RS59248B1

RS59248B1 - Anti il-36r atitela

Info

Publication number: RS59248B1
Authority: RS
Inventors: Su-Ellen Brown; Keith Canada; Lukasz Chlewicki; Michael Howell; Detlev Mennerich; Jr Joseph Robert Woska
Original assignee: Boehringer Ingelheim Int
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2012-11-14
Publication date: 2019-10-31
Also published as: MX347164B; PE20142041A1; FIC20230020I1; ZA201402491B; TWI573804B; CA2852994A1; NL301233I1; EA201400579A1; CN107007833B; NO2025001I1; EP3536710B1; IL272035A; US20200231684A1; HRP20191835T1; LTPA2023518I1; CY1122278T1; PT3536710T; KR102038310B1; DK3536710T3; ECSP14004976A

Description

Sekvencna Lista

Predmetna prijava sadrži Sekvencnu Listu koja je podneta u vidu ASCII formata preko EFS-Web i ovde je inkorporirana sa referencom u celosti. Navedena ASCII kopija, kreirana Novembar 12, 2012, je nazvana 09-0583WO.txt i veličine je od 147,390 bita.

Oblast pronalaska

Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na anti-IL-36R antitela za dijagnostičku i terapeutsku primenu. Antitela se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama i kitovima koji sadrže takva jedinjenja. Antitela su korisna u postupcima za lečenje raznih oboljenja ili poremećaja, na primer imunoloških, inflamatornih, autoimunih, fibrotičnih i respiratornih oboljenja kod ljudi.

Stanje tehnike

IL-1 familija citokina je sastavljena od 11 različitih liganada, uglavnom, IL-1α (takođe nazvan IL-1F1), IL-1β (IL-1F2), IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra or IL-1F3), IL-18 (IL-1F4), IL-1F5 to IL-1F10, i IL-1F11 (ili IL-33). IL-1α i IL-1β su poznati da izazivaju pro-inflamatorne aktivnosti pri vezuvanju za tip I IL-1 receptora (IL-1RI) i angažuju zajedničkog ko-receptora IL-1 receptorski dodatak proteinu (IL-1RAcP), gde IL-1Ra deluje kao kompetitivni inhibitor IL-1 koji se vezuje za IL-1RI, čime vrši anti-inflamatornu aktivnost. Brojne studije su prijavile da IL-18 je proinflamatorni citokin koji indukuje IFN-γ, pri čemu je IL-33 opisan kao imunoregulatorni citokin koji je uključen naročito u kontrolu Th2 odgovora. Novi članovi IL-1 familije, uključujući IL-1F5, IL-1F6, IL-1F8, i IL-1F9, su identifikovani kroz pretragu u DNK bazi podataka za homologe IL-1. Kod ljudi i miševa, svi geni kodiraju ove citokinske mape za manje od 300 kb hromozoma 2q, gde su bočno vezani sa IL1A, IL1B, i IL1RN genima. IL-1F6, IL-1F8, i IL-1F9 dele 21% do 37% amino kiselinske sekvence homologa sa IL-1 i IL-1Ra, pri čemu IL-1F5 prikazuje 52% amino kiselinske sekvence homologa sa IL-1Ra, predlagajući da IL-1F5 može predstavljati antagonist endogenog receptora.

IL-1F6, IL-1F8, i IL-1F9 se vezuju za IL-1Rrp2, receptor IL-1R familije, i koristi IL-1RAcP kao koreceptor da stimuliše intraćelijske signale koji su slični onima koji su indukovani sa IL-1, gde IL-1F5 je pokazano da inhibira IL-1F9–indukovanu NF-κB aktivaciju u Jurkat T ćelijama tako da prekomerno ekspresuje IL-1Rrp2. Koa što je IL-1β, svim ovim IL-1 homolozima nedostaje vodeći peptid i ne može se otpustiti kroz uobičajenu sekretorsku putanju, iako studije predlažu da otpuštanje IL-1Rrp2 agonista može biti kontrolisano sa mehanizmima koji su različiti od onih koji regulišu IL-1β sekreciju. Kako bi se potvrdili određeni biološki efekti ovih citokina i prepoznali da su svi vezani za isti receptor, nedavno je predloženo da se izmeni nomenklatura IL-1 homologa. Stoga, IL-1Rrp2 je sada nazvan IL-36R a njegovi ligandi su nazvani IL-36α (IL-1F6), IL-36β (IL-1F8), i IL-36γ (IL-1F9). Dodatno, IL-1F5, za koje se pokazalo da vrši aktivnosti antagonista receptora, preimenovan je u IL-36Ra.

Informacione RNK za IL-36α, IL-36β, i IL-36γ su visoko ekspresovane u nekoliko tkiva, naročito u unutrašnjim epitelnim tkivima, koji su izloženi patogenima i na koži. Zanimljivo je da izraz IL-36Ra i IL-36α znatno je regulisano u IL-1β/TNF-α–stimulisanim humanim keratinocitima, i IL-36Ra i IL-36γ mRNK su visoko povećane na leziji kože koja boluje od psorijaze. Pored toga, IL-36γ proizvodnja proteina je poboljšana u humanim keratinocitima posle TNF-α i IFN-γ stimulacije. Povišena IL-36α mRNK i proteinska ekspresija je prijavljena takođe i kod hroničnog oboljenja bubrega.

Transgenski miševi koji previše ekspresuju IL-36α u keratinocitima pokazuju zapaljene lezije kože koje dele neke osobine sa psorijazom. Ovaj fenotip je bio teži kada su transgeni miševi bili ukršteni sa miševima kojim nedostaje IL-36Ra, podržavajući regulatornu funkciju IL-36Ra in vivo. Inflamatorno stanje kože kod keratinocitno specifičnog IL-36α transgena je čak još sličniji ljudskoj psorijazi ako se miševi leče sa 12-O-tetradekanoilforbol 13-acetatom, tako da nalikuje ljudskoj bolesti histološki, molekularno i po svom odgovoru na terapeutske lekove. Pored toga, ljudska psorijazna lezija kože koja je presađena na imunodeficirane miševe se normalizuje kada su miševi tretirani antitelom protiv IL-36R, tvrdeći da je IL-36 osa potrebna za održavanje fenotipa lezije na ljudskoj psorijaznoj kož. Uzeto zajedno, ovi podaci ukazuju da IL-36R ligandi, uključujući IL-36α, IL-36β, i IL-36γ, vrše proinflamatorne efikasnosti in vitro i in vivo i da IL-36Ra deluje kao prirodni antagonist, na taj način oponašajući IL-1/IL-1Ra sistem.

Stoga postoje dokazi da su IL-36R ligandi uključeni u brojna stanja oboljenja, i postoji potreba za novim terapeutskim agensima koji ciljaju ovaj put, naročito za upotrebu u lečenju inflamatornih oboljenja.

Kratak opis pronalaska

Obim pronalaska je definisan sa priloženim zahtevima. Predmetni pronalazak upućuje na gore navedenu potrebu da se obezbede bioterapeutici, naročito antitela, koja se vezuju za IL-36R. Antitela predmetnog pronalaska blokiraju IL36 ligand koji posreduje u signalizaciji (α, β i/ili γ). Takođe, antitela predmetnog pronalaska su korisna, na primer za lečenje epitelno posredovane inflamacije/fibroze kod oboljenja kao što je psorijaza, inflamatorno oboljenje creva, skleroderma, COPD, i hronično oboljenje bubrega.

U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80, i verijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87;

varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80, i verijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 88; ili

varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80, i verijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 89.

U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska ima veliki molekulski/ćelijski vezujući potencijal. U jednom rešenju, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za humani IL-36R pri KD< 0.1 nM. U drugom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmentog pronalaska, naročito humanizovano anti-IL-36R antitelo, se vezuje za humani IL-36R pri KD< 50 pM. U jednom aspketu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za IL-36R ekspresujuću ćeliju na EC90<5 nM.

U drugom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska ima veliku funkcionalnu blokirajuću osobinu zasnovanu na ćeliji. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska blokira sva tri IL-36R agonistička liganda (D, E, J) pri IC90<5 nM, u ćelijskim linijama i primarnim ćelijama bitnim za oboljenje.

U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska ima molekulsko/ćelijsku vezujuću osobinu i funkcionalno blokirajuću osobinu zasnovano na ćeliji koja je gore navedena.

U daljem aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska ima veliku selektivnost na primer veću od 1000-preklopne selektivnosti protiv humanih IL-1R1 ili IL-36R negativnih ćelijskih linija.

U daljem aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska se ne vezuje za humane IL-1R1 ili IL-36R negativne ćelijske linije.

U prvom primeru izvođenja, anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment se vezuje za humani IL-36R pri KDjednako ili < 0.1 nM.

U drugom primeru izvođenja, anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezuju ći fragment prema prvom izvođenju je monoklonsko antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment.

U trećem primeru izvođenja, anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema prvom ili drugom primeru izvođenja je humanizovano antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment.

U četvrtom primeru izvođenja, anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema trećem primeru izvođenja se vezuje za humani IL-36R pri KDjednako ili < 50 pM.

U petom primeru izvođenja, anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema bilo kom od primera izvođenja od jedan do četiri se ne vezuje za humani IL-1R1.

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema petom primeru izvođenja, gde antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment sadrži: a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26 (L-CDR1); amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104 (L-CDR2); amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 44 (L-CDR3); i

b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 53 (H-CDR1); amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 62 (H-CDR2); amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 72 (H-CDR3), gde antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80; varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu bilo koje SEQ ID NO: 87, 88, 89.

U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov antigenski vezujući frgament koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80, i verijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87; ili

U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo, gde antitelo sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125, 126 i 127.

U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo, gde antitelo sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125.

U drugom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo, gde antitelo sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126.

U još jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo, gde antitelo sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencuSEQ ID NO: 127.

U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema pronalasku je monoklonalno antitelo. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema pronalasku je humanizovano antitelo. U jednom primeru izvođenja, antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema pronalasku je monoklonalno humanizovano antitelo.

U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili antigenski vezujući fragment prema bilo kom prethodnom primeru izvođenja i farmaceutski prihvatljivi nosač.

U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo ili antigenski vezujući fragment prema bilo kom prethodnom primeru izvođenja, za primenu u medicini.

U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku, za primenu u lečenju inflamatornog oboljenja, autoimunog oboljenja, respiratornog oboljenja, metaboličkog poremećaja, epitelno posredovanog inflamatornog poremećaja, fibroze ili kancera.

U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutsku kompoziciju za primenu prema pronalasku, gde je primena za lečenje psorijaze, inflamatornog oboljenja creva, psorijaznog artritisa, multipla skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme ili ankiloznog spondilitisa.

U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutsku kompoziciju za primenu prema pronalasku, gde je primena za lečenje inflamatornog oboljenja creva.

U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutsku kompoziciju za primenu prema pronalasku, gde je oboljenje Crohnova bolest.

Drugi primeri izvođenja pronalaska obuhvataju:

- Izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja kodira anti-IL-36R antitelo ili antigenski vezujući fragment prema pronalasku, poželjno DNK ili RNK sekvenca;

- izolovani polinukleotid prema pronalasku, koji kodira (a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80, i verijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87, 88 ili 89; ili (b) laki lanac i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 125, respektivno; SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 126, respektivno; ili SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 127, respektivno;

- vektor koji sadrži polinukleotid prema pronalasku, poželjno ekspresioni vektor, naročito vektor koji sadrži polinukleotid prema pronalasku u funkcionalnoj povezanosti sa eskpresionom kontrolnom sekvencom;

- ćeliju domaćina koja sadrži polinukleotid prema pronalasku i/ili vektor prema pronalasku; - postupak za proizvodnju anti-IL-36R antitela ili antigenskog vezujućeg fragmenta prema pronalasku, poželjno rekombinantni postupak proizvodnje koji sadrži primenu polinukleotida prema pronalasku, i/ili vektora prema pronalasku i/ili ćelije domaćina prema pronalasku; - takav postupak poželjno obuhvata korake (a) kultivacije ćelije doma ćina pod ulsovima koji dozvoljavaju ekspresiju anti-IL-36R antitela ili antigenskog vezujućeg fragmenta i (b) oporavak anti-IL-36R antitela ili antigenskog vezujućeg fragmenta;

- dijagnostički kit ili dijagnostički postupak koji sadrži anti-IL-36R antitelo ili antigenski vezujući fragment prema pronalasku, ili njegovu primenu;

- dijagnostički kit ili dijagnostički postupak prema pronalasku, za dijagnozu inflamatornog oboljenja, autoimunog oboljenja, respiratornog oboljenja, metaboličkog poremećaja, epitelno posredovanog inflamatornog poremećaja, fibroze, kancera, psorijaze, inflamatornog oboljenja creva, psorijaznog artritisa, multipla skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme, ankiloznog spondilitisa, ili Crohn-ove bolesti.

Kratak Opis Slika

Slika 1: IL-36 antagonist ligandi (IL-36RA/IL1F5 , IL-38/ILF10) inhibiraju signalizaciju kaskade.

Slika 2: Gene chip analiza pokazuje IL-36R ligande da su neregulisani na koži koja boluje od psorijaze (IL-36 RA, IL-36 α i IL-36 γ).

Slika 3: Profil ekspresije koristeći delove ljudske kože.

Formalin-fiksirani parafin ugrađen sa titracijom antitela koristeći antitelo 33D10 Slika 4: Postupak procene debljine Epiderma ljudskih delova kože

Opis pronalaska

Ovaj pronalazak se odnosi na anti-IL-36R antitela. U jednom aspektu, antitela predmetnog pronalaska su za dijagnostičku i terapeutsku primenu, na primer kod ljudi.

Predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja se vezuju za IL-36R, naročito humani IL-36R. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na humanizovana antitela koja vezuju IL-36R. U određenim primerima izvođenja, sekvenca ovih humanizovanih antitela je identifikovana na osnovu sekvenci određenih navedenih antitela miša.

Bez želje da bude vezan ovom teorijom, veruje se da se anti-IL-36R antitela ili njegovi antigenski vezujući fragmenti vezuju za humani IL-36R i stoga ometaju vezivanje IL-36 agonista, i na taj način bar delimično blokiraju signalnu kaskadu iz IL-36R do imflamacionih medijatora. Ovo je ilustrovano sa Slikom 1.

U jednom aspektu, antitela predmetnog pronalaska su za primenu u modelima humanog oboljenja. IL-36R je takođe poznat kao IL-1RL2 i IL-1Rrp2. Prijavljeno je da agonistički IL-36 ligandi (D, E, or J) pokreću kaskadu signalizacije uključivanjem IL-36 receptora koji potom obrazuje heterodimer sa IL-1 receptorskim proteinskim dodatkom (IL-1RAcP). IL-36 antagonist ligandi (IL-36RA/IL1F5, IL-38/ILF10) inhibiraju signalizaciju kaskade (videti sliku 1).

U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska ima visoku molekulsku/ćelijsku vezujuću sposobnost. U jednoma spektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za humani IL-36R pri KD< 0.1 nM. U daljem aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska, naročito humanizovano anti-IL-36R antitelo, se vezuje za humani IL-36R pri KD< 50 pM. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska se vezuje za IL-36R ekspresione ćelije pri EC90<5 nM.

U drugom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska ima visoki potencijal blokiranja na bazi ćelije. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska blokira sva tri IL-36R agonistička liganda (D, E, J) pri IC90<5 nM, u ćelijskim linijama i primarnim ćelijama bitnim za bolest.

U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska ima visoku molekulsku/ćelijsku vezujuću sposobnost i visoki potencijal blokiranja na bazi ćelije koji je naveden ranije ovde.

U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska je humanizovano antitelo. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska je monoklonalno antitelo. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska je antitelo pune dužine. U jednom aspektu, anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska je humanizovano monoklonalno antitelo, na primer humanizovano monoklonalno antitelo pune dužine.

Antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment predmetnog pronaalska prepoznaje određeni "IL-36R antigen epitop" ili " IL-36R epitop". Kao što je ovde korišćeno, ovi termini se odnose na molekul (npr. peptid) ili fragment molekula koji je sposoban za imunoreaktivnost sa anti-IL-36R antitelom.

Epitopi su najčešće proteini, kratki oligopeptidi, koji oponaša oligopeptide (odn., organska jedinjenja koja oponašaju vezujuće sposobnosti antitela IL-36R antigena), ili njihove kombinacije. Smatra se da minimalna veličina peptidnog ili polipeptidnog epitopa za antitelo iznosi oko četiri do pet amino kiselina. Peptidni ili polipeptidni epitopi sadrže na primer najmanje sedam amino kiselina ili na primer najmanje devet amino kiselina ili na primer između oko 15 do oko 20 amino kiselina. Pošto antitelo može prepoznati antigenski peptid ili polipeptid u svom tercijarnom obliku, amino kiseline koje sadrže epitop ne moraju biti povezane, a u nekim slučajevima mogu čak i da budu na istom lancu peptida. Epitopi se mogu odrediti različitim tehnikama poznatim u tehnici, kao što je kristalografija rendgenskih zraka, Masena spektrometrija za razmenu vodonika / deuterija (HXMS), mutageneza usmerena na mesto, mutageneza alanin skeniranja i metode peptidnog skrininga.

Generalizovana struktura antitela ili imunoglobulina je dobro poznato onima koji su vešti u ovoj oblasti. Ovi molekuli su heterotetramerni glikoproteini, tipično od oko 150 000 daltona, sastavljeni od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca i obično se nazivaju antitela pune dužine. Svaki laki lanac je kovalentno povezan jednim teškim lancem jednom sa jednom disulfidnom vezom da bi se obrazovao heterodimer, a heterotetramerni molekul je formiran kroz kovalentnu disulfidnu vezu između dva identična teška lanca heterodimera. Iako su laki i teški lanci povezani zajedno jednom disulfidnom vezom, broj disulfidnih veza između dva teška lanca varira u zavisnosti od izotipa imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac takođe ima regularno raspoređene disulfidne mostove unutar lanca. Svaki teški lanac ima na amino-kraju varijabilni domen (VH), pračen sa tri ili četiri konstantna domena (CH1, CH2, CH3, and CH4), kao i područje veze između CH1i CH2. Svaki laki lanac ima dva domena, promenljivi domen aminokraja (VL) i konstantni domen karboksi-kraja (CL). VLdomen se vezuje ne kovalentno sa VHdomenom, gde CLdomen je obično kovalentno vezan za CH1domen preko disulfidne veze. Smatra se da određeni ostaci amino kiselina formiraju interfejs između varijabilnih domena lakog i teškog lanca (Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol.186:651-663). Varijabilni domeni se ovde takođe nazivaju varijabilnim regionima.

Određeni domeni unutar varijabilnih domena znatno se razlikuju između različitih antitela, odn. su “hipervarijabilni“. Ovi hipervarijabilni domeni sadrže ostatke koji su direktno uključeni u vezivanje i specifičnost svakog određenog antitela za njegovu specifičnu antigenu determinantu. Hipervarijabilnost, i kod varijabilnih domena lakog lanca i teškog lanca, koncentrisana je u tri segmenta poznata kao regioni koji određuju komplementarnost (CDRs) ili hipervarijabilne petlje

1

(HVL). CDR su definisani poređenjem sekvenci u Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5<th>Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., gde HVLs (ovde su takođe navedeni kao CDRs) su strukturno definisani prema trodimenzijalnoj strukturi varijabilnog domena, kao što je opisano od strane Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917. Ove dve metode rezultiraju u malo drugačijim identifikacijama CDR. Kao što je definisano sa Kabatom, CDR-L1 je pozicioniran na ostacima 24-34, CDR-L2, na ostacima 50-56, i CDR-L3, na ostacima 89-97 u varijabilnom domenu lakog lanca; CDR-H1 je pozicioniran na ostacima 31-35, CDR-H2 na ostacima 50-65, i CDR-H3 na ostacima 95-102 u varijabilnom domenu teškog lanca. Tačni brojevi ostataka koji obuhvataju određeni CDR će varirati u zavisnosti od sekvence i veličine CDR. Oni koji poznaju ovu oblast mogu rutinski da odrede koji ostaci sadrže određeni CDR s obzirom na antitelo varijabilnog regiona amino kiselinske sekvence. CDR1, CDR2, CDR3 teškog i lakog lanca stoga definišu jedinstvena i funkcionalna svojstva specifična za dato antitelo.

