RS60056B1 - Epitopi f proteina respiratornog sincicijalnog virusa - Google Patents

Description

Opis

POZADINA

[0001] Respiratorni sincicijalni virus (RSV) je virus prehlade koji spada u familiju paramiksovirusa. RSV je zarazan, lako se prenosi i najčešći je uzrok bolesti donjeg respiratornog trakta kod dece mlađe od 2 godine. Do 98% dece koja pohađaju obdanište će biti zaraženo tokom jedne sezone RSV. Kod između 0,5% i 3,2% dece zaražene putem RSV javlja se potreba za hospitalizacijom. Približno 90.000 prijema u bolnicu i 4500 smrti godišnje prijavljeno je u Sjedinjenim Američkim Državama. Glavni faktori rizika za hospitalizaciju usled RSV su prevremeno rođenje, hronična bolest pluća, urođene srčane mane, ugrožen imunitet i starost manja od 6 nedelja kod inače zdrave dece. Nije dostupno efikasno lečenje RSV pozitivnog bronhiolitisa osim palijativne nege u vidu odgovarajuće ishrane i lečenja kiseonikom. Antivirusne terapije poput ribavirina nisu se pokazale efikasnim kod infekcije putem RSV. Trenutno ne postoji vakcina za profilaksu RSV.

[0002] Jedino lečenje specifično za RSV koje je danas dostupno je humanizovano monoklonsko antitelo, palivizumab (naziva se i SYNAGIS®), koje je odobreno od strane Uprave za hranu i lekove SAD za prevenciju RSV bolesti donjeg respiratornog trakta kod visokorizične novorođenčadi. Međutim, palivizumab nije uvek efikasan. Drugo monoklonsko antitelo, motavizumab, koje se ovde naziva i „mota“, dobijeno je od palivizumaba sa pojačanom antivirusnom aktivnošću. I palivizumab i motavizumab vezuju antigensko mesto A, visoko očuvani region na RSV-F proteinu između aminokiselina 258 i 275. Poznato je da većina anti-F antitela, uključujući palivizumab i motavizumab, prepoznaje epitop koji dele dve konformacije u kojima RSV-F može da se savije, metastabilni prefuzioni oblik i veoma stabilna postfuziona konformacija.

[0003] Predmetno otkriće obezbeđuje konformacioni epitop na prefuzionoj konformaciji RSV-F proteina, prepoznat od strane nedavno identifikovanog anti-RSV monoklonskog antitela D25, otkrivenog u WO 2008/147196. Ciljanjem prefuzione strukture RSV-F, koja je aktivna meta za inhibiciju fuzije posredovane putem RSV-F, predmetno otkriće takođe obezbeđuje postupak za skrining efikasnijih anti-RSV antitela koja su manje podložna neproduktivnim događajima vezivanja, te tako može pružiti bolju prevenciju ili lečenje RSV infekcije.

KRATAK REZIME

[0004] Ovde je obezbeđen konformacioni epitop na površini fuzionog proteina respiratornog sincicijalnog virusa (RSV F), pri čemu epitop sadrži najmanje 6 aminokiselina od aminokiselina 1 do 34 SEQ ID NO:7 ili aminokiselina 1 do 34 SEQ ID NO:9, pri čemu RSV F protein koji obuhvata epitop može biti specifično vezan monoklonskim antitelom D25 ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, varijantom, analogom ili derivatom, pod uslovom da je RSV F protein u prefuzionoj konformaciji.

[0005] U prvom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovani fuzioni protein kako je definisan u zahtevu 1.

[0006] U jednom razmatranju, F protein RSV u prefuzionoj konformaciji koji obuhvata epitop može biti vezan monoklonskim antitelom D25 ili njegovim fragmentom, varijantom, analogom ili derivatom sa najmanje 100 puta većim afinitetom nego F protein RSV koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu F proteina dobijenih od mutanata rezistentnih na monoklonska antitela (monoclonal antibody resistant mutants, MARM), pri čemu F proteini iz MARM sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 ili SEQ ID NO:14. Epitop se može javiti na površini F proteina humanog RSV podtipa A, i takođe na površini F proteina humanog RSV podtipa B.

[0007] U određenim razmatranjima, vezivanje mAb D25 za ovde obezbeđeni konformacioni epitop je izmenjeno ili uništeno različitim tretmanima za koje je poznato da uništavaju prefuzionu konformaciju F proteina RSV, npr. zagrevanjem, dugoročnim skladištenjem, fiksacijom ili denaturacijom.

[0008] Ovde obezbeđeni konformacioni epitop je lociran C-terminalno od heptadnog ponavljanja F proteina.

[0009] Dalje je razmatrana izolovana struktura antigen-antitelo koja obuhvata prethodno opisani konformacioni epitop; specifično vezan za mAb D25 ili njegov antigen vezujući fragment, varijantu, analog ili derivat. U određenim aspektima, struktura je kristalna struktura.

[0010] Dalje je razmatran izolovani fuzioni protein koji obuhvata fragment F proteina RSV koji se suštinski sastoji od aminokiselina 1 do 34 SEQ ID NO:7 ili aminokiselina 1 do 34 SEQ ID NO:9, i skelet polipeptida, pri čemu skelet ograničava fragment F proteina u konformaciji koja se može specifično vezati monoklonskim antitelom D25 ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, varijantom, analogom ili derivatom. U određenim razmatranjima, skelet je dobijen od proteina omotača izloženog na površini, npr. inhibitora proteaze kao što je inhibitor proteaze familije bundeva. U određenim specifičnim razmatranjima, skelet je dobijen od tripsinskog inhibitora Ecballium elaterium II (EETI-II). U određenim razmatranjima, inhibitorska petlja EETI-II je zamenjena aminokiselinama 1 do 34 SEQ ID NO:7 ili aminokiselinama 1 do 34 SEQ ID NO:9. U određenim aspektima, fuzioni protein sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5.

[0011] Dalje je obezbeđen izolovani polinukleotid koji kodira ovde obezbeđeni fuzioni protein, ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid i/ili ćelija domaćin koja obuhvata polinukleotid ili vektor.

[0012] U određenim aspektima, ovde obezbeđeni fuzioni protein može biti deo imunogene kompozicije koja obuhvata fuzioni protein i nosač, ekscipijens i/ili adjuvans.

[0013] U daljem aspektu, ovde obezbeđeni fuzioni protein može da se koristi u postupku za identifikovanje antitela anti-RSV F proteina koja se vezuju za ovde obezbeđeni konformacioni epitop, pri čemu postupak obuhvata pretragu biblioteke antitela na antitelo koje se vezuje za fuzioni protein u skladu sa zahtevima, ali se ne vezuje samo za skelet.

KRATAK OPIS CRTEŽA/SLIKA

[0014]

SLIKA 1 prikazuje vezivanje monoklonskog antitela D25 za nefiksirane i acetonom fiksirane HEp-2 ćelije inficirane virusom RSV A2 (ATCC VR-1540), u poređenju sa vezivanjem palivizumaba, motavizumaba i R347 (kao negativne kontrole).

SLIKA 2 prikazuje vezivanje motavizumaba obeleženog pomoću Eu<3+>(„mota“) i D25 za de novo ili termički tretirani RSV-F protein. Ćelije 293 stabilno transficirane F proteinom RSV A2 čuvane su na ledu ili tretirane u vodenom kupatilu tokom 15 minuta na 55°C.

SLIKA 3 prikazuje interferometrijsku analizu biosloja (Sl. 3A) za testiranje vezivanja motavizumaba („mota“) i D25 za de novo ili termički tretirani RSV-F protein (Sl.3B). R347 je korišćen kao negativna kontrola.

