RS60080B1 - Metodi lečenja tauopatije - Google Patents

Metodi lečenja tauopatije

Info

Publication number
RS60080B1
RS60080B1 RS20200245A RSP20200245A RS60080B1 RS 60080 B1 RS60080 B1 RS 60080B1 RS 20200245 A RS20200245 A RS 20200245A RS P20200245 A RSP20200245 A RS P20200245A RS 60080 B1 RS60080 B1 RS 60080B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
amino acid
tau
acid sequence
Prior art date
Application number
RS20200245A
Other languages
English (en)
Inventor
Irene Griswold-Prenner
Nancy E Stagliano
Vu Dang
Original Assignee
Ipierian Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ipierian Inc filed Critical Ipierian Inc
Publication of RS60080B1 publication Critical patent/RS60080B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/02—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by the carrier, i.e. characterised by the agent or material covalently linked or complexing the radioactive nucleus
    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
    • A61K51/10—Antibodies or immunoglobulins; Fragments thereof, the carrier being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. a camelised human single domain antibody or the Fc fragment of an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4709—Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)

Description

Opis
UVOD
[0001] Tau protein pridružen mikrotubulama visoko je zastupljen u centralnom nervnom sistemu i proizvode ga prvenstveno neuroni. Primarna funkcija tau je stabilizacija mikrotubula. U mozgu odraslog čoveka postoji šest izoformi tau proteina; tau izoforme su proizvodi alternativog splajsovanja jednog gena. Monoklonska antitela Tau-12 i Tau-13, kao i upotrebu Tau-13 u ispitivanju skraćivanja tau proteina tokom napredovanja Alzheimerove bolesti opisali su Garcia-Sierra et al. (Journal of Alzheimer's Disease 5:65-77, 2003). U ovoj publikaciji Garcia-Sierra et al. opisano je da se Tau-12 i Tau-13 vezuju za rezidue 9-18 N-terminusa tau proteina.
[0002] Tauopatije predstavljaju klasu neurodegenerativnih bolesti koje nastaju usled patološke agregacije tau proteina u takozvanim neurofibrilarnim klupčićima (neurofibrillary tangles, NFT) u mozgu. Neki primeri tauopatija uključuju frontotemporalnu demenciju (frontotemporal dementia, FTD), Alzheimerovu bolest, progresivnu supranuklearnu palsiju, kortikobazalnu degeneraciju, i degeneraciju frontotemporalnog lobusa.
[0003] U struci postoji potreba za metodima lečenja tauopatija, kao i za reagensima pogodnim za korišćenje u tim metodima.
[0004] Boutajangout et al. (J. Neurochem (2011) 118(4):658-667) izučavaju pasivnu imunizaciju korišćenjem PHF1 antitela u mišjem modelu.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0005] Predmetna objava obezbeđuje metode lečenja tauopatije, koji uključuju primenu anti-Tau antitela. Predmetna objava obezbeđuje i anti-Tau antitela, i formulacije koje ih sadrže, za upotrebu u metodima.
OSOBINE
[0006] Predmetna objava obezbeđuje izolovano humanizovano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za epitop u okviru amino-kiselina 15-24 Tau polipeptida. U nekim slučajevima, epitop ne uključuje fosforilisanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, epitop ne uključuje nitrovanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, epitop uključuje fosforilisanu aminokiselinu, nitrovanu amino-kiselinu, ili i fosforilisanu amino-kiselinu i nitrovanu amino-kiselinu.
[0007] Predmetna objava obezbeđuje izolovano antitelo koje uključuje region okvira humanizovanog lakog lanca; i region okvira humanizovanog teškog lanca, pri čemu izolovano antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom na N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12. U nekim slučajevima, region lakog lanca i region teškog lanca prisutni su u zasebnim polipeptidima. U nekim slučajevima, region lakog lanca i region teškog lanca prisutni su u jednom polipeptidu. U nekim slučajevima, region teškog lanca je izotipa IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. U nekim slučajevima, region teškog lanca je izotipa IgG4. U nekim od ovih primera izvođenja, region zgloba uključuje S241P supstituciju. Vidi, npr., Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105. U nekim slučajevima, antitelo je Fv, scFv, Fab, F(ab')2, ili Fab'. U nekim slučajevima, antitelo uključuje kovalentno vezani nepeptidni sintetski polimer, npr., poli(etilen glikol) polimer. U nekim slučajevima, antitelo je fuzionisano, direktno ili preko linkera, sa nosačkim molekulom, peptidom ili proteinom koji promoviše prolazak kroz krvno-moždanu barijeru. U nekim slučajevima, epitop je u okviru amino-kiselina 15-24 Tau polipeptida. U nekim slučajevima, region okvira humanizovanog lakog lanca uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija prikazanih u Tabeli 3. U nekim slučajevima, region okvira humanizovanog teškog lanca uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 aminokiselinskih supstitucija prikazanih u Tabeli 2.
[0008] Predmetna objava obezbeđuje izolovano antitelo, pri čemu je antitelo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, ili Fab', i pri čemu antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12. U nekim slučajevima, izolovano antitelo uključuje region okvira humanizovanog lakog lanca. U nekim slučajevima, region okvira humanizovanog lakog lanca uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija prikazanih u Tabeli 3. U nekim slučajevima, izolovano antitelo uključuje region okvira humanizovanog teškog lanca. U nekim slučajevima, region okvira humanizovanog teškog lanca uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 aminokiselinskih supstitucija prikazanih u Tabeli 2.
[0009] Predmetna objava obezbeđuje izolovano antitelo, pri čemu izolovano antitelo uključuje konstantni region humanog lakog lanca i konstantni region humanog teškog lanca, i pri čemu izolovano antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12.
[0010] Predmetna objava obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja uključuje: a) anti-Tau antitelo predmetne objave; i b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent.
[0011] Predmetna objava obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja uključuje: a) antitelo koje se specifično vezuje za epitop u N-terminalnom delu Tau, pri čemu antitelo uključuje: (i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; (iv) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (v) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (vi) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12; i b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi, pri čemu formulacija ne sadrži endotoksine. U nekim slučajevima, antitelo uključuje region okvira humanizovanog lakog lanca. U nekim slučajevima, region okvira humanizovanog lakog lanca uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija prikazanih u Tabeli 3. U nekim slučajevima, antitelo uključuje region okvira humanizovanog teškog lanca. U nekim slučajevima, region okvira humanizovanog teškog lanca uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 aminokiselinskih supstitucija prikazanih u Tabeli 2. U nekim slučajevima, antitelo je inkapsulirano u lipozom. U nekim slučajevima, antitelo je formulisano sa sredstvom koje ubrzava prolazak kroz krvnomoždanu barijeru. U nekim slučajevima, antitelo je fuzionisano, direktno ili preko linkera, sa nosačkim molekulom, peptidom ili proteinom koji promoviše prolazak kroz krvno-moždanu barijeru. U nekim slučajevima, antitelo je Fv, scFv, Fab, F(ab')2, ili Fab'.
[0012] Predmetna objava obezbeđuje rekombinantni ekspresioni vektor koji uključuje nukleotidnu sekvencu kodirajuću za anti-Tau antitelo predmetne objave, pri čemu je nukleotidna sekvenca operabilno povezana sa transkripcionum kontrolnim elementom koji je aktivan u eukariotskoj ćeliji. Predmetna objava obezbeđuje in vitro ćeliju-domaćina genetički modifikovanu rekombinantnim ekspresionim vektorom predmetne objave.
[0013] Predmetna objava obezbeđuje sterilni kontejner koji sadrži farmaceutsku formulaciju predmetnog pronalaska. U nekim slučajevima, kontejner je špric.
[0014] Predmetna objava obezbeđuje metod lečenja tauopatije kod individue, metod uključuje primenu, kod individue, anti-Tau antitela predmetne objave, ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska.
[0015] Predmetna objava obezbeđuje metod lečenja tauopatije kod individue, metod uključuje primenu, kod individue, farmaceutske kompozicije koja uključuje: a) antitelo koje kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: i) regione koji određuju komplementarnost (complementarity-determining region, CDR), lakog lanca antitela, prikazanog na Slici 1B; i CDR teškog lanca antitela, prikazanog na Slici 1A; ili ii) CDR lakog lanca antitela, prikazanog na Slici 2B; i CDR teškog lanca antitela, prikazanog na Slici 2A; i b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi. U nekim slučajevima, antitelo uključuje: (i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; (iv) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (v) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (vi) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12. U nekim slučajevima, antitelo uključuje region okvira humanizovanog lakog lanca. U nekim slučajevima, antitelo uključuje region okvira humanizovanog teškog lanca. U nekim slučajevima, antitelo je inkapsulirano u lipozom. U nekim slučajevima, antitelo je formulisano sa sredstvom koje olakšava prolazak kroz krvno-moždanu barijeru. U nekim slučajevima, antitelo je fuzionisano, direktno ili preko linkera, sa nosačkim molekulom, peptidom ili proteinom koji promoviše prolazak kroz krvno-moždanu barijeru. U nekim slučajevima, antitelo je Fv, scFv, Fab, F(ab')2, ili Fab'. U nekim slučajevima, primena je intravenska. U nekim slučjevima, primena je intratekalna.
[0016] U nekim slučajevima, primena predmetnog anti-Tau antitela rezultuje promenom jednog ili više od sledećeg: a) količina slobodnog vanćelijskog tau u moždanom tkivu; b) količina slobodnog vanćelijskog tau u intersticijalnoj tečnosti (interstitial fluid, ISF); c) količina slobodnog vanćelijskog tau u cerebrospinalnoj tečnosti (cerebrospinal fluid, CSF); d) širenje tau proteina od neurona do neurona; e) količina agregata tau proteina u neuronu; f) stepen aktivacije mikroglije i/ili astrocita; g) količina fosforilisanog ili hiperfosforilisanog tau; h) količina ukupnog Tau ili slobodnog tau u ISF ili CSF; i) količina unutarćelijskih N-terminalnih tau fragmenata; j) hiperaktivnost neurona; k) količina Aβ40 i/ili Aβ42 u CSF; l) opterećenje Aβ plakama; m) sekrecija Aβ40 i/ili Aβ42 iz neurona; n) aktivnost promotora za amiloid-prekursor protein (amyloid precursor protein, APP); o) nivo APP mRNK i/ili proteina; p) aktivnost betasekretaze i/ili gama-sekretaze; q) stanje aktivacije Aβ-indukovanog signalnog puta; r) količina ukupnog unutarćelijskog tau ili slobodnog tau; s) količina tau vezanog za anti-tau antitelo u ISF ili CSF; i t) količina tau vezanog za anti-tau antitelo u ćeliji.
[0017] U nekim slučajevima, metod predmetne objave za lečenje tauopatije kod individue uključuje još i primenu najmanje jednog dodatnog sredstva koje leči tauopatiju.
[0018] Predmetna objava obezbeđuje metod praćenja napredovanja tauopatije kod individue, metod uključuje: a) određivanje prvog nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue u prvoj vremenskoj tački; b) određivanje drugog nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue u drugoj vremenskoj tački; i c) upoređivanje drugog nivoa Tau sa prvim nivoom Tau, pri čemu pomenuto određivanje uključuje: i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa antitelom iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1, 5, 16, i 21; i ii) kvantifikovanje vezivanja antitela za Tau polipeptid prisutan u uzorku. U nekim slučajevima, biološki uzorak je cerebrospinalna tečnost, krv, plazma, serum, urin, ili saliva. U nekim slučajevima, kvantifikovani Tau polipeptid je ukupni Tau polipeptid. U nekim slučajevima, kvantifikovani Tau polipeptid je N-terminalni fragment Tau polipeptida pune dužine. U nekim slučajevima, prva vremenska tačka je vremenska tačka pre početka režima lečenja, a druga vremenska tačka je vremenska tačka posle početka režima lečenja.
[0019] Predmetna objava obezbeđuje metod detektovanja Tau polipeptida kod žive individue, in vivo, metod uključuje: a) primenu, kod individue, antitela iz bilo kojeg od zahteva 1, 5, 16, i 21; i b) detektovanje vezivanja antitela za tau polipeptid u moždanom tkivu individue, korišćenjem metoda dobijanja slike. U nekim slučajevima, antitelo sadrži kontrastno sredstvo pogodno za upotrebu u metodu dobijanja slike. U nekim slučajevima, metod dobijanja slike je magnetna rezonanca ili pozitronska emisiona tomografija.
[0020] Predmetna objava obezbeđuje in vitro metod detektovanja Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue, metod uključuje: a) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa antitelom koje kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau sa antitelom koje uključuje: i) regione koji određuju komplementarnost (CDR), lakog lanca antitela, prikazanog na Slici 1B; i CDR teškog lanca antitela, prikazanog na Slici 1A; ili ii) CDR lakog lanca antitela, prikazanog na Slici 2B; i CDR teškog lanca antitela, prikazanog na Slici 2A; i b) detektovanje vezivanja antitela za Tau polipeptid prisutan u uzorku. U nekim slučajevima, biološki uzorak je krv, serum, plazma, urin, saliva, ili cerebrospinalna tečnost. U nekim slučajevima, osoba je suspektna na tauopatiju, dijagnostikovana joj je tauopatija, ili ima genetičku predispoziciju da razvije tauopatiju. U nekim slučajevima, metod je kvantitativan. U nekim slučajevima, detektovani Tau polipeptid je ukupni Tau polipeptid. U nekim slučajevima, detektovani Tau polipeptid je N-terminalni fragment Tau polipeptida pune dužine.
[0021] Na osnovu objave sadržane u ovom tekstu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo koje se specifično vezuje za Tau, pri čemu antitelo uključuje:
a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:41;
b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:40;
c) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:41;
d) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:42;
e) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:43;
f) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:40;
g) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:42;
h) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:43;
i) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:40;
j) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:41;
k) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:42;
l) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:43;
m) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:39 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:40;
n) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:39 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:41;
o) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:39 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:42; ili
p) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:39 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:43.
[0022] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje:
a) antitelo pronalaska; i
b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent.
[0023] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje rekombinantni ekspresioni vektor koji uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo pronalaska, pri čemu je nukleotidna sekvenca operabilno povezana sa transkripcionim kontrolnim elementom koji je aktivan u eukariotskoj ćeliji.
[0024] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje in vitro ćeliju-domaćina genetički modifikovanu rekombinantnim ekspresionim vektorom pronalaska.
[0025] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo pronalaska, ili farmaceutsku kompoziciju pronalaska, za upotrebu u lečenju tauopatije kod ljudi.
[0026] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje metod praćenja napredovanja tauopatije kod humanog subjekta, metod uključuje:
a) određivanje prvog nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od humanog subjekta u prvoj vremenskoj tački;
b) određivanje drugog nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od humanog subjekta u drugoj vremenskoj tački; i
c) upoređivanje drugog nivoa Tau sa prvim nivoom Tau, pri čemu pomenuto određivanje uključuje:
i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa antitelom pronalaska; i
ii) kvantifikovanje vezivanja antitela za Tau polipeptid prisutan u uzorku.
[0027] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje antitelo pronalaska za upotrebu u metodu detektovanja Tau polipeptida u živom humanom subjektu kod kojeg je primenjeno antitelo, pri čemu pomenuti metod uključuje detektovanje vezivanja antitela za Tau polipeptid u moždanom tkivu u živom humanom subjektu, korišćenjem metoda dobijanja slike.
[0028] Predmetni pronalazak i primeri izvođenja istog, izloženi su u priloženim patentnim zahtevima.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0029]
Slike 1A i 1B prikazuju aminokiselinske sekvence IPN001 VH (Slika 1A) i VL (Slika 1B). Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) predstavljeni su masnim slovima i podvučeni su.
Slike 2A i 2B prikazuju aminokiselinske sekvence IPN002 VH (Slika 2A) i VL (Slika 2B). Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) predstavljeni su masnim slovima i podvučeni su.
Slike 3A-D prikazuju efekat anti-Tau antitela IPN002 na depolarizaciju membrane kortikalnih neurona, posredovanu Tau proteinom.
Slike 4A-C prikazuju izolaciju Tau iz cerebrospinalne tečnosti (CSF), na osnovu afiniteta. Slika 5 prikazuje kvantifikaciju uzoraka CSF i kondicioniranih medijuma (conditioned medium, CM) pre i posle izolacije Tau na osnovu afiniteta.
Slike 6A-D prikazuju aminokiselinske sekvence humanog Tau pune dužine.
Slika 7 prikazuje detekciju fragmenata Tau u kondicioniranom medijumu, u intersticijalnoj tečnosti (ISF) P301L tau miševa, i u CSF pacijenata obolelih od PSP i AD.
Slike 8A-D prikazuju indukovanje hiperaktivnosti kortikalnih neurona vanćelijskim fragmentom tau (extracellular tau, eTau) (Slike 8A-C); i smanjenje hiperaktivnosti neurona indukovane eTau, korišćenjem anti-Tau antitela IPN001.
Slika 9 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanizovane VH varijante 1, IPN002; i nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu.
Slika 10 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanizovane VH varijante 2, IPN002; i nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu.
Slika 11 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanizovane VH varijante 3, IPN002; i nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu.
Slika 12 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanizovane VH varijante 4, IPN002; i nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu.
Slika 13 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanizovane Vκ varijante1, IPN002; i nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu.
Slika 14 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanizovane Vκ varijante 2, IPN002; i nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu.
Slika 15 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanizovane Vκ varijante 3, IPN002; i nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu.
Slika 16 prikazuje aminokiselinsku sekvencu humanizovane Vκ varijante 4, IPN002; i nukleotidnu sekvencu koja kodira aminokiselinsku sekvencu.
Slika 17 predstavlja Tabelu 4, koja prikazuje osobine vezivanja varijanti humanizovanog IPN-002 za eTau proteine.
Slika 18 predstavlja Tabelu 5, koja prikazuje osobine vezivanja humanizovanih varijanti IPN-002 za Tau-383.
Slike 19A i 19B prikazuju osobine humanizovanih varijanti IPN002. Slika 19A prikazuje vezivanje humanizovanih varijanti IPN-002 za tau prisutan u iPSC-CN kondicioniranom medijumu; iPSC-CN lizatima; AD lizatima mozga; i P301L tau lizatu moždanog korteksa miša; i lizatima mozga majmuna cinomolgusa (Cyno). Slika 19B prikazuje inhibiciju eTauindukovane hiperaktivnosti neurona humanizovanim varijantama IPN002.
1
Slika 20 prikazuje aminokiselinske sekvence eTau fragmenata, u poravnavanju sa aminokiselinskom sekvencom fetalnog tau.
Slike 21A-C prikazuju proliferativni odgovor na humanizovano anti-Tau antitelo (Slika 21A), himerno antitelo (Slika 21B), i humanizovano A33 (Slika 21C).
Slika 22 prikazuje efekat IPN002 na nivoe fosforilisanog Tau in vivo.
Slika 23 prikazuje smanjenje nivoa slobodnog tau i ukupnih nivoa tau u intersticijalnoj tečnosti (ISF) posle tretmana korišćenjem IPN002.
Slika 24 prikazuje smanjenje nivoa slobodnog tau u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) posle tretmana koriščenjem IPN002.
Slika 25 prikazuje smanjenje eTau-indukovane hiperaktivnosti neurona, korišćenjem IPN002. Slika 26 prikazuje prisustvo Tau fragmenata u CSF individue koja verovatno ima hroničnu traumatsku encefalopatiju.
Slika 27 prikazuje vezivanje humanizovane varijante IPN002 za sintetske tau peptide, korišćenjem testa na čvrstoj fazi.
Slika 28 prikazuje vezivanje humanizovane varijante IPN002 za sintetske tau peptide, korišćenjem testa na tečnoj fazi.
Slika 29 prikazuje vezivanje humanizovane varijante IPN002 za rekombinantni Tau i za PAD peptid.
Slika 30 prikazuje kompeticiju nebiotinisanih formi sintetskih tau peptida sa biotinisanim formama sintetskih tau peptida, za vezivanje sa humanizovanom varijantom IPN002.
Slika 31 prikazuje efekat primene kontrolnog IgG, PHF1, ili IPN002 na skorove refleksa privlačenja zadnjih ekstremiteta, u modelu P310L miševa.
Slika 32 prikazuje efekat primene kontrolnog IgG, PHF1, ili IPN002 na prosečnu latenciju u testu hoda npo gredi, u modelu P310L miševa.
Slika 33 prikazuje efekat primene kontrolnog IgG, PHF1, ili IPN002 na nivo slobodnog tau (tau koji nije vezan za anti-tau antitelo) u uzorcima CSF, u modelu P310L miševa.
Slika 34 prikazuje inhibiciju eTau1a-indukovane hiperekscitabilnosti neurona, korišćenjem antitela.
Slika 35 prikazuje efekat PHF1-reaktivnog tau pune dužine ili eTau1a, na hiperekscitabilnost neurona, kod kortikalnih neurona in vitro.
Slika 36 grafički prikazuje efekat PHF1-reaktivnog tau pune dužine ili eTau1a, na hiperekscitabilnost neurona, kod kortikalnih neurona in vitro.
Slika 37 prikazuje uticaj kontrolnog IgG, BACE inhibitora, ili IPN002 na nivoe Aβ40 (leva tabla) ili Aβ42 (desna tabla) sekretovanog iz kortikalnih neurona.
Slika 38 prikazuje efekat kontrolnog IgG, BACE inhibitora, ili anti-Tau antitela na nivoe Aβ40 sekretovanog iz primarnih koritikalnih neurona.
Slika 39 prikazuje efekat kontrolnog IgG, BACE inhibitora, ili anti-Tau antitela na nivoe Aβ42 sekretovanog iz primarnih koritikalnih neurona.
Slika 40 prikazuje rezultate mapiranja epitopa humanizovane varijante IPN002 (hu-IPN002). Slika 41 prikazuje test za detektovanje različitih tau polipeptida u CSF.
Slika 42 prikazuje vezivanje Tau u CSF za IPN002, PHF1, ili poliklonsko antitelo koje se vezuje za linearni epitop u C-terminalnom delu Tau (pAb-tau linearni epitop).
Slika 43 prikazuje uticaj tretmana P301L miševa kontrolnim IgG, PHF1, ili IPN002 na ukupne nivoe tau u CSF.
Slike 44A-H prikazuju uticaj tretmana P301L miševa kontrolnim IgG, PHF1, ili IPN002 na AT8 fosfo Tau u različitim regionima mozga i tkivima.
Slike 45A-E prikazuju uticaj tretmana P301L miševa kontrolnim IgG, PHF1, ili IPN002 na nivoe fosforilisanog Tau u različitim regionima mozga i tkivima.
Slika 46 prikazuje uticaj tretmana P301L miševa kontrolnim IgG, PHF1, ili IPN002 na nivo AT8 fosfo Tau histologije u zadnjem mozgu.
Slika 47 prikazuje uticaj tretmana P301L miševa kontrolnim IgG, PHF1, ili IPN002 na nivo AT100 fosfo Tau histologije u zadnjem mozgu.
Slike 48A i 48B prikazuju uticaj tretmana P301L miševa kontrolnim IgG, PHF1, ili IPN002 na nivo GFAP proteina u homogenatu hipokampusa i u homogenatu korteksa.
Slike 49A i 49B prikazuju uticaj tretmana P301L miševa kontrolnim IgG, PHF1, ili IPN002 na nivo Iba1 proteina u homogenatu hipokampusa i u homogenatu korteksa.
Slike 50A i 50B prikazuju uticaj tretmana P301L miševa kontrolnim IgG, PHF1, ili IPN002 na nivo Aβ40 u homogenatu korteksa i S1 frakciji korteksa.
Slika 51 prikazuje uticaj tretmana P301L miševa kontrolnim IgG, PHF1, ili IPN002 na procenat miševa koji mogu da izvedu test hoda po gredi.
Slika 52 prikazuje vezivanje hu-IPN002 za različite Tau peptide.
Slika 53 prikazuje vezivanje različitih biotinisanih Tau peptida za hu-IPN002.
Slike 54A i 54B šematski prikazuju testove za Tau koji nije vezan za IPN002 (slobodni tau) (Slika 54A); i Tau vezan za IPN002 (vezani Tau) (Slika 54B).
DEFINICIJE
[0030] Izrazi "antitela" i "imunoglobulin" uključuju antitela ili imunoglobuline bilo kojeg izotipa, fragmente antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen, uključujući, ali ne ograničavajući se na Fab, Fv, scFv, i Fd fragmente, himerna antitela, humanizovana antitela, jednolančana antitela, bispecifična antitela, i fuzione proteine koji uključuju antigen-vezujući deo antitela i protein koji nije antitelo. Antitela mogu biti detektabilno obeležena, npr., radioizotopom, enzimom koji stvara detektabilni proizvod, fluorescentnim proteinom, i slično. Antitela, pored toga mogu biti konjugovana sa drugim komponentama, kao što su članovi specifičnih vezujućih parova, npr., biotin (koji je član specifičnog vezujućeg para biotin-avidin), i slično. Isto tako, antitela mogu biti vezana za čvrstu podlogu, uključujući, ali ne ograničavajući se na polistirenske ploče ili perlice, i slično. Izrazom su obuhvaćeni i Fab', Fv, F(ab')2, i/ili drugi fragmenti antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen, i monoklonska antitela. Antitelo može biti monovalentno ili bivalentno.
[0031] Izraz "humanizovani imunoglobulin", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na imunoglobulin koji uključuje delove imunoglobulina različitog porekla, pri čemu najmanje jedan deo uključuje aminokiselinske sekvence humanog porekla. Na primer, humanizovano antitelo može uključivati delove poreklom iz imunoglobulina nehumanog porekla sa potrebnom specifičnosšću, na primer iz miša, i iz imunoglobulinskih sekvenci humanog porekla (npr., himerni imunoglobulin), hemijski spojene konvencionalnim tehnikama (npr., sintetski) ili pripremljeni u vidu kontinuiranog polipeptida, korišćenjem tehnika genetičkog inženjerstva (npr., DNK koja kodira proteinske delove himernog antitela može se eksprimirati da proizvede kontinuirani polipeptidni lanac). Sledeći primer humanizovanog imunoglobulina je imunoglobulin koji sadrži jeda ili više imunoglobulinskih lanaca koji uključuju CDR poreklom iz antitela nehumanog porekla i region okvira poreklom iz lakog i/ili teškog lanca humanog porekla (npr., CDR-graftovana antitela sa ili bez promena okvira). Himerna ili CDR-graftovana jednolančana antitela takođe su obuhvaćena izrazom "humanizovani imunoglobulin". Vidi, npr., Cabilly et al., U.S. pat. br.4,816,567; Cabilly et al., evropski patent br.0,125,023 B1; Boss et al., U.S. pat. br.4,816,397; Boss et al., evropski patent br.0,120,694 B1; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533; Neuberger, M. S. et al., evropski patent br. 0,194,276 B1; Winter, U.S. pat. br. 5,225,539; Winter, evropski patent br. 0,239,400 B1; Padlan, E. A. et al., evropska patentna prijava br. 0,519,596 A1. Vidi i Ladner et al., U.S. pat. br. 4,946,778; Huston, U.S. pat. br.5,476,786; i Bird, R. E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)), u vezi sa jednolančanim antitelima.
[0032] Na primer, humanizovani imunoglobulini mogu da se proizvedu korišćenjem sinteskih i/ili rekombinantnih nukleinskih kiselina da bi se pripremili geni (npr., cDNK) koji kodiraju željeni humanizovani lanac. Na primer, sekvence nukleinskih kiselina (npr., DNK) koje kodiraju humanizovane varijabilne regione mogu se konstruisati korišćenjem metoda PCR
1
mutageneze za izmenu DNK sekvenci koje kodiraju humani ili humanizovani lanac, kao što je DNK templat iz prethodno humanizovanog varijabilnog regiona (vidi, npr., Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K., et al., Cancer Research, 53: 851-856 (1993); Daugherty, B. L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); i Lewis, A. P. and J. S. Crowe, Gene, 101: 297-302 (1991)). Korišćenjem ovih ili drugih pogodnih metoda, varijante se takođe mogu lako proizvesti. Na primer, klonirani variijabilni regioni mogu da se mutagenizuju, i sekvence koje kodiraju varijante sa željenom specifičnošću mogu da se odaberu (npr., iz biblioteke faga; vidi, npr., Krebber et al., U.S. pat. br.5,514,548; Hoogenboom et al., WO 93/06213, objavljen 1. aprila 1993)).
[0033] "Fragment antitela" uključuje deo intaktnog antitela, na primer, antigen-vezujući ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela (Zapata et al., Protein Eng.8(10): 1057-1062 (1995)); molekule jednolančanih antitela; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Digestija antitela papainom proizvodi dva identična antigen-vezujuća fragmenta koji se nazivaju "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigen-vezujućim mestom, i rezidualni "Fc" fragment, što je oznaka koja odražava sposobnost brze kristalizacije. Tretman pepsinom daje F(ab')2fragment koji ima dva mesta za kombinovanje sa antigenom i koji je sposoban da vrši unakrsno povezivanje antigena.
[0034] "Fv" je najmanji fragment antitela koji sadrži celo antigen-prepoznavajuće i antigenvezujuće mesto. Ovaj region sastoji se od dimera varijabilnog regiona jednog teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj asocijaciji. U ovoj konfiguraciji, tri CDR svakog varijabilnog domena interaguju kako bi definisala antigen-vezujuće mesto na površini VH-VLdimera. Zajedno, šest CDR daje antigen-vezujuću specifičnost antitelu. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv, koja uključuje samo tri CDR specifična za antigen) ima sposobnost prepoznavanja i vezivanja sa antigenom, mada sa nižim afinitetom nego celo vezujuće mesto.
[0035] "Fab" fragment sadrži i konstantni domen lakog lanca i prvi konstantni domen (CH1) teškog lanca. Fab fragmenti se razlikuju od Fab' fragmenata po dodavanju nekoliko rezidua na karboksil terminusu CH1domena teškog lanc,a uključujući jedan ili više cisteina iz regiona zgloba antitela. Fab'-SH je u ovom tekstu oznaka za Fab' u kojem cisteinska rezidua/rezidue konstantnog domena nose slobodnu tiol-grupu. F(ab')2fragmenti antitela originalno su bili proizvedeni kao parovi Fab' fragmenata koji između sebe imaju cisteine zglobnog regiona. Poznati su i drugi načini hemijskog povezivanja fragmenata antitela.
[0036] "Laki lanci" antitela (imunoglobulina) iz svake vrste vertebrata mogu se svrstati u jedan od dva jasno različita tipa, nazvana kapa i lambda, na osnovu aminokiselinskih sekvenci njihovih konstantnih domena. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena teških lanaca, imunoglobulini se mogu svrstati u različite klase. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i nekoliko njih mogu se dalje podeliti u potklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, i IgA2.
[0037] "Jednolančani Fv" ili "sFv" fragmenti antitela uključuju VHi VLdomene antitela, pri čemu su ovi domeni prisutni u jednom polipeptidnom lancu. U nekim primerima izvođenja, Fv polipeptid uključuje još i polipeptidni linker između VHi VLdomena, koji omogućava da sFv formira željenu strukturu za vezivanje sa antigenom. Za pregled sFv, vidi Pluckthun, u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994).
[0038] Izraz "dijatela" odnosi se na male fragmente antitela sa dva antigen-vezujuća mesta, pri čemu fragmenti uključuju varijabilni domen teškog lanca (VH) spojen sa varijabilnim domenom lakog lanca (VL) u istom polipeptidnom lancu (VH-VL). Korišćenjem linkera koji je suviše kratak da bi dopustio sparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su prisiljeni da se sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvaraju dva antigen-vezujuća mesta. Dijatela su detaljnije opisana na primer, u EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.
[0039] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "afinitet" odnosi se na konstantu ravnoteže za reverzibilno vezivanje dva sredstva (npr., antitelo i antigen) i izražava se kao konstanta disocijacije (dissociation constant, Kd). Afinitet može biti najmanje 1-struko veći, najmanje 2-struko veći, najmanje 3-struko veći, najmanje 4-struko veći, najmanje 5-struko veći, najmanje 6-struko veći, najmanje 7-struko veći, najmanje 8-struko veći, najmanje 9-struko veći, najmanje 10-struko veći, najmanje 20-struko veći, najmanje 30-struko veći, najmanje 40-struko veći, najmanje 50-struko veći, najmanje 60-struko veći, najmanje 70-struko veći, najmanje 80-struko veći, najmanje 90-struko veći, najmanje 100-struko veći, ili najmanje 1000-struko ili više, veći od afiniteta antitela za nesrodne aminokiselinske sekvence. Afinitet antitela za ciljni protein može biti, na primer, od oko 100 nanomolarnog (nM) do oko 0.1 nM, od oko 100 nM do oko 1 pikomolarnog (pM), ili od oko 100 nM do oko 1 fentomolarnog (fM) ili veći. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "aviditet" odnosi se na rezistenciju kompleksa dva ili više sredstava da disosuju posle razblaživanja. Izrazi "imunoreaktivan" i "preferencijalno se vezuje sa" koriste se u ovom tekstu naizmenično, u vezi sa antitelima i/ili antigen-vezujućim fragmentima.
1
[0040] Izraz "vezivanje" odnosi se na direktno udruživanje dva molekula usled, na primer, uspostavljanja kovalentnih, elektrostatičkih, hidrofobnih, i jonskih i/ili vodoničnih vezujućih interakcija, uključujući interakcije kao što su slani mostovi i vodeni mostovi. Predmetno anti-Tau antitelo vezuje se specifično za epitop u Tau polipeptidu. Nespecifično vezivanje odnosi se na vezivanje sa afinitetom manjim od oko 10<-7>M, npr., vezivanje sa afinitetom od 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, itd.
[0041] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "CDR" ili "region koji određuje komplementarnost" koristi se da označi nekontinuirana mesta unutar varijabilnog regiona polipeptida teškog i lakog lanca, koja se kombinuju sa antigenom. CDR su opisali Kabat et al., J. Biol. Chem.252:6609-6616 (1977); Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991); Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); i MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), gde definicije uključuju preklapanje podgrupa aminokiselinskih rezidua kada se upoređuju jedne sa drugima. Bez obzira na to, korišćenje obeju definicija za označavanje CDR antitela ili graftovanih antitela ili njihovih varijanti obuhvaćena je izrazom definisanim i upotrebljavanim u ovom tekstu. Aminokiselinske rezidue koje pripadaju CDR definisanim svakom od gore navedenih referenci, navedene su u Tabeli 1, radi poređenja.
Tabela 1: Definicije CDR
[0042] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "okvir" upotrebljen u vezi sa varijabilnim regionom antitela označava sve aminokiselinske rezidue izvan CDR regiona, unutar varijabilnog regiona antitela. Okvir varijabilnog regiona je obično diskontinuirana aminokiselinska sekvenca dužine
1
oko 100-120 amino-kiselina, i odnosi se samo na one amino-kiseline koje su izvan CDR. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "region okvira" označava svaki domen okvira koji je razdvojen pprisustvom CDR.
[0043] "Izolovano" antitelo je ono koje je identifikovano i izdvojeno ili preuzeto iz komponentni svog prirodnog okruženja. Kontaminirajuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi interferirali sa dijagnostičkim ili terapijskim upotrebama antitela i mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske rastvore. U nekim primerima izvođenja, antitelo će biti prečišćeno (1) do više od 90%, više od 95%, ili više od 98%, po težini antitela, kako je određeno Lowryjevim metodom, na primer, više od 99% po težini, (2) do stepena dovoljnog za dobijanje najmanje 15 rezidua N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence, korišćenjem "spinning cup" sekvenatora, ili (3) do homogenosti, pomoću elektroforeze na natrijum-dodecilsulfat-poliamidakrilnom gelu (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) pod redukujućim ili neredukujućim uslovima, uz korišćenje bojenja Coomassie plavim ili srebrom. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ, unutar rekombinantne ćelije, pošto najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela nije prisutna. U nekim slučajevima, izolovano antitelo biće pripremljeno korišćenjem najmanje jednog koraka prečišćavanja.
[0044] Izrazi "polipeptid", "peptid" i "protein", upotrebljeni u ovom tekstu naizmenično, odnose se na polimernu formu amino-kiselina, bilo koje dužine, koja može uključivati genetički kodirane i genetički nekodirane amino-kiseline, hemijski ili biohemijski modifikovane ili derivatizovane amino-kiseline, i polipeptide koji imaju modifikovane peptidne osovine. Izraz obuhvata i fuzione proteine, uključujući, ali ne ograničavajući se na fuzione proteine sa heterolognom aminokiselinskom sekvencom, fuzije sa heterolognim i homolognim liderskim sekvencama, sa ili bez N-terminalnih metioninskih rezidua; imunološki markirane proteine; i slično.
[0045] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "lečenje/tretiranje", "lečiti/tretirati" i slično, odnose se na postizanje željenog farmakološkog i/ili fiziološkog efekta. Efekat može biti profilaktički u smislu potpunog ili delimičnog preveniranja bolesti ili njenih simptoma i/ili može biti terapijski u smislu delimičnog ili potpunog izlečenja bolesti i/ili neželjenog efekta koji se pripisuje bolesti. "Lečenje/tretiranje", kako se koristi u ovom tekstu, podrazumeva svako lečenje/tretiranje bolesti kod sisara, posebno kod čoveka i uključuje: (a) prevenciju pojave bolesti kod subjekta koji može biti predisponiran za bolest, ali ona još nije dijagnostikovana; (b) inhibiciju bolesti, tj., zaustavljanje njenog razvoja; i (c) olakšavanje bolesti, tj., izazivanje povlačenja bolesti.
1
[0046] Izrazi "pojedinac", "subjekt", "domaćin" i "pacijent" upotrebljavaju se u ovom tekstu naizmenično i odnose se na sisara uključujući, ali ne ograničavajući se na prave miševe (pacovi, miševi), nehumane primate, ljude, pse, mačke, kopitare (npr., konji, goveda, ovce, svinje, koze), itd.
[0047] "Terapijski efikasna količina" ili "efikasna količina" odnosi se na količinu anti-Tau antitela koja je, kada se primeni kod sisara ili drugog subjekta da bi se bolest lečila, dovoljna da dovede do takvog lečenja bolesti. "Terapijski efikasna količina" variraće u zavisnosti od anti-Tau antitela, bolesti i njene jačine i starosti, težine, itd., subjekta kojeg treba lečiti.
[0048] "Biološki uzorak" obuhvata različite tipove uzoraka dobijene od individue i koji se mogu koristiti u dijagnostičkom testu ili testu praćenja. Definicija obuhvata krv i druge tečne uzorke biološkog porekla, uzorke solidnih tkiva kao što su uzorci biopsije, ili tkivne kulture ili ćelije poreklom iz njih, i njihovo potomstvo. Definicija uključuje i uzorke koji su na bilo koji način obrađeni posle dobijanja, na primer tretirani reagensima, solubilizovani ili obogaćeni u pogledu određenih komponenti kao što su polinukleotidi. Izraz "biološki uzorak" obuhvata klinički uzorak, a uključuje i ćelije u kulturi, ćelijske supernatante, ćelijske lizate, serum, plazmu, biološku tečnost i uzorke tkiva. Izraz "biološki uzorak" uključuje urin, salivu, cerebrospinalnu tečnost, frakcije krvi kao što su plazma i serum, i slično.
[0049] Pre detaljnog opisa predmetnog pronalaska, treba razumeti da ovaj pronalazak nije ograničen na određene opisane primere izvođenja, jer oni, razume se, mogu varirati. Isto tako, treba razumeti da terminologija koja se koristi u ovom tekstu služi samo za opisivanje određenih primera izvođenja i nije ograničavajuća, jer će obim predmetnog pronalaska biti ograničen samo priloženim zahtevima.
[0050] Kada je naveden raspon vrednosti, podrazumeva se da pronalazak obuhvata svaku vrednost između navedenih vrednosti, do desetine jedinice donje granične vrednosti, ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Gornja i donja granična vrednost ovih manjih raspona mogu nezavisno biti uključene u manje raspone i takođe su obuhvaćene pronalaskom, u slučaju posebno isključene granične vrednosti u navedenom rasponu. Kada navedeni raspon uključuje jednu ili obe granične vrednosti, rasponi koji isključuju jednu ili obe ove granične vrednosti, takođe su uključeni u pronalazak.
[0051] Ukoliko nije drugačije navedeno, svi tehnički i naučni pojmovi upotrebljeni u ovom tekstu imaju značenje koje obično razume prosečno obučeni stručnjak u oblasti kojoj pronalazak pripada. Iako se u izvođenju ili ispitivanju predmetnog pronalaska mogu koristiti svi metodi i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su opisani u ovom tekstu, ovde su opisani poželjni metodi i materijali. Sve publikacije pomenute u ovom tekstu uključene su u ovaj tekst kao
1
reference, za objavljivanje i opisivanje metoda i/ili materijala u vezi sa kojima su publikacije navedene.
[0052] Treba napomenuti da, kada se koriste u ovom tekstu i priloženim patentnim zahtevima, izrazi u jednini uključuju i izraze u množini, ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Prema tome, na primer, upućivanje na "humanizovano anti-Tau antitelo" uključuje množinu tih antitela, a upućivanje na "tauopatiju" uključuje upućivanje na jednu ili više tauopatija i njihove ekvivalente, kako je poznato stručnjaku u oblasti, i tako dalje. Treba napomenuti još i to da patentni zahtevi mogu biti izvedeni tako da isključe svaki opcioni element. Kao takav, ovaj stav treba da služi kao prethodna osnova za upotrebu terminologije isključivanja kao "jedino", "samo" i slično u vezi sa navođenjem elemenata patentnih zahteva, ili upotrebom "negativnog" ograničenja.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0053] Predmetna objava obezbeđuje metode lečenja tauopatije, koji uključuju primenu anti-Tau antitela. Predmetna objava obezbeđuje i anti-Tau antitela, i formulacije koje ih sadrže, za upotrebu u metodima. Predmetna objava obezbeđuje i in vitro i in vivo metode detekcije korišćenjem anti-Tau antitela opisanog u ovom tekstu.
