RS59935B1 - Anti-cd40 antitela i njihove upotrebe - Google Patents

Anti-cd40 antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS59935B1
RS59935B1 RS20200134A RSP20200134A RS59935B1 RS 59935 B1 RS59935 B1 RS 59935B1 RS 20200134 A RS20200134 A RS 20200134A RS P20200134 A RSP20200134 A RS P20200134A RS 59935 B1 RS59935 B1 RS 59935B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
antibodies
amino acid
seq
antigen
Prior art date
Application number
RS20200134A
Other languages
English (en)
Inventor
Lorenzo Benatuil
Maria A Argiriadi
Bradford L Mcrae
Chung-Ming Hsieh
David A Egan
John E Harlan
Russell A Judge
Rui Wang
Gillian A Kingsbury
Original Assignee
Abbvie Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Abbvie Inc filed Critical Abbvie Inc
Publication of RS59935B1 publication Critical patent/RS59935B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/06—Antigout agents, e.g. antihyperuricemic or uricosuric agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30 CD40 or CD95

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)

Description

Opis pronalaska
OBLAST TEHNIKE NA KOJU SE PRONALAZAK ODNOSI
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na CD40 (CD40) antitela.
STANJE TEHNIKE
[0002] CD40 je član familije receptora za faktor nekroze tumora (TNF) koji ima važnu ulogu u razvoju B-ćelija, aktivaciji limfocita i funkciji antigen-prezentujućih ćelija (APC). Ekspresija CD40 na epitelu, leukocitima i vaskularnom endotelu je povišena kod autoimunih oboljenja specifičnih za organe, kao i kod sistemskog autoimuniteta kao što je sistemski eritematozni lupus (SLE). Remećenje CD40L/CD40 signalnog puta smanjuje proizvodnju proinflamatornih citokina poput IL-23 i TNF, smanjuje diferencijaciju i funkciju T-pomoćnih ćelija i dalje inhibira aktivaciju makrofaga kod pacijenata sa hroničnim inflamatornim oboljenjima poput Kronove bolesti. Interakcija CD40 sa CD40L indukuje kako humoralni tako i imuni odgovor posredovan ćelijama. CD40 reguliše ovakvo uparivanje liganda i receptora da bi se aktivirale B-ćelije i druge antigen-prezentujuće ćelije (APC), uklјučujući dendritične ćelije (DC).
[0003] CD40 je transmembranski protein tipa I od 48 kDa (van Kooten, J Leukoc Biol., janur 2000; 67(1):2-17) koji se eksprimira na širokom spektru hematopoetskih (npr. na limfocitima, monocitima, dendritičnim ćelijama) i nehematopoetskih ćelijskih tipova (npr. epitela, endotela, u fibroblastima). CD40L se prvenstveno eksprimira na aktiviranim T-ćelijama, B-ćelijama i trombocitima. Većina razumevanja biologije CD40/CD40L potiče od interakcije između APC (tj. ekspresije CD40 bilo na dendritičnim ćelijama (DC) ili B-ćelijama) i T-ćelija koje eksprimiraju CD40L. Na mirujućim B-ćelijama, angažovanje CD40L pokreće aktivaciju, proliferaciju B-ćelija i razvoj memorijskih B-ćelija (Kehry, Immunol. 1. april 1996.; 156(7):2345-8). CD40 signalizacija je takođe potrebna za izmenu klase imunoglobulina i obrazovanje germinativnih centara. Važnost CD40/CD40L signalnog puta u biologiji B-ćelija je očigledna kod miševa sa deficijencijom u CD40 ili CD40L kojima nedostaju germinativni centri i kod kojih su suprimirani T-ćelijski odgovori zavisni od antitela. Ipak, kod CD40-/- miševa ostaju intaktni IgG odovori nezavisni od T-ćelija, što uklazuje da kod ovih miševa zapravo nedostaja interaktcija tipa ćelija-ćelija. Miševi sa deficijencijom CD40 takođe su sa deficitima u T-ćelijskom kompartmanu. Signalizacija preko CD40 pozitivno reguliše MHC klasu II, kao i razne kositumulatorne molekule poput CD80 i CD86 u dendritičnim ćelijama i pospešuje sazrevanje DC. Zreli DC stimulišu aktivaciju i preživlјavanje CD4+ T-ćelija kroz proizvodnju citokina kao što su IL-2 i IL-12. Deluje da je neefikasno prajmovanje T-ćelija glavni uzrok kompromitovanih humoralnih odgovora zavisnih od T-ćelija kod CD40L-/- miševa (Grewal, Nature, decembar 1995. 7;378(6557):617-20). Sličan B-ćelijski fenotip može biti uočen kod lјudi sa X-vezanim hiper IgM sindromom. Ovi bolesnici pate od primarne imunodeficijencije usled mutacija u lokusu CD40L koje su uzrok obustavljanja CD40/CD40L signalizacije. Ove osobe karakterišu povišeni nivoi IgM i nemogućnost proizvodnje IgA, IgG i IgE, što rezultuje povećanim rizikom od oportunističkih infekcija (Adriana, J Clin Immunol., maj 2008., 28 Supl 1:S62-6).
[0004] CD40 signalni put je sa centralnom ulogom u prevođenju mirujućih ili naivnih limfocita i APC u aktiviran/zreli fenotip. Iako se prajming T-ćelija i aktivacija B-ćelija mogu odvijati u odsustvu CD40/CD40L signalizacije, ovaj put je neophodan za generisanje snažnog adaptivnog imunog odgovora. Rezultat angažovanje CD40 sa CD40L je regrutovanje faktora koji su asocirani sa TNF receptorima (TRAF-ova) na citoplazmatski domen CD40 (Bishop, Adv Exp Med Biol. 2007; 597:131-51). Fosforilacija raznih TRAF proteina rezultuje aktivacijom i kanonskih i nekanonskih NFkB puteva. Dodatno, veza JAK3 sa citoplazmatskim repom CD40 rezultuje aktivacijom STAT5 koji dalje indukuje sazrevanje DC, kao i proizvodnju TNF i IFNγ. PI3K aktivacija zavisna od TRAF6 je kritičan signal preživlјavanja u DC, dok su TRAF2/TRAF6 sa redundantnim funkcijama u aktivaciji NFkB i pozitivnoj regulaciji ekspresije CD80 (Hostager, J Biol Chem., 14. novembar 2003.; 278(46):45382-90). Pokazano je da svi od TRAF 2, 3, 5 i 6 imaju važnu ulogu u izmeni klase imunoglobulina koja je posredovana CD40 signalizacijom (Leo, Proc Natl Acad Sci U S A., 16. februara 1999.; 96(4):1421-1426).
[0005] Pokazano je takođe da je CD40/CD40L signalni put uključen u patogenezu mnogih autoimunih oboljenja, uklјučujući sistemski eritematozni lupus (SLE), inflamatornu bolest creva (IBD), multiplu sklerozu, reumatoidni artritis i Sjogrenov sindrom (Law i Grewal, Adv Exp Med Biol.2009;647:8-36). Ekspresija CD40 je povišena na makrofagima, endotelu, epitelu i B-ćelijama, u tkivima koja su oštećena hroničnom autoimunošću, uključujući bubrege, creva i zglobove (Borcherding, Am J Pathol., april 2010.; 176(4):1816-27; Sawada-Hase, Am J Gastroenterol., jun 2000.; 95(6):1516-23). Solubilni CD40L je povišen kod pacijenata koji boluju od SLE, IBD i Sjogrenovog sindroma i u skladu je sa inflamatornim opterećenjem kod ovih pacijenata.
[0006] Pojedini od najranijih dokaza učešća CD40/CD40L puta u hroničnoj inflamaciji creva su proizašli iz pretkliničkih modela u kojima su anti-CD40L mAt ispoljila protektivno dejstvo na eksperimentalni kolitis kod glodara (de Jong, Gastroenterology, septembar 2000.; 119(3):715-23; Liu J., Immunol., 1. jun 2000.; 164(11):6005-14; Stuber J., Exp Med 1. februar 1996; 183(2):693-8). Smanjenje skora aktivnosti oboljenja je bilo u korelaciji sa smanjenom proizvodnjom proinflamatornih citokina u crevima i protektivnim dejstvom na hroničan gubitak telesne težine. Slični rezultati su uočeni kod životinja sa genetički zasnovanom deficijencijom CD40 ili CD40L (de Jong, Gastroenterology, septembar 2000.; 119(3):715-23). Tretman miševa sa anti-CD40L mAt nakon početka bolesti je bio i dalje efektivan u smanjenju aktivnosti oboljenja, što ukazuje je ovaj put kritičan za održavanje hroničnog inflamatornog oboljenja. Dodatno, agonistička anti-CD40 antitela su bila dovolјna za pokretanje crevne inflamacije kod miševa kojima nedostaju limfociti (Uhlig, Immunity, avg 2006.; 25(2):309-18). Najskoriji podaci dobijeni upotrebom CD40 siRNK takođe ukazuju na važnu ulogu CD40 signalizacije u kolitisu (Arranz, J Control Release, 10. februar 2013.; 165(3):163-72). U Kronovoj bolesti, periferna krv je obogaćena monocitima lamine propria i monocitima epitela koji eksprimiraju visoke nivoe CD40 i CD40+. Štaviše, polimorfizmi u CD40 lokusu su povezani sa povećanom podložnošću IBD. Kod pacijenata obolelih od Kronove bolesti koji su lečeni anti-TNF antitelima, transkripciono profilisanje ukazuje da nivoi CD40 iRNK opadaju kod pacijenata sa adekvatnim odgovorom na lečenje. Ipak, kod pacijenata sa slabim odgovorom na inhibitore TNF-a, nivoi CD40 iRNK su nepromenjeni, što ukazuje da putevi zavisni od CD40 i nezavisni od TNF-a mogu pospešiti inflamaciju kod ovih bolesnika. Studije sugerišu da je inhibicija signalizacije posredovane sa CD40 važna u patogenezi IBD i drugih autoimunih oboljenja. Shodno navedenom, ostaje potreba za antagonističkim anti-CD40 antitelima i njihovim delovima koji vezuju antigen koji bi mogli biti upotrebljeni u terapijske svrhe za lečenje hroničnih inflamatornih oboljenja i poremećaja poput Kronove bolesti.
[0007] WO 2011/123489 opisuje humanizovana antagonistička anti-CD40 antitela i terapijske i dijagnostičke postupke i kompozicije za upotrebu istih.
[0008] US 2004/120948 opisuje antitelo ili njegov funkcionalni fragment koji deluju agonistički ili antagonistički na CD40.
[0009] WO 2007/124299 opisuje stabilne tečne farmaceutske kompozicije koje sadrže antagonističko anti-CD40 antitelo.
KRATKO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0010] Ovaj pronalazak se odnosi na antagonistička anti-CD40 antitela. Antitela pronalaska su antagonistička humanizovana antitela koja su sposobna da vezuju humani CD40 i suštinski su oslobođena agonističke aktivnosti.
[0011] Predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CD40 antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 41 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 40.
[0012] Takođe su obezbeđeni:
farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-CD40 antitelo pronalaska i farmaceutski prihvatlјiv nosač;
izolovana nukleinska kiselina koja kodira SEQ ID NO: 41 i SEQ ID NO: 40;
vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu pronalaska;
ćelija domaćin koja sadrži vektor pronalaska, pri čemu je, po izboru, ćelija domaćin prokariotska ćelija ili eukariotska ćelija, i, dalјe, pri čemu je po izboru ćelija domaćin CHO ćelija ili COS ćelija; i postupak proizvodnje anti-CD40 antitela pronalaska, postupak koji obuhvata korake kultivisanja ćelije domaćina pronalaska, u medijumu za kulturu ćelija i pod uslovima dovolјnim da se proizvede anti-CD40 antitelo.
[0013] Antitelo pronalaska sadrži varijabilni region teškog lanca koja sadrži CDR set od SEQ ID NO: 6, 42 i 8, i varijabilni region lakog lanca koja sadrži CDR set od SEQ ID NO: 21, 11 i 12.
[0014] Antagonističko anti-CD40 antitelo pronalaska je humanizovano. Ovde su prijavljena antagonistička anti-CD40 antitela, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, koji sadrže humani akceptorski uokvirujući region, pri čemu, po izboru, humani akceptorski uokvirujući region sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO: 82-106. Takođe su prijavljena antagonistička anti-CD40 antitela, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, koji sadrže humani akceptorski uokvirujući region, pri čemu uokvirujući region sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju uokvirujućeg regiona i pri čemu je aminokiselinska sekvenca uokvirujućeg regiona najmanje 65% identična sekvenci navedenog humanog akceptorskog uokvirujućeg regiona i koji dalje sadrži najmanje 70 aminokiselinskih ostataka identičnih navedenom humanom akceptorskom uokvirujućem regionu. Ovde je takođe prijavljeno da humani akceptorski uokvirujući region sadrži najmanje jednu aminokiselinsku supstituciju ključnog ostatka u uokvirujućem regionu, pri čemu je navedeni ključni ostatak izabran između:
ostatka koji je susedan CDR sekvenci;
ostatka koji je mesto glikozilacije;
retkog ostatka i;
ostatka sposobnog da interaguje sa humanim CD40;
ostatka sposobnog da interaguje sa CDR;
kanonskog ostatka;
ostatka koji predstavlja mesto kontakta između varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca;
ostatka unutar Vernijerove zone; i
ostatka u regionu koji se preklapa između CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca definisanog po Chotia numeraciji i prvog uokvirujućeg regiona teškog lanca definisanog po Kabatu.
[0015] Prema jednom aspektu opisa, ključni ostatak je izabran od 48H, 49H i 36L. Prema drugom aspektu opisa, supstitucija klјučnog ostatka je u varijabilnom regionu teškog lanca i predstavlja V48I ili S49A. Prema sledećem aspektu, supstitucija klјučnog ostataka je u varijabilnom regionu lakog lanca i predstavlja Y36F.
[0016] Antagonističko anti-CD40 antitelo pronalaska sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 28 i varijabilni region lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 20
[0017] U jednom primeru izvođenja, antagonističko anti-CD40 antitelo je suštinski oslobođeno agonističke aktivnosti. U drugom primeru izvođenja, antagonističko anti-CD40 antitelo inhibira vezivanje CD40 sa ligandom CD40 (CD40L) ili sa solubilnim CD40 ligandom (sCD40L). U još jednom dalјem primeru izvođenja, antagonističko anti-CD40 antitelo se vezuje za cino CD40. U jednom primeru izvođenja, anti-CD40 antitelo vezuje humani i cino CD40, ali ne vezuje CD40 pacova, zeca ili miša.
[0018] U narednom primeru izvođenja, antagonističko anti-CD40 antitelo je sposobno da moduliše biološku funkciju CD40. U sledećem primeru izvođenja, antagonističko anti-CD40 antitelo je sposobno da neutrališe CD40. U još dalјem primeru izvođenja, antagonističko anti-CD40 antitelo inhibira aktivaciju NF-κB.
[0019] U jednom primeru izvođenja, antagonističko anti-CD40 antitelo karakteriše konstanta brzine asocijacije (Kon, od engl. on rate constant) sa CD40 koja je izabrana od najmanje oko 10<2>M<-1>s<-1>; najmanje oko 10<3>M<-1>s<-1>; najmanje oko 10<4>M<-1>s<-1>; najmanje oko 10<5>M<-1>s<-1>; i najmanje oko 10<6>M<-1>s<-1>; što je izmereno površinskom plazmonskom rezonancom.
[0020] U drugom primeru izvođenja, antagonističko anti-CD40 antitelo karakteriše konstanta disocijacije (KD) za CD40 izabrana iz grupe koja se sastoji od: najviše oko 10<-7>M; najviše oko 10<-8>M; najviše oko 10<-9>M; najviše oko 10<-10>M; najviše oko 10<-11>M; najviše oko 10<-12>M; i najviše 10<-13>M.
[0021] Ovde je takođe prijavljeno antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koji sadrži varijabilni domen teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 28 i/ili varijabilni domen lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 20.
[0022] Ovde je prijavljeno i antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koji sadrži teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 41, ili sekvencu koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 41, i/ili laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 40, ili sekvencu koja je najmanje 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična SEQ ID NO: 40. Prema jednom aspektu opisa, teški lanac antagonističkog anti-CD40 antitela, ili njegovog dela koji vezuje antigen, sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 41 i laki lanac antagonističkog anti-CD40 antitela, ili njegovog dela koji vezuje antigen, sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 40.
[0023] U jednom primeru izvođenja, antitela pronalaska su rekombinantna.
[0024] Predmetni pronalazak takođe prijavljuje, u određenim primerima izvođenja, farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-CD40 antitelo, kao što je navedeno u bilo kom od primera izvođenja koji su ovde opisani, i farmaceutski prihvatlјiv nosač.
[0025] Predmetni pronalazak takođe prijavljuje, u drugim određenim primerima izvođenja, farmaceutsku kompoziciju koja sadrži anti-CD40 antitelo kao što je navedeno u bilo kom od primera izvođenja koji su ovde opisani, i polisorbat. U dodatnim srodnim primerima izvođenja, polisorbat je polisorbat 80.
[0026] U drugom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži histidinski pufer.
[0027] U sledećem dodatnom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija sadrži poliol. U srodnom primeru izvođenja, poliol je izabran između manitola, sorbitola, trehaloze ili saharoze.
[0028] U sledećem primeru izvođenja, pH farmaceutske kompozicije je od oko 4 do oko 8. U srodnom primeru izvođenja, pH farmaceutske kompozicije je od oko 5 do oko 7.
[0029] U sledećem primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je liofilizovana.
[0030] Predmetni pronalazak takođe prijavljuje, u drugim primerima izvođenja, izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira aminokiselinsku sekvencu antagonističkog anti-CD40 antitela prema bilo kom od ovde opisanih aspekata i primera izvođenja. U daljem primeru izvođenja, predmetni pronalazak prijavljuje vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu. U srodnom primeru izvođenja, vektor je izabran od pcDNK, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV i pBJ vektora.
[0031] U drugom primeru izvođenja, ćelija domaćin sadrži vektor. U srodnom primeru izvođenja, ćelija domaćin je prokariotska ćelija ili eukariotska ćelija. U dalјem primeru izvođenja, eukariotska ćelija je ćelija protista, životinjska ćelija, bilјna ćelija, ćelija gljivica, sisarska ćelija, ptičija ćelija ili ćelija insekta. U još dalјem primeru izvođenja, sisarska ćelija je CHO ćelija ili COS ćelija.
[0032] Predmetni pronalazak takođe prijavljuje, u određenim primerima izvođenja, postupak proizvodnje antagonističkog anti-CD40 antitela, postupak koji obuhvata korake kultivisanja ćelije domaćina iz bilo kog od primera izvođenja koji je ovde opisan, u medijumu za kulturu ćelija i pod uslovima dovolјnim da se proizvede anti-CD40 antitelo. U dodatnim primerima izvođenja, postupkom se proizvodi antagonističko anti-CD40 antitelo.
[0033] Predmetni opis takođe prijavljuje, prema drugim određenim aspektima, postupak za određivanje prisustva CD40 ili njegovog fragmenta u ispitivanom uzorku upotrebom imunoanaliza, pri čemu imunoanaliza obuhvata kontakt ispitivanog uzorka sa najmanje jednim antitelom ili njegovim delom koji vezuje antigen prema bilo kom od aspekata ili primera izvođenja koji su ovde opisani, i dalje sa najmanje jednim obeleživačem koji se može detektovati. Prema dodatnim aspektima, postupak dodatno obuhvata korake: (i) dovođenja ispitivanog uzorka u kontakt sa najmanje jednim antitelom ili njegovim delom koji vezuje antigen, pri čemu se antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen vezuju za epitop na CD40 ili na njegovom fragmentu tako da se obrazuje prvi kompleks; (ii) dovođenje kompleksa u kontakt sa najmanje jednim detektabilnim obeleživačem, pri čemu se detektabilni obeleživač vezuje za epitop na prvom komleksu ili na CD40 ili njegovom fragmentu koji nije vezan antitelom ili njegovim delom koji vezuje antigen, da bi se obrazovao drugi kompleks; i (iii) detektovanje prisustva CD40 ili njegovog fragmenta u ispitivanom uzorku na osnovu signala generisanog detektabilnim obeleživačem, pri čemu je prisustvo CD40 ili njegovog fragmenta u direktnoj korelaciji sa signalom koga generiše detektabilan obeleživač. Prema daljem srodnom aspektu, postupak dalje obuhvata korake: (i) dovođenja ispitivanog uzorka u kontakt sa najmanje jednim antitelom ili njegovim delom koji vezuje antigen, pri čemu se antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen vezuje za epitop na CD40 ili na njegovom fragmentu tako da se obrazuje prvi kompleks; (ii) dovođenje kompleksa u kontakt sa najmanje jednim detektabilnim obeleživačem, pri čemu je detektabilni obeleživač u kompeticiji sa CD40 ili njegovim fragmentom u vezivanju za antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, tako da se obrazuje drugi kompleks; i (iii) detektovanje prisustva CD40 ili njegovog fragmenta u ispitivanom uzorku na osnovu signala generisanog od strane detektabilnog obeleživača u drugom kompleksu, pri čemu je prisustvo CD40 ili njegovog fragmenta u indirektnoj korelaciji sa signalom koga generiše detektabilan obeleživač.
[0034] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje DVD-Ig koji sadrži regione vezivanja, npr. CDR sekvence koje su ovde opisane. Prema jednom aspektu, DVD-Ig pronalaska sadrži četiri polipeptidna lanca, pri čemu dva polipeptidna lanca sadrže VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, pri čemu je VD1 prvi varijabilni domen teškog lanca, VD2 je drugi varijabilni domen teškog lanca, C je konstantni domen teškog lanca, XI je linker, pod uslovom da nije CH1, i X2 je Fc region; dok dva polipeptidna lanca sadrže VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n, pri čemu je VD1 prvi varijabilni domen lakog lanca, VD2 je drugi varijabilni domen lakog lanca, C je konstantni domen lakog lanca, XI je linker, pod uslovom da nije CH1, a X2 ne sadrži Fc region; i n je 0 ili 1; pri čemu navedena četiri polipeptidna lanca navedenog vezujućeg proteina obrazuju četiri funkcionalna mesta vezanja antigena. Prema jednom aspektu, prvi (i/ili drugi) teški lanac DVD-a sadrži CDR set naveden u SEQ ID NO: 6, 42 i 8. Prema jednom aspektu, prvi (i/ili drugi) varijabilni domen lakog lanca sadrži CDR set naveden u SEQ ID NO: 21, 11 i 12. Prema jednom aspektu, DVD-Ig pronalaska je monospecifičan i vezuje huCD40. Prema drugom aspektu, DVD-Ig pronalaska je multispecifičan i vezuje CD40 i drugi ciljni molekul.
KRATAK OPIS NACRTA
Slika 1A grafički prikazuje antagonističku aktivnost himernog antitela (Antitelo 1 (At1)) u odnosu na agonističku kontrolu i poznata antagonistička antitela (4D11 (Astellas) i Bib (Boehringer)). Slika 1B grafički prikazuje aktivnost istog himernog antitela At1 u agonističkoj analizi u kojoj su upotrebljene iste agonističke i antagonističke kontrole kao na Slici 1A.
Slika 2 grafički prikazuje agonističku aktivnost (Slika 2A) i antagonističku aktivnost (Slika 2B) humanizovanog antitela At101 u poređenju sa antitelom 4D11, antitelom Blb, IgG antitelom (kontrola) i kontrolnim agonističkim antitelom (2141).
Slika 3 grafički prikazuje rezultate iz in vivo studija za humanizovano antitelo At101. Slika 3A grafički prikazuje proizvodnju IgG-a u huscid miševima koji su primili humane PBMC u kombinaciji sa Ig kontrolom, CTLA4-Ig fuzionim kompleksom ili At101 antitelom. Slika 3B grafički prikazuje preživljavanje B-ćelija u istom modelu miša kome su primenjeni isti agensi kao na Slici 3A.
Slika 4 prikazuje poravnate aminokiselinske sekvence mišijih antagonističkih anti-humanih CD40 antitela i poravnate konsenzusne sekvence. Slika 4A prikazuje poravnavate sekvence varijabilnih regiona lakih lanaca Antitela 3 (At3) (SEQ ID NO: 48), At1 (SEQ ID NO: 9) i Antitela 2 (At2) (SEQ ID NO: 76), kao i konsenzusne sekvence varijabilnog regiona lakog lanca (SEQ ID NO: 116). Slika 4B prikazuje poravnavate sekvence varijabilnih regiona teških lanaca At3 (SEQ ID NO: 44), At1 (SEQ ID NO: 5) i At2 (SEQ ID NO: 75) i konsenzusne sekvence varijabilnog regiona teškog lanca (SEQ ID NO: 117).
Slike 5A i 5B grafički prikazuju reprezentativnu potenciju neutralizacije (antagonističku aktivnost) (Slika 5A) i agonističku aktivnost (Slika 5B) At102 za humani CD40 u testovima aktivacije monocita koji su opisani u Primeru 7. U svakom testu, aktivacija monocita je u korelaciji sa povećanjima u koncentraciji TNF-a.
Slika 6 grafički prikazuje inhibiciju zavisnu od doze za endoskopski skor prilikom profilaktičke primene antitela 138 (At138). Antitelo 138 je ispitivano u dozama od 15, 5, 1,5 i 0,5 mg/kg. Korišćena je IgG negativna kontrola. Tretman sa anti-p40IL-12/23 je upotrebljen kao pozitivna kontrola. Bolest je posredovana CD45Rbvisokćelijama koje su prenete u životinje. RBnizak se odnosi na grupu negativnih kontrola. CD45RBnizakćelije ne posreduju u bolesti.
Slika 7 grafički prikazuje rezultate imunohistohemijske analize za detekciju IBA1+ makrofaga u debelom crevu prilikom primene antitela 138 (At138). Histološka analiza preseka debelog creva je pokazala smanjenje makrofaga (opšta mera inflamacije). Korišćena je IgG negativna kontrola. Tretman sa anti-p40IL-12/23 je upotrebljen kao pozitivna kontrola.
Figura 8 grafički prikazuje serumske nivoe cirkulišućeg antitela 138 (At138), 96 sati (jednako sa Ctokom) nakon poslednje primene doze u modelu kolitisa sa uvođenjem T-ćelija. Pokazalo se da nivoi u serumu zavise od doze. Tretman sa anti-p40IL-12/23 je upotrebljen kao pozitivna kontrola. Samo jedna životinja iz grupe za 0,5 mg/kg je imala merlјive nivoe At138.
Slika 9A grafički prikazuje rezultate endoskopije nakon primene antitela 138 u mišijem modelu kolitisa. Tretman antitelom 138 (At138) je započet tri nedelјe po injeciranju ćelija, nakon endoskopske potvrde bolesti, a beležen je zbirni MEDAI skor inhibicije u odgovoru na dozu. Najveća doza (15 mg/kg) je dostigla statističku značajnost (Slika 9A).
Slika 9B grafički prikazuje histološke rezultate nakon primene antitela 138. Histološka analiza IBA1+ makrofaga u debelom crevu kao mera mijeloidne inflamacije je prikazana na Slici 9B.
Slika 10 grafički prikazuje rezultate koji pokazuju da je At102 suprimiralo anti KLH IgM i anti KLH IgG (isprekidana linija) u poređenju sa kontrolnim životinjama koje su bile tretirane samo nosačem (pune linije). Cinomolgus majmunima (dve životinje/polu/grupi) je potkožno (SC) primenjivano At102 u dozama od 0 (samo nosač) ili 10 mg/kg, tokom 5 nedelja. Hemocijanin iz prilepka Megathura crenulata (KLH) je primenjen svim životinjama 8. dana. Uzorci seruma iz svake životinje su prikuplјeni Dana -11, -7, 0, 4, 7, 10, 14 i 21 u odnosu na primenu KLH (KLH dani).
Slika 11A je grafik koji pokazuje da tretman anti-CD40 antitelom 138 sprečava proteinuriju kod MRL/lpr miševa. Miševima su primenjene doze od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Samostalna primena fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom (PBS-a) je upotrebljena kao kontrola. Proteinurija je određivana kao procenat proteina u urinu < 300 mg/dL.
Slika 11B je grafik koji prikazuje rezultate koji pokazuju da je tretman anti-CD40 antitelom 138 produžio preživlјavanje MRL/lpr miševa. Životinjama su primenjene doze od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača je upotrebljena kao kontrola. Procenat preživlјavanja je naznačen tokom vremena.
Slika 12A je grafik koji prikazuje rezultate koji pokazuju da je tretman anti-CD40 antitelom 138 sprečio razvoj nefritisa. Slika 12A prikazuje efekat antitela 138, dobijen Dana 29 i Dana 63, na glomerularnu bolest kod miševa kojima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljena je kao kontrola. Glomerularna bolest je procenjivana na skali 0-4. Kako se težina glomerularne bolesti pogoršala kod MRL miševa koji su starili, antitelo 138 uu dozi od 5 i 15 mg/kg je zadržalo efikasnost u smanjenju glomerularne bolesti do minimum. Perivaskularna inflamacija je procenjivana na skali 0-4 na osnovu sledećih kriterijuma: 0 - do nekoliko retkih limfocita; 1 - nekoliko limfocita koji obrazuju labave agregate; 2 - limfociti koji obrazuju diskretne male agregate; 3 - polarizovani agregat limfocita koji se širi na lumen susedne
1
vene, ali ne uspeva da okruži arkuatnu arteriju u potpunosti; 4 - limfocitni agregat koji u potpunosti okružuje arkuatnu arteriju i proširuje se u vezivni sloj (lat. tunica adventitia).
Slika 12B je grafik koji prikazuje rezultate koji pokazuju da je tretman anti-CD40 antitelom 138 sprečio razvoj nefritisa. Slika 12B prikazuje rezultate dobijene Dana 29 i Dana 63 koji pokazuju efekat antitela 138 na perivaskularnu (PV) inflamaciju bubrega kod miševa kojima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola. Anti-CD40 antitelo u koncentraciji od 5 i 15 mg/kg je bilo efektivno u smanjenju perivaskularnih (PV) infiltrata u bubregu Dana 29 i 63.
Slika 12C je grafik koji pokazuje da je tretman anti-CD40 antitelom 138 sprečilo razvoj nefritisa. Slika 12C prikazuje efekat antitela 138, dobijen Dana 29 i Dana 60, na tubulointersticijsku inflamaciju (TI) kod miševa kojima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola. TI je bio smanjen u ranoj fazi bolesti.
Slika 13A je grafik koji pokazuje da je tretman anti-CD40 antitelom 138 sprečio inflamaciju plјuvačnih žlezda. Slika 13A prikazuje efekat antitela 138, dobijen Dana 29 i Dana 60, na inflamaciju plјuvačnih žlezda kod miševa kojima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola. Periduktalna inflamacija je ocenjivana na skali 0-4 na osnovu sledećih kriterijuma: 0 - do nekoliko retkih leukocita; 1 - nekoliko leukocita koji obrazuju labave agregate; 2 - leukociti koji obrazuju diskretne male agregate; 3 - polarizovani agregat leukocita koji u potpunosti okružuje kanal; 4 - agregat leukocita koji se proširuje u žlezdani parenhim plјuvačne žlezde.
Slika 13B je grafik koji pokazuje da je tretman anti-CD40 antitelom 138 sprečio upalu zglobova. Slika 13B prikazuje efekat antitela 138, dobijen Dana 29 i Dana 60, na inflamaciju zglobova kod miševa kojima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola. Upala zglobova je ocenjivana za svaku od dve šape po mišu, sa skalom 0-4, na osnovu sledećih kriterijuma: 0 - bez upale; 1 - nekoliko leukocita u prostoru zgloba; 2 - česti leukociti unutar prostora zglob sa blagom sinovijalnom proliferacijom; 3 - leukociti se šire van prostora zgloba uz umerenu sinovijalnu proliferaciju; 4 - leukociti i sinovijalna proliferacija se šire i spajaju u svim prostorima zgloba uz izraženu eroziju kostiju i/ili proliferaciu. Rezultati su dodavani da bi se dobio ukupan mogući rezultat od 8 po mišu.
Slika 14 je panel četiri grafika (i-iv) koja pokazuje da je antitelo 138 anti-CD40 sprečilo ekspanziju folikularnih pomoćnih T-ćelija (Tfh) i germinativnih centara (GC) B-ćelija u slezini, što je određeno protočnom citometrijom. Miševima su primenjivane doze od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola. Panel (i) prikazuje broj Tfh ćelija u slezini na Dan 29. Panel (ii) prikazuje broj Tfh ćelija u slezini na Dan 63. Panel (iii) prikazuje broj GC B-ćelija u slezini na Dan 29. Panel (iv) prikazuje broj GC B-ćelija u slezini na Dan 63.
Slika 15A je grafik koji pokazuje da je tretman anti-CD40 antitelom 138 sprečio povećanje ukupnog nivoa IgG-a u cirkulaciji Dana 29. Miševima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg. kg antitela 2x/nedelјno i 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola.
Slika 15B je grafik koji pokazuje da je tretman anti-CD40 antitelom 138 sprečio povećanje ukupnog nivoa IgG-a u cirkulaciji na Dan 63. Miševima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg. kg antitela 2x/nedelјno i 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola.
Slika 16A je grafik koji pokazuje efekat tretmana anti-CD40 antitelom 138 na titre antitela za dvolančanu DNK (anti-dsDNK) na Dan 29. Miševima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola. Dana 29, određivani su anti-dsDNK titri.
Slika 16B je grafik koji prikazuje efekat tretmana anti-CD40 antitelom 138 na titre antitela za dvolančanu DNK (anti-dsDNK) na Dan 63. Miševima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 5 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola. Dana 63, određivani su anti-dsDNK titri.
Slika 17A je grafik koji prikazuje da je profilaktička primena anti-CD40 antitela 138 sprečila proteinuriju. Profilaktički tretman je započet kod miševa starih 26 nedelјa, a proteinurični miševi su isklјučeni iz studije. Miševima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola. Proteinurija je određivana kao procenat proteina u urinu < 300 mg/dL.
Slika 17B je grafik koji prikazuje da je profilaktička primena anti-CD40 antitela 138 produžila preživlјavanje pri upotrebi SLE mišjeg modela. Profilaktički tretman je započet kod miševa starih 26 nedelјa, a proteinurični miševi su isklјučeni iz studije. Miševima je primenjivana doza od 15 mg/kg antitela 2x/nedelјno, 1,5 mg.kg antitela 2x/nedelјno ili 15 mg/kg antitela 1x/nedelјno. Primena samog nosača, PBS-a, upotrebljavana je kao kontrola. Procenat preživlјavanja je ispitivan do starosti od 36 nedelјa.
Slika 18A je grafik koji pokazuje da su miševi tretirani antitelom 138 u dozi od 15 mg/kg IP 2x/nedelјno, razvili nisku proteinuriju tokom vremena, a što je prikazano stepenom proteina u urinu (ekvivalenti u vidu mg/dL). PBS kao nosač, primenjivan je 2x/nedelјno IP i upotrebljen je kao kontrola. Prednizolon je primenjivan u dozi od 10 mg/kg oralno (PO), jednom dnevno (SID). Ni netretirani kontrolni miševi, tretirani PBS-om kao nosačem, ni miševi tretiranini prenizolonom nisu razvili nisku proteinuriju. Prag proteinurije je naznačen kao 300 mg/dL.
Slika 18B je grafik koji pokazuje stopu oporavka od proteinurije kod miševa tretiranih antitelom 138 u dozi od 15 mg/kp IP 2x/nedelјno. Na osnovu stope oporavka od proteinurije, utvrđene procenatom od normalnog nivoa proteina u urinu, prosečno vreme oporavka od proteinurije je iznosilo 23±7 dana. PBS kao nosač, primenjivan je 2x/nedelјno IP i upotrebljen je kao kontrola. Prednizolon je primenjivan u dozi od 10 mg/kg oralno (PO), jednom dnevno (SID).
Slika 18C je grafik koji pokazuje da je kod miševa tretiranih anti-CD40 antitelom 138 u dozi od 15 mg/kp IP 2x/nedelјno, značajno produženo preživlјavanje, kao što je pokazano procenatom preživlјavanja. PBS kao nosač, primenjivan je 2x/nedelјno IP i upotrebljen je kao kontrola. Prednizolon je primenjivan oralno (PO), jednom dnevno (SID).
Slika 19A je grafik koji pokazuje da je proizvodnja pljuvačke očuvana prilikom profilaktičkog tretmana sa atitelom 138 u dozi od 15 mg/kp IP 2x/nedelјno, 1,5 mg/kg 2x/nedelјno, 15 mg/kg 1x/nedelјno. Nosač, PBS, upotrebljavan je kao kontrola. Prednizolon je primenjivan u dozi od 10 mg/kg. Proizvodnja plјuvačke kod NZBWF-1 miševa starih 7 nedelja koji predstavljaju mlađe, neobolele miševe, upotrebljavana je za dalje poređenje. Određivana je količina pljuvačke (mg). Proizvodnja plјuvačke kod miševa tretiranih sa anti-CD40 bila je relativno ujednačena.
Slika 19B je grafik koji pokazuje da je zapremina pljuvačke očuvana prilikom profilaktičkog tretmana sa atitelom 138 u dozi od 15 mg/kp IP 2x/nedelјno, 1,5 mg/kg 2x/nedelјno, 15 mg/kg 1x/nedelјno. Nosač, PBS, upotrebljavan je kao kontrola. Prednizolon je primenjivan u dozi od 10 mg/kg. Određivana je zapremina plјuvačke po telesnoj težini (mg/gm). Proizvodnja plјuvačke kod miševa tretiranih sa anti-CD40 antitelom je bila značajno veća nego kod netretiranih kontrolnih miševa.
Slika 20A je grafik koji pokazuje da je proizvodnja pljuvačke očuvana prilikom terapijskog tretmana sa anti-CD40 antitelom 138 u dozi od 15 mg/kg. Prednizolon je primenjivan u dozi od 10 mg/kg. Proizvodnja plјuvačke kod miševa starih 11 nedelјa je upotrebljavana za dalje poređenje. Određivana je količina pljuvačke (mg).
1
Slika 20B je grafik koji pokazuje da je proizvodnja pljuvačke očuvana prilikom terapijskog tretmana sa anti-CD40 antitelom 138 u dozi od 15 mg/kg. Prednizolon je primenjivan u dozi od 10 mg/kg. Proizvodnja plјuvačke kod miševa starih 11 nedelјa je upotrebljavana za dalje poređenje. Određivana je zapremina plјuvačke po telesnoj težini (mg/gm).
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0036] Ovaj pronalazak se odnosi na antagonistička anti-CD40 antitela i njihove upotrebe. Razni aspekti pronalaska se odnose na antitela i njihove farmaceutske kompozicije, kao i na nukleinske kiseline, rekombinantne ekspresione vektore i ćelije domaćine za stvaranje takvih antitela. Ovde su opisani postupci upotrebe antitela pronalaska za detekciju humanog CD40, inhibiciju aktivnosti humanog CD40/CD40L, bilo in vitro ili in vivo. Takođe su opisana anti-CD40 antitela za upotrebu u postupku prevencije ili lečenja oboljenja ili poremećaja u kome je CD40 štetan kod humanog subjekta, kao što su hronična inflamatorna bolest i Kronova bolest.
[0037] Ukoliko ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini upotrebljeni u vezi sa predmetnim pronalaskom su sa značenjima koja se uobičajeno i podrazumevaju od strane stručnjaka iz oblasti tehnike. Značenje i opseg termina bi trebali da budu jasni, međutim, u slučaju bilo koje moguće nejasnoće, definicije koje su ovde obezbeđene imaju prednost nad bilo kojim rečnikom ili spoljnom definicijom. Nadalјe, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, jednina termina treba da obuhvata i njegovu množinu, dok množina termina treba da uključi i jedninu. U ovoj prijavi, upotreba "ili" podrazumeva "i/ili" osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Štaviše, upotreba termina "uklјučujući", kao i drugih njegovih oblika poput "uklјučuje" i "uklјučeno", nije ograničavajuća. Takođe, termini kao što su „element“ ili „komponenta“ obuhvataju i elemente i komponente koji sadrže jednu jedinicu, kao i elemente i komponente koji sadrže više od jedne subjedinice, ukoliko nije izričito navedeno drugačije.
