RS60318B1 - Ublažavanje tkivnog oštećenja i fibroze pomoću anti-ltbp4 antitela - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak je dobijen uz podršku vlade pod brojem granta HL61322, dodeljenog od Nacionalnih zdravstvenih instituta (NIH). Vlada polaže određena prava u pronalasku.

OBLAST

[0002] Predmetni prikaz se odnosi na kompozicije i postupke za ublažavanje tkivnog oštećenja i fibroze kod pacijenta pomoću latentnog proteina koji se vezuju za transformišući faktor rasta beta (LTBP4).

LISTING SEKVENCI

[0003] Ova prijava sadrži, kao odvojeni deo prikaza, listing sekvenci u obliku koji se može čitati na kompjuteru (naziv dokumenta: 46577_SeqListing.txt; kreiran: 1 avgusta, 2012; 217,614 bajta - ASCII text file).

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0004] Superfamilija proteina transformišućeg faktora rasta (TGF) beta su ključni regulatori fibroze u svim parenhimskim organima [Kisseleva et al., Proc Am Thorac Soc. 5: 338-42 (2008)]. Dišenova mišićna distrofija (DMD) se karakteriše sa progresivnom fibrozom koja je udružena sa povećanom TGFβ signalizacijom [Bernasconi et al., J Clin Invest. 96: 1137-44 (1995); Chen et al., Neurology 65: 826-34 (2005)]. U DMD, fibroza ne samo da direktno doprinosi mišićnoj disfunkciji ali takođe inhibira regeneraciju. DMD se karakteriše sa fragilnosti mišićne membrane koja dovodi do progresivnog gubitka miovlakna. Sa progresijom bolesti, DMD mišić je zamenjen sa fibrozom. Iako je mišić visoko regenerativan, regeneracija u DMD nije dovoljna nadoknadi degeneraciju koja vodi do mišićne slabosti. Glukokortikoidni steroidi su korišćeni da uspore progresiju u DMD, ali upotreba steroida je komplikovana nepoželjnim efektima uključujući osteoporozu i dobijanje na težini (Bushby et al., 2010). Eksperimentalne terapije za DMD uključuju pristupe za povećanje ekspresije distrofina, modulaciju inflamatornog odgovora, promovišu rast mišića i smanjuju fibrozu [Bushby et al., Lancet 374: 1849-56 (2009)].

[0005] U poslednjih nekoliko godina, biološka jedinjenja kao što su antitela su pokazala efikasnost za lečenje hroničnih oboljenja. Na primer, antitela koja su usmerena prema TNFα (infliksimab) ili anti-TNF receptor (etanercept) su sada u širokoj upotrebi za reumatoidni artritis i drugih povezanih poremećaja. Dok su inicijalno razvijeni za njegovu anti-kancerogenu aktivnost, anti-VEGF antitelo se sada koristi za lečenje makularne degeneracije (bevacizumab). Prema tome, dugotrajna upotreba sa biološkim jedinjenjima može da bude efikasna i bezbedna. U skladu sa terapijskim pristupima koji obuhvataju davanje biološkog jedinjenja kao što je antitelo je činjenica da se antitela brzo detektuju u matriksu distrofičnog mišića, kao što je mišić kod DMD pacijenata.

[0006] Brojni pristupi, uključujući ali bez ograničenja na inhibiciju angiotenzina, ili kroz konvertujući enzim ili receptor angiotenzina, inhibiciju aldosterona, i inhibiciju sa antitelima koja su usmerena prema TGFβ su ili su testirana da smanje fibrozu u DMD. [Cohn et al., Nat Med. 13: 204-10 (2007); Rafael-Fortney et al., Circulation.124: 582-8 (2011); Nelson et al., Am J Pathol.178: 2611-21 (2011)]. Glavno ograničenje ovih pristupa je da su ovi lekovi aktivni na sistemskom nivou i često imaju nepoželjne efekte kao što je sniženi krvni pritisak. S obzirom na relativnu hipotenziju DMD pacijenata, posebno pacijenta sa naprednim oblikom DMD, takvi pristupi su ograničeni.

[0007] WO 2012/006181 prikazuje LTBP4 u punoj dužini u kontekstu upotrebe inhibitora RNK da se spreči smanjenje u ekspresiji LTBP4. US 2011/0151490 prikazuje postupke za detekciju kancera određivanjem nivoa ekspresije (inter alia) LTBP4. WO 2004/083241 prikazuje ekspresije i fuzije BTC (nikada nije definisano, ali verovatno betacelulin) i različiti drugi proteini, uključujući LTBP4, da se pronađu agensi koji će modulirati kompleks u lečenju različitih stanja uključujući fibrozu.

SUŠTINA PRONALASKA

[0008] Ovde su prikazane kompozicije u skladu sa patentnim zahtevima. Kompozicije prema postupku moduliraju aktivnost i/ili proteolizu latentnog TGFβ vezujućeg proteina 4 (LTBP4).

[0009] Kompozicije su korišćene za lečenje pacijenta koji ima Dišenovu Mišićnu Distrofiju, udnopojanu (eng. Limb Girdle) Mišićnu Distrofiju, Bekerevu Mišićnu Distrofiju, miopatiju, cističnu fibrozu, plućnu fibrozu, kardiomiopatiju, akutnu povredu pluća, akutnu povredu mišića, ili akutnu miokardijalnu povredu.

[0010] Agens je antitelo.

[0011] U daljim aspektima iz prikaza, ovde prikazani postupci dalje obuhvataju davanje efikasne količine drugog sredstva, gde je drugo sredstvo izabrano iz grupe koja se sastoji iz modulatora inflamatornog odgovora, promotera mišićnog rasta, hemoterapeutskog sredstva i modulatora fibroze.

[0012] Drugi aspekt iz prikaza je usmeren na postupak lečenja pacijenta koji ima bolest koja je povezana sa transformišućim faktorom rasta beta (TGFβ), koji obuhvata davanje pacijentu efikasne količine sredstva koje pojačano reguliše aktivnost latentnog TGFβ vezujućeg proteina 4 (LTBP4).

[0013] Dalji aspekt prikaza obezbeđuje postupak odlaganja početka ili prevencije bolesti povezane sa transformišućim faktorom rasta beta (TGFβ), koji obuhvata davanje pacijentu efikasne količine sredstva koje pojačano reguliše aktivnost latentnog TGFβ vezujućeg proteina 4 (LTBP4).

[0014] U nekim izvođenjima postupaka, LTBP4 interaguje sa TGFβ superfamilijom proteina, i u još daljim izvođenjima TGFβ superfamilija proteina je izabrana iz grupe koja se sastoji iz TGFβ, faktora rasta i diferencijacije (GDF), aktivina, inhibina, i koštani morfogenetski protein. U specifičnim izvođenjima, GDF je miostatin.

[0015] U nekim izvođenjima, obezbeđeno je izolovano antitelo koje se specifično vezuje za peptid koji obuhvata bilo koju od sekvenci koje su predstavljene u SEQ ID NOs: 2-5. U daljim izvođenjima, prikaz obezbeđuje izolovano antitelo koje se specifično vezuje za peptid koji je najmanje 70% identičan sa peptidom koji obuhvata bilo koju od sekvenci predstavljenih u SEQ ID NOs: 2-5, gde antitelo zadržava sposobnost specifičnog vezivanja za LTBP4 i da se smanji osetljivost LTBP4 proteolizi.

[0016] U drugom aspektu, obezbeđena je farmaceutska formulacija koja obuhvata efikasnu količinu, kao što je terapeutski efikasna količina, antitela iz prikaza, i farmaceutski prihvatljivi nosač ili rastvarač.

[0017] Dalji aspekt is prikaza obezbeđuje kit koji obuhvata efikasnu količinu, kao što je terapeutski efikasna količina, antitela iz prikaza, farmaceutski prihvatljivi nosač ili rastvarač i instrukcije za upotrebu.

[0018] U nekim izvođenjima, formulacija ili kit iz prikaza dalje obuhvata efikasnu količinu, kao što je terapetuski efikasna količina, drugog agensa, gde je drugi agens je izabran iz grupe koja obuhvata modulator inflamatornog odgovora, promoter mišićnog rasta, hemoterapeutski agens i modulator fibroze.

KRATAK OPIS NACRTA

[0019]

Slika 1 prikazuje model za delovanje LTBP4 (latentni TGFβ vezujući protein 4). LTBP4 se direktno vezuje za članove TGFβ familije proteina. U vanćelijskom matriksu, kompleks LTBP4 proteina i TGFβ obrazuje veliki latentni kompleks. Sa proteolizom, LTBP4 prolazi kroz konformacionu promenu koja oslobađa TGFβ, na taj način ga čini dostupnim za oslobađanje i vezivanje za TGFβ receptore na susednim ćelijma. Vezivanje TGFβ za njegov receptor dovodi do TGFβ signalizacije u ćelijama. Slika 2 prikazuje gensku strukturu za LTBP4. Polimorfizam insercije delecije u Ltbp4 menja region bogat prolinom kod miševa. N-kraj LTBP se vezuje za vanćelijski matriks (ECM). LTBP4 protein je sastavljen iz brojnih ponovaka epidermalnog faktora rasta (EGF) koji su isprekidani sa motivima koji sadrže 8 cisteinskih ostataka (8-Cys). Treći 8-cys ponovak direktno vezuje TGFβ. Region bogat prolinom (obeleženi horizontalni pravougaonik) razdvaja domen za vezivanje matriksa od ostatka proteina. Mišji129 je zaštićen od mišićne distrofije zbog insercije od 12 amino kiselina u regionu koji je bogat prolinom. Mišićna distrofija u D2 sojevima miševa je znatno teža. Pacov, pas, krava, i ljudi svaki nose veću deleciju regiona bogatog prolinom LTBP4.

Slika 3 prikazuje rezultate ispitivanja upotrebom fragmenata humanog i mišjeg LTBP4 koji su eksprimirani i digestirani. Humani LTBP4 se lakše cepa od mišjeg LTBP4. Položaji amino kiselina naznačeni za TP i TP2E su zasnovani na humanoj izoformi sekvence LTBP4 (SEQ ID NO: 1).

Slika 4 prikazuje rezultate ispitivanja upotrebom blokirajućeg antitela koje je dizajnirano da prepozna i da se veže za regon bogat prolinom (Y) LTBP4. Kada se inkubira sa ćelijskim lizatima koji eksprimiraju LTBP4, prisustvo antitela inhibira cepanje sa plazminom. Nespecifično antitelo nije inhibiralo cepanje.

Slika 5 prikazuje region bogat prolinom humanog LTBP4 se lakše cepa od mišjeg LTBP4.

Slika 6 prikazuje rezultate ispitivanja upotrebom blokirajućeg antitela koje inhibira cepanje LTBP4 pune dužine. Nespecifično blokirajuće antitelo nije pokazalo efekat. Testovi su sprovedeni u triplikatu sa značajnom inhibicijom uočene proteolize.

Slika 7 prikazuje rezultate ispitivanja pri čemu bakterijski veštački transgen koji eksprimira humani LTBP4 (hLTBP4 Tg) je prenet u mišji mdx model Dišenove Mišićne distrofije. (A) hLTBP4/mdx miševi imaju pojačanu fibrozu u njihovim mišićima kao što je grubo histološki definisano i direktnom kvantifikacijom. Kada je kvantifikovana, fibrotičko područje je povećano kod hLTBP4/mdx miševa u poređenju sa mdx mišem iz istog legla. (B) hLTBP4/mdx miševi imaju smanjenu snagu držanja.

Snaga držanja je poređena između hLTBP4/mdx miševa i mdx miševa da se odredi da li humani LTBP4 gen pogoršava mišićnu bolest koja se uočava kod mdx miševa. hLTBP4/mdx miševi su slabiji od mdx miševa iz legla (*). Snaga držanja je merena upotrebom Treat NMD standardnih protokola. Slika 8 pokazuje da LTBP4 formira kompleks sa miostatinom. HEK293 ćelije su transfektovane sa LTBP4 i epitop-obeleženim miostatinom. LTBP4 se precipitira sa dva različita anti-LTBP4 antitela (trake 3 i 5), i precipitat se nakon toga imunoblotuje sa anti-myc antitelom. Neobrađeni miostatin je detektovan u imunoprecipitatu (strelica). Gornja traka u linijama 1 i 2 koja migrira iznad 50 KDa je endogeni c-myc, koji je 63 KDa.

Slika 9 prikazuje rezultate eksperimenata kojima se ispituju efekti kardiotoksina i na miševe divljeg tipa i transgene miševe koji eksprimiraju humani LTBP4. A) transgeni miš ispoljava pojačanu povredu nakon povrede kardiotoksinom koja se vidi kao veći inflamatorni infiltrat mononuklearnih ćelija i fibroza i deponovanje masti u povređeni mišić. B) Nivoi LTBP4 proteina su povećani posle povrede.

Slika 10 pokazuje da anti-LTBP4 antitela ublažuju povredu mišića in vivo. U poređenju sa miševima kojima je ubrizgan PBS, miševi koji su tretirani sa LTBP4-831 antitelom pokazuju smanjenu centralnu nukleaciju (panel A) i smanjenu fibrozu (panel B) koja prati ubrizgavanje kardiotoksina injekcijom.