METODI LEČENJA TAUOPATIJE
[0054] Predmetna objava obezbeđuje metode lečenja tauopatije. Metodi uopšteno uključuju davanje efikasne količine anti-Tau antitela predmetne objave individui kojoj je to potrebno. U nekim slučajevima, primena predmetnog anti-tau antitela smanjuje nivo patološkog tau polipeptida u ćeliji, tkivu ili tečnosti pojedinca, i leči tauopatiju.
[0055] Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetni metod može uključivati primenu, kod individue kojoj je to potrebno, efikasne količine izolovanog humanizovanog monoklonskog antitela koje se specifično vezuje za epitop u okviru amino-kiselina 15-24 Tau polipeptida. U nekim primerima izvođenja, antitelo je prisutno u farmaceutskoj formulaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, npr., farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom koji je pogodan za primenu kod ljudi.
[0056] Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetni metod može uključivati primenu, kod individue kojoj je to potrebno, efikasne količine izolovanog antitela koje uključuje region okvira humanizovanog lakog lanca; i region okvira humanizovanog teškog lanca, pri čemu izolovano antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži
1
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12. U nekim primerima izvođenja, antitelo je prisutno u farmaceutskoj formulaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, npr., farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom koji je pogodan za primenu kod ljudi.
[0057] Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetni metod može uključivati primenu, kod individue kojoj je to potrebno, efikasne količine izolovanog antitela, pri čemu je antitelo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, ili Fab', i pri čemu antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12. U nekim primerima izvođenja, antitelo je prisutno u farmaceutskoj formulaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, npr., farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom koji je pogodan za primenu kod ljudi.
[0058] Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetni metod može uključivati primenu, kod individue kojoj je to potrebno, efikasne količine izolovanog antitela, pri čemu izolovano antitelo uključuje konstantni region humanog lakog lanca i konstantni region humanog teškog lanca, i pri čemu izolovano antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12. U nekim primerima izvođenja, antitelo je prisutno u farmaceutskoj formulaciji sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom, npr., farmaceutski prihvatljivim ekscipijentom koji je pogodan za primenu kod ljudi.
2
[0059] Anti-Tau antitelo predmetne objave vezuje se za vanćelijski tau. "Vanćelijski tau" ("eTau"), kako se koristi u ovom tekstu, obuhvata svaki Tau polipeptid koji može da se detektuje u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) ili intersticijalnoj tečnosti (ISF). U nekim primerima izvođenja, eTau je polipeptid dug 175 amino-kiselina i uključuje amino-kiseline 2-176 tau proteina pune dužine; na primer, u nekim primerima izvođenja eTau je polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:45. U nekim primerima izvođenja, eTau je polipeptid dug 171 amino-kiselinu i uključuje amino-kiseline 2-172 (SEQ ID NO:44) tau proteina pune dužine; na primer, u nekim primerima izvođenja eTau je polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:44. U nekim primerima izvođenja, eTau je eTau-2 polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:46. U nekim primerima izvođenja, eTau je eTau-3 polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:47. U nekim primerima izvođenja, eTau je eTau-4 polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:48.
[0060] U nekim slučajevima, eTau polipeptid je dug od oko 50 amino-kiselina do oko 175 amino-kiselina, npr., od oko 50 amino-kiselina (amino acid, aa) do oko 75 aa, od oko 75 aa do oko 100 aa, od oko 100 aa do oko 125 aa, od oko 125 aa do oko 150 aa, ili od oko 150 aa do oko 175 aa; i može uključivati od 50 do oko 75, od oko 75 do oko 100, od oko 100 do oko 125, od oko 125 do oko 150, ili od oko 150 do oko 175, kontinuiranih amino-kiselina 2-176 tau proteina pune dužine. Primeri eTau polipeptida prikazani su na Slici 20.
[0061] Kako je detaljnije opisano u nastavku ovog teksta, anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje za Tau, pri čemu je epitop vezan za antitelo linearni epitop, i uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-terminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau proteina, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau proteina, u okviru aminokiselina 9 do 18 Tau proteina, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau proteina, u okviru aminokiselina 15-44 Tau proteina, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau proteina. Aminokiselinske sekvence izoformi humanog Tau prikazane su na Slikama 6A-D. Amino-kiseline 1-18 Tau proteina su: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:53). Vidi, npr., Garcia-Sierra et al. (2003) J. Alzheimer's Disease 5:65; i Horowitz et al. (2004) J. Neurosci. 24:7895. Aminokiseline 15-24 Tau proteina su: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51).
[0062] U nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje za Tau, pri čemu je epitop vezan za antitelo linearni epitop i uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina 1-25 Tau proteina, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau proteina, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau proteina. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina 1-25 Tau proteina, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau proteina, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau proteina, pri čemu epitop ne uključuje fosforilisanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina 1-25 Tau proteina, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau proteina, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau proteina, pri čemu epitop uključuje fosforilisanu aminokiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina 1-25 Tau proteina, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau proteina, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau proteina, pri čemu epitop ne uključuje nitrovanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina 1-25 Tau proteina, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau proteina, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau proteina, pri čemu epitop uključuje nitrovanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina 1-25 Tau proteina, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau proteina, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau proteina, pri čemu epitop uključuje nitrovanu amino-kiselinu, a ne uključuje fosforilisanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina 1-25 Tau proteina, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau proteina, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau proteina, pri čemu epitop uključuje fosforilisanu amino-kiselinu, a ne uključuje nitrovanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina 1-25 Tau proteina, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau proteina, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau proteina, pri čemu epitop uključuje nitrovanu amino-kiselinu i fosforilisanu amino-kiselinu.
[0063] Na primer, u nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51) Tau. U nekim primerima izvođenja, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51) Tau.
[0064] U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51) Tau, pri čemu epitop ne uključuje fosforilisanu aminokiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51) Tau, pri čemu epitop uključuje fosforilisanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51) Tau, pri čemu epitop ne uključuje nitrovanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51) Tau, pri čemu epitop uključuje nitrovanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51) Tau, pri čemu epitop uključuje nitrovanu amino-kiselinu i ne uključuje fosforilisanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51) Tau, pri čemu epitop uključuje fosforilisanu amino-kiselinu i ne uključuje nitrovanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave specifično se vezuje sa linearnim epitopom koji uključuje aminokiselinske rezidue u okviru amino-kiselina AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51) Tau, pri čemu epitop uključuje nitrovanu amino-kiselinu i fosforilisanu amino-kiselinu.
[0065] U nekim slučajevima, metod predmetne objave za lečenje tauopatije uključuje primenu, kod individue kojoj je to potrebno, farmaceutske kompozicije koja uključuje: a) anti-Tau antitelo koje sadrži: i) jedan, dva ili tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) lakog lanca antitela, prikazanog na Slici 1; i jedan, dva ili tri CDR teškog lanca antitela, prikazanog na Slici 1; ili ii) jedan, dva ili tri l CDR lakog lanca antitela, prikazanog na Slici 2; i jedan, dva ili tri CDR teškog lanca antitela, prikazanog na Slici 2; i b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi.
[0066] U nekim slučajevima, metod predmetne objave za lečenje tauopatije uključuje primenu, kod individue kojoj je to potrebno, farmaceutske kompozicije koja uključuje: a) antitelo koje se specifično vezuje za epitop u okviru humanog Tau polipeptida, pri čemu antitelo kompetira za vezivanje za epitop sa antitelom koje uključuje: i) regione koji određuju kompelementarnost (CDR) lakog lanca antitela, prikazanog na Slici 1B; i CDR teškog lanca antitela, prikazanog na Slici 1A; ili ii) CDR lakog lanca antitela, prikazanog na Slici 2B; i CDR teškog lanca antitela, prikazanog na Slici 2A; i b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi.
2
[0067] U nekim slučajevima, metod predmetne objave za lečenje tauopatije uključuje primenu, kod individue kojoj je to potrebno, farmaceutske kompozicije koja uključuje: a) antitelo koje kompetira sa humanizovanim IPN002 (hu-IPN002) za vezivanje sa epitopom u Tau koji se prepoznaje hu-IPN002 (npr., linearni epitop u okviru N-terminalnog dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau, u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru aminokiselina 15-24 Tau); i b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi.
[0068] IPN001 (označeno u ovom tekstu i kao "IPN1" ili "IPN-1") i IPN002 (označeno u ovom tekstu i kao "IPN2" ili "IPN-2") specifično se vezuju za Tau. Epitop vezan sa IPN001 je linearni epitop, i uključuje aminokiselinske rezidue u okviru aminoterminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau.
[0069] U nekim slučajevima, anti-Tau antitelo predmetne objave koje je pogodno za upotrebu u metodu lečenja tauopatije uključuje: a) varijabilni region lakog lanca, koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VLCDR antitela IPN001; ii) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) varijabilni region teškog lanca, koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VHCDR antitela IPN001; i ii) region okvira humanizovanog teškog lanca; pri čemu su VHi VLCDR definisani po Kabatu (vidi, npr., Tabela 1, gore; i Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)).
[0070] U nekim slučajevima, anti-Tau antitelo predmetne objave koje je pogodno za upotrebu u metodu lečenja tauopatije uključuje: a) region lakog lanca, koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VLCDR antitela IPN001; i ii) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) region teškog lanca, koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VHCDR antitela IPN001; i ii) region okvira humanizovanog teškog lanca; pri čemu su VHi VLCDR definisani po Chothia (vidi, npr., Tabela 1, gore; i Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)).
[0071] U drugim slučajevima, anti-Tau antitelo predmetne objave koje je pogodno za upotrebu u metodu lečenja tauopatije uključuje: a) region lakog lanca, koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VLCDR antitela IPN002; i ii) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) region teškog lanca, koji sadrži: i) jedan, dva, ili tri VHCDR antitela IPN002; i ii) region okvira humanizovanog teškog lanca; pri čemu su VHi VLCDR definisani po Kabatu (vidi, npr., Tabela 1, gore; i Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)).
[0072] U drugim slučajevima, anti-Tau antitelo predmetne objave (npr., predmetno antitelo koje se specifično vezuje sa epitopom u Tau polipeptidu, pri čemu je epitop u okviru aminoterminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru aminokiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau, u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau), uključuje: a) region lakog lanca, koji sadrži: i) jedan, dva, ili tri VLCDR antitela IPN002; i ii) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) region teškog lanca, koji sadrži: i) jedan, dva, ili tri VHCDR antitela IPN002; i ii) region okvira humanizovanog teškog lanca; pri čemu su VHi VLCDR definisani po Chothia (vidi, npr., Tabela 1, gore; i Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
[0073] U nekim slučajevima, metod predmetne objave za lečenje tauopatije uključuje primenu, kod individue kojoj je to potrebno, efikasne količine farmaceutske kompozicije koja uključuje: a) antitelo koje se specifično vezuje za linearni epitop u okviru amino-terminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau (pri čemu su amino-kiseline 1-18 Tau: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:53), u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau (pri čemu su amino-kiseline 15-24 Tau: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51)), pri čemu antitelo uključuje: (i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; (iv) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (v) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (vi) a VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12; i b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi.
[0074] Aminokiselinske sekvence VHi VLIPN001 prikazane su na Slikama 1A i 1B. CDR (kako je definisano po Kabatu) prikazani su masnim slovima i podvučeni su. Aminokiselinske sekvence VHi VLIPN002 prikazane su na Slikama 2A i 2B. CDR (kako je definisano po Kabatu) prikazani su masnim slovima i podvučeni su.
[0075] SEQ ID NO:1-12 su sledeće:
RSSQTILHSNGNTYLE (SEQ ID NO:1);
KVSKRFS (SEQ ID NO:2);
FQGSLVPWA (SEQ ID NO:3);
SYGMS (SEQ ID NO:4);
TISSSGSRTYFPDSVKG (SEQ ID NO:5);
TWDGAMDY (SEQ ID NO:6);
KSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:7);
2
KVSNRFS (SEQ ID NO:8);
FQGSLVPWA (SEQ ID NO:9);
KYGMS (SEQ ID NO:10);
TISSSGSRTYYPDSVKG (SEQ ID NO:11);
SWDGAMDY (SEQ ID NO:12).
[0076] U nekim slučajevima, antitelo uključuje region okvira humanizovanog lakog lanca i/ili region okvira humanizovanog teškog lanca. Humanizovana anti-Tau antitela opisana su detaljno u nastavku ovog teksta.
[0077] Tauopatija je poremećaj koji se karakteriše nenormalnim nivoom tau u ćeliji, tkivu, ili telesnoj tečnosti pojedinca. U nekim slučajevima, tauopatija se karakteriše prisustvom povišenih (viših nego normalno) nivoa tau ili tau polipeptida i/ili patoloških formi tau u ćeliji, tkivu, ili tečnosti. "Viši od normalnog" nivo tau u ćeliji, tkivu, ili tečnosti ukazuje na to da je nivo tau u tkivu ili tečnosti viši od normalnog, kontrolnog nivoa, npr., viši od normalnog, kontrolnog nivoa za individuu ili populaciju individua iste starosne grupe. Vidi, npr., Blomberg et al. (2001) "Cerebrospinal fluid tau levels increase with age in healthy individuals" Dement. Geriatr. Cogn. Disord. 12:127. U nekim slučajevima, individua koja ima tauopatiju ispoljava jedan ili više dodatnih simptoma tauopatije (npr., pad kognitivnih sposobnosti).
[0078] U drugim slučajevima, tauopatija se karakteriše prisustvom nivoa tau u ćeliji, tkivu, ili telesnoj tečnosti, koji su niži od normalnih. "Niži od normalnog" nivo tau u tkivu ili tečnosti ukazuje na to da je nivo tau u ćeliji, tkivu, ili tečnosti niži od normalnog, kontrolnog nivoa za individuu ili populaciju individua iste starosne grupe.
[0079] Alzheimerova bolest i određene forme frontotemporalne demencije (Pickova bolest, sporadična frontotemporalna demencija i frontotemporalna demencija sa parkinsonizmom vezana za hromozom 17) najčešće su forme tauopatije. Predmetna objava obezbeđuje metod lečenja, kako je gore opisano, pri čemu je tauopatija Alzheimerova bolest, Pickova bolest, sporadična frontotemporalna demencija i frontotemporalna demencija sa parkinsonizmom vezana za hromozom 17. Druge tauopatije uljučuju, ali se ne ograničavaju na progresivnu supranuklearnu palsiju (progressive supranuclear palsy, PSP), koritiko-bazalnu degeneraciju (corticobasal degeneration, CBD) i subakutni sklerotizujući panencefalitis.
[0080] Neurodegenerativne tauopatije uključuju Alzheimerovu bolest, amiotrofičnu lateralnu sklerozu/parkinsonizam-demencija kompleks, argirofilnu zrnastu demenciju, britanski tip amiloidne angiopatije, cerebralnu amiloidnu angiopatiju, kortikobazalnu degeneraciju, Creutzfeldt-Jakobovu bolest, demenciju pugilistiku, difuzne neurofibrilarne klupčiće sa kalcifikacijom, Downov sindrom, frontotemporalnu demenciju (FTD), frontotemporalnu
2
demenciju sa parkinsonizmom vezanu za hromozom 17, frontotemporalnu lobusnu degeneraciju, Gerstmann-Straussler-Scheinkerovu bolest, Hallervorden-Spatzovu bolest, miozitis inkluzionih telašaca, multiplu sistemsku atrofiju, miotoničnu distrofiju, Niemann-Pickovu bolest tip C, ne-Guamanian bolest motornih neurona sa neurofibrilarnim klupčićima, Pickovu bolest, postencefalitični parkinsonizam, cerebralnu amiloidnu angiopatiju prionskog proteina, progresivnu subkortikalnu gliozu, progresivnu supranuklearnu palsiju, subakutni sklerotizujući panencefalitis, senilnu demenciju - tip neurofibrilarni klupčići, multiinfarktnu demenciju, ishemični moždani udar, hroničnu traumatsku encefalopatiju (chronic traumatic encephalopathy, CTE), traumatsku povredu mozga (traumatic brain injury, TBI), i moždani udar.
[0081] Predmetna objava obezbeđuje i metode lečenja sinukleinopatije, npr., Parkinsonove bolesti (PD); demencije sa Lewyjevim telima (dementia with Lewy Bodies, DLB); multiple sistemske atrofije (MSA); itd. Na primer, PD sa demencijom (PDD) može se lečiti predmetnim metodom.
[0082] U jednom primeru izvođenja, anti-tau antitelo predmetne objave sprečava ili odlaže pojavu najmanje jednog simptoma neurodegenerativne tauopatije kod subjekta. U jednom primeru izvođenja, predmetno anti-tau antitelo smanjuje ili eliminiše najmanje jedan simptom neurodegenerativne tauopatije kod subjekta. Simptom može biti formiranje jednog ili više patoloških tau depozita; vaćelijskih rastvorljivih i/ili Tau fragmenata; hiperfosforilisanih tau depozita; nerastvorljivih tau depozita; neurofibrilarnih klupčića; neurofibrilarnih vlakana; preklupčastih fosfo-tau agregata; intraneuronalnih neurofibrilarnih klupčića; hiperaktivnost neurona; i formiranje vanneuronskih neurofibrilarnih klupčića u mozgu ili kičmenoj moždini subjekta. Simptom može biti neurološki simptom, na primer, ometena kognitivna funkcija, ometena memorija, gubitak motorne funkcije, itd. U nekim slučajevima, anti-tau antitelo predmetne objave može poboljšati kognitivnu funkciju. U nekim slučajevima, anti-tau antitelo predmetne objave može sniziti stopu opadanja kognitivne funkcije. U nekim slučajevima, antitau antitelo predmetne objave može poboljšati motornu funkciju. U nekim slučajevima, anti-tau antitelo predmetne objave može sniziti stopu opadanja motorne funkcije.
[0083] Simptom može biti i nivo Tau polipeptida u CSF kod individue. Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetno anti-tau antitelo, kada se primeni u jednoj ili više doza kao monoterapija ili kombinovana terapija, kod individue koja ima tauopatiju, smanjuje nivo Tau polipeptida u CSF individue za najmanje oko 10%, najmanje oko 15%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, ili više od 50%, u poređenju sa nivoom Tau polipeptida u CSF individue pre tretmana anti-tau antitelom.
2
[0084] Primena predmetnog anti-tau antitela kod individue može rezultovati jednim ili više od sledećeg: smanjenje količine slobodnog vanćelijskog Tau u moždanom tkivu; smanjenje širenja Tau (npr., Tau fragmenata) od ćelije do ćelije (npr., širenje od neurona do neurona); smanjenje ukoličine tau agregata (npr., unutarćelijskih (npr., unutarneuronskih) tau agregata); smanjenje količine neurofibrilarnih klupčića; smanjenje nivoa aktivacije mikroglije i/ili aktivacije astrocita; smanjenje količine fosforilisanog tau; smanjenje količine hiperfosforilisanog tau; smanjenje ukupnog Tau (npr., ukupan unutarćelijski Tau; i/ili ukupan vanćelijski Tau); smanjenje slobodnog Tau (npr., Tau koji nije vezan za predmetno anti-Tau antitelo); smanjenje hiperaktivnosti neurona; i smanjenje količine N-terminalnih Tau fragmenata. "Ukupni Tau" može uključivati zbir ukupnog Tau pune dužine bilo koje izoforme; i bilo kojih N-terminalnih Tau fragmenata koji su prisutni i koji prikazuju epitop prepoznat predmetnim anti-Tau antitelom. Aminokiselinske sekvence humanog Tau pune dužine predstavljene su Slikama 6A-D. Smanjenje fosforilisanog Tau može se odrediti korišćenjem bilo kojeg poznatog metoda, npr., imunološkog metoda u kojem se koriste anti-fosfo-Tau antitela.
[0085] Primena predmetnog anti-tau antitela kod individue može rezultovati promenom jednog ili više od sledećeg: a) količina slobodnog vanćelijskog tau u moždanog tkiva; b) količina slobodnog vanćelijskog tau u intersticijalnoj tečnosti (ISF); c) količina slobodnog vanćelijskog tau u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF); d) širenje tau od neurona do neurona; e) količina unutarneuronskih tau agregata; f) stepen aktivacije mikroglije i/ili astrocita; g) količina fosforilisanog ili hiperfosforilisanog tau; h) količina ukupnog Tau ili slobodnog tau u ISF ili CSF; i) količina unutarćelijskih N-terminalnih tau fragmenata; j) hiperaktivnost neurona; k) količina Aβ40 i/ili Aβ42 u CSF; l) opterećenje Aβ plakama; m) sekrecija Aβ40 i/ili Aβ42 iz neurona; n) aktivnost promotora amiloidnog prekursorskog proteina (APP); o) nivo APP mRNK i/ili proteina; p) aktivnost beta-sekretaze i/ili gama sekretaze; q) stanje aktivacije signalnog puta indukovanog Aβ; r) količina unutarćelijskog ukupnog tau ili slobodnog tau; s) količina tau vezanog za anti-tau antitela u ISF ili CSF; i t) količina unutarćelijskog tau vezanog za anti-Tau antitelo.
[0086] Primena predmetnog anti-tau antitela kod individue može u nekim slučajevima poboljšati kognitivnu funkciju kod individue, ili bar smanjiti stopu smanjenja kognitivne funkcije kod individue.
[0087] U nekim slučajevima, primena predmetnog anti-tau antitela kod individue smanjuje količinu slobodnog vanćelijskog tau polipeptida (npr., količinu slobodnog vanćelijskog tau polipeptida u moždanom tkivu) za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%,
2
najmanje oko 50%, ili više od 50%, u poređenju sa količinom slobodnog vanćelijskog tau polipeptida kod individue pre primene anti-tau antitela.
[0088] U nekim slučajevima, primena predmetnog anti-tau antitela kod individue smanjuje širenje tau polipeptida (npr., patološkog tau polipeptida) od ćelije do ćelije (npr., od neurona do neurona) za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, ili više od 50%, u poređenju sa širenjem od ćelije do ćelije pre primene anti-tau antitela.
[0089] U nekim slučajevima, primena predmetnog anti-tau antitela kod individue smanjuje količinu tau agregata (npr., unutarćelijskih (npr., unutarneuronskih) tau agregata) za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, ili više od 50%, u poređenju sa količinom tau agregata pre primene anti-tau antitela.
[0090] U nekim slučajevima, primena predmetnog anti-tau antitela kod individue smanjuje neurotoksičnost kod individue; i/ili smanjuje neuroinflamaciju kod individue; i/ili smanjuje aktivaciju astrocita i mikroglije; i/ili smanjuje indukciju patoloških elektrofizioloških efekata; i/ili smanjuje količinu tau u egzozomima.
[0091] U nekim slučajevima, primena predmetnog anti-tau antitela kod individue smanjuje hiperaktivnost neurona za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, ili više od 50%, u poređenju sa nivoom hiperaktivnosti neurona pre primene anti-tau antitela. U nekim slučajevima, primena predmetnog anti-tau antitela kod individue smanjuje hiperaktivnost neurona za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 50%, ili više od 50%, kako je određeno tehnikom fiksacije voltaže na mikropodručjima membrane, primenjenom na celoj ćeliji - kortikalnom neuronu poreklom iz indukovane pluripotentne matične ćelije (induced pluripotent stem cell-derived cortical neuron iPSC-CN) ili kulture humanih koritkalnih neurona (human cortical neuron cultures, HCC).
[0092] Primena odgovarajućih kompozicija može se izvršiti na različite načine, npr., intravenskom, intraperitonealnom, subkutanom, intrakranijalnom, intratekalnom, intraarterijskom (npr., preko karotidne arterije), intramuskularnom, intranazalnom, površinskom ili intradermalnom primenom ili spinalnom ili moždanom dostavom. Aerosolne formulacije, kao što su formulacije nazalnog spreja, uključuju prečišćene vodene ili druge rastvore aktivnih sredstava sa prezervirajućim sredstvima i izotoničnim sredstvima. Takve formulacije imaju pH i izotoničnost kompatibilne sa nosnom sluzokožom.
[0093] U nekim slučajevima, predmetno anti-tau antitelo je modifikovano, ili formulisano, na takav način da antitelu daje sposobnost prolaska kroz krvno-moždanu barijeru. Takvo antitelo ili kompozicija antitela može se primeniti, kod individue koja ima tauopatiju, različitim enteralnim i parenteralnim putevima primene, uključujući oralni, intravenski, itd.
2
[0094] Preparati za parenteralnu primenu uključuju sterilne vodene ili nevodene rastvore, suspenzije i emulzije. Primeri nevodenih rastavarača su propilen glikol, polietilen glikol, biljna ulja kao što je maslinovo ulje, i injektabilni organski estri kao što je etil oleat. Vodeni nosači uključuju vodu, alkoholne/vodene rastvore, emulzije ili suspenzije, uključujući slani rastvor i puferisane medijume. Parenteralni prenosnici uključuju rastvor natrijum hlorida, Ringerovu dekstrozu, dekstrozu i natrijum hlorid, Ringerov rastvor sa laktatom, ili neisparljiva ulja. Intravenski prenosnici uključuju sredstva za nadoknadu tečnosti i nutrijenata, sredstva za nadoknadu elektrolita (kao što su oni bazirani na Ringerovoj dekstrozi), i slično. Mogu biti prisutni i prezervansi i drugi aditivi kao što su, na primer, antimikrobna sredstva, antioksidanti, helirajuća sredstva i inertni gasovi, i slično. Pored toga, farmaceutska kompozicija predmetne objave može uključivati dodatna sredstva kao što su dopamin ili psihofarmakološki lekovi, zavisno od upotrebe za koju je farmaceutska kompozicija namenjena.
[0095] Dozni režim odrediće nadležni lekar ili drugo medicinsko osoblje, na osnovu različitih kliničkih faktora. Kao što je dobro poznato u medicini, doziranje za svakog pacijenta zavisi od različitih faktora, uključujući veličinu pacijenta, površinu tela, starost, određeno jedinjenje koje će se primeniti, pol, vreme i put primene, opšte zdravstveno stanje, i druge lekove koji se primenjuju u isto vreme. Doza predmetnog anti-tau antitela može biti, na primer, u rasponu od 0.001 µg do 1000 µg; međutim, predviđene su i doze ispod ili iznad ovog primera raspona, posebno imajući u vidu gorepomenute faktore. Uopšteno, doza može biti u rasponu, npr., od oko 0.0001 do 100 mg/kg, ili od oko 0.01 do 5 mg/kg (npr., 0.02 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, itd.), telesne težine domaćina. Na primer, doze mogu iznositi 1 mg/kg telesne težine ili 10 mg/kg telesne težine ili u rasponu od of 1-10 mg/kg, ili najmanje 1 mg/kg. Doze unutar navedenog raspona takođe su predviđene obimom pronalaska. Subjektima se te doze mogu davati svakog dana ili svakog drugog dana, ili nedeljno ili prema nekom drugom rasporedu određenom empirijskom analizom. Primer lečenja podrazumeva primenu većeg broja doza tokom dužeg vremenskog perioda, na primer najmanje šest meseci. Dodatni primer lečenja podrazumeva primenu jednom na svake dve nedelje ili jednom mesečno ili jednom na 3 do 6 meseci. Primer doznog rasporeda uključuje 1-10 mg/kg ili 15 mg/kg svakog dana, 30 mg/kg svakog drugog dana ili 60 mg/kg nedeljno. U nekim metodima, dva ili više monoklonskih antitela sa različitim vezujućim specifičnostima primenjuju se istovremeno, u kom slučaju je doza svakog primenjenog antitela u navedenmm rasponima. Napredak se može pratiti periodičnim kontrolama.
Kombinovana terapija
[0096] Anti-tau antitelo predmetne objave može se primeniti kod individue kojoj je to potrebno samo (npr., kao monoterapija); ili u kombinovanoj terapiji sa jednim ili više dodatnih terapijskih sredstava.
[0097] Za lečenje AD, pogodna dodatna terapijska sredstva uključuju, ali se ne ograničavaju na inhibitore acetilholinesteraze, uključujući, ali ne ograničavajući se na Aricept (donepezil), Exelon (rivastigmin), metrifonat, i takrin (Cognex); anti-Aβ antitelo; nesteroidna antiinflamatorna sredstva, uključujući, ali ne ograničavajući se na ibuprofen i indometacin; inhibitore ciklooksigenaze-2 (cyclooxygenase-2, Cox2) kao što je Celebrex; i inhibitore monoamino-oksidaze, kao što je selegilen (Eldepryl ili Deprenyl). Doziranje svakog od pomenutih sredstava poznato je u struci.
[0098] Drugo pogodno dodatno terapijsko sredstvo za lečenje AD je sredstvo koje inhibira agregaciju tau, npr., naftohinonski derivat koji inhibira agregaciju tau, kako je opisano u U.S. pat. br. 7,605,179. Drugo pogodno dodatno terapijsko sredstvo je sredstvo koje inhibira fosforilaciju tau, npr., 3-supstituisani-4-pirimidonski derivat koji inhibira tau protein kinazu 1, kako je opisano u U.S. pat. br.7,572,793.
[0099] "U kombinaciji sa", kako se koristi u ovom tekstu, označava upotrebe u kojima se, na primer, prvo jedinjenje primenjuje tokom čitavog vremena primene drugog jedinjenja; u kojima se prvo jedinjenje primenjuje tokom vremenskog perioda koji se preklapa sa primenom drugog jedinjenja, npr. kada primena prvog jedinjenja počinje pre primene drugog jedinjenja, a primena prvog jedinjenja se završava pre završetka primene drugog jedinjenja; kada primena drugog jedinjenja počinje pre primene prvog jedinjenja, a primena drugog jedinjenja se završava pre završetka primene prvog jedinjenja; kada primena drugog jedinjenja počinje pre početka primene prvog jedinjenja, a primena prvog jedinjenja se završava pre završetka primene drugog jedinjenja. Tako, "u kombinaciji" može da označi i režim koji uključuje primenu dva ili više jedinjenja. "U kombinaciji sa", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se i na primenu dva ili više jedinjenja koja se mogu primenjivati u istoj ili različitim formulacijama, istim ili različitim putevima, i u doznoj formi istog ili različitog tipa.
Individue koje se leče
[0100] Individue pogodne za lečenje predmetnim anti-tau antitelom uključuju individue kojima je dijagnostikovana tauopatija; individue koje su pod povećanim rizikom u odnosu na opštu populaciju da razviju tauopatiju (npr., individue koje imaju genetičku predispoziciju da razviju tauopatiju); individue sa PDD; i slično. U nekim slučajevima, individua je odrasli čovek. U nekim slučajevima, odrasli čovek je star 30 ili više godina; 40 ili više godina, 50 ili više godina,
1
60 ili više godina, 70 ili više godina, ili 80 ili više godina. Na primer, odrasli čovek može biti star od 40 godina do 50 godina, od 50 do 60 godina, od 60 do 70 godina, ili stariji od 70 godina.
METODI SNIŽAVANJA NIVOA Aβ40 I Aβ42
[0101] Predmetna objava obezbeđuje metod snižavanja nivoa Aβ40i/ili Aβ42u neuronskoj ćeliji i/ili vanćelijskoj tečnosti kod individue. Metod uopšteno uključuje primenu kod individue: a) efikasne količine humanizovanog antitela koje se vezuje za N-terminalni region tau polipeptida; ili b) farmaceutske kompozicije koja uključuje humanizovano antitelo.
[0102] Humanizovano antitelo koje se vezuje za N-terminalni region tau polipeptida i koje je pogodno za upotrebu u predmetnom metodu snižavanja Aβ40 i Aβ42 u neuronskoj ćeliji i/ili vanćelijskoj tečnosti, je humanizovano antitelo koje se vezuje za epitop Tau u okviru aminokiselina 2-176 Tau, npr., u okviru amino-kiselina 2-15, amino-kiselina 15-24, amino-kiselina 24-50, amino-kiselina 2-25, amino-kiselina 15 do 50, amino-kiselina 50 do 75, amino-kiselina 40 do 60, amino-kiselina 75 do 100, amino-kiselina 60 do 80, amino-kiselina 100 do 125, amino-kiselina 80-115, amino-kiselina 125 do 150, amino-kiselina 115 do 140, amino-kiselina 150 do 176, ili amino-kiselina 140 do 160, Tau. Primeri Tau polipeptida prikazani su na Slici 20; antitelo koje snižava nivo Aβ40i/ili Aβ42u neuronskoj ćeliji i/ili vanćelijskoj tečnosti kod individue može biti humanizovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop u Tau polipeptidu prikazanom na Slici 20.
[0103] U nekim slučajevima, antitelo koje snižava nivo Aβ40i/ili Aβ42u neuronskoj ćeliji i/ili vanćelijskoj tečnosti kod individue, i koje je pogodno za upotrebu u predmetnom metodu, je humanizovano anti-Tau antitelo predmetne objave. U nekim slučajevima, antitelo je humanizovano antitelo koje se vezuje za epitop u okviru amino-kiselina 15-24 Tau.
ANTI-TAU ANTITELA
[0104] Predmetna objava obezbeđuje izolovana anti-Tau antitela, i farmaceutske formulacije koje ih sadrže.
[0105] Predmetna objava obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop u okviru N-terminalnog regiona Tau polipeptida (npr., linearni epitop u okviru aminoterminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru aminokiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau (pri čemu su amino-kiseline 1-18 Tau: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:53), u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau (pri čemu su amino-kiseline 15-24 Tau: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51). U nekim slučajevima, antitelo je humanizovano, npr., jedan ili više regiona okvira varijabilnog regiona teškog lanca i/ili
2
varijabilnog regiona lakog lanca uključuju sekvence poreklom iz humanog imunoglobulinskog okvira.
[0106] Predmetna objava obezbeđuje izolovano humanizovano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za epitop u okviru amino-kiselina 15-24 Tau polipeptida. U nekim slučajevima, epitop ne uključuje fosforilisanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, epitop ne uključuje nitrovanu amino-kiselinu. U nekim slučajevima, epitop uključuje fosforilisanu aminokiselinu, nitrovanu amino-kiselinu, ili i fosforilisanu amino-kiselinu i nitrovanu amino-kiselinu.
[0107] Humanizacija jednog ili više regiona okvira smanjuje rizik da antitelo pobudi odgovor humanim antimišjim antitelima (human-anti-mouse-antibody, HAMA) u ljudima. U struci poznati metodi određivanja imunskog odgovora mogu se izvesti za praćenje HAMA odgovora kod određenog pacijenta ili tokom kliničkih ispitivanja. Kod pacijenata kod kojih se primenjuju humanizovana antitela može se uraditi procena imunogenosti na početku i tokom primene terapije. HAMA odgovor se meri, na primer, detektovanjem antitela na humanizovani terapijski reagens, u uzorcima seruma pacijenata, korišćenjem metoda poznatog stručnajku u oblasti, uključujući tehnologiju rezonancije površinskog plazmona (BIACORE) i/ili analizu imunoenzimskim testom na čvrstoj fazi (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA). U mnogim slučajevima, predmetno humanizovano anti-Tau antitelo suštinski ne pobuđuje HAMA odgovor kod humanog subjekta. U nekim slučajevima, predmetno humanizovano anti-Tau antitelo ima smanjeni imunogeni potencijal, kako je određeno EpiScreen™ testom koji se izvodi korišćenjem CD8<+>-depletovanih mononuklearnih ćelija periferne krvi. U nekim slučajevima, predmetno humanizovano anti-Tau antitelo ispoljava stimulacioni indeks manji od 2.0.
[0108] Određene amino-kiseline okvirnih rezidua humanog varijabilnog regiona odabrane su za supstituisanje na osnovu njihovog mogućeg uticaja na konformaciju CDR i/ili vezivanje za antigen. Neprirodna jukstapozicija mišjih CDR regiona uz okvir humanog varijabilnog regiona može za rezultat imati neprirodnu konformacionu restrikciju, koja, ako se ne koriguje supstitucijom određenih aminokiselinskih rezidua, dovodi do gubitka vezujućeg afiniteta.
[0109] Odabir aminokiselinskih rezidua za supstituciju može se odrediti, delom, kompjuterskim modelovanjem. Kompjuterski hardver i softver za proizvođenje trodimenzionalnih slika imunoglobulinskih molekula poznat je u struci. Uopšteno, molekularni modeli se proizvode počevši od poznatih struktura imunoglobulinskih lanaca ili njihovih domena. Lanci koji će se modelirati upoređuju se u pogledu sličnosti aminokiselinske sekvence sa lancima ili domenima poznatih trodimenzionalnih struktura, i lanci ili domeni koji pokazuju najveeću sekvencionu sličnost biraju se kao polazni za konstruisanje molekularnog modela. Za modelovanje se biraju lanci ili domeni koji imaju najmanje 50% sekvencione identičnosti , npr., za modelovanje se biraju oni koji imaju najmanje 60%, 70%, 80%, 90%, ili više od 90%, sekvencione identičnosti ili više. Poznate polazne strukture modifikuju se kako bi se omogućile različitosti između aktuelnih amino-kiselina u imunoglobulinskim lancima ili domenima koji se modeluju, i onima u polaznoj strukturi. Modifikovane strukture se zatim sklapaju u složeni imunoglobulin. Na kraju, model se poboljšava minimizacijom energije i potvrđivanjem da su svi atomi na odgovarajućim rastojanjima jedan od drugog i da su dužine i uglovi veza u okvirima hemijski prihvatljivih ograničenja.
[0110] CDR i regioni okvira definisani su po Kabatu, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991). Alternativnu strukturnu definiciju predložili su Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901 (1987); Nature 342:878 (1989); i J. Mol. Biol.186:651 (1989) (zajedno označeno kao "Chothia"). Kada rezidue okvira, definisane po Kabatu, gore, čine rezidue strukturne petlje definisane po Chothia, gore, amino-kiseline prisutne u mišjem antitelu mogu da se odaberu za supstituisanje u humanizovanom antitelu. Rezidue koje su "pored CDR regiona" uključuju aminokiselinske rezidue na pozicijama neposredno pored jednog ili više CDR u primarnoj sekvenci humanizovanog imunoglobulinskog lanca, na primer, na pozicijama neposredno pored CDR definisanih po Kabatu, ili CDR definisanih po Chothia (vidi, npr., Chothia and Lesk JMB 196:901 (1987)). Za ove amino-kiseline je naročito verovatno da interaguju sa amino-kiselinama u CDR i, ako se odaberu iz akceptora, remete donorske CDR i smanjuju afinitet. Pored toga, susedne aminokiseline mogu da interaguju direktno sa antigenom (Amit et al., Science, 233:747 (1986)) i biranje ovih amino-kiselina iz donora može biti poželjno da bi se zadržali svi kontakti antigena koji obezbeđuju afinitet u originalnom antitelu.
[0111] Predmetna objava obezbeđuje izolovano antitelo koje uključuje region okvira humanizovanog lakog lanca; i region okvira humanizovanog teškog lanca, pri čemu izolovano antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida, sa antitelom koje sadrži: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12. U nekim slučajevima, region lakog lanca i region teškog lanca prisutni su u odvojenim polipeptidima. U drugim slučajevima, region
4
lakog lanca i region teškog lanca prisutni su u jednom polipeptidu. Izolovano antitelo može uključivati teški lanac koji sadrži konstantni region izotipa IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. U drugim slučajevima, antitelo je Fv, scFv, Fab, F(ab')2, ili Fab'. Antitelo može sadržati kovalentno vezani nepeptidni sintetski polimer, npr., kada je sintetski polimer poli(etilen glikol) polimer. U nekim slučajevima, izolovano antitelo je fuzionisano, direktno ili preko linkera, sa nosačkim molekulom, peptidom ili proteinom koji promoviše prolazak kroz krvno-moždanu barijeru. U nekim slučajevima, epitop vezan sa izolovanim antitelom je u okviru amino-kiselina 15-24 Tau polipeptida. Region okvira humanizovanog lakog lanca izolovanog antitela može uključivati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija prikazanih u Tabeli 3. Region okvira humanizovanog teškog lanca izolovanog antitela može uključivati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 aminokiselinskih supstitucija prikazanih u Tabeli 2.
[0112] U nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave, (npr., predmetno antitelo koje se specifično vezuje sa epitopom u Tau polipeptidu, npr., linearnim epitopom u okviru amino-terminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau (pri čemu su aminokiseline 1-18 Tau: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:53), u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau (pri čemu su amino-kiseline 15-24 Tau: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51)) uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) jedan, dva ili tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) antitela IPN001, pri čemu su CDR definisani po Kabatu (vidi, npr., Tabelu 1, gore; i Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)).
[0113] U nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave, (npr., predmetno antitelo koje se specifično vezuje sa epitopom u Tau polipeptidu, npr., linearnim epitopom u okviru amino-terminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau (pri čemu su aminokiseline 1-18 Tau: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:53), u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau (pri čemu su amino-kiseline 15-24 Tau: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51)) uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VLCDR antitela IPN001; i ii) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) region teškog lanca koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VHCDR antitela IPN001; i ii) region okvira humanizovanog teškog lanca; pri čemu su VHi VLCDR definisani po Kabatu (vidi, npr., Tabelu 1, gore; i Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)). U nekim od ovih primera izvođenja, anti-Tau antitelo uključuje region okvira humanizovanog VHi/ili VL.
