RS59876B1 - Kompleks faktora viii sa xten i proteinom fon vilebrandovog faktora, i njihova primena - Google Patents

Kompleks faktora viii sa xten i proteinom fon vilebrandovog faktora, i njihova primena

Info

Publication number
RS59876B1
RS59876B1 RS20200123A RSP20200123A RS59876B1 RS 59876 B1 RS59876 B1 RS 59876B1 RS 20200123 A RS20200123 A RS 20200123A RS P20200123 A RSP20200123 A RS P20200123A RS 59876 B1 RS59876 B1 RS 59876B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fviii
domain
xten
amino acid
protein
Prior art date
Application number
RS20200123A
Other languages
English (en)
Inventor
Ekta Seth Chhabra
Tongyao Liu
Pei-Yun Chang
Robert T Peters
John Kulman
Original Assignee
Bioverativ Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bioverativ Therapeutics Inc filed Critical Bioverativ Therapeutics Inc
Publication of RS59876B1 publication Critical patent/RS59876B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
STANJE TEHNIKE
[0001] Hemofilija A je poremećaj krvarenja izazvan defektima gena koji kodira faktor koagulacije VIII (FVIII) i pogađa 1-2 na 10.000 rođenih muškaraca. Graw i dr., Nat. Rev. Genet. 6(6): 488-501 (2005). Pacijenti pogođeni hemofilijom A mogu se tretirati infuzijom prečišćenog ili rekombinantno proizvedenog FVIII. Međutim, poznato je da svi komercijalno dostupni FVIII proizvodi imaju poluživot od oko 8-12 sati, što zahteva čestu intravenoznu primenu pacijentima. Pogledati Weiner M.A. i Cairo, M.S., Pediatric Hematology Secrets, Lee, M.T., 12. Disorders of Coagulation, Elsevier Health Sciences, 2001; Lillicrap, D.
Thromb. Res. 122 Suppl 4:S2-8 (2008). Pored toga, brojni pristupi su isprobani kako bi se produžio poluživot FVIII. Na primer, pristupi u razvoju za produžavanje poluživota faktora koagulacije uključuju pegilaciju, glikopegilaciju i konjugaciju sa albuminom. Pogledati Dumont i dr., Blood.119(13): 3024-3030 (objavljeno na Internetu 13. januara 2012). Bez obzira na upotrebljeni proteinski inženjering, navodi se da FVIII proizvodi dugotrajnog delovanja koji su trenutno u razvoju imaju ograničene polu živote - samo na oko 1,5 do 2 sata u pretkliničkim životinjskim modelima. Pogledati id. Dokazani su konzistentni rezultati kod ljudi, na primer, za rFVIIIFc se navodi da je poboljšava poluživot do ~1,7 puta u poređenju sa ADVATE® kod pacijenata sa hemofilijom A. Pogledati Id. Zbog toga povećanje poluživota, uprkos manjim poboljšanjima, može ukazivati na prisustvo drugih faktora koji ograničavaju T1/2. Pogledati Liu, T. I dr., 2007 ISTH sastanak, apstrakt #P-M-035; Henrik, A. I dr., 2011 ISTH sastanak, apstrakt #P=MO-181; Liu, T. I dr., 2011 ISTH sastanak, apstrakt #P-WE-131.
[0002] Poluživot u plazmi Fon Vilebrandovog Faktora (VWF) iznosi oko 12 sati (u rasponu od 9 do 15 sati). http://www.nhlbi.nih.gov/guidelines/vwd/2 scientificoverview.htm (poslednji put posećeno 22. Oktobra 2011). Na poluživot VWF može uticati više faktora: obrazac glikozilacije, ADAMTS-13 (dezintegrin i metaloproteaza sa motivom trombospondina-13) i različite mutacije u VWF.
[0003] U plazmi 95-98% FVIII cirkuliše u tesnom nekovalentnom kompleksu sa VWF pune dužine. Formiranje ovog kompleksa važno je za održavanje odgovarajućih nivoa FVIII u plazmi in vivo. Lenting i dr., Blood.92(11): 3983-96 (1998); Lenting i dr., J. Thromb.
Haemost. 5(7): 1353-60 (2007). divljeg tipa FVIII pune dužine uglavnom je prisutan kao heterodimer sa teškim lancem (MW 200kD) i lakim lancem (MW 73kD). Kada se FVIII aktivira zbog proteolize na položajima 372 i 740 u teškom lancu i na položaju 1689 u lakom lancu, VWF vezan za FVIII uklanja se iz aktiviranog FVIII. Aktivirani FVIII, zajedno sa aktiviranim faktorom IX, kalcijumom i fosfolipidom („kompleks tenaze“), indukuje aktiviranje faktora X, stvarajući velike količine trombina. Trombin, sa svoje strane, zatim razdvaja fibrinogen kako bi formirao rastvorljive monomere fibrina, koji se zatim spontano polimeriziraju kako bi se formirao rastvorljivi polimer fibrina. Trombin takođe aktivira faktor XIII, koji zajedno sa kalcijumom služi za unakrsno povezivanje i stabilizaciju rastvorljivog polimera fibrina, formirajući unakrsno povezani (nerastvorljivi) fibrin. Aktivirani FVIII se brzo čisti iz cirkulacije proteolizom.
[0004] Zbog učestalog doziranja i neprijatnosti prouzrokovanih rasporedom doziranja, još uvek postoji potreba za razvojem FVIII proizvoda koji omogućavaju ređu upotrebu, tj. FVIII proizvod koji ima poluživot duži od ograničenja poluživota od 1,5 do 2 puta.
[0005] WO 2011/060242 opisuje postupke, sastave i komplete za pripremu i upotrebu FVIII. Ovaj dokument takođe opisuje VWF polipeptide i molekule nukleinske kiseline koji kodiraju VWF polipeptide.
[0006] WO 2011/069164 opisuje postupke primene FVIII i himernih i hibridnih polipeptida koji sadrže FVIII. Takođe opisuje polinukleotide koji kodiraju takve himerne i hibridne polipeptide, ćelije koje sadrže takve polinukleotide i postupke proizvodnje himernih i hibridnih polipeptida koristeći te ćelije.
[0007] Schellenberger i dr. (Nat. Biotechnol. (2009) 27(12):1186-90) pokazuju da genetska fuzija XTEN sa peptidom ili proteinom pruža pristup produženom poluživotu u plazmi.
KRATAK SAŽETAK PRONALASKA
[0008] Na osnovu obelodanjenja koje je ovde sadržano, predmetni pronalazak pruža himerni protein koji sadrži (i) fragment fon Vilebrandovog Faktora (VWF) koji sadrži D' domen i D3 domen od VWF, (ii) polipeptidnu sekvencu produžene dužine (XTEN), (iii) protein Faktora VIII (FVIII), (iv) prvi Ig konstantni region ili njegov deo i (v) drugi Ig konstantni region ili njegov deo,
gde su VWF fragment i XTEN sekvenca povezani opcionim veznikom,
gde su XTEN sekvenca ili VWF fragment povezani sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom,
gde je FVIII protein povezani sa drugim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, i gde je prvi Ig konstantni region ili njegov deo vezan za ili je vezan za drugi Ig konstantnim regionom ili njegovim delom putem kovalentne veze.
[0009] U nekim otelotvorenjima, himerni protein obuhvata formulu koja obuhvata:
(g) V-L2-X-L1-F1:FVIII-L3-F2;
(h) V-L2-X-L1-F1:F2-L3-FVIII;
(i) F1-L1-X-L2-V:FVIII-L3-F2;
(j) F1-L1-X-L2-V:F2-L3-FVIII;
(k) V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2;
(l) F2-L3-FVIII-L4-F1-LL1-X-L2-V;
(m) FVIII-L3-F2-L4-V-L2-X-L1-F1; ili (n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L3-FVIII,
gde V je VWF fragment,
svaki od L1, L2, i L3 je opcioni veznik, npr., razdvojivi veznik,
L4 je opcioni veznik, npr., veznik za obradu,
FVIII obuhvata FVIII protein,
X obuhvata jednu ili više XTEN sekvenci,
F1 je prvi Ig konstantni region ili njegov deo,
F2 je drugi Ig konstantni region ili njegov deo, i
(:) je kovalentna veza.
[0010] Ne-ograničavajući primeri himernih proteina mogu da obuhvataju formulu, koja obuhvata:
(1) FVIII(X1)-L1-F1:V-L2-X2-L3-F2;
(2) FVIII(X1)-L1-F1:F2-L3-X2-L2-V;
(3) F1-L1-FVIII(X1):V-L2-X2-L3-F2;
(4) F1-L1-FVIII(X1):F2-L3-X2-L2-V;
(5) FVIII(X1)-L1-F1-L4-V-L2-X2-L3-F2;
(6) FVIII(X1)-L1-F1-L4-F2-L3-X2-L2-V;
(7) F1-L1-FVIII(X1)-L4-V-L2-X2-L3-F2,
ili
(8) F1-L1-FVIII(X1)-L4-F2-L3-X2-L2-V,
gde FVIII(X1) obuhvata FVIII protein i jednu ili više XTEN sekvenci, gde su jedna ili više XTEN sekvenci vezane za N-terminus ili C-terminus FVIII proteina ili umetnute neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina u FVIII proteinu (npr., jedno ili više XTEN mesto umetanja);
svaki od L1, L2, ili L3 je opcioni veznik, npr., razdvojivi veznik;
L4 je veznik, veznik za obradu;
X2 je druga XTEN sekvenca;
F1 je Ig konstantni region ili njegov deo;
F2 opcioni dodatni Ig konstantni region ili njegov deo, i V je VWF fragment;
(-) je peptidna veza; i
(:) je kovalentna veza.
[0011] Jedan aspekt predmetnog pronalaska je da se VWF fragment koristan za himerni protein ne vezuje za VWF klirens receptor, što sprečava ili inhibira interakciju FVIII proteina sa endogenim VWF. Himerni protein koji sadrži VWF fragment tako ima smanjen klirens ili se ne uklanja kroz VWF put klirensa. naredni aspekt pronalaska je da VWF fragment može da zaštiti FVIII protein od jednog ili više razdvajanja proteaze, zaštiti FVIII protein od aktivacije, stabilizuje teški lanac i/ili laki lanac FVIII proteina, ili spreči klirens FVIII proteina pomoću jednog ili više skevindžer receptora.
[0012] Zbog sposobnosti VWF fragmenta da spreči ili inhibira interakciju između FVIII proteina i endogenog VWF, poluživot FVIII proteina produžen je u poređenju sa FVIII proteinom bez VWF fragmenta. U jednom aspektu, poluživot FVIII proteina produžava se najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili najmanje oko 12 puta u odnosu na divljeg tipa FVIII. U drugom otelotvorenju, poluživot FVIII proteina iznosi najmanje oko 10 sati, najmanje oko 11 sati, najmanje oko 12 sati, najmanje oko 13 sati, najmanje oko 14 sati, najmanje oko 15 sati, na najmanje oko 16 sati, najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sat, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati, ili najmanje oko 108 sati.
[0013] Ig konstantni region ili njegov deo koji je koristan u predmetnom pronalasku i dodatni Ig konstantni region ili njegov deo koristan u predmetnom pronalasku su identični ili različiti.
[0014] U nekim aspektima, FVIII protein je vezan za XTEN sekvencu na C-terminusu ili N-terminusu FVIII proteina ili je umetnut neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina u zrelom nativnom ljudskom FVIII (npr., jedno ili više mesta umetanja) ili bilo koje njihove kombinacije. Jedno ili više mesta umetanja u FVIII protein mogu se nalaziti unutar jednog ili više domena FVIII proteina izabranih iz grupe koju čine A1 domen, a1 kiseli region, A2 domen, a2 kiseli region, A3 domena, B domen, C1 domen, C2 domen i sve njihove kombinacije, ili između jednog ili više domena FVIII proteina izabranih iz grupe koju čine A1 domen i a1 kiseli region, a1 kiseli region i A2 domen, A2 domen i a2 kiseli region, a2 kiseli region i B domen, B domen i A3 domen, A3 domen i C1 domen, C1 domen i C2 domen, i sve njihove kombinacije, ili između dva domena FVIII proteina odabranih iz grupe koju čine A1 domen i a1 kiseli region, a1 kiseli region i A2 domen, A2 domen i a2 kiseli region, A2 kiseli region i B domen, B domen i A3 domen, A3 domen i C1 domen, C1 domen i C2 domen, i sve njihove kombinacije.
[0015] U jednom aspektu, jedno ili više mesta umetanja nalaze se neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina kod zrelog nativnog ljudskog FVIII (npr., SEQ ID NO: 4 [zreo FVIII sekvenca, pune dužine]) izabranog iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci u Tabelama 7, 8, 9, 10, 11, ili bilo koja njihova kombinacija.
[0016] U drugom otelotvorenju, jedno ili više mesta umetanja nalaze se u jednoj ili više dozvoljenih petlji zrelog nativnog ljudskog FVIII. U drugim otelotvorenjima, jedno ili više mesta umetanja nalaze se u a3 regionu zrelog nativnog ljudskog FVIII. Na primer, XTEN sekvenca se može neposredno nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4 (zreo FVIII pune dužine). U drugim otelotvorenjima, FVIII protein je povezan sa najmanje dve XTEN sekvence, prva XTEN sekvenca umetnuta u a3 region, i druga XTEN sekvenca je umetnuta unutar permisivne petlje u FVIII proteinu (npr., A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 ili A3-2). U još nekim otelotvorenjima, FVIII protein je povezan sa najmanje tri XTEN sekvence, prva XTEN sekvenca umetnuta u a3 region i druga XTEN sekvenca i treća XTEN sekvenca umetnuta unutar jedne ili dve permisivne petlje u FVIII proteinu (npr., A1-1, A1-2, A2-1, A2-2, A3-1 ili A3-2).
[0017] U nekim otelotvorenjima, jedno ili više mesta umetanja za jedno ili više XTEN umetanja su neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (numerisanih u odnosu na zrelu FVIII sekvencu) izabranih iz grupe koju čine:
(1) aminokiselina 3, (2) aminokiselina 18, (3) aminokiselina 22, (4) aminokiselina 26, (5) aminokiselina 32, (6) aminokiselina 40, (7) aminokiselina 60, (8) aminokiselina 65, (9) aminokiselina 81, (10) aminokiselina 116, (11) aminokiselina 119, (12) aminokiselina 130, (13) aminokiselina 188, (14) aminokiselina 211, (15) aminokiselina 216, (16) aminokiselina 220, (17) aminokiselina 224, (18) aminokiselina 230, (19) aminokiselina 333, (20) aminokiselina 336, (21) aminokiselina 339, (22) aminokiselina 375, (23) aminokiselina 399, (24) aminokiselina 403, (25) aminokiselina 409, (26) aminokiselina 416, (26) aminokiselina 442, (28) aminokiselina 487, (29) aminokiselina 490, (30) aminokiselina 494, (31) aminokiselina 500, (32) aminokiselina 518, (33) aminokiselina 599, (34) aminokiselina 603, (35) aminokiselina 713, (36) aminokiselina 745, (37) aminokiselina 1656, (38) aminokiselina 1711, (39) aminokiselina 1720,
(40) aminokiselina 1725, (41) aminokiselina 1749, (42) aminokiselina 1796,
(43) aminokiselina 1802, (44) aminokiselina 1827, (4 5) aminokiselina 1861, (46) aminokiselina 1896, (47) aminokiselina 1900, (48) aminokiselina 1904,
(49) aminokiselina 1905, (50) aminokiselina 1910, (51) aminokiselina 1937,
(52) aminokiselina 2019, (53) aminokiselina 2068, (54) aminokiselina 2111,
(55) aminokiselina 2120, (56) aminokiselina 2171, (57) aminokiselina 2188,
(58) aminokiselina 2227, (59) aminokiselina 2277, i
(60) dve ili više njihovih kombinacija.
[0018] U nekim otelotvorenjima, jedan XTEN je umetnut u FVIII protein. U nekim otelotvorenjima, dva su umetnuta u FVIII protein. U nekim otelotvorenjima, 3 su umetnuta u FVIII protein.
[0019] U posebnom primeru, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 26, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4 (zreo FVIII pune dužine). U drugom primeru, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 403, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim primerima, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4. U ostalim primerima, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 26, što odgovara SEQ ID NO: 4, drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treći XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4. U daljim otelotvorenjima, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 403, što odgovara SEQ ID NO: 4, drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treći XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim drugim otelotvorenjima, prvi XTEN je umetnut između aminokiselina 403 i 404, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treći XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 26, što odgovara SEQ ID NO: 4 (zreo FVIII pune dužine), drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treći XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1900, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 26, što odgovara SEQ ID NO: 4, drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1656, odgovara SEQ ID NO: 2, treći XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4, i četvrti XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1900, što odgovara SEQ ID NO: 4. U drugom primeru, XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 745, što odgovara SEQ ID NO: 4. U dodatnom primeru, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1900, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 26, što odgovara SEQ ID NO: 4, drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treći XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1900 što odgovara SEQ ID NO: 4. U drugom primeru, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 403, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 745 što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 745, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1900, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima, prvi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 18, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 745, što odgovara SEQ ID NO: 4.
[0020] U nekim otelotvorenjima, FVIII protein je dvolančani FVIII izoform. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein je jednolančani FVIII izoform.
[0021] U nekim otelotvorenjima, XTEN koji se umeće je SEQ ID NO: 39 (AE288). U nekim primerima, XTEN koji se umeću su SEQ ID NO: 38 i 37 (AG144 i AE144). U nekim primerima, XTEN koji se umeću su SEQ ID NO: 37, 38 i 37 (AE144, AG144 i AE144). U nekim otelotvorenjima XTEN koji se umeću su SEQ ID NO: 37 i 40 (AE144 i AE288). U nekim otelotvorenjima, XTEN koji se umeću su AE42 (SEQ ID NO: 36), AE72 (SEQ ID NO: 127), AE144_2A (SEQ IDNO: 128), AE1443B (SEQ ID NO: 129), AE144_4A (SEQ ID NO: 130), AE144_5A (SEQ IDNO: 131), AE144_6B (SEQ IDNO: 132), AG144 A (SEQ ID NO: 133), AG144_B (SEQ IDNO: 134), AG144_C (SEQ ID NO: 135), AG144_F (SEQ IDNO: 136), AE864 (SEQ ID NO: 43), AE576 (SEQ ID NO: 41), AE288 (SEQ IDNO: 39), AE288_2 (SEQ ID NO: 137), AE144 (SEQ ID NO: 37), AG864 (SEQ ID NO: 44), AG576 (SEQ ID NO: 42), AG288 (SEQ ID NO: 40), AG144 (SEQ ID NO: 38), i bilo koja njihova kombinacija.
[0022] FVIII protein koristan u predmetnom pronalasku može da sadrži B domen ili njegov deo, npr., FVIII sa izbrisanim SQ B domenom. U jednom otelotvorenju, FVIII protein sadrži jednolančani FVIII. U drugom otelotvorenju, jednolančani FVIII sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u ostatku koji odgovara ostatku 1648, ostatku 1645, ili oba od polipeptida zrelog Faktora VIII pune dužine (SEQ ID NO: 4) ili ostatku 754, ostatku 751, ili oba od SQ BDD Faktora VIII (SEQ ID NO: 6). U drugim otelotvorenjima, aminokiselinska supstitucija je aminokiselina koja nije arginin. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein sadrži teški lanac od FVIII i laki lanac od FVIII, gde su teški i laki lanac međusobno povezani metalnom vezom.
[0023] FVIII protein može imati nizak afinitet, ili da se ne vezuje uopšte za protein povezan sa lipoprotein receptorom niske gustine (LRP), npr., tako što sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju koja smanjuje afinitet ili eliminiše vezivanje za LRP. Takva najmanje jedna aminokiselinska supstitucija može biti u ostatku koji odgovara ostatku 471, ostatku 484, ostatku 487, ostatku 490, ostatku 497, ostatku 2092, ostatku 2093, ili dve ili više njihovih kombinacija zrelog FVIII pune dužine. U posebnom otelotvorenju, aminokiselinska supstitucija u ostatku 471, 484 ili 497 je aminokiselina koja nije arginin, aminokiselinska supstitucija u ostatku 487 je aminokiselina koja nije tirozin, i aminokiselinska supstitucija u ostatku 2092 je aminokiselina koja nije lizin, ili aminokiselinska supstitucija u ostatku 2093 je aminokiselina koja nije fenilalanin.
[0024] U nekim otelotvorenjima, FVIII protein sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju, koja indukuje da FVIII protein bude stabilniji od FVIII proteina bez supstitucije. Takve supstitucije mogu da budu locirane u A2 domenu i A3 domenu FVIII proteina, npr., na ostatku koji odgovara ostatku 664, ostatku 1826, ostatku 662, ostatku 1828, ili dve ili više njihovih kombinacija zrelog FVIII pune dužine.
[0025] VWF fragment koristan za predmetni pronalazak sadrži D' domen i D3 domen, koji su zajedno sposobni da se vezuju za FVIII. VWF fragment može da sadrži aminokiselinsku sekvencu D' domena koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinama 764 do 866 od SEQ ID NO: 2 i/ili je aminokiselinska sekvenca D3 domena najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinama 867 do 1240 od SEQ ID NO: 2. U jednom otelotvorenju, VWF fragment je monomer. U drugom otelotvorenju, VWF fragment sadrži najmanje dva VWF fragmenta, najmanje tri VWF fragmenta, najmanje četiri VWF fragmenta, najmanje pet VWF fragmenata ili najmanje šest VWF fragmenata. U jednom aspektu, dva ili više VWF fragmenta mogu biti identični ili mogu biti različiti. VWF fragment može da sadrži aminokiselinu koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinama 764 do 1240 od SEQ ID NO: 2. VWF fragment može da se suštinski sastoji ili sastoji od aminokiselina 764 do 1240 od SEQ ID NO: 2. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment može da sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u ostatku koji odgovara ostatku 1099, ostatku 1142, ili oba ostatka 1099 i 1142 od SEQ ID NO: 2. U drugim otelotvorenjima, VWF fragment dalje sadrži D1 domen, D2 domen ili D1 i D2 domene VWF.
1
[0026] VWF fragment može dalje da sadrži VWF domen izabran iz grupe koju čine A1 domen, A2 domen, A3 domen, D4 domen, B1 domen, B2 domen, B3 domen, C1 domen, C2 domen, CK domen, jedan ili više njegovih fragmenata, i bilo koja njihova kombinacija. Na primer, VWF fragment može u osnovi da se sastoji od: (1) D' i D3 domena VWF ili njegovih fragmenata; (2) D1, D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; (3) D2, D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; (4) D1, D2, D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; ili (5) D1, D2, D' , D3 i A1 domena VWF ili njihovih fragmenata. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment dalje sadrži signalni peptid od VWF ili FVIII koji je operativno povezan sa VWF fragmentom.
[0027] Jedan ili više veznika korisnih u pronalasku imaju dužinu najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, ili 2000 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više veznika imaju dužinu od oko 1 do oko 2000 aminokiselina. U jednom aspektu, jedan ili više veznika imaju dužinu najmanje oko 20, 35, 42, 48, 73, 75, 95, 98, 144, 288, 324, 333, 576 ili 864 aminokiselina. U drugom otelotvorenju, jedan ili više veznika sadrže gly/ser peptid, XTEN sekvencu ili oba. Primeri gly/ser peptida uključuju, ali nisu ograničeni na, formulu (Gly4Ser)n(SEQ ID NO: 139) ili S(Gly4Ser)n(SEQ ID NO: 140), gde je n pozitivan ceo broj izabran iz grupe koju čine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 i 10. Na primer, (Gly4Ser)nveznik može biti (Gly4Ser)3(SEQ ID NO: 63) ili (Gly4Ser)4(SEQ ID NO: 138). U jednom otelotvorenju, veznik obuhvata najmanje jedno prvo mesto razdvajanja na N-terminusu veznika, najmanje jedno drugo mesto razdvajanja na C-terminusu veznika, ili oba. U narednom otelotvorenju, veznik obuhvata 20 aminokiselina, 35 aminokiselina, 48 aminokiselina, 73 aminokiselina, ili 95 aminokiselina veznika razdvojiv trombinom. Veznici koji se mogu da se razdvajaju mogu da sadrže jedno ili više mesta razdvajanja proteazom odabranom iz grupe koju čine faktor XIa, faktor XIIa, kalikrein, faktor VIIa, faktor IXa, faktor Xa, faktor IIa (trombin), Elastaza-2, Granzime-B, TEV, Enterokinaza, Proteaza 3C, Sortaza A, MMP-12, MMP-13, MMP-17 i MMP-20, npr., TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 8). Neograničavajući primeri jednog ili više mesta razdvajanja sadrže aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine RRRR (SEQ ID NO: 9), RKRRKR (SEQ ID NO: 10), RRRRS (SEQ ID NO: 11), TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 12), SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 13), DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 14), TTKIKPR (SEQ ID NO: 15), LVPRG (SEQ ID NO: 16), ALRPR (SEQ ID NO: 17), KLTRAET (SEQ ID NO: 18), DFTRVVG (SEQ ID NO: 19), TMTRIVGG (SEQ ID NO: 20), SPFRSTGG (SEQ ID NO: 21), LQVRIVGG (SEQ ID NO: 22), PLGRIVGG (SEQ ID NO:23), IEGRTVGG (SEQ ID NO: 24), LTPRSLLV (SEQ ID NO: 25), LGPVSGVP (SEQ ID NO: 26), VAGDSLEE (SEQ ID NO: 27), GPAGLGGA (SEQ ID NO: 28), GPAGLRGA (SEQ ID NO: 29), APLGLRLR (SEQ ID NO: 30), PALPLVAQ (SEQ ID NO: 31), ENLYFQG (SEQ ID NO: 32), DDDKIVGG (SEQ ID NO: 33), LEVLFQGP (SEQ ID NO: 34), i LPKTGSES (SEQ ID NO: 35). U nekim otelotvorenjima, prvo mesto razdvajanja i drugo mesto razdvajanja su identično ili različito.
[0028] XTEN sekvenca korisna za pronalazak može biti izabrana iz grupe koju čine AE42 (SEQ ID NO: 36), AE144 (SEQ ID NO: 37), AG144 (SEQ ID NO: 38), AE288 (SEQ ID NO: 39), AG288 (SEQ ID NO: 40), AE576 (SEQ ID NO: 41). AG576 (SEQ ID NO: 42), AE864 (SEQ ID NO: 43), AE72 (SEQ ID NO: 127), AE144_2A (SEQ ID NO: 128), AE144_3B (SEQ ID NO: 129), AE144_4A (SEQ ID NO: 130), AE144_5A (SEQ ID NO: 131), AE144_6B (SEQ ID NO: 132), AG144 A (SEQ ID NO: 133), AG144_B (SEQ ID NO: 134), AG144_C (SEQ ID NO:135), AG144_F (SEQ ID NO: 136), AE288_2 (SEQ ID NO: 137), ili AG864 (SEQ ID NO: 44). U određenom otelotvorenju, XTEN sekvenca sadrži AE288 ili AG288.
[0029] Himerni protein prema predmetnom pronalasku može biti polisijalizovan, pegilovan ili hezilovan.
[0030] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na polinukleotid ili skup polinukleotida koji kodiraju himerni protein pronalaska. Polinukleotid može dalje da sadrži polinukleotidni lanac, koji kodira PC5 ili PC7. U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža vektor koji sadrži polinukleotid ili skup polinukleotida pronalaska i jedan ili više promotera koji su operativno povezani sa polinukleotidom ili setom polinukleotida pronalaska. Vektor može dalje da sadrži dodatni vektor, koji sadrži polinukleotidni lanac koji kodira PC5 ili PC7.
Pronalazak se takođe privlači ka ćeliji domaćinu koja sadrži polinukleotid ili vektor predmetnog pronalaska. Ćelija domaćin može biti ćelija sisara, npr., HEK293 ćelija, CHO ćelija ili BHK ćelija. U nekim otelotvorenjima PC5 ili PC7 ćelije domaćina razdvaja D1D2 domene od VWF.
[0031] Pronalazak je takođe usmeren na farmaceutski sastav koji sadrži himerni protein, polinukleotid, vektor ili ćeliju domaćina iz pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
Sastav predmetnog pronalaska stoga ima produženi poluživot u poređenju sa divljeg tipa FVIII proteina. Poluživot FVIII proteina produžava se za najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili najmanje oko 12 puta u odnosu na divljeg tipa FVIII. Poluživot Faktora VIII iznosi najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sata, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 26 sati, najmanje oko 27 sati, najmanje oko 28 sati, najmanje oko 29 sati, najmanje oko 30 sati, najmanje oko 31 sat, najmanje oko 32 sata, najmanje oko 33 sata, najmanje oko 34 sata, najmanje oko 35 sati, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 84 sata sati, najmanje oko 96 sati, ili najmanje oko 108 sati.
[0032] Sastav predmetnog pronalaska može se primeniti putem odabranim iz grupe koju čine lokalna primena, intraokularna primena, parenteralna primena, intratekalna primena, subduralna primena i oralna primena. U jednom slučaju, sastav se primenjuje putem parenteralne primene, npr., intravenska ili subkutana primena. Sastav predmetnog pronalaska je koristan za tretman bolesti ili poremećaja krvarenja kod pacijenta koji ima potrebu za tim. Bolest ili poremećaj krvarenja su izabrani iz grupe koju čine poremećaj koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, hemoragija, hemoragija u mišićima, oralna hemoragija, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru, krvarenje u omotaču iliopsije, i bilo koja njihova kombinacija. U jednom slučaju, osoba koja je tretirana himernim proteinom treba da se podvrgne operaciji. U drugom slučaju, tretman je profilaktički ili na zahtev.
[0033] Obelodanjenje je takođe usmereno na postupak sprečavanja ili inhibicije vezivanja FVIII proteina sa endogenim VWF, koji sadrži dodavanje efikasne količine himernog proteina, polinukleotidnog vektora, ćelije domaćina ili sastave pacijentu koji ima potrebu za tim, gde se VWF fragment vezuje za FVIII protein i tako sprečava ili inhibira vezivanje endogenog VWF. Predmetno obelodanjenje je dalje usmereno na postupak produžavanja ili povećanja poluživota FVIII proteina, gde se postupak sastoji od primene efikasne količine
1
himernog proteina, polinukleotida, vektora, ćelije domaćina ili sastava pacijentu koji ima potrebu za tim, gde se VWF fragment vezuje za FVIII protein i na taj način produžava ili povećava poluživot FVIII proteina. Takođe je pružen postupak sprečavanja ili inhibicije klirensa FVIII proteina iz ćelije, gde se postupak odnosi na primenu efikasne količine himernog proteina, polinukleotida, vektora, ćelije domaćina ili sastava na ćeliju koja sadrži FVIII protein ili polinukleotid koji kodira FVIII protein, gde se protein koji ima aktivnost VWF vezuje za FVIII protein. Pacijent koristan za ove postupke je životinja, npr., čovek, npr., pacijent koji boluje od hemofilije A.
[0034] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža himerni protein pronalaska, polinukleotid ili skup polinukleotida pronalaska, ćeliju domaćina pronalaska ili sastav predmetnog pronalaska za upotrebu u tretmanu bolesti ili poremećaja krvarenja kod pacijenta koji ima potrebu za tim. Bolest ili poremećaj krvarenja su izabrani iz grupe koju čine poremećaj koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, hemoragija, hemoragija u mišićima, oralna hemoragija, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru, krvarenje u omotaču iliopsije. Tretman može biti profilaktički ili na zahtev. U jednom aspektu, efikasna količina je 0,1 µg/kg do 500 mg/kg.
[0035] U drugom aspektu, predmetni pronalazak pruža postupak pravljenja himernog proteina predmetnog pronalaska, koji uključuje transfekciju jedne ili više ćelija domaćina sa polinukleotidom ili vektorom pronalaska, i eksprimiranje himernog proteina u ćeliji domaćinu. Predmetni pronalazak i njegova otelotvorenja su pruženi u priloženim patentnim zahtevima.
KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA
[0036]
Slika 1A-D. Šematski dijagrami VWF fragmenata. Slika 1A prikazuje tri primerna VWF fragmenta korisna za pronalazak, npr., VWF-002, VWF-010 i VWF-013.
VWF-002 sadrži aminokiseline 1 do 477 od SEQ ID NO: 124 (aminokiseline 764 do 1240 od SEQ ID NO: 2) i sintetiše se bez pre/propeptidnih sekvenci. VWF-010 sadrži D1D2 domene, uz D'D3 domen. VWF-013 sadrži D1D2D'D3 domene, uz ostatke alanina koji zamenjuju cisteine na ostacima 336 i 379 od SEQ ID NO: 123. Slika 1B prikazuje VWF-031, koji sadrži D1D2D'D3 domene spojene za Ig konstantni region ili njegov deo, npr., Fc region, pomoću veznika za razdvajanje, npr., veznika razdvojiv trombinom od 48 aminokiselina. Slika 1C prikazuje VWF-025, koji predstavlja nukleotidnu sekvencu koja kodira D1D2D'D3 domene sadržane u pLIVE vektoru, i VWF-029, koji je nukleotidna sekvenca koja kodira D1D2D'D3 domene sa dve aminokiselinske supstitucije, C336A i C379A, u pLIVE vektoru. Slika 1D prikazuje VWF fragment pune dužine koji sadrži propeptid (D1 i D2 domeni) i zrele podjedinice (D', D3, A1, A2, A3, D4, B1-3, C1-2 domeni). VWF fragment je oko 250 kDa protein i formira multimere (> 20 MDa) disulfidnom vezom. VWF fragment se povezuje sa na FVIII (95-98%) u nekovalentnom kompleksu, i zatim produžava poluživot FVIII zaštitom FVIII od razdvajanja/aktivacije proteaze, stabilizacijom teškog i lakog lanca i sprečavanjem klirensa FVIII od strane skevindžer receptora. VWF fragment takođe može ograničiti poluživot FVIII uklanjanjem FVIII-VWF kompleksa putem VWF receptora i sprečavanjem pinocitoze i recikliranja rFVIIIFc. Slika 2. Farmakokinetički profil rFVIII-XTEN (rFVIII-AE288 ili rFVIII-288AE) kod miševa koji eksprimiraju VWF D'D3 ili kod FVIII i VWF dvostrukih knockout (DKO) miševa. Slika 2A prikazuje vremenski tok hidrodinamičke injekcije (HDI) D'D3 domena koji kodira plazmidnu DNK (VWF-025) (dan 5), intravenozno doziranje rFVIII-XTEN AE288 (dan 0) i prikupljanje PK uzoraka (dan 5). Slika 2B prikazuje FVIII aktivnost merenu FVIII hromogenim testom posle IV doziranja rFVIII-XTEN288 kod D1D2D'D3 miševa (obrnuti trougao) i rFVIII-XTEN288 kod DKO miševa (dijamant). Slika 2C prikazuje nivo D'D3 u plazmi (ng/mL) nakon primene VWF-025. X osa predstavlja vreme u satima.
Slika 3. Šematski dijagram primernih VWF:FVIII heterodimernih konstrukata.
Konstrukti imaju zajedničku strukturu predstavljenu kao formula FVIII-F1-L1-V-X-L2-F2, ali sadrže primere različitih varijabilnih veznika. Prikazan konstrukt (FVIII-161) sadrži heterodimerni FVIII (teški i laki lanac su povezani metalnom vezom) povezan sa prvim Fc regionom i VWF fragmentom, koji je D' i D3 domen od VWF (tj. aminokiseline 1 do 477 od SEQ ID NO: 2 sa aminokiselinskim supstitucijama C336A i C379A) povezane za XTEN sekvencu, koja je dalje povezana sa veznikom koji se može razdvojiti i drugim Fc regionom. XTEN sekvenca sadržana u FVIII-161 je XTEN AE288 sekvenca, i veznik je veznik razdvojiv trombinom koji ima 35 aminokiselina. U FVIII-161, FVIII protein povezan sa prvim Fc regionom povezan je
1
sa VWF fragmentom veznikom za obradu. Nakon eksprimiranja, veznik za obradu se može razdvojiti pomoću intracelularnog enzima za obradu obrade, čime se konstruišu tri polipeptidna lanca međusobno povezana.
Slika 4 je šematski dijagram primera FVIII-VWF heterodimera ili monomera. FVIII-168, FVIII-175, FVIII-172, FVIII-174 i FVIII170. Konstrukt FVIII-168 sadrži jednolančanu FVIII sekvencu (koja ima ostatak alanina koji supstituiše ostatke arginina na ostacima 1645 i 1648) povezan je sa prvim Fc regionom, koji se zatim spaja u VWF fragment povezan sa drugim Fc regionom veznika razdvojiv trombinom koji ima 48 aminokiselina. AE288 XTEN je umetnut u B domen jednolančane FVIII sekvence. Veza između prvog Fc regiona i VWF fragmenta sadrži razdvojivi veznik pomoću intracelularnog enzima za obradu, tj. Veznika za obradu. Konstrukt FVIII-175 sadrži jednolančani FVIII (koji ima ostatak alanina koji supstituiše ostatke arginina na ostacima 1645 i 1648) povezan sa AE288 XTEN i prvim Fc regionom, koji je vezom vezan za drugi Fc region, npr., veznik za obradu. AE288 XTEN je umetnut u B domen jednolančane FVIII sekvence. Konstrukt FVIII-172 sadrži dva polipeptidna lanca, prvi lanac koji sadrži teški lanac FVIII sekvence spojene za AE288 XTEN, drugi lanac koji sadrži laki lanac FVIII sekvence, prvi Fc region, veznik (npr., veznik za obradu), VWF fragment, razdvojivi veznik trombinom (npr., 48 aminokiseline) i drugi Fc region. Konstrukt FVIII-174 sadrži dva polipeptidna lanca, prvi lanac koji sadrži teški lanac FVIII sekvence spojene za AE288 XTEN, i drugi lanac sadrži laki lanac FVIII, prvi Fc region, veznik (npr., veznik za obradu) i drugi Fc region. Konstrukt FVIII-170 sadrži VWF fragment, AE288 XTEN, veznik (npr., veznika razdvojiv trombinom, koji je dužine 35 aminokiselina), i jednolančanu FVIII sekvencu.
Slika 5. Farmakokinetički profil FVIII/VWF heterodimera koji sadrže XTEN sekvencu u kombinaciji sa Fc regionom. Konstrukti FVIII-161, FVIII-168 i FVIII-172 su primenjeni na FVIII:VWF dvostruke knockout (DKO) miševe hidrodinamičkom injekcijom (HDI) u dozi od 100 µg/miš. Konstrukt FVIII-170 primenjen je FVIII:VWF DKO miševima pomoću HDI u dozi od 50 µg/miš. Post-HDI FVIII aktivnost u plazmi je analizirana FVIII hromogenim testom tokom 24 sata posle HDI. FVIII FVIII aktivnost:VWF heterodimera koji sadrže XTEN sekvencu i Fc domene je upoređena sa FVIII aktivnošću BDD-FVIII bez VWF fragmenta, XTEN sekvence i Fc domena.
Slika 6. Šematski dijagrami FVIII-VWF heterodimera primeri sistema ko-
1
transfekcije. Slika 6A. Konstrukt FVIII-169 sadrži FVIII sekvencu pune dužine (sa ostatkom alanina koji supstituiše ostatke arginina u 1645 i 1648 i sa XTEN sekvencom umetnutom u jednolančanu FVIII sekvencu), koja je povezana sa Fc regionom. VWF-031 sadrži D1D2D'D3 fragment (sa ostatkom alanina koji supstituiše cisteinske ostatke na 336 i 379) koji je povezan sa drugim Fc regionom sa 48 veznikom razdvojiv trombinom. Nakon intracelularne obrade, konstrukt FVIII-169 proizvodi jednolančani FVIII (SCFVIII) pune dužine spojen za jedan Fc fragment i XTEN sekvencu, i konstrukt VWF-031 stvaraD'D3 fragment aminokiseline 477 povezan sa drugim Fc fragmentom. Dve kovalentne veze mogu da se formiraju između Fc fragmenata koji su povezani sa SC FVIII ili D'D3 fragmentom, što zauzvrat omogućava nekovalentnu povezanost FVIII i D'D3. Slika 6B. Konstrukt FVIII-173 sadrži heterodimernu FVIII sekvencu, FVIII sekvencu teškog lanca povezanu sa XTEN sekvencom i FVIII sekvencu lakog lanca vezanu za Fc region. VWF-031 je opisan iznad. Nakon intracelularne obrade, konstrukt FVIII-173 proizvodi heterodimerni protein, teški lanac FVIII spojen za XTEN sekvencu, laki lanac FVIII spojen za jedan Fc fragment, i konstrukt VWF-031 stvara D'D3 fragment aminokiseline 477 povezan sa drugim Fc fragmentom. Dve kovalentne veze mogu da se formiraju između Fc fragmenata koji su povezani sa lakim lancem FVIII ili D'D3 fragmentom, što zauzvrat omogućava nekovalentnu povezanost FVIII i D'D3.
Slika 7. Afiniteta vezivanja primernog FVIII:VWF koji sadrži XTEN sekvencu i Fc domene za imobilisani hVWF u Oktet testu. Afinitet vezivanja za FVIII-169/VWF-031 i FVIII-057 (rFVIIIFc) spojen za imobilisan hVWF testiran je korišćenjem merenja zasnovanih na bioplastičnoj interferometriji (Oktet test). Slika 7A u nanomolima prikazuje odgovor vezivanja leka FVIII169 i leka FVIIIFc (pozitivna kontrola) na imobilisani hVWF. Slika 7B prikazuje odgovor vezivanja ljudskog IgGl (negativna kontrola) na imobilisani ljudski VWF.
Slika 8. Farmakokinetički (PK) profil FVIII-169 kod HemA i FVIII:VWF dvostrukih knockout (DKO) miševa. Slika 8A prikazuje PK profil FVIII-169/VWF-031 i FVIIIFc kod HemA miševa. HemA miševi su tretirani jednom intravenskom dozom FVIII-169/VWF-031 pri 200 IU/kg. Uzorci plazme prikupljeni od miševa testirani su FVIII hromogenim testom. Poluživot FVIII-169/VWF-031 je izračunat korišćenjem WinNonlin programa. Slika 8B prikazuje PK profil FVIII-169/VWF-031, FVIII-169/Fc i FVIIIFc kod FVIII/VWF DKO miševa.
Slika 9. PK profil FVIII-XTEN varijanti u D'D3 koji eksprimiraju FVIII/VWF DKO
1
miševe. Slika 9A prikazuje poređenje PK profila FVIII-XTEN varijanti, FVIII sa jednim XTEN, FVIII sa dva XTEN i FVIII sa tri XTEN. Jedan, dva ili tri XTEN umetnuti su u različite delove FVIII, uključujući C-terminus i B domen. CT pokazuje da je XTEN povezan sa C-terminusom FVIII. Mesto umetanja B/CT ukazuje da je jedan XTEN umetnut između aminokiselinskog ostatka 745 i aminokiselinskog ostatka 746 FVIII proteina, i drugi XTEN je povezan sa C-terminusom FVIII proteina. Numerisanje aminokiselinskih ostataka odgovara SQ BDD FVIII proteinskoj sekvenci. Mesto umetanja 1900/B/CT pokazuje da je prvi XTEN umetnut između aminokiselinskog ostatka 1900 i aminokiselinskog ostatka 1901 od FVIII, drugi XTEN je umetnut između aminokiselinskog ostatka 745 i aminokiselinskog ostatka 746 iz FVIII, i treći XTEN je vezan za C-terminus od FVIII. Soj miševa korišćen za primenu FVIII-XTEN varijanti je DKO soj miševa koji eksprimira D'D3 domene. Slika 9B prikazuje PK profil FVIII-XTEN sa tri XTEN umetanja. FVIII-XTEN (1900/B/CT) varijanta je primenjena bilo FVIII/VWF DKO miševima ili HemA miševima. Upoređuje se poluživot FVIII-XTEN (1900/B/CT).
Slika 10. FVIII aktivnost FVIIIFc (šuplji trougao), FVIII169: Fc (ispunjeni krug) i FVIII 169:VWF31 (šuplji trougao) u plazmi DKO miševa mereno hromogenom analizom. FVIII: Fc sadrži dvolančani FVIII (teški i laki lanac) spojen za Fc dimer (tj. monomer-dimer hibrid). FVIII169 je opisan iznad (sadrži AE288 u B domenu, neposredno nizvodno od aminokiseline 745 koja odgovara zreloj FVIII sekvenci). FVIII169: Fc sadrži FVIII169 spojen za Fc dimer. FVIII169:VWF31 sadrži VWF31 pored Fc dimera, FVIII169 spojen za prvi Fc region i VWF31 spojen za drugi Fc region, gde prvi Fc region i drugi Fc region formiraju kovalentnu vezu, npr., jedna ili više disulfidnih veza.
Slika 11. Efekti Fc, XTEN i VWF-D'D3 fragmenata na produžetak poluživota FVIII. BDD-FVIII (REFACTO®) (kvadrat), FVIIFc (krug), FVIII169/Fc (trougao) i FVIII169/VWF031 (obrnuti trougao) su primenjeni FVIII i VWF dvostrukim knockout (DKO) miševima. FVIII aktivnost merena je hromogenom analizom, i poluživot je izračunat korišćenjem WinNonlin-Phoenix programa. X osa pokazuje vreme, i Y osa pokazuje FVIII aktivnost u plazmi u mU/mL.
Slika 12A-C. Efekti različitih XTEN u rFVIII-XTEN/VWF heterodimeru kod HemA miševa. na Slici 12A prikazana je FVIII aktivnost u plazmi normalizovana na petominutne vrednosti (%) dva XTEN koja su umetnuta neposredno nizvodno od ostataka 1900 i 1656, što odgovara zreloj FVIII sekvenci (tj. FVIII-195 (dvolančani
1
FVIII izoform) i FVIII-199 (jednolančani FVIII izoform)), u poređenju sa FVIII-169 koji sadrži XTEN neposredno nizvodno od ostatka 745, što odgovara zreloj FVIII sekvenci. FVIII-169/VWF-031 (ispunjeni krug), FVIII-199/VWF-031 (ispunjen kvadrat) i FVIII-195/VWF031 (šuplji kvadrat) su primenjeni kod HemA miševa za merenje aktivnosti FVIII plazme. Slika 12B prikazuje efekat produženja poluživota drugog XTEN umetanja neposredno nizvodno od ostataka 403 (A2 domen) i 745 (B domen) (tj., FVIII-203) i ostataka 745 (B domen) i 1900 (A3 domen) (FVIII-204), što odgovara zreloj FVIII sekvenci u poređenju sa FVIII-169 (XTEN umetanje samo u B domenu). FVIII-204/VWF031 (ispunjeni trougao), FVIII-169/VWF-031 (ispunjeni krug), FVIII-203/VWF-031 (ispunjen kvadrat) i scBDD-FVIII (šuplji dijamant) su primenjeni na HemA miševima. X osa pokazuje FVIII aktivnost u plazmi normalizovanu na petominutnu vrednost (%), i Y osa prikazuje vreme u satima. Slika 12C prikazuje efekat produženja poluživota od strane dva XTEN umetanja neposredno nizvodno od ostataka 18 (A1 domen) i 745 (B domen) (tj. FVIII-205) u poređenju sa FVIII-169 (jedno XTEN umetanje u B domenu) i jednolančanim FVIII bez Fc regiona ili bilo kojih XTEN (tj. FVIII-207). Slika 12C dodatno prikazuje efekat produženja poluživota tri XTEN umetanja uključenih neposredno nizvodno od ostataka 26 (A1 domen), 1656 (A3 domen) i 1900 (A3 domen) (tj. FVIII-201) u poređenju sa FVIII-169 (jedan XTEN umetanje neposredno nizvodno od ostatka 745).. FVIII-205/VWF-031 (ispunjeni kvadrat), FVIII-201/VWF-031 (obrnuti trougao), FVIII-169/VWF-031 (ispunjeni krug) i FVIII-207 (šuplji dijamant) su primenjeni HemA miševima. FVIII aktivnost u plazmi normalizovana na petominutne vrednosti (%) (X osa) je merena tokom vremena u satima (Y osa).
Slika 13. FVIII aktivnost rFVIII-XTEN/VWF-XTEN heterodimera kod FVIII/VWF DKO miševa. FVIII aktivnost uzoraka plazme analizirana je FVIII hromogenim testom, i prikazana je regresiona kriva FVIII aktivnosti u plazmi (X osa) kao funkcija vremena (Y osa). FVIII-155 (scFVIIIFc bez ikakvih XTEN) ko-eksprimiran je sa VWF-034 (VWF-Fc sa AE 288 XTEN plus veznik razdvojiv trombinom od 35 ostataka). Poluživot FVIII-155/VWF-034 je upoređen sa onim od FVIII-169/VWF-031, koji ima AE 288 XTEN umetnut u spoj domena B (neposredno nizvodno od ostatka 745, što odgovara zrelom FVIII polipeptidu) od FVIII.
Slika 14A-H. Šematski dijagrami različitih rFVIII-XTEN/VWF konstrukta. Ovi konstrukti su takođe opisani u drugim odeljcima ovde. Slika 14A prikazuje jednolančani FVIII protein sa izbrisanim B domenom (na nekim mestima ovde
1
označen kao scBDD-FVIII). SCBDD-FVIII konstrukti sadrže dve supstitucije na ostacima 1645 i 1648 od Arg do Ala. Slika 14B prikazuje dva konstrukta polipeptidnog lanca (FVIII155/VWF031), prvi lanac koji sadrži jednolančani FVIII povezan sa Fc regionom bez ikakvog XTEN i drugi lanac koji sadrži VWF D'D3 fragment povezan sa Fc regionom. Ovaj konstrukt se koristi kao kontrola. Slika 14C prikazuje dva konstrukta polipeptidnog lanca (FVIII199/VWF031), prvi lanac koji sadrži jednolančani FVIII vezan za Fc region, u kom je prvi XTEN umetnut neposredno nizvodno od ostatka 1900, što odgovara zreloj FVIII sekvenci, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od ostatka 1656, što odgovara zreloj FVIII sekvenci i drugog lanca koji sadrži VWF D'D3 fragment povezan sa Fc regionom. Slika 14D prikazuje dva konstrukta polipeptidnog lanca (FVIII201/VWF031), prvi lanac koji sadrži jednolančani FVIII protein povezan sa Fc regionom, u kom je prvi XTEN umetnut neposredno nizvodno od ostatka 26, što odgovara zreloj FVIII sekvenci, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od ostatka 1656, što odgovara zreloj FVIII sekvenci, i treći XTEN je umetnut neposredno nizvodno od ostatka 1900, što odgovara zreloj FVIII sekvenci, i drugi lanac koji sadrži VWF D'D3 fragment povezan sa Fc regionom. Slika 14E prikazuje dva konstrukta polipeptidnog lanca (FVIII169/VWF031), prvi lanac koji sadrži jednolančani FVIII protein povezan sa Fc regionom, u koji je XTEN umetnut neposredno nizvodno od ostatka 745 (označen kao „B“), što odgovara zreloj FVIII sekvenci, i drugi lanac koji sadrži VWF D'D3 fragment povezan sa Fc regionom. Slika 14F prikazuje dva konstrukta polipeptidnog lanca (FVIII203/VWF031), prvi lanac koji sadrži jednolančani FVIII protein, u koji je prvi XTEN umetnut kod ostatka 745 („B“), što odgovara zreloj FVIII sekvenci, i drugi XTEN je umetnut kod ostatka 1900, što odgovara zreloj FVIII sekvenci, i drugi lanac koji sadrži VWF D'D3 fragment povezan sa Fc regionom. Slika 14G prikazuje dva konstrukta polipeptidnog lanca (FVIII204/VWF031), prvi lanac koji sadrži jednolančani FVIII protein vezan za Fc region, u kom je prvi XTEN umetnut neposredno nizvodno od ostatka 403, što odgovara zreloj FVIII sekvenci, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od ostatka 745 („B“), što odgovara zreloj FVIII sekvenci, i drugi lanac koji sadrži VWF D'D3 fragment povezan sa Fc regionom. Slika 14H prikazuje dva konstrukta polipeptidnog lanca (FVIII205/VWF031), gde prvi lanac sadrži jedan lanac FVIII, u kom je prvi XTEN umetnut neposredno nizvodno od ostatka 18, što odgovara zreloj FVIII sekvenci, i drugi XTEN je umetnut neposredno nizvodno od ostatka 745 („B“), što odgovara
2
zreloj FVIII sekvenci, i drugi lanac koji sadrži VWF D'D3 fragment povezan sa Fc regionom.