Tri CDRs unutar svakog od teških i lakih lanaca razdvojena su okvirnim regionima (FR), koji sadrže sekvence koje imaju za nameru da budu manje promenljive. Od amino kraja do karboksi kraja varijabilnih domena teškog i lakog lanca, FR i CDR su raspoređeni redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Uglavnom E-sheet konfiguracija FRs dovodi CDRs unutar svakog od lanaca u neposrednoj blizini jedan drugog, kao i CDRs iz drugog lanca. Dobijena konformacija doprinosi mestu vezanja antigena (videti Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669), iako nisu svi CDR ostaci nužno direktno uključeni u vezanje antigena.

FR ostaci i Ig konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali doprinose vezivanju antigena i/ili posreduju antitelo efektorsku funkciju. Smatra se da neki ostaci FR imaju značajan uticaj na vezanje antigena na najmanje tri načina: nekovalentnim vezivanjem direktno na epitop, interakcijom sa jednim ili više CDR ostataka i uticajem na interfejs između teškog i lakog lanca. Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali posreduju različite Ig efektorske funkcije, poput učešća antitela u ćelijskoj citotoksičnosti zavisnog antitela (ADCC), komplementarnoj zavisnoj citotoksičnosti (CDC) i ćelijskoj fagocitozi zavisnoj od antitela (ADCP).

Laki lanci imunoglobulina kičmenjaka svrstani su u jednu od dve jasno različite klase, kapa (N) i lambda (O), na osnovu amino kiselinske sekvence konstantnog domena. Poređenja radi, teški lanci imunoglobulina iz sisara su dodeljeni jednoj od pet glavnih klasa, prema sekvenci konstantnih domena: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM. IgG i IgA su dalje podeljeni na podklase (izotope), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, i IgA2. Konstantni domeni teških lanaca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina su nazvani D G, H, J, i P, respektivno. Strukturne podjedinice i trodimenzionalne konfiguracije klasa nativnih imunoglobulina su dobro poznate.

Termini, "antitelo", "anti-IL-36R antitelo", "humanizovano anti-IL-36R antitelo", "humanizovano anti-IL-36R epitop antitelo", i "varijantni humanizovani anti-IL-36R epitop antitela" posebno obuhvataju monoklonalna antitela (uključujući monoklonalna antitela pune dužine), poliklonalna antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), i fragmenti antitela kao što su varijabilni domeni i drugi delovi antitela koji pokazuju željenu bilošku aktivnost, npr., IL-36R vezivanje. Termin "monoklonalno antitelo" (mAb) se odnosi na antitelo koje je vrlo specifično, koje je usmereno protiv pojedinačne antigenske determinante, “epitop”. Prema tome, modifikator "monoklonalni" ukazuje na antitela usmerena na identični epitop i ne treba ga tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Treba razumeti da se monoklonska antitela mogu dobiti bilo kojom tehnikom ili metodologijom poznatom u datoj oblasti; uključujući npr. postupak hibridoma ( Kohler et al., 1975, Nature 256:495), ili rekombinantne DNK postupke poznate u datoj oblasti (videti, npr., U.S. Pat. No. 4,816,567), ili postupke izolacije monoklonalnog rekombinantnog proizvoda korišćenjem biblioteke antitela fage, primenom tehnika opisanih u Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, i Marks et al., 1991, J. Mol. Biol.222: 581-597.

Termin "monomer" odnosi se na homogeni oblik antitela. Na primer, za antitelo pune dužine, monomer znači monomerno antitelo koje ima dva identična teška lanca i dva identična laka lanca.

Himerna antitela se sastoje od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca antitela jedne vrste (npr., sisara koji nije čovek, poput miša) i konstantnih regiona teškog i lakog lanca druge vrste (npr., čoveka) antitelo i može biti dobijeno povezivanjem DNK sekvenci koje kodiraju varijabilne regione antitela iz prve vrste (npr., miš) sa DNK sekvencama za konstantne oblasti antitela iz druge (npr., ljudske) vrste i transformišu domaćina sa ekspresijskim vektorom koji sadrži povezane sekvence kako bi se omogućilo stvaranje himernog antitela. Alternativno, himerno antitelo takođe može biti onaj u kome su jedan ili više regiona ili domena teškog i/ili lakog lanca identični, homologni, ili varijanta odgovarajuće sekvence u monoklonskom antitelu iz druge imunoglobulinske klase ili izotipa, ili iz konsenzusnog ili germline sekvence. Himerna antitela mogu obuhvatati fragmente takvih antitele, pod uslovom da fragment antitela pokazuje željenu biološku aktivnost matičnog antitela, na primer vezivanje za isti epitop (videti, npr., U.S. Pat. No.

4,816,567; i Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

Termini, "fragment antitela", " fragment anti-IL-36R antitela", " fragment anti-IL-36R epitop antitela", " fragment humanizovanog anti-IL-36R antitela ", " fragment humanizovanog anti-IL-36R epitop antitela", "fragment varijantno humanizovanog anti-IL-36R epitop antitela" odnosi se na deo pune dužine anti-IL-36R antitela, u kome se zadržava promenljiva oblast ili funkcionalna sposobnost, na primer, specifično IL-36R epitop vezivanje. Primeri fragmenata antitela obuhvataju, ali nisu ograničeni na, a Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv i scFv-Fc fragment, diatelo, linearno antitelo, antitelo pojedinačnog lanca, minitelo, diatelo obrazovano iz fragmenata antitela, i multispecifična antitela obrazovana iz fragmenata antitela.

Puna dužina antitela se može tretirati sa enzimima kao što je papain ili pepsin kako bi se generisali korisni fragmenti antitela. Papainska obrada se koristi za proizvodnju dva identična antigenska vezujuća fragmenta antitela nazvan "Fab" fragmenti, svaki sa pojedinačnim antigenskim vezujućim mestom, i "Fc" fragment ostatkom. Fab fragment takođe sadrži domen lakog lanca i CH1domen teškog lanca. Tretiranje sa pepsin daje F(ab')2fragment koji ima dva antigenska vezujuća mesta i još uvek je sposoban za unakrsno vezivanje antigena.

Fab' fragmenti se razlikuju od Fab fragmenata po prisustvu dodatnih ostataka koji uključuju jedan ili više cisteina iz zavisnog regiona antitela na C-krajevima CH1domena. F(ab')2antitelo fragmenti su delovi Fab' fragmenata koji su vezani za ostatek cisteina u regiji vezivanja. Druga hemijska kuplovanja fragmenata antitela su takođe poznata.

"Fv" fragment sadrži kompletno mesto prepoznavanja antigena i vezivanja koje se sastoji od dimera jednog teškog i jednog lakog lanca varijabilnog domena u uskoj, ne kovalentnoj povezanosti. U ovoj konfiguraciji, tri CDRs svakog varijabilnog domena uzajamno deluje kako bi se definisao antigensko vezujuće mesto na površini VH-VLdimera. Kolektivno, šest CDRs deli antigensku vezujuću specifičnost za antitelo.

"Pojedinačni lanac Fv" ili "scFv" fragment antitela je pojedinačni lanac Fv varijante koja sadrži VHi VLdomene antitela gde su domeni prisutni u pojedinačnom polipeptidnom lancu.

1

Pojedinačni lanac Fv je sposoban da prepozna i veže antigen. scFv polipeptid može opciono takođe da sadrži polipeptidni linker postavljen između VHi VLdomena u cilju da se olakša formulacija željene trodimenzionalne strukture za vezivanje antigena sa scFv (videti, npr., Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antitela, Vol.113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, str.269-315).

"Diatelo" se odnosi na male fragmente antitela sa dva antigenska vezujuća mesta,čiji fragmenti sadrže varijabilni domen teškog lanca (V.sub.H) spojen za varijabilni domen lakog lanca (V.sub.L) u istom polipeptidnom lancu (V.sub.H-V.sub.L ili V.sub.L-V.sub.H). Diatela su opisana u više detalja u, npr., Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448.

Druga prepoznata fragmenta antitela uključuju ona koja sadrže par tandemskih Fd segmenata (VH-CH1-VH-CH1) kako bi obrazovali par antigenskih vezujućih regija. Ova “linearna antitela” mogu biti bispecifična ili monospecifična kao što je opisano, na primer, Zapata et al. 1995, Protein Eng.8(10):1057-1062.

“Humanizovano antitelo” ili “fragment humanizovanog antitela” je određeni tip himernog antitela koji obuhvata imunoglobulinsku varijantu amino kiselinske sekvence, ili njegov fragment, koji je sposoban da se veže za prethodno određen antigen i koji, sadrži jedan ili više FRs koji imaju značajnu amino kiselinsku sekvencu humanog imunoglobulina i jedan ili više CDRs koji imaju značajnu amino kiselinsku sekvencu ne-humanog imunoglobulina. Ova ne-humana amino kiselinska sekvenca koja se često odnosi na kao "važnu" sekvenca se obično uzima od "važnog" domena antitela, naročito varijabilnog domena. Uopšteno, humanizovano antitelo uključuje bar CDRs ili HVLs ne-humanog antitela, ubačen između FRs humanog varijabilnog domena teškog i lakog lanca. Predmetni pronalazak opisuje određena humanizovana anti-IL-36R antitela koji sadrže CDRs izveden iz mišijeg monoklonskog antitela ili humanizovanih CDRs ubačeni između FRs humane germlinijske sekvence varijabilnih domena teškog i lakog lanca. Shvatiće se da izvesni mišiji FR ostaci mogu biti važni za funkciju humanizovanog antitela i stoga izvesna humana germlinijska sekvenca ostataka varijabilnih domena teškog i lakog lanca su modifikovana tako da budu ista kao ona odgovarajuće mišije sekvence.

U drugom aspektu, humanizovano anti-IL-36R antitelo sadrži suštinski sve, bar jedan, i obično dva, varijabilna regiona (kao što je, na primer, u Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, i Fv fragmentima) u kojima svi, ili suštinski svi, CDRs odgovaraju onima iz ne-humanog imunoglobulina, a posebno ovde, svi CDRs su mišije ili humanizovane sekvence kao što je detaljno opisano ovde i svi, ili suštinski svi, FRs su oni humanog imunoglobulinskog konsenzusa ili germlinijske sekvence. U drugom aspektu, humanizovano anti- IL-36R antitelo takođe uključuje bar deo imunoglobulinskog Fc regiona, obično od humanog imunoglobulina. Obično, antitelo će sadržati oba laki lanac kao i bar varijabilni domen teškog lanca. Antitelo takođe može obuhvatati jedan ili više CH1, vezivnih, CH2, CH3, i/ili CH4regiona teškog lanca, po potrebi.

Humanizovano anti-IL-36r antitelo može biti odabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo koji izotip, uključujući IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2. Na primer, konstantni domen može biti dopunjen fiksnim konstantnim domenom gde je poželjno da humanizovano antitelo pokazuje citotoksičnu aktivnost, i izotip je obično IgG1. Gde takva citotoksična aktivnost nije poželjna, konstantni domen može biti od drugog izotipa, npr., IgG2. Alternativno humanizovano anti-IL-36R antitelo može sadržati sekvence iz više od jedne imunoglobulinske klase ili izotipa, i selektovanje određenih konstantnih domena kako bi se optimizovale željene efektorske funkcije spada u običnu veštinu u datoj oblasti. U određenim izvođenjima, predmetni pronalazak obezbeđuje antitela koja su IgG1 antitela a naročito, su IgG1 antitela u kojima postoje efektorske funkcije izbacivanja.

FRs i CDRs, ili HVLs, humanizovana anti-IL-36R antitela ne moraju tačno da odgovaraju roditeljskim sekvencama. Na primer, jedan ili više ostatka u uvoznoj CDR, ili HVL, ili konsenzusnoj ili germlinijskoj FR sekvenci može biti izmenjeno (npr., mutagenizovano) sa supstitucijom, ubacivanjem ili uklanjanjem tako da rezultujući amino kiselinski ostatak nije više identičan originalnom ostatku u odgovarajućoj poziciji u bilo kojoj roditeljskoj sekvenci ali antitelo pak zadržava funkciju vezivanja za IL-36R. Takve izmene obično neće biti opsežne i biće konzervativne izmene. Obično, bar 75% ostataka humanizovanog antitela će odgovarati onim roditeljskim konsenzusnim ili germlinijskim FR i uvoznim CDR sekvencama, češće barem 90%, i najčešće više od 95%, ili više od 98% ili više od 99%.

Imunoglobulinski ostaci koji deluju na površini između varijabilnih regiona teškog i lakog lanca ("the VL-VHpovršine") su one koje deluju na blizinu ili orjentaciju dva lanca u pogledu jedan na drugi. Određeni ostaci koji mogu biti uključeni u međuodnosne interakcije uključuju VLostatke 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, i 98 i VHostatke 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100, i 103 (koristeći sistem brojanja naveden u Kabat et al., Sekvencas of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). U.S. Pat. No. 6,407,213 takođe

1

otkriva da ostaci kao što su VLostaci 43 i 85, i VHostaci 43 i 60 takođe mogu biti uključeni u ovu interakciju. Iako su ovi ostaci ukazani smo za humani IgG, primenjive su za sve vrste. Važni ostaci antitela za koje se opravdano očekuje da budu uključeni u međusobne interakcije izabrani su za zamenu u konsenzusnoj sekvenci.

Termini "konsenzusna sekvenca" i "konsenzusno antitelo" se odnosi na amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata amino kiselinski ostatak koji se najčešće javlja na svakoj lokaciji u svim imunoglobulinima bilo koje određene klase, izotipa, ili podjedinične strukture, npr., humani imunoglobulinski varijabilni domen. Konsenzusna sekvenca može biti zasnovana na imunoglobulinima određene vrste ili više vrsta. "Konsenzusna" sekvenca, struktura, ili antitelo se podrazumeva da obuhvata konsenzusnu humanu sekvencu kao što je opisano u određenim izvođenjima, i da se odnosi na amino kiselinsku sekvencu koja obuhvata amino kiselinske ostatke koji se najčešće javljaju na svakoj lokaciji u svim humanim imunoglobulinima bilo koje određene klase, izotipa, ili podjedinične strukture. Stoga, konsenzusna sekvenca sadrži amino kiselinsku sekvencu koja na svakoj poziciji ima amino kiselinu koja je prisutna u jednom ili više bilo kojih pojedinačnih imunoglobulina, ali koji nisu u mogućnosti da dupliciraju celu amino kiselinsku sekvencu bilo kog pojedinačnog imunoglobulina. Varijabilni region konsenzusne sekvence nije dobijen iz bilo kog prirodno dobijenog antitela ili imunoglobulina. Kabat et al., 1991, Sekvences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., i njihove varijante.

Humane germlinijske sekvence su pronađene prirodno u svim ljudskim populacijama. Kombinacija ovih germlinijskih gena generiše raznovrsnost antitela. Germlinijske sekvence antitela za laki lanac antitelo proizilazi iz sačuvanih humanih germlinijskih kapa ili lambda vgena i j-gena. Slično, teški lanac sekvenci proizilaze iz germlinijskih v-, d- i j-gena (LeFranc, M-P, i LeFranc, G, “The Imunoglobulin Facts Book” Academic Press, 2001).

Kao što je koriščeno ovde, "varijanta", "anti- IL-36R varijanta", "humanizovana anti- IL-36R varijanta", ili "varijanta humanizovanog anti- IL-36R" svaka se odnosi na humanizovano anti-IL-36R antitelo koje ima bar varijabilni murinski CDR lakog lanca. Varijante uključuju one koje imaju jednu ili više amino kiselinskih promena u jednom ili oba varijabilna domena lakog lanca ili teškog lanca, obezbeđujući da amino kiselinska promena suštinski ne narušava vezivanje antitela za IL-36R.

1

"Izolovano" antitelo je ono koje je identifikovano i odvojeno i/ili oporavljeno iz komponenete njegovog prirodnog okruženja. Kontaminirane komponenete antitelovog prirodnog okruženja su oni materijali koji mogu da ometaju dijagnostičku ili terapeutsku primenu antitela, i mogu biti enzimi, hormoni, ili drugi proteinski ili neproteinski rastvori. U jednom aspektu, antitelo će biti prečišćeno najviše barem do 95% izolacije po težini antitela.

Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija u kome se proizvodi, pošto barem jedna komponenta antitelnog priordnog okruženja neće biti prisutno. Međutim, obično se izolovano antitelo priprema u najmanje jednom koraku prečišćavanja u kome se uklanja rekombinantni ćelijski materijal.

Termin "antitelna performanca" se odnosi na faktore koji doprinose prepoznavanju antitela antigena ili efikasnosti antitela in vivo. Promene u amino kiselinskoj sekvenci antitela mogu delovati na osobine antitela kao što je preklapanje, i mogu uticati na fizičke faktore kao što je početna brzina vezivanja antitela za antigen (ka), konstanta disocijacije antitela za antigen (kd), konstanta afiniteta antitela za antigen (Kd), konformacija antitela, stabilnost proteina, i poluvek antitela.

Termin "označeni epitop" kada se koristi ovde, odnosi se na anti-IL-36R antitelo spojeno za "označeni epitop". "Označeni epitop" je polipeptid koji ima dovoljan broj amino kiselina da se obezbedi epitop za proizvodnju antitela, ipak je dizajniran tako da ne ometa željenu aktivnost humanizovanog anti-IL-36R antitela. Označeni epitop je obično dovoljno jedinstven tako da antitelo podignut protiv označenog epitopa suštinski ne reaguje unakrsno sa drugim epitopima. Pogodni označeni polipeptidi uopšteno sadrže najmanje 6 amino kiselinskih ostataka i i obično sadrže oko 8 do 50 amino kiselinskih ostataka, ili oko 9 do 30 ostataka. Primeri označenih epitopa i antitelo koje vezuje epitop uključuju flu HA tag polipeptid i njegovo antitelo 12CA5 (Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165; c-myc tag i 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 i 9E10 antitela još uz to (Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616; i Herpes simplex virus glikoprotein D (gD) tag i njegovo antitelo (Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553). U određenim primerima izvođenja, označeni epitope je "spašeni receptor koji vezuje epitop". Kao što se koristi ovde, termin " spašeni receptor koji vezuje epitop " se odnosi na epitop Fc regiona IgG molekula (kao što je IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4) koji je odgovoran za povećanje in vivo serumskog polu veka IgG molekula.

1

U nekim primerima izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu biti konjugovani do citotoksičnog agensa. Ovo je bilo koja supstanca koja inhibira ili sprečava funkciju ćelija i/ili izaziva destrukciju ćelija. Termin ima za nameru da obuhvati radioaktivne izotope (kao što su I<131>, I<125>, Y<90>, i Re<186>), hemoterapeutske agense, i toksine kao što su enzimsko aktivni toksini bakterija, gljiva, biljnog, ili životinjskog poreka, i njihovi fragmenti. Takvi citotoksični agensi mogu da se povežu sa humanizovanim antitelom predmetnog pronalaska korišćenjem standardnih postupaka, koji se, na primer, koriste za lečenje pacijenta naznačenog za lečenje sa antitelom.

