RS59537B1 - Bcma himerni antigenski receptori - Google Patents

Bcma himerni antigenski receptori

Info

Publication number
RS59537B1
RS59537B1 RS20191327A RSP20191327A RS59537B1 RS 59537 B1 RS59537 B1 RS 59537B1 RS 20191327 A RS20191327 A RS 20191327A RS P20191327 A RSP20191327 A RS P20191327A RS 59537 B1 RS59537 B1 RS 59537B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
cell
car
vector
promoter
Prior art date
Application number
RS20191327A
Other languages
English (en)
Inventor
Richard Morgan
Kevin Friedman
Original Assignee
Bluebird Bio Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bluebird Bio Inc filed Critical Bluebird Bio Inc
Publication of RS59537B1 publication Critical patent/RS59537B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4214—Receptors for cytokines
    • A61K40/4215—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Description

Opis
OSNOV PRONALASKA
Oblast tehnike
[0001] U ovom tekstu opisuju se poboljšane kompozicije i metodi lečenja stanja u vezi sa B ćelijama. Tačnije, objavljuju se poboljšani himerni antigenski receptori (chimeric antigen receptors, CAR) koji uključuju mišja anti-BCMA antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente, imunske efektorske ćelije genetički modifikovane da eksprimiraju te CAR, i upotreba ovih kompozicija za efikasno lečenje stanja u vezi sa B ćelijama.
Opis stanja tehnike u vezi sa pronalaskom
[0002] Nekoliko značajnih oboljenja vezano je za B limfocite, tj., B ćelije. Nenormalna fiziologija B ćelija može dovesti do razvoja imunskih oboljenja uključujući, ali ne ograničavajući se na sistemski eritemski lupus (systemic lupus erythematosus, SLE). Maligna transformacija B ćelija dovodi do kancera uključujući, ali ne ograničavajući se na limfome, npr., multipli mijelom i ne-Hodgkinov limfom.
[0003] Velika većina pacijenata koji imaju malignitete B ćelija, uključujući ne-Hodgkinov limfom (non-Hodgkin’s lymphoma, NHL) i multipli mijelom (multiple myeloma, MM), značajno doprinose broju smrtnih slučajeva usled kancera. Maligniteti B ćelija raznovrsno odgovaraju na različite oblike lečenja. Korist od tradicionalnih metoda lečenja B ćelijskih maligniteta, koji uključuju hemoterapiju i radioterapiju, ograničena je zbog sporednih toksičnih efekata. Imunoterapija koja podrazumeva korišćenje anti-CD19, anti-CD20, anti-CD22, anti-CD23, anti-CD52, anti-CD80 i anti-HLA-DR terapijskih antitela imala je ograničen uspeh, delom zbog lošeg farmakokinetičkog profila, brze eliminacije antitela serumskim proteazama i filtracijom na nivou glomerulusa, i ograničenog prodiranja na mesto tumora i nivoa ekspresije ciljnih antigena na kancerskim ćelijama. Pokušaji korišćenja genetički modifikovanih ćelija koje eksprimiraju himerne antigenske receptore (CAR) takođe se susrela sa ograničenim uspehom. Pored toga, terapijska efikasnost datog antigen-vezujućeg domena upotrebljenog u CAR je nepredvidljiva: ako se antigen-vezujući domen vezuje suviše snažno, CAR T ćelije indukuju masivno oslobađanje citokina što za rezultat ima potencijalno fatalnu imunsku reakciju označenu kao "citokinska oluja", a ako se antigen-vezujući domen vezuje suviše slabo, CAR T ćelije ne ispoljavaju dovoljnu terapijsku efikasnost u eliminisanju ćelija kancera.
[0004] WO 2013/154760 A1, Carpenter, R.O. et. al., Clin Cancer Res, vol. 19, br. 8, 2048-2060 (2013) i Wang, X, et. al., Blood, vol. 124, br. 21, apstrakt 1114 (2014) svi objavljuju polinukleotide koji kodraju anti-BCMA-CAR.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0005] U prvom aspektu pronalaska obezbeđuje se polinukleotid koji kodira CAR, pri čemu je polinukleotidna sekvenca navedena u SEQ ID NO: 10.
[0006] Poželjni primeri izvođenja pronalaska u svakom od svojih različitih aspekata su kako je opisano u nastavku ovog teksta ili kako je definisano u patentnim zahtevima, ispod.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0007]
Slika 1 šematski prikazuje konstrukte maturacioni antigen mišjih B ćelija (murine B cell maturation antigen, muBCMA)-CAR.
Slika 2a prikazuje količinu IFNg oslobođenog iz anti-BCMA02 CAR T ćelija, anti-BCMA10 CART ćelija i CAR19Δ T ćelija pošto su ćelije bile 24 sata kokultivisane sa K562 ćelijama koje eksprimiraju BCMA.
Slika 2b prikazuje količinu IFNg oslobođenog anti-BCMA02 CAR T ćelija, anti-BCMA10 CART ćelija i CAR19Δ T ćelija pošto su ćelije bile 24 sata kokultivisane sa K562 ćelijama koje nisu eksprimirale BCMA u poređenju sa K562 ćelijama koje eksprimiraju BCMA.
Slika 3 prikazuje količinu inflamatornih citokina u medijumu za rast netransdukovanih kontrolnih T ćelija, anti-BCMA02 CAR T ćelija, anti-BCMAlO CART ćelija i CAR19Δ T ćelija, stimulisanih 10 dana pre testa.
Slika 4 prikazuje količinu inflamatornih citokina koje su proizvele anti-BCMA02 CAR T ćelije, anti-BCMAlO CART ćelije i CAR19Δ T ćelije u odsustvu stimulacije antigenom.
Slika 5 prikazuje ekspresiju fenotipskih markera aktivacije na kraju proizvodnje anti-BCMA CAR T ćelija. Ekspresija HLA-DR i CD25 merena je u anti-BCMA02 CAR T ćelijama, anti-BCMAlO CAR T ćelijama i CAR19Δ T ćelijama.
Slika 6 prikazuje nivoe aktivirane kaspaze-3, neophodnog koraka u apoptozi i važnoj za AICD, u anti-BCMA10 CAR T ćelijama i anti-BCMA02 CAR T ćelijama u odsustvu stimulacije antigenom.
Slika 7 prikazuje količinu oslobađanja inflamatornih citokina u anti-BCMA02 i anti-BCMA10 CAR T ćelijama u medijumu koji sadrži fetalni goveđi serum (fetal bovine serum, FBS), humani AB serum (HABS), ili 100 ng/ml solubilnog BCMA.
Slika 8A prikazuje zapreminu tumora kod NOD scid gama (NSG) miševa koji nose eksperimentalni subkutani humani multipli mijelom (RPMI-8226) zapremine ∼100 mm3. Miševi su tretirani prenosnikom, anti-BCMA02 CAR T ćelijama u količini od 107, anti-BCMAlO CAR T ćelijama u količini od 10<7>, ili bortezomibom (Velcade).
Slika 8B prikazuje zapreminu tumora kod NOD scid gama (NSG) miševa koji nose eksperimentalni subkutani humani multipli mijelom (RPMI-8226) zapremine ∼100 mm<3>. Miševi su tretirani prenosnikom, anti-BCMA02 CAR T ćelijama u količini od 107, anti-BCMAlO CAR T ćelijama u količini od 10<7>, ili bortezomibom (Velcade).
Slika 9 prikazuje nivo ekspresije BCMA na ćelijskim linijama limfoma i leukemije (krugovi) i aktivnost anti-BCMA CAR T ćelija prema svakoj od ćelijskih linija (oslobađanje IFNγ, kvadratići). BCMA-negativne (BCMA-) tumorske ćelijske linije: mijelogena leukemija (K562), akutna limfoblastna leukemija (NALM-6 i NALM-16); limfom plaštanih ćelija (REC-1); ili Hodgkinov limfom (HDLM-2), pokazuju malo ili nimalo oslobađanja IFNγ. BCMA-pozitivne (BCMA<+>) tumorske ćelijske linije: hronična limfoblastna leukemija B ćelija (MEC-1), limfom plaštanih ćelija (JeKo-1), Hodgkinov limfom (RPMI-6666), Burkittov limfom (Daudi ćelije i Ramos ćelije) i multipli mijelom (RPMI-8226), pokazuju značajno oslobađanje IFNγ.
Slika 10A prikazuje in vivo aktivnost prenosnika, anti-CD19Δ CAR T ćelija, anti-CD 19 CAR T ćelija i anti-BCMA CAR T ćelija prema BCMA-eksprimirajućim ćelijama Burkittovog limfoma (Daudi ćelije) u NSG mišjem modelu kada se CAR T ćelije administriraju miševima 8 dana posle indukovanja tumora.
Slika 10B prikazuje in vivo aktivnost prenosnika, anti-CD19Δ CAR T ćelija, anti-CD19 CAR T ćelija i anti-BCMA CAR T ćelija prema BCMA-eksprimirajućim ćelijama Burkittovog limfoma (Daudi ćelije) u NSG mišjem modelu kada se CAR T ćelije administriraju miševima 18 dana posle indukovanja tumora.
Slika 11 prikazuje snažnu in vitro aktivnost anti-BCMA CAR T ćelija postignutu uz 50-postotnu redukciju ekspresije anti-BCMA CAR. (A) Populacije T ćelija bile su transdukovane korišćenjem između 4x10<8>i 5x10<7>transdukujućih jedinica lentivirusa koji kodira anti-BCMA CAR molekul (MOI od 5 do 40). Dobijene populacije T ćelija normalizovane su da sadrže 26 ± 4% anti-BCMA CAR-pozitivnih T ćelija. (B) MFI normalizovanih anti-BCMA CAR T ćelija u opsegu od 885 do 1875, testirano protočnom citometrijom. (C) K562 ćelije i K562-BCMA ćelije kokultivisane sa normalizovanim anti-BCMA CAR T ćelijama pri odnosu 20:1 ili 10:1 efektora (E; T ćelija) prema cilju (T; 1:1 mešavina K562 i K562 BCMA ćelija) pokazale su uporedivu citolitičku aktivnost.
Slika 12 prikazuje pouzdanost procesa proizvodnje anti-BCMA CAR T ćelija. (A) anti-BCMA CAR T ćelijski proizvodi izrađeni od PBMC poreklom iz 11 pojedinačnih donora pokazuju uporedive nivoe ekspanzije u odnosu na paralelne kulture netransdukovanih donorskih T ćelija. (B) anti-BCMA CAR T ćelijski proizvodi izrađeni od 11 donora pokazali su uporedivu efikasnost lentivirusne transdukcije (lentiviral transduction efficiency, VCN). (C) Frekvencija anti-BCMA CAR pozitivnih T ćelija merena je protočnom citometrijom i nađeno je da je ekspresija BCMA bila uporediva kod svih donora. (D) anti-BCMA CAR T ćelijski proizvodi izrađeni od 11 donora pokazali su terapijski relevantne nivoe oslobađanja IFNγ kada su bili izloženi BCMA-eksprimirajućim K562 ćelijama.
Slika 13 prikazuje Vennove dijagrame koekspresije CD127, CD197 i CD38 u CD62L pozitivnim anti-BCMA02 T ćelijama kultivisanim u prisustvu IL-2 ili IL-2 i ZSTK474 tokom deset dana. Anti-BCMA02 CAR T ćelije tretirane korišćenjem ZSTK474 pokazale su porast procenta ćelija koje koeksprimiraju CD127, CD197 i CD38 u poređenju sa anti-BCMA CAR T ćelijama kultivisanim u prisustvu samo IL-2.
Slika 14 prikazuje porast procenta CD8-eksprimirajućih anti-BCMA02 CAR T ćelija u kulturama tretiranim korišćenjem IL-2 i ZSTK474 (n=7) u poređenju sa kulturama tretiranim korišćenjem samo IL-2. Ekspresija CD8 određivana je uz upotrebu fluorescentno obeleženog anti-CD8 antitela i protočne citometrije.
Slika 15 prikazuje količinu IFN-γ oslobođenog iz anti-BCMA02 CAR T ćelija, iz 14 donora posle kultivisanja u prisustvu samo IL-2 ili IL-2 i ZSTK474. Na kraju perioda kultivacije, ekvivalentan broj anti-BCMA02 CAR T ćelija je rekultivisan tokom 24 sata, samo u medijumu. Količina IFN-γ oslobođenog tokom 24 sata kvantifikovana je pomoću ELISA. Kultivisanje u ZSTK474 nije značajno povisilo tonično oslobađanje citokina iz anti-BCMA02 CAR T ćelija u poređenju sa anti-BCMA02 CAR T ćelijama kultivisanim samo u prisustvu IL-2.
Slika 16 prikazuje antitumorsku aktivnost anti-BCMA02 CAR T ćelija tretiranih korišćenjem IL-2, ili IL-2 i ZSTK474, ili usled skraćivanja signalnog domena signalno deficijentnih anti-BCMA02 (tBCMA02) CAR T ćelija tretiranih korišćenjem IL-2 i ZSTK474 u modelu agresivnog Daudi tumora. Potpuna regresija tumora zapažena je kod 50% miševa kod kojih su primenjene anti-BCMA02 CAR T ćelije tretirane IL-2 i ZSTK474.
Slika 17 prikazuje antitumorsku aktivnost anti-BCMA02 CAR T ćelija tretiranih IL-2, ili IL-2 i ZSTK474 u tumorskom modelu multiplog mijeloma (RPMI-8226). Kod životinja tretiranih IL-2- ili IL-2 i ZSTK474-kultivisanim anti-BCMA02 CAR T ćelijama potpuno je preveniran rast tumora.
KRATAK OPIS IDENTIFIKATORA SEKVENCI
[0008]
SEQ ID NO: 1-3 prikazuju aminokiselinske sekvence primera CDR sekvenci lakog lanca za BCMA CAR razmatrane u ovom tekstu.
SEQ ID NO: 4-6 prikazuju aminokiselinske sekvence primera CDR sekvenci teškog lanca za BCMA CAR razmatrane u ovom tekstu.
SEQ ID NO: 7 prikazuje aminokiselinsku sekvencu primera sekvenci lakog lanca BCMA CAR razmatranih u ovom tekstu.
SEQ ID NO: 8 prikazuje aminokiselinsku sekvencu primera sekvenci teškog lanca za BCMA CAR razmatranih u ovom tekstu.
SEQ ID NO: 9 prikazuje aminokiselinsku sekvencu primera BCMA CAR razmatranu u ovom tekstu.
SEQ ID NO: 10 prikazuje polinukleotidnu sekvencu koja kodira primer BCMA CAR razmatran u ovom tekstu.
SEQ ID NO: 11 prikazuej aminokiselinsku sekvencu humanog BCMA.
SEQ ID NO: 12-22 prikazuju aminokiselinske sekvence različitih linkera.
SEQ ID NO: 23-35 prikazuju aminokiselinske sekvence mesta sečenja proteazom i mesta sečenja samoisecajućim polipeptidom.
SEQ ID NO: 36 prikazuje polinukleotidnu sekvencu vektora koji kodira BCMA CAR.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
A. PREGLED
[0009] U ovom tekstu opisuju se poboljšane kompozicije i metodi za lečenje stanja povezanih sa B ćelijama. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "stanja povezana sa B ćelijama" odnosi se na stanja koja uključuju neodgovarajuću aktivnost B ćelija i malignitete B ćelija.
[0010] Posebno, objava se odnosi na poboljšanu adoptivnu ćelijsku terapiju stanja povezanih sa B ćelijama korišćenjem genetički modifikovanih imunskih efektorskih ćelija. Genetički pristupi nude potencijalne načine pojačavanja imunskog prepoznavanja i eliminacije kancerskih ćelija. Obećavajuću strategiju predstavlja genetičko inženjerisanje imunskih efektorskih ćelija da eksprimiraju himerne antigenske receptore (CAR) koji preusmeravaju citotoksičnost prema kancerskim ćelijama. Međutim, postojeće adoptivne ćelijske imunoterapije za lečenje poremećaja B ćelija nose ozbiljan rizik za kompromitovanje humoralnog imuniteta zbog toga što ćelije ciljaju antigene koji se nalaze na svim ili na većini B ćelija. Prema tome, takve terapije nisu klinički poželjne i, dakle, u struci postoji potreba za efikasnijim terapijama stanja povezanih sa B ćelijama, koje će očuvati humoralni imunitet.
[0011] Poboljšane kompozicije i metodi adoptivne ćelijske terapije objavljeni u ovom tekstu, obezbeđuju genetički modifikovane imunske efektorske ćelije koje lako mogu da se ekspandiraju, koje ispoljavaju dugotrajnu perzistenciju in vivo, i u manjoj meri ometaju humoralni imunitet time što ciljaju B-ćelijsku ekspresiju antigena maturacije B ćelija (B cell maturation antigen, BCMA, poznat i kao CD269 ili član 17 superfamilije receptora faktora nekroze tumora (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 17; TNFRSF17).
[0012] BCMA je član superfamilije receptora faktora nekroze tumora (vidi, npr., Thompson et al., J. Exp. Medicine, 192(1): 129-135, 2000, i Mackay et al., Annu. Rev. Immunol, 21: 231-264, 2003. BCMA se vezuje za faktor koji aktivira B ćelije (B-cell activating factor, BAFF) i ligand koji indukuje proliferaciju (proliferation inducing ligand, APRIL) (vidi, npr., Mackay et al., 2003 and Kalled et al., Immunological Reviews, 204: 43-54, 2005). Saopšteno je da se među nemalignim ćelijama BCMA eksprimira uglavnom u plazma-ćelijama i podgrupama zrelih B-ćelija (vidi, npr., Laabi et al., EMBO J., 77(1): 3897-3904, 1992; Laabi et al., Nucleic Acids Res., 22(7): 1147-1154,, 1994; Kalled et al., 2005; O’Connor et al., J. Exp. Medicine, 199(1): 91-97, 2004; i Ng et al., J. Immunol., 73(2): 807-817, 2004). Miševi deficijentni u BCMA zdravi su i imaju normalan broj B ćelija, ali preživljavanje dugoživećih plazma-ćelija je ometeno (vidi, npr., O’Connor et al., 2004; Xu et al., Mol. Cell. Biol, 21(12): 4067-4074, 2001; i Schiemann et al., Science, 293(5537): 2 111-21 14, 2001). BCMA RNK bila je univerzalno detektovana u ćelijama multiplog mijeloma kao i u drugim limfomima, a nekoliko istraživača je detektovalo BCMA protein na površini plazma-ćelija pacijenata obolelih od multiplog mijeloma (vidi, npr., Novak et al., Blood, 103(2): 689-694, 2004; Neri et al., Clinical Cancer Research, 73(19): 5903-5909, 2007; Bellucci et al., Blood, 105(10): 3945-3950, 2005; i Moreaux et al., Blood, 703(8): 3148-3157, 2004.
[0013] CAR koji uključuju sekvence mišjeg anti-BCMA antitela mogu biti visokoefikasni u poređenju sa BCMA CAR koji uključuju određene sekvence humanih antitela; mogu podleći robusnoj ekspanziji in vivo; i prepoznati humane B ćelije koje eksprimiraju BMCA; mogu pokazati citotoksičnu aktivnost protiv BCMA-eksprimirajućih B ćelija; i mogu pokazati znake indukovanja "oluje citokina", potencijalno fatalnog stanja u kojem citokini oslobođeni iz aktiviranih T ćelija dovode do iznenadnog inflamatornog odgovora u sistemu, koji daje neinfektivnu groznicu.
[0014] Preciznije, obezbeđen je CAR koji uključuje mišje anti-BCMA antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, transmembranski domen i jedan ili više unutarćelijskih signalnih domena.
[0015] Posebno, obezbeđena je imunska efektorska ćelija genetički modifikovana da eksprimira CAR razmatran u ovom tekstu. T ćelije koje eksprimiraju CAR u ovom tekstu su označene kao CAR T ćelije ili CAR-modifikovane T ćelije.
[0016] Genetički modifikovane imunske efektorske ćelije razmatrane u ovom tekstu mogu se primeniti kod pacijenta koji ima stanje vezano za B ćelije, npr., autoimunsko oboljenje udruženo sa B ćelijama, ili malignitet B ćelija.
[0017] U izvođenju predmetnog pronalaska koristiće se, ukoliko specifično nije napomenuto drugačije, konvencionalni metodi hemije, biohemije, organske hemije, molekularne biologije, mikrobiologije, tehnika rekombinantne DNK, genetike, imunologije i ćelijske biologije, koji su u okvirima osposobljenosti stručnjaka u oblasti, a mnogi od njih su detaljno opisani u nastavku teksta, u svrhu ilustracije. Takve tehnike u potpunosti su objašnjene u literaturi. Vidi, npr., Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition, 2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, obnovljeno jula 2008); Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Glover, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, Techniques for the Analysis of Complex Genomes, (Academic Press, New York, 1992); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, Eds., 1984); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) Current Protocols in Immunology Q. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); Annual Review of Immunology; kao i monografije u žurnalima kao što je Advances in Immunology.
B. DEFINICIJE
[0018] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju značenje koje uobičajeno prepoznaju prosečno obučeni stručnjaci u oblasti. Iako se metodi i materijali slični ili ekvivalentni opisanim u ovom tekstu mogu koristiti u izvođenju ili testiranju predmetne objave, poželjni primeri izvođenja kompozicija, metoda i materijala opisani su u ovom tekstu. Za potrebe predmetne objave, u nastavku su definisani izrazi koji slede.
[0019] Izrazi upotrebljeni u ovom tekstu koriste se da označe jedan ili više od jednog (tj., najmanje jedan ili jedan do više) gramatičkih objekata teksta. Na primer, "element" znači jedan element ili jedan ili više elemenata.
[0020] Upotrebu alternative (npr., "ili") treba razumeti tako da označava jedan, oba ili bilo koju kombinaciju alternativa.
[0021] Izraz "i/ili" treba razumeti tako da označava jednu ili obe alternative.
[0022] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "oko" ili "približno" odnosi se na količinu, nivo, vrednost, broj, frekvenciju, procenat, dimenziju, veličinu, iznos, težinu ili dužinu koja varira za 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ili 1% u odnosu na referentnu količinu, nivo, vrednost, broj, frekvenciju, procenat, dimenziju, veličinu, iznos, težinu ili dužinu. Izraz "oko" ili "približno" može označavati raspon količine, nivoa, vrednosti, broja, frekvencije, procenta, dimenzije, veličine, iznosa, težine ili dužine ± 15%, ± 10%, ± 9%, ± 8%, ± 7%, ± 6%, ± 5%, ± 4%, ± 3%, ± 2%, ili ± 1% od referentne količine, nivoa, vrednosti, broja, frekvencije, procenta, dimenzije, veličine, iznosa, težine ili dužine.
[0023] U ovoj specifikaciji, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reči "uključiti", "uključuje" i "koji uključuje" podrazumevaju uključivanje navedenog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata, a ne isključivanje nekog drugog koraka ili elementa ili grupe koraka ili elemenata. Pod "sastoji se od" misli se na "uključuje" i "ograničava se na", zavisno od onoga što sledi posle izraza "sastoji se od". Prema tome, izraz "sastoji se od" ukazuje na to da su navedeni elementi neophodni ili obavezni i da nema prisutnih drugih elemenata. Pod "sastoji se suštinski od" misli se na uključenost svakog od elemenata navedenih posle izraza i ograničava se na druge elemente koji ne interferiraju ili ne doprinose aktivnosti ili dejstvu specifikovanim u objavi za navedene elemente. Prema tome, izraz "sastoji se suštinski od" ukazuje na to da su navedeni elementi neophodni ili obavezni, ali da nisu prisutni drugi elementi koji materijalno utiču na aktivnost ili dejstvo navedenih elemenata.
[0024] U ovoj specifikaciji, upućivanje na "jedan primer izvođenja", "primer izvođenja", "poseban primer izvođenja", "srodan primer izvođenja", "određeni primer izvođenja", "dodatni primer izvođenja" ili "još jedan primer izvođenja" ili njihove kombinacije znače da su određena osobina, struktura ili karakteristika opisane u vezi sa primerom izvođenja uključene u najmanje jedan primer izvođenja predmetnog pronalaska. Prema tome, pojavljivanje gornjih izraza na različitim mestima u ovoj specifikaciji ne mora se odnositi na isti primer izvođenja. Pored toga, određene osobine, strukture, ili karakteristike mogu biti kombinovane na bilo koji pogodan način u jednom ili više primera izvođenja. Isto tako, treba razumeti da pozitivno navođenje osobine u jednom primeru izvođenja služi kao osnov za isključivanje osobine u određenom primeru izvođenja.
C. HIMERNI ANTIGENSKI RECEPTORI
[0025] Obezbeđeni su genetički inženjerisani receptori koji preusmeravaju citotoksičnost imunskih efektorskih ćelija ka B ćelijama. Ovi genetički inženjerisani receptori u ovom tekstu označeni su kao himerni antigenski receptori (CAR). CAR su molekuli koji kombinuju specifičnost prema željenom antigenu (npr., BCMA) baziranu na antitelima sa T ćelijskim receptor-aktivirajućim unutarćelijskim domenom, da bi se stvorio himerni protein koji ispoljava specifičnu anti-BCMA ćelijsku imunsku aktivnost. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "himerni" opisuje sačinjenost od delova različitih proteina ili DNK različitog porekla.
[0026] CAR koji se razmatraju u ovom tekstu, uključuju vanćelijski domen (označen i kao vezujući domen ili antigen-specifični vezujući domen) koji se vezuje za BCMA, transmembranski domen i unutarćelijski signalni domen. Vezivanje anti-BCMA antigenvezujućeg domena CAR sa BCMA na površini ciljne ćelije za rezultat ima grupisanje CAR i dostavu aktivacionog stimulusa CAR-sadržavajućoj ćeliji. Glavna karakteristika CAR je njihova sposobnost da preusmere specifičnost imunske efektorske ćelije, čime pokreću proliferaciju, proizvodnju citokina, fagocitozu ili proizvodnju molekula koji mogu da posreduju u ćelijskoj smrti ciljne antigen-eksprimirajuće ćelije na način nezavisan od glavnog kompleksa histokompatibilnosti (major histocompatibility complex, MHC), koristeći sposobnosti ćelijski specifičnog ciljanja monoklonskih antitela, solubilnih liganda ili ćelijskih specifičnih koreceptora.
[0027] CAR može uključivati vanćelijski vezujući domen koji uključuje mišji anti-BCMA-specifični vezujući domen; transmembranski domen; jedan ili više unutarćelijskih kostimulatornih signalnih domena; i primarni signalni domen.
[0028] CAR može uključivati vanćelijski vezujući domen koji uključuje mišje anti-BCMA antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment; jedan ili više zglobnih domena ili spejserskih domena; transmembranski domen; jedan ili više unutarćelijskih kostimulatornih signalnih domena; i primarni signalni domen.
1. VEZUJUĆI DOMEN
[0029] CAR razmatrani u ovom tekstu mogu uključivati vanćelijski vezujući domen koji uključuje mišje anti-BCMA antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za humani BCMA polipeptid eksprimiran na B ćeliji. U ovom tekstu, izrazi "vezujući domen", "vanćelijski domen", "vanćelijski vezujući domen", "antigen-specifični vezujući domen" i "vanćelijski antigen-specifični vezujući domen" koriste se naizmenično i označavaju CAR sa sposobnošću specifičnog vezivanja za ciljni antigen od interesa, npr., BCMA. Po poreklu, vezujući domen može biti prirodan, sintetski, polusintetski ili rekombinantan.
[0030] Izrazi "specifični vezujući afinitet" ili "specifično vezuje" ili "specifično vezan" ili "specifično vezivanje" ili "specifično cilja" kako se koriste u ovom tekstu, opisuju vezivanje anti-BCMA antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta (ili CAR koji uključuje isto) za BCMA sa većim afinitetom vezivanja od pozadinskog vezivanja. Vezujući domen (ili CAR koji uključuje vezujući domen ili fuzioni protein koji sadrži vezujući domen) "specifično se vezuje" za BCMA ako se vezuje ili udružuje sa BCMA sa afinitetom ili Ka(tj., ravnotežna konstanta asocijacije određene vezujuće interakcije sa jedinicama 1/M), na primer, jednakim ili većim od oko 10<5>M<-1>. Vezujući domen (ili njegov fuzioni protein) mogu se vezati za cilj sa Ka koja je jednaka ili veća od oko 10<6>M<-1>, 10<7>M<-1>, 10<8>M<-1>, 10<9>M<-1>, 10<10>M<-1>, 10<11>M<-1>, 10<12>M-1 , ili 1013 M-1. "Visokoafinitetni" vezujući domeni (ili njihovi jednolančani fuzioni proteini) odnosi se na one vezujuće domene koji imaju Kanajmanje 107 M-1 , najmanje 108 M-1 , najmanje 109 M-1 , najmanje 1010 M-1 , najmanje 1011 M-1 , najmanje 1012 M-1 , najmanje 1013 M-1 , ili veću.
[0031] Alternativno, afinitet se može definisati kao ravnotežna konstanta disocijacije (Kd) određene vezujuće interakcije sa jedinicama M (npr., 10<-5>M do 10<-13>M, ili manje). Afiniteti polipeptida vezujućeg domena i CAR proteina prema predmetnoj objavi mogu se lako odrediti korišćenjem konvencionalnih tehnika, npr., kompetitivnim ELISA (enzimski imunotest, enzyme-linked immunosorbent assay), ili udruživanjem vezivanjem ili testovima izmeštanja uz korišćenje obeleženih liganada, ili korišćenjem uređaja za određivanje rezonance površinskog plazmona kao što je Biacore T100, koji se može nabaviti od Biacore, Inc., Piscataway, NJ, ili optičke biosenzorne tehnologije kao što je EPIC sistem ili EnSpire, koji se mogu nabaviti od Corning, odnosno Perkin Elmer (vidi i, npr., Scatchard et al. (1949) Ann. N.Y. Acad. Sci.51:660; i U.S. patent br.5.283.173; 5.468.614, ili ekvivalentno) .
[0032] Afinitet specifičnog vezivanja može biti oko 2 puta veći od pozadinskog vezivanja, oko 5 puta veći od pozadinskog vezivanja, oko 10 puta veći od pozadinskog vezivanja, oko 20 puta veći od pozadinskog vezivanja, oko 50 puta veći od pozadinskog vezivanja, oko 100 puta veći od pozadinskog vezivanja, ili oko 1000 puta veći od pozadinskog vezivanja ili više.
[0033] Vanćelijski vezujući domen CAR može uključivati antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. "Antitelo" se odnosi na vezujuće sredstvo koje je polipeptid koji sadrži bar varijabilni region lakog lanca ili teškog lanca imunoglobulina, koji specifično prepoznaje i vezuje se za epitop antigena, kao što su peptid, lipid, polisaharid, ili nukleinska kiselina koji sadrže antigensku determinantu, kao što su one koje se prepoznaju imunskim ćelijama.
[0034] "Antigen (Ag)" odnosi se na jedinjenje, kompoziciju, ili supstancu koji mogu stimulisati proizvodnju antitela ili odgovora T ćelija u životinji, uključujući kompozicije (kao što je ona koja uključuje kancer-specifični protein) koje se injektiraju ili apsorbuju u životinji. Antigen reaguje sa proizvodima specifičnog humoralnog ili ćelijskog imuniteta, uključujući one koji su indukovani heterolognim antigenima, kao što su objavljeni antigeni. Ciljni antigen može biti epitop BCMA polipeptida.
[0035] "Epitop" ili "antigenska determinanta" odnosi se na region antigena za koji se vezuje vezujuće sredstvo. Epitopi mogu biti formirani od kontinuiranih amino-kiselina ili od nekontinuiranih amino-kiselina koje su jukstapozicionirane tercijarnim nabiranjem proteina. Epitopi koji su formirani od kontinuiranih amino-kiselina tipično se održavaju posle izlaganja denaturišućim rastvorima, dok se epitopi formirani tercijarnim nabiranjem tipično gube posle tretmana denaturišućim rastvaračima. Epitop tipično uključuje najmanje 3 i, češće, najmanje 5, oko 9, ili oko 8-10 amino-kiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
[0036] Antitela uključuju antigen-vezujuće fragmente istih, kao što su Ig kamile, Ig NAR, Fab fragmenti, Fab’ fragmenti, F(ab)’2fragmenti, F(ab)’3fragmenti, Fv, jednolančani Fv proteini ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minitela, dijatela, trijatela, tetratela, disulfidnom vezom stabilisani Fv proteini ("dsFv") i jednolančana domenska antitela (sdAb, nanotelo) i delove antitela pune dužine odgovorne za vezivanje antigena. Izraz takođe uključuje genetički inženjerisane forme kao što su himerna antitela (na primer, humanizovana mišja antitela), heterokonjugatska antitela (kao što su bispecifična antitela) i njihove antigen-vezujuće fragmente. Vidi i Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997.
[0037] Kako bi stručnjak u oblasti razumeo i kako je opisano na drugom mestu u ovom tekstu, kompletno antitelo uključuje dva teška lanca i dva laka lanca. Svaki teški lanac sastoji se od varijabilnog regiona i prvog, drugog i trećeg konstantnog regiona, dok se svaki laki lanac sastoji od varijabilnog regiona i konstantnog regiona. Teški lanci sisara klasifikovani su kao α, δ, ε, γ i μ. Laki lanci sisara klasifikovani su kao λ ili κ. Imunoglobulini koji uključuju α, δ, ε, γ i μ teške lance klasifikuju se kao imunoglobulin (Ig)A, IgD, IgE, IgG i IgM. Kompletno antitelo formira "Y" oblik. "Peteljka" Y sastoji se od drugog i trećeg konstantnog regiona (i kod IgE i IgM, četvrtog konstantnog regiona) dva povezana teška lanca, a disulfidne veze (međulančane) se formiraju u regionu zgloba. Teški lanci γ, α i δ imaju konstantni region sačinjen od tri tandemska (u nizu) Ig domena i regiona zgloba, za dodatnu fleksibilnost; teški lanci μ i ε imaju konstantni region sačinjen od četiri imunoglobulinska domena. Drugi i treći konstantni region označeni su kao "CH2 domen", odnosno "CH3 domen". Svaka ručica Y uključuje varijabilni region i prvi konstantni region jednog teškog lanca koji su vezani za varijabilni i konstantni region jednog lakog lanca. Varijabilni regioni lakog i teškog lanca odgovorni su za vezivanje antigena.
[0038] Varijabilni regioni lakog i teškog lanca sadrže "okvirni" region isprekidan umetanjem tri hipervarijabilna regiona koji se nazivaju još i "regioni koji određuju komplementarnost" ("complementarity-determining regions") ili "CDR". CDR mogu da se definišu ili identifikuju konvencionalnim metodima, kao što su sekvenca prema Kabat et al (Wu, TT and Kabat, E. A., J Exp Med. 132(2):211-50, (1970); Borden, P. and Kabat E. A., PNAS, 84: 2440-2443 (1987); (vidi, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991), ili struktura prema Chothia et al (Choithia, C. and Lesk, A.M., J Mol. Biol., 196(4): 901-917 (1987), Choithia, C. et al, Nature, 342: 877 - 883 (1989)).
[0039] Sekvence okvirnih regiona različitih lakih ili teških lanaca relativno su konzervirane unutar vrste kao što je na primer ljudska vrsta. Okvirni region antitela, koji je kombinovani okvirni region konstituentnog lakog i teškog lanca, služi za pozicioniranje i poravnavanje CDR u trodimenzionalnom prostoru. CDR su prvenstveno odgovorni za vezivanje sa epitopom antigena. CDR svakog lanca se tipično označavaju kao CDR1, CDR2 i CDR3, numerisani redom počevši od N-terminusa i takođe se tipično identifikuju po lancu u kojem je lociran određeni CDR. Prema tome, CDR locirani u varijabilnom domenu teškog lanca antitela označeni su kao CDRH1, CDRH2 i CDRH3, dok su CDR locirani u varijabilnom domenu lakog lanca antitela označeni kao CDRL1, CDRL2 i CDRL3. Antitela sa različitim specifičnostima (tj., različitim kombinujućim mestima za različite antigene) imaju različite CDR. Iako su CDR ti koji variraju od jednog do drugog antitela, samo je ograničen broj aminokiselinskih pozicija unutar CDR direktno uključen u vezivanje antigena. Ove pozicije unutar CDR nazivaju se rezidue koje određuju specifičnost (specificity determining residues, SDR). Ilustrativni primeri lakolančanih CDR koji su pogodni za konstruisanje humanizovanih BCMA CAR razmatranih u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na CDR sekvence prikazane u SEQ ID NO: 1-3. Ilustrativni primeri teškolančanih CDR koji su pogodni za konstruisanje humanizovanih BCMA CAR razmatranih u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na CDR sekvence prikazane u SEQ ID NO: 4-6.
[0040] Upućivanje na "VH" ili "VH" odnosi se na varijabilni region imunoglobulinskog teškog lanca, uključujući onaj iz antitela, Fv, scFv, dsFv, Fab, ili drugog fragmenta antitela, kako je objavljeno u ovom tekstu. Pozivanje na "VL" ili "VL" odnosi se na varijabilni region imunoglobulinskog lakog lanca, uključujući onaj iz antitela, Fv, scFv, dsFv, Fab, ili drugog fragmenta antitela, kako je objavljeno u ovom tekstu.
[0041] "Monoklonsko antitelo" je antitelo koje je proizveo jedan klon B limfocita ili ćelija u koju su transfektovanigeni lakog i teškog lanca jednog antitela. Monoklonska antitela proizvedena su metodima poznatim stručnjacima u oblasti, na primer pravljenjem hibridnih ćelija koje formiraju antitelo, fuzijom ćelija mijeloma sa imunskim ćelijama slezine. Monoklonska antitela uključuju humanizovana monoklonska antitela.
[0042] "Himerno antitelo" ima rezidue okvirnog regiona iz jedne vrste, na primer iz čoveka, a CDR (koji su generalno odgovorni za vezivanje antigena) iz druge vrste, na primer iz miša. CAR razmatran u ovom tekstu može sadržati antigen-specifični vezujući domen koji je himerno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.
[0043] "Humanizovano" antitelo je imunoglobulin koji uključuje humani okvirni region i jedan ili više CDR iz nehumanog (na primer mišjeg, pacovskog ili sintetskog) imunoglobulina. Nehumani imunoglobulin koji daje CDR označava se kao "donor", a humani imunoglobulin koji daje okvir označava se kao "akceptor".
[0044] Mišje anti-BCMA antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, mogu da uključuju, ali se ne ograničavaju na kamelidni Ig (kamelidno antitelo (VHH)), Ig NAR, Fab fragmente, Fab’ fragmente, F(ab)’2 fragmente, F(ab)’3 fragmente, Fv, jednolančano Fv antitelo ("scFv"), bis-scFv, (scFv)2, minitelo, dijatelo, trijatelo, tetratelo, disulfidnom vezom stabilisani Fv protein ("dsFv") i jednodomensko antitelo (sdAb, nanotelo).
[0045] "Kamelidnil Ig" ili "kamelidni VHH" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na najmanju poznatu antigen-vezujuću jedinicu teškolančanog antitela (Koch-Nolte, et al, FASEB J., 21: 3490-3498 (2007)). "Teškolančano antitelo " ili "kamelidno antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži dva VH domena i ne sadrži lake lance (Riechmann L. et al, J. Immunol. Methods 231:25-38 (1999); WO94/04678; WO94/25591; U.S. patent br.6,005,079).
[0046] "IgNAR" ili "immunoglobulinski novi antigenski receptor" (immunoglobulin new antigen receptor) odnosi se na klasu antitela iz imunskog repertoara ajkule, koja se sastoje od homodimera sačinjenih od jednog varijabilnog novog antigen-receptorskog (variable new antigen receptor (VNAR) domena i pet konstantnih novih antiigen-receptorskih (constant new antigen receptor, CNAR) domena. IgNAR predstavljaju neke od najmanjih poznatih na imunoglobulinima baziranih proteinskih skafolda i visoko su stabilni i karakterišu se efikasnošću pri vezivanju. Inherentna stabilnost može se pripisati (i) osnovnom Ig skafoldu, koji je predstavljen značajnim brojem naelektrisanih i hidrofilnih rezidua izloženih na površini u poređenju sa konvencionalnim VH i VL domenima antitela prisutnim u mišjim antitelima; i (ii) stabilišućim strukturnim osobinama u petljama regiona koji određuju komplementarnost (CDR) uključujući disulfidne mostove između petlji i obrasce vodoničnih veza unutar petlji.
[0047] Digestija antitela papainom proizvodi dva identična antigen-vezujuća fragmenta, koji se nazivaju "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigen-vezujućim mestom i rezidualni "Fc" fragment, čije ime reflektuje njegovu sposobnost da lako podleže kristalizaciji. Tretman pepsinom daje F(ab’)2 fragment koji ima dva antigen-kombinujuća mesta i sposoban je i dalje za unakrsno povezivanje antigena.
[0048] "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno antigen-vezujuće mesto. U jednom primeru izvođenja, dvolančana Fv vrsta sastoji se od dimera sačinjenog od jednog teško- i jednog lakolančanog varijabilnog domena u bliskoj, nekovalentnoj asocijaciji. U jednolančanoj Fv (scFv) vrsti, jedan teško- i jedan lakolančani varijabilni domen mogu biti kovalentno povezani fleksibilnim peptidnim linkerom tako da se laki i teški lanac mogu udružiti u "dimernu" strukturu koja je analogna onoj u dvolančanoj Fv vrsti. U ovoj konfiguraciji tri hipervarijabilna regiona (hypervariable region, HVR) svakog varijabilnog domena interaguju da definišu antigen-vezujuće mesto na površini VH-VL dimera. Šest HVR zajedno, daju antitelu antigen-vezujuću specifičnost. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koji uključuje samo tri HVR specifična za antigen) ima sposobnost da prepozna antigen i da se veže za njega, mada sa nižim afinitetom nego čitavo vezujuće mesto.
[0049] Fab fragment sadrži varijabilne domene teškog i lakog lanca i sadrži još i konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CHI) teškog lanca. Fab’ fragmenti razlikuju se od Fab fragmenata po dodavanju nekoliko rezidua na karboksi terminusu teškolančanog CH1 domena uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zgloba antitela. Fab’-SH je u ovom tekstu oznaka za Fab’ u kojem jedna ili više cisteinskih rezidua konstantnih domena nose slobodnu tiolnu grupu. F(ab’)2 fragmenti antitela originalno se proizvode kao parovi Fab’ fragmenata koji između sebe imaju cisteine zgloba. Poznati su i drugi načini hemijskog povezivanja fragmenata antitela.