Slika 15. FVIII aktivnost rFVIII-XTEN/VWF i BDD-FVIII kod FVIII/VWF DKO miševa. FVIII aktivnost uzoraka plazme analizirana je FVIII hromogenim testom, i prikazana je regresiona kriva FVIII aktivnosti u plazmi (X osa) kao funkcija vremena (Y osa). Poluživot rFVIII-XTEN/VWF (FVIII-205/VWF-031) je upoređen sa onim od BDD-FVIII i rFVIIIFc.
Slika 16. Efikasnost FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc heterodimera kod HemA miševa korišćenjem modela krvarenja iz repa. Model krvarenja iz repa HemA miševa korišćen je za poređivanje efikasnosti FVIII169/VWF034, FVIII205/VWF031 i BDD-FVIII. Srednji gubitak krvi u ml za 200 IU/kg FVIII169/VWF034 i FVIII205/VWF031 poredi se sa 200 IU/kg BDD-FVIII, 65 IU/kg BDD-FVIII, 20 IU/kg BDD-FVIII i nosačem.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
DEFINICIJE
[0037] Treba napomenuti da se oblici jednine odnose takođe i na oblike množine; na primer, „nukleotidna sekvenca“ se podrazumeva da predstavlja jednu ili više nukleotidnih sekvenci. Stoga, izrazi „jedan“, „jedan ili više“ i „barem jedan“ mogu se ovde koristiti naizmenično.
[0038] Izraz „polinukleotid“ ili „nukleotid“ treba da obuhvati singularnu nukleinsku kiselinu kao i više nukleinskih kiselina, i odnosi se na izolovani molekul ili konstrukt nukleinske kiseline, npr., mesindžer RNK (mRNK) ili plazmidna DNK (pDNK). U nekim otelotvorenjima, polinukleotid sadrži konvencionalnu fosfodiestersku vezu ili nekonvencionalnu vezu (npr., amidna veza, kakva se nalazi u peptidnim nukleinskim kiselinama (PNK). Izraz „nukleinska kiselina“ odnosi se na bilo koji ili više segmenata nukleinske kiseline, npr., fragmenti DNK ili RNK, prisutni u polinukleotidu. Pod „izolovanom“ nukleinskom kiselinom ili polinukleotidom misli se na molekul nukleinske kiseline, DNK ili RNK, koji je uklonjen iz nativnog okruženja. Na primer, rekombinantni polinukleotid koji kodira polipeptid Faktora VIII sadržan u vektoru smatra se izolovanim za potrebe predmetnog pronalaska. Dalji primeri izolovanog polinukleotida uključuju rekombinantne polinukleotide održavane u heterolognim ćelijama domaćina ili su prečišćeni (delimično ili pretežno) od drugih polinukleotida u rastvoru. Izolovani molekuli RNK uključuju in vivo ili in vitro RNK transkripti polinukleotida predmetnog pronalaska. Izolovani polinukleotidi ili nukleinske kiseline prema predmetnom pronalasku dalje uključuju takve molekule proizvedene sintetički. Pored toga, polinukleotid ili nukleinska kiselina mogu da sadrže regulatorne elemente kao što su promoteri, pojačivači, mesta vezivanja ribozoma ili signale za završavanje transkripcije.
[0039] Kako se ovde koristi, „kodirajući region“ ili „kodirajuća sekvenca“ je deo polinukleotida koji se sastoji od kodona koji se mogu prevesti u aminokiseline. Iako se „zaustavni kodon“ (TAG, TGA ili TAA) obično ne prevodi u aminokiselinu, može se smatrati da je deo kodirajućeg regiona, ali bilo koja bočna sekvenca, na primer promoteri, mesta vezivanja ribozoma, transkripcioni terminatori, introni i slično, nisu deo kodirajućeg regiona. Granice kodirajućeg regiona obično su određene početnim kodonom na 5' terminusu, koji kodira amino terminus rezultujućeg polipeptida, i translacionim zaustavnim kodonom na 3' terminusu, koji kodira karboksilni terminus rezultujućeg polipeptida. Dva ili više kodirajućih regiona predmetnog pronalaska mogu biti prisutni u jednom polinukleotidnom konstruktu, npr., na jednom vektoru, ili u odvojenim polinukleotidnim konstruktima, npr., na zasebnim (različitim) vektorima. Sledi, dakle, da jedan vektor može da sadrži samo jedan kodirajući region, ili sadrži dva ili više regiona, npr., jedan vektor može odvojeno kodirati vezujući domen-A i vezujući domen-B kao što je opisano u nastavku. Pored toga, vektor, polinukleotid ili nukleinska kiselina predmetnog pronalaska može da kodira heterologne kodirajuće regione, bilo spojene ili razdvojene od nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen pronalaska. Heterologni regioni kodiranja uključuju, bez ograničavanja, specijalizovane elemente ili motive, kao što su sekretorni signalni peptid ili heterologni funkcionalni domen.
[0040] Određeni proteini koje luče ćelije sisara povezani su sa sekretornim signalnim peptidom koji se razdvaja iz zrelog proteina nakon što je pokrenut izvoz rastućeg lanca proteina kroz grubi endoplazmatični retikulum. Stručnjaci u ovoj oblasti su svesni da su signalni peptidi obično spojeni sa N-terminusom polipeptida i da se razdvajaju iz celog ili polipeptida „pune dužine“ kako bi se stvorio izlučeni ili „zreli“ oblik polipeptida. U nekim otelotvorenjima, nativni signalni peptid ili funkcionalni derivat te sekvence koji zadržava sposobnost usmeravanja lučenja polipeptida koji je operativno povezan sa njim. Alternativno, heterologni signalni peptid sisara, npr., može se koristiti plazminogeni aktivator ljudskog tkiva (TPA) ili mišji B-glukuronidazni signalni peptid, ili njegov funkcionalni derivat.
[0041] Izraz „nizvodno“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja je smeštena 3' u odnosu na referentnu nukleotidnu sekvencu. U nekim otelotvorenjima, nizvodne nukleotidne sekvence se odnose na sekvence koje prate početnu tačku transkripcije. Na primer, kodon početka translacije gena smešten je nizvodno od početnog mesta transkripcije.
[0042] Izraz „uzvodno“ odnosi se na nukleotidnu sekvencu koja je smeštena 5' u odnosu na na referentnu nukleotidnu sekvencu. U nekim otelotvorenjima, uzvodne nukleotidne sekvence odnose se na sekvence koje su smeštene na 5' strani kodirajućeg regiona ili početne tačke transkripcije. Na primer, većina promotera smeštena je uzvodno od početnog mesta transkripcije.
[0043] Kako se ovde koristi, izraz „regulatorni region“ odnosi se na nukleotidne sekvence smeštene uzvodno (5' nekodirajuće sekvence), unutar ili nizvodno (3' nekodirajuće sekvence) od kodirajućeg regiona, i koje utiču na transkripciju, obradu RNK, stabilnost ili translaciju pridružene regioni kodiranja. Regulatorni regioni mogu da uključuju promotere, liderske sekvence translacije, introne, sekvence prepoznavanja poliadenilacije, mesta za obradu RNK, mesta vezivanja efektora i strukture matičnih petlji. Ako je kodirajući region namenjena za eksprimiranje u eukariotskoj ćeliji, poliadenilacioni signal i sekvenca prekida transkripcije obično se nalaze 3' u odnosu na kodirajuću sekvenci.
[0044] Polinukleotid koji kodira genski proizvod, npr., polipeptid, može da sadrži promoter i/ili druge kontrolne elemente za transkripciju ili prevod, koji su operativno povezani sa jednim ili više kodirajućih regiona. U operativnom povezivanju kodirajućeg regiona za genski proizvod, npr., polipeptid, povezan je sa jednim ili više regulatornih regiona na takav način da stavi eksprimiranje genskog proizvoda pod uticaj ili kontrolu regulacionog regiona. Na primer, kodirajući region i promoter su „operativno povezani“ ako indukcija funkcije promotera rezultuje transkripcijom mRNK koja kodira genski proizvod kodiran od strane kodirajućeg regiona, i ako priroda veze između promotera i kodirajućeg regiona ne ometa sposobnost promotera da usmerava eksprimiranje genskog proizvoda ili ometa sposobnost transkripcije DNK obrazaca. Ostali elementi za kontrolu transkripcije, pored promotera, na primer pojačivači, operateri, represori i signali završavanja transkripcije, mogu se takođe operativno povezati sa kodirajućim regionom kako bi usmerili eksprimiranje genskog proizvoda.
2
[0045] Stručnjacima su poznati različiti regioni za kontrolu transkripcije. Oni uključuju, bez ograničenja, regione za kontrolu transkripcije koji funkcionišu u ćelijama kičmenjaka, kao što su, ali bez ograničavanja na njih, segmenti promotera i pojačivača iz citomegaloviruusa (neposredni rani promoter, u kombinaciji sa intronom-A), simijan virusa 40 (rani promoter) i retrovirusa (kao što je Rous sarkom virus). Ostali regioni za kontrolu transkripcije uključuju one izvedene iz gena kičmenjaka kao što su aktin, protein toplotnog šoka, goveđi hormon rasta i zečji β-globin, kao i druge sekvence koje mogu da kontrolišu eksprimiranje gena u eukariotskim ćelijama. Dodatni pogodni regioni za kontrolu transkripcije uključuju promotere i pojačivače specifične za tkivo, kao i promotere indukovane limfokinom (npr., promoteri indukovani interferonima ili interleukinima).
[0046] Slično tome, stručnjacima su poznati različiti elementi kontrole translacije. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na mesta za vezivanje ribozoma, kodone inicijacije translacije i terminacione kodone i elemente izvedene iz pikornavirusa (posebno interno mesto ulaska u ribozome, ili IRES, koji se takođe nazivaju CITE sekvenca).
[0047] Izraz „eksprimiranje“, kako se ovde koristi, odnosi se na postupak u kom polinukleotid proizvodi genski proizvod, na primer, RNK ili polipeptid. To uključuje neograničenu transkripciju polinukleotida u mesindžer RNK (mRNK), transfernoj RNK (tRNK), RNK male ukosnice (shRNK), maloj interferirajućoj RNK (siRNK) ili bilo kom drugom RNK proizvodu, i translaciju mRNK u polipeptid. Eksprimiranje proizvodi „genski proizvod“. Kako se ovde koristi, genski proizvod može biti ili nukleinska kiselina, npr., mesindžer RNK proizvedena transkripcijom gena, ili polipeptid koji je preveden iz transkripta. Ovde opisani genski proizvodi dalje uključuju nukleinske kiseline sa posttranskripcijskim modifikacijama, npr., poliadenilacija ili splajsovanje, ili polipeptidi sa posttranslacijskim modifikacijama, npr., metilacija, glikozilacija, dodavanje lipida, povezanost sa drugim podjedinicama proteina ili proteolitičko razdvajanje.
[0048] „Vektor“ se odnosi na svaki agens za kloniranje i/ili prenos nukleinske kiseline u ćeliju domaćina. Vektor može biti replikon na koji se može vezati drugi segment nukleinske kiseline tako da dolazi do replikacije vezanog segmenta. „Replikon“ se odnosi na bilo koji genetski element (npr., plazmid, fag, kozmid, hromozom, virus) koji funkcioniše kao autonomna jedinica replikacije in vivo, tj. sposoban je za replikaciju pod sopstvenom kontrolom. Izraz „vektor“ uključuje i virusni i nevirusni nosač za unošenje nukleinske kiseline u ćeliju in vitro, ex vivo ili in vivo. U struci je poznat i korišćen veliki broj vektora, uključujući, na primer, plazmide, modifikovane eukariotske viruse ili modifikovane bakterijske viruse. Umetanje polinukleotida u pogodan vektor može se postići vezivanjem odgovarajućih polinukleotidnih fragmenata u odabrani vektor koji ima komplementarne kohezivne terminuse.
[0049] Vektori mogu biti dizajnirani tako da kodiraju selektivne markere ili reportere koji pružaju izbor ili identifikaciju ćelija koje su ugradile vektor. Eksprimiranje selektivnih markera ili reportera omogućava identifikaciju i/ili selekciju ćelija domaćina koje sadrže i eksprimiraju ostale kodirajuće regione sadržane u vektoru. Primeri selektivnih marker gena koji su poznati i korišćeni u struci uključuju: gene koji pružaju rezistenciju na ampicilin, streptomicin, gentamicin, kanamicin, higromicin, bialafos herbicid, sulfonamid i slično; i geni koji se koriste kao fenotipski markeri, tj. antocijaninski regulatorni geni, izopentanil transferazni gen i slično. Primeri reportera poznatih i korišćeni u struci uključuju: luciferazu (Luc), zeleni fluorescentni protein (GFP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT), -galaktozidazu (LacZ), -glukuronidazu (Gus) i slično. selekcioni markeri takođe se mogu smatrati reporterima.
[0050] Izraz „plazmid“ odnosi se na ekstra hromozomski element koji često nosi gen koji nije deo centralnog metabolizma ćelije, i obično je u obliku kružnih dvolančanih molekula DNK. Takvi elementi mogu biti autonomno replicirajuće sekvence, sekvence za integraciju genom, fagne ili nukleotidne sekvence, linearne, kružne ili super-uvijene, jednolančane ili dvolančane DNK ili RNK, izvedene iz bilo kog izvora, u kojima je sekvenca nukleotidnih sekvenci spojen ili rekombinovani u jedinstvenu konstrukciju koja je sposobna da u ćeliju unese fragment promotera i DNK sekvencu za izabrani genski proizvod zajedno sa odgovarajućom 3' neprevedenom sekvencom.
[0051] Eukariotski virusni vektori koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, adenovirusne vektore, retrovirusne vektore, adeno-pridružene virusne vektore i poksvirus, npr., vektori vakcinija virusa, bakulovirusni vektori ili herpesvirusni vektori. Ne-virusni vektori uključuju plazmide, lipozome, lipidome koji su naelektrisani (citofektini), DNK-protein komplekse i biopolimere.
2
[0052] „Klonirajući vektor“ odnosi se na „replikon“, koji je jedinična dužina nukleinske kiseline koja se replicira sekvencijalno i koja sadrži poreklo replikacije, kao što su plazmid, fag ili kosmid, na koji može biti vezan drugi segment nukleinske kiseline, tako da dođe do replikacije priključenog segmenta. Određeni vektori kloniranja mogu se replicirati u jednoj ćelijskoj vrsti, npr., bakteriji, a eksprimirati u drugoj, npr., eukariotskoj ćeliji. Klonirani vektori obično sadrže jednu ili više sekvenca koje se mogu koristiti za odabir ćelija koje sadrže vektor i/ili jedno ili više višestrukih mesta kloniranja za umetanje nukleinskih kiselina od interesa.
[0053] Izraz „vektor eksprimiranja“ odnosi se na nosač dizajniran da omogući eksprimiranje umetnute sekvence nukleinske kiseline posle umetanja u ćeliju domaćina. Umetnuta sekvenca nukleinske kiselina smeštena je u operativnoj vezi sa regulatornim regionima kao što je opisano iznad.
[0054] Vektori se unose u ćelije domaćine postupcima dobro poznatim u struci, npr., transfekcija, elektroporacija, mikroinjekcija, transdukcija, fuzija ćelija, DEAE dekstran, taloženje kalcijum-fosfata, lipofekcija (fuzija lizozoma), upotreba genskog pištolja ili transportera DNK vektora.
[0055] „Kultura“, „kultivisanje“ i „uzgajanje“, kako se ovde koristi, znači inkubiranje ćelija pod in vitro uslovima koji omogućavaju rast ili deljenje ćelija ili održavanje ćelija u živom stanju. „Kultivisane ćelije“, kako se ovde koristi, označavaju ćelije koje se razmnožavaju in vitro.
[0056] Kako se ovde koristi, izraz „polipeptid“ treba da obuhvati pojedinačni „polipeptid“ kao i množinu „polipeptida“, i odnosi se na molekul sastavljen od monomera (aminokiseline) linearno povezanih amidnim vezama (takođe poznate kao peptidne veze). Izraz „polipeptid“ odnosi se na bilo koji lanac ili lance od dve ili više aminokiselina, i ne odnosi se na određenu dužinu proizvoda. Tako su peptidi, dipeptidi, tripeptidi, oligopeptidi, „protein“, „lanac aminokiselina“, ili bilo koji drugi izraz koji se koristi za označavanje lanca ili lanaca sa dve ili više aminokiselina, uključeni u definiciju „polipeptida“, i izraz „polipeptid“ može se upotrebiti umesto bilo kog od ovih izraza, ili ih može izmeniti. Izraz „polipeptid“ se takođe odnosi na produkte modifikacija polipeptida posle eksprimiranja, uključujući bez ograničenja glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju, amidaciju, derivatizaciju
2
poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičko razdvajanje ili modifikaciju neprirodno nastalih aminokiselina. Polipeptid može biti dobijen iz prirodnog biološkog izvora ili proizveden rekombinantnom tehnologijom, ali nije nužno preveden iz naznačene sekvence nukleinske kiseline. Može se proizvesti na bilo koji način, uključujući hemijsku sintezu.
[0057] „Izolovani“ polipeptid ili njegov fragment, varijanta ili derivat odnosi se na polipeptid koji nije u svom prirodnom okruženju. Nije potreban određeni nivo prečišćavanja. Na primer, izolovani polipeptid može se jednostavno ukloniti iz nativnog ili prirodnog okruženja.
Rekombinantno proizvedeni polipeptidi i proteini eksprimirani u ćelijama domaćina smatraju se izolovanim za svrhe pronalaska, kao što su urođeni ili rekombinantni polipeptidi koji su odvojeni, fragmentisani ili delimično ili pretežno prečišćeni bilo kojom pogodnom tehnikom.
[0058] Takođe su obuhvaćeni ovim pronalaskom fragmenti ili varijante polipeptida i bilo koje njihove kombinacije. Izraz „fragment“ ili „varijanta“ kada se odnosi na domene koji se vezuju za polipeptide ili vezujuće molekule predmetnog pronalaska uključuju bilo koji polipeptid koji zadržava bar neka svojstva (npr., FcRn afinitet vezivanja za FcRn vezujući domen ili Fc varijantu, koagulaciona aktivnost za FVIII varijantu ili FVIII aktivnost vezivanja za VWF fragment) referentnog polipeptida. Fragmenti polipeptida uključuju proteolitičke fragmente, kao i fragmente brisanja, pored specifičnih fragmenata antitela koji su ovde razmatrani, ali ne uključuju prirodni polipeptid pune dužine (ili zreli polipeptid). Varijante domena koji vezuju polipeptide ili molekuli vezivanja predmetnog pronalaska uključuju fragmente kao što je opisano iznad, i takođe polipeptide sa izmenjenim aminokiselinskim sekvencama zbog aminokiselinskih supstitucija, brisanja ili umetanja. Varijante mogu biti one koje se javljaju i koje se ne javljaju u prirodi. Varijante koje se ne javljaju u prirodi mogu se proizvesti korišćenjem poznatih tehnika mutageneze. Varijantni polipeptidi mogu da sadrže konzervativne ili nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, brisanja ili dodavanja.
[0059] Izraz „VWF fragment“ ili „VWF fragmenti“ koji se ovde koristi označava bilo koji VWF fragment koji deluje u interakciji sa FVIII i zadržava najmanje jedno ili više svojstava koja se obično pružaju FVIII pomoću VWF pune dužine, npr., sprečavanje prerane aktivacije na FVIIIa, sprečavanje preuranjene proteolize, sprečavanje povezanosti sa fosfolipidnim membranama koje mogu dovesti do prevremenog klirensa, sprečavanje vezivanja za FVIII receptore klirensa koji mogu da vezuju goli FVIII, ali ne i VWF-vezani FVIII, i/ili
2
stabilizovanje interakcije teškog lanca i lakog lanca FVIII.
[0060] „Konzervativna aminokiselinska supstitucija“ je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom sa sličnim bočnim lancem. Porodice aminokiselinskih ostataka sa sličnim bočnim lancima su definisane u struci, uključujući bazne bočne lance (npr., lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr., aspartanska kiselina, glutaminska kiselina), ne-naelektrisane polarne bočne lance (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance (npr., treonin, valin, izoleucin) i aromatične bočne lance (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Stoga, ako je aminokiselina u polipeptidu zamenjena drugom aminokiselinom iz iste porodice bočnih lanaca, supstitucija se smatra konzervativnom. U drugom otelotvorenju, aminokiselinska sekvenca može se konzervativno zameniti strukturno sličnom sekvencom koji se razlikuje po redosledu i/ili sastavu članova porodice bočnih lanaca.
[0061] Kao što je poznato u struci, „identičnost sekvence“ između dva polipeptida je određena poređenjem aminokiselinske sekvence jednog polipeptida sa sekvencom drugog polipeptida. Kada se ovde razmatra, da li je neki određeni polipeptid najmanje oko 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili 100% identičan drugom polipeptidu može se utvrditi korišćenjem postupaka i računarskih programa/softvera poznatih u struci, kao što je, ali bez ograničavanja na, BESTFIT program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711). BESTFIT koristi algoritam lokalne homologije od Smith i Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), kako bi se pronašao najbolji segment homologije između dve sekvence. Kada se koristi BESTFIT ili bilo koji drugi program za poravnavanje sekvenci kako bi se utvrdilo da li je određena sekvenca, na primer, 95% identična referentnoj sekvenci u skladu sa ovim pronalaskom, parametri se postavljaju, naravno, tako da se procenat identičnosti izračunava preko pune dužina referentne polipeptidne sekvence, i dozvoljene su razlike u homologiji do 5% ukupnog broja aminokiselina u referentnoj sekvenci.
[0062] Kako se ovde koristi, „aminokiselina koja odgovara“ ili „ekvivalentna aminokiselina“ u VWF sekvenci ili FVIII proteinskoj sekvenci identifikuje se poravnanjem kako bi se maksimizovala identičnost ili sličnost između prve VWF ili FVIII sekvence i
2
druge VWF ili FVIII sekvence. Broj korišćen za identifikaciju ekvivalentne aminokiseline u drugoj VWF ili FVIII sekvenci zasnovan je na broju korišćenom za identifikaciju odgovarajuće aminokiseline u prvoj VWF ili FVIII sekvenci.
[0063] Kako se ovde koristi, izraz „mesto umetanja“ odnosi se na položaj u FVIII polipeptidu, ili njegovom fragmentu, varijanti ili njenom derivatu, koji je neposredno uzvodno od položaja u koji se može umetnuti heterologni deo. „Mesto umetanja“ je određeno kao broj, gde je to broj aminokiseline u zrelom nativnom FVIII (SEQ ID NO: 4) kom mesto umetanja odgovara, koje je neposredno N-terminalno prema položaju umetanja. Na primer, izraz „a3 sadrži XTEN na mestu umetanja koji odgovara aminokiselini 1656 od SEQ ID NO: 4“ ukazuje da je heterologni deo smešten između dve aminokiseline koje odgovaraju aminokiselini 1656 i aminokiselini 1657 od SEQ ID NO: 4.
[0064] Izraz „neposredno nizvodno od aminokiseline“, kako se ovde koristi, odnosi se na položaj neposredno pored terminalne karboksilne grupe aminokiseline. Slično tome, izraz „neposredno uzvodno od aminokiseline“ odnosi se na položaj neposredno pored terminalne aminske grupe aminokiseline. Stoga se izraz „između dve aminokiseline mesta umetanja“, kako se ovde koristi, odnosi na položaj u kom je XTEN ili bilo koji drugi polipeptid umetnut između dve susedne aminokiseline. Stoga se izrazi „umetnuti neposredno nizvodno od aminokiseline“ i „umetnuti između dve aminokiseline mesta umetanja“ upotrebljavaju sinonimno sa „umetnuti na mestu umetanja".
[0065] Izrazi „umetnuti“, „umetnut“, „umetnut u“ ili gramatički povezani pojmovi, kako se ovde koristi, odnose se na položaj XTEN u himernom polipeptidu u odnosu na analogni položaj nativnog zrelog ljudskog FVIII. Kako se ovde koriste, izrazi se odnose na karakteristike rekombinantnog FVIII polipeptida u odnosu na matični zreli ljudski FVIII i ne označavaju, podrazumevaju niti kao zaključak nameću bilo koji postupak ili proces kojim je proizveden himerni polipeptid. Na primer, u vezi sa ovde navedenim himernim polipeptidom, izraz „XTEN je umetnut neposredno nizvodno od ostatka 745 od FVIII polipeptida“ znači da himerni polipeptid sadrži XTEN neposredno nizvodno od aminokiseline koja odgovara aminokiselini 745 nativnog zrelog ljudskog FVIII, npr., ograničen aminokiselinama koje odgovaraju aminokiselinama 745 i 746 matičnog zrelog ljudskog FVIII.
[0066] „Fuzija“ ili „himerni“ protein sadrži prvu aminokiselinsku sekvencu koja je povezana
2
sa drugom aminokiselinskom sekvencom sa kojom nije prirodno povezana. Aminokiselinske sekvence koje normalno postoje u odvojenim proteinima mogu se spojiti u fuzioni polipeptid, ili se aminokiselinske sekvence koje normalno postoje u istom proteinu mogu smestiti u novi raspored u fuzionom polipeptidu, npr., fuzija domena Faktora VIII pronalaska sa Ig Fc domenom. fuzioni protein nastaje, na primer, hemijskom sintezom ili stvaranjem i translacijom polinukleotida u kom su peptidne regioni kodirane u željenom odnosu. Himerni protein može dalje da sadrži drugu aminokiselinsku sekvencu koja je povezana sa prvom aminokiselinskom sekvencom kovalentnom, nepeptidnom vezom ili nekovalentnom vezom.
[0067] Kako se ovde koristi, izraz „poluživot“ se odnosi na biološki poluživot određenog polipeptida in vivo. Poluživot može biti predstavljen vremenom potrebnim da se polovina količine koja se primenjuje pacijentu očisti iz cirkulacije i/ili drugih tkiva životinje. Kada je kriva klirensa datog polipeptida konstruisana kao funkcija vremena, kriva je obično dvofazna sa brzom α-fazom i dužom β-fazom. α-faza obično predstavlja ravnotežu primenjenog Fc polipeptida između intra- i van-vaskularnog prostora, i delom je određena veličinom polipeptida. β-faza obično predstavlja katabolizam polipeptida u intravaskularnom prostoru. U nekim otelotvorenjima, FVIII i himerni proteini koji sadrže FVIII su monofazni, te stoga nemaju alfa fazu, već samo jednu beta fazu. Zbog toga se u određenim otelotvorenjima izraz poluživot kako se ovde koristi odnosi na poluživot polipeptida u β-fazi. Tipični poluživot βfaze ljudskog antitela kod ljudi je 21 dan.
[0068] Izraz „povezan“ kako se ovde koristi, odnosi se na prvu aminokiselinsku sekvencu ili nukleotidnu sekvencu kovalentno ili nekovalentno spojenu sa drugom aminokiselinskom sekvencom ili nukleotidnom sekvencom, respektivno. Prva aminokiselinska ili nukleotidna sekvenca može se direktno pridružiti ili postaviti do druge aminokiselinske ili nukleotidne sekvence ili alternativno intervenišuća sekvenca se može kovalentno pridružiti prvu sekvencu drugoj sekvenci. Izraz „povezan“ podrazumeva ne samo fuziju prve aminokiselinske sekvence sa drugom aminokiselinskom sekvencom na C-terminusu ili N-terminusu, već takođe uključuje umetanje čitave prve aminokiselinske sekvence (ili druge aminokiselinske sekvence) u bilo koje dve aminokiseline u drugoj aminokiselinskoj sekvenci (ili prvoj aminokiselinskoj sekvenci, respektivno). U jednom otelotvorenju, prva aminokiselinska sekvenca može biti povezana sa drugom aminokiselinskom sekvencom peptidnom vezom ili veznikom. Prva nukleotidna sekvenca može se povezati sa drugom nukleotidnom sekvencom fosfodiesterskom vezom ili veznikom. Veznik može biti peptid ili polipeptid (za polipeptidne lance) ili nukleotid ili nukleotidni lanac (za nukleotidne lance) ili bilo koja hemijska grupa (i za polipeptidne i za polinukleotidne lance). Izraz „povezan“ je takođe naznačen crticom (-).
[0069] Kako se ovde koristi, izraz „povezan sa“ odnosi se na kovalentnu ili nekovalentnu vezu formiranu između prvog aminokiselinskog lanca i drugog aminokiselinskog lanca. U jednom otelotvorenju, izraz „povezan sa“ označava kovalentnu, nepeptidnu vezu ili nekovalentnu vezu. Ova povezanost može biti označeno sa dve tačke, tj. (:) U drugom otelotvorenju, to označava kovalentnu vezu koja nije peptidna. Na primer, aminokiselina cistein sadrži tiolnu grupu koja može da formira disulfidnu vezu ili most sa tiolnom grupom na drugom cisteinskom ostatku. U većini IgG molekula koji se nalaze u prirodi, CH1 i CL regioni povezani su disulfidnom vezom, i dva teška lanca povezana su sa dve disulfidne veze na položajima koje odgovaraju 239 i 242 pomoću Kabat sistema numerisanja (položaj 226 ili 229, EU sistem numerisanja). Primeri kovalentnih veza uključuju, ali nisu ograničeni na, peptidnu vezu, metalnu vezu, vodoničnu vezu, disulfidnu vezu, sigma vezu, pi vezu, delta vezu, glikozidnu vezu, agnostičku vezu, savijenu vezu, dipolarnu vezu, Pi zadnju vezu, dvostruku vezu, trostruku vezu, četvorostruku vezu, petostruku vezu, šestostruku vezu, konjugaciju, hiperkonjugaciju, aromatičnost, haptičnost ili anti-vezivanje. Neograničavajući primeri nekovalentne veze uključuju jonsku vezu (npr., katjon-pi vezu ili slanu vezu), metalnu vezu, vodoničnu vezu (npr., di-vodonična veza, di-vodonični kompleks, vodonična veza sa niskom barijerom ili simetrična vodonična veza), van der Walls sila, Londonska disperziona sila, mehanička veza, halogena veza, aurofilnost, interkalacija, slaganje, entropna sila ili hemijska polarnost.
[0070] Izraz „monomer-dimer hibrid“, kako se ovde koristi, odnosi se na himerni protein koji sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, koji su međusobno povezani disulfidnom vezom, gde prvi lanac sadrži faktor koagulacije, npr., Faktor VIII, i prvi Fc region i drugi lanac obuhvata, značajno se sastoji ili sadrži drugi Fc region bez faktora koagulacije. Monomer-dimer hibridni konstrukt je stoga hibrid koji sadrži monomerni aspekt koji ima samo jedan faktor koagulacije i dimerni aspekt koji ima dvi Fc regiona.
[0071] Kako se ovde koristi, izraz „mesto razdvajanja“ ili „mesto enzimatskog razdvajanja“ odnosi se na mesto prepoznato od strane enzima. Određena mesta enzimskog razdvajanja sadrže intracelularno mesto obrade. U jednom aspektu, polipeptid ima mesto enzimatskog razdvajanja razdvojeno enzimom koji se aktivira tokom kaskade koagulacije,
1
tako da se razdvajanje takvih mesta dešava na mestu formiranja ugruška. Primerna mesta uključuju, npr., ona prepoznate pomoću trombina, Faktora XIa ili Faktora Xa. Primerna FXIa mesta razdvajanja uključuju, npr., TXFNDFTR (SEQ ID NO: 45) i SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 46). Primerna mesta razdvajanja trombina uključuju, npr., DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 47), TTKIKPR (SEQ ID NO: 48), LVPRG (SEQ ID NO: 49) i ALRPR (aminokiseline 1 do 5 SEQ ID NO: 50). Druga mesta enzimskog razdvajanja su poznata u struci.
[0072] Kako se ovde koristi, izraz „mesto obrade“ ili „mesto intracelularne obrade“ odnosi se na vrstu mesta enzimskog razdvajanja u polipeptidu koje je cilj za enzime koji deluju posle translacije polipeptida. U jednom aspektu, takvi enzimi funkcionišu tokom transporta iz Goldžijevog lumena u trans-Goldžijev odeljak. Intracelularni enzimi za obradu razdvajaju polipeptide pre izlučivanja proteina iz ćelije. Primeri takvih mesta za obradu uključuju, npr., one koje cilja PACE/furin (gde je PACE akronim za enzim za razdvajanje uparenih baznih aminokiselina) endopeptidaza. Ovi enzimi su lokalizovani na Goldžijevoj membrani i razdvajaju proteine na karboksterminalnoj strani motiva sekvence Arg-[bilo koji ostatak]-(Lys ili Arg)-Arg. Kako se ovde koristi, „furin“ porodica enzima uključuje, npr., PCSK1 (takođe poznat kao PC1/Pc3), PCSK2 (takođe poznat kao PC2), PCSK3 (takođe poznat kao furin ili PACE), PCSK4 (takođe poznat kao PC4), PCSK5 (takođe poznat kao PC5 ili PC6), PCSK6 (takođe poznat kao PACE4) ili PCSK7 (takođe poznat kao PC7/LPC, PC8 ili SPC7). Ostala mesta za obradu su poznata u struci.
[0073] Kod konstrukata koji uključuju više od jednog mesta obrade ili razdvajanja, razumeće se da takva mesta mogu biti ista ili različita.
[0074] Izraz „Furin“ odnosi se na enzime koji odgovaraju EC No.3.4.21.75. Furin je proprotein konvertaza slična subtilizinu, koja je poznata i kao PACE (enzim za razdvajanje uparenih baznih aminokiselina). Furin briše delove neaktivnih prekursor proteina kako bi ih pretvorio u biološki aktivne proteine. Tokom svog ćelijskog transporta, pro-peptid VWF se može razdvojiti iz zrelog molekula VWF pomoću Furin enzima. U nekim otelotvorenjima, Furin razdvaja D1D2 od D'D3 VWF. U drugim otelotvorenjima, nukleotidna sekvenca koja kodira Furin može se eksprimirati zajedno sa nukleotidnom sekvencom koja kodira VWF fragment tako da se D1D2 domeni mogu intracelularno razdvojiti pomoću Furina.
[0075] Kod konstrukata koji uključuju više od jednog mesta obrade ili razdvajanja, razumeće
2
se da takva mesta mogu biti ista ili različita.
[0076] „Veznik za obradu“, kako se ovde koristi, odnosi se na veznik koji sadrži najmanje jedno intracelularno mesto obrade, koji je ovde opisano na drugom mestu.
[0077] Hemostatski poremećaj, kako se ovde koristi, znači genetski nasleđeno ili stečeno stanje koje karakteriše sklonost krvarenju, bilo spontano, bilo kao posledica traume, usled oslabljene sposobnosti ili nemogućnosti formiranja fibrinskog ugruška. Primeri takvih poremećaja uključuju hemofiliju. Tri glavna oblika su hemofilija A (nedostatak faktora VIII), hemofilija B (nedostatak faktora IX ili „božićna bolest“) i hemofilija C (nedostatak faktora XI, blaga tendencija krvarenja). Ostali hemostatski poremećaji uključuju, npr., Fon Vilebrandovu bolest, nedostatak faktora XI (nedostatak PTA), nedostatak faktora XII, nedostaci ili strukturne nepravilnosti fibrinogena, protrombina, Faktora V, Faktora VII, Faktora X ili Faktora XIII, Bernard-Souliera sindrom, što je oštećenje ili nedostatak GPIb. GPIb, receptor za VWF, može biti neispravan i dovesti do nedostatka formiranja primarnog ugruška (primarna hemostaza) i povećane tendencije krvarenja) i Glanzman i Naegeli trombastenija (Glanzmann-ova trombastenija). Kod otkazivanja jetre (akutni i hronični oblici), jetra ne proizvodi dovoljno faktora koagulacije; što može povećati rizik od krvarenja.
[0078] Himerni molekuli predmetnog pronalaska mogu se upotrebiti profilaktički. Kako se ovde koristi, izraz „profilaktički tretman“ odnosi se na primenu molekula pre epizode krvarenja. U jednom aspektu, pacijent kom je potreban opšti hemostatski agens je podvrgnut operaciji ili će biti podvrgnut. Himerni protein prema predmetnom pronalasku može se primeniti pre ili posle operacije kao profilaktički. Himerni protein prema predmetnom pronalasku može se primeniti tokom ili posle operacije za kontrolu akutne epizode krvarenja. Operacija može da uključuje, ali nije ograničena na, transplantaciju jetre, resekciju jetre, stomatološke procedure ili transplantaciju matičnih ćelija.
[0079] Himerni protein prema predmetnom pronalasku takođe se koristi za tretman na zahtev. Izraz „tretman na zahtev“ odnosi se na primenu himernog molekula kao odgovor na simptome epizode krvarenja, ili pre aktivnosti koja može da izazove krvarenje. U jednom aspektu, tretman na zahtev može se primeniti pacijentu kada započne krvarenje, na primer posle povrede ili kada se očekuje krvarenje, kao što je pre operacije. U drugom aspektu, tretman na zahtev može se primeniti pre aktivnosti koje povećavaju rizik od krvarenja, kao što su dodirni sportovi.
[0080] Kako se ovde koristi, izraz „akutno krvarenje“ odnosi se na epizodu krvarenja bez obzira na osnovni uzrok. Na primer, osoba može imati traumu, uremiju, nasledni poremećaj krvarenja (npr., nedostatak Faktora VII) poremećaj trombocita ili rezistenciju usled razvoja antitela na faktore koagulacije.
[0081] Tretirati, tretman, tretiranje, kako se ovde koriste, odnose se, npr., na smanjenje težine bolesti ili poremećaja; smanjenje trajanja bolesti; ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolesti ili stanjem; pružanje korisnih efekata na pacijenta sa bolesti ili stanjem, bez nužnog iztretmana bolesti ili poremećaja, ili na profilaksu jednog ili više simptoma povezanih sa bolesti ili stanjem. U jednom otelotvorenju, izraz „tretiranje“ ili „tretman“ znači održavanje nivoa FVIII najmanje oko 1 IU/dL, 2 IU/dL, 3 IU/dL, 4 IU/dL, 5 IU/dL, 6 IU/dL, 7 IU/dL, 8 IU/dL, 9 IU/dL, 10 IU/dL, 11 IU/dL, 12 IU/dL, 13 IU/dL, 14 IU/dL, 15 IU/dL, 16 IU/dL, 17 IU/dL, 18 IU/dL, 19 IU/dL, ili 20 IU/dL kod pacijenta primenom himernog proteina ili VWF fragmenta pronalaska. U drugom otelotvorenju, tretiranje ili tretman znači održavanje najnižeg nivoa FVIII između oko 1 i oko 20 IU/dL, oko 2 i oko 20 IU/dL, oko 3 i oko 20 IU/dL, oko 4 i oko 20 IU/dL, oko 5 i oko 20 IU/dL, oko 6 i oko 20 IU/dL, oko 7 i oko 20 IU/dL, oko 8 i oko 20 IU/dL, oko 9 i oko 20 IU/dL, ili oko 10 i oko 20 IU/dL. Tretman ili tretiranje bolesti ili poremećaja takođe može da uključi održavanje FVIII aktivnosti kod pacijenta na nivou uporedivom sa najmanje oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ili 20% FVIII aktivnosti kod pacijenta koji nije hemofiličan. Minimalni nivo potreban za tretman može se meriti jednim ili više poznatih postupaka i može se prilagoditi (povećati ili smanjiti) za svaku osobu.
HIMERNI PROTEINI
[0082] Predmetni pronalazak je usmeren na produženje poluživota proteina Faktor VIII korišćenjem VWF fragmenta i XTEN sekvence sprečavanjem ili inhibicijom faktora ograničavanja poluživota FVIII, tj. endogenog VWF, od povezivanja sa FVIII proteinom. Endogeni VWF se povezuje sa oko 95% do oko 98% FVIII u nekovalentnim kompleksima. Iako je endogeni VWF faktor ograničavanja FVIII poluživota , poznato je da endogeni VWF vezan za FVIII protein takođe štiti FVIII na različite načine. Na primer, VWF pune dužine (kao multimer sa oko 250 kDa) može zaštititi FVIII od razdvajanja proteaze i FVIII aktivacije, stabilizovati teški i/ili laki lanac FVIII i sprečiti klirens FVIII od strane skevindžer
4
receptora. Ali, istovremeno, endogeni VWF ograničava poluživot FVIII sprečavanjem pinocitoze i uklanjanjem FVIII-VWF kompleksa iz sistema kroz VWF put klirensa. Veruje se, iako nije vezano teorijom, da je endogeni VWF faktor ograničavanja poluživota koji sprečava da poluživot FVIII proteina spojenog za produživač poluživota bude duži od približno dvostrukog u odnosu na divlji tip FVIII. Stoga je predmetni pronalazak usmeren na sprečavanje ili inhibiranje interakcije između endogenog VWF i FVIII proteina korišćenjem VWF fragmenta, čime se povećava poluživot FVIII proteina korišćenjem same XTEN sekvence, ili XTEN sekvence u kombinaciji sa Ig konstantnim regionom ili njegovim delom. XTEN sekvenca se može povezati sa FVIII proteinom ili VWF fragmentom. Na taj način se FVIII protein povezan sa VWF fragmentom polako uklanja iz cirkulacije jednim ili više VWF receptora, i zatim može da ima produženi poluživot XTEN sekvence ili XTEN sekvence u kombinaciji sa Ig konstantnim regionom, u poređenju sa divljeg tipa FVIII ili FVIII proteinom bez VWF fragmenta.
[0083] U jednom otelotvorenju, VWF fragment je kovalentnom vezom povezan sa (ili vezan za) FVIII proteinom. U nekim slučajevima, fizička blokada ili hemijsko udruživanje (npr., nekovalentna veza) između VWF fragmenta i FVIII proteina mogu da ne budu dovoljno jaki kako bi pružili stabilan kompleks koji sadrži FVIII protein i VWF fragment u prisustvu endogenog VWF. Na primer, VWF fragment koji formira nekovalentnu vezu sa FVIII proteinom bez ikakvih drugih veza može se lako disocirati in vivo iz FVIII proteina u prisustvu endogenog VWF, zamenjujući VWF fragment (npr., rekombinantni VWF, tj. rVWF) sa endogenim VWF. Prema tome, FVIII protein koji se nekovalentno vezuje za endogeni VWF prošao bi VWF put klirensa i lako bi se očistio iz sistema. Kako bi se sprečila disocijacija VWF fragmenta sa FVIII proteinom, povezanost ili veza između FVIII proteina i VWF fragmenta je kovalentna veza, npr., peptidna veza ili disulfidna veza. U nekim otelotvorenjima, povezanost (tj. Veza) je peptidna veza ili veznik između FVIII proteina i VWF fragmenta („FVIII/VWF veznik“). Neograničavajući primeri veznika opisani su na drugim mestima ovde. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment je polipeptid koji sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od najmanje oko 10, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2500, 3000 ili 4000 aminokiselina. Neograničavajući primeri VWF fragmenta su opisani na drugim mestima ovde.
[0084] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment se hemijski (npr., nekovalentno) vezuje za ili fizički blokira jedno ili više vezivnih mesta VWF na FVIII proteinu. VWF mesto vezivanja za FVIII protein nalazi se unutar A3 domena ili C2 domena FVIII proteina. U još nekim otelotvorenjima, VWF mesto vezivanja za FVIII protein nalazi se unutar A3 domena i C2 domena. Na primer, VWF mesto vezivanja na FVIII proteinu može da odgovara aminokiselinama 1669 do 1689 i/ili 2303 do 2332 od SEQ ID NO: 4 [zreo FVIII pune dužine].
[0085] Obelodanjenje takođe pruža himerni protein (koji obuhvata FVIII protein i VWF fragment) koji dalje sadrži jednu ili više XTEN sekvenci, koje pružaju dodatna svojstva produženja poluživota. Jedna ili više XTEN sekvenci mogu biti umetnute unutar FVIII proteina ili VWF fragmenta ili vezane za N-terminus ili C-terminus FVIII proteina ili VWF fragmenta. Obelodanjenje takođe uključuje FVIII protein vezan za XTEN sekvencu (prvi deo za produženje poluživota) i Ig konstantni region ili njegov deo (drugi deo za produženje poluživota) tako da dva dela za produženje poluživota produžavaju poluživot FVIII proteina kroz dva različita mehanizma.
[0086] U nekim slučajevima, himerni protein sadrži FVIII protein povezan sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom (npr., prvi FcRn vezujući partner), VWF fragment vezan za drugi Ig konstantnim regionom ili njegovim delom (npr., drugi FcRn vezujući partner), i jednu ili više XTEN sekvenci umetnutih ili povezanih sa FVIII proteinom ili VWF fragmentom, gde VWF fragment sprečava da se faktor ograničavanja FVIII poluživota (npr., endogeni VWF) vezuje za FVIII protein, gde prvi i drugi Ig konstantni region ili njihovi delovi formiraju kovalentnu vezu, npr., disulfidnu vezu, i jedna ili više XTEN sekvenci produžava poluživot FVIII proteina.
[0087] U određenim slučajevima, himerni protein predmetnog obelodanjenja sadrži FVIII protein povezan sa VWF fragmentom opcionim veznikom (tj. FVIII/VWF veznik) i jednu ili više XTEN sekvenci umetnutih ili povezanih sa FVIII proteinom ili VWF fragmentom, gde VWF fragment sprečava da se faktor ograničavanja FVIII poluživota (npr., endogeni VWF) vezuje za FVIII protein i jedna ili više XTEN sekvenci produžava poluživot FVIII proteina. U jednom slučaju, opcioni veznik (FVIII/VWF veznik) sadrži motiv prepoznavanja sortaze. U drugom slučaju, opcioni veznik (FVIII/VWF veznik) sadrži mesto koje se može razdvojiti. Primeri veznika za razdvajanje (tj. Veznik koji sadrži jedno ili više mesta razdvajanja) su ovde opisani na drugim mestima.
[0088] Himerni protein predmetnog obelodanjenja uključuje, ali nije ograničen na:
(1) VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen, XTEN sekvencu i FVIII, gde je XTEN sekvenca povezana sa VWF fragmentom;
(2) FVIII protein, XTEN sekvencu i Ig konstantni region ili njegov deo, gde je FVIII protein vezan za XTEN sekvencu i Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, ili (3) FVIII protein, XTEN sekvencu i VWF fragment, gde je XTEN sekvenca vezana za FVIII protein na C-terminusu ili N-terminusu ili je umetnuta neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr., jedno ili više XTEN mesta umetanja) FVIII, i VWF fragment i FVIII protein su povezani jedni sa drugima.
(1) Fragment Fon Vilebrandovog Faktora (VWF) vezan za XTEN FVIII
[0089] Predmetno obelodanjenje je usmereno na himerni protein koji sadrži (i) VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, (ii) XTEN sekvencu i (iii) FVIII protein, gde (i), (ii) i (iii) su vezani ili su povezani jedni sa drugima. VWF fragment vezan za XTEN sekvencu, kao deo himernog proteina u predmetnom pronalasku, povezuje se sa FVIII proteinom, čime se sprečava ili inhibira interakcija između endogenog VWF i FVIII proteina. U određenim slučajevima, VWF fragment, koji je u stanju da spreči ili inhibira vezivanje FVIII proteina sa endogenim VWF, može istovremeno imati bar jedno zaštitno svojstvo nalik VWF. Primeri zaštitnih svojstava nalik VWF uključuju, ali nisu ograničeni na, zaštitu FVIII od razdvajanja proteaze i aktiviranja FVIII, stabilizovanje teškog i/ili lakog lanca FVIII i sprečavanje uklanjanja FVIII od strane skevindžer receptora. Kao rezultat toga, VWF fragment može sprečiti klirens FVIII proteina kroz VWF put klirensa, smanjujući tako klirens FVIII iz cirkulatornog sistema. U nekim slučajevima, VWF fragmenti predmetnog pronalaska se vezuju ili su povezani sa FVIII proteinom i/ili fizički ili hemijski blokiraju VWF vezujuće mesti na FVIII proteinu. FVIII protein povezan sa VWF fragmentom se tako izbacuje iz cirkulacije sporije, u poređenju sa divljeg tipa FVIII ili FVIII koji nije povezan sa VWF fragmentom.
[0090] U jednom slučaju, obelodanjenje je usmereno na himerni protein koji sadrži (i) VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, (ii) XTEN sekvencu i (iii) FVIII protein, gde je XTEN sekvenca je povezana sa VWF fragmentom (npr., (a1) V-X ili (a2) X-V, gde V sadrži VWF fragment i X sadrži XTEN sekvencu), i VWF fragment je vezan ili povezan za FVIII protein. U drugom slučaju, VWF fragment i XTEN sekvenca mogu biti povezani veznikom (npr., (a3) V-L-X ili (a4) X-L-V) ili peptidnom vezom. Veznik može biti razdvojivi veznik, npr., veznik razdvojiv trombinom, koji može da se razdvaja na mestu koagulacije. U drugim slučajevima, VWF fragment, XTEN sekvenca i FVIII protein su smešteni u jednom polipeptidnom lancu. U drugim slučajevima, himerni protein sadrži dva polipeptidna lanca, prvi lanac koji sadrži VWF fragment i XTEN sekvencu i drugi lanac koji sadrži FVIII protein. U još nekim slučajevima, himerni protein sadrži tri polipeptidna lanca, prvi lanac koji sadrži VWF fragment i XTEN sekvencu, drugi lanac koji sadrži laki lanac FVIII i treći lanac koji sadrži teški lanac FVIII, gde su prvi lanac i drugi lanac su povezani jedan sa drugim (npr., kovalentna veza, npr., disulfidna veza), i drugi i treći lanac su povezani jedan sa drugim (npr., metalna veza). U drugim slučajevima, XTEN sekvenca se može povezati sa N-terminusom ili C-terminusom VWF fragmenta ili umetnuti neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina u VWF fragmentu.
[0091] U određenim slučajevima, himerni protein predmetnog obelodanjenja obuhvata formulu koja obuhvata:
(a) V-X-FVIII,
(b) FVIII-X-V,
(c) V-X:FVIII,
(d) X-V:FVIII,
(e) FVIII:V-X,
(f) FVIII:X-V,
ili
(a5) X-V-FVIII,
gde V obuhvata VWF fragment,
X obuhvata jednu ili više XTEN sekvenci,
FVIII obuhvata FVIII protein;
(-) predstavlja peptidnu vezu ili jednu ili više aminokiselina; i
(:) je hemijska ili fizička veza. U jednom slučaju, (:) predstavlja hemijsku vezu, npr., barem jedna ne-peptidna veza. U drugom slučaju, hemijska veza, tj. (:) je kovalentna veza. U drugim slučajevima, hemijska veza, tj. (:) je nekovalentna interakcija, npr., jonska interakcija, hidrofobna interakcija, hidrofilna interakcija, Van der Waals-ova interakcija ili vodonična veza. U drugim slučajevima, (:) je nepeptidna kovalentna veza. U ostalim slučajevima, (:) je peptidna veza. U drugim slučajevima, (:) predstavlja fizičku vezu između dve sekvence, gde je deo prve sekvence u neposrednoj blizini druge sekvence, tako da prva sekvenca štiti ili blokira deo druge sekvence u interakciji sa drugim delom i dalje, ova fizička veza se održava ne dozvoljavajući drugoj sekvenci da komunicira sa drugim delovima. Ovde je prikazana orijentacija polipeptidnih formula od N-terminusa (levo) do C-terminusa (desno). Na primer, formula V-X-FVIII označava formulu NH2-V-X-FVIII-COOH. U jednom slučaju, ovde opisane formule mogu da sadrže bilo koje dodatne sekvence između dva dela. Na primer, formula V-X-FVIII može dalje da sadrži bilo koje sekvence na N-terminusu od V između V i X, između X i FVIII, ili na C-terminusu FVIII, ako nije drugačije navedeno. U drugom slučaju, crtica (-) ukazuje na peptidnu vezu.
[0092] U drugim slučajevima, himerni protein obelodanjenja obuhvata formulu koja obuhvata:
(a) V(X1)-X2-FVIII,
(b) FVIII-X2-V(X1),
(c) V(X1):FVIII,
(d) FVIII:V(X1),
ili
(a5) X2-V(X1)-FVIII,
gde V(X1) obuhvata VWF fragment i prvu XTEN sekvencu (X1),
gde XTEN sequence je umetnute neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina u VWF fragment,
X2 obuhvata jednu ili više opcionih XTEN sekvenci,
FVIII obuhvata FVIII protein;
(-) je peptidna veza ili jedna ili više aminokiselina; i
(:) je hemijska ili fizička veza.