"Hemoterapeutski agens" je hemijsko jedinjenje korisno u lečenju raka. Postoji veliki broj primera hemoterapeutskih agenasa koji mogu biti spojeni sa terapeutskim antitelima predmetnog pronalaska. Primeri takvih hemoterapeutskih agenasa uključuju alkilacione agense kao što su tiotepa i ciklosfosfamid; alkil sulfonati kao što su busulfan, improsulfan, i piposulfan; aziridini kao što su benzodopa, karbohion, meturedopa, i uredopa; etilenimini i metilamelamini uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid, i trimetilolomelamin; acetogenini (naročito bulatacin i bulatacinon); kamptotecin (uključujući sintetički analogni topotecan); briostatin; calistatin; CC-1065 (uključujući njegov adozelesin, karzelesin, i bizelesin sintetički analozi); criptoficini (naročito kriptoficin 1 i kriptoficin 8); dolastatin, auristatins, (uključujući analoge monometil-auristatin E i monometil-auristatin F); duokarmicin (uključujući sintetičke analoge, KW-2189 i CBI-TMI); eleuterobin; pankratistatin; sarkodictin; spongistatin; nitrogen mustarde kao što su hlorambucil, hlomaphazine, holofosfamid, estramustin, ifosfamie, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin; trofosfamid, uracil mustard; nitrosureas kao što je karmustin, hlorozotocin, fotemustine, lomustine, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su enediyn antibiotici (npr., calicheamicin, naročito calichemicin gama1I i calicheamicin phiI1, videti na primer, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186; dinemicin, uključujući dinemicin A; bisfosfonati, kao što su klodronat; esperamicin; kao i neokarzinostatin hromofor i srodni hromoprotein enediyne antibiotiski hromomofori), aclacinomisini, aktinomicin, autramicin, azaserine, bleomicini, cactinomicin, karabicin, kaminomicin, karzinofilin, hromomicini, dactinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin (Adriamycin™) (uključujući morfolino-doxorubicin, cijanomorfolino-doksorubicin, 2-pirolinodoksorubicin, i deoksidoksorubicin), epirubucin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini kao što su mitomicin C, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicine, quelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analozi folne

1

kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; analozi purina kao što su fludarabin, 6-mercaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin; irogeni kao što su calusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; anti-adranali kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; zamene folne kiseline kao što su frolinska kiselina; aceglaton; aldofosphamid glikozid; aminolevulinska kiselina; eniluracil; amsacrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; democolcin; diazihon; elfomitin; elliptinium acetat; epotilon; etoglucid; galium nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; maitanzinoidi kao što su maitanzin i ansamitocini; mitoguazon, mitoksantron; mopidamol; nitracrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; losoksantron; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK®; razoksan; rhizoksin; sizofuran; spirogermanium; tenuazonska kiselina; triazihon; 2,2',2''-trihlorotrietilamin; trihoteceni (naročito T-2 toksin, veracurin A, roridin A i anguidin); uretan; vindesin; dakarbazin; manomustin; mitabronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinosid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, npr., paclitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i doksetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); hlorambucil; gemcitabin (Gemzar™); 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analozi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastine; platinum; etoposid (VP-16); ifosfamid; mitoksantron; vincristin; vinorelbin Navelbine™); novantron; teniposid; edatreksat; daunomicin; aminopterin; kseloda; ibironat; CPT-11; topoisomerazni inhibitor RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoidi kao što je retinoinska kiselina; capecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline, ili derivati bilo kojih gore navedenih. Takođe su obuhvaćeni ovom definicijom anti-hormonski agensi koji deluju tako da regulišu ili inhibiraju hormonsku aktivnost na tumroima kao što su anti-estrogeni i odabrani estrogen receptor modulatori (SERMs), uključujući, na primer, tamoksifen (uključujući Nolvadex™), raloksifen, droloksifen, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston, i toremifen (Fareston™); aromatozni inhibitori koji inhibiraju enzim aromatozu, koji reguliše proizvodnju estrogena u nadbubrežnoj žlezdi, kao što su, na primer, 4(5)-imidazoli, aminoglutetimid, megestrol acetat (Megace™), eksemestan, formestan, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol (Femara™), i anastrozol (Arimidex™); i anti-irogeni kao što su flutamid, nilutamid, bicalutamid, leuprolid, i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline, ili derivate bilo kog koji je napred naveden. Bilo koji od ovih agensa ili više njih može biti konjugovano na humanizovanom antitelu predmetnog pronalaska kako bi se obezbedio koristan terapeutski agens za lečenje raznih oboljenja.

1

Antitela takođe mogu biti konjugovana za prolekove. "Prolek" je prekursorski ili derivatni oblik farmaceutski aktivne supstance koja je manje toksična na ćelije tumora kada se poredi sa srodnim lekom i njegovom sposonosti da bude enzimski aktivan ili konvertovan u mnogo viši aktivni oblik. Videti, na primer, Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", In Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast i Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press. Korisni prolekovi uključuju, ali nisu ograničeni na njih, prolekove koji sadrže fosfor, prolekovi koji sadrže tiofosfat, prolekove koji sadrže sumpor, prolekove koji sadrže peptid, prolekove koji modifikuju D-amino kiselinu, glikozilatne prolekove, prolekove koji sadrže β-laktam, opciono prolekove koji sadrže supstituisani fenoksiacetamid, i opciono prolekove koji sadrže supstituisani fenilacetamid, 5-fluorocitozin i druge 5-fluorouridin prolekove koji mogu da budu konvertovani u više aktivne citotoskične slobodne lekove. Primeri citotoksičnih lekova koji mogu da budu derivatizovani u prolek oblik uključuju, ali nisu ograničeni na, one hemoterapeutske agense koji su napred opisani.

Za dijagnostičke i terapeutske svrhe, antitela pronalaska takođe mogu biti konjugovana sa oznakom, bilo samo oznakom, bilo oznakom i dodatnim drugim agensom (prolek, hemoterapeutski agens i slično). Oznaka, za razliku od ostalih drugih agenasa, odnosi se na agens koji je detektirajuće jedinjenje ili kompozicija i može biti konjugovano direktno ili indirektno sa humanizovanim antitelom predmetnog pronalaska. I sama oznaka može da se otkrije (npr., radioizotopske oznake ili fluorescentne oznake) ili, u slučaju enzimske oznake, može katalizovati hemijsku promenu supstrata ili smeše supstrata koji se može otkriti. Označeno humanizovano anti-IL-36R antitelo može se pripremiti i koristiti u različitim aplikacijama uključuju ći in vitro i in vivo dijagnostiku.

Antitela predmetnog pronaalska mogu da se formulišu kao deo liposomskog preparata u cilju da se utiče na njegovo sprovođenje in vivo. "Lipozom" je mali mehurić sastavljen od raznih tipova lipida, fosfolipida, i/ili površinski aktivnih supstanci. Lipozomi su korisni za dostavu jedinjenja ili formulacije sisaru, kao što je humanizovano anti-IL-36R antitelo otkriveno ovde, opciono, spojeno za ili u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski aktivnih agenasa i/ili oznaka. Komponente lipozoma su uobičajeno postavljene u višeslojnu formulaciju, sličnoj lipidnoj postavi bioloških membrana.

2

Izvesni aspekti predmetnog pronalaska odnose se na izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju jednu ili više domena humanizovanog antitela predmetnog pronalaska. "Izolovani" molekul nukleinske kiseline je molekul nukleinske kiseline koji je identifikovan i odvojen od najmanje jednog kontaminantnog molekula nukleinske kiseline sa kojim je obično povezan u prirodnom izvoru antitelo nukleinske kiseline. Izolovani molekul nukleinske kiseline razlikuje se od molekula nukleinske kiseline kakav postoji u prirodnim ćelijama.

U raznim aspektima predmetnog pronalaska, jedan ili više domena humanizovanog antitela biće rekombinantno ekspresovano. Takva rekombinantna ekspresija može da koristi jedan ili više kontrolnih sekvenca, odn. polinukleotidne sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina. Kontrolne sekvence pogodne za upotrebu u prokariotskim ćelijama obuhvataju, na primer, promotor, operator, i mesto vezivanja sekvenci za ribozome. Eukariotski kontrolne sekvence uključuju, ali nisu ograničene na, promotore, poliadenilacione signale, i pojačivače. Ove kontrolne sekvenke se mogu koristiti za ekspresiju i proizvodnju humanizovanog anti-IL-36R antitela u prokariotskim i eukariotskim ćelijama domaćina.

Sekvenca nukleinske kiseline je "operativno povezana" kada je postavljena u funkcionalni odnos sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, presekvenca nukleinske kiseline ili sekretorni lider je operativno povezana sa nukleinskom kiselinom koja kodira polipeptid ako je izražena kao preprotein koji učestvuje u izlučivanju polipeptida; promoter ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja za ribozom operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da olakša prevod. Uopšteno, "operativno povezan" znači da su DNK sekvence koje se povezuju neprekidno, i, u slučaju vođenja izlučivanja, istovremeno i u okviru za čitanje. Međutim, pojačivači su po izboru neposredni. Povezivanje se može obaviti ligacijom na pogodnim mjestima za ograničenje. Ukoliko takva mesta ne postoje, mogu se koristiti sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri.

Kao što je ovde korišćeno, izrazi "ćelija", "ćelijska linija", "ćelijska kultura" se naizmenično koriste i sve takve oznake uključuju potomstvo istih. Prema tome, "transformanti" i "transformisane ćelije" uključuju primarnu ćeliju i kulture dobijene od njih bez obzira na broj transfera.

Izraz "sisar" za potrebe lečenja odnosi se na svaku životinju koja je klasifikovana kao sisar, uključujući ljude, pripitomljene i domaće životinje, životinje iz zoološkog vrta, sportske ili kućne ljubimce, kao što su psi, konji, mačke, krave i slično. Poželjno, sisar je čovek.

"Poremećaj", kako što se ovde koristi, je svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja humanizovanim anti-IL-36R antitelom opisanim ovde. Ovo uključuje hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju sisara ka predmetnom poremećaju. Neograničavajući primeri ili poremećaji koji će se ovde lečiti uključuju upalne, angiogene, autoimune i imunološke poremećaje, respiratorne poremećaje, kancer, hematološke malignitete, benigne i maligne tumore, leukemije i limfne malignosti.

Termin "rak" i "kancer" se odnose ili opisuju fiziološko stanje kod sisara koji je obično karakterističan neregulisanim rastom ćelija. Primeri raka uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, i leukemiju.

Poremećaj povezan sa IL-36R uključuje bolesti i poremećaje imunog sistema, kao što su autoimuni poremećaji i upalni poremećaji. Takvi uslovi uključuju, ali nisu ograničeni na, reumatoidni artritis (RA), sistemski eritematozni lupus (SLE), sklerodermiju, Sjogrenov sindrom, multiplu sklerozu, psorijazu, psorijatični artritis, upalnu bolest creva (npr. Ulcerozni kolitis i Crohnova bolest), plućne bolesti zapaljenja, astma, idiopatska trombocitopenična purara (ITP), upalni poremećaji epitela, fibroza i ankilozirajući spondilitis.

Termin "intravenska infuzija" odnosi se na unošenje agensa u venu životinje ili čoveka tokom perioda većeg od približno 15 minuta, uglavnom između približno 30 do 90 minuta.

Termin "intravenski bolus" ili "intravenski potisak" odnosi se na primenu leka u venu životinje ili čoveka tako da telo prima lek za otprilike 15 minuta ili manje, uglavnom 5 minuta ili manje.

Termin "potkožna primena" odnosi se na unošenje agensa ispod kože životinje ili čoveka, poželjno u džepu između kože i ispod tkiva, relativno sporom, neprekidnom isporukom iz posude za lek. Zatezanje ili izvlačenje kože odozdo prema donjem tkivu može stvoriti džep.

Termin "potkožna infuzija" odnosi se na unošenje leka ispod kože životinje ili čoveka, po mogućnosti unutar džepa između kože i ispod tkiva, relativno sporom, neprekidnom isporukom iz posude za lek tokom određenog vremena, ali ne ograničavajući se na 30 minuta ili manje, ili 90 minuta ili manje. Po izboru, infuzija se može načiniti potkožnom implantacijom pumpe za dovod leka implantirane ispod kože životinje ili čoveka, gde pumpa isporučuje unapred određenu količinu leka u unapred određenom vremenskom periodu, kao što je 30 minuta, 90 minuta, ili vremenski period koji se proteže dužinom režima lečenja.

Termin "potkožni bolus" odnosi se na primenu lekova ispod kože životinje ili čoveka, gde je bolus isporuka leka kraća od približno 15 minuta; u drugom aspektu, manje od 5 minuta, a u drugom aspektu, manje od 60 sekundi. U još jednom drugom aspektu, administracija se nalazi unutar džepa između kože i ispod tkiva, pri čemu se džep može stvoriti štipanjem ili povlačenjem kože i podložnog tkiva.

Termin "terapeutski efikasna količina" se koristi da se odnosi na količinu aktivnog agensa koja ublažava ili ublažava jedan ili više simptoma poremećaja koji se leči. U drugom aspektu, terapeutski efikasna količina odnosi se na ciljanu koncentraciju u serumu za koju se pokazalo da deluje efikasno, na primer, u usporavanju napredovanja bolesti. Učinkovitost se može meriti na konvencionalni način, u zavisnosti od stanja koje se leči.

Termin "lečenje" i "terapija" i slično, kao što se koristi ovde, podrazumeva da uključuje terapeutske, kao i profilaktičke ili supresivne mere za bolest ili poremećaj koji dovode do bilo kakvog klinički poželjnog ili korisnog efekta, uključujući ali bez ograničenja na ublažavanje ili ublažavanje jednog ili više simptoma, regresija, usporavanje ili prestanak napredovanja bolesti ili poremećaja. Tako, na primer, termin lečenje uključuje davanje agensa pre ili posle pojave simptoma bolesti ili poremećaja čime se sprečavaju ili uklanjaju jedan ili više znakova bolesti ili poremećaja. Kao još jedan primer, termin uključuje davanje agensa posle kliničke manifestacije bolesti radi suzbijanja simptoma bolesti. Dalje, primena agensa posle pojave i nakon pojave kliničkih simptoma gde primena utiče na kliničke parametre bolesti ili poremećaja, kao što su stepen povrede tkiva ili količina ili stepen metastaza, preterano lečenje dovodi do ublažavanja bolest, obuhvata "lečenje" ili "terapiju" kako se ovde koristi. Štaviše, sve dok kompozicije ovog pronalaska samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensom ublažuje ili ublažuje najmanje jedan simptom poremećaja koji se leči u poređenju sa tim simptomom u odsustvu upotrebe kompozicije humanizovanog anti-IL-36R antitela, rezultat treba smatrati efikasnim lečenjem osnovnog poremećaja bez obzira da li su svi simptomi poremećaja ublaženi ili nisu.

2

Termin "uložak za pakovanje" koristi se za upućivanje na uputstva koja su obično uključena u komercijalna pakovanja terapijskih proizvoda, koja sadrže informacije o indikacijama, upotrebi, primeni, kontraindikacijama i / ili upozorenjima za upotrebu takvih terapijskih proizvoda.

Antitela

U jednom aspektu, ovde opisani i otkriveni su anti-IL-36R antitela, naročito humanizovana anti-IL-36R antitela, i kompozicije i proizvodi proizvodnje koji sadrže jedno ili više anti-IL-36R antitela, naročito jedno ili više humanizovanih anti -IL-36R antitela predmentog pronalaska. Takođe su opisani vezivni agensi koji uključuju antigenski vezujući fragment anti-IL-36 antitela, naročito humanizovanog anti-IL-36R antitela.

Variabilni regioni i CDRs predstavljenih antitela predmetnog pronalaska su opisani u nastavku:

Anti-IL-36R Mišije Sekvence Antitela

Variabilni regioni i CDRs predstavljenih antitela i mišijeg vodećeg antitela predmentog pronalaska (označen mišijim; antitelo 81B4) su prikazani u nastavku:

Varijabilni Region Lakog Lanca (VK) Amino Kiselinskih Sekvenci

Varijabilni Region Teškog Lanca (VH) Amino Kiselinskih Sekvenci

2

Anti-IL-36R Mišije CDR Sekvence

Kratak pregled CDR sekvenci vodećih mišijih antitela je prikazan u nastavku:

1

2

Sekvence Anti-IL-36R Humanizovanog Antitela

Humane okvirne sekvence su odabrane za glavne mišije zasnovane na homologiji okvira, CDR strukturi, sačuvanim kanonskim ostacima, sačuvanim interfejsima pakovanja ostataka i drugim parametrima za proizvodnju humanizovanih varijabilnih regiona (videti Primer 5).

Reprezentativni humanizovani varijabilni regioni izvedene iz antitela 81B4 i 73C5 (vodeća mišja antitela pronalska) i 73C5 (referentno antitelo) su prikazani u nastavku.

Varijabilni Region Lakog Lanca (VK) Amino Kiselinskih Sekvenci

4

Varijabilni Regioni Teškog Lanca (VH) Amino Kiselinskih Sekvenci

CDR sekvence iz humanizovanih variabilnih regiona izvedeni iz antitela 81B4 i 73C5 prikazani gore su prikazani u nastavku dole.

L-CDR1 Amino Kiselinske Sekvence

>81B4vK32_3 L-CDR1

4

KGGYSGSWFAY (SEQ ID NO: 73)

U jednom aspektu, varijabilni region predmetnog pronaalska je povezan za konstantni region. Na primer, varijabilni region predmetnog pronaalska je povezan za konstantni region prikazan u nastvaku kako bi se obrazovao teški lanac ili laki lanac antitela.

Reprezentativne sekvence lakog lanva i teškog lanca predmetnog pronalaska su prikazane u nastavku dole (humanizovani variabilni regioni izvedeni iz antitela 81B4 i 73C5 povezani za konstantne regione).

Laki Lanac Amino Kiselinskih Sekvenci

4

Teški Lanac Amino Kiselinskih Sekvenci

4 GQPENNYKTTP

(SEQ ID NO: 133)

4

CDRs prethodno navedeni su definisani korišćenjem Chothia sistema brojanja (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948).

U jednom aspektu, antitelo predmetnog pronalaska sadrži 3 laka lanca CDRs i 3 teška lanca CDRs, na primer kao što je predstavljeno napred u tekstu.

U jednom aspektu, antitelo predmetnog pronalaska sadrži laki lanac i teški lanac varijabilnog regiona kao što je predstavljeno napred u tekstu. U jednom aspektu, varijabilni region lakog lanca pronalaska je spojen za konstantni region lakog lanca, na prime kapa ili lambda konstantni region. U jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca pronalaska je spojen za konstantni region teškog lanca, na primer IgA, IgD, IgE, IgG or IgM, naročito, IgG1, IgG2, IgG3or IgG4.

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125 (Antitelo B1).

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126 (Antitelo B2).

4

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 115; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127 (Antitelo B3).

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125 (Antitelo B4).

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126 (Antitelo B5).

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127 Antitelo B6).

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138 (Antitelo C3).

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139 (Antitelo C2).

Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-IL-36R antitelo koje sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 124; i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138 (Antitelo C1)

Reprezentativna antitela predmetnog pronalaska su prikazani u nastavku dole.

Tabela A.

