RS60187B1 - Metoda za pripremanje amg 416 - Google Patents

Description

Opis

OBLAST

[0001] Predmetno obelodanjivanje se odnosi na oblast polipeptidne sinteze, preciznije, na sintezu AMG 416 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

POZADINA

[0002] AMG 416 je sintetički, selektivni agonist peptida receptora za opažanje kalcijuma sa osam amino kiselina. Razvija se kao intravensko tretiranje sekundarnog hiperparatiroidizma (SHPT) kod pacijenata sa hemodijalizom koji imaju hroničnu bubrežnu bolest - mineralno koštani poremećaj (CKD-MBD).

[0003] Hidrohloridna so AMG 416 ima hemijsku strukturu:

[0004] Glavni lanac ima 7 amino kiselina, sve u D-konfiguraciji. Bočni lanac cistein ostatka je u L-konfiguraciji. Molekularna formula AMG 416 (slobodna baza) je C38H73N21O10S2, i računa se kao srednja molekulska masa 1048,3 Da.

[0005] AMG 416 i metoda za njegovo pripremanje su opisani u međunarodnoj objavi patenta br. WO 2011/014707. Kao što je opisano u međunarodnoj objavi patenta br. WO 2011/014707, AMG 416 se može napraviti sintezom čvrste faze iz odgovarajućih Fmoczaštićenih D-amino kiselina. Nakon deljenja od smole, materijal se može tretirati sa Boc-L-Cys(NPyS)-OH kako bi se formirala disulfidna veza. Boc grupa se može ukloniti trifluoroacetatom (TFA) i dobijeni proizvod se može prečistiti tečnom hromatografijom sa visokim pritiskom i reverznom fazom (HPLC) i izolovati kao oblik TFA soli liofilizovanjem. TFA so se može pretvoriti u farmaceutski prihvatljivu so vršenjem procedure uzastopne izmene soli. Takve procedure su dobro poznate u struci i obuhvataju, npr., jonoizmenjivačke tehnike, opciono praćene prečišćavanjem dobijenog proizvoda (na primer tečnom hromatografijom sa reverznom fazom ili reverznom osmozom).

[0006] Postoji potreba za efikasnom metodom za proizvodnju AMG 416 ili njegove farmaceutske prihvatljive soli (npr., AMG 416 HCl), a naročito za onom koja je pogodna za proizvodnju u komercijalnoj razmeri.

[0007] WO 2011/014707 obelodanjuje konjugat koji obuhvata peptidni nosač gde je peptid na svom N-terminalnom kraju konjugovan sa Cys ostatkom i njegovu upotrebu pri tretiranju sekundarnog hiperparatiroidizma.

[0008] Castell i dr. (1979) Helvetic Chimica Acta obelodanjuje korisna svojstva 2-Piridin sulfenil hlorida (PS-Cl) kod simultane deprotekcije i aktiviranja merkapto-grupe cisteina i cistein-peptida pre formiranja disulfidne veze.

REZIME

[0009] U pogledu iznad opisanih problema, cilj obelodanjivanja je, između ostalog, da se pruži metoda za pripremanje AMG 416 ili njegove farmaceutski prihvatljive soli.

Prema prvom aspektu pronalaska, data je metoda za pripremanje AMG 416 kao što je dato u formuli (I):

navedena metoda obuhvata:

dovođenje peptida koji ima strukturu Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2(SEQ ID NO:4) u kontakt sa L-Cys kako bi se dobio konjugovani proizvod formule (I). Prema sledećem aspektu, data je metoda za pripremanje AMG 416 kao što je dato u formuli (I):

navedena metoda obuhvata:

prečišćavanje peptida koji ima strukturu Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-ArgD-Ala-D-Arg-NH2(SEQ ID NO:4) sa HPLC u rastvoru trifluorosirćetne kiseline (TFA);

vršenje razmene rastvarača azeotropnom destilacijom na prečišćenom peptidu; i dovođenje prečišćenog peptida u kontakt sa L-Cys kako bi se dobio konjugovani proizvod formule (I).

[0010] Takođe je ovde obelodanjena metoda za pripremanje AMG 416, gde metoda obuhvata: pružanje peptida vezanog za smolu koji ima strukturu izabranu iz grupe koju čine Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[Smola] (SEQ ID NO:2) i Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[Smola] (SEQ ID NO:3); deljenje peptida od čvrste podloge; i aktiviranje bočnog lanca D-Cys ostatka podeljenog peptida.

[0011] U jednom ili više otelotvorenja ovog obelodanjivanja, koraci deljenja i aktiviranja se vrše u istom sudu.

[0012] U jednom ili više sledećih otelotvorenja, peptid vezan za smolu se dovodi u kontakt sa rastvorom koji obuhvata vodu, trifluorosirćetnu kiselinu, triizopropilsilan i dipiridildisulfid.

[0013] U jednom aspektu, data je metoda za pripremanje AMG 416, gde metoda obuhvata: pružanje peptida koji ima strukturu Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2(SEQ ID NO:4); i dovođenje peptida u kontakt sa L-Cy kako bi se dobio konjugovani proizvod.

[0014] U nekim otelotvorenjima, peptid se dovodi u kontakt sa vodenim rastvorom koji obuhvata L-Cys i trifluorosirćetnu kiselinu.

[0015] U sledećem otelotvorenju, metoda dalje obuhvata liofilizovanje konjugovanog proizvoda.

[0016] U još nekim sledećim otelotvorenjima, metoda dalje obuhvata dovođenje konjugovanog proizvoda u kontakt sa vodenim rastvorom koji obuhvata izopropil alkohol (IPA) i hlorovodoničnu kiselinu (HCl) čime se proizvodi talog koji obuhvata AMG 416 HCl.

[0017] U još jednom ili više sledećih otelotvorenja, metoda dalje obuhvata prečišćavanje taloga tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC).

[0018] Takođe je ovde obelodanjena metoda za pripremanje AMG 416, gde metoda obuhvata: pružanje peptida vezanog za smolu koji ima strukturu izabranu iz grupe koju čine Fmoc-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[Smola] (SEQ ID NO:2) i Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-[Smola] (SEQ ID NO:3); deljenje peptida od čvrste podloge, tj., kako bi se pružio peptid bez podloge, i aktiviranje bočnog lanca D-Cys ostatka peptida bez podloge kako bi se stvorio AMG 416 SPy međuproizvod (gde je SPy 2-piridinsulfenil ili S-Pyr), rastvaranje AMG 416 SPy međuproizvoda u vodenoj 0,1% TFA (trifluorosirćetna kiselina) i prečišćavanje AMG 416 SPy derivata sa HPLC.

[0019] U nekim otelotvorenjima, metoda dalje obuhvata azeotropnu destilaciju AMG 416 SPy međuproizvoda, kako bi se uticalo na razmenu rastvarača za proizvodnju rastvora AMG 416 SPy u novom rastvaraču, npr., vodi ili izopropil alkoholu.

[0020] U još nekim dodatnim otelotvorenjima, metoda dalje obuhvata dovođenje rastvora izopropil alkohola - vode AMG 416 SPy, u nekim otelotvorenjima u obliku svoje trifluoroacetat soli, u kontakt sa vodenim rastvorom koji obuhvata L-Cys.

[0021] Takođe je ovde obelodanjena metoda za pripremanje H-D-Arg(Pbf)-OH, tj., pogodnog početnog materijala za određene sintetičke metode koje su ovde date.

[0022] U nekim otelotvorenjima obelodanjivanja, metoda obuhvata pretvaranje Boc-D-Arg-OH u Boc-D-Arg(Pbf)-OH u prisustvu NaI (natrijum jodid). U još nekim sledećim otelotvorenjima, natrijum jodid je prisutan pri koncentraciji od oko 5% mol.

[0023] U nekim dodatnim otelotvorenjima obelodanjivanja, metoda dalje obuhvata pretvaranje Boc-D-Arg(Pbf)-OH u D-Arg(Pbf)-OH, i kristalizaciju D-Arg(Pbf)-OH u sistemu IPA/vodeni rastvarač.

