histidin i α -metil-histidin), aminokiseline koje imaju dodatni metilen u bočnom lancu ("homo" aminokiseline), i aminokiseline u kojima je karboksilna kiselina funkcionalna grupa u bočnom lancu zamenjena grupom sulfonske kiseline (npr., cisteinske kiseline). Inkorporacija ne-prirodnih aminokiselina, uključujući sintetske nenativne aminokiseline, supstituisane aminokiseline, ili jednu ili više D-aminokiselina u proteine predmetnog pronalaska može imati prednost u brojnim različitim načinima. Peptidi koji sadrže D-aminokiselinu, itd., ispoljavaju povećanu stabilnost in vitro ili in vivo u poređenju sa sadržajima koji sadrže L-aminokiselinu. Prema tome, konstrukcija peptida, itd., koji sadrže D-aminokiseline može biti posebno korisna kada je viša intraćelijska stabilnost poželjna ili potrebna. Konkretnije, D-peptidi, itd., su otporni na endogene peptidaze i proteaze, time obezbeđujući poboljšanu bioraspoloživost molekula, i produženo vreme života in vivo kada su takva svojstva poželjna, Dodatno, D-peptidi, itd., ne mogu se efikasno obraditi za ograničenu prezentaciju glavnog histokompatibilnog kompleksa klase II pomoćnim T ćelijama, i stoga je, manje verovatno da indukuju humoralni imuni odgovor u celom organizmu.
[0149] Aminokiseline se ovde mogu navoditi bilo njihovim uobičajeno poznatim simbolima sa tri slova ili sa simbolima sa jednim slovom preporučenim od strane IUPAC-IUB Komisija za biohemijsku nomenklaturu. Nukleotidi, isto tako, mogu se navoditi svojim obično prihvaćenim kodovima sa jednim slovom.
[0150] "Konzervativno modifikovane varijante" se odnose na sekvence i aminokiseline i nukleinske kiseline. U odnosu na posebne sekvence nukleinske kiseline, "konzervativno modifikovane varijante " se odnosi na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili esencijalno identične aminokiselinske sekvence, ili gde nukleinska kiselina ne kodira aminokiselinske sekvence, u esencijalno identične sekvence. Zbog degeneracije genetskog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira bilo koji protein. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU svi kodiraju aminokiselinu alanin. Prema tome, na svakom položaju gde je alanin određen kodonom, kodon se može izmeniti u bilo koji od odgovarajućih kodona koji su opisani bez izmene kodiranog polipeptida, Takve varijacije nukleinskih kiselina su "tihe varijacije", koje su jedna vrsta konzervativno modifikovanih varijacija. Svaka sekvenca nukleinske kiseline koja ovde kodira polipeptid takođe opisuje svaku moguću tihu (silent) varijaciju nukleinske kiseline. Prosečan poznavalac u oblasti će prepoznati da se svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG, koji je obično jedini kodon za metionin, iTGG, koji je obično jedini kodon za triptofan) može modifikovati da se dobije funkcionalno identičan molekul. Shodno tome, svaka tiha varijacija nukleinske kiseline koja kodira polipeptid je implicitna u svakoj opisanoj sekvenci.
[0151] Što se tiče aminokiselinskih sekvenci, prosečan poznavalac u oblasti će prepoznati da pojedinačne supstitucije, brisanja ili dodavanja sekvenci nukleinske kiseline, peptida, polipeptida, ili proteina koje menjaju, dodaju ili brišu pojedinačnu aminokiselinu ili mali procenat aminokiseline u kodiranoj sekvenci je "konzervativno modifikovana varijanta" gde izmena rezultuje u brisanju aminokiseline, dodavanju aminokiseline, ili supstituciji aminokiseline sa hemijski sličnom aminokiselinom. Tabele konzervativne supstitucije koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline su poznate prosečnim poznacvaocima u oblasti. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatak i ne isključuju polimorfne varijante, interspecijske homologe, i alele pronalaska.
[0152] Tabele konzervativne supstitucije aminokiseline koje obezbeđuju funkcionalno slične aminokiseline su poznate prosečnim poznacvaocima u oblasti tehnike. Sledećih osam grupa sadrži aminokiseline koje su konzervativne supstitucije jedna za drugu:
1) Alanin (A), Glicin (G);
2) Asparaginska kiselina (D), Glutaminska kiselina (E);
3) Asparagin (N), Glutamin (Q);
4) Arginin (R), Lizin (K);
5) Izoleucin (I), Leucin (L), Metionin (M), Valin (V);
6) Fenilalanin (F), Tirozin (Y), Triptofan (W);
7) Serin (S), Treonin (T); i
8) Cistein (C), Metionin (M)
(videti, npr., Creighton, Proteins: Strustures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2. izdanje (Decembar 1993).
[0153] Termini "identičan" ili procentno "identitet," u kontekstu dve ili više sekvenci nukleinskih kiselina ili polipeptida, se odnose na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste. Sekvence su "suštinski identične" ako imaju procenat aminokiselinskih ostataka ili nukleotida koji su isti (tj., oko 60% identiteta, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, ili oko 95% identiteta u određenom regionu), kada se porede i svrstavaju za maksimalno podudaranje preko prozora za poređenje, ili naznačenog regiona kao što je mereno korišćenjem jednog od sledećih algoritama za poređenje sekvenci (ili drugim algoritmima dostupnim prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike) ) ili ručnim usklađivanjem i vizuelnom inspekcijom. Ova definicija se takođe odnosi na dopunu test sekvence. Identitet može da postoji duž regiona koji je najmanje oko 50 aminokiselina ili nukleotida u dužini, ili duž regiona koji je 75-100 aminokiselina ili nukleotida u dužini, ili, gde nije određeno, duž cele sekvence polinukleotida ili polipeptida. Polinukleotid koji kodira polipeptid predmetnog pronalaska, uključujući homologe iz vrsta drugih od humanih, može se dobiti procesom koji sadrži korake skrininga biblioteke pod strogim uslovima hibridizacije sa obeleženom probom koja ima polinukleotidnu sekvencu pronalaska ili njen fragment, i izolovanjem cele-dužine cDNK i genomskih klonova koji sadrže navedenu polinukleotidu sekvencu. Takve tehnike hidridizacije su dobro poznate prosečnim poznavaocima.
[0154] Za poređenje sekvence, tipično jedna sekvenca ima ulogu kao referentna sekvenca, sa kojom se upoređuju test sekvence. Kada se koristi algoritam poređenja sekvence, test i referentne sekvence se unose u kompjuter, koordinate podsekvence su označene, ako je potrebno, i programski parametri algoritma sekvence su označeni. Podrazumevani programski parametri se mpgu koristiti, ili alternativni parametri mogu se označiti. Algoritam poređenja sekvence zatim izračunava procenat identiteta sekvence za test sekvence u odnosu na referentnu sekvencu, zasnovano na programskim parameterima.
[0155] "Prozor za poređenje", kao što je korišćeno ovde, uključuje referencu na segment bilo kojeg od broja susednih položaja izabranih iz grupe koja se sastoji od 20 do 600, obično oko 50 do oko 200, običnije oko 100 do oko 150 u kojoj sekvenca se može porediti sa referentnom sekvencom istog broja susednih položaja nakon što su dve sekvence optimalno poravnane. Metode poravnavanja sekvenci za poređenje su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može se izvesti pomoću, uključujući ali nije ograničeno na, lokalnog algoritma homologije od Smith-a i Vodaman-a (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, algoritma poravnajna homologije od Needleman-a i Wunsch-a (1970) J. Mol. Biol.48:443, metodom za pretragu sličnosti od Pearson-a i Lipman-a (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, kompjuterizovanim implementacijama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ili pomoću ručnog poravnanja i vizuelne inspekcije (videti, npr., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 dodatak)).
[0156] Jedan primer algoritma koji je pogodan za određivanje procenta identiteta sekvence i sličnosti sekvence su BLAST i BLAST 2.0 algoritmi, koji su opisani u Altschul et al. (1997) Nuc. Acids Res.25:3389-3402, i Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410, redom. Softver za izvođenje BLAST analize je javno dostupan preko National Center for Biotechnology Information dostupnog na World Wide Web (svetskoj mreži) na ncbi.nlm.nih.gov. Parametri BLAST algoritam W, T, i X određuju osetljivost i brzinu poravnanja. BLASTN program (za nukleotidne sekvence) koristi kao podrazumevano dužinu reči (W) od 11, očekivanje (E) ili 10, M=5, N=-4 i poređenje oba lanca. Za aminokiselinske sekvence, BLASTP program koristi kao podrazumevano dužinu reči od 3, i očekivanje (E) od 10, a BLOSUM62 matrica za bodovanje (videti Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) poravnanja (B) od 50, očekivanje (E) od 10, M=5, N=-4, i poređenje oba lanca. BLAST algoritam se obično izvodi sa isključenim filterom "niska kompleksnost" ("low complexity").
[0157] BLAST algoritam takođe izvodi statističku analizu sličnosti između dve sekvence (videti, npr., Karlin i Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Jedna mera sličnosti koju obezbeđuje BLAST algoritam je najmanja suma verovatnoće (P(N)), koja obezbeđuje naznaku verovatnoće da se slučajno dogodi podudaranje između nukleotidnih ili aminokiselinskih sekvenci. Na primer, nukleinska kiselina se smatra sličnom referentnoj sekvenci ukoliko najmanja suma verovatnoće u poređenju testne nukleinske kiseline sa referentnom nukleinskom kiselinom je manje od oko 0.2, ili manje od oko 0.01, ili manje od oko 0.001.
[0158] Fraza "selektivno (ili konkretno) hidridizuje na" se odnosi na vezivanje, udvostručavanje, ili hibridizaciju molekula samo za određenu nukleotidnu sekvencu pod strogim uslovima hibridizacije kada je ta sekvenca prisutna u složenoj smeši (uključujući ali nije ograničeno na, ukupnu ćelijsku ili DNK ili RNK iz biblioteke).
[0159] Fraza "strogi uslovi hibridizacije" se odnosi na hibridizaciju sekvence DNK, RNK, PNK, ili druge mimike nukleinske kiseline, ili njihove kombinacije pod uslovima niske jonske jačine i visoke temperature kao što je poznato u oblasti tehnike. Tipično, pod strogim uslovima proba će hibridizovati do svoje ciljne subsekvence u složenoj smeši nukleinske kiseline (uključujući ali nije ograničeno na, ukupnu ćelijsku ili DNK ili RNK iz biblioteke) ali neće hibridizovati u druge sekvence u složenoj smeši. Strogi uslovi su zavisni od sekvence i biće različiti u različitim okolnostima. Duže sekvence hibridizuju posebno na višim temperaturama. Opsežan vodič za hibridizaciju nukleinskih kiselina može se naći u Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays " (1993). Obično, strogi se biraju da budu oko 5-10o C niži od termalne tačke topljenja (Tm) za određenu sekvencu pri pH definisane jonske jačine. Tm je temperatura (pri definisanom jonskom jačinom, pH, i nukleinskom koncentracijom) na kojoj 50% proba je komplementarno sa ciljem hibridizuje sa ciljnom sekvencom u ravnoteži (pošto su ciljne sekvence prisutne u višku, na Tm 50% proba je zauzeto u ravnoteži). Strogi uslovi mogu biti oni u kojima koncentracija soli je manja od oko 1.0 M jona natrijum, obično oko 0.01 do 1.0 M koncentracije jona natrijuma (ili druge soli) pri pH 7.0 do 8.3 a temperatura je najmanje oko 30oC za kratke probe (uključujući ali nije ograničeno na, 10 do 50 nukleotida) i najmanje oko 60o C za duge probe (uključujući ali nije ograničeno na, veće od 50 nukleotida). Strogi uslovi mogu se takođe postići dodavanjem agensa za destabilizaciju kao što je formamid. Za selektivnu ili specifičnu hibridizaciju, pozitivan signal može biti najmanje dve puta pozadinski, po izboru 10 puta pozadinska hibridizacija. Primeri strogih uslova hibridizacije mogu biti sledeći: 50% formamid, 5X SSC, i 1% SDS, inkubiranje na 42oC, ili 5X SSC, 1% SDS, inkubiranje na 65oC, sa ispiranjem sa 0.2X SSC, i 0.1% SDS at 65oC. Takva ispiranja se mogu izvoditi tokom 5, 15, 30, 60, 120, ili više minuta.
[0160] Kao što je korišćeno ovde, termin "eukariot" se odnosi na organizme koji pripadaju filogenetskom domenu Eucarya, kao što su životinje (uključujući ali nije ograničeno na, sisare, insekte, gmizavce, ptice, itd.), treplje, biljke (uključujući ali nije ograničeno na, monokote, dikoti, alge itd.), gljivice, kvasci, flagelati, mikrosporidije, protisti, itd.
[0161] Kao što je korišćeno ovde, termin "neeukariotski" se odnosi na neeukariotske organizme. Na primer, neeukariotski organizmi mogu da pripadaju Eubacteria (uključujući ali nije ograničeno na, Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus steardrugimophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, itd.) filogenetskom domenu, ili Archaea (uključujući ali nije ograničeno na, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium kao što je Haloferax volcanii i Halobacterium vrste NRC-1, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernix, itd.) filogenetskom domenu.
[0162] Termin "subjekat" kao što je korišćeno ovde, se odnosi na životinju, u nekim tehničkim rešenjima na sisara, a u drugim tehničkim rešenjima na čoveka, koji je objekat tretmana, posmatranja ili eksperimenta. Životinja može da bude kućni ljubimac (npr., psi, mačke i slično), domaća životinja (npr. krave, ovce, svinje, konji i slično) ili laboratorijska životinja (npr. pacovi, miševi, zamorci i slično).
[0163] Termin "efikasna količina" kao što je korišćeno ovde se odnosi na onu količinu modifikovanog polipeptida ne-prirodne aminokiseline koji se administrira koji će donekle ublažiti jedan ili više simptoma bolesti, stanja ili poremećaja koji se leči. Kompozicije koje sadrže modifikovan polipeptid ne-prirodne aminokiseline opisan ovde može se administrirati u svrhu profilaktičkog, pojačavajućeg i/ili terapijskog lečenja.
[0164] Termini "poboljšati" ili "poboljšanje" označavaju poboljšati ili produžiti željeni efekat ili u jačini, ili u trajanju. Prema tome, što se tiče poboljšanja efekta terapijskih agenasa, termin "poboljšanje" se odnosi na sposobnost da se poveća ili produži, bilo po jačini ili trajanju, efekat drugih terapijskih agenasa na sistem. "Poboljšana-efikasna količina," kao što je korišćeno ovde, se odnosi na količinu koja je adekvatna da se poboljša efekat drugog terapijskog agensa u željenom sistemu. Kada se koriste kod pacijenta, količine koje su efikasne za ovu primenu zavisiće od ozbiljnosti i toka bolesti, poremećaja ili stanja, prethodne terapije, zdravstvenog stanja pacijenta i reakcije na lekove, i procene lekara koji leči.
[0165] Termin "modifikovan," kao što je korišćeno ovde se odnosi na bilo koje promene učinjene na datom polipeptidu, kao što su promene u dužini polipeptida, aminokiselinskoj sekvenci, hemijskoj strukturi, kotranslacijskoj modifikaciji, ili posttranslacionoj modifikaciji polipeptida. Oblik termina "(modifikovan)" označava da su polipeptidi o kojima se diskutuje po izboru modifikovani, to jest, polipeptidi o kojima se diskutuje mogu biti modifikovani ili nemodifikovani.
[0166] Termin " posttranslaciono modifikovan" se odnosi na bilo koju modifikaciju prirodne ili ne-prirodne aminokiseline koja nastaje kod takve aminokiseline nakon što je inkorporisana u polipeptidni lanac. Termin obuhvata, samo putem primera, kotranslacijske in vivo modifikacije, kotranslacijske in vitro modifikacije (kao što je u translacijskom sistemu bez ćelije), posttranslacione in vivo modifikacije, i posttranslacione in vitro modifikacije.
[0167] U profilaktičkim primenama, kompozicije koje sadrže polipeptid relaksina su administrirane pacijentu podložnom ili na drugi način u riziku od određene bolesti, poremećaja ili stanja. Takva količina je definisana kao "profilaktički efikasna količina". U ovoj primeni, precizne količine takođe zavise od zdravstvenog stanja pacijenta, težine, i slično. Smatra se da je u skladu sa znanjem u oblasti tehnike da se odrede takve profilaktički efikasne količine rutinskim eksperimentima (npr. kliničko ispitivanje eskalacije doze).
[0168] Termin "zaštićen" se odnosi na prisustvo "zaštitne grupa" ili segmenta koji sprečava reakciju hemijski reaktivne funkcionalne grupe pod određenim reakcionim uslovima. Zaštitna grupa će varirati u zavisnosti od vrsta hemijski reaktivne grupe koja je zaštićena. Na primer, ako je hemijski reaktivna grupa amin ili hidrazid, zaštitna grupa može biti odabrana iz grupe terc-butiloksikarbonil (t-Boc) i 9-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc). Ako je hemijski reaktivna grupa tiol, zaštitna grupa može biti ortopiridildisulfid. Ako je hemijski reaktivna grupa karboksilna kiselina, kao što je butanoična ili propionska kiselina, ili hidroksilna grupa, zaštitna grupa može biti benzil ili alkil grupa kao što je metil, etil ili tercbutil. Takođe se mogu koristiti i druge zaštitne grupe poznate u oblasti tehnike u ili sa metodama i kompozicijama koje su opisane ovde, uključujući fotolabilne grupe kao što je Nvoc i MeNvoc. Ostale zaštitne grupe poznate u oblasti tehnike takođe se mogu koristiti u ili sa metodama i kompozicijama koje su opisane ovde.
[0169] Samo prema primeru, blokirajuće/zaštitne grupe mogu se odabrati od:
[0170] Druge zaštitne grupe su opisane u Greene i Wuts, Protective Grupas in Organic Synthesis, 3. izd., John Wiley & Sons, Njujork, NY, 1999, koji je ovde inkorporiran referencom u celosti.
[0171] U terapijskim primenama, kompozicije koje sadrže modifikovani polipeptid prirodne aminokiseline iz lava su administrirane pacijentu pati od bolesti, stanja ili poremećaja, u količini dovoljnoj da izleči ili bar delimično zaustavi simptome bolesti, poremećaja ili stanja. Takva količina je definisana kao "terapeutski efikasna količina", i zavisiće od ozbiljnosti i toka bolesti, poremećaja ili stanja, prethodne terapije, zdravstvenog stanja pacijenta i odgovora na lekove, i procene lekara koji leči. Smatra se da je u skladu sa znanjem u oblasti tehnike da se odrede takve terapijski efikasne količine rutinskim eksperimentima (npr. kliničko ispitivanje eskalacije doze).
[0172] Polipeptidi relaksina predmetnog pronalaska mogu se primeniti za modulaciju vazokonstrikcije, proizvodnje NO, ET-1, Ang II i agregacije trombocita. U nekim slučajevima, pacijent kojem je to potrebno prima terapijsku količinu polipeptida relaksina predmetnog pronalaska koji bi smanjili vazokonstrikciju pacijenta u odnosu na osnovnu tačku njihovog traženog lečenja sa 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, više od 100%, 150%, više od 150%, 200%, više od 200%. Takođe na uvid javnosti stavljena je metoda lečenja pacijenta kojem je to potrebno da poveća proizvodnju NO pacijenta administriranjem terapijski efikasne količine polipeptida relaksina za povećanje proizvodnja NO sa 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, više od 100%, 150%, više od 150%, 200%, više od 200%.
[0173] Stavljena je na uvid javnosti metoda lečenja pacijenta kojem je to potrebno sa terapijskom količinom polipeptida relaksina predmetnog pronalaska koja pacijentovu agregaciju trombocita za 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, više od 100%, 150%, više od 150%, 200%, više od 200%. Takođe stavljena je na uvid javnosti metoda lečenja pacijenta kojem je to potrebno sa terapijskom količinom polipeptida relaksina za smanjenje. U sledećem tehničkom rešenju predmetnog pronalaska stavljena je na uvid javnosti metoda lečenja pacijenta kojem je to potrebno sa terapijskom količinom polipeptida relaksina predmetnog pronalaska koja smanjuje sintezu proteina stimulisanu CF-om za 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, više od 100%, 150%, više od 150%, 200%, više od 200%. Takođe stavljena je na uvid javnosti metoda lečenja pacijenta kojem je to potrebno za povećanje ANP ekspresije pacijenta administriranjem terapeutski efikasne količine polipeptida relaksina za povećanje proizvodnje NO za 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, više od 100%, 150%, više od 150%, 200%, više od 200%.
[0174] Predmetne metode prema kojima peg-relaksin predmetnog pronalaska ima 10-puta povećanje AUC-a u poređenju sa divljim tipom relaksina 15-puta povećanje; više od 15-puta povećanje; 20-puta povećanje; više od 20-puta povećanje; 25 puta povećanje; više od 25-puta povećanje; 30-puta povećanje; više od 30-puta povećanje; 35-puta povećanje; više od 35-puta povećanje; 40-puta povećanje; više od 40-puta povećanje; 45-puta povećanje; više od 45-puta povećanje; 50-puta povećanje; više od 50-puta povećanje; 55-puta povećanje; više od 55-puta povećanje; 60-puta povećanje; više od 60-puta povećanje; 65-puta povećanje; više od 65-puta povećanje; 70-puta povećanje; više od 70-puta povećanje; 75-puta povećanje; više od 75-puta povećanje; 80-puta povećanje; više od 80-puta povećanje; 85-puta povećanje; više od 85-puta povećanje; 90-puta povećanje; više od 90-puta povećanje; 95-puta povećanje; više od 95-puta povećanje; 100-puta povećanje; više od 100-puta povećanje.
[0175] Termin "lečenje" se koristi za upućivanje ili na profilaktička i/ili terapijska lečenja.
[0176] Polipeptidi ne-prirodno kodirane aminokiseline koji su ovde prikazani mogu da uključuju izotopno-označena jedinjenja sa jednim ili više atoma zamenjenih atomom koji ima atomsku masu ili masni broj različit od atomske mase ili masenog broja koji se obično nalazi u prirodi. Primeri izotopa koji se mogu inkorporirati u predmetna jedinjenja uključuju izotope vodonika, ugljenika, azota, kiseonika, fluora i hlora, kao što su 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 180, 170, 35S, 18F, 36C1, redom. Određena neizotopno-obeležena jedinjenja opisana ovde, na primer ona u kojima su radioaktivni izotopi kao što je 3H i 14C inkorporirani, mogu se primeniti u ispitivanjima distribucije leku i/ili supstrata u tkivu. Zatim, supstitucija sa izotopima kao što je deuterijum, tj., 2H, može pružiti određene terapijske prednosti koje rezultiraju od veće metaboličke stabilnosti, na primer povećanog in vivo poluživota ili smanjenih potreba za doziranjem.
[0177] Svi izomeri uključujući ali nije ograničeno na dijastereomere, enantiomere, i njihove smeše se smatraju delom kompozicija koje su opisane ovde. U dodatnim ili sledećim tehničkim rešenjima, polipeptidi ne-prirodno kodirane aminokiseline se metabolizuju nakon administracije u organizam kojem je to potrebno da se proizvede metabolit koji se zatim primenjuje da se proizvede željeni efekat, uključujući željeni terapijski efekat. U dodatnim ili sledećim tehničkim rešenjima su aktivni metaboliti polipeptida ne-prirodno kodirane aminokiseline.
[0178] U nekim situacijama, polipeptidi ne-prirodno kodirane aminokiseline mogu da postoje kao tautomeri. Pored toga, polipeptidi ne-prirodno kodirane aminokiseline ovde opisani mogu biti u nesolvatnim kao i u solvatnim oblicima sa farmaceutski prihvatljiveim rastvaračima kao što je voda, etanol, i slično. Takođe se smatra da su solvatni oblici ovde stavljeni na uvid javnosti. Oni koji su prosečni poznavaoci iz oblasti tehnike će prepoznati da neka od jedinjenja ovde navedenih mogu da postoje u nekoliko tautomernih oblika. Svi takvi tautomerni oblici se smatraju delom kompozicija koje su opisane ovde.
[0179] Ukoliko nije drugačije naznačeno, uobičajene metode masene spektroskopije, NMR, HPLC, hemija proteina, biohemija, tehnike rekombinantne DNK i farmakologije, u okviru znanja iz oblasti tehnike se koriste.
DETALJAN OPIS
I. Uvod
[0180] Polipeptidi relaksina koji sadrže najmanje jednu neprirodnu aminokiselins su ovde stavljeni na uvid javnosti. U određenim slučajevima, polipeptid relaksina sa najmanje jednom neprirodnom aminokiselinom uključuje najmanje jednu posttranslacionu modifikaciju. U jednom slučaju, najmanje jedna posttranslaciona modifikacija sadrži vezivanje molekula uključujući ali nije ograničeno na, oznaku, boju, polimer, polimer rastvorljiv u vodi, derivat polietilen glikola, sredstvo za fotoumrežavanje, radionukleid, citotoksično jedinjenje, lek, oznaku afiniteta, oznaku fotoafiniteta, reaktivno jedinjenje, smolu, drugi protein ili polipeptid ili analog polipeptida, antitelo ili fragment antitela, metalni helator, kofaktor, masnu kiselinu, karbohidrat, polinukleotid, DNK, RNK, antisens polinukleotid, saharid, dendrimer rastvorljiv u vodi, ciklodekstrin, inhibitornu ribonukleinsku kiselinu, biomaterijal, nanočesticu, spin oznaku, fluorofor, segment koji sadrži metal, radioaktivni segment, novu funkcionalnu grupu, grupu koja kovalentnno ili nekovalentno intereaguje sa drugim molekulima, fotoosetljiv segment, segment koji se može ekscitirati aktinskom radijacijom, segment sa mogućnošću fotoizomerizacije, biotin, derivat biotina, analog biotina, segment koji sadrži težak atom, grupu koja se može hemijski ocepiti, grupu koja se može foto ocepiti, izduženi bočni lanac, ugljenik-povezan sa šećerom, redoks-aktivni agens, amino tiokiselina, toksični segment, izotopno obeležen segment, biofizičku probu, fosforescentnu grupu, hemiluminiscentnu grupu, elektron gustu grupu, magnetnu grupu, interkalirajuću grupu, hromofor, agens za transfer energije, biološki aktivni agens, detektibilnu oznaku, mali molekul, kvantnu tačku, nanotransmiter, radionukleotid, radiotransmiter, agens za hvatanje neutrona, ili bilo koja kombinacija iznad navedenih ili bilo koje drugo poželjno jedinjenje ili substanca, koji sadrže drugu reaktivnu grupu za najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu koja sadrži prvu reaktivnu grupu korišćenjem hemijske metodologije koja je poznata prosečnom poznavaocu iz oblasti da je pogodna za posebno reaktivne grupe. Na primer, prva reaktivna grupa je alkinil segment (uključujući ali nije ograničeno na, u neprirodnoj aminokiselini p-propargiloksifenilalanin, gde se propargil grupa takođe ponekad odnosi na acetilen segment) a druga reaktivna grupa je azido segment, i [3+2] metodologije hemijske cikloadicije su korišćene. U drugom primeru, prva reaktivna grupa je azido segment (uključujući ali nije ograničeno na, u neprirodnoj aminokiselini p-azido-L-fenilalanin) a druga reaktivna grupa je alkinil segment. U određenim slučajevima modifikovanog polipeptida relaksina predmetnog pronalaska, najmanje jedna neprirodna aminokiselina (uključujući ali nije ograničeno na, neprirodna aminokiselina koja sadrži keto funkcionalnu grupu) koja sadrži najmanje jednu posttranslacionu modifikaciju, je primenjena gde najmanje jedna posttranslaciona modifikacija sadrži saharid segment. U određenim slučajevima, posttranslaciona modificatioja je urađena in vivo u eukariotskoj ćeliji ili u neeukariotskoj ćeliji. Veznik, polimer, polimer rastvorljiv u vodi, ili drugi molekul može da veže molekul za polipeptid. Molekul se može povezati direktno za polipeptid.
[0181] U određenim slučajevima, protein uključuje najmanje jednu posttranslacionu modifikaciju koja je urađena in vivo od jedne ćelije domaćina, gde posttranslaciona modifikacija nije obično urađena od drugog tipa ćelije domaćina. U određenim slučajevima, protein uključuje najmanje jednu posttranslacionu modifikaciju koja je urađena in vivo od strane eukariotske ćelije, gde posttranslaciona modifikacija nije obično urađena od strane neeukariotske ćelije. Primeri posttranslacionih modifikacija uključuju, ali nisu ograničeni na, glikozilaciju, acetilacija, acilacija, lipid-modifikaciju, palmitoilacija, dodavanje palmitata, fosforilacija, glikolipid-povezivanje modifikaciju modifikacija glikolipid-povezivanja, i slično.
[0182] U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina za glikozilaciju, acetilaciju, acilaciju, lipid-modifilaciju, palmitoilaciju, dodavanje palmitata, fosforilaciju, modifikaciju glikolipid-povezivanja polipeptida. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina za glikozilaciju polipeptida. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži jednu ili više prirodno kodiranih aminokiselina za glikozilaciju, acetilaciju, acilaciju, lipid-modifikaciju, palmitoilaciju, dodavanje palmitata, fosforilaciju, ili modifikaciju glikolipid-povezivanja polipeptida. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži jednu ili više prirodno kodiranih aminokiselina za glikozilaciju polipeptida.
[0183] U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži dodavanja i/ili supstitucije jedne ili više ne-prirodno kodirane aminokiseline koje poboljšavaju glikozilaciju polipeptida. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži jedno ili više brisanja koja poboljšavaju glikozilaciju polipeptida. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži dodavanja i/ili supstitucije jedne ili više ne-prirodno kodirane aminokiseline koja poboljšavaju glikozilaciju na različitoj aminokiselini u polipeptidu. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži jedno ili više brisanja koja poboljšavaju glikozilaciju na različitoj aminokiselini u polipeptidu. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži dodavanja i/ili supstitucije jedne ili više ne-prirodno kodirane aminokiseline koja poboljšavaju glikozilaciju ne-prirodno kodirane aminokiselina u polipeptidu. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži dodavanja i/ili supstitucije jedne ili više ne-prirodno kodirane aminokiseline koja poboljšavaju glikozilaciju na prirodno kodiranoj aminokiselini u polipeptidu. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži dodavanja i/ili supstitucije jedne ili više prirodno kodirane aminokiseline koja poboljšavaju glikozilaciju na različitoj aminokiselini u polipeptidu. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži dodavanja i/ili supstitucije jedne ili više ne-prirodno kodirane aminokiseline koja poboljšavaju glikozilaciju na prirodno kodiranoj aminokiselini u polipeptidu. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina sadrži dodavanja i/ili supstitucije jedne ili više ne-prirodno kodirane aminokiseline koja poboljšavaju glikozilaciju na ne-prirodno kodiranoj aminokiselini u polipeptidu.
[0184] U jednom slučaju, posttranslaciona modifikacija sadrži vezivanje oligosaharida za asparagin pomoću GlcNAc-asparagin povezivanja (uključujući ali nije ograničeno na, gde oligosaharid sadrži (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc, i slično). U sledećem slučaju, posttranslaciona modifikacija sadrži vezivanje oligosaharida (uključujući ali nije ograničeno na, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, itd.) za serin ili treonin pomoću GalNAc-serin, GalNAc-treonin, GlcNAc-serin, ili GlcNAc-treonin povezivanja. U određenim slučajevima, protein ili polipeptid pronalaska može da sadrži sekvencu sekrecije ili lokalizacije, oznaku epitopa, FLAG oznaku, polihistidinsku oznaku, GST fuziju, i/ili slično. Primeri sekrecionih signalnih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na, sekrecionu signalnu sekvencu prokariota, sekrecionu signalnu sekvencu eukariota, sekrecionu signalnu sekvencu eukariota 5'-optimizovanu za bakterijsko eksprimiranje, novu sekrecionu signalnu sekvencu, sekrecionu signalnu sekvencu pektat liaze, Omp A sekrecionu signalnu sekvenci, i fag sekrecionu signalnu sekvencu. Primeri sekrecionih signalnih sekvenci, uključuju, ali nisu ograničeni na, STII (prokariotske), Fd GIII i M13 (fag), Bgl2 (kvasac), i signalnu sekvencu bla izvedenu iza transposona. Bilo koja takva sekvenca se može modifikovati da se obezbedi željeni rezultat sa polipeptidom, uključujući ali nije ograničeno na, supstituciju jedne signalne sekvence sa drugom signalnom sekvencom, supstituciju vodeće sekvence sa drugom vodećom sekvencom, itd.
[0185] Protein ili polipeptid od interesa može da sadrži najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, ili deset ili više neprirodnih aminokiselina. Neprirodne aminokiseline mogu biti iste ili različite, na primer, može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više različitih mesta u proteinu koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više različitih neprirodnih aminokiselina. U određenim slučajevima, najmanje jedna, ali manje od svih, određena aminokiselina prisutna u verziji proteina koji se javlja u prirodi je supstituisana sa neprirodnom aminokiselinom.
[0186] Ovde stavljene na uvid javnosti su metode i kompozicije zasnovane na relaksinu koje sadrže najmanje jednu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu. Uvođenje najmanje jedne ne-prirodno kodirane aminokiseline u relaksin može omogućiti primenu hemijskih konjugacija koje uključuju specifične hemijske reakcije, uključujući, ali nije ograničeno na, sa jednom ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina dok ne reaguju sa 20 aminokiselina koje se uobičajeno javljaju. U nekim slučajevima, relaksin koji sadrže ne-prirodno kodiranu aminokiselinu je povezan sa polimerom rastvorljivim u vodi, kao što je polietilen glikol (PEG), pomoću bočnog lanca ne-prirodno kodirane aminokiseline. Ovde je stavljena na uvid javnosti je visoko efikasna metoda za selektivnu modifikaciju proteina sa PEG derivatima, koja uključuje selektivnu inkorporaciju negenetski kodiranih aminokiselina, uključujući ali nije ograničeno na, one aminokiseline koje sadrže funkcionalne grupe ili supstituente kojih nema u 20 prirodno inkorporiranih aminokiselina, uključujući ali nije ograničeno na keton, azid ili acetilen segment, u proteinima kao odgovor na selektor kodon i naknadnu modifikaciju tih aminokiselina sa pogodnim reaktivnim PEG derivatom. Jednom inkorporirani, aminokiselinski bočni lanci mogu se potom modifikovati korišćenjem hemijskih metodologija poznatim prosečnim poznavaocima iz oblasti known koje su pogodne za određene funkcionalne grupe ili supstituente prisutne u ne-prirodno kodiranoj aminokiselini. Poznate hemijske metodologije širokog spektra su pogodne za primenu u predmetnoj objavi da se inkorporira polimer rastvorljiv u vodi u protein. Takve metodologije uključuju ali nisu ograničene na reakciju Huisgen-ove [3+2] cikloadicije (videti, npr., Padwa, A. u Comprehensive Organic Synthesis, tom. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oksford, str. 1069-1109; i, Huisgen, R. u 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, Njujork, str. 1-176) sa, uključujući ali nije ograničeno na, derivate acetilena ili azida, redom.
[0187] Pošto metoda Huisgen-ove [3+2] cikloadicije uključuje cikloadiciju pre nego reakciju nukleofilne supstitucije, proteini se mogu modifikovanti sa izuzetnom visokom selektivnošću. Reakciju se može izvesti na sobnoj temperaturi u vodenim uslovima sa odličnom selektivnosti regiona (1,4 > 1,5) dodavanjem katalitičkih količina Cu(I) soli u reakcionu smešu. Videti, npr., Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; i, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed.41:2596-2599; i WO 03/101972. Molekul koji se može dodati u protein objave prema [3+2] cikloadiciji uključuje gotovo bilo koji molekul sa pogodnom funkcionalnom grupom ili supstituentom uključujući ali nije ograničeno na azido ili acetilen derivate. Ovi molekuli mogu se dodati u neprirodnu aminokiselinu sa acetilen grupom, uključujući ali nije ograničeno na, ppropargiloksifenilalanin, ili azido grupu, uključujući ali nije ograničeno na p-azidofenilalanin, redom.
[0188] Pet-očlani prsten koji rezultuje iz Huisgen-ove [3+2] cikloadicije nije obično reverzibilan u redukcionom okruženju i stabilan je u odnosu na hidrolizu tokom dužih perioda u vodenim sredinama. Stoga, fizičke i hemijske karakteristike širokog spektra supstanci mogu se modifikovati pod zahtevanim vodenim uslovima sa aktivnim PEG derivatima predmetne objave. Još važnije, pošto su azid i acetilen segmenti specifični jedan za drugi (i ne, na primer, reaguju sa bilo kojom od 20 uobičajenih, genetski-kodiranih aminokiselina), proteini se mogu modifikovati na jednom ili više specifičnih mesta sa izuzetno visokom selektivnosti.
[0189] Takođe ovde su stavljeni na uvid rastvorljivi u vodi i hidrolitički stabilni derivati PEG derivata i srodnih hidrofilih polimera koji imaju jedan ili više acetilen ili azid segmenata. Derivati PEG polimera koji sadrže acetilenske segmente su visoko selektivni za spajanje sa azidnim segmentima koji su uvedeni selektivno u proteine kao odgovor na selektor kodon. Slično, derivati PEG polimera koji sadrže azid segmente su visoko selektivni za spajanje sa acetilen segmentima koji su uvedeni selektivno u proteine kao odgovor na selektor kodon.
[0190] Konkretnije, azidni segmenti sadrže, ali nisu ograničeni na, alkil azide, aril azide i derivate tih azida. Derivati alkil i aril azida mogu da uključe druge supstituente sve dok je reaktivnost specifična za acetilen sačuvana. Acetilen segmenti sadrže alkil i aril acetilene i derivate istih. Derivati alkil i aril acetilena mogu da uključe druge supstituente sve dok je reaktivnost specifična za azid sačuvana.
[0191] Ovde stavljeni na uvid su konjugati supstanci koji imaju širok spektar funkcionalnig grupa, supstituenta ili segmenta, sa drugim supstancama uključujući ali nije ograničeno na oznaku; boju; polimer; polimer rastvorljiv u vodi; derivat polietilen glikola; sredstvo za fotoumrežavanje; radionukleid; citotoksično jedinjenje; lek; oznaku afiniteta; oznaku fotoafiniteta; reaktivno jedinjenje; smolu; drugi protein ili polipeptid ili analog polipeptida; antitelo ili fragment antitela; metalni helator; kofaktor; masnu kiselinu; karbohidrat; polinukleotid; DNK; RNK; antisens polinukleotid; saharid; dendrimer rastvorljiv u vodi; ciklodekstrin; inhibitornu ribonukleinsku kiselinu; biomaterijal; nanočesticu; spin oznaku; fluorofor; segment koji sadrži metal; radioaktivni segment; novu funkcionalnu grupu; grupu koja kovalentno ili nekovalentno intereaguje sa drugim molekulima; fotoosetljiv segment; segment sa mogućnošću aktinske radijacije; segment sa mogućnošću fotoizomerizacije; biotin; derivat biotina; analog biotina; segment koji sadrži težak atom; hemijsku grupu koja se može ocepiti; grupu koja se može foto-ocepiti; izduženi bočni lanac; ugljenik-povezan sa šećerom; redoks-aktivni agens; amino tiokiselina; toksični segment; izotopno obeležen segment; biofizičku probu; fosforescentnu grupu; hemiluminiscentnu grupu; elektron gustu grupu; magnetnu grupu; interkalirajuću grupu; hromofor; agens za transfer energije; biološki aktivni agens; detektibilnu oznaku; mali molekul; kvantnu tačku; nanotransmiter; radionukleotid; radiotransmiter; agens za hvatanje; ili bilo koja kombinacija iznad navedenih ili bilo koje drugo poželjno jedinjenje ili substanca. Takođe su ovde stavljeni na uvid konjugati supstanci koji imaju azidne ili acetilenske segmente sa derivatima PEG polimera koji imaju odgovarajuće acetilenske ili azidne segmente. Na primer, PEG polimer koji ima azidni segment može se spojiti sa biološki aktivnim molekulom na položaju u proteinu koja sadrži negenetski kodiranu aminokiselinu koji ima funkciju acetilena. Povezivanje pomoću kojeg PEG i biološki aktivni molekul su spojeni uključuje ali nije ograničena na proizvod Huisgen-ov [3+2] cikloadicije.
[0192] Dobro je poznato u oblasti tehnike da se PEG može koristiti da se modifikuju površine biomaterijala (videti, npr., američki patent 6,610,281; Mehvar, R., J. Pharm Pharm Sci., 3(1):125-136 (2000)). Takođe ovde su stavljeni na uvid biomaterijali koji sadrže površinu koja ima jedno ili više reaktivnih azid ili acetilen mesta i jedan ili više polimera koji sadrže azid ili acetilen objave spojenih na površinu putem povezivanja Huisgen-ovom [3+2] cikloadicijom. Biomaterijali i druge supstance mogu se takođe spojiti sa azid- ili acetilen-aktiviranim polimernim derivatima preko povezivanja koje nije povezivanje azidom ili acetilenom, kao što je preko povezivanja koje sadrži karboksilnu kiselinu, amin, alkohol ili tiol segment, da ostavi azid ili acetilen segment dostupnim za naredne reakcije.
[0193] ovde je stavljena na uvid javnosti metoda za sintezu polimera objave koji sadrže azid i acetilen. U slučaju PEG derivata koji sadrži azid, azid može biti direktno vezan za atom ugljenika polimera. Alternativno, PEG derivat koji sadrži azid može se pripremiti vezivanjem agensa za vezivanje koji ima azid segment na jednom terminusu za konvencionalno aktivirani polimer tako da rezultujući polimer ima azid segment na svom terminusu. U slučaju PEG derivata koji sadrži acetilen, acetilen se može vezati direktno za atom ugljenika polimera. Alternativno, PEG derivat koji sadrži acetilen može se pripremiti vezivanjem agensa za vezivanje koji ima acetilen segment na jednom terminalnusu za konvencionalno aktivirani polimer tako da rezultujući polimer ima acetilen segment na svom terminusu.
[0194] Konkretnije, u slučaju PEG derivata koji sadrži azid, polimer rastvorljiv u vodi koji ima najmanje jedan aktivni hidroksil segment podleže reakciji da se proizvede supstituisani polimer koji ima reaktivniji segment, kao što je mezilat, trezilat, tozilat ili halogen odlazeća grupa, na njemu. Priprema i primena PEG derivata koji sadrže halid sulfonil kiseline, atome halogena i druge odlazeće grupe su poznati prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Rezultujući supstituisani polimer zatim podleže reakciji da zameni za reaktivniji segment azid segment na terminusu polimera. Alternativno, polimer rastvorljiv u vodi koji ima najmanje jedan aktivni nukleofilni ili elektrofilni segment podleže reakciji sa agensom za vezivanje koji ima azid na jednom terminusu tako da je kovalentna veza oblikirana između PEG polimera i agensa za vezivanje a azid segment je pozicioniran na terminusu polimera. Nukleofilni i elektrofilni segmenti, uključujući amine, tiole, hidrazide, hidrazine, alkohole, karboksilate, aldehide, ketone, tioestre i slično, su poznati prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike.
[0195] Konkretnije, u slučaju PEG derivata koji sadrži acetilen, polimer rastvorljiv u vodi koji ima najmanje jedan aktivni hidroksil segment podleže reakciji da premesti halogen ili drugu aktiviranu odlazeću grupu iz prekursora koji sadrži acetilen segment. Alternativmno, polimer rastvorljiv u vodi koji ima najmanje jedan aktivni nukleofilni ili elektrofilni segment podleže reakciji sa agensom za vezivanje koji ima acetilen na jednom terminusu tako da je kovalentna veza oblikirana između PEG polimera i agensa za vezivanje i acetilen segment je pozicioniran na terminusu polimera. Primena halogen segmenata, aktivirane odlazeće grupe, nukleofilnih i elektrofilnih segmenata u kontekstu organskih sinteza i priprema i primena PEG derivata je dobro poznata stručnjacima u oblasti tehnike.
[0196] Takođe je ovde stavljena na uvid javnosti metoda za selektivnu modifikaciju proteina da se dodaju druge supstance u modifikovan protein, uključujući ali nije ograničeno na polimere rastvorljive u vodi kao što je PEG i PEG derivati koji sadrže azid ili acetilen segment. PEG derivati koji sadrže azid ili acetilen mogu se koristiti da modifikuju svojstva površina i molekula gde su biokompatibilnost, stabilnost, rastvorljivost i nedostatak imunogenosti važni, uz istovremeno obezbeđivanje selektivnijih sredstava za vezivanje PEG derivata na proteinima što je prethodno poznato iz oblasti tehnike.
Opšte metode rekombinantne nukleinske kiseline za primenu sa pronalaskom
[0197] U brojnim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska, nukleinske kiseline koje kodiraju polipeptid relaksina od interesa biće izolovane, klonirane i često menjane korišćenjem rekombinantnih metoda. Takva tehnička rešenja su korišćena, uključujući ali nije ograničeno na, za eksprimiranje proteina ili tokom generisanja varijanti, derivata, ekspresionih kaseta, ili drugih sekvenci izvedenih iz polipeptida relaksina. U nekim tehničkim rešenjima, sekvence koje kodiraju polipeptide pronalaska su operativno povezane sa heterogenim promoterom.
[0198] Nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu može se sintetisati na osnovu aminokiselinske sekvence roditeljskog polipeptida, uključujući ali nije ograničeno na, koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 2 i zatim promenom nukleotidne sekvence tako da utiče na uvođenje (tj., inkorporaciju ili supstituciju) ili uklanjanje (tj., brisanje ili supstituciju) relevantnog(ih) aminokiselinskih ostataka. Nukleotidna sekvenca može se povoljno modifikovati mutagenezom usmerenom na mesto u skladu sa konvencionalnom metodom. Alternativno, nukleotidna sekvenca može se pripremiti hemijskom sintezom, uključujući ali nije ograničeno na, korišćenjem oligonukleotidnog sintesajzera, pri čemu su oligonukleotidi dizajnirani na osnovu aminokiselinske sekvence željenog polipeptida, i poželjno odabirom onih kodona koji su favorizovani u ćeliji domaćina u kojoj će rekombinantni polipeptid biti proizveden.
[0199] Ovaj pronalazak primenjuje rutinske tehnike iz oblasti rekombinantne genetike. Osnovni tekstovi koji stavljaju na uvid javnosti uopštene metode primene u ovom pronalasku uključuju Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3. izd.
2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); i Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994)).
[0200] Uopšteni tekstovi koji opisuju molekularno biološke tehnike uključuju Berger i Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Metode in Enzymology tom 152 Academic Press, Inc., San Dijego, CA (Berger); Sambrook et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual (2. izd.), tom.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Njujork, 1989 ("Sambrook") i Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., izd., Current Protocols, zajednički poduhvat između Greene Publishing Associates, Inc. i John Wiley & Sons, Inc., (dopunjeno kroz 1999) ("Ausubel")). Ovi tekstovi opisuju mutageneze, primenu vektora, promotera i mnogih drugih relevantnih tema koje se odnose na, uključujući ali nije ograničeno na, stvaranje gena ili polinukleotida koji uključuju selektor kodone za proizvodnju proteina koji obuhvataju neprirodne aminokiseline, ortogonalne tRNA, ortogonalne sintetaze, i njihove parove.
[0201] Razni tipovi mutageneze su korišćeni u pronalasku u razne svrhe, uključujući ali nije ograničeno na, da proizvedu nove sintetaze ili tRNK, da mutiraju tRNK molekuli, da mutiraju polinukleotidi koji kodiraju sintetaze, da proizvedu biblioteke tRNK-a, da proizvedu sintetaze, da proizvedu selektor kodone, za ubacivanje selektor kodona koji kodiraju neprirodne aminokiseline u proteinu ili polipeptidu od interesa, One uključuju ali nisu ograničene na specifične za mesto, nasumične tačkaste mutageneze, homolognu rekombinaciju, DNK mešanje ili druge metode rekurzivne mutageneze, himerne konstrukcije, mutageneze primenom obrazaca koji sadrže uracil, mutageneze usmerenu oligonukleotidom, fosforotioatom-modifikovane DNK mutageneze, mutageneze primenom gapped dupleks DNK ili slično, PCT-posredovane mutageneze, ili bilo koja kombinacija istih. Dodatne pogodne metode uključuju tačkastu reparaciju pogrešno sparenih baza mutageneze primenom sojeva domaćina deficijentnih u reparaciji, restrikciju-selekcije i restrikciju-prčišćavanja, delecijske mutageneze, mutageneze totalnom sintezom gena, reparacija dvolančanih prekida, i slično. Mutageneze, uključujući ali nije ograničeno na, koje uključuju himerne konstrukte, su takođe uključene u predmetnom pronalasku. U jednom tehničko rešenju, mutageneze mogu biti vođene poznatim informacijama o molekulu koji se javlja u prirodi ili izmenjenom ili mutiranom molekuliu koji se javlji u prirodi, uključujući ali nije ograničeno na, sekvencu, poređenja sekvence, fizička svojstva, sekundarnu, tercijarnu ili kvaternarnu strukturu, kristalnu strukturu ili slično.
[0202] Tekstovi i primeri koji se ovde nalaze opisuju ove procedure. Dodatne informacije se nalaze u sledećim objavama i referencama citiranim u njima: Ling et al., Approaches to DNA mutageneze: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997); Dale et al., Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Metode Mol. Biol.57:369-374 (1996); Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet.19:423-462 (1985); Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985); Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986); Kunkel, The efficiency of oligonukleotid directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. i Lilley, D.M.J. izd., Springer Verlag, Berlin) (1987); Kunkel, Rapid and efficientsite-specific mutagenesis without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 82:488-492 (1985); Kunkel et al., Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol, 154, 367-382 (1987); Bass et al., Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988); Zoller & Smith, Oligonukleotid-directed mutageneze using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res.10:6487-6500 (1982); Zoller & Smith, Oligonukleotiddirected mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol.
100:468-500 (1983); Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol.154:329-350 (1987); Taylor et al., The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzima reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985); Taylor et al., The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res.13: 8749-8764 (1985); Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986); Sayers et al., 5'-3' Exonucleases in phosphorothioatebased oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988); Sayers et al., Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction
endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res.16: 803-814; Kramer et al., The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984); Kramer & Fritz Oligonucleotidedirected construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol.154:350-367 (1987); Kramer et al., Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotidedirected construction of mutations, Nucl. Acids Res.16: 7207 (1988); Fritz et al., Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988); Kramer et al., Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the metil-directed DNA mismatch-repair sistem of E. coli, Cell 38:879-887 (1984); Carter et al., Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors, Nucl. Acids Res.13: 4431-4443 (1985); Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using M13 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987); Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986); Wells et al., Importance of hydrogen-bond
formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415-423 (1986); Nambiar et al., Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984); Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988); Wells et al., Kaseta mutageneze: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985); Grundstrom et al., Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale 'shot-gun' gene sinteza, Nucl. Acids Res.13: 3305-3316 (1985); Mandecki, Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: Method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 83:7177-7181 (1986); Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993); Sieber, et al., Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001); W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994); i, I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995). Dodatni detalji za mnoge od gore navedenih metoda mogu se pronaći u Methods in Enzymology tom 154, koji takođe opisuje korisne kontrole za rešavanje problema u vezi sa različitim metodama mutageneze.
[0203] Oligonukleotidi, npr., za primenu u mutagenezama predmetnog pronalaska, npr., biblioteke sintetaza koje mutiraju, ili menjanje tRNK kiseline, su obično sintetisani hemijski u skladu sa metodom čvrste faze fosforamidit triestra opisanom od Beaucage i Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862, (1981) npr., korišćenjem automatizovanog sintetizatora, kao što je opisano u Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984).
[0204] Pronalazak se takođe odnosi na ćelije eukariotskog domaćina, ćelije neeukariotskog domaćina, i organizme za in vivo inkorporaciju neprirodne aminokiseline pomoću ortogonalnih tRNK/RS parova. Ćelije domaćina su proizvedene genteskim inženjeringom (uključujući ali nije ograničeno na, transformisane, transduktovane ili transfektovane) sa polinukleotidima pronalaska ili konstruktima koji uključuju polinukleotid pronalaska, uključujući ali nije ograničeno na, vektor pronalaska, koji može biti, na primer, vektor za kloniranje ili vektor za eksprimiranje. Na primer, regioni za kodiranje za ortogonalnu tRNK, ortogonalnu tRNA sintetazu, i protein koji će se derivatizovati su operativno povezani sa elementima kontrole ekspresije gena koji su funkcionalni u željenoj ćeliji domaćina. Vektor može biti, na primer, u obliku plazmida, kozmida, faga, bakterije, virusa, golog polinukleotida, ili konjugovanog polinukleotida. Vektori se uvode u ćelije i/ili mikroorganizme standardnom metodom uključujući elektroporaciju (Fromm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 82, 5824 (1985)), infekciju virusnim vektorima, balističku penetraciju velike brzine malim česticama sa nukleinskom kiselinom bilo sa matriksom malih kuglica ili čestica, ili na površini (Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987)), i/ili slično. Tehnike pogodne za transfer nukleinske kiseline u ćelije in vitro uključuju primenu lipozoma, mikroinjekcije, fuzije ćelije, DEAE-dekstran, metodu taloženja kalcijum fosfatom, itd. In vivo tehnike transfera gena uključuju, ali nisu ograničene na, transfekciju sa virusnim (tipično retrovirusnim) vektorima i transfekciju posredovanu virusnim kapsidnim proteinom-lipozomom [Dzau et al., Trends in Biotechnology 11:205-210 (1993)]. U nekim situacijama može biti poželjno da se obezbedi izvor nukleinske kiseline sa agensom koji cilja ciljne ćelije, kao što je antitelo specifično za protein ćelijijske površine membrane ili ciljnu ćeliju, ligand za receptor na ciljnoj ćeliji, itd. Gde se koriste lipozomi, proteini koji se vezuju za protein ćelijske površine membrane povezane sa endocitozom mogu se koristiti za ciljanje i/ili olakšavanje preuzimanja, npr. kapsidni proteini ili fragmenati istih tropni za određen tip ćelije, antitela za proteine koji podležu internalizaciji u cikliranju, proteini koji ciljaju intraćelijsku lokalizaciju i poboljšavaju intraćelijski poluživot.
[0205] Ćelije domaćina proizvedene inženjeringom mogu se kultivisati u konvencionalnom hranljivom medijumu modifikovane kao što je prikladno za takve aktivnosti kao što su, na primer, koraci skrininga, aktiviranje promotera ili selektovanjem transformanata. Ove ćelije mogu po izboru biti kultivisane u transgenom organizmu. Druge korisne reference, uključujući ali nije ograničeno na za izolovanje i kultivisanje ćelija (npr., za naknadnu izolovanje nukleinske kiseline) uključuju Freshney (1994) Culture of Animal Cell, a Manual of Basic Technique, treće izdanje, Wiley- Liss, Njujork i reference koje su citirane u njima; Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Sistems John Wiley & Sons, Inc. Njujork, NY; Gamborg i Phillips (izd.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg Njujork) i Atlas i Parks (izd.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL.
[0206] Nekoliko dobro poznatih metoda uvođenja ciljnih nukleinskih kiselina u ćelije je dostupno, bilo koja od njih se može koristiti u pronalasku. One uključuje: fuziju recipijentnih ćelija sa bakterijskim protoplastima koji sadrže DNK, elektroporaciju, bombardovanje projektilom, i infekciju sa virusnim vektorima (razmotreno dalje, ispod), itd. Bakterijske ćelije mogu se koristiti da se poveća broj plazmida koji sadrže DNK konstrukte ovog pronalaska. Bakterije se uzgajaju do log faze i plasmidi unutar bakterije mogu biti izolovani pomoću raznih metoda poznatih u oblasti tehnike (videti, na primer, Sambrook). Pored toga, kitovi za prečišćavanje plazmida iz bakterije su komercijalno dostupni, (videti, npr., EasyPrep™, FlexiPrep™, oba od Pharmacia Biotech; StrataClean™ od Stratagene; i, QIAprep™ od Qiagen). Izolovani i prečišćeni plazmidi su zatim dalje korišćeni da se proizvedu drugi plazmidi, korišćeni da transfektuju ćelije ili inkorporirani u srodne vektore da inficiraju organizam. Uobičajeni vektori sadrže terminatore transkripcije i translacije, sekvence koje iniciraju transkripciju i translaciju, i promotere korišćene za regulisanje eksprimiranja posebne ciljne nukleinske kiseline. Vektori po izboru sadrže generičke ekspresione kasete koje sadrže najmanje jednu nezavisnu terminatorsku sekvencu, sekvence dozvoljavaju replikaciju kasete u eukariotima, ili prokariotima, ili u oba, (uključujući ali nije ograničeno na, šatl (shuttle) vektore) i selekcione markere i za prokariotske i eukariotska sisteme. Vektori su pogodni za replikaciju i integraciju u prokariotima, eukariotima, ili u oba. Videti, Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979); Roberts, et al., Nature, 328:731 (1987); Schneider, E., et al., Protein Expr. Purif.6(1):10-14 (1995); Ausubel, Sambrook, Berger (all supra). Katalog bakterija i bakteriofaga korisnih za kloniranje je obezbeđen, npr., od ATCC, npr., ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Gherna et al. (eds) koji je objavljen od ATCC. Dodatne osnovne procedure za sekvenciranje, kloniranje i drugi aspekti molekularne biologije i osnovna teorijska razmatranja se takođe nalaze u Watson et al. (1992) Recombinant DNA drugo izdanje Scientific American Books, NY. Pored toga, esencijalno bilo koja nukleinska kiselina (i praktično bilo koja obeležena nukleinska kiselina, bilo standardna ili nestandardna) može biti po meri ili standardno naručena od bilo kog od raznih komercijalnih izvora, kao što je Midland Certified Reagent Company (Midland, TX dostupno na World Wide Web na mcrc.com), Great American Gene Company (Ramona, CA dostupno na World Wide Web na genco.com), ExpressGen Inc. (Chicago, IL dostupno na World Wide Web na expressgen.com), Operon Technologies Inc. (Alameda, CA) i mnogi drugi.
SELEKTOR KODONI
[0207] Selektor kodoni pronalaska proširuju okvir genetskih kodona proteina biosintetske mašinerije. Na primer, selektor kodon uključuje, ali nije ograničen na, jedinstveni trobazni kodon, nonsens kodon, kao što je stop kodon, uključujući ali nije ograničeno na, ćilibar kodon (UAG), oker kodon, ili opal kodon (UGA), neprirodni kodon, četvoro ili više bazni kodon, retki kodon, ili slično. Prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike je očigledno da postoji širok raspon u broju selektor kodona koji mogu biti uvedeni u željeni gen ili polinukleotid, uključujući ali nije ograničeno na, jedan ili više, dva ili više, tri ili više, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više u pojedinačnom polinukleotidu koji kodira najmanje deo polipeptida relaksina. Takođe je očigledno prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike da postoji širok raspon u broju selektor kodona koji mogu biti uvedeni u željeni gen ili polinukleotid, uključujući ali nije ograničeno na, jedan ili više, dva ili više, tri ili više, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više njih ukupno pronađenih u A lancu i B lancu polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju najmanje deo polipeptida relaksina.
[0208] U jednom tehničkom rešenju, metode uključuju primenu selector kodona koji je stop kodon za inkorporaciju jedne ili više neprirodnih aminokiselina in vivo. Na primer, O-tRNK je proizvedena koja prepoznaje stop kodon, uključujući ali nije ograničeno na, UAG, i aminoacilovana je pomoću O-RS sa željenom neprirodnom aminokiselinom. Ovu O-tRNK ne prepoznaju aminoacil-tRNK sintetaze domaćina koje se javljaju u prirodi. Uobičajene specifične za mesto mutageneze mogu se primeniti da se uvede stop kodon, uključujući ali nije ograničeno na, TAG, na mestu od interesa u polipeptidu od interesa. Videti, npr., Sayers, J.R., et al. (1988), 5'-3' Exonucleases in phosphorotioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res, 16:791-802. Kada se O-RS, O-tRNK i nukleinska kiselina koji kodira polipeptid od interesa kombinuju in vivo, neprirodna aminokiselina je inkorporirana kao odgovor na UAG kodon da da polipeptid koji sadrži neprirodno aminokiselinu na određenom položaju.
[0209] Inkorporacija neprirodne aminokiseline in vivo može se uraditi bez značajnog uznemiravanja ćelije eukariotskog domaćina. Na primer, pošto efikasnost supresije za UAG kodon zavisi od konkurencije između O-tRNK, uključujući ali nije ograničeno na, ćilibar supresorsku tRNK, i faktor eukariotskog oslobađanja (uključujući ali nije ograničeno na, eRF) (koji se vezuje za stop kodon i inicira oslobađanje rastućeg peptida iz ribozoma), efikasnost supresije se može modulirati pomoću, uključujući ali nije ograničeno na, povećanje nivoa eksprimiranja O-tRNK, i/ili supresorske tRNK.
[0210] Neprirodne aminokiseline mogu se takođe kodirati sa retkim kodononima. Na primer, kada je koncentracija arginina u in vitro reakciji sinteze proteina smanjena, za retki kodon za arginin, AGG, je dokazano da je efikasan za umetanje Ala pomoću sintetske tRNK acilovane sa alaninom. Videti, npr., Ma et al., Biochemistry, 32:7939 (1993). U ovom slučaju, sintetska tRNA takmiči se sa tRNKArg koja se javlja u prirodi, koja postoji kao manje vrste u Escherichia coli. Neki organizmi ne koriste sve triplet kodone. Nedodeljen kodon AGA u Micrococcus luteus je korišćen za umetanje aminokiseline u in vitro transkripcione/translacione ekstrakte. Videti, npr., Kowal i Oliver, Nucl. Acid. Res., 25:4685 (1997). Komponente ovog pronalaska mogu se proizvesti korišćenjem ovih retkih kodona in vivo.
[0211] Selektor kodoni takođe sadrže produžene kodone, uključujući ali nije ograničeno na, četvoro ili više bazne kodone, kao što su, četvoro, peto, šesto ili više bazni kodoni. Primeri četvorobaznih kodona uključuju, ali nisu ograničeni na, AGGA, CUAG, UAGA, CCCU i slično. Primeri petobaznih kodons uključuje, ali nisu ograničeni na, AGGAC, CCCCU, CCCUC, CUAGA, CUACU, UAGGC i slično. Karakteristika pronalaska uključuje korišćenje produženih kodona zasnovanih na vanfaznoj (frameshift) supresiji. Četvoro ili više bazni kodoni mogu umetnuti, uključujući ali nije ograničeno na, jednu ili više neprirodnih aminokiselina u isti protein. Na primer, u prisustvu mutiranih O-tRNK, uključujući ali nije ograničeno na, posebnu vanfaznu supresorsku tRNK, sa antikodonskim petljama, na primer, sa najmanje 8-10 nt antikodon petlji, četvoro ili više bazni kodon se čita kao pojedinačna aminokiselina. U drugim tehničkim rešenjima, antikodon petlje mogu da dekodiraju, uključujući ali nije ograničeno na, najmanje četvorobazni kodon, najmanje petobazni kodon, ili najmanje šestobazni kodon ili više. Pošto postoji 256 mogućih četvorobaznih kodona, višestruke neprirodne aminokiseline mogu biti kodirane u istoj ćeliji primenom četvoro ili više baznog kodona. Videti, Anderson et al., (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244; Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of "Shifty" Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol.307: 755-769.
[0212] Na primer, četvorobazni kodoni su primenjeni da inkorporiraju neprirodne aminokiseline u proteine primenom in vitro biosintetske metode. Videti, npr., Ma et al., (1993) Biochemistry, 32:7939; i Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:34. CGGG i AGGU su primenjeni da istovremeno inkorporiraju 2-naftilalanin i NBD derivat lizina u streptavidin in vitro sa dve hemijski acilovane vanfazne supresorske tRNK. Videti, npr., Hohsaka et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:12194. U in vivo studiji, Moore et al. je ispitao sposobnost tRNALeu derivata sa NCUA antikodonima da suzbije UAGN kodone (N može biti U, A, G, ili C), i pronašao je da četvorostruka UAGA se može dekodirati pomoću tRNALeu sa UCUA antikodonom sa efikasnošću od 13 do 26% sa malim dekodiranjem u 0 ili -1 okviru. Videti, Moore et al., (2000) J. Mol. Biol., 298:195. U jednom tehničkom rešenju, produženi kodoni zasnovani na retkim kodononima ili nonsens kodononima mogu se primeniti u predmetnom pronalasku, što može smanjiti pogrešno čitanje missense readthrough i vanfazne supresije na drugim neželjenim mestima.
[0213] Za dati sistem, selektor kodon može takođe da uključi jedan od prirodnih trobaznih kodona, pri čemu endogen sistem ne primenjuje (ili retko primenjuje) prirodno bazni kodon. Na primer, ovo uključuje sistem kojem nedostaje tRNK koja prepoznaje prirodni trobazni kodon, i/ili sistem gde je trobazni kodon retki kodon.
[0214] Selektor kodoni po izboru uključuju neprirodne bazne parove. Ovi neprirodni bazni parovi dodatno proširuju postojeću genetsku abecedu. Jedan dodatni bazni par povećava broj triplet kodona od 64 do 125. Svojstva trećeg baznog para uključuju stabilno i selektivno bazno uparivanje, efikasnu enzimsku inkorporaciju u DNK sa velikom preciznošću sa polimerazom, i efikasnu kontinuiranu ekstenziju prajmera nakon sinteze neprirodnog baznog para u nastajanju. Opisi neprirodnih baznih parova koji se mogu prilagoditi metodama i kompozicijama uključuju, npr., Hirao, et al., (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182. Videti, takođe, Wu, Y., et al., (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626-14630. Druge relevantne objave su navedene ispod.
[0215] Za in vivo primenu, neprirodni nukleozid je propustljiv u odnosu na membranu i fosforilovan je da formira odgovarajući trifosfat. Pored toga, povećana genetska informacija je stabilna i nije uništena ćelijskim enzimima. Prethodni napori Benner i drugih su iskoristili prednosti obrazaca vezivanja vodonika koji su različiti od onih u kanonskim ' Watson-Crick-ovim parovima, od kojih je najistaknutiji primer izo-C:izo-G par. Videti, npr., Switzer et al., (1989) J. Am. Chem. Soc., 111:8322; i Piccirilli et al., (1990) Nature, 343:33; Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602. Ove baze se uspšteno ne uparuju u nekom stepenu sa prirodnim bazama i ne mogu se enzimski replicirati. Kool i saradnici su pokazali da hidrofobne interakcije pakovanja između baza mogu da zamene vezivanje vodonikom da pokrene formiranje baznog para. Videti, Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602; i Guckian ai Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825. U nastojanju da razviju neprirodni bazni par koji zadovoljava sve iznad navedene zahteve, Schultz, Romesberg i saradnici su sistematski sintetisali i proučili niz neprirodnih hidrofonih baza. Za PICS:PICS samostalni par je pronađeno da je stabilniji nego prirodni bazni parovi, i može biti efikasno inkorporiran u DNK pomoću Klenow-og fragmenta Escherichia coli DNA polimeraze I (KF). Videti, npr., McMinn et al., (1999) J. Am. Chem. Soc., 121:11585-6; i Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:3274. A 3MN:3MN samostalni par može se sintetisati pomoću KF sa efikasnošću i selektivnosti dovoljnoj za biološku funkciju. Videti, npr., Ogawa et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:8803. Međutim, obe baze deluju kao lanac terminator za dalju replikaciju. Nedavno je evoluirana mutirajuća DNK polimeraza koja se može primeniti za replikaciju PICS samostalnog para. Dodatno, 7AI samostalni par se može replicirati, Videti, npr., Tae et al., (2001) J. Am. Chem. Soc., 123:7439. Nov metalobazni par, Dipic:Py, je takođe razvijen, koji formira stabilan par nakon vezivanja Cu(II). Videti, Meggers et al., (2000) J. Am. Chem. Soc., 122:10714. Pošto su produženi kodoni i neprirodni kodoni suštinski ortogonalni prirodnim kodonima, metode pronalaska mogu iskoristiti prednosti ovog svojstva za generisanje ortogonalne tRNK za njih.
[0216] Translacioni premošćavajući sistem se takođe može primeniti da se inkorporira neprirodna aminokiselina u željeni polipeptid. U translacionom premošćavajućem sistemu, velika sekvenca je inkorporirana u gen ali nije translatovana u protein. Sekvenca sadrži strukturu koja služi kao znak da se indukuje ribozom da preskoči sekvencu i nastavi translaciju nizvodno od umetanja.
[0217] U određenim tehničkim rešenjima, protein ili polipeptid od interesa (ili njegov deo) u metodama i/ili kompozicijama pronalaska je kodiran sa nukleinskom kiselinom. Uobičajeno, nukleinska kiselina sadrži najmanje jedan selektor kodon, najmanje dva selektor kodona, najmanje tri selektor kodona, najmanje četiri selektor kodona, najmanje pet selektor kodona, najmanje šest selektor kodona, najmanje sedam selektor kodona, najmanje osam selektor kodona, najmanje devet selektor kodona, deset ili više selektor kodona.