[0038] U principu, nomenklature upotrebljene u vezi sa, kao i tehnike iz, kulture ćelija ili tkiva, molekularne biologije, imunologije, mikrobiologije genetike i hemije i hibridizacije protiena i nukleinskih kiselina, koje su ovde opisane, su one koje su dobro poznate i uobičajeno se upotrebljavaju u oblasti tehnike. Postupci i tehnike predmetnog pronalaska se generalno izvode prema uobičajenim postupcima koji su dobro poznati u praksi i kao što je opisano u raznim opštim ili specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane kroz predmetnu specifikaciju, osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se izvode prema specifikacijama proizvođača, što se uobičajeno ostvaruje kao u praksi ili kao što je ovde opisano. Nomenklature upotrebljene u vezi sa, kao i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hemije, sintetske organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane, su one koje su dobro poznate i uobičajeno se koriste u oblasti tehnike. Standardne tehnike se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske pripreme, formulisanje i isporuku, kao i lečenje pacijenata.
[0039] Da bi se predmetni pronalazak mogao lakše razumeti, odabrani pojmovi su definisani u tekstu koji sledi.
[0040] Termin "polipeptid", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na bilo koji polimerni lanac aminokiselina. Termini "peptid" i "protein" se upotreblјavaju naizmenično sa terminom polipeptid i takođe se odnose na polimerni lanac aminokiselina. Termin "polipeptid" obuhvata nativne ili veštačke proteine, fragmente proteina i polipeptidne analoge proteinske sekvence. Polipeptid može biti monomeran ili polimerni.
[0041] Izraz "izolovan protein" ili "izolovan polipeptid" je protein ili polipeptid koji zbog svog porekla ili izvora iz koga je izveden, nije u vezi sa komponentama sa kojima se udružuje u prirodi i koje su mu pridružene u njegovom nativnom stanju; suštinski je oslobođen od drugih proteina iz iste vrste; eksprimira se od strane ćelije iz druge vrste; ili se ne javlja u prirodi. Tako, polipeptid koji je hemijski sintetisan ili je sintetisan u ćelijskom sistemu različitom od ćelije iz koje prirodno potiče, biće "izolovan" i odvojen od svojih komponenti sa kojima se udružuje u prirodi. Protein takođe može izolacijom biti izdvojen tako da bude suštinski oslobođen od komponenti sa kojima je udružen u prirodi, upotrebom tehnika prečišćavanja proteina koje su dobro poznate u stanju tehnike. Primer izolovanog polipeptida je izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen.
[0042] Izraz "ponovno dobijanje", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na proces izdvajanja hemijske vrste kao što je polipeptid, a koja je suštinski oslobođena komponenti sa kojima se udružuje u prirodi, putem izolacije, npr. upotrebom tehnika prečišćavanja proteina koje su dobro poznate u stanju tehnike.
[0043] Termini "humani CD40" i " humani CD40 divlјeg tipa" (ovde skraćeni kao hCD40, hCD40wt), kako se ovde koriste, odnosi se na transmembranski protein tipa I. U jednom primeru izvođenja, predviđeno je da termin humani CD40 obuhvata rekombinantan humani CD40 (rhCD40), koji može biti pripremljen standarndim postucima rekombinantne ekspresije. Tabela 1 obezbeđuje aminokiselinsku sekvencu humanog CD40 (tj. SEQ ID NO.1) i njegovog vanćelijskog domena (tj. SEQ ID NO: 107) koji su poznati u stanju tehnike.
Tabela 1: Sekvenca humanog CD40
1
[0044] "Biološka aktivnost", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na sva inherentna biološka svojstva receptora CD40. Biološka svojstva CD40 uklјučuju, ali nisu ograničena na, vezivanje CD40L; uključenost u razvoju B-ćelija; uključenost u aktivaciju limfocita; uključenost u funkciju ćelija koje prezentuju antigen; regulisanje aktivnosti dendritičnih ćelija, makrofaga i B-ćelija; indukovanje proizvodnje inflamatornih citokina u makrofagima i dendritičnim ćelijama; pozitivnu regulaciju prezentacije antigena; pozitivnuu regulaciju stimulacije T-ćelija; i pospešivanje izmene klasa imunoglobulina u B-ćelijama.
[0045] Izrazi "specifično vezivanje" ili "karakteristično vezivanje", kako se ovde upotrebljavaju, kada se odnose na interakciju antitela, proteina ili peptida sa drugim hemijskim vrstama, označavaju da interakcija zavisi od prisustva određene strukture (npr. antigene determinante ili epitopa) na hemijskoj vrsti; na primer, antitelo prepoznaje i vezuje se prevashodno za specifičnu proteinsku strukturu, a ne generalno za proteine. Ukoliko je antitelo specifično za epitop "A", prisustvo molekula koji sadrži epitop A (ili slobodan, neobeležen A), u reakciji koja sadrži obeležen "A" i antitelo, doći će do smanjenja količine obeleženog A koji je vezan za antitelo.
[0046] Termin "agonista", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na modulator koji, kada je u kontaktu sa molekulom od interesa, npr. CD40, prouzrokuje porast u redu veličine određene aktivnosti ili funkcije molekula, u poređenju sa redom veličine aktivnosti ili funkcije koja se uočava u odsustvu agoniste.
[0047] Termin "antagonista" ili "inhibitor", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na modulator koji, kada je u kontaktu sa molekulom od interesa, npr. CD40, prouzrokuje pad u redu veličine određene aktivnosti ili funkcije molekula, u poređenju sa redom veličine aktivnosti ili funkcije koja se uočava u odsustvu antagoniste. Posebni antagonisti od interesa obuhvataju one koji blokiraju ili modulišu biološku ili imunološku aktivnost humanog CD40 (hCD40). Antagonističko antitelo za hCD40 može, na primer, inhibirati pozitivnu regulaciju CD86 u primarnim humanim B-ćelijama koje su gajene sa (ili se izlažu) CD40L (kao što je kultivisanje B-ćelija sa humanim T-ćelijama koje eksprimiraju CD40L). Prema jednom aspektu opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen,
1
koje je suštinski oslobođeno agonističke aktivnosti, definisano je kao ono sa nivoom aktivnosti koji je ekvivalentan ili unutar opsega jedne standardne devijacije u odnosu na nivo kod negativne kontrole u agonističkom testu, kao što je test agonističke aktivnosti na monocitima koji je opisan u Primeru 7.
[0048] Antitelo predmetnog pronalaska je antagonističko antitelo koje prouzrokuje smanjenje aktivnosti ili funkcije CD40 u poređenju sa aktivnošću ili funkcijom CD40 u odsustvu antitela. U posebnim primerima izvođenja, antitelo je suštinski bez agonističke aktivnosti, tj. antitelo ne prouzrokuje povećanje reda veličine aktivnosti ili funkcije CD40 u poređenju sa aktivnošću ili funkcijom CD40u odsustvu antitela. Agonistička ili antagonistička aktivnost može takođe biti ispitana upotrebom postupaka koji su poznati u stanju tehnike, npr. upotrebom signala koji se dobija sekrecijom alkalne fosfataze (AP) koja je posredovana sa NFkB iz reporterske ćelijske linije koja eksprimira CD40, ili sa B-ćelijim testom. Nadalјe, agonistička ili antagonistička aktivnost može biti ispitana upotrebom in vitro testova agonističke ili antagonističke aktivnosti sa monocitima koji je opisan u Primeru 7.
[0049] Termin "inhibira vezivanja za CD40L" se odnosi na sposobnost antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen, da spreči vezivanje CD40 za ligand, CD40L. Takva inhibicija vezivanja za CD40L bi rezultovala smanjenjem ili ukidanjem biološke aktivnosti koja je posredovana vezivanjem CD40 za CD40L.
[0050] Termin "antitelo", kako se ovde upotrebljava, šire se odnosi na bilo koji imunoglobulinski (Ig) molekul koji se sastoji od četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) i dva laka (L) lanca, ili na bilo koji njegov funkcionalni fragment, mutanta, varijantu ili derivat koji zadržava suštinske karakteristike vezivanja epitopa koje karakterišu molekul Ig-a. Takvi formati mutanata, varijanti ili derivata anatitela su poznati u stanju tehnike. Primeri navedenih se razmatraju u nastavku teksta.
[0051] U antitelu pune dužine, svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (označenog ovde skraćenicama HCVR ili VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (označenog ovde skraćenicama LCVR ili VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, CL. VH i VL regioni mogu dalјe biti podeljeni na regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), a koji se smenjuju sa regionima koji su više evolutivno očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a raspoređenih od amino-kraja ka karboksilnom-kraju po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Molekuli imunoglobulina mogu biti bilo kog tipa (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili podklase.
1
[0052] Izrazi "deo koji vezuje antigen" ili "fragment koji vezuje antigen" antitela (ili jednostavno "deo antitela" ili "fragment antitela"), kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vezuju za antigen (npr. hCD40). Pokazano je se da funkcija vezivanja antigena antitela može odvijati fragmentima antitela pune dužine. Takvi fragmenti mogu biti bispecifični, dvostruko specifični ili multi-specifični formati; specifično se vezivati za dva ili više različitih antigena. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih unutar termina "deo koji vezuje antigen" ili "fragment koji vezuje antigen" antitela obuhvataju (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od domena VL, VH, CL i CH1; (ii) F(ab')2fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba; (iii) Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAt fragment (Ward i saradnici (1989) Nature 341:544-546, Winter i saradnici, PCT publikacija WO 90/05144 A1) koji se sastoji od jednog varijabilnog domena; i (vi) izolovan region koji određuje komplementarnost (CDR). Štaviše, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana razdvojenim genima, oni mogu biti spojeni, upotrebom rekombinantnih postupaka, sa sintetskim linkerom koji im omogućava da budu napravlјeni kao jedinstven proteinski lanac u kome su VL i VH regioni upareni tako da se obrazuju monovalentni molekuli (poznati i kao jednolančani Fv (scFv); pogledati npr. Bird i saradnici (1988) Science 242:423-426; i Huston i saradnici (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Predviđeno je da i ovakva jednolančana antitela budu obuhvaćena terminom "deo koji vezuje antigen" ili "fragment koji vezuje antigen" antitela. Obuhvaćeni su i drugi oblici jednolančanih antitela, poput dimernih antitela. Dimerna antitela su bivalentna, bispecifična antitela, u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali upotrebom linkera koji je prekratak da bi omogućio uparivanje dva domena u istom lancu, čime se domeni primoravaju da se upare sa komplementarnim domenima drugog lanca ili da stvore dva mesta vezivanja antigena (pogledati npr. Holliger P. i saradnici (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Polјak R.J. i saradnici (1994) Structure 2:1121-1123). Navedeni delovi antitela za vezivanje su poznati u stanju tehnike (Kontermann i Dubel, ur., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. Nјu Jork. 790 str. (ISBN 3-540-41354-5).
[0053] Termin "konstrukt antitela", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na polipeptid koji sadrži jedan ili više delova koji vezuju antigen pronalaska koji su povezani sa linkerskim polipeptidom ili sa konstantnim domenom imunoglobulina. Linkerski polipeptidi sadrže dva ili više aminokiselinskih ostataka koji su spojeni peptidnim vezama i koji se koriste za povezivanje jednog ili više delova koji vezuju antigen. Takvi linkerski polipeptidi su dobro poznati u stanju tehnike (pogledati npr. Holliger P. i saradnici (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Polјak R.J. i saradnici (1994) Structure 2:1121-1123). Imunoglobulinski konstantni domen se odnosi na konstantan domen teškog ili lakog
1
lanca. Aminokiselinske sekvence konstantnih domena teških i lakih lanaca humanog IgG-a su poznati u stanju tehnike i predstavlјene su u Tabeli 2.
TABELA 2: Sekvenca konstantnog domena teškog i lakog lanca humanog IgG-a
[0054] Ipak, antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, mogu biti deo većih imunoadhezivnih molekula, obrazovanih kovalentnim ili nekovalentnim udruživanjem antitela ili dela antitela sa jednim ili sa više drugih proteina ili peptida. Primeri takvih imunoadhezivnih molekula obuhvataju upotrebu cetralnog regiona streptavidina regiona radi stvaranja tetramernog scFv molekula (Kipriyanov S.M. i saradnici (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) i upotrebu cisteinskog ostatka, marker peptida i C-terminalnog polihistidinskog taga da bi se napravili bivalentni i biotinizirani scFv molekuli (Kipriyanov S.M. i saradnici (1994) Mol. Immunol.31:1047-1058). Delovi antitela, kao što su Fab i F(ab’)2fragmenti, mogu biti pripremljeni iz celih antitela, upotrebom konvencionalnih tehnika, kao što su papainska ili pepsinska digestija celih antitela, tim redom. Štaviše, antitela, delovi antitela i imunoadhezivni molekuli mogu biti dobijeni upotrebom standardnih tehnika rekombinantne DNK, kao što je ovde opisano.
[0055] Predviđeno je da se termin "izolovano antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi na antitelo koje je suštinski oslobođeno od drugih antitela sa drugačijim specifičnostima za antigene (npr. izolovano antitelo koje specifično vezuje hCD40 je suštinski bez antitela koja specifično vezuju antigene drugačije od hCD40). Izolovano antitelo koje specifično vezuje hCD40 može, međutim,
1
unakrsno reagovati sa drugim antigenima, kao što su molekuli CD40 iz drugih vrsta. Štaviše, izolovano antitelo može biti suštinski oslobođeno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija.
[0056] Termin "himerno antitelo" se odnosi na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca iz jedne vrste i sekvence konstantnih regiona iz druge vrste, kao što su antitela sa mišjim varijabilnim regionima teških i lakih lanaca koji su povezani sa konstantnim regionima čoveka.
[0057] Termin "antitelo sa CDR-graftom" se odnosi na antitela koja sadrže sekvence varijabilnog regiona teškog i lakog lanca iz jedne vrste, ali u kojima su sekvence jednog ili više CDR regiona VH i/ili VL zamenjene sa CDR sekvencama druge vrste, kao što su antitela koja sadrže mišje varijabilne regione teških i lakih lanaca u kojima je jedna ili više mišjih CDR sekvenci (npr. CDR3) zamenjena humanim CDR sekvencama.
[0058] Izrazi "numeracija po Kabatu", "Kabat definicije i "Kabat obeležavanje" se ovde koriste naizmenično. Ovi izrazi, lako prepoznatljivi u oblasti tehnike, odnose se na sistem numeracije aminokiselinskih ostataka koji su varijabilniji (tj. hipervarijabilni) u odnosu na druge aminokiselinske ostatake u varijabilnim regionima teških i lakih lanca antitela ili njihovog dela koji vezuje antigen (Kabat i saradnici (1971) Ann NY Acad, Sci.190:382-391 i, Kabat E.A. i saradnici (1991.) Sequences of Proteins of Immunological Interest, peto izdanje, U.S. Department of Health and Human Services, NIH publikacija br. 91-3242). U varijabilnom regionu teškog lanca, hipervarijabilni region obuhvata opseg aminokiselina od aminokiselinske pozicije 31 do 35 za CDR1, od aminokiselinske pozicije 50 do 65 za CDR2 i od aminokiselinske pozicije 95 do 102 za CDR3. Za varijabilni region lakog lanca, hipervarijabilni region obuhvata opseg aminokiselina od aminokiselinske pozicije 24 do 34 za CDR1, od aminokiselinske pozicije 50 do 56 za CDR2 i od aminokiselinske pozicije 89 do 97 za CDR3.
[0059] Kao što se ovde upotrebljava, termini "akceptor" i "akceptorsko antitelo" se odnose na sekvencu antitela ili nukleinske kiseline koja obezbeđuje ili kodira najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili 100% aminokiselinskih sekvenci jednog ili više uokvirujućih regiona. U pojedinim primerima izvođenja, termin "akceptor" se odnosi na aminokiselinsku ili sekvencu nukleinske kiseline antitela koja obezbeđuje ili kodira konstantni region(e). Termin "akceptor" se takođe može odnositi na aminokiselinsku ili sekvencu nukleinske kiseline antitela koja obezbeđuje ili kodira jedan ili više uokvirujućih regiona i konstantnih regiona. Prema specifičnom aspektu ovog opisa, termin "akceptor" se odnosi na aminokiselinsku ili sekvencu nukleinske kiseline koja obezbeđuje ili kodira najmanje 80%, poželјno najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili 100% aminokiselinskih sekvenci jednog ili više uokvirujućih regiona. U skladu sa ovim aspektom, akceptor može sadržavati najmanje 1, najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4, najmanje 5 ili najmanje 10 aminokiselinskih ostataka koji se (ne) javljaju na jednoj ili na više specifičnih pozicija u humanom antitelu. Akceptorski uokvirujući region i/ili akceptorski konstantni
2
region(i) mogu biti, npr. izvedeni ili dobijeni iz germinativnog gena antitela, preuređenog/zrelog gena antitela, funkcionalnog antitela (npr. iz antitela koja su dobro poznata u stanju tehnike, iz antitela u razvoju ili iz antitela koja su komercijalno dostupna).
[0060] Kao što se ovde upotrebljava, termin "CDR" se odnosi na region koji određuje komplementarnost unutar varijabilnih sekvenci antitela. Postoje tri CDR sekvence u svakom varijabilnom region teškog i lakog lanca, a koje su označene kao CDR1, CDR2 i CDR3 za svaki od varijabilnih regiona. Termin "CDR set", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na grupu od tri CDR sekvence koje se javljaju u jednom varijabilnom region sposobnom da vezuje antigen. Tačne granice ovih CDR sekvenci se definišu različito shodno različitim sistemima numeracije. Sistem koji je opisao Kabat (Kabat i saradnici, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) i (1991)) ne samo da obezbeđuje nedvosmislen sistem numeracije ostataka koji se može primeniti na bilo koji varijabilni region antitela, već obezbeđuje i precizne granice ostataka koji definišu tri CDR sekvence. Ove CDR sekvence mogu biti označene kao Kabatovi CDR-ovi. Chothia i saradnici (Chothia i saradnici, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987) i Chothia i saradnici, Nature 342:877-883 (1989)) su ustanovili da određeni pod-regioni unutar Kabatovih CDR sekvenci usvajaju gotovo identične konformacije peptidne okosnice uprkos velikoj raznovrsnosti na nivou aminokiselinske sekvence. Ovi podregioni su označeni kao L1, L2 i L3 ili HI, H2 i H3, gde "L" i "H" označavaju regione lakih lanaca i teških lanaca, tim redom. Ovi regioni se mogu nazvati Chothia CDR-ovi, a koji su sa granicama koje se preklapaju sa Kabatovim CDR-ovima. Ostale granice koje definišu CDR sekvence i koje se preklapaju sa Kabatovim CDR definicijama, opisali su Padlan (FASEB J.9:133-139 (1995)) i MacCallum (J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)). Ipak, druge definicije granica CDR sekvenci ne moraju striktno slediti jedan od prethodno navedenih sistema, već se mogu preklapati sa Kabatovom definicijom CDR sekvenci, mada iste mogu biti skraćene ili produžene u kontekstu predviđanja ili eksperimentalnih nalaza da određeni ostaci ili grupe ostataka ili čak čitave CDR sekvence ne utiču značajno na vezivanje antigena. Postupci koji se ovde upotrebljavaju mogu koristiti CDR sekvence definisane u skladu sa bilo kojim od ovih sistema, mada poželјni primeri izvođenja upotrebljavaju CDR sekvence definisane po Kabatu ili Chothia-i sistemu.
[0061] Kako se ovde upotrebljava, termin "kanonski" ostatak se odnosi na ostatak u CDR ili uokvirujućem regionu koji definiše određenu kanonsku CDR strukturu, kao što je definisano od strane Chothia i saradnika (J. Mol. Biol.196:901-907 (1987); Chothia i saradnici, J. Mol. Biol.227:799 (1992)). Prema publikaciji Chothia i saradnika, bitni delovi CDR sekvenci mnogih antitela su sa skoro identičnim konformacijama peptidne okosnice uprkos velikoj raznovrsnosti na nivou aminokiselinske sekvence. Svaka kanonska struktura prvenstveno određuje set uglova torzije peptidne okosnice za kontinualan segment aminokiselinskih ostataka koji obrazuju petlјu.
[0062] Kao što se ovde upotrebljava, termini "donor" i "donorsko antitelo" se odnose na antitelo koje obezbeđuje jedan ili više CDR-ova. U kontekstu humanizovanog antitela, termin "donorsko antitelo" se odnosi na antitelo koje nije humano i obezbeđuje jednu ili više CDR sekvenci.
[0063] Kao što se ovde upotrebljava, termin "uokvirujući region" ili "uokvirujuća sekvenca" se odnosi na preostale sekvence varijabilnog regiona umanjene za CDR sekvence. Pošto se tačna definicija CDR sekvence može odrediti različitim sistemima, značenje uokvirujuće sekvence može biti predmet odgovarajuće različitih interpretacija. Šest CDR sekvenci (CDR-L1, CDR-L2 i CDR-L3 lakog lanca i CDR-H1, CDR-H2 i CDR-H3 teškog lanca) takođe deli uokvirujuće regione lakog lanca i teškog lanca na četiri podregiona (FR1, FR2, FR3 i FR4) na svakom lancu, pri čemu je CDR1 pozicioniran između FR1 i FR2, CDR2 između FR2 i FR3, a CDR3 između FR3 i FR4. Bez preciziranja određenih podregiona poput FR1, FR2, FR3 ili FR4, uokvirujući region, kako navode drugi, predstavlja kombinovane FR sekvence unutar varijabiljnog regiona jedinstvenog imunoglobulinskog lanca koji se javlja u prirodi. Kako se ovde upotrebljava, FR predstavlјa jedan od četiri podregiona, a FR u množini predstavlјa dva ili više od četiri podregiona koje čine uokvirujući region.
[0064] Akceptorske sekvence humanih teških lanaca i lakih lanaca su poznate u stanju tehnike. Akceptorske sekvence humanih teških lanaca i lakih lanaca opisa su odabrane od sekvenci opisanih u Tabeli 3 i Tabeli 4.
TABELA 3: Akceptorske sekvence teškog lanca
TABELA 4 Ak r k k n l k l n
[0065] Kao što se ovde upotrebljava, izraz "germinativni gen antitela" ili "genski fragment" se odnosi na imunoglobulinsku sekvencu kodiranu nelimfoidnim ćelijama koje nisu podvrgnute procesu sazrevanja koji dovodi do genetičkog rearanžmana i mutacija u cilju ekspresije određenog imunoglobulina. (Pogledati, npr. Shapiro i saradnici, Crit. Rev. Immunol. 22(3):183-200 (2002); Marchalonis i saradnici, Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). Jedna od prednosti obezbeđena antitelima predmetnog pronalaska proizilazi iz prepoznavanja da su germinativni geni antitela verovatniji od preuređenih/sazrelih gena antitela u očuvanju esencijalnih struktura aminokiselinskih sekvenci karakterističnih za jedinke u vrsti, čime je manje verovatno da budu prepoznate kao one iz stranog izvora kada se upotrebljavaju kao terapija u toj vrsti.
2
[0066] Kako se ovde upotrebljava, termin "klјučni" ostaci se odnosi na određene ostatke unutar varijabilnog regiona koji su sa većim uticajem na specifičnost vezivanja i/ili afinitet antitela, naročito humanizovanog antitela. Klјučni ostatak obuhvata, ali nije ograničen na, jedno ili više sledećeg: ostatak koji je susedan CDR sekvenci, potencijalno mesto glikozilacije (može biti mesto bilo N- ili O-glikozilacije), redak ostatak, ostatak sposoban za interakciju sa antigenom, ostatak sposoban da interaguje sa CDR sekvencom, kanonski ostatak, ostatak koji predstavlja kontakt između varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca, ostatak unutar Vernijerove zone i ostatak u regionu koji se preklapa između CDR1 varijabilnog regiona teškog lanca definisanog po Chothia i Kabatove definicije prvog uokvirujućeg regiona teškog lanca.
[0067] Kao što se ovde upotrebljava, termin "humanizovano antitelo" je antitelo ili njegova varijanta, derivat, analog ili fragment koji se imunospecifično vezuje za antigen od interesa (npr. humani CD40) i koji sadrži uokvirujući region (FR) koji suštinski sadrži aminokiselinsku sekvencu humanog antitela i region koji određuje komplementarnost (CDR) koji suštinski sadrži aminokiselinsku sekvencu antitela koje nije humano. Kako se ovde upotrebljava, termin "suštinski", u kontekstu CDR sekvenci, odnosi se na CDR čija je aminokiselinska sekvenca najmanje 80%, poželјno najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identična aminokiselinskoj sekvenci CDR-a iz antitela koje nije humano. Humanizovano antitelo sadrži uglavnom sve od najmanje jednog, a uobičajeno dva, varijabilna domena (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv) u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju onima iz imunoglobulina različitog od humanog (tj. donorskog antitela), dok su svi ili suštinski svi uokvirujući regioni oni iz humane imunoglobulinske konsenzusne sekvence. Poželljno je da humanizovano antitelo takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), obično onog iz humanog imunoglobulina. Ovde je opisano da humanizovano antitelo sadrži i laki lanac, kao i najmanje varijabilni domen teškog lanca. Antitelo može takođe sadržavati CH1, zglobni region, CH2, CH3 i CH4 regione teškog lanca. Prema pojedinim aspektima opisa, humanizovano antitelo sadrži samo humanizovani laki lanac. Prema pojedinim aspektima opisa, humanizovano antitelo sadrži samo humanizovani teški lanac. Prema specifičnim aspektima, humanizovano antitelo sadrži samo humanizovan varijabilni domen lakog lanca i/ili humanizovan teški lanac.
[0068] Humanizovano antitelo može biti izabrano iz bilo koje klase imunoglobulina, uklјučujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i od bilo kog izotipa, uklјučujući, bez ograničavanja na, IgG 1, IgG2, IgG3 i IgG4. Humanizovano antitelo može sadržavati sekvence iz više od jedne klase ili izotipa, a određeni konstantni domeni mogu biti izabrani tako da optimiziraju želјene efektorske funkcije, upotrebom tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike.
[0069] Uokvirujući i CDR regioni humanizovanog antitela ne moraju precizno odgovarati originalnoj sekvenci, npr. CDR donorskog antitela ili konsenzusni uokvirujući region mogu biti mutirani supstitucijom, insercijom i/ili delecijom najmanje jednog aminokiselinskog ostatka, tako da ostatak na tom mestu u CDR ili uokvirujućem regionu ne odgovara ni donorskom antitelu niti konsenzusnoj sekvenci uokvirujućeg regiona. U poželjnim primerima izvođenja, takve mutacije, međutim, neće biti opsežne. Obično će najmanje 80%, poželјno najmanje 85%, poželјnije najmanje 90% i najpoželјnije najmanje 95% ostataka humanizovanog antitela odgovarati onima iz matičnih FR i CDR sekvenci. Kao što se ovde upotrebljava, termin "konsenzusna sekvenca uokvirujućeg regiona" se odnosi na uokvirujući region u konsenzusnoj sekvenci imunoglobulina. Kao što se ovde upotrebljava, termin "konsenzusna imunoglobulinska sekvenca" se odnosi na sekvencu koja je formirana od aminokiselina (ili nukleotida) koje su najćešće prisutne u familiji srodnih imunoglobulinskih sekvenci (pogledati npr. Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Nemačka, 1987). U familiji imunoglobulina, svaku poziciju u konsenzusnoj sekvenci zauzima aminokiselina koja se najčešće javlja na toj poziciji u familiji. Ukoliko se dve aminokiseline javlјuju podjednako često, bilo koja može biti uključena u konsenzusnu sekvencu.
[0070] Kako se ovde upotrebljava, "Vernijerova" zona se odnosi na podskup ostataka uokvirujuće sekvence koji učestvuju u podešavanju strukture CDR regiona i preciznom prilagođavanju antigenu, kao što je to opisano u publikaciji Foote i Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499). Ostaci iz Vernijerove zone obrazuju region koji je u osnovi CDR sekvenci i koji može uticati na strukturu CDR sekvenci i time na afinitet antitela.
[0071] Termin "multivalentan vezujući protein" se upotrebljava u ovoj specifikaciji da označi vezujući protein koji sadrži dva ili više mesta vezanja antigena. Multivalentan vezujući protein poželјno se konstruiše tako da sadrži tri ili više mesta vezanja antigena i uglavnom ne predstavlja antitelo koje se javlja u prirodi. Termin "multispecifičan vezujući protein" se odnosi na vezujući protein sposoban da vezuje dva ili više srodnih ili nesrodnih ciljnih molekula.
[0072] Termini "dvostruko varijabilni domen" ili "DVD" ili "DVD-Ig", koji se ovde koriste naizmenično, podrazumevaju proteine koji vezuju antigen i koji sadrže dva ili više mesta vezanja antigena, odnosno tetravalentni ili multivalentni su vezujući proteini. Takvi DVD-ovi mogu biti monospecifični, tj. sposobni da vezuje jedan antigen ili multispecifični, tj. sposobni da vezuje dva ili više antigena. DVD vezujući proteini koji sadrže dva teška lanca DVD polipeptida i dva laka lanca DVD polipeptida se označavaju kao DVD Ig. Svaka polovina DVD Ig-a sadrži teški lanac DVD polipeptida i laki lanac DVD polipeptida, kao i dva mesta vezanja antigena. Svako vezujuće mesto sadrži varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca sa ukupno 6 CDR sekvenci uklјučenih u vezivanje antigena po mestu vezivanja antigena. Prema jednom aspektu, CDR sekvence koje su ovde opisane (npr. SEQ ID NO: 6, 42 i 8 (teški lanac) i 21, 11 i 12 (laki lanac)), upotrebljavaju se u anti-CD40 DVD-u. Primeri DVD-Ig struktura su poznati u stanju tehnike i opisani su, npr. u US Patent No.7,612,181.
2
[0073] Kao što se ovde upotrebljava, termin "neutrališući" se odnosi na neutralizaciju biološke aktivnosti citokinskih receptora kada se antitelo ili njegov vezujući deo specifično veže za citokinski receptor. Poželјno je da neutrališuće antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, predstavlja neutrališuće antitelo čije vezivanje za hCD40 rezultuje u inhibiciji biološke aktivnosti hCD40. Poželјno je i da neutrališuće antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, vezuje hCD40 i smanjuju biološku aktivnost hCD40 za najmanje oko 20%, 40%, 60%, 80%, 85% ili više. Inhibicija biološke aktivnosti hCD40 sa neutrališućim antitelom ili njegovim delom koji vezuje anigen može biti ispitana merenjem jednog ili više pokazatelјa biološke aktivnosti hCD40 koji je dobro poznat u stanju tehnike.
[0074] Termin "aktivnost" obuhvata aktivnosti kao što su specifičnost vezivanja/afinitet antitela za antigen, npr. anti-hCD40 antitela koje se vezuje za hCD40 antigen, i/ili potencijal neutralizacije antitela, na primer, anti-hCD40 antitela čije vezivanje za hCD40 inhibira biološku aktivnost hCD40, npr. vezivanjem CD40L; uklјučenost u razvoj B-ćelija; uklјučenost u aktivaciju limfocita; učešće u funkciji ćelija koje prezentuju antigen; regulisanje aktivnosti dendritičnih ćelija, makrofaga i B-ćelija; indukovanje proizvodnje inflamatornih citokina u makrofagima i dendritičnim ćelijama; pozitivno regulisanje prezentacije antigena; pozitivno regulisanje stimulacije T-ćelija; i pospešivanje izmene klase imunoglobulina u B-ćelijama.
[0075] Primeri analiza za procenu aktivnosti anti-CD40 antitela predmetnog pronalaska uklјučuju in vitro i in vivo analize, kao što je ovde navedeno. Preciznije, analize mogu biti upotrebljene za utvrđivanje da li je anti-CD40 antitelo agonističko ili antagonističko antitelo.
[0076] Na primer, vezivanje humanog CD40 i inhibicija CD40-CD40L interakcije mogu biti ispitani upotrebom humane ćelijske linije koja eksprimira CD40 i potom FACS analizama. Antagonističke i agonističke aktivnosti mogu biti utvrđene upotrebom reporterskih ćelijskih linija koje eksprimiraju CD40, i to humani CD40, na osnovu sekrecije alkalne fosfataze (AP) koja je posredovana sa NFkB. Kada se signal primi preko CD40, aktivacija NFkB dovodi do sekrecije AP čija se količina meri kolorimetrijskim supstratom. Agonistička analiza za primer podrazumeva CD40 reportersku liniju koja može biti kultivisana bilo sa Jurkat ćelijskom linijom koja eksprimira CD40L (da bi se obezbedila interakcija sa fiziološkim ligandom) ili sa solubilnim CD40L čime može biti ispitana sposobnost anti-CD40 antitela da blokira NFkB signal. Antagonistička analiza za primer podrazumeva reportersku ćelijsku liniju sa humanim CD40 koja može biti tretirana sa anti-CD40 antitelima, nakon čega se meri NFkB signal kao što je to prethodno opisano.
[0077] Alternativno, može biti upotrebljen B-ćelijski agonistički test u kome se B-ćelije aktiviraju sa niskom dozom anti-IgM i IL4, pre doprimene antagonističkog anti-CD40 antitela. Pojačana aktivacija B-ćelija može biti izmerena u vidu pozitivne regulacije CD86, što zauzvrat ukazuje na agonističku aktivnost. Slično navedenom, može biti upotrebljen B-ćelijski antagonistički test u kome se primarne
2
humane B-ćelije uzgajaju sa humanom T-ćelijskom linijom koja eksprimira CD40L, što dovodi do aktivacije B-ćelija i pozitivne regulacije ekspresije CD86 putem CD40/CD40L interakcije. Inhibicija pozitivne regulacije CD86 u primarnim humanim B-ćelijama ukazuje na antagonističku aktivnost.
[0078] Termin "epitop" obuhvata bilo koju peptidnu determinatnu sposobnu da specifično vezuje antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen. U određenim primerima izvođenja, determinante epitopa uklјučuju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci sa šećerima, fosforil ili sulfonil grupe, dok u određenim primerima izvođenja, iste mogu biti sa specifičnim trodimenzionalnim strukturnim karakteristikama i/ili specifičnim karakteristikama naelektrisanja. U raznim primerima izvođenja, epitop može biti linearan ili sekvencijalni epitop, tj. linearna sekvenca aminokiselina, u primarnoj strukturi antigena, tj. CD40. Alternativno, u drugim primerima izvođenja, epitop može biti konformacioni epitop sa specifičnim trodimenzionalnim oblikom koji nastaje kada antigen poprimi svoju sekundarnu strukturu. Na primer, konformacioni epitop može sadržavati nelinearne, tj. nesekvencijalne aminokiseline antigena.
[0079] U posebnom primeru izvođenja, epitop je region antigena koga vezuje antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen. U određenim primerima izvođenja, navodi se da antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen specifično vezuje antigen kada isti preferencijalno prepoznaje svoj cilјni antigen u složenoj smeši proteina i/ili makromolekula.
[0080] Predviđeno je da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata antitela koja sadrže varijabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Humana antitela pronalaska mogu uključivati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani humanim germinativnim imunoglobulinskim sekvencama (npr. usled mutacija uvedenih slučajnom ili mutagenezom usmerenom na mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer, u CDR sekvencama, a posebno u CDR3. Ipak, ne podrazumeva se da termin "humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata antitela u kojima su CDR sekvence izvedene iz germinativnih sekvenci drugih sisarskih vrsta, poput mišjih, koje su ugrađene u vidu grafta u humane uokvirujuće sekvence.
[0081] Predviđeno je da se termin "rekombinantno humano antitelo", kako se ovde upotrebljava, obuhvata sva humana antitela koja su pripremlјena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim tehnikama, kao što su antitela eksprimirana upotrebom rekombinantnog ekspresionog vektora koji je transfekcijom uveden u ćeliju domaćina (dodatno opisano ispod, u Odelјku II C), antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanih antitela (Hoogenboom H.R. (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H. i Highsmith W.E. (2002) Clin. Biochem.
35:425-445; Gavilondo J.V. i Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H. i Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koji je transgen za humane imunoglobulinske gene (pogledati npr. Taylor L. D. i saradnici (1992) Nucl. Acids
2
Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A. i Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. i saradnici (2000) Immunology Today 21:364-370) ili antitela pripremlјena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uklјučuje udruživanje humanih imunoglobulinskih genskih sekvenci sa drugim DNK sekvencama. Takva rekombinantna humana antitela sadrže varabilne i konstantne regione izvedene iz humanih germinativnih imunoglobulinskih sekvenci. Prema određenim aspektima, međutim, takva rekombinantna humana antitela se podvrgavaju in vitro mutagenezi (ili, kada se upotrebljava transgena životinja za humane Ig sekvence, in vivo somatskoj mutagenezi), čime aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela predstavljaju sekvence koje, iako su izvedene i srodne sa humanim germinativnim VH i VL sekvencama, ne mogu prirodno postojati unutar germinativnog repertoara humanih antitela in vivo. Jedan aspekt obezbeđuje potpuno humana antitela sposobna da vezuju humani CD40, koja mogu biti generisana upotrebom tehnika koje su dobro poznate u stanju tehnike, kao što su, bez ograničavanja na, upotreba fagnih biblioteka za humani Ig poput onih koje su opisane u Jermutus i saradnici, PCT publikacija br. WO 2005/007699 A2.
[0082] Termin "površinska plazmonska rezonanca", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analizu biospecifičnih interakcija u realnom vremenu, detektovanjem promena u koncentraciji proteina unutar biosenzornog matriksa, na primer, upotrebom BIAcore sistema (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Švedska i Piscataway, NJ). Za dodatne opise, pogledati Jönsson U. i saradnici (1993) Ann Biol. Clin. 51:19-26; Jönsson U. i saradnici (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson B. i saradnici (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; i Johnnson, B. i saradnici (1991) Anal. Biochem.198:268-277.
[0083] Predviđeno je da se termin "kon", kako se ovde upotrebljava, odnosi na konstantu brzine asocijacije (engl. on rate constant) antitela sa antigenom da bi se obrazovao kompleks antitela i antigena, kao što je poznato u stanju tehnike.
[0084] Predviđeno je da se termin "koff", kako se ovde upotrebljava, odnosi na konstantu brzine disocijacije (engl. off rate constant) antitela iz kompleksa antitela i antigena, kao što je poznato u stanju tehnike.
[0085] Predviđeno je da se termin "KD", kako se ovde upotrebljava, odnosi na konstantu disocijacije određene interakcije antigena i antitela, kao što je poznato u stanju tehnike.
[0086] Termin "obeleženo antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na antitelo sa ugrađenim molekulom za obeležavanje koji obezbeđuje identifikaciju antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen. Poželјno je da obeleživač bude marker koji se može detektovati, npr. može se podrazumevati ugrađivanje radioaktivno obeležene aminokiseline ili vezivanje za polipeptid sa ostatkom biotina koji može biti detektovan obeležavanjem sa avidinom (npr. to može biti
2
streptavidin povezan sa fluorescentnim markerom ili koga karakteriše enzimska aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim postupcima). Primeri obeleživača za polipeptide obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.<3>H,<14>C,<35>S,<90>Y,<99>Tc,
<111>In,<125>J,<131>J,<177>Lu,<166>Ho ili<153>Sm); fluorescentne obeleživače (npr. FITC, rodamin, lantanidne fosfore), enzimske obeleživače (npr. peroksidazu rena, luciferazu, alkalnu fosfatazu); hemiluminiscentne markere; biotinil grupe; predeterminisane polipeptidne epitope koje prepoznaju sekundarni reporteri (npr. parne sekvence leucinskih zipera, vezujuća mesta za sekundarna antitela, domeni koji vezuju metale, epitopske oznake/tagovi); i magnetne agense, kao što su helati gadolinijuma.
[0087] Termini "kristal" i "kristalizovan" kako se ovde upotrebljavaju, odnose se na antitelo, ili na njegov deo koji vezuje antigen, koji postoje u obliku kristala. Kristali su jedan oblik čvrstog stanja materije, koji je jasno različit od drugih oblika kao što su amorfno čvrsto stanje ili tečno kristalno stanje. Kristali se sastoje od pravilnih, ponavlјajućih, trodimenzionalno postavljenih grupa atoma, jona, molekula (npr. proteina kao što su antitela) ili molekulskih sklopova (npr. čine ih kompleksi antigena i antitela). Ovakve trodimenzionalne strukture se raspoređuju shodno specifičnim matematičkim odnosima koji su dobro poznati u polju. Osnovna jedinica, ili gradivni blok, koji se ponavlja u kristalu, naziva se asimetrična jedinica. Ponavlјanje asimetrične jedinice po rasporedu koji odgovara datoj, dobro definisanoj kristalografskoj simetriji obezbeđuje "jediničnu ćeliju" kristala. Ponavlјanje jedinične ćelije, pravilno u sve tri dimenzije, obezbeđuje kristal. Pogledati Giege R. i Ducruix A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, drugo izdanje, str. 201-16, Oxford University Press, Nju Jork, Nju Jork, (1999)."