[0050] Izraz "dijatela" odnosi se na fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, fragmenti uključuju teškolančani varijabilni domen (VH) spojen sa lakolančanim varijabilnim domenom (VL) u istom polipeptidnom lancu (VHVL). Korišćenjem linkera koji je prekratak da bi dozvolio sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prinuđeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i tako kreiraju dva antigen-vezujuća mesta. Dijatela mogu biti bivalentna ili bispecifična. Dijatela su opisana potpunije u, na primer, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med.9:129-134 (2003); i Hollinger et al., PNAS USA 90: 6444-6448 (1993). Trijatela i tetratela su opisana u Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
[0051] "Jednodomensko antitelo" ili "sdAb" ili "nanotelo" odnosi se na fragment antitela koji se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca antitela (VH domen) ili varijabilnog regiona lakog lanca antitela (VL domen) (Holt, L., et al, Trends in Biotechnology, 21(11): 484-490).
[0052] "Jednolančani Fv" ili "scFv" fragmenti antitela uključuju VH i VL domene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu i u jednoj orijentaciji (npr., VL-VH ili VH-VL). Uopšteno, scFv polipeptid uključuje još i polipeptidni linker između VH i VL domena, koji omogućava da scFv formira željenu strukturu za vezivanje sa antigenom. Za pregled scFv, vidi, npr., Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp.269-315.
[0053] CAR razmatran u ovom tekstu može sadržati antigen-specifični vezujući domen koji je mišji scFv. Jednolančana antitela mogu biti klonirana iz gena V regiona hibridoma specifičnog za željeni cilj. Proizvodnja takvog hibridoma postala je rutinska. Tehnika koja se može koristiti za kloniranje varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) opisana je, na primer, u Orlandi et al., PNAS, 1989; 86: 3833-3837.
[0054] Antigen-specifični vezujući domen može biti mišji scFv koji se vezuje za humani BCMA polipeptid. Ilustrativni primeri varijabilnih teških lanaca pogodnih za konstruisanje BCMA CAR razmatranih u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 8. Ilustrativni primeri varijabilnih lakih lanaca pogodnih za konstruisanje BCMA CAR razmatranih u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 7.
[0055] BCMA-specifični vezujući domeni obezbeđeni u ovom tekstu sadrže i jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR. Ti CDR mogu biti nehumani CDR ili izmenjeni nehumani CDR odabrani između CDRL1, CDRL2 i CDRL3 lakog lanca i CDRH1, CDRH2 i CDRH3 teškog lanca. U određenim primerima izvođenja, BCMA- specifični vezujući domen uključuje (a) varijabilni region lakog lanca koji sadrži lakolančani CDRL1, lakolančani CDRL2 i lakolančani CDRL3, i (b) varijabilni region teškog lanca koji uključuje teškolančani CDRH1, teškolančani CDRH2 i teškolančani CDRH3.
2. LINKERI
[0056] CAR razmatrani u ovom tekstu mogu uključivati linkerske rezidue između različitih domena, npr., dodate za održavanje pogodnog razmaka i konformacije molekula. Linker može biti linkerska sekvenca varijabilnog regiona. "Linkerska sekvenca varijabilnog regiona" je aminokiselinska sekvenca koja spaja VHi VLdomen i obezbeđuje spejsersku funkciju kompatibilnu sa interakcijom dva sub-vezujuća domena tako da rezultujući polipeptid zadržava specifični vezujući afinitet za isti ciljni molekul kao antitelo koje sadrži iste varijabilne regione lakog i teškog lanca. CAR razmatrani u ovom tekstu mogu sadržati jedan, dva, tri, četiri ili pet ili više linkera. Dužina linkera može iznositi oko 1 do oko 25 aminokiselina, oko 5 do oko 20 amino-kiselina, ili oko 10 do oko 20 amino-kiselina, ili dužina linkera može iznositi bilo koji broj amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, linker je dug 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, ili više amino-kiselina.
[0057] Ilustrativni primeri linkera uključuju glicinske polimere (G)n; glicin-serinske polimere (G1-5S1-5)n, gde je n ceo broj od najmanje jedan, dva, tri, četiri ili pet; glicin-alaninske polimere; alanin-serinske polimere; i druge fleksibilne linkere poznate u struci. Glicinski i glicin-serinski polimeri su relativno nestrukturirani i zato mogu služiti kao neutralni dodaci između domena fuzionih proteina kao što su CAR opisani u ovom tekstu. Glicin pristupa značajno većem fi-psi prostora nego čak i alanin, i mnogo je manje ograničen nego rezidue sa dužim bočnim lancima (vidi Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Uobičajeno obučen stručnjak prepoznaće da dizajn CAR u određenim primerima izvođenja može uključivati linkere koji su u celini ili delom fleksibilni, tako da linker može uključivati fleksibilni linker, kao i jedan ili više delova koji daju manje fleksibilnu strukturu, da bi se obezbedila željena struktura CAR.
[0058] Drugi primeri linkera uključuju, ali se ne ograničavaju na sledeće aminokiselinske sekvence: GGG; DGGGS (SEQ ID NO: 12); TGEKP (SEQ ID NO: 13) (vidi, npr., Liu et al., PNAS 5525-5530 (1997)); GGRR (SEQ ID NO: 14) (Pomerantz et al. 1995, gore); (GGGGS)ngde = 1, 2, 3, 4 ili 5 (SEQ ID NO: 15) (Kim et al., PNAS 93, 1156-1160 (1996.); EGKSSGSGSESKVD (SEQ ID NO: 16) (Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:1066-1070); KESGSVSSEQLAQFRSLD (SEQ ID NO: 17) (Bird et al., 1988, Science 242:423-426), GGRRGGGS (SEQ ID NO: 18); LRQRDGERP (SEQ ID NO: 19); LRQKDGGGSERP (SEQ ID NO: 20); LRQKd(GGGS)2ERP (SEQ ID NO: 21). Alternativno,
fleksibilni linkeri mogu racionalno da se dizajniraju korišćenjem kompjuterskog programa koji može da modeluje DNK-vezujuća mesta i same peptide (Desjarlais & Berg, PNAS 90:2256-2260 (1993), PNAS 91:11099-11103 (1994)) ili metodima prikazivanja fagima. U jednom primeru izvođenja, linker uključuje sledeću aminokiselinsku sekvencu: GSTSGSGKPGSGEGSTKG (SEQ ID NO: 22) (Cooper et al., Blood, 101(4): 1637-1644 (2003)).
3. SPEJSERSKI DOMEN
[0059] Vezujući domen CAR može biti praćen jednim ili većim brojem "spejserskih domena", što se odnosi na region koji pomera antigen-vezujući domen od površine efektorske ćelije da bi se omogućio dobar kontakt između dve ćelije, vezivanje antigena i aktivacija (Patel et al., Gene Therapy, 1999; 6: 412-419). Region zgloba može biti izveden iz prirodnog, sintetskog, polusintetskog ili rekombinantnog izvora. Spejserski domen može biti deo imunoglobulina, uključujući, ali ne ograničavajući se na jedan ili više konstantnih regiona teškog lanca, npr., CH2 i CH3. Spejserski domen može uključivati aminokiselinsku sekvencu prirodnog imunoglobulinskog zglobnog regiona ili izmenjenog imunoglobulinskog zglobnog regiona.
[0060] Spejserski domen može uključivati CH2 i CH3 domen IgG1 ili IgG4.
4. ZGLOBNI DOMEN
[0061] Vezujući domen CAR je obično praćen jednim ili većim brojem "zglobnih domena" koji imaju ulogu u pozicioniranju antigen-vezujućeg domena od površine efektorske ćelije da bi se omogućio dobar kontakt između dve ćelije, vezivanje antigena i aktivacija. CAR uobičajeno uključuje jedan ili više zglobnih domena između vezujućeg domena i transmembranskog domena (transmembrane domain, TM). Zglobni domen može biti poreklom iz prirodnog, sintetskog, polusintetskog ili rekombinantnog izvora. Zglobni domen može uključivati aminokiselinsku sekvencu prirodnog imunoglobulinskog zglobnog regiona ili izmenjenog imunoglobulinskog zglobnog regiona.
[0062] "Izmenjeni zglobni region" odnosi se na (a) prirodni zglobni region sa do 30% aminokiselinskih promena (npr., do 25%, 20%, 15%, 10%, ili 5% aminokiselinskih supstitucija ili delecija), (b) deo prirodnog zglobnog regiona, koji je dug najmanje 10 aminokiselina (npr., najmanje 12, 13, 14 ili 15 amino-kiselina) sa do 30% aminokiselinskih promena (npr., do 25%, 20%, 15%, 10%, ili 5% aminokiselinskih supstitucija ili delecija), ili (c) deo prirodnog zglobnog regiona koji uključuje središnji zglobni region (koji može biti dug 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15, ili najmanje 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15 amino-kiselina). Jedna ili više cisteinskih rezidua u prirodnom zglobnom regionu mogu biti supstituisane jednom ili većim brojem aminokiselinskih rezidua (npr., jednom ili većim brojem serinskih rezidua). Izmenjeni imunoglobulinski zglobni region može alternativno ili dodatno imati prolinsku reziduu divljeg tipa imunoglobulinskog zglobnog regiona supstituisanu drugom aminokiselinskom reziduom (npr., serinskom reziduom).
[0063] Drugi ilustrativni zglobni domeni pogodni za upotrebu u CAR opisanim u ovom tekstu uključuju zglobni region izveden iz vanćelijskih regiona membranskih proteina tipa 1 kao što su CD8α, CD4, CD28 i CD7, koji mogu biti zglobni regioni divljeg tipa iz ovih molekula ili mogu biti izmenjeni. Zglobni domen može uključivati CD8α zglobni region.
5. TRANSMEMBRANSKI (TM) DOMEN
[0064] "Transmembranski domen" je deo CAR koji spaja vanćelijski vezujući deo i unutarćelijski signalni domen i ukotvljuje CAR u ćelijsku membranu imunske efektorske ćelije. TM domen može biti poreklom iz prirodnog, sintetskog, polusintetskog ili rekombinantnog izvora. TM domen može biti izveden iz (tj., uključivati najmanje transmembranski region/transmembranske regione) alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 i PD1. TM domen može biti sintetski i pretežno uključivati hidrofobne rezidue kao što su leucin i valin.
[0065] CAR razmatrani u ovom tekstu mogu uključivati TM domen izveden iz CD8α. CAR razmatran u ovom tekstu može uključivati TM domen izveden iz CD8α i kratki oligo- ili polipeptidni linker, dug poželjno između 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 amino-kiselina, koji povezuje TM domen i unutarćelijski signalni domen CAR. Linker baziran na glicinu-serinu posebno je pogodan linker.
6. UNUTARĆELIJSKI SIGNALNI DOMEN
[0066] CAR razmatrani u ovom tekstu mogu uključivati unutarćelijski signalni domen. "Unutarćelijski signalni domen" odnosi se na deo CAR koji učestvuje u prenošenju poruke efektivnog BCMA CAR vezivanja za humani BCMA polipeptid, u unutrašnjost imunske efektorske ćelije da bi se pobudila funkcija efektorske ćelije, npr., aktivacija, proizvodnja citokina, proliferacija i citotoksična aktivnost, uključujući oslobađanje citotoksičnih faktora u CAR-vezanu ciljnu ćeliju, ili drugi ćelijski odgovori podstaknuti vezivanjem antigena za vanćelijski CAR domen.
[0067] Izraz "efektorska funkcija" odnosi se na specijalizovanu funkciju imunske efektorske ćelije. Efektorska funkcija T ćelije, na primer, može biti citolitička aktivnost ili pomoć ili aktivnost koja uključuje sekreciju citokina. Prema tome, izraz "unutarćelijski signalni domen" odnosi se na deo proteina koji sprovodi efektorski funkcijski signal i usmerava ćeliju da obavi sprecijalizovanu funkciju. Iako se obično može koristiti čitav unutarćelijski domen, u mnogim slučajevima to nije neophodno. U vezi sa merom skraćenja unutarćelijskog signalnog domena, skraćeni deo može da se koristi umesto celog domena dokle god prenosi efektorski funkcionalni signal. Izraz unutarćelijski signalni domen uključuje svaki skraćeni deo unutarćelijskog signalnog domena koji je dovoljan da sprovede efektorski funkcionalni signal.
[0068] Poznato je da signali koji se generišu samo preko TCR nisu dovoljni za punu aktivaciju T ćelija i da je potreban i sekundarni ili kostimulatorni signal. Prema tome, može se reći da aktivacija T ćelije može biti posredovana uključivanjem dveju različitih klasa unutarćelijskih signalnih domena: primarnog signalnog domena koji inicira antigen-zavisnu primarnu aktivaciju preko TCR (npr., TCR/CD3 kompleksa) i kostimulatornog signalnog domena koji deluju na antigen-nezavisan način, da bi se obezbedio sekundarni ili kostimulatorni signal. CAR razmatran u ovom tekstu može uključivati unutarćelijski signalni domen koji uključuje jedan ili više "kostimulatornih signalnih domena" i "primarni signalni domen".
[0069] Primarni signalni domeni regulišu primarnu aktivaciju TCR kompleksa na stimulatoran ili na inhibitoran način. Primarni signalni domeni koji deluju na stimulatoran način mogu sadržati signalne motive koji su poznati kao imunoreceptorski aktivacioni motivi bazirani na tirozinu (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) ili ITAM.
[0070] Ilustrativni primeri ITAM-sadržavajućih primarnih signalnih domena koji su posebno korisni uključuju one koji su izvedeni iz TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b i CD66d. Posebno, CAR može uključivati CD3ζ primarni signalni domen i jedan ili više kostimulatornih signalnih domena. Unutarćelijski primarni signalni i kostimulatorni signalni domen mogu biti povezani bilo kojim redom u tandemu za karboksi terminus transmembranskog domena.
[0071] CAR razmatrani u ovom tekstu uključuju jedan ili više kostimulatornih signalnih domena za pojačanje efikasnosti i ekspanzije T ćelija koje eksprimiraju CAR receptore. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "kostimulatorni signalni domen" ili "kostimulatorni domen", odnosi se na unutarćelijski signalni domen kostimulatornog molekula. Kostimulatorni molekuli su ćelijski površinski molekuli različiti od antigenskih receptora ili Fc receptora, koji obezbeđuju drugi signal potreban za efikasnu aktivaciju i funkciju T limfocita posle vezivanja sa antigenom. Ilustrativni primeri takvih kostimulatornih molekula uključuju CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM i ZAP70. CAR može uključivati jedan ili više kostimulatornih signalnih domena odabranih iz grupe koja se sastoji od CD28, CD137 i CD134, i CD3ζ primarni signalni domen.
[0072] CAR može uključivati CD28 i CD137 kostimulatorne signalne domene i CD3ζ primarni signalni domen.
[0073] CAR može uključivati CD28 i CD134 kostimulatorne signalne domene i CD3ζ primarni signalni domen.
[0074] CAR može uključivati CD137 i CD134 kostimulatorne signalne domene i CD3ζ primarni signalni domen.
[0075] CAR razmatrani u ovom tekstu mogu uključivati mišje anti-BCMA antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za BCMA polipeptid eksprimiran na B ćelijama.
[0076] CAR može uključivati mišji anti-BCMA scFv koji se vezuje za BCMA polipeptid; transmembranski domen izveden iz polipeptida odabranog iz grupe koja se sastoji od: alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD152, CD154 i PD1; i jedan ili više unutarćelijskih kostimulatornih signalnih domena iz kostimulatornog molekula odabranog iz grupe koja se sastoji od: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM i ZAP70; i primarni signalni domen iz TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b i CD66d.
[0077] CAR može uključivati mišji anti-BCMA scFv koji se vezuje za BCMA polipeptid; zglobni domen odabran iz grupe koja se sastoji od: IgG1 zglob/CH2/CH3, IgG4 zglob/CH2/CH3, i CD8α zgloba; transmembranski domen izveden iz polipeptida odabranog iz grupe koja se sastoji od: alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 i PD1; i jedan ili više unutarćelijskih kostimulatornih signalnih domena iz kostimulatornog molekula odabranog iz grupe koja se sastoji od: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM i ZAP70; i primarni signalni domen iz TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b i CD66d.
[0078] CAR može uključivati mišji anti-BCMA scFv koji se vezuje za BCMA polipeptid; zglobni domen odabran iz grupe koja se sastoji od: IgG1 zglob/CH2/CH3, IgG4 zglob/CH2/CH3, i CD8α zgloba; transmembranski domen izveden iz polipeptida odabranog iz grupe koja se sastoji od: alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD3ε, CD3ζ, CD4, CD5, CD8α, CD9, CD 16, CD22, CD27, CD28, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD152, CD 154 i PD1; kratki oligo- ili polipeptidni linker, dug poželjno između 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 amino-kiselina koji povezuje TM domen sa unutarćelijskim signalnim domenom CAR; i jedan ili više unutarćelijskih signalnih domena iz kostimulatornog molekula odabranog iz grupe koja se sastoji od: CARD11, CD2, CD7, CD27, CD28, CD30, CD40, CD54 (ICAM), CD83, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD150 (SLAMF1), CD152 (CTLA4), CD223 (LAG3), CD270 (HVEM), CD273 (PD-L2), CD274 (PD-L1), CD278 (ICOS), DAP10, LAT, NKD2C SLP76, TRIM i ZAP70; i primarni signalni domen iz TCRζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD22, CD79a, CD79b i CD66d.
[0079] CAR može uključivati mišji anti-BCMA scFv koji se vezuje za BCMA polipeptid; zglobni domen koji uključuje IgG1 zglob/CH2/CH3 polipeptid i CD8α polipeptid; CD8α transmembranski domen koji uključuje polipeptidni linker od oko 3 do oko 10 amino-kiselina; CD137 unutarćelijski kostimulatorni signalni domen; i CD3ζ primarni signalni domen.
[0080] CAR može uključivati mišji anti-BCMA scFv koji se vezuje za BCMA polipeptid; zglobni domen koji uključuje CD8α polipeptid; CD8α transmembranski domen koji uključuje polipeptidni linker od oko 3 do oko 10 amino-kiselina; CD 134 unutarćelijski kostimulatorni signalni domen; i CD3ζ primarni signalni domen.
[0081] CAR može uključivati mišji anti-BCMA scFv koji se vezuje za BCMA polipeptid; zglobni domen koji uključuje CD8α polipeptid; CD8α transmembranski domen koji uključuje polipeptidni linker od oko 3 do oko 10 amino-kiselina; CD28 unutarćelijski kostimulatorni signalni domen; i CD3ζ primarni signalni domen.
[0082] Pored toga, dizajn CAR razmatranih u ovom tekstu omogućava poboljšanu ekspanziju, dugotrajnu perzistenciju i tolerabilne osobine citotoksičnosti T ćelijama koje eksprimiraju CAR u poređenju sa nemodifikovanim T ćelijama ili T ćelijama modifikovanim da eksprimiraju druge CAR.
D. POLIPEPTIDI
[0083] Predmetna objava delom razmatra CAR polipeptide i njihove fragmente, ćelije i kompozicije koje ih sadrže, i vektore koji eksprimiraju polipeptide. Moguće je obezbediti polipeptid koji uključuje jedan ili više CAR, kako je prikazano u SEQ ID NO: 9.
[0084] "Polipeptid", "polipeptidni fragment", "peptid" i "protein" koriste se naizmenično, ukoliko nije drugačije specifikovano, i u skladu sa konvencionalnim značenjem, tj., kao sekvenca amino-kiselina. Polipeptidi nisu specifično ograničeni dužinom, npr., mogu uključivati proteinsku sekvencu pune dužine ili fragment proteina pune dužine, i mogu uključivati posttranslacione modifikacije polipeptida, na primer, glikozilacije, acetilacije, fosforilacije i slično, kao i druge modifikacije poznate u struci, koje se sreću u prirodi i koje se ne sreću u prirodi. CAR polipeptidi razmatrani u ovom tekstu mogu uključivati signalnu (ili lidersku) sekvencu na N-terminalnom kraju proteina, koja vrši kotranslaciono ili posttranslaciono usmeravanje transporta proteina. Ilustrativni primeri odgovarajućih signalnih sekvenci korisnih u CAR objavljenim u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na signalnu sekvencu teškog lanca IgG1 i CD8α signalnu sekvencu. Polipeptidi mogu da se pripreme korišćenjem bilo koje od različitih dobro poznatih rekombinantnih tehnika i/ili tehnika veštačke sinteze. Polipeptidi razmatrani u ovom tekstu specifično obuhvataju CAR predmetne objave, ili sekvence koje imaju delecije, adicije i/ili supstitucije jedne ili više amino-kiselina CAR, kako je objavljeno u ovom tekstu.
[0085] "Izolovani peptid" ili "izolovani polipeptid" i slično, kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na in vitro izolaciju i/ili prečišćavanje peptidnog ili polipeptidnog molekula iz ćelijske sredine i iz asocijacije sa drugim komponentama ćelije, tj., on nije u značajnoj meri značajno udružen sa in vivo supstancama. Slično tome, "izolovana ćelija" odnosi se na ćeliju koja je dobijena iz in vivo tkiva ili organa i suštinski ne sadrži vanćelijski matriks.
[0086] Polipeptidi uključuju "polipeptidne varijante". Polipeptidne varijante mogu da se razlikuju od polipeptida koji se sreću u prirodi po jednoj ili više supstitucija, delecija, adicija i/ili insercija. Takve varijante mogu biti one koje se sreću u prirodi ili mogu biti sintetski stvorene, na primer, modifikovanjem jedne ili više gornjih polipeptidnih sekvenci. Na primer, može biti poželjno poboljšati vezujući afinitet i/ili druge biološke osobine CAR uvođenjem jedne ili više supstitucija, delecija, adicija i/ili insercija u vezujući domen, zglob, TM domen, kostimulatorni signalni domen ili primarni signalni domen CAR polipeptida. Poželjno, polipeptidi uključuju polipeptide sa najmanje oko 65%, 70%, 75%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99% aminokiselinske identičnosti sa tim.
[0087] Polipeptidi uključuju "polipeptidne fragmente". "Polipeptidni fragmenti" odnosi se na polipeptid, koji može biti monomeran ili multimeran, koji nosi aminoterminalnu deleciju, karboksiterminalnu deleciju, i/ili unutrašnju deleciju ili supstituciju prirodnog ili rekombinantno proizvedenog polipeptida. Polipeptidni fragment može uključivati aminokiselinski lanac dug najmanje 5 do oko 500 amino-kiselina. Podrazumeva se da fragmenti mogu biti dugi najmanje 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ili 450 amino-kiselina. Posebno korisni polipetidni fragmenti uključuju funkcionalne domene, uključujući antigen-vezujuće domene ili fragmente antitela. U slučaju mišjeg anti-BCMA antitela, korisni fragmenti uključuju, ali se ne ograničavaju na: CDR region, CDR3 region teškog ili lakog lanca; varijabilni region teškog ili lakog lanca; deo lanca antitela ili varijabilni region koji uključuje dva CDR; i slično.
[0088] Polipeptid može biti fuzionisan i "u ramu čitanja" ili konjugovan sa linkerom ili drugom sekvencom za lakšu sintezu, prečišćavanje ili identifikaciju polipeptida (npr., poli-His), ili pojačavanje vezivanja polipeptida za čvrstu podlogu.
[0089] Kako je napomenuto gore, polipeptidi mogu biti izmenjeni na različite načine uključujući aminokiselinske supstitucije, delecije, trunkacije i insercije. Metodi takvih manipulacije uopšteno su poznati u struci. Na primer, varijantne aminokiselinske sekvence referentnog polipeptida mogu se pripremiti mutacijom u DNK. Metodi mutageneze i izmene nukleotidne sekvence dobro su poznati u struci. Vidi, na primer, Kunkel (1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), U.S. pat. br.4,873,192, Watson, J. D. et al., (Molecular Biology of the Gene, Fourth Edition, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif., 1987) i tamo navedene reference. Uputstva o pogodnim aminokiselinskim supstitucijama koje ne utiču na biološku aktivnost proteina od interesa mogu se naći u modelu Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.).
[0090] Varijanta može sadržati konzervativne supstitucije. "Konzervativna supstitucija" je ona u kojoj je amino-kiselina supstituisana drugom aminokiselinom koja ima slične osobine, tako da stručnjak u oblasti hemije peptida može očekivati da sekundarna struktura i hidropatska priroda polipeptida budu suštinski neizmenjene. Modifikacije se mogu napraviti u strukturi polinukleotida i polipeptida, a da se i dalje dobija funkcionalni molekul koji kodira varijantni ili izvedeni polipeptid sa željenim karakteristikama. Kada se želi izmena aminokiselinske sekvence polipeptida da bi se stvorio ekvivalentan ili čak poboljšan varijantni polipeptid, stručnjak u oblasti, na primer, može izmeniti jedan ili više kodona kodirajuće DNK sekvence nrp., u skladu sa Tabelom 1.
TABELA 1. Aminokiselinski kodoni
[0091] Uputstvo za određivanje aminokiselinskih rezidua koje mogu biti supstituisane, insertovane, ili deletovane bez gubljenja biološke aktivnosti može se naći korišćenjem kompjuterskih programa dobro poznatih u struci, na primer DNASTAR™ softver. Poželjno, aminokiselinske promene u proteinskim varijantama objavljene u ovom tekstu su konzervativne aminokiselinske promene, tj., supstitucije slično naelektrisanim ili nenaelektrisanim aminokiselinama. Konzervativna aminokiselinska promena podrazumeva supstituciju jedne ili familije amino-kiselina sličnih po svom bočnom lancu. Amino-kiseline koje se sreću u prirodi obično se grupišu u četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan) i nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) amino-kiseline. Fenilalanin, triptofan i tirozin se ponekad zajedno klasifikuju kao aromatične amino-kiseline. U peptidu ili proteinu, pogodne konzervativne supstitucije amino-kiselina poznate su stručnjacima u oblasti i obično se mogu napraviti bez menjanja biološke aktivnosti rezultujućeg molekula. Stručnjaci u oblasti prepoznaju da, obično, supstitucije pojedinačnih amino-kiselina u neesencijalnim regionima polipeptida suštinski ne menjaju biološku aktivnost (vidi, npr., Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p.224). Primeri konzervativnih supstitucija opisani su u U.S. privremenoj prijavi patenta br.61/241,647.
[0092] Pri pravljenju takvih promena, treba razmotriti hidropatski indeks amino-kiselina. Značaj hidropatskog indeksa amino-kiselina u obezbeđivanju interaktivne biološke funkcije proteina obično se razume u struci (Kyte and Doolittle, 1982). Svakoj amino-kiselini dodeljen je hidropatski indeks na osnovu njene hidrofobnosti i karakteristika naelektrisanja (Kyte and Doolittle, 1982). Ove vrednosti su: izoleucin (+4.5); valin (+4.2); leucin (+3.8); fenilalanin (+2.8); cistein/cistein (+2.5); metionin (+1.9); alanin (+1.8); glicin (-0.4); treonin (-0.7); serin (-0.8); triptofan (-0.9); tirozin (-1.3); prolin (-1.6); histidin (-3.2); glutamat (-3.5); glutamin (-3.5); aspartat (-3.5); asparagin (-3.5); lizin (-3.9); i arginin (-4.5).
[0093] U struci je poznato da određene amino-kiseline mogu da se supstituišu drugim aminokiselinama koje imaju sličan hidropatski indeks ili skor, a da se i dalje za rezultat dobija protein sa sličnom biološkom aktivnošću, tj., da se i dalje se dobija biološki funkcionalno ekvivalentan protein. Prilikom uvođenja takvih promena, supstitucija amino-kiselina čiji su hidropatski indeksi unutar ±2 je poželjna, onih unutar ±1 je posebno poželjna, i onih unutar ±0.5 je još poželjnija. Isto tako, u struci se razume da se supstitucije sličnih amino-kiselina mogu efikasno napraviti na osnovu hidrofilnosti.
[0094] Kako je detaljno rečeno u U.S. patentu br. 4,554,101, sledeće vrednosti hidrofilnosti pripisane su aminokiselinskim reziduama: arginin (+3.0); lizin (+3.0); aspartat (+3.0 ± 1); glutamat (+3.0 ± 1); serin (+0.3); asparagin (+0.2); glutamin (+0.2); glicin (0); treonin (-0.4); prolin (-0.5 ± 1); alanin (-0.5); histidin (-0.5); cistein (-1.0); metionin (-1.3); valin (-1.5); leucin (-1.8); izoleucin (-1.8); tirozin (-2.3); fenilalanin (-2.5); triptofan (-3.4). Razume se da amino-kiselina može biti supstituisana drugom koja ima sličnu vrednost hidrofilnosti, a da se i dalje dobija biološki ekvivalentan i, posebno, imunološki ekvivalentan protein. U takvim promenama, supstitucija amino-kiselina čije vrednosti hidrofilnosti su unutar ±2 je poželjna, onih unutar ±1 je posebno poželjna, a onih unutar ±0.5 još poželjnija.
[0095] Kako je naznačeno ranije u ovom tekstu, aminokiselinske supstitucije mogu biti bazirane na relativnoj sličnosti aminokiselinskih bočnih lanaca supstituenata, na primer njihovoj hidrofobnosti, hidrofilnosti, naelektrisanju, veličini i slično.
[0096] Polipeptidne varijante uključuju još i glikozilovane forme, agregativne konjugate sa drugim molekulima i kovalentne konjugate sa nesrodnim hemijskim komponentama (npr., pegilisanim molekulima). Kovalentne varijante mogu se pripremiti povezivanjem funkcionalnosti sa grupama koje se nalaze u aminokiselinskom lancu ili na N- ili C-terminalnoj rezidui, kao što je poznato u struci. Varijante takođe uključuju alelske varijante, vrsne varijante i muteine. Trunkacije ili delecije regiona, koje ne utiču na funkcionalnu aktivnost proteina takođe su varijante.
[0097] Kada je poželjna ekspresija dva ili više polipeptida, polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju mogu biti razdvojene IRES sekvencom, o čemu se govori na drugom mestu u ovom tekstu. Dva ili više polipeptida mogu da se eksprimiraju kao fuzioni protein koji uključuje jednu ili više samoisecajućih polipeptidnih sekvenci.
[0098] Polipeptidi uključuju fuzione polipeptide. Fuzioni polipeptidi i polinukleotidi koji kodiraju fuzione polipeptide mogu biti obezbeđeni, npr., CAR. Fuzioni polipeptidi i fuzioni proteini odnose se na polipeptid sa najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, ili deset ili više polipeptidnih segmenata. Fuzioni polipeptidi su tipično spojeni C-terminusom za N-terminus, mada mogu biti spojeni i C-terminusom za C-terminus, N-terminusom za N-terminus, ili N terminusom za C-terminus. Polipeptidi fuzionog proteina mogu biti postavljeni bilo kojim redom ili određenim redom. Fuzioni polipeptidi ili fuzioni proteini mogu uključivati i konzervativno modifikovane varijante, polimorfne varijante, alele, mutante, subsekvence i međuvrsne homologe, dokle god je očuvana željena transkripciona aktivnost fuzionog polipeptida. Fuzioni polipeptidi mogu se proizvesti hemijskim metodima sinteze ili uspostavljanjem hemijkih veza između dve komponente ili mogu uopšteno da se pripreme korišćenjem drugih standardnih tehnika. Vezane DNK sekvence koje uključuju fuzioni polipeptid operabilno su povezane sa pogodnim transkripcionim ili translacionim kontrolnim elementima, o čemu se govori na drugom mestu u ovom tekstu.
[0099] Fuzioni partner može uključivati sekvencu koja pomaže u eksprimiranju proteina (ekspresioni enhenser) sa većim prinosom od nativnog rekombinantnog proteina. Drugi fuzioni partneri mogu se birati tako da povećaju solubilnost proteina ili da omoguće da se protein uputi ka željenim unutarćelijskim kompartmentima ili da se olakša transport fuzionog proteina kroz ćelijsku membranu.
[0100] Fuzioni polipeptidi mogu uključivati još i polipeptid-isecajući signal između svakog od polipeptidnih domena opisanih u ovom tekstu. Pored toga, polipeptidno mesto može biti smešteno u bilo koju linkersku peptidnu sekvencu. Primeri polipeptid-isecajućih signala uključuju mesta prepoznavanja isecanja polipeptida kao što su mesta sečenja proteazom, mesta sečenja nukleazom (npr., masta prepoznavanja za retke restrikcione enzime, mesta prepoznavanja za samoisecajući ribozim) i samoisecajuće virusne oligopeptide (vidi deFelipe and Ryan, 2004. Traffic, 5(8); 616-26).
[0101] Pogodna mesta za sečenje proteazom i samoisecajući peptidi poznati su stručnjaku u oblasti (vidi, npr., u Ryan et al., 1997. J. Gener. Virol. 78, 699-722; Scymczak et al. (2004) Nature Biotech. 5, 589-594). Primeri mesta sečenja proteazom uključuju, ali se ne ograničavaju na mesta sečenja za potivirusne NIa proteaze (npr., proteaza virusa graviranosti duvana), potivirusne HC proteaze, potivirusne P1 (P35) proteaze, biovirusne NIa proteaze, biovirusne RNK-2-kodirane proteaze, aftovirusne L proteaze, enterovirusne 2A proteaze, rinovirusne 2A proteaze, pikorna 3C proteaze, komovirusne 24K proteaze, nepovirusne 24K proteaze, RTSV ("tungro" sferični virus pirinča, rice tungro spherical virus) 3C-slična proteaza, PYVF (virus žute pegavosti paškanata, parsnip yellow fleck virus) 3C-slična proteaza, heparin, trombin, faktor Xa i enterokinaza. Zbog visoke stringentnosti sečenja, u jednom primeru izvođenja poželjna su mesta sečenja za TEV (virus graviranosti duvana) proteazu, npr., EXXYXQ(G/S) (SEQ ID NO: 23), na primer, ENLYFQG (SEQ ID NO: 24) i ENLYFQS (SEQ ID NO: 25), gde X predstavlja bilo koju amino-kiselinu (sečenje putem TEV dešava se između Q i G ili Q i S).
[0102] Samoisecajući peptidi mogu uključivati polipeptidne sekvence koje su dobijene iz peptida potivirusa i kardiovirusa 2A, FMDV (foot-and-mouth disease virus, virus slinavke i šapa), virusa rinitisa A konja, Thosea asigna virusa i prasećeg teshovirusa.
[0103] Samoisecajuće polipeptidno mesto može uključivati 2A ili 2A-slično mesto, sekvencu ili domen (Donnelly et al., 2001. J. Gen. Virol.82:1027-1041).
TABELA 2: Primeri 2A mesta uključuju sledeće sekvence:
[0104] Polipeptid razmatran u ovom tekstu može uključivati CAR polipeptid.
E. POLINUKLEOTIDI
[0105] Može se obezbediti polinukleotid koji kodira jedna ili više CAR polipeptida, npr., SEQ ID NO: 10. Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "polinukleotid" ili "nukleinska kiselina" odnose se na informacionu RNK (messenger RNA, mRNK), RNK, genomsku RNK (gRNK), plus lanac RNK (RNK(+)), minus lanac RNK (RNK(-)), genomsku DNK (gDNK), komplementarnu DNK (cDNK) ili rekombinantnu DNK. Polinukleotidi uključuju jednolančane i dvolančane polinukleotide. Poželjno, polinukleotidi uključuju polinukleotide ili varijante sa najmanje oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sekvencione identičnosti sa bilo kojom od referentnih sekvenci opisanih u ovom tekstu (vidi, npr., Listu sekvenci), pri čemu tipično varijante zadržavaju najmanje jednu biološku aktivnost referentne sekvence. Razmatraju se polinukleotidi koji uključuju ekspresione vektore, virusne vektore i transfer-plazmide, i kompozicije, i ćelije koje sadrže iste.
[0106] Mogu se obezbediti polinukleotidi koji kodiraju najmanje oko 5, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 1000, 1250, 1500, 1750, ili 2000 ili više kontinuiranih rezidua aminokiselina u polipeptidu, kao i sve intermedijarne dužine. Lako će se razumeti da "intermedijarne dužine" u ovom kontekstu označavaju svaku dužinu između navedenih vrednosti, na primer, 6, 7, 8, 9, itd., 101, 102, 103, itd; 151, 152, 153, itd; 201, 202, 203, itd.
[0107] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "polinukleotidna varijanta" i "varijanta" i slično, odnose se na polinukleotide koji pokazuju bitnu sekvencionu identičnost sa referentnom polinukleotidnom sekvencom ili polinukleotidima koji se hibridizuju sa referentnom sekvencom pod stringentnim uslovima definisanim kasnije u ovom tekstu. Ovi izrazi uključuju polinukleotide u kojima su jedan ili više nukleotida dodati ili deletovani, ili zamenjeni različitim nukleotidima u poređenju sa referentnim polinukleotidom. U tom pogledu, u struci se podrazumeva da se u referentnom polinukleotidu mogu izvesti određene promene koje uključuju mutacije, adicije, delecije i supstitucije, pri čemu izmenjeni polinukleotid zadržava biološku funkciju ili aktivnost referentnog polinukleotida.
[0108] Izrazi "sekvenciona identičnost" ili, na primer, izrazi koji obuhvataju "sekvencu koja je 50% identična sa", kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na meru u kojoj su sekvence identične na osnovu poređenja "nukleotid po nukleotid" ili "amino-kiselina po aminokiselina" u prozoru poređenja. Prema tome, "procenat sekvencione identičnosti" može se izračunati upoređivanjem dve optimalno poravnate sekvence u prozoru poređenja, uz određivanje broja pozicija na kojima se u obe sekvence sreću identična baza nukleinske kiseline (npr., A, T, C, G, I) ili identična aminokiselinska rezidua (npr., Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys i Met) da bi se dobio broj uparenih pozicija, deljenjem broja uparenih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u prozoru poređenja (tj., veličina prozora), i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat sekvencione identičnosti. Uključeni su nukleotidi i polipeptidi koji imaju najmanje oko 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% sekvencione identičnosti sa bilo kojom od referentnih sekvenci opisanih u ovom tekstu, tipično gde polippetidna varijanta zadržava najmanje jednu biološku aktivnost referentnog polipeptida.
[0109] Izrazi upotrebljeni za opisivanje sekvencionog odnosa između dva ili više polinukleotida ili polipeptida uključuju "referentnu sekvencu", "prozor poređenja", "sekvencionu identičnost", "procenat sekvencione identičnosti" i "suštinsku identičnost". "Referentna sekvenca" je duga najmanje 12, ali često 15 do 18 i često najmanje 25 monomernih jedinica, uključujući nukleotide i amino-kiselinske rezidue. Zbog toga što svaki od dva polinukleotida može uključivati (1) sekvencu (tj., samo deo kompletne polinukleotidne sekvence) koja je slična između dva polinukleotida, i (2) sekvencu koja se razlikuje kod dva polinukleotida, poređenja sekvenci između dva (ili više) polinukleotida se tipično izvode upoređivanjem sekvenci dva polinukleotida duž "prozora poređenja", da bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sekvencione sličnosti. "Prozor poređenja" odnosi se na konceptualni segment od najmanje 6 kontinuiranih pozicija, obično oko 50 do oko 100, češće oko 100 do oko 150, u kojima se sekvenca upoređuje sa referentnom sekvencom sačinjenom od istog broja kontinuiranih pozicija, posle optimalnog poravnavanja dveju sekvenci. Za optimalno poravnavanje dveju sekvenci, prozor poređenja može uključivati adicije ili delecije (tj., procepe) od oko 20% ili manje u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne uključuje adicije ili delecije). Optimalno poravnavanje sekvenci za poravnavanje prozora poređenja može se izvesti kompjuterizovanom implementacijom algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA) ili ispitivanjem i najboljim poravnavanjem (tj., koje za rezultat ima najviši procenat homologije u prozoru poređenja) dobijenim bilo kojim metodom odabranim između više različitih metoda. Upućivanje se takođe može izvršiti na BLAST familiju programa, kako je na primer objavljeno u Altschul et al., 1997, Nucl. Acids Res. 25:3389. Detaljno razmatranje analize sekvenci može se naći u Jedinici 19.3, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Poglavlje 15.
[0110] Kako se koristi u ovom tekstu, "izolovani polinukleotid" označava polinukleotid izdvojen iz sekvence koja ga sa obe strane ograničava kada se nalazi u svom prirodnom stanju, npr., fragment DNK koji je odvojen od sekvenci koje se normalno nalaze uz taj fragment. "Izolovani polinukleotid" označava i komplementarnu DNK (cDNK), rekombinantnu DNK ili drugi polinukleotid koji ne postoji u prirodi i koji je napravljen čovekovom rukom.
[0111] Izrazi koji opisuju orijentaciju polinukleotida uključuju: 5’ (normalno kraj polinukleotida koji ima slobodnu fosfatnu grupu) i 3’ (normalno kraj polinukleotida koji ima slobodnu hidroksilnu (OH) grupu). Polinukleotidne sekvence mogu se navoditi u 5’ ka 3’ orijentaciji ili 3’ ka 5’ orijentaciji. Za DNK i mRNK, 5’ ka 3’ lanac označen je kao "smisleni", "plus", ili "kodirajući" lanac zbog toga što je njegova sekvenca identična sekvenci premesendžer (premRNK) [osim za uracil (U) u RNK, umesto timina (T) u DNK]. Za DNK i mRNK, komplementarni 3’ ka 5’ lanac koji je lanac prepisan RNK polimerazom označen je kao "templat", "besmisleni", "minus" ili "nekodirajući" lanac. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "reverzna orijentacija" označava sekvencu 5’ ka 3’ napisanu u 3’ ka 5’ orijentaciji ili 3’ ka 5’ sekvencu napisanu u 5’ ka 3’ orijentaciji.
[0112] Izrazi "komplementaran" i "komplementarnost" odnose se na polinukleotide (tj., sekvencu nukleotida) srodne prema pravilima sparivanja baza. Na primer, komplementarni lanac DNK sekvence 5’ A G T C A T G 3’ je 3’ T C A G T A C 5’. Ova druga sekvenca često se piše kao reverzni komplement sa 5’ krajem na levoj strani i 3’ krajem na desnoj, 5’C A T G A C T 3’. Sekvenca koja je jednaka reverznom komplementu označava se kao palindromska sekvenca. Komplementarnost može biti "parcijalna", kada su samo neke od baza nukleinske kiseline sparene prema pravilima o sparivanju baza. Ili, komplementarnost između nukleinskih kiselina može biti "kompletna" ili "potpuna".
[0113] Pored toga, prosečno obučeni stručnjaci u oblasti prepoznaće da, kao rezultat degeneracije genetičkog koda, ima mnogo nukleotidnih sekvenci koje kodiraju polipeptid, ili njegov fragment ili varijantu, kako je opisano u ovom tekstu. Neki od ovih nukleotida imaju minimalnu homologiju sa nukleotidnom sekvencom nekog nativnog gena. Ipak, polinukleotidi koji variraju zbog razlike u upotrebi kodona specifično se imaju u vidu, na primer polinukleotidi koji su optimizovani za selektovanje humanog i/ili primatskog kodona. Pored toga, aleli gena koji uključuju polinukleotidne sekvence date u ovom tekstu takođe se mogu koristiti. Aleli su endogeni geni koji su izmenjeni kao rezultat jedne ili više mutacija, kao što su delecije, adicije i/ili supstitucije nukleotida.