Slika 11 pokazuje da je povećana TGFβ signalizacija je povezana sa povećanom infiltracijom makrofaga kod hLTBP4/mdx mišića u poređenju sa mdx mišićem. A) Mišići su obojeni sa antitelom za aktivirane makrofage upotrebom F4/80 antitela. B) hLTBP4/mdx mišić pokazuje porast u cepanju LTBP4 proteina u poređenju sa mdx, dok mali LTBP4 protein se uočava u divljem tipu i hLTBP4 mišiću u odsustvu povrede ili mišićne distrofije. C) Proteolitičko cepanje i konformaciona promena u LTBP4 je povezana sa oslobađanjem TGFβ.

DETALJNI OPIS

[0020] Superfamilija transformišućeg faktora rasta beta (TGFβ) se sastoji iz više od 40 članova uključujući TGFβ, aktivine, inhibine, faktora diferencijacije rasta i koštanih morfogenetskih proteina (BMPs). Svi članovi ove familije dele zajedničke elemente sekvence i strukturne motive. Oni su multifunkcionalni regulatori ćelijske deobe, diferencijacije, migracije, adhezije, organizacije i smrti, promovišući proizvodnju vanćelijskog matriksa (ECM), tkivne homeostaze i embriogeneze [Massague et al., Genes Dev 19: 2783-810 (2005); Javelaud et al., Int J Biochem Cell Biol 36: 1161-5 (2004); Moustakas et al., Immunol Lett 82: 85-91 (2002)]. Između ovih proteina, TGFβ ima kritičnu ulogu u tkivnoj homeostazi i prekidi u TGFβ putu su uključeni u mnogim humanim bolestima, uključujući kancer, autoimunim, fibroznim i kardiovaskularnim bolestima [Ruiz-Ortega et al., Cardiovascular Research 74: 196 - 206 (2007)].

[0021] TGFβ je sintetisan kao inaktivni protein, koji je poznat pod imenom latentni TGFβ, koji se sastoji od glavnog regiona i latentno asocirani peptid (LAP). Ovaj protein interaguje sa latentnim TGFβ vezujućim proteinima (npr., LTBP4) i usidren je u vanćelijskom matriksu (ECM). TGFβ se aktivira nakon proteolize LTBP4, koji rezultuje u oslobađanju TGFβ. Specifično, i kao što je ovde prikazano, region bogat prolinom LTBP4 je podložan proteolizi od strane proteaze, i ova proteoliza dovodi do oslobađanja i aktivacije TGFβ.

[0022] Aktivni TGFβ se zatim veže za svoje receptore i funkcioniše na autokrinim i parakrinim načinima da ispolji svoje biološke i patološke aktivnosti preko Smad-zavisnih i nezavisnih signalnih puteva [Lan, Int J Biol Sci 7(7): 1056-1067 (2011); Derynck et al., Nature.425: 577-84 (2003)].

[0023] Prema tome, inhibicija proteolize LTBP4 će inhibirati oslobađanje vezanog TGFβ, i rezultujuća sekvestracija TGFβ će inhibirati nishodne signalne efekte TGFβ, koji dovode do ublažavanja TGFβpovezanih bolesti.

[0024] Radni primeri i ovde prikazani eksperimentalni prodaci pokazuju da je region bogat prolinom LTBP4 podložan proteolizi. Ovi rezultati podržavaju terapeutike i terapije usmerene ka modulaciji proteolize LTBP4 kod pacijenta koji ima TGFβ-povezanu bolest.

[0025] Ovde prikazani eksperimentalni rezultati takođe pokazuju da proteoliza LTBP4 može da bude inhibirana antitelima. Očekuje se da inhibicija proteolize LTBP4 upotrebom farmakoloških pristupa obezbedi efikasni pristup za lečenje TGFβ-povezanih bolesti.

[0026] Ovde prikazani eksperimentalni rezultati dodatno pokazuju da je fragment humanog LTBP4 podložniji proteolizi u odnosu na mišju sekvencu LTBP4. Stoga, fenomen koji je rasvetljen kod miševa se ogleda kod ljudi, i očekuje sa da inhibicija proteolize LTPB4 obezbedi efikasni tretman za TGFβpovezane bolesti.

[0027] Osim ukoliko ovde nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini koji se koriste u prikazu imaće značenja koja se obično razumeju i koriste od stane onog ko je uobičajeno verziran u stanje tehnike. Osim ukoliko nije drugačije zahtevano kontekstom, razume se da će termini u jednini uključiti termine u množini istih termini u množini će uključiti jedninu. Specifično, kao što se ovde koristi i u patentnim zahtevima, oblici u jednini uključuju referencu množine osim ukoliko kontekst jasno ne ukazuje drugačije.

[0028] Kao što se koristi u prikazu, termin "lečenje" ili "tretman" se odnosi na intervenciju izvedenu u nameri prevencije daljeg razvoja ili promene patologije bolesti ili infekcije. Prema tome, "tretman" se odnosi i na terapeutski tretman i profilaktičke ili preventivne mere. Naravno, kada se "tretman" koristi zajedno sa oblikom zasebnog termina "profilaksa," jasno je da se "tretman" odnosi na sužavanje značenja menjanja patologije bolesti ili stanja. "Prevencija" se odnosi na preventivne mere koje se uzimaju sa subjektom koji nema stanje ili bolest. Terapeutsko sredstvo može direktno da smanji patologiju bolesti, ili učini bolest podložnijom lečenju sa drugim terapeutskim sredstvom(ima) ili, na primer, imuni sistem domaćina. Tretman pacijenata koji pate od kliničkih, biohemijskih, ili subjektivnih simptoma bolesti mogu da uključe ublažavanje jednog ili više od ovih simptoma ili smanjenja predispozicije prema bolesti. Unapređenje posle tretmana može da se manifestuje kao smanjenje ili eliminacija jednog ili više takvih simptoma.

[0029] Kao što se ovde koristi, fraza "efikasna količina" je namenjena da se odnosi na količinu terapeutika (tj., terapeutski efikasna količina), profilaktički (tj., profilaktički efikasna količina), ili ublažavanje simptoma (tj., efikasna količina za ublažavanje simptoma) jedinjenje (npr., agens ili drugi agens) dovoljan za modulaciju proteolize latentnog TGFβ vezujućeg proteina 4 (LTBP4), kao što bi bilo bilo pogodno za izvođenje iz prikaza u izazivanju željenog terapeutskog, profilaktičkog, ili efekta za ublažavanje simptoma ili odgovora, uključujući ublažavanje jednog ili više od takvih simptoma bolesti ili smanjenja predispodicije prema bolesti.

[0030] Kao što se ovde koristi, "hibridizacija" označava sparivanje u suštini komplementarnih lanaca polimernih jedinjenja. Jedan mehanizam sparivanja uključuje vezivanje obrazovanjem vodoničnih veza, koje može da bude Watson-Crick, Hoogsteen ili reverzno Hoogsteen vezivanje vodonika, između komplementarnih baza nukleotida (nukleotidi) lanaca polimernih jedinjenja. Na primer, adenin i timin su komplementarni nukleotidi koji se sparuju preko obrazovanja vodoničnih veza. Hibridizacija može da se dogodi pod različitim okolnostima.

[0031] Antisens jedinjenje "specifično hibidizuje" kada vezivanje jedinjenja sa ciljnom nukleinskom kiselinom interferira sa normalnom funkcijom ciljne nukleinske kiseline da se uzrokuje modulacija funkcije i/ili aktivnosti, i postoji dovoljan stepen komplementarnosti da se izbegne nespecifično vezivanje antisens jedinjenja sa ne-ciljnim sekvencama nukleinske kiseline pod uslovima u kojima je specifično vezivanje poželjno, tj., pod fiziološkim uslovima u slučaju in vivo primena kao što je terapeutski tretman, i pod uslovima u kojima su testovi izvedeni u slučaju in vitro testova.

[0032] Kao što se ovde koristi, fraza "strogi uslovi hibridizacije" ili "strogi uslovi" se odnosi na uslove pod kojima jedinjenje (npr., agens) koje je ovde prikazano će hibridizovati sa njegovom ciljnom sekvencom, ali sa minimalnim brojem drugih sekvenci. Strogi uslovi su zavisni od sekvence i razlikovaće se u različitim okolnostima i u kontekstu ovog prikaza, "strogi uslovi" pod kojima polimerna jedinjenja hibridizuju sa ciljnom sekvencom su određena prirodom i kompozicijom polimernih jedinjenja i uključenim primenom(ama). Generalno, strogi uslovi hibridizacije obuhvataju nisko koncentracije soli (<0.15M) sa neorganskim katjonima kao što su Na<++>ili K<++>(tj., niska jonska jačina), temperature veće od 20°C-25°C ispod Tmpolimerno jedinjenje:ciljna sekvenca kompleksa, i prisustva denaturanata kao što su formamid, dimetilformamid, dimetil sulfoksid, ili deterdžent natrijum dodecil sulfat (SDS). Primer visoko strogih uslova hibridizacije je 0.1X natrijum hloridni-natrijum citratni pufer (SSC)/0.1% (mas/v) SDS na 60°C u trajanju od 30 minuta.

[0033] "Komplementarni," kao što se ovde koristi, se odnosi na kapacitet za precizno sparivanje između dva nukleotida na jednom ili dva polimerna lanaca. U skladu sa Watson-Crick-ovim pravilima baznog sparivanja (A vezuje T ili U; G vezuje C; gde A, G, C, T i U su uobičajeni ribo-, ili dezoksiribo-, nukleotid monofosfati). "Koji specifično hibridizuju" i "komplementarni" su termini koji se koriste da označe dovoljni stepen preciznog nukleotidnog sparivanja ili komplementarnosti u odnosu na dovoljan broj nukleotida tako da stabilno i specifično vezivanje se pojavljuje između polimernog jedinjenja i ciljne nukleinske kiseline. Termini prema tome omogućuju praznine (eng. gaps) u baznom sparivanju, ali ne u onoj meri koja sprečava stabilno i specifično vezivanje.

[0034] U oblasti tehnike je jasno da sekvenca polimernog jedinjenja ne treba da bude 100% komplementarna sa onom ciljane nukleinske sekvence da bi specifično hibridizovala. Osim toga, polinukleotid može da hibridizuje preko jednog ili više segmenata tako da interventni ili susedni segmenti nisu uključeni u događaj hibridiacije (npr., struktura petlje, struktura pogrešno sparenih ili struktura ukosnice). Polimerna jedinjenja iz predmentnog prikaza obuhvataju najmanje oko 70%, ili najmanje oko 75%, ili najmanje oko 80%, ili najmanje oko 85%, ili najmanje oko 90%, ili najmanje oko 95%, ili najmanje oko 99% komplementarnosti sekvence sa ciljnim regionom, unutar ciljne nukleinske sekvence prema kojoj su ciljani. Na primer, antisensno jedinjenje u kome 18 od 20 nukleotida antisensnog jedinjenja su komplementarni sa ciljnim regionom, i prema tome će specifično hibridizovati, predstavljaće 90 procentnu komplementarnost. U ovom primeru, preostali nekomplementarni nukleotidi mogu da budu grupisani ili rasuti sa komplementarnim nukleotidima i ne moraju biti bliski jedni sa drugima ili sa komplementarnim nukleotidima. Kao takvo, antisensno jedinjenje koje je dužine 18 nukleotida ima 4 (četiri) nekomplementarna nukleotida koji su ograničeni sa dva regiona potpune komplementarnosti sa ciljnom nukleinskom kiselinom će imati sveukupnu 77.8% komplementarnost sa ciljnom nukleinskom kiselinom i prema tome ulazi u obim predmetnog prikaza. Procenat komplementarnosti antisensnog jedinjenja sa regionom ciljne nukleinske kiseline može da se odredi upotrebom rutinskog softvera i algoritama za upoređivanje sekvenci, npr., BLAST programi (eng. basic local alignment search tools) i PowerBLAST programi koji su poznati u oblasti tehnike [Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990); Zhang and Madden, Genome Res., 7: 649-656 (1997)]. Procent homologije, identičnost sekvence ili komplementarnost, može da se odredi, na primer, Gap programom (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), upotrebom osnovnih podešavanja, koji koristi Smith i Waterman-ov algoritam [Adv. Appl. Math., 2: 482-489 (1981)].

[0035] Kao što se ovde koristi, termin "(Tm)" označava temperaturu topljenja i odnosi se na temperaturu, pod definisanom jonskom jačinom, pH, i koncentraciju nukleinske kiseline, na kojoj 50% polinukleotida komplementarno sa ciljnom sekvencom hibridizuje sa ciljnom sekvencom na ekvilibrijumu. Obično, strogi uslovi će biti oni u kojima je koncentracija soli bar oko 0.01 do 1.0 M koncentracije jona natrijuma (ili drugih soli) na pH 7.0 do 8.3 i temperatura je najmanje oko 30°C za kratke polinukleotide (npr., 10 do 50 nukleotida). Strogi uslovi mogu takođe da se postignu sa dodavanjem agensa koji destabilizuju kao što je formamid.

[0036] Kao što se ovde koristi, "modulacija" aktivnosti označava ili povećanje (stimulacija) ili smanjenje (inhibicija) u toj aktivnosti. Na primer, bez ograničenja, modulacija proteolize može da označi ili povećanje u proteolizi ili smanjenje u proteolizi.