[0088] Termin "polinukleotid", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na polimerni oblik dva ili više nukleotida, bilo ribonukleotida ili dezoksinukleotida, ili na modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Termin obuhvata jednolančane i dvolančane oblike DNK, ali poželјno podrazumeva dvolančanu DNK.
[0089] Termin "izolovan polinukleotid", kako se ovde upotrebljava, treba da označava polinukleotid (npr. genomski, cDNK ili polinukleotid sintetskog porekla, ali i pojedine njihove kombinacije) koji, shodno upravo svom poreklu: nije udružen sa svim ili delom polinukleotida sa kojim se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi; operativno je povezan sa polinukleotidom sa kojim u prirodi nije povezan; ili se ne javlja u prirodi kao deo veće sekvence.
[0090] Predviđeno je da se termin "vektor", kako se ovde upotrebljava, odnosi na molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. Jedna vrsta vektora je "plazmid", koji podrazumeva kružni dvolančani molekul DNK u koju se ligacijom mogu ugraditi dodatni DNK segmenti. Drugi tip vektora je virusni vektor, u koga se dodatni
2
DNK segmenti ugrađuju ligacijom sa virusnim genomom. Određeni vektori su sposobni za autonomnu replikaciju u ćeliji domaćinu u koju se uvode (npr. bakterijski vektori sa početkom replikacije koji je iz bakterija i epizomalni sisarski vektori). Ostali vektori (npr. ne-epizomalni sisarski vektori) mogu biti ugrađeni u genom ćelije domaćina nakon uvođenja u ćeliju domaćina i tako se replicirati zajedno sa genomom domaćina. Štaviše, određeni vektori su u stanju da usmeravaju ekspresiju gena sa kojima su operativno povezani. Takvi vektori se ovde označavaju kao "rekombinantni ekspresioni vektori" (ili jednostavno, "ekspresioni vektori"). U principu, ekspresioni vektori od koristi u tehnikama rekombinantne DNK su često u obliku plazmida. U predmetnoj specifikaciji, "plazmid" i "vektor" mogu biti korišćeni naizmenično, pošto je plazmid najčešće upotrebljavan oblik vektora. Ipak, namera predmetnog pronalaska je da obuhvati i druge oblike ekspresionih vektora, kao što su virusni vektori (npr. retrovirusni vektori sa defektnom replikacijom, adenovirusni i vektori adeno-asociranih virusa) koji mogu poslužiti na ekvivelatan način.
[0091] Termin "operativno povezan" se odnosi na pojam susednih pozicija, pri čemu su opisane komponente u odnosu koji im dozvoljava da funkcionišu na predviđeni način. Kontrolišuća sekvenca "operativno povezana" sa kodirajućom sekvencom, ligacijom je povezana na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima koji su kompatibilni sa sekvencom koja kontroliše. "Operativno povezane" sekvence obuhvataju i sekvence kontrole ekspresije koje su u kontinuitetu sa genom od interesa i sekvence kontrole ekspresije koje deluju na trans način ili koje kontrolišu gen od interesa sa određene udaljenosti. Termin “sekvenca kontrole ekspresije", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na polinukleotidne sekvence koje su neophodne da bi se ostvario efekat na ekpresiju i obradu kodirajućih sekvenci sa kojima su one povezane ligacijom. Sekvence kontrole ekspresije obuhvataju odgovarajuće sekvence inicijacije i terminacije transkripcije, kao i promotorske i sekvence pojačivača; efikasne signale za procesovanje RNK poput signala obrade i za poliadenaliciju; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku iRNK; sekvence koje pojačavaju efikasnost translacije (tj. Kozak konsenzusnu sekvecu); sekvence koje poboljšavaju stabilnost proteina; i kada je to poželjno, sekvence koje pojačavaju sekreciju proteina. Priroda takvih kontrolišućih sekvenci se razlikuje u zavisnosti od organizma domaćina; kod prokariota, takve kontrolišuće sekvence uglavnom podrazumevaju promotor, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu terminacije transkripcije; kod eukariota, takve sekvence podrazumevaju promotore i sekvencu terminacije transkripcije. Predviđeno je zapravo da termin "kontrolišuće sekvence" obuhvata komponente čije je prisustvo suštinski neophodno za ekspresiju i obradu, ali i da može uključivati i dodatne komponente čije prisustvo predstavlja prednost, na primer, liderske sekvence i fuzione partnerske sekvence. Proteinski konstrukti predmetnog pronalaska mogu biti eksprimirani i prećišćeni upotrebom ekspresionih vektora i ćelija domačina koji su poznati u stanju tehnike, uključujući ekspresione kasete, vektore, rekombinantne ćelije domaćine i postupke za rekombinantnu ekspresiju i proteolitičku obradu rekombinantnih poliproteina i pre-proteina iz jednog otvorenog okvira čitanja (npr. WO 2007/014162).
[0092] "Transformacija", kako je ovde definisana, odnosi se na bilo koji proces kojim egzogena DNK ulazi u ćeliju domaćina. Transformacija se može odvijati pod prirodnim ili veštačkim uslovima, upotrebom raznih postupaka koji su dobro poznati u stanju tehnike. Transformacija se može oslanjati na bilo koji poznati postupak za inserciju strane sekvence nukleinske kiseline u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina. Postupak se bira na osnovu tipa ćelije domaćina koji se transformiše i može obuhvatati, ali nije ograničen na, virusnu infekciju, elektroporaciju, lipofekciju i bombardovanje česticama. Tako "transformisane" ćelije obuhvataju stabilno transformisane ćelije u kojima je insertovana DNK sposobna da se replikuje bilo kao autonomno replikujući plazmid ili kao deo hromozoma domaćina. One takođe obuhvataju ćelije koje tranzientno eksprimiraju insertovanu DNK ili RNK tokom ograničenog vremenskog perioda.
[0093] Predviđeno je da se termin "rekombinantna ćelija domaćina" (ili jednostavno "ćelija domaćin"), kako se ovde upotrebljava, odnosi na ćeliju u koju je uvedena egzogena DNK. Potrebno je napomenuti da je predviđeno da se ovakvi termini odnose ne samo na određenu predmetnu ćeliju, već i na potomstvo takve ćelije. Kako se u narednim generacijama mogu dogoditi određene modifikacije, ili usled mutacija ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne mora, u stvari, biti identično matičnoj ćeliji, ali je još uvek obuhvaćeno terminom "ćelija domaćin" kao što se ovde upotrebljava. Poželјne ćelije domaćini uklјučuju prokariotske i eukariotske ćelije izabrane iz bilo kog od carstava živih orgnaizama. Poželjne eukariotske ćelije uključuju ćelije protista, gljivica, bilјne i životinjske ćelije. Najpoželјnije ćelije domaćini obuhvataju, ali nisu ograničene na, prokariotsku ćelijsku liniju E.Coli; sisarske ćelijske linije CHO, HEK 293 i COS; ćelijsku liniju iz insekata Sf9; i ćeliju glјivice Saccharomices cerevisiae.
[0094] Za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, kao i kulturu tkiva i transformaciju (npr. elektroporacijom, lipofekcijom), mogu biti upotrebljene standardne tehnike. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja se mogu sprovoditi prema specifikacijama proizvođača ili kao što se obično izvodi u stanju tehnike ili kao što je ovde opisano. Prethodno navedene tehnike i procedure mogu generalno biti urađene u skladu sa konvencionalnim postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike i kao što je opisano u raznim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane u okviru predmetne specifikacije. Pogledati npr. Sambrook i saradnici, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1989)).
[0095] "Transgeni organizam", kao što je poznato u stanju tehnike i kao što se ovde upotrebljava, odnosi se na organizam koji ima ćelije koje sadrže transgen, pri čemu transgen koji je uveden u
1
organizam (ili u pretka organizma) eksprimira polipeptid koji se prirodno ne eksprimira u organizmu. "Transgen" je konstrukt DNK koji je stabilno i operativno integrisan u genom ćelije iz koje se razvija transgeni organizam, čime se usmerava ekspresija kodiranog genskog proizvoda tako da je bude prisutna u jednoj ili u više ćelijskih tipova ili tkiva transgenog organizma.
[0096] Termin "regulisati" i "modulisati" se upotreblјavaju naizmenično i, kao što se ovde upotrebljava, odnose se na promenu ili izmenu u aktivnosti molekula od interesa (npr. biološku aktivnost hCD40). Modulacija može biti povećanje ili smanjenje reda veličine određene aktivnosti ili funkcije molekula od interesa. Aktivnosti i funkcije molekula za primer obuhvataju, ali nisu ograničeni na, karakteristike vezivanja, enzimsku aktivnost, aktivaciju ćelijskih receptora i transdukciju signala.
[0097] U skladu sa navedenim, termin "modulator", kako se ovde upotrebljava, predstavlja jedinjenje koje je sposobno da promeni ili izmeni aktivnost ili funkciju molekula od interesa (npr. biološku aktivnost hCD40). Na primer, modulator može prouzrokovati povećanje ili smanjenje reda veličine određene aktivnosti ili funkcije molekula u poređenju sa redom veličine aktivnosti ili funkcije koja se zapaža u odsustvu modulatora. Prema određenim aspektima, modulator je inhibitor, koji smanjuje red veličine najmanje jedne aktivnosti ili funkcije molekula. Primeri inhibitora obuhvataju, ali nisu ograničeni na, proteine, peptide, antitela, peptidna antiela, uglјene hidrate ili male organske molekule. Peptidna antitela su opisana, npr. u WO01/83525.
[0098] Kao što se ovde upotrebljava, termin "efektivna količina" se odnosi na količinu terapije koja je dovolјna da se smanji ili ublaži ozbiljnost i/ili period trajanje poremećaja ili jednog ili više od njegovih simptoma, spreči napredovanje poremećaja, izazove regresija poremećaja, spreči pojava recidiva, razvoja, početka ili napredovanja jednog ili više simptoma udruženih sa poremećajem, kao i da se detektuje poremećaj ili pojača ili poboljša profilaktički ili terapijski efekat/efekti druge terapije (npr. profilaktičkog ili terapijskog agensa).
[0099] Kao što se ovde upotrebljava, izraz "subjekat koji ne reaguje" se upotrebljava za označavanje subjekta koji boluje od IBD (npr. Kronove bolesti ili ulceroznog kolitisa) i kod koga ne dolazi, ili je pobolјšanje u njegovom kliničkom statusu oboljenja nakon lečenja sa inhibitorom TNFα ograničeno ili neadekvatno (npr. nema smanjenja u CDAI skoru, smanjenje upotrebe kortikosteroida odsustvuje). U jednom primeru izvođenja, subjekat koji ne reaguje na TNF je subjekat koji boluje od IBD i koji ne uspeva da postigne smanjenje od 100 bodova ili više u skoru indeksa aktivnosti Kronove bolesti (CDAI) nakon tretmana sa inhibitorom TNFα. U jednom primeru izvođenja, subjekat koji ne reaguje predstavlja subjekta kod koga se ne može postići smanjenje od 100 bodova ili više u njegovom skoru indeksa aktivnosti Kronove bolesti (CDAI) u određenom vremenskom okviru nakon tretmana sa inhibitorom TNFα.
2
I. Antitela koja vezuju humani CD40 (hCD40)
[0100] Predmetni pronalazak obezbeđuje antagonistička humanizovana antitela koja vezuju CD40, uklјučujući humani CD40 (hCD40). Ovde su takođe prijavljena mišja monoklonska antitela, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, koji se vezuju za CD40, kao i himerna antitela koja sadrže varijabilne regione mišjih anti-CD40 antitela koja su ovde opisana. Poželjno je da su antitela pronalaska antagonistička anti-CD40 (npr. antitela na humani CD40) antitela koja ne karakteriše značajna agonistička aktivnost.
1. Humanizovana anti-hCD40 antagonistička antitela izvedena iz antitela 1 (At1)
[0101] Pronalazak se, barem delimično, zasniva na identifikaciji humanizovanih anti-CD40 antitela koja su sa antagonističkim karakteristikama i koja, u određenim primerima izvođenja, ne ispoljavaju značajnu agonističku aktivnost.
[0102] Kao što je opisano u Primeru 1, identifikovana su tri antagonistička anti-hCD40 mišja antitela, tj. At1 (VL sekvenca opisana u SEQ ID NO: 9 i VH sekvenca opisana u SEQ ID NO: 5), At2 (VL sekvenca opisana u SEQ ID NO: 76 i VH sekvenca opisana u SEQ ID NO: 75) i At3 (VL sekvenca opisana u SEQ ID NO: 48 i VH sekvenca opisana u SEQ ID NO: 44).
[0103] Konsenzusne CDR sekvence su utvrđene na osnovu poravnanja CDR aminokiselinskih sekvenci mišjih antagonističkih antitela At1, At2 i At3. Konsenzusne aminokiselinske sekvence za VH CDR1, CDR2 i CDR3 regione su opisane u SEQ ID NO 78, 79 i 80, tim regom, dok su konsenzusne aminokiselinske sekvence za VL CDR1, CDR2 i CDR3 aminokiselinske sekvence opisane u SEQ ID NO 108, 109 i 110, tim redom. Sve sekvence su takođe opisane ispod, u Tabeli 5 i na Slici 4.
Tabela 5. Poravnanja aminokiselinskih sekvenci CDR domena anti-CD40 iz hibridoma
[0104] Konsenzusna aminokiselinska sekvenca CDR1 domena teškog lanca je navedena kao SEQ ID NO:78 (G(F/Y)TF(S/T)(D/S)Y(G/T)M(N/H)). Konsenzusna aminokiselinska sekvenca CDR2 domena varijabilnog regiona teškog lanca je navedena kao SEQ ID NO:79 (YI(S/N)(S/P)(G/S)(R/S) (D/S/G)(N/Y)(I/P) (Y/N)Y(A/N)(D/Q)(T/K) (V/F)K(G/D)). Konsenzusna aminokiselinska sekvenca CDR3 domena varijabilnog regiona teškog lanca je navedena kao SEQ ID NO: 80 ((S/W)(W/G)(G/Y)(Y/S)FDV).
[0105] Konsenzusna aminokiselinska sekvenca CDR1 domena varijabilnog regiona lakog lanca je navedena kao SEQ ID NO:108 ((K/R)SS(Q/K)SLL(N/H)S(G/-)N(Q/G) (K/N)(N/T)YL(T/Y)). Konsenzusna aminokiselinska sekvenca CDR2 domena varijabilnog regiona lakog lanca je navedena kao SEQ ID NO:109 ((W/R)(A/M) ST (R/L) (E/A)S). Konsenzusna aminokiselinska sekvenca CDR3 domena varijabilnog regiona lakog lanca je navedena kao SEQ ID NO:110 ((Q/M)(N/Q) (D/H)(Q/L)(T/E)YPLT).
[0106] Prema jednom aspektu, opis obezbeđuje anti-CD40 antagonističko antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koga čine varijabilni laki lanac koji sadrži CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 108, CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 109, CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 110, kao i varijabilni region teškog lanca koga čine CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 78, CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 79, CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 80.
[0107] Nakon identifikacije mišjih antitela At1, At2 i At3, antitela At1 i At3 su izabrana za humanizaciju (opisanu u daljem tekstu, u Primeru 2). Tabele 11 i 12 obezbeđuju aminokiselinske sekvence za CDR, VH i VL regione humanizovanih At1 i At3, tim redom. Preciznije, stvoreno je devet različitih humanizovanih antitela na osnovu At3 (pogledati Primer 2 i Tabelu 12 ispod). Kreirana su i četiri različita humanizovana antitela zasnovana na At1, uklјučujući sledeća:
A) huAt1VH.1 / VL.1 (VH aminokiselinska sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 13 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence navedene kao SEQ ID NO: 6, 7 i 8, tim redom; i VL amino kiselinska sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 14 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence navedene kao SEQ ID NO: 10, 11 i 12, tim redom);
B) huAt1VH.1A/VL.1 (VH aminokiselinska sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 15 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence navedene kao SEQ ID NO: 6, 7 i 8, tim redom; i VL amino kiselinska sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 14 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence navedene kao SEQ ID NO: 10, 11 i 12, tim redom);
C) huAt1VH.1/VL.1A (VH aminokiselinska sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 13 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence navedene kao SEQ ID NO: 6, 7 i 8, tim redom; i VL amino kiselinska
4
sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 16 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence navedene kao SEQ ID NO: 10, 11 i 12, tim redom); i
D) huAt1VH.1A / VL.1A (VH aminokiselinska sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 15 i VH CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence navedene kao SEQ ID NO: 6, 7 i 8, tim redom; VL aminokiselina sekvenca navedena kao SEQ ID NO: 16 i VL CDR1, CDR2 i CDR3 sekvence navedene kao SEQ ID NO: 10, 11 i 12, tim redom).
[0108] Humanizovane verzije At1 su dodatno modifikovane da bi se uklonilo potencijalno mesto deamidacije u CDR1 lakog lanca. Analizirano je šest varijanti huAt1 antitela, pri čemu su četiri antitela identifikovana kao antagonisti CD40. Šest antitela je ovde označeno kao At1v1, Atlv2, Atlv3, Atlv4, Atlv5 i Atlv6 (CDR i varijabilne sekvence su obezbeđene ispod, u Tabeli 13). Od šest humanizovanih varijanti At1, huAt1v1 je izabran kao onaj koga karakteriše posebno superiorna antagonistička aktivnost. Varijabilna sekvenca teškog lanca huAt1v1 je obezbeđena u SEQ ID NO: 15 sa CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencama opisanim u SEQ ID NO: 6, 7 i 8, tim redom. Varijabilna sekvenca lakog lanca huAt1v1 je obezbeđena u SEQ ID NO: 20 sa CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencama opisanim u SEQ ID NO: 21, 11 i 12, tim redom.
[0109] CDR2 teškog lanca antitela huAtlv1 je dodatno podvrgnut mutagenezi što je rezultovalo u sedamnaest varijanti (opisano ispod, u Primeru 4). Ove CDR2 varijante teškog lanca huAt1v1 su ovde označene kao huAt1v1CDR2v1 - huAt1v1CDR2v17. Sekvence teških lanaca huAt1v1CDR2v1 -huAt1v1CDR2v17 su obezbeđene u Tabeli 16, pri čemu je VH huAt1v1CDR2v7 izabran kao klon koji ispoljava posebno superiornu antagonističku aktivnost prema CD40, a ostajući relativno oslobođen agonističke aktivnosti. Varijabilna sekvenca teškog lanca huAt1v1CDR2v7 je obezbeđena u SEQ ID NO: 28 sa CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencama opisanim u SEQ ID NO: 6, 42 i 8, tim redom.
[0110] Nakon odabira huAt1v1CDR2v7 VH (VH SEQ ID NO: 28 sa CDR1, CDR2 i CDR3 sekvencama opisanim u SEQ ID NO: 6, 42 i 8, tim redom) i huAt1v1 VL (VL SEQ ID NO: 20 sa sekvencama CDR1, CDR2 i CDR3 opisanim u SEQ ID NO: 21, 11 i 12, tim redom), varijabilni regioni su klonirani u dva različita IgG molekula što je rezultovalo u dva anti-CD40 antagonistička antitela, tj. At101 i At102. Tabela 6 (i Tabela 19) obezbeđuje sekvence teškog lanca i lakog lanca pune dužine za posebne aspekte opisa koji se odnose na ova IgG antitela. U Tabeli 6, konstantni regioni su podvučeni, dok su CDR domeni naglašeni podebljanim slovima.
l il
t
ji it1 i 1t1litt
ti-
i
: l
[0111] U skladu sa navedenim, predmetni pronalazak je usmeren na antagonističko anti-CD40 antitelo koje sadrži laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:40 i teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:NO:41 (At102). Takođe je prijavljeno antagonističko anti-CD40 antitelo koje sadrži laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 40 i teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: NO: 39 (At101).
[0112] Stoga, pronalazak obuhvata mišja, himerna i humanizovana anti-CD40 antitela sa agonističkom aktivnošću. Prema određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, uklјučujući varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12 i/ili varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8. Preciznije, antagonističko anti-CD40 antitelo predmetnog pronalaska sadrži CDR1 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:6, CDR2 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:42, CDR3 teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:8, CDR1 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom kao navedno u SEQ ID NO:21, CDR2 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:11 i CDR3 lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:12. Određenije, antagonističko anti-CD40 antitelo pronalaska sadrži varijabilni domen teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navednom u SEQ ID NO: 28 i varijabilni domen lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navednom u SEQ ID NO: 20 Još određenije, antagonističko anti-CD40 antitelo pronalaska sadrži teški lanac sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 41; i laki lanac koga čini aminokiselinska sekvenca navedena u SEQ ID NO: 40. Ovde su takođe prijavljena antagonistička anti-CD40 antitela, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, koja uklјučuju težak lanac sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 39; i laki lanac sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 40.
[0113] U opis su uklјučena i antitela sa aminokiselinskim sekvencama (varijabilnog regiona ili CDR) opisanim u Tabelama 5, 6, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18 i 19. U skladu sa time, prema jednom aspektu, predmetni opis je usmeren na antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koji se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 10, 17, 19 ili 21; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 11; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12. Alternativno, ili u kombinaciji, antagonističko anti-CD40 antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen sadrže varijabilni region teškog lanca koja sadrži (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 7 ili 42; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8.
[0114] Prema posebnom aspektu opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region lakog lanca koga čine (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 10; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 11; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 7; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8.
[0115] Prema drugom aspektu opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region lakog lanca koga čine (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 19; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 11; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 7; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8.
[0116] Prema sledećem aspektu ovog opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region lakog lanca koga čine (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 17; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 11; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 7; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8.
[0117] Prema sledećem aspektu opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region lakog lanca koga čine (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 21; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 11; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 7; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8.
[0118] Prema narednom aspektu opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region lakog lanca koga čine (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 21; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 11; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 42; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8.
[0119] Prema sledećem aspektu ovog opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region lakog lanca koga čine (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 108; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 109; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 110; i varijabilni region teškog lanca koji sadrži (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 78; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 79; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 80.
[0120] Prema još jednom aspektu ovog opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, čine varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 5, 13, 15 ili 22-38 ; i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 9, 14, 16, 18, 20 ili 43.
[0121] Prema posebnom aspektu ovog opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 5 i varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 9.
[0122] Prema sledećem aspektu ovog opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 13 i varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 14, 16 ili 18.
[0123] Prema sledećem aspektu opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 15 i varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 14, 16, 18, 20 ili 43.
[0124] Prema sledećem aspektu ovog opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 28 i varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 20.
[0125] Antitela koja su ovde opisana, a posebno antitelo At102, karakteriše antagonistička aktivnost bez značajne agonističke aktivnosti za CD40. Stoga, u pronalazak su uključena antitela koja se vezuju za epitop koga prepoznaju antitela At102 i At101. Prema posebnom aspektu, pronalazak obuhvata izolovano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, pri čemu navedeno antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, vezuju humani CD40 tako da je CD40 sa navedenim antitelom, ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen, kada je vezan za epitop definisan topografskim regionima Cys62-Phe67, Gln79-Cys83, Arg90-Thr99 i Thr24-Cys37 iz SEQ ID NO:1, inhibiran u vezivanju za CD40 ligand (CD40L). Prema drugom aspektu, pronalazak se odnosi na antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji je sposoban da vezuje humani CD40 koji se vezuje za epitop u humanom CD40 koji sadrži tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, petnaest, šesnaest, sedamnaest, osamnaest, devetnaest, dvadeset, dvadeset i jedan, dvadeset i dva, dvadeset i tri, dvadeset i četiri, dvadeset i pet, dvadeset i šest, dvadeset i sedam, dvadeset i osam, dvadeset i devet, trideset, trideset i jedan, trideset i dva, trideset i tri, trideset i četiri ili sve aminokiselinske ostatke Cys62-Phe67 (Cys62, Gli63, Glu64, Ser65, Glu66, Phe67), Gln79-Cys83 (Gln79, His 80, Lys 81, Tyr82, Cys83), Arg90-Thr99 (Arg90, Val91, Gln92, Gln93, Lys94, Gly95, Thr96, Ser97, Glu98 i Thr99) i Thr24-Cys37 (Thr24, Ala25, Cys26, Arg27, Glu28, Lys29, Gln30, Tyr31, Leu32, Ile33, Asn34, Ser35, Gln36, Cys37) iz SEQ ID NO:1.
[0126] Prema drugom aspektu, predmetni opis obezbeđuje CDR2 region teškog lanca sa antagonističkom aktivnošću na CD40. Preciznije, ostatak 55 (ostatak X) iz VH CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom YISSGRXNIYYADTVKG (SEQ ID NO: 112) identifikovan je kao onaj sa ulogom u povećanju antagonističke aktivnosti antitela u odnosu na matičnu CDR2 sekvencu koja sadrži ostatak S55. Ostaci Thr, Asp, Val, Leu, Ile i Met na poziciju 55 u HC CDR2 rezultuju nižim nivoom antagonističke aktivnosti u odnosu na druge aminokiseline na poziciju 55. Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koga čine varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 111 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 11. Aminokiselinske sekvence CDR1 i CDR3 domena koji mogu biti kombinovani sa SEQ ID NO: 111 u varijabilnim teškim i lakim lancima antitela su opisane kroz specifikaciju, uklјučujući, npr. Tabele 13 i 18.
[0127] Prema dodatnom aspektu, predmetni opis obezbeđuje CDR1 region lakog lanca koji sadrži ostatak identifikovan kao prekidač antagonističkog/agonističkog dejstva. Kao što je opisano ispod u Primeru 3, rezultat modifikacije „NS“ motiva u VL CDR1 regionu KSSQSLLNSGNQKNYLT (SEQ ID NO: 10) na ostatku „S“ može biti prebacivanje sa antagonističkog antitela na agonističko antitelo. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, pronalazak uklјučuje antagonističko anti-CD40 antitelo koje sadrži CDR1 VL region koga čini SEQ ID NO: 113 (KSSQSLLNXGNQKNYLT; gde X nije aminokiselinski ostatak Pro).
[0128] Termin "kompetitivna antitela" se ovde odnosi na bilo koji broj antitela koja cilјano deluju na isti molekulski ili stabilan, ali nekovalentno povezan supermolekulski entitet, poželјno isti molekul, tj. CD40, pri čemu je najmanje jedan sposoban da specifično smanji merljivo vezivanje drugog, poželјno steričnim ometanjem njegovog pristupa ciljnom epitopu (opisano prethodno), ili indukovanjem i/ili stabilizacijom konformacije u ciljnom entitetu tako da se smanji afinitet za ciljno mesto drugog antitela, a poželjnije direktnom blokadom pristupa drugog antitela ciljnom eptiopu, i to vezivanjem za epitop koji je dovoljno blizu prvonavedenom, preklapa se sa prethodno navedenim ili mu je identičan i najpoželјnije preklapanjem sa ili time što je eptiop identičan, a zapravo naročito time što je im je epitop identičan. Za dva epitopa se ovde navodi da se "preklapaju" ukoliko dele deo svojih hemijskih struktura, poželјno svoje aminokiselinske sekvence, dok su epitopi "identični" ukoliko su njihove hemijske strukture, poželjno njihove aminokiselinske sekvence, identične.
[0129] Prema posebnim aspektima, kompetitivno antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, predstavlja antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen i koji su u kompeticiji sa bilo kojim antitelom koje je ovde predstavljeno. Prema jednom aspektu, prijava obezbeđuje kompetitivno antitelo koje može biti u kompeticiji sa antitelima koja su ovde opisana (npr. sa At101 ili At102) i vezuje se za topografski epitop humanog CD40 koji uključuje ostatke Cys62-Phe67, Gln79-Cys83, Arg90-Thr99 i Thr24-Cys37.
[0130] Prema posebnim aspektima, agonističko antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 7; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8; i varijabilni region lakog lanca koji uključuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 74; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 11; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12.
[0131] Prema drugim posebnim aspektima, agonističko antitelo sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 7; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8; i varijabilni region lakog lanca koji uklјučuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 17; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 11; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12.
[0132] Prema daljim aspektima, agonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrže varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 15 ili 13; i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 77 ili 43.
2. Humanizovana anti-CD40 antitela izvedena iz antitela 3 (At3)
[0133] Aminokiselinske sekvence za humanizovane verzije teških i lakih lanaca mišjeg At3 su obezbeđene ispod, u Tabeli 11. Stoga, opis dalje prijavljuje antitela koja sadrže varijabilne i/ili CDR sekvence iz antitela 3 (At3).
[0134] Prema jednom aspektu, predmetni opis obezbeđuje humanizovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji uključuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:49; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 50; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 51; i varijabilni region teškog lanca koji uklјučuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 45; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 46; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 47.
[0135] Shodno navedenom, prema jednom aspektu, predmetni opis je usmeren na antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca koji uključuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:49; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 50; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 51. Alternativno, ili u kombinaciji, antagonističko anti-CD40 antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen sadrže varijabilni region teškog lanca koji uključuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 45; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 46; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 47.
[0136] Prema još jednom aspektu predmetnog opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen sadrže varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 44, 52, 54 ili 55; i/ili varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 48, 53, 56 ili 57.
[0137] Prema posebnom aspektu, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 44 i varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 48.
[0138] Prema drugom aspektu, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 52 i varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 53, 56 ili 57.
[0139] Prema sledećem aspektu, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 54 i varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 53, 56 ili 57.
[0140] Prema sledećem aspektu, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 55 i varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 53, 56 ili 57.
3. Himerna anti-CD40 antitela
[0141] Himerno antitelo je molekul u kome su različiti delovi antitela izvedeni iz različitih životinjskih vrsta, kao što su antitela koja sadrže varijabilni region izveden iz mišjeg monoklonskog antitela i humani imunoglobulinski konstantni region. Postupci za proizvodnju himernih antitela su poznati u stanju tehnike. Pogledati npr. Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi i saradnici, BioTechniques 4:214 (1986); Gillies i saradnici (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; U.S. Pat. No. 5,807,715; 4,816,567; i 4,816,397. Dodatno, mogu biti upotrebljene tehnike koju su razvijene za proizvodnju "himernih antitela" (Morrison i saradnici, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci.81:85855; Neuberger i saradnici, 1984, Nature 312:604-608; Takeda i saradnici, 1985, Nature 314:452-454), procesovanjem gena iz molekula mišijeg antitela odgovarajuće specifičnosti za antigen zajedno sa genima iz molekula humanog antitela odgvorarajuće biološke aktivnosti.
[0142] Prema drugom aspektu, predmetni opis je usmeren na antagonističko anti-CD40 antitelo. ili njegov deo koji vezuje antigen, koji sadrži varijabilni region lakog lanca koji uključuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 11; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12; i varijabilni region teškog lanca koji uklјučuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 42; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8. Prema posebnom aspektu, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region lakog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO:76 i varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:75.
[0143] Prema sledećem aspektu, predmetni opis je usmeren na antagonističko anti-CD40 antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca koji uklјučuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:49 ; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 50; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 51; i varijabilni region teškog lanca koji uklјučuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 45; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 46; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 47. Prema posebnom aspektu, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrži varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO:48 i varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:44.
[0144] Prema sledećem aspektu, predmetni opis je usmeren na antagonističko anti-CD40 antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, koji sadrže varijabilni region lakog lanca koji uklјučuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO:10; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 11; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 12; i varijabilni region teškog lanca koji uklјučuje (a) CDR1 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 7; i (c) CDR3 sa aminokiselinskom sekvencom kao što je navedeno u SEQ ID NO: 8. Prema posebnom aspektu, antagonističko anti-CD40 antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, sadrže varijabilni region lakog lanca sa aminokiselinskom sekvencom navedenom u SEQ ID NO: 9 i varijabilni region teškog lanca koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO: 5.
[0145] Prethodno izolovane CDR sekvence anti-CD40 antitela uspostavlјaju novu familiju CD40 antitela ili njihovih delova koji vezuju antigen, izolovane u skladu sa ovim pronalaskom, uklјučujući antitela koja sadrže CDR sekvence navedene u Tabelama 5, 11-13 i 15-18. Da bi se generisale i odabrale CDR sekvence pronalaska sa poželјnom aktivnošću vezivanja i/ili neutralizacije CD40 u odnosu na hCD40, mogu biti upotrebljeni standardni postupci koji su poznati u stanju tehnike za generisanje antitela predmetnog opisa i analizu karakteristika vezivanja i/ili neutralizacije CD40 ovih antitela, uključujući, ali se ne ograničavajući na one koji su ovde specifično opisani.
4. Karakterizacija antitela pronalaska
[0146] Anti-CD40 antitela predmetnog pronalaska su antagonistička antitela i mogu ispoljiti visok kapacitet za smanjenje ili neutralizaciju aktivnosti CD40, npr. što se procenjuje bilo kojom od nekoliko in vitro i in vivo analiza koje su poznate u stanju tehnike i ovde opisane. U određenim primerima izvođenja, anti-CD40 antitela pronalaska su antagonistička i suštinski su oslobođena agonističke aktivnosti. Antagonistička i agonistička aktivnost može biti određena analizama poznatim u stanju tehnike, uklјučujući one koje su ovde opisane. Na primer, vezivanje humanog CD40 i inhibicija CD40-CD40L interakcije može biti ispitana upotrebom ćelijske linije koja eksprimira CD40 i potom FACS analizama.
[0147] Prema jednom aspetku opisa, CD40 antagonistička ili antagonistička aktivnost anti-CD40 antitela se utvrđuje upotrebom reporterske ćelijske linije. Na primer, antagonističke ili antagonističke aktivnosti mogu biti ispitane upotrebom reporterske ćelijske linije koja eksprimira humani CD40 i izlučuje alkalnu fosfatazu (AP) što je posredovano sa NFkB. Kada se signal primi preko CD40, aktivacija NFkB dovodi do izlučivanja AP čija se količina se meri kolorimetrijskim supstratom. Agonistička analiza za primer podrazumeva CD40 reportersku liniju koja može biti kultivisana bilo sa Jurkat ćelijskom linijom koja eksprimira CD40L (da bi se obezbedila interakcija sa fiziološkim ligandom) ili sa solubilnim CD40L čime može biti ispitana sposobnost anti-CD40 antitela da blokira NFkB signal. Antagonistička analiza za primer podrazumeva reportersku ćelijsku liniju sa humanim CD40 koja može biti tretirana sa anti-CD40 antitelima, nakon čega se meri NFkB signal (što se vidi kao prisustvo AP iznad nivoa u negativnoj kontroli), kao što je prethodno opisano. Primer CD40 reporterske ćelijske linije su HEK-Blue™ CD40L ćelije (InvivoGen), koje služe za merenje bioaktivnosti CD40L putem sekrecije embrionalne alkalne fosfataze (SEAP) po aktivaciji NF-κB nakon stimulacije CD40. CD40L-CD40 interakcija može biti praćena ispitivanjem nivoa SEAP, upotrebom QUANTI-Blue reagensa (InvivoGen).
[0148] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antagonističko antitelo opisa, ili njegov antigen-vezujući fragment, karakteriše IC50 od 0,4 nM ili manje, što je utvrđeno antagonističkom reporterskom analizom sa solubilnim CD40. Prema jednom aspektu, anti-CD40 agonističko antitelo opisa, ili njegov antigenvezujući fragment, karakteriše IC50 od 51 nM ili manje, što je utvrđeno antagonističkom CD40 reporterskom analizom u Jurkat ćelijskoj liniji. Prema jednom aspektu, anti-CD40 antagonističko antitelo opisa, ili njegov fragment koji vezuje antigen, karakteriše IC50 od 3,4 nM ili manje, što je utvrđeno antagonističkom CD40 reporterskom analizom u Jurkat ćelijskoj liniji. Prema jednom primeru izvođenja, anti-CD40 antagonističko antitelo opisa, ili njegov antigen-vezujući fragment, karakteriše IC50 od 0,9 nM ili manje, što je utvrđeno antagonističkom CD40 reporterskom analizom u Jurkat ćelijskoj liniji.
[0149] Prema jednom aspektu opisa, CD40 antagonistička ili antagonistička aktivnost anti-CD40 antitela se utvrđuje upotrebom B-ćelijske agonističke analize. Na primer, može biti upotrebljena B-ćelijska agonistička analiza u kojoj se B-ćelije aktiviraju niskim dozama anti-IgM i IL4, pre doprimene CD40 antagonističkog antitela. Pojačana aktivacija B-ćelija može biti izmerena kao pozitivna regulacija CD86, što zauzvrat ukazuje na agonističku aktivnost. Slično navedenom, može biti upotrebljena B-ćelijska agonistička analiza u kojoj se primarne humane B-ćelije kultivišu sa humanom T-ćelijskom linijom koja eksprimira CD40L, a što dovodi do aktivacije B-ćelija i pozitivne regulacije ekspresije CD86 putem CD40/CD40L interakcije. Inhibicija pozitivne regulacije CD86 u primarnim humanim B-ćelijama ukazuje na antagonističku aktivnost.
[0150] Prema jednom aspektu opisa, CD40 antagonistička ili antagonistička aktivnost anti-CD40 antitela se određuje upotrebom analize posredovane citotoksičnošću koja je posredovana ćelijama i zavisna od antitela (ADCC). Antagonističke ili antagonističke aktivnosti mogu biti ispitane sposobnoću antitela da posreduju u ADCC. Antagonističko CD40 antitelo će biti efektivan posrednik ADCC-a, dok agonističko antitelo neće ispoljiti ADCC aktivnost. Ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) se odnosi na vrstu citotoksičnosti koja se indukuje aktivacijom makrofaga, NK ćelija, neutrofilnih ćelija itd., a koje prepoznaju cilјne ćelije vezivanjem za konstantni region antitela preko Fc receptora eksprimiranih na njihovoj površini. Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) se odnosi na vrstu citotoksičnosti koju indukuje aktivacija sistema komplemenata do koje dolazi kroz vezivanje antitela za antigen. Smanjanje ADCC i CDC aktivnosti označava smanjanje u ovim aktivnostima u poređenju sa, na primer, kontrolnim anti-CD40 antagonističkim antitelom kao što je monoklonsko antitelo proizvedeno od strane hibridoma 4D11 (pristupni br. FERM BP-7758). EP1707627B1, opisuje analize za određivanje ADCC i CDC aktivnosti.
[0151] Dodatno, za ispitivanje antagonističke aktivnosti može biti upotrebljena biološka aktivnost dendritičnih ćelija (DC) stimulisanih sa imobilisanim anti-CD40 At. Smatra se da su DC najpotentnije ćelije koje prezentuju antigene, a sposobne da antigene preuzmu u nelimfoidnim tkivima i prenesu ih do sekundarnih limfoidnih organa da bi se prajmovale T-ćelije u vidu odgovora na stimulacije sazrevanja poput signala opasnosti i ispomoći. Nasuprot navedenom, rezultat prezentacija antigena od strane DC bez aktivacije je eliminacija efektorskih T-ćelija koje imaju kognatne TCR ili indukcija regulatornih T-ćelija u sekundarnim limfoidnim tkivima. Stoga, za nezrele DC u perifernim tkivima, prisustvo ili odsustvo signala maturacije deluje kao prekidač za indukciju bilo adaptivnog imunog odgovora ili tolerancije. Glavni signal ispomoći iz CD4+ T-ćelija za sazrevanje DC se obezbeđuje interakcijom između CD40 eksprimiranog na DC i CD40 liganda (L) eksprimiranog na aktiviranim CD4+ T-ćelijama. U skladu sa navedenim, stimulacija CD40 indukuje migraciju DC u sekundarno limfoidno tkivo pozitivnom regulacijom ekspresije CCR7. Watanabe i saradnici, 2003 J Immunol; 171: 5828-5836 opisuju analize koje mogu biti upotrebljene za određivanje da li anti-CD40 antitela mogu aktivirati DC, a da bi se utvrdila agonistička i antagonistička aktivnost. Takve analize za primer obuhvataju određivanje ekspresije antigena MHC klase I/II, kao i kostimulatornih molekula na BM-DC koje su stimulisane sa imobilisanim anti-CD40 At, i dalje in vivo određivanje migratorne aktivnosti BM-DC stimulisanih sa imobilisanim anti-CD40 antitelima, kao i in vitro migratornu aktivnosti i ekspresiju CCR7 u BM-DC koje su stimulisane sa imobilisanim anti-CD40 At.
[0152] Prema jednom aspektu opisa, agonistička aktivnost anti-CD40 antitela, ili njegovog dela koji vezuje antigen, određuje se upotrebom in vitro analize aktivacije monocita, kao što je analiza opisana u nastavku, u Primeru 7. In vitro analiza aktivacije monocita obuhvata izlaganje monocita anti-CD40 antitelu ili njegovom delu koji vezuje antigen, pri čemu, ukoliko je antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, aktivator CD40 (agonista), dolazi do povećanja u proizvodnji TNF-a. Upotrebom in vitro analiza aktivacije monocita, antagonističko anti-CD40 antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, koji su suštinski oslobođeni agonističke aktivnosti, dovešće do odsustva ili minimalne proizvodnje TNF-a, kao što je opisano u Primeru 7.
