RS60030B1

RS60030B1 - Monoklonska antitela protiv humanog antigena sazrevanja b ćelija (bcma)

Info

Publication number: RS60030B1
Application number: RS20200276A
Authority: RS
Inventors: Minh Diem Vu; Klaus Strein; Oliver Ast; Marina Bacac; Camille Delon; Lydia Jasmin Duerner; Anne Freimoser-Grundschober; Christian Klein; Ekkehard Moessner; Samuel Moser; Pablo Umana; Tina Weinzierl
Original assignee: Engmab Sarl
Priority date: 2015-08-03
Filing date: 2016-08-03
Publication date: 2020-04-30
Also published as: EA201890441A1; CN108350073A; CN108350073B; MX2020009649A; EA202092435A2; HUE048939T2; KR102717307B1; SMT202000139T1; DK3331910T3; AU2016302881A1; CL2018000281A1; PL3331910T3; EP3331910B1; MX377710B; BR112018001955B1; EP3670535A1; US10683369B2; IL257233B; EA036975B1; JP6682632B2

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na nova antitela protiv BCMA, njihovu proizvodnju i upotrebu.

Osnov pronalaska

[0002] Humani antigen sazrevanja B ćelija, poznat i kao BCMA; TR17_HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223), član je superfamilije receptora za faktor nekroze tumora koji se prvenstveno eksprimira u diferenciranim plazmocitima (Laabi et al. 1992; Madry et al. 1998). BCMA je neglikozilovani transmembranski protein tipa III uključen u sazrevanje, rast i preživljavanje B ćelija. BCMA je receptor za dva liganda iz superfamilije TNF: APRIL (ligand koji indukuje proliferaciju), visokoafinitetni ligand za BCMA, i faktor aktivacije B ćelija BAFF, niskoafinitetni ligand za BCMA (THANK, BlyS, stimulator B limfocita, TALL-1 i zTNF4). APRIL i BAFF pokazuju strukturnu sli čnost i specifičnost vezivanja za receptor koja se preklapa, ali je ipak distinktivna. Negativni regulator TACI takođe se vezuje i za BAFF i za APRIL. Koordinisano vezivanje APRIL i BAFF za BCMA i/ili TACI aktivira transkripcioni faktor NF-кB i povećava ekspresiju čllanova familije Bcl-2 koji podstiču preživljavanje (npr. Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1) i negativnu regulaciju pro-apoptotskih faktora (npr. Bid, Bad, Bik, Bim, itd.), inhibirajući na taj na čin apoptozu i podstičući preživljavanje. Ovo kombinovano dejstvo pokreće diferencijaciju, proliferaciju, preživljavanje B-ćelija i proizvodnju antitela u njima (kao što je pregledno dato u Rickert RC et al., Immunol Rev (2011) 244 (1): 115-133).

[0003] Antitela protiv BCMA opisana su npr. kod Gras M-P. et al. Int Immunol. 7 (1995) 1093-1106, WO200124811, WO200124812, WO2010104949 i WO2012163805. Antitela protiv BCMA i njihova upotreba u lečenju limfoma i multiplog mijeloma pominju se npr. u WO2002066516 i WO2010104949. WO2013154760 i WO2015052538 se odnose na himerne antigenske receptore (CAR) koji sadrže fragment prepoznavanja BCMA i fragment aktivacije T ćelija. Ryan, MC et al., Mol. Cancer Ther. 6 (2007) 3009-3018 se odnosi na anti-BCMA antitela sa aktivnošću blokiranja liganda koja bi mogla da podstaknu citotoksičnost za ćelijske linije multiplog mijeloma (MM) kao „gola“ antitela ili kao konjugati antitelo-lek. Ryan je pokazao da SG1, inhibitorno antitelo protiv BCMA, blokira APRIL-zavisnu aktivaciju nuklearnog faktoraкB na dozno-zavisan način in vitro. Ryan takođe pominje antitelo SG2, koje inhibira APRIL, koje se ne vezuje značajno za BCMA.

[0004] U bliskoj prošlosti razvijeni su veoma raznovrsni formati rekombinantnih bispecifičnih antitela, npr., fuzijom, npr. antitela IgG formata i jednolančanih domena (videti npr. Kontermann RE, mAbs 4:2, (2012) 1-16). Bispecifična antitela u kojima su varijabilni domeni VL i VH ili konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim opisana su u WO2009080251 i WO2009080252.

[0005] Pristup za prevazilaženje problema pogrešno sparenih sporednih proizvoda, poznat kao "izbočine u udubljenjima", ima za cilj forsirano sparivanje dva različita teška lanca antitela uvođenjem mutacija u CH3 domene kako bi se modifikovala kontaktna površina. Na jednom lancu, glomazne aminokiseline zamenjuju se aminokiselinama sa kratkim bočnim lancima da bi se napravilo "udubljenje". Nasuprot tome, aminokiseline sa velikim bočnim lancima uvode se u drugi CH3 domen, da bi se napravila "izbočina". Koeksprimiranjem ova dva teška lanca (i dva identična laka lanca koja moraju biti odgovarajuća za oba teška lanca), zapaženi su visoki prinosi formiranih heterodimera ("izbočina-udubljenje") u odnosu na formirane homodimere ("udubljenje-udubljenje" ili "izbočina-izbočina") (Ridgway JB, Presta LG, Carter P. Protein Eng.

9, 617-621 (1996); i WO1996027011). Procenat heterodimera mogao bi dodatno da se poveća preoblikovanjem površina interakcije dva CH3 domena korišćenjem pristupa prikaza na fagu i uvođenjem disulfidnog mosta za stabilizovanje heterodimera (Merchant A.M, et al, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; AĲwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., J Mol. Biol 270 (1997) 26-35). Novi pristupi tehnologije "izbočine u udubljenjima" opisani su npr. u EP 1870459A1. Iako ovaj format izgleda veoma privlačno, trenutno nema podataka koji govore o napretku ka kliničkoj upotrebi. Jedno važno ograničenje ove strategije je to što laki lanci dva roditeljska antitela treba da budu identični da bi se sprečilo pogrešno sparivanje i formiranje neaktivnih molekula. Prema tome, ova tehnika nije pogodna za lako razvijanje rekombinantnih bispecifičnih antitela protiv dva ciljna molekula polazeći od dva antitela protiv prvog i drugog ciljnog molekula, jer teški lanci ovih antitela i/ili identični laki lanci treba da budu optimizovani. Xie, Z., et al, J Immunol. Methods 286 (2005) 95-101 odnosi se na format bispecifičnog antitela koje koristi scFv u kombinaciji sa tehnologijom "izbočine u udubljenjima" za FC deo.

[0006] Kompleks TCR/CD3 T limfocita sastoji se od TCR alfa (α)/beta (β) ili TCR gama (у)/delta (δ) heterodimera koeksprimiranih na svim ćelijskim površinama sa nepromenjenim subjedinicama CD3 obeleženim kao gama (γ), delta (δ), epsilon (ε), zeta (ζ), i eta (η). Humani CD3ε je opisan pod brojem UniProt P07766 (CD3E_HUMAN).

[0007] Anti-CD3ε antitelo opisano u stanju tehnike je SP34 (Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100). SP34 reaguje sa CD3 primata, kao i čoveka. SP34 je dostupno kod Pharmingen. Sledeće anti-CD3 antitelo opisano u stanju tehnike je UCHT-1 (videti WO2000041474). Sledeće anti-CD3 antitelo opisano u stanju tehnike je BC-3 (Fred Hutchinson Cancer Research Institute; korišćeno u fazi I/II ispitivanja GvHD, Anasetti et al., Transplantation 54: 844 (1992)). SP34 se razlikuje od UCHT-1 i BC-3 po tome što SP-34 prepoznaje epitop prisutan samo na ε lancu CD3 (videti Salmeron et al., (1991) J. Immunol. 147: 3047), dok UCHT-1 i BC-3 prepoznaju epitop kome doprinose i ε i γ lanac. Dodatna anti-CD3 antitela su opisana u WO2008119565, WO2008119566, WO2008119567, WO2010037836, WO2010037837, WO2010037838, i US8236308 (WO2007042261). CDR, VH i VL sekvence dodatnog anti-CD3 antitela prikazane su u SEQ ID NO:7 i 8.

[0008] Bispecifična antitela protiv CD3 i BCMA pomenuta su u WO2007117600, WO2009132058, WO2012066058, i WO2012143498. CAR jedinjenja antitela protiv BCMA pomenuta su u WO2013154760, WO2013154760, i WO2014140248.

[0009] Ćelijski-posredovane efektorske funkcije monoklonskih antitela (kao ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC)) mogu da se poboljšaju konstruisanjem njihove oligosaharidne kompozicije na Asn297 kao što je opisano kod Umaña, P., et al., Nature Biotechnol. 17 (1999) 176-180; i US6602684. WO1999054342, WO2004065540, WO2007031875, i WO2007039818, Hristodorov D, Fischer R, Linden L., Mol Biotechnol.2012 Oct 25. (Epub) se takođe odnosi na konstruisanje glikozilacije antitela za poboljšanje Fcposredovane ćelijske citotoksičnosti.

[0010] Nekoliko aminokiselinskih rezidua u regionu zgloba i CH2 domenu takođe utiče na ćelijski-posredovane efektorske funkcije monoklonskih antitela (Eur. J. Immunol., 23, 1098 (1993), Immunology, 86, 319 (1995), Chemical Immunology, 65, 88 (1997)] Chemical Immunology, 65, 88 (1997)]. Stoga modifikacije takvih aminokiselina mogu da poboljšaju ćelijski-posredovane efektorske funkcije. Takve modifikacije antitela za povećanje ćelijskiposredovanih efektorskih funkcija pominju se u EP1931709, WO200042072 i sadrže u Fc delu supstitucije na aminokiselinskoj poziciji/pozicijama 234, 235, 236, 239, 267, 268, 293, 295, 324, 327, 328, 330, i 332. Sledeće modifikacije antitela za povećanje ćelijski-posredovanih efektorskih funkcija pomenute su u EP1697415 i obuhvataju zamenu aminokiseline na EU aminokiselinskim pozicijama 277, 289, 306, 344, ili 378 naelektrisanom aminokiselinom, polarnom aminokiselinom, ili nepolarnom aminokiselinom.

[0011] Formati antitela i formati bispecifičnih i multispecifičnih antitela su takođe pep-tela (WO200244215), novi antigenski receptor ("NAR") (WO2003014161), dimeri diatelo-diatelo "TandAbs" (WO2003048209), polialkilen oksid-modifikovani scFv (US7150872), humanizovana antitela kunića (WO2005016950), sintetski imunoglobulinski domeni (WO2006072620), kovalentna diatela (WO2006113665), fleksi-tela (WO2003025018), domenska antitela, dAb (WO2004058822), vakci-tela (WO2004076489), antitela sa okvirnim regionom primata novog sveta (WO2007019620), konjugat antitelo-lek sa linkerima koji mogu da se isecaju (WO2009117531), IgG4 antitela sa uklonjenim regionom zgloba (WO2010063785), bispecifična antitela sa IgG4 kao CH3 domenima (WO2008119353), antitela kamelida (US6838254), nano-tela (US7655759), CAT diatela (US5837242), bispecifični (scFv)2usmeren protiv ciljnog antigena i CD3 (US7235641),), sIgA plAntitela (US6303341), mini-tela (US5837821), IgNAR (US2009148438), antitela sa modifikovanim zglobnim i Fc regionima (US2008227958, US20080181890), trifunkcionalna antitela (US5273743), triomab (US6551592), „troy“-tela (US6294654).

[0012] WO2014122143 opisuje anti-humana BCMA antitela koja se odlikuju time što vezivanje pomenutog antitela nije redukovano sa 100 ng/ml APRIL za više od 20% mereno ELISA testom kao OD na 405 nm u poređenju sa vezivanjem pomenutog antitela za humani BCMA bez APRIL, pomenuto antitelo ne menja APRIL-zavisnu aktivaciju NF-KB za više od 20%, u poređenju sa samim APRIL, i pomenuto antitelo ne menja aktivaciju NF-KB bez APRIL za više od 20%, u poređenju sa analizom bez pomenutog antitela. WO2014122144 opisuje bispecifična antitela koja se specifično vezuju za dva ciljna molekula, humani CD3E i humani BCMA, koja sadrže anti-humana BCMA antitela iz WO2014122143. Anti-humano BCMA antitelo sa jedinstvenim svojstvima, posebno u pogledu njegove terapijske upotrebe kao bispecifičnog molekula koji vezuje T ćelije, je antitelo 83A10, koje se odlikuje time što sadrži kao CDR regione CDR1H sekvence SEQ ID NO: 15, CDR2H sekvence SEQ ID NO:16, CDR3H sekvence SEQ ID NO: 17, CDR1L sekvence SEQ ID NO:18, CDR3L sekvence SEQ ID NO:19 i CDR3L sekvence SEQ ID NO:20, takođe opisane u WO2014122143 i WO2014122144.

Kratak opis pronalaska

[0013] Na osnovu otkrića koje je ovde sadržano, ovaj pronalazak obezbeđuje monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za humani antigen sazrevanja B ćelija (BCMA), pri čemu antitelo sadrži CDR3H region sekvence SEQ ID NO: 17 i CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju regiona CDR1H, CDR2H, CDR1L, i CDR2L odabranu iz grupe: a) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:25, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:26, i b) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:27, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:28.

[0014] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za BCMA i humani CD3ε (u nastavku takođe označen kao "CD3"), pri čemu bispecifično antitelo sadrži CDR3H region sekvence SEQ ID NO:17 i CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju regiona CDR1H, CDR2H, CDR1L i CDR2L odabranu iz grupe: a) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:25, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:26, i b) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:27, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:28.

[0015] U sledećem aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za BCMA i CD3, pri čemu bispecifično antitelo sadrži: a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela prema pronalasku: i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za CD3, i gde su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedan drugim: i c) pri čemu je u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a) aminokiselina na poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu su u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D), pri čemu, opciono, bispecifično antitelo sadrži dodatno Fab fragment pomenutog prvog antitela (u nastavku takođe označen kao "BCMA-Fab") i u konstantnom domenu CL pomenutog BCMA-Fab aminokiselina na poziciji 124 je supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu), i gde su, u konstantnom domenu CH1 pomenutog BCMA-Fab, aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema indeksu EU Kabata).

[0016] U još jednom dodatnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za BCMA i CD3, pri čemu bispecifično antitelo sadrži: a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela prema pronalasku: i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za CD3, i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedan drugim; i pri čemu je c) u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) aminokiselina na poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu su u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b) aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema indeksu EU Kabata),

[0017] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za pripremu antitela prema pronalasku koji obuhvata korake: a) transformaciju ćelije-domaćina b) vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira laki lanac i teški lanac antitela prema pronalasku, c) kultivisanje ćelije-domaćina pod uslovima koji omogućavaju sintezu molekula pomenutog antitela: i d) izdvajanje molekula pomenutog antitela iz pomenute kulture.

[0018] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo pronalaska i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0019] U još jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju pronalaska, za upotrebu kao lek pri čemu je opciono farmaceutska kompozicija za upotrebu kao lek u lečenju poremećaja plazmocita.

[0020] U još jednom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek u lečenju multiplog mijeloma, sistemskog eritemskog lupusa, plazmocitne leukemije ili AL-amiloidoze.

[0021] U još jednom aspektu predmetni pronalazak obezbeđuje himerni antigenski receptor (CAR), pri čemu CAR sadrži fragment prepoznavanja antigena usmeren protiv BCMA i fragment aktivacije T ćelija, pri čemu je fragment prepoznavanja antigena monoklonsko antitelo ili fragment antitela prema pronalasku.

[0022] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje ćeliju-domaćina koja sadrži vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira antitelo prema pronalasku.

[0023] Predmetni pronalazak i njegovi primeri izvođenja prikazani su u priloženim patentnim zahtevima.

[0024] Pronalazak sadrži monoklonska antitela koje se specifično vezuje za humani antigen sazrevanja B ćelija (BCMA). Antitela prema pronalasku sadrže kao CDR3H i CDR3L regione iste CDR regione kao antitelo 83A10.

[0025] Antitela prema pronalasku sadrže u jednom primeru izvođenja kao CDR3H i CDR3L regione iste CDR regione kao antitelo 83A10, ali pokazuju posebno snažne i efikasne prednosti u poređenju sa antitelom 83A10 kada je u pitanju ubijanje MM ćelija u aspiratima koštane srži pacijenta.

[0026] Otkriće sadrži monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za BCMA, koje se odlikuje time što sadrži CDR3H region sekvence SEQ ID NO:17 i CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju regiona CDR1H, CDR2H, CDR1L, i CDR2L odabranu iz grupe:

a) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:23, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:24,

b) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:25, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:26, c) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:27, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:28,

d) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:29 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:30, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:31, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:32,

e) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:34 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:35, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:31, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:32, i

f) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:36 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:37, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:31, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:32,

[0027] Otkriće sadrži monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za BCMA, koje se odlikuje time što sadrži VH region koja sadrži CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21, CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22 i CDR3H region sekvence SEQ ID NO:17 i VL region koji sadrži CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju regiona CDR1L i CDR2L odabranu iz grupe

a) CDR1L region sekvence SEQ ID NO:23 i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:24, b) CDR1L region sekvence SEQ ID NO:25 i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:26, ili c) CDR1L region sekvence SEQ ID NO:27 i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:28.

[0028] Otkriće obezbeđuje antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona sekvenci SEQ ID NO:12, 13, i 14 pri čemu je aminokiselina 49 izabrana iz grupe aminokiselina tirozina (Y), glutaminske kiseline (E), serina (S), i histidina (H). U jednom slučaju aminokiselina 49 je E u SEQ ID NO:12, S u SEQ ID NO:13 ili H u SEQ ID NO:14.

[0029] Otkriće obezbeđuje antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona sekvenci SEQ ID NO:12, 13, i 14 pri čemu je aminokiselina 74 treonin (T) ili alanin (A). U jednom primeru izvođenja aminokiselina 74 je A u SEQ ID NO:14.

[0030] Antitela prema otkriću sadrže u jednom slučaju kao CDR3H, CDR1L, CDR2L, i CDR3L regione iste CDR regione kao antitelo 83A10. Otkriće sadrži monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za BCMA, koje se odlikuje time što sadrži VH region koja sadrži CDR3H region sekvence SEQ ID NO:17 i VL region koja sadrži CDR1L region sekvence SEQ ID NO:31, CDR2L region sekvence SEQ ID NO:32 i CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju regiona CDR1L i CDR2L odabranu iz grupe

a) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:29 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:30,

b) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:34 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:35, ili

c) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:36 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:37.

[0031] Otkriće obezbeđuje u jednom slučaju antitelo prema otkriću koje se odlikuje time što sadrži VL region sekvence SEQ ID NO:12 i VH region izabran iz grupe koja sadrži VH regione sekvenci SEQ ID NO:38, 39, i 40. Otkriće obezbeđuje antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži VL region SEQ ID NO:12, pri čemu je aminokiselina 49 izabrana iz grupe aminokiselina tirozin (Y), glutaminska kiselina (E), serin (S), i histidin (H). U jednom slučaju aminokiselina 49 je E.

[0032] Pronalazak obezbeđuje u jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku, koje se odlikuje time što sadrži kao VH region VH region sekvence SEQ ID NO:10. Otkriće obezbeđuje u jednom slučaju antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži kao VL region VL region izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona sekvenci SEQ ID NO:12, 13, i 14. Otkriće obezbeđuje u jednom slučaju antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži kao VH region VH region sekvence SEQ ID NO:10 i kao VL region VL region sekvence SEQ ID NO:12. Pronalazak obezbeđuje u jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku, koje se odlikuje time što sadrži kao VH region VH region sekvence SEQ ID NO:10 i kao VL region VL region sekvence SEQ ID NO:13. Pronalazak obezbeđuje u jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku, koje se odlikuje time što sadrži kao VH region VH region sekvence SEQ ID NO:10 i kao VL region VL region sekvence SEQ ID NO:14.

[0033] Otkriće obezbeđuje u jednom slučaju antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži kao VH region VH region izabran iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:38, 39, i 40. Otkriće obezbeđuje u jednom slučaju antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži kao VH region VH region sekvence SEQ ID NO:38 i kao VL region VL region sekvence SEQ ID NO:12. Otkriće obezbeđuje u jednom slučaju antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži kao VH region VH region sekvence SEQ ID NO:39 i kao VL region VL region sekvence SEQ ID NO:12. Otkriće obezbeđuje u jednom slučaju antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži kao VH region VH region sekvence SEQ ID NO:40 i kao VL region VL region sekvence SEQ ID NO:12.

[0034] U jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku se dodatno odlikuje time što se takođe specifično vezuje za BCMA cinomolgusa. U jednom primeru izvođenja, antitelo pronalaska pokazuje u pogledu vezivanja za BCMA disparitet afiniteta cinomolgus/čovek između 1.5 i 5 ili 1.5 i 10 ili 1.5 i 16 (tabela 5).

[0035] Bispecifično antitelo prema pronalasku se stoga u jednom primeru izvođenja odlikuje time što se takođe specifično vezuje za CD3 cinomolgusa. U jednom primeru izvođenja bispecifično anti-BCMA/anti-CD3 antitelo pronalaska pokazuje disparitet vrednosti cinomolgus/čovek Mab CD3 između 1.25 i 5 ili između 0.8 i 1.0.

[0036] U sledećem primeru izvođenja pronalaska antitelo prema pronalasku je antitelo sa Fc delom ili bez Fc dela uključujući multispecifično antitelo, bispecifično antitelo, jednolančani varijabilni fragment (scFv) kao što je bispecifični T-ćelijski aktivator, diatelo, ili tandemski scFv, antitelo mimetik kao što je DARPin, „golo“ monospecifično antitelo, ili konjugat antitelo-lek. U jednom primeru izvođenja multispecifično antitelo, bispecifično antitelo, bispecifični T-ćelijski aktivator, diatelo, ili tandemski scFv se specifično vezuju za BCMA i CD3.

[0037] Na osnovu antitela prema pronalasku moguće je stvoriti konjugate antitelo-lek protiv BCMA i multispecifična ili bispecifična antitela protiv BCMA i jednog ili više dodatnih ciljnih molekula u različitim formatima sa ili bez Fc dela, poznata u stanju tehnike (videti npr. iznad u odeljku "Osnov pronalaska"), jednolančane varijabilne fragmente (scFv) kao što su bispecifični T-ćelijski aktivatori, diatela, tandemski scFv, i mimetike antitela kao što su DARPin, pri čemu svi oni predstavljaju primere izvođenja pronalaska. Formati bispecifičnih antitela su dobro poznati u stanju tehnike i npr. takođe opisani kod Kontermann RE, mAbs 4:2 1-16 (2012); Holliger P., Hudson PJ, Nature Biotech.23 (2005) 1126- 1136 i Chan AC, Carter PJ Nature Reviews Immunology 10, 301-316 (2010) i Cuesta AM et al., Trends Biotech 28 (2011) 355-362.

[0038] Sledeći primer izvođenja pronalaska je bispecifično antitelo protiv dva ciljna molekula, humanog CD3ε (u nastavku označen i kao "CD3") i ekstracelularnog domena humanog BCMA (u nastavku označen i kao "BCMA"), koje se odlikuje time što sadrži, kao BCMA-vezujući deo, anti-BCMA antitelo prema pronalasku.

[0039] Otkriće se u jednom slučaju odnosi na bispecifično antitelo protiv BCMA i CD3, koje se odlikuje time što sadrži u BCMA-vezujućem delu CDR3H region sekvence SEQ ID NO:17 i CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju regiona CDR1H, CDR2H, CDR1L, i CDR2L odabranu iz grupe:

1

b) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:25, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:26,

c) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:27, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:28,

[0040] Otkriće se odnosi u jednom slučaju na bispecifično antitelo protiv BCMA i CD3, koje se odlikuje time što sadrži VH region antitela prema otkriću (u nastavku nazvan "BCMA VH") koji sadrži CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21, CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22 i CDR3H region sekvence SEQ ID NO:17 i VL region (u nastavku nazvan "BCMA VL") koji sadrži CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju regiona CDR1L i CDR2L odabranu iz grupe:

a) CDR1L region sekvence SEQ ID NO:23 i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:24,

b) CDR1L region sekvence SEQ ID NO:25 i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:26, ili

c) CDR1L region sekvence SEQ ID NO:27 i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:28.

[0041] Pronalazak obezbeđuje u jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo prema pronalasku, koje se odlikuje time što sadrži kao BCMA VH, VH region sekvence SEQ ID NO:10.

[0042] Otkriće se odnosi u jednom slučaju na bispecifično antitelo protiv BCMA i CD3, koje se odlikuje time što je BCMA VL izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona sekvenci SEQ ID NO:12, 13, i 14. Otkriće obezbeđuje u jednom slučaju antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži kao BCMA VH region, VH region sekvence SEQ ID NO:10 i kao VL region, VL region sekvence SEQ ID NO:12. Pronalazak obezbeđuje u jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku, koje se odlikuje time što sadrži kao BCMA VH, VH region sekvence SEQ ID NO:10 i kao VL region, VL region sekvence SEQ ID NO:13. Pronalazak obezbeđuje u jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku, koje se odlikuje time što sadrži kao BCMA VH, VH region sekvence SEQ ID NO:10 i kao VL region, VL region sekvence SEQ ID NO:14.

[0043] Otkriće obezbeđuje bispecifično antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona sekvenci SEQ ID NO:12, 13, i 14 pri čemu je aminokiselina 49 izabrana iz grupe aminokiselina tirozin (Y), glutaminska kiselina (E), serin (S), i histidin (H). U jednom slučaju aminokiselina 49 je E (SEQ ID NO:12), S (SEQ ID NO:13) ili H (SEQ ID NO:14). Otkriće obezbeđuje bispecifično antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži VL region izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona sekvenci SEQ ID NO:12, 13, i 14 pri čemu je aminokiselina 74 treonin (T) ili alanin (A). U jednom primeru izvođenja aminokiselina 74 je A u SEQ ID NO:14.

[0044] Otkriće se odnosi na bispecifično antitelo protiv BCMA i CD3, koje se odlikuje time što sadrži BCMA VH koji sadrži CDR3H region sekvence SEQ ID NO:17 i BCMA VL koji sadrži CDR1L region sekvence SEQ ID NO:31, CDR2L region sekvence SEQ ID NO:32 i CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju regiona CDR1L i CDR2L odabranu iz grupe:

a) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:29 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:30,

b) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:34 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:35, ili

c) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:36 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:37.

[0045] Bispecifično antitelo protiv BCMA i CD3 odlikuje se u jednom primeru izvođenja time što sadrži anti-BCMA antitelo prema pronalasku i anti-CD3 antitelo, pri čemu se

a) laki lanac i teški lanac antitela specifično vezuju za jedan od pomenutih ciljnih molekula CD3 i BCMA; i

b) laki lanac i teški lanac antitela specifično vezuju za drugi od pomenutih t ciljnih molekula, pri čemu su varijabilni domeni VL i VH ili konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim.

[0046] U jednom primeru izvođenja VH domen pomenutog dela anti-CD3 antitela vezan je za CH1 ili CL domen pomenutog dela anti-BCMA antitela. U jednom primeru izvođenja VL domen pomenutog dela anti-CD3 antitela vezan je za CH1 ili CL domen pomenutog dela anti-BCMA antitela.

[0047] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo sadrži ne više od jednog Fab fragmenta dela anti-CD3 antitela, ne više od dva Fab fragmenta dela anti-BCMA antitela i ne više od jednog Fc dela, u jednom primeru izvođenja humanog Fc dela. U jednom primeru izvođenja ne više od jednog Fab fragmenta dela anti-CD3 antitela i ne više od jednog Fab fragmenta dela anti-BCMA antitela vezani su za Fc deo i vezivanje je sprovedeno vezivanjem C-terminalnog kraja Fab fragmenta/fragmenata za region zgloba. U jednom primeru izvođenja drugi Fab fragment dela anti-BCMA antitela vezan je preko svog C-terminalnog kraja ili za N-terminalni kraj Fab fragmenta of dela anti-CD3 antitela ili za region zgloba Fc dela i prema tome nalazi se između Fc dela i dela anti-CD3 antitela. Poželjna bispecifična antitela prikazana su na slikama 1 do 3.

[0048] Posebno poželjna su bispecifična antitela koja sadrže samo Fab fragmente i Fc deo kao što je navedeno, sa ili bez "ak supstitucije":

Fab BCMA-Fc-Fab CD3 (bispecifični format sl.1A ili 1B),

Fab BCMA-Fc-Fab CD3-Fab BCMA (bispecifični format sl.2A ili 2B),

Fab BCMA-Fc-Fab BCMA-Fab CD3 (bispecifični format sl.2C ili 2D),

Fc-Fab CD3-Fab BCMA (bispecifični format sl.3A ili 3B),

Fc-Fab BCMA-Fab CD3 (bispecifični format sl.3C ili 3D).

[0049] Kao što je prikazano na slikama 1 do 3 "Fab BCMA-Fc, "Fab BCMA-Fc-Fab CD3" i "Fab BCMA-Fc-Fab CD3" znači da je Fab fragment/fragmenti vezan/vezani preko njegovog/njihovih C-terminalnih krajeva za N-terminalni kraj Fc fragmenta. "Fab CD3- Fab BCMA" znači da je Fab CD3 fragment vezan svojim N-terminalnim krajem za C-terminalni kraj Fab BCMA fragmenta. "Fab BCMA - Fab CD3" znači da je Fab BCMA fragment vezan svojim N-terminalnim krajem za C-terminalni kraj Fab CD3 fragmenta.

[0050] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo sadrži drugi Fab fragment pomenutog anti-BCMA antitela vezan svojim C-terminalnim krajem za N-terminalni kraj dela antitela protiv CD3 pomenutog bispecifičnog antitela. U jednom primeru izvođenja VL domen pomenutog prvog dela anti-CD3 antitela vezan je za CH1 ili CL domen pomenutog drugog anti-BCMA antitela.

[0051] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo sadrži drugi Fab fragment pomenutog anti-BCMA antitela vezan svojim C-terminalnim krajem za Fc deo (kao prvi Fab fragment pomenutog anti-BCMA antitela) i vezan svojim N-terminalnim krajem za C-terminalni kraj dela antitela protiv CD3. U jednom primeru izvođenja CH1 domen pomenutog dela anti-CD3 antitela vezan je za VH domen pomenutog drugog dela anti-BCMA antitela.

1

[0052] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo sadrži Fc deo vezan svojim N-terminalnim krajem za C-terminalni kraj Fab fragmenta pomenutog antitela protiv CD3. U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo sadrži Fc deo vezan svojim prvim N-terminalnim krajem za C-terminalni kraj Fab fragmenta pomenutog antitela protiv CD3 i drugi Fab fragment pomenutog anti-BCMA antitela vezan svojim C-terminalnim krajem za drugi N-terminalni kraj Fc dela. U jednom primeru izvođenja CL domen Fab fragmenta antitela protiv CD3 vezan je za zglobni region Fc dela. U jednom primeru izvođenja CH1 domen Fab fragmenta antitela protiv BCMA vezan je za zglobni region Fc dela.

[0053] Fab fragmenti su hemijski međusobno spojeni upotrebom odgovarajućeg linkera prema stanju tehnike. U jednom primeru izvođenja koristi se (Gly4-Ser1)3 linker (Desplancq DK et al., Protein Eng.1994 Aug;7(8):1027-33 i Mack M. et al., PNAS July 18, 1995 vol. 92 no.15 7021-7025). "Hemijski vezan" (ili "vezan") znači da su fragmenti vezani kovalentnom vezom. Kako je linker peptidni linker, takvo kovalentno vezivanje se obično sprovodi biohemijskim rekombinantnim metodama, upotrebom nukleinske kiseline koja kodira VL i/ili VH domene odgovarajućih Fab fragmenata, linker i po potrebi, lanac Fc dela.

[0054] Pronalazak se odnosi u jednom primeru izvođenja na bispecifično antitelo protiv BCMA i CD3 prema pronalasku, koje se odlikuje time što varijabilni domen VH dela anti-CD3 antitela (u nastavku označen kao "CD3 VH") sadrži CDR regione teškog lanca sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao, redom, CDR1H, CDR2H i CDR3H teškog lanca i varijabilni domen VL dela anti-CD3 antitela (u nastavku označen kao "CD3 VL") sadrži CDR regione lakog lanca sekvenci SEQ ID NO: 4, 5 i 6 kao, redom, CDR1L, CDR2L i CDR3L lakog lanca.

[0055] U jednom primeru izvođenja takvo bispecifično antitelo prema pronalasku odlikuje se time što varijabilni domeni dela anti-CD3İ antitela imaju sekvence SEQ ID NO:7 i 8.

[0056] Pronalazak se odnosi na bispecifično antitelo prema pronalasku, koje se odlikuje time što je deo anti-CD3 antitela vezan svojim N-terminalnim krajem za C-terminalni kraj dela anti-BCMA antitela i varijabilni domeni VL i VH dela anti-CD3 antitela ili konstantni domeni CL i CH1 su zamenjeni jedan drugim.

[0057] U jednom primeru izvođenja VH domen pomenutog dela anti-CD3 antitela vezan je za CH1 ili CL domen pomenutog dela anti-BCMA antitela. U jednom primeru izvođenja VL domen pomenutog dela anti-CD3 antitela vezan ke za CH1 ili CL domen pomenutog dela anti-BCMA antitela.

[0058] Deo antitela prema pronalasku u jednom primeru izvođenja je Fab fragment odgovarajućeg antitela.

[0059] U sledećem primeru otkrića, bispecifično antitelo u kome su varijabilni domeni VL i VH u lakom lancu i odgovarajući teški lanac dela anti-CD3 antitela ili dela anti-BCMA antitela zamenjeni jedan drugim, odlikuje se time što sadrži konstantni domen CL dela anti-CD3 antitela ili dela anti-BCMA antitela pri čemu je aminokiselina na poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu), i u odgovarajućem konstantnom domenu CH1, aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 su nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D). U jednom primeru izvođenja antitelo je monovalentno za vezivanje za CD3. U jednom primeru izvođenja pored zamene aminokiseline na poziciji 124 u konstantnom domenu CL, aminokiselina na poziciji 123 je supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (u nastavku nazvana "izmena varijante naelektrisanja"). U jednom primeru izvođenja antitelo je monovalentno za vezivanje za CD3 i aminokiselina 124 je K, aminokiselina 147 je E, aminokiselina 213 je E, i aminokiselina 123 je R. U jednom primeru izvođenja, bispecifično antitelo sadrži dodatno isti anti-BCMA-vezujući deo još jednom (u jednom primeru izvođenja Fab fragment). To takođe znači, da ako prvi anti-BCMA-vezujući deo sadrži izmenu varijante naelektrisanja, tada i drugi anti-BCMA-vezujući deo sadrži istu izmenu varijante naelektrisanja. (Sve numeracije aminokiselina su prema Kabatu).

[0060] Otkriće se odnosi na bispecifično antitelo prema otkriću, koje se odlikuje time što sadrži

a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA; i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za CD3, i u kome su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedan drugim i

c) gde je u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a) aminokiselina na poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija po Kabatu), i gde su u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 supstituisane nezavisno glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija po Kabatu) (videti npr. slike 1A, 2A, 2C, 3A, 3C).