[0024] Dodatna otelotvorenja ovde opisanih metoda će biti očigledna iz sledećeg opisa, primera i patentnih zahteva. Kao što se može shvatiti iz iznad navedenog i sledećeg opisa, svako ovde opisano svojstvo i svaka kombinacija dva ili više takvih svojstava je obuhvaćeno u okviru predmetnog obelodanjivanja uz uslov da svojstva obuhvaćena u takvim kombinacijama nisu međusobno neusklađena. Dodatno, bilo koje svojstvo ili kombinacija svojstava mogu biti naročito isključena iz bilo kog otelotvorenja predmetnog pronalaska.

KRATAK OPIS SLIKA

[0025]

SL. 1 prikazuje hemijsku strukturu AMG 416 (Ac-D-Cys(L-Cys-OH)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2) (SEQ ID NO:1).

SL. 2 prikazuje hemijsku strukturu Rink Amid AM smole i Ac-D-Cys(Trt)- D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-smole (SEQ ID NO:3).

SL. 3 prikazuje reakcionu šemu gde se SPy međuproizvod (Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2) (SEQ ID NO:4) formira iz peptidil-smole (Ac-D-Cys(Trt)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-NH-smola) (SEQ ID NO:3).

SL. 4 prikazuje reakcionu šemu gde se TFA so AMG 416 formira iz SPy međuproizvoda (AA<1-7(SPy)>).

SL. 5 prikazuje reakcionu šemu gde se HCl AMG 416 formira iz TFA soli AMG 416. SL. 6 prikazuje reakcionu šemu gde se Boc-D-Arg(Pbf)-OH formira iz Boc-D-Arg-OH.

SL. 7 prikazuje reakcionu šemu gde se D-Arg(Pbf)-OH formira iz Boc-D-Arg(Pbf)-OH.

DETALJNI OPIS

[0026] Predmetno obelodanjivanje će sada potpunije biti opisano.

[0027] Kada se isti termin definiše i u objavi, patentu ili patentnoj prijavi koje su ovde navedene i u predmetnom obelodanjivanju, definicija predmetnog obelodanjivanja predstavlja kontrolnu definiciju.

[0028] Naslovi odeljaka koji su ovde upotrebljeni samo u organizacione svrhe i nisu konstruisani da ograničavaju opisanu tematiku.

[0029] Ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini koji se koriste u vezi sa predmetnom prijavom će imati značenja koja su uopšteno prihvaćena od strane stručnjaka u ovoj oblasti. Dalje, ukoliko nije drugačije zahtevano kontekstom, termini u jednini će obuhvatati množinu a termini u množini će obuhvatati jedninu.

[0030] Uopšteno, nomenklature koje se koriste u vezi sa, i tehnike, molekularne biologije i hemije proteina koje su ovde opisane su dobro poznate i obično korišćene u struci. Metode i tehnike predmetne patentne prijave se uopšteno vrše u skladu sa konvencionalnim metodama dobro poznatim u struci i kao što je opisano u različitim opštim i naročitim referencama koje su citirane i razmatrane kroz predmetnu specifikaciju ukoliko nije drugačije ukazano. Videti, npr., Laszlo, Peptide-Based Drug Design: Methods and Protocols, Humana Press (2008); Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press (2005); Ausubel i dr., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992). Tehnike prečišćavanja su izvršene u skladu sa specifikacijama proizvođača, kao što se obično vrši u struci ili kao što je ovde opisano. Terminologija koja se koristi u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane su dobro poznate i obično se koriste u struci. Standardne tehnike se mogu koristiti za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutske preparate, formulacije i za isporuku i tretiranje pacijenata.

[0031] Trebalo bi prihvatiti da ovo obelodanjivanje nije ograničeno na naročitu metodologiju, protokole i reagense, itd., koji su ovde opisani i kao takvo može varirati. Terminologija koja se ovde koristi je u svrhu opisivanja samo naročitih otelotvorenja i nije namenjena da ograniči okvir obelodanjenog, što je definisano samo patentnim zahtevima.

[0032] Termin „oko“ naročito kada se odnosi na datu količinu je predviđen da obuhvati devijacije od plus ili minus pet procenata.

I. Opšte definicije

[0033] Članovi u engleskom jeziku „a“ i „an“ se ovde koriste za označavanje jednog ili više od jednog (tj., bar jednog) od gramatičkih objekata člana, ukoliko nije drugačije ukazano. Putem primera „element“ predstavlja jedan element ili više od jednog elementa.

[0034] Termin „AMG 416“ je takođe poznat kao etelkalcetid, prethodno poznat kao velkalcetid ili KAI-4169, i odnosi se na jedinjenje koje ima hemijski naziv: N-acetil-Dcistenil-D-alanil-D-arginil-D-arginil-D-arginil-D-alanil-D-arginamid disulfid sa L-cisteinom, koji ima sledeću strukturnu formulu:

[0035] Referenca na AMG 416 ili bilo koje jedinjenje ili fragment, međuproizvod ili prekursor AMG 416 koji su ovde opisani, je namenjena da obuhvati njegove neutralne, nepromenjene oblike, kao i njegove farmaceutski prihvatljive soli, hidrate i solvate.

[0036] Termini „AMG 416 hidrohlorid“ i „AMG 416 HCl“ su naizmenični i odnose se na oblik hidrohloridne soli AMG 416 koji ima sledeću strukturnu formulu:

[0037] Uopšteno, x ima vrednost od 3-5 (npr., 3, 4 ili 5).

[0038] „Farmaceutski prihvatljiva so“ se odnosi na oblik soli jedinjenja koje ima bar jednu grupu pogodnu za formiranje soli koja ne izaziva štetno toksikološko dejstvo kod pacijenta. Termin „farmaceutski prihvatljiva so“ se može, u jednom pogledu, odnositi na relativno netoksične, neorganske ili organske adicione soli jedinjenja kao što je ovde dato, npr., AMG 416 kao i fragmenti, međuproizvodi, prekursori AMG 416 i slično koji poseduju jednu ili više amin grupa koje se mogu jonizovati. Reprezentativne soli obuhvataju hidrohlorid, hidrohlorid, sulfat, bisulfat, fosfat, nitrat, acetat, valerat, oleat, palmitat, stearat, laurat, benzoat, laktat, fosfat, tozilat, citrat, maleat, fumarat, sukcinat, tartarat, naftilat, mezilat, glukoheptonat, laktobionat i laurilsulfonat soli i slično. (Videti, na primer, Berge i dr. (1977) „Pharmaceutical Salts“, J. Pharm. Sci.66:1-19). Dodatni pogodni oblici farmaceutski prihvatljivih soli se mogu pronaći, npr., u Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, Weinheim/Zürich:Wiley-VCH/VHCA, 2002; P. H. Stahl i C. G. Wermuth, ured.

[0039] Kako se ovde koristi, termini „amino kiselina“ i „ostatak“ se koriste naizmenično i, kada se koriste u kontekstu peptida ili polipeptida, odnose se i na prirodne i veštačke amino kiseline, kao i analoge amino kiselina, mimetike amino kiselina i amino kiseline nije se ne javljaju u prirodu koje su hemijski slične prirodnim amino kiselinama. „Slobodna amino kiselina“ ili „slobodna amino grupa“ se odnosi na amino kiselinu, peptidni fragment ili peptid koji ima amino grupu koja je u obliku -NH2, koji je nezaštićen.

[0040] Fraza „zaštitna grupa“ ili „PG“ kako se ovde koristi se odnosi na trenutni supstituent ili supstituente koji štite potencijalno reaktivnu funkcionalnu grupu od neželjene hemijske transformacije. Primeri takvih zaštitnih grupa obuhvataju estre karboksilne kiseline, silil etre alkohola i acetale i ketale aldehida i ketona, respektivno. Videti, npr., Greene, T.W.; Wuts, P.G.M. Protective Groups in Organic Synthesis, 4. izd.; Wiley: New York, 2007; Isidro-Llobet, A., i dr., Amino Acid-Protecting Groups, Chem. Rev 2009, 109, 2455-2504.