LATENTNI TGFβ VEZUJUĆI PROTEIN 4 (LTBP4)

[0037] Predmetni prikaz je delo usmeren na Ltbp4, gen kodira latentni TGFβ vezujući protein (LTBP4; GenBank Accession Number NP_001036009.1; SEQ ID NO: 1), koji je identifikovan u genetičkom skriningu kao glavni genetički modifikator mišićne distrofije [Heydemann et al., J Clin Invest. 119: 3703-12 (2009)]. Ovaj genetički skrining je sproveden upotrebom miševa kojima nedostaje protein asociran sa distrofinom, γ-sarkoglikan (Sgcg „null“ miševi). Sgcg model pojasne mišićne distrofije (eng. limb girdle muscular dystrophy (LGMD)) je izabran zbog toga što je bilo dovoljno dokaza iz humanog LGMD važnosti genetičkih modifikatora koji utiču na ozbiljnost ovde bolesti [McNally et al., Am J Hum Genet. 59:1040-7 (1996)]. Iznenađujuće je pronađeno da modifikatori identifikovani za sarkoglikanposredovanu mišićnu distrofiju slično modifikuju DMD. Narušavanje distrofin glikoproteinskog kompleksa, ili u DMD ili sarkoglikan-povezane LGMDs, dovodi do fragilne mišićne membrane, pojačane prekidanjem miovlakna, i zamenom normalnog mišićnog tkiva sa fibrozom. U ranoj patologiji, fibrotična zamena je minimalna, ali kod pacijenta sa naprednim oblikom DMD , mišić je skoro u potpunosti zamenjen sa fibrozom.

[0038] LTBP4 je lociran na humanom hromozomu 19q13.1-q13.2, i to je protein vanćelijskog matriksa koji vezuje i sekvestrita TGFβ (Slika 1). LTBP4 modifikuje mišju mišićnu distrofiju preko polimorfizma u genu koji kodira za Ltbp4. Postoje dve poznate varijante Ltbp4 gena kod miševa. Većina sojeva miševa, uključujući mdx miš, imaju Ltbp4 insercioni alel (Ltbp4<I/I>). Insercija od 36 baznih parova (12 amino kiselina) u region bogat prolinom LTBP4 koji je kodiran sa Ltbp4<I/I>dovodi do blažeg oblika bolesti. Delecija 36 bp/12aa u regionu bogatom prolinom je povezana sa težim oblikom bolesti (Ltbp4<D/D>) (Slika 2). Pronađeno je da Ltbp4 genotip snažno korelira sa dva različita aspekta patologije mišićne distrofije, tj., curenjem membrane i fibrozom, i ove karakteristike definišu patologiju DMD.

[0039] Da bi se ispitalo curenje mišićne membrane, korišćena je boja Evans plavo (EBD), koja može da obrazuje kompleks sa albumnom iz seruma, i prema tome je mera permeabilnosti membrane. EBD je ubrizgana intraperitonealno i mišići iz životnje koja je primila injekciju su sakupljeni približno 8-40 sati kasnije. Curenje membrane mišiće je procenjeno određivanjem količine EBD u brojnim razlčitim grupama mišića, uključujući kvadricepse i druge skeletne mišiće. Sadržaj hidroksiprolina je meren da bi se kvantifikovala fibroza, i ovaj test je takođe izveden na brojnim različitim grupama mišića. Otkriveno je da je da genotip Ltbp4 predstavlja skoro 40% varijanse u membranskom curenju u mišićima kvadricepsa [Swaggart et al., Physiol Genomics 43: 24-31 (2011)]. Slično, Ltbp4 genotip je takođe u visokoj korelaciji sa fibrozom u skeletnim mišićima na bazi udova gde takođe predstavlja značajnu količinu varijanse. Ltbp4 je obično snažan genetički modifikator i ima dejstvo i na krhkost memebrane i na fibrozu. Prema tome, predmetni pronalazak identifikuje LTBP4 kao cilj za terapiju zbog toga što će stabilizovati plazma membranu pored smanjenja fibroze kod pacijenta kojima je potrebno.

[0040] Kao što se ovde gore u tekstu razmatra, LTBP4 je protein asociran sa matriksom koji vezuje i i izoluje TGFβ. TGFβ u ovom obliku je veliki latentni kompleks, koji zahteva dalju proteolizu da bi u postao u potpunosti aktivan. Očekuje se da je matriks-vezani latentni TGFβ najmanje aktivni oblik s obzirom na angažovanje receptora i prema tome predstavlja idealni korak u kome može da se inhibira oslobađanje TGFβ. LTBP4, četvrti član LTBP familije proteina nosače, je visoko eksprimiran u srcu, mišiću, plućima i debelom crevu [Saharinen et al., J Biol Chem.273: 18459-69 (1998)]. LTBP4 protein, slično drugim članovima ove familije, mogu da budu proteolizovani sa plazminom, što dovodi do oslobađanja TGFβ [Saharinen et al., J Biol Chem.273: 18459-69 (1998); Ge et al., J Cell Biol.175: 111-20 (2006)]. Insercija/delecija 12 amino kiselina menja osetljivost LTBP4 na proteolizu, što sa druge strane menja oslobađanje TGFβ i njegovu sposobnost vezivanja za TGFβ receptore i aktivira signalizaciju. Ovde je prikazano da će inhibiranje cepanja LTBP4 držati TGFβ inaktivnim i ograničiti nishodne efekte oslobađanja TGFβ.

AGENSI

[0041] Prikaz razmatra lečenje pacijenta koji ima TGFβ-povezanu bolest koje obuhvata davanje pacijentu efikasne količine agensa koji modulira aktivnost LTBP4.

[0042] Termin "agens" u ovom kontekstu se odnosi na antitelo, peptid, i njihove kombinacije.

Antitela

[0043] Termin "antitelo" je korišćen u najširem smislu i uključuje puna sastavljena antitela, monoklonska antitela, poliklonska antitela, multispecifična antitela (npr., bispecifična antitela), fragmente antitela koji mogu da vezuju antigen (npr., Fab’, F’(ab)2, Fv, jednolančana antitela, diatela), kamilja antitela i rekombinovani peptidi koji sadrže gore navedeno pod uslovom da oni ispoljavaju željenu biološku aktivnost. Fragmenti antitela mogu da budu proizvedeni upotrebom postupaka rekombinovane DNK ili enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela i opisuju se dalje ispod u tekstu. Ne-ograničavajući primeri monoklonskih antitela uključuju mišje, himerno, humanizovano, humano, i imunoglobuline konstruisane na čoveku, antitela, himerne fuzione proteine sa sekvencama koje su izvedene iz imunoglobulinsa, ili muteini ili njihovi derivati, svaki opisani dalje u tekstu ispod. Razmatraju se multimeri ili agregati intaktnih molekula i/ili fragmenata, uključujući hemijski izvedena antitela. Razmatraju se antitela bilo koje klase ili podklase izotipa.

[0044] Termin "monoklonsko antitelo" kao što se ovde koristi odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije u suštini homogenih antitela, tj., individualna antitela koje populacija sadrži su identična osim mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi koje mogu da budu zastupljene u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su protiv jednog antigenog mesta. Za razliku od konvencionalnih (poliklonalnih) preparata antitela koji uobičajeno uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv pojedinačne determinante na antigenu. Pored njihove specifičnosti, monoklonska antitela daju prednost u tome što se sintetišu u homogenoj kulturi, nekontamirano drugim imunoglobulinima sa različitim specifičnostima i karakteristikama.

[0045] Modifikator "monoklonski" označava da je antitelo kao dobijeno iz u suštini homogene populacije antitela, i ne treba ga tumačiti da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim drugim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja će se koristiti u skladu sa prikazom mogu da se dobiju korišćenjem postupka hibridoma koji je prvo opisan od strane Kohler et al., Nature 256: 495 (1975), ili mogu da se dobije postupcima rekombinovane DNK (videti, npr., U.S. Patent Number 4,816,567). "Monoklonska antitela" takođe mogu da budu rekombinovana, himerna, humanizovana, humana, Humana EngineeredTM, ili fragmenti antitela, na primer.

[0046] Ovde opisana antitela su razmotrena u Primeru 3. U određenim izvođenjima, razmotrena je varijanta antitela iz prikaza. Pod "varijanta" je označeno da antitelo sadrži jednu ili više supstitucija amino kiseina, delecija amino kiselina, ili adicija amino kiselina kao referentna sekvenca amino kiselina. Varijante uključuju, ali nisu ograničene na, antitela koja imaju sekvencu amino kiseline koja je bar 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa bilo kojim od sekvenci amino kiselina ovde obezbeđenog antitela, pod uslovom da antitelo zadržava sposobnost da blokira i/ili inhibira proteolizu LTBP4.

[0047] U daljim izvođenjima, ovde opisano anti-LTBP4 antitelo specifično vezuje bar jedan peptid odabran iz grupe koja se sastoji iz peptida koji imaju sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NOs: 2-5, ili peptid odabran iz grupe koja se sastoji iz peptida sa sekvencom koja je bar 70% identična sa peptidom koji ima sekvecnu predstavljenu u SEQ ID NOs: 2-5. U dodatnim izvođenjima, ovde opisano<-6 -7 -8 -9>-10 anti-LTBP4 antitelo vezuje bar jedan epitop iz LTBP4 sa afinitetom 10 M, 10 M, 10 M, 10 M, 10 -11 -12

M, 10 M, ili 10 M ili manje (niži znači veći afinitet vezivanja), ili opciono vezuje svaki od LTBP4 sa afinitetom od 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M 10<-10>M, 10<-11>M, ili 10<-12>M ili manje. U nekim izvođenjima, ovde opisano antitelo "specifično vezuje" sa LTBP4 najmanje 2-50 puta, 10-100 puta, 2-puta, 5-puta, 10-puta, 25-puta, 50-puta ili 100-puta, ili 20-50%, 50-100%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100% većim afinitetom u poređenju sa vezivanjem za ne-ciljni protein.

[0048] Antitela koja su opisana u nastavku su pogodna za upotrebu u ovde opisanim postupcima. Takođe se razmatraju dodatna antitela, pod uslovom da antitelo poseduje svojstvo modulacije proteolize ili pojačane regulacije aktivnosti LTBP4. Takva antitela mogu, na primer, da budu humanizovana u skladu sa poznatim postupcima i modifikovani i/ili formulisani da se omogući isporuka i unutarćelijski kontakt sa LTBP4.

Peptidi

[0049] Prikaz obezbeđuje peptide koji imaju sposobnost da deluju kao supstrat za proteazu (tj., "peptid-supstrat za proteazu"). Proteaza, kao što se ovde razmatra, označava proteazu koja može da cepa LTBP4. U jednom izvođenju, proteaza je serin proteaza. U daljim izvođenjima, proteaza je izabrana iz gupe koja se sastoji iz plazmina, leukocitne elastaze, pankreazne elastaze, himaze humanih mast ćelija, tripsina, himotripsina, pepsina i papaina.

[0050] Sposobnost peptida da deluje kao supstrat za proteazu može brzo da se odredi od strane osobe koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike. Kao neograničavajući primer, peptid može da se ispita in vitro inkubiranjem obeleženog LTBP4 proteina (ili njegovog obeleženog fragmenta) sa peptidom kandidatom i serin proteazom. Obeleživač može da bude bilo koji obeleživač koji može da se detektuje u oblasti tehnike, i u jednom izvođenju je radioaktivni obeleživač. Nakon inkubacije i elektroforeze na gelu koja sledi, može da se odredi da li je LTBP4 protein (ili njegov fragment) bio otporan na proteolizu na osnovu veličine proteina na gelu. Ukoliko LTBP4 protein nije zaštićen od proteolize od strane peptida, radioaktivna traka na gelu će biti manja nego što je neko očekivao za LTBP4 protein pune dužine. Prema tome, dok se ovde prikazane peptidne sekvence razmatraju za upotrebu prema postupcima iz prikaza, razmatraju se i dodatni peptidi, pod uslovom da je njihova sposobnost da deluju kao supstrat za proteazu na način koji je čini inhibitorom proteolize LTBP4.

[0051] Upotreba jednog ili više peptida ili antitela iz prikaza, od kojih svaki ima sposobnost da deluje ili kao supstrat za proteazu (peptid) ili da deluje kao inhibitor proteolize (antitelo), je očekivano da pojačano reguliše aktivnost LTBP4 u poređenju sa aktivnosti LTBP4 u odsustvu jednog ili više peptida. U ovom konteksu, pojačana regulacija aktivnosti LTBP4 nastaje iz njegove zaštite od proteolize preko delovanja jednog ili više peptida i/ili antitela iz prikaza. Nishodni efekat ove pojačane regulacije

1

aktivnosti LTBP4 je istovremena smanjena regulacija TGFβ signalizacije. Intaktni LTBP4 će nastaviti da se veže i odvaja TGFβ i prema tome sprečava njegovo oslobađanje i kasnije nishodne efekte. Prema tome, u različitim izvođenjima, pojačana regulacija aktivnosti LTBP4 je merena kvantifikovanjem signalizacije TGFβ. Postupci kvantifikovanja TGFβ signalizacije su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike, i uključuju određivanje Smad signalizacije iz biološkog uzorka koji je dobijen od pacijenta. Smatra se da je, u nekim izvođenjima, Smad signalizacija kod pacijenta kome se daje jedan ili više agen(asa)sa i/ili dodatnih agen(asa)a iz prikaza je smanjena za najmanje oko 1% i do oko 5%, oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40% ili oko 50% u odnosu na pacijenta koji nije tako tretiran. U daljim izvođenjima, Smad signalizacija kod pacijenta kome se daje jedan ili više agen(as)a i/ili dodatnih agen(as)a iz prikaza je smanjena za najmanje oko 10% i do oko 20%, oko 50%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 99% ili više u odnosu na pacijenta koji nije tako tretiran. U specifičnim izvođenjima, Smad signalizacija kod pacijenta kome se daje jedan ili više agen(as)a i/ili dodatnih agen(as)a iz prikaza je smanjena za najmanje oko 1%, oko 2%, oko 5%, oko 10%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 99% ili više u odnosu na pacijenta koji nije tako lečen.