[0061] U jednom slučaju, pomenuto bispecifično antitelo opisano u poslednjem prethodnom paragrafu dalje se karakteriše time što pomenuto bispecifično antitelo dodatno sadrži Fab fragment pomenutog prvog antitela (dalje označen i kao "BCMA-Fab") i u konstantnom domenu CL pomenutog BCMA-Fab aminokiselina na poziciji 124 supstituisana je nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija po Kabatu), i pri čemu su u konstantnom domenu CH1 pomenutog BCMA-Fab aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema Kabatu) (videti npr. slike 2A, 2C).

1

[0062] Otkriće se dalje odnosi na bispecifično antitelo u skladu sa otkrićem, okarakterisano time što sadrži

a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela koje se specifično vezuje za BCMA; i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za CD3, i gde su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedan drugim; i gde je

c) u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) aminokiselina na poziciji 124 supstituisana nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija po Kabatu), i gde su u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca pod b) aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 supstituisane nezavisno glutaminskom kiselinom (E) ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija po Kabatu).

[0063] U jednom slučaju pored zamene aminokiseline na poziciji 124 u konstantnom domenu CL prvog ili drugog lakog lanca, aminokiselina na poziciji 123 supstituisana je nezavisno lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H).

[0064] U jednom slučaju u konstantnom domenu CL, aminokiselina na poziciji 124 supstituisana je lizinom (K), u konstantnom domenu CH1 aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 supstituisane su glutaminskom kiselinom (E). U jednom slučaju, pored toga, u konstantnom domenu CL aminokiselina na poziciji 123 supstituisana je argininom (R).

[0065] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, bispecifično antitelo prema pronalasku sastoji se od jednog Fab fragmenta antitela koji se specifično vezuje za CD3 (dalje označeno i kao "CD3-Fab") i jednog Fab fragmenta anti-BCMA antitela prema pronalasku (dalje označeno i kao "BCMA-Fab") i Fc dela, pri čemu su CD3-Fab i BCMA-Fab povezani preko svojih C-terminalnih krajeva sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela. CD3-Fab ili BCMA-Fab sadrže ak (aminokiselinsku) supstituciju i CD3-Fab sadrži unakrsnu razmenu (slike 1A i 1B).

[0066] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, bispecifično antitelo prema pronalasku sastoji se od jednog CD3-Fab i jednog BCMA-Fab i Fc dela, pri čemu su CD3-Fab i BCMA-Fab povezani preko svojih C-terminalnih krajeva sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela, i drugog BCMA-Fab koji je svojim C-terminalnim krajem vezan za N-terminalni kraj CD3-Fab. CD3-Fab sadrži unakrsnu razmenu i bilo CD3-Fab ili oba BCMA-Fab sadrže ak supstituciju (slike 2A i 2B). Posebno je poželjno bispecifično antitelo koje sadrži BCMA-Fab-Fc-CD3-Fab-BCMA-Fab, pri čemu oba BCMA-Fab sadrže ak supstituciju i CD3-Fab sadrži unakrsnu razmenu VL/VH (slika 2A). Posebno je poželjno bispecifično antitelo koje se sastoji od BCMA-Fab-Fc-CD3-Fab-BCMA-Fab, pri čemu oba BCMA-Fab sadrže ak supstituciju Q124K, E123R, K147E i K213E i

1

CD3-Fab sadrži VL/VH unakrsnu razmenu. Posebno je poželjno da oba BCMA-Fab sadrže kao CDR regione, CDR regione antitela 21, 22, ili 42, ili kao VH/VL, VH/VL antitela 21, 22, ili 42.

[0067] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska bispecifično antitelo prema pronalasku sastoji se od dva BCMA-Fab i Fc dela, pri čemu su jedan BCMA-Fab i CD3 Fab vezani preko svojih C-terminalnih krajeva za zglobni region pomenutog Fc dela, a drugi BCMA-Fab je vezan svojim C-terminalnim krajem za N-terminalni kraj CD3-Fab. CD3-Fab sadrži unakrsnu razmenu i bilo CD3-Fab ili oba BCMA-Fab sadrže ak supstituciju (slike 2A i 2B).

[0068] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, bispecifično antitelo prema pronalasku sastoji se od dva BCMA-Fab i Fc dela, pri čemu su BCMA-Fab povezani preko svojih C-terminalnih krajeva sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela, i CD3-Fab koji je povezan svojim C-terminalnim krajem sa N-terminalnim krajem jednog BCMA-Fab. CD3-Fab sadrži unakrsnu razmenu i CD3-Fab ili oba BCMA-Fab sadrže ak supstituciju (slike 2C i 2D).

[0069] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska antitelo prema pronalasku sastoji se od jednog CD3-Fab, koji je vezan preko svog C-terminalnog kraja za zglobni region pomenutog Fc dela i BCMA-Fab, koji je vezan svojim C-terminalnim krajem za N-terminalni kraj CD3-Fab. CD3-Fab sadrži unakrsnu razmenu i bilo CD3-Fab ili BCMA-Fab sadrže ak supstituciju (slike 1A i 1B).

[0070] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo prema pronalasku sastoji se od jednog CD3-Fab, koji je preko svog C-terminalnog kraja povezan sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela i BCMA-Fab, koji je povezan svojim C-terminalnim krajem sa N-terminalnim krajem CD3-Fab. CD3-Fab sadrži unakrsnu razmenu i CD3-Fab ili BCMA-Fab sadrže ak supstituciju (slike 3A i 3B).

[0071] U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo prema pronalasku sastoji se od jednog BCMA-Fab koji je povezan preko svog C-terminalnog kraja sa zglobnim regionom pomenutog Fc dela, i CD3-Fab koji je povezan svojim C-terminalnim krajem sa N-terminalnim krajem BCMA-Fab. CD3-Fab sadrži unakrsnu razmenu i CD3-Fab ili BCMA-Fab sadrže ak supstituciju (slike 3C i 3D).

[0072] Fab fragmenti su hemijski spojeni upotrebom odgovarajućeg linkera u skladu sa stanjem tehnike. U jednom primeru izvođenja, koristi se (Gly4-Ser1)3 linker (Desplancq DK et al., Protein Eng.1994 Aug;7(8):1027-33 i Mack M. et al., PNAS July 18, 1995 vol. 92 no. 157021-7025). Spoj između dva Fab fragmenta uspostavlja se između teških lanaca. Dakle, C-terminalni kraj CH1 prvog Fab fragmenta povezan je sa N-terminalnim krajem VH drugog Fab fragmenta (nema unakrsne razmene) ili za VL (unakrsna razmena). Spoj između Fab fragmenta i Fc dela uspostavlja se prema pronalasku kao veza između CH1 i CH2.

1

[0073] Prvi i drugi Fab fragment antitela koje se specifično vezuje za BCMA u jednom primeru izvođenja izvedeni su iz istog antitela i u jednom primeru izvođenja su identični po CDR sekvencama, sekvencama varijabilnih domena VH i VL i/ili sekvencama konstantnih domena CH1 i CL. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinske sekvence prvog i drugog Fab fragmenta antitela koje se specifično vezuje za BCMA su identične. U jednom slučaju antitelo protiv BCMA je antitelo koje sadrži CDR sekvence antitela 21, 22, ili 42, antitelo koje sadrži VH i VL sekvence antitela 21, 22, ili 42, ili antitelo koje sadrži VH, VL, CH1 i CL sekvence antitela 21, 22, ili 42.

[0074] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo sadrži kao Fab fragmente i Fc deo, ne više od jednog Fab fragmenta anti-CD3 antitela, ne više od dva Fab fragmenta anti-BCMA antitela i ne više od jednog Fc dela, u jednom primeru izvođenja, humanog Fc dela. U jednom primeru izvođenja drugi Fab fragment anti-BCMA antitela vezan je preko svog C-terminalnog kraja bilo za N-terminalni kraj Fab fragmenta anti-CD3 antitela ili za region zgloba Fc dela. U jednom primeru izvođenja veza je ostvarena između CH1 u BCMA-Fab i VL u CD3-Fab (VL/VH unakrsna razmena).

[0075] U jednom primeru izvođenja deo antitela koji se specifično vezuje za humani CD3, u jednom primeru izvođenja Fab fragment, karakteriše se time što sadrži varijabilni domen VH koji uključuje CDR regione teškog lanca SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao, redom, CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca, i varijabilni domen VL koji uključuje CDR regione sekvenci SEQ ID NO: 4, 5 i 6 lakog lanca kao, redom, CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca anti-CD3İ antitela (CDR MAB CD3). U jednom primeru izvođenja, deo antitela koji se specifično vezuje za humani CD3 karakteriše se time što su varijabilni domeni SEQ ID NO:7 i 8 (VHVL MAB CD3).

[0076] Otkriće se odnosi na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za ekstracelularni domen humanog BCMA i za humani CD3İ, okarakterisano time što sadrži set teškog i lakog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od polipeptida:

i) SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, i SEQ ID NO:51(2x); (set 1 TCB antitela 21),

ii) SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, i SEQ ID NO:54 (2x) (set 2 TCB antitela 22), i

iii) SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, i SEQ ID NO:57(2x) (set 3 TCB antitela 42).

1

[0077] U jednom primeru izvođenja bispecifično antitelo prema ovom pronalasku karakteriše se time što se CH3 domen jednog teškog lanca i CH3 domen drugog teškog lanca susreću na kontaktnoj površini koja sadrži originalnu kontaktnu površinu između CH3 domena antitela; pri tome je pomenuta kontaktna površina izmenjena tako da pokrene formiranje bispecifičnog antitela, pri čemu se promena karakteriše time što je:

a) CH3 domen jednog teškog lanca izmenjen, tako da se unutar originalne kontaktne površine CH3 domena jednog teškog lanca koja se susreće sa originalnom kontaktnom površinom CH3 domena drugog teškog lanca u bispecifičnom antitelu, aminokiselinska rezidua zamenjuje aminokiselinskom reziduom sa bočnim lancem veće zapremine, čime se unutar kontaktne površine CH3 domena jednog teškog lanca stvara izbočina koja može da se smesti u udubljenje u kontaktnoj površini CH3 domena drugog teškog lanca i b) CH3 domen drugog teškog lanca je izmenjen, tako da se unutar originalne kontaktne površine drugog CH3 domena koja se susreće sa originalnom kontaktnom površinom prvog CH3 domena u bispecifičnom antitelu, aminokiselinska rezidua zamenjuje aminokiselinskom reziduom sa bočnim lancem manje zapremine, čime se stvara udubljenje unutar kontaktne površine drugog CH3 domena u koje može da se smesti ispupčenje u kontaktnoj površini prvog CH3 domena.

[0078] U jednom primeru izvođenja takvo bispecifično antitelo karakteriše se time što se pomenuta aminokiselinska rezidua sa bočnim lancem veće zapremine bira iz grupe koja sadrži arginin (R), fenilalanin (F), tirozin (Y), triptofan (W).

[0079] U jednom primeru izvođenja takvo bispecifično antitelo karakteriše se time što se pomenuta aminokiselinska rezidua sa bočnim lancem manje zapremine bira iz grupe koja sadrži alanin (A), serin (S), treonin (T), valin (V).

[0080] U jednom primeru izvođenja takvo bispecifično antitelo karakteriše se time što su oba CH3 domena dodatno izmenjena uvođenjem cisteina (C) kao aminokiseline na odgovarajućim pozicijama svakog od CH3 domena.

[0081] U jednom primeru izvođenja takvo bispecifično antitelo karakteriše se time što je jedan od konstantnih domena CH3 teškog lanca iz oba teška lanca zamenjen konstantnim domenom CH1 teškog lanca; a drugi konstantni domen CH3 teškog lanca zamenjen je konstantnim domenom CL lakog lanca.

[0082] Pronalazak se dalje odnosi na antitelo prema pronalasku, koje sadrži modifikovani Fc deo koji indukuje ćelijsku smrt 20% ili više ćelija preparata ćelija koje eksprimiraju BCMA posle 24 časa pri koncentraciji pomenutog antitela od 100 nM putem ADCC u odnosu na kontrolu pod

1

identičnim uslovima uz korišćenje istog antitela sa parentalnim Fc delom kao kontrolom. Takvo antitelo je u jednom primeru izvođenja „golo“ antitelo.

[0083] U jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku je antitelo sa količinom fukoze od 60% ili manje od ukupne količine oligosaharida (šećera) na Asn297 (videti npr. US20120315268).

[0084] U jednom primeru izvođenja Fc deo sadrži aminokiselinske supstitucije koje su uvedene u humani Fc deo i opisane u SEQ ID NO:55 i 56.

[0085] Sledeći primer izvođenja pronalaska je himerni antigenski receptor (CAR) anti-BCMA antitela prema pronalasku. U takvom primeru izvođenja anti-BCMA antitelo sastoji se od jednolančanog VH i VL domenskog antitela prema pronalasku i CD3-zeta transmembranskog i endodomena. Poželjno, CD3 zeta domen je vezan preko spejsera sa C-terminalnim krajem pomenutog VL domena, a N-terminalni kraj VL domena je vezan preko spejsera sa C-terminalnim krajem pomenutog VH domena. Himerni antigenski receptori BCMA antitela, korisni transmembranski domeni i endodomeni, i postupci za proizvodnju opisani su npr. kod Ramadoss NS. et al., J. Am. Chem. Soc. J., DOI: 10.1021/jacs.5b01876 (2015), Carpenter RO et al., Clin. Cancer. Res. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-12-2422 (2013), WO2015052538 i WO2013154760.

[0086] Sledeći primeri otkrića su antitela Mab21, Mab22, Mab42, Mab27, Mab33, i Mab39 kao što je ovde opisano pomoću njihovih CDR sekvenci, i/ili VH/VL sekvenci zajedno sa opisanim CL i CH1 sekvencama, kao antigen-vezujući fragmenti, posebno Fab fragmenti, kao bispecifična antitela koja se vezuju za BCMA i CD3, sa i bez Fc dela, kao bispecifična antitela u opisanim formatima, posebno u formatu 2+1, i bispecifična antitela sa teškim i lakim lancima kao što je ovde opisano, posebno kao što je opisano u tabeli 1A.

[0087] Sledeći primer otkrića je postupak za stvaranje anti-BCMA antitela koje smanjuje broj, u bispecifičnom formatu prema otkriću, humanih malignih plazmocita u aspiratima koštane srži obolele od multiplog mijeloma MM do najmanje 80% posle 48-časovnog tretmana pri koncentraciji između 10 nM i 1 fM uključujući granične vrednosti, koji se odlikuje selekcijom prema afinitetu varijabilnog teškog lanca (VH) i varijabilnog lakog lanca (VL) biblioteke prikaza na fagu antitela 83A10 (VH biblioteka, VL biblioteka) sa 1-50 nM BCMA cinomolgusa u 1-3 ciklusa i selekcijom varijabilnog lakog lanca i varijabilnog teškog lanca koji imaju takve odlike, kao bispecifični molekul koji vezuje T ćelije. Poželjno se selekcija prema afinitetu sprovodi u 3 ciklusa, upotrebom 50 nM BCMA cinomolgusa za ciklus 1, 25 nM cyBCMA za ciklus 2 i 10 nM cyBCMA za ciklus 3. Poželjno, biblioteke su nasumične za CDR1 i CDR2 lakog lanca ili za CDR1 i CDR2 teškog lanca. Poželjno, identifikuju se laki i teški lanac, od kojih se svaki vezuje kao Fab fragment, koji sadrži dodatno odgovarajući VH ili VL antitela 83A10, za huBCMA sa

2

Kd od 50pM do 5nM i za BCMA cinomolgusa sa Kd od 0.1 nM do 20 nM. Poželjno, bispecifični format je format sa sl. 2A, koji sadrži odgovarajuće konstantne domene VL i VH CD3 Fab zamene jednog drugim, i u oba BCMA Fab aminokiselinske izmene K213E i K147E u CH1 domenu, i aminokiselinske izmene E123R i Q124K u CL domenu.

[0088] Sledeći primer izvođenja pronalaska je postupak za pripremu antitela prema pronalasku koji uključuje korake

a) transformisanja ćelije-domaćina

b) vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira laki lanac i teški lanac antitela prema pronalasku,

c) kultivisanja ćelije-domaćina pod uslovima koji omogućavaju sintezu molekula pomenutog antitela; i

d) izdvajanja molekula pomenutog antitela iz pomenute kulture.

[0089] Sledeći primer izvođenja pronalaska je postupak za pripremu bispecifičnog antitela prema pronalasku koji uključuje korake

e) transformisanja ćelije-domaćina

f) vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira laki lanac i teški lanac antitela koje se specifično vezuje za prvi ciljni molekul

g) vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira laki lanac i teški lanac antitela koje se specifično vezuje za drugi ciljni molekul, pri čemu su varijabilni domeni VL i VH ili konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim;

h) kultivisanja ćelije-domaćina pod uslovima koji omogućavaju sintezu molekula pomenutog antitela; i

i) izdvajanja molekula pomenutog antitela iz pomenute kulture.

[0090] Sledeći primer izvođenja pronalaska je ćelija-domaćin koja sadrži vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira antitelo prema pronalasku. Sledeći primer izvođenja pronalaska je ćelija-domaćin koja sadrži vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira laki lanac i teški lanac antitela koje se specifično vezuje za prvi ciljni molekul i vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira laki lanac i teški lanac antitela koje se specifično vezuje za drugi ciljni molekul, pri čemu su varijabilni domeni VL i VH ili konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedan drugim.

[0091] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0092] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek.

[0093] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek u lečenju poremećaja plazmocita.

[0094] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek u lečenju multiplog mijeloma.

[0095] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek u lečenju sistemskog eritemskog lupusa.

[0096] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku, uključujući monospecifično antitelo, ADCC-pojačano „golo“ antitelo, konjugat antitelo-lek, multispecifično antitelo ili bispecifično antitelo za upotrebu kao lek u lečenju odbacivanja posredovanog antitelima.

[0097] U jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku može da se koristi za lečenje poremećaja plazmocita kao što je multipli mijelom MM ili drugih poremećaja plazmocita koji eksprimiraju BCMA kao što je opisano ispod u tekstu. MM je malignitet plazmocita koji se karakteriše monoklonalnom ekspanzijom i nakupljanjem abnormalnih plazmocita u odeljku koštane srži. MM takođe podrazumeva cirkulišuće klonalne plazmocite sa istim IgG genskim rearanžmanom i somatskom hipermutacijom. MM nastaje od asimptomatskog, premalignog stanja nazvanog monoklonska gamopatija nepoznatog značaja (MGUS), koje se karakteriše niskim nivoima plazmocita i monoklonalnog proteina u koštanoj srži. Stopa proliferacije ćelija MM je niska. MM je rezultat progresivnog nastanka višestrukih strukturnih hromozomskih promena (npr. nebalansiranih translokacija). MM uključuje uzajamne interakcije malignih plazmocita i mikrookruženja koštane srži (npr. normalnih ćelija strome koštane srži). Klinički znaci aktivnog MM uključuju nagli porast monoklonskih antitela, prenaseljenost koštane srži plazocitima, litičke lezije i destrukciju kosti kao rezultat preterane stimulacije osteoklasta (Dimopulos & Terpos, Ann Oncol 2010; 21 suppl 7: vii143-150). Još jedan poremećaj plazmocita koji uključuje plazmocite tj. ekspresiju BCMA je sistemski eritemski lupus (SLE), poznat i kao lupus. SLE je sistemsko autoimuno oboljenje koje može da zahvati bilo koji deo tela, a predstavljen je imunim sistemom koji napada ćelije i tkiva sopstvenog tela, što za rezultat ima hroničnu inflamaciju i oštećenje tkiva. To je reakcija preosetljivosti tipa III u kojoj imunski kompleksi antitela precipitiraju i dovode do daljeg imunskog odgovora (Inaki & Lee, Nat Rev Rheumatol 2010; 6: 326-337). Dodatni poremećaji plazmocita su plazmocitna leukemija i AL-amiloidoza (videti i primere 19 i 20). Kod svih ovih poremećaja plazmocita, očekivano je da će smanjenje broja plazmocita/malignih plazmocita pomoću antitela prema pronalasku biti korisno za pacijente koji boluju od ovakve bolesti.

[0098] Sledeći primer ovog otkrića je antitelo prema pronalasku za lečenje odbacivanja alografta posredovanog antitelima koje uključuje plazmocite i alo-antitela, uključujući akutno i hronično antitelima-posredovano odbacivanje (AMR). Akutni AMR se odlikuje poremećenom funkcijom grafta koja se javlja u danima nakon transplantacije i rezultat je bilo unapred, ili de novo, nakon transplantacije formiranih donor-specifičnih antitela. Javlja se kod oko 5-7% svih transplantacija bubrega i izaziva 20-48% akutnih epizoda odbacivanja među presenzibilisanim pacijentima sa pozitivnim testom kompatibilnosti (Colvin i Smith, Nature Rev Immunol 2005; 5 (10): 807-817). Histopatologija kod pacijenata sa akutnim AMR često otkriva bubrenje endotelnih ćelija, infiltraciju glomerula i peritubularnih kapilara neutrofilima, fibrinske trombove, intersticijalni edem, i krvarenje (Trpkov et al. Transplantation 1996; 61 (11): 1586-1592). AMR može da se identifikuje C4d-bojenjem ili drugim poboljšanim metodama detekcije antitela u biopsiji alografta. Drugi oblik AMR poznat je i kao hronično oštećenje alografta koje takođe uključuje donor-specifična antitela, ali se manifestuje tokom meseci, ili čak godina nakon transplantacije. Javlja se kao glomerulopatija transplanta (poznata i kao hronična glomerulopatija alografta) na biopsijama bubrega i odlikuje se glomerularnom mezangijalnom ekspanzijom i duplikacijom bazalne membrane kapilara (Regele et al. J Am Soc Nephrol 2002; 13 (9): 2371-2380). Kliničke manifestacije variraju od pacijenata koji su ranim stadijumima asimptomatski, pa do proteinurije nefrotskog raspona, hipertenzije i disfunkcije alografta u uznapredovalim stadijumima. Napredovanje bolesti može da bude prilično brzo, posebno uz kontinuirani akutni AMR, što rezultuje neuspehom transplantacije u roku od nekoliko meseci (Fotheringham et al. Nephron -Clin Pract 2009; 113 (1): c1-c7). Učestalost transplantacione glomerulopatije u biopsijama pacijenata varira između 5% tokom 1 godine do 20% tokom 5 godina (Cosio et al. Am J Transplant 2008; 8: 292-296).

[0099] Sledeći primer otkrića ja antitelo prema otkriću za upotrebu kao lek.

[0100] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek.

[0101] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži „golo“ antitelo ili bispecifično antitelo prema pronalasku za upotrebu kao lek.

[0102] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku sa povećanom efektorskom funkcijom za upotrebu kao lek.

[0103] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku sa sniženom efektorskom funkcijom za upotrebu kao lek.

[0104] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku kao bispecifično antitelo za upotrebu kao lek.

2

[0105] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku kao multispecifično antitelo za upotrebu kao lek.

[0106] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku kao konjugat sa terapijskim sredstvom (konjugat leka) npr. sa citotoksičnim sredstvom ili radioaktivno obeleženo, za upotrebu kao lek.

[0107] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku kao diatelo za upotrebu kao lek.

[0108] U jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku, posebno kada je bispecifično antitelo protiv CD3 i BCMA, primenjuje se jednom ili dva puta nedeljno u jednom primeru izvođenja subkutanom primenom (npr. u jednom primeru izvođenja u opsegu doza od 0.1 do 2.5, poželjno do 25 mg/m<2>/nedeljno, poželjno do 250 mg/m<2>/nedeljno). Zbog vrhunskih aktivnosti citotoksičnosti antitela prema pronalasku, ono može da se primeni barem u istom redu veličine raspona kliničke doze (ili čak nižem) u poređenju sa konvencionalnim monospecifičnim antitelima ili konvencionalnim bispecifičnim antitelima koja nisu bispecifična za T ćelije (tj. ne vezuju se za CD3 na jednoj ručici). Predviđeno je da je za antitelo prema pronalasku poželjna subkutana primena u kliničkom okruženju (npr. u opsegu doza od 0.1 - 250 mg/m<2>/nedeljno). Dodatno, kod pacijenata sa visokim serumskim nivoima APRIL i BAFF (npr. pacijenti sa multiplim mijelomom) možda neće biti potrebno povećanje doze antitela prema pronalasku budući da na njega neće uticati kompeticija sa ligandom. Nasuprot tome, kod ovih pacijenata može da bude potrebno povećanje doze drugih anti-BCMA antitela koja blokiraju/kompetiraju sa ligandom. Još jedna prednost antitela prema pronalasku je poluvreme eliminacije od oko 4 do 12 dana što omogućava primenu najmanje jednom ili dva puta nedeljno.

[0109] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku u slučaju „golog“/nekonjugovanog monospecifičnog antitela sa pojačanim ADCC je antitelo sa svojstvima koja omogućavaju tretman jednom/dvaput nedeljno intravenskim putem, ali poželjno subkutanom primenom (npr. dozom u opsegu od 200-2000 mg/m/nedeljno tokom 4 nedelje). Predviđeno je da je za antitelo prema pronalasku u kliničkom okruženju moguća i poželjna subkutana primena (npr. u opsegu doza od 200-2000 mg/m<2>/nedeljno, u zavisnosti od indikacija bolesti). Pored toga, kod pacijenata sa visokim serumskim nivoima APRIL i BAFF (npr. pacijenti sa multiplim mijelomom) možda neće biti potrebno povećanje doze antitela prema pronalasku (npr. antitelo koje ne blokira/kompetira sa ligandom) budući da na njega neće uticati kompeticija sa ligandom. Nasuprot tome, kod ovih pacijenata može da bude potrebno povećanje doze drugih anti-BCMA antitela koja blokiraju/kompetiraju sa ligandom, što čini subkutanu primenu tehnički komplikovanijom (npr. farmaceutski). Još jedna prednost antitela prema pronalasku zasniva se na uključivanju Fc dela, što je povezano sa poluvremenom eliminacije od oko 4 do 12 dana i omogućava primenu najmanje jednom ili dva puta nedeljno.

[0110] Sledeći poželjni primer otkrića je dijagnostička kompozicija koja sadrži antitelo prema otkriću.

Opis slika

[0111]

Slika 1. Bispecifična bivalentna antitela koja sadrže samo Fab fragmente (specifične za CD3 i BCMA) i Fc deo, kako je navedeno: (A) Fab BCMA(RK/EE)-Fc-Fab CD3; (B) Fab BCMA-Fc-Fab CD3(RK/EE). ak supstitucije RK/EE uvedene u CL-CH1 za smanjenje LC pogrešnog sparivanja/sporednih proizvoda pri proizvodnji. Fab CD3 uključuje VL-VH unakrsnu razmenu za smanjenje LC pogrešnog sparivanja i sporednih proizvoda.

Slika 2. Poželjna bispecifična trivalentna antitela sadrže samo Fab fragmente (specifične za CD3 i BCMA) i Fc deo kako je navedeno: (A) Fab BCMA(RK/EE)-Fc-Fab CD3-Fab BCMA(RK/EE); (B) Fab BCMA-Fc-Fab CD3(RK/EE)-Fab BCMA; (C) Fab BCMA(RK/EE)-Fc-Fab BCMA(RK/EE)-Fab CD3; (D) Fab BCMA-Fc-Fab BCMA-Fab CD3(RK/EE). ak supstitucije RK/EE uvedene u CL-CH1 za smanjenje LC pogrešnog sparivanja/sporednih proizvoda pri proizvodnji. Poželjno, Fab CD3 uključuje VL-VH unakrsnu razmenu za smanjenje LC pogrešnog sparivanja i sporednih proizvoda. Poželjno, Fab CD3 i Fab BCMA povezani su jedan sa drugim fleksibilnim linkerima.

Slika 3. Bispecifična bivalentna antitela koja sadrže samo Fab fragmente (specifične za CD3 i BCMA) i Fc deo kako je navedeno: (A) Fc-Fab CD3-Fab BCMA(RK/EE); (B) Fc-Fab CD3(RK/EE)-Fab BCMA; (C) Fc-Fab BCMA(RK/EE)-Fab CD3; (D) Fc-Fab BCMA-Fab CD3(RK/EE). Poželjno, Fab CD3 uključuju VL-VH unakrsnu razmenu za smanjenje LC pogrešnog sparivanja i sporednih proizvoda. Fab CD3 i Fab BCMA povezani su jedan sa drugim fleksibilnim linkerima.

Slika 4. Preusmerena T-ćelijska liza H929 MM ćelija indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena preko oslobađanja LDH. Krive koncentracionog odgovora za lizu H929 MM ćelija indukovanu 21-TCBcv (ispunjeni krug), 22-TCBcv (ispunjeni trougao), 42-TCBcv (ispunjeni kvadrat) u poređenju sa

2

83A10-TCBcv (prazan krug, tačkasta linija). Ubijanje H929 ćelija zavisno od koncentracije zapaženo je kod svih anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela, dok ubijanje ćelija nije zapaženo sa kontrolnim-TCB. Eksperimenti su obavljeni sa PBMC davaoca 1 (A), davaoca 3 (B), davaoca 4 (C), davaoca 5 (D), uz korišćenje odnosa efektorskih ćelija prema tumorskim ciljnim ćelijama (E:T) od 10 PBMC prema 1 MM ćeliji (videti primer 8).

Slika 5. Preusmerena T-ćelijska liza L363 MM ćelija indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena preko oslobađanja LDH. Krive koncentracionog odgovora za lizu L363 MM ćelija indukovanu pomoću 21-TCBcv (ispunjeni krug), 22-TCBcv (ispunjeni trougao), 42-TCBcv (ispunjeni kvadrat) u poređenju sa 83A10-TCBcv (prazan krug, tačkasta linija). Zapaženo je koncentracionozavisno ubijanje L363 ćelija kod svih anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela, dok sa kontrolnim-TCB nije zapaženo ubijanje. Eksperimenti su obavljeni sa PBMC davaoca 1 (A), davaoca 2 (B), davaoca 3 (C), davaoca 4 (D), davaoca 5 (E), uz korišćenje odnosa E:T od 10 PBMC prema 1 MM ćeliji (videti primer 9).

Slika 6. Preusmerena T-ćelijska liza RPMI-8226 MM ćelija indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena preko oslobađanja LDH. Krive koncentracionog odgovora za lizu RPMI-8226 MM ćelija indukovanu pomoću 21-TCBcv (ispunjeni krug), 22-TCBcv (ispunjeni trougao), 42-TCBcv (ispunjeni kvadrat) u poređenju sa 83A10-TCBcv (prazan krug, tačkasta linija). Koncentraciono-zavisno ubijanje RPMI-8226 ćelija zapaženo je kod svih anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela, dok sa kontrolnim-TCB nije zapaženo ubijanje ćelija. Eksperimenti su izvedeni sa PBMC davaoca 2 (A), davaoca 3 (B), davaoca 4 (C), davaoca 5 (D), uz korišćenje E:T odnosa 10 PBMC prema 1 MM ćeliji (videti primer 10).

Slika 7. Preusmerena T-ćelijska liza JJN-3 MM ćelija indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena protočnom citometrijom. Koncentracionozavisno ubijanje JJN-3 MM ćelija pomoću 22-TCBcv (ispunjeni trougao), 42-TCBcv (ispunjeni kvadrat) u poređenju sa 83A10-TCBcv (prazan krug, tačkasta linija). Određen je i nanesen na dijagram procenat aneksin-V-pozitivnih JJN-3 ćelija (A, C) i liza tumorskih ćelija (B, D). Procenat lize JJN-3 ćelija indukovane specifičnom koncentracijom anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela određen je na sledeći način: apsolutni broj aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija za datu koncentraciju TCB oduzima se od apsolutnog broja aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija bez TCB;

2

podeljeno sa apsolutnim brojem aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija bez TCB. Eksperimenti su izvedeni sa PBMC uzetim od 2 davaoca: davaoca 1 (A, B) i davaoca 2 (C, D), uz korišćenje odnosa E:T 10 PBMC prema 1 MM ćeliji (videti primer 11).

Slika 8. Preusmerena T-ćelijska liza mijelomskih plazmocita iz koštane srži pacijenata obolelih od multiplog mijeloma, u prisustvu autologih T-ćelija koje infiltriraju koštanu srž (aspirati cele koštane srži pacijenta), indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena multiparametarskom protočnom citometrijom. Određen je procenat aneksin-V- pozitivnih mijelomskih plazmocita i nanesen na dijagram u odnosu na koncentracije TCB. Zapažena je koncentraciono-zavisna i specifična liza pacijentovih mijelomskih plazmocita, dok liza T-ćelija, B-ćelija i NK-ćelija nije zapažena, bazirano na 8-kolornom multiparametarskom panelu. Nije bilo indukcije ćelijske smrti mijelomskih plazmocita sa kontrolnim-TCB, pri najvišoj testiranoj koncentraciji TCB antitela. U poređenju sa 83A10-TCBcv (A), 42-TCBcv (B) i 22-TCBcv (C) su snažnije indukovali ubijanje plazmocita mijeloma u koštanoj srži pacijenta (videti primer 13).

Slika 9. Preusmerena T-ćelijska liza mijelomskih plazmocita iz koštane srži pacijenata obolelih od multiplog mijeloma, u prisustvu autologih T-ćelija koje infiltriraju koštanu srž (aspirati cele koštane srži pacijenta), indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena protočnom citometrijom. Određen je procenat aneksin-V negativnih mijelomskih plazmocita i nanesen na dijagram u odnosu na koncentracije TCB. Zapažena je koncentraciono-zavisna i specifična liza pacijentovih mijelomskih plazmocita, dok liza ne-malignih ćelija koštane srži nije zapažena (podaci nisu prikazani). Nije zapažena indukcija ćelijske smrti mijelomskih plazmocita sa kontrolnim TCB ni pri najvišim ispitivanim koncentracijama TCB antitela (podaci nisu prikazani). U poređenju sa 83A10-TCBcv, 42-TCBcv i 22-TCBcv su snažnije indukovali ubijanje mijelomskih plazmocita iz koštane srži pacijenata što se odražava koncentraciono-zavisnom redukcijom vijabilnih (aneksin-V negativnih) mijelomskih plazmocita. Reprezentativni eksperimenti kod pacijenta 001 (A) i pacijenta 007 (B) (videti primer 13).

Slika 10. Preusmerena T-ćelijska liza mijelomskih plazmocita iz koštane srži pacijenata obolelih od multiplog mijeloma, u prisustvu autologih T-ćelija koje infiltriraju koštanu srž, indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena protočnom citometrijom. Određen je procenat propidijum-jodid-negativnih mijelomskih plazmocita, i procenat vijabilnih plazmocita koštane srži u odnosu na kontrolni medijum

2

(MC) nanet je na dijagram u odnosu na koncentracije TCB. Zapažena je koncentraciono-zavisna i specifična liza mijelomskih plazmocita obolelih (A-G), dok liza mikrosredine koštane srž (BMME) nije zapažena (H). Nije zapažena indukcija ćelijske smrti mijelomskih plazmocita sa kontrolnim-TCB ni pri najvišoj testiranoj koncentraciji TCB antitela. U poređenju sa 83A10-TCBcv, 42-TCBcv i 22-TCBcv su snažnije indukovali ubijanje mijelomskih plazmocita koštane srži pacijenta što se reflektuje koncentraciono-zavisnom redukcijom vijabilnih (propidijum-jodid-negativnih) mijelomskih plazmocita. Efekat se smatra za statistički značajan ako P-vrednost odgovarajućeg statističkog testa iznosi <5% (*), < 1% (**) ili <0.1% (***). Eksperimenti su izvedeni korišćenjem uzoraka aspirata koštane srži dobijenih od pacijenta 1 (A), pacijenta 2 (B), pacijenta 3 (C), pacijenta 4 (D), pacijenta 5 (E), pacijenta 6 (F) i pacijenta 7 (G, H) (videti primer 13).

