RS59633B1 - Konstrukti antitela za cdh19 i cd3 - Google Patents

Description

Opis

Polje pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na izolovani multispecifični konstrukt antitela koji sadrži prvi humani vezujući domen koji je u stanju da se veže za humani CDH19 na površini ciljne ćelije i drugi domen koji je u stanju da se veže za humani CD3 na površini T ćelije. Štaviše, pronalazak obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstrukt antitela prema pronalasku, vektor koji sadrži pomenutu sekvencu nukleinske kiseline i ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu sa pomenutim vektorom. Dalje, pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju konstrukta antitela prema pronalasku, medicinsku upotrebu pomenutog konstrukta antitela i komplet koji sadrži pomenuti konstrukt antitela.

Pozadina pronalaska

[0002] Melanom je rak kože koji je uzrokovan onkogenom transformacijom melanocita, koji su pigmenti koji proizvode ćelije kože. Od 2009. godine, melanom je imao prevalencu više od 870.000 slučajeva samo u SAD-u (Američki nacionalni instituti za zdravlje). Svake godine se u SAD dijagnostikuje preko 75000 novih slučajeva melanoma, a približno 25% pacijenata ima uznapredovalu bolest u trenutku postavljanja dijagnoze. Uprkos činjenici da se slučajevi primarnog melanoma mogu izlečiti operativnim zahvatom ako se otkriju dovoljno rano, melanom je vodeći uzrok smrti od kožnih bolesti u SAD-u, odgovoran za oko 10000 smrti godišnje u SAD-u. Jednom kada se bolest proširila i postala metastazna, prognoza je loša, sa 5-godišnjim relativnim preživljavanjem od 15%.

[0003] Postoje četiri osnovne vrste melanoma. Tri vrste se nalaze u gornjim slojevima kože, a četvrta je invazivna i prodrla je dublje u kožu i možda se proširila na druge delove tela.

[0004] Superficijalno šireći melanom je najčešći tip melanoma koji obuhvata oko 70% svih slučajeva. Raste duž gornjeg sloja kože prilično dugo vremena pre nego što prodire dublje.

Prvo se pojavljuje kao ravna ili blago uzdignuta obojena mrlja koja ima nepravilne obrube i može biti pomalo asimetrična po obliku. Boja varira i mogu se videti delovi žute boje, smeđe, crne, crvene, plave ili bele. Ova vrsta melanoma može se pojaviti u ranije benignom mladežu i nalazi se najčešće kod mladih ljudi.

[0005] Lentigo maligna je slična tipu superficijalno širećeg melanoma, što takođe ostaje blizu površine kože duže vreme, i obično se pojavljuje kao ravan ili blago povišen pegav mladež, braon ili tamno braon promene boje. Nalazi se najčešće kod starijih osoba. Kada ovaj kancer postane invazivan, naziva se melanomom lentigo maligna.

[0006] Akralni lentiginozni melanom takođe se širi superficijalno pre prodiranja dublje. Mada se poprilično razlikuje od ostalih, jer se obično pojavljuje kao crna ili smeđa boja promena boje ispod noktiju ili na tabanima stopala ili dlanovima ruku. Ovaj tip melanoma ponekad se nalazi kod ljudi tamne kože i često može napredovati brže od superficijalno širećeg melanoma i melanoma lentigo maligna.

[0007] Nodularni melanom je obično invazivan u trenutku kada je prvi puta dijagnostikovan. Malignitet se prepoznaje kada postane ispupčenje. Obično je crn, ali povremeno je plavog, sivog, belog, braon, žutog, crvenog ili tona kože. Ovo je najagresivniji od melanoma i nalazi se u 10 do 15 procenata slučajeva.

[0008] Uobičajeni tretmani za metastatskog melanoma uključuju hemoterapiju, ciljane terapije za podobne pacijente (npr. tretman BRAF inhibitorom za pacijente sa BRAF mutacijama) i imunoterapija. Metastatski melanoma je tip tumora gde je dokazano da imunoterapija ne samo da usporava napredovanje bolesti, već dovodi i do izlečenja kod pacijenata u kasnoj fazi. Interleukin-2 je odobren za upotrebu kod metastatskog melanoma u 1998, i u 2011 antitelo koje cilja CTLA4, član nove generacije inhibitora imunoloških kontrolnih tačaka, dobio je odobrenje od FDA. Halachmi & Gilchrest Curr Opin Oncol 13:129-136, 2001 daje informacije o genetskim događajima u patogenezi melanoma, i Torabian & Kashani-Sabet Curr Opin Oncol 17: 167-171, 2005 objavljuje biomarkere za melanom. Bittner i sar. Nature 406: 536-540, 2000 otkriva molekularnu klasifikaciju kožnih malignih melanoma putem profiliranja gena, i Winnepenninckx i sar. J transl Med 4: 50, 2006 opisuje profiliranje ekspresije gena primarnog kožnog melanoma i klinički ishod.

[0009] CDH19 je tip II kadherina transmembranskog proteina nepoznatog funkcije. Ljudski gen je kloniran 2000. godine na bazi sličnosti njegove sekvence sa CDH7 (Kools, P. i sar. Genomics. 2000). Eksprimirane oznake sekvence (ESTs) za CDH19 izolovane su iz biblioteka melanocitnih cDNK, što ukazuje da ekspresija CDH19 može biti ograničena na ćelije neuralnog grebena (Kools, P. i sar. Genomics. 2000). U prilog ovoj ideji, pronađeno je da se CDH19 pacova eksprimira primarno u nervnim ganglijama i u Švanovim ćelijama tokom embrionalnog razvoja pacova (Takahashi, M. i Osumi, O. Devl Dynamics.2005.). Bertucci, F. i sar. Anticancer Research 27: 3441-3450 (2007) otkriva nekoliko prognostičkih markera, npr. CDH19, povezanih sa metastatskim napredovanjem u ćelijama humanog melanoma koji mogu predstavljati molekularne terapeutske ciljeve kod metastatskog melanoma.

[0010] Dijagnostička antitela koja detektuju CDH19 u Vestern Blot-u, imunohistohemiji ili protočnoj citometriji su poznata u struci i komercijalno dostupna. Ta antitela sadrže poli- i monoklonska antitela koja se stvaraju u životinjskim domaćinima.

Suština pronalaska

[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovani multispecifični konstrukt antitela koji sadrži prvi humani vezujući domen koji je u stanju da se veže za humani CDH19 na površini ciljne ćelije i drugi domen koji je u stanju da se veže za humani CD3 na površini T ćelije kao što je definisano u zahtevima.

[0012] U jednoj realizaciji konstrukta antitela prema pronalasku prvi vezujući domen sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koju čine:

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 4, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 5, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 6, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 172, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 173 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 174, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 10, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 11, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 12, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 178, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 179 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 180, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 196, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 198, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 34, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 35, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 36, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 202, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 203 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 204, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 48, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 214, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 216, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 58, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 59, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 60, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 226, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 227 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 228, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 64, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 65, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 66, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 232, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 233 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 234, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 70, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 71, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 72, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 238, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 239 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 240, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 161, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 328, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 48, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 924, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 216, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 902, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 924, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 216, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 903, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 924, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 216, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 48, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 925, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 216, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 70, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 907, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 72, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 238, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 239 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 240, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 70, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 907, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 908, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 238, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 239 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 240, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 901, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 922, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 923, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 58, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 905, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 906, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 226, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 227 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 228, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 58, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 905, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 60, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 226, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 227 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 228, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 161, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 939, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 921, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 939, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 940, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 161, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 941, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 196, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 923, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 922, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 923, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 901, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 922, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 923, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 939, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 970, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 971, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 972, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 973, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 974 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 975, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1061, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1062, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1063, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1064, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1065 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1066,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1139, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1140, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1141, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1142, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1143 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1144,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1152, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1153, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1154, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1155, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1156 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1157,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1178, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1179, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1180, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1181, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1182 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1183,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1191, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1192, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1193, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1194, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1195 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1196,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1204, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1205, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1206, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1207, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1208 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1209,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1217, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1218, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1219, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1220, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1221 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1222,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1230, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1231, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1232, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1233, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1234 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1235,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1308, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1309, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1310, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1311, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1312 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1313,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1321, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1322, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1323, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1324, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1325 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1326,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1373, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1374, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1375, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1376, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1377 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1378,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1386, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1387, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1388, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1389, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1390 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1391,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1399, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1400, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1401, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1402, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1403 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1404,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1412, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1413, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1414, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1415, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1416 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1417,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1777, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1778, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1779, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1780, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1781 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1782,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1790, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1791, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1792, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1793, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1794 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1795,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1803, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1804, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1805, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1806, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1807 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1808,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1816, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1817, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1818, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1819, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1820 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1821,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1829, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1830, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1831, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1832, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1833 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1834,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1842, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1843, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1844, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1845, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1846 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1847,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1855, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1856, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1857, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1858, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1859 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1860,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1868, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1869, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1870, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1871, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1872 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1873,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1881, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1882, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1883, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1884, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1885 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1886,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2063, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2064, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2065, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2066, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2067 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2068,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2076, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2077, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2078, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2079, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2080 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2081,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2089, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2090, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2091, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2092, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2093 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2094,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2102, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2103, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2104, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2105, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2106 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2107,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2115, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2116, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2117, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2118, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2119 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2120,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2128, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2129, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2130, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2131, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2132 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2133,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2141, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2142, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2143, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2144, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2145 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2146,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2154, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2155, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2156, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2157, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2158 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2159,

1

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2180, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2181, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2182, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2183, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2184 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2185,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2193, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2194, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2195, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2196, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2198, i

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2206, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2207, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2208, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2209, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2210 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2211.

[0013] U sledećoj realizaciji konstrukta antitela prema pronalasku prvi vezujući domen sadrži VH region izabran iz grupe koju čine VH regioni

kako je prikazano u SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 541, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 1068, SEQ ID NO: 1146, SEQ ID NO: 1159, SEQ ID NO: 1185, SEQ ID NO: 1198, SEQ ID NO: 1211, SEQ ID NO: 1224, SEQ ID NO: 1237, SEQ ID NO: 1315, SEQ ID NO: 1328, SEQ ID NO: 1380, SEQ ID NO: 1393, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1469, SEQ ID NO: 1478, SEQ ID NO: 1485, SEQ ID NO: 1494, SEQ ID NO: 1501, SEQ ID NO: 1508, SEQ ID NO: 1519, SEQ ID NO: 1526, SEQ ID NO: 1533, SEQ ID NO: 1542, SEQ ID NO: 1549, SEQ ID NO: 1558, SEQ ID NO: 1565, SEQ ID NO: 1784, SEQ ID NO: 1797, SEQ ID NO: 1810, SEQ ID NO: 1823, SEQ ID NO: 1836, SEQ ID NO: 1849, SEQ ID NO: 1862, SEQ ID NO: 1875, SEQ ID NO: 1888, SEQ ID NO: 2070, SEQ ID NO: 2083, SEQ ID NO: 2096, SEQ ID NO: 2109, SEQ ID NO: 2122, SEQ ID NO: 2135, SEQ ID NO: 2148, SEQ ID NO: 2161, SEQ ID NO: 2187, SEQ ID NO: 2200, i SEQ ID NO: 2213.

[0014] U drugoj realizaciji konstrukta antitela prema pronalasku prvi vezujući domen sadrži VL region izabran iz grupe koju čine VL regioni

kako je prikazano u SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 563, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 635, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 1070, SEQ ID NO: 1148, SEQ ID NO: 1161, SEQ ID NO: 1187, SEQ ID NO: 1200, SEQ ID NO: 1213, SEQ ID NO: 1226, SEQ ID NO: 1239, SEQ ID NO: 1317, SEQ ID NO: 1330, SEQ ID NO: 1382, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1421, SEQ ID NO: 1471, SEQ ID NO: 1480, SEQ ID NO: 1487, SEQ ID NO: 1496, SEQ ID NO: 1503, SEQ ID NO: 1510, SEQ ID NO: 1521, SEQ ID NO: 1528, SEQ ID NO: 1535, SEQ ID NO: 1544, SEQ ID NO: 1551, SEQ ID NO: 1560, SEQ ID NO: 1567, SEQ ID NO: 1786, SEQ ID NO: 1799, SEQ ID NO: 1812, SEQ ID NO: 1825, SEQ ID NO: 1838, SEQ ID NO: 1851, SEQ ID NO: 1864, SEQ ID NO: 1877, SEQ ID NO: 1890, SEQ ID NO: 2072, SEQ ID NO: 2085, SEQ ID NO: 2098, SEQ ID NO: 2111, SEQ ID NO: 2124, SEQ ID NO: 2137, SEQ ID NO: 2150, SEQ ID NO: 2163, SEQ ID NO: 2189, SEQ ID NO: 2202, i SEQ ID NO: 2215.

[0015] Pronalazak dalje obezbeđuje realizaciju konstrukta antitela prema pronalasku, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VH region i VL region izabran iz grupe koju čine:

parovi VH regioni i VL regioni kako je prikazano u SEQ ID NOs: 352+408, SEQ ID NOs: 360+416, SEQ ID NOs: 388+444, SEQ ID NOs: 386+442, SEQ ID NOs: 340+396, SEQ ID NOs: 346+402, SEQ ID NOs: 374+430, SEQ ID NOs: 348+404, SEQ ID NOs: 390+446, SEQ ID NOs: 463+558, SEQ ID NOs: 464+559, SEQ ID NOs: 465+560, SEQ ID NOs: 466+561, SEQ ID NOs: 467+562, SEQ ID NOs: 468+563, SEQ ID NOs: 469+564, SEQ ID NOs: 470+565, SEQ ID NOs: 471+566, SEQ ID NOs: 472+567, SEQ ID NOs: 473+568, SEQ ID NOs: 474+569, SEQ ID NOs: 475+570, SEQ ID NOs: 488+583, SEQ ID NOs: 489+584, SEQ ID NOs: 490+585, SEQ ID NOs: 491+586, SEQ ID NOs: 513+608, SEQ ID NOs: 514+609, SEQ ID NOs: 515+610, SEQ ID NOs: 516+611, SEQ ID NOs: 540+635, SEQ ID NOs: 541+636, SEQ ID NOs: 542+637, SEQ ID NOs: 543+638, SEQ ID NOs: 977+979, SEQ ID NOs: 1068+1070, SEQ ID NOs: 1146+1148, SEQ ID NOs: 1159+1161, SEQ ID NOs: 1185+1187, SEQ ID NOs: 1198+1200, SEQ ID NOs: 1211+1213, SEQ ID NOs: 1224+1226, SEQ ID NOs: 1237+1239, SEQ ID NOs: 1315+1317, SEQ ID NOs: 1328+1330, SEQ ID NOs: 1380,+1382 SEQ ID NOs: 1393+1395, SEQ ID NOs: 1406+1408, SEQ ID NOs: 1419+1421, SEQ ID NOs: 1469+1471, SEQ ID NOs: 1478+1480, SEQ ID NOs: 1485+1487, SEQ ID NOs: 1494+1496, SEQ ID NOs: 1501+1503, SEQ ID NOs: 1508+1510, SEQ ID NOs: 1519+1521, SEQ ID NOs: 1526+1528, SEQ ID NOs: 1533+1535, SEQ ID NOs: 1542+1544, SEQ ID NOs: 1549+1551, SEQ ID NOs: 1558+1560, SEQ ID NOs: 1565+1567, SEQ ID NOs: 1784+1786, SEQ ID NOs: 1797+1799, SEQ ID NOs: 1810+1812, SEQ ID NOs: 1823+1825, SEQ ID NOs: 1836+1838, SEQ ID NOs: 1849+1851, SEQ ID NOs: 1862+1864, SEQ ID NOs: 1875+1877, SEQ ID NOs: 1888+1890, SEQ ID NOs: 2070+2072, SEQ ID NOs: 2083+2085, SEQ ID NOs: 2096+2098, SEQ ID NOs: 2109+2111, SEQ ID NOs: 2122+2124, SEQ ID NOs: 2135+2137, SEQ ID NOs: 2148+2150, SEQ ID NOs: 2161+2163, SEQ ID NOs: 2187+2189, SEQ ID NOs: 2200+2202, i SEQ ID NOs: 2213+2215.

[0016] U daljoj realizaciji prema pronalasku konstrukt antitela je u formatu izabranom iz grupe koju čine (scFv)2, scFv-jednostrukog domena mAb, diatela i njihovi oligomeri.

[0017] U poželjnoj realizaciji prvi vezujući domen sadrži sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koju čine sekvence

kako je prikazano u SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 1072, SEQ ID NO: 1150, SEQ ID NO: 1163, SEQ ID NO: 1189, SEQ ID NO: 1202, SEQ ID NO: 1215, SEQ ID NO: 1228, SEQ ID NO: 1241, SEQ ID NO: 1319, SEQ ID NO: 1332, SEQ ID NO: 1384, SEQ ID NO: 1397, SEQ ID NO: 1410, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1473, SEQ ID NO: 1482, SEQ ID NO: 1489, SEQ ID NO: 1498, SEQ ID NO: 1505, SEQ ID NO: 1512, SEQ ID NO: 1523, SEQ ID NO: 1530, SEQ ID NO: 1537, SEQ ID NO: 1546, SEQ ID NO: 1553, SEQ ID NO: 1562, SEQ ID NO: 1569, SEQ ID NO: 1788, SEQ ID NO: 1801, SEQ ID NO: 1814, SEQ ID NO: 1827, SEQ ID NO: 1840, SEQ ID NO: 1853, SEQ ID NO: 1866, SEQ ID NO: 1879, SEQ ID NO: 1892, SEQ ID NO: 2074, SEQ ID NO: 2087, SEQ ID NO: 2100, SEQ ID NO: 2113, SEQ ID NO: 2126, SEQ ID NO: 2139, SEQ ID NO: 2152, SEQ ID NO: 2165, SEQ ID NO: 2191, SEQ ID NO: 2204, i SEQ ID NO: 2217.

1

[0018] U drugoj realizaciji konstrukta antitela prema pronalasku drugi vezujući domen je u stanju da se veže za humani i Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus CD3 ipsilon.

[0019] U poželjnoj realizaciji konstrukt antitela prema pronalasku ima sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koju čine sekvence

kako je prikazano u SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 1073, SEQ ID NO: 1151, SEQ ID NO: 1164, SEQ ID NO: 1190, SEQ ID NO: 1203, SEQ ID NO: 1216, SEQ ID NO: 1229, SEQ ID NO: 1242, SEQ ID NO: 1320, SEQ ID NO: 1333, SEQ ID NO: 1385, SEQ ID NO: 1398, SEQ ID NO: 1411, SEQ ID NO: 1424, SEQ ID NO: 1474, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1476, SEQ ID NO: 1483, SEQ ID NO: 1490, SEQ ID NO: 1491, SEQ ID NO: 1492, SEQ ID NO: 1499, SEQ ID NO: 1506, SEQ ID NO: 1513, SEQ ID NO: 1514, SEQ ID NO: 1515, SEQ ID NO: 1516, SEQ ID NO: 1517, SEQ ID NO: 1524, SEQ ID NO: 1531, SEQ ID NO: 1538, SEQ ID NO: 1539, SEQ ID NO: 1540, SEQ ID NO: 1547, SEQ ID NO: 1554, SEQ ID NO: 1555, SEQ ID NO: 1556, SEQ ID NO: 1563, SEQ ID NO: 1570, SEQ ID NO: 1571, SEQ ID NO: 1572, SEQ ID NO: 1573, SEQ ID NO: 1574, SEQ ID NO: 1575, SEQ ID NO: 1576, SEQ ID NO: 1577, SEQ ID NO: 1578, SEQ ID NO: 1579, SEQ ID NO: 1580, SEQ ID NO: 1581, SEQ ID NO: 1789, SEQ ID NO: 1802, SEQ ID NO: 1815, SEQ ID NO: 1828, SEQ ID NO: 1841, SEQ ID NO: 1854, SEQ ID NO: 1867, SEQ ID NO: 1880, SEQ ID NO: 1893, SEQ ID NO: 2075, SEQ ID NO: 2088, SEQ ID NO: 2101, SEQ ID NO: 2114, SEQ ID NO: 2127, SEQ ID NO: 2140, SEQ ID NO: 2153, SEQ ID NO: 2166, SEQ ID NO: 2192, SEQ ID NO: 2205, i SEQ ID NO: 2218 do 2228.

[0020] Pronalazak dalje obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstrukt antitela prema pronalasku.

[0021] Dalje, pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema pronalasku. Štaviše, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu sekvencom nukleinske kiseline iz pronalaska.

[0022] U daljoj realizaciji pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju konstrukta antitela prema pronalasku, pomenuti postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju konstrukta antitela prema pronalasku i regenerisanje proizvedenog konstrukta antitela iz kulture.

[0023] Štaviše, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konstrukt antitela prema pronalasku ili proizveden prema procesu prema pronalasku

[0024] U jednoj realizaciji pronalazak obezbeđuje konstrukt antitela prema pronalasku ili proizveden prema procesu prema pronalasku za upotrebu u prevenciji ili lečenju bolesti melanoma ili bolesti metastaza melanoma.

[0025] Bolest melanoma ili metastatska bolest melanoma može biti izabrana iz grupe koju čine superficijalno šireći melanom, lentigo maligna, melanom lentigo maligna, akralni lentiginozni melanom i nodularni melanom.

[0026] U daljoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži konstrukt antitela prema pronalasku, ili proizveden prema procesu prema pronalasku, vektor prema pronalasku, i/ili ćeliju domaćina prema pronalasku.

Kratak opis crteža

[0027]

Slika 1:

FIG. 1 prikazuje podatke o vijabilnosti ćelija Colo-699 koje su tretirane sa potpuno humanim anti-CDH19 antitelima i visokom koncentracijom kozjeg anti-humanog Fc monovalentnog Fab konjugovanog sa DM1 (DM1-Fab) u odnosu lek-antitelo (DAR) (∼1.3).

Slika 2:

FIG. 2 prikazuje prosečne podatke o vijabilnosti ćelija iz CHL-1 testa koji je prikazan nasuprot prosečnim podacima o vijabilnosti ćelija iz testa Colo-699.

Slika 3:

FIG. 3 prikazuje relativnu ekspresiju CDH19 mRNK u uzorcima metastatskog i primarnog melanoma.

Slika 4:

FIG. 4 prikazuje ekspresiju proteina CDH19 u uzorcima humanog tumora od IHC.

Slika 5:

1

FIG. 5 prikazuje rezultate analize tumorskih ćelijskih linija protočnom citometrijom i IHC da bi se identifikovali modeli sistema sa CDH19 ekspresijom sličnom humanim tumorima na osnovu broja CDH19 receptora prisutnih na ćelijskoj površini.

Slika 6:

FACS analiza CDH19/CD3 bispecifičnih antitela na naznačene ćelijske linije:

1) netransfektovane L1.2. 2) L1.2 ćelije stabilno transfektovane sa humanim CDH19, 3) ćelijska linija melanoma CHL-1, 4) ćelijska linija melanoma A2058, 5) humana CD3 pozitivna humana T ćelijska linija HBP-ALL, 6) makaki T ćelijska linija 4119 LnPx. Negativne kontrole [1) do 6)]: antitela za detekciju bez prethodnih CDH19/CD3 bispecifičnih antitela.

Slika 7:

Citotoksična aktivnost CDH19/CD3 bispecifičnih antitela izmerena u 48-satnom testu citotoksičnosti zasnovanog na FACS-u. Efektorske ćelije: nestimulirane humane PBMC. Ciljne ćelije: kako je navedeno. Razmer efektorske prema ciljnoj ćeliji (E:T): 10:1.

Slika 8:

Inhibicija rasta tumora in vivo ćelija Colo699 primenom CDH19 BiTE 2G6. Bispecifični konstrukt antitela inhibira rast tumora u dozi od 0.5 mg/kg.

Slika 9:

Inhibicija rasta tumora in vivo ćelija CHL-1 primenom CDH19 BiTE 2G6. Bispecifični konstrukt antitela inhibira rast tumora u dozi od 0.5 mg/kg.

Slika 10:

Citotoksična aktivnost CDH19/CD3 bispecifičnih antitela izmerena u testu citotoksičnosti zasnovanom na 48 sati snimanja. Efektorske ćelije: nestimulisane humane T ćelije. Ciljne ćelije: kako je navedeno. Razmer efektorske prema ciljnoj ćeliji (E:T): 10:1.

Slika 11:

Hromatogram IMAC hvatanje i eluiranje CH19 2G6 302 x I2C SA21

Tipični IMAC profil eluiranja dobijen prilikom prečišćavanja CDH19 BiTE antitela. Crvena linija označava apsorpciju na 254 nm, plava linija označava apsorpciju na 280 nm. Smeđa linija označava provodljivost.1 - hvatanje. 2 - Pre-eluiranje 50 mM Imidazola.3. BiTE eluiranje 500 mM Imidazola.

Slika 12:

Hromatogram Protein_A hvatanje i eluiranje CH19 2G6302 x F12Q

Tipični Protein_A profil eluiranja dobijen prilikom prečišćavanja CDH19 BiTE antitela. Crvena linija označava apsorpciju na 254 nm, plava linija označava apsorpciju na 280 nm.

1

Smeđa linija označava provodljivost. Zelena linija označava primenjeni procenat gradijenta.1 - hvatanje.2 - BiTE eluiranje

Slika 13:

SEC profil eluiranja CDH19 BiTE antitela 2G6302 x I2C SA21

Tipični SEC profil eluiranja dobijen prilikom prečišćavanja CDH19 BiTE antitela. Označeni su vrhovi proteina koji odgovaraju monomernim i dimernim izoformama BiTE antitela. LMW = niska molekularna težina. Crvena linija označava apsorpciju na 254 nm, plava linija označava apsorpciju na 280 nm. Smeđa linija označava provodljivost. 1 - ne BiTE agregati u SEC zapremini isključenja. 2. BiTE dimer. 3. BiTE monomer. 4. Kontaminanti i soli niske molekularne težine

Slika 14:

Redukovana SDS PAGE analitika za CDH19 BiTE Monomer CH19 2G6 302 x I2C SA21 (levo) i marker molekularne težine Novex Sharp Protein Standard (Life Technologies).

Slika 15:

HP-SEC hromatogram koji pokazuje eluiranje CDH19 BiTE CH192G6302 x I2C SA21 posle sedam dana čuvanja na 37°C. Ružičasta linija pokazuje optičku apsorpciju na talasnoj dužini 210 nm. Smeđa linija označava provodljivost.

1 BiTE Dimer.2. BiTE Monomer

Slika 16:

HP-SEC hromatogram koji pokazuje eluiranje CDH19 BiTE CH192G6302 x I2C SA21 nakon tri ciklusa zamrzavanja / odmrzavanja. Ružičasta linija pokazuje optičku apsorpciju na talasnoj dužini 210 nm. Smeđa linija označava provodljivost. 1. BiTE Monomer

Slika 17:

CatlEX hromatogram eluiranja CDH19 BiTE CH192G6 302 x I2C SA21. Plava linija koja pokazuje optičku apsorpciju na 280 nm. Crvena linija koja pokazuje optičku apsorpciju na 254 nm.

Slika 18:

HIC profil eluiranja CDH19 BiTE CH192G6 302 x I2C SA21. Plava linija koja pokazuje optičku apsorpciju na 280 nm. Crvena linija koja pokazuje optičku apsorpciju na 254 nm. Smeđa linija označava provodljivost.

Slika 19:

FACS analiza CDH19/CD3 bispecifičnih antitela na naznačene ćelijske linije: 1) HEK293 ćelije stabilno transfektovane sa humanom CDH19, 2) humana CD3 pozitivna humana T

1

ćelijska linija HBP-ALL; Negativne kontrole [1) i 2)]: antitela za detekciju bez prethodnog supernatanta ćelijske kulture CDH19/CD3 bispecifičnog antitela.

Slika 20:

Citotoksična aktivnost CDH19/CD3 bispecifičnih antitela izmerena u 18-satnom testu citotoksičnosti na osnovu oslobađanja hroma. Efektorske ćelije: stimulisane humane CD8+ T-ćelije. Ciljne ćelije: HEK293 transfektovane sa humanim CDH19. Razmer efektorske prema ciljnoj ćeliji (E:T): 10:1.

Detaljan opis pronalaska

Definicije:

[0028] Treba napomenuti da kako se ovde koristi, oblici jednine, obuhvataju reference na množinu ukoliko kontekst jasno ne navodi drugačije. Tako, na primer, referenca na "reagens" obuhvata jedan ili više takvih različitih reagensa, a upućivanje na "metod" uključuje referencu na ekvivalentne korake i metode poznate onima koji imaju uobičajene veštine u polju tehnike, a koji bi mogli biti modifikovani ili zamenjeni za ovde opisane metode.

[0029] Ukoliko nije drugačije naznačeno, termin "najmanje" koji prethodi nizu elemenata treba shvatiti da se odnosi na svaki element u nizu. Oni koji poznaju ovo polje tehnike će prepoznati ili će moći da utvrde koristeći ne više od rutinskog eksperimentiranja, mnogo ekvivalenta za specifične realizacije ovde opisanog pronalaska.

[0030] Termin "i/ili" gde god se ovde koristi podrazumeva "i", "ili" i " sve ili bilo koje druge kombinacije elemenata povezanih navedenim terminom".

[0031] Termin "oko" ili "približno" kako se ovde koristi označava unutar ±20%, poželjno unutar ±15%, poželjnije unutar ±10%, i najpoželjnije unutar ±5% od date vrednosti ili opsega.

[0032] Kroz ovu specifikaciju i patentne zahteve koji slede, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, reč "čine", te varijacije kao što su "obuhvata" i "sadrži", biće shvaćeno da implicira uključivanje navedenog celog broja ili koraka ili grupe celih brojeva ili koraka, ali ne i isključenje bilo kojeg drugog celog broja ili koraka ili grupe celog broja ili koraka. Kada se ovde koristi, termin "sadrži" može biti supstituisan sa terminom "koji sadrži" ili "uključujući" ili ponekad kada se ovde koristi sa terminom "ima".

1

[0033] Kada se ovde koristi, "koji se sastoji od" isključuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nije naveden u elementu zahteva. Kada se ovde koristi, "u osnovi se sastoji od" ne isključuje materijale ili korake koji ne utiču materijalno na osnovne i nove karakteristike zahteva.

[0034] U svakom slučaju ovde bilo koji od termina "sadrži" u osnovi se sastoji od" i "sastoji se od" može biti zamenjen sa bilo kojim od druga dva termina.

[0035] Definicija termina "antitelo" obuhvata i primere izvođenja kao što su monoklonalna, himerna, jednolančana, humanizovana i humana antitela, kao i fragmenti antitela, kao što su, između ostalog, Fab fragmenti. Fragmenti ili derivati antitela dalje sadrže F(ab')2, Fv, scFv fragmente ili antitela jednostrukog domena kao što su antitela za domen ili nanotela, antitela sa jednim varijabilnim domenom ili imunoglobulini sa jednim varijabilnim domenom koji sadrže samo jedan promenljivi domen, koji može biti VHH, VH ili VL, koji specifično vezuju antigen ili epitop nezavisno od ostalih V regiona ili domena; videti, na primer, Harlow i Lane (1988) i (1999), loc. cit.; Kontermann and Dübel, Antibody Engineering, Springer, 2nd ed.

2010 i Little, Recombinant Antibodies for Immunotherapy, Cambridge University Press 2009. Takav imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domen obuhvata ne samo izolovano antitelo polipeptida sa jednim varijabilnim domenom, bu već i veće polipeptide koji sadrže jedan ili više monomera antitela sa jednim promenljivim domenom polipeptidne sekvence.

[0036] U skladu sa ovom definicijom sve gore opisane realizacije termina antitela mogu se podvesti pod termin "konstrukt antitela". Navedeni termin takođe obuhvata diatela ili ponovno ciljajuća dvo-afinitetna (DART) antitela. Dalje se predviđaju (bispecifična) jednolančana diatela, tandem diatela (Tandab's), "minitela" koja su prikazana strukturom koja je kako sledi: (VH-VL-CH3)2, (scFv-CH3)2ili (scFv-CH3-scFv)2, "Fc DART" antitela i "IgG DART" antitela, i multitela kao što su triatela. Imunoglobulinski pojedinačni varijabilni domeni obuhvataju ne samo izolovano antitelo polipeptida sa jednim varijabilnim domenom, već i veće polipeptide koji sadrže jedan ili više monomera antitela sa jednim promenljivim domenom polipeptidne sekvence.

1

[0037] Različiti postupci su poznati u struci i mogu se koristiti za proizvodnju takvih konstruktata antitela (antitela i/ili fragmenata). Stoga se derivati (antitela) mogu proizvesti peptidomimeticima. Dalje, tehnike opisane za proizvodnju jednolančanih antitela (videti, između ostalog, američki patent 4,946,778, Kontermann i Dübel (2010), loc. cit. i Little(2009), loc. cit.) mogu se prilagoditi tako da proizvode antitela sa jednim lancem specifična za izabrane polipeptide. Takođe, transgene životinje se mogu koristiti za ekspresiju humanizovanog antitela specifičnog za polipeptide i fuzione proteine iz ovog pronalaska. Za pripremu monoklonalnih antitela, može se koristiti bilo koja tehnika koja obezbeđuje antitela proizvedena neprekidnim kulturama linije ćelijske linije. Primeri takvih tehnika obuhvataju hibridomsku tehniku (Kohler i Milstein Nature 256 (1975), 495-497), tehniku trioma, tehniku humanog B-ćelijskog hibridoma (Kozbor, Immunology Today 4 (1983), 72) i tehniku EBV-hibridoma za proizvodnju humanih monoklonalnih antitela (Cole i sar., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985), 77-96). Površinska plazmonska rezonanca koja se koristi u sistemu BIAcore može se koristiti za povećanje efikasnosti fage antitela koja se vezuju za epitop ciljnog polipeptida, kao što je CD3 ipsilon (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). Takođe je u kontekstu ovog pronalaska predviđeno da termin "antitelo" sadrži konstrukte antitela, koji se mogu eksprimirati u domaćinu kako je ovde opisano, npr. konstrukti antitela koji se mogu transficirati i/ili transducirati preko, između ostalog, virusima ili plazmidnim vektorima.

[0038] Dalje, termin "antitelo" kako je korišćeno u specifikaciji takođe se odnosi na derivate ili varijante na ovde opisanih antitela koje prikazuju istu specifičnost kao opisana antitela.

[0039] Termini "antigen-vezujući domen", "antigen-vezujući fragment" i "vezujući region antitela" kada se ovde koriste odnose se na deo molekula antitela koji sadrži aminokiseline odgovorne za specifično vezivanje između antitela i antigena. Deo antigena koji je specifično prepoznat i vezan antitelom naziva se "epitop" kako je gore opisano. Kao što je gore pomenuto, antigen-vezujući domen obično može da sadrži varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH); međutim, međutim, ne mora da sadrži i jedno i drugo. Fd fragmenti, na primer, imaju dva VH regiona i često zadržavaju neku antigenvezujuću funkciju netaknutog antigen-vezujućeg domena. Primeri antigen-vezujućih fragmenata antitela uključuju (1) Fab fragment, monovalentni fragment koji ima VL, VH, CL i CH1 domene; (2) F(ab')2 fragment, dvovalentni fragment koji ima dva Fab fragmenta

2

povezana sa disulfidnim mostom u regionu šarke; (3) Fd fragment koji ima dva VH i CH1 domena; (4) Fv fragment koji ima VL i VH domene antitela sa jednim krakom, (5) dAb fragment (Ward i sar., (1989) Nature 341 :544-546), koji ima VH domen; (6) vani region koji određuje komplementarnost (CDR), i (7) jednolančani Fv (scFv). Iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH kodirana sa odvojenim genima, oni se mogu spojiti, rekombinantnim metodama, sa sintetskim linkerom koji im omogućava stvaranje kao jedinstveni proteinski lanac u kom se VL i VH regioni formiraju par tako da grade monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr., Huston i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci SAD 85:5879-5883). Ovi fragmenti antitela su dobijeni korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih onima koji poznaju ovo polje tehnike, a fragmenti su procenjeni za funkciju na isti način kao i intaktna antitela.

[0040] Termin "monoklonalno antitelo" kako se ovde koristi se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije uglavnom homogenih antitela, tj., pojedinačna antitela koja sadrže populaciju su identična, osim mogućih mutacija koje su prirodno prisutne i/ili post-translacionih modifikacija (npr., izomerizacije, amidacije) koje mogu biti prisutne u manjim iznosima. Monoklonalna antitela su izrazito specifična, usmerena su prema jednom antigenom mestu. Dalje, za razliku od konvencionalnih (poliklonalnih) preparata antitela koji obično obuhvataju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklonalno antitelo je usmereno protiv pojedinačne determinante na antigenu. Pored svoje specifičnosti, monoklonalna antitela su povoljna po tome što ih je sintetizovala kultura hibridoma, nezagađena drugim imunoglobulinima. Modifikator „monoklonalni“ ukazuje na karakter antitela koje je dobiveno iz uglavnom homogene populacije antitela, što ne treba tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Na primer, monoklonalna antitela koja će se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom mogu se načiniti metodom hibridoma koju je prvi opisao Kohler i sar., Nature, 256: 495 (1975), ili se može proizvesti rekombinantnim DNK metodama (videti, npr., U. S. Patent Ne. 4,816,567). "Monoklonalna antitela" takođe se može izolovati iz biblioteke fag antitela korišćenjem tehnika opisanih u na primer Clackson i sar., Nature, 352: 624-628 (1991) i Marks i sar., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991).

[0041] Termin "humano antitelo" obuhvata antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione koji u suštini odgovaraju za humani humanim embrionskim sekvencama imunoglobulina koje su poznate u struci, uključujući, na primer, one koje opisuje Kabat i sar. (videti Kabat i sar.

(1991) loc. cit.). Humana antitela prema pronalasku mogu da uključuju aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim embrionskim sekvencama imunoglobulina (npr., mutacije uvedene slučajnom mutagenezom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ovima, i naročito, u CDR3. Humano antitelo može imati najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet, ili više položaja zamenjenih aminokiselinskim ostatkom koji nije kodiran sa humanom embrionskom sekvencom imunoglobulina. Naglašeno je da definicija humanih antitela kako se ovde koristi takođe razmatra potpuno humana antitela, koja obuhvataju samo ne-veštački i/ili genetski modifikovane humane sekvence antitela, jer se one mogu dobiti korišćenjem tehnologija koje koriste sisteme kao što je Xenomice.

[0042] Primeri "varijanti antitela" sadrže humanizovane varijante ne-humanih antitela, antitela "sazrelog afiniteta" (videti, npr. Hawkins i sar. J. Mol. Biol.254, 889-896 (1992) i Lowman i sar., Biochemistry 30, 10832- 10837 (1991)) i mutante antitela sa izmenjenom efektorskom funkcijom (videti, npr., US Patent 5, 648, 260, Kontermann i Dübel (2010), loc. cit. i Little(2009), loc. cit.).

[0043] Kako se ovde koristi, "in vitro generisano antitelo" odnosi se na antitelo gde je ceo ili deo varijabilnog regiona ( (npr., najmanje jedan CDR) generisan u ne imunoj selekciji ćelija (npr., in vitro prikazivanje faga, protein čip ili bilo koji drugi postupak u kojima se mogu testirati kandidatske sekvence na njihovu sposobnost vezanja na antigen). Ovaj termin prema tome poželjno isključuje sekvence generisane genomskim preuređivanjem u imunološkoj ćeliji.

[0044] Uparivanje VH i VL zajedno formira jedno mesto vezivanja antigena. Domen CH koji je najbliži VH označen je kao CH1. Svaki L lanac vezan je za H lanac sa jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok su dva H lanca međusobno povezana pomoću jedne ili više disulfidnih veza u zavisnosti od izotipa H lanca. VH i VL domeni sastoje se od četiri regiona relativno sačuvanih sekvenci koje se nazivaju okvirni regioni (FR1, FR2, FR3, i FR4), koji formiraju skele za tri regiona hipervarijabilnih sekvenci (koji određuju komplementarnost, CDR-ovi). CDR-ovi sadrže većinu ostataka odgovornih za specifične interakcije antitela sa antigenom. CDR-ovi se nazivaju CDR 1, CDR2, i CDR3. Shodno tome, sastavni delovi CDR na teškom lancu se nazivaju H1, H2, i H3, dok se sastavni delovi CDR na lakom lancu se nazivaju L1, L2, i L3.