Reaktivne amino kiseline ili peptidni fragmenti kao što je ovde opisano pogodno sadrže jednu ili više zaštitnih grupa na funkcionalnostima koje nisu cilj date hemijske transformacije. Primerne zaštitne grupe obuhvataju, npr., karboksibenzil, takođe se naziva benziloksikarbonil („Cbz“ ili „Z“), 9-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc), 2,2,4,6,7-pentametildihirobenzofuran-5-sulfonil (Pbf), terc-butiloksikarbonil (Boc), tritil (Trt), metil estar (OMe), 2-piridinsulfenil (SPy ili S-Pyr), amid i slično. U ovde datim skraćenim strukturama, -NH2na C-terminusu označava amid zaštitnu grupu (∼C(O)NH2), „H“ na N-terminusu predstavlja slobodnu amino grupu i označavanje zaštitne grupe u zagradama označava da je zaštitna grupa na δ azotu ili ornitinu.

[0041] Kako se ovde koristi, termini „sredstvo koje eliminiše zaštitu“ ili „sredstvo za deprotekciju“ se mogu koristiti naizmenično i predstavljaju hemijski reagens za uklanjanje amino-zaštitnih sredstava povezanih sa amino kiselinama, i amino-zaštitna sredstva mogu biti dobro poznata u oblasti, kao što su, bez ograničenja Fmoc i Boc.

[0042] Kako se ovde koristi, termini „sredstvo za spajanje“, „sredstvo za kondenzaciju“, „sredstvo za aktiviranje“, „sredstvo za aktiviranje kondenzacije“ se ovde koriste naizmenično i odnose se na hemijski reagens koji olakšava reakciju amino grupe iz jedne amino kiseline sa karboksil grupom iz druge amino kiseline kako bi se formirala peptidna veza. Primerna sredstva za spajanje su dobro poznata u struci i obuhvataju ali nisu ograničena na karboimide kao što su N,N'- diizopropilkarbodiimid (DIC), dicikloheksilkarbodiimid (DCC), 1-[Bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat (HATU), [benzotriazol-1-iloksi(dimetilamino)metiliden]-dimetilazanijum;tetrafluoroborat (TBTU), N,N,N',N'-tetrametil-O-(1H-benzotriazol-1-il)uronijum heksafluorofosfat, O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HBTU), i N,N-diizopropiletil amin (DIPEA).

Videti ,npr., El-Faham, A. i Albericio, F., „Peptide Coupling Reagents, More than a Letter Soup“, Chem. Rev.2011, 111, 6557-6602. Takva jedinjenja su lako dostupna kod komercijalnih prodavaca.

[0043] Kako se ovde koristi, termin „sredstvo za deljenje“ se odnosi na hemijsko sredstvo koje može podeliti peptidnu vezu na smolu od smole. Sredstva za deljenje su dobro poznata stručnjacima u ovoj oblasti i obuhvataju kisele rastvore koji sadrže TFA i HCl rastvor.

[0044] Termin „tretiranje“ se odnosi na bilo koju indikaciju uspeha pri tretiranju ili poboljšanja povrede, patologije ili stanja, uključujući bilo koji objektivni ili subjektivni parametar kao što je smanjenje; remisija; smanjenje znakova ili simptoma ili činjenje da se povreda, patologija ili stanje lakše tolerišu od strane pacijenta; usporavanje brzine degeneracije ili opadanja; činjenje krajnje tačke degeneracije slabijom; poboljšanje fizičkog ili mentalnog zdravlja pacijenta. Tretiranje ili poboljšavanje znakova ili simptoma se može zasnovati na objektivnim ili subjektivnim parametrima; uključujući rezultate fizičkog pregleda. Na primer, određene metode koje su ovde predstavljene uspešno tretiranju SHPT kod pacijenata sa hemodijalizom sa CKD-MBD smanjenjem nepromenjenog paratiroidnog hormona (iPTH) u serumu.

[0045] „Delotvorna količina“ je uopšteno količina koja je dovoljna da smanji ozbiljnost i/ili učestalost simptoma, da eliminiše simptome i/ili bolest ispod njih, da spreči javljanje simptoma i/ili bolesti ispod njih i/ili da poboljša ili ukloni oštećenje koje je rezultat ili je povezano sa bolesti (npr., povišeni PTH nivoi). „Terapeutski delotvorna količina“ je količina koja je dovoljna da ukloni bolesti ili simptome, naročito stanje ili simptome koji su povezani sa bolesti ili na drugi način da spreči, ometa, uspori ili vrati tok napredovanja bolesti ili bilo kog drugog neželjenog simptoma povezanog sa bolesti na bilo koji način. Potpuno terapeutsko dejstvo se ne javlja nužno davanjem jedne doze i može se javiti nakon davanja samo jedne doze u okviru niza. Zbog toga, terapeutski delotvorna količina se može dati u okviru jednog ili više davanja.

1

[0046] Termini „Terapeutski delotvorna doza“ i „terapeutski delotvorna količina“, kako se ovde koristi, predstavljaju količinu koja izaziva biološki ili medicinski odgovor u sistemu tkiva, životinji ili čoveku koji se prati od strane istraživača, lekara ili drugog kliničara, koji obuhvataju ublažavanje ili poboljšanje znakova ili simptoma bolesti ili poremećaja koji se tretiraju, tj., količinu velkalcetida koja pomaže nivou koji se može pratiti jednog ili više željenih bioloških ili medicinskih odgovora, na primer, smanjenje iPTH.

[0047] Termini „peptid“, „polipeptid“ i protein“ su naizmenični i odnose se na polimer ili ostatke amino kiseline. Termini se takođe mogu primeniti na polimere amino kiselina gde je jedan ili više aminokiselinskih ostataka analog ili mimetik odgovarajuće prirodne amino kiseline, kao i prirodnih polimera amino kiselina. Termini takođe mogu obuhvatati polimere amino kiselina koji su modifikovani, npr., dodavanjem ostataka ugljenih hidrata kako bi se formirali glikoprotein ili kako bi se izvršila fosforilacija. Peptidi, polipeptidi i proteini se mogu proizvesti sintezom sa tečnom fazom ili sintezom sa čvrstom fazon ili genetskim inženjeringom ili rekombinantnim ćelijama i obuhvataju molekule koji imaju aminokiselinsku sekvencu.

[0048] „Varijanta“ peptida ili polipeptida obuhvata aminokiselinsku sekvencu gde je jedan ili više aminokiselinskih ostataka unet u, izbrisan i/ili zamenjen sa aminokiselinskim ostatkom relativno u odnosu na drugu polipeptidnu sekvencu. Varijante obuhvataju fuzione proteine.

[0049] „Derivat“ peptida ili polipeptida je peptid ili polipeptid koji je hemijski modifikovan na način koji se razlikuje od unošenja, brisanja ili zamenjivanja varijante, npr., konjugovanjem sa drugim hemijskim delom. Takve modifikacije mogu obuhvatati kovalentno dodavanje grupe amino i/ili karboksi terminusa peptida ili polipeptida, npr., acetilacija amino terminusa i/ili amidacija karboksi terminusa peptida ili polipeptida.

[0050] Termin „amino kiselina“ obuhvata normalno značenje u struci. Dvadeset prirodnih amino kiselina i njihove skraćenice prate konvencionalnu upotrebu. Videti, Immunology-A Synthesis, 2. izdanje, (E. S. Golub i D. R. Green, eds.), Sinauer Associates: Sunderland, Mass. (1991). Stereoizomeri (npr., D-amino kiseline) 19 konvencionalnih amino kiselina (osim glicina), amino kiseline koje nisu prirodne, kao što su [alfa]-, [alfa]-distribuirane amino kiseline, N-alkil amino kiseline i druge nekonvencionalne amino kiseline takođe mogu biti pogodne komponente za polipeptide i uključene su u okviru izraza „amino kiselina“. Primeri nekonvencionalnih amino kiselina obuhvataju: homocistein, ornitin, 4-hidroksiprolin, [gama]-karboksiglutamat, [epsilon]-N,N,N-trimetilizin, [epsilon]-N-acetilizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilisin, [sigma]-N-metilarginin, i druge slične amino kiseline i imino kiseline (npr., 4-hidroksiprolin), U notaciji polipeptida koja je ovde korišćena, sa leve strane je smer amino terminusa, a sa desne strane je smer karboksi terminusa, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.