[0114] Izraz "nukleinskokiselinska kaseta", kako se koristi u ovom tekstu, označava genetičke sekvence unutar vektora koje mogu eksprimirati RNK, a zatim i protein. Nukleinskokiselinska kaseta sadrži gen od interesa, npr., CAR. Nukleinskokiselinska kaseta je poziciono i po redu orijentisana u vektoru tako da nukleinska kiselina u kaseti može da se transkribuje u RNK i, kada je potrebno, translatuje u protein ili polipeptid, podlegne odgovarajućim posttranslacionalnim modifikacijama potrebnim za aktivnost u transformisanoj ćeliji, i bude translocirana u odgovarajući kompartment gde će obavljati biološku aktivnost ciljanjem odgovarajućih unutarćelijskih kompartmenata ili sekrecijom u vanćelijske kompartmente. Poželjno, kaseta ima svoje 3’ i 5’ krajeve prilagođene za laku inserciju u vektor, npr., na svakom kraju ima mesto za delovanje restrikcione endonukleaze. Poželjno, nukleinskokiselinska kaseta sadrži sekvencu himernog antigenskog receptora upotrebljenog za lečenje maligniteta B ćelija. Kaseta može da se izdvoji i insertuje u plazmidni ili virusni vektor kao jedna jedinica.
[0115] Posebno, polinukleotidi uključuju najmanje jedan polinukleotid od interesa. Kako se koristi u ovom tekstu "polinukleotid od interesa" odnosi se na polinukleotid koji kodira polipeptid (tj., polipeptid od interesa), insertovan u ekspresioni vektor koji treba da se eksprimira. Vektor može uključivati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 polinukleotida od interesa. Polinukleotid od interesa može kodirati polipeptid koji obezbeđuje terapijski efekat u lečenju ili prevenciji bolesti ili poremećaja. Polinukleotidi od interesa i njima kodirani polipeptidi uključuju polinukleotide koji kodiraju divlji tip polipeptida, kao i njihove funkcionalne varijante i fragmente. U posebnim primerima izvođenja, funkcionalna varijanta ima najmanje 80%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 99% identičnosti sa odgovarajućim divljim tipom referentne polinukleotidne ili polipeptidne sekvence. Funkcionalna varijanta ili fragment mogu imati najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, ili najmanje 90% biološke aktivnosti odovarajućeg divljeg tipa polipeptida.
[0116] Polinukleotid od interesa ne mora kodirati polipeptid nego može služiti kao templat za transkribovanje miRNK, siRNK, ili shRNK, ribozima, ili drugih inhibitornih RNK. Polinukleotid može uključivati polinukleotid od interesa koji kodira CAR i jedan ili više dodatnih polinukleotida od interesa uključujući, ali ne ograničavajući se na inhibitornu sekvencu nukleinske kiseline uključujući, bez ograničavanja: siRNK, miRNK, shRNK i ribozim.
[0117] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "siRNK" ili "kratka interferirajuća RNK" ("short interfering RNA") odnose se na kratku polinukleotidnu sekvencu koja posreduje u procesu sekvenciono specifičnog posttranskripcionog utišavanja gena, inhibiciji translacije, inhibiciji transkripcije, ili epigenetici RNKi kod životinja (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950-951; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 13, 139-141; i Strauss, 1999, Science, 286, 886). siRNK može uključivati prvi lanac i drugi lanac koji imaju isti broj nukleozida; međutim, prvi i drugi lanac su postavljeni tako da dva terminalna nukleozida na prvom i drugom lancu nisu upareni sa reziduom na komplementarnom lancu. U određenim slučajevima, dva nukleozida koji nisu upareni nose timidin. siRNA trebalo bi da uključuje region sa dovoljnom homologijom sa ciljnim genom, i da bude dovoljne dužine u smislu nukleotida, tako da siRNK, ili njen fragment mogu posredovati u negativnoj regulaciji ciljnog gena. Prema tome, siRNK uključuje region koji je bar delimično komplementaran sa ciljnom RNK. Nije neophodno da postoji savršena komplementarnost između siRNK i cilja, ali saglasnost mora biti dovoljna da omogući da siRNK ili proizvod njenog sečenja, usmere sekvenciono-specifično utišavanje, na primer, RNKi-sečenjem ciljne RNK. Komplementarnost ili stepen homologije sa ciljnim lancem, najkritičniji je u antismislenom lancu. Iako je savršena komplementarnost, posebno u antismislenom lancu, često poželjna, neki primeri izvođenja uključuju jedan ili više, poželjno 10, 8, 6, 5, 4, 3, 2, ili manje pogrešnih sparivanja u odnosu na ciljnu RNK. Pogrešna sparivanja najbolje se tolerišu u terminalnim regionima i, ako su prisutna, poželjna su u terminalnom regionu ili regionima, npr., u 6, 5, 4, ili 3 nukleotida na 5’ i/ili 3’ terminusu. Smisleni lanac treba samo da bude dovoljno komplementaran sa antismislenim lancem da bi se održao ukupan dvolančani karakter molekula.
[0118] Pored toga, siRNK može biti modifikovana ili uključivati analoge nukleozida. Jednolančani regioni siRNK mogu biti modifikovani ili uključivati analoge nukleozida, npr., nesparene regione ili regione sa strukturom ukosnice, npr., region koji povezuje dva komplementarana regiona, može imati modifikacije ili nukleozidne analoge. Modifikacija za stabilisanje jednog ili više 3’- ili 5’-terminusa siRNK, npr prema dejstvu endonukleaze, ili za favorizovanje antismislenog siRNK sredstva da uđe u RISC, takođe su korisne. Modifikacije mogu uključivati C3 (ili C6, C7, C12) amino linkere, tiol linkere, karboksil linkere, nenukleotidne spejsere (C3, C6, C9, C12, abazno mesto, trietilen glikol, heksaetilen glikol), specijalni biotin ili fluoresceinske reagense koji dolaze kao fosforoamidati i koji imaju drugu DMT-protektovanu hidroksilnu grupu, što omogućava višestruko povezivanje tokom sinteze RNK. Dužina svakog lanca siRNK može biti jednaka ili manja od 30, 25, 24, 23, 22, 21, ili 20 nukleotida. Lanac je poželjno dug najmanje 19 nukleotida. Na primer, svaki lanac može biti dug između 21 i 25 nukleotida. Poželjne siRNK imaju region dupleksa od 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24, ili 25 nukleotidnih parova, i jedan ili više prepusta od 2-3 nukleotida, poželjno jedan ili dva 3’ prepusta od 2-3 nukleotida.
[0119] Kako se koristi u ovom tekstu, izrazi "miRNK" ili "mikroRNK" odnose se na male nekodirajuće RNK od 20-22 nukleotida, tipično isečene iz ∼70 nukleotida dugih presavijenih RNK prekursorskih struktura poznatih kao pre-miRNK. miRNK negativno regulišu svoje ciljeve na jedna od dva načina zavisno od stepena komplementarnosti između miRNK i cilja. Prvo, miRNK koje se vezuju sa savršenom ili skoro savršenom komplementarnošću za protein-kodirajuće mRNK sekvence indukuju put RNK-posredovane interferencije (RNKi). miRNK koje ispoljavaju svoje regulatorne efekte vezivanjem za nesavršeno komplementarna mesta unutar 3’ netranslatujućih regiona (untranslated regions, UTR) svojih mRNK ciljeva, vrše represiju ekspresije ciljnog gena posttranskripciono, očigledno na nivou translacije, preko RISC kompleksa koji je sličan, ili moguće identičan sa onim koji se koristi za RNAi put. Konzistentno sa translacionom kontrolom, miRNK koje koriste ovaj mehanizam redukuju nivoe proteina svojih ciljnih gena, ali uticaj na nivoe mRNK ovih gena je samo minimalan. miRNK obuhvataju miRNK koje se sreću u prirodi kao i veštački dizajnirane miRNK koje mogu da specifično ciljaju bilo koju mRNK sekvencu. Na primer, vešt stručnjak može dizajnirati RNK konstrukte u vidu kratke ukosnice eksprimirane kao primarni transkripti humane miRNK (npr., miR-30 ili miR-21). Ovaj dizajn daje Drosha mesto obrade konstruktu u vidu ukosnice i pokazano je da u velikoj meri povećava efikasnost "nokdauna" (Pusch et al., 2004). Osovina ukosnice sastoji se od 22-nt dsRNK (npr., antismisleni ima savršenu komplementarnost sa željenim ciljem) i 15-19-nt petlju iz humane miR. Dodavanje miR petlje i miR30 bočnih sekvenci na jednoj ili obe strane ukosnice rezultuje više nego desetostrukim porastom Drosha i Dicer obrađivanja eksprimiranih ukosnica u poređenju sa konvencionalnim shRNK dizajnima bez mikroRNK. Povećana Drosha i Dicer obrada prevodi se u veću proizvodnju siRNK/miRNK i veću snagu za eksprimirane ukosnice.
[0120] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "shRNK" ili "kratka ukosnica RNK" odnose se na dvolančanu strukturu koja se formira jednim samokomplementarnim RNK lancem. shRNK konstrukti koji sadrže nukleotidnu sekvencu identičnu sa delom kodirajuće ili nekodirajuće sekvence ciljnog gena poželjne su za inhibiciju. Isto tako, nađeno je da su RNK sekvence sa insercijama, delecijama i pojedinačnim tačkastim mutacijama u odnosu na ciljnu sekvencu efikasne za inhibiciju. Poželjno je više od 90% sekvencione identičnosti, ili čak 100% sekvencione identičnosti između inhibitorne RNK i dela ciljnog gena. Dužina dupleksformirajućeg dela shRNK može iznositi najmanje 20, 21 ili 22 nukleotida, npr., po veličini odgovara RNK proizvodima proizvedenim Dicer-zavisnim isecanjem. shRNK konstrukt može biti dug najmanje 25, 50, 100, 200, 300 ili 400 baza. shRNK konstrukt može biti dug 400-800 baza. shRNK konstrukti su visoko tolerantni za varijacije u sekvenci petlje i veličini petlje.
[0121] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ribozim" odnosi se na katalitički aktivan molekul RNK sposoban da vrši sečenje ciljne mRNK specifično za mesto. Opisano je nekoliko podtipova ribozima, npr., ribozimi "glava čekića" i "ukosnica". Ribozimska katalitička aktivnost i stabilnost mogu se poboljšati supstituisanjem ribonukleotida deoksiribonukleotidima na nekatalitičkim bazama. Iako ribozimi koji seku mRNK na specifičnim mestima prepoznavanja u sekvenci mogu da se koriste za razgradnju određenih mRNK, poželjna je upotreba ribozima "glava čekića". Ribozimi "glava čekića" seku mRNK na mestima koja diktiraju bočni regioni koji formiraju komplementarne bazne parove sa ciljnom mRNK. Jedini uslov je da ciljna mRNK ima sledeću sekvencu dve baze: 5’-UG-3’. Konstrukcija i proizvodnja ribozima "glava čekića" dobro su poznate u struci.
[0122] Poželjni metod dostave polinukleotida od interesa koji podrazumevaju siRNK, miRNK, shRNK, ili ribozim uključuje jednu ili više regulatornih sekvenci, kao što su, na primer, snažni konstitutivni pol III, npr., humani U6 snRNK promotor, mišji U6 snRNK promotor, humani i mišji HI RNK promotor i humani tRNK-val promotor, ili snažni konstitutivni pol II promotor, kako je opisano na drugom mestu u ovom tekstu.
[0123] Polinukleotidi, bez obzira na dužinu same kodirajuće sekvence, mogu se kombinovati sa drugim DNK sekvencama, kao što su promotori i/ili enhenseri, netranslatujući regioni (untranslated regions, UTR), signalne sekvence, Kozakove sekvence, poliadenilacioni signali, dodatna mesta za restrikcione enzime, višestruka mesta kloniranja, mesta unutrašnjeg ulaska ribozoma (internal ribosomal entry sites, IRES), mesta prepoznavanja za rekombinazu (npr., LoxP, FRT i Att mesta), terminacioni kodoni, signali terminacije transkripcije, i polinukleotidi koji kodiraju samoisecajuće polipeptide, epitopski tagovi, kako je objavljeno na drugom mestu u ovom tekstu ili kako je poznato u struci, tako da njihova ukupna dužina može značajno varirati. Stoga se smatra da polinukleotidni fragment skoro svake dužine može da se upotrebi, pri čemu je ukupna dužina poželjno ograničena jednostavnošću pripreme i upotrebom u protokolu rekombinantne DNK kojem je namenjen.
[0124] Polinukleotidi mogu da se pripreme, obrade i/ili eksprimiraju korišćenjem bilo koje od većeg broja različitih tehnika poznatih i raspoloživih u struci. Da bi se eksprimirao željeni polipeptid, nukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid može da se insertuje u odgovarajući vektor. Primeri vektora su plazmidi, autonomno replicirajuće sekvence i transpozabilni elementi. Dodatni primeri vektora uključuju, bez ograničavanja, plazmide, fagemide, kozmide, veštačke hromozome kao što je veštački hromozom kvasca (yeast artificial chromosome, YAC), bakterijski veštački hromozom (bacterial artificial chromosome, BAC), ili P1-izvedeni veštački hromozoma (P1-derived artificial chromosome, PAC), bakteriofage kao lambda fag ili M13 fag i životinjske viruse. Primeri kategorija životinjskih virusa koji su korisni kao vektori uključuju, bez ograničavanja, retrovirus (uključujući lentivirus), adenovirus, adeno-udruženi virus, herpesvirus (npr., herpes simpleks virus), poksvirus, bakulovirus, papilomavirus i papovavirus (npr., SV40). Primeri ekspresionih vektora su pClneo vektori (Promega) za ekspresiju u sisarskim ćelijama; pLenti4/V5-DEST™, pLenti6/V5-DEST™ i pLenti6.2N5-GW/lacZ (Invitrogen) za lentivirusom-posredovani genski transfer i ekspresiju u sisarskim ćelijama. Kodirajuće sekvence himernih proteina objavljenih u ovom tekstu mogu biti povezane u takve ekspresione vektore za ekspresiju himernog proteina u sisarskim ćelijama.
[0125] Vektor koji kodira CAR razmatran u ovom tekstu može uključivati polinukleotidnu sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 36.
[0126] Vektor može biti epizomski vektor ili vektor koji se održava ekstrahromozomski. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "epizomski" odnosi se na vektor koji može da se replicira bez integracije u domaćinovu hromozomsku DNK i bez postepenog gubljenja iz ćelijedomaćina koja se deli, što takođe znači da se pomenuti vektor replicira ekstrahromozomski ili epizomski. Vektor je inženjerisan tako da nosi sekvencu koja kodira mesto početka replikacije DNK ili "ori" iz limfotrofnog herpes virusa ili gama herpesvirusa, adenovirusa, SV40, goveđeg papiloma virusa, ili kvasca, specifično mesto početka replikacije limfotrofnog herpes virusa ili gama herpesvirusa, što odgovara oriP EBV. U posebnom aspektu, limfotrofni herpes virus može biti Epstein Barrov virus (EBV), herpes virus Kaposijevog sarkoma (Kaposi’s sarcoma herpes virus, KSHV), herpes virus saimiri (HS), ili virus Marekove bolesti (Marek’s disease virus, MDV). Epstein Barrov virus (EBV) i herpes virus Kaposijevog sarkoma (KSHV) takođe su primeri gama herpes virusa. Tipično, ćelija-domaćin uključuje transaktivatorski protein virusne replikacije, koji aktivira replikaciju.
[0127] "Kontrolni elementi" ili "regulatorne sekvence" prisutne u ekspresionom vektoru su oni netranslatujući regioni vektorskog mesta početka replikacije, selekcione kasete, promotora, enhensera, introni signala inicijacije translacije (Shine Dalgarno sekvenca ili Kozakova sekvenca), poliadenilaciona sekvenca, 5’ i 3’ netranslatujući regioni - koji interaguju sa proteinima ćelije-domaćina da bi se izvršila transkripcija i translacija. Takvi elementi mogu varirati u pogledu snage i specifičnosti. U zavisnosti od upotrebljenog vektorskog sistema i domaćina, može se koristiti bilo koji broj pogodnih transkripcionih i translacionih elemenata, uključujući sveprisutne promotore i inducibilne promotore.
[0128] Vektor za upotrebu u izvođenju predmetne objave koji uključuje, ali se ne ograničava na ekspresione vektore i virusne vektore, obuhvatiće egzogene, endogene, ili heterologne kontrolne sekvence kao što su promotori i/ili enhenseri. "Endogena" kontrolna sekvenca je ona koja je prirodno povezana sa datim genom u genomu. "Egzogena" kontrolna sekvenca je ona koja je jukstapozicionirana uz gen putem genetičke manipulacije (tj., tehnikama molekularne biologije) tako da transkripcija gena bude pod kontrolom enhensera/promotora sa kojim je spojen. "Heterologna" kontrolna sekvenca je egzogena sekvenca koja je iz vrste različite od vrste iz koje je genetički manipulisana ćelija.
[0129] Izraz "promotor", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na mesto prepoznavanja polinukleotida (DNK ili RNK) za koji se vezuje RNK polimeraza. RNK polimeraza inicira i transkribuje polinukleotide operabilno povezane sa promotorom. Promotori operativni u sisarskim ćelijama mogu uključivati AT-bogati region lociran približno 25 do 30 baza ushodno od mesta gde je inicirana transkripcija i/ili drugu sekvencu koja se nalazi 70 do 80 baza ushodno od mesta početka transkripcije, CNCAAT region, pri čemu N može biti bilo koji nukleotid.
[0130] Izraz "enhenser" odnosi se na segment DNK koji sadrži sekvence sposobne da obezbede pojačanu transkripciju i u nekim slučajevima mogu da funkcionišu nezavisno od orijentacije u odnosu na drugu kontrolnu sekvencu. Enhenser može da funkcioniše kooperativno ili aditivno sa promotorskim i/ili drugim enhenserskim elementima. Izraz "promotor/enhenser" odnosi se na segment DNK koji sadrži sekvencu sposobnu da obezbedi i promotorsku i enhensersku funkciju.
[0131] Izraz "operabilno povezan", odnosi se na jukstapoziciju pri kojoj su opisane komponente u odnosu koji im dopušta da funkcionišu na predviđen način. Izraz se može odnositi na funkcionalnu vezu između kontrolne sekvence nukleinske kiseline (kao promotor i/ili enhenser) i druge polinukleotidne sekvence, npr., polinukleotid od interesa, pri čemu ekspresiona kontrolna sekvenca usmerava transkripciju nukleinske kiseline koja odgovara drugoj sekvenci.
[0132] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "konstitutivna ekspresiona kontrolna sekvenca" odnosi se na promotor, enhenser, ili promotor/enhenser koji u kontinuitetu ili stalno omogućavaju transkripciju operabilno povezane sekvence. Konstitutivna ekspresiona kontrolna sekvenca može biti "sveprisutni" promotor, enhenser, ili promotor/enhenser koji omogućavaju ekspresiju u velikom broju različitih tipova ćelija i tkiva, odnosno "za ćeliju specifičan", "za tip ćelije specifičan", "za ćelijsku liniju specifičan" ili "tkivno specifičan" promotor, enhenser, ili promotor/enhenser koji omogućava ekspresiju u ograničenom broju različitih tipova ćelija i tkiva.
[0133] Ilustrativne sveprisutne ekspresione kontrolne sekvence pogodne za upotrebu uključuju, ali se ne ograničavaju na citomegalovirusni (cytomegalovirus, CMV) neposredni rani promotor, simijan virusni 40 (SV40) (npr., rani ili kasni), LTR promotor Moloney virusa mišje leukemije (Moloney murine leukemia virus, MoMLV), LTR Rous sarkoma virusa (RSV), promotor herpes simpleks virusa (HSV) (timidin kinaza), H5, P7.5 i P11 promotore iz vakcinija virusa, promotor elongacionog faktora 1-alfa (elongation factor 1-alpha, EF1a), "early growth response 1" (EGR1), feritina H (FerH), feritina L (FerL), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH), eukariotskog faktora inicijacije translacije 4A1 (eukaryotic translation initiation factor 4A1, EIF4A1), proteina 5 toplotnog šoka 70 kDa (heat shock 70 kDa protein 5, HSPA5), proteina toplotnog šoka 90 kDa beta, član 1 (heat shock protein 90 kDa beta, member 1, HSP90B1), proteina toplotnog šoka 70 kDa (HSP70), β-kinezin (β-KIN), humanog ROSA 26 lokusa (Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477 - 1482 (2007)), promotor ubikvitina C (Ubiquitin C promoter, UBC), promotor fosfoglicerat-kinaze-1 (phosphoglycerate kinase-1, PGK), promotor citomegalovirusnog pojačivača/pileći β-aktin (cytomegalovirus enhancer/chicken β-actin, CAG), promotor β-aktina i enhenser mijeloproliferativnog sarkoma virusa, negativni kontrolni region uklonjen, dl587rev prajmer-vezujuće mesto supstituisani (MND) promotor (Challita et al., J Virol.69(2):748-55 (1995)).
[0134] Vektor može uključivati MND promotor.
[0135] Vektor može uključivati EFla promotor koji sadrži prvi intron humanog EF1a gena.
[0136] Vektor može uključivati EFla promotor koji ne sadrži prvi intron humanog EF1a gena.
[0137] Može biti poželjno eksprimirati polinukleotid koji uključuje CAR, iz T ćelijskog specifičnog promotora.
[0138] Kako se koristi u ovom tekstu, "uslovna ekspresija" može da se odnosi na bilo koji tip uslovne ekspresije uključujući, ali ne ograničavajući se na inducibilnu ekspresiju; represibilnu ekspresiju; ekspresiju u ćelijama ili tkivima koji imaju određeno fiziološko, biološko ili bolesno stanje, itd. Ova definicija ne isključuje ekspresiju specifičnu za tip ćelije ili tkivo. Obezbeđena je uslovna ekspresija polinukleotida od interesa, npr., ekspresija je kontrolisana izlaganjem ćelije, tkiva, organizma, itd. tretmanu ili uslovu koji dovode do ekspresije polinukleotida ili prouzrokuju porast ili smanjenje ekspresije polinukleotida kodiranog polinukleotidom od interesa.
[0139] Ilustrativni primeri inducibilnih promotora/sistema uključuju, ali se ne ograničavaju na steroid-inducibilne promotore kao što su promotori za gene koji kodiraju glukokortikoidne ili estrogenske receptore (inducibilne tretiranjem odogvarajućim hormonom), metalotioninski promotor (inducibilan tretmanom različitim teškim metalima), MX-1 promotor (inducibilan interferonom), "GeneSwitch" mifepriston-regulabilni sistem (Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), kumat-inducibilni genski prekidač (WO 2002/088346), tetraciklin-zavisni regulatorni sistemi, itd.
[0140] Uslovna ekspresija može da se postigne korišćenjem DNK rekombinaze specifične za mesto. Vektor može sadržati najmanje jedno, tipično dva mesta za rekombinaciju posredovanu rekombinazom specifičnom za mesto. Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "rekombinaza" ili "rekombinaza specifična za mesto" uključuju ekscizivne ili integrativne proteine, enzime, kofaktore ili pridružene proteine koji su uključeni u rekombinacione reakcije koje uključuju jedno ili više tekombinacionih mesta (npr., dva, tri, četiri, pet, sedam, deset, dvanaest, petnaest, dvadest, trideset, pedeset, itd.), koji mogu biti proteini divljeg tipa (vidi Landy, Current Opinion in Biotechnology 3:699-707 (1993)), ili mutanti, derivati (npr., fuzioni proteini koji sadrže rekombinacione proteinske sekvence ili njihove fragmente), fragmenti i varijante istog. Ilustrativni primeri rekombinaza pogodnih za upotrebu uključuju, ali se ne ograničavaju na: Cre, Int, IHF, Xis, Flp, Fis, Hin, Gin, ΦC31, Cin, Tn3 resolvazu, TndX, XerC, XerD, TnpX, Hjc, Gin, SpCCE1 i ParA.
[0141] Vektori mogu uključivati jedno ili više rekombinacionih mesta za bilo koju od velikog broja različitih za mesto specifičnih rekombinaza. Treba razumeti da je ciljno mesto za rekombinazu specifičnu za mesto dodatno u odnosu na neko jedno ili više mesta potrebnih za integraciju vekotra, npr., retrovirusnog vektora ili lentivirusnog vektora. Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "rekombinaciona sekvenca", "rekombinaciono mesto" ili "specifično rekombinaciono mesto" odnose se na određenu sekvencu nukleinske kiseline koju rekombinaza prepoznaje i za koju se vezuje.
[0142] Na primer, jedno rekombinaciono mesto za Cre rekombinazu je loxP, što je sekvenca od 34 bazna para koja uključuje dva invertovana ponovka od 13 baznih parova (služe kao mesta vezivanja rekombinaze) koji bočno ograničavaju središnju sekvencu od 8 baznih parova (vidi SL. 1 iz Sauer, B., Current Opinion in Biotechnology 5:521-527 (1994)). Drugi primeri loxP mesta uključuju, ali se ne ograničavaju na: lox511 (Hoess et al., 1996; Bethke and Sauer, 1997), lox5171 (Lee and Saito, 1998), lox2272 (Lee and Saito, 1998), m2 (Langer et al., 2002), lox71 (Albert et al., 1995) i lox66 (Albert et al., 1995).
[0143] Pogodna mesta prepoznavanja za FLP rekombinazu uključuju, ali se ne ograničavaju na: FRT (McLeod, et al., 1996), F1, F2, F3(Schlake and Bode, 1994), F4, F5(Schlake and Bode, 1994), FRT(LE) (Senecoff et al., 1988), FRT(RE) (Senecoff et al., 1988).
[0144] Drugi primeri mesta prepoznavanja su attB, attP, attL i attR sekvence, koje se prepoznaju rekombinaznim enzimom λ integrazom, npr., phi-c31. φC31 SSR posreduje u rekombinaciji samo između heterotipskih mesta attB (34 bp dužine) i attP (39 bp dužine) (Groth et al., 2000). attB i attP, označeni prema mestima prikačinjanja fag-integraze na bakterijskom genomu i genomu faga, respektivno, oba sadrže nesavršene invertovane ponovke koji su verovatno vezani φC31 homodimerima (Groth et al., 2000). Mesta proizvoda, attL i attR, efektivno su inertni za dodatnu φC31-posredovanu rekombinaciju (Belteki et al., 2003), čineći reakciju ireverzibilnom. Za katalisanje insercija, nađeno je da se attB-noseća DNK insertuje u genomsko attP mesto lakše nego attP mesto u genomsko attB mesto (Thyagarajan et al., 2001; Belteki et al., 2003). Prema tome, tipične strategije postavljaju homologom rekombinacijom attP-noseće "mesto ukotvljavanja" u definisani lokus, a ono se zatim udružuje sa attB-nosećom dolazećom sekvencom, radi insercije.
[0145] Kako se koristi u ovom tekstu, "unutrašnje mesto vezivanja ribozoma" ili "IRES" odnosi se na element koji pokreće direktno unutrašnje vezivanje ribozoma za inicijacioni kodon kao što je ATG, cistrona (protein-kodirajući region), čime dovodi do "cap"-nezavisne translacije gena. Vidi, npr., Jackson et al., 1990. Trends Biochem Sci 15(12):477-83) i Jackson and Kaminski. 1995. RNA 1(10):985-1000. Vektori mogu uključivati jedan ili više polinukleotida od interesa koji kodiraju jedan ili više polipeptida. Da bi se postigla efikasna translacija svakog od većeg broja polipeptida, polinukleotidne sekvence mogu biti razdvojene jednom ili više IRES sekvenci ili polinukleotidnih sekvenci koje kodiraju samoisecajuće polipeptide.
[0146] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "Kozakova sekvenca" odnosi se na kratku nukleotidnu sekvencu koja u velikoj meri olakšava inicijalno vezivanje mRNK za malu podjedinicu ribozoma i povećava translaciju. Konsenzusna Kozakova sekvenca je (GCC)RCCATGG, gde je R purin (A ili G) (Kozak, 1986. Cell.44(2):283-92 i Kozak, 1987. Nucleic Acids Res. 15(20):8125-48). Vektori mogu uključivati polinukleotide koji imaju konsenzusnu Kozakovu sekvencu i koji kodiraju željeni polipeptid, npr., CAR.
[0147] Polinukleotid ili ćelija koja nosi polinukleotid mogu koristiti suicidni gen, uključujući inducibilni suicidni gen za smanjenje rizika za direktnu toksičnost i/ili nekontrolisanu proliferaciju. Suicidni gen ne mora biti imunogen za domaćina koji nosi polinukleotid ili ćeliju. Jedan primer suicidnog gena koji može da se koristi je kaspaza-9 ili kaspaza-8 ili citozin deaminaza. Kaspaza-9 može da se aktivira korišćenjem specifičnog hemijskog induktora dimerizacije (chemical inducer of dimerization, CID).
[0148] Vektori mogu uključivati genske segmente koji dovode do toga da imunske efektorske ćelije, npr., T ćelije budu podložne negativnoj selekciji in vivo. Pod "negativnom selekcijom" misli se na to da ćelije unete infuzijom mogu da se eliminišu kao rezultat promene in vivo uslova individue. Negativno selektabilni fenotip može biti rezultat insercije gena koji daje senzitivnost na primenjeno sredstvo, na primer, jedinjenje. Negativno selektabilni geni poznati su u struci i uključuju, između ostalih, sledeće: herpes simpleks virus tip I timidin kinazni (HSV-I TK) gen (Wigler et al., Cell 11:223, 1977) koji daje osetljivost na ganciklovir; gen za ćelijsku hipoksantin fosforibozil transferazu (hypoxanthine phosphribosyltransferase, HPRT), gen za ćelijsku adenin fosforiboziltransferazu (adenine phosphoribosyltransferase, APRT) i bakterijsku citozin deaminazu (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:33 (1992)).
[0149] Genetički modifikovane imunske efektorske ćelije, kao što su T ćelije, mogu sadržati polinukleotid koji uključuje još i pozitivni marker koji omogućava selekciju ćelija negativnog selektabilnog fenotipa in vitro. Pozitivni selektabilni marker može biti gen koji, pošto je uveden u ćeliju-domaćina, eksprimira dominantni fenotip omogućavajući pozitivnu selekciju ćelija koje nose gen. Geni ovog tipa poznati su u struci i uključuju, između ostalih, gen za higromicin-B fosfotransferazu (hph) koji daje rezistenciju na higromicin B, gen za amino glikozid fosfotransferazu (neo ili aph) iz Tn5 koji kodira za rezistenciju na antibiotik G418, gen za dihidrofolat reduktazu (DHFR), gen za adenozin deaminazu (ADA) i gen za rezistenciju na veći broj lekova (multi-drug resistance, MDR).
[0150] Poželjno, pozitivni selektabilni marker i negativni selektabilni element povezani su tako da je gubitak negativnog selektabilnog elementa nužno udružen sa gubitkom pozitivnog selektabilnog markera. Još poželjnije, pozitivni i negativni selektabilni marker fuzionisani su tako da gubitak jednog obavezno dovodi do gubitka i drugog. Primer fuzionisanog polinukleotida koji kao ekspresioni proizvod daje polipeptid odgovoran za gore opisane željene pozitivne i negativne selekcione osobine je fuzioni gen higromicin fosfotransferazatimidin kinaza (hygromycin phosphotransferase thymidine kinase, HyTK). Ekspresija ovog gena daje polipeptid odgovoran za rezistenciju na higromicin B za pozitivnu selekciju in vitro i senzitivnost na ganciklovir za negativnu selekciju in vivo. Vidi Lupton S. D., et al, Mol. and Cell. Biology 1 1:3374-3378, 1991. Pored toga, polinukleotidi koji kodiraju himerne receptore mogu biti retrovirusni vektori koji sadrže fuzionisani gen, posebno onaj koji daje rezistenciju na higromicin B za pozitivnu selekciju in vitro i senzitivnost na ganciklovir za negativnu selekciju in vivo, na primer HyTK retrovirusni vektor opisan u Lupton, S. D. et al. (1991), gore. Vidi i publikacije PCT US91/08442 i PCT/US94/05601, S. D. Lupton, gde se opisuje upotreba bifunkcionalnih selektabilnih fuzionih gena dobijenih fuzijom dominantnih pozitivnih selektabilnih markera sa negativnim selektabilnim markerima.
[0151] Poželjni pozitivni selektabilni markeri izvedeni su iz gena odabranih iz grupe koja se sastoji od hph, nco i gpt, a poželjni negativni selektabilni markeri izvedeni su iz gena odabranih iz grupe koja se sastoji od citozin deaminaze, HSV-I TK, VZV TK, HPRT, APRT i gpt. Posebno poželjni markeri su bifunkcionalni selektabilni fuzioni geni, pri čemu je pozitivni selektabilni marker izveden iz hph ili neo, a negativni selektabilni marker je izveden iz citozin deaminaze ili TK gena ili selektabilnog markera. Inducibilni suicidni geni
F. VIRUSNI VEKTORI
[0152] Ćelija (npr., imunska efektorska ćelija) može da se transdukuje retrovirusnim vektorom, npr., lentivirusnim vektorom, koji kodira CAR. Na primer, imunska efektorska ćelija je transdukovana vektorom koji kodira CAR koji uključuje mišje anti-BCMA antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za BCMA polipeptid, sa unutarćelijskim signalnim domenom CD3ζ, CD28, 4-1BB, Ox40, ili bilo kojom njihovom kombinacijom. Prema tome, ove transdukovane ćelije pobuđuju CAR-posredovani citotoksični odgovor.
[0153] Retrovirusi su čest alat za dostavu gena (Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). Retrovirus može da se koristi da bi se ćeliji dostavio polinukleotid koji kodira himerni antigenski receptor (CAR). Kako se koristi u ovom tekstu izraz "retrovirus" označava RNK virus koji reverzno transkribuje svoju genomsku RNK u linearnu dvolančanu DNK kopiju i zatim kovalentno integriše svoju genomsku DNK u genom domaćina. Kada se virus integriše u genom domaćina, označava se kao "provirus". Provirus služi kao templat za RNK polimerazu II i usmerava ekspresiju RNK molekula koji kodiraju strukturne proteine i enzime potrebne za proizvodnju novih virusnih čestica.
[0154] Ilustrativni retrovirusi pogodni za upotrebu uključuju, ali se ne ograničavaju na: virus Moloneyjeve mišje leukemije (Moloney murine leukemia virus, M-MuLV), virus Moloneyjevog mišjeg sarkoma (Moloney murine sarcoma virus, MoMSV), virus Harveyjevog mišjeg sarkoma (Harvey murine sarcoma virus, HaMuSV), virus tumora mlečne žlezde miša (murine mammary tumor virus, MuMTV), virus leukemije gibona (gibbon ape leukemia virus, GaLV), virus mačje leukemije (feline leukemia virus, FLV), spumavirus, virus Friendove mišje leukemije, virus mišjih matičnih ćelija (murine stem cell virus, MSCV) i virus Rousovog sarkoma (RSV)) i lentivirus.
[0155] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "lentivirus" odnosi se na grupu (ili rod) kompleksnih retrovirusa. Ilustrativni lentivirusi uključuju, ali se ne ograničavaju na: HIV (virus humane imunodeficijencije; uključujući HIV tip 1 i HIV tip 2); visna-maedi virus (VMV); virus artritisa-encefalitisa koze (caprine arthritis-encephalitis virus, CAEV); virus infektivne anemije konja (equine infectious anemia virus, equine infectious anemia virus, EIAV); virus mačje imunodeficijencije (feline immunodeficiency virus, FIV); virus goveđe imunodeficijencije (bovine immune deficiency virus, BIV); i virus imunodeficijencije kod majmuna (simian immunodeficiency virus, SIV). U jednom primeru izvođenja, poželjne su HIV-bazirane vektorske osovine (tj., HIV cis-delujući sekvencioni elementi). Lentivirus može da se koristi da bi se ćeliji dostavio polinukleotid koji sadrži CAR.
[0156] Mogu se koristiti retrovirusni vektori i, preciznije, lentivirusni vektori. Prema tome, izraz "retrovirus" ili "retrovirusni vektor", kako se koristi u ovom tekstu, treba da uključi "lentivirus", odnosno "lentivirusne vektore".
[0157] Izraz "vektor" koristi se u ovom tekstu da označi molekul nukleinske kiseline koji može da prenese ili transportuje drugi molekul nukleinske kiseline. Preneta nukleinska kiselina je obično povezana, npr., insertovana, u molekul vektorske nukleinske kiseline. Vektor može uključivati sekvence koje usmeravaju autonomnu replikaciju u ćeliji, ili mogu uključivati sekvence koje su dovoljne da omoguće integraciju u DNK ćelije-domaćina. Korisni vektori uključuju, na primer, plazmide (npr., DNK plazmide ili RNK plazmide), transpozone, kozmide, bakterijske veštačke hromozome i virusne vektore. Korisni virusni vektori uključuju, npr., replikaciono defektne retroviruse i lentiviruse.
[0158] Kao što će stručnjaku u oblasti biti jasno, izraz "virusni vektor" široko se koristi da označi molekul nukleinske kiseline (npr., transfer plazmid) koji uključuje elemente nukleinske kiseline izvedene iz virusa, koji tipično olakšavaju transfer molekula nukleinske kiseline ili integraciju u genom ćelije ili u virusnu česticu koja posreduje u transferu nukleinske kiseline. Virusne čestice će tipično uključivati različite virusne komponente, a ponekad i komponente ćelije-domaćina, pored jedne ili više nukleinskih kiselina.
[0159] Izraz virusni vektor može označavati virus ili virusnu česticu sposobnu da prenese nukleinsku kiselinu u ćeliju ili samu prenetu nukleinsku kiselinu. Virusni vektori i transfer plazmidi sadrže strukturne i/ili funkcionalne genetičke elemente koji su primarno izvedeni iz virusa. Izraz "retrovirusni vektor" odnosi se na virusni vektor ili plazmid koji sadrži strukturne i funkcionalne genetičke elemente ili njihove delove koji su primarno izvedeni iz retrovirusa. Izraz "lentivirusni vektor" odnosi se na virusni vektor ili plazmid koji sadrži strukturne i funkcionalne genetičke elemente, ili njihove delove, uključujući LTR koji su primarno izvedeni iz lentivirusa. Izraz "hibridni vektor" odnosi se na vektor, LTR ili drugu nukleinsku kiselinu koji sadrže retrovirusne, npr., lentivirusne sekvence i nelentivirusne virusne sekvence. Ahibridni vektor može da se odnosi na vektor ili transfer-plazmid koji uključuju retrovirusne, npr., lentivirusne sekvence za reverznu transkripciju, replikaciju, integraciju i/ili pakovanje.
[0160] Izrazi "lentivirusni vektor", "lentivirusni ekspresioni vektor" mogu da se koriste da označe lentivirusne transfer-plazmide i/ili infektivne lentivirusne čestice. Kada se u ovom tekstu vrši pozivanje na elemente kao što su klonirajuća mesta, promotori, regulatorni elementi, heterologe nukleinske kiseline, itd., treba razumeti da su sekvence ovih elemenata u lentivirusnim česticama prisutne u RNK formi i da su u DNK plazmidima prisutne u DNK formi.
[0161] Na svakom kraju provirusa nalaze se strukture nazvane "dugi terminalni ponovci" (long terminal repeats) ili "LTR". Izraz "dugi terminalni ponovak (LTR)" odnosi se na domene baznih parova locirane na krajevima retrovirusnih DNK koji su, u svom prirodnom sekvencionom kontekstu, direktni ponovci i sadrže U3, R i U5 regione. LTR obično obezbeđuju funkcije fundamentalne za ekspresiju retrovirusnih gena (npr., promocija, inicijacija i poliadenilacija genskih transkripata) i replikaciju virusa. LTR sadrži brojne regulatorne signale uključujući transkripcione kontrolne elemente, poliadenilacione signale i sekvence potrebne za replikaciju i integraciju virusnog genoma. Virusni LTR podeljen je u tri regiona nazvana U3, R i U5. U3 region sadrži enhenserske i promotorske elemente. U5 region je sekvenca između mesta vezivanja prajmera i R regiona i sadrži poliadenilacionu sekvencu. R (ponovak) region bočno je ograničen U3 i U5 regionom. LTR sastavljen od U3, R i U5 regiona javlja se i na 5’ i na 3’ kraju virusnog genoma. Uz 5’ LTR su sekvence potrebne za reverznu transkripciju genoma (tRNK prajmer-vezujuće mesto) i za efikasno pakovanje virusne RNK u čestice (psi mesto).
[0162] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "pakujući signal" ili "pakujuća sekvenca" odnosi se na sekvencu lociranu unutar retrovirusnog genoma, koja je potrebna za inserciju virusne RNK u virusni kapsid ili česticu, vidi, npr., Clever et al., 1995. J. of Virology, Vol.69, No.4; pp. 2101-2109. Nekoliko retrovirusnih vektora koristi minimalni pakujući signal (označen i kao psi [Ψ] sekvenca) potreban za inkapsulaciju virusnog genoma. Prema tome, kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "pakujuća sekvenca", "pakujući signal", "psi" i simbol "Ψ" koriste se u vezi sa nekodirajućom sekvencom potrebnom za inkapsulisanje retrovirusnih RNK lanaca tokom formiranja virusne čestice.
[0163] Vektori mogu uključivati modifikovani 5’ LTR i/ili 3’ LTR. Jedan ili oba LTR mogu imati jednu ili više modifikacija uključujući, ali ne ograničavajući se na jednu ili više delecija, insercija ili supstitucija. Modifikacije 3’ LTR često se prave da bi se povećala bezbednost lentivirusnih ili retrovirusnih sistema, čineći viruse replikaciono defektnim. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "replikaciono defektan" odnosi se na virus koji nije sposoban za kompletnu, efikasnu replikaciju, tako da ne dolazi do proizvodnje infektivnih viriona (npr., replikaciono defektno lentivirusno potomstvo). Izraz "replikaciono kompetentan" odnosi se na divlji tip virusa ili mutantni virus koji je sposoban za replikaciju, tako da virusna replikacija može da proizvede infektivne virione (npr., replikaciono kompetentno lentivirusno potomstvo).
[0164] "Samoinaktivirajući" (self-inactivating, SIN) vektori, odnosi se na replikaciono defektne vektore, npr., retrovirusne ili lentivirusne vektore, u kojima je desni (3’) LTR enhenser-promotor region, poznat kao U3 region, modifikovan (npr., delecijom ili supstitucijom) da bi se prevenirala virusna transkripcija dalje od prvog kruga replikacije virusa. Ovo je zbog toga što se desni (3’) LTR U3 region koristi kao templat za levi (5’) LTR U3 region tokom replikacije virusa i, prema tome, virusni transkript ne može da se napravi bez U3 enhensera-promotora. 3’ LTR može da se modifikuje tako da se U5 region zameni, na primer, idealnom poli(A) sekvencom. Treba napomenuti da su uključene i modifikacije u LTR kao što su modifikacije 3’ LTR, 5’ LTR, ili i 3’ i 5’ LTR.