[0093] U nekim slučajevima, himerni protein sadrži (i) VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, (ii) XTEN sekvencu, (iii) FVIII protein, (iv) prvi opcioni veznik i (v) drugi opcioni veznik, gde je XTEN sekvenca vezana za VWF fragment i/ili FVIII protein pomoću veznika. U određenim slučajevima, himerni protein obuhvata formulu koja obuhvata:
(b1) V-L1-X-L2-FVIII,
(b2) FVIII-L2-X-L1-V,
(b3) V-L1-X:FVIII,
(b4) X-L1-V:FVIII,
(b5) FVIII:V-L1-X,
(b6) FVIII:X-L1-V,
(b7) X-L1-V-L2-FVIII, ili
(b8) FVIII-L2-V-L1-X,
gde V obuhvata VWF fragment,
X obuhvata jednu ili više XTEN sekvenci,
FVIII obuhvata FVIII protein,
L1 obuhvata prvi opcioni veznik, npr., prvi razdvojivi veznik,
L2 obuhvata drugi opcioni veznik, npr., drugi razdvojivi veznik ili opcioni veznik za obradu;
(-) je peptidna veza ili jedna ili aminokiselina; i
(:) je hemijska ili fizička veza. U jednom slučaju, (:) predstavlja hemijsku vezu, npr., barem jedna ne-peptidna veza. U drugom slučaju, hemijska veza, tj. (:) je kovalentna veza. U drugim slučajevima, hemijska veza, tj. (:) je nekovalentna interakcija, npr., jonska interakcija, hidrofobna interakcija, hidrofilna interakcija, Van der Waals-ova interakcija ili vodonična veza. U drugim slučajevima, (:) je nepeptidna kovalentna veza. U ostalim slučajevima, (:) je peptidna veza. U drugim slučajevima, (:) predstavlja fizičku vezu između dve sekvence, gde je deo prve sekvence u neposrednoj blizini druge sekvence, tako da prva sekvenca štiti ili blokira deo druge sekvence u interakciji sa drugim delom i dalje, ova fizička veza se održava ne dozvoljavajući drugoj sekvenci da komunicira sa drugim delovima. Ovde je prikazana orijentacija polipeptidnih formula od N-terminusa (levo) do C-terminusa (desno). Na primer, formula (b1) V-L1-X-L2-FVIII označava formulu NH2-V-L1-X-L2-FVIII-COOH. U jednom slučaju, ovde opisane formule mogu da sadrže bilo koje dodatne sekvence između dva dela. U drugom slučaju, crtica (-) ukazuje na peptidnu vezu.
[0094] Naredni primer predmetnog obelodanjenja je FVIII himerni protein koji ima smanjene interakcije, ili ih nema uopšte, sa faktorom ograničavanja poluživota FVIII, npr., endogeni VWF, i istovremeno maksimizuje poluživot FVIII proteina korišćenjem XTEN sekvence (prvi produživač poluživota) u kombinaciji sa drugim produživačem poluživota ili delom koji pruža kovalentnu vezu između FVIII proteina i VWF fragmenta, npr., Ig konstantni region ili njegov deo. U jednom slučaju, himerni protein predmetnog obelodanjenja sadrži (i) VWF
4
fragment koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, (ii) XTEN sekvencu, (iii) FVIII protein i (iv) Ig konstantni region ili njegov deo (takođe ovde nazivan F), gde je (1) VWF fragment povezan XTEN sekvencom opcionim veznikom, npr., (2) VWF fragment je povezan sa ili vezan za FVIII proteinom dodatnim opcionim veznikom, npr., razdvojivim veznikom i (3) Ig konstantni region ili njegov deo povezan je sa VWF fragmentom, XTEN sekvencom ili FVIII proteinom. Himerni protein prema pronalasku sadrži (i) VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, (ii) XTEN sekvencu, (iii) FVIII protein, (iv) Ig konstantni region ili njegov deo (F1 ili prvi Ig konstantni region ili njegov deo), i (v) dodatni Ig konstantni region ili njegov deo (F2 ili drugi Ig konstantni region ili njegov deo), gde je (1) VWF fragment vezan za XTEN sekvencu opcionog veznika, npr., razdvojivog veznika, (2) XTEN sekvenca ili VWF fragment je vezani za Ig konstantni region ili njegov deo, (3) FVIII je povezan sa dodatnim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, i (4) Ig konstantni region ili njegov deo vezan je ili povezan sa dodatnim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, kovalentnom vezom, npr., disulfidnom vezom. U narednom otelotvorenju, povezivanje ili veza između dva Ig konstantna regiona ili njihovih delova je veznik za obradu, gde je veznik za obradu intracelularno obrađen od strane proteaze. Na primer, himerni protein obuhvata formulu koja obuhvata::
(g) V-L2-X-L1-F1: FVIII-L3-F2;
(h) V-L2-X-L1-F1:F2-L3-FVIII;
(i) F-L1-X-L2-V: FVIII-L3-F2;
(j) F-L1-X-L2-V:F2-L3-FVIII;
(k) V-L2-X-L1-F1-L4-FVIII-L3-F2;
(l) F2-L3-FVIII-L4-F1-LL1-X-L2-V;
(m) FVIII-L2-F2-L4-V-L2-X-L1-F1;
ili
(n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII,
gde V obuhvata VWF fragment,
svaki od L1 i L3 obuhvata opcioni veznik,
L2 obuhvata opcioni veznik, npr., razdvojivi veznik,
L4 je opcioni veznik, npr., veznik za obradu,
FVIII obuhvata FVIII protein,
X obuhvata jednu ili više XTEN sekvenci,
F1 obuhvata prvi Ig konstantni region ili njegov deo,
F2 obuhvata drugi Ig konstantni region ili njegov deo;
(-) je peptidna veza ili jednu ili više aminokiselina; i
(:) je kovalentna veza.
[0095] U nekim otelotvorenjima, FVIII protein u bilo kom ovde opisanom konstruktu ili formuli može dalje da sadrži najmanje jednu, najmanje dve, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, ili najmanje šest XTEN sekvenci, gde su sve XTEN sekvence umetnute neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina u FVIII proteinu ili vezane za N-terminus ili C-terminus FVIII proteina. Neograničavajući primeri XTEN mesta umetanja obelodanjeni su na drugim mestima ovde.
[0096] U jednom aspektu, (:) predstavlja kovalentnu vezu. U drugim otelotvorenjima, (:) je nepeptidna kovalentna veza. U drugim otelotvorenjima, (:) je peptidna veza. Ovde je prikazana orijentacija polipeptidnih formula od N-terminusa (levo) do C-terminusa (desno). Na primer, formula (n) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII označava formulu NH2-F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L2-FVIII-COOH. U jednom aspektu, ovde opisane formule mogu da sadrže bilo koje dodatne sekvence između dve grupe. U drugom otelotvorenju, crtica (-) ukazuje na peptidnu vezu.
[0097] U jednom otelotvorenju, bilo jedan ili oba od Ig konstantnog regiona ili njegovog dela (ponekad je ovde označen sa „F“ ili „F1“) i dodatnog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela (koji je ovde ovde ponekad označen sa „F2“) povezani za VWF fragment ili FVIII protein mogu produžiti poluživot VWF fragmenta, FVIII proteina ili oba. U drugom otelotvorenju, Ig konstantni region ili njegov deo (ponekad je ovde označen sa „F“ ili „F1“) i dodatni Ig konstantni region ili njegov deo (ponekad je ovde označen sa „F2“), od kojih je svaki vezan za VWF fragment i FVIII protein, pruža vezu jaču od nekovalentne veze između FVIII proteina i VWF fragmenta, tj. kovalentna veza, npr., disulfidna veza, čime sprečava endogeni VWF da zameni VWF fragment in vivo. F1 ili F2 mogu sadržati Fc region ili FcRn vezujući partner. U drugim otelotvorenjima, F1 ili F2 ili oba, povezani sa VWF fragmentom i/ili FVIII proteinom, formiraju kovalentnu vezu (npr., disulfidnu vezu) između F1 i F2, stavljajući VWF fragment i FVIII protein u neposrednu blizinu kako bi sprečili interakciju FVIII proteina sa VWF fragmentom. U nekim otelotvorenjima, F1 i F2 su identični ili različiti. Neograničavajući primeri F1 i F2 mogu biti izabrani iz grupe koju čine CH1 domen, CH2 domen, CH3 domen, CH4 domen, zglobni domen, bilo kojih funkcionalnih fragmenata, derivata ili njihovih analoga i dve ili više njihovih kombinacija. U jednom aspektu, F1, F2, ili oba sadrže najmanje jedan CH1 domen, najmanje jedan CH2 domen, najmanje jedan CH3 domen, najmanje jedan CH4 domen, ili njihove funkcionalne fragmente, derivate ili analoge. U drugom otelotvorenju, F1, F2 ili oba sadrže najmanje jedan zglobni domen ili njegov deo i najmanje jedan CH2 domen ili njegov deo (npr., u zglob-CH2 orijentaciji). U drugim otelotvorenjima, F1, F2, ili oba sadrže najmanje jedan CH2 domen ili njegov deo i najmanje jedan CH3 domen ili njegov deo (npr., u CH2-CH3 orijentaciji.) Primeri kombinacije uključuju, ali nisu ograničeni na, CH2 domen, CH3 domen i zglobni domen, koji su takođe poznati kao Fc region (ili Fc domen), npr., prvi Fc region ili prvi FcRn vezujući partner za F1 i drugi Fc region ili drugi FcRn vezujući partner za F2. U drugim otelotvorenjima, F1 je vezan za VWF fragment pomoću veznika, i/ili F2 je vezan za FVIII protein pomoću veznika. U nekim otelotvorenjima, F1 i/ili F2 sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od zglobnog regiona. Dodatni neograničavajući primeri Fc regiona ili FcRn vezujućih partnera opisani su na drugim mestima ovde.
[0098] U određenim otelotvorenjima, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži dva polipeptidna lanca, prvi polipeptidni lanac koji sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od VWF fragmenta koji sadrži D' domen i D3 domen, XTEN sekvence, prvog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela (npr., prvi Fc region) i opcionog veznika između VWF fragmenta i XTEN sekvence ili XTEN sekvence ili prvog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela, i drugi polipeptidni lanac koji sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od FVIII proteina i drugog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela (npr., drugi Fc region). Veznik između VWF fragmenta i prvog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela može biti razdvojivi veznik, npr., veznik razdvojiv trombinom, koji može da se razdvaja na mestu koagulacije. Prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac povezani su jedan s drugim. Povezanost prvog i drugog lanca sprečava zamenu prvog lanca koji sadrži VWF fragment endogenim VWF in vivo. Veza između prvog i drugog lanca je kovalentna veza. U posebnom otelotvorenju, kovalentna veza je disulfidna veza. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein u drugom lancu dalje sadrži jednu ili više XTEN sekvenci povezanih na C-terminus ili N-terminus FVIII proteina, ili umetnutu neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr., bar jedno mesto umetanja obelodanjeno ovde) u FVIII proteinu. Neograničavajući primeri mesta umetanja opisani su na drugim mestima ovde.
[0099] U drugim otelotvorenjima, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži tri
4
polipeptidna lanca, gde prvi polipeptidni lanac sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od teškog lanca FVIII proteina, i drugi polipeptidni lanac sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od lakog lanca FVIII proteina spojenog za prvi Ig konstantni region ili njegov deo (npr., prvi Fc region) i treći polipeptidni lanac sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od VWF fragmenta koji sadrži D' domen i D3 domen, XTEN sekvencu, drugi Ig konstantni region ili njegov deo (npr., drugi Fc region), i opcioni veznik između XTEN sekvence i drugog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela ili VWF fragmenta i XTEN sekvence. Veznik u trećem lancu može biti razdvojivi veznik koji se razdvaja na mestu koagulacije, npr., mestu razdvajanja trombina. U nekim otelotvorenjima, teški lanac FVIII ili laki lanac FVIII povezan je sa jednom ili više XTEN sekvenci, koje mogu biti povezane za N-terminus, C-terminus ili umetnute unutar jednog ili više mesta umetanja unutar FVIII sekvence. Neograničavajući primeri mesta umetanja obelodanjeni su na drugim mestima ovde.
[0100] U još nekim slučajevima, himerni protein predmetnog obelodanjenja sadrži dva polipeptidna lanca, prvi polipeptidni lanac koji sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od teškog lanca FVIII proteina i drugog polipeptidnog lanca koji sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od lakog lanca FVIII proteina, prvog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela (npr., prvi Fc region), prvog veznika (npr., veznik za obradu, koji sadrži jedno ili više mesta razdvajanja proteaze koja sadrže jedno ili više mesta intracelularne obrade), VWF fragmenta, drugog veznika (npr., veznik razdvojiv trombinom), XTEN sekvence i drugog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela (npr., drugi Fc region), gde je laki lanac FVIII proteina povezan sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom (npr., prvi Fc region), koji je dalje povezan sa VWF fragmentom prvog veznika, i gde je VWF fragment vezan za XTEN sekvencu, koja je dalje povezana sa drugim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom drugim veznikom. U određenim slučajevima, prvi veznik je veznik za obradu, i drugi veznik je razdvojivi veznik. Nakon eksprimiranja, himerni protein može biti obrađen enzimom za intracelularnu obradu, koji razdvaja veznik za obradu, i na taj način himerni protein sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od tri polipeptidna lanca. Pored toga, VWF fragment se može razdvojiti na mestu koagulacije zahvaljujući razdvojivom vezniku.
[0101] U određenim otelotvorenjima, himerni protein prema pronalasku sadrži jedan polipeptidni lanac, koji sadrži jednolančani FVIII protein, prvi Ig konstantni region ili njegov deo (npr., prvi Fc region), prvi veznik (npr., veznik za obradu), VWF fragment, XTEN sekvencu, drugi veznik (npr., veznik razdvojiv trombinom) i drugi Ig konstantni region ili njegov deo (npr., drugi Fc region), gde je jednolančani FVIII protein povezan sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, koji je takođe povezan sa VWF fragmentom prvog veznika, i VWF fragment je vezan za XTEN sekvencu, koja je dalje povezana sa drugim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom. U jednom aspektu, VWF fragment i XTEN sekvenca su povezani drugim veznikom. U drugom otelotvorenju, XTEN sekvenca i drugi Ig konstantni region ili njegov deo su povezani drugim veznikom. U drugim otelotvorenjima, drugi lanac dalje sadrži i treći veznik. Jedan polipeptidni lanac može na taj način da sadrži VWF fragment vezan za XTEN sekvencu pomoću drugog veznika i XTEN vezan za drugi Ig konstantni region ili njegov deo trećim veznikom. Drugi veznik i treći veznik mogu biti identični ili različiti. U jednom otelotvorenju, prvi veznik je veznik za obradu. U drugom otelotvorenju, drugi veznik ili treći veznik je razdvojivi veznik, i koji sadrži jedno ili dva razdvojiva mesta. U specifičnom otelotvorenju, drugi veznik je veznik razdvojiv trombinom. Veznici korisni u predmetnom pronalasku su ovde opisani na drugim mestima.
(2) FVIII, XTEN i Fc
[0102] Himerni protein predmetnog obelodanjenja takođe sadrži (i) FVIII protein, (ii) XTEN sekvencu (prvi produživač poluživota) i (iii) Ig konstantni region ili njegov deo (drugi produživač poluživota), u kojima je XTEN sekvenca vezana za FVIII protein opcionim veznikom i Ig konstantni region ili njegov delo dodatnim opcionim veznikom. XTEN sekvenca i Ig konstantni region ili njegov deo mogu se koristiti zajedno da produže poluživot FVIII proteina. U jednom slučaju, himerni protein je monomer. U drugom slučaju, himerni protein je dimer (homodimer ili heterodimer).
[0103] Predmetno obelodanjenje je takođe usmereno na himerni protein koji sadrži (i) FVIII protein, (ii) XTEN sekvencu, (iii) Ig konstantni region ili njegov deo (tj. prvi Ig konstantni region ili njegov deo, „F,“ ili „F1“), i (iv) dodatni Ig konstantni region ili njegov deo (tj. drugi Ig konstantni region ili njegov deo ili „F2“). U jednom slučaju, XTEN sekvenca je vezana za FVIII protein na C-terminusu ili N-terminusu ili je umetnuta neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina u FVIII proteinu (npr., jedno ili više XTEN mesta umetanja), FVIII protein je povezan sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, i prvi Ig konstantni region ili njegov deo i drugi Ig konstantni region ili njegov deo su povezani sa ili međusobno povezani opcionim veznikom. U određenim aspektima, himerni protein je monomer-dimer hibrid, koji sadrži prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, gde prvi
4
polipeptidni lanac sadrži FVIII protein, XTEN sekvencu i prvi Ig konstantni region ili njegov deo, i drugi polipeptidni lanac sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od drugog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela bez FVIII proteina, i gde su prvi i drugi lanac povezani jedan sa drugim. Veza između Ig konstantnog regiona ili njegovog dela (npr., prvi Fc region) i dodatnog Ig konstantnog regiona ili njegov deo (npr., drugi Fc region) je hemijska veza ili fizička veza. U određenim slučajevima, hemijska veza je kovalentna veza. U drugim slučajevima, hemijska veza je nekovalentna interakcija, npr., jonska interakcija, hidrofobna interakcija, hidrofilna interakcija, Van der Waals-ova interakcija ili vodonična veza. U drugim slučajevima, veza je nepeptidna kovalentna veza. U drugim slučajevima, veza je peptidna veza.
[0104] U drugim slučajevima, himerni protein je pojedinačni polipeptidni lanac koji sadrži FVIII protein, XTEN sekvencu, prvi Ig konstantni region ili njegov deo, veznik, npr., veznik za obradu i drugi Ig konstantni region ili njegov deo, gde se jedan polipeptidni lanac nakon eksprimiranja obrađuje intracelularnim enzimom i nastaju dva polipeptidna lanca.
[0105] U jednom slučaju, Ig konstantni region ili njegov deo (ponekad ovde označen sa „F“ ili „F1“) vezan za FVIII protein može produžiti poluživot FVIII proteina zajedno sa XTEN sekvencom. U drugom slučaju, Ig konstantni region ili njegov deo („F“ ili „F1“) je Fc region ili FcRn vezujući partner opisan na drugim mestima ovde.
[0106] U drugim slučajevima, dodatni Ig konstantni region ili njegov deo (ponekad ovde označen sa „F2“ ili drugi Ig konstantni region ili njegov deo) povezan sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom takođe može produžiti poluživot FVIII proteina. U drugim slučajevima, drugi Ig konstantni region ili njegov deo („F2“) zajedno sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom i XTEN sekvencom mogu produžiti poluživot FVIII proteina. Dodatni Ig konstantni region ili njegov deo može biti Fc region ili FcRn vezujući partner opisan na drugim mestima ovde.
[0107] U nekim slučajevima, drugi Ig konstantni region ili njegov deo povezan sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom je dalje povezan sa VWF fragmentom koji je ovde opisan na drugim mestima, i opcionom XTEN sekvencom.
[0108] U nekim slučajevima, ili jedan ili oba od Ig konstantnog regiona ili njegovog deo
4
(„F“ ili „F1“ ili prvi Ig konstantan region ili njegov deo) i dodatnog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela (tj. drugi Ig konstantni region ili njegov deo ili „F2“) (označen u ovom paragrafu kao „Ig konstantni region ili njegov deo“) može uključivati, bez ograničavanja, CH1 domen, CH2 domen, CH3 domen, CH4 domen, zglobni domen, bilo koje njihove funkcionalne fragmente, derivate ili analoge ili dve ili više njihovih kombinacija. U jednom slučaju, Ig konstantni region ili njegov deo sadrži najmanje jedan CH1 domen, najmanje jedan CH2 domen, najmanje jedan CH3 domen, najmanje jedan CH4 domen, ili njihove funkcionalne fragmente, derivate ili analoge. U drugom slučaju, Ig konstantni region ili njegov deo sadrži najmanje jedan zglobni domen ili njegov deo i najmanje jedan CH2 domen ili njegov deo (npr., u zglob-CH2 orijentaciji). U drugim slučajevima, Ig konstantni domen ili njegov deo sadrži najmanje jedan CH2 domen ili njegov deo i najmanje jedan CH3 domen ili njegov deo (npr., u CF2-CH3 orijentaciji). Primeri kombinacije uključuju, ali nisu ograničeni na, CH2 domen, CH3 domen i zglobni domen, koji su takođe poznati kao Fc region (ili Fc domen), npr., prvi Fc region. Dodatni primeri Ig konstantnih regiona ili njihovih delova su opisani drugde ovde.
[0109] Himerni protein predmetnog obelodanjenja može imati produženi poluživot FVIII proteina u poređenju sa divljeg tipa FVIII. U jednom aspektu, poluživot FVIII proteina produžava se najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili najmanje oko 12 puta u odnosu na poluživot divljeg tipa FVIII. U drugom otelotvorenju, poluživot FVIII proteina iznosi najmanje oko 10 sati, najmanje oko 11 sati, najmanje oko 12 sati, najmanje oko 13 sati, najmanje oko 14 sati, najmanje oko 15 sati, na najmanje oko 16 sati, najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sat, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati, ili najmanje oko 108 sati.
(3) FVIII, XTEN i VWF
[0110] U jednom slučaju, himerni protein predmetnog obelodanjenja sadrži (i) FVIII protein, (ii) XTEN sekvencu i (iii) VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, gde je FVIII protein vezan za XTEN sekvencu i gde je FVIII protein vezan ili povezan sa VWF fragmentom. U jednom slučaju, VWF fragment himernog proteina koji je ovde opisan nije
4
sposoban da se vezuje za VWF klirens receptor. U drugom slučaju, VWF fragment je sposoban da štiti FVIII protein od jednog ili više razdvajanja proteaze, štiti FVIII protein od aktivacije, stabilizuje teški lanac i/ili laki lanac FVIII proteina, ili sprečava uklanjanje FVIII proteina pomoću jednog ili više skevindžer receptora. U drugim slučajevima, VWF fragment sprečava ili inhibira vezivanje endogenog VWF na VWF mesto vezivanja u FVIII proteinu. VWF mesto vezivanja može se nalaziti u A3 domenu ili C2 domenu FVIII proteina ili i u A3 domenu i C2 domenu. U specifičnom primeru, VWF mesto vezivanja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara aminokiselinama 1669 do 1689 i/ili aminokiselinama 2303 do 2332 od SEQ ID NO: 2.
[0111] U drugom slučaju, himerni protein sadrži (i) FVIII protein, (ii) XTEN sekvencu, (iii) VWF fragment, koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, i (iv) Ig konstantni region ili njegov deo, gde je XTEN sekvenca vezana za FVIII protein na C-terminusu ili N-terminusu ili je umetnuta neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr., jedno ili više XTEN mesto umetanja obelodanjeno ovde) u FVIII proteinu, VWF fragment je vezan ili povezan za FVIII protein ili XTEN sekvencu, i Ig konstantni region ili njegov deo je vezan za FVIII protein, XTEN sekvencu, VWF fragment ili bilo koju njihovu kombinaciju. Ig konstantni region ili njegov deo koristan za himerne proteine obelodanjenja je ovde opisan na drugom mestu. U jednom slučaju, Ig konstantni region ili njegov deo može produžiti poluživot FVIII proteina. U drugom slučaju, Ig konstantni region ili njegov deo sadrži prvi Fc region ili prvi FcRn vezujući partner. U drugim slučajevima, Ig konstantni region ili njegov deo je vezan za FVIII protein opcionim veznikom. U drugim slučajevima, veznik obuhvata razdvojivi veznik. Himerni protein može biti jedan polipeptidni lanac, tj. monomer (tj. jedan lanac) koji sadrži (i), (ii), (iii) i (iv) ili dva lanca koja sadrže prvi lanac koji sadrži (i) i (ii) i drugi lanac koji sadrži (iii) i (iv). U drugim slučajevima, himerni protein je dimer (npr., homodimer ili heterodimer). U jednom slučaju, himerni protein sadrži dva lanca, od kojih svaki sadrži (i), (ii), (iii) i (iv).
[0112] U određenim slučajevima, himerni protein sadrži (i) FVIII protein, (ii) XTEN sekvencu, (iii) VWF fragment, koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, (iv) Ig konstantni region ili njegov deo (ponekad takođe označen sa „F“, „prvi Ig konstantni region ili njegov deo“, ili „F2“), i (v) dodatni Ig konstantni region ili njegov deo (ponekad takođe označen sa „F2 „ili“ drugi Ig konstantni region ili njegov deo “), gde je (1) FVIII protein vezan za XTEN sekvencu na C-terminusu ili N-terminusu FVIII proteina ili je umetnut neposredno nizvodno
4
od jedne ili više aminokiseline (npr., jedno ili više ovde obelodanjenih XTEN mesta umetanja) u FVIII proteinu, (2) ili su XTEN sekvenca ili FVIII protein vezani za Ig konstantni region ili njegov deo, (3) VWF fragment je vezan za drugi Ig konstantni region ili njegov deo i (4) Ig konstantni region ili njegov deo vezan za drugi Ig konstantni region ili njegov deo. U jednom slučaju, Ig konstantni region ili njegov deo povezan sa FVIII proteinom ili XTEN sekvencom je dalje povezan sa VWF fragmentom, npr., veznikom za obradu. U drugom slučaju, dodatni Ig konstantni region ili njegov deo koristan za himerne proteine obelodanjenja može se dalje povezati sa FVIII proteinom ili Ig konstantnim regionom ili njegovim delom opcionim veznikom, npr., veznikom za obradu. U nekim slučajevima, par Ig konstantnog regiona ili njegovog dela i dodatnog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela, od kojih je svaki povezan sa VWF fragmentom i FVIII proteinom, pruža vezu jaču od nekovalentne veze između FVIII proteina i fragmenta VWF, tj., kovalentna veza, npr., disulfidna veza, čime sprečava endogeni VWF da zameni VWF fragment in vivo. U drugim slučajevima, bilo jedan ili oba od Ig konstantnog regiona ili njegovog dela i dodatnog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela mogu produžiti poluživot FVIII proteina ili VWF fragmenta. U drugim slučajevima, dodatni Ig konstantni region ili njegov deo sadrže drugi Fc region ili FcRn vezujući partner. Ig konstantni region ili njegov deo i dodatni Ig konstantni region ili njegov deo u himernim proteinima su identični ili različiti.
[0113] U određenim slučajevima, Ig konstantni region ili njegov deo i dodatni Ig konstantni region ili njegov deo su povezani hemijskom vezom ili fizičkom vezom. U jednom slučaju, hemijska veza, tj., (:), je bar jedna nepeptidna veza. U određenom slučaju, hemijska veza, tj., (:), je kovalentna veza. U drugom slučaju, hemijska veza, tj., (:), je nekovalentna interakcija, npr., jonska interakcija, hidrofobna interakcija, hidrofilna interakcija, Van der Waals-ova interakcija ili vodonična veza. U drugom slučaju, (:) je nepeptidna kovalentna veza. U drugom slučaju, (:) je peptidna veza. U drugom slučaju, (:) predstavlja fizičku veza između dve sekvence, gde je deo prve sekvence u neposrednoj blizini druge sekvence, tako da prva sekvenca štiti ili blokira deo druge sekvence u interakciji sa drugim delom. U nekim slučajevima, veza između Ig konstantnog regiona ili njegovog dela i dodatnog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela može biti kovalentna veza, npr. disulfidna veza, koja sprečava zamenu VWF fragmenta ili polipeptida koji sadrži VWF fragment endogenim VWF. Stoga, sprečavanje interakcije između FVIII proteina i endogenog VWF smanjuje ili eliminiše ovaj faktor ograničavanja poluživota za FVIII protein, pa se stoga poluživot FVIII proteina produžava u poređenju sa FVIII proteinom bez VWF proteina ili divlji tip FVIII.
4
[0114] U drugim aspektima, himerni protein obuhvata formulu koja obuhvata:
(1) FVIII(X1)-L1-F1:V-L2-X2-L3-F2;
(2) FVIII(X1)-L1-F1 :F2-L3-X2-L2-V;
(3) F1-L1-FVIII(X1):V-L2-X2-L3-F2;
(4) F1-L1-FVIII(X1):F2-L3-X2-L2-V;
(5) FVIII(X1)-L1-F1-L4-V-L2-X2-L3-F2;
(6) FVIII(X1)-L1-F1-L4-F2-L3-X2-L2-V;
(7) F1-L1-FVIII(X1)-L4-V-L2-X2-L3-F2,
ili
(8) F1-L1-FVIII(X1)-L4- F2-L3-X2-L2-V,
gde FVIII (X1) sadrži FVIII protein i jednu ili više XTEN sekvenci, gde su jedna ili više XTEN sekvenca vezane za N-terminus ili C-terminus FVIII proteina ili su umetnute neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr., jedno ili više ovde obelodanjeno XTEN mesto umetanja) u FVIII proteinu;
svaki od L1, L2 ili L3 sadrži opcioni veznik, npr., razdvojivi veznik;
L4 je veznik, npr., veznik za obradu;
X2 sadrži jednu ili više opcionih XTEN sekvenci;
F1 sadrži prvi Ig konstantni region ili njegov deo;
F2 sadrži drugi Ig konstantni region ili njegov deo, i
V sadrži VWF fragment;
(-) je peptidna veza ili jedna ili više aminokiselina; i
(:) sadrži kovalentnu vezu. U drugim otelotvorenjima, (:) je nepeptidna kovalentna veza. U drugim otelotvorenjima, (:) je peptidna veza. Orijentacija polipeptidnih formula je ovde navedena od N-terminusa (levo) do C-terminusa (desno). Na primer, formula V-X-FVIII označava formulu NH2-V-X-FVIII-COOH. U jednom aspektu, ovde opisane formule mogu da sadrže bilo koje dodatne sekvence između dve grupe. Na primer, formula V-X-FVIII može dalje da sadrži bilo koje sekvence na N-terminusu V između V i X, između X i FVIII, ili na C-terminusu FVIII, ako nije drugačije navedeno. U drugom otelotvorenju, crtica (-) ukazuje na peptidnu vezu.
[0115] U jednom aspektu, himerni protein sadrži dva polipeptidna lanca, (A) prvi lanac koji sadrži (i) jednolančani FVIII protein (ii) XTEN sekvencu i (iii) prvi Ig konstantni region ili njegov deo, npr., prvi Fc region ili FcRn vezujući partner, gde je XTEN sekvenca vezana za FVIII protein na N-terminusu ili C-terminusu ili je umetnuta neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina FVIII proteina (npr., jedno ili više ovde obelodanjenih XTEN mesta umetanja) i prvi Ig konstantni region ili njegov deo je vezan za XTEN sekvencu kada je XTEN sekvenca vezana za FVIII protein na N-terminusu ili C-terminusu ili FVIII protein kada je XTEN sekvenca umetnuta u FVIII protein, i (B) drugi lanac koji sadrži (iv) VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen, (v) veznik i (vi) drugi Ig konstanti region ili njegov deo, npr., drugi Fc region ili drugi FcRn vezujući partner, gde je VWF fragment povezan sa veznikom, npr. razdvojivi veznik, koji je dalje vezan za drugi Ig konstantni region ili njegov deo, i gde su prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac povezani međusobno kovalentnom vezom, npr., disulfidnom vezom. U jednom aspektu, veznik je razdvojivi veznik, ovde opisan na drugom mestu ovde, npr., veznik razdvojiv trombinom. Drugi lanac sadrži jednu ili više XTEN sekvenci između (iv) i (v) ili (v) i (vi).
[0116] U drugim aspektima, himerni protein sadrži jedan polipeptidni lanac koji sadrži (i) jednolančani FVIII protein (ii) XTEN sekvencu, (iii) prvi Ig konstantni region ili njegov deo, npr., prvi Fc region ili prvi FcRn vezujući partner, (iv) prvi veznik, (v) VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen, (vi) drugi veznik i (vii) drugi Ig konstanti region ili njegov deo, npr., drugi Fc region ili drugi FcRn vezujući partner, gde su (i) do (vii) povezani redom ili bilo kojim redosledom. U jednom aspektu, prvi veznik je veznik za obradu, koji se nakon eksprimiranja može intracelularno obrađivati ili razdvojiti i pretvara jedan polipeptidni lanac u dva polipeptidna lanca. U drugom otelotvorenju, drugi veznik je ovde opisan razdvojivi veznik, npr., veznik razdvojiv trombinom. XTEN sekvenca koja se ovde koristi može biti povezana sa FVIII proteinom opcionim veznikom na N-terminusu ili C-terminusu FVIII proteina ili je umetnuta neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr., jedno ili više XTEN mesta umetanja) u FVIII proteinu.
[0117] U određenim slučajevima, himerni protein sadrži tri polipeptidna lanca, (A) prvi polipeptidni lanac koji sadrži (i) teški lanac FVIII proteina i (ii) XTEN sekvencu, koji su međusobno povezani i (B) drugi polipeptidni lanac koji sadrži (iii) laki lanac FVIII proteina i (iv) prvi Ig konstantni region ili njegov deo, npr., prvi Fc region ili prvi FcRn vezujući partner, koji su povezani jedni sa drugima, i (C) treći polipeptidni lanac koji sadrži (v) VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen, (vi) veznik, i (vii) drugi Ig konstantni region ili njegov deo, npr., drugi Fc region ili drugi FcRn vezujući partner, gde je drugi lanac povezan
1
sa prvim i trećim lancem. U jednom slučaju, veza između prvog i drugog lanca je hemijska veza ili fizička veza. Na primer, veza između prvog i drugog lanca može biti metalna veza. U drugom slučaju, veza između drugog i trećeg lanca je takođe hemijska veza ili fizička veza, npr., kovalentna veza ili nekovalentna veza. U određenim slučajevima, veza između drugog i trećeg lanca je kroz dva Ig konstantna regiona ili njihove delove, i u pitanju je disulfidna veza. Vezivanje između drugog i trećeg lanca sprečava ili inhibira vezivanje FVIII proteina sa endogenim VWF, čime se sprečava uklanjanje FVIII proteina od strane VWF puta klirensa. U nekim slučajevima, veznik je veznik za obradu, koji se intracelularno razdvaja nakon eksprimiranja u ćeliji domaćinu. XTEN sekvenca koja se ovde koristi vezuje se za FVIII protein opcionim veznikom na N-terminusu ili C terminusu FVIII proteina ili je umetnuta neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr., jedno ili više XTEN mesta umetanja) u FVIII proteinu.
[0118] U nekim slučajevima, VWF fragment je direktno vezan za FVIII protein, koji sadrži jedan ili više XTEN, peptidnu vezu ili veznika. Kao jedan od načina povezivanja VWF fragmenta i FVIII proteina, u kom su jedan ili više XTEN umetnuti ili povezana direktnom vezom (npr. peptidna veza) ili veznikom, može se koristiti enzimatska ligacija (npr., sortaza). Na primer, sortaza se odnosi na grupu prokariotskih enzima koji modifikuju površinske proteine prepoznavanjem i razdvajanjem karboksi-terminalnog sortirajućeg signala. Za većinu supstrata enzima sortaze, signal za prepoznavanje sastoji se od motiva LPXTG (Leu-Pro-bilo-Thr-Gly (SEQ ID NO: 51), zatim visoko hidrofobne transmembranske sekvence, zatim grupe baznih ostataka kao što je arginin. Razdvajanje dolazi između Thr i Gly, privremenim spajanjem kroz Thr ostatak do aktivnog mesta Cys ostatka ligacijskog partnera, nakon čega sledi transpeptidacija koja protein vezuje kovalentno na ćelijski zid. U nekim slučajevima, partner za ligaciju sadrži Gly(n). U drugim slučajevima, himerni protein dalje sadrži motiv prepoznavanja sortaze. U nekim slučajevima, VWF fragment je vezan za FVIII koji sadrži jedan ili više XTEN koji su umetnuti u ili povezani pomoću sortaze posredovane in vitro vezivanjem proteina.
[0119] U jednom slučaju, VWF fragment povezan sa motivom prepoznavanja sortaze opcionim veznikom može biti spojen za FVIII protein povezan sa Gly(n) sortazom, gde n može biti bilo koji celi broj, i gde je jedan ili više XTEN umetnuto u ili vezan za FVIII protein. Konstrukt ligacije sadrži VWF fragment (N-terminalni deo konstrukta) i FVIII protein, u kom su jedan ili više XTEN umetnuti ili vezani (C-terminalni deo konstrukta), gde
2
je motiv prepoznavanja sortaze umetnut između. Drugi konstrukt ligacije sadrži VWF fragment (N-terminalni deo konstrukta, veznik, motiv prepoznavanja sortaze i FVIII protein, u kom su jedan ili više XTEN umetnuti ili vezani (C-terminalni deo konstrukta). U drugom primeru, FVIII protein povezan sa motivom prepoznavanja sortaze putem opcionog veznika može se spojiti u VWF fragment povezan sa Gly(n) pomoću sortaze, gde je n bilo koji ceo broj. Rezultujući konstrukt ligacije sadrži FVIII protein (N- terminalni deo konstrukta), u kom su jedan ili više XTEN umetnuti ili vezani, i VWF fragment (C-terminalni deo konstrukta), gde je motiv za prepoznavanje sortaze umetnut između. Drugi rezultujući konstrukt vezivanja sadrži FVIII protein (N-terminalni deo konstrukta), u kom su jedan ili više XTEN umetnuti ili vezani, veznik, motiv prepoznavanja sortaze i VWF fragment (C-terminalni deo konstrukta). U drugim slučajevima, VWF fragment vezan za motiv za prepoznavanje sortaze od strane prvog opcionog veznika može se spojiti u heterologni deo, npr., konstantni region imunoglobulina ili njegov deo, npr., Fc region, povezan sa mestom razdvajanja trombina drugim opcionim veznikom. Rezultujući konstrukt može da sadrži VWF fragment (N-terminalni deo), prvi veznik, motiv prepoznavanja sortaze, mesto razdvajanja proteaze, drugi opcioni veznik i heterologni deo.
[0120] U nekim slučajevima, VWF fragment je vezan za FVIII protein. Veza između VWF fragmenta i FVIII proteina može biti hemijska veza ili fizička veza. Hemijska veza može biti nekovalentna interakcija, npr., jonska interakcija, hidrofobna interakcija, hidrofilna interakcija, Van der Waals-ova interakcija ili vodonična veza. U drugim slučajevima, veza FVIII proteina i VWF fragmenta je fizička veza između dve sekvence, npr., zbog dodatne povezanosti između sekvence koja sadrži FVIII protein i sekvence koja ima VWF fragment, gde je deo prve sekvence u neposrednoj blizini druge sekvence tako da prva sekvenca štiti ili blokira deo druge sekvence od interakcije sa drugim delom.
[0121] Kao rezultat sprečavanja ili inhibicije interakcije endogenog VWF sa FVIII proteinom pomoću VWF fragmenta, ovde opisan himerni protein ima produženi poluživot u poređenju sa divljeg tipa FVIII ili odgovarajućim himernim proteinom bez VWF fragmenta. U jednom aspektu, poluživot FVIII proteina produžava se najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili najmanje oko 12 puta u odnosu na FVIII protein bez VWF fragmenta. U drugom otelotvorenju, poluživot FVIII proteina iznosi najmanje oko 10 sati, najmanje oko 11 sati, najmanje oko 12 sati, najmanje oko 13 sati, najmanje oko 14 sati, najmanje oko 15 sati, na najmanje oko 16 sati, najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sat, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati, ili najmanje oko 108 sati. U određenom otelotvorenju, poluživot FVIII proteina produžava se najmanje 10 sati, najmanje oko 11 sati, najmanje oko 12 sati, najmanje oko 13 sati, najmanje oko 14 sati, najmanje oko 15 sati, najmanje oko 16 sati, najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sat, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 26 sati, ili najmanje oko 27 sati kod HemA miševa.
A) Fragmenti Fon Vilebrandovog faktora (VWF)
[0122] VWF (poznat i kao F8VWF) je veliki multimerni glikoprotein prisutan u krvnoj plazmi i proizveden konstitutivno u endotelu (u Weibel-Palade telima), megakariocitima (αgranule trombocita) i subendotelnom vezivnom tkivu. Osnovni VWF monomer je protein 2813 aminokiseline. Svaki monomer sadrži određeni broj specifičnih domena sa određenom funkcijom, D'/D3 domen (koji se vezuje za faktor VIII), A1 domen (koji se vezuje za GPIb receptor trombocita, heparin i/ili eventualno kolagen), A3 domen (koji se vezuje za kolagen), C1 domen (u kom se RGD domen vezuje za trombocitni integrin αIIbβ3 kada je ovo aktivirano), i domen „cisteinskog čvora“ na C-terminalnom kraju proteina (koji VWF deli sa faktorom rasta izvedenim iz trombocita (PDGF), transformišući faktor rasta-β (TGFP) i βljudski horionski gonadotropin (βHCG).
[0123] Izraz „VWF fragment“ kako se ovde koristi uključuje, ali nije ograničen na, funkcionalne VWF fragmente koji sadrže D' domen i D3 domen, koji mogu inhibirati vezivanje endogenog VWF za FVIII. U jednom aspektu, VWF fragment se vezuje za FVIII protein. U drugom otelotvorenju, VWF fragment blokira VWF mesto vezivanja za FVIII protein, čime inhibira interakciju FVIII proteina sa endogenim VWF. VWF fragmenti uključuju derivate, varijante, mutante ili analoge koji zadržavaju ove aktivnosti VWF.
[0124] 2813 monomerna aminokiselinska sekvenca za ljudski VWF je objavljena kao Accession Number_NP_000543.2_ u Genbank. Nukleotidna sekvenca koja kodira ljudski VWF je objavljena kao Accession Number_NM_000552.3_ u Genbank. Nukleotidna
4
sekvenca ljudskog VWF označena je kao SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 2 je aminokiselinska sekvenca kodirana sa SEQ ID NO: 1. Svaki domen od VWF je naveden u Tabeli 1.
TABLE 1. VWF Sekvence
�
�
[0125] VWF fragment kako se ovde koristi može biti VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, gde se VWF fragment vezuje za Faktor VIII (FVIII) i inhibira vezivanje endogenog VWF (VWF pune dužine) za FVIII. VWF fragment koji sadrži D' domen i D3 domen može dalje da sadrži VWF domen izabran iz grupe koju čine A1 domen, A2 domen, A3 domen, D1 domen, D2 domen, D4 domen, B1 domen, B2 domen, B3 domen, C1 domen, C2 domen, CK domen, jedan ili više njihovih fragmenata, i bilo koja njihova kombinacija. U
4
jednom otelotvorenju, VWF fragment sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od: (1) D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; (2) D1, D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; (3) D2, D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; (4) D1, D2, D' i D3 domena VWF ili njihovih fragmenata; ili (5) D1, D2, D' , D3 i A1 domena VWF ili njihovih fragmenata. Ovde opisani VWF fragment ne sadrži mesto koje se vezuje za VWF receptor za uklanjanje. U drugom otelotvorenju, ovde opisani VWF fragment nije aminokiselina 764 do 1274 SEQ ID NO: 2. VWF fragment može da sadrži bilo koje druge sekvence povezane za VWF fragment ili spojene sa njima. Na primer, ovde opisani VWF fragment može dalje da sadrži signalni peptid.
[0126] U jednom aspektu, VWF fragment se vezuje ili je vezan za FVIII protein. Vezivanjem ili povezivanjem sa FVIII proteinom, VWF fragment pronalaska štiti FVIII od razdvajanja proteaze i aktivacije FVIII, stabilizuje teški i laki lanac FVIII i sprečava uklanjanje FVIII od strane skevindžer receptora. U drugom otelotvorenju, VWF fragment se vezuje ili povezuje sa FVIII proteinom i blokira ili sprečava vezivanje FVIII proteina na fosfolipidni i aktivirani protein C. Prevencijom ili inhibiranjem vezivanja FVIII proteina sa endogenim, VWF pune dužine, VWF fragment predmetnog pronalaska smanjuje klirens FVIII pomoću VWF klirens receptora i na taj način produžava poluživot FVIII proteina. U jednom aspektu, produženje poluživota FVIII proteina nastaje usled vezivanja ili povezivanja sa VWF fragmentom kom nedostaje mesto vezivanja VWF klirens receptora na FVIII protein i čuvanjem ili zaštitom FVIII proteina od strane VWF fragmenta od endogenog VWF koji sadrži mesto vezivanja receptora za VWF klirens. FVIII protein vezan za VWF fragment ili zaštićen njime takođe može omogućiti recikliranje FVIII proteina. Eliminacijom mesta vezivanja receptora VWF puta klirensa koja se nalaze u molekulu VWF pune dužine, FVIII/VWF heterodimeri predmetnog pronalaska su zaštićeni od VWF puta klirensa, dodatno produžavajući poluživot FVIII.
[0127] U jednom otelotvorenju, VWF fragment sadrži D' domen i D3 domen VWF, gde je D' domen najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinama 764 do 866 SEQ ID NO: 2, gde VWF fragment sprečava vezivanje endogenog VWF za FVIII. U drugom otelotvorenju, VWF fragment sadrži D' domen i D3 domen VWF, gde je D3 domen najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan aminokiselinama 867 do 1240 od SEQ ID NO: 2, gde VWF fragment sprečava vezivanje endogenog VWF za FVIII. U nekim otelotvorenjima, ovde opisani VWF fragment sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od D' domena i D3 domena VWF, koji su najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identični aminokiselinama 764 do 1240 od SEQ ID NO: 2, gde VWF fragment sprečava vezivanje endogenog VWF za FVIII. U drugim otelotvorenjima, VWF fragment sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od D1, D2, D' i D3 domena najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnih aminokiselinama 23 do 1240 od SEQ ID NO: 2, gde VWF fragment sprečava vezivanje endogenog VWF za FVIII. U još nekim otelotvorenjima, VWF fragment dalje sadrži signalni peptid koji je operativno vezan za njega.
[0128] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment se sastoji od (1) D'D3 domena, D1D'D3 domena, D2D'D3 domena ili D1D2D'D3 domena i (2) dodatne VWF sekvence do oko 10 aminokiselina (npr., bilo koje aminokiselinske sekvence 764 do 1240 od SEQ ID NO: 2 do aminokiselina 764 do 1250 od SEQ ID NO: 2), do oko 15 aminokiselina (npr., bilo koje aminokiselinske sekvence 764 do 1240 od SEQ ID NO: 2 do aminokiselina 764 do 1255 od SEQ ID NO: 2), do oko 20 aminokiselina (npr., bilo koje aminokiselinske sekvence 764 do 1240 od SEQ ID NO: 2 do aminokiselina 764 do 1260 od SEQ ID NO: 2), do oko 25 aminokiselina (npr., bilo koje aminokiselinske sekvence 764 do 1240 od SEQ ID NO: 2 do aminokiselina 764 do 1265 SEQ ID NO: 2), ili do oko 30 aminokiselina (npr., bilo koje aminokiselinske sekvence 764 do 1240 od SEQ ID NO: 2 do aminokiselina 764 do 1260 od SEQ ID NO: 2). U posebnom otelotvorenju, VWF fragment koji sadrži ili se sastoji u osnovi od D' domena i D3 domena nije ni aminokiselina 764 do 1274 od SEQ ID NO: 2, niti zreli VWF pune dužine. U nekim otelotvorenjima, D1D2 domen je eksprimiran u trans sa D'D3 domenom. U nekim otelotvorenjima, D1D2 domen je eksprimiran u cis sa D'D3 domenom.
[0129] U drugim otelotvorenjima, VWF fragment koji sadrži D'D3 domene povezane sa D1D2 domenima dalje sadrži mesto intracelularnog razdvajanja, npr., (mesto razdvajanja sa PACE (furin) ili PC5), omogućavajući razdvajanje D1D2 domena iz D'D3 domena nakon eksprimiranja. Neograničavajući primeri mesta intracelularnog razdvajanja obelodanjeni su na drugim mestima ovde.
[0130] U još nekim otelotvorenjima, VWF fragment sadrži D' domen i D3 domen, ali ne sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine (1) aminokiseline 1241 do 2813 SEQ ID NO: 2, (2) aminokiseline 1270 do aminokiseline 2813 od SEQ ID NO: 2, (3) aminokiseline 1271 do aminokiseline 2813 od SEQ ID NO: 2, (4) aminokiseline 1272 do aminokiseline 2813 od SEQ ID NO: 2, (5) aminokiseline 1273 do aminokiseline 2813 SEQ ID NO: 2, (6) aminokiseline 1274 do aminokiseline 2813 SEQ ID NO: 2, i bilo koje njihove kombinacije.
[0131] U još nekim drugim otelotvorenjima, VWF fragment sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od aminokiselinske sekvence koja odgovara D' domenu, D3 domenu i A1 domenu, gde je aminokiselinska sekvenca najmanje 60%, 70%, 75 %, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 764 do 1479 od SEQ ID NO: 2, gde VWF fragment sprečava vezivanje endogenog VWF za FVIII. U određenom otelotvorenju, VWF fragment nije aminokiselina 764 do 1274 od SEQ ID NO: 2.
[0132] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment sadrži D' domen i D3 domen, ali ne sadrži najmanje jedan VWF domen izabran iz grupe koju čine (1) A1 domen, (2) A2 domen, (3) A3 domen, (4) D4 domen, (5) B1 domen, (6) B2 domen, (7) B3 domen, (8) C1 domen, (9) C2 domen, (10) CK domen, (11) CK domen i C2 domen, (12) CK domen, C2 domen, i C1 domen, (13) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, (14) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, (15) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, i B1 domen, (16) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, B1 domen, i D4 domen, (17) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, B1 domen, D4 domen, i A3 domen, (18) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, B1 domen, D4 domen, A3 domen, i A2 domen, (19) CK domen, C2 domen, C1 domen, B3 domen, B2 domen, B1 domen, D4 domen, A3 domen, A2 domen, i A1 domen, i (20) bilo koja njihova kombinacija.
[0133] U još nekim otelotvorenjima, VWF fragment sadrži D'D3 domene i jedan ili više domena ili modula. Primeri takvih domena ili modula uključuju, ali nisu ograničeni na, domene i module obelodanjene kod Zhour i dr., Blood objavljeno na internetu 6. aprila 2012: DOI 10.1182/blood-2012-01-405134. Na primer, VWF fragment može da sadrži D'D3 domen i jedan ili više domena ili modula izabranih iz grupe koju čine A1 domen, A2 domen, A3 domen, D4N modul, VWD4 modul, C8-4 modul, TIL-4 modul, C1 modul, C2 modul, C3 modul, C4 modul, C5 modul, C5 modul, C6 modul, i sve njihove kombinacije.
[0134] U još nekim otelotvorenjima, VWF fragment je povezan sa heterolognom jedinicom, gde je heterologna grupa vezana za N-terminus ili C-terminus VWF fragmenta ili je umetnuta neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr., jedno ili više XTEN mesta umetanja) FVIII proteina u VWF fragmentu. Na primer, mesta za umetanje heterologne grupe u VWF fragment mogu biti u D' domenu, D3 domenu ili oba. Heterologna grupa može biti produživač poluživota.
[0135] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment formira multimer, npr., dimer, trimer, tetramer, pentamer, heksamer, heptamer ili multimere višeg reda. U drugim otelotvorenjima, VWF fragment je monomer koji ima samo jedan VWF fragment. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment može imati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, brisanja, umetaka ili modifikacija. U jednom otelotvorenju, VWF fragment može da sadrži aminokiselinske supstitucije, brisanja, umetke ili modifikacije tako da VWF fragment nije u stanju da formira disulfidnu vezu ili formira dimer ili multimer. U drugom otelotvorenju, aminokiselinska supstitucija je unutar D' domena i D3 domena. U posebnom otelotvorenju, VWF fragment sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju u ostatku koji odgovara ostatku 1099, ostatku 1142, ili ostacima 1099 i 1142 od SEQ ID NO: 2. Najmanje jedna aminokiselinska supstitucija može biti bilo koja aminokiselina koja se ne javlja prirodno u divljem tipu VWF. Na primer, aminokiselinska supstitucija može biti bilo koja aminokiselina osim cisteina, npr., izoleucin, alanin, leucin, asparagin, lizin, asparaginska kiselina, metionin, fenilalanin, glutaminska kiselina, treonin, glutamin, triptofan, glicin, valin, prolin, serin, tirozin, arginin ili histidin. U drugom primeru, aminokiselinska supstitucija ima jednu ili više aminokiselina koje sprečavaju ili inhibiraju VWF fragmente da formiraju multimere.