[0052] Gore opisani peptidi (tj., peptidni inhibitori LTBP4 proteolize) su predstavljeni u Primeru 3 i Tabeli 1. Prema tome, u određenim izvođenjima, peptid obuhvata ili se sastoji iz sekvence amino kiseline prema bilo kojoj od SEQ ID NOs: 2-5 ili varijante bilo koje gore pomenute. Pod "varijanta" se podrazumeva da peptid koji obuhvata jednu ili više supstitucija amino kiselina, delecija amino kiselina, ili adicija amino kiselina na referentnu aminokiselinsku sekvencu (npr., bilo koja od SEQ ID NOs: 2-5). Varijante uključuju, ali nisu ograničene na, peptide koji imaju sekvencu amino kiselina koja je najmanje 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična sa bilo kojom od sekvenci amino kiselina koje su ovde obezbeđene dok se zadržava sposobnost da deluju kao supstrat za proteazu.

[0053] U jednom aspektu, peptid se sastoji iz 35 amino kiselina ili manje. U različitim izvođenjima, peptid obuhvata 15-35 ostataka amino kiselina (npr., 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, ili 35 ostataka amino kiselina). Takođe se razmatra da je ovde opisani peptid koji obuhvata jednu ili više delecija pogodan u kontekstu prikaza sve dok peptid može da deluje kao supstrat za proteazu. U nekim izvođenjima, amino kiseline se uklanjaju iz sekvence amino kiselina, na N-kraju, i/ili na C-kraju. Takvi peptidni fragmenti mogu da se sastoje iz 3-14 ostataka amino kiselina (npr., 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, ili 14 ostataka amino kiselina).

[0054] Opciono, peptid obuhvata jednu ili više supstitucija amino kiselina (sa referencama na bilo koju od ovde obezbeđenih sekvenci amino kiselina) koje ne uništavaju sposobnost peptida da deluje kao supstrat za proteazu. Supstitucije amino kiselina uključuju, ali nisu ograničene na, one koje: (1) smanjuju osetljivost na proteolizu, (2) smanjuju osetljivost na oksidaciju, (3) menjaju afinitete vezivanja, i/ili (4) daju ili modifikuju druga fizičkohemijska ili funkcionalna svojstva peptida. U jednom aspektu, supstitucija je konzervativna supstitucija, gde je ostatak amino kiseline zamenjen sa ostatkom amino kiseline koja ima slični bočni lanac. Familije ostataka amino kiselina koje imaju slične bočne lance su definisane u oblasti tehnike, i uključuju amino kiseline sa baznim bočnim lancima (npr., lizin, arginin, i histidin), kisele bočne lance (npr., asparaginska kiselina i glutaminska kiselina), nenaelektrisani polarni bočni lanci (npr., glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, i cistein), nepolarni bočni lanci (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, i triptofan), beta-razgranati bočni lanci (npr., treonin, valin, i izoleucin) i bočni lanci sa aromatičnim karakterom (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, i histidin). Treba imati u vidu, međutim, da praktikant nije ograničen na konzervativne supstitucije, sve dok dobijeni peptid zadržava sposobnost da deluje kao supstrat, u celosti ili delom, za proteazu. Prikaz takođe obuhvata peptide supstrate proteaze koji obuhvataju atipične, amino kiseline koje se ne nalaze u prirodi, koje su dobro poznate u oblasti tehnike. Individualne amino kiselone mogu da imaju ili L ili D stereohemiju kada je to potrebno, iako se L stereohemija obično koristi za sve amino kiseline u peptidu.

[0055] Prikaz dalje uključuje varijante peptida supstrata proteaze koji obuhvataju jednu ili više amino kiselina insertovane u sekvenci amino kiseline koja je ovde obezbeđena i/ili vezana za N-kraj ili C-kraj. U nekim izvođenjima, peptid dalje obuhvata jednu ili više amino kiselina koje olakšavaju sintezu, rukovanje, ili upotrebu peptida uključujući, ali bez ograničenja na, jedan ili dva lizina na N-kraju i/ili C-kraju da se poveća rastvorljivost peptida. Pogodni fuzioni peptidi uključuju, ali nisu ograničeni na, proteine koji obuhvatau peptide koji su spojeni sa drugim polipeptidom, polipeptidnim fragmentom, ili amino kiselinama nisu generalno prepoznati kao deo proteinske sekvence. U nekim izvođenjima, fuzioni peptid obuhvata cele sekvence amino kiselina dva ili više peptida ili, alternativno, obuhvata porcije (fragmente) dva ili više peptida. Pored svih ili dela ovde opisanih peptida, fuzioni protein opciono uključuje sve ili deo bilo kog pogodnog peptida koji obuhvata željenu biološku aktivnost/funkciju. Zaista, u nekim izvođenjima, peptid je operativno povezan sa, na primer, jednim ili više od sledećih: peptid sa dugim polu-životom u cirkulaciji, marker proteinom, peptidom koji olakšava prečišćavanje peptida supstrata proteaze, peptidne sekvence koja promoviše obrazovanje multimernih proteina, ili fragment bilo kog od gore pomenutog. U jednom izvođenju, dva ili više peptida supstrata proteaze su spojena zajedno, povezana sa domenom za multimerizaciju, ili vezana preko hemijskog linkera da se dobije peptidni supstrat-proteaza kompleks. Peptidi supstrati proteaze mogu da budu isti ili različiti.

[0056] "Derivati" se takođe razmatraju u prikazu i uključuju peptide supstrate proteaze koji su hemijski modifikovani na neki način koji je različit od adicije, delecije, ili supstitucije amino kiselina. U tom pogledu, ovde obezbeđeni peptid je hemijski povezan sa polimerima, lipidima, i drugim organskim ostacima, i/ili neorganskim ostacima. Derivati su dobijeni u nekim situacijama da bi se povećala rastvorljivost, apsorpcija, ili polu-život u cirkulaciji. Različite hemijske modifikacije eliminišu ili ublažuju bilo koji nepoželjni sporedni efekat sredstva. U tom pogledu, prikaz obezbeđuje peptide supstrate proteaze kovalentno modifikovane da uključe jedan ili više vezanih polimera koji su rastvorljivi u vodi. Korisni polimeri koji su poznati u oblasti tehnike uključuju, ali nisu ograničeni na, polietilen glilkol, polioksietilen glikol, polipropilen glikol, monometoksi-polietilen glikol, dekstran, celuloza, poli-(N-vinil pirolidon)-polietilen glikol, propilen glikol homopolimeri, polipropilen oksid/etilen oksid ko-polimer, polioksietillovani polioli (npr., glicerol) i polivinil alkohol, kao i smeše bilo kog prethodno navedenog. Za dalju diskusiju vezanih polimera rastvorljivih u vodi, videti U.S. Patent br-i.4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192; and 4,179,337. U drugim izvođenjima, derivat peptida uključuje ciljani molekul koji je specifičan za određeni tip ćelija, tkivo, i/ili organ. Alternativno, peptid je povezan sa jednim ili više hemijskih ostataka koji olakšavaju prečišćavanje, detekciju, multimerizaciju, i/ili karakterizacija aktivnosti peptida.

[0057] Derivati takođe uključuju peptide koji obuhvataju modifikovane ili ne-proteinogene amino kiseline ili modifikovane linker grupe [videti, npr., Grant, Synthetic Peptides: A User’s Guide, Oxford University Press (1992)]. Modifikovane amino kiseline uključuju, na primer, amino kiseline gde je amino i/ili karboksilna grupa zamenjena sa drugom grupom. Primeri koji ne ograničavaju uključuju modifikovane amino kiseline koje uključuju tioamide, uree, tiouree, acilhidrazide, estre, olefine, sulfonamide, amide fosforne kiseline, ketone, alkohole, amide borne kiseline, benzodiazepine i druge aromatične ili ne-aromatične heterocikle [videti Estiarte et al., Burgers Medicinal Chemistry, 6th edition, Volume 1, Part 4, John Wiley & Sons, New York (2002)]. Modifikovane amino kiseline su često povezane sa peptidom sa bar jednom od gore pomenutih funkcionalnih grupa umesto amidne veze. Ne-proteinogene amino kiseline uključuju, ali nisu ograničeni na, β-alanin (β-Ala), norvalin (Nva), norleucin (Nle), 4-aminobuterna kiselina (γ-Abu), 2-aminoizobuterna kiselina (Aib), 6-aminoheksanska kiselina (ε-Ahx), ornitin (orn), hidroksiprolin (Hyp), sarkozin, citrulin, cisteinska kiselina (Coh), cikloheksilalanin, metioninsulfoksid (Meo), metioninsulfon (Moo), homoserinmetilestar (Hsm), propargilglicin (Eag), 5-fluoro-triptofan (5Fw), 6-fluorotriptofan (6Fw), 3’,4’-dimetoksifenil-alanin (Ear), 3’,4’-difluorofenilalanin (Dff), 4’-fluorofenil-alanin (Pff), 1-naftil-alanin (1Ni), 1-metiltriptofan (1Mw), penicilamin (Pen), homoserin (HSe), α-amino izobuterna kiselina, t-butilglicin, t-butilalanin, fenilglicin (Phg), benzotienilalanin (Bta), L-homo-cistein (L-Hcys), N-metil-fenilalanin (NMF), 2-tienilalanin (Thi), 3,3-difenilalanin (Ebw), homofenilalanin (Hfe), s-benzil-L-cistein (Ece) i cikloheksilalanin (Cha). Ove i druge ne-proteinogene amino kiseline mogu da postoje kao D- ili L-izomeri i D-izomeri proteinogenih amino kiselina takođe mogu da se nađu u derivatima.

[0058] Primeri modifikovanih linkera uključuju, ali nisu ograničeni na, fleksibilni linker 4,7,10-trioksa-1,13-tridekandiamin (Ttds), glicin, 6-aminoheksanska kiselina, beta-alanin, i kombinacije Ttds, glicin, 6-aminoheksanska kiselina i beta-alanin.

[0059] Peptidi supstrati proteaze su napravljeni različitim načinima. U nekim izvođenjima, peptidi su sintetisani solidno-faznim postupcima sinteze uključujući one koji su opisani u Merrifield, J. Am. Chem. Soc.85: 2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl.10: 394-414 (1985); Larsen et al., J. Am. Chem. Soc.

115: 6247 (1993); Smith et al., J. Peptide Protein Res. 44:183 (1994); O’Donnell et al., J. Am. Chem. Soc.118: 6070 (1996); Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freeman (1969); Finn et al., The Proteins, 3rd ed., vol.2, pp.105-253 (1976); i Erickson et al., The Proteins, 3rd ed., vol.2, pp.257-527 (1976). Alternativno, peptid supstrat proteaze je rekombinantno eksprimira uvođenjem nukleinske kiseline koja kodira peptid supstrat proteaze u ćelije domaćina koji se gaje u kulturi da bi se eksprimirao peptid. Takvi peptidi su prečišćeni iz ćelijske kulture upotrebom standardnih postupaka prečišćavanja proteina.

[0060] Prikaz takođe obuhvata nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili peptid supstrat proteaze. Postupci za dobijanje DNK i/ili RNK molekula su dobro poznati u oblasti tehnike. U jednom aspektu, ovde obezbeđeni molekul DNK/RNK koji kodira antitelo ili peptid-supstrat proteaze je dobijen upotrebom postupaka hemijske sinteze i/ili upotrebom lančane reakcije polimeraze (PCR). Ukoliko je poželjno, antitelo i/ili sekvenca koja kodira peptid supstrat proteaze je ugrađena u ekspresioni vektor. Stručnjak iz oblasti tehnike će razumeti da bilo koji od brojnih ekspresionih vektora koji su poznati u oblasti tehnike su pogodni u kontekstu prikaza, kao što je, ali bez ograničenja na, plazmide, komplekse plazmida-lipozoma, i virusne vektore. Bilo koji od ovih ekspresionih vektora su pripremljeni upotrebom standardnih postupaka rekombinovane DNK koji su opisani u, npr., Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994). Opciono, nukleinska kiselina je operativno povezana sa jednom ili više regulatornih sekvenci, kao što je promotor, aktivator, pojačivač, signal za dodavanje kape, signal za poliadenilaciju, ili drugi signal koji je uključen u kontrolu transkripcije ili translacije.

[0061] Kao sa svim vezujućim agensima i testovima za ispitivanje vezivanja, stručnjak iz oblasti tehnike prepoznaje da različiti ostaci za koje agens za vezivanje ne treba da se detektabilno veže da bi biološki (npr., terapeutski) bio efikasan mogu da budu iscrpni i nepraktični za navođenje. Prema tome, kada se peptid razmatra, termin "specifično vezuje" se odnosi na sposobnost peptida da se veže za (ili na drugi način inhibira) proteazu koja je uključena u cepanje LTBP4 sa većim afinitetom nego što se veže za neciljni kontrolni protein koji nije proteaza. Na primer, peptid može da se veže za proteazu sa afinitetom koji je najmanje, 5, 10, 15, 25, 50, 100, 250, 500, 1000, ili 10,000 veći od afiniteta za kontrolni protein. U nekim izvođenjima, peptid se vezuje za proteazu sa većim afinitetom nego što se vezuje za "antimetu," protein ili druga supstanca koja se prirodno pojavljuje kod ljudi gde vezivanje peptida može da dovede do nepoželjnih sporednih efekata. Nekoliko klasa peptida su potencijalna anti-ciljna sredstva. Zbog toga se očekuje da peptidi supstrati proteaze ispolje njihovu aktivnost u ekstracelularnom matriksu, ECM proteini se razmatraju kao anti-mete.