[0165] Dodatno poboljšanje bezbednosti obezbeđuje se zamenom U3 regiona 5’ LTR heterolognim promotorom za vođenje transkripcije virusnog genoma tokom proizvodnje virusnih čestica. Primeri heterolognih promotora koji se mogu koristiti uključuju, na primer, promotore simijan virusa 40 (SV40) (npr., rani ili kasni), citomegalovirusa (CMV) (npr., neposredni rani), virusa Moloneyjeve mišje leukemije (MoMLV), virusa Rousovog sarkoma (RSV) i herpes simpleks virusa (HSV) (timidin kinaza). Tipični promotori sposobni su da vode visoke nivoe transkripcije na Tat-nezavisan način. Ova zamena smanjuje mogućnost rekombinacije da stvori replikaciono kompetentni virus jer nema kompletne U3 sekvence u sistemu za proizvodnju virusa. Heterologni promotor može imati dodatne prednosti u kontroli načina transkripcije virusnog genoma. Na primer, heterologni promotor može biti inducibilan, tako da će se transkripcija celog ili dela virusnog genoma desiti samo kada su prisutni indukcioni faktori. Indukcioni faktori uključuju, ali se ne ograničavaju na jedno ili više hemijskih jedinjenja, ili fiziološke uslove kao što su temperatura ili pH, pri kojima se kultivišu ćelije-domaćini.
[0166] Virusni vektori mogu uključivati TAR element. Izraz "TAR" odnosi se na genetički element "transaktivacioni odgovor" (trans-activation response) lociran u R regionu lentivirusnih (npr., HIV) LTR. Ovaj element interaguje sa lentivirusnim transaktivatorskim (tat) genetičkim elementom da bi se pojačala replikacija virusa. Međutim, ovaj element nije neophodan u primerima izvođenja u kojima je U3 region 5’ LTR zamenjen heterolognim promotorom.
[0167] "R region" odnosi se na region unutar retrovirusnih LTR, koji počinje na početku "capping" grupe (tj., početak transkripcije) i završava se neposredno pre početka poli A trakta. R region se takođe definiše kao bočno ograničen U3 i U5 regionima. R region ima ulogu tokom reverzne transkripcije u dopuštanju transfera nascentne DNK sa jednog kraja genoma na drugi.
[0168] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "FLAP element" odnosi se na nukleinsku kiselinu čija sekvenca uključuje centralni polipurinski trakt i centralne terminacione sekvence (central polypurine tract, central termination sequences, cPPT i CTS) retrovirusa, npr., HIV-1 ili HIV-2. Pogodni FLAP elementi opisani su u U.S. pat. br. 6,682,907 i u Zennou, et al., 2000, Cell, 101:173. Tokom reverzne transkripcije HIV-1, centralna inicijacija plus lanca DNK na centralnom polipurinskom traktu (cPPT) i centralna terminacija na centralnoj terminacionoj sekvenci (central termination sequence, CTS) dovode do formiranja trolančane DNK strukture: HIV-1 centralni DNK prepust. Bez želje za ograničavanjem teorijom, DNK prepust može delovati kao cis-aktivna determinanta lentivirusnog genomskog nukleusnog importa i/ili može povisiti titar virusa. Retrovirusne ili lentivirusne vektorske okosnice mogu uključivati jedan ili više FLAP elemenata ushodno ili nishodno u odnosu na heterologne gene od interesa u vektorima. Na primer, transfer-plazmid može uključivati FLAP element. Vektor može uključivati FLAP element izolovan iz HIV-1.
[0169] Retrovirusni ili lentivirusni transfer-vektori mogu uključivati jedan ili više eksportnih elemenata. Izraz "eksportni element" odnosi se na cis-delujući posttranskripcioni regulatorni element koji reguliše transport RNK transkripta iz nukleusa u citoplazmu ćelije. Primeri RNK eksportnih elemenata uključuju, ali se ne ograničavaju na rev odgovorni element (rev response element, RRE) virusa humane imunodeficijencije (HIV) (vidi, npr., Cullen et al., 1991. J. Virol. 65: 1053; i Cullen et al., 1991. Cell 58: 423), i posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa B (hepatitis B virus post-transcriptional regulatory element, HPRE).
Uopšteno, RNK eksportni element smešten je unutar 3’ UTR gena, a može se insertovati u vidu jedne ili većeg broja kopija.
[0170] Ekspresija heterolognih sekvenci u virusnim vektorima može se povećati inkorporisanjem posttranskripcionih regulatornih elemenata, efikasnih poliadenilacionih mesta i, opciono, transkripcijom terminacionih signala u vektorima. Različiti posttranskripcioni regulatorni elementi mogu povećati ekspresiju heterologne nukleinske kiseline na nivou proteina, npr., posttranskripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, WPRE; Zufferey et al., 1999, J. Virol., 73:2886); postranskripcioni regulatorni element prisutan u virusu hepatitisa B (posttranscriptional regulatory element present in hepatitis B virus, HPRE) (Huang et al., Mol. Cell. Biol., 5:3864); i slično (Liu et al., 1995, Genes Dev., 9:1766). Vektori mogu uključivati posttranskripcioni regulatorni element kao što je WPRE ili HPRE. Vektorima mogu nedostajati ili vektori mogu da ne uključuju posttranskripcioni regulatorni element (posttranscriptional regulatory element, PTE) kao što su WPRE ili HPRE jer u nekim slučajevima ovi elementi povećavaju rizik za ćelijsku transformaciju i/ili suštinski ili značajno ne povećavaju količinu mRNK transkripta ili stabilnost mRNK. Prema tome, vektorima mogu nedostajati ili vektori mogu da ne sadrže PTE. U drugim primerima izvođenja, vektorima nedostaju ili vektori ne sadrže WPRE ili HPRE, što je dodatna mera bezbednosti.
[0171] Elementi koji usmeravaju efikasnu terminaciju i poliadenilaciju heterolognih transkripata nukleinske kiseline povećavaju ekspresiju heterolognog gena. Signali za terminaciju transkripcije se obično nalaze nishodno od poliadenilacionog signala. Vektori mogu uključivati poliadenilacionu sekvencu 3’ polinukleotida kodirajućeg za polipeptid koji treba da se eksprimira. Izrazi "poliA mesto" ili "poliA sekvenca", kada se koriste u ovom tekstu, označavaju DNK sekvencu koja usmerava i terminaciju i poliadenilaciju nascentnog RNK transkripta RNK polimerazom II. Poliadenilacione sekvence mogu promovosati stabilnost mRNK dodavanjem poliA repa na 3’ kraj kodirajuće sekvence i tako doprineti povećanoj efikasnosti translacije. Efikasna poliadenilacija rekombinantnog transkripta je poželjna jer su transkripti koji nemaju poliA rep nestabilni i brzo se degradiraju. Ilustrativni primeri poliA signala koji mogu da se koriste u vektoru uključuju idealnu poliA sekvencu (npr., AATAAA, ATTAAA, AGTAAA), poliA sekvencu goveđeg hormona rasta (bovine growth hormone polyA sequence, BGHpA), poliA sekvencu zečjeg β-globina (rabbit β-globin polyA sequence, rβgpA), ili drugu pogodnu heterologu ili endogenu poliA sekvencu poznatu u struci.
[0172] Retrovirusni ili lentivirusni vektor može uključivati još i jedan ili više insulatorskih elemenata. Insulatorski elementi mogu doprinositi zaštiti lentivirus-eksprimiranih sekvenci, npr., terapijskih polipeptida, od efekata na mestu integracije, koji mogu biti posredovani cisdelujućim elementima prisutnim u genomskoj DNK i dovesti do deregulisane ekspresije transferisanih sekvenci (tj., pozicioni efekti; vidi, npr., Burgess-Beusse et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99:16433; i Zhan et al., 2001, Hum. Genet., 109:471). Transfer-vektori mogu uključivati jedan ili više insulatorskih elemenata 3’ LTR i posle integracije provirusa u genom domaćina, provirus uključuje jedan ili više insulatora na 5’ LTR ili 3’ LTR, zahvaljujući duplikaciji 3’ LTR. Insulatori pogodni za upotrebu uključuju, ali se ne ograničavaju na pileći β-globinski insulator (vidi Chung et al., 1993. Cell 74:505; Chung et al., 1997. PNAS 94:575; i Bell et al., 1999. Cell 98:387). Primeri insulatorskih elemenata uključuju, ali se ne ograničavaju na insulator iz β-globinskog lokusa, kao što je pileći HS4.
[0173] Većina ili sve osovinske sekvence virusnih vektora mogu biti izvedene iz lentivirusa, npr., HIV-1. Međutim, treba razumeti da se mogu koristiti ili kombinovati mnogi različiti izvori retrovirusnih i/ili lentivirusnih sekvenci i da se mogu načiniti brojne supstitucije i izmene u određenim lentivirusnim sekvencama bez ometanja sposobnosti transfer-vektora da obavi funkcije opisane u ovom tekstu. Pored toga, u struci su poznati različiti lentivirusni vektori, vidi Naldini et al., (1996a, 1996b i 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, U.S. pat. br.6,013,516; i 5,994,136, od kojih se mnogi mogu prilagoditi da proizvedu virusni vektor ili transfer-plazmid.
[0174] Vektori mogu uključivati promotor operabilno povezan sa polinukleotidom koji kodira CAR polipeptid. Vektori mogu imati jedan ili više LTR, gde LTR uključuje jednu ili više modifikacija, na primer jednu ili više nukleotidnih supstitucija, adicija ili delecija. Vektori mogu uključivati još i jedan ili više dodatnih elemenata za povećanje efikasnosti transdukcije (npr., cPPT/FLAP), pakovanja virusa (npr., psi (Ψ) pakujuči signal, RRE), i/ili druge elemente koji povećavaju ekspresiju terapijskog gena (npr., poli (A) sekvence) i opciono mogu uključivati WPRE ili HPRE.
[0175] Transfer-vektor može uključivati levi (5’) retrovirusni LTR; centralni polipurinski trakt/DNK prepust (cPPT/FLAP); retrovirusni eksportni element; promotor aktivan u T ćeliji, operabilno povezan sa polinukleotidom koji kodira CAR polipeptid razmatran u ovom tekstu; i desni (3’) retrovirusni LTR; i opciono WPRE ili HPRE.
[0176] Transfer-vektor može uključivati levi (5’) retrovirusni LTR; retrovirusni eksportni element; promotor aktivan u T ćeliji, operabilno povezan sa polinukleotidom koji kodira CAR polipeptid razmatran u ovom tekstu; desni (3’) retrovirusni LTR; i poli (A) sekvencu; i opciono WPRE ili HPRE. Isto tako, obezbeđen je lentivirusni vektor koji uključuje: levi (5’) retrovirusni LTR; cPPT/FLAP; RRE; promotor aktivan u T ćeliji, operabilno povezan sa polinukleotidom koji kodira CAR polipeptid razmatran u ovom tekstu; desni (3’) retrovirusni LTR; i poliadenilacionu sekvencu; i opciono WPRE ili HPRE.
[0177] Isto tako, obezbeđen je lentivirusni vektor koji uključuje: levi (5’) HIV-1 LTR; Psi (Ψ) pakujući signal; cPPT/FLAP; RRE; promotor aktivan u T ćeliji, operabilno povezan sa polinukleotidom koji kodira CAR polipeptid razmatran u ovom tekstu; desni (3’) samoinaktivirajući (SIN) HIV-1 LTR; i zečju β-globinsku poliadenilacionu sekvencu; i opciono WPRE ili HPRE.
[0178] Isto tako, obezbeđen je vektor koji uključuje: najmanje jedan LTR; centralni polipurinski trakt/DNK prepust (cPPT/FLAP); retrovirusni eksportni element; promotor aktivan u T ćeliji, operabilno povezan sa polinukleotidom koji kodira CAR polipeptid razmatran u ovom tekstu; i opciono WPRE ili HPRE.
[0179] Isto tako, obezbeđen je vektor koji uključuje: najmanje jedan LTR; cPPT/FLAP; RRE; promotor aktivan u T ćeliji, operabilno povezan sa polinukleotidom koji kodira CAR polipeptid razmatran u ovom tekstu; i poliadenilacionu sekvencu; i opciono WPRE ili HPRE.
[0180] Isto tako, obezbeđen je najmanje jedan SIN HIV-1 LTR; psi (Ψ) pakujući signal; cPPT/FLAP; RRE promotor aktivan u T ćeliji, operabilno povezan sa polinukleotidom koji kodira CAR polipeptid razmatran u ovom tekstu; i zečja β-globinska poliadenilaciona sekvenca; i opciono WPRE ili HPRE.
[0181] Vektor može biti integrišući virusni vektor.
[0182] Vektor može biti epizomski ili neintegrišući virusni vektor.
[0183] Vektori koji se razmatraju u ovom tekstu mogu uključivati neintegrišući ili integraciono defektni retrovirus. "Integraciono defektan" retrovirus ili lentivirus može označavati retrovirus ili lentivirus koji ima integrazu kojoj nedostaje kapacitet da integriše virusni genom u genom ćelija-domaćina. Integrazni protein može biti mutiran da bi se specifično smanjila njegova integrazna aktivnost. Integraciono nekompetentni lentivirusni vektori dobijeni su modifikovanjem pol gena koji kodira integrazni protein, što rezultuje mutiranim pol genom koji kodira integrativno deficijentnu integrazu. Takvi integraciono nekompetentni virusni vektori opisani su u patentnoj prijavi WO 2006/010834. Ilustrativne mutacije u HIV-1 pol genu pogodne za smanjenje integrazne aktivnosti uključuju, ali se ne ograničavaju na: H12N, H12C, H16C, H16V, S81 R, D41A, K42A, H51A, Q53C, D55V, D64E, D64V, E69A, K71A, E85A, E87A, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, K160A, R166A, D167A, E170A, H171A, K173A, K186Q, K186T, K188T, E198A, R199c, R199T, R199A, D202A, K211A, Q214L, Q216L, Q221 L, W235F, W235E, K236S, K236A, K246A, G247W, D253A, R262A, R263A i K264H.
[0184] Ilustrativne mutacije u HIV-1 pol genu pogodne za smanjenje integrazne aktivnosti uključuju, ali se ne ograničavaju na: D64E, D64V, E92K, D116N, D1161, D116A, N120G, N1201, N120E, E152G, E152A, D35E, K156E, K156A, E157A, K159E, K159A, W235F i W235E.
[0185] Integraza može uključivati mutaciju jedne ili više amino-kiselina D64, D116 ili E152. Integraza može uključivati mutaciju u amino-kiselinama D64, D116 i E152. Defektna HIV-1 integraza može uključivati D64V mutaciju.
[0186] "Ćelija-domaćin" uključuje ćelije elektroporisane, transfektovane, inficirane ili transdukovane in vivo, ex vivo, ili in vitro, rekombinantnim vektorom ili polinukleotidom. Ćelije-domaćini mogu uključivati pakujuće ćelije, ćelije producente i ćelije inficirane virusnim vektorima. Ćelije-domaćini inficirane virusnim vektorom pronalaska primenjuju se kod subjekta kojem je potrebna terapija. Izraz "ciljna ćelija" može se koristiti naizmenično sa izrazom ćelija-domaćin i odnosi se na ransfektovane, inficirane ili transdukovane ćelije željenog tipa. Ciljna ćelija može biti T ćelija.
[0187] Proizvodnja virusnih čestica u velikom obimu često je neophodna da bi se dostigao razuman titar virusa. Virusne čestice se proizvode transfektovanjem transfer-vektora u pakujuću ćelijsku liniju koja uključuje virusne strukturne i/ili dodatne gene, npr., gag, pol, env, tat, rev, vif, vpr, vpu, vpx, ili nef gene ili druge retrovirusne gene.
[0188] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "pakujući vektor" odnosi se na ekspresioni vektor ili virusni vektor kojem nedostaje pakujući signal i uključuje polinukleotid koji kodira jedan, dva tri, četiri ili više virusnih strukturnih i/ili dodatnih gena. Tipično, pakujući vektori uključeni su u pakujuće ćelije, a introdukovani su u ćelije transfekcijom, transdukcijom ili infekcijom. Metodi transfekcije, transdukcije ili infekcije dobro su poznati stručnjacima u oblasti. Retrovirusni/lentivirusni transfer-vektor može da se introdukuje u pakujuću ćelijsku liniju, putem transfekcije, transdukcije ili infekcije, da bi se stvorila producentska ćelija ili ćelijska linija. Pakujući vektori mogu da se uvedu u humane ćelije ili ćelijske linije standardnim metodima uključujući, npr., kalcijum fosfatnu transfekciju, lipofekciju ili elektroporaciju. Pakujući vektori mogu da se introdukuju u ćelije zajedno sa dominantnim selektabilnim markerima, kao što su neomicin, higromicin, puromicin, blastocidin, zeocin, timidin kinaza, DHFR, Gln sintetaza ili ADA, praćeno selekcijom u prisustvu odgovarajućeg leka i izolacijom klonova. Selektabilni marker gen može fizički da se poveže sa genima kodiranim pakujućim vektorom, npr., IRES ili samoisecajući virusni peptidi.
[0189] Proteini virusnog omotača (envelope, env) određuju opseg ćelija-domaćina koje konačno mogu biti inficirane i transformisane rekombinantnim retrovirusima stvorenim od ćelijskih linija. U slučaju lentivirusa, kao što su HIV-1, HIV-2, SIV, FIV i EIV, env proteini uključuju gp41 i gp120. Poželjno, virusni env proteini eksprimirani u pakujućim ćelijama kodirani su na vektoru različitom od onog sa virusnim gag i pol genima, kako je ranije opisano.
[0190] Ilustrativni primeri env gena poreklom iz retrovirusa, koji mogu da se koriste uključuju, ali se ne ograničavaju na: MLV omotače, 10A1 omotač, BAEV, FeLV-B, RD114, SSAV, Ebola, Sendai, FPV (fowl plague virus, virus ptičje kuge), influenca virusni omotači. Slično, mogu se koristiti geni koji kodiraju omotače RNK virusa (npr., familije RNK virusa Picornaviridae, Calciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae) kao i DNK virusa (familije Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxyiridae i Iridoviridae). Reprezentativni primeri uključuju FeLV, VEE, HFVW, WDSV, SFV, Rabies, ALV, BIV, BLV, EBV, CAEV, SNV, ChTLV, STLV, MPMV, SMRV, RAV, FuSV, MH2, AEV, AMV, CT10 i EIAV.
[0191] Proteini omotača za pseudotipizaciju virusa uključuju, ali se ne ograničavaju na neki od sledećih virusa: influenca A kao H1N1, H1N2, H3N2 i H5N1 (ptičji grip), influenca B, influenca C virus, hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis D virus, hepatitis E virus, rotavirus, bilo koji virus Norwalk grupe virusa, crevni adenovirusi, parvovirus, virus Dengue groznice, majmunske boginje, Mononegavirales, Lyssavirus kao virus besnila, virus lagoskog slepog miša, Mokola virus, Duvenhage virus, virus evropskog slepog miša 1 & 2 i virus australijskog slepog miša, Ephemerovirus, Vesiculovirus, virus vezikularnog stomatitisa (vesicular stomatitis virus, VSV), herpesvirusi kao herpes simpleks virus tipovi 1 i 2, varičela zoster, citomegalovirus, Epstein-Barov virus (EBV), humani herpesvirusi (HHV), humani herpesvirus tip 6 i 8, virus humane imunodeficijencije (HIV), papiloma virus, mišji gamaherpesvirus, arenavirusi kao virus argentinske hemoragične groznice, virus bolivijske hemoragične groznice, virus Sabia-udružene hemoragične groznice, virus venecuelanske hemoragične groznice, virus Lassa groznice, Machupo virus, virus limfocitnog horiomeningitisa (lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV), Bunyaviridiae kao virus Krim-Kongo hemoragične groznice, Hantavirus, virus koji izaziva hemoragičnu groznicu sa renalnim sindromom, virus Rift Valley groznice, Filoviridae (filovirus) uključujući ebola hemoragičnu groznicu i Marburg hemoragičnu groznicu, Flaviviridae uključujući virus Kaysanur Forest bolesti, virus omske hemoragične groznice, virus koji izaziva krpeljski encefalitis i Paramyxoviridae kao Hendra virus i Nipah virus, variola major i variola minor, alfavirusi kao virus venecuelanskog konjskog encefalitisa, virus istočnog konjskog encefalitisa, virus zapadnog konjskog encefalitisa, SARS-pridruženi koronavirus (SARS-CoV), virus Zapadnog Nila, bilo koji virus koji izaziva encefalitis.
[0192] Obezbeđene su pakujuće ćelije koje proizvode rekombinantni retrovirus, npr., lentivirus, pseudotipiziran VSVG glikoproteinom.
[0193] Izrazi "pseudotip" ili "pseudotipizacija", kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na virus čiji su proteini virusnog omotača supstituisani onima iz drugog virusa koji poseduju poželjne karakteristike. Na primer, HIV može biti pseudotipiziran G-proteinima omotača virusa vezikularnog stomatitisa (VSV-G), što omogućava da HIV inficira širi opseg ćelija zbog toga što proteini HIV omotača (kodirani env genom) normalno usmeravaju virus ka CD4+ prezentujućim ćelijama. Lentivirusni proteini omotača su pseudotipizirani sa VSV-G. Obezbeđene su pakujuće ćelije koje proizvode rekombinantni retrovirus, npr., lentivirus, pseudotipiziran sa VSV-G glikoproteinom omotača.
[0194] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "pakujuće ćelijske linije" odnosi se na ćelijske linije koje ne sadrže pakujući signal, ali stabilno ili prolazno eksprimiraju virusne strukturne proteine i replikacione enzime (npr., gag, pol i env) koji su neophodni za ispravno pakovanje virusnih čestica. Svaka pogodna ćelijska linija može da se koristi za pripremanje pakujućih ćelija. Obično, ćelije su sisarske ćelije. Ćelije upotrebljene za proizvodnju pakujuće ćelijske linije mogu biti čovečje ćelije. Pogodne ćelijske linije koje se mogu koristiti uključuju, na primer, CHO ćelije, BHK ćelije, MDCK ćelije, C3H 10T1/2 ćelije, FLY ćelije, Psi-2 ćelije, BOSC 23 ćelije, PA317 ćelije, WEHI ćelije, COS ćelije, BSC 1 ćelije, BSC 40 ćelije, BMT 10 ćelije, VERO ćelije, W138 ćelije, MRC5 ćelije, A549 ćelije, HT1080 ćelije, 293 ćelije, 293T ćelije, B-50 ćelije, 3T3 ćelije, NIH3T3 ćelije, HepG2 ćelije, Saos-2 ćelije, Huh7 ćelije, HeLa ćelije, W163 ćelije, 211 ćelije i 211A ćelije. Pakujuće ćelije su poželjno 293 ćelije, 293T ćelije, ili A549 ćelije. Ćelije poželjno mogu biti A549 ćelije.
[0195] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "producentska ćelijska linija" odnosi se na ćelijsku liniju koja je sposobna da proizvede rekombinantne retrovirusne čestice, uključujući pakujuću ćelijsku liniju i transfer-vektorski konstrukt koji sadrži pakujući signal. Proizvodnja infektivnih virusnih čestica i virusnih stok-rastvora može se obaviti korišćenjem konvencionalnih tehnika. Metodi pripremanja virusnih stok-rastvora poznati su u struci i ilustrovani su u, npr., Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res.23:628-633 i N. R. Landau et al. (1992) J. Virol.66:5110-5113. Infektivne virusne čestice mogu da se prikupe iz pakujućih ćelija korišćenjem konvencionalnih tehnika. Na primer, infektivne čestice mogu da se prikupe lizom ćelija ili prikupljanjem supernatanta ćelijske kulture, što je poznato u struci. Opciono, po želji, prikupljene virusne čestice mogu da se prečiste,. Pogodne tehnike prečišćavanja dobro su poznate stručnjacima u oblasti.
[0196] Dostava jednog ili više gena ili druge polinukleotidne sekvence korisšćenjem retrovirusnog ili lentivirusnog vektora putem virusne infekcije umesto transfekcije označava se kao "transdukcija". Retrovirusni vektori mogu da se transdukuju u ćeliju infekcijom i provirusnom integracijom. Ciljna ćelija, npr., T ćelija je "transdukovana" ako sadrži gensku ili drugu polinukleotidnu sekvencu dostavljenu ćeliji infekcijom uz korišćenjem virusnog ili retrovirusnog vektora. Transdukovana ćelija može u svom ćelijskom genomu uključivati jednu ili više genskih ili drugih polinukleotidnih sekvenci dostavljenih retrovirusnim ili lentivirusnim vektorom. Ćelije-domaćini transdukovane virusnim vektorom koji eksprimira jedan ili više polipeptida, mogu se primeniti kod subjekta za lečenje i/ili prevenciju maligniteta B ćelija. Drugi metodi vezani za upotrebu virusnih vektora u genskoj terapiji koji se mogu koristiti, mogu se naći u npr., Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Supp.):138S-142S; Ferry, N. and Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. and Liu, J. M. (2000) Gene Ther.7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol.12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol.23:746-58; Brody, S. L. and Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci.
716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. and Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; i Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8.
G. GENETIČKI MODIFIKOVANE ĆELIJE
[0197] Imaju se u vidu ćelije modifikovane da eksprimiraju CAR razmatrane u ovom tekstu, za upotrebu u lečenju stanja koja su u vezi sa B ćelijama. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "genetički inženjerisan" ili "genetički modifikovan" odnosi se na dodavanje, ukupnom genetičkom materijalu ćelije, posebnog genetičkog materijala u vidu DNK ili RNK. Izrazi "genetički modifikovane ćelije", "modifikovane ćelije" i "preusmerene ćelije" koriste se naizmenično. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "genska terapija" označava introdukovanje, u ukupan genetički materijal ćelije, posebnog genetičkog materijala u vidu DNK ili RNK, koji ponovo uspostavlja, koriguje ili modifkuje ekspresiju gena, ili u svrhu eksprimiranja terapijskog polipeptida, npr., CAR.
[0198] CAR razmatrani u ovom tekstu mogu se introdukovati i eksprimirati u imunskim efektorskim ćelijama tako da preusmere njihovu specifičnost ka ciljnom antigenu od interesa, npr., BCMA polipeptidu. "Imunska efektorska ćelija" je svaka ćelija imunskog sistema koja ima jednu ili više efektorskih funkcija (npr., aktivnost citotoksičnog ubijanja ćelija, sekrecija citokina, indukcija ADCC i/ili CDC).
[0199] Imunske efektorske ćelije mogu biti autologe/autogene ("sopstvene’) ili neautologe ("nesopstvene", npr., alogene, singene ili ksenogene).
[0200] "Autologe", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na ćelije iz istog subjekta.
[0201] "Alogene", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na ćelije iz iste vrste koje se razlikuju genetički od ćelije sa kojom se upoređuju.
[0202] "Singene", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na ćelije različitog subjekta koje su genetički identične sa ćelijom sa kojom se upoređuju.
[0203] "Ksenogene", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na ćelije iz različite vrste u odnosu na ćeliju sa kojom se upoređuju. Poželjno, ćelije su alogene. Ilustrativne imunske efektorske ćelije upotrebljene sa CAR razmatranim u ovom tekstu uključuju T limfocite. Izrazi "T ćelija" ili "T limfocit" poznati su u struci i treba da uključuju timocite, nezrele T limfocite, zrele T limfocite, mirujuće T limfocite ili aktivirane T limfocite. T ćelija može biti T pomažuća (T helper, Th) ćelija, na primer T pomažuća 1 (Th1) ili T pomažuća 2 (Th2) ćelija. T ćelija može biti pomažuća T ćelija (HTL; CD4<+>T ćelija) CD4<+>T ćelija, citotoksična T ćelija (CTL; CD8<+>T ćelija), CD4<+>CD8<+>T ćelija, CD4-CD8<->T ćelija, ili bilo koja druga podgrupa T ćelija. Druge ilustrativne populacije T ćelija pogodne za upotrebu uključuju naivne T ćelije i memorijske T ćelije.
[0204] Kako će razumeti obučena osoba, druge ćelije takođe mogu da se koriste kao imunske efektorske ćelije sa CAR opisanim u ovom tekstu. Tačnije, imunske efektorske ćelije uključuju i NK ćelije, NKT ćelije, neutrofile i makrofage. Imunske efektorske ćelije uključuju i progenitore efektorskih ćelija, pri čemu takve progenitorske ćelije mogu da se pokrenu na diferencijaciju in vivo ili in vitro u imunske efektorske ćelije. Prema tome, imunske efektorske ćelije mogu uključivati progenitore imunskih efektorskih ćelija kao što su hematopoetske matične ćelije (hematopoietic stem cells, HSC) sadržane u populaciji CD34<+>ćelija poreklom iz krvi pupčane vrpce, kostne srži ili mobilisane periferne krvi koje se posle primene kod subjekta diferenciraju u zrele imunske efektorske ćelije, ili koje mogu da se indukuju in vitro da se diferenciraju u zrele imunske efektorske ćelije.
[0205] Kako se koristi u ovom tekstu, imunske efektorske ćelije genetički inženjerisane da sadrže BCMA-specifični CAR mogu se označiti kao "BCMA-specifično preusmerene imunske efektorske ćelije".
[0206] Izraz "CD34+ ćelije", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na ćeliju koja na svojoj površini eksprimira CD34 protein. "CD34", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na ćelijski površinski glikoprotein (npr., sijalomucinski protein) koji često deluje kao međućelijski adhezioni faktor i uključen je ulazak T ćelije u limfne čvorove. Populacija CD34+ ćelija sadrži hematopoetske matične ćelije (HSC) koje se posle primene kod pacijenta diferenciraju i doprinose svim linijama hematopoeze, uključujući T ćelije, NK ćelije, NKT ćelije, neutrofile i ćelije monocitno/makrofagne linije.
[0207] Obezbeđeni su i metodi stvaranja imunskih efektorskih ćelija koje eksprimiraju CAR razmatran u ovom tekstu. Metod može uključivati transfektovanje ili transdukovanje imunskih efektorskih ćelija izolovanih iz individue tako da imunske efektorske ćelije eksprimiraju jedan ili više CAR opisanih u ovom tekstu. Imunske efektorske ćelije mogu biti izolovane iz individue i genetički modifikovane bez dodatnih manipulacija in vitro. Takve ćelije zatim mogu da se direktno ponovo daju individui. Imunske efektorske ćelije mogu prvo da se aktiviraju i stimulišu da proliferišu in vitro pre nego što se gentički modifikuju da eksprimiraju CAR. U tom smislu, imunske efektorske ćelije mogu da se kultivišu pre i/ili pošto se genetički modifikuju (tj., transdukuju ili transfektuju da eksprimiraju CAR razmatran u ovom tekstu).
[0208] Pre in vitro manipulacije ili genetičke modifikacije imunskih efektorskih ćelija opisanih u ovom tekstu, ćelije se mogu dobiti iz subjekta kao izvora. Tačnije, CAR-modifikovane imunske efektorske ćelije mogu uključivati T ćelije. T ćelije mogu se dobiti iz većeg broja izvora uključujući, ali ne ograničavajući se na mononuklearne ćelije periferne krvi, kostnu srž, tkivo limfnih čvorova, krv pupčane vrpce, tkivo timusa, tkivo sa mesta infekcije, ascit, pleuralnu efuziju, tkivo slezine i tumore. T ćelije mogu se dobiti iz jedinice krvi uzete od subjekta korišćenjem neke od brojnih tehnika poznatih stručnjaku, kao što su sedimentacija, npr., FICOLL™ separacija. Ćelije iz cirkulišuće krvi individue mogu se dobiti aferezom. Proizvod afereze tipično sadrži limfocite, uključujući T ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druga nukleisana bela krvna zrnca, crvena krvna zrnca i pločice. Ćelije prikupljene aferezom mogu da se isperu da bi se uklonila frakcija plazme i da bi se ćelije stavile u odgovarajući pufer ili medijum za dalje procesovanje. Ćelije mogu da se isperu korišćenjem PBS ili drugog pogodnog rastvora koji ne sadrži kalcijum, magnezijum i većinu, ako ne i sve druge dvovalentne katjone. Kako će razumeti prosečno obučen stručnjak u oblasti, korak ispiranja može da se obavi metodima poznatim stručnjacima u oblasti, kao što su korišćenje poluautomatske protočne centrifuge. Na primer, Cobe 2991 ćelijski procesor, Baxter CytoMate, ili slično. Posle ispiranja, ćelije mogu da se resuspenduju u različitim biokompatibilnim puferima ili nekom drugom slanom rastvoru sa ili bez pufera. Neželjene komponente uzorka afereze mogu da se uklone iz ćelija direktno resuspendovanih u medijumu za kultivaciju.
[0209] T ćelije mogu da se izoluju iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) liziranjem crvenih krvnih zrnaca i uklanjanjem monocita, na primer, centrifugiranjem na PERCOLL™ gradijentu. Specifična potpopulacija T ćelija koje eksprimiraju jedan ili više sledećih markera: CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA i CD45RO, može zatim da se izoluje tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. U jednom primeru izvođenja, specifična potpopulacija T ćelija koje eksprimiraju CD3, CD28, CD4, CD8, CD45RA i CD45RO dalje se izoluje tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Na primer, obogaćivanje populacije T ćelija negativnom selekcijom može da se obavi kombinacijom antitela usmerenih na površinske markere jedinstvene za negativno selektovane ćelije. Jedan metod za upotrebu u ovom tekstu je sortiranje ćelija i/ili selekcija negativnom magnetnom imunoadherencijom ili protočnom citometrijom koja koristi koktel monoklonskih antitela usmerenih na površinske markere prisutne na negativno selektovanim ćelijama. Na primer, za izdvajanje CD4+ ćelija negativnom selekcijom, koktel monoklonskih antitela tipično uključuje antitela na CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR i CD8. Protočna citometrija i ćelijsko sortiranje takođe mogu da se koriste za izolovanje populacija ćelija koje su od interesa za korišćenje.
[0210] Korišćenjem metoda razmatranih u ovom tekstu, PBMC se mogu direktno genetički modifikovati da eksprimiraju CAR. Posle izolacije PBMC, T limfociti mogu dalje da se izoluju i citotoksični i pomažući T limfociti mogu da se sortiraju u naivne, memorijske i efektorske potpopulacije T ćelija, pre ili posle genetičke modifikacije i/ili ekspanzije.
[0211] CD8+ ćelije mogu da se dobiju korišćenjem standardnih metoda. CD8<+>ćelije mogu dodatno da se soritiraju u naivne, centralne memorijske i efektorske ćelije, identifikovanjem ćelijskih površinskih antigena udruženih sa svakim od ovih tipova CD8<+>ćelija.
[0212] Naivni CD8+ T limfociti mogu da se karakterišu ekspresijom fenotipskih markera naivnih T ćelija uključujući CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD 127 i CD45RA.
[0213] Memorijske T ćelije mogu biti prisutne u CD62L<+>i CD62L<->podgrupi CD8<+>limfocita periferne krvi. Posle bojenja anti-CD8 i anti-CD62L antitelima, PBMC se sortiraju u CD62L-CD8+ i CD62L+CD8+ frakcije. Ekspresija fenotipskih markera centralnih memorijskih T ćelija obuhvata CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 i CD127 i može biti negativna za granzim B. Centralne memorijske T ćelije mogu biti CD45RO<+>, CD62L<+>, CD8<+>T ćelije.
[0214] Efektorske T ćelije mogu biti negativne za CD62L, CCR7, CD28, i CD127, i pozitivne za granzim B i perforin.
[0215] CD4+T ćelije mogu dodatno da se sortiraju u potpopulacije. Na primer, CD4<+>T pomažuće ćelije mogu da se soritraju u naivne, centralne memorijske i efektorske ćelije, identifikovanjem ćelijskih populacija koje imaju ćelijske površinske antigene. CD4<+>limfociti mogu da se dobiju standardnim metodima. Naivni CD4+ T limfociti mogu biti CD45RO- , CD45RA+ , CD62L+ CD4+ T ćelije. Centralne memorijske CD4<+>ćelije mogu biti CD62L pozitivne i CD45RO pozitivne. Efektorske CD4+ ćelije mogu biti CD62L i CD45RO negativne.
[0216] Imunske efektorske ćelije kao što su T ćelije, mogu se posle izolovanja genetički modifikovati korišćenjem poznatih metoda, ili imunske efektorske ćelije mogu biti aktivirane i ekspandirane (ili diferencirane u slučaju progenitora) in vitro pre genetičkog modifikovanja. Imunske efektorske ćelije kao što su T ćelije, genetički su modifikovane himernim antigenskim receptorima razmatranim u ovom tekstu (npr., npr., transdukovane virusnim vektorom koji uključuje nukleinsku kiselinu koja kodira CAR) i zatim aktivirane i ekspandirane in vitro. T ćelije mogu biti aktivirane i ekspandirane pre ili posle genetičke modifikacije za ekspresiju CAR, korišćenjem metoda opisanih u, npr., U.S. patentima 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7, 172,869; 7,232,566; 7, 175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; 6,867,041; i U.S. objavljenoj patentnoj prijavi br.20060121005.
[0217] Uopšteno, T ćelije se ekspandiraju kontaktom sa površinom na kojoj se nalazi prikačeno sredstvo koje stimuliše signal udružen sa CD3 TCR kompleksom i ligand koji stimuliše kostimulatorni molekul na površini T ćelija. T ćelijske populacije mogu biti stimulisane kontaktom sa anti-CD3 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, ili anti-CD2 antitelom imobilisanim na površini, ili kontaktom sa aktivatorom protein kinaze C (npr., briostatin) zajedno sa kalcijumskom jonoforom. Kostimulacija pridruženih molekula na površini T ćelija takođe se ima u vidu.
[0218] PBMC ili izolovane T ćelije mogu biti u kontaktu sa stimulatornim sredstvom i kostimulatornim sredstvom, kao što su anti-CD3 i anti-CD28 antitela, obično prikačena za perlicu ili drugu površinu, u kultivacionom medijumu sa odgovarajućim citokinima, kao što su IL-2, IL-7, i/ili IL-15. Da bi se stimulisala proliferacija CD4+ T ćelija ili CD8<+>T ćelija, anti-CD3 antitelo i anti-CD28 antitelo. Mogu se koristiti primeri anti-CD28 antitela koji uključuju 9.3, B-T3, XR-CD28 (Diacione, Besancon, France), kao i drugi metodi opšte poznati u struci (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9): 13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth.227(1-2):53-63, 1999). Anti-CD3 i anti-CD28 antitela prikačena za istu perlicu služe kao "surogat" antigen prezentujuće ćelije (antigen presenting cell, APC). T ćelije mogu biti aktivirane i stimulisane da proliferišu ćelijama hraniteljicama i odgovarajućim antitelima i citokinima korišćenjem metoda kao što su oni opisani u US6040177; US5827642; i WO2012129514.
[0219] Arteficijalne APC (aAPC) napravljene inženjerisanjem K562, U937, 721.221, T2 i C1R ćelija za usmeravanje stabilne ekspresije i sekrecije različitih kostimulatornih molekula i citokina. K32 ili U32 aAPC mogu se koristiti za usmeravanje prikazivanja jednog ili više stimulatornih molekula baziranih na antitelima na površini AAPC ćelije. Ekspresija različitih kombinacija gena na aAPC omogućava preciznu determinaciju zahteva za aktivacijom humanih T ćelija, tako da aAPC mogu biti prilagođene optimalnoj propagaciji podgrupe T ćelija sa specifičnim zahtevima za rast i različitim funkcijama. aAPC podržavaju ex vivo rast i dugotrajnu ekspanziju funkcionalnih humanih CD8 T ćelija, ne zahtevajući dodavanje egzogenih citokina, što je suprotno od situacije kada se koriste prirodne APC. Populacije T ćelija mogu da se ekspandiraju pomoću aAPC koje eksprimiraju različite kostimulatorne molekule uključujući, ali ne ograničavajući se na CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L), i/ili CD80 ili CD86. Konačno, aAPC obezbeđuju efikasnu platformu za ekspanziju genetički modifikovanih T ćelija i održavanje CD28 ekspresije na CD8 T ćelijama. Ovo se odnosi na aAPC obezbeđene u WO 03/057171 i US2003/0147869.
[0220] CD34+ ćelije mogu da se transdukuju nukleinskokiselinskim konstruktom. Transdukovane CD34+ ćelije mogu da se diferenciraju u zrele imunske efektorske ćelije in vivo posle primene kod subjekta, obično subjekta iz kojeg su ćelije originalno izolovane. CD34+ ćelije mogu da se stimulišu in vitro pre ili posle genetičkog modifikovanja sa CAR, kako je opisano u ovom tekstu, sa jednim ili više od sledećih citokina: Flt-3 ligand (FLT3), faktor matičnih ćelija/stem cell factor, SCF), faktor rasta i diferencijacije megakariocita (megakariocyte growth and differentiation factor, TPO), IL-3 i IL-6 u skladu sa metodima opisanim ranije (Asheuer et al., 2004; Imren, et al., 2004).
[0221] Isto tako, obezbeđena je populacija modifikovanih imunskih efektorskih ćelija za lečenje kancera, modifikovane imunske efektorske ćelije uključuju CAR kao što je objavljeno u ovom tekstu. Na primer, populacija modifikovanih imunskih efektorskih ćelija pripremljena je od mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) dobijenih od pacijenta kojem je dijagnostikovan malignitet B ćelija opisan u ovom tekstu (autologni donori). PBMC formiraju heterogene populacije T limfocita koji mogu biti CD4+ , CD8+ , ili CD4+ i CD8+ .
[0222] PBMC mogu uključivati druge citotoksične limfocite kao što su NK ćelije ili NKT ćelije. Ekspresioni vektor koji nosi kodirajuću sekvencu CAR razmatranog u ovom tekstu može se introdukovati u populaciju humanih donorskih T ćelija, NK ćelija ili NKT ćelija. Uspešno transdukovane T ćelije koje nose ekspresioni vektor mogu se sortirati korišćenjem protočne citometrije za izolovanje CD3 pozitivnih T ćelija i zatim dalje propagirati da bi se povećao broj CAR protein-eksprimirajućih T ćelija, kao dodatak aktivaciji ćelija korišćenjem anti-CD3 antitela i/ili anti-CD28 antitela i IL-2 ili bilo kojeg drugog metoda poznatog u struci, kako je opisano na drugom mestu u ovom tekstu. Standardni postupci koriste se za krioprezervaciju T ćelija koje eksprimiraju CAR protein, da bi se one uskladištile i/ili pripremile za korišćenje kod čoveka. In vitro transdukcija, kultivisanje i/ili ekspanzija T ćelija mogu se izvesti u odsustvu proizvoda poreklom iz nehumane životinje, kao što je fetalni teleći serum i fetalni goveđi serum. Pošto je heterogena populacija PBMC genetički modifikovana, dobijene transdukovane ćelije predstavljaju heterogenu populaciju modifikovanih ćelija koje uključuju BCMA-ciljajući CAR, kako se razmatra u ovom tekstu.