[0218] Geni koji kodiraju proteine ili polipeptide od interesa mogu biti mutirani primenom metoda poznatih prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike i opisanih ovde da uključe, na primer, jedan ili više selektor kodona za inkorporaciju neprirodne aminokiseline. Na primer, nukleinska kiselina za protein od interesa je mutirana da uključi jedan ili više selektor kodona, obezbeđujući inkorporaciju jedne ili više neprirodnih aminokiselina. Pronalazak uključuje bilo koju takvu varijantu, uključujući ali nije ograničeno na, mutant, verzije bilo kog proteina, na primer, uključujući najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu. Slično, pronalazak takođe uključuje odgovarajuće nukleinske kiseline, tj., bilo koju nukleinsku kiselinu sa jednim ili više selektor kodona koje kodiraju jednu ili više neprirodnih aminokiselina.
[0219] Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju protein od interesa kao što je polipeptid relaksina mogu lako da se mutiraju da se uvede cistein na bilo koji željeni polpžaj polipeptida. Cistein je široko korišćen da se uvedu reaktivni molekuli, polimeri rastvorljivi u vodi, proteini, ili široka paleta drugih molekula, na protein od interesa. Pogodne metode za inkorporaciju cisteina u željeni položaj polipeptida su poznate prosečnim poznavaocima oblasti tehnike, kao što su one opisane u američkom patentu br. 6,608,183, i standardne tehnike mutageneze.
Ne-prirodno kodirane aminokiseline
[0220] Veoma širok izbor ne-prirodno kodiranih aminokiseline su pogodne da budu uvedene u polipeptid relaksina. Uopšteno, uvedene ne-prirodno kodirane aminokiseline su suštinski hemijski inertne prema 20 uobičajenih, genetski-kodiranih aminokiselina (tj., alanin, arginin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutamin, glutaminska kiselina, glicin, histidin, izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, prolin, serin, treonin, triptofan, tirozin, i valin). U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirane aminokiseline uključuje funkcionalne grupe bočnog lanca koje efikasno reaguju i selektivno sa funkcionalnim grupama koje nisu pronađene u 20 uobičajenih aminokiselina (uključujući ali nije ograničeno na, azido, keton, aldehid i aminooksi grupe) da se formiraju stabilni konjugati. Na primer, polipeptid relaksina koji uključuje ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrže azido funkcionalnu grupu može da reaguje sa polimerom (uključujući ali nije ograničeno na, poli(etilen glikol) ili, alternativno, drugi polipeptid koji sadrži alkin segment da formira stabilni konjugat koji rezultuje selektivnom reakcijom azid i alkin funkcionalnih grupa da se formira proizvod Huisgen-ove [3+2] cikloadicije.
[0221] Generička struktura alfa-aminokiseline je ilustrovana na sledeći način (Formula I):
[0222] Ne-prirodno kodirana aminokiselina je tipično bilo koja struktura koja ima iznad navedenu formulu gde je R grupa bilo koji supstituent drugi nego onaj koji se koristi u dvadeset prirodnih aminokiselina, i može biti pogodan za primenu u predmetnoj objavi. Pošto se ne-prirodno kodirane aminokiseline tipično razlikuju od prirodnih aminokiselina samo u strukturi bočnog lanca, ne-prirodno kodirana aminokiseline formira amid veze sa drugim aminokiselinama, uključujući ali nije ograničeno na, prirodnu ili ne-prirodno kodiranu, na isti način na koji su formirane u polipeptidima koji se javljaju u prirodi.
[0223] Međutim, ne-prirodno kodirane aminokiseline imaju grupe bočnog lanaca koje ih razlikuju od prirodnih aminokiselina. Na primer, R po izboru sadrži alkil-, aril-, acil-, keto-, azido-, hidroksil-, hidrazin, cijano-, halo-, hidrazid, alkenil, alkinl, etar, tiol, seleno-, sulfonil-, borat, boronat, fosfo, fosfono, fosfin, heterociklični, enon, imin, aldehid, ester, tiokiselina, hidroksilamin, amino grupa, ili slično ili bilo koja kombinacija istih. Druge aminokiseline od interesa koje se ne javljaju u prirodi koje mogu biti pogodne za primenu u predmetnoj objavi uključuju, ali nisu ograničene na, aminokiseline koje sadrže fotoaktivirajući umreživač, spin-obeležene aminokiseline, fluorescentne aminokiseline, metal vezujuće aminokiseline, aminokiseline koje sadrže metal, radioaktivne aminokiseline, aminokiseline sa novim funkcionalnim grupama, aminokiseline koje kovalentno ili nekovalentno međusobno reaguju sa drugim molekulima, fotoosetljive i/ili koje podležu fotoizomerizaciji aminokiseline, aminokiseline koje sadrže biotin ili analog biotina, glikozilovane aminokiseline kao što je serin supstituisan šećerom, druge aminokiseline modifikovane ugljenim hidratima, aminokiseline koje sadrže keto, aminokiseline koje sadrže polietilen glikol ili polietar, aminokiseline supstituisane teškim atomima, aminokiseline koje se mogu hemijski i/ili foto ocepiti, aminokiseline sa izduženim bočnim lancima u poređenju sa prirodnim aminokiselinama, uključujući ali nije ograničeno na, polietre ili ugljovodonike sa dugim lancem, uključujući ali nije ograničeno na, sa više od oko 5 ili više od oko10 ugljenika, aminokiseline koje sadrže ugljenikom povezan šećer, redoks-aktivne aminokiseline, aminokiseline koje sadrže amion tiokiselinu, i aminokiseline koje sadrže jedan ili više toksičnih segmenta.
[0224] Primeri ne-prirodno kodiranih aminokiselina koje mogu biti pogodne za primenu u predmetnoj objavi i koje su korisne za reakcije sa polimerima rastvorljivim u vodi uključuju, ali nisu ograničeni na, one sa karbonil, aminooksi, hidrazin, hidrazid, semikarbazid, azid i alkin reaktivne grupe. U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirane aminokiseline sadrže saharid segment. Primeri takvih aminokiselina uključuju N-acetil-L-glukozaminil-L-serin, N-acetil-L-galaktozaminil-L-serin, N-acetil-L-gluzosaminil-L-treonin, N-acetil-L-glukozaminil-L-asparagin i O-manozaminil-L-serin. Primeri takvih aminokiselina takođe uključuje primere u kojima N- ili O- povezivanje koje se javlja u prirodi između aminokiseline i saharida je zamenjeno sa kovalentnim povezivanjem koje se obično ne može pronaći u prirodi - uključujući ali nije ograničeno na, alken, oksim, tioetar, amid i slično. Primeri takvih aminokiselina takođe uključuju saharide koji se obično ne mogu naći u proteinima koji se javljaju u prirodi kao što je 2-deoksi-glukoza, 2-deoksigalaktoza i slično.
[0224] Mnoge od ne-prirodno kodiranih aminokiselina koje su ovde obezbeđene su komercijalno dostupne, npr., od Sigma-Aldrich (Sent Luis, MO, SAD), Novabiochem (ogranak EMD Biosciences, Darmštat, Nemačka), ili Peptech (Burlington, MA, SAD). One koje nisu komercijalno dostupne su po izboru sintetisane kao što je ovde navedeno ili korišćenjem standardnih metoda koje su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Za tehnike organskih sinteza, videti, npr., Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, drugo izdanje, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry by March (treće izdanje, 1985, Wiley and Sons, Njujork); i Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (treće izdanje, delovi A i B, 1990, Plenum Press, Njujork). Videti, takođe, američke patente sa brojevima.7,045,337 i 7,083,970. Dodatno za neprirodne aminokiseline koje sadrže nove boče lance, neprirodne aminokiseline koje mogu biti pogodne za primenu u predmetnoj objavi takođe po izboru sadrže modifikovane osnove strukture, uključujući ali nije ograničeno na, kao što je ilustrovano strukturama Formule II i III:
gde Z tipično sadrži OH, NH2, SH, NH-R', ili S-R'; X a Y, koje može biti isto ili različito, tipično sadrži S ili O, a R i R', koji su po izboru isti ili različiti, su tipično odabrani iz iste liste konstituenata za R grupu opisanu iznad za neprirodne aminokiseline koje imaju Formulu I kao i vodonik. Na primer, neprirodne aminokiseline po izboru sadrže supstitucije u amino ili karboksil grupi kao što je ilustrovano Formulama II i III. Neprirodne aminokiseline ovog tipa uključuju, ali nisu ograničene na, α-hidroksi kiseline, α-tiokiseline, α-aminotiokarboksilate, uključujući ali nije ograničeno na, sa bočnim lancima koji odgovaraju uobičajenim dvadeset prirodnim aminokiselinama ili neprirodnim bočnim lancima. Pored toga, supstitucije na α-ugljeniku po izboru uključuju, ali nisu ograničene na, L, D, ili α-α-disupstituisane aminokiseline kao što je D-glutamat, D-alanin, D-metil-O-tirozin, aminobuterna kiselina, i slično. Druge strukturne alternative uključuju ciklične aminokiseline, kao što su analozi prolina kao i 3, 4 ,6, 7, 8, i 9 -očlani prstenasti analozi prolina, β i γ aminokiseline kao što su supstituisani β-alanin i γ-amino buterna kiselina.
[0226] Mnoge neprirodne aminokiseline su zasnovane na prirodnim aminokiselinama, kao što su tirozin, glutamin, fenilalanin, i slično, i pogodne su za primenu u predmetnoj objavi. Analozi tirozina uključuju, ali nisu ograničeni na, para-supstituisane tirozine, ortosupstituisane tirozine, i meta supstituisane tirozine, gde supstituisan tirozin sadrži, uključujući ali nije ograničeno na, keto grupu (uključujući ali nije ograničeno na, acetil grupu), benzoil grupu, amino grupu, hidrazin, hidroksiamin, tiol grupu, karboksi grupu, izopropil grupu, metil grupu, C 6 - C20 ravan lanac ili razgranati ugljovodonik, zasićen ili nezasićen ugljovodonik, O-metil grupu, polietar grupu, nitro grupu, alkinil grupu ili slično. Dodatno, višestruko supstituisani aril prsteni su takođe razmatrani. Analozi glutamina koji mogu biti pogodni za primenu u predmetnoj objavi uključuju, ali nisu ograničeni na, ahidroksi derivate, g-supstituisane derivate, ciklične derivate, i amid supstituisane glutamin derivate. Primeri analoga fenilalanina koji mogu biti pogodni za primenu u predmetnoj objavi uključuju, ali nisu ograničeni na, para-supstituisane fenilalanine, orto-supstituisane fenilalanine, i meta-supstituisane fenilalanine, gde supstituent sadrži, uključujući ali nije ograničeno na, hidroksi grupu, metoksi grupu, metil grupu, allil grupu, aldehid, azido, jodo, bromo, keto grupu (uključujući ali nije ograničeno na, acetil grupu), benzoil, alkinil grupu, ili slično. Specifični primeri neprirodnih aminokiselina koji mogu biti pogodni za primenu u predmetnoj objavi uključuju, ali nisu ograničeni na, p-acetil-L- fenilalanin, O-metil- L-tirozin, L-3-(2-naftil)alanin, 3-metil-fenilalanin, O-4-allil- L-tirozin, 4-propil- L-tirozin, tri-O-acetil-GlcNAc b-serin, L-Dopa, fluorovan fenilalanin, izopropil- L-fenilalanin, pazido-L- fenilalanin, p-acil-L-fenilalanin, p-benzoil-L- fenilalanin, L- fosfoserin, fosfonoserin, fosfonotirozin, p-jodo-fenilalanin, p-bromofenilalanin, p-amino-L-fenilalanin, izonopropil- L-fenilalanin, i p-propargiloksi-fenilalanin, i slično. Primeri struktura raznih neprirodnih aminokiselina koje mogu biti pogodne za primenu u predmetnoj su obezbeđeni u, na primer, WO 2002/085923 pod nazivom "In vivo incorporation of unnatural amino acids". Videti takođe Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24, za dodatne analoge metionina. Međunarodna prijava br. PCT/US06/47822, pod nazivom " Compositions Containing, Methods Involving, and Uses of Non-natural Amino Acids and Polypeptides", opisuje reduktivnu alkilaciju aromatičnih amin segmenata, uključujući ali nije ograničeno na, p-amino-fenilalanin i reduktivnu aminaciju.
[0227] U jednom slučaju, kompozicije polipeptida relaksina koje uključuju neprirodnu aminokiselinu (kao što je p-(propargiloksi)-fenialanin) su obezbeđene. Razne kompozicije koje sadrže p-(propargiloksi)-fenialanin i, uključujući ali nije ograničeno na, proteine i/ili ćelije, su takođe obezbeđene. U jednom aspektu, kompozicija koja uključuje p-(propargiloksi)-fenialanin neprirodnu aminokiselinu, dalje uključuje ortogonalnu tRNK. Neprirodna aminokiselina može se vezati (uključujući ali nije ograničeno na, kovalentno) za ortogonalnu tRNK, uključujući ali nije ograničeno na, kovalentno vezanu za ortogonalnu tRNK kroz amino-acil vezu, kovalentno vezanu za 3'OH ili 2'OH terminalnog šećera riboze ortogonalne tRNK, itd.
[0228] Hemijski segmenti pomoću neprirodnih aminokiselina koji mogu biti inkorporirani u proteine nude različite prednosti i manipulacije proteina. Na primer, jedinstvena reaktivnost keto funkcionalne grupe omogućava selektivnu modifikaciju proteina sa bilo kojim od brojnih reagenasa koji sadrže hidrazin ili hidroksilamin in vitro i in vivo. Neprirodna aminokiselina sa teškim atomom, na primer, može biti korisna za faziranje podataka o strukturi X-zraka. Uvođenje na specifično mesto teških atoma korišćenjem neprirodnih aminokiselina takođe obezbeđuje selektivnost i fleksibilnost u odabiru položaja za teške atome. Fotoreaktivne neprirodne aminokiseline (uključujući ali nije ograničeno na, aminokiseline sa benzofenonom i arilazidom (uključujući ali nije ograničeno na, fenilazid) bočne lance), na primer, omogućavaju efikasno in vivo i in vitro fotoumrežavanje proteina. Primeri fotoreaktivnih neprirodnih aminokiselina uključuju, ali nisu ograničeni na, p-azidofenilalanin i p-benzoil-fenilalanin. Protein sa fotoreaktivnim neprirodnim aminokiselinama može zatim biti umrežen po volji ekscitacijom fotoreaktivne grupe-koja obezbeđuje privremenu kontrolu. U jednom primeru, metil grupa neprirodne amino može biti supstituisana sa izotopski obeleženom, uključujući ali nije ograničeno na, metil grupu, kao probu lokalne strukture i dinamika, uključujući ali nije ograničeno na, sa primenom nuklearne magnetne rezonance i vibracijske spektroskopije. Alkinil ili azido funkcionalne grupe, na primer, omogućava selektivna modifikacija proteina sa molekulima pomoću reakcije [3+2] cikloadicije.
[0229] Ne-prirodna aminokiselina inkorporirana u polipeptid na amino terminusu može biti sastavljena od R grupe koja je bilo koji supstituent drugi od onog koriščenom u dvadeset prirodnih aminokiselina i druge reaktivne grupe različite od NH2 grupe obično prisutne u α-aminokiselinama (videti Formulu I). Slična ne-prirodna aminokiselina može biti inkorporirana na karboksil terminus sa drugom reaktivnom grupom različitom od COOH grupe koja je obično prisutna u α-aminokiselinama (videti Formulu I).
[0230] Neprirodne aminokiseline mogu biti odabrane ili dizajnirane da obezbede dodatne karakteristike koje nisu dostupne u dvadeset prirodnih aminokiselina. Na primer, neprirodna aminokiselina može po izboru biti dizajnirana ili odabrana da modifikuje biološka svojstva proteina, npr., u koji je inkorporirana. Na primer, sledeća svvojstva mogu po izboru biti modifikovana uključivanjem neprirodne aminokiseline u protein: toksičnost, biodistribucija, rastvorljivost, stabilnost, npr., termička, hidrolitička, oksidativna, otpornost na enzimsku razgradnju, i slično, lakoća prečišćavanja i obrade, strukturna svojstva, spektroskopska svojstva, hemijska i/ili fotohemijska svojstva, katalitička aktivnost, redoks potencijal, poluživot, sposobnost reagovanja sa drugim molekulima, npr., kovalentno ili nekovalentno, i slično.
STRUKTURA I SINTEZA NE-PRIRODNIH AMINOKISELINA: KARBONIL, KARBONIL-SLIČNE, MASKIRANE KARBONIL, ZAŠTIĆENE KARBONIL GRUPE, I HIDROKSILAMIN GRUPE
[0231] U nekim tehničkim rešenjima predmetni pronalazak obezbeđuje relaksin povezan sa polimerom rastvorljivim u vodi, npr., PEG, pomoću oksim veze.
[0232] Mnogi tipovi ne-prirodno kodiranih aminokiselina su pogodni za formiranje oksim veza. Oni uključuju, ali nisu ograničene na, ne-prirodno kodirane aminokiseline koje sadrže karbonil, dikarbonil, ili hidroksilamin grupu. Takve aminokiseline su opisane u objavi američke prijave patenta sa brojevima 2006/0194256, 2006/0217532, i 2006/0217289 i WO 2006/069246 pod nativom " Compositions containing, methods involving, and uses of nonnatural amino acids and polypeptides ". Ne-prirodno kodirane aminokiseline su takođe opisane u američkom patentu br.7,083,970 i američkom patentu br.7,045,337.
[0233] Pronalazak koristi polipeptide relaksina koji su supstituisani na jednom ili više položaja sa para-acetilfenilalanin aminokiselinom. Sinteza p-acetil-(+/-)-fenilalanina i macetil-(+/-)-fenilalanina je opisana u Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003), koji je inkorporiran referencom. Druge aminokiseline koje sadrže karbonil- ili dikarbonilmogu slično pripremiti prosečni poznavaoci u oblasti tehnike. Dalje, neograničavajući primeri sinteza ne-prirodnih aminokiselina koji su ovde uključeni su prikazani na Slikama 4, 24-34 i 36-39 američkog patenta br..7,083,970, koji je inkorporiran referencom u celosti.
[0234] Aminokiseline sa elektrofilnom reaktivnom grupom omogućavaju raznolikost reakcija za povezivanje molekula pomoću reakcije nukleofilne adicije između ostalih. Takve elektrofilno reaktivne grupe uključuju karbonil grupu (uključujući keto grupu i dikarbonil grupu), karbonil-sličnu grupu (koja ima reaktivnost sličnu karbonil grupi (uključujući keto grupu i dikarbonil grupu) i strukturno je slična karbonil grupi), maskiranu karbonil grupu (koja se lako konvertuje u karbonil grupu (uključujući keto grupu i dikarbonil grupu)), ili zaštićenu karbonil grupu (koja ima reaktivnost sličnu karbonil grupi (uključujući keto grupu i dikarbonil grupu) nakon uklanjanja zaštite). Takve aminokiseline uključuju aminokiseline koje imaju strukturu Formule (IV):
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
B je po izboru, i kada prisutna je veznik odabran iz grupe koja se sastoji od nižeg alkilena, supstituisanog nižeg alkilena, nižeg alkenilena, supstituisanog nižeg alkenilena, nižeg heteroalkilena, supstituisanog nižeg heteroalkilena, -O-, -O-(alkilen ili supstituisan alkilen)-, -S-, -S-(alkilen ili supstituisan alkilen)-, -S(O)k- gde k je 1, 2, ili 3, -S(O)k(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)-, -C(O)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(S)-, -C(S)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')-, -NR'-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')CO-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, and -C(R')2-N(R')-N(R')-, gde svaka R' je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
Svaka R" je nezavisno H, alkil, supstituisani alkil, ili zaštitna grupa, ili kada je više od jedne R" grupe prisutno, dve R" po izboru formirajua heterocikloalkil;
R1je po izboru, i kada je prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada je prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
svaka od R3i R4je nezavisno H, halogen, niži alkil, ili supstituisani niži alkil, ili R3i R4ili dve R3grupe po izboru formiraju cikloalkil ili heterocikloalkil;
ili -A-B-J-R grupe zajedno formiraju biciklični ili triciklični cikloalkil ili heterocikloalkil koji sadrži najmanje jednu karbonil grupu, uključujući dikarbonil grupu, zaštićena karbonil grupu, uključujući zaštićena dikarbonil grupu, ili maskiranu karbonil grupu, uključujući maskiranu dikarbonil grupu;
ili -J-R grupa zajedno formira monociklični ili biciklični cikloalkil ili heterocikloalkil koji sadrži najmanje jednu karbonil grupu, uključujući dikarbonil grupu, zaštićena karbonil grupu, uključujući zaštićena dikarbonil grupu, ili maskiranu karbonil grupu, uključujući maskiranu dikarbonil grupu;
pod uslovom da kada je A fenilen i svaka R3je H, B je prisutno; i da kada je A -(CH2)4- i svaki R3 je H, B nije -NHC(O)(CH2CH2)-; i da kada A i B su odsutni i svaki R3je H, R nije metil.
[0235] Pored toga, sa strukturom Formule (V) su uključeni:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
B je po izboru, i kada prisutna je veznik odabran iz grupe koja se sastoji od nižeg alkilena, supstituisanog nižeg alkilena, nižeg alkenilena, supstituisanog nižeg alkenilena, nižeg heteroalkilena, supstituisanog nižeg heteroalkilena, -O-, -O-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S-, -S-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S(O)k- gde k je 1, 2, ili 3, -S(O)k(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)-, -C(O)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(S)-, -C(S)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')-, -NR'-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')CO-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, i -C(R')2-N(R')-N(R')-, gde svaka R' je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
Pod uslovom da kada A je fenilen, B je prisutno; i da kada A je -(CH2)4-, B nije-NHC(O)(CH2CH2)-; i da kada A i B su odsutni, R nije metil.
[0236] Pored toga, aminokiseline koje imaju strukturu Formule (VI) su uključene:
gde:
B je veznik odabran iz grupe koja se sastoji od nižeg alkilena, supstituisanog nižeg alkilena, nižeg alkenilena, supstituisanog nižeg alkenilena, nižeg heteroalkilena, supstituisanog nižeg heteroalkilena, -O-, -O-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S-, -S-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S(O)k- gde k je 1, 2, ili 3, -S(O)k(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)-, -C(O)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(S)-, -C(S)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-,-N(R')-, -NR'-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')CO-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, i -C(R')2-N(R')-N(R')-, gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutno, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutno, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
svaka Raje nezavisno odabrana iz grupe koji se sastoji od H, halogena, alkila, supstituisanog alkila, -N(R')2, -C(O)kR' gde k je 1, 2, ili 3, -C(O)N(R')2, -OR', i -S(O)kR', gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil.
[0237] Pored toga, sledeće aminokiseline su uključene:
gde su takva jedinjenje po izboru amino zaštićena grupa, karboksil zaštićena ili njihova so. Pored toga, bilo koja od sledećih ne-prirodnih aminokiselina može biti inkorporirana u polipeptid ne-prirodne aminokiseline.
[0238] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (VII) su uključene:
gde
B je po izboru, i kada prisutno je veznik odabran iz grupe koja se sastoji od nižeg alkilena, supstituisanog nižeg alkilena, nižeg alkenilena, supstituisanog nižeg alkenilena, nižeg heteroalkilena, supstituisanog nižeg heteroalkilena, -O-, -O-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S-, -S-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S(O)k- gde k je 1, 2, ili 3, -S(O)k(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)-, -C(O)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(S)-, -C(S)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')-, -NR'-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')CO-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=,C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, i -C(R')2-N(R')-N(R')-, gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutno, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutno, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
svaka Raje nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od H, halogena, alkila, supstituisanog alkila, -N(R')2, -C(O)kR' gde k je 1, 2, ili 3, -C(O)N(R')2, -OR', i -S(O)kR', gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil; i n je 0 do 8;
pod uslovom da kada A je -(CH2)4-, B nije -NHC(O)(CH2CH2)-.
[0239] Pored toga, sledeće aminokiseline su uključene:
gde takva jedinjenja su po izboru amino zaštićena, po izboru karboksil zaštićena, po izboru amino zaštićena i karboksil zaštićena, ili soli istih. Pored toga, ove ne-prirodne aminokiseline i bilo koje od sledećih ne-prirodnih aminokiselina mogu biti inkorporirane u polipeptid ne-prirodne aminokiseline.
[0240] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (VIII) su uključene:
gde A je po izboru, i kada prisutno je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilene, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
B je po izboru, i kada prisutno je veznik odabran iz grupe koja se sastoji od nižeg alkilena, supstituisanog nižeg alkilena, nižeg alkenilena, supstituisanog nižeg alkenilena, nižeg heteroalkilena, supstituisanog nižeg heteroalkilena, -O-, -O-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S-, -S-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S(O)k- gde k je 1, 2, ili 3, -S(O)k(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)-, -C(O)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(S)-, -C(S)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')-, -NR'-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')CO-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=,-C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, i -C(R')2-N(R')-N(R')-, gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid.
[0241] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formula (IX) su uključene:
B je po izboru, i kada prisutna je veznik odabran iz grupe koja se sastoji od nižeg alkilena, supstituisanog nižeg alkilena, nižeg alkenilena, supstituisanog nižeg alkenilena, nižeg heteroalkilena, supstituisanog nižeg heteroalkilena, -O-, -O-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S-, -S-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S(O)k- gde k je 1, 2, ili 3, -S(O)k(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)-, -C(O)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(S)-, -C(S)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')-, -NR'-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, C(O)N(R')-, -CON(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')CO-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=,-C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, i -C(R')2-N(R')-N(R')-, gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
gde svaki Raje nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od H, halogena, alkila, supstituisanog alkila, -N(R')2, -C(O)kR' gde k je 1, 2, ili 3, -C(O)N(R')2, -OR', i -S(O)kR', gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil.
[0242] Pored toga, sledeće aminokiseline su uključene:
gde su takva jedinjenja po izboru amino zaštićena, po izboru karboksil zaštićena, po izboru amino zaštićena i karboksil zaštićena, ili njihove soli. Pored toga, ove ne-prirodne aminokiseline i bilo koje od sledećih ne-prirodnih aminokiselina mogu biti inkorporirane u polipeptid ne-prirodna aminokiseline.
[0243] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (X) su uključene:
gde B je po izboru, i kada prisutna je veznik odabran iz grupe koja se sastoji od nižeg alkilena, supstituisanog nižeg alkilena, nižeg alkenilena, supstituisanog nižeg alkenilena, nižeg heteroalkilena, supstituisanog nižeg heteroalkilena, -O-, -O-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S-, -S-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S(O)k- gde k je 1, 2, ili 3,-S(O)k(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)-, -C(O)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-,-C(S)-, -C(S)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')-, -NR'-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')CO-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, i -C(R')2-N(R')-N(R')-, gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
svaka Ra je nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od H, halogena, alkila, supstituisanog alkila, -N(R')2, -C(O)kR' gde k je 1, 2, ili 3, -C(O)N(R')2, -OR', i -S(O)kR', gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil; i n je 0 do 8.
[0244] Pored toga, sledeće aminokiseline su uključene:
gde takva jedinjenja su po izboru amino zaštićena, po izboru karboksil zaštićena, po izboru amino zaštićena i karboksil zaštićena, ili njihove soli. Pored toga, ove ne-prirodne aminokiseline i bilo koje od sledećih ne-prirodnih aminokiselina mogu biti inkorporirane u polipeptid ne-prirodne aminokiseline.
[0245] Pored monokarbonil struktura, ne-prirodne aminokiseline opisane ovde mogu da uključuju grupe kao što su dikarbonil, slična dikarbonil, maskirana dikarbonil i zaštićena dikarbonil grupe.
[0246] Na primer, sledeće aminokiseline koje imaju struktura Formule (XI) su uključene:
gde A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
B je po izboru, i kada prisutna je veznik odabran iz grupe koja se sastoji od nižeg alkilena, supstituisanog nižeg alkilena, nižeg alkenilena, supstituisanog nižeg alkenilena, nižeg heteroalkilena, supstituisanog nižeg heteroalkilena, -O-, O-(alkilen ili supstituisani alkilen)-,-S-, S-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S(O)k- gde k je 1, 2, ili 3, -S(O)k(alkilen ili supstituisani alkilen)-, C(O)-, C(O)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(S)-, C(S)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')-, NR'-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, C(O)N(R')-, CON(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -CSN(R')-, CSN(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, N(R')CO-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, N(R')C(O)O-, S(O)kN(R')-, N(R')C(O)N(R')-, N(R')C(S)N(R')-, N(R')S(O)kN(R')-, N(R')-N=,-C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, C(R')2-N=N-, i C(R')2 N(R') N(R')-, gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid,
[0247] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XII) su uključene:
B je po izboru, i kada prisutna je veznik odabran iz grupe koja se sastoji od nižeg alkilena, supstituisanog nižeg alkilena, nižeg alkenilena, supstituisanog nižeg alkenilena, nižeg heteroalkilena, supstituisanog nižeg heteroalkilena, -O-, -O-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S-, -S-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S(O)k- gde k je 1, 2, ili 3, -S(O)k(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)-, -C(O)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(S)-, -C(S)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')-, -NR'-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')CO-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=,-C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, i -C(R')2-N(R')-N(R')-, gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
gde svaka Ra je nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od H, halogena, alkila, supstituisanog alkila, -N(R')2, -C(O)kR' gde k je 1, 2, ili 3, -C(O)N(R')2, -OR', i -S(O)kR', gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil.
[0248] Pored toga, sledeće aminokiseline su uključene:
gde takva jedinjenja su po izboru amino zaštićena, po izboru karboksil zaštićena, po izboru amino zaštićena i karboksil zaštićena, ili njihove soli. Pored toga, ove ne-prirodne aminokiseline i bilo koje od sledećih ne-prirodna aminokiselina mogu biti inkorporirane u polipeptid ne-prirodna aminokiseline.
[0249] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XIII) su uključene:
gde B je po izboru, i kada prisutna je veznik odabran iz grupe koja se sastoji od nižeg alkilena, supstituisanog nižeg alkilena, nižeg alkenilena, supstituisanog nižeg alkenilena, nižeg heteroalkilena, supstituisanog nižeg heteroalkilena, -O-, -O-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S-, -S-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -S(O)k- gde k je 1, 2, ili 3, - S(O)k(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)-, -C(O)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(S)-, -C(S)-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')-, -NR'-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -C(O)N(R')-, -CON(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -CSN(R')-, -CSN(R')-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')CO-(alkilen ili supstituisani alkilen)-, -N(R')C(O)O-, -S(O)kN(R')-, -N(R')C(O)N(R')-, -N(R')C(S)N(R')-, -N(R')S(O)kN(R')-, -N(R')-N=, -C(R')=N-, -C(R')=N-N(R')-, -C(R')=N-N=, -C(R')2-N=N-, i -C(R')2-N(R')-N(R')-, gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
svaka Raje nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od H, halogena, alkila, supstituisanog alkila, -N(R')2, -C(O)kR' gde k je 1, 2, ili 3, -C(O)N(R')2, -OR', i-S(O)kR', gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil; a n je 0 do 8.
[0250] Pored toga, sledeće aminokiseline su uključene:
gde takva jedinjenja su po izboru amino zaštićena, po izboru karboksil zaštićena, po izboru amino zaštićena i karboksil zaštićena, ili njihove soli. Pored toga, ove ne-prirodne aminokiseline i bilo koje od sledećih ne-prirodnih aminokiselina mogu biti inkorporirane u polipeptid ne-prirodne aminokiseline.
[0251] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XIV) su uključene:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1 je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2 je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
X1 je C, S, ili S(O); a L je alkilen, supstituisani alkilen, N(R')(alkilen) ili N(R')(supstituisani alkilen), gde R' je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil.
[0252] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XIV-A) su uključene:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1 je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2 je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
L je alkilen, supstituisani alkilen, N(R')(alkilen) ili N(R')(supstituisani alkilen), gde R' je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil.
[0253] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XIV-B) su uključene:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1 je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2 je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
L je alkilen, supstituisani alkilen, N(R')(alkilen) ili N(R')(supstituisani alkilen), gde R' je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil.
[0254] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XV) su uključene:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
X1je C, S, ili S(O); i n je 0, 1, 2, 3, 4, ili 5; i svaka R<8>i R<9>na svakoj CR<8>R<9>grupi je nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od H, alkoksi, alkilamina, halogena, alkila, arila, ili bilo koje R<8>i R<9>mogu zajedno da formiraju =O ili cikloalkil, ili bilo koja do susednih R<8>grupa mogu zajedno da formiraju cikloalkil.
[0255] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XV-A) su uključene:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
n je 0, 1, 2, 3, 4, ili 5; i svaka R<8>i R<9>na svakoj CR<8>R<9>grupi je nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od H, alkoksi, alkilamina, halogena, alkila, arila, ili bilo koja R<8>i R<9>mogu zajedno da formiraju =O ili cikloalkil, ili bilo koja do susednih R8 grupa mogu zajedno da formiraju cikloalkil.
[0256] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XV-B) su uključene:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
n je 0, 1, 2, 3, 4, ili 5; i svaka R<8>i R<9>na svakoj CR<8>R<9>grupi je nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od H, alkoksi, alkilamina, halogena, alkila, arila, ili bilo koja R<8>i R<9>mogu zajedno da formiraju =O ili cikloalkil, ili bilo koja do susednih R<8>grupa mogu zajedno da formiraju cikloalkil.
[0257] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XVI) su uključene:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
X1je C, S, ili S(O); i L je alkilen, supstituisani alkilen, N(R')(alkilen) ili N(R')(supstituisani alkilen), gde R' je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil.
[0258] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XVI-A) su uključene:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; a
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
L je alkilen, supstituisani alkilen, N(R')(alkilen) ili N(R')(supstituisani alkilen), gde R' je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil.
[0259] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XVI-B) su uključene:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
R je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
L je alkilen, supstituisani alkilen, N(R')(alkilen) ili N(R')(supstituisani alkilen), gde R' je H, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil.
[0260] Pored toga, aminokiseline koja imaju strukturu Formule (XVII) su uključene:
gde:
A je po izboru, i kada prisutna je niži alkilen, supstituisani niži alkilen, niži cikloalkilen, supstituisani niži cikloalkilen, niži alkenilen, supstituisani niži alkenilen, alkinilen, niži heteroalkilen, supstituisani heteroalkilen, niži heterocikloalkilen, supstituisani niži heterocikloalkilen, arilen, supstituisani arilen, heteroarilen, supstituisani heteroarilen, alkarilen, supstituisani alkarilen, aralkilen, ili supstituisani aralkilen;
gde (a) označava vezivanje za A grupu a (b) označava vezivanje za odgovarajuće karbonil grupe, R3i R4su nezavisno odabrani od H, halogena, alkila, supstituisanog alkila, cikloalkila, ili supstituisanog cikloalkila, ili R3i R4ili dve R3grupe ili dve R4grupe po izboru formiraju cikloalkil ili heterocikloalkil;
R je H, halogen, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil; T3je veza, C(R)(R), O, ili S, a R je H, halogen, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid.
[0261] Pored toga, aminokiseline koja imaju strukturu Formule (XVIII) su uključene:
gde:
M je -C(R3)-,
gde (a) označava vezivanje za A grupu a (b) označava vezivanje za odgovarajuće rkarbonil grupe, R3i R4su nezavisno odabrani od H, halogena, alkila, supstituisanog alkila, cikloalkila, ili supstituisanog cikloalkila, ili R3i R4ili dve R3grupe ili dve R4grupepo izboru formiraju cikloalkil ili heterocikloalkil;
R je H, halogen, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil; T3je veza, C(R)(R), O, ili S, a R je H, halogen, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil;
R1je po izboru, i kada prisutna, je H, amino zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid; i
R2je po izboru, i kada prisutna, je OH, estar zaštitna grupa, smola, aminokiselina, polipeptid, ili polinukleotid;
svaka Raje nezavisno odabrana iz grupe koja se sastoji od H, halogena, alkila, supstituisanog alkila, -N(R')2, -C(O)kR' gde k je 1, 2, ili 3, -C(O)N(R')2, -OR', i -S(O)kR', gde svaka R’ je nezavisno H, alkil, ili supstituisani alkil.
[0262] Pored toga, aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XIX) su uključene:
gde:
R je H, halogen, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil; i T3je O, ili S.
[0263] Pored toga, aminokiseline koje imaju strukturu Formule (XX) su uključene:
gde:
R je H, halogen, alkil, supstituisani alkil, cikloalkil, ili supstituisani cikloalkil.
[0264] Pored toga, sledeće aminokiseline koje imaju strukture Formule (XXI) su uključene:
[0265] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid koji sadrži ne-prirodnu aminokiselinu je hemijski modifikovan da generiše reaktivnu karbonil ili dikarbonil funkcionalnu grupu. Na primer, aldehidna funkcionalnost korisna za reakcije konjugacije može se generisati iz funkcionalnosti koju imaju susedne amino i hidroksil grupe. Kada je biološki aktivni molekul polipeptid, na primer, N-terminalni serin ili treonin (koji može biti normalno prisutan ili može biti izložen hemijskoj ili enzimskoj digestiji) može se koristiti da generiše aldehidnu funkcionalnost pod blagim uslovima oksidativnog cepanja primenom perjodata. Videti, npr., Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem.3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Međutim, metode koje su poznate u oblasti tehnike su ograničene na aminokiselinu na N-terminusu peptida ili protein.
[0266] U predmetnoj objava, ne-prirodna aminokiselina koja nosi susedne hidroksil i amino grupe može biti inkorporirana u polipeptid kao "maskirana" aldehid funkcionalnost. Na primer, 5-hidroksilizin nosi hidroksil grupu koja je susedna epsilon aminu. Reakciju uslovi za generisanje aldehida tipično uključuje dodavanje molarnog viška natrijum metaperjodata pod blagim uslovima da se izbegne oksidacija na drugim mestima u polipeptidu. pH reakcije oksidacije je tipično oko 7.0. Karakteristična reakcija uključuje dodavanje od oko 1.5 molarnog viška natrijum meta perjodata u puferovani rastvor polipeptida, praćeno inkubacijom tokom oko 10 minuta u mraku. Videti, npr. američki patent br.6,423,685.
[0267] Karbonil ili dikarbonil funkcionalnost može selektivno sa reagensom koji sadrži hidroksilamin pod blagi uslovima u vodenom rastvor da se formira odgovarajuće oksim povezivanje koje je stabilno pod fiziološkim uslovima. Videti, npr., Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959); Shao, J. i Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc.117:3893-3899 (1995). Štaviše, jedinstvena reaktivnost karbonil ili dikarbonil grupa omogućava selektivnu modifikaciju u prisustvu ostalih bočnih lanaca aminokiselina. Videti, npr., Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997).
Struktura i sinteza ne-prirodnih aminokiselina: aminokiseline koje sadrže hidroksilamin
[0268] Američka prijava patenta br. 11/316,534 (objava američke prijave patenta br.
20060189529) je navedena. Prema tome, objave obezbeđene u odeljku V (pod nazivom " Non-natural Amino Acids"), deo B (pod nazivom "Structure and Synthesis of Non-Natural Amino Acids: Hydroxylamine-Containing Amino Acids"), u američkoj prijavi patenta br.
11/316,534 (objava američke prijave patenta br.20060189529) primenjuje se u potpunosti na metode, kompozicije (uključujući Formule I-XXXV), tehnike i strategije za pravljenje, prečišćavanje, karakterizacije, i korišćenje ne-prirodnih aminokiselina, polipeptida neprirodne aminokiseline i modifikovanih polipeptida ne-prirodne aminokiseline koji su opisani ovde. Američke objave prijave patenta sa brojevima 2006/0194256, 2006/0217532, i 2006/0217289 i WO 2006/069246 sa nazivom "Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides," su takođe navedene.
HEMIJSKA SINTEZA NEPRIRODNA AMINOKISELINA
[0269] Mnoge od neprirodnih aminokiselina pogodnih za primenu u predmetnoj objavi su komercijalno dostupne, npr., od Sigma (SAD) ili Aldrich (Milvoki, WI, SAD). One koje nisu komercijalno dostupne su po izboru sintetisane kao što je obezbeđeno ovde ili kao što je obezbeđeno u raznim publikacijama ili korišćenjem standardnih metoda koje su poznate prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike. Za tehnike organske sinteze, videti, npr., Organic Chemistry od Fessendon-a i Fessendon-a, (1982, drugo izdanje, Willard Grant Press, Boston Mass.); Advanced Organic Chemistry od March-a (treće izdanje, 1985, Wiley and Sons, Njujork); i Advanced Organic Chemistry od Carey-a i Sundberg-a (treće izdanje, delovi A i B, 1990, Plenum Press, Njujork). Dodatne publikacije koje opisuju sintezu neprirodnih aminokiselina uključuju, npr., WO 2002/085923 sa nazivom "In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids;" Matsoukas et al., (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669; King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc., 3315-3319; Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752; Craig, J.C. et al. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine). J. Org. Chem. 53, 1167-1170; Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamin analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5; Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Org. Chem. 50:1239-1246; Barton et al., (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-AminoAdipic Acids, L-alpha-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308; i, Subasinghe et al., (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of betaheterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives
and their activity at a novel quisqualate-sensitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7. Videti takođe, objavu američke prijave patenta br. US 2004/0198637 sa nazivom "Protein Arrays".
A. Karbonil reaktivne grupe
[0270] Aminokiseline sa karbonil reaktivnom grupom omogućavaju različite reakcije za povezivanje molekula (uključujući ali nije ograničeno na, PEG ili druge molekule rastvorljive u vodi) pomoću reakcija nukleofilne adicije ili aldolne kondenzacije između ostalih.
[0271] Aminokiseline koje sadrže karbonil koje su uzete kao primer mogu biti predstavljene kao što sledi:
gde je n 0-10; R1je alkil, aril, supstituisani alkil, ili supstituisani aril; R2je H, alkil, aril, supstituisani alkil, i supstituisani aril; i R3je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa za modifikacija amino kraja, a R4je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa za modifikaciju karboksi kraja. U nekim slučajevima, n je 1, R1je fenil a R2je jednostavni alkil (tj., metil, etil, ili propil) i keton segment se nalazi u para poziciji u odnosu na alkil bočni lanac. U nekim slučajevima, n je 1, R1je fenil a R2je jednostanavni alkil (tj., metil, etil, ili propil) a keton segment se nalazi u meta poziciji u odnosu na alkil bočni lanac.
[0272] Sinteza p-acetil-(+/-)-fenilalanina i m-acetil-(+/-)-fenilalanina je opisana u Zhang, Z., et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Druge aminokiseline koje sadrže karbonil mogu biti slično pripremljene od strane prosečnog poznavaoca u oblasti tehike.
[0273] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptid koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu je hemijski modifikovan da proizvede reaktivnu karbonil funkcionalnu grupu. Na primer, aldehid funkcionalnost korisna za reakciju konjugacije može se generisati iz funkcionalnosti koju imaju susedne amino i hidroksil grupe. Kada je biološki aktivni molekul polipeptid, na primer, N-terminalni serin ili treonin (koji može obično biti prisutan ili može biti izložen hemijskoj ili enzimskoj digestiji) može se koristiti da generiše aldehid funkcionalnost pod blagim uslovima oksidativnog cepanja pomoću perjodata. Videti, npr., Gaertner, et al., Bioconjug. Chem.3: 262-268 (1992); Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992); Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994). Međutim, metode koje su poznate u oblasti tehnike su ograničene na aminokiselinu na N-terminusu peptida ili proteina.
[0274] U predmetnoj objava, ne-prirodno kodirana aminokiselina koja nosi susedne hidroksil i amino grupe može se inkorporirati u polipeptid kao "maskirana" aldehid funkcionalnost. Na primer, 5-hidroksilizin nosi hidroksil grupu koja je pored epsilon amina. Reakcioni uslovi za generisanje aldehida tipično uključuju dodavanje molarnog viška natrijum metaperjodata pod blagim uslovima da se izbegne oksidacija na drugim mestima u polipeptidu. pH reakcije oksidacije reakciju je obično oko 7.0. Karakteristična reakcija uključuje dodavanje oko 1.5 molarnog viška natrijum meta perjodata u puferovan rastvor polipeptida, praćeno inkubacijom tokom oko 10 minuta u mraku. Videti, npr. američki patent br.6,423 ,685.
[0275] Karbonil funkcionalnost može reagovati selektivno sa reagensom koji sadrži hidrazin, hidrazid, hidroksilamin, ili semikarbazid pod blagim uslovima u vodenom rastvoru da formira odgovarajuća hidrazon, oksim, ili semikarbazon povezivanja, redom, koja su stabilna pod fiziološkim uslovima. Videti, npr., Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc.
81, 475-481 (1959); Shao, J. i Tam, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995). Štaviše, jedinstvena reaktivnost karbonil grupe omogućava selektivnu modifikaciju u prisustvu drugih bočnih lanaca aminokiseline. Videti, npr., Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996); Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem.
3:138-146 (1992); Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997).
B. Hidrazin, hidrazid ili semikarbazid reaktivne grupe
[0276] Ne-prirodno kodirane aminokiseline koje sadrže nukleofilnu grupu, kao što je hidrazin, hidrazid ili semikarbazid, omogućavaju reakciju sa raznim elektrofilnim grupama da se formiraju konjugati (uključujući ali nije ograničeno na, sa PEG-om ili drugim polimerima rastvorljivim u vodi).
[0277] Aminokiseline koje sadrže hidrazin, hidrazid ili semikarbazid koje su uzete kao primer mogu biti predstavljene kao što sledi:
gde n je 0-10; R1je alkil, aril, supstituisani alkil, ili supstituisani aril ili nije prisutana; X, je O, N, ili S ili nije prisutana; R2je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa za modifikaciju amino kraja, a R3je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa za modifikaciju karboksi kraja.
[0278] U nekim slučajevima, n je 4, R1nije prisutna, a X je N. U nekim slučajevima, n je 2, R1nije prisutna, i X nije prisutna. U nekim slučajevima, n je 1, R1je fenil, X je O, i atom kiseonika je pozicioniran para u odnosu na alfatičnu grupu na aril prstenu.
[0279] Aminokiseline koje sadrže hidrazid, hidrazin, i semikarbazid su dostupne iz komercijalnih izvora. Na primer, L-glutamate-□-hidrazid je dostupne od Sigma Chemical (Sent Luis, MO). Druge aminokiseline koje nisu dostupne komercijalno mogu pripremiti prosečni poznavaoci u oblasti tehnike. Videti, npr., američki patent br.6,281,211.
[0280] Polipeptidi koji sadrže ne-prirodno kodirane aminokiseline koje nose hidrazid, hidrazin ili semikarbazid funkcionalnosti mogu da reaguju efikasno i selektivno sa raznim molekulima koji sadrže aldehide ili druge funkcionalne grupe sa sličnom hemijskom reaktivnošću. Videti, npr., Shao, J. i Tam, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995).
Jedinstvena reaktivnost hidrazid, hidrazin i semikarbazid funkcionalnih grupa čini ih značajno reaktivnijim prema aldehidima, ketonima i drugim elektrofilnim grupama u poređenju sa nukleofilnim grupama koje su prisutne na 20 uobičajenih aminokiselina (uključujući ali nije ograničeno na, hidroksil grupu serina ili treonina ili amino grupe lizina i N-terminus).
C. Aminokiseline koje sadrže aminooksi
[0281] Ne-prirodno kodirane aminokiseline koje sadrže aminooksi (takođe se naziva hidroksilamin) grupu omogućavaju reakciju sa raznim elektrofilnim grupama da formiraju konjugate (uključujući ali nije ograničeno na, sa PEG-om ili drugim polimerima rastvorljivim u vodi). Slično hidrazinima, hidrazidima i semikarbazidima, poboljšana nukleofilnost aminooksi grupe dozvoljava joj da reaguje efikasno i selektivno sa raznim molekulima koji sadrže aldehide ili druge funkcionalne grupe sa sličnom hemijskom reaktivnošću. Videti, npr., Shao, J. i Tam, J., J. Am. Chem. Soc.117:3893-3899 (1995); H. Hang i C. Bertozzi, Acc. Chem. Res. 34: 727-736 (2001). Dok je rezultat reakcije sa hidrazin grupom odgovarajući hidrazon, međutim, oksim obično rezultuje iz reakcije aminooksi grupe sa grupom koja sadrži karbonil kao što je keton.
[0282] Aminokiseline koje sadrže aminooksi grupe koje su uzete kao primer mogu biti predstavljene kao što sledi:
gde n je 0-10; R1je alkil, aril, supstituisani alkil, ili supstituisani aril ili nije prisutana; X je O, N, S ili nije prisutana; m je 0-10; Y = C(O) ili nije prisutana; R2je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa za modifikaciju amino kraja, a R3je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa za modifikaciju karboksi kraja. U nekim slučajevima, n je 1, R1je fenil, X je O, m je 1, i Y je prisutna. U nekim slučajevima, n je 2, R1i X nisu prisutne, m je 0, i Y nije prisutna.
[0283] Aminokiseline koje imaju aminooksi mogu se pripremiti od već dostupnih aminokiselinskih prekursora (homoserin, serin i treonin). Videti, npr., M. Carrasco i R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003). Određene aminokiseline koje sadrže aminooksi, kao što je L-2-amino-4-(aminooksi)buterna kiselina), su izolovane iz prirodnih izvora (Rosenthal, G., Life Sci. 60: 1635-1641 (1997). Druge aminokiseline koje sadrže aminooksi mogu pripremiti prosečni poznavaoci iz oblasti tehnike.
D. Azid i alkin reaktivne grupe
[0284] Jedinstvena reaktivnost azid i alkin funkcionalnih grupa čini ih izuzetno korisnim za selektivnu modifikaciju polipeptida i drugih bioloških molekula. Organski azidi, naročito alfatični azido, i alkini su obično stabilni u odnosu na uobičajene reaktivne hemijske uslove. Naročito, i azid i alkin funkcionalne grupe su inertne prema bočnim lancima (tj., R grupama) 20 uobičajenih aminokiselina pronađenim u polipeptidima koji se javljaju u prirodi. Međutim, kada se dovedu u blizinu, "opružena" priroda azid i alkin grupa se otkriva i oni reaguju selektivno i efikasno kroz reakciju Huisgen-ove [3+2] cikloadicije da bi se stvorio odgovarajući triazol. Videti, npr., Chin J., et al., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc.124:9026-9027 (2002).
[0285] Pošto reakcija Huisgen-ove cikloadicije uključuje reakciju selektivne cikloadicije (videti, npr., Padwa, A., u COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS,, tom. 4, (izd. Trost, B. M., 1991), str. 1069-1109; Huisgen, R. u 1,3- DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (izd. Padwa, A., 1984), str. 1-176) pre nego nukleofilnu supstituciju, inkorporacija ne-prirodno kodiranih aminokiselina koje imaju bočne lance koji sadrže azid i alkin omogućava da rezultujući polipeptidi budu modifikovani selektivno na položaju neprirodno kodirane aminokiseline. Reakcija cikloadicije koja uključuje polipeptid relaksina koji sadrži azid ili alkin može se izvesti na sobnoj temperaturi pod vodenim uslovima dodavanjem Cu(II) (uključujući ali nije ograničeno na, u obliku katalitičke količine CuSO4) u prisustvu redukcionog sredstva za redukovanje Cu(II) u Cu(I), in situ, u katalitičkoj količini. Videti, npr., Wang, Q., et al., J. Am. Chem. Soc.125, 3192-3193 (2003); Tornoe, C. W., et al., J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. Int. Izd. 41:2596-2599 (2002). Primeri redukcionih sredstava obuhvataju, uključujući ali nije ograničeno na, askorbat, metalni bakar, kinin, hidrohinon, vitamin K, glutation, cistein, Fe<2+>, Co<2+>, i primenjeni električni potencijal.
[0286] U nekim slučajevima, kada je reakcija Huisgen-ove [3+2] cikloadicije između azida i alkina je poželjna, polipeptid relaksina sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži alkin segment i polimer rastvorljiv u vodi koji se vezuje za aminokiselinu koja sadrži azid segment. Alternativno, obrnuta reakcija (tj., sa azid segmentom na aminokiselini i alkin segmentom prisutnim na polimeru rastvorljivim u vodi) može se takođe izvesti.
[0287] Azid funkcionalna grupa može takođe da reaguje selektivno sa polimerom rastvorljivim u vodi koji sadrži aril estar i odgovarajuće funkcionalizovanim sa aril fosfin segmentom da generiše amid povezivanje. Aril fosfin grupa redukuje azid in situ i rezultujući amin zatim reaguje efikasno sa proksimalnim estar povezivanjem da generiše odgovarajući amid. Videti, npr., E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). Aminokiselina koja sadrži azid može biti bilo alkil azid (uključujući ali nije ograničeno na, 2-amino-6-azido-1-heksanoična kiselina) ili aril azid (p-azido-fenilalanin).
[0288] Polimeri rastvorljivi u vodi koji sadrže aril estar i fosfin segment koji su uzeti kao primer mogu biti predstavljeni kao što sledi:
gde X može biti O, N, S ili nije prisutana, Ph je fenil, W je polimer rastvorljiv u vodi i R može biti H, alkil, aril, supstituisani alkil i supstituisane aril grupe. Primeri R grupa uključuju ali nisu ograničeni na -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', -halogen, -C(O)R',-CONR'R", -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN i -NO2. R', R", R'" i R"" svaki nezavisno se odnosi na vodonik, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil, supstituisani ili nesupstituisani aril, uključujući ali nije ograničeno na, aril supstituisan sa 1-3 halogena, supstituisani ili nesupstituisani alkil, alkoksi ili tioalkoksi grupe, ili arilalkil grupe. Kada jedinjenje uključuje više od jedne R grupe, na primer, svaka R grupa je nezavisno odabrana kao i svake R’, R", R'" i R"" grupe kada je više od jedne od ovih grupa prisutno. Kada su R' i R" vezane za isti atom azota, one se mogu kombinovati sa atomom azota da formiraju 5-, 6-, ili 7-očlani prsten. Na primer, -NR'R" označava da uključuje, ali nije ograničeno, 1-pirolidinil i 4-morfolinil. Iz gornjeg razmatranja supstituenata, prosečan poznavalac oblasti tehnike će razumeti da termin "alkil" označava da uključuje grupe uključujući atome ugljenika vezane za grupe koje nisu vodonične grupe, kao što su haloalkil (uključujući ali nije ograničeno na, - CF3i -CH2CF3) i acil (uključujući ali nije ograničeno na, -C(O)CH3, -C(O)CF3,-C(O)CH2OCH3, i slično).
[0289] Azid funkcionalna grupa može takođe selektivno da reaguje sa polimerom rastvorljivim u vodi koji sadrži tioester i odgovarajuće funkcionalizovanim sa aril fosfin segmentom da generiše amid povezivanje. Aril fosfin grupa redukuje azid in situ i rezultujući amin zatim efikasno reaguje sa tioestar povezivanjem da generiše odgovarajući amid. Polimeri rastvorljivi u vodi koji sadrže tioestar i fosfin segment koji su uzeti kao primer mogu biti predstavljeni kao što sledi:
gde n je 1-10; X može biti O, N, S ili nije prisutana, Ph je fenil, i W je polimer rastvorljiv u vodi.
[0290] Aminokiseline koje sadrže alkin koje su uzete kao primer mogu biti predstavljene kao što sledi:
gde je n 0-10; R1je alkil, aril, supstituisani alkil, ili supstituisani aril ili nije prisutana; X je O, N, S ili nije prisutana; m je 0-10, R2je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa za modifikacija amino kraja, a R3 je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa za modifikaciju karboksi kraja. U nekim slučajevima, n je 1, R1je fenil, X nije prisutna, m je 0 i acetilen segment je pozicioniran u para poziciji u odnosu na alkil bočni lanac. U nekim slučajevima, n je1, R1je fenil, X je O, m je 1 i propargiloksi grupa je pozicionirana u para poziciji u odnosu na alkil bočni lanac (tj., O-propargil-tirozin). U nekim slučajevima, n je 1, R1i X nisu presetni i m je 0 (tj., proparilglicin).
[0291] Aminokiseline koje sadrže alkin su komercijalno dostupne. Na primer, propargilglicin je komercijalno dostupan od Peptech (Burlington, MA). Alternativno, aminokiseline koje sadrže alkin mogu se pripremiti u skladu sa standardnim metodama. Na primer, p-propargiloksifenilalanin se može sintetisati, na primer, kao što je opisano u Deiters, A., et al., J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003), a 4-alkinil-L-fenilalanin se može sintetisati kao što je opisano u Kayser, B., et al., Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997). Druge aminokiseline koje sadrže alkin mogu pripremiti prosečni poznavaoci u oblasti tehnike.
[0292] Aminokiseline koje sadrže azid koje su uzete kao primer mogu biti predstavljenie kao što sledi:
gde je n 0-10; R1je alkil, aril, supstituisani alkil, supstituisani aril ili nije prisutana; X je O, N, S ili nije prisutana; m je 0-10; R2je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa za modifikaciju amino kraja, a R3je H, aminokiselina, polipeptid, ili grupa za modifikaciju karboksi kraja. U nekim slučajevima, n je 1, R1je fenil, X nije prisutna, m je 0 i azid segment je pozicioniran para u odnosu na alkil bočni lanac. U nekim slučajevima, n je 0-4 a R1i X nisu prisutne, i m=0. U nekim slučajevima, n je 1, R1je fenil, X je O, m je 2 i βazidoetoksi segment je pozicioniran u para poziciji u odnosu na alkil bočni lanac.
[0293] Aminokiseline koje sadrže azid su dostupne iz komercijalnih izvora. Na primer, 4-azidofenilalanin se može nabaviti od Chem-Impex International, Inc. (Wood Dale, IL). Za one aminokiseline koje sadrže azid koje nisu komercijalno dostupne, azid grupa se može pripremiti relativno lako korišćenjem standardih metoda poznatih prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike, uključujući ali nije ograničeno na, preko zamene pogodne odlazeće grupe (uključujući ali nije ograničeno na, halid, mezilat, tozilat) ili preko otvaranja pogodnog zaštićenog laktona. Videti, npr., Advanced Organic Chemistry od March-a (treće izdanje, 1985, Wiley and Sons, Njujork).
E. Aminotiol reaktivne grupe
[0294] Jedinstvena reaktivnost beta-supstituisanih aminotiol funkcionalnih grupa čini ih izuzetno korisnim za selektivnu modifikaciju polipeptida i drugih bioloških molekula koji sadrže aldehid grupe preko formiranja tiazolidina. Videti, npr., J. Shao i J. Tam, J. Am. Chem. Soc.1995, 117 (14) 3893-3899. U nekim slučajevima, beta-supstituisane aminotiol aminokiseline mogu se inkorporirati u polipeptide relaksina i zatim reagovati sa polimerima rastvorljivim u vodi koji sadrže aldehid funkcionalnost. U nekim slučajevima, polimer rastvorljiv u vodi, konjugat leka ili drugi korisni sadržaj može biti spojen sa polipeptidom relaksina koji sadrži beta-supstituisanu aminotiol aminokiselinu preko formiranja tiazolidina.
F. Dodatne reaktivne grupe
[0295] Dodatne reaktivne grupe i ne-prirodno kodirane aminokiseline, uključujući ali nije ograničeno na para-amino-fenilalanin, koje mogu biti inkorporirane u polipeptide relaksina su opisane u sledećim patentnim prijavama: objava američke prijave patenta br.
2006/0194256, objava američke prijave patenta br.2006/0217532, objava američke prijave patenta br.2006/0217289, američka privremena prijava patenta br. 60/755,338; američka privremena prijava patenta br. 60/755,711; američka privremena prijava patenta br.
60/755,018; međunarodna prijava patenta br. PCT/US06/49397; WO 2006/069246; američka privremena prijava patenta br. 60/743,041; američka privremena prijava patenta br. 60/743,040; međunarodna prijava patenta br. PCT/US06/47822; američka privremena prijava prijava br. 60/882,819; američka privremena prijava prijava br. 60/882,500; i američka privremena prijava patenta br. 60/870,594. Ove prijave takođe razmatraju reaktivne grupe koje mogu biti prisutne na PEG-u ili drugim polimerima, uključujući ali nije ograničeno na, hidroksilamin (aminooksi) grupe radi konjugacije.
ĆELIJSKO PREUZIMANJE NEPRIRODNIH AMINOKISELINA
[0296] Preuzimanje neprirodne aminokiseline od strane ćelije je jedno pitanje koje se tipično razmatra pri dizajniranju odabiru neprirodnih aminokiselina, uključujući ali nije ograničeno na, za inkorporaciju u protein. Na primer, visoka gustina naelektrisanja αaminokiselina sugeriše da ova jedinjenja verovatno neće biti propusna za ćelije. Prirodne aminokiseline se prenose u eukariotsku ćeliju putem kolekcije transportnih sistema zasnovanih na proteinu. Brza provera, koja procenjuje koje neprirodne aminokiseline, ako ih ima, će ćelije preuzeti može se uraditi. Videti, npr., ispitivanja toksičnosti u, npr., objavi američke prijave patenta br. US 2004/0198637 sa nazivom "Protein Arrays"; i Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS Sjedinjenih Američkih Država 96:4780-4785. Iako se preuzimanje lako analizira raznim ispitivanjima, alternativa dizajniranju neprirodnih aminokiselina koje su podesne putevima ćelijskog preuzimanja je da se obezbede biosintetski putevi za stvaranje aminokiselina in vivo.
BIOSINTEZA NEPRIRODNIH AMINOKISELINA
[0297] Mnogi biosintetski putevi već postoje u ćelijama za proizvodnju aminokiselina i drugih jedinjenja. Dok biosintetska metoda za određenu neprirodnu aminokiselinu možda ne postoji u prirodi, uključujući ali nije ograničeno na, u ćeliji, takve metode su ovde stavljene na uvid javnosti. Na primer, biosintetski putevi za neprirodne aminokiseline su po izboru generisani u ćelijama domaćina dodavanjem novih enzima ili modifikovanjem postojećih puteva ćelije domaćina. Dodatni novi enzimi su po izboru enzimi koji se javljaju u prirodi ili veštački razvijeni enzimi. Na primer, biosinteza p-aminofenilalanin (kao što je predstavljeno u primeru u WO 2002/085923 sa nazivom "In vivo incorporation of unnatural amino acids ") se oslanja na dodavanje kombinacija poznatih enzima iz drugih organizama. Geni za ove enzime se mogu uvesti u eukariotsku ćeliju transformisanjem ćelije sa plazmidom koji sadrži gene. Geni, kada se eksprimiraju u ćeliji, obezbeđuju enzimski put za sintezu željenog jedinjenja. Primeri tipova enzima koji se po izboru dodaju su obezbeđeni u primerima ispod. Dodatne sekvence enzima nalaze se, na primer, u banci gena. Veštački razvijeni enzimi se takođe po izboru dodaju u ćeliju na isti način. Na ovaj način, ćelijska mašinerija i resursi ćelije se manipulišu da proizvedu neprirodne aminokiseline.
[0298] Razne metode su dostupne za proizvodnju novih enzima za primenu u biosintetskim putevima ili za procenu postojećih puteva. Na primer, rekurzivna rekombinacija, uključujući ali nije ograničeno na, kao što je razvio Maxygen, Inc. (dostupna na World Wide Web na maxygen.com), je opciono primenjena da se razviju novi enzimi i putevi. Videti, npr., Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389-391; i, Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751. Slično DesignPath™, koji je razvio Genencor (dostupno na World Wide Web na genencor.com) je opciono primenjen za inženjering metaboličkog puta, uključujući ali nije ograničeno na, da se inženjeringom dobije put za stvaranje O-metil-L-tirozina u ćeliji. Ova tehnologija rekonstruiše postojeće puteve u organizmima domaćina primenom kombinacije novih gena, uključujući ali nije ograničeno na, one identifikovane preko funkcionalnih genomika, i molekularne evolucije i dizajna. Diversa Corporation (dostupna na World Wide Web na diversa.com) takođe obezbeđuje tehnologiju za biblioteke gena i genskih puteva koje se brzo pretražuju, uključujući ali nije ograničeno na, da se stvaraju novi putevi.
[0299] Tipično, neprirodna aminokiselina proizvedena biosintetskim putem dobijenog inženjeringom je proizvedena u koncentraciji koja je dovoljna za efikasnu biosintezu proteina, uključujući ali nije ograničeno na, prirodnu ćelijsku količinu, ali ne u tolikoj meri da utiče na koncentraciju ostalih aminokiselina ili iscrpljenih ćelijskih resursa. Tipične koncentracije proizvedene in vivo na ovaj način su oko 10 mM do oko 0.05 mM. Jednom kada je ćelija transformisana sa plazmidom koji sadrže gen korišćen da se proizvedu enzimi željeni za određen put i neprirodna aminokiselina se generiše, in vivo selekcije su po izboru upotrebljene da se dalje optimizuje proizvodnja neprirodne aminokiseline i za sintezu ribozomalnog proteina i rast ćelije.
POLIPEPTIDI SA NEPRIRODNIM AMINOKISELINAMA
[0300] Inkorporacija neprirodne aminokiseline može se uraditi u razne svrhe, uključujući ali nije ograničeno na, prilagođavanje promena u strukturi i/ili funkciji proteina, promene veličine, acidnost, nukleofilnost, vezivanje vodonika, hidrofobnost, pristupačnosti ciljanih mesta proteaza, ciljanje u segmentu (uključujući ali nije ograničeno na, za niz proteina), dodavanje biološki aktivnog molekula, vezivanje polimera, vezivanje radionuklida, modulaciju poluživota u serumu, modulacija penetracije tkiva (npr. tumori), modulacija aktivnog transporta, modulacija specifičnosti ili distribucije tkiva, ćelija ili organa, modulacija imunogenosti, modulacija otpornosti na proteazu, itd. Proteini koji uključuju neprirodnu aminokiselinu mogu imati poboljšana ili čak potpuno nova katalitička ili biofizička svojstva. Na primer, sledeća svojstva su po izboru modifikovana uključivanjem neprirodne aminokiseline u protein: toksičnost, biodistribucija, strukturalna svojstva, spektroskopska svojstva, hemijska i/ili fotohemijska svojstva, katalitička sposobnost, poluživot (uključujući ali nije ograničeno na, poluživot u serumu), sposobnost reagovanja sa drugim molekulima, uključujući ali nije ograničeno na, kovalentno ili nekovalentno, i slično. Kompozicije koje uključuju proteine koji uključuju najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu su korisne za, uključujući ali nije ograničeno na, nove terapeutike, dijagnostike, katalitičke enzime, industrijske enzime, vezujuće proteine (uključujući ali nije ograničeno na, antitela), i uključujući ali nije ograničeno na, studiju strukture i funkciju proteina. Videti, npr., Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652.
[0301] U jednom aspektu pronalaska, kompozicija uključuje najmanje jedan protein sa najmanje jednom, uključujući ali nije ograničeno na, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam, najmanje devet, ili najmanje deset ili više neprirodnih aminokiselina. Neprirodne aminokiseline mogu biti iste ili različite, uključujući ali nije ograničeno na, može biti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više različitih mesta u proteinu koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više različitih neprirodnih aminokiselina. U drugom aspektu, kompozicija uključuje protein sa najmanje jednom, ali manje od svih, određenom aminokiselinom prisutnom u proteinu i koja je supstituisana sa neprirodnom aminokiselinom. Za dati protein sa više od jedne neprirodne aminokiseline, neprirodne aminokiseline mogu biti identičane ili različite (uključujući ali nije ograničeno na, protein može da uključuje dve ili više različitih tipova neprirodnih aminokiselina, ili može da uključuje dve od iste neprirodne aminokiselina). Za dati protein sa više od dve neprirodne aminokiseline, neprirodne aminokiseline mogu biti iste, različite ili kombinacija višestrukih neprirodnih aminokiselina iste vrste sa najmanje jednom razlišitom neprirodnom aminokiselinom.
[0302] Proteini ili polipeptidi od interesa sa najmanje jednom neprirodnom aminokiselinom su karakteristika pronalaska. Pronalazak takođe uključuje polipeptide ili proteine sa najmanje jednom neprirodnom aminokiselinom proizvedenom primenom kompozicija i metoda pronalaska. Ekscipijent (uključujući ali nije ograničeno na, farmaceutski prihvatljive ekscipijente) može takođe biti prisutan sa proteinom.
[0303] Proizvodnjom proteina ili polipeptidsa od interesa sa najmanje jednom neprirodnom aminokiselinom in eukariotskim ćelijama, proteini ili polipeptidi će tipično uključivati eukariotske posttranslacione modifikacija. U određenim slučajevima, protein uključuje najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu i najmanje jednu posttranslacionu modifikaciju koju je in vivo urađena od eukariotske ćelije, gde posttranslaciona modifikacija nije urašena od prokariotske ćelije. Na primer, posttranslaciona modifikacija obuhvata, uključujući ali nije ograničeno na, acetilaciju, acilaciju, lipid-modifikaciju, palmitoilaciju, dodavanje palmitata, fosforilaciju, modifikaciju glikolipid-povezivanja, glikozilaciju, i slično. U jednom aspekt, posttranslaciona modifikacija uključuje vezivanje oligosaharida (uključujući ali nije ograničeno na, (GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAc)) za asparagin pomoću GlcNAc-asparagin povezivanja. Videti Tabelu 1 koja navodi neke primere N-povezanih oligosaharida eukariotskih proteina (dodatni ostaci mogu takođe biti prisutni, koji nisu prikazani). U sledećem aspektu, posttranslaciona modifikacija uključuje pričvršćivanje oligosaharida (uključujući ali nije ograničeno na, Gal-GalNAc, Gal-GlcNAc, itd.) za serin ili treonin sa GalNAc-serin ili GalNAc-treonin povezivanjem, ili a GlcNAc-serin ili GlcNAc-treonin povezivanjem.