[0136] U nekim otelotvorenjima, VWF fragment koji je ovde koristan može se dalje modifikovati kako bi se poboljšala njegova interakcija sa FVIII, npr., za poboljšanje afiniteta vezivanja za FVIII. Kao neograničavajući primer, VWF fragment sadrži serinski ostatak na ostatku koji odgovara aminokiselini 764 od SEQ ID NO: 2 i lizinski ostatak na ostatku koji odgovara aminokiselini 773 od SEQ ID NO: 2. Ostaci 764 i/ili 773 mogu doprineti afinitetu vezivanja VWF fragmenata za FVIII. U drugim otelotvorenjima, VWF fragmenti korisni za pronalazak mogu imati druge modifikacije, npr., protein može da bude pegiliran, glikoziliran, hezilovan ili polisililiran.
B) XTEN sekvence
[0137] Kako se ovde koristi, „XTEN sekvenca“ odnosi se na polipeptide proširene dužine sa prirodno neprekidnim sekvencama koje se uglavnom sastoje od malih hidrofilnih aminokiselina, gde sekvenca ima nizak stepen ili nema sekundarne ili tercijarne strukture u fiziološkim uslovima. Kao partneri himernog proteina, XTEN mogu da posluže kao nosač, dajući određena poželjna farmakokinetička, fizičko-hemijska i farmaceutska svojstva kada su povezani sa VWF fragmentom ili FVIII sekvencom predmetnog pronalaska kako bi stvorili himerni protein. Takva poželjna svojstva uključuju, ali nisu ograničena na poboljšane farmakokinetičke parametre i karakteristike rastvorljivosti. Kako se ovde koristi, „XTEN“ posebno isključuje antitela ili fragmente antitela, kao što su jednolančana antitela ili Fc fragmenti lakog ili teškog lanca.
[0138] U nekim otelotvorenjima, XTEN sekvenca predmetnog pronalaska je peptid ili polipeptid koji ima više od oko 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800 ili 2000 aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, XTEN je peptid ili polipeptid koji ima više od oko 20 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka, više od 30 do oko 2500 ostataka, više od 40 do oko 2000 ostataka, više od 50 do oko 1500 ostataka, više od 60 na oko 1000 ostataka, više od 70 do oko 900 ostataka, više od 80 do oko 800 ostataka, više od 90 do oko 700 ostataka, više od 100 do oko 600 ostataka, više od 110 do oko 500 ostataka, ili više od 120 do oko 400 ostataka.
[0139] XTEN sekvenca predmetnog pronalaska može da sadrži jedan ili više motiva sekvenci od 9 do 14 aminokiselinskih ostataka ili aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu motivu sekvence, gde motiv sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od 4 do 6 vrsta aminokiselina odabranih iz grupe koju čine glicin (G), alanin (A), serin (S), treonin (T), glutamat (E) i prolin (P). Pogledati US 2010-0239554 A1.
[0140] U nekim otelotvorenjima, XTEN sadrži motive sekvence koji se ne preklapaju u kojima se oko 80%, ili najmanje oko 85%, ili najmanje oko 90%, ili oko 91%, ili oko 92%, ili oko 93%, ili oko 94 %, ili oko 95%, ili oko 96%, ili oko 97%, ili oko 98%, ili oko 99%, ili oko 100% sekvence sastoji se od više jedinica sekvenci koje se ne preklapaju, izabranih iz jedne porodice motiva izabranih iz Tabele 2A, što rezultuje porodicom sekvenci. Kako se ovde koristi, „porodica“ znači da XTEN ima motive odabrane samo iz jedne kategorije motiva iz Tabele 2A; tj., AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC ili BD XTEN, i da su bilo koje druge aminokiseline u XTEN iz motiva porodice izabrane kako bi se postigla potrebna osobina, kao što je dopuštanje ugradnje restrikcionog mesta kodiranjem nukleotida, ugradnja sekvence razdvajanja ili za postizanje bolje povezanosti za FVIII ili VWF. U nekim otelotvorenjima XTEN porodica, XTEN sekvenca sadrži više jedinica motiva sekvenci koje se ne preklapaju porodice AD motiva, ili porodice AE motiva, ili porodice AF motiva, ili porodice AG motiva, ili AM porodica motiva, ili porodica AQ motiva, ili BC porodice, ili BD porodice, gde dobijeni XTEN pokazuje raspon homologije opisan iznad. U drugim otelotvorenjima, XTEN sadrži više jedinica sekvenci motiva iz dve ili više porodica motiva iz Tabele 2A. Ove sekvence mogu biti odabrane tako da postignu željene fizičke/hemijske karakteristike, uključujući takva svojstva kao što su neto naboj, hidrofilnost, nedostatak sekundarne strukture ili nedostatak ponavljanja koji su dodeljeni aminokiselinskom sastavu motiva, što je detaljnije opisano u nastavku. U otelotvorenjima opisanim iznad u ovom paragrafu, motivi ugrađeni u XTEN mogu se izabrati i sastaviti koristeći ovde opisane postupke kako bi se postigao XTEN od oko 36 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka.
Tabela 2A. XTEN motivi sekvence 12 aminokiselina i porodice motiva
[0141] XTEN može imati različite dužine za umetanje u ili vezivanje za FVIII ili VWF. U jednom aspektu, dužina XTEN sekvenci se bira na osnovu svojstva ili funkcije koja se treba postići u fuzionom proteinu. U zavisnosti od svojstva ili funkcije koja je namenjena, XTEN može biti sekvenca kratke ili srednje dužine, ili duža sekvenca koja može poslužiti kao nosač. U određenim otelotvorenjima, XTEN uključuje kratke segmente od oko 6 do oko 99 aminokiselinskih ostataka, srednje dužine od oko 100 do oko 399 aminokiselinskih ostataka, i duže dužine od oko 400 do oko 1000 i do oko 3000 aminokiselinskih ostataka. Prema tome, XTEN umetnut u FVIII ili VWF može da ima dužinu od oko 6, oko 12, oko 36, oko 40, oko 42, oko 72, oko 96, oko 144, oko 288, oko 400, oko 500, oko 576, oko 600, oko 700, oko 800, oko 864, oko 900, oko 1000, oko 1500, oko 2000, oko 2500, ili dužinu do oko 3000 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, XTEN sekvence su oko 6 do oko 50, oko 50 do oko 100, oko 100 do 150, oko 150 do 250, oko 250 do 400, oko 400 do oko 500, oko 500 do oko 900, oko 900 do 1500, oko 1500 do 2000, ili oko 2000 do oko 3000 aminokiselinskih ostataka dugačke. Precizna dužina XTEN umetnutog u FVIII ili VWF može varirati bez negativnog uticaja na FVIII aktivnost ili VWF. U jednom aspektu, jedan ili više ovde korišćenih XTEN ima 36 aminokiselina, 42 aminokiselina, 72 aminokiselina, 144
1
aminokiselina, 288 aminokiselina, 576 aminokiselina ili 864 aminokiselina i može se izabrati od jedne ili više porodice XTEN sekvenci; tj., AD, AE, AF, AG, AM, AQ, BC ili BD.
[0142] U nekim otelotvorenjima, XTEN sekvenca koja se koristi u pronalasku je najmanje 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sekvenci izabranoj iz grupe koju čine AE42, AG42, AE48, AM48, AE72, AG72, AE108, AG108, AE144, AF144, AG144, AE180, AG180, AE216, AG216, AE252, AG252, AE288, AG288, AE324, AG324, AE360, AG360, AE396, AG396, AE432, AG432, AE468, AG468, AE504, AG504, AF504, AE540, AG540, AF540, AD576, AE576, AF576, AG576, AE612, AG612, AE624, AE648, AG648, AG684, AE720, AG720, AE756, AG756, AE792, AG792, AE828, AG828, AD836, AE864, AF864, AG864, AM875, AE912, AM923, AM1318, BC864, BD864, AE948, AE1044, AE1140, AE1236, AE1332, AE1428, AE1524, AE1620, AE1716, AE1812, AE1908, AE2004A, AG948, AG1044, AG1140, AG1236, AG1332, AG1428, AG1524, AG1620, AG1716, AG1812, AG1908 i AG2004 Pogledati US 2010-0239554 A1.
[0143] U jednom otelotvorenju, XTEN sekvenca je najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koju čine AE42 (SEQ ID NO: 36), AE72 (SEQ ID NO: 127), AE144_2A (SEQ IDNO: 128), AE144_3B (SEQ ID NO: 129), AE144_4A (SEQ ID NO: 130), AE144_5A (SEQ IDNO: 131), AE144_6B (SEQ IDNO: 132), AG144 A (SEQ ID NO: 133), AG144_B (SEQ IDNO: 134), AG144_C (SEQ ID NO: 135), AG144_F (SEQ IDNO: 136), AE864 (SEQ ID NO: 43), AE576 (SEQ ID NO: 41), AE288 (SEQ IDNO: 39), AE288_2 (SEQ ID NO: 137), AE144 (SEQ ID NO: 37), AG864 (SEQ ID NO: 44), AG576 (SEQ ID NO: 42), AG288 (SEQ ID NO: 40), AG144 (SEQ ID NO: 38), i bilo koje njihove kombinacije.
[0144] U nekim otelotvorenjima, manje od 100% aminokiselina od XTEN je izabrano od glicina (G), alanina (A), serina (S), treonina (T), glutamata (E) i prolina (P), ili manje od 100% sekvence čine motivi sekvence iz Tabele 2A ili XTEN sekvence Tabele 2B. U takvim otelotvorenjima, preostali aminokiselinski ostaci od XTEN su izabrani od bilo koje od ostalih 14 prirodnih L-aminokiselina, ali mogu se poželjno odabrati od hidrofilnih aminokiselina tako da XTEN sekvenca sadrži najmanje oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili bar oko 99% hidrofilnih aminokiselina. Sadržaj hidrofobnih aminokiselina u XTEN korišćenim u konstruktima konjugacije može biti manji od 5%, ili manji od 2%, ili manji od
2
1% sadržaja hidrofobnih aminokiselina. Hidrofobni ostaci koji su manje povoljni za izgradnju XTEN uključuju triptofan, fenilalanin, tirozin, leucin, izoleucin, valin i metionin. Pored toga, XTEN sekvence mogu da sadrže manje od 5% ili manje od 4% ili manje od 3% ili manje od 2% ili manje od 1% ili nijednu od narednih aminokiselina: metionin (na primer, kako bi se izbegla oksidacija) ili asparagin i glutamin (kako bi se izbegla desamidacija).
[0145] U drugom otelotvorenju, XTEN sekvenca je izabrana iz grupe koju čine AE42 (SEQ ID NO: 36), AE72 (SEQ ID NO: 127), AE144_2A (SEQ IDNO: 128), AE144_3B (SEQ ID NO: 129), AE144_4A (SEQ ID NO: 130), AE144_5A (SEQ IDNO: 131), AE144_6B (SEQ IDNO: 132), AG144_A (SEQ ID NO: 133), AG144_B (SEQ IDNO: 134), AG144_C (SEQ ID NO: 135), AG144_F (SEQ IDNO: 136), AE864 (SEQ ID NO: 43), AE576 (SEQ ID NO: 41), AE288 (SEQ IDNO: 39), AE288_2 (SEQ ID NO: 137), AE144 (SEQ ID NO: 37), AG864 (SEQ ID NO: 44), AG576 (SEQ ID NO: 42), AG288 (SEQ ID NO: 40), AG144 (SEQ ID NO: 38), i bilo koja njihova kombinacija. U specifičnom otelotvorenju, XTEN sekvenca je AE288. Aminokiselinske sekvence za određene XTEN sekvence predmetnog pronalaska prikazane su u Tabeli 2B.
TABELA 2B. XTEN Sekvence e
4
[0146] U daljim otelotvorenjima, XTEN sekvenca koja se koristi u pronalasku utiče na fizičko ili hemijsko svojstvo, npr., farmakokinetika himernog proteina predmetnog pronalaska. XTEN sekvenca koja se koristi u predmetnom pronalasku može da pokazuje jedno ili više narednih povoljnih svojstava: konformaciona fleksibilnost, povećana rastvorljivost u vodi, visok stepen otpornosti na proteazu, niska imunogenost, nisko vezivanje za sisarske receptore ili povećani hidrodinamički (ili Stokes) poluprečnici. U specifičnom otelotvorenju, XTEN sekvenca koja je povezana sa FVIII proteinom u predmetnom pronalasku povećava farmakokinetička svojstva kao što je duži terminalni poluživot ili povećana površina ispod krive (AUC), tako da ovde opisani himerni protein ostaje in vivo u dužem vremenskom periodu u poređenju sa divljeg tipa FVIII. U daljim otelotvorenjima, XTEN sekvenca korišćena u predmetnom pronalasku povećava farmakokinetička svojstva kao što su duži terminalni poluživot ili povećana površina ispod krive (AUC), tako da FVIII protein ostaje in vivo u dužem vremenskom periodu u poređenju sa divljeg tipa FVIII.
[0147] Za određivanje fizičkih/hemijskih svojstava proteina koji sadrže XTEN sekvencu mogu se koristiti različiti postupci i ispitivanja. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na analitičko centrifugiranje, EPR, HPLC-jonsku razmenu, HPLC isključenje veličine, obrnutu fazu HPLC, raspršivanje svetlosti, kapilarnu elektroforezu, kružni dihroizam, diferencijalnu skenirajuću kalorimetriju, fluorescenciju, HPLC jonsku razmenu, HPLC isključenje veličine, IR, NMR, Raman spektroskopiju, refraktometriju i UV/Vidljivu spektroskopiju. Dodatni postupci su obelodanjeni kod Amau i dr., Prot Expr and Purif 48, 1-13 (2006).
[0148] Dodatni primeri XTEN sekvenci koje se mogu koristiti prema predmetnom pronalasku i su obelodanjeni u US Objava patenta br.2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, ili 2011/0172146 A1, ili Međunarodna Objava patenta br. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO 2011028229 A1, ili WO 2011028344 A2.
C) Protein Faktora VIII (FVIII)
[0149] „FVIII protein“, kako se ovde koristi, označava funkcionalni FVIII polipeptid u svojoj normalnoj ulozi u koagulaciji, osim ako nije drugačije određeno. Izraz FVIII protein uključuje njegov funkcionalni fragment, varijantu, analog ili derivat koji zadržava funkciju divljeg tipa Faktora VIII pune dužine u putu koagulacije. „FVIII protein“ se koristi naizmenično sa FVIII polipeptidom (ili proteinom) ili FVIII. Primeri funkcija FVIII uključuju, ali nisu ograničeni na, sposobnost aktiviranja koagulacije, sposobnost da deluje kao kofaktor za faktora IX ili sposobnost formiranja kompleksa tenaze sa faktorom IX u prisustvu Ca<2+>i fosfolipida koji potom pretvaraju Faktor X u aktivirani oblik Xa. FVIII protein može biti ljudski, svinjski, pasji, pacovski ili mišji FVIII protein. Pored toga, poređenjem FVIII od ljudi i drugih vrsta utvrđeni su sačuvani ostaci koji će verovatno biti potrebni za funkcionisanje (Cameron i dr., Thromb. Haemost.79:317-22 (1998); US 6,251,632).
[0150] Na raspolaganju su brojni testovi za procenu funkcije koagulacionog sistema: test aktiviranog parcijalnog vremena tromboplastina (aPTT), hromogeni test, ROTEM test, test protrombinskog vremena (PT) (takođe korišćen za određivanje INR), ispitivanje fibrinogena (često pomoću Clauss-ovg postupka), brojanje trombocita, ispitivanje funkcije trombocita (često pomoću PFA-100), TCT, vreme krvarenja, test mešanja (da li se abnormalnost ispravlja ako se pacijentova plazma meša sa normalnom plazmom), analize faktora koagulacije, antifosfolipidna antitela, D- dimer, genetski testovi (npr., faktor V Leiden, protrombinska mutacija G20210A), vreme razblaženog otrova raselove ljutice (dRVVT), razni testovi trombocitnih funkcija, tromboelastografija (TEG ili Sonoclot), tromboelastometrija (TEM®, npr., ROTEM®), ili vreme lize euglobulina (ELT).
[0151] APTT test je indikator performansi koji meri efikasnost i „unutrašnjeg“ (što se takođe odnosi na dodiri put aktivacije) i zajedničkog puta koagulacije. Ovaj test se obično koristi za merenje aktivnosti koagulacije komercijalno dostupnih rekombinantnih faktora koagulacije, npr., FVIII ili FIX. Koristi se zajedno sa protrombinskim vremenom (PT), koje meri spoljni put.
[0152] ROTEM analiza pruža informacije o celokupnoj kinetici hemostaze: vremenu koagulacije, stvaranju ugrušaka, stabilnosti ugrušaka i lizi. Različiti parametri u tromboelastometriji zavise od aktivnosti plazmatičnog sistema koagulacije, funkcije trombocita, fibrinolize ili mnogih faktora koji utiču na ove interakcije. Ovaj test može pružiti kompletan pregled sekundarne hemostaze.
[0153] Poznati su FVIII polipeptidni i polinukleotidni nizovi, kao i mnogi funkcionalni fragmenti, mutanti i modifikovane verzije. Primeri ljudskih FVIII sekvenci (pune dužine) su prikazani u nastavku.
TABELA 3. Aminokiselinske sekvence Faktora VIII pune dužine
�
�
�
[0154] FVIII polipeptidi uključuju FVIII pune dužine, FVIII pune dužine bez Met na N-terminusu, zreli FVIII (minus signalna sekvenca), zreli FVIII sa dodatnim Met na N-terminusu i/ili FVIII sa potpunim ili delimičnim brisanjem B domena. U nekim otelotvorenjima, varijante FVIII uključuju brisanje B domena, bilo delimično ili potpuno brisanje.
[0155] Sekvenca urođenog zrelog ljudskog FVIII predstavljena je kao SEQ ID NO: 4.
Nativni FVIII protein ima narednu formulu: A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2, gde su A1, A2 i A3 su strukturno povezani „A domeni“, B je „B domen“, C1 i C2 su strukturno povezani „C domeni“, i a1, a2 i a3 su kiseli regioni odstojnici. Pozivajući se na položaj primarne aminokiselinske sekvence u SEQ ID NO: 4, A1 domen ljudskog FVIII proteže se od Ala1 do oko Arg336, a1 region odstojnik se proteže od oko Met337 do oko Val374, A2 domen se proteže od oko Ala375 do oko Tir719, a2 region odstojnik se proteže od oko Glu720 do oko Arg740, B domen se proteže od oko Ser741 do oko Arg 1648, a3 region odstojnik se proteže od oko Glu1649 do oko Arg1689, A3 domen se proteže od oko Ser1690 do oko Leu2025, C1 domen se proteže od oko Gly2026 do Asn2072, i C2 domen se proteže od oko Ser2073 do Tyr2332. Pored određenih mesta proteolitičkog razdvajanja, označavanje mesta granica između domena i regiona FVIII može se razlikovati u različitim referencama u literaturi. Ograničene vrednosti ovde su označene kao približne upotrebom izraza „otprilike".
[0156] Ljudski FVIII gen je izolovan i eksprimiran u ćelijama sisara (Toole, J. J., i dr., Nature 312:342-347 (1984); Gitschier, J., i dr., Nature 312:326-330 (1984); Wood, W. I., i dr., Nature 312:330-337 (1984); Vehar, G. A., i dr., Nature 312:337-342 (1984); WO 87/04187; WO 88/08035; WO 88/03558; i U.S. Pat. No.4,757,006). FVIII aminokiselinska sekvenca je izvedena iz cDNK kao što je prikazano U.S. Pat. No.4,965,199. Pored toga, FVIII sa delimično ili u potpunosti izbrisanim B domenom prikazan je u U.S. Pat. Nos. 4,994,371 i 4,868,112. U nekim otelotvorenjima, ljudski FVIII B domen je zamenjen sa B domenom ljudskog faktora V kao što je prikazano na U.S. Pat. No.5,004,803. cDNK sekvenca koja kodira ljudski faktor VIII i aminokiselinska sekvenca prikazane su u SEQ ID NO: 4 i 5, respektivno US objava prijave br.2005/0100990.
[0157] Svinjska FVIII sekvenca objavljena je kod Toole, J. J., i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5939-5942 (1986). Dalje, kompletna svinjska cDNK sekvenca dobijena PCR amplifikacijom FVIII sekvence iz cDNK biblioteke svinjske slezine je objavljena kod Healey, J. F., i dr., Blood 88:4209-4214 (1996). Hibridni ljudski/svinjski FVIII sa supstitucijama svih domena, svih podjedinica i specifičnih aminokiselinskih sekvenci su obelodanjeni u U.S. Pat. No.5,364,771 od strane Lollar i Runge, i u WO 93/20093. U novije vreme, nukleotidne i odgovarajuće aminokiselinske sekvence A1 i A2 domena svinjskog FVIII i himernog FVIII sa svinjskim A1 i/ili A2 domenima supstituisane za odgovarajuće ljudske domene objavljene su u WO 94/11503. U.S. Pat. No.5,859,204, Lollar, J. S., takođe obelodanjuje svinjske cDNK i izvedene aminokiselinske sekvence. U.S. Pat. No.6,458,563 obelodanjuje svinjski FVIII sa izbrisanim B domenom.
[0158] U.S. Pat. No.5,859,204 do Lollar, J. S. izveštava o funkcionalnim mutantima FVIII koji imaju smanjenu antigenost i smanjenu imunoreaktivnost. U.S. Pat. No.6,376,463 do Lollar, J. S. takođe izveštava o mutantima FVIII koji imaju smanjenu imunoreaktivnost. US Appl. Publ. No.2005/0100990 do Saenko i dr. izveštava o funkcionalnim mutacijama u A2 domenu FVIII.
[0159] U jednom aspektu, FVIII (ili FVIII deo himernog proteina) može biti najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan FVIII aminokiselinskoj sekvenci aminokiselina 1 do 1438 od SEQ ID NO: 6 ili aminokiselina 1 do 2332 od SEQ ID NO: 4 (bez signalne sekvence) ili FVIII aminokiselinske sekvence aminokiselina 1 do 19 od SEQ ID NO: 3 i 1 do 1438 od SEQ ID NO: 6 ili aminokiseline 1 do 19 od SEQ ID NO: 3 i aminokiseline 1 do 2332 od SEQ ID NO: 4 (sa signalnom sekvencom), gde FVIII ima aktivnost koagulacije, npr., aktivira Faktor IX kao kofaktor za pretvaranje Faktora X u aktivirani Faktor X. FVIII (ili FVIII himernog proteina) može biti identičan FVIII aminokiselinskoj sekvenci aminokiselina 1 do 1438 od SEQ ID NO: 6 ili aminokiselina 1 do 2332 SEQ ID NO: 4 (bez signalne sekvence). FVIII može dalje sadržati signalnu sekvencu.
[0160] „B domen“ FVIII, kako se ovde koristi, je isti kao B domen poznat u struci koji je definisan internom identičnosti aminokiselinske sekvence i mesta proteolitičkog razdvajanja npr., ostaci Ser741-Arg1648 ljudskog FVIII pune dužine. Ostali ljudski FVIII domeni su definisani narednim aminokiselinskim ostacima: Al, ostaci Ala1-Arg372; A2, ostaci Ser373-Arg740; A3, ostaci Ser1690-Asn2019; C1, ostaci Lys2020-Asn2172; C2, ostaci Ser2173-Tyr2332. A3-C1-C2 sekvenca uključuje ostatke Ser1690-Tyr2332. Preostala sekvenca, ostaci Glu1649-Arg1689, obično se naziva a3 kiseli region. Mesta granica za sve domene, uključujući B domene, za svinjski, mišji i pseći FVIII takođe su poznate u struci. U jednom aspektu, B domen FVIII se briše („faktor VIII sa izbrisanim B domenom“ ili „BDD FVIII“). Primer BDD FVIII je REFACTO® (rekombinantni BDD FVIII), koji ima istu sekvencu kao Faktor VIII deo u sekvenci u Tabeli 5. (BDD FVIII teški lanac je dvostruko podvučen; B domen je u kurzivu; BDD FVIII laki lanac je običan tekst). Nukleotidna sekvenca koja kodira aminokiselinsku sekvencu iz Tabele 5 (SEQ ID NO: 7) prikazana je u Tabeli 6.
TABELA 5. Aminokiselinski sekvenca Faktora VIII sa izbrisanim B domenom (BDD
FVIII)
�
* Podvučene nukleinske kiseline kodiraju signalni peptid.
[0161] „FVIII sa izbrisanim B domenom“ može imati celokupna ili delimična brisanja objavljena u U.S. Pat. Nos.6,316,226, 6,346,513, 7,041,635, 5,789,203, 6,060,447, 5,595,886, 6,228,620, 5,972,885, 6,048,720, 5,543,502, 5,610,278, 5,171,844, 5,112,950, 4,868,112, i 6,458,563. U nekim otelotvorenjima, FVIII sekvenca sa izbrisanim B domenom predmetnog pronalaska sadrži bilo koje od brisanja koja su obelodanjena u kol.4, kol.4 do kol. 5, redu 28 i primerima 1-5 od U.S. Pat. No.6,316,226 (takođe u US 6,346,513). U drugom otelotvorenju, Faktor VIII sa izbrisanim B domenom je S743/Q1638 Faktor VIII sa izbrisanim B domenom (SQ BDD FVIII) (npr., Faktor VIII koji ima brisanje od aminokiseline 744 do aminokiseline 1637, npr., Faktor VIII koji sadrži aminokiseline 1-743 i aminokiseline 1638-2332 SEQ ID NO: 4, tj., SEQ ID NO: 6). U nekim otelotvorenjima, FVIII sa izbrisanim B domenom predmetnog pronalaska ima brisanje obelodanjeno kol.2, redovi 26-51 i Primeri 5-8 od U.S. Patent No.5,789,203 (takođe US 6,060,447, US 5,595,886, i US 6,228,620). U nekim otelotvorenjima, Faktor VIII sa izbrisanim B domenom ima brisanje opisano u k kol.1, redovi 25 do kol.2, red 40 od US Patent No.5,972,885; kol.
6, redovi 1-22 i primer 1 od U.S. Patent no.6,048,720; kol.2, redovi 17-46 od U.S. Patent No. 5,543,502; kol.4, red 22 do kol.5, red 36 od U.S. Patent no.5,171,844; kol.2, redovi 55-68, Slika 2, i primer 1 od U.S. Patent No.5,112,950; kol.2, red 2 do kol.19, red 21 i table 2 od U.S. Patent No.4,868,112; kol.2, red 1 do kol.3, red 19, kol.3, red 40 do kol.4, red 67, kol. 7, red 43 do kol.8, red 26, i kol.11, red 5 do kol.13, red 39 od U.S. Patent no.
7,041,635; ili kol.4, redovi 25-53, od U.S. Patent No.6,458,563 U nekim otelotvorenjima, FVIII sa izbrisanim B domenom ima brisanje većeg dela B domena, ali ipak sadrži aminoterminalne sekvence B domena koje su neophodne za in vivo proteolitičku obradu primarnog proizvoda translacije u dva polipeptidna lanca, kao što je obelodanjeno WO 91/09122. U
2
nekim otelotvorenjima, FVIII sa izbrisanim B domenom konstruisan je sa brisanjem aminokiselina 747-1638, tj. praktično potpunim brisanjem B domena. Hoeben Hoeben R.C., i dr. J. Biol. Chem.265 (13): 7318-7323 (1990).Faktor VIII sa izbrisanim B domenom takođe može da sadrži brisanje aminokiselina 771-1666 ili aminokiselina 868-1562 iz FVIII.
Meulien P., i dr. Protein Eng. 2(4): 301-6 (1988). Dodatne brisanja B domena koja su deo pronalaska uključuju: brisanje aminokiselina 982 do 1562 ili 760 do 1639 (Toole i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1986) 83, 5939-5942)), 797 do 1562 (Eaton, i dr. Biochemistry (1986) 25:8343-8347)), 741 do 1646 (Kaufman (PCT objavljena prijava pod brojem WO 87/04187)), 747-1560 (Sarver, i dr., DNA (1987) 6:553-564)), 741 do 1648 (Pasek (PCT prijava br.88/00831)), ili 816 do 1598 ili 741 do 1648 (Lagner (Behring Inst. Mitt. (1988) No 82:16-25, EP 295597)). U drugim otelotvorenjima, BDD FVIII uključuje FVIII polipeptid koji sadrži fragmente B domena koji zadržavaju jedno ili više N-vezanih mesta glikozilacije, npr., ostaci 757, 784, 828, 900, 963 ili opciono 943, koji odgovaraju aminokiselinskoj sekvenci FVIII sekvence pune dužine. Primeri fragmenata B domena uključuju 226 aminokiseline ili 163 aminokiseline B domena kako je obelodanjeno kod Miao, H.Z., i dr., Blood 103(a): 3412-3419 (2004), Kasuda, A, i dr., J. Thromb. Haemost.6: 1352-1359 (2008), i Pipe, S.W., i dr., J. Thromb. Haemost. 9: 2235-2242 (2011) (tj., zadržava se prvih 226 aminokiselina ili 163 aminokiselina B domena). U još nekim otelotvorenjima, BDD FVIII dalje sadrži tačku mutaciju na ostatku 309 (od Phe do Ser) kako bi se poboljšalo eksprimiranje BDD FVIII proteina. Pogledati Miao, H.Z., i dr., Blood 103(a): 3412-3419 (2004). U još nekim otelotvorenjima, BDD FVIII uključuje FVIII polipeptid koji sadrži deo B domena, ali ne sadrži jedno ili više mesta razdvajanja furina (npr., Arg1313 i Arg 1648). Pogledati Pipe, S.W., i dr., J. Thromb. Haemost.9: 2235-2242 (2011). Svako od prethodnih brisanja može se izvršiti u bilo kojoj FVIII sekvenci.
[0162] U nekim otelotvorenjima, FVIII ima delimični B domen. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein sa delimičnim B domenom je FVIII 198 (SEQ ID NO: 89). FVIII198 je delimični B domen koji sadrži jednolančani FVIIIFc molekul-226N6. 226 predstavlja 226 aminokiselinu N-terminusa od FVIII B domena, i N6 predstavlja šest mesta N-glikozilacije u B domenu.
[0163] U jednom otelotvorenju, FVIII se razdvaja odmah posle arginina u aminokiselini 1648 (u faktoru VIII ili SEQ ID NO: 4), aminokiselini 754 (u S743/Q1638 Faktoru VIII sa izbrisanim B domenom ili u SEQ ID NO: 6), ili odgovarajućem ostatku arginina (u drugim varijantama), što rezultuje teškim i lakim lancem. U drugom otelotvorenju, FVIII sadrži teški i laki lanac, koji su vezani ili su povezani nekovalentnom vezom posredovanom metalnim jonima.
[0164] U drugim otelotvorenjima, FVIII je jednolančani FVIII koji nije razdvojen odmah nakon arginina u aminokiselini 1648 (FVIII pune dužine ili SEQ ID NO: 4), aminokiselina 754 (u S743/Q1638 FVIII sa izbrisanim B domenom ili SEQ ID NO: 6), ili odgovarajući ostatak arginina (u drugim varijantama). Jednolančani FVIII može da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija. U jednom otelotvorenju, aminokiselinska supstitucija je u ostatku koji odgovara ostatku 1648, ostatku 1645, ili oba, od polipeptida zrelog Faktora VIII pune dužine (SEQ ID NO: 4) ili ostatku 754, ostatku 751, ili oba, od SQ BDD Faktora VIII (SEQ ID NO: 6). Aminokiselinska supstitucija može biti bilo koja aminokiselina osim arginina, npr., izoleucin, leucin, lizin, metionin, fenilalanin, treonin, triptofan, valin, alanin, asparagin, asparaginska kiselina, cistein, glutaminska kiselina, glutamin, glicin, prolin, selenocistein, serin, tirozin, histidin, tarostinin, ornitin, pirinin.
[0165] FVIII se dalje može razdvojiti trombinom i zatim aktivirati kao FVIIIa, i služi kao kofaktor za aktivirani Faktor IX (FIXa). Uz to Aktivirani FIX zajedno sa aktiviranim FVIII formira kompleks Xaze i pretvara Faktor X u aktivirani Faktor X (FXa). Za aktivaciju, FVIII se razdvaja trombinom nakon tri ostatka arginina, u aminokiselinama 372, 740 i 1689 (što odgovara aminokiselinama 372, 740 i 795 u FVIII sekvenci sa izbrisanim B domenom), i razdvajanje stvara FVIIIa koji ima 50kDa A1, 43kDa A2 i 73kDa A3-C1-C2 lance. U jednom otelotvorenju, FVIII protein koristan za predmetni pronalazak je neaktivni FVIII. U drugom otelotvorenju, FVIII protein je aktivirani FVIII.
[0166] Protein koji ima FVIII polipeptid vezan ili povezan sa VWF fragmentom može da sadrži sekvencu koja je najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 4 ili 6, gde sekvenca ima FVIII aktivnost koagulacije, npr., aktiviranje Faktora IX kao kofaktora za pretvaranje Faktora X u aktivirani Faktor X (FXa).
[0167] „Hibridni“ ili „himerni“ polipeptidi i proteini, kako se ovde koriste, uključuju kombinaciju prvog polipeptidnog lanca, npr., VWF fragmenta, opciono spojenog za prvi Ig konstantni region ili njegov deo, sa drugim polipeptidnim lancem, npr.FVIII protein vezan za
4
XTEN sekvencu, opciono spojen za drugi Ig konstantni region ili njegov deo, formirajući tako heterodimer. U drugom otelotvorenju, prvi polipeptid i drugi polipeptid u hibridu povezani su međusobno putem disulfidnih ili drugih kovalentnih veza. Hibridi su opisani, na primer, u US 2004/101740 i US 2006/074199. U drugom otelotvorenju, prvi polipeptid sadrži VWF fragment-XTEN-Fc fuzioni protein, i drugi polipeptid sadrži FVIII-Fc fuzioni protein, što čini hibrid heterodimerom. U daljim otelotvorenjima, prvi polipeptid sadrži VWF fragment-XTEN-Fc fuzioni protein, i drugi polipeptid sadrži FVIII X)-Fc fuzioni protein. Prvi polipeptid i drugi polipeptid su povezani kovalentnom vezom, npr., disulfidnom vezom, između prvog Fc regiona i drugog Fc regiona. Prvi polipeptid i drugi polipeptid mogu se dalje povezati međusobno vezivanjem između VWF fragmenta i FVIII proteina.
[0168] FVIII protein koristan u predmetnom pronalasku može da uključuje FVIII koji ima jednu ili više dodatnih XTEN sekvenci, koje ne utiču na FVIII aktivnost koagulacije. Takve XTEN sekvence mogu biti spojene za C-terminus ili N-terminus FVIII proteina ili umetnute između jednog ili više aminokiselinskih ostataka u FVIII proteinu, gde umetanje ne utiče na FVIII aktivnost koagulacije ili na funkciju FVIII. U jednom otelotvorenju, umeci poboljšavaju farmakokinetička svojstva FVIII proteina (npr., poluživot). U drugom otelotvorenju, umeci mogu da budu višestruki umeci, npr., više od dva, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset umetaka. Primeri mesta umetanja uključuju, ali nisu ograničeni na, mesta navedena u Tabelama 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ili bilo koja njihova kombinacija.
[0169] FVIII protein povezan sa jednom ili više XTEN sekvenci može biti predstavljen kao FVIII(X), FVIII(X1), FVIIU(a→b)X-FVIII(a→b),gde FVIII(a→b)sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od prvog dela FVIII proteina od aminokiselinskog ostatka „a“ do aminokiselinskog ostatka „b"; X ili XI sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od jedne ili više XTEN sekvenci, FVIII(c→d)sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od drugog dela FVIII proteina od aminokiselinskog ostatka „c“ do aminokiselinskog ostatka „d“;
a je N-terminalni aminokiselinski ostatak prvog dela FVIII proteina,
b je C-terminalni aminokiselinski ostatak prvog dela FVIII proteina, ali je takođe i N-terminalni aminokiselinski ostatak dve aminokiseline od mesta umetanja u koja je umetnuta XTEN sekvenca,
c je N-terminalni aminokiselinski ostatak drugog dela FVIII proteina, ali je takođe i C-terminalni aminokiselinski ostatak dve aminokiseline od mesta umetanja u koje je umetnuta XTEN sekvenca i
d je C-terminalni aminokiselinski ostatak FVIII proteina, i
gde prvi deo FVIII proteina i drugi deo FVIII proteina nisu identični jedan sa drugim i imaju dovoljno dužine zajedno, tako da FVIII protein ima FVIII aktivnost koagulacije.
[0170] U jednom otelotvorenju, prvi deo FVIII proteina i drugi deo FVIII proteina su fragmenti SEQ ID NO: 4 [zrela FVIII sekvenca pune dužine] ili SEQ ID NO: 6 [FVIII sa izbrisanim B domenom], npr., N-terminalni deo i C-terminalni deo, respektivno. U nekim otelotvorenjima, prvi deo FVIII proteina sadrži A1 domen i A2 domen FVIII proteina. Drugi deo FVIII proteina sadrži A3 domen, C1 domen i opciono C2 domen. U daljim otelotvorenjima, prvi deo FVIII proteina sadrži A1 domen i A2 domen, i drugi deo FVIII proteina sadrži deo B domena, A3 domen, C1 domen i opciono C2 domen. U još nekim otelotvorenjima, prvi deo FVIII proteina sadrži A1 domen, A2 domen i deo B domena FVIII proteina, i drugi deo FVIII proteina sadrži A3 domen, C1 domen i opciono C2 domen. U još nekim otelotvorenjima, prvi deo FVIII proteina sadrži A1 domen, A2 domen i prvi deo B domena FVIII proteina. Drugi deo FVIII proteina sadrži drugi deo B domena, A3 domen, C1 domen i opciono C2 domen. U nekim otelotvorenjima, dve aminokiseline („b“ i „c“) mogu biti bilo koja ili više mesta umetanja aminokiselinskih ostataka prikazanih u Tabelama 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 i 15. Na primer, „b“ može biti aminokiselinski ostatak neposredno nizvodno od mesta na kom je jedna ili više XTEN sekvenci umetnuta ili povezana, i
„c“ može biti aminokiselinski ostatak neposredno nizvodno od mesta na kome je jedna ili više XTEN sekvenci umetnuta ili povezana. U nekim otelotvorenjima, „a“ je prva zrela aminokiselinska sekvenca FVIII proteina, i „d“ je poslednja aminokiselinska sekvenca FVIII proteina. Na primer, FVIII(a→b)može biti aminokiselinska sekvenca najmanje 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 1 do 745 od SEQ ID NO: 6 [FVIII aminokiselinska sekvenca sa izbrisanim B domenom] ili SEQ ID NO: 4 [FVIII pune dužine] i FVIII(c→d)mogu biti aminokiseline 746 do 1438 od SEQ ID NO: 6 ili aminokiseline 1641 do 2332 od SEQ ID NO: 4, respektivno.
[0171] U nekim aspektima, mesto umetanja u FVIII protein nalazi se u jednom ili više domena FVIII proteina, koji su N-terminus, A1 domen, A2 domen, A3 domen, B domen, C1 domen, domen C2, C-terminus ili dve ili više njihovih kombinacija ili između dva domena FVIII proteina, koji su A1 domen i a1 kiseli region, i a1 kiseli region i A2 domen, A2 domen i a2 kiseli region, a2 kiseli region i B domen, B domen i A3 domen, i A3 domen i C1 domen, C1 domen i C2 domen, ili bilo koja njihova kombinaciju. Na primer, mesta umetanja u koja se XTEN sekvenca može umetnuti izabrana su iz grupe koju čine N-terminus i A1 domen, N-terminus i A2 domen, N-terminus i A3 domen, N-terminus i B domen, N-terminus i C1 domen, N-terminus i C2 domen, N-terminus i C-terminus, domeni A1 i A2, A1 i A3 domeni, A1 i B domeni, A1 i C1 domeni, A1 i C2 domeni, A1 domen i C-terminus, A2 i A3 domeni, A2 i B domeni, A2 i C1 domeni, A2 i C2 domeni, A2 domen i C-terminus, A3 i B domeni, A3 i C1 domeni, A3 i C2 domeni, A3 domen i C-terminus, B i C1 domeni, B i C2 domeni, B domen i C-terminus, C1 i C2 domeni, C1 i C-terminus, C2 domen i C-terminus, i dve ili više njihovih kombinacija. Neograničavajući primeri mesta umetanja navedeni su u Tabelama 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 i 15.
[0172] FVIII protein, u kom je XTEN sekvenca umetnuta neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr., jedno ili više XTEN mesta umetanja) u FVIII proteinu ili je povezana na C-terminusu ili N-terminusu, zadržava FVIII aktivnost nakon povezivanja ili umetanja XTEN sekvence. XTEN sekvenca se može umetnuti u FVIII protein jednom ili više puta, dva puta, tri puta, četiri puta, pet puta ili šest puta tako da umetanja ne utiču na FVIII aktivnost (tj., FVIII protein i dalje zadržava svojstvo koagulacije).
[0173] FVIII protein koristan u predmetnom pronalasku može biti povezan sa jednim ili više XTEN polipeptida na N-terminusu ili C-terminusu FVIII proteina opcionim veznikom ili je umetnut neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina (npr., jedno ili više XTEN mesta umetanja) u FVIII protein od strane jednog ili više opcionih veznika. U jednom otelotvorenju, dva aminokiselinska ostatka u koja je umetnuta XTEN sekvenca ili aminokiselinski ostatak za koji je vezana XTEN sekvenca odgovaraju jednom ili dva aminokiselinska ostatka od SEQ ID NO: 4 [zrela FVIII pune dužine] odabrana iz grupe koju čine ostaci iz Tabele 7, Tabele 8, Tabele 9 i Tabele 10, i bilo koja njihova kombinacija.
[0174] U drugim otelotvorenjima, najmanje jedna XTEN sekvenca je umetnuta u bilo koje jedno ili više XTEN mesta umetanja koja su obelodanjena ovde, ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednom aspektu, najmanje jedna XTEN sekvenca je umetnuta u jedno ili više XTEN mesta umetanja obelodanjenih u jednoj ili više aminokiselina obelodanjenih u Tabeli 7.
TABELA 7: Primerna XTEN mesta za umetanje
1
11
[0175] U nekim otelotvorenjima, jedna ili više XTEN sekvenci su umetnute unutar oko šest aminokiselina nagore ili nadole od aminokiselina 32, 220, 224, 336, 339, 399, 416, 603, 1656, 1711, 1725, 1905 ili 1910, što odgovara SEQ ID NO: 4, ili bilo koja kombinacija toga.
TABELA 8. Primerni rasponi umetanja XTEN
1 2
[0176] U drugim otelotvorenjima, jedna ili više XTEN sekvenci su umetnute neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina koje odgovaraju zrelom ljudskom FVIII pune dužine, izabranog iz grupe koju čine jednog ili više mesta umetanja u Tabeli 9.
TABELA 9. Primerna XTEN mesta ili rasponi za umetanje
1
[0177] U još nekim otelotvorenjima, jedan ili više XTEN su umetnuti u B domen FVIII. U jednom primeru, XTEN je umetnut između aminokiselina 740 i 1640 što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII sekvenca između aminokiselina 740 i 1640 opciono nije prisutna. U drugom primeru, XTEN je umetnut između aminokiselina 741 i 1690 što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII sekvenca između aminokiselina 740 i 1690 opciono nije prisutna. U ostalim primerima, XTEN je umetnut između aminokiselina 741 i 1648 što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII sekvenca između aminokiselina 741 i 1648 opciono nije prisutna. U daljim primerima, XTEN je umetnut između aminokiselina 743 i 1638 što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII sekvenca između aminokiselina 743 i 1638 opciono nije prisutna. U narednim primerima, XTEN je umetnut između aminokiselina 745 i 1656 što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII sekvenca između aminokiselina 745 i 1656 opciono nije prisutna. U nekim primerima, XTEN je umetnut između aminokiselina 745 i 1657 što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII sekvenca između aminokiselina 745 i 1657 opciono nije prisutna. U određenim primerima, XTEN je umetnut između aminokiselina 745 i 1667 što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII sekvenca između aminokiselina 745 i 1667 opciono nije prisutna. U narednim primerima, XTEN je umetnut između aminokiselina 745 i 1686 što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII sekvenca između aminokiselina 745 i 1686 opciono nije prisutna. U još nekim primerima, XTEN je umetnut između aminokiselina 747 i 1642 što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII sekvenca između aminokiselina 747 i 1642 opciono nije prisutna. U narednim primerima, XTEN je umetnut između aminokiselina 751 i 1667 što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII sekvenca između aminokiselina 751 i 1667 opciono nije prisutna.
[0178] U nekim otelotvorenjima, jedna ili više XTEN su umetnuti u jednu ili više aminokiselina neposredno nizvodno od aminokiseline mesta umetanja izabrane iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci u Tabeli 10.
TABELA 10: FVIII XTEN mesta umetanja i oznake konstrukata
1 4
1
1
[0179] U jednom aspektu, jedno ili više XTEN mesta umetanja smešteno je unutar jedne ili više površinski izložene strukture fleksibilne petlje FVIII (npr., permisivna petlja). Na primer, najmanje jedna XTEN sekvenca može biti umetnuta u svaki FVIII „A“ domenu koji sadrži najmanje dve „permisivne petlje“ u koje se može umetnuti najmanje jedan XTEN polipeptid bez eliminisanja prokoagulantne aktivnosti rekombinantnog proteina ili sposobnosti rekombinantnog proteine koji se eksprimiraju in vivo ili in vitro u ćeliji domaćina. Permisivne petlje su regioni koje omogućavaju umetanje najmanje jedne XTEN sekvence uz, između ostalih atributa, visoku izloženost površini ili rastvaraču i veliku konformacijsku fleksibilnost. A1 domen sadrži region permisivne petlje-1 (A1-1) i region permisivne petlje-2 (A1-2), domen A2 sadrži region permisivne petlje-1 (A2-1) i region permisivne petlje-2 (A2-2), A3 domen sadrži region permisivne petlje-1 (A3-1) i region permisivne petlje-2 (A3-2).
[0180] U jednom aspektu, prva permisivna petlja u domenu FVIII A1 (A1-1) nalazi se između beta lanca 1 i beta lanca 2, i druga permisivna petlja u FVIII A2 domenu (A1-2) je smeštena između beta lanca 11 i beta lanca 12. Prva permisivna petlja u domenu FVIII A2 (A2-1) nalazi se između beta lanca 22 i beta lanca 23, i druga permisivna petlja u domenu FVIII A2 (A2-2) nalazi se između beta lanca 32 i beta lanca 33. Prva permisivna petlja u domenu FVIII A3 (A3-1) nalazi se između beta lanca 38 i beta lanca 39, i druga permisivna petlja u FVIII A3 (A3-2) nalazi se između beta lanca 45 i beta lanca 46. U određenim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A1-1 odgovara regionu nativnog zrelog ljudskog FVIII od oko aminokiseline 15 do oko aminokiseline 45 od SEQ ID NO: 4, npr., od oko aminokiseline 18 do približno aminokiseline 41 od SEQ ID NO: 4. U drugim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A1-2 odgovara regionu nativnog zrelog ljudskog FVIII od oko aminokiseline 201 do oko aminokiseline 232 od SEQ ID NO: 4, npr., od oko aminokiseline 218 do približno aminokiseline 229 od SEQ ID NO: 4. U drugim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A2-1 odgovara regionu nativnog zrelog ljudskog FVIII od oko aminokiseline 395 do oko aminokiseline 421 od SEQ ID NO: 4, npr. Od oko aminokiseline 397 do oko aminokiseline
1
418 SEQ ID NO: 4. U još nekim drugim otelotvorenjima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A2-2 odgovara regionu matičnog zrelog čoveka FVIII od oko aminokiseline 577 do oko aminokiseline 635 od SEQ ID NO: 4, npr., od oko aminokiseline 595 do približno aminokiseline 607 SEQ ID NO: 4. U određenim aspektima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A3-1 odgovara regionu nativnog zrelog ljudskog FVIII od oko aminokiseline 1705 do približno aminokiseline 1732 od SEQ ID NO: 4, npr., od oko aminokiseline 1711 do oko aminokiseline 1725 od SEQ ID NO: 4. U daljim otelotvorenjima, površinski izložena, fleksibilna struktura petlje koja sadrži A3-2 odgovara regionu nativnog zrelog ljudskog FVIII od oko aminokiseline 1884 do oko aminokiseline 1917 od SEQ ID NO: 4, npr., od oko aminokiseline 1899 do približno aminokiseline 1911 od SEQ ID NO: 4.
[0181] U drugom otelotvorenju, jedna ili više aminokiselina u koje je umetnuta najmanje jedna XTEN sekvenca je smešten unutar a3 domena, npr., aminokiseline 1649 do 1689, što odgovara zrelom FVIII polipeptidu pune dužine. U posebnom otelotvorenju, XTEN sekvenca je umetnuta između aminokiselina 1656 i 1657 od SEQ ID NO: 4 (zreo FVIII pune dužine). U specifičnom otelotvorenju, FVIII protein koji sadrži XTEN sekvencu umetnutu neposredno nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4 dalje sadrži brisanje od aminokiseline 745 u aminokiselinu 1656 što odgovara SEQ ID NO: 4.
[0182] U nekim otelotvorenjima, jedno ili više mesta umetanja za jedno ili više XTEN umetanja su neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina izabranih iz grupe koju čine: (1) aminokiselina 3, (2) aminokiselina 18, (3) aminokiselina 22, (4) aminokiselina 26, (5) aminokiselina 32, (6) aminokiselina 40, (7) aminokiselina 60, (8) aminokiselina 65, (9) aminokiselina 81, (10) aminokiselina 116, (11) aminokiselina 119, (12) aminokiselina 130, (13) aminokiselina 188, (14) aminokiselina 211, (15) aminokiselina 216, (16) aminokiselina 220, (17) aminokiselina 224, (18) aminokiselina 230, (19) aminokiselina 333, (20) aminokiselina 336, (21) aminokiselina 339, (22) aminokiselina 375, (23) aminokiselina 399, (24) aminokiselina 403, (25) aminokiselina 409, (26) aminokiselina 416, (26) aminokiselina 442, (28) aminokiselina 487, (29) aminokiselina 490, (30) aminokiselina 494, (31) aminokiselina 500, (32) aminokiselina 518, (33) aminokiselina 599, (34) aminokiselina 603, (35) aminokiselina 713, (36) aminokiselina 745, (37) aminokiselina 1656, (38) aminokiselina 1711, (39) aminokiselina 1720, (40) aminokiselina 1725, (41) aminokiselina 1749, (42) aminokiselina 1796, (43) aminokiselina 1802, (44) aminokiselina 1827, (45) aminokiselina
1
1861, (46) aminokiselina 1896, (47) aminokiselina 1900, (48) aminokiselina 1904, (49) aminokiselina 1905, (50) aminokiselina 1910, (51) aminokiselina 1937, (52) aminokiselina 2019, (53) aminokiselina 2068, (54) aminokiselina 2111, (55) aminokiselina 2120, (56) aminokiselina 2171, (57) aminokiselina 2188, (58) aminokiselina 2227, (59) aminokiselina 2277, i (60) dve ili više njihovih kombinacija.
[0183] U jednom otelotvorenju, FVIII protein koristan za pronalazak sadrži dve XTEN sekvence, prvu XTEN sekvencu umetnutu u prvo XTEN mesto umetanja i drugu XTEN umetnutu u drugo XTEN mesto umetanja. Neograničavajući primeri XTEN prvog mesta umetanja i drugog XTEN mesta umetanja su navedeni u Tabeli 11.