4

Tabela B

1

Antitela predmetnog pronalaska su korisna u postupcima za lečenje raznih oboljenja ili poremećaja, na primer imunoloških, inflamatornih, autoimunih oboljenja i respiratornih obolenja kod ljudi. Na primer, antitela predmetnog pronalaska su korisna u postupcima za lečenje psorijaze, reumatoidnog artritisa, inflamatornog obolenja creva ili psoriaznog artritisa. Na primer, antitela predmetnog pronalaska su korisna u postupcima za lečenje hroničnog obstruktivnog pulmonarnog poremećaja (COPD) ili astme. Na primer, antitela predmetnog pronalaska su korisna u postupcima za lečenje skleroderma, palmoplantarne pustuloze, opšte pustularne psorijaze, dijabetične nefropatije, lupus nefritisa, skleroderma, ankiloznog spondilitisa, deficijencije kod IL-36 receptor antagoniste autoimunog oboljenja (DITRA), deficijencija kod IL-1 receptor antagoniste autoimunogo oboljenja (DIRA) ili criopirin povezani periodični sindromi (CAPS).

U nekim aspetcima, humanizovano antitelo pokazuje blokirajuću aktivnost, pri čemu se smanjuje vezivanje IL-36 liganda za IL-36 receptor za bar 45%, za bar 50%, za bar 55%, za bar 60%, za bar 65%, za bar 70%, za bar 75%, za bar 80%, za bar 85%, za bar 90%, za bar 95%. Sposobnost antitela da blokira vezivanje IL-36 liganda za IL-36 receptor se može izmeriti korišćenjem komparativnih vezujućih analiza koje su poznate u tehnici. Alternativno, aktivnost blokiranja antitela se može meriti procenom bioloških efekata IL-36, kao što je proizvodnja IL-8, IL-6, i GM-CSF da bi se utvrdilo da li je signalizacija posredovana receptorom IL-36 inhibirana.

U drugom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje humanizovano anti-IL-36R antitelo koje ima povoljna biofizička svojstva. U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska je prisutno u najmanje 90% monomernog oblika, ili u najmanje 92% monomernog oblika, ili u najmanje 95% monomernog oblika u puferu. U drugom aspektu, humanizovano anti-IL-36R antitelo predmetnog pronalaska preostaje u najmanje 90%

2

monomernog oblika, ili u najmanje 92% monomernog oblika, ili u najmanje 95% monomernog oblika u puferu na jedan mesec ili na četiri meseca.

U jednom aspektu, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska je Antitelo B4, Antitelo B5, ili Antitelo B6. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:125 (Antitelo B4). U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:126 (Antitelo B5). U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:127 (Antitelo B6).

U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:125 (Antitelo B4). U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:126 (Antitelo B5). U drugom primeru izvođenja, humanizovano antitelo predmetnog pronalaska sadrži sekvencu lakog lanca SEQ ID NO:118 i sekvencu teškog lanca SEQ ID NO:127 (Antitelo B6).

U nekim primerima izvođenja, humanizovana anti-IL-36R antitela, uključujući njegove antigenske vezujuće fragmente, kao što su varijabilni regioni teškog i lakog lanca, sadrže amino kiselinsku sekvencu ostataka izvedeni iz Antitela B4, Antitela B5, Antitela B6.

Humanizovana anti-IL-36R antitela opciono uključuje specifične amino kiselinske supstitucije u konsenzusnim ili germlinijskim okvirnim regionima. Određena supstitucija amino kiselinskih ostataka u ovim okvirnim pozicijama može poboljšati razne aspekte performanci antitela uključujući vezujući afinitet i/ili stabilnost, preko onoga što je demonstrirano u humanizovanom antitelu obrazovanom od strane "direktne zamene" CDRs ili HVLs u humanim germlinijskim okvirnim regionima.

U nekim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje monoklonalna antitela sa kombinacijama varijabilnim regionima lakog lanca i varijabilnim regionima teškog lanca SEQ ID NO: 80/88, 80/89, ili 80/87. Takvi varijabilni regioni mogu da budu kombinovani sa humanim konstantnim regionima.

Ovde je otkriveno anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji sadrži:

a) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 21, 30, 39, 48, 57 i 67, respektivno; ili

b) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 22, 31, 40, 49, 58 i 68, respektivno; ili

c) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 23, 32, 41, 50, 59 i 69, respektivno; ili

d) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 24, 33, 42, 51, 60 i 70, respektivno; ili

e) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 25, 34, 43, 52, 61 i 71, respektivno; ili

f) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 26, 35, 44, 53, 62 i 72, respektivno; ili

g) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 27, 36, 45, 54, 63 i 73, respektivno; ili

h) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 27, 36, 45, 54, 64 i 74, respektivno; ili

i) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 27, 36, 45, 54, 64 i 73, respektivno; ili

j) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 28, 37, 46, 55, 65 i 74, respektivno; ili

k) L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvenca SEQ ID NO: 29, 38, 47, 56, 66 i 75, respektivno.

Anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment prema predmetnom pronalasku sadrži: L-CDR1, L-CDR2 i L-CDR3, H-CDR1, H-CDR2 i H-CDR3 sekvence SEQ ID NO: 26, 104, 44, 53, 62 i 72, respektivno.

U određenim primerima izvođenja, humanizovano anti-IL-36R antitelo je fragment antitela. Razni fragmenti antitela su uopšteno prethodno diskutovani i postoje tehnike koje su se razvile za proizvodnju fragmenata antitela. Fragmenti mogu biti izvedeni putem proteolitičke digestije netaknutih antitela (videti, npr., Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical i Biophysical Metods 24:107-117; i Brennan et al., 1985, Science 229:81). Alternativno, fragmenti se mogu proizvesti direktno u rekombinantnim ćelijama domaćina. Na primer, Fab'-SH fragmenti mogu se

4

direktno oporaviti iz E. coli i hemijski vezati tako da obrazuju F(ab')2fragmente (videti, npr., Karter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167). Drugim pristupom, F(ab')2fragmenti mogu da budu izolovani direktno iz rekombinantne ćelijske kulture domaćina. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela će biti očigledne stručnjaku. Prema tome, u jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje fragmente antitela koji sadrže jednu od kombinacija varijabilnih regiona lakog lanca i varijabilnih regiona teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80 i sekvencu SEQ ID NO: 87, 88 ili 89, respektivno.

Određena izvođenja obuhvataju F(ab')2fragment humanizovanog anti-IL-36R antitela koji sadrži sekvencu lakog lanca bilo koje SEQ ID NO: 123 ili 124 u kombinaciji sa sekvencom teškog lanca SEQ ID NO: 138 ili 139. Takva izvođenja mogu sadržati netaknuto antitelo koje sadrži takav F(ab')2.

U nekim primerima izvođenja, antitelo ili fragment antitela sadrži konstantan region koji posreduje efektorsku funkciju. Konstantan region može obezbediti odgovore antitela zavisno na ćelijsku citotoksičnost (ADCC), antitela zavisno na ćelijsku fagocitozu (ADCP) i/ili komplementne zavisne citotoksičnost (CDC) protiv IL-36R ekspresione ciljane ćelije. Efektorski domen(i) može biti, na primer, Fc region Ig molekula.

Efektorski domen antitela može biti iz bilo koje odgovarajuće životinjske vrste i izotopa kičmenjaka. Izotopi iz različitih životinjskih vrsta koje se razlikuju u sposobnosti da posreduju efektorske funkcije. Na primer, sposobnost humanog imunoglobulina da posreduje CDC i ADCC/ADCP je uopšteno u redosledu IgM§IgG1§IgG3>IgG2>IgG4i IgG1§IgG3>IgG2/IgM/IgG4, respektivno. Murinski imunoglobulini posreduju CDC i ADCC/ADCP uopšteno u redosledu murinske IgM§IgG3>>IgG2b>IgG2a>>IgG1i IgG2b>IgG2a>IgG1>>IgG3, respektivno. U drugom primeru, murinski IgG2aposreduje ADCC dok oba murinska IgG2ai IgM posreduju CDC.

Modifikacije Antitela

Humanizovana anti-IL-36R antitela i agensi mogu obuhvatiti modifikacije humanizovanog anti-IL-36R antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta. Na primer, možda je poželjno da se antitelo modifikuje u odnosu na efektorsku funkciju, tako da se poveća efikasnost antitela u lečenju raka. Jedna takva modifikacija je uvođenje cisteinskog(ih) ostatka(aka) u Fc region, time dozvoljavajući obrazovanje međusobne disulfidne veze u ovom regionu. Homodimerno antitelo tako generisano može imati poboljšanu sposobnost internalizacije i/ili pojačano ubijanje ćelija posredovano komplementom i/ili antitelo zavisno na ćelijsku citotoksičnost (ADCC). Videti, na prime, Karon et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; i Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922. Homodimerna antitela koja imaju pojačanu anti-tumornu aktivnost mogu se takođe dobiti korišćenjem heterobifunkcionalnih unakrsnih linkera kao što je opisnao u Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565. Alternativno, antitelo može bit konstruisano tako da sadrži dvostruke Fc regione, pojačavajući komplementni lizin i ADCC sposobnost antitela. Videti Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230.

Antitela sa poboljšanom sposobnošću da podrže ADCC su generisana modifikacijom glikozilacijskog šablona njihovog Fc regiona. Ovo je moguće pošto antitelo glikozilacije na ostatku asparagina, N297, u CH2domenu je angažovano u međusobnoj reakciji između IgG i FcȖ receptora preduslov za ADCC. ûelijska linija domaćina projektovana je da izražava antitela sa izmenjenom glikozilacijom, kao što je povećana razgradljivost N-acetilglukozamina, ili smanjene fukoze. Redukcija fukoze omogućava veće poboljšanje na aktivnosti ADCC nego što povećava prisustvo razgradnje N-acetilglukozamina. Štaviše, poboljšanje ADCC sa niskom fukozom antitela je nezavisno FcȖRIIIa V/F polimorfizam.

Modifikovanjem amino kiselinske sekvence Fc regiona antitelo predstavlja alternativu na glikolizaciju koja je konstruisana kako bi pojačala ADCC. Mesto vezivanja na humanom IgG1za FcȖ receptore je određeno sa povećanom mutacionom analizom. Ovo dovodi do generacije humanizovano IgG1antitela sa Fc mutacijama koje povećavaju sposobnost vezivanja za FcȖRIIIa i pojačanje ADCC in vitro. Dodatno, Fc varijante su dobijene sa mnogo različitih permutacija sposobnosti vezivanja, npr., poboljšano vezivanje za određene FcȖR receptore sa nepromenjenim ili umanjenim vezivanjem za druge FcȖR receptore.

Drugi aspekt uključuje imunokonjugate koji sadrže humanizovano antitelo ili njegove fragmente konjugovane sa citotoksičnim agensom kao što je hemoterapijski agens, toksin (npr., enzimatski aktivni toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njegovi fragmenti), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat).

Hemoterapeutski agensi koji su korisni u stvaranju takvih imunokonjugata su napred opisani. Enzimatski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu koristiti za formiranje korisnih imunokonjugata uključuju difteriju A lanca, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, egzotoksin A lanca (iz Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modecin A lanac, alfa-sarcin, Aleurites fordii proteini, diantinski proteini, Phitolaca americana proteini (PAPI, PAPII, i PAP-S), inhibitor Momordica karantia, kurcin, krotin, inhibitor Sapaonaria officinalis, gelonin, mitogellin, restriktocin, fenomicin, enomicin, i trikoteceni, i slično. Različiti radionuklidi su dostupni za proizvodnju radiokonjugovanih humanizovanih anti-IL-36R antitela. Primeri uključuju<212>Bi,<131>I,<131>In,<90>Y, i<186>Re.

Konjugati humanizovanog anti-IL-36R antitela i citotoksični ili hemoterapeutski agens može se napraviti poznatim postupcima, korsiteći razne bifunkcionalne proteinske agense za spajanje kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutareldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivati (kao što je bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricin imunotoksin se može dobiti kao što je opisano u Vitetta et al., 1987, Science 238:1098. Karbon-14-označeni 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) je primerno helatni agens za konjugaciju radionukleotida za antitelo. Konjugati se takođe mogu obrazovati sa linkerom koji se može odcepiti.

Humanizovana anti-IL-36R antitela koja su ovde otkrivena takođe se mogu formulisati kao imunolipozomi. Lipozomi koji sadrže antitelo su dobijeni postupcima koji su poznati u tehnici, kao što je opisano u Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; i U.S. Pat. Nos. 4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi koji imaju pojaćano vreme cirkulacije su otkriveni, u U.S. Pat. Br.5,013,556.

Naročito korisni lipozomi se mogu generisati reverznom fazom postupka isparavanja sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi su ekstrudirani kroz filtere definisane veličine otvora kako bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom. Fab' fragmenti antitela koji su ovde otkriveni mogu biti konjugovani do lipozoma kao što je opisano u Martin et al., 1982, J. Biol. Chem.

257:286-288 preko disulfidne reakcije razmene. Hemoterapeutski agens (kao što je doksorubicin) je opciono sadržan unutar lipozoma. Videti, npr., Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst.81(19):1484.

Antitela opisana i otkrivena ovde mogu takođe da se korsite u ADEPT (Antitelo-Usmerenoj Enzimskoj Prolek Terapiji) procedurama konjugacijom antitelo za prolek-aktivirajući enzim koji konvertuje prolek (npr., peptidil hemoterapeutski agens), u aktivni anti-kancer lek. Videti, na primer, WO 81/01145, WO 88/07378, i U.S. Pat. Br. 4,975,278. Enzimska komponenta imunokonjugata korisnog za ADEPT jeste enzimska sposobnost da deluje na prolek na takav način da ga konvertuje u aktivniji, citotoksični oblik. Određeni enzimi koji su korisni u ADEPT uključuju, ali nisu ograničeni na, alkalin fosfatazu za konvertovanje prolekova koji sadrži fosfat u slobodne lekove; arilsulfataza za konvertovanje prolekova koji sadrži sulfat u slobodne lekove; citozin deaminaza za konvertovanje ne-toksičnog 5-fluorocitozina u anti-kancer lek, 5-fluorouracil; proteaze, kao što su seratia proteaza, termolisin, subtilisin, karboksipeptidaze, i katepsini (kao što je katepsini B i L), za konvertovanje prolekova koji sadrže peptid u slobodne lekove; D-alanilkarboksipeptidaze, za konvertovanje prolekova koji sadrže D-amino kiselinske supstituente; enzime koji odcepljuju karbohidrate kao što su β-galaktozidaza i neuraminidaza za konvertovanje glikozilatnih prolekova u slobodne lekove; β-laktamaza za konvertovanje lekova koji su derivatizovani sa β-laktamima u slobodne lekove; i penicillin amidaze, kao što je penicilin V amidaza ili penicilin G amidaza, za konvertovanje lekova derivatizovani na njihovim aminskim azotima sa fenoksiacetil ili fenilacetil grupama, respektivno, u slobodne lekove. Alternativno, antitela koja imaju enzimsku aktivnost ("abzimi") se mogu koristiti da konvertuju prolekove u slobodne aktivne lekove (videti, na primer, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Antitelo-abzim konjugati se mogu dobiti poznatim postupcima za dostavu abzima u ćelijsku populaciju tumora, na primer, kovalentnim vezivanjem enzima za humanizovano anti-IL-36R antitelo/heterobifunkcionalno unakrsno vezanim reagensima koji su prethodno diskutovani. Alternativno, fuzioni proteini koji sadrže bar jedan antigenski vezujući region antitela opisan ovde vezan za bar funkcionalno aktivnu porciju enzima kao što je prethodno opisano mogu da budu konstruisani korišćenjem rekombinantnih DNK tehnika (videti, npr., Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608).

U nekim primerima izvođenja, možda bi bilo poželjno da se koristi humanizovani fragment anti-IL-36R antitela, umesto netaknutog antitela, na primer da se poveća penetracija u tkivo. Možda je poželjno da se modifikuje fragment antitelo kako bi se povećao njegov poluživot u serumu. To se može postići, na primer, ugradnjom epitopa za spašavanje receptora u fragment antitela. U jednom postupku, odgovarajuća regija fragmenta antitela može biti izmenjena (npr., mutirana), ili epitop može biti ugrađen u peptidnu oznaku koja se zatim spaja za fragment antitela na bilo kojem kraju ili u sredini, na primer, pomoću sinteze DNK ili peptida. Videti, npr., WO 96/32478.

U jednom primeru izvođenja, kovalentne modifikacije humanizovanog anti-IL-36R antitela su takođe uključene. Kovalentne modifikacije uključuju modifikaciju ostataka cisteina, histidilnih ostataka, lizinila i amino-terminalnih ostataka, arginilnih ostataka, tirozilnih ostataka, karboksilnih bočnih grupa (aspartil ili glutamil), ostataka glutaminila i asparaginila, ostataka serila ili treonila. Druga vrsta kovalentne modifikacije uključuje hemijsko ili enzimsko vezivanje glikozida za antitelo. Takve modifikacije se mogu izvršiti hemijskom sintezom ili enzimskim ili hemijskim cepanjem antitela, ako je primenljivo. Ostale vrste kovalentnih modifikacija antitela mogu se uvesti u molekul reakcijom ciljanih amino kiselinskih ostataka antitela sa organskim derivatizovanim agensom koji je sposoban da reaguje sa odabranim bočnim lanacima ili ostacima amino- ili karboksi-terminala.

Uklanjanje bilo kojih karbohidratnih ostataka prisutnog na antitelo se može izvesti hemijski ili enzimatski. Hemijska deglikozilacija je opisana od strane Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys.259:52 i by Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131. Enzimatsko cepanje karbohidratnih ostataka na antitela se može postići korišćenjem raznih endo- i ekso-glikozidaza kao što je opisano od strane Thotakura et al., 1987, Met. Enzymol 138:350.

Druga vrsta korisnih kovalentnih modifikacija uključuje povezivanje antitela sa jednim od različitih neproteinskih polimera, npr., polietilen glikola, polipropilen glikola ili polioksialkilena, na način izložen u jednom ili više U.S. Pat. Br. 4,640,835, U.S. Pat. Br. 4,496,689, U.S. Pat. Br.

4,301,144, U.S. Pat. Br.4,670,417, U.S. Pat. Br.4,791,192 i U.S. Pat. Br.4,179,337.

Humanizacija i Varijante Amino Kiselinske Sekvence

Vatijante amino kiselinske sekvence anti-IL-36R antitela se mogu dobiti uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u anti-IL-36R antitelo DNK, ili sa peptidnom sintezom. Takve varijante uključuju, na primer, brisanje iz, i/ili ubacivanje u i/ili supstitucija, ostataka unutar amino kiselinskih sekvenci anti-IL-36R antitela primera prikazani ovde. Bilo koje kombinacije brisanja, ubacivanja, i supstitucije su napravljene kako bi se dostigla finalna konstrukcija, obezbeđujući tako da finalna konstrukcija poseduje željene karakteristike. Amino kiselinske promene takođe mogu izmeniti post-translacione procese humanizovanog ili variantnog anti-IL-36R antitela, kao što je menjanje broja ili pozicija glikozilacionih mesta.

Koristan postupak za identifikaciju određenih ostataka ili regiona anti-IL-36R antitela koja predstavljaju poželjne lokacije za mutagenezu se naziva "mutageneza skenirana od strane alanina," kao što je opisano od strane Cunningham i Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). Ovde, ostatak ili grupa cilajnih ostataka su identifikovani (npr., naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys, i glu) i zamenjeni sa neutralno ili negativno naelektrisanom amino kiselinom (obično alanin) kako bi se uticalo na međusobnu reakciju amino kiselina sa IL-36R antigenom. Te amino kiselinske lokacije koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije su zatim oplemenjene uvođenjem ostalih ili drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije. Prema tome, dok je mesto za uvođenje varijacije amino kiselinske sekvence predodređeno, priroda mutacije sama po sebi ne mora da bude unapred određena. Na primer, za analizu performansi mutacije na datom mestu, vrši se alanin skeniranje ili se nasumična mutageneza sprovodi na ciljnom kodonu ili regionu, a izražene varijante anti-IL-36R antitela se pretražuju za željenu aktivnost.