Slika 11. Aktivacija T-ćelija koštane srži pacijenata obolelih od mijeloma u prisustvu plazmocita koštane srži (aspirati cele koštane srži obolelih) indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, merena multiparametarskom protočnom citometrijom (8-kolorni panel za bojenje). Magnituda aktivacije T-ćelija upoređena je između 83A10-TCBcv (A), 42-TCBcv (B) i 22-TCBcv (C) (videti primer 14).

Slika 12. Koncentracije 83A10-TCBcv merene u uzorcima seruma (ispunjeni simboli i pune linije) i uzorcima koštane srži (prazni simboli i tačkaste linije) cinomolgus majmuna posle jedne intravenske (IV) injekcije 83A10-TCBcv, u dozi od 0.003, 0.03 i 0.1 mg/kg. Sakupljanje uzoraka seruma obavljeno je pre doziranja i 30, 90, 180 min, 7, 24, 48, 96, 168, 336, 504 h posle doziranja. Uzorci koštane srži uzimani su pre doziranja i 96 i 336 h posle doziranja (videti primer 16).

Slika 13. Preraspodela perifernih T-ćelija zapažena kod cinomolgus majmuna posle jedne IV injekcije 83A10-TCBcv (0.003, 0.03 i 0.3 mg/kg). Životinje A i B, C i D i E i F, respektivno, primile su IV injekciju 83A10-TCBcv u dozi od 0.003, 0.03 i 0.3 mg/kg. Apsolutne vrednosti broja T-ćelija u krvi (CD2<+>ćelije po ȝL krvi) nanete su na dijagram u odnosu na vreme posle tretmana (videti primer 16).

Slika 14. Redukcija broja plazmocita u krvi zapažena kod cinomolgus majmuna posle jedne IV injekcije 83A10-TCBcv (0.3 mg/kg), kako je izmereno multiparametarskom protočnom citometrijom. Plazmociti (PC) su identifikovani na osnovu 6-kolornog panela za bojenje i procenat PC prema limfocitima određen je i unet u konturne dijagrame (A).

2

Prikazana je kinetika deplecije krvnih plazmocita posle tretmana sa 83A10-TCBcv u dozi od 0.3 mg/kg, kod cinomolgus majmuna (B) (videti primer 16).

Slika 15. Antitumorska aktivnost indukovana 83A10-TCBcv anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelom u ksenograftskom modelu H929 humanog mijeloma uz korišćenje PBMC-humanizovanih NOG miševa. Imunodeficijentni NOD/Shi-scid IL2rgamma(null) (NOG) primili su, na dan 0 (d0), H929 ćelije humanog multiplog mijeloma, u vidu subkutane (SC) injekcije u desnu polovinu dorzalnog regiona. Na dan 15 (d15), NOG miševi primili su jednu intraperitonealnu (IP) injekciju humanih PBMC. Miševi su zatim pažljivo nasumično raspoređeni u različite grupe tretmana i kontrole (n=9/grupi) i obavljen je statistički test za utvrđivanje homogenosti između grupa. Eksperimentalne grupe bile su kontrolna netretirana grupa, kontrolna-TCB tretirana grupa, grupa tretirana sa 2.6 nM/kg 83A10-TCBcv i grupa tretirana sa 2.6 nM/kg BCMA50-BiTE® (BCMAxCD3 (scFv)2). Tretman antitelima injektiranjem u repnu venu, počeo je na dan 19 (d19), tj.19 dana posle SC injekcije H929 tumorskih ćelija. Raspored tretmana TCB antitelom podrazumevao je intravensku primenu jednom nedeljno, tokom 3 nedelje (tj. ukupno 3 injekcije TCB antitela). Zapremina tumora (TV) merena je tokom studije nonijusom i napredak je procenjivan poređenjem TV između grupa. TV (mm3) naneta je na dijagram u odnosu na dane posle injektiranja tumora. Na d19, prvog dana tretmana, srednja zapremina tumora dostigla je 300 ± 161 mm3 za kontrolnu grupu tretiranu vehikulumom (A), 315 ± 148 mm3 za grupu tretiranu kontrolnim TCB, 2.6 nM/kg (A), 293 ± 135 mm3 za grupu tretiranu sa 2.6 nM/kg 83A10-TCBcv (B) i 307 ± 138 mm3 za grupu tretiranu sa 2.6 nM/kg BCMA50-BiTE® (C). TV svakog pojedinačnog miša po eksperimentalnoj grupi nanet je na dijagram u odnosu na dan posle injektiranja tumora: (A) kontrolne grupe, uključujući kontrolu sa vehikulumom (puna linija) i kontrolno TCB (tačkasta linija), (B) 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) grupa, i (C) BCMA50-BiTE® (2.6 nM/kg). Crna strelica pokazuje kada je TCB tretman dat IV injekcijom. U grupi 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg), kod 6 od 9 miševa (67%) došlo je do regresije tumora, čak do TV zabeležene na d19 tj. na dan prvog TCB-tretmana i regresija tumora se održala do kraja studije. Kod 3 miša u grupi tretiranoj sa 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) kod kojih nije došlo do regresije tumora, TV na d19 iznosila je 376, 402 odnosno 522 mm3. Nasuprot tome, ni kod jednog od 9 miševa (0%) tretiranih ekvimolarnom dozom BCMA50-BiTE® (2.6 nM/kg) po režimu jednom nedeljno, tokom 3 nedelje, nije došlo do regresije tumora, ni u jednoj tački vremena (videti primer 17).

2

Slika 16. Procenat rasta tumora (TG) izračunat za d19 do d43 i poređenje između 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) grupe i BCMA50-BiTE<®>(2.6 nM/kg). Procenat rasta tumora definisan kao TG (%) određen je izračunavanjem: TG (%) = 100 x (medijana TV analizirane grupe)/(medijana TV kontrolne grupe tretirane vehikulumom). Iz etičkih razloga, miševi su eutanazirani kada je TV dostigla 2000 mm3. TG (%) bio je konzistentno i značajno redukovan kod 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) grupe, a takođe je i TG (%) bio uvek niži u poređenju sa BCMA50-BiTE® (2.6 nM/kg) (videti primer 17).

Slika 17. Rezonancija površinskog plazmona (SPR) 70 klonova odabranih iz ELISA testa. Svi eksperimenti sprovedeni su na 25°C upotrebom PBST kao pufera za razdvajanje (10 mM PBS, pH 7.4 i 0.005% (zapr./zapr.) Tween®20) sa ProteOn XPR36 biosenzorom opremljenim senzorskim čipovima GLC i GLM i reagensima za kuplovanje. Imobilizacije su sprovedene pri 30 µl/min na čipu GLM. pAb (kozje) anti hu IgG, F(ab)2 specifično Ab (Jackson) kuplovano je u vertikalnom pravcu upotrebom standardne procedure za kuplovanje amina: svih šest kanala za ligand aktivirano je tokom 5 min smešom EDC (200 mM) i sulfo-NHS (50 mM). Odmah nakon aktiviranja površina, pAb (kozje) anti hu IgG, F(ab)2 specifično antitelo (50 µg/ml, 10 mM natrijum acetat, pH 5) injektovano je kroz svih šest kanala tokom 5 min. Najzad, kanali su blokirani pomoću injekcije 1 M etanolamina-HCl (pH 8.5) tokom 5 min. Finalni imobilizacioni nivoi bili su slični na svim kanalima, u opsegu od 11000 do 11500 RU. Varijante Fab su izdvojene iz E.coli supernatanta istovremenim ubrizgavanjem duž pet odvojenih celih horizontalnih kanala (30 µl/min) tokom 5 min, što je rezultovalo nivoima u opsegu od 200 do 900 RU, u zavisnosti od koncentracije Fab u supernatantu; kondicionirani medijum ubrizgan je duž šestog kanala da bi se obezbedila procesna slepa proba u cilju upotrebe dvostrukog standarda. Jednostepena kinetička merenja sprovedena su injektovanjem serija razblaženja BCMA čoveka i cinomolgusa (50, 10, 2, 0.4, 0.08, 0 nM, 50 µl/min) tokom 3 min duž vertikalnih kanala. Disocijacija je praćena 5 min. Kinetički podaci su analizirani u ProteOn Manager v. 2.1. Obrada podataka reakcionih tačaka uključuje upotrebu standarda dobijenog poređenjem između tačaka, i koraka dvostrukog standarda upotrebom procesne slepe probe za pufer (Myszka, 1999). Obrađeni podaci iz ponovljenih jednostepenih ubrizgavanja uklopljeni su u jednostavan 1:1 model vezivanja Langmuira bez prenosa mase (O'Shannessy et al., 1993).

Slika 18. Afinitet vezivanja antitela za BCMA na HEK-huBCMA ćelijama meren protočnom citometrijom. Anti-BCMA antitela su korišćena kao prvo antitelo, a zatim je sekundarno PE-obeleženo antitelo protiv humanog Fc korišćeno kao detekciono antitelo. Nađeno je da vezivanje antitela Mab 21, Mab 22, Mab 27, Mab 39 i Mab 42 za huBCMA na HEK ćelijama nije značajno bolje od vezivanja Mab 83A10 na huBCMA-HEK ćelijama.

Slika 19. Koncentracije 42-TCBcv merene u serumu i koštanoj srži posle jedne IV ili SC injekcije kod cinomolgus majmuna. Životinje su primile jednu IV ili SC. injekciju 42-TCBcv) i uzorci krvi u vremenskim tačkama su sakupljeni preko periferne vene za procene PK pre doziranja, 30, 90, 180 min, 7, 24, 48, 96, 168, 336, 504 h posle doziranja. Uzorci krvi ostavljeni su da se zgrušavaju u epruvetama za odvajanje seruma tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Ugrušak je oboren centrifugiranjem. Rezultujući serum je neposredno skladišten na -80°C do daljih analiza. Uzorci koštane srži za procene PK takođe su prikupljeni iz butne kosti pod anestezijom/analgezijom pre doziranja, 96 i 336 h posle doziranja. Uzorci koštane srži ostavljeni su da se zgrušavaju u epruvetama za odvajanje seruma tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Ugrušak je oboren centrifugiranjem. Rezultujuća koštana srž je neposredno skladištena na -80°C do daljih analiza. Urađena je analiza i procena PK podataka. Standardna nekompartmentalna analiza urađena je upotrebom paketa Watson (v 7.4, Thermo Fisher Scientific Waltman, MA, SAD) ili sistema Phoenix WinNonlin (v. 6.3, Certara Company, SAD). Opseg efektivnih koncentracija 42-TCBcv u aspiratima koštane srži pacijenta sa multiplim mijelomom odgovara 10 pm do 10 nM (siva oblast). Koncentracije u zagradama su u nM.

Slika 20. Preusmerena T-ćelijska liza leukemijskih ćelija koštane srži pacijenta sa plazmocitnom leukemijom u prisustvu autologih T ćelija ili T ćelija koje infiltriraju koštanu srž indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima mereno protočnom citometrijom. Procenat propidijum jodid-negativnih mijelomskih plazmocita je određen i procenat vijabilnih ćelija plazmocitne leukemije koštane srži u odnosu na kontrolu medijuma (MC) nanet je na grafik naspram koncentracija TCB. Zapažena je koncentraciono-zavisna i specifična liza ćelija plazmocitne leukemije kod pacijenta (A, B) dok liza mikrookruženja koštane srži nije zapažena (BMME) (podaci nisu prikazani). Sa kontrolnim TCB nije zapažena indukcija ćelijske smrti mijelomskih plazmocita pri najvišoj ispitivanoj koncentraciji TCB antitela. 42-TCBcv je veoma snažnu indukovao ubijanja ćelija plazmocitne leukemije u koštanoj srži pacijenta, što se reflektuje koncentraciono-zavisnim smanjenjem broja vijabilnih (propidijum jodidnegativnih) mijelomskih plazmocita. Dejstvo je smatrano statistički značajnim ako je P-

1

vrednost odgovarajućeg statističkog testa bila <5% (*), < 1% (**) ili <0.1% (***). Slika prikazuje rezultate dobijene iz uzoraka koštane srži pacijenta 1(A) i pacijenta 2(B) (videti takođe primer 20).

Detaljan opis pronalaska

[0112] Pojam "BCMA, ciljni BCMA, humani BCMA" kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na humani antigen sazrevanja B ćelija, poznat i kao BCMA; TR17_HUMAN, TNFRSF17 (UniProt Q02223), koji je član superfamilije receptora za faktor nekroze tumora i koji se prvenstveno eksprimira na diferenciranim plazmocitima. Vanćelijski domen BCMA sastoji se, prema UniProt, od aminokiselina 1-54 (ili 5-51). Izraz "antitelo protiv BCMA, anti-BCMA antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antitelo koje se specifično vezuje za ekstracelularni domen BCMA.

[0113] "Specifično vezivanje za BCMA ili vezivanje za BCMA" odnosi se na antitelo koje je sposobno da se veže za ciljni BCMA sa dovoljnim afinitetom, tako da antitelo bude korisno kao terapijsko sredstvo u ciljnom delovanju na BCMA. U nekim primerima izvođenja, stepen vezivanja anti-BCMA antitela za nesrodni, ne-BCMA protein je oko 10 puta, poželjno >100 puta manji od vezivanja antitela za BCMA mereno, npr., rezonancijom površinskog plazmona (SPR) npr. Biacore®, enzimski-vezanim imunosorbentnim testom (ELISA) ili protočnom citometrijom (FACS). U jednom primeru izvođenja antitelo koje se vezuje za BCMA ima konstantu disocijacije (Kd) od 10<-8>M ili manje, poželjno od 10<-8>M do 10<-13>M, poželjno od 10<-9>M do 10<-13>M. U jednom primeru izvođenja anti-BCMA antitelo se vezuje za epitop BCMA koji je konzervativan među BCMA različitih vrsta, poželjno između čoveka i cinomolgusa, i dodatno poželjno i sa BCMA miša i pacova. "Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za CD3 i BCMA, bispecifično antitelo protiv CD3 i BCMA" odnosi se na odgovarajuću definiciju za vezivanje za oba ciljna molekula. Antitelo koje se specifično vezuje za BCMA (ili BCMA i CD3) ne vezuje se za druge humane antigene. Prema tome, u ELISA testu, OD vrednosti za takve nesrodne ciljne molekule biće jednake ili niže od limita detekcije specifičnog testa, poželjno > 0.3 ng/mL, ili jednake ili niže od OD vrednosti kontrolnih uzoraka bez BCMA vezanog za ploču ili sa netransfektovanim HEK293 ćelijama.

[0114] Poželjno, anti-BCMA antitelo se specifično vezuje za grupu BCMA, koja se sastoji od humanog BCMA i BCMA nehumanog sisarskog porekla, poželjno BCMA cinomolgusa, miša i/ili pacova. "Odstupanje vrednosti cinomolgus/čovek" odnosi se na odnos afiniteta KD BCMA cinomolgusa [M]/KD humanog BCMA[M] (detalje videti u primeru 3). "Disparitet vrednosti cinomolgus/čovek Mab CD3", kako se ovde koristi, odnosi se na odnos afiniteta KD CD3

2

cinomolgusa [M]/KD humanog CD3[M]. U jednom primeru izvođenja bispecifično anti-BCMA/anti-CD3 antitelo pronalaska pokazuje disparitet vrednosti cinomolgus/čovek Mab CD3 između 1.25 i 5 ili između 0.8 i 1.0. Bispecifično antitelo prema pronalasku se u jednom primeru izvođenja odlikuje time što se specifično vezuje i za CD3 cinomolgusa. U jednom primeru izvođenja bispecifično anti-BCMA/anti-CD3 antitelo pronalaska pokazuje disparitet vrednosti cinomolgus/čovek Mab CD3 između 1.25 i 5 ili između 0.8 i 1.0. Poželjan disparitet vrednosti cinomolgus/čovek je u istom opsegu za anti-BCMA- i anti-CD3 antitelo.

[0115] Izraz "APRIL", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na rekombinantni, skraćeni mišji APRIL (aminokiseline 106-241; NP_076006). APRIL može da se proizvede kako je opisano kod Ryan, 2007 (Mol Cancer Ther; 6 (11): 3009-18).

[0116] Izraz "BAFF", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na rekombinantni, skraćeni humani BAFF (UniProt Q9Y275 (TN13B_HUMAN) koji može da bude proizveden kao što je opisano kod Gordon, 2003 (Biochemistry; 42 (20): 5977-5983). Poželjno His-obeleženi BAFF koristi se prema otkriću. Poželjno, His-obeleženi BAFF proizvodi se kloniranjem DNK fragmenta koji kodira BAFF rezidue 82-285 u ekspresioni vektor, stvaranjem fuzije sa N-terminalnom His-oznakom praćene trombinskim mestom cepanja, eksprimiranjem pomenutog vektora i cepanjem izdvojenog proteina trombinom.

[0117] Anti-BCMA antitela analiziraju se pomoću ELISA testa u pogledu vezivanja za humani BCMA upotrebom BCMA vezanog za ploču. Za ovaj test koristi se količina BCMA vezanog za ploču od poželjno 1.5 ȝg/mL i koncentracija/koncentracije anti-BCMA antitela u opsegu od 0.1 pM do 200 nM.

[0118] Izraz "NF-κB", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na rekombinantni NF-κB p50 (pristupni broj (P19838)). Aktivnost NF-κB može da se meri DNK-vezujućim ELISA testom ekstrakta NCI-H929 MM ćelija (CRL-9068™). NCI-H929 MM ćelije, netretirane ili tretirane sa 0.1 µg/mL TNF-α, 1000 ng/mL toplotom obrađenog HT-skraćenog-BAFF, 1000 ng/mL skraćenog-BAFF, 0.1 pM do 200 nM izotipske kontrole, i sa ili bez 0.1 pM do 200 nM anti-BCMA antitela inkubirane su 20 min. Aktivnost NF-κB može da se testira korišćenjem funkcionalnog ELISA testa koji detektuje hemiluminiscentni signal sa p65 vezanog za NF-κB konsenzusnu sekvencu (US6150090).

[0119] Izraz "dodatni ciljni molekul", kako se koristi u ovom tekstu, označava poželjno CD3ε. Izraz "prvi ciljni molekul i drugi ciljni molekul" označava ili CD3 kao prvi ciljni molekul i BCMA kao drugi ciljni molekul ili označava BCMA kao prvi ciljni molekul i CD3 kao drugi ciljni molekul.

[0120] Izraz "CD3ε ili CD3", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na humani CD3ε opisan pod UniProt P07766 (CD3E_HUMAN). Izraz "antitelo protiv CD3ε, anti-CD3ε antitelo" odnosi se na antitelo koje se specifično vezuje za CD3ε. U jednom primeru izvođenja antitelo sadrži varijabilni domen VH koja sadrži CDR regione teškog lanca sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao, redom, CDR1H, CDR2H i CDR3H teškog lanca i varijabilni domen VL koji sadrži CDR regione lakog lanca sekvenci SEQ ID NO: 4, 5 i 6 kao, redom, CDR1L, CDR2L i CDR3L lakog lanca. U jednom primeru izvođenja antitelo sadrži varijabilne domene sekvenci SEQ ID NO:7 (VH) i SEQ ID NO:8 (VL).

[0121] Izraz "antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na monoklonsko antitelo. Antitelo se sastoji od dva para, svaki od "lakog lanca" (LC) i "teškog lanca" (HC) (takvi parovi laki lanac (LC)/teški lanac ovde su skraćeno označeni kao LC/HC). Laki lanci i teški lanci takvih antitela su polipeptidi koji se sastoje od nekoliko domena. Svaki teški lanac sadrži varijabilni region teškog lanca (ovde skraćeno HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sadrži konstantne domene CH1, CH2 i CH3 teškog lanca (klase antitela IgA, IgD, i IgG) i opciono konstantni domen CH4 teškog lanca (klase antitela IgE i IgM). Svaki laki lanac sadrži varijabilni domen VL lakog lanca i konstantni domen CL lakog lanca. Varijabilni domeni VH i VL mogu dodatno da se podele u regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), ispresecane konzervativnijim regionima, označenim kao regioni okvira (FR). Svaki VH i VL sastoji se od tri CDR i četiri FR, postavljena od aminoterminalnog kraja do karboksi-terminalnog kraja sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. "Konstantni domeni" teškog lanca i lakog lanca nisu direktno uključeni u vezivanje antitela za ciljni molekul, ali pokazuju različite efektorske funkcije. Izraz "antitelo", kako se ovde koristi, obuhvata i deo antitela koji je potreban bar za specifično vezivanje za antigen CD3 odnosno BCMA. Stoga takvo antitelo (ili deo antitela) može da bude u jednom primeru izvođenja Fab fragment, ako je pomenuti deo antitela sadržan u bispecifičnom antitelu prema pronalasku. Antitelo prema pronalasku može da bude i Fab', F(ab')2, scFv, di-scFv, ili bispecifični T-ćelijski aktivator (BiTE).

[0122] Izraz "antitelo" uključuje npr. mišja antitela, humana antitela, himerna antitela, humanizovana antitela i antitela konstruisana genetskim inženjeringom (varijantna ili mutantna antitela) dokle god zadržavaju svoja karakteristična svojstva. Posebno su poželjna humana ili humanizovana antitela, posebno kao rekombinantna humana ili humanizovana antitela. Sledeći primeri izvođenja su heterospecifična antitela (bispecifična, trispecifična itd.) i drugi konjugati, npr. sa citotoksičnim malim molekulima.

[0123] Izraz "bispecifično antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se u jednom primeru izvođenja na antitelo u kome se jedan od dva para teškog lanca i lakog lanca (HC/LC) specifično vezuje za CD3, a drugi se specifično vezuje za BCMA. Izraz se odnosi i na druge formate

4

bispecifičnih antitela prema stanju tehnike, u jednom primeru izvođenja na bispecifična jednolančana antitela.

[0124] Izraz "TCB", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za BCMA i CD3. Izraz "83A10-TCBcv", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za BCMA i CD3 kao što je specifično određeno njegovom kombinacijom teškog i lakog lanca sekvenci SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47 (2x), i SEQ ID NO:48, i kao što je prikazano na slici 2A i opisano u EP14179705. Izrazi "21-TCBcv, 22-TCBcv, 42-TCBcv", kako se koriste u ovom tekstu, odnose se na odgovarajuća bispecifična antitela Mab21, kao što je specifično određeno njegovom kombinacijom teškog i lakog lanca sekvenci SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, i SEQ ID NO:51 (2x), Mab 22 kao što je specifično određeno njegovim kombinacijama teškog i lakog lanca sekvenci SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, i SEQ ID NO:54 (2x), i Mab42 kao što je specifično određeno njegovom kombinacijom teškog i lakog lanca sekvenci SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, i SEQ ID NO:57-(2x).

[0125] Izraz "golo antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antitelo koje se specifično vezuje za BCMA, koje sadrži Fc deo i nije konjugovano sa terapijskim sredstvom npr. sa citotoksičnim agensom ili radioaktivno obeleženo. Izraz "konjugovano antitelo, konjugat leka", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antitelo koje se specifično vezuje za BCMA, i konjugovano je sa terapijskim sredstvom npr. sa citotoksičnim agensom ili je radioaktivno obeleženo.

[0126] Izraz "bispecifično jednolančano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na jedan polipeptidni lanac koji sadrži u jednom primeru izvođenja dva vezujuća domena, jedan koji se specifično vezuje za BCMA i drugi, koji se, u jednom primeru izvođenja specifično vezuje za CD3. Svaki vezujući domen sadrži jedan varijabilni region iz teškog lanca antitela ("VH region"), pri čemu se VH region prvog vezujućeg domena specifično vezuje za CD3 molekul, a VH region drugog vezujućeg domena specifično se vezuje za BCMA. Dva vezujuća domena su opciono spojena jedan sa drugim pomoću kratkog polipeptidnog spejsera. Neograničavajući primer polipeptidnog spejsera je Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (G-G-G-G-S) i njegovi ponovci. Svaki vezujući domen može dodatno da sadrži jedan varijabilni region iz lakog lanca antitela ("VL region"), pri čemu su VH region i VL region u svakom od prvog i drugog vezujućeg domena spojeni jedan sa drugim putem polipeptidnog linkera, koji je dovoljno dugačak da omogući VH regionu i VL regionu prvog vezujućeg domena i VH regionu i VL regionu drugog vezujućeg domena da se spare jedan sa drugim tako da, zajedno, mogu specifično da se vežu za odgovarajući prvi i drugi vezujući domen (videti npr. EP0623679).

Bispecifična jednolančana antitela pomenuta su i kod npr. Choi BD et al., Expert Opin Biol Ther.

2011 Jul;11(7):843 -53 i Wolf E. et al., Drug Discov Today.2005 Sep 15;10(18):1237-44.

[0127] Izraz "diatelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na mali bivalentni i bispecifični fragment antitela koji sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) spojen sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) na istom polipeptidnom lancu (VH- VL) povezane peptidnim linkerom koji je suviše kratak da omogući sparivanje između dva domena na istom lancu (Kipriyanov, Int. J. Cancer 77 (1998), 763-772). Ovo forsira sparivanje sa komplementarnim domenima drugog lanca i podstiče sklapanje dimernog molekula sa dva funkcionalna antigenvezujuća mesta. Za konstruisanje bispecifičnih diatela pronalaska, V-domeni anti-CD3 antitela i anti-BCMA antitela fuzionišu se tako da stvore dva lanca VH(CD3)-VL(BCMA), VH(BCMA)-VL(CD3). Svaki lanac za sebe ne može da veže odgovarajući antigen, ali obnavlja funkcionalna antigena-vezujuća mesta anti-CD3 antitela i anti-BCMA antitela prilikom udruživanja sa drugim lancem. Dva scFv molekula, sa linkerom između varijabilnog domena teškog lanca i varijabilnog domena lakog lanca koji je previše kratak za intramolekulsku dimerizaciju, se koeksprimiraju i samo-sklapaju tako da obrazuju bispecifične molekule sa dva vezujuća mesta na suprotnim krajevima. Na primer, varijabilni regioni koji kodiraju vezujuće domene za BCMA i CD3, respektivno, mogu da se amplifikuju pomoću PCR sa DNK konstrukata dobijenih kao što je opisano, tako da mogu da budu klonirani u vektor kao pHOG, kao što je opisano kod Kipiriyanov et al., J. Immunol, Methods, 200, 69-77 (1997a). Dva scFV konstrukta se zatim kombinuju u jedan ekspresioni vektor u željenoj orijentaciji, pri čemu se VH-VL linker skraćuje da bi se sprečilo savijanje lanaca samih sa sobom. DNK segmenti su razdvojeno STOP kodonom i ribozom-vezujućim mestom (RBS). RBS omogućava transkripciju iRNK u vidu bi-cistronske poruke, koja se pomoću ribozoma translatira u dva proteina koji nekovalentno interaguju da bi obrazovali molekul diatela. Diatela, kao drugi fragmenti antitela, imaju tu prednost da mogu da se eksprimiraju u bakterijama (E. coli) i kvascu (Pichia pastoris) u funkcionalnom obliku i sa visokim prinosima (do Ig/l).

[0128] Izraz "tandemski scFV", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na jednolančani Fv molekul (tj. molekul obrazovan udruživanjem varijabilnih domena imunoglobulinskog teškog i lakog lanca, VH i VL, respektivno) kao što je opisano npr, u WO 03/025018 i WO 03/048209. Takvi Fv molekuli, poznati kao TandAbs® sadrže četiri varijabilna domena antitela, pri čemu se (i) bilo prva dva ili poslednja dva od četiri varijabilna domena vezuju intramolekulski jedan za drugi u istom lancu obrazujući antigen-vezujući scFv u orijentaciji VH/VL ili VL/VH (ii) druga dva domena vezuju se intermolekulski sa odgovarajućim VH ili VL domenima drugog lanca da obrazuju antigen-vezujuće parove VH/VL. U poželjnom primeru izvođenja, kao što je pomenuto u WO 03/025018, monomeri takvog Fv molekula sadrže najmanje četiri varijabilna domena od kojih dva susedna domena jednog monomera obrazuju antigen-vezujuću VH- VL ili VL- VH scFv jedinicu.

[0129] Izraz "DARPin", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na bispecifični molekul sa ankirinskim ponovkom kao što je opisano npr. u US 2009082274. Ovi molekuli potiču od prirodnih ankirinskih proteina, koji se mogu naći u humanom genomu i predstavljaju jedan od najrasprostranjenijih tipova vezujućih proteina. Modul biblioteke DARPin definisan je proteinskim sekvencama sa prirodnim ankirinskim ponovkom, upotrebom 229 ankirinskih ponovaka za polaznu konstrukciju i dodatnih 2200 za naknadno poboljšanje. Moduli služe kao gradivni blokovi za biblioteke DARPin. Moduli biblioteke liče na sekvence humanog genoma. DARPin je sačinjen od 4 do 6 modula. Kako svaki modul ima pribl.3.5 kDa, veličina prosečnog DARPin je 16-21 kDa. Izbor vezujućih antitela urađen je metodom ribozomalnog prikaza, koji potpuno isključuje upotrebu ćelija i opisan je u He M i Taussig MJ., Biochem Soc Trans. 2007, Nov;35(Pt 5):962-5.

[0130] Pod izrazom "T-ćelijski bispecifični aktivator" podrazumevaju se fuzioni proteini koji se sastoje od dva jednolančana varijabilna fragmenta (scFvs) različitih antitela, ili aminokiselinske sekvence sa četiri različita gena, na jednom peptidnom lancu od oko 55 kilodaltona. Jedan od scFv se vezuje za T ćelije putem CD3 receptora, a drugi za BCMA.

[0131] Postoji pet tipova teških lanaca sisarskih antitela, koji su označeni grčkim slovima: α, δ, ε, γ i μ (Janeway CA, Jr et al (2001). Immunobiology. 5th ed., Garland Publishing). Tip prisutnog teškog lanca definiše klasu antitela; ovi lanci nalaze se u IgA, IgD, IgE, IgG i IgM antitelima, respektivno (Rhoades RA, Pflanzer RG (2002). Human Physiology, 4th ed., Thomson Learning). Posebni teški lanci razlikuju se u veličini i sastavu; α i γ sadrže približno 450 aminokiselina, dok μ i ε imaju približno 550 aminokiselina.

[0132] Svaki teški lanac ima dva regiona, konstantni region i varijabilni region. Konstantni region je identičan u svim antitelima istog izotipa, ali se razlikuje u antitelima različitog izotipa. Teški lanci γ, α i δ imaju konstantni region sačinjen od tri konstantna domena CH1, CH2, i CH3 (u nizu), i zglobni region za dodatnu fleksibilnost (Woof J, Burton D Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99); teški lanci μ i ε imaju konstantni region sastavljen od četiri konstantna domena CH1, CH2, CH3 i CH4 (Janeway CA, Jr et al (2001). Immunobiology. 5th ed., Garland Publishing). Varijabilni region teškog lanca različit je u antitelima proizvedenim u različitim B ćelijama, ali je isti za sva antitela proizvedena u jednoj B ćeliji ili klonu B ćelija. Varijabilni region svakog teškog lanca dug je približno 110 aminokiselina i sačinjen je od jednog domena antitela.

[0133] Kod sisara postoje samo dva tipa lakog lanca koji se nazivaju lambda (λ) i kapa (κ). Laki lanac ima dva sukcesivna domena: jedan konstantni domen CL i jedan varijabilni domen VL. Približna dužina lakog lanca je 211 do 217 aminokiselina. U jednom primeru izvođenja laki lanac je kapa (κ) laki lanac i konstantni domen CL u jednom primeru izvođenja potiče od kapa (K) lakog lanca (konstantni domen CK).

[0134] "Ak supstitucija", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na nezavisnu aminokiselinsku supstituciju u konstantnom domenu CH1 na aminokiselini na pozicijama 147 i 213 glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) i u konstantnom domenu CL aminokiselina na poziciji 124 supstituisana je lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H). U jednom primeru izvođenja dodatno je, u konstantnom domenu CL, aminokiselina na poziciji 123 nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H). U jednom primeru izvođenja aminokiselina 124 je K, aminokiselina 147 je E, aminokiselina 213 je E, i aminokiselina 123 je R. Ak supstitucije su ili u CD3 Fab ili u jednom ili dva BCMA Fab. Bispecifična antitela protiv BCMA i CD3 kao varijante naelektrisanja opisana su u EP14179705, opisana referencom (u nastavku teksta nazvana "varijante naelektrisanja što odgovara izmeni varijante naelektrisanja").

[0135] Sva numeracija aminokiselina u ovom dokumentu je prema Kabatu (Kabat, E.A. et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242).

[0136] Izrazi "monoklonska antitelo" ili "kompozicija monoklonskih antitela", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na preparat molekula antitela sa jednim sastavom aminokiselina.

[0137] "Antitela" prema pronalasku mogu biti bilo koje klase (npr. IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, poželjno IgG ili IgE), ili potklase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2, poželjno IgG1), pri čemu oba antitela od kojih je izvedeno bivalentno bispecifično antitelo prema pronalasku, imaju Fc deo iste potklase (npr. IgG1, IgG4 i slično, poželjno IgG1), poželjno istog alotipa (npr. kavkaskog).

[0138] "Fc deo antitela" je izraz koji je dobro poznat iskusnom stručnjaku i definisan je na osnovu sečenja antitela papainom. Antitela prema pronalasku kao Fc deo sadrže, u jednom primeru izvođenja, Fc deo humanog porekla i poželjno sve druge delove humanih konstantnih regiona. Fc deo antitela direktno je uključen u aktivaciju komplementa, C1q vezivanje, aktivaciju C3 i vezivanje za Fc receptor. Iako uticaj antitela na sistem komplementa zavisi od određenih uslova, vezivanje za C1q prouzrokovano je definisanim vezivnim mestima u Fc delu. Takva vezivna mesta poznata su u stanju tehnike i opisana su npr. u Lukas, TJ., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., MoI. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., MoI. Immunol.37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol.75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; i EP 0307 434.

[0139] Takva vezivna mesta su npr. L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 i P329 (numeracija prema EU indeksu Kabata). Antitela potklase IgG1, IgG2 i IgG3 obično pokazuju aktivaciju komplementa, vezivanje za C1q i aktivaciju C3, dok IgG4 ne aktivira sistem komplementa, ne vezuje se za C1q i ne aktivira C3. U jednom primeru izvođenja Fc deo je humani Fc deo.

[0140] U jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku sadrži Fc varijantu Fc regiona divljeg tipa humanog IgG, pomenuta Fc varijanta sadrži aminokiselinsku supstituciju na poziciji Pro329 i najmanje još jednu aminokiselinsku supstituciju, pri čemu su rezidue numerisane prema Kabatovom EU indeksu, i pri čemu pomenuto antitelo ispoljava smanjeni afinitet prema humanim FcγRIIIA i/ili FcγRIIA i/ili FcγRI, u poređenju sa antitelom koje sadrži IgG-Fc region divljeg tipa, i pri čemu je ADCC indukovana pomenutim antitelom redukovana bar na 20% od ADCC indukovane antitelom koje sadrži humani IgG-Fc region divljeg tipa. U specifičnom primeru izvođenja, Pro329 humanog Fc regiona divljeg tipa u antitelu prema pronalasku, supstituisan je glicinom ili argininom ili aminokiselinskom reziduom koja je dovoljno velika da naruši prolinski sendvič unutar površine kontakta Fc/Fcγ receptor, koji se formira između prolina 329 Fc i triptofanskih rezidua Trp 87 i Tip 110 FcγRIII (Sondermann et al.: Nature 406, 267-273 (20 jul 2000)). U sledećem aspektu pronalaska, najmanje još jedna aminokiselinska supstitucija u Fc varijanti je S228P, E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D ili P331S i u još jednom primeru izvođenja pomenuta najmanje jedna dodatna aminokiselinska supstitucija je L234A i L235A Fc regiona humanog IgG1 ili S228P i L235E Fc regiona humanog IgG4. Takve Fc varijante opisane su detaljno u WO2012130831.