1

[0062] U ovom prikazu se takođe specifično razmaraju peptidi koji pokreću imunski odgovor na LTBP4 u postupcima za modulaciju LTBP4 koji uključuju imuni sistem domaćina. Prema tome, u nekim aspektima, obzebeđena je kompozicija koja sadrži peptid iz prikaza za upotrebu kao vakcina kod individue. Vakcine često uključuju adjuvans. Kompozicije koje sadrže jedan ili više peptida koje se ovde opisuju mogu takođe da sadrže adjuvans, ili da se daju sa adjuvansom. Prema tome, adjuvas može da se da sa peptidnim kompozicijama ili kao deo peptidnih kompozicija, pre peptidnih kompozicija, ili posle peptidnih kompozicija.

[0063] Različiti adjuvansi su pogodni za upotrebu u kombinaciji sa peptidnom kompozicijom da bi se pokrenuo imuni odgovor prema peptidu. Poželjni adjuvansi povećavaju intrinzični odgovor prema antigenu bez uzrokovanja konformacionih promena u antigenu koje imaju uticaja na kvalitativni odgovor antigena. Adjuvani za upotrebu u ovde prikazanim postupcima uključuju, nisu ograničeni na, „keyhole limpet“ hemocijanin (KLH), oblike aluma (videti u tekstu ispod) i 3 De-O-acilovani monofosforil lipid A (MPL ili 3-DMP) [videti GB 2220211]. Drugi pogodni adjuvans uključuje QS21, koji je triterpen glikozid ili saponin izolovan iz kore Quillaja Saponaria Molina drveta koje se nalazi u Južnoj Americi [videti Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell and Newman, Plenum Press, NY, 1995); U.S. Pat. No.5,057,540] i CpG [Bioworld Today, Nov.15, 1998]. Još drugi pogodni adjuvansi su opisani u sladećem paragrafu.

[0064] Jedna klasa pogodnih adjuvanasa, koji su istaknuti gore u tekstu, su aluminijumove soli (alum), kao što je aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, i aluminijum sulfat. Takvi adjuvansi mogu da se koriste sa ili bez drugih specifičnih imunostimulišućih agenasa kao što su MPL ili 3-DMP, QS21, polimerne ili monomerne amino kiseline kao što su poliglutaminska kiselina ili polilizin. Druga klasa pogodnih adjuvanasa su formulacije emulzije ulja u vodi [kao što je skvalen ili ulje kikirikija], opciono kombinovano sa imunološkim simulansima, kao što je monofosforil lipid A [videti Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)]. Takvi adjuvansi mogu da se koriste sa ili bez drugih specifičih immunostimulišućih agenasa kao što su muramil peptidi (npr., N-acetilmuramil-L-treonil-D-izoglutamin (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-izoglutamin (nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanil-D-izoglutaminil-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-(hidroksifosforiloksi)) etilamid (MTP-PE), N-acetilglukzaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-izoglu-L-Ala-dipalmitoksi propilamid (DTP-DPP) teramidTM), ili druge komponente bakerijskog ćelijskog zida. Dodatne emulzije ulja u vodi uključuju (a) MF59 (WO 90/14837), koji sadrži 5% Skvalen, 0.5% Tween 80, i 0.5% Span 85 (opcioo sadrži različite količine MTP-PE) formulisane u submikronske čestice upotrebom mikrofluidizera kao što su Model 110Y mikrofluidizer (Microfluidics, Newton Mass.), (b) SAF, koji sadrži 10% Skvalan, 0.4% Tween 80, 5% pluronski-blokirani polimer L121, i thr-MDP, ili mikrofluidiziran u submikronsku emulziju ili vorteksovan da se dobije emulzija sa većom veličinom čestica, i (c) Ribi adjuvansni sistem (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, Mont.) koji sadrži 2% skvalen, 0.2% Tween 80, i jednu ili više komponenti iz bakterijkog ćelijskog zida iz grupe koja se sastoji iz monofosforil lipida A (MPL), trehaloze dimikolata (TDM), i skeleta ćelijskog zida (CWS), poželjno MPL+CWS (DetoxTM). Druga klasa pogodnih adjuvanasa su saponinski adjuvansi, kao što je StimulonTM (QS21, Aquila, Worcester, Mass.) ili čestice koje su iz njih generisane kao što su ISCOMs (immunostimulišći kompleksi) i ISCOMATRIX. Drugi adjuvansi uključuju kompletni Frojndov adjuvans (CFA) i nekompletni Frojndov adjuvans (IFA). Bilo koji od pogodnih adjuvanasa može da uključi citokin, kao što je interleukin (IL-1, IL-2, ili IL-12), faktor stimulacije kolonije makrofaga (M-CSF), faktor nekroze tumora (TNF), ili kombinacije citokina.

[0065] Adjuvans može da se primenjuje sa kompozicijom peptida iz prikaza kao jedna kompozicija, ili može da se primeni pre, istovremeno sa ili posle primene kompozicije peptida iz prikaza. Imunogen i adjuvans mogu da se pakuju i isporuče u istoj bočici ili mogu da budu spakovani u odvojenim bočicama i pomešani pre upotrebe. Imunogen i adjuvans su obično spakovani sa oznakom koja ukazuje na namenjenu primenu, kao što je primena u terapeutske svrhe. Ukoliko su imunogen i adjuvans spakovani odvojeno, pakovanje obično uključuje instrukcije za mešanje pre upotrebe. Izbor adjuvansa i/ili nosača zavisi od stabilnosti vakcine koja sadrži adjuvans, načina davanja, režima doziranja, efikasnosti adjuvansa za vrste kojima se daje vakcina, i, kod ljudi, farmaceutski prihvatljiv adjuvans je onaj koji je odobren ili je prihvatljiv za primenu na ljudima od strane relevantnih regulatornih agencija. Na primer, kompletni Frojndov adjuvans nije prihvatljiv za primenu na ljudima, dok su alum, MPL i QS21 prihvatljivi. Opciono, dva ili više različitih adjuvanasa mogu da se koriste istovremeno, kao što je alum sa MPL, alum sa QS21, MPL sa QS21, i alum, QS21 i MPL zajedno. Takođe, nekompletni Frojndov adjuvans može da se koristi [Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews 32, 173-186 (1998)], opciono kombinovano sa bilo kojim od alum, QS21, i MPL i svim njihovim kombinacijama.

[0066] Kao što se ovde koristi, termin "ciljni polinukleotid" obuhvata DNK, RNK (obuvata pre-iRNK i iRNK) koja se transkribuje sa takve DNK, i takođe cDNK koja se dobija sa takve RNK, kodirajućih sekvenci, nekodirajućih sekvenci, sens polinuleotida ili antisens polinukleotida. Specifična hibridizacija polimernog jedinjenja sa njegovom ciljnom nukleinskom sekvencom interferira sa normalnom funkcijom ciljne nukleinske kiseline. Ova modulacija funkcije ciljne nukleinske kiseline ili polinukleotida od strane jedinjenja koja specifično hibridizuju sa njima se generalno odnosi na antisensnu modulaciju ili inhibiciju. Funkcije DNK koje treba da se interferiraju uključuju, na primer, replikaciju i transkripciju. Funkcije RNK koje treba da se interferiraju uključuju sve vitalne fukcije kao što su, na primer i bez ograničenja, translokacija RNK do mesta translacije proteina, translacija proteina sa RNK, splajsovanje RNK da se dobiju jedna ili više vrsta iRNK, katalitička aktivnost koja može da bude angažovana u ili olakšana pomoću RNK, i/ili translacija da bi se eksprimirao kodirani polipeptid. Sveukupni efekat takve modulacije (npr., inhibicije) sa funkcijom ciljnog polinukleotida je modulacija ekspresije kodiranog proizvoda ili aktivnosti samog polinukleotida.

[0067] RNK interferencija "RNKi" je posredovana molekulima dvolančane RNK (dsRNK) koji imaju homologiju specifičnu za sekvencu sa njihovom ciljnom sekvencom nukleinske kiseline(a) [Caplen et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 98: 9742-9747 (2001)]. U određenim izvođenjima predmenog prikaza, medijatori su "mali interferirajući" RNK dupleksi (siRNK-i) od 5-25 nukleotida. siRNK-e se dobijaju obradom dsRNK sa enzimom RNazom koji je poznat pod imenom Dicer [Bernstein et al., Nature 409: 363-366 (2001)]. Proizvodi dupleksa siRNK su regrutovani u multi-proteinski siRNK kompleks pod nazivom RISC (RNK-Indukovani utišavajući kompleks). Male interferirajuće RNK koje mogu da se koriste u skladu sa predmetnim prikazom mogu da se sintetišu i koriste u skladu sa postupcima koji su dobro poznati u oblasti tehnike koji će biti poznati osobi koja je uobičajeno verzirana u stanje tehnike. siRNK-i za upotrebu u postupcima iz predmetnog pronalaska pogodno obuhvataju između oko 1 do oko 50 nukleoitda (nt). U ne-ograničavajućim izvođenjima, siRNK-i obuhvataju oko 5 do oko 40 nt, oko 5 do oko 30 nt, oko 10 do oko 30 nt, oko 15 do oko 25 nt, ili oko 20-25 nukleotida.

[0068] Obezbeđeni su postupci za inhibiciju ekspresije ciljnog nukleotida koji uključuju one u kojima je ekspresija ciljnog polinukleotida je u 5% i do oko 10%, 20%, 50% ili 100%, najmanje oko 5% i do oko 30%, 60%, 70% ili 90%, ili najmanje 10% i do oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. U dodatnim izvođenjima, ekspresija ciljnog polinukleotida je inhibirana za najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, za najmanje oko 15%, za najmanje oko 20%, za najmanje oko 25%, za najmanje oko 30%, za najmanje oko 35%, za najmanje oko 40%, za najmanje oko 45%, za najmanje oko 50%, za najmanje oko 55%, za najmanje oko 60%, za najmanje oko 65%, za najmanje oko 70%, za najmanje oko 75%, za najmanje oko 80%, za najmanje oko 85%, za najmanje oko 90%, za najmanje oko 95%, za najmanje oko 96%, za najmanje oko 97%, za najmanje oko 98%, za najmanje oko 99%, ili 100% u poređenju sa ekspresijom ciljnog polinukleotida u odsustvu inibitorne nukleinske kiseline. Drugim rečima, postupci inibiranja ekspresije ili aktivnosti polinukleotida prema prikazu rezultira u suštini bilo kojim strepenom inibicije ekspresije ciljnog polinukleotida.

1

[0069] Stepen inhibicije se određuje in vivo iz uzorka telesne tečnosti ili iz uzorka biopsije ili postupcima snimanja koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Alternativno, stepen inhibicije se određuje u testu ćelijske kulture, generalno kao predvidljiva mera stepena inhibicije koja može se može očekivati in vivo koji je rezultat upotrebe specifičnog tipa specifične inhibitorne nukleinske kiseline.

Preskakanje egzona

[0070] Inhibitorne nukleinske kiseline se takođe razmatraju za upotrebu u preskakanju egzona. Generalno, preskakanje egzona je postupak u kome su inhibitorne nukleinske kiseline dizajnirane da moduliraju spajanje gena od interesa, što ima za rezultat iRNK transkripte koji su sposobni da napreve neki nivo genskog proizvoda sa nekom funkcijom. Inhibitorne nukleinske kiseline su, u različitim izvođenjima, kratke sekvence nukleinske kiseline koja je dizajnirana da se selektivno veže za specifičnu iRNK ili pre-iRNK sekvence da se dobiju mali dvolačani regioni ciljne iRNK. Vezivanjem za ove regione i obrazovanjem dvostrukih lanaca na ključnim mestima na kojima bi se splajsozom ili proteini splajsozoma normalno vezali, mutirani (sa promenom okvira čitanja) egzoni su preskočeni i preostali deo pre-iRNK je ispravno editovan u okviru, iako je kraći.

[0071] Preskakanje egzona je generalno opisano u Hoffman et al. [The American J. of Path.179(1): 12-22 (2011)], Lu et al. [The American Soc. of Gene and Cell Therapy 19(1): 9-15 (2011)], i U.S. Patent Numbers 8,084,601, 7,960,541 i 7,973,015.

KOMPOZICIJE

[0072] Bilo koje od agenasa i/ili ovde opisanih dodatnih agenasa (ili nukleinskih kiselina koje kodiraju bilo koji od agenasa i/ili ovde opisanih dodatnih agenasa) takođe je obezbeđeno u kompoziciji. U tom pogledu, agens i/ili dodatni agens je formulisan sa fiziološki prihvatljivim (tj., farmakološki prihvatljivim) nosačem, puferom, ili razblaživačem, kao što se ovde dalje opisuje. Opciono, peptid je u obliku fiziološki prihvatljive soli, koja je obuvaćena prikazom. "Fiziološki prihvatljive soli" označava bilo koje soli koje u farmaceutski prihvatljive. Neki primeri odgovarajući soli uključuju acetatne, trifluoroacetatne, hidrohloridne, hidrobromidne, sulfatne, citratne, tartratne, glikolatne, i oksalatne.

TGFβ-POVEZANE BOLESTI

[0073] TGFβ-povezane bolesti koje se razmatraju za lečenje u skladu sa predmetnim prikazom uključuju Dišenovu mišićnu distrofiju, udno-pojasne mišićne distrofije, Bekerove mišićne distrofije, miopatije, cistične fibroze, plućne fibroze, kardiomiopatije, akutne povrede pluća, akutne mišićn povrede i akutne miokardijalne povrede.