[0223] Mešavina, npr., jednog, dva, tri, četiri, pet ili više različitih ekspresionih vektora može se koristiti u genetičkoj modifikaciji donorske populacije imunskih efektorskih ćelija, pri čemu svaki vektor kodira različiti himerni antigenski receptorski protein, kako se razmatra u ovom tekstu. Dobijene modifikovane imunske efektorske ćelije formiraju mešovitu populaciju modifikovanih ćelija, sa srazmerom modifikovanih ćelija koje eksprimiraju više od jednog različitog CAR proteina.
[0224] Obezbeđen je i metod skladištenja genetički modifikovanih mišjih, humanih ili humanizovanih CAR protein-eksprimirajućih imunskih efektorskih ćelija koje ciljaju BCMA protein, koji uključuje krioprezervaciju imunskih efektorskih ćelija tako da ćelije ostaju vijabilne posle otapanja. Frakcija imunskih efektorskih ćelija koje eksprimiraju CAR proteine može se krioprezervirati metodima poznatim u struci da bi se obezbedio stalni izvor tih ćelija za buduće lečenje pacijenta koji ima stanje povezano sa B ćelijama. Po potrebi, krioprezervirane transformisane efektorske ćelije mogu da se otope, rastu i da se ekspandiraju da bi se dobilo još takvih ćelija.
[0225] Kako se koristi u ovom tekstu, "krioprezervacija" označava prezervaciju ćelija hlađenjem na temperature ispod nule, na primer (tipično) 77 K ili -196° C (tačka ključanja tečnog azota). Krioprotektivna sredstva često se koriste na temperaturama ispod nule da bi se sprečilo oštećenje ćelija usled zamrzavanja na niskim temperaturama ili zagrevanja na sobnu temperaturu. Krioprezervansi i optimalna stopa hlađenja mogu zaštiti ćelije od oštećenja. Krioptorektivna sredstva koja mogu da se koriste uključuju, ali se ne ograničavaju na dimetil sulfoksid (dimethyl sulfoxide, DMSO) (Lovelock and Bishop, Nature, 1959; 183:1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirolidin (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576) i polietilen glikol (Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). Poželjna stopa hlađenja je 1° do 3° C/minutu. Posle najmanje dva sata, T ćelije dostižu temperaturu od -80° C. i mogu da se stave direktno u tečni azot (-196° C.) kako bi se trajno uskladištile, na primer u posudi za dugotrajno kriogeno skladištenje.
H. METODI PROIZVODNJE T ĆELIJA
[0226] T ćelije proizvedene metodima razmatranim u ovom tekstu obezbeđuju poboljšane kompozicije za adoptivnu imunoterapiju. Bez želje za ograničavanjem nekom posebnom teorijom, veruje se da T ćelijske kompozicije proizvedene metodima razmatranim u ovom tekstu imaju superiorne osobine uključujući povećano preživljavanje, ekspanziju i relativno odsustvo diferencijacije, i perzistenciju in vivo. Metod proizvodnje T ćelija može uključivati dovođenje u kontakt ćelije sa jednim ili više sredstava koja modulišu PI3K ćelijski signalni put. U jednom primeru izvođenja, metod proizvodnje T ćelija uključuje dovođenje u kontakt ćelija sa jednim ili više sredstava koja modulišu PI3K/Akt/mTOR ćelijski signalni put. U različitim primerima izvođenja, T ćelije se mogu dobiti iz bilo kojeg izvora i dovoditi u kontakt sa sredstvom tokom faze aktivacije i/ili ekspanzije, procesa proizvodnje. Dobijene T ćelijske kompozicije bogate su razvojno potentnim T ćelijama koje imaju sposobnost da proliferišu i eksprimiraju jedan ili više od sledećih biomarkera: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197 i CD38. Populacije ćelija koje uključuju T ćelije tretirane jednim ili većim brojem PI3K inhibitora mogu se obogatiti populacijom CD8<+>T ćelija koje koeksprimiraju jedan ili više ili sve od sledećih biomarkera: CD62L, CD127, CD197 i CD38.
[0227] Mogu se proizvesti modifikovane T ćelije koje imaju održive nivoe proliferacije i smanjenu diferencijaciju. T ćelije mogu da se proizvedu stimulisanjem T ćelija da postanu aktivirane i da proliferišu u prisustvu jednog ili više stimulatornih signala i sredstva koje je inhibitor PI3K ćelijskog signalnog puta.
[0228] T ćelije mogu da se modifikuju da eksprimiraju anti-BCMA CAR. T ćelije mogu da se modifikuju transdukovanjem T ćelija virusnim vektorom koji uključuje anti-BCMA CAR razmatran u ovom tekstu. T ćelije mogu da se modifikuju pre stimulacije i aktivacije u prisustvu inhibitora PI3K ćelijskog signalnog puta. T ćelije mogu da se modifikuju posle stimulacije i aktivacije u prisustvu inhibitora PI3K ćelijskog signalnog puta. T ćelije mogu da se modifikuju u okviru 12 sati, 24 sata, 36 sati ili 48 sati od stimulacije i aktivacije u prisustvu inhibitora PI3K ćelijskog signalnog puta.
[0229] Posle aktivacije T ćelija, ćelije se kultivišu da bi proliferisale. T ćelije mogu da se kultivišu najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 dana, najmanje 2 nedelje, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 meseci ili više, uz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više ciklusa ekspanzije.
[0230] Kompozicije T ćelija mogu da se proizvedu u prisustvu jednog ili više inhibitora PI3K puta. Inhibitori mogu ciljati jednu ili više aktivnosti u putu ili pojedinačnu aktivnost. Bez želje za ograničavanjem nekom posebnom teorijom, smatra se da tretman ili dovođenje u kontakt T ćelija sa jednim ili više inhibitora PI3K puta tokom faza stimulacije, aktivacije i/ili ekspanzije procesa proizvodnje preferencijalno povećavaju mlade T ćelije, čime se proizvode superiorne terapijske T ćelijske kompozicije.
[0231] Obezbeđuje se metod za povećanje proliferacije T ćelija koje eksprimiraju T ćelijski receptor. Takvi metodi mogu uključivati, na primer, izdvajanje izvora T ćelija iz subjekta, stimulisanje i aktiviranje T ćelija u prisustvu jednog ili više inhibitora PI3K puta, modifikaciju T ćelija da eksprimiraju anti-BCMA CAR, npr., anti-BCMA02 CAR i ekspandiranje T ćelija u kulturi.
[0232] Metod za proizvodnju populacije T ćelija koje u povećanoj meri eksprimiraju jedan ili više od sledećih biomarkera: CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197 i CD38. Mlade T ćelije mogu uključivati jedan ili više ili sve od sledećih bioloških markera: CD62L, CD127, CD197 i CD38. Obezbeđene su mlade T ćelije koje mogu da ne eksprimiraju CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 i LAG3. Kako je rečeno na drugom mestu u ovom tekstu, nivoi ekspresije biomarkera mladih T ćelija relativni su u odnosu na nivoe ekspresije takvih markera u diferenciranijim T ćelijama ili populacijama imunskih efektorskih ćelija.
[0233] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) mogu se koristiti kao izvor T ćelija u metodima proizvodnje T ćelija razmatranim u ovom tekstu. PBMC formiraju heterogenu populaciju T limfocita koji mogu biti CD4+ , CD8+ , ili CD4+ i CD8+ i mogub uključivati druge mononuklearne ćelije kao što su monociti, B ćelije, NK ćelije i NKT ćelije. Ekspresioni vektor koji uključuje polinukleotid koji kodira inženjerisani TCR ili CAR razmatran u ovom tesktu može se introdukovati u populaciju humanih donorskih T ćelija, NK ćelija ili NKT ćelija. Uspešno transdukovane T ćelije koje nose ekspresioni vektor mogu se sortirati korišćenjem protočne citometrije kako bi se izolovale CD3 pozitivne T ćelije i zatim dalje propagirale sa ciljem povećanja broja modifikovanih T ćelija, uz ćelijsku aktivaciju korišćenjem anti-CD3 antitela i/ili anti-CD28 antitela i IL-2, IL-7, i/ili IL-15, ili bilo kojim drugim metodima poznatim u struci, kako je opisano na drugom mestu u ovom tekstu.
[0234] Metodi proizvodnje razmatrani u ovom tekstu mogu uključivati još i krioprezervaciju modifikovanih T ćelija za skladištenje i/ili pripremanje za korišćenje kod humanog subjekta. T ćelije se krioprezerviraju tako da ćelije ostaju vijabilne posle otapanja. Po potrebi, krioprezervirane transformisane imunske efektorske ćelije mogu da se otope, rastu i da se ekspandiraju za dobijanje još takvih ćelija. Kako se koristi u ovom tekstu, "krioprezerviranje" se odnosi na prezerviranje ćelija hlađenjem na temperature ispod nule, na primer (tipično) 77 K ili -196° C (tačka ključanja tečnog azota). Krioprotektivna sredstva se često koriste na temperaturama ispod nule da bi se sprečilo oštećenje ćelija usled zamrzavanja na niskim temperaturama ili zagrevanja na sobnu temperaturu. Krioprezervansi i optimalna stopa hlađenja mogu zaštiti ćelije od oštećenja. Krioprotektivna sredstva koja mogu da se koriste uključuju, ali se ne ograničavaju na dimetil sulfoksid (DMSO) (Lovelock and Bishop, Nature, 1959; 183:1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), glicerol, polivinilpirolidin (Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576) i polietilen glikol (Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48). Poželjna stopa hlađenja je 1° do 3° C/minutu. Posle najmanje dva sata, T ćelije dostižu temperaturu od -80° C. i mogu da se stave direktno u tečni azot (-196° C) za trajno skladištenje, na primer u posudi za dugotrajno kriogeno skladištenje.
1. T ĆELIJE
[0235] Razmatra se i proizvodnja poboljšanih CAR T ćelijskih kompozicija. T ćelije upotrebljene za proizvodnju CAR T ćelija mogu biti autologne/autogene ("sopstvene’) ili neautologne ("nesopstvene", npr., alogene, singene ili ksenogene). T ćelije mogu se dobiti iz sisarskog subjekta. T ćelije dobijene su iz subjekta koji je primat. T ćelije dobijene su iz subjekta koji je čovek.
[0236] T ćelije mogu se dobiti iz brojnih izvora uključujući, ali ne ograničavajući se na mononuklearne ćelije periferne krvi, kostnu srž, tkivo limfnih čvorova, krv pupčane vrpce, tkivo timusa, tkivo sa mesta infekcije, ascit, pleuralnu efuziju, tkivo slezine i tumore. T ćelije mogu se dobiti iz jedinice krvi uzete od subjekta korišćenjem neke od brojnih tehnika poznatih stručnjaku, kao što su sedimentacija, npr., FICOLL™ separacija. Ćelije iz cirkulišuće krvi individue mogu se dobiti aferezom. Proizvod afereze tipično sadrži limfocite, uključujući T ćelije, monocite, granulocite, B ćelije, druga nukleisana bela krvna zrnca, crvena krvna zrnca i pločice. Ćelije prikupljene aferezom mogu da se isperu da bi se uklonila frakcija plazme i da bi se ćelije stavile u odgovarajući pufer ili medijum za dalje procesovanje. Ćelije mogu da se isperu korišćenjem PBS ili drugog pogodnog rastvora koji ne sadrži kalcijum, magnezijum i većinu, ako ne i sve druge dvovalentne katjone. Kako će razumeti prosečno obučen stručnjak u oblasti, korak ispiranja može da se obavi metodima poznatim stručnjacima u oblasti, kao što su korišćenje poluautomatske protočne centrifuge. Na primer, Cobe 2991 ćelijski procesor, Baxter CytoMate, ili slično. Posle ispiranja, ćelije mogu da se resuspenduju u različitim biokompatibilnim puferima ili nekom drugom slanom rastvoru sa ili bez pufera. Neželjene komponente uzorka afereze mogu da se uklone iz ćelija direktno resuspendovanih u medijumu za kultivaciju.
[0237] Populacija ćelija koja uključuje T ćelije, npr., PBMC, može da se koristi za metode proizvodnje razmatrane u ovom tekstu. Izolovana ili prečišćena populacija T ćelija može da se koristi za metode proizvodnje razmatrane u ovom tekstu. Ćelije mogu da se izoluju iz mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) liziranjem crvenih krvnih zrnaca i uklanjanjem monocita, na primer, centrifugiranjem na PERCOLL™ gradijentu. Posle izolacije PBMC, citotoksični i pomažući T limfociti mogu da se sortiraju u potpopulacije naivnih, memorijskih i efektorskih T ćelija, pre ili posle aktivacije, ekspanzije i/ili genetičke modifikacije.
[0238] Specifična potpopulacija T ćelija koje eksprimiraju jedan ili više od sledećih markera: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD 127 i HLA-DR može se dalje izolovati tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. Specifična potpopulacija T ćelija koje eksprimiraju jedan ili više markera odabranih iz grupe koja se sastoji od i) CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; ili ii) CD38 ili CD62L, CD127, CD197 i CD38, može se dalje izolovati tehnikama pozitivne ili negativne selekcije. U različitim primerima izvođenja, proizvedene kompozicije T ćelija ne eksprimiraju ili mogu da suštinski ne eksprimiraju jedan ili više od sledećih markera: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 i LAG3.
[0239] Ekspresija jednog ili više markera odabranih iz grupe koja se sastoji od CD62L, CD127, CD197 i CD38 povišena je najmanje 1.5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 25 puta, ili više u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i ekspandiranih bez PI3K inhibitora.
[0240] Ekspresija jednog ili više markera odabranih iz grupe koja se sastoji od CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 i LAG3 smanjena je najmanje 1.5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 25 puta, ili više u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i ekspandiranih sa PI3K inhibitorom.
[0241] Metodi proizvodnje razmatrani u ovom tekstu mogu povećati broj CAR T ćelija koje uključuju jedan ili više markera naivnih ili razvojno potentnih T ćelija. Bez želje za ograničavanjem nekom posebnom teorijom, ovi izumitelji veruju da tretiranje populacije ćelija koja uključuje T ćelije jednim ili većim brojem PI3K inhibitora za rezultat ima porast ekspanzije razvojno potentih T ćelija i obezbeđuje robusniju i efikasniju adoptivnu CAR T ćelijsku imunoterapiju u poređenju sa postojećim CAR T ćelijskim terapijama.
[0242] Ilustrativni primeri markera naivnih ili razvojno potentnih T ćelija povećanih u T ćelijama proizvedenim korišćenjem metoda razmatranih u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na CD62L, CD127, CD197 i CD38. Naivne T ćelije mogu da ne eksprimiraju ili da suštinski ne eksprimiraju jedan ili više od sledećih markera: CD57, CD244, CD160, PD-1, BTLA, CD45RA, CTLA4, TIM3 i LAG3.
[0243] U vezi sa T ćelijama, populacije T ćelija koje su rezultat različitih metodologija ekspanzije razmatranih u ovom tekstu mogu imati različite fenotipske osobine, zavisno od upotrebljenih uslova. Populacije ekspandiranih T ćelija uključuju jedan ili više od sledećih fenotipskih markera: CD62L, CD127, CD197, CD38 i HLA-DR.
[0244] Takvi fenotipski markeri mogu podrazumevati povećanu ekspresiju jednog ili više, ili svih od CD62L, CD127, CD197 i CD38. CD8+ T limfociti koji se karakterišu ekspresijom fenotipskih markera naivnih T ćelija uključujući CD62L, CD127, CD197, i CD38 mogu da se ekspandiraju.
[0245] T ćelije koje se karakterišu ekspresijom fenotipskih markera centralnih memorijskih T ćelija uključujući CD45RO, CD62L, CD127, CD197 i CD38 i negativne su na granzim B mogu da se ekspandiraju. Centralne memorijske T ćelije mogu biti CD45RO<+>, CD62L<+>, CD8<+>T ćelije.
[0246] CD4+ T limfociti koji se karakterišu ekspresijom fenotipskih markera naivnih CD4<+>ćelija uključujući CD62L i negativni su za ekspresiju CD45RA i/ili CD45RO mogu da se ekspandiraju. CD4+ ćelije karakterisane ekspresijom fenotipskih markera centralnih memorijskih CD4+ ćelija mogu uključivati CD62L i CD45RO pozitivne. Efektorske CD4<+>ćelije mogu biti CD62L pozitivne i CD45RO negativne.
[0247] T ćelije mogu da se izoluju iz individue i aktiviraju i stimulišu da proliferišu in vitro pre nego što se genetički modifikuju da eksprimiraju anti-BCMA CAR. U vezi sa tim, T ćelije mogu da se kultivišu pre i/ili posle gentičkog modifikovanja (tj., transdukovanja ili transfektovanja da bi eksprimirale anti-BCMA CAR razmatran u ovom tekstu).
2. AKTIVACIJA I EKSPANZIJA
[0248] Sa ciljem postizanja dovoljnih terapijskih doza T ćelijskih kompozicija, T ćelije se često izlažu jednom ili većem broju ciklusa stimulacije, aktivacije i/ili ekspanzije. T ćelije mogu da se aktiviraju i ekspandiraju uopšteno korišćenjem metoda opisanih, na primer, u U.S. patentima 6,352,694; 6,534,055; 6,905,680; 6,692,964; 5,858,358; 6,887,466; 6,905,681; 7,144,575; 7,067,318; 7,172,869; 7,232,566; 7,175,843; 5,883,223; 6,905,874; 6,797,514; i 6,867,041. T ćelije modifikovane da eksprimiraju anti-BCMA CAR mogu da se aktiviraju i ekspandiraju pre i/ili pošto su T ćelije modifikovane. Pored toga, T ćelije mogu da se dovedu u kontakt sa jednim ili više sredstava koja modulišu PI3K ćelijske signalne puteve pre, tokom, i/ili posle aktivacije i/ili ekspanzije. T ćelije proizvedene metodima razmatranim u ovom tekstu mogu proći jedan, dva, tri, četiri ili pet ili više ciklusa aktivacije i ekspanzije, od kojih svaki uključuje jedno ili više sredstava koja modulišu PI3K ćelijski signalni put.
[0249] Kostimulatorni ligand može biti prisutan na antigen-prezentujućoj ćeliji (npr., aAPC, dendritska ćelija, B ćelija i slično) koja se specifično vezuje za odgovarajući kostimulatorni molekul na T ćeliji, čime obezbeđuje signal koji, pored primarnog signala obezbeđenog, na primer, vezivanjem TCR/CD3 kompleksa, posreduje u željenom odgovoru T ćelija. Pogodni kostimulatorni ligandi uključuju, ali se ne ograničavaju na CD7, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), PD-L 1, PDL2, 4-1BBL, OX40L, inducibilni kostimulatorni ligand (inducible costimulatory ligand, ICOS-L), međućelijski adhezivni molekul (intercellular adhesion molecule, ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, limfotoksin beta receptor, ILT3, ILT4, agonist ili antitelo koje se vezuje za Toll ligand-receptor, i ligand koji se specifično vezuje za B7-H3.
[0250] Kostimulatorni ligand uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za kostimulatorni molekul prisutan na T ćelijama uključujući, ali ne ograničavajući se na CD27, CD28, 4-IBB, OX40, CD30, CD40, PD-1, 1COS, sa funkcijom limfocita udruženi antigen-1 (lymphocyte function-associated antigen-1, LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, i ligand koji se specifično vezuje sa CD83.
[0251] Pogodni kostimulatorni ligandi uključuju ciljne antigene koji mogu biti obezbeđeni u solubilnoj formi ili eksprimirani na APC ili aAPC koje vezuju inženjerisane TCR ili CAR eksprimirane na modifikovanim T ćelijama.
[0252] Metod proizvodnje T ćelija razmatran u ovom tekstu može uključivati aktiviranje populacije ćelija koje sadrže T ćelije i ekspandiranje populacije T ćelija. Aktivacija T ćelija može da se obavi obezbeđivanjem primarnog stimulatornog signala preko T ćelijskog TCR/CD3 kompleksa ili putem stimulacije CD2 površinskog proteina i obezbeđivanjem sekundarnog kostimulatornog signala preko dodatnog molekula, npr., CD28.
[0253] TCR/CD3 kompleks može da se stimuliše dovođenjem u kontakt T ćelije sa pogodnim CD3-vezujućim sredstvom, npr., CD3 ligandom ili anti-CD3 monoklonskim antitelom.
Ilustrativni primeri CD3 antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na OKT3, G19-4, BC3 i 64.1.
[0254] CD2 vezujuće sredstvo može da se koristi za obezbeđivanje primarnog stimulatornog signala za T ćelije. Ilustrativni primeri CD2 vezujućih sredstava uključuju, ali se ne ograničavaju na CD2 ligande i anti-CD2 antitela npr., T11.3 antitelo u kombinaciji sa T11.1 ili T11.2 antitelom (Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36:897-906) i 9.6 antitelom (koje prepoznaje isti epitop kao TI 1.1) u kombinaciji sa 9-1 antitelom (Yang, S. Y. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097-1100). Mogu se koristiti i druga antitela koja se vezuju za iste epitope kao svako od gore opisanih antitela. Dodatna antitela, ili kombinacije antitela, mogu se pripremiti i identifikovati standardnim tehnikama kako je objavljeno na drugom mestu u ovom tekstu.
[0255] Pored primarnog stimulacionog signala obezbeđenog preko TCR/CD3 kompleksa ili putem CD2, indukcija odgovora T ćelija zahteva drugi, kostimulatorni signal. CD28 vezujuće sredstvo može se koristiti za obezbeđivanje kostimulatornog signala. Ilustrativni primeri CD28 vezujućih sredstava uključuju, ali se ne ograničavaju na: prirodne CD 28 ligande, npr., prirodni ligand za CD28 (npr., član B7 familije proteina, kao B7-1(CD80) i B7-2 (CD86); i anti-CD28 monoklonsko antitelo ili njegov fragment sposoban za unakrsno povezivanje CD28 molekula, npr., monoklonskih antitela 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 i EX5.3D10.
[0256] Molekul koji obezbeđuje primarni stimulatorni signal, na primer molekul koji obezbeđuje stimulaciju preko TCR/CD3 kompleksa ili CD2, i kostimulatorni molekul mogu biti vezani za istu površinu.
[0257] Vezujuća sredstva koja obezbeđuju stimulatorne i kostimulatorne signale mogu biti lokalizovana na površini ćelije. Ovo se može obaviti transfektovanjem ili transdukovanjem ćelije nukleinskom kiselinom koja kodira vezujuće sredstvo u vidu pogodnom za njenu ekspresiju na ćelijskoj površini ili alternativno vezivanjem vezujućeg sredstva za površinu ćelije.
[0258] Molekul koji obezbeđuje primarni stimulacioni signal, na primer molekul koji obezbeđuje stimulaciju preko TCR/CD3 kompleksa ili CD2, i kostimulatorni molekul mogu biti prikazani na antigen-prezentujućim ćelijama.
[0259] U jednom primeru izvođenja, molekul koji obezbeđuje primarni stimulacioni signal, na primer molekul koji obezbeđuje stimulaciju preko TCR/CD3 kompleksa ili CD2, i kostimulatorni molekul mogu biti obezbeđeni na zasebnim površinama.
[0260] Jedno od vezujućih sredstava koja obezbeđuju stimulatorne i kostimulatorne signale može biti solubilno (dato u rastvoru), a drugo sredstvo/sredstva data su na jednoj ili više površina.
[0261] Vezujuća sredstava koja obezbeđuju stimulatorne i kostimulatorne signale mogu biti data u solubilnoj formi (data u rastvoru).
[0262] Metodi za proizvodnju T ćelija razmatrani u ovom tekstu mogu uključivati aktiviranje T ćelija anti-CD3 i anti-CD28 antitelima.
[0263] T ćelijske kompozicije proizvedene metodima razmatranim u ovom tekstu uključuju T ćelije aktivirane i/ili ekspandirane u prisustvu jednog ili više sredstava koja inhibiraju PI3K ćelijski signalni put. T ćelije modifikovane da eksprimiraju anti-BCMA CAR mogu se aktivirati i ekspandirati pre i/ili posle modifikacije T ćelija. Populacija T ćelija može biti aktivirana, modifikovana da eksprimira anti-BCMA CAR, i zatim kultivisana za ekspanziju.
[0264] T ćelije proizvedene metodima razmatranim u ovom tekstu mogu uključivati povećan broj T ćelija koje eksprimiraju markere koji ukazuju na visoki proliferativni potencijal i sposobnost samoobnavljanja, ali koje ne eksprimiraju ili eksprimiraju suštinski nedetektabilne markere diferencijacije T ćelija. Ove T ćelije mogu ponavljano da se aktiviraju i ekspandiraju na robustan način i time obezbeđuju poboljšanu terapijsku kompoziciju T ćelija.
[0265] Populacija T ćelija aktiviranih i ekspandiranih u prisustvu jednog ili više sredstava koja inhibiraju PI3K ćelijski signalni put mogu se ekspandirati najmanje 1.5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 25 puta, najmanje 50 puta, najmanje 100 puta, najmanje 250 puta, najmanje 500 puta, najmanje 1000 puta, ili više u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i ekspandiranih bez PI3K inhibitora.
[0266] Populacija T ćelija koje se karakterišu ekspresijom markera mladih T ćelija može se aktivirati i ekspandirati u prisustvu jednog ili više sredstava koja inhibiraju PI3K ćelijski signalni put i može se ekspandirati najmanje 1.5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 25 puta, najmanje 50 puta, najmanje 100 puta, najmanje 250 puta, najmanje 500 puta, najmanje 1000 puta, ili više u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i ekspandiranih bez PI3K inhibitora.
[0267] Ekspandiranje T ćelija aktiviranih metodima razmatranim u ovom tekstu može uključivati još i kultivisanje populacije ćelija koja uključuje T ćelije, nekoliko sati (oko 3 sata) do oko 7 dana do oko 28 dana ili bilo koja cela vrednost sati između toga. Kompozicija T ćelija može se kultivisati 14 dana. T ćelije se mogu kultivisati oko 21 dan. Kompozicije T ćelija mogu se kultivisati oko 2-3 dana. Može biti poželjno nekoliko ciklusa stimulacije/aktivacije/ekspanzije tako da vreme kultivisanja T ćelija može iznositi 60 dana ili više.
[0268] Uslovi pogodni za kultivisanje T ćelija mogu uključivati odgovarajući medijum (npr., minimalni esencijalni medijum ili RPMI medijum 1640 ili, X-vivo 15, (Lonza)) i jedan ili više faktora neophodnih za proliferaciju i vijabilnost uključujući, ali ne ograničavajući se na serum (npr., fetalni goveđi ili humani serum), interleukin-2 (IL-2), insulin, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ i TNF-α ili bilo koje druge aditive pogodne za rast ćelija, poznate iskusnom stručnjaku.
[0269] Dodatni ilustrativni primeri medijuma za kulturu ćelija uključuju, ali se ne ograničavaju na RPMI 1640, Clicks, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 15, i X-Vivo 20, Optimizer, sa dodatim amino-kiselinama, natrijum piruvatom i vitaminima, bez seruma ili uz dopunu odgovarajućom količinom seruma (ili plazme) ili definisanim setom hormona, i/ili količinom citokina dovoljnom za rast i ekspanziju T ćelija.
[0270] Ilustrativni primeri drugih aditiva za ekspanziju T ćelija uključuju, ali se ne ograničavaju na surfaktant, plazmanate, pH pufere kao HEPES, i redukujuća sredstva kao N-acetilcistein i 2-merkaptoetanol.
[0271] Antibiotici, npr., penicilin i streptomicin, uključeni su samo u eksperimentalne kulture, ne i u kulture ćelija koje će se infuzijom uneti u subjekta. Ciljne ćelije se održavaju pod uslovima koji su potrebni da podrže rast, na primer, pogodna temperatura (npr., 37° C) i atmosfera (npr., vazduh sa 5% CO2).
[0272] PBMC ili izolovane T ćelije mogu se dovesti u kontakt sa stimulatornim sredstvom i kostimulatornim sredstvom, kao što su anti-CD3 i anti-CD28 antitela, obično prikačena za perlicu ili drugu površinu, u kultivacionom medijumu sa odgovarajućim citokinima, kao što su IL-2, IL-7, i/ili IL-15.
[0273] Arteficijalne APC (aAPC) napravljene inženjerisanjem K562, U937, 721.221, T2, i C1R ćelija za usmeravanje stabilne ekspresije i sekrecije različitih kostimulatornih molekula i citokina. K32 ili U32 aAPCs mogu se koristiti za usmeravanje prikazivanja jednog ili više na antitelima baziranih stimulatornih molekula na površini AAPC. Populacije T ćelija mogu se ekspandirati pomoću aAPC koje eksprimiraju različite kostimulatorne molekule uključujući, ali ne ograničavajući se na CD137L (4-1BBL), CD134L (OX40L), i/ili CD80 ili CD86. Konačno, aAPC obezbeđuju efikasnu platformu za ekspanziju genetički modifikovanih T ćelija i za održavanje ekspresije CD28 na CD8 T ćelijama. aAPC date u WO 03/057171 i US2003/0147869.
3. SREDSTVA
[0274] Obezbeđen je metod proizvodnje T ćelija koji ekspandira nediferencirane ili razvojno potentne T ćelije, koji uključuje dovođenje u kontakt T ćelija sa sredstvom koje moduliše PI3K put u ćelijama. Obezbeđen je metod proizvodnje T ćelija koji ekspandira nediferencirane ili razvojno potentne T ćelije, koji uključuje dovođenje u kontakt T ćelija sa sredstvom koje moduliše PI3K/AKT/mTOR put u ćelijama. Ćelije mogu biti dovođene u kontakt pre, tokom i/ili posle aktivacije i ekspanzije. Kompozicije T ćelija zadržavaju dovoljnu potenciju T ćelija tako da one mogu proći kroz više ciklusa ekspanzije bez suštinskog porasta diferencijacije.
[0275] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "moduliše", "modulator" ili "modulatorno sredstvo" ili slični izrazi odnose se na sposobnost sredstva da podstakne promenu u ćelijskom signalnom putu. Modulator može da poveća ili smanji količinu, aktivnost komponente puta ili da poveća ili smanji željeni efekat ili "izlaz" ćelijskog signalnog puta. Modulator može biti inhibitor. Modulator je aktivator.
[0276] "Sredstvo" označava jedinjenje, mali molekul, npr., mali organski molekul, nukleinsku kiselinu, polipeptid, ili fragment, izoformu, varijantu, analog, ili derivat istog upotrebljen u modulaciji PI3K/AKT/mTOR puta.
[0277] "Mali molekul" označava kompoziciju koja ima molekulsku težinu manju od oko 5 kD, manju od oko 4 kD, manju od oko 3 kD, manju od oko 2 kD, manju od oko 1 kD, ili manju od oko .5kD. Mali molekuli mogu uključivati nukleinske kiseline, peptide, polipeptide, peptidomimetike, peptoide, ugljene hidrate, lipide, njihove komponente ili druge organske ili neorganske molekule. Biblioteke hemijskih i/ili bioloških mešavina, kao što su eksctrakti gljivica, bakterija ili algi, poznati su u struci i mogu se pretraživati bilo kojim od testova. Primeri metoda za sintezu molekulskih biblioteka mogu se naći u: (Carell et al., 1994a; Carell et al., 1994b; Cho et al., 1993; DeWitt et al., 1993; Gallop et al., 1994; Zuckermann et al, 1994).
[0278] "Analog" odnosi se na malo organsko jedinjenje, nukleotid, protein, ili polipeptid koji poseduje sličnu ili identičnu aktivnost ili funkciju/funkcije kao jedinjenje, nukleotid, protein, ili polipeptid ili jedinjenje koje ima željenu aktivnost ali ne mora obavezno da sadrži sekvencu ili strukturu koja je slična ili identična sekvenci ili strukturi poželjnog primera izvođenja.
[0279] "Derivat" se odnosi na jedinjenje, protein ili polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu roditeljskog proteina ili polipeptida izmenjenu uvođenjem supstitucije, delecije ili adicije aminokiselinske rezidue, ili nukleinske kiseline ili nukleotida koji je bio modifikovan introdukovanjem supstitucije ili delecije nukleotida, adicija ili mutacija. Izvedena nukleinska kiselina, nukleotid, protein ili polipeptid poseduje sličnu ili identičnu funkciju kao roditeljski polipeptid.
[0280] Sredstvo koje moduliše PI3K put može aktivirati komponentu puta. "Aktivator" ili "agonist" označava sredstvo koje promoviše, povećava ili indukuje jednu ili više aktivnosti molekula u PI3K/AKT/mTOR putu uključujući, bez ograničavanja, molekul koji inhibira jednu ili više aktivnosti PI3K.
[0281] Sredstvo koje moduliše PI3K put može inhibirati komponentu puta. "Inhibitor" ili "antagonist" označava sredstvo koje inhibira, snižava ili smanjuje jednu ili više aktivnostimolekula u PI3K putu uključujući, bez ograničavanja, PI3K. Inhibito može biti dvojni molekulski inhibitor. Inhibitor može inhibirati klasu molekula koji imaju iste ili suštinski slične aktivnosti (paninhibitor) ili može specifično inhibirati aktivnost molekula (selektivni ili specifični inhibitor). Inhibicija može biti ireverzibilna ili reverzibilna.
[0282] Inhibitor može imati IC50 od najmanje 1 nM, najmanje 2 nM, najmanje 5 nM, najmanje 10 nM, najmanje 50 nM, najmanje 100 nM, najmanje 200 nM, najmanje 500 nM, najmanje 1 μM, najmanje 10 μM, najmanje 50 μM, ili najmanje 100 μM. Određivanje IC50 može se obaviti korišćenjem bilo koje konvencionalne tehnike poznate u struci. Na primer, IC50 može da se odredi merenjem aktivnosti datog enzima u prisustvu opsega koncentracija inhibitora koji se ispituje. Eksperimentalno dobijene vrednosti enzimske aktivnosti zatim se nanose na dijagram u odnosu na upotrebljene koncentracije inhibitora. Koncentracija inhibitora koja pokazuje 50% enzimske aktivnosti (u poređenju sa aktivnošću u odsustvu inhibitora) uzima se kao "IC50" vrednost. Analogno, druge inhibitorne koncentracije mogu se definisati odgovarajućim određivanjima aktivnosti.
[0283] T ćelije mogu se dovesti u kontakt ili tretirati ili kultivisati sa jednim ili više modulatora PI3K puta u koncentraciji od najmanje 1 nM, najmanje 2 nM, najmanje 5 nM, najmanje 10 nM, najmanje 50 nM, najmanje 100 nM, najmanje 200 nM, najmanje 500 nM, najmanje 1 μM, najmanje 10 μM, najmanje 50 μM, najmanje 100 μM, ili najmanje 1 M.
[0284] T ćelije mogu se dovesti u kontakt ili tretirati ili kultivisati sa jednim ili više modulatora PI3K puta tokom najmanje 12 sati, 18 sati, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 dana, najmanje 2 nedelje, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 meseci ili duže sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više ciklusa ekspanzije.
a. PI3K/Akt/mTOR put
[0285] Fosfatidil-inozitol-3 kinaza/Akt/sisarski cilj za rapamicin-put služi kao linija za integrisanje signalizacije faktorima rasta sa ćelijskom proliferacijom, diferencijacijom, metabolizmom i preživljavanjem. PI3K predstavljaju familiju visoko konzerviranih unutarćelijskih lipid-kinaza. Klasa IA PI3K aktivira se receptorskim tirozin kinazama (receptor tyrosine kinases, RTK) faktora rasta, direktno ili preko interakcije sa familijom supstrata receptora za insulin adapterskih molekula. Ova aktivnost rezultuje proizvodnjom fosfatidil-inozitol-3,4,5-trifosfata (phosphatidyl-inositol-3,4,5-trisphospate, PIP3) regulatora serin/treonin kinaze Akt. mTOR deluje preko kanoničkog PI3K puta preko 2 različita kompleksa, od kojih se svaki karakteriše različitim vezujućim partnerima koji daju različite aktivnosti. mTORC1 (mTOR u kompleksu sa PRAS40, raptorom, i mLST8/GbL) deluje kao nishodni efektor PI3K/Akt signalizacije, povezujući signale faktora rasta sa translacijom proteina, ćelijskim rastom, proliferacijom i preživljavanjem. mTORC2 (mTOR u kompleksu sa riktorom, mSIN1, protorom, i mLST8) deluje kao ushodni aktivator Akt.
[0286] Posle aktivacije PI3K posredovane receptorom faktora rasta, Akt se regrutuje u membranu preko interakcije svog plekstrinskog homolognog domena sa PIP3, čime izlaže svoju aktivacionu petlju i omogućava fosforilaciju na treoninu 308 (Thr308) konstitutivno aktivnom fosfoinozitid-zavisnom protein kinazom 1 (phosphoinositide-dependent protein kinase 1, PDK1). Za maksimalnu aktivaciju, Akt se takođe fosforiliše pomoću mTORC2, na serinu 473 (Ser473) svog C-terminalnog hidrofobnog motiva. Pokazano je i da su DNK-PK i HSP važni u regulaciji Akt aktivnosti. Akt aktivira mTORC1 preko inhibitorne fosforilacije TSC2, što zajedno sa TSC1, negativno reguliše mTORC1 inhibiranjem Rheb GTPaze, pozitivnog regulatora mTORC1. mTORC1 ima 2 dobro definisana supstrata, p70S6K (označen kasnije u ovom tesktu kao S6K1) i 4E-BP1, koji kritično regulišu sintezu proteina. Prema tome, mTORC1 je važan nishodni efektor PI3K, koji povezuje signalizaciju faktorima rasta sa translacijom proteina i proliferacijom ćelija.
b. PI3K inhibitori
[0287] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "PI3K inhibitor" odnosi se na nukleinsku kiselinu, peptid, jedinjenje ili mali organski molekul koji se vezuje i inhibira najmanje jednu aktivnost PI3K. PI3K proteini mogu da se svrstaju u tri klase, klasu 1 PI3K, klasu 2 PI3K, i klasu 3 PI3K. PI3K klase 1 postoje kao heterodimeri koji se sastoje od jedne od četiri p110 katalitičke subjedinice (p110α, p110β, p110δ i p110γ) i jedne od dve familije regulatornih subjedinica. PI3K inhibitor poželjno cilja klasu 1 PI3K inhibitora. PI3K inhibitor može pokazati selektivnost za jednu ili više izoformi PI3K inhibitora klase 1 (tj., selektivnost za p110α, p110β, p110δ i p110γ ili jedan ili više od p110α, p110β, p110δ i p110γ). PI3K inhibitor može da ne ispoljava selektivnost za izoforme i da se smatra kao "panPI3K inhibitor". PI3K inhibitor može kompetirati za vezivanje sa ATP za PI3K katalitički domen.
[0288] PI3K inhibitor može, na primer, ciljati PI3K kao i dodatne proteine u PI3K-AKT-mTOR putu. PI3K inhibitor može ciljati i mTOR i PI3K i može se označiti kao mTOR inhibitor ili PI3K inhibitor. PI3K inhibitor koji cilja samo PI3K može se označiti kao selektivni PI3K inhibitor. Može se razumeti da se selektivni PI3K inhibitor odnosi na sredstvo koje ispoljava 50% inhibitornu koncentraciju u odnosu na PI3K, koja je najmanje 10-struko, najmanje 20-struko, najmanje 30-struko, najmanje 50-struko, najmanje 100-struko, najmanje 1000-struko, ili više, niža od IC50 inhibitora u odnosu na mTOR i/ili druge proteine puta.
[0289] Primeri PI3K inhibitora mogu inhibirati PI3K sa IC50 (koncentracija koja inhibira 50% aktivnosti) od oko 200 nM ili manje, poželjno oko 100 nm ili manje, još poželjnije oko 60 nM ili manje, oko 25 nM, oko 10 nM, oko 5 nM, oko 1 nM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM, ili manje. PI3K inhibitor može inhibirati PI3K sa IC50 od oko 2 nM do oko 100 nm, poželjnije od oko 2 nM do oko 50 nM, još poželjnije od oko 2 nM do oko 15 nM.
[0290] Ilustrativni primeri PI3K inhibitora pogodni za upotrebu u metodima proizvodnje T ćelija razmatranim u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na BKM120 (klasa 1 PI3K inhibitora, Novartis), XL147 (klasa 1 PI3K inhibitora, Exelixis), (pan-PI3K inhibitor, GlaxoSmithKline) i PX-866 (klasa 1 PI3K inhibitora; p110α, p110β i p110γ izoforme, Oncothyreon).
[0291] Drugi ilustrativni primeri selektivnih PI3K inhibitora uključuju, ali se ne ograničavaju na BYL719, GSK2636771, TGX-221, AS25242, CAL-101, ZSTK474, and IPI-145.
[0292] Drugi ilustrativni primeri pan-PI3K inhibitora uključuju, ali se ne ograničavaju na BEZ235, LY294002, GSK1059615, TG100713 i GDC-0941.
c. AKT Inhibitori
[0293] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "AKT inhibitor" označava nukleinsku kiselinu, peptid, jedinjenje ili mali organski molekul koji inhibira najmanje jednu aktivnost AKT. AKT inhibitori mogu da se svrstaju u nekoliko klasa, uključujući inhibitore bazirane na lipidima (npr., inhibitori koji ciljaju plekstrinski homologni domen AKT koji prevenira lokalizaciju AKT u plazminoj membrani), ATP-kompetitivne inhibitore i alosterične inhibitore. AKT inhibitori mogu delovati vezivanjem za AKT katalitičko mesto. Akt inhibitori mogu delovati inhibiranjem fosforilacije nishodnih AKT ciljeva kao što je mTOR. AKT aktivnost može da se inhibira inhibiranjem ulaznih signala koji aktiviraju Akt inhibiranjem, na primer, DNK-PK aktivacije AKT, PDK-1 aktivacije AKT, i/ili mTORC2 aktivacije Akt.
[0294] AKT inhibitori mogu ciljati sve tri AKT izoforme, AKT1, AKT2, AKT3 ili mogu biti selektivni za izoforme i ciljati samo jednu ili dve AKT izoforme. AKT inhibitor može ciljati AKT kao i dodatne proteine u PI3K-AKTmTOR putu. AKT inhibitor koji cilja samo AKT može se označiti kao selektivni AKT inhibitor. Može se razumeti da se selektivni AKT inhibitor odnosi na sredstvo koje ispoljava 50% inhibitornu koncentraciju u odnosu na AKT, koja je najmanje 10-struko, najmanje 20-struko, najmanje 30-struko, najmanje 50-struko, najmanje 100-struko, najmanje 1000-struko, ili više niža od IC50 inhibitora u odnosu na druge proteine puta.