SLIKA 4 prikazuje spori gubitak vezivanja D25 za RSV-F protein nakon čuvanja na 4°C, u poređenju sa vezivanjem motavizumaba („mota“) za RSV-F protein u istim uslovima, kako je analizirano interferometrijom biosloja.

SLIKA 5 prikazuje interferometrijsku analizu biosloja za testiranje vezivanja motavizumaba i D25 za de novo ili termički tretirani RSV-F protein, praćeno vezivanjem za poliklonsko antitelo zečjeg anti-6-heliksnog svežnja (Sl. 5B) ili za monoklonsko antitelo C mesta anti-RSV-F 1331H (Sl. 5B umetak). Motavizumab i D25 su imobilisani na senzoru za hvatanje Fc antihumanog IgG (Sl.5A).

SLIKA 6 prikazuje poznata antigenska mesta na RSV-F proteinu. RSV-F ima najmanje šest različitih uobičajeno opisanih neutrališućih antigenskih mesta, uključujući mesta A/II, B/I i C. SLIKA 7 prikazuje test kompetitivnog vezivanja korišćenjem različitih anti-RSV-F antitela sa poznatim antigenskim mestima za identifikovanje epitopa D25. 100 ng/ml biotinom obeleženog D25 antitela je korišćeno za sve testove vezivanja. Sl. 7A-D prikazuju konkurenciju od strane poznatih anti-RSV-F antitela koja se vezuju za A/II, B/I ili C, odnosno za nepoznato mesto.

SLIKA 8 pokazuje da je aminokiselina 209 značajna za neutrališuću aktivnost antitela AM23. SLIKA 9 prikazuje poravnanje sekvenci RSV-F divljeg tipa i D25 mutanata rezistentnih na monoklonsko antitelo (MARM) u predloženom antigenskom mestu D25. Uokvirene aminokiseline ukazuju na mutaciju.

SLIKA 10 prikazuje mapiranje epitopa D25 na RSV-F proteinu. Sl. 10A je dijagram koji prikazuje lokaciju 3 aminokiselinske mutacije u identifikovanim D25 mutantima rezistentnim na monoklonsko antitelo (MARM). Sl. 10B je prostorni model koji prikazuje lokaciju identifikovanog epitopa D25 na površini RSV-F proteina. Podebljana bela strelica pokazuje identifikovani region epitopa kritičan za vezivanje D25.

SLIKA 11 prikazuje testove neutralizacije koji porede aktivnost monoklonskih antitela D25 i movatizumaba („mota“) na D25 MARM.

SLIKA 12 prikazuje testove neutralizacije na bazi ćelija sa ćelijama inficiranim putem D25 MARM od strane monoklonskih antitela palivizumaba i D25.

SLIKA 13 je dijagram koji ilustruje konstrukciju SK-epitopa. Podvučena sekvenca odgovara aminokiselinama 195-211 F proteina RSV A2, a dvostruko podvučena sekvenca odgovara aminokiselinama 212-228 F proteina RSV A2 sa supstitucijom C212S.

SLIKA 14 pokazuje poređenje vezivanja D25 za region HR1 ili za SK-epitop F proteina RSV A2, analizirano interferometrijom biosloja.

DETALJAN OPIS

Definicije

[0015] U ovom otkriću, termin za neki entitet odnosi se na jedninu ili množinu tog entiteta; na primer, „polinukleotid“ predstavlja jedan ili više polinukleotida. Kao takvi, termini „jedan“, „jedan ili više“ i „najmanje jedan“ ovde se mogu koristiti naizmenično.

[0016] Nadalje, „i/ili“, kada se ovde koristi, treba razumeti kao specifično otkriće svake od dve naznačene karakteristike ili komponente sa drugom ili bez nje. Tako, termin „i/ili“, kako se koristi u frazi poput „A i/ili B“, ovde treba da obuhvati „A i B“, „A ili B“, (samo) „A“ i (samo) „B“. Slično tome, termin „i/ili“, kako se koristi u frazi poput „A,B i/ili C“, treba da obuhvati svaki od sledećih aspekata: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; (samo) A; (samo) B; i (samo) C.

[0017] Jasno je da uvek kada su aspekti ovde opisani izrazom „obuhvata“, analogni aspekti opisani terminima „sastoji se od“ i/ili „suštinski se sastoji od“ su takođe obezbeđeni.

[0018] Ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji se ovde koriste imaju isto značenje kao što je poznato osobi sa uobičajenim znanjima u oblasti na koju se otkriće odnosi. Na primer, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2. izd., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3. izd., 1999, Academic Press; i the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, pružaju osobi sa veštinama opšti rečnik mnogih termina koji se koriste u ovom otkriću.

[0019] Jedinice, prefiksi i simboli su naznačeni u svom obliku prihvaćenom prema Međunarodnom sistemu jedinica (SI). Numerički rasponi uključuju brojeve koji definišu raspon. Osim ako nije drugačije naznačeno, aminokiselinske sekvence se pišu sleva nadesno u smeru od amino prema karboksi. Ovde dati naslovi ne predstavljaju ograničenja različitih aspekata otkrića, koji se mogu dobiti uvidom u specifikaciju kao celinu. Shodno tome, termini definisani u neposrednom nastavku su detaljnije definisani uvidom u specifikaciju kao celinu.

[0020] Kako se ovde koristi, termin „polipeptid“ treba da obuhvati „polipeptid“ u jednini kao i „polipeptide“ u množini, i obuhvata svaki lanac ili lance dve ili više aminokiselina. Tako, kako se ovde koristi, „peptid“, „fragment peptida“, „protein“, „lanac aminokiseline“, „aminokiselinska sekvenca“ ili bilo koji drugi termin koji se koristi da se ukaže na lanac ili lance dve ili više aminokiselina, generički su obuhvaćeni definicijom „polipeptida“, iako svaki od ovih termina može imati specifičnije značenje. Termin „polipeptid“ može da se koristi umesto bilo kog od ovih termina ili naizmenično sa njima. Termin dalje obuhvata polipeptide koji su podvrgnuti posttranslacionim ili postsintetičkim modifikacijama, na primer, glikozilaciji, acetilovanju, fosforilaciji, amidaciji, derivatizaciji pomoću poznatih zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkom cepanju, ili modifikacijama pomoću aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi.

[0021] Specifičnije, termin „peptidni“ fragment, kako se ovde koristi, obuhvata peptid manji od pune dužine ili njegovu varijantu ili derivat ili analog. „Peptidni fragment“, kako je ovde prikazan, npr. RSV-F peptidni fragment, može biti deo fuzionog polipeptida koji obuhvata dodatne komponente koje nisu RSV F protein, kao što je protein omotača izložen na površini korišćen kao strukturni skelet. Peptid kao što je ovde opisan takođe se može derivatizovati na brojne različite načine.

[0022] Termini „analog“, „derivat“ ili „varijanta“, kada se odnose na RSV-F peptidni fragment, uključuju svaki peptidni fragment koji zadržava barem deo željene aktivnosti, npr. vezivanja za anti-RSV antitelo.