[0074] Kao šo se ovde koristi, "kardiomiopatija " se odnosi na bilo koju bolest ili disfunkciju miokardijuma (mišića srca) u kom je srce abnormalno uvećano, zadebljano i/ili ukrućeno. Kao rezultat, sposobnost rčanog mišića da pump krv je obično oslabljena, često dovodi do kongestivne srčane insuficijencije. Bolest ili poremećaj može da bude, na primer, inflamatorni, metabolički, toksični, infiltrativni, fibrozni, hematološki, genetički, ili nepoznatog porekla. Takve kardiomiopatije mogu da budu rezultat nedostatka kiseonika. Druge bolesti uključuju one koje mogu da nastanu iz iokardijalne povrede koja uključuje oštećenje mišića ili miokardijuma u srčanom zidu kao rezulat bolesti ili traume. Miokardijalna povreda može da se prepiše mnogim stvarima kao što su, ali bez ograničenja na, kardiomiopatiju, infarkt miokarda, ili kongenitalno oboljenje srca. Srčani poremećaj može da bude pedijatrijskog porekla. Kardiomiopatija uključuje, ali nije ograničena na, kardiomiopatiju (dilatacijska, hipertrofna, restriktivna, arhitmogena, genetička, idiopatska i neklasifikovana kardiomiopatija), sporadična dilatacijska kardiomiopatija, X-vezana Dilatacijska Kardiomiopatija (XLDC), akutna i

1

hronična srčana insuficijencija, zatajenje desnog srca, zatajenje levog srca, biventrikularni srčani zastoj, kongenitalni srčani deficiti, miokardijalna fibroza, stenoza mitralog zaliska, insuficijencija mitralnog zaliska, stenozu aortnog zalistka, isuficijenciju aortnog zalistka, stenoza trikuspidalnog zalistka, insuficijencija trikuspidalnog zalistka, stenoza plućnog zalistka, insuficijencija plućnog zalistka, defekti kombinovanih zalistaka, miokarditis, akutni miokarditis, hronični miokarditis, miokarditis indukovan virusom, diastolna srčana insuficijencija, sistolna srčana insuficijencija, dijabetička insuficijencija srca i bolesti nakupljanja.

TGFβ PROTEINI

[0075] Prikaz obezbeđuje kompozicije i postupke koji su usmereni na modulaciju aktivnosti, uključujući ekspresiju, LTBP4, koji je protein koji interaguje sa TGFβ proteinima. Modulacija aktivnosti bilo kog proteina koji interaguje sa LTBP4 se razmatra u prikazu, i u različitim izvođenjima TGFβ protein je odabran iz grupe koja se sastoji iz faktora rasta i diferencijacije (GDF), aktivina, inhibina, i morfogenetskog proteina kostiju. TGFβ proteini su poznati u oblasti tehnike i razmatraju se, na primer i bez ograničenja, u Schmierer et al. (Nature Reviews Molecular Cell Biology 8: 970-982 (2007)]. Pored toga, izoforme TGFβ proteina se razmatraju i uključuju, bez ograničenja, TGFβ 1, TGFβ 2, TGFβ 3, GDF 8, i GDF 11.

[0076] Praksa postupaka prikaza gde se pacijentu daje jedan ili više agen(a)sa i opciono očekuje se da dodatni agens(i) rezultuju u modulaciji aktivnosti TGFβ proteina za najmanje oko 1% u odnosu na pacijenta koji nije tretiran na taj način. U daljim izvođenjima, aktivnost TGFβ proteina kod pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i/ili dodatni agens(i) se modulira za najmanje oko 1% i do bilo kog od oko 2%, oko 5%, oko 10% ili oko 15% aktivnosti TGFβ u odnosu na pacijenta koji nije tretiran na taj način. U još daljim izvođenjima, aktivnost TGFβ proteina kod pacijenta kome se daje jedan ili više agen(a)sa i opciono dodatni agens(i) je moduliran za najmanje oko 10% i do bilo kog od oko 15%, oko 20%, oko 25% ili oko 30% aktivnosti TGFβ u odnosu na pacijenta koji nije tretiran na taj način. U daljim izvođenjima, aktivnost TGFβ proteina kod pacijenta kome se daje jedan ili više agen(a)sa i/ili dodatni agens(i) je moduliran za najmanje oko 10% i do bilo kog od oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 99% ili više aktivnosti TGFβ u odnosu na pacijenta koji nije na taj način tretiran. U određenim izvođenjima, aktivnost TGFβ proteina kod pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i opciono dodatni agens(i) je modulisana za najmanje oko 1%, oko 2%, oko 5%, oko 10%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 99% aktivnosti TGFβ ili više u odnosu na pacijenta koji nije na taj način lečen. Proteinska aktivnost može da se kvantifikuje postupcima koji su generalno poznati stručnjacima iz oblasti tehnike.

DODATNI (DRUGI) AGENSI

[0077] U različitim izvođenjima iz prikaza se podrazumeva da se drugi agens daje sa agensom koji modulira aktivnost LTBP4 modulacijom proteolize LTBP4. Neograničavajući primeri drugog sredstva su modulator inflamatornog odgovora, promoter mišićnog rasta, hemoterapeutski agens i modulator fibroze. Dalje, ovde korišćeni postupci mogu, u različitim izvođenjima, obuhvatiti jedan ili više od takvih agenasa, ili jedan ili više od takvih agenasa u kompoziciji sa bilo kojim drugim aktivnim agensom(sima).

Hemoterapeutski agensi

[0078] Hemoterapeutski agensi koji se razmatraju za upotrebu uključuju, bez graničenja, agense za alkilovanje uključujući: azotne iperite, kao što su mehlor-etamin, ciklofosfamid, ifosfamid, melfalan i hlorambucil; nitrozouree, kao što je karmustin (BCNU), lomustin (CCNU), i semustin (metil-CCNU); etilenimini/metilmelamin kao što je trietilenmelamin (TEM), trietilen, tiofosforamid (tiotepa),

1

heksametilmelamin (HMM, altretamin); alkil sulfonati kao što je busulfan; triazini kao što je dakarbazin (DTIC); antimetaboliti uključujući analoge folne kiseline kao što je metotreksat i trimetreksat, analoge pirimidina kao što je 5-fluorouracil, fluorodeoksiuridin, gemcitabin, citozin arabinozid (AraC, citarabin), 5-azacitidin, 2,2’-difluorodeoksicitidin, analoge purina kao što je 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, azatioprin, 2’-deoksikoformicin (pentostatin), eritrohidroksinoniladenin (EHNA), fludarabin fosfat, i 2-hlorodeoksiadenozin (kladribin, 2-CdA); prirodni proizvodi uključujući antimitotičke lekove kao što je paklitaksel, vinka alkaloide uključujući vinblastin (VLB), vinkristin, i vinorelbin, taksoter, estramustin, i estramustin fosftat; epipodofilotoksine kao što je etopozid i tenipozid; antibiotike kao što su aktimomicin D, daunomicin (rubidomicin), doksorubicin, mitoksantron, idarubicin, bleomicini, plikamicin (mitramicin), mitomicin C, i aktinomicin; enzimi kao što su L-asparaginaza; modifikatori biološkog odgovora kao što je interferon-alfa, IL-2, G-CSF i GM-CSF; raznovrsni agensi uključujući koordinacione komplekse sa platinom kao što je cisplatin i karboplatin, antracendioni kao što su mitoksantron, supstituisana urea kao što je hidroksiurea, metilhidrazin derivati uključujući N-metilhidrazin (MIH) i prokarbazin, adrenokortikalni supresanti kao što su mitotan (o,p’-DDD) i aminoglutetimid; hormoni i antagonisti uključujući adrenokortikosteroidne antagoniste kao što su prednizon i ekvivalenti, deksametazon i aminoglutetimid; progestin kao što je hidroksiprogesteron kaproat, medroksiprogesteron acetat i megestrol acetat; estrogen kao što je dietilstilbestrol i etinil estradiol ekvivalenti; antiestrogen kao što je tamoksifen; androgeni uključujući testosteron propionat i fluoksimesteron/ekvivalente; antiandrogene kao što je flutamid, analoge gonadotropinoslobađajućeg hormona i leuprolid; i ne-steroidne antiandrogene kao što je flutamid.

Modulatori fibroze

[0079] "Modulator fibroze" kao što se ovde koristi je sinonim sa antifibroznim agensom. Termin "antifibrozno sredstvo" se odnosi na hemijsko jedinjenje koje ima antifibroznu aktivnost (tj., sprečava ili smanjuje fibrozu) kod sisara. Ovo uzima u obzir abnormalno obrazovanje fibroznog vezujućeg tkiva, koje se obično sastoji iz kolagena. Ova jedinjenja mogu da imaju različite mehanizme delovanja, neka smanjuju obrazovanje kolagena ili drugog proteina, drugi pojačavaju katabolizam ili uklanjanje kolagena u pogođenoj oblasti tela. Ovde su uključena sva takva jedinjenja koja imaju aktivnosti u smanjenju prisustva fibroznog tkiva, bez obzira na određeni mehanizam delovanja pod kojim svaki takav lek funkcioniše. Antifibrozni agensi korisni u postupcima i kompozicije iz prikaza uključuju one koji se opisuju u U.S. Patent broju 5,720,950. Dodatni antifibrozni agensi koji se razmatraju od strane prikaza uključuju, ali nisu ograničeni na, agoniste receptora Tip II interferona (npr., interferon-gama); pirfenidon i analozi pirfenidona; anti-angiogeni agensi, kao što su antagonisti VEGF, antagonisti VEGF receptora, bFGF antagonisti, antagonisti bFGF receptora, TGFβ antagonisti, antagonisti TGFβ receptora; anti-inflamatorni agensi, IL-1 antagonisti, kao što su IL-1Ra, inhibitori angiotenzinkonvertujućeg-enzima (ACE), blokatori receptora za angiotenzion i antagonisti aldosterona.

Modulatori inflamatornog odgovora

[0080] Modulator inflamatornog odgovora uključuje sledeća sredstva. U jednom izvođenju iz prikaza, modulator inflamatornog odgovora je antagonist beta2-adrenergičkog receptora (npr., albuterol). Termin agonist beta2-adrenergičkog receptora se ovde koristi da definiše klasu lekova koji imaju dejstvo na β2-adrenergički receptor, time uzrokujući opuštanje glatkog mišića što rezultira dilatacijom bronhijalnih puteva, vazodilatacijom u mišiću i jetri, opuštanju mišića materice i oslobađanja insulina. U jednom izvođenju, agonist beta2-adrenergičkog receptora za upotrebu prema prikazu je albuterol, imunosupresantni lek koji se u znatnoj meri koristi u inhalacijskom obliku za astmatičare. Smatra se da albuterol usporava napredovanje bolesti suprimiranjem infiltriranja makrofaga i drugih imunih ćelija koje doprinose gubitku inflamatornog tkiva. Takođe se čini da albuterol ima neke anaboličke efekte i promoviše rast mišićnog tkiva. Albuterol može takođe da suprimira proteinsko degradiranje (moguće inhibicijom kalpaina).

1

[0081] U DMD, gubitak distrofina dovodi do pucanja membrane mišićne ćelije, i destabilizuje neuronsku sintazu azot monoksida (nNOS), protein koji normalno generiše azot monoksid (NO). Smatra se da se deo degeneracije mišića koji se uočava kod DMD pacijenata može da bude rezultat smanjene proizvodnje neuronalne sintaze azot monoksida povezane sa mišićnom membranom. Ovo smanjenje može da dovede do oslabljene regulacije vazokonstriktornog odgovora i eventualnog mišićnog oštećenja.

[0082] U jendom izvođenju, modulatori inflamatornog odgovora pogodni za upotrebu u kompozicijama iz prikaza su inhibitori Nuklearnog Faktora Kapa-B (NF-κB). NF-κB je glavni transkripcioni faktor koji vrši modulaciju ćelijskog imunog, inflamatornog i proliferativnih odgovora. NF-κB funkcioniše u aktiviranim makrofagima da promoviše inflamacijom i nekrozu mišića i u vlaknima skeletnog mišića da se ograniči regeneracija preko inhibicije mišićnih progenitorskih ćelija. Aktivacija ovog faktora DMD doprinosi patologiji bolesti. Prema tome, NF-kB igra važnu ulogu u progresiji mišićne distrofije i IKK/NF-κB signalnog puta je potencijalna terapeutska meta za lečenje TGFβpovezane bolesti. Inhibitori NF-κB (na primer, IRFI 042, analog avitamin E) pojačavaju mišićnu funkciju, smanjuju kreatin kinaze (CK) u serumu i nekrozu mišića i pojačavaju mišićnu regeneraciju. Dalje, specifična inhibicija signalizacije posredovane sa NF-κB preko IKK ima slične prednosti.

[0083] U daljem izvođenju, modulator inflamatornog odgovora je antagonist faktora alfa nekroze tumora. TNF-α je jedan od ključnih citokina koji pokreće i održava inflamatorni odgovor. U jednom specifičnom izvođenju iz prikaza, modulator inflamatornog odgovora je TNF-α antagonist infliksimab.