Tabela 1: Primeri oligosaharida preko GLCNAC-povezivanja
[0304] U još sledećem aspektu, posttranslaciona modifikacija uključuje proteolitičku obradu prekursora (uključujući ali nije ograničeno na, prekursor kalcitonina, prekursor peptida genski srodanom kalcitoninu, preproparatiroidni hormon, preproinsulin, proinsulin, prepro-opiomelanokortin, pro-opiomelanokortin i slično), spajanje u protein sa više podjedinica ili makromolekulski sklop, translaciju na drugo mesto u ćeliji (uključujući ali nije ograničeno na, do organela, kao što su endoplazmatični retikulum, Goldžijev aparat, jezgro, lizozome, peroksizome, mitohondrije, hloroplaste, vakuole, itd., ili kroz sekretorni put). U određenim tehničkim rešenjima, protein sadrži sekrecionu ili lokalizacionu sekvencu, oznaku epitopa, FLAG oznaku, polihistidin oznaku, GST fuziju, ili slično.
[0305] Jedna prednost neprirodne aminokiseline je u tome da ona predstavlja dodatne hemijske segmente koji se mogu primeniti za dodavanje molekula. Ove modifikacije se mogu uraditi in vivo u eukariotskoj ili neeukariotskoj ćeliji, ili in vitro. Prema tome, u određenim tehničkim rešenjima, posttranslaciona modifikacija je putem neprirodne aminokiseline. Na primer, posttranslaciona modifikacija može biti putem nukleofilnoelektrofilne reakcije. Većina reakcija koje se trenutno primenjuju za selektivnu modifikaciju proteina uključuju formiranje kovalentne veze između nukleofilnih i elektrofilnih učesnika reakcije, uključujući ali nije ograničeno na reakciju α-haloketona sa histidin ili cistein bočnim lancima. Selektivnost u ovim slučajevima je određena brojem i pristupačnosti nukleofilnih ostataka u proteinu. U proteinima pronalaska, druge selektivnije reakcije mogu se primeniti kao što je reakcija neprirodne keto-aminokiseline sa hidrazidima ili aminooksi jedinjenjima, in vitro i in vivo. Videti, npr., Cornish, et al., (1996) J. Am. Chem. Soc., 118:8150-8151; Mahal, et al., (1997) Science, 276:1125-1128; Wang, et al., (2001) Science 292:498-500; Chin, et al., (2002) J. Am. Chem. Soc.124:9026-9027; Chin, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., 99:11020-11024; Wang, et al., (2003) Proc. Natl. Acad. Sci., 100:56-61; Zhang, et al., (2003) Biochemistry, 42:6735-6746; i, Chin, et al., (2003) Science, 301:964-7. Ovo omogućava selektivno obeležavanje gotovo bilo kog proteina sa mnoštvom reagensa uključujući fluorofore, agense za umrežavanje, derivate saharida i citotoksične molekule. Videti takođe, američki patent br. 6,927,042 sa nazivom "Glycoprotein synthesis". Posttranslacione modifikacija, uključujući ali nije ograničeno na, preko azido aminokiseline, se takođe mogu izvršiti pomoću Staudingerove ligacije (uključujući ali nije ograničeno na, sa triarilfosfin reagensima). Videti, npr., Kiick et al., (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24.
[0306] Ovde je stavljena na uvid javnosti druga visoko efikasna metoda za selektivnu modifikaciju proteina, koja uključuje genetsku inkorporaciju neprirodnih aminokiselina, uključujući ali nije ograničeno na, koje sadrže azid ili alkinil segment u proteinima kao odgovor na selektor kodon. Ovi aminokiselinski bočni lanci mogu se zatim modifikovati pomoću, uključujući ali nije ograničeno na, reakcije Huisgen-ove [3+2] cikloadicije (videti, npr., Padwa, A. u Comprehensive Organic Synthesis, tom 4, (1991) izd. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, str.1069-1109; i, Huisgen, R. u 1,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry, (1984) izd. Padwa, A., Wiley, Njujork, str. 1-176) sa, uključujući ali nije ograničeno na, alkinil ili azid derivatima, redom. Pošto ova metoda obuhvata cikloadiciju pre nego nukleofilnu supstituciju, proteini se mogu modifikovanti sa izuzetno visokom selektivnošću. Ova reakcija se može izvesti na sobnoj temperaturi u vodenim uslovima sa odličnom regioselektivnošću (1,4 > 1,5) dodavanjem katalitičke količine Cu(I) soli u reakcionu smešu. Videti, npr., Tornoe, et al., (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064; i, Rostovtsev, et al., (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599. Druga metoda koje se može koristiti je izmena liganada na jedinjenju bisarsena sa tetracisteinskim motivom, videti, npr., Griffin, et al., (1998) Science 281:269-272.
[0307] Molekul koji se može dodati u protein preko [3+2] cikloadicije uključuje gotovo bilo koji molekul sa azid ili alkinil derivatom. Molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na, boje, fluorofore, agense za umrežavanje, derivate saharida, polimere (uključujući ali nije ograničeno na, derivate polietilen glikola), fotoumreživače, citotoksična jedinjenja, oznake afiniteta, derivate biotina, smole, kuglice, drugi protein ili polipeptid (ili više), polinukleotid(e) (uključujući ali nije ograničeno na, DNK, RNK, itd.), helatore metala, kofaktore, masne kiseline, ugljovodonike, i slično. Ovi molekuli se mogu dodati neprirodnoj aminokiselini sa alkinil grupom, uključujući ali nije ograničeno na, ppropargiloksifenilalanin, ili azido grupu, uključujući ali nije ograničeno na, p-azidofenilalanin, redom.
In vivo generisanje polipeptida relaksina koji sadrže ne-prirodno-kodirane aminokiseline
[0308] Polipeptidi relaksina pronalaska se mogu generisati in vivo primenom modifikovane tRNK i tRNK sintetaze da se dodaju ili supstituišu aminokiseline koje nisu kodirane u sistemima koji se javljaju prirodno.
[0309] Metode za generisanje tRNK kiselina i tRNK sintetaze koje primenjuju aminokiseline koje nisu kodirane u sistemima koji se javljaju prirodno su opisane u, npr., američkim patentima sa brojevima. 7,045,337 i 7,083,970. Ove metode uključuju generisanje translacione mašinerije koja funkcioniše nezavisno od sintetaze i tRNK kiselina endogenih za translacioni sistem (i usled toga se ponekad označavaju kao "ortogonalne"). Tipično, translacioni sistem sadrži ortogonalnu tRNK (O-tRNK) i ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS). Tipično, O-RS prvenstveno aminoaciluje O-tRNK sa najmanje jednom aminokiselinom koja se ne javlja u prirodi u translacionom sistem i O-tRNK prepoznaje najmanje jedan selektor kodon koji nije prepoznala druga tRNK kiselina u sistemu. Translacioni sistem prema tome umeće ne-prirodno-kodiranu aminokiselinu u protein proizveden u sistemu, kao odgovor na kodiran selektor kodon, time vršeći "supstituciju" aminokiseline u položaju na kodiranom polipeptidu.
[0310] Širok spektar ortogonalnih tRNK i aminoacil tRNK sintetaza je opisan u oblasti tehnike za umetanje posebnih sintetskih aminokiselina u polipeptide, i koje su obično pogodne za primenu u predmetnom pronalasku. Na primer, keto-specifične O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaze su opisane u Wang, L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) i Zhang, Z. et al., Biochem.42(22):6735-6746 (2003). O-RS koja je uzeta kao primer, ili delovi iste, su kodirane polinukleotidne sekvence i uključuje aminokiselinske sekvence stavljene na uvid javnosti u američkim patentima sa brojevima 7,045,337 i 7,083,970. Odgovarajući O-tRNK molekuli za primenu sa O-RS-ama su takođe opisani u američkim patentima sa brojevima 7,045,337 i 7,083,970. Dodatni primeri O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaza parova su opisani u WO 2005/007870, WO 2005/007624; i WO 2005/019415.
[0311] Primer azid-specifični O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaza sistem je opisani u Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc.124:9026-9027 (2002). O-RS sekvence koje su uzete kao primer za p-azido-L-Phe uključuju, ali nisu ograničene na, nukleotidne sekvence SEQ ID NOs: 14-16 i 29-32 i aminokiselinske sekvence SEQ ID NOs: 46-48 i 61-64 kao što je stavljeno na uvid javnosti u američkom patentu br.7,083,970. O-tRNK sekvence koje su uzete za primer pogodne za primenu u predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničene na, nukleotidne sekvence SEQ ID NOs: 1-3 kao što je stavljeno na uvid javnosti u američkom patentu br. 7,083,970. Drugi primeri O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaza parova specifičnih za posebne ne-prirodno kodirane aminokiseline su opisani u američkom patentu br.7,045,337. O-RS i O-tRNK koje inkorporiraju aminokiseline koje sadrže i keto i azid u S. cerevisiae su opisane u Chin, J. W., et al., Science 301:964-967 (2003).
[0312] Nekoliko drugih ortogonalnih parova je zabeleženo. Glutaminil (videti, npr., Liu, D. R., i Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. S. A. D.96:4780-4785), aspartil (videti, npr., PastRNKk, M., et al., (2000) Helv. Chim. Acta 83:2277-2286), i tirozil (videti, npr., Ohno, S., et al., (1998) J. Biochem. (Tokyo, Jpn.) 124:1065-1068; i, Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. S. A. D. 98:2268-2273) sistemi izvedeni iz S. cerevisiae tRNK'-e i sintetaza su opisani za potencijalnu inkorporaciju neprirodnih aminokiselina u E. coli. Sistemi izvedeni iz E. coli glutaminil (videti, npr., Kowal, A. K., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. S. A. D. 98:2268-2273) i tirozil (videti, npr., Edwards, H., i Schimmel, P. (1990) Mol. Cell. Biol.10:1633-1641) sintetaza su opisani za primenu u S. cerevisiae. E. coli tirozil sistem se primenjuje za inkorporaciju 3-jodo-L-tirozina in vivo, u ćelijama sisara. Videti, Sakamoto, K., et al., (2002) Nucleic Acids Res.30:4692-4699.
[0313] Primena o O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaza uključuje selekciju specifičnog kodona koji kodira ne-prirodno kodiranu aminokiselinu. Iako se bilo koji kodon može primeniti, obično je poželjno da se odabere kodon koji se retko ili nije nikad korišćen u ćeliji u kojoj je O-tRNK/aminoacil-tRNK sintetaza eksprimirana. Na primer, primer kodona uključuje nonsens kodon kao što su stop kodoni (ćilibar, oker, i opal), četvoro ili više bazni kodoni i drugi prirodni tro-bazni kodoni koji se retko ili ne koriste.
[0314] Specifični selektor kodon(i) mogu se uvesti na odgovarajuće položaje u polinukleotidnim kodirajućim sekvencama relaksina primenom metoda mutageneze poznatih u oblasti tehnike (uključujući ali nije ograničeno na, mutageneze specifične za mesto, kasetne mutageneze, mutageneze restrikcione selekcije, itd.).
[0315] Metode za generisanje komponenti biosintetska mašinerija proteina, kao što su O-RS-e, O-tRNK-e, i ortogonalni O-tRNK/O-RS parovi koji se mogu primeniti za incorporisanje ne-prirodno kodirane aminokiseline su opisane u Wang, L., et al., Science 292: 498-500 (2001); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc.124:9026-9027 (2002); Zhang, Z. et al., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003). Metode i kompozicije za in vivo inkorporacija ne-prirodno kodiranih aminokiselina su opisane u američkom patentu br.
7,045,337, koji je ovde inkorporiran referencom. Metode za selekciju ortogonalnog tRNK-tRNK sintetaza para za primenu u in vivo translacionom sistemu organizma su takođe opisane u američkim patentima sa brojevima 7,045,337 i 7,083,970. PCT objava br. WO 04/035743 sa nazivom " "Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into Proteins," koja je ovde inkorporirana referencom u celosti, opisuje ortogonalne RS i tRNK parove za inkorporaciju keto aminokiselina. PCT objava br. WO 04/094593, sa nazivom "Expanding the Eukaryotic Genetic Code", opisuje ortogonalne RS i tRNK parove za inkorporaciju neprirodno kodiranih aminokiselina u ćelijama eukariotskog domaćina.
[0316] Metode za proizvodnju najmanje jedne rekombinantne ortogonalne aminoaciltRNK sintetaze (O-RS) sadrže: (a) generisanje biblioteke (po izboru mutant) RS izvedene od najmanje jedne aminoacil-tRNK sintetaze (RS) iz prvog organizma, uključujući ali nije ograničeno na, prokariotski organizam, kao što je Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, ili slično, ili eukariotski organizam; (b) selektovanjem (i/ili skriningom) biblioteke RS (po izboru mutant RS) za članove koji aminoaciluju ortogonalnu tRNK (O-tRNK) u prisustvu ne-prirodno kodirane aminokiseline i prirodne aminokiseline, time obezbeđujući pul aktivnih (po izboru mutant) RS; i/ili, (c) selektovanjem (po izboru negativnom selekcijom) pula za aktivne RS (uključujući ali nije ograničeno na, mutant RS-e) koje prvenstveno aminoaciluju O-tRNK u odsustvu neprirodno kodirane aminokiseline, time obezbeđujući najmanje jednu rekombinantnu O-RS; pri čemu najmanje jedna rekombinantna O-RS prvenstveno aminoaciluje O-tRNK sa neprirodno kodiranom aminokiselinom.
[0317] U jednom tehničkom rešenju, RS je neaktivna RS. Neaktivna RS se može generisati mutiranjem aktivne RS. Na primer, neaktivna RS može se generisati mutiranjem najmanje oko 1, najmanje oko 2, najmanje oko 3, najmanje oko 4, najmanje oko 5, najmanje oko 6, ili najmanje oko 10 ili više aminokiselina u različite aminokiseline, uključujući ali nije ograničeno na, alanin.
[0318] Biblioteke mutant RS-a se mogu generisati primenom različitih tehnika poznatih u oblasti tehnike, uključujući ali nije ograničeno na racionalni dizajn zasnovan na tro dimenzionalnoj RS strukturi proteina, ili mutagenezama RS nukleotida u nasumičnoj ili racionalnog dizajna tehnici. Na primer, mutant RS se mogu generisati pomoću mutacija specifičnih za mesto, nasumičnih mutacija, rekombinacijske mutacije koje generišu diverzitet, himernih konstrukata, racionalnog dizajna i drugim metodama ovde opisanim ili poznatim u oblasti tehnike.
[0319] U jednom tehničkom rešenju, selektovanje (i/ili skrining) biblioteke RS (po izboru mutant RS) za članove koji su aktivni, uključujući ali nije ograničeno na, koji aminoaciluju ortogonalnu tRNK (O-tRNK) u prisustvu ne-prirodno kodirane aminokiseline i prirodne aminokiselina, uključuje: uvođenje markera za pozitivnu selekciju ili skrining, uključujući ali nije ograničeno na, gen rezistentan na antibiotik, ili slično, i biblioteke (po izboru mutant) RS u mnoštvo ćelija, gde marker za pozitivnu selekciju i/ili skrining sadrži najmanje jedan selektor kodon, uključujući ali nije ograničeno na, ćilibar, oker, ili opal kodon; rasta mnoštva ćelija u prisustvu agensa za selekciju; identifikovanja ćelija koje preživljavaju (ili pokazuju specifičan odgovor) u prisustvu agensa za selekciju i/ili skrining suzbijanjem najmanje jednog selektor kodona u markeru za pozitivnu selekciju ili skrining, time obezbešujući podskup pozitivno selektovanih ćelija koje sadrže pul aktivnih (po izboru mutant) RS. Po izboru, koncentracija agensa za selekciju i/ili skrining može da varira.
[0320] U jednom aspektu, marker pozitivne selekcije je hloramfenikol acetiltransferaza (CAT) gen a selektor kodon je ćilibar stop kodon u CAT genu. Po izboru, marker pozitivne selekcije je β-laktamaza gen a selektor kodon je ćilibar stop kodon u β-laktamaza genu. U sledećem aspektu marker pozitivne selekcije sadrži fluorescentni ili luminescentni skrining marker ili skrining marker zasnovan na afinitetu (uključujući ali nije ograničeno na, marker površine ćelije).
[0321] U jednom tehničkom rešenju, negativno selektovanje ili skrining pula za aktivne RS (po izboru mutantne) koje prvenstveno aminoaciluju O-tRNK u odsustvu ne-prirodno kodirane aminokiseline uključuje: uvođenje markera za negativnu selekcije ili skrining sa pulom aktivnih (po izboru mutant) RS iz pozitivne selekcije ili skrininga u mnoštvo ćelija drugog organizma, gde marker za negativnu selekciju ili skrining sadrži najmanje jedan selektor kodon (uključujući ali nije ograničeno na, gen rezistentana na antibiotik, uključujući ali nije ograničeno na, hloramfenikol acetiltransferaza (CAT) gen); i, identifikovanje ćelija koje preživljavaju ili pokazuju specifičan skrining odgovor u prvom medijumu dopunjenom sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom i agensom za skrining ili selekciju, ali koje ne uspeju da prežive ili pokažu specifični odgovor u drugom medijumu koji nije dopunjen sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom i agensom za selekciju ili skrining, time obezbeđujući preživele ćelije ili skrinovane ćelije sa najmanje jednom rekombinantnom O-RS. Na primer, CAT identifikacioni protokol po izboru deluje kao pozitivna selekcija i/ili negativni skrining pri određivanju pogodnih O-RS rekombinanti. Na primer, pul klonova se po izboru replicira na pločama za rast koje sadrže CAT (koji sadrži najmanje jedan selektor kodon) ili sa ili bez jedne ili više ne-prirodno kodirane aminokiseline. Kolonije koje rastu isključivo na pločama koje sadrže ne-prirodno kodirane aminokiseline se prema tome odnose na one koje sadrže rekombinantne O-RS. U jednom aspektu, koncentracija agensa za selekciju (i/ili skrining) varira. U nekim aspektima prvi i drugi organizmi su različiti. Prema tome, prvi i/ili drugi organizam po izboru sadrži: prokariot, eukariot, sisar, Escherichia coli, gljivu, kvasac, arhebacteriju, eubacteriju, biljku, insekt, protist, itd. U drugim tehničkim rešenjima, skrining marker sadrži fluorescentni ili luminescentni skrining marker ili skrining marker zasnovan na afinitetu.
[0322] U sledećem tehničkom rešenju, skrining ili selektovanje (uključujući ali nije ograničeno na, negativnu selektovanje) pula za aktivne (po izboru mutant) RS uključuje: izolovanje pula aktivnih mutant RS iz koraka pozitivne selekcije (b); uvođenje markera za negativnu selekciju ili skrining, gde marker za negativnu selekciju ili skrining sadrži najmanje jedan selektor kodon (uključujući ali nije ograničeno na, toksični marker gen, uključujući ali nije ograničeno na, ribonukleaza barnaza gen, koje sadrže najmanje jedna selektor kodon), i pul aktivnih (po izboru mutant) RS u mnoštvo ćelija drugog organizma; i identifikovanja ćelija koje preživljavaju ili pokazuju specifičan skrining odgovor u prvom medijumu koja nije dopunjena sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom, ali nisu uspeli da prežive ili pokažu specifičan skrining odgovor u drugom medijumu koji je dopunjen sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom, time obezbeđujući preživele ili skrinovane ćelije sa najmanje jednom rekombinantnom O-RS, gde najmanje jedna rekombinantna O-RS je specifična za ne-prirodno kodiranu aminokiselinu. U jednom aspektu, najmanje jedan selektor kodon sadrži oko dva ili više selektor kodona. Takva tehnička rešenja po izboru mogu da sadrže gde najmanje jedan selektor kodon sadrži dva ili više selektor kodona, i gde su prvi i drugi organizam različiti (uključujući ali nije ograničeno na, svaki organizam je opciono, uključujući ali nije ograničeno na, prokariot, eukariot, sisar, Escherichia coli, gljiva, kvasac, arhebakterija, eubakterija, biljka, insekt, protist, itd.). Takođe, neki aspekti uključuje gde marker za negativnu selekciju sadrži ribonukleaza barnaza gen (koji sadrži najmanje jedan selektor kodon). Drugi aspekti uključuje gde skrining marker po izboru sadrži fluorescentni ili luminescentni skrining marker ili skrining marker zasnovan na afinitetu. U tehničkim rešenjima ovde, skrininzi i/ili selekcije po izboru uključuju varijacije strogosti skrininga i/ili selekcije.
[0323] U jednom tehničkom rešenju, metode za proizvodnju najmanje jedne rekombinantne ortogonalne aminoacil-tRNK sintetaze (O-RS) mogu dalje da sadrže: (d) izolovanje najmanje jedne rekombinantne O-RS; (e) generisanje drugog seta O-RS (po izboru mutiranog) izvedenog iz najmanje jedne rekombinantne O-RS; i, (f) ponavljanja koraka (b) i (c) dok se mutirana O-RS nije dobijena koja sadrži sposobnost da prvenstveno aminoaciluje O-tRNK. Po izboru, koraci (d)-(f) se ponavljaju, uključujući ali nije ograničeno na, najmanje oko dva puta. U jednom aspektu, drugi set mutirane O-RS izveden iz najmanje jedne rekombinantne O-RS može se generisati mutagenezom, uključujući ali nije ograničeno na, nasumične mutageneze, mutageneze specifične za mesto, njihovu rekombinaciju ili kombinacija.
[0324] Strogost koraka za selekciju/skrining, uključujući ali nije ograničeno na, korak za pozitivnu selekciju/skrining (b), korak za negativnu selekciju/skrining (c) ili i koraci za pozitivnu i negativnu selekciju/skrining (b) i (c), u iznad-opisanim metodama, po izboru uključuje variranje strogosti selekcije/skrininga. U sledećem tehničkom rešenju, korak za pozitivnu selekciju/skrining (b), korak za negativnu selekciju/skrining (c) ili i koraci za pozitivnu i negativnu selekciju/skrining (b) i (c) sadrže primenu reportera, gde reporter detektuje fluorescentno aktivirano ćelijsko sortiranje (FACS - fluorescence-activated cell sorting) ili gde je reporter detektovan luminescencijom. Po izboru, reporter se prikazuje na površini ćelije, na prikazu faga ili slično i selektovan je na osnovu afiniteta ili katalitičke aktivnost koja uključuje ne-prirodno kodiranu aminokiselinu ili analog. U jednom tehničkom rešenju, mutirana sintetaza se prikazuje na površini ćelije, prikazu faga ili slično.
[0325] Metode za proizvodnju rekombinantne ortogonalne tRNK (O-tRNK) uključuju: (a) generisanje biblioteka mutant tRNK izvedenih iz najmanje jedne tRNK, uključujući ali nije ograničeno na, supresorska tRNK, iz prvog organizma; (b) selektovanje (uključujući ali nije ograničeno na, negativno selektovanje) ili skrining biblioteke iz (po izboru mutant) tRNK koje su aminoacilovane sa aminoacil-tRNK sintetazom (RS) iz drugog organizma u odsustvu RS iz prvog organizma, time obezbeđujući pul tRNK- kiselina (po izboru mutant); i, (c) selektovanje ili skrining pula tRNK kiselina (po izboru mutant) za članove koji su aminoacilovani sa uvedenom ortogonalnom RS (O-RS), time obezbeđujući najmanje jednu rekombinantnu O-tRNK; gde najmanje jedna rekombinantna O-tRNK prepoznaje selektor kodon i nije efikasno prepoznata od strane RS iz drugog organizma i prvenstveno je aminoacilovana sa O-RS. U nekim tehničkim rešenjima najmanje jedna tRNK je supresorska tRNK i/ili sadrži jedinstveni trobazni kodon prirodnih i/ili neprirodnih baza, ili je nonsens kodon, retki kodon, neprirodni kodon, kodon koji sadrži najmanje 4 baze, ćilibar kodon, oker kodon, ili opal stop kodon. U jednom tehničkom rešenju, rekombinantna O-tRNK poseduje poboljšanje ortogonalnosti. Ceniće se da u nekim tehničkim rešenjima, O-tRNK je po izboru uvedena u prvi organizam iz drugog organizma bez potrebe za modifikacijom. U raznim tehničkim rešenjima, prvi i drugi organizmi su ili isti ili različiti i po izboru su odabrani od, uključujući ali nije ograničeno na, prokariote (uključujući ali nije ograničeno na, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacterium, itd.), eukariote, sisare, gljive, kvasce, arhebakterije, eubakterije, biljke, insekte, protiste, itd. Dodatno, rekombinantna tRNK je po izboru aminoacilovana sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom, gde ne-prirodno kodirana aminokiselina je biosintetisana in vivo ili prirodnom ili pomoću genetske manipulacije. Ne-prirodno kodirana aminokiselina se po izboru dodaje u medijum za rast za najmanje prvi ili drugi organizam.
[0326] U jednom aspektu, selektovanje (uključujući ali nije ograničeno na, negativno selektovanje) ili skrining biblioteka za (po izboru mutant) tRNK koje su aminoacilovane sa aminoacil-tRNK sintetazom (korak (b)) uključuje: uvođenje toksičnog marker gen, gde toksični marker gen sadrži najmanje jedan od selektor kodona (ili gen koji dovodi do proizvodnje toksičnog ili statičnog agensa ili gena koji je neophodan za organizam pri čemu takav marker gen sadrži najmanje jedan selektor kodon) i biblioteke (po izboru mutant) tRNK-a u mnoštvo ćelija iz drugog organizma; i, selektovanje preživelih ćelija, pri čemu preživele ćelije sadrže pul (po izboru mutant) tRNK-a koje sadrže najmanje jednu ortogonalnu tRNK ili nefunkcionalnu tRNK. Na primer, preživele ćelije se mogu selektovati korišćenjem ispitivanja poređenja gustine ćelije.
[0327] U drugom aspektu, toksični marker gen može da uključuje dva ili više selektor kodona. U drugom tehničkom rešenju metode, toksični marker gen je ribonukleaza barnaza gen, pri čemu ribonukleaza barnaza gen sadrži najmanje jedan ćilibar kodon. Po izboru, ribonukleza barnaza gen može da uključuje dva ili više ćilibar kodona.
[0328] U jednom tehničkom rešenju, selektovanje ili skrining pula (po izboru mutant) tRNK-a za članove koji su aminoacilovani pomoću uvedene ortogonalne RS (O-RS) može da uključuje: uvođenje marker gena za pozitivnu selekciju ili skrining, gde pozitivni marker gen sadrži gen otporan na lek (uključujući ali nije ograničeno na, □-laktamaza gen, koji sadrže najmanje jedan od selektor kodona, kao što je najmanje jedan ćilibar stop kodon) ili gen primaran za organizam, ili gen koji dovodi do detoksikacije toksičnog agensa, zajedno sa O-RS, i pula (po izboru mutant) tRNK-a u mnoštvo ćelija iz drugog organizma; i, identifikovanje preživelih ili skrinovanih ćelija koje su rasle u prisustvu agensa za selekciju ili skrining, uključujući ali nije ograničeno na, antibiotik, time obezbeđujući pul ćelija koje imaju najmanje jednu rekombinantnu tRNK, pri čemu najmanje jedna rekombinantna tRNK se aminoaciluje pomoću O-RS i umeće aminokiselinu u translacioni proizvod kodiran pozitivnim marker genom, kao odgovor na najmanje jedan selektor kodon. U drugom tehničko rešenje, koncentracija agensa za selekciju i/ili skrining varira.
[0329] Metode za generisanje specifičnih O-tRNK/O-RS parova su obezbeđene. Metode uključuju: (a) generisanje biblioteke mutant tRNK-a izvedenih od najmanje jedne tRNK iz prviog organizma; (b) negativno selektovanje ili skrining biblioteke za (po izboru mutant) tRNK-e koje se aminoacilauju pomoću aminoacil-tRNK sintetaze (RS) iz drugog organizma u odsustvu RS iz prvog organizma, time obezbeđujući pul (po izboru mutant) tRNK-a; (c) selektovanje ili skrining pula (po izboru mutant) tRNK-a za članove koji se aminoaciluju pomoću uvedene ortogonalne RS (O-RS), time obezbeđujući najmanje jednu rekombinantnu O-tRNK. Najmanje jedna rekombinantna O-tRNK prepoznaje selektor kodon i nije efikasno prepoznata od strane RS iz drugog organizma i prvenstveno se aminoaciluje pomoću O-RS. Metoda takođe uključuje (d) generisanje biblioteke (po izboru mutant) RS izvedenih od najmanje jedne aminoacil-tRNK sintetaze (RS) iz trećeg organizma; (e) selektovanje ili skrining biblioteke mutant RS-a za članove koji prvenstveno aminoaciluju najmanje jednu rekombinantnu O-tRNK u prisustvu ne-prirodno kodirane aminokiseline i prirodne aminokiseline, time obezbeđujući pul aktivnih (po izboru mutant) RS; i, (f) negativno selektovanje ili skrining pula za aktivne (po izboru mutant) RS koje prvenstveno aminoaciluju najmanje jednu rekombinantnu O-tRNK u odsustvu ne-prirodno kodirane aminokiseline, time obezbeđujući najmanje jedan specifični O-tRNK/O-RS par, gde najmanje jedan specifični O-tRNK/O-RS par sadrži najmanje jednu rekombinantnu O-RS koja je specifična za ne-prirodno kodiranu aminokiselinu i najmanje jednu rekombinantnu O-tRNK. Specifični O-tRNK/O-RS parovi proizvedeni metodama su uključene. Na primer, specifični O-tRNK/O-RS par može da uključuje, uključujući ali nije ograničeno na, mutRNKTyr-mutTyrRS pai, kao što je mutRNKTyr-SS12TyrRS par, mutRNKLeu-mutLeuRS par, mutRNKThr-mutThrRS par, mutRNKGlu-mutGluRS par, ili slično. Dodatno, takve metode uključuju gde prvi i treći organizam su isti (uključujući ali nije ograničeno na, Methanococcus jannaschii).
[0330] Metode za selektovanje ortogonalnog tRNK-tRNK sintetaza para za primenu u in vivo translacionom sistemu drugog organizma su takođe uključene u predmetnom pronalasku. Metode uključuju: uvođenje marker gena, tRNK i aminoacil-tRNK sintetaze (RS) izolovane ili izvedene iz prvog organizma u prvi set ćelija iz drugog organizma; uvođenje marker gena i tRNK u duplikat seta ćelija iz drugog organizma; i, selektovanje preživelih ćelija u prvom setu koje nisu uspele da prežive u duplikatu seta ćelija ili skrining ćelija koje pokazuju specifičan skrining odgovor koje nisu uspele da daju takav odgovor u duplikatu seta ćelija, pri čemu prvi set i duplikat seta ćelija set se uzgajaju u prisustvu agensa za selekciju ili skrining, gde preživele ili skrinovane ćelije sadrže ortogonalni tRNK-tRNK sintetaza par za primenu u in vivo translacionom sistemu drugog organizma. U jednom tehničkom rešenju, upoređivanje i selektovanje ili skrining uključuje in vivo ispitivanje komplementacije. Koncentracija agensa za selekciju ili skrining može da varira.
[0331] Organizmi predmetnog pronalaska uključuju razne organizme i razne kombinacije. Na primer, prvi i drugi organizmi metoda predmetnog pronalaska mogu biti isti ili različiti. U jednom tehničkom rešenju, organizmi su po izboru prokariotski organizam, uključujući ali nije ograničeno na, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, ili slično. Alternativno, organizmi po izboru sadrže eukariotski organizam, uključujući ali nije ograničeno na, biljke (uključujući ali nije ograničeno na, složene biljke kao što su monokote, ili dikote), alge, protisti, gljive (uključujući ali nije ograničeno na, kvasac, itd), životinje (uključujući ali nije ograničeno na, sisare, insekte, artropode, itd.), ili slično. U drugom tehničkom rešenju, drugi organizam je prokariotski organizam, uključujući ali nije ograničeno na, Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, Halobacterium, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, T. thermophilus, ili slično. Alternativno, drugi organizam može biti eukariotski organizam, uključujući ali nije ograničeno na, kvasac, životinjsku ćeliju, biljnu ćeliju, gljivicu, ćeliju sisara, ili slično. U raznim tehničkim rešenjima prvi i drugi organizmi su različiti.
Mesto aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi u polipeptidima relaksina
[0332] Predmetni pronalazak razmatra inkorporaciju jedne ili više aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi u polipeptidima relaksina. Jedna ili više aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi može biti inkorporirana na određenoj poziciji koja ne remeti aktivnost polipeptida. Ovo se može postići izvođenjem "konzervativnih" supstitucija, uključujući ali nije ograničeno na, supstituciju hidrofobnih aminokiselina hidrofobnim aminokiselinama, glomaznih aminokiselina glomaznim aminokiselinama, hidrofilnih aminokiselina hidrofilnim aminokiselinama i/ili umetanjem aminokiseline koja se ne javljaju u prirodi na mestu koje nije potrebno za aktivnost.
[0333] Različiti biohemijski i strukturni pristupi mogu se koristiti da se odaberu željena mesta za supstituciju sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom unutar Insulin polipeptida. Lako je očigledno prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike da bilo koja pozicija lanca polipeptida je pogodna za selekciju da se inkrporira ne-prirodno kodirana aminokiselina, i selekcija može biti zasnovana na racionalnom dizajnu ili nasumičnoj selekciji za bilo koju ili bez određene željene svrhe. Selekcija željenih mesta može biti za proizvodnju molekula relaksina koji ima bilo koje željeno svojstvo ili aktivnost, uključujući ali nije ograničeno na, agoniste, super-agoniste, inverzne agoniste, antagoniste, modulatore za vezivanje receptora, modulatore aktivnosti receptora, formiranje dimera ili multimera, ne menjajući aktivnost ili svojstvo u poređenju sa izvornim molekulom, ili manipulisanje bilo kojeg fizičkog ili hemijskog svojstva polipeptida kao što je rastvorljivost, agregacija, ili stabilnost. Na primer, mesta u polipeptidu potrebna za biološku aktivnost polipeptida relaksina mogu se identifikovati primenom analiza tačkaste mutacije, skeniranja alanina, zasićene mutagenze i skrininga za biološku aktivnost, ili metode skeniranja homologa poznate u oblasti tehnike. Druge metode mogu se primeniti za identifikuju ostataka za modifikaciju polipeptida relaksina uključuju, ali nisu ograničeni na, profilisanje sekvence (Bowie i Eisenberg, Science 253(5016): 164-70, (1991)), selekcije biblioteke rotamera (Dahiyat i Mayo, Protein Sci 5(5): 895-903 (1996); Dahiyat i Mayo, Science 278(5335): 82-7 (1997); Desjarlais i Handel, Protein Science 4: 2006-2018 (1995); Harbury et al, PNAS SAD 92(18): 8408-8412 (1995); Kono et al., Proteins: Structure, Function and Gentics 19: 244-255 (1994); Hellinga i Richards, PNAS SAD 91: 5803-5807 (1994)); i potencijali ostatka para (Jones, Protein Science 3: 567-574, (1994)), i racionalni dizajn primenom Protein Design Automation® tehnologije. (Videti američke patente sa brojevima 6,188,965; 6,269,312; 6,403,312; WO98/47089). Ostaci koji su kritični za bioaktivnost relaksina, ostaci koji su uključeni u farmaceutsku stabilnost, epitopi antitela, ili ostaci koji vezuju receptore mogu biti mutirani. Američki patent br.5,580,723; 5,834,250; 6,013,478; 6,428,954; i 6,451,561 opisuju metode za sistematsku analizu strukture i funkcije polipeptida kao što je relaksin identifikovanjem aktivnih domena koji utiču na aktivnost polipeptida sa ciljanom supstancom. Ostaci drugi osim onih koji su identifikovani kao kritični za biološku aktivnost pomoću alanin ili homolog skenirajućih mutagenza mogu biti dobri kandidati za supstituciju sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom u zavisnosti od željene aktivnosti tražene za polipeptid. Alternativno, mesta koja su identifikovana kao kritična za biološku aktivnost mogu takođe biti dobri kandidati za supstituciju sa neprirodno kodiranom aminokiselinom, opet u zavisnosti od željene aktivnosti tražene za polipeptid. Druga alternativa bi bila da se jednostavno napravi niz supstitucija u svakom položaju na lancu polipeptida sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom i da se posmatra efekat na aktivnosti polipeptida. Prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike je jasno očigledno da je svako sredstvo, tehnika ili metoda za selektovanje položaja za supstituciju sa ne-prirodnom aminokiselinom u bilo kom polipeptido pogodna za upotrebu u predmetnom pronalasku.
[0334] Struktura i aktivnost mutanata polipeptida relaksin koji sadrže brisanje takođe se može ispitati da se odrede regioni proteina za koje je verovatno da tolerišu supstituciju sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom. Na sličan način, digestija proteazama i monoklonska antitela mogu se primeniti da se identifikuju regioni relaksina koji su odgovorni za vezivanje receptora relaksina. Jednom kada su ostaci za koje je verovatno da imaju netoleranciju na supstituciju sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom eliminisani, uticaj predloženih supstitucija na svakoj preostaloj poziciji može biti ispitan. Modeli mogu biti generisani iz trodimenzionalnih kristalnih struktura drugih članova porodice relaksina i receptora relaksina. Banka podataka o proteinima (PDB, dostupna na World Wide Web na rcsb.org) je centralizovana baza podataka koja sadrži podatke o trodimenzionalnoj strukturi velikih molekula proteina i nukleinskih kiselina. Modeli se mogu praviti istražujući sekundarnu i tercijarnu strukturu polipeptida, ako nisu dostupni podaci o trodimenzionalnoj strukturi. Prema tome, prosečni poznavaoci iz oblasti tehnike mogu lako identifikovati položaje aminokiselina koje mogu biti supstituisane sa ne-prirodno kodiranim aminokiselinama.
(nastavlja se)
(nastavlja se)
[0335] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptidi relaksina pronalaska sadrže jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina pozicioniranih u regionu proteina koji ne narušava strukturu polipeptida.
[0336] Primeri ostataka inkorporacije ne-prirodno kodirane aminokiseline mogu biti oni koji su izuzeti od potencijalnih regiona za vezivanje receptora, mogu biti potpuno ili delimično izloženi rastvaraču, imati minimalne ili nikakve interakcije vezivanja vodonika sa okolnim ostacima, mogu biti minimalno izloženi okolnim reaktivnim ostatacima, mogu biti na jednoj ili više izloženih strana, mogu biti mesto ili mesta koja su postavljena pored drugog relaksina, ili drugog molekula ili njegovog fragmenta, mogu biti u regionima koji su visoko fleksibilni, ili strukturno kruti, kao što je predviđeno trodimenzionalnom, sekundarnom, tercijarnom, ili kvarternarnom strukturom relaksina, vezani ili nisu vezani za svoj receptor, ili spojeni ili nisu spojeni za drugi biološki aktivni molekul, ili mogu da moduliraju konformaciju samog relaksina ili dimera ili multimera koji sadrži jedan ili više relaksina, menjajući fleksibilnost ili krutost kompletne strukture po želji.
[0337] Prosečan poznavalac iz oblasti tehnike prepoznaje da takve analize relaksina omogućavaju određivanje koji aminokiselinski ostataci su površinski izloženi u poređenju sa aminokiselinskim ostatacima koji su pokriveni u tercijernoj strukturi proteina. Prema tome, tehničko rešenje predmetnog pronalaska je supstitucija ne-prirodno kodirane aminokiseline aminokiselinom koja je površinski izložen ostatak.
[0338] Principijelno, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina može biti inkorporirana u jednoj ili više od sledećih pozicija u relaksinu: u A lancu pre pozicije 1 (na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (tj., na karboksil terminusu proteina), i bilo kojoj kombinaciji istih (SEQ ID NO: 1) ili u B lancu pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (SEQ ID NO: 2).
[0339] Ispitivanje kristalne strukture relaksina i njegove interakcije sa receptorom relaksina može da ukaže koji određeni aminokiselinski ostaci imaju bočne lance koji su potpuno ili delimično dostupni rastvaraču. Bočni lanac ne-prirodno kodirane aminokiseline na ovim položajima može se usmeravati od površine proteina i van u rastvarač.
[0340] U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana aminokiselina na jednoj ili više od ovih položaja je povezan sa polimerom rastvorljivim u vodi, uključujući ali nije ograničeno na, pozicije: u A lancu pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (tj., na karboksil terminusu proteina), i bilo kojoj kombinaciji istih (SEQ ID NO: 1) ili u B lancu pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 (SEQ ID NO: 2).
[0341] Širok opseg ne-prirodno kodiranih aminokiselina može biti supstituisan za, ili inkorporiran u, datu poziciju u polipeptidu relaksina. Generalno, određena ne-prirodno kodirana aminokiselina je odabrana za inkorporaciju zasnovanu na ispitivanju trodimenzionalne kristalne strukture polipeptida relaksina ili drugog člana familije relaksina ili analoga relaksina sa svojim receptorom, sklonosti za konzervativne supstitucije (tj., ne-prirodno kodirane aminokiseline zasnovane na arilu, kao što je p-acetilfenilalanin ili O-propargiltirozin zamenjen sa Phe, Tyr ili Trp), i specifične hemije konjugacije koja se želi uvesti u polipeptid relaksina (npr., uvođenje 4-azidofenilalanin ukoliko se želi da se ostvari Huisgen-ova [3+2] cikloadicija sa polimerom rastvorljivim u vodi koji ima formiranje alkin segmenta ili amid veze sa polimerom rastvorljivim u vodi koji ima aril estar koji, zauzvrat, inkorporira fosfin segment)
[0342] U jednom slučaju, metoda dalje uključuje inkorporaciju neprirodne aminokiseline u protein, pri čemu neprirodna aminokiselina sadrži prvu reaktivnu grupu; i dovođenje u kontakt proteina sa molekulom (uključujući ali nije ograničeno na, oznaku, boju, polimer, polimer rastvorljiv u vodi, derivat polietilen glikola, fotoumreživač, radionuklid, citotoksično jedinjenje, lek, oznaku afiniteta, oznaku fotoafiniteta, reaktivno jedinjenje, smolu, drugi protein ili polipeptid ili analog polipeptida, antitelo ili fragment antitela, metalni helator, kofaktor, masnu kiselinu, ugljovodonik, polinukleotid, DNK, RNK, antisens polinukleotid, saharid, dendrimer rastvorljiv u vodi, ciklodekstrin, inhibitornu ribonukleinsku kiselinu, biomaterijal, nanočesticu, spin oznaku, fluorofor, segment koji sadrži metal, radioaktivni segment, novu funkcionalnu grupu, grupu koja kovalentno ili nekovalentno međusobno reaguje sa drugim molekulom, fotoostljiv segment, segment sa mogućnošću aktinske radijacije, segment sa mogućnošću fotoizomerizacije, biotin, derivat biotina, analog biotina, segment koji sadrži težak atom, grupu koja se može hemijski ocepiti, grupu koja se može foto ocepiti, izduženi bočni lanac, ugljenik-povezan sa šećerom, redoks-aktivni agens, amino tiokiselina, toksični segment, izotopno obeležen segment, biofizičku probu, fosforescentnu grupu, hemiluminiscentnu grupu, elektron gustu grupu, magnetnu grupu, interkalirajuću grupu, hromofor, agens za prenos energije, biološki aktivni agens, detektibilnu oznaku, mali molekul, kvantnu tačku, nanotransmiter, radionukleotid, radiotransmiter, agens za hvatanje neutrona, ili bilo koja kombinacija iznad navedenih ili bilo koje drugo poželjno jedinjenje ili substanca) koji sadrži drugu reaktivnu grupu. Prvi reaktivna grupa reaguje sa drugom reaktivnom grupom da veže molekul za neprirodnu aminokiselinu preko [3+2] cikloadicije. U jednom slučaju, prva reaktivna grupa je alkinil ili azido segment a druga reaktivna grupa je azido ili alkinil segment. Na primer, prva reaktivna grupa je alkinil segment (uključujući ali nije ograničeno na, u neprirodnoj aminokiselini p-propargiloksifenilalanin) a druga reaktivna grupa je azido segment. U drugom primeru, prva reaktivna grupa je azido segment (uključujući ali nije ograničeno na, u neprirodnoj aminokiselini p-azido-L-fenilalanin) a druga reaktivna grupa je alkinil segment.
[0343] U nekim slučajevima, supstitucija(e) ne-prirodno kodirane aminokiseline će se kombinovati sa drugi dodavanjima, supstitucijama ili brisanjima u okviru polipeptida relaksina da se utiče na druge biološke osobine polipeptida relaksina. U nekim slučajevima, druga dodavanja, supstitucije ili brisanja mogu da povećaju stabilnost (uključujući ali nije ograničeno na, otpornost na proteolitičku degradaciju) polipeptida relaksina ili povišen afinitet polipeptida relaksina za njegov receptor. U nekim slučajevima, druga dodavanja, supstitucije ili brisanja mogu da povećaju farmaceutsku stabilnost polipeptida relaksina. U nekim slučajevima, druga dodavanja, supstitucije ili brisanja mogu poboljšati anti-virusnu aktivnost polipeptida relaksina. U nekim slučajevima, druga dodavanja, supstitucije ili brisanja mogu povećati rastvorljivost (uključujući ali nije ograničeno na, kada se eksprimiraju u E. coli ili drugim ćelijama domaćina) polipeptida relaksina. U nekim slučajevima dodavanja, supstitucije ili brisanja mogu poboljšati rastvorljivost polipeptida relaksina nakon eksprimiranja u E. coli ili drugim rekombinantnim ćelijama domaćina. U nekim slučajevima odabrana su mesta za supstituciju sa prirodno kodiranom ili neprirodnom aminokiselinom pored drugih mesta za inkorporaciju ne-prirodne aminokiseline koja rezultuje povećanom rastvorljivosti polipeptida nakon eksprimiranja u E. coli ili drugim rekombinantnim ćelijama domaćina. U nekim slučajevima, polipeptidi relaksina sadrže dodatno dodavanje, supstituciju ili brisanje koje modulira afinitet za receptor polipeptida relaksina, vezujuće proteine, ili povezani ligand, modulira signalnu transdukciju nakon vezivanja za receptor relaksina, modulira poluživot u cirkulaciji, modulira oslobađanje ili bioraspoloživost, olakšava prečišćavanje, ili poboljšava ili menja određeni put administracije. U nekim slučajevima, polipeptidi relaksina sadrže dodavanje, supstituciju ili brisanje koje povećava afinitet varijante relaksina za njegov receptor. Slično, polipeptidi relaksina mogu da sadrže sekvence hemijski ili enzimski cepane, sekvence cepane proteazom, reaktivne grupe, antitelo-vezujuće domene (uključujući ali nije ograničeno na, FLAG ili poli-His) ili druge sekvence zasnovane na afinitetu (uključujući, ali nije ograničeno na, FLAG, poli-His, GST, itd.) ili povezane molekule (uključujući, ali nije ograničeno na, biotin) koji poboljšavaju detekciju (uključujući, ali nije ograničeno na, GFP), prečišćavanje, transport kroz membrane tkiva ili ćelija membranes, oslobađanje proleka ili aktivaciju, redukciju veličine relaksina, ili druge osobine polipeptida.
[0344] U nekim slučajevima, supstitucija ne-prirodno kodirane aminokiseline generiše antagonist relaksina. U nekim slučajevima, ne-prirodno kodirana aminokiselina je supstituisana ili dodata u regionu vezanom za vezivanje receptora. U nekim slučajevima, antagonisti relaksina sadrže najmanje jednu supstituciju koja izaziva da relaksin deluje kao antagonist. U nekim slučajevima, antagonist relaksina sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu povezanu sa polimerom rastvorljivim u vodi koji je prisutan u regionu za vezivanje receptora molekula relaksina.
[0345] U nekim slučajevima, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više aminokiselina je supstituisano sa jednom ili više ne-prirodno-kodiranih aminokiselina. U nekim slučajevima, polipeptid relaksina dalje uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više supstitucija jedne ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina aminokiselinama koje se javljaju u prirodi. Na primer, u nekim slučajevima, jedan ili više ostataka u relaksinu je supstituisano sa jednom ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselia. U nekim slučajevima, jedan ili više ne-prirodno kodiranih ostataka su povezani sa jednim ili više linearnih ili razgranatih PEG-i niže molekulske mase, time poboljšavajući afinitet vezivanja i uporedivi poluživot u serumu u odnosu na vrste vezane za pojedinačan, PEG više molekulske mase.
[0346] U nekim slučajevima, do dva od sledećih ostataka relaksina su supstituisani sa jednom ili više ne-prirodno-kodiranih aminokiselina.
Eksprimiranje u ne-eukariotima i eukariotima
[0347] Da bi se dobio visok nivo eksprimiranja kloniranih polinukleotida relaksina, obično se subkloniraju polinukleotidi koji kodiraju polipeptid relaksina pronalaska u ekspresioni vektor koji sadrži jak promoter da usmeri transkripciju, transkripcioni/translacioni terminator, i ako za nukleinsku kiselinu koja kodiraja protein, mesto vezivanja ribozoma za translaciono uvođenje. Pogodni bakterijski promoteri su poznati prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike i opisani, npr., u Sambrook et al. i Ausubel et al.
[0348] Bakterijski ekspresioni sistemi za eksprimiranje polipeptida relaksina pronalaska su dostupni u, uključujući ali nije ograničeno na, E. coli, Bacillus sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, i Salmonella (Palva et al., Gen 22:229-235 (1983); Mosbach et al., Nature 302:543-545 (1983)). Kitovi za takve ekspresione sisteme su komercijalno dostupni. Eukariotski ekspresioni sistemi za ćelije sisara, kvasac, i ćelije insekata su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike i takođe su komercijalno dostupni. U slučaju gde su ortogonalne tRNK i aminoacil tRNK sintetaze (opisane iznad) korišćene da eksprimiraju polipeptide relaksina pronalaska, ćelije domaćina za eksprimiranje su odabrane zasnovano na njihovoj sposobnosti da koriste ortogonalne komponente. Primeri ćelija domaćina uključuju Gram-pozitivne bakterije (uključujući ali nije ograničeno na B. brevis, B. subtilis, ili Streptomyces) i Gram-negative bakterije (E. coli, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida), kao i kvasac i druge eukariotske ćelije. Ćelije koje sadrže O-tRNK/O-RS parove mogu se primeniti kao što je ovde opisano.
[0349] Ćelija eukariotskog domaćina ili ćelija neeukariotskog domaćina predmetnog pronalaska pruža mogućnost sintetaze proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline u velikim korisnim količinama. U jednom aspektu, kompozicija po izboru uključuje, uključujući ali nije ograničeno na, najmanje 10 mikrograma, najmanje 50 mikrograma, najmanje 75 mikrograma, najmanje 100 mikrograma, najmanje 200 mikrograma, najmanje 250 mikrograma, najmanje 500 mikrograma, najmanje 1 miligram, najmanje 10 miligrama, najmanje 100 miligrama, najmanje jedan gram, ili više proteina koji sadrži neprirodnu aminokiselinu, ili količinu koja može biti postignuta sa in vivo metodom proizvodnje proteina (detalji o proizvodnji rekombinantnog proteina i prečišćavanju ovde obezbeđeni). U sledećem aspektu, protein je po izboru prisutan u kompoziciji pri koncentracija od, uključujući ali nije ograničeno na, najmanje 10 mikrograma proteina po litru, najmanje 50 mikrograma proteina po litru, najmanje 75 mikrograma proteina po litru, najmanje 100 mikrograma proteina po litru, najmanje 200 mikrograma proteina po litru, najmanje 250 mikrograma proteina po litru, najmanje 500 mikrograma proteina po litru, najmanje 1 miligram proteina po litru, ili najmanje 10 miligrama proteina po litru ili više, u, uključujući ali nije ograničeno na, lizatu ćelije, puferu, farmaceutskom puferu, ili drugim tečnim suspenzijama (uključujući ali nije ograničeno na, u zapremini od, uključujući ali nije ograničeno na, bilo gde od oko 1 nl do oko 100 L ili više). Proizvodnja velikih količina (uključujući ali nije ograničeno na, veće od onih obično mogućih sa drugim metodama, uključujući ali nije ograničeno na, in vitro translacije) proteina u eukariotskoj ćeliji uključujući najmanje jednu neprirodnu aminokiselinu je karakteristika pronalaska.
[0350] Ćelija eukariotskog domaćina ili ćelija neeukariotskog domaćina predmetnog pronalaska pruža mogućnost biosinteze proteina koji sadrže neprirodne aminokiseline u velikim korisnim količinama. Na primer, proteini koji sadrže neprirodnu aminokiselinu mogu se proizvesti pri koncentraciji od, uključujući ali nije ograničeno na, najmanje 10 µg/litar, najmanje 50 µg/litar, najmanje 75 µg/litar, najmanje 100 µg/litar, najmanje 200 µg/litar, najmanje 250 µg/litar, ili najmanje 500 µg/litar, najmanje 1mg/litar, najmanje 2mg/litar, najmanje 3 mg/litar, najmanje 4 mg/litar, najmanje 5 mg/litar, najmanje 6 mg/litar, najmanje 7 mg/liter, najmanje 8 mg/litar, najmanje 9 mg/litar, najmanje 10 mg/litar, najmanje 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 mg/litar, 1 g/litar, 5 g/litar, 10 g/litar ili više proteina u ekstraktu ćelije, lizatu ćelije, medijumu kulture, puferu, i/ili slično.
[0351] Brojni vektori pogodni za eksprimiranje relaksina su komercijalno dostupni. Korisni ekspresioni vektori za eukariotske domaćine, uključuju ali nisu ograničeni na, vektore koji sadrže eksprimiranje kontrolnih sekvenci iz SV40, goveđeg papiloma virusa, adenovirusa i citomegalovirusa. Takvi vektori uključuju pCDNA3.1(+)\Hyg (Invitrogen, Carlsbad, Calif., SAD) i pCI-neo (Stratagen, La Jolla, Calif., SAD). Bakterijski plazmidi, kao što su plazmidi iz E. coli, uključujući pBR322, pET3a i pET12a, plazmidi sa širokim spektrom domaćina, kao što su RP4, fag DNK-a, npr., brojni derivati faga lambda, npr., NM989, i drugi DNK fagovi, kao što su M13 i vlaknasti fagovi jednolančane DNK mogu se koristiti.
2µ plazmid i njegovi derivati, POT1 vektor (američki patent br.4,931,373), pJS037 vektor (opisani u Okkels, Ann. New York Aced. Sci. 782, 202 207, 1996) i pPICZ A, B ili C (Invitrogen) mogu se koristiti sa ćelijama domaćina kvasca. Za ćelije insekta, vektori uključuju ali nisu ograničeni na, pVL941, pBG311 (Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Gens for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gen In Animal Cells", Cell, 45, str.685 98 (1986), pBluebac 4.5 i pMelbac (Invitrogen, Carlsbad, CA).
[0352] Nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid relaksina može ili ne mora takođe da uključuje sekvencu koja kodiraja signalni peptid. Signalni peptid je prisutan kada se polipeptid izlučuje iz ćelija u kojima se eksprimira. Takva signalni peptid može biti bilo koja sekvenca. Signalni peptid može biti prokariotski ili eukariotski. Coloma, M (1992) J. Imm. Metode 152:89104) opisuje signalni peptid za primenu u ćelijama sisara (murinski Ig kapa lakog lanca signalni peptid). Drugi signalni peptidi uključuju ali nisu ograničeni na, α-faktor signalni peptid iz S. cerevisiae (američki atent br. 4,870,008), signalni peptid pljuvačne amilaze miša (O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, str. 643-646), modifikovan karboksipeptidaza signalni peptid (L. A. Valls et al., Cell 48, 1987, str.887-897), BAR1 signalni peptid kvasca (WO 87/02670, koji je ovde inkorporiran referencom), i asparaginska proteaza 3 iz kvasca (YAP3 - yeast aspartic protease 3) signalni peptid (cf. M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, str.127-137).
[0353] Primeri pogodnih ćelija sisara domaćina su poznati prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike. Takve ćelije domaćina mogu biti ćelije iz jajnika kineskog hrčka (CHO -Chinese hamster ovary), (npr. CHO-K1; ATCC CCL-61), ćelije zelenog majmuna (COS) (npr. COS 1 (ATCC CRL-1650), COS 7 (ATCC CRL-1651)); mišje ćelije (npr. NS/O), ćelijske linije bubrega mladog hrčka (BHK - Baby Hamster Kidney) (npr. ATCC CRL-1632 ili ATCC CCL-10), i humane ćelije (npr. HEK 293 (ATCC CRL-1573)), kao i biljne ćelije u kulturi tkiva. Ove ćelijske linije i druge su dostupne iz javnih depozitorija kao što je Američka kolekcija kultura sojeva (American Type Culture Collection), Rockville, Md. Da bi se obezbedila poboljšana glikozilacija polipeptida relaksina, ćelija sisara domaćina može se modifikovati da eksprimira sialiltransferazu, npr.1,6-sialiltransferazu, npr. kao što je opisano u američkom patentu br.5,047,335.
[0354] Metode za uvođenje egzogene DNK u ćelije sisara domaćina uključuju ali nisu ograničeni na, kalcijum fosfar-posredovanu transfekciju, elektroporaciju, DEAE-dekstran posredovanu transfekciju, lipozom-posredovanu transfekciju, virusne vektore i metode transfekcije opisane od Life Technologies Ltd, Pejsli, UK primenom Lipofectamin 2000 i Roche Diagnostics Corporation, Indijanapolis, SAD korišćenjem FuGEN 6. Ove metode su dobro poznate u oblasti tehnike i opisane su od Ausbel et al. (eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Njujork, SAD. Kultivisanje ćelija sisara može se izvesti u skladu sa ustanovljenim metodama, npr. kao što je stavljeno na uvid javnosti u (Animal Cell Biotechnology, Metode and Protocols, izdato od Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc. Totova, N.J., SAD i Harrison Mass. i Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997).
Ekspresioni sistemi, kultura, i izolovanje
[0355] Polipeptidi relaksina mogu biti eksprimirani u bilo kojem broju pogodnih ekspresionih sistema uključujući, na primer, kvasac, ćelije insekta, ćelije sisara, i bakterije. Opis ekspresionih sistema koji su dati kao primer je obezbeđen ispod.
[0356] Kvasac Kao što je korišćeno ovde, termin "kvasac" uključuje bilo koji od raznih kvasaca sposobnih da eksprimiraju gen koji kodira polipeptid relaksina. Takvi kvasaci uključuje, ali nisu ograničeni na, askosporogene kvasace (Endomycetales), bazidiosporogene kvasace i kvasace koji pripadaju Fungi imperfecti (Blastomycetes) grupi. Askosporogeni kvasaci su podeljeni u dve familije, Spermophthoraceae iSaccharomycetaceae. Potonja se sastoji od četiri podfamilije, Schizosaccharomycoideae (npr., rod Schizosaccharomyces), Nadsonioideae, Lipomycoideae i Saccharomycoideae (npr., rodovi Pichia, Kluyveromyces i Saccharomyces). Bazidiosporogeni kvasaci uključuju rodove Leucosporidium, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, i Filobasidiella. Kvasaci koji pripadaju Fungi Imperfecti (Blastomycetes) grupi su podeljeni u dve familije, Sporobolomycetaceae (npr., rodovi Sporobolomyces i Bullera) i Cryptococcaceae (npr., rod Candida).
[0357] Od posebnog interesa za primenu sa predmetnim pronalaskom su vrste u okviru rodova Pichia, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Hansenula, Torulopsis, i Candida, uključujući, ali nije ograničeno na, P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S, norbensis, S. ovioblikis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa, i H. polimorpha.
[0358] Odabir pogodnog kvasca za eksprimiranje polipeptida relaksina je u domenu prosečnog poznavaoca iz oblasti tehnike. Pri odabiru kvasca domaćina za eksprimiranje, pogodni domaćini mogu da uključuju one koji su pokazali da imaju, na primer, dobar kapacitet sekrecije, nisku proteolitičku aktivnost, dobar kapacitet sekrecije, dobru proizvodnju rastvorljivih proteina, i ukupnu robusnost. Kvasac su obično dostupni iz raznih izvora uključujući, ali nije ograničeno na, Centar genetičkih zaliha kvasaca (Yeast Gentic Stock Center), Odeljenje za biofiziku i medicinsku fiziku, Univerzitet Kalifornije (Berkli, CA), i Američku kolekciju kultura sojeva ("ATCC") (Manasas, VA).
[0359] Termin "kvasac domaćin" ili "ćelija kvasca domaćina" uključuje kvasac koji može da bude, ili je bio, korišćen kao recipijent za rekombinantne vektore ili drugu transportnu DNK. Termin uključuje potomstvo originalne ćelije kvasca domaćina koja je primila rekombinantne vektore ili drugu transportnu DNK. Razume se da potomstvo pojedinačne roditeljske ćelije ne mora nužno biti u potpunosti identično u morfologiji ili u genomskom ili ukupnom DNK komplementu sa originalnim roditeljem, usled slučajne ili namerne mutacije. Potomstvo roditeljske ćelije koje je dovoljno slično roditeljskoj da se karakterišu relevantnim svojstvom, kao što je prisustvo nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid relaksina, je uključeno u potomstvo namenjeno ovom definicijom.
[0360] Ekspresioni i transformacioni vektori, uključujući ekstrahromozomalne replikone ili integrišući vektori, su razvijeno za transformacije u mnoge kvasace domaćine. Na primer, ekspresioni vektori su razvijeni za S. cerevisiae (Sikorski et al., GENTICS (1989) 122:19; Ito et al., J. BACTERIOL. (1983) 153:163; Hinnen et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929); C. albicans (Kurtz et al., MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142); C. maltosa (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); H. polimorpha (Gleeson et al., J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459; Roggenkamp et al., MOL. GENTICS AND GENOMICS (1986) 202:302); K. fragilis (Das et al., J. BACTERIOL. (1984) 158:1165); K. lactis (De Louvencourt et al., J. BACTERIOL. (1983) 154:737; Van den Berg et al., BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135); P. guillerimondii (Kunze et al., J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141); P. pastoris (Američki patenti sa brojevima 5,324,639; 4,929,555; i 4,837,148; Cregg et al., MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376); Schizosaccharomyces pombe (Bsvaki et al., NATURE (1982) 300:706); i Y. lipolitica; A. nidulans (Ballance et al., BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89; Tilburn et al., GEN (1983) 26:205-221; i Yelton et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74); A. niger (Kelly i Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479); T. reesia (EP 0 244 234); i vlaknaste gljive kao što su, npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357).
[0361] Kontrolne sekvence za vektore kvasca su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike i uključuju, ali nisu ograničene na, promoter regione iz gena kao što su alkohol dehidrogenaza (ADH) (EP 0 284 044); enolaza; glukokinaza; glukoza-6-fosfat izomeraza; gliceraldehid-3-fosfat-defidrogenaza (GAP ili GAPDH); heksokinaza; fosfofruktokinaza; 3-fosfoglicerat mutaza; i piruvat kinaza (PyK) (EP 0329 203). PHO5 gen kvasca, koji kodira acidnu fosfatazu, takođe može da obezbedi korisne promoter sekvence (Miyanohara et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. SAD (1983) 80:1). Druge pogodne promoter sekvence za primenu sa kvasac domaćinima mogu da uključuju promotere za 3-fosfoglicerat kinazu (Hitzeman et al., J. BIOL. CHEM. (1980) 255:12073); i druge glikolitičke enzime, kao što je piruvat dekarboksilaza, triosefosfat izomeraza, i fosfoglukoza izomeraza (Holland et al., BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900; Hess et al., J. ADV. ENZIMA REG. (1969) 7:149). Inducibilni promoteri kvasca koji imaju dodatnu prednost transkripcija kontrolisanih uslovima rasta mogu da uključuju promoter regione za alkohol dehidrogenazu 2; izocitohrom C; acidnu fosfatazu; metalotionein; gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu; degradativne enzime povezane sa metabolizmom azota; i enzime odgovorne za korišćenje maltoze i galaktoze. Pogodni vektori i promoteri za primenu u eksprimiranju kvasca su dalje opisani u EP 0073 657.
[0362] Pojačivači kvasca takođe mogu biti korišćeni sa promoterima kvasca. Pored toga, sintetski promoteri mogu takođe funkcionisati kao promoteri kvasca. Na primer, uzvodne aktivirajuće sekvence (UAS) promotera kvasca mogu se pridružiti regionu za aktivaciju transkripcije drugog promotora kvasca, stvarajući sintetički hibridni promotor. Primeri takvih hidridnih promotera uključuju ADH regulatornu sekvencu povezan GAP regionom za aktivaciju transkripcije. Videti američke patente sa brojevima 4,880,734 i 4,876,197. Drugi primeri hibridnih promotera uključuju promotere koji se sastoje od regulatornih sekvenci ADH2, GAL4, GAL10, ili PHO5 gena, kombinovanih sa regionom za aktivaciju transkripcije glikolitičkog enzim gena kao što je GAP ili PyK. Videti EP 0164 556. Osim toga, kvasac promoter može uključiti promotere koji se javljaju u prirodi ne-kvasnog porekla koji imaju sposobnost da vežu RNK polimerazu kvasca i započnu transkripciju.
[0363] Drugi kontrolni elementi koji mogu da sadrže delove ekspresionih vektora kvasca uključuju terminatore, na primer, iz GAPDH ili enolaza gena (Holland et al., J. BIOL. CHEM. (1981) 256:1385). Pored toga, poreklo replikacije iz porekla 2µ plazmida je pogodno za kvasac. Odgovarajući selekcioni gen za primenu u kvascu je trp1 gen prisutan u plasmidu kvasca. Videti Tschumper et al., GEN (1980) 10:157; Kingsman et al., GEN (1979) 7:141. trp1 gen obezbeđuje selekcioni marker za mutantni soj kvasca kojem nedostaje sposobnost da raste u triptofanu. Slično, sojevi kvasca deficijentni u Leu2 (ATCC 20,622 ili 38,626) nadopunjuju se poznatim plazmidima koji nose Leu2 gen.
[0364] Metode uvođenje egzogene DNK u kvasac domaćine su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike, i tipično uključuji, ali nisu ograničene na, bilo transformaciju sferoplasta ili netaknutih ćelije kvasca domaćina tretiranih sa alkalim katjonima. Na primer, transformacija kvasca može se izvesti metodi opisanoj u Hsiao et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. SAD (1979) 76:3829 i Van Solingen et al., J. BACT. (1977) 130:946. Međutim, druge metode za uvođenje DNK u ćelije kao što je pomoću nuklearne injekcije, elektroporacije, ili fuzije protoplasta mogu se takođe primeniti kao što je generalno opisano u SAMBROOK ET AL., MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001). Ćelije kvasca domaćina mogu se zatim kultivisati primenom standardne tehnike poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike.
[0365] Druge metode za eksprimiranje heterolognih proteina u ćelijama kvasca domaćina su poznate prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike. Videti obično objavu američke prijave patenta br. 20020055169, američke patente sa brojevima 6,361,969; 6,312,923; 6,183,985; 6,083,723; 6,017,731; 5,674,706; 5,629,203; 5,602,034; i 5,089,398; američke ponovo ispitane patente sa brojevima RE37,343 i RE35,749; PCT objavljene prijave patenata WO 99/07862; WO 98/37208; i WO 98/26080; evropske prijave patenata EP 0 946 736; EP 0732 403; EP 0 480 480; WO 90/10277; EP 0340 986; EP 0329 203; EP 0 324 274; i EP 0 164 556. Videti takođe Gellissen et al., ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(1-2):79-93; Romanos et al., KVASAC (1992) 8(6):423-488; Goeddel, METODE IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7.
[0366] Sojevi kvasca domaćina mogu se uzgajati u fermentorima tokom faze amplifikacije korišćenjem standardnih dolivnih (feed batch) metoda fermentacije poznate prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike. Metode fermentacije mogu biti prilagođene tako da uvažavaju razlike u putu korišćenja ugljenika određenog kvasca domaćina ili načinu kontrole eksprimiranja. Na primer, fermentacija Saccharomyces kvasca domaćina može zahtevati jedno glukozno napajanje, kompleksni izvor azota (npr., kazein hidrolizate), i višestruku vitaminsku suplementaciju. Suprotno, metilotrofni kvasac P. pastoris može zahtevati glicerol, metanol, i mineralnu hranu u tragovima, ali samo jednostavne amonijum (azotne) soli za optimalan rast i ekspresiju. Videti, npr., američki patent br. 5,324,639; Elliott et al., J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95; i Fieschko et al., BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113.
[0367] Takve metode fermentacije, međutim, mogu imati određene zajedničke karakteristike nezavisno od korišćenog soja kvasca. Na primer, hranjiva materija koja ograničava rast, obično ugljenik, može se dodati fermentoru tokom faze amplifikacije kako bi se omogućio maksimalan rast. Pored toga, metode fermentacije obično koriste medijume za fermentaciju dizajniran da sadrži adekvatne količine ugljenika, azota, osnovnih soli, fosfora i drugih neznatnih hranljivih materija (vitamini, tragovi minerali i soli itd.). Primeri medijuma za fermentaciju pogodnih za primenu sa Pichia su opisani u američkim patentima sa brojevima 5,324,639 i 5,231,178.