[0023] Termin „varijanta“, kako se ovde koristi, odnosi se na peptid koji se razlikuje od navedenog peptida usled aminokiselinskih supstitucija, delecija, insercija i/ili modifikacija. Varijante mogu da se proizvedu korišćenjem tehnika mutageneze koje su poznate u struci. Varijante mogu takođe, ili alternativno, da sadrže druge modifikacije - na primer, peptid može biti konjugovan ili kuplovan, npr. spojen sa heterologom aminokiselinskom sekvencom ili drugim ostatkom, npr. radi povećanog poluživota, rastvorljivosti ili stabilnosti. Primeri za ostatke koji se konjuguju ili kupluju sa ovde obezbeđenim peptidom obuhvataju, ali nisu ograničeni na, albumin, Fc region imunoglobulina, polietilen glikol (PEG), i slično. Peptid takođe može biti konjugovan ili proizveden kao kuplovan sa linkerom ili drugom sekvencom radi lakše sinteze, prečišćavanja ili identifikacije peptida (npr. 6-His), ili radi pojačavanja vezivanja polipeptida za čvrsti nosač.

[0024] Termin „identičnost sekvence“, kako se ovde koristi, odnosi se na odnos između dve ili više sekvenci polinukleotida ili između dve ili više sekvenci peptida. Kada je pozicija u jednoj sekvenci zauzeta istom bazom nukleinske kiseline ili aminokiselinom u odgovarajućoj poziciji uporedne sekvence, za sekvencu se kaže da je „identična“ na toj poziciji. Procenat „identičnosti sekvence“ izračunava se određivanjem broja pozicija na kojima se identične baze nukleinske kiseline ili aminokiseline javljaju u obe sekvence, kako bi se dobio broj „identičnih“ pozicija. Broj „identičnih“ pozicija se zatim deli ukupnim brojem pozicija u okviru za poređenje, i množi sa 100 kako bi se dobio procenat „identičnosti sekvence“. Procenat „identičnosti sekvence“ utvrđuje se poređenjem dve optimalno poravnate sekvence u okviru za poređenje. Kako bi se sekvence za poređenje optimalno poravnale, deo sekvence polinukleotida ili polipeptida u okviru za poređenje može da sadrži adicije ili delecije koje se nazivaju praznine, dok referentna sekvenca ostaje konstantna. Optimalno poravnanje je poravnavanje koje, čak i sa prazninama, daje najveći mogući broj „identičnih“ pozicija između referentnih i uporednih sekvenci. Procenat „identičnosti sekvence“ između dve sekvence može se odrediti korišćenjem verzije programa „BLAST 2 Sequences“ koja je dostupna kod Nacionalnog centra za biotehnološke informacije od 1. septembra 2004. godine, i taj program obuhvata programe BLASTN (za poređenje sekvenci nukleotida) i BLASTP (za poređenje sekvenci polipeptida), i ti programi su zasnovani na algoritmu čiji su autori Karlin i Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(12):5873-5877, 1993). Kada se koriste „sekvence BLAST 2“, mogu da se koriste sledeći parametri koji su bili podrazumevani 1. septembra 2004.: word size (3), open gap penalty (11), extension gap penalty (1), gap drop-off (50), expect value (10), i svaki drugi potreban parametar, uključujući, bez ograničenja, opciju matrice.

[0025] Termin „antitelo“ označava molekul imunoglobulina koji prepoznaje cilj i specifično se vezuje za cilj, kao što je protein, polipeptid, peptid, ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid, ili kombinacija gorepomenutog putem najmanje jednog mesta za prepoznavanje antigena u varijabilnom regionu molekula imunoglobulina. Kako se ovde koristi, termin „antitelo“ obuhvata netaknuta poliklonska antitela, netaknuta monoklonska antitela, antigen vezujuće fragmente antitela (kao što su fragmenti Fab, Fab', F(ab')2 i Fv), jednolančane Fv (scFv) mutante, multispecifična antitela, kao što su bispecifična antitela nastala od najmanje dva netaknuta antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzione proteine koji obuhvataju antigen vezujući deo antitela, i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji obuhvata mesto za prepoznavanje antigena, sve dok antitelo ispoljava željenu biološku aktivnost. Antitelo može biti bilo koje od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, ili njihovih potklasa (izotipovi) (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), na osnovu identičnosti njihovih konstantnih domena teškog lanca koji se nazivaju alfa, delta, epsilon, gama, odnosno mu. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije.

[0026] Pod „specifično vezuje“, uobičajeno se smatra da se antitelo vezuje za epitop putem svog antigen vezujućeg domena, i da vezivanje podrazumeva određenu komplementarnost između antigen vezujućeg domena i epitopa. Prema ovoj definiciji, za antitelo se kaže da se „specifično vezuje“ za epitop kada se vezuje za taj epitop putem svog antigen vezujućeg domena lakše nego što bi se vezalo za nasumični, nevezani epitop.

[0027] Termin „anti-RSV antitelo“ ili „RSV antitelo“ odnosi se na antitelo koje je sposobno za specifično vezivanje za virus RSV.

[0028] Termin „fragment antitela“ odnosi se na deo netaknutog antitela. Specifično, „antigen vezujući fragment“ netaknutog antitela je deo antitela koji specifično može da veže antigen. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente, linearna antitela, jednolančana antitela i multispecifična antitela izgrađena od fragmenata antitela.

[0029] Termin „epitop“ se odnosi na taj deo antigena koji može da se prepozna i specifično veže konkretnim antitelom. Kada je antigen polipeptid, epitopi mogu nastati od susednih aminokiselina ili nesusednih aminokiselina koje su postavljene jedna uz drugu pomoću tercijarnog savijanja proteina. Epitopi nastali od susednih aminokiselina tipično opstaju po denaturaciji proteina, dok se epitopi nastali tercijarnim savijanjem uobičajeno gube po denaturaciji proteina. Epitop obično obuhvata najmanje 3, a uobičajenije, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji. U jednom specifičnom otelotvorenju, epitop obuhvata najmanje 6 aminokiselina.

[0030] „Linearni epitop“ ili „sekvencijalni epitop“ je epitop koji je prepoznat od strane antitela po svojoj linearnoj sekvenci aminokiselina, ili primarnoj strukturi. „Konformacioni epitop“ ili „nesekvencijalni epitop“ je epitop koji je prepoznat od strane antitela po svojoj tercijarnoj strukturi. Ostaci koji sačinjavaju ove epitope ne moraju biti susedni u primarnoj aminokiselinskoj sekvenci, ali su približeni jedan drugom u tercijarnoj strukturi molekula. Linearni i konformacioni epitopi se generalno drugačije ponašaju kada je protein denaturisan, fragmentovan ili redukovan. U određenim otelotvorenjima, konformacioni epitop se može naći na jednom obliku proteina, npr. prefuzionoj konformaciji RSV-F proteina, ali ne u drugoj konformaciji, npr. postfuzionoj konformaciji RSV-F proteina. Fragmentacija proteina ili redukcija njegovih disulfidnih veza često uništava konformacione epitope.

[0031] „Afinitet vezivanja“ se uopšteno odnosi na snagu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između pojedinačnog mesta vezivanja molekula (npr. antitela) i njegovog vezujućeg partnera (npr. antigena). Osim ako nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, „afinitet vezivanja“ se odnosi na suštinski afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para (npr. antitela i antigena). Afinitet molekula X prema njegovom partneru Y uopšteno se može predstaviti konstantom disocijacije (KD). Afinitet se može meriti uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koji su ovde opisani. Antitela malog afiniteta generalno polako vezuju antigen i lako se otpuštaju, dok antitela velikog afiniteta generalno brže vezuju antigen i duže ostaju vezana. Različiti postupci za merenje afiniteta vezivanja su poznati u struci, i bilo koji od njih može da se koristi u svrhe predmetnog otkrića. Specifična ilustrativna otelotvorenja su opisana u nastavku.