TABELA 11. Primerna mesta umetanja za dva XTEN
1
11
[0184] Dva XTEN koja su umetnuta ili povezana sa FVIII proteinom mogu biti identična ili različita. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein koristan za pronalazak sadrži dve XTEN sekvence umetnute u FVIII protein, prvu XTEN sekvencu umetnutu neposredno nizvodno od aminokiseline 745, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugu XTEN sekvencu umetnutu neposredno nizvodno od aminokiseline 2332, što odgovara SEQ ID NO: 4 (C-terminus). U drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26, 40, 1656 ili 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4, i druga XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 403, što odgovara SEQ ID NO: 4. U još nekim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26 ili 40, što odgovara SEQ ID NO: 4, i druga XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 599, što odgovara SEQ ID NO: 4. U još nekim drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je odmah umetnuta nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4, i druga XTEN sekvenca je neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26, 40, 399, 403, 1725, 1720, 1900, 1905, ili 2332, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 1900, što odgovara SEQ ID NO: 4, i druga XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26 ili 40, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26 ili 40, što odgovara SEQ ID NO: 4, i druga XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 399, što odgovara SEQ ID NO: 4. U drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4, i druga XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26 ili 40 što odgovara SEQ ID NO: 4. U još nekim drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4, i druga XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 18 što odgovara SEQ ID NO: 4. U određenom otelotvorenju, FVIII protein sadrži dve XTEN sekvence, prvu XTEN sekvencu umetnutu neposredno nizvodno od aminokiseline 745, što odgovara SEQ ID NO: 4 i drugu XTEN sekvencu umetnutu neposredno nizvodno od aminokiseline 2332, što odgovara SEQ ID NO: 4, gde FVIII protein dalje ima brisanje od aminokiseline 745, što odgovara SEQ ID NO: 4 do aminokiseline 1685, što odgovara SEQ ID NO: 4, mutaciji ili supstitucija u aminokiselini 1680, što odgovara SEQ ID NO: 4, npr., Y1680F, mutacija ili supstitucija u aminokiselini 1648, što odgovara SEQ ID NO: 4, npr., R1648A, ili najmanje dve mutacije ili supstitucije u aminokiselini 1648,, što odgovara SEQ ID NO: 4, npr., R1648A i aminokiselina 1680, što odgovara SEQ ID NO: 4, npr., Y1680F. U specifičnom otelotvorenju, FVIII protein sadrži dve XTEN sekvence, prvi XTEN umetnut neposredno nizvodno od aminokiseline 1656 što odgovara SEQ ID NO: 4 i druga XTEN sekvenca koji je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 2332 od SEQ ID NO: 4, gde FVIII protein dalje ima brisanje od aminokiseline 745 do aminokiseline 1656 što odgovara SEQ ID NO: 4.
[0185] U nekim otelotvorenjima, FVIII protein sadrži tri XTEN sekvence, prvu XTEN sekvencu umetnutu u prvo XTEN mesto umetanja, drugu XTEN sekvencu umetnutu u drugu XTEN sekvencu i treću XTEN sekvencu umetnutu u treće XTEN mesto umetanja. Prva, druga ili treća XTEN sekvenca mogu biti identične ili različite. Prvo, drugo i treće mesto umetanja mogu biti izabrani iz grupe koju čine sva ovde navedena mesta umetanja. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein koji sadrži tri XTEN sekvence može dalje sadržati mutaciju ili supstituciju, npr., aminokiselinu 1648, što odgovara SEQ ID NO: 4, npr., R1648A. Na primer, neograničavajući primeri prvog, drugog i trećeg XTEN mesta umetanja su navedeni u Tabeli 12.
TABELA 12. Primerna mesta umetanja za tri XTEN
[0186] U nekim otelotvorenjima, FVIII protein sadrži tri XTEN sekvence, prvu XTEN sekvencu umetnutu neposredno nizvodno od aminokiseline 26, što odgovara SEQ ID NO: 4, drugu XTEN sekvencu umetnutu nizvodno od aminokiseline 403, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treću XTEN sekvencu umetnutu nizvodno od aminokiseline 1656, 1720 ili 1900, što odgovara SEQ ID NO: 4. U drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 26, što odgovara SEQ ID NO: 4, i druga XTEN sekvenca je umetnuta nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treća XTEN sekvenca je umetnuta nizvodno od aminokiseline 1720 ili 1900, što odgovara SEQ ID NO: 4. U još nekim drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 26, što odgovara SEQ ID NO: 4, druga XTEN sekvenca je umetnuta nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treća XTEN sekvenca je umetnuta nizvodno od aminokiseline 1900 odgovara SEQ ID NO: 4. U još nekim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 403, što odgovara SEQ ID NO: 4, druga XTEN sekvenca je umetnuta nizvodno od aminokiseline 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treća XTEN sekvenca je umetnuta nizvodno od aminokiseline 1720 ili 1900, što odgovara SEQ ID NO: 4. U drugim otelotvorenjima, prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 403 ili 1656, što odgovara SEQ ID NO: 4, druga XTEN sekvenca je umetnuta nizvodno od aminokiseline 1720, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treća XTEN sekvenca je umetnuta nizvodno od aminokiseline 1900, što odgovara SEQ ID NO: 4. U drugim otelotvorenjima,
11
prva XTEN sekvenca je umetnuta neposredno nizvodno od aminokiseline 18, 26, 40, 399, 403, 1711, 1720, 1725, 1900, 1905 ili 1910, što odgovara SEQ ID NO: 4, druga XTEN sekvenca je umetnuta nizvodno od aminokiseline 745 koja odgovara SEQ ID NO: 4 i treća XTEN sekvenca je umetnuta nizvodno od aminokiseline 2332, što odgovara SEQ ID NO: 4.
[0187] U drugim otelotvorenjima, FVIII protein pronalaska sadrži četiri XTEN sekvence, prvu XTEN sekvencu umetnutu na prvo mesto umetanja, drugu XTEN sekvencu umetnutu u drugo mesto umetanja, treću XTEN sekvencu umetnutu u treće mesto umetanja, i četvrtu XTEN sekvencu umetnutu u četvrto mesto umetanja. Prva, druga, treća i četvrta XTEN sekvenca mogu biti identične, različite ili kombinacije toga. U nekim otelotvorenjima, FVIII protein koji sadrži četiri XTEN sekvence može dalje da sadrži mutaciju ili supstituciju, npr., aminokiselina 1648, što odgovara SEQ ID NO: 4, npr., R1648A. Neograničavajući primeri prvog, drugog, trećeg i četvrtog XTEN mesta umetanja navedeni su u Tabeli 13.
TABELA 13. Primerna mesta umetanja za četiri XTEN
11
11
[0188] U nekim otelotvorenjima, FVIII protein sadrži pet XTEN sekvenci, prva XTEN sekvenca je umetnuta u prvo mesto umetanja, druga XTEN sekvenca je umetnuta u drugo mesto umetanja, treća XTEN sekvenca je umetnuta u treće XTEN mesto umetanja, četvrta XTEN sekvenca umetnut u četvrto XTEN mesto umetanja, i peta XTEN sekvenca je umetnuta u peto XTEN mesto umetanja. Prva, druga, treća, četvrta, peta XTEN sekvenca može biti identične, različite ili kombinacije toga. Neograničavajući primeri prvog, drugog, trećeg, četvrtog i petog mesta umetanja navedeni su u Tabeli 14.
TABELA 14. Primerna mesta umetanja za pet XTEN
[0189] U nekim otelotvorenjima, FVIII protein sadrži šest XTEN sekvenci, prva XTEN sekvenca umetnuta u prvo XTEN mesto umetanja, druga XTEN sekvenca je umetnuta u drugo XTEN mesto umetanja, treća XTEN sekvenca umetnuta u treće XTEN mesto umetanja, četvrta XTEN sekvenca umetnuta u četvrto XTEN mesto umetanja, peta XTEN sekvenca umetnuta u petu XTEN mesto umetanja i šesta XTEN sekvenca umetnuta u šesto XTEN mesto umetanja. Prva, druga, treća, četvrta, peta ili šesta XTEN sekvenca mogu biti
11
identične, različite ili kombinacije toga. Primeri šest XTEN mesta za umetanje uključuju, ali nisu ograničeni na mesta umetanja navedena u Tabeli 15.
TABELA 15. Primerna XTEN mesta umetanja za šest XTEN
[0190] U posebnom primeru, prvi XTEN je umetnut između aminokiselina 26 i 27 što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut između aminokiselina 1720 i 1721, što odgovara SEQ ID NO: 4 (zreo FVIII pune dužine). U drugom primeru, prvi XTEN je umetnut između aminokiselina 403 i 404, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut između aminokiselina 1720 i 1721, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim primerima, prvi XTEN je umetnut između aminokiselina 1656 i 1657, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut između aminokiselina 1720 i 1721, što odgovara SEQ ID NO: 4. U drugim primerima, prvi XTEN je umetnut između aminokiselina 26 i 27 odgovara SEQ ID NO: 4, drugi XTEN je umetnut između aminokiselina 1656 i 1657, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treći XTEN je umetnut između aminokiselina 1720 i 1721, što odgovara SEQ ID NO: 4. U daljim otelotvorenjima, prvi XTEN je umetnut između aminokiselina 403 i 404, što odgovara SEQ ID NO: 4, drugi XTEN je umetnut između aminokiselina 1656 i 1657, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treći XTEN je umetnut između aminokiselina 1720 i 1721, što odgovara SEQ ID NO: 4. U drugim otelotvorenjima, prvi XTEN je umetnut između aminokiselina 403 i 404, što odgovara SEQ ID NO: 4, drugi XTEN je umetnut između aminokiselina 1656 i 1657, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treći XTEN je umetnut između aminokiselina 1720 i 1721, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima, prvi XTEN je umetnut između aminokiselina 26 i 27, što odgovara SEQ ID NO: 4, drugi XTEN je umetnut između aminokiselina 1720 i 1721, što odgovara SEQ ID NO: 4, i treći XTEN je umetnut između aminokiselina 1900 i 1901, što odgovara SEQ ID NO: 4. U nekim otelotvorenjima, prvi XTEN je umetnut između aminokiselina 26 i 27, što odgovara SEQ ID NO: 4, i drugi XTEN je umetnut između aminokiselina 1656 i 1657, što odgovara SEQ ID NO: 4, treći XTEN je umetnut između aminokiselina 1720 i 1721, što odgovara SEQ ID NO: 4, i četvrti XTEN je umetnut između 1900 i 1901, što odgovara SEQ ID NO: 4.
11
[0191] U određenom otelotvorenju, XTEN sekvenca je umetnuta između aminokiselina 745 i 746 od Faktora VIII pune dužine ili odgovarajućeg mesta umetanja Faktora VIII sa izbrisanim B domenom.
[0192] U nekim otelotvorenjima, himerni protein pronalaska sadrži dve polipeptidne sekvence, prvu polipeptidnu sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 90%, 95% ili 100% identična sekvenci odabranoj od FVIII-161 (SEQ ID NO: 101), FVIII-169 (SEQ ID NO: 103), FVIII-170 (SEQ ID NO: 102), FVIII-173 (SEQ ID NO: 104); FVIII-195 (SEQ ID NO: 105); FVIII-196 (SEQ ID NO: 106), FVIII-199 (SEQ ID NO: 107), FVIII-201 (SEQ ID NO: 108); FVIII-203 (SEQ ID NO: 109), FVIII-204 (SEQ ID NO: 110), FVIII-205 (SEQ ID NO: 111), FVIII-266 (SEQ ID NO:112), FVIII-267 (SEQ ID NO: 113), FVIII-268 (SEQ ID NO: 114), FVIII-269 (SEQ ID NO: 115), FVIII-271 (SEQ ID NO: 116), ili FVIII-272 (SEQ ID NO: 117) i drugu polipeptidni sekvenca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje oko 80%, 90%, 95% ili 100% identična sekvenci odabranoj od VWF031 (SEQ ID NO: 118), VWF034 (SEQ ID NO: 119) ili VWF -036 (SEQ ID NO: 120).
D) Ig konstantni region ili njegov deo
[0193] VWF fragment ili FVIII protein vezan za XTEN sekvencu predmetnog obelodanjenja mogu dalje da sadrže Ig konstantni region ili njegov deo. Ig konstantni region ili njegov deo može poboljšati farmakokinetička ili farmakodinamička svojstva VWF fragmenta ili FVIII proteina u kombinaciji sa XTEN sekvencom. U nekim otelotvorenjima, Ig konstantni region ili njegov deo produžava poluživot molekula spojenog za Ig konstantni region ili njegov deo.
[0194] Ig konstantni region sastoji se od domena označenih kao CH (konstantnoiteški) domeni (CH1, CH2, itd.). Zavisno od izotipa, (tj. IgG, IgM, IgA, IgD ili IgE), konstantni region može da se sastoji od tri ili četiri CH domena. Neki izotipovi (npr. IgG) konstantnih regiona takođe sadrže zglobni region. Pogledati Janeway i dr.2001, Immunobiology, Garland Publishing, N.Y., N.Y.
[0195] Ig konstantni region ili njegov deo za proizvodnju himernog proteina predmetnog pronalaska može se dobiti iz više različitih izvora. U nekim otelotvorenjima, Ig konstantni region ili njegov deo je izveden iz ljudskog Ig. Međutim, podrazumeva se da Ig konstantni region ili njegov deo može biti dobijen od Ig drugog sisara, uključujući na primer glodara
11
(npr. miš, pacov, zec, zamorac) ili primata koji nije čovek (npr. šimpanza, makaki). Štaviše, Ig konstantni region ili njegov deo može se izvesti iz bilo koje Ig klase, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog Ig izotipa, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom otelotvorenju se koristi ljudski izotip IgGl.
[0196] Razne genske sekvence konstantnih regiona Ig (npr., genske sekvence ljudskog konstantnog regiona) dostupne su u obliku javno dostupnih depozita. Sekvenca domena konstantnog regiona može se izabrati sa određenom efektorskom funkcijom (ili da joj nedostaje određena efektorska funkcija) ili sa određenom modifikacijom kako bi se smanjila imunogenost. Objavljene su mnoge sekvence antitela i gena koji kodiraju antitela i pogodne su sekvence Ig konstantnih regiona (npr., zglobne, CH2 i/ili CH3 sekvence ili njihovi delovi) mogu se izvesti iz ovih sekvenci koristeći tehnike priznate u struci. Genetski materijal dobijen koristeći bilo koji od gore navedenih postupaka može se zatim izmeniti ili sintetisati kako bi se dobili polipeptidi predmetnog pronalaska. Dalje će se razumeti da obim predmetnog pronalaska obuhvata alele, varijante i mutacije DNK sekvence konstantnih regiona.
[0197] Sekvence Ig konstantnog regiona ili njegov deo mogu se klonirati, npr., korišćenjem lančane reakcije polimeraze i prajmera koji su izabrani da amplifikuju domen od interesa. Kako bi klonirali sekvencu Ig konstantnog regiona ili njegovog dela iz antitela, mRNK se može izolovati iz hibridoma, slezine ili limfnih ćelija, reverzno transkribovati u DNK i gene antitela amplifikovanih koristeći PCR. Postupci PCR amplifikacije su detaljno opisani u U.S. Pat. Nos.4,683,195; 4,683,202; 4,800,159; 4,965,188; i u, npr., „PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications” Innis i dr. eds., Academic Press, San Diego, CA (1990); Ho i dr.
1989. Gene 77:51; Horton i dr.1993. Methods Enzymol.217:270). PCR se može inicirati konsenzusnim prajmerima sa konstantnim regionom ili specifičnijim prajmerima na osnovu objavljenih DNK sekvenci teškog i lakog lanca. Kao što je gore razmatrano, PCR se takođe može koristiti za izolovanje DNK klonova koji kodiraju antitela lakim i teškim lancima. U ovom slučaju, biblioteke mogu biti prikazane konsenzusnim prajmerima ili većim homolognim sondama, kao što su sonde za mišji konstantni region. U struci su poznati brojni kompleti prajmera pogodni za amplifikaciju gena antitela (npr., 5' prajmeri zasnovani na N-terminalnoj sekvenci pročišćenih antitela (Benhar i Pastan.1994. Protein Engineering 7:1509); brza amplifikacija cDNK krajeva (Ruberti, F. i dr.1994. J. Immunol. Methods 173:33); liderske sekvence antitela (Larrick i dr.1989 Biochem. Biophys. Res. Commun.
12
160:1250). Kloniranje sekvenci antitela je dalje opisano kod Newman i dr., U.S. Pat. No. 5,658,570, podneseno 25. januara 1995.
[0198] Ig konstantni region koji se ovde koristi može obuhvatati sve domene i zglobni region ili njihove delove. U jednom otelotvorenju, Ig konstantni region ili njegov deo sadrži CH2 domen, CH3 domen i zglobni region, tj. Fc region ili FcRn vezujući partner.
[0199] Kako se ovde koristi, izraz „Fc region“ je definisan kao deo polipeptida koji odgovara Fc regionu nativnog Ig, tj. kao što je formirano dimernim povezivanjem respektivnih Fc domena njegova dva teška lanca. Nativni Fc region formira homodimer sa drugim Fc regionom. Suprotno tome, izraz „genetski spojen Fc region“ ili „jednolančani Fc region“ (scFc region), kako se ovde koristi, odnosi se na sintetički dimerni Fc region koji se sastoji od Fc domena genetski povezanih u jednom polipeptidnom lancu (tj., kodirani u jedinstvenoj genetskoj sekvenci).
[0200] U jednom aspektu, „Fc region“ se odnosi na deo jednog teškog Ig teškog lanca koji počinje u zglobnom regionu tik iznad mesta razdvajanja papaina (tj. Ostatak 216 u IgG, uzimajući da je prvi ostatak konstantnog regiona teškog lanca 114) i završava se na C-terminusu antitela. Shodno tome, kompletan Fc domen sadrži najmanje zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen.
[0201] Fc region Ig konstantnog regiona, zavisno od Ig izotipa, može obuhvatati CH2, CH3 i CH4 domene, kao i zglobni region. Himerni proteini koji sadrže Fc region Ig daju nekoliko poželjnih svojstava himernom proteinu uključujući povećanu stabilnost, povećani poluživot u serumu (pogledati Capon i dr., 1989, Nature 337:525) kao i vezivanje za Fc receptore kao što je neonatalni Fon receptor (FcRn) (U.S. Pat. Nos.6,086,875, 6,485,726, 6,030,613; WO 03/077834; US2003-0235536A1).
[0202] Ig konstantni region ili njegov deo može biti FcRn vezujući partner. FcRn je aktivan u epitelnim tkivima odraslih i eksprimira se u lumenu creva, plućnim disajnim putevima, nosnim površinama, vaginalnim površinama, debelom crevu i rektalnoj površini (U.S. Pat. No. 6,485,726). FcRn vezujući partner je deo Ig koji se vezuje za FcRn.
[0203] FcRn receptor je izolovan od nekoliko vrsta sisara, uključujući ljude. Poznate su sekvence ljudskog FcRn, majmunskog FcRn, pacovskog FcRn i mišjeg FcRn (Story i dr. 1994, J. Exp. Med.180:2377). FcRn receptor vezuje IgG (ali ne i druge klase Ig kao što su IgA, IgM, IgD i IgE) pri relativno niskom pH, aktivno transportuje IgG transcelularno u luminalnom ka seroznom smeru, i zatim oslobađa IgG pri relativno višem pH koji se nalazi u međuprostornoj tečnosti. eksprimira se u epitelnom tkivu odraslih (U.S. Pat. Nos.6,485,726, 6,030,613, 6,086,875; WO 03/077834; US2003-0235536A1) uključujući plućni i crevni epitel (Israel i dr.1997, Immunology 92:69), bubrežni proksimalni tubularni epitel (Kobayashi i dr.2002, Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282:F358) kao i nazalni epitel, vaginalne površine i površine bilijarnog stabla.
[0204] FcRn vezujući partneri korisni u predmetnom pronalasku obuhvataju molekule koje FcRn receptor može specifično da veže, uključujući čitav IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente koji uključuju kompletni vezujući region FcRn receptora. Region Fc dela IgG koji se vezuje za FcRn receptor opisan je na osnovu kristalografije rendgenskih zraka (Burmeister i dr.1994, Nature 372:379). Glavni region dodira Fc sa FcRn je blizu spoja domena CH2 i CH3. Svi Fc-FcRn dodiri su unutar jednog teškog lanca Ig. FcRn vezujući partneri uključuju ceo IgG, Fc fragment IgG i druge fragmente IgG koji uključuju kompletan FcRn vezujući region. Glavna dodirna mesta uključuju aminokiselinske ostatke 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 od CH2 domena i aminokiselinske ostatke 385-387, 428 i 433-436 od CH3 domena. Upućivanja na aminokiselinsko numerisanje Ig ili Ig fragmenata, ili region, zasnivaju se na Kabat i dr.1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S.
Department of Public Health, Bethesda, Md.
[0205] Fc region ili FcRn vezujući partneri vezani za FcRn mogu se efikasno prebaciti preko epitelijskih barijera, tako što pružaju neinvazivni način za sistemsku primenu željenog terapijskog molekula. Pored toga, fuzioni proteini koji sadrže Fc region ili FcRn vezujući partner su endocitozirani od strane ćelija koje eksprimiraju FcRn. Ali umesto da budu obeleženi za razgradnju, ovi fuzioni proteini se ponovo recikliraju nazad u cirkulaciju i na taj način povećavaju in vivo poluživot ovih proteina. U nekim otelotvorenjima, delovi Ig konstantnih regiona su Fc region ili FcRn vezujući partner koji se obično povezuje, disulfidnim vezama i drugim nespecifičnim interakcijama, sa drugim Fc regionom ili drugim FcRn vezujućim partnerom radi formiranja dimera i multimera višeg reda.
[0206] Dva FcRn receptora mogu da vežu jedan molekul Fc. Kristalografski podaci sugerišu da svaki molekul FcRn vezuje jedan polipeptid Fc homodimera. U jednom otelotvorenju, povezivanje FcRn vezujućeg partnera, npr., Fc fragmenta od IgG, u biološki aktivni molekul pruža način za isporuku biološki aktivnog molekula oralno, bukalno, sublingvalno, rektalno, vaginalno, kao aerosol koji se primenjuje nazalno ili plućnim putem, ili očnim putem. U drugom otelotvorenju, himerni protein može se primeniti invazivno, npr., potkožno, intravenski.
[0207] Region FcRn vezujućeg partnera je molekul ili njegov deo koji se može specifično vezati za FcRn receptor sa posledičnim aktivnim transportom od FcRn receptora od Fc regiona Fc. Specifično se odnosi na dva molekula koja formiraju kompleks koji je relativno stabilan u fiziološkim uslovima. Specifično vezivanje karakteriše visoki afinitet i nizak do umeren kapacitet, za razliku od nespecifičnog vezivanja koje obično ima nizak afinitet sa umerenim do visokim kapacitetom. Obično se vezivanje smatra specifičnim kada je konstanta afiniteta KA veća od 10<6>M<-1>ili veća od 10<8>M<-1>. Ako je potrebno, nespecifično vezivanje može se smanjiti bez znatnog uticaja na specifično vezivanje, promenom uslova vezivanja. Stručnjak u oblasti može koristeći rutinske tehnike da optimizuje odgovarajuće uslove vezivanja kao što su koncentracija molekula, jonska jačina rastvora, temperatura, vreme dozvoljeno za vezivanje, koncentracija agensi za blokiranje (npr. album od seruma, mlečni kazein), itd.
[0208] U određenim otelotvorenjima, himerni protein pronalaska sadrži jedan ili više skraćenih Fc regiona koji su ipak dovoljni da daju svojstva vezivanja Fc receptora (FcR) Fc regionu. Na primer, deo Fc regiona koji se vezuje za FcRn (tj. deo za vezivanje FcRn) sadrži otprilike aminokiseline 282-438 od IgGl, EU numerisanje (gde su primarna dodirna mesta aminokiseline 248, 250-257, 272, 285, 288, 290-291, 308-311 i 314 od ostaci CH2 i aminokiselina 385-387, 428 i 433-436 domena CH3. Dakle, Fc region pronalaska može da sadrži ili se sastoji od FcRn vezujućeg dela. FcRn vezujući delovi mogu biti izvedeni iz teških lanaca bilo kog izotipa, uključujući IgGl, IgG2, IgG3 i IgG4. U jednom otelotvorenju se koristi FcRn vezujući deo iz antitela ljudskog izotipa IgG4.
[0209] U drugom otelotvorenju, „Fc region“ uključuje aminokiselinsku sekvencu Fc domena ili je izveden iz Fc domena. U nekim otelotvorenjima, Fc region sadrži najmanje jedan od: zglobni (npr., gornji, srednji i/ili donji zglobni region) domen (oko aminokiselina 216-230 od Fc regiona antitela prema EU numeraciji), CH2 domen (oko aminokiselina 231-340 od Fc
12
regiona antitela prema EU numeraciji), CH3 domen (oko aminokiselina 341-438 od Fc regioni antitela prema EU numeraciji), CH4 domen, ili njegova varijanta, deo ili fragment. U drugim otelotvorenjima, Fc region sadrži kompletan Fc domen (tj. zglobni domen, CH2 domen i CH3 domen). U nekim otelotvorenjima, Fc region sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od zglobnog domena (ili njegovog dela) spojenog za CH3 domen (ili njegov deo), zglobni domen (ili njegov deo) spojen za CH2 domen (ili njegov deo), CH2 domen (ili njegov deo) spojen za CH3 domen (ili njegov deo), CH2 domen (ili njegov deo) spojen za zglobni domen (ili njegov deo) i CH3 domen (ili njegov deo). U još nekim otelotvorenjima, Fc regionu nedostaje bar deo CH2 domena (npr., celokupni ili deo CH2 domena). U određenom otelotvorenju, Fc region sadrži ili se sastoji od aminokiselina koje odgovaraju EU brojevima 221 do 447.
[0210] Fc regioni označeni kao F, F1 ili F2 ovde mogu biti dobijeni iz više različitih izvora. U jednom aspektu, Fc region polipeptida je izveden iz ljudskog Ig. Međutim, podrazumeva se da Fc region može da se dobije iz Ig druge vrste sisara, uključujući na primer glodara (npr. miš, pacov, zec ili zamorac) ili primata koji nije čovek (npr. šimpanze, makaki). Štaviše, polipeptid Fc domena ili njegovi delovi mogu da se dobije iz bilo koje klase Ig, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i bilo kog Ig izotipa, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. U drugom otelotvorenju se koristi ljudski izotip IgG1.
[0211] U nekim otelotvorenjima, varijanta Fc daje promenu u najmanje jednoj efektorskoj funkciji koju daje Fc region koji sadrži pomenuti Fc domen divljeg tipa (npr., poboljšanje ili smanjenje sposobnosti Fc regiona da se vezuje za Fc receptore (npr. FcγRI, FcγRII ili FcγRIII) ili proteina komplementa (npr. C1q), ili da izazove citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), fagocitozu ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDCC)). U drugim otelotvorenjima, Fc varijanta pruža sintetički ostatak cisteina.
[0212] Fc regioni pronalaska mogu da koriste Fc varijante poznate u struci za koje se zna da unose promenu (npr., poboljšanje ili smanjenje) efektorske funkcije i/ili FcR ili FcRn vezivanje. Specifično, vezujući molekul pronalaska može obuhvatati, na primer, promenu (npr., supstituciju) na jednom ili više aminokiselinskih položaja obelodanjenih u Međunarodna PCT Publications WO88/07089A1, WO96/14339A1, WO98/05787A1, WO98/23289A1, WO99/51642A1, WO99/58572A1, WO00/09560A2, WO00/32767A1, WO00/42072A2, WO02/44215A2, WO02/060919A2, WO03/074569A2, WO04/016750A2, WO04/029207A2, WO04/035752A2, WO04/063351A2, WO04/074455A2, WO04/099249A2, WO05/040217A2, WO04/044859, WO05/070963A1, WO05/077981A2, WO05/092925A2, WO05/123780A2, WO06/019447A1, WO06/047350A2, i WO06/085967A2; US Objava patenta br. US2007/0231329, US2007/0231329, US2007/0237765, US2007/0237766, US2007/0237767, US2007/0243188, US20070248603, US20070286859, US20080057056 ; ili US Patents 5,648,260; 5,739,277; 5,834,250;
5,869,046; 6,096,871; 6,121,022; 6,194,551; 6,242,195; 6,277,375; 6,528,624; 6,538,124; 6,737,056; 6,821,505; 6,998,253; 7,083,784; 7,404,956, i 7,317,091. U jednom otelotvorenju, specifična promena (npr., specifična supstitucija jedne ili više aminokiselina obelodanjenih u struci) može se izvršiti na jednom ili više obelodanjenih aminokiselinskih položaja. U drugom otelotvorenju, drugačija promena na jednom ili više obelodanjenih aminokiselinskih položaja (npr., može se izvršiti različita supstitucija jednog ili više aminokiselinskih položaja otkrivenih u struci).
[0213] Fc region ili FcRn vezujući partner od IgG može se modifikovati u skladu sa dobro prepoznatim postupcima, kao što je mutageneza usmerena na mesto i slično, kako bi se modifikovani fragmenti IgG ili Fc ili njihovi delovi povezali za FcRn. Takve modifikacije uključuju modifikacije udaljene od FcRn dodirnih mesta kao i modifikacije unutar dodirnih mesta koje čuvaju ili čak poboljšavaju vezivanje za FcRn. Na primer, naredni pojedinačni aminokiselinski ostaci u ljudskom IgG1 Fc (Fc γ1) mogu da se supstituišu bez značajnog gubitka afiniteta vezivanja Fc za FcRn: P238A, S239A, K246A, K248A, D249A, M252A, T256A, E258A, T260A, D265A, S267A, H268A, E269A, D270A, E272A, L274A, N276A, Y278A, D280A, V282A, E283A, H285A, N286A, T289A, K290A, R292A, E293A, E294A, Q295A, Y296F, N297A, S298A, Y300F, R301A, V303A, V305A, T307A, L309A, Q311A, D312A, N315A, K317A, E318A, K320A, K322A, S324A, K326A, A327Q, P329A, A330Q, P331A, E333A, K334A, T335A, S337A, K338A, K340A, Q342A, R344A, E345A, Q347A, R355A, E356A, M358A, T359A, K360A, N361A, Q362A, Y373A, S375A, D376A, A378Q, E380A, E382A, S383A, N384A, Q386A, E388A, N389A, N390A, Y391F, K392A, L398A, S400A, D401A, D413A, K414A, R416A, Q418A, Q419A, N421A, V422A, S424A, E430A, N434A, T437A, Q438A, K439A, S440A, S444A, i K447A, gde na primer P238A predstavlja divlji tip prolina koji je supstituisan na položaju broj 238. Kao primer, konkretno otelotvorenje uključuje N297A mutaciju, uklanjajući visoko očuvano mesto N-glikozilacije. Pored alanina, druge aminokiseline mogu biti supstituisane za divlje vrste aminokiselina na gore navedenim položajima. Mutacije se mogu uvesti pojedinačno u Fc, što dovodi do više od
12
stotinu Fc regiona koji se razlikuju od matičnih Fc. Pored toga, kombinacije dve, tri ili više ovih pojedinačnih mutacija mogu se uvesti zajedno, što stvara dodatne stotine Fc regiona. Štaviše, jedan od Fc regiona konstrukta predmetnog pronalaska može biti mutiran, dok drugi Fc region konstrukta može uopšte da ne bude mutiran, ili oba mogu biti mutirani, ali sa različitim mutacijama.
[0214] Neke od gore navedenih mutacija mogu dodeliti novu funkcionalnost Fc regionu ili FcRn vezujućem partneru. Na primer, jedna varijanta uključuje N297A, uklanjajući visoko očuvano mesto N-glikozilacije. Efekat ove mutacije je da smanji imunogenost, poboljšavajući na taj način poluživot u cirkulaciji Fc regiona, i da učini da Fc region ne bude sposoban da se vezuje za FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB i FcγRIIIA, i da ne ugrozi afinitet za FcRn (Routledge i dr. 1995, Transplantation 60:847; Friend i dr.1999, Transplantation 68:1632; Shields i dr. 1995, J. Biol. Chem.276:6591). Kao dodatni primer nove funkcionalnosti koja proizilazi iz gore opisanih mutacija, afinitet za FcRn u nekim slučajevima može biti veći od divljeg tipa. Ovaj povećani afinitet može odražavati povećanu „on“ stopu, smanjenu „off“ stopu ili i povećanu „on“ stopu i smanjenu „off“ stopu. Primeri mutacija za koje se veruje da daju povećani afinitet za FcRn uključuju, ali nisu ograničeni na, T256A, T307A, E380A i N434A (Shields i dr.2001, J. Biol. Chem. 276:6591).
[0215] Pored toga, čini se da najmanje tri ljudska Fc gama receptora prepoznaju mesto vezivanja za IgG unutar donjeg zglobnog regiona, obično aminokiseline 234-237. Zbog toga, drugi primer nove funkcionalnosti i potencijalne smanjene imunogenosti može nastati mutacijama ovog regiona, na primer zamenom aminokiselina 233-236 ljudskog IgG1 „ELLG“ odgovarajućom sekvencom iz IgG2 „PVA“ (sa jednim brisanjem aminokiseline). Pokazano je da se FcγRI, FcγRII i FcγRIII, koji posreduju različite efektorske funkcije, neće vezati za IgG1 kada su takve mutacije uvedene. Ward i Ghetie 1995, Therapeutic Immunology 2:77 and Armour i dr.1999, Eur. J. Immunol. 29:2613.
[0216] U jednom aspektu, Ig konstantni region ili njegov deo, npr., Fc region, je polipeptid koji uključuje sekvencu PKNSSMISNTP (SEQ ID NO: 52) i opciono dalje uključuje sekvencu odabranu od HQSLGTQ (SEQ ID NO: 53), HQNLSDGK (SEQ ID NO: 54), HQNISDGK (SEQ ID NO: 55), ili VISSHLGQ (SEQ ID NO: 56) (U.S. Pat. No.5,739,277).
[0217] U drugom otelotvorenju, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo sadrže
12
aminokiselinsku sekvencu u zglobnom regionu ili njegovom delu, koja formira jednu ili više disulfidnih veza sa drugim konstantnim regionom imunoglobulina ili njegovim delom.
Disulfidna veza sa konstantnim regionom imunoglobulina ili njegovim delom postavlja prvi polipeptid koji sadrži FVIII, i drugi polipeptid koji sadrži VWF fragment zajedno, tako da endogeni VWF ne zamenjuje VWF fragment i ne vezuje se za FVIII. Zbog toga, disulfidna veza između prvog konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela i drugog konstantnog regiona imunoglobulina ili njegovog dela sprečava interakciju između endogenog VWF i FVIII proteina. Ova inhibicija interakcije između VWF i FVIII proteina omogućava da poluživot FVIII proteina pređe granicu od dva puta. Zglobni region ili njegov deo mogu se dalje povezati sa jednim ili više domena CH1, CH2, CH3, njihovim fragmentom i bilo kojom njihovom kombinacijom. U posebnom otelotvorenju, konstantni region imunoglobulina ili njegov deo je zglobni region i CH2.
[0218] U određenim otelotvorenjima, Ig konstantni region ili njegov deo je hemi-glikoziliran. Na primer, himerni protein koji sadrži dvi Fc regiona ili FcRn vezujuće partnere može da sadrži prvi, glikoziliran, Fc region (npr., glikozilirani CH2 region) ili FcRn vezujući partner i drugi, aglikozilirani, Fc region (npr., aglikozilirani CH2 region) ili FcRn vezujući partner. U jednom aspektu, veznik može biti smešten između glikoziliranog i aglikoziliranog Fc regiona. U drugom otelotvorenju, Fc region ili FcRn vezujući partner je u potpunosti glikoziliran, tj. svi Fc regioni su glikozilirani. U drugim otelotvorenjima, Fc region može biti aglikoziliran, tj. nijedan od Fc delova nije glikoziliran.
[0219] U nekim otelotvorenjima, himerni protein predmetnog pronalaska sadrži aminokiselinsku supstituciju u konstantnom regionu Ig ili njegovom delu (npr., Fc varijante), koji menja antigen-nezavisne efektorske funkcije Ig konstantnog regiona, naročito poluživot proteina u cirkulaciji.
[0220] Takvi proteini pokazuju ili povećano ili smanjeno vezivanje za FcRn u poređenju sa proteinima kojima nedostaju ove supstitucije i, prema tome, imaju povećan ili smanjen poluživot u serumu, respektivno. Očekuje se da Fc varijante sa poboljšanim afinitetom za FcRn imaju duži poluživot u serumu, i takvi molekuli imaju korisne primene u postupcima tretmana sisara gde je poželjan dugi poluživot primenjenog polipeptida, npr., za tretman hronične bolesti ili poremećaja (pogledati npr., US Patents 7,348,004, 7,404,956, i 7,862,820). Suprotno tome, očekuje se da varijante Fc sa smanjenim afinitetom vezivanja
12
FcRn imaju kraći poluživot, i takvi molekuli su takođe korisni, na primer, za primenu sisaru gde može biti korisno skraćeno vreme cirkulacije, npr. za in vivo dijagnostičko snimanje ili u situacijama kada početni polipeptid ima toksične sporedne efekte kada je prisutan u cirkulaciji duže vreme. Fc varijacije sa smanjenim afinitetom vezivanja FcRn takođe imaju manju verovatnoću da prelaze preko placente i tako su takođe korisne u tretmanu bolesti ili poremećaja kod trudnica. Pored toga, druge primene u kojima smanjeni afinitet vezivanja FcRn može biti poželjan uključuju one primene u kojima se želi lokalizacija mozga, bubrega i/ili jetre. U jednom oglednom primeru, himerni protein pronalaska pokazuje smanjeni transport preko epitela bubrežnih glomerula iz vaskulature. U narednom otelotvorenju, himerni protein predmetnog pronalaska pokazuje smanjeni transport kroz krvno-moždanu barijeru (BBB) iz mozga u vaskularni prostor. U jednom aspektu, protein sa izmenjenim FcRn vezivanjem sadrži najmanje jedan Fc region ili FcRn vezujućeg partnera (npr. jedan ili dvi Fc regiona ili FcRn vezujućih partnera) koji imaju jednu ili više aminokiselinskih supstitucija unutar „FcRn vezujuće petlje“ Ig konstantnog regiona. FcRn vezujuća petlja sastoji se od aminokiselinskih ostataka 280-299 (prema EU numeraciji) divljeg tipa Fc regiona pune dužine. U drugim otelotvorenjima, Ig konstantni region ili njegov deo u himernom proteinu pronalaska koji ima izmenjen afinitet vezivanja FcRn sadrži najmanje jedan Fc region ili FcRn vezujućeg partnera koji ima jednu ili više aminokiselinskih supstitucija unutar 15 Ǻ FcRn „dodirnoj zoni“. Kako se ovde koristi, izraz 15 Ǻ FcRn „dodirna zona“ uključuje ostatke na narednim položajima divljeg tipa, celokupne Fc grupe: 243-261, 275-280, 282-293, 302-319, 336-348, 367, 369, 372-389, 391, 393, 408, 424, 425-440 (EU numeracija). U drugim otelotvorenjima, Ig konstantni region ili njegov deo pronalaska koji ima izmenjen FcRn afinitet vezivanja sadrži najmanje jedan Fc region ili FcRn vezujući partner koji ima jednu ili više aminokiselinska supstitucija na položaju aminokiselina koji odgovara bilo kom od narednih EU položaja: 256, 277-281, 283-288, 303-309, 313, 338, 342, 376, 381, 384, 385, 387, 434 (npr., N434A ili N434K), i 438. Primerene aminokiselinske supstitucije koje su promenile FcRn aktivnost vezivanja obelodanjene su u Međunarodna PCT Publication No. WO05/047327.
[0221] Fc region ili FcRn vezujući partner korišćen u pronalasku takođe može da sadrži aminokiselinsku supstituciju koja je poznata u struci i koja menja glikozilaciju himernog proteina. Na primer, Fc region ili FcRn vezujući partner himernog proteina povezan sa VWF fragmentom ili FVIII proteinom može da sadrži Fc region koji ima mutaciju što dovodi do smanjene glikozilacije (npr., N- ili O-vezana glikozilacija) ili može da sadrži izmenjeni
12
glikoform od dela Fc divljeg tipa (npr., glikon sa niskom razinom fukoze ili bez glukoze).
[0222] U jednom otelotvorenju, neobrađeni himerni protein prema pronalasku može da sadrži genetski spojen Fc region (tj. scFc region) koji ima dva ili više svoja Ig konstantna regiona ili njihove delove nezavisno izabrane od Ig konstantnog regiona ili njegovog dela koji je ovde opisan. U jednom aspektu, Fc regioni dimernog Fc regiona su isti. U drugom otelotvorenju, najmanje dvi Fc regiona su različita. Na primer, Fc regioni ili FcRn vezujući partneri proteina predmetnog pronalaska sadrže isti broj aminokiselinskih ostataka ili se mogu razlikovati u dužini po jednom ili više aminokiselinskih ostataka (npr., oko 5 aminokiselinskih ostataka (npr., 1, 2, 3, 4, ili 5 aminokiselinskih ostataka), oko 10 ostataka, oko 15 ostataka, oko 20 ostataka, oko 30 ostataka, oko 40 ostataka ili oko 50 ostataka). U daljim otelotvorenjima, Fc regioni ili FcRn vezujući partneri proteina predmetnog pronalaska mogu se razlikovati po sekvenci u jednom ili više aminokiselinskih položaja. Na primer, najmanje dvi Fc regiona ili FcRn vezujuća partnera mogu se razlikovati na oko 5 aminokiselinskih položaja (npr., 1, 2, 3, 4, ili 5 aminokiselinskih položaja), oko 10 položaja, oko 15 položaja, oko 20 položaja, oko 30 položaja, oko 40 položaja ili oko 50 položaja).
E) Veznici
[0223] Himerni protein predmetnog pronalaska dalje sadrži jedan ili više veznika. Jedna vrsta veznika je razdvojivi veznik koji se može razdvojiti različitim proteazama kada se primenjuje pacijentu in vivo, npr., na mestu koagulacije. U jednom aspektu, razdvojivi veznik omogućava razdvajanje dela, npr., VWF fragmenta, iz himernog proteina na mestu koagulacione kaskade, omogućavajući aktiviranom FVIII (FVIIIa) da ima svoju FVIIIa aktivnost. Druga vrsta veznika je veznik za obradu, koji sadrži intracelularno mesto razdvajanja i na taj način se može razdvojiti enzimom za intracelularnu obradu u ćeliji domaćinu, omogućavajući pogodno eksprimiranje polipeptida i formiranje himernog proteina.
[0224] Jedan ili više veznika mogu biti prisutni između bilo koja dva proteina u himernom proteinu. U jednom slučaju, himerni protein sadrži (i) VWF fragment, (ii) XTEN sekvencu i (iii) FVIII protein, gde je VWF fragment veznikom povezan sa XTEN sekvencom, npr., razdvojivim veznikom, i XTEN sekvenca je dalje povezana sa FVIII proteinom (tj. V-L-X-FVIII). U drugom slučaju, himerni protein sadrži (i) VWF fragment, (ii) XTEN sekvencu i (iii) FVIII protein, gde je VWF fragment vezan za XTEN sekvencu, i XTEN sekvenca je
12
vezana za FVIII protein pomoću veznika, npr., razdvojivog veznika (tj. V-X-L-FVIII).
[0225] U određenim otelotvorenjima, himerni protein sadrži (i) VWF fragment, (ii) XTEN sekvencu, (iii) prvi Ig konstantni region ili njegov deo (npr., prvi Fc region), (iv) FVIII protein i (v) drugi Ig konstantni region ili njegov deo (npr., drugi Fc region), gde je VWF fragment vezan za XTEN sekvencu opcionim veznikom, npr., razdvojivim veznikom. XTEN sekvenca se dalje može povezati sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom veznikom, npr., razdvojivim veznikom. FVIII protein (sa ili bez XTEN sekvence) takođe se može povezati sa drugim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom opcionim veznikom, npr. razdvojivim veznikom. U određenim otelotvorenjima, himerni protein dalje sadrži jedan ili više veznika, npr., veznik za obradu, između prvog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela (npr., prvi Fc region) i drugog Ig konstantnog region ili njegovog dela (npr., drugi Fc region), između VWF fragmenta i drugog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela, ili između FVIII proteina i prvog Ig konstantnog regiona ili njegovog dela (npr., prvi Fc region).
[0226] U nekim slučajevima, predmetno obelodanjenje uključuje himerni protein koji sadrži (i) FVIII protein, (ii) XTEN sekvencu, (iii) prvi Ig konstantni region ili njegov deo i (iv) drugi Ig konstantni region ili njegov deo, gde su prvi Ig konstantni region ili njegov deo i drugi Ig konstantni region ili njegov deo povezani veznikom za obradu.
[0227] Veznik koristan u predmetnom pronalasku može da sadrži bilo koji organski molekul. U jednom aspektu, veznik obuhvata polimer, npr., polietilen glikol (PEG) ili hidroksietil skrob (HES). U drugom otelotvorenju, veznik obuhvata aminokiselinsku sekvencu. Veznik može da obuhvata najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400 ,500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ili 2000 aminokiselina. Veznik može da obuhvata 1-5 aminokiselina, 1-10 aminokiselina, 1-20 aminokiselina, 10-50 aminokiselina, 50-100 aminokiselina, 100-200 aminokiselina, 200-300 aminokiselina, 300-400 aminokiselina, 400-500 aminokiselina, 500-600 aminokiselina, 600-700 aminokiselina, 700-800 aminokiselina, 800-900 aminokiselina, ili 900-1000 aminokiselina. U jednom otelotvorenju, veznik obuhvata XTEN sekvencu. Dodatni primeri XTEN mogu se koristiti prema predmetnom pronalasku i su obelodanjeni u US Objava patenta br.2010/0239554 A1, 2010/0323956 A1, 2011/0046060 A1, 2011/0046061 A1, 2011/0077199 A1, ili 2011/0172146 A1, ili Međunarodna Objava patenta br. WO 2010091122 A1, WO 2010144502 A2, WO 2010144508 A1, WO 2011028228 A1, WO
1
2011028229 A1, ili WO 2011028344 A2. U drugom otelotvorenju, veznik je PAS sekvenca.
[0228] Veznik koristan u predmetnom pronalasku može da sadrži bilo koji organski molekul. U jednom aspektu, veznik je polimer, npr., polietilen glikol (PEG) ili hidroksietil skrob (HES). U drugom otelotvorenju, veznik je aminokiselinska sekvenca. Veznik može da obuhvata najmanje oko 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ili 2000 aminokiselina. Veznik može da obuhvata 1-5 aminokiselina, 1-10 aminokiselina, 1-20 aminokiselina, 10-50 aminokiselina, 50-100 aminokiselina, 100-200 aminokiselina, 200-300 aminokiselina, 300-400 aminokiselina, 400-500 aminokiselina, 500-600 aminokiselina, 600-700 aminokiselina, 700-800 aminokiselina, 800-900 aminokiselina, ili 900-1000 aminokiselina.
[0229] Primeri veznika su dobro poznati u struci. U jednom aspektu, veznik obuhvata sekvencu Gn. Veznik može da obuhvata sekvencu (GA)n. Veznik može da obuhvata sekvencu (GGS)n. U drugim otelotvorenjima, veznik obuhvata (GGGS)n(SEQ ID NO: 57). U još nekim otelotvorenjima, veznik obuhvata sekvencu (GGS)n(GGGGS)n(SEQ ID NO: 58). U tim slučajevima, n može biti ceo broj od 1-100. U drugim slučajevima, n može biti ceo broj od 1-20, tj., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20. Primeri veznika uključuju, ali nisu ograničeni na, GGG, SGGSGGS (SEQ ID NO: 59), GGSGGSGGSGGSGGG (SEQ ID NO: 60), GGSGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 61), GGSGGSGGSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 62), ili GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 63). Veznik ne eliminište niti smanjuje aktivnost VWF fragmenta ili aktivnost koagulacije Faktora VIII. Po izboru, veznik pojačava aktivnost VWF fragmenta ili aktivnost koagulacije proteina Faktor VIII, npr., dodatnim umanjivanjem efekata steričkog ometanja i čineći VWF fragment ili deo Faktora VIII dostupnijim svom ciljanom mestu vezivanja.
[0230] U jednom aspektu, veznik koristan za himerni protein je dugačak 15-25 aminokiselina. U drugom otelotvorenju, veznik koristan za himerni protein je dugačak 15-20 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, veznik za himerni protein je dugačak 10-25 aminokiselina. U drugim otelotvorenjima, veznik za himerni protein je dugačak 15 aminokiselina. U još nekim otelotvorenjima, veznik za himerni protein je (GGGGS)n(SEQ ID NO: 64) gde G predstavlja glicin, S predstavlja serin i n je ceo broj od 1-20.
1 1
F) Mesta razdvajanja
[0231] Veznik takođe može da obuhvati deo koji se može razdvojiti hemijski (npr., hidroliza esterske veze), enzimatski (tj. ugrađivanje sekvence razdvajanja proteaze), ili fotolitički (npr., hromofor kao što je 3-amino-3- (2-nitrofenil) proprionska kiselina (ANP)) kako bi se jedan molekul oslobodio od drugog.
[0232] U jednom otelotvorenju, veznik je razdvojivi veznik. Razdvojivi veznici mogu da sadrže jedno ili više mesta razdvajanja na N-terminusu ili C-terminusu, ili na oba. U drugom otelotvorenju, razdvojivi veznik obuhvata ili se značajno sastoji od jednog ili više mesta razdvajanja. U drugim otelotvorenjima, razdvojivi veznici sadrže heterologne sekvence aminokiselinskog veznika koje su ovde opisane ili polimere i jedno ili više mesta razdvajanja.
[0233] U nekim otelotvorenjima, razdvojivi veznik obuhvata jedno ili više mesta razdvajanja koja se mogu razdvojiti u ćeliji domaćina (tj. mesta za intracelularnu obradu).
Neograničavajući primeri mesta razdvajanja uključuju RRRR (SEQ ID NO: 9), RKRRKR (SEQ ID NO: 10) i RRRRS (SEQ ID NO: 11).
[0234] U drugim otelotvorenjima, razdvojivi veznik obuhvata jedno ili više mesta razdvajanja koja se razdvajaju proteazom nakon što je himerni protein koji sadrži razdvojivi veznik dat pacijentu. U jednom otelotvorenju, mesto razdvajanja se razdvaja proteazom odabranom iz grupe koju čine faktor XIa, faktor XIIa, kalikrein, faktor VIIa, faktor IXa, faktor Xa, faktor IIa (trombin), Elastaza-2, MMP-12, MMP -13, MMP-17 i MMP-20. U drugom otelotvorenju, mesto razdvajanja je izabrano iz grupe koju čine FXIa mesto razdvajanja (npr., KLTR↓AET (SEQ ID NO: 65)), FXIa mesto razdvajanja (npr., DFTR↓VVG (SEQ ID NO: 66)), FXIIa mesto razdvajanja (npr., TMTR↓IVGG (SEQ ID NO: 67)), kalikreinsko mesto razdvajanja (npr., SPFR↓STGG (SEQ ID NO: 68)), FVIIa mesto razdvajanja (npr., LQVR↓IVGG (SEQ ID NO: 69)), FIXa mesto razdvajanja (npr., PLGR↓IVGG (SEQ ID NO: 70)), FXa mesto razdvajanja (npr., IEGR↓TVGG (SEQ ID NO: 71)), FIIa (trombin) mesto razdvajanja (npr., LTPR↓SLLV (SEQ ID NO: 72)), Elastaza-2 mesto razdvajanja (npr., LGPV↓SGVP (SEQ ID NO: 73)), Granzim-B razdvajanje (npr., VAGD↓SLEE (SEQ ID NO: 74)), MMP-12 mesto razdvajanja (npr., GPAG↓LGGA (SEQ ID NO: 75)), MMP-13 mesto razdvajanja (npr., GPAG↓LRGA (SEQ ID NO: 76)), MMP-17 mesto razdvajanja (npr., APLG↓LRLR (SEQ ID NO: 77)), MMP-20 mesto razdvajanja (npr., PALP↓LVAQ (SEQ ID NO: 78)), TEV mesto razdvajanja (npr., ENLYFQ↓G (SEQ ID NO: 79)), enterokinazno mesto razdvajanja (npr.,
1 2
DDDK↓IVGG (SEQ ID NO: 80)), Proteaza 3C (PRESCISSION™) mesto razdvajanja (npr., LEVLFQ↓GP (SEQ ID NO: 81)), i Sortaza A mesto razdvajanja (npr., LPKT↓GSES) (SEQ ID NO: 82). U nekim otelotvorenjima, FXIa mesta razdvajanja uključuju, ali nisu ograničena na, npr., TQSFNDFTR (SEQ ID NO: 83) i SVSQTSKLTR (SEQ ID NO: 84).
Neograničavajući primeri mesta razdvajanja trombina uključuju, npr., DFLAEGGGVR (SEQ ID NO: 85), TTKIKPR (SEQ ID NO: 86), ili LVPRG (SEQ ID NO: 87), i sekvenca koja sadrži, obuhvata ili se značajno sastoji od ALRPR (SEQ ID NO: 17) (npr., ALRPRVVGGA (SEQ ID NO: 88)).
[0235] U specifičnom otelotvorenju, mesto razdvajanja je TLDPRSFLLRNPNDKYEPFWEDEEK (SEQ ID NO: 8).