[0051] "Ispitanik" ili "pacijent“ kako se ovde koristi može biti bilo koji sisar. U tipičnom otelotvorenju obelodanjivanja, ispitanik je čovek.

[0052] Termin „q.s.“ predstavlja da se dodaje količina koja je dovoljna da se postigne željena funkcija, npr., da se rastvor dovede do željene zapremine (tj., 100%).

II. Otelotvorenja

[0053] U jednom ili više otelotvorenja, AMG 416 hidrohlorid je pripremljen nizom faza procesa kao što sledi: primerne faze obuhvataju peptidnu sintezu sa čvrstom fazom sedmočlanog linearnog fragmenta (faza I) AMG 416, što je praćeno deljenjem peptidnog lanca od smole pratećom deprotekcijom bočnog lanca i aktiviranjem cisteina (faza II), što je praćeno in situ konjugacijom peptidnog lanca sa L-Cys (formiranje disulfida) kako bi se dobio sirovi AMG 416 (faza III), što je praćeno, u nekim otelotvorenjima, neposredno, preparativnom HPLC i liofilizovanjem kako bi se dobila AMG 416 TFA so (faza IV). Faza IV je praćena kasnijim izmenjivanjem soli (TFA u HCl) taloženjem, a u nekim otelotvorenjima je praćena mikrofiltracijom i liofilizovanjem kako bi se dobila prečišćena AMG 416 hidrohloridna so (faza V).

Sinteza peptida čvrste faze

[0054] Sedmočlani linearni fragment AMG 416 se može sintetisati bilo kojom metodom poznatom u struci, uključujući peptidnu sintezu sa čvrstom fazom (SPPS). Kako se ovde koristi, termin „sinteza sa čvrstom fazom“ ili „peptida sinteza sa čvrstom fazom“ se odnosi na metodu, dobro poznatu stručnjaku u ovoj oblasti gde je rastući peptidni lanac povezan za čvrstu podlogu. Sinteza sa čvrstom fazom se obično sastoji od koraka: (i) kovalentno vezivanje prve amino kiseline (čija je amino grupa blokirana ili „zaštićena“) sa nosačem čvrste faze; (ii) uklanjanje zaštitne grupe iz amino grupe upotrebom sredstva za deprotekciju; (iii) aktiviranje karboksila druge amino kiseline (čija je amino grupa blokirana) i dovođenje druge amino kiseline u kontakt sa prvom amino kiselinom vezanom za nosač čvrste faze tako da se dobije dipeptid (čija je amino grupa blokirana); (iv) ponavljanje koraka formiranja peptidne veze i time je peptidni lanac produžen od C-terminusa do N-terminusa; i (v) uklanjanje zaštitne grupe amino grupe i odvajanje peptidnog lanca od nosača čvrste faze sa sredstvom za deljenje kako bi se dobio peptid.

[0055] Pogodne tehnike sinteze sa čvrstom fazom su dobro poznate u struci, i obuhvataju one koje su opisane u Merrifield, in Chem. Polypeptides, str.335-61 (Katsoyannis i Panayotis ured. 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc.85:2149 (1963); Davis i dr., Biochem. Intl.

10:394-414 (1985); Stewart i Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); pat. SAD.. br. 3,941,763; Finn i dr., The Proteins, 3. izd., tom.2, str.105-253 (1976); i Erickson i dr., The Proteins, 3. izd., tom. 2, str.257-527 (1976). Takođe videti Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry. Dodatne pomoćne knjige 4. izd., Tom E22A, „Synthesis of Peptides and Peptidomimetics“, glavni urednik M. Goodman. Georg Thieme Verlag: Stuttgard i New York.

2002, str.685-877; Chan, W.C., White, P.D., „Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach“. Oxford University Press, (200), str.9-109. Sinteza čvrste faze je obično poželjna tehnika za pravljenje pojedinačnih peptida kao što je AMG 416, kako je najčešće najekonomičnija metoda za pravljenje malih peptida.

[0056] U nekim otelotvorenjima, linearni fragment glavnog lanca AMG 416 je napravljen upotrebom standardnih protokola peptidne sinteze sa čvrstom fazom koji koriste strategiju Fmoc zaštite i, na primer, Rink amid (RAM) smolu kao što je dostupno od Sigma Aldrich, kako bi se dobio amid koji je na C-terminusu vezan za smolu zajedno sa acetilacijom N-terminusa peptida. U nekim drugim otelotvorenjima, druge smole i sredstva za vezivanje se mogu koristiti (npr., Ramage amid AM smola koja se takođe naziva kao vezivna smola triciklični amid). Pravljenje linearnog fragmenta glavnog lanca može obuhvatati korake: (i) mešanje Fmoc-Rink amid Am smole sa sredstvom za deprotekciju kako bi se dobila Rink amid AM smola; (ii) kondenzovanje Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH sa Rink amid AM smolom kako bi se dobila Fmoc-D-Arg(Pbf)-Rink amide AM smola; (iii) ponavljanje Fmoc deprotekcije u koraku (i) i kondenzovanje između amino kiseline i polipeptida na smoli u koraku (ii) za svaki preostali aminokiselinski ostatak linearnog fragmenta glavnog lanca AMG 416, postupanjem od C-terminusa do N-terminusa (npr., upotrebom Fmoc- D-Cys(Trt)-OH, Fmoc-D-Ala-OH i Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH) kako bi se formirala polipeptidna smola predstavljena sa SEQ ID NO:2; i (iv) ponavljanje Fmoc deprotekcije u koraku (i) i acetilacija N-terminusa kako bi se

1

formirala peptidna smola predstavljena sa SEQ ID NO:3. Videti SL. 2.

[0057] Obično, deljenje Fmoc zaštitne grupe se postiže upotrebom sredstva za deprotekciju kao što je piperidin u DMF. U jednom otelotvorenju, spajanje Fmoc-zaštićene amino kiseline se vrši u rastvaraču kao što je dimetilformamid (DMF) upotrebom pogodnog sredstva za spajanje kao što je karbodiimid sredstvo za spajanje, N,N-diizopropilkarbodiimid (DIC), opciono u prisustvu aditiva kao što je etil 2-cijano-2-(hidroksiimino)acetat (Oksima) za sve amino kiseline osim cisteina. U slučaju produženja peptidnog lanca sa cisteinom, spajanje se obično vrši upotrebom N,N-diizopropilkarbodiimida (DIC) u prisustvu benzotriazol aditiva kao što je hidroksibenzotriazol (HOBT) u sistemu rastvarača kao što je dimetil formamiddihlorometan (tj., DMF, DCM, HOBt, DIC).

[0058] Acetilacija N-terminusa se može ostvariti bilo kojom metodom poznatom u struci. U jednom otelotvorenju, acetilacija N-terminusa se vrši upotrebom, na primer, anhidrida sirćetne kiseline (Ac2O) u piridinu i DMF.

Deljenje od smole

[0059] Peptid se može odvojiti od podloge, i zaštitne grupe se mogu ukloniti od bočnih lanaca na načine koji su poznati u struci. Videti, npr., Synthetic Peptides: A User's Guide (G.A. Grant, ured.), W.H. Freeman i Company, New York, 1992; i Chan, W.C., White, P.D. „Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach“, Oxford University Press (2000), str.

64-66 i 105-109.