[0032] Termin „imunogena kompozicija“, kako se ovde koristi, označava bilo koju farmaceutsku kompoziciju koja sadrži RSV antigen, i ta kompozicija se može koristiti za prevenciju ili lečenje bolesti ili stanja povezanog sa RSV infekcijom kod ispitanika. Poželjna imunogena kompozicija može da indukuje, stimuliše ili pojača imunski odgovor na RSV.

[0033] Termini „kompozicija“ ili „farmaceutska kompozicija“ označavaju kompozicije koje sadrže izolovani polipeptid koji je ovde obezbeđen, zajedno sa, npr. farmaceutski prihvatljivim nosačima, ekscipijensima ili razblaživačima za primenu kod ispitanika kome je potrebno lečenje, npr. ljudskog ispitanika zaraženog RSV virusom.

1

[0034] Termin „farmaceutski prihvatljiva“ odnosi se na kompozicije koje su, u okviru zdravog medicinskog rasuđivanja, pogodne za kontakt sa tkivima ljudskih bića i životinja bez preterane toksičnosti ili drugih komplikacija srazmerno razumnom odnosu koristi/rizika.

[0035] Termin „ispitanik“ označava svakog ispitanika, posebno ispitanika koji je sisar, kome je potrebno lečenje kompozicijom koja obuhvata ovde obezbeđen izolovani polipeptid. Ispitanici koji su sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, ljude, pse, mačke, zamorce, zečeve, pacove, miševe, konje, stoku, medvede, krave, čovekolike majmune, majmune, orangutane i šimpanze, i tako dalje. U jednom otelotvorenju, ispitanik je ljudski ispitanik.

RSV F protein

[0036] Respiratorni sincicijalni virus (RSV) spada u rod Pneumovirus porodice Paramyxoviridae. Virusni genom se sastoji od jednolančanog molekula RNK negativne polarnosti koji kodira 11 proteina. Dva od ovih proteina su glavni površinski glikoproteini viriona, i to: (i) protein za vezivanje (G) koji posreduje u vezivanju virusa za ćelijsku površinu, i (ii) fuzioni protein (F) koji promoviše spajanje virusa i ćelijskih membrana tokom ulaska virusa, kao i spajanje membrana inficiranih ćelija sa okolnim ćelijama radi nastajanja sincicijuma. Dve glavne antigenske grupe, A i B, prvenstveno se izdvajaju po razlikama u G proteinu, pri čemu je grupa A najzastupljenija.

[0037] RSV-F protein je glikoprotein tipa I koji se formira kao homotrimer. Svaki monomer se sintetiše kao neaktivni prekursor (F0) koji mora da se cepa na dva polibazna mesta (I i II) kako bi postao fuziono kompetentan. F protein preuzima metastabilnu prefuzionu konformaciju u čestici virusa dok se virus ne veže za ciljnu membranu. F protein se zatim aktivira i pokreće seriju konformacionih promena, tako da do fuzije dolazi u pravo vreme i na pravom mestu. Nakon fuzije, F protein preuzima veoma stabilnu postfuzionu konformaciju prevashodno određenu formiranjem 6-heliksnog svežnja (6HB), sastavljenog od sekvenci dva heptadna ponavljanja (HR1 i HR2) iz svakog monomera. Slobodna energija oslobođena tokom prelaska F proteina iz prefuzione u postfuzionu strukturu pokreće proces fuzije membrane.

[0038] Termin „RSV-F protein“ odnosi se na prirodni ili rekombinantno nastali F protein pune dužine iz RSV virusa i njegove fragmente, varijante, analoge ili derivate. F protein RSV može biti u prefuzionoj ili postfuzionoj konformaciji. U određenim otelotvorenjima, RSV virus je humani RSV virus. U određenim otelotvorenjima, RSV virus je podtipa A. U jednom specifičnom otelotvorenju, RSV podtip A je RSV A2. U drugim otelotvorenjima, RSV virus je podtipa B. U jednom specifičnom otelotvorenju, RSV podtip B je RSV 18537. U drugom specifičnom otelotvorenju, RSV podtip B je RSV B9320.

[0039] Termin „de novo F protein“ ili „prefuzioni F protein“ odnosi se na RSV-F protein u prefuzionoj konformaciji. Pokazalo se da nativni, neaktivirani RSV-F protein postoji u metastabilnom stanju koje se može konvertovati in vitro u stabilniju, fuzogenu konformaciju šest-heliksnog svežnja putem povećanja toplotne energije, recimo zagrevanjem na 55°C do 60°C tokom 10 do 15 minuta.

[0040] Reprezentativne sekvence F proteina RSV-A (soj A2) i RSV-B (soj 18537) prikazane su u nastavku. Predviđeni signalni peptidi su dvostruko podvučeni, a regioni za koje je utvrđeno da sadrže epitop za mAb D25 su jednom podvučeni.

Sekvenca F proteina RSV-A iz soja A2 (SEQ ID NO:1)

> gi|2627305|gb|AAB86664.1| prekursor fuzionog F glikoproteina [Humani respiratorni sincicijalni virus]

Sekvenca F proteina RSV-B iz soja 18537 (SEQ ID NO:2)

> gi|222565|dbj|BAA00240.1| prekursor fuzionog proteina [Humani respiratorni sincicijalni virus]

Anti-RSV antitelo D25

[0041] Termini „monoklonsko antitelo D25“ ili „mAb D25“ odnose se na anti-RSV monoklonsko antitelo nazvano „D25“, kao i na njegov antigen vezujući fragment, varijantu, derivat i/ili analog, kako je prethodno opisano u WO 2008/147196.

[0042] Takođe su uključeni fragmenti, derivati, analozi ili varijante D25 mAb, i sve njihove kombinacije. Termini „fragment“, „varijanta“, „derivat“ i „analog“, kada se odnose na D25 mAb, označavaju svaki polipeptid koji zadržava najmanje deo antigen vezujućih svojstava odgovarajućeg antitela ili antitela polipeptida iz pronalaska. Fragmenti uključuju proteolitičke fragmente, kao i delecione fragmente, pored specifičnih fragmenata antitela koji su razmotreni u drugim delovima ovog teksta. Varijante D25 mAb uključuju fragmente koji su prethodno opisani, i takođe polipeptide sa izmenjenim aminokiselinskim sekvencama usled aminokiselinskih supstitucija, delecija ili insercija. Varijante se mogu javiti u prirodi, ili su one koje ne postoje u prirodi. Varijante antitela mogu da sadrže konzervativne ili nekonzervativne aminokiselinske supstitucije, delecije ili adicije. Kako se ovde koristi, „derivat“ D25 mAb se odnosi na antitelo ili njegov fragment sa jednim ili više ostataka koji su hemijski derivatizovani putem reakcije funkcionalne bočne grupe. Analog D25 mAb ima analogna svojstva. To se, na primer, postiže putem pretrage biblioteke peptida ili biblioteke displeja faga za D25 analoge koji se vezuju za konformacioni epitop koji je ovde obezbeđen.

Epitopi RSV-F proteina

[0043] Kako je pokazano u Primerima, mAb D25 se vezuje za konformacioni epitop na prefuzionom obliku F proteina RSV. D25 se ne vezuje u velikoj meri za rastvorljivi F protein. D25 se vezuje za površinu nefiksiranih ćelija inficiranih putem RSV, ali se ne vezuje za fiksirane inficirane ćelije. Pored toga, D25 se ne vezuje za površinu inficiranih ćelija koje su zagrevane, in vitro tretmanom koji dovodi do toga da F protein RSV poprimi postfuzionu konformaciju.