Umetanja amino kiselinske sekvence uključuje amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije u rasponu od jednog ostatka do polipeptida koji sadrže stotine ili više ostataka, kao i umetanje intrasekvence jednostrukih ili višestrukih ostataka amino kiselina. Primeri terminalnih umetanja uključuju anti-IL-36R antitelo spojeno za epitopsku oznaku. Ostale varijante umetanja molekula anti-IL-36R antitela uključuju spajanje za N- ili C-krajeve anti-IL-36R antitela enzima ili polipeptida koji povećava poluživot antitela u serumu.

Druga vrsta varijante je supstituciona varijanta amino kiseline. Ove varijante imaju najmanje jedan amino kiselinski ostatak u uklonjenom molekulu anti-IL-36R antitela, a na njenom mestu je ubačen drugačiji ostatak. Mesta od najvećeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione, ali se razmatraju i promene FR. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 5 pod naslovom "poželjne supstitucije". Ako takve supstitucije rezultiraju u promeni biološke aktivnosti, tada se mogu uvesti značajnije promene, denominovane "primerne supstitucije" ili kako je dole opisano u daljem tekstu u vezi sa amino kiselinskim klasama, mogu se uvesti, a proizvodi pregledati.

U proteinskoj hemiji, uopšteno je prihvatljivo da biološke osobine antitela se mogu psotiči odabirom supstitucija koje se razlikuju značajno po njihovoj efikasnosti u održavanju (a) strukture polipeptidnog kostura u području supstitucije, na primer, kao obrazac ili helikalna konformacija, (b) naelektrisanja ili hidrofobnosti molekula na ciljanom mestu, ili (c) najvećeg dela bočnog lanca. Ostaci koji se prirodno javljaju su podeljeni u grupe n aosnovu uobičajenih osobina bočnog lanca:

(1) hidrofobni: norleucine, met, ala, val, leu, ile;

(2) neutralni hidrofilni: cys, ser, thr;

(3) kiselinski: asp, glu;

(4) bazni: asn, gin, his, lys, arg;

1

(5) ostaci koji utiču na orjentaciju lanca: gly, pro; i

(6) aromatični: trp, tyr, phe.

Ne-konzervativne supstitucije će podrazumevati razmenu člana jedne od ovih klasa sa drugom klasom.

Bilo koji ostatak cisteina koji nije uključen u održavanje odgovarajuće konformacije humanizovanog ili varijantnog anti-IL-36R antitela takođe može biti supstituisan, obično sa serinom, da bi se poboljšala oksidaciona stabilnost molekula, sprečilo neskladno umrežavanje ili obezbedilo utvrđene tačke konjugacije na citotoksično ili citostatično jedinjenje. Suprotno tome, cisteinska veza(e) mogu se dodati u antitelo kako bi se poboljšala njegova stabilnost (naročito gde je antitelo fragment antitela, kao što je Fv fragment).

Tip supstitucione varijante uključuje supstituciju jednog ili više hipervarijabilnih regionskih ostataka matičnog antitela (npr., humanizovano ili humano antitelo). Uopšteno, rezultirajuća varijanta(e) odabrana za daljnji razvoj će imati poboljšane biološke osobine u odnosu na matično antitelo iz kojeg se generišu. Pogodan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti je sposobnost sazrevanja koristeći fagni prikaz. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilnog regiona (npr., 6-7 mesta) se mutira kako bi se generisale sve moguće amino supstitucije na svakom mestu. Tako dobijene varijante antitela su prikazane na monovalentan način od čestica filamentnih faga kao fuzije do gena III proizvoda M13 koji je pakovan unutar svake čestice. Zatim su skenirane varijante fagnog prikaza na njihovu biološku aktivnost (npr., afinitet vezivanja). U cilju da se identifikuju kandidati mesta hipervarijabilnog regiona za modifikaciju, može se izvesti mutageneza skeniranja alanina radi identifikacije ostataka hipervarijabilnog regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili pored toga, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigen-antitelo da bi se utvrdile tačke kontakta između antitela i humanog IL-36R. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su cijati za supstituciju prema ovde obrađenim tehnikama. Jednom kada se generišu takve varijante, panel varijanti se podvrgava skriningu kao što je ovde opisano, a antitela sa superiornim svojstvima u jednom ili više relevantnih testova mogu biti izabrana za dalji razvoj.

Druga vrsta amino kiselinske varijante antitela menja originalni obrazac glikozilacije antitela. Pod "promenom" podrazumeva se brisanje jednog ili više ugljovodoničnih ostataka pronađenih u antitelu, i/ili dodavanje jednog ili više mesta glikozilacije koja nisu prisutna u antitelu.

2

U nekim primerima izvođenja, može biti poželjno modifikovati antitela pronalaske tako da se dodaju mesta glikozilacije. Glikozilacija antitele je obično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezanje ugljovodoničnog ostatka za bočni lanac ostatka asparagina. Tripeptidni sekvence asparagin-X-serina i asparagin-X-treonina, gde X je bilo koja amino kiselina osim prolina, su prepoznavanje sekvenci za enzimsko vezivanje ugljovodoničnog ostatka za bočnio lanac asparagina. Stoga, prisustvo bilo kog od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šećera N-aceilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiaminsku kiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se može koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilisin. Stoga, da bi se glikozilirao dati protein, npr., antitelo, dizajnirana je amino kiselina sekvenca proteina koja sadrži jedan ili više gore opisanih sekvenci tripeptida (za N-povezana mesta glikozilacije). Izmena se takođe može izvršiti dodavanjem, ili supstitucijom, jednog ili više ostataka serina ili treonina u sekvenci originalnog antitela (za O-povezana mesta glikozilacije).

Molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju varijante amino kiselinske sekvence anti-IL-36R antitela su pripremljeni različitim postupcima poznati u tehnici. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, izolovanje iz prirodnog izvora (u slučaju varijante amino kiselinske sekvence koja se prirodno pojavljuje) ili preparaciju oligonukleotidnom posredovanom (ili usmeren na mesto) mutagenezom, PCR mutagenezom, i kasetnom mutagenezom ranije pripremljene varijantne ili ne-varijantne verzije anti-IL-36R antitela.

Polinukleotidi, Vektori, Ćelije Domaćina, i Rekombinantni Postupci

Drugi primeri izvođenja obuhvataju izolovane polinukleotide koji sadrže sekvencu koja kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo, vektore, i čelije domaćina koje sadrže polinukleotide, i rekombinantne tehnike za proizvodnju humanizovanog antitela. Izolovani polinukleotidi mogu kodirati bilo koji željeni oblik anti-IL-36R antitela uključujući, na primer, monoklonalna antitela pune dužine, Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente, diatela, linearna antitela, molekule antitela pojdinačnog lanca, i multispecifična antitela obrazovana iz fragmenata antitela.

Neki primeri izvođenja uključuju izolovane polinukleotide koji sadrže sekvence koje kodiraju varijabilni region lakog lanca antitela ili fragmenta antitela koji ima bilo koju amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80 i varijabilni region teškog lanca antitela ili fragmenta antitela koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87-89.

Neki primeri izvođenja obuhvataju izolovane polinukleotide koji sadrže sekvence koje kodiraju varijabilni region lakog lanca variable region koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118 i varijabilni region teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125-127.

U jednom aspektu, izolovana polinukleotidna sekvenca(e) kodiraju anitelo ili fragment antitela koji ima varijabilni region lakog lanca i teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 126, respektivno; SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 127, respektivno; ili SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 125.

Polinukleotid(i) koji sadrže sekvencu koja kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo ili nejgov fragment ili lanac može biti spojen za jedan ili više regulatornih ili kontrolnih sekvenci, kao što je poznato u tehnici, i mogu biti sadržane u pogodnim ekspresionim vektorima ili ćeliji domaćina koje su poznate u tehnici. Svaki od polinukleotidnih molekula koji kodiraju varijabilne domene teškog ili lakog lanca mogu nezavisno da budu spojena za polinukleotidnu sekvencu koja kodira konstantan domen, kao što je humani konstantan domen, omogućavajući proizvodnju netaknutog antitela. Alternativno, polinukleotidi, ili njegovi delovi, mogu da budu spojeni zajedno, obezbeđujući uzorke za proizvodnju antitela pojedinačnog lanca.

Za rekombinantnu proizvodnju, polinukleotid koji kodira antitelo je ubačen u replicirani vektor za kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. Mnogi pogodni vektori za ekspresiju rekombinantog antitela su dostupni. Komponente vektora uopšteno sadrže, ali nisu ograničeni na, jedno ili više sledećih: signalnu sekvencu, poreklo replikacije, jedan ili više marker gena, element za poboljšanje, promoter, i transkripcionu terminacionu sekvencu.

Humanizovana anti-IL-36R antitela takođe mogu biti proizvedena kao spojeni peptidi, u kojima je antitelo spojeno sa heterolognim polipeptidom, kao što je signalna sekvenca ili drugi polipeptid koji ima određeno mesto cepanja na amino krajevima zrelog proteina ili polipeptida. Odabrana heterologna signalna sekvenca je obično ona koja je prepoznata i procesuirana (odn., odcepljena sa signalnim peptidima) od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćina koje ne prepoznaju i procesuiraju humanizovano anti-IL-36R antitelo signalne sekvence, signalna sekvenca može biti supstituisana sa prokariotičkom signalnom sekvencom. Signalna sekvenca može bit, na primer, alkalin fosfataza, penicilinaza, lipoprotein, enterotoksin II leaderi koji su stabilni na toploti, i slično. Za sekreciju kvasca, nativna signalna sekvenca može biti supstituisana, na primer, sa vodećom sekvencom dobijenom iz invertaze alfa-faktora

4

iz kvasca (uključujući Saccharomyces i Kluyveromyces Į-faktor lidere), kiselina fosfataze, C. albikans glukoamilaza, ili signala opisanog u WO90/13646. U ćelijama sisara, mogu se koristiti signalne sekvence sisara kao i virusni sekretorni lideri, na primer, herpes simplek gD signal. DNK za takav prekursorski region se veže u okviru za čitanje za DNK koji kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo.

Vektori ekspresije i kloniranja sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava vektoru da se replicira u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina. Uopšteno, u vektorima za kloniranje ova sekvenca je ona koja omogućava vektoru da se replicira nezavisno od domaćinskog hromozoma DNK, i uključuje poreklo replikacije ili autonomno repliciranu sekvencu. Takve sekvence su poznate iz raznim bakterija, kvasaca i virusa. Poreklo replikacije iz plazmida pBR322 pogodno je za većinu gram-negativnih bakterija, 2-X poreklo plazmida je pogodno za kvasce, a različita virusna porekla (SV40, polioma, adenovirus, VSV, i BPV) korisni su za kloniranje vektora u ćelijama sisara. Uopšteno, poreklo komponente replikacije nije potrebno za ekspresione vektore sisara (poreklo SV40 obično se može koristiti samo zato što sadrži rani promotor).

Vektori ekspresije i kloniranja mogu sadržati gen koji kodira selektirajući marker kako bi se olakšala identifikacija ekspresije. Tipični selektivni marker geni kodiraju proteine koji daju otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr., ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, ili alternativno, su komplement auksotrofičnih nedostataka ili u drugim alternativama daju specifične hranjive sastojke koji nisu prisutni u složenom medijumu, npr., gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacili.

Jedan primer selekcione šeme koristi lek za zaustavljanje rasta ćelije domaćina. One ćelije koje se uspešno transformišu sa heterolognim genom stvaraju protein koji daje rezistenciju na lekove i tako preživljavaju režim selekcije. Primeri takve dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu, i higromicin. Uobičajeni odabrani markeri za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih za uzimanje nukleinske kiseline koja kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo, kao što je DHFR (dihidrofolat reduktaza), timidin kinaza, metalotionein-I i -II (takvi kao primarni metalotioneinski geni), adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza i slično. ûelije transformisane sa genom za selekciju DHFR su prvo identifikovane kultivacijom svih transformatora u medijumu za kulturu koji sadrži metotreksat (Mtk), kompetitivni antagonist DHFR. Odgovarajuća ćelija domaćina kada se koristi divlji tip DHFR je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka (CHO) sa nedostatkom DHFR aktivnosti (npr., DG44).

Alternativno, ćelije domaćina (posebno domaćini divljeg tipa koji sadrže endogeni DHFR) transformisane su ili ko-transformisane sa DNK sekvencama koje kodiraju anti-IL-36R antitelo, divlji tip DHFR proteina, i drugi selekcioni marker kao što je aminoglikozidna 3'-fosfotransferaza (APH ), mogu biti izabrane rastom ćelije u medijumu koji sadrži selekciono sredstvo za selektirajući marker, kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin, ili G418. Videti, npr., U.S. Pat. Br.4,965,199.

Kada se rekombinantna proizvodnja vrši u ćeliji kvasca kao ćelija domaćin, TRP1 gen prisutnog u plazmidu kvasca YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39) se može koristiti kao selektivni marker. TRP1 gene obezbeđuje selekciju markera za mutantni soj kvaska kome nedostaje sposobnost za rast u triptofanu, na primer, ATCC Br.44076 ili PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). Prisustvo lezije trp1 u genomu kvasca ćelijskog domaćina tada obezbeđuje efektivno okruženje za detekciju transformacije rastom u odsustvu triptofana. Slično, Leu2pdeficientni sojevi kvasca kao što su ATCC 20,622 i 38,626 su upotpunjeni poznatim plazmidima koji nose LEU2 gen.

Pored toga, vektori izvedeni iz 1.6 ȝm cirkularnog plazmida pKD1 se mogu koristiti za transformaciju Kluyveromyces kvasaca. Alternativno, ekspresioni sistem za proizvodnju velike razmere rekombinanantnog telećeg himozin je prijavljen za K. lactis (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). Stabilni ekspresioni vektori sa više kopija za sekreciju zrelog rekombinantnog humanog serumskog albumina od strane industrijskih sojeva Kluyveromyces su takođe otkriveni (Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975).

Vektori ekspresije i kloniranja obično sadrže promotor koji je prepoznat od strane organizma domaćina i operativno je povezan sa molekulom nukleinske kiseline koji kodira anti-IL-36R antitelo ili njegov polipeptidni lanac. Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promoter, β-laktamazu i laktozni sistem promotera, alkalnu fosfatazu, triptofan (trp) promoterski sistem, i hibridne promotere kao što je tac promoter. Takođe su pogodni i drugi poznati bakterijski promoteri. Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima će takođe sadržati Shine-Dalgarno (S.D.) sekvencu koja je operativno povezana sa DNK koji kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo.

Poznati su mnogi eukariotske promoter sekvence. Skoro svi eukariotski geni imaju regiju bogatu AT koja se nalazi otprilike 25 do 30 baza uzvodno od mesta na kome je započeta transkripcija. Druga sekvenca koja je pronađena 70 do 80 baza uzvodno od početka transkripcije mnogih gena je regija CNCAAT u kojoj N može biti bilo koji nukleotid. Na 3 ' kraju većine eukariotskih gena je AATAAA sekvenca koja može biti signal za dodavanje repa poli A na 3' kraju kodirajuće sekvence. Sve ove sekvence su prikladno ubačene u eukariotske ekspresione vektore.

Primeri pogodnih promotivnih sekvenca za upotrebu sa domaćinima kvasca uključuju promotere za 3-fosfogliceratnu kinazu ili druge glikolitičke enzime, kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfatna izomeraza, 3-fosfogliceratna mutaza, piruvat kinaza, triosefosfatna izomeraza, fosfoglukozna izomeraza, i glukokinaza.

Inducioni promoteri imaju dodatnu prednost transkripcije kontrolisane uslovima rasta. Ovo obuhvata promoterne regione kvasca za alkoholnu dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselina fosfataze, enzimske derivate povezane sa azotnim metabolizmom, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfatna dehidrogenaza, i enzimi odgovorni za maltoznu i galaktoznu utilizaciju. Pogodni vektori i promotori za upotrebu u ekspresiji kvasca su dalje opisani u EP 73,657. Pojačivači kvasca takođe se korisno koriste sa promoterima kvasca.

Humanizovana anti-IL-36R antitelna transkripcija iz vektora u ćelijama domaćina kod sisara je kontrolisana, na primer, promoterima dobijenim iz visrusnih genoma kao što su polioma virus, ptičiji virus, adenovirus (kao što je Adenovirus 2), goveđi papiloma virus, avian sarkoma virus, citomegalovirus, retrovirus, hepatitis-B virus i Simian Virus 40 (SV40), iz heterolognih sisarskih promotera, npr., delujući promoter ili imunoglobulinski promoter, iz promotera toplotnog udara, obezbeđeni takvi promoteri su kompatibilni sa ćelijskim sistemima domaćina.

Rani i kasni promotori virusa SV40 povoljno se dobijaju kao fragment restrikcije SV40 koji takođe sadrži SV40 virusno poreklo replikacije. Neposredni rani promoter humanog citomegalovirusa prikladno je dobijen kao HindIII E restrikcijski fragment. Sistem za ekspresiju DNK kod domaćina sisara koristeći goveđeg papiloma virus kao vektor otkriven je u U.S. Pat. Br. 4,419,446. Modifikacija ovog sistema opisana je u U.S. Pat. Br. 4,601,978. Vidi takođe Reyes et al., 1982, Nature 297: 598-601, otkrivajući ekspresiju humane p-interferonske cDNK u mišjim ćelijama pod kontrolom promotera timidin kinaze iz virusa herpes simpleksa. Alternativno, kao promoter može se koristiti dugotrajno ponavljanje Rous sarkoma virusa.

Sledeći korisni element koji se može upotrijebiti u rekombinantnom ekspresionom vektoru je pojačivač sekvence, koji se koristi za povećanje transkripcije DNK koja kodira humanizovano anti-IL-36R antitelo sa višim eukariotima. Mnoge pojačavajuće sekvence poznate su sada iz genom sisara (npr., globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein, i insulin). Međutim, obično se koristi pojačivač virusa eukariotske ćelije. Primeri uključuju pojačivač SV40 na kasnoj strani porekla replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani porekla replikacije, i pojačivače adenovirusa. Videti takođe Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 za opis pojačivajućih elemenata za aktivaciju eukariotskih promotera. Pojačivaći mogu biti podeljeni u vektor na poziciji 5' ili 3' kodirajuće sekvence humanizovanog anti-IL-36R antitela, ali je poželjno locirana na mestu 5' iz promotera.

Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćina (kvasci, gljivice, insekti, biljke, životinje, ljudi ili nukleirane ćelije iz drugih višećelijskih organizama) takođe mogu sadržati sekvence neophodne za prekid transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obično dostupni iz 5 ' i, povremeno 3', neprevedenih regiona eukariotske ili virusne DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente prepisane kao poliadenilirani fragmenti u neprevođenom delu mRNK koja kodira anti-IL-36R antitelo. Jedna korisna komponenta ukidanja transkripcije je goveđi hormon rasta u području poliadenilacije. Videti WO94/11026 i ekspresioni vektor koji je tamo otkriven. U nekim primerima izvođenja, humanizovano anti-IL-36R antitelo može se izraziti korišćenjem CHEF sistema. (Videti, npr., U.S. Pat. Br.5,888,809;)

Pogodne ćelije domaćina za kloniranje ili ekspresiju DNK u ovde navedenim vektorima su prokariotske, kvasne ili više eukariotske ćelije opisane gore. Pogodni prokarioti za tu svrhu uključuju eubakterije, kao što su gram-negativni ili gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što su Escherichia, e.g., E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr., Salmonella typhimurium, Serratia, npr., Serratia marcescans, i Shigella, kao i Bacilli kao što su B. subtilis i B. licheniformis (npr., B. licheniformis 41 P otkriven u DD 266,710 objavljen Apr. 12, 1989), Pseudomonas kao što su P. aeruginosa, i Streptomyces. Jedan poželjni E. coli klonirajući domaćin je E. coli 294 (ATCC 31,446), iako drugi sojevi kao što su E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), i E. coli W3110 (ATCC 27,325) su pogodniji. Ovi primeri su ilustrativni, a ne ograničavajući.