[0114] U nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave, (npr., predmetno antitelo koje se specifično vezuje sa epitopom u Tau polipeptidu, npr., linearnim epitopom u okviru amino-terminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau (pri čemu su aminokiseline 1-18 Tau: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:53), u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau (pri čemu su amino-kiseline 15-24 Tau: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51)) uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VLCDR antitela IPN001; i ii) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) region teškog lanca koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VHCDR antitela IPN001; i ii) region okvira humanizovanog teškog lanca; pri čemu su VHi VLCDR definisani po Chothia (vidi, npr., Tabelu 1, gore; i Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)).
[0115] U nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave, (npr., predmetno antitelo koje se specifično vezuje sa epitopom u Tau polipeptidu, npr., linearnim epitopom u okviru amino-terminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau (pri čemu su aminokiseline 1-18 Tau: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:53), u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau (pri čemu su amino-kiseline 15-24 Tau: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51)) uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VLCDR antitela IPN002; i ii) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) region teškog lanca koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VHCDR antitela IPN002; i ii) region okvira humanizovanog teškog lanca; pri čemu su VHi VLCDR definisani po Kabatu (vidi, npr., Tabelu 1, gore; i Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)).
[0116] U nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave, (npr., predmetno antitelo koje se specifično vezuje sa epitopom u Tau polipeptidu, npr., linearnim epitopom u okviru amino-terminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau (pri čemu su aminokiseline 1-18 Tau: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:53), u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau (pri čemu su amino-kiseline 15-24 Tau: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51)) uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VLCDR antitela IPN002; i ii) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) region teškog lanca koji sadrži: i) jedan, dva ili tri VHCDR antitela IPN002; i ii) region okvira humanizovanog teškog lanca; pri čemu su VHi VLCDR definisani po Chothia (vidi, npr., Tabelu 1, gore; i Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)).
[0117] U nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave, (npr., predmetno antitelo koje se specifično vezuje sa epitopom u Tau polipeptidu, npr., linearnim epitopom u okviru amino-terminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau (pri čemu su aminokiseline 1-18 Tau: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:53), u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau (pri čemu su amino-kiseline 15-24 Tau: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51)) uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) jedan, dva, ili tri CDR odabrana između SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, i SEQ ID NO:3; i ii) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) region teškog lanca koji sadrži: i) jedan, dva, ili tri CDR odabrana između SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, i SEQ ID NO:6; i ii) region okvira humanizovanog teškog lanca.
[0118] U nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave, (npr., predmetno antitelo koje se specifično vezuje sa epitopom u Tau polipeptidu, npr., linearnim epitopom u okviru amino-terminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau, u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau (pri čemu su aminokiseline 1-18 Tau: MAEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:53), u okviru amino-kiselina 15-44 Tau, u okviru amino-kiselina 13-24 Tau, ili u okviru amino-kiselina 15-24 Tau (pri čemu su amino-kiseline 15-24 Tau: AGTYGLGDRK (SEQ ID NO:51)) uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) jedan, dva, ili tri CDR odabrana između SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, i SEQ ID NO:9; i ii) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) region teškog lanca koji sadrži: i) jedan, dva, ili tri CDR odabrana između SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, i SEQ ID NO:12; i ii) region okvira humanizovanog teškog lanca.
[0119] U nekim slučajevima, antitelo uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i (iv) region okvira humanizovanog lakog lanca; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12; i iv) region okvira humanizovanog teškog lanca.
[0120] U nekim primerima izvođenja, predmetno anti-Tau antitelo uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži jedan, dva, ili tri CDR teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom koja se bira između jedne ili više od SEQ ID NO:4, 5, i 6; i jedan, dva, tri, ili četiri FR regiona koji su humanizovani. Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži, redom od N-terminusa do C-terminusa: FR1 humanizovanog teškog lanca; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:4; FR2 humanizovanog teškog lanca; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:5; FR3 humanizovanog teškog lanca; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6; i FR4 humanizovanog teškog lanca.
[0121] U nekim primerima izvođenja, predmetno anti-Tau antitelo uključuje varijabilni region lakog lanca koji sadrži jedan, dva, ili tri CDR lakog lanca sa polipeptidnom sekvencom koja se bira između jedne ili više od SEQ ID NO:1, 2, i 3; i jedan, dva, tri, ili četiri FR regiona koji su humanizovani. Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje varijabilni region lakog lanca koji sadrži, redom od N-terminusa do C-terminusa: FR1 humanizovanog lakog lanca; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:1; FR2 humanizovanog lakog lanca; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:2; FR3 humanizovanog lakog lanca; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:3; i FR4 humanizovanog lakog lanca.
[0122] U nekim primerima izvođenja, predmetno anti-Tau antitelo uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži jedan, dva, ili tri CDR teškog lanca sa aminokiselinskom sekvencom koja se bira između jedne ili više od SEQ ID NO:10, 11, i 12; i jedan, dva, tri, ili četiri FR regiona koji su humanizovani. Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži, redom od N-terminusa do C-terminusa: FR1 humanizovanog teškog lanca; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:10; FR2 humanizovanog teškog lanca; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:11; FR3 humanizovanog teškog lanca; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12; i FR4 humanizovanog teškog lanca.
[0123] U nekim primerima izvođenja, predmetno anti-Tau antitelo uključuje varijabilni region lakog lanca koji sadrži jedan, dva, ili tri CDR lakog lanca sa polipeptidnom sekvencom koja se bira između jedne ili više od SEQ ID NO:7, 8, i 9; i jedan, dva, tri, ili četiri FR regiona koji su humanizovani. Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje varijabilni region lakog lanca koji uključuje redom od N-terminusa do C-terminusa: FR1 humanizovanog lakog lanca; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:7; FR2 humanizovanog lakog lanca; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8; FR3 humanizovanog lakog lanca; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:9; FR4 humanizovanog lakog lanca .
[0124] Aminokiselinske sekvence VHi VLIPN001 prikazane su na Slikama 1A i 1B. CDR (kako su definisane po Kabatu) predstavljeni su masnim slovima i podvučeni su. Aminokiselinske sekvence VHi VLIPN002 prikazane su na Slikama 2A i 2B. CDR (kako su definisane po Kabatu) predstavljeni su masnim slovima i podvučeni su.
[0125] SEQ ID NO:1-12 su sledeće:
RSSQTILHSNGNTYLE (SEQ ID NO:1);
KVSKRFS (SEQ ID NO:2);
FQGSLVPWA (SEQ ID NO:3);
SYGMS (SEQ ID NO:4);
TISSSGSRTYFPDSVKG (SEQ ID NO:5);
TWDGAMDY (SEQ ID NO:6);
KSSQSIVHSNGNTYLE (SEQ ID NO:7);
KVSNRFS (SEQ ID NO:8);
FQGSLVPWA (SEQ ID NO:9);
KYGMS (SEQ ID NO:10);
TISSSGSRTYYPDSVKG (SEQ ID NO:11);
SWDGAMDY (SEQ ID NO:12).
[0126] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 1B i navedenom u SEQ ID NO:13.
[0127] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 1A i navedenom u SEQ ID NO:14.
[0128] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 2B i navedenom u SEQ ID NO:15.
[0129] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 2A i navedenom u SEQ ID NO:16.
[0130] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 9 (VH varijanta 1).
[0131] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 10 (VH varijanta 2).
[0132] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 11 (VH varijanta 3).
[0133] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 12 (VH varijanta 4).
[0134] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 13 (Vk varijanta 1).
[0135] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 14 (Vk varijanta 2).
[0136] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 15 (Vk varijanta 3).
[0137] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa sekvencom prikazanom na Slici 16 (Vk varijanta 4).
[0138] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 aminokiselinskih supstitucija okvira (framework, FR), u odnosu na aminokiselinske sekvence FR roditeljskog IPN002 antitela, što je prikazano u Tabeli 2.
Tabela 2: Varijante VH
4
[0139] Na primer, predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji sadrži supstituciju H→Q na aminokiselinskoj poziciji 3 u VH FR1 i/ili supstituciju K→R na aminokiselinskoj poziciji 19 u VH FR1.
[0140] Kao drugi primer, predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji sadrži supstituciju T→A na aminokiselinskoj poziciji 40 u VH FR2 i/ili supstituciju D→G na aminokiselinskoj poziciji 42 u VH FR2 i/ili supstituciju R→G na poziciji 44 u VH FR2.
[0141] Kao sledeći primer, predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji sadrži supstituciju Q→R na aminokiselinskoj poziciji 66 u VH FR3 i/ili supstituciju S→N na aminokiselinskoj poziciji 83 u VH FR3 i/ili supstituciju L→S na aminokiselinskoj poziciji 85 u VH FR3 i/ili supstituciju K→R na aminokiselinskoj poziciji 86 u FR3 i/ili supstituciju S→A na aminokiselinskoj poziciji 87 u VH FR3 i/ili supstituciju S→A na aminokiselinskoj poziciji 93 u VH FR3.
[0142] Kao sledeći primer, predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region teškog lanca koji sadrži supstituciju S→T na aminokiselinskoj poziciji 108 u VH FR4.
[0143] U nekim slučajevima, predmetno izolovano anti-Tau antitelo može uključivati, redom od N-terminusa do C-terminusa VH region koji uključuje:
EVX1LVESGGALVKPGGSLRLSCAASGFSFS (SEQ ID NO:83); VH CDR1 kako je pokazano na Slici 2A; WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID NO:84); VH CDR2 kako je pokazano na Slici 2A;
RFTISRDNAKNTLYLQMX2SX3X4X5EDTAMYYCX6I (SEQ ID NO:85); VH CDR3 kako je pokazano na Slici 2A; WGQGTX7VTVSS (SEQ ID NO:86), gde je X1H ili Q; X2je S ili N; X3je S ili L; X4je K ili R; X5je S ili A; X6je S ili A; i X7je S ili T.
[0144] Predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji uključuje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 aminokiselinskih supstitucija okvira (FR), u odnosu na aminokiselinske sekvence FR roditeljskog IPN002 antitela, što je prikazano u Tabeli 3.
Tabela 3: VarijanteVk
[0145] Na primer, predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji sadrži supstituciju L→V na aminokiselinskoj poziciji 3 u VL FR1 i/ili supstituciju T→S na aminokiselinskoj poziciji 7 u VL FR1 i/ili supstituciju S→T na aminokiselinskoj poziciji 14 u VL FR1 i/ili supstituciju D→Q na aminokiselinskoj poziciji 17 u VL FR1 i/ili supstituciju Q→P na aminokiselinskoj poziciji 18 u VL FR1.
[0146] Kao drugi primer, predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji sadrži supstituciju K→Q na aminokiselinskoj poziciji 45 u VL FR2 i/ili supstituciju V→I na aminokiselinskoj poziciji 48 u VL FR2.
[0147] Kao sledeći primer, predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji sadrži supstituciju L→V na aminokiselinskoj poziciji 83 u VL FR3 i/ili supstituciju T→V na aminokiselinskoj poziciji 85 u VL FR3.
[0148] Kao sledeći primer, predmetno anti-Tau antitelo može uključivati varijabilni region lakog lanca koji sadrži supstituciju L→V na aminokiselinskoj poziciji 104 u VL FR4.
[0149] U nekim slučajevima, predmetno izolovano anti-Tau antitelo može uključivati, redom od N-terminusa do C-terminusa VL region koji uključuje: DVX1MTQSPLSLPVTLGQPASISC (SEQ ID NO:54); VL CDR1 kako je pokazano na Slici 2B; WYLQKPGQSPQLLX2Y (SEQ ID NO:55); VL CDR2 kako je pokazano na Slici 2B; GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGX3YYC (SEQ ID NO:56); CDR3 VL kako je pokazano na Slici 2B; FGGGTKVEIK (SEQ ID NO:57); gde je X1L ili V; X2je V ili I; i X3je T ili V.
[0150] U nekim slučajevima, anti-Tau antitelo predmetne objave uključuje:
a) VH varijantu 1 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 9; i Vk varijantu 1 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 13;
b) VH varijantu 1 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 9; i Vk varijantu 2 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 14;
4
c) VH varijantu 1 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 9; i Vk varijantu 3 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 15;
d) VH varijantu 1 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 9; i Vk varijantu 4 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 16;
e) VH varijantu 2 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 10; i Vk varijantu 1 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 13;
f) VH varijantu 2 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 10; i Vk varijantu 2 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 14;
g) VH varijantu 2 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 10; i Vk varijantu 3 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 15;
h) VH varijantu 2 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 10; i Vk varijantu 4 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 16;
i) VH varijantu 3 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 11; i Vk varijantu 1 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 13;
j) VH varijantu 3 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 11; i Vk varijantu 2 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 14;
k) VH varijantu 3 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 11; i Vk varijantu 3 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 15;
l) VH varijantu 3 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 11; i Vk varijantu 4 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 16;
m) VH varijantu 4 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 12; i Vk varijantu 1 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 13;
n) VH varijantu 4 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 12; i Vk varijantu 2 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 14;
o) VH varijantu 4 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 12; i Vk varijantu 3 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 15; ili
p) VH varijantu 4 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 12; i Vk varijantu 4 koja uključuje aminokiselinsku sekvencu prikazanu na Slici 16.
[0151] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje anti-Tau teškolančane CDR i anti-Tau lakolančane CDR u jednom polipeptidnom lancu, npr., u nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo je scFv. U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje, redom od N-terminusa do C-terminusa: prvu aminokiselinsku sekvencu dugu od oko 5 amino-kiselina do oko 25 amino-kiselina; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:1; drugu aminokiselinsku sekvencu dugu od oko 5 amino-kiselina do oko 25 aminokiselina; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:2; treću aminokiselinsku sekvencu dugu od oko 5 amino-kiselina do oko 25 amino-kiselina; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:3; četvrtu aminokiselinsku sekvencu dugu od oko 5 amino-kiselina do oko 25 amino-kiselina; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:4; petu aminokiselinsku sekvencu dugu od oko 5 amino-kiselina do oko 25 amino-kiselina; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:5; šestu aminokiselinsku sekvencu dugu od oko 5 amino-kiselina do oko 25 amino-kiselina; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6; i sedmu aminokiselinsku sekvencu dugu od oko 5 amino-kiselina do oko 25 aminokiselina.
[0152] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje, redom od N-terminusa do C-terminusa: lakolančani FR1 region; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:1; lakolančani FR2 region; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:2; lakolančani FR3 region; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:3; opciono lakolančani FR4 region; linkerski region; opciono teškolančani FR1 region; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID:4; teškolančani FR2 region; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:5; teškolančani FR3 region; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6; i teškolančani FR4 region. U nekim od ovih primera izvođenja, jedan ili više FR regiona predstavljeno je humanizovanim FR regionom. U nekim od ovih primera izvođenja, svaki od FR regiona je humanizovani FR region. Linkerski region može biti dug od oko 5 amino-kiselina do oko 50 amino-kiselina, npr., dug od oko 5 aa do oko 10 aa, od oko 10 aa do oko 15 aa, od oko 15 aa do oko 20 aa, od oko 20 aa do oko 25 aa, od oko 25 aa do oko 30 aa, od oko 30 aa do oko 35 aa, od oko 35 aa do oko 40 aa, od oko 40 aa do oko 45 aa, ili od oko 45 aa do oko 50 aa.
[0153] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje, redom od N-terminusa do C-terminusa: teškolančani FR1 region; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID:4; teškolančani FR2 region; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:5; teškolančani FR3 region; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:6; opciono teškolančani FR4 region; linker; opciono lakolančani FR1 region; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:1; lakolančani FR2 region; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:2; lakolančani FR3 region; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:3; i lakolančani FR4 region. U nekim od ovih primera
4
izvođenja, jedan ili više FR regiona predstavljeno je humanizovanim FR regionom. U nekim od ovih primera izvođenja, svaki od FR regiona je humanizovani FR region. Linkerski region može biti dug od oko 5 amino-kiselina do oko 50 amino-kiselina, npr., dug od oko 5 aa do oko 10 aa, od oko 10 aa do oko 15 aa, od oko 15 aa do oko 20 aa, od oko 20 aa do oko 25 aa, od oko 25 aa do oko 30 aa, od oko 30 aa do oko 35 aa, od oko 35 aa do oko 40 aa, od oko 40 aa do oko 45 aa, ili od oko 45 aa do oko 50 aa.
[0154] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje, redom od N-terminusa do C-terminusa: lakolančani FR1 region; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:7; lakolančani FR2 region; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8; lakolančani FR3 region; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:9; opciono lakolančani FR4 region; linkerski region; opciono teškolančani FR1 region; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID:10; teškolančani FR2 region; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:11; teškolančani FR3 region; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12; i teškolančani FR4 region. U nekim od ovih primera izvođenja, jedan ili više FR regiona predstavljeno je humanizovanim FR regionom. U nekim od ovih primera izvođenja, svaki od FR regiona je humanizovani FR region. Linkerski region može biti dug od oko 5 amino-kiselina do oko 50 amino-kiselina, npr., dug od oko 5 aa do oko 10 aa, od oko 10 aa do oko 15 aa, od oko 15 aa do oko 20 aa, od oko 20 aa do oko 25 aa, od oko 25 aa do oko 30 aa, od oko 30 aa do oko 35 aa, od oko 35 aa do oko 40 aa, od oko 40 aa do oko 45 aa, ili od oko 45 aa do oko 50 aa.
[0155] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje, redom od N-terminusa do C-terminusa: teškolančani FR1 region; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID:10; teškolančani FR2 region; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:11; teškolančani FR3 region; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:12; opciono teškolančani FR4 region; linker; opciono lakolančani FR1 region; CDR1 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:7; lakolančani FR2 region; CDR2 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:8; lakolančani FR3 region; CDR3 koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:9; i lakolančani FR4 region. U nekim od ovih primera izvođenja, jedan ili više FR regiona predstavljeno je humanizovanim FR regionom. U nekim od ovih primera izvođenja, svaki od FR regiona je humanizovani FR region. Linkerski region može biti dug od oko 5 amino-kiselina do oko 50 amino-kiselina, npr., dug od oko 5 aa do oko 10 aa, od oko 10 aa do oko 15 aa, od oko 15 aa do oko 20 aa, od oko 20 aa do
4
oko 25 aa, od oko 25 aa do oko 30 aa, od oko 30 aa do oko 35 aa, od oko 35 aa do oko 40 aa, od oko 40 aa do oko 45 aa, ili od oko 45 aa do oko 50 aa.
[0156] Linkeri pogodni za upotrebu u predmetnom antitelu obuhvataju "fleksibilne linkere". Ako su prisutni, linkerski molekuli su obično dovoljno dugi da omoguće neke pokrete savijanja između povezanih regiona. Linkerski molekuli su obično dugi oko 6-50 atoma. Linkerski molekuli mogu biti, na primer, aril acetilen, etilen glikol oligomeri koji sadrže 2-10 monomernih jedinica, diamini, diacidi, amino-kiseline, ili njihove kombinacije. U svetlu ove objave, mogu se koristiti i drugi linkerski molekuli koji mogu da se vežu za polipeptide.
[0157] Pogodni linkeri mogu se lako odabrati i mogu biti bilo koje različite pogodne dužine, na primer od 1 amino-kiseline (npr., Gly) do 20 amino-kiselina, od 2 amino-kiseline do 15 aminokiselina, od 3 amino-kiseline do 12 amino-kiselina, uključujući 4 amino-kiseline do 10 aminokiselina, 5 amino-kiselina do 9 amino-kiselina, 6 amino-kiselina do 8 amino-kiselina ili 7 amino-kiselina do 8 amino-kiselina, i mogu biti dugi 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 amino-kiseline.
[0158] Primeri fleksibilnih linkera uključuju polimere glicina (G)n, polimere glicin-serin (uključujući, na primer, (GS)n, GSGGSn(SEQ ID NO:58) i GGGSn(SEQ ID NO:59), gde je n ceo broj od najmanje jedan), polimere glicin-alanin, polimere alanin-serin, i druge fleksibilne linkere poznate u struci. Glicin i polimeri glicin-serin od interesa su jer su obe ove aminokiseline relativno nestrukturirane, i tako mogu služiti kao neutralna veza između komponenti. Polimeri glicina su od posebnog interesa jer glicin pristupa značajno većem fi-psi prostoru nego čak i alanin, i ima znatno manju restrikciju nego rezidue sa dužim bočnim lancem (vidi Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Primeri fleksibilnih linkera uključuju, ali se ne ograničavaju na GGSG (SEQ ID NO:60), GGSGG (SEQ ID NO:61), GSGSG (SEQ ID NO:62), GSGGG (SEQ ID NO:63), GGGSG (SEQ ID NO:64), GSSSG (SEQ ID NO:65), i slično. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti prepoznaće da dizajn peptida konjugovanog sa bilo kojim od goreopisanih elemenata može uključiti linkere koji su u celini ili delimično fleksibilni, tako da linker može obuhvatati fleksibilni linker kao i jedan ili više delova koji daju manje fleksibilnu strukturu.
[0159] U nekim slučajevima, predmetno izolovano antitelo je fragment antitela, Fv, scFv, Fab, F(ab')2, ili Fab'. Prema tome, predmetna objava obezbeđuje izolovano antitelo, pri čemu je antitelo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, ili Fab', i pri čemu antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region
4
teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12. U nekim od ovih primera izvođenja, izolovano antitelo uključuje jedan, dva, tri ili četiri regiona okvira humanizovanog VL, kako je opisano gore. U nekim od ovih primera izvođenja, izolovano antitelo uključuje jedan, dva, tri ili četiri regiona okvira humanizovanog VH, kako je opisano gore
[0160] U nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave je scFv antitelo. U nekim primerima izvođenja, anti-Tau antitelo predmetne objave uključuje scFv multimere. Na primer, u nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo je scFv dimer (npr., uključuje dva tandemska scFv (scFv2)), scFv trimer (npr., uključuje tri tandemska scFv (scFv3)), scFv tetramer (npr., uključuje četiri tandemska scFv (scFv4)), ili je multimer od više od četiri scFv (npr., u tandemu). scFv monomeri mogu biti povezani u tandem preko linkera dugih od oko 2 aminokiseline do oko 10 amino-kiselina (aa), npr., dugih 2 aa, 3 aa, 4 aa, 5 aa, 6 aa, 7 aa, 8 aa, 9 aa, ili 10 aa. Pogodni linkeri uključuju, npr., (Gly)x, gde je x ceo broj od 2 do 10. Drugi pogodni linkeri su oni o kojima je bilo reči gore. U nekim primerima izvođenja, svaki od scFv monomera u predmetnom scFV multimeru je humanizovan, kako je gore opisano.
[0161] U nekim slučajevima, predmetno antitelo uključuje konstantni region imunoglobulina (npr., Fc region). Fc region, ako je prisutan, može biti humani Fc region. Ako su konstantni regioni prisutni, antitelo može sadržati konstantne regione i lakog i teškog lanca. Pogodni teškolančani konstantni CH1, zglobni, CH2, CH3, i CH4 region. Antitela opisana u ovom tekstu uključuju antitela koja imaju sve tipove konstantnih regiona, uključujući IgM, IgG, IgD, IgA i IgE, i sve izotipove, uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4. Primer pogodnog teškolančanog Fc regiona je Fc humanog izotipa IgG1. U nekim slučajevima, teškolančani region je izotip IgG4. U nekim od ovih primera izvođenja, zglobni region uključuje S241P supstituciju. Vidi, npr., Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105. Konstantni regioni lakog lanca mogu biti lambda ili kapa. Predmetno antitelo (npr., predmetno humanizovano antitelo) može uključivati sekvence iz više od jedne klase ili izotipa. Antitela se mogu eksprimirati kao tetrameri koji sadrže dva laka i dva teška lanca, kao zasebni teški lanci, laki lanci, kao Fab, Fab' F(ab')2, i Fv, ili kao jednolančana antitela u kojima su teškolančani i lakolančani varijabilni domeni povezani spejserom.
[0162] U nekim primerima izvođenja, ova objava obezbeđuje izolovano antitelo, pri čemu izolovano antitelo uključuje konstantni region humanog lakog lanca i konstantni region humanog teškog lanca, i gde izolovano antitelo kompetira za vezivanje sa epiotpom u N-
4
terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12. U nekim od ovih primera izvođenja, izolovano antitelo uključuje jedan, dva, tri, ili četiri regiona okvira humanizovanog VL, kako je opisano gore. U nekim od ovih primera izvođenja, izolovano antitelo uključuje jedan, dva, tri, ili četiri regiona okvira humanizovanog VH, kako je opisano gore.
[0163] Predmetno antitelo može uključivati slobodnu tiol (-SH) grupu na karboksil terminusu, pri čemu se tiol grupa može koristiti za povezivanje antitela sa drugim polipeptidom (npr., drugim antitelom, uključujući predmetno antitelo), skafoldom, nosačem, itd.
[0164] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje jednu ili više aminokiselina koje se ne sreću prirodno. U nekim primerima izvođenja, amino-kiselina koja nije kodirana prirodno sadrži karbonil grupu, acetil grupu, aminooksi grupu, hidrazin grupu, hidrazid grupu, semikarbazid grupu, azid grupu, ili alkin grupu. Vidi, npr., U.S. patent br.
7,632,924 za pogodne amino-kiseline koje se ne sreću prirodno. Uključivanje amino-kiseline koja se ne sreće prirodno može obezbediti vezu sa polimerom, drugim polipeptidom, skafoldom, itd. Na primer, predmetno antitelo vezano za polimer rastvorljiv u vodi može se napraviti reakcijom polimera rastvorljivog u vodi (npr., PEG), koji uključuje karbonil grupu, sa anttielom, pri čemu antitelo uključuje amino-kiselinu koja nije kodirana prirodno, koja sadrži aminooksi, hidrazin, hidrazid ili semikarbazid grupu. Kao drugi primer, predmetno antitelo vezano za polimer rastvorljiv u vodi može se napraviti reakcijom predmetnog antitela koje uključuje alkin-sadržavajuću amino-kiselinu, sa polimerom rastvorljivim u vodi (npr., PEG) koji uključuje azidnu komponentu; u nekim primerima izvođenja, azid ili alkin grupa vezana je za PEG molekul preko amidne veze. "Amino-kiselina koja nije kodirana prirodno" odnosi se na amino-kiselinu koja nije jedna od 20 uobičajenih amino-kiselina ili pirolizin ili selenocistein. Drugi izrazi koji se mogu koristiti kao sinonimi sa izrazom "amino-kiselina koja nije kodirana prirodno" su "neprirodna amino-kiselina", "amino-kiselina koja se ne sreće prirodno" i njihove različite verzije napisane sa crticom ili bez nje. Izraz "amino-kiselina koja nije kodirana prirodno" uključuje, ali se ne ograničava na amino-kiseline koje nastaju modifikacijom (npr. posttranslacionim modifikacijama) prirodno kodiranih amino-kiselina (uključujući, ali ne
4
ograničavajući se na 20 uobičajenih amino-kiselina ili pirolizin i selenocistein), ali koje se kao takve prirodno ne uključuju translacionim kompleksom u rastući polipeptidni lanac. Primeri takvih amino-kiselina koje se ne sreću prirodno uključuju, ali se ne ograničavaju na N-acetilglukozaminil-L-serin, N-acetilglukozaminil-L-treonin, i O-fosfotirozin.
[0165] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo je vezano (npr., kovalentno vezano) za polimer (npr., polimer različit od polipeptida). Pogodni polimeri uključuju, npr., biokompatibilne polimere i biokompatibilne polimere rastvorljive u vodi. Pogodni polimeri uključuju sintetske polimere i polimere koji se sreću prirodno. Pogodni polimeri uključuju, npr., supstituisane ili nesupstituisane linearne ili granate polialkilen-, polialkenilen- ili polioksialkilen-polimere ili granate ili negranate polisaharide, npr. homo- ili heteropolisaharide. Pogodni polimeri uključuju, npr., etilen vinil alkohol kopolimer (opštepoznat pod generičkim imenom EVOH ili komercijalnim imenom EVAL); polibutilmetakrilat; poli(hidroksivalerat); poli(L-mlečnu kiselinu); polikaprolakton; poli(laktid-ko-glikolid); poli(hidroksibutirat); poli(hidroksibutirat-ko-valerat); polidioksanon; poliortoestar; polianhidrid; poli(glikolnu kiselinu); poli(D,L-mlečnu kiselinu); poli(glikolna kiselina-kotrimetilen karbonat); polifosfoestar; polifosfoestar uretan; poli(amino-kiseline); cijanoakrilate; poli(trimetilen karbonat); poli(iminokarbonat); kopoli(etar-estre) (npr., poli(etilen oksid)-poli(mlečnu kiselinu) (PEO/PLA) ko-polimere); polialkilen oksalate; polifosfazene; biomolekule, kao što su fibrin, fibrinogen, celuloza, skrob, kolagen i hijaluronska kiselina; poliuretane; silikone; poliestre; poliolefine; poliizobutilen i etilen-alfaolefin kopolimere; akrilne polimere i kopolimere; vinil halid polimere i kopolimere, kao što su polivinil hlorid; polivinil etere kao što su polivinil metil etar; poliviniliden halide, kao što su poliviniliden fluorid i poliviniliden hlorid; poliakrilonitril; polivinil ketone; polivinil aromatike, kao što je polistiren; polivinil estre, kao što je polivinil acetat; kopolimere vinil monomera jedne sa drugima i sa olefinima, kao što su etilen-metil metakrilat kopolimeri, akrilonitril-stiren kopolimeri, ABS smole, i etilen-vinil acetat kopolimeri; poliamide, kao što su Nylon 66 i polikaprolaktam; alkid smole; polikarbonate; polioksimetilene; poliimide; polietre; epoksi smole; poliuretane; rajon; rajon-triacetat; celulozu; celuloza acetat; celuloza butirat; celuloza acetat butirat; celofan; celuloza nitrat; celuloza propionat; celuloza etre; amorfni teflon; poli(etilen glikol); i karboksimetil celulozu.
[0166] Pogodni sintetski polimeri uključuju nesupstituisani i supstituisani linearni ili granati poli(etilenglikol), poli(propilenglikol) poli(vinilalkohol), i njihove derivate, npr., supstituisani poli(etilenglikol) kao što su metoksipoli(etilenglikol), i njegovi derivati. Pogodni polimeri koji se sreću prirodno uključuju, npr., albumin, amilozu, dekstran, glikogen, i njihove derivate.
[0167] Pogodni polimeri mogu imati prosečnu molekulsku težinu u rasponu od 500 Da do 50000 Da, npr., od 5000 Da do 40000 Da, ili od 25000 do 40000 Da. Na primer, u nekim primerima izvođenja, gde predmetno antitelo uključuje poli(etilen glikol) (PEG) ili metoksipoli(etilenglikol) polimer, PEG ili metoksipoli(etilenglikol) polimer može imati molekulsku težinu u rasponu od oko 0.5 kilodaltona (kDa) do 1 kDa, od oko 1 kDa do 5 kDa, od 5 kDa do 10 kDa, od 10 kDa do 25 kDa, od 25 kDa do 40 kDa, ili od 40 kDa do 60 kDa.
[0168] Kako je napomenuto gore, u nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo je kovalentno vezano za PEG polimer. U nekim primerima izvođenja, predmetni scFv multimer je kovalentno vezan za PEG polimer. Vidi, npr., Albrecht et al. (2006) J. Immunol. Metods 310:100. Metodi i reagensi pogodni za PEGilaciju proteina dobro su poznati u struci i mogu se naći, u npr., U.S. pat. br. 5,849,860. PEG pogodan za konjugaciju sa proteinom obično je rastvorljiv u vodi na sobnoj temperaturi, i ima opštu formulu R(O-CH2-CH2)nO-R, gde je R vodonik ili protektivna grupa, na primer alkil ili alkanol grupa, i n je ceo broj od 1 do 1000. Kada je R protektivna grupa, obično sadrži od 1 do 8 ugljenika.
[0169] PEG konjugovan za predmetno antitelo može biti linearan. PEG konjugovan za predmetni protein može biti i granat. Granati PEG derivati kao što su oni opisani u U.S. pat. br.
5,643,575, "star-PEG" i PEG sa više ručica kao što su oni koji su opisani u katalogu Shearwater Polymers, Inc. "Polyethylene Glycol Derivatives 1997-1998". Zvezdasti PEG opisani su u struci uključujući, npr., U.S. patent br.6,046,305.
[0170] Predmetno antitelo može biti glikozilovano, npr., predmetno antitelo može uključivati kovalentno vezanu ugljenohidratnu ili polisaharidnu komponentu. Glikozilacija antitela je tipično N-glikozilacija ili O-glikozilacija. N-glikozilacija označava da je ugljenohidratna komponenta vezana za bočni lanac asparaginske rezidue. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin i asparagin-X-treonin, gde je X bilo koja amino-kiselina osim prolina, predstavljaju sekvence prepoznavanja za enzimsko povezivanje ugljenohidratne komponente za asparaginski bočni lanac. Prema tome, prisustvo jedne od ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu predstavlja potencijalno mesto glikozilacije. O-glikozilacija odnosi se na vezu jednog od šećera N-acetilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze sa hidroksiamino-kiselinom, najčešće serinom ili treoninom, mada se mogu koristiti i 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.
[0171] Dodavanje glikozilacionih mesta antitelu konvencionalno se vrši menjanjem aminokiselinske sekvence tako da ona sadrži jednu ili više goreopisanih tripeptidnih sekvenci (za N-glikozilaciona mesta). Promene se mogu načiniti i dodavanjem ili supstituisanjem, jedne ili više serinskih ili treoninskih rezidua u sekvenci originalnog antitela (za O-glikozilaciona
1
mesta). Slično tome, uklanjanje glikozilacionih mesta može se izvršiti menjanjem aminokiselina unutar nativnih glikozilacionih mesta antitela.
[0172] Predmetno antitelo će u nekim primerima izvođenja uključivati "radioneprovidni" obeleživač, npr. obeleživač koji će se lako vizuelizovati korišćenjem, na primer, x-zraka. Radioneprovidni materijali dobro su poznati stručnjaku u oblasti. Najčešći radioneprovidni materijali uključuju jodidne, bromidne ili barijumove soli. Drugi radioneprovidni materijali takođe su poznati i uljučuju, ali se ne ograničavaju na organske derivate bizmuta (vidi, npr., U.S. pat. br. 5,939,045), radioneprovidne multiuretane (vidi U.S. pat. br. 5,346,981), organobizmutska kompozitna jedinjenja (vidi, npr., U.S. pat. br. 5,256,334), radioneprovidne multimerne komplekse barijuma (vidi, npr., U.S. pat. br.4,866,132), i slično.
[0173] Predmetno antitelo može biti kovalentno vezano za drugu komponentu (npr., lipid, polipeptid različit od predmetnog antitela, sintetski polimer, ugljeni hidrat, i slično) korišćenjem, na primer, glutaraldehida, homobifunkcionalnog unakrsnog linkera, ili heterobifunkcionalnog unakrsnog linkera. Glutaraldehid unakrsno povezuje polipeptide preko njihovih amino komponenti. Homobifunkcionalni unakrsni linkeri (npr., homobifunkcionalni imidoestar, homobifunkcionalni N-hidroksisukcinimidil (N-hydroxysuccinimidyl, NHS) estar, ili homobifunkcionalni sulfhidril reaktivni unakrsni linker) sadrže dve ili više identične reaktivne komponente i mogu se koristiti u jednostepenoj reakcionoj proceduri u kojoj se unakrsni linker dodaje rastvoru koji sadrži mešavinu polipeptida koji treba da se povežu. Homobifunkcionalni NHS estar i imido estri unakrsno povezuju polipeptide koji sadrže amin. Pri blago alkalnom pH, imido estri reaguju samo sa primarnim aminima da formiraju imidoamide, ne utičući na ukupno naelektrisanje unakrsno povezanih polipeptida. Homobifunkcionalni sulfhidril-reaktivni unakrsni linkeri uključuju bismaleimidheksan (bismaleimidhexane, BMH), 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen (1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene, DFDNB), i 1,4-di-(3',2'-piridilditio) propinoamido butan (1,4-di-(3’,2’-pyridyldithio) propinoamido butane, DPDPB).
[0174] Heterobifunkcionalni unakrsni linkeri imaju dve ili više različitih reaktivnih komponenti (npr., amin-reaktivnu komponentu i sulfhidril-reaktivnu komponentu) i unakrsno su povezani sa jednim od polipeptida preko aminske ili sulfhidrilne reaktivne komponente, zatim reaguju sa drugim polipeptidom preko slobodne komponente. Na raspolaganju postoje mnogi heterobifunkcionalni haloacetil unakrsni linkeri, kao što su piridil disulfidni unakrsni linkeri. Karbodiimidi su klasičan primer heterobifunkcionalnih unakrsno-povezujućih reagenasa za povezivanje karboksilnih grupa sa amino grupama, čime nastaju amidne veze.
2
[0175] Predmetno antitelo može da se imobiliše na čvrstoj podlozi. Pogodne podloge dobro su poznate u struci i uključuju, između ostalog, komercijalno dostupne materijale za kolonu, polistirenske perlice, perlice od lateksa, magnetne perlice, koloidne metalne čestice, staklene i/ili silikonske ljuspice i površine, nitrocelulozne trake, najlonske membrane, ploče, duracite, bunarčiće reakcionih ploča (npr., ploče sa većim brojem bunarčića), plastične epruvete, itd. Čvrsta podloga može uključivati svaku od različitih supstanci, uključujući, npr., staklo, polistiren, polivinil hlorid, polipropilen, polietilen, polikarbonat, dekstran, najlon, amilozu, prirodne i modifikovane celuloze, poliakrilamide, agaroze, i magnetit. Pogodni metodi imobilisanja predmetnog antitela na čvrstoj podlozi dobro su poznati i uključuju, ali se ne ograničavaju na jonske, hidrofobne, kovalentne interakcije i slično. Čvrste podloge mogu biti rastvorljive ili nerastvorljive, npr., u vodenom rastvoru. U nekim primerima izvođenja, pogodna čvrsta podloga obično je nerastvorljiva u vodenom rastvoru.
[0176] Predmetno antitelo će u nekim primerima izvođenja uključivati detektabilni obeleživač. Pogodni detektabilni obeleživači uključuju svaku kompoziciju detektabilnu spektroskopskim, fotohemijskim, biohemijskim, imunohemijskim, električnim, optičkim ili hemijskim načinima. Pogodni uključuju, ali se ne ograničavaju na magnetne perlice (npr. Dynabeads™), fluorescentne boje (npr., fluorescein izotiocijanat, teksas crveno, rodamin, zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, žuti fluorescentni protein, i slično), radioobeleživače (npr.,<3>H,<125>I,<35>S,<14>C, ili<32>P), enzime (npr., peroksidaza rena, alkalna fosfataza, luciferaza, i drugi koji se obično koriste u imunoenzimskom testu (ELISA)), i kolorimetrijske obeleživače kao što su koloidno zlato ili obojene staklene ili plastične (npr. polistirenske, polipropilenske, od lateksa, itd.) perlice.
[0177] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje kontrastno sredstvo ili radioizotop, pri čemu je kontrastno sredstvo ili radioizotop onaj koji je pogodan za upotrebu u dobijanju slike, npr., procedurama dobijanja slike koje se sprovode na ljudima. Neograničavajući primeri obeleživača uključuju radioizotope kao što su<1231>I (jod),<18>F (fluor),<99>Tc (tehnicijum),<111>In (indijum), i<67>Ga (galijum), i kontrastna sredstva kao gadolinijum (Gd), disprozijum, i gvožđe. Radioaktivni izotopi Gd (<153>Gd) takođe su na raspolaganju i pogodni su za procedure dobijanja slike u nehumanim sisarima. Predmetno antitelo se može obeležiti korišćenjem standardnih tehnika. Na primer, predmetno antitelo može biti jodinisano korišćenjem hloramina T ili 1,3,4,6-tetrahloro-3a,6a-difenilglikourila. Za fluorisanje, fluor se dodaje predmetnom antitelu tokom sinteze, reakcijom izmeštanja fluoridnog jona. Vidi, Muller-Gartner, H., TIB Tech., 16:122-130 (1998) i Saji, H., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 16(2):209-244 (1999) za pregled sinteze proteina sa takvim radioizotopima. Predmetno antitelo može takođe da se obeleži kontrastnim sredstvom, standardnim tehnikama. Na primer, predmetno antitelo može da se obeleži Gd konjugovanjem niskomolekularnih Gd helata kao što su Gd dietilen triamin pentasirćetna kiselina (Gd diethylene triamine pentaacetic acid, GdDTPA) ili Gd tetraazaciklododekantetrasirćetna kiselina (Gd tetraazacyclododecanetetraacetic, GdDOTA) sa antitelom. Vidi, Caravan et al., Chem. Rev.
99:2293-2352 (1999) i Lauffer et al., J. Magn. Reson. Imaging, 3:11-16 (1985). Predmetno antitelo može da se obeleži pomoću Gd, na primer, konjugovanjem polilizin-Gd helata sa antitelom. Vidi, na primer, Curtet et al., Invest. Radiol., 33(10):752-761 (1998). Alternativno, predmetno antitelo može da se obeleži pomoću Gd inkubiranjem paramagnetnih polimerizovanih lipozoma koji sadrže Gd-helatorski lipid sa avidinom i biotinisanim antitelom. Vidi, na primer, Sipkins et al., Nature Med., 4:623-626 (1998).