[0141] Pod "efektorskom funkcijom", kako se koristi u ovom tekstu, podrazumeva se biohemijski događaj koji rezultuje iz interakcije Fc regiona antitela sa Fc receptorom ili ligandom. Efektorske funkcije uključuju, ali nisu ograničene na ADCC, ADCP i CDC. Pod "efektorskom ćelijom", kako se koristi u ovom tekstu, podrazumeva se ćelija imunog sistema koja eksprimira jedan ili više Fc receptora i posreduje u jednoj ili više efektorskih funkcija. Efektorske ćelije uključuju, ali nisu ograničene na monocite, makrofage, neutrofile, dendritske ćelije, eozinofile, mast ćelije, trombocite, B ćelije, velike granularne limfocite, Langerhansove ćelije, ćelije prirodne ubice (NK), i γδ T ćelije, i mogu da potiču iz bilo kog organizma uključujući, ali bez ograničenja ljude, miševe, pacove, kuniće i majmune. Pod "bibliotekom" ovde se podrazumeva set Fc varijanti u bilo kom obliku, uključujući, ali bez ograničenja spisak sekvenci nukleinskih kiselina ili aminokiselina, spisak supstitucija nukleinskih kiselina ili aminokiselina na varijabilnim pozicijama, fizičku biblioteku koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju sekvence biblioteke, ili fizičku biblioteku koja sadrži proteine Fc varijanti, bilo u prečišćenom ili neprečišćenom obliku.

[0142] Pod "Fc gama receptorom" ili "FcγR", kako se koristi u ovom tekstu, podrazumeva se bilo koji član familije proteina koji se vezuje za Fc region IgG antitela i suštinski je kodiran FcγR genima. Kod ljudi ova familija uključuje, ali nije ograničena na FcγRI (CD64), uključujući izoforme FcγRIa, FcγRIb, i FcγRIc; FcγRII (CD32), uključujući izoforme FcγRlla (uključujući alotipove H131 i R131), FcγRllb (uključujući FcγRllb-1 i FcγRllb-2), i FcγRllc; i FcγRIII (CD16), uključujući izoforme FcγRllla (uključujući alotipove V158 i F158) i FcγRlllb (uključujući alotipove FcγRlllb-NA1 i FcγRlllb- NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65), kao i bilo koje neotkrivene humane FcγRs ili FcγR izoforme ili alotipove. FcγR može da potiče iz bilo kog organizma, uključujući, ali bez ograničenja ljude, miševe, pacove, kuniće i majmune. Mišji FcγR uključuju, ali nisu ograničeni na FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII (CD16), i FcγRIII-2 (CD16-2), kao i bilo koje neotkrivene mišje FcγRs ili FcγR izoforme ili alotipove.

[0143] "Fc varijanta sa povećanom efektorskom funkcijom", kako se koristi u ovom tekstu, označava Fc sekvencu koja se razlikuje od parentalne Fc sekvence na osnovu bar jedne aminokiselinske modifikacije ili se odnosi na druge modifikacije kao što je izmena glikozilacije na npr. Asn279 koja povećava efektorske funkcije. Takve modifikacije se npr. pominju kod Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991 , J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al., 1995, //77muno/ Lett 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963- 4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178- 4184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200: 16-26; Idusogie et al., 2001 , J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001 , J Biol Chem 276:6591 -6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; US5624821; US5885573; US6194551; WO200042072; WO199958572. Takve Fc modifikacije takođe uključuju konstruisane glikoforme Fc dela. Pod "konstruisanom glikoformom", kako se koristi u ovom tekstu, podrazumeva se kompozicija ugljenih hidrata koja je kovalentno vezana za Fc polipeptid, pri čemu se pomenuta kompozicija ugljenih hidrata hemijski razlikuje od one kod parentalnog Fc polipeptida. Konstruisane glikoforme mogu da se dobiju bilo kojim postupkom, na primer upotrebom konstruisanih ili sojeva sa varijantnom ekspresijom, koekspresijom sa jednim ili više enzima, na primer D1-4-N-acetilglukozaminiltransferazom III (GnTIII), ekspresijom Fc polipeptida u različitim organizmima ili ćelijskim linijama različitih organizama, ili modifikovanjem ugljenog hidrata/ugljenih hidrata posle ekspresije Fc polipeptida. Postupci za stvaranje konstruisanih glikoformi poznati su u stanju tehnike i pominju se u Umana et al., 1999,

4

Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001 , Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) US6602684; WO200061739; WO200129246; WO200231140; WO200230954; tehnologiji Potelligent™ (Biowa, Inc., Princeton, N.J.); tehnologiji konstruisanja glikozilacije GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG, Zurich, Švajcarska)). Konstruisane glikoforme tipično se odnose na drugačiju ugljenohidratnu ili oligosaharidnu kompoziciju u odnosu na parentalni Fc polipeptid.

[0144] Antitela prema pronalasku koja sadrže Fc varijantu sa povećanom efektorskom funkcijom pokazuju visok afinitet vezivanja za Fc gama receptor III (FcγRIII, CD 16a). Visok afinitet vezivanja za FcγRIII označava da je vezivanje za CD16a/F158 poboljšano najmanje 10 puta u odnosu na parentalno antitelo (95% fukozilacije) kao standard eksprimiran u CHO ćelijamadomaćinima, kao što su CHO DG44 ili CHO K1 ćelije, ili/i je vezivanje za CD16a/V158 poboljšano najmanje 20 puta u odnosu na parentalno antitelo mereno rezonancijom površinskog plazmona (SPR) upotrebom imobilisanog CD 16a pri koncentraciji antitela od 100 nM. FcγRIII-vezivanje može da se poveća postupcima u skladu sa stanjem tehnike, npr. modifikovanjem aminokiselinske sekvence Fc dela ili glikozilacijom Fc dela antitela (videti npr. EP2235061). Mori, K et al., Cytotechnology 55 (2007)109 i Satoh M, et al., Expert Opin Biol Ther. 6 (2006) 1161-1173 se odnose na CHO linije sa isključenim genom FUT8 (α-1,6-fukoziltransferaza) za stvaranje afukozilisanih antitela.

[0145] Izraz "himerno antitelo" odnosi se na antitelo koje sadrži varijabilni region tj. vezujući region iz jednog izvora ili vrste i najmanje deo konstantnog regiona izveden iz različitog izvora ili vrste, obično pripremljeno tehnikama rekombinantne DNK. Poželjna su himerna antitela koja sadrže mišji varijabilni region i humani konstantni region. Druge poželjne forme "himernih antitela" obuhvaćene predmetnim pronalaskom su one u kojima je konstantni region modifikovan ili izmenjen u odnosu na onaj kod originalnog antitela da bi se generisale osobine od interesa, posebno u vezi sa vezivanjem za C1q i/ili za Fc receptor (FcR). Takva himerna antitela označena su i kao "antitela sa promenjenom klasom". Himerna antitela proizvodi su ekspresije imunoglobulinskih gena koji uključuju DNK segmente koji kodiraju varijabilne regione imunoglobulina i DNK segmenata koji kodiraju konstantne regione imunoglobulina. Metodi proizvodnje himernih antitela uključuju konvencionalne tehnike rekombinantne DNK i tehnike transfekcije gena, dobro poznate u struci. Vidi, npr., Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US Patent No.5,202,238 i 5,204,244.

[0146] Izraz "humanizovano antitelo" odnosi se na antitela u kojima su regioni okvira ili "regioni koji određuju komplementarnost" (CDR) modifikovani tako da sadrže CDR imunoglobulina različite specifičnosti u poređenju sa onom roditeljskog imunoglobulina. U poželjnoj formi, mišji CDR graftovan je u okvirni region humanog antitela da bi se pripremilo "humanizovano antitelo". Vidi, npr., Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; i Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270. Drugi oblici "humanizovanih antitela" obuhvaćeni predmetnim pronalaskom su oni u kojima je konstantni region dodatno modifikovan ili izmenjen u odnosu na originalno antitelo, tako da se generišu osobine od interesa, posebno u vezi sa vezivanjem za C1q i/ili za Fc receptor (FcR).

[0147] Izraz "humano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, treba da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz imunoglobulinskih sekvenci humane klicine linije. Humana antitela dobro su poznata u stanju tehnike (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). Humana antitela mogu da se proizvedu i u transgenim životinjama (npr., miševima) sposobnim da, posle imunizacije, proizvode pun repertoar ili odabrana humana antitela, uz izostanak proizvodnje endogenih imunoglobulina. Transfer niza imunoglobulinskih gena humane klicine linije u takve miševe sa mutacijom klicine linije rezultovaće proizvodnjom humanih antitela (vidi, npr., Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol.7 (1993) 33-40). Humana antitela mogu da se proizvedu i u bibliotekama prikazanim na fagu (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol.222 (1991) 581-597). Tehnike prema Cole et al. i Boerner et al. takođe su na raspolaganju za pripremanje humanih monoklonskih antitela (Cole et al., Monoklonska Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); i Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Kao što je već pomenuto za himerna i humanizovana antitela prema pronalasku, izraz "humano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, obuhvata i antitela koja su modifikovana u konstantnom regionu da bi se generisale osobine od interesa, posebno u vezi sa vezivanjem za C1q i/ili za FcR, npr., "promenom klasa" tj. promenom ili mutacijom Fc delova (npr. iz IgG1 u IgG4 i/ili IgG1/IgG4 mutacija).

[0148] Izraz "rekombinantno humano antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, treba da uključi sva humana antitela koja se pripremaju, eksprimiraju, kreiraju ili izoluju rekombinantnim načinom, kao što su antitela izolovana iz ćelije-domaćina, npr. NSO ili CHO ćelija, ili iz životinje (npr. miša) koja je transgena za humane imunoglobulinske gene ili antitela eksprimirana korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora transfektovanog u ćelijudomaćina. Takva rekombinantna humana antitela imaju varijabilne i konstantne regione u rearanžiranom obliku. Rekombinantna humana antitela prema pronalasku podvrgnuta su in vivo somatskoj hipermutaciji. Tako, aminokiselinske sekvence VH i VL regiona rekombinantnih antitela su sekvence koje, iako izvedene i srodne sa humanim VH i VL sekvencama klicine linije, ne moraju prirodno postojati u repertoaru antitela humane klicine linije in vivo.

[0149] "Varijabilni domen" (varijabilni domen lakog lanca (VL), varijabilni region teškog lanca (VH)), kako se ovde koristi, označava svaki od parova lakog i teškog lanca direktno uključen u vezivanje antitela prema pronalasku. Domeni varijabilnih humanih lakih i teških lanaca imaju istu opštu strukturu i svaki domen sadrži četiri regiona okvira (FR) čije su sekvence široko konzervirane, povezane preko tri "hipervarijabilna regiona" (ili regiona koji određuju komplementarnost, CDR). Regioni okvira zauzimaju konformaciju β-ploče, CDR mogu formirati petlje koje povezuju strukturu β-ploče. CDR u svakom lancu održavaju se u svojoj trodimenzionalnoj strukturi pomoću regiona okvira i zajedno sa CDR iz drugog lanca formiraju vezivno mesto. CDR3 regioni teškog i lakog lanca antitela imaju posebno važnu ulogu u specifičnosti/afinitetu vezivanja antitela prema pronalasku i tako predstavljaju sledeći cilj otkrića.

[0150] Izrazi "hipervarijabilni region" ili "deo antitela koji se specifično vezuje sa ciljem", kada se koriste u ovom tekstu, odnose se na aminokiselinske rezidue antitela koje su odgovorne za vezivanje sa ciljnim molekulom. Hipervarijabilni region obuhvata aminokiselinske rezidue iz "regiona koji određuju komplementarnost" ili "CDR". "Okvirni" ili "FR" regioni su oni regioni varijabilnog domena koji su različiti od rezidua hipervarijabilnog regiona, kako je ovde definisano. Prema tome, laki i teški lanci antitela sadrže od N- do C-terminalnog kraja domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. CDR na svakom lancu razdvojeni su aminokiselinama regiona okvira. Posebno, CDR3 teškog lanca je region koji najviše doprinosi vezivanju za ciljni molekul. CDR i FR regioni određeni su prema standardnoj definiciji iz Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Izrazi "CDR1H, CDR2H i CDR3H", kako se ovde koriste, odnose se na odgovarajuće CDR regione teškog lanca smeštene u varijabilnom domenu VH. Izrazi "CDR1L, CDR2L i CDR3L", kako se ovde koriste, odnose se na odgovarajuće CDR regione lakog lanca smeštene u varijabilnom domenu VL.

[0151] Konstantni domen CH1 teškog lanca kojim je zamenjen domen CH3 teškog lanca može da bude bilo koje klase Ig (npr. IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM), ili potklase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2). Konstantni domen CL lakog lanca kojim je zamenjen domen CH3 teškog lanca može da bude tipa lambda (λ) ili kapa (κ), poželjno tipa kapa (κ).

[0152] Izrazi "cilj" ili "ciljni molekul", kako se koriste u ovom tekstu, koriste se kao sinonimi i odnose se na humani BCMA. U pogledu bispecifičnih antitela, izraz odnosi se na BCMA i drugi ciljni molekul. Poželjno, u pogledu bispecifičnih antitela izraz se odnosi na BCMA i CD3.

[0153] Izraz "epitop" uključuje svaku polipeptidnu determinantu sposobnu da se specifično veže sa antitelom. Epitopske determinante uključuju hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, fosforil ili sulfonil, i mogu imati specifične

4

trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop je region ciljnog molekula za koji se vezuje antitelo.

[0154] Uopšteno postoje dva vektora koja kodiraju laki lanac i teški lanac antitela prema pronalasku. Što se tiče bispecifičnog antitela, postoje dva vektora koja kodiraju laki lanac i teški lanac pomenutog antitela koje se specifično vezuje za prvi ciljni molekul, i još dva vektora koja kodiraju laki lanac i teški lanac pomenutog antitela koje se specifično vezuje za drugi ciljni molekul. Jedan od dva vektora kodira odgovarajući laki lanac, a drugi od dva vektora kodira odgovarajući teški lanac. Međutim, u alternativnom postupku za pripremu antitela prema pronalasku, za transformaciju ćelije-domaćina mogu da se koriste samo jedan prvi vektor koji kodira laki lanac i teški lanac antitela koje se specifično vezuje za prvi ciljni molekul i samo jedan drugi vektor koji kodira laki lanac i teški lanac antitela koje se specifično vezuje za drugi ciljni molekul.

[0155] Izraz "nukleinska kiselina ili molekul nukleinske kiseline ", kako se koristi u ovom tekstu, namenjen je da obuhvati molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančani ili dvolančani, ali poželjan je dvolančani DNK molekul.

[0156] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "ćelija", "ćelijska linija" i "kultura ćelija" koriste se kao sinonimi i sve takve oznake uključuju i potomstvo. Tako, reči "transformanti" i "transformisane ćelije" uključuju primarnu ćeliju o kojoj se govori i iz nje izvedene kulture, bez obzira na broj transfera. Podrazumeva se takođe da, zbog namernih ili slučajnih mutacija, ne mora svo potomstvo biti precizno identično po sadržaju DNK. Uključene su i varijante potomstva koje imaju istu funkciju ili biološku aktivnost prema kojima je vršen skrining originalno transformisanih ćelija. Iz konteksta će biti jasno kada se koriste distinktne oznake.

[0157] Izraz "transformacija", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na proces transfera vektora/nukleinske kiseline u ćeliju-domaćina. Ako se ćelije bez bitnog ćelijskog zida koriste kao ćelije-domaćini, transfekcija se obavlja npr. metodom precipitacije kalcijum-fosfatom, kako su opisali Graham and Van der Eh, Virology. 52 (1978) 546ff. Međutim, mogu se koristiti i drugi metodi introdukovanja DNK u ćelije-domaćine kao što su injektiranje u nukleus ili fuzija protoplasta. Ako se koriste prokariotske ćelije ili ćelije koje imaju značajan ćelijski zid, jedan metod transfekcije je npr. tretman kalcijumom uz korišćenje kalcijum-hlorida, kako su opisali Cohen SN, et al, PNAS 1972, 69 (8): 2110-2114.

[0158] Rekombinantna proizvodnja antitela uz korišćenje transformacije dobro je poznata u stanju tehnike i opisana je, na primer, u preglednim člancima Makrides, S. C, Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., ProteinExpr. Purif.8 (1996) 271-282; Kaufman, RJ., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., et al., Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880 kao i u US6331415 i US4816567.

[0159] Kako se ovde koristi, "ekspresija" se odnosi na proces kojim se nukleinska kiselina transkribuje u iRNK i/ili proces kojim se transkribovana iRNK (označena i kao transkript) posle toga translatira u peptide, polipeptide ili proteine. Transkripti i kodirani polipeptidi zajedno se označavaju kao genski proizvod. Ako je polinukleotid poreklom iz genomske DNK, ekspresija u eukariotskoj ćeliji može uključivati splajsovanje iRNK.

[0160] "Vektor" je molekul nukleinske kiseline, posebno samoreplicirajući, koji prenosi insertovani molekul nukleinske kiseline u i/ili između ćelija-domaćina. Izraz obuhvata vektore čija je primarna funkcija insertovanje DNK ili RNK u ćeliju (npr., hromozomska integracija), replicirajuće vektore koji funkcionišu prvenstveno za replikaciju DNK ili RNK, i ekspresione vektore koji imaju funkciju u transkripciji i/ili translaciji DNK ili RNK. Obuhvaćeni su i vektori koji obezbeđuju više od jedne opisane funkcije.

[0161] "Ekspresioni vektor" je polinukleotid koji, kada se introdukuje u odgovarajuću ćelijudomaćina, može da se transkribuje ili translatira u polipeptid. "Ekspresioni sistem" obično se odnosi na pogodnu ćeliju-domaćina koja sadrži ekspresioni vektor, čijim funkcionisanjem se dobija željeni ekspresioni proizvod.

[0162] Antitela prema pronalasku se poželjno proizvode rekombinantno. Takvi metodi su opšte poznati u stanju tehnike i sastoje se od ekspresije proteina u prokariotskoj i eukariotskoj ćeliji, praćene izolacijom polipeptida antitela i obično prečišćavanjem do farmaceutski prihvatljive čistoće. Za ekspresiju proteina, nukleinske kiseline koje kodiraju lake i teške lance ili njihove fragmente, insertuju se u ekspresione vektore standardnim metodima. Ekspresija se obavlja u odgovarajućim prokariotskim ili eukariotskim ćelijama-domaćinima kao što su CHO ćelije, NSO ćelije, SP2/0 ćelije, HEK293 ćelije, COS ćelije, ćelije kvasca ili E.coli i antitelo se izdvaja iz ćelija (supernatanta ili ćelija posle lize). Bispecifična antitela mogu biti prisutna u celim ćelijama, u lizatu ćelija ili u delimično prečišćenoj ili suštinski čistoj formi. Prečišćavanje se obavlja da bi se eliminisale druge ćelijske komponente ili drugi kontaminanti, npr. druge ćelijske nukleinske kiseline ili proteini, standardnim tehnikama uključujući tretman baza/SDS, hromatografiju na koloni i druge dobro poznate u struci. Vidi Ausubel, F., et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

[0163] Ekspresija u NS0 ćelijama opisana je npr. kod Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; i Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. Prolazna ekspresija opisana je npr. kod Durocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. Kloniranje varijabilnih domena opisano je kod Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; i Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Poželjan sistem za prolaznu ekspresiju (HEK293) opisali

4

su Schlaeger, E.- J., i Christensen, K., u Cytotechnology 30 (1999) 71-83 i Schlaeger, E.-J., u J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

[0164] Kontrolne sekvence koje su pogodne za prokariote, na primer, uključuju promotor, opciono operatorsku sekvencu i mesto vezivanja ribozoma. Poznato je da eukariotske sekvence koriste promotore, pojačivače i poliadenilacione signale.

[0165] Antitela se pogodno izdvajaju iz kultivacionog medijuma uobičajenim postupcima prečišćavanja imunoglobulina kao što su, na primer, prečišćavanje pomoću proteina A-sefaroze, hromatografija na hidroksiapatitu, gel-elektroforeza, dijaliza, ili afinitetna hromatografija. DNK ili RNK koje kodiraju monoklonska antitela lako se izoluju i sekvenciraju korišćenjem konvencionalnih postupaka. Kao izvor takve DNK i RNK mogu da služe ćelije hibridoma. Jednom izolovana, DNK može da se insertuje u ekspresione vektore koji se zatim transfektuju u ćelije-domaćine kao što su HEK293 ćelije, CHO ćelije ili ćelije mijeloma, koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein, da bi došlo do sinteze rekombinantnih monoklonskih antitela u ćelijama-domaćinima.

[0166] Varijante aminokiselinskih sekvenci (ili mutanti) antitela pripremaju se uvođenjem pogodnih nukleotidnih promena u DNK antitela, ili sintezom nukleotida. Međutim, takve modifikacije mogu da se obave samo u veoma ograničenom opsegu, npr. kako je gore opisano. Na primer, modifikacije ne menjaju karakteristike gore pomenutog antitela kao što su IgG izotip i vezivanje za ciljni molekul, ali mogu poboljšati prinos rekombinantne proizvodnje, stabilnost proteina ili olakšati prečišćavanje.

[0167] Pronalazak obezbeđuje u jednom primeru izvođenja sekvencu izolovane ili prečišćene nukleinske kiseline koja kodira himerni antigenski receptor (CAR), pri čemu CAR sadrži fragment prepoznavanja antigena usmeren protiv BCMA, transmembranski fragment i fragment aktivacije T ćelija, okarakterisan time što je fragment prepoznavanja antigena antitelo prema pronalasku (ovde nije bispecifično antitelo). Kodirano antitelo može da bude i njegov antigenvezujući fragment kao što je navedeno. Strukture i stvaranje takvih "BCMA CAR" opisane su npr. u WO2013154760, WO2015052538, WO2015090229 i WO2015092024.

[0168] U jednom slučaju otkriće sadrži himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži:

(i) fragment koji prepoznaje antigen sazrevanja B ćelija (BCMA);

(ii) domen spejsera; i

(ii) transmembranski domen; i

(iii) intracelularni domen signalizacije T ćelija,

4

koji se odlikuje time što je fragment prepoznavanja BCMA monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za BCMA, koje se odlikuje time što sadrži CDR3H region sekvence SEQ ID NO:17 i CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju regiona CDR1H, CDR2H, CDR1L, i CDR2L odabranu iz grupe:

f) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:36 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:37, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:31, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:32.

[0169] Fragment aktivacije T ćelija može da bude bilo koji pogodan fragment koji potiče od, ili je dobijen iz bilo kog pogodnog molekula. U jednom primeru, fragment aktivacije T ćelija sadrži transmembranski domen. Transmembranski domen može da bude bilo koji transmembranski domen koji potiče od, ili je dobijen iz bilo kog molekula poznatog u struci. Na primer, transmembranski domen može da bude dobijen iz, ili da potiče od molekula CD8a ili molekula CD28. CD8 je transmembranski glikoprotein koji služi kao ko-receptor za T-ćelijski receptor (TCR), i eksprimira se prvenstveno na površini citotoksičnih T ćelija. Najčešći oblik CD8 postoji kao dimer sačinjen od CD8 alfa i CD8 beta lanca. CD28 se eksprimira na T ćelijama i obezbeđuje ko-stimulatorne signale potrebne za aktivaciju T ćelija. CD28 je receptor za CD80 (B7.1) i CD86 (B7.2). U poželjnom primeru, CD8 alfa i CD28 su humani. Pored transmembranskog domena, fragment aktivacije T ćelija dodatno sadrži intracelularni (tj., citoplazmatski) domen signalizacije T ćelija. Intracelularni domen signalizacije T ćelija može da bude dobijen iz, ili da potiče od molekula CD28, molekula CD3 zeta ili njihovih modifikovanih verzija, lanca humanog Fc receptora gama (FcRy), molekula CD27, molekula OX40, molekula

4

4-IBB, ili drugih intracelularnih signalnih molekula poznatih u struci. Kao što je razmatrano u tekstu iznad, CD28 je T-ćelijski marker značajan u ko-stimulaciji T ćelija. CD3 zeta se udružuje sa TCR da bi nastao signal i sadrži imunoreceptorske aktivacione motive na bazi tirozina (ITAM). 4-1BB, poznat i kao CD137, prenosi snažan kostimulatorni signal na T ćelije, podstičXći diferencijaciju i povećavajući dugoročno preživljavanje T limfocita. U jednom slučaju, CD28, CD3 zeta, 4-1BB, OX40 i CD27 su humani.

[0170] Otkriće obezbeđuje u jednom primeru izolovanu ili prečišćenu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni antigenski receptor (CAR) kao što je navedeno u tekstu iznad.

[0171] T-ćelijski bispecifični vezujući molekuli (TCB) imaju veoma visoku moć ubijanja ćelija zavisnu od koncetracije/okupiranja receptora na tumorskoj ćeliji (npr. EC50u testovima ubijanja ćelija in vitro je u sub- ili niskom pikomolarnom opsegu; Dreier et al. Int J Cancer 2002), T-ćelijski bispecifični vezujući molekuli (TCB) primenjuju se u mnogo nižim dozama nego konvencionalna monospecifična antitela. Na primer, blinatumomab (CD19xCD3) se daje u obliku kontinuirane intravenske doze od 5 do 15 μg/m<2>/dan (tj. samo 0.35 do 0.105 mg/m<2>/nedeljno) za lečenje akutne limfocitne leukemije, ili 60 μg/m<2>/dan za lečenje ne-Hočkinovog limfoma, a koncentracije u serumu pri ovim dozama su u opsegu od 0.5 do 4 ng/ml (Klinger et al., Blood 2012; Topp et al., J Clin Oncol 2011; Goebeler et al. Ann Oncol 2011). Zbog toga što niske doze TCB mogu kod pacijenata ispoljiti visoku efikasnost, smatra se da antitelo pronalaska može da se primeni subkutano i da je ovakva primena poželjna u kliničkom okruženju (poželjno u opsegu doza od 0.1 do 2.5, poželjno 25 mg/m<2>/nedeljno, poželjno 250 mg/m2/nedeljno). Čak i pri ovim niskim koncentracijama/dozama/okupiranju receptora, TCB može da dovede do značajnih neželjenih efekata (Klinger et al., Blood 2012). Stoga je od kritične važnosti kontrolisati okupiranost/pokrivenost tumorske ćelije. Kod pacijenata sa visokim i varijabilnim nivoima APRIL i BAFF u serumu (npr. oboleli od multiplog mijeloma, Moreaux et al. 2004; Blood 103(8): 3148-3157), broj TCB vezanih za tumorske ćelije odn. okupiranost tumorskih ćelija, može znatno zavisiti od APRIL/BAFF. Ali, pri korišćenju pomenutog antitela prema ovom pronalasku, kada je u pitanju okupiranost tumorske ćelije odnosno efikasnost/bezbednost, možda neće biti potrebno povećavati dozu antitela prema pronalasku, jer pomenuto antitelo ne može da bude pod uticajem kompeticije sa APRIL/BAFF ligandom. Druga prednost antitela prema pronalasku zasnovana je na uključivanju Fc dela koji produžava poluvreme eliminacije na oko 4 do 12 dana i nudi mogućnost primene bar jednom ili dva puta nedeljno, u poređenju sa TCB bez Fc dela (npr. blinatumomab) koje treba davati intravenski i u kontinuitetu pomoću pumpe koju pacijent nosi.

[0172] Biološka svojstva antitela prema pronalasku odnosno relevantnih anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela ispitivana su u nekoliko studija u poređenju sa 83A10-TCBcv. Mogućnost

4

indukcije T-ćelijske preusmerene citotoksičnosti npr. anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima 21-TCBcv, 22-TCBcv, 42-TCBcv u poređenju sa 83A10-TCBcv merena je na H929 MM ćelijskoj liniji (primer 8, tabela 12, slika 4). Antitela prema ovom pronalasku koja su ispitivana i analizirana pokazala su koncentraciono-zavisno ubijanje H929 ćelija odnosno, nađeno je da su vrednosti EC50 više od vrednosti EC50 određenih za 83A10-TCBcv; što ukazuje na to da su anti-BCMA antitela prema pronalasku kao TCB bila manje snažna u indukovanju ubijanja H929 MM ćelija nego Mab 83A10 kao TCB. Iznenađujuće, preokret je zapažen kada je T-ćelijska preusmerena citotoksičnost merena na RPMI-8226 MM ćelijskoj liniji, kao i na JJN-3 ćelijskoj liniji (redom, primeri 10 i 11, tabele 13, i 14 i 15, slike 6 i 7): antitela prema pronalasku kao TCB pokazala su nižu EC50 i prema tome veću potenciju nego 83A10-TCBcv. Na iznenađenje pronalazača, antitela prema pronalasku kao TCB ispoljila su nekoliko prednosti u direktnom poređenju sa 83A10 TCBcv u aspiratima koštane srži koji su sveže uzeti od pacijenata obolelih od MM (napomena: da bi se dobilo najbolje moguće poređenje, u svim aspiratima koštane srži uvek su sva T-ćelijska bispecifična (TCB) antitela ispitivana u istim koncentracijama);

● Veća sposobnost ubijanja ćelija mijeloma, tj. isti % ubijanja već na nižim koncentracijama nego kod 83A10-TCBcv, odnosno krive ubijanja ćelija zavisno od koncentracije pomerene ulevo (primer 13, tabele 18,19 i 20, slike 8, 9 i 10). Već pri koncentraciji od 1 nM antitela kao TCB prema pronalasku u aspiratima koštane srži sedam različitih pacijenata redukcija u odnosu na kontrolu propidijum jodid-negativnih vijabilnih kancerskih ćelija multiplog mijeloma bila je između 77.1 i 100%. Sa 1 nM 83A10-TCBcv u istih sedam aspirata koštane srži postignuta je redukcija od samo 37.1 do 98.3% (tabele 20 i 21).

● Veće maksimalno ubijanje ćelija u poređenju sa 83A10-TCBcv postignuto je pri najvećoj ispitivanoj koncentraciji (10 nM) u istom eksperimentu sa sedam (7) aspirata koštane srži za antitela kao TCB prema pronalasku (tabele 20 i 21).

● Neresponderi na 83A10-TCBcv mogu da se preobrate u respondere ako se koriste 22-TCBcv/42-TCBcv: U dva (2) uzorka koštane srži pacijenata kod kojih nije zapažen odgovor ubijanja ćelija na 83A10-TCBcv, iznenađujuće je nađeno da dolazi do ubijanja ćelija sa antitelima kao TCB prema pronalasku (slike 9A i 9B).

[0173] BCMAxCD3 TCB prema pronalasku vezuju se za BCMA čoveka i cinomolgus majmuna (cyno) i za BCMA miša i pacova, pogodno za toksikološko ispitivanje na cinomolgus majmunima ukoliko se molekul koji vezuje CD3 takođe vezuje za CD3 cinomolgusa ili na

4

mišu/pacovu ako se molekul koji vezuje CD3 takođe vezuje za BCMA miša/pacova. Iznenađujuće, afinitet vezivanja BCMA cinomolgusa je veoma blizak afinitetu vezivanja za BCMA čoveka. SPR je korišćen za merenje afiniteta vezivanja za BCMA čoveka i cinomolgusa (primer 2, tabela 4). Disparitet vrednosti cinomolgus/čovek (odnos afiniteta za BCMA cinomolgusa naspram humanog, KD) izračunat je iz podataka za izmereni afinitet deljenjem afiniteta za BCMA cinomolgusa sa afinitetom za humani BCMA (primer 3, tabela 5). Za 83A10 nađen je disparitet vrednosti cinomolgus/čovek od 15.3 (tj. 15.3 puta niži afinitet vezivanja za BCMA cinomolgusa nego čoveka). Na iznenađenje pronalazača, antitela prema pronalasku pokazala su disparitete vrednosti cinomolgus/čovek između 15.4 i 1.7, što je sličan, ili u većini slučajeva povoljniji, disparitet vrednosti cinomolgus/čovek nego u slučaju 83A10 (tabela 5). Budući da je molekul koji vezuje CD3 upotrebljen u BCMAxCD3 TCB prema pronalasku unakrsno reaktivan sa CD3 cinomolgus majmuna, farmakokinetička i farmakodinamička istraživanja mogu da se obave na cinomolgus majmunima (videti primer 16). I toksikološka istraživanja na cinomolgus majmunima su prediktivna za farmakološka i toksikološka dejstva kod ljudi i svojstvo unakrsne reaktivnosti sa cinomolgus majmunima predstavlja povoljnost za pacijente. BCMA antitela prema ovom pronalasku takođe se vezuju za mišji BCMA (npr. Kd klonova 22 i 42 merena pomoću SPR je 0.9 nM i 2.5 nM) videti tabelu 2D u primeru 1.1.1A.4). Molekul koji vezuje CD3 u BCMAxCD3 TCB nije unakrsno reaktivan sa mišjim CD3.

[0174] Ukratko, prednosti u vidu potencije i efikasnosti ubijanja ćelija MM ćelijskih linija sa niskom ekspresijom BCMA kao RPMI-8226 i JJN-3 i posebno ubijanja MM ćelija u aspiratima koštane srži pacijenta i pored toga vrlo povoljan disparitet vrednosti cinomolgus/čovek kod afiniteta vezivanja za BCMA, čini antitela prema ovom pronalasku i odgovarajuće TCB suštinski obećavajućim agensima za lečenje pacijenata sa MM. Pored toga, anti-BCMAxCD3 TCBcv ovog pronalaska imaju, kao 83A10-TCBcv, povoljna svojstva kao što je dugo poluvreme eliminacije, efikasnost pri primeni jednom nedeljno (intravenski, subkutano), niska ili nikakva tendencija ka agregaciji i mogućnost proizvodnje sa visokom čistoćom i dobrim prinosom.

Tabela 1A: Sekvence antitela

1

2

4

Tabela 1B: Sekvence antitela (kratka lista)

Tabela 2A: Dodatni konstrukti

Tabela 2B: Dodatni konstrukti

[0175] Da bi se napravila sledeća (2+1) anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela koja sadrže Fc, korišćeni su odgovarajući konstrukti / ID sekvence, kao što je pomenuto u tabeli 2B iznad:

83A10-TCBcv: 45, 46, 47 (x2), 48 (slika 2A)

21-TCBcv: 48, 49, 50, 51 (x2) (slika 2A)

22-TCBcv: 48, 52, 53, 54 (x2) (slika 2A)

42-TCBcv: 48, 55, 56, 57 (x2) (slika 2A)

[0176] U jednom primeru, vezivanje antitela prema pronalasku nije redukovano sa 100 ng/ml APRIL za više od 20% mereno ELISA testom kao OD na 405 nm u poređenju sa vezivanjem pomenutog antitela za humani BCMA bez APRIL, ne menja APRIL-zavisnu NF-κB aktivaciju za više od 20%, u poređenju sa APRIL, i ne menja NF-κB aktivaciju bez APRIL za više od 20%, u poređenju sa analizom bez pomenutog antitela.

[0177] U jednom primeru, vezivanje antitela u koncentraciji od 6.25 nM nije redukovano sa 140 ng/ml mišjeg APRIL za više od 10%, poželjno nije redukovano za više od 1%, mereno ELISA testom kao OD na 450 nm u poređenju sa vezivanjem pomenutog antitela za humani BCMA bez APRIL. Vezivanje pomenutog antitela u koncentraciji od 50nM nije redukovano sa 140 ng/ml mišjeg APRIL za više od 10%, mereno ELISA testom kao OD na 450 nm, u poređenju sa vezivanjem pomenutog antitela za humani BCMA bez APRIL.