[0368] Ćelije insekta inficirane bakulovirusom T Termin "insekt domaćin" ili "ćelija insekta domaćina" se odnosi na insekt koji može biti, ili je bio, primenjen kao recipijent za rekombinantne vektore ili drugu transportnu DNK. Termin uključuje potomstvo originalne ćelije insekta domaćina koje su transfektovane. Razume se da potomstvo jedne roditeljske ćelije ne mora nužno biti potpuno identično u morfologiji ili u genomskom ili ukupnom DNK komplementu sa originalnim roditeljem, usled slučajne ili namerne mutacije. Potomstvo roditeljske ćelije koje je dovoljno slično roditeljskoj da se karakterišu relevantnim svojstvom, kao što je prisustvo nukleotidne sekvence koja kodira relaksin polipeptid, je uključeno u potomstvo namenjeno ovom definicijom. Eksprimiranje polipeptida relaksina bakulovirusom je korisno u ovom pronalasku i primena rDNK tehnologije, polipeptida ili njihovih prekursora, jer se relaksin može biosintetizovati u bilo kojem broju ćelija domaćina, uključujući bakterije, ćelije sisara, ćelije insekta, kvasac ili gljive. Tehničko rešenje predmetnog pronalaska uključuje biosintezu relaksina, modifikovanog relaksina, polipeptida relaksina, ili analoga relaksina u bakterijama, kvascu ili ćelijama sisara. Sledeće tehničko rešenje predmetnog pronalaska uključuje biosintezu izvršenu u E. coli ili kvascu. Primeri biosinteze u ćelijama sisara i transgenim životinjama su opisani u Hakola, K. [Molecular and Cellular Endocrinology, 127:59-69, (1997)].
[0369] Izbor pogodnih ćelija insekata za eksprimiranje polipeptida relaksina je poznato prosečnim poznavaocima iz oblasti tehnike. Nekoliko vrsta insekata dobro je opisano u oblasti tehnike i komercijalno je dostupno uključujući Aedes aegypti, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda, i Trichoplusia ni. U odabranim insekt domaćinima za eksprimiranje, pogodni domaćini mogu uključivati one za koje se pokazuje, između ostalog, da imaju dobru sposobnost sekrecije, nisku proteolitičku aktivnost i opštu robusnost. Insekti su obično dostupni iz raznih izvora uključujući, ali nije ograničeno na, Centar genetičkih zaliha insekata (Insect Genetic Stock Center), Odeljenje za biofiziku i medicinsku fiziku, Univerzitet Kalifornije (Berkli, CA); i Američku kolekciju kultura sojeva ("ATCC") (Manasas, VA).
[0370] Obično, komponente ekspresionog sistema insekata inficiranih bakulovirusom uključuju vektor prenosa, obično bakterijski plazmid, koji sadrži i fragment genoma bakulovirusa, i pogodno mesto restrikcije za umetanje heterolognog gena koji treba eksprimirati; divlji tip bakulovirusa sa sekvencama homolognim fragmentom specifičnim za bakulovirus u vektoru prenosa (ovo omogućava homolognu rekombinaciju heterolognog gena u genomu bakulovirusa); i odgovarajuće ćelije insekta domaćina i sredstva za rast. Materijali, postupci i tehnike koji se koriste u konstrukciji vektora, transfektovanju ćelija, skupljanju plakova, rastućim ćelijama u kulturi i slično su poznati u oblasti tehnike a priručnici koji opisuju ove tehnike su dostupni.
[0371] Nakon umetanja heterolognog gena u vektor prenosa, vektor i virusni genom divljeg tipa su transfektovani u ćeliju insekta domaćina pri čemu vektor i virusni genom rekombinuju. Upakovani rekombinantni virus se eksprimira i rekombinantni plakovi se identifikuju i prečišćavaju. Materijali i metode za ekspresione sisteme baculovirus/insekt ćelija su komercijalno dostupni u obliku kita od, na primer, Invitrogen Corp. (Karlsbad, CA). Ove tehnike su obično poznete prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike i potpuno opisani u SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN br. 1555 (1987). Videti takođe, RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995); AUSUBEL ET AL., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994); KING AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992); i O'REILLY ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).
[0372] Zaista, proizvodnja različitih heterolognih proteina korišćenjem ekspresionih sistema ćelija insekata i bakulovirusa je poznata prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Videti, npr., američki patenti sa brojevima 6,368,825; 6,342,216; 6,338,846; 6,261,805; 6,245,528, 6,225,060; 6,183,987; 6,168,932; 6,126,944; 6,096,304; 6,013,433; 5,965,393; 5,939,285; 5,891,676; 5,871,986; 5,861,279; 5,858,368; 5,843,733; 5,762,939; 5,753,220; 5,605,827; 5,583,023; 5,571,709; 5,516,657; 5,290,686; WO 02/06305; WO 01/90390; WO 01/27301; WO 01/05956; WO 00/55345; WO 00/20032; WO 99/51721; WO 99/45130; WO 99/31257; WO 99/10515; WO 99/09193; WO 97/26332; WO 96/29400; WO 96/25496; WO 96/06161; WO 95/20672; WO 93/03173; WO 92/16619; WO 92/02628; WO 92/01801; WO 90/14428; WO 90/10078; WO 90/02566; WO 90/02186; WO 90/01556; WO 89/01038; WO 89/01037; WO 88/07082.
[0373] Vektori koji su korisni u ekspresionim sistemima bakulovirus/insekt ćelija su poznati u oblasti tehnike i uključuju, na primer, ekspresione i vektore prenosa insekta izvedene iz bakulovirusa Autografikacalifornica nuclear polihedrosis virus (AcNPV), koji je nezavisan od pomagača, virusni ekspresioni vektor. Virusni ekspresioni vektori izvedeni iz ovog sistema obično primenjuju jak virusni polihedrin gen promoter da vodi eksprimiranje heterolognih gena. Videti obično, O'Reilly ET AL., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992).
[0374] Pre umetanja stranih gena u genom bakulovirusa, gore opisane komponente, koje sadrže promoter, vodeću (ako je poželjna), kodirajuću sekvencu od interesa, i transkripcionu terminacionu sekvencu, se obično sastavljaju u intermedijarnom konstruktu premeštanja (vektor prenosa). Intermedijerni konstrukti premeštanja se često održavaju u replikonu, kao što je ekstra hromozomalni element (npr., plazmidi) sposoban za stabilno održavanje u domaćinu, kao što je bakterija. Replikon će imati replikacioni sistem, omogućavajući mu održavanje u pogodnom domaćinu za kloniranje i amplifikaciju. Tačnije, plazmid može da sadrži signal poliadenilacije poliedrina (Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42: 177) i prokariotski ampicilin-rezistentan (amp)gen i poreklo replikacije za selekciju i razmnožavanje u E. coli.
[0375] Jedan uobičajeno primenjen vektor prenosa za uvođenje stranih gena u AcNPV je pAc373. Mnogi drugi vektori, poznati prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike, su takođe naznačeni uključujući, na primer, pVL985, koji menja start kodon polihedrina iz ATG u ATT, i koji uvodi BamHI mesto kloniranja 32 bazna para nizvodno od ATT. Videti Luckow i Summers, VIROLOGY 170:31 (1989). Drugi komercijalno dostupni vektori uključuju, na primer, PBlueBac4.5/V5-His; pBlueBacHis2; pMelBac; pBlueBac4.5 (Invitrogen Corp., Karlsbad, CA).
[0376] Nakon umetanja heterolognog gena, vektor prenosa i bakuloviralni genom divljeg tipa se ko-transfektuju u ćelije insekta domaćina. Metode za uvođenje heterologne DNK na željeno mesto u baculovirus virusu su poznate u oblasti tehnike. Videti SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN br. 1555 (1987); Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156; Luckow i Summers, VIROLOGY (1989) 170:31. Na primer, umetanje može biti u genu kao što je gen polihedrina, homolognom dvostrukom unakrsnom rekombinacijom; umetanje takođe može biti u mestu restrikcije enzima proizvedenog inženjeringom u željenom bakulovirusnom genu. Videti Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4):91.
[0377] Transfekcija može biti postignuto elektroporacijom. Videti TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Mann i King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501. Alternativno, lipozomi se mogu koristiti da transfektuju ćelije insekta sa rekombinantnim ekspresionim vektorom i baculovirusom. Videti, npr., Liebman et al., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36; Graves et al., BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050; Nomura et al., J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22):13570; Schmidt et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323; Siffert et al., NATURE GENTICS (1998) 18:45; TILKINS ET AL., CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998); Cai et al., PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263; Dolphin et al., NATURE GENTICS (1997) 17:491; Kost et al., GEN (1997) 190:139; Jakobsson et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271:22203; Rowles et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37):22376; Reverey et al., J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39):23607-10; Stanley et al., J. BIOL. CHEM. (1995) 270:4121; Sisk et al., J. VIROL. (1994) 68(2):766; i Peng et al., BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274. Komercijalno dostupni lipozomi uključuji, na primer, CELLfectin® i Lipofectin® (Invitrogen, Corp., Karlsbad, CA). Pored toga, transfekcija kalcijum fosfatom može se primeniti. Videti TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995); Kitts, NAR (1990) 18(19):5667; i Mann i King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501.
[0378] Bakulovirusni ekspresioni vektori obično sadrže bakulovirusni promoter. Bakulovirusni promoter je bilo koja DNK sekvenca sposobna da vezuje bakulovirusnu RNK polimerazu i inicira nizvodnu (3') transkripciju kodirajuće sekvence (npr., strukturni gen) u mRNK. Promoter će imati region iniciranja transkripcije koji je obično smešten proksimalno do 5' kraja kodirajuće sekvence. Ovaj region iniciranja transkripcije obično uključuje mesto vezivanja RNK polimeraze i mesto iniciranja transkripcije. Bakulovirusni promoter može takođe da ima drugi domen nazvan pojačivač, koji, ako je prisutan, je obično distalno od strukturnog gena. Štaviše, eksprimiranje može biti ili regulisano ili konstituitivno.
[0379] Strukturni geni, obilno transkribovani pri kasnim vremenima u ciklusu infekcije, obezbeđuju naročito korisne promoter sekvence. Primeri uključuju sekvence izvedene iz gena koji kodira virusni polihedron protein (FRIESEN ET AL., The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986); EP 0127839 i 0155476) i gen koji kodira p10 protein (Vlak et al., J. GEN. VIROL. (1988) 69:765).
[0380] Novoformirani bakulovirusni ekspresioni vektor je upakovan u infektivni rekombinantni bakulovirus i naknadno uzgojeni plakovi mogu se prečistiti tehnikama poznatim prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Videti Miller et al., BIOESSAYS (1989) 11(4):91; SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN BR.1555 (1987).
[0381] Rekombinantni bakulovirusni ekspresioni vektori su razvijeni za infekciju u nekoliko ćelija insekata. Na primer, rekombinantni bakulovirusi su razvijeni za, između ostalog, Aedes aegypti (ATCC br. CCL-125), Bombyx mori (ATCC br. CRL-8910), Drosophila melanogaster (ATCC br. 1963), Spodoptera frugiperda, i Trichoplusia ni. Videti Wright, NATURE (1986) 321:718; Carbonell et al., J. VIROL. (1985) 56:153; Smith et al., MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156. Videti uopšteno, Fraser et al., IN VITRO CELL. DEV. BIOL. (1989) 25:225. Konkretnije, ćelijske linije primenjenje za bakulovirusne ekspresione vektor sisteme obično uključuju, ali nisu ograničene na, Sf9 (Spodoptera frugiperda) (ATCC br. CRL-1711), Sf21 (Spodoptera frugiperda) (Invitrogen Corp., kat. br. 11497-013 (Karlsbad, CA)), Tri-368 (Trichopulsia ni), i High-Five™ BTI-TN-5B1-4 (Trichopulsia ni).
[0382] Ćelije i medijum kulture su komercijalno dostupni i za direktnu i fuziono eksprimiranje heterolognih polipeptida u bakulovirus/eksprimiranju, a tehnologija ćelijske kulture je obično poznata prosečnom poznavaocu u oblasti tehnike.
[0383] E. Coli, Pseudomonas vrste, i drugi prokarioti Tehnike eksprimiranja bakterije su poznate prosečnom poznavaocu u oblasti tehnike. Veliki izbor vektora je dostupan za primenu u bakterijskim domaćinima. Vektori mogu biti pojedinačna kopija ili niži ili viši multikopijski vektori. Vektori mogu služiti za kloniranje i/ili eksprimiranje. S obzirom na obilnu literaturu koja se tiče vektora, komercijalna dostupnost mnogih vektora, i čak i priručnike koji opisuju vektore i njihove resrikcione mape i karakteristike, ovde nije potrebna opsežna diskusija. Kao što je dobro poznato, vektori normalno uključuju markere koji dozvoljavaju selekciju, koji markers mogu obezbediti rezistenciju citotoksičnog agensa, prototrofiju ili imunitet. Često, prisutno je više markera, koji omogućavaju različite karakteristike.
[0384] Bakterijski promotor je svaka DNK sekvenca koja može da vezuje bakterijsku RNK polimerazu i pokreće nizvodnu (3 ') transkripciju kodirajuće sekvence (npr. strukturni gen) u mRNK. Promoter će imati region iniciranja transkripcije koji je obično smešten proksimalno do 5' kraja kodirajuće sekvenc. Ovaj region iniciranja transkripcije tipično uključuje mesto vezivanja RNK polimeraze i mesto iniciranja transkripcije. Bakterijski promoter može takođe da ima drugi domen nazvan operator, koja se može preklapati sa susednim mestom vezivanja RNA polimeraze na kome započinje sinteza. Operator dozvljava negativno regulisanu (inducibilnu) transkripciju, jer gen represor protein može da veže operator i na taj način inhibira transkripciju određenog gena. Konstitutivno eksprimiranje se može desiti u odsustvu negativnih regulatornih elemenata, kao što je operator. Pored toga, pozitivna regulacija može se postići vezujućom sekvencom gen aktivator proteina, koja, ako prisutna je proksimalno (5') u odnosu na vezujuću sekvencu RNK polimeraze. Primer gen aktivator proteina je katabolit aktivator protein (CAP), koji pomaže iniciranje transkripcije lac operona u Escherichia coli (E. coli) [Raibaud et al., ANNU. REV. GENT. (1984) 18:173]. Regulisano eksprimiranje može prema tome biti pozitivno ili negativno, time ili povećavajući ili redukujući transkripciju.
[0385] Sekvence koje kodiraju metabolički put enzima obezbeđuju naročito korisne promoter sekvence. Primeri uključuje promoter sekvence izvedene od enzima koji metabolizuju šećer, kao što je galaktoza, lakoza (lac) [Chang et al., NATURE (1977) 198:1056], i maltoza. Dodatni primeri uključuje promoter sekvence izvedene od biosintetskih enzima kao što su triptofan (trp) [Goeddel et al., NUC. ACIDS RES. (1980) 8:4057; Yelverton et al., NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731; američki patent br.4,738,921; EP brojevi objave 036776 i 121 775]. β-galaktozidaza (bla) promoter sistem [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes". U Interferon 3 (izd. I. Gresser)], bakteriofag lambda PL [Shimatake et al., NATURE (1981) 292:128] i T5 [američki patent br. 4,689,406] promoter sistemi takođe obezbeđuju korisne promoter sekvence. Poželjne metode predmetnog pronalaska koriste jake promotere, kao što je T7 promoter da indukuju polipeptide relaksina na visokim nivoima. Primeri takvih vektora su poznati prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike i uključuju pET29 serije od Novagen-a, i pPOP vektore opisane u WO99/05297. Takvi ekspresioni sistemi proizvode visoke nivoe polipeptida relaksina u domaćinu bez ugrožavanja održivosti ćelija domaćina ili parametara rasta. pET19 (Novagen) je sledeći vektor poznat u oblasti tehnike.
[0386] Pored toga, sintetski promotere koji se ne pojavljuju u prirodi takođe funkcionišu kao bakterijski promoteri. Na primer, sekvence aktivacije transkripcije jednog bakterijskog ili bakteriofagnog promotera mogu se pridružiti sekvencama operona drugog bakterijskog ili bakteriofagnog promotera, stvarajući sintetički hibridni promoter [američki patent br.
4,551,433]. Na primer, tac promoter je hibridni trp-lac promoter sastavljen od i trp promotera i sekvenci lac operona koji je regulisan lac represorom [Amann et al., GEN (1983) 25:167; de Boer et al., PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21]. Nadalje, bakterijski promotor može uključivati promotere koji se javljaju u prirodi
ne-bakterijskog porekla koji ima sposobnost da veže bakterijsku RNK polimerazu i inicira transkripciju. Promoter koji se javlja u prirodi ne-bakterijskog porekla može takođe biti spojen sa kompatibilnom RNK polimerazom da proizvede visoke nivoe eksprimiranja nekih gena u prokariotima. Bakteriofag T7 RNA polimeraza/promoter sistem je primer spojenog promoter sistema [Studier et al., J. MOL. BIOL. (1986) 189:113; Tabor et al., Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074]. Pored toga, hibridni promoter može takođe biti sastavljen od bakteriofagnog promotera i operator regiona E. coli (EP objava br.267 851).
[0387] Pored funkcionalne promoter sekvence, efikasno mesto vezivanja ribozoma je takođe korisno za eksprimiranje stranih gena u prokariotima. U E. coli, mesto vezivanja ribozoma se naziva Šajn-Dalgarno (SD) sekvenca i uključuje inicijacioni kodon (ATG) i sekvencu 3-9 nukleotida u dužina koja se nalazi 3-11 nukleotida uzvodno od inicijacioni kodona [Shine et al., NATURE (1975) 254:34]. Smatra se da SD sekvenca promoviše vezivanje mRNK za ribozom uparivanjem baza između SD sekvence i 3' i od E. coli 16S rRNK [Steitz et al. "Gentic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979)]. Eksprimirati eukariotske gene i prokariotske gene sa slabim mestom vezivanja ribozoma [Sambrook et al. "Expression of cloned genes in Escherichia coli", Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989].
[0388] Termin "bakterijski domaćin" ili " ćelija bakterijskog domaćina" se odnosi na bakteriju koja može biti, ili je bila, korišćena kao recipijent za rekombinantne vektore ili drugu transportnu DNK. Termin uključuje potomstvo originalne ćelije bakterijskog domaćina koja je transfektovana. Razume se da potomstvo pojedinačne roditeljske ćelije ne mora nužno da bude potpuno identičano u morfologiji ili genomskom ili ukupnom DNK komplementu originalnog roditelja, usled slučajne ili namerne mutacije. Potomstvo roditeljske ćelije koje je dovoljno slično roditeljskoj da se karakteriše relevantnim svojstvom, kao što je prisustvo nukleotidne sekvence koja kodira polipeptid relaksina, je uključeno u potomstvo namenjeno ovom definicijom.
[0389] Odabir pogodne bakterije domaćina za eksprimiranje polipeptida relaksina je poznato prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. U odabiru bakterijskih domaćina za eksprimiranje, pogodni domaćini mogu da uključuju one koji su pokazali da imaju, između ostalog, dobar kapacitet za formiranje inkluzionog, nisku proteolitičku aktivnost, i sveobuhvatnu robusnost. Bakterijski domaćini su obično dostupni iz raznih izvora uključujući, ali nije ograničeno na, Centar genetičkih zaliha bakterija (Bacterial Gentic Stock Center), Odeljenje za biofiziku i medicinsku fiziku, Univerzitet Kalifornije (Berkli, CA); i Američku kolekciju kultura sojeva ("ATCC") (Manasas, VA). Industrijska/farmaceutska fermentacija generalno koristi bakteriju izvedene od K sojeva (npr. W3110) ili od bakterije izvedene od B sojeva (npr. BL21). Ovi sojevi su naročito korisni jer njihovi parametri rasta su izuzetno dobro poznati i robusni. Pored toga, ovi sojevi su nepatogeni, što je komercijalno važno zbog bezbednosti i ekoloških razloga. Drugi primeri pogodnih E. coli domaćina uključuju, ali nisu ograničeni na, sojeve BL21, DH10B, ili njihove derivate. U drugom tehničkom rešenju metoda predmetnog pronalaska, E. coli domaćin je proteaza minus soj uključujući, ali nije ograničeno na, OMP- i LON-. Soj ćelije domaćina može biti vrste Pseudomonas, uključujući ali nije ograničeno na, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, i Pseudomonas putida. Pseudomonas fluorescens biovar 1, označeni soj MB101, je poznat da je korisan za rekombinantnu proizvodnju i dostupan je za terapijski protein production procese. Primeri Pseudomonas ekspresionog sistema uključuju sistem dostupan od Dow Chemical Company kao soj domaćina (Midlend, MI dostupno na World Wide Web na dow.com).
[0390] Jednom kada je uspostavljen rekombinantni soj ćelije domaćina (tj., ekspresioni kostrukt je uveden u ćeliju domaćina i ćelije domaćina su sa odgovarajućim ekspresionim konstruktom izolovane), rekombinantni soj ćelije domaćina se uzgaja u uslovima pogodnim za proizvodnju polipeptida relaksina. Kao što je očigledno prosečnom poznavaocu u oblasti tehnike, metoda kulture rekombinantnog soja ćelije domaćina će biti zavisna od prirode ekspresionog konstrukta koji je korišćen i identiteta ćelije domaćina. Rekombinantni sojevi domaćina se obično kultivišu korišćenjem metoda koje su dobro poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Rekombinantne ćelije domaćina su tipično kultivisane u tečnom medijumu koji sadrži izvore ugljenika koji se mogu asimilirati, azot, i neorganske soli i, po izboru, koji sadrži vitamine, aminokiseline, faktore rasta, i druge dodatke proteinske kulture poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Tečni medijum za kulture ćelija domaćina mogu po izboru da sadrže antibiotike ili anti-fungicide da spreče rast neželjenih mikroorganizama i/ili jedinjenja uključujući, ali nije ograničeno na, antibiotike za selekciju ćelija domaćina koji sadrže ekspresioni vektor.
[0391] Rekombinantne ćelije domaćina mogu biti kultivisane u šaržnim ili kontinuiranim formatima, ili sa sakupljanjem ćelije (u slučaju gde se polipeptid relaksina akumulira unutarćelijski) ili sakupljanjem supernatanta kulture ili u šaržnim ili kontinuiranim formatima. Za proizvodnju prokariotske ćelije domaćina, šaržna kultura i sakupljanje ćelije su poželjni.
[0392] Polipeptidi relaksina predmetnog pronalaska su obično prečišćeni nakon eksprimiranja u rekombinantnim sistemima. Polipeptid relaksina može biti prečišćen iz ćelije domaćina ili medijuma kulture raznim metodama poznatim u oblasti tehnike. Polipeptidi relaksina proizvedeni u ćelijama bakterije domaćina mogu biti slabo rastvorljivi ili nerastvorljivi (u obliku inkluzionih tela). U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, aminokiselinske supstitucije mogu se lako uraditi u polipeptidu relaksina koje su odabrane u svrhu povećanja rastvorljivosti rekombinantno proizvedenog proteina korišćenjem metoda ovde stavljenih na uvid javnosti kao i onima poznatim u oblasti tehnike. U slučaju nerastvorljivog proteina, protein se može sakupiti iz lizata ćelije domaćina centrifugacijom i može dalje biti praćeno homogenizacijom ćelija. U slučaju slabo rastvorljivih proteina, jedinjenja uključujući, ali nije ograničeno na, polietilen imin (PEI) mogu se dodati da se uvede taloženje delimično rastvorljivog proteina. Istaloženi protein se tada može prikladno prikupiti centrifugacijom. Rekombinantne ćelije domaćina mogu da se poremete ili homogenizuju da se oslobode inkluziona tela iz ćelija korišćenjem različitih metoda poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Poremećaj ili homogenizacija ćelija domaćina mogu se izvesti korišćenjem dobro poznate tehnike koje uključuju, ali nisu ograničene na, enzimski poremećaj ćelija, sonikaciju, homogenizaciju dounce-om ili poremećaj oslobađanjem visokog pritiska. U jednom tehničkom rešenju metode predmetnog pronalaska, tehnika oslobađanja visokog pritiska je korišćena da se poremete E. coli ćelije domaćina oslobode inkluziona tela polipeptida relaksina. Pri rukovanju sa inkluzivionim telima polipeptida relaksina, može biti korisno da se minimizira vreme homogenizacije pri ponavljanju kako bi se maksimizirao prinos inkluzionih tela bez gubitaka usled faktora kao što je solubilizacija, mehaničko sečenje ili proteoliza.
[0393] Nerastvorljivi ili istaloženi polipeptid relaksina može se zatim solubilizovati korišćenjem bilo kog od brojnih pogodnih agenasa za solubilizaciju poznatih u oblasti tehnike. Polieptid relaksina može se solubilizovati sa ureeom ili gvanidin hidrohloridom. Zapremina solubilizovanog polipeptida relaksina treba da bude minimizirana tako da se mogu proizvesti velike šarže korišćenjem veličina šarže kojima se može povoljno upravljati. Ovaj faktor može biti značajan u komercijalnom okruženju velikih razmera gde se rekombinantni domaćin može uzgajati u šaržama koje su zapremine hiljade litara. Pored toga, prilikom proizvodnje polipeptida relaksina u komercijalnom okruženju velikih razmera, posebno za humane farmaceutske primene, trebalo bi izbegavati oštre hemikalije koje mogu oštetiti mašineriju i posudu, ili sam proteinski proizvod, ako je moguće. Pokazano je u metodi predmetnog pronalaska da se blaži agens za denaturaciju urea može koristiti za solubilizaciju inkluzionih tela polipeptida relaksina polipeptida umesto oštrijeg agensa za denaturaciju gvanidin hidrohlorida. Primena uree značajno smanjuje rizik od oštećenja opreme od nerđajućeg čelika koja se koristi u procesu proizvodnje i prečišćavanja polipeptida relaksina, dok se efikasno solubilizuju inkluziona tela polipeptida relaksina.
[0394] U slučaju rastvorljivog proteina relaksina, relaksin se može izlučiti u periplazmatski prostor ili u medijum kulture. Pored toga, rastvorljiv relaksin može biti prisutan u citoplazmi ćelija domaćina. Može biti poželjno da se koncentriše rastvorljiv relaksin pre izvođenja koraka prečišćavanja. Standardne tehnike poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike mogu se koristiti da se koncentriše rastvorljiv relaksin iz, na primer, ćelija lizata ili medijuma kulture, Pored toga, standardne tehnike poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike mogu se koristiti da poremete ćelije domaćina i oslobode rastvorljiv relaksin iz citoplazme ili periplazmatskog prostora ćelija domaćina.
[0395] Kada je polipeptid relaksina proizveden kao fuzioni protein, fuziona sekvenca može se ukloniti. Uklanjanje fuzione sekvence može biti postignuto enzimskim ili hemijskim cepanjem. Enzimsko uklanjanje fuzionih sekvenci može biti postignuto korišćenjem metoda poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Izbor enzima za uklanjanje fuzione sekvence će biti određen identitetom fuzije, a reakcioni uslovi će biti određeni izborom enzima koji će biti očigledan prosečnom poznavaocu oblasti tehnike. Hemijsko cepanje može biti postignuto korišćenjem reagenasa koji su poznati prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike, uključujući ali nije ograničeno na, cijanogen bromid, TEV proteazu, i druge reagense. Odcepljeni polipeptid relaksina može biti prečišćen od odcepljene fuzione sekvence metodama koje su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Takve metode će biti određene identitetom i svojstvima fuzione sekvence i polipeptida relaksina, što će biti očigledno prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Metode za prečišćavanje mogu da uključuju, ali nisu ograničene na, gel (ekskluzionu) hromatografiju, hromatografiju hidrofobnih interakcija, jonoizmenjivačku hromatografiju ili dijaliza ili bilo koju njihovu kombinaciju.
[0396] Polipeptid relaksina može takođe biti prečišćen da se ukloni DNK iz rastvora proteina. DNK se može ukloniti bilo kojom pogodnom metodom poznatoj u oblasti tehnike, kao što je taloženje ili jonoizmenjivačka hromatografija, ali se može ukloniti taloženjem sa agensom za taloženje nukleinske kiseline, kao što je, ali nije ograničeno na, protamin sulfat. Polipeptid relaksina može biti odvojen od istaložene DNK primenom standardne dobro poznate metode uključujući, ali nije ograničeno na, centrifugaciju ili filtracija. Uklanjanje molekula domaćina nukleinske kiseline je važan faktor u okruženju u kojem će polipeptid relaksina biti primenjen da leči ljude i metode predmetnog pronalaska redukuju DNK ćeliju domaćina na farmaceutski prihvatljive nivoe.
[0397] Metode za fermentaciju male razmere ili velike razmere se takođe mogu primeniti u ekspresiji proteina, uključujući ali nije ograničeno na, fermentore, posude za mešanje, bioreaktore sa fluidizovanim slojem, bioreaktore sa šupljim vlaknima, sisteme roller boca za kulture (roller bottle culture systems), i bioreaktorske sisteme sa mešanjem rezervoara. Svaka od ovih metode se može izvesti u šarži, fed-batch, ili sa kontinualnim režimom procesu.
[0398] Humani polipeptidi relaksina pronalaska se obično mogu ponovo dobiti standardnim metodama u oblasti tehnike. Na primer, medijum kulture ili lizat ćelije može se centrifugovati ili filtrirati da se uklone ćelijski ostaci. Supernatant se može da se koncentruje ili razblaži do željene zapremine ili dijafiltrira u pogodnom puferu da bi se kondicionirao za prečišćavanje. Dalje prečišćavanje polipeptida relaksina predmetnog pronalaska uključuje odvajanje deamidnih i isečenih oblika varijante polipeptida relaksina varijanta iz netaknutog oblika.
[0399] Bilo koja od sledećih procedura koje su date kao primer može se koristiti za prečišćavanje polipeptida relaksina pronalaska: afinitetna hromatografija; anjon- ili katjonizmenjivačka hromatografija (korišćenjem, uključujući ali nije ograničeno na, DEAE SEPHAROSE); hromatografiju na silici; tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC); HPLC sa referznom fazom; gel filtraciju (korišćenjem, uključujući ali nije ograničeno na, SEPHADEX G-75); hromatografiju hidrofobnih interakcija; hromatografiju isključivanja po veličini; metal-helatnu hromatografiju; ultrafiltraciju/dijafiltraciju; taloženje sa etanolom; taloženje sa amonijum sulfatom; hromatofokusiranje; zamenska hromatografija; elektroforetski postupci (uključujući, ali nisu ograničeni na preparativno izoelektrično fokusiranje), diferencijalna rastvorljivost (uključujući, ali ne ograničavajući se na taloženje sa amonijum sulfatom), SDSPAGE ili ekstrakciju.
[0400] Proteini, uključujući ali nije ograničeno na, proteine koji sadrže neprirodne aminokiseline, peptide koji sadrže neprirodne aminokiseline, antitela na proteine koji sadrže neprirodne aminokiseline, vezujući partneri za proteine koji sadrže neprirodne aminokiseline, itd., mogu biti prečišćeni, ili parcijalno ili suštinski do homogenosti, prema standardnim procedurama poznatim i korišćenih od strane prosečnih poznavaoca u oblasti tehnike. Prema tome, polipeptidi pronalaska mogu se obnoviti i prečistiti bilo kojom od brojnih metoda koje su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike, uključujući ali nije ograničeno na, taloženje sa etanolom ili amonijum sulfatom, ekstrakcija kiselinom ili bazom, hromatografiju na koloni, afinitetnu hromatografiju na koloni, anjon ili katjon izmenjivačku hromatografiju, hromatografija na fosfocelulozi, hromatografiju hidrofobnih interakcija, hromatografija na hidroksiapatitu, hromatografija na licitinu, gel elektroforeza i slično. Koraci ponovnog savijanja proteina mogu se koristiti, po želji, pri dobijanju tačno savijenih zrelih proteina. Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC), afiniteta hromatografija ili druge pogodne metode mogu se koristiti u finalnim koracima prečišćavanja gde je visoka čistoća poželjna. U jednom tehničkom rešenju, antitela napravljena za neprirodne aminokiseline (ili proteini ili peptidi koji sadrže neprirodne aminokiseline) su korišćeni kao reagensi za prečišćavanje, uključujući ali nije ograničeno na, za prečišćavanje zasnovano na afinitetu proteina ili peptida koji sadrže jednu ili više neprirodnu(ih) aminokiselinu(a). Jednom prečišćen, parcijalno ili do homogenosti, po želji, polipeptidi se po izboru primenjuju za širok izbor upotreba, uključujući ali nije ograničeno na, kao komponente ispitivanja, terapeutici, za profilaksu, za dijagnostiku, reagensi za istraživanje, i/ili kao imunogeni za proizvodnju antitela. Antitela generisana za polipeptid predmetnog pronalaska mogu se dobiti administriranjem polipeptida ili fragmenata koji nose epitop, ili ćelija životinji, poželjno ne-humanoj životinji, pomoću rutinskih protokola. Prosečan poznavalac u oblasti tehnike bi mogao generisati antitela korišćenjem raznim poznatim tehnikama. Takođe, transgeni miševi, ili drugi organizmi, uključujući druge sisare, mogu se koristiti za ekspresiju humanizovanih antitela. Antitela koja su opisana iznad mogu se koristiti da se izoluju ili identifikuju klonovi koji eksprimiraju polipeptid ili prečiste polipeptidi. Antitela za polipeptid predmetnog pronalaska mogu se takođe koristiti za lečenje bolesti.
[0401] Polipeptidi i polinukleotidi predmetnog pronalaska mogu se takođe primeniti kao vakcine. Prema tome, u sledećem aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na metodu za indukovanje imunološkog odgovora u sisaru koja obuhvata inokulaciju sisara sa polipeptidom predmetnog pronalaska, adekvatnim da se proizvede antitelo i/ili T ćelijski imuni odgovor, uključujući, na primer, T ćelije koje proizvode citokine ili citotoksične T ćelije, da se zaštiti navedena životinja od bolesti, bilo da je ta bolest već uspostavljena kod pojedinca ili ne. Imunološki odgovor u sisaru može se takođe indukovati metodom koja obuhvata isporuku polipeptida predmetnog pronalaska pomoću vektorski usmerenom ekspresijom polinukleotida i kodiranje polipeptida in vivo da bi se indukovao takav imunološki odgovor da se proizvede antitelo da se zaštiti navedena životinja od bolesti pronalaska. Jedan način administriranja vektora je njegovo ubrzavanje u željene ćelije kao prevlake na česticama ili na neki drugi način. Takav vektor nukleinske kiseline može da sadrži DNK, RNK, modifikovanu nukleinsku kiselinu, ili DNK/RNK hibrid. Za primenu kao vakcina, polipeptid ili vektor nukleinske kiseline će normalno biti obezbeđen kao vakcinska formulacija (kompozicija). Formulacija može dalje da sadrži pogodan nosač. Pošto se polipeptid može razgraditi u stomaku, može se administrirati parenteralno (na primer, supkutano, intramuskularno, intravenski ili intra-dermalnom injekcijom). Formulacije pogodne za parenteralno administriranje uključuju vodene i ne-vodene sterilne rastvore injekcija koji mogu da sadrže anti-oksidante, pufere, bakteriostati i rastvori koji čine formulaciju instoničnom sa krvlju primaoca; i vodene i ne-vodene sterilne suspenzije koje mogu da uključuju agense za suspendovanje ili agensi za zgušnjavanje. Formulacija vakcine može takođe da uključuje pomoćne sisteme za poboljšanje imunogenosti formulacije koji su poznati prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Doza će zavisiti od specifične aktivnosti vakcine i može se lako odrediti rutinskim ekspermimentisanjem.
Eksprimiranje u alternativnim sistemima
[0402] Nekoliko strategija je korišćeno da se uvedu neprirodne aminokiseline u proteine u ne-rekombinantnoj ćeliji domaćina, mutiranoj ćeliji domaćina, ili sistemima bez ćelija. Ovi sistemi su takođe pogodni za primenu u pravljenju polipeptida relaksina predmetnog pronalaska. Derivatizacija aminokiselina sa reaktivnim bočnim lancima kao što su Lys, Cys i Tyr je rezultovala u konverziji lizina u N<2>-acetil-lizin. Hemijska sinteza takođe obezbeđuje direktnu metodu da se inkorporiraju neprirodne aminokiseline. Sa skorašnjim razvojem enzimske ligacije i prirodne hemijske ligacije fragmenata peptida, moguće je dobiti duže proteine. Videti, npr., P. E. Dawson i S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem, 69:923 (2000). Hemijska peptidna ligacija i prirodna hemijska ligacija su opisane u američkom patentu br.6,184,344, objavi američke prijave patenta br.2004/0138412, objavi američke prijave patenta br. 2003/0208046, WO 02/098902, i WO 03/042235. Opšta in vitro metoda biosinteze u kojoj je supresorska tRNK hemijski acilovana željenom neprirodnim amino kiselinom dodata in vitro ekstraktu koji može da podrži biosintezu proteina, korišćena je za inkorporaciju specifičnu za mesto preko 100 neprirodnih aminokiselina u različite proteine gotovo bilo koje veličine. Videti, npr., V. W. Cornish, D. Mendel i P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995); C.J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P.G. Schultz, Opšta metoda za inkorporaciju specifičnu za mesto neprirodnih aminokiselina u proteine, Science 244:182-188 (1989); i, J.D. Bain, C.G. Glabe, T.A. Dix, A.R. Chamberlin, E.S. Diala, Biosintetska inkorporacija specifična za mesto neprirodnih aminokiselina u polipeptid, J. Am. Chem. Soc. 111:8013-8014 (1989). Širok opseg funkcionalnih grupa je uveden u proteine radi studije stabilnosti proteina, savijanje proteine, mehanizma enzima, i signalne transdukcije.
[0403] Pored drugih refereni koje su ovde navedene, razne metode prečišćavanja/savijanja proteina su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike, uključujući, ali nije ograničeno na, one izložene u R. Scopes, Protein Purification, Spprstener-Verlag, N.Y. (1982); Deutscher, Methods in Enzymology tom. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. (1990); Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.; Bollag et al. (1996) Protein Methods, 2. Izdanje Wiley-Liss, NY; Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris i Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press u Oksfordu, Oksford, Engleska; Harris i Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press u Oksfordu, Oksford,, Engleska; Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3. Izdanje Springer Verlag, NY; Janson i Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Drugo Izdanje Wiley-VCH, NY; i Walker (1998), Protein Protocols na CD-ROM-u Humana Press, NJ; i reference citirane u njima.
[0404] Jedna prednost proizvodnje proteina ili polipeptida od interesa sa neprirodnom aminokiselinom u eukariotskoj ćeliji domaćina ili neeukariotskoj ćeliji domaćina je da će tipično proteini ili polipeptidi biti savijeni u njihovim prirodnim konformacijama. Međutim, u određenim tehničkim rešenjima pronalaska, presečni poznavaoci u oblasti tehnike će prepoznati da, nakon sinteze, eksprimiranja i/ili prečišćavanja, proteini ili peptidi mogu imati konformaciju koja je različita od željenih konformacija relevantnih polipeptida. U jednom aspektu pronalaska, eksprimiran protein ili polipeptid je po izboru denaturisan i zatim renaturisan. Ovo je postignuto korišćenjem metoda poznatim u oblasti tehnike, uključujući ali nije ograničeno na, dodavanjem pratioca (chaperonin) proteinu ili polipeptidu od interesa, solubizacijom proteina u haotropnom agensu kao što je guanidin HCl, korišćenjem protein disulfid izomeraze, itd.
[0405] Generalno, povremeno je poželjno da se denaturišu i redukuju eksprimirani polipeptidi i zatim da se izazove da se polipeptid ponovo savije u poželjnu konformaciju. Na primer, guanidin, urea, DTT, DTE, i/ili pratilac mogu se dodati translacionom proizvodu od interesa. Metode za redukovanje, denaturaciju i renaturaciju proteina su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike (videti, reference iznad, i Debinski, et al. (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065-14070; Kreitman i Pastan (1993) Bioconjug. Chem., 4: 581-585; i Buchner, et al., (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270). Debinski, et al., na primer, opisuje denaturaciju i redukciju proteina inkluzionog tela u guanidin-DTE. Proteini se mogu ponovo uviti u redoks puferu koji sadrži, uključujući ali nije ograničeno na, oksidovan glutation i L-arginin. Reagensi za ponovno mogu da teku ili na drugi način pomeraju pri kontaktu sa jednim ili više polipeptida ili drugim proizvodima ekspresije, ili obrnuto.
[0406] U slučaju prokariotske proizvodnje polipeptida relaksina, polipeptid relaksina prema tome proizveden može se pogrešno uviti i prema tome nemati ili imati redukovanu biološku aktivnost. Bioaktivnost proteina može se obnoviti "ponovnim savijanje". Generalno, pogrešno savijen polipeptid relaksina se ponovo savija solubizacijom (gde polipeptid relaksina je takođe nerastvorljiv), razvijanje i smanjenje polipeptidnog lanca korišćenjem, na primer, jednog ili više haotropnih agenasa (npr. urea i/ili guanidin) i redukcionog sredstva koje sposobno da redukuje disulfidne veze (npr. ditiotreitol, DTT ili 2-merkaptoetanol, 2-ME). Pri umerenoj koncentraciji haotropa, oksidaciono sredstvo se zatim dodaje (npr., kiseonik, cistin ili cistamin), koje dozvoljava ponovno oblikiranje disulfidnih veza. Polipeptid relaksina može se ponovo uviti primenom standardnih metoda poznatih u oblasti tehnike, kao što su one opisane u američkim patentima sa brojevima 4,511,502, 4,511,503, i 4,512,922. Polipeptid relaksina može se takođe kouviti sa drugim proteinima da se formiraju heterodimeri ili heteromultimeri.
[0407] Nakon ponovnog savijanja, relaksin se može dalje prečistiti. Prečišćavanje relaksina može se postići primenom raznih tehnika poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike, uključujući hromatografiju hidrofobnih interakcija, gel (ekskluzionu) hromatografiju, jonoizmenjivačku hromatografiju, tečnu hromatografiju visokih performansi sa reverznom fazom, afinitetnu hromatografija, i slično ili bilo kojom kombinacijom istih. Dodatno prečišćavanje može takođe da uključuje korak sušenja ili taloženja prečišćenog proteina.
[0408] Nakon prečišćavanja, relaksin se može izmeniti u različitim puferima i/ili koncentrovati bilo kojom od raznih metoda poznatim u oblasti tehnike, uključujući, ali nije ograničeno na, dijafiltraciju i dializu. Relaksin koji je dobijen kao pojedinačni prečišćeni može se podvrgnuti agregaciji i taloženju.
[0409] Prečišćen relaksin može biti najmanje 90% čist (mereno tečnom hromatografijom visokih performansi sa reverznom fazom, RP-HPLC, ili natrijum dodecil sulfatpoliacrilamid gel elektroforezom, SDS-PAGE) ili najmanje 95% čist, ili najmanje 98% čist, ili najmanje 99% ili više čist. Bez obzira na tačnu brojčanu vrednost čistoće relaksina, relaksin je dovoljno čist za primenu kao farmaceutski proizvod ili za dalje obrađivanje, kao što je konjugacija sa polimerom rastvorljivim u vodi kao što je PEG.
[0410] Određeni molekuli relaksina mogu se primeniti kao terapijski agensi u odsustvu drugih aktivnih sastojaka ili proteina (drugi nego ekscipijensi, nosači, i stabilizatori, serum albumin i slično), ili mogu biti u kompleksu sa drugim proteinom ili polimerom.
[0411] Opšte metode prečišćavanja Bilo koji od raznih koraka izolovanja mogu se izvesti na ćelijskom lizatu, ekstraktu, medijumu kulture, inkluzionim telima, periplazmatskom prostoru ćelija domaćina, citoplazmi ćelija domaćina, ili drugim materijalima, koji sadrže polipeptid relaksina ili na bilo kojoj smeši polipeptida relaksina koja rezultuje iz koraka izolovanja uključujući, ali nije ograničeno na, afinitetnu hromatografiju, jonoizmenjivačku hromatografiju, hromatografiju hidrofobnih interakcija, gel filtracionu hromatografiju, tečna hromatografija visokih performansi ("HPLC"), HPLC sa reverznom fazom ("RP-HPLC"), adsorpcija u ekspandiranom sloju, ili bilo koja kombinacija i/ili ponavljanje istih i bilo kojim pogodnim redom.
[0412] Oprema i drugi potrebni materijali korišćeni za izvođenje tehnika ovde opisanih su komercijalno dostupni. Pumpe, sakupljači frakcija, monitori, rekorderi, i celokupni sistemi su dostupne od, na primer, Applied Biosystems (Foster Siti, CA), Bio-Rad Laboratories, Inc. (Herkjuliz, CA), i Amersham Biosciences, Inc. (Piskatavej, NJ). Materijali za hromatografiju uključujući, ali nije ograničeno na, materijale za razmenu matrica, medijume, i pufere su takođe dostupni od takvih kompanija.
[0413] Ravnoteža, i drugi koraci u procesu hromatografije na koloni ovde opisani kao što su pranje i eluiranje, mogu se brže postići primenom specijalizovane opreme kao što je pumpa. Komercijalno dostupne pumpe uključuju, ali nisu ograničeni na, HILOAD® pumpu P-50, peristaltičku pumpu P-1, pumpu P-901, i pumpu P-903 (Amersham Biosciences, Piskatavej, NJ).
[0414] Primeri sakupljača frakcija uključuju RediFrac Fraction Collector, FRAC-100 i FRAC-200 sakupljače frakcija, i SUPERFRAC® sakupljač frakcija (Amersham Biosciences, Piskatavej, NJ). Mešalice su takođe dostupni da se formiraju pH i linearni koncentracijski gradijenti. Komercijalno dostupne mešalice uključuje gradijentnu mešalicu GM-1 i In-Line Mešalicu (Amersham Biosciences, Piskatavej, NJ).
[0415] Hromatografski proces se može pratiti primenom bilo koje komercijalno dostupnog monitora. Takvi monitori mogu se koristiti da prikupe informacije kao što su UV, pH, i provodljivost. Primeri detektora uključuju monitor UV-1, UVICORD® S II, monitor UV-M II, monitor UV-900, monitor UPC-900, monitor pH/C-900, i monitor provodljivosti (Amersham Biosciences, Piskatavej, NJ). Zaista, celokupni sistemi su komercijalno dostupni uključujući razne AKTA® sisteme od Amersham Biosciences (Piskatavej, NJ).
[0416] U jednom tehničkom rešenjm predmetnog pronalaska, na primer, polipeptid relaksina se može redukovati ili denaturisati prvo denaturacijom rezultujućeg prečišćenog polipeptida relaksina u urei, a zatim razblaživanjem u TRIS puferu koji sadrži redukciono sredstvo (kao što je DTT) pri pogodnoj pH. U drugom tehničkom rešenju, polipeptid relaksina se denaturiše u urei u koncentraciji u opsegu između oko 2 M do oko 9 M, praćeno razblaživanjem u TRIS puferu pri pH u opsegu od oko 5.0 do oko 8.0. Smeša za ponovno savijanje ovog tehničkog rešenja može se zatim inkubirati. U jednom tehničkom rešenju, smeša za ponovno savijanje se inkubira na sobnoj temperaturi tokom četiri do dvadeset četiri sata. Smeše redukovanih i denaturisanih polipeptida relaksina mogu zatim biti izolovane ili prečišćene.
[0417] Kao što je ovde naznačeno, pH prve smeše polipeptida relaksina može se prilagoditi pre izvođenja bilo kojih narednih koraka izolovanja. Pored toga, prva smeša polipeptida relaksina ili bilo koja sledeže smeša istih može se koncentrovati primenom tehnika poznatih u oblasti tehnike. Štaviše, elucioni pufer koji sadrži prvi smešu polipeptida relaksina ili bilo koju sledeću smešu istih može se zameniti sa puferom pogodnim za sledeći korak izolovanja primenom tehnika poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike.
[0418] Jonoizmenjivačka hromatografija U jednom tehničkom rešenju, i po izboru, dodatni korak, jonoizmenjivačka hromatografija može se izvesti na prvoj smeši polipeptida relaksina. Generalno videti ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS (kat. br. 18-1114-21, Amersham Biosciences (Piskatavej, NJ)). Komercijalno dostupne jonoizmenjivačke kolone uključuju HITRAP®, HIPREP®, i HILOAD® kolone (Amersham Biosciences, Piskatavej, NJ). Takve kolone koriste jake anjonske izmenjivače kao što su Q SEPHAROSE® Fast Flow, Q SEPHAROSE® High Performance, i Q SEPHAROSE® XL; jaki katjonski izmenjivači kao što su SP SEPHAROSE® High Performance, SP SEPHAROSE® Fast Flow, i SP SEPHAROSE® XL; slabe anjonske izmenjivači kao što je DEAE SEPHAROSE® Fast Flow; i slabi katjonski izmenjivači kao što je CM SEPHAROSE® Fast Flow (Amersham Biosciences, Piskatavej, NJ). Anjon ili katjon izmenjivačka hromatografija na koloni može se izvesti na polipeptidu relaksina u bilo kojoj fazi procesa prečišćavanja da se izoluje suštinski prečišćen polipeptid relaksina. Korak katjon-izmenjivačke hromatografije može se izvesti primenom bilo kojeg pogodnog matriksa za katjonsku izmenu. Korisne matrice za katjonsku izmenu uključuju, ali nisu ograničeni na, vlaknaste, porozne, neporozne, mikrogranularne, zrnaste, ili umrežene katjoske izmenjivačke matriksne materijale. Takvi katjonski izmenjivački matriksni materijali uključuju, ali nisu ograničeni na, celulozu, agarozu, dekstran, poliakrilat, polivinil, polistiren, siliku, polietar, ili kompozite bilo kojih od gore navedenih.
[0419] Katjonski izmenjivački matriks može biti bilo koji pogodan katjonski izmenjivač uključujući jake i slabe katjonske izmenjivače. Jaki katjonski izmenjivači mogu ostati jonizovani tokom širokog opsega pH i prema tome, mogu bit u stanju da vežu relaksin tokom širokog opsega pH. Slabi katjonski izmenjivači, međutim, mogu izgubiti jonizaciju kao funkciju pH. Na primer, slabi katjonski izmenjivači mogu izgubiti naelektrisanje kada se pH spusti ispod oko pH 4 ili pH 5. Pogodni jaki katjonski izmenjivači uključuju, ali nisu ograničeni na, nabijene funkcionalne grupe kao što je sulfopropil (SP), metil sulfonat (S), ili sulfoetil (SE). Katjonski izmenjivački matriks može biti jak katjonski izmenjivač, poželjno koji ima pH opseg za vezivanje relaksina od oko 2.5 do oko 6.0. Alternativno, jaki katjonski izmenjivač može imati pH opseg za vezivanje relaksina od oko pH 2.5 do oko pH 5.5. Katjonski izmenjivački matriks može biti jak katjonski izmenjivač koji ima pH opseg za vezivanje relaksina od oko 3.0. Alternativno, katjonski izmenjivački matriks može biti jak katjonski izmenjivač, poželjno koji ima pH opseg za vezivanje relaksina od oko 6.0 do oko 8.0. Katjon izmenjivački matriks može biti jak katjonski izmenjivač poželjno koji ima pH opseg za vezivanje relaksina od oko 8.0 do oko 12.5. Alternativno, jak katjonski izmenjivač može imati pH opseg za vezivanje relaksina od oko pH 8.0 do oko pH 12.0.
[0420] Pre dodavanja relaksina, katjonski izmenjivački matriks može biti uravnotežen, na primer, primenom nekoliko zapremina kolona razblažene, slabe kiseline, npr., četiri zapremine kolone 20 mM sirćetne kiseline, pH 3. Nakon ravnoteže, relaksin se može dodati i kolona se može isprati jednom do nekoliko puta, pre eluiranja suštinski prečišćenog relaksina, takođe primenom rastvora slabe kiseline kao štoje slaba sirćetna kiselina ili rastvor fosforna kiselina. Na primer, približno 2-4 zapremine kolone 20 mM sirćetne kiseline, pH 3, moše se koristiti da se ispere kolona. Dodatna ispiranja korišćenjem, npr., 2-4 zapremina kolone 0.05 M natrijum acetata, pH 5.5, ili 0.05 M natrijum acetata pomešanog sa 0.1 M natrijum hlorida, pH 5.5, može se takođe koristiti. Alternativno, primenom metoda poznatih u oblasti tehnike, katjonski izmenjivački matriks može biti uravnotežen korišćenjem nekoliko zapremina kolone ratblažene, slabe baze.
[0421] Alternativno, suštinski prečišćen relaksin može se eluirati pri kontaktu katjonskog izmenjivačkog matriksa sa puferom koji ima dovoljno nizak pH ili jonsku snagu da premesti relaksin iz matriksa. pH elucionog pufera može biti u opsegu od oko pH 2.5 do oko pH 6.0. Konkretnije, pH elucionog pufera može biti u opsegu od oko pH 2.5 do oko pH 5.5, oko pH 2.5 do oko pH 5.0. Elucioni pufer može da ima pH od oko 3.0. Pored toga, količina elucionog pufera može široko da varira i obično će biti u opsegu od oko 2 do oko 10 zapremina kolone.
[0422] Nakon adsorpcije polipeptida relaksina na katjonski izmenjivački matriks, suštinski prečišćen polipeptid relaksina može se eluirati kontaktom matriksa sa puferom koji ima dovoljno visok pH ili jonsku snagu da premesti polipeptid relaksina iz matriks. Pogodni puferi za primenu u eluiranju pri visokoj pH suštinski prečišćenog polipeptida relaksina mogu da uključu, ali nije ograničeno na, citrat, fosfat, format, acetate, HEPES, i MES pufere koji variraju u koncentraciji od najmanje oko 5 mM do najmanje oko 100 mM.
[0423] Hromatografija sa reverznom fazom RP-HPLC se može izvesti da se prečiste proteini prateći pogodne protokole koji su poznati prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Videti, npr., Pearson et al., ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982); Rivier et al., J. CHROM. (1983) 268:112-119; Kunitani et al., J. CHROM. (1986) 359:391-402. RP-HPLC se može izvesti na polipeptidma relaksina da se izoluje suštinski prečišćen polipeptid relaksina. U tom pogledu, smole derivatizovane silikom sa alkil funkcionalnostima sa raznim opsegom dužina, uključujući, ali nije ograničeno na, najmanje oko C3 do najmanje oko C30, najmanje oko C3 do najmanje oko C20, ili najmanje oko C3 do najmanje oko C18, smole mogu se koristiti. Alternativno, polimerna smola može se koristiti. Na primer, TosoHaas Amberchrome CG1000sd smola može se koristiti, koja je stiren polimerna smola. Cijano ili polimerne smole sa širokim opsegom dužina alkil lanca može se takođe koristiti. Pored toga, RP-HPLC kolona se može isprati sa rastvarač kao što je etanol. Izvorna RP kolona je drugi primer RP-HPLC kolone
[0424] Pogodan elucioni pufer koji sadrži agens za jonske parove i organski modifikator kao što je metanol, izopropanol, tetrahidrofuran, acetonitril ili etanol, može se primeniti da se eluira polipeptid relaksina iz RP-HPLC kolone. Najčešće primenjeni agensi za jonske parove uključuju, ali nisu ograničeni na, sirćetnu kiselinu, mravlju kiselinu, perhlornu kiselinu, fosfornu kiselinu, trifluorosirćetnu kiselinu, heptafluorobuternu kiselinu, trietilamin, tetrametilamonijum, tetrabutilamonijum, i trietilamonijum acetat. Eluiranje se može izvesti primenom jednog ili više gradijentnih ili izokratskih uslova, sa gradijentnim uslovima koji su poželjni da se redukuje vreme separacije i smanji đirina pika. Druga metoda uključuje primena dva gradijenta sa različitim opsezima koncentracije rastvarača. Primeri pogodnih elucionih pufera za primenu ovde mogu da uključu, ali nisu ograničeni na, amonijum acetatne i acetonitrilne rastvore.
Tehnike prečišćavanja hromatografijom hidrofobnih interakcija
[0425] Hromatografija hidrofobnih interakcija (HIC) može se izvesti na polipeptidu relaksina. Videti obično HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (kat. br. 18-1020-90, Amersham Biosciences (Piskatavej, NJ). Pogodne HIC matrice mogu da uključuju, ali nisu ograničene na, alkil- ili aril-supstituisane matrice, kao što je butil-, heksil-, oktil- ili fenil-supstituisane matrice uključujući agarozu, umreženu agarozu, sefarozu, celulozu, siliku, dekstran, polistiren, poli(metacrilat) matrice, i mixed-mode smole, uključujući ali nije ograničeno na, polietilenamin smolu ili butil- ili fenil-supstituisani poli(metacrilat) matriks. Komercijalno dostupni izvori hromatografije hidrofobnih interakcija u koloni uključuju, ali nisu ograničeni na, HITRAP®, HIPREP®, i HILOAD® kolone (Amersham Biosciences, Piskatavej, NJ).
[0426] Ukratko, pre punjenja, HIC kolona se mora uravnotežiti primenom standardnih pufera poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike, kao što je rastvor sirćetna kiselina/natrijum hlorid ili HEPES koji sadrže amonijum sulfat. Amonijum sulfat može se koristiti kao pufer za punjenje HIC kolone. Nakon punjenja polipeptida relaksina, kolona se zatim može isprati primenom standardnih pufera i uslova da se uklone neželjeni materijali ali zadržavajući polipeptid relaksina na HIC kolona. Polipeptid relaksina se može eluirati sa oko 3 do oko 10 zapremina kolone standardnog pufera, kao što je HEPES pufer koji sadrži EDTA i nižu koncentraciju amonijum sulfata nego ravnotežni pufer, ili pufer sirćetna kiselina/natrijum hlorid, između ostalih. Opadajući linearni gradijent soli primenom, na primer, gradijenta kalijum fosfata, se može takođe primeniti da se eliuraju molekuli relaksina. Eluant se zatim može koncentrovati, na primer, filtracijom kao što je dijafiltracija ili ultrafiltracija. Dijafiltracija se može koristiti da se ukloni so koja je korišćena da se eluira polipeptid relaksina.
[0427] Druge tehnike prečišćavanja Još sledeći korak izolovanja primenom, na primer, gel filtracije ((GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS (kat. br.18-1022-18, Amersham Biosciences, Piskatavej, NJ), hidroksiapatit hromatografije (pogodni matriksi uključuju, ali nisu ograničeni na, HA-Ultrogel, Visoka Rezolucija (Calbiochem), CHT keramički hidroksiapatit (Ceramic Hydroxyapatite) (BioRad), Bio - Gel HTP Hidroksiapatit (BioRad)), HPLC, adsorpcija u ekspandiranom sloju, ultrafiltracija, dijafiltracija, liofilizacija, i slično, mogu se izvesti na prvoj smeši polipeptida relaksina ili bilo kojoj narednoj smeši istih, da se ukloni bilo koji višak soli i da se zameni pufer sa pogodnim puferom za sledeći korak izolovanja ili čak formulaciju finalnog proizvoda leka.
[0428] Prinos polipeptida relaksina, uključujući suštinski prečišćen polipeptid relaksina, može se pratiti na svakom koraku koji je ovde opisan primenom tehnika poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Takve tehnike mogu se takođe primeniti da se proceni prinos suštinski prečišćenog polipeptida relaksina nakon poslednjeg koraka izolovanja. Na primer, prinos polipeptida relaksina može se pratiti korišćenjem bilo koje od nekoliko kolona tečne hromatografija visokih performansi sa reverznom fazom, koje imaju različite dužine alkilnih lanaca kao što je cijano RP-HPLC, C18RP-HPLC; kao i katjon-izmenjivačka HPLC i gel filtraciona HPLC.
[0429] U specifičnim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska, prinos relaksina nakon svakog koraka prečišćavanje mogu biti najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 45%, najmanje oko 50%, najmanje oko 55%, najmanje oko 60%, najmanje oko 65%, najmanje oko 70%, najmanje oko 75%, najmanje oko 80%, najmanje oko 85%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99%, najmanje oko 99.9%, ili najmanje oko 99.99%, relaksina u početnom materijalu za svaki korak prečišćavanja.
[0430] Čistoća se može odrediti primenom standardnih tehnika, kao što je SDS-PAGE, ili merenjem polipeptida relaksina primenom Western blot-a i ELISA ispitivanja. Na primer, poliklonalna antitela mogu se generisati za proteine izolovane iz negativne kontrolne fermentacije kvasca i obnove katjonskim izmenjivačem. Antitela se mogu takođe koristiti za ispitivanje prisutnosti kontaminirajućihproteina ćelija domaćina.
[0431] RP-HPLC materijal Vydac C4 (Vydac) se sastoji od čestica silika gela, čije površine nose C4-alkil lanci. Separacija polipeptida relaksina iz proteinskih nečistoća zasniva se na razlici u snazi hidrofobnih interakcija. Eluiranje se izvodi sa gradijentom acetonitrila u razblaženoj trifluorosirćetnoj kiselini. Preparativna HPLC se izvodi primenom kolone od nerđajućeg čelika (napunjenoj sa 2.8 do 3.2 litara Vydac C4 silikagela). Hidroksiapatit Ultrogel eluat se zakiseli dodavanjem trifluorosirćetne kiseline i punjenjem na Vydac C4 koloni. Za pranje i eluiranje se koristi gradijent acetonitrila u razblaženoj trifluorosirćetnoj kiselini. Frakcije se sakupljaju i odmah neutrališu sa fosfatnim puferom. Frakcije polipeptida relaksina koje su u granicama IPC-a su sakupljene.
[0432] DEAE Sefaroza (Pharmacia) materijal koji se sastoji od dietilaminoetil (DEAE)-grupa koje su kovalentno vezane na površini Sefaroza kuglica. Vezivanje polipeptida relaksina na DEAE grupe je posredovano jonskim interakcijama. Acetonitril i trifluorosirćetna kiselina prolaze kroz kolonu bez da se zadržavaju. Nakon što su ove supstance isprane, nečistoće u tragovima se uklanjaju pranjem kolone sa acetatnim puferom pri niskim pH. Zatim se kolona ispere sa neutralnim fosfatnim puferom i polipeptid relaksinase eluira sa puferom sa povišenom jonskim snagom. Kolona se pakuje sa brzim protokom DEAE Sefaroze. Zapremina kolone je prilagođena da se osigura relaksin opterećenje polipeptida u opsegu od 3-10 mg polipeptida relaksina/ml gela. Kolona se ispere vodom i ravnotežim puferom (natrijum/kalijum fosfat). Sakupljene frakcije HPLC eluata se napune i kolona se ispere sa ravnotežnim puferom. Zatim se kolona ispere sa puferom za pranje (natrijum acetatni puferom) nakon čega sledi pranje
sa ravnotežnom ravnotežnim puferom. Nakon toga, polipeptid relaksina se eluira iz kolone sa eluacionim puferom (natrijum hlorid, natrijum/kalijum fosfat) i sakuplja u pojedinačne frakciju u skladu sa glavnim profilom eluacije. Eluat DEAE Sefaroza kolone se podešava na definisanu provodljivost. Dobijena lekovita supstanca je sterilno filtrirana
u teflonske boce i čuva se na -70°C.
[0433] Dodatne metode koje se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničene na, korake za uklanjanje endotoksina. Endotoksini su lipopoli-saharidi (LPSs) koji se nalaze na spoljnoj membrani gram-negativnih ćelija domaćina, kao npr. na primer, Escherichia coli. Metode za smanjenje nivoa endotoksina su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike i uključuju, ali nisu ograničene na, tehnike prečišćavanja pomoću silika nosača, staklenog praha ili hidroksiapatita, reverzne faze, afiniteta, isključivanje po veličini, anjonizmenjivačk hromatografiju sa anionskom razmenom, hidrofobna interakciona hromatografija, hromatografiju hidrofobnih interakcija, i kombinaciju ovih metoda, i slično. Modifikacije ili dodatne metode mogu biti potrebne za uklanjanje kontaminanata, kao što su proteini koji komigriraju, od polipeptida od interesa. Metode za merenje nivoa endotoksina su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike i uključuju, ali nisu ograničene na, ispitivanja limulus amebocit lizata (LAL - Limulus Amebocyte Lysate). EndosafeTM-PTS ispitivanje je je kolorimetrični sistem sa jednom cevi koji koristi kertridže koji su unapred napunjeni LAL reagensom, hromogenim supstratom, i kontrolnim standardnim endotoksinom zajedno sa ručnim spektrofotometrom. Alternativne metode uključuju, ali nisu ograničene na, kinetičku LAL metodu koja je turbidimetrička i koristi format od 96 bunarčića.
[0434] Širok spektar metoda i procedura može se koristiti za procenu prinosa i čistoće proteina relaksina koji sadrže jednu ili više ne-prirodno kodiranih, uključujući, ali bez ograničenja na, Bradford ispitivanje, SDS-PAGE, srebrom obojen SDS-PAGE, „coomassie“ obojena SDS-PAGE, masena spektrometrija (uključujući, ali ne ograničavajući se na, MALDI-TOF) i druge metode za karakterizaciju proteina poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike.
[0435] Dodatne metode uključuju, ali nisu ograničene na: SDS-PAGE zajedno sa metodama bojenja proteina, imunobloting, matriksom potpomognuta laserska desorpcija/jonizaciono-masena spektrometrija (MALDI-MS), tečna hromatografija/masena spektrometrija, izoelektrično fokusiranje, analitička anjonska izmena, hromatofokusiranje i cirkularni dihroizam.
[0436] In vivo metoda, nazvana ugradnja putem selektivnog pritiska, je razvijena da iskoristi raznorodnost sintetaza divljih tipova. Videti, npr., N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger, F. M. Dong, L. Moroder i R. Huber, FASEB J., 13:41 (1999). Auksotrofni soj, u kojem je relevantni metabolički put koji snabdeva ćeliju sa određenom prirodnom aminokiselinom isključen, se uzgaja u minimalnom medijumu koji sadrži ograničene koncentracije prirodne aminokiseline, dok je transkripcija ciljnog gena potisnuta. Na početku stacionarne faze rasta, prirodna aminokiselina je iscrpljena i zamenjena analogom neprirodne aminokiseline. Indukcija ekspresije rezultata rekombinantnog proteina pri nakupljanju proteina koji sadrži neprirodni analog. Na primer, koristeći ovu strategiju, o, m i p-fluorofenilalanini su inkorporirani u proteine, i pokazuju dva karakteristična ramena u UV spektru koja se mogu lako identifikovati, videti, npr., C. Minks, R. Huber, L. Moroder i N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000); trifluorometionin je primenjen da zameni metionin u bakteriofag T4 lizozomu za proučavanje njegove interakcije sa hitooligosaharidnim ligandima pomoću<19>F NMR, videti, npr., H. Duewel, E. Daub, V. Robinson i J. F. Honek, Biochemistry, 36:3404 (1997); i trifluoroleucin je inkorporiran umesto leucina, rezultujući u povećanoj termičkoj i hemijskoj stabilnosti leucinskog-zatvarač proteina. Videti, npr., Y. Tang, G. Ghirlanda, W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado i D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001). Štaviše, selenometionin i telurometionin su inkorporirani u razne rekombinantne proteine da olakša rastvor faza u rengenskoj kristalografiji. Videti, npr., W. A. Hendrickson, J. R. Horton i D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990); J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda i M. Hatada, Nat. Struct. Biol., 1:283 (1994); N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann i R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995); i, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder i R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616 (1997). Analozi metionina analozi sa alken ili alkin hunkcionalnostima su takođe inkorporirani efikasno, omogućavajući dodatnu modifikaciju proteina hemijskim sredstvima. Videti, npr., J. C. van Hest i D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998); J. C.. van Hest, K. L. Kiick and D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122:1282 (2000); i, K. L. Kiick i D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000); američki patent br. 6,586,207; objava američke prijave patenta 2002/0042097.
Uspeh ove metode zavisi od prepoznavanja analoga neprirodne aminokiseline od strane aminoacil-tRNK sintetaze, koja, generalno, zahteva visoku selektivnost da se osigura tačnost translacije proteina. Jedan način da se proširi obim ove metode je da se oslabi specifičnost aminoacil-tRNK sintetaze, što je postignuto u ograničenom broju slučajeva. Na primer, zamena Ala<294>sa Gly u Escherichia coli fenilalalanil-tRNK sintetazi (PheRS) povećava veličinu džepa za vezivanje supstrata, i rezultuje u acilaciji tRNKPhe sa p-Clfenilalaninom (p-Cl-Phe). Videti, M. Ibba, P. Kast i H. Hennecke, Biochemistry, 33:7107 (1994). Escherichia coli soj koji luči ova mutant PheRS dozvoljava inkorporaciju p-Clfenilalanina ili p-Br-fenilalanina umesto fenilalanina. Videti, npr., M. Ibba i H. Hennecke, FEBS Lett., 364:272 (1995); i, N. Sharma, R. Furter, P. Kast i D. A. Tirrell, FEBS Lett., 467:37 (2000). Slično, tačkastom mutacija Phe130Ser u blizini mesta vezivanja amoinokiseline Escherichia coli tirozil-tRNK sintetaze je pokazala da je omogućeno da se azatirozin efikasnije inkorporira od tirozina. Videti, F. Hamano-Takaku, T. Iwama, S. Saito-Yano, K. Takaku, Y. Monden, M. Kitabatake, D. Soll i S. Nishimura, J. Biol. Chem., 275:40324 (2000).