Pored prokariota, eukariotski mikrobi poput filamentoznih gljivica ili kvasca su pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za kodirajući vektor humanizovanog anti-IL-36R antitela. Saccharomices cerevisiae, ili obični pekarski kvasac, najčešće se koristi među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćina. Međutim, mnogi drugi rodovi, vrste i sojevi su ovde dostupni i korisni, kao što su Schizosaccharomyces pombe; Kluyveromyces hosts kao što su, npr., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, i K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Ciida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis; i filamentozna gljiva kao što je, npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i Aspergillus domaćini kaošto su A. nidulans i A. niger.

Pogodne ćelije domaćina za ekspresiju glikoziliranog humanizovanog anti-IL-36R antitela potiču iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata, uključujući, npr., brojne bakuloviralne sojeve i varijante i odgovarajuće dozvoljene ćelije domaćina insekata iz domaćina, kao što su Spodoptera frugiperda (caterpillar), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (fruitfly), i Bombyx mori (silk crv). Raznovrsni virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr., L-1 varianta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, i takvi virusi mogu da se koriste, naročito za transfekciju Spodoptera frugiperda ćelija.

Biljne ćelijske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, duvana mogu se takođe koristiti kao domaćini.

U drugom aspektu, ekspresija humanizovanog anti-IL-36R se vrši u ćelijama kičmenjaka. Razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postala je rutinska procedura i tehnike su široko dostupne. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su majmunksa CV1 linija bubrega transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), humana embrionska linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, (Graham et al., 1977, J. Gen Virol.

36: 59), ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10), ćelije jejnika kineskog hrčka /-DHFR1 (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; npr., DG44), mišije sertoli ćelije (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), ćelije majmunskog bubrega (CV1 ATCC CCL 70), ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587), humane cervikalne karcinoma ćelije (HELA, ATCC CCL 2), kanine ćelije bubrega (MDCK, ATCC CCL 34), ćelije jetre bivo štakora (BRL 3A, ATCC CRL 1442), humane ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75), humane ćelije jetre (Hep G2, HB 8065), mišiji mamarinski tumor (MMT 060562, ATCC CCL51), TR1 ćelije (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), MRC 5 ćelije, FS4 ćelije, i humana hepatom linija (Hep G2).

ûelije domaćina se transformišu gore opisanom ekspresijom ili klonirajućim vektorima za proizvodnju humanizovanog anti-IL-36R antitela i kultivišu se u konvencionalnim hranljivim medijumima modifikovanim kako je pogodno za indukciju promotera, odabirom transformatora, ili amplifirajućih gena koji kodiraju željene sekvence.

ûelije domaćina korišćene za proizvodnju humanizovanog anti-IL-36R antitela opisanog ovde mogu se kultivisati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni mediji kao što su Ham's F10 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), Minimalni esencijalni medijum ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), i Dulbecco's Modifikovani Eagle's Medijum ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.) su pogodni za kultivisanje ćelija domaćina. Dodatno, bilo koji od medija opisan u jednom ili više Ham et al., 1979, Met. Enz.58: 44, Barnes et al., 1980, Anal. Biochem.102: 255, U.S. Pat. No. 4,767,704, U.S. Pat. Br. 4,657,866, U.S. Pat. Br. 4,927,762, U.S. Pat. Br.

4,560,655, U.S. Pat. Br. 5,122,469, WO 90/103430, i WO 87/00195 može se koristiti kao kultruni medijum za ćelije domaćina. Bilo koji od ovih medija može se po potrebi dopuniti hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES ), nukleotidima (kao adenozin i timidin), antibioticima (kao što je gentamicin), elementima u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u krajnjoj koncentraciji u mikromolarnom opsegu), i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Drugi dodaci se takođe mogu uključiti u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima iz ove oblasti. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju, i biće očigledne običnom stručnjaku.

Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti intracelularno, u periplazmatskom prostoru, ili direktno izlučiti u medijum. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, ćelije mogu da se poremete kako bi oslobađale protein kao prvi korak. Krhotine čestica, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, mogu se ukloniti, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Karter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167 opisuju postupak za izolaciju antitela koja su sekterovana u periplazmični prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se odleđuje u prisustvu natrijum acetata (pH 3,5), EDTA, i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 minuta. Ćelijski ostaci se mogu ukloniti centrifugiranjem. Kada se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih ekspresionih sistema se obično prvo koncentrišu koristeći komercijalno dostupan filter za koncentraciju proteina, na primer, jedinice za ultrafiltraciju Amicon ili Millipore Pellicon. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiciju proteolize i antibiotici mogu biti uključeni da spreče rast slučajnih kontaminanata. Razni postupci se mogu koristiti za izolovanje antitela iz ćelije domaćina.

Kompozicija antitela pripremljena iz ćelija može se prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksilapatitske hromatografije, gel elektroforeze, dijalize, i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija tipična tehnika pročišćavanja. Prikladnost proteina A kao afinitet liganda zavisi od vrste i izotipa bilo kojeg imunoglobulina Fc domen koji je prisutan u antitelu. Protein A se može koristiti za pročišćavanje antitela koje su bazirana na humanom gama1, gama2, ili gama4 teškoh lanaca (videti, npr., Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Met. 62:1-13). Protein G preporučuje se za sve izotope miša i za humani gama3 (videti, npr., Guss et al., 1986 EMBO J.5:1567-1575). Matriks na koji se vezuje srodni ligand najčešće je agaroza, ali dostupni su i drugi matriksi. Mehanički stabilni matriksi kao što su kontrolno pore staklo ili poli (stirenedivinil) benzen omogućavaju brži protok i kraća vremena obrade nego što se to može postići sa agarozom. Gde antitelo sadrži CH3domen, Bakerbond ABX™ smola (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) je korsina za prečišćavanje. Ostale tehnike za prečišćavanje proteina, kao što su frakcionacija na koloni za razmenu jona, taloženje etanola, HPLC reverzne faze, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparinu SEPHAROSE™ hromatografija na anjonskoj ili katjonskoj razmenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliaspartične kiseline), hromatofokusiranje, SDS-PAGE, i amonijum sulfatno taloženje su takođe dostupni u zavisnosti od antitela koje treba da se oporavi.

Posle bilo kog preliminarnog koraka prečišćavanja, smeša koja sadrži antitelo od interasa i kontaminata može biti podvrgnuta hidrofobnoj interakcijskoj hromatografiji sa niskim pH korišćenjem elucijskog pufera sa pH između oko 2.5-4.5, koji se obično izvodi u malim koncentracijama soli (npr., od oko 0-0.25 M soli).

Takođe su ovde obuhvaćene nukleinske kiseline koje hibridiziraju pod uslovima niske, umerene, i visoke strogosti, kao što je ovde definisano, na sve ili na deo (npr., deo koji kodira promenljivo područje) nukleotidne sekvence, rpredstavljenog sa izolovanim polinukleotidnim sekvencama

1

koje kodiraju antitelo ili fragment antitela predmetnog pronalaska. Hibridizacioni deo hibridizacione nukleinske kiseline je obično najmanje 15 (npr., 20, 25, 30 ili 50) nukleotida u dužini. Hibridizacioni deo hibridizirajuće nukleinske kiseline je najmanje 80%, npr., najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98%, identičan sekvenci dela ili cele nukleinske kiseline koja kodira anti-IL -36R polipeptid (npr., varijabilni region teškog lanca ili lakog lanca), ili njegov komplement. Hibridiziranje nukleinskih kiselina tipa ovde opisanog može se koristiti, na primer, kao sonda za kloniranje, prajmer, npr., PCR prajmer, ili dijagnostička sonda.

Ne terapeutske Primene

Ovde opisana antitela su korisna kao agensi za prečišćavanje. U ovom procesu, antitela su imobilisana na čvrstoj fazi kao što je smola proteina A, koristeći postupke dobro poznate u tehnici. Imobilisano antitelo je u kontaktu sa uzorkom koji sadrži IL-36R protein (ili njegov fragment) koji se prečišćava, a nakon toga se podloga ispira sa pogodnim rastvaračem koji će ukloniti suštinski sav materijal u uzorku, osim IL-36R proteina, koji je vezan za imobilisano antitelo. Konačno, nosač se ispere sa drugim pogodnim rastvaračem koji će osloboditi IL-36R protein iz antitela.

Anti-IL-36R antitela, na primer humanizovana anti-IL-36R antitela, takođe su korisna u dijagnostičkim testovima za detekciju i/ili kvantifikaciju IL-36R proteina, na primer, detekciji ekspresije IL-36R u specifičnim ćelijama, tkivima ili serumu. Anti-IL-36R antitela se mogu koristiti dijagnostički za, na primer, nadgledanje razvoja ili napredovanja bolesti kao dela kliničkog postupka testiranja, na primer, za određivanje efikasnosti datog režima lečenja i/ili prevencije. Detekcija se može olakšati spajanjem anti-IL-36R antitela. Primeri supstanci koje se mogu detektovati uključuju različite enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminiscentne materijale, bioluminescentne materijale, radioaktivne materijale, metale koji emituju pozitrone koristeći različite pozitronske emisione tomografije, i neradioaktivne paramagnetne jone metala. Videti, na primer, U.S. Patent Br. 4,741,900 za jone metala koji se mogu konjugovati sa antitelom za upotrebu kao dijagnostike prema predmetnom pronalasku.

Anti-IL-36R antitela se mogu koristiti u postupcima za dijagnostikovanje poremećaja povezanim sa IL-36R (npr., poremećak okarakterisan sa abnormalnom ekspresijom IL-36R) ili da se odredi da li subjekat ima povećani rizik razvoja poremećaja povezanim sa IL-36R. Takvi postupci uključuju kontaktiranje biološkog uzorka iz subjekta sa IL-36R antitelom i detektovanje vezivanja

2

antitela za IL-36R. Pod "biološkim uzorkom" podrazumeva se svaki biološki uzorak dobijen od pojedinačne, ćelijske linije, kulture tkiva, ili drugog izvora ćelija koji potencijalno ekspresuju IL-36R. Postupci za dobijanje biopsije tkiva i telesnih tečnosti od sisara su dobro poznati u tehnici.

U nekim primerima izvođenja, postupak može dalje da sadrži poređenje nivoa IL-36R u uzorku pacijenta u odnosu na kontrolni uzorak (npr., subjekat koji nema IL-36R-povezani poremećaj) kakob i se odredilo da li pacijent ima poremećaj povezan sa IL-36R ili je u riziku od razvoja poremećaja povezanim sa IL-36R.

Bilo bi povoljno u nekim primerima izvođenja, na primer, za dijagnostičke svrhe da se antitelo obeleži detektabilnim ostatkom. Dostupne su brojne detektabilne oznake, uključujući radioizotope, fluorescentne oznake, oznake supstrata enzima i slično. Oznaka se može indirektno konjugovati sa antitelom koristeći različite poznate tehnike. Na primer, antitelo se može konjugovati sa biotinom, a bilo koje od tri šire kategorije gore pomenutih oznaka mogu biti konjugovane sa avidinom, ili obrnuto. Biotin se selektivno vezuje za avidin i na taj način se oznaka može konjugovati sa antitelom na indirektan način. Alternativno, da bi se postigla indirektna konjugacija oznake sa antitelom, antitelo se može konjugovati sa malim haptenom (poput digoksina), a jedna od gore navedenih različitih oznaka konjuguje se sa anti-hapten antitelom (npr., anti- digoksin antitelo). Tako se može postići indirektna konjugacija oznake sa antitelom.

Primerni radioizotopi oznake obuhvataju<35>S,<14>C,<125>I,<3>H, i<131>I. Antitelo može biti označeno sa radioizotopomkoristeći tehnike opisane ovde, na primer, u Current Protocols in Immunology, Volumes 1 i 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N.Y., Pubs. Radioaktivnost se može izmeriti, na primer, sa scintilacionim brojanjem.

Primeri fluorescentnih oznaka uključuju oznake izvedene iz retkih zemljanih helata (europijum helat) ili fluoresceina i njegovih derivata, rodamin i njegovi derivati, dansil, lizamin, fitoketrin, i Tekas Red su dostupni. Fluorescentne oznake se mogu konjugovati za antitelo poznatim tehnikama, poput onih otkrivenih, na primer, u Current Protocols in Immunologi. Fluorescencija se može kvantifikovati korišćenjem fluorimetra.

Postoje različite dobro okarakterisane oznake enzima i supstrata koje su poznate u tehnici (videti, npr., U.S. Pat. Br.4,275,149 za pregled). Enzim uglavnom katalizuje hemijsku promenu hromogenog supstrata koja se može meriti korišćenjem raznih tehnika. Na primer, promena može biti promena boje supstrata koja se može meriti spektrofotometrijski. Alternativno, enzim može da izmeni fluorescenciju ili hemiluminiscenciju supstrata. Tehnike za kvantifikaciju promene fluorescencije su gore opisane. Hemiluminiscentni supstrat postaje elektronski uzbudjen hemijskom reakcijom, a zatim može da emituje svetlost koja se može meriti, na primer, pomoću hemiluminometra, ili daje energiju fluorescentnom akceptoru.

Primeri enzimskih oznaka obuhvataju luciferaze kao što su firefli luciferaza i bakterijska luciferaza (U.S. Pat. Br. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihidroftalazinedioni, malat dehidrogenaza, ureaza, peroksidaza kao što je horseradish peroksidaza (HRPO), alkalin fosfataza, βgalaktozidaza, glukoamilaza, lizozim, saharid oksidaze (kao što su glukoza oksidaza, galaktoza oksidaza, i glukoza-6-fosfat dehidrogenaza), heterocidične oksidaze (kao što je uricaza i ksantin oksidaza), laktoperoksdidaza, mikroperoksidaza, i slično. Tehnike za konjugaciju enzima za antitelo su opisane, na primer, u O'Sullivan et al., 1981, Metods for the Preparation of Enzyme-Antitelo Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Metods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166.

Primeri kombinacija enzima i supstrata uključuju, na primer: Horseradish peroksidazu (HRPO) sa hidrogen peroksidazom kao supstratom, pri čemu vodonik peroksidaza oksiduje prekursor boje, kao što je ortofenilen diamin (OPD) ili 3,3',5,5'-tetrametil benzidin hidrohlorid (TMB); alkalin fosfataza (AP) sa para-Nitrofenil fosfatom kao hromogenski supstrat; i β-D-galaktozidaza (β-D-Gal) sa hromogenskim supstratom kao što je p-nitrofenil-β-D-galaktozidaza ili fluorogenski supstrat 4-metilumbeliferil-β-D-galaktozidaza.

Mnoge druge kombinacije enzim-supstrat dostupno je stručnjacima. Za opšti pregled ovih, videti U.S. Pat. Br.4,275,149 i U.S. Pat. Br.4,318,980.

U drugom primeru izvođenja, humanizovano anti-IL-36R antitelo se korsiti neoznačeno i detektovano je sa označenim antitelom koje vezuje humanizovano anti-IL-36R antitelo.

Ovde opisana antitela mogu se upotrebiti u bilo kom poznatom postupku ispitivanja, kao što su kompetitivni testovi vezivanja, direktni i indirektni sendvič testovi, i imunoprecipitacioni testovi. Videti, npr., Zola, Monoclonal Antitela: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc.

1987).

4

Anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment može se upotrebiti da inhibira vezivanje liganda za IL-36 receptor. Takvi postupci uključuju davanje anti-IL-36R antitela ili njegovog antigenskog vezujućeg fragmenta u ćeliju (npr., ćeliju sisara) ili ćelijskom okruženju, pri čemu se signalizacija posredovana receptorom IL-36 inhibira. Ovi postupci se mogu izvesti in vitro ili in vivo. Pod "ćelijskim okruženjem" podrazumeva se tkivni, medijski ili vanćelijski matriks koji okružuje ćeliju. Anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment se daje u ćelijsko okruženje ćelije na takav način da antitelo ili fragment može da se veže za molekule IL-36R izvan i koje okružuje ćeliju, prema tome, sprečavajući vezanje IL-36 liganda za njegov receptor.

Diagnostički Kitovi

Anti-IL-36R antitelo se može koristiti u dijagnostičkom kitu, odn., pakovanoj kombinaciji reagenasa u prethodno određenim količinama sa instrukcijama za izvođenje dijagostičke analize. Gde je antitelo označeno sa enzimom, kit može obuhvatati supstrate i kofaktore koji su potrebni enzimu kao što je supstratni prekursor koji obezbeđuje detektovan hromofor ili fluorofor. Dodatno, mogu se uključiti i drugi aditivi, poput stabilizatora, pufera (na primer blokpufer ili pufer za liziranje), i slično. Relativne količine raznih reagenasa mogu se široko menjati da bi se postigle koncentracije u rastvorima reagenasa koji suštinski optimiziraju osetljivost testa. Reagensi se mogu obezbediti u obliku suvih prahova, obično liofilizovanih, uključujući ekscipijense koji će nakon rastvaranja obezbediti rastvor reagensa koji ima odgovarajuću koncentraciju.

Terapeutske Primene

U drugom primeru izvođenja, humanizovano anti-IL-36R antitelo otkriveno ovde je korisno u lečenju raznih poremećaja povezanih sa ekspresijom IL-36R kao što je opisano ovde. Humanizovano anti-IL-36R antitelo za primenu u lečenju IL-36R povezanih poremećaja sadrži primenu terapeutske efikasne količine humanizovanog anti-IL-36R antitela za primenuna subjekta kome je potrebno.

Humanizovano anti-IL-36R antitelo ili agens se primenjuje bilo kojim pogodnim sredstvom, uključujući parenteralno, potkožno, intraperitonealno, intrapulmonarno, i intranazalno, i, ako je potrebno za lokalno imunosupresivno lečenje, intralezionalno davanje (uključujući perfuziju ili kontaktiranje grafta na neki drugi način sa antitelom pre transplantacije). Humanizovano anti-IL-36R antitelo ili agens može se primeniti, na primer, kao infuzija ili kao bolus. Parenteralne infuzije uključuju intramuskularnu, intravensku, intraarterijsku, intraperitonealnu, ili potkožnu primenu. Pored toga, humanizovano anti-IL-36R antitelo se na odgovarajući način daje pulsnom infuzijom, posebno sa smanjenjem doza antitela. U jednom aspektu, doziranje se daje injekcijama, najpoželjnije intravenskim ili potkožnim injekcijama, u zavisnosti naročito od toga da li je primena kratka ili hronična.

Za prevenciju ili lečenje oboljenja, odgovarajuća doza antitela zavisiće od različitih faktora kao što su vrste oboljenja koja se leči, kao što je definisano gore, težine i toka oboljenja, gde se antitelo daje za prevencijske ili terapeutske svrhe, prethodne terapije, kliničke istorije pacijenta i odgovora na antitelo, i diskrecije lekara. Antitelo se prikladno daje pacijentu odjednom ili tokom niza lečenja.

U zavisnosti od tipa i težine oboljenja, oko 1 Pg/kg do 20 mg/kg (npr., 0.1-15 mg/kg) antitela je početna kandidatska doza za davanje pacijentu, na primer, jednom ili više zasebnih administracija, ili sa kontinuiranom infuzijom. Tipična dnevna doza može biti u opsegu od približno 1 ȝg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od faktora koji su prthodno navedeni. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se održava sve dok se ne pojavi željena supresija simptoma bolesti. Međutim, mogu biti korisni i drugi režimi doziranja. Napredak ove terapije se lako prati konvencionalnim tehnikama. Primer režima doziranja je onaj otkriven u WO 94/04188.