[0084] Antagonisti TNF-α za upotrebu prema prikazu uključuju, pored infliksimaba (RemicadeTM), himerno monoklonalno antitelo koje obuhvata mišje VK i VH domene i humane konstantne Fc domene. Lek blokira delovanje TNF-α njegovim vezivanjem i sprečavanjem signalizacije u receptorima za TNF-α na površini ćelija. Drugi antagonist TNF-α za upotrebu prema prikazu je adalimumab (HumiraTM). Adalimumab je puno humano monoklonalno antitelo. Drugi antagonist TNF-α za upotrebu prema prikazu je etanercept (EnbrelTM). Etanercept je dimerni fuzioni protein koji obuhvata rastvorljivi receptor humanog TNF koji je spojen sa Fc porcijom IgG1. To je veliki molekul koji vezuje TNF-α i prema tome blokira njegovo delovanje. Etanercept imitira inhibitorne efekte rastvorljivih TNF receptora koji se nalaze u prirodi, ali kao što je fuzioni protein ima značajno produžen polu-život u cirkulaciji i prema tome dublji i dugotrajniji inhibitorni efekat.

[0085] Drugi antagonist TNF-α za upotrebu prema prikazu je pentoksifilin (TrentalTM), hemijsko ime 1-(5-oksoheksil)-3,7-dimetilksantin. Uobičajena doza u obliku tablete sa kontrolisanim oslobđanjem je jedna tablete (400 mg) tri puta uz obroke.

[0086] Doziranje: Remikad se ordinira intravenoznom infuzijom, obično u 2-mesečnim intervalima. Preporučena doza je 3 mg/kg koja se daje kao intravenozna infuzija praćeno sa dodatnim sličnim dozama na 2 i 6 nedelje posle prve infuzije, zatim svakih 8 nedelja nakon toga. Za pacijente koji imaju nepotpune odgovore, može se razmotriti prilagođavanje doze do 10 mg/kg ili lečenje onoliko često koliko je svake 4 nedelje. Humira se prodaje u oba prethodno napunjena 0.8 ml (40 mg) šprica i takođe u prethodno napunjenim spravama u obliku olovke, oba se ubrizgavaju subkutanozno, obično od strane pacijenta koji se nalazi kod kuće. Etanercept može da se daje u dozi od 25 mg (dva puta nedeljno) ili 50 mg (jednom nedeljno).

[0087] U drugom izvođenju iz pronalaska, modulator inflamatornog odgovora je ciklosporin. Ciklosporin A, glavni oblik leka, je ciklični neribozomalni peptid od 11 amino kiselina proizveden od strane gljivice Tolypocladium inflatum. Smatra se da se ciklosporin vezuje za citoplazmatski protein ciklofilin (imunophilin) imunokompetentnih limfocita (posebno T-limfociti). Ovaj kompleks ciklosporina i ciklospirina inhibira kalcineurin, koji pod normalnim uslovima je odgovoran za aktivaciju

1

transkripciju interleukina-2. On takođe inhibira proizvodnju limfokina i oslobađanje interleukina i prema tome dovodi do smanjene funkcije efektorskih T-ćelija. Ovo ne pogađa citostatsku aktivnost. Takođe ima efekat na mitohondrije, sprečavajući mitohondrijske PT pore od otvaranja, prema tome inhibirajući oslobađanje citohroma c (potentni faktor stimulacije apoptoze). Ciklosporin može da se daje u dozi od 1-10 mg/kg/danu.

Promoter mišićnog rasta

[0088] U nekim izvođenjima iz prikaza, pacijentu se daje terapeutski efikasna količina promotora mišićnog rasta. Promotori mišićnog rasta predviđeni prikazom uključuju, ali nisu ograničeni na, insulinu sličan faktor rasta-1 (IGF-1), Akt/proteinska kinaza B, klenbuterol, kreatin, dekorin (videti U.S. objavi patenta br 20120058955), steroid (na primer i bez ograničenja, kortikosteroid ili glukokortikoid steroid), testosteron i antagonist miostatina.

Antagonist miostatina

[0089] Druga klasa promotera mišićnog rasta koji su pogodni za upotrebu u kombinacijama iz prikaza su antagonisti miostatina. Miostatin, takođe poznat pod imenom faktor rasta/diferencijacije 8 (GDF-8) je član superfamilije transformišućeg faktora rasta-β (TGFβ) koji je uključen u regulaciju mase skeletnog mišića. Većina članova familije TGF-β-GDF su široko eksprimirani i plejotropni su; međutim, miostatin je primarno eksprimiran u tkivu skeletnog mišića u kome negativno kontroliše rast skeletnog mišića. Miostatin se sintetiše kao inaktivni preproprotein koji se aktivira proteolitičkim cepanjem. Prekursorski protein se cepa da se proizvede približno 109-amino-kiselina COOH-terminalni protein koji, u obliku homodimera 25 kDa, je zreo, aktivni oblik. Čini se da zreli dimer cirkuliše u krvi kao inaktivni zreli kompleks koji je vezan za propeptid. Kao što se ovde koristi termin "antagonist miostatina" definiše klasu agenasa koja inhibira ili blokira bar jednu aktivnost miostatina, ili alternativno, blokira ili smanjuje ekspresiju miostatina ili njegovog receptora (na primer, interferencijom sa vezivanjem miostatina za njegov receptor i/ili blokiranje signalne transdukcije koja nastaje iz vezivanja miostatina za njegov receptor). Takva sredstva prema tome uključuju agense koji se vezuju za sami miostatin ili za njegov receptor.

[0090] Antagonisti miostatina za upotrebu prema prikazu uključuju antitela prema GDF-8; antitela prema GDF-8 receptorima; rastvorljive GDF-8 receptore i njihove fragmente (npr., ActRIIB fuzione polipeptide kao što je opisano u U.S. Objavi patenta broj 2004/0223966, uključujući rastvorljive ActRIIB receptore u kojima je ActRIIB povezan sa Fc porcijom imunoglobulina); GDF-8 propeptid i njegovi modifikovani oblici (npr., kao što je opisano u WO 2002/068650 ili U.S. Pat. No. 7,202,210, uključujući oblike u kojima je GDF-8 propeptid spojen sa Fc porcijom imunoglobulina i/ili oblik u kome je GDF-8 mutiran na ostatku aspartata (asp), npr., asp-99 u mišjem GDF-8 propeptidu i asp-100 u humanom GDF-8 propeptid); mali molekul inhibitor GDF-8; folistatin (npr., kao što je opisano u U.S. Pat. No.6,004,937, ovde uključeno referencom) ili proteini koji sadrže domen folistatina (npr., GASP-1 ili drugi proteini kao što se opisuje u U.S. patent broju 7,192,717 i U.S. Patent br.7,572,763, svaki ovde uključeni referencom); i modulatori aktivnosti metaloproteaze koja utiče na aktivaciju GDF-8, kao što je opisano u U.S. objavi patenta broj 2004/0138118.

[0091] Dodatni antagonisti miostatina uključuju antitela prema miostatinu koja se vezuju za i inhibiraju ili neutralizuju miostatin (uključujući proprotein miostatina i/ili zreli protein, u monomernom ili dimernom obliku). Antitela prema miostatinu su sisarska ili nesisarska izvedena antitela, na primer IgNAR antitela dobijena iz ajkula, ili humanizovana antitela, ili sadrže funkcionalni fragment koji je dobijen iz antitela. Takva antitela se opisuju, na primer, u WO 2005/094446 i WO 2006/116269. Antitela prema miostatinu takođe uključuju ona antitela koja se vezuju za proprotein miostatina i sprečavaju cepanje u zdrav aktivni oblik. Dodatni antagonisti antitela uključuju antitela koja se opisuju

2

u U.S. Patent broju 6,096,506 i U.S. Patent broju 6,468,535. U nekim izvođenjima, GDF-8 inhibitor je monoklonalno antitelo ili njegov fragment koji blokira vezivanje GDF-8 za njegov receptor. Dalja izvođenja uključuju mišje monoklonalno antitelo JA-16 (kao što je opisano u U.S. Patent broju 7,320,789 (ATCC Depozit br. PTA- 4236); njegovi humanizovani derivati i puna humana monoklonalna anti-GDF-8 antitela (npr., Myo29, Myo28 i Myo22, ATCC Depozit br-i. PTA-4741, PTA-4740, i PTA-4739, redom, ili njihovi derivati) kao što se opisuje u U.S. Patent broju 7,261,893.

[0092] U još daljim izvođenjima, antagonisti miostatina uključuju rastvorljive receptore koji se vezuju za miostatin i inhibiraju bar jednu njegovu aktivnost. Termin "rastvorljivi receptor" ovde uključuje prekinute verzije ili fragmente receptora miostatina koji specifično vezuje miostatin na taj način inhibira ili blokira signalnu transdukciju miostatina. Prekinute verzije receptora miostatina, na primer, uključuju rastvorljive domene koji se pojavljuju u prirodi, kao i varijacije koje su proizvedene proteolizom N- ili C-terminusa. Rastvorljivi domen uključuje svaki od dela vanćelijskog domena receptora, ili samog ili vezanog sa dodatnim peptidima ili drugim ostacima. Zbog toga što miostatin vezuje aktivinske receptore (uključujući receptor aktivin tipa IEB (ActRHB) i receptor aktivin tipa HA (ActRHA)), receptori aktivina mogu da formiraju osnovu antagonista rastvorljivog receptora. Takođe mogu da se koriste rastvorljivi proteini fuzionog receptora, uključujući rastvorljivi receptor Fc (videti U.S. Objava patenta broj 2004/0223966 i WO 2006/012627).

[0093] Drugi antagonisti miostatina zasnovani na receptorima miostatina su ALK-5 i/ili inhibitori ALK-7 (videti na primer WO 2006/025988 i WO 2005/084699). Kao TGF-β citokin, miostatin ima signalizaciju preko familije pojedinačnih transmembranskih receptora serin/treonin kinaza. Ovi receptori mogu da budu podeljeni u dve klase, tip I ili aktivinu-slični kinazni (ALK) receptori i receptori tipa II. ALK receptori se razlikuju od receptora Tipa II u tome što ALK receptorima (a) nedostaje serin/treonin-bogati unutarćelijski rep, (b) sadrži serin/treonin kinazne domene koji su visoko homologi između receptora Tipa I, i (c) imaju zajednički motiv sekvence koji je poznat pod imenom GS domen, koji se sastoji iz regiona bogatog u ostacima glicina i serina. GS domen je na amino terminalnom kraju unutarćelijskog kinaznog domena i veruje se da je kritičan za aktivaciju sa receptorom Tipa II. Nekoliko studija je pokazalo da TGF-β signalizacija zahteva i ALK (Tip I) i Tip II receptore. Specifično, Tip II receptor fosforiluje GS domen Tip 1 receptora za TGFβ ALK5, u prisustvu TGFβ. ALK5, sa druge strane, fosforiluje citoplazmatske proteine smad2 i smad3 na dva karboksi terminalna serina. Generalno, veruje se da u mnogim vrstama, Tip II receptori regulišu ćelijsku proliferaciju i Tip I receptori regulišu proizvodnju matriksa. Opisani su različiti inhibitori ALK5 receptora (videti, na primer, U.S. Patent broj 6,465,493, U.S. Patent broj 6,906,089, U.S. Objave patenata brojevi 2003/0166633, 2004/0063745 i 2004/0039198). Prema tome, antagonisti miostatina za upotrebu prema postupku mogu da sadrže miostatin-vezujući domen ALK5 i/ili ALK7 receptora.

[0094] Drugi antagonisti miostatina uključuju rastvorljive antagoniste liganda koji se nalaze u kompeticiji sa miostatinom za vezivanje sa receptorima za miostatin. Termin "rastvorljiv antagonist liganda" se ovde odnosi na rastvoljive peptide, polipeptide ili peptidomimetike sposobne za neproduktivno vezivanje za receptor(e) miostatina (npr., aktivin tip HB receptor (ActRHA)) i time kompetitivno blokira miostatin-receptor signalnu transdukciju. Rastvorljivi ligand antagonisti uključuju varijante miostatina, takođe naznačene sa "miostatinski analozi" koji imaju homologiju sa, ali ne aktivnost, miostatina. Takvi analozi uključuju prekinute (kao što su N- ili C-terminalni prekidi, supstitucije, delecije, i druge izmene u sekvenci amino kiseline, kao što su varijante koje imaju neamino kiselinske supstitucije).

[0095] Dodatni antagonisti miostatina koji se razmatraju u prikazu uključuju inhibitorne nukleinske kiseline kao što se ovde opisuju. Ovi antagonisti uključuju antisens ili sens polinukleotide koji sadrže jednolančanu polinukleotidnu sekvencu (ili RNK ili DNK) koja je sposobna za vezivanje sa iRNK (sens) ili DNK (antisens) sekvencama. Prema tome, interferencija RNK (RNKi) koja se proizvodi uvođenjem specifične male interferirajuće RNK (siRNK), može takođe da se koristi da inhibira ili ukloni aktivnost miostatina.