[0045] Termin "promenljiva" odnosi se na delove imunoglobulinskih domena koji pokazuju varijabilnost u njihovoj sekvenci i koji su uključeni u određivanje specifičnosti i afiniteta vezivanja određenog antitela (tj., "promenljivi domen(i)"). Varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz promenljive domene antitela; koncentrisana je u poddomene svakog od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca. Ovi poddomeni nazivaju se "hipervarijabilnim" regionima ili "regionima koji određuju komplementarnost" (CDR-ovi). Očuvaniji (tj., nehipervarijabilni) delovi promenljivih domena se zovu "okvirni" regioni (FRM). Varijabilni domeni prirodnih teških i lakih lanaca sačinjavaju četiri FRM regije, uglavnom usvajaju konfiguraciju β-lista, povezane sa tri hipervarijabilna regiona, koji formiraju petlje koje povezuju, i u nekim slučajevima čine deo, strukture β-lista. Hipervarijabilni regioni u svakom lancu drže se zajedno u neposrednoj blizini pomoću FRM i, w sa hipervarijabilnim regionima iz drugog lanca, doprinose formiranju mesta za vezanje antigena (videti Kabat i sar., loc. cit.). Konstantni domeni nisu direktno uključeni u vezivanje antigena, ali pokazuju različite efektorske funkcije, kao što su, na primer, antitelo zavisna, ćelijski posredovana citotoksičnost i aktivacija komplementa.

[0046] Termini "CDR", i njegova množina "CDR-ovi", odnose se na region koji određuje komplementarnost (CDR) od kojih tri čine vezujući karakter varijabilnog regiona lakog lanca (CDRL1, CDRL2 i CDRL3) i tri čine vezujući karakter varijabilnog regiona teškog lanca (CDRH1, CDRH2 i CDRH3). CDR-ovi doprinose funkcionalnom delovanju molekula antitela i razdvojeni su sa aminokiselinskim sekvencama koje sadrže skelete ili okvire regione. Tačne definitivne CDR granice i dužine su podložne različitim sistemima klasifikacije i numerisanja CDR-ovi se mogu pozivati na Kabat, Chothia, kontakt ili bilo koje druge granične definicije, uključujući ovde opisani sistem numerisanja. Uprkos različitim granicama, svaki od ovih sistema ima određeni stepen preklapanja u onome što čine takozvane „hipervarijabilne regije" unutar promenljivih sekvenci. Definicije CDR prema ovim sistemima mogu se, dakle, razlikovati u dužini i graničnim oblastima u odnosu na susedni okvirni region. Videti na primer Kabat, Chothia, i/ili MacCallum (Kabat i sar., loc. cit.; Chothia i sar., J. Mol. Biol, 1987, 196: 901; i MacCallum i sar., J. Mol. Biol, 1996, 262: 732). Međutim, preferirano je numerisanje u skladu sa takozvanim Kabat sistemom. CDR3 lakog lanca i, posebno, CDR3 teškog lanca mogu predstavljati najvažnije determinante u vezivanju antigena unutar varijabilnih regiona lakog i teškog lanca. U nekim konstruktima antitela, čini se da je CDR3 teškog lanca glavni deo

2

kontakta između antigena i antitela. In vitro šeme selekcija u kojima sam CDR3 varira mogu se upotrebiti za promenu karakteristika vezivanja antitela ili za određivanje koji ostaci doprinose vezivanju antigena.

[0047] "U osnovi se sastoji od" znači da aminokiselinska sekvenca može da varira za oko 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ili 15% u odnosu na recitovanu sekvencu SEQ ID NO: i dalje zadržava biološku aktivnost, kao što je ovde opisano.

[0048] U nekim realizacijama, konstrukti antitela prema pronalasku su izolovani proteini ili suštinski čisti proteini. "Izolovani" protein nije praćen sa najmanje nekim materijalom sa kojim je on obično povezan u svom prirodnom stanju, pri čemu, na primer predstavlja najmanje oko 5%, ili najmanje oko 50 mas.% o ukupnog proteina u datom uzorku. Podrazumeva se da izolovani protein može da čini od 5 do 99.9 mas.% ukupnog sadržaja proteina u zavisnosti od okolnosti. Na primer, protein može da se dobije u značajno većoj koncentraciji korišćenjem inducibilnog promotora ili promotora visoke ekspresije, tako da je protein dobijen u povećanim nivoima koncentracije. Definicija obuhvata proizvodnju antigen vezujućeg proteina u velikom broju različitih organizama i/ili ćelija domaćina koji su poznati u stanju tehnike.

[0049] Za aminokiselinske sekvence, identičnost sekvenci i/ili sličnost je određena korišćenjem standardnih tehnika poznatih u struci, uključujući, ali nije ograničeno na, algoritam identiteta lokalne sekvence od Smith i Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482, algoritam poravnanja identičnosti sekvence od Needleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.

48:443, potraga za metodom sličnosti od Pearson i Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.

85:2444, kompjuterizovane implementacije ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u softverskom paketu za genetiku Viskonsin, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), Best Fit program za sekvence opisan od Devereux i sar., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395, poželjno koristeći zadata podešavanja, ili pregledom. Poželjno, procenat identičnosti izračunava FastDB na osnovu sledećih parametara: kazna zbog neusklađenosti od 1; kazna zbog zazora od 1; kazna zbog veličine zazora od 0.33; i kazna zbog spajanja od 30, "Current Methods in Sequence Comparison i Analysis," Macromolecule Sequencing i Synthesis, Selected Methods i Applications, pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.

[0050] Primer korisnog algoritma je PILEUP. PILEUP stvara više poravnanja sekvenci iz grupe srodnih sekvenci koristeći progresivna, parna poravnanja. Takođe može da crta prikaz strukture koja prikazuje odnose klastera koji se koriste za kreiranje poravnanja. PILEUP koristi pojednostavljenje metode progresivnog poravnanja Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol.

35:351-360; metoda je slična onoj koju su opisali Higgins i Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Korisni PILEUP parametri uključuju zadanu težinu praznine od 3.00, zadanu dužinu težine praznine 0.10, i ponderisane krajnje praznine.

[0051] Sledeći primer korisnog algoritma je BLAST algoritam, opisan u: Altschul i sar., 1990, J. Mol. Biol.215:403-410; Altschul i sar., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; i Karin i sar., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.90:5873-5787. Naročito koristan BLAST program je WU-BLAST-2 program koji je dobijen od Altschul i sar., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. WU-BLAST-2 koristi nekoliko parametara pretraživanja, od kojih je većina postavljena na zadane vrednosti. Podesivi parametri se postavljaju sa sledećim vrednostima: raspon preklapanja=1, frakcija preklapanja=0.125, prag reči (T)=II. Parametri HSP S i HSP S2 su dinamičke vrednosti i određuje ih sam program ovisno o sastavu određene sekvence i sastavu određene baze podataka za koju se pretražuje interesantna sekvenca; međutim, vrednosti se mogu podesiti da se poveća osetljivost.

[0052] Dodatni koristan algoritam je BLAST sa jazom kako su izveštavali Altschul i sar., 1993, Nucl. Acids Res.25:3389-3402. BLAST sa jazom koristi BLOSUM-62 rezultate supstitucije; parametar praga T postavljen na 9; metodu sa dva pogotka za pokretanje nekorišćenih ekstenzija, dužine praznina punjenja k iznosi 10+k; Xu je postavljen na 16, i Xg je postavljen na 40 za fazu pretrage baze podataka i na 67 za izlaznu fazu algoritama. Dostupna poravnanja pokreću se rezultatom koji odgovara oko 22 bita.

[0053] Uglavnom, homologija aminokiseline, sličnost ili identičnost između pojedinih varijanti CDR-ova su bar 80% sličnost ili identičnost između pojedinih varijanti, i preciznije sa poželjno rastućim homologijama ili identitetima za najmanje 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, i gotovo 100%. Na sličan način, " "procenat (%) identiteta sekvence nukleinske kiseline" u odnosu na sekvencu nukleinske kiseline ovde identifikovanih vezujućih proteina je definisan kao procenat u kandidatskoj sekvenci koji su identični sa

2

nukleotidnim ostacima u kodiranoj sekvenci proteina koji veže antigen Specifična metoda koristi BLASTN modul VU-BLAST-2 postavljen na zadane parametre sa rasponom preklapanja i frakcijom preklapanja podešenom na 1 i 0,125, respektivno.

[0054] Uglavnom, homologija sekvenci nukleinskih kiselina, sličnost ili identičnost između nukleotidnih sekvenci koje kodiraju pojedinačnu varijantu CDR-ova i ovde prikazane nukleotidne sekvence su najmanje 80%, a tipičnije sa poželjno povećanjem homologije ili identičnosti od najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%, i gotovo 100%.

Prema tome, "varijanta CDR" je jedna sa specificiranom homologijom, sličnošću ili identitetom matičnog CDR-a prema pronalasku, i deli biološku funkciju, uključujući, ali nije ograničeno na, najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% specifičnosti i/ili aktivnosti roditeljskog CDR.

[0055] Iako je mesto ili regija za uvođenje varijacije sekvenci aminokiselina unapred određeno, mutacije same po sebi ne moraju biti unapred određene. Na primer, da bi se optimiziralo performanse mutacije na datom mestu, može se izvesti nasumična mutageneza na ciljnom kodonu ili regionu i eksprimirane varijante CDR antigen vezujućeg proteina pregledaju za optimalnu kombinaciju željene aktivnosti. Tehnike izrade supstitucionih mutacija na unapred određenim mestima u DNK koja imaju poznatu sekvencu su dobro poznate, na primer, M13 primer mutageneza i PCR mutageneza. Pregledavanje mutanata se izvodi korišćenjem ispitivanja aktivnosti antigen vezujućeg proteina, kao što je CDH19 vezivanje.

[0056] Termin "aminokiselina" ili "aminokiselinski ostatak" se obično odnosi na aminokiselinu koja ima svoju definiciju priznatu u polju tehnike kao što su aminokiseline izabrane iz grupe koju čine: alanin (Ala ili A); arginin (Arg ili R); asparagin (Asn ili N); asparaginska kiselina (Asp ili D); cistein (Cys ili C); glutamin (Gln ili Q); glutaminska kiselina (Glu ili E); glicin (Gly ili G); histidin (His ili H); izoleucin (He ili I): leucin (Leu ili L); lizin (Lys ili K); metionin (Met ili M); fenilalanin (Phe ili F); prolin (Pro ili P); serin (Ser ili S); treonin (Thr ili T); triptofan (Trp ili W); tirozin (Tyr ili Y); i valin (Val ili V), iako se modifikovane, sintetičke ili retke aminokiseline mogu koristiti po želji. Uglavnom, aminokiseline se mogu grupisati kao da imaju nepolarni bočni lanac (npr., Ala, Cys, He, Leu, Met, Phe, Pro, Val); negativno nabijeni bočni lanac (npr., Asp, Glu); pozitivno nabijeni bočni

2

lanac (npr., Arg, His, Lys); ili neutralan polarni bočni lanac (npr., Asn, Cys, Gln, Gly, His, Met, Phe, Ser, Thr, Trp, i Tyr).

[0057] Termin "hipervarijabilni region" (takođe poznat kao "regioni koji određuju komplementarnost " ili CDR-ovi) kada se ovde koristi odnosi se aminokiselinske ostatake antitela koji su (obično tri ili četiri kratka regiona ekstremne varijabilnosti sekvence) unutar domena V-regije imunoglobulina koje formiraju mesto vezivanja antigena site i glavne su determinante specifičnosti antigena. Postoje najmanje dve metode za identificiranje CDR ostataka: (1) Pristup zasnovan na varijabilnosti sekvenci među vrstama (tj., Kabat i sar., loc. cit.); i (2) Pristup zasnovan na kristalografskim studijama kompleksa antigen-antitelo (Chothia, C. i sar., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). Međutim, u meri u kojoj ove dve tehnike identifikacije ostataka definišu regione preklapajućih, ali ne identičnih regiona, one se mogu kombinovati radi definisanja hibridnog CDR. Međutim, uglavnom, CDR ostaci su poželjno identifikovani u skladu sa takozvanim Kabat (brojevnim) sistemom.

[0058] Termin "okvirni region" odnosi se na prepoznate delove antitela varijabilnog regiona iz stanja tehnike koji postoje između više divergentnih (tj., hipervarijabilnih) CDR-ova. Takvi okvirni regioni se obično nazivaju okviri 1 do 4 (FR1, FR2, FR3, i FR4) i pružaju skele za prezentaciju šest CDR-ova (tri iz teškog lanca i tri iz lakog lanca) tri dimenzionalnom prostoru, da formiraju površinu koja veže antigen.

[0059] Tipično, CDR-ovi formiraju strukturu petlje koja može biti klasifikovana kao kanonska struktura. Termin "kanonska struktura" odnosi se na konformaciju glavnog lanca koja je usvojena petljama vezanja antigena (CDR). Iz uporednih strukturnih studija, nađeno je da pet od šest petlja za vezanje antigena ima samo ograničen repertoar dostupnih konformacija. Svaku kanonsku strukturu mogu karakterisati torzioni uglovi polipeptidne okosnice. Reporterske petlje između antitela mogu, zbog toga, imati veoma slične trodimenzionalne strukture, uprkos velikoj varijabilnosti sekvenci aminokiselina i u većini delova petlji (Chothia i Lesk, J. Mol. Biol., 1987, 196: 901; Chothia i sar., Nature, 1989, 342: 877; Martin i Thornton, J. Mol. Biol, 1996, 263: 800). Dalje, postoji odnos između usvojene strukture petlje i aminokiselinskih sekvenci koje je okružuju. Konformacija određene kanonske klase određena je dužinom petlje i aminokiselinskih ostataka koji se nalaze na ključnim pozicijama unutar petlje, kao i unutar sačuvanog okvira (tj., izvan petlje). Dodela određenoj kanonskoj klasi može se, dakle, izvršiti

2

na osnovu prisustva ovih ključnih aminokiselinskih ostataka. Termin "kanonska struktura" takođe može obuhvatati razmatranja u pogledu linearne sekvence antitela, na primer, kao što je katalogizirao Kabat (Kabat i sar., loc. cit.). Kabat šema numerisanja (sistem) je široko usvojen standard za numerisanje varijabilnog domena aminokiselinskih ostataka antitela na dosledan način, što je poželjna šema primenjena u ovom pronalasku kao što je takođe pomenuto drugde ovde. Dodatna strukturalna razmatranja takođe se mogu koristiti za određivanje kanonske strukturu antitela. Na primer, te razlike koje nisu u potpunosti odražene Kabat-ovim numerisanjem mogu se opisati sistemom numerisanja Chothia i sar. i/ili se otkrivaju drugim tehnikama, na primer, kristalografijom i dvo- ili tro-dimenzionalnim računarskim modeliranjem. Shodno tome, data sekvenca antitela može se svrstati u kanonsku klasu koja omogućava, između ostalog, identifikovanje odgovarajućih sekvenci skeleta (npr., zasnovano na želji da se u biblioteku uključe različite kanonske strukture). Kabat numerisanje sekvenci aminokiselina za antitela i strukturna razmatranja kao što je opisano u Chothia i sar., loc. cit. i njihove implikacije na konstruisanje kanonskih aspekata strukture antitela, su opisani u literaturi.

[0060] CDR3 je tipično najveći izvor molekularne raznolikosti unutar mesta za vezivanje antitela. H3, na primer, može biti kratak kao dva aminokiselinska ostatka ili veći od 26 aminokiselina. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina dobro su poznate u stanju tehnike. Za pregled strukture antitela, pogledajte Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow i sar., 1988. Stručnjak u ovoj oblasti prepoznaće da svaka struktura podjedinice, npr., CH, VH, CL, VL, CDR, FR struktura, sadrži aktivne fragmente, npr., deo VH, VL, ili CDR podjedinica se vezuje za antigen, tj., antigen-vezujući fragment, ili, npr., deo CH podjedinice koji vezuje za i/ili aktiviše, npr., Fc receptor i/ili komplement. CDR-ovi se obično odnose na Kabat CDR-ove, kako je opisano u sekvencama proteina od imunološkog interesa, US Department of Health i Human Services (1991), eds. Kabat i sar. Drugi standard za karakterizaciju mesta vezanja odnosi se na hipervarijabilne petlje kao što je opisano u Chothia. Videti, npr., Chothia, i sar. (1987; J. Mol. Biol.227:799-817); i Tomlinson i sar. (1995) EMBO J.14: 4628-4638. Još jedan standard je definicija AbM koju koristi softver za modeliranje antitela Oxford Molecular's AbM. Videti, uglavnom, npr., Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. U: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. i Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Realizacije opisane u odnosu na Kabat CDR-ove mogu se alternativno

2

sprovesti koristeći slične opisane odnose u odnosu na Chothia hipervarijabilne petlje ili prema AbM-definisanim petljama.

[0061] Sekvenca gena antitela posle sklapanja i somatske mutacije veoma je raznolika, i za ove raznolike gene se procenjuje da kodiraju 10<10>različitih molekula antitela (Immunoglobulin Genes, 2nd ed., eds. Jonio i sar., Academic Press, San Diego, CA, 1995). Shodno tome, imunološki sistem pruža široki repertoar imunoglobulina. Termin "repertoar" odnosi se na najmanje jednu nukleotidnu sekvencu izvedenu u celini ili delimično iz najmanje jedne sekvence koja kodira bar jedan imunoglobulin. Sekvence mogu biti generisane preuređivanjem in vivo V, D, i J segmenata teških lanaca, i V i J segmenata lakih lanaca. Alternativno, sekvence mogu biti generisane z ćelije kao odgovor na koji se dešava preuređivanje, npr., in vitro stimulacija. Alternativno, deo ili čitava sekvenca može se dobiti spajanjem DNK, nukleotidnom sintezom, mutagenezom, i drugim metodama, videti, npr., Američki patent 5,565,332. Repertoar može da sadrži samo jednu sekvencu ili može da sadrži mnoštvo sekvenci, uključujući one u genetski raznolikoj kolekciji.

[0062] Termin "vezujući molekul" ili "konstrukt antitela" u smislu ovog otkrića označava bilo koji molekul koji je sposoban da se (specifično) vezuje na, za interakciju sa ili za prepoznavanje ciljnih molekula CDH19 i CD3. Takvi molekuli ili konstrukti mogu da sadrže proteinske delove i ne-proteinske delove (npr. hemijski linkeri ili hemijska sredstva za umrežavanje poput glutaraldehida).

[0063] U slučaju da se koristi linker, ovaj linker je poželjan u dužini i u sekvenci koja je dovoljna da obezbedi da svaki prvi i drugi domen mogu, nezavisno jedan od drugog, da zadrže svoje različitosti specifičnosti vezivanja. Najpoželjnije i kako je dokumentovano u priloženim primerima, konstrukt antitela prema pronalasku je "bispecifični jednolančani konstrukt antitela", poželjnije bispecifični jednolančani Fv (scFv). Bispecifični jednolančani molekuli poznati su u struci i opisani su u WO 99/54440, Mack, J. Immunol. (1997), 158, 3965-3970, Mack, PNAS, (1995), 92, 7021-7025, Kufer, Cancer Immunol. Immunother., (1997), 45, 193-197, Löffler, Blood, (2000), 95, 6, 2098-2103, Brühl, Immunol., (2001), 166, 2420-2426, Kipriyanov, J. Mol. Biol., (1999), 293, 41-56.

2

[0064] Pomenuti promenljivi domeni sadržani u ovde opisanim konstruktima antitela mogu biti povezani dodatnim linker sekvencama. Termin "peptidni linker" definiše u skladu sa predstavljenim pronalaskom aminokiselinsku sekvencu kojim su međusobno povezane aminokiselinske sekvence prvog domena i drugog domena konstrukta antitela prema pronalasku. Osnovna tehnička karakteristika takvog peptidnog linkera je da pomenuti peptidni linker ne sadrži bilo kakvu aktivnost polimerizacije. Među pogodnim peptidnim linkerima su oni opisani u Američkim patentima 4,751,180 i 4,935,233 ili WO 88/09344. Poželjnu realizaciju peptidnog linkera karakteriše sekvenca aminokiselina Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, tj. Gly4Ser, ili njezini polimeri, tj. (Gly4Ser)x, gde x je ceo broj 1 ili veći. Karakteristike pomenutog peptidnog linkera, koje obuhvataju odsustvo promocije sekundarnih struktura su poznate u ovom polju tehnike i opisane npr. i Dall'Acqua i sar. (Biochem. (1998) 37, 9266-9273), Cheadle i sar. (Mol Immunol (1992) 29, 21-30) i Raag i Whitlow (FASEB (1995) 9(1), 73-80). Poželjni su peptidni linkeri koji takođe ne promovišu nijednu sekundarnu strukturu. Veza navedenih domena jedna sa drugom može biti obezbeđena sa, npr. genetičkim inženjeringom, kako je opisano u primerima. Metode za pripremu fuzionisanih i operativno povezanih bispecifičnih jednolančanih konstrukata i njihovu ekspresiju u ćelijama sisara ili bakterijama su dobro poznati u struci (npr. WO 99/54440 ili Sambrook i sar., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).

[0065] Za peptidne linkere, koji povezuju bar dva vezujuća domena u konstruktu antitela prema pronalasku, poželjno je da peptidni linkeri sadrže samo mali broj aminokiselinskih ostataka, npr. 12 aminokiselinskih ostataka ili manje. Prema tome, poželjni su peptidni linkeri od 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 aminokiselinskih ostataka. Predviđeni peptidni linker sa manje od 5 aminokiselina sadrži 4, 3, 2 ili jednu aminokiselinu pri čemu su poželjni linkeri bogati sa Gly. Posebno poželjna "pojedinačna" aminokiselina u kontekstu pomenutog "peptidnog linkera" je Gly. Shodno tome, pomenuti peptidni linker može se sastojati od jedne aminokiseline Gly.

[0066] Termin "multispecifičan" kako se ovde koristi odnosi se na vezujući molekul koji je konstrukt antitela i sadrži bar prvi i drugi vezujući domen, pri čemu je prvi vezujući domen sposoban da se vezuje za jedan antigen ili metu, a drugi vezujući domen sposoban da se vezuje za drugi antigen ili metu. Shodno tome, konstrukti antitela prema pronalasku sadrže bar specifičnosti za dva različita antigena ili mete i bar su bispecifični. "Konstrukt antitela" prema pronalasku takođe sadrži multispecifične vezujuće molekule kao što su npr. trispecifične vezujuće molekule, pri čemu potonji obuhvataju tri vezujuća domena.

[0067] Takođe je predviđeno da konstrukt antitela prema pronalasku ima, pored svoje funkcije da se vezuje za ciljne molekule CDH19 i CD3, dalju funkciju. U ovom formatu, konstrukt antitela je tri-ili multifunkcionalan konstrukt antitela ciljajući plazma ćelije vezanjem na CDH19, posredujući citotoksičnu T ćelijsku aktivnost vezivanjem za CD3 i obezbeđujući dalju funkciju kao što je potpuno funkcionalni Fc konstantni domen koji posreduje ćelijsku citotoksičnost zavisnu o antitelu kroz regrutovanje efektorskih ćelija poput NK ćelija, obeleživač (fluorescentni itd.), terapeutski agens poput npr. toksina ili radionuklida, i/ili sredstava za poboljšanje poluživota seruma, itd.

[0068] Termin "vezujući domen" karakteriše u vezi sa ovim pronalaskom domen koji je sposoban da se specifično vezuje za / interakciju sa datim ciljnim epitopom ili datim ciljnim mestom na ciljanim molekulima CDH19 i CD3.

Vezujući domeni mogu se izvesti od donatora vezujućeg domena kao što je na primer antitelo. Predviđeno je da vezujući domen iz prikazanog pronalaska sadrži bar pomenuti deo bilo kog od gore spomenutih vezujućih domena koji je potreban za vezivanje za / interakciju sa datim ciljnim epitopom ili određenim ciljnim mestom na ciljnim molekulima CDH19 i CD3.

[0069] Predviđeno je da se vezujući domen gore pomenutih donatora vezivanja domena karakteriše sa onim delom tih donatora koji je odgovoran za vezivanje na odgovarajući cilj, tj. kada se taj deo uklanja iz vezujućeg domena donora, pomenuti donor gubi svoju sposobnost vezivanja. "Gubitak" znači smanjenje za najmanje 50% sposobnosti vezivanja u poređenju sa donatorom vezivanja. Metode za mapiranje ovih mesta vezivanja su dobro poznate u struci -stoga je u okviru standardnog znanja iskusnog lica da locira /označi mesto vezivanja donatora vezujućeg domena i, na taj način, da "izvuče" pomenuti vezujući domen iz odgovarajućih donatora vezujućeg domena.

[0070] Termin "epitop" se odnosi na mesto na antigenu na koje se vezujući domen, kao što je antitelo ili imunoglobulin ili derivat ili fragment antitela ili imunoglobulina, specifično vezuje. "Epitope" je antigenski i pre zato se termin epitop ponekad takođe naziva kao "antigenska struktura" ili "antigenska determinanta ". Prema tome, vezujući domen je "mesto interakcije

1

antigena". Navedeno vezivanje / interakcija takođe se podrazumeva da definiše "specifično prepoznavanje". U jednom primeru, pomenuti vezujući domen koji se (specifično) vezuje za / ima interakciju sa datim ciljnim epitopom ili datim ciljnim mestom na ciljnim molekulima CDH19 i CD3 je antitelo ili imunoglobulin, i navedeni vezujući domen je VH i/ili VL region antitela ili imunoglobulina.

[0071] "Epitopi" mogu biti formirani i od susednih aminokiselina ili ne-susednih aminokiselina suprotstavljene sa tercijarnim savijanjem proteina. "Linearni epitop" je epitop gde primarna sekvenca aminokiseline sadrži prepoznati epitop. Linearni epitop tipično obuhvata najmanje 3 ili najmanje 4, i obično, najmanje 5 ili najmanje 6 ili najmanje 7, na primer, oko 8 do oko 10 aminokiselina u jedinstvenoj sekvenci.

[0072] "Konformacioni epitop" za razliku od linearnog epitopa je epitop gde primarna sekvenca aminokiselina koje sadrže epitop nije jedina priznata komponenta za definisanje epitopa (npr., epitope pri čemu primarna sekvenca aminokiselina nije nužno prepoznata sa vezujućim domenom). Tipično konformacioni epitop sadrži povećan broj aminokiselina u odnosu na linearni epitop. Što se tiče prepoznavanja konformacionih epitopa, vezujući domen prepoznaje trodimenzionalnu strukturu antigena, poželjno peptida ili proteina ili njihovog fragmenta (u kontekstu ovog pronalaska, antigen za jedan od vezujućih domena se nalazi u okviru proteina CDH19). Na primer, kada se molekul proteina savije da formira trodimenzionalnu strukturu, određene aminokiseline i/ili okosnica polipeptida koji formiraju konformacioni epitop postaju međusobno suprotstavljeni što omogućava antitelu da prepozna epitop. Metode za određivanje konformacije epitopa obuhvataju, ali nisu ograničene na, rentgensku kristalografiju, spektroskopiju dvodimenzionalnom nuklearnom magnetnom rezonancom (2D-NMR) spektroskopiju i lokalno usmereno spinovanje i spektroskopiju elektronskom para magnetnom rezonancom (EPR). Štaviše, navedeni primeri opisuju dalju metodu za karakterizaciju datog vezujućeg domena pomoću stavljanja u kore, što obuhvata ispitivanje da li se dati vezujući domen vezuje na jedan ili više epitopskih klastera datog proteina, naročito na CDH19.

[0073] Kako se ovde koristi, termin "klaster epitopa" označava celokupnost epitopa koji leže u definisanom neprekidnom delu antigena. Klaster epitopa može da sadrži jedan, dva ili više

2

epitopa. Koncept klastera epitopa se takođe koristi za karakterizaciju karakteristika konstrukta antitela iz ovog pronalaska.

[0074] Termini "(sposoban) za vezivanje na", "specifično prepoznaje", "usmeren na" i "reaguje sa" znače u skladu sa ovim pronalaskom da je vezujući domen sposoban za specifičnu interakciju sa jednom ili više, poželjno bar dve, poželjnije bar tri i najpoželjnije najmanje četiri aminokiseline iz epitopa.

[0075] Kako se ovde koriste, termini "specifična interakcija", "specifično vezivanje" ili "specifična vezivanja" znače da vezujući domen ispoljava značajan afinitet za određeni protein ili antigen i uopšte ne pokazuje značajnu reaktivnost sa proteinima ili antigenima koji nisu CDH19 ili CD3. " Uočljiv afinitet" uključuje vezivanje sa afinitetom od oko 10<-6>M (KD) ili jačim. Poželjno, vezivanje se smatra specifičnim kada je afinitet vezivanja oko 10<-12>do 10<-8>M, 10<-12>do 10<-9>M, 10<-12>do 10<-10>M, 10<-11>do 10<-8>M, poželjno od oko 10<-11>do 10<-9>M. Da li vezujući domen specifično reaguje ili se veže za cilj može se lako testirati sa, između ostalog, upoređivanjem reakcije navedenog vezujućeg domena sa ciljanim proteinom ili antigenom sa reakcijom navedenog vezujućeg domena sa proteinima ili antigenima koji nisu CDH19 ili CD3. Poželjno, vezujući domen prema pronalasku se u suštini ne vezuje ili nije sposoban da se vezuje za proteine ili antigene koji nisu CDH19 ili CD3 (tj. prvi vezujući domen nije sposoban da se vezuje za proteine koji nisu CDH19 i drugi vezujući domen nije sposoban da se vezuje za proteine koji nisu CD3).

[0076] Termin "suštinski ne vezuje", ili "nije sposoban za vezivanje" znači da vezujući domen prikazanog pronalaska ne vezuje drugi protein ili antigen osim CDH19 ili CD3, tj., ne pokazuje reaktivnost od više od 30%, poželjno ne više od 20%, poželjnije ne više od 10%, naročito poželjno ne više od 9%, 8%, 7%, 6% ili 5% sa proteinima ili antigenima osim CDH19 ili CD3, pri čemu je vezivanje za CDH19 ili CD3, redom, postavljeno da bude 100%.

[0077] Za specifično vezivanje se veruje da se izvršava sa specifičnim motivima u aminokiselinskoj sekvenci vezujućeg domena i antigena. Prema tome, vezivanje se postiže kao rezultat njihove primarne, sekundarne i/ili tercijarne strukture kao i rezultata sekundarnih modifikacija pomenutih struktura. Specifična interakcija mesta interakcije antigena sa njegovim specifičnim antigenom može rezultovati jednostavnim vezivanjem navedenog mesta na antigen. Štaviše, specifična interakcija mesta interakcije antigena sa njegovim specifičnim antigenom može alternativno ili dodatno rezultovati pokretanjem signala, npr. usled indukcije promene konformacije antigena, oligomerizacije antigena, itd.

[0078] Proteini (uključujući njihove fragmente, poželjno biološki aktivne fragmente, i peptide, obično imaju manje od 30 aminokiselina) sadrže jednu ili više aminokiselina međusobno kuplovane preko kovalentne peptidne veze (što rezultuje sa lancem aminokiselina). Termin "polipeptid" kako se ovde koristi opisuje grupu molekula, koja se sastoji od više od 30 aminokiselina. Polipeptidi mogu dalje formirati multimere poput dimera, trimera i viših oligomera, tj. sastoje se od više polipeptidnih molekula. Polipeptidni molekuli koji formiraju takve dimere, trimere itd. mogu biti identični ili ne-identični. Odgovarajuće strukture višeg reda takvih multimera su, prema tome, nazvane homo- ili heterodimeri, homo- ili heterotrimeri itd. Primer za hereteromultimer je molekul antitela, koji se u svom prirodnom obliku sastoji od dva identična laka polipeptidna lanca i dva identična teška polipeptidna lanca Termini "polipeptid" i "protein" takođe se odnose na prirodno modifikovane polipeptide/proteine gde je modifikacija izvršena npr. sa post-translacionim modifikacijama poput glikozilacije, acetilacije, fosforilacije i slično. Kada se ovde misli na "polipeptid" on može takođe da bude hemijski modifikovan kao što je pegilovan. Takve modifikacije su dobro poznate u ovoj oblasti tehnike.

[0079] "Izolovan", kada se koristi da se opiše ovde otkriven konstrukt antitela, označava konstrukt antitela koji je identifikovan, odvojen i/ili oporavljen iz komponente u njegovom proizvodnom okruženju. Poželjno, izolovani konstrukt antitela se ne povezuje sa svim ostalim komponentama iz njegovog proizvodnog okruženja. Kontaminantne komponente njegovog proizvodnog okruženja, poput one koja rezultuje iz rekombinantnih transfektovanih ćelija, su materijali koji obično ometaju dijagnostičko ili terapijsko korišćenje polipeptida i mogu obuhvatati enzime, hormone i druge proteinske ili ne-proteinske rastvore. U poželjnim realizacijama, konstrukt antitela će biti prečišćen (1) do stepena dovoljnog da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence korišćenjem okretnog sekvenatora, ili (2) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod ne-redukujućim ili redukujućim uslovima korišćenjem Coomassie plavog ili, poželjno, bojanjem srebrom. Međutim, obično, izolovano antitelo će se pripremiti bar jednim korakom prečišćavanja.

4

[0080] Razmotrene su modifikacije sekvenci amino kiselina ovde opisanih konstrukata antitela. Na primer, može biti poželjno da se poboljša afinitet vezivanja i/ili druge biološke karakteristike antitela. Varijante sekvenci aminokiselina konstrukata antitela se pripremaju uvođenjem odgovarajućih nukleotidnih promena u nukleinsku kiselinu konstrukata antitela, ili sintezom peptida.

[0081] Takve modifikacije obuhvataju, na primer, delecije iz, i/ili insercije u, i/ili supstitucije ostataka unutar aminokiselinskih sekvenci konstrukata antitela. Bilo koja kombinacija delecija, insercija, i supstitucija se vrši se da bi se dobio konačni konstrukt, pod uslovom da krajnji konstrukt poseduje željene karakteristike. Promene aminokiselina takođe mogu promeniti procese translacionih konstrukata antitela, kao što je promena broja ili položaja mesta glikozilacije. Poželjno, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselina može biti supstituisano u CDR, dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 25 aminokiselina može biti supstituisano u okvirnim regionima (FR-ovi). Supstitucije su po mogućnosti konzervativne supstitucije kao što je ovde opisano. Dodatno ili alternativno, 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 aminokiselina može biti ubačeno ili izbrisano u svakom od CDR-ova (naravno, zavisno od njihove dužine), dok 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili 25 aminokiselina može biti ubačeno ili izbrisano u svakom od FR-ova.

[0082] Korisna metoda za identifikaciju određenih ostataka ili regiona konstrukta antitela koje su pogodne lokacije za mutagenezu nazvana je "alanin skenirajuća mutageneza" kako je opisano u Cunningham i Wells u Science, 244: 1081-1085 (1989). Ovde je identifikovan ostatak ili grupa ciljnih ostataka unutar konstrukta antitela (npr. naelektrisani ostaci kao što su arg, asp, his, lys, i glu) i zamenjeni neutralnom ili negativno naelektrisanom aminokiselinom (najpoželjnije alanin ili polialanin) da utiču na interakciju aminokiselina sa epitopom.

[0083] Te lokacije aminokiselina koje pokazuju funkcionalnu osetljivost na supstitucije zatim su rafinirane uvođenjem daljih ili drugih varijanti na, ili za, mesta supstitucije. Prema tome, dok je mesto za uvođenje varijacije aminokiselinskih sekvenci unapred određeno, priroda mutacija sama po sebi ne mora da bude unapred određena. Na primer, za analizu performansi mutacije na datom mestu, ala skeniranje ili slučajna mutageneza izvedena je na ciljanom kodonu ili regionu i eksprimirane varijante konstrukta antitela su pregledane na željenu aktivnost.

[0084] Poželjno, insercije aminokiselinskih sekvenci uključuju amino- i/ili karboksilne terminalne fuzije u dužini od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 ostataka do polipeptida koji sadrže stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvencijalne insercije pojedinih ili više aminokiselinskih ostataka. Insercijska varijanta konstrukta antitela uključuje fuziju N-ili C-terminalnog kraja antitela na enzim ili fuziju u polipeptid što povećava serumski poluživot antitela.

[0085] Drugi tip varijante je varijanta supstitucije aminokiseline. Ove varijante su poželjno najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 aminokiselinskih ostataka u konstruktu antitela zamenjene sa drugim ostatkom Mesta od najvećeg interesovanja za supstitucionu mutagenezu uključuju CDR-ove teškog i/ili lakog lanca, posebno hipervarijabilne regione, se takođe razmatraju FR promene u teškom i/ili lakom lancu.

[0086] Na primer, ako CDR sekvenca obuhvata 6 aminokiselina, predviđeno je da jedna, dve ili tri od ovih aminokiselina su supstituisane. Slično tome, ako CDR sekvenca obuhvata 15 aminokiselina predviđeno je da jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest ovih aminokiselina budu supstituisane.

[0087] Uglavnom, ako su aminokiseline supstituisane u jednom ili više ili u svim CDR-ovima teškog i/ili lakog lanca, poželjno je da tada dobijena "supstituisana" sekvenca ima najmanje 60%, poželjnije 65%, još poželjnije 70%, posebno poželjno 75%, još posebno poželjno 80% identičnosti sa "originalnom" CDR sekvencom. To znači da je zavisna od dužine CDR-a u kojoj je meri identična "supstituisanoj" sekvenci. Na primer, CDR koji sadrži 5 aminokiselina je poželjno 80% identičan svojoj supstituisanoj sekvenci kako bi imali najmanje jednu supstituisanu aminokiselinu. Shodno tome, CDR-ovi konstrukta antitela mogu imati različit stepen identičnosti u odnosu na supstituisane sekvence, npr., CDRL1 može imati 80%, dok CDRL3 može imati 90%.

[0088] Poželjne supstitucije (ili zamene) su konzervativne supstitucije. Međutim, bilo koja supstitucija (uključujući ne konzervativnu supstituciju ili jednu ili više iz „oglednih supstitucija“ navedenih u Tabeli 1, dole) j je predviđena sve dok konstrukt antitela zadržava svoju sposobnost da se veže za CDH19 preko prvog vezujućeg domena i za CD3 epsilon preko drugog vezujućeg domena i/ili njegovi CDR-ovi imaju identičnost sa tada supstituisanom sekvencom (najmanje 60%, poželjnije 65%, još poželjnije 70%, naročito poželjno 75%, još naročito poželjno 80% identičnosti sa "originalnom" CDR sekvencom).

[0089] Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 pod naslovom "poželjne supstitucije". Ako takve supstitucije rezultuju promenom biološke aktivnosti, tada se mogu uvesti značajnije promene, označene kao "ogledne supstitucije" u Tabeli 1, ili kao što je dalje opisano u vezi sa klasama aminokiselina, te se produkti pregledavaju radi željene karakteristike.

Tabela 1: Supstitucije aminokiselina

[0090] Značajne modifikacije u biološkim svojstvima konstrukta antitela predmetnog otkrića su postignute izborom supstitucija koje se značajno razlikuju u njihovom uticaju na održavanje (a) strukture okosnice polipeptida u oblasti supstitucije, na primer, kao ploča ili spiralna konformacija, (b) naboj ili hidrofobnost molekula na ciljnom mestu, ili (c) najveći deo bočnog lanca. Ostaci koji se javljaju prirodno su podeljeni u grupe na osnovu zajedničkih karakteristika bočnih lanaca: (1) hidrofobni: norleucin, met, ala, val, leu, ile; (2) neutralni hidrofilni: cys, ser, thr; (3) kiseli: asp, glu; (4) bazični: asn, gin, his, lys, arg; (5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: gly, pro; i (6) aromatični: trp, tyr, phe.