[0295] Primer AKT inhibitora može inhibirati AKT sa IC50 (koncentracija koja inhibira 50% aktivnosti) od oko 200 nM ili manje, poželjno oko100 nm ili manje, još poželjnije oko 60 nM ili manje, oko 25 nM, oko 10 nM, oko 5 nM, oko 1 nM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM, ili manje. AKT može inhibirati AKT sa IC50 od oko 2 nM do oko 100 nm, poželjnije od oko 2 nM do oko 50 nM, još poželjnije od oko 2 nM do oko 15 nM.
[0296] Ilustrativni primeri AKT inhibitora za upotrebu u kombinaciji sa konjugatima antitelolek na bazi auristatina uključuju, na primer, perifosin (Keryx), MK2206 (Merck), VQD-002 (VioQuest), XL418 (Exelixis), GSK690693, GDC-0068 i PX316 (PROLX Pharmaceuticals).
[0297] Ilustrativni neograničavajući primer selektivnog Akt1 inhibitora je A-674563.
[0298] Ilustrativni neograničavajući primer selektivnog Akt2 inhibitora je CCT128930.
[0299] Akt inhibitor DNK-PK-aktivacija Akt, PDK-1-aktivacija Akt, mTORC2-aktivacija Akt, ili HSP-aktivacija Akt.
[0300] Ilustrativni primeri DNK-PK inhibitora uključuju, ali se ne ograničavaju na NU7441, PI-103, NU7026, PIK-75 i PP-121.
d. mTOR Inhibitori
[0301] Izrazi "mTOR inhibitor" ili "sredstvo koje inhibira mTOR" označava nukleinsku kiselinu, peptid, jedinjenje ili mali organski molekul koji inhibira najmanje jednu aktivnost mTOR proteina, kao što je na primer, serin/treonin protein kinazna aktivnost na najmanje jednom od njegovih supstrata (npr., p70S6 kinaza 1, 4E-BP1, AKT/PKB i eEF2). mTOR inhibitori sposobni su da se vežu direktno i da inhibiraju mTORC1, mTORC2 ili oba, mTORC1 i mTORC2.
[0302] Inhibicija mTORC1 i/ili mTORC2 aktivnosti može da se odredi redukcijom signalne transdukcije PI3K/Akt/mTOR puta. Veliki broj različitih očitavanja može da se koristi za uspostavljanje redukcije izlaza takvog signalnog puta. Neki neograničavajući primeri očitavanja uključuju (1) smanjenje fosforilacije Akt na reziduama, uključujući, ali ne ograničavajući se na 5473 i T308; (2) smanjenje aktivacije Akt kako je pokazano, na primer, smanjenjem fosforilacije Akt supstrata uključujući, ali ne ograničavajući se na Fox01/O3a T24/32, GSK3a/β; S21/9 i TSC2 T1462; (3) smanjenje fosforilacije signalnih molekula nishodno od mTOR, uključujući, ali ne ograničavajući se na ribozomski S6 S240/244, 70S6K T389 i 4EBP1 T37/46; i (4) inhibiciju proliferacije kancerskih ćelija. mTOR inhibitori mogu biti inhibitori aktivnog mesta. Ovo su mTOR inhibitori koji se vezuju za ATP-vezujuće mesto (označeno i kao ATP-vezujući "džep") mTOR i inhibiraju katalitičku aktivnost mTORC1 i mTORC2. Jedna klasa inhibitora aktivnog mesta pogodna za upotrebu u metodima proizvodnje T ćelija razmatranim u ovom tekstu su dvojno specifični inhibitori koji ciljaju i direktno inhibiraju PI3K i mTOR. Dvojno specifični inhibitori vezuju se za ATP-vezujuće mesto i mTOR i PI3K. Ilustrativni primeri takvih inhibitora uključuju, ali se ne ograničavaju na: imidazohinazoline, vortmanin, LY294002, PI-103 (Cayman Chemical), SF1126 (Semafore), BGT226 (Novartis), XL765 (Exelixis) i NVP-BEZ235 (Novartis).
[0303] Sledeća klasa inhibitora aktivnog mesta mTOR pogodna za upotrebu u metodima razmatranim u ovom tekstu selektivno inhibira mTORC1 i mTORC2 aktivnost relativno u odnosu na jednu ili više fosfatidilinozitol 3-kinaza tipa I, npr., PI3 kinaze α, β, γ, ili δ. Ovi inhibitori aktivnog mesta vezuju se za aktivno mesto mTOR, ali ne i PI3K. Ilustrativni primeri takvih inhibitora uključuju, ali se ne ograničavaju na: pirazolopirimidine, Torin1 (Guertin and Sabatini), PP242 (2-(4-amino-1-izopropil-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-3-il)-1H-indol-5-ol), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth) i AZD8055 (Liu et al., Nature Review, 8, 627-644,2009).
[0304] Selektivni mTOR inhibitor označava sredstvo koje pokazuje 50% inhibitornu koncentraciju (IC50) u odnosu na mTORC1 i/ili mTORC2, koja je najmanje 10-struko, najmanje 20-struko, najmanje 50-struko, najmanje 100-struko, najmanje 1000-struko, ili više niža od IC50 inhibitora u odnosu na jednu, dve , tri ili više PI3 kinaze tipa I ili na sve PI3 kinaze tipa I.
[0305] Sledeća klasa razmatranih inhibitora mTOR označena je u ovom tekstu kao "rapalozi". Kako se koristi u ovom tekstu izraz "rapalozi" označava jedinjenja koja se specifično vezuju za mTOR FRB domen (FKBP rapamicin-vezujući domen), koja su strukturno slična rapamicinu i zadržavaju mTOR-inhibirajuća svojstva. Izraz rapalozi isključuje rapamicin. Rapalozi obuhvataju estre, etre, oksime, hidrazone, i hidroksilamine rapamicina, kao i jedinjenja u kojima su funkcionalne grupe na osnovnoj strukturi rapamicina modifikovane, na primer, redukcijom ili oksidacijom. Farmaceutski prihvatljive soli takvih jedinjenja razmatraju se i kao derivati rapamicina. Ilustrativni primeri rapaloga pogodnih za upotrebu u metodima razmatranim u ovom tekstu uključuju, bez ograničavanja, temsirolimus (CC1779), everolimus (RAD001), deforolimus (AP23573), AZD8055 (AstraZeneca) i OSI-027 (OSI). Sredstvo može biti mTOR inhibitorni rapamicin (sirolimus).
[0306] Primeri mTOR inhibitora za upotrebu mogu inhibirati mTORC1, mTORC2 ili i mTORC1 i mTORC2 sa IC50 (koncentracija koja inhibira 50% aktivnosti) od oko 200 nM ili manje, poželjno oko100 nm ili manje, još poželjnije oko 60 nM ili manje, oko 25 nM, oko 10 nM, oko 5 nM, oko 1 nM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM, ili manje. mTOR inhibitor za upotrebu inhibira mTORC1, mTORC2 ili i mTORC1 i mTORC2 sa IC50 od oko 2 nM do oko 100 nm, poželjnije od oko 2 nM do oko 50 nM, još poželjnije od oko 2 nM do oko 15 nM.
[0307] Primeri mTOR inhibitora mogu inhibirati PI3K i mTORC1 ili mTORC2 ili i mTORC1 i mTORC2 i PI3K sa IC50 (koncentracija koja inhibira 50% aktivnosti) od oko 200 nM ili manje, poželjno oko100 nm ili manje, još poželjnije oko 60 nM ili manje, oko 25 nM, oko 10 nM, oko 5 nM, oko 1 nM, 100 μM, 50 μM, 25 μM, 10 μM, 1 μM, ili manje. mTOR inhibitor za upotrebu može inhibirati PI3K i mTORC1 ili mTORC2 ili i mTORC1 i mTORC2 i PI3K sa IC50 od oko 2 nM do oko 100 nm, poželjnije od oko 2 nM do oko 50 nM, još poželjnije od oko 2 nM do oko 15 nM.
[0308] Drugi ilustrativni primeri mTOR inhibitora pogodni za upotrebu razmatranu u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na AZD8055, INK128, rapamicin, PF-04691502 i everolimus.
[0309] Pokazano je da mTOR ispoljava robusnu i specifičnu katalitičku aktivnost prema fiziološkim proteinskim supstratima, p70 S6 ribozomskoj protein kinazi I (p70S6K1) i eIF4E vezujućem proteinu (eIF4E binding protein 1, 4EBP1), kako je izmereno fosfor-specifičnim antitelima u Western blotu.
[0310] Inhibitor PI3K/AKT/mTOR puta može biti inhibitor s6 kinaze odabran iz grupe koja se sastoji od: BI-D1870, H89, PF-4708671, FMK i AT7867.
I. KOMPOZICIJE I FORMULACIJE
[0311] Kompozicije razmatrane u ovom tekstu mogu uključivati jedan ili više polipeptida, polinukleotida, vektora koji uključuju isto, genetički modifikovane imunske efektorske ćelije, itd., kako se razmatra u ovom tekstu. Kompozicije uključuju, aali se ne ograničavaju na farmaceutske kompozicije. "Farmaceutska kompozicija" označava kompoziciju formulisanu u farmaceutski prihvatljivim ili fiziološki prihvatljivim rastvorima, za primenu na ćelijama ili kod životinje, samu ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapijskih modaliteta. Treba takođe razumeti da, po želji, kompozicije mogu da se primene i u kombinaciji sa drugim sredstvima kao što su, npr., citokini, faktori rasta, hormoni, mali molekuli, hemoterapeutici, prolekovi, lekovi, antitela, ili različita druga farmaceutski aktivna sredstva. Praktično nema ograničenja za druge komponente koje mogu biti uključene u kompozicije, uz uslov da dodatna sredstva ne utiču negativno na sposobnost kompozicije da dostavi predviđenu terapiju.
[0312] Izraz "farmaceutski prihvatljiv" upotrebljava se u ovom tekstu da označi ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili dozne forme koje su u okviru opšte medicinske procene, pogodne za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i životinja bez preterane toksičnosti, izazivanja iritacije, alergijskog odgovora ili drugog problema ili komplikacije, uz razuman odnos koristi prema riziku.
[0313] Kako se koristi u ovom tekstu "farmaceutski prihvatljivi nosač, razblaživač ili ekscipijent" uključuje, bez ograničavanja, svaki adjuvans, nosač, ekscipijent, glidans, sredstvo za zaslađivanje, razblaživač, prezervans, boju/sredstvo za bojenje, pojačivač ukusa, surfaktant, sredstvo za vlaženje, dispergujuće sredstvo, suspendujuće sredstvo, stabilizer, izotonično sredstvo, razblaživač, surfaktant, ili emulgator koje je odobrila Uprava za hranu i lekove Sjedinjenih Američkih Država kao prihvatljive za upotrebu kod ljudi ili domaćih životinja. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača uključuju, ali se ne ograničavaju na šećere, kao što su laktoza, glukoza i saharoza; skrobove kao što su kukuruzni skrob i krompirov skrob; celulozu i njene derivate kao što su natrijum karboksimetil celuloza, etil celuloza i celuloza acetat; tragant; slad; želatin; talk; kakao buter, voskove, životinjske i biljne masti, parafine, silikone, bentonite, silicijumovu kiselinu, cink oksid; ulja, kao ulje kikirikija, ulje semena pamuka, ulje šafrana, susamovo ulje, maslinovo ulje, kukuruzno ulje i sojino ulje; glikole, kao propilen glikol; poliole, kao glicerin, sorbitol, manitol i polietilen glikol; estre, kao etil oleat i etil laurat; agar; puferišuća sredstva kao magnezijum hidroksid i aluminijum hidroksid; alginsku kiselinu; vodu oslobođenu pirogena; izotonični slani rastvor; Ringerov rastvor; etil alkohol; fosfatom puferisani rastvori; i bilo koje druge kompatibilne supstance korišćene u farmaceutskim formulacijama.
[0314] U posebnim primerima izvođenja, kompozicije uključuju količinu CAR-eksprimirajuće imunske efektorske ćelije razmatrane u ovom tekstu. Kako se ovde koristi, izraz "količina" odnosi se na "količinu efikasnu" ili "efikasnu količinu" genetički modifikovane terapeutske ćelije, npr., T ćelije, za postizanje korisnog ili željenog profilaktičkog ili terapijskog rezultata, uključujući kliničke rezultate.
[0315] "Profilaktički efikasna količina" odnosi se na količinu genetički modifikovane terapijske ćelije efikasnu za postizanje željenog profilaktičkog rezultata. Tipično, ali ne obavezno, pošto se profilaktička doza upotrebljava kod subjekta pre bolesti ili na ranijem stupnju bolesti, profilaktički efikasna količina je manja od terapijski efikasne količine.
[0316] "Terapijski efikasna količina" genetički modifikovane terapijske ćelije može varirati u skladu sa faktorima kao što su stanje bolesti, starost, pol i težina osobe, i sposobnost matičnih i progenitorskih ćelija da podstaknu željeni odgovor kod osobe. Terapijski efikasna količina je i ona kod koje je svaki toksični štetni efekat virusa ili transdukovanih terapeutskih ćelija prevladan terapijski korisnim efektima. Izraz "terapijski efikasna količina" uključuje količinu koja je efikasna za "lečenje" subjekta (npr., pacijenta). Kada je navedena terapijska količina, precizne količine kompozicija koje će se primeniti može odrediti lekar uz razmatranje individualnih razlika u starosti, težini, veličini tumora, opsegu infekcije ili metastaze i stanja pacijenta (subjekta). Uopšteno se može smatrati da farmaceutska kompozicija koja uključuje T ćelije opisane u ovom tekstu može da se primeni u dozama od 10<2>do 10<10>ćelija/kg telesne težine, poželjno 10<5>do 10<6>ćelija/kg telesne težine, uključujući sve cele vrednosti unutar ovih opsega. Broj ćelija zavisiće od konačne upotrebe kojoj je kompozicija namenjena kao i od tipa ćelija koje su u njoj. Za upotrebe date u ovom tekstu, ćelije su obično u zapremini od litra ili manje, mogu biti u zapremini od 500 mL ili manje, čak 250 mL ili 100 mL ili manje. Stoga je gustina željenih ćelija tipično veća od 10<6>ćelija/ml i obično je veća od 10<7>ćelija/ml, obično 108 ćelija/ml ili veća. Klinički relevantan broj imunskih ćelija može biti raspoređen u više infuzija koje su kumulativno jednake ili prevazilaze 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 , ili 1012 ćelija. Posebno pošto će sve infuzirane ćelije biti preusmerene ka određenom ciljnom antigenu (npr., κ ili λ laki lanac), može se primeniti manji broj ćelija, u opsegu od 106/kilogram (106-1011 po pacijentu). CAR-eksprimirajuće ćelijske kompozicije mogu da se primene više puta, u dozama u okviru ovih opsega. Ćelije mogu biti alogene, singene, ksenogene, ili autologne za pacijenta koji je podvrgnut terapiji. Po želji, lečenje može uključivati i primenu mitogena (npr., PHA) ili limfokina, citokina, i/ili hemokina (npr., IFN-γ, IL-2, IL-12, TNF-alfa, IL-18, i TNF-beta, GM-CSF, IL-4, IL-13, Flt3-L, RANTES, MIP1α, itd.) kako je opisano u ovom tekstu, za pojačanje indukcije imunskog odgovora.
[0317] Uopšteno, kompozicije koje uključuju ćelije aktivirane i ekspandirane kako je opisano u ovom tekstu mogu da se koriste u lečenju i prevenciji bolesti koje nastaju kod osoba koje su imunokompromitovane. Posebno, kompozicije koje uključuju CAR-modifikovane T ćelije razmatrane u ovom tekstu koriste se za lečenje maligniteta B ćelija. CAR-modifikovane T ćelije mogu da se primene same ili kao farmaceutska kompozicija u kombinaciji sa nosačima, razblaživačima, ekscipijentima, i/ili drugim komponentama kao što su IL-2 ili drugi citokini ili populacije ćelija. Farmaceutske kompozicije razmatrane u ovom tekstu uključuju količinu genetički modifikovanih T ćelija u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski ili fiziološki prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenata.
[0318] Farmaceutske kompozicije koje uključuju populaciju CAR-eksprimirajućih imunskih efektorskih ćelija kao što su T ćelije, mogu uključivati pufere kao što je neutralno puferisani slani rastvor, fosfatom puferisani slani rastvor i slično; ugljene hidrate kao što su glukoza, manoza, saharoza ili dekstrani, manitol; proteine; polipeptide ili amino-kiseline kao što je glicin; antioksidante; helirajuća sredstva kao EDTA ili glutation; adjuvanse (npr., aluminijum hidroksid); i prezervanse. Kompozicije predmetnog pronalaska poželjno su formulisane za parenteralnu primenu, npr., intravaskularnu (intravensku ili intraarterijsku), intraperitonealnu ili intramuskularnu primenu.
[0319] Tečne farmaceutske kompozicije, bilo da su rastvori, suspenzije ili druge slične forme, mogu uključivati jedno ili više od sledećeg: sterilni razblaživači kao što su voda za injekcije, slani rastvor, poželjno fiziološki slani rastvor, Ringerov rastvor, izotonični natrijum hlorid, fiksirana ulja kao što su sintetski mono ili digliceridi koji mogu služiti kao medijum za rastvaranje ili suspendovanje, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge rastvarače; antibakterijska sredstva kao što su benzil alkohol ili metil paraben; antioksidante kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helirajuća sredstva kao etilendiamintetrasirćetna kiselina; puferi kao što su acetati, citrati ili fosfati i sredstva za podešavanje toničnosti kao natrijum hlorid ili dekstroza. Parenteralni preparat može biti zatvoren u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili fiole sa većim brojem doza napravljene od stakla ili plastike. Injektabilna farmaceutska kompozicija je poželjno sterilna.
[0320] Kompozicije razmatrane u ovom tekstu uključuju efikasnu količinu CAR-eksprimirajućih imunskih efektorskih ćelija, samih ili u kombinaciji sa jednim ili više terapijskih sredstava. Prema tome, kompozicije CAR-eksprimirajućih imunskih efektorskih ćelija mogu se primeniti same ili u kombinaciji sa drugim poznatim načinima lečenja kancera, kao što su terapija zračenjem, hemioterapija, transplantacija, imunoterapija, hormonska terapija, fotodinamička terapija, itd. Kompozicije mogu da se primene i u kombinaciji sa antibioticima. Takva terapijska sredstva mogu biti prihvaćena u struci kao standardni način lečenja određenih bolesnih stanja, kako je opisano u ovom tekstu, na primer određenih kancera. Primeri terapijskih sredstava razmatranih u ovom tekstu uključuju citokine, faktore rasta, steroide, NSAID, DMARD, antiinflamatorna sredstva, hemioterapeutike, radioterapeutike, terapijska antitela, ili druga aktivna ili pomoćna sredstva.
[0321] Kompozicije koje uključuju CAR-eksprimirajuće imunske efektorske ćelije objavljene u ovom tekstu mogu se primeniti zajedno sa bilo kojim brojem hemioterapijskih sredstava.
Ilustrativni primeri hemioterapijskih sredstava uključuju alkilirajuća sredstva kao što su tiotepa i ciklofosfamid (CYTOXAN™); alkil sulfonate kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziridine kao što su benzodopa, karbokvon, meturedopa i uredopa; etilenimine i metilamelamine uključujući altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforoamid i trimetilolomelamin; azotne iperite kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehloretamin, mehloretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembicin, fenesterin, prednimustin, trofosfamid, uracilni iperit; nitrozuree kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotike kao što su aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, kalihemicin, karabicin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norleucin, doksorubicin, epirubicin, esorubicin, idarubicin, marcelomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; antimetabolite kao što su metotreksat i 5-fluorouracil (5-FU); analoge folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinske analoge kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; pirimidinske analoge kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-FU; androgene kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadrenalna sredstva kao što su aminoglutetimid, mitotan, trilostan; obnavljače folne kiselinekao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfamid glikozid; aminolevulinsku kiselinu; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikvon; elformitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitrakrin; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilinsku kiselinu; 2-etilhidrazid; prokarbazin; PSK®; razoksan; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonsku kiselinu; triazikvon; 2,2’,2"-trihlorotrietilamin; uretan; vindezin; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolaktol; pipobroman; gacitozin; arabinozid ("Ara-C"); ciklofosfamid; tiotepu; taksoide, npr. paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) i doksetaksel (TAXOTERE®., Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France); hlorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analoge platine kao cisplatin i karboplatin; vinblastin; platinu; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; navelbin; novantron; tenipozid; daunomicin; aminopterin; kselodu; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilomitin (DMFO); derivate retinoinske kiseline kao što su Targretin™ (beksaroten), Panretin™ (alitretinoin) ; ONTAK™ (denileukin diftitoks); esperamicine; kapecitabin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kojeg od gore navedenih. U ovu definiciju uključena su i antihormonska sredstva koja deluju da regulišu ili inhibiraju dejstvo hormona na kancere, kao što su antiestrogeni uključujući na primer tamoksifen, raloksifen, aromataza-inhibirajuće 4(5)-imidazole, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY117018, onapriston i toremifen (Fareston); i antiandrogene kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; i farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivate bilo kojeg od gore navedenih.
[0322] Različita druga terapijska sredstva mogu da se koriste zajedno sa kompozicijama opisanim u ovom tekstu. Kompozicija koja uključuje CAR-eksprimirajuće imunske efektorske ćelije može se primeniti sa antiinflamatornim sredstvom. Antiinflamatorna sredstva ili lekovi uključuju, ali se ne ograničavaju na steroide i glukokortikoide (uključujući betametazon, budesonid, deksametazon, hidrokortizon acetat, hidrokortizon, hidrokortizon, metilprednizolon, prednizolon, prednizon, triamcinolon), nesteroidne antiinflamatorne lekove (nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS) uključujući aspirin, ibuprofen, naproksen, metotreksat, sulfasalazin, leflunomid, anti-TNF medikaciju, ciklofosfamid i mikofenolat.
[0323] Drugi primeri NSAID odabrani su iz grupe koja se sastoji od ibuprofena, naproksena, naproksen natrijuma, Cox-2 inhibitora kao VIOXX® (rofekoksib) i CELEBREX® (celekoksib) i sijalilata. Primeri analgetika biraju se iz grupe koja se sastoji od acetaminofena, oksikodona, tramadola ili propoksifen hidrohlorida. Primeri glukokortikoida biraju se iz grupe koja se sastoji od kortizona, deksametazona, hidrokortizona, metilprednizolona, prednizolona, ili prednizona. Primeri modifikatora biološkog odgovora uključuju molekule usmerene protiv ćelijskih površinskih markera (npr., CD4, CD5, itd.), inhibitore citokina, kao što su antagonisti TNF (npr., etanercept (ENBREL®), adalimumab (HUMIRA®) i infliksimab (REMICADE®), inhibitore hemokina i inhibitore adhezionih molekula. Modifikatori biološkog odgovora uključuju monoklonska antitela kao i rekombinantne forme molekula. Primeri DMARD uključuju azatioprin, ciklofosfamid, ciklosporin, metotreksat, penicilamin, leflunomid, sulfasalazin, hidroksihlorokin, zlato (oralno (auranofin) i intramuskularno) i minociklin.
[0324] Ilustrativni primeri terapijskih antitela pogodnih za kombinaciju sa CAR-modifikovanim T ćelijama razmatranim u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na bavituksimab, bevacizumab (avastin), bivatuzumab, blinatumomab, konatumumab, daratumumab, duligotumab, dacetuzumab, dalotuzumab, elotuzumab (HuLuc63), gemtuzumab, ibritumomab, indatuksimab, inotuzumab, lorvotuzumab, lukatumumab, milatuzumab, moksetumomab, okaratuzumab, ofatumumab, rituksimab, siltuksimab, teprotumumab i ublituksimab.
[0325] U određenim primerima izvođenja, kompozicije opisane u ovom tekstu primenjuju se zajedno sa citokinom. Pod "citokin" u ovom tekstu misli se na generički izraz za proteine koji se oslobađaju iz populacije ćelija, koji deluju na druge ćelije kao međućelijski medijatori. Primeri takvih citokina su limfokini, monokini i tradicionalni polipeptidni hormoni. U citokine se ubrajaju hormoni rasta kao humani hormon rasta, N-metionil humani hormon rasta i goveđi hormon rasta; paratiroidni hormon; tiroksin; insulin; proinsulin; relaksin; prorelaksin; glikoproteinski hormoni kao folikulostimulirajući hormon (follicle stimulating hormone, FSH), tirostimulirajući hormon (thyroid stimulating hormone, TSH) i luteinizirajući hormon (luteinizing hormone, LH); hepatički faktor rasta; faktor rasta fibroblasta; prolaktin; laktogen placente; faktor nekroze tumora-alfa i -beta; milerijanska inhibitorna supstanca; mišji gonadotropin-pridruženi peptid; inhibin; aktivin; faktor rasta vaskularnog endotela; integrin; trombopoetin (thrombopoietin, TPO); faktori rasta nerava kao NGF beta; faktor rasta krvnih pločica; transformišući faktori rasta (transforming growth factors, TGF) kao TGF-alfa i TGF-beta; insulinu sličan faktor rasta-I i -II; eritropoetin (erythropoietin, EPO); osteoinduktivni faktori; interferoni kao interferon-alfa, beta i -gama; faktori stimulacije kolonija (colony stimulating factors, CSF) kao makrofagni-CSF (macrophage-CSF, M-CSF); granulocitnimakrofagni-CSF (granulocyte-macrophage-CSF, GM-CSF); i granulocitni-CSF (granulocyte-CSF, G-CSF); interleukini (IL) kao IL-1, IL-1alfa, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL- 11, IL-12; IL-15, IL-21, faktor nekroze tumora, kao TNF-alfa ili TNF-beta; i drugi polipeptidni faktori uključujući LIF i kit ligand (KL). Kako se koristi u ovom tekstu, izraz citokin uključuje proteine iz prirodnih izvora ili iz kulture rekombinantnih ćelija i biološki aktivne ekvivalente nativnih sekvenci citokina.
[0326] Kompozicija može uključivati CAR T ćelije razmatrane u ovom tekstu koje su kultivisane u prisustvu PI3K inhibitora kako je ovde objavljeno i koje eksprimiraju jedan ili više sledećih markera: CD3, CD4, CD8, CD28, CD45RA, CD45RO, CD62, CD127 i HLA-DR, i mogu se dodatno izolovati pozitivnim ili negativnim tehnikama selekcije. Kompozicija može uključivati specifičnu potpopulaciju T ćelija koje eksprimiraju jedan ili više markera odabranih iz grupe koja se sastoji od CD62L, CCR7, CD28, CD27, CD122, CD127, CD197; i CD38 ili CD62L, CD127, CD197 i CD38, dodatno se izoluje i pozitivnim ili negativnim tehnikama selekcije. Kompozicije mogu da ne eksprimiraju ili da ne eksprimiraju bitno jedna ili više od sledećih markera: CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 i LAG3.
[0327] Ekspresija jednog ili više markera odabranih iz grupe koja se sastoji od CD62L, CD127, CD197 i CD38 povećana je najmanje 1.5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 25 puta, ili više u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i ekspandiranih bez PI3K inhibitora.
[0328] Ekspresija jednog ili više markera odabranih iz grupe koja se sastoji od CD57, CD244, CD160, PD-1, CTLA4, TIM3 i LAG3 smanjena je najmanje 1.5 puta, najmanje 2 puta, najmanje 3 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta, najmanje 6 puta, najmanje 7 puta, najmanje 8 puta, najmanje 9 puta, najmanje 10 puta, najmanje 25 puta, ili više u poređenju sa populacijom T ćelija aktiviranih i ekspandiranih bez PI3K inhibitora.
J. TERAPIJSKI METODI
[0329] Genetički modifikovane imunske efektorske ćelije razmatrane u ovom tekstu obezbeđuju poboljšane metode adoptivne imunoterapije za upotrebu u lečenju stanja povezanih sa B ćelijama, koja uključuju, ali se ne ograničavaju na imunoregulatorna stanja i hematološke malignitete.
[0330] Specifičnost primarne imunske efektorske ćelije može da se preusmeri na B ćelije genetičkim modifikovanjem primarne imunske efektorske ćelije pomoću CAR razmatranog u ovom tekstu. Virusni vektor može da se koristi za genetičku modifikaciju imunske efektorske ćelije određenim polinukleotidom koji kodira CAR koji uključuje mišji anti-BCMA antigenvezujući domen koji se vezuje za BCMA polipeptid; domen zgloba; transmembranski (TM) domen, kratki oligo- ili polipeptidni linker, koji povezuje TM domen sa unutarćelijskim signalnim domenom CAR; i jedan ili više unutarćelijskih kostimulatornih signalnih domena; i primarni signalni domen.b
[0331] Objavljen je i tip ćelijske terapije u kojem su T ćelije modifikovane da eksprimiraju CAR koji cilja BCMA-eksprimirajuće B ćelije. Anti-BCMA CAR T ćelije mogu biti kultivisane u prisustvu IL-2 i PI3K inhibitora da bi se poboljšale terapijske osobine i perzistencija CAR T ćelija. CAR T ćelije se zatim infuzijom uvedu u primaoca kojem je to potrebno. Ćelija uneta infuzijom sposobna je da ubije B ćelije koje izazivaju bolest kod primaoca. Za razliku od terapije antitelima, CAR T ćelije su sposobne da se repliciraju in vivo što rezultuje dugotrajnom perzistencijom koja dovodi do održive antikanceske terapije.
[0332] CAR T ćelije mogu proći robusnu in vivo ekspanziju T ćelija i mogu perzistirati tokom produženog perioda vremena. CAR T ćelije mogu se razviti u specifične memorijske T ćelije koje se mogu reaktivirati kako bi se inhibiralo svako dodatno formiranje ili rast tumora.
[0333] Kompozicije koje uključuju imunske efektorske ćelije koje sadrže CAR razmatran u ovom tekstu mogu se koristiti u lečenju stanja udruženih sa nenormalnom aktivnošću B ćelija.
[0334] Ilustrativni primeri stanja koja se mogu lečiti, prevenirati ili ublažiti korišćenjem imunskih efektorskih ćelija koje sadrže CAR razmatran u ovom tekstu uključuju, ali se ne ograničavaju na: sistemski eritemski lupus, reumatoidni artritis, mijasteniju gravis, autoimunsku hemolitičku anemiju, idiopatsku trombocitopenijsku purpuru, antifosfolipidni sindrom, Chagasovu bolest, Gravesovu bolest, Wegenerovu granulomatozu, poliarteritis nodoza, Sjogrenov sindrom, pemfigus vulgaris, sklerodermu, multiplu sklerozu, antifosfolipidni sindrom, ANCA udruženi vaskulitis, Goodpastureovu bolest, Kawasakijevu bolest i brzo progredirajući glomerulonefritis.
[0335] Modifikovane imunske efektorske ćelije mogu se primenjivati i kod poremećaja plazma-ćelija kao što su oboljenje teškog lanca, primarna ili imunocit-udružena amiloidoza i monoklonska gamopatija neodređenog značaja (monoclonal gammopathy of undetermined significance, MGUS).
[0336] Kako se koristi u ovom tekstu, "malignitet B ćelija" označava tip kancera koji se formira u B ćelijama (tip ćelija imunskog sistema), kako je bilo reči ranije u ovom tekstu.
[0337] Kompozicije koje uključuju CAR-modifikovane T ćelije razmatrane u ovom tekstu mogu se koristiti u lečenju hematoloških maligniteta uključujući, ali ne ograničavajući se na malignitete B ćelija kao što su na primer, multipli mijelom (multiple myeloma, MM) i ne-Hodgkinov limfom (non-Hodgkin’s lymphoma, NHL).
[0338] Multipli mijelom je malignitet B ćelija sa morfologijom zrelih plazma-ćelija, koji se karakteriše neoplastičnom transformacijom jednog klona ovih tipova ćelija. Ove plazma-ćelije proliferišu u BM i mogu invadirati susednu kost i ponekad krv. Različite forme multiplog mijeloma uključuju otvoreni multipli mijelom, leukemiju plazma-ćelija, nesekretorni mijelom, IgD mijelom, osteosklerotski mijelom, solitarni plazmacitom kosti i ekstramedularni plazmacitom (vidi, na primer, Braunwald, et al. (eds), Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15th Edition (McGraw-Hill 2001)).
[0339] Ne-Hodgkinov limfom obuhvata veliku grupu kancera limfocita (bele krvne ćelije). Non-Hodgkinovi limfomi mogu da se sretnu kod osoba bilo koje starosti i često se karakterišu limfnim čvorovima koji su veći nego normalno, groznicom i gubitkom težine. Postoje mnogi različiti tipovi ne-Hodgkinovog limfoma. Na primer, ne-Hodgkinov limfom može da se podeli u agresivni (brzorastući) i indolentni (spororastući) tip. Iako ne-Hodgkinovi limfomi mogu biti poreklom od B ćelija i od T-ćelija, u ovom tekstu, izraz "ne-Hodgkinov limfom" i "B ćelijski ne-Hodgkinov limfom" koriste se naizmenično. B ćelijski ne-Hodgkinovi limfomi (non-Hodgkin lymphomas, NHL) uključuju Burkittov limfom, hroničnu limfocitnu leukemiju/limfom malih limfocita (chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma, CLL/SLL), difuzni krupnoćelijski B-limfom, folikularni limfom, imunoblastni krupnoćelijski limfom, prekursorski B-limfoblastni limfom i limfom plaštanih ćelija. Limfomi koji se sreću posle transplantacije kostne srži ili matičnih ćelija obično su ne-Hodgkinovi limfomi B ćelija.
[0340] Hronična limfocitna leukemija (CLL) je indolentni (spororastući) kancer koji dovodi do sporog porasta nezrelih belih krvnih ćelija nazvanih B limfociti, ili B ćelije. Kancerske ćelije se šire u krv i kostnu srž i mogu zahvatiti i limfne čvorove ili druge organe kao što su jetra i slezina. CLL na kraju dovode do gubitka funkcije kostne srži. Ponekad, u kasnijim stadijumima bolesti, bolest se naziva limfom malih limfocita.
[0341] Obezbeđeni su metodi koji uključuju primenu terapijski efikasne količine CAR-eksprimirajućih imunskih efektorskih ćelija, razmatrani u ovom tekstu ili kompozicije koje ih sadrže, kod pacijenta kojem je to potrebno, samih ili u kombinaciji sa jednim ili više terapijskih sredstava. Ćelije mogu da se koriste za lečenje pacijenata koji imaju rizik za razvijanje stanja udruženog sa nenormalnom aktivnošću B ćelija ili malignitetom B ćelija. Prema tome, predmetna objava obezbeđuje metode lečenja ili prevencije stanja udruženog sa nenormalnom aktivnošću B ćelija ili malignitetom B ćelija,cb koji uključuju primenu, kod subjekta kojem je to potrebno, terapijski efikasne količine CAR-modifikovanih ćelija razmatranih u ovom tekstu.
[0342] Kako se ovde koriste, izrazi "osoba/pojedinac" i "subjekt" često se koriste naizmenično i odnose se na svaku životinju koja ispoljava simptome bolesti, poremećaja ili stanja koje se može lečiti genskim terapijskim vektorima, terapijskim sredstvima baziranim na ćelijama i metodima objavljenim na drugim mestima u ovom tekstu. Subjekt može biti svaka životinja koja ispoljava simptome bolesti, poremećaja ili stanja hematopoetskog sistema, npr., malignitet B ćelija, koji se mogu lečiti genskim terapijskim vektorima, terapijskim sredstvima baziranim na ćelijama i metodima objavljenim na drugim mestima u ovom tekstu. Pogodni subjekti (npr., pacijenti) uključuju laboratorijske životinje (kao što su miš, pacov, zec ili zamorac), životinje na farmama i domaće životinje ili kućne ljubimce (kao što su mačka ili pas). Uključeni su nehumani primati i, poželjno, humani pacijentic. Tipični subjekti uključuju humane pacijente koji imaju malignitet B ćelija, kojima je dijagnostikovan malignitet B ćelija ili imaju rizik da dobiju malignitet B ćelija. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "pacijent" odnosi se na subjekta kojem je dijagnostikovana određena bolest, poremećaj ili stanje, koji se mogu lečiti genskim terapijskim vektorima, terapijskim sredstvima baziranim na ćelijama i metodima objavljenim na drugim mestima u ovom tekstu.
[0343] Kako se koristi u ovom tekstu,"lečenje" ili "lečiti" uključuju svaki koristan ili željeni efekat na simptome ili patologiju bolesti ili patološkog stanja i mogucb uključivati makar i minimalno smanjenje jednog ili više merljivih markera bolesti ili stanja koje se leči. Lečenje može uključivati opciono smanjenje ili ublažavanje bolesti ili stanja, ili odlaganje napredovanja bolesti ili stanja. "Lečenje" ne mora obavezno označavati kompletno iskorenjivanje ili izlečenje bolesti ili stanja, ili sa njima udruženih simptoma.
[0344] Kako se koristi u ovom tekstu, "prevenirati" i slične reči kao što su "preveniran", "preveniranje" itd., ukazuju na pristup prevencije, inhibiranja ili smanjenja verovatnoće pojave ili povratka bolesti ili stanja. Isto tako, označavaju odlaganje pojave ili povratka bolesti ili stanja ili odlaganje pojave ili povratka simptoma bolesti ili stanja. Kako se koristi u ovom tekstu, "prevencija" i slične reči uključuju i smanjenje intenziteta, efekta, simptoma i/ili tereta bolesti ili stanja pre pojave ili povratka bolesti ili stanja.
[0345] Pod "pojačati" ili "promovisati" ili "povećati" ili "ekspandirati" označava se uopšteno sposobnost kompozicije razmatrane u ovom tekstu, npr., genetički modifikovanih T ćelija ili vektora koji kodira CAR, da proizvedu, pobude ili izazovu veći fiziološki odgovor (tj., nishodne efekte) u poređenju sa odgovorom koji je izazvan prenosnikom ili kontrolnim molekulom/kompozicijom. Merljivi fiziološki odgovor može uključivati porast T ćelijske ekspanzije, aktivacije, perzistencije i/ili porast sposobnosti ubijanja kancerskih ćelija, pored ostalog što je očigledno na osnovu razumevanja u struci i opisa datih u ovom tekstu. "Povećana" ili "pojačana" količina je tipično "statistički značajna" količina i može uključivati porast koji iznosi 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ili više (npr., 500, 1000 puta) (uključujući sve cele brojeve i decimalne tačke između i iznad 1, npr., , 1.5, 1.6, 1.7.
1.8, itd.), proizveden prenosnikom ili kontrolnom kompozicijom.
[0346] Pod "smanjiti" ili "niže" ili "smanjen" ili "redukovan" ili "sniziti" označava se uopšteno sposobnost kompozicije razmatrane u ovom tekstu da proizvede, pobudi ili izazove manji fiziološki odgovor (tj., nishodne efekte) u poređenju sa odgovorom koji je izazvan prenosnikom ili kontrolnim molekulom/kompozicijom. "Smanjena" ili "redukovana" količina je tipično "statistički značajna" količina i može uključivati smanjenje koje iznosi 1.1, 1.2, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 ili više puta (npr., 500, 1000 puta) (uključujući sve cele brojeve i decimalne tačke između i iznad 1, npr., , 1.5, 1.6, 1.7.1.8, itd.) u odnosu na odgovor (referentni odgovor) proizveden prenosnikom, kontrolnom kompozicijom ili odgovorom u određenoj ćelijskoj liniji.
[0347] Izrazi "održava" ili "čuva" ili "održavanje" ili "bez promene" ili "bez bitne promene" ili "bez bitnog smanjenja" označavaju uopšteno sposobnost kompozicije razmatrane u ovom tekstu da proizvede, pobudi ili izazove manji fiziološki odgovor (tj., nishodne efekte) u ćeliji, u poređenju sa odgovorom koji je izazvan prenosnikom, kontrolnom kompozicijom, ili odgovorom u određenoj ćelijskoj liniji. Komparabilni odgovor je onaj koji nije značajno različit ili merljivo različit od referentnog odgovora.
[0348] Metod lečenja stanja u vezi sa B ćelijama kod subjekta kojem je to potrebno, uključuje primenu efikasne količine, npr., terapijski efikasne količine kompozicije koja uključuje genetički modifikovane imunske efektorske ćelije razmatrane u ovom tekstu. Količina i učestalost primene biće određene faktorima kao što su stanje pacijenta i tip i jačina pacijentovog oboljenja, mada se pogodne doze mogu odrediti kliničkim ispitivanjima.
[0349] Količina T ćelija u kompoziciji koja se primenjuje kod subjekta može iznositi najmanje 0.1 x 105 ćelija, najmanje 0.5 x 10<5>ćelija, najmanje 1 x 10<5>ćelija, najmanje 5 x 10<5>ćelija, najmanje 1 x 10<6>ćelija, najmanje 0.5 x 10<7>ćelija, najmanje 1 x 10<7>ćelija, najmanje 0.5 x 108 ćelija, najmanje 1 x 10<8>ćelija, najmanje 0.5 x 10<9>ćelija, najmanje 1 x 10<9>ćelija, najmanje 2 x 109 ćelija, najmanje 3 x 10<9>ćelija, najmanje 4 x 10<9>ćelija, najmanje 5 x 10<9>ćelija, ili najmanje 1 x 10<10>ćelija. U posebnim primerima izvođenja, kod subjekta se primenjuje oko 1 x 107 CAR T ćelija do oko 1 x 10<9>CAR T ćelija, oko 2 x 10<7>CAR T ćelija do oko 0.9 x 109 CAR T ćelija, oko 3 x 10<7>CAR T ćelija do oko 0.8 x 10<9>CAR T ćelija, oko 4 x 107 CAR T ćelija do oko 0.7 x 10<9>CAR T ćelija, oko 5 x 10<7>CAR T ćelija do oko 0.6 x 109 CAR T ćelija, ili oko 5 x 10<7>CAR T ćelija do oko 0.5 x 10<9>CAR T ćelija.