[0178] Pogodni fluorescentni proteini koji mogu da se vežu za predmetno antitelo uključuju, ali se ne ograničavaju na zeleni fluorescentni protein iz Aequoria victoria ili njegov mutant ili derivat npr., kako je opisano u U.S. patentima br.6,066,476; 6,020,192; 5,985,577; 5,976,796; 5,968,750; 5,968,738; 5,958,713; 5,919,445; 5,874,304; npr., pojačani GFP, mnogi takvi GFP komercijalno su dostupni, npr., od Clontech, Inc.; crveni fluorescentni protein; žuti fluorescentni protein; bilo koji od različitih fluorescentnih i obojenih proteina iz vrsta antozoa, kako je opisano u, npr., Matz et al. (1999) Nature Biotechnol.17:969-973; i slično.
[0179] Predmetno antitelo će u nekim primerima izvođenja biti povezano (npr., kovalentnom ili nekovalentnom vezom) sa fuzionim partnerom, npr., ligandom; epitopskim markerom; peptidom; proteinom različitim od antitela; i slično. Pogodni fuzioni partneri uključuju peptide i polipeptide koji povećavaju stabilnost in vivo (npr., produžavaju poluživot u serumu); olakšavaju prečišćavanje, npr., (His)n, npr., 6His, i slično; obezbeđuju sekreciju fuzionog proteina iz ćelije; obezbeđuju epitopski marker, npr., GST, hemaglutinin (hemagglutinin, HA; npr., YPYDVPDYA; SEQ ID NO:71), FLAG (npr., DYKDDDDK; SEQ ID NO:69), c-myc (npr., EQKLISEEDL; SEQ ID NO:68), i slično; obezbeđuju detektabilni signal, npr., enzim koji generiše detektabilni proizvod (npr., β-galaktozidaza, luciferaza), ili protein koji je detektabilan kao takav, npr., zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, žuti fluorescentni protein, itd.; obezbeđuje multimerizaciju, npr., multimerizacioni domen kao što je Fc deo imunoglobulina; i slično.
[0180] Fuzija može uključivati i afinitetni domen, uključujući peptidne sekvence koje mogu da interaguju sa vezujućim partnerom, npr., kao što je onaj koji je imobilisan na čvrstoj podlozi, koristan za identifikaciju i prečišćavanje. Uzastopne pojedinačne amino-kiseline, kao što je histidin, kada se fuzionišu sa proteinom, mogu se upotrebiti u jednostepenom prečišćavanju
4
fuzionog proteina visokoafinitetnim vezivanjem za smolu na koloni, kao što je nikl sefaroza. Primeri afinitetnih domena uključuju His5 (HHHHH) (SEQ ID NO:66), HisX6 (HHHHHH) (SEQ ID NO:67), C-myc (EQKLISEEDL) (SEQ ID NO:68), Flag (DYKDDDDK) (SEQ ID NO:69), StrepTag (WSHPQFEK) (SEQ ID NO:70), hemaglutinin, npr., HA marker (YPYDVPDYA; SEQ ID NO:71), glutation-S-transferazu (glutathione-S-transferase, GST), tioredoksin, celuloza-vezujući domen, RYIRS (SEQ ID NO:72), Phe-His-His-Thr (SEQ ID NO:73), hitin-vezujući domen, S-peptid, T7 peptid, SH2 domen, RNK marker na C-kraju, WEAAAREACCRECCARA (SEQ ID NO:74), metal-vezujuće domene, npr., cink-vezujuće domene ili kalcijum-vezujuće domene kao što su oni iz kalcijum-vezujućih proteina, npr., kalmodulina, troponina C, kalcineurina B, lakog lanca miozina, rekoverina, S-modulina, visinina, VILIP, neurokalcina, hipokalcina, frekvenina, kaltraktina, velike podjedinice kalpaina, S100 proteina, parvalbumina, kalbindina D9K, kalbindina D28K, i kalretinina, inteini, biotin, streptavidin, MyoD, leucinske "zipper" sekvence, i maltoza-vezujući protein.
[0181] Predmetno antitelo će u nekim primerima izvođenja biti fuzionisano sa polipeptidom koji se vezuje za endogeni receptor krvno-moždane barijere (blood brain barrier, BBB). Vezivanje predmetnog antitela za polipeptid koji se vezuje za endogeni BBB receptor olakšava prolaz kroz BBB, npr., u predmetnom metodu lečenja (vidi u nastavku ovog teksta) koji uključuje primenu predmetnog antitela kod individue kojoj je to potrebno. Pogodni polipeptidi koji se vezuju za endogeni BBB receptor uključuju antitela, npr., monoklonska antitela, ili njihove antigen-vezujuće fragmente, koji se specifično vezuju za endogeni BBB receptor. Pogodni endogeni BBB receptori uključuju, ali se ne ograničavaju na insulinski receptor, transferinski receptor, leptinski receptor, lipoproteinski receptor, i receptor za insulinu sličan faktor rasta. Vidi, npr., U.S. patentnu publikaciju br.2009/0156498.
[0182] Kao primer, predmetno anti-Tau antitelo može biti bispecifično antitelo koje uključuje prvi antigen-vezujući deo koji se specifično vezuje za epitop u Tau polipeptidu (npr., linearni epitop u okviru amino-terminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru amino-kiselina 1-18 Tau, ili u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau); i drugi antigen-vezujući deo koji se vezuje za endogeni BBB receptor. Na primer, u nekim slučajevima, predmetno anti-tau antitelo je bispecifično antitelo koje uključuje prvi antigen-vezujući deo koji se specifično vezuje za epitop u Tau polipeptidu (npr., linearni epitop u okviru aminoterminalnog (N-terminalnog) dela Tau, npr., u okviru amino-kiselina 1-25 Tau, u okviru aminokiselina 1-18 Tau, ili u okviru amino-kiselina 9 do 18 Tau); i drugi antigen-vezujući deo koji se vezuje za receptor za transferin.
[0183] Na primer, anti-Tau antitelo predmetne objave može biti fuzionisano sa peptidom koji olakšava prolaz kroz BBB, peptid je dug od oko 15 amino-kiselina do oko 25 amino-kiselina, i uključuje amino-kiselinsku sekvencu koja ima najmanje oko 85% identičnosti u sekvenci amino-kiselina sa jednim od sledećih peptida: Angiopep-1 (TFFYGGCRGKRNNFKTEEY; SEQ ID NO:75); Angiopep-2 (TFFYGGSRGKRNNFKTEEY; SEQ ID NO:76); cys-Angiopep-2 (CTFFYGGSRGKRNNFKTEEY; SEQ ID NO:77); Angiopep-2-cys (TFFYGGSRGKRNNFKTEEYC; SEQ ID NO:78); i aprotininski fragment (TFVYGGCRAKRNNFKS; SEQ ID NO:79). Vidi, npr., U.S. patentne publikacije br.
2011/0288011; i 2009/0016959. Peptid koji olakšava prolaz kroz BBB može da bude fuzionisan sa N-terminusom anti-Tau lakolančanog regiona, sa C-terminusom anti-Tau lakolančanog regiona, sa N-terminusom anti-Tau teškolančanog regiona, sa C-terminusom anti-Tau teškolančanog regiona, sa N-terminusom predmetnog anti-Tau jednolančanog antitela, sa C-terminusom predmetnog anti-Tau jednolančanog antitela, itd.
[0184] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo uključuje poliaminsku modifikaciju. Poliaminska modifikacija predmetnog antitela povećava sposobnost prolaska modifikovanog antitela kroz BBB. Predmetno antitelo može da se modifikuje poliaminima koji su prirodni ili veštački. Vidi, na primer, U.S. pat. br. 5,670,477. Korisni prirodni poliamini uključuju putrescin, spermidin, spermin, 1,3-diaminopropan, norspermidin, sinhomospermidin, termin, termospermin, kaldopentamin, homokaldopentamin, i kanavalmin. Putrescin, spermidin i spermin su posebno korisni. Sintetski poliamini imaju empirijsku formulu CXHYNZ, mogu biti ciklični ili aciklični, granati ili negranati, ugljovodonični lanci od 3-12 ugljenikovih atoma koji uključuju još i 1-6 NR ili N(R)2komponenti, pri čemu je R H, (C1-C4) alkil, fenil, ili benzil. Poliamini se mogu vezati za antitelo korišćenjem bilo kojeg standardnog metoda unakrsnog povezivanja.
[0185] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo je modifikovano tako da uključuje ugljenohidratnu komponentu, pri čemu ugljenohidratna komponenta može biti kovalentno povezana sa antitelom. U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo je modifikovano tako da uključuje lipidnu komponentu, pri čemu lipidna komponenta može biti kovalentno povezana sa antitelom. Pogodne lipidne komponente uključuju, npr., N-masnu acil grupu kao što je N-lauroil, N-oleoil, itd.; masni amin kao dodecil amin, oleoil amin, itd.; C3-C16 alifatični lipid dugog lanca; i slično. Vidi, npr., U.S. pat. br. 6,638,513). U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo ugrađeno je u lipozom.
Metodi proizvodnje predmetnog antitela
[0186] Predmetno antitelo može se proizvesti bilo kojim poznatim metodom, npr., konvencionalnim metodima sinteze proteina; metodima rekombinantne DNK; itd.
[0187] Kada je predmetno antitelo jednolančani polipeptid, ono se može sintetisati korišćenjem standardnih tehnika hemijske sinteze peptida. Kada se polipeptid sintetiše hemijski, sinteza se može odvijati na tečnoj fazi ili na čvrstoj fazi. Sinteza polipeptida na čvrstoj fazi (solid phase polipeptid synthesis, SPPS), u kojoj se C-terminalna amino-kiselina sekvence prikači za nerastvorljivu podlogu, posle čega sledi sekvencijalno dodavanje preostalih amino-kiselina u sekvenci, predstavlja primer metoda pogodnog za hemijsku sintezu predmetnog antitela. Različiti oblici SPPS, kao što su Fmoc i Boc, na raspolaganju su za sintetisanje predmetnog antitela. Tehnike sinteze na čvrstoj fazi opisali su Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 u The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Metods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 (1963); Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. (1984); i Ganesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10 i Camarero JA et al.2005 Protein Pept Lett.12:723-8. Ukratko, male nerastvorljive, porozne perlice tretiraju se funkcionalnim jedinicama na koje se nadograđuju peptidni lanci. Posle ponavljanja ciklusa povezivanja/deprotekcije, slobodni N-terminalni amin prikačen za čvrstu fazu vezuje se za pojedinačnu N-protektovanu aminokiselinsku jedinicu. Ova jedinica se zatim deprotektuje, otkrivajući novi N-terminalni amin za koji se sledeća amino-kiselina može prikačiti. Peptid ostaje imobilisan na čvrstoj fazi i podleže procesu filtracije pre nego što bude odsečen.
[0188] Standardni rekombinantni metodi mogu se koristiti za proizvodnju predmetnog antitela. Na primer, nukleinske kiseline koje kodiraju varijabilne regione lakog i teškog lanca, opciono vezane sa konstantnim regionima, insertuju se u ekspresione vektore. Laki i teški lanac mogu da se kloniraju u istom ili u različitim ekspresionim vektorima. DNK segmenti koji kodiraju imunoglobulinske lance operabilno su povezani sa kontrolnim sekvencama u ekspresionom vektoru/vektorima da bi se osigurala ekspresija imunoglobulinskih polipeptida. Ekspresione kontrolne sekvence uključuju, ali se ne ograničavaju na promotore (npr., prirodno udružene ili heterologne promotore), signalne sekvence, enhenserske elemente, i sekvence terminacije transkripcije. Ekspresione kontrolne sekvence mogu biti eukariotski promotorski sistemi u vektorima sposobnim da transformišu ili transfektuju eukariotske ćelije-domaćine (npr., COS ili CHO ćelije). Kada se vektor ugradi u odgovarajućeg domaćina, domaćin se drži pod uslovima pogodnim za visok nivo ekspresije nukleotidnih sekvenci i sakupljanje i prečišćavanje antitela.
[0189] Zbog degeneracije koda, različite sekvence nukleinskih kiselina mogu biti kodirajuće za svaku aminokiselinsku sekvencu imunoglobulina. Željene sekvence nukleinskih kiselina mogu se proizvesti de novo sintezom DNK na čvrstoj fazi ili mutagenezom lančanom reakcijom polimeraze (polymerase chain reaction, PCR) ranije pripremljene varijante željenog polinukleotida. Mutageneza posredovana oligonukleotidom predstavlja primer metoda pogodnog za pripremanje supstitucionih, delecionih i insercionih varijanti DNK ciljnog polipeptida. Vidi Adelman et al., DNA 2:183 (1983). Ukratko, DNK ciljnog polipeptida menja se hibridizovanjem oligonukleotida koji kodira željenu mutaciju sa jednolančanim DNK templatom. Posle hibridizacije, DNK polimeraza se koristi za sintetisanje celog drugog komplementarnog lanca templata koji je inkorporisan u oligonukleotidni prajmer, i kodira odabranu promenu u DNK ciljnog polipeptida.
[0190] Pogodni ekspresioni vektori tipično mogu da se repliciraju u organizmima-domaćinima, kao epizomi ili kao integralni delovi hromozomske DNK domaćina. Obično, ekspresioni vektori sadrže selekcione markere (npr., rezistencija na ampicilin, rezistencija na higromicin, rezistencija na tetraciklin, rezistencija na kanamicin ili rezistencija na neomicin) da bi se omogućila detekcija ćelija transformisanih željenim DNK sekvencama.
[0191] Escherichia coli je primer prokariotske ćelije-domaćina koji se može koristiti za kloniranje polinukleotida koji kodira predmetno antitelo. Drugi mikrobni domaćini pogodni za upotrebu uključuju bacile, kao što je Bacillus subtilis, i druge enterobakterije kao što su Salmonella, Serratia, i različite vrste Pseudomonas. U ovim prokariotskim domaćinima, moguće je napraviti ekspresione vektore, koji će tipično sadržati ekspresione kontrolne sekvence kompatibilne sa ćelijom-domaćinom (npr., mesto početka replikacije). Pored toga, biće prisutan bilo koji broj različitih dobro poznatih promotora, kao što su laktozni promotorski sistem, triptofanski (trp) promotorski sistem, beta-laktamazni promotorski sistem, ili promotorski sistem iz lambda-faga. Promotori će tipično kontrolisati ekspresiju, opciono sa operatorskom sekvencom, i imaće sekvence mesta vezivanja ribozoma i slično, za otpočinjanje i završavanje transkripcije i translacije.
[0192] Drugi mikrobi, kao kvasac, takođe su korisni za ekspresiju. Saccharomyces (npr., S. cerevisiae) i Pichia su primeri pogodnih kvasaca kao ćelija-domaćina, sa pogodnim vektorima koji imaju ekspresione kontrolne sekvence (npr., promotore), mesto početka replikacije, sekvence terminacije i slično, po želji. Tipični promotori uključuju 3-fosfoglicerat kinazu i druge glikolitičke enzime. Inducibilni promotori kvasca uključuju, između ostalih, promotore iz alkohol dehidrogenaze, izocitohroma C, i enzima odgovornih za korišćenje maltoze i galaktoze.
[0193] Pored mikroorganizama, ćelije sisara (npr., ćelije sisara gajene in vitro u ćelijskim kulturama) takođe se mogu koristiti za ekspresiju i proizvodnju anti-tau antitela predmetne objave (npr., polinukleotidi koji kodiraju predmetno anti-Tau antitelo). Vidi Winnacker, From Genes to Clones, VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987). Pogodne sisarske ćelije-domaćini uključuju CHO ćelijske linije, različite Cos ćelijske linije, HeLa ćelije, ćelijske linije mijeloma, i transformisane B-ćelije ili hibridome. Ekspresioni vektori za ove ćelije mogu uključivati ekspresione kontrolne sekvence, kao što su mesto početka replikacije, promotor, i enhenser (Queen et al., Immunol. Rev.89:49 (1986)), i neophodna mesta obrade informacije, kao što su mesta vezivanja ribozoma, RNK splajsujuća mesta, poliadenilaciona mesta, i sekvence terminacije transkripcije. Primeri pogodnih ekspresionih kontrolnih sekvenci su promotori poreklom iz imunoglobulinskih gena, SV40, adenovirusa, goveđeg papiloma virusa, citomegalovirusa i slično. Vidi Co et al., J. Immunol. 148:1149 (1992).
[0194] Kada se sintetišu (hemijski ili rekombinantno), cela antitela, njihovi dimeri, pojedinačni laki i teški lanci, ili druge forme predmetnog antitela (npr., scFv, itd.) mogu se prečišćavati prema standardnim postupcima struke, uključujući amonijum-sulfatnu precipitaciju, afinitetne kolone, hromatografiju na koloni, prečišćavanje tečnom hromatografijom visokih performansi (high performance liquid chromatography, HPLC), elektroforezu na gelu, i slično (vidi uopšteno Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., (1982)). Predmetno antitelo može biti suštinski čisto, npr., čisto najmanje oko 80% do 85%, najmanje oko 85% do 90%, najmanje oko 90% do 95%, ili 98% do 99%, ili više, npr., da ne sadrži kontaminante kao što su ćelijski detritus, makromolekuli različiti od predmetnog antitela, itd.
Kompozicije
[0195] Predmetna objava obezbeđuje kompoziciju koja uključuje predmetno antitelo. Kompozicija predmetnog antitela može uključivati, pored predmetnog antitela, jedno ili više od sledećeg: so, npr., NaCl, MgCl2, KCl, MgSO4, itd.; puferišuće sredstvo, npr., Tris pufer, N-(2-hidroksietil)piperazin-N'-(2-etansulfonska kiselina) (N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N’-(2-ethanesulfonic acid, HEPES), 2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid, MES), 2-(N-morfolino)etansulfonska kiselina natrijumova so (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid sodium salt, MES), 3-(N-morfolino)propansulfonska kiselina (3-(N-Morpholino)propanesulfonic acid, MOPS), N-tris[hidroksimetil]metil-3-aminopropansulfonska kiselina (N-tris[hydroxymethyl]methyl-3-aminopropanesulfonic acid, TAPS), itd.; solubilizujuće sredstvo; deterdžent, npr., nejonski deterdžent kao što je Tween-20, itd.; inhibitor proteaze; glicerol; i slično.
NUKLEINSKE KISELINE, EKSPRESIONI VEKTORI I ĆELIJE-DOMAĆINI
[0196] Predmetna objava obezbeđuje nukleinske kiseline koje obuhvataju nukleotidne sekvence koje kodiraju predmetno anti-Tau antitelo.
[0197] Nukleotidna sekvenca koja kodira predmetno anti-Tau antitelo može uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca i ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti nukleotidne sekvence sa nukleotidnom sekvencom prikazanom na Slici 1B i navedenom u SEQ ID NO:17.
[0198] Nukleotidna sekvenca koja kodira predmetno anti-Tau antitelo može uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca i ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti nukleotidne sekvence sa nukleotidnom sekvencom prikazanom na Slici 1A i navedenom u SEQ ID NO:18.
[0199] Nukleotidna sekvenca koja kodira predmetno anti-Tau antitelo može uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca i ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti nukleotidne sekvence sa nukleotidnom sekvencom prikazanom na Slici 2B i navedenom u SEQ ID NO:19.
[0200] Nukleotidna sekvenca koja kodira predmetno anti-Tau antitelo može uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca i ima najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti nukleotidne sekvence sa nukleotidnom sekvencom prikazanom na Slici 2A i navedenom u SEQ ID NO:20.
[0201] Nukleotidna sekvenca koja kodira predmetno antitelo može biti operabilno povezana sa jednim ili više regulatornih elemenata, kao što su promotor i enhenser, koji omogućavaju ekspresiju nukleotidne sekvence u željenim ciljnim ćelijama (npr., ćelija koja je genetički modifikovana tako da sintetiše kodirano antitelo).
[0202] Pogodni promotorski i enhenserski elementi poznati su u struci. Za ekspresiju u bakterijskoj ćeliji, pogodni promotori uključuju, ali se ne ograničavaju na lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P i trc. Za ekspresiju u eukariotskoj ćeliji, pogodni promotori uključuju, ali se ne ograničavaju na promotorske i enhenserske elemente gena za laki i/ili teški lanac imunoglobulina; neposredni rani promotor citomegalovirusa; promotor timidin kinaze herpes simpleks virusa; rane i kasne promotore SV40; promotore prisutne u dugim terminalnim ponovcima, iz retrovirusa; promotor metalotioneina-I miša; i različite tkivno-specifične promotore poznate u struci.
[0203] U nekim primerima izvođenja, npr., za ekspresiju u ćeliji kvasca, pogodni promotor je konstitutivni promotor kao ADH1 promotor, PGK1 promotor, ENO promotor, PYK1 promotor i slično; ili regulabilni promotor kao GAL1 promotor, GAL10 promotor, ADH2 promotor, PHO5 promotor, CUP1 promotor, GAL7 promotor, MET25 promotor, MET3 promotor, CYC1 promotor, HIS3 promotor, ADH1 promotor, PGK promotor, GAPDH promotor, ADC1 promotor, TRP1 promotor, URA3 promotor, LEU2 promotor, ENO promotor, TP1 promotor, i AOX1 (npr., za upotrebu u Pichia). Izbor odgovarajućeg vektora i promotora u okvirima je prosečne obučenosti u oblasti.
[0204] Pogodni promotori za upotrebu u prokariotskim ćelijama-domaćinima uključuju, ali se ne ograničavaju na promotor T7 RNK polimeraze bakteriofaga; trp promotor; promotor lac operona; hibridni promotor, npr., lac/tac hibridni promotor, tac/trc hibridni promotor, trp/lac promotor, T7/lac promotor; trc promotor; tac promotor, i slično; araBAD promotor; in vivo regulisane promotore, kao što su ssaG promotor ili srodni promotor (vidi, npr., U.S. patentnu publikaciju br. 20040131637), a pagC promotor (Pulkkinen and Miller, J. Bacteriol., 1991: 173(1): 86-93; Alpuche-Aranda et al., PNAS, 1992; 89(21): 10079-83), nirB promotor (Harborne et al. (1992) Mol. Micro. 6:2805-2813), i slično (vidi, npr., Dunstan et al. (1999) Infect. Immun. 67:5133-5141; McKelvie et al. (2004) Vaccine 22:3243-3255; i Chatfield et al. (1992) Biotechnol.10:888-892); sigma70 promotor, npr., konsenzusni sigma70 promotor (vidi, npr., GenBank pristupni br. AX798980, AX798961, i AX798183); stacionarno-fazni promotor, npr., dps promotor, spv promotor, i slično; promotor poreklom iz ostrvca patogenosti SPI-2 (vidi, npr., WO96/17951); actA promotor (vidi, npr., Shetron-Rama et al. (2002) Infect. Immun.
70:1087-1096); rpsM promotor (vidi, npr., Valdivia and Falkow (1996). Mol. Microbiol.
22:367); tet promotor (vidi, npr., Hillen,W. and Wissmann,A. (1989) u: Saenger,W. and Heinemann,U. (eds), Topics in Molecular and Structural Biology, Protein-Nucleic Acid Interaction. Macmillan, London, UK, Vol.10, pp.143-162); SP6 promotor (vidi, npr., Melton et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12:7035); i slično. Pogodni jaki promotori za upotrebu u prokariotima kao što je Escherichia coli uključuju, ali se ne ograničavaju na Trc, Tac, T5, T7, i PLambda. Neograničavajući primeri operatora za upotrebu u bakterijskim ćelijama-domaćinima uključuju laktozni promotor-operator (LacI represorski protein menja konformaciju kada dođe u kontakt sa laktozom, čime se sprečava da se LacI represorski protein veže za operator), triptofanski promotor-operator (kada se kompleksuje sa triptofanom, TrpR represorski protein ima konformaciju koja se vezuje za operator; u odsustvu triptofana, TrpR represorski protein ima konformaciju koja se ne vezuje za operator), i tac promotor operator (vidi, na primer, deBoer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.80:21-25).
1
[0205] Nukleotidna sekvenca koja kodira predmetno antitelo može biti prisutna u ekspresionom vektoru i/ili klonirajućem vektoru. Kada predmetno antitelo uključuje dva odvojena polipeptida, nukleotidne sekvence koje kodiraju dva polipeptida mogu biti klonirane u isti ili u zasebne vektore. Ekspresioni vektor može uključivati selektabilni marker, mesto početka replikacije, i druge osobine koje obezbeđuju replikaciju i/ili održavanje vektora.
[0206] Veliki broj pogodnih vektora i promotora poznat je stručnjacima u oblasti; mnogi se mogu komercijalno nabaviti, kako bi se napravili predmetni rekombinantni konstrukti. Sledeći vektori dati su kao primer. Bakterijski: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Calif., USA); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, i pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Sweden). Eukariotski: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG i pSVL (Pharmacia).
[0207] Ekspresioni vektori obično imaju pogodna restrikciona mesta locirana u blizini promotorske sekvence, da bi se obezbedilo insertovanje sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju heterologne proteine. Selektabilni marker operativan u ekspresionom domaćinu može biti prisutan. Pogodni ekspresioni vektori uključuju, ali se ne ograničavaju na virusne vektore (npr. virusni vektori bazirani na vakcinija virusu; poliovirusu; adenovirusu (vidi, npr., Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:77007704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:10881097, 1999; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 i WO 95/00655); adeno-udruženom virusu (vidi, npr., Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591594, 1996; Srivastava in WO 93/09239, Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; i Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617); SV40; herpes simpleks virusu; virusu humane imunodeficijencije (vidi, npr., Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999); retrovirusnim vektorima (npr., virus mišje leukemije, virus nekroze slezine, i vektori poreklom iz retrovirusa kao što je virus Rousovog sarkoma, virus Harveyjevog sarkoma, virus ptičje leukoze, virusu humane imunodeficijencije, virus mijeloproliferativnog sarkoma, i virus tumora mlečne žlezde); i slično.
[0208] Kako je gore napomenuto, predmetna nukleinska kiselina uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira predmetno antitelo. Predmetna nukleinska kiselina može uključivati nukleotidnu sekvencu koja kodira CDR teškog i lakog lanca iz IPN001. U nekim primerima izvođenja, predmetna nukleinska kiselina uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira CDR
2
teškog i lakog lanca iz IPN002, pri čemu su CDR-kodirajuće sekvence isprekidane FR-kodirajućim nukleotidnim sekvencama. U nekim primerima izvođenja, FR-kodirajuće nukleotidne sekvence su FR-kodirajuće nukleotidne sekvence čoveka.
Ćelije-domaćini
[0209] Predmetna objava obezbeđuje izolovane genetički modifikovane ćelije-domaćine (npr., in vitro ćelije) koje su genetički modifikovane predmetnom nukleinskom kiselinom. U nekim primerima izvođenja, predmetna izolovana genetički modifikovana ćelija-domaćin može proizvoditi predmetno antitelo.
[0210] Pogodne ćelije-domaćini uključuju eukariotske ćelije-domaćine, kao što su ćelije sisara, insekatske ćelije-domaćine, ćeliju kvasca; i prokariotske ćelije kao što je bakterijska ćelija. Uvođenje predmetne nukleinske kiseline u ćeliju-domaćina može se vršiti, na primer, precipitacijom kalcijum fosfatom, DEAE dekstran posredovanom transfekcijom, lipozomima posredovanom transfekcijom, elektroporacijom ili drugim poznatim metodom.
[0211] Pogodne sisarske ćelije uključuju primarne ćelije i imortalizovane ćelijske linije. Pogodne sisarske ćelijske linije uključuju humane ćelijske linije, ćelijske linije nehumanih primata, ćelijske linije glodara (npr., miš, pacov), i slično. Pogodne sisarske ćelijske linije uključuju, ali se ne ograničavaju na HeLa ćelije (npr., American Type Culture Collection (ATCC) No. CCL-2), CHO ćelije (npr., ATCC br. CRL9618, CCL61, CRL9096), 293 ćelije (npr., ATCC br. CRL-1573), Vero ćelije, NIH 3T3 ćelije (npr., ATCC br. CRL-1658), Huh-7 ćelije, BHK ćelije (npr., ATCC br. CCL10), PC12 ćelije (ATCC br. CRL1721), COS ćelije, COS-7 ćelije (ATCC br. CRL1651), RAT1 ćelije, mišje L ćelije (ATCC br. CCLI.3), humane embrionske bubrežne ćelije (human embryonic kidney, HEK) (ATCC br. CRL1573), HLHepG2 ćelije, i slično. U nekim slučajevima, ćelije su HEK ćelije. U nekim slučajevima, ćelije su CHO ćelije, npr., CHO-K1 ćelije (ATCC br. CCL-61), CHO-M ćelije, CHO-DG44 ćelije (ATCC No. PTA-3356), i slično.
[0212] Pogodne ćelije kvasca uključuju, ali se ne ograničavaju na Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha, Kluyveromyces sp., Kluyveromyces lactis, Candida albicans, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Chrysosporium lucknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora crassa, Chlamydomonas reinhardtii, i slično.
[0213] Pogodne prokariotske ćelije uključuju, ali se ne ograničavaju na bilo koji laboratorijski soj Escherichia coli, Lactobacillus sp., i slično. Vidi, npr., Carrier et al. (1992) J. Immunol.
148:1176-1181; U.S. patent br. 6,447,784; i Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302. Tipično, laboratorijski soj je onaj koji nije patogen. Neograničavajući primeri drugih pogodnih bakterija uključuju, ali se ne ograničavaju na Bacillus subtilis, i slično. U nekim primerima izvođenja, ćelija-domaćin je Escherichia coli.
FARMACEUTSKE FORMULACIJE
[0214] The predmetna objava obezbeđuje kompozicije, uključujući farmaceutske kompozicije, koje sadrže predmetno antitelo. Uopšteno, formulacija uključuje efikasnu količinu predmetnog antitela. "Efikasna količina" označava dozu koja je dovoljna da proizvede željeni rezultat, npr., smanjenje nepoželjnih simptoma udruženih sa tauopatijom, ublažavanje simptoma tauopatije, usporavanje napredovanja tauopatije, itd. Obično, željeni rezultat je bar smanjenje simptoma tauopatije u poređenju sa kontrolom. Predmetno antitelo može se dostaviti na takav način da se izbegne krvno-moždana barijera, kako je opisano detaljnije u nastavku ovog teksta. Predmetno antitelo može da se formuliše i/ili modifikuje da bi se omogućilo da antitelo prođe kroz krvnomoždanu barijeru.
[0215] Predmetna objava obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja uključuje: a) antitelo koje se specifično vezuje za epitop u okviru N-terminalnog dela Tau, pri čemu antitelo uključuje: (i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; (iv) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (v) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (vi) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12; i b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi, pri čemu formulacija ne sadrži endotoksine.
[0216] Predmetna objava obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja uključuje: a) izolovano humanizovano monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za epitop u okviru aminokiselina 15-24 Tau polipeptida; i b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent, pri čemu je u nekim primerima izvođenja farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi.
[0217] Predmetna objava obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja uključuje: A) izolovano antitelo koje sadrži region okvira humanizovanog lakog lanca; i region okvira humanizovanog teškog lanca, pri čemu izolovano antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2
4
koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12; i B) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent, pri čemu je u nekim primerima izvođenja farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi.
[0218] Predmetna objava obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja uključuje: A) izolovano antitelo, pri čemu je antitelo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, ili Fab', i pri čemu antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12; i B) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent, pri čemu je u nekim primerima izvođenja farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi.
[0219] Predmetna objava obezbeđuje farmaceutsku formulaciju koja uključuje: A) izolovano antitelo, pri čemu izolovano antitelo uključuje konstantni region humanog lakog lanca i konstantni region humanog teškog lanca, i pri čemu izolovano antitelo kompetira za vezivanje sa epitopom u N-terminalnom regionu Tau polipeptida sa antitelom koje uključuje: a) region lakog lanca koji sadrži: i) VLCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:7; (ii) VLCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:8; i (iii) VLCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:3 ili SEQ ID NO:9; i b) region teškog lanca koji sadrži: (i) VHCDR1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:4 ili SEQ ID NO:10; (ii) VHCDR2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:11; i (iii) VHCDR3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:12; i B) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent, pri čemu je u nekim primerima izvođenja farmaceutski prihvatljivi ekscipijent pogodan za primenu kod ljudi.
Formulacije
[0220] U predmetnim metodima, predmetno antitelo može se primeniti kod domaćina korišćenjem bilo kojeg pogodnog načina koji rezultuje željenim terapijskim efektom ili dijagnostičkim efektom. Prema tome, sredstvo može da se inkorporiše u različite formulacije za terapijsku primenu. Preciznije, predmetno antitelo može da se formuliše u farmaceutske kompozicije kombinovanjem sa odgovarajućim, farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima, i može se formulisati u preparate u čvrstoj, polučvrstoj, tečnoj ili gasovitoj formi, na primer u tablete, kapsule, praškove, granule, masti, rastvore, supozitorije, injekcije, inhalante i aerosole.
[0221] U farmaceutskim doznim formama, predmetno antitelo može se primeniti u vidu farmaceutski prihvatljivih soli, ili se može koristiti samo ili u odgovarajućoj asocijaciji, kao i kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim jedinjenjima. Metodi i ekscipijenti koji slede služe samo kao primer i nisu ni na koji način ograničavajući.
[0222] Za oralne preparate, predmetno antitelo može se koristiti samo ili u kombinaciji sa odgovarajućim aditivima da bi se napravile tablete, praškovi, granule ili kapsule, na primer, sa konvencionalnim aditivima, kao što su laktoza, manitol, kukuruzni skrob ili krompirov skrob; sa povezivačima kao što su kristalna celuloza, celulozni derivati, akacija, kukuruzni skrob ili želatini; sa sredstvima za dezintegrisanje, kao što su kukuruzni skrob, krompirov skrob ili natrijum karboksimetilceluloza; sa lubrikansima kao što su talk ili magnezijum stearat; i po želji, sa razblaživačima, puferišućim sredstvima, sredstvima za vlaženje, prezervansima i sredstvima za poboljšanje ukusa.
[0223] Predmetno antitelo može da se formuliše u preparate za injekciju rastvaranjem, suspendovanjem ili emulgovanjem u vodenom ili nevodenom rastvaraču, na primer, biljnom ili drugim sličnim uljima, sintetskim alifatičnim kiselim gliceridima, estrima viših alifatičnih kiselina ili propilen glikolu; i po želji, sa konvencionalnim aditivima kao što su solubilizatori, izotonična sredstva, suspendujuća sredstva, emulgujuća sredstva, stabilizeri i prezervansi.
[0224] Farmaceutske kompozicije koje sadrže predmetno antitelo pripremaju se mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistoće, sa opcionim fiziološki prihvatljivim nosačima, ekscipijentima, stabilizerima, surfaktantima, puferima i/ili sredstvima za toničnost. Prihvatljivi nosači, ekscipijenti i/ili stabilizeri su u upotrebljenim dozama i koncentracijama netoksični za primaoce, i uključuju pufere kao što su fosfatni, citratni i puferi koji sadrže druge organske kiseline; antioksidante uključujući askorbinsku kiselinu, glutation, cistein, metionin i limunsku kiselinu; prezervanse (kao što su etanol, benzil alkohol, fenol, m-krezol, p-hlor-m-krezol, metil ili propil parabeni, benzalkonijum hlorid, ili njihove kombinacije); amino-kiseline kao što su arginin, glicin, ornitin, lizin, histidin, glutaminska kiselina, asparaginska kiselina, izoleucin, leucin, alanin, fenilalanin, tirozin, triptofan, metionin, serin, prolin i njihove kombinacije; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate; polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 rezidua); proteine, kao što su želatin ili serum albumin; helirajuća sredstva kao što je EDTA; šećere kao što su trehaloza, suharoza, laktoza, glukoza, manoza, maltoza, galaktoza, fruktoza, sorboza, rafinoza, glukozamin, N-metilglukozamin, galaktozamin, i neuraminska kiselina; i/ili nejonske surfaktante kao što su Tween, Brij Pluronics, Triton-X, ili polietilen glikol (PEG).
[0225] Farmaceutska kompozicija može biti u tečnoj formi, liofilizovanoj formi ili tečnoj formi rekonstituisanoj iz liofilizovane forme, pri čemu liofilizovani preparat treba da se pre primene rekonstituiše sa sterilnim rastvorom. Standardni postupak rekonstituisanja liofilisane kompozicije je vraćanje zapremine čiste vode (tipično ekvivalentne zapremini koja je uklonjena tokom liofilizovanja); međutim, i rastvori koji uključuju antibakterijska sredstva mogu se koristiti za proizvodnju farmaceutskih kompozicija za parenteralnu primenu; vidi i Chen (1992) Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54.
[0226] Primeri koncentracija antitela u predmetnoj farmaceutskoj kompoziciji mogu biti u rasponu od oko 1 mg/mL do oko 200 mg/ml ili od oko 50 mg/mL do oko 200 mg/mL, ili od oko 150 mg/mL do oko 200 mg/mL.
[0227] Vodena formulacija antitela može da se pripremi u pH-puferisanom rastvoru, npr., na pH u rasponu od oko 4.0 do oko 7.0, ili od oko 5.0 do oko 6.0, ili alternativno oko 5.5. Primeri pufera pogodnih za pH u ovom opsegu uključuju fosfatni, histidinski, citratni, sukcinatni, acetatni pufer i druge organskokiselinske pufere. Koncentracija pufera može biti od oko 1 mM do oko 100 mM, ili od oko 5 mM do oko 50 mM, u zavisnosti, npr., od pufera i željene toničnosti formulacije.
[0228] Tonična sredstva mogu biti uključena u formulaciju antitela da bi modulisala toničnost formulacije. Primeri toničnih sredstava uključuju natrijum hlorid, kalijum hlorid, glicerin i bilo koju komponentu iz grupe amino-kiselina, šećera, kao i njihove kombinacije. U nekim primerima izvođenja, vodena formulacija je izotonična, mada pogodni mogu biti i hipertonični ili hipotonični rastvori. Izraz "izotoničan" označava rastvor koji ima istu toničnost kao neki drugi rastvor sa kojim se upoređuje, kao što je fiziološki slani rastvor ili serum. Tonična sredstva mogu se koristiti u količini od oko 5 mM do oko 350 mM, npr., u količini od 100 mM do 350 nM.
[0229] Surfaktantni se takođe mogu dodati formulaciji antitela da bi se smanjilo agregiranje formulisanog antitela i/ili na najmanju meru smanjilo formiranje čestica u formulaciji i/ili smanjila adsorpcija. Primeri surfaktanata uključuju polioksietilensorbitan masnokiselinske estre (Tween), polioksietilen alkil etre (Brij), alkilfenilpolioksietilen etre (Triton-X), polioksietilen-polioksipropilen kopolimer (Poloxamer, Pluronic), i natrijum dodecil sulfat (sodium dodecyl sulfate, SDS). Primeri pogodnih polioksietilensorbitan-masnokiselinskih estara su polisorbat 20, (prodaje se pod zaštićenim imenom Tween 20™) i polisorbat 80 (prodaje se pod zaštićenim imenom Tween 80™). Primeri pogodnih polietilen-polipropilen kopolimera su oni koji se prodaju pod imenima Pluronic® F68 ili Poloxamer 188™. Primeri pogodnih polioksietilen alkil etara su oni koji se prodaju pod zaštićenim imenom Brij™. Primeri koncentracija surfaktanta mogu biti u opsegu od oko 0.001% do oko 1% w/v (tež./zapr.).
[0230] Lioprotektant može se takođe dodati da bi se zaštitio labilni aktivni sastojak (npr. protein) od destabilišućih uslova tokom procesa liofilizovanja. Na primer, poznati lioprotektanti uključuju šećere (među njima glukozu i saharozu); poliole (uključujući manitol, sorbitol i glicerol); i amino-kiseline (uključujući alanin, glicin i glutaminsku kiselinu). Lioprotektantni mogu biti prisutni u količini od oko 10 mM do 500 nM.
[0231] U nekim primerima izvođenja, predmetna formulacija uključuje predmetno antitelo, i jedno ili više od gore identifikovanih sredstava (npr., surfaktant, pufer, stabilizer, sredstvo za toničnost) i suštinski ne sadrži jedan ili više prezervanasa, kao što su etanol, benzil alkohol, fenol, m-krezol, p-hlor-m-krezol, metil ili propil parabeni, benzalkonijum hlorid, i njihove kombinacije. U drugim primerima izvođenja, prezervans je uključen u formulaciju, npr., u koncentracijama u opsegu od oko 0.001 do oko 2% (w/v).
[0232] Na primer, predmetna formulacija može biti tečna ili liofilizovana formulacija pogodna za parenteralnu primenu, i može uključivati: oko 1 mg/mL do oko 200 mg/mL predmetnog antitela; oko 0.001% do oko 1% najmanje jednog surfaktanta; oko 1 mM do oko 100 mM pufera; opciono oko 10 mM do oko 500 mM stabilizera; i oko 5 mM do oko 305 mM sredstva za toničnost; i ima pH od oko 4.0 do oko 7.0.
[0233] Kao sledeći primer, predmetna parenteralna formulacija je tečna ili liofilizovana formulacija koja uključuje: oko 1 mg/mL do oko 200 mg/mL predmetnog antitela; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 250 mM saharoze; i ima pH 5.5.
[0234] Kao sledeći primer, predmetna parenteralna formulacija uključuje liofilizovanu formulaciju koja uključuje: 1) 15 mg/mL predmetnog antitela; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 250 mM saharoze; i ima pH 5.5; ili 2) 75 mg/mL predmetnog antitela; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 250 mM saharoze; i ima pH 5.5; ili 3) 75 mg/mL predmetnog antitela; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 250 mM saharoze; i ima pH 5.5; ili 4) 75 mg/mL predmetnog antitela; 0.04% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 250 mM trehaloze; i ima pH 5.5; ili 6) 75 mg/mL predmetnog antitela; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 250 mM trehaloze; i ima pH 5.5.