[0153] Prema jednom aspektu opisa, antagonističko anti-CD40 antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen koji su suštinski oslobođeni agonističke aktivnosti, ispoljavaju aktivnost koja je unutar opsega jedne standardne devijacije u odnosu na negativnu kontrolu, u in vitro CD40 agonističkom testu, npr. agonističkoj analizi na monocitima koja je opisana u Primeru 7.
[0154] Agonističke analize su dalje opisane u US 5786456, US2011/0243932 i EP1707627B1. Antagonističke analize za ispitivanje funkcije antitela su dalje opisane u US 7361345, US2011/0243932 i EP1707627B1.
[0155] Prema poželјnom aspektu opisa, izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, vezuju humani CD40, pri čemu antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen disociraju od humanog CD40 sa konstantom brzine koffod oko 0,1s<-1>ili manje, određenom površinskom plazmonskom rezonancom, ili inhibiraju aktivnost humanog CD40 sa IC50od oko 1 x 10<-6>M ili manje. Alternativno, antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen mogu disocirati od humanog CD40 sa konstantnom brzine koffod otprilike 1 x 10<-2>s<-1>ili manje, određenom površinskom plazmonskom rezonancom, ili mogu inhibirati aktivnost humanog CD40 sa IC50od oko 1 x 10<-7>M ili manje. Alternativno, antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen mogu disocirati od humanog CD40 sa konstantnom brzine koffod otprilike 1 x 10<-3>s<-1>ili manje koja je određena površinskom plazmonskom rezonancom, ili mogu inhibirati humani CD40 sa IC50od oko 1 x 10<-8>M ili manje. Alternativno, antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen mogu disocirati od humanog CD40 sa konstantnom brzine koffod otprilike 1 x 10<-4>s<-1>ili manje, određenom površinskom plazmonskom rezonancom, ili mogu inhibirati aktivnost CD40 sa IC50od oko 1 x 10<-9>M ili manje. Alternativno, antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen mogu disocirati od humanog CD40 sa konstantnom brzine koffod otprilike 1 x 10<-5>s<-1>ili manje koja je određena površinskom plazmonskom rezonancom, ili mogu inhibirati CD40 sa IC50od oko 1 x 10<-10>M ili manje. Alternativno, antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen mogu disocirati od humanog CD40 sa konstantnom brzine koffod otprilike 1 x 10<-5>s<-1>ili manje koja je određena površinskom plazmonskom rezonancom, ili mogu inhibirati aktivnost CD40 sa IC50od oko 1 x 10<-11>M ili manje.
[0156] Antitela su humanizovana kao što je opisano u nastavku teksta, u Primerima. Povratne mutacije uokvirujućeg regiona su uvedene u sekvence antitela sa CDR-graftovima de novo sintezom varijabilnog domena ili mutagenim oligonukleotidnim prajmerima i lančanom reakcijom polimeraze, ili sa oba, čime su omogućene različite kombinacije povratnih mutacija i drugih mutacija za svaki od CDR-graftova. Humanizovani varijabilni regioni mišjih monoklonskih antitela CD40 su klonirani u IgG ekspresione vektore radi funkcionalne karakterizacije.
[0157] Prema određenim aspektima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca, kao što je konstantni region IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD. Poželјno je da konstantni region teškog lanca bude konstantni region teškog lanca IgG1 ili konstantni region teškog lanca IgG4. Štaviše, antitelo može sadržavati konstantni region lakog lanca, bilo konstantni region kapa lakog lanca ili konstantni region lambda lakog lanca. Poželјno je i da antitelo sadrži konstantni region kapa lakog lanca. Alternativno, deo antitela može biti, na primer, Fab fragment ili jednolančani Fv fragment.
5. Generisanje anti-CD40 humanizovanih antitela
[0158] Kao što je prethodno opisano, humanizovana antitela su molekuli antitela iz antitela vrsta različitih od čoveka koja se vezuju za želјeni antigen koji sadrži jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) iz vrste različite od čoveka i uokvirujuće regione iz humanog imunoglobulinskog molekula. Poznate humane Ig sekvence su prijavljene, npr. na internet stranicam www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.-html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito-/Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isacnet.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrccpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOseminar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h-umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat i saradnici, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Tako importovane sekvence mogu biti upotrebljene za smanjenje imunogenosti ili za smanjenje, pojačavanje ili modifikovanje vezivanja, afiniteta, brzine asocijacije, brzine disocijacije, specifičnosti, poluživota ili bilo koje druge pogodne karakteristike, a kao što je poznato u stanju tehnike.
[0159] Ostaci uokvirujućih regiona u humanim uokvirujućim regionima mogu biti supstituisani sa odgovarajućim ostatkom iz CDR donorskog antitela da bi se izmenilo, poželjno poboljšalo, vezivanje antigena. Ovakve supstitucije u uokvirujućim regionima su identifikovane postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike, npr. modelovanjem interakcija ostataka iz CDR i uokvirujućih regiona da bi se identifikovali ostaci uokvirujućih regiona koji su važni za vezivanje antigena, kao poređenjem sekvenci da bi se identifikovali neobični ostaci uokvirujući regiona na određenim pozicijama. (Pogledati, npr. Queen i saradnici, U.S. Pat. No. 5,585,089; Riechmann i saradnici, Nature 332:323 (1988)). Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su obično dostupni i poznati su stručnjacima iz oblasti. Dostupni su i kompjuterski program koji ilustruju i prikazuju verovatne trodimenzionalne konformacione strukture izabranih imunoglobulinskih sekvenci kandidata. Uvid u ove prikaze omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju imunoglobulinske sekvence kandidata, tj. analizu ostataka koji utiču na sposobnost imunoglobulina kandidata da vezuje svoj antigen. Na ovaj način, FR ostaci mogu biti odabrani i iskombinovani iz konsenzusnih i importovanih sekvenci tako da se postigne želјena karakteristika antitela, poput povećanog afiniteta za cilјni antigen/antigene. U principu, CDR ostaci su direktno i u najvećoj meri uklјučeni u uticaj na vezivanje antigena. Antitela mogu biti humanizovana upotrebom raznih tehnika koje su poznate u stanju tehnike, kao što su, ali bez obraničavanja na, one koje su opisane u Jones i saradnici, Nature 321:522 (1986)); Verhoeyen i saradnici, Science 239:1534 (1988)), Sims i saradnici, J. Immunol. 151:2296 (1993)); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter i saradnici, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta i saradnici, J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka i saradnici, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska i saradnici, PNAS 91:969-973 (1994); PCT publikacija WO 91/09967, PCT/: US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246; EP 592,106; EP 519,596; EP 239,400; U.S. Pat. No. 5,565,332; 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5814476; 5763192; 5723323; 5,766886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567.
[0160] Primeri humanizovanih anti-CD40 antitela su obezbeđeni prethodno, u Odelјcima 1 i 2, i u nastavku teksta, u Primerima.
II. Proizvodnja antitela i ćelijskih linija koje proizvode antitela
[0161] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti pripremljena bilo kojom od brojnih tehnika koje su poznate u stanju tehnike.
1. Proizvodnja monoklonska anti-CD40 antitela upotrebom tehnologije hibridoma
[0162] Monoklonska antitela mogu biti pripremljena upotrebom širokog spektra tehnika koje su poznate u stanju tehnike, uklјučujući upotrebu hibridoma, rekombinantnih i tehnika prikazivanja na fagima, ili njihovih kombinacijama. Na primer, monoklonska antitela mogu biti proizvedena upotrebom tehnika hibridoma uključujući one koje su poznate u stanju tehnike i opisane, na primer, u Harlov i saradnici, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izdanje, 1988); Hammerling i saradnici, u: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Termin "monoklonska antitela", kako se ovde upotrebljava, nije ograničen na antitela proizvedena putem tehnologije hibridoma. Termin "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo koje je izvedeno iz jednog klona, uklјučujući bilo koji eukariotski, prokariotski ili fagni klon, a ne na postupak kojim je proizvedeno.
[0163] Postupci za proizvodnju i skrining specifičnih antitela upotrebom tehnologije hibridoma su rutinski i dobro su poznati u stanju tehnike. U jednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke generisanja monoklonskih antitela, kao i antitela proizvedenih postupkom koji obuhvata kultivisanje ćelija hibridoma koje izlučuju antitelo pronalaska, gde je poželjno da je hibridom generisan fuzionisanjem splenocita izolovanih iz miša koji je imunizovan sa antigenom pronalaska i ćelija mijeloma, a potom skriningom hibridoma koji su rezultat fuzije da bi se detektovali klonovi hibridoma koji izlučuju antitelo sposobno da se vezuje za polipeptid pronalaska (pogledati Primer 1). Ukratko, miševi mogu biti imunizovani sa CD40 antigenom. U poželјnom primeru izvođenja, CD40 antigen se primenjuje sa adjuvansom da bi stimulisao imuni odgovor. Takvi adjuvansi uklјučuju potpuni ili nepotpuni Frojndov adjuvans, RIBI (muramyl dipeptid) ili ISCOM (imunostimulirajuće komplekse). Takvi adjuvansi mogu zaštititi polipeptid od brzog širenja, razdvajajući ga u lokalne depozite, ili mogu sadržavati supstance koje stimulišu domaćina da izlučuje faktora koji su hemotaktični za makrofage i druge komponente imunog sistema. Poželјno je da, ukoliko se primenjuje polipeptid, raspored imunizacije uključuje dve ili više primena polipeptida koje su raspoređene tokom perioda od nekoliko nedelјa.
[0164] Nakon imunizacije životinje sa CD40 antigenom, iz životinje mogu biti dobijena antitela i/ili ćelije koje proizvode antitela. Serum koji sadrži anti-CD40 antitelo se dobija iz životinje uzorkovanjem krvi ili žrtvovanjem životinje. Serum može biti upotrebljen u obliku koji je dobijen iz životinje, a iz seruma se može dobiti i imunoglobulinska frakcija ili anti-CD40 antitela mogu biti prečišćena iz seruma. Serum ili imunoglobulini dobijeni na ovaj način su poliklonski, odnosno sa heterogenim su nizom svojstava.
[0165] Jednom kada se imuni odgovor detektuje, npr. kada se antitela specifična za CD40 antigen detektuju u mišjem serumu, slezina miša se izdvaja disekcijom i izoluju se splenociti. Splenociti se zatim fuzionišu, upotrebom tehnika koje su dobro poznate, sa bilo kojim pogodnim ćelijama mijeloma, na primer, sa ćelijama iz ćelijske linije SP20 koja je dostupna kod kompanije ATCC. Hibridomi se selektuju i kloniraju putem ograničenih razblaženja. Klonovi hibridoma se dalje ispituju postupcima koji su poznati u stanju tehnike, za selekciju ćelija koje izlučuju antitela sposobna da vezuju CD40. Ascitna tečnost, koja uglavnom sadrži visok nivo antitela, može biti generisana imunizacijom miševa sa pozitivnim klonovima hibridoma.
[0166] Imortalizovani hibridomi koji proizvode antitela mogu biti pripremljeni iz imunizovane životinje. Nakon imunizacije, životinja se žrtvuje i B-ćelije slezine se fuzionišu sa imortalizovanim ćelijama mijeloma, kao što je dobro poznato u stanju tehnike. Pogledati, npr. Harlov i Lane, navedeno iznad. U poželјnom primeru izvođenja, antitela pronalaska se proizvode upotrebom ćelija mijeloma koje ne izlučuju imunoglobulinske polipeptide (nesekretorna ćelijska linija). Nakon fuzije i selekcije sa antibioticima, hibridomi se ispituju upotrebom CD40, ili njegovog dela, ili upotrebom ćelije koja eksprimira CD40. U poželјnom primeru izvođenja, početni skrining se vrši upotrebom enzimskih imunoeseja (ELISA) ili radioimunoeseja (RIA), poželјno ELISA testa. Primer ELISA skrininga je obezbeđen u WO 00/37504.
[0167] Hibridomi koji proizvode anti-CD40 antitelo se selektuju, kloniraju i dalje pregledaju radi detekcije željenih karakteristika, uklјučujući robusan rast hibridoma, visoku proizvodnju antitela i poželјne karakteristike antitela, kao što se razmatra u nastavku teksta. Hibridomi mogu biti uzgajani i propagirani in vivo kod singenih životinja, kod životinja kojima nedostaje imuni sistem, npr. u “golim” miševima, ili u ćelijskoj kulturi in vitro. Postupci selekcije, kloniranja i propagacije hibridoma su dobro poznati prosečno iskusnim stručnjacima iz oblasti tehnike.
[0168] U poželјnom primeru izvođenja, hibridomi su mišji hibridomi, kao što je prethodno opisano. U drugom poželјnom primeru izvođenja, hibridomi se proizvode u vrstama koje su različite od čoveka i miša, kao što su pacovi, ovce, svinje, koze, goveda ili konji. U drugom primeru izvođenja, hibridomi su humani hibridomi, u kojima je humani nesekretorni mijelom fuzionisan sa humanom ćelijom koja eksprimira anti-CD40 antitelo.
[0169] Fragmenti antitela koji prepoznaju specifične epitope mogu biti generisani poznatim tehnikama. Na primer, Fab i F(ab’)2 fragmenti predmetnog pronalaska mogu biti proizvedeni proteolitičkim cepanjem imunoglobulinskih molekula, upotrebom enzima poput papaina (za proizvodnju Fab fragmenata) ili pepsina (za dobijanje F(ab')2 fragmenata). F(ab’)2 fragmenti sadrže varijabilni region, konstantni region lakog lanca i CHI domen teškog lanca.
2. Proizvodnja monoklonska anti-CD40 antitela upotrebom SLAM
[0170] Prema sledećem aspektu predmetnog opisa, rekombinantna antitela se generišu iz pojedinačnih, izolovanih limfocita, upotrebom procedure koja se u stanju tehnike označava kao postupak selekcije antitela iz limfocita (SLAM), a kao što je opisano u U.S. Patent No. 5,627,052, PCT publikaciji WO 92/02551 i Babcock J.S. i saradnici (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7843-7848. U ovom postupku, pojedinačne ćelije koje luče antitela od interesa, npr. limfociti izvedeni iz bilo koje od imunizovanih životinja opisanih u Odelјku 1, podvrgavaju se skriningu upotrebom testova sa hemolitičkim plakovima specifičnim za antigen, gde se CD40 antigen, subjedinica CD40 ili njegov fragment, kupluju sa crvenim krvnim ćelijama ovaca upotrebom linkera poput biotina i potom koriste za identifikaciju pojedinačnih ćelija koje luče antitela sa specifičnošću za CD40. Nakon identifikacije ćelija koje izlučuju antitela od interesa, cDNK varijabilnih regiona teških i lakih lanaca se izdvajaju iz ćelija reverznom transkriptazom-PCR-om i ovakvi varijabilni regioni se zatim mogu eksprimirati, u kontekstu odgovarajućih imunoglobulinskih konstantnih regiona (npr. humanih konstantnih regiona), u sisarskim ćelijama domaćinima kao što su COS ili CHO ćelije. Ćelije domaćini se dalje transfektuju sa umnoženim imunoglobulinskim sekvencama, izvedenim iz in vivo selektovanih limfocita, a potom se podvrgavaju daljoj analizi i selekciji in vitro, na primer, izdvajanjem transfektovanih ćelija da bi se izolovale ćelije koje eksprimiraju anit-CD40 antitela. Umnoženim imunoglobulinskim sekvencama se dalje može manipulisati in vitro, upotrebom postupaka poput in vitro afinitetnog sazrevanja kao što su oni opisani u PCT publikaciji WO 97/29131 i PCT publikaciji WO 00/56772.
3. Proizvodnja monoklonskih anti-CD40 antitela upotrebom transgenih životinja
[0171] Prema sledećem aspektu opisa, antitela se proizvode imunizacijom životinje različite od čoveka koja sadrži pojedine, ili sve, od humanih imunoglobulinskih lokusa sa CD40 antigenom. Prema poželјnom aspektu, životinja različita od čoveka je tzv. XENOMOUSE transgeni miš, mišji soj koji je konstruisan genetičkim inženjeringom tako da sadrži velike fragmente humanih imunoglobulinskih lokusa i deficijentan je u proizvodnji mišjih antietela. Pogledati, npr. Green i saradnici, Nature Genetics 7:13-21 (1994) i patente Sjedinjenih Država 5,916,771; 5,939,598; 5,985,615; 5,998,209; 6,075,181; 6,091,001; 6,114,598 i 6,130,364. Pogledati takođe WO 91/10741, objavljen 25. jula 1991, WO 94/02602, objavljen 3. februara 1994, WO 96/34096 i WO 96/33735, oba objavljena 31. oktobra 1996, WO 98/16654, objavljen 23. aprila 1998, WO 98/24893, objavljen 11. juna 1998, WO 98/50433, objavljen 12. novembra 1998, WO 99/45031, objavljen 10. septembra 1999, WO 99/53049, objavljen 21. oktobra 1999, WO 00 09560, objavljen 24. februara 2000 i WO 00/037504, objavljen 29. juna 2000. Transgeni miš XENOMOUSE proizvodi repertoar u potpunosti humanih antitela koji su slični adultnima i stvara humana MAt koja su specifična za antigen. Transgeni miš XENOMOUSE sadrži približno 80% repertoara humanih antitela koji se uvodi putem YAC fragmenata germinativne konfiguracije koji su veličine u megabazama i sadrže lokuse humanih teških lanaca i x lokuse lakog lanca. Pogledati Mendez i saradnici, Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green i Jakobovits J. Exp. Med.188:483-495 (1998).
4. Porizvodanja monoklonskih anti-CD40 antitela upotrebom rekombinantnih biblioteka antitela
[0172] In vitro postupci takođe mogu biti upotrebljeni za pravljenje antitela pronalaska, pri čemu se biblioteke antitela pregledavaju da bi se identifikovalo antitelo sa želјenom specifičnošću vezivanja.
Postupci takvog skrininga biblioteka rekombinantnih antitela su dobro poznati u stanju tehnike i obuhvataju postupke opisane u, na primer, Ladner i saradnici, U.S. Patent No. 5,223,409; Kang i saradnici, PCT publikacija br. WO 92/18619; Dower i saradnici, PCT publikacija br. WO 91/17271; Winter i saradnici, PCT publikacija br. WO 92/20791; Markland i saradnici, PCT publikacija br. WO 92/15679; Breitling i saradnici, PCT publikacija br. WO 93/01288; McCafferty i saradnici, PCT publikacija br. WO 92/01047; Garrard i saradnici, PCT publikacija br. WO 92/09690; Fuchs i saradnici (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay i saradnici (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse i saradnici (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty i saradnici, Nature (1990) 348:552-554; Griffiths i saradnici (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins i saradnici (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson i saradnici (1991) Nature 352: 624-628; Gram i saradnici (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad i saradnici (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom i saradnici (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; i Barbas i saradnici (1991) PNAS 88:7978-7982, kao i u SAD patentnoj prijavi 20030186374 i PCT publikaciji br. WO 97/29131.
[0173] Biblioteka rekombinantnih antitela može biti od subjekta imunizovanog sa CD40 ili sa delom CD40, kao što je vanćelijski domen. Alternativno, biblioteka rekombinantnih antitela može biti od netretiranog subjekta, tj. iz onog koji nije bio imunizovan sa CD40, kao što je biblioteka humanih antitela iz humanog subjekta koja nije bio imunizovan sa humanim CD40. Antitela pronalaska su odabrana skriningom biblioteke rekombinantnih antitela sa peptidom koji je sadržavao humani CD40 da bi se time selektovala ona antitela koja prepoznaju CD40. Postupci za sprovođenje takvog skrininga i selekcije su dobro poznati u stanju tehnike, kao što je opisano u referencama u prethodnom paragrafu. Da bi se odabrala antitela pronalaska koja karakterišu određeni afiniteti vezivanja za hCD40, kao što su ona koja disociraju od humanog CD40 sa određenim konstantom brzine disocijacije koff, može biti upotrebljen postupak površinske plazmonske rezonance koji je dobro poznat u stanju tehnike za selekciju antitela sa željenom konstantom brzine disocijacije koff. Za selekciju antitela pronalaska sa određenom aktivnošću neutralizacije za hCD40, kao što su ona sa određenim IC50, mogu biti upotrebljeni standardni postupci koji su poznati u stanju tehnike za ispitivanje aktivnosti inhibicije hCD40.
[0174] Prema jednom aspektu, opis se odnosi na izolovano antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, koji vezuje humani CD40. Poželјno je da je antitelo neutrališuće antitelo. Prema raznim aspektima, antitelo je rekombinantno antitelo ili monoklonsko antitelo.
[0175] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti generisana upotrebom postupaka prikazivanja na fagima koji su poznati u stanju tehnike. U postupcima prikazivanja na fagima, funkcionalni domeni antitela se prikazuju na površini čestica faga koje nose polinukleotidne sekvence koje ih kodiraju. Preciznije, takav fag može biti upotrebljen za prikaz domena koji vezuju antigen i koji su eksprimirani iz repertoara ili kombinatorne biblioteke antitela (npr. čoveka ili miševa). Fag koji eksprimira domen koji vezuje antigen od interesa može biti odabran ili identifikovan sa antigenom, npr. upotrebom obeleženog antigena ili antigena vezanog ili prićvršćenog za čvrstu podlogu ili zrna. Fag upotrebljen u ovim postupcima obično predstavlja filamentozan fag koji uključuje fd i M13 vezujuće domene eksprimirane u fagu sa Fab, Fv ili Fv domene antitela koji su stabilizovani disulfidnim vezama i rekombinantno fuzionisni bilo sa fagnim proteinom gena III ili gena VIII. Primeri postupaka prikaza na fagu koji mogu biti upotrebljeni za pripremu antitela predmetnog pronalakska obuhvataju one koji su prijavljeni u Brinkman i saradnici, J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames i saradnici, J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough i saradnici, Eur. J. Immunol.24:952-958 (1994); Persic i saradnici, Gene 1879-18 (1997); Burton i saradnici, Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT aplikaciji br. PCT/GB91/01134; PCT publikacijama WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; i U.S. patentima br. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 i 5,969,108.
[0176] Kao što je opisano u prethodno navedenim referencama, nakon selekcije faga, kodirajući regioni antitela iz faga mogu biti izolovani i upotrebljeni za generisanje celokupnih antitela, uklјučujući humana antitela ili bilo koji drugi želјeni fragment koji vezuje antigen, a zatim eksprimirani u bilo kojem želјenom domaćinu, uklјučujući sisarske ćelije, ćelije iz insekata, bilјne ćelije, kvasce i bakterije, npr. kao što je detalјno opisano u nastavku. Na primer, tehnike za rekombinantnu proizvodnju Fab, Fab' i F(ab')2 fragmenata mogu takođe biti iskorišćene upotrebom postupaka koji su poznati u stanju tehnike, kao što su oni prijavljeni u PCT publikaciji WO 92/22324; Mullinax i saradnici, BioTechniques 12(6):864-869 (1992); i Sawai i saradnici, AJRI34:26-34 (1995); i Better i saradnici, Science 240:1041-1043 (1988). Primeri tehnika koje mogu biti upotrebljene za proizvodnju jednolančanih Fv i antitela uklјučuju one opisane u U.S. Pat. 4,946,778 i 5,258,498; Huston i saradnici, Methods in Enzimology 203:46-88 (1991); Shu i saradnici, PNAS 90:7995-7999 (1993); i Skerra i saradnici, Science 240:1038-1040 (1988).
[0177] Kao alternativa skriningu biblioteka rekombinantnih antitela putem prikaza na fagu, mogu biti primenjene druge metodologije iz stanja tehnike za skrining velikih kominatornih biblioteka, a da bi se identifikovala antitela pronalaska sa dvojnom specifičnošću. Jedan tip alternativnog ekspresionog sistema je onaj u kome se biblioteka rekombinantnih antitela eksprimira u vidu fuzionisanih molekula proteina i RNK, kao što je opisano u PCT publikaciji br. WO 98/31700 od strane Szostak-a i Roberts-a, i u Roberts R.W. i Szostak J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. U ovom sistemu, vrši se kovalentna fuzija između iRNK i peptida ili proteina koga ona kodira, in vitro translacijom sintetskih iRNK koje nose puromicin, peptidilni akceptorski antibiotik, na svom 3' kraju. Na ovaj način se iz kompleksne smeše iRNK (npr. kombinatorne biblioteke) može obogatiti sadržaj specifične iRNK, na osnovu osobina kodiranog peptida ili proteina, npr. antitela ili njegovog dela, kao što je vezivanje antitela ili njegovog dela za antigen dvostruke specifičnosti. Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju antitela ili njihove delove i izdvojene nakon pretraživanja takvih biblioteka, mogu biti eksprimirane rekombinantnim načinima, kao što je prethodno opisano (npr. u sisarskim ćelijama domaćinima), i, štaviše, mogu biti podvrgnute i daljoj afinitetnoj maturaciji bilo dodantim rundama skrininga fuzionisanih iRNK i peptida u kojima su mutacije uvedene u prvobitno izabrane sekvence, ili drugim postupcima afinitetnog sazrevanja rekombinantnih antitela in vitro, kao što je prethodno opisano.
[0178] Prema drugom pristupu, antitela predmetnog pronalaska mogu biti generisana i upotrebom postupaka prikazivanja na kvascima koji su poznati u stanju tehnike. U postupcima prikazivanja u kvascima, za pričvršćivanje domena antitela za zid ćelije kvasca, i time njihovo prikazivanje na površini kvasca, koriste se postupci iz genetičkog inženjeringa. Preciznije, takvi kvasci mogu biti upotrebljeni za prikazivanje domena koji vezuju antigen i koji eksprimirani su iz repertoara ili kombinatorne biblioteke antitela (npr. čoveka ili miševa). Primeri postupaka prikaza na kvascima koji mogu biti upotrebljeni za pravljene antitela predmetnog pronalaska uklјučuju one koja su prijavljeni u publikaciji Wittrup-a i saradnika.
5. Proizvodnja rekombinantnih CD40 antitela
[0179] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti proizvedena bilo kojom od brojnih tehnika koje su poznate u stanju tehnike. Na primer, ekspresijom u ćelijama domaćinima, pri čemu ekspresioni vektor(i) kodira(ju) teške i lake lance i trasfekcijom se uvode u ćeliju domaćina, standardnim tehnikama. Predviđeno je da razni oblici termina "transfekcija" obuhvate širok spektar tehnika koje se uobičajeno koriste za uvođenje egzogene DNK u prokariotsku ili eukariotsku ćeliju domaćina, npr. elektroporaciju, precipitaciju kalcijum-fosfatom, transfekciju sa DEAE-dekstranom i slične. Iako je antitela predmetnog pronalaska moguće eksprimirati bilo u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćinima, poželјna je ekspresija antitela u eukariotskim ćelijama i najpoželјnija je u sisarskim ćelijama domaćinima, pošto je verovatnije da će takve eukariotske ćelije (a naročito sisarske ćelije) povezati i izlučiti pravilno uvijena i imunološki aktivna antitela nego što bi to bio slučaj u prokariotskim ćelijama.
[0180] Poželјne sisarske ćelije domaćini za ekspresiju rekombinantnih antitela pronalaska obuhvataju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO ćelije) (uklјučujući dhfr-CHO ćelije, opisane u Urlaub i Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, koje se upotrebljavaju sa DHFR selektivnim markerom, npr. kao što je opisano u R.J. Kaufman i P.A. Sharp (1982) Mol. Biol.159: 601-621), NS0 ćelije mieloma, COS ćelije i SP2 ćelije. Kada se rekombinantni ekspresioni vektori koji kodiraju gene antitela uvode u sisarske ćelije domaćine, antitela se proizvode gajenjem ćelija domaćina u kulturi tokom perioda koji je dovoljan da se omogući ekspresija antitela u ćelijama domaćinima ili, poželјnije, sekrecija antitela u medijum za kulturu u kome se gaje ćelije domaćini. Antitela mogu biti izdvojena iz medijuma za kulturu upotrebom standardnih postupaka prečišćavanja proteina.
[0181] Ćelije domaćini mogu takođe biti upotrebljene za proizvodnju funkcionalnih fragmenata antitela, kao što su Fab fragmenti ili scFv molekuli. Podrazumeva se i da su varijacije prethodno navedene procedure unutar područja predmetnog pronalaska. Na primer, može biti poželјno da se ćelija domaćin transfektuje sa DNK koja kodira funkcionalne fragmente bilo lakog lanca i/ili teškog lanca antitela ovog pronalaska. Rekombinantna DNK tehnologija može takođe biti upotrebljena za uklanjanje pojedinih ili svih DNK koje kodiraju bilo jedan ili oba od lakih i teških lanaca koji nisu neophodni za vezivanje antigena od interesa. Molekuli eksprimirani sa tako skraćenih DNK molekula su takođe uključeni u antitela pronalaska. Dodatno, mogu biti proizvedena bifunkcionalna antitela u kojima jedan teški i jedan laki lanac predstavljaju antitelo pronalaska, dok su drugi teški i laki lanac specifični za antigen koji je drugačiji od antigena od interesa, a koja se dobijaju umrežavanjem antitela pronalaska sa drugima antitelom upotrebom standardnih postupaka hemijskog umrežavanja.
[0182] U poželјnom sistemu za rekombinantnu ekspresiju antitela pronalaska, rekombinantni ekspresioni vektor koji kodira i teški lanac antitela i laki lanac antitela, uvodi se u dhfr-CHO ćelije putem transfekcije posredovane kalcijum fosfatom. Unutar rekombinantnog ekspresionog vektora, geni teškog i lakog lanca antitela su operativno povezani sa regulatornim elementima CMV pojačivača/AdMLP promotora da bi se pokrenuli visoki nivoi transkripcije gena. Rekombinantan ekspresioni vektor takođe nosi DHFR gen, što omogućava selekciju CHO ćelija koje su transfekovane sa vektorom, upotrebom selekcije/amplifikacije sa metotreksatom. Selektovane transformisane ćelije domaćini se dalje gaje u kulturi tako da se omogući ekspresija teških i lakih lanaca antitela, a intaktno antitelo se izdvaja iz medijuma za kulturu ćelija. Za pripremu rekombinantnog ekspresionog vektora, transfekciju ćelija domaćina, selekciju transformisanih ćelija, kultivisanje ćelija domaćina i izdvajanje antitela iz medijuma kulture, upotrebljavaju se standardne tehnike molekularne biologije. Nadalјe, pronalazak obezbeđuje postupak sinteze rekombinantnog antitela pronalaska kultivisanjem ćelije domaćina pronalaska u pogodnom medijumu za kulturu dok se ne sintetiše rekombinantno antitelo pronalaska. Postupak može dalјe obuhvatati izolovanje rekombinantnog antitela iz medijuma za kulturu.
[0183] Sledeći aspekt opisa obezbeđuje glikozilovano antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, pri čemu antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen sadrže jedan ili više ostataka uglјenih hidrata. Nascentna in vivo proizvodnja proteina može biti podvrgnuta dalјoj obradi, poznatoj kao post-tralaciona modifikacija. Preciznije, ostaci šećera (glikozil grupe) mogu biti dodate enzimskim putem, procesom koji je poznat kao glikozilacija. Dobijeni proteini koji nose kovalentno povezane oligosaharidne bočne lance su poznati kao glikoziolovani proteini ili glikoproteini. Antitela su glikoproteini sa jednim ili sa više ostataka ugljenih hidrata u Fc domenu, kao i u varijabilnom domenu. Ostaci uglјenih hidrata u Fc domenu imaju važan uticaj na efektorsku funkciju Fc domena, uz minimalan uticaj na vezivanje antigena ili poluživot antitela (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), str. 11-16). Nasuprot navedenom, glikozilacija varijabilnog domena može negativno uticati na aktivnost vezivanja antitela za antigen. Glikozilacija u varijabilnom domenu može imati negativan uticaj na afinitet vezivanja antitela, verovatno usled steričkih ometanja (Co M.S. i saradici, Mol. Immunol. (1993) 30:1361 - 1367), ili može rezultovati povećanim afinitetom za antigen (Wallick S.C. i saradnici, Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright A. i saradnici, EMBO J. (1991) 10:2717-2723).
[0184] Jedan aspekt predmetnog opisa je usmeren na stvaranje mutanata u mestu glikozilacije u kojima je mutirano O- ili N-vezano mesto glikozilacije antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen. Stručnjak iz oblasti može proizvesti takve mutante upotrebom standardne, dobro poznate tehnologije. Mutanti na mestu glikozilacije koji zadržavaju biološku aktivnost, ali imaju povećanu ili smanjenu aktivnost vezivanja, predstavalju drugačiji predmet ovog opisa.
[0185] Prema još jednom drugom aspektu, glikozilacija antitela opisa, ili njegovog dela koji vezuje antigen, je modifikovana. Na primer, može se napraviti aglikolizovano antitelo (tj. antitelo kome nedostaje glikozilacija). Glikozilacija može biti izmenjena, na primer, da bi se povećao afinitet antitela za antigen. Takve modifikacije uglјenih hidrata mogu biti postignute, na primer, izmenom jednog ili više mesta glikozilacije unutar sekvence antitela. Na primer, može se izvršiti jedna ili više aminokiselinskih supstitucija čiji će rezultat biti eliminacija jednog ili više meta glikozilacije u varijabilnom regionu i čime bi se glikozilacija na tom mestu eliminisala. Takve glikozilacije mogu povećati afinitet antitela za antigen. Ovakav pristup je detalјnije opisan u PCT publikaciji WO2003016466A2 i u U.S. Pat. No. 5,714,350 i 6,350,861.
[0186] Dodatno ili alternativno, modifikovano antitelo opisa može biti napravljeno tako da sadrži alternativni tip glikozilacije, kao što hipofukozilovano antitelo koga karakteriše smanjena količina fukozilnih ostataka ili antitelo koga karakteriše bisekcija GlcNAc struktura. Pokazano je da takvi izmenjeni obrasci glikozilacije povećavaju ADCC sposobnost antitela. Navedene modifikacije uglјenih hidrata se mogu postići, npr. ekspresijom antitela u ćeliji domaćinu sa izmenjenom mašinerijom za glikozilaciju. Ćelije sa izmenjenom mašinerijom za glikozilaciju su opisane u stanju tehnike i mogu biti upotrebljene kao ćelije domaćini u kojima se eksprimiraju rekombinantna antitela pronalaska da bi se time proizvela antitela sa izmenjenom glikozilacijom. Pogledati, na primer, Shields R. L. i saradnici (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana i saradnici (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, kao i Evropski patent br. EP 1,176,195; PCT publikacije WO 03/035835; WO 99/5434280.
[0187] Glikozilacija proteina zavisi od aminokiselinske sekvence proteina od interesa, kao i od ćelije domaćina u kojoj se protein eksprimira. Različiti organizmi mogu proizvesti različite enzime glikozilacije (npr. glikoziltransferaze i glikozidaze) i imati dostupnima različite supstrate (nukleotidne šećere). Zbog ovakvih faktora, obrazac glikozilacije proteina i sastav glikozilovanih ostataka se može razlikovati u zavisnosti od sistema domaćina u kojem se određeni protein eksprimira. Glikozilovani ostaci koji su korisni za pronalazaku mogu uklјučivati, ali nisu ograničeni na, glukozu, galaktozu, manozu, fukozu, nacetilglukozamin i sijalinsku kiselinu. Poželјno je glikozilovano antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen, a koje sadrži glikozilne ostatke tako da je obrazac glikozilacije humani.
[0188] Stručnjacima iz oblasti tehnike je poznato da razlike u glikozilaciji proteina mogu rezultovati razlikama u karakteristikama proteina. Na primer, efikasnost terapijskog proteina proizvedenog u mikroorganizamu kao domaćinu, poput kvasca, i glikozilacija upotrebom endogenog puta kvasca može biti smanjena u poređenju sa onom za isti protein eksprimiran u sisarskoj ćeliji kao što je CHO ćelijska linija. Takvi glikoproteini takođe mogu biti imunogeni kod lјudi i ispoljavati smanjen poluživot in vivo nakon primene. Specifični receptori kod lјudi i drugih životinja mogu prepoznavati specifične glikozilovane ostatke i podsticati brzo uklanjanje proteina iz krvotoka. Ostali štetni efekti mogu obuhvatati promene u uvijanju proteina, rastvorlјivosti, podložnosti proteazama, njihovom obrtu, transportu, lokalizaciji u kompartmanima, sekreciji, prepoznavanju od strane drugih proteina i faktora, antigenosti ili alergenosti. Shodno navedenom, stručno lice može preferirati terapijski protein sa specifičnim sastavom i obrascem glikozilacije, na primer sastav glikozilacije i obrazac identičan, ili barem sličan onome koji se proizvodi u humanim ćelijama ili u ćelijama specifičnim za predviđenu vrstu životinje od interesa.
[0189] Ekspresija glikozilovanih proteina različitih od onih iz ćelije domaćina se može postići genetičkim modifikovanjem ćelije domaćina tako da eksprimira heterologne enzime glikozilacije. Upotrebom tehnika koje su poznate u stanju tehnike, stručno lice može generisati antitela, ili njihove delove koji vezuju antigen, koje karakteriše glikozilacija karakteristična za humane proteine. Na primer, sojevi kvasca su bili genetički modifikovani tako da eksprimiraju enzime glikozilacije koji se ne javljaju u prirodi, kao što su glikozilovani protieni (glikoproteini) proizvedeni u tim sojevima kvasca koji ispoljavaju glikozilaciju proteina koja je identična onoj u životinjskim ćelijama, naročito humanim ćelijama (SAD patentne publikacije br.20040018590 i 20020137134 i PCT publikacija WO2005100584 A2).
[0190] Pored antitela ili njihovih delova koji vezuju antigen, predmetni opis je takođe usmeren na antiidiotipska (anti-Id) antitela specifična za takva antitela opisa ili njihove delove koji vezuju antigen. Anti-Id antitelo je antitelo koje prepoznaje jedinstvene determinante koje su uglavnom povezane sa regionom koji vezuje antigen drugog antitela. Anti-Id može biti pripremljen imunizacijom životinje sa antitelom ili njegovim delom koji vezuje antigen, ili pak sa njegovim regionom koji sadrži CDR. Imunizovana životinja će prepoznati i odgovoriti na idiotipske determinante imunizujućeg antitela i proizvesti anti-Id antitelo. Anti-Id antitelo takođe može biti upotrebljeno kao "imunogen" da bi se indukovao imuni odgovor u još nekoj drugoj životinji, čime se proivodi takozvano anti-anti-Id antitelo.
[0191] Dalјe, stručnjaku iz oblasti je važna napomena da protein od interesa može biti eksprimiran upotrebom biblioteke ćelija domaćina genetički konstruisanih tako da eksprimiraju razne glikozilovane enzime, a tako da članovi ćelija domaćina biblioteke proizvode protein od interesa sa raznim varijantama obrazaca glikozilacije. Stručnjak tada može odabrati i izolovati protein od interesa sa određenim novim obrascem glikozilacije. Poželjno je da protein sa određenim odabranim novim obrascem glikozilacije ispoljava pobošana ili izmenjena biološka svojstva.
III. Upotreba antagonističkih anti-CD40 antitela
[0192] Imajući u vidu njihovu sposobnost da se vezuju za humani CD40, antitela za humani CD40 opisa ili njihovi delovi, mogu biti upotrebljeni za detekciju humanog CD40 (npr. u biološkom uzorku kao što je serum ili plazma), upotrebom konvencionalnih imunoanaliza, kao što su imunosorbentne analize povezane sa enzimom (ELISA), radioimunoeseji (RIA) ili imunohistohemija na tkivima. Opis obezbeđuje postupak za detekciju humanog CD40 u biološkom uzorku koji obuhvata kontakt biološkog uzorka sa antitelom ili delom antitela iz opisa i detekciju bilo antitela (ili dela antitela) koje je vezano za humani CD40 ili nevezanog antitela (ili dela antitela), čime se zapravo detektuje humani CD40 u biološkom uzorku. Antitelo je direktno ili indirektno obeleženo supstancom koja se može detektovati da bi se olakšala detekcija vezanog ili nevezanog antitela. Pogodne supstance koje mogu biti detektovane obuhvataju razne enzime, prostetične grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima obuhvataju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, βgalaktozidazu ili acetilholinesterazu; primeri pogodnih kompleksa sa prostetičnim grupama uklјučuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uklјučuju umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala uklјučuje luminol; dok primeri pogodnog radioaktivnog materijala uklјučuju<3>H,<14>C,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>J,<131>J,<177>Lu,<166>Ho ili<153>Sm.