POLINUKLEOTIDI, VEKTORI I ĆELIJE DOMAĆINI
[0236] U obelodanjenju je takođe pružen polinukleotid koji kodira (a) VWF fragment vezan za XTEN sekvencu i FVIII proteinom, (b) FVIII protein vezan za XTEN sekvencu i Fc, ili (c) FVIII protein vezan za XTEN sekvencu i VWF fragment opisan ovde. Kada je himerni protein pojedinačni polipeptidni lanac (npr., F2-L2-X-V-L1-F1-FVIII, gde FVIII sadrži FVIII protein, F1 sadrži prvi Ig konstantni region ili njegov deo, npr., prvi Fc region, L1 sadrži prvi veznik, V sadrži VWF fragment, X sadrži XTEN sekvencu, L2 sadrži drugi veznik, i F2 sadrži drugi Ig konstantni region ili njegov deo, npr., drugi Fc region), pronalazak se svodi na jedan polinukleotidni lanac koji kodira jedan polipeptidni lanac. Kada himerni protein sadrži prvi i drugi polipeptidni lanac (F2-L2-XV: FVIII-F1), prvi polipeptidni lanac sadrži VWF fragment vezan za XTEN sekvencu, koja je dalje povezana sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom (npr., prvi Fc region) razdvojivim veznikom (npr., F2-L2-X-V) i drugi polipeptidni lanac koji sadrži FVIII protein i drugi Ig konstantni region ili njegov deo (npr., drugi Fc region) (npr. FVIII-F1), gde su prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac međusobno povezani, polinukleotid može da sadrži prvu nukleotidnu sekvencu i drugu nukleotidnu sekvencu. U jednom otelotvorenju, prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac mogu biti kodirani jednim polinukleotidnim lancem. U drugom otelotvorenju, prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac su kodirani sa dva različita polinukleotida, tj. prvom nukleotidnom sekvencom i drugom nukleotidnom sekvencom. U drugom otelotvorenju, prva nukleotidna sekvenca i druga nukleotidna sekvenca nalaze se na dva različita polinukleotida (npr., različiti vektori). U određenim otelotvorenjima, predmetni pronalazak je usmeren na grupu polinukleotida koji sadrže prvi nukleotidni lanac i drugi
1
nukleotidni lanac, gde prvi nukleotidni lanac kodira VWF fragment himernog proteina, i drugi nukleotidni lanac kodira FVIII protein. U nekim otelotvorenjima, himerni protein koji sadrži dva polipeptidna lanca ili tri polipeptidna lanca može se kodirati jednim polinukleotidnim lancem, i zatim se preraditi u dva ili tri (ili više) polipeptidnih lanaca. U drugim otelotvorenjima, himerni protein koji sadrži ove polipeptidne lance može biti kodiran sa dva ili tri polinukleotidna lanca.
[0237] U drugim otelotvorenjima, grupa polinukleotida dalje sadrži dodatni nukleotidni lanac (npr., drugi nukleotidni lanac kada je himerni polipeptid kodiran jednim polinukleotidnim lancem ili treći nukleotidni lanac kada je himerni protein kodiran od strane dva polinukleotidna lanca) koji kodira proteinsku konvertazu. Proteinska konvertaza može biti izabrana iz grupe koju čine proproteinska konvertaza subtilinin/keksin tip 5 (PCSK5 ili PC5), proproteinska konvertaza subtilinin/keksin tip 7 (PCSK7 ili PC5), kvasac Kex 2, proproteinska konvertaza subtilinin/keksin tip 3 (PACE ili PCSK3) i dve ili više njihovih kombinacija. U nekim otelotvorenjima, protein konvertaza je PACE, PC5 ili PC7. U specifičnom otelotvorenju, protein konvertaza je PC5 ili PC7. Pogledati Međunarodna prijava br. PCT/US2011/043568.
[0238] Kako se ovde koristi, vektor eksprimiranja odnosi se na bilo koji konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži neophodne elemente za transkripciju i translaciju umetnute kodirajuće sekvence, ili u slučaju RNK virusnog vektora, neophodne elemente za replikaciju i translaciju, kada se uvede u odgovarajuću ćeliju domaćina. Vektori eksprimiranja mogu uključivati plazmide, fagemide, viruse i njihove derivate.
[0239] Vektori eksprimiranja predmetnog pronalaska će uključivati polinukleotide koji kodiraju ovde opisan himerni protein. U jednom otelotvorenju, jedna ili više kodirajućih sekvenci za VWF fragment i XTEN, za FVIII protein i XTEN, ili za oba, operativno su povezane sa kontrolnom sekvencom eksprimiranja. Kako se ovde koristi, dve sekvence nukleinske kiseline su operativno povezane kada su kovalentno povezane na takav način da omogućuju svakoj komponenti nukleinskih kiselina da zadrži svoju funkcionalnost. Za kodirajuću sekvencu i za kontrolnu sekvencu eksprimiranja gena kaže se da su operativno povezane kada su kovalentno povezane na takav način da stave eksprimiranje ili transkripciju i/ili translaciju kodirajuće sekvence pod uticaj ili kontrolu kontrolne sekvence eksprimiranja gena. Za dve DNK sekvence se kaže da su operativno povezane ako indukcija promotera u 5'
1 4
sekvenci eksprimiranja gena rezultuje transkripcijom kodirajuće sekvence i ako priroda povezanosti između dve sekvence DNK ne (1) rezultuje uvođenjem mutacije koja pomera okvir, (2) ometa sposobnost promoterskog regiona da usmerava transkripciju kodirajuće sekvence, ili (3) ometa sposobnost odgovarajućeg RNK transkripta da se prevede u protein. Prema tome, sekvenca eksprimiranja gena bila bi operativno vezana za kodirajuću sekvencu nukleinskih kiselina ukoliko bi sekvenca eksprimiranja gena bila sposobna da izvrši transkripciju te kodirajuće sekvence nukleinskih kiselina tako da je rezultujući transkript preveden u željeni protein ili polipeptid.
[0240] Kao ovde korišćena kontrolna sekvenca eksprimiranja gena je bilo koja regulatorna nukleotidna sekvenca, poput promoterske sekvence ili kombinacije pojačivač-promoter, koja olakšava efikasnu transkripciju i translaciju kodirajuće nukleinske kiseline za koju je operativno povezana. Kontrolna sekvenca eksprimiranja gena može, na primer, biti sisarski ili virusni promoter, poput konstitutivnog ili inducibilnog promotera. Konstitutivni promoteri sisara uključuju, ali nisu ograničeni na, promotere za naredne gene: hipoksantin fosforibosil transferaza (HPRT), adenozin deaminaza, piruvat kinaza, beta-aktinski promoter i drugi konstitutivni promoteri. Primeri virusnih promotera koji konstitutivno deluju u eukariotskim ćelijama uključuju, na primer, promotere iz citomegalovirusa (CMV), simijan virusa (npr., SV40), papiloma virusa, adenovirusa, virusa ljudske imunodeficijencije (HIV), Rous sarkom virus, citomegalovirusa, dugačkih terminalnih ponavljanja (LTR) virusa Moloney leukemije i drugih retrovirusa, i promoter timidin kinaze herpes simpleks virusa. Ostali konstitutivni promoteri poznati su stručnjacima. Promoteri korisni kao sekvence eksprimiranja gena predmetnog pronalaska takođe uključuju inducibilne promotere. Inducibilni promoteri su eksprimirani u prisustvu agensa za indukciju. Na primer, induktor metalotioneina indukuje se da promoviše transkripciju i translaciju u prisustvu određenih metalnih jona. Drugi inducibilni promoteri su poznati stručnjacima.
[0241] Generalno, kontrolna sekvenca eksprimiranja gena uključuje, prema potrebi, 5' netranskripicione i 5' ne-translacione sekvence uključene u započinjanje transkripcije i translacije, kao što su TATA kutija, sekvenca ograničavanja, CAAT sekvenca i slično.
Naročito, takve 5' ne-transkripicione sekvence će uključivati promoterski region koji uključuje promotersku sekvencu za kontrolu transkripcije operativno spojene kodirajuće nukleinske kiseline. Sekvence eksprimiranja gena opciono uključuju sekvence pojačivača ili sekvence uzlaznog aktivatora, prema želji.
1
[0242] Virusni vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence nukleinskih kiselina iz narednih virusa: retrovirus, kao što je virus Moloney mišje leukemije, virus Harvey mišjeg sarkoma, virus mišjeg tumora dojke i virus Rous sarkoma; adenovirus, adeno-pridruženi virus; SV40-virusi; polomavirusi; Epstein-Barr virusi; papiloma virusi; herpes virus; virus vakcinije; polio virus; i RNK virus kao što je retrovirus. Može se lako koristiti drugi vektori dobro poznate u ovoj oblasti. Određeni virusni vektori zasnivaju se na ne-citopatskim eukariotskim virusima u kojima su ne-esencijalni geni zamenjeni genom od interesa. Necitopatski virusi uključuju retroviruse čiji životni ciklus uključuje obrnutu transkripciju genomske virusne RNK u DNK sa kasnijom provirusnom integracijom u DNK ćelije domaćina. Retrovirusi su odobreni za ispitivanja ljudskih genskih terapija. Najkorisniji su oni retrovirusi kojima nedostaje replikacija (tj., koji su sposobni da usmeravaju sintezu željenih proteina, ali nesposobani za proizvodnju infektivnih čestica). Takvi genetski izmenjeni retrovirusni vektori eksprimiranja imaju opštu korisnost za visoko efikasnu transdukciju gena in vivo. Standardni protokoli za proizvodnju retrovirusa sa nedostatkom replikacije (uključujući korake ugradnje egzogenog genetskog materijala u plazmid, transfekciju linije pakovanja ćelija plazmidom, proizvodnju rekombinantnih retrovirusa linijom pakovanja ćelija, prikupljanje virusnih čestica iz medijuma kulture tkiva, i infekcije ciljanih ćelija virusnim česticama) su pruženi kod Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) and Murry, E. J., Methods in Molecular Biology, Vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J. (1991).
[0243] U jednom otelotvorenju, virus je adeno-povezani virus, dvolančani DNK virus.
Adeno-povezani virus može se konstruisati tako da nema replikaciju i da je sposoban inficira širok spektar ćelijskih tipova i vrsta. Pored toga, ima prednosti kao što su stabilnost toplotnih i lipidnih rastvarača; visoke frekvencije transdukcije u ćelijama različitih linija, uključujući hematopoetske ćelije; i nedostatak inhibicije superinfekcije, što omogućava višestruke serije transdukcija. Kako se izveštava, adeno-povezani virus može se integrisati u ljudsku ćelijsku DNK na način specifičan za mesto, čime se minimizuje mogućnost umetanje mutageneze i promenljivost eksprimiranja umetnutog gena karakteristične za retrovirusnu infekciju. Pored toga, infekcije virusom divljeg tipa su praćene u kulturi tkiva više od 100 prolazaka u odsustvu selektivnog pritiska, što implicira da je genomska integracija adeno-povezanog virusa relativno stabilan događaj. Adeno-povezani virus takođe može funkcionisati na ekstrahromozomski način.
1
[0244] Ostali vektori uključuju plazmidne vektore. Plazmidni vektori su opsežno opisani u struci i dobro su poznati onima koji poznaju obu oblasti. Pogledati, npr., Sambrook i dr., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. U posljednjih nekoliko godina otkriveno je da su plazmidni vektori posebno povoljni za isporuku gena ćelijama in vivo zbog svoje nemogućnosti da se repliciraju unutar i integrišu u genom domaćina. Ovi plazmidi, međutim, koji imaju promoter kompatibilan sa ćelijom domaćinom, mogu eksprimirati peptid iz gena koji je operativno kodiran unutar plazmida. Neki najčešće korišćeni plazmidi dostupni od komercijalnih dobavljača uključuju pBR322, pUC18, pUC19, različite pcDNK plazmide, pRC/CMV, različite pCMV plazmide, pSV40 i pBlueScript. Dodatni primeri specifičnih plazmida uključuju pcDNK3.1, kataloški broj V79020; pcDNK3.1/higro, kataloški broj V87020; pcDNK4/mic-His, kataloški broj V86320; i pBudCE4.1, kataloški broj V53220, svi od kompanije Invitrogen (Carlsbad, CA.). Ostali plazmidi su dobro poznati stručnjacima. Pored toga, plazmidi mogu biti prilagođeni dizajniranju koristeći standardne tehnike molekularne biologije za uklanjanje i/ili dodavanje određenih fragmenata DNK.
[0245] U jednom sistemu eksprimiranja insekata koji se može koristiti za proizvodnju proteina predmetnog pronalaska, Autographa californica nuklearni polihidrozni virus (AcNPV) koristi se kao vektor za eksprimiranje stranih gena. Virus raste u Spodoptera frugiperda ćelijama. Kodirajuća sekvenca može se klonirati u ne-esencijalne regione (na primer, polihedron gen) virusa i staviti pod kontrolu ACNPV promotera (na primer, polihedron promotera). Uspešno umetanje kodirajuće sekvence rezultovaće inaktivacijom polihedron gena i proizvodnjom ne-okluzivnog rekombinantnog virusa (tj., virus kom nedostaje proteinski omotač kodiran polihedron genom). Ovi rekombinantni virusi se zatim koriste za infekciju Spodoptera frugiperda ćelija u kojima je umetnuti gen eksprimiran. (pogledati, npr., Smith i dr. (1983) J Virol 46:584; U.S. Pat. No.4,215,051). Dalji primeri ovog sistema eksprimiranja mogu se naći kod Ausubel i dr., eds. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience.
[0246] Drugi sistem koji se može koristiti za eksprimiranje proteina predmetnog pronalaska je sistem eksprimiranja gena glutamin sintetaze, koji se takođe naziva „GS sistem eksprimiranja“ (Lonza Biologics PLC, Berkshire UK). Ovaj sistem eksprimiranja je detaljno opisan u U.S. Pat. No.5,981,216.
1
[0247] U ćelijama domaćina sisara mogu se koristiti brojni virusni sistemi za eksprimiranje. U slučajevima kada se adenovirus koristi kao vektor eksprimiranja, kodirajuća sekvenca može da se vezuje za kontrolni kompleks transkripcije/translacije adenovirusa, npr., kasni promoter i tripartitna liderska sekvenca. Ovaj himerni gen može se zatim umetnuti u genom adenovirusa in vitro ili in vivo rekombinacijom. Umetanje u ne-esecncijalni region virusnog genoma (npr., region E1 ili E3) rezultovaće rekombinantnim virusom koji je održiv i sposoban da eksprimira peptid u zaraženim domaćinima. Pogledati, npr., Logan & Shenk (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:3655). Alternativno se može koristiti promoter vakcinije 7,5 K. Pogledati, npr., Mackett i dr. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:7415; Mackett i dr. (1984) J Virol 49:857; Panicali i dr. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:4927.
[0248] Kako bi se povećala efikasnost proizvodnje, polinukleotidi mogu da se dizajniraju tako da kodiraju više jedinica proteina predmetnog pronalaska razdvojenih mestima enzimatskog razdvajanja. Dobijeni polipeptid se može razdvojiti (na primer, tretmanom odgovarajućim enzimom) kako bi se povratile polipeptidne jedinice. Ovo može povećati prinos polipeptida vođenih jednim promoterom. Kada se koristi u odgovarajućim virusnim sistemim eksprimiranja, translacija svakog polipeptida kodiranog od strane mRNK je usmerena interno u transkript; npr., putem internog mesta za ulazak u ribozome, IRES. Prema tome, polikistronski konstrukt usmerava transkripciju pojedinačne, velike polikistroničke mRNK koja, zauzvrat, usmerava translaciju višestrukih, pojedinačnih polipeptida. Ovaj pristup eliminiše proizvodnju i enzimsku obradu poliproteina i može značajno povećati prinos polipeptida vođenih jednim promoterom.
[0249] Vektori koji se koriste u transformaciji obično sadrže selekcioni marker i koji se koristi za identifikaciju transformatora. U bakterijskim sistemima, to može uključiti gen rezistencije na antibiotike, poput ampicilina ili kanamicina. Selekcioni markera za upotrebu u kulturama ćelija sisara uključuju gene koji daju otpornost na lekove, kao što su neomicin, higromicin i metotreksat. Selekcioni marker može biti selekcioni marker koji se može amplifikovati. Jedan selekcioni marker koji se može amplifikovati je gen dihidrofolat reduktaze (DHFR). Simonsen C C i dr. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:2495-9.
Selekcioni markeri su obrađeni od strane Thilly (1986) Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, Mass., i izbor selekcionih markera je unutar veštine stručnjaka.
1
[0250] selekcioni markeri se mogu uvesti u ćeliju na odvojenom plazmidu istovremeno sa genom od interesa, ili se mogu uvesti na istom plazmidu. Ako su na istom plazmidu, selekcioni marker i gen od interesa mogu biti pod kontrolom različitih promotera ili istog promotera, gde ako su pod kontrolom istog stvaraju dikistroničnu poruku. Konstrukti ovog tipa su poznati u struci (na primer, U.S. Pat. No.4,713,339).
[0251] Vektori eksprimiranja mogu kodirati oznake koje omogućavaju lako pročišćavanje rekombinantno proizvedenog proteina. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, vektor pUR278 (Ruther i dr. (1983) EMBO J 2:1791), gde kodirajuće sekvence proteina koje treba eksprimirati mogu biti vezane u vektor u okviru sa lac z kodirajućim regionom, tako da se stvara označeni fuzioni protein; pGEX vektori se mogu koristiti za eksprimiranje proteina predmetnog pronalaska sa oznakom glutation S-transferaze (GST). Ovi proteini su obično rastvorljivi i mogu se lako očistiti iz ćelija adsorpcijom u zrnca glutation-agaroze, posle čega sledi eluiranje u prisustvu slobodnog glutationa. Vektori uključuju mesta razdvajanja (trombin ili Factor X proteaza ili PRESCISSION PROTEASE ™ (Pharmacia, Peapack, N. J.)) za lako uklanjanje oznake nakon prečišćavanja.
[0252] Vektor ili vektori eksprimiranja se zatim transficiraju ili ko-transficiraju u pogodnu ćeliju koja će eksprimirati polipeptide. Tehnike transfekcije poznate u struci uključuju, ali nisu ograničene na taloženje kalcijum-fosfata (Wigler i dr. (1978) Cell 14:725), elektroporaciju (Neumann i dr. (1982) EMBO J 1:841) i reagense na bazi lipozoma. Za eksprimiranje ovde opisanih proteina, uključujući prokariontske i eukariotske ćelije, mogu se koristiti različiti vektorski sistemi eksprimiranja domaćina. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na, mikroorganizme, poput bakterija (npr., E. coli) transformisanih sa rekombinantnim vektorima eksprimiranja bakteriofagne DNK ili plazmidne DNK koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; kvasce ili vlaknaste gljive transformisane sa rekombinantnim vektorima eksprimiranja kvasca ili gljiva koji sadrže odgovarajuću kodirajuću sekvencu; sisteme ćelija insekata zaraženih vektorima eksprimiranja rekombinantnih virusa (npr., bakulovirus) koji sadrži odgovarajuću kodirajuću sekvencu; sisteme biljnih ćelija zaraženih vektorima eksprimiranja rekombinantnih virusa (npr., mozaični virus karfiola ili mozaični virus duvana) ili transformisan rekombinantnim vektorima eksprimiranja plazmida (npr., Ti plazmid) koji sadrži odgovarajuću kodirajuću sekvencu; ili sistemima životinjskih ćelija, uključujući ćelije sisara (npr., HEK 293, CHO, Cos, HeLa, HKB11 i BHK ćelije).
1
[0253] U jednom aspektu, ćelija domaćin je eukariotska ćelija. Kako se ovde koristi, eukariotska ćelija se odnosi na bilo koju životinjsku ili biljnu ćeliju koja ima definitivno jedro. Eukariotske ćelije životinja uključuju ćelije kičmenjaka, npr., sisari i ćelije beskičmenjaka, npr., insekti. Eukariotske ćelije biljaka posebno mogu da uključuju, bez ograničenja, ćelije kvasca. Eukariotska ćelija se razlikuje od prokariotske ćelije, npr., bakterije.
[0254] U nekim otelotvorenjima, eukariotska ćelija je ćelija sisara. Ćelija sisara je svaka ćelija dobijena od sisara. Ćelije sisara posebno uključuju, ali nisu ograničene na, ćelijske linije sisara. U jednom aspektu, ćelija sisara je ljudska ćelija. U drugom otelotvorenju ćelija sisara je HEK 293 ćelija, koja je bubrežna ćelijska linija ljudskog embriona. HEK 293 ćelije su dostupne kao CRL-1533 od strane American Type Culture Collection, Manassas, VA, i kao 293-H ćelije, Kataloški br.11631-017 ili 293-F ćelije, Kataloški br.11625-019 od kompanije Invitrogen (Carlsbad, Calif.). U nekim otelotvorenjima ćelija sisara je PER.C6® ćelija, koja je ljudska ćelijska linija izvedena iz mrežnjače. PER.C6® ćelije su dostupne od strane kompanije Crucell (Leiden, The Netherlands). U drugim otelotvorenjima, ćelija sisara je jajna ćelija kineskog hrčka (CHO). CHO ćelije su dostupne od strane American Type Culture Collection, Manassas, VA. (npr., CHO-Kl; CCL-61). U još nekim otelotvorenjima, ćelija sisara je bubrežna ćelija beba hrčaka (BHK). BHK ćelije su dostupne od strane American Type Culture Collection, Manassas, VA. (npr., CRL-1632). U nekim otelotvorenjima ćelija sisara je HKB11 ćelija, koja je hibridna ćelijska linija HEK293 ćelije i ljudske B ćelijske linije. Mei i dr., Mol. Biotechnol.34(2): 165-78 (2006).
[0255] U jednom slučaju, plazmid koji uključuje FVIII(X)-Fc fuzionu kodirajuću sekvencu, VWF fragment-L-Fc fuzionu kodirajuću sekvencu, ili oba i selekcioni marker, npr., otpornost na zeocin, transficiraju se u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina.
[0256] U drugom otelotvorenju, plazmid koji uključuje FVIII-Fc fuzionu kodirajuću sekvencu, VWF fragment-XTEN-L-Fc fuzionu kodirajuću sekvencu, ili oba i selekcioni marker, npr., otpornost na zeocin, transficiraju se u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina.
[0257] U drugim slučajevima, plazmid koji uključuje FVIII (X)-Fc fuzionu kodirajuću
14
sekvencu, Fc fuzionu kodirajuću sekvencu, ili oba i selekcioni marker, npr., otpornost na zeocin, transficiraju se u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina.
[0258] U nekim slučajevima, prvi plazmid koji uključuje FVIII (X)-Fc fuzionu kodirajuću sekvencu i prvi selekcioni marker, npr., gen otpornosti na zeocin i drugi plazmid koji uključuje Fc kodirajuću sekvencu ili VWF fragment-L-Fc kodirajuću sekvencu i drugi selekcioni marker, npr., gen otpornosti na neomicin i treći plazmid koji uključuje kodirajuću sekvencu protein konvertaze i treći selekcioni marker, npr., gen otpornosti na higromicin, kotransficira se u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina. Prvi i drugi plazmidi se mogu uvesti u jednakim količinama (tj., u molarnom odnosu 1:1), ili se mogu uvesti u nejednakim količinama.
[0259] U još nekim otelotvorenjima, prvi plazmid koji uključuje FVIII-Fc fuzionu kodirajuću sekvencu i prvi selekcioni marker, npr., gen otpornosti na zeocin i drugi plazmid koji uključuje Fc kodirajuću sekvencu ili VWF fragment-XTEN-L-Fc kodirajuću sekvencu i drugi selekcioni marker, npr., gen otpornosti na neomicin i treći plazmid koji uključuje kodirajuću sekvencu protein konvertaze i treći selekcioni marker, npr., gen otpornosti na higromicin, kotransficira se u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina. Prvi i drugi plazmidi se mogu uvesti u jednakim količinama (tj., u molarnom odnosu 1:1), ili se mogu uvesti u nejednakim količinama.
[0260] U daljim otelotvorenjima, prvi plazmid koji uključuje FVIII (X)-Fc fuzionu kodirajuću sekvencu i prvi selekcioni marker, npr., gen otpornosti na zeocin i drugi plazmid koji uključuje Fc kodirajuću sekvencu ili VWF fragment-XTEN-L-Fc kodirajuću sekvencu i drugi selekcioni marker, npr., gen otpornosti na neomicin i treći plazmid koji uključuje kodirajuću sekvencu protein konvertaze i treći selekcioni marker, npr., gen otpornosti na higromicin, ko-transficira se u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina. Prvi i drugi plazmidi se mogu uvesti u jednakim količinama (tj., u molarnom odnosu 1:1), ili se mogu uvesti u nejednakim količinama.
[0261] U određenim otelotvorenjima, prvi plazmid, uključujući himerni protein koji kodira FVIII (sa ili bez XTEN)-F1-L1-V-XTEN-L2-F2 kodirajuću sekvencu i prvi selekcioni marker, npr., gen otpornosti na zeocin i drugi plazmid koji uključuje kodirajuću sekvencu protein konvertaze i drugi selekcioni marker, npr., gen otpornosti na higromicin, kotransficira se u HEK 293 ćelije, za proizvodnju himernog proteina. Promoteri za FVIII (X)-Fc kodirajuću sekvencu i VWF-XTEN-Fc kodirajuću sekvencu mogu biti različiti ili mogu biti isti.
[0262] U još nekim drugim otelotvorenjima, transficirane ćelije su stabilno transficirane. Ove ćelije mogu biti odabrane i održavane kao stabilna ćelijska linija, koristeći konvencionalne tehnike poznate stručnjacima.
[0263] Ćelije domaćini koje sadrže DNK konstrukte proteina uzgajaju se u odgovarajućem medijumu za rast. Kako se ovde koristi, izraz „odgovarajući medijum za rast“ označava medijum koji sadrži hranljive materije potrebne za rast ćelija. Hranljivi sastojci potrebni za rast ćelija mogu da uključuju izvor ugljenika, izvor azota, esencijalne aminokiseline, vitamine, minerale i faktore rasta. Po izboru, mediji mogu da sadrže jedan ili više faktora selekcije. Po izboru, mediji mogu da sadrže goveđi teleći serum ili fetalni teleći serum (FCS). U jednom aspektu, medijum u suštini ne sadrži IgG. Medijum za rast obično će birati za ćelije koje sadrže DNK konstrukt, na primer, odabirom leka ili nedostatkom esencijalnog hranljivog materijala koji je praćen selektivnim markerom na DNK konstruktu ili kotransficiran sa DNK konstrukcijom. Kultivisane ćelije sisara uglavnom se uzgajaju u komercijalno dostupnim medijima koji sadrže serum ili su bez seruma (npr., MEM, DMEM, DMEM/F12). U jednom otelotvorenju, medijum je CD293 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). U drugom otelotvorenju, medijum je CD17 (Invitrogen, Carlsbad, CA.). Izbor medijuma pogodnog za određenu ćelijsku liniju je unutar veštine stručnjaka.
[0264] Kako bi se eksprimirala dva polipeptidna lanca himernog proteina, ćelije domaćini se uzgajaju pod uslovima koji omogućavaju eksprimiranje oba lanca. Kako se ovde koristi, kultivacija se odnosi na održavanje živih ćelija in vitro barem određeno vreme. Održavanje može, ali ne mora uključivati, i povećanje populacije živih ćelija. Na primer, ćelije održavane u kulturi mogu da budu statične u populaciji, ali još uvek održive i sposobne da proizvode željeni proizvod, npr., rekombinantni protein ili rekombinantni fuzioni protein. Pogodni uslovi za kultivaciju eukariotskih ćelija dobro su poznati u struci i uključuju odgovarajući izbor medijuma kulture, suplemente medijuma, temperaturu, pH, zasićenost kiseonikom i slično. U komercijalne svrhe, kultivisanje može obuhvatati upotrebu bilo koje od različitih vrsta sistema za merenje, uključujući boce za mućkanje, boce sa valjcima, bioreaktore sa šupljim vlaknima, bioreaktore sa mešanim rezervoarima, bioreaktore za vazdušni prenos, talasne bioreaktore i druge.
[0265] Uslovi ćelijske kulture su takođe odabrani da omoguće povezivanje VWF fragmenta sa FVIII proteinom. Uslovi koji omogućavaju eksprimiranje VWF fragmenta i/ili FVIII proteina mogu uključivati prisustvo izvora vitamina K. Na primer, u jednom otelotvorenju, stabilno transficirane HEK 293 ćelije se uzgajaju u CD293 medijumu (Invitrogen, Carlsbad, CA) ili OptiCHO medijumu (Invitrogen, Carlsbad, CA) dopunjenom 4 mM glutaminom.
[0266] U jednom aspektu, predmetni pronalazak je usmeren na postupak eksprimiranja, pravljenja ili proizvodnje himernog proteina predmetnog pronalaska koji sadrži a) transfekciju ćelije domaćina koja sadrži polinukleotid koji kodira himerni protein iz pronalaska i b) kultivaciju ćelije domaćina u medijumu za kulturu pod uslovima pogodnim za eksprimiranje himernog proteina, gde je himerni protein eksprimiran.
[0267] U daljim otelotvorenjima, proteinski proizvod koji sadrži VWF fragment vezan za XTEN sekvencu ili FVIII protein vezan za XTEN sekvencu se izlučuje u medijum. Medijumi se odvajaju od ćelija, koncentrišu, filtriraju, i zatim prevlače preko dve ili tri afinitetne kolone, npr., kolona proteina A i jedna ili dve kolone za razmenu anjona.
[0268] U određenim slučajevima, predmetno obelodanjenje se odnosi na himerni protein proizveden ovde opisanim postupcima.
[0269] In vitro proizvodnja omogućava povećanje obima kako bi se dobile velike količine željenih izmenjenih polipeptida predmetnog pronalaska. Tehnike za kultivisanje ćelija sisara u uslovima kulture tkiva su poznate u struci i uključuju homogenu suspenzionu kulturu, npr. u reaktoru sa vazdušnim liftom ili u reaktoru sa neprekidnom mešalicom ili imobilisanom ili zarobljenom ćelijskom kulturom, npr. u šupljim vlaknima, mikrokapsulama, na agaroznim mikrotrakama ili keramičkim ulošcima. Ako je potrebno i/ili poželjno, rastvori polipeptida mogu se prečistiti uobičajenim postupcima hromatografije, na primer gel filtracijom, hromatografijom razmene jona, hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC, hromatografija preko DEAE-celuloze ili afinitetnom hromatografijom.
FARMACEUTSKI SASTAV
[0270] Sastavi koje sadrže himerni protein predmetnog pronalaska mogu sadržati pogodan
14
farmaceutski prihvatljiv nosač. Na primer, mogu da sadrže ekscipijente i/ili pomoćne materijale koji olakšavaju preradu aktivnih jedinjenja u preparate koji su dizajnirani za isporuku na mesto delovanja.
[0271] Farmaceutski sastav se može formulisati za parenteralnu primenu (tj. intravenski, subkutano ili intramuskularno) bolusnom injekcijom. Formulacije za injekcije mogu se predstaviti u jediničnom doznom obliku, npr., u ampulama ili u višedoznim kontejnerima sa dodatkom konzervansa. Sastavi mogu biti u takvim oblicima kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u uljnim ili vodenim nosačima i sadrže formulacione agense kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju. Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praška za konstituciju sa odgovarajućim nosačem, npr., voda bez pirogena.
[0272] Prikladne formulacije za parenteralnu primenu takođe uključuju vodene rastvore aktivnih jedinjenja u obliku rastvorljivom u vodi, na primer, soli rastvorljive u vodi. Pored toga, mogu se primeniti suspenzije aktivnih jedinjenja kao odgovarajuće uljane suspenzije za injekcije. Pogodni lipofilni rastvarači ili nosači uključuju masna ulja, na primer, susamovo ulje ili sintetičke estere masnih kiselina, na primer, etil oleat ili trigliceride. Vodene suspenzije za injekcije mogu da sadrže supstance koje povećavaju viskozitet suspenzije, uključujući, na primer, natrijum karboksimetil celulozu, sorbitol i dekstran. Opciono, suspenzija takođe može da sadrži stabilizatore. Lipozomi se takođe mogu koristiti za inkapsulaciju molekula predmetnog pronalaska za isporuku u ćelije ili među prostore. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača su fiziološki kompatibilni rastvarači, disperzioni medijumi, obloge, antibakterijski i antifungalni agensi, izotonična i agensi za odlaganje apsorpcije, voda, fiziološki rastvor, fosfatom puferisan fiziološki rastvor, dekstroza, glicerol, etanol i slično. U nekim otelotvorenjima, sastav sadrži izotonične agense, na primer, šećere, polialkohole poput manitola, sorbitola ili natrijum hlorida. U drugim otelotvorenjima, sastavi sadrže farmaceutski prihvatljive supstance kao što su agensi za vlaženje ili manje količine pomoćnih supstanci kao što su ovlaživači ili emulgatori, konzervansi ili puferi koji povećavaju rok trajanja ili efikasnost aktivnih sastojaka.
[0273] Sastavi predmetnog pronalaska mogu biti u različitim oblicima, uključujući, na primer, tečnost (npr., rastvori za injekcije i infuzije), disperzije, suspenzije, polučvrste i čvrste dozne oblike. Poželjni oblik zavisi od načina primene i terapijske primene.
[0274] Sastav se može formulisati kao rastvor, mikro emulzija, disperzija, lipozom ili druga naručena struktura pogodna visokoj koncentraciji leka. Sterilni rastvori za injekcije mogu se pripremiti tako da se aktivni sastojak u potrebnoj količini ugradi u odgovarajuće rastvarače sa jednim ili kombinacijom gore nabrojanih sastojaka, i po potrebi je filtriran sterilizacijom. Generalno, disperzije se pripremaju tako što se aktivni sastojak ugradi u sterilan nosač koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne ostale sastojke od gore nabrojanih. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, poželjni postupci za pripremu su sušenje vakuumom i sušenjem smrzavanjem koji daju prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora. Ispravna tečnost rastvora može se održati, na primer, upotrebom obloga kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom površinski aktivnih materija. Produžena apsorpcija sastava za injektiranje može se postići uključivanjem u sastav agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, monostearatne soli i želatin.
[0275] Aktivni sastojak se može formulisati sa formulacijom ili uređajem sa kontrolisanim oslobađanjem. Primeri takvih formulacija i uređaja uključuju implantate, transdermalne flastere i mikrokapsulirane sisteme za isporuku. Biorazgradivi, biokompatibilni polimeri mogu se koristiti, na primer, etilen vinil acetat, polihidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, polorthoesteri i poliaktična kiselina. Postupci za pripremanje takvih formulacija i uređaja poznati su u struci. Pogledati npr., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[0276] Formulacije za injektiranje mogu se proizvesti formiranjem mikrokapsuliranih matrica leka u biorazgradivim polimerima kao što je polaktid-poliglikolid. U zavisnosti od odnosa leka prema polimeru i prirode upotrebljenog polimera, može se kontrolisati brzina oslobađanja leka. Ostali uzorni biorazgradivi polimeri su poliorthoesteri i polihidridi.
Formulacije za deponovanje injekcija takođe se mogu pripremiti umetanjem leka u lipozome ili mikroemulzije.
[0277] Dopunska aktivna jedinjenja mogu biti ugrađena u sastave. U jednom aspektu, himerni protein pronalaska je formulisan sa drugim faktorom koagulacije, ili njegovom varijantom, fragmentom, analogom ili derivatom. Na primer, faktor koagulacije uključuje, ali nije ograničen na, faktor V, faktor VII, faktor VIII, faktor IX, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII, protrombin, fibrinogen, fon Vilebrandov faktor ili rekombinantni faktor
14
rastvorljivog tkiva (rsTF) ili aktivirane oblike bilo kog od prethodnih. Faktor koagulacije hemostatskog agensa može takođe da uključuje antifibrinolitičke lekove, npr., epsilonaminokapronu kiselinu, traneksamsku kiselinu.
[0278] Režimi doziranja se mogu prilagoditi tako da pruže optimalni željeni odgovor. Na primer, može se primeniti jedan bolus, može se primeniti više podeljenih doza tokom vremena, ili se doza proporcionalno smanjuje ili povećati kako je naznačeno potrebama terapijske situacije. Povoljno je formulisati parenteralne sastave u doznom jedinstvenom obliku za lakšu primenu i ujednačenost doziranja. Pogledati, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., Easton, Pa.1980).
[0279] Pored aktivnog jedinjenja, tečni dozni oblik mogu da sadrži inertne sastojke kao što su voda, etil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetilformamid, ulja, glicerol, tetrahidrofurfurilni alkohol, polietilen glikole i estre masnih kiselina sorbitana.
[0280] Neograničavajući primeri pogodnih farmaceutskih nosača su takođe opisani u Remington's Pharmaceutical Sciences od E. W. Martin. Neki primeri pomoćnih sastojaka uključuju skrob, glukozu, laktozu, saharozu, želatinu, slad, pirinač, brašno, kredu, silika gel, natrijum stearat, glicerol monostearat, talk, natrijum hlorid, sušeno obrano mleko, glicerol, propilen, glikol, vodu, etanol, i slično. Sastav takođe može da sadrži pH puferišuće reagense i agense za vlaženje ili emulgator.
[0281] Za oralnu primenu, farmaceutski sastav može biti u obliku tableta ili kapsula pripremljenih na konvencionalni način. Sastav se takođe može pripremiti kao tečnost, na primer sirup ili suspenzija. Tečnost može da sadrži agense za suspendovanje (npr., sirup sorbitola, derivate celuloze ili hidrogenizovane jestive masti), emulgatore (lecitin ili akacija), nevodene nosače (npr., bademovo ulje, masne estre, etil alkohol ili fragmentisana biljna ulja) i konzervanse (na primer, metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparat takođe može da sadrži agense za aromatizovanje, bojenje i zaslađivanje. Alternativno, smeša se može predstaviti kao suvi proizvod za mešanje sa vodom ili drugim pogodnim nosačem.
[0282] Za bukalnu primenu, sastav može biti u obliku tableta ili pastila u skladu sa konvencionalnim protokolima.
14
[0283] Za primenu inhalacijom, jedinjenja za upotrebu prema predmetnom pronalasku su pogodno isporučena u obliku nebulizovanog aerosola sa ili bez ekscipijenata ili u obliku aerosolnog spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, opciono propelanta, npr., dihlorodifluorometan, trihlorofluorometan, dihlorotetrafluorometan, ugljen dioksid ili drugi pogodni gas. U slučaju aerosola pod pritiskom dozna jedinica može se odrediti uz pomoć ventila za isporuku izmerene količine. Kapsule i kertridži od, npr., želatin za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu se formulisati tako da sadrže praškastu mešavinu jedinjenja i pogodnu praškastu mešavinu kao što su laktoza ili skrob.
[0284] Farmaceutski sastav se takođe može formulisati za rektalnu primenu kao supozitorijum ili retencioni klistir, npr., koje sadrže uobičajene baze supozitorija kao što je kakao maslac ili drugi gliceridi.
[0285] U jednom aspektu, farmaceutski sastav sadrži himerni protein, polinukleotid koji kodira himerni protein, vektor koji sadrži polinukleotid ili ćeliju domaćina koja sadrži vektor i farmaceutski prihvatljiv nosač. FVIII protein u himernom proteinu produžio je poluživot u poređenju sa divljeg tipa FVIII proteina ili odgovarajućim FVIII proteinom bez VWF fragmenta. U jednom otelotvorenju, gde je poluživot FVIII proteina produžen najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili najmanje oko 12 puta duže od divljeg tipa FVIII. U drugom otelotvorenju, poluživot Faktora VIII je najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sata, najmanje oko 22 sata, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 26 sati, najmanje oko 27 sati, najmanje oko 28 sati, najmanje oko 29 sati, najmanje oko 30 sati, najmanje oko 31 sat sati, najmanje oko 32 sata, najmanje oko 33 sata, najmanje oko 34 sata, najmanje oko 35 sati, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati, ili najmanje oko 108 sati.
[0286] U nekim slučajevima, sastav se primenjuje putem odabranim iz grupe koju čine lokalna primena, intraokularna primena, parenteralna primena, intratekalna primena, subduralna primena i oralna primena. Parenteralna primena može biti intravenska ili
14
subkutana primena.
[0287] U drugim slučajevima, sastav se koristi za tretman bolesti ili poremećaja krvarenja kod pacijenta koji ima potrebu za tim. Bolest ili poremećaj krvarenja su izabrani iz grupe koju čine poremećaj koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, hemoragija, hemoragija u mišićima, oralna hemoragija, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru, krvarenje u omotaču iliopsije i bilo koja njihova kombinacija. U ostalim slučajevima, zakazana je operacija pacijenta. U drugim slučajevima, tretman je profilaktički ili na zahtev.
GENSKA TERAPIJA
[0288] Himerni protein predmetnog pronalaska se može proizvesti in vivo kod sisara, npr., ljudskog pacijenta, korišćenjem terapeutski korisne genske terapije za tretman bolesti krvarenja ili poremećaja izabranog iz grupe koju čine poremećaj koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, hemoragija, hemoragija u mišićima, oralna hemoragija, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru i krvarenje u omotaču iliopsije. U jednom slučaju, bolest ili krvarenje je hemofilija. U drugom slučaju, bolest ili poremećaj krvarenja je hemofilija A. To uključuje primenu odgovarajuće nukleinske kiseline koja kodira himerne proteine, operativno povezane sa odgovarajućim sekvencama za kontrolu eksprimiranja. U određenim slučajevima, ove sekvence su ugrađene u virusni vektor. Pogodni virusni vektori za takvu gensku terapiju uključuju adenovirusne vektore, lentivirusne vektore, bakulovirusne vektore, Epstein Barr virusne vektore, papovavirusne vektore, virusne vektore vakcinije, virusne vektore herpes simpleksa i adeno povezane virusne vektore (AAV). Virusni vektor može biti virusni vektor sa nedostatkom replikacije. U drugim slučajevima, adenovirusni vektor ima brisanje u svom E1 genu ili E3 genu. Kada se koristi adenovirusni vektor, sisar ne može biti izložen nukleinskoj kiselini koja kodira selekcioni marker gen. U drugim slučajevima, sekvence su ugrađene u ne-virusni vektor poznat stručnjacima.
POSTUPCI KORIŠĆENJA HIMERNIH PROTEINA
14
[0289] Predmetno obelodanjenje je usmereno na postupak upotrebe himernog proteina koji je ovde opisan za sprečavanje ili inhibiciju endogenog vezivanja VWF za FVIII protein.
Predmetno obelodanjenje je takođe usmereno na postupak upotrebe himernog proteina koji ima FVIII protein vezan za XTEN i Ig konstantni region ili njegov deo.
[0290] Jedan aspekt predmetnog obelodanjenja usmeren je na sprečavanje ili inhibiciju interakcije FVIII sa endogenim VWF blokiranjem ili zaštitom VWF vezujućeg mesta na FVIII od endogenog VWF, i istovremeno produžavanjem poluživota FVIII proteina korišćenjem XTEN sekvence u kombinaciji sa Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, koji takođe može biti produživač poluživota. U jednom slučaju, obelodanjenje je usmereno na postupak za konstrukciju FVIII proteina koji ima poluživot duži od divljeg tipa FVIII. U jednom slučaju, XTEN sekvenca inhibira ili sprečava interakciju FVIII proteina u himernom proteinu sa endogenim VWF. U drugom slučaju, Ig konstantni region ili njegov deo inhibira ili sprečava interakciju FVIII proteina sa endogenim VWF. Himerni protein koristan u ovom postupku uključuje bilo koji ili više ovde opisanih himernih proteina.
[0291] Naredni aspekt predmetnog obelodanjenja uključuje postupak primene pacijentu, koji ima potrebu za tim, himernog protein koji sadrži FVIII protein koji ima poluživot duži od divljeg tipa FVIII, gde se postupak sastoji od primene ovde opisanog himernog proteina.
[0292] U jednom slučaju, obelodanjenje je usmereno na postupak korišćenja XTEN sekvence i Ig konstantnog regiona ili njegovog dela da se produži poluživot FVIII proteina i VWF fragmenta za sprečavanje ili inhibiciju endogene VWF interakcije sa FVIII proteinom. FVIII protein vezan za XTEN sekvencu (npr., FVIII(X)), i zatim vezan za VWF fragment ili je povezan sa njim, sačuvan je ili zaštićen od VWF puta klirensa i tako ima smanjeni klirens u poređenju sa FVIII proteinom koji nije vezan za VWF fragment. Zaštićeni FVIII protein tako ima maksimalno produženje poluživota u poređenju sa FVIII proteinom koji nije vezan ili povezan za XTEN sekvencu i VWF fragment. U određenim slučajevima, FVIII protein povezan sa ili zaštićen VWF fragmentom i vezan za XTEN sekvencu se ne uklanja VWF klirens receptorom. U drugim slučajevima, FVIII protein povezan sa ili zaštićen VWF fragmentom i vezan za XTEN sekvencu uklanja se iz sistema sporije od FVIII proteina koji nije povezan sa ili zaštićen VWF fragmentom i vezan je za XTEN sekvencu.
[0293] U jednom aspektu, himerni protein koji sadrži FVIII protein vezan za XTEN sekvencu
14
ili FVIII protein vezan za ili povezan sa VWF fragmentom povezanim sa XTEN ima smanjeni klirens iz cirkulacije jer VWF fragment ne sadrži mesto vezivanja receptora za VWF klirens. VWF fragment sprečava ili inhibira uklanjanje FVIII vezanog ili povezanog sa VWF fragmentom iz sistema kroz VWF put klirensa. Fragmenti VWF korisni za predmetni pronalazak takođe mogu da daju najmanje jedno ili više svojstava zaštite VWF-nalik FVIII koje pruža endogeni VWF. U nekim otelotvorenjima, VWF fragment ili XTEN sekvenca takođe mogu da maskiraju jedno ili više mesta vezivanja FVIII klirens receptora, čime sprečava uklanjanje FVIII sopstvenim klirens putem.
[0294] U nekim slučajevima, sprečavanje ili inhibicija vezivanja FVIII proteina na endogeni VWF pomoću VWF fragmenta ili XTEN sekvence može biti in vitro ili in vivo.
[0295] Takođe je pružen postupak povećanja poluživota FVIII proteina koji sadrži primenu himernog proteina opisanog ovde pacijentu koji ima potrebu za tim. Poluživot neaktiviranog FVIII vezanog za ili povezanog sa VWF pune dužine je oko 12 do 14 sati u plazmi. Kod VWD tipa 3, gde skoro da nema VWF u cirkulaciji, poluživot FVIII je samo oko šest sati, što dovodi do simptoma blage do umerene hemofilije A kod takvih pacijenata, usled smanjene koncentracije FVIII. Poluživot FVIII proteina vezanog za ili povezanog sa VWF fragmentom ili XTEN sekvencom predmetnog pronalaska može se povećati najmanje oko 1,5 puta, 1,6 puta, 1,7 puta, 1,8 puta, 1,9 puta, 2,0 puta, 2,1 puta, 2,2 puta, 2,3 puta, 2,4 puta, 2,6 puta, 2,7 puta. puta, 2,8 puta, 2,9 puta, 3,0 puta, 3,1 puta, 3,2 puta, 3,3 puta, 3,4 puta, 3,5 puta, 3,6 puta, 3,7 puta, 3,8 puta, 3,9 puta ili 4,0 puta višeg od poluživota neaktiviranog FVIII vezanog za ili povezanog sa VWF pune dužine.
[0296] U jednom otelotvorenju, poluživot FVIII proteina vezanog za ili povezanog sa VWF fragmentom ili vezanog za Ig konstantni region ili njegov deo u himernom proteinu koji sadrži XTEN sekvencu povećava se najmanje oko 2 puta, 2,5 puta, 3,0 puta, 3,5 puta, 4,0 puta, 4,5 puta, 5,0 puta, 5,5 puta, 6,0 puta, 7 puta, 8 puta, 9 puta, ili 10 puta u odnosu na poluživot neaktiviranog FVIII vezanog ili povezanog sa VWF pune dužine. U drugom otelotvorenju, poluživot FVIII proteina vezanog za ili povezanog sa VWF fragmentom ili Ig konstantnim regionom ili njegovim delom u himernom proteinu koji sadrži XTEN sekvencu povećava se oko 2 do oko 5 puta, oko 3 do oko 10 puta, oko 5 do oko 15 puta, oko 10 do oko 20 puta, oko 15 do oko 25 puta, oko 20 do oko 30 puta, oko 25 do oko 35 puta, oko 30 do oko 40 puta, oko 35 do oko 45 puta u odnosu na poluživot neaktiviranog FVIII vezanog ili
1
povezanog sa VWF pune dužine ili divljeg tipa FVIII. U specifičnom otelotvorenju, poluživot FVIII proteina vezanog za ili povezanog sa VWF fragmentom ili vezanog za Ig konstantni region u himernom proteinu koji sadrži XTEN sekvencu povećava se najmanje za oko 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ili 40 puta u odnosu na poluživot divljeg tipa FVIII kod FVIII i VWF dvostrukih knockout miševa.
[0297] U nekim otelotvorenjima, poluživot himernog proteina koji sadrži VWF fragment spojen u prvi Ig konstantni region ili njegov deo, npr., prvi Fc region i XTEN sekvencu, i FVIII protein vezan za XTEN sekvencu i drugi Ig konstantni region ili njegov deo, npr., drugi Fc region, duži je od poluživota FVIII povezanog sa endogenim VWF. U drugim otelotvorenjima, poluživot himernog proteina je najmanje oko 1,5 puta, 2 puta, 2,5 puta, 3,5 puta, 3,6 puta, 3,7 puta, 3,8 puta, 3,9 puta, 4,0 puta, 4,5 puta, ili 5,0 puta duži u odnosu na poluživot divljeg tipa FVIII ili FVIII proteina povezanog sa endogenim VWF.
[0298] U nekim otelotvorenjima, kao rezultat pronalaska, poluživot FVIII proteina je produžen u poređenju sa FVIII proteinom bez VWF fragmenta ili divljeg tipa FVIII.
Poluživot himernog proteina predmetnog pronalaska je najmanje oko 1,5 puta, najmanje oko 2 puta, najmanje oko 2,5 puta, najmanje oko 3 puta, najmanje oko 4 puta, najmanje oko 5 puta, najmanje oko 6 puta, najmanje oko 7 puta, najmanje oko 8 puta, najmanje oko 9 puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 11 puta, ili najmanje oko 12 puta duži u odnosu na poluživot FVIII proteina bez VWF fragmenta ili divljeg tipa FVIII. U jednom aspektu, poluživot FVIII je oko je oko 1,5 puta do oko 20 puta, oko 1,5 puta do oko 15 puta, ili oko 1,5 puta do oko 10 puta duži nego poluživot od divljeg tipa FVIII. U drugom otelotvorenju, poluživot od FVIII je produžen oko 2 puta do oko 10 puta, oko 2 puta do oko 9 puta, oko 2 puta do oko 8 puta, oko 2 puta do oko 7 puta, oko 2 puta do oko 6 puta, oko 2 puta do oko 5 puta, oko 2 puta do oko 4 puta, oko 2 puta do oko 3 puta, oko 2,5 puta do oko 10 puta, oko 2,5 puta do oko 9 puta, oko 2,5 puta do oko 8 puta, oko 2,5 puta do oko 7 puta, oko 2,5 puta do oko 6 puta, oko 2,5 puta do oko 5 puta, oko 2,5 puta do oko 4 puta, oko 2,5 puta do oko 3 puta, oko 3 puta do oko 10 puta, oko 3 puta do oko 9 puta, oko 3 puta do oko 8 puta, oko 3 puta do oko 7 puta, oko 3 puta do oko 6 puta, oko 3 puta do oko 5 puta, oko 3 puta do oko 4 puta, oko 4 puta do oko 6 puta, oko 5 puta do oko 7 puta, ili oko 6 puta do oko 8 puta u poređenju sa onim od divljeg tipa FVIII ili FVIII proteinom bez VWF fragmenta. U drugim otelotvorenjima, poluživot himernog proteina predmetnog pronalaska iznosi najmanje oko 17 sati, najmanje oko 18 sati, najmanje oko 19 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 21 sat,
1 1
najmanje oko 22 sata sati, najmanje oko 23 sata, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 26 sati, najmanje oko 27 sati, najmanje oko 28 sati, najmanje oko 29 sati, najmanje oko 30 sati, najmanje oko 31 sat, najmanje oko 32 sata, najmanje oko 33 sata, najmanje oko 34 sata, najmanje oko 35 sati, najmanje oko 36 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 84 sata, najmanje oko 96 sati, ili najmanje oko 108 sati. U još nekim otelotvorenjima, poluživot himernog proteina predmetnog pronalaska je oko 15 sati do oko dve nedelje, oko 16 sati do oko jedne nedelje, oko 17 sati do oko jedne nedelje, oko 18 sati do oko jedne nedelje, oko 19 sati do oko jedne nedelje, oko 20 sati do oko jedne nedelje, oko 21 sat do oko jedne nedelje, oko 22 sata do oko jedne nedelje, oko 23 sata do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko jedne nedelje, oko 36 sati do oko jedne nedelje, oko 48 sati do oko jedne nedelje, oko 60 sati do oko jedne nedelje, oko 24 sata do oko šest dana, oko 24 sata do oko pet dana, oko 24 sata do oko četiri dana, oko 24 sata do oko tri dana, ili oko 24 sata do oko dva dana.