[0178] U jednom primeru, vezivanje pomenutog antitela nije redukovano za 100 ng/ml APRIL i nije redukovano sa 100 ng/ml BAFF za više od 20% mereno ELISA testom kao OD na 405 nm u poređenju sa vezivanjem pomenutog antitela za humani BCMA bez APRIL ili BAFF redom, antitelo ne menja APRIL-zavisnu NF-κB aktivaciju za više od 20%, u poređenju sa samim APRIL, ne menja BAFF-zavisnu NF-κB aktivaciju za više od 20%, u poređenju sa samim BAFF, i ne menja NF-κB aktivaciju bez BAFF i APRIL za više od 20%, u poređenju sa analizom bez pomenutog antitela.

[0179] U jednom primeru, vezivanje pomenutog antitela za humani BCMA nije redukovano sa 100 ng/ml APRIL za više od 15%, mereno pomenutim ELISA testom, nije redukovano sa 1000 ng/ml APRIL, za više od 20%, mereno pomenutim ELISA testom, i nije redukovano za 1000 ng/ml APRIL za više od 15%, mereno pomenutim ELISA testom.

[0180] U jednom primeru, vezivanje pomenutog antitela za humani BCMA nije redukovano sa 100 ng/ml APRIL i nije redukovano sa 100 ng/ml BAFF za više od 15%, mereno pomenutim ELISA testom, nije redukovano sa 1000 ng/ml APRIL i nije redukovano sa 1000 ng/ml BAFF, za više od 20%, mereno pomenutim ELISA testom, nije redukovano sa 1000 ng/ml APRIL i nije redukovano sa 1000 ng/ml BAFF za više od 15%, mereno pomenutim ELISA testom.

[0181] U jednom slučaju antitelo prema pronalasku ne menja APRIL-zavisnu NF-kB aktivaciju za više od 15%, ne menja BAFF- zavisnu NF-kB aktivaciju za više od 15%, i ne menja NF-κB aktivaciju bez APRIL i BAFF za više od 15%.

[0182] U jednom primeru, vezivanje antitela za BCMA nije redukovano pomoću APRIL, nije redukovano pomoću BAFF za više od 25%, ne više od 20%, i ne više od 10%, mereno kao vezivanje pomenutog antitela u koncentraciji od 5nM, poželjno 50nM, i 140nM za NCI-H929 ćelije (ATCC® CRL-9068™) u prisustvu ili odsustvu APRIL ili respektivno BAFF u koncentraciji od 2.5µg/ml u poređenju sa vezivanjem pomenutog antitela za NCI-H929 ćelije bez APRIL ili BAFF respektivno.

[0183] Sledeći primeri, lista sekvenci i slike dati su da bi pomogli u razumevanju predmetnog pronalaska čiji je istinski okvir naveden u priloženim patentnim zahtevima.

Materijali i opšte metode

Tehnike rekombinantne DNK

[0184] Za obradu DNK korišćeni su standardni metodi opisani u Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Molekularno-biološki reagensi korišćeni su prema uputstvima proizvođDča. Opšte informacije u vezi sa nukleotidnim sekvencama lakih i teških lanaca humanih imunoglobulina date su u: Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242. Aminokiseline lanaca antitela numerisane su i označene prema Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991).

Sinteza gena

[0185]

a) Željeni genski segmenti su pripremljeni od oligonukleotida napravljenih hemijskom sintezom. 600-1800 bp dugi genski segmenti, bočno ograničeni pojedinačnim mestima sečenja restrikcionim endonukleazama, sklopljeni su hibridizacijom i ligacijom oligonukleotida, uz PCR amplifikaciju, i potom klonirani preko navedenih restrikcionih mesta npr. Kpnl/ Sad ili Ascl/Pacl u pGA4 klonirajući vektor na bazi pPCRScript (Stratagene). DNK sekvence subkloniranih genskih fragmenata potvrđene su sekvenciranjem DNK. Fragmenti iz genske sinteze su naručeni prema datim specifikacijama kod Geneart (Regensburg, Nemačka).

1

b) Željeni genski segmenti su po potrebi generisani pomoću PCR, uz korišćenje odgovarajućih matrica ili su sintetisani u Geneart AG (Regensburg, Nemačka) od sintetskih oligonukleotida i PCR proizvoda automatizovanom sintezom gena. Genski segmenti bočno ograničeni pojedinačnim mestima sečenja restrikcionim endonukleazama klonirani su u standardne ekspresione vektore ili u sekvencirajuće vektore, za dalju analizu. Plazmidna DNK je prečišćena iz transformisanih bakterija korišćenjem komercijalno dostupnih kitova za prečišćavanje plazmida. Koncentracija plazmida određena je UV spektroskopijom. DNK sekvenca subkloniranih genskih fragmenata potvrđena je DNK sekvenciranjem. Genski segmenti su dizajnirani sa pogodnim restrikcionim mestima, kako bi se omogućilo subkloniranje u odgovarajuće ekspresione vektore. Po potrebi, geni koji kodiraju proteine konstruisani su sa 5'-kraj DNK sekvencom koja kodira liderski peptid koji u eukariotskim ćelijama usmerava proteine za sekreciju.

Određivanje sekvence DNK

[0186] DNK sekvence su određene sekvenciranjem dvostrukog lanca.

Analiza sekvence DNK i proteina i obrada podataka o sekvenci

[0187] Softverski paket Clone Manager (Scientific & Educational Software) verzija 9.2 korišćen je za mapiranje sekvence, analizu, napomene i ilustraciju.

Ekspresioni vektori

[0188]

a) Fuzioni geni koji sadrže lance opisanih antitela, kako je dole opisano, generisani su pomoću PCR i/ili genske sinteze i sklopljeni poznatim rekombinantnim metodima i tehnikama, spajanjem odgovarajućih segmenata nukleinske kiseline, npr. korišćenjem jedinstvenih restrikcionih mesta u odgovarajućim vektorima. Subklonirane sekvence nukleinske kiseline proveravane su sekvenciranjem DNK. Za prolazne transfekcije, veće količine plazmida pripremane su iz kultura E. coli (Nucleobond AX, Macherey-Nagel).

b) Za generisanje ekspresionih vektora za anti-BCMA antitelo, DNK sekvence varijabilnih regiona lakog i teškog lanca subklonirane su u okviru čitanja sa konstantnim teškim lancem humanog IgG1 ili konstantnim lakim lancem hum IgG1 prethodno insertovanim u odgovarajući generički recipijentni ekspresioni vektor optimizovan za

2

ekspresiju u sisarskim ćelijskim linijama. Ekspresija antitela vođena je himernim MPSV promotorom koji sadrži CMV pojačivač i MPSV promotor praćen sa 5’ UTR, intronom i Ig kapa MAR elementom. Transkripcija se okončava sintetskom polyA signalnom sekvencom na 3’ kraju CDS. Svi vektori nose na 5’-kraju DNK sekvencu koja kodira liderski peptid koji usmerava proteine ka sekreciji iz eukariotiskih ćelija. Pored toga, svaki vektor sadrži EBV OriP sekvencu za epizomsku replikaciju plazmida u ćelijama koje eksprimiraju EBV EBNA.

c) Za generisanje vektora za BCMAxCD3 bispecifično antitelo, bispecifični molekuli izvedeni iz IgG1 sadrže najmanje dve antigen-vezujuće komponente sposobne da se specifično vežu za dve različite antigenske determinante CD3 i BCMA. Antigenvezujuće komponente su Fab fragmenti sastavljeni od teškog lanca i lakog lanca, gde svaki sadrži varijabilni i konstantni region. Najmanje jedan od Fab fragmenata je "Crossfab" fragment, gde su VH i VL razmenjeni. Razmena VH i VL unutar Fab fragmenta osigurava da Fab fragmenti različite specifičnosti nemaju identične domenske aranžmane. Dizajn bispecifičnog molekula je monovalentan za CD3 i bivalentan za BCMA kada je jedan Fab fragment fuzionisan za N-terminalni kraj unutrašnjeg CrossFab (2+1). Bispecifični molekul sadrži Fc deo, kako bi poluživot molekula bio dug. Šematski prikaz konstrukata dat je na slici 2; poželjne sekvence konstrukata prikazane su u SEQ ID NO 39 do 52. Molekuli su proizvedeni kotransfektovanjem HEK293 EBNA ćelija gajenih u suspenziji sisarskim ekspresionim vektorima, uz korišćenje rastvora na bazi polimera. Za pripremanje 2+1 CrossFab-IgG konstrukata, ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1:1 ("vektor Fc(izbočina)" : "vektor lakog lanca" : "vektor lakog lanca CrossFab" : "vektor teškog lanca-CrossFab").

Tehnike kulture ćelija

[0189] Standardne tehnike kulture ćelija korišćene su kako je opisano u Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J. S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.

Prolazna ekspresija u HEK293 ćelijama (HEK293-EBNA sistem)

[0190] Bispecifična antitela eksprimirana su prolaznom kotransfekcijom odgovarajućih sisarskih ekspresionih vektora u HEK293-EBNA ćelije gajene u suspenziji, korišćenjem rastvora na bazi polimera. Jedan dan pre transfekcije, HEK293-EBNA ćelije su zasejane u količini od 1.5 mil. vijabilnih ćelija/mL u Ex-Cell medijumu, dopunjenom 6 mM L-glutaminom. Za svaki mL zapremine finalnog proizvoda, 2.0 mil. vijabilnih ćelija je centrifugirano (5 minuta na 210 x g). Supernatant je aspiriran i ćelije su resuspendovane u 100 μL CD CHO medijuma. DNK za svaki mL zapremine finalnog proizvoda pripremljen je mešanjem 1 μg DNK (odnos teški lanac : modifikovani teški lanac : laki lanac : modifikovani laki lanac = 1:1:2:1) u 100 μL CD CHO medijuma. Posle dodavanja 0.27 μL rastvora na bazi polimera (1 mg/mL) mešavina je vorteksovana 15 sekundi i ostavljena na sobnoj temperaturi 10 minuta. Posle 10 minuta, resuspendovane ćelije i mešavina DNK/rastvor na bazi polimera su spojene i prenete u odgovarajući kontejner koji je stavljen na uređaj za mućkanje (37°C, 5% CO2). Posle 3 sata inkubacije, za svaki mL zapremine finalnog proizvoda dodato je 800 ȝL Ex-Cell medijuma, dopunjenog 6 mM L-glutaminom, 1.25 mM valproinskom kiselinom i 12.5% Pepsoy (50 g/L). Posle 24 sata, 70 μL Feed rastvora dodato je na svaki mL zapremine finalnog proizvoda. Posle 7 dana ili kada je vijabilnost ćelija bila jednaka ili niža od 70%, ćelije su odvojene od supernatanta centrifugiranjem i sterilnom filtracijom. Antitela su prečišćena korišćenjem afinitetnog koraka i jednog ili dva koraka dodatnog prečišćavanja, koji predstavljaju katjonsko-izmenjivačku hromatografiju i ekskluzionu hromatografiju zasnovanu na veličini. Po potrebi, korišćen je dodatni korak prečišćavanja. Rekombinantno anti-BCMA humano antitelo i bispecifična antitela proizvedena su u suspenziji kotransfektovanjem HEK293-EBNA ćelija sisarskim ekspresionim vektorima, uz korišćenje rastvora na bazi polimera. ûelije su transfektovane sa dva ili četiri vektora, zavisno od formata. Za humani IgG1, jedan plazmid je kodirao teški lanac, a drugi plazmid je kodirao laki lanac. Za bispecifična antitela kotransfektovana su četiri plazmida. Dva od njih kodirala su dva različita teška lanca, a druga dva su kodirala dva različita laka lanca. Jedan dan pre transfekcije HEK293-EBNA ćelije su zasejane u količini od 1.5 mil. vijabilnih ćelija/mL, u F17 medijumu, dopunjenom 6 mM L-glutaminom.

Određivanje proteina

[0191] Određivanje koncentracije antitela obavljeno je merenjem apsorbancije na 280 nm, uz korišćenje teorijske vrednosti apsorbancije 0.1% rastvora antitela. Ova vrednost bazira se na aminokiselinskoj sekvenci i izračunava pomoću GPMAW softvera (Lighthouse data).

SDS-PAGE

[0192] NuPAGE® Pre-Cast gel sistem (Invitrogen) koristi se prema uputstvima proizvođača. Konkretno, koriste se 10% ili 4-12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast gelovi (pH 6.4) i puferi za razdvajanje NuPAGE® MES (redukovani gelovi, sa NuPAGE® Antioxidant aditivom za pufer za razdvajanje) ili MOPS (neredukovani gelovi).

4

Prečišćavanje proteina

Afinitetnom hromatografijom na proteinu A

[0193] Za afinitetni korak, supernatant je nanet na protein A-kolonu (HiTrap Protein A FF, 5 mL, GE Healthcare) ekvilibrisanu sa 6 CV 20 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijum-citrata, pH 7.5. Posle koraka ispiranja istim puferom, antitelo je eluirano sa kolone korakom eluiranja sa 20 mM natrijum-fosfatom, 100 mM natrijum-hloridom, 100 mM glicinom, pH 3.0. Frakcije sa željenim antitelom su odmah neutralisane 0.5 M natrijum-fosfatom, pH 8.0 (1:10), sakupljene i koncentrovane centrifugiranjem. Koncentrat je sterilno filtriran i dalje obrađen katjonskoizmenjivačkom hromatografijom i/ili ekskluzionom hromatografijom na osnovu veličine.

Katjonsko-izmenjivačkom hromatografijom

[0194] Za korak katjonsko-izmenjivačke hromatografije, koncentrovani protein je razblažen u razmeri 1:10 puferom za eluiranje korišćenim za afinitetni korak i nanesen na katjonskoizmenjivačku kolonu (Poros 50 HS, Applied Biosystems). Posle dva koraka ispiranja ekvilibrirajućim puferom odnosno puferom za ispiranje, 20 mM natrijum-fosfat, 20 mM natrijum-citrat, 20 mM TRIS, pH 5.0 i 20 mM natrijum-fosfat, 20 mM natrijum-citrat, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum-hlorid, pH 5.0, protein je eluiran gradijentom uz korišćenje 20 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijum-citrata, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum-hlorida, pH 8.5. Frakcije sa željenim antitelom su sakupljene, koncentrovane centrifugiranjem, sterilno filtrirane i dodatno obrađene korakom ekskluzione hromatografije zasnovane na veličini.

Analitičkom ekskluzionom hromatografijom baziranom na veličini

[0195] Za korak ekskluzione hromatografije bazirane na veličini, koncentrovani protein je injektiran na XK16/60 HiLoad Superdex 200 kolonu (GE Healthcare), sa 20 mM histidinom, 140 mM natrijum-hloridom, pH 6.0 sa ili bez Tween20 kao formulacionim puferom. Frakcije koje sadrže monomere su sakupljene, koncentrovane centrifugiranjem i sterilno filtrirane u sterilnu fiolu.

Merenje čistoće i sadržaja monomera

[0196] Čistoća i sadržaj monomera finalnog proteinskog preparata određeni su CE-SDS (Caliper LabChip GXII sistemom (Caliper Life Sciences)) odnosno HPLC (TSKgel G3000 SW XL analitičkom kolonom za ekskluzionu hromatografiju baziranu na veličini (Tosoh)) u 25 mM kalijum-fosfatu, 125 mM natrijum-hloridu, 200 mM L-arginin-monohidrohloridu, 0.02% (tež./zapr.) natrijum-azidu kao puferu, pH 6.7.

Potvrđivanje molekulske težine LC-MS analizama

Deglikozilacija

[0197] Da bi se potvrdilo da su pripremljeni molekuli homogeni, finalni proteinski rastvor je analiziran LC-MS analizama. Da bi se uklonila heterogenost uvedena ugljenim hidratima, konstrukti su tretirani sa PNGaseF (ProZyme). pH proteinskog rastvora podešen je na 7.0 dodavanjem 2 μl 2 M Tris u 20 μg proteina u koncentraciji od 0.5 mg/ml. Dodato je 0.8 μg PNGaseF i inkubirano 12 h na 37 °C.

LC-MS analiza – „On-line“ detekcija

[0198] LC-MS metod je izveden na Agilent HPLC 1200 sistemu povezanom sa TOF 6441 masenim spektrometrom (Agilent). Hromatografska separacija je obavljena na polistirenskoj koloni Macherey Nagel; RP1000-8 (8 μm veličina čestica, 4.6 x 250 mm; kat. br. 719510). Eluent A bio je 5% acetonitril i 0.05% (zapr./zapr.) mravlja kiselina u vodi, eluent B bio je 95% acetonitril, 5% voda i 0.05% mravlja kiselina. Stopa protoka bila je 1 ml/min, separacija je obavljeno na 40 °C i 6 μg (15 μl) proteinskog uzorka dobijeno je tretmanom kako je ranije opisano.

[0199] Tokom prva 4 minuta eluat je usmeravan u otpad da bi se maseni spektrometar zaštitio od kontaminacije solju. ESI-izvor je pokrenut, uz protok gasa za sušenje od 121/min, temperaturu od 350 °C i pritisak raspršivača od 60 psi. MS spektri su dobijeni korišćenjem napona fragmentora od 380 V i masenog opsega 700 do 3200 m/z, uz korišćenje pozitivnog jonskog moda. MS podaci su sakupljeni softverom instrumenta, od 4. do 17. minuta.

Izolacija humanih PBMC iz krvi

[0200] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremljene su centrifugiranjem na Histopaque gustinskom gradijentu, iz preparata obogaćenih limfocitima (interfaze), dobijenih iz lokalnih banaka krvi ili iz sveže krvi zdravih humanih davalaca. Ukratko, krv je razblažena sterilnim PBS-om i pažljivo nanesena na Histopaque gradijent (Sigma, H8889). Posle 30 min centrifugiranja na 450 x g na sobnoj temperaturi (isključena kočnica), deo plazme iznad interfaze koja sadrži PBMC je odliven. PBMC su prebačeni u nove Falcon epruvete od 50 ml i epruvete su dopunjene PBS-om do ukupne zapremine od 50 ml. Mešavina je centrifugirana na sobnoj temperaturi, 10 minuta na 400 x g (uključena kočnica). Supernatant je odliven i talog sa PBMC je ispran dva puta sterilnim PBS (koraci centrifugiranja na 4 °C, 10 minuta na 350 x g). Dobijena populacija PBMC se broji automatski (ViCell) i skladišti u RPMI1640 medijumu, koji sadrži 10% FCS i 1% L-alanil-L-glutamin (Biochrom, K0302) na 37 °C, 5% CO2, u inkubatoru do početka testa.

Izolacija primarnih PBMC cinomolgusa iz heparinizovane krvi

[0201] Mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) pripremaju se centrifugiranjem na gustinskom gradijentu iz sveže krvi zdravih davalaca cinomolgusa na sledeći način: Heparinizovana krv je razblažena u razmeri 1:3 sterilnim PBS-pm, i Lymphoprep medijum (Axon Lab #1114545) je razblažen do 90% sterilnim PBS-om. Dve zapremine razblažene krvi nanesene su na jednu zapreminu razblaženog gustinskog gradijenta i PBMC frakcija je izdvojena centrifugiranjem 30 min na 520 x g, bez kočenja, na sobnoj temperaturi. Traka sa PBMC je prenesena u novu Falcon epruvetu od 50 ml i isprana sterilnim PBS-om, centrifugiranjem 10 min na 400 x g na 4 °C. Urađeno je jedno centrifugiranje na maloj brzini da bi se uklonili trombociti (15 min na 150 x g, 4 °C) i dobijena populacija PBMC je automatski izbrojana i odmah korišćena za sledeće testove.

Primeri

Primer 1: Stvaranje anti-BCMA antitela

Primer 1.1: Proizvodnja antigena i pomoćnih reagenasa

Primer 1.1.1: Rekombinanti, solubilni, vanćelijski domen humanog BCMA

[0202] Vanćelijski domeni BCMA čoveka, cinomolgusa i miša, koji se koriste kao antigeni za selekcije prikaza na fagima, prolazno su eksprimirane kao N-terminalna monomerna Fc-fuzija u HEK EBNA ćelijama i in vivo mesto-specifično biotinilisane putem koekspresije BirA biotinligaze, na sekvenci prepoznavanja avi-tag lociranoj na C-terminalnom kraju Fc dela koji nosi receptorski lanac (Fc lanac izbočine). Vanćelijski domeni humanog i cinomolgusovog BCMA sadržali su metionin 4 do asparagin 53, i metionin 4 do asparagin 52, respektivno. Oni su bili N-terminalno fuzionisani sa zglobom humanog IgG1, omogućavajući heterodimerizaciju sa nefuzionisanim Fc delom (lanac udubljenja) humanog IgG1 tehnologijom "izbočina u udubljenju".

Primer 1.1.1A: Generisanje anti-BCMA antitela sazrevanjem

1.1.1A.1 Biblioteke i selekcije

[0203] Konstruisane su dve biblioteke na bazi antitela 83A10. Ove biblioteke su nasumične bilo po CDR1 i CDR2 lakog lanca (83A10 L1/L2) ili CDR1 i CDR2 teškog lanca (83A10 H1/H2), redom. Svaka od ovih biblioteka je konstruisana u 2 uzastopna koraka amplifikacije i sklapanja. Finalni proizvodi sklapanja digestirani su pomoću NcoI / BsiWI za 83A10 L1/L2 biblioteku, pomoću MunI i NheI za 83A10 H1/H2 biblioteku, zajedno sa slično tretiranim akceptorskim vektorima na bazi plazmidnih preparata klona 83A10. Sledeće količine digestiranih nasumičnih (parcijalnih) V-domena i digestiranog/digestiranih akceptorskog/akceptorskih vektora su ligirane za odgovarajuće biblioteke (µg V-domena / µg vektora): a.m.83A10 L1/L2 biblioteka (3/10), 83A10 H1/H2 biblioteka (3/10), prečišćene ligacije 83A10 L1/L2 i 83A10 H1/H2 biblioteka su spojene, respektivno, i upotrebljene za 15 transformacija E.coli TG1 ćelija za svaku od 2 biblioteke, da bi se dobile finalne veličine biblioteka od 2.44 × 10<10>za 83A10 L1/L2 biblioteku, i 1.4 × 10<10>za a.m.83A10 H1/H2 biblioteku. Fagmidne čestice koje prikazuju ove Fab biblioteke su izdvojene i prečišćene.

1.1.1A.2 Selekcije klonova

[0204] Sprovedene su selekcije u odnosu na ektodomen antigena sazrevanja B ćelija (BCMA) čoveka ili cinomolgusa, ushodno od koga su klonirani Fc i avi-tag. Pre selekcija, ploče sa neutravidinom su obložene Fc depletorom pri koncentraciji od 500 nM. Selekcije su sprovedene prema sledećem obrascu:

1) vezivanje ׽ 10<12>fagmidnih čestica 83A10 L1/L2 biblioteke ili 83A10 H1/H2 biblioteke za imobilizovani Fc depletor tokom 1h, 2) transfer nevezanih fagmidnih čestica 83A10 L1/L2 biblioteke ili 83A10 H1/H2 biblioteke do 50nM, 25nM, 10nM, ili 2nM BCMA čoveka ili cinomolgusa (u zavisnosti od biblioteke i ciklusa selekcije) tokom 20 min, 3) dodavanje magnetnih streptavidinskih perli tokom 10 min, 4) pranje magnetnih streptavidinskih perli upotrebom 10 × 1ml PBS/Tween® 20 i 10 × 1ml PBS, 5) elucija fagnih čestica dodavanjem 1ml 100mM TEA (trietilamin) tokom 10 min i neutralizacija dodavanjem 500ul 1M Tris®/HCl pH 7.4 i 6) re-infekcija E.coli TG1 ćelija u log-fazi rasta, infekcija helper-fagom VCSM13 i zatim PEG/NaCl precipitacija fagmidnih čestica za upotrebu u narednim ciklusima selekcije.

[0205] Selekcije su sprovođene tokom 3 ciklusa i uslovi su podešeni u 5 tokova za svaku od 2 biblioteke pojedinačno. Detaljno, selekcioni parametri bili su:

Proizvodna linija 1 (50nM huBCMA za ciklus 1, 25nM cynoBCMA za ciklus 2, 10nM huBCMA za ciklus 3),

Proizvodna linija 2 (50nM huBCMA za ciklus 1, 10nM huBCMA za ciklus 2, 2nM huBCMA za ciklus 3),

Proizvodna linija 3 (50nM huBCMA za ciklus 1, 25nM huBCMA za ciklus 2, 10nM cynoBCMA za ciklus 3),

Proizvodna linija 4 (50nM huBCMA za ciklus 1, 25nM cynoBCMA za ciklus 2, 10nM cynoBCMA za ciklus 3),

Proizvodna linija 5 (50nM cynoBCMA za ciklus 1, 25nM cynoBCMA za ciklus 2, 10nM cynoBCMA za ciklus 3).

[0206] Teški lanci Mab 21, Mab 22, Mab 33, i Mab 42 BCMA antitela potiču iz proizvodne linije 5 u kojoj je upotrebljen samo cynoBCMA.

1.1.1 A.3 Postupak skrininga

[0207] Pojedinačni klonovi su eksprimirani u bakterijama kao kulture od 1 ml u formatu sa 96 bunarčLća i supernatanti su podvrgnuti skriningu pomoću ELISA testa. Specifični vezujući molekuli su definisani kao signali veći od 5 x nivoa fona za BCMA čoveka i cinomolgusa i signali niži od 3 x nivoa fona za Fc depletor. Neutravidinom obložene strip-ploče sa 96 bunarčLća obložene su sa 10nM huBCMA, 10nM cyBCMA ili 50nM Fc-depletora nakon čega su dodati bakterijski supernatanti koji sadrže Fab i detekcija Fab koji se specifično vezuju preko svojih Flag-oznaka je obavljena upotrebom anti-Flag/HRP sekundarnog antitela. Klonovi koji su bili pozitivni u ELISA testu eksprimirani su u bakterijama kao kulture od 1ml u formatu ploče sa 96 bunarčLća i supernatanti su podvrgnuti eksperimentu kinetičkog skrininga ProteOn. Identifikovano je 500 pozitivnih klonova, od kojih je većina imala sličan afinitet.

1.1.1A.4 Skrining metodom rezonancije površinskog plazmona sa rastvorljivim Fab i IgG

[0208] 70 je dalje ispitivano pomoću SPR. Svi eksperimenti su sprovedeni na 25°C upotrebom PBST kao pufera za razdvajanje (10 mM PBS, pH 7.4 i 0.005% (zapr./zapr.) Tween®20). Biosenzor ProteOn XPR36 opremljen senzorskim čipovima GLC i GLM i reagensima za kuplovanje (10 mM natrijum acetat, pH 4.5, sulfo-N-hidroksisukcinimid, 1-etil-3-(3-dimetilaminpropil)-karbodiimid hidrohlorid [EDC] i etanolamin) su nabavljeni od BioRad Inc. (Hercules, CA). Imobilizacije su sprovedene pri 30 µl/min na čipu GLM. pAb (kozje) anti hu IgG, F(ab)2 specifično Ab (Jackson) kuplovano je u vertikalnom pravcu upotrebom standardne procedure za kuplovanje amina: svih šest kanala za ligand aktivirano je tokom 5 min smešom EDC (200 mM) i sulfo-NHS (50 mM). Odmah nakon aktiviranja površina, pAb (kozje) anti hu IgG, F(ab)2 specifično antitelo (50 µg/ml, 10 mM natrijum acetat, pH 5) injektovano je kroz svih šest kanala tokom 5 min. Najzad, kanali su blokirani pomoću injekcije 1 M etanolamina-HCl (pH 8.5) tokom 5 min. Finalni imobilizacioni nivoi bili su slični na svim kanalima, u opsegu od 11000 do 11500 RU. Varijante Fab su izdvojene iz E.coli supernatanta istovremenim ubrizgavanjem duž pet odvojenih celih horizontalnih kanala (30 µl/min) tokom 5 min, što je rezultovalo nivoima u opsegu od 200 do 900 RU, u zavisnosti od koncentracije Fab u supernatantu; kondicionirani medijum ubrizgan je duž šestog kanala da bi se obezbedila procesna slepa proba u cilju upotrebe dvostrukog standarda. Jednostepena kinetička merenja sprovedena su injektovanjem serija razblaženja BCMA čoveka, cinomolgusa i miša (50, 10, 2, 0.4, 0.08, 0 nM, 50 µl/min) tokom 3 min duž vertikalnih kanala. Disocijacija je praćena 5 min. Kinetički podaci su analizirani u ProteOn Manager v. 2.1. Obrada podataka reakcionih tačaka uključuje upotrebu standarda dobijenog poređenjem između tačaka, i koraka dvostrukog standarda upotrebom procesne slepe probe za pufer (Myszka, 1999). Obrađeni podaci iz ponovljenih jednostepenih ubrizgavanja uklopljeni su u jednostavan 1:1 model vezivanja Langmuira bez prenosa mase (O'Shannessy et al., 1993).

[0209] Za merenja IgG iz supernatanta proizvodnje HEK u formatu sa 6 bunarčića, varijante IgG su izdvojene iz supernatanta HEK293 istovremenim injektovanjem duž pet odvojenih celih horizontalnih kanala (30 µl/min) tokom 5 min, što je rezultovalo nivoima u opsegu od 200 do 400 RU; kondicionirani medijum ubrizgan je duž šestog kanala da bi se obezbedila procesna slepa proba u cilju upotrebe dvostrukog standarda. Jednostepena kinetička merenja sprovedena su injektovanjem serija razblaženja BCMA čoveka, cinomolgusa i miša (25, 5, 1, 0.2, 0.04, 0 nM, 50 µl/min) tokom 3 min duž vertikalnih kanala. Disocijacija je praćena 5 min. Kinetički podaci su analizirani kao što je gore opisano. OSK merenja su sumirana u tabeli 2D; i/m, nepouzdano merenje. Nađeno je da afinitet za huBCMA iznosi između oko 50 pm i 5 nM. Nađeno je da afinitet za cynoBCMA iznosi između oko 2 nM i 20 nM (nekoliko klonova se nalazi izvan opsega, videti sliku 17).

1.1.1A5. Dodatna selekcija klonova HC i LC

[0210] Zahvaljujući svom iskustvu, pronalazači su od ovih 70 klonova odabrali sledećih 27 klonova na osnovu njihovog vezivanja za huBCMA, cynoBCMA, murineBCMA, i odnosa, mereno različitim testovima. Od ovih klonova, odabrani su klonovi 4VH i 9VL, što je rezultovalo kombinacijama 34 VH/VL. Meren je afinitet vezivanja na HEK-huBCMA ćelijama (slika 18 i tabela 2E). Nađeno je da vezivanje antitela Mab 21, Mab 22, Mab 27, Mab 39 i Mab 42 za huBCMA na HEK ćelijama nije značajno bolje od vezivanja Mab 83A10 za huBCMA-HEK ćelija. Međutim, Mab21, Mab22, Mab27, Mab33, Mab39 i Mab42 su odabrana zbog svojih ukupnih svojstava, kao što je afinitet za huBCMA, cynoBCMA, vezivanje kao bispecifično antitelo za BCMA-pozitivne ćelijske linije H929, L363 i RPMI-8226 multiplog mijeloma pomoću protočne citometrije, potencijala za ubijanje ćelija mijeloma H929, L363 i RPMI-8226, vijabilnih mijelomskih plazmocita iz aspirata koštane srži pacijenta, i farmakokinetičkih (PK)) i farmakodinamičkih (ubijanje BCMA pozitivnih ćelija) podataka dobijenih na cinomolgus majmunima.

Tabela 2C: Odnos antitela prema tokovima

Tabela 2D: Jednostepena kinetička merenja afiniteta za BCMA čoveka, cinomolgusa i miša

1

Tabela 2E: Vezivanje IgG varijanti na HEK-huBCMA ćelijama

Primer 1.2: Ćelije koje eksprimiraju BCMA kao alati

Primer 1.2.1: Ćelijske linije humanog mijeloma čije ćelije na svojoj površini eksprimiraju BCMA i kvantifikacija broja receptora BCMA na ćelijskoj površini

[0211] Ekspresija BCMA procenjena je na pet ćelijskih linija humanog mijeloma (NCI-H929, RPMI-8226, U266B1, L-363 i JJN-3), korišćenjem protočne citometrije. NCI-H929 ćelije ((H929) ATCC® CRL-9068™) su kultivisane u 80-90% RPMI 1640, sa 10-20% toplotom inaktiviranim FCS, i koji može sadržati 2 mM L-glutamin, 1 mM natrijum-piruvat i 50 mM

2

merkaptoetanol. RPMI-8226 ćelije ((RPMI) ATCC® CCL-155™) su kultivisane u medijumu koji sadrži 90% RPMI 1640 i 10% toplotom inaktivirani FCS. U266B1 ((U266) ATCC® TIB-196™) ćelije su kultivisane u RPMI-1640 medijumu modifikovanom da sadrži 2 mM L-glutamin, 10 mM HEPES, 1 mM natrijum-piruvat, 4500 mg/L glukoze i 1500 mg/L natrijumbikarbonata, i 15% toplotom inaktivirani FCS. L-363 ćelijska linija (Leibniz Institute DSMZ -Nemačka kolekcija mikroorganizama i ćelijskih kultura; DSMZ No. ACC 49) su kultivisane u 85% RPMI 1640 i 15% toplotom inaktiviranom FCS. JJN-3 ćelijska linija (DSMZ No. ACC 541) je kultivisana u medijumu 40% Dulbecco-ov MEM 40% Iscove-ov MDM 20% toplotom inaktivirani FBS. Ukratko, ćelije su sakupljene, oprane, brojanjem je određena vijabilnost, resuspendovane do 50000 ćelija/bunarčLću na pločama sa 96-bunarčića sa okruglim dnom i inkubirane sa antihumanim BCMA-antitelom (Abcam, #ab54834, mišji IgG1) pri 10 μg/ml, 30 min na 4°C (da se spreči internalizacija). Mišji IgG1 je korišćen kao izotipska kontrola (BD Biosciences, #554121). Ćelije su zatim centrifugirane (5 min na 350 x g), oprane dva puta i inkubirane sa FITC-konjugovanim antimišjim sekundarnim antitelom, 30 min na 4°C. Na kraju perioda inkubacije, ćelije su centrifugirane (5 min na 350 x g), oprane dva puta sa FACS puferom, resuspendovane u 100 μl FACS pufera i analizirane na CantoII uređaju sa FACS Diva softverom. Relativna kvantifikacija broja BCMA receptora na površini membrane H929, RPMI-8226 i U266B1 ćelijskih linija mijeloma procenjena je QIFIKIT analizom (Dako, #K0078, prema uputstvima proizvođača). H929 ćelije su eksprimirale humani BCMA sa najvećom gustinom koja je do 5-6 puta veća nego kod drugih ćelijskih linija mijeloma. H929 se smatra ćelijskom linijom koja u visokoj meri eksprimira BCMA u poređenju sa U266 i L363, koje predstavljaju ćelije mijeloma sa srednjom/niskom ekspresijom BCMA, RPMI-8226 koje predstavljaju ćelije mijeloma sa niskom ekspresijom BCMA i JJN-3 koje predstavljaju ćelije mijeloma sa veoma niskom ekspresijom BCMA. Tabela 3 zbirno prikazuje relativan broj BCMA receptora na površini ćelija ćelijskih linija humanog multiplog mijeloma za svaki eksperiment (n=5).