[0437] Druga strategija da se inkorporiraju neprirodne aminokiseline u proteine je da se modifikuju sintetaze koje imaju proofreading mehanizme. Ove sintetaze se ne mogu razlikovati i prema tome aktiviraju aminokiseline koje su strukturno slične srodnim prirodnim aminokiselinama. Ova greška je ispravljena na posebnom mestu, koje deaciluje pogrešno naelektrisanu aminokiselinu iz tRNK da bi se održala tačnost translacije proteina. Ako je korigovana aktivnost sintetaze onemogućena, strukturni analozi koji su pogrešno aktivirani mogu izbeći funkciju uređivanja i biti inkorporirani. Ovaj pristup je nedavno demonstriran sa valil-tRNK sintetazom (ValRS). Videti, V. Doprsten, H. D. Mootz, L. A. Nangle, T. L. Hendrickson, V. de Crecy-Lagard, P. Schimmel i P. Marliere, Science, 292:501 (2001). ValRS može pogrešno aminoacilovati tRNKVal sa Cys, Thr, ili aminobutiratom (Abu); ove nesrodne aminokiseline su naknadno hidrolizovane domenom koji edituje. Nakon nasumične mutageneze Escherichia coli hromozoma, mutirana Escherichia coli soj je selektovan koji ima mutaciju na mestu za editovanje ValRS. Ovaj neispravan za editovanje ValRS netačno puni tRNKVal sa Cys. pošto Abu prostorno podseća na Cys (-SH grupa Cys je zamenjena sa -CH3 u Abu), mutirani ValRS takođe inkorporira Abu u proteinima kada ovaj mutirani Escherichia coli raste u prisustvu Abu. Analiza masenom spektrometrijom pokazuje da oko 24% valina je zamenjeno sa Abu na svakoj poziciji valina u nativnom proteinu.
[0438] Metode sinteze u čvrstoj fazi i semisintetske metode su takođe omogućile sintezu određenog broja proteina koji sadrže nove aminokiseline. Na primer, videti sledeće publikacije i reference citirane u njima, koje su kao što sledi: Crick, F.H.C., Barrett, L. Brenner, S. Watts-Tobin, R. Genral nature of the gentic code for proteins. Nature, 192:1227-1232 (1961); Hofmann, K., Bohn, H. Studies on polypeptids. XXXVI. The effect of pyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment, J. Am Chem, 88(24):5914-5919 (1966); Kaiser, E.T. Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes, Acc Chem Res, 22:47-54 (1989); Nakatsuka, T., Sasaki, T., Kaiser, E.T. Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin, J Am Chem Soc, 109:3808-3810 (1987); Schnolzer, M., Kent, S B H. Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides: backbone-engineered HIV protease, Science, 256(5054):221-225 (1992); Chaiken, I.M. Semisynthetic peptids and proteins, CRC Crit Rev Biochem, 11(3):255-301 (1981); Offord, R.E. Protein engineering by chemical means? Protein Eng., 1(3):151-157 (1987); i, Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells, J.A. A Designed Peptide Ligase for Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues, Science, 266(5183):243 (1994).
[0439] Hemijska modifikacija je korišćena da se uvedu razni neprirodni bočni lanci, uključujući kofaktore, spin oznake i oligonukleotidi u proteine in vitro. Videti, npr., Corey, D.R., Schultz, P.G. Generation of a hybrid sequencespecific single-stranded deoxyribonuclease, Science, 238(4832): 1401-1403 (1987); Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. The chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem, 54:565-595 (1985); Kaiser, E.T., Lawrence, D.S. Chemical mutation of enyzme active sites, Science, 226(4674):505-511 (1984); Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E. Properties of thiol-subtilisin, J Biol. Chem, 243(24):6392-6401 (1968); Polgar, L. et M.L. Bender. A new enzyme containing a synthetically formed active site. Tiol-subtilisin. J. Am Chem Soc, 88:3153-3154 (1966); i, Pollack, S.J., Nakayama, G. Schultz, P.G. Introduction of nukleofils and spectroscopic probes into antibody combining sites, Science, 242(4881):1038-1040 (1988).
[0440] Alternativno, biosintetske metode koje koriste hemijski modifikovane aminoaciltRNK kiseline su primenjene da se inkorporiraja nekoliko biofizičkih proba u proteine sintetisane in vitro. Videti sledeće publikacije i reference citirane u njima: Brunner, J. New Photolabeling and crosslinking methods, Annu. Rev Biochem, 62:483-514 (1993); i, Krieg, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E. Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle, Proc. Natl. Acad. Sci, 83(22):8604-8608 (1986).
[0441] Prethodno, pokazano je da neprirodne aminokiseline mogu biti inkorporirane sna odreženo mesto u proteine in vitro dodavanjem hemijski aminoacilovanih supresorskih tRNK kiselina u reakciju sinteze proteina programiranih genom koji sadrže željenu ćilibar nonsens mutaciju. Korišćenjem ovih pristupa, mogu se supstituisati brojne od uobičajenih dvadeset aminokiselina sa bliskom strukturnim homolozima, npr., fluorofenilalanin za fenilalanin, primenom sojeva auksotropnih za određenu aminokiselina. Videti, npr., Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science, 244: 182-188 (1989); M.W. Nowak,et al., Science 268:439-42 (1995); Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J. Am Chem Soc, 111:8013-8014 (1989); N. Budisa C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins, Methods in Enz., vol.202, 301-336 (1992); i, Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct. 24, 435-62 (1995).
[0442] Na primer, supresorska tRNK je pripremljena koja prepoznaje stop kodon UAG i hemijski je aminoacilovana sa neprirodnom aminokiselinom. Konvencionalne mutagenze specifične za mesto su primenjene da se uvede stop kodon TAG, na mestu od interesa u u genu proteina. Videti, npr., Sayers, J.R., Schmidt, W. Eckstein, F. 5'-3' Exonucleases in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802 (1988). Kada se kombinuju acilovana supresorska tRNK i mutirani gen u in vitro transkripcionom/translacionom sistemu, neprirodna aminokiselina se inkorporira kao odgovora na UAG kodon koji je dao protein koji sadrži tu aminokiselinu na određenoj poziciji. Eksperimenti primenom [<3>H]-Phe i eksperimenti sa α-hidroksi kiselinama su demonstrirali da je samo željena aminokiselina inkorporirana na položaju koju je odredio UAG kodon i da ova aminokiselina nije inkorporirana na bilo kom drugom mestu u proteinu. Videti, npr., Noren, et al, supra; Kobayashi et al., (2003) Nature Structural Biology 10(6):425-432; and, Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G. Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science, 255(5041):197-200 (1992).
[0443] tRNK može da se aminoaciluje željenom aminokiselinom bilo kojom metodom ili tehnikom, uključujući ali bez ograničenja na, hemijsku ili enzimsku aminoacilaciju tRNK.
[0444] Aminoacilacija se može postići aminoacil tRNK sintetazom ili drugim enzimskim molekulima, uključujući ali nije ograničeno na, ribozimima. Termin "ribozim" je zamenljiv sa "katalitička RNK." Cech i saradnici (Cech, 1987, Science, 236:1532-1539; McCorkle et al., 1987, Concepts Biochem.64:221-226) su demonstrirali prisustvo RNK kiselina koje se javljaju u prirodi koji imaju ulogu katalizatora (ribozimi). Međutim, iako se pokazalo da ovi prirodni RNK katalizatori deluju samo na supstratima ribonukleinske kiseline radi cepanja i spajanja, nedavni razvoj veštačke evolucije ribozima je proširio repertoar katalize na razne hemijske reakcije. Studije su identifikovale RNK molekule koji mogu da kaltalizuju aminoacil-RNA veze na svojim (2')3'-terminusima (Illangakekare et al., 1995 Science 267:643-647), a RNK molekul koji može preneti aminokiselinu iz jednog molekula RNK u (Lohse et al., 1996, Nature 381:442-444).
[0445] Objava američke prijave patenta 2003/0228593, opisuje metode za konstrukciju ribozima i njihovu primenu u aminoacilaciji tRNK kiselina sa prirodno kodiranim i neprirodno kodiranim aminokiselinama. Oblici imobilizovani na supstratu enzimskih molekula koji mogu da aminoaciluju tRNK kiseline, uključujući ali nije ograničeno na, ribozime, mogu omogućiti efikasno afinitetno prečišćavanje aminoacilovanih proizvoda. Primeri pogodnih supstrata uključuju agarozu, sefarozu, i magnetne kuglice. Proizvodnja i primena oblika imobilizovanih na supstratu ribozima za aminoacilaciju je opisana u Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084 i objavi američka prijave patenta 2003/0228593.
[0446] Metode hemijske aminoacilacije uključuju, ali nisu ograničene na, one koje su pretstavili Hecht i saradnici (Hecht, S. M. Acc. Chem. Res.1992, 25, 545; Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C.; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254; Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem.1978, 253, 4517) i Schultz, Chamberlin, Dougherty i drugi (Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.
1995, 34, 621; Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc.1991, 113, 2722; Noren, C. J.; Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C.; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182; Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chćilibarlin, A. R. J. Am. Chem. Soc.1989, 111, 8013; Bain, J. D. et al. Nature 1992, 356, 537; Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol.1997, 4, 740; Turcatti, et al. J. Biol. Chem.1996, 271, 19991; Nowak, M. W. et al. Science, 1995, 268, 439; Saks, M. E. et al. J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169; Hohsaka, T. et al. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34) da se izbegne primena sintetaza u aminoacilaciji. Te metode ili druge hemijske metode aminoacilacije mogu se primeniti da se aminoaciluju tRNK molekuli.
[0447] Metode za generisanje katalitičke RNA mogu uključiti generisanje zasebnih pulova nasumičnih sekvenci ribozima, izvođenje usmerene evolucije na pulovima, skrining pulova za željenu aktivnost aminoacilacije, i selektovanje sekvenci ovih ribozima koji ispoljavaju željenu aktivnost aminoacilacije.
[0448] Ribozimi mogu da sadrže motive i/ili regione koji olakšavaju acilacionu aktivnost, kao što je GGU motiv i U-bogat region. Na primer, prijavljeno je da U-bogati regioni mogu olakšati prepoznavanje supstrata aminokiseline, a GGU-motiv može formirati bazne parove sa 3'-terminusima tRNK. U kombinaciji, GGU i motiv i U-bogati region olakšavaju istovremeno prepoznavanje i aminokiselina i tRNK istovremeno, i na taj način olakšavaju aminoacilaciju od 3'-terminusa tRNK.
[0449] Ribozimi se mogu generisati in vitro selekcijom primenom parcijalno randomizovanog r24mini konjugovanog sa tRNK<Asn>CCCG, praćeno sistematskim inženjeringom konsenzusne sekvence pronađena u aktivnim klonovima. Primer ribozima dobijenog ovom metodom se naziva "Fx3 ribozim" i opisan je opisani u objavi američke prijave br.2003/0228593 deluje kao svestrani katalizator za sintezu raznih aminoacil-tRNK kiselina punjenih sa srodnom ne-prirodnim aminokiselinama.
[0450] Imobilizacija na supstratu može se koristiti da se omogući efikasno afinitetno prečišćavanje aminoacilovanih tRNK. Primeri pogodnih supstrata uključuju, ali nisu ograničeni na, agarozu, sefarozu i magnetne kuglice. Ribozimi se mogu imobilizovati na smolama koristeći prednosti hemijske strukture RNK, kao što je 3-cis-diol na ribozi RNK koji može da se oksiduje perjodatom da bi se dobio odgovarajući dialdehid da bi se olakšala imobilizacija RNK na smoli. Mogu se koristiti različite vrste smola, uključujući jeftine hidrazidne smole pri čemu reduktivna aminacija preuzrokuje interakciju između smole i nepovratnog povezivanja ribozima je veza. Sinteza aminoacil-tRNK se može značajno olakšati ovom tehnikom aminoacilacije na koloni. Kourouklis et al. Methods 2005; 36:239-4 opisuju sistem aminoacilacije zasnovan na koloni.
[0451] Izolovanje aminoacilovanih tRNK može se postići na razne načine. Jedna pogodna metoda je da se eluira aminoacilovane tRNK iz kolone sa puferom kao što je rastvor natrijum acetata sa 10 mM EDTA, pufer koji sadrži 50 mM N-(2-hidroksietil)piperazin-N'-(3-propansulfonske kiseline), 12.5 mM KCl, pH 7.0, 10 mM EDTA, ili jednostavno EDTA puferovanom vodom (pH 7.0).
[0452] Aminoacilovane tRNK mogu se dodati u translacione reakcije da bi se inkorporirala aminokiselina sa kojom je tRNK aminoacilovana u pozicija od izbora u polipeptidu dobijenom translacionom reakcijom. Primeri translacionih sistema u kojima aminoacilovane tRNK predmetnog pronalaska se mogu primeniti uključuju, ali nisu ograničeni na ćelijske lizate. Ćelijski lizati omogućavaju reakcione komponente neophodne za in vitro translaciju polipeptida iz izlazne mRNK. Primeri tih reakcionih komponenti uključuju ali nisu ograničeni na ribozomalne proteine, rRNA, aminokiseline, tRNK kiseline, GTP, ATP, faktore inicijacije i elongacije translacije i dodatne faktore koji su povezani sa translacijom. Dodatno, translacioni sistemi mogu biti serijske translacije ili kompartmentalizacione translacije. Serijski translacioni sistemi kombinuju reakcione komponente u pojedinačnim kompartmentima dok kompartmentalizacione translacioni sistemi odvajaju reakcione komponente translacije od reakcionih proizvoda koji mogu da inhibiraju efikasnost translacije. Takvi translacioni sistemi SU dostupne komercijalno.
[0453] Dalje, spregnut transkripcioni/translacioni sistem se može primeniti. Spregnuti transkripcioni/translacioni sistemi omogućavaju i transkripciju izlazne DNK u odgovarajućoj RNK, koje se zauzvrat translatuje reakcionim komponentama. Primer komercijalno dostupne spregnute transkripcije/translacije je Rapid Translation System (RTS, Roche Inc.). Sistem uključuje smešu koja sadrži lizat E. coli za obezbeđivanje translacionih komponenti kao što su ribozomi itranslacioni factori. Pored toga, RNK polimeraza je uključuna u transkripciju izlazne DNK u mRNK templejt za primenu u translaciji. RTS može koristiti kompartmentalizaciju reakcionih komponenti pomoću membrane koja je smeštena između reakcionih kompartmenta, uključujući kompartment za snabdevanje/otpatke i kompartment za transkripciju/translaciju.
[0454] Aminoacilacija tRNK može se izvesti sa drugim agensima, uključujući ali nije ograničeno na, transferaze, polimeraze, katalitička antitela, multi-funkcionalne proteine, i slično.
[0455] Stephan in Scientist 10. oktobar 2005; strane 30-33 opisuje dodatne metode za inkorporiranje ne-prirodno kodiranih aminokiselina u proteine. Lu et al. u Mol Cell. Oktobar 2001;8(4):759-69 opisuje metodu u kojoj se protein hemijski vezuje za sintetski peptid koji sadrži neprirodne aminokiseline (izražena proteinska ligacija).
[0456] Tehnike mikroinjekcije su takođe korišćene da se inkorporiraju neprirodne aminokiseline u proteine. Videti, npr.M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty iH. A. Lester, Science, 268:439 (1995); i, D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol., 4:645 (2000). Oocit ksenopusa (Xenopus) je injektovan zajedno sa dve RNK vrste napravljene in vitro: mRNK koja kodira ciljni protein sa UAG stop kodonom na aminokiselinskoj poziciji od interesa i ćilibar supresorsku tRNK aminoacilovana sa željenom neprirodnom aminokiselinom. Translaciona mašnerija oocita zatim umeće neprirodnu aminokiselinu na poziciju koji je odredio UAG. Ova metoda je omogućila in vivo studije strukture-funkcije integralnih membranskih proteina, koji generalno nisu podložni in vitro ekspresijskim sistemima. Primeri uključuju inkorporiranje fluorescentne aminokiseline u tahikinin neurokinin-2 receptoru za merenje udaljenosti transfera fluorescentne rezonantne energije, videti, npr., G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel i A. Chollet, J. Biol. Chem., 271:19991 (1996); inkorporacija biotinilovanih aminokiselina da se identifikuju površinski izloženi ostaci u jonskim kanalima, videti, npr., J. P. Gallivan, H. A. Lester i D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); primena zarobljenih analoga tirozina za praćenje konformacijskih promena u jonskim kanalima u realnom vremenu, videti, npr., J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty i H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998); i, primena alfa hidroksi aminokiselina da se promene osnove jonskih kanala za sondiranje njihovih gejting mehanizama. Videti, npr., P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty i H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999); i, T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz iJ. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001).
[0457] Sposobnost da se neprirodne aminokiseline direktno inkorporiraju u proteine in vivo nudi širok opseg prednosti uključujući ali nije ograničeno na, visoke prinose mutiranih proteina, tehničku lakoću, potencijal za proučavanje mutiranih proteina u ćelijama ili eventualno u živim organizmima i primena ovih mutiranih proteina u terapijskim tretmanima i dijagnostičkim primenama. Sposobnost uključivanja neprirodnih aminokiselina različitih veličina, kiselosti, nukleofilnosti, hidrofobnosti i drugih svojstava u proteine može u velikoj meri proširiti našu sposobnost racionalnog i sistematskog manipulisanja strukturama proteina, i za sondiranje proteinskih funkcija i stvaranje novih proteina ili organizama sa novim svojstva.
[0458] U jednom pokušaju da se mesto-specifično inkorporira para-F-Phe, ćilibar supresor tRNKPheCUA /fenilalanil-tRNK sintetaza par kvasca je primenjen u p-F-Phe rezistentnom, Phe-auksotrofnom soju Escherichia coli. Videti, npr., R. Furter, Protein Sci., 7:419 (1998).
[0459] Takođe može biti moguće dobiti ekspresiju relaksin polinukleotida predmetnog pronalaska korišćenjem ćelijskog (in vitro) translacionog sistema. Translacioni sistemi mogu biti ćelijski ili bez ćelije, a mogu biti prokariotski ili eukariotski. Ćelijski translacioni sistemi uključuju, ali nisu ograničeni na, preparate celih ćelija kao što je permeabilise ćelije ili ćelijske kulture pri čemu se željena sekvenca nukleinskih kiselina može transkribovati u mRNK i mRNK translatovati. Translacioni sistemi bez ćelija su komercijalno dostupni i mnogi različiti tipovi i sistemi su dobro poznati. Primeri sistema bez ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, prokariotske lizate, kao što su lizati Escherichia coli, i eukariotske lizate kao što su ekstrakti pšeničnih klica, lizati ćelija insekata, lizati zečijih retikulocita, lizati zečijih oocita i lizati humanih ćelija. Eukariotski ekstrakti ili lizati mogu biti poželjni kada je dobijeni protein glikozilovan, fosforilovan ili na drugačije modifikovan jer su mnoge takve modifikacije moguće samo u eukariotskim sistemima. Neki od ovih ekstrakata i lizata su dostupni komercijalno (Promega; Madison, Wis.; Stratagen; La Jolla, Calif.; Amersham; Arlington Heights, Ill.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y.). Ekstrakti membrana, kao što su pseći pankreasni ekstrakti koji sadrže mikrozomalne membranee, su takođe dostupni koji se koriste za translaciju sekretornih proteina. U ovim sistemima, koji mogu uključivati ili mRNK kao templejt (in-vitro translacija) ili DNK kao templejt (kombinovana in-vitro transkripcija itranslacija), in vitro sinteza je usmerena ribozomima. Znatan napor je uložen u razvoj sistema za ekspresiju proteina bez ćelija. Videti, npr., Kim, D.M. i J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 74 :309-316 (2001); Kim, D.M. i J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000); Kim, D.M., i J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000); Kim, D.M., i J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999); i Patnaik, R. i J.R. Swartz, Biotechniques 24, 862-868, (1998); američki patent br. 6,337,191; objavu američke prijave patenta br.
2002/0081660; WO 00/55353; WO 90/05785. Sledeći approach koji se može primeniti mogu za eksprimiranje polipeptida relaksina koji sadrže ne-prirodno kodiranu aminokiselinu uključuju tehniku fuzije mRNK-peptida. Videti, npr., R. Roberts i J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) 94:12297-12302 (1997); A. Frankel, et al., Chemistry & Biology 10:1043-1050 (2003). U ovom pristupu, mRNK templejt povezan sa puromicinom je translatovan u peptid na ribozomu. Ako je jedan ili više tRNK molekula modifikovano, ne-prirodna aminokiseline se može takođe inkorporirati u peptid. Nako što se oslednji mRNK kodon pročita, puromicin hvata C-terminus peptida. Ako je za rezultujući mRNKpeptid konjugat pronađeno da ima interesantna svojstva pri in vitro ispitivanju, njegov identitet se može lako otkriti iz mRNK sekvence. Na ovaj način, mogu se prikazati biblioteke polipeptida relaksina koji sadrže jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina radi identifikacije polipeptida koji imaju željena svojstva. U skorije vreme, in vitro translacije ribosoma sa prečišćenim komponentama koje omogućavaju sintezu supstituiranih peptida sa ne-prirodno kodiranim aminokiselinama su prijavljene. Videti, npr., A. Forster et al., Proc. Natl Acad. Sci. (SAD) 100:6353 (2003).
[0460] Rekonstruisani translacioni sistemi se takođe mogu primeniti. Smeše prečišćenih translacionih faktora se uspešno koriste za translaciju mRNK u protein kao i kombinacije lizata ili lizata dopunjenih prečišćenim translacionim faktorima kao što su faktor inicijacije-1 (IF-1), IF-2, IF-3 (α ili β), faktor elongacije T (EF-Tu), ili terminacioni faktori. Sistemi bez ćelija mogu takođe biti združeni transkripcioni/translacioni sistemi gde se DNK uvodi u sistem, transkribovana u mRNK i mRNK translatovana kao što je opisano u Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. izdavači, Wiley Interscience, 1993). RNK transkribovana u eukariotski transkripcioni sistem može biti u obliku heteronuklearne RNK (hnRNk) ili 5'-kraja kapica (7-metil guanozin) i 3'-kraja zrele mRNK sa poli A repom, koja može biti prednost u određenim translacionim sistemima. Na primer, mRNK kiseline sa kapicama se translatuju sa visokom efikasnošću u sistem lizata retikulocita.
Makromolekularni polimeri povezani sa relaksinskim polipeptidima
[0461] Razne modifikacije polipeptida ne-prirodnih aminokiselina ovde opisane mogu se izvršiti korišćenjem kompozicija, metoda, tehnika i strategija ovde opisanih. Ove modifikacije uključuju inkorporaciju dalje funkcionalnosti na ne-prirodnoj aminokiselinskoj komponenti polipeptida, uključujući, ali bez ograničenja, oznaku; boju; polimer; polimer rastvorljiv u vodi; derivat polietilen glikola; fotoumreživač; radionuklid; citotoksično jedinjenje; lek; oznaku afiniteta; oznaku fotoafiniteta; reaktivna jedinjenja; smolu; drugi protein ili polipeptid ili analog polipeptida; antitelo ili fragment antitela f; a metalni helator; kofaktor; masnu kiselina; ugljovodonik; polinukleotid; DNK; RNK; antisens polinukleotid; saharid; dendrimer rastvorljiv u vodi; ciklodekstrin; inhibitorna ribonukleinska kiselina; biomaterijal; nanočestica; spin oznaka; fluorofor, segment koji sadrži metal; radioaktivni segment; nova funkcionalna grupa; grupa koja kovalentno ili nekovalentno intereaguje sa drugim molekulmai; fotoosetljiv segment; segment sa mogućnošću aktinske radijacije; segment sa mogućnošću fotoizomerizacije; biotin; derivat biotina; analog biotina; segment koji sadrži težak atom; grupu koja se može hemijski ocepiti; grupu koja se može foto ocepiti; izduženi bočni lanac; ugljenik-povezan sa šećerom; redoks-aktivni agens; amino tiokiselina; toksični segment; izotopno obeležen segment; biofizičku probu; fosforescentnu grupu; hemiluminiscentnu grupu; elektron gustu grupu; magnetnu grupu; interkalirajuću grupu; hromofor; agens za transfer energije; biološki aktivni agens; detektibilnu oznaku; mali molekul; kvantnu tačku; nanotransmiter; radionukleotid; radiotransmiter; agens za hvatanje neutrona ili bilo koja kombinacija gornjih, ili bilo koja druge poželjna jedinjenja ili substanca. Kao ilustrativni, neograničavajući primer kompozicija, metoda, tehnika i strategija ovde opisanih, sledeći opis će se fokusirati na dodavanje makromolekularnih polimera ne-prirodnom aminokiselinskom polipeptidu uz razumevanje da kompozicije, metode, tehnike i strategije opisane u njima su takođe primenljive (uz odgovarajuće modifikacije, ako su potrebne i koje bi prosečan poznavalac u oblasti tehnike mogao da napravi sa objavom koja je ovde) za dodavanje drugih funkcionalnosti, uključujući, ali ne ograničavajući se na gore navedene.
[0462] Širok spektar makromolekularnih polimera i drugih molekula može biti povezan sa polipeptidima relaksina predmetnog pronalaska radi modulacije bioloških svojstava polipeptida relaksina i/ili pružanja novih bioloških svojstava molekula relaksina. Ovi makromolekularni polimeri mogu biti povezani sa polipeptidom relaksina preko prirodno kodirane aminokiseline, preko ne-prirodno kodirane aminokiseline ili bilo kojeg funkcionalnog supstituenta prirodne ili ne-prirodne aminokiseline, ili bilo kojeg supstituenta ili funkcionalne grupe dodate prirodnoj ili ne-prirodnoj aminokiselini. Molekulska masa polimera može biti širokog raspona, uključujući, ali bez ograničenja na, između oko 100 Da i oko 100,000 Da ili više. Molekulska masa polimera može biti između oko 100 Da i oko 100,000 Da, uključujući ali nije ograničeno na, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, i 100 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulsak masa polimera je između oko 100 Da i oko 50,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa polimera je između oko 100 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa polimera je između oko 1,000 Da and oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa polimera je između oko 5,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa polimera je između oko 10,000 Da i oko 40,000 Da.
[0463] Predmetni pronalazak obezbeđuje suštinski homogene preparate polimer:protein konjugata. "Suštinski homogen" kao što je korišćeno ovde označava da je uočeno da su molekuli polimer:protein konjugata molekuli već nego polovina ukupnog proteina. Ppolimer:protein konjugat ima biološku aktivnost a predmetni "suštinski homogeni" preparati PEGilovanog polipeptida relaksina obezbeđeni ovde su oni koji su dovoljno homogeni da ispolje prednosti homogenog preparata, npr., jednostavnost u kliničkoj primeni u predvidljivosti puno do puno farmakokinetike.
[0464] Takođe se može izabrati da se pripremi smeša molekula polimer:protein konjugata, a prednost koja je ovde obezbeđena je ta što se može odabrati udeo mono-polimer:protein konjugata koji će biti uključen u smešu. Prema tome, po želji, može se pripremiti smeša različitih proteina sa različitim brojem vezanih polimernih segmenata (tj., di-, tri-, tetra-, itd.) i kombinovati navedene konjugate sa mono-polimer:protein konjugaton pripremljenim korišćenjem metode predmetnog pronalaska, i imati smeša sa unapred određenim udelom mono-polimer:protein konjugata.
[0465] Odabrani polimer može biti rastvorljiv u vodi tako da se protein na koji je vezan ne taloži u vodenom okruženju, kao što je fiziološko okruženje. Polimer može biti razgranat ili nerazgranat. Za terapijsku primenu preparata krajnjeg proizvoda, polimer će biti farmaceutski prihvatljiv.
[0466] Primeri polimera uključuju ali nisu ograničeni na polialkil etre i alkoksi-kaptirani analozi istih (npr., polioksietilen glikol, polioksietilen/propilen glikol, i metoksi ili etoksikaptirani analozi istih, naročito polioksietilen glikol, potonji je takođe poznat kao polietilenglikol ili PEG); polivinilpirolidoni; polivinilalkil etri; polioksazolini, polialkil oksazolini i polihidroksialkil oksazolini; poliakrilamidi, polialkil akrilamidi, i polihidroksialkil akrilamidi (npr., polihidroksipropilmetakrilamid i njegovi derivati); polihidroksialkil akrilati; polisalicilne kiseline i njeni analozi; hidrofilne peptidne sekvence; polisaharidi i njihovi derivati, uključujući dekstran i derivate dekstrana, npr., karboksimetildekstran, dekstran sulfate, aminodekstran; celulozu i njene derivate, npr., karboksimetil celulozu, hidroksialkil celuloze; hitin i njegove derivate, npr., hitozan, sukcinil hitozan, karboksimetilhitin, karboksimetilhitozan; hijaluronsku kiselinu i njene derivate; skrobove; alginate; hondroitin sulfat; albumin; pululan i karboksimetil pululan; poliaminokiseline i njihove derivate f, npr., poliglutaminske kiseline, polilizine, poliasparaginske kiseline, poliaspartamide; maleinske anhidrid kopolimere kao što su: stiren maleinski anhdrid kopolimer, diviniletil etar malenski anhidrid kopolimer; polivinil alkohole; njihove kopolimere; njihove terpolimere; njihove smeše; i derivate iznad navedenih.
[0467] Proporcija molekula polietilen glikola u odnosu na molekule proteina će varirati, kao što će i njihove koncentracije u reakcionoj smeši, Generalno, optimalan odnos (u smislu efikasnosti reakcije u kojoj postoji minimalan višak nereagovalog proteina ili polimera) može se odrediti molekulskom masom odabranog polietilen glikola i brojem dostupnih reaktivnih grupa na raspolaganju. Što se tiče molekulske mase, obično je veća molekulska masa polimera, manji broj molekula polimera koji mogu biti vezani za protein. Slično tome, grananje polimera treba uzeti u obzir prilikom optimizacije ovih parametara. Obično, što je veća molekulska masa (ili više grana) veći je odnos polimer:protein.
[0468] Kao što je korišćeno ovde, i pri razmatranju konjugata PEG: polipeptid relaksina, termin "terapijski efikasna količina" se odnosi na količinu koja pacijentun daje željenu korist. Količina će varirati od jednog do drugog i zavisiće od brojnih faktora, uključujući sveukupno fizičke stanje pacijenta i osnovni uzrok stanja koje se mora lečiti. Količina polipeptida relaksinakorišćena za terapiju daje prihvatljivu brzinu promene i održava željeni odgovor na korisnom nivou. Terapijski efikasnu količinu ovih kompozicija može lako utvrditi prosečan poznavalac u oblasti tehnike koristeći javno dostupne materijale i procedure.
[0469] Polimer rastvorljiv u vodi može biti bilo kojeg strukturnog oblika uključujući ali nije ograničeno na linearni, rašljast ili razgranat. Tipično, polimer rastvorljiv u vodi je poli(alkilen glikol), kao što je poli(etilen glikol) (PEG), ali drugi polimeri rastvorljivi u vodi mogu se takođe koristiti. Kao primer, PEG se koristi da opiše određena tehnička rešenja ovog pronalaska.
[0470] PEG je dobro poznat, u vodi rastvorljiv polimer koji je komercijalno dostupan ili se može pripremiti polimerizacijom otvaranja-prstena etilen glikola, metodama poznatim prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike (Sandler i Karo, Polimer Synthesis, Academic Press, Njujork, tom.3, strane 138-161). Termin "PEG" se široko koristi da obuhvata bilo koji molekul polietilen glikola, bez obzira na veličinu ili modifikaciju na kraju PEG-a, i može se predstaviti kao povezan sa polipeptidom relaksina pomoću formule:
XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y
gde je n 2 do 10,000 i X je H ili terminalna modifikacija, uključujući ali nije ograničeno na, C1-4alkil, zaštitnu grupa, ili terminalnu funkcionalnu grupu.
[0471] U nekim slučajevima, PEG primenjen u pronalasku završava se na jednom kraju sa hidroksi ili metoksi, tj., X je H ili CH3("metoksi PEG"). Alternativno, PEG se može završiti reaktivnom grupom, formirajući time bifunkcionalni polimer. Tipične reaktivne grupe mogu da uključuju one reaktivne grupe koje se uobičajeno koriste da reaguju sa funkcionalnim grupama koje se nalaze u 20 uobičajenih aminokiselina (uključujući ali nije ograničeno na, maleimid grupe, aktivirane karbonate (uključujući ali nije ograničeno na, pnitrofenil estar), aktivirane estre (uključujući ali nije ograničeno na, N-hidroksisukcinimid, p-nitrofenil estar) i aldehide) kao i funkcionalne grupe koje su inertne za 20 uobičajenih aminokiselina ali reaguju konkretno sa komplementarnim funkcionalnim grupama prisutnim u ne-prirodno kodiranim aminokiselinama (uključujući ali nije ograničeno na, azid grupe, alkin grupe). Notirano je da će se drugi kraj PEG-a, koji je u gornjoj formuli prikazan sa Y, vezati ili direktno ili indirektno za polipeptid relaksina preko aminokiselina koje se javljaju u prirodi ili ne-prirodno kodiranih. Na primer, Y može biti amid, karbamat ili urea povezivanje za amin grupu (uključujući ali nije ograničeno na, epsilon amin lizina ili N-terminus) polipeptida. Alternativno, Y može biti maleimid povezivanje za tiol grupu (uključujući ali nije ograničeno na, tiol grupu cisteina). Alternativno, Y može biti povezivanje za ostatak koji nije uobičajeno dostupan 20 uobičajenih aminokiselina. Na primer, azid grupa na PEG-u može da reaguje sa alkin grupom na polipeptidu relaksina da formira proizvod Huisgen-ove [3+2] cikloadicije. Alternativno, alkin grupa na PEG-u može da reaguje sa azid grupom prisutnom u ne-prirodno kodiranoj aminokiselini da formira sličnan proizvod. U nekim tehničkim rešenjima, jak nukleofil (uključujući ali nije ograničeno na, hidrazin, hidrazid, hidroksilamin, semikarbazid) može da reaguje sa aldehid ili keton grupom prisutnom u ne-prirodno kodiranoj aminokiselini da formira hidrazon, oksim ili semikarbazon, prema potrebi, koji u nekim slučajevima može biti dalje redukovan tretiranjem pogodnim redukcionim sredstvom. Alternativno, jak nukleofil može se inkorporirati u polipeptid relaksina pomoću ne-prirodno kodirane aminokiseline i koristiti da reaguje prvenstveno sa keton ili aldehid grupom prisutnom u polimeru rastvorljivom u vodi.
[0472] Bilo koja molekulska masa PEG-a može se koristiti kao praktično poželjna, uključujući ali nije ograničeno na, od oko 100 Daltona (Da) do 100,000 Da ili više po želji (uključujući ali nije ograničeno na, ponekad 0.1-50 kDa ili 10-40 kDa). Molekulska masa PEG-a može biti u širokom opsegu, uključujući ali nije ograničeno na, između oko 100 Da i oko 100,000 Da ili više. PEG može biti između oko 100 Da i oko 100,000 Da, uključujući ali nije ograničeno na, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, i 100 Da. U nekim tehničkim rešenjima, PEG je između oko 100 Da i oko 50,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, PEG je između oko 100 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, PEG je između oko 1,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, PEG je između oko 5,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, PEG je između oko 10,000 Da i oko 40,000 Da. Razgranat lanac PEG-a, uključujući ali nije ograničeno na, PEG molekule sa svakmi lancem koji ima MM (MW) koja varira 1-100 kDa (uključujući ali nije ograničeno na, 1-50 kDa ili 5-20 kDa) može se takođe koristiti. Molekulska masa svakog lanca razgranatog lanca PEG-a može biti, uključujući ali nije ograničeno na, između oko 1,000 Da i oko 100,000 Da ili više. Molekulska masa svakog lanca PEG razgranatog lanca može biti između oko 1,000 Da i oko 100,000 Da, uključujući ali nije ograničeno na, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, i 1,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa svakog lanca PEG razgranatog lanca je između oko 1,000 Da i oko 50,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa svakog lanca PEG razgranatog lanca je između oko 1,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa svakog lanca PEG razgranatog lanca je između oko 5,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa svakog lanca PEG razgranatog lanca je između oko 5,000 Da ioko 20,000 Da. Širok spektar PEG molekula je opisan u, uključujući ali nije ograničeno na, Shearwater Polymers, Inc. catalog, Nektar Therapeutics catalog.
[0473] Obično, najmanje jedan terminus molekula PEG-a je dostupan za reakciju sa neprirodo-kodiranom aminokiselinom. Na primer, derivati PEG-a koji ima alkin i azid segmente za reakciju sa bočnim lancima aminokiselina mogu se primeniti da vežu PEG za ne-prirodno kodirane aminokiseline kao što je ovde opisano. Ako ne-prirodno kodirana aminokiselina sadrži azid, onda će PEG tipično da sadrži ili alkin segment da utiče na formiranje proizvoda [3+2] cikloadicije ili aktivirane PEG vrste (tj., estra, karbonata) koji sadrže fosfin grupu da utiče na formiranje amid povezivanja. Alternativno, ako ne-prirodno kodirane aminokiseline adrže alkin, onda će PEG tipično da sadrži azid segment da utiče na formiranje proizvoda [3+2] Huisgen-ove cikloadicije. Ako ne-prirodno kodirana aminokiselina sadrži karbonil grupu, PEG će tipično da sadrži potentni nukleofil (uključujući ali nije ograničeno na, hidrazid, hidrazin, hidroksilamin, ili semikarbazid funkcionalnost) da bi se formirala odgovarajući hidrazon, oksim, i semikarbazon povezivanja, redom. U drugim alternativama, može se koristiti obrnuta orjentacija reaktivnih grupa koje su iznad opisane, tj., azid segment u ne-prirodno kodiranoj aminokiselini može da reaguje sa PEG derivatom koji sadrži alkin.
[0474] U nekim tehničkim rešenjima, varijanta polipeptida relaksina varijanta sa PEG derivatom sadrži hemijsku funkcionalnost koja je reaktivna sa hemijskom funkcionalnošću prisutnoj na bočnom lancu ne-prirodno kodirane aminokiseline.
[0475] Pronalazak obezbeđuje u nekim tehničkim rešenjima polimerne derivate koji sadrže azide i acetilen koji sadrže osnovu polimera rastvorljivu u vodi koja ima prosečnu molekulsku masu od oko 800 Da do oko 100,000 Da. Osnova polimera vodo-rastvorljivog polimera može biti poli(etilen glikol). Međutim, treba razumeti da širok spektar polimera rastvorljivih u vodi uključujući ali nije ograničeno na poli(etilen)glikol i druge srodne polimere, uključujući poli(dekstran) i poli(propilen glikol), su takođe pogodni za primenu u izvođenju ovog pronalaska i da upotreba termina PEG ili poli(etilen glikol) predviđeno je da obuhvati i uključi sve takve molekule. Termin PEG uključuje, ali nije ograničen na, poli(etilen glikol) u bilo kojem od svojih oblika, uključujući bifunkcionalni PEG, multigranat PEG, derivatizovan PEG, rašljasti PEG, razgranat PEG, viseći PEG (tj. PEG ili srodni polimeri koji imaju jednu ili više funkcionalnih grupas koje vise sa osnove polimera), ili PEG sa razgradivim povezivanjima u njemu.
[0476] PEG je obično bistar, bezbojan, bez mirisa, rastvorljiv u vodi, stabilan na toplotu, inertan na mnoge hemijske agense, ne hidrolizuje ili propada i obično je netoksičan. Poli(etilen glikol) se smatra biokompatibilnim, što znači da je PEG sposoban da koegzistencira sa živim tkivima ili organizmima bez da nanosi štetu. Konkretnije, PEG je suštinski ne-imunogeni, što znači da PEG nema tendenciju da proizvodi imunološki odgovor u telu. Kada se veže na molekul koji ima neku poželjnu funkciju u telu, kao što je biološki aktivno sredstvo, PEG teži maskiranju sredstva i može da smanji ili eliminiše bilo koji imuni odgovor tako da organizam može da toleriše prisustvo agensa. Konjugati PEG obično ne proizvode značajan imuni odgovor ili izazivaju zgrušavanje ili druge neželjene efekte. PEG koji ima formulu -- CH2CH2O--(CH2CH2O)n-- CH2CH2--, gde je n od oko 3 do oko 4000, tipično od oko 20 do oko 2000, je pogodan za primenu u predmetnom pronalasku. PEG koji imaju molekulsku masu od oko 800 Da do oko 100,000 Da su u nekim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska naročito korisni kao osnove polimera. Molekulska masa PEG može biti širokog opsega, uključujući ali nije ograničeno na, između oko 100 Da i oko 100,000 Da ili više. Molekulska masa PEG može biti između oko 100 Da i oko 100,000 Da, uključujući ali nije ograničeno na, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, i 100 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa PEG je između oko 100 Da i oko 50,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa PEG je između oko 100 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa PEG je između oko 1,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa PEG je između oko 5,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulska masa PEG je između oko 10,000 Da i oko 40,000 Da.
[0477] Osnova polimera može biti linearna ili razgranata. Razgranate osnove polimera su obično poznate u oblasti tehnike. Tipično, razgranat polimer ima segment centralnog jezgra grane i mnoštvo linearnih polimernih lanaca povezanih sa centralanim jezgrom grane. PEG se obično koristi u razgranatim oblicima koji se mogu pripremiti dodavanjem etilen oksida raznim poliolima, kao što je glicerol, oligomeri glicerols, pentaeritritol isorbitol. Segment centralne grane može se takođe izvesti od nekoliko aminokiselina, kao što je lizin. Razgranat poli(etilen glikol) može biti predstavljen u opštem obliku kao R(-PEG-OH)mu kojem je R izvedena iz segmenta jezgra, kao što je glicerol, oligomeri glicerola, ili pentaeritritol, a m predstavlja broj krakova. PEG molekuli sa više krakova, kao što su oni opisani u američkim patentima sa brojevima 5,932,462; 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; objavi američke prijave patenta 2003/0143596; WO 96/21469; i WO 93/21259 mogu se takođe primeniti kao osnove polimera.
[0478] Razgranat PEG može takođe biti u obliku rašljastog PEG predstavljenog sa PEG(-YCHZ2)n, gde Y je vezujuća grupa a Z je aktiviran terminalna grupa povezan sa CH pomoću lanca atoma definisane dužine.
[0479] Još jedan razgranat oblik, viseći PEG, ima reaktivne grupe, kao što je karboksil, duž PEG osnove pre nego na kraju PEG lanaca.
[0480] Dodatno ovim oblicima PEG-a, polimer može se takođe pripremiti sa slabim ili razgradivim povezivanjima u osnovi. Na primer, PEG se može pripremiti sa estar povezivanjima u osnovi polimera koji su podvrgnuti hidrolizi. Kao što je prikazano ispod, ova hidroliza rezultuje cepanjem polimera na fragmente niže molekulske mase:
-PEG-CO2-PEG-+H2O → PEG-CO2H+HO-PEG-Razumljivo je od strane prosečnih poznavaoca u oblasti tehnike da termin poli(etilen glikol) ili PEG predstavlja ili uključuje sve oblike poznate u oblasti tehnike uključujući ali nije ograničeno one ovde stavljene na uvid javnosti.
[0481] Mnogi drugi polimeri su takođe pogodni za primenu u predmetnom pronalasku. U nekim tehničkim rešenjima, osnove polimera koje su rastvorljive u vodi, sa od 2 do oko 300 terminusa, su naročito korisni u pronalasku. Primeri pogodnih polimera uključuju, ali nisu ograničeni na, druge poli(alkilen glikole), kao što je poli(propilen glikol) ("PPG"), njegovi kopolimeri (uključujući ali nije ograničeno na kopolimere etilen glikola i propilen glikola), njegove terpolimere, njihove smeše, i slično. Iako molekulika masa svakog lanca osnove polimera može da varira, obično je u opsegu od oko 800 Da do oko 100,000 Da, često od oko 6,000 Da do oko 80,000 Da. Molekulika masa svakog lanca osnove polimera može biti između oko 100 Da i oko 100,000 Da, uključujući ali nije ograničeno na, 100,000 Da, 95,000 Da, 90,000 Da, 85,000 Da, 80,000 Da, 75,000 Da, 70,000 Da, 65,000 Da, 60,000 Da, 55,000 Da, 50,000 Da, 45,000 Da, 40,000 Da, 35,000 Da, 30,000 Da, 25,000 Da, 20,000 Da, 15,000 Da, 10,000 Da, 9,000 Da, 8,000 Da, 7,000 Da, 6,000 Da, 5,000 Da, 4,000 Da, 3,000 Da, 2,000 Da, 1,000 Da, 900 Da, 800 Da, 700 Da, 600 Da, 500 Da, 400 Da, 300 Da, 200 Da, i 100 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulika masa svakog lanca osnove polimera je između oko 100 Da i oko 50,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulika masa svakog lanca osnove polimera je između oko 100 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulika masa svakog lanca osnove polimera je između oko 1,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulika masa svakog lanca osnove polimera je između oko 5,000 Da i oko 40,000 Da. U nekim tehničkim rešenjima, molekulika masa svakog lanca osnove polimera je između oko 10,000 Da and i 40,000 Da.
[0482] Prosečni poznavaoci u oblasti tehnike će prepoznati da gorepomenuta lista za suštinski rastvorljive u vodi osnove ni u kom slučaju nije iscrpna i samo je ilustrativna, i da su svi polimerni materijali koji imaju gore opisane kvalitete za koje se pretpostavlja da su pogodni za primenu u predmetnom pronalasku.
[0483] U nekim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska derivati polimer su "multifunkcionalni", što znači da osnova polimera ima najmanje dva terminusa, i verovatno čak oko 300 terminusa, funkcionalizovanih ili aktiviranih funkcionalnom grupom. Multifunkcionalni derivati polimerni uključuju, ali nisu ograničeni na, linearne polimere koji imaju dva terminusa,
svaki terminus je vezan za funkcionalnu grupu koja može biti ista ili različita.
[0484] U jednom tehničkom rešenju, derivat polimera ima strukturu:
X-A-POLI-B-N=N=N
gde:
N=N=N je azid segment;
B je vezujući segment, koji može biti prisutan ili odsutan;
POLI je ne-antigenski polimer rastvorljiv u vodi;
A je vezujući segment, koja može biti prisutna ili odsutna i koja može biti ista kao B ili različita; i
X je druga funkcionalna grupa.
Primeri vezujućeg segmenta za A i B uključuju, ali nisu ograničeni na, višestrukofunkcionalizovanu alkil grupu koja sadrži do 18, i može da sadrži između 1-10 atoma ugljenika. Heteroatom kao što je azot, kiseonik ili sumpor mogu biti uključeni sa alkil lancem. Alkil lanac može takođe biti razgranat na heteroatomu. Drugi primeru vezujućeg segmenta za A i B uključuju, ali nisu ograničeni na, višestruko funkcionalizovanu aril grupu, koja sadrže do 10 i može da sadrži 5-6 atoma ugljenika. Aril grupa može biti supstituisana sa još jednim atomima ugljenika, azota, kiseonika ili atomima sumpora. Drugi primeri pogodnih vezujućih grupa uključuju one vezujuće grupe opisane u američkim patentima sa brojevima 5,932,462; 5,643,575; i američkom prijavom patenta sa objavom 2003/0143596. Prosečni poznavaoci u oblasti tehnike će prepoznati da gorepomenuta lista za vezujuće segmente ni u kom slučaju nije iscrpna i samo je ilustrativna, i da svi vezujući segmenti koji imaju gore opisane kvalitete se smatraju da su pogodni za primenu u predmetnom pronalasku.
[0485] Primeri pogodnih funkcionalnih grupa za primenu kao X uključuju, ali nisu ograničeni na, hidroksil, zaštićeni hidroksil, alkoksil, aktivni estar, kao što su N-hidroksisukcinimidil estri i 1-benzotriazolil estri, aktivne karbonate, kao što su N-hidroksisukcinimidil karbonati i 1-benzotriazolil karbonati, acetal, aldehid, aldehid hidrate, alkenil, acrilat, metakrilat, akrilamid, aktivne sulfone, amin, aminooksi, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, zaštićeni tiol, karboksilnu kiselinu, zaštićenu karboksilnu kiselinu, izocijanat, izotiocijanat, maleimid, vinilsulfon, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, glioksale, dione, mezilate, tozilate, trezilat, alken, keton, i azid. Kao što se razume od strane prosečnih poznavaoca u oblasti tehnike, odabrani X segment trebalo bi da bude kompatibilan sa azid grupom tako da se reakcija sa azid grupom ne desi. Derivati polimera koji sadrže azid MOGU BITI homobifunkcionalni, što znači da je druga funkcionalna grupa (tj., X) takođe azid segment, ili heterobifunkcionalni, što znači da je druga funkcionalna grupa različita funkcionalna grupa.
[0486] Termin "zaštićena" se odnosi na prisustvo zaštitne grupa ili segmenta koji sprečavaju reakciju hemijski reaktivne funkcionalne grupe pod određenim uslovima reakcije. Zaštitna grupa će varirati u zavisnosti od tipa hemijski reaktivne grupe koja je zaštićena. Na primer, ako je hemijski reaktivni grupa amin ili hidrazid, zaštitna grupa moće biti odabrana iz grupe terc-butiloksikarbonil (t-Boc) i 9-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc). Ako je hemijski reaktivna grupa tiol, zaštitna grupa može biti ortopiridildisulfid. Ako je hemijski reaktivna grupa karboksilna kiselina, kao što je butanoična ili propionska kiselina, ili hidroksil grupa, zaštitna grupa može biti benzil ili alkil grupa kao što je metil, etil, ili terc-butil. Druge zaštitne grupe poznate u oblasti tehnike mogu takođe biti primenjene u predmetnom pronalasku.
[0487] Specifični primeri terminalnih funkcionalnih grupa u litaraturi uključuju, ali nisu ograničeni na, N-sukcinimidil karbonat (videti npr., američke patente sa brojevima 5,281,698, 5,468,478), amin (videti, npr., Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zalipsky et al. Eur. Polim. J.19:1177 (1983)), hidrazid (videti, npr., Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), sukcinimidil propionat i sukcinimidil butanoat (videti, npr., Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, str 170-181, Harris & Zalipsky Eds., ACS, Vašington, okrug Kolumbija., 1997; videti takođe američki patent br. 5,672,662), sukcinimidil sukcinat (videti, npr., Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) i Joppich et al. Makromol. Chem. 180:1381 (1979), sukcinimidil estar (videti, npr., američki patent br. 4,670,417), benzotriazol karbonat (videti, npr., američki patent br.5,650,234), glicidil etar (videti, npr., Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oksikarbonilimidazol (videti, npr., Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)), p-nitrofenil karbonat (videti, npr., Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); i Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldehid (videti, npr., Harris et al. J. Polim. Sci. Chem. Ed.22:341 (1984), američki patent br. 5,824,784, američki patent br. 5,252,714), maleimid (videti, npr., Goodson et al. Biotechnology (NY) 8:343 (1990), Romani et al. u Chemistry of Peptids and Proteins 2:29 (1984)), i Kogan, Synthetic Comm.22:2417 (1992)), ortopiridildisulfid (videti, npr., Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)), acrilol (videti, npr., Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfon (videti, npr., američki patent br. 5,900,461).
[0488] U određenim slučajevima predmetne objave, derivati polimera sadržie osnovu polimer koja ima strukturu:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-N=N=N
gde:
X je funkcionalna grupa kao što je opisano iznad; a
n je oko 20 do oko 4000.
U drugom slučaju, derivati polimera objave sadrže osnovu polimera koja ima strukturu:
X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2- O-(CH2)m-W-N=N=N gde:
W je alifatični ili aromatični vezni segment koji sadrži između 1-10 atoma ugljenika;
n je oko 20 do oko 4000; i
X je funkcionalna grupa kao što je opisano iznad. m je između 1 i 10.
[0489] PEG derivati koji sadrži azide mogu se pripremiti raznim metodama poznatim u oblasti tehnike i/ili ovde stzavljenim na uvid javnosti. U jednoj metodi, prikazanoj ispod, osnova polimera rastvorljivog u vodi koja ima prosečno molekulsku masu od oko 800 Da do oko 100,000 Da, osnova polimera koja ima prvi terminus vezan za prvu funkcionalnu grupu i drugi terminus vezan za pogodnu odlazeću grupu, reaguje sa azid anjonom (koji može biti uparen sa bilo kojim od brojnih pogodnih kontra-jona, uključujući natrijum, kalijum, terc-butilamonijum i tako dalje). Odlazeća grupa podleže nukleofilnom uklanjanju i zamenjena je sa azid segmentom, dajuži željeni PEG polimer koji sadrži azid.
X-PEG-L N3<->→ X-PEG- N3
[0490] Kao što je prikazano, pogodna osnova polimera za primenu u predmetnom pronalasku ima formulu X-PEG-L, gde PEG je poli(etilen glikol) a X je funkcionalna koja ne reaguje sa azid grupama a L je pogodna odlazeća grupa. Primeri pogodnih funkcionalnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, hidroksil, zaštićeni hidroksil, acetal, alkenil, amin, aminooksi, zaštićeni amin, zaštićeni hidrazid, zaštićeni tiol, karboksilnu kiselinu, zaštićenu karboksilnu kiselinu, maleimid, ditiopiridin, i vinilpiridin, i keton. Primeri pogodnih odlazećih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, hlorid, bromid, jodid, mezilat, trezilat, i tozilat.
[0491] U drugoj metodi za pripremanje derivata polimera koji sadrži azid-predmetne objave, agens za vezivanje koji nosi azid funkcionalnost reaguje sa polimerom rastvorljivim u vodi osnove koja ima prosečnu molekulsku masu od oko 800 Da do oko 100,000 Da, gde agens za vezivanje nosi hemijsku funkcionalnost koja će reagovati selektivno sa hemijskom funkcionalnošću na PEG polimeru, da formira proizvod derivat polimer koji sadrži azid gde je azid razdvojen od osnove polimera pomoću vezujuće grupe.
[0492] Primer reakcione šeme je prikazan ispod:
X-PEG-M N-veznik-N=N=N → PG-X-PEG-veznik-N=N=N gde:
PEG je poli(etilen glikol) i X je zatvarajuća grupa kao što je alkoksi ili funkcionalna grupa kao što je opisano iznad; i
M je funkcionalna grupa koja nije reaktivna sa azid funkcionalnošću ali koja će reagovati efikasno i selektivno sa N funkcionalnom grupom.
[0493] Primeri pogodnih funkcionalnih grupa uključuju, ali nisu ograničeni na, M koji je karboksilna kiselina, karbonat ili aktivni estar ako je N amin; M koja je keton ako je N hidrazid ili aminooksi segment; M koja je odlazeća grupa ako je N nukleofil.
[0494] Prečišćavanje sirovog proizvoda može se postignuti poznatim metodama uključujući, ali nisu ograničeni na, taloženje proizvoda praćeno hromatografijom, ako je potrebno.
[0495] Specifičniji primer je prikazan ispod u slučaju PEG diamina, u kojem jedan od amina je zaštićen segmentom zaštitne grupe kao što je terc-butil-Boc i rezultujući monozaštićen PEG diamin reaguje sa vezujućim segmentom koji nosi azid funkcionalnost:
BocHN-PEG-NH2+ HO2C-(CH2)3-N=N=N
[0496] U ovom slučaju, amin grupa može biti spojena sa grupom karboksilne kiseline primenom raznih aktivirajućih agenasa kao što je tionil hlorid ili karbodiimid reagensi i N-hidroksisukcinimid ili N-hidroksibenzotriazol da se obrazuje amid veza između monoamin PEG derivata i veznik segmenta koji nosi azid. Nakon uspešnog oblikovanja amid veze, rezultujući N-terc-butil-Boc-zaštićeni derivat koji sadrži azid može se koristiti direktno da se modifikuju bioaktivni molekuli ili se može dalje razraditi za instaliranje drugih korisnih funkcionalnih grupa. Na primer, N-t-Boc grupa grupa se može hidrolizovati tretiranjem jakom kiselinom da bi se generisao omega-amino-PEG-azid. Dobijeni amin može se koristiti kao sintetička potpora za instaliranje drugih korisnih funkcionalnosti kao što su maleimid grupe, aktivirani disulfidi, aktivirani estri i tako dalje za stvaranje vrednih heterobifunkcionalnih reagenasa.
[0497] Heterobifunkcionalni derivati su posebno korisni kada je potrebno da se na svaki terminus polimera vežu različiti molekuli. Na primer, omega-N-amino-N-azido PEG bi omogućio vezivanje molekula koji ima aktiviranu elektrofilnu grupu, kao što je aldehid, keton, aktivirani ester, aktivirani karbonat i tako dalje,
na jedan terminus PEG-a i molekula koji ima acetilen grupu na drugom terminusu PEG-a.
[0498] U sledećem slučaju, derivat polimera ima strukturu:
X-A-POLI-B-C≡C-R
gde:
R može biti ili H ili alkil, alken, alkioksi, ili aril ili supstituisana aril grupa; B je vezujući segment, koji može biti prisutan ili odsutan;
POLI je ne-antigenski polimer rastvorljiv u vodi;
A je vezujući segment, koji može biti prisutan ili odsutan i koji može biti isti kao B ili različit; i
X je druga funkcionalna grupa.
[0499] Primeri vezujućeg segmenta za A i B uključuju, ali nisu ograničeni na, višestrukofunkcionalizovanu alkil grupu koja sadrže do 18, i može da sadrži između 1-10 atoma ugljenika. Heteroatom kao što je azot, kiseonik ili sumpor može biti uključen sa alkil lancem. Alkil lanac može takođe biti razgranat na heteroatomu. Drugi primeri vezujućeg segmenta za A i B uključuju, ali nisu ograničeni na, višestruko funkcionalizovanu aril grupu, koa sadrži do 10 i može da sadrži 5-6 atoma ugljenika. Aril grupa može biti supstituisana sa još jednim od atoma ugljenika, azota, kiseonika, ili atoma sumpora. Drugi primeri pogodnih vezujućih grupa uključuju one vezujuće grupe opisane u američkim patentima sa brojevima 5,932,462 i 5,643,575 i objavom američke prijave 2003/0143596. Prosečni poznavaoci u oblasti tehnike će prepoznati da gore navedena lista vezujućih segmenata ni u kom slučaju nije iscrpna i namenjena je da bude samo ilustrativna, i da širok spektar vezujućih segmenata koji imaju kvalitete iznad opisane su razmatrani kao korisni u predmetnoj objavi.
[0500] Primeri pogodnih funkcionalnih grupa za primenu kao X uključuju hidroksil, zaštićeni hidroksil, alkoksil, aktivni estar, kao što su N-hidroksisukcinimidil estri i 1-benzotriazolil estri, aktivni karbonat, kao što su N-hidroksisukcinimidil karbonati i 1-benzotriazolil karbonati, acetal, aldehid, aldehid hidrati, alkenil, acrilat, metakrilat, akrilamid, aktivni sulfon, amin, aminooksi, zaštićeni amin, hidrazid, zaštićeni hidrazid, zaštićeni tiol, karboksilna kiselina, zaštićena karboksilna kiselina, izocijanat, izotiocijanat, maleimid, vinilsulfon, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, glioksali, dioni, mezilati, tozilati, i trezilat, alken, keton, i acetilene. Kao što se razume, odabrani X segment trebalo bi da bude kompatibilan sa acetilen grupom tako da se reakcija sa acetilen grupom ne desi. Derivati polimera koji sadrže acetilen mogu biti homobifunkcionalnil, značenje that the druga funkcionalna grupa (tj., X) is takođe an acetilene segment, or heterobifunctional, što znači da druga funkcionalna grupa je različita funkcionalna grupa.
[0501] U drugom slučaj,derivati polimera sadrže osnovu polimera koja ima strukturu: X-CH2CH2O--(CH2CH2O)n--CH2CH2-O-(CH2)m-C≡CH
gde:
X je funkcionalna grupa kao što je opisano iznad;
n je oko 20 do oko 4000; i
m je između 1 i 10.
Specifični primeri svakog od heterobifunkcionalnih PEG polimera su prikazani ispod.
[0502] Derivati PEG-a koji sadrže acetilene mogu se pripremiti primenom metoda poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike i/ili ovde stavljenim na uvid javnosti. U jednoj metodi, osnova polimera rastvorljivog u vodi ima prosečnu molekulsku masu od oko 800 Da do oko 100,000 Da, osnovu polimera koja ima prvi terminus vezan za prvu funkcionalnu grupu i drugi terminus vezan za pogodnu nukleofilnu grupu, reaguje sa jedinjenjem koje ima i acetilen funkcionalnost i odlazeću grupu koja je pogodna za reakciju sa nukleofilnom grupom PEG-a. Kada PEG polimer koji ima nukleofilni segment i molekul koji ima odlazeću grupu su kombinovani, odlazeća grupa podleže nukleofilnom premeštanju i zamenjena je nukleofilnim segmentom, pri čemu se dobije željeni polimer koji sadrži acetilen.
X-PEG-Nu L-A-C → X-PEG-Nu-A-C≡CR'
[0503] Kao što je prikazano, poželjna osnova polimera za primenu u reakciji ima formulu X-PEG-Nu, gde PEG je poli(etilen glikol), Nu je nukleofilni segment a X je funkcionalna grupa koja ne reaguje sa Nu, L ili acetilen funkcionalnošću.
[0504] Primeri Nu uključuju, ali nisu ograničeni na, amin, alkoksi, ariloksi, sulfhidril, imino, karboksilat, hidrazid, aminoksi grupe koje bi primarno reagovale pomoću mehanizma SN2-tipa. Dodatni primeri Nu grupa uključuju one funkcionalne grupe koje bi primarno reagovale pomoću reakcije nukleofilne adicije. Primeri L grupa uključuju hlorid, bromid, jodid, mezilat, trezilat, i tozilat i druge grupe za koje se očekuje da podležu nukleofilnom premeštanju kao i ketoni, aldehidi, tioestri, olefini, alfa-beta nezasićene karbonil grupe, karbonati i druge elektrofilne grupe za koje je očekivano da podležu adiciji nukleofilima.
[0505] U drugom slučaj, A je alifatični veznik od između 1-10 atoma ugljenika ili supstituisani aril prsten od između 6-14 atoma ugljenika. X je funkcionalna grupa koja ne reaguje sa azid grupama a L je pogodna odlazeća grupa.
[0506] U drugoj metodi za pripremanje derivata polimera koji sadrže acetilen, PEG polimer koji ima prosečnu molekulsku masu od oko 800 Da do oko 100,000 Da, nosi ili zaštićenu funkcionalnu grupu ili agens za zatvaranje na jednom terminusu i pogodnu odlazeću grupu na drugom terminusu se kontaktira acetilen anjonom.
[0507] Primer reakcione šeme je prikazan ispod:
X-PEG-L -C≡CR' → X-PEG-C≡CR'
gde:
PEG je poli(etilen glikol) a X je zatvarajuća grupa kao što je alkoksi ili funkcionalna grupa kao što je opisano iznad; i
R' je ili H, alkil, alkoksi, aril ili ariloksi grupa ili supstituisani alkil, alkoksil, aril ili ariloksi grupa.
[0508] U primeru iznad, odlazeća grupa L bi trebalo da bude dovoljno reaktivna da podlegne premeštanju SN2-tipa kada je u kontaktu sa dovoljnom koncentracijom acetilen anjona. Reakcioni uslovi potrebni da se postigne SN2 premeštanje odlazećih grupa acetilen anjonima su poznati prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike.
[0509] Prečišćavanje sirovog proizvoda se obično može postići metodama poznatim u oblasti tehnike uključujući, ali nisu ograničene na, taloženje proizvoda praćeno hromatografijom, ako je potrebno.
[0510] Polimeri rastvorljivi u vodi mogu biti povezani sa polipeptidima relaksina pronalaska. Polimeri rastvorljivi u vodi mogu biti povezani pomoću ne-prirodno kodirane aminokiseline inkorporirane u polipeptidu relaksina ili bilo kojom funkcionalnom grupom ili supstituentom ne-prirodno kodirane ili prirodno kodirane aminokiseline, ili bilo koje funkcionalne grupe ili supstituenta koji je dodat ne-prirodno kodiranoj ili prirodno kodiranoj aminokiselini. Alternativno, polimeri rastvorljiv u vodi su povezani polipeptidom relaksina koji ima inkorporiranu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu pomoću aminokiseline koja se javlja u prirodi (uključujući ali nije ograničeno na, cistein, lizin ili amin grupu N-terminalnog ostatka). U nekim slučajevima, polipeptidi relaksina pronalaska sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ne-prirodne aminokiseline, gde jedna ili više ne-prirodnokodirana(e) aminokiselina(e) su povezane sa polimerom(ima) rastvorljivim u vodi (uključujući ali nije ograničeno na, PEG i/ili oligosaharide). U nekim slučajevima, polipeptidi relaksina pronalaska dalje sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili više prirodnokodiranu(ih) aminokiselinu(a) povezanih sa polimerima rastvorljivim u vodi. U nekim slučajevima, polipeptidi relaksina pronalaska sadrže jednu ili više ne-prirodno kodiranu(ih) aminokiselinu(e) povezanih sa polimerima rastvorljiv u vodi i jednu ili više aminokiselina koje se javljaju u prirodi povezanih sa polimerima rastvorljivim u vodi. U nekim tehničkim rešenjima, polimeri rastvorljiv u vodi upotrebljeni u predmetnom pronalasku poboljšavaju poluživot u serumu polipeptid relaksina u odnosu na nekonjugovan oblik.
[0511] Brojni polimeri rastvorljivi u vodi povezani sa polipeptidom relaksina (tj., produžetak PEGilacije ili glikozilacije) predmetnog pronalaska mogu se prilagoditi da obezbede izmenjene (uključujući ali nije ograničeno na, povećane ili smanjene) farmakološke, farmakokinetičke ili farmakodinamičke karakteristike kao što je in vivo poluživot. U nekim tehničkim rešenjima, poluživot relaksina je povećan najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 procenata, 2- puta, 5-puta, 6-puta, 7-puta, 8-puta, 9-puta, 10-puta, 11-puta, 12-puta, 13-puta, 14-puta, 15-puta, 16-puta, 17-puta, 18-puta, 19-puta, 20-puta, 25-puta, 30-puta, 35-puta, 40-puta, 50-puta, ili najmanje oko 100-puta u odnosu na nemodifikovani polipeptid.
PEG derivati koji sadrži jaku nukleofilnu grupu (tj., hidrazid, hidrazin, hidroksilamin ili semikarbazid)
[0512] U jednom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, polipeptid relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži karbonil je modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži terminalni hidrazin, hidroksilamin, hidrazid ili semikarbazid segment koji je povezan direktno sa PEG osnovom.
[0513] U nekim tehničkim rešenjima, hidroksilamin-terminalni PEG derivat će imati strukturu:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-O-NH2
gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1,000 (tj., prosečna molekulska masa je između 5-40 kDa).
[0514] U nekim tehničkim rešenjima, PEG derivat koji sadrži hidrazin ili hidrazid će imati strukturu:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2
gde R je jednostavan simple alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 a n je 100-1,000 a X je po izboru karbonil grupa (C=O) koja može biti prisutna ili odsutna.
[0515] U nekim tehničkim rešenjima, PEG derivat koji sadrži semikarbazid će imati strukturu:
RO-(CH2CH2O)n -O-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2
gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1,000.
[0516] U drugom tehničkom rešenju pronalaska, polipeptid relaksina koji sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil je modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži terminalni hidroksilamin, hidrazid, hidrazin, ili semikarbazid segment koji je povezan sa PEG osnovom što označava amid povezivanje.
[0517] U nekim tehničkim rešenjima, hidroksilamin-terminalni PEG derivati imaju strukturu:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2
gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1,000 (tj., prosečna molekulska masa je između 5-40 kDa).
[0518] U nekim tehničkim rešenjima, PEG derivati koji sadrže hidrazin ili hidrazid imaju strukturu:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2 gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, je n 100-1,000 a X je po izboru karbonil grupa (C=O) koja može biti prisutna ili odsutna.
[0519] U nekim tehničkim rešenjima, PEG derivati koji sadrže semikarbazid imaju strukturu:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2 gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1,000.
[0520] U drugom tehničkom rešenju pronalaska, polipeptid relaksina koji sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil je modifikovan sa razgranatim PEG derivatom koji sadrži terminalni hidrazin, hidroksilamin, hidrazid ili semikarbazid segment, sa svakim lancem razgranatog PEG-a koji ima MM u opsegu od 10-40 kDa i, može biti od 5-20 kDa.
[0521] U drugom tehničko rešenju pronalaska, polipeptid relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu je modifikovan PEG derivatom koji ima razgranatu strukturu. Na primer, u nekim tehničkim rešenjima, PEG derivat sa hidrazin ili hidrazid terminalima će imati sledeću strukturu:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2 gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1,000, a X je po izboru karbonil grupa (C=O) koja može biti prisutna ili odsutna.
[0522] U nekim tehničkim rešenjima, PEG derivati koji sadrže semikarbazid grupu će imati strukturu:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2 gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), X je po izboru NH, O, S, C(O) ili nije prisutana, m je 2-10 i n je 100-1,000.
[0523] U nekim tehničkim rešenjima, PEG derivati koji sadrže hidroksilamin grupu će imati strukturu:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2 gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), X je po izboru NH, O, S, C(O) ili nije prisutana, m je 2-10 i n je 100-1,000.