[0350] Količina T ćelija u kompoziciji koja se primenjuje kod subjekta može iznositi najmanje 0.1 x 104 ćelija/kg telesne težine, najmanje 0.5 x 10<4>ćelija/kg telesne težine, najmanje 1 x 104 ćelija/kg telesne težine, najmanje 5 x 10<4>ćelija/kg telesne težine, najmanje 1 x 105 ćelija/kg telesne težine, najmanje 0.5 x 10<6>ćelija/kg telesne težine, najmanje 1 x 10<6>ćelija/kg telesne težine, najmanje 0.5 x 10<7>ćelija/kg telesne težine, najmanje 1 x 10<7>ćelija/kg telesne težine, najmanje 0.5 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, najmanje 1 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, najmanje 2 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, najmanje 3 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, najmanje 4 x 108 ćelija/kg telesne težine, najmanje 5 x 10<8>ćelija/kg telesne težine, ili najmanje 1 x 109 ćelija/kg telesne težine.Kod subjekta se može primeniti oko 1 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 1 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine, oko 2 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 0.9 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine, oko 3 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 0.8 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine, oko 4 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 0.7 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine, oko 5 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 0.6 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine, ili oko 5 x 10<6>CAR T ćelija/kg telesne težine do oko 0.5 x 10<8>CAR T ćelija/kg telesne težine.
[0351] Prosečno obučeni stručnjak u oblasti prepoznaće da za ostvarivanje željenog lečenja može biti potrebno primeniti kompozicije veći broj puta. Na primer kompozicija se može primeniti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 ili više puta u rasponu od 1 nedelje, 2 nedelje, 3 nedelje, 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseca, 5 meseci, 6 meseci, 1 godine, 2 godine, 5 godina, 10 godina ili više.
[0352] Može biti poželjno dati subjektu aktivirane imunske efektorske ćelije i zatim uzeti krv (ili izvesti aferezu), aktivirati imunske efektorske ćelije iz nje, i infuzijom ponovo u pacijenta uneti ove aktivirane i ekspandirane imunske efektorske ćelije. Ovaj proces može da se vrši više puta svakih nekoliko nedelja. U određenim primerima izvođenja, imunske efektorske ćelije mogu da se aktiviraju iz uzoraka krvi uzetih u količini od 10 cc do 400 cc. Imunske efektorske ćelije mogu da se aktiviraju iz uzoraka krvi uzetih bu količini od 20 cc, 30 cc, 40 cc, 50 cc, 60 cc, 70 cc, 80 cc, 90 cc, 100 cc, 150 cc, 200 cc, 250 cc, 300 cc, 350 cc, ili 400 cc ili više. Bez teorijskog ograničavanja, korišćenje protokola višestrukog uzimanja krvi/višestrukih ponovnih infuzija može služiti za selektovanje određenih populacija imunskih efektorskih ćelija.
[0353] Primena kompozicija razmatranih u ovom tekstu može se vršiti bilo kojim pogodnim načinom, uključujući aerosolnu inhalaciju, injekciju, ingestiju, transfuziju, implantaciju ili transplantaciju. Poželjno, kompozicije se primenjuju parenteralno. Izrazi "parenteralna primena" i "primenjen parenteralno", kako se ovde koristi, označava načine primene različite od enteralne i površinske primene, obično injekcijom, i uključuje, bez ograničavanja, intravaskularnu, intravensku, intramuskularnu, intraarterijsku, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intratumorsku, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu i intrasternalnu injekciju i infuziju. U jednom primeru izvođenja, kompozicije razmatrane u ovom tekstu primenjuju se kod subjekta direktnim injektiranjem u tumor, limfni čvor ili na mesto infekcije.
[0354] Subjekt kojem je to potrebno može primiti efikasnu količinu kompozicije za povećanje ćelijskog imunskog odgovora prema stanju u vezi sa B ćelijama, kod subjekta. Imunski odgovor može uključivati ćelijske imunske odgovore posredovane citotoksičnim T ćelijama sposobnim da ubiju inficirane ćelije, odgovore regulatornih T ćelija i pomažućih T ćelija. Humoralni imunski odgovori, posredovani prvenstveno pomažućim T ćelijama sposobnim da aktiviraju B ćelije dovodeći time do proizvodnje antitela, takođe mogu biti indukovani.
Različite tehnike mogu se koristiti za analiziranje tipa imunskih odgovora indukovanih kompozicijama, koje su dobro opisane u struci; npr., Current Protocols in Immunology, Edited by: John E. Coligan, Ada M. Kruisbeek, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (2001) John Wiley & Sons, NY, N.Y.
[0355] U slučaju ubijanja posredovanog T ćelijama, CAR-ligand vezivanje inicira CAR signalizaciju T ćelicjama, što rezultuje aktivacijom različitih T ćelijskih signalnih puteva koji indukuju T ćelije da proizvedu ili oslobađaju proteine sposobne da indukuju apoptozu ciljnih ćelija različitim mehanizmima. Ovi mehanizmi posredovani T ćelijama uključuju (ali se ne ograničavaju na) transfer unutarćelijskih citotoksičnih granula iz T ćelije u ciljnu ćeliju, T ćelijsku sekreciju proinflamatornih citokina koji mogu indukovati ubijanje ciljne ćelije direktno (ili indirektno regrutovanjem drugih ubilačkih efektorskih ćelija), i pozitivnom regulacijom liganda receptora ćelijske smrti (npr., FasL) na površini T ćelije, što indukuje apoptozu ciljne ćelije posle vezivanja za odgovarajuće receptore ćelijske smrti (npr., Fas) na ciljnoj ćeliji.
[0356] Isto tako, obezbeđen je i metod lečenja subjekta kojem je dijagnostikovano stanje povezano sa B ćelijama, koji uključuje uklanjanje imunskih efektorskih ćelija iz subjekta kojem je dijagnostikovano stanje povezano sa BCMA-eksprimirajućim B ćelijama, genetičko modifikovanje pomenutih imunskih efektorskih ćelija vektorom koji uključuje nukleinsku kiselinu koja kodira CAR kako se razmatra u ovom tekstu, čime se proizvodi populacija modifikovanih imunskih efektorskih ćelija, i davanje populacije modifikovanih imunskih efektorskih ćelija istom subjektu. Poželjno, imunske efektorske ćelije uključuju T ćelije.
[0357] Isto tako, obezbeđeni su i metodi stimulisanja imunskim efektorskim ćelijama posredovanog imunskog modulatornog odgovora na ciljnoj ćelijskoj populaciji kod subjekta, koji uključuje korake primene kod subjekta populacije imunskih efektorskih ćelija koje eksprimiraju konstrukt nukleinske kiseline koji kodira CAR molekul.
[0358] Metodi primene ćelijskih kompozicija opisani u ovom tekstu uključuju svaki metod koji je efikasan u ponovnom uvođenju ex vivo genetički modifikovanih imunskih efektorskih ćelija koje direktno eksprimiraju CAR, kod subjekta ili posle ponovnog uvođenja genetički modifikovanih progenitora imunskih efektorskih ćelija koje se posle uvođenja u subjekta diferenciraju u zrele imunske efektorske ćelije koje eksprimiraju CAR. Jedan metod uključuje transdukovanje T ćelija periferne krvi ex vivo konstruktom nukleinske kiseline i vraćanje transdukovanih ćelija u subjekta.
PRIMERI
PRIMER 1
KONSTRUKCIJA BCMA CAR
[0359] CAR koji sadrže mišja anti-BCMA scFv antitela dizajnirani su da sadrže MND promotor operabilno povezan sa anti-BMCA scFv, zglob i transmembranski domen iz CD8α i CD137 kostimulatorne domene praćene unutarćelijskim signalnim domenom CD3ζ lanca. Vidi, npr., Sliku 1. BCMA CAR prikazan na Slici 1 uključuje CD8α signalnu peptidnu (SP) sekvencu za površinsku ekspresiju na imunskim efektorskim ćelijama. Polinukleotidna sekvenca primera BCMA CAR data je u SEQ ID NO: 10; primer polipeptidne sekvence BCMA CAR dat je u SEQ ID NO: 9; i vektorska mapa primera CAR konstrukta prikazana je na Slici 1. Tabela 3 prikazuje identitet, Genbank-referencu, naziv izvora i citat za različite nukleotidne segmente BCMA CAR lentivirusnog vektora.
Tabela 3.
PRIMER 2
EVALUACIJA MIŠJEG BCMA CAR
Uvod
[0360] Adoptivni transfer T ćelija genetički inženjerisanih himernim antigenskim receptorima (CAR) otvorila je obećavajući pristup lečenju kancera. CAR je arteficijalni molekul sačinjen od antigen-reaktivnog jednolančanog varijabilnog fragmenta (single chain variable fragment, scFv) fuzionisanog sa T ćelijskim signalnim domenima preko transmembranskog regiona. U ovom primeru, ispitivan je CAR molekul specifičan za B ćelijski maturacioni antigen (BCMA). BCMA se eksprimira na ćelijama multiplog mijeloma, plazmacitoma i nekih limfoma, ali je normalna ekspresija ograničen na plazma-ćelije (Avery et al., 2003; Carpenito et al., 2009; Chiu et al., 2007).
[0361] Anti-BCMA02 CAR konstruisan je korišćenjem sekvenci iz mišjeg anti-BCMA antitela (C11D5.3). Anti-BCMAIO CAR konstruisan je korišćenjem modifikovanih sekvenci i predstavlja "humanizovanu" verziju anti-BCMA02 CAR. U nizu in vitro testova, anti-BCMA02 CAR T ćelije i anti-BCMA10 CAR T ćelije ispoljavaju tumorsku specifičnost, visoku ekspresiju CAR, i uzrokuju potentnu reaktivnost na ciljeve koji eksprimiraju antigen. Pokazano je da anti-BCMA02 CAR T ćelije i anti-BCMA10 CAR T ćelije imaju komparabilnu reaktivnost na BCMA-eksprimirajuće tumorske ćelijske linije. Iako su i anti-BCMA02 CAR T ćelije i anti-BCMA10 CAR T ćelije sposobne da izazovu regresiju u mišjem modelu tumora, anti-BCMA10 CAR T ćelije pokazuju antigen-nezavisnu sekreciju citokina, i tako imaju potencijal da dovedu do visokih nivoa citokina udruženih sa kliničkom citotoksičnošću.
Rezultati
Tonično oslobađanje inflamatornih citokina iz anti-BCMA10 T ćelija udruženo sa apoptozom
[0362] BCMA protein je detektabilan u serumu pacijenata sa multiplim mijelomom (Sanchez et a/., 2012). Prosečan nivo serumskog BCMA kod pacijenata sa multiplim mijelomom je 10 ng/mL ali može dostići pikove i do 100 ng/mL. Ispitivan je uticaj fizioloških nivoa solubilnog BCMA na kandidatske anti-BCMA CAR T ćelije.
[0363] Oslobađanje IFNγ iz anti-BCMA02 CAR T ćelija, anti-BCMA10 CART ćelija i CAR19Δ T ćelija ispitivano je posle 24 sata kultivisanja sa solubilnim BCMA (Slika 2a). Anti-BCMA02 CAR T ćelije odgovorile su minimalnim oslobađanjem citokina posle 24 sata kultivisanja uz najviše 1 ug/mL BCMA. Nasuprot tome, anti-BCMA10 CAR T ćelije odgovorile su rastućim nivoima IFNγ, koji su bili srazmerni koncentraciji solubilnog BCMA dodatog kulturi. Pri 100 ng/mL BCMA, što je maksimalni nivo saopšten kod pacijenata sa multiplim mijelomom, anti-BCMA10 CAR T ćelije sekretovale su 82.1 ng/ml IFNγ u poređenju sa 28.8 ng/ml IFNγ sekretovanog iz anti-BCMA02 CAR T ćelija. IFNγ je čak detektovan u nekoliko eksperimenata kokultivacije sa anti-BCMA10 CAR T ćelijama plus kontrolne ćelijske linije koje nemaju BCMA antigen (Slika 2b, K562 kokultura). Ovi podaci sugerišu da anti-BCMA10 CAR T ćelije imaju povišenu osetljivost na stimulaciju solubilnim BCMA i potencijal za antigen-nezavisne citokinske odgovore kod T ćelija.
[0364] Ispitivan je potencijal za toničnu sekreciju citokina iz anti-BCMA02 CAR T ćelija, anti-BCMA10 CART ćelija (10 dana od inicijacije kulture) i CAR19Δ T ćelija. Posle proizvodnje CAR T ćelija, medijumi za rast kultura anti-BCMA02 CAR T ćelija, anti-BCMA10 CART ćelija i CAR19Δ T ćelija analizirani su na prisustvo inflamatornih citokina. Uprkos odsustvu stimulacije antigenom, anti-BCMA10 CAR T ćelijske kulture sadržale su više od 10 ng/mL IFNγ u poređenju sa manje od 1 ng/mL of IFNγ u anti-BCMA02 CAR T ćelijskim kulturama (Slika 3). Anti-BCMA10 CAR T ćelijske kulture sadržale su i značajno (p<0.001) više TNFα. Da bi se dodatno kvantifikovala količina citokina proizvedenog anti-BCMA10 CAR T ćelijama bez stimulacije antigenom, mereno je oslobađanje citokina iz 5 x 104 CAR T ćelija tokom 24 sata kultivacije. Anti-BCMA10 CAR T ćelije proizvele su značajno veće količine inflamatornih citokina MIP1α, IFNγ, GMCSF, MIP1β, IL-8 i TNFα u poređenju sa anti-BCMA02 CAR T ćelijama (Slika 4, p<0.0001). Koncentracije MIP1α i IFNγ bile su najviše među svim ispitivanim citokinima. Anti-BCMA10 CAR T ćelije proizvodile su 4.7 ng MIP1α/5 x 10<4>ćelija/24 sata, 3.0 ng IFNγ/5 x 10<4>ćelija/24 sata i ∼1ng/5 x 104 ćelija/24 sata ili manje, drugih citokina. Nije detektovana značajna razlika za antiinflamatorne citokine IL-10, IL-2 i IL-4.
[0365] Ekspresija fenotipskih markera T ćelijske aktivacije na kraju proizvodnje anti-BCMA10 CAR T ćelija merena je da bi se ispitalo da li tonična sekrecija inflamatornih citokina ukazuje na hiperaktivno stanje anti-BCMA10 CAR T ćelija. HLA-DR i CD25 su površinski markeri koji normalno ispoljavaju pik ekspresije 12-24 sata posle aktivacije T ćelija i zatim je vremenom smanjuju. CAR T ćelije pripremljene iz tri normalna donora pokazale su da prosečno 40±2% anti-BCMA02 CAR T ćelija eksprimira HLA-DR. Ekspresija HLA-DR u ovim bćelijama bila je uporediva sa netransdukovanim (43±2.3%) T ćelijama i CAR19Δ (32±2.2%) kontrolnim T ćelijama. Nasuprot tome, 88±1.2% anti-BCMA10 CAR T ćelija eksprimiralo je HLA-DR (Slika 5). Ekspresija drugog aktivacionog markera CD25 takođe je bila viša na anti-BCMA10 CAR T ćelijama u poređenju sa anti-BCMA02 CAR T ćelijama (53±0.9% vs 35±2.4%). Prema tome, anti-BCMA10 CAR T ćelije pokazale su fenotipske karakteristike aktiviranih T ćelija u odsustvu dodatih antigena.
[0366] Hiperaktivnost T ćelija obično je udružena sa aktivacijom indukovanom ćelijskom smrću (activation-induced cell death, AICD) apoptozom. Nivoi aktivirane kaspaze-3 mereni su da bi se ispitalo da li hiperaktivnost anti-BCMA10 CAR T ćelija može za rezultat imati više nivoe apoptoze u poređenju sa anti-BCMA02 CAR T ćelijama.48% anti-BCMA10 CAR T ćelija iz dva donora imalo je aktivnu kaspazu-3 u poređenju sa 16% anti-BCMA02 CAR T ćelija (Slika 6). Prema tome, u odsustvu dodatog BCMA antigena, anti-BCMA10 CAR T ćelije imaju veću učestalost apoptotskih ćelija udruženih sa povećanom aktivacijom i sekrecijom inflamatornih citokina u poređenju sa anti-BCMA02 CAR T ćelijama.
[0367] Anti-BCMA02 CAR T ćelije i anti-BCMA10 CAR T ćelije ispitivane su u pogledu toga da li CAR T ćelije mogu selektivno da odgovore na niske nivoe BCMA ili da budu unakrsno reaktivne sa nesrodnim antigenom u humanom serumu upotrebljenom za rast T ćelija. T anti-BCMA02 CAR T ćelije i anti-BCMA10 CAR T ćelije održavane su dva dana u medijumu koji nije sadržao humani serum i zatim je medijum zamenjen onim koji sadrži fetalni goveđi serum (FBS), humani serum (HABS), ili HABS u prisustvu ili odsustvu 100 ng/mL solubilnog BCMA (Slika 7). Oslobađanje IFNγ ispitivano je 24 sata kasnije korišćenjem ELISA. I anti-BCMA02 CAR T ćelije i anti-BCMA10 CAR T ćelije odgovorile su na solubilni BCMA. Međutim, anti-BCMA10 CAR T ćelije sekretovale su 10 puta više IFNγ nego anti-BCMA02 CAR T ćelije. U odsustvu BCMA, samo anti-BCMA10 CAR T ćelije oslobodile su IFNγ bez obzira na kultivisanje u fetalnom goveđem seruu (FBS) (p=0.0002) ili humanom AB serumu (HABS) (p=0.0007). Ovi podaci sugerisali su da je sekrecija inflamatornih citokina prirođena anti-BCMA10 CAR T ćelijama.
Inferiorna antitumorska funkcija anti-BCMA10 CAR T ćelija u mišjem modelu multiplog mijeloma
[0368] Hiperaktivacija i porast apoptoze mogu negativno uticati na perzistenciju CAR T ćelija kod pacijenata i konačnu kliničku efikasnost. Antitumorska funkcija anti-BCMA02 CAR T ćelija i anti-BCMA10 CAR T ćelija ispitivana je u mišjem tumorskom modelu. NOD scid gama (NSG) miševi sa eksperimentalnim tumorom - subkutanim humanim multiplim mijelomom veličine ∼100 mm<3>(RPMI-8226) tretirani su korišćenjem 10<7>anti-BCMA02 CAR T ćelija, 10<7>anti-BCMA10 CAR T ćelija ili bortezomiba (Velcade). Rast RPMI-8226 praćen je merenjem pomoću nonijusa. U dva nezavisna eksperimenta (Slike 8a i 8b), bortezomib je kontrolisao rast tumora u poređenju sa kontrolnim životinjama tretiranim prenosnikom. Životinje kod kojih je izvršen adoptivni transfer anti-BCMA02 CAR T ćelija pokazale su brzo i trajno oslobađanje od tumora (insertovani grafikoni naglašavaju ranu regresiju tumora). Adoptivni transfer anti-BCMA10 CAR T ćelija takođe je doveo do regresije tumora ali koja je bila odložena u oba eksperimenta u poređenju sa anti-BCMA02 CAR T ćelijama.
Zaključci
[0369] Anti-BCMA02 CAR T ćelije i anti-BCMA10 CAR T ćelije ispoljile su uporedivu antitumorsku funkciju u testovima in vitro, ali anti-BCMA10 CAR T ćelije imale su karakteristike koje bi mogle negativno uticati na bezbednost i efikasnost u lečenju pacijenata. Anti-BCMA10 CAR T ćelije odgovorile su robusnom sekrecijom inflamatornih citokina posle izlaganja fiziološkim nivoima BCMA proteina. "Citokinska oluja" ili sindrom oslobađanja citokina poznata je klinička toksičnost udružena sa lečenjem CAR T ćelijama. Zabrinutost u vezi sa oslobađanjem citokina u odgovoru na BCMA povećana je posle zapažanja tonične aktivnosti anti-BCMA10 CAR T ćelija. Čak i u odsustvu stimulacije antigenom, anti-BCMA10 CAR T ćelije oslobađaju visoke nivoe inflamatornih citokina. Perzistentna sekrecija citokina ima potencijal da dovede do značajne kliničke toksičnosti, kao i da negativno utiče na antitumorsku funkciju. Zaista, našli smo kompoziciju sa više apoptotskih ćelija i uz inferiornu antitumorsku funkciju u slučaju anti-BCMA10 CAR T ćelija, u poređenju sa anti-BCMA02 CAR T ćelijskim kulturama, u mišjem modelu multiplog mijeloma.
Reference
[0370] Avery et al., (2003). BAFF selectively enhances the survival of plasmablasts generated from human memory B cells. J Clin Invest, 112(2), 286-297.
[0371] Carpenito et al., (2009). Control of large, established tumor xenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains. Proc Natl Acad Sci USA, 106(9), 3360-3365.
[0372] Chiu et al., (2007). Hodgkin lymphoma cells express TACI and BCMA receptors and generate survival and proliferation signals in response to BAFF and APRIL. Blood, 109(2), 729-739.
[0373] Sanchez et al. (2012). Serum B-cell maturation antigen is elevated in multiple myeloma and correlates with disease status and survival. Br J Haematol, 158(6), 727-738.
PRIMER 3
MINIMALNA BCMA EKSPRESIJA NA LIMFOMIMA AKTIVIRA ANTI-BCMA CAR T ĆELIJE
[0374] Nivo BCMA ekspresije na ćelijskim linijama limfoma i leukemije (Daudi i Raji) merena je sa ciljem određivanja da li je ekspresija dovoljna da aktivira anti-BCMA02 CAR T ćelije.
[0375] BCMA ekspresija na ćelijama limfoma, leukemije i multiplog mijeloma kvantifikovana je protočnom citometrijom. U ovom testu, relativna ekspresija BCMA na ćelijama procenjivana je korelisanjem intenziteta fluorescencije BCMA ekspresije sa poznatim brojem vezanih antitela (kapacitet vezivanja antitela, antibody binding capacity, ABC). Nivoi ekspresije BCMA u ćelijskim linijama limfoma upoređivani su sa nivoima ekspresije BCMA u ćelijskim linijama multiplog mijeloma (RPMI-8226) za koje se zna da aktiviraju anti-BCMA02 CAR T ćelije. 12590±1275 BCMA02 molekula bilo je eksprimirano na površini RPMI-8226 ćelija. Za razliku od toga, Daudi ćelije eksprimirale su 1173±234 BCMA02 molekula, a JeKo-1 ćelije (ćelijska linija limfoma plaštanih ćelija) eksprimirale su samo 222±138 BCMA02 molekula (Slika 9, krugovi).
[0376] U sledećem setu eksperimenata testirana je aktivnost anti-BCMA02 CAR T ćelija na male nivoe BCMA zapažene na ćelijskim linijama limfoma i leukemije (Slika 9, kvadrati). Anti-BCMA02 CAR T ćelije generisane su korišćenjem standardnih metoda i aktivnost je procenjivana korišćenjem IFNγ ELISA posle kokultivisanja sa BCMA-pozitivnim i BCMA-negativnim tumorskim ćelijskim linijama. Reaktivnost anti-BCMA02 CAR T ćelija korelisana je sa relativnom količinom BCMA mRNK ekspresije (iznad praga) i/ili gustinom BCMA receptora na površini različitih tumorskih ćelijskih linija posle kokultivisanja (Slika 9). Malo ili nimalo IFNγ oslobađa se posle kokultivisanja BCMA CAR T ćelija sa BCMA-negativnim (BCMA-) tumorskim ćelijskim linijama: mijelogena leukemija (K562), akutna limfoblastna leukemija (NALM-6 i NALM-16); limfom plaštanih ćelija (REC-1); ili Hodgkinov limfom (HDLM-2). Nasuprot tome, značajne količine IFNγ oslobađaju se posle kokultivisanja BCMA02 CAR T ćelija sa BCMA-pozitivnim (BCMA<+>) tumorskim ćelijskim linijama: hronična limfoblastn leukemija B ćelija (MEC-1), limfom plaštanih ćelija (JeKo-1), Hodgkinov limfom (RPMI-6666), Burkittov limfom (Daudi ćelije i Ramos ćelije) i multipli mijelom (RPMI-8226).
[0377] Reaktivnost anti-BCMA02 CAR T ćelija na BCMA-eksprimirajuće ćelije Burkittovog limfoma (Daudi ćelije) proširena je na in vivo studije na životinjama. Daudi ćelije eksprimiraju i CD19. In vivo aktivnost anti-BCMA02 CAR T ćelija upoređivana je sa in vivo aktivnošću anti-CD 19 CAR T ćelija. NOD scid gama (NSG) miševi injektirani su IV sa 2 x 106 Daudi ćelija i dopušteno je da se akumulira veliki sistemski tumor pre nego što se pritupilo tretmanu CAR T ćelijama. CAR T ćelije primenjene su 8 dana i 18 dana posle indukcije tumora (Slike 10A odnosno 10B). Prenosnik i negativna kontrola (anti-CD19Δ CAR T ćelije) nisu uspeli da preveniraju rast tumora, kako je pokazano log-faznim porastima bioluminiscencije, što je za rezultat imalo gubitak težine i smrt (Slika 10A, dva leva panela miševa). Anti-CD 19 i anti-BCMA02 CAR T ćelije prevenirale su rast tumora, što je za rezultat imalo održavanje telesne težine i preživljavanje. Anti-CD 19 i anti-BCMA02 CAR T ćelije bile su jednako efikasne kada su primenjene na dan 8 (Slika 10A, dva desna panela miševa). Anti-BCMA02 CAR T ćelije bile su efikasne u smanjenju opterećenja tumorom i kada su primenjene 18 dana posle indukovanja tumora. Slika 10B, desni panel.
PRIMER 4
SNAŽNA IN VITRO AKTIVNOST ANTI-BCMA CAR T ĆELIJA
[0378] Potentna in vitro aktivnost anti-BCMA02 CAR T ćelija postignuta je uz 50 procenata redukcije ekspresije anti-BCMA02 CAR. Populacije T ćelija bile su transdukovane sa od 4x108 do 5x107 transdukujućih jedinica lentivirusa koji kodira anti-BCM02A CAR molekul. Dobijene populacije T ćelija pokazale su smanjenu frekvenciju anti-BCMA02 CAR T ćelija (testirano kao procenat pozitivnih) i smanjenu ekspresiju anti-BCMA02 CAR molekula (testirano kao srednji intenzitet fluorescencije (mean florescence intensity): MFI).
[0379] Određivan je uticaj smanjene ekspresije CAR molekula na anti-BCMA02 aktivnost. Frekvencija anti-BCMA CAR-pozitivnih T ćelija normalizovana je netransdukovanim T ćelijama da sadrže 26 ± 4% BCMA-reaktivnih T ćelija (Slika 11A). MFI normalizovanih anti-BCMA02 CAR T ćelija u opsegu je od 885 do 1875 (Slika 11B). K562 je CML ćelijska linija koja ne eksprimira BCMA. K562 ćelije inženjerisane su da eksprimiraju BCMA i koriste se u citolitičkom testu in vitro za procenu aktivnosti anti-BCMA02 CAR T ćelija uz različitu ekspresiju BCMA CAR (Slika 11C). K562 ćelije obeležene su korišćenjem "cell trace violet" dok su K562 ćelije koje stabilno eksprimiraju BCMA (K562-BCMA) obeležene pomoću CFSE. T ćelije, K562 ćelije i K562-BCMA ćelije prikupe se, isperu i resuspenduju u medijumu bez egzogenih citokina. Ćelije se kultivišu u odnosu 20:1 ili 10:1 efektora (E; T ćelije) prema cilju (T; 1:1 mešavina K562 i K562 BCMA ćelija), 4 h u inkubatoru na 37 °C, 5% CO2. Ćelije se zatim boje pomoću Live/Dead i analiziraju korišćenjem FACS.
Citotoksičnost se određuje razlikom u odnosu K562:K562-BCMA ćelija, normalizovanom u odnosu na uslove bez T ćelija.
PRIMER 5
PROCES PROIZVODNJE ANTI-BCMA CAR T ĆELIJE
[0380] Jedinstveni anti-BCMA02 CAR T ćelijski produkti proizvode se za lečenje svakog pacijenta ponaosob. Pouzdanost procesa proizvodnje anti-BCMA02 CAR T ćelijskih proizvoda evaluira se stvaranjem anti-BCMA02 CAR T ćelija od PBMC 11 pojedinačnih normalnih donora. Ekspanzija anti-BCMA02 CAR T ćelija iz svakog donora bila je uporediva sa odgovarajućom paralelno netransdukovanom izvedenom kulturom (Slika 12A).
[0381] Na kraju perioda kultivacije (dan 10), efikasnost transdukcije T ćelija procenjivana je kvantifikovanjem broja integrisanih lentivirusa pomoću qPCR i lentivirusnih specifičnih prajmerskih setova (broj kopija vektora, vector copy number, VCN). Anti-BCMA02 CAR T ćelijske kulture iz 11 donora pokazale su uporedivu efikasnost transdukcije lentivirusa (Slika 12B). Frekvencija anti-BCMA02 CAR pozitivnih T ćelija merena je protočnom citometrijom i nađeno je da je ekspresija BCMA bila uporediva za sve donore (Slika 12C).
[0382] Aktivnost svakog anti-BCMA02 CAR T ćelijskog proizvoda procenjivana je oslobađanjem IFNγ posle kokultivisanja sa K562 ćelijama inženjerisanim da eksprimiraju BCMA. Svi anti-BCMA CAR02 T ćelijski proizvodi pokazali su terapijski relevantne nivoe oslobađanja IFNγ kada se izlože BCMA-eksprimirajućim K562 ćelijama (Slika 12D).
PRIMER 6
EKSPRESIJA CD62L, CD127, CD197 I CD38 NA CAR T ĆELIJAMA TRETIRANIM IL-2 ILI IL-2 I ZSTK474
[0383] CAR T ćelije kultivisane sa IL-2 i ZSTK474 pokazuju porast CD62L ekspresije u poređenju sa CAR T ćelijama kultivisanim samo sa IL-2. Analiza ekspresije 29 dodatnih površinskih markera na anti-BCMA02 CAR T ćelijama kultivisanim sa IL-2 i ZSTK474 izvedena je korišćenjem multiparametarske masene citometrije (CyTOF) i upoređivana sa CAR T ćelijama kultivisanim samo u IL-2. Tri dodatna markera (CD127, CD197 i CD38) pokazala su porast ekspresije IL-2 ZSTK474-tretiranih CAR T ćelija u poređenju sa CAR T ćelijama tretiranim samo sa IL-2. Prema tome, koekspresija CD62L, CD127, CD197 i CD38 vrši dodatnu stratifikaciju ZSTK474-kultivisanih CAR T ćelija. Posle kultivisanja u medijumu koji sadrži IL-2, 7.44% anti-BCMA02 CAR T koeksprimira CD127, CD197 i CD38 u poređenju sa 24.5% anti-BCMA02 CAR T ćelija kultivisanih sa IL-2 i ZSTK474. Vennov dijagram na Slici 13 ilustruje koekspresiju CD127, CD197 i CD38 u CD62L pozitivnim anti-BCMA02 T ćelijama.
PRIMER 7
ZSTK474 TRETMAN POVIŠAVA FREKVENCIJU CD8 T ĆELIJA
[0384] Ekspresija CD8 kvantifikovana je u anti-BCMA02 CAR T ćelijama tretiranim samo IL-2 ili IL-2 i ZSTK474. Ekspresija CD8 određena je korišćenjem fluorescentno obeleženog anti-CD8 antitela i protočne citometrije. Anti-BCMA02 CAR T ćelije iz sedam normalnih donora, kultivisane sa IL-2 i ZSTK474 imale su značajno višu ekspresiju CD8 u poređenju sa anti-BCMA02 CAR T ćelijama kultivisanim samo sa IL-2. Slika 14.
PRIMER 8
IZOSTANAK ANTIGEN-NEZAVISNE AKTIVNOSTI U ZSTK474-TRETIRANIM ANTI-BCMA CAR T ĆELIJAMA
[0385] Tonična aktivnost CAR T ćelija u odsustvu antigena bila je udružena sa smanjenom biološkom aktivnošću. Tonična aktivnost anti-BCMA02 CAR T ćelija procenjivana je kvantifikovanjem oslobađanja interferona-γ (IFN-γ) u odsustvu antigena, posle kultivisanja u prisustvu IL-2 i ZSTK474, u poređenju sa standardnim uslovima kultivisanja samo sa IL-2. Anti-BCMA CAR T ćelijske kulture pripremaju se korišćenjem sistema koji se direktno može prevesti u velike kliničke proizvodne procese. Ukratko, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) kultivišu se u statičkim flakonima u medijumu koji sadrži IL-2 (CellGenix) i antitela specifična za CD3 i CD28 (Miltenyi Biotec). 2x10<8>transdukujućih jedinica lentivirusa koji kodira anti-BCMA CAR doda se jedan dan posle inicijacije kulture.
[0386] Anti-BCMA02 CAR T ćelije se održavaju u log-fazi dodavanjem svežeg medijuma koji sadrži IL-2 i optimizovanu dozu ZSTK474 tokom ukupno deset dana kultivisanja. Na kraju proizvodnje, ekvivalentan broj anti-BCMA02 CAR T ćelija se rekultiviše 24 sata samo u medijumu. Količina IFN-γ oslobođenog za 24 sata kvantifikuje se korišćenjem ELISA. U ovom testu nivoi IFN-γ ispod 200 pg/mL predstavljaju toničnu aktivnost. Slika 15 prikazuje da je količina IFN-γ oslobođenog iz anti-BCMA02 CAR T ćelija iz 14 donora konzistentna sa izostankom tonične aktivnosti, bilo da su CAR T ćelije kultivisane sa ZSTK474 ili ne.
PRIMER 9
ZSTK474-TRETIRANE ANTI-BCMA02 CAR T ĆELIJE POKAZUJU TERAPIJSKU AKTIVNOST U TUMORSKOM MODELU LIMFOMA
[0387] Daudi tumori upotrebljeni su za ispitivanje antitumorske aktivnosti anti-BCMA02 CAR T ćelija kultivisanih sa IL-2 ili IL-2 i ZSTK474. Daudi ćelije eksprimiraju nizak nivo BCMA proteina i daju tumorski model limfoma koji je agresivan i težak za lečenje.
[0388] 2 x 106 Daudi tumorskih ćelija obeleženo je genom za luciferazu svica i injektirano u NOD scid IL-2 receptor gama lanac-nokaut miševe (NSG) intravenskom injekcijom. Pošto se sačeka da se tumori formiraju, 1x10<7>CAR T ćelija se injektira u miševe koji nose tumor. Miševi se injektiraju sa i) anti-BCMA02 CAR T ćelijama tretiranim deset dana IL-2 ili IL-2 i ZSTK474; ili ii) skraćenim signalno deficijentnim anti-BCMA02 (tBCMA02) CAR T ćelijama tretiranim deset dana IL-2 i ZSTK474. Rast tumora prati se bioluminiscencijom korišćenjem Xenogen-IVIS Imaging sistema.
[0389] Poptuna regresija tumora zapažena je kod 50% miševa koji su primili anti-BCMA02 CAR T ćelije tretirane IL-2 i ZSTK474. Slika 16.
PRIMER 10
ZSTK474-TRETIRANE T ĆELIJE POKAZUJU TERAPIJSKU AKTIVNOST U MIŠJEM MODELU HUMANOG MIJELOMA
[0390] Životinjama koje nose subkutane multiple mijelome zapremine 100 mm<3>(RPMI-8226) daje se infuzija ekvivalentnih doza CAR T ćelija (1x10<6>anti-BCMA02 CAR-pozitivne T ćelije) ili nemodifikovanih T ćelija iz odgovarajućih donora T ćelija (netransdukovane). Anti-BCMA CAR T ćelije bile su tretirane IL-2 ili IL-2 i ZSTK474 kako je opisano u Primeru 8.
[0391] Životinje tretirane IL-2- ili IL-2 i ZSTK474-kultivisanim anti-BCMA02 CAR T ćelijama potpuno preveniraju rast tumora. Slika 17. Nasuprot tome, životinje tretirane netransdukovanim ili prenosnikom nisu mogle da kontrolišu rast tumora. Slika 17.

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Polinukleotid koji kodira CAR, naznačen time, što je polinukeotidna sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 10.
2. Vektor, naznačen time, što uključuje polinukleotid iz patentnog zahteva 1.
3. Vektor iz patentnog zahteva 2, naznačen time, što je vektor ekspresioni vektor, epizomski vektor, virusni vektor, retrovirusni vektor, ili lentivirusni vektor.
4. Vektor iz patentnog zahteva 2, naznačen time, što se lentivirusni vektor bira iz grupe koja se sastoji suštinski od: virusa humane imunodeficijencije 1 (HIV-1); virusa humane imunodeficijencije 2 (HIV-2), visna-maedi virusa (VMV); virusa artritisaencefalitisa koze (CAEV); virusa infektivne anemije konja (EIAV); virusa mačje imunodeficijencije (FIV); virusa goveđe imunodeficijencije (BIV); i virusa imunodeficijencije kod simijan majmuna (SIV).
5. Vektor prema bilo kojem od patentnih zahteva 2 do 4, naznačen time, što uključuje levi (5’) retrovirusni LTR, psi (Ψ) pakujući signal, centralni polipurinski trakt/DNK prepust (cPPT/FLAP), retrovirusni eksportni element; promotor operabilno povezan sa polinukleotidom; i desni (3’) retrovirusni LTR.
6. Vektor iz patentnog zahteva 5, naznačen time, što uključuje još i heterolognu poliadenilacionu sekvencu.
7. Vektor iz patentnog zahteva 5 ili patentnog zahteva 6, naznačen time, što je promotor 5’ LTR zamenjen heterolognim promotorom.
8. Vektor iz patentnog zahteva 7, naznačen time, što je heterologni promotor citomegalovirusni (CMV) promotor, promotor Rous sarkoma virusa (RSV), ili promotor simijan virusa 40 (SV40).
9. Vektor iz bilo kojeg od patentnih zahteva 5 do 8, naznačen time, što je 5’ LTR ili 3’ LTR lentivirusni LTR.
10. Vektor iz bilo kojeg od patentnih zahteva 5 do 8, naznačen time, što je 3’ LTR samoinaktivirajući (SIN) LTR.
11. Vektor iz bilo kojeg od patentnih zahteva 5 do 10, naznačen time, što je poliadenilaciona sekvenca poliadenilaciona sekvenca goveđeg hormona rasta ili signalna poliadenilaciona sekvenca zečjeg β-g|obina.
12. Vektor iz bilo kojeg od patentnih zahteva 5 do 11, naznačen time, što je promotor operabilno povezan sa polinukleotidom iz patentnog zahteva 1 odabran iz grupe koja se sastoji od: citomegalovirusnog neposrednog ranog genskog promotora (CMV), promotora elongacionog faktora 1 alfa (EF1-α), promotora fosfoglicerat kinaze-1 promoter (PGK), promotora ubikvitina-C (UBQ-C), promotora citomegalovirusnog enhensera/pilećeg beta-aktina (CAG), promotora polioma enhensera/herpes simpleks timidin kinaze (MC1), promotora beta aktina (β-ACT), promotora simijan virusa 40 (SV40), i enhensera mijeloproliferativnog sarkoma virusa, negativni kontrolni region uklonjen, dl587rev prajmer-vezujuće mesto supstituisani (MND) promotor.
13. Ex vivo ili in vitro imunska efektorska ćelija, naznačena time, što uključuje vektor iz bilo kojeg od patentnih zahteva 2 do 12.
14. Ex vivo ili in vitro imunska efektorska ćelije iz patentnog zahteva 13, naznačena time, što se imunska efektorska ćelija bira iz grupe koja se sastoji od: T limfocita i urođenoubilačke (NK) ćelije.
15. Kompozicija, naznačena time, što uključuje ex vivo ili in vitro imunsku efektorsku ćeliju iz patentnog zahteva 13 ili patentnog zahteva 14 i fiziološki prihvatljivi ekscipijent.
RS20191327A 2014-12-12 2015-12-07 Bcma himerni antigenski receptori RS59537B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462091419P 2014-12-12 2014-12-12
US201562200505P 2015-08-03 2015-08-03
PCT/US2015/064269 WO2016094304A2 (en) 2014-12-12 2015-12-07 Bcma chimeric antigen receptors
EP15868392.0A EP3230321B1 (en) 2014-12-12 2015-12-07 Bcma chimeric antigen receptors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59537B1 true RS59537B1 (sr) 2019-12-31

Family

ID=56108356

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20191327A RS59537B1 (sr) 2014-12-12 2015-12-07 Bcma himerni antigenski receptori
RS20211267A RS62527B1 (sr) 2014-12-12 2015-12-07 Bcma receptori himernog antigena

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211267A RS62527B1 (sr) 2014-12-12 2015-12-07 Bcma receptori himernog antigena

Country Status (29)

Country Link
US (11) US10383929B2 (sr)
EP (4) EP3640262A1 (sr)
JP (4) JP6671370B2 (sr)
KR (3) KR102584938B1 (sr)
CN (2) CN112358551B (sr)
AU (2) AU2015360845B2 (sr)
BR (1) BR112017012502B1 (sr)
CL (2) CL2017001515A1 (sr)
CO (1) CO2017006808A2 (sr)
CY (2) CY1122528T1 (sr)
DK (2) DK3628687T3 (sr)
EA (1) EA036379B1 (sr)
EC (1) ECSP17044494A (sr)
ES (2) ES2895640T3 (sr)
HK (1) HK1245801B (sr)
HR (2) HRP20191873T1 (sr)
HU (2) HUE046815T2 (sr)
IL (2) IL252783B (sr)
LT (2) LT3230321T (sr)
MX (2) MX383542B (sr)
NZ (1) NZ733025A (sr)
PL (2) PL3230321T3 (sr)
PT (2) PT3230321T (sr)
RS (2) RS59537B1 (sr)
SG (2) SG11201704727WA (sr)
SI (2) SI3230321T1 (sr)
SM (2) SMT202100594T1 (sr)
WO (1) WO2016094304A2 (sr)
ZA (1) ZA201704059B (sr)

Families Citing this family (222)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102240555B1 (ko) 2012-11-27 2021-04-16 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 태아 헤모글로빈 재유도를 위한 bcl11a 원위 조절 요소의 표적화
KR101605421B1 (ko) 2014-03-05 2016-03-23 국립암센터 B 세포 림프종 세포를 특이적으로 인지하는 단일클론항체 및 이의 용도
MA39867A (fr) 2014-04-23 2017-03-01 Juno Therapeutics Inc Procédés d'isolement, de culture et de manipulation génétique de populations de cellules immunitaires pour une thérapie adoptive
LT3689899T (lt) * 2014-04-25 2021-12-10 2Seventy Bio, Inc. Mnd promotorių chimerinių antigenų receptoriai
BR112016024565A2 (pt) 2014-04-25 2018-01-23 Children's Medical Center Corporation composições e métodos de tratar hemoglobinopatias
RS60544B1 (sr) 2014-04-25 2020-08-31 Bluebird Bio Inc Poboljšani metodi za proizvodnju adoptivnih ćelijskih terapija
MX380612B (es) 2014-06-06 2025-03-12 2Seventy Bio Inc Composiciones de celulas t mejoradas.