[0235] Kao sledeći primer, predmetna parenteralna formulacija je tečna formulacija koja uključuje: 1) 7.5 mg/mL predmetnog antitela; 0.022% Tween 20 w/v; 120 mM L-histidina; i 250 125 mM saharoze; i ima pH 5.5; ili 2) 37.5 mg/mL predmetnog antitela; 0.02% Tween 20 w/v; 10 mM L-histidina; i 125 mM saharoze; i ima pH 5.5; ili 3) 37.5 mg/mL predmetnog antitela; 0.01% Tween 20 w/v; 10 mM L-histidina; i 125 mM saharoze; i ima pH 5.5; ili 4) 37.5 mg/mL predmetnog antitela; 0.02% Tween 20 w/v; 10 mM L-histidina; 125 mM trehaloze; i ima pH 5.5; ili 5) 37.5 mg/mL predmetnog antitela; 0.01% Tween 20 w/v; 10 mM L-histidina; i 125 mM trehaloze; i ima pH 5.5; ili 6) 5 mg/mL predmetnog antitela; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 250 mM trehaloze; i ima pH 5.5; ili 7) 75 mg/mL predmetnog antitela; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 250 mM manitola; i ima pH 5.5; ili 8) 75 mg/mL predmetnog antitela; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L histidina; i 140 mM natrijum hlorida; i ima pH 5.5; ili 9) 150 mg/mL predmetnog antitela; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 250 mM trehaloze; i ima pH 5.5; ili 10) 150 mg/mL predmetnog antitela; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 250 mM manitola; i ima pH 5.5; ili 11) 150 mg/mL predmetnog antitela; 0.02% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 140 mM natrijum hlorida; i ima pH 5.5; ili 12) 10 mg/mL predmetnog antitela; 0.01% Tween 20 w/v; 20 mM L-histidina; i 40 mM natrijum hlorida; i ima pH 5.5.
[0236] Predmetno antitelo može da se koristi u aerosolnoj formulaciji koja se primenjuje inhalacijom. Predmetno antitelo može da se formuliše u prihvatljive propelante pod pritiskom kao što su dihlorodifluorometan, propan, azot i slično.
[0237] Pored toga, predmetno antitelo može da bude u vidu supozitorija, što se postiže mešanjem različitih baza kao što su emulgujuće baze ili baze koje se rastvaraju u vodi. Predmetno antitelo može da se primeni rektalno, putem supozitorija. Supozitorija može uključivati prenosnike kao što su kakao buter, karbovoskovi i polietilen glikoli, koji se tope na telesnoj temperaturi, ali su na sobnoj temperaturi u čvrstom stanju.
[0238] Mogu se obezbediti jedinične dozne forme za oralnu ili rektalnu primenu kao što su sirupi, eliksiri, i suspenzije, pri čemu svaka dozna jedinica, na primer, kafena kašičica, tableta ili supozitorija sadrži unapred određenu količinu kompozicije koja sadrži jedan ili više inhibitora. Slično tome, jedinične dozne forme za injekciju ili intravensku primenu mogu uključivati predmetno antitelo u kompoziciji kao rastvor u sterilnoj vodi, normalnom slanom rastvoru ili drugom farmaceutski prihvatljivom nosaču.
[0239] Izraz "jedinična dozna forma", kako se koristi u ovom tekstu, označava fizički odvojene jedinice pogodne za pojedinačno doziranje kod ljudi ili životinja, svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu anti-Tau antitela predmetne objave u količini dovoljnoj da proizvede željeni efekat, udruženu sa farmaceutski prihvatljivim razblaživačem, nosačem ili prenosnikom.
Specifikacije za predmetno antitelo mogu zavisiti od određenog antitela koje se koristi i efekta koji treba da se postigne, i farmakodinamike udružene sa svakim antitelom, u domaćinu.
[0240] Drugi načini primene takođe će se upotrebljavati u metodu predmetne objave. Na primer, predmetno antitelo može da se formuliše u supozitorije i, u nekim slučajevima, aerosole i intranazalne kompozicije. Za supozitorije, prenosna kompozicija će uključivati tradicionalne povezivače i nosače kao što su polialkilen glikoli, ili trigliceridi. Takve supozitorije mogu da se formiraju od mešavina koje sadrže aktivni sastojak u rasponu od oko 0.5% do oko 10% (w/w, tež./tež.), npr., oko 1% do oko 2%.
[0241] Intranazalne formulacije obično će uključivati prenosnike koji ne izazivaju iritaciju nosne sluzokože i ne narušavaju značajno funkciju cilija. Mogu se upotrebiti razblaživači kao što su voda, vodeni slani rastvor ili druge poznate supstance. Nazalne formulacije mogu sadržati i prezervanse kao što su, bez ograničavanja, hlorobutanol i benzalkonijum hlorid. Surfaktant može biti prisutan da bi se povećala apsorpcija predmetnog antitela preko nosne sluzokože.
[0242] Predmetno antitelo može da se primeni u vidu injektabilne formulacije. Tipično, injektabilne kompozicije se pripremaju kao tečni rastvori ili suspenzije; čvrste forme pogodne za razstvaranje ili suspendovanje u tečnom prenosniku pre injektiranja, takođe se mogu pripremiti. Preparat može i da se emulguje ili da se antitelo inkapsulira u lipozomske prenosnike.
[0243] Pogodni ekscipijentni prenosnici su, na primer, voda, slani rastvor, dekstroza, glicerol, etanol, ili slično, i njihove kombinacije. Pored toga, po želji, prenosnik može sadržati male količine pomoćnih supstanci kao što su vlažeća ili emulgujuća sredstva ili pH puferišuća sredstva. Aktuelni metodi pripremanja takvih doznih formi poznati su ili će biti vidljivi stručnjacima u oblasti. Vidi, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 17th edition, 1985. Kompozicija ili formulacija koja će se primeniti u svakom slučaju će sadržati količinu predmetnog antitela dovoljnu za postizanje željenog stanja kod subjekta koji se leči.
[0244] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti kao što su prenosnici, adjuvansi, nosači ili razblaživači, široko su dostupni javnosti. Pored toga, farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance, kao što su sredstva za podešavanje pH i puferišuća sredstva, sredstva za podešavanje toničnosti, stabilizeri, sredstva za vlaženje i slično, široko su dostupni javnosti.
[0245] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo je formulisano u formulaciji sa kontrolisanim oslobađanjem. Preparati sa produženim oslobađanjem mogu se pripremiti korišćenjem metoda dobro poznatih u struci. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrikse čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, gde su matriksi u obliku uobličenih artikala, npr. filmova ili mikrokapsula. Primeri matriksa za produženo oslobađanje uključuju poliestre, kopolimere L-glutaminske kiseline i etil-L-glutamata, nedegradabilni etilen-vinil acetat, hidrogelove, polilaktide, degradabilne kopolimere mlečna kiselina-glikolna kiselina i poli-D-(-)-3-hidroksibuternu kiselinu. Moguće gubljenje biološke aktivnosti i moguće promene imunogenosti antitela ukljućenih u preparate sa produženim oslobađanjem mogu se sprečiti korišćenjem odgovarajućih aditiva, kontrolisanjem sadržaja vlage i razvijanjem specifičnih polimernih matriksnih kompozicija.
[0246] Može se smatrati da kontrolisano oslobađanje u predmetnom pronalasku označava bilo koju od mnogih doznih formi sa produženim oslobađanjem. U svrhu predmetnog pronalaska, može se smatrati da su sledeći izrazi suštinski ekvivalentni kontrolisanom oslobađanju: kontinuirano oslobađanje, kontrolisano oslobađanje, odloženo oslobađanje, depo, postepeno oslobađanje, dugo oslobađanje, programirano oslobađanje, produženo oslobađanje, proporcionalno oslobađanje, dugotrajno oslobađanje, repozitorijum, usporeno, sporo oslobađanje, oslobađanje sa prekidima, trajno oslobađanje, vremenska obloga, oslobađanje tokom vremena, odloženo dejstvo, produženo dejstvo, vremenski slojevito dejstvo, dugo dejstvo, produženo dejstvo, ponovljeno dejstvo, usporeno delovanje, trajno dejstvo, lek sa trajnim dejstvom, i produženo oslobađanje. Dodatna rasprava o ovim izrazima može se naći u Lesczek Krowczynski, Extended-Release Dosage Forms, 1987 (CRC Press, Inc.).
[0247] Različite tehnologije kontrolisanog oslobađanja pokrivaju veoma širok spektar doznih formi lekova. Tehnologije kontrolisanog oslobađanja uključuju, ali se ne ograničavaju na fizičke sisteme i hemijske sisteme.
[0248] Fizički sistemi uključuju, ali se ne ograničavaju na sisteme rezervoara sa membranama koje kontrolišu stopu oslobađanja, kao mikroinkapsulacija, makroinkapsulacija i membranski sistemi; sisteme rezervoara bez membrana koje kontrolišu stopu oslobađanja, kao što su šuplja vlakna, ultramikroporozni celuloza triacetat, i porozni polimerni supstrati i pene; monolitni sistemi, uključujući sisteme fizički rastvorene u neporoznim, polimernim ili elastomernim matriksima (npr., neerodibilni, erodibilni, u koje prodiru sredstva iz okoline, i degradabilni), i materijale fizički dispergovane u neporoznim, polimernim ili elastomernim matriksima (npr., neerodibilni, erodibilni, u koje prodiru sredstva iz okoline, i degradabilni); laminatne strukture, koje uključuju slojeve rezervoara, hemijski slične ili različite u odnosu na spoljašnje kontrolne slojeve; i druge fizičke metode, kao što su osmotske pumpe, ili adsorbovanje na jonoizmenjivačkim smolama.
[0249] Hemijski sistemi uključuju, ali se ne ograničavaju na hemijsku eroziju polimernih matriksa (npr., heterogena ili homogena erozija), ili biološku eroziju polimernog matriksa (npr.,
1
heterogena ili homogena). Dodatna rasprava o kategorijama sistema za kontrolisano oslobađanje može se naći u Agis F. Kydonieus, Controlled Release Technologies: Metods, Theory and Applications, 1980 (CRC Press, Inc.).
[0250] Postoje brojne formulacije lekova sa kontrolisanim oslobađanjem razvijene za oralnu primenu. One uključuju, ali se ne ograničavaju na gastrointestinalne dostavne sisteme kontrolisane osmotskim pritiskom; gastrointestinalne dostavne sisteme kontrolisane hidrodinamičkim pritiskom; gastrointestinalne dostavne sisteme kontrolisane permeacijom membrane, koji uključuju gastrointestinalne dostavne uređaje kontrolisane permeacijom mikroporozne membrane; gastrointestinalne dostavne uređaje sa kontrolisanim oslobađanjem rezistentne na želudačnu tečnost, koji ciljaju crevo; gel difuzijom kontrolisane gastrointestinalne dostavne sisteme; i gastrointestinalne dostavne sisteme kontrolisane jonoizmenjivanjem, koji uključuju katjonske i anjonske lekove. Dodatne informacije u vezi sa sistemima za dostavu lekova sa kontrolisanim oslobađanjem mogu se naći u Yie W. Chien, Novel Drug Delivery Systems, 1992 (Marcel Dekker, Inc.).
Doze
[0251] Pogodnu dozu može odrediti nadležni lekar ili druga medicinski kvalifikovana osoba, na osnovu različitih kliničkih faktora. Kao što je dobro poznato u medicinskoj struci, doze za svakog pojedinačnog pacijenta zavise od mnogih faktora, uključujući pacijentovui veličinu, površinu tela, starost, određeno jedinjenje koje će se primeniti, pol pacijenta, vreme i put primene, opšte stanje zdravlja, i druge lekove koji se uporedno primenjuju. Predmetno antitelo može se primeniti u količini između 1 ng/kg telesne težine i 20 mg/kg telesne težine po dozi, npr. između 0.1 mg/kg telesne težine do 10 mg/kg telesne težine , npr. između 0.5 mg/kg telesne težine do 5 mg/kg telesne težine; međutim, predviđene su i doze ispod ili iznad ovog primera raspona, posebno imajući u vidu gorepomenute faktore. Ako je režim kontinuirana infuzija, ona može biti u rangu od 1 µg do 10 mg po kilogramu telesne težine, po minutu.
[0252] Stručnjak u oblasti će lako proceniti da dozni nivoi mogu varirati u funkciji specifičnog antitela, jačine simptoma i podložnosti subjekta sporednim efektima. Poželjne doze za dato jedinjenje lako može odrediti stručnjak u oblasti, različitim načinima.
Putevi primene
[0253] Predmetno antitelo primenjuje se kod individue korišćenjem bilo kojeg raspoloživog metoda i puta pogodnog za dostavu leka, uključujući in vivo i ex vivo metode, kao i sistemske i lokalizovane puteve primene.
[0254] Konvencionalni i farmaceutski prihvatljivi putevi primene uključuju intranazalni, intramuskularni, intratrahealni, intratekalni, supkutani, intradermalni, površinsko nanošenje,
2
intravenski, intraarterijski, rektalni, nazalni, oralni i druge enteralne i parenteralne puteve primene. Putevi primene mogu da se kombinuju, po želji, ili prilagođavaju u zavisnosti od antitela i/ili željenog efekta. Kompozicija predmetnog antitela može se primeniti u jednoj dozi ili u više doza. U nekim primerima izvođenja, kompozicija predmetnog antitela primenjuje se oralno. U nekim primerima izvođenja, kompozicija predmetnog antitela primenjuje se putem inhalacije. U nekim primerima izvođenja, kompozicija predmetnog antitela primenjuje se intranazalno. U nekim primerima izvođenja, kompozicija predmetnog antitela primenjuje se lokalno. U nekim primerima izvođenja, kompozicija predmetnog antitela primenjuje se intrakranijalno. U nekim primerima izvođenja, kompozicija predmetnog antitela primenjuje se intravenski. U nekim primerima izvođenja, kompozicija predmetnog antitela primenjuje se intratekalno.
[0255] Antitelo predmetne objave može se primeniti kod domaćina koiršćenjem bilo kojeg raspoloživog metoda i puta pogodnog za dostavu konvencionalnih lekova, uključujući sistemske i lokalizovane puteve. Uopšteno, putevi primene koji se razmatraju u pronalasku uključuju, ali se ne ograničavaju obavezno na enteralni, parenteralni, ili inhalacioni put.
[0256] Parenteralni putevi primene različiti od primene inhalacijom uključuju, ali se ne ograničavaju obavezno na površinski, transdermalni, supkutani, intramuskularni, intraorbitalni, intrakapsularni, intraspinalni, intrasternalni, intratekalni, i intravenski put, tj., svaki put primene različit od primene preko alimentarnog kanala. Parenteralna primena može da se izvede da bi se postigla sistemska ili lokalna dostava predmetnog antitela. Kada je poželjna sistemska primena, davanje obično uključuje invazivnu ili sistemski apsorbovanu površinsku ili mukoznu primenu farmaceutskih preparata.
[0257] Predmetno antitelo može da se dostavi subjektu i enteralnom primenom. Enteralni putevi primene uključuju, ali se ne ograničavaju obavezno na oralnu i rektalnu (npr., korišćenjem supozitorije) dostavu.
[0258] Pod tretmanom/lečenjem podrazumeva se bar ublažavanje simptoma udruženih sa patološkim stanjem od kojeg domaćin pati, gde se ublažavanje koristi u širem smislu da označi bar smanjenje jačine parametra, npr. simptoma, udruženog sa patološkim stanjem koje se leči, kao što je tauopatija. Kao takav, tretman uključuje i situacije u kojima se patološko stanje ili bar simptomi udruženi sa njim, potpuno inhibiraju, npr., sprečava se njihova pojava, ili se zaustavljaju, npr. završavaju, tako da domaćin više ne pati od patološkog stanja, ili bar simptoma kojima se karakteriše patološko stanje.
[0259] U nekim primerima izvođenja, predmetno antitelo se primenjuje injekcijom i/ili dostavom na mesto u moždanoj arteriji ili direktno u moždano tkivo. Predmetno antitelo može da se primeni i direktno na ciljno mesto npr., biolističkom dostavom na ciljno mesto.
[0260] Različiti domaćini (gde se izraz "domaćin" koristi u ovom tekstu naizmenično sa izrazima "subjekt", "individua" i "pacijent") leče se u skladu sa predmetnim metodima. Obično su ti domaćini "sisari" ili "sisar", pri čemu se ovi izrazi koriste u širem smislu za opisivanje organizama koji pripadaju klasi sisara, uključujući redove mesojeda (npr., psi i mačke), glodara (npr., miševi, zamorci i pacovi), i primata (npr., ljudi, šimpanze i majmuni). U nekim primerima izvođenja, domaćini će biti ljudi.
[0261] Obezbeđeni su kitovi sa jediničnim dozama predmetnog antitela, npr. u oralnim ili injektabilnim dozama. U tim kitovima, pored kontejnera koji sadrže jedinične doze, biće i upakovana informacija koja opisuje upotrebu i očekivanu korist od antitela u lečenju patološkog stanja od interesa. Poželjna jedinjenja i jedinične doze su one koje su opisane ranije u ovom tekstu.
METODI DETEKCIJE
[0262] Predmetna objava obezbeđuje in vitro metode detektovanja Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue; i metode detektovanja Tau polipeptida i živoj individui in vivo. Predmetni in vitro metod detekcije može biti kvantitativan. Tau može tako služiti kao biomarker napredovanja tauopatije, ili odgovora na lečenje tauopatije.
[0263] Tau polipeptid koji se detektuje/kvantifikuje može biti: a) Tau pune dužine; b) N-terminalni fragment Tau pune dužine; c) ukupni Tau, gde "ukupni Tau" može uključivati Tau pune dužine bilo koje izoforme; d) slobodni Tau, npr., Tau koji nije vezan za predmetno antitau antitelo; i e) svi N-terminalni Tau fragmeni koji su prisutni u biološkom uzorku i koji prikazuju epitop prepoznat predmetnim anti-Tau antitelom. Aminokiselinske sekvence humanog Tau pune dužine prikazane su na Slikama 6A-D.
[0264] U nekim slučajevima, predmetni metod detekcije može uključivati još i određivanje nivoa Aβ40 i/ili Aβ42 u biološkom uzorku. Određivanje nivoa Aβ40 i/ili Aβ42 u biološkom uzorku može se izvesti korišćenjem imunskog testa (npr., ELISA), npr., korišćenjem antitela koje se vezuje za Aβ40 i/ili Aβ42.
[0265] Pogodni biološki uzorci uključuju, npr., cerebrospinalnu tečnost, krv, plazmu, serum, urin, i salivu.
[0266] In vitro metod predmetne objave detektovanja Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue uopšteno uključuje: a) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa anti-Tau antitelom, kako je opisano u ovom tekstu; i b) detektovanje vezivanja antitela za Tau
4
polipeptid prisutan u uzorku. U nekim slučajevima, anti-Tau antitelo uključuje VH i/ili VL CDR prikazane na Slikama 1A i 1B. U nekim slučajevima, anti-Tau antitelo uključuje VH i/ili VL CDR sa Slika 2A i 2B.
[0267] Detekcioni metod predmetne objave može se koristiti za određivanje da li individua ima, ili je pod rizikom da razvije tauopatiju. Detekcioni metod predmetne objave može se koristiti za određivanje stadijuma (jačine) tauopatije. Detekcioni metod predmetne objave može se koristiti za određivanje pacijentovog odgovora na režim tretmana za lečenje tauopatije. Biološki uzorak se može testirati korišćenjem predmetnog metoda detekcije, pri čemu je biološki uzorak dobijen od individue za koju se misli da ima tauopatiju, individue kod koje je dijagnostikovana tauopatija, individue koja ima genetičku predispoziciju da razvije tauopatiju, itd.
[0268] Predmetna objava obezbeđuje metod dijagnostikovanja neurodegenerativne tauopatije kod individue. Metod uopšteno uključuje (a) procenu nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue; i (b) upoređivanje nivoa Tau polipeptida sa referentnom, standardnom, ili normalnom kontrolnom vrednošću koja pokazuje nivo Tau kod normalnih kontrolnih subjekata. Značajna razlika između nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku i normlane kontrolne vrednosti ukazuje na to da individua ima neurodegenerativnu tauopatiju.
[0269] Predmetna objava obezbeđuje metod praćenja napredovanja, ili praćenja odgovora na lečenje neurodegenerativne tauopatije kod individue. Metod uopšteno uključuje upoređivanje nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue u prvoj vremenskoj tački, sa nivoom Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue u drugoj vremenskoj tački. Razlika u nivou Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue u drugoj vremenskoj tački, u poređenju sa nivoom Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue u prvoj vremenskoj tački, može ukazati na to: i) da li tauopatija napreduje ili je napredovanje bolesti zaustavljeno; i/ili ii) koliko brzo tauopatija napreduje; i/ili iii) da li individua ispoljava klinički koristan odgovor na lečenje lekom ili drugim režimom tretmana za lečenje tauopatije.
[0270] Predmetna objava obezbeđuje metod određivanja stadijuma tauopatije. Na primer, predmetni metod može obezbediti određivanje stadijuma Alzheimerove bolesti. Na primer, nivo Tau polipeptida u biološkom uzorku (npr., CSF ili drugi tečni biološki uzorak) iz žive individue može pružiti uvid u Braakov stadijum AD. Braak and Braak (1995) Neurobiol. Aging 16:271. Na primer, nivo Tau polipeptida u biološkom uzorku iz žive individue može pružiti uvid u to da li je individua u transentorinalnim stadijumima I-II AD; limbičnim stadijumima III-IV AD; ili neokortikalinim stadijumima V-VI AD.
[0271] Nivo Tau polipeptida u biološkom uzorku može se proceniti bilo kojim metodom poznatim u struci. Pogodni metodi uključuju, ali se ne ograničavaju na proteinski ("Western") blot, imunoprecipitaciju, enzimski imunotest (ELISA), radioimunotest (adioimmunoassay, RIA), sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (fluorescent activated cell sorting, FACS), dvodimenzionalnu gel-elektroforezu, masenu spektroskopiju (mass spectroscopy, MS), matriksom potpomognutu lasersku desorpciju/jonizaciju-vreme leta-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight-MS, MALDI-TOF), površinom potpomognutu lasersku desorpciju/jonizaciju-vreme leta-MS (SELDI-TOF), tečnu hromatografiju visokih performansi (HPLC), brzu proteinsku tečnu hromatografiju (fast protein liquid chromatography, FPLC), multidimenzionalnu tečnu hromatografiju (multidimensional liquid chromatography, LC) praćenu tandemskom masenom spektrometrijom (MS/MS), i lasersku denzitometriju.
[0272] Predmetna objava obezbeđuje metod praćenja napredovanja tauopatije kod individue, pri čemu metod uopšteno uključuje: a) određivanje prvog nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue u prvoj vremenskoj tački; b) određivanje drugog nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue u drugoj vremenskoj tački; i c) upoređivanje drugog nivoa Tau sa prvim nivoom Tau. Koraci određivanja mogu uključivati: i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa predmetnim anti-Tau antitelom; i ii) kvantifikovanje vezivanja antitela za Tau polipeptid prisutan u uzorku.
[0273] U nekim slučajevima, prva vremenska tačka je vremenska tačka pre otpočinjanja režima lečenja, a druga vremenska tačka je vremenska tačka posle otpočinjanja režima lečenja. Prema tome, ova objava obezbeđuje metod praćenja odgovora na lečenje sredstvom koje leči tauopatiju, pri čemu metod uključuje: a) određivanje prvog nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue u prvoj vremenskoj tački koja predstavlja tačku pre otpočinjanja lečenja sredstvom za lečenje tauopatije; b) određivanje drugog nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue u drugoj vremenskoj tački koja predstavlja tačku posle otpočinjanja lečenja sredstvom za lečenje tauopatije; i c) upoređivanje drugog nivoa Tau sa prvim nivoom Tau.
[0274] Predmetni metod praćenja napredovanja tauopatije može se primeniti i na napredovanje sinukleopatije, npr., Parkinsonove bolesti (PD); demencije sa pojavom Lewyjevih tela (DLB); multiple sistemske atrofije (MSA); itd. Na primer, napredovanje PD sa demencijom (PDD) može se pratiti predmetnim metodom.
[0275] U nekim tauopatijama, nivo Tau raste sa napredovanjem bolesti. U drugim tauopatijama, nivo Tau opada sa napredovanjem bolesti. Prema tome, npr., nivo Tau raste sa napredovanjem AD; i opada sa napredovanjem FTD.
[0276] Predmetni metod može uključivati upotrebu kita ili testnog uređaja koji uključuje predmetno anti-Tau antitelo. Predmetna objava obezbeđuje kitove i testne uređaje za izvođenje metoda, kako je opisano u ovom tekstu. Predmetni kit uključuje anti-tau antitelo predmetne objave.
[0277] Anti-tau antitelo može da se imobiliše na nerastvorljivoj podlozi (npr., testna traka, bunarčić ploče sa većim brojem bunarčića, perlica (npr., magnetna perlica), itd.). Pogodne podloge dobro su poznate u struci i uključuju, između ostalog, komercijalno dostupne materijale za kolonu, polistirenske perlice, lateksne perlice, magnetne perlice, koloidne metalne čestice, staklene i/ili silikonske ljuspice i površine, nitrocelulozne trake, najlonske membrane, ploče, bunarčići reakcionih ploča (npr., ploče sa većim brojem bunarčića), plastične epruvete, itd. Čvrsta podloga može uključivati bilo koju od različitih supstanci, uključujući, npr., staklo, polistiren, polivinil hlorid, polipropilen, polietilen, polikarbonat, dekstran, najlon, amilozu, prirodne i modifikovane celuloze, poliakrilamide, agaroze, i magnetit. Pogodni metodi imobilisanja predmetnog antitela na čvrstoj podlozi dobro su poznati i uključuju, ali se ne ograničavaju na jonske, hidrofobne, kovalentne interakcije i slično. Čvrste podloge mogu biti rastvorljive ili nerastvorljive, npr., u vodenom rastvoru. U nekim primerima izvođenja, pogodna čvrsta podloga je obično nerastvorljiva u vodenom rastvoru.
[0278] Anti-tau antitelo predmetne objave može uključivati detektabilni obeleživač. Kada antitelo uključuje detektabilni obeleživač, predmetni kit može sadržati jedan ili više reagenasa za razvijanje detektabilnog obeleživača. Obeleženo antitelo može uključivati obeleživač kao što je hemiluminiscentno sredstvo, čestični obeleživač, kolorimetrijsko sredstvo, sredstvo za transfer energije, enzim, fluorescentno sredstvo, ili radioizotop. Pogodni detektabilni obeleživači uključuju bilo koju kompoziciju koja se može detektovati spektroskopski, fotohemijski, biohemijski, imunohemijski, električnim putem, optički ili hemijski. Pogodni detektabilni obeleživači uključuju, ali se ne ograničavaju na fluorescentne obeleživače (npr., fluorescein izotiocijanat, teksas crveno, rodamin, zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, žuti fluorescentni protein, i slično); radioobeleživače (npr.,<3>H,<125>I,<35>S,<14>C, ili<32>P); i enzime (npr., peroksidaza rena, alkalna fosfataza, luciferaza, i drugi enzimi koji deluju na supstrat da bi se dobio proizvod koji će se detektovati fluorometrijski, kolorimetrijski, ili spektrofotometrijski).
[0279] Predmetni kit može uključivati još i jednu ili više dodatnih komponenti, pri čemu pogodne dodatne komponente uključuju: 1) pozitivnu kontrolu; 2) pufer (npr., pufer za vezivanje; pufer za ispiranje; itd.); 3) reagense za upotrebu u stvaranju detektabilnog signala; i slično. Druge opcione komponente kita uključuju: inhibitor proteaze; detektabilni obeleživač; itd. Različite komponente kita mogu biti prisutne u zasebnim kontejnerima ili određene kompatibilne komponente mogu biti unapred spojene u istom kontejneru, po želji.
[0280] Pored gorepomenutih komponenti, predmetni kit može uključivati uputstva za upotrebu komponenti kita prilikom izvođenja predmetnog metoda. Uputstva za izvođenje predmetnog metoda obično su zabeležena na pogodnom medijumu. Na primer, uputstva mogu biti odštampana na podlozi kao što su papir ili plastika, itd. Kao takva, uputstva mogu biti prisutna u kitovima umetnuta u pakovanje, na mestima obeležavanja kontejnera kita ili njegovih komponenti (tj., udružena sa pakovanjem ili delom pakovanja) itd. U drugim primerima izvođenja, uputstva su prisutna u vidu elektronskog dokumenta na odgovarajućem medijumu koji se može očitati na kompjuteru, npr. kompakt disk-"read only memory" (CD-ROM), "digital versatile disk" (DVD), disketa, itd. U drugim primerima izvođenja, uputstva nisu prisutna u kitu, nego se dobijaju iz udaljenih izvora, npr. preko interneta. Primer ovih primera izvođenja je kit koji uključuje web-adresu na kojoj se uputstva mogu videti i/ili sa kojih se mogu preuzeti. Kao i uputstva, obaveštenje o načinu dobijanja uputstava nalazi se odštampano na pogodnoj podlozi.
[0281] Testni uređaj uključuje predmetno anti-tau antitelo imobilisano na čvrstom supstratu. Testni uređaj može biti u bilo kojem od različitih formata, npr., testna traka, štapić za uranjanje; itd.
In vivo dobijanje slike
[0282] Kako je gore rečeno, predmetna objava obezbeđuje metode detektovanja Tau polipeptida u živoj individui, npr., tehnikom in vivo dobijanja slike. Na primer, u jednom primeru izvođenja, in vivo dobijanje slike Tau polipeptida može se obaviti pozitronskom emisionom tomografijom (positron emission tomography, PET), tomografijom sa emitovanjem pojedinačnog fotona (single photon emission tomography, SPECT), optičkim dobijanjem slike talasnim dužinama u blizini infracrvene svetlosti (near infrared, NIR), ili dobijanjem slike magnetnom rezonancom (magnetic resonance imaging, MRI). Predmetno anti-tau antitelo se primeni kod individue, i zatim se detektuje prisustvo i/ili nivo tau polipeptida. Anti-tau antitelo može uključivati obeleživač pogodan za upotrebu u PET, SPECT, NIR, ili MRI. Takvi obeleživači uključuju kontrastno sredstvo ili radioizotop, pri čemu su kontrastno sredstvo ili radioizotop pogodni za upotrebu u dobijanju slike, npr., postupcima dobijanja slike koji se izvode na ljudima, kako je gore opisano. U nekim slučajevima, anti-tau antitelo uključuje VH i/ili VL CDR IPN001. U nekim slučajevima, anti-tau antitelo uključuje VH i/ili VL CDR IPN002. Anti-tau antitelo može uključivati jedan ili više humanizovanih regiona okvira, kako je opisano ranije u ovom tekstu.
Sastavljenje izveštaja
[0283] U nekim slučajevima, predmetni metod detekcije uključuje detektovanje Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue; i, na osnovu nivoa detektovanog Tau polipeptida, sastavljabje izveštaja i/ili usmeravanje terapije ili lečenja individue od koje je dobijen biološki uzorak.
[0284] Izveštaj može uključivati jedno ili više od sledećeg: indikaciju da li je verovatno da individua ima tauopatiju; indikaciju jačine tauopatije; indikaciju da li individua ispoljava klinički koristan odgovor na lečenje tauopatije; i slično.
[0285] Prema tome, izveštaj može uključivati informacije kao što su predviđena verovatnoća da individua ima ili će razviti tauopatiju; preporuke u vezi sa daljom evaluacijom; preporuke u vezi sa terapijskim lekom i/ili drugom intervencijom u upravljanju bolešću; i slično.
[0286] Na primer, metodi objavljeni u ovom tekstu mogu uključivati još i korak sastavljanja ili izdavanja izveštaja koji obezbeđuje rezultate procene subjekta, ovaj izveštaj može biti dat u vidu elektronskog medijuma (npr., elektronski displej na kompjuterskom monitoru), ili u vidu opipljivog medijuma (npr., izveštaj odštampan na papiru ili drugom opipljivom medijumu). Procena verovatnoće da osoba ima, ili je pod rizikom da razvije tauopatiju može se označiti kao "izveštaj o riziku", "skor rizika" ili "skor verovatnoće". Osoba ili entitet koji priprema izveštaj ("stvaralac izveštaja") može izvesti i korake kao što su prikupljanje uzoraka, obrada uzoraka, i slično. Alternativno, entitet različit od stvaraoca izveštaja može izvesti korake kao što su prikupljanje uzoraka, obrada uzoraka, i slično. Izveštaj o proceni rizika može biti dat korisniku. "Korisnik" može biti zaposleni u zdravstvu (npr., kliničar, laboratorijski tehničar, ili lekar). Smernice za upravljanje zdravstvenim stanjem
[0287] U nekim slučajevima, predmetni metod detekcije uključuje detektovanje Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od individue; i, na osnovu nivoa detektovanog Tau polipeptida, sastavljanje izveštaja i/ili usmeravanje terapije ili vođenje individue od koje je dobijen biološki uzorak.
[0288] Prema tome, npr., u zavisnosti od ishoda predmetnog metoda detekcije, može se dati preporuka da se individua podvrgne terapijskoj intervenciji (tretmanu) tauopatije i/ili da se razmotre posbne mogućnosti lečenja.
[0289] Terapijska intervencija može uključivati, npr., terapiju lekom za lečenje Alzheimerove bolesti. Primeri terapije lekom za lečenje Alzheimerove bolesti uključuju, ali se ne ograničavaju na inhibitore acetilholinesteraze, uključujući, ali ne ograničavajući se na Aricept (donepezil), Exelon (rivastigmin), metrifonat, i takrin (Cognex); anti-Aβ antitelo (npr., solanezumab); antitau antitelo; nesteroidna antiinflamatorna sredstva, uključujući, ali ne ograničavajući se na ibuprofen i indometacin; inhibitore ciklooksigenaze-2 (Cox2) kao što je Celebrex; i inhibitore monoamino oksidaze, kao što je selegilen (Eldepryl ili Deprenyl). Doziranje svakog od gorepomenutih sredstava poznato je u struci. Na primer, Aricept može da se primeni u dozi od 50 mg oralno, jednom dnevno tokom 6 nedelja, i, ako ga individua dobro podnosi, 10 mg na dan posle toga.
ODREĐIVANJE KOLIČINE SLOBODNOG I VEZANOG VANĆELIJSKOG TAU
[0290] Posle davanja anti-eTau antitela individui, od interesa može biti određivanje količine eTau preostalog u CSF ili ISF, nevezanog za anti-eTau antitelo. Predmetna objava obezbeđuje metode određivanja količine takvog slobodnog eTau. Šematski prikaz metoda određivanja količine eTau preostalog u CSF ili ISF, nevezanog za anti-eTau antitelo predstavljen je na Slici 54A. Posle primene anti-eTau antitela kod individue, od interesa može biti i određivanje količine eTau u CSF ili ISF vezanog za anti-eTau antitelo. Šematski prikaz metoda određivanja količine eTau u CSF ili ISF koji je vezan za anti-eTau antitelo predstavljen je na Slici 54B. Određivanje količine slobodnog vanćelijskog Tau
[0291] Predmetna objava obezbeđuje metod određivanje količine vanćelijskog Tau (eTau) nevezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji anti-eTau antitelom. Metod uopšteno uključuje: a) dovođenje u kontakt imobilisanog antitela sa uzorkom CSF ili ISF dobijenom od subjekta, pri čemu imobilisano antitelo kompetira za vezivanje sa eTau sa anti-eTau antitelom primenjenim kod subjekta, i pri čemu je dovođenje u kontakt pod uslovima pogodnim za vezivanje nevezanog eTau za imobilisano antitelo; i b) određivanje količine eTau vezanog za imobilisano antitelo. Količina eTau vezanog za imobilisano antitelo ukazuje na količinu eTau nevezanog za anti-tau antitelo u uzorku. U nekim slučajevima, količina eTau vezanog za imobilisano antitelo određuje se korišćenjem detektabilno obeleženog trećeg antitela koje ne kompetira sa imobilisanim antitelom za vezivanje sa eTau.
[0292] Kako je gore napomenuto, test meri količinu eTau u uzorku CSF ili ISF dobijenom od individue koja je podvrgnuta terapiji anti-eTau antitelom. U nekim slučajevima, anti-eTau antitelo je terapijsko humanizovano anti-eTau antitelo. U nekim slučajevima, anti-eTau antitelo je humanizovano anti-eTau antitelo predmetne objave. U nekim slučajevima, anti-eTau antitelo je hu-IPN002.
[0293] U nekim slučajevima, predmetni metod će uključivati: a) određivanje količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; i b) određivanje nivoa ukupnog tau u uzorku.
[0294] U nekim slučajevima, predmetni metod će uključivati: a) određivanje količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; i b) upoređivanje nivoa nevezanog Tau u uzorku sa nivoom ukupnog tau u uzorku CSF ili ISF dobijenom od individue pre tretmana antieTau antitelom.
[0295] Predmetni metod detekcije pogodan je za određivanje nivoa vanćelijskog tau. "Vanćelijski tau" ("eTau"), kako se koristi u ovom tekstu, obuhvata svaki Tau polipeptid koji se može detektovati u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) ili intersticijalnoj tečnosti (ISF). U nekim primerima izvođenja, eTau je polipeptid dužine 175 amino-kiselina i uključuje amino-kiseline 2-176 tau pune dužine; na primer, u nekim primerima izvođenja, eTau je polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:45. U nekim primerima izvođenja, eTau je polipeptid dužine 171 amino-kiselinu i uključuje amino-kiseline 2-172 tau pune dužine; na primer, u nekim primerima izvođenja eTau je polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:44. U nekim primerima izvođenja, eTau je eTau-2 polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:46. U nekim primerima izvođenja, eTau je eTau-3 polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:47. U nekim primerima izvođenja, eTau je eTau-4 polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:48.
[0296] U nekim slučajevima, eTau polipeptid ima dužinu od oko 50 amino-kiselina do oko 175 amino-kiselina, npr., od oko 50 amino-kiselina (aa) do oko 75 aa, od oko 75 aa do oko 100 aa, od oko 100 aa do oko 125 aa, od oko 125 aa do oko 150 aa, ili od oko 150 aa do oko 175 aa; i može uključivati od 50 do oko 75, od oko 75 do oko 100, od oko 100 do oko 125, od oko 125 do oko 150, ili od oko 150 do oko 175, kontinuiranih amino-kiselina od amino-kiselina 2-176 tau pune dužine. Primeri eTau polipeptida prikazani su na Slici 20.
Određivanje količine vanćelijskog Tau vezanog za anti-eTau antitelo
[0297] Predmetna objava obezbeđuje metod određivanja količine eTau vezanog za terapijsko anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji terapijskim anti-eTau antitelom. Metod uopšteno uključuje: a) dovođenje u kontakt imobilisanog antitela sa uzorkom CSF ili ISF dobijenim od subjekta, pri čemu imobilisano antitelo ne kompetira za vezivanje za eTau sa anti-eTau antitelom primenjenim kod subjekta, pomenuto dovođenje u kontakt je pod uslovima pogodnim za vezivanje eTau vezanog za terapijsko antitelo, za imobilisano antitelo; i b) određivanje količine kompleksa terapijsko antieTau/eTau vezanog za imobilisano antitelo, pri čemu količina kompleksa terapijsko anti-eTau antitelo/eTau vezanog za imobilisano antitelo ukazuje na količinu eTau vezanog za terapijsko
1
antitelo, prisutnu u uzorku. Količina kompleksa terapijsko anti-eTau antitelo/eTau vezanog za imobilisano antitelo određuje se detektovanjem anti-eTau antitela prisutnog u kompleksu antieTau antitelo/eTau. Količina kompleksa anti-eTau antitelo/eTau vezanog za imobilisano antitelo koja se određuje detektovanjem anti-eTau antitela prisutnog u kompleksu anti-eTau antitelo/eTau ukazuje na količinu Tau vezanog za terapijsko antitelo u uzorku CSF ili ISF.
[0298] Kako je gore napomenuto, test meri količinu eTau vezanog za terapijsko antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od individue koja je podvrgnuta terapiji anti-eTau antitelom. U nekim slučajevima, anti-eTau antitelo je terapijsko humanizovano anti-eTau antitelo. U nekim slučajevima, anti-eTau antitelo je humanizovano anti-eTau antitelo predmetne objave. U nekim slučajevima, anti-eTau antitelo je hu-IPN002.
[0299] U nekim slučajevima, predmetni metod će uključivati: a) određivanje količine eTau vezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; i b) određivanje nivoa ukupnog tau u uzorku. U nekim slučajevima, predmetni metod će uključivati: a) određivanje količine eTau vezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji antieTau antitelom, kako je gore opisano; b) određivanje količine eTau u uzorku CSF ili ISF koji nije vezan za terapijsko anti-eTau antitelo. U nekim slučajevima, predmetni metod će uključivati: a) određivanje količine eTau vezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; i b) određivanje nivoa ukupnog tau u uzorku; i c) određivanje količine eTau u uzorku CSF ili ISF, koji nije vezan za terapijsko anti-eTau antitelo.
[0300] U nekim slučajevima, predmetni metod će uključivati: a) određivanje količine eTau vezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; i b) upoređivanje nivoa Tau vezanog za antie-Tau antitelo u uzorku sa nivoom ukupnog tau u uzorku CSF ili ISF dobijenom od individue pre lečenja anti-eTau antitelom.