[0524] Stepen i mesta na kojima polimeri rastvorljivi u vodi su povezani sa polipeptidom relaksina mogu da moduliraju vezivanje polipeptida relaksina za receptor polipeptida relaksina. U nekim tehničkim rešenjima, povezivanja su raspoređena tako da polipeptid relaksina vezuje receptor polipeptida relaksina sa Kd od oko 400 nM ili nižim, sa Kd od 150 nM ili nižim, a u nekim slučajevima sa Kd od 100 nM ili nižim, mereno ispitivanjem vezivanja pri ravnoteži, kao što je ono opisano u Spencer et al., J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988).
[0525] Metode i hemija za aktivaciju polimera kao i za konjugaciju peptida su opisani u litaraturi i poznati su u oblasti tehnike. Uobičajeno primenjene metode za aktivaciju polimera uključuju, ali nisu ograničene na, aktivaciju funkcionalnih grupa sa cijanogen bromidom, perjodatom, glutaraldehidom, biepoksidima, epihlorohidrinom, divinilsulfonom, karbodiimidom, sulfonil halidima, trihlorotriazinom, itd. (videti, R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R.L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series tom.469, Američko hemijsko društvo, Vašington, okrug 1991).
[0526] Dostupno je nekoliko recenzija i monografija o funkcionalizaciji i konjugaciji PEG-a. Videti, na primer, Harris, Macromol. Chem. Phys. C25: 325-373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem..6: 150-165 (1995).
[0527] Metode za aktivaciju polimera se takođe mogu pronaći u WO 94/17039, američkom pat. br.5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, američkom pat. br.5,219,564, američkom pat. br. 5,122,614, WO 90/13540, američkom pat. br. 5,281,698, i WO 93/15189, a za konjugaciju između aktiviranog polimera i enzima uključujući ali nije ograničeno na Koagulacioni Faktor VIII (WO 94/15625), hemoglobin (WO 94/09027), molekul koji nosi kiseonik (američki pat. br. 4,412,989), ribonukleazu i superoksid dismutazu (Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-52 (1985)). PEGilaciju (tj., dodavanje bilo kog polimera rastvorljivog u vodi) polipeptida relaksina koji sadrže ne-prirodno kodiranu aminokiselinu, kao što je p-azido-L-fenilalanin, se izvodi bilo kojom konvencionalnom metodom. Na primer, polipeptid relaksina je PEGilovan sa mPEG derivatom sa alkin krajem. Ukratko, višak čvrste supstance mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH se dodaje, sa mešanjem, u vodeni rastvor p-azido-L-Phe-koji sadrži polipeptid relaksina na sobnoj temperaturi. Tipično, vodeni rastvor se pufeeruje sa puferom koji ima pKa blizu pH na kojoj se reakcija izvodi (obično oko pH 4-10). Primeri pogodnih pufera za PEGilaciju pri pH 7.5, na primer, uključuju, ali nisu ograničeni na, HEPES, fosfat, borat, TRIS-HCl, EPPS, i TES. pH se kontinulano prati i prilagođava ukoliko je potrebno. Reakcija se tipično odigrava tokom između oko 1-48 sati.
[0528] Reakcioni proizvodi se zatim podvrgavaju hromatografiji hidrofobnih interakcija da odvoje varijante PEGilovanog polipeptida relaksina od slobodnog mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH i bilo kojeg kompleksa sa visokom molekulskom masom PEGilovanog polipeptida relaksina koji može da formira kada je odblokirani PEG aktiviran na oba kraja molekula, time umrežavajući varijantne molekule polipeptida relaksina. Uslovi tokom hromatografije hidrofobnih interakcija su takvi da slobodan mPEG(5000)-O-CH2-C≡CH teče kroz kolonu, dok se svaki umreženi varijantni kompleks PEGilovanog polipeptida relaksina eluira nakon željenih oblika, koji sadrže jedan molekul varijante polipeptida relaksina konjugovan na jednu ili više PEG grupa. Pogodni uslovi variraju u zavisnosti od relativnih veličina umreženih kompleksa nasuprot željenim konjugatima i lako su određeni od prosečnih poznavaoca u oblasti tehnike. Eluent koji sadrži željene konjugate je koncentrovan ultrafiltracijom i uklonjena je so dijafiltracijom.
[0529] Ako je neophodno, PEGilovan polipeptid relaksina dobijen hidrofodnom hromatografijom može se prečistiti dalje sa jednom ili više procedura poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike uključujući, ali nisu ograničene na, afinitetnu hromatografija; anjon- ili katjon-izmenjivačku hromatografiju (korišćenjem, uključujući ali nije ograničeno na, DEAE SEFAROZU); silika hromatografiju; HPLC sa reverznom fazom; gel filtraciju (korišćenjem, uključujući ali nije ograničeno na, SEFADEKS G-75); hromatografiju hidrofobnih interakcija; hromatografiju isključivanja veličinom, metalhelatnu hromatografiju; ultrafiltraciju/djiafiltraciju; taloženje sa etanolom; taloženje sa amonijum sulfatom; hromatofokusiranje; zamenska hromatografiju; elektroforetski postupci (uključujući ali nije ograničeno na preparativno izoelektrično fokusiranje), diferencijalnu rastvorljivost (uključujući ali nije ograničeno na taloženje sa amonijum sulfatom), ili ekstrakciju. Očigledna molekulska masa se može proceniti prema GPC-u u poređenju sa globularnim standardima proteina (Preneta, AZ u PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). Čistoća relaksin-PEG konjugata mođe se proceniti proteolitičkom degradacijom (uključujući ali nije ograničeno na, cepanje tripsina) praćenom analizom masene spektometrije. Pepinsky RB., et al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3):1059-66 (2001).
[0530] Polimer rastvorljiv u vodi povezan sa aminokiselinom polipeptida relaksina pronalaska može se dalje derivatizovati ili supstituisati bez ograničenja.
PEG derivat koji sadrži azide
[0531] U drugom slučaju, polipeptid relaksina je modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži azid segment koji će reagovati sa alkin segmentom prisutnim na bočnom lancu ne-prirodno kodirane aminokiseline. Uopšteno PEG derivati će imati prosečnu molekulsku masu u opsegu od 1-100 kDa i, u nekim slučajevima, od 10-40 kDa.
[0532] U nekim slučajevima, azid-terminalni PEG derivat će imati strukturu:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3
gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1,000 (tj., prosečna molekulska masa je između 5-40 kDa).
[0533] U drugom slučaju, azid-terminalni PEG derivat će imati strukturu:
RO-(CH2CH2O)n -O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-N3
gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, p je 2-10 i n je 100-1,000 (tj., prosečna molekulska masa je između 5-40 kDa).
[0534] U drugom slučaju, polipeptid relaksina koji sadrži aminokiselinu koja sadrži alkin je modifikovan sa razgranatim PEG derivatom koji sadrži terminalni azid segment, sa svakim lancem razgranatog PEG-a koji ima MM u opsegu od 10-40 kDa i može biti od 5-20 kDa. Na primer, u nekim slučajevima, azid-terminalni PEG derivat će imati sledeću strukturu:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pN3 gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, p je 2-10, i n je 100-1,000, i X je po izboru O, N, S ili karbonil grupa (C=O), koja u svakom slučaju može biti prisutna ili odsutna.
PEG derivati koji sadrže alkin
[0535] U drugom slučaju, polipeptid relaksina je modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži alkin segment koji će reagovati sa azid segmentom prisutnim na bočnom lancu ne-prirodno kodirane aminokiseline.
[0536] U nekim slučajevima, alkin-terminalni PEG derivat će imati sledeću strukturu:
RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-C≡CH
gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10 i n je 100-1,000 (tj., prosečna molekulska masa je između 5-40 kDa).
[0537] U sledećem slučaju, polipeptid relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži alkin je modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži terminalni azid ili terminalni alkin segment koji je povezan sa PEG osnovom pomoću amid povezivanja.
[0538] U nekim slučajevima, alkin-terminali PEG derivat će imati sledeću strukturu:
RO-(CH2CH2O)n -O-(CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C≡CH
gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, p is 2-10 i n je 100-1,000.
[0539] U drugom slučaju, polipeptid relaksina koji sadrži aminokiselinu koja sadrži azid je modifikovan sa razgranatim PEG derivatom koji sadrži terminalni alkin segment, sa svakim lancem razgranatog PEG-a koji ima MM u opsegu od 10-40 kDa i može biti od 5-20 kDa. Na primer, u nekim slučajevima, alkin-terminalni PEG derivat će imati sledeću strukturu:
[RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-(CH2)pC≡CH gde R je jednostavan alkil (metil, etil, propil, itd.), m je 2-10, p je 2-10, i n je 100-1,000, i X je po izboru O, N, S ili karbonil grupa (C=O), ili nije prisutana
PEG derivati koji sadrže fosfin
[0540] U drugom slučaju, polipeptid relaksina je modifikovan sa PEG derivatom koji sadrži aktiviranu funkcionalnu grupu (uključujući ali nije ograničeno na, estar, karbonat) koja dalje sadrži aril fosfin grupu koja će reagovati sa azid segmentom prisutnim na bočnom lancu ne-prirodno kodirane aminokiseline. Uopšteno, PEG derivati će imati prosečnu molekulsku masu u opsegu od 1-100 kDa i, u nekim slučajevima, od 10-40 kDa.
[0541] U nekim slučajevima, PEG derivat će imati strukturu:
gde je n 1-10; X može biti O, N, S ili nije prisutana, Ph je fenil, a W je polimer rastvorljiv u vodi.
[0542] U nekim slučajevima, PEG derivat će imati strukturu:
gde X može biti O, N, S ili nije prisutana, Ph je fenil, W je polimer rastvorljiv u vodi a R može biti H, alkil, aril, supstituisane alkil i supstituisane aril grupe. Primeri R grupa uključuju ali nisu ograničeni na -CH2, -C(CH3)3, -OR', -NR'R", -SR', -halogen, -C(O)R', -CONR'R", -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN i -NO2. R', R", R'" i R"" svaki nezavisno se odnose na vodonik, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil, supstituisani ili nesupstituisani aril, uključujući ali nije ograničeno na, aril supstituisan sa 1-3 halogena, supstituisani ili nesupstituisani alkil, alkoksi ili tioalkoksi grupe, ili arilalkil grupe. Kada jedinjenje pronalaska uključuje više od jedne R grupe, na primer, svaka od R grupa je nezavisno odabrana kao i svaka R’, R", R'" i R"" grupa kada je prisutno više od jedne od ovih grupa. Kada R' i R" su vezani za isti atom azota, oni mogu biti kombinovani sa atomom azota da formirjua 5-, 6-, ili 7-očlani prsten. Na primer, -NR'R" označava da uključuje, ali nije ograničen na, 1-pirolidinil i 4-morfolinil. Iz gornjeg razmatranja supstituenata, prosečan poznavalac u oblasti tehnike će razumeti da termin "alkil" označava da uključuje grupe koje uključuju atome ugljenika vezane za grupe druge nego vodonične grupe, kao što je haloalkil (uključujući ali nije ograničeno na, -CF3i -CH2CF3) i acil (uključujući ali nije ograničeno na, - C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, i slično).
Drugi PEG derivati i opšte tehnike PEGilacije
[0543] Drugi primeri molekuli PEG-a koji mogu biti povezani sa polipeptidima relaksina, kao i metode PEGilacije uključuju, ali nisu ograničeni na, one opisane u, npr., objavi američke prijave patenta br.2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0021763; američkom patentu br.6,646,110; 5,824,778; 5,476,653; 5,219,564; 5,629,384; 5,736,625; 4,902,502; 5,281,698; 5,122,614; 5,473,034; 5,516,673; 5,382,657; 6,552,167; 6,610,281; 6,515,100; 6,461,603; 6,436,386; 6,214,966; 5,990,237; 5,900,461; 5,739,208; 5,672,662; 5,446,090; 5,808,096; 5,612,460; 5,324,844; 5,252,714; 6,420,339; 6,201,072; 6,451,346; 6,306,821; 5,559,213; 5,747,646; 5,834,594; 5,849,860; 5,980,948; 6,004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921131, WO 98/05363, EP 809996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605963, EP 510356, EP 400472, EP 183503 i EP 154316. Bilo koji od PEG molekula ovde opisanih mogu se koristiti u bilo kom obliku, uključujući ali nije ograničeno na, pojedinačan lanac, razgranat lanac, višekraki lanac, jednofunkcionalan, bi-funkcionalan, multi-funkcionalan, ili bilo koja kombinacija istih.
[0544] Dodatni polimerni i PEG derivati uključujući ali nije ograničeno na, hidroksilamin (aminooksi) PEG derivate, su opisani narednim patentnim prijavama: objava američke prijave patenta br. 2006/0194256, objava američke prijave patenta br. 2006/0217532, objava američke prijave patenta br. 2006/0217289, privremena američka prijava br.
60/755,338; privremena američka prijava br.60/755,711; privremena američka prijava br..
60/755,018; međunarodna prijava patenta br. PCT/US06/49397; WO 2006/069246; privremena američka prijava br.60/743,041; privremena američka prijava br.60/743,040; međunarodna prijava patenta br. PCT/US06/47822; privremena američka prijava br.
60/882,819; privremena američka prijava br.60/882,500; i privremena američka prijava br.
60/870,594.
Heterologni Fc fuzioni Proteini
[0545] Jedinjenja relaksina opisana iznad mogu se spojiti direktno ili preko peptidnog veznika u Fc deo imunoglobulina. Imunoglobulini su molekuli koji sadrži polipeptidne lance koji se drže zajedno disulfidnim vezama, tipično koji imaju dva laka lanca i dva teška lanca. U svakom lancu, jedan domen (V) ima varijabilnu aminokiselinsku sekvencu koja zavisi od specifičnosti antitela molekula. Drugi domeni (C) imaju ili konstantnu sekvencu zajedničku za molekule iste klase.
[0546] Kao što je korišćeno ovde, Fc deo imunoglobulina ima značenje uobičajeno dato terminu u oblasti imunologije. Konkretno, ovaj termim se odnosi na fragment antitela fragment koji se dobija uklanjanjem dva regiona za vezivanje antigena (Fab fragmenti) iz antitela. Jedan način za uklanjanje Fab fragmenata je varenje imunoglobulina sa papain proteazom. Prema tome, Fc deo je formiran od približno jednakih veličina fragmenata konstantnog regiona iz oba teška lanca, koji se povezuju kroz nekovalentne interakcije i disulfidne veze. Fc deo može da uključuje zglobne regione i proširiti se kroz CH2 i CH3 domene do C-terminusa antitela. Reprezentativni zglobni regioni za humane i imunoglobuline miša mogu se pronaći u Antibody Engineering, A Practical Guide, Borrebaeck, C. A. K., ed., W. H. Freeman and Co., 1992. Fc deo može dalje da uključi jedno ili više mesta glikozilacije. Aminokiselinske sekvence brojnih reprezentativnih Fc proteina koji sadrže zglobni region, CH2 i CH3 domene, i jedno mesto N-glikozilacije su dobro poznati u oblasti tehnike.
[0547] Postoji pet tipova humanih imunoglobulinskih Fc regiona sa različitim efektorskim funkcijama i farmakokinetičkim svojstvima: IgG, IgA, IgM, IgD, i IgE. IgG je najbrojniji imunoglobulin u serumu. IgG takođe ima najduži poluživot u serumu od bilo kojih imunoglobulina (23 dana). Za razliku od drugih imunoglobulina, IgG se efikasno recirkuliše nakon vezivanja na Fc receptor. Postoji četiri IgG podklase G1, G2, G3, i G4, svaki od njih ima različite efektorske funkcije. G1, G2, i G3 mogu da vežu C1q i poprave komplement dok G4 ne može. Iako je G3 sposoban da veže C1q efikasnije nego G1, G1 je efikasniji u posredovanju komplement-usmerenoj lizi ćelija. G2 popravlja komplement veoma neefikasno. Mesto vezivanja C1q u IgG je smešteno na karboksi terminalnom regionu CH2 domena.
[0548] Sve IgG podklase su sposobne da se vezuju za Fc receptore (CD16, CD32, CD64) pri čemu su G1 i G3 efikasniji od G2 i G4. Vezujući region Fc receptora IgG je formiran ostacima smeštenim i u zglobnim i karboksi terminalnim regionima CH2 domena.
[0549] IgA može da postoji i u monomernom i u dimernom obliku koji su zajedno povezani pomoću J-lanca. IgA je drugi najzastupljeniji Ig u serumu, ali ima poluživot od samo 6 dana. IgA ima tri efektorske funkcije. Veže se za IgA specifični receptor za makrofage i eozinofile, koji pokreću fagocitozu i degranulaciju, redom. Takođe može da popravi komplement nepoznatim alternativnim putevima.
[0550] IgM se eksprimira bilo kao pentamer ili heksamer, koji su zajedno povezani pomoću J-lanca. IgM ima poluživot u serumu od 5 dana. Veže se slabo za C1q pomoću mesta vezivanja smeštenog u njegovom CH3 domenu. IgD ima poluživot od 3 dana u serumu. Nejasno je koje efektorske funkcije se mogu pripisati ovom Ig. IgE je monomerni Ig i ima poluživot u serumu od 2.5 dana. IgE se vezuje za dva Fc receptora koji pokreću degranulaciju i rezultuje oslobađanjem proinflamatornih agenasa.
[0551] U zavisnosti od željenog in vivo efekta, heterologni fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu da sadrže bilo koji od izotipova iznad opisanih ili mogu da sadrže mutirane Fc regione pri čemu su komplement i/ili funkcije vezivanja Fc receptora izmenjeni. Prema tome, heterologni fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu da sadrže celokupan Fc deo imunoglobulina, fragmente Fc dela imunoglobulina, ili njihove analoge spojene za interferon beta jedinjenje.
[0552] Fuzioni proteini predmetnog pronalaska mogu da se sastoje od proteina sa jednim lancem ili polipeptida sa više lanaca. Dva ili više Fc fuzionih proteina mogu se proizvesti tako da oni međusobno reaguju preko disulfidnih veza koje se prirodno formiraju između Fc regiona. Ovi multimeri mogu biti homogeni u odnosu na interferon beta jedinjenje ili mogu da sadrže različita interferon beta jedinjenja spojena na N-terminusu Fc dela fuzionog proteina.
[0553] bez obzira na finalnu strukturu fuzionog proteina, Fc ili Fc-slični region može da služi da produži in vivo poluživot u plazmi interferon beta jedinjenja spojenom na N-terminusu. Takođe, interferon beta komponenta fuzionog protein jedinjenja trebalo bi da zadrži najmanje jednu biološku aktivnost interferon beta. Povećanje terapijskog ili poluživota u cirkulaciji može se demonstrirati primenom metode opisane ovde ili poznate u oblasti tehnike, gde se poluživot fuzionog proteina poredi sa poluživotom samog interferon beta jedinjenja. Biološka aktivnost može se odrediti in vitro i in vivo metodama poznatim u oblasti tehnike.
[0554] Pošto Fc region IgG proizveden proteolizom ima isti in vivo poluživot kao i intaktni IgG molekul i Fab fragmenti se brzo razgrađuju, veruje se da relevantna sekvenca za produženje poluživota boravi u domenima CH2 i/ili CH3. Dalje, u literauri je pokazano da se kataboličke stope IgG varijanti koje ne vežu Fc receptor visokog afiniteta ili C1q ne razlikuje od brzine klirensa roditeljskog divljeg-tipa antitela, što ukazuje da se kataboličko mesto razlikuje od mesta koja su uključena u Fc receptor ili vezivanje C1q. [Wawrzynczak et al., (1992) Molecular Immunology 29:221]. Studije mutagenze specifične za mesto primenom murinskog IgG1 Fc regiona sugerišu da mesto IgG1 Fc regiona koje kontroliše kataboličku stopu je smešteno na interfejsu CH2-CH3 domena. Fc regioni se mogu modifikovati na kataboličkom mestu da se optimizuje poluživot fuzionog proteina. Fc region proimenjen za fuzione proteine predmetnog pronalaska može biti izveden iz IgG1 ili IgG4 Fc regiona, i može da sadrži i CH2 i CH3 regione uključujući zglobni region.
Heterologni albumin fuzioni proteini
[0555] Relaksin opisan ovde može se spojiti direktno ili pomoću peptidnog veznika, polimera rastvorljivog u vodi, ili prolek veznika za albumin ili analog, fragment, ili derivat istog. Obično, albumin proteini koji su deo fuzionog proteina predmetnog pronalaska mogu se izvesti iz albumina kloniranog od bilo koje vrste, uključujući humanu. Humani serum albumin (HSA) se sastoji od pojedinačnog ne-glikozilovanog polipeptidnog lanca od 585 aminokiseline sa molekulskom masom formule od 66,500. Aminokiselinska sekvenca humanog HSA je poznata [Videti FEBS Letters 58:136; Behrens, et al. (1975) Fed. Proc.
34:591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114; Minghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6747]. Opisane su razne polimorfne varijante kao i analozi i fragmenti albumina. [Videti Weitkamp, et al., (1973) Ann. Hum. Gent. 37:219]. Na primer, u EP 322,094, razni kraći oblici HSA. Neki od ovih fragmenti HSA su stavljeni na uvid javnosti, uključujući HSA(1-373), HSA(1-388), HSA(1-389), HSA(1-369), i HSA(1-419) i fragmenti između 1-369 i 1-419. EP 399,666 stavlja na uvid javnosti albuminske fragmente koji uključuju HSA(1-177) i HSA(1-200) i fragmente između HSA(1-177) i HSA(1-200).
[0556] Podrazumeva se da heterologni fuzioni proteini predmetnog pronalaska uključuju relaksin jedinjenja koja su spojena sa bilo kojim albuminskim proteinima uključujući fragmente, analoge, i derivate pri čemu je takav fuzioni protein biološki aktivan i ima duži poluživot u plazmi od samog relaksin jedinjenja. Prema tome, deo albuminskog fuzionisanog proteina ne mora nužno da ima poluživot u plazmi jednak onome izvornog humanog albumina. Fragmenti, analozi i derivati su poznati ili mogu da se generišu sa dužim poluživotima ili poluživotima između onih prirodnog humanog albumina i relaksina redinjenja od interesa.
[0557] Heterologni fuzioni proteini predmetnog pronalaska obuhvataju proteine koji imaju konzervativne supstitucije aminokiselina u relaksin jedinjenju i/ili Fc ili albuminski deo fuzionog proteina. "Konzervativna supstitucija" je zamena aminokiseline drugom aminokiselinom koja ima isti neto elektronsko naelektrisanje i približno je iste veličine i oblika. Aminokiseline sa alifatičnim ili supstituisanim alifatskim bočnim lancima aminokiselina imaju približno iste veličine kada se ukupan broj ugljenika i heteroatoma u njihovim bočnim lancima razlikuje za ne više od oko četiri. Oni imaju približno isti oblik kada se broj grana u njihovim bočnim lancima razlikuje za ne više od jedan. Smatra se da amino kiseline sa fenil ili supstituisanim fenil grupama u svojim bočnim lancima imaju približno iste veličine i oblik. Osim ako je ovde drugačije naznačeno, konzervativne supstitucije su poželjno napravljene sa aminokiselinama koja se javljaju u prirodi.
[0558] Proteini albumina divljeg tipa i imunoglobulina mogu se dobiti iz različitih izvora. Na primer, ovi proteini se mogu dobiti iz biblioteke cDNK pripremljene iz tkiva ili ćelija koje eksprimiraju mRNK od interesa na nivou koji se detektuje. Biblioteke mogu biti skrinovane sondom dizajniranom korišćenjem objavljene DNK ili proteinske sekvence za određeni protein koji je od interesa. Na primer, imunoglobulinski laki ili teški lanci konstantnih regiona su opisani u Adams, et al. (1980) Biochemistry 19:2711-2719; Goughet, et al. (1980) Biochemistry 19:2702-2710; Dolby, et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 77:6027-6031; Rice et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 79:7862-7862; Falkner, et al. (1982) Nature 298:286-288; I Morrison, et al. (1984) Ann. Rev. Immunol.
2:239-256. Neke reference stavljaju na uvid javnosti albuminske proteine i DNK sekvence uključujeći Meloun, et al. (1975) FEBS Letters 58:136; Behrens, et al. (1975) Fed. Proc.
34:591; Lawn, et al. (1981) Nucleic Acids Research 9:6102-6114; i Minghetti, et al. (1986) J. Biol. Chem.261:6747.
Karakterizacija heterolognih fuzionih proteini predmetnog pronalaska
[0559] Postoje brojne metode za karakterizaciju fuzionisanih proteina predmetnog pronalaska. Neki od ovih metoda uključuju, ali nisu ograničeni na: SDS-PAGE u kombinaciji sa metodama bojenja proteina ili imunoblotingom korišćenjem anti-IgG ili anti-HSA antitela. Ostale metode uključuju lasersku desorpcionu/jonizaciono-masnu spektrometriju (MALDI-MS), tečnu hromatografiju/masnu spektrometriju, izoelektrično fokusiranje, analitičku razmenu anjona, hromatofokusiranje, i kružni dihroizam, na primer.
Poboljšanje afiniteta za serumski albumin
[0560] Različiti molekuli se takođe mogu fuzionisane polipeptidima relaksina predmetnog pronalaska da moduliraju poluživot polipeptida relaksina u serumu. U nekim tehničkim rešenjima, molekuli su povezani ili spojeni za polipeptide relaksina predmetnog pronalaska kako bi se povećao afinitet za endogeni albumin u serumu kod životinja.
[0561] Na primer, u nekim slučajevima, se pravi rekombinantna fuzija polipeptida relaksina i sekvence vezivanja albumina. Primeri sekvence vezivanja albumina uključuju, ali nisu ograničeni na, domen vezivanja albumina iz streptokoknog proteina G (videti. npr., Makrides et al., J. Pharmacol. Exp. Ther.277:534-542 (1996) i Sjolander et al., J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997)), ili peptidi koji vezuju albumine kao što su oni opisani u, npr., Dennis, et al., J. Biol. Chem.277:35035-35043 (2002).
[0562] U drugim tehničkim rešenjima, polipeptidi relaksina predmetnog pronalaska su acililovani masnim kiselinama. U nekim slučajevima, masne kiseline promovišu vezivanje za serumski albumin. Videti, npr., Kurtzhals, et al., Biochem. J.312:725-731 (1995).
[0563] U drugim tehničkim rešenjima, polipeptidi relaksina predmetnog pronalaska su direktno spojeni sa albuminom seruma (uključujući, ali bez ograničenja na, humani serumski albumin). Prosešni poznavaoci u oblasti tehnike će prepoznati da se široki spektar drugih molekula može se takođe povezati sa relaksinom iz predmetnog pronalaska da modulira vezivanje na albumin u serumu ili druge komponente seruma.
Glikozilacija polipeptida relaksina
[0564] Pronalazak uključuje polipeptide relaksina koji inkorporiraju jednu ili više neprirodno kodiranih aminokiselina koje imaju saharidne ostatke. Ostaci saharida mogu biti ili prirodni (uključujući, ali bez ograničenja na, N-acetilglukozamin) ili ne-prirodni (uključujući, ali ne ograničavajući se na, 3-fluorogalaktozu). Saharidi mogu biti povezani sa ne-prirodno kodiranim aminokiselinama ili pomoću N- ili O-povezanim glikozidnim povezivanjem (uključujući, ali nije ograničeno na, N-acetilgalaktoza-L-serin) ili neprirodnim povezivanjem (uključujući ali nije ograničeno na, oksim ili odgovarajući C- ili S-povezani glikozid).
[0565] Saharidni (uključujući ali nije ograničeno na, glikozil) segmenti mogu se dodati polipeptidima relaksina in vivo ili in vitro. U nekim tehničkim rešenjima pronalaska, polipeptid relaksina koji sadrži karbonil-ne-prirodno kodiranu aminokiselinu je modifikovan saharidom derivatizovanim sa aminooksi grupom da bi se generisao odgovarajući glikozilovan polipeptid povezan preko oksim povezivanja. Jednom kada je vezan za ne-prirodno kodiranu aminokiselinu, saharid se može dalje razraditi tretmanom glikoziltransferazama i drugim enzimima da bi se generisao oligosaharid vezan za polipeptid relaksina. Videti, npr., H. Liu, et al. J. Am. Chem. Soc.125: 1702-1703 (2003).
[0566] U nekim tehničkim rešenjima pronalaska, polipeptid relaksina koji sadrži karbonil ne-prirodno kodiranu aminokiselinu je modifikovan direktno sa glikanom sa definisanom strukturom pripremljenim kao aminooksi derivat. Prosečan poznavalac u oblasti tehnike će prepoznati da se druge funkcionalnosti, uključujući azid, alkin, hidrazid, hidrazin i semikarbazid, mogu koristiti za povezivanje saharida sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom.
[0567] U nekim slučajevima, polipeptid relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži azid ili alkinil može se zatim modifikovati, uključujući, ali ne ograničavajući se na, Huisgen-ovu [3 2] reakciju cikloadicije sa, uključujući ali nije ograničeno na, alkinil ili azid derivate, redom. Ova metoda omogućava modifikaciju proteina uz izuzetno visoku selektivnost
Dimeri i multimeri relaksina
[0568] Predmetni pronalazak takođe obezbeđuje kombinacije relaksina i analoga relaksina kao što su homodimeri, heterodimeri, homomultimeri, ili heteromultimeri (tj. trimeri, tetrameri, itd.) gde je relaksin koji sadrži jednu ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina vezanih za drugi relaksin ili njegovu relaksinsku varijantu ili bilo koji drugi polipeptid koji nije relaksin ili njegova relaksinska varijanta, bilo direktno na polipeptidnuosnovu ili pomoću veznika. Usled povećane molekulske mase u odnosu na monomere, relaksin dimeri ili multimerni konjugati mogu da pokazuju nova ili poželjna svojstva, uključujući, ali ne ograničavajući se na različita farmakološka, farmakokinetička, farmakodinamička, moduliran terapijski poluživot, ili modulirani poluživot u plazmi u odnosu na monomerni relaksin. Za primere monomernih analoga relaksina videti, na primer, Balschmidt, P., et al., američki pat. br.5,164,366, izdat 17,. novembra 1992; Brange, J., et al., američki pat. br.
5,618,913, izdat 8. aprila 1997; Chance, R. E., et al., američki pat. br. 5,514,646, izdat 7. maja 1996; i Ertl, J., et al., EPO broj objave 885,961, 23. decembar 1998. Neka tehnička rešenja predmetnog pronalaska obezbeđuju monomerne analoge relaksina koji sadrže jedan ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselinskih ostataka a u nekim tehničkim rešenjima oni uključuju monomerne analoge relaksina pri čemu je pozicija B28 Asp, Lys, Ile, Leu, Val ili Ala a aminokiselinski ostatak na položaju B29 je Lys ili Pro; monomerni analog relaksina sa Lys(B28)Pro(B29)-humanim relaksinom; monomerni analog relaksina Asp(B28)-humani relaksin; i monomerni analog relaksina Lys(B3)Ile(B28)-humani relaksin. U nekim tehničkim rešenjima, dimeri relaksina pronalaska će modulirati signalnu transdukciju receptora relaksina. U sledećim tehničkim rešenjima, dimeri ili multimeri relaksina predmetnog pronalaska će delovati kao antagonist, agonist, ili modulator receptora relaksina.
[0569] U nekim tehničkim rešenjima, jedan ili više molekula relaksina koji su prisutni u relaksinu koji sadrži dimer ili multimer koji sadrži neprirodno kodiranu minokiselinu povezanu sa polimerom rastvorljivim u vodi.
[0570] U nekim tehničkim rešenjima, polipeptidi relaksina su povezan direktno, uključujući ali nije ograničeno na, pomoću Asn-Lys amid povezivanja ili Cys-Cys disulfid povezivanja. U nekim tehničkim rešenjima, polipeptidi relaksina, i/ili povezani ne-relaksin molekul, će sadržati različite ne-prirodno kodirane aminokiseline da bi se olakšala dimerizacija, uključujući ali nije ograničeno na, alkin u jednoj ne-prirodno kodiranoj aminokiselini prvog polipeptida relaksina a azid u drugoj ne-prirodno kodiranoj aminokiselini drugog molekula biće konjugovan pomoću Huisgen-ove [3+2] cikloadicije. Alternativno, relaksin i/ili povezani molekul ne-relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži keton može biti konjugovan sa drugim polipeptidom koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži hidroksilamin a polipeptidi reaguju formiranjem odgovarajućeg oksima.
[0571] Alternativno, dva polipeptida relaksina i/ili povezan molekul ne-relaksina su povezani preko veznika. Bilo koji hetero- ili homo-bifunkcionalni veznik može se koristiti za povezivanje dva molekula i/ili povezanih molekula ne-relaksina, koji mogu imati istu ili različitu primarnu sekvencu. U nekim slučajevima, veznik koji se koristi za vezivanje relaksina i/ili povezanih molekula ne-relaksina može biti bifunkcionalni PEG reagens. Veznik može imati širok opseg molekulske mase ili molekulsku dužinu. Veznici sa većom ili manjom molekulskom masom mogu se koristiti za obezbeđivanje željenog prostornog odnosa ili konformacije između relaksina i povezanog entiteta ili između relaksina i njegovog receptora, ili između povezanog entiteta i njegovog vezujućeg partnera, ako postoji. Veznici sa dužom ili kraćom molekulskom dužinom takođe se mogu koristiti da obezbede željeni prostor ili fleksibilnost između relaksina i povezanog entiteta, ili između povezanog entiteta i njegovog vezujućeg partnera, ako postoji.
[0572] U nekim tehničkim rešenjima, pronalazak obezbeđuje vodo-rastvorljive bifunkcionalne veznike koji imaju strukturu u obliku tega koja uključuje: a) azid, alkin, hidrazin, hidrazid, hidroksilamin, ili segment koji sadrži karbonil na najmanje prvom kraju osnove polimera; ib) najmanje drugu funkcionalnu grupu na drugom kraju osnove polimera. Druga funkcionalna grupa može biti ista ili različita kao prva funkcionalna grupa. Druga funkcionalna grupa, u nekim tehničkim rešenjima, nije reaktivna sa prvom funkcionalnom grupom. Pronalazak obezbeđuje, u nekim tehničkim rešenjima, vodarastvorljiva jedinjenja koja sadrže najmanje jedan krak razgranate molekulske strukture. Na primer, razgranat molekulska struktura može biti dendritska.
[0573] U nekim tehničkim rešenjima, pronalazak obezbeđuje multimere koji sadrže jedan ili više polipeptida relaksina, formiranih reakcijom sa rastvorljivim u vodi aktiviranim polimerima koji imaju strukturu:
R-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X
gde je n od oko 5 do 3,000, m je 2-10, X može biti azid, alkin, hidrazin, hidrazid, aminooksi grupa, hidroksilamin, acetil, ili segment koji sadrži karbonil, a R je zatvarajuća grupa, funkcionalna grupa, ili odlazeća grupa koja može biti ista ili različitt od X. R može biti, na primer, funkcionalna grupa odabrano iz grupe koja se sastoji od hidroksil, zaštićeni hidroksil, alkoksil, N-hidroksisukcinimidil estar, 1-benzotriazolil estar, N-hidroksisukcinimidil karbonat, 1-benzotriazolil karbonat, acetal, aldehid, aldehid hidrati, alkenil, akrilat, metakrilat, akrilamid, aktivni sulfon, amin, aminooksi, zaštićen amin, hidrazid, zaštićen hidrazid, zaštićen tiol, karboksilna kiselina, zaštićena karboksilna kiselina, izocijanat, izotiocijanat, maleimid, vinilsulfon, ditiopiridin, vinilpiridin, jodoacetamid, epoksid, glioksali, dioni, mezilati, tozilati, i trezilat, alken, i keton.
Merenja aktivnosti polipeptida relaksina i afiniteta polipeptida relaksina za receptor relaksina
[0574] Akrivnost polipeptida relaksina aktivnost može se odrediti primenom standarda ili poznatim in vitro ili in vivo ispitivanjima. Polipeptidi relaksina mogu biti analizirani za biološku aktivnost pogodnim metodama poznatim u oblasti tehnike. Takva ispitivanja uključuju, ali nisu ograničeni na, aktivaciju interferon-responzivnih gena, ispitivanja vezivanja receptora, ispitivanja anti-virusne aktivnosti, ispitivanja inhibicije citopatskog efekta, (Familletti et. al., Meth. Enzymol. 78:387-394), ispitivanja anti-proliferacije (Aebersold i Sample, Meth. Enzymol. 119:579-582), imunomodulatorna ispitivanja (američki patenti sa brojevima 4,914,033; 4,753,795), i ispitivanja koja prate indukciju MHC molekula (npr., Hokland et al, Meth. Enzymol. 119:688-693), kao što je opisano u Meager, J. Immunol. Meth., 261:21-36 (2002).
[0575] Preuzimanje glukoze u 3T3-1 adipocitima može se proceniti sledećom metodom.
3T3-L1 ćelije su dobijene iz Američke kolekcije kultura sojeva (ATCC, Rokvil, Md.). Ćelije se uzgajaju u mediju za rast (GM – grown media) koji sadrži 10% obogaćenog gvožđem serum fetusa goveda u Dulbecco-vom modifikovanom Eagle medijumu. Za standardnu diferencijaciju adipocita, dva dana nakon što su ćelije dostigle konfluentnost (pominje se kao dan 0), ćelije su izložene mediju za diferencijaciju (DM) koji sadrži 10% fetalni goveđi serum, 10 µg/ml relaksina, 1 µM deksametazona i 0.5 µM izobutilmetilksantina, tokom 48 sati. Ćelije se zatim održavaju u mediju za post diferencijaciju koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma, i 10 µg ml relaksina. In vitro potencija može se meriti ispitivanjima preuzimanja glukoze koji su poznati prosečnim poznavaocima u oblasti. In vitro potencija može da se definiše kao mera preuzimanja glukoze relaksinskog jedinjenja u ćelijski-baziranom ispitivanju ćelije i jeste mera biološke potencije relaksin jedinjenja. Može se izraziti kao EC50 koji je efikasna koncentracija jedinjenja koja rezultira 50% aktivnošću u eksperimentu sa odgovorom na jednu dozu.
[0576] Ispitivanje transporta glukoze--zavisno o relaksinu--preuzimanje heksoze, kako je određivano nakupljanjem 0.1 mM 2-deoksi-D-[14C]glukoze, meri se na sledeći način: 3T3-L1 adipociti u pločicama sa 12 bunarčića dva puta se isperu sa KRP puferom (136 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 10 mM NaPO4, 0.9 mM CaCl2, 0.9 mM MgSO4, pH 7.4) zagreju na 37oC i sadrže 0.2% BSA, inkubirani u Leibovitz-ovom medijumu L-15 koji sadrži 0.2% BSA tokom 2 sata na 37oC na sobnom vazduhu, opet dva puta su isprani sa KRP koji sadrži, 0,2% BSA pufera, i inkubirani u KRP, 0,2% BSA puferu u odsustvu (Me2SO samo) ili prisustvu vortmanina u trajanju od 30 minuta na 3 oC na sobnom vazduhu. Zatim se doda relaksin u krajnjoj koncentraciji od 100 nM tokom 15 minuta, a preuzimanje 2-deoksi-D-[14C] glukoze se meri poslednja 4 minuta. Nespecifično preuzimanje, mereno u prisustvu 10 µM citohalasina B, oduzima se od svih vrednosti. Koncentracije proteina se određuju pomoću Pierce bicinhoninska kiselina eseja. Preuzimanje se rutinski meri trostruko ili četvorostruko za svaki eksperiment. Učinak akutne i hronične prethodne obrade 3T3-L1 adipocita sa FGF-21 u prisustvu relaksina može se istražiti.
[0577] Ispitivanje transporta glukoze--nezavisno o relaksinu--3T3-L1 fibroblast postavljaju se u pločice sa 96 bunarića i diferenciraju u masne ćelije (adipocite) tokom 2 nedelje. Posle diferencijacije oni gladuju u medijumu bez seruma i tretiraju se različitim polipeptidima relaksina predmetnog pronalaska tokom 24 sata. Nakon tretmana, ćelije su isprane dva puta sa KRBH puferom, koji sadrži 0.1% BSA. Preuzimanje glukoze se vrši u prisustvu obeležene glukoze u KPBH puferu. Ovo omogućava kvalitativnu procenu raznih polipeptida i analoga relaksina proizvedenih pomoću predmetnog pronalaska, a oni koji su pegilovani kao što je poznato da pegilovanje uzrokuje smanjenje efikasnosti nativnih molekula, i upoređuju efikasnost različitih insulina. Pored toga, može se prikazati da polipeptidi relaksina predmetnog pronalaska indukuju preuzimanje glukoze u ex vivo modelu tkiva.
[0578] U ex vivo modelu transporta glukoze, ispitivanje transporta glukoze je opisano kao što sledi: Krebs-Henseleit-ov puferni rastvori - štok 1: NaCl (1.16 M); KCl (0.046 M); KH2PO4 (0.0116 M); NaHC03 (0.0253 M). Štok 2: CaCl2 (0.025 M); MgS04 (2H20) (0.0116 M). BSA: Koristiti ICN Cohn-ovu frakciju V, BSA bez masnih kiselina direktno bez dijalize. Priprema medijuma: Dodajti 50 ml Krebs-ovog štok 1 do 395 ml dH2O i gasa sa 95% O2/5% CO2 tokom 1 sata. Dodajti 50 ml štok 2 i dovesti do 500 ml sa dH2O. Dodajti 500 mg BSA bez masnih kiselina ICN. Medij za predinkubaciju i inkubaciju: 32 mM manitola, 8 mM glukoze. Medij za pranje: 40 mM manitola, 2 mM piruvata. Transportni medijumi: 39 mM Mannitola, 1 mM 2-DG; 32 mM Manitola, 8 mM 3-O-MG. Rastvor relaksina: (svinjski relaksin [Lilly] 100,000,000 µU/ml) pri krajnjoj koncentraciji od 2000 µU/ml ili 13.3 nM. Priprema radioaktivnog medijuma sa oznakom: Posebne aktivnosti koje se koriste: 2DG = 1.5 mCi/ml; 3-0-MG = 437 µCi/ml; ili, Manitol=8 µCi m. Pacovi se anesteziraju sa 0.1 ccm Nembutala na 100 g telesne težine. Mišićno tkivo se iseče i ispere u 0.9% fiziološkom rastvoru a zatim se stavi u medijum za pred-inkubaciju (2 ml) na 29oC tokom 1 sata. Mišićno tkivo se prenosi u inkubacioni medijum (2 ml; isto kao i za pred-inkubaciju osim uključujući relaksin ili test jedinjenje) i inkubira se 30 minuta (zavisi od eksperimentalnih uslova). Zatim se mišićno tkivo prebaci u medijum za pranje (2 ml) tokom 10 minuta na 29oC, zatim prebaci u medijum sa oznakom (1.5 ml) tokom 10 minuta (3-O-MG) ili 20 min (2DG). Mišićno tkivo se podreže, izmeri i stavi u polipropilenske cevi na suvom ledu. 1 ml 1 N KOH se doda u epruvete koje se zatim postavljaju u vodeno kupatiloj na 70oC tokom 10-15 minuta, vrteći epruvete na svakih nekoliko minuta. Epruvete se ohlade na ledu i doda se 1 ml 1 N HCl, pa se dobro izmeša.
200 µl supernatanta se zatim stavi u duple scintilacione bočice i broji na scintilacijskom brojaču u poređenju sa poznatim radioaktivnim standardima.
[0579] Za kontrakciju, mišići se najpre inkubiraju tokom 1 sata u predinkubacionom/inkubacionom medijumu. Nakon jednog sata, jedan mišić svakog para (jedan par po pacovu) se zakači na aparat za stimulaciju a drugi mišić se prenese u novu posudu medija za inkubaciju. Kontrahovani mišić je stimulisan 200 msek nizom od 70 Hz sa svakim impulsom u nizu koji je 0.1 msek. Nizovi se isporučuju u 1/sek pri 10-15V tokom 2x10 minuta sa pauzom od 1 minute. Na kraju perioda stimulacije, mišić se uklanja iz aparata za stimulaciju i stavlja u medijum za pranje na 10 minuta, zatim sledi medijum sa oznakom kao što je gore navedeno.
[0580] Prosečne količine relaksina, polipeptida relaksina i/ili analoga relaksina predmetnog pronalaska mogu da variraju i naročito treba da se zasnivaju na preporukama i propisivanju kvalifikovanog lekara. Tačna količina relaksina, polipeptida relaksina i/ili analoga analoga predmetnog pronalaska je stvar preferencije podložne takvim faktorima kao što su tačan tip i/ili ozbiljnost stanja koje se leči, stanje pacijenta koji se leči, kao i ostali sastojci u kompoziciji. Pronalazak takođe omogućava primenu terapeutski efikasne količine drugog aktivnog agensa. Količina koju treba dati može lako da odredi prosečan poznavalac u oblasti tehnike na osnovu terapije relaksinom, dostupnih terapija rečlaksina i/ili drugih analoga relaksina.
[0581] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu se dobiti na konvencionalan način.
PRIMERI
[0582] Primeri koji slede su ponuđeni da ilustruju, ali ne ograničavaju pronalazak za koji se traži zaštita.
Primer 1
[0583] Ovaj primer opisuje jedna od mnogih potencijalnih setova kriterijuma za selekciju mesta inkorporacije ne-prirodno kodiranih aminokiselina u relaksin.
[0584] Slike 1-4 prikazuju strukturu i sekvencu relaksina a tabela ispod uključuje sekvence sa A lancem, B lancem, relaksina i prorelaksina. Polipeptidi relaksina su generisani supstitucijom prirodno kodirane aminokiseline sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom. Svaki polipeptid je imao jednu od aminokiselina supstituisanih sa para-acetilfenilalaninom (pAcF ili pAF). Polipeptidi koji su generisali nisu imali vodeću sekvencu i bili su polipeptidi relaksina sa A/B lancem (SEQ ID NO.1-3). Svaki od generisanih polipeptida je imao supstituciju ne-prirodno kodirane aminokiseline na jednoj od sledećih pozicija 1, 5, 18, 13, 2 od SEQ ID NO: 4 ili u tim pozicijama A lanca bilo koje od poznatim sekvenci relaksina ili 5, 7, 18, 28 od SEQ ID NO: 5 ili 6 u tim istim pozicijama u B lancu bilo koje od poznatih sekvenci relaksina. Slika 2 prikazuje strukturu humanog relaksina koji je obeležen primenom PyMOL softvera (DeLano Scientific; Palo Alto, CA) i neke aminokiseline koje su odgovarajuće onima supstituisanim sa para-acetilfenilalaninom u polipeptidima relaksina pronalaska.
[0585] Sledeći set kriterijuma za selekciju poželjnih mesta inkorporacije ne-prirodno kodiranih aminokiselina uključuje primenu i poređenje kristalnih struktura iz Banke podataka o proteinima (Protein Data Bank), ili druge banke podataka, koji se koriste za modelovanje strukture relaksina i identifikuju se ostaci koji 1) ne bi ometali vezivanje za njihov receptor, i 2) ne bi bili prisutni u unutrašnjosti proteina. U nekim tehničkim rešenjima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporisane na, ali ne ograničavajući se na, jednu ili više sledećih pozicija relaksina: 1, 5, 18, 13, 2 SEQ ID NO: 4 ili u onim pozicijama A lanca bilo koje od poznatih sekvenci relaksina ili 5, 7, 18, 28 SEQ ID NO: 5 ili 6 u tim istim pozicijama B lanca bilo koje od poznatih sekvenci relaksina.
[0586] Sledeći kriterijumi su korišćeni za procenu svakog analoga relaksina i relaksina za inkorporaciju ne-prirodno kodirane aminokiseline: ostatak (a) ne sme da ometa vezivanje receptora na osnovu strukturne analize, b) ne bi trebalo da bude pod uticajem mutageneze skeniranja alanina ili homologa mutageneza (c) trebalo bi da bude površinski izložen i da ispoljava minimalne van der Valsove ili interakcije vezivanja vodonika sa okolnim ostacima, (d) trebalo bi da bude obrisan ili varijabilan u varijantama relaksina, (e) će rezultirati konzervativnim promenama nakon supstitucije sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom i (f) se može naći u ili visoko fleksibilnim regionima ili u strukturno rigidnim regionima. Pored toga, mogu se izvršiti dalje kalkulacije na molekulu relaksina, korišćenjem Cx programa (Pintar et al. (2002) Bioinformatics, 18, str. 980) da se proceni stepen protruzije za svaki atom proteina.
[0587] Principijelno, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina može biti inkorporirana na jednoj ili više sledećih pozicija u A lancu relaksina: pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 (tj., na karboksil terminusu proteina) (SEQ ID NO: 4 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NOs: 1-3). U nekim slučajevima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane na jednoj ili više od sledećih pozicija u B lancu relaksina: pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 (tj., na karboksil terminusu proteina) (SEQ ID NO: 5 ili 6 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NOs: 1-3). U nekim slučajevima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane na jednoj ili više od sledećih pozicija u relaksinu: 1, 5, 31, 2, 13, 29, 18, 52 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NOs: 2 i 3). U nekim slučajevima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane u jednoj ili više od sledećih pozicija u relaksinu: 5, 31, 2, 13, 29, 18, 52 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NOs: 2 i 3). U nekim slučajevima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane u jednoj ili više od sledećih pozicija u relaksinu: 1, 5, 31, 2, 13, 29 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NOs: 2 i 3). U nekim slučajevima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina je inkorporirano u jednoj ili više od sledećih pozicija u relaksinu: 5, 31, 2, 13, 29 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NOs: 2 i 3). U nekim slučajevima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiseline su inkorporirane na jednoj ili više od sledećih pozicija u relaksinu: 1, 5, 31, 2, 13 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NOs: 2 i 3). U nekim slučajevima, jedna ili više ne-prirodno kodiranih aminokiselina su inkorporirane na jednoj ili više od sledećih pozicija u relaksinu: 5, 31, 2, 13 (SEQ ID NO: 1 ili odgovarajuće aminokiseline u SEQ ID NOs: 2 i 3).
Primer 2
[0588] Ovaj primer detaljno objašnjava kloniranje i ekspresiju polipeptida relaksina, uključujući ne-prirodno kodiranu aminokiselinu u E. coli.
[0589] Metode kloniranja relaksina su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. Polipeptidne i polinukleotidne sekvence za relaksin i kloniranje relaksina u ćelije domaćina je detaljno objašnjeno u američkom patentu br. 4,758,516; američkom patentu br.
5,166,191; američkom patentu br.5,179,195, 5,945,402; i 5,759,807.
[0590] Cdnk koja kodira relaksin je prikazana kao SEQ ID NOs: 12 a zreli polipeptidna aminokiselinska sekvenca je prikazana kao SEQ ID NO: 1.
TABELA 1: Citirane seklvence relaksina
[0591] Uvedeni translacioni sistem koji sadrži ortogonalnu tRNK (O-tRNk) i ortogonalnu aminoacil tRNK sintetazu (O-RS) koristi se za ekspresiju relaksina ili analoga relaksina koji sadrže ne-prirodno kodiranu aminokiselinu. O-RS preferentno aminoacuje O-tRNK sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom. Zauzvrat translacioni sistem ubacuje ne-prirodno kodiranu aminokiselinu u relaksin ili analog relaksina, kao odgovor na kodirani selektorkodon. Pogodne O-RS i O-tRNK sekvence su opisane u WO 2006/068802 sa nayivom " "Compositions of AminoacyltRNA Synthetase and Uses Thereof " (E9; SEQ ID NO: 16) i WO 2007/021297 sa nazivom " "Compositions of tRNA and Uses Thereof" (F13; SEQ ID NO: 17).
TABELA 2: Citirane sekvence
[0592] Transformacija E. coli sa plazmidima koji sadrže modifikovani gen za relaksin ili analog relaksina i par ortogonalna aminoacil tRNK sintetaza/tRNK (specifičan za željenu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu) omogućava mesto-specifičnu inkorporaciju neprirodno kodirane aminokiseline u polipeptidu relaksina.
[0593] Divlji tip zrelog relaksina je amplifikovan pomoću PCR iz reakcije sinteze cDNK korišćenjem standardnih protokola i kloniran u pET30 (NcoI-BamHI). Pre ili alternativno nakon potvrđivanja sekvence, relaksin koji uključuje N-terminalnu HHHHHHSGG sekvencu je subkloniran u supresijski vektor koji sadrži amber supresor tirozil tRNKTyr/CUA iz Methanococcus jannaschii (Mj tRNKTyr/CUA) pod konstitutivnom kontrolom sintetskog promotera izvedenog iz E.coli lipoproteinske promoter sekvence (Miller, J.H., Gene, 1986), kao i ortogonalnu tirozil-tRNK-sintetazu (MjTyrRS) pod kontrolom E. coli GlnRS promotera. Ekspresija relaksina je pod kontrolom T7 promotera. Amber mutacije se uvode standardnim protokolima mutacije brzih promena (Stratagene; La Jolla, Kalifornija). Konstrukti su verifikovani sekvencom.
[0594] Testiranje relaksin jedinjenja dugog delovanja može se uraditi primenom modela STZ dijabetesea kod pacova (PCO 08-400-209).
Supresija sa para-acetil-fenilalaninom (pAcF)
[0595] Plazmidi (npr. pt_RLX_BA1_AV13am_p1395 (AXID2381)) su primenjeni za transformisanje u Escherichia coli soj W3110B57 da se proizvede RLX-BA1-AV13pAF W3110 B2 soj E. coli u kojem je eksprimiranje T7 polimeraze bilo pod kontrolom arabinoza-inducibilnog promotera. Bakterijske kulture koje su odstojale preko noći su razblažene 1:100 u posudama za mešanje koje sadrže 2X YT medijuma kulture i uzgajane na 37°C do OD600od ∼ 0.8. Proteinska ekspresija je indukovana dodavanjem arabinoze (0.2% konačna), i para-acetil-fenilalanina (pAcF) do finalne koncentracije od 4 mM. Kulture su inkubirane na 37 °C tokom 5 sata. Ćelije su granulirane i resuspendovane u B-PER puferu za liziranje (Pierce) 100ul/OD/ml 10ug/ml DNaza i inkubirane na 37°C tokom30 min. Ćelijski materijal je uklonjen centrifugiranjem i supernatant je uklonjen. Granule su re-suspendovane u jednake količine SDS-PAGE pufera za punjenje proteina. Svi uzorci su stavljeni na 4-12% PAGE gel sa MES i DTT. Metode za prečišćavanje relaksin su poznate prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike i potvrđene su SDS-PAGE, Western Blot analizom, ili elektro-sprej-jonizaciono masenom spektrometrijom spektometrijom i slično.
His-tagovani mutirani relaksinski proteini mogu se prečistiti primenom metoda poznatih prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. ProBond nikl-helatna smola (Invitrogen, Karlsbad, CA) može se koristiti putem standardnih His-tagovanih procedura za prečišćavanje proteina koje obezbeđuje proizvođač. Funkcionalna merenja proteina mogu se uraditi metodama poznatim u oblasti tehnike, metodama obezbeđenim u okviru ove prijave i ovde citiranim referencama, ili alternativno, ELISA na živim ćelijama može da se razvije za procenu polipeptida relaksina prema pronalasku.
TABELA 3: Analiza varijanti relaksina
TABELA 4: Gubitak aktivnosti varijante relaksina
Primer 3
[0596] Ovaj primer detaljno prikazuje ekspresiju polipeptida pro-relaksina od strane E. coli.
[0597] E.coli eksprimira pro-relaksin kao jednolančani protein sastavljen od 88 aminokiselina. Nakon digestije tripsinom i karboksipeptidazom, vezni peptidni i vode’a sekvenca se uklanjaju. Rezultirajući peptid je mali 6-kDa dvolančani peptidni član superfamilije insulina koji se sastoji od 24 ostatka A lanca i 29 ostatka B lanca.
Strukturni pregib karakterišu dva peptidna lanca koja su spojena sa dva međusobna lanca (Cys11-Cys36 i Cys24-Cys48) i jednom unutarlančanom (Cys10-Cys15) disulfidnom vezom. Tercijarna struktura zasnovana na kristalnoj strukturi humanog relaksina-2 otkrila je kompaktni pregib koji sadrži tri spiralna segmenta i kratki produženi region koji obuhvata hidrofobno jezgro.
[0598] Relaksin sa jednom ili više ne-prirodno kodiranom(im) aminokiselinom(ama) koja(e) pruža(ju) jedinstvenu hemiju i omogućavaju specifičnu PEGilovanu rekombinantnu varijantu koja sadrži biosintetski inkorporisanu, hemijski reaktivnu karbonilnu grupu, zamenom prirodne aminokiseline sa para-acetilfenilalaninom (pAcF), obezbeđujući jedinstveno kovalentno mesto vezivanja za poli(etilen) glikol (PEG).
Primer 4
[0599] Ovaj primer detaljno prikazuje ekspresiju polipeptida pro-relaksina od strane E. coli.
[0600] Ovaj primer opisuje porast proizvodnje polipeptida relaksina koristeći pet (5) litarski fermentor. Ove metode i porast mogu se takođe koristiti za serije od 10L, 30L, 150L i1000L. U nekim tehničkim rešenjima predmetnog pronalaska, najmanje 2g proteina relaksina je proizvedeno za svaki litar ćelijske kulture. U drugom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, najmanje 4 g proteina relaksina je proizvedeno za svaki litar ćelijske kulture. U drugom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, najmanje 6 g proteina relaksina je proizvedeno za svaki litar ćelijske kulture. U drugom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, najmanje 8 g proteina relaksina je proizvedeno za svaki litar ćelijske kulture, u drugom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, najmanje 10 g proteina relaksina je proizvedeno za svaki litar ćelijske kulture. U drugom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, najmanje 15 g proteina relaksina je proizvedeno za svaki litar ćelijske kulture. U drugom tehničkom rešenju predmetnog pronalaska, najmanje 20 g proteina relaksina je proizvedeno za svaki litar ćelijske kulture.
2.1 Posude za mešanje semena
[0601] Soj Escherichia coli W3110B57 [F- IN(rrnD-rrnE) lambda-araB::gl tetA fhuA::dhfr ompT::cat] koji luči plasmid pt_RLX_BA1_AV13am_p1395 (AXID2381) je korišćen da proizvede RLX-BA1-AV13pAF. Jedna bočica banke ćelija za ispitivanje (RCB - research cell bank) je uzeta iz -80°C i otopljena na sobnoj temperaturi, zatim 50 µL je korišćeno za inokulaciju 50 mL semenskog medijuma (hemijski definisan medijum) dopunjenog sa 50 µg/mL kanamicin sulfata u 250 mL erlenmajeru sa pregradom. Primarna semenska kultura je uzgajana približno 18 sati na 37oC i 250 o/min (1-inč zamah). Primarna semenska kultura je sub-kultivisana u drugu semensku kulturu do optičke gustine merene pri talasnoj dužini od 600 nm (OD600) od 0.05 u 500 mL erlenmajeru sa pregradom koji sadrži 100 mL semenskog medijuma dopunjenog sa 50 µg/mL kanamicin sulfata. Druga semenska kultura je uzgajana na 37oC i 250 o/min (1-inč zamah) tokom približno 8 sati ili kada je OD600 dostignula između 2 i 4.
2.2 Fermentori
[0602] Sartorius Biostat B 5-L posude su napunjene sa 2.1-L proizvodnog medijuma (hemijski definisan medijum) dopunjen sa 50 µg/L kanamicin sulfata. Druge semenske kultura su korišćene za inokulaciju fermentora na početni OD600 od 0.035. Kulture su uzgajane na 37°C i rastvoreni kiseonik je postavljen da održava 30% (zasićenost vazduhom) sa primarnom kaskadom mešanja (480 - 1200 o/min) i sekundarnom O2 kaskadom. Protok vazduha od 5 LPM sa povratnim pritiskom od 6 psi održavan je tokom cele fermentacije. PH kulture je postavljen na 7.2 ± 0.05 uz dodatak 15% amonijum hidroksida a DowChemical P2000 antipena je dodata po potrebi za kontrolu pene. Kada je kultura dostigla OD600 između 35 ± 5 (kada je početni glicerol u šaržnom medijumu gotovo potrošen), pokrenuto je bolus hranjenje od 200mL i istovremeno podešena pH vrednost od 7.2 ± 6.6. Nakon početnog hranjenja bolusom, započeto je kontinuirano hranjenje brzinom od 0.25 mL/L/min i nastavljeno do berbe. Odmah nakon započinjanja hranjenja, 2.5 ml/L (0.2 g/L konačnog volumena kulture) 100 g/L L-Ala-pAcF rastvora dipeptida napravljenog u vodi je dodato u fermentor. Petnaest minuta nakon dodavanja dipeptida, kultura je indukovana dodavanjem L-arabinoze (recept dat u PTR-FGF-002) u koncentraciji od 2 g/L (konačni volumen kulture). Kultura je uzgajana 6 sati nakon dodavanja arabinoze i sakupljana.
[0603] Slikas 5 prikazuje SDS-PAGE gel prorelaksina proizvedenog ovim metodama sa lanacem B1 amimo kiseline kao Ala i para-acetil fenilalaninom u 13. poziciji A lanca aminokisline, supstituisanim valinom.
Primer 5
[0604] Ovaj primer detaljno prikazuje uvođenje aminokiseline koja sadrži karbonil i zatim reakciju sa PEG-om koji sadrži aminooksi.
[0605] Ovaj primer prikazuje metodu za generisanje polipeptida relaksina koji inkorporira ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži keton koja zatim reaguje sa PEG-om koji sadrži aminooksi od oko 5,000 MM. Svaki od ostataka pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućih aminokiselina u SEQ ID NOs: 3, 5, 7, 9, 11) i svaki od ostataka pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 2 ili odgovarajućih aminokiselina u SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12) je posebno supstituisan sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom koja ima sledeću strukturu:
[0606] Sekvence korišćene za mesto-specifičnu inkorporaciju p-acetil-fenilalanina u relaksin su SEQ ID NO: 1 i 2 (A i B lanci relaksina), a SEQ ID NO: 16 ili 17 (muttRNK, M. jannaschii), i 15, 29, 30 ili 31 (TyrRS LW1, 5, ili 6) opisani u Primeru 2 iznad.
[0607] Jednom modifikovana, varijanta polipeptida relaksina koja sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil reaguje sa PEG derivatom koji sadrži aminooksi oblika:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
gde R je metil, n je 3 i n je približno 5,000 MM. Prečišćen relaksin koji sadrži pacetilfenilalanin rastvoren pri 10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 7.0, ili u 10 mM natrijum acetata (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 4.5, reaguje sa 10 do 100-puta viška PEG koji sadrži aminooksi, a zatim se meša tokom 10 - 16 sati na sobnoj temperaturi (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc.1959, 81, str 475). PEG-relaksin se zatim razblaži u odgovarajućem puferu za trenutno prečišćavanje i analizu.
Primer 6
[0608] Ovaj primer prikazuje uvođenje aminokiseline koja sadrži karbonil i naknadnu reakciju sa PEG-om koji sadrži aminooksi.
[0609] Ovaj primer prikazuje metodu za generisanje polipeptida relaksina koji inkorporira ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži keton koji zatim reaguje sa PEG-om koji sadrži aminooksi od približno 20,000 MM. Svaki od ostataka pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućih aminokiselina u SEQ ID NOs: 2 i 3) je odvojeno supstituisan sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom koja ima sledeću strukturu:
[0610] Sekvence korišćene za mesto-specifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina u relaksin su SEQ ID NO: 4 i 5 ili 6 (A i B lanci relaksina), i SEQ ID NO: 16 ili 17 (muttRNK, M. jannaschii), i sekvence opisane iznad i inkorporirane za mesto-specifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina.
[0611] Jednom modifikovana, varijanta polipeptida relaksina koja sadrže aminokiselinu koja sadrži karbonil je reagovala sa PEG derivatom koji sadrži aminooksi oblika:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
gde R je metil, n je 3 i n je približno 20,000 MM. Prečišćen relaksin koji sadrže paminofenilalanina rastvoren pri 10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 7.0, ili u 10 mM natrijum acetata (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 4.5, reaguje sa 10 do 100-puta viškom PEG-a koji sadrži aminooksi, a zatim se meša tokom 10 - 16 sati na sobnoj temperaturi (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc.1959, 81, str 475). PEG-relaksin se zatim razblaži u odgovarajućem puferu za trenutno prečišćavanje i analizu.
Primer 7
[0612] Ovaj primer detaljno prikazuje uvođenje aminokiseline koja sadrži karbonil i zatim reakciju sa PEG-om koji sadrži aminooksi.
[0613] Ovaj primer pokazuje metodu za generisanje polipeptida relaksina koji inkorporira ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koji uključuje keton koja nakon toga reaguje sa PEG-om koji sadrži aminooksi od oko 20,000 MM. Svaki od ostataka pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućim aminokiselinskim pozicijama u SEQ ID NOs: 2 i 3) je odvojeno supstituisan sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom koja ima sledeću strukturu:
[0614] Sekvence korišćene za mesto-specifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina u relaksin su SEQ ID NO: 13, i SEQ ID NO: 16 ili 17 (muttRNK, M. jannaschii), i sekvence opisane iznad i inkorporirane za mesto-specifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina.
[0615] Jednom modifikovana, varijanta polipeptida relaksina koja sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil reaguje sa PEG derivatom koji sadrži aminooksi oblika:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
gde R je metil, n je 3 i n je približno 20,000 MM. Prečišćen relaksin koji sadrži paminofenilalanina rastvoren sa 10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 7.0, ili u 10 mM natrijum acetat (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 4.5, reaguje sa 10 do 100-puta viškom PEG-a koji sadrži aminooksi, a zatim se meša tokom 10 - 16 sata na sobnoj temperaturi (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc.1959, 81, str 475). PEG-relaksin se zatim razblaži sa odgovarajućim puferom za trenutno prečišćavanje i analizu.
Primer 8
[0616] Ovaj primer detaljno prikazuje uvođenje aminokiseline koja sadrži karbonil i zatim reakciju sa PEG-om koji sadrži aminooksi.
[0617] Ovaj primer pokazuje metodu za proizvodnju polipeptida relaksin polipeptida koji inkorporira ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja uključuju keton koja nakon toga reaguje sa PEG-om koji sadrži aminooksi od oko 20,000 MM. Svaki od ostataka pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućim aminokiselinskim pozicijama u SEQ ID NOs: 2 i 3) je odvojeno supstituisan sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom koja ima sledeću strukturu:
[0618] Sekvence korišćene za mesto-specifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina u relaksin su SEQ ID NO: 1, i SEQ ID NO: 16 ili 17 (muttRNK, M. jannaschii), i sekvence opisane iznad i inkorporirane za mesto-specifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina.
[0619] Jednom modifikovana, varijanta polipeptida relaksina koja sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil reaguje sa PEG derivatom koji sadrži aminooksi oblika:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
gde R je metil, n je 3 i n je približno 20,000 MM. Prečišćen relaksin koji sadrži paminofenilalanin rastvoren sa 10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 7.0, ili u 10 mM natrijum acetata (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 4.5, reaguje sa 10 do 100-puta viškom PEG-a koji sadrži aminooksi, a zatim se meša tokom 10 - 16 sata na sobnoj temperaturi (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc.1959, 81, str 475). PEG-relaksin se zatim razblaži sa odgovarajućim puferom za trenutno prečišćavanje i analizu.
Primer 9
[0620] Ovaj primer detaljno prikazuje uvođenje aminokiseline koja sadrži karbonil i zatim reakciju sa PEG-om koji sadrži aminooksi.
[0621] Ovaj primer prikazuje metodu za generisanje polipeptida relaksina koji inkorporira ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja uključuje keton koja zatim reaguje sa PEG-om koji sadrži aminooksi od oko 30,000 MM. Svaki od ostataka pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućim pozicijama uSEQ ID NOs: 2 i 3) je odvojeno supstituisan sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom koja ima sledeću strukturu:
[0622] Sekvence korišćene za mesto-specifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina u relaksin su SEQ ID NO: 1 (ili SEQ ID NO: 2, ili 3), i SEQ ID NO: 16 ili 17 (muttRNK, M. jannaschii), i sekvence opisane iznad i inkorporirane za mesto-specifičnu inkorporaciju paminofenilalanina.
[0623] Jednom modifikovana, varijanta polipeptida relaksina koja sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil reaguje sa PEG derivatom koji sadrži aminooksi oblika:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
gde R je metil, n je 3 i n je približno 30,000 MM. Prečišćen relaksin koji inkorporira paminofenilalanin rastvoren sa 10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 7.0, ili u 10 mM natrijum acetata (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 4.5, reaguje sa 10 do 100-puta viškom PEG-a koji sadrži aminooksi, a zatim se meša tokom 10 - 16 sata na sobnoj temperaturi (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc.1959, 81, str 475). PEG-relaksin se zatim razblaži sa odgovarajućim puferom za trenutno prečišćavanje i analizu.
Primer 10
[0624] Ovaj primer detaljno prikazuje uvođenje aminokiseline koja sadrži karbonil i zatim reakciju sa PEG-om koji sadrži aminooksi.