[0044] Ovo otkriće razmatra konformacioni epitop na površini fuzionog proteina respiratornog sincicijalnog virusa (RSV F), koji obuhvata najmanje 6 aminokiselina od aminokiselina 1 do 34 SEQ ID NO:7 (tj. aminokiselina 195 do 228 SEQ ID NO:1) ili aminokiselina 1 do 34 SEQ ID NO:9 (tj. aminokiselina 195 do 228 SEQ ID NO:2). Kako je ovde obezbeđeno, F protein

1

RSV koji obuhvata epitop može biti specifično vezan monoklonskim antitelom D25 ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, analogom, varijantom ili derivatom, pod uslovom da je F protein RSV u prefuzionoj konformaciji.

[0045] U određenim otelotvorenjima, F protein RSV u prefuzionoj konformaciji koji obuhvata konformacioni epitop, kako je ovde obezbeđeno, može biti vezan monoklonskim antitelom D25 ili njegovim fragmentom, varijantom, analogom ili derivatom sa najmanje 100 puta većim afinitetom od F proteina RSV koji obuhvata aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 ili SEQ ID NO:14 (MARM mutanti).

[0046] Konformacioni epitop, kako je ovde obezbeđeno, može se nalaziti na površini F proteina humanog RSV podtipa A, npr. iz RSV soja A2 ili F proteina humanog RSV podtipa B, npr. iz RSV soja 18537.

[0047] Takođe se razmatra i izolovana struktura koja obuhvata konformacioni epitop, kako je ovde obezbeđen i prethodno opisan, pri čemu je epitop specifično vezan za monoklonsko antitelo D25 ili njegov antigen vezujući fragment, varijantu, analog ili derivat. U određenim otelotvorenjima, struktura je kristalna struktura.

[0048] Takođe se razmatra i izolovani fuzioni protein koji obuhvata konformacioni epitop, kako je ovde obezbeđeno. U određenim otelotvorenjima, fuzioni protein uključuje fragment F proteina RSV koji obuhvata, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od aminokiselina 1 do 34 SEQ ID NO:7 ili aminokiselina 1 do 34 SEQ ID NO:9 i polipeptidnog skeleta. U skladu sa pronalaskom, fuzioni protein je ograničen konformacijom koja može biti specifično vezana monoklonskim antitelom D25 ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, varijantom, analogom ili derivatom. U određenim razmatranjima, skelet može da sadrži protein omotača izložen na površini. U nekim razmatranjima, protein omotača izložen na površini je inhibitor proteaze, kao što je onaj iz familije Kunicovih inhibitora proteaze ili familije inhibitora proteaze iz bundeve. U skladu sa razmatranjem, protein skeleta je tripsinski inhibitor Ecballium elaterium II (EETI-II). Christmann, i sar. Protein Eng. 12:797-806 (1999). U određenim razmatranjima, inhibitorska petlja EETI-II je zamenjena aminokiselinama 1 do 34 SEQ ID NO:7 ili aminokiselinama 1 do 34 SEQ ID NO:9. U određenim otelotvorenjima, fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5.

[0049] Svaki od peptida koji se ovde razmatraju može biti deo fuzionog peptida, pri čemu je RSV-F epitop konformaciono ograničen u strukturnom skeletu. Fuzioni peptid može i ne mora da sadrži sekvence linkera. U nekim razmatranjima, epitop je spojen sa proteinom omotača izloženim na površini.

[0050] U jednom otelotvorenju, inhibitorska petlja EETI-II (koja odgovara ostacima 3-8) zamenjena je ostacima 195-228 SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:2. U specifičnijem razmatranju, supstituisan je cistein na poziciji 212 RSV-F proteina.

[0051] Takođe je obezbeđen izolovani polinukleotid koji kodira bilo koji od ovde opisanih fuzionih proteina. Dalje je obezbeđen vektor, npr. ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid, i ćelija domaćin koja obuhvata polinukleotid ili vektor.

[0052] Takođe se razmatra rekombinantni antigen RSV koji obuhvata fuzioni peptid kako je ovde opisano. U određenim otelotvorenjima, fuzioni protein, kako je ovde obezbeđeno, može biti formulisan kao imunogena kompozicija koja, kada se primeni kod ispitanika kome je to potrebno, može izazvati imunski odgovor na RSV. U određenim razmatranjima, imunogena kompozicija sadrži jedan ili više nosača, ekscipijenasa ili adjuvanasa.

[0053] Kompozicije iz otkrića mogu biti formulisane u skladu sa poznatim postupcima. Pogodni postupci pripreme su opisani, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences,19. izdanje, A.R. Gennaro, izd., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995. Kompozicija može biti u različitim oblicima, uključujući, bez ograničenja, vodeni rastvor, emulziju, gel, suspenziju, liofilizovani oblik, ili bilo koji drugi oblik poznat u struci. Pored toga, kompozicija može da sadrži farmaceutski prihvatljive aditive uključujući, na primer, razblaživače, vezivače, stabilizatore i konzervanse. Nakon formulisanja, kompozicije kako su ovde obezbeđene mogu se neposredno primeniti na ispitaniku.

[0054] Nosači koji se mogu koristiti sa ovde obezbeđenom kompozicijom su dobro poznati u struci i uključuju, bez ograničenja, npr. tiroglobulin, albumine poput albumina ljudskog seruma, tetanus toksoid, i poliaminokiseline kao što su poli L-lizin, poli L-glutaminska kiselina, protein jezgra virusa influence, hepatitisa B, i slično. Mogu se koristiti različiti vodeni nosači, npr. voda, puferovana voda, 0,8% fiziološki rastvor, 0,3% glicin, hijaluronska kiselina, i slično. Kompozicije takođe mogu biti sterilisane uobičajenim, dobro poznatim tehnikama sterilizacije,

1

ili mogu biti sterilno filtrirane. Dobijena kompozicija može biti zapakovana za upotrebu u datom stanju ili liofilizovana, pri čemu se liofilizovani preparat kombinuje sa sterilnim rastvorom pre primene. Kompozicije mogu po potrebi da sadrže farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance kako bi se dobili uslovi približni fiziološkim, kao što su agensi za podešavanje pH i puferovanje, agensi za prilagođavanje toničnosti, kvašljivci i slično, na primer, natrijum acetat, natrijum laktat, natrijum hlorid, kalijum hlorid, kalcijum hlorid, sorbitan monolaurat, trietanolamin oleat, itd.

[0055] U određenim razmatranjima, fuzioni protein, kako je obezbeđeno ovde, može da se koristi u postupku za identifikovanje antitela anti-RSV F proteina koja se vezuju za isti konformacioni epitop kao što je ovde opisano, i stoga su analogna sa D25 mAb. Na primer, fuzioni protein može da se koristi za pretragu biblioteke antitela na antitela koja se vezuju za fuzioni protein, ali se ne vezuju samo za protein skeleta. Biblioteke antitela i postupci panovanja i/ili pretrage za antitela koja se specifično vezuju za konkretni antigen su dobro poznati osobama sa uobičajenim znanjima u struci.

[0056] Neke sekvence RSV-F epitopa koje se koriste u razmatranjima su navedene u Tabeli 1 u nastavku.