[0193] Kao alternativa obeležavanju antitela, humani CD40 može biti ispitan u biološkim tečnostima upotrebom kompetitivnih imunoanaliza koje koriste rhCD40 standarde obeležene supstancom koja se može detektovati i neobeleženo anti-humano CD40 antitelo. U ovoj analizi, kombinuju se biološki uzorak, obeleženi rhCD40 standardi i anti-humano CD40 antitelo i određuje se količina obeleženog rhCD40 standarda koji je vezan za neobeleženo antitelo. Količina humanog CD40 u biološkom uzorku je obrnuto proporcionalna količini obeleženog rhCD40 standarda koji je vezan za anti-CD40 antitelo. Slično navedenom, humani CD40 takođe može biti ispitan u biološkim tečnostima kompetitivnom imunoanalizom u kojoj se koriste rhCD40 standardi obeleženi detektabilnom supstancom i neobeležena anti-humana CD40 antitela.
[0194] Poželjno je da su antitela i delovi antitela opisa sposobni da neutrališu aktivnost humanog CD40 kako in vitro tako in vivo. Shodno tome, takva antitela i delovi antitela pronalaska mogu biti upotrebljeni za inhibiciju aktivnosti hCD40, npr. u ćelijskoj kulturi koja sadrži hCD40, kod lјudi ili kod drugih sisarskih subjekata koji imaju CD40 sa kojim antitelo pronalaska unakrsno reaguje. Prema jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za inhibiciju aktivnosti hCD40 koji obuhvata dovođenje u kontakt hCD40 sa antitelom, ili sa delom antitela pronalaska, tako da je aktivnost hCD40 inhibirana. Na primer, u ćelijskoj kulturi koja sadrži ili za koju se sumnja da sadrži hCD40, antitelo ili deo antitela pronalaska mogu biti dodati u medijum kulturu da bi se inhibirala aktivnost hCD40 u kulturi.
[0195] Ovde je takođe prijavljen postupak za smanjenje aktivnosti hCD40 kod subjekta, prevashodno kod subjekta koji boluje od bolesti ili poremećaja u kome je aktivnost CD40 štetna. Pronalazak obezbeđuje postupke za smanjenje aktivnosti CD40 kod subjekta koji boluje od takve bolesti ili poremećaja, pri čemu postupak obuhvata primenu antitela ili dela antitela opisa subjektu tako da se aktivnost CD40 kod subjekta smanji. Poželјno je da je CD40 humani CD40 i da je subjekat humani subjekat. Alternativno, subjekat može biti sisar koji eksprimira CD40 za koji je antitelo predmetnog pronalaska sposobno da se veže. Nadalјe, subjekat može biti sisar u koga je uveden CD40 (npr. primenom CD40 ili ekspresijom CD40 transgena). Antitelo pronalaska može biti primenjeno humanom subjektu u terapijske svrhe. Štaviše, antitelo pronalaska može biti primenjeno sisaru različitom od čoveka koji eksprimira CD40 sa kojim je antitelo sposobno da se vezuje u veterinarske svrhe ili kada životinja predstavlja animalni model humanog oboljenja. U pogledu drugog slučaja, ovakvi životinjski modeli mogu biti korisni za procenu terapijske efikasnosti antitela pronalaska (npr. za ispitivanje doza i vremenskih tokova primene).
[0196] Kao što se ovde upotrebljava, predviđeno je da termin "poremećaj u kome je aktivnost CD40 štetna" obuhvata oboljenja i druge poremećaje za koje je pokazano ili za koje se sumnja da je prisustvo CD40 kod subjekata koji boluje od poremećaja odgovorno za patofiziologiju ili je faktor koji doprinosi pogoršanju poremećaja. Shodno tome, poremećaj u kome je aktivnost CD40 štetna je poremećaj u kome se očekuje da smanjenje aktivnosti CD40 ublaži simptome i/ili napredovanje poremećaja. Takvi poremećaji mogu biti utvrđeni, na primer, povećanjem koncentracije CD40 u biološkoj tečnosti subjekata koji boluje od poremećaja (npr. porastom koncentracije CD40 u serumu, plazmi, sinovijalnoj tečnosti, itd. subjekata), a koji mogu biti detektovani, na primer, upotrebom anti-CD40 antitela kao što je prethodno opisano. Neograničavajući primeri poremećaja koji mogu biti lečeni sa antitelima pronalaska i njihovim varijantama ili njihovim fragmentima koji vezuju antigen, obuhvataju one poremećaje koji se razmatraju u odeljcima koji slede i odnose se na farmaceutske kompozicije antitela pronalaska. Na primer, odgovarajući poremećaji obuhvataju, ali nisu ograničeni na, sistemski eritematozni lupus (SLE), diskoidni lupus, lupusni nefritis, sarkoidozu, juvenilni artritis, reumatoidni artritis, psorijatični artritis, Rojterov sindrom, ankilozirajući spondilitis, gihtni artritis, odbacivanje transplantiranih organa ili tkiva, bolest “domaćin protiv kalema”, multiplu sklerozu, hiper IgE sindrom, poliarteritis nodozu, primarnu bilijarnu cirozu, inflamatornu bolest creva, Kronovu bolest, celijakiju (enteropatija osetljivu na gluten), autoimuni hepatitis, pernicioznu anemiju, autoimunu hemolitičku anemiju, psorijazu, sklerodermu, mijasteniju gravis, autoimunu trombocitopeniju purpura, autoimuni tiroiditis, Gravovu bolest, Hašimotov tiroiditis, bolest taloženja imunih kompleksa, sindrom imune disfunkcije sa hroničnim umorom (CFIDS), polimiozitis i dermatomiozitis, krioglobulinemiju, trombolizu, kardiomiopatiju, pemfigus vulgaris, plućnu interstitalnu fibrozu, sarkoidozu, dijabetes melitus tipa I i II, hipersenzitivnost odloženog tipa 1, 2, 3 i 4, alergiju ili alergijski poremećaji, astmu, Čarg-Štrausov sindrom (alergijsku granulomatozu), atopijski dermatitis, alergijski i nadražajni kontaktni dermatitis, koprivnjaču, alergiju posredovanu sa IgE, aterosklerozu, vaskulitis, idiopatske inflamatorne miopatije, hemolitičku bolest, Alchajmerovu bolest i hroničnu inflamatornu demijelinizacionu polineuropatiju. U posebnom primeru izvođenja, oboljenje ili poremećaj je hronični inflamatorni poremećaj. U posebnom primeru izvođenja, poremećaj u kome je aktivnost CD40 štetna je inflamatorna bolest creva (IBD), uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, Kronovu bolest ili ulcerozni kolitis.
[0197] Ovde je takođe prijavljeno da anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, mogu biti upotrebljeni za lečenje poremećaja u kome je aktivnost TNFα štetna, uklјučujući, ali ne ograničavajući se na, reumatoidni artritis, ulcerozni kolitis, hidradenitis supurativa, juvenilni idiopatski artritis, psorijatični artritis, psorijazu, ankilozirajući spondilitis i Kronovu bolest. Prema jednom aspektu opisa, poremećaj u kome je aktivnost TNFα štetna je uveitis.
[0198] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje humanog subjekata koji boluje od inflamatorne bolesti creva (IBD).
[0199] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje ulceroznog kolitisa.
[0200] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje Kronove bolesti.
[0201] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje sistemskog eritematoznog lupusa (SLE).
[0202] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje sarkoidoze.
[0203] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje humanog subjekata koji boluje od juvenilnog artritisa.
[0204] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje reumatoidnog artritisa.
[0205] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje psorijatičnog artritisa.
[0206] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje humanog subjekata koji boluje od ankilozirajućeg spondilitisa.
[0207] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje hidradenitisa supurativa.
[0208] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje uveitisa.
[0209] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje Sjogrenog.
[0210] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje psorijaze.
[0211] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje atopijskog dermatitisa.
[0212] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje skleroderme.
[0213] Monoklonska anti-CD40 atitela predmetnog pronalaska će imati potencijal za lečenje i bioloških naivnih pacijenata i populacije koja neadekvantno odgovara na anti-TNF tretman usled centralne uloge CD40 kako u urođenim tako i u adaptivnim imunim odgovorima. Predmenti opisa obezbeđuje tremtan sposoban da inhibira CD40 signalizaciju i time suprimira molekulske puteve kao što su proizvodnja TNF-a i IL-23, ali i ekspresiju adhezionih /kostimulatornih molekula koji održavaju hroničnu inflamaciju u crevima. Na osnovu ekspresionog profilisanja pacijenata koji boluju od Kronove bolesti i lečeni su anti-TNF tretmanom, lečenje sa anti-CD40 može biti sa potencijalom da se proširi izvan populacije koja reaguje na anti-TNF tretman, a da bi se lečio širi obim pacijenata sa Kronovom bolešču. Prema određenim aspektima, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja subpopulacije pacijenata sa IBD-om, onih koji ne reaguju na anti-TNF terapiju. Takvi IBD pacijenti mogu bolovati od Kronove bolesti ili ulceroznog kolitisa i mogu biti oni koji nisu uspeli da reaguju ili su ograničeno reagovali na lečenje sa inhibitorom TNFα, kao što su, ali bez ograničavanja na, infliksimab, adalimumab, certolizumab pegol ili golimumab. Antagonističkog anti-CD40 antitela koja su ovde opisana mogu biti upotrebljena za lečenje pacijenata sa Kronovom bolešću ili ulceroznim kolitisom koji ne reaguju na anti-TNF terapiju. Prema određenim aspektima, pronalazak obuhvata postupak lečenja tretiranog pacienta, npr. odraslog pacijenta, sa umereno do ozbilјno aktivnom Kronovom bolešću, a koji ne reaguje na anti-TNF terapiju.
[0214] Antitela pronalaska, ili njihovi delovi koji vezuju antigen, mogu biti upotrebljeni samostalno ili u kombinaciji za lečenje ovakvih oboljenja. Podrazumeva se da antitela pronalaska, ili njihov deo koji vezuje antigen, mogu biti upotrebljeni samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim agensom, npr. terapijskim agensom, pri čemu je navedeni dodatni agens izabran od strane iskusnog stručnjaka zbog svoje predviđene namene. Na primer, dodatni agens može biti terapijski agens koji je prepoznat u praksi kao koristan u lečenju oboljenja ili stanja koja se leče antitelom predmetnog pronalaska. Dodatni agensi takođe mogu biti agensi koji doprinose korisnoj osobini terapijske kompozicije, npr. agens koji utiče na viskoznost kompozicije. Podrazumeva se i da kombinacije koje će biti obuhvaćene predmetnom prijavom predstavljaju one kombinacije koje su korisne za svoje predviđene namene. Agensi koji su navedeni u dalјem tekstu su ilustrativni za navedene svrhe i nije predviđeno da budu ograničavajući. Kombinacije, koje su deo predmentog opisa, mogu podrazumevati antitela predmetnog pronalaska i najmanje jedan dodatni agens koji je izabran sa spiskova koji slede. Kombinacija takođe može uključivati više od jednog dodatnog agensa, npr. dva ili tri dodatna agensa, ukoliko je kombinacija takva da obrazovana kompozicija može izvršiti predviđenu funkciju.
[0215] Kombinovana terapija može podrazumevati jednan ili više CD40 antagonista, npr. anti-CD40 antitela ili njihove fragmente, formulisane sa i/ili istovremeno primenjene sa jednim ili sa više dodatnih terapijskih agenasa, npr. sa jednim illi sa više od inhibitora citokina i faktora rasta, imunosupresiva, antiinflamatornih agenasa (npr. sistemskih anti-inflamatornih agenasa), antifibrotičnih agenasa, metaboličkih inhibitora, inhibitora enzima i/ili citotoksičnih ili citostatskih agenasa, mitotičkih inhibitora, antitumorskih antibiotika, imunomodulišućih sredstava, vektora za gensku terapiju, alkilirajućh agenasa, antiangiogenih agenasa, antimetabolita, agenasa koji sadrže bor, hemoprotektivnih agenasa, hormona, antihormonskih agenasa, kortikosteroida, fotoaktivnih terapijskih agenasa, oligonukleotida, radionuklidnih agenasa, inhibitora topoizomeraze, inhibitora tirozin kinaze ili radiosenzibilizatora, kako je ovde detaljnije opisano.
[0216] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se u kombinaciji sa drugim agensom za lečenje inflamatorne bolesti creva (IBD). Prema određenim aspektima, drugi agens je mezalamin, balsalazid, azatioprin, 6-MP, metotreksat, infliksimab, certolizumab, adalimumab, golimumab, natalizumab, vedolizumab, ustekinumab ili neka od njihovih kombinacija.
[0217] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se u kombinaciji sa drugim agensom za lečenje SLE, pri čemu je drugi agens nitropasta/nitroglicerin, nifedipin, sildenafil, tadalifil ili neka od njihovih kombinacija.
[0218] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se u kombinaciji sa drugim agensom za lečenje SLE, pri čemu je drugi agens kortikosteroid, endogeni steroidni proizvođač, NSAID, anti-inflamatorni agens, antireumatski lek koji modifikuje bolest (DMARD), imunosupresivni agens, antikoagulans ili neka od njihovih kombinacija.
[0219] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se u lečenju SLE u kombinaciji sa kortikosteroidom. Primeri kortikosteroida koji mogu biti upotrebljeni obuhvataju prednizolon, metilprednizolon, prednizon ili njihove kombinacije.
[0220] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje SLE u kombinaciji sa agensom koje utiče na endogenu proizvodnju steroida, npr. sa kortikotropinom (Acthar).
[0221] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje SLE u kombinaciji sa topikalnom ili injekcionom terapijom. Primer takve terapije uklјučuje, ali nije ograničen na, kortizon, hidrokortizon, pimekrolimus kremu, takrolimus mast, imikvimod ili njihove kombinacije.
[0222] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se u kombinaciji sa nesteroidnim anti-inflamatornim lekom (NSAID) za lečenje SLE. Primer NSAID koji se može biti upotrebljen u kombinovanoj terapiji obuhvata, ali nije ograničen na, indometacin, nabumeton, celekoksib, ibuprofen, naproksen, diklofenak ili njihove kombinacije.
[0223] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje SLE u kombinaciji sa anti-inflamatornim lekom. Prema dodatnim aspektima, anti-inflamatorni lek je acetaminofen i/ili su salicilati.
[0224] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje SLE u kombinaciji sa antireumatskim lekovima koji modifikuju bolest (DMARD). Primer DMARD uklјučuje, ali nije ograničen na, hidroksihlorokin (Plaquenil), hlorokin, metotreksat (Rheumatrex), leflunomid (Arava), sulfasalazin ili njihove kombinacije.
[0225] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se u kombinaciji sa Belimumabom (Benlysta), Rituksimabom (Rituxan), intravenskim Ig ili njihovim kombinacijama.
[0226] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje SLE u kombinaciji sa imunosupresivnim agensom. Primeri imunosupresivnog agensa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, azatioprin (Imuran), ciklofosfamid (Citoxan), ciklosporin, takrolimus i mikofenolat.
[0227] Prema jednom aspektu, anti-CD40 antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, npr. At102, upotrebljava se za lečenje SLE u kombinaciji sa antikoagulansnim agensima. Primeri antikoagulansnog agensa obuhvataju, ali nisu ograničeni na, aspirin, heparin, varfarin i enoksaparin (Lovenox).
[0228] Dalјe slede primeri poželјnih dodatnih terapijskih agenasa koji mogu biti istovremeno primenjeni i/ili formulisani sa jednim ili sa više CD40 antagonista, npr. sa anti-CD40 antitelima ili njihovim fragmentima. Takve kombinacije mogu biti upotrebljene za lečenje poremećaja povezanih sa CD40 kao što je ovde navedeno. Dodatni primeri terapijskih agenasa koji mogu biti istovremeno primenjeni i/ili formulisani sa jednim ili sa više anti-CD40 antitela ili njihovih fragmenata obuhvataju jedan ili više od: TNF antagonista (npr. solubilni fragment TNF receptora, npr. p55 ili p75 humanog TNF receptora ili njegove derivate, npr. TNFR-IgG od 75 kD (fuzioni protein TNF receptora i IgG-a od 75 kD, ENBREL); antagonista enzima za TNF, npr. inhibitore enzima koji konvertuju TNF (TACE); antagonista muskarinskih receptora; antagonista TGF-beta; interferona gama; perfenidona; hemoterapijskih agenasa, npr. metotreksat, leflunomid ili sirolimus (rapamicin) ili njegov analog, npr. CCI-779; inhibitora COX2 i cPLA2; nesteroidnih anti-inflamatornih lekova (NSAID); imunomodulatora; inhibitora p38, inhibitora TPL-2, MK-2 i NFkB, između ostalih.
[0229] Ostale poželјne kombinacije su anti-inflamatorni lekovi koji suprimiraju citokine (CSAID); antitela na ili antagonisi drugih humanih citokina ili faktora rasta, na primer, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-31, interferona, EMAP-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF i endotelina-1, kao i receptora ovih citokina i faktora rasta. Antitela pronalaska ili njihovi delovi koji vezuju antigen se mogu kombinovati sa antitelima za površinske ćelijske molekule kao što su CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD86 (B7.2), CD90, CTLA ili njihovi ligandi, uklјučujući CD154 (gp39 ili CD40L).
[0230] Poželјne kombinacije terapijskih agenasa mogu interferirati u različitim tačkama inflamatorne kaskade; poželјni primeri obuhvataju TNF antagoniste poput himernih, humanizovanih ili humanih TNF antitela, adalimumab, (HUMIRA; D2E7; PCT publikacija br. WO 97/29131), CA2 (REMICADE), CDP 571 i solubilne p55 ili p75 TNF receptore, njihove derivate, (p75TNFR1gG (ENBREL) ili p55TNFR1gG (LENERCEPT), kao i inhibitore enzima koji konvertuje TNF (TACE); slično navedenom, iz istih razloga mogu biti efektivni i ihibitori IL-1 (inhibitori enzima koji konvertuju interleukin-1, IL-1RA itd.). Ostale poželјne kombinacije obuhvataju Interleukin 4.
[0231] Režim doziranja se može prilagoditi tako da se obezbedi optimalni želјeni odgovor (npr. terapijski ili profilaktički odgovor). Na primer, može biti primenjen jedan bolus, može biti primenjeno više podelјenih doza tokom određenog vremenskog perioda ili doza može biti proporcionalno smanjena ili povećana shodno potrebama terapijske situacije. Naročito je pogodno da se matične kompozicije formulišu u jedinične dozne oblike koji su pogodni za lakšu primenu i ujednačenost režima primene doza. Jedinični dozni oblici, kako se ovde upotrebljava, odnose se na fizički diskretne jedinice koje su pogodne kao jedinične doze kojima će biti tretirani sisarski subjekti; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja za koju je izračunato da proizvodi želјeni terapijski efekat kada se udruži sa neophodnim farmaceutskim nosačem. Specifikacija jediničnih doznih oblika pronalaska je usmerena sa ili usmerena u zavisnosti od (a) jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i određenog terapijskog ili profilaktičkog efekta koji je potrebno postići i (b) ograničenja svojstvenih stanju tehnike za jedinjenja poput aktivnog jedinjenja za lečenje osetlјivosti kod pojedinaca.
[0232] Potrebno je napomenuti da vrednosti doza mogu varirati sa tipom i ozbiljnošću stanja koje je potrebno ublažiti. Podrazumeva se dalje da je za svakog određenog subjekta potrebno podesiti specifične režime doiziranja tokom određenog vremenskog perioda, shodno individualnim potrebama i profesionalnoj proceni stručnjaka koji primenjuje ili nadgleda primenu kompozicija, kao i da su opsezi doza koji su ovde navedeni samo primer i da nije predviđeno da ograničavaju obim ili praksu prijavljene kompozicije.
[0233] Prema sledećem aspektu, ova prijava ukazuje na postupak lečenja (npr. izlečenja, suprimiranja, ublažavanja, odlaganja ili prevencije početka ili prevencije ponovne pojave ili relapsa) ili prevencije poremećaja u kome je aktivnost CD40 štetna za subjekta. Postupak obuhvata: primenu CD40 vezujućeg agensa (naročito antagoniste), npr. anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta subjektu, kao što je ovde opisano, u količini dovolјnoj za lečenje ili prevenciju poremećaja asociranog sa CD40. CD40 antagonista, npr. anti-CD40 antitelo ili njegov fragment, može biti primenjeno subjektu samostalno ili u kombinaciji sa drugim terapijskim modalitetima, kao što je ovde opisano.
[0234] Prema sledećem aspektu, ova prijava opisuje postupak za detekciju prisustva CD40 u uzorku in vitro (npr. u biološkom uzorku poput seruma, plazme, tkiva, biopsije). Predmetni postupak može biti upotrebljen za dijagnozu poremećaja, npr. inflamatornog poremećaja. Postupak obuhvata: (i) dovođenje uzorka ili kontrolnog uzorka u kontakt sa anti-CD40 antitelom ili njegovim fragmentom, kao što je ovde opisano; i (ii) detekciju obrazovanja kompleksa između anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta i uzorka ili kontrolnog uzorka, pri čemu statistički značajna promena obrazovanja kompleksa u uzorku u odnosu na kontrolni uzorak ukazuje na prisustvo CD40 u uzorku.
[0235] Prema još jednom aspektu, predmetna prijava opisuje postupak za detekciju prisustva CD40 in vivo (npr. smimanjem subjekta in vivo). Predmetni postupak može biti upotrebljen za dijagnozu poremećaja, npr. poremećaja povezanog sa CD40. Postupak obuhvata: (i) primenu anti-CD40 antitela ili njegovog fragmenta subjektu ili kontrolnom subjektu, kao što je ovde opisano, pod uslovima koji omogućavaju vezivanje antitela ili fragmenta za CD40; i (ii) detekciju obrazovanja kompleksa između antitela ili fragmenta i CD40, pri čemu statistički značajna promena u obrazovanju kompleksa kod subjekata u odnosu na kontrolnog subjekta ukazuje na prisustvo CD40.
[0236] Zamene aminokiselinskih ostataka u Fc delu, a da bi se izmenila efektorska funkcija antitela, poznate su u stanju tehnike (Winter i saradnici, U.S. Patent No. 5,648,260; 5624821). Fc deo antitela posreduje u nekoliko važnih efektorskih funkcija, npr. indukciji citokina, ADCC, fagocitozi, citotoksičnosti zavisnoj od komplementa (CDC) i stopi poluživota/klirensa antitela i kompleksa antigen-anatitelo. U pojedinim slučajevima, ove efektorske funkcije su poželјne za terapijsko antitelo, dok u drugim slučajevima mogu biti nepotrebne ili čak štetne, u zavisnosti od terapijskih cilјeva. Određeni humani IgG izotipovi, naročito IgG1 i IgG3, posreduju u ADCC i CDC putem vezivanja za FcγRs i komplement C1q, tim redom. Neonatalni Fc receptori (FcRn) su kritične komponente koje određuju poluživot antitela u cirkulaciji. U još jednom primeru izvođenja, najmanje jedan aminokiselinski ostatak u konstantnom regionu antitela, npr. Fc regionu antitela, je zamenjen tako da su efektorske funkcije antitela izmenjene.
[0237] Jedan aspekt obezbeđuje obeleženo antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, pri čemu je antitelo ili deo antitela pronalaska derivatizovan ili povezan sa jednim ili sa više funkcionalnih molekula (npr. sa drugim peptidom ili proteinom). Na primer, obeleženo antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, mogu biti izvedeni funkcionalnim povezivanjem antitela ili dela antitela iz opisa (hemijskim kuplovanjem, genetičkom fuzijom, nekovalentnim udruživanjem ili na neki drugi način) sa jednim ili sa više drugih molekulskih entiteta kao što su drugo antitelo (npr. sa bispecifično antitelo ili dimerno antitelo), agens koji se može detektovati, farmaceutski agens, protein ili peptid koji može posredovati u udruživanju antitela ili dela antitela sa drugim molekulom (kao što je centralni region streptavidina ili polihistonski tag) i/ili citotoksični ili terapijski agens izabran iz grupe koju čine mitotski inhibitor, antitumorski antibiotik, imunomodulatorni agens, vektor za gensku terapiju, alkilujući agens, antiangiogeni agens, antimetabolit, agens koji sadrži bor, hemoprotektivni agens, hormon, antihormonski agens, kortikosteroid, fotoaktivni terapijski agens, oligonukleotid, radionuklidni agens, inhibitor topoizomeraze, inhibitor tirozin kinaze, radiosenzibilizator i njihova kombinacija.
[0238] Korisni agensi za detekciju sa kojima antitelo ili deo antitela iz opisa mogu biti derivatizovani obuhvataju fluorescentna jedinjenja. Primeri fluorescentnih agenasa koji se mogu detektovanti uključuju fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, 5-dimetilamin-1-naftalensulfonil hlorid, fikoeritrin i slične. Antitelo takođe može biti derivatizovano sa enzimima koji se mogu detektovati poput alkalne fosfataze, peroksidaze rena, glukozne oksidaze i sličnih. Kada se antitelo derivatizuje enzimom koji se može detektovati, ono se detektuje dodavanjem dodatnih reagenasa koje enzim uporebljava za proizvodnju detektabilnog reakcionog proizvoda. Na primer, kada je kao agens koji se može detektovati prisutna peroksidaza rena, dodavanje vodonik peroksida i diaminobenzidina dovodi do obojenog produkta reakcije koji se može detektovati. Antitelo se takođe može derivatizovati biotinom i detektovati indirektnim merenjem vezivanja avidina ili streptavidina.
[0239] Sledeći aspekt opisa obezbeđuje kristalizovano antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen. Poželјno je da se prijava odnosi na kristale celokupnih anti-CD40 antitela i njihovih fragmenata koji su ovde prijavljeni, kao i na formulacije i kompozicije koje takve kristale sadrže. Prema jednom aspektu, kristalizovano antitelo ili njegov deo koji vezuje antigen imaju veći poluživot in vivo nego solubilni parnjak antitela ili njegovog dela koji vezuje antigen. Prema drugom aspektu, antitelo, ili njegov deo koji vezuje antigen, zadržava biološku aktivnost nakon kristalizacije.
[0240] Kristalizovano antitelo opisa, ili njegov deo koji vezuje antigen, može biti proizvedeno prema postupcima koji su poznati u stanju tehnike i kao što je prijavljeno u WO 02072636.
IV. Farmaceutske kompozicije
[0241] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo pronalaska i farmaceutski prihvatlјiv nosač.
[0242] Farmaceutske kompozicije pronalaska mogu sadržavati "terapijski efektivnu količinu" ili "profilaktički efektivnu količinu" antitela pronalaska. "Terapijski efektivna količina" se odnosi na količinu koja je, u dozama i tokom neophodnog vremenskog perioda, efektivna u postizanju želјenog terapijskog rezultata. Terapijski efektivnu količinu antitela ili dela antitela može odrediti stručnjak iz oblasti tehnike i ona može varirati u zavisnosti od faktora kao što su stanje oboljenja, starost, pol i telesna težina pojedinca, kao i od sposobnosti antitela ili dela antitela da izazove želјeni odgovor kod individue. Terapijski efektivna količina je takođe ona pri kojoj korisni terapijski efekti nadmašuju bilo koja toksična ili štetna dejstva antitela ili dela antitela. "Profilaktički efektivna količina" se odnosi na količinu koja je, u dozama i tokom neophodnog vremenskog perioda, efektivna u postizanju želјenog profilaktičkog rezultata. Uobičajeno je da, pošto se profilaktička doza koristi kod subjekata pre ili u ranijem stadijumu bolesti, profilaktički efektivna količina bude manja od terapijski efektivne količine.
[0243] Farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela pronalaska su za upotrebu u, ali ne ograničavajući se na postavljanje dijagnoze, detekciju ili praćenje poremećaja, kao i u prevenciji, lečenju, kontroli ili pobolјšanju poremećaja ili jednog ili više od njegovih simptoma, i/ili u istraživanju. U specifičnom primeru izvođenja, kompozicija sadrži jedno ili više antitela pronalaska. Takođe su prijavljene farmaceutske kompozicije koje sadrže jedno ili više antitela pronalaska i jedan ili više profilaktičkih ili terapijskih agenasa koja nisu antitela pronalaska, a za lečenje poremećaja u kome je aktivnost CD40 štetna. Poželјno je da se upotrebljavaju profilaktički ili terapijski agensi za koja je poznato da su od koristi za ili koji su bili primenjeni ili se trenutno koriste u prevenciji, lečenju, kontroli ili pobolјšanju poremećaja ili jednog ili više od njegovih simptoma. U skladu sa ovim primerima izvođenja, kompozicija može dalјe sadržavati nosač, razblaživač ili ekscipijens.
[0244] Antitela pronalaska mogu biti ugrađena u farmaceutske kompozicije pogodne za primenu subjektu. Farmaceutska kompozicija obično sadrži antitelo pronalaska i farmaceutski prihvatlјiv nosač. Kao što se ovde upotrebljava, "farmaceutski prihvatlјiv nosač" obuhvata bilo koji i sve rastvarače, disperzione medijume, sredstva za oblaganje, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične i agense za odloženu apsorpciju i slične koji su fiziološki kompatibilni. Primeri farmaceutski prihvatlјivih nosača obuhvataju jedno ili više od vode, fiziološkog rastvora, fiziološkog rastvora puferisanog fosfatom, dekstroze, glicerola, etanola i sličnog, kao i njihove kombinacije. U mnogim slučajevima, poželjnije je da u kompoziciju budu uključeni izotonični agensi, npr. šećeri, polialkoholi poput manitola, sorbitola ili natrijum hlorid. Farmaceutski prihvatlјivi nosači mogu dalјe obuhvatati minorne količine pomoćnih supstanci kao što su ovlaživači ili emulgatori, konzervansi ili puferi, a koji povećavaju rok trajanja ili efektivnost antitela ili dela antitela.
[0245] Poznati su razni sistemi za isporuku i oni mogu biti upotrebljeni za primenu jednog ili više antitela pronalaska ili kombinacije jednog ili više antitela pronalaska i profilaktičkog agensa ili terapijskog agensa koji je od koristi za prevenciju, kontrolisanje, lečenje ili ublažavanje poremećaja ili jednog ili više od njegovih simptoma, npr. inkapsulacija u lipozome, mikročestice, mikrokapsule, rekombinantne ćelije sposobne da eksprimiraju antitelo ili fragment antitela, endocitoza posredovana receptorima (pogledat npr. Wu i Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), sinteza konstrukta nukleinske kiseline kao dela retrovirusnog ili drugog vektora, itd. Postupci primene profilaktičkog ili terapijskog agensa pronalaska obuhvataju, ali nisu ograničeni na, parenteralnu primenu (npr. intradermalnu, intramuskularnu, intraperitonealnu, intravensku i subkutanu), epiduralnu primenu, intratumorsku primenu i primenu preko sluzokože (npr. intranazalne i oralne puteve primene). Dodatno, može se koristiti primena putem pluća, npr. upotrebom inhalatora ili nebulizatora, kao i formulisanjem sa aerosolubilizujućim agensom. Pogledati npr. U.S. Pat. No. 6,019,968; 5,985, 320; 5,985,309; 5,934, 272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290, 540 i 4,880,078; i PCT publikacije br. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 i WO 99/66903. Prema jednom aspektu opisa, antitelo pronalaska, kombinovana terapija ili kompozicija predmetnog pronalaska se primenjuju upotrebom Alkermes AIR tehnologije za primenu lekova putem pluća (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass). Prema specifičnom aspektu, profilaktički ili terapijski agensi pronalaska se primenjuju intramuskularno, intravenski, intratumorski, oralno, intranazalno, putem pluća ili potkožno. Profilaktički ili terapijski agensi mogu biti primenjeni bilo kojim konvencionalnih načinom primene, na primer, infuzijom ili bolusnom injekcijom, apsorpcijom kroz epitelne ili mukokutane ovojnice (npr. kroz oralnu, rektalnu ili sluzokožu creva, itd.), a mogu biti primenjeni i zajedno sa drugim biološki aktivnim agensima. Primena može biti sistemska ili lokalna.
[0246] Prema specifičnom aspektu, može biti poželјno da se profilaktički ili terapijski agensi pronalaska primenjuju lokalno na područje kome je lečenje potrebno; ovo se može postići, na primer, a da ne predstavlja ograničenje, putem lokalne infuzije, injekcije ili putem implanta, pri čemu je navedeni implant od poroznog ili neporoznog materijala i uključuje i membrane i matrikse poput sijalasičnih membrana, polimera, fibroznih matrica (npr. TISSUEL) ili kolagenih matriksa. Prema jednom aspektu, efektivna količina jednog ili više od antitela kao antagonista pronalaska, primenjuje se subjektu lokalno na zahvaćeno područje da bi se sprečio, lečio, kontrolisao i/ili pobolјšao poremećaj ili njegov simptom. Prema drugom aspektu, efektivna količina jednog ili više antitela pronalaska se primenjuje subjektu lokalno na zahvaćeno područje, u kombinaciji sa efektivnom količinom jedne ili više terapija različitih od antitela pronalaska (npr. sa jednim ili sa više profilaktičnih ili terapijskih agenasa), da bi se sprečio, lečio, kontrolisao i/ili pobolјšao poremećaj ili jedan ili više od njegovih simptoma.
[0247] Prema sledećemm aspektu, profilaktički ili terapijski agens pronalaska može biti isporučen sistemom za kontrolisano oslobađanje ili za kontinuirano oslobađanje. Prema jednom aspektu, za postizanje kontrolisanog ili kontinuiranog oslobađanja može biti upotrebljena pumpa (pogledati Langer, navedeno prethodno; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald i saradnici, 1980, Surgery 88:507; Saudek i saradnici, 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Prema drugom aspektu, za postizanje kontrolisanog ili kontinuiranog oslobađanja terapija pronalaska mogu biti upotrebljeni polimerni materijali (pogledati npr. Medical Applications of Controlled Release, Langer i Wise (ur.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen i Ball (ur.), Wiley, New York (1984); Ranger i Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; pogledati takođe Levy i saradnici, 1985, Science 228:190; During i saradnici, 1989, Ann Neurol.25:351; Howard i saradnici, 1989, J. Neurosurg.71:105); U.S. Pat. No.5,679,377; U.S. Pat. No.5, 916,597; U. S. Pat. No. 5,912,015; U.S. Pat. No. 5,989,463; U.S. Pat. No. 5,128,326; PCT publikaciju br. WO 99/15154; i PCT publikaciju br. WO 99/20253. Primeri polimera koji se upotrebljavaju u formulacijama za kontinuirano oslobađanje obuhvataju, ali nisu ograničeni na, poli(2-hidroksi etil metakrilat), poli(metil metakrilat), poli(akrilnu kiselinu), poli(etilen-ko-vinil acetat), poli(metakrilnu kiselinu), poliglikolide (PLG), polianhidride, poli(N-vinil pirolidon), poli(vinil alkohol), poliakrilamid, poli(etilen glikol), polilaktide (PLA), poli(laktid-ko-glikolide) (PLGA) i poliortoestre. U poželјnom primeru izvođenja, polimer upotrebljen u formulaciji za kontinuirano oslobađanje je inertan, osobođen nečistoća koje se mogu ispirati, stabilan je pri skladištenju, sterilan i biorazgradiv. U još jednom izvođenju, sistem sa kontrolisanim ili kontinuiranim oslobađanjem može biti postavlјen u blizini profilaktičkog ili terapijskog cilјnog molekula čime zapravo postaje neophodna samo frakcija sistemske doze (pogledati npr. Goodson, u Medical Applications of Controlled Release, naveden prehtodno, vol. 2, str. 115-138 (1984)).
[0248] Sistemi za kontrolisano oslobađanje su razmatrani u revijskom pregledu Langer-a (1990, Science 249:1527-1533). Bilo koja tehnika poznata stručnjaku može biti upotrebljena za proizvodnju formulacija sa kontinuiranim oslobađanjem koje sadrže jedno ili više terapijskih agensa pronalaska. Pogledati, npr.
U. S. Pat. No.4,526, 938, PCT publikaciju WO 91/05548, PCT publication WO 96/20698, Ning i saradnici, 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song i saradnic, 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek i saradnici, 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application", Pro. Int’l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854 i Lam i saradnici, 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proc. Int’l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater.24:759- 760.
[0249] Prema specifičnom aspektu opisa, kada je kompozicija opisa nukleinska kiselina koja kodira profilaktički ili terapijski agens, nukleinska kiselina može biti primenjena in vivo da bi se podstakla ekpresija profilaktičkog ili terapijskog agensa koga ona kodira, konstruisanjem iste tako da bude deo odgovarajućeg vektora koji eksprimira nukleinsku kiselinu i odgovarajućom primenom vektora da bi on postao unutarćelijski, npr. upotrebom retrovirusnog vektora (pogledati U. S. Pat. No. 4,980,286) ili direktnim injeciranjem ili upotrebom bombardovanja mikročesticama (npr. sa genskim pištoljem; Biolistic, Dupont), ili pak oblaganjem sa lipidima ili receptorima ćelijske površine ili sa transfekcionim agensima, ili dalje primenom iste tako što se povezuje sa peptidom sličnim homeoboks peptide, za koga je poznato da ulazi u jedro (pogledati npr. Joliot i saradnici, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). Alternativno, nukleinska kiselina može biti uvedena unutar ćelije i ugrađena unutar DNK ćelije domaćina radi ekspresije homolognom rekombinacijom.
[0250] Farmaceutska kompozicija predmetnog pronalaska je formulisana tako da bude kompatibilna sa predviđenim načinom njene primene. Primeri načina primene obuhvataju, ali nisu ograničeni na, parenteralnu, npr. intravensku, intradermalnu, subkutanu, oralnu, intranazalnu (npr. inhalacijom), transdermalnu (npr. topikalnu), transmukozalnu i rektalnu primenu. U specifičnom primeru izvođenja, kompozicija je formulisana u skladu sa rutinskim procedurama, tj. kao farmaceutska kompozicija prilagođena za intravensku, subkutanu, intramuskularnu, oralnu, intranazalnu ili topikalnu primenu kod lјudi. Uobičajeno je i da su kompozicije za intravensku primenu rastvori u sterilnom izotoničnom vodenom puferu. Kada je to potrebno, kompozicija može takođe sadržavati agens za solubilizaciju i lokalni anestetik poput lignokamna, da bi se ublažio bol na mestu injeciranja.
[0251] Ukoliko se kompozicije pronalaska primenjuju topikalno, kompozicije mogu biti formulisane u obliku masti, kreme, transdermalnog flastera, losiona, gela, šampona, spreja, aerosola, rastvora, emulzije ili drugog oblika koji je dobro poznat stručnjaku iz oblasti tehnike. Pogledati, npr. Remington’s Pharmaceutical Sciences i Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19. Izdanje, Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Za topikalne dozne oblike koji nisu u vidu spreja se koriste viskozni do polučvrsti ili čvrsti oblici koji sadrže nosač ili jedan ili više ekscipijenasa koji su kompatibilni sa topikalnom primenom i dinamičke su viskoznosti koja je poželјno veća od vode. Pogodne formulacije obuhvataju, bez ogranenja, rastvore, suspenzije, emulzije, kreme, masti, prahove, obloge, meleme i slične, koji se, ukoliko je to poželjno, sterilišu ili mešaju sa pomoćnim agensima (npr. konzervansima, stabilizatorima, agensima za vlaženje, puferima ili solima) da bi se uticalo na razna svojstva poput, na primer, osmotskog pritiska. Ostali pogodni topikalni dozni oblici obuhvataju aerosolne preparate koji se mogu raspršivati, gde je aktivni sastojak, poželјno u kombinaciji sa čvrstim ili tečnim inertnim nosačem, zapakovan u smešu sa isparljivom supstancom pod pritiskom (npr. sa gasovitim propelentom poput freona) ili u bocu iz koje se istiskuje. Agensi za održavanje vlage illi vlaženje takođe mogu biti dodati farmaceutskim kompozicijama i doznim oblicima, ukoliko je to potrebno. Primeri takvih dodatnih sastojaka su dobro poznati u stanju tehnike.
[0252] Ukoliko se kompozicije pronalaska primenjuju intranazalnim putem, kompozicija može biti formulisana u obliku aerosola, spreja, pare ili u obliku kapi. Preciznije, profilaktički ili terapijski agensi za upotrebu prema predmetnom opisu mogu biti konvencionalno isporučeni u obliku aerosolnog spreja iz pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, uz upotrebu pogodnog potiskujućeg gasa (npr. dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana, uglјen dioksida ili drugog pogodnog gasa). U slučaju aerosola pod pritiskom, dozna jedinica može biti određena obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i ulošci (sastavlјeni od, npr. želatina) za upotrebu u inhalatoru ili insuflatoru mogu biti formulisani tako da sadrže praškastu smešu jedinjenja i odgovarajuće baze u prahu, kao što su laktoza ili skrob.