[0091] Nekonzervativne supstitucije podrazumevaće zamenu člana jedne od ovih klasa za drugu klasu. Bilo koji ostatak cisteina koji nije uključen u održavanje odgovarajuće konformacije konstrukta antitela može biti supstituisan, uglavnom sa serinom, da bi se poboljšala oksidaciona stabilnost molekula i sprečilo aberantno umrežavanje. Suprotno tome, cisteinska veza(e) mogu se dodati antitelu da bi se poboljšala njegova stabilnost (naročito gde je antitelo fragment antitela, kao što je Fv fragment).

[0092] Posebno preferirani tip supstitucione varijante obuhvata zamenu jednog ili više ostataka hipervarijabilnog regiona roditeljskog antitela (npr. humanizovano ili humano antitelo). Uglavnom, rezultujuća varijanta(e) odabrana za dalji razvoj imaće poboljšana biološka svojstva u odnosu na roditeljsko antitelo iz koga je generisana. Pogodan način za generisanje takvih supstitucionih varijanti uključuje sazrevanje afiniteta pomoću prikaza faga. Ukratko, nekoliko mesta hipervarijabilnog regiona (npr. 6-7 mesta) se mutiraju da bi se stvorile sve moguće supstitucije aminokiselina na svakom mestu. Tako generisane varijante antitela prikazane su na monovalentan način od čestica filamentnih faga kao fuzija do produkta gena III od M13 koji je pakovan unutar svake čestice. Zatim su prikazane varijante faga pregledavane na biološku aktivnost (npr. afinitet vezivanja) kao što je ovde otkriveno. Da bi se identifikovala mesta hipervarijabilnog regiona za modifikaciju, može se izvesti mutageneza skeniranja alanina radi identifikacije ostataka hipervarijabilnog regiona koji značajno doprinose vezivanju antigena. Alternativno, ili dodatno, može biti korisno analizirati kristalnu strukturu kompleksa antigenantitelo kako bi se identifikovale tačke kontakta između vezujućeg domena i, npr., humanog CDH19. Takvi kontaktni ostaci i susedni ostaci su kandidati za supstituciju prema ovde opisanim tehnikama. Jednom kada se generišu takve varijante, panel varijanti je podvrgnut skriningu kao što je ovde opisano i za dalji razvoj mogu biti odabrana antitela sa superiornim karakteristikama u jednom ili više relevantnih ispitivanja.

[0093] Ovde su razmatrane druge modifikacije konstrukta antitela. Na primer, konstrukt antitela može da bude povezan sa jednim od različitih ne-proteinskih polimera, npr., polietilen glikolom, polipropilen glikolom, polioksialkilenima, ili kopolimerima polietilen glikola i polipropilen glikola. Konstrukt antitela se takođe može ugraditi u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom (na primer, hidroksimetilcelulozom ili mikrokapsulama želatine i poli (metilmetakilatnim) mikrokapsulama, redom), u koloidnim sistemima za dostavu lekova (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule), ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u publikaciji Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. izdanje, Oslo, A., Ed., (1980).

[0094] Konstrukti antitela koji su ovde otkriveni mogu takođe da se formulišu kao imunolipozomi. "Lipozom" je mala vezikula sastavljena od različitih vrsta lipida, fosfolipida i/ili surfaktanata koja je korisna za isporuku leka sisaru. Komponente lipozoma su obično uređene u okviru dvoslojne formacije, slično rasporedu lipida bioloških membrana. Lipozomi koji sadrže antitelo su pripremljeni postupcima poznatim u struci, kao što je opisano u Epstein i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 82: 3688 (1985); Hwang i sar. , Proc. Natl Acad. Sci. SAD, 77: 4030 (1980); američki patenti br. 4,485,045 i 4,544,545; i WO 97/38731 objavljeni 23. oktobra 1997. Lipozomi sa povećanim vremenom cirkulacije otkriveni su u američkom patentu br. 5,013, 556. Posebno korisni lipozomi mogu se proizvesti metodom isparavanja iz reverzne faze sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju pomoću filtera definisane veličine pora da bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom. Fab' Lipozomi se ekstrudiraju pomoću filtera definisane veličine pora da bi se dobili lipozomi sa željenim prečnikom antitela iz prikazanog pronalaska mogu se konjugovati sa lipozomima kako je opisano u Martin i sar. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982) preko reakcije disulfidne razmene. Hemoterapeutsko sredstvo je opciono sadržano unutar lipozoma. Videti Gabizon i sar. J. National Cancer Inst.

81 (19) 1484 (1989).

[0095] Kada se koriste rekombinantne tehnike, konstrukt antitela može biti proizveden intracelularno, u periplazmatskom prostoru, ili se direktno izlučuje u medijumu. Ako se konstrukt antitela proizvodi intracelularno, kao prvi korak, ostaci čestica, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter i sar., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisuje postupak izolacije antitela koja se izlučuju u periplazmatski prostor E. coli.

[0096] Kompozicija konstrukta antitela koja je pripremljena iz ćelija može biti prečišćena korišćenjem, na primer, hidroksilapatitnom hromatografijom, gel elektroforezom, dijalizom, i afinitetnom hromatografijom, gde je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja.

[0097] Termin "nukleinska kiselina" je dobro poznat stručnjaku i obuhvata DNK (kao što je cDNK) i RNK (kao što je mRNK). Nukleinska kiselina može biti dvolančana, jednolančana, linearna i kružna. Navedeni molekul nukleinske kiseline se poželjno nalazi u vektoru koji je poželjno sadržan u ćeliji domaćinu. Spomenuta ćelija domaćin je, na primer, nakon transformacije ili transfekcije sekvencom nukleinske kiseline iz ovog pronalaska, sposobna da eksprimira konstrukt antitela. U tu svrhu, molekul nukleinske kiseline je operativno povezan sa kontrolnim sekvencama.

[0098] Vektor je molekul nukleinske kiseline koji se koristi kao vehikul za prenos (stranog) genetskog materijala u ćeliju. Termin "vektor" obuhvata - ali nije ograničen na - plazmide, viruse, kozmide i veštačke hromozome. Uglavnom, konstruisani vektori sadrže poreklo replikacije, mesto multikloniranja i marker koji se može birati. Sam vektor je uglavnom nukleotidna sekvenca, obično DNK sekvenca, koja sadrži umetak (transgen) i veću sekvencu koja služi kao "okosnica" vektora. Savremeni vektori mogu da obuhvate i dodatne karakteristike pored transgenog umetka i okosnice: promotor, genetski marker, rezistenciju na antibiotike, reporterski gen, ciljajuću sekvencu, obeleživač za prečišćavanje proteina. Vektori koji se nazivaju ekspresijski vektori (ekspresijski konstrukti) specifični su za ekspresiju transgena u ciljnoj ćeliji, i obično imaju kontrolne sekvence kao što je promotorska sekvenca koja pokreće ekspresiju transgena. Umetanje vektora u ciljanu ćeliju obično se naziva "transformacija" za bakterije, "transfekcija" za eukariotske ćelije, mada se ubacivanje virusnog vektora takođe naziva "transdukcija".

4

[0099] Kako se ovde koristi, termin " ćelija domaćin" se odnosi na ćeliju u koju se nukleinska kiselina koja kodira konstrukciju antitela iz ovog pronalaska uvodi putem transformacije, transfekcije i slično. Treba razumeti da se takvi termini ne odnose samo na određenu predmetnu ćeliju već i na potomstvo ili potencijalno potomstvo takve ćeli. Budući da se u sledećim generacijama mogu dogoditi određene modifikacije ili zbog mutacija ili uticaja okoline, takvi potomci u stvari ne mogu biti identični matičnoj ćeliji, ali su još uvek uključeni u obim termina kako se ovde koristi.

[0100] Kako se ovde koristi, termin "ekspresija" obuhvata bilo koji korak u proizvodnji antitela konstrukta antitela prema pronalasku uključujući, ali ne ograničavajući se na, transkripciju, post-transkripcione modifikacije, translaciju, post-translacione modifikacije, i sekreciju.

[0101] Termin " kontrolne sekvence" označava DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćinu. Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, opciono operativnu sekvencu, i vezujuće mesto za ribozome. Poznato je da se eukariotske ćelije koriste promotorima, signalima poliadenilacije i pojačivačima.

[0102] Nukleinska kiselina je "operativno povezana" kada je stavljena u funkcionalnu vezu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za predsekvencu ili sekretorni lider je operativno povezan sa DNK za polipeptid ako je eksprimirana kao predprotein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili pojačivač je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili mesto vezivanja ribozoma je operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da translaciju. Uglavnom, termin "operativno povezan" znači da su DNK sekvence koje se povezuju neprekidne, te u slučaju sekretornog vođe neprekidne i u fazi čitanja. Međutim, pojačivači ne moraju da budu neprekidni. Povezivanje se ostvaruje ligacijom na pogodnim mestima restrikcije. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetički oligonukleotidni adapteri ili linkeri u skladu sa uobičajenom praksom.

[0103] Termini " ćelija domaćin", "ciljna ćelija" ili "ćelija primaoc" treba da uključi svaku pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može biti ili je bila primaoc za vektore ili inkorporisanje egzogenih molekula nukleinske kiseline, polinukleotida i/ili proteina. Takođe je predviđeno da uključi potomstvo jedne ćelije, a potomstvo ne mora nužno da bude potpuno identično (u morfologiji ili u genomskom ili ukupnom komplementu DNK) sa originalnom matičnom ćelijom zbog prirodne, slučajne ili namerne mutacije. Ćelije mogu da budu prokariotske ili eukariotske i obuhvataju, ali nisu ograničene na bakterije, ćelije kvasca, životinjske ćelije i ćelije sisara, npr., mišje, pacova, makaki majmuna ili čoveka.

[0104] Pogodne ćelije domaćini obuhvataju prokariotske i eukariotske ćelije domaćine uključujući kvasce, gljive, ćelije insekata i ćelije sisara.

[0105] Konstrukt antitela prema pronalasku može se proizvesti u bakterijama. Posle ekspresije, konstrukt antitela iz ovog pronalaska, poželjno konstrukt antitela je izolovan iz ćelije E. coli u rastvorljivoj frakciji i može se prečistiti, npr., afinitetnom hromatografijom i/ili hromatografijom isključenjem veličine. Konačno prečišćavanje se može izvesti slično procesu prečišćavanja antitela eksprimiranog na primer, u CHO ćelijama.

[0106] Pored prokariota, eukariotski mikrobi poput filamentoznih gljivica ili kvasca su pogodni za kloniranje ili domaćini ekspresije za konstrukt antitela prema pronalasku. Saccharomyces cerevisiae, ili obični pekarski kvas, se najčešće koristi među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćina. Međutim, brojni drugi rodovi, vrste i sojevi su ovde dostupni i korisni, poput Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces domaćini poput, npr., K. lactis, K. fragilis (ATCC 12424), K. bulgaricus (ATCC 16045), K. wickeramii (ATCC 24178), K. waltii (ATCC 56500), K. drosophilarum (ATCC 36906), K. thermotolerans, i K. marxianus; yarrowia (EP 402 226); Pichia pastoris (EP 183 070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244 234); Neurospora crassa; Schwanniomyces poput Schwanniomyces occidentalis; i filamentozne gljivice poput, npr., Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, i domaćini Aspergillus poput A. nidulans i A. niger.

[0107] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog konstrukta antitela prema pronalasku, poželjno konstrukti antitela dobijeni iz antitela su izvedene iz višećelijskih organizama. Primeri ćelija beskičmenjaka obuhvataju ćelije biljaka i insekata. Identifikovani su brojni bakuloviralni sojevi i varijante i odgovarajuće dozvoljene ćelije domaćina insekata iz domaćina poput Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna muva), i Bombyx mori. Različiti virusni sojevi za transfekciju su javno dostupni, npr. , L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soja Bombyx mori NPV, a takvi se virusi ovde mogu koristiti kao virus prema ovom pronalasku, naročito za transfekciju ćelija Spodoptera frugiperda.

[0108] Ćelijske kulture biljaka pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, Arabidopsis i duvana mogu se takođe koristiti kao domaćini. Vektori kloniranja i ekspresije korisni u proizvodnji proteina u biljnoj ćelijskoj kulturi poznati su onima koji poznaju ovu oblast tehnike. Videti npr. Hiatt i sar., Nature (1989) 342: 76-78, Owen i sar. (1992) Bio/Technology 10: 790-794, Artsaenko i sar. (1995) The Plant J 8: 745-750, i Fecker i sar. (1996) Plant Mol Biol 32: 979-986.

[0109] Međutim, interes je najveći u ćelijama kičmenjaka, i propagacija ćelija kičmenjaka u kulturi (propagacija ćelija kičmenjaka u kulturi) postala je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su linija bubrega majmuna CV1 transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionska bubrežna linija (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzionoj kulturi, Graham i sar. , J. Gen Virol.36 : 59 (1977)); ćelije bubrega beba hrčaka (BHK, ATCC CCL 10); jajne ćelije kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 77: 4216 (1980)); mišje sertoli ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod.23: 243-251 (1980)); ćelije majmunskih bubrega (CVI ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL1587) ; ljudske ćelije karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije bubrega psa (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ljudske ćelije pluća (W138, ATCC CCL 75); ljudske ćelije jetre (Hep G2,1413 8065); mišji tumor dojke (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather i sar., Annals N. Y Acad. Sci.383 : 44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i humana linija hepatoma (Hep G2).

[0110] Kada se koriste rekombinantne tehnike, konstrukt antitela prema pronalasku može se proizvesti intracelularno, u periplazmatskom prostoru, ili direktno u medijumu. Ako se konstrukt antitela proizvodi intracelularno, kao prvi korak, ostaci čestica, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, uklanjaju se, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter i sar., Bio/Technology 10: 163-167 (1992) opisuju postupak izolacije antitela koja se izlučuju u periplazmatski prostor E. coli. Ukratko, ćelijska pasta se odmrzava u prisustvu natrijum acetata (pH 3.5), EDTA, i fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF) tokom oko 30 min. Stanični ostaci se

4

mogu ukloniti centrifugiranjem. Kada se antitelo izlučuje u medijum, supernatanti iz takvih sistema ekspresije se obično prvo koncentrišu pomoću komercijalno dostupnog filtra za koncentraciju proteina, na primer, jedinica za ultrafiltraciju Amicon ili Millipore Pellicon. Inhibitor proteaze kao što je PMSF može biti uključen u bilo koji od prethodnih koraka za inhibiciju proteolize i antibiotici mogu biti uključeni da spreče rast slučajnih kontaminanata.

[0111] Konstrukt antitela prema pronalasku dobijen iz ćelija domaćina može biti prečišćen korišćenjem, na primer, hidroksilapatitnom hromatografijom, gel elektroforezom, dijalizom i afinitetnom hromatografijom, pri čemu je afinitetna hromatografija poželjna tehnika prečišćavanja.

[0112] Matrica za koju je vezan afinitetni ligand najčešće je agaroza, ali su dostupne i druge matrice. Mehanički stabilne matrice kao što su kontrolisano porozno staklo ili poli (stirendivinil) benzen omogućavaju veće brzine protoka i kraća vremena tretmana nego što se to može postići sa agarozom. Gde konstrukt antitela prema pronalasku sadrži CH3 domen, za prečišćavanje je koristan Bakerbond ABXMresin (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ). Ostale tehnike za prečišćavanje proteina kao što su frakcionisanje na koloni za izmenu jona, taloženje etanola, HPLC reverzne faze, hromatografija na silicijum dioksidu, hromatografija na heparin SEPHAROSE™, hromatografija na anjonskoj ili katjonskoj razmenjivačkoj smoli (kao što je kolona poliaspartinske kiseline), hromato-fokusiranje, SDS-PAGE, i taloženje amonijum sulfata su takođe dostupne u zavisnosti od antitela koje se treba dobiti.

[0113] Termin "kultiviranje" odnosi se na in vitro održavanje, diferencijaciju, rast, proliferaciju i/ili razmnožavanje ćelija pod pogodnim uslovima u medijumu.

[0114] Kako se ovde koristi, termin "farmaceutska kompozicija" se odnosi na kompoziciju za davanje pacijentu, poželjno humanom pacijentu. Posebno poželjna farmaceutska kompozicija iz ovog pronalaska sadrži konstrukt antitela prema pronalasku. Poželjno, farmaceutska kompozicija sadrži pogodne formulacije nosača, stabilizatora i/ili ekscipijenata. U poželjnoj realizaciji, farmaceutska kompozicija sadrži kompoziciju za parenteralno, transdermalno, intraluminalno, intraarterijsko, intratekalno i/ili intranazalno davanje ili direktnom injekcijom u tkivo. Posebno je predviđeno da se navedena kompozicija daje pacijentu putem infuzije ili injekcije. Davanje pogodnih kompozicija može se izvršiti na različite načine, npr., davanjem intravenozno, intraperitonealno, potkožno, intramuskularno, topikalno ili intradermalno. Posebno, ovaj pronalazak obezbeđuje neprekidno davanje pogodne kompozicije. Kao ne ograničavajući primer, neprekidno, tj. kontinuirano davanje može se ostvariti malim pumpnim sistemom koji nosi pacijent radi merenja priliva terapeutskog sredstva u telo pacijenta. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konstrukt antitela prema pronalasku može se davati korišćenjem pomenutih pumpnih sistema. Takvi pumpni sistemi su opšte poznati u stanju tehnike i obično se oslanjaju na periodičnu zamenu patrona koje sadrže terapeutsko sredstvo koje se treba davati infuzijom. Kada se zamenjuje patrona u takvom pumpnom sistemu, može doći do privremenog prekida inače neprekidnog protoka terapeutskog sredstva u telo pacijenta. U takvom slučaju, faza davanja pre zamene patrone i faza davanja posle zamene patrone će se i dalje razmotriti unutar značenja farmaceutskih sredstava i metode prema pronalasku zajedno čine jednu "neprekidnu primenu" takvog terapeutskog sredstva.

[0115] Kontinuirana ili neprekidna primena ovih konstrukata antitela prema pronalasku može da bude intravenozna ili subkutana pomoću uređaja za isporuku fluida ili malog pumpnog sistema uključujući fluid mehanizam za pogon fluida za fluid pokretanje fluida iz rezervoara i mehanizam za aktiviranje za aktiviranje mehanizma za pogon. Pumpni sistemi za potkožno davanje mogu sadržati iglu ili kanilu za prodiranje u kožu pacijenta i dovođenje odgovarajuće kompozicije u telo pacijenta. Navedeni pumpni sistemi mogu se direktno fiksirati ili pričvrstiti na kožu pacijenta nezavisno od vene, arterije ili krvnih žila, omogućavajući tako direktan kontakt između pumpnog sistema i kože pacijenta. Pumpni sistem može da se pričvrsti na kožu pacijenta tokom 24 sata do nekoliko dana. Pumpni sistem može biti malih dimenzija i sa rezervoarom za male zapremine. Kao ne ograničavajući primer, zapremina rezervoara za odgovarajuću farmaceutsku kompoziciju koja se primenjuje može biti između 0,1 i 50 ml.

[0116] Kontinuirana primena može biti transdermalna putem flastera koji se nosi na koži i koji se zamenjuje u intervalima. Stručnjak u ovoj oblasti je svestan sistema flastera za isporuku lekova koji su pogodni za ovu svrhu. Treba primetiti da je transdermalna primena posebno podložna neprekidnoj primeni, jer se zamena prvog iskorišćenoga flastera može pogodno izvršiti istovremeno sa postavljanjem novog, drugog flastera, na primer na površini kože odmah pored prvog iskorišćenoga flastera i neposredno pre uklanjanja prvog iskorišćenoga flastera. Ne dolazi do problema sa prekidom protoka ili kvarom napajanja.

4

[0117] Inventivne kompozicije pronalaska mogu dalje da sadrže farmaceutski prihvatljiv nosač. Primeri pogodnih farmaceutskih nosača su dobro poznati u tehnici i uključuju rastvore, npr. fiziološke otopine puferirane fosfatima, vodu, emulzije, kao što su emulzije ulje/voda, razne vrste ovlaživača, sterilni rastvori, lipozomi, itd. Kompozicije koje sadrže takve nosače mogu biti formulisane prema dobro poznatim konvencionalnim metodama. Formulacije mogu da sadrže ugljene hidrate, puferske rastvore, aminokiseline i/ili surfaktante. Ugljeni hidrati mogu da budu ne-redukujući šećeri, poželjno trehaloza, saharoza, oktasulfat, sorbitol ili ksilitol. Uglavnom, kako se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljiv nosač" označava bilo koji i sve rastvarače, medijume za disperziju, obloge, antibakterijska i antifungalna sredstva, izotonička sredstva i sredstva za odlaganje apsorpcije, kompatibilna sa farmaceutskom primenom. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance je dobro poznata u stanju tehnike. Prihvatljivi nosači, pomoćne tvari ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama i obuhvataju: dodatna puferirajuća sredstva; konzervanse; ko-rastvarače; antioksidante, uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; helatorska sredstva kao što je EDTA; metalne komplekse (npr., kompleksi Zn-protein); biorazgradive polimere, poput poliestera; kontra-jone koji grade sol, kao što su natrijum, holihidroksilni šećerni alkoholi; aminokiseline kao što su alanin, glicin, asparagin, 2-fenilalanin i treonin; šećeri ili šećerni alkoholi, poput trehaloze, saharoze, oktansulfata, sorbitola ili ksilitol stahioze, manoze, sorboze, ksiloze, riboze, mioinisitoze, galaktoze, laktitola, ribitola, mioinizitola, galaktitola, glicerola, ciklitola (npr., inozitol), polietilen glikola; redukciona sredstva koja sadrže sumpor, kao što su glutation, tioktična kiselina, natrijum tioglikolat, tioglicerol, [alfa]-monotioglicerol, i natrijum tio sulfat; proteini male molekulske mase, kao što su ljudski serumski albumin, goveđi serumski albumin, želatina ili drugi imunoglobulini; i hidrofilni polimeri, poput polivinilpirolidona. Takve formulacije mogu da se koriste za kontinuirano davanje koje može biti intravenozno ili subkutano sa i/ili bez pumpnih sistema. Aminokiseline mogu biti nabijene aminokiseline, poželjno lizin, lizin acetat, arginin, glutamat i/ili histidin. Surfaktanti mogu biti deterdženti, poželjno sa molekulskom masom od >1.2 KD i/ili polieter, poželjno sa molekulskom masom od >3 KD. Ne ograničavajući primeri poželjnih deterdženata su Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 ili Tween 85. Ne ograničavajući primeri poželjnih polietera su PEG 3000, PEG 3350, PEG 4000 ili PEG 5000. Sistemi pufera korišćeni u ovom pronalasku mogu imati poželjan pH od 5-9 i mogu da sadrže citrat, sukcinat, fosfat, histidin i acetat.

4

[0118] Kompozicije prikazanog pronalaska se mogu davati subjektu u pogodnoj dozi koja se može odrediti npr. studijama eskalacije doze primenom rastućih doza polipeptida prema pronalasku koji ispoljavaju ovde opisanu unakrsnu specifičnost vrsta na primate koji nisu čimpanze, na primer makaki majmuni. Kao što je gore navedeno, konstrukt antitela prema pronalasku koji ispoljava ovde opisanu unakrsnu specifičnost vrsta može se povoljno koristiti u identičnom obliku u pretkliničkim ispitivanjima na primate koji nisu čimpanze i kao lek kod ljudi. Ove kompozicije se takođe mogu primenjivati u kombinaciji sa drugim proteinskim i neproteinskim lekovima. Ovi lekovi se mogu primenjivati istovremeno sa kompozicijom koja sadrži polipeptid iz ovog pronalaska kao što je ovde definisano ili odvojeno pre ili posle primene pomenutog polipeptida u blagovremeno definisanim intervalima i dozama. Režim doziranja će odrediti lekar i klinički faktori. Kao što je dobro poznato u medicini, doziranje za bilo kojeg pacijenta zavisi od mnogih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, određeno jedinjenje koje se treba davati, pol, vreme i put primene, opšte zdravstveno stanje i druge lekove koji se daju istovremeno.

[0119] Preparati za parenteralnu primenu obuhvataju sterilne vodene ili ne-vodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri ne-vodenih rastvarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja poput maslinovog ulja i organski estri koji se mogu injektirati kao što je etil oleat. Vodeni nosači obuhvataju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući fiziološki rastvor i puferirani medijum. Parenteralni nosači uključuju rastvor natrijum-hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum-hlorid, Ringerov laktat, ili fiksirana ulja. Intravenozni nosači uključuju tečnosti i hranljivih materije, elektrolite za nadopunjavanje (poput onih zasnovanih na Ringerovoj dekstrozi), i slično. Takođe mogu biti prisutni konzervansi i drugi aditivi, kao što su, na primer, antimikrobni lekovi, anti-oksidanti, helatorska sredstva, inertni gasovi i slično. Pored toga, kompozicija iz ovog pronalaska može da sadrži proteinske nosače, kao što su, npr., serumski albumin ili imunoglobulin, poželjno ljudskog porekla. Predviđeno je da kompozicija iz ovog pronalaska može sadržavati, pored polipeptida iz pronalaska prema pronalasku koji je ovde definisan, druga biološki aktivna sredstva, u zavisnosti od namere upotrebe kompozicije. Takva sredstva mogu biti lekovi koji deluju na gastrointestinalni sistem, lekovi koji deluju kao citostatici, lekovi koji sprečavaju hiperurikemiju, lekovi koji inhibiraju imunoreakcije (npr. kortikosteroidi), lekovi koji moduliraju inflamatorni odgovor, lekovi koji deluju na krvožilni sistem i/ili sredstva poput

4

citokina poznatih u stanju tehnike. Takođe je predviđeno da se konstrukt antitela prikazanog pronalaska primenjuje u zajedničkoj terapiji, tj., u kombinaciji sa drugim lekom protiv raka.

[0120] Biološka aktivnost ovde definisane farmaceutske kompozicije može se odrediti na primer sa testovima citotoksičnosti, kako je opisano u sledećim primerima, u WO 99/54440 ili od Schlereth i sar. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12). "Efikasnost" ili "in vivo efikasnost" kako se ovde koristi odnosi se na odgovor na terapiju sa farmaceutskom kompozicijom prema pronalasku, koristeći npr. standardizovane kriterijume NCI odgovora. Uspeh ili in vivo efikasnost terapije korišćenjem farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska odnosi se na efikasnost kompozicije prema njezinoj predviđenoj nameni, tj. odnosno na sposobnost kompozicije da izazove željeni efekat, odnosno iscrpljivanje patoloških ćelija, npr. ćelija tumora. In vivo efikasnost može se nadzirati utvrđenim standardnim metodama za odgovarajuće di entitete bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na broj leukocita, razlike, sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom i aspiraciju koštane srži. Pored toga, mogu se koristiti različiti klinički hemijski parametri specifični za bolest i druge utvrđene standardne metode. Dalje, kompjuterski potpomognuta tomografija, rendgensko zračenje, tomografija nuklearnom magnetnom rezonancom (npr. za procenu odgovora zasnovanog na kriterijumima Nacionalnog instituta za rak [Cheson BD, Horning SJ, Coiffier B, Shipp MA, Fisher RI, Connors JM, Lister TA, Vose J, Grillo-Lopez A, Hagenbeek A, Cabanillas F, Klippensten D, Hiddemann W, Castellino R, Harris NL, Armitage JO, Carter W, Hoppe R, Canellos GP. Izveštaj sa međunarodne radionice o standardizaciji kriterijuma odgovora za ne-Hodgkinove limfome. NCI sponzorisana međunarodna radna grupa. J Clin Oncol. 1999 Apr;17(4):1244]), mogu se koristiti pozitronsko-emisijska tomografija, brojanje belih krvnih zrnaca, diferencijali, sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom, aspiracija koštane srži, biopsije limfnih čvorova /histologije, i različiti klinički hemijski parametri specifični za limfom (npr. laktat dehidrogenaza) i druge utvrđene standardne metode.

[0121] Još jedan veliki izazov za razvoj lekova kao što su farmaceutske kompozicije prema pronalasku je predvidljiva modulacija farmakokinetičkih karakteristika. U tu svrhu se može uspostaviti farmakokinetički profil kandidata za lek, tj. profil farmakokinetičkih parametara koji utiču na sposobnost određenog leka da leči određeno stanje. Farmakokinetički parametri leka koji utiču na sposobnost leka za lečenje određenog entiteta bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na: poluživot, količinu distribucije, metabolizam jetre u prvom prolazu i stepen

4

vezivanja krvnog seruma. Na efikasnost datog leka može da utiče svaki od gore navedenih parametara.

[0122] "Poluživot" označava vreme kada se 50% primenjenog leka eliminiše kroz biološke procese, npr. metabolizam, izlučivanje, itd.

[0123] „Jetreni metabolizam prvog prolaza " označava sklonost leka da se metaboliše pri prvom kontaktu sa jetrom, odnosno tokom njegovog prvog prolaza kroz jetru.

[0124] "Obim distribucije" označava stepen zadržavanja leka u različitim delovima tela, kao npr. intracelularnim i ekstracelularnim prostorima, tkivima i organima, itd. i distribuciju leka u unutar tih prostora.

[0125] "Stepen vezivanja u krvnom serumu" označava sklonost leka za interakciju sa i vezivanje na proteine serumske krvi, kao što je albumin, što dovodi do smanjenja ili gubitka biološke aktivnosti leka.

[0126] Farmakokinetički parametri uključuju bioraspoloživost, vreme kašnjenja (Tlag), Tmax, stope apsorpcije, vreme početka i/ili Cmax za datu količinu primenjenog leka. "Bioraspoloživost" znači količinu leka u krvi. "Vreme kašnjenja" znači vremensko odlaganje između davanja leka i njegovog otkrivanja i mogućnosti merenja u krvi ili plazmi.

[0127] "Tmax" je vreme posle kojeg se postiže maksimalna koncentracija leka u krvi, i "Cmax" je maksimalno dobijena koncentracija u krvi sa datim lekom. Na vreme postizanja koncentracije leka u krvi ili tkivu koje je potrebno za njegovo biološko dejstvo utiču svi parametri. Farmakokinetički parametri bispecifičnih jednolančanih antitela koja pokazuju specifičnost unakrsne vrste, koja se može odrediti pretkliničkim ispitivanjima na životinjama kod primata koji nisu čimpanze kako je gore navedene, takođe su navedeni npr. u publikaciji sa Schlereth i sar. (Cancer Immunol. Immunother. 20 (2005), 1-12).

[0128] Termin "toksičnost" kako se ovde koristi odnosi se na toksične efekte leka koji se manifestuju u neželjenim događajima ili teškim neželjenim događajima. Ovi sporedni događaji mogu se odnositi na nedostatak podnošljivosti leka uopšte i/ili a nedostatak lokalne tolerancije

4

posle primene. Toksičnost takođe može da uključi teratogene ili kancerogene efekte izazvane lekom.

[0129] Termin "bezbednost", "in vivo bezbednost" ili "tolerancija" kako se ovde koristi definiše davanje leka bez izazivanja ozbiljnih neželjenih dejstava neposredno posle administracije (lokalna podnošljivost) i tokom dužeg perioda primene leka. "Bezbednost", "in vivo bezbednost" ili "tolerancija" mogu se proceniti, na primer, u redovnim intervalima tokom perioda lečenja i praćenja. Merenja uključuju kliničku procenu, npr. organ organske manifestacije i skrining laboratorijskih abnormalnosti. Može se izvršiti klinička evaluacija i odstupanja od normalnih nalaza evidentirati/kodirati prema standardima NCI-CTC i/ili MedDRA. Organske manifestacije mogu uključivati kriterijume kao što su alergija/imunologija, krv/ koštana srž, srčana aritmija, koagulacija i slično, kao što je navedeno npr. u zajedničkim terminološkim kriterijumima za neželjene događaje v3.0 (CTCAE). Laboratorijski parametri koji se mogu testirati obuhvataju na primer hematologiju, kliničku hemiju, profil koagulacije i analizu urina i ispitivanje drugih telesnih tečnosti kao što su serum, plazma, limfna ili kičmena tečnost, likvor i slično. Bezbednost se, dakle, može proceniti npr. fizičkim pregledom, tehnikama snimanja (tj. ultrazvukom, rendgenom, CT pretragom, magnetnom rezonancom (MRI), drugim merama sa tehničkim uređajima (tj. elektrokardiogramom), vitalnim znakovima, merenjem laboratorijskih parametara i snimanjem štetnih događaja. Na primer, neželjeni događaji kod primata koji nisu čimpanze u upotrebama i metodama prema pronalasku mogu se ispitivati histopatološkim i/ili histohemijskim metodama.

[0130] Termin "efikasna doza" ili "efikasno doziranje" se definiše kao količina dovoljna da se postigne ili barem delimično postigne željeni efekat. Termin "terapeutski efikasna doza" se definiše kao količina dovoljna da izleči ili bar delimično zaustavi bolest i njene komplikacije kod pacijenta koji već pati od bolesti. Količine koje su efikasne za ovu upotrebu zavise od težine infekcije i opšteg stanja imunološkog sistema subjekta. Termin "pacijent" obuhvata ljude i druge sisare koji su primali ili profilaktički ili terapeutski tretman.

[0131] Termin "efikasna i ne-toksična doza" kako se ovde koristi odnosi se na podnošljive doze inventivnog konstrukta antitela koja je dovoljno visoka da uzrokuje iscrpljivanje patoloških ćelija, eliminaciju tumora, skupljanje tumora ili stabilizaciju bolesti bez ili suštinski bez velikih toksičnih efekata. Takve efikasne i netoksične doze mogu se odrediti npr. studijama eskalacije doze opisanim u struci i treba da budu ispod doze koja izaziva teške neželjene posledice (toksičnost koja ograničava dozu, DLT).

[0132] Gornji termini se takođe odnose na npr. pretkliničku procenu bezbednosti farmaceutskih lekova dobijenih iz biotehnologije S6; ICH harmonizovana trostrana smernica; sastanak Upravnog odbora ICH-a od 16. jula 1997. godine.

[0133] Odgovarajuća doza, ili terapeutski efektivna količina, konstrukta antitela prema pronalasku zavisiće od stanja koje se leči, ozbiljnosti stanja, prethodne terapije, i kliničke istorije pacijenta i odgovora na terapeutski agens. Odgovarajuća doza može se prilagoditi prema proceni lekara tako da se pacijentu može davati jednokratno ili tokom niza primena. Farmaceutska kompozicija se po potrebi može primeniti kao jedini terapeutski agens ili u kombinaciji sa dodatnim terapijama, kao što su terapije protiv raka.

[0134] Farmaceutske kompozicije iz ovog pronalaska su naročito korisne za parenteralno davanje, odnosno subkutano, intramuskularno, intravenski, intraartikularno i/ili intrasinovijalno. Parenteralno davanje može biti bolusnom injekcijom ili kontinuiranom infuzijom.

[0135] Ako je farmaceutska kompozicija liofilizovana, liofilizovani materijal se prvo rekonstituiše u odgovarajućoj tečnosti pre primene. Liofilizovani materijal može biti rekonstituisan u, na primer, bakteriostatskoj vodi za injekciju (BWFI), fiziološkom rastvoru soli, fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatima (PBS), ili istoj formulaciji u kojoj je protein bio pre liofilizacije.

[0136] U internoj analizi podataka o ekspresijama mRNA iznenađujuće je utvrđeno da je ekspresija CDH19 povišena i u primarnom i metastatskom tumoru melanoma u poređenju sa normalnim, ne transformisanim tkivima. Interna analiza je takođe potvrdila da je ekspresija CDH19 u normalnim tkivima ograničena na periferne nervne ganglije i nervna vlakna. Diferencijalna ekspresija CDH19 u normalnom i tumorskim tkivima čini ovaj protein privlačnim za lekove koji ciljaju površinu ćelije. CDH 19 prethodno je razmatran kao jedan marker kao deo dugih lista markera povezanih sa nekim vrstama karcinoma (videti npr.

1

WO2009/055937) ili sa Parkinsonovom bolesti (videti npr. WO2005/067391) i CDH19 je razmatran kao mogući prognostički marker i cilj leka u vezi sa metastatskim melanomom (Bertucci, F. i sar.2007).

[0137] Kao što je pomenuto gore, ovaj pronalazak daje izolovani multispecifični konstrukt antitela koji sadrži prvi humani vezujući domen koji je u stanju da se veže za humani CDH19 na površini ciljne ćelije i drugi domen koji je u stanju da se veže za humani CD3 na površini T ćelije kao što je definisano u zahtevima.

[0138] "CDH19 ekstracelularni domen" ili "CDH19 ECD" odnosi se na oblik CDH19 koji je u suštini bez transmembranskih i citoplazmatskih domena CDH19. Stručnjak će razumeti da je transmembranski domen identifikovan za CDH19 polipeptid prikazanog pronalaska identifikovan u skladu sa kriterijumima koji se rutinski koriste u oblasti za identifikaciju te vrste hidrofobnog domena. Tačne granice transmembranskog domena mogu varirati, ali najverovatnije ne više od oko 5 aminokiselina na bilo kom kraju domena koji je ovde posebno pomenut. Poželjni humani CDH19 ECD je prikazan u SEQ ID NO: 948. U ovom kontekstu se podrazumeva da CDH19 ECD predstavlja deo CDH19 na površini ciljne ćelije.

[0139] Kompleks T ćelijskog receptora CD3 receptor je kompleks proteina i sastoji se od četiri različita lanca. Kod sisara kompleks sadrži CD3γ lanac, CD3δ lanac, i dva CD3ε (ipsilon) lanca. Ovi lanci se udružuju sa molekulom poznatim kao T ćelijski receptor (TCR) i ζ lancem da bi generisali signal aktivacije u T limfocitima.

[0140] Preusmerena liza ciljnih ćelija putem regrutovanja T ćelija od strane multispecifičnog, najmanje bispecifičnog, konstrukta antitela uključuje formiranje citolitičke sinapse i isporuku perforina i granzima. Angažovane T ćelije su sposobne za serijsku lizu ciljnih ćelija, i na njih ne utiču imunološki mehanizmi bekstva koji ometaju obradu i prezentaciju peptidnih antigena, ili klonalnu diferencijaciju T ćelija; videti, na primer, WO 2007/042261.

[0141] Afinitet prvog vezujućeg domena za humani CDH19 je poželjno ≤15 nM, poželjnije ≤10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije ≤0.5 nM, još poželjnije ≤0.1 nM, i najpoželjnije ≤0.05 nM. Prvog vezujućeg domena za makaki CDH19 je poželjno ≤15

2

nM, poželjnije ≤ 10 nM, još poželjnije ≤5 nM, još poželjnije ≤1 nM, još poželjnije ≤ 0.5 nM, još poželjnije ≤0.1 nM, i najpoželjnije ≤0.05 nM ili čak ≤0.01 nM.

[0142] Afinitet se može meriti, na primer u Biacore testu ili u Scatchard testu, npr. kako je opisano u primerima. Jaz u afinitetu za vezivanje na makaki CDH19 nasuprot humanom CDH19 je poželjno [1:10-1:5] ili [5:1-10:1], poželjnije [1:5-5:1], i najpoželjnije [1:2-3:1] ili čak [1:1-3:1]. Ostale metode za određivanje afiniteta su dobro poznate stručnoj osobi.

[0143] Human antitela, odnosno humani konstrukti antitela, izbegavaju neke od problema povezanih sa antitelima/konstruktima antitela koje imaju mišji ili pacovski varijabilni i/ili konstantni regioni. Prisustvo takvih proteina dobijenih od miševa ili pacova može dovesti do brzog uklanjanja antitela/konstrukta antitela ili može dovesti do stvaranja imunog odgovora protiv antitela/konstrukta antitela od strane pacijenta. Da bi se izbegla upotreba antitela/konstrukata antitela dobijenih iz miševa ili pacova, humana ili potpuno humana antitela mogu se generisati uvođenjem funkcije humanog antitela u glodara tako da glodar proizvodi potpuno humana antitela.