[0625] Ovaj primer demonstrira metodu za generisanje polipeptida relaksina koji inkorporira ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja uključuje keton koja zatim reaguje sa PEG-om koji sadrži aminooksi od oko 40,000 MM. Svaki od ostataka pre pozicije 1 (tj. na N-terminus), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućim pozicijama u SEQ ID NOs: 2 i 3) je odvojeno supstituisan sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom koja ima sledeću strukturu:
[0626] Sekvence korišćene za mesto-specifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina u relaksinu su SEQ ID NO: 13 (ili SEQ ID NO: 1, 2, ili 14), i SEQ ID NO: 16 ili 17 (muttRNK, M. jannaschii), i sekvence opisane iznad i inkorporirane za mesto-specifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina.
[0627] Jednom modifikovana, varijanta polipeptida relaksina koja sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil reaguje sa PEG derivatom koji sadrži aminooksi oblika:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
gde R je metil, n je 3 i n je približno 40,000 MM. Prečišćen relaksin koji sadrži paminofenilalanin rastvoren sa 10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 7.0, ili u 10 mM natrijum acetatu (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 4.5, reaguje sa 10 do 100-puta viškom PEG koji sadrži aminooksi, a zatim se meša tokom 10 - 16 sata na sobnoj temperaturi (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc.1959, 81, str 475). PEG-relaksin se zatim razblaži sa odgovarajućim puferom za trenutno prečišćavanje i analizu.
Primer 11
[0628] Ovaj primer detaljno prikazuje uvođenje aminokiseline koja sadrži karbonil i zatim reakciju sa PEG-om koji sadrži aminooksi.
[0629] Ovaj primer prikazuje metodu za generisanje polipeptida relaksina koji sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu koja uključuje keton koja zatim reaguje sa PEG koji sadrži aminooksi od približno 10,000 MM. Svaki od ostataka pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 (tj., na karboksil terminuus proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućim pozicijama u SEQ ID NOs: 2 i 3) je odvojeno supstituisan sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom koja ima sledeću strukturu:
[0630] Sekvence korišćene za mesto-specifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina u relaksin su SEQ ID NO: 13 (ili odgovarajuće pozicije u SEQ ID NO: 1, 2, ili 14), i SEQ ID NO: 16 ili 17 (muttRNK, M. jannaschii), i sekvence opisane iznad i inkorporirane za mestospecifičnu inkorporaciju p-aminofenilalanina.
[0631] Jednom modifikovana, varijanta polipeptida relaksina koja sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil reaguje sa PEG derivatom koji sadrži aminooksi oblika:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
gde R je metil, n je 3 i n je približno 10,000 MM. Prečišćen relaksin koji sadrži paminofenilalanin rastvoren sa 10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 7.0, ili u 10 mM natrijum acetata (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 4.5, reaguje sa 10 do 100-puta viška PEG koji sadrži aminooksi, a zatim se meša tokom 10 - 16 sata na sobnoj temperaturi (Jencks, W. J. Am. Chem. Soc.1959, 81, str 475). PEG-relaksin se zatim razblaži sa odgovarajućim puferom za trenutno prečišćavanje i analizu.
Primer 12
[0632] Konjugacija sa PEG koja se sastoji od hidroksilamin grupe povezane sa PEG preko amid povezivanja.
[0633] PEG reagens koji ima sledeću strukturu je spojen sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom koja sadrži keton primenom procedure opisane u primerima 3-9:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-O-NH2
gde R = metil, n=4 i n je približno 5,000 MW - 40,000 MW. Uslovi reakcije, prečišćavanja, i analize su opisani i poznati u oblasti tehnike.
Primer 13
[0634] Ovaj primer detaljno objašnjava uvođenje dve različite ne-prirodno kodirane aminokiseline u polipeptide relaksina i polipeptide analoga relaksina.
[0635] Ovaj primer demonstrira metoda za generisanje polipeptida relaksina koji inkorporira ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja sadrži keton funkcionalnost na dve pozicije između sledećih ostataka: pre pozicije1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućim pozicijama u SEQ ID NOs: 2 i 3). Polipeptid relaksina se priprema kao što je opisano iznad, osim što se selektor kodon uvodi na dve različita mesta unutar nukleinske kiseline.
Primer 14
[0636] Ovaj primer detaljno objašnjava konjugaciju polipeptida relaksina ili polipeptida analoga relaksina analog sa PEG-om koji sadrži hidrazid i naknadnu in situ redukciju.
[0637] Polipeptid relaksina koji inkorporira aminokiselinu koja sadrži karbonil je pripremljen prema proceduri opisanoj iznad. Jednom modifikovan, PEG koji sadrži hidrazid koji ima sledeću strukturu je spojen sa polipeptidom relaksina:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
gde R = metil, n=2 i N = 5,000; 10,000, 20,000; 30,000; ili 40,000 MM a X je karbonil (C=O) grupa. Prečišćen relaksin koji sadrže p-acetilfenilalan je rastvoren sa između 0.1-10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 7.0, ili u10 mM natrijum acetata (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 4.5, reaguje sa 1 do 100-puta viška PEG-a koji sadrži hidrazid, i odgovarajući hidrazon se redukuje in situ dodavanjem štok 1M NaCNBH3 (Sigma Chemical, Sent Luis, MO), rastvorenog u H2O, do finalne koncentracije od 10-50 mM. Reakcije se izvode u mraku na 4 °C do RT tokom 18-24 sata. Reakcije se zaustavljaju dodavanjem 1 M Tris (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) na oko pH 7.6 do finalne koncentracije Tris od 50 mM ili razblaže odgovarajućim puferom za trenutno prečišćavanje.
Primer 15
[0638] Ovaj primer detaljno prikazuje konjugaciju polpieptida relaksina ili polipeptida analoga relaksina sa PEG-om koji sadrži hidrazid i zatim in situ redukciju.
[0639] Polipeptid relaksina koji inkorporira aminokiselinu koja sadrži karbonil se priprema prema proceduri opisanoj iznad. Jednom modifikovan, PEG koji sadrži hidrazid koji ima sledeću strukturu se konjuguje sa polipeptidom relaksina:
R-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-X-NH-NH2
gde R = metil, n=2 i N = 20,000 MW a X je karbonil (C=O) grupa. Prečišćen relaksin koji sadrži p-acetilfenilalan se rastvara pri između 0.1-10 mg/mL u 25 mM MES (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 6.0, 25 mM Hepes (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 7.0, ili u 10 mM natrijum acetata (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) pH 4.5, reaguje sa 1 do 100-puta viška PEG-a koji sadrži hidrazid, i odgovarajući hidrazon se redukuje in situ dodavanjem štok 1M NaCNBH3 (Sigma Chemical, Sent Luis, MO), rastvorenog u H2O, do finalne koncentracije od 10-50 mM. Reakcije se izvode u mraku na 4°C do RT tokom 18-24 sata. Reakcije se zaustavljaju dodavanjem 1 M Tris (Sigma Chemical, Sent Luis, MO) na oko pH 7.6 do finalne koncentracije Tris od 50 mM ili razblaće u odgovarajućem puferu za trenutno prečišćavanje.
Primer 16
[0640] Ovaj primer detaljno objašnjava uvođenje aminokiseline koja sadrži alkin u polipeptid relaksina ili polipeptid analoga relaksina i derivatizaciju sa mPEG-azidom..
[0641] Sledeći ostataci, pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućim pozicijama u SEQ ID NOs: 2 i 3), su svaki supstituisani sa sledećom ne-prirodno kodiranom aminokiselinom:
[0642] Sekvence korišćene za mesto-specifičnu inkorporaciju p-propargil-tirozina u relaksin su SEQ ID NO: 1 (ili odgovarajue apozicije u SEQ ID NO:2 ili 3), SEQ ID NO: 16 ili 17 (muttRNK, M. jannaschii), i 22, 23 ili 24 opisane iznad. Polipeptid relaksina koji sadrži propargil tirozin se eksprimira u E. coli i prečišćava korišćenjem uslova koji su iznad opisani.
[0643] Prečišćen relaksin koji sadrži propargil-tirozin rastvoren pri između 0.1-10 mg/mL u PB puferu (100 mM natrijum fosfata, 0.15 M NaCl, pH = 8) i 10 do 1000-puta višak PEG koji sadrži azid se dodaje reakcionoj smeši. Katalitička količina CuSO4 i Cu žice se zatim dodaje reakcionoj smeš. Nakon što je smeša inkubirana (uključujući ali nije ograničeno na, oko 4 sata na sobnoj temperaturi ili 37° C, ili preko noći na 4°C), H2O se dodaje i smeša se filtrira kroz membranu za dijalizu. Uzorak se može analizirati za dodavanje, uključujući ali nije ograničeno na, sličnim procedurama opisanim u primeru 3. U tom primeru, PEG će imati sledeću strukturu:
R-PLG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)n-N3
gde R je metil, n je 4 a N = 5,000; 10,000, 20,000; 30,000; ili 40,000 MM.
Primer 17
[0644] Ovaj primer detaljno objašnjava supstituciju velike, hidrofobne aminokiseline u polipeptidu relaksina sa propargil tirozinom.
[0645] Phe, Trp ili Tyr ostatak prisutan u jednom od sledećih regiona relaksina: pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućim pozicijama u SEQ ID NOs: 2 i 3), je supstituisan sa sledećom ne-prirodno kodiranom aminokiselinom kao što je opisano iznad:
[0646] Jednom modifikovan, PEG je vezan za varijantu polipeptida relaksina koja sadrži aminokiselinu koja sadrži alkin. PEG će imati sledeću strukturu:
Me-PEG(N)-O-(CH2)2-N3
a procedure spajanja sledile bi one u gornjim primerima. Ovo će generisati varijantu polipeptida relaksina koja sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja je otprilike izosterna sa jednom od velikih hidrofobnih aminokiselina koje se javljaju u prirodi i koja je modifikovana PEG derivatom na različitom mestu unutar polipeptida.
Primer 18
[0647] Ovaj primer detaljno prikazuje generisanje homodimera, heterodimera, homomultimera ili heteromultimera polipeptida relaksina razdvojenih sa jednim ili više PEG veznika. Multimeri polipeptida relaksina mogu da se formiraju između proinsulina ili između zrelih polipeptida relaksina A i B lanca pronalaska.
[0648] Varijanta polipeptida relaksina koja sadrži alkin proizveden u primeru iznad reaguje sa bifunkcionalnim PEG derivatom oblika:
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3 gde n je 4 a ima prosečnu MM od približno 5,000; 10,000; 20,000; 30,000; ili 40,000 MM da se generiše odgovarajući homodimer polipeptida relaksina pri čemu dva molekula relaksina su fizički odvojena PEG-om. Na analogan način polipeptid relaksina može biti spojen sa jednim ili više drugih polipeptida da formira heterodimere, homomultimere, ili heteromultimere. Spajanje, prečišćavanje, i analiza će se izvesti kao u primerima iznad.
Primer 19
[0649] Ovaj primer detaljno prikazuje generisanje homodimera, heterodimera, homomultimera, ili heteromultimera polipeptida relaksina odvojenih jednim ili više PEG veznika. Multimeri polipeptida relaksina mogu biti formirani između A lanaca i drugih A lanaca ili B lanaca i drugih B lanaca.
[0650] Varijanta polipeptida relaksina koja sadrži alkin proizvedena u gornjem primeru je bifunkcionalni PEG derivat oblika:
N3-(CH2)n-C(O)-NH-(CH2)2-O-PEG(N)-O-(CH2)2-NH-C(O)-(CH2)n-N3 gde n je 4 a PEG ima prosečnu MM od približno 5,000; 10,000; 20,000; 30,000; ili 40,000 MM da generiše odgovarajući homodimer polipeptida relaksina pri čemu su dva molekula relaksin fizički odvojena PEG-om. Na analogan način polipeptid relaksina može biti spojen za jedan ili više drugih polipeptida da formira heterodimere, homomultimere, ili heteromultimere. Spajanje, prečišćavanje, i analize će se izvesti kao u primerima iznad.
Primer 20
[0651] Ovaj primer detaljno prikazuje spajanje saharid segmenta za polipeptid relaksina.
[0652] Jedan ostatak od sledećih je supstituisan sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom ispod: pre pozicije 1 (tj. na N-terminusu), 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54 (tj., na karboksil terminusu proteina sa SEQ ID NO: 1 ili odgovarajućim pozicijama u SEQ ID NOs: 2 i 3), kao što je opisano iznad.
[0653] Jednom modifikovana, varijanta polipeptida relaksina koja sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil reaguje sa β-povezanim aminooksi analogom N-acetilglukozamina (GlcNAc). Varijanta polipeptida relaksina (10 mg/mL) i aminooksi saharid (21 mM) se mešaju u vodenom 100 mM natrijum acetatnom puferu (pH 5.5) i inkubiraju na 37°C tokom 7 do 26 sata. Drugi saharid je spojen za prvi enzimski inkubiranjem saharid-konjugovanog polipeptida relaksina (5 mg/mL) sa UDP-galaktozom (16 mM) i β-1,4-galacitoziltransferazom (0.4 jedinica/mL) u 150 mM HEPES pufera (pH 7.4) tokom 48 sata na temperaturi okoline (Schanbacher et al. J. Biol. Chem.1970, 245, 5057-5061).
Primer 22
[0654] Ovaj primer detaljno prikazuje generisanje PEGilovanog antagonista polipeptida relaksina.
[0655] Ostatak, uključujući ali nije ograničeno na, one uključene u vezivanje receptora relaksina je supstituisan sa sledećom ne-prirodno kodiranom aminokiselinom kao što je opisano iznad. Jednom modifikovana, varijanta polipeptida relaksina koja sadrži aminokiselinu koja sadrži karbonil će reagovati sa PEG derivatom koji sadrži aminooksi oblika:
R-PEG(N)-O-(CH2)n-O-NH2
gde R je metil, n je 4 i N je 5,000; 10,000; 20,000; 30,000; ili 40,000 MM da generiše antagonist polipeptid relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu koja je modifikovana sa PEG derivatom na pojedinačnom mestu unutar polipeptida. Spajanje, prečišćavanje, i analize se izvode kao što je opisano iznad.
Primer 21
[0656] Generisanje homodimera, heterodimera, homomultimera, ili heteromultimera polipeptida relaksina u kojima su molekuli relaksina povezani direktno
[0657] Varijanta polipeptida relaksina koji sadrži aminokiselinu koja sadrži alkin može se direktno spojiti za drugu varijantu polipeptida relaksina koja sadrži aminokiselinu koja sadrži azido. Na analogan način polipeptid polipeptid relaksina može se spojiti za jedan ili više drugih polipeptida da formira heterodimere, homomultimere, ili heteromultimere. Više opisa koji se odnmose na multimere koji se mogu formirati je obezbeđeno iznad u primerima 16 i 17 a spajanje, prečišćavanje, i analize su izvedeni kao što je opisano iznad.
Primer 22
[0658]
[0659] Polialkilen glikol (P-OH) reaguje alkil halidom (A) da formira etar (B). U ovim jedinjenjima, n je ceo broj od jedan do devet a R' može biti ravan- ili razgranat-lanac, zasićena ili nezasićena C1, do C20 alkil ili heteroalkil grupa. R' može takođe biti C3 do C7 zasićeni ili nezasićeni ciklični alkil ili ciklični heteroalkil, supstituisana ili nesupstituisana aril ili heteroaril grupa, ili supstituisana ili nesupstituisana alkaril (alkil je C1 do C20 zasićen ili nezasićen alkil) ili heteroalkaril grupa. Tipično, PEG-OH je polietilen glikol (PEG) ili monometoksi polietilen glikol (mPEG) koji ima molekulsku masu od 800 do 40,000 Daltona (Da).
Primer 23
[0660]
mPEG-OH Br-CH2-C≡CH → mPEG-O-CH2-C≡CH
[0661] mPEG-OH sa molekulskom masom od 20,000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se tretira sa NaH (12 mg, 0.5 mmol) u THF-u (35 mL). Rastvor propargil bromida, rastvorenog kao 80% maseni rastvor u ksilenu (0.56 mL, 5 mmol, 50 ekviv., Aldrich), i katalitička količina KI se zatim dodaje rastvoru a rezultujuća smeša se zagreva do refluksa tokom 2 sata. Voda (1 mL) se zatim doda i rastvarač se uklanja pod vakuumom. U ostatak se doda CH2Cl2 (25 mL) i organski sloj se odvaja, suši iznad anhidrovanog Na2SO4, a volume se redukuje do približno 2 mL. Ovaj CH2Cl2 rastvor se doda u dietil etar (150 mL) u kapima. Rezultujući talog se sakupi, ispere sa nekoliko delova hladnog dietil etra, i suši da se dobije propargil-O-PEG.
Primer 24
[0662]
mPEG-OH Br-(CH2)3-C≡CH → mPEG-O-(CH2)3-C≡CH
[0663] mPEG-OH sa molekulskom masom od 20,000 Da (mPEG-OH 20 kDa; 2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se tretira sa NaH (12 mg, 0.5 mmol) u THF-u (35 mL). Pedeset ekvivalenata 5-bromo-1-pentina (0.53 mL, 5 mmol, Aldrich) i katalitička količina KI se zatim doda u smešu. Rezultujuća smeša se zagreje do refluksa tokom 16 sati. Voda (1 mL) se zatim doda a rastvarač se uklanja pod vakuumom. U ostatak se doda CH2Cl2 (25 mL) i organski sloj se odvoji, suši iznad anhidrovanog Na2SO4, a zapremina se redukuje do približno 2 mL. Ovaj CH2Cl2 rastvor se doda u dietil etar (150 mL) u kapima. Rezultujući talog se sakupi, ispere sa nekoliko delova hladnog dietil etra, i suši da se dobije odgovarajući alkin.5-hloro-1-pentin se može koristiti u slićnoj reakciji.
Primer 25
[0664]
(1) m-HOCH2C6H4OH NaOH Br- CH2-C≡CH → m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH (2) m-HOCH2C6H4O-CH2-C≡CH MsCl N(Et)3→ m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH (3) m-MsOCH2C6H4O-CH2-C≡CH LiBr → m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH
(4) mPEG-OH m-Br-CH2C6H4O-CH2-C≡CH → mPEG-O-CH2-C6H4O-CH2-C≡CH
[0665] U rastvor 3-hidroksibenzilalkohola (2.4 g, 20 mmol) u THF-u (50 mL) i vode (2.5 mL) se prvo doda praškasti natrijum hidroksid (1.5 g, 37.5 mmol) a zatim rastvor propargil bromida, rastvoren kao 80% maseni rastvor u ksilenu (3.36 mL, 30 mmol). Reakciona smeša se zagreva pri refluksu tokom 6 sati. U smešu se doda 10% limunska kiselina (2.5 mL) i rastvarač se uklanja pod vakuumom. Ostatak se ekstrahuje sa etil acetatom (3 x 15 mL) a kombinovani organski slojevi se isperu sa zasićenim rastvorom NaCl (10 mL), suše iznad MgSO4 i koncentruju da se dobije 3-propargiloksibenzil alkohol.
[0666] Metanesulfonil hlorid (2.5 g, 15.7 mmol) i trietilamin (2.8 mL, 20 mmol) se dodaju u rastvor jedinjenja 3 (2.0 g, 11.0 mmol) u CH2Cl2 na 0°C i reakcije se stavlja u frižider tokom 16 sati. Uobičajenom obradom dobije se mezilat kao svetlo žuto ulje. Ovo ulje (2.4 g, 9.2 mmol) se rastvara u THF-u (20 mL) i LiBr (2.0 g, 23.0 mmol) se doda. Reakciona smeša se zagreje do refluksa tokom 1 sata i zatim ohladi do sobne temperature. U smeša se doda voda (2.5 mL) i rastvarač se uklanja pod vakuumom. Ostatak se ekstrahuje sa etil acetatom (3 x 15 mL) i kombionovani organski slojevi se isperu sa zasićenim rastvorom NaCl (10 mL), suše iznad anhidrovanog Na2SO4, i koncentruju da se dobije željeni bromid.
[0667] mPEG-OH 20 kDa (1.0 g, 0.05 mmol, Sunbio) se rastvori u THF-u (20 mL) i rastvor se ohladi u kupatilu sa ledom. NaH (6 mg, 0.25 mmol) se doda sa energičnim mešanjem tokom perioda od nekoliko minuta praćeno dodavanjem bromida dobijenog iznad (2.55 g, 11.4 mmol) i katalitičke količine KI. Kupatilo za hlađenje se uklanja a rezultujuća smeša se zagreva do refluksa tokom 12 sata. Voda (1.0 mL) se doda u smešu a rastvarač se uklanja pod vakuumom. U ostatak se doda CH2Cl2 (25 mL) a organski sloj se odvaja, suši iznad anhidrovanog Na2SO4, i zapremina se redukuje do približno 2 mL. Dodavanje u kapima u rastvor etra 150 mL) rezultovalo je belim talogom, koji se sakupi da se dobije PEG derivat.
Primer 26
[0668]
mPEG-NH2+ X-C(O)-(CH2)n-C≡CR' → mPEG-NH-C(O)-(CH2)n-C≡CR'
[0669] Termininalni koji sadrže alkin poli(etilen glikolni) polimeri mogu se takože dobiti spajanjem poli(etilen glikolnog) polimera koji sadrži terminalnu funkcionalnau grupu za reaktivni molekul koji sadrži alkin funkcionalnost kao što je prikazano iznad. n je između 1 i 10. R' može biti H ili mala alkil grupa od C1 do C4.
Primer 27
[0670]
(1) HO2C-(CH2)2-C≡CH NHS DCC→ NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH
(2) mPEG-NH2+ NHSO-C(O)-(CH2)2-C≡CH → mPEG-NH-C(O)-(CH2)2-C≡CH
[0671] 4-pentinoična kiselina (2.943 g, 3.0 mmol) se rastvori u CH2Cl2 (25 mL). N-hidroksisukcinimid (3.80 g, 3.3 mmol) i DCC (4.66 g, 3.0 mmol) se daodaju i rastvor se meša tokom noći na sobnoj temperaturi. Rezultujući sirovi cNHS estar 7 je koriščen u sledećim reakcijama bez daljeg prečišćavanja.
[0672] mPEG-NH2 sa molekulskom masom od 5,000 Da (mPEG-NH2, 1 g, Sunbio) se rastvori u THF-u (50 mL) i smeša se ohladi do 4°C. NHS ester 7 (400 mg, 0.4 mmol) se doda u delovima sa energičnim mešanjem. Smeša se ostavi da se meša tokom 3 sata dok se zagreva do sobne temperature. Voda (2 mL) se zatim doda i rastvarač se uklanja pod vakuumom. U ostatak se doda CH2Cl2 (50 mL) I organski sloj se odvaja, suši iznad anhidrovanog Na2SO4, a zapremina se redukuje do približno 2 mL. Ovaj CH2Cl2 rastvor se doda u etar (150 mL) u kapima. Rezultujući talog se sakupi i suši u vakuumu.
Primer 28
[0673] Ovaj Primer predstavlja pripremu metan sulfonil estra poli(etilen glikola), koji se takođe može nazivati kao metanesulfonat ili mezilat poli(etilen glikola). Odgovarajući tozilat i halidi mogu se pripremiti sličnim procedurama.
mPEG-OH CH3SO2Cl N(Et)3→ mPEG-O-SO2CH3→ mPEG-N3
[0674] mPEG-OH (MW = 3,400, 25 g, 10 mmol) u 150 mL toluena se azeotropno destiliše tokom 2 sata pod azotom a rastvor se ohladi do sobne temperature.40 mL suvog CH2Cl2 i2.1 mL suvog trietilamina (15 mmol) se doda u rastvor. Rastvor se ohladi u kupatilu sa ledom i1.2 mL destilovanog metanesulfonil hlorida (15 mmol) se doda u kapima. Rastvor se meša na sobnoj temperaturi pod azotom tokom noći, a reakcija se ugasi dodavanjem 2 mL apsolutnog etanola. Smeša se upari pod vakuumom da se uklone rastvarači, primarno oni drugi od toluena, filtrira, ponovo koncentruje pod vakuumom, i zatim taloži u 100 mL dietil etra. Ffiltrat swe ispere sa nekoliko delova hladnog dietil etra i suši u vakuumu da se dobije mezilat.
[0675] Mezilat (20 g, 8 mmol) se rastvori u 75 ml THF-a i rastvor se ohladi do 4°C. U ohlažđen rastvor se doda natrijum azid (1.56 g, 24 mmol). Reakcija je zagreje do refluksa pod azotom tokom 2 sata. Rastvarači se zatim upare a ostatak se razblaži sa CH2Cl2 (50 mL). Organska frakcija se ispere sa rastvorom NaCl i suši iznad anhidrovanog MgSO4. Zapremina se redukuje do 20 ml a proizvod se istaloži dodavanjem 150 ml hladnog suvog etra.
Primer 29
[0676]
(1) N3-C6H4-CO2H → N3-C6H4CH2OH
(2) N3-C6H4CH2OH → Br-CH2-C6H4-N3
(3) mPEG-OH Br-CH2-C6H4-N3→ mPEG-O-CH2-C6H4-N3
[0677] 4-azidobenzil alkohol može biti proizveden primenom metode opisane u američkom patentu 5,998,595. Metanesulfonil hlorid (2.5 g, 15.7 mmol) i trietilamin (2.8 mL, 20 mmol) se dodaju rastvoru 4-azidobenzil alkohola (1.75 g, 11.0 mmol) u CH2Cl2 na 0°C i reakciju se smešta u frižider tokom 16 sati. Uobičajenim postupkom se dobije mezilat kao svetlo žuto ulje. Ovo ulje (9.2 mmol) se rastvori u THF-u (20 mL) i LiBr (2.0 g, 23.0 mmol) se doda. reakciona smeša se zagreje do refluksa tokom 1 sata i tatim se ohladi do sobne temperature. U smešu se doda voda (2.5 mL) i rastvarač se uklanja pod vakuumom. Ostatak se ekstrahuje sa etil acetatOM (3 x 15 mL) a kombionovani organski slojevi se isperu sa zasićenim rastvorom NaCl (10 mL), suše iznad anhidrovanog Na2SO4, i koncentruju da se dobije željeni bromid.
[0678] mPEG-OH 20 kDa (2.0 g, 0.1 mmol, Sunbio) se tretira sa NaH (12 mg, 0.5 mmol) u THF-u (35 mL) i bromid (3.32 g, 15 mmol) se doda u smeša zajedno sa katalitičkom količinom KI. Rezultujuća smeša se zagreje do refluksa tokom 12 sati. Voda (1.0 mL) se doda u smešu a rastvarač se ukloni pod vakuumom. U ostatak se doda CH2Cl2 (25 mL) a organski sloj se odvoji, suši iznad anhidrovanog Na2SO4, a zapremina se redukuje do približno 2 mL. Dodavanje u kapima u rastvor etra (150 mL) rezultovalo je talogom, koji se sakupi da se dobije mPEG-O-CH2-C6H4-N3.
Primer 30
[0679]
NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H N3-CH2CH2CO2-NHS → N3-CH2CH2-C(O)NH-PEG-O-CH2CH2CO2H
[0680] NH2-PEG-O-CH2CH2CO2H (MW 3,400 Da, 2.0 g) se rastvori u zasićenom vodenom rastvoru NaHCO3 (10 mL) i rastvor se ohladi na 0°C. 3-azido-1-N-hidroksisukcinimido propionat (5 ekviv.) se doda sa energičnim mešanjem. Nakon 3 sata, 20 mL H2O se doda i smeša se meša tokom dodatnih 45 minuta na sobnoj temperaturi. pH se podesi na 3 sa 0.5 N H2SO4 i NaCl se doda do koncentracije od približno 15 mas%. Reakciona smeša se ekstrahuje sa CH2Cl2 (100 mL x 3), suši iznad Na2SO4 i koncentruje. Nakon taloženje sa hladnim dietil etrom, proizvod se sakupi filtracijom i suši pod vakuumom da se dobije omega-karboksi-azid PEG derivat.
Primer 31
[0681]
mPEG-OMs HC≡CLi → mPEG-O-CH2-CH2-C≡C-H
[0682] U rastvor litijum acetilida (4 ekviv.), pripremljenog kao što je poznatoj u oblasti tehnike i ohlađenog na -78°C u THF, se doda u kapima rastvor mPEG-OMs rastvoren u THF-u a energičnim mešanjem. Nakon 3 sata, reakciju je ostavljena da se zagreje do sobne temperature i ugasi dodavanjem 1 mL butanola.20 mL H2O se zatim doda i smeša se meša tokom dodatnih 45 minuta na sobnoj temperaturi. pH se podesi na 3 sa 0.5 N H2SO4 i NaCl se doda do koncentracije od približno 15 mas%. Reakciona smeša se ekstrahuje sa CH2Cl2 (100 mL x 3), suši iznad Na2SO4 i koncentruje. Nakon taloženja sa hladnim dietil etrom, proizvod se sakupi filtracijom i suši pod vakuumom da se dobije 1-(but-3-iniloksi)-metoksipolietilen glikol (mPEG).
Primer 32
[0683] Aminokiseline koje sadrže azid i acetilene mogu se mesto-selektivno inkorporirati u proteine primenom metoda opisanih u L. Wang, et al., (2001), Science 292:498-500, J.W. Chin et al., Science 301:964-7 (2003)), J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), Chem Bio Chem 3(11):1135-1137; J. W. Chin, et al., (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024: i, L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. Comm., 1:1-11. Jednom kada su aminokiseline inkorporirane, reakcija cikloadicije se izvede sa 0.01 mM proteina u fosfatnom puferu (PB – phosphate buffer), pH 8, u prisustvu 2 mM PEG derivata, 1 mM CuSO4, i ∼1 mg Cu-žice tokom 4 sata na 37 °C.
Primer 33
[0684] Ovaj primer opisuje sintezu p-Acetil-D,L-fenilalanina (pAF) i m-PEG-hidroksilamin derivata.
[0685] Racemski pAF se sintetizuje primenom prethodno opisane procedure u Zhang, Z., Smith, B. A. C., Wang, L., Brock, A., Cho, C. & Schultz, P. G., Biochemistry, (2003) 42, 6735-6746 .
[0686] Da se sintetiše m-PEG-hidroksilamin derivat, sledeće procedure su izvršene. U rastvor (N-t-Boc-aminooksi)sirćetne kiseline (0.382 g, 2.0 mmol) i 1,3-diizopropilkarbodiimida (0.16 mL, 1.0 mmol) u dihlorometanu (DCM, 70mL), koji se meša na sobnoj temperaturi (RT) tokom 1 sata, metoksi-polietilen glikol amin (m-PEG-NH2, 7.5 g, 0.25 mmol, Mt.30 K, od BioVectra) i diizopropiletilamin (0.1 mL, 0.5 mmol) se doda. Reakcija se meša na RT tokom 48 sata, a zatim koncentruje do oko 100 mL. Smeša se doda u kapima hladnom etru (800 mL). t-Boc-zaštićeni proizvod se istaložio i sakupljen je filtriranjem, ispran sa etrom 3x100mL. Dalje je prečišćen ponovnim rastvaranjem u DCM -u (100 mL) i istaložen u etru (800 mL) dvaput. Proizvod se suši u vakuumu dajući 7.2 g (96%), potvrženog sa NMR i Nihydrin-ovim testom.
[0687] deBoc zaštićenog proizvoda (7.0 g) dobijenog iznad se izvodi u 50% TFA/DCM (40 mL) na 0°C tokom 1 sata a zatim na RT tokom 1.5 sata. Nakon ukljanjanja većine TFA u vakuumu, TFA so hidroksilamin derivata se konvertuje u HCl so dodavanjem 4N HCl u dioksanu (1mL) ostatku. Talog se rastvori u DCM-u (50 mL) i ponovo taloži u etru (800 mL). FinalNI proizvod (6.8 g, 97%) se sakupi filtriranjem, ispere sa etrom 3x 100mL, suši u vakuumu, čuva pod azotom. Drugi PEG (5K, 20K) hidroksilamin derivati su sintetisani primenom iste procedure.
Primer 34
In Vivo studija PEGilovanog relaksina
[0688] PEG-Relaksin, nemodifikovani relaksin i puferni rastvor su administrirani miševima ili pacovima. Rezultati će pokazati superiorniju aktivnost i produženi poluživot PEGilovanog relaksina predmetnog pronalaska u poređenju sa nemodifikovanim relaksinom. Slično, modifikovan relaksin, nemodifikovane relaksin, i puferni rastvor su administrirani miševima ili pacovima.
Farmakokinetičke analize
[0689] Polipeptid relaksina pronalaska je administriran mičevima intravenskim ili subkutanim putevima. Životinjama se oduzima krv pre i u vremenskim tačkama nakon doziranja. Plazma se sakuplja iz svakog uzorka i analizira radioimunološkim ispitivanjem. Poluživot eliminacije može se izračunati i uporediti između polipeptida relaksina koji sadrže ne-prirodno kodiranu aminokiselinu i divljeg tipa relaksina ili različitih analognih polipeptida relaksina pronalaska. Slično tome, polipeptidi relaksina pronalaska mogu se davati cinomolgus majmunima. Životinjama se oduzima krv pre i u vremenskim tačkama nakon doziranja. Plazma se sakuplja iz svakog uzorka i analizira radioimunološkim ispitivanjem.
[0690] Polipeptid se može miševima administrirati putem višestrukih doza, kontinuirane infuzije, ili jedne doze, itd.
Primer 35
[0691] Relaksin se eksprimira pomoću Novagen ekspresionog sistema (inducibilni T7 promotor; detaljno opisan u pET System mANUAL, verzija 9), ekspresionog vektora pET30a i ekspresionog soja BL21 (DE3).
[0692] 2mL LB/Kanamicin (10 µg/ml) kulture inokulirano je pomeranjem sa BL21 (DE3) ploče transformisano sa željenim analogom. Ovo smanjuje efekte izazvane kolonijom na promenljivost kolonije u ekspresionim nivoima. Ova kultura se uzgaja preko noći na 37°C sa energičnim mešanjem a sledećeg dana, 10 ml LB/Kanamicin kulture se inokuliše sa 1 ml od kulture koja je prenoćila (OD600 ∼ 0.4-0.5). Preostali mL kulture kulture koja je prenoćila mogu se zalediti kao glicerol štok.
[0693] 10 mL uzgojene kulture se stavi na 37°C i 250 o/min tokom 30-45 min dok OD600 ne dostigne 0.8-0.9. Zatim se indukuje sa 1mM IPTG (sa 1mL koji mogu biti izdvojeni kao neindukovana kontrola kulture) i sakuplje obično 3-4 sata posle indukcije i analizira na SDS-PAGE.
[0694] Takođe je moguće da se uradi vremenski tok eksprimiranja (npr. tačke 1,2,4,6 sata posle indukcije iO/N) da bi se odredila brzinu nakupljanja, stabilnost proteina itd.
[0695] Analiza gela: u željenoj vremenskoj tački post-indukcijski 1mL se sakuplja iz kulture, ćelije se centrifugiraju, resuspenduju u 100 µl 2X SDS-PAGE, sonikuju da se smanji viskoznost i 10 µl se propusti u SDS-PAGE. Po želji, može se uporediti sa neindukovanom kontrolom ili kontrolama i/ili poznatoj pozitivnoj kontroli ili standardnoj a nivoi eksprimiranja se mogu proceniti (npr. dobro eksprimiranje može biti pri > 100 µg/ml). Western blot analiza može se takođe primeniti. Takođe je moguće da se izdvoji 4 ml kulture, pripreme inkluziona tela (ako eksprimiraju nerastvorljive analoge) i uradi analiza masenog spektra na njima da se potvrdi identitet prekomerno eksprimiranog proteina.
[0696] Za ekspresiju proteina većeg obima, > 250 mL LB/Kanamicina (10 µg/ml) se inokulira sa 250µL zaleđenog đtok glicerola i uzgaja preko noći. Sledećeg dana, 10 X 1L LB/Kanamicin kulture se inokulira sa 25 mL iz kulture koja je prenoćila (OD600 ∼ 0.1).
[0697] 1L kulture se uzgaja na 37°C i 250 o/min ∼ 2h dok OD600 ne dostigne 0.8-0.9. Zatim se indukuje sa 1 mM IPTG i sakupi 4 h posle indukcije ili sledećeg jutra (sakupljeno se može centrifugirati tokom 15 min na 4,000 o/min). Granule se isperu sa 50 mM Tris-HCl, pH 8.0 (50 ml po peletu 50 ml da se ispere boca) ukoliko je poželjno da se redukuje endotoksin i olakša prečišćavanje. Granule se sakupe i ponovo centrifugiraju.
Primer 36
Studija eksprimiranja Pichia – priprema DNK, elektroporacija, protokoli eksprimiranja
[0698] Ovaj primer obezbeđuje protokol za pripremu polipeptida relaksina predmetnog pronalaska u Pichia. SEQ ID NOs: 34, 35, 36, i 37 su korišćeni, a plazmid se može koristiti za kloniranje u Pichia a ovi ili drugi modifikovani plazmidi mogu se koristiti da se postigne eksprimiranje proteina polipeptida relaksina u Pichia, modifikacije napravljene u plazmidu korišćenjem metoda poznatih u oblasti tehnike.
[0699] Na dan 1 protokola, vrši se digestija tokom noći, tipično upotrebom 2U enzima po µg DNK da se digestuje i 10mL YPhyD kulture se inokuliše preko noći u tikvici od 50mL, mešanjem na 260omin na 30°C iz štoka glicerola.
Pripremanje DNK
[0700] DNK se taloži dodavanjem prvo 1/10 zapremine sterilnog 3M NaOAc a zatim 0.7 zapremine sterilnog IPA a potom se uzorak energično meša i taloženje se nastavi tokom noći na -20°C ili na -70°C dok se ne smrzne. DNA se zatim granulira centrifugiranjem (benchtop centrifuga 14,000 o/min/10 minuta), supernatant se ukloni, a granula se ispere upotrebom 500 µL sterilnog 70 % ETOH. Centrifugovati (bench-top centrifuga 14,000 o/min/10 minuta) i dekantovati supernatant i sušiti vazduhom granule tokom 15-20 minuta. Resuspendovati granulu DNK sa sterilnom vodom do 1µg/µl i transformisati Pichia sa 10µg DNK.
Elektroporacija
[0701] Korišćenjem kulture koja je prenoćila sa OD600, razblažiti u YPhyD do OD600= 0.2. Mešati kulturu pri 260 o/min na 30°C dok OD600ne dostigne 0.8-1.0. Sakupiti ćelije centrifugiranjem (4000 o/min/5 minutea). Dekantovati medijum, isprati ćelije u 20 mL ledeno hladne sterilne vode, ponovo dekantovati i ponoviti. Nakon dužeg ispiranja, isprati granulu u 20 mL ledeno hladnog sterilnog 1 M sorbitola, dekantovati, i resuspendovati isprane ćelijsku granulu u 600 µL 1 M hladnog sorbitola, zatim se može čuvati na ledu.
[0702] Od ispranih ćelija, pomešati 50 µL sa 10 µg linearizovane DNK u sterilnoj ependorfskoj tubi od 1.5 mL, mešati nežno i inkubirati na ledu tokom 25 minuta. Preneti smešu ćelija/DNK u prethodno ohlađenu kivetu od 0.2 cm korišćenjem dugih nastavaka za pipete. Elektroporacija ćelija korišćenjem BioRad GenPulsar II jedinice sa sledećim podešavanjima: 2000 V, 200 Oma, 25 µFd (koristiti jedan impuls) i odmah dodati 0.5 mL YPhyD medijuma u kivete i mešati pipetiranjem. Preneti celokupan sadržaj u sterilnu epruvetu sa okruglim dnom i lagano mućkati (200 o/min) tokom 30 minuta na 30°C. Ravnomerno položite i rasporedite ćelije i inkubirajte ploče, obrnuto, tokom 3 dana na 30°C.
[0703] Nakon trodnevne inkubacije, izabrati kolonije sa petljom i inokulirati 10 ml BYPhyD medija u tikvici od 50 ml i inkubirati tokom 3 dana na 30°C. Prebrojati kolonije na pločama od 20µl i zabeležiti prosečan broj a zatim sakupiti ćelije, prvo pripremanjem 2 seta kriobočica označenih sa imenom soja i klonskim brojem, relaksinom (tj. eksprimiran protein), i datumom. Preneti kulture u konične epruvete od 15 ml, uzeti OD600od svake kulture, razblažiti kulturu 1:50 ili 1:20 u YPhyD medijumu. Sačuvati alikvot kulture za štok glicerola. Zatim granulisati kvasac pri 4000 o/min tokom 5 min na RT, preneti supernatant u novu, obeleženu koničnu epruvetu od 15 mL, i čuvati na -20 ili -80°C dok ne bude potreban za analitičke podatke.
Analiza ekspresije proteina
[0704] Izvedite uzorke na 4-12% NuPAGE TB gelu (Novex). SDS-PAGE reagensi koje koristi Invitrogen, analizom Western blot-a ili analizom obojenog gela
Formulacije medija
[0705]
Puferovana fiton dekstroza kvasca (BYPhyD - Buffered Yeast Phytone Dextrose)
Ekstrakt kvasca 10 g/L
Fiton pepton 20 g/L
1 M kalijum fosfatni pufer (pH 6) 100 ml/L
10X YNB 100 mL/L
20% Dekstroza 100 mL/L
Kvasac Fiton dekstroza kvasca (YphyD - Yeast Phytone Dextrose)
Ekstrakt kvasca 10 g/L
Fiton pepton 20 g/L
20% Dekstroza 100 ml/L
10X YNB (Yeast Nitrogen Bas ) (13.4% Azotna baza kvasca sa amonijum sulfatom bez aminokiselina)
Azotna baza kvasca 134 g/L
Primer 37
Proizvodnja relaksina A21G
[0706] U ovom primeru, 4.0L kultura je fermentirano da bi se dobio 13.4g mokre ćelijske paste i urađena priprema inkluzionog tela sa i bez Triton-XlOO. Na ovaj način je proizvedeno 2.07 g vlažnih inkluzionih tela, a zatim je usledila solubilizacija i ponovno savijanje. Inkluziona tela su ponovo suspendovana sa 200mL H2O po gramu vlažnih inkluzionih tela (IBs - inclusion bodies) do krajnje koncentracije od 3mM a cistein je dodat u resuspenziju. IB se zatim rastvaraju povećanjem pH na 11.5 tokom 1sata na RT. Dozvoljeno je ponovo savijanje spuštanjem ukapavanjem pH solubizovanog materijala na 10.6±0.1 i čuva na 2-8°C tokom ∼72 sata i ovi rezultati su prikazani na slici 10. Reakcija ponovnog savijanja je zaustavljena dodavanjem HCl u krajnji pH od 3.0, 0.45 µM je filtrirano i čuva se na 2-8°C do dalje obrade.
[0707] Ponovo savijeni protein je prečišćen povećanjem pH kvenčovanog ponovnog savijanja do 8.0 sa Tris bazom i direktnim punjenjem na Q HP kolonu. Provodljivost punjenja u prikazanom primeru je >3.5mS/cm. Uslovi rada su bili were (A) 20mM Tris, 8.0; (B) 20mM Tris, 8.0; 200mM NaCl i bilo je 0-100%B preko 30CV. Ispravno ponovo savijeni proinsulin je sakupljen i 79 mg proinsulina je oporavljeno.
[0708] Ultrafiltracija/dijafiltracija (UF/DF) je sprovedena i taloženje je izvedena sa 25mM cinka, istaloženi protein je resuspendovan do koncentracije od 2mg/mL sa 20 mM NaOAc, 4.0, 30% ACN, 5 mM EDTA i 20K PEG se doda u konačni molarni odnos od 10:1 PEG prema proteinu i ostavi se da se inkubira tokom 48-72 sata na 28°C.
[0709] Reakcioni PEG je razblažen 1:10 u 0.5X PEG pufera A, 0.22µM je filtrirano i pušteno preko SP 650S kolone. Uslovi rada su bili (A) 10mM NaOAc, 4.0, 1 mM EDTA; (B) 10mM NaOAc, 4.0, 1mM EDTA, 0.4M NaCl; 0-50%B preko 20CV i uzorci PEG-a formulisani u 10mM NaCitrata, 6.5; 150mM NaCl što je prikazano na slici 12.
[0710] Ove metode su primenjene da se proizvedu razni polipeptidi relaksina sa neprirodnim aminokiselinama i opsegom od 0.1-22mg za krajnje količine proteina prečišćenih i PEGilovanih varijanti. Otkriveno je da ACN pomaže solubizaciju smeše PEG/protein u PEG reakciji i taloženju cinka pri pI olakšanom koncentrisanju u prisustvu CAN.
Primer 38
Kliničko ispitivanje sigurnosti i/ili efikasnosti PEGilovanog relaksina koji sadrži neprirodno kodiranu aminokiselinu kod ljudi.
[0711] Cilj: Posmatranje sigurnosti i farmakokinetika subkutano administriranog PEGilovanog rekombinantnog humanog relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu.
[0712] Pacijenti U studiju je uključeno osamnaest zdravih volontera u dobi između 20-40 godina i težine između 60-90 kg. Subjekti neće imati klinički značajne abnormalne laboratorijske vrednosti za hematologiju ili hemiju seruma, kao i negativnu toksikološku proveru urina, HIV proveru i hepatitis B površinski antigen. Oni ne bi trebalo da imaju nikakve dokaze o sledećem: hipertenziji; istoriji bilo koje primarne hematološke bolesti; istoriji značajne hepatične, bubrežne, kardiovaskularne, gastrointestinalne, genitourinarne, metaboličke, neurološke bolesti; istoriji anemije ili poremećaju napada; poznatoj osetljivost na proizvode koji potiču iz bakterija ili sisara, PEG, ili albumin iz humanog seruma; uobičajenim i teškim potrošačima pića koja sadrže kofein; učestvovanju u bilo kojem drugom kliničkom ispitivanju ili transfuziji ili doniranju krvi u roku od 30 dana od početka ispitivanja; imali izloženost relaksinu u roku od tri meseca od ulaska u studiju; imali bolest u roku od sedam dana od ulaska na studij; i imaju značajne abnormalnosti na fizičkom pregledu pred-ispitivanja ili kliničkoj laboratorijskoj proceni u roku od 14 dana od početka ispitivanja. Svi subjekti vrednuju se radi sigurnosti, a svi uzorci krvi za farmakokinetičku analizu se prikupljaju prema rasporedu. Sve studije se izvode uz odobrenje institucionalne komisije za etiku i saglasnost pacijenta.
[0713] Dizajn studije: Ovo će biti Faza I, jednocentrična, otvorena-obeležena, randomizirana, dvoperiodno prelazna studija kod zdravih muškaraca volontera. Osamnaest subjekata nasumično je dodeljeno jednoj od dve grupe lečenja sekvencom (devet subjekata/grupi). Relaksin se administrira tokom dva odvojena perioda doziranja kao bolus s.c. injekcijom u gornji deo bedra korišćenjem ekvivalentnih doza PEGilovanog relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu i izabrani komercijalno dostupan proizvod. Doza i učestalost administracije komercijalno dostupnog proizvoda su propisani na etiketi na pakovanju. Dodatno doziranje, učestalost doziranja, ili drugi parametri po želji, upotrebom komercijalno dostupnih proizvoda mogu se dodati u studiju uključivanjem dodatnih grupa subjekata. Svaki period doziranja odvojen je 14-dnevnim periodom ispiranja. Subjekti su ograničeni na istraživački centar najmanje 12 sati pre i 72 sata nakon doziranja za svaki od dva perioda doziranja, ali ne između perioda doziranja. Dodatne grupe subjekata mogu biti dodate ako treba da bude dodatno doziranje, učestalost, ili drugi parametar, koji će se testirati i za PEGilovani relaksin. Eksperimentalna formulacija relaksina je PEGilovani relaksin koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu.
[0714] Uzorkovanje krvi: Serijska krv se uzima direktnom punkcijom vena pre i posle davanja relaksina, uzorci venske krvi (5 ml) za određivanje koncentracije relaksina u serumu dobijaju se na oko 30, 20 i 10 minuta pre doziranja (3 osnovna uzorka) i na približno sledećim vremenima nakon doziranja: 30 minuta i u 1, 2, 5, 8, 12, 15, 18, 24, 30, 36, 48, 60 i 72 sata. Svaki uzorak seruma je podeljen u dva alikvota. Svi uzorci seruma čuvaju se na -20°C. Uzorci seruma se isporučuju na suvom ledu. Klinički laboratorijski testovi na postu (hematologija, hemija seruma i analiza mokraće) izvode se neposredno pre početne doze dana 1, ujutro 4. dana, neposredno pre doziranja 16. dana i ujutru 19. dana.
[0715] Bioanalitičke metode: ELISA kit je korišćen za određivanje koncentracija relaksina u serumu.
[0716] Sigurnosna određivanja: Vitalni znakovi se beleže neposredno pre svakog doziranja (1. i 16. dan) i nakon 6, 24, 48 i 72 sata nakon svakog doziranja. Određivanje sigurnosti zasniva se na učestalosti i vrsti neželjenih događaja i promenama u kliničkim laboratorijskim testovima od početne vrednosti. Pored toga, procenjuju se promene pre studije na merenjima vitalnog znaka, uključujući krvni pritisak, i rezultate fizičkog pregleda.
[0717] Analiza podataka: Vrednosti koncentracije post-doze u serumu koriguju se za osnovne koncentracije relaksina oduzimanjem od svake od vrednosti post-doze srednju vrednost osnovne vrednosti relaksina utvrđene iz proseka nivoa relaksina iz tri uzorka sakupljena u 30-om, 20-om i 10-om minutu pre doziranja. Koncentracije u serumu relaksina u pre-dozi nisu uključene u proračun srednje vrednosti ako su ispod nivoa kvantifikacije ispitivanja. Farmakokinetički parametri se određuju iz podataka o koncentraciji u serumu korigovanih za osnovne koncentracije relaksina. Farmakokinetički parametri izračunavaju se modelom nezavisnih metoda na računarskom sistemu Digital Ekuipment Corporation VAX 8600 koristeći najnoviju verziju softvera BIOAVL. Određeni su sledeći parametri farmakokinetike: maksimalna koncentracija u serumu (Cmax); vreme do maksimalne koncentracije u serumu (tmax); oblast pod krivom koncentracije i vremena (AUC) od nule do poslednjeg vremena uzorkovanja krvi (AUCO-72) izračunata upotrebom linearnog trapezoidnog pravila; i terminalni eliminacioni poluživot (t1/2), izračunato iz konstante brzine eliminacije. Konstanta brzine eliminacije procenjuje se linearnom regresijom uzastopnih tačaka podataka u terminalnom linearnom regionu grafikona log-linearna koncentracija-vreme. Srednja vrednost, standardna devijacija (SD) i koeficijent varijacije (CV) farmakokinetičkih parametara izračunavaju se za svaki tretman. Odnos parametra označava (sačuvana formulacija/ne sačuvana formulacija) se izračunava.
[0718] Rezultati bezbednosti: Učestalost neželjenih događaja je podjednako raspoređena po grupama za lečenje. Nema klinički značajnih promena u odnosu na početne ili prethodne studije kliničkih laboratorijskih testova ili krvnog pritiska, niti su primetne promene od prethodnog ispitivanja u rezultatima fizičkog pregleda i merenja vitalnog znaka. Bezbednosni profili za dve grupe za lečenje treba da izgledaju slično.
[0719] Farmakokinetički rezultati: Srednja vrednost profila koncentracija relaksina u serumu-vreme (neispravljeni za osnovne nivoe relaksina) kod svih 18 subjekata nakon primanja PEGilovanog relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu u svakoj izmerenoj vremenskoj tački. Svi subjekti trebalo bi da imaju pre-doznu osnovnu koncentraciju relaksina unutar normalnog fiziološkog opsega, Farmakokinetički parametri se određuju iz podataka o serumu korigiranih za pre-doznu srednju vrednost osnovne koncentracije relaksina i određuju se Cmax i tmax. Srednja vrednost tmax za bilo koji odabrani klinički komparator(e) je značajno kraća od tmax za PEGilovani relaksin koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu. Vrednosti terminalnog poluživota značajno su kraće za testirani predklinički komparator(e) u poređenju sa terminalnim poluživotom za PEGilovani relaksin koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu.
[0720] Iako se predmetna studija izvodi na zdravim muškim subjektima, slične karakteristike apsorpcije i sigurnosni profili mogli bi se očekivati i kod ostalih populacija pacijenata; kao što su muški ili ženski pacijenti sa dijabetesom, muški ili ženski pacijenti sa kancerom ili hroničnom bubrežnom insuficijencijom, pedijatrijski pacijenti sa bubrežnom insuficijencijom, pacijenti u programima autolognih predispozicija ili pacijenti predviđeni za izbornu operaciju.
[0721] Kao zaključak, subkutano administrirane pojedinačne doze PEGilovanog relaksina koji sadrže ne-prirodno kodiranu aminokiselina će biti bezbedne i dobro podnošene od strane zdravih muškim subjekata. Zasnovano na komparativnoj učestalosti neželjenih događaja, kliničkih laboratorijskih vrednosti, vitalnih znakova, i rezultata fizičkog pregleda, sigurnosni profili komercijalno dostupnih oblika relaksina i PEGilovanog relaksina koji sadrže ne-prirodno kodiranu aminokiselinu biće ekvivalentni. PEGilovani relaksin koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu potencijalno pruža veliku kliničku korist pacijentima i zdravstvenim radnicima.
Primer 39
Razvoj funkcionalnog ispitivanja relaksina
[0722] Ovaj primer obezbeđuje detalje funkcionalnog ispitivanja relaksina.
Humani periferni krvni monociti, THP-1 ćelije, su korišćeni da se demonstrira merljiv cAMP povećanje uporedo sa pozitivnim kontrolama Izoproterenol i Forskolin, THP-1 ćelije su prethodno inkubirane u 500uM IBMX tokom 30 minuta, RLX ko-stimulacija sa 2uM Forskolina tokom 20min. Izoproterenol, Forskolin, i polipeptidi relaksina, uključujući divlji-tip A (saAlaninom u 1. aminokiselinskoj poziciji B lanca) a varijanta RLX-BA1-AV13pAF (varijanta relaksina sa osnovom aminokiselinske sekvence Alanina u 1. aminokiselinskoj poziciji B lanca sa pAF supstituisanim za poziciju 13 (valin) u A lancu, sa četiri (4) različite veličine vezanih PEG'-a; 5K, 10K, 20K, i 30K. TABELA 5
TABELA 5:
Primer 40
[0723] Ovaj primer procenjuje farmakokinetička svojstva 20 kDa PEGilovanig polipeptida relaksina posle pojedinačne subkutane injekcije kod SD pacova.
[0724] Sprague-Dawley-ovi (SD) pacovi su primljeni iz Charles River Laboratories (CRL) u starosti od otprilike 7-8 nedelja (približno 280 g na početku studije). Životinje su primljene nakon što je kateterizirana jugularna vena na CRL. Životinje su se zatim aklimatizovale tokom 3 dana pre nego što su stavljene u studiju.
[0725] Životinje su primile jednu subkutanu injekciju prvog dana i PK uzorci su sakupljeni tokom narednih 80 sati. Uzorci krvi uzeti su životinjama tretiranim sa PEG-relaksinom za analizu koncentracije u serumu u skladu sa sledećim rasporedom uzorkovanja (vremena uzorkovanja su približna):
Dan 1: pre-doza, 1, 2, 4, 8, 12, 25, 34, 50, 58, 73 i 80 sati posle doze
[0726] Koncentracije jedinjenja su merene korišćenjem premošćavajućeg (bridging) ECLA zasnovanom na ispitivanju koje je razvijeno u Ambrx-u. Koncentracije su izračunate korišćenjem standardne krive koja je generisana iz odgovarajućeg doziranog jedinjenja i saopštena u Excel formatu proračunske tabele (videti dodatak). Farmakokinetički parametri su procenjeni upotrebom programa za modelovanje WinNonlin (Pharsight, verzija 5.1).
Nekompartmentalna analiza za podatke o pojedinim životinjama sa linear up/log-down trapezoidnom integracijom je korišćena, a podaci o koncentraciji su ravnomerno vrednovani. Kompartmentalna analiza je izvedena je korišćenjem dva kompartmenta, model eliminacije 1. reda i Gauss-Newton-ov (Levenberg-Hartley-ev) model jednačenja. Tabela 6 prikazuje grupu srednje vrednosti koncentracije PEG-relaksina u serumu u odnosu na vreme. Slika 8 upoređuje grupu srednje vrednosti koncentracije u serumu u odnosu na vreme za sva dozirana PEG-relaksin jedinjenja. Sve dozne grupe d su imale merljive nivoe PEG-relaksina u serumu.
[0727] Pojedinačna koncentracija u serumu u odnosu na vreme je prikazana na slici 9 iz životinja doziranih SC sa 0.5 mg/kg PEG20K-AQ1-RLX. Pojedinačna koncentracija u serumu u odnosu na vreme je prikazana na slici 10 iz životinja doziranih SC sa 0.5 mg/kg PEG20K-AA5-RLX. Pojedinačna koncentracija u serumu u odnosu na vreme je prikazana na slici 11 iz životinja doziranih SC sa 0.5 mg/kg PEG20K-AR18-RLX. Pojedinačna koncentracija u serumu u odnosu na vreme je prikazana na slici 12 iz životinja doziranih SC sa 0.5 mg/kg PEG20K-BV7-RLX. Pojedinačna koncentracija u serumu u odnosu na vreme je prikazana na slici 13 iz životinja doziranih SC sa 0.5 mg/kg PEG20K-BW28-RLX. Pojedinačna koncentracija u serumu u odnosu na vreme je prikazana na slici 14 iz životinja doziranih SC sa 0.5 mg/kg PEG20K-AV13.
[0728] Ne-kompartmentalna analiza koncentracije u serumu u odnosu na vremenske podatke iz subkutano doziranih životinja je sumirana u Tabeli 6.
Tabela 6: Srednja vrednost koncentracija u serumu za SD pacove nakon pojedinačne doze PEG-Relaksina.
NE, nije ocenjeno; BQL, ispod ograničenja koja se može meriti; PD, pred doza Tabela 7
[0729] Krive koncentracija naspram vreme su procenjene ne-kompartmentalnom analizom (Pharsight, verzijab4.1). N=5 pacova po grupi. terminalni HL, terminalni poluživot; Cmax, izmerena maksimalna koncentracija u serumu; Tmax, vreme na kojoj je došlo do Cmax; AUCinf, oblast ispod krive koncentracija-vreme za sve serumske uzorke/vremenske tačke ekstrapolirane u beskonačnost; Cl, prividni ukupni klirens u serumu; Vz, prividna zapreminan distribucije tokom terminalne faze.
[0730] Rastvori doze su mereni pomoću ECLIA metode koja je korišćena za merenja koncentracije u serumu. Rastvori za doziranje su razblaženi tako da budu u opsegu ispitivanja. Svi 20KPEG-RLX rastvori doze su bili unutar određenih 30 procenata razlike u odnosu na teorijski (PDT). Tabela 8 ispod sumira rezultate analize za ovu studiju.
Tabela 8
Primer 41
[0731] Ovaj primer procenjuje farmakokinetičke karakteristike jedinjenja divljeg-tipa (WT) Relaksina nakon pojedinačne subkutane injekcija SD pacovima.
[0732] SD Pacovi su dobijeni od Charles River laboratorija (CRL) sa približno 5 nedelja starosti (približno 280 g na početku studije). Životinje su dobijene sa kateteriziranom jugularnnom venom kod CRL. Životinje su se zatim aklimatizovale 3 dana pre nego stavljanja u studiju.
[0733] Životinje su primile jednu subkutanu injekciju na dan 1 i PK uzorci su sakupljani tokom narednih 12 sati. Uzorci krvi su uzeti od životinje tretiranih sa WT rhRelaksinom za analizu koncentracije u serumu u skladu sa sledećim rasporedom uzorkovanja (vremena uzorkovanja su približna: Dan 1: pred-doza, 0.33, 0.66, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 9 i 12 sati posle doze.
[0734] Koncentracije jedinjenja su merene korišćenjem premošćavajućeg ECLA zasnovanog na ispitivanju koje je razvijeno u Ambrx-u. Koncentracije su izračunate primenom standardne krive generisane iz odgovarajućeg doziranog jedinjenja i saopštene u excel formatu proračunske tabele (videti dodatak). Farmakokinetički parametri su procenjeni upotrebom programa za modelovanje WinNonlin (Pharsight, verzija 5.1). Nekompartmentalna analiza za podatke o pojedinim životinjama sa linear up/log-down trapezoidnom integracijom je korišćena, a podaci o koncentraciji su ravnomerno vrednovani.
[0735] Tabela 9 prikazuje srednju vrednost vrednosti koncentracija wt rhRelaksina u serumu grupe naspram vremena. Slika 1 upoređuje srednju vrednost koncentracije u serumu u odnosu na vreme za wt rhRelaksin. Sve životinje su imale merljive nivoe relaksina u serumu.
[0736] Pojedinačna koncentracija u serumu u odnosu na vreme je iscrtana na slici 2 iz životinja doziranih SC sa0.5 mg/kg wt relaksina. Ne-kompartmentalna analiza koncentracije u serumu u odnosu na podatke za vreme iz subkutano doziranih životinja je sumirana u Tabeli 2. Tabela 9 je rezime analiza rastvora doze. Rastvori za doziranje su ispunili prihvatljiv kriterijum manjim ili jednakim 30% PDT.
Tabela 9
Tabela 10
[0737] Krive koncentracija u odnosu na vreme su procenjene ne-kompartmentalnom analizom (Pharsight, verzija 4.1). N=5 pacova po grupi. terminalni HL, terminalni poluživot; Cmax, izmerena maksimalna koncentracija u serumu; Tmax, vreme na kojoj je došlo do Cmax; AUCinf, oblast ispod krive koncentracija-vreme za sve serumske uzorke/vremenske tačke ekstrapolirane u beskonačnost; Cl, prividni ukupni klirens u serumu; Vz, prividni volumen distribucije tokom terminalne faze. Brojevi su srednja vrednost sa SD u zagradama.
Tabela 11
[0738] Rastvori doze su mereni sa ECLA metodama korišćenim za merenja koncentracije u serumu. Rastvori za doziranje su razblaženi tako da su u opsegu ispitivanja. Svi rastvori doze wt rhRelaksina su bili unutar određenih 30 procenata razlike u odnosu na teorijski (PDT). Tabela 3 ispod sumira rezultate analize rastvora doze za ovu studiju.
Tabela 11. Analiza rastvor doze artikla testa.
Primer 42
[0739] Ovaj primer procenjuje farmakokinetička svojstva 20 kDa PEGilovanog Relaksin jedinjenja nakon pojedinačne subkutane ili intravenske injekcija SD pacovima,
[0740] SD Pacovi su dobijeni od Charles River Laboratories (CRL) sa približno 7-8 nedelja starosti (približno 280 g na početku studije). Životinjama koje su dobijene je jugularna vena kateterizovana u CRL. Životinje su se zatim aklimatizovale tokom 3 dana pre stavljanja u studiju. Životinje su primile jednu subkutanu injekciju na dan 1 a PK uzorci su sakupljeni tokom naredna 82 sata. Uzorci krvi su uzeti od životinje tretiranih sa PEG-Relaksinom za analizu koncentracije u serumu u skladu sa sledećim rasporedom uzorkovanja (vremena uzorkovanja su približna): Dan 1: pred-doza, 1, 3, 5, 10, 25, 34, 48, 58, 72 i 82 sata posle doze,
[0741] Koncentracije jedinjenja su merene korišćenjem premošćavajućeg ECLA zasnovanom na ispitivanju koje je razvijeno u Ambrx-u. Koncentracije su izračunate primenom standardne krive generisane iz odgovarajućeg doziranog jedinjenja i saopštene u excel formatu proračunske tabele (videti dodatak). Farmakokinetički parametri su procenjeni upotrebom programa za modelovanje WinNonlin (Pharsight, verzija 5.1). Nekompartmentalna analiza za podatke o pojedinim životinjama sa linear up/log-down trapezoidnom integracijom je korišćena, a podaci o koncentraciji su ravnomerno vrednovani. Kompartmentalna analiza je izvedena korišćenjem dva kompartmenta, model eliminacije 1. reda i Gauss-Newton-ov (Levenberg-Hartley-ev) model podešavanja jednačina.
[0742] Tabela 12 prikazuje srednju vrednost vrednosti koncentracije PEG-Relaksina u serumu u odnosu na vreme.
Tabela 12
NE, nije ocenjeno; BQL, ispod ograničenja koje se može meriti; PD, pred-doza
Primer 43
[0743] Ovaj primer procenjuje farmakolološki aktivnu dozu i sistemsku izloženost divljem-tipu relaksina i varijanti PEG-relaksin kod ženki Long-Evans pacova.
[0744] Cilj ovih studija generisanja signala bio je uspostavljanje in vivo aktivnosti i definisanje farmakološki aktivne doze PEG-relaksin varijante. Da bi se postigli ovi ciljevi, procenjene su fiziološki relevantne krajnje tačke koje su reagovale na relaksin kod ženki Long-Evans pacova, uključujući preuzimanje vode, izlučivanje urina i odabranu kliničku hemiju urina i krvi. Da bi se omogućila identifikacija krajnjih tačaka kandidata, relaksin divljeg tipa ispitan je prvo (Faza 1), u dozama izračunatim za postizanje koncentracije u plazmi od 0.3X, 1X i 10X od in vitro ciljne inhibicije. Ciljane doze isporučene bolusnim intravenskim (IV) doziranjem nakon 6. časovne kontinuirane infuzije. Doze od 0.3X, 1X, i 10X relaksina divljeg tipa izazvale su povećanje od 95%, 68%, i 32%, redom, u preuzimanju vode u poređenju sa transporterom. Promene u srednjoj vrednosti koncentracija natrijuma u plazmi od osnovne tačke do 2 i 6 sati su bile -9.5 i1.2 mEq/L za transporter (0X); -5.8 i -9.0 mEq/L pri 0.3X; 1.0 i -1.5 mEq/L pri IX; -4.7 i -1.4 mEq/L pri 10X. Promene u osmolarnosti plazme od osnovne tačke do 2 i 6 sati su bile -20.7 i 1.0 mosmol/kg vode za transporter (0X); -11.0 i -19.1 mosmol/kg vode pri 0.3X; 0.3 i -4.4 mosmol/kg vode za 1X; -10.3 i -3.8 mosmol/kg vode za 10X.
[0745] PEG-relaksin (Faza 2) je administriran pri bolusnoj zapremini od 1 µL po gramu telesne mase sa krvi sakupljenom 2 i 6 sata nakon doziranja a urin se sakupi tokom 6 sati nakon doziranja. Tretman sa PEG-relaksinom pri 0.1X, 0.3X i 1X dozama rezultovalo je sa 93%, 128% i105% povećanjem, redom, u preuzimanju vode u poređenju sa transporter grupom. Promene u srednjoj vrednosti koncentracije natrijuma u plazmi od osnovne tačke do 2 i 6 sati su bile 2.5 i 1.5 mEq/L za transporter (0X); -1.5 i -4.8 mEq/L pri 0.1X; -4.0 i -2.9 mEq/L pri 0.3X; -2.3 i -4.0 mEq/L pri 1X. Promene u osmolarnosti plazme od osnovne tačke do 2 i 6 sati su bile 4.5 i 2.1 mosmol/kg vode za transporter (0X); -5.1 i-11.0 mosmol/kg vode pri 0.1X; -8.2 i -5.0 mosmol/kg vode pri 0.3X; -5.6 i -9.5mosmol/kg vode pri 1X. Nije bilo jasnih promena u vrednosti kliničke hemije urina nakon tretmana divljim tipom ili PEG-relaksinom. Ovi podaci uspostavljaju in vivo aktivnost i omogućavaju racionalnu selekciju doze za naredne in vivo studije bolesti sa PEG-relaksinom.
Tabela 13: Dizajn grupa životinja
Tabela 14:
Faza 1 Divlji-tip Relaksina
[0746] Ženka Long-Evans pacova 12-14 nedelja starosti sa with dvo-lateralnim kateterima jugularne vene koji su hirurški stavili dobavljači su dobijeni od Charles River Laboratories. Dva seta od četiri pacova su korišćena. Svaki set je korišćen da se procene dve doze divljegtip relaksina. Postojao je period pranja od 36 sati ili više između Grupa 1 i 2 i Grupa 3 i 4 jer su pacovi iz Grupa 1 i 3 ponovo korišćeni u Grupama 2 i 4, redom. Pacovi su imali ad libitum pristup hrani i vodi i bili su smešteni u Culex ABS metaboličkom kaveznom sistemu (Culex Automated Blood Sampler, Bioanalytical Sistem Inc) noć pre započinjanja doziranja i 6 sati nakon IV bolusne doze i početka doziranja infuzijom.
Faza 1 Administriranje doze divljeg-tipa relaksina
[0747] U fazi 1 svakom pacovu je dat jednokratni IV bolus i 6-satna IV infuzija. IV bolusna injekcija preko hirurški implantiranih jugularnih katetera nakon čega sledi IV infuzija preko hirurški implantiranih jugularnih katetera. Najmanje 36 sati između grupa 1 i 2 u prvom setu pacova i grupa 3 i 4 u drugom setu pacova omogućilo je ispiranje.