[0253] Ukoliko kompozicije pronalaska treba primenjivati oralnim putem, kompozicije mogu biti formulisane za oralnu primenu u obliku tableta, kapsula, kašeta, želatinoznih kaspula, rastvora, suspenzija i sličnog. Tablete ili kapsule mogu biti pripremljene konvencionalnim načinima, sa farmaceutski prihvatlјivim eksipijensima kao što su agensi za povezivanje (npr. preželatinovan kukuruzni skrob, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza); ispunjivači (npr. laktoza, mikrokristalna celuloza ili kalcijum hidrogen fosfat); lubrikanti (npr. magnezijum stearat, talk ili silika); dezintegransi (npr. skrob krompira ili natrijumski glikolat skroba); ili agensi za vlaženje (npr. natrijum lauril sulfat). Tablete mogu biti obložene postupcima koji su dobro poznati u stanju tehnike. Tečni preparati za oralnu primenu mogu biti oblika, ali bez ograničavanja samo na njih, rastvora, sirupa ili suspenzija, ili mogu biti pripremljeni u vidu suvih proizvoda za rekonstituisanje sa vodom ili sa drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Takvi tečni preparati mogu biti pripremljeni na uobičajen način, sa farmaceutski prihvatlјivim aditivima, kao što su agensi za resuspendovanje (npr. sirup sorbitola, derivati celuloze ili hidrogenizovane jestive masti); emulgatori (npr. lecitin ili akacija); nevodeni nosači (npr. bademovo ulјe, masni estri, etil alkohol ili frakcionirana bilјna ulјa); i konzervansi (npr. metil ili propil-p-hidroksibenzoati ili sorbinska kiselina). Preparati mogu takođe sadržavati puferske soli, arome, boje i zaslađivače, prema potrebi. Preparati za oralnu primenu se mogu formulisati na odgovarajući način za sporo oslobađanje, kontrolisano oslobađanje ili kontinuirano oslobađanje profilaktičkog ili terapijskog agensa/agenasa.
[0254] Postupak opisa može obuhvatati primenu preko pluća, npr. upotrebom inhalatora ili nebulizatora, za kompoziciju formulisanu sa aerosolubilizujućim agensom. Pogledati, npr. U.S. Pat. No.
6,019, 968; 5,985, 320; 5, 985,309, 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913, 5,290,540 i 4,880,078; i PCT publikacije br. WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 i WO 99/66903. Prema specifičnom aspektu, antitelo pronalaska, kombinovana terapija i/ili kompozicija pronalaska se primenjuju upotrebom Alkermes AIR tehnologije za primenu lekova preko pluća (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).
[0255] Postupak opisa može obuhvatati primenu kompozicije koja je formulisana za parenteralnu primenu injeciranjem (npr. putem bolusne injekcije ili kontinuirane infuzije). Formulacije za injekciranje mogu biti pripremljene u jediničnom doznom obliku (npr. u ampulama ili u višedoznim posudama) sa dodatkom konzervansa. Kompozicije mogu biti u takvim oblicima kao što su suspenzije, rastvori ili emulzije u ulјanim ili vodenim nosačima, a mogu sadržavati i agense za formulisanje kao što su agensi za resuspendovanje, stabilizaciju i/ili dispergovanje. Alternativno, aktivan sastojak može biti u vidu praška za rekonstituciju sa odgovarajućim nosačem (npr. sa sterilnom vodom bez pirogena) pre upotrebe.
[0256] Postupci opisa mogu dodatno obuhvatati primenu kompozicije formulisane u vidu depopreparata. Takve dugodelujuće formulacije mogu biti primenjene implantacijom (npr. subkutano ili intramuskularno) ili intramuskularnim injeciranjem. Tako, na primer, kompozicije mogu biti formulisane sa pogodnim polimernim ili hidrofobnim materijalima (npr. kao emulzija u prihvatlјivom ulјu) ili sa jonoizmenjivačkim smolama, ili u vidu slabo rastvorljivih derivata (npr. u vidu slabo rastvorlјive soli).
[0257] Postupci opisa obuhvataju primenu kompozicija formulisanih u vidu neutralnih ili oblika soli. Farmaceutski prihvatlјive soli obuhvataju one koje se obrazuju sa anjonima poput onih izvedenih iz hlorovodonične, fosforne, sirćetne, oksalne, vinske kiseline itd., kao i one obrazovane sa katjonima poput onih izvedenih iz natrijuma, kalijuma, amonijuma, kalcijuma, hidroksida gvožđa, izopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanola, histidina, prokaina itd.
[0258] U principu, sastojci kompozicija se isporučuju bilo odvojeno ili se mešaju zajedno u jediničnom doznom obliku, na primer, u vidu su suvog liofilizovanog praha ili koncentrata bez vode u hermetički zatvorenom spremniku poput ampule ili vrećice sa naznačenom količinom aktivnog agensa. Kada je način primene infuzija, kompozicija može biti raspodeljena u boce za infuziju koje sadrže sterilnu vodu ili fiziološki rastvor farmaceutskog stepena čistoće. Ukoliko je način primene injeciranjem, može biti obezbeđena ampula sterilne vode za injekcije ili fiziološkog rastvora, tako da se sastojci mogu pomešati pre primene.
[0259] Preciznije, pronalazak takođe obezbeđuje jedan ili više od profilaktičkih ili terapijskih agenasa, ili su farmaceutske kompozicije pronalaska upakovane u hermetički zatvorenom spremniku, poput ampule ili vrećice sa nazančenom količina agensa. U jednom primeru izvođenja, jedan ili više od profilaktičkih ili terapijskih agenasa ili farmaceutskih kompozicija pronalaska se isporučuje u vidu suvog sterilisanog liofilizovanog praha ili koncentrata bez vode, u hermetički zatvorenom spremniku, i mogu se rekonstituisati (npr. sa vodom ili fiziološkim rastvorom) do odgovarajuće koncentracije za primenu subjektu. Poželјno je da se jedan ili više od profilaktičkih ili terapijskih agenasa ili farmaceutskih kompozicija pronalaska isporučuje u obliku sterilnog suvog liofilizovanog praha u hermetički zatvorenom spremniku, u jediničnoj dozi od najmanje 5 mg, poželјnije najmanje 10 mg, najmanje 15 mg, najmanje 25 mg, najmanje 35 mg, najmanje 45 mg, najmanje 50 mg, najmanje 75 mg ili najmanje 100 mg. Liofilizovane profilaktičke ili terapijske agense ili farmaceutske kompozicije pronalaska bi trebalo čuvati na temperaturi između 2° C i 8° C, u originalnom spremniku, i profilaktičke ili terapijske agense ili farmaceutske kompozicije pronalaska bi trebalo primeniti u roku od jedne nedelјe, poželјno u roku od 5 dana, u roku od 72 sata, u roku od 48 sati, u roku od 24 sata, u roku od 12 sati, u roku od 6 sati, u roku od 5 sati, u roku od 3 sata ili u roku od jednog sata nakon rekonstitucije. U alternativnom primeru izvođenja, jedan ili više od profilaktičkih ili terapijskih agenasa ili farmaceutskih kompozicija pronalaska se isporučuje u tečnom obliku, u hermetički zatvorenom spremniku sa naznačenom količinom i koncentracijom agensa. Poželјno je da se tečni oblik primenjene kompozicije isporučuje u hermetički zatvorenom spremniku sa koncentracijom od najmanje 0,25 mg/ml, poželјnije najmanje 0,5 mg/ml, najmanje 1 mg/ml, najmanje 2,5 mg/ml, najmanje 5 mg/ml, najmanje 8 mg/ml, najmanje 10 mg/ml, najmanje 15 mg/ml, najmanje 25 mg/ml, najmanje 50 mg/ml, najmanje 75 mg/ml ili najmanje 100 mg/ml. Tečni oblik bi trebalo čuvati na temperaturi između 2° C i 8° C, u njegovoj originalnoj ambalaži.
[0260] Antitela pronalaska mogu biti ugrađena u farmaceutsku kompoziciju koja je pogodna za parenteralnu primenu. Poželјno je da antitelo bude pripremlјeno kao rastvor za injeciranje koji sadrži 0,1-250 mg/ml antitela. Injekcioni rastvor može biti sastavlјen bilo od tečnog ili liofilizovanog doznog oblika u kvarcnoj ili ćilibarnoj bočici, ampuli ili u prehtodno napunjenom špricu. Pufer može biti L-histidin (1-50 mM), optimalno koncentracije 5-10 mM, pH 5,0 do 7,0 (optimalan pH je 6,0). Drugi pogodni puferi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, natrijum sukcinat, natrijum citrat, natrijum fosfat ili kalijum fosfat. Natrijum hlorid može biti upotrebljen za modifikaciju toksičnosti rastvora u koncentraciji od 0-300 mM (za tečni dozni oblik je optimalno 150 mM). Krioprotektanti mogu biti uklјučeni u liofilizovan dozni oblik i uglavnom podrazumevaju 0-10% saharozu (optimalno je 0,5-1,0%). Drugi pogodni krioprotektanti obuhvataju trehalozu i laktozu. Sredstva za zgušnjavanje mogu biti uključena u liofilizovan dozni oblik, uglavnom u vidu 1-10% manitola (optimalno je 2-4%). Stabilizatori mogu biti upotrebljeni i u tečnim i liofilizovanim doznim oblicima i uglavnom se podrazumeva L-metionin u koncentradiji 1-50 mM (optimalno 5-10 mM). Drugi pogodni agensi za zgušnjavanje podrazumevaju glicin, arginin, a može biti uključen i 0-0,05% polisorbat-80 (optimalno 0,005-0,01%). Dodatni površinski aktivni agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, polisorbat 20 i BRIJ surfaktant. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitela pronalaska, pripremlјena kao injekcioni rastvor za parenteralnu primenu, može dalјe sadržavati agens koji je koristan kao adjuvans, poput onog koji se upotrebljava za povećanje apsorpcije ili disperzije terapijskog proteina (npr. antitela). Posebno koristan adjuvans je hijaluronidaza, kao što je HYLENEX (rekombinantna humana hijaluronidaza). Dodavanje hijaluronidaze u injekcioni rastvoru pobolјšava bioraspoloživost nakon parenteralne primene kod ljudi, posebno nakon subkutane primene. Omogućava i primene većih zapremina na mestu injeciranja (tj. veće od 1 ml) sa manje bola i nelagode, kao i minimalnu učestalost reakcija na mestu injeciranja (pogledati WO2004078140, US2006104968).
[0261] U jednom primeru izvođenja, pronalazak uključuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo pronalaska, npr. antitelo At102, histidin i polisorbat, npr. polisorbat 80. U jednom primeru izvođenja, pronalazak obuhvata farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo koga čine teški lanac koji sadrži aminokiseline iz SEQ ID NO: 41 i laki lanac koji sadrži aminokiseline iz SEQ ID NO: 40, histidin i polisorbat, npr. polisorbat 80. U određenim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je liofilizovana.
[0262] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu biti u raznim oblicima. Oni obuhvataju, na primer, tečne, polučvrste i čvrste dozne oblike poput tečnih rastvora (npr. injektibilnih i infuzivnih rastvora), disperzija ili suspenzija, tableta, pilula, praškova, lipozoma i supozitorija. Poželјan oblik zavisi od planiranog načina primene i terapijske primene. Uobičajene poželјne kompozicije su u obliku injekcionih ili infuzionih rastvora, kao što su kompozicije slične onima koje se koriste za pasivnu imunizaciju lјudi sa drugim antitelima. Poželјan način primene je parenteralni (npr. intravenski, subkutani, intraperitonealni, intramuskularni). U poželјnom primeru izvođenja, antitelo se primenjuje intravenskom infuzijom ili injekcijom. U drugom poželјnom primeru izvođenja, antitelo se obezbeđuje intramuskularnom ili subkutanom injekcijom.
[0263] Terapijske kompozicije obično moraju biti sterilne i stabilne u uslovima proizvodnje i skladištenja. Kompozicija može biti formulisana kao rastvor, mikroemulzija, disperzija, lipozom ili druga ciljna struktura koja je pogodna za visoku koncentraciju leka. Sterilni injekcioni rastvori mogu biti pripremljeni ugradnjom aktivnog jedinjenja (tj. antitela ili dela antitela) u količini koja je potrebna, i u odgovarajućem rastvaraču, sa jednom ili sa kombinacijom sastojaka koja je prethodno nabrojana, ukoliko je to potrebno, nakon čega sledi sterilizacija filtriranjem. U principu, disperzije se pripremaju ugradnjom aktivnog jedinjenja u sterilni nosač koji sadrži osnovni mediju za dispergovanje i druge neophodne sastojke od onih koji su prethodno nabrojani. U slučaju sterilnih, liofilizovanih prahova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, poželјni postupci pripreme su sušenje pod vakuumom i sušenje raspršivanjem koje obezbeđuje prašak aktivnog sastojka sa bilo kojim dodatnim želјenim sastojkom iz prethodno filtersterilisanog rastvora. Pravilna fluidnost rastvora može biti održana, na primer, upotrebom premaza poput lecitina, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije, i upotrebom površinski aktivnih materija. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija se može postići uklјučivanjem, u kompoziciju, agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, monostearatnih soli i želatina.
[0264] Antitela predmetnog pronalaska mogu biti primenjena raznim postupcima koji su poznati u stanju tehnike, iako je za mnoge terapijske primene poželјan put/način primene u vidu subkutane injekcije, intravenske injekcije ili infuzije. Kao što će stručnjak prepoznati, put i/ili način primene će se razlikovati u zavisnosti od želјenih rezultata. U određenim primerima izvođenja, aktivno jedinjenje može biti pripremljeno sa nosačem koji će zaštititi jedinjenje od brzog otpuštanja, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem koja podrazumeva implante, transdermalne flastere i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Mogu biti upotrebljeni biorazgradivi, biokompatibilni polimeri poput etilen vinil acetata, polihidrida, poliglikolne kiseline, kolagena, polortoestara i polimlečne kiseline. Mnogi postupci za pripremu takvih formulacija su patentirani ili su opšte poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Pogledati, npr. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ur., Marcel Dekker, Inc., Nju Jork, 1978.
[0265] U pojedinim primerima izvođenja, antitelo pronalaska može biti primenjivano oralno, na primer, sa intertnim razblaživačem ili sa jestivim nosačem koji se može asimilovati. Jedinjenje (i drugi sastojci, po želјi) takođe mogu biti inkapsulirani u tvrdu ili meku želatinožnu kapsulu, komprimirani u tablete ili direktno uvedeni u ishranu subjekata. Za oralnu terapijsku primenu, jedinjenja mogu biti ugrađena sa eksipijensima i upotrebljena u obliku tableta za gutanje, bukalnih tableta, dražeja, kapsula, eliksira, suspenzija, sirupa, oblandi i sličnog. Za primenu jedinjenja pronalaska drugačijim načinom od parenteralne primene, može biti neophodno da se jedinjenje obloži sa ili istovremeno primeni sa materijalom koji sprečava njegovu inaktivaciju.
[0266] U drugim primerima izvođenja, antitelo pronalaska može biti konjugovano sa supstratom na bazi polimera tako da navedeni supstrat na bazi polimera može obezbediti dovoljnu veličinu navedenom antitelu ili delu antitela, a što navedenom antitelu ili delu antitela pronalaska dalje obezbeđuje korist tipa pojačane permeabilnosti i efekta zadržavanja (EPR efekat) (pogledati takođe PCT publikaciju br. WO2006/042146A2 i SAD publikacije br. 2004/0028687A1, 2009/0285757A1 i 2011/0217363A1, kao i U.S. Patent No.7,695,719.
[0267] Dopunska aktivna jedinjenja takođe mogu biti ugrađena u kompozicije. U određenim primerima izvođenja, antitelo pronalaska je formulisano i/ili se istovremeno primenjuje sa jedinim ili sa više dodatnih terapijskih agenasa koji su korisni za lečenje poremećaja u kojima je aktivnost CD40 štetna. Na primer, anti-hCD40 antitelo ili deo antitela pronalaska može biti formulisano i/ili se istovremeno primenjeno sa jedinim ili sa više dodatnih antitela koja vezuju druge cilјne molekule (npr. sa antitelima koja vezuju citokine ili koja vezuju molekule ćelijske površine). Pored toga, jedno ili više antitela pronalaska može biti upotrebljeno u kombinaciji sa dva ili više prethodno navedenih terapijskih agenasa. Takve kombinovane terapije mogu biti od koristi zbog upotrebe nižih doza terapijskih agenasa koji se primenjuju, čime se izbegavaju moguće toksičnosti ili komplikacije povezane sa raznim monoterapijama.
[0268] U određenim primerima izvođenja, antitelo na CD40 je povezano sa nosačem za produžavanje polu-života koji je poznat u stanju tehnike. Takvi agensi obuhvataju, ali nisu ograničeni na, Fc domen, polietilen glikol i dekstran. Ovakvi nosači su opisani, npr. u SAD prijavi serijskog broja 09/428,082 i objavlјenoj PCT prijavi br. WO 99/25044.
[0269] Ovde je prijavljeno i da se sekvence nukleinskih kiselina koje sadrže nukleotidne sekvence koje kodiraju antitelo pronalaska ili drugog profilaktičkog ili terapijskog agensa primenjuju za lečenje, prevenciju, kontrolisanje ili poboljšavanje poremećaja ili jednog ili više od njegovih simptoma putem genske terapije. Genska terapija se odnosi na terapiju koju se sprovodi primenom eksprimirane, ili nukleinske kiseline koja se može eksprimirati, subjektu. Prema ovom aspektu opisa, nukleinske kiseline proizvode svoje kodirajuće antitelo ili profilaktički ili terapijski agens koji posreduje u profilaktičkom ili terapijskom efektu.
[0270] Bilo koja od postupaka za gensku terapiju koji je dostupan u stanju tehnike može biti upotrebljen u skladu sa predmetnim opisom. Za opšte preglede postupaka genske terapije, pogledati Goldspiel i saradnici, 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu i Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); i Morgan i Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; maj, 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Postupci koji su uobičajeno poznati u stanju tehnike rekombinantne DNK i koji mogu biti upotrebljeni su opisani u Ausubel i saradnici (ur.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); i Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Detalјan opis raznih postupaka genske terapije je obezbeđen u US20050042664 A1.
[0271] Stručnjacima će biti jasno da su druge pogodne modifikacije i prilagođavanja ovde opisanih postupaka pronalaska očigledne i da se mogu izvesti upotrebom odgovarajućih ekvivalenta bez odstupanja od područja pronalaska ili primera izvođenja koji su ovde opisani. Nakon što je sada detalјno opisan predmetni pronalazak, isti će biti jasnije shvaćen pozivanjem na primere koji slede, a koji su uklјučeni samo u svrhu ilustracije, odnosno za koje nije predviđeno da ograničavaju pronalazak.
PRIMERI
Primer 1: Antagonistička monoklonska antitela za humani CD40 (hCD40)
[0272] Da bi se identifikovala specifična antagonistička antitela za CD40, korišćena je tehnologija hibridoma da bi se izololovala mišja monoklonska anti-CD40 antitela.
[0273] Ukratko, miševi su imunizovani humanim CD40 antigenom i adjuvansom. Nakon imunizacije, koja je podrazumevala nekoliko primena antigena tokom nekoliko nedelјa, prikuplјen je serum iz svake imunizovane životinje. Serum je zatim ispitan upotrebom standardnih ELISA testova i potom protočnom citometrijom, a da bi se identifikovao serum koji sadrži antitela koja su bila u stanju da detektuju CD40. Jednom kada je u mišjem serumu, na osnovu analiza vezivanja, detektovano prisustvo antitela specifičnih za CD40, disekcijom je izdvojena slezina miša i standardnim tehnikama su izolovane ćelije koje proizvode antitela. Splenociti su zatim fuzionisani, poznatim tehnikama, da bi se obrazovale ćelije mijeloma koje proizvode antitela. Nakon fuzije, hibridomi su podvrgnuti skriningu, ELISA testovima i protočnom citometrijom, da bi se utvrdile razne karakteristike blokiranja i neutralizacije CD40 antitela.
[0274] Nakon skrininga, dok je većina antitela bila identifikovana kao ona koje karakteriše agonistička aktivnost, tri mišja monoklonska antitela (At1, At2 i At3) su identifikovana kao antitela sa antagonističkom aktivnošću za CD40 i to bez značajne agonističke aktivnosti. Aminokiselinske sekvence teških i lakih lanaca ova tri mišja antitela su opisane ispod, u Tabelama od 7 do 9. CDR sekvence unutar varijabilnih regiona teških (VH) i varijabilnih regiona lakih (VL) lanaca su naznačene podeblјanim slovima (CDR1, CDR2 i CDR3, redom).
Tabela 7: Aminokiselinske sekvence za VH i VL mišjeg antitela 1 (At1)
Tabela 8: Aminokiselinske sekvence za VH i VL mišjeg antitela 3 (At3)
Tabela 9: Aminokiselinske sekvence za VH i VL mišjeg antitela 2 (At2)
[0275] Konsenzusne sekvence CDR regiona iz tri monoklonska antagonistička anti-CD40 mišja antitela (At1, At2 i At3) su identifikovane i obezbeđene su prethodno u Tabeli 5. Poravnanja aminokiselinskih sekvenci varijabilnih regiona tri mišja antitela su takođe obezbeđena na Slikama 4A (laki lanac) i 4B (teški lanac).
[0276] Mišji varijabilni regioni teškog i lakog lanca (VH i VL) tri antitela su klonirani upotrebom reverzne transkriptaze-PCR-a (RT-PCR-a). Ovi VH i VL regioni (opisani prethodno u Tabelama od 7 do 9) naknadno su klonirani u vektore koji su sadržavali humane imunoglobulinske konstantne regione (Ig), a zatim su eksprimirani u sisarskim ćelijama domaćinima kao himerna antitela. Ovakva humana himerna antitela (sa humanim konstantnim i mišjim varijabilnim regionima) dalje su okarakterisana upotrebom in vitro analiza da bi se utvrdilo da li su svi ispoljili antagonistički i/ili agonistički efekat.
[0277] FACS analiza je upotrebljena da bi se utvrdilo da li tri himerna anti-CD40 antitela mogu vezivati bilo huCD40 ili cino CD40 koji je bio eksprimiran na humanim embrionalnim ćelijama bubrega (HEK). Dok bi svako od tri himerna antitela moglo vezivati humani CD40 eksprimiran na HEK ćelijama, samo dva himerna antitela koja su prepoznala cino-himerno Antitelo 3 (chAt3) nisu se vezivala za cino CD40. Rezultati FACS studije vezivanja su sumirani u Tabeli 10.
[0278] FACS analiza je takođe upotrebljena da se utvrdi da li tri himerna antitela mogu inhibirati vezivanje solubilnog CD40 liganda (sCD40L) za CD40. Upotrebom HEK ćelija koje eksprimiraju CD40, izmerene su IC50 vrednosti. Kao što je opisano u Tabeli 10, svako od himernih antitela je bilo u stanju da blokira vezivanje CD40 za njegov ligand.
[0279] Pored analiza vezivanja, antagonističke i agonističke aktivnostu su izmerene upotrebom reporterskih ćelijskih linija koje su eksprimirale CD40, i to humani CD40, merenjem količine izlučene alkaline fosfataze (AP) što je posredovano sa NFkB. U analizi sa reporterskim ćelijskim linijama koje su eksprimirale CD40, kada je detektovan signal putem CD40, NFkB aktivacija je dovela do izlučivanja AP čija je količina izmerena kolorimetrijskim supstratom. Da bi se odredila antagonističku aktivnost, CD40 reporterska ćelijska linija (HEK) je gajena bilo sa Jurkat ćelijskom linijom koja eksprimira CD40L (da bi se obezbedila interakcija sa fiziološkim ligandom) ili sa solubilnim CD40L (npr. His-CD40L navedenim u Tabeli 10). Izmerena je i sposobnost anti-CD40 antitela da blokiraju NFkB signal. Da bi se izmerila agonistička aktivnost, humana CD40 reporterska ćelijska linija je direktno tretirana sa anti-CD40 antitelom i izmeren je NFkB signal. Reprezentativni podaci CD40 antagonističkih i agonističkih analiza za tri himerna antitela su sumirani u Tabeli 10 i na Slikama 1A i 1B.
Tabela 10: Sumarni podaci funkcionalnih karakteristika anti-CD40 himernih antitela
[0280] Kao što je opisano u Tabeli 10 i na Slici 1, himerna anti-CD40 antitela su ispoljila antagonističku aktivnost bez detektabilne agonističke aktivnosti. Na osnovu rezultata iz prethodnih eksperimenata, varijabilni regioni teških i lakih lanca anti-CD40 antagonističkih antitela At1 i At3 su izabrani za humanizaciju.
Primer 2: Humanizacija antagonističkih anti-CD40 antitela At1 i At3
Humanizacija antagonističkog anti-CD40 antitela At1
[0281] Humanizovana antitela su generisana na osnovu CDR sekvenci varijabilnih regiona teških (VH) i varijabilnih regiona lakih lanaca (VL) At1. Preciznije, izabrane su humane germinativne sekvence za konstruisanje humanizovanih At1 antitela sa CDR-graftovima, gde su CDR domeni VH i VL lanaca At1 ugrađeni u vidu graftova u različite humane akceptorske sekvence teškog i lakog lanca. Na osnovu poravnanja sa VH i VL sekvencama monoklonskog antitela At1, sledeće humane sekvence su izabrane kao akceptori:
1. IGHV3-21<*>01 i IGHJ6<*>01 za konstruisanje akceptorskih sekvenci teškog lanaca
2. IGHV3-48<*>01 i IGHJ6<*>01 kao alternativni akceptor za konstruisanje teškog lanca
3. IGKV4-1<*>01 i IGKJ2<*>01 za konstruisanje akceptorskih sekvenci lakog lanca
4. IGKV2-40<*>01 i IGKJ2<*>01 kao alternativni akceptor za konstruisanje lakog lanca
[0282] Antitela sa CDR-graftom su zatim pripremljena ugrađivanjem odgovarajućih CDR sekvenci VH i VL iz At1 u vidu grafta, u akceptorske sekvence koje su prethodno opisane u tačkama 1-4.
[0283] Da bi se generisalo humanizovano antitelo sa povratnom mutacijom/mutacijama u uokvirujućem regionu, mutacije uokvirujućeg regiona su identifikovane i uvedene u antitela sa CDR-graftom. Ovakve mutacije su uvođene upotrebom standardnih tehnika, uključujući de novo sintezu varijabilnog domena sa povratnim mutacijama, kao i upotrebom mutagenih oligonukleotidnih prajmera i lančane reakcije polimeraze. Za svako od antitela sa CDR-graftom (koje je sadržavalo CDR sekvence antitela At1), konstruisane su različite kombinacije povratnih mutacija i drugih mutacija, na način koji sledi. (Napomena: Brojevi ostataka za mutacije koje su navedene ispod, zasnivaju se na Kabatovom sistemu numeracije.)
[0284] Za teške lance antitela sa CDR-graftom, jedan ili više od sledećih Vernijerovih i VH/VL dodirujućih ostataka je povratno mutiran na sledeći način: V48I i/ili S49A.
[0285] Za lake lance antitela sa CDR-graftom, sledeći Vernijerov i VH/VL dodirujući ostatak je povratno mutiran na sledeći način: Y36F.
[0286] Opisi varijabilnih regiona humanizovanih antitela izvedenih iz mišjeg monoklonskog At1 su dati u nastavku:
• Humanizovano At1 (huAt1VH.1) je VH At1 antitela sa CDR-graftom koji sadrži IGHV3-21<*>01 i IGHJ6<*>01 sekvence uokvirujućeg regiona;
• Humanizovano At1VH.1a (huAt1VH.1A) je humanizovan teški lanac koji sadrži aminokiselinske sekvence huAt1VH.1 sa sledeće dve povratne mutacije u uokvirujućem regionu: V48I, S49A;
• Humanizovano At1VL.1 (huAt1VL.1) je VL At1 antitela sa CDR-graftom koji sadrži IGKV4-1<*>01 i IGKJ2<*>01 sekvence uokvirujućeg regiona; i
• Humanizovano At1VL.1a (huAt1VL.1A) je humanizovan laki lanac zasnovan na huAt1VL.1 koji sadrži 1 predloženu povratnu mutaciju u uokvirujućem regionu: Y36F.
[0287] Napomena: IGHV3-21_IGHJ6 se odnosi na antitelo koje sadrži varijabilne sekvence koje odgovaraju IGHV3-21<*>01 i IGHJ6<*>01.
[0288] Humanizovani varijabilni regioni su zatim klonirani u IgG ekspresione vektore radi funkcionalne karakterizacije četiri različita humanizovana antitela na osnovu sledećih kombinacija varijabilnih regiona teških i lakih lanaca:
A. huAt1VH.1/VL.1
B. huAt1VH.1A/VL.1
C. huAt1VH.1/VL.1A
D. huAt1VH.1A/VL.1A
[0289] Varijabilni region i CDR aminokiselinske sekvence prethodno navedenih humanizovanih antitela su opisani u Tabeli 11 koja sledi.
Tabela 11: VH i VL sekvence humanizovane verzije antitela 1 (huAt1)
[0290] Kao što je prethodno opisano, CDR sekvence humanizovane verzije VH i VL regiona At1 su identične mišjem At1 antitelu.
Humanizacija antagonističkog anti-CD40 antitela 3 (At3)
[0291] Humanizovana antitela su takođe generisana na osnovu CDR sekvenci varijabilnih regiona teških (VH) i varijabilnih regiona lakih lanaca (VL) At3. Za konstruisanje humanizovanih At3 antitela sa CDR-graftovima su izabrane humane germinativne sekvence, pri čemu su CDR domeni VH i VL lanaca At3 ugrađeni u vidu graftova u različite humane akceptorske sekvence teškog i lakog lanca. Na osnovu poravnanja sa VH i VL sekvencama monoklonskog antitela At3, sledeće humane sekvence su izabrane kao akceptori:
1. IGHV3-69*06 i IGHJ6*01 za konstruisanje akceptorskih sekvencija teškog lanca
2. IGHV1-18*01 i IGHJ6*01 kao alternativni akceptor za konstruisanje teškog lanca
3. IGKV2-29*02 i IGKJ2*01 za konstruisanje akceptorskih sekvenci lakog lanca
4. IGKV2-28*01 i IGKJ2*01 kao alternativni akceptor za konstruisanje lakog lanca
[0292] Antitela sa CDR-graftom su pripremljena ugrađivanjem odgovarajućih CDR sekvenci VH i VL iz At3 u vidu grafta, u akceptorske sekvence koje su prethodno opisane u tačkama 1-4.
[0293] Da bi se generisalo humanizovano antitelo sa povratnom mutacijom/mutacijama u uokvirujućem regionu, mutacije uokvirujućeg regiona su identifikovane i uvedene u antitela sa CDR-graftom. Ovakve mutacije su uvođene upotrebom standardnih tehnika, uključujući de novo sintezu varijabilnog domena sa povratnim mutacijama, kao i upotrebom mutagenih oligonukleotidnih prajmera i lančane reakcije polimeraze. Za svako od antitela sa CDR-graftom (koja su sadržavala CDR sekvence antitela At3), konstruisane su različite kombinacije povratnih mutacija i drugih mutacija. (Napomena: Brojevi ostataka za mutacije koje su navedene ispod, zasnivaju se na Kabatovom sistemu numeracije.)
[0294] Za teške lance At3, jedan ili više od sledećih Vernijerovih i VH/VL dodirujućih ostataka je povratno mutiran na sledeći način: M48I, V67A, I69L. Dodatno, razmatraju se promene u Q1E. Q1E mutacija je uvedena da bi se sprečilo obrazovanje piroglutamata.
[0295] Za lake lance At3, jedan ili više od sledećih Vernijerovih i VH/VL dodirujućih ostataka je povratno mutiran na sledeći način: Y36F, L46Y.
[0296] Opisi varijabilnih regiona humanizovanih antitela izvedenih iz mišjeg monoklonskog At3 su opisani u nastavku:
• huAt3VH.1z je humanizovan VH At3 sa CDR graftom, koji sadrži IGHV1-69*06 i IGHJ6*01 sekvence uokvirujućeg regiona.
• huAt3VH.1 je zasnovan na huAt3VH.1z, sa Q1E promenom da bi se sprečilo obrazovanje piroglutamata
• huAt3VH.1A je humanizovano antitelo dizajnirano na osnovu huAt3VH.1 koje sadrži 3 dodatne povratne mutacije u uokvirujućem regionu: M48I, V67A, I69L.
• huAt3VH.1b je intermedijarno antitelo dizajnirano između huAt3VH.1 i huAt3VH.1A koje sadrži 1 predloženu povratnu mutaciju u uokvirujućem regionu: I69L.
• huAt3VL.1 je humanizovan VL At3 sa CDR graftom, koji sadrži IGKV2-28*01 i IGKJ2*01 sekvence uokvirujućeg regiona.
• huAt3VL.1A je humanizovano antitelo dizajnirano na osnovu huAt3VL.1 koje sadrži 2 povratne mutacij u uokvirujućem regionu: Y36F, L46Y.
• huAt3VL.1B je intermedijarno antitelo dizajnirano između huAt3VL.1 i huAt3VL.1A. Sadrži 1 predloženu povratnu mutaciju u uokvirujućem regionu: L46Y.
[0297] Zapaziti takođe da je *IGHV1-69_IGHJ6 sastavlјen od IGHV1-69<*>06 i IGHJ6<*>01 germinativnih sekvenci.
[0298] Humanizovani varijabilni regioni su zatim klonirani u IgG ekspresione vektore radi funkcionalne karakterizacije devet različitih humanizovanih antitela na osnovu sledećih kombinacija varijabilnih regiona teških i lakihg lanaca:
A. huAt3VH.1/VL.1
B. huAt3VH.1B/VL.1
C. huAt3VH.1
D. huAt3VH.1/VL.1A
E. huAt3VH.1B/VL.1A
F. huAt3VH.1A/VL.1A
G. huAt3VH.1/VL.1B
H. huAt3VH.1B/VL.1B
I. huAt3VH.1A/VL.1B
[0299] Varijabilni region i CDR aminokiselinske sekvence prethodno navedenih humanizovanih antitela su opisane u Tabeli 12 koja sledi.
Tabela 12. Aminokiselinske sekvence VH i VL regiona humanizovanih At3 antitela
[0300] Kao što je prethodno opisano, CDR sekvence humanizovanih verzija VH i VL regiona At3 su identične mišjem At3 antitelu.
[0301] Kako se At3 nije vezao za cino CD40 (pogledati Primer 1), za dalјu analizu su izabrane humanizovane verzije At1.
Primer 3: Modifikacija CDR1 sekvenci VL iz humanizovanih At1 antitela
[0302] Ispitivanjem prethodno opisanih humanizovanih sekvenci VH i VL iz antitela At1, identifikovan je potencijalni motiv deamidacione sekvence (motiv „NS“) koji je bio izložen u CDR1 sekvenci lakog lanca. Identifikovano mesto „NS“ motiva može dovesti do deamidacije i hidrolize, i dalje do obrazovanja sukcinimidnog intermedijera i aspartil-ASP ili izo-ASP. Stoga, genetičkim inzenjeringom je izbačen voaj motiv sekvence iz humanizovanih CDR1 sekvenci VL At1. Uklanjanje "NS" motiva je trebalo da omogući poboljšanu proizvodnju antitela.
[0303] Rezultat dalje izmene humanizovanog At1 genetičkim inženjeringom je šest različitih antitela. Primetno je da su četiri zadržala antagonističku aktivnost, dok su dva postala agonistička antitela (huAt1v4 i huAt1v3). Kao što je prikazano u Tabeli 14, huAt1v4 i huAt1v3 su ispoljili agonističku aktivnost, što je utvrđeno huCD40 reporterskom analizom, a bez ispoljavanja antagonističke aktivnosti, što je utvrđeno u Jurkat/Reporterskoj analizi. Aminokiselinske sekvence VH i VL, kao i CDR, varijanti humanizovanih At1 antitela (d huAt1v1 do huAt1v6) su opisane ispod, u Tabeli 13.
Tabela 13. Aminokiselinske sekvence VH i VL varijanti humanizovanih At1 antitela (huAt1v#)
[0304] Pored modifikacije „NS“ motiva u CDR1 domenu VL, varijante huAt1v2 i huAt1v3 koje su prethodno opisane u Tabeli 13 su bile sa dodatnim mutacijama uokvirujućeg regiona u svojim VH domenima.
[0305] Tabela 14 koja sledi obezbeđuje sumarne podatke vezivanja, agonističke i antagonističke aktivnosti varijante. Opisi analiza se mogu pronaći iznad, u Primeru 2. "NS" motiv koji je bio mutiran u CDR1 domenu VL podvučen je u Tabeli 14 koja je prikazana ispod. Kao što je opisano u Tabeli 14, antitela huAt1v4 (koje sadrži "P" mutaciju u CDR1 domenu VL) i huAt1v3 (koje sadrži "L" mutaciju u CDR1 domenu VL i mutacije u uokvirujućem regionu unutar VH regiona) ispoljavaju agonističku aktivnost, iako su izvedena iz matičnog antitela sa antagonističkom aktivnošću.
Tabela 14: Pregled sekvenci i funkcionalnosti za varijante humanizovana antitela
[0306] Humanizovano anti-CD40 antitelo huAt1v1 je izabrano za dalјe proučavanje i pobolјšavanje.
Primer 4: Konstruisanje CDR2 domena HC anti-CD40 antitela huAt1v1
[0307] Iz varijanti opisanih u Primeru 3, za dalјe analize je izabrano antitelo huAt1v1. Da bi se dodatno
pobolјšala potencija ovog antitela, proizvedene su varijante teškog lanca (HC) huAt1v1 koje su
sadržavale mutacije unutar CDR2 domena HC. Sintetisano je sedamnaest dodatnih varijanti (koje su
označene kao od huAt1v1CDR2v1 do v17). Varijante HC regiona su uparene sa HuAt1v1 LC (SEQ ID NO:
20) da bi se ispitala aktivnost i odredile agonistička i antagonistička aktivnost. na sledeći način sedamnaest varijantnih teških lanaca i in vitro studije aktivnosti su pokazale da varijante uglavnom zadržavaju svoju antagonističku aktivnost i raznovrsnu potenciju u odnosu na huAt1v1. Tabela 15 pokazuje da je, dok su varijante antitela održavale antagonističku aktivnost, potencija svake varijante varirala.
TABELA 15: Funkcionalni pregled za varijante huAt1v1 CDR2 HC.
[0308] Sve varijante HC huAt1v1 su mutirane na poziciji S55, kao što je opisano ispod, u Tabeli 16 (pozicija 55 je podvučena).
Tabela 16: Aminokiselinske sekvence dodatnih VH regiona (Varijante huAt1v1VH)
[0309] Tabela 17 koja sledi, obezbeđuje poređenje CDR2 regiona HC iz prethodno opisanih varijanti huAt1v1, nakon izmene ostatka S55 genetičkim inženjeringom (podeblјano/podvučeno). CDR2 region VH huAt1v1 odgovara aminokiselinskim ostacima 50-66 iz SEQ ID NO: 15.
G K
V
55 A iju
icY poz
Y
ti na
ij<a>n N var
R CDR2
C G
H
t1v1
uA
i h
venc
sek
ja Y
Tab
R
A
[0310] Varijabilni region teškog lanca huAt1v1CDR2v7 je izabran kao onaj sa naročito povolјnim svojstvima u odnosu na ostale varijante koje su proizvedene i opisane prethodno u Tabelama 15-17. Primetno je da huAt1v1CDR2v7 sadrži mutaciju u svom CDR2 domenu HC koja je identifikovana kao S55G. Preciznije, za antitelo koje sadrži VL antitela huAt1v1 (SEQ ID NO: 20; pogledati Tabelu 13) i VH huAt1v1CDR2v7 je utvrđeno da imaju 20X povećanu antagonističku aktivnost u poređenju sa antitelom huAt1v1.
[0311] VL huAtv1 i VH huAt1v1CDR2v7 su eksprimirani u kontekstu dva različita humana IgG1 konstantna regiona. Jedan IgG1 konstantni region je izabran pošto je njegova efektorska funkcija bila umanjena (hCg1, z, non-a L234A, L235A ili LALA), a drugi konstantni region IgG1 je izabran pošto su obe njegove efektorske funkcije bile umanjene i sadržavao je set mutacija koje pojačavaju vezivanje FcRn (hCg1, z, non-a L234A, L235A - T250Q, M428L ili LALA-QL). Tabele 18 i 19 koje slede obezbeđuju informacije o aminokiselinskoj sekvenci za teške i lake lance anti-humanih CD40 antitela At101 (VL huAtv1 / VH huAt1v1CDR2v7 / hCg1/k-LALA) i At102 (VL huAtv1 / VH huAt1v1CDR2v7 / hCg1/k-LALA-QL). Aminokiselinski ostaci pojedinačnih CDR sekvenci svake VH ili VL sekvence su naznačeni podeblјanim slovima. U Tabeli 19 su podvučeni konstatni regioni.