Tabela 1. Sekvence heptadnih ponavljanja za konstrukte RSV-F proteina

1

[0057] Primena predmetnog pronalaska će koristiti, ako nije drugačije naznačeno, uobičajene tehnike ćelijske biologije, ćelijskog uzgajanja, molekularne biologije, transgene biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su pokrivene znanjima u struci. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Pogledajte, na primer, Sambrook i sar. izd. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2. izd.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook i sar. izd. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover izd., (1985) DNA Cloning, Volumes I i II; Gait, izd. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis i sar. U.S. Pat. Br.4,683,195; Hames i Higgins, izd. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames i Higgins, izd. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller i Calos izd. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu i sar. izd., Methods In Enzymology, Vols. 154 i 155; Mayer i Walker, izd. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir i Blackwell, izd., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); i u Ausubel i sar. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

[0058] Opšti principi konstruisanja antitela su dati u Borrebaeck, izd. (1995) Antibody Engineering (2. izd.; Oxford Univ. Press). Opšti principi konstruisanja proteina su dati u Rickwood i sar. izd. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Opšti principi antitela i vezivanja antitelo-hapten su dati u: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2. izd.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); i

1

Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.). Pored toga, standardni postupci u imunologiji poznati u struci koji nisu specifično opisani generalno se prate kao u Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites i sar., izd. (1994) Basic and Clinical Immunology (8. izd; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) i Mishell i Shiigi (izd) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).

[0059] Standardni referentni radovi koji postavljaju generalne principe imunologije uključuju Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett i sar., izd. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" u Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, izd. Burden i sar. (Elsevere, Amsterdam); Goldsby i sar. izd. (2000) Kuby Immunnology (4. izd.; H. Freemand & Co.); Roitt i sar. (2001) Immunology (6. izd.; London: Mosby); Abbas i sar. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5. izd.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann i Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook i Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall2003); Harlow i Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach i Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

[0060] Sledeći primeri su dati kao ilustracija, i ne treba ih tumačiti kao ograničavajuće.

Primeri

Primer 1

D25 se vezuje za ćelije koje eksprimiraju prefuzioni oblik RSV-F proteina

[0061] Kako bi se razumeli zahtevi za vezivanje za neutralizacioni epitop prepoznat od strane antitela D25, upotrebljene su brojne strategije.

[0062] Prvo, sproveden je ELISA test kako bi se testiralo vezivanje D25 za fiksirane acetonom ili nefiksirane HEp-2 ćelije inficirane virusom RSV-A2 (ATCC VR-1540), kako bi se utvrdilo da li se D25 vezuje za prefuzionu ili postfuzionu konformaciju RSV-F proteina. Vezivanje

1

druga dva monoklonska antitela anti-RSV-F proteina, palivizumaba i motavizumaba, takođe je testirano. R347 je korišćen kao negativna kontrola vezivanja.

[0063] HEp2 (ATCC CCL-23) su uzgajane do 90% konfluencije u EMEM medijumu sa dodatkom 5% FBS na ploči sa 96 bunarčića. Ćelije su inficirane višestrukom infekcijom od 0,5-1,0 (pod pretpostavkom da je ukupan broj ćelija po bunarčiću ∼5× 10<4>) RSV A2 virusa (ATCC VR-1540). Nakon 24 sata infekcije, medijum je uklonjen i ćelije su fiksirane za ploču putem sušenja (nefiksirane) ili tretiranjem 20 minuta 80% acetonom, a zatim sušenjem. Inficirani ćelijski slojevi su blokirani 1% kazeinskim blokom (Thermo) tokom 1 sata pre inkubacije sa antitelom razblaženim u kazeinu u opsegu od 1000 ng/ml do 1 ng/ml. Antitelo je inkubirano 1 sat na sobnoj temperaturi, isprano sa PBS/0,1% Tween-20 i inkubirano pri razblaženju 1:10.000 antitela antihumanog HRP konjugata (Jackson Immuno-research) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane i razvijene korišćenjem reagensa SureBlue Reserve (KPL). Apsorbanca je merena na 450 nm.

[0064] Kao što je prikazano na Sl. 1A, D25 se vezuje za nefiksirane HEp-2 ćelije inficirane putem RSV-A2 na način zavisan od koncentracije, ali pokazuje neznatno vezivanje za acetonom fiksirane HEp-2 ćelije inficirane putem RSV-A2 (Sl. 1B), dok se palivizumab i motavizumab vezuju i za fiksirane i za nefiksirane ćelije na sličan način.

Primer 2

D25 se ne vezuje za termički tretirani RSV-F protein

[0065] Da bi se potvrdilo da D25 prepoznaje samo konformacioni epitop na prefuzionom RSV-F proteinu, vezivanje D25 obeleženog pomoću Eu<3+>je testirano na nezagrevanom de novo RSV-F proteinu koji predstavlja prefuzioni oblik, ili na zagrevanom (obrnutom) RSV-F proteinu koji je sličan postfuzionom obliku.

[0066] Stabilno transficirana linija 293 koja eksprimira sekvencu F proteina RSV A2 pod dejstvom promotera koji se može indukovati tetraciklinom (TREx-F ćelije) prethodno je opisana u Huang, K. i sar. Virus Genes 40:212-221 (2010). Motavizumab, D25 i R347 (kao negativna kontrola) obeleženi su pomoću Eu<3+>korišćenjem Delfia Eu-N1-ITC helata za obeležavanje, i okarakterisani su prema smernicama proizvođača (Perkin Elmer). TREx-F ćelije su uzgajane do konfluencije, i ekspresija F proteina je indukovana tetraciklinom pri 15

1

µg/ml tokom 20 h nakon indukcije. Ćelije su zatim sakupljene i ponovo suspendovane do ∼1 × 10<7>vijabilnih ćelija/ml u 50% medijumu/50% LR puferu za vezivanje (sistem pufera na bazi Tris, Perkin Elmer). Ćelije su držane na ledu ili tretirane u vodenom kupatilu 15 minuta na 55°C. Približno 1 × 10<5>ćelija je pomešano sa 25 nM motavizumaba obeleženog pomoću Eu<3+>, D25 ili R347 u LR puferu za vezivanje u reakcionoj zapremini od 100 µl. Ćelije sa monoklonskim antitelom su inkubirane 1 h na 4°C, a zatim dodate na ploče Pall GHP za vakuum filtraciju. Nevezano monoklonsko antitelo je isprano sa 5 × 200 µl ispiranja Delfia test puferom za ispiranje (Perkin Elmer) i fluorescencija Eu<3+>je oslobođena dodavanjem 200 µl pojačavajućeg rastvora (Perkin Elmer). Vremenski razložena fluorescencija je očitana na čitaču Envision (Perkin Elmer) nakon 1 h inkubacije na 37°C uz blago trešenje. Broj Eu<3+>je konvertovan u vezane ng IgG, i specifično vezani motavizumab ili D25 su izračunati oduzimanjem nespecifičnog vezivanja R347 od ukupnog vezivanja.

[0067] Kako je prikazano na Sl. 2, zagrevanje ćelija 293 koje eksprimiraju RSV-F na 55°C tokom 15 minuta skoro u potpunosti je ukinulo vezivanje D25 za ćelije (Sl.2B), uz neznatno smanjeno vezivanje motavizumaba (Sl. 2A). Stoga, rezultat ovog testa vezivanja ćelija potvrđuje da D25 reaguje na konformacioni epitop koji postoji samo u prefuzionom obliku RSV-F proteina.

Primer 3

Studije vezivanja D25 pomoću interferometrijske analize biosloja

[0068] Interometrijska analiza biosloja je korišćena za utvrđivanje efekta konformacione promene RSV-F proteina putem zagrevanja ili dugotrajnog čuvanja na 4°C na vezivanje D25 za RSV-F protein.