JP7054622B2 (ja) 2014-07-21 2022-04-14 ノバルティス アーゲー ヒト化抗ｂｃｍａキメラ抗原受容体を使用した癌の処置
RU2747457C2 (ru) 2014-07-24 2021-05-05 Блубёрд Био, Инк. Химерные антигенные рецепторы к bcma
MY191537A (en) 2014-12-05 2022-06-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen and uses thereof
SMT202100221T1 (it) 2014-12-05 2021-07-12 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anticorpi bersaglianti l'antigene di maturazione delle cellule e metodi d'uso
PL3230321T3 (pl) 2014-12-12 2020-03-31 Bluebird Bio, Inc. Chimeryczne receptory antygenowe bcma
FI3240805T3 (fi) 2014-12-15 2025-02-17 Univ California Cd19- ja cd20-vasteellinen bispesifinen tai-veräjän kimeerinen antigeenireseptori
US11384350B2 (en) 2014-12-15 2022-07-12 The Regents Of The University Of California Cytotoxic molecules responsive to intracellular ligands for selective T cell mediated killing
KR102208443B1 (ko) 2015-04-13 2021-01-27 화이자 인코포레이티드 B-세포 성숙 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체
WO2016182917A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Children's Medical Center Corporation Targeting bcl11a enhancer functional regions for fetal hemoglobin reinduction
EP3331910B1 (en) 2015-08-03 2019-12-11 EngMab Sàrl Monoclonal antibodies against human b cell maturation antigen (bcma)
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
WO2017099712A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Bluebird Bio, Inc. Improved t cell compositions
JP2019513347A (ja) 2016-03-04 2019-05-30 ノバルティス アーゲー 複数のキメラ抗原受容体（ｃａｒ）分子を発現する細胞およびその使用
TWI691596B (zh) 2016-04-01 2020-04-21 美商凱特製藥公司 嵌合抗原和ｔ細胞受體及使用方法
EP3436036A4 (en) 2016-04-01 2020-03-18 Kite Pharma, Inc. BCMA BINDING MOLECULES AND METHODS OF USE THEREOF
SI3436030T1 (sl) 2016-04-01 2023-01-31 Kite Pharma, Inc. Himerni receptorji in načini njihove uporabe
EP3440191A4 (en) * 2016-04-07 2019-12-11 Bluebird Bio, Inc. CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T-CELL COMPOSITIONS
BR112018076767A2 (pt) 2016-06-21 2019-04-02 Teneobio, Inc. anticorpos de ligação a cd3
WO2018002181A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Umc Utrecht Holding B.V. TREATMENT OF IgE-MEDIATED DISEASES WITH ANTIBODIES THAT SPECIFICALLY BIND CD38
RS64925B1 (sr) 2016-08-10 2023-12-29 Legend Biotech Ireland Ltd Himerni antigenski receptori koji ciljaju bcma i postupci njihove upotrebe
US11701384B2 (en) 2016-09-02 2023-07-18 The Regents Of The University Of California Methods and compositions involving interleukin-6 receptor alpha-binding single chain variable fragments
MX2019002967A (es) 2016-09-14 2019-07-04 Teneobio Inc Anticuerpos de union a cd3.
US12109234B2 (en) * 2016-11-04 2024-10-08 2Seventy Bio, Inc. Anti-BCMA CAR T cell compositions
EP3548005A4 (en) 2016-11-29 2020-06-17 Puretech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
KR20250072712A (ko) 2016-12-02 2025-05-26 앤젤레스 테라퓨틱스, 인코포레이티드 합성 면역 수용체 및 이의 사용 방법
KR20250016462A (ko) * 2016-12-21 2025-02-03 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
CN108276493B (zh) * 2016-12-30 2023-11-14 南京传奇生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
EP3572427B1 (en) * 2017-01-23 2025-06-25 CRAGE medical Co., Limited Bcma-targeting antibody and use thereof
EP3577134A1 (en) 2017-01-31 2019-12-11 Novartis AG Treatment of cancer using chimeric t cell receptor proteins having multiple specificities
IL268349B2 (en) 2017-02-17 2024-08-01 Hutchinson Fred Cancer Res Combination therapies for treatment of bcma-related cancers and autoimmune disorders
SG11201908844YA (en) * 2017-03-29 2019-10-30 Bluebird Bio Inc Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies
US11261441B2 (en) 2017-03-29 2022-03-01 Bluebird Bio, Inc. Vectors and compositions for treating hemoglobinopathies
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
EP3615055A1 (en) 2017-04-28 2020-03-04 Novartis AG Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200078404A1 (en) 2017-05-01 2020-03-12 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a cell therapy and an immunomodulatory compound
EP3622092A4 (en) 2017-05-11 2021-06-23 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS OF USE OF CD8 + TUMOR-INFILTRATING LYMPHOCYTE SUBTYPES AND GENE SIGNATURES THEREOF
US11166985B2 (en) 2017-05-12 2021-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
CA3062506A1 (en) 2017-05-12 2019-05-23 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for engineering cells and uses thereof in immuno-oncology
US11788087B2 (en) 2017-05-25 2023-10-17 The Children's Medical Center Corporation BCL11A guide delivery
US11897953B2 (en) 2017-06-14 2024-02-13 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
US11970540B2 (en) 2017-06-20 2024-04-30 Teneobio, Inc. Anti-BCMA heavy chain-only antibodies
CN118146370A (zh) 2017-06-20 2024-06-07 特纳奥尼股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
WO2019014581A1 (en) 2017-07-14 2019-01-17 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING THE ACTIVITY OF A CYTOTOXIC LYMPHOCYTE
US12043870B2 (en) 2017-10-02 2024-07-23 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for detecting and modulating an immunotherapy resistance gene signature in cancer
CN107475194B (zh) * 2017-10-09 2018-07-24 天津长和生物技术有限公司 Nkt细胞培养基、培养方法及二者的应用
AU2018351050B2 (en) 2017-10-18 2025-09-18 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
SG11202003501XA (en) * 2017-11-01 2020-05-28 Juno Therapeutics Inc Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
MX2020004572A (es) 2017-11-01 2020-10-07 Juno Therapeutics Inc Receptores de antigenos quimericos especificos para el antigeno de maduracion de celulas b y polinucleotidos que codifican los mismos.
KR20200099137A (ko) 2017-11-06 2020-08-21 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 세포 요법 및 감마 세크레타제 억제제의 조합
WO2019094955A1 (en) 2017-11-13 2019-05-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for targeting developmental and oncogenic programs in h3k27m gliomas
EP3710039A4 (en) 2017-11-13 2021-08-04 The Broad Institute, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF CANCER BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH
RU2020119365A (ru) 2017-11-15 2021-12-13 Новартис Аг Химерный антигенный рецептор, нацеливающийся на всма, химерный антигенный рецептор, нацеливающийся на cd19, и средства комбинированной терапии
JP7517983B2 (ja) * 2017-11-20 2024-07-17 ユリウス－マクシミリアン－ウニヴェルシテート・ヴュルツブルク 非常に低レベルのｃｄ１９を発現する骨髄腫細胞を除去するｃｄ１９ｃａｒｔ細胞
CA3083949A1 (en) 2017-11-30 2020-06-06 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
CN119193493A (zh) 2017-12-08 2024-12-27 朱诺治疗学股份有限公司 生产工程化t细胞组合物的过程
CN109971715A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 深圳华大生命科学研究院 一种扩增特异性car-t细胞的培养方法
EP3737408A1 (en) 2018-01-08 2020-11-18 Novartis AG Immune-enhancing rnas for combination with chimeric antigen receptor therapy
EP3746116A1 (en) 2018-01-31 2020-12-09 Novartis AG Combination therapy using a chimeric antigen receptor
PL3674328T3 (pl) 2018-02-01 2024-09-16 Nanjing IASO Biotechnology Co., Ltd. Chimeryczny receptor antygenu (car) wiążący się z bcma i jego zastosowania
TWI728309B (zh) * 2018-02-01 2021-05-21 大陸商南京馴鹿醫療技術有限公司 一種結合ｂｃｍａ的嵌合抗原受體（ｃａｒ）及其應用
CN110157675B (zh) * 2018-02-12 2022-05-27 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向性t淋巴细胞及其制备方法和应用
EP3752203A1 (en) 2018-02-13 2020-12-23 Novartis AG Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
EP3755718A1 (en) 2018-02-21 2020-12-30 Celgene Corporation Bcma-binding antibodies and uses thereof
CN112119099A (zh) 2018-03-02 2020-12-22 Cdr-生物科技股份有限公司 三特异性抗原结合蛋白
EP3549597A1 (en) * 2018-04-06 2019-10-09 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Synthetic signalling constructs and its use
CN110372796B (zh) 2018-04-12 2023-05-02 上海赛比曼生物科技有限公司 靶向bcma的嵌合抗原受体及其制法和应用
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
EP3788144B1 (en) 2018-05-01 2025-09-24 The Children's Medical Center Corporation Enhanced bcl11a rnp / crispr delivery & editing using a 3xnls-cas9
EP3787600A4 (en) 2018-05-02 2022-02-16 The Children's Medical Center Corporation ENHANCED BCL11A MICRORNAS FOR THE TREATMENT OF HEMOGLOBINOPATHIES
JP7542441B2 (ja) 2018-05-11 2024-08-30 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト 癌を治療するための方法及び組成物
WO2019232542A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
UY38251A (es) 2018-06-01 2019-12-31 Novartis Ag Moléculas de unión contra bcma y usos de las mismas
CA3103610A1 (en) * 2018-06-12 2019-12-19 The Regents Of The University Of California Single-chain bispecific chimeric antigen receptors for the treatment of cancer
JP7438988B2 (ja) 2018-06-13 2024-02-27 ノバルティス アーゲー Ｂｃｍａキメラ抗原受容体及びその使用
US12036240B2 (en) 2018-06-14 2024-07-16 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods targeting complement component 3 for inhibiting tumor growth
CN112243381B (zh) * 2018-06-14 2025-02-07 2赛文缇生物公司 抗bcma car抗体、缀合物和使用方法
JP7477112B2 (ja) * 2018-06-19 2024-05-01 ナンジン レジェンド バイオテック カンパニー，リミテッド 操作された細胞およびその使用
MX2021000283A (es) * 2018-07-11 2021-06-18 Celgene Corp Usos de los receptores del antigeno quimerico anti-bcma.
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
MA69412B1 (fr) * 2018-07-19 2025-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Récepteurs antigéniques chimériques présentant une spécificité pour bcma et leurs utilisations
AR114544A1 (es) * 2018-08-08 2020-09-16 Dragonfly Therapeutics Inc Proteínas de unión multiespecíficas que unen a bcma, nkg2d y cd16, y métodos de uso
IL280659B2 (en) 2018-08-09 2024-11-01 Juno Therapeutics Inc Processes for generating engineered cells and compositions thereof
BR112021002487A2 (pt) 2018-08-10 2021-07-27 Eutilex Co., Ltd. receptor de antígeno quimérico que se liga a hla-dr e célula car-t
BR112021003410A2 (pt) * 2018-08-24 2021-05-18 Shenzhen Pregene Biopharma Co. Ltd. anticorpos de domínio único anti-bcma, grupo de genes dos ditos anticorpos, polipeptídeo, vetor de expressão, célula hospedeira, receptor de antígeno quimérico, célula t modificada pelo mesmo, composição farmacêutica e usos dos ditos anticorpos
CN109134665B (zh) * 2018-08-24 2021-06-11 上海先博生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及应用
TW202538050A (zh) 2018-08-31 2025-10-01 瑞士商諾華公司 製備表現嵌合抗原受體的細胞之方法
EP3844265A2 (en) 2018-08-31 2021-07-07 Novartis AG Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3847254A4 (en) 2018-09-07 2022-08-10 Beam Therapeutics Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR DELIVERING A NUCLEOBASE EDITING SYSTEM
WO2020051562A2 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Beam Therapeutics Inc. Compositions and methods for improving base editing
JP7458382B2 (ja) 2018-09-27 2024-03-29 オートラス リミテッド キメラ抗原受容体
US20210382068A1 (en) 2018-10-02 2021-12-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
WO2020081730A2 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating microenvironment
US20220170097A1 (en) 2018-10-29 2022-06-02 The Broad Institute, Inc. Car t cell transcriptional atlas
MA54079A (fr) 2018-11-01 2021-09-08 Juno Therapeutics Inc Récepteurs antigéniques chimériques spécifiques du gprc5d (élément d du groupe 5 de classe c des récepteurs couplés à la protéine g)
AU2019372331A1 (en) 2018-11-01 2021-05-27 Juno Therapeutics, Inc. Methods for treatment using chimeric antigen receptors specific for B-cell maturation antigen
KR20210111247A (ko) 2018-11-08 2021-09-10 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 치료 및 ｔ 세포 조절을 위한 방법 및 조합
US20220257650A1 (en) * 2018-11-30 2022-08-18 Windmil Therapeutics, Inc. MARROW INFILTRATING LYMPHOCYTES (MILs) EXPRESSING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CAR), METHOD OF MANUFACTURING SAME, AND METHOD OF USING IN THERAPY
WO2020113234A1 (en) * 2018-11-30 2020-06-04 Celularity, Inc. Placenta-derived allogeneic car-t cells and uses thereof
US20220062394A1 (en) 2018-12-17 2022-03-03 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
CN109651511B (zh) * 2018-12-26 2020-06-09 广州百暨基因科技有限公司 一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
EP3911370A4 (en) * 2019-01-14 2022-10-26 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. CHIMERIC RECEPTOR POLYPEPTIDES AND THEIR USES
CN111454358A (zh) * 2019-01-18 2020-07-28 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
US20220152150A1 (en) 2019-02-25 2022-05-19 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
SG11202109057XA (en) 2019-03-05 2021-09-29 Nkarta Inc Cd19-directed chimeric antigen receptors and uses thereof in immunotherapy
WO2020186101A1 (en) 2019-03-12 2020-09-17 The Broad Institute, Inc. Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells
CA3158025C (en) * 2019-03-15 2023-07-11 Yi Zhang Anti-bcma chimeric antigen receptors
US20220142948A1 (en) 2019-03-18 2022-05-12 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity
US20230074800A1 (en) 2019-03-21 2023-03-09 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
CA3132587A1 (en) 2019-03-21 2020-09-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of il-4/il-13 pathway inhibitors and plasma cell ablation for treating allergy
AU2020254699A1 (en) * 2019-04-05 2021-12-02 2Seventy Bio, Inc. Manufacturing anti-BCMA CAR T cells
MX2021012205A (es) 2019-04-05 2022-02-21 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada que se unen al psma.
WO2020210678A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
US20220251152A1 (en) 2019-04-24 2022-08-11 Novartis Ag Compositions and methods for selective protein degradation
US20220249558A1 (en) 2019-04-30 2022-08-11 Crispr Therapeutics Ag Allogeneic cell therapy of b cell malignancies using genetically engineered t cells targeting cd19
WO2020236967A1 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Random crispr-cas deletion mutant
TWI905099B (zh) 2019-05-21 2025-11-21 瑞士商諾華公司 Cd19 結合分子及其用途
UY38748A (es) 2019-06-14 2021-01-29 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
CN111850013B (zh) * 2019-06-25 2021-05-18 浙江康佰裕生物科技有限公司 一种共刺激受体增效的嵌合抗原受体及其应用
CN112143700B (zh) * 2019-06-26 2024-07-19 上海细胞治疗集团股份有限公司 制备过表达外源基因的免疫效应细胞的方法
US12544391B2 (en) 2019-07-16 2026-02-10 Oric Pharmaceuticals, Inc. CD73 inhibitors
WO2021030627A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 The General Hospital Corporation Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof
US20210047423A1 (en) 2019-08-16 2021-02-18 Janssen Biotech, Inc. Therapeutic immune cells with improved function and methods for making the same
US12421557B2 (en) 2019-08-16 2025-09-23 The Broad Institute, Inc. Methods for predicting outcomes and treating colorectal cancer using a cell atlas
WO2021041922A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
US20220370500A1 (en) * 2019-09-18 2022-11-24 Board Of Regents, The University Of Texas System A method of engineering natural killer-cells to target bcma-positive tumors
WO2021051390A1 (zh) * 2019-09-20 2021-03-25 上海吉倍生物技术有限公司 靶向bcma的抗体及嵌合抗原受体
JP2022548943A (ja) * 2019-09-25 2022-11-22 フェイト セラピューティクス，インコーポレイテッド 複数標的化エフェクター細胞およびその使用
US12297426B2 (en) 2019-10-01 2025-05-13 The Broad Institute, Inc. DNA damage response signature guided rational design of CRISPR-based systems and therapies
US12394502B2 (en) 2019-10-02 2025-08-19 The General Hospital Corporation Method for predicting HLA-binding peptides using protein structural features
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US12195725B2 (en) 2019-10-03 2025-01-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for modulating and detecting tissue specific TH17 cell pathogenicity
US11793787B2 (en) 2019-10-07 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis
JP7544815B2 (ja) * 2019-10-30 2024-09-03 オリック ファーマシューティカルズ，インク． Ｃｄ７３阻害剤
US11844800B2 (en) 2019-10-30 2023-12-19 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia
AU2020377930A1 (en) 2019-11-05 2022-05-19 Bristol-Myers Squibb Company Uses of anti-BCMA chimeric antigen receptors
BR112022010206A2 (pt) 2019-11-26 2022-11-29 Novartis Ag Receptores de antígeno quiméricos e usos dos mesmos
CN112980886B (zh) * 2019-12-02 2022-02-22 河北森朗生物科技有限公司 一种能高效制备且应用安全的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法与应用
WO2021113759A1 (en) * 2019-12-04 2021-06-10 Celularity Inc. Placenta-derived allogeneic car-t cells and uses thereof
KR20220114043A (ko) * 2019-12-16 2022-08-17 2세븐티 바이오, 인코포레이티드 항-bcma car 항체, 접합체, 및 사용 방법
KR20220116221A (ko) * 2019-12-16 2022-08-22 난징 레전드 바이오테크 씨오., 엘티디. Bcma를 표적화하는 단일 도메인 항체 및 키메라 항원 수용체 및 이들의 사용 방법
US12165747B2 (en) 2020-01-23 2024-12-10 The Broad Institute, Inc. Molecular spatial mapping of metastatic tumor microenvironment
IL295381A (en) * 2020-02-12 2022-10-01 Juno Therapeutics Inc bcma-directed chimeric t-cell antigen receptor compounds and methods and uses thereof
CN115087666B (zh) 2020-02-13 2023-10-03 北京艺妙神州医药科技有限公司 嵌合抗原受体的优化
EP4103596A4 (en) * 2020-02-14 2024-09-04 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS WITH CD2 ACTIVATION
CA3173737A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
CN115175695A (zh) 2020-02-27 2022-10-11 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
AU2021251265A1 (en) 2020-04-10 2022-11-03 Juno Therapeutics, Inc. Methods and uses related to cell therapy engineered with a chimeric antigen receptor targeting B-cell maturation antigen
US12264190B2 (en) * 2020-04-24 2025-04-01 Astrazeneca Ab Compositions and methods of treating cancer with chimeric antigen receptors
EP4142723A2 (en) 2020-04-28 2023-03-08 Juno Therapeutics, Inc. Combination of bcma-directed t cell therapy and an immunomodulatory compound
US20230304031A1 (en) * 2020-05-11 2023-09-28 Abintus Bio, Inc. Vectors and methods for in vivo transduction
CA3185455A1 (en) 2020-06-11 2021-12-16 Novartis Ag Zbtb32 inhibitors and uses thereof
KR20230069090A (ko) 2020-07-20 2023-05-18 이난타 파마슈티칼스, 인코포레이티드 항바이러스제로서의 기능화된 펩타이드
CN111909271B (zh) * 2020-08-12 2021-03-23 深圳市茵冠生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及其应用
US20230302155A1 (en) 2020-08-21 2023-09-28 Novartis Ag Compositions and methods for in vivo generation of car expressing cells
CN111944850B (zh) * 2020-08-28 2023-03-31 澳门大学 表达抗cd22嵌合抗原受体和pd-l1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用
CN116685349A (zh) 2020-09-25 2023-09-01 比姆医疗股份有限公司 抗自相残杀的修饰的免疫细胞及其使用方法
US11352363B1 (en) 2020-11-23 2022-06-07 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11384090B2 (en) 2020-11-23 2022-07-12 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
AU2021383832A1 (en) 2020-11-23 2023-06-22 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Novel spiropyrrolidine derived antiviral agents
US12540141B2 (en) 2020-11-23 2026-02-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
CN116888474A (zh) 2020-12-04 2023-10-13 细胞基因公司 嵌合抗原受体(car)t细胞疗法与炎症相关可溶性因子抑制剂的组合用途
AU2021401052A1 (en) 2020-12-18 2023-06-22 Century Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor systems with adaptable receptor specificity
US20240108654A1 (en) 2021-03-03 2024-04-04 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a t cell therapy and a dgk inhibitor
US20260055430A1 (en) * 2021-03-08 2026-02-26 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Lentivirus with altered integrase activity
IL307612A (en) 2021-04-16 2023-12-01 Celgene Corp Combined therapies with BCMA-directed T-cell therapy
CN117529333A (zh) 2021-04-16 2024-02-06 细胞基因公司 对先前进行过干细胞移植的患者的t细胞疗法
EP4330381A1 (en) 2021-04-27 2024-03-06 Novartis AG Viral vector production system
KR20240018454A (ko) 2021-05-06 2024-02-13 주노 테라퓨틱스 게엠베하 T 세포의 자극 및 형질도입 방법
US11319325B1 (en) 2021-05-11 2022-05-03 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic spiropyrrolidine derived antiviral agents
US20240263153A1 (en) * 2021-05-26 2024-08-08 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Integrase compositions and methods
US20240342215A1 (en) 2021-07-14 2024-10-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Engineered t cell receptors fused to binding domains from antibodies
US11325916B1 (en) 2021-07-29 2022-05-10 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
US11339170B1 (en) 2021-07-23 2022-05-24 Enanta Pharmaceuticals, Inc. Spiropyrrolidine derived antiviral agents
JP2024531364A (ja) 2021-08-20 2024-08-29 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
CA3237175A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod reduction in treatment with anti-cd38 antibodies
KR20240112994A (ko) 2021-11-03 2024-07-19 셀진 코포레이션 골수종을 치료하는 데 사용하기 위한 b-세포 성숙 항원에 특이적인 키메라 항원 수용체
WO2023081750A1 (en) * 2021-11-04 2023-05-11 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for treating metachromatic leukodystrophy disease and related disorders
WO2023147515A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Juno Therapeutics, Inc. Methods of manufacturing cellular compositions
US20250297282A1 (en) 2022-05-05 2025-09-25 Juno Therapeutics Gmbh Viral-binding protein and related reagents, articles, and methods of use
WO2023220641A2 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Juno Therapeutics, Inc. Methods and uses related to t cell therapy and production of same
US20250302954A1 (en) 2022-05-11 2025-10-02 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
US20250345432A1 (en) 2022-05-25 2025-11-13 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
CN119585438A (zh) 2022-05-26 2025-03-07 再生元制药公司 用于维持慢病毒载体的组合物及其用途
KR20250047766A (ko) 2022-08-05 2025-04-04 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Gprc5d 및 bcma에 특이적인 키메라 항원 수용체
JP2025531850A (ja) 2022-09-08 2025-09-25 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｔ細胞療法および継続的または間欠的ｄｇｋ阻害剤投薬の組合せ
EP4598949A1 (en) 2022-10-07 2025-08-13 The General Hospital Corporation Methods and compositions for high-throughput discovery of peptide-mhc targeting binding proteins
CN120112650A (zh) 2022-10-26 2025-06-06 诺华股份有限公司 慢病毒配制品
EP4611798A1 (en) 2022-11-02 2025-09-10 Celgene Corporation Methods of treatment with t cell therapy and immunomodulatory agent maintenance therapy
WO2024100604A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Juno Therapeutics Gmbh Methods for manufacturing engineered immune cells
WO2024124044A1 (en) 2022-12-07 2024-06-13 The Brigham And Women’S Hospital, Inc. Compositions and methods targeting sat1 for enhancing anti¬ tumor immunity during tumor progression
EP4630782A1 (en) 2022-12-09 2025-10-15 Juno Therapeutics, Inc. Machine learning methods for predicting cell phenotype using holographic imaging
KR20240094169A (ko) * 2022-12-13 2024-06-25 진셀비티 주식회사 B-세포 성숙 항원을 표적화하는 신규한 키메라 항원 수용체 및 이의 용도
EP4658675A1 (en) 2023-02-03 2025-12-10 C3S2 GmbH Methods for non-viral manufacturing of engineered immune cells
WO2024168192A1 (en) 2023-02-10 2024-08-15 Celgene Corporation Assessment of bcma in biological samples
CA3278900A1 (en) 2023-03-31 2024-10-03 AbelZeta Inc. BISPECIFIC CHIMERIC ANTIGENIC RECEPTORS TARGETING CD20 AND BCMA
CN121666232A (zh) 2023-05-31 2026-03-13 开普斯坦治疗公司 脂质纳米颗粒制剂和组合物
WO2025059533A1 (en) 2023-09-13 2025-03-20 The Broad Institute, Inc. Crispr enzymes and systems
US20250127728A1 (en) 2023-10-05 2025-04-24 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained Ionizable Cationic Lipids and Lipid Nanoparticles
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
WO2025097055A2 (en) 2023-11-02 2025-05-08 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of use of t cells in immunotherapy
WO2025109119A1 (en) 2023-11-22 2025-05-30 Priothera Sas Methods of treatment with multispecific antigen-binding proteins in combination with s1p receptor modulators
WO2025117544A1 (en) 2023-11-29 2025-06-05 The Broad Institute, Inc. Engineered omega guide molecule and iscb compositions, systems, and methods of use thereof
WO2025160340A2 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
TW202540428A (zh) 2024-01-26 2025-10-16 美商雷傑納榮製藥公司 使用漿細胞耗乏劑及／或ｂ細胞耗乏劑遏制宿主抗ａａｖ抗體反應且實現ａａｖ轉導及重複給藥的方法及組成物
WO2025171383A2 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Dispatch Biotherapeutics, Inc. Engineered cancer antigens and related methods and uses
WO2025171388A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 Dispatch Biotherapeutics, Inc. Engineered cancer antigens with modified domains and related methods and uses
US20250276092A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
WO2025196590A1 (en) * 2024-03-16 2025-09-25 Indian Institute Of Technology Bombay Novel anti-bcma chimeric antigen receptor, its nucleic acid sequence, and its preparation
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
CN118325927A (zh) * 2024-06-13 2024-07-12 广州安捷生物医学技术有限公司 编码nk细胞衔接器和car的多核苷酸及包含其的修饰细胞
WO2026006767A1 (en) 2024-06-28 2026-01-02 Dispatch Biotherapeutics, Inc. Tethered il-9/il-9r and related engineered cells and methods
WO2026025092A1 (en) 2024-07-26 2026-01-29 Juno Therapeutics, Inc. Synthetic promoters for t cell expression

Family Cites Families (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
US4873192A (en) 1987-02-17 1989-10-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Process for site specific mutagenesis without phenotypic selection
ATE86967T1 (de) 1988-01-09 1993-04-15 Asta Medica Ag 1,2-bis(aminomethyl)cyclobutan-platin-komplexe.
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US7479269B2 (en) 1988-11-23 2009-01-20 Genetics Institute, Llc Methods for selectively enriching TH1 and TH2 cells
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5283173A (en) 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US6005079A (en) 1992-08-21 1999-12-21 Vrije Universiteit Brussels Immunoglobulins devoid of light chains
PT1498427E (pt) 1992-08-21 2010-03-22 Univ Bruxelles Imunoglobulinas desprovidas de cadeias leves
DE69427974T2 (de) 1993-04-29 2001-12-06 Unilever N.V., Rotterdam Herstellung von antikörpern oder funktionstüchtig gemachten teilen davon, abgeleitet von schweren ketten von immunglobulinen von camelidae
DE4415263C1 (de) 1994-04-15 1995-11-30 Asta Medica Ag Cis-[trans-1,2-Cyclobutanbis(methylamin)-N,N']-[(2S)-lactato-O·1·, O·2·]-platin(II)-trihydrat (Lobaplatin-Trihydrat), seine Herstellung und arzneiliche Verwendung
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
CA2247131A1 (en) 1996-03-04 1997-09-12 Targeted Genetics Corporation Modified rapid expansion methods ("modified-rem") for in vitro propagation of t lymphocytes
US20020177125A1 (en) 1997-03-04 2002-11-28 Kamb Carl Alexander Human rhinovirus assays, and compositions therefrom
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
FR2777909B1 (fr) 1998-04-24 2002-08-02 Pasteur Institut Utilisation de sequences d'adn de structure triplex pour le tranfert de sequences de nucleotides dans des cellules, vecteurs recombinants contenant ces sequences triplex
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
KR20030032922A (ko) 2000-02-24 2003-04-26 싸이트 테라피스 인코포레이티드 세포의 동시 자극 및 농축
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
AU2002238052A1 (en) 2001-02-20 2002-09-04 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
WO2002088346A2 (en) 2001-05-01 2002-11-07 National Research Council Of Canada A system for inducible expression in eukaryotic cells
DE10132502A1 (de) 2001-07-05 2003-01-23 Gsf Forschungszentrum Umwelt Angriff auf Tumorzellen mit fehlender, niedriger oder anormaler MHC-Expression durch kombinieren von nicht MHC-Restringierten T-Zellen/NK-Zellen und MHC-Restringierten Zellen
WO2003057171A2 (en) 2002-01-03 2003-07-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Activation and expansion of t-cells using an engineered multivalent signaling platform
GB0224442D0 (en) 2002-10-21 2002-11-27 Molmed Spa A delivery system
DK1623017T3 (da) 2003-05-08 2011-01-10 Life Technologies Corp Frembringelse og isolering af antigenspecifikke T-celler
EP1765988B1 (en) 2004-05-27 2017-09-20 The Trustees of The University of Pennsylvania Novel artificial antigen presenting cells and uses therefor
FR2872170B1 (fr) 2004-06-25 2006-11-10 Centre Nat Rech Scient Cnrse Lentivirus non interactif et non replicatif, preparation et utilisations
GB0503936D0 (en) 2005-02-25 2005-04-06 San Raffaele Centro Fond Method
AU2006251621A1 (en) 2005-05-20 2006-11-30 Virxsys Corporation Transduction of primary cells
WO2007018318A1 (ja) 2005-08-10 2007-02-15 National University Corporation Kanazawa University 小脳星状細胞及び／又は籠細胞特異的な遺伝子発現方法
EP2094837B1 (en) 2006-12-14 2012-04-25 Medical Research Council Use of pi3k, m-tor and akt inhibitors to induce foxp3 expression and generate regulatory t cells
AU2008262487B2 (en) 2007-05-23 2013-10-31 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for increased transgene expression
ES2688721T3 (es) 2007-11-01 2018-11-06 Astellas Pharma Inc. Polipéptidos y ácidos nucleicos inmunosupresores
WO2009091826A2 (en) 2008-01-14 2009-07-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Compositions and methods related to a human cd19-specific chimeric antigen receptor (h-car)
ES2961498T3 (es) 2008-08-26 2024-03-12 Hope City Método y composiciones para el funcionamiento mejorado del efecto antitumoral de las células T
EP2172211B1 (en) 2008-10-01 2014-12-03 Immatics Biotechnologies GmbH Composition of tumor-associated peptides and related anti-cancer vaccine for the treatment of glioblastoma (GBM) and other cancers
ES2647351T3 (es) 2008-12-05 2017-12-21 Abraxis Bioscience, Llc Péptidos de unión a SPARC y usos de los mismos
HRP20161194T1 (hr) 2009-03-10 2016-11-04 Biogen Ma Inc. Anti-bcma protutijela
CA2776143A1 (en) 2009-10-01 2011-04-07 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Departmen T Of Health And Human Services Anti-vascular endothelial growth factor receptor-2 chimeric antigen receptors and use of same for the treatment of cancer
HUE044461T2 (hu) 2009-11-03 2019-10-28 Hope City Csonkolt epidermális növekedési faktor receptor (EGFRT) transzdukált T-sejt szelekcióhoz
US8999398B2 (en) 2009-11-06 2015-04-07 Transtarget Inc. Polyclonal bispecific antibody compositions and method of use
GB201004200D0 (en) 2010-03-15 2010-04-28 Univ Basel Spirocyclic compounds and their use as therapeutic agents and diagnostic probes
EP2614143B1 (en) 2010-09-08 2018-11-07 Baylor College Of Medicine Immunotherapy of non-small lung cancer using genetically engineered gd2-specific t cells
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
CA2824997C (en) 2011-01-18 2023-01-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for treating cancer
US20160002601A1 (en) 2011-03-03 2016-01-07 Stempeutics Research Pvt. Ltd. Methods of upscaling mesenchymal stromal cell production, compositions and kit thereof
AU2012230780B2 (en) 2011-03-23 2016-10-27 Fred Hutchinson Cancer Center Method and compositions for cellular immunotherapy
CN103502439B (zh) 2011-04-13 2016-10-12 因缪尼卡姆股份公司 用于抗原特异性t细胞增殖的方法
FI3415531T3 (fi) 2011-05-27 2023-09-07 Glaxo Group Ltd Bcma:aa (cd269/tnfrsf17) sitovia proteiineja
JP6143231B2 (ja) 2011-06-10 2017-06-07 ブルーバード バイオ， インコーポレイテッド 副腎脳白質ジストロフィおよび副腎脊髄神経障害のための遺伝子療法ベクター
US20140322216A1 (en) 2011-11-08 2014-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3-specific antibody and uses thereof
AU2013222267A1 (en) 2012-02-22 2014-07-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for generating a persisting population of T cells useful for the treatment of cancer
KR20240136359A (ko) * 2012-04-11 2024-09-13 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 B-세포 성숙 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체
US20130280220A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
AU2013204923A1 (en) 2012-06-21 2014-01-16 Anthrogenesis Corporation Modified t lymphocytes having improved specificity
EP3584256A1 (en) 2012-07-13 2019-12-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of assessing the suitability of transduced t cells for administration
PT3824905T (pt) 2012-08-20 2025-03-21 Seattle Childrens Hospital Dba Seattle Childrens Res Inst Método e composições para imunoterapêutica celular
PT2893004T (pt) 2012-09-04 2019-01-21 Cellectis Recetor de antígeno quimérico de cadeia múltipla e utilizações do mesmo
EP2711418B1 (en) 2012-09-25 2017-08-23 Miltenyi Biotec GmbH Method for polyclonal stimulation of T cells by flexible nanomatrices
AR092745A1 (es) 2012-10-01 2015-04-29 Univ Pennsylvania Composiciones que comprenden un dominio de union anti-fap y metodos para hacer blanco en celulas estromales para el tratamiento del cancer
MX370148B (es) 2012-10-02 2019-12-03 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Composiciones y su uso para inmunoterapia.
WO2014055771A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Human alpha-folate receptor chimeric antigen receptor
US9597357B2 (en) 2012-10-10 2017-03-21 Sangamo Biosciences, Inc. T cell modifying compounds and uses thereof
TW201425336A (zh) 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
US20150329640A1 (en) 2012-12-20 2015-11-19 Bluebird Bio, Inc. Chimeric antigen receptors and immune cells targeting b cell malignancies
AU2013204922B2 (en) 2012-12-20 2015-05-14 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors
DE112012007250B4 (de) 2012-12-20 2024-10-24 Mitsubishi Electric Corp. Fahrzeuginterne Vorrichtung und Programm
WO2014130635A1 (en) * 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
EP3623380B1 (en) 2013-03-15 2025-10-22 Novartis AG Targeting cytotoxic cells with chimeric receptors for adoptive immunotherapy
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
EP3102609B1 (en) 2014-02-04 2024-08-28 The United States of America, as Represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Methods for producing autologous t cells useful to treat b cell malignancies and other cancers and compositions thereof
CA2937750A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 Bellicum Pharmaceuticals, Inc. Methods for activating t cells using an inducible chimeric polypeptide
JP6698546B2 (ja) 2014-04-14 2020-05-27 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ 癌免疫療法のためのｂｃｍａ（ｃｄ２６９）特異的キメラ抗原受容体
LT3689899T (lt) 2014-04-25 2021-12-10 2Seventy Bio, Inc. Mnd promotorių chimerinių antigenų receptoriai
WO2015164739A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 Bluebird Bio, Inc. Kappa/lambda chimeric antigen receptors
RS60544B1 (sr) 2014-04-25 2020-08-31 Bluebird Bio Inc Poboljšani metodi za proizvodnju adoptivnih ćelijskih terapija
MX380612B (es) 2014-06-06 2025-03-12 2Seventy Bio Inc Composiciones de celulas t mejoradas.
JP7054622B2 (ja) 2014-07-21 2022-04-14 ノバルティス アーゲー ヒト化抗ｂｃｍａキメラ抗原受容体を使用した癌の処置
RU2747457C2 (ru) 2014-07-24 2021-05-05 Блубёрд Био, Инк. Химерные антигенные рецепторы к bcma
PL3230321T3 (pl) 2014-12-12 2020-03-31 Bluebird Bio, Inc. Chimeryczne receptory antygenowe bcma
WO2016154628A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Xiuli Wang Bi-specific targeted chimeric antigen receptor t cells
WO2016164408A1 (en) 2015-04-06 2016-10-13 The General Hospital Corporation Anti-cspg4 reagents and methods of treating cancer
CN108137669B (zh) 2015-05-18 2023-02-17 优瑞科生物技术公司 抗ror1嵌合抗原受体
WO2017099712A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Bluebird Bio, Inc. Improved t cell compositions
US9916433B2 (en) 2016-02-10 2018-03-13 ContinUse Biometrics Ltd. Condition authentication based upon temporal-spatial analysis of vibrational responsivity
US12109234B2 (en) 2016-11-04 2024-10-08 2Seventy Bio, Inc. Anti-BCMA CAR T cell compositions
CN112980886B (zh) 2019-12-02 2022-02-22 河北森朗生物科技有限公司 一种能高效制备且应用安全的嵌合抗原受体t细胞及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20210077604A1 (en) 2021-03-18
US20190388526A1 (en) 2019-12-26
US20210052711A1 (en) 2021-02-25
MX2021007011A (es) 2021-10-22
US11020466B2 (en) 2021-06-01
US20190388528A1 (en) 2019-12-26
SMT201900596T1 (it) 2019-11-13
EA036379B1 (ru) 2020-11-02
LT3230321T (lt) 2019-12-10
MX383542B (es) 2025-03-04
HRP20211648T1 (hr) 2022-02-04
DK3628687T3 (da) 2021-10-18
PT3628687T (pt) 2021-10-20
CA2970466A1 (en) 2016-06-16
SG10202013144UA (en) 2021-02-25
CL2017001515A1 (es) 2018-01-12
EP3230321A4 (en) 2018-07-25
SI3230321T1 (sl) 2019-12-31
US20180085444A1 (en) 2018-03-29
US20190388527A1 (en) 2019-12-26
US10639358B2 (en) 2020-05-05
CN112358551A (zh) 2021-02-12
US20190388525A1 (en) 2019-12-26
PT3230321T (pt) 2019-10-30
EP3230321A2 (en) 2017-10-18
HRP20191873T1 (hr) 2020-01-24
IL252783A0 (en) 2017-08-31
BR112017012502B1 (pt) 2020-09-15
IL281484A (en) 2021-04-29
US20210038705A1 (en) 2021-02-11
CN107207598A (zh) 2017-09-26
US20210077603A1 (en) 2021-03-18
HK1245801B (en) 2020-05-15
KR102584938B1 (ko) 2023-10-05
US12029784B2 (en) 2024-07-09
EP3628687A1 (en) 2020-04-01
CY1124886T1 (el) 2022-11-25
US10624960B2 (en) 2020-04-21
WO2016094304A3 (en) 2016-10-13
ECSP17044494A (es) 2017-10-31
US11633463B2 (en) 2023-04-25
BR112017012502A2 (pt) 2017-12-26
PL3628687T3 (pl) 2022-03-21
KR20170090501A (ko) 2017-08-07
HUE056074T2 (hu) 2022-01-28
JP6671370B2 (ja) 2020-03-25
AU2021201147A1 (en) 2021-03-11
US11351236B2 (en) 2022-06-07
US10639359B2 (en) 2020-05-05
US10646558B2 (en) 2020-05-12
AU2015360845A1 (en) 2017-07-13
EP3628687B1 (en) 2021-07-28
US11382965B2 (en) 2022-07-12
KR102731379B1 (ko) 2024-11-19
US20200330572A1 (en) 2020-10-22
ES2750725T3 (es) 2020-03-26
WO2016094304A2 (en) 2016-06-16
CN112358551B (zh) 2024-02-02
SI3628687T1 (sl) 2021-12-31
EA201791310A1 (ru) 2017-11-30
JP2022090086A (ja) 2022-06-16
EP3971210A1 (en) 2022-03-23
KR20240166596A (ko) 2024-11-26
CL2018001556A1 (es) 2018-07-20
RS62527B1 (sr) 2021-11-30
SG11201704727WA (en) 2017-07-28
DK3230321T3 (da) 2019-10-28
CY1122528T1 (el) 2021-01-27
KR20230146100A (ko) 2023-10-18
ZA201704059B (en) 2021-08-25
JP7065136B2 (ja) 2022-05-11
AU2021201147B2 (en) 2024-08-22
JP2017538710A (ja) 2017-12-28
JP2020092707A (ja) 2020-06-18
CN107207598B (zh) 2020-12-08
NZ733025A (en) 2022-01-28
US10383929B2 (en) 2019-08-20
SMT202100594T1 (it) 2021-11-12
JP2023178438A (ja) 2023-12-14
IL252783B (en) 2021-04-29
PL3230321T3 (pl) 2020-03-31
EP3640262A1 (en) 2020-04-22
LT3628687T (lt) 2021-11-10
NZ770737A (en) 2024-07-05
CO2017006808A2 (es) 2018-01-05
HUE046815T2 (hu) 2020-03-30
MX2017007575A (es) 2018-03-01
EP3230321B1 (en) 2019-08-28
US20250026845A1 (en) 2025-01-23
JP7375098B2 (ja) 2023-11-07
AU2015360845B2 (en) 2020-11-26
IL281484B (en) 2022-04-01
ES2895640T3 (es) 2022-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7375098B2 (ja) Ｂｃｍａキメラ抗原受容体
EP4223269A2 (en) Uses of anti-bcma chimeric antigen receptors
HK1245801A1 (en) Bcma chimeric antigen receptors
HK40071486A (en) Composition for use in the treatment of b cell related conditions in a subject in need thereof comprisine an effector cell comrising a bcma chimeric antigen receptors
CA2970466C (en) Bcma chimeric antigen receptors
HK40027843A (en) Bcma chimeric antigen receptors for use in the treatment of a hematological malignancy
HK40024953B (en) Bcma chimeric antigen receptors
HK40024953A (en) Bcma chimeric antigen receptors
EA045264B1 (ru) Способ лечения гемобластоза с помощью иммунных эффекторных клеток, содержащих химерные антигенные рецепторы к bcma