Tabela 3: Kvantifikacija broja BCMA receptora na površini membrane H929, L363, RPMI-8226, U266B1 i JJN-3 humanih ćelijskih linija mijeloma

Primer 2: Testovi vezivanja BCMA: rezonancija površinskog plazmona

[0212] Procena vezivanja anti-BCMA antitela za rekombinantni BCMA rezonancijom površinskog plazmona (SPR) urađena je na sledeći način. Svi SPR eksperimenti sprovedeni su na Biacore T200, na 25 °C sa HBS-EP kao puferom za razdvajanje (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% surfaktant P20, Biacore, Freiburg/Nemačka). Određen je aviditet interakcije između anti-BCMA antitela i rekombinantnog BCMA Fc(kih) (čoveka i cinomolgusa). Biotinilisani rekombinantni BCMA Fc(kih) čoveka i cinomolgusa direktno su kuplovani na SA čip prema uputstvima (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije bio je od 200 do 700 RU. Anti-BCMA antitela propuštana su u dvostrukom rasponu koncentracija (1.95 do 500 nM) uz protok od 30 μL/minutu kroz ćelijski tok, u trajanju od 120 sekundi. Disocijacija je praćena 180 sekundi. Velike razlike refraktornog indeksa korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnom toku ćelija. Ovde su anti-BCMA antitela propuštana preko prazne površine prethodno aktivirane i deaktivirane kako je opisano u kitu za standardno kuplovanje amina. Prividne kinetičke konstante izvedene su korišćenjem softvera za procenu Biacore T200 (vAA, Biacore AB, Uppsala/Švedska), da bi se jednačine za stopu 1:1 Langmuirovog vezivanja podesile numeričkom integracijom, uprkos bivalenciji interakcije, u svrhu poređenja. Određivan je i afinitet interakcije između anti-BCMA antitela i rekombinantnog humanog BCMA Fc(kih). Antihumano Fab antitelo (GE Healthcare) direktno je kuplovano na CM5 čip pri pH 5.0 uz korišćenje kita za standardno kuplovanje amina (Biacore, Freiburg/Nemačka). Nivo imobilizacije bio je oko 6500 RU. Anti-BCMA antitelo zadržavano je tokom 90 sekundi, pri 25 nM. Rekombinantni humani BCMA Fc(kih) propuštan je pri opsegu 4-strukih koncentracija (1.95 do 500 nM), uz protok od 30 μL/minutu, kroz tok ćelija, tokom 120 sekundi. Disocijacija je praćena 120 sekundi. Velike razlike refraktornog indeksa korigovane su oduzimanjem odgovora dobijenog na referentnom toku ćelija. Ovde je rekombinantni BCMA tekao preko površine sa imobilisanim antihumanim Fab antitelom, ali na koju je HBS-EP injektiran umesto anti-BCMA antitela. Kinetičke konstante izvedene su korišćenjem softvera za procenu Biacore T100 (vAA, Biacore AB, Uppsala/Švedska, da bi se jednačine za stopu 1:1 Langmuirovog vezivanja podesile numeričkom integracijom (Tabela 4).

4

Tabela 4. Konstante afiniteta određene podešavanjem jednačina za stopu 1:1 Langmuirovog vezivanja

Primer 3: Disparitet afiniteta čovek/cinomolgus (hu/cyno)

[0213] Na osnovu vrednosti afiniteta opisanih u primeru 2, upoređeni su afinitet anti-BCMA antitela za humani BCMA i BCMA cinomolgusa i izračunate su vrednosti odnosa afiniteta (disparitet) cyno/hu (tabela 5). Disparitet afiniteta cyno/hu izračunat je kao afinitet antitela prema BCMA cinomolgusa podeljen afinitetom prema BCMA čoveka i znači da se antitelo protiv BCMA vezuje za BCMA čoveka sa afinitetom vezivanja x puta u odnosu na BCMA cinomolgusa, pri čemu x= vrednost dispariteta cyno/hu. Rezultati su prikazani u tabeli 5.

Tabela 5: Afinitet anti-BCMA antitela prema BCMA čoveka naspram BCMA cinomolgusa i vrednosti dispariteta hu/cyno

Primer 4: Generisanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela

[0214] Anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijska bispecifična antitela generisana su prema WO2014/122144.

Primer 4.1: Anti-CD3 antitela

[0215] Izraz "CD3ε ili CD3", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na humani CD3ε opisan pod UniProt P07766 (CD3EHUMAN). Izraz "antitelo protiv CD3, anti CD3 antitelo" odnosi se na antitelo koje se vezuje za CD3ε. Poželjno antitelo sadrži varijabilni domen VH koji uključuje CDR regione teškog lanca SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao, redom, CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca, i varijabilni domen VL koji uključuje CDR regione lakog lanca SEQ ID NO: 4, 5 i 6 kao, redom, CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca. Poželjno, antitelo sadrži varijabilne domene SEQ ID NO:7 (VH) i SEQ ID NO:8 (VL). Anti-CD3 antitelo kao što je gore opisano koristi se za generisanje T-ćelijskih bispecifičnih antitela koja se koriste u sledećim primerima.

Primer 4.2: Generisanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela formata 2+1 koja sadrže Fc

[0216] cDNK koje kodiraju cele teške i lake lance odgovarajućih anti-BCMA IgG1 antitela, kao i anti-CD3 VH i VL cDNK, upotrebljeni su kao polazni materijali. Za svako bispecifično antitelo, uključena su četiri proteinska lanca koja sadrže teške i lake lance odgovarajućeg anti-BCMA antitela, odnosno teške i lake lance anti-CD3 antitela opisanog gore u tekstu. Da bi se svelo na najmanju meru formiranje sporednih proizvoda sa pogrešno sparenim teškim lancima, na primer sporednih proizvoda sa dva teška lanca anti-CD3 antitela, koriste se mutirani heterodimerni Fc regioni koji nose mutacije "ispupčenja u udubljenjima" i konstruisanu disulfidnu vezu, kako je opisano u WO2009080251 i u WO2009080252. Da bi se minimiziralo formiranje sporednih proizvoda sa pogrešno sparenim lakim lancima, na primer sporednih proizvoda sa dva laka lanca anti-BCMA antitela, kod teških i lakih lanaca anti-CD3 antitela primenjuje se unakrsna razmena CH1 x konstantni kapa, uz korišćenje metodologije opisane u WO2009080251 i u WO2009080252.

a) Anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijsko bispecifično antitelo sa formatom 2+1 tj. bispecifično (Fab)2x (Fab) antitelo koje je bivalentno za BCMA i monovalentno za CD3 imalo bi prednosti u jačini, predvidljivoj efikasnosti i bezbednosti, jer bi se prvenstveno vezivalo za tumorski ciljni molekul BCMA uz izbegavanje "odlivanja" antitela na CD3, čime se povećava verovatnoća da će izlaganje leku biti usmereno na tumor.

[0217] Proizvedeno je anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijsko bispecifično antitelo formata 2+1, tj. bispecifično (Fab)2 x (Fab) antitelo bivalentno za BCMA i monovalentno za CD3, sa Fc, za prethodno odabrana humana BCMA antitela. cDNK koje kodiraju cele Fab (VH i CH1 domene teškog lanca plus VL i CL domene lakog lanca) odgovarajućih anti-BCMA IgG1 antitela, kao i anti-CD3 VH i VL cDNK, korišćene su kao polazni materijali. Za svako bispecifično antitelo, uključena su četiri proteinska lanca koja sadrže teške i lake lance odgovarajućeg anti-BCMA antitela i teške i lake lance anti-CD3 antitela opisanih gore, respektivno, sa Fc regionima.

[0218] Ukratko, svako bispecifično antitelo proizvodi se simultanom kotransfekcijom četiri sisarska ekspresiona vektora koji kodiraju, redom a) cDNK celog lakog lanca odgovarajućeg antitela protiv BCMA, b) fuzionu cDNK generisanu standardnim molekularno-biološkim metodima, kao što je PCR na bazi splajsovanja preklapanjem ekstenzije, koja kodira fuzioni protein sačinjen od (redom od N- do C-terminalnog kraja) sekretorne liderske sekvence, Fab (VH praćen CH1 domenima) odgovarajućeg anti-BCMA antitela opisanog gore, fleksibilnog glicin(Gly)-serin(Ser) linkera sa sekvencom Gly-Gly- Gly-Gly-Ser-Gly-Gly- Gly- Gly-Ser, Fab (VH domen praćen CH1 domenima) odgovarajućeg anti-BCMA antitela opisanog gore, fleksibilnog glicin(Gly)-serin(Ser) linkera sa sekvencom Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser, VH anti-CD3 antitela opisanog gore i konstantnog kapa domena humanog lakog lanca cDNK, c) fuzionu cDNK generisanu standardnim molekularno-biološkim metodima, kao što je PCR na bazi splajsovanja preklapanjem ekstenzije, koja kodira fuzioni protein sačinjen od (redom od N- do C-terminalnog kraja) sekretorne liderske sekvence, VL anti-CD3 antitela opisanog gore, konstantnog CH1 domena humanog IgG1 cDNK. Ko-transfekcija sisarskih ćelija i proizvodnja i prečišćavanje antitela upotrebom gore opisanih metoda proizvodnje humanih ili humanizovanih IgG1 antitela urađena je sa jednom modifikacijom: za prečišćavanje antitela, prvi korak zadržavanja ne obavlja se korišćenjem proteina A, nego korišćenjem kolone za afinitetnu hromatografiju pakovane smolom koja se vezuje za humani kapa konstantni region lakog lanca, npr. KappaSelect (GE Healthcare Life Sciences). Pored toga, može se uključiti disulfid za povećanje stabilnosti i prinosa, kao i dodatne rezidue koje formiraju jonske mostove i pojačavaju heterodimerizacioni prinos (EP 1870459A1).

[0219] Za generisanje vektora za BCMAxCD3 bispecifično antitelo, bispecifični molekuli poreklom iz IgG1 sastoje se od najmanje dva antigen-vezujuća fragmenta koji mogu da se specifično vezuju za dve različite antigenske determinante, CD3 i BCMA. Antigen-vezujući fragmenti su Fab fragmenti sastavljeni od teškog lanca i lakog lanca, gde svaki sadrži varijabilni i konstantni region. Najmanje jedan od Fab fragmenata je "Crossfab" fragment pri čemu su konstantni domeni teškog i lakog lanca Fab razmenjeni. Razmena konstantnih domena teškog i lakog lanca unutar Fab fragmenta osigurava da Fab fragmenti različite specifičnosti nemaju identične domenske aranžmane i prema tome ne razmenjuju lake lance. Dizajn bispecifičnog molekula bio je monovalentan za CD3 i bivalentan za BCMA, gde je jedan Fab fragment fuzionisan sa N-terminalnim krajem unutrašnjeg CrossFab (2+1). Bispecifični molekul sadržao je Fc deo da bi imao duži poluživot. Šematski prikaz konstrukata dat je na slikama 1-3; sekvence poželjnih konstrukata prikazane su u tabeli 2A. Molekuli su proizvedeni kotransfektovanjem HEK293 EBNA ćelija gajenih u suspenziji, sisarskim ekspresionim vektorima uz korišćenje rastvora na bazi polimera. Za pripremanje 2+1 CrossFab-IgG konstrukata, ćelije su transfektovane odgovarajućim ekspresionim vektorima u odnosu 1:2:1:1 ("vektor Fc(izbočina)" : "vektor laki lanac" : "vektor laki lanac CrossFab" : "vektor teški lanac-CrossFab").

Primer 4.3: Generisanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za komparaciju

[0220] Generisanje BCMA50-sc(Fv)2(poznatog i kao BCMA50-BiTE®) anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela i upotrebljene aminokiselinske sekvence bile su u skladu sa WO2013072406 i WO2013072415.

Primer 5: Proizvodnja i prečišćavanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela (2+1) koja sadrže Fc sa varijantama naelektrisanja

[0221] Anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijska bispecifična antitela proizvedena su i prečišćena prema WO2014/12214.

[0222] Za proizvodnju bispecifičnih antitela, bispecifična antitela se eksprimiraju prolaznom kotransfekcijom odgovarajućih sisarskih ekspresionih vektora u HEK293-EBNA ćelije koje su kultivisane u suspenziji, korišćenjem rastvora na bazi polimera. Jedan dan pre transfekcije, HEK293-EBNA ćelije su zasejane u količini od 1.5 mil. vijabilnih ćelija/mL u Ex-Cell medijumu dopunjenom 6 mM L-glutaminom. Za svaki mL zapremine finalnog proizvoda centrifugirana je zapremina od 2.0 mil. vijabilnih ćelija (5 minuta na 210 x g). Supernatant je aspiriran i ćelije su resuspendovane u 100 μL CD CHO medijuma. DNK je, za svaki mL finalne proizvodne zapremine, pripremljena mešanjem 1 ȝg DNK (odnos teški lanac:modifikovan teški lanac:laki lanac:modifikovani laki lanac = 1:1:2:1) u 100 μL CD CHO medijuma. Posle dodavanja 0.27 μL rastvora na bazi polimera (1 mg/mL) mešavina je vorteksovana 15 sekundi i ostavi na sobnoj temperaturi 10 minuta. Posle 10 minuta, resuspendovane ćelije i mešavina DNK/rastvor na bazi polimera su spojene i zatim prenesene u odgovarajući kontejner koji se stavlja na uređaj za mućkanje (37°C, 5% CO2). Posle 3 sata inkubacije 800 μL Ex-Cell medijuma, dopunjenog sa 6 mM L-glutaminom, 1.25 mM valproinskom kiselinom i 12.5% Pepsoy (50 g/L), dodato je za svaki mL finalne proizvodne zapremine. Posle 24 sata, na svaki mL finalne proizvodne zapremine dodato je 70 μL Feed rastvora. Posle 7 dana ili kada je vijabilnost ćelija bila jednaka ili niža od 70%, ćelije su odvojene od supernatanta centrifugiranjem i sterilnom filtracijom. Antitela su prečišćena afinitetnim korakom i jednim ili dva koraka dodatnog prečišćavanja, koji predstavljaju katjonsko-izmenjivačku hromatografiju i ekskluzionu hromatografiju zasnovanu na veličini. Po potrebi, korišćen je dodatni korak naknadnog prečišćavanja.

[0223] Za afinitetni korak supernatant je nanesen na kolonu sa proteinom A (HiTrap Protein A FF, 5 mL, GE Healthcare) ekvilibrisanu sa 6 CV 20 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijumcitrata, pH 7.5. Posle koraka ispiranja istim puferom, antitelo je eluirano sa kolone korakom eluiranja sa 20 mM natrijum-fosfatom, 100 mM natrijum-hloridom, 100 mM glicinom, pH 3.0. Frakcije sa željenim antitelom su odmah neutralisane 0.5 M natrijum-fosfatom, pH 8.0 (1:10), sakupljene i koncentrovane centrifugiranjem. Koncentrat je sterilno filtriran i dalje obrađen katjonsko-izmenjivačkom hromatografijom i/ili ekskluzionom hromatografijom zasnovanom na veličini.

[0224] Za korak katjonsko-izmenjivačke hromatografije, koncentrovani protein je razblažen u odnosu 1:10 puferom za eluiranje korišćenim za afinitetni korak i nanesen na katjonskoizmenjivačku kolonu (Poros 50 HS, Applied Biosystems). Posle dva koraka ispiranja puferom za ekvilibraciju i puferom za ispiranje, redom, 20 mM natrijum-fosfat, 20 mM natrijum-citrat, 20 mM TRIS, pH 5.0 i 20 mM natrijum-fosfat, 20 mM natrijum-citrat, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum-hlorid pH 5.0, protein je eluiran gradijentom uz korišćenje 20 mM natrijum-fosfata, 20 mM natrijum-citrata, 20 mM TRIS, 100 mM natrijum-hlorida, pH 8.5. Frakcije sa željenim antitelom su sakupljene, koncentrovane centrifugiranjem, sterilno filtrirane i dalje obrađene korakom ekskluzione hromatografije zasnovane na veličini.

[0225] Za korak ekskluzione hromatografije zasnovane na veličini, koncentrovani protein je injektovan na XK16/60 HiLoad Superdex 200 kolonu (GE Healthcare), uz 20 mM histidin, 140 mM natrijum-hlorid, pH 6.0 sa ili bez Tween20 kao pufer za formulaciju. Frakcije koje sadrže monomere su sakupljene, koncentrovane centrifugiranjem i sterilno filtrirane u sterilnu fiolu.

[0226] Određivanje koncentracije antitela obavljeno je merenjem apsorbancije na 280 nm, korišćenjem teorijske vrednosti apsorbancije 0.1% rastvora antitela. Ova vrednost bazirana je na aminokiselinskoj sekvenci i izračunata pomoću GPMAW softvera (Lighthouse data).

[0227] Čistoća i sadržaj monomera finalnog proteinskog preparata određeni su CE-SDS (Caliper LabChip GXII sistemom (Caliper Life Sciences)) odnosno HPLC (TSKgel G3000 SW XL analitičkom kolonom za ekskluzionu hromatografiju (Tosoh)) u puferu sa 25 mM kalijumfosfata, 125 mM natrijum-hlorida, 200 mM L-arginin-monohidrohlorida, 0.02% (tež./zapr.) natrijum-azida, pH 6.7.

[0228] Za potvrdu molekulske težine finalnih proteinskih preparata i potvrdu homogenosti pripreme molekula finalnog proteinskog rastvora, upotrebljen je metod tečne hromatografijemasene spektrometrije (LC-MS). Prvo je izvršen korak deglikozilacije. Da bi se uklonila heterogenost uvedena ugljenim hidratima, konstrukti su tretirani sa PNGaseF (ProZyme). Dakle, pH proteinskog rastvora podešen je na pH 7.0 dodavanjem 2 μl 2 M Tris u 20 ȝg proteina sa koncentracijom od 0.5 mg/ml. Dodato je 0.8 μg PNGaseF i inkubirano 12 h na 37 °C. Zatim je urađena LC-MS „on-line“ detekcija. LC-MS metod je izveden na Agilent HPLC 1200 sistemu povezanom sa TOF 6441 masenim spektrometrom (Agilent). Hromatografska separacija je obavljena na Macherey Nagel polistirenskoj koloni; RP1000-8 (8 μm veličina čestica, 4.6 x 250 mm; kat. br. 719510). Eluent A bio je 5% acetonitril i 0.05% (zapr./zapr.) mravlja kiselina u vodi, eluent B bio je 95% acetonitril, 5% voda i 0.05% mravlja kiselina. Stopa protoka bila je 1 ml/min, separacija je obavljena na 40 °C i 6 μg (15 μl) proteinskog uzorka, dobijenog tretmanom kako je ranije opisano.

[0229] Tokom prva 4 minuta eluat je usmeren u otpad da bi se maseni spektrometar zaštitio od kontaminacije solju. ESI-izvor je pokrenut, uz protok gasa za sušenje od 121/min, temperaturu od 350 °C i pritisak raspršivača od 60 psi. MS spektri su dobijeni korišćenjem napona fragmentora od 380 V i masenog opsega 700 do 3200 m/z uz korišćenje pozitivnog jonskog moda. MS podaci su dobijeni pomoću softvera instrumenta, od 4. do 17. minuta.

[0230] Slika 10 u EP14179705 prikazuje CE-SDS (neredukujući uslovi) grafikone finalnih proteinskih preparata posle različitih metoda prečišćavanja, za 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela.

Koraci prečišćavanja protein A (PA)-afinitetnom hromatografijom i hromatografijom baziranom na veličini (SEC), primenjeni na 83A10-TCB antitelo rezultovali su čistoćom od <30% i sadržajem monomera 82.8% (A). Kada su na finalne proteinske preparate u (A) primenjeni dodatni koraci prečišćavanja, uključujući katjonsko-izmenjivačku hromatografiju (cIEX) i finalnu ekskluzionu hromatografiju zasnovanu na veličini (re-SEC), čistoća se povećala na 93.4%, ali sadržaj monomera je ostao isti i prinos se značajno smanjio na 0.42 mg/L. Međutim kada su primenjene specifične modifikacije naelektrisanja kod 83A10 anti-BCMA Fab CL-CH1, tj. 83A10-TCBcv antitela, zapažen je superiorni profil proizvodnje/prečišćavanja TCB molekula, što se manifestuje čistoćom od 95.3%, sadržajem monomera od 100% i prinosom do 3.3 mg/L, čak i kada se primenjuju PA cIEX SEC koraci prečišćavanja (C), u poređenju sa (B) sa profilom proizvodnje/prečišćavanja koji pokazuje 7.9 puta niži prinos i 17.2% niži sadržaj monomera uprkos tome što se uključuje dodatni korak prečišćavanja re-SEC.

[0231] Nakon toga, urađena je uporedna proizvodnja za direktno poređenje profila proizvodnje/prečišćavanja 83A10-TCB naspram 83A10-TCBcv antitela kako bi se dodatno procenile prednosti CL-CH1 modifikacija naelektrisanja primenjenih na antitela. 83A10-TCB i 83A10-TCBcv molekuli su, oba, u molekularnom formatu opisanom na slici 2a. Kako je prikazano na slici 11, osobine 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela merene su paralelno i upoređivane posle svakog koraka prečišćavanja 1) samo PA afinitetna hromatografija (A, B), 2) PA afinitetna hromatografija, zatim SEC (C, D) i 3) PA afinitetna hromatografija, zatim SEC, zatim cIEX i re-SEC (E, F). CE-SDS (neredukujući uslovi) grafikoni finalnih proteinskih rastvora posle odgovarajućih metoda prečišćavanja za 83A10-TCB i 83A10-TCBcv antitela pokazani su na slici 11 u EP14179705. Kao što je pokazano na slikama 11A i 11B u EP14179705, poboljšanja sa primenom varijanti naelektrisanja kod TCB antitela zapažena su već posle prečišćavanja samo PA afinitetnom hromatografijom. U ovoj uporednoj studiji, korak prečišćavanja PA afinitetnom hromatografijom primenjen na 83A10-TCB antitelo za rezultat je imao čistoću od 61.3%, prinos od 26.2 mg/L i sadržaj monomera 63.7% (11A). U poređenju sa tim, kada je 83A10-TCBcv antitelo prečišćavano PA afinitetnom hromatografijom sve osobine su poboljšane, uz bolju čistoću od 81.0%, bolji prinos od 51.5 mg/L i sadržaj monomera 68.2% (11B). Kada se primeni dodatni korak prečišćavanja SEC na finalne proteinske preparate, kako se vidi na slikama 12A i 12B u EP14179705, 83A10-TCB dostiže čistoću od 69.5%, prinos 14.1 mg/L i sadržaj monomera 74.7% (C) u poređenju sa 83A10-TCBcv sa poboljšanom čistoćom i sadržajem monomera od sve do 91.0%, odnosno 83.9% i prinosom od 10.3 mg/L (D). ýak i uz malo manji prinos (tj. 27% manji) za 83A10-TCBcv nego za 83A10-TCB u ovom konkretnom eksperimentu, procenat ispravnih molekula bio je mnogo bolji za 83A10-TCBcv nego za 83A10-TCB, redom 90% naspram 40-60%, mereno pomoću LC-MS. U trećem direktnom poređenju, 83A10-TCB i 83A10-TCBcv finalni proteinski preparati sa slika 11C i 11D u EP14179705 su spojeni sa približno 1 L (ekvivolumen) respektivnih finalnih proteinskih preparata iz druge serije prečišćavanja (ista proizvodnja) posle koraka samo PA afinitetne hormatografije. Spojeni proteinski preparati su zatim dodatno prečišćeni pomoću cIEX i SEC metoda prečišćavanja. Kao

1

što je pokazano na slikama 11E i 11F u EP14179705, poboljšanje profila proizvodnje/prečišćavanja TCB antitela sa varijantama naelektrisanja zapaženo je konzistentno, u poređenju sa TCB antitelom bez varijante naelektrisanja. Posle nekoliko koraka metoda prečišćavanja (tj. PA /- SEC cIEX SEC) upotrebljenih za prečišćavanje 83A10-TCB antitela, postignuta je čistoća od samo 43.1%, i moga je da bude dostignut sadržaj monomera od 98.3%, ali uz smanjeni prinos koji je iznosio 0.43 mg/L. Procenat ispravnih molekula izmeren pomoću LC-MS i dalje je bio mali, 60-70%. Na kraju, kvalitet finalnog proteinskog preparata nije bio prihvatljiv za in vitro upotrebu. U oštroj suprotnosti sa tim, kada su isti višestruki koraci prečišćavanja, sa istom hronologijom, primenjeni na 83A10-TCBcv antitelo, dostignuta je čistoća od 96.2% i sadržaj monomera 98.9%, kao i 95% ispravnih molekula, mereno putem LC-MS. Prinos je međutim takođe veoma redukovan, na 0.64 mg/L posle cIEX koraka prečišćavanja. Rezultati pokazuju da bolja čistoća, veći sadržaj monomera, veći procenat ispravnih molekula i bolji prinos mogu da se postignu sa 83A10-TCBcv antitelom posle samo dva standardna koraka prečišćavanja tj. PA afinitetne hromatografije i SEC (slika 11D u EP14179705), dok takve osobine nisu mogle da se dostignu sa 83A10-TCB, čak ni kada su primenjeni dodatni koraci prečišćavanja (slika 11E u EP14179705).

[0232] Tabela 12 u EP14179705 sumira osobine 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv posle PA koraka prečišćavanja. Tabela 13 u EP14179705 sumira osobine 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv posle PA i SEC koraka prečišćavanja. Tabela 14 u EP14179705 sumira osobine 83A10-TCB u poređenju sa 83A10-TCVcv posle PA i SEC plus samo PA, zatim cIEX i re-SEC koraka prečišćavanja. Za tabele 12 do 14 u EP14179705, podebljane vrednosti naglašavaju superiorna svojstva pri poređenju 83A10-TCB naspram 83A10-TCVcv. Sa jednim izuzetkom (tj. respektivne vrednosti prinosa, videti tabelu 13 u EP14179705) koji ne mora biti reprezentativan, svi parametri i vrednosti proizvodnje/prečišćavanja koji su rezultat 3 eksperimenta direktnog poređenja bili su superiorni za 83A10-TCBcv u odnosu na 83A10-TCB. Ukupni rezultati jasno pokazuju da prednosti u osobinama proizvodnje/prečišćavanja mogu da se postignu ako se CL-CH1 modifikacije naelektrisanja primene na TCB antitela i da su samo dva koraka prečišćavanja (tj PA afinitetna hromatografija i SEC) bila potrebna za dobijanje visokokvalitetnih proteinskih preparata sa veoma dobrim osobinama koje omogućavaju dalji razvoj. Na osnovu poboljšanih svojstava proizvodnje/prečišćavanja 83A10-TCBcv, 21-TCBcv, 22-TCBcv, 27-TCBcv, 33-TCBcv, 39-TCBcv i 42-TCBcv su stvoreni sa varijantama naelektrisanja, na sličan način kao 83A10-TCBcv.

Tabela 6: Profil proizvodnje/prečišćavanja anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela posle koraka prečišćavanja protein A-afinitetnom hromatografijom

2

Tabela 7: Profil proizvodnje/prečišćavanja anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela posle koraka prečišćavanja protein A-afinitetnom hromatografijom i ekskluzionom hromatografijom zasnovanom na veličini

Tabela 8: Profil proizvodnje/prečišćavanja anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela posle koraka prečišćavanja 1.a) protein A-afinitetnom hromatografijom i ekskluzionom hromatografijom zasnovanom na veličini i 1.b) samo protein A-afinitetnom hromatografijom, spojeno, zatim 2) katjonsko-izmenjivačkom hromatografijom i 3) finalnom ekskluzionom hromatografijom zasnovanom na veličini

Primer 6: Vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za BCMA-pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma (protočna citometrija)

[0233] Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (21-TCBcv, 22-TCBcv, 42-TCBcv, 83A10-TCBcv) analizirana su protočnom citometrijom u pogledu vezivanja za humani BCMA na BCMA-eksprimirajućim H929, L363 i RPMI-8226 ćelijama. MKN45 (ćelijska linija humanog želudačnog adenokarcinoma koja ne eksprimira BCMA) korišćena je kao negativna kontrola. Ukratko, kultivisane ćelije su sakupljene, izbrojane i ćelijska vijabilnost je procenjena uz korišćenje ViCell. Broj vijabilnih ćelija je podešen na 2 x 10<6>ćelija po ml u FACS puferu za bojenje (BD Biosciences) koji sadrži BSA. 100 μl ove ćelijske suspenzije po bunarčiću alikvotirano je na ploči sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i inkubirano sa 30 μl anti-BCMA antitela ili odgovarajućeg kontrolnog IgG, 30 min na 4 °C. Sva anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (i TCB kontrole) titrirane su i analizirane u finalnoj koncentraciji u opsegu od 1-300 nM. Ćelije su zatim centrifugirane (5 min, 350 x g), oprane sa 120 μl/bunarčiću FACS pufera za bojenje (BD Biosciences), resuspendovane i inkubirane dodatnih 30 min na 4 °C sa fluorohromkonjugovanim PE-konjugovanim AffiniPure F(ab’)2-fragmentom kozjeg anti-humanog IgG, specifičnim za Fc-fragment (Jackson Immuno Research Lab; 109-116-170). Ćelije su zatim dva puta oprane puferom za bojenje (BD Biosciences), fiksirane korišćenjem 100 μl BD pufera za fiksiranje (#BD Biosciences, 554655) po bunarčiću, na 4 °C 20 min, resuspendovane u 120 μl FACS pufera i analizirane korišćenjem BD FACS CantoII. Kada je moguće, vrednosti EC50 su izračunate korišćenjem Prism GraphPad (LaJolla, CA, SAD) i EC50 vrednosti koje označavaju koncentraciju antitela potrebnu da se postigne 50% maksimalnog vezivanja za vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela za H929 ćelije, L363 ćelije i RPMI-8226 ćelije su sumirane u tabeli 8, tabeli 9 i tabeli 10, redom. Zvezdica označava procenjene vrednosti EC50 ekstrapolirane i izračunate pomoću softvera Prism. Vrednosti EC50 za vezivanje 21-TCBcv za L363 ćelije i vezivanje 22-TCBcv za RPMI-8226 ćelije nije moglo da bude procenjeno.

Tabela 8: EC50 vrednosti za vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za H929 ćelije multiplog mijeloma

Tabela 9: EC50 vrednosti za vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za L363 ćelije multiplog mijeloma

4

Tabela 10: EC50 vrednosti za vezivanje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za RPMI-8226 ćelije multiplog mijeloma

Primer 7: Proizvodnja citokina u aktiviranim T ćelijama posle vezivanja anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela za CD3-pozitivne T ćelije i BCMA-pozitivne ćelijske linije multiplog mijeloma (test oslobađanja citokina, CBA analiza)

[0234] Anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijska bispecifična antitela analiziraju se u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T ćelijama posredovanu proizvodnju citokina de novo, u prisustvu ili odsustvu humanih BCMA-eksprimirajućih humanih ćelija mijeloma (RPMI-8226, JJN-3). Ukratko, humane PBMC se izoluju iz interfaze i 0.3 miliona ćelija po bunarčiću se zaseje na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom. Alternativno, 280 μl cele krvi uzete od zdravog davaoca zaseje se u svaki bunarčić ploče sa 96 dubokih bunarčića. Dodaju se BCMA-pozitivne tumorske ciljne ćelije da se dobije finalni odnos E:T od 10:1. Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela i kontrole dodaju se do finalne koncentracije od 0.1 pM-10 nM. Posle inkubacije koja je trajala do 24 h, na 37°C, 5% CO2, ploča u testu se centrifugira 5 min na 350 x g i supernatant se prenese na novu ploču sa 96 dubokih bunarčLća za sledeće analize. CBA analiza je izvedena na FACS CantoII prema uputstvima proizvođača, uz korišćenje Human Th1/Th2 Cytokine Kit II (BD #551809) ili kombinacije sledećih CBA Flex setova: humani granzim B (BD #560304), humani IFN-γ Flex set (BD #558269), humani TNF-Į Flex set (BD #558273), humani IL-10 Flex set (BD #558274), humani IL-6 Flex set (BD #558276), humani IL-4 Flex set (BD #558272), humani IL-2 Flex set (BD #558270). Tabela 13 pokazuje da je 83A10-TCBcv indukovao koncentraciono-zavisno povećanje proizvodnje citokina i serin proteaze granzim B, markera citotoksične funkcije T ćelija. Tabela 11 prikazuje vrednosti EC50 i količinu izlučenih citokina/proteaza u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela.

Tabela 11. Izlučivanje citokina i proteaza, indukovano anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima u prisustvu RPMI-8226 ćelija

Primer 8: Preusmerena citotoksičnost T ćelija na H929 ćelije mijeloma sa visokom ekspresijom BCMA indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (kolorimetrijski test oslobađanja LDH)

[0235] Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela analizirana su u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijski posredovanu apoptozu u MM ćelijama sa visokom ekspresijom BCMA posle umrežavanja konstrukta, putem vezivanja antigen-vezujućih fragmenata za BCMA na ćelijama. Ukratko, humane H929 ciljne ćelije multiplog mijeloma sa visokom ekspresijom BCMA sakupljene su pomoću pufera za disocijaciju ćelija, oprane i resuspendovane u RPMI dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Približno 30000 ćelija po bunarčiću zasejano je na ploču sa 96 bunarčLća sa zaobljenim dnom i odgovarajuće razblaženje konstrukta dodato je za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije bile su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM. Za odgovarajuće poređenje, kod svih TCB konstrukata i kontrola podešen je isti molaritet. Humane PBMC (efektorske ćelije) dodate su u bunarčLće da se dobije finalni odnos E:T od 10:1, koji odgovara odnosu E:T od približno 3 do 5 T ćelija na 1 tumorsku ciljnu ćeliju. Negativne kontrolne grupe su predstavljene samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Za normalizaciju, maksimalna liza H929 MM ciljnih ćelija (= 100%) određena je inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1% Tritona X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%) predstavljena je ciljnim ćelijama ko-inkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela. Posle 20-24h ili 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, oslobađanje LDH iz apoptotskih/nekrotičkih MM ciljnih ćelija u supernatant mereno je pomoću kita za detekciju LDH (Roche Applied Science), prema uputstvima proizvođača. Procenat oslobađanja LDH nanet je na dijagram u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela u vidu koncentraciono-zavisnih krivih. EC50 vrednosti su merena korišćenjem softvera Prism (GraphPad) i određene kao koncentracija TCB antitela koja daje 50% maksimalnog oslobađanja LDH. Kao što je pokazano na slici 4, sva anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (21-, 22-, 42-, i 83A10-TCBcv) indukovala su koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih H929 ćelija mijeloma, kako je izmereno oslobađanjem LDH. Liza H929 ćelija je specifična jer kontrolno TCB antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije, nego samo za CD3 na T-ćelijama, nije indukovalo oslobađanje LDH ni pri najvišim testiranim koncentracijama. Tabela 12 sumira vrednosti EC50 za preusmereno ubijanje T ćelijama H929 ćelija sa visokom ekspresijom BCMA indukovano anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima.