[0144] Sposobnost da se klonira i rekonstruiše humani lokus megabazne veličine u YAC i da ih se uvede u embrione miša obezbeđuje moćan pristup razjašnjavanju funkcionalnih komponenti veoma velikih ili grubo mapiranih lokusa kao i za stvaranje korisnih modela humanih bolesti. Dalje, korišćenje takve tehnologije za zamenu mišjih lokusa njihovim humanim ekvivalentima moglo bi pružiti jedinstveni uvid u ekspresiju i regulaciju ljudskih genskih proizvoda tokom razvoja, njihovu komunikaciju sa drugim sistemima i njihovo učešće u indukciji i progresiji bolesti.

[0145] Važna praktična primena takve strategije jeste "humanizacija" mišjeg humoralnog imunskog sistema. Uvođenje lokusa humanog imunoglobulina (Ig) u miševe kod kojih su inaktivisani endogeni Ig geni daje mogućnost proučavanja mehanizama koji stoje iza programirane ekspresije i sklapanja antitela kao i njihove uloge u razvoju B-ćelija. Štaviše, takva strategija mogla bi da pruži idealan izvor za proizvodnju potpuno humanih monoklonskih antitela (mAbs) - važnu prekretnicu ka ispunjenju obećanja o terapiji antitelom za ljudsku bolest. Očekuje se da će potpuno ljudska antitela/konstrukti antitela minimizirati imunogene i alergijske odgovore svojstvene mišjim ili derivatima mišjih mAbs i prema tome povećati efikasnost i sigurnost primenjenih antitela antitela/konstrukata antitela. Može se očekivati da će upotreba potpuno humanih antitela/konstrukata antitela obezbediti značajnu prednost u lečenju hroničnih i ponavljajućih ljudskih bolesti, inflamacija, autoimunosne bolesti i rak, koje zahtevaju ponovljena davanja jedinjenja.

[0146] Jedan pristup prema tom cilju je bio konstruisanje sojeva miševa koji su deficijentni u proizvodnji mišjih antitela sa velikim fragmentima humanih Ig lokusa u očekivanju da će takvi miševi proizvoditi veliki repertoar humanih antitela u odsustvu mišjih antitela. Veliki humani Ig fragmenti sačuvali bi veliku varijabilnu raznolikost gena kao i pravilno regulisanje proizvodnje i ekspresije antitela. Iskorišćavanjem miševa za diversifikaciju i selekciju antitela i nedostatak imunološke tolerancije na humane proteine, repertoar reprodukovanih humanih antitela u ovim mišjim sojevima trebalo bi da dobije antitela visokog afiniteta prema bilo kom antigenu od interesa, uključujući humane antigene. Korišćenjem tehnologije hibridoma, humana antigen-specifična mAbs sa željenom specifičnošću se mogu lako proizvesti i izabrati. Ova opšta strategija je demonstrirana u vezi sa našom generacijom prvih XenoMouse mišjih sojeva, kao što je objavljeno 1994. (videti Green i sar. Nature Genetics 7:13-21 (1994)) XenoMouse sojevi konstruisani su sa veštačkim hromozomima kvasaca (YAC) koji sadrže fragmente embrionske konfiguracije veličine 245 kb i 190 kb humanog lokusa teškog lanca i kapa lokusa lakog lanca, redom, koji sadrže sekvence jezgra varijabilnih i konstantnih regiona. Humani Ig koji sadrži veštačke hromozome kvasaca (YAC) pokazali su se kompatibilni sa mišjim sistemom i za preuređivanje i za ekspresiju antitela i bili su sposobni da zamene inaktivisane mišje Ig gene. Ovo je pokazalo njihovu sposobnost da indukuju razvoj B-ćelija, tako da proizvode zreli humani repertoar potpuno humanih antitela, i da stvaraju antigenspecifična humana mAbs. Ovi rezultati takođe sugerišu da uvođenje većih delova humanih Ig lokusa koji sadrže veći broj V gena, dodatnih regulatornih elemenata i humanih Ig konstantnih regiona može bitno da rekapituliše kompletan repertoar koji je karakterističan za ljudski humoralni odgovor na infekciju i imunizaciju. Rad od Green i sar. nedavno je proširen na uvođenje više od oko 80% repertoara humanih antitela kroz uvođenje megabazne veličine, embrionske konfiguracije YAC fragmenata humanog lokusa teškog lanca i kapa lokusa lakog lanca, redom. Videti Mendez i sar. Nature Genetics 15:146-156 (1997).

[0147] Proizvodnja XenoMouse miševa se dalje razmatra i definisana je u američkim patentima br. 6,673,986, 6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, i 5,939,598 i japanskim

4

patentima br.3 068 180 B2, 3068 506 B2, i 3068 507 B2. Videti takođe Mendez i sar. Nature Genetics 15:146-156 (1997) i Green i Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998). Videti takođe evropski patent br., EP 0463151 B1, registracija objavljena Jun.12, 1996, međunarodna prijava patenta br., WO 94/02602, objavljena Feb. 3, 1994, međunarodna prijava patenta br., WO 96/34096, objavljena Okt. 31, 1996, WO 98/24893, objavljena Jun. 11, 1998, WO 00/76310, objavljena Dec.21, 2000, WO 03/47336.

[0148] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc., su koristili pristup "minilokusa“. U pristupu minilokusa, egzogeni Ig lokus se oponašao uključivanjem delova (pojedinačnih gena) iz Ig lokusa. Prema tome, jedan ili više V.sub.H gena, jedan ili više gena D.sub.H gena, jedan ili više gena J.sub.H gena, mu konstantni region i drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) su formirani u konstrukt za ubacivanje u životinju. Ovaj pristup je opisan u američkom patentu br. 5,545,807 od Surani i sar. i američkim patentima 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, i 6,255,458 svaki od Lonberg i Kay, američkim patentima 5,591,669 i 6,023.010 od Krimpenfort i Berns, U.S. Pat. Nos.5,612,205, 5,721,367, i 5,789,215 od Berns i sar., i američkom patentu br. 5,643,763 od Choi i Dunn. Videti takođe evropski patent br.0 546 073 B1, međunarodna prijava patenta br. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884 i U.S. Pat. Ne. 5,981,175. Dalje videti Tailor i sar., 1992, Chen i sar., 1993, Tuaillon i sar., 1993, Choi i sar., 1993, Lonberg i sar., (1994), Tailor i sar., (1994), i Tuaillon i sar., (1995), Fishwild i sar., (1996).

[0149] Kirin takođe pokazuje generisanje humanih antitela od miševa u kom, kroz mikroćelijsku fuziju, su uvedeni veliki komadi hromozoma ili čitavih hromozoma. Videti publikaciju evropskih patentnih prijava br. 773 288 i 843 961. Xenerex Biosciences razvija tehnologiju za potencijalno generisanje humanih antitela. U ovoj tehnologiji, SCID mice su rekonstituisani sa humanim limfnim ćelijama, npr., B i/ili T ćelijama. Zatim su miševi imunizovani antigenom i mogu da proizvedu imuni odgovor na antigen. Videti američki patenti br. 5,476,996, 5,698,767, i 5,958,765.

[0150] Odgovori humanog anti-mišjeg antitela (HAMA) doveli su industriju do pripreme himernih ili na drugi način humanizovanih antitela. Dok himerna antitela imaju humani konstantni region i mišji varijabilni region, očekuje se da će se primetiti određeni odgovori humanih antihimernih antitela (HACA), naročito u hroničnoj ili višestrukoj upotrebi antitela. Stoga bi bilo poželjno da se obezbede potpuno humana antitela protiv EGFRvIII u cilju oslobađanja od i/ili efekata odgovora HAMA ili HACA.

[0151] Citotoksičnost posredovana CDH19/CD3 bispecifičnim konstruktima antitela može se meriti na različite načine. Ćelije efektora mogu biti npr. stimulisane obogaćenim (humanim) CD8 pozitivnim T ćelijama ili stimulisanim (humanim) mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC). Ako su ciljne ćelije makaki porekla ili eksprimiraju ili su transfektovane sa makaki CDH19, efektorske ćelije bi takođe trebale da budu makaki porekla kao što je makaki T ćelijska linija, npr.4119LnPx. Ciljne ćelije treba da eksprimiraju (barem vanćelijski domen od) CDH19, npr. human ili makaki CDH19. Ciljne ćelije mogu da budu ćelijska linija (kao što je CHO) koja je stabilno ili prolazno transfektovana sa CDH19, npr. humani ili makaki CDH19. Alternativno, ciljne ćelije mogu da budu CDH19 pozitivna prirodna ekspresivna ćelijska linija, kao što je ćelijska linija ljudskog mijeloma CHL-1 ili Colo-699. Obično se očekuje da vrednosti EC50 budu niže sa ciljnim ćelijskim linijama koje ispoljavaju više nivoe CDH19 na ćelijskoj površini. Odnos efektor-ciljna ćelija (E:T) je obično oko 10:1, ali takođe može varirati. Citotoksična aktivnost CDH19/CD3 bispecifičnih konstrukata antitela može se izmeriti u testu oslobađanja 51-hroma (vreme inkubacije oko 18 sati) ili u testu na citotoksičnosti zasnovanom na FACS (vreme inkubacije oko 48 sati). Takođe su moguće modifikacije vremena inkubacije ispitivanja (citotoksična reakcija). Ostale metode merenja citotoksičnosti su dobro poznate stručnoj osobi i obuhvataju MTT ili MTS testove, ATP-zasnovane testove uključujući bioluminescentne testove, sulforodamin B (SRB) test, WST test, klonogeni test i ECIS tehnologiju.

[0152] Citotoksična aktivnost posredovana CDH19/CD3 bispecifičnim konstruktima antitela iz prikazanog pronalaska se poželjno meri sa ćelijski zasnovanim testom citotoksičnosti. Predstavljena je sa EC50vrednosti, koja odgovara polovini maksimalne efektivne koncentracije (koncentracija konstrukta antitela koja indukuje citotoksični odgovor na pola puta između osnovne vrednosti i maksimuma). Poželjno, EC50vrednost CDH19/CD3 bispecifičnih konstrukta antitela je ≤20.000 pg/ml, poželjnije ≤5000 pg/ml, još poželjnije ≤1000 pg/ml, još poželjnije ≤500 pg/ml, još poželjnije ≤350 pg/ml, još poželjnije ≤320 pg/ml, još poželjnije ≤250 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, još poželjnije ≤50 pg/ml, još poželjnije ≤10 pg/ml, i najpoželjnije ≤5 pg/ml.

[0153] Bilo koja od gore datih EC50vrednosti može da se kombinuje sa bilo kojim od naznačenih scenarija testova ćelijski zasnovane citotoksičnosti. Na primer, kada se kao efektorske ćelije koriste (humane) CD8 pozitivne T ćelije ili makaki T ćelijska linija, EC50vrednost CDH19/CD3 bispecifičnog konstrukta antitela je poželjno ≤1000 pg/ml, poželjnije ≤500 pg/ml, još poželjnije ≤250 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, još poželjnije ≤ 50 pg/ml, još poželjnije ≤10 pg/ml, te najpoželjnije ≤5 pg/ml. Ako su u ovom testu ciljne ćelije (ljudske ili makaki) CDH19 transfektovane ćelije kao što su CHO ćelije, EC50vrednost CDH19/CD3 bispecifičnog konstrukta antitela je poželjno ≤150 pg/ml, poželjnije ≤100 pg/ml, još poželjnije ≤50 pg/ml, još poželjnije ≤30 pg/ml, još poželjnije ≤10 pg/ml, i najpoželjnije ≤5 pg/ml.

Ako su ciljne ćelije su CDH19 pozitivne prirodno eksprimirana ćelijska linija, onda je EC50vrednost poželjno ≤350 pg/ml, poželjnije ≤320 pg/ml, još poželjnije ≤250 pg/ml, još poželjnije ≤200 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, još poželjnije ≤ 150 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, te najpoželjnije ≤50 pg/ml, ili niža.

Kada se kao efektorske ćelije koriste (ljudske) PBMC, EC50vrednost za CDH19/CD3 bispecifični konstrukt antitela je poželjno ≤1000 pg/ml, poželjnije ≤750 pg/ml, poželjnije ≤500 pg/ml, još poželjnije ≤350 pg/ml, još poželjnije ≤320 pg/ml, još poželjnije ≤250 pg/ml, još poželjnije ≤100 pg/ml, i najpoželjnije ≤ 50 pg/ml, ili niža.

[0154] Razlika citotoksične aktivnosti između monomerne i dimerne izoforme pojedinačnih CDH19/CD3 bispecifičnih konstrukata antitela se naziva "jaz potencije". Ovaj jaz potencije se na primer može izračunati kao odnos između EC50vrednosti monomerne i dimerne forme molekula. Jazovi potencije CDH19/CD3 bispecifičnih konstrukata antitela iz prikazanog pronalaska su poželjno ≤5, poželjnije ≤4, još poželjnije ≤3, još poželjnije ≤2 i najpoželjnije ≤1.

[0155] Konstrukt antitela prema pronalasku je fuzioni protein koji sadrži najmanje dva vezujuća domena, sa ili bez peptidnih linkera (spacer peptidi). Među pogodnim peptidnim linkerima su oni opisani u američkim patentima br.4,751,180 i 4,935,233 ili WO 88/09344. Druga metoda za pripremu oligomernih derivata konstrukta antitela uključuje upotrebu leucinskog zatvarača. Domeni leucinskog zatvarača su peptidi koji promovišu oligomerizaciju proteina u kojima su nađeni. Leucinski zatvarači prvobitno su identifikovani u nekoliko proteina koji vezuju DNK (Landschulz i sar., 1988, Science 240:1759), i od tada su pronađeni u različitim proteinima. Među poznatim leucinskim zatvaračima su prirodni peptidi i njihovi derivati koji dimeriziraju ili trimeriziraju. Primeri domena leucinskog zatvarača koji su pogodni za proizvodnju rastvorljivih oligomernih proteina su opisani u PCT prijavi WO 94/10308, i leucinski zatvarači dobijeni iz proteina surfaktanata pluća D (SPD) su opisani u Hoppe i sar., 1994, FEBS Letters 344:191. Upotreba modifikovanog leucinskog zatvarača koja omogućava stabilnu trimerizaciju heterolognog proteina koji je sa njim fuzionisan opisana je u Fanslow i sar., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. U jednom pristupu, rekombinantni fuzioni proteini koji sadrže fragment CDH19 antitela ili derivat fuzionisan na leucinski zatvarač peptida se eksprimiraju u pogodnim ćelijama domaćina, i rastvorljivi oligomerni fragmenti CDH19 antitela ili derivati koji se formiraju dobijaju se iz kulture supernatanta.

[0156] Kovalentne modifikacije antigen vezujućih proteina su obuhvaćene obimom ovog pronalaska, i obično, ali ne uvek, urađene post-translatorno. Na primer, nekoliko vrsta kovalentnih modifikacija vezujućih proteina antigena se uvodi u molekul reakcijom specifičnih aminokiselinskih ostataka vezujućih proteina antigena sa organskim sredstvom za deriviranje koje može da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili sa N- ili C-terminalnim ostacima.

[0157] Cisteinilni ostaci najčešće reaguju sa α-haloacetatima (i odgovarajućim aminima), kao što je hlorosirćetna kiselina ili hloroacetamid, dajući karboksimetil ili karboksiamidometil derivate. Cisteinilni ostaci se takođe prevode reakcijom sa bromotrifluoroacetonom, α-bromoβ-(5-imidozoil)propionskom kiselinom, hloroacetil fosfatom, N-alkilmaleimidima, 3-nitro-2-piridil disulfid, metil 2-piridil disulfid, p-hloroživabenzoatom, 2-hloroživa-4-nitrofenolom, ili hloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diazolom.

[0158] Histidil ostaci su derivatizuju reagovanjem sa dietilpirokarbonatom pri pH 5.5-7.0 jer je ovaj agens relativno specifičan za bočni lanac histidila. Para-bromofenacil bromid je takođe koristan; reakcija se poželjno izvodi u 0.1M natrijum kakodilata pri pH 6.0. Lizinil i amino terminalni ostaci reaguju sa sukcinskim ili drugim anhidridima karboksilne kiseline. Derivatizacija sa ovim agensima ima efekat preokretanja naboja lizinil ostataka. Drugi pogodni reagensi za derivatizaciju ostataka koji sadrže alfa-amino uključuju imidoestre kao što je metil pikolinimidat; piridoksal fosfat; piridoksal; hloroborohidrid; trinitrobenzensulfonska kiselina; O-metilizourea; 2,4-pentandion; i reakcija katalizovana transaminazom sa glioksilatom.

[0159] Arginil ostaci se modifikuju reakcijom sa jednim ili nekoliko konvencionalnih reagenasa, među njima su fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-cikloheksandion, i ninhidrin. Derivatizacija ostataka arginina zahteva da se reakcija izvodi u alkalnim uslovima zbog visokog pKa gvanidinske funkcionalne grupe. Dalje, ovi reagensi mogu reagovati sa grupama lizina kao i arginin ipsilon-amino grupom.

[0160] Specifična modifikacija tirozil ostataka može biti napravljena, sa posebnim interesovanjem za uvođenje spektralnih oznaka u tirozil ostatke reakcijom sa aromatičnim diazonijum jedinjenjima ili tetranitrometanom. Najčešće se, N-acetilimidizol i tetranitrometan koriste za formiranje O-acetil tirozil vrsta i 3-nitro derivata, redom. Tirozil ostaci su jodovani korišćenjem<125>I ili<131>I za pripremu obeleženih proteina za upotrebu u radio imunološkom ispitivanju, pri čemu je pogodan gore opisani hloraminski T metod.

[0161] Karboksilne bočne grupe (aspartil ili glutamil) se selektivno modifikuju reakcijom sa karbodiimidima (R'-N=C=N--R'), gde su R i R' opciono različite alkilne grupe, kao što je 1-cikloheksil-3-(2-morfolinil-4-etil) karbodiimid ili 1-etil-3-(4-azonija-4,4-dimetilpentil) karbodiimid. Dalje, aspartil i glutamil ostaci se konvertuju u ostatke asparaginil i glutaminil reakcijom sa amonijum jonima.

[0162] Derivatizacija sa bifunkcionalnim sredstvima je korisna za umrežavanje antigen vezujućih proteina u vodi ne rastvorljivi matriks podloge ili površinu f za korišćenje u različitim metodima. Najčešće korišćena sredstva za umrežavanje obuhvataju, na primer, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletan, glutaraldehid, N-hidroksisukcinimidne estre, na primer, estre sa 4-azidosalicilnom kiselinom, homobifunkcionalne imidoestre, uključujući disukcinimidilne estre kao što je 3,3'-ditiobis(sukcinimidilpropionat), i bifunkcionalne maleimide kao što je bis-N-maleimido-1,8-oktan. sredstva za derivatizaciju kao što je metil-3-[(pazidofenil)ditio]propioimidat daju fotoaktivacione intermedijere koji mogu da formiraju umreženja u prisustvu svetlosti. Alternativno, za imobilizaciju proteina se koriste reaktivni u vodi ne rastvorljivi matriksi kao što su ugljeni hidrati aktivisani cijanogen bromidom i reaktivni supstrati opisani u američkim patentima br. 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537; i 4,330,440.

[0163] Glutaminil i asparaginil ostaci se često deamiduju u odgovarajuće glutamil i aspartil ostatke, redom. Alternativno, ovi ostaci se deamiduju pod blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka spada unutar obima ovog pronalaska.

[0164] Druge modifikacije obuhvataju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa seril ili treonil ostataka, metilaciju a-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina, i histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure i Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), acetilaciju N-terminalnog amina, i amidaciju bilo koje C-terminalne karboksilne grupe.

[0165] Drugi tip kovalentne modifikacije antigen vezujućeg proteina obuhvaćen unutar obima ovog pronalaska obuhvata promenu obrazaca glikozilacije proteina. Kao što je poznato u stanju tehnike, obrasci glikozilacije mogu zavisiti i od sekvence proteina (npr., prisustvo ili odsustvo određenih aminokiselinskih ostataka glikozilacije, koji su navedeni u daljem tekstu), ili ćelije ili organizma domaćina u kom se protein proizvodi. U nastavku su razmotreni pojedini sistemi ekspresije.

[0166] Glikozilacija polipeptida je tipično ili N-povezana ili O-povezana. N-povezana se odnosi na vezanje dela ugljenog hidrata na bočni lanac ostatka asparagina. Tri-peptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja aminokiselina izuzev prolina, su sekvence prepoznavanja za enzimsko vezivanje ugljenog hidrata u bočni lanac asparagina. Prema tome, prisustvo bilo koje od ovih tri-peptidnih sekvenci u polipeptidu stvara potencijalno mesto glikozilacije. O-povezana glikozilacija se odnosi na vezanje jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze ili ksiloze na hidroksiamino kiselinu, najčešće serin ili treonin, mada se takođe može koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0167] Dodavanje mesta glikozilacije na antigen vezujući protein se pogodno postiže menjanjem aminokiselinske sekvence tako da sadrži jednu ili više gore opisanih tri-peptidnih sekvenci (za N-povezana mesta glikozilacije). Izmena se takođe može izvršiti dodavanjem ili supstituisanjem jednog ili više ostataka serina ili treonina na početnu sekvencu (za O-povezana mesta glikozilacije). Radi jednostavnosti, sekvenca aminokiseline antigen vezujućeg proteina je poželjno izmenjena promenama na nivou DNK, naročito mutiranjem DNK koja kodira ciljni polipeptid u prethodno odabranim bazama, tako da se stvaraju kodoni koji će se prevesti u željene aminokiseline.

[0168] Drugi način za povećanje broja ugljohidratnih funkcionalnih grupa na antigen vezujućem proteinu je hemijskim ili enzimskim kuplovanjem glikozida za protein. Ove procedure su povoljne jer ne zahtevaju proizvodnju proteina u ćeliji domaćinu koja ima sposobnost glikozilacije za N- i O-povezanu glikozilaciju. U zavisnosti od korišćenog načina kuplovanja, šećer(i) se mogu vezati za (a) arginin i histidin, (b) slobodne karboksilne grupe, (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što je cistein, (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su serin, treonin, ili hidroksiprolin, (e) aromatične ostatke kao što su fenilalanin, tirozin ili triptofan, ili (f) amidnu grupu glutamina. Ove metode su opisane u WO 87/05330 publikovanom Sep. 11, 1987, i u Aplin i Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306.

[0169] Uklanjanje ugljohidratnih grupa prisutnih na početnom antigen vezujućem proteinu može se postići hemijski ili enzimatski. Hemijska deglikozilacija zahteva izlaganje proteina jedinjenju trifluorometansulfonske kiseline, ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovaj tretman dovodi do cepanja većine ili svih šećera, osim vezujućeg šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), dok polipeptid ostavlja netaknut. Hemijska deglikozilacija je opisana od Hakimuddin i sar., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 i od Edge i sar., 1981, Anal. Biochem. 118:131. Enzimsko cepanje ostataka ugljenih hidrata na polipeptidima može se postići upotrebom različitih endo- i egzo-glikozidaza kako je opisano u Thotakura i sar., 1987, Meth. Enzymol.138:350. Glikozilacija na potencijalnim mestima glikozilacije može se sprečiti upotrebom jedinjenja tunicamicina kako su opisali Duskin i sar., 1982, J. Biol. Chem.

257:3105. Tunicamicin blokira formiranje protein-N-glikozidnih veza.

[0170] Drugi tip kovalentne modifikacije antigen vezujućeg proteina obuhvata povezivanje antigen vezujućeg proteina različitim ne-proteinskim polimerima, uključujući, ali ne ograničavajući se na, različite poliole kao što je polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkilene, na način utvrđen u američkim patentima br.4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337. Pored toga, kao što je poznato u stanju tehnike, supstitucije aminokiselina mogu se izvršiti na različitim položajima unutar proteina koji se veže za antigen da bi se olakšalo dodavanje polimera kao što je PEG.

1

[0171] U nekim realizacijama, kovalentna modifikacija antigen vezujućeg proteina prema pronalasku uključuje dodavanje jedne ili više obeleživača.

[0172] Termin "grupa za obeležavanje" označava bilo koji marker koji se može detektovati. pogodnih grupa za obeležavanje obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<89>Zr,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne grupe (npr., FITC, rodamin, lantanidni fosfor), enzimske grupe (npr., renova peroksidaza, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentne grupe, biotinil grupe, ili unapred određene polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., parovi sekvenci leucin zatvarač, mesta vezivanja za sekundarna antitela, metal vezujući domeni, oznake epitopa). U nekim realizacijama, grupa za obeležavanje je povezana sa antigen vezujućim proteinom preko razmaknutih krakova različitih dužina da bi se smanjila potencijalna sterička prepreka. U struci su poznati razne metode za obeležavanje proteina i mogu se koristiti u izvođenju ovog pronalaska.

[0173] Uopšteno, obeleživači spadaju u različite klase, zavisno od testa u kom se trebaju otkriti: a) izotopski obeleživači, koje mogu biti radioaktivni ili teški izotopi; b) magnetni obeleživači (npr., magnetne čestice); c) redoks aktivne grupe; d) optičke boje; enzimske grupe (npr. peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza); e) biotinilirane grupe; i f) unapred određeni polipeptidni epitopi prepoznati od strane sekundarnog reportera (npr., sekvence para leucin zatvarač, vezna mesta za sekundarna antitela, metal vezujući domeni, epitop obeleživači, itd.). U nekim realizacijama, grupa za obeležavanje povezana je sa antigen vezujućim proteinom preko razmaknutih krakova različitih dužina to da bi se smanjila potencijalna sterička prepreka. U izvođenju ovog pronalaska mogu se koristiti različite metode za obeležavanje proteina koji su poznati u struci.

[0174] Specifični obeleživači uključuju optičke boje, uključujući, ali nije ograničeno na, hromofore, fosfore i fluorofore, sa tim da su poslednje specifične u mnogim slučajevima. Fluorofore mogu biti ili fluore "malog molekula", ili proteinske fluore.

[0175] Termin "fluorescentni marker" označava bilo koji molekul koji se može detektovati putem njegovih inherentnih fluorescentnih svojstava. Pogodni fluorescentni markeri

2

obuhvataju, ali nisu ograničeni na, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, kumarin, metil-kumarini, piren, Malacite zeleno, stilben, Lucifer Žuta, Kaskadno PlavaJ, Teksas Crveno, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Crveno 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Crveno 705, Oregon zeleno, Aleksa-Fluor boje (Aleksa Fluor 350, Aleksa Fluor 430, Aleksa Fluor 488, Aleksa Fluor 546, Aleksa Fluor 568, Aleksa Fluor 594, Aleksa Fluor 633, Aleksa Fluor 660, Aleksa Fluor 680), Kaskadno Plava, Kaskadno Žuta i R-fikoeritrin (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR), FITC, Rodamin, i Teksas Crveno (Pierce, Rockford, IL), Cy5, Cy5.5, Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA). Pogodne optičke boje, uključujući fluorofore, su opisane i objavljene u publikaciji Molecular Probes Handbook od Richard P. Haugland.

[0176] Pogodni proteinski fluorescentni obeleživači takođe uključuju, ali ne ograničavajući se na, zeleni fluorescentni protein, uključujući vrste Renilla, Ptilosarcus ili Aekuorea od GFP (Chalfie i sar., 1994, Science 263:802-805), EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank pristupni broj U55762), plavi fluorescentni protein (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc.1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Kanada H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim i sar., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), pojačani žuti fluorescentni protein (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferazu (Ichiki i sar., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), β-galaktozidazu (Nolan i sar., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

85:2603-2607) i Renilla (WO92/15673, WO95/07463, WO98/14605, WO98/26277, WO99/49019, U.S. Patent Nos. 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558).

[0177] Konstrukt antitela prema pronalasku takođe može da sadrži dodatne domene, koji su npr. korisni u izolaciji molekula ili se odnose na prilagođeni farmakokinetički profil molekula.

[0178] Domeni korisni za izolaciju konstrukta antitela mogu biti izabrani iz peptidnih motiva ili sekundarno uvedenih delova, koji se mogu uhvatiti u metodi izolacije, npr. izolaciona kolona. Ne ograničavajuće realizacije takvih dodatnih domena sadrže peptidne motive poznate kao Myc-tag, HAT-tag, HA-tag, TAP-tag, GST-tag, hitin vezujući domen (CBD-tag), protein koji veže maltozu(MBP-tag), Flag-tag, Strep-tag i njihove varijante (npr. Strepll-tag) i His-tag. Svi ovde otkriveni konstrukti antitela okarakterisani sa identifikovanim CDR-ovima su preferirani da sadrže His-tag domen, koji je opšte poznat kao ponavljanje uzastopnih His ostataka u aminokiselinskoj sekvenci molekula, poželjno šest His ostataka.

[0179] Kao što je opisano u priloženom primeru 2 širok broj CDH19 specifičnih veziva se karakteriše u odnosu na identifikovane karakteristike vezivanja i ta veziva u grupisana u pet različitih korpi, koje se odnose na pet različitih podgrupa CDH19 specifičnih domena za vezivanje. Shodno tome, u jednoj realizaciji konstrukta antitela prema pronalasku prvi vezujući domen sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koju čine:

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 4, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 5, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 6, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 172, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 173 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQID NO: 174, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 10, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 11, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 12, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 178, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 179 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 180, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 196, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQID NO: 198, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 34, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 35, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 36, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 202, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 203 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 204, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 48, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 214, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQID NO: 216, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 58, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 59, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 60, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 226, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 227 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 228, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 64, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 65, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 66, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 232, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 233 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 234, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 70, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 71, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 72, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 238, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 239 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 240, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 161, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano

4

u SEQ ID NO: 328, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 48, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 924, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQID NO: 216, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 902, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 924, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQID NO: 216, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 903, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 924, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQID NO: 216, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 48, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 925, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQID NO: 216, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 70, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 907, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 72, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 238, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 239 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 240, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 70, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 907, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 908, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 238, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 239 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 240, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 901, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 922, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 923, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 58, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 905, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 906, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 226, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 227 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 228, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 58, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 905, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 60, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 226, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 227 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 228, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 161, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 939, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 921, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 939, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 940, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 161, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 941, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 196, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQID NO: 923, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 922, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQID NO: 923, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 901, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 922, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 923,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 939, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 970, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 971, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 972, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 973, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 974 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 975,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1061, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1062, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1063, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1064, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1065 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1066,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1139, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1140, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1141, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1142, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1143 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1144,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1152, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1153, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1154, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1155, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1156 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1157,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1178, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1179, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1180, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1181, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1182 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1183,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1191, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1192, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1193, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1194, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1195 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1196,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1204, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1205, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1206, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1207, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1208 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1209,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1217, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1218, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1219, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1220, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1221 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1222,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1230, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1231, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1232, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1233, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1234 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1235,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1308, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1309, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1310, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1311, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1312 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1313,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1321, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1322, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1323, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1324, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1325 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1326,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1373, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1374, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1375, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1376, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1377 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1378,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1386, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1387, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1388, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1389, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1390 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1391,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1399, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1400, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1401, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1402, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1403 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1404,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1412, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1413, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1414, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1415, CDR-L2 kako je prikazano u SEQID NO: 1416 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1417,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1777, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1778, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1779, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1780, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1781 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1782,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1790, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1791, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1792, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1793, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1794 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1795,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1803, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1804, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1805, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1806, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1807 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1808,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1816, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1817, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1818, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1819, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1820 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1821,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1829, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1830, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1831, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1832, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1833 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1834,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1842, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1843, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1844, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1845, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1846 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1847,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1855, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1856, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1857, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1858, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1859 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1860,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1868, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1869, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1870, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1871, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1872 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1873,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1881, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1882, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1883, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1884, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1885 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1886,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2063, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2064, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2065, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2066, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2067 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2068,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2076, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2077, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2078, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2079, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2080 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2081,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2089, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2090, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2091, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2092, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2093 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2094,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2102, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2103, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2104, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2105, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2106 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2107,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2115, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2116, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2117, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2118, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2119 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2120,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2128, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2129, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2130, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2131, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2132 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2133,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2141, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2142, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2143, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2144, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2145 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2146,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2154, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2155, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2156, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2157, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2158 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2159,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2180, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2181, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2182, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2183, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2184 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2185,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2193, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2194, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2195, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2196, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2198, i

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2206, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2207, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2208, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2209, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2210 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2211

koji svi karakterišu domene za vezivanje za CDH19 grupisane u korpu 4.

[0180] U daljim ovde opisanim konstruktima antitela prvi vezujući domen sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koju čine:

(a) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 52, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 53, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 54, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 220, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 221 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 222, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 82, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 83, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 84, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 250, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 251 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 252, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 82, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 83, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 84, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 250, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 251 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 927, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 82, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 83, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 909, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 250, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 251 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 927, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 52, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 53, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 54, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 220, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 221 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 926,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 52, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 53, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 904, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 220, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 221 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 926,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1126, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1127, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1128, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1129, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1130 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1131,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1165, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1166, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1167, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1168, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1169 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1170,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1334, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1335, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1336, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1337, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1338 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1339,

1

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1347, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1348, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1349, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1350, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1351 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1352, i

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1360 CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1361, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1362, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1363, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1364 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1365,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1425 CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1426, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1427, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1428, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1429 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1430,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1438 CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1439, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1440, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1441, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1442 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1443, i

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2167 CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2168, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2169, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2170, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2171 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2172,

koji svi karakterišu domene za vezivanje za CDH19 grupisane u korpu 1;

(b) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 124, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 125, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 126, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 292, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 293 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 294, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 130, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 131, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 132, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 298, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 299 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 300, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 136, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 137, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 138, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 304, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 305 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 306, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 142, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 143, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 144, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 310, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 311 i CDR-L3 kako je prikazano

2

u SEQ ID NO: 312, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 148, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 149, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 150, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 316, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 317 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 318, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 166, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 167, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 168, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 334, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 335 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 336, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 124, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 125, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 915, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 292, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 293 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 294, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 124, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 125, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 915, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 292, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 293 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 928, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 124, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 125, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 915, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 292, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 293 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 929, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 166, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 167, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 168, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 334, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 335 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 336, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 166, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 167, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 168, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 334, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 335 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 942, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 166, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 167, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 168, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 334, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 335 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 943, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 148, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 149, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 150, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 316, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 317 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 318, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 148, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 149, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 150, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 316, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 317 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 937, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 148, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 149, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 150, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 316, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 317 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 938, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 148, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 149, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 919, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 316, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 317 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 938, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 142, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 143, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 144, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 310, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 311 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 935, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 142, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 143, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 918, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 310, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 311 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 935, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 142, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 143, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 918, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 310, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 311 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 936, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 136, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 137, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 138, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 304, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 305 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 933, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 136, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 137, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 917, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 304, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 305 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 934, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 130, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 131, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 132, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 298, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 299 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 930, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 130, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 131, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 916, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 298, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 299 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 931, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 130, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 131, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 916, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 298, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 299 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 932, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1009, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1010, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1011, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1012, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1013 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1014,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1022, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1023, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1024, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID

4

NO: 1025, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1026 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1027,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1035, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1036, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1037, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1038, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1039 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1040,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1074, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1075, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1076, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1077, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1078 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1079,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1100, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1101, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1102, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1103, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1104 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1105,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1113, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1114, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1115, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1116, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1117 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1118,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1243, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1244, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1245, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1246, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1247 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1248,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1256, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1257, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1258, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1259, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1260 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1261,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1269, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1270, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1271, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1272, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1273 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1274,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1282, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1283, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1284, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1285, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1286 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1287, i

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1295, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1296, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1297, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1298, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1299 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1300,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1647, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1648, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1649, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1650, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1651 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1652,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1660, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1661, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1662, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1663, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1664 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1665,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1894, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1895, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1896, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1897, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1898 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1899,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1907, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1908, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1909, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1910, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1911 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1912,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1933, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1934, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1935, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1936, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1937 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1938,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1946, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1947, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1948, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1949, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1950 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1951,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1959, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1960, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1961, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1962, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1963 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1964,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1972, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1973, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1974, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1975, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1976 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1977,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1985, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1986, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1987, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1988, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1989 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1990,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1998, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1999, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2000, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2001, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2002 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2003,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2011, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2012, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2013, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2014, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2015 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2016,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2024, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2025, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2026, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2027, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2028 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2029,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2037, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2038, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2039, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2040, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2041 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2042, i

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2050, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2051, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2052, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2053, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2054 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2055,

koji svi karakterišu domene za vezivanje za CDH19 grupisane u korpu 2;

(c) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 94, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 95, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 96, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 262, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 263 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 264, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 100, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 101, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 102, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 268, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 269 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 270, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 118, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 119, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 120, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 286, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 287 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 288, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 154, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 155, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 156, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 322, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 323 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 324, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 100, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 101, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 912, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 268, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 269 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 270, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 100, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 101, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 913, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 268, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 269 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 270, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 94, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 95, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 910, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 262, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 263 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 264, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 94, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 95, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 911, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 262, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 263 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 264, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 118, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 119, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 120, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 286, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 287 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 288, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 118, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 914, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 120, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 286, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 287 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 288, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 154, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 155, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 920, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 322, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 323 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 324, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 996, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 997, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 998, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 999, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1000 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1001,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1048, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1049, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1050, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1051, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1052 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1053,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1087, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1088, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1089, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1090, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1091 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1092,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1608, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1609, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1610, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1611, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1612 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1613,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1621, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1622, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1623, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1624, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1625 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1626,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1634, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1635, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1636, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1637, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1638 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1639,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1673, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1674, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1675, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1676, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1677 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1678,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1686, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1687, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1688, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1689, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1690 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1691,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1699, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1700, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1701, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1702, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1703 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1704,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1712, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1713, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1714, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1715, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1716 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1717,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1725, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1726, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1727, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1728, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1729 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1730,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1738, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1739, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1740, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1741, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1742 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1743,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1751, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1752, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1753, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1754, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1755 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1756,

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1764, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1765, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1766, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1767, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1768 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1769, i

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1920, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1921, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1922, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1923, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1924 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1925,

koji svi karakterišu domene za vezivanje za CDH19 grupisane u korpu 3; i

(e) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 76, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 77, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 78, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 244, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 245 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 246, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 88, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 89, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 90, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 256, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 257 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 258, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 106, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 107, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 108, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 274, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 275 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 276, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 112, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 113, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 114, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 280, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 281 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 282, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 106, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 107, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 108, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 274, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 275 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 276, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 983, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 984, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 985, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 986, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 987 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 988, CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1582, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1583, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1584, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1585, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1586 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1587, i

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1595, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1596, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1597, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1598, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1599 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1600,

koji svi karakterišu domene za vezivanje za CDH19 grupisane u korpu 5.

[0181] U daljoj realizaciji konstrukta antitela prema pronalasku prvi vezujući domen sadrži VH region izabran iz grupe koju čine VH regioni kako je prikazano u SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 388, SEQ ID NO: 386, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 348, SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470, SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID NO: 475, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491, SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 516, SEQ ID NO: 540, SEQ ID NO: 541, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 977, SEQ ID NO: 1068, SEQ ID NO: 1146, SEQ ID NO: 1159, SEQ ID NO: 1185, SEQ ID NO: 1198, SEQ ID NO: 1211, SEQ ID NO: 1224, SEQ ID NO: 1237, SEQ ID NO: 1315, SEQ ID NO: 1328, SEQ ID NO: 1380,

1

SEQ ID NO: 1393, SEQ ID NO: 1406, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1469, SEQ ID NO: 1478, SEQ ID NO: 1485, SEQ ID NO: 1494, SEQ ID NO: 1501, SEQ ID NO: 1508, SEQ ID NO: 1519, SEQ ID NO: 1526, SEQ ID NO: 1533, SEQ ID NO: 1542, SEQ ID NO: 1549, SEQ ID NO: 1558, SEQ ID NO: 1565, SEQ ID NO: 1784, SEQID NO: 1797, SEQ ID NO: 1810, SEQ ID NO: 1823, SEQ ID NO: 1836, SEQID NO: 1849, SEQ ID NO: 1862, SEQ ID NO: 1875, SEQ ID NO: 1888, SEQ ID NO: 2070, SEQ ID NO: 2083, SEQ ID NO: 2096, SEQ ID NO: 2109, SEQ ID NO: 2122, SEQ ID NO: 2135, SEQ ID NO: 2148, SEQ ID NO: 2161, SEQ ID NO: 2187, SEQ ID NO: 2200, i SEQ ID NO: 2213, grupisane u korpu 4.