[0069] Kao što je prikazano na Sl. 3A, da bi se testiralo dejstvo zagrevanja, monoklonsko antitelo 1331H, koje reaguje na definisanom C mestu F proteina RSV (Yunus i sar. Virology, 396(2): 226-237 (2010); Beeler i Coelingh, Journal of Virology, 63(7): 2941-2950 (1989)), vezano je za antimišji Fc senzor za hvatanje (ForteBio). Senzori su prvo inkubirani sa RSV-F proteinom koji je zagrevan na 60°C tokom 10 minuta ili nezagrevan (de novo), zatim prebačeni u bunarčiće koji sadrže motavizumab, R347 (negativnu kontrolu). Vezivanje antitela za kompleks senzor 1331H sF je detektovano kao deflekcija očitavanja signala kao promena u nm svetlosti (Δnm).

2

[0070] Kao što je prikazano na Sl. 3B, u skladu sa rezultatima vezivanja ćelija u Primeru 2, vezivanje D25 za RSV-F protein je skoro u potpunosti ukinuto kada je F protein zagrevan, dok se motavizumab vezivao i za de novo i za zagrevane RSV-F proteine.

[0071] Slično tome, da bi se testiralo dejstvo dugotrajnog čuvanja na 4°C, kompleks senzor 1331H je prvo inkubiran sa RSV-F proteinom koji je čuvan na 4°C u CD CHO medijumu tokom 6 do 7 nedelja ili nije čuvan, zatim prebačen u bunarčiće koji sadrže D25 ili motavizumab, i izmerena je vrednost Δnm.

[0072] Sl.4 pokazuje da je došlo do sporog gubitka vezivanja D25 za RSV-F protein kada je čuvan na 4°C u CD CHO medijumu, verovatno usled konformacione promene F proteina. Nasuprot tome, motavizumab nije pokazao gubitak vezivanja nakon čuvanja tokom 7 nedelja na 4°C, što je u skladu sa nalazima da prepoznaje nekonformacioni epitop.

[0073] Stoga, rezultat ovog testa vezivanja ćelija potvrđuje da D25 reaguje na konformacioni epitop koji postoji samo u prefuzionom obliku RSV-F proteina.

Primer 4

D25 se ne takmiči sa antitelom anti-6-heliksnog svežnja

[0074] Interferometrijska analiza biosloja je korišćena za dalje utvrđivanje lokacije D25 epitopa, naročito, da se testira da li se D25 takmiči sa drugim RSV antitelima sa dobro okarakterisanim regionima epitopa.

[0075] Kao što je prikazano na Sl. 5A, D25, motavizumab ili antitelo R347 kao negativna kontrola vezuju se za Fc senzor za hvatanje antihumanog IgG (ForteBio) u koncentraciji od 1,5 µg/ml. Senzori su pomereni u bunarčić koji sadrži kinetički pufer (ForteBio) kako bi se uspostavila osnovna vrednost pre pomeranja u bunarčić koji sadrži sF koji sadrži CHO medijum koji je zagrevan na 60°C tokom 10 minuta ili nije tretiran. Senzori su prebačeni u sledeći bunarčić koji sadrži ili 30 µg/ml afinitetno prečišćenog zečjeg poliklonskog IgG reaktivnog na šest heliksni svežanj postfuzionog oblika F proteina RSV ili 15 µg/ml mAb 1331H, antitela koje reaguje na definisanom C mestu F proteina RSV (Yunus i sar. Virology, 396(2): 226-237 (2010); Beeler i Coelingh, Journal of Virology, 63(7): 2941-2950 (1989)). Od svih krivih vezivanja je oduzeta osnovna vrednost u odnosu na antitelo negativne kontrole. Vezivanje proteina za senzor je detektovano kao deflekcija očitavanja signala kao promena u nm svetlosti (Δnm).

[0076] Rezultati prikazani na Sl. 5B potvrđuju da se D25 vezao za nezagrevani (prefuzioni) RSV-F protein, ali ne za termički tretirani (postfuzioni) F protein koji se snažno vezivao za antitelo zečjeg anti-6-heliksnog svežnja (6xHB). Umetak na Sl.5B pokazuje da D25 i 1331H prepoznaju različite epitope na prefuzionom obliku RSV-F proteina.

Primer 5

D25 se ne takmiči sa antitelima koja se vezuju za antigenska mesta A, B ili C

[0077] RSV-F protein ima najmanje 6 različitih uobičajeno opisanih neutrališućih antigenskih mesta. Prethodno identifikovana anti-RSV monoklonska antitela, palivizumab (SYNAGIS®), motavizumab, 1153, 1121, 13/19, 92-11C, 131-2A, 1331H i 1308F, vezuju se za dobro okarakterisana antigenska mesta A/II, B/I ili C, kako je prikazano na Sl.6.

[0078] Kako bi se utvrdilo da li se D25 vezuje za bilo koji od ovih dobro okarakterisanih antigenskih regiona, testovi kompetitivnog vezivanja su sprovedeni da bi se ispitalo da li bilo koje od prethodno pomenutih anti-RSV antitela može da se takmiči sa D25 za njegovo antigensko mesto. 100 ng/ml biotinom obeleženog D25 antitela je korišćeno u svim testovima vezivanja. Neobeleženi D25 je korišćen kao pozitivna kontrola, a R347 je korišćen kao negativna kontrola. Apsorbanca je merena na 450 nm.

[0079] Kako je prikazano na Sl.7A-C, nijedno od antitela za koja je poznato da se vezuju za antigensko mesto A, B ili C nije moglo da se takmiči sa D25 u vezivanju za RSV-F protein, što ukazuje na to da se D25 ne vezuje za mesto A, B ili C. Sa druge strane, kako je prikazano na Sl. 7D, nekoliko anti-RSV-F antitela sa nepoznatim antigenskim mestima, naime AM22 i AM23, efektivno se takmičilo sa D25 u testu vezivanja, što sugeriše da se epitop D25 preklapa sa epitopima AM22 i AM23. AM23 se takmičio sa D25 efikasnije nego AM22, što ukazuje na to da njegov epitop može biti sličniji epitopu D25.

[0080] AM22 i AM23 su prethodno objavljeni u US 2012/0070446 A1, odnosno US 2010/0239593 A1. Prethodno je otkriveno da AM23 nije neutralisao nijedan od sojeva RSV B osim jednog kliničkog izolata (CP096-B15). Takođe je pokazano da je aminokiselina 209 značajna za neutrališuću aktivnost AM23 (Sl.8). Generalno, ovi rezultati ukazuju na to da se D25 može vezati za antigenski region uključujući aminokiselinu 209.

Primer 6

Mapiranje D25 epitopa

[0081] Ovaj primer prijavljuje nastajanje serije mutanata rezistentnih na monoklonsko antitelo (MARM) koji se ne mogu neutralisati pomoću D25, da bi se dalje odredilo koje aminokiseline RSF-F proteina su ključne za vezivanje D25.

[0082] Ova analiza je obavljena na izolatu A i izolatu B virusa RSV. Ukratko, 1-5 ×10<6>pfu/ml RSV A2 ili RSV B virusa 18537 je inkubirano u 450 ng/ml (200×IC50) D25 mAb tokom 1 sata pre infekcije konfluentnih HEp2 ćelija na ploči sa 24 bunarčića. Do 6 dana posle infekcije ploče su zamrznute i otopljene kako bi se otpustio virus, i supernatanti iz ovog procesa su presejani u novi konfluentni sloj Hep2 ćelija nakon 2 sata inkubacije sa 450 ng/ml D25. Treće presejavanje je izvršeno kako je opisano za drugo presejavanje. Prinos virusa nakon 3 kruga selekcije bio je 8 × 10<5>do 3 × 10<6>za virus A2 i 1,3 × 10<4>do 5 × 10<4>za virus B. Nakon trećeg presejavanja, ćelije su zadržane, lizirane, i ukupna RNK je izolovana iz ćelija. Gen F proteina je amplifikovan putem PCR i sekvenciran.