[0301] U nekim slučajevima, predmetni metod će uključivati: a) određivanje količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; b) određivanje količine eTau vezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji antieTau antitelom, kako je gore opisano; i c) upoređivanje nivoa nevezanog Tau i nivoa Tau vezanog za anti-eTau antitelo u uzorku sa nivoom ukupnog tau u uzorku CSF ili ISF dobijenom od individue pre lečenja anti-eTau antitelom.
2
[0302] Predmetni metod detekcije pogodan je za određivanje nivoa vanćelijskog tau vezanog za terapijsko antitelo. "Vanćelijski tau" ("eTau"), kako se koristi u ovom tekstu, obuhvata svaki Tau polipeptid koji se može detektovati u cerebrospinalnoj tečnosti (CSF) ili intersticijalnoj tečnosti (ISF). U nekim primerima izvođenja, eTau je polipeptid dužine 175 amino-kiselina, koji uključuje amino-kiseline 2-176 tau pune dužine; na primer, u nekim primerima izvođenja eTau je polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:45. U nekim primerima izvođenja, eTau je polipeptid dug 171 amino-kiselinu i uključuje aminokiseline 2-172 tau pune dužine; na primer, u nekim primerima izvođenja eTau je polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:44. U nekim primerima izvođenja, eTau je eTau-2 polipeptid koji uključuje amino-kiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:46. U nekim primerima izvođenja, eTau je eTau-3 polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:47. U nekim primerima izvođenja, eTau je eTau-4 polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:48.
[0303] U nekim slučajevima, eTau polipeptid ima dužinu od oko 50 amino-kiselinas do oko 175 amino-kiselina, npr., od oko 50 amino-kiselina (aa) do oko 75 aa, od oko 75 aa do oko 100 aa, od oko 100 aa do oko 125 aa, od oko 125 aa do oko 150 aa, ili od oko 150 aa do oko 175 aa; i može uključivati od 50 do oko 75, od oko 75 do oko 100, od oko 100 do oko 125, od oko 125 do oko 150, ili od oko 150 do oko 175, kontinuiranih amino-kiselina od amino-kiselina 2-176 tau pune dužine. Primeri eTau polipeptida Prikazani su na Slici 20.
Sastavljenje izveštaja
[0304] U nekim slučajevima, predmetni metod će uključivati: a) određivanje količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; i b) sastavljanje izveštaja i/ili usmeravanje terapije ili vođenja individue od koje je uzorak dobijen. U nekim slučajevima, predmetni metod će uključivati: a) određivanje količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; b) upoređivanje nivoa nevezanog Tau u uzorku sa nivoom ukupnog tau u uzorku CSF ili ISF dobijenom od individue pre lečenja anti-eTau antitelom; i c) sastavljanje izveštaja i/ili usmeravanje terapije ili vođenje individue od koje je uzorak dobijen.
[0305] U nekim slučajevima, predmetni metod će uključivati: a) određivanje količine eTau vezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut terapiji anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; i b) sastavljanje izveštaja sa rezultatima određivanja. Izveštaj će uključivati još i jedno ili oba od: količine nevezanog Tau u uzorku sa nivoom ukupnog tau u uzorku CSF ili ISF posle lečenja anti-tau antitelom; i količine ukupnog Tau u CSF ili ISF dobijenom od individue pre lečenja anti-eTau antitelom.
[0306] Izveštaj može uključivati, npr., indikaciju da li individua ispoljava klinički koristan odgovor na lečenje tauopatije; indikaciju da li doze anti-eTau antitela treba da se održe, povećaju ili smanje; i slično.
[0307] Prema tome, izveštaj može uključiti informacije kao što su: preporuka u vezi sa daljom evaluacijom; preporuka u vezi sa terapijskim lekom i/ili drugom intervencijom u pogledu upravljanja zdravstvenim stanjem; preporuka za povećanje doze anti-eTau antitela; preporuka za održavanje doze anti-eTau antitela; preporuka za smanjenje doze anti-eTau antitela; i slično.
[0308] Na primer, metodi objavljeni u ovom tekstu mogu uključivati još i korak sastavljanja ili izdavanja izveštaja, koji sadrži rezultate procene subjekta, ovaj izveštaj može biti dat u vidu elektronskog medijuma (npr., elektronski displej na kompjuterskom monitoru), ili u vidu opipljivog medijuma (npr., izveštaj odštampan na papiru ili drugom opipljivom medijumu). Osoba ili entitet koji priprema izveštaj ("stvaralac izveštaja") može izvesti i korake kao što su prikupljanje uzoraka, obrada uzoraka, i slično. Alternativno, entitet različit od stvaraoca izveštaja može izvesti korake kao što su prikupljanje uzoraka, obrada uzoraka, i slično. Izveštaj o proceni rizika može biti dat korisniku. "Korisnik" može biti zaposleni u zdravstvu (npr., kliničar, laboratorijski tehničar, ili lekar).
Smernice za upravljanje zdravstvenim stanjem
[0309] U nekim slučajevima predmetni metod uključuje a) određivanje količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo u zorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut lečenu anti-eTau antitelom, kako je opisano gore; i na osnovu određene količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo, sastavljanje izveštaja i/ili usmeravanje terapije ili vođenja individue od koje je dobijen biološki uzorak.
[0310] U nekim slučajevima, predmetni metod uključuje a) određivanje količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut lečenju anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; i na osnovu određene količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo, održavanje doze anti-eTau antitela koja se primenjuje kod subjekta. U nekim slučajevima, predmetni metod uključuje a) određivanje količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut lečenju anti-eTau antitelom, kako je gore opisano; i na osnovu određene količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo, povećanje anti-eTau antitela koja se primenjuje kod subjekta. U nekim slučajevima, predmetni metod uključuje a) određivanje količine eTau nevezanog za anti-eTau antitelo u uzorku CSF ili ISF dobijenom od subjekta koji je podvrgnut lečenju anti-
4
eTau antitelom, kako je gore opisano; i na osnovu određene količine eTau nevezanog za antieTau antitelo, smanjenje anti-eTau antitela koja se primenjuje kod subjekta.
PRIMERI
[0311] Primeri koji slede izneti su da bi prosečno obučenim stručnjacima u oblasti pružili potpuno objavljivanje i opis kako napraviti i upotrebiti predmetni pronalazak, i nemaju za cilj ograničavanje obima onoga što pronalazači smatraju svojim pronalaskom, niti predstavljanje da su eksperimenti u prokazani u nastavku svi ili jedini koji su bili izvođeni. Uložen je trud se osigura tačnost u pogledu upotrebljenih brojeva (npr. količine, temperatura, itd.), ali treba imati u vidu i neke eksperimentalne greške i devijacije. Ukoliko nije drugačije navedeno, delovi su delovi po težini, molekularna težina je prosečna molekularna težina molekula, temperatura je u Celsiusovim stepenima i pritisak je atmosferski ili blizu atmosferskog. Mogu se koristiti standardne skraćenice, npr., bp, bazni par; kb, kilobaza; pl, pikolitar; s ili sec, sekund; min, minut; h hr, sat; aa, amino-kiselina; kb, kilobaza; bp, bazni par; nt, nukleotid; i.m., intramuskularno; i.p., intraperitonealno; s.c., supkutano; i slično.
Primer 1: Kloniranje i sekvenciranje VH i VL regiona IPN001 i IPN002
[0312] Određene su aminokiselinske sekvence VH i VL regiona IPN001 antitela (označenog u ovom tekstu i kao "IPN1" ili "IPN-1") i IPN002 antitela (označenog u ovom tekstu i kao "IPN2" ili "IPN-2"). Aminokiselinske sekvence VH i VL regiona IPN001 prikazane su na Slikama 1A, odnosno 1B. Aminokiselinske sekvence VH i VL regiona IPN002 prikazane su na Slikama 2A odnosno 2B. CDR su prikazani masnim slovima i podvučeni su. CDR su određeni korišćenjem metoda po Kabat et al. (vidi Tabelu 1; i J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977); i Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of proteins of immunological interest" (1991)).
Primer 2: Elektrofiziološka analiza efekta anti-Tau antitela
MATERIJALI I METODI
[0313] Merenje fiksacije voltaže na mikropodručjima membrane cele ćelije - koritkalnih neurona poreklom iz indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC), gajenih na monosloju normalnih humanih astrocita izvedeno je korišćenjem odgovarajuće mikropipete (2-5 MOhm) napunjene rastvorom koji sadrži (mM): K-metil-sulfat (140), NaCl (10), CaCl2(1), Mg-ATP (3); Na-GTP (0.4), EGTA (0.2), HEPES (10), fosfokreatin sa prilagođenim pH = 7.3 i mOsm = 300. Neuroni su perfundovani (2 ml/min) veštačkom cerebrospinalnom tečnošću koja sadrži (mM): NaCl (140), KCl (2.5), MgCl2(2) CaCl2(2), Hepes (10), D-glukozu (10), saharozu (20). Prilagođeni pH= 7.4 mOsm = 310. Beleženje podataka izvršeno je korišćenjem pClamp-10.3 softvera za prikupljanje podataka (Molecular Devices) i MultiClamp 700B amplifikatora (Axon Instrument; Foster City CA). AD tau i AD Tau pre-inkubiran sa IPN001 ili IPN002 (2 h na sobnoj temperaturi ili 24-h na 4 stepena C pri težinskom odnosu 10:1) naneti su MinisQuirt mikroperfuzionim sistemom (AutoMate, Berkeley, CA). Analiza podataka izvršena je "oflajn" korišćenjem Clampfit 10.2 analitičkog softvera (Molecular Devices). Sva merenja izvršena su na sobnoj temperaturi.
REZULTATI
[0314] Podaci su prikazani na Slikama 3A-D.
[0315] Primena AD-Tau (6 µg/ml) izaziva depolarizaciju membrane kortikalnog neurona (A, B, i C). Preinkubiranje AD-Tau (6 µg/ml) sa IPN001 (60 µg/ml) (A) ili IPN002 (60 µg/ml) (B) tokom >2 h smanjuje AD-Tau posredovanu depolarizaciju membrane. C. Preinkubiranje AD-Tau (6 µg/ml) sa mišjim IgG (60 µg/ml) nije smanjilo AD-Tau posredovanu depolarizaciju membrane u kortikalnim neuronima. D. Podaci zbirno pokazuju da IPN001 i IPN002 značajno smanjuju AD-Tau posredovanu depolarizaciju membrane (parni t-test * p<0.037; * p < 0.009, p < 0.003).
Primer 3: Imunoreaktivnost IPN001 i IPN002 sa Tau u CSF pacijenata obolelih od AD [0316] Cerebrospinalna tečnost (CSF) je prikupljena od 10 zdravih donora (1 ml od svakog). CSF je takođe prikupljen 10 pacijenata obolelih od Alzheimerove bolesti (AD) (1 ml od svakog). Alikvoti pulova CSF ostavljeni su za ELISA analizu.10 ml kondicioniranog medijuma koritkalnih neurona diferenciranih 315 dana iz Downovih indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC), iPSC linija (8941.1), upotrebljeno je kao kontrola za CSF afinitetnu izolaciju i alikvot je sačuvan takođe za ELISA analizu. Za određivanje da li CSF sadrži IPN002-reaktivni Tau, svaki od CSF pulovanih uzoraka i kondicioniranog medijuma prethodno se prečisti na IgG1-kuplovanoj smoli i zatim pusti preko IPN001-kuplovane smoli. IPN001 smole se dobro isperu slanim rastvorom puferisanim fosfatom (phosphate buffered saline, PBS) i vezani proteini se eluiraju 50 mM glicinom, 150 mM NaCl, pH 2.3 i neutralizuju pomoću 1M Tris, pH 8.3 posle eluiranja. Eluirani proteini se koncentruju na YM10 koncentratorima i dodaju puferu za uzorak za elektroforezu na natrijum dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE) i analizu metodom Western blot.
[0317] Za određivanje da li IPN002 reaguje sa nekom formom Tau u CSF, Western blotovi IPN002 eluiranog proteina testiraju se korišćenjem IPN001, Santa Cruz Tau H-150 (aa1-150) i Dako Tau #A0024 antitelom koje reaguje sa C-terminusima (aa#243-441) Tau. Podaci su prikazani na Slikama 4A-C.
[0318] Western blotovi su pokazali IPN001- (Slika 4a) i Tau H-150 (Slika 4b)-imunoreaktivne trake prisutne u IPN002 afinitetno prečišćenom proteinu iz zdravih i AD CSF koje su odgovarale rasponu molekularne težine od ∼25 kd do 37 kd. Ovi Tau fragmenti bili su slični po veličini, ali ne i po relativnoj zastupljneosti, eTau fragmentima izolovanim iz kondicioniranog medijuma Downove linije. Dako C-terminalno tau antitelo (Slika 4c) nije detektovalo nijednu reaktivnu vrstu iz IPN002 afinitetne izolacije ni iz CSF ni iz kondicioniranog medijuma. Tau pune dužine nije detektovan nijednim od Tau antitela iz IPN002 afinitetne izolacije. Zbog toga što su IPN002 afinitetno izolovani proteini bili reaktivni sa IPN001 i IPN002 na Western blotu, zaključeno je da je Tau u CSF takođe IPN001-reaktivan.
[0319] CSF i kondicionirani medijum, pušteni preko IPN002 afinitnih smolam zatim su redom nanošeni i eluirani sa T46 (Tau #428-441) i HT7 (Tau #159-163) da bi se odredilo da li je bilo C-terminalnih ili središnjih tau fragmenata koji nisu izolovani korišćenjem IPN002. Eluati su testirani Dakovim C-terminalnim antitelom (Slika 4c), ali imunoreaktivnost nije detektovana. Ovi podaci sugerišu da je IPN001 i IPN002 imunoreaktivni tau zastupljeniji od fragmenata pune dužine, središnjeg regiona ili C-terminalnih tau fragmenata.
[0320] Alikvoti propuštanog materijala iz svakog od CSF i kondicioniranog medijuma bili su sačuvani za upoređivanje pre- u odnosu na postizolaciju, da bi se odredilo da li je sav detektabilan tau uklonjen tokom izolacije, korišćenjem komercijalno dostupnog kita koji se obično koristi za određivanje nivoa Tau u CSF. Podaci su prikazani na Slici 5. Ova analiza pokazuje da je tokom procesa izolovanja na osnovu afiniteta sav detektabilni tau bio uklonjen iz post-CSF uzoraka.
[0321] Ovi podaci daju jak dokaz da i IPN001 i IPN002 reaguju sa glavnim tau vrstama prisutnim u CSF iz zdravih ljudi i pacijenata obolelih od AD.
Primer 4: Detektovanje eTau u uzorcima dobijenim od pacijenata
MATERIJALI I METODI
Sakupljanje kondicioniranog medijuma iz kortikalnih neurona izvedenih iz iPSC [0322] iPSC (indukovane pluripotentne matične ćelije) dobijene su iz zdravih kontrola odgovarajuće starosti i pacijenata obolelih od Alzheimerove bolesti, korišćenjem Yamanaka metoda (Takahashi et al. (2007) Cell 131(5), 861), kako je opisano u Dimos et al. (2008) Science 321:1218. iPSC su diferencirane u kortikalne neurone uglavnom u skladu sa objavljenim protokolima, korišćenjem dvojnog SMAD metoda na monosloju (Chambers et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:275) praćenog diferencijacijom kortikalnih neurona slično kao što je opisano u Shi et al. (2012) Nat. Neurosci. 15:477). Kortikalni neuroni izvedeni iz iPSC (iPSC-CN), kultivisani 108 dana, isperu se, doda im se sveži medijum, i kondicionirani medijum se sakupi posle tri dana, ukoliko nije drugačije naznačeno. Iz linija se izvede veći broj diferenciranja da bi se osigurala reproducibilnost nivoa eTau. Kondicionirani medijum se centrifugira na 15000 rpm, 15 minuta pre obrade za Western blot ili tau-ELISA. Za eksperiment sa brefeldinom A, iPSC-CN kulture se isperu korišćenjem PBS pre dodavanja svežeg medijuma sa ili bez 1 µM brefeldina A i medijum se kondicionira jedan sat pre sakupljanja.
Sakupljanje kondicioniranog medijuma humanih primarnih kortikalnih neurona [0323] Kulture humanih kortikalnih neurona (HCC) pripremljene su kako je opisano u Wright et al. (2007) Neurobiol. Aging 28:226. Ukratko, tkivo cerebralnog korteksa humanog fetusa dobijeno je od Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA) u skladu sa saveznim smernicama za istraživanja na tkivima fetusa i Zakonom o zaveštanju organa. Tkivo je isprano u Hankovom puferisanom slanom rastvoru (Cellgro) i triturisano u prisustvu 1 µg/ml DNaze (EMD) i sprovedeno kroz 100 µm-sko ćelijsko sito. Posle centrifugiranja, pelet je resuspendovan u 0.05% tripsin/EDTA (Invitrogen) 20 min na 37°C. Tripsin je inaktiviran dodavanjem jednake zapremine medijuma koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (fetal bovine serum, FBS) i uzorak je pažljivo ponovo triturisan u prisustvu DNaze. Posle centrifugiranja ćelije su resuspendovane u medijumu za zasejavanje (Neurobasal sa B27, Invitrogen) i brojane. Ćelije su zasejane na ploče ili na pokrovna stakalca obložena poli-d-lizinom sa lamininom. Tri nedelje stare HCC su isprane, dodat je sveži medijum i medijum je sakupljen posle tri dana kondicioniranja. Kondicionirani medijum se centrifugira na 15000 rpm 15 minuta pre obrade za Western blot.
Sakupljanje ISF P301L miševa i CSF ljudi
[0324] Miševi se anesteziraju izofluranom (2%, 800 mL/min O2). Bupivakain/epinefrin se upotrebljavaju za lokalnu analgeziju, a finadin ili karprofen za peri-/postoperativnu analgeziju. Životinje se stave u stereotaksički ram (Kopf instrumenti, USA). "Push-pull" probe za mikrodijalizu (fosfatidil etanolaminska (phosphatidyl ethanolamine, PEE) membrana, Brainlink, the Netherlands) insertuju se u hipokampus (3 mm izložena površina). Mikrodijalizno uzorkovanje izvodi se 24 i 48 sati posle operacije. Na dane uzorkovanja, probe životinja spoje se fluorinisanim etilen propilen (fluorinated ethylene propylene, FEP) cevčicama sa mikroperfuzionom pumpom (Harvard PHD 2000 Syringe pump, Holliston, MA ili slično). Mikrodijalizne probe se perfunduju veštačkim CSF (aCSF) koji sadrži 147 mM NaCl, 3.0 mM KCl, 1.2 mM CaCl2i 1.2 mM MgCl2, i 0.15% goveđi serum albumin (bovine serum albumin, BSA) pri stopi protoka od 0.75 µL/min. Mikrodijalizni uzorci se sakupljaju u periodima od 60 minuta. Posle perioda stabilizacije, sakupe se bazalni uzorci. Drugog dana uzorkovanja, gornja procedura se ponovi (Brains Online). Intersticijalna tečnost (ISF) se centrifugira na 15000 rpm 15 minuta i iprečišćeni supernatanti se koriste za eTau Western blotove.
[0325] 10 ml CSF (Precision Med) iz pula od 10 zdravih (Precision Med), 10 AD pacijenata (Precision Med) i 10 PSP pacijenata su sakupljeni, centrifugirani na 15000 rpm, 15 minuta, supernatanti prethodno prečišćeni na IgG-afinitetnoj smoli, posle čega sledi izolacija tau na IPN002 anti-tau afinitetnoj smoli, ispiranje, eluiranje sa 50 mM glicinom, pH 2.3 sa 150 mM NaCl u epruveti koja sadrži 1M TBS, pH 8.3 da se neutralizuje pH, koncentrisanje na YM10 filterima i pripremanje za tau-Western blotove. iPSC-CN kondicionirani medijum iz fAD PSEN1 pacijenta izoluje se na sličan način kao pozitivna kontrola da bi se uporedili obrasci traka.
Western blotovi
[0326] Kondicionirani medijumi se razblaže u Laemmli puferu (Sigma). Kultivisani neuroni se isperu u PBS pre nego što se inkubiraju u 0.05% tripsinu u DMEM (Invitrogen), isperu i liziraju u Laemmli puferu. Svi uzorci se dovedu do ključanja, razdvoje na tris-glicin poliakrilamidnim gelovima (Invitrogen) i prenesu na nitrocelulozne membrane korišćenjem iBlot (Invitrogen). Membrane se inkubiraju u blokirajućem puferu (LiCor), testiraju 0.5 µg/ml IPN001 antitelom na tau i antitelom na β-aktin (1:2000; Abcam) u blokirajućem puferu koji sadrži 0.1% Tween-20, i antimišje 680 i antizečje 800 sekundarno antitelo (LiCor). Blotovi se skeniraju upotrebom Odyssey SA infrared sistema za dobijanje slike i analiziraju Odyssey SA softverom (LiCor).
Tau ELISA
[0327] Medijumi iz kultura iPSC-izvedenih kortikalnih neurona se sakupe posle trodnevnog perioda kondicioniranja i testiraju koriščenjem Alphascreen homogenog testa za merenje tau.
10 µg/ml anti-tau AlphaLISA akceptorskih perlica i 1nM biotinisano-anti-tau antitelo pomešaju se sa kondicioniranim medijumom preko noći na sobnoj temperaturi. Doda se 40 µg/ml streptavidin-donorskih perlica (Perkin Elmer), 30 minuta na sobnoj temperaturi i ploča se očitava na Envision čitaču ploča.
Prečišćavanje eTau
[0328] Kondicionirani medijumi sakupljeni iz iPSC-CN od AD pacijenata centrifugiraju se na 15000 rpm 15 minuta, supernatanti se sakupe i prečiste na IgG afinitetnoj smoli. Prečišćeni supernatant se propusti kroz smolu sa IPN002 anti-tau antitelom, ispere i eTau eluira 50 mM natrijum citratom, pH 2.3 sa 150 mM NaCl u epruvetu koja sadrži 1M TBS, pH 8.3 za neutralizovanje pH. Eluat se koncentruje i pufer zameni u PBS.
Imunofluorescencija
[0329] MCC se isperu u PBS, fiksiraju u 4% paraformaldehidu, blokiraju 10% normalnim magarećim serumom (Jackson ImmunoResearch) u PBS, permeabilizuju (ukoliko nije drugačije opisano) korišćenjem 0.2% Triton-x-100 u PBS 15 minuta, i boje korišćenjem IPN001 antitela na tau, magarećim antimišjim-A488 sekundarnim antitelom (Molecular Probes) i DAPI (Invitrogen). Slike se dobijaju Leica DMI 600 B mikroskopom na 40x, uz korišćenje LAS AF softvera (Leica). Konfokalne slike dobijaju se korišćenjem Nikon Eclipse Ti konfokalnog mikroskopa (Nikon).
REZULTATI
[0330] Vrše se testovi za detektovanje eTau fragmenata u različitim tečnostima. Rezultati su prikazani na Slici 7. Kako je prikazano na Slici 7, leva tabla, endogeni tau se sekretuje iz kortikalnih neurona izvedenih iz humanih indukovanih pluripotentnih matičnih ćelija (iPSC-CN), pri čemu se sekretovani Tau označava kao vanćelijski Tau ili "eTau." Kako je prikazano na Slici 7, drugi panel sleva, eTau je prisutan i u kondicioniranom medijumu iz humanih primarnih neurona ("HCC"), što potvrđuje da eTau nije artefakt iPSC-diferencijacije. Ovi eTau fragmenti se detektuju i u lizatima neurona, što sugeriše da se tau seče unutar neurona pre sekretovanja eTau.
[0331] Kako je prikazano na Slici 7, srednja tabla, slični tau fragmenti detektovani su i u intersticijalnoj tečnosti (ISF) iz P301L tau miševa, pri čemu tau pune dužine nije detektovan ni u jednom sistemu. P301L miševi su transgeni za formu humanog tau sa P301L mutacijom; P301L miševi su modeli za humanu tauopatiju. Vidi, npr., Götz et al. (2001) J. Biol. Chem.
276:529; i Lewis et al. (2000) Nature Genetics 25:402.
[0332] Kako je prikazano na Slici 7, desna tabla, nivoi eTau su povišeni u CSF iz AD pacijenata, i u više linija iz pacijenata obolelih od familijarne AD (fAD), u poređenju sa linijama iz zdravih osoba. Kako je prikazano na Slici 7, desna tabla, eTau je detektovan i u CSF iz PSP pacijenata.
Primer 5: eTau indukuje hiperaktivnost neurona
METODI
[0333] Merenje fiksacije voltaže na mikropodručjima membrane cele ćelije - iPSC-CN gajenih na monosloju normalnih humanih astrocita korišćenjem mikropipete (2-5 MOhm) napunjene rastvorom koji sadrži (mM): K-metil-sulfat (140), NaCl (10), CaCl2(1), Mg-ATP (3); Na-GTP (0.4), EGTA (0.2), HEPES (10), fosfokreatin (10) sa prilagođenim pH = 7.3 i mOsm = 305. Neuroni su perfundovani (2 ml/min) veštačkom cerebrospinalnom tečnošću koja sadrži (mM): NaCl (140), KCl (2.5), MgCl2(2) CaCl2(2), Hepes (10), D-glukozu (10), saharozu (20), prilagođeni pH= 7.4 mOsm = 310. Beleženje podataka vršeno je korišćenjem pClamp-10.3 softvera za prikupljanje podataka (Molecular Devices) i MultiClamp 700B amplifikatora (Axon Instrument; Foster City CA). "Puff" nanošenje eTau, ili eTau sa inhibitorima, tetrodotoksinom (tetrodotoxin, TTX) (Tocris), MK801 (Sigma), NBQX (Tocris), ili anti-tau antitelom, IPN001, izvodi se korišćenjem MiniSquirt mikroperfuzionog sistema (AutoMate, Berkeley, CA).
"Oflajn" analiza podataka vrši se korišćenjem Clampfit 10.2 analitičkog softvera (Molecular Devices). Sva merenja su izvedena na 34-37°C.
REZULTATI
[0334] Da bi se odredilo da li eTau može da izmeni funkciju neurona, prečišćeni eTau fragment nanosi se na iPSC-CN ili HCC. Rezultati su prikazani na Slikama 8A-C.
[0335] Kako je pokazano na Slici 8A, dodavanjem mešavine prečišćenog eTau fragmenta ovim neuronima pokreće se njihova hiperaktivnost. Kako je pokazano na Slici 8B, hiperaktivnost indukovana eTau mešavinom inhibira se tetrodotoksinom (TTX) i NMDA i AMPA glutamatreceptorskim antagonistima, MK801, odnosno NBQX. TTX blokira akcione potencijale u nervima vezivanjem za voltažno-zavisne, brze natrijumske kanale u membrani nervnih ćelija. Ovi podaci sugerišu da eTau-indukovana neuronska hiperaktivnost zavisi od oslobađanja glutamata posredovanog akcionim potencijalom. Nasuprot tome, kako je pokazano na srednjoj tabli Slike 8A, nanošenje tau pune dužine ne proizvodi detektabilne promene neuronske aktivnosti čak ni u bitno višim koncentracijama, što pokazuje da eTau-indukovana hiperaktivnost zavisi od tau fragmenata. Ovi rezultati o eTau-indukovanoj hiperaktivnosti snažno sugerišu da u neuronima može doći do mobilizacije kalcijuma. Da bi se odredilo da li u neuronima dolazi do mobilizacije kalcijuma, ispitivan je efekat eTau na mobilizaciju kalcijuma. Kako je pokazano na Slici 8C, eTau-1a robusno mobiliše kalcijum. Ovaj tip neuronske hiperaktivnosti, ako je hroničan kao u AD, može rezultovati disfunkcijom neurona preko ometene sinaptičke transmisije i aberantne stimulacije neurona. eTau-1a uključuje aminokiseline 2-166 fetalnog tau, tj., amino-kiseline 2-166 SEQ ID NO:27.
Primer 6: Anti-tau antitelo smanjuje eTau-posredovanu hiperaktivnost neurona
[0336] Elektrofiziološke analize izvedene su kako je opisano u Primeru 5. Ispitivan je efekat IPN001 i IPN002 na e-Tau-posredovanu hiperaktivnost neurona.
[0337] Kako je pokazano na Slici 8D, IPN001 smanjuje eTau-posredovanu hiperaktivnost neurona. Kako je pokazano na Slici 19B, IPN002 smanjuje eTau-posredovanu hiperaktivnost neurona.
Primer 7: Humanizovana anti-Tau antitela
[0338] Pripremljene su humanizovane varijante IPN002. Aminokiselinske sekvence VH domena teškog lanca humanizovanih varijanti 1-4, i nukleotidne sekvence koje kodiraju VH domen teškog lanca humanizovanih varijanti, prikazani su na Slikama 9-12. Aminokiselinske sekvence VL domena lakog lanca humanizovanih varijanti 1-4, i nukleotidne sekvence koje kodiraju VL domen lakog lanca humanizovanih varijanti, prikazani su na Slikama 3-16.
1
Aminokiselinske razlike u odnosu na aminokiselinsku sekvencu IPN002 zbirno su prikazane u Tabelama 4 i 5.
Tabela 4: VH varijante
Tabela 5: Vk varijante
2
[0339] Jednoslovne šifre amino-kiselina su sledeće:
G - Glicin (Gly)
P - Prolin (Pro)
A - Alanin (Ala)
V - Valin (Val)
L - Leucin (Leu)
I - Izoleucin (Ile)
M - Metionin (Met)
C - Cistein (Cys)
F - Fenilalanin (Phe)
Y - Tirozin (Tyr)
W - Triptofan (Trp)
H - Histidin (His)
K - Lizin (Lys)
R - Arginin (Arg)
Q - Glutamin (Gln)
N - Asparagin (Asn)
E - Glutaminska kiselina (Glu)
D - Asparaginska kiselina (Asp)
S - Serin (Ser)
T - Treonin (Thr)
Primer 8: Karakterizacija humanizovanih IPN002 varijanti
[0340] Relativni vezujući afiniteti tau za vezivanje sa svakim od rekombinantnih tau (rekombinantni tau od 383 amino-kiseline) kao i za eTau 1a, eTau 1b, eTau2, eTau3 i eTau4 za svaku od 16 kombinacija VH#1-4 sa Vk#1-4 antitela, prikazane su u Tabeli 4, koja je predstavljena ma Slici 17. Relativni vezujući afiniteti za svaku tau i eTau vrstu u rasponu su od 121 pM do 1030 pM za svaki od VH/Vk kombinacija antitela. eTau 1a uključuje amino-kiseline 2-166 fetalnog tau, tj., amino-kiseline 2-166 SEQ ID NO:27; i eTau 1b uključuje amino-kiseline 2-196 i 217-228 fetalnog tau, tj., amino-kiseline 2-196 i 217-228 SEQ ID NO:27. Aminokiselinske sekvence eTau3 i eTau 4 prikazane su na Slici 20.
[0341] Da bi se dobili apsolutni afiniteti, kao i Koni Kdisza ova VH/Vk humana antitela, izvedena je Octet analiza korišćenjem tau (rekombinantni tau od 383 amino-kiseline). KDsu bile u rasponu od 42.6 pM do 2120 pM. Za sve VH/Vk varijante, Konvrednosti bile su visoke, a Kdisvrednosti bile su niske za Tau i za svaku eTau vrstu. Podaci su dati u Tabeli 5, koja je prikazana na Slici 18.
[0342] Podgrupa gore opisanih humanizovanih IPN002 varijanti testirana je u dodatnoj analizi. Kako je pokazano na Slici 19A, tri varijante, VH2/Vk1, VH2/Vk2, i VH2/Vk3, korišćene su u testu metodom Western blot sa različitim uzorcima koji sadrže tau. Uzorci koji sadrže tau uključivali su iPSC-CN kondicionirani medijum; iPSC-CN lizate; lizate AD mozga; i lizate moždanog korteksa P301L tau miševa; i lizate mozga majmuna cinomolgusa. Podaci pokazuju da goreopisane humanizovane IPN002 varijante reaguju sa tau u različitim uzorcima.
[0343] Podgrupa gore opisanih humanizovanih IPN002 varijanti testirana je u pogledu sposobnosti smanjivanja eTau-indukovane hiperaktivnosti neurona. Kako je pokazano na Slici 19B, roditeljski IPN002, i varijante VH2/Vk1, VH2/Vk2, i VH2/Vk3 blokiraju eTauindukovanu hiperaktivnost.
Primer 9: Testiranje imunogenosti humanizovanih IPN002 varijanti
[0344] Procenjuje se imunogeni potencijal humanizovanog anti-tau antitela. Koristi se EpiScreen™ test. Vidi, npr., Jones et al. (2004) J. Interferon Cytokine Res. 24:560; i Jones et al. (2005) J. Thromb. Haemost. 3:991. Vremenski tok testa T ćelija izveden je korišćenjem CD8<+>-depletovanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC); proliferacija T ćelija merena je inkorporisanjem [<3>H]-timidina u različitim vremenskim tačkama, posle dodavanja uzoraka testnih antitela.
[0345] PBMC su izolovane iz sloja istaloženih leukocita i trombocita ("buffy coat") zdravih donora (npr., iz krvi uzete manje od 24 sata od testiranja). Odgovori T ćelija na testno antitelo (npr., humanizovana IPN002 varijanta) upoređuju se sa kliničkim standardnim antitelom.
[0346] Prečišćeno testno antitelo (varijanta humanizovanog IPN002) doda se PBMC kulturama in vitro u finalnoj koncentraciji u medijumu kulture od 50 µg/ml, da bi se dobio testni uzorak. Kliničko kontrolno antitelo (pozitivna kontrola), i kontrola samo sa medijumom za kulturu (nestimulisana kontrola), uključeni su kao kontrolni uzorci. Testni uzorci (PBMC plus testno antitelo), i kontrolni uzorci, inkubirani su 8 dana na 37°C sa 5% CO2. Na dane 5, 6, 7, i 7, ćelije u testnim i kontrolnim uzorcima suspenduju se i prenesu u bunarčiće ploče za kulturu sa većim brojem bunarčića. Testnim i kontrolnim uzorcima se ponudi 0.75 µCi [<3>H]-timidin i inkubiraju se narednih 18 sati pre nego što se sakupe na filtere. Određivan je broj signala u minutu (counts per minute, cpm) za svaki bunarčić, pomoću scintilacionog brojača.
4
[0347] Za testove proliferacije, korišćen je prag vrednosti SI jednak ili veći od 2, pri čemu su uzorci koji su indukovali proliferativni odgovor iznad ovog praga smatrani za pozitivne. SI (stimulacioni indeks) je srednja vrednost testnog uzorka podeljena srednjom vrednošću za nestimulisanu kontrolu.
[0348] Podaci su prikazani na Slikama 21A-C. Proliferativni odgovori T ćelija zdravih donora na humanizovano IPN002 testno antitelo. Uzorkovane su PBMC iz velikih kultura i procenjivana je njihova proliferacija na dane 5, 6, 7, i 8 posle inkubacije sa testnim uzorcima. Proliferacioni odgovori sa SI ≥ 2.0 (p < 0.05), naznačeni isprekidanom horizontalnom linijom, koji su bili značajni (p < 0.05) po neparnom dvouzoračkom Studentovom t-testu smatrani su za pozitivne.
[0349] Kako je prikazano na Slici 21A, testno potpuno humanizovanog IPN002 antitelo imalo je nizak imunogeni potencijal (ispod vrednosti praga za SI od 2.0). Slika 21B prikazuje rezultate dobijene za referentno himerno antitelo, pri čemu referentno himerno antitelo ima IPN002 mišje teško- i lakolančane varijabilne regione i humani IgG4 konstantni region; i Slika 21C prikazuje rezultate sa imunogenim kliničkim kontrolnim humanizovanim A33 antitelom.
Primer 10: IPN002 smanjuje nivo fosforilisanog Tau in vivo
[0350] Ispitivan je efekat primene IPN002 na nivo Tau koji je fosforilisan na amino-kiselinama 202 i 205.
[0351] Korišćen je model P301L miševa. P301L miševi su transgeni za formu humanog tau sa mutacijom P301L; P301L miševi su modeli humane tauopatije. Vidi, npr., Götz et al. (2001) J. Biol. Chem.276:529.
[0352] P301L miševi (stari 3-4 meseca) tretirani su: 1) kontrolnim IgG; 2) PHF1 antifosoforilisani Tau-antitelom; ili 3) IPN002. IgG kontrolna i IPN002 antitela injektirana su intraperitonealno u koncentraciji od 10 mg/kg tokom 4 nedelje; zatim u koncentraciji od 20 mg/kg još 4 nedelje. PHF1 je primenjivano u koncentraciji od 10 mg/kg tokom svih 8 nedelja. Na dan 60 od početka tretmana antitelom, meren je nivo fosforilisanog Tau u hipokampusu. Rezultati su prikazani na Slici 22.
[0353] Tau koji je forforilisan na amino-kiselinama 202 i 205 označen je kao "AT8". Kako je pokazano na Slici 22, tretman IPN002 rezultovao je statistički značajnim smanjenjem nerastvorljivog fosfo-Tau (AT8), kako je procenjeno korišćenjem ELISA (leva tabla), i trendom smanjenja, kako je procenjeno Western blot analizom (desna tabla), u poređenju sa tretmanom kontrolnim IgG. PHF1-tretman pokazao je trend smanjenja nerastvorljivog AT8, što je bilo u skladu sa nalazima Chai et al. ((2011) J. Biol. Chem.286:34457) i Boutajangout et al. ((2011) J. Neurochem.118:658).
Primer 11: IPN002 snižava nivoe slobodnog tau u ISF i CSF
[0354] Određivan je efekat primene IPN002 na nivoe slobodnog tau u CSF i intersticijalnoj tečnosti (ISF). P301L miševi tretirani su kako je opisano u Primeru 10. Nivo slobodnog tau prisutnog u ISF, koji nije vezan za IPN002 određivan je korišćenjem IPN001. Kako je pokazano na Slici 23, IPN002-tretman snizio je nivoe slobodnog Tau (nevezanog za IPN002) (leva tabla) u ISF kod P301L miševa tretiranih korišćenjem IPN002.
[0355] Da bi se odredilo da li IPN002 snižava nivoe slobodnog Tau u CSF u istoj meri kao u ISF, P301L miševi tretirani su kako je opisano u Primeru 10, i određivan je efekat IPN002 tretmana na nivo slobodnog tau (nevezanog za IPN002) u CSF tretiranih miševa. Rezultati su prikazani na Slici 24.
[0356] Na levoj tabli Slike 24, prikazani su nivoi slobodnog tau (nevezanog za IPN002; označen kao "slobodni tau (IPN002)") u CSF netretiranih, kontrolnim IgG-tretiranih, PHF1-tretiranih, i IPN002-tretiranih miševa. Kako je pokazano na desnoj tabli Slike 24, nivoi slobodnog tau u CSF uporedivi su sa nivoima slobodnog tau u ISF IPN002-tretiranih miševa, što pokazuje da je ISF tau analiza u dobroj korelaciji sa klinički relevantnijim materijalom, CSF.
Primer 12: Anti-tau antitelo snižava eTau-posredovanu hiperaktivnost neurona
[0357] Elektrofiziološka analiza izvedena je kako je opisano u Primeru 5. Procenjivan je efekat IPN002 na e-Tau-indukovanu hiperaktivnost neurona.
[0358] Kako je prikazano na Slici 25, IPN002 snižava eTau-posredovanu hiperaktivnost neurona.
Primer 13: Tau fragmenti su prisutni u CSF dobijenoj od individua sa verovatnom hroničnom traumatskom encefalopatijom (chronic traumatic encephalopathy, CTE)
[0359] Uzorci CSF dobijeni su od nekadašnjeg igrača Nacionalne fudbalske lige, koji ispoljava ponašajno-kognitivne deficite, i za kojeg se smatra da verovatno ima CTE. Uzorci CSF ispitivani su na prisustvo eTau fragmenata. eTau fragmenti bili su izolovani na osnovu afiniteta iz pulovanih uzoraka CSF zdravih individua i individua sa verovatnom CTE. Izolovani eTau fragmenti su razdvojeni korišćenjem elektroforeze na poliakrilamidnom gelu; i razdvojeni fragmenti su preneti na membranu. Membrana je testirana nanošenjem IPN001. Rezultati, prikazani na Slici 26, pokazuju da su Tau fragmenti prisutni u CSF dobijenoj od osoba sa verovatnom CTE.
Primer 14: Vezivanje humanizovane varijante IPN002 za sintetske Tau peptide
[0360] Vezivanje humanizovane varijante IPN002 ("hu-IPN002") za sintetski biotinisani Tau peptid 1 i 2 testirano je testovima na čvrstoj fazi i u rastvoru.
[0361] Aminokiselinske sekvence peptida 1 i peptida 2 su sledeće:
Peptid 1 (Tau amino-kiseline 13-24): DHAGTYGLGDRK (SEQ ID NO:49);
Peptid 2 (Tau amino-kiseline 15-44):
AGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLK (SEQ ID NO:50).