Tabela 18. Aminokiselinske sekvence VH i VL anti-hCD40 antitela At101 i At102.
Tabela 19. Aminokis. sekvence teškog lanca (HC) i lakog lanca (LC) anti-hCD40 antitela At101 i At102.
Primer 5: Funkcionalna karakterizacija humanizovanih antagonističkih anti-hCD40 antitela At101 i At102
In vitro analiza
[0312] Oba humanizovana anti-CD40 antitela At101 i At102 su pokazala antagonističku aktivnost sličnu nalazima u reporterskoj analizi opisanoj u Primeru 1. Pošto je rezidualna agonistička aktivnost povezana sa potencijalnim rizicima, razvijena je B-ćelijska agonistička analiza. U ovoj analizi, procenjivana je inhibicija pozitivne regulacije CD86 u humanim B-ćelijama. Humane B-ćelije konstitutivno eksprimiraju CD40, a signalizacija preko CD40 dovodi do aktivacije B-ćelija, što se meri pozitivnom regulacijom CD86 na površini. B-ćelije su aktivirane niskim dozama anti-IgM i IL4, nakon čega su dodata antagonistička anti-CD40 antitela. Pojačavana aktivacija B-ćelija je izmerena kao pozitivna regulacija CD86, koja je uočena u prisustvu agoniststičkog CD40, ali ne i antagonističkog CD40 At, što ukazuje na agonističku aktivnost koja se ne može detektovati za glavnog kandidata in vitro. Da bi se izmerila antagonistička aktivnost, primarne humane B-ćelije su kultivisane sa humanom T-ćelijskom linijom koja eksprimira CD40L, što dovodi do aktivacije B-ćelija i pozitivne regulacije ekspresije CD86 posredstvom CD40/CD40L interakcije. Izmerena je i sposobnost antagoniste CD40 da inhibira pozitivnu regulaciju CD86 u primarnim humanim B-ćelijama i time je pokazana snažna antagonistička aktivnost anti-CD40 antitela At101, kao što je prikazano na Slici 2B. Slika 2A pokazuje da antitelo At101 ne ispoljava agonističku aktivnost. Primetno je i da, kao što je opisano na Slici 2B, antitelo At101 karakteriše IC50vrednost od 1,333 u poređenju sa antagonističkim antitelom Blb (Boehringer Ingelheim) čija je IC50vrednost iznosila 4,213, kao i sa agonističkim antitelom AD11 (Astellas) čija je IC50vrednost iznosila 0,1906. Shodno navedenom, antitelo At101 (i At102 s obzirom na identične varijabilne regione) je jak antagonista CD40 i suštinski ne ispoljava agonističku aktivnost in vitro.
In vivo analiza
[0313] Da bi se ispitala in vivo aktivnost antitela At101, uspostavljen je model stvaranja humanih antitela i preživlјavanja B-ćelija. Ukratko, kada su humane PBMC, izolovane iz zdravih davalaca, prebačene u imunokompromitovane scid miševe, bila je merlјiva proizvodnja humanog IgG-a kao odgovora na mišje antigene, 14 dana kasnije. Dodatno, FACS analiza splenocita iz ovih miševa je ukazala na usađivanje i preživljavanje humanih B-ćelija. Izmeren je dalje odgovor specifičan za antigen, uključivanjem signala za izazivanje reakcije sa vakcinom koja je sadržavala tetanusni toksoid (TetTox) i merenjem IgG-a specifičnog za anti-TetTox (Naito, 2000; Jeurissen, 2004).
[0314] Lečenje ovih huscid miševa sa nedelјnim dozama anti-humanog CD40 (At101, 5 mg/kg IP) rezultovalo je inhibicijom proizvodnje humanog IgG-a za > 85% (Slika 3A) i preživlјavanjem B-ćelija (Slika 3B), čime je jasno pokazano da je antitelo aktivno in vivo. Preciznije, Slika 3A pokazuje da je antitelo At101 bilo u mogućnosti da inhibira proizvodnju IgG-a u poređenju sa Ig kontrolom, dok Slika 3B ukazuje da je primena antitela At101 kod prethodno navedenog huscid modela inhibirala preživljavanje B-ćelija.
Primer 6: Analiza epitopa Fab At102
[0315] Upotrebom Fab At102, urađene su kristalografske studije da bi se utvrdio epitop za koji se Fab At101 vezuje. Kao što je prethodno opisano, VH i VL sekvence antitela At101 i At102 su iste, i, prema tome, upotreba Fab At102 u sledećoj studiji kristalne strukture je reprezentativna za osobine vezivanja oba antitela, At101 i At102.
[0316] Kristalne strukture su određene samostalno za At102 Fab i za Fab iz At101 u kompleksu sa CD40 antigenom. Dobijeni su kristali i podaci su prikuplјeni upotrebom IMCA-CAT 17ID linijskog snopa.
Kristalna struktura At102 Fab je razrešena do rezolucije od 1,74 Å, dok je struktura kompleksa At102 Fab/CD40 razrešena do rezolucije od 2,84 Å. Kristalne strukture su obezbedile identifikaciju 3D konformacionog epitopa Fab iz At102.
Identifikacija 3D konformacionog epitopa Fab iz At102
[0317] Kontakti između At102 Fab i CD40 uključuju i kritičnu vodoničnu vezu i hidrofobne interakcije koje stabilizuju dodirne površine. Lista molekulskih kontakata (merenih ispod 4,0 Å) je generisana upotrebom NCONT programa iz CCP4 programskog paketa. Kontakti su izmereni između dva odvojena kristalografska monomera CD40 i odgovarajućeg vezanog lakog i teškog lanca Fab iz At102. Uočeni su dodatni kontakti između At102 Fab i kristalografskog dimera CD40 (dimer stvoren kontaktima kristala). Na osnovu ovih informacija, utvrđeno je da se epitop vezivanja At102 Fab u CD40 sastoji od topografskog regiona definisanog sa Cys62-Phe67, Gln79-Cys83, Arg90-Th99, Thr24-Cys37.
Materijali i metode
Priprema i prečišćavanje CD40 antigena:
[0318] DNK sekvenca koja kodira vanćelijski domen humanog CD40 (aminokiseline 1-193) je klonirana u pHybE vektor, nakon čega je sledilo uvođenje mesta cepanja za Tev proteazu i heksahistidinskog taga na C-kraju, unutar okvira čitanja (SEQ ID NO: 115). Plazmid je transfekcijom uveden u HEK293 6e ćelije (MRL) sa gustinom od 1x10e6 ćelija/ml, upotrebom transfekcionog reagensa Polietilenimina (PEI, Polysciences Inc) i u odnosu PEI:DNK od 4:1. Transfektovanoj ćelijskoj kulturi je 24 sata nakon transfekcije dodat tripton-Nl (do 0,5%). Sedam dana nakon transfekcije, transfektovana ćelijska kultura je centrifugirana, nakon čega je sledila filtracija kroz PES filter od 0,2u (Corning). Izbistren medijum je izmenjen sa PBS-om, pH 7,4, upotrebom Kvick TFF sistema opremlјenog membranama od 10 kDa (GE Healthcare), nakon čega je medijum nanet na HisTrap FF kolone od 5 ml (GE Healthcare), ekvilibrisane sa PBS-om, pH 7.4. Kolona je dalje isprana sa 25 mm imidazolom u PBS-u, pH 7,4, a vezani protein je eluiran sa 250 mM imidazola u PBS-u, pH 7,4. Eluirani protein je koncentrovan upotrebom Amicon Ultra-15 uređaja za filtiranje centrifugiranjem (Millipore) čija donja granica molekulske težine iznosi 10 kDa, pa je rastvor dodatno prečišćen upotrebom SEC na 26/60 Superdex 200 koloni (GE Healthcare), ekvilibrisan i propušten sa PBS-om, pH 7,4. Frakcije koje su sadržavale CD40 su spojene, koncentracija je izmerena apsorbancijom na 280 nm, nakon čega su uzorci analizirani SEC, SDS-PAGE postupcima i masenom spektrometrijom. [CD40(h)(21-193)]-Tev-His6 ("His6" prijavljen kao SEQ ID NO: 115) je čuvan u alikvotima na - 80° C.
Priprema i prečišćavanje Fab fragmenta CD40 At102:
[0319] Fab fragment CD40 At102 je pripremlјen papainskom digestijom originalnog mAt kao što je detalјnije prikazano u nastavku teksta. Papain je aktiviran sa 50 mM cisteina u PBS puferu, pH 7,4. mAt CD40 At102 [hu IgGl/k] LALA QL u PBS puferu, pH 7,4, pomešano je sa papainom u težinskom odnosu papaina prema mAt od 1:100 i rastvor je inkubiran 1 sat na 37°C. Reakcija je zaustavljena sa 5 mM jodoacetamida. Smeša je zatim prečišćena sa 10 ml Mab SelectSure smole (GE Healthcare), pri čemu je Fab fragment prikupljan u vidu tečnosti koja je prolazila kroz kolonu. Tešnost sa kolone je koncentrovana uptorebom uređaja za centrifugiranje Ultrafree-15 Biomax sa donjom granicom razdvajanja molekulskih težina od 10 kDa (MWCO) (Millipore). Koncentrovana smeša je prečišćena na Sephacryl 200 HiPrep koloni od 2,6 cm x 60 cm (GE Healthcare), prethodno ekvilibrisanoj u puferu sa 50mM HEPES-a, 50mM NaCl, pH 7,5. Frakcije koje su sadržavale Fab fragment (praćeno UV apsorbancijom na 280 nm) su objedinjene i zamrznute na - 80° C. Čistoća uzorka je ispitana analitičkom SEC, SDS-PAGE analizom i masenom spektrometrijom.
Priprema kompleksa CD40/CD40 Fab At102:
[0320] Rekombinantan humani CD40 je eksprimiran u sisarskom ekspresionom sistemu i naknadno je prečišćen tehnikama koje su dobro poznate u stanju tehnike. Rekombinantan humani CD40 i CD40 At102 Fab protein su pomešani u molarnom odnosu od 1,1:1 i inkubirani tokom 4 sata na 4° C. Uzorak sa kompleksima je nanet na Sephacryl 200 HiPrep kolonu od 2,6 cm x 60 cm (GE Healthcare), prethodno ekvilibrisanu u puferu sa 50mM HEPES-a, 50mM NaCl, pH 7,5, i propušten sa stopom protoka od 1 ml/min. Frakcije koje su sadržavale kompleks (praćeno UV apsorbancijom na 280 nm) su objedinjene i koncentrovane do 18 mg/ml upotrebom uređaja za centrifugiranje Ultrafree-15 Biomax sa donjom granicom razdvajanja molekulskih težina od 10 kDa (MWCO) (Millipore). Čistoća uzorka je ispitivana analitičkim SEC i SDS-PAGE analizama.
Kristalizacija At102 Fab:
[0321] Sam Fab je obezbeđen u vidu rastvora od 22,5 mg/ml u 50mM HEPES-a, 50 mM NaCl-a, pH 7,5. Kristali su rasli difuzijom pare na 23° C. Rezervoar je sadržavao 25% (w/v) PMME 550, 0,1M MES pH 6,5 i 0,01M cink sulfata. Kap je napravlјena dodavanjem jednakih zapremina rastvora proteina i rastvora za rezervoar. Kristali su rasli kao guste prizme i bili su štićeni od zamrzavanja upotrebom rastvora za rezervoar sa dodatkom 10% (v/v) propilen glikola. Kristali su prikuplјeni, rastvoreni u rastvoru za zamrzavanje i ohlađeni do smrzavanja direktno u tečnom azotu. Difrakcioni podaci do 1,74 Å su prikuplјani pod gasom azota, na 100 K i pri liniji snopa od 17ID, upotrebom Advanced Photon Source programa u Argonne National Laboratories (Argonne IL).
Kkristalizacija Fab At102 u kopleksu sa CD40 antigenom:
[0322] Fab kompleks je nabavljen u koncentraciji od 18mg/ml, u 50mM HEPES-u, 50mM NaCl-u, pH 7,5. Upotrebljen konstrukt antigena je bio [CD40 (h) (21-193)]-TEV-6His ("His6" je opisan kao SEQ ID NO: 115). Kristali su rasli difuzijom pare na 23°C. Rezervoar je sadržavao 2M amonijum sulfat, 0,1M fosfatnicitrat pH 4,2. Kap je napravlјena dodavanjem jednakih zapremina rastvora proteina i rezervoara. Kristali su rasli kao tanke šipke i bili su štićeni od zamrzavanja upotrebom 2,5M litijum sulfata. Kristali su zatim prikuplјeni, rastvoreni u rastvoru za zamrzavanje i direktno ohlađeni do smrzavanja u tečnom azotu. Difrakcioni podaci do 2,84 Å su prikuplјani pod gasom azota, na 100 K i pri liniji snopa od 17ID, upotrebom Advanced Photon Source programa u Argonne National Laboratories (Argonne IL).
Određivanje strukture kompleksa CD40 sa At102 Fab i At102 Fab CD40
[0323] Difrakcioni podaci za obe kristalne strukture su obrađeni upotrebom programa autoPROC kompanije Global Phasing Ltd.
[0324] Skup podataka za At102 Fab je obrađen u prostornoj grupi C2221sa sledećim dimenzijama jedinične ćelije: a=64,65 b=130,4 c=132,6. Maksimalno verovatnoća molekulskog zamenskog rešenja je određena upotrebom programa PHASER i modela pretraživanja Fab koji je prethodno prijavljen (pristupni broj u Banci podataka za proteine – engl. Protein Data Bank - 3Q0S). Koordinate za 1 Fab molekul su dobijene na osnovu proračuna molekulskih zamena. Prelimanarno fino podešavanje dobijenih proračuna je urađeno upotrebom REFMAC-a i programa BUSTER. Konstrukcija modela iterativnog proteina je urađena upotrebom programa COOT i ispitivanjem mapa elektronske gustine za 2Fo-Fc i Fo-Fc. Fina podešavanju su završena dodavanjem molekula vode i upotrebom programa BUSTER. Konačna statistika finih podešavanja je prijavila vrednost Roslobođenog/ Rradnogod 0,23/0,19.
[0325] Skup podataka za kompleks At102 Fab i CD40 je obrađen u prostornoj grupi P21212 sa sledećim dimenzijama jedinične ćelije: a=173,3 b=76,0 c=126,1. Maksimalno verovatnoća molekulskog zamenskog rešenja je određena upotrebom programa PHASER i upotrebom rešenja za At102 Fab koji je prethodno naveden. Koordinate za 2 Fab molekula su ustanovljene na osnovu proračuna molekulske zamene. Prelinarno fino podešavanja rezultujućeg proračuna je urađeno upotrebom REFMAC-a i programa BUSTER. Model za CD40 je konstruisan ručno, upotrebom COOT programa i mapa elektronske gustine za 2Fo-Fc i Fo-Fc. Fina podešavanju su završena dodavanjem molekula vode i upotrebom BUSTER programa. Konačna statistika finih podešavanja je prijavila vrednost Roslobođenog/ Rradnogod 0,25/0,20.
Primer 7: Potencija neutralizacije i agonistička aktivnost At102 u testu aktivacije monocita
[0326] Postupci koji slede su upotrebljeni u ovom primeru za ispitivanje antagonistističke i agonističke aktivnosti At102 in vitro.
[0327] Antagonistička analiza: Sposobnost At102 da blokira aktivaciju monocita posredstvom CD40 je ispitana antagonističkom analizom. Prečišćeni monociti (gustine 2x10<6>/mL) su pomešani sa 1 µg/mL MEGACD40L (Enzo) u prisustvu 80 ng/mL GM-CSF i 80 ng/mL IFNγ. U mikrotitar ploču sa 96 bunarića za kulture tkiva (TC) sa U-dnom, dodato je zatim po 50 µL po bunariću. Razblaženja ispitivanih materijala su pripremlјena u medijumu za kulturu, pa je po 50 µL razblaženja dodavano humanim monocitima dobijenim od donora. Ćelije su kultivisane na 37°C, sa 5% CO2tokom dva dana, pre nego što su supernatanti prikuplјeni za analizu citokina (TNF-a) upotrebom platforme za imunoanalize Meso Scale Discovery (MSD).
[0328] Agonistička analiza: Ispitivana je sposobnost At102 da indukuje aktivaciju monocita putem CD40. MEGACD40L (Enzo) je upotrebljavan kao pozitivna kontrola za aktivaciju monocita. Prečišćeni humani monociti su razblaženi do 2x10<6>/ mL u medijumu za kulturu, u prisustvu 80 ng/mL GM-CSF i 80 ng/mL IFNγ, pa je po 50 µL/bunariću dodatu u TC mikrotitar ploču sa 96 bunarića U-dna. Razblaženja ispitivanih materijala su pripremana u medijumu za kulturu, a monocitima je dodavno po 50 µl razblaženja. Ćelije su gajene na 37°C, sa 5% CO2, tokom dva dana, pre nego što su supernatanti prikuplјeni za analizu citokina (TNF-a) upotrebom platforme za imunoanalize Meso Scale Discovery (MSD).
[0329] Kako mijeloidne ćelije imaju važnu ulogu u patogenezi Kronove bolesti, prethodno navedene analize su razvijene da bi se procenila funkcionalna aktivnost At102. CD40 signalizacija indukuje aktivaciju monocita i time proizvodnju inflamatornih citokina poput TNF-a. Reprezentativne antagonističke i agonističke analize na monocitima za At102 su prikazane na Slikama 5A i 5B, tim redom. Kao što je prikazano na Slici 5A, At102 je blokiralo ekspresiju TNF-a na način koji zavisi od koncentracije. U formatu agonističke analize, solubilni CD40L indukuje proizvodnju TNF-a iz monocita sa EC50od 1,9 nM, dok At102 nije indukovalo proizvodnju TNF-a u koncentracijama do 200 nM. Kao što je opisano na Slici 5B, nivoi TNF-a za At102 su bili slični nivoima u negativnoj kontroli (sa nerelevantnim IgG), pokazujući malu ili odsustvo proizvodnje TNF-a koja se može detektovati. Konzistetni rezultati su dobijeni iz tri različita donora, sa IC50 vrednostima prikazanim ispod, u Tabeli 20.
[0330] Ukratko, rezultati ispitivanja At102, i u antagonističkim i u agonističkim analizama koje su prethodno opisane, pokazali su da je At102 antagonističko anti-CD40 antitelo koje je suštinski oslobođeno agonističke aktivnosti, odnosno bez merljive je agonističke aktivnosti.
Primer 8: Unakrsna reaktivnost At102
[0331] Dalje je ispitivana unakrsna reaktivnost At102 sa CD40 iz različitih vrsta. Upotrebom standardnih tehnika, At102, obeleženo sa Aleksa 647, ispoljilo je slične kinetike vezivanja i za humani i za CD40 cinomolgus majmuna na površini B-ćelija, sa EC50 vrednostima od 0,89 ± 0,17 nM na humanim ćelijama i 1,4 ± 0,15 nM na ćelijama cinomolgus majmuna, kao što je prikazano ispod, u Tabeli 21. Vezivanje At102 za CD40 miša, pacova i zeca se nije moglo detektovati u koncentracijama do 30 µg/mL (200 nM).
Tabela 21. Zbirni pregled vezivanja At102 za razne CD40 na površini B-ćelija
[0332] Ukratko, At102 se vezalo za humani i CD40 cinomolgus majmuna, ali nije ispoljio vezivanje za CD40 miša, pacova ili zeca, što je detektovano upotrebom standardnih analiza vezivanja.
Primer 9: Upotreba mišjeg anti-CD40 antitela 138 za lečenje kolitisa sa uvođenjem T-ćelija
[0333] Postupci koji slede su korišćeni u in vivo studiji za određivanje sposobnosti mišjeg anti-CD40 antitela (antitelo 138) u lečenju kolitisa. Anti-mišje CD40 antitelo 138 je sa karakteristikama sličnim At102, npr. antitelo 138 je antagonističko antitelo bez značajne agonističke aktivnosti, slično At102. Prema tome, antitelo 138 je reprezentativno za aktivnost At102 u modelu miša iz Primera 9. Sledeći odeljak opisuje in vivo model kolitisa sa uvođenjem T-ćelija.
Izolacija i injeciranje naivnih T-ćelija
[0334] Dana 0, slezine su prikuplјene iz balb/c miševa i na ledu su prebačene u RPMI medijum sa dodatkom 4% fetalnog seruma govečeta (kompletni medijum). Suspenzija pojedinačnih ćelija je dobijena mehaničkim dispergovanjem i propuštanjem kroz ćelijska sita od 100 µm, u RPMI medijum sa dodatkom 4% fetalnog seruma govečeta (kompletni medijum). Ćelije su zatim istaložene centrifugiranjem (1250 o/min tokom 10 minuta na 4° C) i resuspendovane u Robosep puferu (Stem Cell Technologies). Koncentracija ćelija je merena upotrebom Moxi Mini brojača ćelija (Orflo) i podešena je na 1 x 10<8>ćelija/mL u Robosep puferu. Upotrebom kompleta sa magnetnim zrnima za negativnu selekciju, izolovane su CD4+ T-ćelije (Stem Cell Technologies) prema uputstvima proizvođača. Ćelije su dalјe prečišćene upotrebom FACS aparata da bi se dobile populacije CD4<+>CD45RB<visok>i CD4<+>CD45RB<nizak>koje su prikuplјene kao najsvetlija frakcija od 42% i najtamnija od 12% ćelija, tim redom. Ćelije su izbrojane i podešene do gustine od 1 x 10<6>ćelija/ml, pa je po 0,5 mL (1x10<5>ćelija) intraperitonealno (IP) injecirano u SCID miševe.
Tretman
[0335] Mišje anti-CD40 antitelo 138 je potom primenjivano SCID miševima IP, u PBS-u i u raznim dozama, dva puta nedelјno (opisano prethodno) počevši bilo od vremenske tačke injeciranja ćelija (profilaktički tretman) ili perioda u kome je bolest potvrđena endoskopijom (terapijski tretman). Dodatno je uključen i veći broj kontrolnih grupa. Grupe su primale ili 1) 15 mg/kg antitela 951 (nerelevantan IgG) IP u PBS-u, dva puta nedelјno ili 2) antitelo 138 (antitelo koje blokira CD40L), IP u PBS-u, dva puta nedelјno. Dodatno, u studijama uvođenja T-ćelija (TCT) su primenjivani bilo anti-p40(IL-12/23) antitelo ili anti-TNF monoklonsko antitelo, a kao antitela koja su klinički relevantna za poređenja.
Endoskopija
[0336] U različitim vremenima nakon injeciranja ćelija u miševe, bolest je procenjivana kolonoskopijom. Nakon anestezije sa izofluranom, fleksibilna igla za gavažu je polako ubacivana u anus, a potom je i polako injecirano 300 µL PBS da bi se uklonili peleti fecesa. Životinjama je dalje omogućeno da se oporave od anestezije i da se kreću da bi se olakšalo izbacivanje preostalih peleta (tokom približno pet minuta). Miševi su zatim ponovo anestezirani izofluranom i endoskopska sonda (Karl Storz) je ubačena u anus do dubine od 3 cm. Fotografije su snimlјene na 3, 2 i 1 cm od analnog ruba. Slike su analizirane kasnije, upotrebom skale koja je detaljno opisana ispod, u Tabeli 22. Rezultati za svaki parameter, na svakom od tri rastojanja, objedinjeni su da bi se dobio zbirni skor aktivnosti mišjeg endoskopsog oboljenja (MEDAI), prikazan u Tabeli 22. Maksimalan zbirni MEDAI skor je iznosio 24.
[0337] U slučaju terapijske primene doza, endoskopsko bodovanje je rađeno tri nedelјe nakon injeciranja ćelija da bi se potvrdila bolest i životinje grupisale za tretman.
Tabela 22. Endoskopski MEDAI skor
Histologija
[0338] Uzorci gastrointestinalnog trakta (GI) su pohranjeni u kasete kao razvučeni segmenti sa jasnom orjentacijom celokupnog debelog creva, što je omogućilo analizu celokupne dužine debelog creva i obradu tkiva fiksiranog u formalinu i ukalupljenog u parafinu (FFPE). Blokovi su secirani na preseke od 5 mikrona, nakon čega su preseci montirani na staklene pločice pre izvođenja imunohistohemije za detekciju jonizovanog adapterskog molekula za vezivanje kalcijuma tipa 1 (IBA1), upotrebom anti-IBAl antitela (kat. br. 019-19741; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). IBA1 marker je upotrebljen za identifikaciju makrofaga u presecima tkiva. Pločice su kontrasno obojene metil zelenom bojom, dehidrirane i montirana je staklena pokrovna pločica.
[0339] Pločice su zatim snimane pod uvećanjem od 4x, upotrebom sistema za snimanje tipa Vectra, a kolažne slike niske rezolucije (4x) su pregledavane pre odabira površina za slikanje pod uvećanjem od 20x.
[0340] Vectra sistem je ponovo skenirao pločice i sačuvao odabrane slike visoke rezolucije (20x) koje su potom podvrgnute algoritmima analize slika u inForm kompjuterskom program (Perkin Elmer). Upotreblјeni sistem algoritama je sadržavo tri algoritma: prvi za utvrđivanje praga IBA1 i CD3 bojenja u spektralno snimlјenim datotekama, da bi se eliminisalo pozadinsko/irelevantno bojenje. Sledeći algoritmi su služili za raspodelu tkiva na tkivo od interesa (lamina propria, epitel, muscularis, submukoza i pozadina) i kvantifikaciju bilo CD3 ili IBA1 signala na RGB slikama koje su dobijene upotrebom prvog algoritma.
[0341] Podaci InForm programa su prebačeni u tekstualne datoteke koje su objedinjene u jednu datoteke podataka bilo za segmente tkiva ili za ćelijske segmente.
[0342] Na osnovu validacije antagonističke aktivnosti u akutnim modelima, model hroničnog kolitisa je upotrebljen za uspostavljanje “dokaza o konceptu”. Urađene su tri studije, da bi se ispitao efekat blokiranja kolitisa nakon uvođenja naivnih T-ćelija u imunokompromitovanog domaćina (SCID miša). Nivo pojedinačnih doza je ispitivan kako za profilaktički, tako i za terapijski režim lečenja, dok je odgovor pune doze ispitivan u profilaktičkom režimu.
Dozni odgovor za mišje anti-CD40 antitelo 138 primenjeno u vreme uvođenja ćelija
[0343] Dozni odgovor za profilaktički primenjeno mišje anti-CD40 antitelo 138 je utvrđen upotrebom T-ćelijskog modela kolitisa. Tretman koji je pokrivao širok opseg doza (0,5; 1,5; 5 i 15 mg/kg) započet je u vreme uvođenja ćelija. Doze do 1,5 mg/kg su rezultovale maksimalnom inibicijom zbirnog MEDAI skora, dok doza od 0,5 mg/kg nije ispoljila značajan efekat. Aktivnost mišjeg anti-CD40 antitela 138 je bila ekvivalentna standardnoj dozi za lečenje sa anti-p40IL-12/23, koja je upotrebljena kao pozitivna kontrola. Histološka analiza preseka debelog creva je ukazala na smanjenje u makrofagima (opšta mera inflamacije), što je dobro korelisalo sa endoskopskim skorom bolesti, kao što je opisano na Slici 6 i Slici 7. Preciznije, Slika 6 prikazuje inhibitorni dozni odgovor Dana 39, dobijen na osnovu endoskopskog skora prilikom profilaktičke primene mišjeg anti-CD40 antitela 138 (terminalni skor). Na Slici 6, RBnizak se odnosi na grupu negativnih kontrola. Ćelije tipa CD45RBnizakne posreduju u bolesti. U ovom modelu kolitisa bolest je posredovana CD45RBvisokćelijama koje su uvedene životinjama. Slika 7 prikazuje broj IBA1+ makrofaga u debelom crevu miševa (određeno histološki) i prikazuje niže nivoe makrofaga pri dozama većim od 0,5 mg/kg, ali i nižim u odnosu na tretman sa pozitivnom kontrolom, p40
[0344] Nivoi cirkulišućeg mišjeg anti-CD40 antitela 138 su izmereni 96 sati nakon poslednje doze (ekvivalentno Ctokom) i pokazano je da zavise od doze, kao što je opisano na Slici 8. Najniži nivo doze (0,5 mg/kg) je rezultovao koncentracijom < od donje granice kvantifikacije (LLOQ) kod svih osim kod jedne životinje iz ove grupe.
Dozni odgovor za mišje anti-CD40 antitelo 138 primenjeno 3 nedelјe nakon uvođenja ćelija
[0345] Kada je tretman mišjim anti-CD40 antitelom 138 započet tri nedelјe nakon injeciranja ćelija, nakon endoskopske potvrde bolesti, primećena je inhibicija zbirnog MEDAI skora koja je zavisila od doze i koja je kod najviše doze (15 mg/kg) dostigla statističku značajnost (Slika 9A). Histološka analiza IBA1<+>makrofaga u debelom crevu kao mera mijeloidne inflamacije ukazala je na slične rezultate, kao što je opisano na Slici 9B. Srednja vrednost serumske koncentracija antitela 138, izmerena 72 sata nakon primene poslednje doze, iznosila je 191,9 µg/ml kod životinja koje su primile 15 mg/kg.
Primer 10: T-ćelijski odgovori zavisni od antitela kod Cinomolgus majmuna
[0346] Ispitivanje T-ćelijskog odgovora zavisnog od antitela (TDAR) je urađeno na cinomolgus majmunima. Kod dva majmuna/polu/grupi je primenjeno At102 u dozi od 0 (samo nosač) ili 10 mg/kg, subkutano (SC), tokom 5 nedelјa. Hemocijanin iz prilepka Megathura crenulata (KLH), primenjen je zatim svim životinjama na Dan 8. Uzorci seruma su prikuplјeni iz svake životinje Dana -11, -7, 0, 4, 7, 10, 14 i 21, u odnosu na primenu KLH. Sve životinje su po završetku poslednjeg planiranog uzorkovanja krvi vraćene u prostor kolonije za životinja koje su u eksperimentu (Slika 10).
[0347] Ustanovljeno je da At102 suprimira kako anti-KLH IgM tako i T-ćelijski odgovor zavisan od IgG antitela u poređenju sa životinjama koje su tretirane samo nosačem, kao što je prikazano na Slici 10.
[0348] Nalazi ove studije su bili u skladu sa farmakološkom supresijom prozvodnje IgM i IgG antitela zavisne od CD40 nakon parenteralne primene prototipskog stranog proteina. Rezultati su ukazali da upotreba At102 može biti relevantna za lečenje lupusa, gde je proizvodnja autoantitela deo oboljenja. Ovi nalazi su podržali i biološku važnost majmuna cinomolgus kao odgovarajuće vrste za prekliničke toksikološke studije. Dalјe, studija je pokazala unakrsnu reaktivnost sa CD40 cinomolgus majmuna i in vivo aktivnost At102 u mehanizmu (T-ćelijski odgovor zavisan od antitela) za koga je poznato da je CD40 neophodan.
Primer 11: Upotreba mišjeg anti-CD40 antitela 138 za lečenje sistemskog eritematoznog lupusa (SLE)
[0349] Zbog antagonističke aktivnosti mišjeg anti-CD40 antitela 138 koja je prikazana u prethodno navedenim akutnim modelima i u modelu kolitisa (pogledati Primer 9), efikasnost ovog mišjeg anti-CD40 antitela je ispitivana i u mišjim modelima sistemskog lupusa eritematozus (SLE). Upotrebljena su dva SLE modela: MRL/lpr i NZB/W-F1 (opisani u Teofilopulos i Kono. 1999. Murine lupus models: gene-specific and genome-wide studies. U Lahita R. G., ur., Systemic Lupus Erythematosus, 3. izd., str. 145). Obrazloženje za procenu efikasnosti anti-CD40 tretmana kod MRL/lpr i NZB/W-F1 miševa je dvostruko. Najpre, modeli se razlikuju po manifestacijama SLE. NZB/W-F1 miševi spontano razvijaju lupusni nefritis i sijaladenitis, dok MRL/lpr miševi pored nefritisa i sijaladenitisa razvijaju manifestacije u zglobovima i na koži (Andrews i saradnici, J. Exp. Med. 148: 1198-1215. 1978). Pošto se pacijenti razlikuju u manifestacijama SLE, upotreba oba modela omogućava procenu potencijalne efikasnosti kod većine bolesnika sa SLE. Drugo, MRL/lpr i NZB/W-F1 miševi se razlikuju u genetičkoj osnovi njihovog oboljenja (Perry i saradnici, J. Biomed. Biotech. 2011, ID članka 271694) i, prema tome, efektivnost u modelima povećava sigurnost translacije rezultata na genetički heterogenu populaciju ljudi.
11.1. MRL/lpr model SLE
[0350] Da bi se odredila efikasnost, miševima je primenjivano mišje anti-CD40 antitelo 138 intraperitonealnom injekcijom (i.p.) počevši od 10. nedelјe starosti, u dozama navedenim ispod, u Tabeli 23. Injekcije PBS-a su korišćene kao negativna kontrola, dok je prednizolon u studiji upotrebljavan kao pozitivna kontrola.
Tabela 23.
[0351] Proteinurija je praćena na nedeljnom nivou, upotrebom Albustix štapića (brend štapića za ispitivanje proteina u urinu, za duboku primenu). Visoka proteinurija, definisana kao ≥300 mg/dL, započela je da se razvija ubrzo nakon početka lečenja, kao što je prikazano na Slici 11A. Kao što je opisano na Slici 11A, Dana 63, kada je studija završena, 50-60% netretiranih kontrolnih miševa i miševa tretiranih sa 1,5 mg/kg anti-CD40 antitela je razvilo visoku proteinuriju. Nasuprot navedenom, skoro svi miševi u drugim grupama tretmana su zadržavali nisku proteinuriju tokom čitave studije. Grupa tretirana sa 15 mg/kg 1x/nedelјno se značajno razlikovala od PBS kontrole. Praćeno je i preživlјavanje i utvrđeno je da primena doze od 15 mg/kg 1x/nedelјno i 5 mg/kg 2x nedelјno značajno produžava preživlјavanje u odnosu na netretirane, PBS kontrolne životinje, kao što je prikazano na Slici 11B. Potrebno je napomenuti da su mnogi miševi bili eutanazirani pre nego što su razvili nefritis zbog problema izazvanih limfadenopatijom koju uzrokuje Faslpr mutacija. Shodno tome, uočeno smanjenje preživlјavanja se ne može pripisati samo nefritisu. Ipak, ovi podaci ukazuju da je doza anti-CD40 antitela sprečila proteinuriju i produžila preživljavanje kod MRL/lpr miševa sklonih lupusu na način koji je zavisan od doze.
[0352] Efikasnost anti-CD40 antitela u lečenje SLE je takođe procenjivana bojenjem preseka tkiva fiksiranih u parafinu i ukalupljenih u parafin (FFPE), iz bubrega, plјuvačne žlezde i zglobova gležnja kod miševa iz različitih grupa tretmana, hematoksilinom i eozinom (H&E). Ozbiljnost oboljenja u svim ispitivanim organima kod kontrolnih, netretiranih PBS miševa se povećavala tokom 9 nedelјa studije, pošto su MRL miševi ostarili od 10. nedelјe starosti na početku i 19. nedelјa na kraju studije.
[0353] U bubregu, tretman anti-CD40 antitelom je bio efikasan u smanjenju glomerularne bolesti i Dana 29 i 63, u grupi tretiranoj sa 15 mg/kg, kao što je prikazano na Slici 12A. Kako se ozbilјnost glomerularne bolesti pogoršala sa starenjem MRL miševa, tretman anti-CD40 antitelom je zadržao efektivnost u smanjenju glomerularne bolesti u dozama od 5 i 15 mg/kg. Anti-CD40 antitelo koje je davano u dozi od 15 mg/kg jednom nedelјno, bilo je jednako efektivno kao i primena iste doze dva puta nedelјno. Antitelo anti-CD40 obezbeđivano u dozi od 5 mg/kg dva puta nedelјno, takođe je bilo gotovo iste efektivnosti.
Anti-CD40 antitelo primenjeno u dozi od 5 i 15 mg/kg je bilo efektivno i u smanjenju perivaskularnih (PV) infiltrata u bubregu, Dana 29 i 63, kao što je prikazano na Slici 12B, sa trendom smanjenja tubulointersticijske upale (TI) u ranoj fazi bolesti, što je prikazano na Slici 12C.
[0354] U plјuvačnoj žlezdi, anti-CD40 antitelo je, primenjivano u dozi od 1,5, 5 i 15 mg/kg, bilo efikasno u smanjenju inflamacije plјuvačnih žlezda 29. dana, dok je 15 mg/kg održavalo efikasnost do 63. dana terapije (Slika 13A). Infiltracija plјuvačnih žlezda se nije značajno promenila kod netretiranih miševa nakon 29. dana.
[0355] U tkivu tarzalnog zgloba, anti-CD40 antitelo, primenjeno u dozi od 1,5, 5 i 15 mg/kg, je bilo efikasno u smanjenju inflamacije oko zgloba na Dan 29, dok je 15 mg/kg održavalo ekfikasnost do 63. dana terapije (Slika 13B). U zglobovima je uočen trend smanjenja inflamacije kod miševa starih 19 nedelјa u poređenju sa miševima od 10 nedelјa. Ipak, tretman sa 15 mg/kg anti-CD40 antitela tokom 63 dana terapije, značajno je smanjio inflamaciju, gotovo do vrednosti od nule.
[0356] Obrazovanje germinativnog centra (GC) zahteva interakciju B- i T-ćelija, odnosno angažovanje CD40 sa GC B-ćelije i CD40L sa folikularnih pomoćnih T-ćelija (Tfh). GC su anatomske strukture u kojima se generišu plazma ćelije i memorijske B-ćelije i u kojima dolazi do afinitetnog sazrevanja i izmene klase Ig-ova. Oni su kritični za razvoj visokog afinitetnih i patogenih autoantitela u SLE.
[0357] Mišje anti-CD40 antitelo 138 je poremetilo B- i T-ćelijsku interakciju i sprečilo stvaranje GC. Da bi se utvrdio obim prevencije obrazovanja GC, broj GC B-ćelija i Tfh-ćelija u slezini je određivan protočnom citometrijom (Slika 14). Broj Tfh ćelija kod svih miševa tretiranih sa anti-CD40 antitelom 138, bez obzira na dozu, bio je značajno niži nego kod kontrola na Dan 29. Među ispitivanim dozama, grupa za dozu od 5 mg/kg je ostala značajno niža u 63. danu u odnosu na kontrolu (Slika 14, pogledati panele (i) i (ii)). GC B-ćelije su takođe bile nižih nivoa u odnosu na kontrolu Dana29, kod svih doznih grupa anti-CD40 antitela, i ostale su niže do Dana 63 kod miševa koji su primal anti-CD40 antitelo u dozama od 5 i 15 mg/kg. Ipak, ove razlike u odnosu na netretirane kontrolne nisu bile statistički značajne. Bez obzira na rezultate, postojao je opšti trend terapijskog efekta u svim doznim grupama. Štaviše, u ovim eksperimentima je mišje anti-CD40 antitelo ispoljilo nisku ili nikakvu agonističku aktivnost.
[0358] Ukupni nivoi IgG-a u cirkulaciji, pored nivoa autoreaktivnih antitela, povećavaju se tokom vremena i kod mišjeg i kod humanog SLE. Stoga su dalje, radi procenu uticaja anti-CD40 antitela 138 na proizvodnju antitela, ispitivani ukupni nivoi IgM i IgG-a u cirkulaciji. Dodatno, ispitivana su i anti-dsDNK antitela, uobičajena autoantitela povezana sa lupusom. Utvrđeno je da su ukupni nivoi IgG-a u miševima tretiranim anti-CD40 antitelom u dozama od 15 i 1,5 mg/kg bili značajno niži od onih u netretiranim kontrolama na Dan 29, kao što je opisano na Slici 15A. Znatno niži ukupni IgG nivoi su se zadržali do 63.
dana kod miševa tretiranih anti-CD40 antitelom 138 u dozi od 15 mg/kg, kao što je opisano na Slici 15B. Pored toga, zapaženi su značajno niži nivoi u istoj vremenskoj tački kod miševa tretiranih sa anti-CD40 antitelom 138 u dozi od 5 mg/kg. Razlika u nivoima cirkulišućeg IgM-a nije utvrđena.