[0083] Izolovano je osam MARM D25 (RSV MARM A1-A5 i B1-B3). Otkriveno je da MARM A1-A5 imaju iste mutacije (Sl.9). Otkriveno je da MARM B2 i B3 imaju iste mutacije (Sl. 9).

[0084] Mutantni F proteini za RSV MARM A1, B1 i B2 su prikazani u nastavku i na Sl.10A. Signalni peptid je dvostruko podvučen, region koji sadrži konformacioni epitop u RSV F A2 proteinu divljeg tipa je podvučen. Mutantna aminokiselina za svaki mutant je prikazana PODEBLJANO.

Sekvenca MARM A1 F proteina (SEQ ID NO:12)

2

[0085] Mutacije se nalaze u aminokiselini N208Y za MARM A1 mutantni virus, aminokiselini N201D u MARM B1 mutantnom virusu, i aminokiselini L204V u MARM B2 virusu. Ovaj region (podvučen u prethodnim sekvencama) je C-terminalni za definisana heptadna ponavljanja F proteina koja su kritična za fuzioni proces proteina. Ovaj identifikovani region epitopa D25 (naznačen podebljanom belom strelicom na Sl. 10B) je na površini RSV-F proteina.

[0086] Sekvence su upoređene u Tabeli 2 u nastavku:

Tabela 2: Sekvence D25 MARM u poređenju sa sekvencama RSV-F proteina divljeg tipa (mutirani ostaci su podebljani i podvučeni)

Primer 7

Test neutralizacije MARM D25

[0087] Test mikroneutralizacije RSV je obavljen da se ispitaju izolovani MARM D25. Bio je to ELISA test na bazi ćelija u kome su HEp-2 ćelije obojene za ekspresiju divljeg tipa ili mutiranih F proteina, i testirane su na vezivanje antitela.

[0088] Prvo, monoklonsko antitelo motavizumab je upoređeno sa D25 na neutrališuću aktivnost za sve identifikovane MARM D25. Razblaženja D25 ili motavizumaba (1-1000 ng/ml) korišćena su u testu neutralizacije, a divlji tip RSV virusa je korišćen kao pozitivna kontrola. Kao što je prikazano na Sl. 11, motavizumab je mogao da neutrališe i RSV viruse divljeg tipa i sve MARM D25, sa 100 ng/ml ili manje motavizumaba (Sl.11C i 11D), dok je D25 mogao da neutrališe samo viruse divljeg tipa, ali nijedan od MARM, kada je korišćeno 1-1000 ng/ml D25 (Sl.11A i 11B).

2

[0089] Slični eksperimenti su obavljeni poređenjem neutrališuće aktivnosti D25 i palivizumaba. Razblaženja D25 ili palivizumaba (0,01 µg/ml do 10 mg/ml) korišćena su u testu mikroneutralizacije, a divlji tip RSV virusa je korišćen kao pozitivna kontrola. Kao što je prikazano na Sl.12, oko 1 µg/ml D25 je mogao da neutrališe RSV virus divljeg tipa, a oko 100 µg/ml palivizumaba je moglo da neutrališe sva tri MARM D25. I MARM B1 i MARM B2 D25 su bili potpuno neosetljivi na D25 neutralizaciju (13B i 13C), što ukazuje na to da su aminokiseline na poziciji 201 i 204 kritične za vezivanje D25. S druge strane, D25 je mogao da neutrališe MARM A2, ali sa najmanje 100-struko većom koncentracijom od one koja je potrebna za neutralizaciju A2 divljeg tipa.

Primer 8

Konstruisanje HR1 i SK epitopa

[0090] Kao što je pomenuto u Primeru 5, identifikovani region ključan za vezivanje D25 je C-terminalni za definisani HR1 F proteina koji je važan za fuzioni proces proteina. Stoga, konstrukt koji sadrži region HR1 (Tabela 1B) je načinjen kako bi se testiralo vezivanje D25.

[0091] Nadalje, čini se da ekstenzija C-terminusa i skraćivanje N-terminusa heptadnog ponavljanja u ograničenom konstruktu može bolje predstavljati prefuzionu strukturu epitopa D25. Ovaj konstrukt nazvan SK-epitop sadrži aminokiseline 195-228 RSV-F proteina iz A2 u prvoj petlji konstrukta čvora bundeve (squash knot, SK) tripsinskog inhibitora Ecballium elaterium II (EETI-II), kao što je prikazano na Sl. 13. Cistein na poziciji 212 RSV-F proteina je supstituisan serinom.

[0092] Ovi konstrukti su eksprimirani u E. coli i proteini su prečišćeni za testove vezivanja. Primer 9

D25 se snažnije vezuje za SK-epitop nego za region HR1

[0093] Interferometrijska analiza biosloja je sprovedena radi poređenja afiniteta vezivanja D25 za SK-epitop i region HR1. D25 je nanet na Fc senzor za hvatanje antihumanog IgG u koncentracijama u opsegu od 1,5625 nM do 100 nM. Senzori su prebačeni u kinetički pufer radi utvrđivanja osnovne vrednosti, zatim prebačeni u bunarčić koji sadrži ili fragment HR1 ili konstrukt SK-epitopa.

2

[0094] Kao što je prikazano na Sl. 14, D25 se vezuje i za HR1 i za SK-epitop na način koji zavisi od koncentracije. Međutim, D25 je ispoljio veći afinitet prema SK-epitopu nego prema HR1, kako je naznačeno izračunatim vrednostima KD(58,5 pM za SK-epitop naspram 1,9 nM za HR1).

2

2

�

�

2

4

4

�

�

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Izolovani fuzioni protein, fuzioni protein koji obuhvata fragment F proteina RSV i ne-RSV protein,

pri čemu se fragment F proteina RSV sastoji od aminokiselina 195 do 228 SEQ ID NO:1, aminokiselina 195 do 228 SEQ ID NO:2, aminokiselina 1 do 34 SEQ ID NO:7 ili aminokiselina 1 do 34 SEQ ID NO:9,

pri čemu ne-RSV protein sadrži inhibitor proteaze familije bundeva Ecballium elaterium tripsinskog inhibitora II (EETI-II),

pri čemu je inhibitorska petlja EETI-II zamenjena fragmentom F proteina RSV i

pri čemu je fuzioni protein ograničen u konformaciji koja može biti specifično vezana monoklonskim antitelom D25 ili njegovim antigen vezujućim fragmentom, varijantom, analogom ili derivatom.

2. Fuzioni protein iz zahteva 1, pri čemu je cistein koji odgovara aminokiselinskom položaju 212 RSV-F proteina supstituisan serinom.

3. Fuzioni protein iz zahteva 2 koji obuhvata sekvencu SEQ ID NO: 5.

4. Izolovani polinukleotid koji kodira fuzioni protein iz bilo kog od zahteva 1-3.

5. Ekspresioni vektor koji obuhvata polinukleotid iz zahteva 4.

6. Ćelija domaćin koja obuhvata polinukleotid iz zahteva 4, ili vektor iz zahteva 5.

7. Imunogena kompozicija koja obuhvata fuzioni protein iz bilo kog od zahteva 1-3, i nosač.

8. Postupak za identifikovanje anti-RSV antitela F proteina, koji obuhvata pregledanje biblioteke antitela za antitelo koje se vezuje za fuzioni protein iz bilo kog od zahteva 1-3, ali se ne vezuje samo za ne-RSV protein.

4