Termin “supresija” se ovde koristi u istom kontekstu kao “amelioracija” i “aleviacija” da označi smanjenje jednog ili više karakteristika oboljenja.

Antitelo kompozicija će biti formulisana, dozirana, i primenjivana na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. ýinjenice za razmatranje u ovom kontekstu uključuju određeni poremećaj koji se leči, određeni sisar koji se leči, kliničko stanje pojedinog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, način primene, raspored primene, i drugi faktori poznati lekarima. "Terapeutski efikasna količina" antitela koji će se primenjivati će biti u skladu sa takvim razmatranjima, i to je minimalna količina neophodna za prevenciju, ublažavanje ili lečenje poremećaja povezanog sa IL-36R ekspresijom.

Antitelo ne mora da bude, već je opciono, formulisano sa jednim ili više agenasa koja se trenutno koriste za sprečavanje ili lečenje dotičnog poremećaja. Efektivna količina takvih drugih agenasa zavisi od količine humanizovanog anti-IL-36R23p19 antitela prisutnog u formulaciji, vrste poremećaja ili lečenja, i drugih faktora koji su gore razmatrani. Obično se koriste u istim dozama i sa načinima primene kao što je ovde ranije korišćeno ili otprilike od 1 do 99% prethodno korišćenih doza.

Farmaceutske Kompozicije i Njihova Primena

Kompozicija koja IL-36R vezujući agens (npr., anti-IL-36R antitelo) može se primeniti na subjekta koji ima ili postoji rizik od imunološkog poremećaja, respiratornog poremećaja ili kancera. Pronalazak dalje obezbeđuje upotrebu IL-36R vezujućeg agensa (npr., anti-IL-36R antitelo) u proizvodnji leka za prevenciju ili lečenje kancera, respiratornog poremećaja ili imunološkog poremećaja. Termin "subjekat" kao što je ovde korišćen označava bilo koji pacijent sisara kome se IL-36R vezujući agens može dati, uključujući npr., ljude i ne-ljudske sisare, kao što su primati, glodari i psi. Subjekti posebno namenjeni za lečenje uključuju ljude. Antitela ili agensi se mogu davati sami ili u kombinaciji sa drugim kompozicijama za prevenciju ili lečenje imunološkog poremećaja, respiratornog poremećaja ili kancera. Takve kompozicije koje se mogu davati u kombinaciji sa antitelom ili agensima uključuju metotreksat (MTX) i imunomodulatore, npr. antitela ili male molekule.

Primeri antitele za upotrebu u takvim farmaceutskim kompozicijama su oni koji sadrže antitelo ili fragment antitela koji ima varijabilni region lakog lanca amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 80. i varijabilni region teškog lanca amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 87-89.

Drugi primeri antitela za primenu u takvim farmaceutskim kompozicijama su oni koji sadrže humanizovano antitelo ili fragment antitela koji ima varijabini region lakog lanca amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 80 i 88, SEQ ID NO: 80 i 89, ili SEQ ID NO: 80 i 87.

Drugi primeri antitela za primenu u takvim farmaceutskim kompozicijama su oni koji sadrže humanizovano antitelo koje ima varijabilni region lakog lanca amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 118, i varijabilni region teškog lanca amino kiselinske sekvence SEQ ID NO: 125, 126, ili 127.

Drugi primeri antitela za primenu u takvim farmaceutskim kompozicijama su takođe oni koji sadrže Antitelo B4, Antitelo B5, ili Antitelo B6.

Poznati su razni sistemi davanja i mogu se koristiti za davanje IL-36R vezujućeg agensa. Postupci uvođenja uključuju, ali nisu ograničeni na intradermalni, intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, potkožni, intranazalni, epiduralni i oralni putevi. IL-36R vezujući agens može se primeniti, na primer infuzijom, bolusom ili injekcijom, i može se primeniti zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima, kao što su hemoterapijski agensi. Primena može biti sistemska ili lokalna. U poželjnim primerima izvođenja, primena je potkožnom injekcijom. Formulacije za takve injekcije mogu se pripremiti na primer u napunjenim špricama koji se mogu davati jednom svake druge nedelje.

U određenim primerima izvođenja, kompozicija IL-36R vezujućeg agensa se primenjuje injekcijom, pomoću katetera, pomoću supozitorija ili implantatom, pri čemu je implantat od poroznog, neporoznog ili želatinoznog materijala, uključujući membranu, kao što je sialastična membrana, ili vlakno. Obično, kada se daje kompozicija, koriste se materijali u koje anti-IL-36R antitelo ili agens ne apsorbuje.

U drugim primerima izvođenja, anti-IL-36R antitelo ili agens se daje u kontrolisanom sistemu otpuštanja. U jendom primeru izvođenja, može da se korsiti pumpa (videti, npr., Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). U durgom priemru izvođenja, mogu da se korsite polimerni materijali. (Videti, npr., Medical Applications of Controlled Release (Langer i Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design i Performance (Smolen i Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger i Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. See also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105.) Drugi kontrolisani sistemi otpuštanja su diksutovani, na primer, u Langer, supra.

IL-36R vezujući agens (npr., anti-IL-36R antitelo) se može primenjivati kao farmaceutske kompozicije koje sadrže terapeutsku efikasnu količinu vezujućih agenasa i jedan ili više farmaceutskih kompatibilnih sastojaka.

U tipičnim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je formulisana u skladu sa rutinskim procedurama kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravensku ili potkožnu primenu kod ljudi. Obično, kompozicije za davanje injekcijom su rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Tamo gde je potrebno, farmaceutski proizvod može takođe da sadrži agens za rastvaranje i lokalni anestetik, kao što je lignokaina, da olakša bol na mestu ubrizgavanja. Uopšteno, sastojci se isporučuju odvojeno ili u mešaju zajedno u jediničnom doznom obliku, na primer, kao suvi liofilizirani prah ili koncentrat bez vode u hermetički zatvorenoj posudi, poput ampule ili vrećice, što ukazuje na količinu aktivnog agensa. Tamo gde se lek daje infuzijom, može se dati infuzijskom bočicom koja sadrži sterilnu farmaceutsku vodu ili fiziološki rastvor. Ako se lek daje injekcijom, može se dobiti ampula sterilne vode za injekcije ili fiziološkog rastvora, tako da se sastojci mogu mešati pre primene.

Dalje, farmaceutska kompozicija može biti obezbeđena kao farmaceutski komplet koji sadrži (a) posudu koja sadrži IL-36R vezujući agens (npr., anti-IL-36R antitelo) u liofilizovanom obliku i (b) drugu posudu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv razblaživač (npr., sterilna voda) za injekciju. Farmaceutski prihvatljiv razblaživač može se koristiti za rekonstituciju ili razblaživanje liofilizovanog anti-IL-36R antitela ili agensa. Opciono povezani sa takvim posudama mogu biti obaveštenja u obliku koji je propisala vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, a koja obaveštava odražava odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za ljudsku administraciju.

Količina IL-36R vezujućeg agensa (npr., anti-IL-36R antitelo) koja je efikasna u lečenju ili sprečavanju imunološkog poremećaja ili kancera može se odrediti strogim kliničkim tehnikama. Pored toga, in vitro ispitivanja mogu se opciono koristiti da bi se utvrdili optimalni dozni opsezi. Tačna doza koja će se koristiti u formulaciji takođe će zavisiti od načina primene, odnosno stadija imunološkog poremećaja ili kancera, o kome treba da se odlučuje u skladu sa procenom lekara i okolnostima svakog pacijenta. Efektivne doze mogu se ekstrapolirati iz kriih dozeodgovor izvedenih iz in vitro ili testnih sistema životinjskog modela.

Uopšteno, doza anti-IL-36R antitelo ili IL-36R vezujućeg agensa koja se daje pacijentu sa imunološkim poremećajem ili IL-36R ekspresionim kancerom je obično oko 0,1 mg/kg do oko 100 mg/kg tela telesne težine subjekta. Doza koja se daje subjektu je od oko 0.1 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 30 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 20 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 15 mg/kg ili otprilike 1 mg/kg do oko 10 mg/kg telesne težine subjekta.

Primerne doze uključuju, ali nisu ograničeni na, od 1 ng/kg do 100 mg/kg. U nekim primerima izvođenja, doza je oko 0.5 mg/kg, oko 1 mg/kg, oko 2 mg/kg, oko 3 mg/kg, oko 4 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 6 mg/kg, oko 7 mg/kg, oko 8 mg/kg, oko 9 mg/kg, oko 10 mg/kg, oko 11 mg/kg, oko 12 mg/kg, oko 13 mg/kg, oko 14 mg/kg, oko 15 mg/kg ili oko 16 mg/kg. Doza se može davati, na primer, svakodnevno, jednom nedeljno (nedeljno), dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, četiri puta nedeljno, pet puta nedeljno, šest puta nedeljno, dve nedelje ili mesečno, svaka dva meseca ili svaka tri meseca. U određenim primerima izvođenja, doza je oko 0.5 mg/kg/nedeljno, oko 1 mg/kg/nedeljno, oko 2 mg/kg/nedeljno, oko 3 mg/kg/nedeljno, oko 4 mg/kg/nedeljno, oko 5 mg/kg/nedeljno, oko 6 mg/kg/nedeljno, oko 7 mg/kg/nedeljno, oko 8 mg/kg/nedeljno, oko 9 mg/kg/nedeljno, oko 10 mg/kg/nedeljno, oko 11 mg/kg/nedeljno, oko 12 mg/kg/nedeljno, oko 13 mg/kg / nedeljno, oko 14 mg/kg/nedeljno, oko 15 mg/kg/nedeljno ili oko 16 mg/kg/nedeljno. U nekim primerima izvođenja, doza se kreće od oko 1 mg/kg/nedeljno do oko 15 mg/kg/nedeljno.

U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije koje sadrže IL-36R vezujući agens mogu dalje da sadrže terapijski agens, bilo konjugovano ili nekonjugovano za vezujući agens. Anti-IL-36R antitelo ili IL-36R vezujući agens može se davati istovremeno u kombinaciji sa jednim ili više terapeutskih agenasa za lečenje ili prevenciju imunoloških poremećaja ili kancera. Takva primena kombinovane terapije može imati aditivni ili sinergistički efekat na parametre oboljenja (npr., ozbiljnost simptoma, broj simptoma ili učestalost recidiva).

U pogledu terapijskih režima za kombinovano davanje, u određenom rešenju, anti-IL-36R antitelo ili IL-36R vezujući agens se daje istovremeno sa terapeutskim agensom. U drugoj određenom primeru izvođenja, terapeutski agens se daje pre ili posle primene anti-IL-36R antitelo ili IL-36R vezujućeg agensa, najmanje sat vremena do nekoliko meseci, na primer najmanje sat, pet sati, 12 sati, dan, nedelja, mesec, ili tri meseca, pre ili posle primene anti-IL-36R antitelo ili IL-36R vezujućeg agensa.

Proizvodi za Proizvodnju

U drugom aspektu, proizvod za proizvodnje koji sadrži materijale korisne za lečenje gore opisanih poremećaja je uključen. Proizvodi za proizvodnju sadrže posudu i etiketu. Odgovarajuće posude uključuju, na primer, boce, bočice, špriceve, epruvete. Posude mogu da se formiraju od raznih materijala kao što su staklo ili plastika. Posuda sadrži smešu koja je efikasna za lečenje stanja i može imati sterilni pristupni otvor. Na primer, posuda može biti vrećica sa intravenskim rastvorom ili bočica koja ima čep koji se može probiti hipodermičkom iglom za ubrizgavanje. Aktivni agens u kompoziciji je humanizovano anti-IL-36R antitelo. Oznaka na ili povezana sa posudom označava da se kompozicija koristi za lečenje stanja izbora. Proizvodi za proizvodnju mogu dalje da sadrže drugu posudu koja sadrži farmaceutski prihvatljiv pufer, kao što je fiziološki rastvora fosfatnog pufera, Ringerov rastvor, i rastvor dekstroze. Pored toga, može uključivati i druge materijale poželjne od komercijalnog korisnika, uključujući i druge pufere, razblaživače, filtere, igle, špriceve, uloške za pakovanje sa uputstvima za upotrebu.

Pronalazak je dalje opisan u sledećim primerima, koji nemaju za nameru da ograniče obim pronalaska.

Antitela predmetnog pronalaska su dalje opisana u Primerima u nastavku teksta.

Primeri

Primer 1: Identifikacija Anti-humanog IL-36R Antitela

Više sojeva miša imunizirano je rekombinantno proizvedenim humanim IL-36R (ECD – ekstraćelijski domen: amino kiseline 20-332 Genbank Accession #NP_003845) protein i oni koji su proizveli snažan titrački odgovor uzet u tradicionalnu generaciju hibridoma. Fuzijski proizvodi koji izazivaju snažno vezivanje za humani IL-36R (ECD), a koji se još uvek ne vezuju za humani IL-1R1 (najzastupljeniji član porodice IL-1R), subklonirani su i ponovo pregledani. Identifikovano je više hibridoma da bi se dobila monoklonska antitela koja vezuju i neutralizuju signalizaciju iz IL-36R (videti primere 2, 3, i 4). Promenljivi domeni klonirani su iz hibridoma korišćenjem mikroznih PCR setova prajdera. Varijabilni domen i specifični CDR rreprezentativnih monoklonskih antitela opisani su gore. Sva mišja antitela su konvertovana u himerna antitela koja se sastoje od mišjih varijabilnih domena na ljudskim konstantnim domenima (hu IgG1KO / kapa). hu IgG1KO (knock out) ima dve zamenjene mutacije (Leu234Ala i Leu235Ala) koje eliminišu ADCC i CDC aktinost redukovanjem efektorskih funkcija kao što je FcJR i komplementarno vezivanje. Varijabilni domeni mišjih i himernih antitela su identični. Himerna antitela se generišu tako da potvrde funkciju antitela i da obezbede tačan varijabilni domen sekvenc koja je dobijena.

1

Primer 2: Sposobnosti Vezanja Molekula Identifikovanih Mišijih Anti-human IL-36R Antitela

A) Kinetičke i vezujuće sposobnosti anti-IL-36R antitela koji se vezuje za rekombinantni humani IL-36R su izmerene korišćenjem Proteon (Bio-Rad, Hercules, CA) korišćenjem materijala generisanih iz hibridoma nakon prečišćavanja u jednoj koloni. Spososbnost vezivanja svih miša dovode do toga da se humani IL-36R pokreće pri pojedinačnoj koncentraciji površinskog sloja IL-36R koja je procenjena da je < 100 pM. Spososbnost vezivanja mišjih antitela za humani IL-36R radi pri 7 različitih površinskih gustina (globalno odgovara) je prikazan u Tabeli 1. Vezivanje himernih anti-IL36R IgG je ekvivalentno odgovarajućim mišjim vođenjima.

Tabela 1: Spososbnost vezivanja mišijih anti-humanih IL-36R antitela.

B) Molekularna selektivnost gotovog mišjeg IL-36R i humanog IL-1R1

Mišija i himerna anti-IL-36R antitela su takođe ubrizgana prekov ili mišje IL-36R ili humane IL-1R1 površine pri koncentraciji od 100 nM. Vezujući signal za mišji IL-36R i za humani IL-1R1 za ova antitela su izmerena korišćenjem Fortebio Octet (Fortebio, Menlo Park, CA) je nula, koji ukazuje da se ova antitela selektivno vezuju za humani IL-36R. Vezivanje anti-IL-36R antitela za humani IL-36R je takođe analiziran u prisustvu 50% humanog seruma i nije primećen značajan uticaj seruma na brzinu vezivanja koji pokazuje visoku specifičnost.

Primer 3: Potencijal mišjeg i himernog anti-human IL-36R antitela u funkcionalnim humanim i hinomolgus analizama

Protokoli: Humane NCI/ADR-RES ćelije pNFNB/Citokin analiza otpuštanja

Reagensi:

R&D Sistemi: truncated rh IL36β

2

R&D Sistemi: truncated rh IL36γ

R&D Sistemi: truncated rh IL36α:

MA6000 Fosfo- NFκB (Ser536) Whole Cell Lysate Kit

Meso Scale Diagnostics, LLC

MSD ELISA prilagođena humana analiza u 96-bunarčića na 4-mesta

Meso Scale Diagnostics, LLC

NCI/ADR-RES ćelije su postavljene pri 45000 ćelijama/bunarčiću, u RPMI medijumu sa 0.25% serumom u ploči sa 96 bunarčića. Jedna ploča je korišćena za analizu pNF2B i druga za oslobađanje citokina. Ploče su zatim inkubirane preko noći na 37<o>C, 5% CO2.Ligis (IL36D, E, or J) i antitela su razblažena na 4x željene koncentracije u serumu starved (SS) medijumu.

Antagonisti (antitela) su dodati ćelijama pre liganda. Za pNFNB: NCI ćelije /- ligand i antagonist su inkubirani 1 sat, 37<o>C, 5% CO2.Medijum je zatim aerisan i ćelije su lizirane u 100 Pl/bunarčiću Kompletni lizinski Pufer na ledu 30 min. Lizate je potom centrifugiran na 2500 RPM, 20 min, 4<o>C, i prebačen u MSD ELISA ploču i analiziran za pNFNB prema protokolu proizvođača. Za otpuštanje Citokina: 18-24 sati posle stimulacije, supernatanti su prebačeni u MSD ELISA ploču i analizirani na citokin prema protokolu proizvođača.

Protokol: pNFκB (S536) MSD ELISA za BaF/3 Cinomolgus IL-36R Ćelije

BaF/3 cinomolgus IL-36R ćelije su postavljene na 90,000 ćelija/bunarčiću u SS medijumu na ploči sa 96 bunarčića.100 ul medijuma je dodato u kontrolne bunarčiće. Antagonisti (antitela) su razblaženi pri 4x željene koncentracije i 50 Pl je dodato u svaki bunarčić. Ligandi (IL36D, E, ili J) su razblaženi pri 4x željene koncentracije u SS medijumu i 50Pl je dodato u svaki bunarčić (za konačnu zapreminu od 200 Pl). Ploče su inkubirane 15 min, 37<o>C, 5% CO2.Ploče su nakratko centrifugirane, medijum je aerisan, aćelije su lizirane u 100 Pl/bunarčiću Kompletni Lizin Pufer (videti MSD pNFκB protokol) i inkubirane na ledu 30min. Lizati su potom centrifugirani pri 2500 RPM, 20 min, 4<o>C i prebačeni u MSD ELISA ploču. Lizati su potom procenjeni na pNFNB aktivnost koristeći MSD kit kao što je ovde opisano.

Reezultati: IC90rezultati za mišja anti-humana IL-36R antitela u humanim funkcionalnim analizama (pNFNB i otpuštanje citokina) i cinomolgusna funkcionalna analiza (pNFkB) sa humanim IL-36 ligandima su prikazani u Tabeli 2. IC90rezultati za himerna anti-humana IL-36R antitela u humanim funkcionalnim analizama (pNFNB i otpuštanje citokina) i cinomolgusna funkcionalna analiza (pNFNB) sa humanim IL-36 ligandima su prikazani u Tabeli 3.