[0182] U daljim ovde opisanim konstruktima antitela prvi vezujući domen sadrži VH region izabran iz grupe koju čine VH regioni:

(a) kako je prikazano u SEQ ID NO: 362, SEQ ID NO: 364, SEQ ID NO: 485, SEQ ID NO: 486, SEQ ID NO: 487, SEQ ID NO: 492, SEQ ID NO: 493, SEQ ID NO: 494, SEQ ID NO: 495, SEQ ID NO: 1133, SEQ ID NO: 1172, SEQ ID NO: 1341, SEQ ID NO: 1354, SEQ ID NO: 1367, SEQ ID NO: 1432, SEQ ID NO: 1445 i SEQ ID NO: 2174, grupisane u korpu 1; (b) kako je prikazano u SEQ ID NO: 342, SEQ ID NO: 366, SEQ ID NO: 370, SEQ ID NO: 344, SEQ ID NO: 372, SEQ ID NO: 368, SEQ ID NO: 496, SEQ ID NO: 497, SEQ ID NO: 498, SEQID NO: 499, SEQ ID NO: 500, SEQ ID NO: 508, SEQ ID NO: 509, SEQ ID NO: 510, SEQ ID NO: 511, SEQ ID NO: 512, SEQ ID NO: 519, SEQ ID NO: 520, SEQ ID NO: 521, SEQ ID NO: 522, SEQ ID NO: 523, SEQ ID NO: 524, SEQ ID NO: 525, SEQ ID NO: 526, SEQ ID NO: 527, SEQ ID NO: 528, SEQ ID NO: 529, SEQ ID NO: 530, SEQ ID NO: 531, SEQ ID NO: 532, SEQ ID NO: 533, SEQ ID NO: 534, SEQ ID NO: 535, SEQ ID NO: 536, SEQ ID NO: 537, SEQ ID NO: 538, SEQ ID NO: 1016, SEQ ID NO: 1029, SEQ ID NO: 1042, SEQ ID NO: 1081, SEQ ID NO: 1107, SEQ ID NO: 1120, SEQ ID NO: 1250, SEQ ID NO: 1263, SEQ ID NO: 1276, SEQ ID NO: 1289, SEQID NO: 1302, SEQ ID NO: 1654, SEQ ID NO: 1667, SEQ ID NO: 1901, SEQID NO: 1914, SEQ ID NO: 1940, SEQ ID NO: 1953, SEQ ID NO: 1966, SEQID NO: 1979, SEQ ID NO: 1992, SEQ ID NO: 2005, SEQ ID NO: 2018, SEQID NO: 2031, SEQ ID NO: 2044, i SEQ ID NO: 2057,

grupisane u korpu 2;

(c) kako je prikazano u SEQ ID NO: 338, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 378, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478, SEQ ID NO: 479, SEQ ID NO: 480, SEQID NO: 481, SEQ ID NO: 482, SEQ ID NO: 483, SEQ ID NO: 484, SEQ ID NO: 501, SEQ ID NO: 502, SEQ ID NO: 503, SEQ ID NO: 504, SEQ ID NO: 505, SEQ ID NO:

2

506, SEQ ID NO: 517, SEQ ID NO: 518, SEQ ID NO: 1003, SEQ ID NO: 1055, SEQ ID NO: 1094, SEQ ID NO: 1615, SEQ ID NO: 1628, SEQ ID NO: 1641, SEQ ID NO: 1680, SEQ ID NO: 1693, SEQ ID NO: 1706, SEQ ID NO: 1719, SEQ ID NO: 1732, SEQ ID NO: 1745, SEQ ID NO: 1758, SEQ ID NO: 1771, i SEQ ID NO: 1927,

grupisane u korpu 3; i

(e) kako je prikazano u SEQ ID NO: 376, SEQ ID NO: 392, SEQ ID NO: 358, SEQ ID NO: 350, SEQ ID NO: 507, SEQ ID NO: 990, SEQ ID NO: 1589, i SEQ ID NO: 1602,

grupisane u korpu 5.

[0183] U drugoj realizaciji konstrukta antitela prema pronalasku prvi vezujući domen sadrži VL region izabran iz grupe koju čine VL regioni kako je prikazano u SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 563, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 635, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 1070, SEQ ID NO: 1148, SEQ ID NO: 1161, SEQ ID NO: 1187, SEQ ID NO: 1200, SEQ ID NO: 1213, SEQ ID NO: 1226, SEQ ID NO: 1239, SEQ ID NO: 1317, SEQ ID NO: 1330, SEQ ID NO: 1382, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1421, SEQ ID NO: 1471, SEQ ID NO: 1480, SEQ ID NO: 1487, SEQ ID NO: 1496, SEQ ID NO: 1503, SEQ ID NO: 1510, SEQ ID NO: 1521, SEQ ID NO: 1528, SEQ ID NO: 1535, SEQ ID NO: 1544, SEQ ID NO: 1551, SEQ ID NO: 1560, SEQ ID NO: 1567, SEQ ID NO: 1786, SEQ ID NO: 1799, SEQ ID NO: 1812, SEQ ID NO: 1825, SEQ ID NO: 1838, SEQ ID NO: 1851, SEQ ID NO: 1864, SEQ ID NO: 1877, SEQ ID NO: 1890, SEQ ID NO: 2072, SEQ ID NO: 2085, SEQ ID NO: 2098, SEQ ID NO: 2111, SEQ ID NO: 2124, SEQ ID NO: 2137, SEQ ID NO: 2150, SEQ ID NO: 2163, SEQ ID NO: 2189, SEQ ID NO: 2202, i SEQ ID NO: 2215, grupisane u korpu 4.

[0184] U daljim ovde opisanim konstruktima antitela prvi vezujući domen sadrži VL region izabran iz grupe koju čine VL regioni:

(a) kako je prikazano u SEQ ID NO: 418, SEQ ID NO: 420, SEQ ID NO: 580, SEQ ID NO: 581, SEQ ID NO: 582, SEQ ID NO: 587, SEQ ID NO: 588, SEQ ID NO: 589, SEQ ID NO: 590, SEQ ID NO: 1135, SEQ ID NO: 1174, SEQ ID NO: 1343, SEQ ID NO: 1356, SEQ ID NO: 1369, SEQ ID NO: 1434, SEQ ID NO: 1447 i SEQ ID NO: 2176, grupisane u korpu 1; (b) kako je prikazano u SEQ ID NO: 398, SEQ ID NO: 422, SEQ ID NO: 426, SEQ ID NO: 400, SEQ ID NO: 428, SEQ ID NO: 424, SEQ ID NO: 591, SEQ ID NO: 592, SEQ ID NO: 593, SEQ ID NO: 594, SEQ ID NO: 595, SEQ ID NO: 603, SEQ ID NO: 604, SEQ ID NO: 605, SEQ ID NO: 606, SEQ ID NO: 607, SEQ ID NO: 614, SEQ ID NO: 615, SEQ ID NO: 616, SEQ ID NO: 617, SEQ ID NO: 618, SEQ ID NO: 619, SEQ ID NO: 620, SEQ ID NO: 621, SEQ ID NO: 622, SEQ ID NO: 623, SEQ ID NO: 624, SEQ ID NO: 625, SEQ ID NO: 626, SEQ ID NO: 627, SEQ ID NO: 628, SEQ ID NO: 629, SEQ ID NO: 630, SEQ ID NO: 631, SEQ ID NO: 632, SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 1018, SEQ ID NO: 1031, SEQ ID NO: 1044, SEQ ID NO: 1083, SEQ ID NO: 1109, SEQ ID NO: 1122, SEQ ID NO: 1252, SEQ ID NO: 1265, SEQ ID NO: 1278, SEQ ID NO: 1291, SEQ ID NO: 1304, SEQ ID NO: 1656, SEQ ID NO: 1669, SEQ ID NO: 1903, SEQ ID NO: 1916, SEQ ID NO: 1942, SEQ ID NO: 1955, SEQ ID NO: 1968, SEQ ID NO: 1981, SEQ ID NO: 1994, SEQ ID NO: 2007, SEQ ID NO: 2020, SEQ ID NO: 2033, SEQ ID NO: 2046, i SEQ ID NO: 2059,

grupisane u korpu 2;

(c) kako je prikazano u SEQ ID NO: 394, SEQ ID NO: 410, SEQ ID NO: 434, SEQ ID NO: 412, SEQ ID NO: 571, SEQ ID NO: 572, SEQ ID NO: 573, SEQ ID NO: 574, SEQ ID NO: 575, SEQ ID NO: 576, SEQ ID NO: 577, SEQ ID NO: 578, SEQ ID NO: 579, SEQ ID NO: 596, SEQ ID NO: 597, SEQ ID NO: 598, SEQ ID NO: 599, SEQ ID NO: 600, SEQ ID NO: 601, SEQ ID NO: 612, SEQ ID NO: 613, SEQ ID NO: 1005, SEQ ID NO: 1057, SEQ ID NO: 1096, SEQ ID NO: 1617, SEQ ID NO: 1630, SEQ ID NO: 1643, SEQ ID NO: 1682, SEQ ID NO: 1695, SEQ ID NO: 1708, SEQ ID NO: 1721, SEQ ID NO: 1734, SEQ ID NO: 1747, SEQ ID NO: 1760, SEQ ID NO: 1773, i SEQ ID NO: 1929,

grupisane u korpu 3; i

(e) kako je prikazano u SEQ ID NO: 432, SEQ ID NO: 448, SEQ ID NO: 414, SEQ ID NO: 406, SEQ ID NO: 602, SEQ ID NO: 992, SEQ ID NO: 1591, i SEQ ID NO: 1604, grupisane u korpu 5.

[0185] Pronalazak dalje obezbeđuje realizaciju konstrukta antitela prema pronalasku, pri čemu prvi vezujući domen sadrži VH region i VL region izabran iz grupe koju čine parovi VH regioni i VL regioni kako je prikazano u SEQ ID NOs: 352+408, SEQ ID NOs: 360+416, SEQ ID NOs: 388+444, SEQ ID NOs: 386+442, SEQ ID NOs: 340+396, SEQ ID NOs: 346+402, SEQ

4

ID NOs: 374+430, SEQ ID NOs: 348+404, SEQ ID NOs: 390+446, SEQ ID NOs: 463+558, SEQ ID NOs: 464+559, SEQ ID NOs: 465+560, SEQ ID NOs: 466+561, SEQ ID NOs: 467+562, SEQ ID NOs: 468+563, SEQ ID NOs: 469+564, SEQ ID NOs: 470+565, SEQ ID NOs: 471+566, SEQ ID NOs: 472+567, SEQ ID NOs: 473+568, SEQ ID NOs: 474+569, SEQ ID NOs: 475+570, SEQ ID NOs: 488+583, SEQ ID NOs: 489+584, SEQ ID NOs: 490+585, SEQ ID NOs: 491+586, SEQ ID NOs: 513+608, SEQ ID NOs: 514+609, SEQ ID NOs: 515+610, SEQ ID NOs: 516+611, SEQ ID NOs: 540+635, SEQ ID NOs: 541+636, SEQ ID NOs: 542+637, SEQ ID NOs: 543+638, SEQ ID NOs: 977+979, SEQ ID NOs: 1068+1070, SEQ ID NOs: 1146+1148, SEQ ID NOs: 1159+1161, SEQ ID NOs: 1185+1187, SEQ ID NOs: 1198+1200, SEQ ID NOs: 1211+1213, SEQ ID NOs: 1224+1226, SEQ ID NOs: 1237+1239, SEQ ID NOs: 1315+1317, SEQ ID NOs: 1328+1330, SEQ ID NOs: 1380,+1382 SEQ ID NOs: 1393+1395, SEQ ID NOs: 1406+1408, SEQ ID NOs: 1419+1421, SEQ ID NOs: 1469+1471, SEQ ID NOs: 1478+1480, SEQ ID NOs: 1485+1487, SEQ ID NOs: 1494+1496, SEQ ID NOs: 1501+1503, SEQ ID NOs: 1508+1510, SEQ ID NOs: 1519+1521, SEQ ID NOs: 1526+1528, SEQ ID NOs: 1533+1535, SEQ ID NOs: 1542+1544, SEQ ID NOs: 1549+1551, SEQ ID NOs: 1558+1560, SEQ ID NOs: 1565+1567, SEQ ID NOs: 1784+1786, SEQ ID NOs: 1797+1799, SEQ ID NOs: 1810+1812, SEQ ID NOs: 1823+1825, SEQ ID NOs: 1836+1838, SEQ ID NOs: 1849+1851, SEQ ID NOs: 1862+1864, SEQ ID NOs: 1875+1877, SEQ ID NOs: 1888+1890, SEQ ID NOs: 2070+2072, SEQ ID NOs: 2083+2085, SEQ ID NOs: 2096+2098, SEQ ID NOs: 2109+2111, SEQ ID NOs: 2122+2124, SEQ ID NOs: 2135+2137, SEQ ID NOs: 2148+2150, SEQ ID NOs: 2161+2163, SEQ ID NOs: 2187+2189, SEQ ID NOs: 2200+2202, i SEQ ID NOs: 2213+2215, svi parovi su grupisani u korpu 4.

[0186] U daljim ovde opisanim konstruktima antitela prvi vezujući domen sadrži VH region i VL region izabran iz grupe koju čine:

(1) parovi VH regioni i VL regioni kako je prikazano u SEQ ID NOs: 362+418, SEQ ID NOs: 364+420, SEQ ID NOs: 485+580, SEQ ID NOs: 486+581, SEQ ID NOs: 487+582, SEQ ID NOs: 492+587, SEQ ID NOs: 493+588, SEQ ID NOs: 494+589, SEQ ID NOs: 495+590, SEQ ID NOs: 1133+1135, SEQ ID NOs: 1172+1174, SEQ ID NOs: 1341+1343, SEQ ID NOs: 1354+1356, SEQ ID NOs: 1367+1369, SEQ ID NOs: 1432+1434, SEQ ID NOs: 1445+1447, i SEQ ID NOs: 2174+2176,

svi parovi su grupisani u korpu 1;

(2) parovi VH regioni i VL regioni kako je prikazano u SEQ ID NOs: 342+398, SEQ ID NOs: 366+422, SEQ ID NOs: 370+426, SEQ ID NOs: 344+400, SEQ ID NOs: 372+428, SEQ ID NOs: 368+424, SEQ ID NOs: 496+591, SEQ ID NOs: 497+592, SEQ ID NOs: 498+593, SEQ ID NOs: 499+594, SEQ ID NOs: 500+595, SEQ ID NOs: 508+603, SEQ ID NOs: 509+604, SEQ ID NOs: 510+605, SEQ ID NOs: 511+606, SEQ ID NOs: 512+607, SEQ ID NOs: 519+614, SEQ ID NOs: 520+615, SEQ ID NOs: 521+616, SEQ ID NOs: 522+617, SEQ ID NOs: 523+618, SEQ ID NOs: 524+619, SEQ ID NOs: 525+620, SEQ ID NOs: 526+621, SEQ ID NOs: 527+622, SEQ ID NOs: 528+623, SEQ ID NOs: 529+624, SEQ ID NOs: 530+625, SEQ ID NOs: 531+626, SEQ ID NOs: 532+627, SEQ ID NOs: 533+628, SEQ ID NOs: 534+629, SEQ ID NOs: 535+630, SEQ ID NOs: 536+631, SEQ ID NOs: 537+632, SEQ ID NOs: 538+633, SEQ ID NOs: 1016+1018, SEQ ID NOs: 1029+1031, SEQ ID NOs: 1042+1044, SEQ ID NOs: 1081+1083, SEQ ID NOs: 1107+1109, SEQ ID NOs: 1120+1122, SEQ ID NOs: 1250+1252, SEQ ID NOs: 1263+1265, SEQ ID NOs: 1276+1278, SEQ ID NOs: 1289+1291, SEQ ID NOs: 1302+1304, SEQ ID NOs: 1654+1656, SEQ ID NOs: 1667+1669, SEQ ID NOs: 1901+1903, SEQ ID NOs: 1914+1916, SEQ ID NOs: 1940+1942, SEQ ID NOs: 1953+1955, SEQ ID NOs: 1966+1968, SEQ ID NOs: 1979+1981, SEQ ID NOs: 1992+1994, SEQ ID NOs: 2005+2007, SEQ ID NOs: 2018+2020, SEQ ID NOs: 2031+2033, SEQ ID NOs: 2044+2046, i SEQ ID NOs: 2057+2059,

svi parovi su grupisani u korpu 2;

(3) parovi VH regioni i VL regioni kako je prikazano u SEQ ID NOs: 338+394, SEQ ID NOs: 354+410, SEQ ID NOs: 378+434, SEQ ID NOs: 356+412, SEQ ID NOs: 476+571, SEQ ID NOs: 477+572, SEQ ID NOs: 478+573, SEQ ID NOs: 479+574, SEQ ID NOs: 480+575, SEQ ID NOs: 481+576, SEQ ID NOs: 482+577, SEQ ID NOs: 483+578, SEQ ID NOs: 484+579, SEQ ID NOs: 501+596, SEQ ID NOs: 502+597, SEQ ID NOs: 503+598, SEQ ID NOs: 504+599, SEQ ID NOs: 505+600, SEQ ID NOs: 506+601, SEQ ID NOs: 517+612, SEQ ID NOs: 518+613, SEQ ID NOs: 1003+1005, SEQ ID NOs: 1055+1057, SEQ ID NOs: 1094+1096, SEQ ID NOs: 1615+1617, SEQ ID NOs: 1628+1630, SEQ ID NOs: 1641+1643, SEQ ID NOs: 1680+1682, SEQ ID NOs: 1693+1695, SEQ ID NOs: 1706+1708, SEQ ID NOs: 1719+1721, SEQ ID NOs: 1732+1734, SEQ ID NOs: 1745+1747, SEQ ID NOs: 1758+1760, SEQ ID NOs: 1771+1773, i SEQ ID NOs: 1927+1929,

svi parovi su grupisani u korpu 3; i

(5) parovi VH regioni i VL regioni kako je prikazano u SEQ ID NOs: 376+432, SEQ ID NOs: 392+448, SEQ ID NOs: 358+414, SEQ ID NOs: 350+406, SEQ ID NOs: 507+602, SEQ ID NOs: 990+992, SEQ ID NOs: 1589+1591, i SEQ ID NOs: 1602+1604,

svi parovi su grupisani u korpu 5.

[0187] U daljoj realizaciji prema pronalasku konstrukt antitela je u formatu izabranom iz grupe koju čine (scFv)2, scFv-jednostrukog domena mAb, diatela i njihovi oligomeri.

[0188] U poželjnoj realizaciji prvi vezujući domen sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine kako je prikazano u SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 1072, SEQ ID NO: 1150, SEQ ID NO: 1163, SEQ ID NO: 1189, SEQ ID NO: 1202, SEQ ID NO: 1215, SEQ ID NO: 1228, SEQ ID NO: 1241, SEQ ID NO: 1319, SEQ ID NO: 1332, SEQ ID NO: 1384, SEQ ID NO: 1397, SEQ ID NO: 1410, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1473, SEQ ID NO: 1482, SEQ ID NO: 1489, SEQ ID NO: 1498, SEQ ID NO: 1505, SEQ ID NO: 1512, SEQ ID NO: 1523, SEQ ID NO: 1530, SEQ ID NO: 1537, SEQ ID NO: 1546, SEQ ID NO: 1553, SEQ ID NO: 1562, SEQ ID NO: 1569, SEQ ID NO: 1788, SEQ ID NO: 1801, SEQ ID NO: 1814, SEQ ID NO: 1827, SEQ ID NO: 1840, SEQ ID NO: 1853, SEQ ID NO: 1866, SEQ ID NO: 1879, SEQ ID NO: 1892, SEQ ID NO: 2074, SEQ ID NO: 2087, SEQ ID NO: 2100, SEQ ID NO: 2113, SEQ ID NO: 2126, SEQ ID NO: 2139, SEQ ID NO: 2152, SEQ ID NO: 2165, SEQ ID NO: 2191, SEQ ID NO: 2204, i SEQ ID NO: 2217, sva veziva su grupisana u korpu 4.

[0189] U daljim ovde opisanim konstruktima antitela prvi vezujući domen sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koju čine:

(a) kako je prikazano u SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 1137, SEQ ID NO: 1176, SEQ ID NO: 1345, SEQ ID NO: 1358, SEQ ID NO: 1371, SEQ ID NO: 1436, SEQ ID NO: 1449 i SEQ ID NO: 2178,

sva veziva su grupisana u korpu 1;

(b) kako je prikazano u SEQ ID NO: 1020, SEQ ID NO: 1033, SEQ ID NO: 1046, SEQ ID NO: 1085, SEQ ID NO: 1111, SEQ ID NO: 1124, SEQ ID NO: 1254, SEQ ID NO: 1267, SEQ ID NO: 1280, SEQ ID NO: 1293, SEQ ID NO: 1306, SEQ ID NO: 1658, SEQ ID NO: 1671, SEQ ID NO: 1905, SEQ ID NO: 1918, SEQ ID NO: 1944, SEQ ID NO: 1957, SEQ ID NO: 1970, SEQ ID NO: 1983, SEQ ID NO: 1996, SEQ ID NO: 2009, SEQ ID NO: 2022, SEQ ID NO: 2035, SEQ ID NO: 2048, i SEQ ID NO: 2061,

sva veziva su grupisana u korpu 2;

(c) kako je prikazano u SEQ ID NO: 1007, SEQ ID NO: 1059, SEQ ID NO: 1098, SEQ ID NO: 1619, SEQ ID NO: 1632, SEQ ID NO: 1645, SEQ ID NO: 1684, SEQ ID NO: 1697, SEQ ID NO: 1710, SEQ ID NO: 1723, SEQ ID NO: 1736, SEQ ID NO: 1749, SEQ ID NO: 1762, SEQ ID NO: 1775, i SEQ ID NO: 1931,

sva veziva su grupisana u korpu 3; i

(e) kako je prikazano u SEQ ID NO: 994, SEQ ID NO: 1593, i SEQ ID NO: 1606, grupisane u korpu 5.

[0190] U jednom aspektu prema pronalasku, drugi vezujući domen je sposoban da se veže za humani CD3 i za makaki CD3, poželjno za humani CD3 ipsilon i za makaki CD3 ipsilon. Pored toga, ili alternativno, drugi vezujući domen može se vezivati na Callithrix jacchus, Saguinus oedipus i/ili Saimiri sciureus CD3 ipsilon. Prema ovim realizacijama, jedan ili oba vezujuća domena konstrukta antitela prema pronalasku su poželjno unakrsne vrste specifične za članove primate iz reda sisara. CD3 vezujući domeni specifični za unakrsne vrste su, na primer, opisani u WO 2008/119567.

[0191] Naročito je poželjno za konstrukt antitela iz prikazanog pronalaska da drugi vezujući domen sposoban da se vezuje za kompleks T ćelija CD3 receptora sadrži VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 odabran od:

(a) CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 27 iz WO 2008/119567, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28 iz WO 2008/119567 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29 iz WO 2008/119567;

(b) CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 117 iz WO 2008/119567, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 118 iz WO 2008/119567 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 119 iz WO 2008/119567; i

(c) CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 153 iz WO 2008/119567, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 154 iz WO 2008/119567 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 155 iz WO 2008/119567.

[0192] U alternativnoj poželjnoj realizaciji konstrukta antitela iz prikazanog pronalaska, drugi vezujući domen sposoban da se vezuje za kompleks T ćelija CD3 receptora sadrži VH region koji sadrži CDR-H 1, CDR-H2 i CDR-H3 odabran od:

(a) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 12 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 13 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 14 iz WO 2008/119567;

(b) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 31 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 32 iz WO 2008/119567;

(c) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 48 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 49 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 50 iz WO 2008/119567;

(d) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 66 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 67 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 68 iz WO 2008/119567;

(e) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 84 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 85 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 86 iz WO 2008/119567;

(f) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 102 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 103 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 104 iz WO 2008/119567;

(g) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 120 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 121 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 122 iz WO 2008/119567;

(h) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 138 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 139 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 140 iz WO 2008/119567;

(i) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 156 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 157 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 158 iz WO 2008/119567; i

(j) CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 174 iz WO 2008/119567, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 175 iz WO 2008/119567 i CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 176 iz WO 2008/119567.

[0193] Još je poželjnije za konstrukt antitela iz prikazanog pronalaska da drugi vezujući domen sposoban da se vezuje za kompleks T ćelija CD3 receptora sadrži VL region izabran iz grupe koju čine VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 35, 39, 125, 129, 161 ili 165 iz WO 2008/119567.

[0194] Alternativno je poželjno da drugi vezujući domen sposoban da se vezuje za kompleks T ćelija CD3 receptora sadrži VH region izabran iz grupe koju čine VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 15, 19, 33, 37, 51, 55, 69, 73, 87, 91, 105, 109, 123, 127, 141, 145, 159, 163, 177 ili 181 iz WO 2008/119567.

[0195] Poželjnije, konstrukt antitela prikazanog pronalaska se karakteriše drugim vezujućim domenom koji je sposoban da se vezuje za kompleks T ćelija CD3 receptora koji sadrži VL region i VH region izabran iz grupe koju čine:

(a) VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 17 ili 21 iz WO 2008/119567 i VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 15 ili 19 iz WO 2008/119567;

(b) VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 35 ili 39 iz WO 2008/119567 i VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 33 ili 37 iz WO 2008/119567;

(c) VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 53 ili 57 iz WO 2008/119567 i VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 51 ili 55 iz WO 2008/119567;

(d) VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 71 ili 75 iz WO 2008/119567 i VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 69 ili 73 iz WO 2008/119567;

(e) VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 89 ili 93 iz WO 2008/119567 i VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 87 ili 91 iz WO 2008/119567;

(f) VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 107 ili 111 iz WO 2008/119567 i VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 105 ili 109 iz WO 2008/119567;

(g) VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 125 ili 129 iz WO 2008/119567 i VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 123 ili 127 iz WO 2008/119567;

(h) VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 143 ili 147 iz WO 2008/119567 i VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 141 ili 145 iz WO 2008/119567;

(i) VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 161 ili 165 iz WO 2008/119567 i VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 159 ili 163 iz WO 2008/119567; i

(j) VL region kako je prikazano u SEQ ID NO: 179 ili 183 iz WO 2008/119567 i VH region kako je prikazano u SEQ ID NO: 177 ili 181 iz WO 2008/119567.

[0196] Prema jednom poželjnom izvođenju konstrukta antitela iz prikazanog pronalaska, naročito drugi vezujući domen koji je sposoban da se vezuje za kompleks T ćelija CD3 receptora, parovi VH-regiona i VL-regiona su u formatu jednolančanog antitela (scFv). VH i VL regioni su raspoređeni redom VH-VL ili VL-VH. Poželjno je da je VH-region smešten N-terminalno prema sekvenci linkera. VL-region je smešten C-terminalno prema sekvenci linkera.

[0197] Poželjna realizacija gore opisanog konstrukta antitela prikazanog pronalaska se karakteriše time da je drugi vezujući domen sposoban da se vezuje za kompleks T ćelija CD3 receptora koji obuhvata sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NOs: 23, 25, 41, 43, 59, 61, 77, 79, 95, 97, 113, 115, 131, 133, 149, 151, 167, 169, 185 ili 187 iz WO 2008/119567.

[0198] U poželjnoj realizaciji konstrukt antitela prema pronalasku ima sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koju čine kako je prikazano u SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 1073, SEQ ID NO: 1151, SEQ ID NO: 1164, SEQ ID NO: 1190, SEQ ID NO: 1203, SEQ ID NO: 1216, SEQ ID NO: 1229, SEQ ID NO: 1242, SEQ ID NO: 1320, SEQ ID NO: 1333, SEQ ID NO: 1385, SEQ ID NO: 1398, SEQ ID NO: 1411, SEQ ID NO: 1424, SEQ ID NO: 1474, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1476, SEQ ID NO: 1483, SEQ ID NO: 1490, SEQ ID NO: 1491, SEQ ID NO: 1492, SEQ ID NO: 1499, SEQ ID NO: 1506, SEQ ID NO: 1513, SEQ ID NO: 1514, SEQ ID NO: 1515, SEQ ID NO: 1516, SEQ ID NO: 1517, SEQ ID NO: 1524, SEQ ID NO: 1531, SEQ ID NO: 1538, SEQ ID NO: 1539, SEQ ID NO: 1540, SEQ ID NO: 1547, SEQ ID NO: 1554, SEQ ID NO: 1555, SEQ ID NO: 1556, SEQ ID NO: 1563, SEQ ID NO: 1570, SEQ ID NO: 1571, SEQ ID NO: 1572, SEQ ID NO: 1573, SEQ ID NO: 1574, SEQ ID NO: 1575, SEQ ID NO: 1576, SEQ ID NO: 1577, SEQ ID NO: 1578, SEQ ID NO: 1579, SEQ ID NO: 1580, SEQ ID NO: 1581, SEQ ID NO: 1789, SEQ ID NO: 1802, SEQ ID NO: 1815, SEQ ID NO: 1828, SEQ ID NO: 1841, SEQ ID NO: 1854, SEQ ID NO: 1867, SEQ ID NO: 1880, SEQ ID NO: 1893, SEQ ID NO: 2075, SEQ ID NO: 2088, SEQ ID NO: 2101, SEQ ID NO: 2114, SEQ ID NO: 2127, SEQ ID NO: 2140, SEQ ID NO: 2153, SEQ ID NO: 2166, SEQ ID NO: 2192, SEQ ID NO: 2205, i SEQ ID NO: 2218 do 2228.

[0199] Dalji ovde otkriveni konstrukti antitela imaju sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koju čine:

1

(a) kako je prikazano u SEQ ID NO: 1138, SEQ ID NO: 1177, SEQ ID NO: 1346, SEQ ID NO: 1359, SEQ ID NO: 1372, SEQ ID NO: 1437, SEQ ID NO: 1450 i SEQ ID NO: 2179;

(b) kako je prikazano u SEQ ID NO: 1021, SEQ ID NO: 1034, SEQ ID NO: 1047, SEQ ID NO: 1086, SEQ ID NO: 1112, SEQ ID NO: 1125, SEQ ID NO: 1255, SEQ ID NO: 1268, SEQ ID NO: 1281, SEQ ID NO: 1294, SEQ ID NO: 1307, SEQ ID NO: 1659, SEQ ID NO: 1672, SEQ ID NO: 1906, SEQ ID NO: 1919, SEQ ID NO: 1945, SEQ ID NO: 1958, SEQ ID NO: 1971, SEQ ID NO: 1984, SEQ ID NO: 1997, SEQ ID NO: 2010, SEQ ID NO: 2023, SEQ ID NO: 2036, SEQ ID NO: 2049, i SEQ ID NO: 2062;

(c) kako je prikazano u SEQ ID NO: 1008, SEQ ID NO: 1060, SEQ ID NO: 1099, SEQ ID NO: 1620, SEQ ID NO: 1633, SEQ ID NO: 1646, SEQ ID NO: 1685, SEQ ID NO: 1698, SEQ ID NO: 1711, SEQ ID NO: 1724, SEQ ID NO: 1737, SEQ ID NO: 1750, SEQ ID NO: 1763, SEQ ID NO: 1776, i SEQ ID NO: 1932; i

(e) kako je prikazano u SEQ ID NO: 995, SEQ ID NO: 1594, i SEQ ID NO: 1607.

[0200] Pronalazak dalje obezbeđuje sekvencu nukleinske kiseline koja kodira konstrukt antitela prema pronalasku.

[0201] Dalje, pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline prema pronalasku. Štaviše, pronalazak obezbeđuje ćeliju domaćina transformisanu ili transfektovanu sekvencom nukleinske kiseline iz ovog pronalaska.

[0202] U daljoj realizaciji pronalazak obezbeđuje proces za proizvodnju konstrukta antitela prema pronalasku, te pomenuti postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju konstrukta antitela prema pronalasku i regenerisanje proizvedenog konstrukta antitela iz kulture.

[0203] Štaviše, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži konstrukt antitela prema pronalasku ili proizveden prema procesu prema pronalasku

[0204] Ovde opisane formulacije su korisne kao farmaceutske kompozicije za lečenje, poboljšanje i/ili prevenciju patološkog medicinskog stanja koje je ovde opisano kod pacijenta kom je to potrebno. Termin "lečenje" odnosi se i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere. Lečenje obuhvata primenu ili davanje formulacije u telo, izolovano tkivo ili

2

ćeliju od pacijenta koji ima bolest/poremećaj, simptom bolesti/poremećaja ili predispoziciju za bolest/poremećaj, sa ciljem da leči, ublažava, ublažava, menja, leči, poboljšava, poboljšava ili utiče na bolest, simptom bolesti ili predispoziciju za bolest.

[0205] Oni „kojima je potrebno lečenje“ obuhvataju one koji već imaju poremećaj, kao i one kod kojih će poremećaj biti sprečen. Izraz "bolest" je svako stanje koje bi imalo koristi od lečenja ovde opisanom proteinskom formulacijom. Ovo obuhvata hronične i akutne poremećaje ili bolesti, uključujući ona patološka stanja koja predisponiraju sisara za predmetnu bolest. Ne ograničavajući primeri bolesti/poremećaja koji se ovde leče obuhvataju proliferativnu bolest, tumorsku bolest ili imunološki poremećaj.

[0206] U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju sadrži terapeutski efikasnu količinu jednog ili mnoštva konstrukata antitela prema pronalasku zajedno sa nekim farmaceutski efektivnim razblaživačima, nosačem, rastvaračem, emulgatorom, konzervansom i/ili adjuvansom. Farmaceutske kompozicije prema pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničene na, tečne, smrznute i liofilizovane kompozicije.

[0207] Poželjno, materijali za formulacije su netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste. U specifičnim realizacijama, farmaceutske kompozicije sadrže terapeutski efikasnu količinu konstrukta antitela prema pronalasku.

[0208] U određenim realizacijama, farmaceutska kompozicija može da sadrži materijale za formulaciju za modifikovanje, održavanje ili konzervaciju, na primer, na primer, pH, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije kompozicije. U takvim realizacijama, pogodni materijali za formulacije uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin, prolin ili lizin); antimikrobni agensi; antioksidanti (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit ili natrijum hidrogen-sulfit); pufere (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati ili druge organske kiseline); sredstva za zgušnjavanje (kao što su manitol ili glicin); helatorska sredstva (kao što je etilendiamin tetra sirćetna kiselina (EDTA)); agensi za kompleksiranje (poput kofeina, polivinilpirolidona, beta-ciklodekstrina ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrina); punila; monosaharidi; disaharidi; i drugi ugljeni hidrati (poput glukoze, manoze ili dekstrina); proteini (kao što su serumski albumin, želatina ili imunoglobulini); sredstva za bojenje, arome i sredstva za razblaživanje; emulgatori; hidrofilni polimeri (poput polivinilpirolidona); polipeptidi male molekulske težine; protivjoni koji stvaraju sol (poput natrijuma); konzervansi (kao što je benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonik peroksid); rastvarači (poput glicerina, propilen glikola ili polietilen glikola); šećerni alkoholi (kao što su manitol ili sorbitol); sredstva za suspendiranje; surfaktanti ili sredstva za vlaženje (kao što su pluronici, PEG, sorbitanski estri, polisorbati, poput polisorbata 20, polisorbata, tritona, trometamina, lecitina, holesterola, tiloksapala); agensi za povećanje stabilnosti (poput saharoze ili sorbitola); agensi za povećanje toniciteta (kao što su halogenidi alkalnih metala, poželjno natrijum ili kalijum hlorid, manitol sorbitol); vehikuli za dostavu; razblaživači; ekscipijensi i/ili farmaceutski adjuvansi. Videti, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" izdanje, (A. R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company.

[0209] U određenim realizacijama, optimalna farmaceutska kompozicija će biti određena od strane stručnjaka u ovoj oblasti u zavisnosti od, na primer, nameravanog načina primene, formata dostave i željene doze. Videti, na primer, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, gore. U određenim realizacijama, takve kompozicije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu in vivo oslobađanja i brzinu in vivo klirensa antigen vezujućih proteina prema pronalasku. U određenim realizacijama, primarni nosač ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može biti ili vodene ili ne-vodene prirode. Na primer, pogodan vehikul ili nosač može biti voda za injekcije, fiziološki rastvor ili veštačka cerebrospinalna tečnost, eventualno dopunjeni sa drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralnu primenu. Neutralni fiziološki rastvor ili fiziološki rastvor pomešan sa serumskim albuminom su dalji primeri nosača. U specifičnim realizacijama, farmaceutske kompozicije sadrže Tris pufer od oko pH 7.0-8.5, ili acetatni pufer od oko pH 4.0-5.5, i mogu dalje uključivati sorbitol ili pogodnu zamenu. U određenim realizacijama prema pronalasku, kompozicije koje sadrže humano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku ili konstrukt antitela prema pronalasku mogu se pripremiti za čuvanje mešanjem odabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim sredstvima za formulisanje (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, gore) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim realizacijama, humano antitelo ili njegov antigen

4

vezujući fragment prema pronalasku ili konstrukt antitela prema pronalasku mogu biti formulisani kao liofilizat koristeći odgovarajuće ekscipijente poput sukroze.

[0210] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku mogu biti izabrane za parenteralnu isporuku. Alternativno, kompozicije mogu biti izabrane za inhalaciju ili za davanje kroz probavni trakt, kao što je oralno. Priprema takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je poznata u struci. Komponente formulacije su poželjno prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto primene. U određenim realizacijama, puferi se koriste za održavanje kompozicije na fiziološkom pH ili na nešto nižem pH, obično u rasponu pH od oko 5 do oko 8.

[0211] Kada se razmatra parenteralna primena, terapeutske kompozicije za upotrebu u ovom pronalasku mogu biti obezbeđene u obliku bez pirogena, parenteralno prihvatljiv vodeni rastvor koji sadrži željeno humano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment prema pronalasku ili konstrukt antitela prema pronalasku u farmaceutski prihvatljivom vehikulu. Naročito pogodan vehikul za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je konstrukt antitela prema pronalasku je formulisan kao pravilno konzervisan, sterilan, izotonični rastvor. U određenim realizacijama, preparat može da obuhvata formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su mikrosfere koje se mogu ubrizgati, bioerodirajuće čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polilaktična kiselina ili poliglikolna kiselina), kuglice ili lipozomi, koji mogu da daju kontrolisano ili zadržano oslobađanje proizvoda koji se može isporučiti putem depo injekcije. U određenim realizacijama, takođe se može koristiti hijaluronska kiselina koja ima efekat promovisanja produženog trajanja u cirkulaciji. U određenim realizacijama, mogu se koristiti implantabilni uređaji za davanje leka za uvođenje željenog antigen vezujućeg proteina.

[0212] Dodatne farmaceutske kompozicije će biti očigledne stručnjacima u ovoj oblasti, uključujući formulacije koje obuhvataju konstrukt antitela prema pronalasku u formulacijama sa odloženim ili kontrolisanim oslobađanjem. Tehnike za formulisanje raznih drugih sredstava za neprekidno ili kontrolisano davanje, kao što su lipozomski nosači, bioerodirajuće mikročestice ili porozne kuglice i depo injekcije, takođe su poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, na primer, objavu međunarodne patentne prijave br. WO9315722, koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija. Preparati sa odloženim oslobađanjem mogu obuhvatati polupropusne polimerne matrice u obliku oblikovanih proizvoda, npr., filmova, ili mikrokapsula. Matrice za odloženo oslobađanje mogu obuhvatati poliestere, hidrogele, polilaktide (kao što je otkriveno u američkom patentu br.3,773,919 i objavi Evropske prijave patenta br. EP 058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman i sar., 1983, Biopolimers 2:547-556), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer i sar., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etilen vinil acetat (Langer i sar., 1981, gore) ili poli-D(-)-3-hidroksimaslačnu kiselinu (objava Evropske prijave patenta br. EP 133,988). Kompozicije sa odloženim oslobađanjem mogu takođe da sadrže lipozome koji se mogu pripremiti bilo kojim od nekoliko postupaka poznatih u stanju tehnike. Videti, npr., Eppstein i sar., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82:3688-3692; objava Evropske prijave patenta br. EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0213] Farmaceutske kompozicije koje se koriste za in vivo primenu su tipično obezbeđene kao sterilni preparati. Sterilizacija se može izvršiti filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Kada je kompozicija liofilizovana, sterilizacija korišćenjem ovog postupka može se izvesti ili pre ili nakon liofilizacije i rekonstituisanja. Kompozicije za parenteralnu primenu mogu se čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Parenteralne kompozicije se obično postavljaju u kontejner sa sterilnim pristupnim otvorom, na primer, vrećicu za intravenski rastvor ili bočicu sa čepom koji se može probiti hipodermičkom iglom za ubrizgavanje.