[0362] Antitelo ili biotinisani peptid razblaži se u slanom rastvoru koji je puferisan fosfatom. Finalne koncentracije bile su: 1 µg/ml hu-IPN002; 1 µg/ml rTau383 (rekombinantni Tau pune dužine); 5 µg/ml (biotinisani peptid 1); i 5 µg/ml (biotinisani peptid 2).100 µl 0.1% kazeina u PBS doda se u bunarčiće ploče sa većim brojem bunarčića. Doda se 150 µl rastvora 1 µg/ml hu-IPN002. Naprave se serijska razblaženja. U bunarčiće se doda 100 µl biotin-peptida u bunarčiće koji sadrže serijski razblaženo antitelo. Ploče sa većim brojem bunarčića se inkubiraju jedan sat na sobnoj temperaturi. Posle perioda inkubacije, bunarčići su isprani u 5 promena 0.05% rastvora Tween 20 u PBS; što je praćeno ispiranjem u 2 promene PBS.
[0363] Sekundarno antitelo konjugovano sa streptavidin-peroksidazom rena (streptavidin-horse radish peroxidase (HRP)) doda se u bunarčiće, i ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi 1 sat. Posle perioda inkubacije, bunarčići se isperu u 5 promena 0.05% rastvora Tween 20 u PBS; što je praćeno ispiranjem u 2 promene PBS.
[0364] Doda se HRP supstrat 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) i inkubira 1-15 minuta. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 100 µl 1 N sumporne kiseline. Očitava se apsorpcija na 450 nm.
[0365] Rezultati su prikazani na Slikama 27 i 28, i zbirno u Tabeli 6.
Tabela 6
[0366] Slika 29 prikazuje vezivanje hu-IPN002 za rekombinantni Tau pune dužine (rTau-383) i fosfataza-aktivirajući domen (phosphatase-activating domain PAD) peptid (tau amino-kiseline 2-28; AEPRQEFEVMEDHAGTY; SEQ ID NO:80). Kako je prikazano na Slici 29, hu-IPN002 ne vezuje se za PAD peptid.
[0367] Slika 30 prikazuje da nebiotinisani Tau peptid 1 (Tau amino-kiseline 13-24) i nebiotinisani peptid 2 (Tau amino-kiseline 15-44) kompetiraju sa biotinisanim formama Tau peptida 1 i Tau peptida 2 za vezivanje sa hu-IPN002. Ovi podaci pokazuju da je vezivanje Tau peptida 1 i Tau peptida 2 za hu-IPN002 specifično i ne dešava se usled dodavanja biotina.
Primer 15: In vivo efekat IPN002 na patologiju
[0368] U ovoj studiji, ispitivan je efekat terapijske intervencije na smanjenu mobilnost i Tau patologiju u modelu tauopatije na transgenim miševima (hTau.P301L-Tg). U ovim miševima, klinički mutant humanog Tau (P301L) eksprimira se pod kontrolom mišjeg Thy1 promotora (neuron-specifična ekspresija). Ponašanje (hod po gredi) se meri na 7, 8, 8.5 i 9 meseci starosti kao i dan pre završetka studije. Završne tačke studije uključivale su: (1) preživljavanje; (2) ponašanje: hod po gredi i ocena refleksa privlačenja zadnjih ekstremiteta; (3) biohemija: pan-Tau u ukupnom homogenatu, rastvorljivim i nerastvorljivim frakcijama moždanog stabla; i (4) biomarkeri: AT8 u ukupnom homogenatu i inerastvorljivim frakcijama moždanog stabla. MATERIJALI I METODI
[0369] P301L miševi (stari 3-4 meseca) tretiraju se na sledeći način: 1) kontrolni IgG; 2) PHF1 anti-fosforilisani Tau-antitelo; ili 3) IPN002. IgG kontrolno i IPN002 antitelo injektiraju se intraperitonealno u koncentraciji od 20 mg/kg jednom nedeljno tokom 6 meseci. PHF1 se primenjuje u koncentraciji od 10 mg/kg 6 meseci. PHF1 je mišje monoklonsko antitelo koje prepoznaje epitop koji uključuje fosfo-Ser<396>i fosfo-Ser<404>. Santacruz et al. (2005) Science 309:476.
Telesna težina i refleks privlačenja zadnjih ekstremiteta
[0370] Telesna težina se određuje nedeljno, tokom tretmana i pri žrtvovanju. Telesna težina i skor refleksa privlačenja zadnjih ekstremiteta beleže se nedeljno od početka studije do starosti od 7 meseci. Od starosti 7 meseci i dalje, miševi se prate dva puta nedeljno u pogledu pokretljivosti u kavezu, gubitka težine i prvih znakova privlačenja zadnjih i prednjih ekstremiteta. Kada se pojave znaci privlačenja ekstremiteta, telesna težina se određuje dnevno i ponašanje u vezi sa privlačenjem ekstremiteta ocenjuje se do momenta 'preranog žrtvovanja'. Da bi se ocenilo ponašanje u vezi sa privlačenjem ekstremiteta, miševi se drže približno 1.5 cm iznad baze repa, oko deset sekundi. Privlačenje ekstremiteta za svaki ekstremitet posebno, ocenjuje se korišćenjem četvorostepene skale. Preliminarno žrtvovani miševima se pripisuje maksimalni skor. Ocene za prednje ekstremitete prvenstveno se koriste kao dokaz koji podržava odluku o žrtvovanju. Ovo se obavlja pošto se zajedno zapaze privlačenje ekstremiteta, gubitak težine i kretanje u kavezu, kao i prema unapred definisanim kriterijumima. Ocene za levi i desni zadnji ekstremitet ujedinjuju se u jedan skor privlačenja ekstremiteta i koriste za evaluaciju privlačenja ekstremiteta tokom tretmana i procenu grupnih razlika na kraju studije. Miševi koji su prerano uginuli usled epilepsije, isključeni su iz analize. Statistička analiza se izvodi korišćenjem dvofaktorske ANOVA sa ponovljenim merenjima, praćene Bonferronijevim posthoc testiranjem, i korišćenjem Studentovog t-testa za srednje vrednosti grupa za poslednje skorove privlačenja ekstremiteta pre žrtvovanja, respektivno.
Hod po gredi
[0371] Test hoda po gredi izvodi se određivanjem bazalne vrednosti (grupa bazalne vrednosti) i na 7, 8, 8.5, i 9 meseci starosti, kao i jedan dan pre okončanja studije, na grupama tretmana, da bi se odredila motorna disfunkcija i motorno učenje. Sposobnost miša da održava ravnotežu na gredi i vreme potrebno da pređe razdaljinu od 1 metra predstavlja meru njegove ravnoteže, koordinacije, fizičke kondicije i motornog planiranja. Bakarna greda dijametra 12 mm postavi se pod uglom od 30°. Startno područje grede osvetli se stonom lampom, dok se izlazna platforma postavlja na njenom kraju. Za početnu obuku koristi se šira greda da bi miševi naučili da hodaju i održavaju ravnotežu do platforme. Posle obuke, meri se latencija vremena potrebnog da se pređe razdaljina od 1 m. Pored toga, opservativno se određuju prvi simptomi motorne disfunkcije (klizanje stopala i vučenje stomaka). Statistička analiza zbira latencije izvodi se korišćenjem dvofaktorske ANOVA praćene Bonferronijevim post-hoc testiranjem.
REZULTATI
Ponašanje u vezi sa privlačenjem zadnjih ekstremiteta i hod po gredi
[0372] Efekat IPN002 na privlačenje ekstremiteta prikazan je na Slici 31. Kako je prikazano na Slici 31, IPN002 tretman smanjuje skor privlačenja ekstremiteta u poređenju sa kontrolnim IgG. Efekat IPN002 na motornu funkciju, procenjen hodom po gredi, prikazan je na Slici 32. Kako je prikazano na Slici 32, IPN002 tretman značajno snižava prosečnu latenciju (što znači da poboljšava motornu funkciju), u poređenju sa kontrolnim IgG. Prema tome, IPN002 trtman značajno smanjuje motorni deficit kod P301L tau transgenih miševa. Korišćenjem istog statističkog metoda, rezultati sa PHF1 tretmanom nisu pokazali značajnost.
Nivoi Tau
[0373] Procenjivan je nivo slobodnog tau (tau nevezan za IPN002) u CSF P301L miševa posle tretmana kontrolnim IgG, PHF1, ili IPN002. Nivo slobodnog tau prisutnog u CSF, koji nije vezan za IPN002, određen je korišćenjem IPN001. Podaci su prikazani na Slici 33. Kako je prikazano na Slici 33, IPN002 tretman je smanjio nivoe slobodnog tau (nevezanog za IPN002) za 96%, u poređenju sa nivoima kod miševa tretirnaih kontrolnim IgG.
Primer 16: Efekat IPN002 na eTau-indukovanu hiperekscitabolnost neurona MATERIJALI I METODI
[0374] Merenje fiksacije voltaže na mikropodručjima membrane cele ćelije izvedeno je na humanim primarnim koritikalnim neuronima u kulturi. Izvrši se perfuzija neurona (2 ml/min) veštačkom cerebrosinalnom tečnošću koja sadrži (mM): NaCl (140), KCl (2.5), MgCl2(2) CaCl2(2), Hepes (10), D-glukozu (10), saharozu (20), prilagođeni pH= 7.4 mOsm = 310. Beleženje podataka izvršeno je korišćenjem pClamp-10.3 softvera za prikupljanje podataka (Molecular Devices) i MultiClamp 700B amplifikatora (Axon Instrument; Foster City CA). "Puff" nanošenje 1) eTau1a (amino-kiseline 2-166); 2) fosforilisanog tau ili eTau sa inhibitorima; 3) kontrolnog IgG; ili 4) anti-tau antitela, PHF1, IPN001, ili Dako (poliklonsko anti-C-terminalni tau), izvodi se korišćenjem MiniSquirt mikroperfuzionog sistema (AutoMate, Berkeley, CA). "Oflajn" analiza podataka vrši se korišćenjem Clampfit 10.2 analitičkog softvera (Molecular Devices). Sva merenja su izvedena na 34-37°C.
REZULTATI
[0375] Podaci su prikazani na Slikama 34 i 35. Kako je prikazano na Slici 34, IPN002 je smanjio eTau1a-indukovanu hiperaktivnost neurona. Ni kontrolni IgG ni "Dako" (anti-C-terminalno poliklonsko Ab) nisu doveli do značajnog smanjenja hiperaktivnost neurona. PHF1 nije smanjio eTau 1a-indukovanu hiperaktivnost neurona.
[0376] Efekat eTau1a na hiperaktivnost neurona upoređivan je sa efektom PHF1-reaktivnog, fosforilisanog Tau pune dužine (fosfo-Tau) na hiperaktivnost neurona. Kako je prikazano na Slici 35, srednja tabla, PHF1-reaktivni fosfo-Tau pune dužine nije indukovao hiperaktivnost neurona u 2 od 3 testirane ćelije; treća testirana ćelija pokazala je samo mali stepen neuronske hiperaktivnosti, u poređenju sa bazalnom vrednošću (gornja tabla). Nasuprot tome, eTau1a indukovao je hiperaktivnost neurona u sve 3 testirane ćelije (donja tabla). Ovi podaci prikazani su grafički na Slici 36.
Primer 17: Efekat IPN002 na nivoeAβ
MATERIJALI I METODI
Sekrecija Aβ iz kortikalnih neurona poreklom od iPSC
[0377] iPSC-izvedeni kortikalni neuroni (iPSC-CN) gajeni su in vitro. iPSC se generišu iz zdravih individua; individua sa porodičnom AD sa mutacijom u proteinu presenilinu (PSEN1); individua sa porodičnom AD sa mutacijom u proteinu presenilinu (PSEN2); i individua sa sporadičnom AD (sAD). Posle približno ∼55-60 dana u kulturi, iPSC-CN sortiraju se na osnovu L1-CAM (CD171) ekspresije radi obogaćivanja zrelim kortikalnim neuronima; sortirane ćelije se gaje u kokulturi sa normalnim humanim astrocitima 30 dana. Posle 30 dana kokultivisanja, iPSC-CN se tretiraju još 25 dana različitim koncentracijama inhibitora enzima razlaganja betamesta amiloidnog prekursorskog proteina (beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme, BACE), kontrolnog IgG, ili IPN002, sa promenama medijuma 2X/nedeljno. Kondicionirani medijum se sakupi i testira u Millipore High Sensitivity Human Amyloid-beta
1
40 i Amyloid-beta 42 ELISA, da se detektuju Aβ1-40("Aβ40") i Aβ1-42("A42"). Aβ40 i Aβ42 su proizvodi razlaganja amiloidnog prekursorskog proteina; senilne plake sadrže Aβ42 i Aβ40.
Sekrecija Aβ iz primarnih humanih kortikalnih neurona
[0378] Tkivo cerebralnog korteksa humanog fetusa dobijeno je od Advanced Bioscience Resources (Alameda, CA) u skladu sa saveznim smernicama za istraživanja na tkivima fetusa i Zakonom o zaveštanju organa. Tkivo je isprano u Hankovom puferisanom slanom rastvoru (Cellgro), triturisano u prisustvu 1 mg/ml DNaze (EMD) i propušteno kroz 100 µm-sko ćelijsko sito. Posle centrifugiranja, pelet je resuspendovan u 0.05% tripsin/EDTA (Invitrogen) 20 min na 37°C. Tripsin je inaktiviran dodavanjem jednake zapremine medijuma koji sadrži 10% fetalni goveđi serum (FBS) i uzorak je pažljivo ponovo triturisan u prisustvu DNaze. Posle centrifugiranja ćelije su resuspendovane u medijumu za zasejavanje (Neurobasal sa B27, Invitrogen) i brojane. Ćelije se zaseju na ploče, kultivišu 5 nedelja i doda im se sveži medijum koji sadrži antitela u početnim koncentracijama, 10 dana, uz menjanje medijuma svaka 3-4 dana uz sakupljanje kondicioniranog medijuma posle 10 dana tretmana. Kondicionirani medijum se centrifugira na 15000 rpm 15 minuta pre obrade za Aβ40 i Aβ42 ELISA analizu, kako je opisano gore.
REZULTATI
[0379] Rezultati su prikazani na Slikama 37-39.
[0380] Kako je prikazano na Slici 37, tretman iPSC-CN korišćenjem IPN002 smanjio je nivoe Aβ40 i Aβ42 sekretovanih iz svih iPSC-CN, dok kontrolni IgG nije smanjio sekreciju Aβ40 ili Aβ42.
[0381] Slika 38 prikazuje dozno-zavisne efekte različitih antitela na količinu Aβ40 sekretovanog iz primarnih humanih kortikalnih neurona. Kako je prikazano na Slici 38, inkubacija primarnih humanih kortikalnih neurona sa 10 µg/ml ili 30 µg/ml IPN001, IPN002, ili hu-IPN002 (humanizovana varijanta IPN002) smanjila je količinu sekretovanog Aβ40. Ni kontrolni IgG ni PHF1 nisu značajno uticali na količinu sekretovanog Aβ40.
[0382] Slika 39 prikazuje dozno-zavisne efekte različitih antitela na količinu Aβ42 sekretovanog iz primarnih humanih kortikalnih neurona. Kako je prikazano na Slici 39, inkubacija primarnih humanih kortikalnih neurona sa 10 µg/ml ili 30 µg/ml IPN001, IPN002, ili hu-IPN002 smanjila je količinu sekretovanog Aβ42. Ni kontrolni IgG ni PHF1 nisu značajno uticali na količinu sekretovanog Aβ42.
Primer 18: Mapiranje epitopa humanizovane varijante IPN002
MATERIJALI I METODI
1 1
[0383] Antitelo ili biotinisani peptid razblaže se slanim rastvorom puferisanim fosfatom (PBS). Finalne koncentracije bile su sledeće: 1 µg/ml humanizovane varijante IPN002 (hu-IPN002); 1 µg/ml rTau383 (rekombinantni Tau pune dužine); 5 µg/ml biotinisanih peptida. 100 µl 0.1% kazeina u PBS doda se u bunarčiće ploče sa većim brojem bunarčića. Doda se 150 µl rastvora 1 µg/ml hu-IPN002. Naprave se serijska razblaženja i nanesu na zidove bunarčića ploče sa većim brojem bunarčića. U bunarčiće koji sadrže serijski razblaženo antitelo doda se 100 µl biotin-peptida ili biotin-Tau pune. Ploče sa većim brojem bunarčića se inkubiraju jedan sat na sobnoj temperaturi. Posle perioda inkubacije, bunarčići se isperu u 5 promena 0.05% rastvora Tween 20 u PBS; što je praćeno ispiranjem u 2 promene PBS.
[0384] Sekundarno antitelo konjugovano sa streptavidin-peroksidazom rena (HRP) doda se u bunarčiće, i ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi 1 sat. Posle perioda inkubacije, bunarčići se isperu u 5 promena 0.05% rastvoru Tween 20 u PBS; što je praćeno ispiranjem u 2 promene PBS.
[0385] Doda se HRP supstrat 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) i inkubira 1-15 minuta. Reakcija se zaustavi dodavanjem 100 µl 1 N sumporne kiseline. Očitava se apsorpcija na 450 nm.
REZULTATI
[0386] Podaci su prikazani na Slici 40. Podaci prikazani na Slici 40 pokazuju da se biotin-Tau 13-24, biotin-Tau 15-24, biotin-Tau15-44, i biotin-fosfo Tau 15-24 (sa fosforilisanim Tyr koji odgovara amino-kiselini 18 Tau pune dužine), i Tau pune dužine (rTau383) efikasno vezuju za hu-IPN002. Prema tome, hu-IPN002 vezuje se za epitop u okviru Tau amino-kiselina 15-24, bez obzira na fosforilacioni status Tyr-18.
Primer 19: Vezivanje antitela za tau u CSF
[0387] Procenjivano je vezivanje IPN002, PHF1, antitela specifičnog za linearni fosforilisani epitop, i kontrolnog antitela, za tau prisutan u CSF.
[0388] Razvijen je test vezivanja za identifikovanje antitela koja se vezuju za tau prisutan u CSF. Test je šematski prikazan na Slici 41. Kontrolni IgG, poliklonsko antitelo specifično za linearni fosforilisani epitop ("poliAb-C-terminalni tau"), PHF1, ili IPN002 nanesu se na zidove bunarčića ploče sa većim brojem bunarčića. Antitelo se razblaži u fosfatom puferisanom slanom rastvoru (PBS). Finalne koncentracije bile su sledeće: 5 µg/ml IPN002, IgG, PHF1, ili poliAb-C-terminalni tau. U bunarčiće ploče sa većim brojem bunarčića doda se 100 µl 0.1% kazeina u PBS. Doda se 100 µl humanog CSF i inkubira 1 sat na RT (room temperature, sobna temperatura). U bunarčiće se doda 100 µl biotin-BT2 biotin-HT7. BT2 je mišje monoklonsko antitelo koje se vezuje za epitop u okviru amino-kiselina 194-198 humanog tau. HT7 je mišje
1 2
monoklonsko antitelo koje se vezuje za epitop u okviru amino-kiselina 159-163 humanog tau. Ploča sa većim brojem bunarčića inkubira se jedan sat na sobnoj temperaturi. Posle inkubacionog perioda, bunarčići se isperu 5 puta rastvorom 0.05% Tween 20 u PBS; posle čega slede 2 ispiranja u PBS.
[0389] Sekundarno antitelo konjugovano sa streptavidin-peroksidazom rena (HRP) doda se u bunarčiće, i ploče se inkubiraju na sobnoj temperaturi 1 sat. Posle perioda inkubacije, bunarčići su isprani u 5 promena 0.05% rastvoru Tween 20 u PBS; što je praćeno ispiranjem u 2 promene PBS. Doda se HRP supstrat 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) i inkubira 1-15 minuta. Reakcija se zaustavi dodavanjem 100 µl 1 N sumporne kiseline. Očitava se apsorpcija na 450 nm.
[0390] Test se kvantifikuje korišćenjem poznatih količina fosfo-tau pune dužine ili poznatih količina eTau1a (amino-kiseline 2-166 tau). Kako je prikazano na Slici 41, donja tabla, test se izvodi korišćenjem tau pune dužine (donja leva tabla) ili eTau-1a (donja desna tabla), u koncentracijama od 0 ng/ml, 0.16 ng/ml, 0.8 ng/ml, 4 ng/ml, 20 ng/ml, i 100 ng/ml. Kako je prikazano na Slici 41, donja leva tabla, IPN002, poliAb-C-terminalni tau, i PHF1 vezuju se za tau pune dužine. Kako je prikazano na Slici 41, donja desna tabla, samo IPN002 se vezuje za eTau1a.
[0391] Goreopisani test izvodi se da bi se ispitalo vezivanje poliAb-C-terminalnog tau, PHF1, i IPN002 za tau prisutan u humanoj CSF iz 1) kontrolnih (zdravih) osoba; 2) MCI pacijenata; 3) pacijenata sa blagom AD ("blago"); 4) pacijenata sa umerenom AD ("umereno"); i pacijenata sa jakom AD. Rezultati su prikazani na Slici 42. Kako je prikazano na Slici 42, tau prisutan u CSF vezuje se za IPN002, ali ne za pAb-tau linearni epitop ili PHF1. Podaci pokazuju sledeće: 1) N-terminalni Tau fragmenti su prisutni u CSF; 2) tau pune dužine detektovan je u CSF; i 3) C-terminalni tau fragmenti koji uključuju BT2 i HT7 epitope nisu detektovani u CSF.
Primer 20: In vivo efekti IPN002
[0392] Rezultati su dobijeni na osnovu šestomesečne studije efikasnosti tau antitela kod P301L tau transgenih miševa. Nađeno je da IPN002 globalno smanjuje napredovanje bolesti, što se vidi po velikom sniženju nivoa slobodnog tau u CSF, sniženju nivoa proteinskog markera astroglioze, poboljšanju tau patologije u više moždanih regiona i fosfotau epitopa, i poboljšanim rezultatima u testovima ponašanja i funkcionalnim testovima. IPN002 pokazalo se kao anti-tau antitelo PHF1 ili bolje od njega. Konačno, dobijena je in vivo potvrda o novim mehanizmima dejstva sekretovanog tau: regulacija nivoa amiloida beta pozitivnom povratnom spregom. Ova studija jasno ističe sposobnost eTau antitela, IPN002, u poređenju sa PHF1, u modulaciji nivoa amiloida beta.
MATERIJALI I METODI
1
Studije na životinjama
[0393] Koristi se model P301L transgenih miševa. P301L transgeni miš sadrži mišji, Thy1 promotorom (neuron-specifična ekspresija) kontrolisani 4R2N-humani tau mutiran na P301L kao transgen. P301L transgeni model pokazuje starosno-zavisnu hiperfosforilaciju tau (AT8 i AT100) u kičmenoj moždini, moždanom stablu, srednjem mozgu i korteksu. Hiperfosforilisani tau pokazuje konformacione promene koje dovode do agregacije tau i miševi razvijaju neurofibrilarne klupčiće od 6. meseca starosti, mada je njihova pojava podložna velikim varijacijama. Kao patološka posledica, kod ovih miševa se progresivno razvijaju motorički deficiti kao što su privlačenje zadnjih ekstremiteta, smanjenje mobilnosti u hodu po gredi i javlja se potreba za preranim žrtvovanjem na stupnju starosti od 8 do 11 meseci. Terwel et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 280:3963.
[0394] 100 nasumično raspoređenih miševa dozorano je i.p. jednom nedeljno antitelom, od 3.5 meseca starosti, tokom 6 meseci, do 9.5 meseci starosti. Tretman korišćenjem 20 mg/kg (mpk) IPN002 upoređivan je sa 20 mpk IgG1 kao negativnim kontrolnim antitelom, i sa anti-tau antitelom, 10 mpk PHF1. PHF1 je mišje monoklonsko antitelo koje prepoznaje epitop koji uključuje fosfo-Ser<396>i fosfo -Ser<404>. Santacruz et al. (2005) Science 309:476. Kod živih miševa ispitivani su deficiti u vezi sa privlačenjem ekstremiteta i hodanjem po gredi. Miševi koji su brzo progredirali do krajnjeg stadijuma bolesti bili su pre vremena žrtvovani (pre 9.5 meseci starosti), uz korišćenje unapred određenih kriterijuma. Uzimani su serum, CSF, hipokampus, korteks, srednji mozak i zadnji mozak; i polovine mozga su sagitalno sečene za histopatološku analizu. Nivoi antitela mereni su u serumu i CSF; ukupni tau i slobodni tau (tau koji nije vezan za IPN002; "tau slobodan od IPN002") mereni su u CSF; izvedene su biohemijske/histološke analize humanog i mišjeg tau; analizirani su i mišji amiloid-beta, kao i proteinski markeri inflamacije i sinapsi i promene genske ekspresije markera inflamatorne, sinaptičke i neuronske aktivnosti. Sve analize su izvedene na neobeleženim uzorcima .
[0395] Broj miševa uključenih u ovu studiju bio je 25-33 po ogranku studije i 10 za bazalne vrednosti. Svim miševima određenim za ovu studiju dodeljeni su nasumično kompjuterom brojevi i nasumično su raspoređeni u grupe tretmana. Grupe miševa prikazane su u Tabeli 7.
Tabela 7
1 4
[0396] Svi eksperimenti na životinjama izvedeni su u skladu sa bioetičkim smernicama koje su u potpunoj saglasnosti sa međunarodno prihvaćenim principima nege i upotrebe laboratorijskih životinja. Tabela 8 prikazuje parametre tretmana.
Tabela 8
[0397] Telesne težine određivane su nedeljno tokom tretmana i prilikom žrtvovanja. Ocene refleksa privlačenja ekstremiteta beležene su nedeljno od 7 meseci sarosti nadalje. Od 7 meseci starosti nadalje, miševi su praćeni dva puta nedeljno u pogledu pokretljivosti u kavezu, gubitka težine i prvih znakova privlačenja zadnjih ekstremiteta.
[0398] Privlačenje zadnjih ekstremiteta. Da bi se ocenilo ponašanje u vezi sa privlačenjem ekstremiteta, miševi se drže pri bazi repa deset sekundi. Privlačenje zadnjih ekstremiteta ocenjuje se korišćenjem 3-stepene skale: 0. zadnji ekstremiteti ispruženi i prsti rašireni.1. jedan zadnji ekstremitet delom privučen > 50% vremena.2. oba zadnja ekstremiteta delom privučena > 50% vremena. 3. oba zadnja ekstremiteta potpuno privučena tokom > 50% vremena. Privlačenje prednjih ekstremiteta ocenjivano je prema: 0. prednji ekstremiteti ispruženi unapred i udaljeni od tela.1. jedna prednji ekstremitet delom privučen > 50% vremena. 2. Oba prednja ekstremiteta delom privučena > 50% vremena.3. Oba prednja ekstremiteta potpuno privučena, nepokretna, gubitak mišića, miš se "moli". Miševi koji su ispoljili jak fenotip privlačenja ekstremiteta rano su žrtvovani.
[0399] Hod po gredi. Test hoda po gredi izvodi se na životinjama starim 7 meseci, 8 meseci, 8.5 meseci, 9 meseci, i 8.5 meseci starosti, da bi se odredila motorna disfunkcija i motorno učenje. Sposobnost miša da održava ravnotežu na gredi i vreme potrebno da pređe razdaljinu od 1 metra predstavlja meru njegove ravnoteže, koordinacije, fizičke kondicije i motornog planiranja. Bakarna greda dijametra 12 mm postavi se pod uglom od 30°. Startno područje grede
1
se osvetli, dok se izlazna platforma postavlja na njenom kraju. Posle probnih pokušaja, meri se latencija. Pored toga, broje se klizanje stopala i vučenje stomaka.
[0400] Grupa za određivanje bazalnih vrednosti žrtvuje se pre početka studije. Miševi u ograncima studije, koji su pokazivali jako privlačenje ekstremiteta, smanjenje telesne težine i/ili koji su bili na umoru, žrtvovani su pre završetka studije (rano žrtvovanje). Preostali miševi žrtvovani su posle 6 meseci tretmana (kasno žrtvovanje).
Tabela 9
[0401] Slobodni PHF1 u plazmi meri se dodavanjem odgovarajuće razblažene plazme na ploče sa bunarčićima obloženim tau i detektovanjem korišćenjem ELISA sa HRP-anti-mišjim IgG antitelom i TMB. Senzitivnost testa slobodnog PHF1 nije bila dovoljna za merenje nivoa slobodnog PHF1 u CSF.
[0402] Slobodno IPN002, u plazmi i CSF, meri se dodavanjem odgovarajuće razblažene plazme ili CSF na ploče obložene tau i detektovanjem korišćenjem ELISA sa HRP-anti-mišjim IgG antitelom i TMB.
[0403] Ukupni tau u CSF meri se pomoću "sendvič"-ELISA korišćenjem oblažućeg anti-tau antitela i detektujućih anti-tau antitela koja su pokazala da ne kompetiraju sa IPN002 ili PHF1.
1
[0404] Slobodni tau (od IPN002) u CSF meri se korišćenjem homogenog ELISA uz korišćenje dva anti-tau antitela za zadržavanje tau u CSF. Jedno od ovih antitela kompetira sa IPN002 i prema tome neće interagovati sa tau koji je prethodno vezan sa IPN002 u CSF.
[0405] Hipokampus i korteks se frakcionišu homogenizovanjem u 10 težinskih zapremina hladnog TBS/Roche proteaza/fosfataza inhibitornog koktela. Homogenat se napravi centrifugiranjem detritusa na 10 000 x g 15 minuta. BCA proteinski sadržaj se određuje na homogenatima; svi homogenati se razblaže do 1 mg/ml i odgovarajuće frakcije ekvivalentno razblaže. Deo homogenata se centrifugira 1 sat na 100000 x g na 4°C da se dobije rastvorljiva frakcija (S1) i nerastvorljivi pelet. Nerastvorljivi peleti se resuspenduju u 1% sarkozil/Roche proteaza/ fosfataza inhibitornom koktelu i centrifugiraju ponovo 1 sat na 100000 x g. Sarkozil solubilizovani supernatanti se obeleže (P1); sarkozil nerastvorljivi pelet se resuspenduje i obeleži (P2). Zadnji mozgovi se frakcionišu na sličan način, osim što se za solubilizaciju PI peleta koristi rastvor soli (0.85M NaCl) praćen 1% sarkozilom.
[0406] Homogeni ELISA za humani tau specifično se odnosi na humani tau i koristi se za određivanje nivoa tau u homogenatu, S1, P1 i P2 frakcijama hipokampusa, korteksa i zadnjeg mozga.
[0407] Humani AT8 homogeni ELISA specifično se odnosi na humani p202/205 tau i koristi se za određivanje nivoa humanog AT8 u homogenatu, S1, P1 i P2 frakcijama hipokampusa, korteksa i zadnjeg mozga.
[0408] HT7, IPN001, Dako poliklonsko-tau, AT8, AT100, anti-p262, anti-p396 i AD2, GFAP, Iba1, sinapsin SDS-PAGE Western blotovi izvode se na frakcijama hipokampusa, korteksa i/ili zadnjeg mozga (homogenat, S1, P1 i/ili P2). Jedna ili više kontrola lizata puštaju se na svaki gel da bi se osigurala ispravna normalizacija među gelovima. Sve analizirane trake normalizovane su prema β-aktinu u odgovarajućem uzorku homogenata. Antitela i njihovi ciljevi prikazani su u Tabeli 10.
Tabela 10
1
[0409] Za histopatologiju, 6/32 nasumično odabranih, sagitalno seečnih polumozgova bojeno je na AT8 i AT100; signali su razvijeni pomoću DAB. Kvantifikovani su (bez obeležavanja materijala) i subtalamusna nukleusna aneksna zona incerta (bregma 2.08-1.12) i interpozicionirani nukleus cerebeluma (anteriorni i posteriorni deo) aneksni lateralni cerebelarni nukleus (IntA/P/LAT; bregma 2.28-1.32).
[0410] ELISA mišjeg amiloida-beta (Aβ40 i Aβ42) izvedeni su za specifičnu detekciju Aβ40 i Aβ42 u homogenatima mozga miša. ELISA za mišji Aβ42 nije bio dovoljno senzitivan da bi se izvršila pouzdana detekcija nivoa u homogenatima mozga miša. ELISA za mišji Aβ40 detektuje nivoe mišjeg Aβ40 u linearnom opsegu testa. ELISA za mišji Aβ40 upotrebljen je za određivanje nivoa Aβ40 u svim kohortskim homogenatima i rastvorljivim (S1) frakcijama.
[0411] Taqman analiza izvedena je na markerima inflamacije, sinaptičkim markerima i markerima aktivnosti neurona. Tabela 11 prikazuje spisak markera.
Tabela 11
1
Statistika
[0412] Longitudinalna statistička analiza izvršena je za refleks privlačenja ekstremiteta i hod po gredi, od strane nezavisnih statističara. Ukratko, nagib krive opadanja određen je za svakog miša i za deficit privlačenja ekstremiteta i za hod po gredi i ovi koeficijenti su upotrebljeni za određivanje da li između grupa postoje značajne razlike. Veći broj metoda korišćen je za određivanje nagiba krivih i značajnosti. Za refleks privlačenja ekstremiteta uključivali su longitudinalnu analizu kompletnog slučaja, združeni model podešavanja za nedostajuće podatke i Bayesova rednu longitudinalnu analizu. Za hod po gredi analize su bile longitudinalna analiza kompletnog slučaja, združeni model podešavanja za nedostajuće podatke, longitudinalna analiza uz korišćenje vrednosti 30 sekundi, Bayesova longitudinalna analiza sa nedostajućim vrednostima i živa ali neukrštena analiza.
[0413] Statistička analiza za određivanje značajnosti za biohemijske i histološke podatke, kao i za ekspresiju gena vršena je na celom kohortu, rano žrtvovanim i kasno žrtvovanim kohortima, korišćenjem jednofaktorske ANOVA praćene Dunnettovom post-hoc analizom. T-test je
1
izveden i za napredovanje bolesti (bazalna vrednost na 3.5 meseca u odnosu na 9.5 meseci, ogranci tretmana IgG) kao komparator za značajnost izvedenu iz jednofaktorske ANOVA analize. Kada je izgledalo da postoji jak trend ka promenama za PHF1 ili IPN002, ali se to nije reflektovalo jednofaktorskom ANOVA analizom, vršen je t-test upoređivanja IgG sa PHF1 ili IPN002 samo da bi se odredilo da li su se obrasci trenda za tu završnu tačku pojavili bez dostizanja značajnosti jednofaktorskom analizom.
[0414] Da bi se odredilo koje od 116 završnih tačaka najbolje koreliraju jedna sa drugom, izvedena je matriksna korelacija; i najviši korelatori rangirani su na osnovu kombinacije njihovih r<2>vrednosti i p vrednosti.
REZULTATI
Nivoi antitela i interakcija sa ciljem
[0415] Plazma i CSF dobijeni su pre žrtvovanja. Određivani su nivoi slobodnog IPN002 i slobodnog PHF1 u plazmi i slobodnog IPN002 u CSF. Test za slobodni PHF1 nije bio dovoljno senzitivan da bi izmerio nivoe slobodnog PHF1 u CSF. Dovoljno CSF je dobijeno da se odrede nivoi i ukupnog Tau i slobodnog Tau (slobodnog od IPN002).
Nivoi slobodnog IPN002 i slobodnog PHF1 u plazmi
[0416] P301L Tau transgeni miševi tretirani su korišćenjem 20 mpk IgG, 20 mpk IPN002 ili 10 mpk PHF1. Ove doze odabrane su na osnovu rezultata studije interakcije sa ciljem #1. Podaci su zbirno prikazani u Tabeli 12.
Tabela 12
[0417] U studiji interakcije sa ciljem #1 nađeno je da 10 mpk IPN002 tokom 4 nedelje, praćeno sa 20 mpk IPN002 tokom još 4 nedelje rezultuje, u proseku, sa 0.65 µM slobodnog IPN002 u plazmi. Ista koncentracija, 0.65 µM slobodnog PHF1, dobijena je sa konstantnom primenom 10 mpk PHF1 tokom 8 nedelja. U sadašnjoj studiji, kako je pokazano u Tabeli 12, prosečne
11
koncentracije u plazmi bile su 0.55 µM za slobodni PHF1 i 0.9 µM za IPN002. Prema tome, prosečni nivoi u plazmi slobodnog IPN002 bili su viši nego slobodnog PHF1.
Nivoi slobodnog IPN002 u CSF
[0418] U proseku, 0.9 nM slobodnog IPN002 bilo je prisutno u CSF IPN002-tretiranih P301L tau miševa, kako je pokazano u Tabeli 13. Ovo se translatuje u 0.1% slobodnog IPN002 u CSF:plazmi; tj., koncentracija IPN002 u CSF bila je 0.1% od koncentracije IPN002 u plazmi (0.9 nM u CSF; 0.9 µM u plazmi).0.1% antitela u CSF je konzistentno sa procentima određenim za druga antitela u vezi sa pristupanjem mozgu i dreniranjem u CSF posle periferne primene. Test slobodnog IPN002 međutim, daje podatke samo o IPN002 koji nije vezan za tau. Tau je vezan za IPN002 u CSF; tako, 0.1% vrednost je manja od stvarne vrednosti ukupnog IPN002 u CSF. Izračunavanja dodavanjem nivoa slobodnog IPN002 nivoima IPN002 vezanog za tau sugerišu da nivoi ukupnog IPN002 u CSF iznose ∼0.2% nivoa u plazmi. Kako je napomenuto u Metodima, test slobodnog PHF1 nije dovoljno senzitivan za merenje nivoa slobodnog PHF1 u CSF.
Tabela 13
Ukupni Tau u CSF
[0419] Nivoi ukupnog Tau u CSF mereni su da bi se odredilo da li PHF1 ili IPN002 menjaju ove nivoe. Kako je prikazano na Slici 43, nivo ukupnog tau u CSF nije značajno izmenjen tretmanom PHF1 ili IPN002. Ovaj rezultat je očekivan iz podataka dobijenih u studiji interakcije sa ciljem.
[0420] Slika 43: Nivoi ukupnog tau u CSF P301L tau transgenih miševa mereni su korišćenjem sendvič-ELISA testa sa tau antitelom. Kako je pokazano na Slici 43, nivoi tau u CSF značajno rastu sa starošću (uporediti bazalne vrednosti na 3 meseca sa mišjim IgG). Ni PHF1 ni IPN002 nisu menjali ukupne nivoe tau.
Slobodni Tau (od IPN002) u CSF
[0421] Test slobodnog Tau (od IPN002) u CSF, kako je opisano u Metodima, je ELISA u kojem jedno od dva antitela kompetira sa IPN002; prema tome, test neće detektovati tau koji je vezan za IPN002. Ovaj test pokazuje da li je IPN002 ušao u mozak i CSF i interagovao sa svojim ciljem (tj., vezao se za tau). Ako je IPN002 interagovao sa svojim ciljem, signal u testu će biti smanjen. Ovaj test je specifičan za tau slobodan od IPN002, i prema tome ne detektuje slobodni Tau (od PHF1). Kako je pokazano na Slici 33, nivoi slobodnog Tau (od IPN002) rastu sa napredovanjem bolesti konzistentno sa gore pokazanim podacima. PHF1 ne utiče na nivoe slobodnog Tau. Nasuprot tome, rezultat tretmana IPN002 je 96% smanjenja signala nivoa slobodnog Tau (od IPN002). Ovi podaci pokazuju da IPN002 u potpunosti reaguje sa svojim ciljem, CSF tau.
Tau i fosfoTau - biohemija i histologija
[0422] Kako je opisano u Metodima, hipokampus, korteks i zadnji mozak frakcionisani su u frakcije homogenata, rastvorljivu (sarkozil-solubilisani), i nerastvorljivu (sarkozilnerastvorljivi). Frakcije su analizirane u pogledu humanog i mišjeg tau, i više fosfotau epitopa (AT8, AT100, p262, p396 i AD2) koji su hiperfosforilisani u mozgovima kod Alzheimerove bolesti. Kako je pokazano na Slikama 44 A-H, IPN002 tretman smanjio je nivoe AT8 u hipokampusnom homogenatu (Slika 44A), hipokampusnoj frakciji S1 (Slika 44B), hipokampusnoj frakciji PI (Slika 44C), hipokampusnoj frakciji P2 (Slika 44D), kortikalnom homogenatu (Slika 44E), i kortikalnoj frakciji PI (Slika 44G), u poređenju sa tretmanom mišjim IgG kontrolnim antitelom. Podaci na Slici 44A-H pokazuju da IPN002 tretman smanjuje nivoe AT8 u sličnoj ili većoj meri nego PHF1 tretman. Podaci prikazani na Slikama 44A-H normalizovani su prema BCA.
[0423] Kako je prikazano na Slici 45A, IPN002 tretman snižava nivo humanog p396-tau u korteksnoj frakciji S1, u poređenju sa tretmanom mišjim IgG kontrolnim antitelom. Kako je prikazano na Slikama 45B i 45C, IPN002 tretman je samnjio nivo fosfo-tau S262 u korteksnom homogenatu (Slika 45B), i u korteksnoj frakciji S1 (Slika 45C), u poređenju sa tretmanom mišjim IgG kontrolnim antitelom. Kako je prikazano na Slikama 45D i 45E, tretman IPN002 smanjio je nivo mišjeg p396-tau u korteksnoj frakciji S1 (Slika 45D), i smanjio nivo mišjeg AT100 u korteksnoj frakciji S1 (Slika 45E), u poređenju sa tretmanom mišjim IgG kontrolnim antitelom.