Faza 2 PEG-Relaksin
[0748] Ženka Long-Evans pacove 12-14 nedelja starosti sa dvo-lateralnim kateterima jugularne vene koje je hirurški postavio dobavljač dobijeni su iz Charles River Laboratories. Četiri seta od četiri pacova su korišćena, pri čemu se svaki set koristio za procenu jedne doze PEG-relaksina. Pacovi koji su primali PEG-relaksin nisu ponovo upotrebljeni nakon perioda ispiranja zbog produžene izloženosti PEGilovanih jedinjenja u plazmi. Pacovi su imali ad libitum pristup hrani i vodi i bili su smešteni u Culex ABS metaboličkim kavezima.
Faza 2 Administracija doze PEG-Relaksin
[0749] U FazI 2, pacovi su primili received jednokratnu IV injekciju pomoću hirurški implantiranih jugularnih katetera.
[0750] Svi bolusni i IV dozni rastvori su formulisani prema ovim instrukcijama odmrzavanja i mešanja za sve rastvore doze:
[0751] Zamrznuta boca uzorka za svaku formulaciju za doziranje je ostavljena da se odmrzne na 4°C tokom 3 do 4 sata, sa satnim proverama procesa odmrzavanja. Jednom kada je proces odmrzavanja završen, formulacija je mešana sa blagom inverzijom pazeći da se ne stvaraju mehurići. Posvećena je pažnja da se pažljivo i temeljno meša svaka formulacija neposredno pre intravenskog doziranja. Svaka formulacija za doziranje je održavana na 4°C dok nije korišćena za doziranje.
[0752] Doze su pripremljene neposredno pre pripreme i svaka grupa je primila koncentracije doza sledećih:
[0753] Životinje korišćene u ovoj studiji su odabrane na osnovu prihvatljivih nalaza iz merenja telesne mase, prolaznosti jugularnog katetera, i funkcionalnosti. Životinje identifikovane kateterima koji nisu pogodni za doziranje ili uzimanje krvi pre početka studije ili tokom perioda uzimanja krvi nakon početka doziranja su uklonjeni iz studije i zamenjeni su pacovima sa odgovarajućim kateterima. Zamena pacova sa kateterima i doziranje jedinjenja desili su se najranije moguće vreme u odnosu na raspored doziranja, raspoloživost osoblja, i primanje pacova od dobavljača.
[0754] Faza 1: Životinje su randomizovane u skladu sa telesnom masom pre studije i dodeljene su Grupi 1. Po završetku doziranja, pacovi iz Grupe 1 su podvrgnuti drugoj randomizaciji nakon perioda ispiranja i dodeljeni su Grupi 2. Nakon završetka doziranja, pacovi u Grupi 3 su podvrgnuta drugoj randomizaciji nakon perioda ispiranja i raspoređeni su Grupi 4.
[0755] Faza 2: Životinje su randomizovane prema prema telesnoj masi pre studije i dodeljene grupama Grupas 5 do 8.
[0756] Svakodnevno na približno 30 minuta i 1, 2, 4, i 6 sata nakon započinjanja doziranja. Vizuelni pregledi fizičkih i promena ponašanja su izvedeni i životinje su ispitane na promene u držanju tela, dlakama, aktivnostima, izlučevini itd. Rutinske telesne mase su uzete i beležena pre doziranja.
Uzorak krvi i urina, sakupljanje, rukovanje, i analiza
Faza 1 protokola studije
[0757] Skupljanje osnovnog urina je započeto noć pre administracija doze, nastavljeno tokom perioda od 15-18 sati, i sakupljeno u ohlađenu (vlažni led) bočicu. Osnovni uzorci krvi (∼400 µL cele krvi) su sakupljeni na kraju prikupljanja osnovnog urina. Na dan eksperimenta, pacovima je data IV bolusna injekcija artikla testa praćena kontinuiranom infuzijom divljih vrsta relaksina uz konstantnu brzinu infuzije isporučenom špric pumpom (Harvard 11 plus) tokom 6 sati preko katetera leve jugularne vene u količinama od 50 µL/sat. Dva dodatna uzorka krvi (ukupno ∼400 µL cele krvi) su sakupljena na 2 i 6 sati posle infuzije relaksina. Svi uzorci krvi su sakupljeni desnim jugularnim kateterom u epruvete za uzorke koje sadrže K3EDTA antikoagulans pomoću metode programiranja uzorkovanja Culex ABS a uzorci su čuvani u rashlađenom okruženju do obrade uzorka. Urin se kontinuirano skupljao u ohlađenu bočicu tokom čitavog trajanja infuzije relaksina. Zabeležena je ukupna zapremina urina iz svake kolekcije, a 2-5 ml svakog uzorka urina je čuvano u Seventh Wave Labs zamrzivaču postavljenog da održava približno -80°, Unos vode tokom 6-satnog perioda infuzije je zabeležen upoređivanjem težine boce pre nakon infuzije voda. Infuziona pumpa je zaustavljena nakon 6 sati kontinuirane infuzije, a pacovi su prošli period ispiranja od najmanje 36 sati pre nego što su bili podvrgnuti drugoj evaluaciji doze.
[0758] Kontinuirana IV infuzija je potrebna za održavanje ciljane, stabilne koncentracije leka u plazmi.
Faza 2 protokola studije
[0759] Prikupljanje osnovnog urina je počelo noć pre administracija doze u periodu od 15-18 sati, a uzorci su sakupljeni u ohlađenu bočicu. Osnovni uzorci krvi (∼400 µL cele krvi) su sakupljenina kraju prikupljanja osnovnog urina. Na dan eksperimenta, pacovima je administrirana pojedinačna doza PEG-relaksina intravenski u zapremini koja ne prelazi 10 mL/kg/dan (jednokratna doza). Dva dodatna uzorka krvi (∼400 µL cele krvi) su sakupljena na 2 i 6 satu nakon administracije relaksina. Svi uzorci krvi su sakupljeni desnim jugularnim kateterom u epruvete za uzorke koje sadrže K3EDTA antikoagulans pomoću metode programiranja uzorkovanja Culex ABS i čuvane u frižideru do obrade. Uzorci urina su kontinuirano sakupljeni u vremenu od 0 do 6 sati nakon primene PEG-Relakina u ohlađenu bočicu tokom uzorkovanja. Ukupna zapremina urina iz svake kolekcije je zabeležena, a 2-5 mL svakog uzorka urina je sačuvano u Seventh Wave Labs zamrzivaču postavljenom da se održi približno - 80°C. Pacovi su eutanazirani 6 sati nakon doziranja. Unos vode tokom perioda infuzije od 6 sati je zabeležen upoređivanjem težine boca voda na početku i na kraju perioda infuzije leka.
Patologija
[0760] Uzorci urina su sakupljeni kao što je već opisano u ovom primeru. Dva do 5 mL ohlađenih uzoraka urina je zamrznuto na suvom ledu i čuvano u zamrzivaču podešenom da održi približno -80°C dok se ne isporuči na suvom ledu u AVL za analizu kreatinina u urinu i BUN za određivanje klirensa kreatinina.
[0761] Uzorak krvi je sakupljen primenom Culex ABS koristeći K3EDTA kao antikoagulant. Petnaest mikrolitara uzoraka cele krvi je filtrirano u netretirane kapilarne epruvete, zapečaćene glinom na jednom kraju, i centrifugirano u hematokritnoj centrifugi (International Equipment Company, IEC MB centrifuga) tokom pet minuta. Rezultati hematokrita su dobijeni korišćenjem uređaja za očitavanje mikrohemakrita koji je obezbedio proizvođač.
[0762] Krv je sakupljena za potencijalno određivanje sistemske izloženosti divljeg tipa i PEG-relaksina u skladu sa rasporedom sakupljanja i procedurama dole navedenim. Postojala su tri intervala sakupljanja. Vremenske tačke za sakupljanje bile su 0, 2 i 6 sati nakon doze za pacove Faze 1 i Faze 2. Faza 1: 8 životinja u vremenskoj tački. Faza 2: 16 životinja u vremenskoj tački. Zapremina sakupljanja je iznosila približno 400 mikro litara cele krvi. Svim životinjama u Grupama 1 do 8 izvađena je krv u tri vremenske tačke: osnovna tačka (pred doza t = 0) i 2 i 6 sati nakon započinjanja infuzije za divlji tip relaksina IV doziranja i nakon IV doziranja za grupe doziranja PEG-relaksina, respektivno. Vreme iniciranja IV infuzionog doziranja stvarno vreme svakog krvarenja su zabeleženi u sirovim podacima za svaku životinju. Prema odluci Sponzora, krvi nije poslata u Ambrx radi sistemskog određivanja izloženosti tokom izvođenja studije. Uzorci su čuvani zamrznuti u Seventh Wave Labs zamrzivaču podešenom da održava približno -80°C i biće vraćeni Sponzoru.
Faza I Divlji tip relaksina REZULTATI
[0763] Prosečan unos vode tokom 6 sati infuzije u transporteru (0X) tretiranih pacova je bio 1.8 mL po 100 grama telesne mase, koji se povećao na 3.6, 3.1, i 2.4 mL po 100 grama telesne mase kod pacova tretiranih sa 0.3X, 1X i 10X divljeg-tipa relaksina, redom. To je povećanje od 95%, 68%, 32% u odnosu na transporter za 0.3X, 1X i 10X grupe za doziranje redom,
[0764] Prosečan hematokrit pri osnovnoj tački, 2 i 6 sata nakon iniciranja doziranja je bio 35.1%, 35.0%, i 34.3% u transporterom tretiranih pacova, redom; 33.1%, 33.7%, i 32.3% u 0.3X grupi; 31.4T, 32.0% i 33.7% u 1X grupi; 29.7%, 31.9% i 30.4% u 10X grupi.
[0765] Prosečno izlučivanje urina tokom 6 sati infuzije je bilo 1.8, 1.5, 1.2 i 1.2 mL po100 grama telesne mase za transporter (0X), 0.3X, 1X i 10X grupe redom.
[0766] Srednja vrednost koncentracije natrijuma u plazmi na osnovnoj tački, 2 i 6 sati nakon iniciranja doziranja je bila 139.3, 129.8, 140.5 mEq/L u transporter (0X) grupi; 141.8, 136.0 i 132.8 mEq/L u 0.3X grupi; 138.8, 139.8 i 137.3 mEq/L u 1X grupu; 137.0, 132.3 i 135.6 mEq/L u 10X grupi. Promena od osnovne tačke u 2 i 6 sati je bila -9.5 i 1.2 mEq/L za transporter (0X); -5.8 i -9.5 mEq/L kod 0.3X; 1.0 i -1.5 mEq/L kod 1X; -4.7 i- 1.4 mEq/L kod 10X.
[0767] Osmolarnost plazme je izračunata primenom sledeće jednačine: osmolarnost (OSM) = (2* na) (Glu/18) (BUN/2.8). Srednja vrednost osmolarnosti plazme pri osnovnoj tački, 2 i 6 sati nakon iniciranja 277.3 mosmol/kg vode u 0.3X grupi; 291.0, 291.3 i 286.6 mosmol/kg vode u 1X grupi; 286.4, 276.1 i 282.6 mosmol/kg vode u 10X grupi. Promena od osnovne tačke u 2 i 6 sata je bila -10.7 in1.0 mosmol/kg vode za transporter (0X); =11.0 i =19.1 mosmol/kg vode kod 0.3X; 0.3 i -4.4 mosmol/kg vode za IX; -10.3 i -3.8 mosmol/kg vode za 10X. Podaci kliničke hemije urina BUN/Cr, izlučivanja Na su sumirani u donjim tabelama:
Tabela 3. Pregled podataka o kliničkoj hemiji urina divljeg tipa relaksina (Faza 1 studije)
Tabela 4. Sirovi podaci kliničke hemije urina divljeg-tipa relaksina (Faza 1 studije)
/100g)
Tabela 5. Sažetak podataka o fiziologiji divljeg- tipa relaksina (Faza 1 Studije)
Faza 2 PEG-Relaksin varijanta REZULTATI
[0768] Prosečni unos vode tokom 6-satnog perioda nakon doze kod pacova tretiranih transporterom (0X) je bio 1.5 mL po 100 grama telesne mase, koji se povećao na 2.9, 3.4, i 3.1 mL po 100 grama telesne mase kod 0.1X, 0.3X i 1X PEG-relaksin varijantom tretiranih pacova, redom. Ovo predstavlja povećanje od 93%, 128% i 105% u odnosu na srednju vrednost transporter grupa za 0.1X, 0.3X i 1X grupe redom.
[0769] Prosečno izlučivanje urina tokom 6-satnog perioda nakon doze je bilo 0.9, 0.2, 0.5 i 0.4 mL po100 grama telesne mase za transporter (0X, 0.3X i 1X grupe redom). Srednje vrednosti koncenmtracije natrijuma u plazmi na osnovnoj tački, 2 i 6 sati nakon doziranja su bile 136.3, 138.8 i 137.8 mEq/L u transporter (0X) grupi, redom; 138.5, 137.0 i 133.7 mEq/L u 0.1X grupi, redom; 137.5, 133.5 i 134.6 mEq/L u 0.3X grupi, redom; 137.3, 135.0 i 133.3 mEq/L u 1X grupi, redom. Promena od osnovne tačke u 2 i 6 sati je bila 2.5 i 1.5 mEq/L za transporter (0X); -1.5 i -4.8 mEq/L kod 0.1X; -4.0 i -2.9 mEq/L kod 0.3X; -2.3 i -4.0 mEq/L kod 1X.
[0770] Srednja vrednost osmolarnosti plazme pri osnovnoj tački, 2 i 6 sati nakon doziranja je bila 285.4, 289.9, i 287.5 mosmol/kg vode u transporter (0X) grupi, redom; 292.7, 287.6 i 281.7 mosmol/kg vode u 0.1X grupi, redom; 287.6, 279.4 i 282.6 mosmol/kg vode u 0.3X grupi, redom; 289.3, 283.7 i 279.4 mosmol/kg vode u 1X grupi, redom. Promena od osnovne tačke u 2 i 6 sati je bila 4.5 i 2.1 mosmol/kg vode za transporter (0X); -5.1 i -11.0 mosmol/kg vode kod 0.1X; -8.2 i -5.0 mosmol/kg vode za 0.3X; -5.6 i -9.9 mosmol kg vode za 1X.
[0771] Podrazumeva se da su primeri i tehnička rešenja ovde opisana samo u ilustrativne svrhe i da različite modifikacije ili promene u njihovom svetlu biće predložene prosečnim poznavaocima u oblasti tehnike. onima koji imaju obične veštine.

Claims (16)

Patentni zahtevi
1. Modifikovani polipeptid relaksina koji sadrži ne-prirodno kodiranu aminokiselinu, gde:
(a) polipeptid relaksina sadrži polipeptid A lanaca relaksina sa SEQ ID NO: 4 i polipeptid B lanca relaksina sa SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 6 supstituisan sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom na položaju odabranoj iz grupe koja se sastoji od: ostatka 1 lanca A, ostatka 5 lanca A, ostatka 13 lanca A, ostatka18 lanca A, i ostatka 7 lanca B; i (b) ne-prirodno kodirana aminokiselina je para-acetil-fenilalanin koja je po izboru povezana sa veznikom, polimerom, polimerom rastvorljivim u vodi, ili biološki aktivnim molekulom.
2. Modifikovan polipeptid relaksina prema patentnom zahtevu 1, gde polipeptid B lanca relaksina je polipeptid sa SEQ ID NO: 6.
3. Modifikovan polipeptid relaksina prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde navedena ne-prirodno kodirana aminokiselina je u poziciji ostatka 1 lanca A.
4. Modifikovan polipeptid relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-3, gde navedena ne-prirodno kodirana aminokiselina je povezana sa navedenim veznikom, polimerom, polimerom rastvorljivim u vodi ili biološki aktivnim molekulom.
5. Modifikovan polipeptid relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-4, gde navedena ne-prirodno kodirana aminokiselina je povezan sa navedenim veznikom, polimerom, polimerom rastvorljivim u vodi ili biološki aktivnim molekulom pomoću oksim povezivanja.
6. Modifikovan polipeptid relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-4, gde ne-prirodno kodirana aminokiselina je povezana sa polimerom rastvorljivim u vodi.
7. Modifikovan polipeptid relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-4, gde ne-prirodno kodirana aminokiselina je povezana sa polimerom koji sadrže poli(etilen glikol).
8. Modifikovan polipeptid relaksina prema patentnom zahtevu 7, gde navedeni poli(etilen glikol) ima prosečnu molekulsku masu od između oko 0.1 kDa i oko 100 kDa, između oko 0.1 kDa i oko 50 kDa, između oko 1 kDa i oko 40 kDa, između oko 5 kDa i oko 40 kDa, ili oko 20 kDa.
9. Modifikovan polipeptid relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-8, gde navedeni modifikovan polipeptid relaksina je rekombinantan, je proizveden u eukariotskoj ćeliji domaćina, je proizveden u neeukariotskoj ćeliji domaćina, ili je proizveden in vitro translacijom.
10. Modifikovan polipeptid relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-9, gde modifikovan polipeptid relaksina pokazuje povećan poluživot u serumu u poređenju sa divljim tipom polipeptida relaksina koji se sastoji od SEQ ID NO: 4 i SEQ ID NO: 5, pri čemu se poluživot u serumu po izboru povećava za količinu odabranu od najmanje oko dva-puta, najmanje oko tri-puta, najmanje oko pet-puta, ili najmanje oko deset-puta.
11. Modifikovan polipeptid relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-10, gde modifikovan polipeptid relaksina je biološki aktivan.
12. Modifikovan polipeptid relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-11 za primenu kao lek.
13. Modifikovan polipeptid relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-11 za primenu u lečenju subjekta koji pati od ateroskleroze; dijabetesa tipa 1; dijabetesa tipa 2; koronarne arterijske bolesti; skleroderme; moždanog udara; dijastolne disfunkcije; porodične hiperholesterolemije; izolovane sistolne hipertenzije; primarne hipertenzije; sekundarne hipertenzije; hipertrofije leve komore; arterijske krutosti povezane sa dugotrajnim pušenjem duvana; arterijske krutosti povezane sa gojaznošću; arterijske krutosti povezane sa godinama; sistemskog eritematoznog lupusa; preeklampsije; hiperholesterolemije ili za primenu u povećanju arterijske komplijanse kod žena u perimenopauzi, menopauzi, i postmenopauzi koje su u riziku od gore pomenutih poremećaja; ili da se modulira vazokonstrikcija, proizvodnja NO, ili agregacija trombocita; ili za primenu u lečenju angiotenzinom-II (Angll)-posrednovane vazokonstrikcije ili endotelinom-1 (ET-1)-posredovane vazokonstrikcije; ili za primenu u lečenju srčane insuficijencije, kongestivne srčane insuficijencije, gubitka ili oštećenja tkiva miokarda, povećanja pritiska ventikularnog punjenja, naprezanja ventikularnog zida, ili oštećene integracije arterijske ili venske vazodilatacije.
14. Primena modifikovanog polipeptida relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1-11 za proizvodnju leka za lečenje subjekta koji pati od ateroskleroze; dijabetesa tipa 1; dijabetesa tipa 2; koronarne arterijske bolesti; skleroderme; moždanog udara; dijastolne disfunkcije; porodične hiperholesterolemije; izolovane sistolne hipertenzije; primarne hipertenzije; sekundarne hipertenzije; hipertrofije leve komore; arterijske krutosti povezane sa dugotrajnim pušenjem duvana; arterijske krutosti povezane sa gojaznošću; arterijske krutosti povezane sa godinama; sistemskog eritematoznog lupusa; preeklampsije; hiperholesterolemije; ili za primenu u povećanju arterijske komplijanse kod žena u perimenopauzi, menopauzi, i post-menopauzi koje su u riziku od gore pomenutih poremećaja; ili da se modulira vazokonstrikcija, proizvodnja NO, ili agregacija trombocita; ili za primenu u lečenju angiotenzinom-II (Angll)-posrednovane vazokonstrikcije ili endotelinom-1 (ET-1)-posredovane vazokonstrikcije; ili za primenu u lečenju srčane insuficijencije, kongestivne srčane insuficijencije, gubitka ili oštećenja tkiva miokarda, povećanja pritiska ventikularnog punjenja, naprezanja ventikularnog zida, ili oštećene integracije arterijske ili venske vazodilatacije.
15. Ćelija domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptid A lanca relaksina sa SEQ ID NO: 4 ili polipeptid B lanca relaksina sa SEQ ID NO: 5 ili SEQ ID NO: 6 supstituisanu sa ne-prirodno kodiranom aminokiselinom na položaju odabranoj iz grupe koja se sastoji od: ostatka 1 lanca A, ostatka 5 lanca A, ostatka 13 lanca A, ostatka 18 lanca A, i ostatka 7 lanca B, pri čemu ne-prirodno kodirana aminokiselina je para-acetil-fenilalanin, ćelija domaćina sadrži ortogonalnu tRNK sintetazu i/ili ortogonalnu tRNK koja, kada se navedena nukleinska kiselina translatuje, rezultuje u inkorporaciji navedene ne-prirodno kodirane aminokiseline u navedeni polipeptid A lanca relaksina ili polipeptid B lanca relaksina, a polinukleotid sadrži najmanje jedna selektor kodon po izboru odabran iz grupe koja se sastoji od amber kodona, oker kodona, opal kodona, jedinstvenog kodona, retkog kodona, petobaznog kodona, i četvorobaznog kodona, pri čemu navedeni selektor kodon kodira navedenu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu.
16. Metoda proizvodnje modifikovanog polipeptida relaksina prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 11, koja sadrži: kultivisanje ćelija koje sadrže (1) polinukleotid ili polinukleotide koji kodiraju navedeni polipeptid A lanca relaksina i navedeni polipeptid B lanca relaksina koji sadrži selektor kodon koji kodira navedenu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu, (2) ortogonalnu RNK sintetazu i (3) ortogonalnu tRNK pod uslovima koji dozvoljavaju eksprimiranje polipeptida relaksina koji sadrži navedenu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu; i prečišćavanje polipeptida relaksina koji sadrže navedenu ne-prirodno kodiranu aminokiselinu.
RSP20191125 2010-08-17 2011-08-17 Modifikovani polipeptidi relaksina i njihova primena RS59193B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US37458210P 2010-08-17 2010-08-17
PCT/US2011/048157 WO2012024452A2 (en) 2010-08-17 2011-08-17 Modified relaxin polypeptides and their uses
EP11818758.2A EP2605789B1 (en) 2010-08-17 2011-08-17 Modified relaxin polypeptides and their uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59193B1 true RS59193B1 (sr) 2019-10-31

Family

ID=45594542

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240224A RS65223B1 (sr) 2010-08-17 2011-08-17 Modifikovani polipeptidi relaksina i njihova primena
RSP20191125 RS59193B1 (sr) 2010-08-17 2011-08-17 Modifikovani polipeptidi relaksina i njihova primena

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20240224A RS65223B1 (sr) 2010-08-17 2011-08-17 Modifikovani polipeptidi relaksina i njihova primena

Country Status (33)

Country Link
US (6) US8735539B2 (sr)
EP (3) EP2605789B1 (sr)
JP (1) JP6054294B2 (sr)
KR (1) KR101963460B1 (sr)
CN (2) CN103201285A (sr)
AU (1) AU2011291943B2 (sr)
BR (1) BR112013003522B1 (sr)
CA (1) CA2808596C (sr)
CL (2) CL2013000475A1 (sr)
CO (1) CO6680644A2 (sr)
CY (1) CY1122101T1 (sr)
DK (2) DK2605789T3 (sr)
EA (1) EA030886B1 (sr)
ES (2) ES2972902T3 (sr)
FI (1) FI3572091T3 (sr)
HK (1) HK1258140A1 (sr)
HR (2) HRP20191564T1 (sr)
HU (2) HUE045845T2 (sr)
IL (1) IL224748A (sr)
LT (2) LT2605789T (sr)
MA (1) MA34521B1 (sr)
MX (1) MX346786B (sr)
MY (1) MY162837A (sr)
NZ (1) NZ607069A (sr)
PE (1) PE20140160A1 (sr)
PH (1) PH12013500241A1 (sr)
PL (2) PL2605789T3 (sr)
PT (2) PT3572091T (sr)
RS (2) RS65223B1 (sr)
SG (3) SG10201913122WA (sr)
SI (2) SI3572091T1 (sr)
SM (2) SMT201900495T1 (sr)
WO (1) WO2012024452A2 (sr)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA030886B1 (ru) 2010-08-17 2018-10-31 Амбркс, Инк. Модифицированные полипептиды релаксина, содержащие некодируемую в природе аминокислоту, связанную с полимером, и их применение
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
RU2014103288A (ru) * 2011-07-01 2015-08-10 Байер Интеллектчуал Проперти Гмбх Слитые полипептиды релаксина и их применение
WO2013033324A2 (en) * 2011-08-31 2013-03-07 University Of Florida Research Foundation, Inc. Materials and methods for modulating activity of bone marrow derived cells
US9393288B2 (en) * 2012-05-29 2016-07-19 The University Of Vermont And State Agricultural College Methods of treating diseases associated with PPARγ
AR094147A1 (es) * 2012-12-27 2015-07-15 Bayer Pharma Aktiengellschaft Polipeptidos de fusion con actividad de relaxina y sus usos
JP6822839B2 (ja) * 2013-09-13 2021-01-27 ザ・スクリップス・リサーチ・インスティテュート 修飾された治療剤、及びその組成物
KR102455171B1 (ko) 2013-12-18 2022-10-14 더 스크립스 리서치 인스티튜트 변형된 치료제, 스테이플드 펩티드 지질 접합체, 및 이의 조성물
MA41794A (fr) * 2015-03-18 2018-01-23 The California Institute For Biomedical Res Agents thérapeutiques modifiés et compositions associées
LT3388075T (lt) 2015-03-27 2023-11-10 Immatics Biotechnologies Gmbh Nauji peptidai ir peptidų deriniai, skirti naudoti imunoterapijai prieš įvairius navikus (seq id 25 - mrax5-003)
GB201505305D0 (en) 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
IL263079B2 (en) 2016-05-18 2024-05-01 Modernatx Inc Polynucleotides encoding relaxin
WO2018068047A1 (en) * 2016-10-07 2018-04-12 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Compositions comprising relaxin and methods of use thereof
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
EP3574004A1 (en) * 2017-01-25 2019-12-04 Medimmune, LLC Relaxin fusion polypeptides and uses thereof
PE20191716A1 (es) 2017-02-08 2019-12-05 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos
AU2018260628A1 (en) 2017-04-25 2019-12-12 Temple Otorongo Llc Pharmaceutical composition comprising tryptophan and phyllokinin derivative for use in treating psychiatric and psychological conditions
TWI844709B (zh) 2019-07-31 2024-06-11 美商美國禮來大藥廠 鬆弛素(relaxin)類似物及其使用方法
MX2022006861A (es) 2019-12-04 2022-07-11 Scripps Research Inst Agonistas del receptor glp2 y metodos de uso.
JP7516061B2 (ja) * 2020-02-18 2024-07-16 ポーラ化成工業株式会社 血管収縮抑制剤
CN114075276A (zh) * 2020-08-17 2022-02-22 成都奥达生物科技有限公司 一种长效松弛素2类似物
KR20240032010A (ko) 2021-06-09 2024-03-08 더 스크립스 리서치 인스티튜트 장기 지속형 이중 gip/glp-1 펩타이드 접합체 및 사용 방법
CN118510536A (zh) 2021-11-11 2024-08-16 泰克托尼治疗股份有限公司 松弛素-2融合蛋白类似物及其使用方法
AU2024270919A1 (en) * 2023-05-18 2026-01-15 Tectonic Operating Company, Inc. Relaxin-2 fusion protein analogs and methods of using same

Family Cites Families (322)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4289872A (en) 1979-04-06 1981-09-15 Allied Corporation Macromolecular highly branched homogeneous compound based on lysine units
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
DE3169595D1 (en) 1980-11-10 1985-05-02 Gersonde Klaus Method of preparing lipid vesicles by ultrasonic treatment, the use of this method and apparatus for its application
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
FR2504010B1 (fr) 1981-04-15 1985-10-25 Sanofi Sa Medicaments anticancereux contenant la chaine a de la ricine associee a un anticorps antimelanome et procede pour leur preparation
US4551433A (en) 1981-05-18 1985-11-05 Genentech, Inc. Microbial hybrid promoters
JPS57206622A (en) 1981-06-10 1982-12-18 Ajinomoto Co Inc Blood substitute
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
DE3218121A1 (de) 1982-05-14 1983-11-17 Leskovar, Peter, Dr.-Ing., 8000 München Arzneimittel zur tumorbehandlung
EP0102324A3 (de) 1982-07-29 1984-11-07 Ciba-Geigy Ag Lipide und Tenside in wässriger Phase
US5145962A (en) 1982-08-12 1992-09-08 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Human pro relaxin polypeptides
EP0101309B1 (en) 1982-08-12 1991-01-16 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Molecular cloning and characterization of a gene sequence coding for human relaxin
US5179195A (en) 1982-12-13 1993-01-12 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Human relaxin polypeptides
IL70414A (en) 1982-12-13 1991-06-10 Florey Howard Inst Polypeptide having human h2-relaxin activity,double-stranded dna fragments coding therefor,vectors containing the dna fragments and methods for preparing the polypeptide,dna fragments and vectors
US4512922A (en) 1982-12-22 1985-04-23 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511503A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US4511502A (en) 1982-12-22 1985-04-16 Genentech, Inc. Purification and activity assurance of precipitated heterologous proteins
US5089398A (en) 1983-02-22 1992-02-18 Chiron Corporation Enhanced yeast transcription employing hybrid GAPDH promoter region constructs
CA1341302C (en) 1983-02-22 2001-10-09 Rae Lyn Burke Yeast expression systems with vectors having gapdh or pyk promoters and synthesis of foreign protein
US4876197A (en) 1983-02-22 1989-10-24 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
JPS59166086A (ja) 1983-03-09 1984-09-19 Teruhiko Beppu 新規な発現型プラスミドとそれらを用いて仔牛プロキモシン遺伝子を大腸菌内で発現させる方法
US4859600A (en) 1983-04-25 1989-08-22 Genentech, Inc. Recombinant procaryotic cell containing correctly processed human growth hormone
US4755465A (en) 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
EP0127839B1 (en) 1983-05-27 1992-07-15 THE TEXAS A&amp;M UNIVERSITY SYSTEM Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
JPS607934A (ja) 1983-06-29 1985-01-16 Dai Ichi Seiyaku Co Ltd リポソ−ムの製造方法
GB8317880D0 (en) 1983-07-01 1983-08-03 Searle & Co Structure and synthesis of interferons
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4689406A (en) 1983-08-10 1987-08-25 Amgen Enhancement of microbial expression of polypeptides
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
DE3483949D1 (de) 1983-09-26 1991-02-21 Udo Dr Med Ehrenfeld Mittel und erzeugnis fuer die diagnose und therapie von tumoren sowie zur behandlung von schwaechen der zelligen und humoralen immunabwehr.
DE3474511D1 (en) 1983-11-01 1988-11-17 Terumo Corp Pharmaceutical composition containing urokinase
JPS60118008A (ja) 1983-11-28 1985-06-25 株式会社竹中工務店 コンクリ−ト直埋配線工法
ZA848495B (en) 1984-01-31 1985-09-25 Idaho Res Found Production of polypeptides in insect cells
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4880734A (en) 1984-05-11 1989-11-14 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
ATE102250T1 (de) 1984-05-11 1994-03-15 Chiron Corp Erhoehte hefetranskription unter verwendung einer hybridkonstruktion der promotorregion.
GB8412564D0 (en) 1984-05-17 1984-06-20 Searle & Co Structure and properties
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4542225A (en) 1984-08-29 1985-09-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Acid-cleavable compound
US4738921A (en) 1984-09-27 1988-04-19 Eli Lilly And Company Derivative of the tryptophan operon for expression of fused gene products
US4659839A (en) 1984-10-10 1987-04-21 Mallinckrodt, Inc. Coupling agents for radiolabeled antibody fragments
US4837148A (en) 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
GB8430252D0 (en) 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
ATE66469T1 (de) 1985-01-14 1991-09-15 Neorx Corp Metall-radionuklid markiertes protein fuer diagnose und therapie.
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
JP2524586B2 (ja) 1985-06-26 1996-08-14 シタス コーポレイション ポリマ−接合を利用する医薬組成物用蛋白質の可溶化
PH25772A (en) 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
US4680338A (en) 1985-10-17 1987-07-14 Immunomedics, Inc. Bifunctional linker
UA41863C2 (uk) 1985-10-25 2001-10-15 Займодженетікс Інк. Спосіб одержання гетерологічного поліпептиду в еукаріотичних мікроорганізмах
US4699784A (en) 1986-02-25 1987-10-13 Center For Molecular Medicine & Immunology Tumoricidal methotrexate-antibody conjugate
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4835251A (en) 1986-06-23 1989-05-30 Genetech, Inc. Method of chain combination
JPS63123383A (ja) 1986-11-11 1988-05-27 Mitsubishi Kasei Corp ハイブリツドプロモ−タ−、発現調節ｄｎａ配列および発現ベクタ−
US5186933A (en) 1986-12-30 1993-02-16 Baylor College Of Medicine Synthesis and immunogenicity of rotavirus genes using a baculovirus expression system
JPH02502876A (ja) 1987-03-16 1990-09-13 アメリカン　バイオジェネティック　サイエンシズ　インク ワクチンと生物学的殺虫剤における組換えバクロウイルス閉塞体
CA1304020C (en) 1987-03-23 1992-06-23 Meher H. Irani High level expression in yeast
US5229490A (en) 1987-05-06 1993-07-20 The Rockefeller University Multiple antigen peptide system
AU2136788A (en) 1987-07-24 1989-03-01 Cetus Corporation Production of ricin toxins in a baculovirus-insect cell expression system
CA1317244C (en) 1987-07-24 1993-05-04 Ernest Seigo Kawasaki Production of biologically active forms of csf using a baculovirus (acnpv)-insect cell expression system
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US4929555A (en) 1987-10-19 1990-05-29 Phillips Petroleum Company Pichia transformation
GB8725529D0 (en) 1987-10-30 1987-12-02 Delta Biotechnology Ltd Polypeptides
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
CA1340772C (en) 1987-12-30 1999-09-28 Patricia Tekamp-Olson Expression and secretion of heterologous protiens in yeast employing truncated alpha-factor leader sequences
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
AU626840B2 (en) 1988-02-26 1992-08-13 Genentech Inc. Human relaxin formulation
CA1324969C (en) 1988-05-06 1993-12-07 Jeffrey R. Shuster High level expression of proteins in yeast
US5674706A (en) 1988-05-06 1997-10-07 Chiron Corporation High level expression of proteins in yeast
FR2631974B1 (fr) 1988-05-31 1992-12-11 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede de preparation et son application en tant que vecteur d'expression de genes
AU4197389A (en) 1988-08-05 1990-03-05 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York, The In vivo infection of live insects with a recombinant baculovirus
GB8819453D0 (en) 1988-08-16 1988-09-21 Roy P Production of bluetongue virus non-structural proteins using baculovirus expression vector
NZ230425A (en) 1988-09-02 1992-07-28 Molecular Eng Ass Production of paramyxovirus fusion (f) protein using recombinant baculovirus expression vector
GB8824591D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
EP0397834B1 (en) 1988-10-28 2000-02-02 Genentech, Inc. Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants
AU649217B2 (en) 1988-11-18 1994-05-19 Regents Of The University Of California, The Method for site-specifically incorporating unnatural amino acids into proteins
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
WO1990006952A1 (fr) 1988-12-22 1990-06-28 Kirin-Amgen, Inc. Facteur de stimulation de colonies de granulocytes modifies chimiquement
HUT56857A (en) 1988-12-23 1991-10-28 Novo Nordisk As Human insulin analogues
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5514646A (en) 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
WO1990010078A1 (en) 1989-02-23 1990-09-07 University Of Ottawa Improved baculovirus expression system capable of producing foreign gene proteins at high levels
CA2045614C (en) 1989-02-24 1997-09-30 James W. Bacus Method and apparatus for determining a proliferation index of a cell sample
US5324844A (en) 1989-04-19 1994-06-28 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ES2136595T5 (es) 1989-04-19 2004-04-01 Enzon, Inc. Carbonatos activos de oxidos de polialquileno para la modificacion de polipeptidos.
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
ATE92107T1 (de) 1989-04-29 1993-08-15 Delta Biotechnology Ltd N-terminale fragmente von menschliches serumalbumin enthaltenden fusionsproteinen.
US5766883A (en) 1989-04-29 1998-06-16 Delta Biotechnology Limited Polypeptides
JPH04501065A (ja) 1989-05-17 1992-02-27 ユニバーシティ オブ ジョージア リサーチ ファウンデーション インコーポレイテッド 改良されたバキュロウイルス発現ベクター
DK0400472T3 (da) 1989-05-27 1996-05-13 Sumitomo Pharma Fremgangsmåde til fremstilling af polyethylenglycolderivater og modificeret protein
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
US5162601A (en) 1989-11-22 1992-11-10 The Upjohn Company Plant potyvirus expression vector with a gene for protease
US5312808A (en) 1989-11-22 1994-05-17 Enzon, Inc. Fractionation of polyalkylene oxide-conjugated hemoglobin solutions
US5219564A (en) 1990-07-06 1993-06-15 Enzon, Inc. Poly(alkylene oxide) amino acid copolymers and drug carriers and charged copolymers based thereon
US5074598A (en) 1990-06-28 1991-12-24 Dayco Products, Inc. Hose construction, coupling unit and system therefor
FR2664905B1 (fr) 1990-07-18 1994-08-12 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede d'obtention, et vecteurs d'expression obtenus a partir dudit baculovirus.
WO1992001800A1 (en) 1990-07-20 1992-02-06 Chiron Corporation Method for integrative transformation of yeast using dispersed repetitive elements
WO1992002628A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 Chiron Corporation Expression of human cmv glycoprotein-h using the baculovirus-insect cell expression system
EP0548267A4 (en) 1990-09-04 1994-11-23 Salk Inst Biotech Ind Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
EP0513332A4 (en) 1990-11-14 1993-03-17 Cargill, Incorporated Conjugates of poly(vinylsaccharide) with proteins for the stabilization of proteins
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5231178A (en) 1991-01-16 1993-07-27 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1
JPH06506217A (ja) 1991-03-18 1994-07-14 エンゾン，インコーポレーテッド ポリペプチドまたはグリコポリペプチドとポリマーとのヒドラジン含有結合体
AU1651992A (en) 1991-03-19 1992-10-21 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Expression of influenza nucleoprotein antigens in baculovirus
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
US6013433A (en) 1991-04-26 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Baculovirus expression vectors and recombinant antigens for detecting type-specific antibodies to herpes simplex virus
US5281698A (en) 1991-07-23 1994-01-25 Cetus Oncology Corporation Preparation of an activated polymer ester for protein conjugation
US5290686A (en) 1991-07-31 1994-03-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Expression of influenza a M2 protein in baculovirus
US5166191A (en) 1991-08-19 1992-11-24 Genentech, Inc. Use of relaxin in cardiovascular therapy
IT1260468B (it) 1992-01-29 1996-04-09 Metodo per mantenere l'attivita' di enzimi proteolitici modificati con polietilenglicole
US6256642B1 (en) 1992-01-29 2001-07-03 Microsoft Corporation Method and system for file system management using a flash-erasable, programmable, read-only memory
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
WO1993021259A1 (en) 1992-04-14 1993-10-28 Cornell Research Foundation Inc. Dendritic based macromolecules and method of production
US5516657A (en) 1992-05-11 1996-05-14 Cambridge Biotech Corporation Baculovirus vectors for expression of secretory and membrane-bound proteins
ZA933926B (en) 1992-06-17 1994-01-03 Amgen Inc Polyoxymethylene-oxyethylene copolymers in conjuction with blomolecules
WO1994000699A1 (en) 1992-06-24 1994-01-06 D & D Group Pty Ltd An engagement device and coupling member
AU5006993A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Enzon, Inc. Novel attachment of polyalkylene oxides to bio-effecting substances
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
NZ250375A (en) 1992-12-09 1995-07-26 Ortho Pharma Corp Peg hydrazone and peg oxime linkage forming reagents and protein derivatives
US5298643A (en) 1992-12-22 1994-03-29 Enzon, Inc. Aryl imidate activated polyalkylene oxides
WO1994015625A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Enzon, Inc. Factor viii - polymeric conjugates
US5349001A (en) 1993-01-19 1994-09-20 Enzon, Inc. Cyclic imide thione activated polyalkylene oxides
US5321095A (en) 1993-02-02 1994-06-14 Enzon, Inc. Azlactone activated polyalkylene oxides
US5532142A (en) 1993-02-12 1996-07-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Method of isolation and purification of fusion polypeptides
IL104734A0 (en) 1993-02-15 1993-06-10 Univ Bar Ilan Bioactive conjugates of cellulose with amino compounds
WO1994028024A1 (en) 1993-06-01 1994-12-08 Enzon, Inc. Carbohydrate-modified polymer conjugates with erythropoietic activity
AU7113594A (en) 1993-06-21 1995-01-17 Enzon, Inc. Site specific synthesis of conjugated peptides
WO1995000645A2 (en) 1993-06-21 1995-01-05 Genentech, Inc. Process for producing relaxin
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5762939A (en) 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US5491076A (en) 1993-11-01 1996-02-13 The Texas A&M University System Expression of foreign genes using a replicating polyprotein producing virus vector
US5605792A (en) 1993-11-04 1997-02-25 The Ohio State University Research Foundation Infectious bursal disease virus VP2 fusion protein expressed by baculovirus, use as diagnostic
US5951974A (en) 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
ATE214940T1 (de) 1993-11-10 2002-04-15 Enzon Inc Verbesserte interferon-polymerkonjugate
US5446090A (en) 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
US6852507B1 (en) 1994-01-31 2005-02-08 L'institut National De La Recherche Agronomique Recombinant baculovirus and use thereof in the production of monoclonal antibodies
FR2715664B1 (fr) 1994-01-31 1996-04-12 Proteine Performance Sa Baculovirus recombinant et son utilisation pour la production d'anticorps monoclonaux.
JP3090586B2 (ja) 1994-03-15 2000-09-25 片倉工業株式会社 システインプロテアーゼ遺伝子欠損バキュロウイルスおよびその製造法並びにこれを利用する有用タンパク質の製造法
US5473034A (en) 1994-03-18 1995-12-05 Hyogo Prefectural Government Method for producing protein-synthetic polymer conjugate and said conjugate produced thereby
US5629384A (en) 1994-05-17 1997-05-13 Consiglio Nazionale Delle Ricerche Polymers of N-acryloylmorpholine activated at one end and conjugates with bioactive materials and surfaces
AU2826495A (en) 1994-06-02 1996-01-04 Enzon, Inc. Method of solubilizing substantially water insoluble materials
US5730990A (en) 1994-06-24 1998-03-24 Enzon, Inc. Non-antigenic amine derived polymers and polymer conjugates
US6403375B1 (en) 1994-08-24 2002-06-11 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Establishment of Trichoplusia ni cell lines in serum-free medium for recombinant protein and baculovirus production
US5650234A (en) 1994-09-09 1997-07-22 Surface Engineering Technologies, Division Of Innerdyne, Inc. Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces
US5871986A (en) 1994-09-23 1999-02-16 The General Hospital Corporation Use of a baculovirus to express and exogenous gene in a mammalian cell
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
CA2204726A1 (en) 1994-11-09 1996-12-27 Robin E. Offord Functionalized polymers for site-specific attachment
US5738846A (en) 1994-11-10 1998-04-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates and process for preparing the same
US5932462A (en) 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US6183987B1 (en) 1995-02-17 2001-02-06 Stichting Institut Voor Dierhouderij En Diergezonheld Production of biologically active recombinant bovine follicle stimulation hormone (rec bFSH) in the baculovirus expression system
FR2732035B1 (fr) 1995-03-23 1997-05-30 Agronomique Inst Nat Rech Procede de regulation de l'expression d'un gene dans un baculovirus, par un site de fixation d'un recepteur de l'acide retinoique, et vecteur pour la mise en oeuvre du dit procede
US6184344B1 (en) 1995-05-04 2001-02-06 The Scripps Research Institute Synthesis of proteins by native chemical ligation
NZ308772A (en) 1995-05-17 1999-04-29 Du Pont Recombinant baculovirus insecticides
WO1996040791A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Novo Nordisk A/S Modification of polypeptides
US5911997A (en) 1995-06-07 1999-06-15 Connetics Corporation Relaxin-like factor and methods and uses thereof
US5833948A (en) 1995-06-15 1998-11-10 Bracco Research S.A. Blood-pool imaging composition comprising micelles containing a lipophilic chelating agent and a non-ionic surfactant
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
CA2229479C (en) 1995-08-15 2010-03-30 Connective Therapeutics, Inc. Method of promoting angiogenesis
GB9526733D0 (en) 1995-12-30 1996-02-28 Delta Biotechnology Ltd Fusion proteins
WO1997026332A1 (en) 1996-01-17 1997-07-24 Schering Corporation Baculovirus expression system for human interleukin 5 receptor and method of screening for interleukin 5 antagonists
US5861279A (en) 1996-01-17 1999-01-19 Schering Corporation Baculovirus expression system for human interleukin 5 receptor and method of screening for interleukin 5 antagonists
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
EP0964702B1 (en) 1996-08-02 2006-10-04 Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc. Polypeptides having a single covalently bound n-terminal water-soluble polymer
US5980948A (en) 1996-08-16 1999-11-09 Osteotech, Inc. Polyetherester copolymers as drug delivery matrices
US6214966B1 (en) 1996-09-26 2001-04-10 Shearwater Corporation Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution
US5998595A (en) 1996-11-05 1999-12-07 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Azidohalogenobenzyl derivatives, sugar compounds and protection of hydroxy groups
EP1935901A1 (en) 1996-12-13 2008-06-25 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Analysis and separation of platelet-derived growth factor proteins
WO1998032466A1 (en) 1997-01-29 1998-07-30 Polymasc Pharmaceuticals Plc Pegylation process
GB9703406D0 (en) 1997-02-19 1997-04-09 Chiron Spa Expression of heterologous proteins
DK0974111T3 (da) 1997-04-11 2003-04-22 California Inst Of Techn Apparat og metode til automatiseret design af proteiner
EP0979102A4 (en) 1997-04-30 2005-11-23 Enzon Inc DETAILED POLYPEPTIDE MODIFIED BY POLYALKYLENE OXIDE
US5990237A (en) 1997-05-21 1999-11-23 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) aldehyde hydrates and related polymers and applications in modifying amines
JP4011124B2 (ja) 1997-06-06 2007-11-21 協和醗酵工業株式会社 化学修飾ポリペプチド
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
US5965393A (en) 1997-07-01 1999-10-12 National Institute Of Immunology Method for enhancing foreign gene expression in baculovirus expression vector system
ES2297889T3 (es) 1997-07-14 2008-05-01 Bolder Biotechnology, Inc. Derivados de hormona de crecimiento y proteinas relacionadas.
GB9715660D0 (en) 1997-07-25 1997-10-01 Zeneca Ltd Proteins
JP2001512684A (ja) 1997-08-05 2001-08-28 カイロン コーポレイション 新規のｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ遺伝子配列およびそれらの使用方法
DE19735593C2 (de) 1997-08-15 1999-08-26 Hepavec Ag Fuer Gentherapie Hüllprotein-modifizierter Baculovirus-Vektor für die Gentherapie
US6090584A (en) 1997-08-21 2000-07-18 University Technologies International Inc. Baculovirus artificial chromosomes and methods of use
US5989868A (en) 1997-09-12 1999-11-23 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Fusion protein systems designed to increase soluble cytoplasmic expression of heterologous proteins in esherichia coli
PT1015576E (pt) 1997-09-16 2005-09-30 Egea Biosciences Llc Metodo para a sintese quimica completa e montagem de genes e de genomas
CA2320156A1 (en) 1997-09-26 1999-04-08 Uab Research Foundation Reduced antigenic cells and uses therefor
US6201072B1 (en) 1997-10-03 2001-03-13 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co- glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
US6004573A (en) 1997-10-03 1999-12-21 Macromed, Inc. Biodegradable low molecular weight triblock poly(lactide-co-glycolide) polyethylene glycol copolymers having reverse thermal gelation properties
DE19748489A1 (de) 1997-11-03 1999-05-06 Roche Diagnostics Gmbh Polyethylenglykol-derivatisierte Biomoleküle und deren Verwendung in heterogenen Nachweisverfahren
US6448369B1 (en) 1997-11-06 2002-09-10 Shearwater Corporation Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation
EP0924298A1 (en) 1997-12-18 1999-06-23 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Protein expression in baculovirus vector expression systems
US5981709A (en) 1997-12-19 1999-11-09 Enzon, Inc. α-interferon-polymer-conjugates having enhanced biological activity and methods of preparing the same
US5985263A (en) 1997-12-19 1999-11-16 Enzon, Inc. Substantially pure histidine-linked protein polymer conjugates
CN1292033A (zh) 1998-03-04 2001-04-18 昂尼克斯药物公司 用于遗传物质高通量表达的杆状病毒表达系统和方法
WO1999045026A1 (en) 1998-03-05 1999-09-10 Chiron Corporation Method for increasing the serum half-life of a biologically active molecule
JP4078032B2 (ja) 1998-03-12 2008-04-23 ネクター セラピューティックス エイエル，コーポレイション 近位の反応性基を持つポリ（エチレングリコール）誘導体
KR100264953B1 (ko) 1998-04-03 2001-03-02 박현우 재조합 베큘로바이러스, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 미생물 살충제
US6451986B1 (en) 1998-06-22 2002-09-17 Immunex Corporation Site specific protein modification
US6168932B1 (en) 1998-07-13 2001-01-02 Parker Hughes Institute Recombinant DTctGMCSF fusion toxin in a baculovirus expression vector system
US6245528B1 (en) 1998-07-28 2001-06-12 Academia Sinica Latent baculovirus expression system
US6368825B1 (en) 1998-08-10 2002-04-09 Academia Sinica Baculovirus containing minimal CMV promoter
EP1107998B1 (en) 1998-08-28 2004-02-04 Gryphon Sciences Method for the preparation of polyamide chains of precise length, their conjugates with proteins
US6251863B1 (en) 1998-09-08 2001-06-26 Samuel K. Yue Method of preventing and treating symptoms of aging and neurodegenerative dysfunctions with relaxin
WO2000020032A1 (en) 1998-10-06 2000-04-13 Trustees Of Dartmouth College RECOMBINANT CAT ALLERGEN, Fel dI, EXPRESSED IN BACULOVIRUS FOR DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CAT ALLERGY
US6420339B1 (en) 1998-10-14 2002-07-16 Amgen Inc. Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility
US6403312B1 (en) 1998-10-16 2002-06-11 Xencor Protein design automatic for protein libraries
ATE365210T1 (de) 1998-10-30 2007-07-15 Novozymes As Glykosylierte proteine mit reduzierter allergenität
US6451346B1 (en) 1998-12-23 2002-09-17 Amgen Inc Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents
US6281211B1 (en) 1999-02-04 2001-08-28 Euro-Celtique S.A. Substituted semicarbazides and the use thereof
US6342216B1 (en) 1999-03-17 2002-01-29 The Board Of Regents, The University Of Texas System Therapy of cancer by insect cells containing recombinant baculovirus encoding genes
WO2000055353A1 (en) 1999-03-17 2000-09-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In vitro macromolecule biosynthesis methods using exogenous amino acids and a novel atp regeneration system
US6994986B2 (en) 1999-03-17 2006-02-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford University In vitro synthesis of polypeptides by optimizing amino acid metabolism
US6337191B1 (en) 1999-03-22 2002-01-08 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Vitro protein synthesis using glycolytic intermediates as an energy source
US6384105B1 (en) 1999-04-16 2002-05-07 William Marsh Rice University Poly(Propylene Fumarate) cross linked with Poly(Ethylene Glycol)
US6261805B1 (en) 1999-07-15 2001-07-17 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Sialyiation of N-linked glycoproteins in the baculovirus expression vector system
AU2039501A (en) 1999-10-15 2001-04-23 Rockefeller University, The System for rapid generation of recombinant baculovirus-based expression vectors for silkworm larvae
US6348558B1 (en) 1999-12-10 2002-02-19 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable polymers and hydrogels made therefrom
CA2394980C (en) 1999-12-22 2008-05-13 Shearwater Corporation Sterically hindered derivatives of water soluble polymers
MXPA02006215A (es) 1999-12-22 2003-10-15 Nektar Therapeutics Al Corp Metodo para preparar esteres de 1-benzotriazolil carbonato de poli(etilenglicol).
US6413507B1 (en) 1999-12-23 2002-07-02 Shearwater Corporation Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol)
US6646110B2 (en) 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
EP1253929B1 (en) 2000-02-09 2007-05-23 BAS Medical, Inc. Use of relaxin to treat diseases related to vasoconstriction
US6602498B2 (en) 2000-02-22 2003-08-05 Shearwater Corporation N-maleimidyl polymer derivatives
WO2001062299A2 (en) 2000-02-28 2001-08-30 Shearwater Corporation Water-soluble polymer conjugates of artelinic acid
US6586207B2 (en) 2000-05-26 2003-07-01 California Institute Of Technology Overexpression of aminoacyl-tRNA synthetases for efficient production of engineered proteins containing amino acid analogues
GB0012997D0 (en) 2000-05-26 2000-07-19 Eurogene Limited Gene delivery
JP2002030098A (ja) 2000-07-17 2002-01-29 Institute Of Immunology Co Ltd バキュロウィルスの発芽ウイルスからウイルスエンベロープを回収する方法
KR20030057529A (ko) 2000-09-08 2003-07-04 그리폰 테라퓨틱스, 인코포레이티드 합성 적혈구생성 자극 단백질
US6436386B1 (en) 2000-11-14 2002-08-20 Shearwater Corporation Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers
TW593427B (en) 2000-12-18 2004-06-21 Nektar Therapeutics Al Corp Synthesis of high molecular weight non-peptidic polymer derivatives
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
WO2002085923A2 (en) 2001-04-19 2002-10-31 The Scripps Research Institute In vivo incorporation of unnatural amino acids
GB0113657D0 (en) 2001-06-05 2001-07-25 Geneprot Inc Improved native chemical ligation with three or more components
US20040138412A1 (en) 2001-09-07 2004-07-15 Paolo Botti Extended native chemical ligation
AUPR814401A0 (en) 2001-10-08 2001-11-01 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Human 3 relaxin
US6908963B2 (en) 2001-10-09 2005-06-21 Nektar Therapeutics Al, Corporation Thioester polymer derivatives and method of modifying the N-terminus of a polypeptide therewith
EP1446438A2 (en) 2001-11-07 2004-08-18 Nektar Therapeutics Al, Corporation Branched polymers and their conjugates
CA2466746A1 (en) 2001-11-14 2003-05-22 Geneprot, Inc. Extended native chemical ligation of three or more peptide fragments
US6716821B2 (en) 2001-12-21 2004-04-06 Immunogen Inc. Cytotoxic agents bearing a reactive polyethylene glycol moiety, cytotoxic conjugates comprising polyethylene glycol linking groups, and methods of making and using the same
ATE437946T1 (de) 2002-02-15 2009-08-15 Univ New York State Res Found Ribozyme mit breiter trna-aminoacylierungswirkung
JP4638225B2 (ja) 2002-05-30 2011-02-23 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 銅を触媒とするアジドとアセチレンのライゲーション
MXPA05003978A (es) 2002-10-16 2005-06-22 Scripps Research Inst Sintesis de glicoproteinas.
JP4444113B2 (ja) 2002-10-16 2010-03-31 ザ スクリップス リサーチ インスティテュート ケトアミノ酸の部位特異的蛋白質組込み方法
CA2508939A1 (en) 2002-12-22 2004-07-15 The Scripps Research Institute Protein arrays
JP5642916B2 (ja) 2003-04-17 2014-12-17 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 真核遺伝コードの拡張
AU2003903124A0 (en) * 2003-06-20 2003-07-10 Mark Del Borgo Analogues of heteromeric proteins
US20060160175A1 (en) 2003-07-07 2006-07-20 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal leucyl-trna and aminoacyl-trna synthetase pairs and uses thereof
WO2005007624A2 (en) 2003-07-07 2005-01-27 The Scripps Research Institute Compositions of orthogonal glutamyl-trna and aminoacyl trna synthetase pairs and uses thereof
EP1649004A4 (en) 2003-07-07 2008-04-09 Scripps Research Inst COMPOSITIONS WITH PAIRS OF ORTHOGONAL LYSYL-TRNA AND AMINOACYL-TRNA-SYNTHETASE AND USES THEREOF
WO2005035727A2 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Ambrx, Inc. Polymer derivatives
BRPI0507169A (pt) 2004-02-02 2007-06-26 Ambrx Inc polipeptìdeos do hormÈnio de crescimento humano modificados e seu usos
US7632924B2 (en) 2004-06-18 2009-12-15 Ambrx, Inc. Antigen-binding polypeptides and their uses
WO2006091231A2 (en) 2004-07-21 2006-08-31 Ambrx, Inc. Biosynthetic polypeptides utilizing non-naturally encoded amino acids
US20060052304A1 (en) 2004-09-02 2006-03-09 Bas Medical, Inc. Method for remodeling bone and related sutures
CN103520735B (zh) 2004-12-22 2015-11-25 Ambrx公司 包含非天然编码的氨基酸的人生长激素配方
EP1836298B1 (en) 2004-12-22 2012-01-18 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
EP2399893B1 (en) 2004-12-22 2018-08-15 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
EP1836316A4 (en) 2004-12-22 2009-07-22 Ambrx Inc PROCESS FOR EXPRESSION AND CLEANING OF RECOMBINANT HUMAN GROWTH HORMONE
BRPI0519430A2 (pt) 2004-12-22 2009-02-10 Ambrx Inc hormânio do crescimento humano modificado
US7883858B2 (en) 2005-01-27 2011-02-08 Institute For Systems Biology Methods for identifying and monitoring drug side effects
AU2006255122B2 (en) 2005-06-03 2010-10-21 Ambrx, Inc. Improved human interferon molecules and their uses
EP1891092A4 (en) 2005-06-03 2011-12-21 Ambrx Inc INSTALLATION OF NATURALLY CODED AMINO ACIDS IN PROTEINS
AU2005335491B2 (en) 2005-08-18 2010-11-25 Ambrx, Inc. Compositions of tRNA and uses thereof
EP1954302A4 (en) 2005-11-02 2009-11-04 Ambrx Inc BIOSYNTHETIC POLYPEPTIDE FUSION INHIBITORS
CN101400646A (zh) 2005-11-08 2009-04-01 Ambrx公司 用于修饰非天然氨基酸和非天然氨基酸多肽的促进剂
DK2339014T3 (en) 2005-11-16 2015-07-20 Ambrx Inc Methods and compositions comprising non-natural amino acids
WO2007070659A2 (en) 2005-12-14 2007-06-21 Ambrx, Inc. Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides
CN105085313A (zh) 2005-12-30 2015-11-25 Ambrx公司 含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途
AU2007215566A1 (en) 2006-01-19 2007-08-23 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid polypeptides having modulated immunogenicity
KR20080106430A (ko) * 2006-03-09 2008-12-05 더 스크립스 리서치 인스티튜트 진정 세균 숙주 세포 내에서의 직교형 번역 성분의 발현을 위한 시스템
WO2007115414A1 (en) * 2006-04-11 2007-10-18 University Of Guelph Modified h2 relaxin for tumor suppression
US8035498B2 (en) 2006-08-15 2011-10-11 Terry Pennisi Wireless monitoring system with a self-powered transmitter
JP2010502221A (ja) 2006-09-08 2010-01-28 アンブルックス，インコーポレイテッド 脊椎動物細胞による非天然アミノ酸の部位特異的組み込み
CN106008699A (zh) 2006-09-08 2016-10-12 Ambrx公司 经修饰的人类血浆多肽或Fc骨架和其用途
JP5399906B2 (ja) 2006-09-08 2014-01-29 アンブルックス，インコーポレイテッド 脊椎動物細胞用のハイブリッドサプレッサーｔｒｎａ
EP2064333B1 (en) 2006-09-08 2014-02-26 Ambrx, Inc. Suppressor trna transcription in vertebrate cells
CN101578264A (zh) * 2006-12-18 2009-11-11 Ambrx公司 含有非天然氨基酸和多肽的组合物、涉及非天然氨基酸和多肽的方法以及非天然氨基酸和多肽的用途
US20100098630A1 (en) 2006-12-28 2010-04-22 Ambrx, Inc. Phenazine and Quinoxaline Substituted Amino Acids and Polypeptides
CN107501407B (zh) 2007-03-30 2022-03-18 Ambrx公司 经修饰fgf-21多肽和其用途
US8114630B2 (en) 2007-05-02 2012-02-14 Ambrx, Inc. Modified interferon beta polypeptides and their uses
CA2689909C (en) 2007-06-08 2016-04-05 Ascendis Pharma As Long-acting polymeric prodrugs of exendin
CA2707840A1 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Allozyne, Inc. Amino acid substituted molecules
WO2009036460A2 (en) 2007-09-14 2009-03-19 Ambrx, Inc. Modified human apolipoprotein a-i polypeptides and their uses
WO2009052435A1 (en) 2007-10-19 2009-04-23 Ambrx, Inc. Anti-tnfri polypeptides and their uses
WO2009055854A1 (en) 2007-10-30 2009-05-07 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Chimeric relaxin polypeptides comprising an a and b chain derived from different relaxin family peptides
JP5513398B2 (ja) 2007-11-02 2014-06-04 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 非天然アミノ酸を含有する蛋白質を使用する指向的進化
MX2010005317A (es) * 2007-11-20 2010-06-02 Ambrx Inc Polipeptidos de insulina modificados y sus usos.
MX344166B (es) 2008-02-08 2016-12-07 Ambrx Inc Leptina-polipeptidos modificados y sus usos.
WO2010051056A2 (en) 2008-03-11 2010-05-06 Ambrx, Inc. ANTI-FcεRI POLYPEPTIDES AND THEIR USES
US20110015345A1 (en) 2008-03-19 2011-01-20 Ambrx, Inc. Modified FGF-23 Polypeptides and Their Uses
CA2724540C (en) * 2008-05-16 2014-07-08 Corthera, Inc. Treating dyspnea associated with acute heart failure with relaxin
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
CN102159230A (zh) 2008-07-23 2011-08-17 Ambrx公司 经修饰的牛g-csf多肽和其用途
BR122012024318A2 (pt) 2008-09-26 2019-07-30 Ambrx, Inc. Polipeptídeos modificados de eritropoetina animal e seus usos
AU2009296267B2 (en) 2008-09-26 2013-10-31 Ambrx, Inc. Non-natural amino acid replication-dependent microorganisms and vaccines
JP5090330B2 (ja) 2008-12-26 2012-12-05 Ｋｄｄｉ株式会社 画像処理装置、画像処理方法およびプログラム
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
BR112012015597A2 (pt) 2009-12-21 2017-01-31 Ambrx Inc peptídeos de somatotropina suínos modificados e seus usos
WO2011079293A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Ambrx, Inc Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand polypeptides and their uses
EP2599284B1 (fr) 2010-07-28 2018-02-28 Orange Communication de données entre modules
US9567386B2 (en) 2010-08-17 2017-02-14 Ambrx, Inc. Therapeutic uses of modified relaxin polypeptides
EA030886B1 (ru) * 2010-08-17 2018-10-31 Амбркс, Инк. Модифицированные полипептиды релаксина, содержащие некодируемую в природе аминокислоту, связанную с полимером, и их применение
KR102356286B1 (ko) 2011-05-27 2022-02-08 암브룩스, 인코포레이티드 비-천연 아미노산 연결된 돌라스타틴 유도체를 함유하는 조성물, 이를 수반하는 방법, 및 용도
CN110078789A (zh) 2011-05-27 2019-08-02 Ambrx 公司 含有非天然氨基酸连接的海兔毒素衍生物的组合物、涉及该海兔毒素衍生物的方法及其用途
WO2013068874A1 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Pfizer Inc. Antibody-drug conjugates
US20150031864A1 (en) 2012-02-29 2015-01-29 Ambrx, Inc. Modified Adiponectin Polypeptides and Their Uses
HK1205686A1 (en) 2012-02-29 2015-12-24 Ambrx, Inc. Novel prodrug containing molecule compostions and their uses
CN104245720A (zh) 2012-02-29 2014-12-24 Ambrx公司 白细胞介素-3多肽结合物和其用途
EP2820033A1 (en) 2012-02-29 2015-01-07 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates and their uses
US9206927B2 (en) 2012-05-18 2015-12-08 Brian K. Carter Utility conduit supporting device, system, and method
CN108727466B (zh) 2012-06-07 2023-04-28 Ambrx公司 前列腺特异性膜抗原抗体药物结合物
CN104619350A (zh) 2012-06-14 2015-05-13 Ambrx公司 结合到核受体配体多肽的抗psma抗体
KR102190832B1 (ko) 2012-06-19 2020-12-15 암브룩스, 인코포레이티드 항cd70 항체 약물 컨쥬게이트
EP4057215A1 (en) 2013-10-22 2022-09-14 Eyenuk, Inc. Systems and methods for automated analysis of retinal images
PE20191716A1 (es) * 2017-02-08 2019-12-05 Bristol Myers Squibb Co Polipeptidos de relaxina modificada que comprenden un mejorador farmacocinetico y sus usos

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012024452A3 (en) 2012-06-07
US20180311368A1 (en) 2018-11-01
EA201390254A1 (ru) 2013-08-30
PL3572091T3 (pl) 2024-07-29
CN108285482A (zh) 2018-07-17
DK3572091T3 (da) 2024-02-19
PT3572091T (pt) 2024-03-01
CA2808596A1 (en) 2012-02-23
BR112013003522A2 (pt) 2016-06-28
IL224748A (en) 2017-10-31
US20230028168A1 (en) 2023-01-26
SI3572091T1 (sl) 2024-07-31
HUE045845T2 (hu) 2021-12-28
EP3572091B1 (en) 2023-12-13
RS65223B1 (sr) 2024-03-29
DK3572091T5 (da) 2024-09-02
HRP20240267T1 (hr) 2024-05-10
EP2605789A2 (en) 2013-06-26
EA030886B1 (ru) 2018-10-31
HRP20191564T1 (hr) 2019-11-29
SG187736A1 (en) 2013-03-28
LT3572091T (lt) 2024-05-10
FI3572091T3 (fi) 2024-03-01
MA34521B1 (fr) 2013-09-02
JP2013542715A (ja) 2013-11-28
CY1122101T1 (el) 2020-11-25
EP2605789B1 (en) 2019-06-05
NZ607069A (en) 2014-10-31
US20120046229A1 (en) 2012-02-23
SI2605789T1 (sl) 2019-10-30
US11439710B2 (en) 2022-09-13
CL2014002493A1 (es) 2015-02-06
PH12013500241A1 (en) 2013-03-11
WO2012024452A2 (en) 2012-02-23
CL2013000475A1 (es) 2014-01-10
KR20130136450A (ko) 2013-12-12
US20140194357A1 (en) 2014-07-10
HK1258140A1 (zh) 2019-11-08
HUE065900T2 (hu) 2024-06-28
ES2972902T3 (es) 2024-06-17
US9452222B2 (en) 2016-09-27
US9962450B2 (en) 2018-05-08
SMT202400182T1 (it) 2024-07-09
AU2011291943B2 (en) 2015-01-22
MX2013001871A (es) 2013-06-28
SG10201913122WA (en) 2020-03-30
EP2605789A4 (en) 2014-03-19
PL2605789T3 (pl) 2019-11-29
AU2011291943A1 (en) 2013-03-07
LT2605789T (lt) 2019-09-10
EP3572091A1 (en) 2019-11-27
BR112013003522A8 (pt) 2017-12-26
CO6680644A2 (es) 2013-05-31
JP6054294B2 (ja) 2016-12-27
US10702588B2 (en) 2020-07-07
EP4302783A2 (en) 2024-01-10
KR101963460B1 (ko) 2019-03-28
US8735539B2 (en) 2014-05-27
CA2808596C (en) 2020-12-15
MY162837A (en) 2017-07-31
PE20140160A1 (es) 2014-02-08
PT2605789T (pt) 2019-09-03
SMT201900495T1 (it) 2019-11-13
ES2742296T3 (es) 2020-02-13
EP4302783A3 (en) 2024-03-13
MX346786B (es) 2017-03-31
SG10201506443TA (en) 2015-10-29
CN103201285A (zh) 2013-07-10
BR112013003522B1 (pt) 2021-05-25
DK2605789T3 (da) 2019-09-16
US20170035897A1 (en) 2017-02-09
US20200360525A1 (en) 2020-11-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11439710B2 (en) Nucleic acids encoding modified relaxin polypeptides
EP2217265B1 (en) Modified insulin polypeptides and their uses
AU2013202792B2 (en) Modified insulin polypeptides and their uses
HK40106050A (en) Modified relaxin polypeptides and their uses
AU2015203349B2 (en) Modified insulin polypeptides and their uses
HK40018122B (en) Modified relaxin polypeptides and their uses
HK40018122A (en) Modified relaxin polypeptides and their uses
AU2012216723A1 (en) Modified insulin polypeptides and their uses
HK1181304A (en) Modified relaxin polypeptides and their uses
HK1181304B (en) Modified relaxin polypeptides and their uses
AU2014274518A1 (en) Modified relaxin polypeptides and their uses