[0060] U jednom otelotvorenju, peptidil-smola se dodaje u pomešani rastvor koji sadrži vodu (npr., dejonizovana voda (DIV)), trifluorosirćetnu kiselinu (TFA), triizopropilsilan (TIPS) i dipiridildisulfid (DPDS). Ovo omogućava da se peptidi odvoje od smole rekombinantnom deprotekcijom bočnog lanca i aktiviranjem cisteina, i time se pripremaju za in situ konjugaciju sa L-Cys. Proizvedeno je sedam međuproizvoda amino kiselina SPy (AA<1-7(SPy)>). Videti SL.3. Sekvenca SPy međuproizvoda je data u SEQ ID NO:4.

Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2

(SEQ ID NO:4)

In-situ konjugacija i preparativna HPLC

[0061] SPy međuproizvod može biti konjugovan sa L-Cys bilo kojom metodom poznatom u struci. U jednom otelotvorenju, konjugacija sa L-Cys se vrši u vodenom TFA.

[0062] Proizvedeni AMG 416 (TFA so) se može prečistiti na bilo koji poznati način u struci. U jednim otelotvorenju, AMG 416 (TFA so) se prečišćava tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC). Na primer, u jednom otelotvorenju, prečišćavanje i koncentracija AMG 416 (TFA so) obuhvata korak prečišćavanja sa HPLC sa reverznom fazom i korak koncentrovanja sa HPLC sa reverznom fazom. Videti SL.4.

[0063] Prečišćeni i koncentrovani uzorak koji sadrži AMG 416 (TFA so) se može liofilizovati.

Konverzija soli

[0064] TFA so se može pretvoriti u farmaceutski prihvatljivu so, kao što je hidrohloridna so, na bilo koji način koji je poznat u struci.

[0065] U jednom otelotvorenju, liofilizovana TFA so AMG 416 je rastvorena u vodenom rastvoru izopropil alkohola (IPA). Rastvor TFA soli se zatim stavlja u HCl rastvor za izmenu soli i taloženje HCl soli. Talog se zatim može rekonstituisati sa vodom, filtrirati kroz mikro filter (npr., 0,2 µm filter) i liofilizovati do izolata HCl soli AMG 416. Videti SL.5.

Prečišćavanje SPy međuproizvoda

[0066] U alternativnom otelotvorenju, međuproizvod SPy je prečišćen pre konjugacije sa L-Cys. Uopšteno, međuproizvodi SPy, naročito peptidni SPy međuproizvodi, se smatraju da su veoma nestabilni, tj., smatra se da nisu dovoljno stabilni da izdrže dovoljno prečišćavanje, kao što je sa HPLC. Međutim, došavši do ovde datih metoda, podnosioci prijave su otkrili da su peptid-SPy međuproizvodi pripremljeni prema ovde opisanim metodama zaista dovoljno stabilni da izdrže odvojeni korak prečišćavanja. Pored toga, dalje je otkriveno da

1

prečišćavanje takvih međuproizvoda pre konjugacije sa L-Cys zapravo može povećati efikasnost i smanjiti troškove proizvodnje krajnjeg proizvoda peptidnog leka.

[0067] U primernom otelotvorenju, alternativna metoda se vrši kao što sledi. Metoda opisana ispod i u Primeru 5 je od koristi za prečišćavanje SPy međuproizvoda kao što je ovde dato, gde međuproizvod preostaje stabilan i pogodan je za konjugaciju sa delom koji sadrži tiol, npr., formiranjem disulfidne veze. Na primer, peptidni SPy međuproizvod je rastvoren u vodenom rastvoru koji ne sadrži više od oko 0,2% TFA, na primer, oko 0,05% do 0,15% TFA, ili oko 0,1% TFA, i zatim se direktno primenjuje u HPLC kolonu za hromatografsko prečišćavanje. Izmena rastvarača HPLC frakcija koje sadrže peptidni SPy međuproizvod se zatim može izvršiti, na primer, azeotropnom destilacijom. Nakon izmene rastvarača peptidnog SPy međuproizvoda u odgovarajući rastvarač, kao što je smeša vode i izopropanola, deo koji sadrži tiol, kao što je L-Cys se dodaje direktno u rastvor peptidnog SPy međuproizvoda kako bi se uticalo na konjugaciju. Dobijeni konjugovani proizvod, npr., u rastvoru, je zatim dostupan za izmenu soli.

[0068] Naročito otelotvorenje prethodne metode prečišćavanja je kao što sledi. Nakon početnog deljenja peptida od podloge smole i izolovanja AA<1-7(SPy)>međuproizvoda, međuproizvod je rastvoren u 0,1% TFA i acetonitrilu, postavljen je u stacionarnu fazonu kolone za HPLC i prečišćen je kao što je opisano iznad. Upotreba 0,1% TFA rastvora je imala više prednosti za HPLC prečišćavanje u poređenju sa upotrebom, na primer, 0,2% TFA rastvora. Na primer, 0,1% TFA je vršio manje štete na stacionarnoj fazi za vreme prečišćavanja od TFA rastvora sa većom koncentracijom. Odnosno, korišćenjem takve optimizovane koncentracije TFA dolazi do manjeg raspadanja stacionarne faze, što za rezultat daje duži vek stacionarne faze. Pored toga, peptidni SPy međuproizvod (npr., AA<1-7(SPy)>) je manje polaran, što za rezultat daje da se međuproizvod bolje zadržava na reverznoj fazi stacionarne faze. Kao rezultat, mnogo veće postavljanje u stacionarnu fazu se može postići u svakom koraku prečišćavanja. U nekim otelotvorenjima, povećani kapacitet postavljanja povećava protok procesa proizvodnje za od 1,5 do 2 puta, ili oko 1,5 puta.

[0069] HPLC frakcije koje sadrže SPy međuproizvod kao TFA so su zatim izložene azeotropnoj destilaciji sa dovoljnim IPA naelektrisanjem kako bi se izmenio rastvarač iz acetonitrila i vode u 15% vodu u IPA rastvoru što je pogodno za L-Cys konjugaciju i izmenu soli. Ova metoda je naročito pogodna ikako se konjugacija i izmena soli mogu izvršiti u

1

jednom sudu, što dalje poboljšava efikasnost i izvodljivost procesa proizvodnje.

Proizvodnja Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH početnog materijala

[0070] AMG 416 obuhvata linearnu sekvencu od 7 amino kiselina, od kojih su 4 D-arginini. Ovde je obelodanjena metoda za sintetisanje Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH, Fmoc derivata D-arginina koji se koristi u sintezi AMG 416. Upotreba Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH početnog materijala visokog kvaliteta može podesiti dodatnu čistoću sirovom AMG 416 od faze I do faze III kako bi se time poboljšao prinos prečišćavanja u fazi IV. Što je važnije, upotreba početnog materijala velike čistoće i visokog kvaliteta može pružiti željeni i pogodno kontrolni element kako bi se osigurala željena čistoća AMG 416. Razvijen je novi proces za pripremanje D-Arg(Pbf)-OH i Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH visokog kvaliteta koji daje veći prinos, i zahteva manje jediničnih operacija, pruža robusniju kontrolu kvaliteta i podložan je za proizvodnju u velikoj razmeri. Ukratko, ovde opisana metoda za pripremanje Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH predstavlja značajno povećanje izvodljivosti proizvodnje AMG 416 koja je praćena potencijalnim povećanjem kvaliteta.

[0071] Sintetički način koji je jedna od najkonciznijih sinteza Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH koje se mogu pronaći u literaturi i koje se mogu koristiti u komercijalnoj razmeri Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH je kao što sledi. Videti, npr., kineski patent br. CN101250172B, 2. maj 2012. Sinteza počinje protekcijom amino grupe D-Arg sa di-terc-butil dikarbonatom (Boc2O) što prinosi Boc-D-Arg-OH u približno kvantitativnom prinosu nakon izolacije. U koraku 2, guanidin grupa bočnog lanca je zaštićena sa Pbf grupom u prisustvu baze kao što je vodeni natrijum hidroksid. Proizvod se direktno koristi u sledećem koraku kao IPA (izopropil alkohol) rastvor bez izolacije. Korak 3 obuhvata uklanjanje Boc zaštitne grupe pod kiselim uslovima, i izolovanje odgovarajućeg proizvoda, D-Arg(Pbf)-OH, kao kristalni međuproizvod. Korak 4 procesa obuhvata instaliranje Fmoc zaštitne grupe na amino funkcionalnosti kako bi se dobio Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH kao krajnji proizvod. Kako su i korak 2 i korak 4 proizvodi amorfni materijali, tj., pružaju ograničenu sposobnost da odbiju nečistoće, kristalni međuproizvod D-Arg(Pbf)-OH (proizvod iz koraka 3) služi kao kontrolna tačka za uticaj i obezbeđivanje čistoće krajnjeg proizvoda.