[0424] Tau histopatologija (AT8 i AT100) analizirana je u dva različita nukleusa u zadnjem mozgu, subtalamusna nukleusna aneksna zona incerta (STH) i interpozicionirani nukleus cerebeluma (anteriorni i posteriorni deo) aneksni lateralni cerebelarni nukleus (IntA/P/LAT). Kako je pokazano na Slici 46, IPN002, kod kasno žrtvovanih miševa, značajno poboljšava AT8 patologiju bolesti. PHF1 je imao trend prema smanjenju, ali nije značajno poboljšao tau histopatologiju. Kako je pokazano na Slici 47, IPN002 tretman je poboljšao AT100 i MC1 patologiju bolesti, u poređenju sa tretmanom kontrolnim IgG.
Inflamacija
[0425] U modelima AD i tauopatije razvijene su astroglioza i mikroglioza. Uloga koju aktivirani astrociti ili mikroglija imaju u bolesti, međutim, nije potpuno jasna. Ako su astrociti ili mikroglija aktivirani u P301L tau transgenom modelu, takva aktivacija bi bila rezultat preterane ekspresije mutiranog tau. Pretpostavljeno je da sekretovani tau indukuje AD patologiju. Ako sekretovani tau indukuje AD patologiju, onda on može indukovati i aktivaciju glije. Prema tome, određivano je da li su proteini koji su povišeni u astrogliozi (GFAP) ili mikrogliozi (Iba1) povišeni u modelu P301L transgeniih miševa.
[0426] Kako je pokazano na Slikama 48A i 48B, nivoi GFAP proteina povišavaju se sa napredovanjem bolesti u hipokampusu i korteksu. Ovi podaci pokazuju ili da su astrociti aktivirani u hipokampusu i korteksu ili da su infiltrirali ove regione mozga. IPN002 tretman značajno smanjuje nivoe GFAP proteina u hipokampusu i korteksu, što pokazuje da IPN002 tretman smanjuje povećanje astroglioze vezano za bolest. PHF1 značajno smanjuje GFAP u hipokampusu, ali ne i u korteksu.
[0427] Nivoi Iba1 proteina, markera mikroglije, mereni su u u hipokampusu i korteksu. Kako je pokazano na Slikama 49A i 49B, Iba1 nije povišen sa napredovanjem bolesti u hipokampusu ali se povišava u korteksu. IPN002 tretman nije uticao na nivoe Iba1 proteina tokom napredovanja bolesti. Nasuprot tome, PHF1 tretman značajno je smanjio nivoe Iba1 proteina. Podaci sugerišu različite mehanizme delovanja IPN002 i PHF1.
Modulacija nivoa amiloida-beta
[0428] Kako je prikazano u Primeru 17, tretman iPSC-CN korišćenjem IPN002 smanjuje nivoe Aβ40 i Aβ42 sekretovanih iz svih iPSC-CN, dok kontrolni IgG ne smanjuje sekreciju Aβ40 ili Aβ42. Zatim je određeno da li IPN002 moduliše nivoe Aβ i in vivo. U P301L mišjem modelu, nije bilo preterane ekspresije humanog APP; prema tome, mereni su nivoi mišjeg Aβ. Senzitivnost ELISA za mišji Aβ42 nije bila dovoljna da meri nivoe Aβ42 u ovim homogenatima. ELISA za mišji Aβ40 međutim, bio je dovoljno osetljiv i dakle korišćen je za određivanje nivoa mišjeg Aβ40 u homogenatima i supernatantnim frakcijama. Nivoi mišjeg Aβ40 rastu sa napredovanjem bolesti. Zapaženi porast nivoa Aβ40 mogao bi biti tau-zavisan i/ili zavisan od starosti. Kako je pokazano na Slikama 50A i 50B, IPN002 tretman snizio je nivoe Ab40 u homogenatu (Slika 50A) i rastvorljivoj frakciji (Slika 50B).
[0429] Podaci na Slikama 50A i 50B pokazuju da preterana ekspresija tau (moguće zajedno sa starenjem) pokreće porast nivoa Aβ40 udružen sa napredovanjem bolesti. Podaci sugerišu da je sekretovani tau uzročni faktor u pokretanju porasta nivoa Aβ, koji IPN002 inhibira blokiranjem funkcije eTau. Nasuprot tome, PHF1, antitelo koje se ne vezuje za eTau, ne utiče na nivoe Aβ.
11
Motorna funkcija
[0430] Određivan je efekat tretmana pomoću IPN002 na motornu funkciju, procenjivan testovima refleksa privlačenja zadnjih ekstremiteta i hoda po gredi. Podaci su prikazani na Slikama 31, 32, 51, i 52.
[0431] Kako je prikazano na Slici 31, tretman korišćenjem IPN002 poboljšava skorove refleksa privlačenja zadnjih nogu, u poređenju sa tretmanom u kojem je korišćen kontrolni mišji IgG.
[0432] Kako je prikazano na Slikama 32 i 51, tretman koiršćenjem IPN002 poboljšao je prosečnu latenciju u testu hoda po gredi (Slika 32), i smanjio procenat miševa nesposobnih da hodaju po pravoj liniji (Slika 51), u poređenju sa tretmanom u kojem je korišćen kontrolni mišji IgG.
Primer 21: Mapiranje epitopa
[0433] Peptidno vezivanje i testovi kompeticije izvedeni su kako je opisano u Primeru 18, ranije u ovom tekstu.
[0434] Korišćeni su sledeći peptidi:
IPIG-1: EVMEDHAGTYGLGDRK (SEQ ID NO:81; amino-kiseline 9-24 tau);
IPIG-2: DHAGTYGLGDRK (SEQ ID NO:49; amino-kiseline 13-24 tau);
IPIG-3: AGTYGLGD (SEQ ID NO:82; amino-kiseline 15-22 tau);
IPIG-4: AGTYGLGDRKDQGGYTMHQDQEGDTDAGLK (SEQ ID NO:50; amino-kiseline 15-44 tau);
PAD peptid: AEPRQEFEVMEDHAGTY (SEQ ID NO:80; amino-kiseline 2-18 tau).
[0435] Rezultati su prikazani na Slikama 53-55.
[0436] Slika 30 prikazuje da nebiotinisani tau peptidi kompetiraju sa biotinisanim formama tau. Gornja tabla prikazuje kompeticiju biotinisanog Tau 13-24 peptida (IPIG-2; SEQ ID NO:49) sa nebiotinisanim Tau 13-24 za vezivanje sa hu-IPN002.
[0437] Slika 52 prikazuje tau pune dužine, IPIG-1, IPIG-2, i IPIG-4 vezane za hu-IPN002. IPIG-3, kojem nedostaju rezidue 23 i 24, nije vezan za hu-IPN002, kao ni PAD. Tako izgleda da su rezidue 23 i 24 potrebne za vezivanje sa hu-IPN002.
[0438] Slika 53 prikazuje da se eTau-4 peptid vezuje za hu-IPN002; međutim, PAD (tau 2-18), Tau 15-22, Tau 19-28, i Tau 21-31 peptidi ne vezuju se za hu-IPN002.
[0439] Podaci ukazuju na to da su rezidue 15-24 izgleda neophodne za vezivanje sa hu-IPN002.
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
14
14
14
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1

Claims (22)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Antitelo koje se specifično vezuje za Tau, naznačeno time, što antitelo uključuje:
a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:41;
b) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:40;
c) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:41;
d) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:42;
e) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:36 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:43;
f) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:40;
g) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:42;
h) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:43;
i) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:40;
j) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:41;
k) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:42;
l) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:38 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:43;
m) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:39 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:40;
n) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:39 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:41;
o) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:39 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:42; ili
p) varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:39 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:43.
2. Antitelo iz patentnog zahteva 1, naznačeno time, što antitelo uključuje varijabilni region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:37 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:41.
3. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili 2, naznačeno time, što antitelo uključuje konstantni region teškog lanca izotipa IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4.
4. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili 2, naznačeno time, što antitelo uključuje teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca i konstantni region humanog IgG4 teškog lanca.
5. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili 2, naznačeno time, što antitelo uključuje teški lanac koji sadrži varijabilni region teškog lanca i konstantni region humanog IgG4 teškog lanca, pri čemu teški lanac uključuje region zgloba koji sadrži supstituciju S241P (Kabatovo numerisanje).
6. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili 2, naznačeno time, što antitelo uključuje (i) teški lanac koji uključuje varijabilni region teškog lanca i konstantni region humanog IgG4 teškog lanca, i (ii) laki lanac koji uključuje varijabilni region lakog lanca i konstantni region humanog kapa lakog lanca.
1
7. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili 2, naznačeno time, što antitelo uključuje (i) teški lanac koji uključuje varijabilni region teškog lanca i konstantni region humanog IgG4 teškog lanca, pri čemu teški lanac uključuje zglobni region koji sadrži supstituciju S241P (numerisanje po Kabatu), i (ii) laki lanac koji uključuje varijabilni region lakog lanca i konstantni region humanog kapa lakog lanca.
8. Antitelo iz patentnog zahteva 1 ili 2, naznačeno time, što je antitelo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, ili Fab'.
9. Antitelo iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time, što antitelo uključuje kovalentno vezani nepeptidni sintetski polimer.
10. Antitelo iz patentnog zahteva 9, naznačeno time, što je sintetski polimer poli(etilen glikol) polimer.
11. Antitelo iz bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, naznačeno time, što je antitelo fuzionisano, direktno ili preko linkera, sa nosačkim molekulom, peptidom ili proteinom koji pokreće prolazak kroz krvno-moždanu barijeru.
12. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što uključuje:
a) antitelo iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 11; i
b) farmaceutski prihvatljivi ekscipijent.
13. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 12, naznačena time, što je antitelo inkapsulirano u lipozom.
14. Farmaceutska kompozicija iz patentnog zahteva 12 ili 13, naznačena time, što je antitelo formulisano sa sredstvom koje olakšava prolazak kroz krvno-moždanu barijeru.
15. Rekombinantni ekspresioni vektor, naznačen time, što uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira antitelo iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 11, pri čemu je nukleotidna sekvenca operabilno povezana sa transkripcionim kontrolnim elementom koji je aktivan u eukariotskoj ćeliji.
16. In vitro ćelija-domaćin, naznačena time, što je genetički modifikovana rekombinantnim ekspresionim vektorom iz patentnog zahteva 15.
17. Antitelo iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 11, ili farmaceutska kompozicija iz bilo kojeg od patentnih zahteva 12 do 14, za upotrebu u lečenju tauopatije kod humanog subjekta.
18. Antitelo ili farmaceutska kompozicija za upotrebu iz patentnog zahteva 17, naznačena time, što je tauopatija progresivna supranuklearna palsija.
19. Antitelo ili farmaceutska kompozicija za upotrebu iz patentnog zahteva 17, naznačena time, što je tauopatija frontotemporalna demencija.
1
20. Antitelo ili farmaceutska kompozicija za upotrebu iz patentnog zahteva 17, naznačena time, što je tauopatija Alzheimerova bolest.
21. Metod praćenja tauopatije kod humanog subjekta, naznačen time, što uključuje:
a) određivanje prvog nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od humanog subjekta u prvoj vremenskoj tački;
b) određivanje drugog nivoa Tau polipeptida u biološkom uzorku dobijenom od humanog subjekta u u drugoj vremenskoj tački; i
c) upoređivanje drugog nivoa Tau sa prvim nivoom Tau, pri čemu pomenuto određivanje uključuje:
i) dovođenje u kontakt biološkog uzorka sa antitelom iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 11; i
ii) kvantifikovanje vezivanja antitela za Tau polipeptid prisutan u uzorku.
22. Antitelo iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 11 za upotrebu u metodu detektovanja Tau polipeptida u živom humanom subjektu kod kojeg je antitelo primenjeno, pri čemu pomenuti metod uključuje detektovanje vezivanja antitela za Tau polipeptid u moždanom tkivu živog humanog subjekta, korišćenjem metoda dobijanja slike.
2
RS20200245A 2012-08-16 2013-08-15 Metodi lečenja tauopatije RS60080B1 (sr)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261683902P 2012-08-16 2012-08-16
US201361754085P 2013-01-18 2013-01-18
US201361781823P 2013-03-14 2013-03-14
US201361813797P 2013-04-19 2013-04-19
US201361833355P 2013-06-10 2013-06-10
PCT/US2013/055203 WO2014028777A2 (en) 2012-08-16 2013-08-15 Methods of treating a tauopathy
EP13830020.7A EP2885010B1 (en) 2012-08-16 2013-08-15 Methods of treating a tauopathy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60080B1 true RS60080B1 (sr) 2020-05-29

Family

ID=50101612

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20200245A RS60080B1 (sr) 2012-08-16 2013-08-15 Metodi lečenja tauopatije

Country Status (32)

Country Link
US (6) US9567395B2 (sr)
EP (2) EP3685854A1 (sr)
JP (1) JP6290212B2 (sr)
KR (1) KR102076384B1 (sr)
CN (1) CN104736185B (sr)
AU (1) AU2013302540B2 (sr)
BR (1) BR112015003326A2 (sr)
CA (1) CA2882034C (sr)
CL (1) CL2015000352A1 (sr)
CY (1) CY1123515T1 (sr)
DK (1) DK2885010T3 (sr)
EA (2) EA035976B1 (sr)
ES (1) ES2775192T3 (sr)
GB (1) GB2507207A (sr)
HR (1) HRP20200036T1 (sr)
HU (1) HUE048780T2 (sr)
IL (1) IL237153B (sr)
LT (1) LT2885010T (sr)
ME (1) ME03667B (sr)
MX (1) MX359817B (sr)
MY (1) MY176838A (sr)
NZ (2) NZ630542A (sr)
PE (1) PE20150646A1 (sr)
PH (1) PH12015500196A1 (sr)
PL (1) PL2885010T3 (sr)
PT (1) PT2885010T (sr)
RS (1) RS60080B1 (sr)
SG (2) SG11201500888SA (sr)
SI (1) SI2885010T1 (sr)
SM (1) SMT202000180T1 (sr)
TN (1) TN2015000050A1 (sr)
WO (1) WO2014028777A2 (sr)

Families Citing this family (65)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9365634B2 (en) 2007-05-29 2016-06-14 Angiochem Inc. Aprotinin-like polypeptides for delivering agents conjugated thereto to tissues
CA2740316A1 (en) 2008-10-15 2010-04-22 Angiochem Inc. Conjugates of glp-1 agonists and uses thereof
SG10201708959WA (en) 2012-07-03 2017-11-29 Univ Washington Antibodies to tau
NZ630542A (en) * 2012-08-16 2017-06-30 Ipierian Inc Methods of treating a tauopathy
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
US10501531B2 (en) 2013-03-13 2019-12-10 Prothena Biosciences Limited Tau immunotherapy
BR112015030356A2 (pt) * 2013-06-10 2017-12-05 Ipierian Inc métodos de tratamento de uma taupatia
BR112016010454A2 (pt) * 2013-11-27 2017-12-05 Ipierian Inc métodos para tratar uma taupatia
AU2014368696A1 (en) 2013-12-20 2016-06-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Humanized anti-Tau(pS422) antibodies and methods of use
JP2017512751A (ja) * 2014-02-14 2017-05-25 アイピエリアン，インコーポレイティド タウペプチド、抗タウ抗体、およびそれらの使用方法
AR100978A1 (es) * 2014-06-26 2016-11-16 Hoffmann La Roche LANZADERAS CEREBRALES DE ANTICUERPO HUMANIZADO ANTI-Tau(pS422) Y USOS DE LAS MISMAS
TWI734975B (zh) * 2014-06-27 2021-08-01 美商Ｃ２Ｎ醫療診斷有限責任公司 人類化抗-tau抗體
TWI669314B (zh) 2015-02-26 2019-08-21 美國禮來大藥廠 針對ｔａｕ之抗體及其用途
WO2016146655A1 (en) 2015-03-16 2016-09-22 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Novel 1,4-bis(3-aminopropyl)piperazine derivative and its use
NZ775762A (en) 2015-06-05 2025-02-28 Genentech Inc Anti-tau antibodies and methods of use
US20200030445A1 (en) * 2015-06-12 2020-01-30 C2N Diagnostics, Llc Stable formulations of humanized anti-tau antibody
EP3307326B9 (en) 2015-06-15 2021-02-24 Angiochem Inc. Methods for the treatment of leptomeningeal carcinomatosis
WO2016207245A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use
US10344081B2 (en) * 2015-07-06 2019-07-09 Ucb Biopharma Sprl Tau-binding antibodies
WO2017005734A1 (en) 2015-07-06 2017-01-12 Ucb Biopharma Sprl Tau-binding antibodies
JO3711B1 (ar) 2015-07-13 2021-01-31 H Lundbeck As أجسام مضادة محددة لبروتين تاو وطرق استعمالها
WO2017027691A1 (en) * 2015-08-13 2017-02-16 New York University Antibody-based molecules selective for the {p}ser404 epitope of tau and their uses in the diagnosis and treatment of tauopathy
PT3452507T (pt) 2016-05-02 2022-12-20 Prothena Biosciences Ltd Imunoterapia anti-tau
MY198194A (en) 2016-05-02 2023-08-09 Prothena Biosciences Ltd Antibodies Recognizing Tau
MX2018013386A (es) 2016-05-02 2019-02-28 Prothena Biosciences Ltd Anticuerpos que reconocen tau.
PH12018502613B1 (en) 2016-07-12 2023-02-01 H Lundbeck As Antibodies specific for hyperphosphorylated tau and methods of use thereof
CA3030754C (en) * 2016-07-20 2022-04-26 Anahit Ghochikyan Humanized anti-tau antibodies and compositions for and methods of making and using in treatment, diagnosis and monitoring of tauopathies
JP7019201B2 (ja) * 2016-08-02 2022-02-15 キュリアールエックス インコーポレーテッド リポソームの調製方法
CA3032692A1 (en) * 2016-08-09 2018-02-15 Eli Lilly And Company Combination antibody therapy for the treatment of neurodegenerative diseases
MX2019006330A (es) * 2016-12-07 2019-09-26 Genentech Inc Anticuerpos anti-tau y metodos de uso.
UA128383C2 (uk) * 2016-12-07 2024-07-03 Дженентек, Інк. Антитіло до тау-білка та спосіб його застосування
SG11201907422RA (en) 2017-02-17 2019-09-27 Denali Therapeutics Inc Anti-tau antibodies and methods of use thereof
JP2018139530A (ja) 2017-02-27 2018-09-13 帝人ファーマ株式会社 認知症治療又は予防のためのヒト化抗体及びその製造方法、並びにそれを用いた認知症治療剤又は予防剤
EP3601337A1 (en) 2017-03-28 2020-02-05 Genentech, Inc. Methods of treating neurodegenerative diseases
KR102784294B1 (ko) 2017-05-02 2025-03-19 프로테나 바이오사이언시즈 리미티드 타우 인식 항체
WO2018231254A1 (en) * 2017-06-16 2018-12-20 Bristol-Myers Squibb Company Compositions and methods for treating tauopathies
AU2018352308B2 (en) 2017-10-16 2025-06-05 Eisai R&D Management Co., Ltd. Anti-tau antibodies and uses thereof
CN108103027B (zh) * 2018-02-02 2021-12-24 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） 高效率血细胞重编程同时实现基因编辑的方法
CN112703402A (zh) * 2018-07-19 2021-04-23 吉宁特有限公司 基于标志物分子将个体鉴定为具有淀粉样蛋白阳性痴呆症或处于发展淀粉样蛋白阳性痴呆症的风险中的方法和相关用途
CA3107788A1 (en) 2018-07-31 2020-02-06 Eli Lilly And Company Combination of anti-tau antibody and oga inhibitor for treatment of diseases characterized by aberrant tau aggregation
US20220089704A1 (en) 2018-10-29 2022-03-24 Biogen Ma Inc. Humanized and stabilized fc5 variants for enhancement of blood brain barrier transport
CA3118818A1 (en) * 2018-11-08 2020-05-14 Prothena Biosciences Limited Antibodies recognizing tau
JP7547350B2 (ja) 2019-01-22 2024-09-09 クレムソン・ユニバーシティ・リサーチ・ファウンデーション 抗エラスチン抗体及び使用方法
JP7630834B2 (ja) 2019-03-03 2025-02-18 プロセナ バイオサイエンシーズ リミテッド タウ認識抗体
JP7181438B2 (ja) 2019-08-06 2022-11-30 アプリノイア セラピューティクス リミテッド 病理学的タウ種に結合する抗体及びその使用
AU2020397508A1 (en) * 2019-12-05 2022-06-09 Axoltis Pharma Peptide compositions and methods for treating Tauopathies
JP7713956B2 (ja) 2020-04-15 2025-07-28 ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッド タウ結合化合物
CA3183835A1 (en) 2020-06-25 2021-12-30 Jeanne E. Baker High affinity antibodies targeting tau phosphorylated at serine 413
US20240018231A1 (en) * 2020-10-30 2024-01-18 Rush University Medical Center Intranasal immunotherapt for the treatment of alzheimer's disease
CN117043183A (zh) 2020-12-16 2023-11-10 沃雅戈治疗公司 Tau结合化合物
CA3208191A1 (en) * 2021-02-14 2022-08-18 Philip James DOLAN III Methods of using antibodies recognizing tau
CL2021001380A1 (es) 2021-05-26 2022-01-14 Corporacion Centro Int De Biomedicina Icc Generación de un nuevo anticuerpo monoclonal sitio específico para la proteína tau y su uso como herramienta en biomarcadores específicos para la detección temprana de enfermedades neurodegenerativas y patologías involucradas con la proteína tau como alzheimer y otras demencias.
JP2024534151A (ja) 2021-08-27 2024-09-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド タウ病態の治療方法
WO2023039107A2 (en) * 2021-09-09 2023-03-16 Alzpath, Inc. Phospho-tau antibodies and methods of use
WO2023081194A2 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Biogen Ma Inc. Methods for treating alzheimer's disease
US20250034559A1 (en) 2021-11-17 2025-01-30 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
US12350658B2 (en) 2022-03-07 2025-07-08 Pavel Kudryavtsev Inorganic ion-exchanger for selective extraction of lithium from lithium-containing natural and industrial brines
US12337309B2 (en) 2022-03-07 2025-06-24 Pavel Kudryavtsev Method of manufacturing inorganic ion exchanger for the selective extraction of lithium from lithium-containing natural and technological brines
CN118871989A (zh) 2022-03-14 2024-10-29 基因泰克公司 基于语音分析来预测神经退行性疾病
JP2025525371A (ja) 2022-06-21 2025-08-05 ジェネンテック， インコーポレイテッド 音声分析に基づくアルツハイマー病（ａｄ）の長期的進行の検出
EP4543473A1 (en) 2022-06-22 2025-04-30 Voyager Therapeutics, Inc. Tau binding compounds
KR20250069606A (ko) 2022-09-15 2025-05-19 보이저 테라퓨틱스, 인크. 타우 결합 화합물
CN116948025B (zh) * 2023-09-14 2024-04-02 北京凯祥弘康生物科技有限公司 一种抗Tau蛋白的抗体
WO2025122634A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2025253337A2 (en) * 2024-06-05 2025-12-11 Sanofi Monospecific and bispecific tau binding proteins and compositions thereof

Family Cites Families (128)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US4866132A (en) 1986-04-17 1989-09-12 The Research Foundation Of State University Of New York Novel radiopaque barium polymer complexes, compositions of matter and articles prepared therefrom
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5811310A (en) 1986-09-30 1998-09-22 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva Univ. The Alz-50 monoclonal antibody and diagnostic assay for alzheimer's disease
ATE243754T1 (de) 1987-05-21 2003-07-15 Micromet Ag Multifunktionelle proteine mit vorbestimmter zielsetzung
US5256334A (en) 1988-09-08 1993-10-26 The Research Foundation Of The State University Of New York Homogeneous radiopaque polymer-organobismuth composites
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5595732A (en) 1991-03-25 1997-01-21 Hoffmann-La Roche Inc. Polyethylene-protein conjugates
EP0519596B1 (en) 1991-05-17 2005-02-23 Merck & Co. Inc. A method for reducing the immunogenicity of antibody variable domains
EP0600951A4 (en) 1991-08-01 1996-10-30 Paul H Voorheis Diagnostic method for alzheimer's disease.
US5733734A (en) 1991-08-14 1998-03-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of screening for Alzheimer's disease or disease associated with the accumulation of paired helical filaments
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
EP0605522B1 (en) 1991-09-23 1999-06-23 Medical Research Council Methods for the production of humanized antibodies
DE69220503T2 (de) 1991-10-25 1998-02-05 Innogenetics Nv Monoklonale Antikörper gegen das mikrotubulusassoziierte Protein Tau.
US5252479A (en) 1991-11-08 1993-10-12 Research Corporation Technologies, Inc. Safe vector for gene therapy
ATE207080T1 (de) 1991-11-25 2001-11-15 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
JP2579202Y2 (ja) 1992-04-10 1998-08-20 株式会社小松製作所 圧力補償弁を備えた操作弁
US5600392A (en) 1992-11-25 1997-02-04 Copal Company Limited Position sensor
EP1024198A3 (en) 1992-12-03 2002-05-29 Genzyme Corporation Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae
US6010913A (en) 1992-12-14 2000-01-04 N.V. Innogenetics S.A. Isolated human tau peptide
WO1994013795A1 (en) 1992-12-14 1994-06-23 N.V. Innogenetics S.A. Monoclonal antibodies directed against the microtubule-associated protein tau, hybridomas secreting these antibodies, antigen recognition by these monoclonal antibodies and their applications
US5346981A (en) 1993-01-13 1994-09-13 Miles Inc. Radiopaque polyurethanes
CA2115811A1 (en) 1993-02-17 1994-08-18 Claus Krebber A method for in vivo selection of ligand-binding proteins
EP0705344B8 (en) 1993-06-24 2006-05-10 Advec Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
AU687117B2 (en) 1993-10-25 1998-02-19 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
US5643575A (en) 1993-10-27 1997-07-01 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
ES2270421T3 (es) 1993-12-21 2007-04-01 Innogenetics N.V. Anticuerpos monoclonales especificos para phf-tau, hibridomas que secretan los mismos, reconocimiento de antigeno por estos anticuerpos y sus aplicaciones.
WO1996004309A1 (en) 1994-07-29 1996-02-15 Innogenetics N.V. Monoclonal antibodies specific for an epitope of a particular subclass or form of phosphorylated tau, hybridomas secreting them, antigen recognition of these antibodies and their applications
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
US7427392B1 (en) 1994-11-14 2008-09-23 Elan Pharmaceuticals, Inc. Methods for aiding in the diagnosis of alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) and tau
KR100551104B1 (ko) 1994-12-09 2006-02-09 임페리얼 컬리지 이노베이션스 리미티드 유전자의 동정
WO1996019487A1 (en) 1994-12-22 1996-06-27 Nissan Chemical Industries, Ltd. Organobismuth derivatives and process for producing the same
US5958713A (en) 1995-01-31 1999-09-28 Novo Nordisk A/S Method of detecting biologically active substances by using green fluorescent protein
US5670477A (en) 1995-04-20 1997-09-23 Joseph F. Poduslo Method to enhance permeability of the blood/brain blood/nerve bariers to therapeutic agents
US5968738A (en) 1995-12-06 1999-10-19 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Two-reporter FACS analysis of mammalian cells using green fluorescent proteins
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US6020192A (en) 1996-01-18 2000-02-01 University Of Florida Humanized green fluorescent protein genes and methods
ES2166097T5 (es) 1996-08-27 2007-03-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Glicoconjugados de neisseria meningitidis de serogrupo b y procedimientos para usarlos.
US5976796A (en) 1996-10-04 1999-11-02 Loma Linda University Construction and expression of renilla luciferase and green fluorescent protein fusion genes
TW371617B (en) 1996-10-09 1999-10-11 Of Animal And Plant Health Inspection And Quarantine Council Of Agriculture Executive Yuan Bureau Method to transplant GFP into autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus for inflicting pest in an attempt to detect and flow up it existence and to improve life span against UV
AU5508798A (en) 1996-11-19 1998-06-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania, The Diagnostic and therapeutic reagents for alzheimer's disease
US6080849A (en) 1997-09-10 2000-06-27 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
KR20010015856A (ko) 1997-12-12 2001-02-26 마크로메드 인코퍼레이션 단백질 변성용으로 헤테로 작용기를 가진 별 모양의폴리(에틸렌글리콜)
US20040014142A1 (en) 1998-07-03 2004-01-22 Innogenetics N.V. Differential diagnosis of neurodegeneration
US5985577A (en) 1998-10-14 1999-11-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Protein conjugates containing multimers of green fluorescent protein
EP1204674A4 (en) 1999-07-27 2005-06-01 Abgenix Inc METHODS AND COMPOUNDS FOR PREVENTING POLYPEPTIDE COLLECTIONS ASSOCIATED WITH NEUROLOGICAL DISORDERS
ATE342509T1 (de) 2000-01-24 2006-11-15 Innogenetics Nv Diagnose von tauopathien durch bestimmung des verhältnisses von tau/phospho-tau
DE60141752D1 (de) 2000-06-30 2010-05-20 Innogenetics Nv Differentielle diagnose von neurologischen krankheiten
JP2004503747A (ja) 2000-07-11 2004-02-05 モレキュラー　ジェリアトリクス　コーポレイション 結合物質の同定するための試薬と方法
AU2002222139A1 (en) * 2000-12-09 2002-06-18 Cambridge University Technical Services Limited Hcv vaccines
US7466180B2 (en) 2000-12-12 2008-12-16 Intel Corporation Clock network
GB0101049D0 (en) 2001-01-15 2001-02-28 Univ Aberdeen Materials and methods relating to protein aggregation in neurodegenerative disease
AT500379B8 (de) 2001-02-02 2009-08-15 Axon Neuroscience Tau-proteine
GB0105924D0 (en) 2001-03-09 2001-04-25 Microscience Ltd Promoter
WO2002094191A2 (en) 2001-05-23 2002-11-28 New York University Detection of alzheimer's amyloid by magnetic resonance imaging
GB0117326D0 (en) 2001-07-16 2001-09-05 Univ Aberdeen Napthoquinone-type inhibitors of protein aggregation
AU2002355477B2 (en) 2001-08-03 2008-09-25 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
IL160701A0 (en) 2001-09-21 2004-08-31 Mitsubishi Pharma Corp 3-substituted-4-pyrimidone derivatives
WO2004001421A2 (en) 2002-06-21 2003-12-31 Innogenetics N.V. Method for the diagnosis and differential diagnosis of neurological diseases
US20060167227A1 (en) 2002-07-12 2006-07-27 Axon Neuroscience Forschungs-Und Entwicklungs Gmbh Truncated tau proteins
US7250551B2 (en) 2002-07-24 2007-07-31 President And Fellows Of Harvard College Transgenic mice expressing inducible human p25
JP4393382B2 (ja) 2002-08-14 2010-01-06 三菱化学株式会社 中枢性タウ蛋白質特異的抗体
EP1480041A1 (en) 2003-05-22 2004-11-24 Innogenetics N.V. Method for the prediction, diagnosis and differential diagnosis of Alzheimer's disease
EP2784084B2 (en) 2003-07-08 2023-10-04 Novartis Pharma AG Antagonist antibodies to IL-17A/F heterologous polypeptides
US20050261475A1 (en) 2004-02-13 2005-11-24 Harvard Medical School Solid-phase capture-release-tag methods for phosphoproteomic analyses
US7238788B2 (en) 2004-02-18 2007-07-03 University Of Iowa Foundation Antibodies to phosphorylated tau, methods of making and methods of use
CA2555989A1 (en) 2004-02-24 2005-09-01 Innogenetics N.V. Method for determining the risk of developing a neurological disease
ES2367311T3 (es) 2004-04-15 2011-11-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Productos de degradación proteolítica de map-2 como biomarcadores de diagnóstico para las lesiones neurales.
CA2570458C (en) * 2004-06-09 2014-05-20 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibodies for selective apoptosis of cells
US7632924B2 (en) 2004-06-18 2009-12-15 Ambrx, Inc. Antigen-binding polypeptides and their uses
CN1721437A (zh) * 2004-07-13 2006-01-18 中南大学 一种与Tau蛋白相关的多肽抗原及抗体
JP4730584B2 (ja) 2004-12-06 2011-07-20 東亞合成株式会社 抗菌ペプチド及びその利用
US20090016959A1 (en) 2005-02-18 2009-01-15 Richard Beliveau Delivery of antibodies to the central nervous system
EP1772732A1 (en) 2005-10-07 2007-04-11 Innogenetics N.V. Polymer replicated interdigitated electrode arrays for (bio)sensing applications
US8741260B2 (en) 2005-10-07 2014-06-03 Armagen Technologies, Inc. Fusion proteins for delivery of GDNF to the CNS
WO2007068105A1 (en) 2005-12-12 2007-06-21 Robarts Research Institute Method of diagnosing amyotrophic lateral sclerosis
US20070218491A1 (en) 2006-02-08 2007-09-20 Oligomerix, Inc. Oligomerization of amyloid proteins
US20110143380A1 (en) 2006-03-14 2011-06-16 The Washington University Alzheimer's disease biomarkers and methods of use
US8012936B2 (en) 2006-03-29 2011-09-06 New York University Tau fragments for immunotherapy
US8729225B2 (en) 2006-11-13 2014-05-20 Intrexon Corporation Glycogen synthase kinase heteropolyligand polypeptide
HRP20140049T1 (hr) 2007-01-05 2014-02-28 University Of Zürich Anti beta-amiloid antitijela i njihova upotreba
WO2008140639A2 (en) 2007-02-08 2008-11-20 Oligomerix, Inc. Biomarkers and assays for alzheimer's disease
WO2009002607A1 (en) 2007-05-01 2008-12-31 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for identifying transforming and tumor suppressor genes
PE20090329A1 (es) 2007-05-30 2009-03-27 Abbott Lab Anticuerpos humanizados contra el globulomero ab(20-42) y sus usos
EP2198292A4 (en) 2007-08-21 2010-09-08 Univ Washington IMPROVED MORBUS ALZHEIMER DIAGNOSIS
WO2009027105A2 (en) 2007-08-31 2009-03-05 Neurimmune Therapeutics Ag Method of providing patient specific immune response in amyloidoses and protein aggregation disorders
WO2009033151A1 (en) 2007-09-07 2009-03-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tau protein screening assay
US8506933B2 (en) 2007-11-30 2013-08-13 Msdx, Inc. Methods of detecting a neurological condition via analysis of circulating phagocytes
JP5781929B2 (ja) 2008-07-15 2015-09-24 ノバルティス アーゲー 免疫原性の両親媒性ペプチド組成物
US20110312059A1 (en) 2008-08-20 2011-12-22 Oligomerix Inc. Tau protease compositions and methods
US9464122B2 (en) 2008-08-20 2016-10-11 Oligomerix, Inc. Methods and compositions comprising tau oligomers
CN102348723A (zh) 2008-12-05 2012-02-08 安吉奥开米公司 肽治疗剂轭合物及其应用
US9605054B2 (en) 2009-02-23 2017-03-28 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Composition and method for treating a tauopathy
UA107571C2 (xx) 2009-04-03 2015-01-26 Фармацевтична композиція
WO2010129674A2 (en) 2009-05-05 2010-11-11 New York University Immunotherapy targeting of the shared abnormal conformational state of amyloidogenic peptides/proteins
CN103154735B (zh) 2009-05-11 2018-10-02 连接Dx股份有限公司 用于检测分析物的方法和组合物
CN106390107B (zh) 2009-06-10 2019-12-31 纽约大学 病理tau蛋白的免疫靶向
US8609097B2 (en) 2009-06-10 2013-12-17 Hoffmann-La Roche Inc. Use of an anti-Tau pS422 antibody for the treatment of brain diseases
JP2013500326A (ja) 2009-07-30 2013-01-07 ファイザー バクシーンズ エルエルシー 抗原性タウペプチドおよびその使用
AU2010286501B2 (en) 2009-08-28 2015-06-11 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Antibodies that bind Tau oligomers
DK2496594T3 (en) 2009-11-06 2018-03-05 The J David Gladstone Inst METHODS AND COMPOSITIONS FOR MODULATING TAU LEVELS
WO2012020124A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Ac Immune S.A. Vaccine engineering
MY164376A (en) * 2010-10-07 2017-12-15 Univ Leuven Kath Phosphospecific antibodies recognizing tau
CA2813493C (en) 2010-10-11 2019-07-09 University Of Zurich Human anti-tau antibodies
US20120244174A1 (en) 2011-01-31 2012-09-27 Intellect Neurosciences Inc. Treatment of tauopathies
EP2686418A4 (en) 2011-03-17 2015-04-22 Minerva Biotechnologies Corp METHOD FOR THE PRODUCTION OF PLURIPOTENTAL STEM CELLS
GB201111361D0 (en) 2011-07-04 2011-08-17 Nordic Bioscience As Biochemical markers for neurodegenerative conditions
GB201112056D0 (en) * 2011-07-14 2011-08-31 Univ Leuven Kath Antibodies
ME03008B (me) 2011-09-19 2018-10-20 Axon Neuroscience Se Terapija na osnovu proteina i dijagnoza patologije u којој posreduje tau u alcнajмerovoj bolesti
CA2811188C (en) 2011-09-23 2020-04-28 Andrea Pfeifer Vaccine therapy
KR101981351B1 (ko) 2011-10-07 2019-09-02 에이씨 이뮨 에스.에이. 타우를 인식하는 포스포특이적 항체
US20140294724A1 (en) 2011-10-24 2014-10-02 Intellect Neurosciences, Inc. Compositions and methods for treatment of proteinopathies
MX350311B (es) 2011-12-20 2017-09-01 Janssen Biotech Inc Anticuerpos anti-phf-tau y sus usos.
RU2644242C2 (ru) 2012-04-05 2018-02-08 Ац Иммуне С.А. Гуманизированное тау-антитело
SG10201708959WA (en) * 2012-07-03 2017-11-29 Univ Washington Antibodies to tau
NZ630542A (en) 2012-08-16 2017-06-30 Ipierian Inc Methods of treating a tauopathy
US20140056901A1 (en) 2012-08-21 2014-02-27 The Institute For Molecular Medicine Anti-tau antibodies and compositions for and methods of making and using in treatment, diagnosis and monitoring of tauopathies
US8980270B2 (en) 2013-01-18 2015-03-17 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
BR112015030356A2 (pt) * 2013-06-10 2017-12-05 Ipierian Inc métodos de tratamento de uma taupatia
US20160122421A1 (en) 2013-06-10 2016-05-05 Ipierian, Inc. Methods of treating a tauopathy
BR112016010454A2 (pt) 2013-11-27 2017-12-05 Ipierian Inc métodos para tratar uma taupatia
JP2017512751A (ja) 2014-02-14 2017-05-25 アイピエリアン，インコーポレイティド タウペプチド、抗タウ抗体、およびそれらの使用方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013302540A1 (en) 2015-04-02
US20140099304A1 (en) 2014-04-10
US20190169275A1 (en) 2019-06-06
EA201590388A1 (ru) 2015-08-31
US9567395B2 (en) 2017-02-14
TN2015000050A1 (en) 2016-06-29
GB2507207A (en) 2014-04-23
EP2885010A2 (en) 2015-06-24
NZ630542A (en) 2017-06-30
WO2014028777A2 (en) 2014-02-20
PH12015500196B1 (en) 2015-04-06
HRP20200036T1 (hr) 2020-08-21
EP2885010A4 (en) 2016-06-08
KR102076384B1 (ko) 2020-02-11
EA202193044A2 (ru) 2022-03-31
PE20150646A1 (es) 2015-05-21
MX359817B (es) 2018-10-11
AU2013302540B2 (en) 2018-02-15
SI2885010T1 (sl) 2020-07-31
SMT202000180T1 (it) 2020-05-08
HK1208175A1 (en) 2016-02-26
CL2015000352A1 (es) 2015-11-13
JP2015532592A (ja) 2015-11-12
US8926974B2 (en) 2015-01-06
CY1123515T1 (el) 2022-03-24
US20140099303A1 (en) 2014-04-10
CA2882034A1 (en) 2014-02-20
EA035976B1 (ru) 2020-09-08
MY176838A (en) 2020-08-24
ME03667B (me) 2020-10-20
EP3685854A1 (en) 2020-07-29
US10040847B2 (en) 2018-08-07
US20170174755A1 (en) 2017-06-22
MX2015001601A (es) 2015-09-25
PH12015500196A1 (en) 2015-04-06
EP2885010B1 (en) 2020-01-01
BR112015003326A2 (pt) 2017-07-04
ES2775192T3 (es) 2020-07-24
IL237153A0 (en) 2015-04-30
DK2885010T3 (da) 2020-02-03
PT2885010T (pt) 2020-03-11
GB201322812D0 (en) 2014-02-05
CA2882034C (en) 2019-10-29
JP6290212B2 (ja) 2018-03-07
US20150239963A1 (en) 2015-08-27
IL237153B (en) 2018-05-31
NZ730763A (en) 2018-06-29
PL2885010T3 (pl) 2020-11-16
HUE048780T2 (hu) 2020-09-28
SG11201500888SA (en) 2015-03-30
CN104736185B (zh) 2018-03-20
US20140086921A1 (en) 2014-03-27
KR20150042828A (ko) 2015-04-21
SG10201701181XA (en) 2017-04-27
WO2014028777A3 (en) 2014-05-08
LT2885010T (lt) 2020-04-27
CN104736185A (zh) 2015-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10040847B2 (en) Methods of treating a tauopathy
US9777058B2 (en) Methods of treating a tauopathy
EP3007726B1 (en) Methods of treating a tauopathy
US20160122421A1 (en) Methods of treating a tauopathy
HK40043983A (en) Methods of treating a tauopathy
HK40031459A (en) Methods of treating a tauopathy
HK1208175B (en) Methods of treating a tauopathy