[0214] Aspekti pronalaska uključuju samo-puferirajuće formulacije konstrukta antitela prema pronalasku, koje se mogu koristiti kao farmaceutske kompozicije, kao što je opisano u međunarodnoj patentnoj prijavi WO 06138181A2.

[0215] Kao što je diskutovano gore, neke realizacije obezbeđuju proteinske kompozicije konstrukta antitela prema pronalasku, naročito farmaceutske kompozicije prema pronalasku, koje sadrže, pored konstrukta antitela prema pronalasku, jedan ili više ekscipijenata kao što su oni ilustrativno opisani u ovom odeljku i drugde u ovom opisu. Ekscipijensi se mogu u ovom pronalasku koristiti širok spektar namena, kao što je prilagođavanje fizičke, hemijske, ili bioloških karakteristika formulacija, kao što je prilagođavanje viskoznosti, ili procesi iz pronalaska radi poboljšanja efikasnosti i/ili stabilizacije takvih formulacija i procesi protiv degradacije i kvarenja zbog, na primer, naprezanja koji nastaju tokom proizvodnje, otpreme, skladištenja, pripreme pre upotrebe, administracije i nakon toga.

Dostupna su različita izlaganja za stabilizaciju proteina i formulacijske materijale i metode korisne u tom smislu, kao što su Arakawa i sar., " Interakcije sa rastvaračima u farmaceutskim formulacijama," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick i sar., " Fizička stabilizacija proteina u vodenom rastvoru," u: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter i Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), i Randolph i sar., " Interakcije surfaktanta i proteina," Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002).

[0216] Soli se mogu koristiti u skladu sa nekim realizacijama ovog pronalaska, na primer, podešavanje jonske jačine i/ili izotoničnosti formulacije i/ili da se poboljša rastvorljivost i/ili fizička stabilnost proteina ili drugog sastojka kompozicije u skladu sa pronalaskom.

[0217] Kao što je dobro poznato, joni mogu da stabilizuju prirodno stanje proteina vezivanjem sa nabijenim ostacima na površini proteina i zaštitom naelektrisanih i polarnih grupa u proteinu i smanjenje snage njihovih elektrostatičkih interakcija, privlačnih, i odbojnih interakcija. Joni takođe mogu stabilizovati denaturirano stanje proteina vezivanjem na, naročito, denaturirane peptidne veze (--CONH) proteina. Dalje, jonska interakcija sa naelektrisanim i polarnim grupama u proteinu može takođe da smanji intermolekularne elektrostatičke interakcije i na taj način spreči ili smanji agregaciju proteina i nerastvorljivost.

[0218] Jonske vrste se značajno razlikuju po svom uticaju na proteine. Razvijen je niz kategoričnih rangiranja jona i njihovih efekata na proteine koji se mogu koristiti u formulisanju farmaceutskih kompozicija u skladu sa pronalaskom. Jedan primer je serija Hofmeister koja rangira jonske i polarne nejonske rastvore po svom uticaju na konformacionu stabilnost proteina u rastvoru. Stabilizujući rastvori nazivaju se "kozmotropnima". Destabilizujući rastvori nazivaju se "haotropnim." Kozmotropi se obično koriste u visokim koncentracijama (npr., >1 molarni amonijum sulfat) za taloženje proteina iz rastvora ("odsoljavanje"). Haotropi se obično koriste za denaturisanje i/ili za solubilizaciju proteina ("zasoljavanje"). Relativna efikasnost jona za "zasoljavanje " i "odsoljavanje" definiše njihov položaj u Hofmeisterovoj seriji.

[0219] Slobodne amino kiseline mogu se koristiti u formulacijama konstrukta antitela prema pronalasku u skladu sa različitim primenama ovog pronalaska kao punioci, stabilizatori, i antioksidanti, kao i za druge standardne upotrebe. Lizin, prolin, serin i alanin mogu se koristiti za stabilizaciju proteina u formulaciji. Glicin je koristan u liofilizaciji kako bi se obezbedila ispravna struktura i svojstva kolača. Arginin može biti koristan za inhibiciju agregacije proteina, kako u tečnim tako i u liofilizovanim formulacijama. Metionin je koristan kao antioksidans.

[0220] Polioli obuhvataju šećere, npr., manitol, saharoza i sorbitol i polihidroksilne alkohole, kao na primer, glicerol i propilen glikol, i za potrebe diskusije ovde, poli polietilen glikol (PEG) i srodne supstance. Polioli su kozmotropni. Oni su korisni stabilizujući agensi u tečnim i liofilizovanim formulacijama za zaštitu proteina od fizičkih i hemijskih procesa razgradnje. Polioli su takođe korisni za podešavanje toniciteta formulacija.

[0221] Među poliolima koji su korisni u odabranim realizacijama pronalaska je manitol, koji se obično koristi da obezbedi strukturnu stabilnost kolača u liofilizovanim formulacijama. Obezbeđuje strukturnu stabilnost kolača. Obično se koristi sa lioprotektantom, npr., saharozom. Sorbitol i saharoza su među poželjnim sredstvima za podešavanje toniciteta i kao stabilizatori za zaštitu od naprezanja od zamrzavanja-smrzavanja tokom odvoza ili pripreme sirovina tokom proizvodnog procesa. Redukcija šećera (koji sadrže slobodne aldehidne ili ketonske grupe), poput glukoze i laktoze, može glikovati površinske ostatke lizina i arginina. Zbog toga oni uglavnom nisu među poželjnim poliolima za upotrebu u skladu sa pronalaskom. Pored toga, šećeri koji grade takve reaktivne vrste, kao što je saharoza, koja se pod kiselim uslovima hidrolizuje u fruktozu i glukozu i posledično povećava glikaciju, takođe u ovom pogledu nisu među poželjnim poliolima ovog pronalaska. PEG je koristan za stabilizaciju proteina i kao krioprotektant i u ovom pogledu se može koristiti u pronalasku.

[0222] Realizacije formulacija konstrukta antitela prema pronalasku dalje sadržavaju surfaktante. Molekuli proteina mogu biti podložni adsorpciji na površinama i denaturaciji i posledičnoj agregaciji na granicama vazduh-tečnost, čvrsto-tečno i tečno-tečno. Ovi efekti su generalno obrnuti prema koncentraciji proteina. Ove štetne interakcije uglavnom se obrnuto povećavaju sa koncentracijom proteina i obično se pogoršavaju sa fizičkom agitacijom, poput one nastale tokom otpreme i rukovanja proizvodom.

[0223] Surfaktanti se rutinski koriste za sprečavanje, minimiziranje ili smanjenje površinske adsorpcije. Korisni surfaktanti iz ovog pronalaska u ovom pogledu obuhvataju polisorbat 20, polisorbat 80, druge estre masnih kiselina sorbitan polietoksilata, i poloksamer 188.

[0224] Surfaktanti se takođe obično koriste za kontrolu konformacione stabilnosti proteina. Upotreba surfaktanata u ovom pogledu je specifična za proteine, jer svaki dani surfaktant obično će stabilizovati neke proteine i destabilizovati druge.

[0225] Polisorbati su podložni oksidativnoj degradaciji i često, u kompletu, sadrže dovoljne količine peroksida da prouzrokuju oksidaciju bočnih lanaca proteinskog ostatka, naročito metionina. Shodno tome, polisorbate treba pažljivo koristiti, a kada se koriste, treba ih koristiti u najmanjoj efikasnoj koncentraciji. Sa tim u vezi, polisorbati daju opšte pravilo da se ekscipijenti trebaju koristiti u najnižim efikasnim koncentracijama.

[0226] Realizacije formulacija konstrukta antitela prema pronalasku dalje sadrže jedan ili više antioksidanata. Do neke mere štetna oksidacija proteina može se sprečiti u farmaceutskim formulacijama održavanjem odgovarajućih nivoa kiseonika i temperature u okolini i izbegavanjem izlaganja svetlosti. Antioksidantni ekscipijenti se takođe mogu koristiti za sprečavanje oksidativne razgradnje proteina. Među korisnim antioksidantima u ovom pogledu su redukciona sredstva, sredstva za uklanjanje kiseonika/slobodnih radikala, i helatorska sredstva. Antioksidanti za upotrebu u terapijskim formulacijama proteina u skladu sa pronalaskom su poželjno rastvorljivi u vodi i održavaju svoju aktivnost tokom roka trajanja proizvoda. EDTA je u tom pogledu poželjni antioksidans u skladu sa pronalaskom.

[0227] Antioksidansi mogu oštetiti proteine. Na primer, redukciona sredstva, naročito glutation, mogu da poremete intramolekularne disulfidne veze. Prema tome, izabrani su antioksidanti koji se koriste u ovom pronalasku da između ostalog eliminišu ili umanjuju mogućnost da sami oštete proteine u formulaciji.

[0228] Formulacije u skladu sa ovim pronalaskom mogu uključivati metalne jone koji su proteinski kofaktori i koji su neophodni za formiranje koordinacije proteinskih kompleksa, kao što je cink potreban za formiranje određenih suspenzija insulina. Joni metala takođe mogu inhibirati neke procese koji razgrađuju proteine. Međutim, joni metala takođe katalizuju fizičke i hemijske procese koji razgrađuju proteine.

[0229] Magnezijum joni (10-120 mM) se mogu koristiti za inhibiciju izomerizacije asparaginska kiselina u izoasparaginsku kiselinu. Ca<+2>joni (do 100 mM) mogu povećati stabilnost humane deoksiribonukleaze. Mg<+2>, Mn<+2>, i Zn<+2>, međutim, mogu destabilizovati rhDNazu. Slično tome, Ca<+2>i Sr<+2>mogu stabilizovati faktor VIII, on se može destabilizovati sa Mg<+2>, Mn<+2>i Zn<+2>, cu<+2>i Fe<+2>, i njegova agregacija može se povećati sa Al<+3>jonima.

[0230] Realizacije formulacija konstrukta antitela prema pronalasku dalje sadrže jedan ili više konzervansa. Konzervansi su neophodni kod razvijanja parenteralnih formulacija sa više doza koje uključuju više ekstrakcija iz istog kontejnera. Njihova primarna funkcija je da inhibiraju rast mikroba i osiguravaju sterilnost proizvoda tokom roka trajanja ili roka upotrebe leka. Najčešće korišćeni konzervansi obuhvataju benzil alkohol, fenol i m-krezol. Iako konzervansi imaju dugu istoriju upotrebe sa parenteralnim kompozicijama malog molekula, razvoj proteinskih formulacija koje uključuju konzervanse može biti izazovan. Konzervansi gotovo uvek imaju destabilizujući efekat (agregaciju) na proteine, i to je postalo glavni faktor ograničavanja njihove upotrebe u formulacijama proteina sa više doza. Do danas je većina proteinskih lekova formulisana samo za jednokratnu upotrebu. Međutim, kada su formulacije sa više doza moguće, one imaju dodatnu prednost omogućavanja praktičnosti za pacijenta, i povećane su marketinške mogućnosti. Dobar primer je onaj za ljudski hormon rasta (hGH) gde je razvoj konzerviranih formulacija doveo do komercijalizacije pogodnijih, proizvoda peninjekcija za višestruku upotrebu. Najmanje četiri takve pen-injekcije koje sadrže konzervisane formulacije hGH su trenutno dostupne na tržištu. Norditropin (tečnost, Novo Nordisk), Nutropin AQ (tečnost, Genentech) & Genotropin (liofilizovan - dvokomorni uložak, Pharmacia & Upjohn) sadrže fenol, dok je Somatrope (Eli Lilly) formulisan sa m-krezolom. Nekoliko aspekata treba razmotriti tokom formulacije i razvoja konzervisanih doznih oblika. Efikasna koncentracija konzervansa u leku mora biti optimizovana. Ovo zahteva testiranje datog konzervansa u doznom obliku sa rasponima koncentracija koji daju antimikrobnu efikasnost bez ugrožavanja stabilnosti proteina.

[0231] Kao što se moglo očekivati, razvoj tečnih formulacija koje sadrže konzervanse je veći izazov nego liofilizovanih formulacija. Liofilizirani proizvodi se mogu liofilizirati bez

1

konzervansa i rekonstituisati sa konzervansom koji sadrži razblaživač u trenutku upotrebe. Ovo skraćuje vreme u kom je konzervans u kontaktu sa proteinima, što značajno minimizira povezane rizike stabilnosti. Sa tečnim formulacijama, treba očuvati efikasnost i stabilnost konzervansa tokom celog roka trajanja proizvoda (oko 18 do 24 meseca). Važno je napomenuti da efikasnost konzervansa treba da se pokaže u krajnjoj formulaciji koja sadrži aktivni lek i sve pomoćne sastojke.

[0232] Konstrukt antitela prema pronalasku generalno će biti namenjen za specifične puteve i metode davanja, između ostalog za određene doze davanja i učestalost davanja, za specifične tretmane pojedinih oboljenja, sa rasponima bioraspoloživosti i persistentnosti. Formulacije mogu tako da budu dizajnirane u skladu sa pronalaskom za isporuku bilo kojim pogodnim putem, uključujući, ali ne ograničavajući se na oralno, auralno, oftalmički, rektalno i vaginalno, i parenteralnim putevima, uključujući intravensku i intraarterijsku injekciju, intramuskularnu injekciju i potkožnu injekciju.

[0233] Kada je farmaceutska kompozicija formulisana, može se uskladištiti u sterilnim bočicama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca, kristal, ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. Takve formulacije se mogu čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr. liofilizovanom) koji treba rekonstituisati pre primene. Pronalazak takođe obezbeđuje komplete za proizvodnju jedinice za davanje jednostruke doze. Svi kompleti iz ovog pronalaska mogu da sadrže i prvi kontejner sa osušenim proteinima i drugi kontejner sa vodenom formulacijom. U određenim realizacijama ovog pronalaska obezbeđeni su kompleti koji sadrže jednostruke i više-komorne napunjene špriceve (npr., tečne špriceve i lio-špriceve). Terapeutski efikasna količina farmaceutske kompozicije konstrukta antitela prema pronalasku koja sadrži protein koja se koristi zavisiće, na primer, od terapijskog konteksta i ciljeva. Stručnjak u ovoj oblasti će razumeti da će odgovarajući nivoi doze za lečenje varirati, delom, u zavisnosti od isporučenog molekula, indikacije za koju se koristi konstrukt antitela iz ovog pronalaska, puta primene i veličine (telesna težina, površina tela ili veličina organa) i/ili stanja (starost i opšte zdravstveno stanje) pacijenta. U određenim realizacijama, lekar može da podešava dozu i modifikuje put primene da bi se dobio optimalni terapeutski efekat. Tipična doza može biti u opsegu od oko 0.1 µg/kg do oko 30 mg/kg ili više, zavisno od gore navedenih faktora. U specifičnim realizacijama, doziranje može biti u rasponu od 1.0 µg/kg do oko 20 mg/kg, opciono od 10 µg/kg do oko 10 mg/kg ili od 100 µg/kg do oko 5 mg/kg.

1 1

[0234] Terapeutski efikasna količina konstrukta antitela prema pronalasku poželjno rezultuje sa smanjenjem ozbiljnosti simptoma bolesti, povećanjem učestalosti ili trajanja perioda bez simptoma bolesti ili prevencijom oštećenja ili nesposobnosti zbog problema izazvanih sa oboljenjem. Za lečenje tumora koji eksprimiraju CDH19, terapeutski efikasna količina konstrukta antitela prema pronalasku, npr. anti-CDH19/CD3 konstrukt antitela, poželjno inhibira rast ćelije ili rast tumora za najmanje oko 20%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, ili najmanje oko 90% u odnosu na nelečene pacijente. Sposobnost jedinjenja da inhibira rast tumora može se proceniti na životinjskom modelu koji predviđa efikasnost kod humanih tumora.

[0235] Farmaceutske kompozicije mogu se primenjivati primenom medicinskog uređaja. Primeri medicinskih uređaja za davanje farmaceutskih kompozicija su opisani u US patentima br. 4,475,196; 4,439,196; 4,447,224; 4,447, 233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,312,335; 5,383,851; i 5,399,163.

[0236] U jednoj realizaciji pronalazak obezbeđuje konstrukt antitela prema pronalasku ili proizveden prema procesu prema pronalasku za upotrebu u prevenciji ili lečenju bolesti melanoma ili bolesti metastaza melanoma.

[0237] U poželjnoj realizaciji, melanomsko oboljenje ili bolest metastatskog melanoma je izabrano iz grupe koju čine superficijalno šireći melanom, lentigo maligna, melanom lentigo maligna, akralni lentiginozni melanom i nodularni melanom.

[0238] U daljoj realizaciji, pronalazak obezbeđuje komplet koji sadrži konstrukt antitela prema pronalasku, ili proizveden prema procesu prema pronalasku, vektor prema pronalasku, i/ili ćeliju domaćina prema pronalasku.

[0239] Treba razumeti da pronalasci ovde nisu ograničeni na određenu metodologiju, protokole ili reagense, koji mogu da variraju. Ovde su predstavljena diskusija i primeri su predstavljeni u svrhu opisivanja samo pojedinih realizacija i nisu namenjeni ograničavanju obima ovog pronalaska, koji je definisan isključivo sa patentnim zahtevima.

1 2

[0240] Ništa se ovde ne treba tumačiti kao priznanje da izum nema pravo na obustavu objavljivanja publikacija i patenata citiranih u tekstu ove specifikacije (uključujući sve patente, prijave patenta, naučne publikacije, specifikacije proizvođača, uputstva, itd.) . U meri u kojoj je citirani materijal u suprotnosti ili je nedosledan sa ovom specifikacijom, specifikacija će zameniti bilo koji takav materijal.

Primeri:

[0241] Sledeći primeri su dati radi ilustrovanja specifične realizacije ili karakteristika predmetnog pronalaska. Ove primere ne treba tumačiti kao ograničavanje obima ovog pronalaska. Primeri su uključeni radi ilustracije, a ovaj pronalazak je ograničen samo sa patentnim zahtevima.

Primer 1 - Potpuno humana monoklonska antitela protiv CDH19

1.1 Imunizacija:

[0242] Potpuno humana antitela na Kadherin-19 (CDH19) generisana su korišćenjem XENOMOUSE® tehnologije, transgeni miševi su konstruisani tako da eksprimiraju različite repertoare potpuno humanih IgGκ i IgGλ antitela odgovarajućeg izotipa. (Američki patenti br.

6,114,598; 6,162,963; 6,833,268; 7,049,426; 7,064,244; Green i sar., 1994, Nature Genetics 7:13-21; Mendez i sar., 1997, Nature Genetics 15:146-156; Green i Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med. 188:483-495; Kellermann i Green, Current Opinion in Biotechnology 13, 593-597, 2002). Miševi su imunizovani sa višestrukim oblicima Kadherin-19 imunogena, uključujući: (1) humani i cinomološki ("cyno") majmunski kadherin-19, (2) izlučeni Kadherin-19 ektodomen (aminokiseline 1-596), i (3) oblik ljudskog kadherina-19 vezan za skraćenu membranu (aminokiseline 1-624). Miševi su imunizovani u periodu od 8 do 10 nedelja sa opsegom od 16-18 pojačanja.

[0243] Serumi su sakupljeni približno 5 i 9 nedelja posle prve injekcije i specifični titri su određeni pomoću FAC obojenja rekombinantnog Kadherin-19 receptora prolazno eksprimiranog na CHO-S ćelijama. Identifikovano je ukupno 37 životinja sa specifičnim imunološkim odgovorima, ove životinje su ujedinjene u 3 grupe i napredovale su da stvaranja antitela.

1.2 Priprema monoklonskih antitela

1

[0244] Identifikovane su životinje koje imaju odgovarajuće titre, a limfociti su dobijeni iz drenažnih limfnih čvorova i, ako je potrebno, objedinjeni za svaku grupu. Limfociti su razdvojeni iz limfoidnog tkiva mlevenjem u pogodnom medijumu (na primer, Dulbeccov modifikovan Eagle medijum (DMEM); dobijen od Invitrogen, Carlsbad, CA) za oslobađanje ćelija iz tkiva i suspendovani u DMEM-u. B ćelije su odabrane i/ili ekspandirane standardnim metodama, i fuzionirane sa pogodnim fuzionim partnerom koristeći tehnike poznate u struci.

[0245] Posle nekoliko dana u kulturi, sakupljeni su hibridomski supernatanti i podvrgnuti ispitivanjima kao što je detaljnije opisano u niže navedenim primerima, uključujući potvrdu vezivanja za humane i majmunske cinomološke ćelijske linije, kao i za sposobnost ubijanja ćelijske linije u sekundarnim bio-testovima konjugata antitelo-lek. Linije hibridoma od interesa za koje je identifikovano da imaju vezujuća i funkcionalna svojstva su zatim izabrane i podvrgnute standardnim tehnikama kloniranja i subkloniranja. Klonalne linije su ekspandirane in vitro, a izlučena humana antitela dobijena su za analizu i izvedeno je sekvenciranje V gena.

1.3 Izbor antitela za vezivanje specifičnih za receptor Kadherin-19 od strane FMAT [0246] Posle 14 dana u kulturi, hibridomski supernatanti su pretraženi na monoklonalna antitela specifična za CDH19 pomoću Fluorometric Microvolume Assay Technology (FMAT) (Applied Biosystems, Foster City, CA). Supernatanti su pretraženi na adherentne CHO ćelije koje su prolazno transfektovane sa humanim Kadherinom-19 i brojačem testiranim na CHO ćelije prolazno transfektovanim sa istim ekspresijskim plazmidom koji ne sadrži gen Kadherin-19.

[0247] Posle više postupaka pretraživanja, identifikovan je panel od 1570 anti-Kadherin-19 vezujućih linija hibridoma i nastavilo se sa daljim ispitivanjima karakterizacije.

Primer 2 - Procena potpuno humanih monoklonalnih antitela protiv CDH19

2.1 Dodatna karakterizacija vezivanja protočnom citometrijom (FACs)

[0248] Provedeni su FACS testovi vezivanja da bi se procenilo vezivanje antitela specifičnog za anti-Kadherin-19 receptor za endogeni Kadherin-19 receptor eksprimiran na ćelijske linije CHL-1 tumora. Pored toga, unakrsno-reaktivno vezivanje na miševe i majmunske Kadherin-19 ortologe je takođe procenjeno od strane FACs korišćenjem rekombinantnih oblika različitih receptora prolazno eksprimiranih na ćelijama 293T.

1 4

[0249] FAC testovi izvedeni su inkubiranjem hibridomskih supernatanta sa 10,000 do 25,000 ćelija u PBS/ 2% fetalni goveđi serum/2mM kalcijum hlorida na 4 °C tokom jednog sata, praćeno sa dva pranja sa PBS/2% fetalni goveđi serum/2mM kalcijum hloridom. Ćelije su zatim tretirane sekundarnom antitelom obeleženim florohromom na 4 °C nakon čega je usledilo jedno pranje. Ćelije su resuspendovane u 50µl PBS/2%FBS i vezivanje antitela analizirano je korišćenjem instrumenta FACSCalibur™.

2.2 Pregled konjugata antitela na potpuno humana antitela izvedena iz XenoMouse® hibridoma

[0250] Ubijanje ćelija pomoću konjugata lekova antitelom zahteva isporuku konjugata u ćeliju internalizacijom i katabolizam konjugata leka u oblik koji je toksičan za ćeliju. Da bi se identifikovala antitela sa tim svojstvima, CDH19-pozitivne ćelijske linije (Colo-699 ili CHL-1) zasejane su u malim ćelijskim gustinama i ostavljene da preko noći leže na ploči sa 384 bunarića. Uzorci XENOMOUSE® hibridoma koji sadrže potpuno humana anti-CDH19 antitela su zatim dodavani ovim ćelijama u prisustvu visoke koncentracije kozjeg anti-humanog Fc monovalentnog Fab konjugovanog sa DM1 (DM1-Fab) u relativno niskom odnosu lekantitelo (DAR) (∼1.3). Ćelije su inkubirane tokom 96 sati na 37°C i 5% CO2u prisustvu uzoraka antitela i DM1-Fab. Krajem ovog vremena, procenjivanje vijabilnosti ćelije procenjeno je korišćenjem CellTiter-Glo® luminescentnog reagensa za vijabilnosti ćelije (Promega) u skladu sa preporukama proizvođača.

[0251] Primer podataka o vijabilnosti ćelije sa Colo-699 ćelijama prikazan je na slici 1 i slici 2. Antitela sposobna da isporučuju DM1-Fab ćelijama i inhibiranje rasta ćelije očitavaju se sa nižim luminescentnim signalom (RLU). Najviše antitela od interesa sa ovog ekrana su posmatrana u donjem levom uglu slike 1 i označena su kao otvoreni krugovi. Ova antitela su prebačena dalje u test vitalnosti ćelije na CHL-1 ćelijama. Podaci o prosečnoj vijabilnosti ćelija iz CHL-1 testa prikazani su u poređenju sa podacima prosečnoj o vijabilnosti ćelija iz testa Colo-699 (Slika 2). Antitela koja je imala aktivnost na oba testa Colo-699 i CHL-1 ćelijama označena je kao otvoreni krugovi na levoj strani slike.

[0252] Ovaj test je izveden istovremeno sa gornjim testom vezivanja FACs antitela (2.2), i rezultati ove dve studije korišćeni su za izbor antitela za dalju karakterizaciju. Sveukupno, 1570 antitela je provedeno kroz ove testove vijabilnosti ćelija i približno 44 antitela je odabrano na

1

temelju in vitro ćelijskog ubijanja i/ili vezivanja antitela za sub-kloniranje, sekvenciranje V gena i eksprimiranje u rekombinantnom obliku za dalje testove karakterizacije kako je opisano ispod.

[0253] Ovih 44 antitela je ponovo testirano kao u Primeru 2 i odabrano je 19 antitela koja sadrže jedinstvene sekvence. Od ovih 19 antitela, analizirano je 18 antitela i njihova svojstva su okarakterisana u Tabeli 2 u daljem tekstu. Podaci u ovoj tabeli su dobijeni korišćenjem FACs vezivanja na rekombinantnom humanom i cinomološkom CDH-19, podacima o vezivanju /-kalcijuma (ca<+2)>na 293/CDH-19 transfektante, vezivanju na endogeni CDH-19 na CHL-1 i Colo699 tumorske ćelije i takmičenju sa antitelom označenim u tabeli kao 4A9. Ovi eksperimenti pružili su dalje karakteristike za grupisanje ovih antitela u 5 grupa ili korpi.

Tabela 2 – Glavna ploča sa košarama korišćenjem informacija za vezivanje antitela

1

[0254] Od tih 18 antitela. Izabrano je 8 antitela za dalju analizu njihovog vezivanja epitopa kako je opisano u nastavku. Najmanje po jedno reprezentativno antitelo iz svake korpe je izabrano za dalju analizu.

Primer 3 – Predikcija epitopa

Predikcija epitopa pomoću takmičenja 4A9 antitela i pomoću himera humanog/mišjeg Kadherina-19

[0255] Metoda nadmetanja vezivanja 4A9 razvijena je za identifikaciju antitela koje se nadmeću sa vezivanjem 4A9. U pločama sa V-dnom sa 96 bunarića (Sarstedt #82.1583.001), 50,000 prolazno transfektovane 293T ćelije su inkubirane sa 5µg/ml prečišćenog anti-CDH19 antitela tokom 1 sat na 4<o>C praćeno sa jednim ispiranjem sa PBS/2%FBS. Tada je u svaki bunarić dodato 25 µl 5µg/ml Alexa647-obeleženim 4A9 i ploče su inkubirane tokom 1 sat na 4°C. Ćelije su zatim isprane dva puta i količina ćelija koja je povezana sa Alexa647-obeleženom 4A9 kvantifikovana je protočnom citometrijom.

[0256] Eksperimenti su uključivali negativne kontrole koje se sastoje samo od PBS/2%FBS. Prosečni signal primećen u ovim negativnim kontrolnim eksperimentima prihvaćen je kao maksimalni mogući signal za test. Antitela su upoređena sa ovim maksimalnim signalom i za svaki bunarić izračunat je procenat inhibicije (% inhibicije = (1-(FL4 srednja vrednost sa anti-CDH19 antitelima/srednja vrednost maksimalnog FL4 signala)).

[0257] Vezanje domena određeno je protočnom citometrijom, kao što je gore navedeno na 293T ćelijama koje su prolazno transfektovane sa plazmidima koji se sastoje od pojedinačnih ili dvostrukih humanih CDH19 kadherin ponovljenih zamena domena u mišjoj Kadherin 19 okosnici kloniranoj u vektor ekspresije pTT5 što neposredno prethodi prirodnim ljudskim ili mišjim CDH19 vodećim sekvencama i Flag oznaci (SEQ ID NO: 968). Eksperiment je

1

obuhvatio ispitivanje anti-CDH19 antitela protiv mišjeg Kadherin19 da bi se utvrdila podobnost za vezivanje na tim himerima čovek/miš.

[0258] Podaci iz ovih eksperimenata predstavljeni su u tabeli ispod naslovljenoj kako sledi:

1

apito epecijikd re ip

ju lci kaa n aanjziv veg no

zitivn se e

ezi-3 ael

Tab

Legenda Tabela 3

Humani i/ili mišji himerni konstrukti

[0259]

1. A = huCDH19(44-772) (videti SEQ ID NO: 944)

2. B = huCDH19(44-141)::muCDH19(140-770) (videti SEQ ID NO: 952)

3. C = huCDH19(44-249)::muCDH19(248-770) (videti SEQ ID NO: 954)

4. D = muCDH19(44-139)::huCDH19(142-249)::muCDH19(248-770) (videti SEQ ID NO: 956)

5. E = muCDH19(44-139)::huCDH19(142-364)::muCDH19(363-770) (videti SEQ ID NO: 958)

6. F = muCDH19(44-247)::huCDH19(250-364)::muCDH19(363-770) (videti SEQ ID NO: 960)

7. G = muCDH19(44-362)::huCDH19(365-772) (videti SEQ ID NO: 962)

8. H = muCDH19(44-461)::huCDH19(464-772) (videti SEQ ID NO: 964)

9. I = muCDH19(44-770) (videti SEQ ID NO: 966)

Predikcija epitopa za himere čovek/pile Kadherin-19

[0260] Vezivanje domena određeno je protočnom citometrijom na 293T ćelijama koje su prolazno transfekcionisane sa plazmidima koji sadrže pojedinačno ljudsko CDH19 kadherin ponavljanje domena zamenama u Kadherin 19 okosnici pileta kloniranoj u ekspresijski vektor pTT5 kom neposredno prethode prirodne ljudske ili pileće CDH19 vodeće sekvence i Flag oznaka. Eksperiment je obuhvatio ispitivanje podgrupe anti-CDH19 antitela protiv pilećeg Kadherina19 kako bi se utvrdila pogodnost za vezivanje ovih ljudskih/pilećih himera.

[0261] Sledeći test vezivanja je završen u prisustvu 2mM CaCl2. U pločama sa V-dnom sa 96 bunarića (Costar 3897), 50,000 prolazno transfektovanih 293T ćelija su inkubirane sa 5 µg/ml prečišćenih anti-CDH19 antitela tokom 1 sat na 4<o>C praćeno sa dva ispiranja sa PBS/2%FBS.

50µl of 5µg/ml Alexa647-obeleženim anti-human IgG sekundarnim antitelom (Jackson Immuno 109-605-098) i zatim je dodato u svaki bunarić 2 µg/ml 7AAD (Sigma A9400) i ploče su inkubirane tokom 15 minuta na 4<o>C. Ćelije su potom isprane jedanput i količina ćelija koja je povezana sa Alexa647-obeleženim Ab kvantifikovana je protočnom citometrijom.

Eksperimenti su obuhvatali Mock transfektovane kontrole. Podaci iz ovih eksperimenata predstavljeni su u tabeli ispod, n.o. = nije određeno.

Tabela 4 - Rezime predikcije epitopa za antitela u korpi C

Legenda Tabela 4

Himerni konstrukti čovek i/ili pile

[0262]

A = huCDH19(44-772) (videti SEQ ID NO: 944)

J = ckCDH19(44-776) (videti SEQ ID NO: 1451)

K = huCDH19(44-141)::ckCDH19(142-776) (videti SEQ ID NO: 1452)

L = ckCDH19(44-141)::huCDH19(142-249)::ckCDH19(250-776) (videti SEQ ID NO: 1453) M = ckCDH19(44-249)::huCDH19(250-364)::ckCDH19(365-776) (videti SEQ ID NO: 1454)

N = ckCDH19(44-364)::huCDH19(365-463)::ckCDH19(469-776) (videti SEQ ID NO: 1455) O = ckCDH19(44-468)::huCDH19(464-772) (videti SEQ ID NO: 1456)

Predikcija epitopa za himere makaki/pas ili pacov/makaki Kadherin-19

[0263] Vezivanje domena određeno je protočnom citometrijom na 293T ćelijama koje su prolazno transfekcionisane sa plazmidima koji sadrže ponavljanje rezus makaki CDH19 kadherin domena 1 ili segmenata domena 1 (označene EC1a, EC1b, EC1c) zamene u psećoj Kadherin19 okosnici, ili ponavljanje pacovskog CDH19 kadherin domena 2 zamenu u rezus Kadherin19 okosnici kloniranoj u ekspresijski vektor pTT5 kom neposredno prethode prirodne rezus ili pseće CDH19 vodeće sekvence i Flag oznaka. Eksperiment je obuhvatio ispitivanje podgrupe anti-CDH19 antitela protiv psećeg, pacova i makaki Kadherina19 da bi se utvrdila pogodnost za vezivanje ovih himera makaki/pas i pacov/rezus.

[0264] Sledeći test vezivanja je završen u prisustvu 2 mM CaCl2. U pločama sa V-dnom sa 96 bunarića (Costar 3897), 50,000 prolazno transfektovanih 293T ćelija su inkubirane sa 5 prečišćenih anti-CDH19 antitela tokom 1 sat na 4<o>C praćeno sa dva ispiranja sa PBS/2%FBS.

50 µl 5µg/ml Alexa647-obeleženim anti-human IgG sekundarnim antitelom (Jackson Immuno 109-605-098) i zatim je dodato u svaki bunarić 2 µg/ml 7AAD (Sigma A9400) i ploče su inkubirane tokom 15 minuta na 4<o>C. Ćelije su potom isprane jedanput i količina ćelija koja je povezana sa Alexa647-obeleženim Ab kvantifikovana je protočnom citometrijom. Eksperimenti su obuhvatali Mock transfektovane kontrole. Podaci iz ovih eksperimenata predstavljeni su u tabeli ispod, n.o. = nije određeno.

Tabela 5 – Rezime predikcije epitopa za antitelo iz Korpe A

11

Legenda Tabela 5

Himerni konstrukti za rezus makaki, psa, i/ili pacova

[0265]

P = rhCDH19(44-772) (videti SEQ ID NO: 1457)

Q = caCDH19(44-770) (videti SEQ ID NO: 1458)

R = rhCDH19(44-141)::caCDH19(141-770) (videti SEQ ID NO: 1459)

S = rhCDH19(44-65)::caCDH19(65-770) (videti SEQ ID NO: 1460)

T = caCDH19(44-87)::rhCDH19(89-114)::caCDH19(115-770) (videti SEQ ID NO: 1461) U = caCDH19(44-120)::rhCDH19(122-137)::caCDH19(137-770) (videti SEQ ID NO: 1462) V = rhCDH19(44-141)::raCDH19(140-247)::rhCDH19(250-772) (videti SEQ ID NO: 1463) W = raCDH19(44-770) (videti SEQ ID NO: 1464)

[0266] Podaci sumirani u Tabeli 5 omogućili su za grupisanje veziva iz korpe A 44-141 u sledeće podgrupe:

Korpa A.144-141

Korpa A.244-141 (44-114)

Korpa A.344-141 (44-65)

Predikcija epitopa za himere Kadherin-19 pacov/miš ili čovek/miš

[0267] Vezivanje domena određeno je protočnom citometrijom na 293T ćelijama koje su prolazno transfekcionisane sa plazmidima koji sadrže supstituisanja kadherin ponavljajućeg domena 3 CDH19 pacova (označena EC3a, EC3b) ili supstituisanje humanog CDH19 kadherin ponavljajućeg domena 3 (označena EC3c) u mišjoj Kadherin19 okosnici kloniranoj u ekspresijski vektor pTT5 koji neposredno prethodi prirodnoj mišjoj CDH19 vodećoj sekvenci i Flag oznaci. Eksperiment je obuhvatio ispitivanje podgrupa anti-CDH19 antitela protiv humanog, pacova i mišjeg Kadherina19 da bi se utvrdila pogodnost za vezivanje ovih himera pacov/miš i čovek/miš.

[0268] Sledeći test vezivanja je završen u prisustvu 2mM CaCl2. U pločama sa V-dnom sa 96 bunarića (Costar 3897), 50,000 prolazno transfektovanih 293T ćelija su inkubirane sa 5 µg/ml prečišćenih anti-CDH19 antitela tokom 1 sat na 4<o>C praćeno sa dva ispiranja sa PBS/2%FBS.

50 µl 5µg/ml Alexa647-obeleženim anti-humanim IgG sekundarnim antitelom (Jackson Immuno 109-605-098) i zatim je dodato u svaki bunarić 2 µg/ml 7AAD (Sigma A9400) i ploče su inkubirane tokom 15 minuta na 4<o>C. Ćelije su potom isprane jedanput i količina ćelija koja je povezana sa Alexa647-obeleženim Ab kvantifikovana je protočnom citometrijom. Eksperimenti su obuhvatali Mock transfektovane kontrole. Podaci iz ovih eksperimenata predstavljeni su u tabeli ispod, n.o. = nije određeno.

Tabela 6 - Rezime predikcije epitopa za antitelo iz Korpe B

11

Legenda Tabela 6

Himerni konstrukti pacov/miš ili čovek/miš

[0269]

A = huCDH19(44-772) (videti SEQ ID NO: 944)

I = muCDH19(44-770) (videti SEQ ID NO: 966)

W = raCDH19(44-770) (videti SEQ ID NO: 1464)

X = muCDH19(44-323)::raCDH19(324-327)::muCDH19(328-770) (videti SEQ ID NO: 1465)

Y = muCDH19(44-770)::raCDH19(290,299,308) (videti SEQ ID NO: 1466)

Z = muCDH19(44-770)::huCDH19(271) (videti SEQ ID NO: 1467)

[0270] Podaci sumirani u Tabeli 6 omogućili su odvajanje veziva iz Korpe B 250-364 u sledeće podgrupe:

Korpa B.1250-364

Korpa B.2 250-364 (324-327)) prema numerisanju glodavaca navedenom u tabeli 6, što odgovara ostacima (326-329) unutar humanog i makaki CDH19.