[0299] U nekim slučajevima, prosečni poluživot himernog proteina predmetnog pronalaska po pacijentu iznosi oko 15 sati, oko 16 sati, oko 17 sati, oko 18 sati, oko 19 sati, oko 20 sati, oko 21 sat, oko 22 sata oko 23 sata, oko 24 sata (1 dan), oko 25 sati, oko 26 sati, oko 27 sati, oko 28 sati, oko 29 sati, oko 30 sati, oko 31 sat, oko 32 sata, oko 33 sata, oko 34 sata, oko 35 sati, oko 36 sati, oko 40 sati, oko 44 sata, oko 48 sati (2 dana), oko 54 sata, oko 60 sati, oko 72 sata (3 dana), oko 84 sati, oko 96 sati (4 dana), oko 108 sati, oko 120 sati (5 dana), oko šest dana, oko sedam dana (jedna nedelja), oko osam dana, oko devet dana, oko 10 dana, oko 11 dana, oko 12 dana, oko 13 dana, ili oko 14 dana.
[0300] Pored toga, obelodanjenje pruža postupak tretmana ili sprečavanja krvarenja ili poremećaja koji obuhvata primenu efikasne količine himernog proteina. U jednom slučaju, bolest ili poremećaj krvarenja je izabran iz grupe koju čine poremećaj koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, hemoragija, hemoragija u mišićima, oralna hemoragija, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru i krvarenje u omotaču iliopsije. U specifičnom slučaju, bolest ili poremećaj krvarenja je hemofilija A.
[0301] Himerni protein koji sadrži XTEN sekvencu i konstantni Ig region ili njegov deo u
1 2
kombinaciji sa ovde opisanim VWF fragmentom, koji sprečava ili inhibira interakciju FVIII proteina sa endogenim VWF pripremljenim u obelodanjenju, ima mnoge koristi koje će prepoznati stručnjak, uključujući, ali ne ograničavajući se na postupke tretmana pacijenta koji imaju hemostatski poremećaj i postupke tretmana pacijenta koji ima potrebu za opštim hemostatskim agensom. U jednom slučaju, obelodanjenje se odnosi na postupak tretmana pacijenta koji ima hemostatski poremećaj koji sadrži primenu terapeutski efikasne količine himernog proteina.
[0302] Udeo FVIII proteina u himernom proteinu tretira ili sprečava hemostatski poremećaj tako što služi kao kofaktor Faktoru IX na negativno naelektrisanoj fosfolipidnoj površini, stvarajući tako kompleks Xaze. Vezivanje aktiviranih faktora koagulacije na površinu fosfolipida lokalizuje ovaj proces na mesta vaskularnog oštećenja. Na fosfolipidnoj površini, Faktor VIIIa približno za 200.000 puta povećava maksimalnu brzinu aktivacije Faktora X od strane Faktora IXa, što dovodi do velikog drugog naleta generacije trombina.
[0303] Himerni protein predmetnog obelodanjenja može se koristiti za tretman bilo kog hemostatskog poremećaja. Hemostatski poremećaji koji se mogu tretirati primenom himernog proteina predmetnog obelodanjenja uključuju, ali nisu ograničeni na, hemofiliju A, kao i nedostatke ili strukturne nepravilnosti koje se odnose na Faktor VIII. U jednom slučaju, hemostatski poremećaj je hemofilija A.
[0304] Himerni protein predmetnog obelodanjenja može se upotrebiti profilaktički za tretman pacijenta sa hemostatskim poremećajem. Himerni protein predmetnog obelodanjenja može se koristiti za tretman akutne epizode krvarenja kod pacijenta sa hemostatskim poremećajem. U drugom slučaju, hemostatski poremećaj može biti rezultat neispravnog faktora koagulacije, npr., fon Vilebrandovog faktora. U jednom slučaju, hemostatski poremećaj je nasledni poremećaj. U drugom slučaju, hemostatski poremećaj je stečeni poremećaj. Stečeni poremećaj može biti rezultat osnovne sekundarne bolesti ili poremećaja. Nepovezano stanje može biti, na primer, ali bez ograničavanja na, rak, auto-imunoa bolest ili trudnoća. Stečeni poremećaj može biti rezultat starosti ili lekova za tretman osnovnih sekundarnih poremećaja (npr. hemoterapija protiv raka).
[0305] Obelodanjenje se takođe odnosi na postupke tretmana pacijenta koji nema urođeni hemostatski poremećaj, ali ima sekundarnu bolest ili poremećaj koji rezultuju sticanjem
1
hemostatskog poremećaja, npr., usled razvoja anti-FVIII antitela ili operacije. Obelodanjenje se prema tome odnosi na postupak tretmana pacijenta koji ima potrebu za opštim hemostatskim agensom, koji sadrži primenu terapeutski efikasne količine himernog proteina pripremljenog predmetnim postupcima.
[0306] Predmetno obelodanjenje je takođe povezano sa postupcima smanjenja imunogenosti FVIII ili indukovanjem manje imunogenosti protiv FVIII, koji obuhvataju primenu efikasne količine ovde opisanih himernih proteina, ili polinukleotida koji ih kodiraju.
[0307] U jednom slučaju, osoba kojoj je potreban opšti hemostatski agens je podvrgnuta operaciji ili će uskoro biti podvrgnuta operaciji. Himerni protein predmetnog obelodanjenja može se primeniti pre, tokom ili posle operacije kao profilaktički režim. Himerni protein predmetnog obelodanjenja može se primeniti pre, tokom ili nakon operacije za kontrolu akutne epizode krvarenja.
[0308] Himerni protein predmetnog obelodanjenja može se koristiti za tretman pacijenta koji ima epizodu akutnog krvarenja, a koji nema hemostatski poremećaj. Epizoda akutnog krvarenja može biti posledica teške traume, npr., operativni zahvat, automobilska nesreća, rana, prostrelna rana iz pištolja ili bilo koji drugi traumatični događaj koji rezultuje nekontrolisanim krvarenjem. Neograničavajući primeri epizoda krvarenja uključuju poremećaj koagulacije krvarenja, hemartroza, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, hemoragija, hemoragija u mišićima, oralna hemoragija, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru i krvarenje u omotaču iliopsije i bilo koja njihova kombinacija.
[0309] Za profilaktičke primene, jedan ili više sastava koji sadrže himerni protein predmetnog obelodanjenja ili njegov koktel daju se pacijentu koji još uvek nije u bolesnom stanju kako bi poboljšao pacijentovu otpornost ili smanjio simptome povezane sa bolesti ili poremećajem. Ovakva količina je definisana kao „efikasna profilaktička doza". U terapeutskim primenama, relativno visoka doza (npr., od oko 1 do 400 mg/kg polipeptida po dozi, gde se doze od 5 do 25 mg češće koriste za radioimuno konjugate i više doze za polipeptide modifikovane citotoksin lekom) u relativno kratkim intervalima, ponekad je
1 4
potrebna sve dok se progresija bolesti ne smanji ili prekine, i sve dok pacijent ne pokaže delimičnu ili potpunu amelioraciju simptoma bolesti. Nakon toga, pacijentu se može uvesti profilaktički režim.
[0310] U nekim slučajevima, himerni protein ili sastav predmetnog obelodanjenja koristi se za tretman na zahtev, što uključuje tretman poremećaja iz grupe koju čine epizode krvarenja, hemartroza, krvarenje u mišićima, oralno krvarenje, trauma, trauma capitis, gastrointestinalno krvarenje, intrakranijalno krvarenje, intra-abdominalno krvarenje, intratorakalno krvarenje, prelom kostiju, krvarenje iz centralnog nervnog sistema, krvarenje u retrofaringealnom prostoru, krvarenje u retroperitonealnom prostoru i krvarenje u omotaču iliopsije. Pacijentu je možda potrebna hirurška profilaksa, peri-operativno upravljanje ili tretman za operaciju. Takve operacije su, npr., mala operacija, velika operacija, vađenje zuba, tonzilaktomija, ingvinalna herniotomija, sinovektomija, totalna zamena kolena, kraniotomija, osteosinteza, trauma hirurgija, intrakranijalna hirurgija, intra-abdominalna hirurgija, intratorakalna hirurgija ili operacija zamene zglobova.
[0311] U jednom slučaju, himerni protein predmetnog obelodanjenja primenjuje se intravenski, subkutano, intramuskularno, ili preko bilo koje površine sluzokože, npr., oralno, sublingvalno, bukalno, nazalno, rektalno, vaginalno ili plućnim putem. Himerni protein koji sadrži VWF fragment i FVIII protein predmetnog obelodanjenja može biti implantiran unutar ili vezan za čvrsti nosač iz biopolimera koji omogućava sporo oslobađanje himernog proteina do mesta krvarenja ili ugrađen u zavoj/oblogu. Doza himernog proteina varira u zavisnosti od pacijenta i od određenog puta primene koji se koristi. Doze mogu biti u rasponu od 0,1 do 100.000 µg/kg telesne težine. U jednom slučaju, raspon doziranja je 0,1-1,000 µg/kg. U drugom slučaju, raspon doziranja je 0,1-500 µg/kg. Protein se može primenjivati kontinuirano ili u određenim vremenskim intervalima. In vitro ispitivanja se mogu koristiti za određivanje optimalnog raspona doza i/ili rasporeda primene. In vitro ispitivanja koja mere aktivnost faktora koagulacije su poznata u struci, npr., STA-CLOT VIIa-rTF test koagulacije ili ROTEM test koagulacije. Pored toga, efikasne doze mogu se ekstrapolirati iz dozaodgovor krivih dobijenih iz životinjskih modela, npr., hemofilični psi (Mount i dr.2002, Blood 99(8):2670).
[0312] Nakon što je sada detaljno opisan predmetni pronalazak, isti će biti jasnije shvaćen pozivanjem na naredne primere, koji su ovde uključeni samo u svrhu ilustracije i nisu
1
namenjeni ograničavanju pronalaska.
Primeri
[0313] Kroz primere su korišćeni naredni materijali i postupci ako nije drugačije navedeno.
Materijali i postupci
[0314] Generalno, praksa predmetnog pronalaska koristi, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike hemije, biofizike, molekularne biologije, rekombinantnu DNK tehnologiju, imunologiju (naročito, npr., tehnologiju antitela) i standardne tehnike u elektroforezi. Pogledati, npr., Sambrook, Fritsch i Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow i dr., CS.H.L. Press, Pub. (1999); i Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel i dr., John Wiley & Sons (1992). Example 1: Cloning different VWF domains (Figure 1)
(a) Kloniranje pSYN-VWF-002
[0315] pSYN-VWF-002 sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju VWF fragment, i to su aminokiseline 1-477 od SEQ ID NO: 100. [VWF-D'D3 protein sekvenca] Numeracija aminokiselina predstavlja zrelu VWF sekvencu bez propeptida i odgovara aminokiselinama 764-1240 od SEQ ID NO: 2. Konstrukt pSYN-VWF-002 ima FVIII signalni peptid na N-terminusu, koji omogućava pravilno lučenje sintetisanog proteina i zatim 6xHis oznaku na C-terminusu, koja se koristi za prečišćavanje proteina. Sintetisan je korišćenjem narednih kombinacija prajmera:
ESC48- Fwd - VWF-D'D3 sa VIII signalom i BsiW1 mestom
ESC51- Rev- VWF D'D3 (1-477 aminokiselina) signalom 6His i Not 1 mestom
[0316] 50 µl PCR reakcija je izvedena sa ESC 48/ESC 51 kombinacijama prajmera i
1
plazmidom od VWF pune dužine kao obrascem, koristeći dvostepeni PCR ciklus amplifikacije: 94°C 2 minuta; 21 ciklus (96°C 30 sekundi, 68°C 2 minuta). Pojas od 1460bp je prečišćen gelom pomoću kompleta za ekstrakciju gela (Qiagen, Valencia, Calif.) i kloniran na BsiWI i Not1 restrikciona mesta od pcDNK 4 kako bi se stvorio pSYN-VWF 002.
(b) Kloniranje pSYN-VWF-010 i 013
[0317] pSYN-VWF-010 je konstruisan koristeći pSYN-VWF-008 i pSYN-VWF-002. pSYN-VWF-008 sadrži VWF sekvencu pune dužine u pcDNK 3.1 (aminokiseline 1-2813 od SEQ ID NO: 2), uključuje 763 aminokiselinski propeptid (tj., D1D2 domeni), praćeno sa preostalih 2050 aminokiselinskih sekvenci zrelog VWF. FVIII signalni peptid u pSYN-VWF-002 je zamenjen sa D1D2 domenima iz pSYN-VWF-008, rezultujući konstrukt je pSYN-VWF-010. pSYN-VWF-008 ima BamH1 mesto na Arg907 i Not1 mesto na kraju regiona kodiranja (nakon zaustavnog kodona). pSYN-VWF-008 i 002 su digestirani sa restrikcionim enzimima BamH1 i Not1. Umeci iz pSYN-VWF-002 (1026 bp) su ligirani u bamH1/Not1 digestiranom sa pSYN-VWF-008 (8242bp) kako bi se dobio pSYN-VWF-010 (D1D2D'D3: aminokiselina 1-1240 od SEQ ID NO: 2), na C-terminusu je takođe dodata 6xHis oznaka. U transformisanim ćelijama pSYN-VWF-010 se sintetiše sa propeptidom, ali zahvaljujući intracelularnoj obradi, izlučeni proizvodi ne sadrže nikakav propeptid (D1D2). Protein iz VWF-010 postoji kao dimer.
[0318] pSYN-VWF-010 je korišćen za generisanje pSYN-VWF-013 koji ima dve tačke mutacije na C336A i C379A, što odgovara SEQ ID NO: 100 (numerisanje aminokiselina predstavlja zrelu VWF sekvencu bez D1D2 domena-VWF sekvenca 2). Predviđa se da ove mutacije sprečavaju dimerizaciju VWF D'D3 domena.
(c) Kloniranje pSYN-VWF-025 i pSYN-VWF-029
[0319] pSYN-VWF-025 sadrži divlji tip D1D2D'D3 sekvence VWF pune dužine u pLIVE vektoru, i pSYN-VWF-029 sadrži D1D2D'D3 sekvencu sa C336A i C379A mutacijom. Za kloniranje pSYN-VWF-025 korišćena je sledeća kombinacija prajmera:
ESC 89-fwd sa Nhel mesto= CTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCCG (SEQ ID NO: 92)
ESC 91-rev sa Sal1=
CTGGATCCCGGGAGTCGACTCGTCAGTGGTGATGGTGATGATG (SEQ ID
NO: 93)
1
[0320] 50 µl PCR reakcija je izvedena sa kombinacijama prajmera ESC 89/ESC91 i pSYN-VWF 010 (za pSYN-VWF-025) ili pSYN-VWF 013 (za pSYN-VWF-029) plazmidom kao obrazacom koristeći ciklus PCR amplifikacije sa 3 koraka: 94°C 2 minuta; 21 ciklus (96°C -30 sekundi, 55°C - 30 sekundi, 68°C - 4 minuta). Pojas očekivane veličine (~3800bp) je prečišćen gel kompletom za ekstrakciju gela (Qiagen, Valencia, Calif) i kloniran u Nheland Sal1 restrikcionim mestima pLIVE-Mirus vektora (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) kako bi se stvorio pSYN-VWF 025 i 029.
(d) Kloniranje pSYN-VWF-031
[0321] pSYN-VWF-031 je D1D2D'D3 (C336A/C379A)-Fc konstrukt koja ima 48 aminokiselina dugačak veznik razdvojiv trombinom (8x GGGGS (SEQ ID NO 94) trombinsko mesto) između VWF D1D2D'D3 (C336A/C379A) i Fc sekvence. Kako bi se napravio ovaj konstrukt, VWF-Fc region je amplificiran iz pSYN-FVIII-064 konstrukta (pogledati FVIII-VWF konstrukt u nastavku). pSYN-FVIII-VWF je digestiran sa Xba1 i Nhe1. Dobijena region umetanja od 4165bp, koji sadrži VWF fragment i Fc region, korišćen je kao obrazac za amplifikaciju VWF i Fc regiona LW22/LW23 kombinacijama prajmera.
LW 22-FWD-VWF-D'D3 sa FVIII signalnom sekvencom i BsiW1 mestom
LW 23-Rev- Fc sa zaustavnim kodonom i Not1 mestom
TCATCAATGTATCTTATCATGTCTGAATTCGCGGCCGCTCATTTACC (SEQ
ID NO:96)
[0322] PCR proizvod dobijen amplifikacijom LW22/LW23 (~2300bp) je kloniran u BSVN/Not1 digestiranom sa pSYN-VWF-002 kako bi se dobio pSYN-VWF-014 međuproizvod. pSYN-VWF-014 sadrži FVIII signalni peptid-D'D3-20 aminokiselinski veznik razdvojiv trombinom, i praćen Fc regionom.
[0323] Kako bi se generisao D1D2D'D3-Fc konstrukt, D1D2D'D3 region je amplifikovana iz pSYN-VWF-013 korišćenjem LW24/LW27 kombinacije prajmera standardnim PCR postupkom.
LW24- Fwd- VWF D1D2D'D3 klonirajući oligo sa BsiW1 mestom
GCGCCGGCCGTACGATGATTCCTGCCAGATTTGCCGGGGTG (SEQ ID
1
NO:97)
LW27-Rev-VWF D'D3 oligo sa EcoRV
CCACCGCCAGATATCGGCTCCTGGCAGGCTTCACAGGTGAG (SEQ ID
NO:98)
[0324] PCR proizvod dobijen LW22/LW23 (~3750bp) amplifikacijom je kloniran u BSVN/EcoRV digestiranom sa pSYN-VWF-014 kako bi se dobio pSYN-VWF-015 međuproizvod. Dužina veznika između VWF fragmenta i Fc regiona je promenjena kako bi se dobio pSYN-VWF-031.
[0325] VWF-D1D2D'D3 proteinska sekvenca 1 (SEQ ID NO: 99)
1
Primer 2: Efekti fuzije D'D3 i XTEN na produžetak poluživota FVIII
[0326] Kako bi se procenio D'D3 FVIII potencijal produženja poluživota na rFVIII-XTEN fuzionom proteinu, VWF D'D3 dimer je uveden u FVIII-VWF DKO miševe hidrodinamičkom injekcijom odgovarajućeg DNK konstrukta VWF-025 (Primer 1). Nakon što je D'D3 dostigao eksprimiranje u stabilnom stanju (dan5 nakon injekcije), jednokratna doza rFVIII-XTEN je primenjena IV injekcijom pri dozi od 200 IU/kg. Uzorci krvi prikupljeni su do 120 sati nakon rFVIII-XTEN doziranja. Aktivnost u plazmi FVIII analizirana je FVIII hromogenim testom. Nivo eksprimiranja D'D3 je meren pomoću VWF ELISA, i rFVIIIFc PK profil je analiziran korišćenjem WinNonlin programa.
[0327] Rezultati studije prikazani su na Slici 2, i PK parametar rFVIII-XTEN sa/bez D'D3 u cirkulaciji naveden je u Tabeli 16. D'D3 dimer je dodatno produžio rFIII-XTEN t1/2 od 3,4 do 17,8 sati, što je 5 puta više. Pored poluživota primećeno je i 5 puta povećanje MRT, 3,6 puta povećanje AUC, 3,8 puta smanjenje klirensa.
1
[0328] Primetili smo sinergetski efekat D'D3 fragmenta i XTEN tehnologije, i serija FVIII/VWF/XTEN konstrukata biće procenjena na osnovu njihovog FVIII potencijala produženja poluživota kod hemofilnih životinja.
TABELA 16: rFVIII-XTEN PK parametar sa/bez D'D3 u cirkulaciji krvi
Proteinsko prečišćavanje FVIII-XTEN
[0329] AE288 XTEN je umetnut na C-terminus od BDD-FVIII za ovu studiju. Za prečišćavanje ovog proteina, prvo je korišćen korak filtracije tangencijalnog toka (TFF) za pufersku razmenu kondicioniranih medijuma. Proizvodi u filtratu su zatim uhvaćeni pomoću snaže hromatografije razmene anjona, i zatim dalje prečišćeni koristeći afinitetnu kromatografiju. Čistoća molekula bila je prihvatljiva pomoću HPLC-SEC i dalje je potvrđena western blotiranjem. Specifična aktivnost molekula bila je uporediva sa FVIII sa izbrisanim B domenom, mereno aPTT testom i pomoću ELISA.
FVIII hromogeni test
[0330] FVIII aktivnost je merena korišćenjem COATEST SP FVIII kompleta od DiaPharme (serijski # N089019) i sve inkubacije su izvedene na 37°C ploči sa mućkanjem.
[0331] Raspon rFVIII standarda bio je od 100 mIU/mL do 0,78 mIU/mL. Skupljena normalna kontrola ljudske plazme i uzorci plazme (razblaženi sa IX Coatest puferom) su dodati u Immulon 2HB ploče sa 96 komorica u u duplikatu (25 µL/komorica). Sveže pripremljena smeša IXa/FX/fosfolipida (50 µL), 25 µL 25 mM CaCl2 i 50 µL FXa supstrata dodati su uzastopno u svaki otvor sa tokom 5 minuta inkubacije između svakog dodavanja. Posle inkubacije sa supstratom, dodato je 25 µL 20% sirćetne kiseline kako bi se prekinula
1 1
reakcija bojenja, i apsorbancija OD405 je izmerena SpectraMAX plus instrumentom (Molecular Devices). Podaci su analizirani SoftMax Pro softverom(verzija 5.2). Najniži nivo kvantifikacije (LLOQ) je 7,8 mIU/mL. VWF ELISA:
[0332] Kozje anti-ljudsko VWF antitelo (afinitetno prečišćeno, afinitetno biološko, GAVWF-AP) je korišćeno kao antitelo za hvatanje u 0,5 µg/komorica, i VWF-EIA-D (Affinity Biologicals, VWF-EIA-D, 1:100, razređivanje) koristi se kao antitelo za detektovanje za VWF ELISA. ELISA test izvršen je po standardnom ELISA postupku, TMB je korišćen kao HRP supstrat, PBST/1,5% BSA/0,5M NaCl pufer je korišćen kao pufer za blokiranje i vezivanje. Standardni raspon testa je 100ng do 0,78ng, i najniži nivo kvantifikacije (LLOQ) analize je 7,8ng/mL.
Primer 3: Konstrukcija plazmida od XTEN koja sadrži FVIII/VWF konstrukte
(a) Kloniranje pSYN-FVIII-161 (Slika 3)
[0333] FVIII-161 plazmid sadrži jednolančanu Fc (scFc) skelu sa mestima razdvajanja enzima koji se tokom sinteze obrađuju u ćeliji. Konstrukt ima FVIII vezujući domen od VWF pune dužine (D'D3).
[0334] Plazmid (pSYN-FVIII-161) je dizajniran za eksprimiranje FVIII-Fc i VWF-Fc heterodimera, gde D'D3 domeni vezuju FVIII i sprečavaju interakciju FVIII sa fosfolipidima i aktiviranim proteinom C. Protein iz pSYN-FVIII-161 eksprimira se u ćeliji kao pojedinačni polipeptid gde je C-terminus FVIII-Fc podjedinice povezan sa N-terminusom VWF D'D3-Fc podjedinice pomoću 6x (GGGGS) polipeptidnog veznika (SEQ ID NO: 64). Pored toga, RRRRS (SEQ ID NO: 11) i RKRRKR (SEQ ID NO: 10) sekvence su umetnute na 5' i 3' kraj polipeptidnog veznika, respektivno, za intracelularno razdvajanje proprotein konvertazama posle poslednjeg Arg kod svake sekvence. Dakle, ćelije mogu da eksprimiraju heterodimer sa dvostrukim lancem FVIII-Fc/D'D3-Fc, gde lanac FVIII-Fc ima RRRRS sekvencu (SEQ ID NO: 11) na C-terminusu, ali je ostatak veznik sekvence uklonjen. Nakon AE288 XTEN fragmenta neposredno sledi IS{5X(GGGGS)}LVPRGSGG (SEQ ID NO: 122) polipeptid (sadrži mesto razdvajanja trombina) između VWF domena i Fc regiona kako bi se olakšalo oslobađanje VWF fragmenta iz FVIII nakon što se FVIII-VWF hetero-dimerni protein aktivira od strane trombinom omogućavajući interakciju FVIII sa drugim faktorima koagulacije.
1 2
[0335] pSYN-FVIII-161 (SEQ ID NO: 101).proteinska sekvenca (FVIII sekvenca položaj aminokiselina 1-1457; podvučeni region predstavlja Fc region; talasasto podvlačenje predstavlja razdvojivi veznik između prvog Fc i VWF fragmenta; dvostruko podvučeni region predstavlja VWF fragment; podebljani region predstavlja razdvojivi veznik između VWF fragmenta i Fc.
1
��
(b) Kloniranje_pSYN-FVIII-168, 175, 172 i 174 (Slika 4A-4D)
[0336] pSYN-FVIII-168, 172, 174 i 175 su derivati pSYN-FVIII-161. Mutacije R1645A/R1648A uvedene su u pSYN-FVIII-161 kako bi se formirao pSYN-FVIII-168, koji stvara SC-FVIII izoform, i AE288 XTEN je direktno spojen u C-terminus FVIII-HC radi produžetka poluživota. Kako bi se konstruisao pSYN-FVIII-175, D'D3 kodonska sekvenca uklonjena je iz oblika pSYN-FVIII-168 radi procene uticaja Fc i XTEN tehnologije na produženje poluživota FVIII.
[0337] Kako bi se konstruisao pSYN-FVIII-172, AE288 XTEN fragment je direktno spojen u C-terminus od FVIII-HC radi daljeg produženja poluživota, i D'D3 kodonska sekvenca je uklonjena iz pSYN-FVIII-172 kako bi se formirao pSYN- FVIII-174 za procenu uticaja Fc i XTEN tehnologije na produženje poluživota FVIII.
(c) Kloniranje pSYN-FVIII-170 (Slika 4E)
[0338] pSYN-FVIII-170 je konstruisan da proceni uticaj XTEN i D'D3 fragmenta na produženje poluživota FVIII. Fragment VWF-D1D2D'D3 kodonske sekvence i BDD-FVIII uvedeni su u 5' i 3' kraj kaskade eksprimiranja, AE288 XTEN kodonska sekvenca koja je praćena 35 aa veznikom razdvojivim trombinom korišćena je za povezivanje VWF i FVIII molekula. Nakon intracelularne obrade, izlučeni protein sadrži polipeptid koji sadrži D'D3
1
fragment zrelog VWF molekula koji je povezan sa N-terminusom zrelog BDD-FVIII pomoću AE288 XTEN/35 aa veznika razdvojivog trombinom.
pSYN-FVIII-170 proteinska sekvenca (SEQ ID NO: 102)
1
Primer 4: Hidrodinamička injekcija XTEN koji sadrži FVIIIF/VWF konstrukte kod miševa sa nedostatkom FVIII i VWF
[0339] DNK konstrukti koji sadrže XTEN na Slikama 3 i 4 kombinuju 2-3 elementa produženja poluživota. Kako bi se procenio njihov potencijal produženja poluživota FVIII, selektivna grupa DNK konstrukta na Slici 3 i Slici 4 uvedena je u FVIII/VWF dvostruke
1
nokaut (DKO) miševe hidrodinamičkom injekcijom (HDI) u dozi od 100 µg/miš. Uzorci krvi su zatim prikupljeni retro orbitalnim prikupljanjem krvi 24 sata nakon HDI. Aktivnost FVIII u plazmi nakon HDI analizirana je hromogenom analizom FVIII, i rezultati su navedeni u Tabeli 17 i na Slici 5. U poređenju sa divljim tipom BDD-FVIII, svi konstrukta DNK koji sadrže XTEN daju značajno veću FVIII aktivnost u plazmi u 24 sata posle HDI, što ukazuje da su odgovarajući molekuli imali značajno duži poluživot proteina u cirkulaciji u odnosu na BDD-FVIII. Primena kombinacije tih elemenata koji produžavaju poluživot dalje je procenjena kod hemofilnih životinja.
TABELA 17: FVIII aktivnost u plazmi 24 sata posle HDI kod FVIII/VWF DKO miševa
Hidrodinamička injekcija:
[0340] Hidrodinamička injekcija je efikasan i siguran nevirusni postupak isporuke gena jetri kod malih životinja, kao što su miševi i pacovi. Prvobitno je opisan kao brza injekcija gole plazmidne DNK/fiziološkog rastvora bez endotoksina u desetini zapremini telesne težine životinje tokom oko 5-7 sekundi. Gola plazmidna DNK sadrži gene od interesa i jetru proizvedenu u desetini zapremini telesne težine životinje. Ciljani protein se stvara u jetri iz injektirane DNK i može se detektovati u roku od 24 sata nakon injekcije. Zatim su prikupljeni uzorci plazme radi proučavanja terapijskog svojstva eksprimiranog proteina.
[0341] Za sve hidrodinamičke injekcije koje su ovde izvedene, 2 ml plazmidne DNK u 0,9% sterilnom fiziološkom rastvoru isporučeno je intravenskom injekcijom u repnu venu u roku od 4-7 sekundi miševima težine 20-35 grama. Miševi su pažljivo nadgledani prvih par sati dok se normalna aktivnost nije nastavila. Nakon uzimanja uzoraka krvi retro-orbitalnim prukupljanjem krvi, dobijeni su uzorci plazme i čuvani na -80°C radi dalje analize.
Primer 5: Konstrukcija plazmidnog sistema ko-transfekcije za FVIIIFc-VWF
1
Heterodimer koji sadrži XTEN umetke (Slika 6)
[0342] Kako bi se povećao prinos proteina, stvorena su dva sistema transfekcije za proizvodnju proteina, koji sadrži tri DNK konstrukta. Prvi DNK konstrukt je kodirao FVIII-Fc fuzioni protein u kom je AE288 XTEN fragment direktno spojen za C-terminus teškog lanca FVIII, i koji je praćen fragmentom lakog lanca divljeg tipa FVIII (pSYN-FVIII-173, Slika 6B) ili fragmentom lakog lanca FVIII sa R1645A/R1648A mutacijama (pSYN-FVIII-169, Slika 6A), laki lanac FVIII je zatim direktno spojen sa jednim Fc fragmentom. Drugi DNK konstrukt je pSYN-VWF-031 koji kodira D'D3-Fc fuzioni protein (Primer 1).
HEK293F ćelije su transficirane sa dva plazmida zajedno sa trećim plazmidom (PC5) u odnosu 80:15:5. Sintetisani proteini su izlučeni kao FVIII (XTEN) Fc/D'D3Fc heterodimer i D'D3Fc dimer, i FVIII (XTEN) Fc/D'D3Fc heterodimer je odvojen od D'D3Fc dimera prečišćavanjem proteina.
pSYN-FVIII-169 zrela proteinska sekvenca (SEQ ID NO: 103):
1
�
pSYN-FVIII-173 zrela proteinska sekvenca (SEQ ID NO: 104):
1 1
Primer 6. Prečišćavanje proteina za FVIII-169/VWF-031 i FVIII-173/VWF-031
[0343] Korak filtracije tangencijalnog protoka (TFF) korišćen je za pufersku razmenu pročišćenog kondicioniranog medijuma. Zatim je heterodimer FVIII-169/VWF-031 ili FVIII-173/VWF-031 prečišćen korišćenjem dvostepene hromatografije. Upotrebljena je slaba anjonska smola praćena afinitetnom hromatografijom. Konačni prečišćeni proizvod je imao prihvatljivu čistoću pomoću SEC-HPLC. Specifična aktivnost bila je kompatibilna sa FVIII izbrisanim iz B domena, mereno FVIII hromogenim testom i A280 koncentracijom. Čistoća i prisustvo svake grupe ovog molekula potvrđeni su SDS-PAGE i Western blotovanjem.
Primer 7. Procena sposobnosti vezivanja VWF FVIII-169/VWF-031 pomoću Oktet testa
1 2
[0344] Sposobnost vezivanja VWF FVIII-169/VWF-031 dobijena je merenjima na bazi BioLayer Interferometry (BLI) (Oktet test) na 25°C ForteBio Octet 384 instrumentu, koristeći Tris pufer za vezivanje (50 mM Tris, pH 7,2, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2). Oktet test za određivanje vezivanja FVIII zasnovan je na hidrofobnoj imobilizaciji ljudskog fon Vilebrandovog faktora (Haematologic Technologies Catalog No. HCVWF-0191) na APS Biosensor, i zatim je vezano 1,0% goveđeg serumskog albumina (Jackson ImmunoResearch Catalog No.001-000-161). Ukratko, hvWF (20 µg/mL) je razblažen u Tris puferu i napunjen preko APS Biosenzora tokom 600 sekundi, čime se dobija približno 3,0 - 3,5 nm vezivanja na reakcionim sondama. Kontrolne APS sonde su bile napunjene sa 1,0% BSA u odsustvu hvWF za referentno oduzimanje. Nakon punjenja, sve sonde su inkubirane u Tris puferu tokom 300 sekundi kako bi se uspostavila nova osnovna linija. Potom se biosenzorne sonde inkubiraju u rastvorima leka FVIII-XTEN 169 ili FVIIIFc (0, 0,6, 2, 6, 20, 60, 200, 600 IU/mL) tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi, nakon čega sledi 5 minuta koraka disocijacije. Koristeći Oktet softver za analizu podataka, odgovor vezivanja (nm) je izveden iz oduzetih podataka (reakciona sonda minus referentna sonda). Nije utvrđeno vezivanje FVIII-169/VWF-031 za imobilisani VWF (Slika 7), što ukazuje na potpunu zaštitu FVIII od VWF molekula pune dužine pruženu od strane D'D3 fragmenta.
Primer 8. FVIII-169/VWF-031 PK kod HemA i FVIII/VWF DKO miševa
[0345] PK profil FVIII-169/VWF-031 testiran je na HemA i FVIII/VWF DKO miševima kako bi se procenila sposobnost D'D3 fragmenta da štiti FVIII deo od endogenog VWF. HemA ili FVIII/VWF DKO miševi su tretirani jednom intravenskom dozom FVIII-169/VWF-031 pri 200 IU/kg, uzorci plazme su zatim sakupljeni na 5 minuta, 8 sati, 24 sata, 48 sati i 72 sata nakon doziranja. FVIII aktivnost uzorka plazme testirana je hromogenim FVIII testom, i poluživot FVIII-169/VWF-031 izračunat je korišćenjem WinNonlin programa.
[0346] Potpuna inhibicija vezivanja konstrukata na imobilisani VWF demonstrirana je bioslojnom interferometrijom (Slika 7) za FVIII-169/VWF-031. To ukazuje da je D'D3 fragment u molekulu uspešno blokirao vezivanje FVIII za nativne VWF molekule, zbog čega je sličan poluživot FVIII-169/VWF-031 predviđen za dva različita soja miša. Kao što je prikazano na Slici 8A i u Tabeli 18, kao što je očekivano, FVIII-169/VWF-031 imao je sličan PK profil i kod HemA i kod FVIII/VWF DKO miševa, što je pokazalo da je poluživot FVIIIFc/VWF heterodimera nezavisan od poluživota endogenog VWF. Razdvajanje
1
poluživota FVIIIFc/VWF heterodimera od endogenog VWF poluživota eliminisalo je ograničenje produžavanja FVIII i otvorilo mogućnost za dalje produženje poluživota FVIII preko granica dvostrukog poluživota koju nameće endogeni VWF.
TABELA 18: FVIII-169/VWF-031 PK kod HemA i FVIII/VWF DKO miševa
[0347] FVIII zaštitna sposobnost XTEN umetka i D'D3 fragmenta procenjena je poređenjem poluživota FVIII-169/VWF-031 sa FVIII-169/Fc i FVIIIFc kod FVIII/VWF DKO miševima. Nakon jedne IV primene, uzorci krvi su sakupljeni na 5 minuta, 8 sati, 24 sata, 48 sati i 72 sata za FVIII-169/VWF-031, 5 minuta, 8 sati, 24 sata, 32 sata, 48 sati za FVIII-169/Fc i na 5 minuta, 1, 2, 4, 6 i 8 sati za FVIIIFc. FVIII aktivnost uzorka plazme testirana je hromogenim testom FVIII, i poluživot FVIII-155/VWF-031 izračunat je korišćenjem WinNonlin programa.
[0348] Rezultati studije sumirani su na Slici 8B i u Tabeli 19, rFVIIIFc ima poluživot od 1,6 sati kod DKO miševa usled gubitka VWF zaštite. Kada je XTEN umetanje uvedeno u FVIIIFc molekulu, rezultujući molekul FVIII-169/Fc ima poluživot od 7 sati, četverostruko produženje poluživota usled XTEN umetanja. Konačno, kada je D'D3 fragment umetnut u molekul kako bi se formirao FVIII-169/VWF-031, primećen je poluživot u trajanju od 17 sati, i još 2,5 puta dalje povećanje D'D3 fragmenta. Pored poboljšanja poluživota, takođe su primećena poboljšana srednja vremena boravka (MRT), čistoća (Cl) i AUC kao što je prikazano u Tabeli 19.
[0349] FVIII-169/VWF-031 je postigao 17-18 sati t1/2kod HemA i FVIII/VWF DKO miševa, što je gornja granica ograničenja produžetka t1/2nametnuta VWF klirensom. Dodatni elementi produžetka t1/2mogu se dalje ugraditi u ovaj molekul, kao što je drugo XTEN umetanje u FVIII. Sinergetski efekat D'D3 fragmenta i XTEN umetanja pružio je mogućnost
1 4
potpune zaštite FVIII od njegovog klirens puta, konačno probijanje dvostrukog ograničenja produžetka t1/2od FVIII može se postići FVIIIFc/XTEN/VWF varijantama.
TABELA 19. FVIII-169/VWF-031 PK kod FVIII/VWF DKO miševa
Primer 9: FVIII-XTEN varijantekoncentrata ćelijskog medijuma PK kod FVIII/VWF DKO miševa koji eksprimiraju D'D3
[0350] Sposobnost D'D3 fragmenta da produži t1/2od FVII-XTEN je procenjen u modelu FVIII/VWF DKO miševa koji eksprimiraju D'D3 (opisan u primeru 2). U ovoj studiji, umesto korišćenja VWF-025 za uvođenje D'D3 dimera u cirkulaciju, VWF-029 konstrukt je korišćena za uvođenje D'D3 monomera u cirkulaciju. Za pripremu proteina FVIII-XTEN varijanti, pripremljen je mali (50-100 mL) prolazni medijum za transfekcionu kulturu, na dan 4 nakon transfekcije, ćelijska kultura je sakupljena i koncentrovana da dostigne 10-20 IU/mL raspona aktivnosti FVIII koji je pogodan za PK studiju. Koncentrovani ćelijski medijum je zatim korišćen za standardno PK ispitivanje kod FVIII/VWF DKO miševa sa ili bez D'D3 u cirkulaciji.
[0351] U sistemu je testirano ukupno 6 FVIII-XTEN varijanti koje sadrže 1-3 XTEN umetanja, njihovi t1/2prikazani su u Tabeli 20, i podaci reprezentativnih varijanti prikazani su na Slici 9A.
[0352] Duži poluživot je primećen za sve varijante FVIII-XTEN sa prisustvom fragmenta u cirkulaciji (Tabela 20), koji je pokazao D'D3 zaštitu za FVIII-XTEN od svojih puteva
1
klirensa. Pored toga, u poređenju sa 14 sati poluživotom kod HemA miševa, LSD0055.021 ima 20,4 sata t1/2kod DKO miševa koji eksprimiraju D'D3 (Slika 9B, Tabela 20), ukazuje na konačno probijanje dvostrukog ograničenja produžetka t1/2za molekule FVIII. Daljom modifikacijom FVIII(XTEN)/VWF molekula, potencijalno bismo mogli postići još duži FVIII t1/2i pružiti pacijentima sa HemA FVIII protein koji zahteva režim doziranja samo jednom nedeljno ili ređe.
TABELA 20. FVIII-XTEN t1/2 kod FVIII/VWF DKO miševa koji eksprimiraju D'D3
Primer 10: Stabilnost FVIII varijanti koje sadrže VWF i XTEN u plazmi FVIII/VWF dvostrukih knockout (DKO) miševa
[0353] Stabilnost u plazmi varijanti proteina rFVIIIFc testirana je u plazmi FVIII/VWF dvostrukih knockout (DKO) miševa. Za test stabilnosti, HEK293 ćelije su ko-transficirane plazmidima koji usmeravaju eksprimiranje rFVIIIFc ili FVIII-169 (rFVIIIFc sa 288 AE XTEN umetnutim na mestu spajanja B domene) i plazmidima koji usmeravaju eksprimiranje IgG-Fc ili VWF-031 (VWF D'D3 region spojen sa IgG-Fc). Na četvrti dan nakon transfekcije, prikupljen je medijum ćelijske kulture i koncentrovan do 30 IU/mL na osnovu
1
hromogenog delovanja FVIII. Koncentrovani medijum ćelijske kulture je zatim dodat u mišju plazmu DKO kako bi se dobila FVIII aktivnost od 5 IU/mL i inkubirala na 37°C. Alikvoti su prikupljeni u različitim vremenskim tačkama za merenje aktivnosti hromogenim testom. Aktivnost u svakoj vremenskoj tački merena je u duplikatu, i prosečna aktivnost je prikazana kao funkcija vremena. Aktivnost FVIIIFc, dvolančanog (dc) FVIII molekula u kom se teški i laki lanac drže zajedno nekovalentnom interakcijom, vremenom opada u plazmi DKO miševa (Slika 10). Aktivnost FVIII-169:Fc, koji sadrži 288 AE XTEN umetanje na spoju B domena, propada smanjenom brzinom u odnosu na rFVIIIFc, što ukazuje da se XTEN umetanjem daje povećana stabilnost. S obzirom da je predloženo da VWF povećava stabilnost FVIII in vivo, procenili smo stabilnost u plazme od FVIII-169:VWF-031. Ovaj heterodimerni molekul, u kom su FVIII element i VWF D'D3 element spojeni u odgovarajuće hemi domene Fc, pokazao je dodatnu stabilnost plazme u odnosu na FVIII-169:Fc, što ukazuje da VWF D'D3 domen i XTEN imaju a sinergetski efekat na stabilnost rFVIIIFc u plazmi. Primer 11: Efekat Fc fuzije, umetanja XTEN i D'D3 fragmenta od VWF na FVIII poluživot.
[0354] Kako bi se procenio efekat Fc fuzije, umetanja XTEN i D'D3 fragmenta od VWF na FVIII poluživot, farmakokinetička svojstva rekombinantnog FVIII sa izbrisanim Bdomenom (rBDD-FVIII), rFVIIIFc, FVIII-169: Fc i FVIII-169:VWF-031 su procenjeni kod FVIII/VWF dvostrukih knockout (DKO) miševa.
[0355] DKO miševi su tretirani jednom intravenskom primenom 200 IU/kg FVIII proteina, i uzorci plazme su sakupljeni u određenim vremenskim tačkama kao što je prikazano na Slici 11. FVIII aktivnost uzoraka plazme analizirana je FVIII hrogenim testom i poluživotom je izračunat je pomoću WinNonlin-Phoenix programa. Farmakokinetički parametri ispitivanih molekula navedeni su u Tabeli 21. Vremenska regresiona kriva aktivnosti FVIII u plazmi za svaku varijantu FVIII prikazana je na Slici 11.
[0356] Nemodifikovani BDD-FVIII imao je poluživot od 0,23 sati kod DKO miševa, FVIIIFc fuzioni protein ima produženi poluživot od 1,66 sati kod DKO miševa usled recikliranja FVIIIFc proteina kroz Fc:FcRn interakciju. Kada je 288 ostatak AEXTEN polipeptida ugrađen u B domenu region od FVIII unutar FVIIIFc molekula, poluživot rezultujućeg FVIII 169/Fc proteina je produžen na 7,41 sati kod DKO miševa. Konačno, dodavanjem D'D3 domena VWF, poluživot FVIII 169/VWF031 heterodimera je dostigao 17,9 sati kod DKO miševa (Slika 11, Tabela 21). Pored poluživota, svi ostali PK parametri su takođe
1
proporcionalno poboljšani sa dodatkom svakog elementa (Tabela 21). FVIII može podneti više elemenata produženja poluživota, i ovaj sinergetski efekat tri elementa na produženje FVIII poluživota omogućio je dalje poboljšanje poluživota FVIII-XTEN VWF heterodimera.
Tabela 21: PK parametri od FVIII varijanti
Primer 12: Farmakokinetička svojstva različitih FVIII-XTEN_VWF heterodimera [0357] Kako bi se procenio kombinovani efekat fragmenta VWF-D'D3 i XTEN umetanja na poluživot FVIII, farmakokinetička svojstva heterodimera FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc testirana su na HemA miševima i upoređena sa efektima jednog lanca izoforma BDD-FVIII (scBDD-FVIII) i FVIII-169:VWF-031 (Primer 10). Stvoreno je sedam novih FVIII-XTEN-Fc konstrukata (proteinske sekvence su navedene u Tabeli 24). Šematski dijagrami tih konstrukta prikazani su na Slici 14A-H. FVIII-195 i FVIII-199 su FVIII dvolančani i jednolančani izoformni oblici koji sadrže po dva XTEN umetanja na položajima 1900 i 1656. FVIII-196 i FVIII-201, respektivno, su FVIII dvolančani i jednolančani izoformi, tako da svaki sadrži tri XTEN umetanja na položajima 26, 1656 i 1900. FVIII-203, -204 i -205 su sc-FVIIIFc molekuli sa dva XTEN umetanja na mestu spajanja domena B i na položajima 1900, 403 ili 18, respektivno. Svaki FVIII-XTEN-Fc konstrukt ko-eksprimiran je sa VWF-031 u HEK293 ćelijama kako bi se proizveli FVIII-XTEN-Fc/VWF heterodimerni proteini. Na četvrti dan posle transfekcije, sakupljen je medijum ćelijske kulture i koncentrovan do 20
1
IU/mL na osnovu FVIII hromogenog delovanja (FVIII-195: VWF-031, FVIII-196: VWF-031, FVIII-199: VWF-031, FVIII-203: VWF-031 i FVIII-204: VWF-031) ili su prečišćeni (scBDD-FVIII, FVIII-169:VWF-031, FVIII-201:VWF-031 i FVIII-205: VWF-031). Nakon što je demonstrirano potpuna intra-molekularna zaštita FVIII molekula endogenog VWF fragmenta od strane D'D3 u FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc heterodimeru (FVIII-169:VWF-031, Primer 5), odabrani su HemA miševi za PK procene. Prečišćeni protein ili koncentrovani medijum ćelijske kulture dat je HemA miševima starim 8-12 nedelja intravenskim primenom u dozi od 200 IU/10 mL/kg. Uzorci plazme prikupljeni su nakon doziranja od 5 minuta, 8 sati, 16 sati, 24 sata, 32 sata, 48 sati, 72 sata i 96 sati. FVIII aktivnost uzoraka plazme analizirana je FVIII hromogenim testom i poluživot je izračunat korišćenjem WinNonlin-Phoenix programa. Farmakokinetički parametri ispitivanih molekula navedeni su u Tabeli 22. Aktivnosti FVIII u plazmi u izabranim vremenskim tačkama za varijante FVIII-XTEN-Fc/VWF-Fc prikazane su na Slikama 12A-C.
[0358] Kada je XTEN umetnut u položaje 1900 i 1656 (FVIII-195, FVIII-199), primećeno je umereno poboljšanje poluživota za scFVIII izoform (FVIII-199:VWF-031) u poređenju sa FVIII-169:VWF-031. Međutim, dcFVIII izoform pokazao je kraći poluživot od FVIII-169:VWF-031, što ukazuje da je jednolančani izoform možda značajno stabilniji od odgovarajućeg dvolančanog izoforma (Tabela 22 i Slika 12A). Kada je treće XTEN umetanje uključeno u FVIII-199 na položaju 26, poluživot rezultujućeg FVIII-201:VWF-031 molekula je dostigao 24,6 sata, što predstavlja više od trostrukog poboljšanja poluživota u odnosu na scBDD-FVIII (Tabela 22 i Slika 12C). Takođe smo testirali efekat produženja poluživota drugog XTEN umetanja na položaju 403 (A2 domen), 1900 (A3 domen) i 18 (A1 domen), svi u kombinaciji sa XTEN umetanjem domena B. Iako dodavanje A2 ili A3 XTEN umetanja nije dalo dodatnu korist za poluživot (Tabela 22, Slika 12b), dodavanje A1 umetanja dodatno je produžilo poluživot FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc heterodimera do 29,4 sata (Tabela 22, Slika 12C), što je trostruko duže nego kod scBDD-FVIII.
[0359] Kada su XTEN uključeni u heterodimerni konstrukt FVIIIFc/VWF, stepen poboljšanja poluživota rezultujućih molekula je promenljiv i nije primećena očigledna veza između poluživota i mesta ili broja umetanja XTEN, što sugeriše da se poluživot FVIII-XTEN-Fc/VWF heterodimera određuje integritetom celog molekula, pre nego brojem ili rasporedom XTEN umetanja.
1
[0360] Poluživot od 24,6 i 29,4 sata, posmatran za heterodimere FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc, očigledno je premašio ograničenje od 1,6 do 2 puta za produženje poluživota FVIII. Ako se ovo otkriće prenese na HemA pacijente, omogući je doziranje jednom nedeljno ili ređe za profilaksu FVIII.
Tabela 22: PK parametri FVIII-XTEN-Fc/VWF-Fc heterodimera
[0361] Pored uključivanja XTEN u FVIII molekul, takođe smo procenili potencijalnu korist produženja poluživota od ugradnje XTEN kao veznika između D'D3 i Fc fragmenta. FVIII-155 (scFVIIIFc) je ko-eksprimiran sa VWF-034 (VWF-Fc sa AE 288 XTEN plus 35 ostatak
1
veznika razdvojvog trombinom) u HEK293 ćelijama. Na dan 4 posle transfekcije, sakupljen je medijum ćelijske kulture i koncentrovan do 20 IU/mL na osnovu ispitivanja FVIII aktivnosti. FVIII/VWF DKO miševi su dozirani sa koncentrovanim medijumom ćelijske kulture na 200 IU/10 mL/kg jednom intravenskom injekcijom. Uzorci plazme prikupljeni su nakon doziranja od 5 min, 8 sati, 24 sata, 48 sati, 72 sati i 96 sati. FVIII aktivnost uzoraka plazme analizirana je hromogenim testom FVIII, i regresiona kriva aktivnosti FVIII u plazmi kao funkcija vremena je izvučena (Slika 13). FVIII-155/VWF-034 je pokazao isto poboljšanje poluživota kao i FVIII-169/VWF-031, koji ima AE 288 XTEN umetnut u spoj domena B od FVIII, što je ilustrovano preko regresionih krivih za dva molekule (Slika 13). Dokaz da umetanje XTEN u VWF-Fc polipeptid omogućava poboljšanje poluživota veličine slične onoj dobijenoj XTEN umetanjem u spoj B domene FVIII polipeptida ukazuje da je moguće poboljšanje poluživota kod molekula heterodimera kod kog je intramolekularno XTEN umetanje u FVIII polipeptid kombinovano sa inter-domenskim XTEN umetanje između VWF i Fc elemenata od VWF-Fc polipeptida.