Tabela 12: EC50 vrednosti za preusmereno ubijanje T ćelijama H929 ćelija indukovano anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima

Primer 9: Preusmerena citotoksičnost T ćelija na L363 ćelije mijeloma sa srednjom/niskom ekspresijom BCMA indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (test oslobađanja LDH)

[0236] Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela su takođe analizirana u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijski posredovanu apoptozu u MM ćelijama sa srednjom/niskom ekspresijom BCMA posle umrežavanja konstrukta putem vezivanja antigen-vezujućih fragmenata za BCMA na ćelijama. Ukratko, humane L363 ciljne ćelije multiplog mijeloma sa srednjom/niskom ekspresijom BCMA sakupljene su pomoću pufera za disocijaciju ćelija, oprane i resuspendovane u RPMI dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Približno 30000 ćelija po bunarčiću zasejano je na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i dodato je odgovarajuće razblaženje konstrukta za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM. Za odgovarajuće poređenje, u svim TCB konstruktima i kontrolama podešen je isti molaritet. Humane PBMC (efektorske ćelije) dodate su u bunarčiće da se dobije finalni odnos E:T od 10:1, što odgovara odnosu E:T od približno 3 do 5 T ćelija na 1 tumorsku ciljnu ćeliju. Negativne kontrolne grupe predstavljene su samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Za normalizaciju, maksimalna liza MM ciljnih ćelija (= 100%) određena je inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1% Tritona X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%) predstavljena je ciljnim ćelijama ko-inkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela. Posle 20-24 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, oslobađanje LDH iz apoptotskih/nekrotičkih MM ciljnih ćelija u supernatant mereno je pomoću kita za detekciju LDH (Roche Applied Science), prema uputstvima proizvođDča. Procenat oslobađanja LDH nanet je na dijagram u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela u vidu koncentraciono-zavisnih krivih. EC50 vrednosti su merene korišćenjem softvera Prism (GraphPad) i određene kao koncentracija TCB antitela koja daje 50% maksimalnog oslobađanja LDH. Kao što je pokazano na slici 5, sva anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (21-, 22-, 42- i 83A10-TCBcv) indukuju koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih L363 ćelija mijeloma, mereno oslobađanjem LDH. Liza L363 ćelija bila je specifična jer kontrolno TCB antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije, nego samo za CD3 na T-ćelijama, nije indukovalo oslobađanje LDH, čak ni pri najvišim testiranim koncentracijama. Tabela 13 zbirno prikazuje EC50 vrednosti za preusmereno ubijanje T ćelijama L363 ćelija sa srednjom/niskom ekspresijom BCMA indukovano anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima.

Tabela 13: EC50 vrednosti za preusmereno ubijanje T ćelijama L363 ćelija indukovano anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima

Primer 10: Preusmerena citotoksičnost T ćelija na RPMI-8226 ćelije mijeloma sa srednjom/niskom ekspresijom BCMA indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (test oslobađanja LDH)

[0237] Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela analizirana su u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijski posredovanu apoptozu u MM ćelijama sa srednjom/niskom ekspresijom BCMA posle umrežavanja konstrukta putem vezivanja antigen-vezujućih fragmenata za BCMA na ćelijama. Ukratko, humane L363 ciljne ćelije multiplog mijeloma sa srednjom/niskom ekspresijom BCMA sakupljene su pomoću pufera za disocijaciju ćelija, oprane i resuspendovane u RPMI dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Približno 30000 ćelija po bunarčiću zasejano je na ploču sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom i dodato je odgovarajuće razblaženje konstrukta za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM. Za odgovarajuće poređenje, kod svih TCB konstrukata i kontrola podešen je isti molaritet. Humane PBMC (efektorske ćelije) dodate su u bunarčLće da se dobije finalni odnos E:T od 10:1, što odgovara odnosu E:T od približno 3 do 5 T ćelija na jednu ciljnu tumorsku ćeliju. Negativne kontrolne grupe bile su predstavljene samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Za normalizaciju, maksimalna liza MM ciljnih ćelija (= 100%) određena je inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1% Tritona X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%) predstavljena je ciljnim ćelijama ko-inkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela. Posle 20-24 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, oslobađanje LDH iz apoptotskih/nekrotičkih MM ciljnih ćelija u supernatant mereno je pomoću kita za detekciju LDH (Roche Applied Science), prema uputstvima proizvođDča. Procenat oslobađanja LDH nanet je na dijagram u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela u vidu koncentraciono-zavisnih krivih. EC50 vrednosti merene su korišćenjem softvera Prism (GraphPad) i određene kao koncentracija TCB antitela koja daje 50% maksimalnog oslobađanja LDH. Kao što je pokazano na slici 6, sva anti-BCMA/anti- CD3 TCB antitela (21-, 22-, 42- i 83A10-TCBcv) indukuju koncentraciono-zavisno ubijanje BCMA-pozitivnih RPMI-8226 ćelija mijeloma, mereno oslobađanjem LDH. Liza RPMI-8226 ćelija bila je specifična jer kontrolno TCB antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije, nego samo za CD3 na T-ćelijama, nije indukovalo oslobađanje LDH, čak ni pri najvišim testiranim koncentracijama. Tabela 13 zbirno prikazuje EC50 vrednosti za preusmereno ubijanje T ćelijama RPMI-8226 ćelija sa srednjom/niskom ekspresijom BCMA indukovano anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima.

Tabela 13: EC50 vrednosti za preusmereno ubijanje T ćelijama RPMI-8226 ćelija indukovano anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima

Primer 11: Preusmerena citotoksičnost T ćelija na JJN-3 ćelije mijeloma sa niskom ekspresijom BCMA indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (protočna citometrija i oslobađanje LDH)

[0238] Anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela analizirana su u pogledu svoje sposobnosti da indukuju T-ćelijski posredovanu apoptozu u MM ćelijama sa niskom ekspresijom BCMA posle umrežavanja konstrukta putem vezivanja antigen-vezujućih fragmenata za BCMA na ćelijama. Ukratko, humane JJN-3 ciljne ćelije multiplog mijeloma sa niskom ekspresijom BCMA sakupljene su pomoću pufera za disocijaciju ćelija, oprane i resuspendovane u RPMI dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom (Invitrogen). Približno 30000 ćelija po bunarčLću zasejano je na ploču sa 96 bunarčLća sa zaobljenim dnom i dodato je odgovarajuće razblaženje konstrukta za željenu finalnu koncentraciju (u triplikatima); finalne koncentracije su u opsegu od 0.1 pM do 10 nM. Za odgovarajuće poređenje, kod svih TCB konstrukata i kontrola podešen je isti molaritet. Humane PBMC (efektorske ćelije) dodate su u bunarčLće da se dobije finalni odnos E:T od 10:1, što odgovara odnosu E:T od približno 3 do 5 T ćelija na jednu ciljnu tumorsku ćeliju. Negativne kontrolne grupe bile su predstavljene samo efektorskim ili samo ciljnim ćelijama. Za normalizaciju, maksimalna liza MM ciljnih ćelija (= 100%) određena je inkubiranjem ciljnih ćelija sa finalnom koncentracijom od 1% Tritona X-100, što indukuje ćelijsku smrt. Minimalna liza (= 0%) predstavljena je ciljnim ćelijama ko-inkubiranim samo sa efektorskim ćelijama, tj. bez T-ćelijskog bispecifičnog antitela, i) Posle 48 h inkubacije na 37 °C, 5% CO2, kultivisane ćelije mijeloma su sakupljene, oprane i obojene fluorohrom-konjugovanim antitelima i aneksinom-V, za određivanje apoptoze ćelija mijeloma. Panel za bojenje sadržao je CD138-APCC750/CD38-FITC/CD5-BV510/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450/ Aneksin-V-PerCP-Cy5.5. Upotrebljena fluorohromom obeležena antitela nabavljena su od BD Biosciences (San Jose, CA) i Caltag Laboratories (San Francisco CA). Podaci su dobijeni korišćenjem multikolornog protočnog citometra i instaliranog softvera (npr. CantoII aparat sa FACS Diva softverom ili FACSCalibur protočni citometar, uz korišćenje CellQUEST softvera). Paint-A-Gate PRO program (BD Biosciences) je korišćen za analizu podataka. Aneksin-V je izmeren na JJN-3 ćelijama i procenat aneksin-V-pozitivnih JJN-3 ćelija nanet je na dijagram u odnosu na koncentraciju anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela. Procenat lize JJN-3 ćelija indukovane specifičnom koncentracijom anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela takođe je određen merenjem apsolutnog broja aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija pri datoj koncentraciji TCB i oduzimanjem te vrednosti od apsolutnog broja aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija bez TCB; podeljeno apsolutnim brojem aneksin-V-negativnih JJN-3 ćelija bez TCB. Slika 7 pokazuje da anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (22-, 42- i 83A10-TCBcv) indukuju koncentraciono-zavisno ubijanje JJN-3 mijelomskih ćelija sa niskom ekspresijom BCMA, mereno protočnom citometrijom. Liza JJN-3 ćelija bila je specifična jer kontrolno TCB antitelo koje se ne vezuje za BCMA-pozitivne ciljne ćelije, nego samo za CD3 na T-ćelijama, nije indukovalo porast aneksin-v-pozitivnih JJN-3 ćelija ili lizu JJN-3 ćelija, čak ni pri najvišim testiranim koncentracijama. Tabela 14 i tabela 15 sumiraju respektivno procente aneksin-v-pozitivnih JJN-3 ćelija i procente lize JJN-3 ćelija indukovane anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima.

[0239] Detekcija LDH je takođe urađena posle 20-24 h ili 48 h inkubacije na 37°C, 5% CO2. Oslobađanje LDH iz apoptotskih/nekrotičkih JJN-3 MM ciljnih ćelija u supernatant je zatim mereno pomoću kita za detekciju LDH (Roche Applied Science), prema uputstvima proizvođDča. Procenat oslobađanja LDH je grafički prikazan u odnosu na koncentracije anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela u vidu koncentraciono-zavisnih krivih. Vrednosti EC50 su merene upotrebom softvera Prism (GraphPad) i određene kao koncentracija TCB antitela koja rezultuje u 50% od maksimalnog oslobađanja LDH.

Tabela 14. Preusmereno ubijanje T ćelijama JJN-3 ćelija sa niskom ekspresijom BCMA indukovano anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima: procenti aneksin-V-pozitivnih ćelija

1

Tabela 15. Preusmereno ubijanje T ćelijama JJN-3 ćelija sa niskom ekspresijom BCMA indukovano anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima: procenti lize JJN-3 ćelija

Primer 12: Ekspresija BCMA na mijelomskim plazmocitima koštane srži kod pacijenata obolelih od multiplog mijeloma

[0240] Humane ćelijske linije koje eksprimiraju tumorski ciljni molekul od interesa veoma su korisna i praktična sredstva za merenje potencije TCB antitela da indukuju citotoksičnost za tumorske ćelije u prisustvu T ćelija i određivanje EC50 vrednosti, kao i za rangiranje TCB molekula. Međutim, uprkos tome što su lako dostupne i praktične, humane ćelijske linije mijeloma imaju nedostatak izražen time što ne reprezentuju heterogenost multiplog mijeloma, veoma kompleksne bolesti koja se odlikuje značajnom heterogenošću na molekulskom nivou. Pored toga, ćelijske linije mijeloma ne eksprimiraju BCMA receptor sa istim intenzitetom i

2

gustinom jer neke ćelije eksprimiraju BCMA snažnije nego druge (npr. H929 ćelije naspram RPMI-8226 ćelija), i takva heterogenost na ćelijskom nivou može se zapaziti i među različitim pacijentima. Kroz akademsku saradnju sa vodećim stručnjacima za multipli mijelom, izučavaju se određivanje ekspresije i gustine BCMA u uzorcima pacijenata i procena anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela na kliničkim uzorcima uzetim od pacijenata. Krv i aspirati koštane srži uzimaju se od obolelih od multiplog mijeloma posle davanja informacija i pristanka pacijenta, u skladu sa uputstvima lokalnog etičkog komiteta i Helsinškom deklaracijom.

a) Ekspresija BCMA detektovana multiparametarskom protočnom citometrijom (srednji intenzitet fluorescencije)

[0241] Da bi se odredila ekspresija BCMA receptora na mijelomskim ćelijama koštane srži, imunofenotipske analize su obavljene korišćenjem sveže izolovanih celih aspirata koštane srži. Uzorci cele koštane srži sa liziranim eritrocitima i antikoagulantom K3-EDTA (etilendiamintetrasirćetna kiselina) upotrebljeni su za imunofenotipske analize. Ukupno 2 x 10<6>ćelija po epruveti je obojeno, lizirano i zatim oprano korišćenjem tehnike direktne imunofluorescencije i multikolornog bojenja kojom se specifično identifikuju i imunofenotipski karakterišu maligni plazmociti identifikovani kao CD138<+>CD38<+>CD45<+>CD19<->CD56<+>. Ćelije su zatim obojene korišćenjem panela fluorohrom-konjugovanih antitela uključujući bar CD38-FITC/CD56-PE/CD19-PerCP-Cy7/CD45-V450/BCMA-APC. Korišćena fluorohromom obeležena antitela nabavljena su od BD Biosciences (San Jose, CA) i Caltag Laboratories (San Francisco CA). U laboratoriji napravljeno APC-konjugovano anti-humano BCMA-antitelo upotrebljeno je u imunofenotipskim analizama. Podaci su dobijeni korišćenjem multikolornog protočnog citometra i instaliranog softvera (npr. CantoII uređaj sa FACS Diva softverom ili FACSCalibur protočni citometar koji koristi CellQUEST softver). Paint-A-Gate PRO program (BD Biosciences) je korišćen za analizu podataka. BCMA ekspresija je merena selekcijom populacije malignih plazmocita, i vrednosti srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) su određene i upoređene među pacijentima obolelim od mijeloma.

Tabela 16. Ekspresija BCMA na plazmocitima mijeloma koštane srži pacijenata, detektovana multiparametarskom protočnom citometrijom (srednji intenzitet fluorescencije)

b) Određivanje antigen-vezujućeg kapaciteta specifičnog za BCMA (kvantitativna protočno-citometrijska analiza)

[0242] Qifikit (Dako) metod koristi se za kvantifikovanje BCMA specifičnog antigen-vezujućeg kapaciteta (SABC) na ćelijskoj površini plazmocita koštane srži obolelih od mijeloma. Plazmociti mijeloma izolovani iz aspirata cele koštane srži obojeni su sa 50 μl mišjeg antihumanog BCMA IgG (BioLegend #357502) ili mišjeg izotipskog kontrolnog IgG2a (BioLegend # 401501), razblaženih u FACS puferu (PBS, 0.1% BSA) do finalne koncentracije od 25 μg/ml (ili pri zasićujućim koncentracijama) i bojenje je sprovođeno tokom 30 min na 4 °C u mraku. Posle toga, 100 ȝl Set-up ili Calibration perli dodato je u zasebne bunarčLće i ćelije, kao i perle, oprane su dva puta FACS puferom. ûelije i perle su resuspendovane u 25 μl FACS pufera koji sadrži fluorescein-konjugovano antimišje sekundarno antitelo (u zasićujućim

4

koncentracijama), obezbeđenih od Qifikit. Ćelije i perle su obojene tokom 45 min na 4 °C u mraku. ûelije su jednom oprane i svi uzorci su resuspendovani u 100 μl FACS pufera. Uzorci su odmah analizirani na multikolornom protočnom citometru i instaliranom softveru (npr. CantoII uređaj sa FACS Diva softverom ili FACSCalibur protočni citometar sa CellQUEST softverom).

Tabela 17. BCMA specifični antigen-vezujući kapacitet na mijelomskim plazmocitima iz koštane srži pacijenata, mereno kvantitativnom protočno-citometrijskom analizom

Primer 13: Preusmerena citotoksičnost T ćelija na mijelomske plazmocite koštane srži pacijenta u prisustvu autologih T ćelija koje infiltriraju koštanu srž indukovanih antiBCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (multiparametarska protočna citometrija)

[0243] Jedna od najznačajnijih i kritičnih in vitro karakterizacija tokom pretkliničke evaluacije kandidatskih TCB antitela za multipli mijelom je da li TCB molekul može da aktivira pacijentove T-ćelije i indukuje preusmereno ubijanje T ćelijama primarnih plazmocita mijeloma iz koštane srži pacijenata. Da bi se procenio dejstvo anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela na indukciju preusmerenog ubijanja T ćelijama mijelomskih plazmocita koštane srži, aspirati cele koštane srži su sakupljeni od pacijenata sa multiplim mijelomom u EDTA-obložene epruvete i odmah korišćeni za testove kulture ćelija. Odnos efektorskih ćelija prema tumorskim ćelijama (E:T odnos) u uzorcima cele koštane srži određen je i meren protočnom citometrijom. Ukratko, 200 μl uzoraka cele koštane srži preneto je na ploče sa 96 dubokih bunarčLća. Razblaženja anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela i kontrolnog antitela pripremljeno je u sterilnom medijumu i 10 μl preparata je dodato u odgovarajuće bunarčiće do finalnih koncentracija u opsegu od 0.1 pM do 30 nM. Suspenzija koštana srž-antitelo mešana je blagim protresanjem i zatim inkubirana na 37 °C, 5% CO248 h, pokrivena parafinskim filmom. Posle inkubacionog perioda, 20 μl odgovarajućeg FACS-rastvora antitela pripremljenog na osnovu panela antitela uključujući CD138-APCC750/CD38-FITC/CD5-BV510/CD56-PE/CD19-PerCPCy7/ CD45-V450/BCMA-APC/aneksin-V-PerCP-Cy5.5 dodato je na ploče sa 96 bunarčića sa zaobljenim dnom. Upotrebljena su fluorohromom-obeležena antitela komercijalno nabavljena od BD Biosciences (San Jose, CA) i Caltag Laboratories (San Francisco CA) i u laboratoriji napravljeno APC-konjugovano antihumano BCMA antitelo. Uzorci su zatim inkubirani 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi i podaci su dobijeni i analizirani korišćenjem multikolornog protočnog citometra. Ćelijska smrt ćelija mijeloma određena je evaluiranjem selektovane aneksin-V-pozitivne ekspresije na populacijama ćelija mijeloma CD138<+>CD38<+>CD45<+>CD19-CD56<+>. Zatim je određen procenat smrti ćelija mijeloma. Procenat lize mijelomskih plazmocita iz koštane srži pacijenata, indukovane specifičnom koncentracijom anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela takođe je određen merenjem apsolutnog broja aneksin-V-negativnih mijelomskih plazmocita pri datoj koncentraciji TCB i oduzimanjem tog broja od aneksin-V-negativnih mijelomskih plazmocita bez TCB; podeljeno apsolutnim brojem aneksin-V-negativnih mijelomskih plazmocita bez TCB. Da bi se proverila specifičnost anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela, ekspresija aneksina-V merena je i u drugim tipovima ćelija koštane srži, npr. T-ćelijama, B-ćelijama i NK-ćelijama. Kako je pokazano na slici 8, postoji koncentraciono-zavisna i specifična liza mijelomskih plazmocita pacijenata, dok liza T-ćelija, B-ćelija i NK-ćelija nije zapažena. Pored toga kontrolno TCB koje se vezuje samo za CD3 ali ne i za BCMA ne indukuje ćelijsku smrt mijelomskih plazmocita ni pri najvišim koncentracijama TCB antitela. Kako je pokazano u tabeli 18, procenat aneksin-V-pozitivnih mijelomskih ćelija iz koštane srži pacijenata pri najvišoj koncentraciji (30 nM) dostigao je 52.54% i 55.72% za 42-TCBcv i 22-TCBcv, redom, u poređenju sa 29.31% za 83A10-TCBcv, što ukazuje na to da 42-TCBcv i 22-TCBcv snažnije od 83A10-TCBcv indukuju ubijanje mijelomskih plazmocita iz koštane srži pacijenata.

Tabela 18. Procenat aneksin-V-pozitivnih mijelomskih plazmocita iz aspirata koštane srži pacijenata indukovanih anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima

[0244] U sledećoj studiji, u aspiratima koštane srži uzetim od 5 različitih MM pacijenta procenat vijabilnih mijeloma plazmocita određivan je selektovanjem aneksin-V-negativne populacije ćelija i nanošenjem na dijagram te vrednosti u odnosu na koncentraciju anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela. EC50 vrednosti su merene i određivane kao koncentracija TCB antitela koja za rezultat daje 50% maksimalnog broja vijabilnih plazmocita mijeloma. EMAX (%) se određuje kao maksimum vijabilnih mijelomskih plazmocita u prisustvu respektivnog anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskog bispecifičnog antitela. 83A10-TCBcv je pokazalo znatno manju potenciju u indukovanju lize mijelomskih plazmocita od 22-TCBcv i 42-TCBcv u većini od pet uzoraka aspirata koštane srži pacijenata obolelih od mijeloma (tabela 26; slika 9 prikazuje kao primer krive koncentracija-odgovor za 2 od 5 pacijenata). Koncentraciono-zavisna redukcija vijabilnih ćelija mijeloma zapažena je kod 5/5 uzoraka uzetih od pacijenata lečenih sa 22-TCBcv ili 42-TCBcv, u poređenju sa samo 1/5 uzoraka uzetih od pacijenta za 83A10-TCBcv. Tabela 19 prikazuje poređenje 83A10-TCBcv sa 22-TCBcv i 42-TCBcv i dejstvo anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela na vijabilnost mijelomskih plazmocita koštane srži. Rezultati jasno pokazuju da je bilo manje vijabilnih mijelomskih plazmocita koštane srži sa 22-TCBcv i 42-TCBcv (tj. više liziranih mijelomskih plazmocita koštane srži) kod 4/5 uzoraka uzetih od pacijenata kao što je pokazano nižim vrednostima EMAX (%) za 22-TCBcv i 42-TCBcv naspram 83A10-TCBcv u odgovarajućim uzorcima uzetim od pacijenata. Zapažena je koncentraciono-zavisna i specifična liza mijelomskih plazmocita pacijenta, dok liza ne-malignih ćelija koštane srži nije zapažena (podaci nisu prikazani).

Tabela 19. EMAX (%)vrednosti u odnosu na aneksin-V-negativne vijabilne mijelomske plazmocite iz aspirata koštane srži pacijenata u prisustvu anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela.

[0245] U sledećim ispitivanjima u kojima su nova anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijska bispecifična antitela ovog pronalaska upoređivana sa 83A10-TCBcv, sedam sveže uzetih uzoraka/aspirata cele koštane srži obolelih bojeno je CD138 magnetnim mikroperlama (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Nemačka), propušteno kroz autoMACS kolonu za separaciju ćelija i sakupljene frakcije sa dovoljnim brojem preostalih MM plazmocita, obično >4% mijelomskih plazmocita, korišćene su za dalje eksperimente. Na pločama sa 24 bunarčLća, inkubirano je 500000 ćelija/bunarčLću i kultivisano 48 sati. Razblaženja anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela i kontrolnog antitela dodata su u odgovarajuće bunarčLće do finalne koncentracije TCB od 0.1. pM do 10 nM. Svaka dozna tačka je urađena u triplikatima. Vijabilnost plazmocita i ćelija mikrosredine koštane srži ispitivana je dvostrukim bojenjem propidijum-jodidom/CD138-FITC, uz korišćenje protočne citometrije (FACSCalibur; Becton Dickinson). Analiza podataka urađena je korišćenjem FACSDiva softvera (Becton Dickinson). Kako je pokazano na slici 10, stubići histograma pokazuju srednje vrednosti normalizovane u odnosu na srednju vrednost triplikata odgovarajuće kontrole medijuma (MC). Za statističku analizu, upotrebljen je jednosmerni t-test. Maksimalna inhibicija rasta MM plazmocita pri koncentraciji od 10 nM (IMAX10) i inhibicija merena na 1 nM (IMAX1), redom, date su u procentu u odnosu na kontrolu medijuma. Maksimalna inhibicija kontrolnog TCB antitela (10 nM) u poređenju sa kontrolom medijuma takođe je prikazana. Izračunavanja su obavljena korišćenjem R 3.1.19, i Bioconductor 2.1310, osim za izračunavanje IMAX vrednosti (Microsoft Excel®; Microsoft Office Professional 2013). Efekat je smatran za statistički značajan ako je P-vrednost odgovarajućeg statističkog testa iznosila <5% (*), < 1% (**) ili <0.1% (***). Kako se vidi na slikama 10A-10G, rezultati jasno pokazuju da je sa 22-TCBcv i 42-TCBcv bilo manje vijabilnih mijeloma plazmocita koštane srži (tj. više lize mijeloma palzmocita iz koštane srži) kod 7/7 uzoraka uzetih od pacijenata, u poređenju sa 83A10-TCBcv. Tabela 20 prikazuje procenat vijabilnih mijelomskih plazmocita iz aspirata koštane srži pacijenata indukovane anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima, u odnosu na kontrolu medijuma. Tabela 21 pokazuje IMAX10 i IMAX1 vrednosti. Rezultati pokazuju da 22-TCBcv i 42-TCBcv znatno jače od 83A10-TCBcv indukuju ubijanje mijelomskih plazmocita iz koštane srži pacijenata. Uprkos specifičnoj lizi plazmocita koštane srži (BMPC) indukovanoj anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima i zapaženoj u svim uzorcima koštane srži pacijenata, nije bilo uticaja na mikrosredinu koštane srži (BMME) u odgovarajućim uzorcima (slika 10H, reprezentativni od 7 uzoraka uzetih od pacijenata).

Tabela 20. Relativni procenat propidijum-jodid-negativnih vijabilnih mijelomskih plazmocita iz aspirata koštane srži pacijenata indukovane anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima.

1 Tabela 21. IMAX10 i IMAX1 vrednosti u odnosu na maksimalnu inhibiciju rasta MM plazmocita pri 10 nM IMAX10 i inhibiciju pri 1 nM IMAX1, na osnovu propidijum-jodidnegativnih vijabilnih mijeloma plazmocita iz aspirata koštane srži pacijenata u prisustvu anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela.

Primer 14: Aktivacija T ćelija iz koštane srži pacijenata indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (multiparametarska protočna citometrija)

[0246] Da bi se procenilo da li anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela indukuju aktivaciju CD4<+>i CD8<+>T ćelija obolelih od mijeloma (tj. T ćelija koje infiltriraju koštanu srž (MIL)), uzorci iz odogvarajućih tretiranih, netretiranih i kontrolnih grupa posle 48 h inkubacije obojeni su FACS rastvorom antitela pripremljenim na osnovu panela antitela uključujući osam markera: CD8/CD69/TIM-3/CD16/CD25/CD4/HLA-DR/PD-1. Uzorci su zatim inkubirani 15 minuta u mraku na sobnoj temperaturi i podaci su dobijeni i analizirani uz korišćenje multikolornog protočnog citometra. Aktivacija T ćelija određivana je evaluacijom CD25, CD69 i/ili HLA-DR pozitivne ekspresije selektovane na CD4<+>i CD8<+>populacijama T-ćelija. Zatim su mereni procenti aktivacije T ćelija. Slika 11 pokazuje koncentraciono-zavisnu pozitivnu regulaciju CD69 i CD25 na CD4<+>i CD8<+>T ćelijama koje infiltriraju koštanu srž obolelih od multiplog mijeloma. Tabela 22 sumira porast CD69 i CD25 ekspresije na CD4<+>i CD8<+>T ćelijama indukovan anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima; podaci za jednog pacijenta.

Tabela 22: T-ćelijska aktivacija autologih T ćelija pacijenta obolelog od mijeloma indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima u prisustvu mijelomskih plazmocita koštane srži pacijenta

1 1

Primer 15: Povećana T-ćelijska funkcija (proizvodnja citokina) T ćelija u koštanoj srži pacijenta indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (imunoesej na bazi multipleksiranih perli /protočna citometrija)

1 2

[0247] Da bi se procenilo da li anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela (83A10-TCBcv, 22-TCBcv i 42-TCBcv) indukuju T-ćelijsku aktivaciju i povećanu funkciju CD4<+>i CD8<+>T ćelija koje infiltriraju koštanu srž kod pacijenta obolelog od mijeloma, supernatanti su sakupljeni iz odgovarajućih kultura tretiranih, netretiranih i kontrolnih grupa posle 48 h inkubacije i izmeren je sadržaj citokina i serin proteaza. Analiza nizova citokinskih perli (CBA) sprovedena je na multikolornom protočnom citometru prema uputstvima proizvođDča, upotrebom kompleta II za humane citokine Th1/Th2 (BD #551809) ili kombinacije sledećih kompleta CBA Flex Set: Flex Set za humani granzim B (BD #560304), Flex Set za humani IFN-γ (BD #558269), Flex Set za humani TNF-α (BD #558273), Flex Set za humani IL-10 (BD #558274), Flex Set za humani IL-6 (BD #558276), Flex Set za humani IL-4 (BD #558272), Flex Set za humani IL-2 (BD #558270).

Primer 16: Farmakokinetičko/farmakodinamičko (PK/PD) ispitivanje na cinomolgus majmunima

[0248] Jasna prednost koju bi anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitelo moglo da ima nad drugim bispecifičnim antitelima kao (scFV)2(npr. BCMAxCD3 bispecifični T-ćelijski aktivator, BiTE®, kako je opisano u WO2013072415 i WO2013072406) je mnogo duže poluvreme eliminacije/niži klirens in vivo, što bi omogućilo IV ili SC primenu dva puta ili jednom nedeljno u poređenju sa veoma kratkim poluvremenom eliminacije (scFV)2(npr. 1 do 4 sata) što zahteva da se lečenje primenjuje pomoću pumpe koju pacijent nosi nedeljama ili mesecima (Topp et al. J Clin Oncol 2011; 29(18): 2493-8). Primena dva puta ili jednom nedeljno bila bi mnogo povoljnija za pacijente i nosila bi mnogo manje rizika (npr. otkazivanje pumpe, problemi sa kateterom, itd.).

a) Da bi se proverilo poluvreme eliminacije/klirens anti-BCMA/anti-CD3 83A10-TCBcv antitela in vivo, jednodozne farmakokinetičke (PK) farmakodinamske (PD) studije sa anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima (83A10-TCBcv, 22-TCBcv i 42-TCBcv) sprovedene su pri iskusnim AAALAC-akreditovanim CRO. Biološki naivni adultni cinomolgus majmuni, stari oko dve godine i teški približno 3 kg, aklimatizovani su najmanje 40 dana i odabrani na osnovu telesne težine, kliničkih opservacija i kliničkopatoloških ispitivanja. Životinje su obeležene individualnom tetovažom i karticama za kavez označenim različitim bojama. Svi postupci sa životinjama (uključujući držanje, praćenje zdravstvenog stanja, obuzdavanje, doziranje, itd) i etička revizija obavljeni su u skladu sa trenutnim državnim zakonodavstvom uz sprovođenje Smernica o zaštiti životinja koje se koriste u biomedicinskim istraživanjima. Životinje su nasumično raspoređene po grupama tretmana na osnovu poslednjeg merenja težine pre eksperimenta.

1

Posle isključivanja životinja sa neprihvatljivim nalazima pre testa, kompjuterski program uključen u Pristima® sistem dizajniran za postavljanje ravnoteže u pogledu telesnih težina pre ispitivanja upotrebljen je da se isključe životinje sa ekstremnim telesnim težinama na oba ekstrema i preostale životinje su nasumično raspoređene u grupe za tretmane. Životinje su određene za tri grupe tretmana sa 83A10-TCBcv (n = 2 životinje tj. 1 ženka i 1 mužjak po grupi), pri 0.003; 0.03; i 0.3 mg/kg. Životinje su primile jednu i.v. injekciju 83A10-TCBcv i preko periferne vene su uzeti uzorci krvi od najmanje 0.8 mL po vremenskoj tački za evaluaciju PK prema sledećem rasporedu sakupljanja i postupcima: pre doziranja, 30, 90, 180 min, 7, 24, 48, 96, 168, 336, 504 h posle doziranja. Uzorci krvi su ostavljeni da koagulišu u epruvetama za izdvajanje seruma, 60 min na sobnoj temperaturi. Koagulum je oboren centrifugiranjem (najmanje 10 min., 1200 g, 4 °C). Dobijeni serum (oko 300 μL) direktno je skladišten na -80 °C do dalje analize. Uzeti su i uzorci koštane srži za PK evaluacije, iz butne kosti, pod anestetskim/analgetskim tretmanom, po sledećem rasporedu: pre doziranja, 96 i 336 h posle doziranja. Uzorci koštane srži ostavljeni su da koagulišu u epruveti za izdvajanje seruma, 60 min na sobnoj temperaturi. Koagulum je oboren centrifugiranjem (najmanje 10 min., 1200 g, 4 °C). Dobijena koštana srž (oko 1 mL) direktno je skladištena na -80 °C do dalje analize. Obavljena je analiza PK podataka i evaluacija. Standardna nekompartmentalna analiza obavljena je korišćenjem Watson paketa (v 7.4, Thermo Fisher Scientific Waltman, MA, SAD) ili Phoenix WinNonlin sistema (v. 6.3, Certara Company, SAD). Kako je pokazano na slici 12 i u tabeli 23, serumske koncentracije 83A10-TCBcv merene su pomoću ELISA iz uzoraka seruma sakupljenih u različitim vremenskim tačkama posle IV injekcije. Tabela 24 pokazuje koncentracije 83A10-TCBcv u koštanoj srži merene pomoću ELISA, za svaku grupu tretmana (BLQ znači ispod nivoa kvantifikacije).

[0249] Nekoliko informacija relevantnih za potencijalnu kliničku upotrebu bispecifičnog antitela prema pronalasku može da se vidi sa slike 12, iz tabele 23 i tabele 24:

U aspiratima koštane srži MM pacijenata, koncentracije od 1 nM ili 10 nM TCB prema ovom opisu indukuju značajno ili čak potpuno ubijanje MM plazmocita; pri dozi od 0.03 mg/kg u intervalu od injekcije do 168 sati (7 dana) dostignute su koncentracije u plazmi između pribl. 1 nM i 4 nM, što pokazuje da terapija jednom nedeljno dozama od približno 0.03 mg/kg može biti izvodljiva (200 ng/ml odgovara pribl.1 nM)

1 4

Slika 12 pokazuje da je u ispitivanom doznom opsegu PK u velikoj meri dozno-linearna; to znači da su koncentracije proporcionalne dozi, što je korisna osobina za kliničku terapiju

MM je bolest uglavnom locirana u koštanoj srži; koncentracije 83A10-TCBcv detektovane u koštanoj srži bliske su koncentracijama u serumu (tabela 24), npr. na 96 h posle injekcije izmerene su koncentracije u koštanoj srži od pribl. 1 i 2 nM; ovo su koncentracije TCB ovog opisa pri kojima se zapaža značajno ubijanje MM plazmocita u aspiratima koštane srži neposredno uzetim od MM pacijenata; što ponovo pokazuje mogućnost za doziranje u pogodnim intervalima, npr. jednom nedeljno

Između 24 i 504 sata posle injekcije, eliminacija je uglavnom prvog reda sa poluvremenom eliminacije od pribl. 6 do 8 dana, što ponovo potvrđuje mogućnost doziranja npr. jednom nedeljno.