[0072] Kada se oslanja na procese zabeležene u literaturi značajan je izazov dobijanje proizvoda velike čistoće. Više rekristalizacija je obično neophodno da bi se zadovoljile potrebe čistoće. Kao primer, D-Arg(Pbf)-OH se rekristalizuje sedam puta u sistemu

1

EtOH/EtOAc/voda tercijarni rastvarač kako bi se poboljšala čistoća do željenog nivoa.

Dodatno, u koraku 2, 20-30% početnog materijala preostaje nereagovano čak i u prisustvu velike količine natrijum hidroksida i PbfCl i ukupni prinos (korak 1 do 3) je obično samo manji od 40%.

[0073] Razvijeni i ovde opisani proces koji je prikazan na SL-ma 6 i 7 pruža nekoliko pogodnosti u odnosu na poznate procese. NaI je uveden kao katalizator za pretvaranje Boc-D-Arg-OH u Boc-D-Arg(Pbf)-OH (videti Korak 2 na SL.6). Inkorporacija natrijum jodida je efikasna i značajno poboljšava kinetiku reakcije i kao rezultat, konverzija koraka 2 se može povećati do više od 95% i prinos analize se može povećati do ∼90%. Dodatno, ukupna količina nečistoća je takođe smanjena.

[0074] D-Orn(Pbf)-OH i etil estar D-Arg(Pbf)-OH su ključne nečistoće formirane u koraku 2 i koraku 3 (SL.7), respektivno, i teško se uklanjaju kristalizaciju, što time doprinosi potrebi za većim brojem rekristalizacija. Poboljšani proces koji je ovde opisan dalje obuhvata upotrebu izopropil acetata (IPAc), estar koji je više sterično sprečen u poređenju sa češće korišćenim EtOAc, kao rastvarača u koraku 3 gde se Boc-D-Arg(Pbf)-OH pretvara u D-Arg(Pbf)-OH. Upotreba IPAc značajno usporava bočnu reakciju, transesterifikaciju, katalisanu jakom kiselinom, HCl. Kao rezultat, sadržaj odgovarajuće nečistoće, estar D-Arg(Pbf)-OH, se smanjuje do manje od oko 0,5% (u odnosu na više od 1,0% u procesu koji koristi EtOAc). Dodatno, pronađeno je da je izopropil alkohol (IPA)/voda moćniji sistem rastvarača što omogućava uklanjanje svih nečistoća procesa dok se minimizira gubitak proizvoda u koracima kristalizacije. U probnoj analizi sprovedenoj u laboratorijskoj razmeri (20 g), čistoća D-Arg(Pbf)-OH (međuproizvod koraka 3) je poboljšana do više od 99,7% samo sa dve kristalizacije a ukupni prinos (koraci od 1 do 3) je bio približno 70%. Jedno otelotvorenje ovog poboljšanog procesa je opisano u Primeru 6 ispod.

[0075] Stručnjak u ovoj oblasti će lako uvažiti da se predmetno obelodanjivanje proširuje na varijante i derivate AMG 416. Na primer, ovde date metode se takođe mogu koristiti sa N-acetil-D-cisteinil-D-alanil-D-arginil-D-arginil-D-arginil-D-alanil-D-arginamid disulfidom sa D-cisteinom. Obelodanjene formulacije se takođe mogu koristiti sa N-acetil-L-cisteinil-L-alanil-L-arginil-L-arginil-L-arginil-L-alanil-L-arginamid disulfidom sa D-cisteinom i/ili N-acetil-L-cisteinil-L-alanil-L-arginil-L-arginil-L-arginil-L-alanil-L-arginamid disulfidom sa L-cisteinom. Obelodanjena formulacija se takođe može koristiti sa N-acetil-D-cisteinil- D-

1

arginil-D-alanil-D-arginil-D-arginil-D-alanil-D-arginamid disulfidom sa L-cisteinom i/ili N-acetil-D-cisteinil-D-arginil-D-alanil-D-arginil-D-arginil-D-alanil-D-arginamid disulfidom sa D-cisteinom. Dodatno, trenutne metode se mogu iskoristiti za pripremanje jednog ili više jedinjenja koja su data u Tabeli 1, Tabeli 2, Tabeli 3, Tabeli 4, Tabeli 5, Tabeli 6, Tabeli 7, Tabeli 8, Tabeli 9 i/ili Tabeli 10 u međunarodnoj objavi patenta br. WO 2011/014707. Ovde opisane metode se takođe mogu koristiti za pripremanje jedinjenja opisanih u međunarodnoj objavi patenta br. WO 2011/014707.

PRIMERI

[0076] Sledeći primeri, uključujući sprovedene eksperimente i dobijene rezultate, su dati samo u prikazne svrhe.

PRIMER 1A

Sinteza linearnog fragmenta glavnog lanca

[0077] Sinteza linearnog fragmenta glavnog lanca je prikazana na SL.2. Rink Amid AM smola (Fmoc 2,4-dimetoksi-4'(karboksimetiloksi)-benzhidrilamin povezan za Aminoetil smolu) (1 kg) je dodat u DMF (5,8 L/kg) i rastvor je mešan pri 22 °C. Smola je filtrirana i muljna smeša je isprana. Uzorak je testiran za preostali Fmoc (UV test) i preostali piperidin (pH). Kaiser i/ili TNBS testovi boje su sprovedeni kako bi se osiguralo da je izvršena Fmoc deprotekcija.

[0078] Prvih šest spajanja derivata amino kiseline je pratilo istu proceduru za prethodnu aktivaciju, spajanje i ispiranje.1,6 ekv zaštićene Fmoc amino kiseline je dodato u DMF, 8,9 L/kg pri 22 °C. Oksima (2,45 ekv) je zatim dodat. Rastvor je ohlađen do 21 °C i DIC (2,13 ekv) je dodato i reakcija je ostavljena da se izvrši. Prethodno aktivirani rastvor je kombinovan sa smolom i reakcija je ostavljena da se izvrši. DIC (1,07 ekv) je dodat i reakcija je ostavljena da se izvrši pri 22 °C. Uzorak je testiran za nekompletno spajanje upotrebom Kaiser i/ili TNBS testa boje. Materijal je ispran, nakon čega je izvršena Fmoc deprotekcija i dodatno ispiranje. Uzorak je testiran za preostali Fmoc (UV test) i preostali piperidin (pH). Kaiser i/ili TNBS testovi boje su sprovedeni kako bi se osiguralo je Fmoc deprotekcija izvršena.

[0079] Fmoc-D-Cys(Trt)-OH 1,6 ekv je dodat u 1:1.7 DMF:DCM rastvor, 12 L/kg, nakon čega je sledilo dodavanje HOBt.H2O (2,45 ekv). Rastvor je ohlađen do 20 °C i DIC (2,13 ekv) je dodat i reakcija je ostavljena da se izvrši. Prethodno aktivirani rastvor je kombinovan sa

1

smolom i reakcija je ostavljena da se izvrši pri 22 °C. DIC 1,07 ekv je stavljen u SPPS reakciju, gde je odnos DMF/DCM bio oko 1:1. Reakcija je ostavljena da se izvrši pri 22 °C. Uzorak je testiran za nekompletno spajanje upotrebom Kaiser i/ili TNBS testa boje.

[0080] Materijal je ispran, nakon čega je izvršena Fmoc deprotekcija i dodatno ispiranje. Uzorak je testiran za preostali Fmoc (UV test) i preostali piperidin (pH). Kaiser i/ili TNBS testovi boje su sprovedeni kako bi se osiguralo je Fmoc deprotekcija izvršena.