Primer 13A: Farmakokinetička svojstva dodatnih FVIII-XTEN_VWF heterodimera [0362] Pored FVIII-XTEN VWF heterodimera koji su navedeni u Tabeli 22, FVIII-XTEN VWF heterodimeri koji sadrže različit sastav XTEN umetanja, jednolančanih i dvolančanih verzija FVIII (Tabela 23A) su kod HemA testirani ili će biti testirani za svoja farmakokinetička svojstva. Različiti FVIII konstrukti (Tabela 23B) i VWF konstrukti (Tabela 23C) su takođe opisani u nastavku. HemA miševi biće tretirani jednom dozom intravenske primene proteina heterodimera pri 200 IU/10 mL/kg. Zatim će uzorci plazme biti uzeti 5 minuta, 24, 48, 72, 96 i 120 sati nakon doziranja. Aktivnost FVIII u uzorcima plazme analiziraće se FVIII hromogenim testom i poluživot će se izračunati korišćenjem WinNonlin-Phoenix programa. Proteinske sekvence navedenih heterodimera date su u Tabeli 25.
Tabela 23A. Moguće FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc kombinacije heterodimera za PK i poboljšanje aktivnosti.
1 1
Tabela 23B. FVIII konstrukti:
12
Tabela 23C. VWF konstrukti:
Primer 13B: Farmakokinetička svojstva dodatnih FVIII-XTEN_VWF heterodimera.
1
[0363] FVIII-XTEN_VWF heterodimiri suna HemA miševima testirani za svoja farmakokinetička svojstva. Ispitivani heterodimiri su FVIII169/VWF034, FVIII205/VWF034, FVIII205/VWF036 i FVIII266/VWF031. HemA miševima su jednom primenjene intravenske doze različitih heterodimernih proteina pri 200 IU/10 mL/kg. Uzorci plazme prikupljeni su nakon 5 do 24, 48, 72, 96 i 120 sati. FVIII aktivnost uzoraka plazme analizirana je FVIII hromogenim testom, i poluživot je izračunat korišćenjem WinNonlin-Phoenix programa. Rezultati PK su prikazani u Tabeli 24 u nastavku.
Tabela 24. Dodatni FVIII-XTEN_VWF - PK kod HemA miševa
pSYNFVIII 010 nukleotidna sekvenca-(dvolančani FVIIIFc) (SEQ ID NO: 125)
1 4
�
�
�
�
pSYNFVIII 010 proteinska sekvenca-(dvolančani FVIIIFc) (SEQ ID NO: 126)
1
Primer 14: Nova klasa molekula koagulacionog Faktora VIII sa više nego trostrukim produženjem poluživota kod miševa sa hemofilijom A
[0364] Nova klasa molekula FVIII dizajnirana je da sadrži dva polipeptida; onaj koji se sastoji od jednolančanog FVIII sa izbrisanim B domenom (BDD) sa XTEN umetnutim na jednom ili više mesta unutar FVIII sekvence, i jednog koji se sastoji od D'D3 regiona VWF. Svaki polipeptid je takođe rekombinantno spojen sa Fc regionom IgGl kako bi se omogućilo da se D'D3 region pravilno postavi za vezivanje grupe FVIII. Dobijene FVIII varijante su eksprimirane u HEK 293 ćelijama prolaznom transfekcijom i očišćene od kondicioniranog medijuma. FVIII aktivnost je procenjena FVIII hromogenim testom, i farmakokinetička svojstva su procenjena i kod FVIII knockout (HemA) i FVIII/VWF dvostrukih knockout (DKO) miševa.
[0365] Uključivanje XTEN i D'D3 regioni VWF u rFVIII dovelo je do razdvajanja klirensa fuzionih proteina od endogenog VWF istovremeno produžavajući njihov poluživot u cirkulaciji. FVIII u ovoj fuzionoj konfiguraciji je u potpunosti zaštićen od interakcije sa VWF, mereno analizom bioslojne interferometrije (Oktet). U skladu sa ovim, otkriveno je da su njihovi farmakokinetički profili kod HemA i DKO miševa identični, što ukazuje da je njihova stopa klirensa kod miševa efikasno isključena sa VWF. Optimizacijom dužine XTEN
1
i mesta za umetanje XTEN identifikovana je podgrupa proteina koji su premašili VWF ograničenje (16 sati), dostigavši poluživot u cirkulaciji do 30 sati kod HemA miševa što predstavlja četverostruko poboljšanje u odnosu na BDD-FVIII. Ono što je posebno važno, ovi proteini su zadržali svoju funkcionalnost, kako je procenjeno FVIII hromogenim testom.
[0366] Zavisnost od VWF postavila je temeljno ograničenje za poluživot terapijskog FVIII. Odvajanje FVIII od VWF puteva klirensa uz produženje poluživota fuzijom D'D3 regiona VWF i XTEN stvorilo je novi FVIII molekul sa 4-kratnim produženjem poluživota. Ovo je prvi izveštaj sintetičkog FVIII koji je premašio ograničenje poluživota primećeno naporima širom industrije u razvoju dugotrajnog FVIII, što predstavlja potencijalno značajan napredak u profilaktičkom tretmanu hemofilije A.
Tabela 25: Proteinske sekvence FVIII-XTEN-Fc i VWF-Fc konstrukata FVIII 195 proteinska sekvenca (dvolančani FVIIIFc sa dva 144 AE XTEN u aminokiselinama 1656 i 1900) (SEQ ID NO: 105)
1 1
FVIII 196 proteinska sekvenca (dvolančani FVIIIFc sa tri 144 AE XTEN na
1 2
aminokiselinama 26, 1656 i 1900) (SEQ ID NO: 106)
1
FVIII 199 proteinska sekvenca (jednolančani FVIIIFc sa tri 144 AE XTEN na
1 4
�
FVIII 201 proteinska sekvenca (jednolančani FVIIIFc sa tri 144 AE XTEN na aminokiselinama 26, 1656 &1900) (SEQ ID NO: 108)
1
�
FVIII 203 proteinska sekvenca (jednolančani FVIIIFc sa dva AE XTEN; jednim 288AE XTEN u B domenu i jednim 144 AE XTEN na aminokiselini 1900) (SEQ
1
FVIII 204 proteinska sekvenca (jednolančani FVIIIFc sa dva AE XTEN; jednim 288AE XTEN u B domenu i jednim 144 AE XTEN na aminokiselini 403) (SEQ ID NO: 110)
1
�
FVIII 205 proteinska sekvenca (jednolančani FVIIIFc sa dva AE XTEN; jednim 288AE XTEN u B domenu i jednim 144 AE XTEN na aminokiselini 18) (SEQ ID
2 1
22
pSYN FVIII 266 proteinska sekvenca (FVIII Fc sa 42 AE-XTEN na aminokiselinama 18 i 288 AE XTEN u B domenu) SEQ ID NO: 112
2
��
pSYN FVIII 267 proteinska sekvenca (FVIII Fc sa 72 AE-XTEN na aminokiselinama 18 i 288 AE XTEN u B domenu) SEQ ID NO: 113
2
pSYN FVIII 268 proteinska sekvenca (FVIII Fc sa 144 AE-XTEN na aminokiselini 18) SEQ ID NO: 114
2
�
pSYN FVIII 269 proteinska sekvenca (FVIII Fc sa 72 AE-XTEN na aminokiselini 18) SEQ ID NO: 115
2
pSYNFVIII 271 proteinska sekvenca (FVIII Fc sa 42 AE-XTEN na aminokiselini 18) SEQ ID NO: 116
2
21
pSYN FVIII proteinska sekvenca 272 (FVIII sa 144 AE XTEN na aminokiselinama 18 i 244 AE XTEN u B domenu- bez Fc) SEQ ID NO: 117
pSYN VWF 031 proteinska sekvenca (VWF D1D2D'D3- 48aa dugačak GS veznik Fc razdvojiv trombinom) SEQ ID NO: 118
21
pSYN VWF 034 proteinska sekvenca (VWF D1D2D'D3- 288AE XTEN- 35aa dugačak GS veznik Fc razdvojiv trombinom) SEQ ID NO: 119
pSYN VWF 036 proteinska sekvenca (VWF DID2D'D-98aa dugačak GS veznik Fc razdvojiv trombinom) SEQ ID NO: 120
21
pSYN Fc-015 proteinska sekvenca (IgG-Fc domen) SEQ ID NO: 121
21
Primer 15: FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc heterodimeri su održavali normalnu FVIII specifičnu aktivnost u poređenju sa divljim tipom BDD-FVIII.
[0368] Određena je FVIII specifična FVIII aktivnost-XTEN-Fc:VWF-Fc heterodimera. Heterodimeri su prečišćeni korišćenjem dvostepene hromatografije. Upotrebljena je slaba anjonska smola praćena afinitetnom hromatografijom. Konačni prečišćeni proizvod je imao prihvatljivu čistoću pomoću SEC-HPLC. Specifična aktivnost je upoređena sa FVIII sa izbrisanim B domenom (BDD-FVIII), mereno FVIII hromogenim testom i koncentracijom A280. Podaci su prikazani u Tabeli 26. Svi ispitivani molekuli pokazali su specifične aktivnosti FVIII u odnosu na BDD-FVIII. Čistoća i prisustvo svake grupe molekula potvrđeno je SDS-PAGE i Western blotovanjem.
Tabela 26: FVIII specifična aktivnost FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc heterodimera
[0369] Poluživoti rFVIII-XTEN/D'D3 i BDD-FVIII su upoređeni kod HemA miševa (Slika 15; Tabela 27). Kao što prikazuje Slika 15, rFVIII-XTEN/D'D3 je postigao poluživot koji je četiri puta duži od poluživota postignutog sa BDD-FVIII.
Tabela 27: rFVIII-XTEN/D'D3 i BDD-FVIII kod HemA miševa
21
Primer 16: FVIII-XTEN-Fc: Potencija heterodimera VWF-Fc (FVIII aktivnost) u hemostazi, mereno aPTT testom sa jednom fazom
[0370] Potencija FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc heterodimera u hemostazi je procenjena njihovom FVIII specifičnom aPTT aktivnošću kao što je rezimirano u Tabeli 28. Kao što je prikazano u Tabeli 28, dok dodavanje VWF D'D3 fragmenta i umetanje XTEN u intra domene FVIII smanjuje FVIII specifičnu aPTT aktivnost heterodimera (kako je naznačeno FVIII155/VWF031 podacima i FVIII205/VWF031 podacima), XTEN umetanje u region B domena od FVIII ili C-terminus od VWF D' D3 fragmenta nema negativan uticaj na FVIII specifičnu aPTT aktivnost (kao što ukazuju FVIII169/VWF031 podaci i FVIII169/VWF034 podaci). U poređenju sa dvolančanim BDD-FVIII (dcBDD-FVIII), FVIII155/VWF031, FVIII169/VWF031, FVIII169/VWF034 i VWF205/VWF031 pokazali su smanjenje specifične aPTT aktivnosti za 2,5 puta, 2,8 puta i 5,5 puta, 2,6 puta, respektivno.
Tabela 28: FVIII specifična aPTT aktivnost FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc heterodimera
FVIII specifični aPTT test
21
[0371] FVIII varijante su razblažene aPTT puferom (0,15 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, 1% BSA, pH 7,4) do linearnog raspona ispitivanja (200 do 1,6 mU/mL). 50 µL razblaženih uzoraka ili standarda se uzastopno meša sa 50 µL od 37°C naivne ljudske HemA plazme, 50 µL od 37°C aPTT reagensa (cefaloplastinski reagens aktiviran sa ACTIN® FSL - Dade Behring, referenca # B4219-2) i inkubira se na 37°C tokom 4 minuta.50 µl 20 mM CaCl2(Dade Behring [referenca # ORFO37]) je zatim dodato u reakcionu smešu kako bi se započele reakcije koagulacije. Korištenje vremena koagulacije svakog uzorka (dužina vremena od dodavanja CaCl2do početka stvaranja ugruška), aPTT aktivnost je izračunata prema standardu koji je generisan sa FVIII koncentratom osmog međunarodnog standarda. Specifična aPTT aktivnost je izračunata u odnosu na koncentraciju proteina u svakom molekulu koja je izmerena sa OD280.
Primer 17: In vivo efikasnost FVIII-XTEN-Fc:VWF-Fc heterodimera u modelu krvarenja iz vrha repa HemA miševa
[0372] Kako bi se dodatno pristupilo potenciji hemostaze heterodimera, procenjena je akutna efikasnost FVIII 169/VWF034 i FVIII205/VWF031 u poređenju sa BDD-FVIII u modelu krvarenja iz vrha repa HemA miševa. HemA miševi su tretirani jednom IV injekcijom BDD-FVIII pri 200, 65 i 20 IU/kg kako bi se generisao nivo kontrole gubitka krvi nakon povrede klipa. Gubitak krvi kod miševa koji su tretirani sa 200 IU/kg FVIII 169/VWF034 ili FVIII205/VWF031 upoređen je sa gubitkom miševa kontrolne grupe tretirane sa BDD-FVIII kako bi se procenila njihova potencija za hemostazu. Životinje tretirane nosačem korišćene su za generisanje osnovne vrednosti gubitka krvi za model. Kao što je prikazano na Slici 16, primećeno je značajno smanjenje gubitka krvi u svim FVIII tretman grupama u poređenju sa životinjama koje su tretirane nosačem (p <0,05). I FVIII169/VWF034 i FVIII205/VWF031 su efikasni u modelu vrha repa HemA miševa. U poređenju sa BDD-FVIII, primećena je oko 3 puta niža potencija za FVIII169/VWF034, što je dokazano sličnim smanjenjem gubitka krvi postignutim za 65 IU/kg BDD-FVIII i 200 IU/kg FVIII169/VWF034. Što se tiče FVIII205/VWF034, primećeno je deset puta smanjenje potencije, što pokazuje slično smanjenje gubitka krvi postignuto sa 20 IU/kg BDD-FVIII i 200 IU/kg FVIII205/VWF031.
[0373] Iako su FVIII69/VWF034 i FVIII205/VWF031 imali sličnu specifičnu FVIII hromogenu aktivnost u poređenju sa rBDD-FVIII, njihova FVIII aPTT aktivnost i in vivo potencija su smanjeni usled modifikacija molekula. Ti podaci pokazuju da je aPTT aktivnost molekula FVIII tačnije merenje pri predviđanju njegove in vivo potencija na hemostazu nego
21
na hromogenu FVIII aktivnost.
Model krvarenja iz vrha repa HemA miševa
[0374] 8-10 nedelja stari mužjaci HemA miševa korišćeni su za ispitivanje. Pre povrede vrha repa, miševi su anestezirani koktelom od 50 mg/kg ketamina/0,5 mg/kg deksmedetomidina i postavljeni na grejni jastuk na 37°C kako bi se održala telesna temperatura. Repovi miševa su zatim uronjeni u vodu na 37°C u trajanju od 10 minuta kako bi se proširila bočna vena.
Nakon dilatacije vene, rFVIII ili rastvora nosača ubrizgava se kroz repnu venu, i 5 min kasnije, distalnih 1 cm repa je odsečeno upotrebom #11 skalpela sa ravnom ivicom. Prolivena krv je sakupljena u 13 ml 37°C toplog fiziološkog rastvora tokom 30 minuta i miševi su potom eutanazirani bilateralnom torakotomijom dok su još uvek bili pod anestezijom.
Gubitak krvi je kvantifikovan gravimetrijski promenom težine epruveta za prikupljanje krvi pre i posle sakupljanja krvi u gramima, što je prevedeno u mililitre (mL) zapremine gubitka krvi (promena težine od 1g = gubitak krvi od 1 mL).
[0375] Prethodni opis specifičnih otelotvorenja će tako u potpunosti otkriti opštu prirodu pronalaska tako da drugi mogu, primenjujući znanje iz struke, lako modifikovati i/ili prilagođavati za različite primene takvih specifičnih otelotvorenja, bez nepotrebnog eksperimentisanja, bez odstupanja od opšte koncepcije predmetnog pronalaska. Stoga su takve adaptacije i modifikacije zamišljene da budu unutar značenja i raspona ekvivalenata obelodanjenih otelotvorenja, na osnovu razmatranja i uputstava ovde. Treba shvatiti da su ovde frazeologija ili terminologija u svrhu opisivanja, a ne ograničavanja, tako da terminologiju ili frazeologiju ove specifikacije stručnjak treba da tumači u svetlu razmatranja i uputstava.
[0376] Ostala otelotvorenja pronalaska će biti jasna stručnjacima iz ovde obelodanjenih razmatranja specifikacije i prakse pronalaska.
22
22
22
22
22
22
22
�
21
22
�
��
�
�
�
�
�
24
��
��
��
��
��
��
2
21
22
�
24
�
�
�
�
�
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
�
2
�
�
2
�
21
22
�
��
�
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
�
�
�
1
11
��
�
��
�
1
�
1
�
�
21
22
�
��
�
�
�
�
�
�
�
�
�
41
42
�
44
�
�
4
�
�
�
�
�
�
�
4
�
�
�
1
�
�
�
�
�
�
41
42
�
44
�
�
�
4
�
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
�
41
42
�
44
�
�
�
�
�
44
44
44
44
44
44
44
�
41
42
�
44
�
4
4
�
�
�
41
42
�
44
�
�
�
�
�
�
41
42
�
44
�
�
�
4
�
�
41
42
�
44
4
4
�
�
�
�
41
42
4
44
�
4
�
�
�
�
�
4
1
11
12
1

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Himerni protein koji sadrži (i) fragment fon Vilebrandovog Faktora (VWF) koji sadrži D' domen i D3 domen VWF, (ii) sekvencu polipeptida produžene dužine (XTEN), (iii) protein Faktora VIII (FVIII), (iv) prvi Ig konstantni region ili njegov deo, i (v) drugi Ig konstantni region ili njegov deo,
gde su VWF fragment i XTEN sekvenca povezani opcionim veznikom, gde su XTEN sekvenca ili VWF fragment povezani sa prvim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, gde je FVIII protein povezan sa drugim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, i gde je prvi Ig konstantni region ili njegov deo vezan za ili povezan sa drugim Ig konstantnim regionom ili njegovim delom, kovalentnom vezom.
2. Himerni protein prema patentnom zahtevu 1, koji sadrži (i) jedan polipeptidni lanac koji sadrži VWF fragment, XTEN sekvencu, prvi Ig konstantni region ili njegov deo, drugi Ig konstantni region ili njegov deo i FVIII protein, ili (ii) prvi polipeptidni lanac i drugi polipeptidni lanac, gde prvi polipeptidni lanac sadrži VWF fragment, XTEN sekvencu i prvi Ig konstantni region ili njegov deo, i drugi polipeptidni lanac sadrži FVIII protein i drugi Ig konstantni region ili njegov deo.
3. Himerni protein patentnog zahteva 1, koji obuhvata formulu:
(a) V-L2-X-L1-F1:FVIII-L3-F2;
(b) V-L2-X-L1-F1:F2-L3-FVIII;
(c) F1-L1-X-L2-V: FVIII-L3-F2;
(d) F1-L1-X-L2-V:F2-L3-FVIII;
(e) V-L2-X-LI-FI-L4-FVIII-L3-F2;
(f) F2-L3-FVIII-L4-F1-L1-X-L2-V;
(g) FVIII-L3-F2-L4-V-L2-X-L1-F1;
ili
(h) F1-L1-X-L2-V-L4-F2-L3-FVIII;
gde V je VWF fragment;
svaki od L1, L2, i L3 je opcioni Veznik;
L4 je opcioni Veznik;
FVIII je FVIII protein;
X je XTEN sekvenca;
F1 je prvi konstantni region imunoglobulina (Ig) ili njegov deo;
F2 je drugi Ig konstantni region ili njegov deo;
(-) je peptidna veza; i
(:) je kovalentna veza.
4. Himerni protein patentnog zahteva 1, koji sadrži formulu:
(a) FVIII(X1)-L1-F1:V-L2-X2-L3-F2;
(b) FVIII(X1)-L1-F1:F2-L3-X2-L2-V;
(c) F1-L1-FVIII(X1):V-L2-X2-L3-F2;
(d) F1-L1-FVIII(X1):F2-L3-X2-L2-V;
(e) FVIII(X1)-L1-F1-L4-V-L2-X2-L3-F2;
(f) FVIII(X1)-L1-F1-L4-F2-L3-X2-L2-V;
(g) F1-L1-FVIII(X1)-L4-V-L2-X2-L3-F2;
ili
(h) F1-L1-FVIII(X1)-L4-F2-L3-X2-L2-V;
gde FVIII (X1) sadrži FVIII protein i XTEN sekvencu, gde je XTEN sekvenca vezana za N-terminus ili C-terminus FVIII proteina ili je umetnuta neposredno nizvodno od jedne ili više aminokiselina („jedno ili više mesta umetanja“) u FVIII proteinu;
svaki od L1, L2 ili L3 je opcioni veznik;
L4 je veznik;
X2 je druga XTEN sekvenca;
F1 je prvi konstantni Ig region ili njegov deo;
F2 je drugi Ig konstantni region ili njegov deo;
V je VWF fragment;
(-) je peptidna veza; i
(:) je kovalentna veza.
5. Himerni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, gde
(a) prvi Ig konstantni region ili njegov deo je prvi Fc region;
(b) drugi Ig konstantni region ili njegov deo je drugi Fc region; ili
(c) i (a) i (b).
1
6. Himerni protein patentnog zahteva 4 ili 5, gde su jedno ili više mesta umetanja u FVIII protein izabrani iz grupe koju čine aminokiselinski ostaci u Tabeli 7, Tabeli 8, Tabeli 9 i Tabeli 10.
7. Himerni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, gde FVIII protein sadrži B domen ili njegov deo, ili ne sadrži B domen.
8. Himerni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, gde himerni protein sadrži najmanje dva XTEN, najmanje tri XTEN, najmanje četiri XTEN, najmanje pet XTEN, ili najmanje šest XTEN.
9. Himerni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, gde je FVIII protein jednolančani FVIII.
10. Polinukleotid ili grupa polinukleotida koji kodiraju himerni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9.
11. Vektor koji sadrži polinukleotid ili grupu polinukleotida prema patentnom zahtevu 10 i jedan ili više promotera operativno povezanih sa polinukleotidom ili grupom polinukleotida.
12. Ćelija domaćin koja sadrži polinukleotid ili grupu polinukleotida prema patentnom zahtevu 10 ili vektor prema patentnom zahtevu 11.
13. Farmaceutski sastav koji sadrži himerni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, polinukleotid ili grupu polinukleotida prema patentnom zahtevu 10, vektor prema patentnom zahtevu 11 ili ćeliju domaćina prema patentnom zahtevu 12 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
14. Himerni protein prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, polinukleotid prema patentnom zahtevu 10, vektor prema patentnom zahtevu 11, ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 12, ili sastav prema patentnom zahtevu 13, za upotrebu u tretmanu bolesti ili poremećaja krvarenja kod pacijenta koji ima potrebu za tim.
1
15. Postupak pravljenja himernog proteina, koji obuhvata transfekciju jedne ili više ćelija domaćina sa polinukleotidom ili grupom polinukleotida prema patentnom zahtevu 10, ili vektorom patentnog zahteva 11, i eksprimiranje himernog proteina u ćeliji domaćinu.
1
RS20200123A 2012-07-11 2013-07-10 Kompleks faktora viii sa xten i proteinom fon vilebrandovog faktora, i njihova primena RS59876B1 (sr)

Applications Claiming Priority (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261670401P 2012-07-11 2012-07-11
US201361759819P 2013-02-01 2013-02-01
US201361801504P 2013-03-15 2013-03-15
US201361801544P 2013-03-15 2013-03-15
US201361827158P 2013-05-24 2013-05-24
US201361840811P 2013-06-28 2013-06-28
EP13816031.2A EP2882450B1 (en) 2012-07-11 2013-07-10 Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof
PCT/US2013/049989 WO2014011819A2 (en) 2012-07-11 2013-07-10 Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59876B1 true RS59876B1 (sr) 2020-03-31

Family

ID=49916682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200123A RS59876B1 (sr) 2012-07-11 2013-07-10 Kompleks faktora viii sa xten i proteinom fon vilebrandovog faktora, i njihova primena

Country Status (29)

Country Link
US (3) US10138291B2 (sr)
EP (3) EP4269431A1 (sr)
JP (6) JP6603128B2 (sr)
KR (2) KR102329315B1 (sr)
CN (2) CN104661674A (sr)
AR (1) AR091735A1 (sr)
AU (4) AU2013290173B2 (sr)
BR (1) BR112015000267B1 (sr)
CL (1) CL2015000060A1 (sr)
CO (1) CO7170123A2 (sr)
CY (1) CY1122729T1 (sr)
DK (1) DK2882450T3 (sr)
EA (2) EA201792485A3 (sr)
ES (1) ES2770501T3 (sr)
HR (1) HRP20200007T1 (sr)
HU (1) HUE047088T2 (sr)
IL (1) IL236412B (sr)
LT (1) LT2882450T (sr)
MX (1) MX381011B (sr)
NZ (1) NZ703366A (sr)
PH (1) PH12015500039B1 (sr)
PL (1) PL2882450T3 (sr)
PT (1) PT2882450T (sr)
RS (1) RS59876B1 (sr)
SG (3) SG10201913893XA (sr)
SI (1) SI2882450T1 (sr)
TW (1) TWI667258B (sr)
UA (1) UA116632C2 (sr)
WO (1) WO2014011819A2 (sr)

Families Citing this family (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2610356T3 (es) * 2009-02-03 2017-04-27 Amunix Operating Inc. Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
CA2771999A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
CN104271150A (zh) * 2012-01-12 2015-01-07 比奥根艾迪克Ma公司 嵌合因子viii多肽及其用途
JP6256882B2 (ja) 2012-02-15 2018-01-10 アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子組成物、ならびに組成物の作製方法および用途
EP2822577B1 (en) 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
US10023628B2 (en) 2012-07-06 2018-07-17 Bioverativ Therapeutics Inc. Cell line expressing single chain factor VIII polypeptides and uses thereof
CN104661674A (zh) 2012-07-11 2015-05-27 阿穆尼克斯运营公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
WO2014127215A1 (en) 2013-02-15 2014-08-21 Biogen Idec Ma Inc. Optimized factor viii gene
WO2014144549A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Biogen Idec Ma Inc. Factor ix polypeptide formulations
EP2796145B1 (en) 2013-04-22 2017-11-01 CSL Ltd. A covalent complex of von willebrand factor and faktor viii linked by a disulphide bridge
CN113817069A (zh) * 2013-06-28 2021-12-21 比奥贝拉蒂治疗公司 具有xten的凝血酶可裂解连接子和其用途
WO2015021423A2 (en) * 2013-08-08 2015-02-12 Biogen Idec Ma Inc. Purification of chimeric fviii molecules
TW202003554A (zh) 2013-08-14 2020-01-16 美商百歐維拉提夫治療公司 因子ｖｉｉｉ－ｘｔｅｎ融合物及其用途
AU2015204646B2 (en) * 2014-01-10 2020-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII chimeric proteins and uses thereof
US11008561B2 (en) 2014-06-30 2021-05-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor IX gene
CN107428831A (zh) * 2015-03-06 2017-12-01 瑞士杰特贝林生物制品重组设备股份公司 用于改善血管性血友病因子的半衰期的化合物
EP3297656B1 (en) 2015-05-22 2020-01-08 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for treating hemophilia
EA201890423A1 (ru) 2015-08-03 2018-07-31 Биовератив Терапьютикс Инк. Слитые белки фактора ix, способы их получения и применения
KR20180031775A (ko) 2015-08-12 2018-03-28 셀 머신스, 인크. 긴 반감기 응집 복합체와 관련된 방법 및 조성물
IL319047A (en) * 2015-08-28 2025-04-01 Amunix Operating Inc Chimeric polypeptide composition and methods for its preparation and use
DK3400002T3 (da) 2016-01-07 2022-04-11 CSL Behring Lengnau AG Muteret, trunkeret von willebrand faktor
CA3012695A1 (en) 2016-02-01 2017-08-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor viii genes
EP3458085B1 (en) * 2016-05-20 2022-12-07 Octapharma AG Glycosylated vwf fusion proteins with improved pharmacokinetics
WO2017222337A1 (ko) * 2016-06-24 2017-12-28 재단법인 목암생명과학연구소 Fviii 및 vwf 인자를 포함하는 키메라 단백질 및 그 용도
CN106279437B (zh) * 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
CN106317226B (zh) 2016-08-19 2017-09-05 安源医药科技（上海）有限公司 用于构建融合蛋白的连接肽
US10738338B2 (en) 2016-10-18 2020-08-11 The Research Foundation for the State University Method and composition for biocatalytic protein-oligonucleotide conjugation and protein-oligonucleotide conjugate
SG11201903954WA (en) 2016-11-11 2019-05-30 CSL Behring Lengnau AG Truncated von willebrand factor polypeptides for extravascular administration in the treatment or prophylaxis of a blood coagulation disorder
US11814421B2 (en) 2016-11-11 2023-11-14 CSL Behring Lengnau AG Truncated von Willebrand Factor polypeptides for treating hemophilia
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
JP2019536794A (ja) 2016-12-02 2019-12-19 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 凝固因子に対する免疫寛容を誘導する方法
EA201991768A1 (ru) 2017-01-31 2020-01-22 Байоверетив Терапьютикс Инк. Слитые белки на основе фактора ix и способы их получения и пути применения
GB201707139D0 (en) * 2017-05-04 2017-06-21 Imp Innovations Ltd Polypeptides
NZ762100A (en) 2017-08-09 2025-12-19 Bioverativ Therapeutics Inc Nucleic acid molecules and uses thereof
AU2018393111B2 (en) 2017-12-21 2025-07-10 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Release segments and binding compositions comprising same
PL3793588T3 (pl) * 2018-05-18 2025-09-01 Bioverativ Therapeutics Inc. Sposoby leczenia hemofilii a
EP3833766A1 (en) 2018-08-09 2021-06-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
CN119264211A (zh) 2018-08-27 2025-01-07 瑞泽恩制药公司 拉曼光谱在下游纯化中的应用
AU2019380606B2 (en) 2018-11-15 2026-04-23 Quantum-Si Incorporated Methods and compositions for protein sequencing
JP7644007B2 (ja) 2018-12-06 2025-03-11 バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド 第ｉｘ因子を発現するレンチウイルスベクターの使用
US10654911B1 (en) 2019-04-02 2020-05-19 Beijing Neoletix Biological Technology Co., Ltd. Vector co-expressing truncated von Willebrand factor and factor VIII
CN114007637A (zh) * 2019-06-19 2022-02-01 比奥维拉迪维治疗股份有限公司 用于治疗血友病和低骨矿物质密度的重组因子viii-fc
CN112175088B (zh) * 2019-07-02 2023-03-28 江苏晟斯生物制药有限公司 改进的fix融合蛋白、缀合物及其应用
CN114364796B (zh) * 2019-09-02 2023-07-11 甘李药业股份有限公司 嵌合蛋白
KR20220097891A (ko) 2019-09-30 2022-07-08 바이오버라티브 테라퓨틱스 인크. 렌티바이러스 벡터 제형
JP7725466B2 (ja) 2019-11-13 2025-08-19 アムニクス ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド バーコード化されたｘｔｅｎポリペプチドおよびその組成物、ならびにその作製および使用方法
EP4085077A4 (en) 2019-12-31 2024-01-17 Beijing QL Biopharmaceutical Co., Ltd. Fusion proteins of glp-1 and gdf15 and conjugates thereof
CN113728013B (zh) 2020-01-11 2022-06-14 北京质肽生物医药科技有限公司 Glp-1和fgf21的融合蛋白的缀合物
EP4143579A2 (en) * 2020-05-20 2023-03-08 Quantum-si Incorporated Methods and compositions for protein sequencing
WO2021247952A2 (en) * 2020-06-05 2021-12-09 Duke University Compositions and methods for augmenting autologous fat grafts
MX2023000156A (es) 2020-06-24 2023-02-16 Bioverativ Therapeutics Inc Metodos para la eliminacion de factor viii libre de preparaciones de vectores lentivirales modificados para expresar dicha proteina.
KR20230041711A (ko) 2020-06-25 2023-03-24 아뮤닉스 파마슈티컬스, 인크. Her-2 표적화 이중특이적 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법
CN114729060B (zh) 2020-09-30 2022-11-25 北京质肽生物医药科技有限公司 多肽缀合物和使用方法
US20240287158A1 (en) 2021-06-23 2024-08-29 Bioverativ Therapeutics Inc. Formulations of factor viii chimeric proteins and uses thereof
CN113862301A (zh) * 2021-08-25 2021-12-31 上海交通大学医学院附属瑞金医院 一种vwf前肽表达载体及其制备方法和应用
EP4323413A4 (en) 2022-03-30 2025-10-15 Beijing Ql Biopharmaceutical Co Ltd LIQUID PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS OF POLYPEPTIDE CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF
KR20250133776A (ko) 2023-02-10 2025-09-08 아뮤닉스 파마슈티컬스, 인크. 전립선-특이적 막 항원(psma)을 표적화하는 조성물 및 이의 제조 방법 및 사용 방법
KR20250168493A (ko) 2023-03-31 2025-12-02 옥타파마 아게 개선된 약동학을 갖는 fviii-vwf 융합 단백질
CN121949565A (zh) 2023-04-17 2026-05-01 阿穆尼克斯制药公司 靶向表皮生长因子受体的组合物及其制备和使用方法
WO2025122957A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Protease activatable cytokines and methods for making and using the same
WO2025181343A1 (en) 2024-02-29 2025-09-04 Octapharma Ag Cystine knot domain fusion protein dimers
WO2026024863A2 (en) 2024-07-24 2026-01-29 Amunix Pharmaceuticals, Inc. Compositions targeting prostate-specific membrane antigen (psma) in combination with androgen receptor antagonists

Family Cites Families (144)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4215051A (en) 1979-08-29 1980-07-29 Standard Oil Company (Indiana) Formation, purification and recovery of phthalic anhydride
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4757006A (en) 1983-10-28 1988-07-12 Genetics Institute, Inc. Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production
US4965199A (en) 1984-04-20 1990-10-23 Genentech, Inc. Preparation of functional human factor VIII in mammalian cells using methotrexate based selection
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
ES8801674A1 (es) 1985-04-12 1988-02-16 Genetics Inst Un procedimiento para la preparacion de una proteina que presenta actividad procoagulante.
KR910006424B1 (ko) 1985-08-21 1991-08-24 인코텍스 비.브이 편성브리프(brief) 제조방법
DE3785102T2 (de) 1986-01-03 1993-07-22 Genetics Inst Verfahren zur herstellung von faktor-viii:c-typ-proteinen.
US5595886A (en) 1986-01-27 1997-01-21 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5543502A (en) 1986-06-24 1996-08-06 Novo Nordisk A/S Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
CA1331157C (en) 1987-04-06 1994-08-02 Randal J. Kaufman Method for producing factor viii:c-type proteins
US6060447A (en) 1987-05-19 2000-05-09 Chiron Corporation Protein complexes having Factor VIII:C activity and production thereof
US6346513B1 (en) 1987-06-12 2002-02-12 Baxter Trading Gmbh Proteins with factor VIII activity: process for their preparation using genetically-engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
IL86693A (en) 1987-06-12 1994-06-24 Stichting Centraal Lab Proteins with factor VIII activity, process for their preparation using genetically engineered cells and pharmaceutical compositions containing them
DE3720246A1 (de) 1987-06-19 1988-12-29 Behringwerke Ag Faktor viii:c-aehnliches molekuel mit koagulationsaktivitaet
FR2619314B1 (fr) 1987-08-11 1990-06-15 Transgene Sa Analogue du facteur viii, procede de preparation et composition pharmaceutique le contenant
US4994371A (en) 1987-08-28 1991-02-19 Davie Earl W DNA preparation of Christmas factor and use of DNA sequences
US6780613B1 (en) 1988-10-28 2004-08-24 Genentech, Inc. Growth hormone variants
US5004803A (en) 1988-11-14 1991-04-02 Genetics Institute, Inc. Production of procoagulant proteins
SE465222C5 (sv) 1989-12-15 1998-02-10 Pharmacia & Upjohn Ab Ett rekombinant, humant faktor VIII-derivat och förfarande för dess framställning
US5846951A (en) 1991-06-06 1998-12-08 The School Of Pharmacy, University Of London Pharmaceutical compositions
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
US6376463B1 (en) 1992-04-07 2002-04-23 Emory University Modified factor VIII
US5859204A (en) 1992-04-07 1999-01-12 Emory University Modified factor VIII
US5364771A (en) 1992-04-07 1994-11-15 Emory University Hybrid human/porcine factor VIII
US6037452A (en) 1992-04-10 2000-03-14 Alpha Therapeutic Corporation Poly(alkylene oxide)-Factor VIII or Factor IX conjugate
US5563045A (en) 1992-11-13 1996-10-08 Genetics Institute, Inc. Chimeric procoagulant proteins
SE504074C2 (sv) 1993-07-05 1996-11-04 Pharmacia Ab Proteinberedning för subkutan, intramuskulär eller intradermal administrering
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
GB9422383D0 (en) 1994-11-05 1995-01-04 Wellcome Found Antibodies
US6818439B1 (en) 1994-12-30 2004-11-16 Chiron Corporation Methods for administration of recombinant gene delivery vehicles for treatment of hemophilia and other disorders
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US6086875A (en) 1995-01-17 2000-07-11 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of immunogens
US6030613A (en) 1995-01-17 2000-02-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6121022A (en) 1995-04-14 2000-09-19 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
SE9503380D0 (sv) 1995-09-29 1995-09-29 Pharmacia Ab Protein derivatives
US6458563B1 (en) 1996-06-26 2002-10-01 Emory University Modified factor VIII
DE69738522T2 (de) 1996-08-02 2009-04-02 Bristol-Myers Squibb Co. Ein verfahren zur inhibierung immunglobulininduzierter toxizität aufgrund von der verwendung von immunoglobinen in therapie und in vivo diagnostik
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
CA2225189C (en) 1997-03-06 2010-05-25 Queen's University At Kingston Canine factor viii gene, protein and methods of use
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
US6242195B1 (en) 1998-04-02 2001-06-05 Genentech, Inc. Methods for determining binding of an analyte to a receptor
US6528624B1 (en) 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
EP1006183A1 (en) 1998-12-03 2000-06-07 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Recombinant soluble Fc receptors
PL209392B1 (pl) 1999-01-15 2011-08-31 Genentech Inc Przeciwciało, komórka gospodarza, sposób wytwarzania przeciwciała oraz zastosowanie przeciwciała
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7829085B2 (en) 1999-07-14 2010-11-09 Life Sciences Research Partners Vzw Methods of treating hemostasis disorders using antibodies binding the C1 domain of factor VIII
EP2213743A1 (en) 2000-04-12 2010-08-04 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
DE60116137T2 (de) 2000-05-16 2006-08-24 Lipoxen Technologies Ltd. Derivatisierung von proteinen in wässrigem lösungsmittel
GB0029407D0 (en) 2000-12-01 2001-01-17 Affitech As Product
US7083784B2 (en) 2000-12-12 2006-08-01 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
AU2002335930B2 (en) 2001-03-09 2005-07-28 Morphosys Ag Serum albumin binding moieties
AU2002364586A1 (en) 2001-12-21 2003-07-30 Delta Biotechnology Limited Albumin fusion proteins
US20080194481A1 (en) 2001-12-21 2008-08-14 Human Genome Sciences, Inc. Albumin Fusion Proteins
KR101271635B1 (ko) 2001-12-21 2013-06-12 휴먼 게놈 사이언시즈, 인코포레이티드 알부민 융합 단백질
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
JP2006502091A (ja) 2002-03-01 2006-01-19 イミューノメディクス、インコーポレイテッド クリアランス速度を高めるための二重特異性抗体点変異
JP2005526769A (ja) 2002-03-15 2005-09-08 ザ・ブリガーム・アンド・ウーメンズ・ホスピタル・インコーポレーテッド 治療剤を全身搬送するための中央気道投与
DK1534335T4 (en) 2002-08-14 2015-10-05 Macrogenics Inc FCGAMMARIIB-SPECIFIC ANTIBODIES AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
WO2004027901A2 (en) 2002-09-17 2004-04-01 Diffusion Science, Inc. Electrochemical generation, storage and reaction of hydrogen and oxygen using gas permeable catalyst-coated hollow microspheres
EP1553975B8 (en) 2002-09-27 2023-04-12 Xencor, Inc. Optimized fc variants and methods for their generation
DK1562972T3 (da) 2002-10-15 2010-12-06 Facet Biotech Corp Modifikation af FcRn-bindingsaffiniteter eller serumhalveringstider for antistoffer ved mutagenese
GB2395337B (en) 2002-11-14 2005-12-28 Gary Michael Wilson Warning Unit
CA2512729C (en) 2003-01-09 2014-09-16 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant fc regions and methods of using same
US7041635B2 (en) 2003-01-28 2006-05-09 In2Gen Co., Ltd. Factor VIII polypeptide
BRPI0407882B1 (pt) 2003-02-26 2021-07-27 Nektar Therapeutics Composição compreendendo conjugados de polímero-porção de fator viii e seu método de fabricação
WO2004076522A1 (ja) 2003-02-28 2004-09-10 Kuraray Co., Ltd. 硬化性樹脂組成物
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
US7348004B2 (en) 2003-05-06 2008-03-25 Syntonix Pharmaceuticals, Inc. Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
PL2298347T3 (pl) 2003-05-06 2016-03-31 Bioverativ Therapeutics Inc Białka chimeryczne czynnika krzepnięcia do leczenia zaburzenia hemostazy
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP1654290B1 (en) 2003-08-12 2019-03-13 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
GB0324368D0 (en) 2003-10-17 2003-11-19 Univ Cambridge Tech Polypeptides including modified constant regions
US7211559B2 (en) 2003-10-31 2007-05-01 University Of Maryland, Baltimore Factor VIII compositions and methods
WO2005047327A2 (en) 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
EP1697520A2 (en) 2003-12-22 2006-09-06 Xencor, Inc. Fc polypeptides with novel fc ligand binding sites
SI1706424T1 (sl) 2004-01-12 2010-01-29 Applied Molecular Evolution Variante fc regij
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
WO2005123780A2 (en) 2004-04-09 2005-12-29 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2006085967A2 (en) 2004-07-09 2006-08-17 Xencor, Inc. OPTIMIZED ANTI-CD20 MONOCONAL ANTIBODIES HAVING Fc VARIANTS
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US7566701B2 (en) 2004-09-07 2009-07-28 Archemix Corp. Aptamers to von Willebrand Factor and their use as thrombotic disease therapeutics
WO2006047350A2 (en) 2004-10-21 2006-05-04 Xencor, Inc. IgG IMMUNOGLOBULIN VARIANTS WITH OPTIMIZED EFFECTOR FUNCTION
CN101163506B (zh) * 2004-12-27 2012-09-26 巴克斯特国际公司 聚合物-von Willebrand因子偶联物
WO2007021494A2 (en) 2005-08-12 2007-02-22 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7846445B2 (en) * 2005-09-27 2010-12-07 Amunix Operating, Inc. Methods for production of unstructured recombinant polymers and uses thereof
AU2007223855B2 (en) 2006-03-06 2013-05-16 Amunix Operating Inc. Unstructured recombinant polymers and uses thereof
EP2032607B2 (en) 2006-06-14 2017-02-22 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
EP2049144B8 (en) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
WO2008033413A2 (en) 2006-09-14 2008-03-20 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
EP2054521A4 (en) 2006-10-03 2012-12-19 Novo Nordisk As PROCESS FOR CLEANING POLYPEPTIDE CONJUGATES
ES2655734T3 (es) 2006-10-04 2018-02-21 Novo Nordisk A/S Glicopéptidos y azúcares pegilados unidos a glicerol
CA2673459C (en) * 2006-12-22 2016-09-13 Stefan Schulte Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
EP1935430A1 (en) 2006-12-22 2008-06-25 CSL Behring GmbH Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
SI2173890T1 (sl) 2007-06-21 2011-06-30 Univ Muenchen Tech Biološko aktivni proteini, ki imajo povečano in vivo in/ali in vitro stabilnost
JP2010536341A (ja) 2007-08-15 2010-12-02 アムニクス， インコーポレイテッド 生物学的に活性なポリペプチドの特性を改変するための組成物および方法
CN101965409A (zh) 2007-11-01 2011-02-02 罗切斯特大学 具有增加的稳定性的重组因子viii
KR20100095441A (ko) 2007-11-09 2010-08-30 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 변형된 재조합 인자 ⅷ 및 폰 빌레브란트 인자 및 사용 방법
SG187410A1 (en) 2007-12-28 2013-02-28 Baxter Int Recombinant vwf formulations
PL2291523T3 (pl) * 2008-06-24 2015-05-29 Csl Behring Gmbh Czynnik VIII, czynnik von Willebranda lub ich kompleksy o wydłużonym okresie półtrwania in vivo
EP2368124A4 (en) 2008-11-24 2012-09-19 Bayer Healthcare Llc METHOD FOR DETERMINING THE ACTIVITY OF A PEGYLATED BLOOD GENERATION FACTOR IN A SILICON-BASED ACTIVATED PART THROMBOPLASTINE TIME ASSAY
US8680050B2 (en) 2009-02-03 2014-03-25 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same
US8703717B2 (en) 2009-02-03 2014-04-22 Amunix Operating Inc. Growth hormone polypeptides and methods of making and using same
ES2610356T3 (es) * 2009-02-03 2017-04-27 Amunix Operating Inc. Polipéptidos recombinantes extendidos y composiciones que comprenden los mismos
US20120121706A1 (en) 2009-04-10 2012-05-17 Tufts Medical Center, Inc. PAR-1 Activation by Metalloproteinase-1 (MMP-1)
KR101813727B1 (ko) 2009-06-08 2018-01-02 아뮤닉스 오퍼레이팅 인코포레이티드 성장 호르몬 폴리펩타이드 및 이를 제조하고 사용하는 방법
WO2010144508A1 (en) 2009-06-08 2010-12-16 Amunix Operating Inc. Glucose-regulating polypeptides and methods of making and using same
WO2011020866A2 (en) 2009-08-20 2011-02-24 Csl Behring Gmbh Albumin fused coagulation factors for non-intravenous administration in the therapy and prophylactic treatment of bleeding disorders
CA2771999A1 (en) 2009-08-24 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Coagulation factor vii compositions and methods of making and using same
WO2011028344A2 (en) 2009-08-25 2011-03-10 Amunix Operating Inc. Interleukin-1 receptor antagonist compositions and methods of making and using same
WO2011060242A2 (en) 2009-11-13 2011-05-19 Talecris Biotherapeutics, Inc. Von willebrand factor (vwf)-containing preparations, and methods, kits, and uses related thereto
SI2506868T1 (en) * 2009-12-06 2018-04-30 Bioverativ Therapeutics Inc. HYPER AND HYBRID POLYPETTIDES FACTOR VIII-FC AND METHODS FOR THEIR USE
JP2013519699A (ja) 2010-02-16 2013-05-30 ノヴォ ノルディスク アー／エス 因子ｖｉｉｉ融合タンパク質
EP2536753B1 (en) * 2010-02-16 2017-12-20 Novo Nordisk A/S Factor viii molecules with reduced vwf binding
EP2650003B1 (en) 2010-05-20 2016-07-27 Allergan, Inc. Degradable clostridial toxins
TW201217527A (en) 2010-07-09 2012-05-01 Biogen Idec Hemophilia Inc Processable single chain molecules and polypeptides made using same
EP3508573A1 (en) 2010-07-09 2019-07-10 Bioverativ Therapeutics Inc. Systems for factor viii processing and methods thereof
US20130017997A1 (en) 2010-08-19 2013-01-17 Amunix Operating Inc. Factor VIII Compositions and Methods of Making and Using Same
CN104271150A (zh) 2012-01-12 2015-01-07 比奥根艾迪克Ma公司 嵌合因子viii多肽及其用途
JP6256882B2 (ja) 2012-02-15 2018-01-10 アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド 第ｖｉｉｉ因子組成物、ならびに組成物の作製方法および用途
EP2822577B1 (en) 2012-02-15 2019-02-06 Bioverativ Therapeutics Inc. Recombinant factor viii proteins
CN104661674A (zh) 2012-07-11 2015-05-27 阿穆尼克斯运营公司 具有xten和血管性血友病因子蛋白的因子viii复合物、及其用途
CN113817069A (zh) 2013-06-28 2021-12-21 比奥贝拉蒂治疗公司 具有xten的凝血酶可裂解连接子和其用途
EP3013359A4 (en) 2013-06-28 2017-01-25 Biogen MA Inc. Thrombin cleavable linker
AU2015204646B2 (en) 2014-01-10 2020-08-27 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor VIII chimeric proteins and uses thereof
PL3793588T3 (pl) * 2018-05-18 2025-09-01 Bioverativ Therapeutics Inc. Sposoby leczenia hemofilii a

Also Published As

Publication number Publication date
DK2882450T3 (da) 2020-02-24
KR20210143931A (ko) 2021-11-29
BR112015000267A2 (pt) 2018-03-06
JP2025134089A (ja) 2025-09-16
JP2020078352A (ja) 2020-05-28
CN104661674A (zh) 2015-05-27
UA116632C2 (uk) 2018-04-25
SG11201500045RA (en) 2015-02-27
KR102329315B1 (ko) 2021-11-19
AU2018203206B2 (en) 2020-08-06
SG10201913893XA (en) 2020-03-30
CN110054699A (zh) 2019-07-26
IL236412B (en) 2020-10-29
TW201414749A (zh) 2014-04-16
US10138291B2 (en) 2018-11-27
LT2882450T (lt) 2020-03-25
US20190169267A1 (en) 2019-06-06
EA029685B1 (ru) 2018-04-30
BR112015000267B1 (pt) 2023-01-24
HUE047088T2 (hu) 2020-04-28
US20150266943A1 (en) 2015-09-24
JP2023166024A (ja) 2023-11-17
EP2882450A4 (en) 2016-06-22
EA201590198A1 (ru) 2015-06-30
TWI667258B (zh) 2019-08-01
PL2882450T3 (pl) 2020-06-29
AU2022252703A1 (en) 2022-11-10
AU2018203206A1 (en) 2018-05-24
JP7022165B2 (ja) 2022-02-17
ES2770501T3 (es) 2020-07-01
MX2015000397A (es) 2015-11-23
PH12015500039B1 (en) 2024-06-28
CL2015000060A1 (es) 2015-08-28
CO7170123A2 (es) 2015-01-28
KR20150036510A (ko) 2015-04-07
IL236412A0 (en) 2015-02-26
EP4269431A1 (en) 2023-11-01
WO2014011819A2 (en) 2014-01-16
KR102403545B1 (ko) 2022-05-30
EP2882450B1 (en) 2019-11-27
JP6603128B2 (ja) 2019-11-06
AU2013290173A1 (en) 2015-01-22
US11091534B2 (en) 2021-08-17
US20220056108A1 (en) 2022-02-24
AU2013290173B2 (en) 2018-02-15
CY1122729T1 (el) 2021-03-12
AR091735A1 (es) 2015-02-25
EP2882450A2 (en) 2015-06-17
MX381011B (es) 2025-03-12
EP3674410A1 (en) 2020-07-01
HRP20200007T1 (hr) 2020-03-20
PH12015500039A1 (en) 2015-03-16
AU2020264355A1 (en) 2020-12-03
JP7682968B2 (ja) 2025-05-26
NZ703366A (en) 2018-03-23
SI2882450T1 (sl) 2020-02-28
JP2015527882A (ja) 2015-09-24
SG10201701037WA (en) 2017-03-30
EA201792485A3 (ru) 2019-03-29
EA201792485A2 (ru) 2018-08-31
JP2022000471A (ja) 2022-01-04
AU2022252703B2 (en) 2024-09-05
JP2018102323A (ja) 2018-07-05
PT2882450T (pt) 2020-02-19
WO2014011819A3 (en) 2014-03-06
HK1211228A1 (en) 2016-05-20
CA2878679A1 (en) 2014-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7682968B2 (ja) ＸＴＥＮおよびｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子タンパク質を有する第ＶＩＩＩ因子の複合体、および、その使用
JP7612637B2 (ja) 第ｖｉｉｉ因子キメラタンパク質及びその使用
RS59670B1 (sr) Himerni polipeptidi faktora viii i njihove upotrebe
RS64664B1 (sr) Gen optimizovanog faktora viii
HK40113039A (en) Factor viii chimeric proteins and uses thereof
HK40092414B (en) Factor viii chimeric proteins and uses thereof
HK40092414A (en) Factor viii chimeric proteins and uses thereof
HK40099494A (en) Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof
HK40095815A (en) Optimized factor viii gene
HK1211228B (en) Factor viii complex with xten and von willebrand factor protein, and uses thereof
HK1230526A1 (en) Factor viii chimeric proteins and uses thereof
HK1230526B (en) Factor viii chimeric proteins and uses thereof