Tabela 2: Potencijalnost antitela miša u ispitivanju funkcionalnih ćelija

(izotopske kontrole nisu pokazale nikakvu inhibicijsku aktivnost u najvišoj koncentraciji koja je testirana na uzorcima)

4

Tabela 3: Potencijalnost himernih antitela u ispitivanju funkcionalnih ćelija (izotopske kontrole nisu pokazale nikakvu inhibicijsku aktivnost u najvišoj koncentraciji koja je testirana na uzorcima)

Primer 4: Vezivanje mišjih anti-humanih IL-36R antitela za ćelije koje eksprimiraju IL-36R

Protokol za vezivanje antitela protočnom citometrijom

HEK293 ćelije koje su transficirane sa humanim IL-36R ili NCI/ADR-RES ćelijama pune dužine pasirane su propuštene 24 sata pre bojenja. Ćelije su uklonjene iz posuda ispiranjem sa 10 ml 5 mM EDTA u PBS, i potom inkubirane na 37<o>C 10 min uz dodatak dodatnih 10 ml 5 mM EDTA i 2.5 ml Accumax do deklump/disperzione ćelije. Antitela su potom razblažena do određenih koncentracija u PBS 2% BSA, i ćelije su inkubirane 20 min na sobnoj temperaturi. Višak antitela je potom isprano dodavanjem 200 Pl PBS i potom centrifugiran. Drugi reagens je potom dodat pri 50 Pl po bunarčLću i ćelije su inkubirane 15 min na sobnoj temperaturi i potom isprane kao što je prethodno navedeno. Ćelije su ponovo suspendovane u 200 Pl PBS i analizirane sa protočnom citometrijom. Vezujuće EC50za mišja anti-human IL-36R antitela koja se vezuju za humane IL-36R HEK transfektante su prikazane u Tabeli 4.

Tabela 4

Primer 5: Proizvodnja Humanizovanog IL-36R Antitela

U cilju da se smanji potencijalna imunogenost nakon davanja čoveku, mišja anti-humana IL-36R monoklonska antitela 81B4 i 73C5 su "humanizovana" kroz proces projektovanja i skrininga. Humane okvirne sekvence su odabrane za mišje odvode na osnovu homologije okvira, CDR strukture, sačuvanih kanonskih ostataka, sačuvanih interfejs pakiranih ostataka i ostalih parametara. Određena supstitucija amino kiselinskih ostataka u ovim okvirnim pozicijama može poboljšati različite aspekte performansi antitela uključujući afinitet vezanja i/ili stabilnosti, u odnosu na onaj demonstrirani u humanizovanim antitelima formiran sa "direktnom razmenom" CDRA ili HVLA u okvirima humanih germlinijskih regiona. Fabs koji su pokazali bolje ili jednako vezivanje i poboljšanu ekspresiju u poređenju sa himernim roditeljskim Fab su izabrani za dalju karakterizaciju. Reprezentativni humanizovani varijabilni regioni za antitelo 81B4 i 73C5 su prikazani u, prikazani su u opisnom delu. Na ovaj način, Antitelo B1 do Antitelo B6 su humanizovana antitela izvedena iz mišjeg antitela 81B4 (kloniranog u humani IgG1 KO (KO = knock-out) / kapa osnova. Antitela B1 do B6 su prikazana u Tabeli A. Antitelo C1 do Antitelo C3 su humanizovana antitela izvedena iz mišjeg antitela 73C5 (kloniran u humani IgG1-KO (KO = knock-out) / kapa osnova. Antitela C1 do C3 su prikazani u Tabeli C.

Primer 6: Vezivanje humanizovanih IL-36R antitela

Kinetička i vezujuća sposobnosti humanizovanih anti-IL-36R antitela koja se vezuju za rekombinantni human IL-36R su izmerene korišćenjem Proteon (Bio-Rad, Hercules, CA).

Humani IL-36R je imobilizovan na 5 različitih površinskih gustina i rezultati su analizirani korišćenjem opšteg podešavanja (videti Tabelu 5 koja pokazuje rezultate tri eksperimenta). Vezivanje humanizovanog antitela za NCI/ADR-RES ćelije putem protočne citometrije je izmereno korišćenjem protokola opisanog u Primeru 4 (Videti Tabelu 5 za EC90vrednosti).

Tabela 5 – Molekularne i Ćelijske sposobnosti vezivanja humanizovanih anti-humanih IL-36R antitela.

Primer 7: Potencijal humanizovanih anti-humanih IL-36R antitela u funkcionalnim humanim analizama

Funkcionalne blokade signalizacije sa humanizovanim IL-36R varijantama iz humanih NCI/ADR-RES ćelija su testirane kao što je opisano u Primeru 3. IC90rezultati za humanizovana anti-human IL-36R antitela u humanim funkcionalnim analizama (pNFNB i citokin otpuštanje) sa humanim IL-36 ligandima su prikazani u Tabeli 6.

Tabela 6: Potencijal [IC90(nM)] humanizovanog antitela u humanim funkcionalnim NCI/ADR-RES ćelijskim analizama

(Rezultati jednaki u proseku najmanje 2 eksperimenta. Kontrole izotopa nisu pokazale inhibicionu aktivnost u najvišoj koncentraciji koja je testirana na uzorcima)

Primer 8: Potencijal anti-IL-36R antitela u funkcionalnim humanim primarnim keratinocitnim analizama

Protokoli: Humane primarne epidermalne keratinocitne analize pNFkB/Citokin otpuštanje Ćelije su postavljene na 30,000 ćelija/bunarčiću u kulturnom medijumu na ploči sa 96 bunarčića i inkubirane preko noći na 37<o>C, 5% CO2.Analize su potom izvedene kao što je opisano u Primeru 3.

Rezultati: IC90rezultati za mišja, himerna, i humanizovana anti-IL-36R antitela u humanim primarnim keratinocitnim analizama (pNFkB i IL-8 otpuštanje) stimulisane sa humanim IL-36 ligandima su prikazani u Tabeli 7, Tabeli 8, i Tabeli 9, respektivno.

Tabela 7 (izotopske kontrole nisu pokazale nikakvu inhibitornu aktivnost u najvišoj koncentraciji koja je testirana na uzorcima)

Tabela 8: Potencijal himernih anti-IL-36R antitela u primarnim humanim keratinocitnim analizama

(izotopske kontrole nisu pokazale nikakvu inhibtornu aktivnost u najvišoj koncentraciji koja je testirana na uzorcima)

Tabela 9: Potencijal humanizovanih anti-IL-36R antitela u primarnim humanim keratinocitnim analizama

(izotopske kontrole nisu pokazale nikakvu inhibitornu aktivnost u najvišoj koncentraciji koja je testirana na uzorcima)

Primer 9 Potencijal anti-IL-36R antitela u funkcionalnim analizama humane primarne intestinalne epitelijalne ćelije

Protokoli: Analize otpuštanja humane primarne intestinanel epitelijalne ćelije pNFkB/Citokin

ûelije su postavljene na 30,000 ćelija/bunarčLću u kulturnom medijumu na ploči sa 96 bunarčLća i inkubirane preko noći na 37<o>C, 5% CO2.Analize su potom izvedene kao što je opisano u Primeru 3.

Rezultati: IC90rezultati za mišja anti-IL-36R antitela u primarnim analizama humane intestinalne epitelne ćelije (pNFkB i IL-8 otpuštanje) stimulisane sa humanim IL-36 ligandima su prikazani u Tabeli 10.

Tabela 10: Potencijal mišjeg anti-IL-36R antitela u primarnim analizama humane intestinalne epitelijalne ćelije

Primer 10: Potencijal anti-IL-36R antitela u funkcionalnim analizama humanog primarnog intestinalnog miofibroblasta

Protokoli: Analize otpuštanja humanog primarnog intestinalnog miofibroblasta pNFκB/Citokin

Rezultati: IC90rezultati za mišja anti-IL-36R antitela u primarnim analizama humane intestinalne epitelne ćelije (pNFkB i IL-8 otpuštanje) stimulisane sa humanim IL-36 ligandima su prikazani u Tabeli 11 i Tabeli 12.

Tabela 11: Potencijal mišjih i himerinih anti-IL-36R antitela u primarnim analizama humanog intestinalnog miofibroblasta

1

Tabela 12: Potencijal humanizovanih anti-IL-36R antitela u primarnim analizama humanog intestinalnog miofibroblasta

Primer 11: Potencijal anti-IL-36R antitela u funkcionalnim analizama humanog primarnog dermalnog fibroblasta

Protokoli: Analiza otpuštanja humanog primarnog dermalnog fibroblasta pNFκB/Citokin

Ćelije su postavljene na 30,000 ćelija/bunarčiću u kulturnom medijumu na ploči sa 96 bunarčića i inkubirane preko noći na 37<o>C, 5% CO2.Analize su potom izvedene kao što je opisano u Primeru 3.

Rezultati: IC90rezultati za anti-IL-36R antitela u analizama humanog dermalnog fibroblasta (pNFkB i IL-8 otpuštanje) stimulisana sa humanim IL-36 ligandima su prikazani u Tabeli 13 i Tabeli 14.

2

Tabela 13: Potencijal mišjih i himernih anti-IL-36R antitela u primarnim analizama humanog dermalnog fibroblasta

Tabela 14: Potencijal humanizovanih anti-IL-36R antitela u primarnim analizama humanog dermalnog fibroblasta

Primer 12: Potencijal mišjih anti-IL-36R antitela u funkcionalnim analizama humane primarne proksimalne tubularne ćelije

Protokol: Analiza otpuštanja humanih primarnih proksimalnih tubularnih ćelija pNFkB/Citokin.

Rezultati: IC90rezultati za mišja, himerna, i humanizovana anti-IL-36R antitela u analizi humane primarne proksimalne tubularne ćelije (IL-8 otpuštanje) stimulisana sa humanim IL-36 ligandima su prikazani u Tabeli 15.

Tabela 15: Potencijal mišjih i humanih anti-IL-36R antitela u primarnoj analizi humane proksimalne tubularne ćelije

Primer 13: Inhibicija IL-8 proizvodnje iz IL-36J stimulisanih rekonstruisanih humanih epiderma

Protokol rekonstruisanih epiderma

Anti-IL-36R antitela (1.5 µg/ml) su prethodno inkubirana sa rekonstruisanim humanim epidermima i stimulisana sa humanim rekombinantnim IL-36γ (20 ng/ml). Rekombinantni humani IL-1β (20 ng/ml; R & D Systems) je korišćen kao pozitvna kontrola. Posle 24 sata u kulturi, ćelijski supernatanti su sakupljeni i testirani na IL-8 (testovi za IL-8 su opisani u Primeru

4

3). Uzorci su testirani u tri primerka i prosečna pg / ml ± standardna greška je prikazana u tabeli ispod (Tabela 16).

Tabela 16

Primer 14: Inhibicija IL-36 liganda indukovanog S100A7 i S100A12 genske ekspresije u rekonstruisanim humanim epidermima

Stimulacija rekonstruisane humane epiderme sa agensitnim IL-36 ligandima indukuje ekspresiju gena S100A7 i S100A12. S100A7 i S100A12 su geni smešteni unutar epidrmalnog diferencijalnog kompleksa.

Protokol: Rekonstruisani humani epidermi su inkubirani sa anti-IL-36R antitelima (1.5 µg/ml) i stimulisani sa humanim rekombinantnim IL-36γ (20 ng/ml). Rekombinantni humani IL-1β (20 ng/mL; R & D Systems) je korišćen kao pozitivna kontrola. Posle 24 sata u kulturi na 5% CO2 i 37 °C, RNK je izolovan iz rekonstruisanih humanih epidermisa i testirana je na gensku ekspresiju reakcijom reverzne transkriptaze-polimeraze u realnom vremenu. Relativna ekspresija je izračunata korišćenjem 2<ΔΔCt>metode. Uzorci su testirani u tri primerka, a prosečna ekspresija ± standardna greška je priakzana u tabeli ispod (Tabela 17).

Primer 15: Efikasnost anti-IL-36R antitela u Ksenotransplantnom Modelu Psoriaze

Protokol: Krv i biopsija ne-lezije kože su dobijene od 24 pacijenta sa psorijazom kojima su klinički dijagnostikovane dermatologijom. Kožne biopsije su presađene na imuno deficijentne NIH-III miševe i kojima je dozvoljeno da se presade za period od četiri do pet nedelja.

Periferne mononuklearne ćelije krvi (PBMC) su izolovane iz krvi prikupljene od svakog davaoca u vreme biopsije radi intradermalne injekcije u engraftovanu kožu. Pre injekcije, PBMC su stimulisane pomoću 1 ȝg/ml Staphilococcal Enterotoxin B (Toxin Technologies, Florida, USA) i 80 U/ml humanog rekombinantnog IL-2 (Peprotech Inc., Oosterhout, The Neterlis). Autologni PBMC su intradermalno ubrizgani sa 7.5 x 10^5 ćelija u PBS kako bi sinhronizovali indukciju zapaljenje kože i fenotip psorijaze. Tri nedelje nakon ubrizgavanja ćelija, biopsije su uzete iz miševa i analizirane histologijom.

Histološko bojenje je izvršeno na krio-očuvanom tkivu kože svih grupa. Dijagonalni preseci (8 ȝm), koji pokrivaju sve slojeve kože, pripremljeni su kao što je opisano na Slici 4. Za procenu debljine epiderme, dva neserijska odeljka su nasumično izabrana iz središta biopsije i obojena hematoksilin-eozinom. Posle toga, odeljci su procenjeni na 100-fold uvećanja. Tokom čitave dužine biopsije, dužine grebena su merene u oba dela pomoću Olympus DP71 kamere i Cell^D imaging softvera (V2.7, Munster, Germany). Dužina grebena je definisana kao: udaljenost između gornje ivice granulatnog sloja do dna grebena. Biopsije su nasumično zabeležene i na slepi način.

Rezultati za prosečnu debljinu epiderma i maksimalnu debljinu epiderma za svaku lečenu grupu su prikazani u Tabeli 18. Rezultati za neto promenu debljine epiderma u svakoj grupi za lečenje prikazani su u Tabeli 19.

Tabela 18

Tabela 19

Primer 16: Subhronična plućna upala nakon 3 nedelje izlaganja cigaretnim dimom kod divljeg tipa i interleukin-1 receptorima sličnim 2 homozigotnim knockout miševima

Protokol: Miševi divljeg tipa ili interleukin-1 receptori slični 2 mišu su bili izloženi cigaretnom dimu tokom 3 nedelje da bi izazvali plućne tegobe. Nedelje 1 i 2 sastojali su se od 5 uzastopnih dana izloženosti, dok su miševi bili izloženi 4 dana zaredom tokom nedelje 3. Miševi su bili izloženi 5 cigareta svaki dan sa intervalima od 24 minute izlaganja cigareti (16 minuta) i svežem vazduhu (8 minuta). Osamnaest sati nakon konačne izloženosti, miševi su isprani sa 2 x 0.8 ml Hank-ovog slanog rastvora (0.6 mM EDTA). Peleta supernatanta i ćelije su sakupljene iz bronhalnog alveolarnog ispiranja nakon centrifugiranja tokom 10 minuta. Ukupni broj ćelija makrofaga i neutrofila u bronhijalnom alveolarnom ispiranju za svaku grupu izloženosti prikazan je u Tabeli 20.

Tabela 20

1

11

12

1

14

1

11

12

1

11

12

1

14

1

14

1

11

12

1

14

1

11

12

1

14

1

�

1

�

1

11

12

�

14

�

1

�

1

11

12

�

��

1

�

1

�

11

��

�

14

�

1

�

2

21

22

2

��

�

2

�

2

21

22

Claims

Patentni zahtevi

1. Anti-IL-36R antitelo ili njegov antigenski vezujući fragment koji sadrži:

a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80, i

b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88 ili SEQ ID NO: 89.

2. Anti-IL-36R antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118 i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 125.

3. Anti-IL-36R antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118 i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 126.

4. Anti-IL-36R antitelo prema zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži laki lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118 i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127.

5. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili antigenski vezujući frgament prema bilo kom od zahteva 1 do 4 i farmaceutski prihvatljivi nosač.

6. Antitelo ili antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 5, za primenu u medicini.

7. Antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 6, gde primena u medicini je primena u postupku za lečenje inflamatornog oboljenja, autoimunog oboljenja, respiratornog oboljenja, metaboličkog poremećaja, epitelialni posredovani inflamatorni poremećaj, fibroza ili kancer.

8. Antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija za primenu prema zahtevu 6 ili 7, gde primena u medicini je primena u postupku za lečenje psorijaze, inflamatornog oboljenja creva, psorijatičnog artritisa, multipla skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme ili ankiloznog spondilitisa.

22

9. Antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od zahteva 6 do 8, gde primena u medicini je primena u postupku za lečenje inflamatornog oboljenja creva.

10. Antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od zahteva 6 do 9, gde primena u medicini je primena u postupku za lečenje Kronovog oboljenja.

11. Antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od zahteva 6 do 9, gde primena u medicini je primena u postupku za lečenje ulcerativnog kolitis oboljenja.

12. Antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od zahteva 6 do 8, gde primena u medicini je primena u postupku za lečenje palmoplantarne pustuloze.

13. Antitelo ili antigenski vezujući fragment ili farmaceutska kompozicija za primenu prema bilo kom od zahteva 6 do 8, gde primena u medicini je primena u postupku za lečenje opšte pustularne psorijaze.

14. Izolovani polinukleotid koji sadrži sekvencu koja kodira anti-IL-36R antitelo ili antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4, poželjno DNK ili RNK sekvencu.

15. Izolovani polinukleotid prema zahtevu 14, koji kodira

(a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 80, i varijabilni region teškog lanca koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 87, 88 ili 89, ili

(b) laki lanac i teški lanac koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO:125, respektivno; SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 126, respektivno; ili SEQ ID NO: 118 i SEQ ID NO: 127, respektivno.

16. Vektor koji sadrži polinukleotid prema zahtevu 14 ili 15, poželjno ekspresioni vektor, naročito poželjni vektor koji sadrži polinukleotid prema pronalasku u funkcionalnoj vezi sa ekspresionom kontrolnom sekvencom.

17. ûelija domaćina koja sadrži polinukleotid prema zahtevu 14 ili 15, i/ili vektor prema zahtevu 16.

18. Postupak za proizvodnju anti-IL-36R antitela ili antigenskog vezujućeg fragmenta prema bilo kom od zahteva 1 do 4, poželjno rekombinantni postupak proizvodnje koji obuhvata primenu polinukleotida prema zahtevu 14 ili 15, i/ili vektora prema zahtevu 16 i/ili ćelije domaćina prema zahtevu 17.

19. Postupak prema zahtevu 18, koji sadrži korak (a) kultivacije ćelije domaćina pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju anti-IL-36R antitela ili antigenskog vezujućeg fragmenta i (b) oporavak anti-IL-36R antitela ili antigenskog vezujućeg fragmenta.

20. Dijagnostički kit koji sadrži anti-IL-36R antitelo ili antigenski vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 4.

21. Dijagnostički kit prema zahtevu 20, za primenu u postupku in vivo dijagnoze inflamatornog oboljenja, autoimunog oboljenja, respiratornog oboljenja, metaboličkog poremećaja, epitelialno posredovanog inflamatornog poremećaja, fibroze, kancera, psorijaze, inflamatornog oboljenja creva, psorijatičnog artritisa, multipla skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme, ankiloznog spondilitisa, Kronovog oboljenja, ili ulcerativnog kolitis oboljenja.

22. Ex vivo dijagnostički postupak koji sadrži primenu anti-IL-36R antitela ili antigenskog vezujućeg fragmenta prema bilo kom od zahteva 1 do 4.

23. Ex vivo dijagnostički postupak prema zahtevu 22, za dijagnozu inflamatornog oboljenja, autoimunog oboljenja, respiratornog oboljenja, metaboličkog poremećaja, epitelialno posredovanog inflamatornog poremećaja, fibroze, kancera, psorijaze, inflamatornog oboljenja creva, psorijatičnog artritisa, multipla skleroze, reumatoidnog artritisa, COPD, hronične astme, ankiloznog spondilitisa, Kronovog oboljenja, ili ulcerativnog kolitis oboljenja.

2