[0081] DMF (0 L/kg); Kiseli anhidrid (1,06 L/kg) i piridin (1,06 L/kg) su dodati u rastvor i rastvor je mešan zbog prethodne aktivacije. Rastvor za prethodnu aktivaciju je kombinovan sa smolom i mešan pri 22 °C. Materijal je filtriran i ispran. Uzorak je testiran za nekompletno stvaranje kape upotrebom Kaiser i/ili TNBS testova boje. Materijal je ispran od muljne smeše. Smola je osušena pod azotom bez mešanja. Uzorak suve smole je uzet za testiranje LOD i preostalog rastvarača. Videti SL.2.

PRIMER 1B

Sinteza linearnog fragmenta glavnog lanca

[0082] Sinteza linearnog fragmenta glavnog lanca AMG 416 je prikazana na SL.2. Peptidni lanac je izgrađen od C-terminusa do N-terminusa na Rink AM amid smolu, sa 1 amino kiselinom po ciklusu. Svaki ciklus se sastoji od 2 reakciona koraka: 1) Fmoc deljenje od N-terminusa; 2) Spajanje sledeće Fmoc-zaštićene amino kiseline ili krajnja acetilacija.

[0083] Početak SPPS: Rink AM amid smola (1,0 mol) je preneta u SPPS reaktor i isprana sa N,N'-Dimetilformamidom (DMF).

[0084] Fmoc deljenje: Smola iz prethodnog koraka je suspendovana u rastvoru 20% piperidina u DMF u trajanju od bar 10 min. Završavanje Fmoc deljenja je praćeno merenjem apsorpcije ultraljubičastog (UV) zračenja. Nakon završetka Fmoc deljenja, smola je isprana alternativno sa DMF i izopropanolom (IPA) sve dok se nije postigla neutralna pH vrednost.

[0085] Spajanje Fmoc-amino kiseline: Nakon koraka Fmoc deljenja, reakcija spajanja je izvršena mešanjem smole sa rastvorom Fmoc-zaštićenim derivatom amino kiseline (> 1,2 mol) i reagenasa za aktivaciju (> 1,8 mola) (N,N'-diizopropilkarbodiimid (DIC) i etil (hidroksiimino)-cijanoacetatom (Oksima)) u DMF. Za spajanje Fmoc-D-Cys(Trt)-OH, DIC i

2

1-hidroksibenzotriazol hidrata (HOBt) su korišćena sredstva za aktivaciju, i smeša DMF i dihlorometana (DCM) je korišćena kao rastvarač za reakciju. Reakciona smeša je mešana na temperaturi okoline preko noći. Kaiser i TNBS testovi su izvršeni radi praćenja završetka spajanja. Negativni rezultat Kaiser i TNBS testova su potrebni pre nego što proces pređe u sledeći ciklus. Nakon svakog koraka spajanja ili stvaranja kape, smola je alternativno isprana sa DMF i IPA.

[0086] Krajnja acetilacija: Nakon krajnje Fmoc deprotekcije, N-terminalna amino grupa peptida je acetilisana upotrebom anhidrid sirćetne kiseline i piridina u DMF. Kaiser i TNBS testovi su izvršeni kako bi se proverio završetak acetilacije. Ukoliko je acetilacija nepotpuna, ista procedura acetilacije je zatim ponovljena sve dok se nisu dobili negativni rezultati i kod Kaiser i TNBS testa.

[0087] Na kraju, zaštićeni glavni lanac peptida supstance leka na smoli (AMG 416-Smola) je izolovan filtracijom, ispran sa DMF, IPA i acetonitrilom (ACN) i osušen pod redukovanim pritiskom.

PRIMER 2A

Deljenje linearnog fragmenta glavnog lanca od smole

[0088] Pomešani rastvor je pripremljen kombinovanjem DIW (016 L/kg); TFA (5,64 L/kg); TIPS (0,46 ekviv) i DPDS, (6,41 ekviv) na sobnoj temperaturi i zatim hlađenjem rastvora do 0±2 °C. Peptid na smoli je dodat u pomešani rastvor pri 0±2 °C i rastvor je zagrejan do 25 °C i reakcija je ostavljena da se izvrši. Smola je uklonjena filtracijom i potom je ispirana. Rastvor je držan na -10 °C i 6.8:1 rastvor IPE:MeCN (24.5 L/kg) pri -10 °C je dodat vremenom kako bi se kontrolisali temperatura i taloženje. Reakcija je ostavljena da se izvrši i AMG 416 SPy međuproizvod je filtriran pri 5 °C i ispran. SPy međuproizvod je osušen pri 20 °C pod punim vakuumom. Videti SL.3.

PRIMER 2B

Deljenje linearnog fragmenta glavnog lanca od smole

[0089] Rastvor za deljenje je pripremljen u reaktoru mešanjem TFA, H2O i triizopropilsilana (TIPS) u odgovarajućem odnosu od 96.9:2.6:0.5 (v/v/v). U rastvor za deljenje, DPDS (>1,2 mola) je dodat kao sredstvo za aktiviranje reagensa sulfhidrilne grupe C-cisteina. AMG 416-Smola (1,0 mol) je stavljena u reaktor i reakciona smeša je mešana u trajanju > 1 h na sobnoj temperaturi. Smola je filtrirana. Filtrat i rastvori za ispiranje su preneti u drugi reaktor i ohlađeni. Hladna smeša protiv rastvaranja diizopropil etra (IPE) i ACN su zatim stavljeni u rastvor kako bi se AMG 416 SPy istaložio. Suspenzija je filtrirana kroz filter za sušenje i filterski kolač AMG 416 SPy je zatim ispran sa ACN i IPE i osušen približno pri 20 °C pod redukovanim pritiskom na filteru za sušenje.

PRIMER 3

In-situ konjugacija sa L-Cys/ preparativna HPLC

[0090] AMG 416 SPy međuproizvod (1,0 mol) je dodat u 0,2% TFA rastvor. L-cistein (> 1,1 molova) je dodat u rastvor i reakcija je ostavljena da se izvrši na sobnoj temperaturi u trajanju od bar 15 min.

[0091] Prečišćavanje sirovog AMG 416 je izvršeno preparativnom hromatografijom upotrebom C18 silika gel stacionarne faze upotrebom ACN / H2O kao mobilne faze i TFA kao modifikatora. Sirovi AMG 416 rastvor iz Faze III je stavljen u kolonu i korišćena je metoda linearnog gradijenta u koraku prečišćavanja. Elucija je praćenja apsorbovanjem UV zračenja pri 230 nm. Nakon svakog stavljanja kolona je isprana sa 80% ACN u vodu (v/v) sve dok se nije postigao stabilni osnovni pravac UV. Frakcije su čuvane pri 5° uzorkovane su i zatim su frakcije koje su imale željenu čistoću (određenu sa HPLC) objedinjene.

Kombinovane frakcije iz koraka prečišćavanja su koncentrovane koncentrovanjem na istoj HPLC koloni. Frakcije su čuvane pri 5 °C. Frakcije sa željenom čistoćom (određenom sa HPLC) su liofilizovane kako bi se izolovala AMG 416 TFA so. Videti SL.4.

PRIMER 4

Konverzija soli

[0092] AMG 416 TFA so je dodata u rastvor od 15% vode u IPA (v/v) 10 L/kg pri 10 °C sve dok se nije primetilo rastvaranje. Rastvor je dodat u rastvor 12M vodene HCl, 0,27 L/kg i IPA 49,4 L/kg u trajanju od 3 sata površinskim dodavanjem, što se ispoljilo direktnim taloženjem AMG 4164,5 HCl soli. Serija je ostavljena 3 sata i uzorkovana radi analize.