Primer 4 – Mutanti žarište/kovarijansa

[0271] Ukupno je 18 antitela analizirano kao potencijalna žarišta i povrede kovarijanse. Dizajnirane varijante (prikazane dole) prikazuju supstitucije aminokiselina koje mogu da smanje i/ili izbegnu izomerizaciju, deamidaciju, oksidaciju, povrede kovarijanse, i slično.80 varijanti konstruisano zajedno sa 15 roditeljskih antitela, što ukupno čini 95 sekvenci, prebačeno je u proces kloniranja, ekspresije i prečišćavanja. Mutageneza usmerena na mesto izvedena je na dizajniranim varijantama u formatu sa 96-bunarića. Roditeljska antitela i konstruisane varijante su eksprimirane prolaznom transfekcijom visoke propusnosti u HEK 293-6E ćelijama, prečišćenim modifikovanim AKTA automatskim uzorkovanjem i testirana su na aktivnost i biofizičke karakteristike. Tri roditeljska antitela koja su imala ili slobodno (neupareno) mesto Cys ili N-glikozilacije nisu uzete dalje u ovom procesu. Ona su zamenjena dizajniranom verzijom roditeljskih antitela. T Dizajnirane varijante prikazuju supstitucije aminokiselina koje mogu redukovati i/ili izbeći izomerizaciju, deamidaciju, oksidaciju, povrede kovarijanse, imunogenost i slično. Biće jasno da su ove varijante sekvenci primeri konstruisanih antitela unutar značenja ove prijave ali jednostruke i/ili višestruke mutacije mogu se kombinovati na bilo koji kombinatorni način da bi se dobio konačni željeni molekul koji veže antigen ili antitelo.

11

Primer 5 - Uzorak ekspresije CDH19 mRNK

[0272] RNK je ekstrahovana iz pojedinih tkiva pacijenta koji predstavljaju tumor (>70% sadržaj tumora prema broju ćelija) ili normalnih tkiva (0% sadržaj tumora prema broju ćelija). Pojedinačna tkiva su homogenizovana koristeći uređaj TisssueLyzer (Qiagen, Valencia, CA) i ukupna RNK je ekstrahovana i prečišćena sa mirVana kompletom za ekstrahovanje RNK (Life Technologies, Foster City, CA). Kvalitet i količina RNK je proverena sa NanoDrop (NanoDrop, Wilmington, DE) očitanjima spektrofotometra i profiliranjem sa Bioanalizatorom RNK (Agilient Technologies, Santa Clara, CA). RNK je tretirana sa DNKazom sa kompletom bez DNK (Life Technologies, Foster City, CA) i reverzibilno je prepisana u skladu sa specifikacijama proizvođača korišćenjem slučajnih heksamera u kompletu za reverznu transkripciju cDNK visokog kapaciteta (Life Technologies, Foster City, CA). Kvantitativna lančana reakcija polimeraze u realnom vremenu (qRT-PCR) izvedena je na cDNK korišćenjem prajmera za CDH19, sonda Hs00253534_m1, (Life Technologies, Foster City, CA) ili ljudski housekeeping gen ACTB (prajmeri CCT GGC ACC CAG CAC AA; GCC GAT CCA CAC GGA GTA CT; probe ATC AAG ATC ATT GCT CCT CCT GAG CG). 10 µL qRT-PCR reakcione komponente; 1.0 ng/µL cDNK, 2xUniversal PCR Master Mix (Life Technologies, Foster City, CA), test za ekspresiju gena (ACTB; 75 nM prajmeri, 150 nM probe. EPOR; 300 nM prajmeri, 250 nM probe) Posle qRT-PCR programa amplifikacije: (1) aktivacija na 50°C tokom 2 min; (2) denaturisanje na 95°C tokom 10 min; (3) amplifikacija 40 ciklusa na 95°C tokom 15 s i 60°C tokom 1 min sa hvatanjem fluorescencije u svakom koraku (ABI PRISM 7900HT Sequence Detection Systems, Applied Biosystems). Vrednosti praga ciklusa (CT) određene su upotrebom softvera Sequence Detector verzija 2.3 (Applied Biosystems) i transformisane u 2<-ΔCT>za relativnu ekspresiju CDH19 specifičnog transkripta u ACTB. Rezultati su prikazani na slici 3. Od 54 jedinstvena uzorka metastatskog i primarnog melanoma za većinu se može videti kako prekomerno eksprimiraju CDH19 mRNK u odnosu na ekspresiju u uzorcima iz normalnog tkiva.

Primer 6 - Ekspresija proteina CDH19

[0273] Ekspresija proteina CDH19 analizirana je u uzorcima humanih tumora pomoću IHC i rezultati su prikazani na slici 4. Uzorci su fiksirani u 10% neutralnom puferisanom formalinu tokom 24 sata, dehidrirani i ugrađeni u parafin. Isečeni su delovi od 4 µm. Delovi su prvo deparafinisani i zatim zagrevani u DIVA Decloaker rastvoru (Biocare) tokom 40 minuta za povraćaj antigena. Preostali koraci IHC izvedeni su na sobnoj temperaturi u uređaju DAKO

11

Autostainer. Delovi su inkubirani tokom 10 minuta sa Peroxidazed 1 (Biocare) da se blokira endogenu peroksidazu, nakon čega je sledila inkubacija tokom 10 minuta sa blokatorom Background Sniper (Biocare) da se smanji nespecifična pozadina. Delovi su inkubirani tokom 60 minuta sa CDH19 antitelom (Novo Biologicals, Katalog #H00028513-B01P) kod 5 µg/ml, zatim su 30 minuta inkubirani sa Envision+ HRP anti-mišji polimer (DAKO), praćeno sa DAB+ (DAKO) tokom 5 minuta. Delovi su kontra obojeni sa hematoksilinom (DAKO) otprilike 1 minut. Ekspresija CDH19 se može otkriti u 62% pregledanih tumora (intenzitet bojenja ≥1+ u 101 od 162 uzoraka). 51% of uzoraka tumora pokazalo je srednju do visoku ekspresiju (intenzitet bojenja od 2+ do 3+ u 83 od 162 uzoraka). CDH19 je pokazao gustu i izrazitu obojenost membrane u mnogim uzorcima, mada je kod nekih tumora primećena heterogenost.

Primer 7 - Izbor modela ćelijskih linija

[0274] Tumorske ćelijske linije se analiziraju protočnom citometrijom i IHC da bi se identifikovali modeli sistema sa CDH19 ekspresijom sličnom tumorima kod ljudi. Humana anti-huCDH19 IgG4 antitela 4A2 su prečišćena direktno iz medijuma koji je kondicionisan sa hibridomom. Za protočnu citometriju, 2x10<5>ćelija su inkubirane sa 200 nM CDH19 4A2 antitela koje je konjugovano na PE u odnosu 1:1. Inkubacija i dalji koraci ispiranja izvedeni su u prisustvu kalcijuma 1.2 mM kalcijuma Epruveta od QuantiBRITE PE liofilizovanih zrnaca sa četiri nivoa PE (BD, cat# 340495) istovremeno je pripremljena prema uputstvima proizvođača. Zrnca su analizovana protočnom citometrijom da bi se dobila standardna kriva. Medijalne vrednosti PE dobijene iz linija melanoma posle FACS analize zatim su kalibrisane prema standardnoj krivoj da bi se izračunala antitela vezana po ćeliji (ABC), što pruža procenu broja receptora za svaku ćeliju. IHC je izvršen kako je opisano u Primeru 6 i rezultati su prikazani na Slici 5. Ćelijska linija melanoma CHL-1 eksprimira oko 10,000 CDH19 molekula na površini ćelije, dok Colo699 ćelije eksprimiraju oko 5,000 receptora.

[0275] Obe ćelijske linije predstavljaju tumore sa srednjim do visokim nivoom ekspresije na osnovu IHC. Ekspresija u A2058 je vrlo niska, dok LOX ćelije ne eksprimiraju CDH19 protein koji se može detektovati.

Primer 8

Bispecifično vezivanje i unakrsna reaktivnost među vrstama

11

[0276] Radi potvrde vezivanja za humani CDH19 i za humani i makaki CD3, bispecifična antitela su testirani sa protočnom citometrijom koristeći naznačene ćelijske linije. Kao antigen pozitivne ćelijske linije korišćene su L1.2 transfektovana sa humanom CDH19, ćelijske linije ljudskog melanoma CHL-1 i A2058 koje eksprimiraju prirodni humani CDH19, CD3 koji eksprimira ćelijske linije humane T ćelijske leukemije HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) i CD3 koji eksprimira makaki T ćelijske linije 4119LnPx (Knappe A, i sar., Blood, 2000, 95, 3256-3261). Štaviše, netransfektovane L1.2 ćelije su korišćene kao negativna kontrola.

[0277] Za protočnu citometriju inkubirano je 200.000 ćelija odgovarajućih ćelijskih linija tokom 30 min na ledu sa 50 µl prečišćenog bispecifičnog antitela u koncentraciji od 5 µg/ml. Ćelije su isprane dva puta u PBS/2% FCS i vezivanje konstrukata je detektovano sa mišjim PentaHis antitelom (Qiagen; razblaženo 1:20 u 50 µl PBS/2% FCS). Posle pranja, vezana PentaHis antitela su detektovana sa Fc gama-specifičnim antitelom (Dianova) konjugovanim na fikoeritrin, razblaženim 1:100 u PBS/2% FCS. Uzorci su mereni protočnom citometrijom na instrumentu FACSCanto II i analizirani sa FACSDiva softverom (oba od Becton Dickinson).

[0278] CDH19/CD3 bispecifična antitela obojene su sa L1.2 ćelijama transfektovanim sa humanim CDH19, humanim ćelijskim linijama CDH19-koje eksprimiraju melanom CHL-1 i A2058 kao i humanim i makaki T ćelijama. Štaviše, nije bilo bojenja netransfektovanih L1.2 ćelija (videti Slika 6).

Primer 9

Citotoksična aktivnost

[0279] Test citotoksičnosti zasnovan na FACS sa nestimuliranim humanim PBMC

Izolacija efektorskih ćelija

[0280] Ljudske mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremljene su Ficoll-ovim gradijentom gustine centrifugiranjem iz obogaćenih preparata limfocita (npr. suspenzije leukocita), sporednih produkata krvnih banaka koje skupljaju krv za transfuzije. Suspenzije leukocita su isporučene od strane lokalne banke krvi i PBMC su pripremljene istog dana uzimanja krvi. Posle Ficoll-ovog centrifugiranja gustine i obimnog ispiranja sa Dulbeccovim PBS-om (Gibco), preostali eritrociti su uklonjeni iz PBMC inkubacijom sa puferom lize

11

eritrocita (155 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 100 µM EDTA). Trombociti su uklonjeni preko supernatanta centrifugiranjem PBMC kod 100 x g. Preostali limfociti uglavnom obuhvataju B i T limfocite, NK ćelije i monocite. PBMC su čuvane u kulturi na 37°C/5% CO2u RPMI medijumu (Gibco) sa 10% FCS (Gibco).

Iscrpljivanje CD14<+>i CD56<+>ćelija

[0281] Za iscrpljivanje CD14<+>ćelija, korišćene su humane CD14 mikročestice (Milteny Biotec, MACS, #130-050-201), za iscrpljivanje NK ćelija korišćene su humane CD56 mikročestice (MACS, #130-050-401). PBMC su izbrojene i centrifugirane tokom 10 min na sobnoj temperaturi sa 300 x g. Supernatant je odbačen i pelet sa ćelijama resuspendovan u MACS izolacionom puferu [80 µL/ 10<7>ćelija; PBS (Invitrogen, #20012-043), 0.5% (v/v) FBS (Gibco, #10270-106), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich, #E-6511)]. Dodate su CD14 mikročestice i CD56 MicroBeads (20 µL/10<7>ćelija) i inkubirane tokom 15 minuta na 4 - 8°C. Ćelije su isprane sa MACS izolacionim puferom (1 - 2 mL/10<7>ćelija). Posle centrifugiranja (videti gore), supernatant je odbačen i ćelije su ponovo suspendovane u MACS izolacionom puferu (500 µL/10<8>ćelija). CD14/CD56 negativne ćelije su zatim izolovane korišćenjem LS kolona (Miltenyi Biotec, #130-042-401). PBMC bez CD14+/CD56+ ćelije su kultivisane u RPMI kompletnom medijumu tj. RPM11640 (Biochrom AG, #FG1215) sa dodatkom 10% FBS (Biochrom AG, #S0115), 1x ne-esencijalne aminokiseline (Biochrom AG, #K0293), 10 mM Hepes pufer (Biochrom AG, #L1613), 1 mM natrijum piruvat (Biochrom AG, #L0473) i 100 U/mL penicilin/streptomicin (Biochrom AG, #A2213) na 37°C u inkubatoru sve dok nije potrebno.

Označavanje ciljne ćelije

[0282] Za analizu ćelijske lize u testovima protočne citometrije, boja za fluorescentne membrane DiOC18(DiO) (Molecular Probes, #V22886) korišćena je za obeležavanje humanih CDH19- kao ciljnih ćelija i razlikuje ih od efektorske ćelije. Ukratko, ćelije su sakupljene, isprane jednom sa PBS i podešen na 10<6>ćelija/mL u PBS koji sadrži 2 % (v/v) FBS i boju za membrane DiO (5 µL/10<6>ćelija). Posle inkubacije od 3 minuta na 37°C, ćelije su isprane dva puta u kompletnom RPMI medijumu i broj ćelija je podešen na 1.25 x 10<5>ćelija/mL. Vitalnost ćelija je određena korišćenjem 0.5 % (v/v) izotoničnog rastvora EosinG (Roth, #45380).

Analiza zasnovana na protočnoj citometriji

12

[0283] Ovaj test je dizajniran da kvantifikuje lizu humanih CDH19-transfektovanih CHO ćelija u prisustvu serijskih razblaženja CDH19 bispecifičnih antitela.

[0284] Jednake zapremine DiO-obeleženih ciljnih ćelija i efektorskih ćelija (tj., PBMC bez CD14<+>ćelija) su pomešane, što dovodi do odnosa ćelija E:T od 10:1.160 µL ove suspenzije preneseno je u svaki bunarić ploče sa 96 bunarića. 40 µL serijskih razblaženja CDH19 bispecifičnih antitela i dodati su bispecifično antitelo negativne kontrole (bispecifično antitelo zasnovano na CD3 koji prepoznaje irelevantni ciljni antigen) ili RPMI kompletni medijum kao dodatna negativna kontrola. Bispecifičnim antitelom posredovana citotoksična reakcija trajala je 48 sati u 7% CO2vlažnom inkubatoru. Zatim su ćelije prebačene na novu ploču sa 96 bunarića i gubitak integriteta ciljne ćelijske membrane praćen je dodavanjem propidijum jodida (PI) u finalnoj koncentraciji od 1 µg/mL. PI je membranska nepropusna boja koja se obično isključuje iz održivih ćelija, dok je uzimaju mrtve ćelije i postaju prepoznatljive sa fluorescentnom emisijom.

[0285] Uzorci su mereni protočnom citometrijom na instrumentu FACSCanto II i analizirani sa FACSDiva softverom (oba od Becton Dickinson).

Ciljne ćelije su identifikovane kao DiO-pozitivne ćelije. PI-negativne ciljne ćelije klasifikovane su kao žive ciljne ćelije. Procenat citotoksičnosti je izračunat po sledećoj formuli:

Citotoksičnost [

n = broj događaja

[0286] Korišćenjem GraphPad Prism 5 softvera (Graph Pad Software, San Diego), procenat citotoksičnosti se određuje prema odgovarajućim koncentracijama bispecifičnih antitela. Krive doznih odgovora su analizirane sa četiri parametarska logistička modela regresije za procenu krivih sigmoidnog doznog odgovora sa fiksnim nagibom i izračunate su EC50 vrednosti. Rezultati su prikazani na slici 7.

Primer 10

In vivo eksperimenti inhibicije rasta tumora

[0287] 5 miliona Colo699 ili CHL-1 ćelija tumora su pomešane sa 2.5 miliona sveže izolovanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) i injektirane subkutano u levu slabinu ženki golih miševa bez timusa na Dan 0. Istog dana, miševi su tretirani intraperitonealno ili sa CDH19 BiTE 2G6 ili sa nespecifičnim kontrolnim BiTE (MEC14) u naznačenim dozama. Doziranje je nastavljeno svakodnevno tokom prvih 10 dana posle inokulacije tumora.

[0288] Zapremine tumora i telesne težine su merene dva puta nedeljno upotrebom šestara i analitičke vage.

[0289] Rezultati eksperimenata sa Colo699 ili CHL-1 ćelijama tumora su prikazani na Slikama 8 i 9.

Primer 11

Citotoksična aktivnost

[0290] Test citotoksičnosti zasnovan na snimanju sa nestimulisanim humanim T-ćelijama.

Efektorske ćelije

[0291] Prečišćene, prirodne humane T ćelije su dobijene iz AllCells LLC, Alameda, SAD.

Analiza zasnovana na slici

[0292] Ovaj test meri lizu ćelija melanoma posredovanu T ćelijama. 3000 A2058 ćelija (CDH19 pozitivne) ili 2500 LOX IMVI ćelija (CDH19 negativne) kombinuju se sa prirodnim humanim T ćelijama u razmeru 1:10 u bunarićima ploča od 384 bunarića. Posle dodavanja serijskog razblaživanja CDH19 koje cilja BiTE molekule kao i negativnog kontrolnog bispecifika (bispecifično antitelo zasnovano na CD3 koji prepoznaje irelevantni ciljni antigen), ćelije su inkubirane tokom 48 sati na 37°C. Zatim su uzorci tretirani tokom 2 sata sa 30 µM Hoechst 33342 da bi se obojila jezgra svih ćelija i 2 µM propidijum jodida (PI) da bi se identifikovale mrtve ćelije.

[0293] Dobijanje i analiza slika se vrši na ThermoFisher ArrayScan sa 10x objektivom. Sakupljaju se podaci za dva kanala, na 386nm (Hoechst 33342) i na 549nm (propidijum jodid).

[0294] Žive ćelije su identifikovane kao Hoechst pozitivni, PI negativni događaji, mrtve ćelije kao Hoechst pozitivni, PI pozitivni.

[0295] Procenat citotoksičnosti određen je kako je opisano u primeru 7. Reprezentativni rezultati su prikazani na slici 10.

Primer 12

Određivanje specifičnosti domena i biohemijskog afiniteta bi-specifičnih veziva

Prečišćavanje CDH19 poddomena kojima nedostaju post-translacione modifikacije [0296] Metionin inicirajući kodon praćen nukleotidnim sekvencama koje kodiraju CDH19 protein poddomena A= huCDH19(140-367 iz SEQ ID NO:944), koji odmah prethodi G4S linkeru i poli-Histidinski obeleživač kloniran je u pogodan vektor pET vektor; dok, su nukleotidne sekvence koje kodiraju proteine poddomena B= huCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:944) i C= rhCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:1457) klonirane u vektor pET-SUMO (Life Technologies, Invitrogen) metodama poznatim u struci. Svaka je eksprimirana u E coli, izolovana iz rastvorljive frakcije i prečišćena do homogenosti afinitetnom hromatografijom metalnog helata, praćenom anjonskom izmenom, i hromatografijom isključenja veličine u HEPES puferiranom fiziološkom rastvoru, 3mM CaCl2, pH 8. Protein poddomena A zadržao je svoj linker i C terminalni polihistidinski obeleživač, ali His-SUMO obeleživači koji sadrže N terminalni krajevi proteina B i C su uklonjeni varenjem sa SUMO proteazom (Life Technologies, Invitrogen) pre anjonske razmene. Za sve proteine je određeno da imaju očekivanu molekulsku masu sa ESI LC/MS. Proteini korišćeni u eksperimentima vezivanja koji su opisani u daljem tekstu nasumično su biotinilirani tipičnim metodama poznatim u struci.

Prečišćavanje CDH19 poddomena sa post-translacionim modifikacijama

[0297] CDH19 proteini pod-domena D= huCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:944), i E= rhCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:1457) su dobijeni kloniranjem nukleotidnih sekvenci koje kodiraju odgovarajuće aminokiselinske ostatake 1-367 u pSURETech235b vektor (Selexis) koji svaki odmah prethodi G4S linkeru i poli-histidinski obeleživač su klonirani u vektor pSURETech235b (Selexis), transfektovan u CHO-S ćelije (Life Technologies, Invitrogen), i stabilni bazeni su generisani sledeći selekciju higromicina postupcima poznatim u stanju tehnike. Stabilni bazeni su ekspandirani i kondicionirani medijum je sakupljen posle 7 dana kultivisanja u medijumu bez seruma. CM je razmenjen sa UF/DF sa 5 diazapremina HEPES puferovanog fiziološkog rastvora plus CaCl2korišćenjem 1 kvadratne stope 10K PES Pellicon 2 membrane i prečišćen do homogenosti kako je gore opisano. CDH19 proteini sub-domena D i E zadržavaju konstitutivni veznik i obeleživač C terminalnog polihistidina. N terminalna sekvenca svakog proteina određena je da bude G44 kao što se očekivalo, dok je ESI LC/MS prečišćenih proteina u poređenju sa istim podvrgnutim varenju PNGase F otkrila prisustvo i N-

12

i O-vezanih glikana. Proteini korišćeni u dole opisanim eksperimentima vezanja su nasumično biotinilirani metodama dobro poznatim u stanju tehnike.

Metode za određivanje afiniteta vezivanja pomoću Octeta

[0298] Biosenzor Octet RED384 je korišćen da okarakteriše kinetiku i afinitet interakcija protein-protein. Minimalno biotinilirani ciljni proteini A-E domena CDH19 bili su vezani za vrhove streptavidina u mašini dok su serijska razblaženja Empirijski ciljni uslovi punjenja utvrđeni su iz razvoja ispitivanja da budu 10-20 nM ciljna koncentracija i punjenje tokom 600 sekundi da bi se dobio 2nm signal. Eksperimenti vezivanja izvedeni su postavljanjem ploče sa 6 tačaka (Tabele 7-9) ili 3-tačke (Tabela 10) 1:3 serijskim razblaživanjem od početnih koncentracija 30nM svakog analita, sa dva referentna bunarića po koloni koji imaju samo pufer. Octet Pufer: 10 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, /- 1 mM CaCl2, 0.13% Triton X-100 i 0.10 mg/ml BSA. Dodatni osnovni bunarići i bunarići za disocijaciju u ploči su takođe sadržavali pufer. Metoda vezivanja bila je sledeća: ForteBio Octet streptavidin vrhovi su (1) namočeni u puferu tokom 10 minuta; (2) prebačeni u osnovne bunariće u ploči i inkubirani tokom 5 minuta; (3) prebačeni u ciljne bunariće i inkubirani tokom 10 minuta; (4) prebačeni u osnovne bunariće u ploči i inkubirani tokom 5 minuta; (5) prebačeni u bunariće za uzorke i inkubirani tokom 5 minuta (Tabela 9) ili 20 minuta (Tabele 7, 8, 10); (6) prebačeni u bunariće za disocijaciju i inkubirani tokom 8.3 minuta (Tabela 9) ili 1.5 sata (Tabele 7, 8, 10). Sirovi podaci su obrađeni na sledeći način: (a) referentne krive vrha su uprosečene i oduzimane od krivih za uzorke; (b) krive asocijacije i disocijacije su izolovane i poravnane sa Y osi; (c) međukorak asocijacije i disocijacije je poravnat; (d) primenjeno je Sailtzki-Golai filtriranje da bi se smanjio šum signala i (e) dobijeni skup krivulja asocijacije i disocijacije za svaku interakciju uzorak-cilj je globalno uklopljen sa jedinim modelom vezivanja 1:1 da bi se odredile izmerene vrednosti konstantnih stopa asocijacije (Ka) i disocijacije (Kd) za izračunavanje ravnotežne konstante disocijacije, KD.

Tabela 7 - Specifičnost domena i biohemijski afinitet bi-specifičnih veziva za izolovane humane CDH19 proteinske domene kojima nedostaju post translacione modifikacije

Legenda Tabela 7

Humane CDH19 proteinske domene kojima nedostaju post translacione modifikacije [0299]

1. A = E coli eksprimirani huCDH19(140-367 iz SEQ ID NO:944)

2. B = E coli eksprimirani huCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:944)

[0300] Podaci sumirani u Tabeli7 su potvrdili CDH19 specifičnost epitopa regiona bispecifičnih veziva i omogućili njihovo relativno rangiranje afiniteta.

Tabela 8 - Kalcijumom modulisan biohemijski afinitet bi-specifičnih veziva na izolovane glikozilirane humane i makaki CDH19 proteinske domene kojima nedostaju post translacione modifikacije

Legenda Tabela 8

CDH19 Proteinski domeni kojima nedostaju post translacione modifikacije

12

B = E coli eksprimirani huCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:944)

C = E coli eksprimirani rhCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:1457)

[0302] Podaci sumirani u tabeli 8 omogućili su određivanje osetljivosti kalcijuma bispecifičnih veziva i njihova relativna rangiranja afiniteta. Podaci nadalje sugerišu konformacione epitope, pri čemu je epitop korpe B.1 više zavisan od asocijacije CDH19/Ca2+ u odnosu na epitop korpe A.2

Tabela 9 - Biohemijski afinitet bi-specifičnih veziva za izolovane humane i makaki CDH19 proteinske domene kojima nedostaju post translacione modifikacije

12

Legenda Tabela 9

CDH19 Proteinski domeni kojima nedostaju post translacione modifikacije

[0303]

B = E coli eksprimirani huCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:944)

C = E coli eksprimirani rhCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:1457)

[0304] Podaci sumirani u tabeli 9 omogućili su relativno rangiranje afiniteta bi-specifičnih veziva za humane i ne-humane domene CDH19 primata kojima nedostaje glikozilacija.

12

Tabela 10 - Kalcijumom modulisan biohemijski afinitet bi-specifičnih veziva na izolovane glikozilirane humane i makaki CDH19 proteinske domene

12

Legenda Tabela 10

Glikozilirani CDH19 domeni proteina

[0305]

D = CHO eksprimirani huCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:944)

E = CHO eksprimirani rhCDH19(44-367 iz SEQ ID NO:1457)

[0306] Podaci sumirani u tabeli 10 omogućili su određivanje osetljivosti na kalcijum bispecifičnih veziva i relativni rang afiniteta prema glikoziliranim proteinima humanog i nehumanog primata CDH19 domena. U poređenju sa podacima iz Tabele 8, afiniteti su slični onima kod domena kojima nedostaju post-translacione modifikacije. Podaci nadalje sugerišu konformacione epitope, gde je epitop korpe B.1 i B.2 više zavisni od asocijacije CDH19/Ca2+ nego epitop korpe A.2

Primer 13

Bispecifično vezivanje i unakrsna reaktivnost među vrstama:

[0307] Za potvrđivanje vezivanja za humani CDH19 i za humani CD3, bispecifična antitela su testirana protočnom citometrijom korišćenjem naznačenih ćelijskih linija. HEK293 transfektovane sa humanim CDH19 (videti primer 14) i CD3 koje eksprimiraju ćelijsku liniju humane T ćelijske leukemije HPB-ALL (DSMZ, Braunschweig, ACC483) korišćene su kao ćelijske linije koje su pozitivne na antigen.

[0308] Za protočnu citometriju 200,000 ćelija odgovarajućih ćelijskih linija bile su inkubirane tokom 30 min na ledu sa 100 µl BiTE koji sadrži supernatant ćelijske kulture. Ćelije su isprane dva puta u PBS/2% FCS i vezivanje konstrukata detektirano je mišjim anti-CD3scFv antitelom (3E5.A5, Amgen; razblaženo do 2 µg/ml PBS/2% FCS). Posle pranja, vezana anti-CD3scFv antitela su detektirana sa Fc gama-specifičnim antitelom (Dianova) konjugovanim na fikoetrin, razblažen 1:100 u PBS/2% FCS. Uzorci su mereni protočnom citometrijom na instrumentu FACSCanto II i analizirani FACSDiva softverom (oba iz Becton Dickinson).

[0309] CDH19/CD3 bispecifična antitela obojenih HEK293 ćelija koje su transfektovane sa humanim CDH19 kao humanim i makaki T ćelijama (videti Sliku 19).

Primer 14

Citotoksična aktivnost

12

[0310] Test oslobađanja hroma sa stimulisanim humanim T ćelijama.

Izolacija efektorskih ćelija

[0311] Petrijeva šolja (145 mm prečnik, Greiner bio-one GmbH, Kremsmunster) je obložena sa komercijalno dostupnim anti-CD3 specifičnim antitelom (OKT3, Orthoclone) u krajnjoj koncentraciji od 1 µg/ml tokom 1 sat na 37°C. Nevezani protein je uklonjen jednim korakom pranja sa PBS-om. 3 - 5 x 10<7>humani PBMC su dodati u prethodno obloženu Petrijevu šolju u 120 ml RPMI 1640 sa stabilizovanim glutaminom / 10% FCS / IL-220 U/ml (Proleukin®, Chiron) i stimulisano tokom 2 dana. O Trećeg dana, ćelije su sakupljene i isprane jednom sa RPMI 1640. IL-2 je dodat u krajnjoj koncentraciji od 20 U/ml i ćelije su ponovo kultivisane jedan dan u istom medijumu ćelijske kulture kao gore.

Iscrpljivanje CD4<+>i CD56<+>ćelija

[0312] CD8<+>citotoksični T limfociti (CTL-ovi) su obogaćeni iscrpljivanjem CD4<+>T ćelija i CD56<+>NK ćelija korišćenjem Dynal-Beads prema protokolu proizvođača.

Analiza zasnovana na oslobađanju<51>Cr

[0313] Humane CDH19-transfektovane HEK293 ciljne ćelije (za proizvodnju videti primer 14) su dva puta isprane sa PBS i označene sa 11.1 MBq<51>Cr u konačnoj zapremini od 50 µl uz dodatak RPMI tokom 60 minuta na 37°C. Nakon toga, obeležene ciljne ćelije su isprane 3 puta sa 5 ml RPMI i zatim su korišćene u testu citotoksičnosti. Ispitivanje je izvedeno na pločici sa 96 bunarića u ukupnoj zapremini od 200 µl uz dodatak RPMI sa odnosom E:T od 10:1. Korišćena je početna koncentracija od 0.1 - 1 µg/ml prečišćenog bispecifičnog antitela i trostruko razblaženje istog. Vreme inkubacije za test je bilo 18 sati. Citotoksičnost je određena kao relativne vrednosti oslobođenog hroma u supernatantu u odnosu na razliku maksimalne lize (dodavanje Triton-X) i spontane lize (bez efektorskih ćelija Sva merenja su izvršena četiri puta. Merenje aktivnosti hroma u supernatantima izvršeno je u gama brojaču Wizard 3" (Perkin Elmer Life Sciences GmbH, Köln, Nemačka). Analiza rezultata izvršena je pomoću programa Prism 6 za Windows (verzija 6.02, GraphPad Software Inc., San Diego, California, SAD). EC50 vrednosti izračunate su programom za analizu iz krivih odgovora sigmoidne doze koje su korišćene za poređenje citotoksične aktivnosti (videti Slika 20).

Primer 15

Proizvodnja i prečišćavanje BiTE antitela

1

[0314] Standardizovana proizvodnja CDH19 BiTE antitela skale istraživanja izvršena je u bocama sa valjkom. Sakupljeni supernatant kulture podvrgnut je filtraciji dvostepenim prečišćavanjem BiTE antitela zasnovanim bilo na hromatografiji sa imobilisanim metalnim jonom (IMAC) i naknadnom hromatografijom isključenja veličine ili snimanjem Proteina_A i naknadnom hromatografijom isključenja veličine (SEC).

15.1 Korak IMAC snimanja BiTE antitela

[0315] Za hromatografiju su korišćeni Äkta® Explorer Systems (GE Life Sciences) kontrolisan sa Unicorn® softverom. Hromatografija sa imobilisanim metalnim jonom (IMAC) izvedena je korišćenjem uređaja Fractogel EMD chelate® (Merck, Darmstadt) koji je napunjen sa ZnCl2 prema protokolu koji je dao proizvođač. Kolona je uravnotežena sa puferom A (20 mM natrijum fosfatni pufer, 0.1 M NaCl, 10 mM Imidazol, pH 7.2) i supernatant ćelijske kulture (1000 ml) je primenjen na kolonu (zapremina pakovanja od 10 ml) pri brzini protoka od 4 ml/min. Kolona je isprana sa puferom A da bi se uklonio nevezani uzorak. Vezani protein je eluiran korišćenjem dvostepenog gradijenta pufera B (20 mM natrijum fosfatni pufer, 0.1 M NaCl, 0.5 M Imidazol, pH 7.2) u skladu sa sledećom procedurom:

Korak 1: 10 % pufer B u 5 zapremina kolone

Korak 2: 100% pufer B u 5 zapremina kolone

[0316] Eluirane frakcije proteina iz koraka 2 su sakupljene za dalje prečišćavanje i koncentrovane do konačne zapremine od 3 ml korišćenjem Vivaspin (Sartorius-Stedim, Gottingen-Nemačka) jedinica za centrifugiranje sa PES membranom i graničnom vrednosti molekulske težine od 10 kDa. Sve hemikalije bile su istraživačke klase i kupljene su od Merck (Darmstadt, Nemačka). Slika 11

15.2 Snimanje Protein_A BiTE antitela

[0317] Za hromatografiju su korišćeni Äkta® Explorer Systems (GE Life Sciences) kontrolisan sa Unicorn® softverom. Afinitetne kolone koji sadrže kuglice sa kovalentno vezanim Protein_A korišćene su za korak snimanja. Kolona je uravnotežena sa puferom za ekvilibraciju pH 7.4 i primenjen je supernatant ćelijske kulture. Posle ispiranja kolone sa tri zapremine kolone puferom za ekvilibraciju za ispiranje nevezanog uzorka, vezana BiTE antitela su eluirana primenom pufera za eluiranje na pH 3.0. Eluirani rastvor je odmah neutralizovan u pH vrednosti sa Tris rastvorom trishidroksimetilamina pH 8.0 koji se već nalazio u epruvetama za frakcionisanje u sakupljaču frakcija.

1 1

[0318] Eluirane frakcije proteina iz koraka 2 su sakupljene za dalje prečišćavanje i koncentrovane do konačne zapremine od 3 ml korišćenjem Vivaspin (Sartorius-Stedim, Gottingen-Nemačka) jedinica za centrifugiranje sa PES membranom i graničnom vrednosti molekulske težine od 10 kDa. Sve hemikalije bile su istraživačke klase i kupljene su od Merck (Darmstadt, Nemačka). Slika 12

15.3 Hromatografija za isključivanje veličine

[0319] Urađena je hromatografija za isključivanje veličine na koloni HiLoad 16/60 Superdex 200 prep grade (GE Healthcare) uravnoteženoj sa SEC puferom (20 mM NaCl, 30 mM NaH2PO4, 100 mM L-Arginin, pH 7.0) pri brzini protoka od 1 ml/min. Frakcije monomera i dimera BiTE antitela su sakupljene i dodaje se 24%-tni osnovni rastvor trehaloze da bi se postigla konačna koncentracija trehaloze od 4%. Uzorci eluiranih proteina podvrgnuti su redukciji SDS-PAGE i Anti His TAG Vestern Blot-u radi analize.

[0320] Bazeni proteina su mereni na 280 nm kivetama od polikarbonata sa putem svetlosti od 1 cm (Eppendorf, Hamburg-Nemačka) i koncentracija proteina je izračunata pomoću softvera Vector NTI za analizu sekvenci koji izračunava faktor svakog proteina.

[0321] Bazeni BiTE monomera su prilagođeni na koncentraciju od 250 µg/ml sa dodatnim formulacionim BiTE puferom (20 mM NaCl, 30 mM NaH2PO4, 100 mM L-Arginin, 4% trehaloza, pH 7.0). Uzeta je količina od najmanje 600 µg za svaki BiTE i preneta je radi neposredne analize proteina kao što je opisano u primeru 16.

[0322] Preostali bazeni proteina monomera BiTE antitela i dimera BiTE antitela su alikvotirani u 15 i 50 µg alikvota proteina i brzo smrznuti u tečnom azotu. Dalje skladištenje do upotrebe urađeno je u zamrzivaču na -80° C do analize biološke aktivnosti i merenja afiniteta. Slika 13.

[0323] Čistoća izolovanog monomera BiTE antitela određena je pomoću SDS-PAGE da bude >95%. Kao što se očekivalo, prečišćeno monomerno BiTE antitelo pojavilo se kao proteinski opseg u rasponu molekulske mase od 54-56 kDa. Slika 14

Primer 16

Svojstva proteina

1 2

[0324] Na sveže pripremljen rastvor BiTE monomera generisan u primeru 15 primenjene su sledeće analitičke metode

● hromatografija visokih performansi sa izdvajanjem po veličini (HP-SEC) inicijalno monomernih CDH19 BiTE antitela nakon nedelje inkubacije pri 250 µg/ml i 37°C. ● konverzija BiTE monomera iz BiTE monomera u dimer pomoću tri ciklusa zamrzavanja / odmrzavanja, a zatim sa HP-SEC

● analitička razmena katjona visoke rezolucije

● hidrofobna interakcijska hromatografija na Sepharose Octil FF matriksu.

● koncentracija do 2500 µg/ml nakon čega sledi noćno skladištenje i merenje zamućenosti

● određivanje TA temperature agregacije merenjem zagrevanja dinamičkog rasejanja laserske svetlosti

16.1 Konverzija BiTE monomera u dimer inkubacijom tokom 7 dana

[0325] 15 µg monomenog CDH19 BiTE antitela u koncentraciji od 250 µg/ml je inkubirano na 37°C tokom 7 dana.

[0326] SEC kolona visoke rezolucije TSK Gel G3000 SWXL (Tosoh, Tokyo-Japan) povezana je na Äkta Purifier 10 FPLC (GE Lifesciences) opremljen sa autosamplerom A905. Ravnoteža kolone i pufer za rad sastojao se od 100 mM KH2PO4 - 200 mM Na2SO4podešeno na pH 6.6. Posle 7 dana inkubacije, rastvor BiTE antitela (15 µg protein) je nanesen na ekvilibriranu kolonu i uređeno je eluiranje pri brzini protoka od 0.75 ml/min pri maksimalnom pritisku od 7 MPa. Čitav rad je praćen optičke apsorbancije kod 280, 254 i 210 nm. Analiza je rađena vršnom integracijom signala 210 nm zabeleženog u listi za procenu softvera Äkta Unicorn Sadržaj dimera izračunat je deljenjem površine pika dimera sa ukupnom površinom monomera plus pik dimera. Slika 15

16.2. Konverzija BiTE monomera u dimer pomoću tri ciklusa zamrzavanja / odmrzavanja

[0327] 15 µg monomenog BiTE antitela u koncentraciji 250 µg/ml je zamrznuto na -80°C tokom 30 minuta nakon čega sledi odmrzavanje tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Posle tri ciklusa zamrzavanja / odmrzavanja, sadržaj dimera je određen sa HP-SEC kao što je opisano u primeru 16.1. Slika 16

1

CDH19 BiTE CH192G6 302 x I2C SA21: 0.50 % sadržaj dimera

16.3 Analitička kromatografija za razmenu jona visoke rezolucije

[0328] Kolona od 1 ml BioPro SP proizvedena od YMC (YMC Europe GmbH, Dinslaken-Nemačka) sa sulfpropilnim grupama kuplovanim na čvrste perle povezana je na uređaj Äkta Micro FPLC (GE Healthcare).

[0329] Za ekvilibraciju kolone, korišćeno je razblaživanje uzorka i ispiranje pufera koji se sastojao od 20 mM natrijum dihidrogen fosfata i 30 mM natrijum hlorida podešenog sa natrijum hidroksidom do pH od 5,5.

[0330] Za eluiranje je korišćen pufer koji se sastoji od 20 mM NaH2PO4 i 1000 mM NaCl podešen sa natrijum hidroksidom do pH od 5.5.

[0331] 50 µg monomera BiTE antitela je razblaženo sa puferom za razblaživanje do konačne zapremine od 50 ml.

[0332] Posle ekvilibracije kolone 40 ml razblaženog rastvora proteina je primenjeno na kolonu nakon čega sledi korak ispiranja.

[0333] Eluiranje je izvedeno neprestano rastućim gradijentom sa puferom eluiranja od nule do 100% u ukupnoj zapremini koja odgovara 200 zapremina kolone. Čitava sekvenca je praćena pri optičkoj apsorpciji od 280 nm (plava linija) i 254 nm (crvena linija).

[0334] Procenat glavnog pika je izračunat deljenjem površine pika glavnog pika sa zbirom površine pika svih otkrivenih pikova zatim množenjem sa faktorom 100. Slika 17 CDH19 BiTE CH192G6 302 x I2C SA21: 89.3 % procenat glavnog maksimuma

16.4 Sepharose Oktil FF

[0335] Eluiranje monomernih BiTE antitela procenjivano je na hidrofobnoj interakcionoj hromatografiji C8 Sepharose Octil FF kolona (GE Healthcare) sa 1 ml zapreminom gela.