[0359] Titri anti-dsDNK se nisu značajno razlikovali kod miševa tretiranih sa anti-CD40 antitelom 138 i kontrolnih miševa na Dan 29, kao što je prikazano na Slici 16A. Ipak, do Dana 63, anti-dsDNK titri su se značajno povećali kod netretiranih kontrolnih miševa, dok su kod miševa tretiranih sa 15 i 5 mg/kg anti-CD40 antitela 138 opali, iako razlika nije bila značajna, kao što je opisano na Slici 16B.
[0360] Rezultati dobijeni iz prethodno opisane studije (Primer 11.1) ukazuju da je anti-CD40 antitelo 138 efikasno u prevenciji razvoja nefritisa kod MRL/lpr miševa sklonih lupusu. Dodatno, anti-CD40 antitelo 138 je sprečilo razvoj inflamacije plјuvačnih žlezda i zglobova. Ovo istraživanje ukazuje da je antagonističko mišje anti-CD40 antitelo 138, sa svojstvima sličnim At102, efikasno u lečenju humanog SLE.
11.2. NZB/W-F1 mišji model SLE
[0361] Ispitivan je i drugi mišji model za SLE da bi se utvrdilo da li je antagonističko mišje anti-CD40 antitelo 138 efikasno u lečenju bolesti. Preciznije, za određivanje efikasnosti anti-CD40 antitela 138, antitelo je ispitivano na NZB/W-F1 miševima, pri čemu su upotrebljavani i profilaktički i terapijski režimi tretmana, sa rasporedom primene doza koji je opisan ispod, u Tabeli 24. Kao i u studiji 11.1, PBS je služio kao negativna kontrola, dok je prednizolon upotrebljavan kao pozitivna kontrola.
Tabela 24
[0362] Za profilaktički režim, tretman je započet kod miševa starih 26 nedelјa. Provereno je da su svi miševi sa <300 mg/dL proteina u urinu. Za terapijski režim, korišćen je tip stalnog uključivanja u studiju; proteinurija kod netretiranih miševa je praćena na nedeljnom nivou i kada su životinje razvile proteinuriju od ≥300 mg/dL, uključivanesu u jednu od tri grupe za terapijski režim tretmana.
Profilaktički tretman
[0363] Proteinurija je praćena na nedeljnom nivou i kao što je prikazano na Slici 17A, oko 50% netretiranih kontrolnih miševa je bilo proteureično do starosti do 32 nedelјe. Nasuprot navedenom, samo 1 miš tretiran anti-CD40 antitelom 138 i nijedan od miševa tretiranih prednizolonom nisu razvili visoku proteinuriju. Ovi rezultati su bili značajno različiti u odnosu na netretirane kontrole. Preživlјavanje, kao što je prikazano na Slici 17B, odslikava takođe nalaz značajne razlike koje su utvrđene za proteinuriji u svim tretiranim grupama u odnosu na PBS kontrole. Stoga, i doze tretmana od 15 i od 1,5 mg/kg su sprečile proteinuriju i produžile preživlјavanje.
Terapijski tretman
[0364] Terapijski tretman anti-CD40 antitelom 138 je takođe bio efikasan u navedenom drugom mišjem modelu SLE. Kao što je prikazano na Slici 18A i Slici 18B, miševi tretirani anti-CD40 antitelom 138 su tokom vremena razvili nisku proteinuriju, dok ni netretirani kontrolni miševi ni miševi tretirani prednizolonom nisu razvili nisku proteinuriju. Na osnovu brzine oporavka od proteinurije, kao što je prikazano na Slici 18B, procenjeno je da je prosečno vreme oporavka od proteinurije iznosilo 23±7 dana. Tretman anti-CD40 antitelom 138 takođe je značajno produžio preživlјavanje, kao što je prikazano na Slici 18C.
Količina izlučene pljuvačke
[0365] Proizvodnja pljuvačke je merena i kod profilaktički i terapijski tretiranih miševa radi analize funkcije plјuvačnih žlezda. Anesteziranim miševima je primenjen pilokarpin nitrat i tokom perioda od 8 minuta je prikupljana pljuvačka na pamučni bris. Količina pljuvačke je izmerena kao neto povećanje težine pamučnog brisa. U profilaktičkoj studiji je ustanovlјeno da je proizvodnja pljuvačke kod netretiranih kontrolnih miševima bila veoma varijabilna, ali i da je bila značajno različita od one kod neobolelih mlađih NZBWF-1 miševa, kao što je opisano na Slikama 19A i 19B. Varijabilnost je verovatno posledica stepena oboljenja pošto je većina kontrolnih miševa sa najnižom proizvodnjom plјuvačke bila i proteinurična (Slika 19A i 19B, lјubičasta linija nasuprot crnoj u grupi tretiranoj nosačem). Važno je, međutim, da je proizvodnja pljuvačke kod miševa tretiranih anti-CD40 antitelom 138 bila relativno ujednačena (Slika 19A) i značajno veća nego kod netretiranih kontrolnih miševa. Iako su sve kohorte tretirane anti-CD40 antitelom 138 imale veću proizvodnju pljuvačke, samo je kohorta tretirana dozom od 1,5 mg/kg zadržala značajno različitu proizvodnju kada je izražena kao funkcija telesne težine (Slika 19B). Ipak, ovi podaci ukazuju da profilaktički tretman anti-CD40 antitelom 138 može sprečiti gubitak funkcije plјuvačnih žlezda.
[0366] Kod terapijski tretiranih miševa, ustanovljeno je da miševi tretirani anti-CD40 antitelom 138 imaju značajno veću proizvodnju pljuvačke u odnosu na netretirane kontrole (Slike 20A i 20B). Slike 20A i 20B pokazuju da se proizvodnja pljuvačke očuvava terapijskom primenom doza anti-CD40 antitela. Navedeno je bilo očigledno bez obzira da li je uzeta u obzir ukupna plјuvačka ili pljuvačka normalizovana u odnosu na telesnu težinu. Primetno je da su svi netretirani miševi bili proteinurični, dok nijedan od miševa tretiranih anti-CD40 antitelom nije bio proteinuričan. Može se stoga zaključiti da terapijska primena doza antagonističkog anti-CD40 antitela koje je suštinski oslobođeno agonističke aktivnosti, sprečava ili preokreće pad u funkciji plјuvačnih žlezda.
[0367] Ova studija ukazuje da je antagonističko anti-CD40 antitelo 138 bilo efikasno u prevenciji razvoja nefritisa kod NZB/W-F1 miševa sklonih lupusu i u poštedi ovih miševa od nefritisa. Dodatno, anti-CD40 antitelo je sprečilo razvoj upale plјuvačnih žlezda i zglobova. Ova studija podržava hipotezu da će antagonističko anti-CD40 antitelo koje je suštinski bez agonističke aktivnosti, biti efikasno u humanom SLE.
[0368] Postupci upotrebljeni u Primerima 11.1 i 11.2 obuhvataju sledeće:
MRL/lpr miševi
[0369] MRL/lpr: Anti-CD40 antitelo (antitelo 138) je primenjivano i.p. MRL/lpr miševima starim 10 nedelјa, u jednoj od 4 doze; 15 mg/kg, 5 mg/kg ili 1,5 mg/kg dva puta nedelјno, ili 15 mg/kg jednom nedelјno. Miševi tretirani sa PBS-om (nosačem) i.p. dva puta nedelјno su upotrebljavani kao negativne kontrole, dok su miševi tretirani sa 10 mg/kg prednizolona PO sid bili pozitivne kontrole.
[0370] NZB/V-F1: Anti-CD40 antitelo 138 je primenjivano NZB/W-F1 miševima u okviru i profilaktičkog i terapijskog režima doziranja. Za profilaktički režim, miševima je davano anti-CD40 antitelo i.p., počevši od 26. nedelјe starosti, u bilo kojoj od dve doze od 15 mg/kg ili 1,5 mg/kg, dva puta nedelјno. Miševi kojima je primenjivan prednizolon u dozi od 10 mg/kg PO ili PBS poslužili su kao pozitivne i negativne kontrole, tim redom. Miševi su ispitivani na proteinuriju od početka i svi miševi sa ≥300 mg/dL su isklјučeni iz profilaktičke studije. U terapijskom režimu, miševima je započeto sa tretmanom kada su razvili proteinuriju od ≥300 mg/dL. Miševi su dobili anti-CD40 antitelo u dozi od 15 mg/kg dva puta nedelјno i.p.. Miševi kojima su davani prednizolon u dozi od 10 mg/kg PO sid ili PBS su poslužili kao pozitivne i negativne kontrole, tim redom.
Proteinurija
[0371] U urinu je svake nedelje ispitivan nivo proteina, upotrebom traka sa Albustix reagensom (Siemens 2191, Pittsburgh, PA). Miševi su smatrani proteinuričnim kada su nivoi proteina u urinu porasli na ≥300 mg/dL tokom najmanje 2 uzastopne analize ili pre smrti ili eutanazije.
Protočna citometrija
[0372] Jednoćelijske suspenzije slezine su pripremane u Hankovom puferisanom slanom rastvoru (Invitrogen) koji je sadržavao 1% seruma fetusa govečeta inaktivirnog toplotom (Invitrogen) i 1x penicilin/streptomycin (Sigma, St Louis, MO). Eritrociti su uklonjeni centrifugiranjem, pa su ćelije resuspendovane u puferu za bojenje (PBS (Invitrogen) sa 1,5% serumom fetusa govečeta inaktiviranim toplotom i 0,02% natrijum-azida (Sigma)). Ćelije su bojene sa antitelima za CD3 (145-2011, BD), CD4 (GK1,5 eBioSciences), ICOS (C398.4A, Biolegend), CXCR5 (L138D7, Biolegend), PD-1 (29F.1A12, Biolegend), GL7 (A488, Biolegend), CD19 (BUV395, BD), CD95 (Jo2, Biolegend). Antitela su bila direktno kuplovana sa fluorescein izotijanatom, fikoeritrinom, fikoeritrinom i cijaninom 5, alofikocijaninom, peridinin hlorofilom i cijaninom 5,5 ili biotinom. Ukupne B-ćelije su identifikovane kao CD19+; GC B-ćelije kao CD19+, CD95+ i GL7<+>; Tfh ćelije kao CD3+, CD4+, ICOS+, CXCR5+ i PD-1+. Ćelije su analizirane protočnim citometrom tipa FACSCalibur (BD Biosciences) i analizirane upotrebom FlowJo kompjuterskog programa (verzija 8.5, Treestar Inc.).
Histologija
[0373] Kada su kontrolni miševi bili na samrti, izolovana su tkiva bubrega, gležnja i plјuvačnih žlezda i fiksirana su u 10% neutralno puferisanom formalinu. Dodatno, u određenim intermedijernim vremenskim tačkama, ova ista tkiva i krv su prikuplјani od reprezentativnih miševa svake grupe. Tkiva su fiksirana u 10% neutralno puferisanom formalinu tokom 8 sati, pa su obrađena i ukalupljena u parafin za H&E bojenje. Inflamatorni infiltrati su analizirani u bubrezima, plјuvačnoj žlezdi i gležnju na osnovu rutinskog H&E bojenja preseka tkiva fiksiranog u formalinu i ukalupljenog u parafinu (FFPE). Za bubreg, patolog je procenjivao H&E preseke od 3um na skali od 0 do 4 na glomerularnu bolest, perivaskularnu infiltraciju i tubulointersticijsku infiltraciju, a na osnovu sledećih kriterijuma bodovanja: Glomerularna bolest: 0 = nema bolesti; 1 = segmentno zadeblјanje mezangijuma u nasumično prisutnim glomerulima; 2 = segmentno do difuzno zadeblјanje mezangijuma u većini glomerula; 3 = difuzno zadeblјanje mezangijuma, hipercelularnost, uvećani podociti, bez adhezija; 4 = difuzno zadeblјanje mezangijuma sa oblastima lošije patološke slike od drugih i sa jednim ili sa više od sledećeg: koagulisanim proteinima, fibrozom, hipocelularnošću, uvećanim podocitima i srpovima Bovmanove kapsule. Perivaskularna inflamacija bubrega: 0 = do nekoliko retkih limfocita; 1 = malo limfocita koji obrazuju labave agregate; 2 = limfociti koji obrazuju diskretne male agregate; 3 = polarizovani agregat limfocita koji izlazi u lumen susedne vene ali ne uspevaju da okruži arkuatnu arteriju u potpunosti; 4 = limfocitni agregati koji u potpunosti okružuju arkuatnu arteriju bez polarizacije. Tubulointersticijska (TI) infiltracija: 0 = nema infiltrata; 1 = minimalno do slabo prisutni TI infiltrati; 2 = blagi infiltrati između 20% tubula; 3 = blagi do umereni infiltrati između do 50% tubula; 4 = umereni infiltrati između i oko > 50% tubula duž renalne kore. Skorovi upale plјuvačnih žlezdi i zglobova su se zasnivali na istim principima i bili su sa sistemom bodovanja 0-4 u skladu sa povećenjem infiltrata unutar tkiva.
Izlučivanje pljuvačke
[0374] Da bi se izmerio stepen izlučivanja pljuvačnih žlezda, miševi su najpre u maloj izolacionoj komori sedirani sa kiseonikom/izofluranom. Nakon sedacije, miševima je i.p. primenjeno 30 ul (60 ug) pilokarpin nitrata (Sigma). Dva minuta nakon injeciranja, prethodno izmereni bezbedni dečiji štapići za uši (isečeni na -1,5 cm, sadrže pamučni vrh i osnovu) postavlјeni su u usta životinja iza prednjih zuba. Miševi su postavlјeni sa njihove strane da bi se omogućilo sakuplјanje plјuvačke u obraz i adsorpcija pamučnim brisom. Nakon 8 minuta, brisevi su uklonjeni i izmereni kako bi se izračunala neto težina plјuvačke.
ELISA
[0375] Ukupni nivoi IgG i IgM u cirkulaciji su određivani ELISA testom, upotrebom komercijalnog kompleta firme eBioscience (kat.br. # 88-50400, 88-50470), prema uputstvima proizvođača.
ZBIRNI PREGLED SEKVENCI

Claims (8)

Patentni zahtevi
1. Anti-CD40 antitelo koje se sastoji od teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 41 i lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u SEQ ID NO: 40.
2. Farmaceutska kompozicija koja sadrži anti-CD40 antitelo prema patentnom zahtevu 1 i farmaceutski prihvatlјiv nosač.
3. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira aminokiselinsku sekvencu anti-CD40 antitela prema patentnom zahtevu 1.
4. Vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 3.
5. Ćelija domaćin koja sadrži vektor prema patentnom zahtevu 4.
6. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 5, pri čemu je ćelija domaćin prokariotska ćelija ili eukariotska ćelija.
7. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 6, pri čemu je ćelija domaćin CHO ćelija ili COS ćelija.
8. Postupak proizvodnje anti-CD40 antitela prema patentnom zahtevu 1, postupak koji obuhvata korake kultivisanja ćelije domaćina prema bilo kom od patentnih zahteva 5-7, u medijumu za kulturu i pod uslovima koji su dovolјni da se proizvede anti-CD40 antitelo.
RS20200134A 2015-05-29 2016-05-27 Anti-cd40 antitela i njihove upotrebe RS59935B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562168425P 2015-05-29 2015-05-29
EP16728520.4A EP3303395B1 (en) 2015-05-29 2016-05-27 Anti-cd40 antibodies and uses thereof
PCT/US2016/034716 WO2016196314A1 (en) 2015-05-29 2016-05-27 Anti-cd40 antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS59935B1 true RS59935B1 (sr) 2020-03-31

Family

ID=56118046

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200134A RS59935B1 (sr) 2015-05-29 2016-05-27 Anti-cd40 antitela i njihove upotrebe

Country Status (33)

Country Link
US (3) US10174121B2 (sr)
EP (3) EP3626744A1 (sr)
JP (3) JP6518917B2 (sr)
KR (2) KR20240056663A (sr)
CN (2) CN107810198B (sr)
AR (1) AR104809A1 (sr)
AU (2) AU2016270640B2 (sr)
CA (1) CA2987051A1 (sr)
CL (1) CL2017003007A1 (sr)
CO (1) CO2017012286A2 (sr)
CR (1) CR20170592A (sr)
CY (1) CY1122593T1 (sr)
DK (1) DK3303395T3 (sr)
DO (1) DOP2017000273A (sr)
EC (1) ECSP17085333A (sr)
ES (1) ES2774016T3 (sr)
HR (1) HRP20200262T1 (sr)
HU (1) HUE048284T2 (sr)
IL (1) IL255961B (sr)
LT (1) LT3303395T (sr)
MX (1) MX392748B (sr)
PE (1) PE20180193A1 (sr)
PH (1) PH12017502161A1 (sr)
PL (1) PL3303395T3 (sr)
PT (1) PT3303395T (sr)
RS (1) RS59935B1 (sr)
RU (1) RU2715597C2 (sr)
SI (1) SI3303395T1 (sr)
TW (2) TWI688574B (sr)
UA (1) UA125208C2 (sr)
UY (1) UY36692A (sr)
WO (1) WO2016196314A1 (sr)
ZA (1) ZA201707903B (sr)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3180087B1 (en) 2014-08-12 2019-03-13 Alligator Bioscience AB Combination therapies with anti cd40 antibodies
AU2015360502A1 (en) 2014-12-10 2017-06-29 Regents Of The University Of Minnesota Genetically modified cells, tissues, and organs for treating disease
US10174121B2 (en) * 2015-05-29 2019-01-08 Abbvie, Inc. Anti-CD40 antibodies
EP3448874A4 (en) 2016-04-29 2020-04-22 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
EP3448987A4 (en) 2016-04-29 2020-05-27 Voyager Therapeutics, Inc. COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE
SI3464361T1 (sl) * 2016-05-27 2022-01-31 Abbvie Biotherapeutics Inc. Protitelesa proti CD40 in njihove uporabe
KR102379464B1 (ko) 2016-06-20 2022-03-29 키맵 리미티드 항-pd-l1 항체
WO2018217976A1 (en) 2017-05-25 2018-11-29 Bristol-Myers Squibb Company Antagonistic cd40 monoclonal antibodies and uses thereof
MX2019014375A (es) 2017-06-01 2020-01-23 Jiangsu Hengrui Medicine Co Anticuerpo anti-cd40, fragmento de union a antigeno del mismo, y uso medico del mismo.
AU2018308088B2 (en) 2017-07-25 2025-05-29 Truebinding, Inc. Treating cancer by blocking the interaction of TIM-3 and its ligand
KR20200095493A (ko) * 2017-12-01 2020-08-10 애브비 인코포레이티드 항-cd40 항체 약물 공액체
CA3090322A1 (en) * 2018-02-12 2019-08-15 Diabetes-Free, Inc. Improved antagonistic anti-human cd40 monoclonal antibodies
CN108918892B (zh) * 2018-08-01 2021-04-27 百奥泰生物制药股份有限公司 一种测定抗vegf抗体活性的方法及其应用
WO2020102454A1 (en) 2018-11-13 2020-05-22 Regents Of The University Of Minnesota Cd40 targeted peptides and uses thereof
AR117091A1 (es) * 2018-11-19 2021-07-07 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos monoclonales antagonistas contra cd40 y sus usos
BR112021009835A2 (pt) 2018-11-30 2021-08-17 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. anticorpo anti-cd40, fragmento de ligação ao antígeno e uso farmacêutico dos mesmos
EP3939998A4 (en) 2018-11-30 2022-08-10 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. PHARMACEUTICAL COMPOSITION WITH CD40 ANTIBODY AND USE THEREOF
WO2020144605A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 Novartis Ag Anti-cd40 antibodies for use in treatment of hidradenitis suppurativa
AU2020214796A1 (en) 2019-01-30 2021-07-29 Truebinding, Inc. Anti-Gal3 antibodies and uses thereof
US11110149B2 (en) 2019-02-20 2021-09-07 Ksl Biomedical Inc. Method for predicting and monitoring the efficacy of low-dose IL-2 and hydroxychloroquine therapy in autoimmune diseases and its long-term use in autoimmune-related conditions
CN109678959B (zh) * 2019-02-22 2020-12-08 北京免疫方舟医药科技有限公司 抗cd40抗体及其应用
IL322315A (en) 2019-05-14 2025-09-01 Provention Bio Inc Methods and preparations for preventing type 1 diabetes
US20220378907A1 (en) * 2019-11-13 2022-12-01 Children's Hospital Medical Center Methods for treating diseases
KR20220109436A (ko) * 2019-12-03 2022-08-04 에보텍 인터내셔널 게엠베하 인터페론-결합된 항원 결합 단백질 및 이의 용도
EP4074725A4 (en) * 2019-12-09 2024-02-28 Optolane Technologies Inc. SWITCH BINDER, METHOD FOR PREPARING SAME, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION, ASSAY KIT, AND METHOD FOR DOSING ANTIGEN AND ANTIBODY, EACH USING THE SAME
MX2022007688A (es) 2019-12-20 2022-07-19 Amgen Inc Constructos de anticuerpo multiespecificos agonistas de cd40 dirigidos a mesotelina para el tratamiento de tumores solidos.
WO2021242776A2 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Truebinding, Inc. Methods of treating inflammatory diseases by blocking galectin-3
KR20230020521A (ko) * 2020-06-04 2023-02-10 셀벡스 피티와이 리미티드 아고니스트 항-cd40 항체
AU2021287998B2 (en) 2020-06-11 2026-03-12 Benaroya Research Institute At Virginia Mason Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
WO2022002065A1 (zh) * 2020-06-30 2022-01-06 百奥泰生物制药股份有限公司 抗cd40抗体或抗原结合片段及其应用
WO2022036495A1 (en) * 2020-08-17 2022-02-24 Utc Therapeutics Inc. Lymphocytes-antigen presenting cells co-stimulators and uses thereof
FI4284512T3 (fi) 2021-01-28 2025-05-22 Regeneron Pharma Koostumuksia ja menetelmiä sytokiinien vapautumisoireyhtymän hoitamiseksi
US12565529B2 (en) 2021-05-24 2026-03-03 Provention Bio, Inc. Methods for treating type 1 diabetes
CN113341161A (zh) * 2021-06-10 2021-09-03 苏州大学附属第一医院 Icos/icosl在诊治变态反应性皮肤病中的应用
CN115768477A (zh) * 2021-06-29 2023-03-07 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 特异性识别cd40的抗体及其应用
WO2023284714A1 (zh) * 2021-07-14 2023-01-19 舒泰神（北京）生物制药股份有限公司 特异性识别cd40的抗体及其应用
CN114158523A (zh) * 2021-08-12 2022-03-11 昆明医科大学 一种改良兔腹主动脉粥样斑块模型的建立方法
US20240383994A1 (en) * 2021-09-24 2024-11-21 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Anti-cd40 antibody and use thereof
AU2022351098A1 (en) * 2021-09-26 2024-05-09 Chia Tai Tianqing Pharmaceutical Group Co., Ltd. Use of anti-cd40 antibody
KR20250017248A (ko) * 2022-05-27 2025-02-04 엘레던 파마슈티컬즈, 아이엔씨. 신장 질환 또는 장애의 치료 방법
WO2024054992A1 (en) 2022-09-09 2024-03-14 Bristol-Myers Squibb Company Methods of separating chelator
US20240190978A1 (en) 2022-11-15 2024-06-13 CSBioAsset LLC Compositions and methods for immunomodulatory bifunctional fusion molecules
CN117777306B (zh) * 2023-07-04 2024-08-20 深圳豪石生物科技有限公司 一种靶向cldn18.2的增强型嵌合抗原受体及其用途
CN117777307B (zh) * 2023-09-26 2024-08-20 深圳豪石生物科技有限公司 一种cldn18.2特异性嵌合t细胞受体、嵌合t细胞受体免疫细胞及其应用
CN116990528B (zh) * 2023-09-27 2024-02-06 成都华西海圻医药科技有限公司 一种基于Gyrolab平台快速测定抗CD40单抗的分析方法
WO2025184567A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
WO2025184603A2 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. The use of cd40 inhibitors for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration

Family Cites Families (150)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US225A (en) 1837-06-03 Machine fob
US4526A (en) 1846-05-16 Improvement in the mode o
US938A (en) 1838-09-22 Improvement in paddle-wheels for propelling boats
US5780A (en) 1848-09-19 Improvement in preparing shoe-pegs
ATE37983T1 (de) 1982-04-22 1988-11-15 Ici Plc Mittel mit verzoegerter freigabe.
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US5128326A (en) 1984-12-06 1992-07-07 Biomatrix, Inc. Drug delivery systems based on hyaluronans derivatives thereof and their salts and methods of producing same
GB2183661B (en) 1985-03-30 1989-06-28 Marc Ballivet Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides or proteins by means of a dna recombinant technique
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5182368A (en) 1986-06-13 1993-01-26 Ledbetter Jeffrey A Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US5247069A (en) 1986-06-13 1993-09-21 Oncogen Ligands and methods for augmenting B-cell proliferation
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US5258498A (en) 1987-05-21 1993-11-02 Creative Biomolecules, Inc. Polypeptide linkers for production of biosynthetic proteins
US4880078A (en) 1987-06-29 1989-11-14 Honda Giken Kogyo Kabushiki Kaisha Exhaust muffler
US5506126A (en) 1988-02-25 1996-04-09 The General Hospital Corporation Rapid immunoselection cloning method
HUT53672A (en) 1988-02-25 1990-11-28 Gen Hospital Corp Quick immunoselective cloning process
EP0436597B1 (en) 1988-09-02 1997-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1990014443A1 (en) 1989-05-16 1990-11-29 Huse William D Co-expression of heteromeric receptors
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
WO1991005548A1 (en) 1989-10-10 1991-05-02 Pitman-Moore, Inc. Sustained release composition for macromolecular proteins
WO1991006287A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Enzytech, Inc. Protein microspheres and methods of using them
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
WO1991010737A1 (en) 1990-01-11 1991-07-25 Molecular Affinities Corporation Production of antibodies using gene libraries
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
EP0585287B1 (en) 1990-07-10 1999-10-13 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
EP0542810A1 (en) 1990-08-02 1993-05-26 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
CA2405246A1 (en) 1990-12-03 1992-06-11 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with alterred binding properties
EP0575485A1 (en) 1991-03-01 1993-12-29 Dyax Corp. Process for the development of binding mini-proteins
DK0580737T3 (da) 1991-04-10 2004-11-01 Scripps Research Inst Heterodimere receptorbiblioteker ved anvendelse af phagemider
WO1992019244A2 (en) 1991-05-01 1992-11-12 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine A method for treating infectious respiratory diseases
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
CA2110799A1 (en) 1991-06-14 1992-12-23 Arnold H. Horwitz Microbially-produced antibody fragments and their conjugates
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
ES2341666T3 (es) 1991-12-02 2010-06-24 Medimmune Limited Produccion de autoanticuerpos de repertorios de segmentos de anticue rpos expresados en la superficie de fagos.
EP1291360A1 (en) 1991-12-13 2003-03-12 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5714350A (en) 1992-03-09 1998-02-03 Protein Design Labs, Inc. Increasing antibody affinity by altering glycosylation in the immunoglobulin variable region
US5912015A (en) 1992-03-12 1999-06-15 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Modulated release from biocompatible polymers
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
US5397703A (en) 1992-07-09 1995-03-14 Cetus Oncology Corporation Method for generation of antibodies to cell surface molecules
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
AU5098493A (en) 1992-08-21 1994-03-15 Schering Corporation Cd40 ligand, anti cd40 antibodies, and soluble cd40
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
US5934272A (en) 1993-01-29 1999-08-10 Aradigm Corporation Device and method of creating aerosolized mist of respiratory drug
ES2211884T3 (es) 1993-10-01 2004-07-16 Immunex Corporation Anticuerpos contra el cd40.
EP0733070A1 (en) 1993-12-08 1996-09-25 Genzyme Corporation Process for generating specific antibodies
EP0751781B1 (en) 1993-12-23 2004-05-26 Immunex Corporation Use of monoclonal antibodies or soluble oligomeric ligands in the manufacture of a medicament for the prevention or treatment of neoplastic disorders
PT1231268E (pt) 1994-01-31 2005-11-30 Univ Boston Bancos de anticorpos policlonais
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
EP0805678B1 (en) 1995-01-05 2003-10-29 THE BOARD OF REGENTS acting for and on behalf of THE UNIVERSITY OF MICHIGAN Surface-modified nanoparticles and method of making and using same
US6091001A (en) 1995-03-29 2000-07-18 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6130364A (en) 1995-03-29 2000-10-10 Abgenix, Inc. Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
EP0826034A4 (en) 1995-04-21 2002-06-19 Cell Genesys Inc PRODUCTION OF LARGE GENOMIC DNA DELETIONS
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
EP0850051A2 (en) 1995-08-31 1998-07-01 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Composition for sustained release of an agent
JP2978435B2 (ja) 1996-01-24 1999-11-15 チッソ株式会社 アクリロキシプロピルシランの製造方法
DK0929578T3 (da) 1996-02-09 2003-08-25 Abbott Lab Bermuda Ltd Humane antistoffer, der binder human TNFalfa
DK0885002T3 (da) 1996-03-04 2011-08-22 Penn State Res Found Materialer og fremgangsmåder til forøgelse af cellulær internalisering
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5874064A (en) 1996-05-24 1999-02-23 Massachusetts Institute Of Technology Aerodynamically light particles for pulmonary drug delivery
US5985309A (en) 1996-05-24 1999-11-16 Massachusetts Institute Of Technology Preparation of particles for inhalation
US5855913A (en) 1997-01-16 1999-01-05 Massachusetts Instite Of Technology Particles incorporating surfactants for pulmonary drug delivery
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
DE69732306T2 (de) 1997-01-16 2006-01-12 Massachusetts Institute Of Technology, Cambridge Zubereitung von partikelhaltigen arzneimitteln zur inhalation
DK1712623T3 (da) 1997-01-21 2012-02-06 Gen Hospital Corp Udvælgelse af proteiner ved anvendelse af RNA-proteinfusioner
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
US5989463A (en) 1997-09-24 1999-11-23 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Methods for fabricating polymer-based controlled release devices
SE512663C2 (sv) 1997-10-23 2000-04-17 Biogram Ab Inkapslingsförfarande för aktiv substans i en bionedbrytbar polymer
US6051228A (en) * 1998-02-19 2000-04-18 Bristol-Myers Squibb Co. Antibodies against human CD40
AU2978899A (en) 1998-03-03 1999-09-20 Abgenix, Inc. Cd147 binding molecules as therapeutics
US20020029391A1 (en) 1998-04-15 2002-03-07 Claude Geoffrey Davis Epitope-driven human antibody production and gene expression profiling
CA2336139C (en) 1998-06-24 2008-10-14 Advanced Inhalation Research, Inc. Large porous particles emitted from an inhaler
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
DK1141028T3 (da) 1998-12-23 2010-05-25 Pfizer Humane monoklonale antistoffer til CTLA-4
SI2168984T1 (sl) 1999-03-25 2012-12-31 Abbott Gmbh & Co. Kg Človeška protitelesa za vezavo IL-12 in postopki izdelave
EP1176195B1 (en) 1999-04-09 2013-05-22 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
IL129907A (en) 1999-05-12 2006-08-01 Compugen Ltd Alternative splice variants
IL130989A0 (en) 1999-07-20 2001-01-28 Compugen Ltd Variants of alternative splicing
WO2001034649A2 (en) 1999-11-09 2001-05-17 Chiron Corporation Compositions and methods for treating autoimmune diseases and transplant rejections
US7148061B2 (en) 2000-02-11 2006-12-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Identification of a novel domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US20030059427A1 (en) * 2000-04-28 2003-03-27 Force Walker R. Isolation and characterization of highly active anti-CD40 antibody
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
EP2322644A1 (en) 2000-06-28 2011-05-18 GlycoFi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
JP4202127B2 (ja) 2000-10-02 2008-12-24 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス，インコーポレーテッド アンタゴニスト抗ｃｄ４０抗体を用いるｂ細胞悪性腫瘍の治療方法
NZ526720A (en) 2000-12-28 2007-11-30 Altus Pharmaceuticals Inc Crystallisation of whole antibodies or fragments thereof, on a large scale and a process allowing an alternative route for delivery of therapeutic antibodies
PT1391464E (pt) * 2001-04-27 2007-11-15 Kirin Pharma Kk Anticorpo monoclonal anti-cd40
JP4025881B2 (ja) * 2001-04-27 2007-12-26 キリンファーマ株式会社 抗ｃｄ４０モノクローナル抗体
JP2005503789A (ja) 2001-08-17 2005-02-10 イーライ・リリー・アンド・カンパニー 抗Ａβ抗体
DK1438400T3 (da) 2001-10-01 2009-10-05 Dyax Corp Flerkædede eukaryote display-vektorer og anvendelser deraf
WO2003029296A1 (en) 2001-10-02 2003-04-10 Chiron Corporation Human anti-cd40 antibodies
HUP0600342A3 (en) 2001-10-25 2011-03-28 Genentech Inc Glycoprotein compositions
US20040028687A1 (en) 2002-01-15 2004-02-12 Waelti Ernst Rudolf Methods and compositions for the targeted delivery of therapeutic substances to specific cells and tissues
AU2003206045A1 (en) 2002-02-22 2003-09-09 Compugen Ltd. CD40 splice variants, method of detection thereof, compositions comprising said variant(s) or nucleic acid encoding the same and use thereof
AU2003217912A1 (en) * 2002-03-01 2003-09-16 Xencor Antibody optimization
US7002164B2 (en) * 2003-01-08 2006-02-21 Intel Corporation Source multiplexing in lithography
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
ES2532399T3 (es) 2003-03-05 2015-03-26 Halozyme, Inc. Glicoproteína hialuronidasa soluble (sHASEGP), proceso para prepararla, usos y composiciones farmacéuticas que la comprenden
GB0407315D0 (en) 2003-07-15 2004-05-05 Cambridge Antibody Tech Human antibody molecules
WO2005035575A2 (en) 2003-08-22 2005-04-21 Medimmune, Inc. Humanization of antibodies
US8277810B2 (en) 2003-11-04 2012-10-02 Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc. Antagonist anti-CD40 antibodies
PT1694360E (pt) 2003-11-04 2010-12-13 Novartis Vaccines & Diagnostic Utilização de anticorpos monoclonais antagonistas anti-cd40 para o tratamento de doenças auto-imunes e inflamatórias e da rejeição ao transplante de orgãos
BRPI0417266B8 (pt) 2003-12-25 2021-05-25 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd anticorpo monoclonal, seu uso e composição farmacêutica
US20050281815A1 (en) 2004-02-26 2005-12-22 Dani Eshel CD40 splice variants and their uses
WO2005105840A2 (en) 2004-03-26 2005-11-10 Five Prime Therapeutics, Inc. Cd40 variants and uses thereof
EP1737969B2 (en) 2004-04-15 2018-09-12 GlycoFi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
US20070292439A1 (en) 2004-04-27 2007-12-20 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Antagonist Anti-Cd40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use
AU2005294214A1 (en) 2004-10-07 2006-04-20 Emory University Multifunctional nanoparticles conjugates and their use
EP2468768A3 (en) 2005-07-21 2012-10-31 Abbott Laboratories Multiple gene expression including sorf contructs and methods with polyproteins, pro-proteins, and proteolysis
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
US8926979B2 (en) 2005-11-01 2015-01-06 Novartis Ag Treatment of cancer or pre-malignant conditions using anti-CD40 antibodies
JP2009513712A (ja) 2005-11-01 2009-04-02 ノバルティス アーゲー 抗ｃｄ４０抗体の使用
MX2008013508A (es) * 2006-04-21 2008-10-31 Novartis Ag Composiciones farmaceuticas de anticuerpos antagonistas anti-cd40.
EP1854810A1 (en) 2006-05-09 2007-11-14 PanGenetics B.V. Deimmunized antagonistic anti-human CD40 monoclonal antibody from the ch5D12 antibody
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
US20090285757A1 (en) 2008-05-16 2009-11-19 Northeastern University Methods of targeting cells for diagnosis and therapy
DK2406286T3 (en) * 2009-03-10 2016-08-22 Baylor Res Inst Anti-cd40 antibodies and uses thereof
EP2406289B1 (en) * 2009-03-10 2017-02-22 Baylor Research Institute Antigen presenting cell targeted anti-viral vaccines
US20110217363A1 (en) 2010-03-05 2011-09-08 Bionanox Two-step targeted tumor therapy with prodrug encapsulated in nanocarrier
BR112012024713B1 (pt) * 2010-03-31 2021-02-17 Boehringer Ingelheim International Gmbh anticorpo humanizado, seus usos e composição farmacêutica que o compreende
AR083847A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Novartis Ag Variantes de fc (fragmento constante) silenciosas de los anticuerpos anti-cd40
HUE065915T2 (hu) 2011-03-11 2024-06-28 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc Anti-CD40 antitestek és alkalmazásaik
BR112013026828A2 (pt) 2011-04-21 2016-11-29 Bristol Myers Squibb Co polipeptídeos de anticorpo que antagonizam cd40
CN113461819B (zh) 2011-04-29 2024-01-02 埃派斯进有限公司 抗-cd40抗体及其使用方法
AU2013337903B2 (en) 2012-10-30 2018-08-16 Apexigen, Inc. Anti-CD40 antibodies and methods of use
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US10174121B2 (en) * 2015-05-29 2019-01-08 Abbvie, Inc. Anti-CD40 antibodies
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016196314A1 (en) 2016-12-08
UA125208C2 (uk) 2022-02-02
CL2017003007A1 (es) 2018-04-27
CN107810198A (zh) 2018-03-16
MX392748B (es) 2025-03-24
IL255961A (en) 2018-01-31
JP2018520654A (ja) 2018-08-02
CR20170592A (es) 2018-02-13
PH12017502161A1 (en) 2018-06-04
RU2017145554A (ru) 2019-07-02
KR20180010265A (ko) 2018-01-30
RU2017145554A3 (sr) 2019-09-03
US20160347850A1 (en) 2016-12-01
DOP2017000273A (es) 2017-12-29
PE20180193A1 (es) 2018-01-26
EP3303395B1 (en) 2019-12-11
EP3626744A1 (en) 2020-03-25
US20220289858A1 (en) 2022-09-15
AU2016270640B2 (en) 2022-03-10
PL3303395T3 (pl) 2020-05-18
CN107810198B (zh) 2021-09-03
HK1248718A1 (zh) 2018-10-19
AU2016270640A1 (en) 2017-12-07
AU2022204066A1 (en) 2022-06-30
ZA201707903B (en) 2021-06-30
KR20240056663A (ko) 2024-04-30
JP2019150024A (ja) 2019-09-12
EP3303395A1 (en) 2018-04-11
TW201708259A (zh) 2017-03-01
JP2021090433A (ja) 2021-06-17
CY1122593T1 (el) 2021-01-27
RU2715597C2 (ru) 2020-03-02
DK3303395T3 (da) 2020-01-27
CO2017012286A2 (es) 2018-02-28
LT3303395T (lt) 2020-02-25
UY36692A (es) 2016-12-30
ES2774016T3 (es) 2020-07-16
AR104809A1 (es) 2017-08-16
IL255961B (en) 2022-02-01
PT3303395T (pt) 2020-02-20
BR112017025693A2 (pt) 2018-08-14
TWI688574B (zh) 2020-03-21
JP6518917B2 (ja) 2019-05-29
JP6842488B2 (ja) 2021-03-17
TWI740384B (zh) 2021-09-21
HRP20200262T1 (hr) 2020-05-29
CA2987051A1 (en) 2016-12-08
ECSP17085333A (es) 2018-02-28
KR102661078B1 (ko) 2024-05-23
EP4047022A1 (en) 2022-08-24
HUE048284T2 (hu) 2020-07-28
TW202043290A (zh) 2020-12-01
CN113603782A (zh) 2021-11-05
SI3303395T1 (sl) 2020-03-31
MX2017015143A (es) 2018-03-28
US20190359725A1 (en) 2019-11-28
US10174121B2 (en) 2019-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220289858A1 (en) Anti-cd40 antibodies and uses thereof
RU2570639C2 (ru) Терапевтические dll4-связывающие белки
AU2011223919B2 (en) Therapeutic DLL4 binding proteins
KR20110040886A (ko) 프로스타글란딘 ｅ2 결합 단백질 및 이의 용도
JP2014503202A (ja) ＴＮＦ−α結合性タンパク質
TW201138825A (en) TNF-α binding proteins
JP2013507929A (ja) Ｉｌ−１結合蛋白質
KR20130080058A (ko) Ｉｌ-12/ｐ40 결합 단백질
HK1248718B (zh) 抗cd40抗体及其用途
BR112017025693B1 (pt) Anticorpo anti-cd40 antagonista de comprimento total e composição farmacêutica que compreende o referido anticorpo
AU2015202980A1 (en) Therapeutic DLL4 binding proteins