[0093] Materijal je filtriran i muljna smeša je isprana sa 96% wt% IPA, 10 L/kg. Kolač je zatim ponovno napravljen u muljnu smešu u trajanju od 4 sata u 10 L/kg 96% wt% IPA. Materijal je filtriran i dodatna muljna smeša je isprana sa 96% IPA, 10 L/kg i zatim IPA 10 L/kg. Materijal je osušen pod punim vakuumom pri 25 °C. Suvi kolač je rastvoren u vodi 8 L/kg i serija je koncentrovana destilacijom kako bi se uklonila preostala IPA i postigla željena koncentracija. Temperatura rastvora je držana ispod 25 °C u toku destilacije. Videti SL.5.

PRIMER 5

Prečišćavanje SPy međuproizvoda i proizvodnja AMG 416 HCl

[0094] Alternativna metoda za pripremanje AMG 416 HCl soli je ovde opisana. Kao što je opisano u Primeru 2 iznad, SPy međuproizvod je osušen pri 20 °C pod punim vakuumom nakon deljenja od smole, taloženja i filtriranja. Talog je zatim rastvoren u 0,1% TFA vodenom rastvoru i stavljen u C-18 kolonu za prečišćavanje pomoću HPLC. Kolona je radila pri <60 bara i temperatura rastvora je bila 15-25 °C. Eluenti su bili 0,1% TFA u acetonitrilu i 0,1% TFA u vodi. Frakcije su čuvane pri 5°, uzorkovane su i zatim su frakcije objedinjene. Kombinovane frakcije iz dva procesa su razblažene i izvršeno je koncentrovanje/prečišćavanje upotrebom iste HPLC kolone kako bi se smanjila ukupna zapremina i uklonile dodane nečistoće. Frakcije su čuvane pri 5 °C.

[0095] Frakcije koje su sadržale AMG 416 SPy međuproizvod su izložene azeotropnoj destilaciji kako bi se promenio rastvarač od 0,1% TFA do 15% vode u IPA rastvoru, menjajući IPA kao što je potrebno. U dobijeni AMG 416 SPy međuproizvod u IPA rastvoru je zatim dodat L-cistein 1,15 ekv i reakcija je ostavljena da se izvrši na sobnoj temperaturi kako bi se javilo konjugovanje radi formiranja AMG 416 TFA soli kao što je opisano iznad u Primeru 4. AMG 416 TFA rastvor je dodat u rastvor 12M vodene HCl, 0,27 L/kg i IPA 49,4 L/kg u trajanju od 3 sata površinskim dodavanjem, što se ispoljilo direktnim taloženjem AMG 416 4,5 HCl soli. Serija je ostavljena 3 sata i uzorkovana radi analize.

[0096] Materijal je filtriran i muljna smeša je isprana sa 96% wt% IPA, 10 L/kg. Kolač je zatim ponovno napravljen u muljnu smešu u trajanju od 4 sata u 10 L/kg 96% wt% IPA. Materijal je filtriran i dodatna muljna smeša je isprana sa 96% IPA, 10 L/kg i zatim IPA 10 L/kg. Materijal je osušen pod punim vakuumom pri 25 °C. Suvi kolač je rastvoren u vodi 8 L/kg i serija je koncentrovana destilacijom kako bi se uklonila preostala IPA i postigla željena koncentracija. Temperatura rastvora je držana ispod 25 °C u toku destilacije.

PRIMER 6

Sinteza H-D-Arg(Pbf)-OH

[0097] Sinteza linearnog fragmenta glavnog lanca kao što je opisano u Primeru 1 zahteva

2

upotrebu Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH za dodavanje D-arginin pod jedinica, što čini do 4 od 7 ostataka u linearnom fragmentu. Poboljšana i efikasnija metoda za sintetisanje Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH je opisana ispod.

[0098] Sinteza počinje zaštitom amino grupe D-Arg sa Di-terc-butil dikarbonatom (Boc2O), što daje Boc-D-Arg-OH u približno kvantitativnom prinosu nakon izolacije kristalizacijom pod standardnom procedurom zabeleženom u literaturi. Guanidin grupa arginin bočnog lanca je zaštićena sa Pbf grupom dodavanjem u trajanju od jednog sata (0-5 °C) 10/1 rastvora acetona/THF Pbf-Cl (1,3 ekv) u prisustvu vodenog NaOH (4,3 ekv)/NaI (5% mol) kao baza, što daje Boc-D-Arg(Pbf)-OH (85-90% prinos analize) Videti SL.6. Boc-D-Arg(Pbf)-OH u IPAc rastvoru je tretiran sa 4,8 ekv koncentrovane HCl pri 20 °C u trajanju od približno 6 h. Nakon reakcije, organski sloj je uklonjen i sirovi proizvod je izolovan iz vodenog sloja podešavanjem pH do 5 upotrebom NaOH, nakon čega je primećena bela suspenzija. Videti SL. 7. Kada je supernatant imao koncentraciju od približno 3 mg/mL pri 20 °C, supernatant je filtriran do sobne temperature i dobijeni kolač je ispran vodom i osušen pod vakuumom. Ukupni prinos analize nakon ovog koraka je bio 80-85%. Čistoća H-D-Arg(Pbf)-OH je povećana do >98,5% ponovnom kristalizacijom iz 3/1 voda/IPA (v/v). Kada je supernatant imao koncentraciju od oko 7 mg/mL filtriran je i osušen pod vakuumom. Nakon ovog koraka, ukupni prinos analize je bio oko 75%. (Obično se u ovom koraku primeti oko 10% gubitka proizvoda). Drugi korak ponovne kristalizacije iz 4/1 voda/IPA (v/v) je izvršen. Filtriranje je izvršeno kada je koncentracija supernatanta bila oko 3,7 mg/mL. Druga ponovna kristalizacija je povećala čistoću H-D-Arg(Pbf)-OH do oko 99,84 procenata čistoće površine (LCAP) sa HPLC bez nečistoća većih od 0,2 LCAP. Tipičan prinos ovog koraka je oko 93% sa oko 5% gubitka proizvoda. H-D-Arg(Pbf)-OH je zatim reagovan sa FmoCOSu u skladu sa standardnim protokolima i proizvod Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH je izolovan upotrebom standardne procedure u literaturi.

2

2

2

2

2

Claims (8)

1. Patentni zahtevi 1. Metoda za pripremanje AMG 416 je izneta u formuli (I):

   gde navedena metoda obuhvata: dovođenje peptida koji ima strukturu Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2(SEQ ID NO:4) u kontakt sa L-Cys kako bi se dobio konjugovani proizvod formule (I).
2. 2. Metoda prema patentnom zahtevu 1, gde navedeno dovođenje u kontakt obuhvata rastvaranje peptida u vodenom rastvoru koji obuhvata L-Cys i trifluorosirćetnu kiselinu (TFA).
3. 3. Metoda prema patentnom zahtevu 1 dalje obuhvata liofilizovanje konjugovanog proizvoda.
4. 4. Metoda prema patentnom zahtevu 1 dalje obuhvata dovođenje konjugovanog proizvoda u kontakt sa vodenim rastvorom koji obuhvata izopropil alkohol (IPA) i HCl, što proizvodi talog koji obuhvata AMG 416 HCL sa SEQ ID NO: 1.
5. 5. Metoda prema patentnom zahtevu 4 dalje obuhvata prečišćavanje taloga sa HPLC.
6. 6. Metoda za pripremanje AMG 416 je izneta u formuli (I):

   gde navedena metoda obuhvata: prečišćavanje peptida koji ima strukturu Ac-D-Cys(SPy)-D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-NH2(SEQ ID NO:4) sa HPLC u rastvoru trifluorosirćetne kiseline (TFA); vršenje izmene rastvarača azeotropnom destilacijom na prečišćenom peptidu; i dovođenje prečišćenog peptida u kontakt sa L-Cys kako bi se dobio konjugovani proizvod formule (I).
7. 7. Metoda prema patentnom zahtevu 6, gde je L-Cys u rastvoru vode i IPA.
8. 8. Metoda prema patentnom zahtevu 7 dalje obuhvata dovođenje konjugovanog proizvoda u kontakt sa vodenim rastvorom koji obuhvata IPA i HCl, što proizvodi talog koji obuhvata AMG 416 HCL sa SEQ ID NO: 1. 1