[0336] 50 µg BiTE antitela monomernog proteina ispunjeno je sa puferom (10 mM limunska kiselina - 75 mM lizin x HCl - 4% trehaloza - pH 7.2) do konačne zapremine od 300 µl. Kolona

1 4

je povezana sa sistemom Äkta Purifier 10 (GE Healthcare). U sistem je spojena 500 µl petlja sa uzorkom. Sistem i kolona su uravnoteženi sa protočnim puferom (10 mM limunska kiselina - 75 mM lizin x HCl -- 200 mM NaCl - pH 7.2).

[0337] Kompletni uzorak je ubrizgan u petlju sa uzorkom i sadržina petlje sa uzorkom je primenjena na kolonu. Nakon ubrizgavanja uzorka na kolonu je naneta zapremina od 10 ml tekućeg pufera sa brzinom protoka od 0,2 ml/min istovremeno beležeći optičku apsorpciju na 254 i 280 nm zajedno sa povodljivošću. Slika 18

CDH19 BiTE CH192G6 302 x I2C SA21: Brzo i potpuno eluiranje

16.5 Koncentrovanje BiTE monomera na 2500 µg/ml praćeno skladištenjem preko noći i merenjem zamućenosti

[0338] 1000 µl CDH19 BiTE monomera je koncentrisano u dve Vivaspin 500 centrifugacione jedinice sa 10 kDa PES membranom (Sartorius-Stedim, Gottingen-Nemačka) do finalne zapremine od 100 µl. Ova je zapremina čuvana tokom noći na 5°C u ormaru za hlađenje. Zamućenost je izmerena tri puta pri apsorpciji optičke talasne dužine 340 nm. Nakon toga je izračunata srednja vrednost za tri vrednosti merenja.

OD340 Zamućenost CDH19 BiTE CH192G6 302 x I2C SA21: 0.034

16.6 Određivanje temperature agregacije TA merenjem zagrevanjem dinamičkog raspršivanja svetlosti

[0339] Zapremina od 40 µl monomernog BiTE antitela pri 250 µg/ml prebačena je u unutrašnju jezgru plastične kivete za jednokratnu upotrebu. Dublje postavljena spoljašnja jezgra bila je ispunjena generičkim BiTE formulacionim puferom. Vrh kivete je zapečaćen gumenim čepom da se izbegne gubitak tečnosti isparavanjem u procesu zagrevanja uzorka.

[0340] Kiveta je smeštena u uređaj Nanostar dinamičkog rasejanja laserske svetlosti (Wyatt) i zagrevana od 40°C do 70°C uz prirast grejanja od 0.5 °C/min

[0341] Stanje agregacije je trajno posmatrano i zabeleženo u celom procesu grejanja. Procena je izvršena softverskim paketom koji je isporučio proizvođač uređaja.

Temperatura agregacije od CDH19 BiTE CH192G6 302 x I2C SA21: 52.4°C

16.7 PEGilacija BiTE antitela sa CysLoop

1

[0342] Monomerno BiTE antitelo koje sadrži c-terminalni kraj CysLoop (videti metodološke detalje iz WO 2006/008096) dijalizovano je naspram Tris/NaCl pufera pH 7.4 i redukovano dodavanjem redukcionog agensa Tris(2-karboksietil)fosfin TCEP (Perbio Pierce) da bi stvorila dva redukovana cisteina sada otvorenog CysLoop.

[0343] TCEP je uklonjen dijalizom. PEG maleimid sposoban za kovalentno vezivanje na redukovani cistein dodat je u molarnom višku i inkubiran je tokom 3 sata na sobnoj temperaturi.

[0344] Sefaroza SP kolona za kolonsku izmenu katjona (GE Healthcare) povezana je sa sistemom Äkta FPLC i ekvilibrirana sa vezujućim puferom (nisko-molarni Fosfat/NaCl pufer sa pH 5.0)

[0345] Rastvor proteina razblažen je vezujućim puferom podešenim na pH 5.0 da se omogući vezivanje BiTE proteina na kolonu za izmenu katjona. Nevezani PEG je uklonjen u koraku ispiranja sa daljnjim vezujućim puferom pH 5.0 preko zapremine od 10 kolona. Vezani protein je eluiran linearnim povećanjem procenta pufera za eluiranje 20 mM fosfat 1 M NaCl.

[0346] Pegilirano BiTE antitelo eluirano je sa nižom molarnošću elucijskog pufera u poređenju sa nemodifikovanim BiTE antitelom.

Tabela sekvenci:

[0347]

TABELA Ia: CDR-ovi TEŠKOG LANCA

1

1

1

1

TABELA Ib: CDR-ovi LAKOG LANCA

14

14

lanca oglakagionre gilnoijab var

ence

sekv

nske seli

inoki

am

dnei

eoti

nukl oli :p

IIB

A

L

E

B

A

T

TABELA IIc: polinukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona teškog lanca 13586 HC [hu anti-<huCDH19> 4F3 VH]

13590 HC [hu anti-<huCDH19> 4B10 VH]

13875 HC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 VH]

13877 HC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 VH]

13879 HC [hu anti-<huCDH19> 22D1.1 VH]

13880 HC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 VH]

1

13882 HC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 VH]

13885 HC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 VH]

14024 HC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-472)(p17E,H47P) VH]

14026 HC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-472)(Q17E,H47P) VH]

14028 HC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-472)(O17E,H47P,D111E,W134Y) VH]

1

14030 HC [hu anti-<huCDH19> 4F3 (1-471)(R17G) VH]

14032 HC [hu anti-<huCDH19> 4F3 (1-471)(R17G,T47A,R141Q) VH]

14034 HC [hu anti-<huCDH19> 4F3 (1-471)(R17G,T47A,D61E,D72E,W134Y,R141Q) VH]

14039 HC [hu anti-<huCDH19> 2G6 (1-477)(R17G,D61E,D72E,K94N) VH]

14041 HC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-469)(T92K) VH]

1

14042 HC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-469)(T92K,D109E) VH]

14044 HC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-469)(T92K) VH]

14046 HC [hu anti-<huCDH19> 17H8.2 (1-471)(D109E) VH]

14048 HC [hu anti-<huCDH19> 17H8.2 (1-471)D109E) VH]

14050 HC [hu anti-<huCDH19> 4F7 VH]

14051 HC [hu anti-<huCDH19> 4F7 (1-468)(W113Y) VH]

1

14053 HC [hu anti-<huCDH19> 4B10 VH]

14055 HC [hu anti-<huCDH19> 4B10 (1-471)(R17G,D61E,D72E) VH]

14057 HC [hu anti-<huCDH19> 4A9 (1-468)(F55I,A56G) VH]

14059 HC [hu anti-<huCDH19> 4A9 (1-468)(F55I,A56G,W113Y) VH]

14061 HC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 VH]

1

14063 HC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 (1-469)(W133Y) VH]

14065 HC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 (1-470)(S82R,A99E) VH]

14067 HC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 (1-470)(A99E) VH]

14069 HC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 (1-470)(D72E,A99E) VH]

14071 HC [hu anti-<huCDH19> 16A4.1 (1-474)(T144L) VH]

1 1

14073 HC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 (1-469)(W133Y) VH]

14075 HC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 VH]

14077 HC [hu anti-<huCDH19> 23A10.3 (1-474)(L92Q) VH]

14079 HC [hu anti-<huCDH19> 23A10.3 (1-474)(R17G,D61E,D72E,L92Q) VH]

1 2

14081 HC [hu anti-<huCDH19> 25G10.1 VH]

14083 HC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 VH]

14085 HC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 VH]

14087 HC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 (1-469)(W133Y) VH]

14089 HC [hu anti-<huCDH19> 26F12.1 VH]

14090 HC [hu anti-<huCDH19> 26F12.1 VH]

1

14092 HC [hu anti-<huCDH19> 26F12.1 (1-469)(W133Y) VH]

14094 HC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 VH]

14096 HC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 (1-469)(F90Y) VH]

14098 HC [hu anti-<huCDH19> 22D1.1 VH]

1 4

14100 HC [hu anti-<huCDH19> 22D1.1 (1-469)(W133Y) VH]

13589 LC [hu anti-<huCDH19> 4A9 VL]

1

13874 LC [hu anti-<huCDH19> 17H8.2 VL]

13876 LC [hu anti-<huCDH19> 16A4.1 VL]

13878 LC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 VL]

13880 LC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 VL]

1

13882 LC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 VL]

13885 LC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 VL]

14024 LC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-236)(N30Q,T102A,P141Q) VL]

14025 LC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-236)(N30Q,T102A) VL]

14027 LC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-236)(N30Q,T102A,P141Q) VL]

14029 LC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-236)(R29Q,N30S) VL]

1

14030 LC [hu anti-<huCDH19> 4F3 VL]

14032 LC [hu anti-<huCDH19> 4F3 VL]

14034 LC [hu anti-<huCDH19> 4F3 VL]

14040 LC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-235)(H105Y) VL]

14042 LC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-235)(H105Y) VL]

14043 LC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-235)(H105Y) VL]

1

14045 LC [hu anti-<huCDH19> 17H8.2 (1-235)(G149R) VL]

14047 LC [hu anti-<huCDH19> 17H8.2 (1-235)(G149R) VL]

14049 LC [hu anti-<huCDH19> 4F7 (1-239)(H57Y) VL]

14051 LC [hu anti-<huCDH19> 4F7 (1-239)(D110E) VL]

1

14053 LC [hu anti-<huCDH19> 4B10 (1-236)(H45Q,A90T) VL]

14055 LC [hu anti-<huCDH19> 4B10 (1-236)(H45Q,A90T) VL]

14056 LC [hu anti-<huCDH19> 4A9 (1-239)(F47L) VL]

14058 LC [hu anti-<huCDH19> 4A9 (1-239)(F47L,D110E) VL]

14060 LC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 (1-235)(S102A) VL]

14062 LC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 (1-235)(K45Q,S102A) VL]

1

14063 [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 (1-235)(K45Q,S102A,D111E,N135Q) VL]

14065 LC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 VL]

14067 LC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 (1-234)(Q97E,S98P) VL]

14069 LC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 (1-234)(V78F,97E,S98P) VL]

14071 LC [hu anti-<huCDH19> 16A4.1 (1-235)(G141Q) VL]

1 1

14072 LC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 (1-235)(K45Q,S102A) VL]

14074 LC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 (1-235)(T11V,K45Q,S102A) VL]

14076 LC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 (1-235)(T11V,K45Q,S102A,W109Y,D111E,N135Q) VL]

14078 LC [hu anti-<huCDH19> 23A10.3 (1-231)(C42S) VL]

14080 LC [hu anti-<huCDH19> 23A10.3 (1-231)(C42Y) VL]

14081 LC [hu anti-<huCDH19> 25G10.1 (1-235)(H105Y) VL]

1 2

14083 LC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 (1-235)(S7P) VL]

14085 LC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 (1-235)(H1Q,S7P,W109Y) VL]

14087 LC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 (1-235)(H1Q,S7P,W109Y,D111E,N135Q) VL]

14089 LC[hu anti-<huCDH19> 26F12.1 (1-235)(S7P) VL]

1

14091 LC [hu anti-<huCDH19> 26F12.1 (1-235)(S7P,D111E) VL]

14093 LC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 (1-235)(K45) VL]

14095 LC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 (1-235)(K45Q,S102A) VL]

14097 LC[hu anti-<huCDH19> 25F8.1 (1-235)(K45Q,S102A,D111E,N135Q) VL]

14099 LC [hu anti-<huCDH19> 22D1.1 (1-235)(K45Q,S102A,D111E,N135Q) VL]

1 4

14101 LC [hu anti-<huCDH19> 22D1.1 (1-235)(K45Q,S102A,W109Y) VL]

13591 LC [hu anti-<huCDH19> 4F7 VL]

14302 LC [hu anti-<huCDH19> 2G6 (1-234)(C42S,D110E) VL]

14304 LC [hu anti-<huCDH19> 23A10.3 (1-231)(C42S) VL]

Polinukleotidne sekvence i aminokiselinske sekvence Anti-CDH19 varijabilnog i konstantnog regiona

[0349]

TABELA IIIa: Polinukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog i konstantnog regiona teškog lanca

2G6

1

A9

1

1

1

1

1

11

12

1

G10

14

TABELA IIIb: Polinukleotidne i aminokiselinske sekvence varijabilnog i konstantnog regiona lakog lanca

2G6

1

A2

F3

1

6C1

1

D3

1

A10

1

D1

2

TABELA IIIc: Polinukleotidne i aminokiselinske sekvence sa varijabilnim i konstantnim regionom teškog lanca

13586 HC [hu anti-<huCDH19> 4F3 VH] ::huIgG1z

13589 HC [hu anti-<huCDH19> 4A9 VH::huIG1z

2 1

13874 HC [hu anti-<huCDH19> 17H8.2 VH]::huIgG1z

13876 HC [hu anti-<huCDH19> 16A4.1 VH]::huIgG1z

13878 HC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 VH]::huIgG1z

2 2

13880 HC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 VH]::huIgG1z

13882 HC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 VH]::huIgG1z

13885 HC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 VH]::huIgG1z

2

14024 HC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-472)(Q17E,H47P) VH]::huIgG1z

14026 HC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-472)(Q17E,H47P) VH]::huIgG1z

14028 HC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-472)(Q17E,H47P,D111E,W134Y) VH]::huIgG1z

2 4

14030 HC [hu anti-<huCDH19> 4F3 (1-471)(R17G) VH]::huIgG1z

14032 HC [hu anti-<huCDH19> 4F3 (1-471)(R17G,T47A,R141Q) VH]::huIgG1z

2

14034 HC [hu anti-<huCDH19> 4F3 (1-471)(R17G,T47A,D61E,D72E,W134Y,R141Q) VH]::huIgG1z

14040 HC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 VH]::huIgG1z

14042 HC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-469)(T92K,D109E) VH::huIG1z

2

14044 HC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-469)(T92K) VH]::huIgG1z

14046 HC [hu anti-<huCDH19> 17H8.2 (1-471)(D109E) VH]::huIgG1z

14048 HC [hu anti-<huCDH19> 17H8.2 (1-471)(D109E) VH]::huIgG1z

2

14050 HC [hu anti-<huCDH19> 4F7 VH]::huIgG1z

14052 HC [hu anti-<huCDH19> 4B10 (1-471)(R17G,D61E,D72E,W134Y) VH::huIG1z

14054 HC [hu anti-<huCDH19> 4B10 (1-471)(R17G) VH]::huIgG1z

2

14056 HC [hu anti-<huCDH19> 4A9 VH]::huIgG1z

14058 HC [hu anti-<huCDH19> 4A9 (1-468)(F55I,A56G) VH]::huIgG1z

14060 HC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 VH]::huIgG1z

14061 HC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 VH]::huIgG1z

2

14063 HC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 (1-469)(W133Y) VH]::huIgG1z

14065 HC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 (1-470)(S82R,A99E) VH]::huIgG1z

14067 HC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 (1-470)(A99E) VH::huIG1z

21

14069 HC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 (1-470)(D72E,A99E) VH]::huIgG1z

14071 HC [hu anti-<huCDH19> 16A4.1 (1-474)(T144L) VH]::huIgG1z

14073 HC anti-<huCDH19> 19B5.1 (1-469)(W133Y) VH]::huIgG1z

14075 HC [hu anti-<huCDH19> 19B.1 VH]::huIgC1z

14077 HC [hu anti-<huCDH19> 23A10.3 (1-474)(L92Q) VH]::huIgG1z

14079 HC [hu anti-<huCDH19> 23A10.3 (1-474)(R17G,D61E,D72E,L92Q) VH]::huIgG1z

14081 HC [hu anti-<huCDH19> 25G10.1 VH]::huIgG1z

14083 HC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 VH]::huIgG1z

21

14085 HC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 VH]::huIgG1z

14087 HC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 (1-469)(W133Y) VH]::huIgG1z

14089 HC [hu anti-<huCDH19> 26F12.1 VH]::huIgG1z

14091 HC [hu anti-<huCDH19> 26F12.1 (1-469)(W133Y) VH]::huIgG1z

14093 HC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 VH]::huIgG1z

14095 HC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 (1-469)(F90Y) VH]::huIgG1z

21

14097 HC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 (1-469)(F90Y,W133Y) VH]::huIgG1z

14099 HC [hu anti-<huCDH19> 22D1.1 VH]::huIgG1z

14101 HC [hu anti-<huCDH19> 22D1.1 (1-469)(W133Y) VH]::huIgG1z

21

13591 HC [hu anti-<huCDH19> 4F7 VH]::huIgG1z

14302 HC [hu anti-<huCDH19> 2G6 (1-477)(R17G,K94N) VH]::huIgG1z

1430_HC[hu anti-<huCDH19> 2G6 (1-477)(R17G) VH]::huIgG1z

21

TABELA IIId: Polinukleotidne i aminokiselinske sekvence sa varijabilnim i konstantnim regionom lakog lanca

13586 LC [hu anti-<huCDH19> 4F3 VL]::huKLC

13590 LC [hu anti-<huCDH19> 4B10 VL]::huKLC

13875 LC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 VL]::huKLC

13877 LC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 VL]::huKLC

13878 LC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 VL]::huLLC-C2

21

13880 LC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 VL]::huLLC-C2

13882 LC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 VL]::huLLC-C2

13885 LC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 VL]::huLLC-C2

14024 LC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-236)(N30Q,T102A,P141Q) VL]::huKLC

21

14026 LC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-236)(N30Q,T102A) VL]::huKLC

14028 LC [hu anti-<huCDH19> 4A2 (1-236)(N30Q,T102A,P141Q) VL]::huKLC

14030 LC [hu anti-<huCDH19> 4F3 VL]::huKLC

22

14032 LC [hu anti-<huCDH19> 4F3 VL]::huKLC

14034 LC [hu anti-<huCDH19> 4F3 VL]::huKLC

14040 LC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-235)(H105Y) VL]::huKLC

14042 LC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-235)(H105Y) VL]::huKLC

14044 LC [hu anti-<huCDH19> 16C1.1 (1-235)(G95R,H105Y,G141Q) VL]::huKLC

14046 LC [hu anti-<huCDH19> 17H8.2 (1-235)(G149R) VL]::huKLC

14048 LC [hu anti-<huCDH19> 17H8.2 (1-235,G149R) VL]::huKLC

14050 LC [hu anti-<huCDH19> 4F7 (1-239)(H57Y,D110E) VL]::huLLC-C2

14051 LC [hu anti-<huCDH19> 4F7 (1-239)(D110E) VL]::huLLC-C2

14053 LC [hu anti-<huCDH19> 4B10 (1-236)(H45Q,A90T) VL]::huKLC

14055 LC [hu anti-<huCDH19> 4B10 (1-236)(H45Q,A90T) VL]::huKLC

14057 LC [hu anti-<huCDH19> 4A9 (1-239)(F47L) VL]::huLLC-C1

14059 LC [hu anti-<huCDH19> 4A9 (1-239)(F47L,D110E) VL]::huLLC-C1

22

14061 LC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 (1-235)(K45Q,S102A) VL]::huLLC-C2

14063 LC [hu anti-<huCDH19> 20D3.1 (1-235)(K45Q,S102A,D111E,N135Q) VL]::huLLC-C2

14065 LC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 VL]::huKLC

14067 LC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 (1-234)(Q97E,S98P) VL]::huKLC

14069 LC [hu anti-<huCDH19> 22G10.1 (1-234)(V78F,Q97E,S98P) VL]::huKLC

14071 LC [hu anti-<huCDH19> 16A4.1 (1-235)(G141Q) VL]::huKLC

14073 LC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 (1-235)(K45Q,S102A) VL]::huLLC-C2

22

14075 LC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 (1-235)(T11V,K45Q,S102A,D111E,N135Q) VL]::huLLC-C2

14076 LC [hu anti-<huCDH19> 19B5.1 (1-235)(T11V,K45Q,S102A,W109Y,D111E,N135Q) VL]::huLLC-C2

14078 LC [hu anti-<huCDH19> 23A10.3 (1-231)(C42S) VL]::huLLC-C2

14080 LC [hu anti-<huCDH19> 23A10.3 (1-231)(C42Y) VL]::huLLC-C2

14082 LC [hu anti-<huCDH19> 25G10.1 (1-235)(H105Y) VL]::huKLC

22

14084 LC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 (1-235)(H1Q,S7P) VL]::huLLC-C2

14086 LC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 (1-235)(H1A,S7P,W109Y,D111E,N135Q) VL]::huLLC-C2

14088 LC [hu anti-<huCDH19> 26D1.1 (1-235)(H1Q,S7P) VL]::huLLC-C2

14090 LC [hu anti-<huCDH19> 26F12.1 (1-235)(S7P,D111E) VL]::huLLC-C2

22

14092 LC [hu anti-<huCDH19> 26F12.1 (1-235)(S7P,W109Y,D111E,N135Q) VL]::huLLC-C2

14094 LC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 (1-235)(K45Q,S102A) VL]::huLLC-C2

14096 LC [hu anti-<huCDH19> 25F8.1 (1-235)(K45Q,S102A,D111E) VL]::huLLC-C2

22

14098 LC [hu anti-<huCDH19> 22D1.1 (1-235)(K45Q,S102A) VL]::huLLC-C2

14100 LC [hu anti-<huCDH19> 22D1.1 (1-235)(K45Q,S102A,W109Y,D111E,N135Q) VL]::huLLC-C2

14102 LC [hu anti-<huCDH19> 22D1.1 (1-235)(K45Q,S102A) VL]::huLLC-C2

14301 LC [hu anti-<huCDH19> 2G6 (1-234)(D110E) VL]::huLLC-C1

22

14304 LC [hu anti-<huCDH19> 23A10.3 (1-231)(C42S) VL]::huLLC-C2

TABELA IVa: CDR-ovi TEŠKOG LANCA

2

TABELA IVb: CDR-ovi LAKOG LANCA

21

22

19

a-

erin

dh

ka

kog

ns

u

ajm

m

gus

ol

om

n

icy

og

an

um :hV ec AnLve E 50]

B3A Sek

[0 T

Bispecifični vezujući molekuli [0351]

24

��

��

��

��

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

�

�

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

�

21

22

�

��

�

�

�

�

�

�

�

�

�

41

42

�

44

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Izolovani multispecifični konstrukt antitela koji sadrži prvi humani vezujući domen koji je u stanju da se veže za humani CDH19 na površini ciljne ćelije i drugi domen koji je u stanju da se veže za humani CD3 na površini T ćelije, naznačen time što prvi vezujući domen sadrži VH region koji sadrži CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 i VL region koji sadrži CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 izabrane iz grupe koju čine:

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 4, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 5, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 6, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 172, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 173 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 174;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 10, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 11, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 12, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 178, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 179 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 180;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 196, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 198;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 34, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 35, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 36, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 202, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 203 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 204;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 48, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 214, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 216;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 58, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 59, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 60, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 226, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 227 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 228;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 64, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 65, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 66, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 232, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 233 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 234;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 70, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 71, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 72, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 238, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 239 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 240;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 161, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 328, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 48, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 924, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 216;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 902, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 924, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 216;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 903, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 924, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 216;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 46, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 47, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 48, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 925, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 215 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 216;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 70, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 907, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 72, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 238, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 239 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 240;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 70, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 907, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 908, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 238, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 239 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 240;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 901, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 922, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 923;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 58, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 905, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 906, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 226, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 227 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 228;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 58, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 905, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 60, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 226, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 227 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 228;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 161, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 939, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 921, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 939, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 940;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 160, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 161, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 162, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 941, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 196, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 923;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 922, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 923;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 901, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 922, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 923;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 28, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 29, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 30, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 939, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 329 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 330;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 970, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 971, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 972, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 973, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 974 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 975;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1061, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1062, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1063, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1064, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1065 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1066;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1139, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1140, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1141, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1142, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1143 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1144;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1152, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1153, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1154, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1155, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1156 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1157;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1178, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1179, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1180, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1181, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1182 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1183;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1191, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1192, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1193, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1194, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1195 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1196;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1204, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1205, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1206, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1207, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1208 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1209;

1

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1217, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1218, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1219, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1220, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1221 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1222;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1230, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1231, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1232, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1233, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1234 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1235;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1308, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1309, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1310, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1311, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1312 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1313;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1321, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1322, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1323, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1324, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1325 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1326;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1373, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1374, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1375, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1376, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1377 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1378;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1386, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1387, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1388, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1389, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1390 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1391;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1399, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1400, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1401, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1402, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1403 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1404;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1412, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1413, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1414, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1415, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1416 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1417;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1777, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1778, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1779, CDR-L1 kako je prikazano

2

u SEQ ID NO: 1780, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1781 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1782;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1790, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1791, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1792, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1793, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1794 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1795;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1803, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1804, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1805, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1806, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1807 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1808;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1816, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1817, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1818, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1819, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1820 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1821;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1829, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1830, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1831, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1832, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1833 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1834;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1842, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1843, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1844, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1845, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1846 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1847;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1855, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1856, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1857, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1858, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1859 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1860;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1868, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1869, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1870, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1871, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1872 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1873;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1881, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1882, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1883, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1884, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1885 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 1886;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2063, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2064, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2065, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2066, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2067 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2068;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2076, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2077, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2078, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2079, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2080 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2081;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2089, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2090, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2091, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2092, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2093 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2096;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2102, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2103, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2104, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2105, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2106 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2107;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2115, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2116, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2117, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2118, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2119 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2120;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2128, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2129, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2130, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2131, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2132 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2133;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2141, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2142, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2143, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2144, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2145 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2146;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2154, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2155, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2156, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2157, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2158 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2159;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2180, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2181, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2182, CDR-L1 kako je prikazano

4

u SEQ ID NO: 2183, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2184 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2185;

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2193, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2194, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2195, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2196, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2197 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2198; i

CDR-H1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2206, CDR-H2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2207, CDR-H3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2208, CDR-L1 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2209, CDR-L2 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2210 i CDR-L3 kako je prikazano u SEQ ID NO: 2211.

2. Konstrukt antitela prema zahtevu 1, naznačen time što prvi vezujući domen sadrži VH region izabran iz grupe koju čine VH regioni

kako je prikazano u SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 360, SEQ ID NO: 388, SEQ ID

NO: 386, SEQ ID NO: 340, SEQ ID NO: 346, SEQ ID NO: 374, SEQ ID NO: 348,

SEQ ID NO: 390, SEQ ID NO: 463, SEQ ID NO: 464, SEQ ID NO: 465, SEQ ID

NO: 466, SEQ ID NO: 467, SEQ ID NO: 468, SEQ ID NO: 469, SEQ ID NO: 470,

SEQ ID NO: 471, SEQ ID NO: 472, SEQ ID NO: 473, SEQ ID NO: 474, SEQ ID

NO: 475, SEQ ID NO: 488, SEQ ID NO: 489, SEQ ID NO: 490, SEQ ID NO: 491,

SEQ ID NO: 513, SEQ ID NO: 514, SEQ ID NO: 515, SEQ ID NO: 516, SEQ ID

NO: 540, SEQ ID NO: 541, SEQ ID NO: 542, SEQ ID NO: 543, SEQ ID NO: 977,

SEQ ID NO: 1068, SEQ ID NO: 1146, SEQ ID NO: 1159, SEQ ID NO: 1185, SEQ

ID NO: 1198, SEQ ID NO: 1211, SEQ ID NO: 1224, SEQ ID NO: 1237, SEQ ID

NO: 1315, SEQ ID NO: 1328, SEQ ID NO: 1380, SEQ ID NO: 1393, SEQ ID NO:

1406, SEQ ID NO: 1419, SEQ ID NO: 1469, SEQ ID NO: 1478, SEQ ID NO: 1485,

SEQ ID NO: 1494, SEQ ID NO: 1501, SEQ ID NO: 1508, SEQ ID NO: 1519, SEQ

ID NO: 1526, SEQ ID NO: 1533, SEQ ID NO: 1542, SEQ ID NO: 1549, SEQ ID

NO: 1558, SEQ ID NO: 1565, SEQ ID NO: 1784, SEQ ID NO: 1797, SEQ ID NO:

1810, SEQ ID NO: 1823, SEQ ID NO: 1836, SEQ ID NO: 1849, SEQ ID NO: 1862,

SEQ ID NO: 1875, SEQ ID NO: 1888, SEQ ID NO: 2070, SEQ ID NO: 2083, SEQ

ID NO: 2096, SEQ ID NO: 2109, SEQ ID NO: 2122, SEQ ID NO: 2135, SEQ ID

NO: 2148, SEQ ID NO: 2161, SEQ ID NO: 2187, SEQ ID NO: 2200, i SEQ ID NO: 2213.

3. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što prvi vezujući domen sadrži VL region izabran iz grupe koju čine VL regioni

kako je prikazano u SEQ ID NO: 408, SEQ ID NO: 416, SEQ ID NO: 444, SEQ ID NO: 442, SEQ ID NO: 396, SEQ ID NO: 402, SEQ ID NO: 430, SEQ ID NO: 404, SEQ ID NO: 446, SEQ ID NO: 558, SEQ ID NO: 559, SEQ ID NO: 560, SEQ ID NO: 561, SEQ ID NO: 562, SEQ ID NO: 563, SEQ ID NO: 564, SEQ ID NO: 565, SEQ ID NO: 566, SEQ ID NO: 567, SEQ ID NO: 568, SEQ ID NO: 569, SEQ ID NO: 570, SEQ ID NO: 583, SEQ ID NO: 584, SEQ ID NO: 585, SEQ ID NO: 586, SEQ ID NO: 608, SEQ ID NO: 609, SEQ ID NO: 610, SEQ ID NO: 611, SEQ ID NO: 635, SEQ ID NO: 636, SEQ ID NO: 637, SEQ ID NO: 638, SEQ ID NO: 979, SEQ ID NO: 1070, SEQ ID NO: 1148, SEQ ID NO: 1161, SEQ ID NO: 1187, SEQ ID NO: 1200, SEQ ID NO: 1213, SEQ ID NO: 1226, SEQ ID NO: 1239, SEQ ID NO: 1317, SEQ ID NO: 1330, SEQ ID NO: 1382, SEQ ID NO: 1395, SEQ ID NO: 1408, SEQ ID NO: 1421, SEQ ID NO: 1471, SEQ ID NO: 1480, SEQ ID NO: 1487, SEQ ID NO: 1496, SEQ ID NO: 1503, SEQ ID NO: 1510, SEQ ID NO: 1521, SEQ ID NO: 1528, SEQ ID NO: 1535, SEQ ID NO: 1544, SEQ ID NO: 1551, SEQ ID NO: 1560, SEQ ID NO: 1567, SEQ ID NO: 1786, SEQ ID NO: 1799, SEQ ID NO: 1812, SEQ ID NO: 1825, SEQ ID NO: 1838, SEQ ID NO: 1851, SEQ ID NO: 1864, SEQ ID NO: 1877, SEQ ID NO: 1890, SEQ ID NO: 2072, SEQ ID NO: 2085, SEQ ID NO: 2098, SEQ ID NO: 2111, SEQ ID NO: 2124, SEQ ID NO: 2137, SEQ ID NO: 2150, SEQ ID NO: 2163, SEQ ID NO: 2189, SEQ ID NO: 2202, i SEQ ID NO: 2215.

4. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što prvi vezujući domen sadrži VH region i VL region izabran iz grupe koju čine:

parove VH regioni i VL regioni kako je prikazano u SEQ ID NOs: 352+408, SEQ ID NOs: 360+416, SEQ ID NOs: 388+444, SEQ ID NOs: 386+442, SEQ ID NOs: 340+396, SEQ ID NOs: 346+402, SEQ ID NOs: 374+430, SEQ ID NOs: 348+404, SEQ ID NOs: 390+446, SEQ ID NOs: 463+558, SEQ ID NOs: 464+559, SEQ ID NOs: 465+560, SEQ ID NOs: 466+561, SEQ ID NOs: 467+562, SEQ ID NOs: 468+563, SEQ ID NOs: 469+564, SEQ ID NOs: 470+565, SEQ ID NOs: 471+566, SEQ ID NOs: 472+567, SEQ ID NOs: 473+568, SEQ ID NOs: 474+569, SEQ ID NOs: 475+570, SEQ ID NOs: 488+583, SEQ ID NOs: 489+584, SEQ ID NOs: 490+585, SEQ ID NOs: 491+586, SEQ ID NOs: 513+608, SEQ ID NOs: 514+609, SEQ ID NOs: 515+610, SEQ ID NOs: 516+611, SEQ ID NOs: 540+635, SEQ ID NOs: 541+636, SEQ ID NOs: 542+637, SEQ ID NOs: 543+638, SEQ ID NOs: 977+979, SEQ ID NOs: 1068+1070, SEQ ID NOs: 1146+1148, SEQ ID NOs: 1159+1161, SEQ ID NOs: 1185+1187, SEQ ID NOs: 1198+1200, SEQ ID NOs: 1211+1213, SEQ ID NOs: 1224+1226, SEQ ID NOs: 1237+1239, SEQ ID NOs: 1315+1317, SEQ ID NOs: 1328+1330, SEQ ID NOs: 1380+1382 SEQ ID NOs: 1393+1395, SEQ ID NOs: 1406+1408, SEQ ID NOs: 1419+1421, SEQ ID NOs: 1469+1471, SEQ ID NOs: 1478+1480, SEQ ID NOs: 1485+1487, SEQ ID NOs: 1494+1496, SEQ ID NOs: 1501+1503, SEQ ID NOs: 1508+1510, SEQ ID NOs: 1519+1521, SEQ ID NOs: 1526+1528, SEQ ID NOs: 1533+1535, SEQ ID NOs: 1542+1544, SEQ ID NOs: 1549+1551, SEQ ID NOs: 1558+1560, SEQ ID NOs: 1565+1567, SEQ ID NOs: 1784+1786, SEQ ID NOs: 1797+1799, SEQ ID NOs: 1810+1812, SEQ ID NOs: 1823+1825, SEQ ID NOs: 1836+1838, SEQ ID NOs: 1849+1851, SEQ ID NOs: 1862+1864, SEQ ID NOs: 1875+1877, SEQ ID NOs: 1888+1890, SEQ ID NOs: 2070+2072, SEQ ID NOs: 2083+2085, SEQ ID NOs: 2096+2098, SEQ ID NOs: 2109+2111, SEQ ID NOs: 2122+2124, SEQ ID NOs: 2135+2137, SEQ ID NOs: 2148+2150, SEQ ID NOs: 2161+2163, SEQ ID NOs: 2187+2189, SEQ ID NOs: 2200+2202, i SEQ ID NOs: 2213+2215.

5. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što je konstrukt antitela u formatu izabranom iz grupe koju čine (scFv)2, scFv-jednostrukog domena mAb, diatela i njihovi oligomeri.

6. Konstrukt antitela prema zahtevu 5, naznačen time što prvi vezujući domen sadrži sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koju čine sekvence

kako je prikazano u SEQ ID NO: 981, SEQ ID NO: 1072, SEQ ID NO: 1150, SEQ ID NO: 1163, SEQ ID NO: 1189, SEQ ID NO: 1202, SEQ ID NO: 1215, SEQ ID NO: 1228, SEQ ID NO: 1241, SEQ ID NO: 1319, SEQ ID NO: 1332, SEQ ID NO: 1384, SEQ ID NO: 1397, SEQ ID NO: 1410, SEQ ID NO: 1423, SEQ ID NO: 1473, SEQ ID NO: 1482, SEQ ID NO: 1489, SEQ ID NO: 1498, SEQ ID NO: 1505, SEQ ID NO: 1512, SEQ ID NO: 1523, SEQ ID NO: 1530, SEQ ID NO: 1537, SEQ ID NO: 1546, SEQ ID NO: 1553, SEQ ID NO: 1562, SEQ ID NO: 1569, SEQ ID NO: 1788, SEQ ID NO: 1801, SEQ ID NO: 1814, SEQ ID NO: 1827, SEQ ID NO: 1840, SEQ ID NO: 1853, SEQ ID NO: 1866, SEQ ID NO: 1879, SEQ ID NO: 1892, SEQ ID NO: 2074, SEQ ID NO: 2087, SEQ ID NO: 2100, SEQ ID NO: 2113, SEQ ID NO: 2126, SEQ ID NO: 2139, SEQ ID NO: 2152, SEQ ID NO: 2165, SEQ ID NO: 2191, SEQ ID NO: 2204, i SEQ ID NO: 2217.

7. Konstrukt antitela prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što je drugi vezujući domen u stanju da se veže za humani i Callithrix jacchus, Saguinus Oedipus ili Saimiri sciureus CD3 ipsilon.

8. Konstrukt antitela prema zahtevu 7, naznačen time što ima sekvencu aminokiseline izabranu iz grupe koju čine sekvence

kako je prikazano u SEQ ID NO: 982, SEQ ID NO: 1073, SEQ ID NO: 1151, SEQ ID NO: 1164, SEQ ID NO: 1190, SEQ ID NO: 1203, SEQ ID NO: 1216, SEQ ID NO: 1229, SEQ ID NO: 1242, SEQ ID NO: 1320, SEQ ID NO: 1333, SEQ ID NO: 1385, SEQ ID NO: 1398, SEQ ID NO: 1411, SEQ ID NO: 1424, SEQ ID NO: 1474, SEQ ID NO: 1475, SEQ ID NO: 1476, SEQ ID NO: 1483, SEQ ID NO: 1490, SEQ ID NO: 1491, SEQ ID NO: 1492, SEQ ID NO: 1499, SEQ ID NO: 1506, SEQ ID NO: 1513, SEQ ID NO: 1514, SEQ ID NO: 1515, SEQ ID NO: 1516, SEQ ID NO: 1517, SEQ ID NO: 1524, SEQ ID NO: 1531, SEQ ID NO: 1538, SEQ ID NO: 1539, SEQ ID NO: 1540, SEQ ID NO: 1547, SEQ ID NO: 1554, SEQ ID NO: 1555, SEQ ID NO: 1556, SEQ ID NO: 1563, SEQ ID NO: 1570, SEQ ID NO: 1571, SEQ ID NO: 1572, SEQ ID NO: 1573, SEQ ID NO: 1574, SEQ ID NO: 1575, SEQ ID NO: 1576, SEQ ID NO: 1577, SEQ ID NO: 1578, SEQ ID NO: 1579, SEQ ID NO: 1580, SEQ ID NO: 1581, SEQ ID NO: 1789, SEQ ID NO: 1802, SEQ ID NO: 1815, SEQ ID NO: 1828, SEQ ID NO: 1841, SEQ ID NO: 1854, SEQ ID NO: 1867, SEQ ID NO: 1880, SEQ ID NO: 1893, SEQ ID NO: 2075, SEQ ID NO: 2088, SEQ ID NO: 2101, SEQ ID NO: 2114, SEQ ID NO: 2127, SEQ ID NO: 2140, SEQ ID NO: 2153, SEQ ID NO: 2166, SEQ ID NO: 2192, SEQ ID NO: 2205, i SEQ ID NO: 2218 do 2228.

9. Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira konstrukt antitela kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 8.

10. Vektor koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline kako je definisana u zahtevu 9.

11. Ćelija domaćina transformisana ili transfektovana sa sekvencom nukleinske kiseline kako je definisano u zahtevu 9 ili sa vektorom kako je definisano u zahtevu 10.

12. Proces za proizvodnju konstrukta antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pomenuti postupak obuhvata kultivisanje ćelije domaćina kako je definisana u zahtevu 11 pod uslovima koji omogućavaju ekspresiju konstrukta antitela kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 8 i regenerisanje proizvedenog konstrukta antitela iz kulture.

13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 8, ili proizveden prema procesu prema zahtevu 12.

14. Konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 8, ili proizveden prema procesu prema zahtevu 12 za upotrebu u prevenciji ili lečenju bolesti melanoma ili bolesti metastaza melanoma.

15. Komplet koji sadrži konstrukt antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 8, ili proizveden prema procesu prema zahtevu 12, vektor kako je definisan u zahtevu 10, i/ili ćeliju domaćina kako je definisana u zahtevu 11.