Tabela 23. Koncentracije 83A10-TCBcv u serumu posle IV tretmana kod cinomolgus majmuna

Tabela 24. Koncentracije 83A10-TCBcv u koštanoj srži posle jednog IV tretmana kod cinomolgus majmuna

0

1

[0250] Farmakodinamička (PD) merenja: Uzorci krvi (vremenske tačke: pre doziranja, 24, 48, 96, 168, 336, 504 h posle doziranja) i uzorci koštane srži (vremenske tačke: pre doziranja, 96 i 336 h posle doziranja) sakupljeni su u epruvete koje sadrže 7.5% K3 EDTA, za evaluaciju PD protočnom citometrijom, da bi se odredio efekat 83A10-TCBcv datog i.v. u jednoj dozi, na plazmocite, B-ćelije i T-ćelije krvi i koštane srži. Primenjen je direktan metod imunofluorescentnog bojenja površinskih markera "liza i ispiranje". Ukratko, 100 ȝL krvi ili koštane srži inkubirano je sa mešavinama dva antitela koje uključuju CD45/CD2/CD16/CD20/CD27/CD38 ili CD45/CD2/CD16/CD4/CD25/CD8, u mraku 30 min na 4 °C. Da bi se lizirale crvene krvne ćelije, uzorku je dodato 2 mL rastvora pufera za liziranje i sve je inkubirano 15 min na sobnoj temperaturi u mraku. ûelije su sakupljene centrifugiranjem i oprane puferom za bojenje (PBS 2% fetalni goveđi serum). Obojeni uzorci su držani u frižideru, zaštićeni od svetlosti do analiziranja na citometru istog dana. Prikupljanje podataka FACS obavljeno je na Becton Dickinson protočnom citometru opremljenom laserskim snopovima od 488 i 635, BD FACS Canto II. BD FACSDiva softver je korišćen za prikupljanje podataka i analizu. Apsolutni broj ćelija dobijen je pomoću dvostruke platforme na bazi broja belih krvnih ćelija dobijenog hematološkim analizatorom (ADVIA<TM>120, Siemens). Kako je pokazano na slici 13, preraspodela perifernih T-ćelija zapažena je kod svih životinja koje su primile jednu dozu IV tretmana 83A10-TCBcv, što je pokazano smanjenjem broja T-ćelija u cirkulaciji. Kako je pokazano na slici 14A, već 24 sata posle tretmana sa 83A10-TCBcv 0.3 mg/kg, kod tretiranih životinja zapaženo je smanjenje plazmocita u krvi (BCMA-pozitivne ćelije), dok ukupan broj B-ćelija (BCMA-negativne ćelije) nije smanjen. Slika 14b pokazuje kinetiku smanjenja broja plazmocita u krvi posle tretmana sa 83A10-TCBcv 0.3 mg/kg, kod cinomolgus majmuna.

[0251] Uzorci krvi su obrađeni i za sakupljanje plazme, za analizu citokina (IL-1b, IL-2, IL-6, IL-10, TNF-α i IFN-γ), u skladu sa sledećim rasporedom sakupljanja: pre doziranja, 30, 90, 180 min, 7, 24, 48, 96, 168 h posle doziranja. Uzorci krvi su stavljeni u plastične epruvete koje se drže u ledenom vodenom kupatilu, zatim su centrifugirani (najmanje 10 min., 1200g, 4 °C). Dobijena plazma je direktno skladištena na -80°C do analize. Analiza citokina obavljena je citokinskim imunotestom na bazi multipleksiranih perli (Luminex Technology). Podaci su

1

analizirani Bio-Plex Manager 4.1 softverom (Bio-Rad): korišćen je petoparametarski logistički regresioni model (5PL).

b) U sledećoj studiji, cinomolgus majmuni su tretirani sa 42-TCBcv ili 22-TCBcv. Životinje (n=2/grupi) su primile jednu IV (0.01; 0.1; i 1.0 mg/kg) ili SC (0.01 i 0.1 mg/kg) injekciju 42-TCBcv ili jednu IV injekciju sa 22-TCBCv (0.1 mg/kg). Uzorci krvi i koštane srži su sakupljeni u određenim vremenskim tačkama prema definisanom rasporedu uzimanja uzoraka i obrađeni za PK i PD merenja (imunofenotipizacija i proizvodnja citokina).

[0252] Životinje su primile jednu IV ili SC injekciju 42-TCBcv ili 22-TCBcv (samo IV) i uzorci krvi u određenim vremenskim tačkama sakupljeni su preko periferne vene za procene PK prema sledećem rasporedu uzorkovanja i postupcima: pre-doziranja, 30, 90, 180 min, 7, 24, 48, 96, 168, 336, 504 h posle doziranja. Uzorci krvi su ostavljeni da koagulišu u epruvetama za izdvajanje seruma, 60 min na sobnoj temperaturi. Koagulum je oboren centrifugiranjem (najmanje 10 min., 1200 g, 4 °C). Dobijeni serum (oko 300 μL) direktno je skladišten na -80 °C do dalje analize. Uzeti su i uzorci koštane srži za PK evaluacije, iz butne kosti, pod anestetskim/analgetskim tretmanom, po sledećem rasporedu: pre doziranja, 96 i 336 h posle doziranja. Uzorci koštane srži ostavljeni su da koagulišu u epruveti za izdvajanje seruma, 60 min na sobnoj temperaturi. Koagulum je oboren centrifugiranjem (najmanje 10 min., 1200 g, 4 °C). Dobijena koštana srž (oko 1 mL) direktno je skladištena na -80 °C do dalje analize. Obavljena je analiza PK podataka i evaluacija. Standardna nekompartmentalna analiza obavljena je korišćenjem Watson paketa (v 7.4, Thermo Fisher Scientific Waltman, MA, SAD) ili Phoenix WinNonlin sistema (v. 6.3, Certara Company, SAD). Kako je pokazano na slici 19 i u tabeli 24A-D, koncentracije 42-TCBcv merene su pomoću ELISA testa iz uzoraka seruma i koštane srži sakupljenih u različitim vremenskim tačkama posle IV ili SC injekcije. Opseg efektivnih koncentracija 42-TCBcv u aspiratima koštane srži pacijenta obolelog od multiplog mijeloma odgovara 10 pm do 10 nM (siva oblast). Koncentracije u zagradama su u nM. BLQ, ispod nivoa kvantifikacije; i/m, nepouzdano merenje.

Tabela 24A. Serumske koncentracije 42-TCBcv posle IV tretmana kod cinomolgus majmuna

1

Tabela 24B. Koncentracije u koštanoj srži 42-TCBcv posle jednog IV tretmana kod cinomolgus majmuna

Tabela 24C. Serumske koncentracije 42-TCBcv posle SC tretmana kod cinomolgus majmuna

1

Tabela 24D. Koncentracije u koštanoj srži 42-TCBcv posle jednog SC tretmana kod cinomolgus majmuna

[0253] Rezultati iz tabela 24A i 24C prikazuju privlačan profil serumske koncentracije pogodan za tretman sa 42-TCBcv jednom nedeljno ili čak jednom na svake dve nedelje. Određena je površina ispod krive AUC za serumske koncentracije posle IV i SC primene, poređenje AUC vrednosti pokazalo je visoku biološku raspoloživost od blizu 100 % sa SC injekcijom 42-TCBcv. Dodatno, rezultati pokazuju da je koncentracija 42-TCBcv u koštanoj srži veoma slična serumskim koncentracijama 42-TCBcv. 42-TCBcv koncentracije u serumu mogle bi dobro da predstavljaju koncentracije 42-TCBcv dostupne u koštanoj srži tj. na osnovnom mestu koje je bogato mijelomskim tumorskim ćelijama.

[0254] Farmakodinamička (PD) merenja su dragocena informacija koja potvrđuje PK merenja. Sprovedene su dodatne PD analize. Cinomolgus CD20<+>B ćelije iz krvi takođe eksprimiraju BCMA na površini ćelije i značajno su češće (veći apsolutan broj) od plazmocita u krvi. Smanjenje broja B ćelija u krvi korišćeno je kao pouzdan farmakodinamički efekat anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela i za poređenje in vivo efikasnosti između 83A10-TCBcv, 42-TCBcv i 22-TCBcv. Apsolutni broj B ćelija izračunat je na osnovu dvostruke platforme koja se sastoji od protočne citometrije i broja belih krvnih ćelija dobijenog pomoću hematološkog analizatora i meren je u sledećim vremenskim tačkama: pre doziranja, 24h, 48h, 96h i 196h posle 10-minutne IV infuzije. Procenat smanjenja broja B ćelija izračunat je kao što sledi:

1

Tabela 24E: Farmakodinamička dejstva anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela: smanjenje broja B ćelija

[0255] 42-TCBcv i 22-TCBcv snažnije od 83A10-TCBcv indukuju smanjenje broja B ćelija koje eksprimiraju BCMA cinomolgus majmuna posle jedne doze IV injekcije (videti tabelu 24E). Budući da tri molekula dele istu molekulsku strukturu i CD3 vezujući molekul, razlika u efikasnosti kod cinomolgus majmuna mogla bi uglavnom da se pripiše odgovarajućem antitelu protiv BCMA.

[0256] Da bi se potvrdilo da smanjenje broja B ćelija koje eksprimiraju BCMA kod cinomolgus majmuna posle IV injekcije predstavlja rezultat mehanističkih farmakodinamičkih dejstava anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela, porast aktiviranih CD8<+>citotoksičnih T ćelija (tj. efektorskih ćelija) meren je u koštanoj srži bogatoj BCMA-pozitivnim ćelijama (tj. ciljnim ćelijama) 4 dana (96 h) i 3 nedelje (336h) posle IV injekcije. Apsolutni broj CD8<+>CD25<+>aktiviranih T ćelija izračunat je na osnovu dvostruke platforme koja se sastoji od protočne citometrije i broja belih krvnih ćelija dobijenog pomoću hematološkog analizatora.

Tabela 24F: Farmakodinamička dejstva anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela: Porast CD8<+>

CD25<+>aktiviranih T ćelija

e

11

[0257] 42-TCBcv i 22-TCBcv snažnije od 83A10-TCBcv indukuju T ćelijsku aktivaciju kod cinomolgus majmuna posle jedne doze IV injekcije (videti tabelu 24F). Budući da tri molekula dele istu molekulsku strukturu i CD3 vezujući molekul, razlika u farmakodinamičkim dejstvima kod cinomolgus majmuna mogla bi uglavnom da se pripiše odgovarajućem antitelu protiv BCMA. Rezultati ukazuju na to da je smanjenje broja BCMA-pozitivnih B ćelija u koštanoj srži i u krvi najverovatnije rezultat aktivacije citotoksičnih T ćelija indukovanih anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitelima.

Primer 17: Antitumorska aktivnost indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelom u ksenograftskom modelu humanog H929 mijeloma upotrebom PBMC-humanizovanih NOG miševa

[0258] Sa dugim poluživotom eliminacije, anti-BCMA/anti-CD3 TCBcv antitela koja sadrže Fc bi mogla da budu efikasnija od bispecifičnih antitela na bazi (scFv)2kao BCMA50-BiTE®, datih u ekvimolarnim dozama, po režimu jednom nedeljno. In vivo efekat 83A10-TCBcv i BCMA50-BiTE® (kako je opisano u WO2013072415 i WO2013072406) upoređen je i evaluiran u ksenograftskom modelu H929 humanog mijeloma u PBMC-humanizovanim NOG miševima. NOG miševi su pogodni za humanizovane mišje modele jer se odlikuju kompletnim odsustvom imunskih ćelija uključujući populaciju rezidentnih NK-ćelija i tako su permisivniji za presađivanje tumora humanih ksenogenih ćelija (Ito et al. Curr Top Microbiol Immunol 2008; 324: 53-76). Ukratko, na dan 0 (d0) studije, 5x10<6>ćelija ćelijske linije humanog mijeloma NCI-H929 (NCI-H929, ATCC® CRL-9068™) u 100 ȝL RPMI 1640 medijuma koji sadrži 50:50 matrigela (BD Biosciences, Francuska) subkutano (SC) je injektirano u desnu polovinu leđa imunodeficijentnih NOD/Shi-scid IL2rgamma(null) (NOG) ženki miševa starosti 8-10 nedelja (Taconic, Ry, Danska). Dvadeset četiri do 72 časa pre SC implantacije H929 tumorskih ćelija, svi miševi su dobili ozračivanje celog tela γ-izvorom (1.44 Gy,<60>Co, BioMep, Bretenières, Francuska). Na dan 15 (d15), NOG miševi primili su jednu intraperitonealnu (IP) injekciju 2x10<7>humanih PBMC (u 500 μL PBS 1X pH 7.4). Karakterizacija humanih PBMC obavljena je imunofenotipizacijom (protočna citometrija). Miševi su zatim pažljivo nasumično raspoređeni u različite grupe tretmana i kontrolne grupe (n = 9/grupi) uz korišćenje Vivo manager® softvera (Biosystemes, Couternon, Francuska) i statistički testovi (analiza varijanse) su obavljeni da bi se testirala homogenost između grupa. Tretman antitelima je započet na dan 19 (d19), tj. 19 dana posle SC injekcije H929 tumorskih ćelija, kada je zapremina tumora kod svih miševa dostigla najmanje 100-150 mm<3>, sa srednjom zapreminom tumora od 300 ± 161 mm<3>za kontrolnu grupu tretiranu vehikulumom, 315 ± 148 mm<3>za grupu tretiranu sa 2.6 nM/kg kontrolnog TCB, 293 ± 135 mm<3>za grupu tretiranu sa 2.6 nM/kg 83A10-TCBcv i 307 ± 138 mm<3>za grupu tretiranu sa 2.6 nM/kg BCMA50-(scFv)2(BCMA50-BiTE®). Raspored tretiranja TCB antitelom zasnovan je na farmakokinetičkim rezultatima ranije dobijenim za 83A10-TCBcv i sastojao se od IV primene jednom nedeljno, u trajanju do 3 nedelje (tj. ukupno 3 injekcije TCB antitela). ýetiri dana posle rekonstitucije miševa-domaćina humanim PBMC (d19), data je prva doza anti-BCMA/anti-CD3 83A10-TCBcv antitela (2.6 nM/kg respektivno 0.5 mg/kg), injekcijom preko repne vene. Uzorci krvi uzimani su punkcijom jugularne/mandibularne vene (pod anestezijom), 1 h pre svakog tretmana, 2 h pre drugog tretmana i na kraju eksperimenta od miševa iz svih grupa tretiranih sa 83A10-TCBcv i kontrolnim TCBcv. Uzorci krvi su odmah preneti u epruvete sa aktivatorom koagulacije (T MG epruvete, tamnocrveni vrh, Capiject®, Terumo®). Epruvete su ostavljene na sobnoj temperaturi 30 min da bi došlo do koagulacije. Epruvete su zatim centrifugirane na 1 300 g 5 min da se koagulum odvoji od seruma. Pripremljeni su alikvoti seruma, brzo zamrznuti u tečnom azotu i skladišteni na -80 °C do dalje analize. Zapremina tumora (TV) merena je nonijusom tokom studije i napredovanje je evaluirano međugrupnim poređenjem TV. Procenat rasta tumora definisan kao TG (%) određen je izračunavanjem TG (%) = 100 x (medijana TV analizirane grupe)/(medijana TV kontrolne grupe tretirane vehikulumom). Iz etičkih razloga, miševi su eutanazirani kada TV dostigne 2000 mm<3>. Slika 15 pokazuje TV svakog pojedinačnog miša po eksperimentalnoj grupi: (A) kontrolne grupe uključujući kontrolu sa vehikulumom (puna linija) i kontrolno -TCB (tačkasta linija), (B) 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) grupa, i (C) BCMA50-BiTE® (2.6 nM/kg). U grupi 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg), 6 od 9 miševa (67%) imalo je regresiju tumora čak ispod TV zabeležene na d19, tj. na dan prvog tretmana TCB i regresija tumora se održala do kraja studije. Tri miša u 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) tretiranoj grupi koja nisu pokazala regresiju tumora imala su TV jednak redom 376, 402 i 522 mm<3>na d19. Nasuprot tome, nijedan od 9 miševa (0%) tretiranih ekvimolarnom dozom BCMA50-BiTE® (2.6 nM/kg) po režimu jednom nedeljno tokom 3 nedelje nije imao regresiju tumora ni u jednoj vremenskoj tački. Tabela 25 pokazuje progresiju zapremina tumora tokom vremena u svim eksperimentalnim grupama. Procenat rasta tumora izračunavan je za d19 do d43 i upoređivan između 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg) grupe i BCMA50-BiTE® (2.6 nM/kg) (slika 16). Rezultati pokazuju da je TG (%) konzistentno i značajno redukovan u grupi 83A10-TCBcv (2.6 nM/kg), kao i da je TG (%) uvek niži kada se upoređuje sa BCMA50-BiTE® (2.6 nM/kg). Tabela 26 pokazuje medijanu zapremine tumora (TV) i procenat rasta tumora (TG (%)) na dane 19 do 43. Ukupni rezultati jasno pokazuju da je 83A10-TCBcv superiorno u odnosu na BCMA50-BiTE® u indukovanju antitumorske aktivnosti in vivo kada se tretman daje u ekvimolarnoj dozi po režimu jednom nedeljno tokom 3 nedelje.

Tabela 25. Napredovanje zapremina tumora tokom vremena kod miševa iz kontrolne grupe sa vehikulumom i miševa tretiranih ekvimolarnim dozama kontrolnog TCB, 83A10-TCBcv i BCMA50-(scFv)2(BCMA50-BiTE®)

11

Tabela 26. Medijana zapremine tumora (TV) i procenat rasta tumora (TG (%)) na dane 19 do 43: 83A10-TCBcv u poređenju sa BCMA50-BiTE®.

Primer 18: Antitumorska aktivnost indukovana anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima u ksenograftskom modelu humanog RPMI-8226 mijeloma u PBMC-humanizovanim NOG miševima

[0259] Kao alternativa H929 ćelijskoj liniji mijeloma, humana RPMI-8226 ćelijska linija mijeloma kod koje je nivo ekspresije površinskog BCMA niži od onog kod H929 i koja je reprezentativnija za nivo detektovan kod primarnih mijelomskih ćelija, koristi se kao tumorski ksenograft. Ukratko, na dan 0 (d0) studije, 10x10<6>- 20x10<6>humanih ćelija RPMI-8226 ćelijske linije mijeloma (ATCC® CCL-155™) u 200 µL 0.9% rastvora NaCl koji sadrži 50:50 matrigela (BD Biosciences, Francuska) je subkutano (SC) je injektirano u desnu polovinu leđa imunodeficijentnih NOD/Shi-scid IL2rgamma(null) (NOG) ženki miševa starosti 8-10 nedelja (Taconic, Ry, Danska). Dvadeset četiri do 72 časa pre SC implantacije RPMI-8226 ćelijske linije, svi miševi su dobili ozračivanje celog tela γ-izvorom (1.44 Gy,<60>Co, BioMep, Bretenières, Francuska). NOG miševi primili su jednu intraperitonealnu (IP) injekciju 2x10<7>humanih PBMC (u 500 μL PBS 1X pH 7.4) jednom između dana 9 (d9) i dana 45 (d45) kada su zapremine

11

tumora dostigle najmanje 100-150 mm<3>. Karakterizacija humanih PBMC urađena je imunofenotipizacijom (protočna citometrija). Miševi su zatim pažljivo nasumično raspoređeni u različite grupe tretmana i kontrolne grupe (n = 9/grupi) uz korišćenje Vivo manager® softvera (Biosystemes, Couternon, Francuska) i statistički testovi (analiza varijanse) su obavljeni da bi se testirala homogenost između grupa. Tretman antitelom započet je najmanje 24h do 48h posle IP injektovanja humanih PBMC i kada je zapremina tumora dostigla najmanje 100-150 mm<3>kod svih miševa. Raspored tretiranja TCB antitelom zasnovan je na prethodnim farmakokinetičkim rezultatima i sastojao se od IV primene jednom ili dva puta nedeljno putem repne vene tokom do 3 nedelje (tj. ukupno 3 injekcije TCB antitela). Uzorci krvi uzimani su punkcijom jugularne/mandibularne vene (pod anestezijom), 1 h pre svakog tretmana, 2 h pre drugog tretmana i na kraju eksperimenta. Uzorci krvi su odmah preneti u epruvete sa aktivatorom koagulacije (T MG epruvete, tamnocrveni vrh, Capiject®, Terumo®). Epruvete su ostavljene na sobnoj temperaturi 30 min da bi došlo do koagulacije. Epruvete su zatim centrifugirane na 1300 g 5 min da se koagulum odvoji od seruma. Pripremljeni su alikvoti seruma, brzo zamrznuti u tečnom azotu i skladišteni na -80 °C do dalje analize. Zapremina tumora (TV) merena je nonijusom tokom studije i napredovanje je evaluirano međugrupnim poređenjem TV. Procenat rasta tumora definisan kao TG (%) određen je izračunavanjem TG (%) = 100 x (medijana TV analizirane grupe)/(medijana TV kontrolne grupe tretirane vehikulumom).

[0260] Razvoj ksenograftskog modela RPMI-8226 humanog mijeloma u PBMC-humanizovanim NOG miševima prvo je izveden da bi se osiguralo da ksenograftski model bude pogodan za testiranje anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela. BCMA<low>-eksprimirajuće RPMI-8226 MM ćelije injektovane su SC u NOG miševe na dan 0. Na dan 22, humani PBMC su injektovani IP i humane T ćelije su mogle da budu detektovane u krvi jednu nedelju kasnije (podaci nisu prikazani). Kao što je prikazano na slici 20, rast tumora i telesna težina su mereni do dana 50. Nažalost i neočekivano, ispostavilo se da ovaj ksenograftski model nije pogodan za ispitivanje antitumorske aktivnosti anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela iz sledećih razloga: 1) ksenograft RPMI-8226 humanog mijeloma nije uspeo da raste konzistentno u PBMC-humanizovanim NOG miševima; 2) PBMC-humanizovani NOG miševi u koje je transplantiran RPMI-8226 ksenograft počeli su da gube telesnu težinu ubrzo nakon IP injekcije humanih PBMC, kao znak bolesti kalem-protiv-domaćina. Ovi miševi su eutanazirani iz etičkih razloga; 3) gubitka ekspresije BCMA zapaženog u ksenograftu tumora posle SC injekcije pri žrtvovanju miševa-domaćina.

Primer 19: Preusmerena citotoksičnost T ćelija na plazmocite iz mononuklearnih ćelija periferne krvi ili aspirata koštane srži pacijenta sa plazmocitnom leukemijom (PCL) u

11

prisustvu autologih T ćelija indukovanih anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima merena protočnom citometrijom

[0261] Plazmocitna leukemija (PCL) je leukemična varijanta mijeloma koja nastaje ili de novo ili potiče iz klinički pre-postojećeg multiplog mijeloma (MM). Trenutno dostupni tretmani su prilično ograničeni i sastoje se uglavnom od kombinacija lekova za MM i hemoterapije. Do danas nijedna terapija nije eksplicitno registrovana za ovu veoma agresivnu i smrtonosnu bolest. BCMA ima suštinsku ulogu u preživljavanju normalnih plazmocita i anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijska bispecifična antitela prema pronalasku mogu da se koriste za lečenje plazmocitne leukemije kod pacijenta koji pati od pomenute bolesti. Sveže uzete mononuklearne ćelija periferne krvi (PBMC) iz uzoraka pacijenta sa plazmocitnom leukemijom koje sadrže > 80% plazmocita pri visokom broju leukocita, izolovane su na gradijentu gustine upotrebom metode po Ficollu ili drugih uporedivih metoda i inkubirane 24h i 48h sa anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelom ili kontrolnim antitelom u koncentracijama od 0.1 pM do 30 nM na 37°C u atmosferi vlažnog vazduha. Celi aspirati koštane srži pacijenata sa plazmocitnom leukemijom mogu takođe da se koriste kao uzorci. Svaka dozna tačka je urađena u triplikatima. Apoptoza je određena bojenjem aneksin/propidijum jodid cele populacije i CD138-pozitivnih ćelija pomoću uređaja FACSCalibur upotrebom Diva softvera (BD). Vijabilnost plazmocita i PBMC cele populacije ispitivani su dvostrukim bojenjem propidijum jodid/CD138-FITC upotrebom protočnog citometra (FACSCalibur; Becton Dickinson). Analiza podataka obavljena je upotrebom FACSDiva softvera (Becton Dickinson). Srednje vrednosti su normalizovane u odnosu na srednju vrednost triplikata odgovarajuće kontrole medijuma (MC). Za statističku analizu, korišćen je jednoparametarski t-test. Maksimalna inhibicija rasta PCL ćelija u koncentraciji od 10 nM (IMAX10) i inhibicija izmerena pri 1 nM (IMAX1), redom, date su u procentima u odnosu na kontrolu medijuma. Maksimalna inhibicija kontrolnog TCB antitela (10 ili 30 nM) u poređenju sa kontrolom medijuma je takođe izmerena. Izračunavanja su sprovedena upotrebom R 3.1.19, i Bioconductor 2.1310, a za izračunavanje vrednosti IMAX (Microsoft Excel®; Microsoft Office Professional 2013). Dejstvo je smatrano statistički značajnim ako je P-vrednost odgovarajućeg statističkog testa <5 % (*), < 1% (**) ili <0.1% (***). Merena je i ekspresija BCMA na PBMC CD138<+>plazmocitima iz uzoraka pacijenata sa plazmocitnom leukemijom, a određen je i odnos efektorskih ćelija prema tumorskim ćelijama (E:T). Kao što se vidi na slici 20, rezultati jasno pokazuju da postoji značajna redukcija vijabilnih plazmocitnih leukemijskih ćelija koštane srži sa 42-TCBcv (tj. više lize plazmocitnih leukemijskih ćelija koštane srži) u dva uzorka pacijenata sa plazmocitnom leukemijom u poređenju sa kontrolom medijuma. Tabela 27 prikazuje procenat maksimalne inhibicije plazmocitnih leukemijskih ćelija

11

iz aspirata koštane srži pacijenata ili periferne krvi indukovane 10 nM (IMAX10) i 1 nM (IMAX1) anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela u odnosu na kontrolu medijuma. Rezultati pokazuju da 42-TCBcv veoma snažno indukuje ubijanje plazmocitnih leukemijskih ćelija koštane srži pacijenata. Uprkos specifičnoj lizi plazmocitnih leukemijskih ćelija koštane srži indukovanoj anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima u posmatranim uzorcima koštane srži (PCL pacijent 1), na mikrosredinu koštane srži (BMME) nije bilo uticaja u odgovarajućim uzorcima (podaci nisu prikazani).

Tabela 27. Vrednosti IMAX10 i IMAX1 u odnosu na maksimalnu inhibiciju rasta plazmocitnih leukemijskih ćelija pri 10 nM (IMAX10) i inhibiciju pri 1nM (IMAX1) na osnovu propidijum jodid- negativnih vijabilnih plazmocitnih leukemijskih ćelija iz aspirata koštane srži pacijenta u prisustvu anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela.

Primer 20: Preusmerena citotoksičnost T ćelija na plazmocite koštane srži pacijenta sa AL amiloidozom u prisustvu autologih T ćelija indukovanih anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskim bispecifičnim antitelima merena protočnom citometrijom

[0262] AL amiloidoza je retka bolest uzrokovana poremećajem koštane srži koja obično pogađa ljude starosti 50-80 i pri čemu su dve trećine pacijenata muškarci. AL amiloidoza se ogleda u nenormalnoj proizvodnji antitela imunoglobulinskog proteina u plazmocitima. Kod AL amiloidoze, laki lanci (LC) antitela su pogrešno savijeni, a rezultat abnormalnog pogrešno savijenog proteina LC je stvaranje amiloida. Ovi pogrešno savijeni amiloidni proteini se deponuju u, i oko, tkiva, nerava i organa. Kako amiloid raste u organu, nervu ili tkivu, on postepeno izaziva oštećenje i utiče na njihove funkcije. Kod pacijenata sa AL amiloidozom zahvaćeno je više od jednog organa. Budući da BCMA ima suštinsku ulogu u preživljavanju normalnih plazmocita, sasvim je opravdano proceniti dejstvo anti-BCMA/anti-CD3 T-ćelijskih bispecifičnih antitela na ubijanje plazmocita kod AL amiloidoze. Sveže uzeti uzorci cele koštane srži/aspirata pacijenta sa AL amiloidozom se ili direktno izlažu anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitelima ili boje CD138 magnetskim mikroperlama (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Nemačka), propuštaju kroz kolonu za razdvajanje ćelija autoMACS i sakupljene frakcije sa dovoljnim brojem preostalih plazmocita AL amiloidoze što je obično >4% koriste se za dalje

11

eksperimente. U pločama sa 24 bunarčLća, 500 000 ćelija/bunarčLću je inkubirano i gajeno 48 časova. Razblaženja anti-BCMA/anti-CD3 TCB antitela i kontrolnog antitela su dodata u odgovarajuće bunarčLće za finalnu koncentraciju TCB od 0.1 pM do 30 nM. Svaka dozna tačka urađena je u triplikatima. Vijabilnost plazmocita i ćelija mikrosredine koštane srži ispitivana je dvostrukim bojenjem propidijum jodid/CD138-FITC upotrebom protočne citometrije (FACSCalibur; Becton Dickinson). Analiza podataka urađena je upotrebom FACSDiva softvera (Becton Dickinson). Srednje vrednosti su normalizovane u odnosu na srednju vrednost triplikata odgovarajuće kontrole medijuma (MC). Za statističku analizu, korišćen je jednoparametarski ttest. Maksimalna inhibicija rasta PCL ćelija u koncentraciji od 10 nM (IMAX10) i inhibicija izmerena pri 1 nM (IMAX1), redom, date su u procentima u odnosu na kontrolu medijuma. Maksimalna inhibicija kontrolnog TCB antitela (10 ili 30 nM) u poređenju sa kontrolom medijuma je takođe izmerena. Izračunavanja su sprovedena upotrebom R 3.1.19, i Bioconductor 2.1310, a za izračunavanje vrednosti IMAX (Microsoft Excel®; Microsoft Office Professional 2013). Dejstvo je smatrano statistički značajnim ako je P-vrednost odgovarajućeg statističkog testa <5 % (*), < 1% (**) ili <0.1% (***). Merena je i ekspresija BCMA na CD138<+>plazmocitima koštane srži iz uzoraka pacijenata sa AL amiloidozom, a određen je i odnos efektorskih ćelija prema tumorskim ćelijama (E:T).

11

12

1

11

12

1

14

1

14

1

11

12

1

14

Claims

Patentni zahtevi

1. Monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za humani antigen sazrevanja B ćelija (BCMA), naznačeno time što antitelo sadrži CDR3H region sekvence SEQ ID NO:17 i CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju CDR1H, CDR2H, CDR1L i CDR2L regiona odabranu iz grupe:

a) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:25, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:26, i b) CDR1H region sekvence SEQ ID NO:21 i CDR2H region sekvence SEQ ID NO:22, CDR1L region sekvence SEQ ID NO:27, i CDR2L region sekvence SEQ ID NO:28.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što antitelo sadrži kao VH region, VH region sekvence SEQ ID NO:10 i kao VL region, VL region izabran iz grupe koja se sastoji od VL regiona sekvence SEQ ID NO: 13 i 14.

3. Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za BCMA i za humani CD3İ (u nastavku označen i kao "CD3"), naznačeno time što bispecifično antitelo sadrži CDR3H region sekvence SEQ ID NO:17 i CDR3L region sekvence SEQ ID NO:20 i kombinaciju CDR1H, CDR2H, CDR1L i CDR2L regiona odabranu iz grupe:

4. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što bispecifično antitelo sadrži, kao BCMA VH, VH region sekvence SEQ ID NO:10 i kao VL region, VL region sekvence SEQ ID NO:13, ili kao BCMA VH, VH region sekvence SEQ ID NO:10 i kao VL region, VL region sekvence SEQ ID NO:14.

5. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 3 ili 4, naznačeno time što bispecifično antitelo sadrži laki lanac i teški lanac antitela koje se specifično vezuje za CD3, pri čemu su varijabilni domeni VL i VH ili konstantni domeni CL i CH1 zamenjeni jedni drugima, pri čemu opciono varijabilni domen VH dela anti-CD3 antitela (u nastavku označen kao "CD3 VH") sadrži CDR regione teškog lanca sekvenci SEQ ID NO: 1, 2 i 3 kao, redom, CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca i varijabilni domen VL dela anti-CD3 antitela (u nastavku označen kao "CD3 VL") sadrži CDR regione lakog lanca sekvenci SEQ ID NO: 4, 5 i 6 kao, redom, CDR1, CDR2 i CDR3 lakog lanca.

6. Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za BCMA i CD3, naznačeno time što bispecifično antitelo sadrži:

a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2; i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za CD3, i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedni drugima; i

c) pri čemu je u konstantnom domenu CL prvog lakog lanca pod a) aminokiselina na poziciji 124 nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu su u konstantnom domenu CH1 prvog teškog lanca pod a) aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D),

pri čemu opciono bispecifično antitelo sadrži dodatno Fab fragment pomenutog prvog antitela (u nastavku označen i kao "BCMA-Fab") i u konstantnom domenu CL pomenutog BCMA-Fab aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu su u konstantnom domenu CH1 pomenutog BCMA-Fab aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema indeksu EU Kabata).

7. Bispecifično antitelo koje se specifično vezuje za BCMA i CD3, naznačeno time što bispecifično antitelo sadrži:

a) prvi laki lanac i prvi teški lanac prvog antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2; i b) drugi laki lanac i drugi teški lanac drugog antitela koje se specifično vezuje za CD3, i pri čemu su varijabilni domeni VL i VH u drugom lakom lancu i drugom teškom lancu drugog antitela zamenjeni jedni drugima; i pri čemu

c) u konstantnom domenu CL drugog lakog lanca pod b) aminokiselina na poziciji 124 je nezavisno supstituisana lizinom (K), argininom (R) ili histidinom (H) (numeracija prema Kabatu), i pri čemu su u konstantnom domenu CH1 drugog teškog lanca b) aminokiselina na poziciji 147 i aminokiselina na poziciji 213 nezavisno supstituisane glutaminskom kiselinom (E), ili asparaginskom kiselinom (D) (numeracija prema indeksu EU Kabata).

1

8. Bispecifično antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 7, naznačeno time što bispecifično antitelo sadrži:

a) ne više od jednog Fab fragmenta dela anti-CD3 antitela, ne više od dva Fab fragmenta dela anti-BCMA antitela i ne više od jednog Fc dela;

b) Fc deo vezan svojim N-terminalnim krajem za C-terminalni kraj pomenutog Fab fragmenta antitela protiv CD3 i za C-terminalni kraj jednog od pomenutih Fab fragmenata antitela protiv BCMA; i/ili

c) drugi Fab fragment pomenutog dela anti-BCMA antitela vezan svojim C-terminalnim krajem za N-terminalni kraj dela antitela protiv CD3 pomenutog bispecifičnog antitela, pri čemu je opciono VL domen pomenutog Fab fragmenta anti-CD3 antitela vezan za CH1 domen pomenutog drugog Fab fragmenta anti-BCMA antitela.

9. Bispecifično antitelo prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time što bispecifično antitelo sadrži set teškog i lakog lanca izabran iz grupe koja se sastoji od polipeptida

i) SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53 i SEQ ID NO:54 (2x), i

ii) SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56 i SEQ ID NO:57 (2x).

10. Postupak za pripremu antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 koji obuhvata korake:

a) transformacija ćelije-domaćina

b) vektorima koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira laki lanac i teški lanac antitela prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9;

c) kultivisanje ćelije-domaćina pod uslovima koji omogućavaju sintezu molekula pomenutog antitela; i

d) izdvajanje molekula pomenutog antitela iz pomenute kulture.

11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za upotrebu kao lek, pri čemu je opciono farmaceutska kompozicija za upotrebu kao lek u lečenju poremećaja plazmocita.

1

13. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 za upotrebu kao lek u lečenju multiplog mijeloma, sistemskog eritemskog lupusa, plazmocitne leukemije ili AL-amiloidoze.

14. Himerni antigenski receptor (CAR), naznačen time što CAR sadrži fragment prepoznavanja antigena usmeren ka BCMA i fragment aktivacije T ćelija, pri čemu je fragment prepoznavanja antigena monoklonsko antitelo ili fragment antitela prema patentnom zahtevu 1 ili 2.

15. Ćelija-domaćin koja sadrži vektore koji sadrže molekule nukleinske kiseline koja kodira antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9.

1