[0096] U specifičnim izvođenjima, antagonisti miostatina uključuju, ali nisu ograničeni na, folistatin, i prodomen miostatina, prodomen faktora rasta i diferencije 11 (GDF-11), prodomein fuzionih proteina, antagonistička antitela ili fragmente antitela koji vezuju miostatin, antagonistička antitela ili fragmente antitela koji se vezuju za aktivin tip IEB receptora, rastvorljivi aktivin tip IHB receptor, rastvorljivi aktivin tip IEB receptor fuzioni proteini, rastvorljive analoge miostatina (rastvorljivi ligandi), polinukleotidi, mali molekuli, peptidomimetici, i agensi koji vezuju miostatin. Drugi antagonisti uključuju peptidne imunogene koji su opisani u U.S. Patent broju 6,369,201 i WO 2001/05820 i multimeri miostatina i imunokonjugati koji su sposobni za pokretanje imunog odgovora i prema tome blokiranja aktivnosti miostatina. Drugi antagonisti uključuju proteinske inhibitore miostatina koji se opisuju u WO 2002/085306, koji uključuju prekinuti Aktivin tip II receptor, miostatin pro-domen, i folistatin. Drugi inhibitori miostatina uključuju one koji su oslobođeni u kulturu iz ćelija koje prekomerno eskprimiraju (videti WO 2000/43781), dominantne negativne miostatin proteine (videti WO 2001/53350) uključujući protein kodiran od strane Piedmontese allele, i zreli peptidi miostatina imaju C-terminalni prekid na položaju koji je ili na ili između položaja amino kiselina 335 do 375. Mali peptidi koji su opisani u U.S. Objavi patenta br 2004/0181033 koji sadrže sekvencu amino kiseline WMCPP, su takođe pogodni za upotrebu u kompozicijama iz prikaza.

TERAPEUTSKI CILJEVI

[0097] U različitim aspektima iz prikaza, upotreba agen(a)sa i opcionih dodatnih agen(a)sa kao što je ovde opisano obezbeđuje jednu ili više prednosti u vezi sa specifičnim terapeutskim ciljevima u odnosu na pacijenta koji nije primio agense i/ili dodatni agens(e).

[0098] U izvođenjima u kojima TGFβ-povezana bolest je bolest povezana sa mišićem (npr., mišićna distrofija ili kardiomiopatija), terapeutske krajnje tačke uključuju, ali nisu ograničene na, dužinu vremena dok pacijent nije ambulatorni, ambulatorni kapacitet meren sa, na primer i bez ograničenja, udaljenost šest minuta hoda, za koje se pokazalo da korelira sa humanim LTBP4 SNPs [videti, na primer, Hersh et al., Am J Respir Crit Care Med.173(9): 977-84 (2006)], relativno zdravlje srca kao što se određuje sa, npr., ehokardiografijom, snimanjem magnetnom rezonancom (MRI), mišićnim mehanikama, plućnom funkcijom i/ili količinom fibroze u tkivima.

[0099] U odnosu na dužinu vremena dok je pacijent ne-ambulatorni, pretpostavlja se da, u nekim izvođenjima, pacijent kome se daje jedan ili više agen(a)sa i, opciono, dodatni agens(i) ostaje ambulatoran najmanje 1 dan i do bilo kog od oko 5, oko 10, oko 30, oko 60 ili oko 90 dana duže od pacijenta koji nije na taj način tretiran. U daljim izvođenjima, pacijent kome se daje jedan ili više agen(a)sa i opciono dodatni agens(i) ostaje ambulatoran najmanje oko 1 mesec i do bilo kog od oko 2, oko 4, oko 6, oko 8, oko 10 ili oko 12 meseci duže od pacijenta koji nije tretiran na taj način. Još dalja izvođenja iz prikaza razmatraju da pacijent kome se daje jedan ili više agen(a)sa i, opciono, dodatni agens(i) ostaje ambulatoran najmanje oko 1 godine i do bilo kog od oko 1.5, oko 2, oko 3, oko 4, oko 5, oko 6, oko 7, oko 8, oko 9, oko 10 ili više godina duže od pacijenta koji nije na taj način tretiran.

[0100] U izvođenjima gde TGFβ-povezana bolest je kancer, terapeutske krajnje tačke uključuju ali nisu ograničeni na smanjenje zapremine tumora (tj., veličine tumora merene količinom prostora koje zauzima izraženo u tradicionalnim jedinicama zapremine (npr., kubni centrimetri) ili kao procent tkiva ili organa u kome je pronađen (npr., zparemina tumora kancera prostate je procenat prostate koje je preuzeo tumor)) i/ili redukcija u metastazi. Što se tiče smanjenja u zapremini tumora i/ili smanjenja u metastazi, predviđeno je da u nekim izvođenjima zapremina tumora ili količina metastaza je smanjena kod pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i, opciono, dodatnih agen(a)sa za oko 1% u odnosu na pacijenta koji nije na taj način tretiran. U daljim izvođenjima, zapremina tumora ili količina metastaza je smanjena kod pacijenta kome sa daje jedno ili više agen(a)sa i, opciono, dodatni agensi za najmanje oko 1% i do bilo koje od oko 2%, oko 5%, oko 10% ili oko 15% u odnosu na pacijenta koji nije na taj način tretiran. U još daljim izvođenjima, zapremina tumora ili količina metastaza je smanjena kod pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i, opciono, dodatni agensi za najmanje oko 10% i do oko 15%, oko 20%, oko 25% ili oko 30% u odnosu na pacijenta koji nije na taj način tretiran. U daljim izvođenjima, zapremina tumora ili količina metastaza je smanjena kod pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i, opciono, dodatni agensi za najmanje oko 10% ili do bilo koji od 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 99% ili više u odnosu na pacijenta koji nije tako lečen. U specifičnim izvođenjima, zapremina tumora ili količina metastaza je smanjena kod pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i, opciono, dodatna sredstva za najmanje oko 1%, oko 2%, oko 5%, oko 10%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 99% ili više u odnosu na pacijenta koji nije tako lečen. Postupci za merenje zapremine tumora kao i količine metastaza su dobro poznati u oblasti tehnike.

[0101] U izvođenjima gde TGFβ-povezana bolest je virusna bolest, terapeutske krajnje tačke se odnose na opterećenje virusom kod pacijenta. Postupci za određivanje virusnog opterećenja su dobro poznati u oblasti tehnike i mogu se kvantifikovati upotrebom postupaka kao što je lančana reakcija polimeraze (PCR), Reverzna transkriptaza PCR (RT-PCR), probno-specifično umnožavanje ili postupkom razgranate DNK (bDNK). U različitim izvođenjima, virusno opterećenje pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i, opciono, dodatni agensi is prikaza je smanjeno za najmanje oko 1% i do bilo koje od oko 5%, oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40% ili oko 50% u odnosu na pacijenta koji nije na taj način tretiran. U daljim izvođenjima, virusno opterećenje pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i, opciono, dodatni agensi iz prikaza je smanjeno za najmanje oko 10% i do bilo koje od oko 20%, oko 50%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 99% ili više u odnosu na pacijenta koji se na taj način ne leči. U specifičnim izvođenjima, opterećenje virusom pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i/ili dodatnih agen(a)sa prikaza je smanjena za najmanje oko 1%, oko 2%, oko 5%, oko 10%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 99% ili više u odnosu na pacijenta koji se ne leči na taj način.

[0102] Generalno, terapeutska krajnja tačka koja se postiže praktikovanjem postupaka iz prikaza je smanjenje u količini fibroze kod pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i, opciono, dodatnih agen(a)sa iz prikaza. Relativne količine fibroze kod pacijenta mogu da se kvantifikuju biopsijom tkiva i naknadnom histologijom, npr., kvantifikovanjem preuzimanja boje Evans plavo kao mere oštećenja miovlakana ili ćelijskog oštećenja [Heydemann et al., Neuromuscular Disorders 15(9-10): 601-9 (2005)], and/or quantitation of hydroxyproline content as described previously [Swaggart et al., Physiol Genomics 43: 24-31 (2011)]. U različitim izvođenjima, količina fibroze kod pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i, opciono, dodatni agensi iz prikaza je smanjeno za najmanje oko 1% i do bilo koje od oko 5%, oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40% ili oko 50% u odnosu na pacijenta koji nije na taj način tretiran. U daljim izvođenjima, količina fibroze kod pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i, opciono, dodatnih agen(a)sa iz prikaza je smanjena za najmanje oko 10% i do oko 20%, oko 50%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 99% ili više u odnosu na pacijente koji nisu na taj način lečeni. U specifičnim izvođenjima, količina fibroze kod pacijenta kome se daje jedno ili više agen(a)sa i/ili dodatni agensi iz prikaza je smanjeno za najmanje oko 1%, oko 2%, oko 5%, oko 10%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 95%, oko 99% ili više u odnosu na pacijenta koji se nije lečio na taj način.

2

[0103] Količina fibroze kod pacijenta može rutinski da se odredi od strane stručnjaka koji je uobičajeno verziran u stanje tehnike. Na primer, i bez ograničenja, količina fibroze može da se odredi uzimanjem biopsije mišića iz pacijenta, sečenja mišića na slajdove i procenjivanjem količine fibroze kao što je otkriveno postupcima bojenja koji su poznati u oblasti tehnike (npr., bojenje Hematoksilinom i Eozinom (H&E) i/i trihromo bojenje po Masonu). Alternativno, ili dodatno, količina fibroze može da se odredi in vivo korišćenjem snimanja magnetnom rezonancom (MRI).

DOZIVANJE/PRIMENA/KOMPLETI

[0104] Određeni režim primene za određenog subjekta će zavisiti, delom, od sredstva i opcionog dodatnog agensa koji se koristi, količine agensa i opcione primene dodatnog agensa, načina davanja, određene bolesti koja se leči, i uzroka i pojava bilo kojih nepoželjnih efekata. Količina sredstva i opcionog dodatnog sredstva koje se primenjuje na subjektu (npr., sisaru, kao što je čovek) dovoljna je da bi se postigao željeni odgovor. Doza obično zavisi od različitih faktora, uključujući određeni agens i/ili dodatni agens koji se koristi, starosti i telesne težine subjekta, kao i postojanja i ozbiljnosti bilo koje bolesti i poremećaja kod subjekta. Veličina doze će takođe biti određena načinom primene, vremenom, i učestalosti primene. Prema tome, kliničar može da podešava dozu i modifikuje način davanja da se dobije optimalni terapeutski efekat, i konvencionalni postupci za otkrivanje doza su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Čisto kao ilustracija, u nekim izvođenjima, postupak obuhvata primenu, npr., od oko 0.1 mg/kg do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od faktora koji se pominju gore u tekstu. U drugim izvođenjima, doza može imati opseg od 1 mg/kg do oko 75 mg/kg; ili 5 mg/kg do oko 50 mg/kg; ili 10 mg/kg do oko 20 mg/kg. U određenim izvoođenjima, doza obuhvata oko 0.5 mg/kg do oko 20 mg/kg (npr., oko 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 2.3 mg/kg, 2.5 mg/kg, 3 mg/kg, 3.5 mg/kg, 4 mg/kg, 4.5 mg/kg, 5 mg/kg, 5.5 mg/kg, 6 mg/kg, 6.5 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, ili 10 mg/kg) sredstva i opciono dodatnog sredstva. U izvođenjima u kojima se primenjuju sredstvo i dodatno sredstvo, pretpostavlja se da gore navedene doze predstavljaju količinu svakog agensa koji se primenjuje, ili u daljim izvođenjima doza predstavlja ukupnu dozu koja se primenjuje. Uzimajući u obzir hroničnu prirodu mnogih TGFβ-povezanih poremećaja, predviđa se da će subjekt primiti sredstvo i/ili dodatno sredstvo tokom kursa tretmana koji traje nedeljama, mesecima, ili godinama, i može da zahteva jednu ili više doza dnevno ili nedeljno. Doze se takođe razmatraju za jednom dnevno, dva puta dnevno (BID) ili doziranje tri puta dnevno (TID). Jedinična doza može da bude formulisana ili u obliku kapsule ili tablete. U drugim izvođenjima, sredstvo i opciono dodatno sredstvo se daje za lečenje akutnog stanja (npr., akutne mišićne povrede ili akutne povrede miokardijuma) za relativno kratak period lečenja, npr., jedan do 14 dana.

[0105] Pogodni postupci davanja fiziološki-prihvatljive kompozicije, kao što je farmaceutska kompozicija koja obuhvata sredstvo i opciono ovde opisano dodatno sredstvo, su dobro poznati u oblasti tehnike. Iako više od jednog načina može da se koristi za primenu agensa i/ili dodatnog agensa, poseban način davanja može da obezbedi neposredniji i efiksaniji pristup u odnosu na drugi način. U zavisnosti od okolnosti, farmaceutska kompozicija se primenjuje ili uliva u telesne šupljine, apsorbuje preko kože ili mukoznih membrana, ingestira, inhalira, i/ili uvodi u cirkulaciju. U nekim izvođenjima, kompozicija koja obuhvata agens i/ili dodatni agens se primenjuje intravenozno, intraarterijski, ili intraperitonealno da bi se agens i opciono dodatni agens uneo u krvotok. Ne-intravenozna primena je takođe prikladna, posebno u odnosu na terapeutike niske molekulske težine. U određenim okolnostima, poželjno je farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata sredstvo i/ili dodatno sredstvo isporučiti oralno, topikalno, sublingvalno, vaginalno, rektalno; davanjem injekcije preko intracerebralnog (intra-parenhimalnog), intracerebroventrikularnog, intramuskularno, intraokularnog, intraportalnog, intralezionalnog, intramedularnog, intratekalnog, intraventrikularnog, transdermalnog, subkutanoznog, intranazalnog, uretralnog, ili enteralnog načina primene; sistemima za odloženo oslobađanje; ili implantacionim spravama. Ukoliko je poželjno, agens i/ili dodatni agens se ordinira regionalno pomoću intraarterijalnog ili intravenoznog davanja u region od interesa, npr., femoralnom arterijom za isporuku u nogu. U jednom izvođenju, kompozicija se primenjuje implantacijom membrane, sunđera, ili drugi odgovarajući materijal unutar ili na kome je poželjni agens i opciono poželjni agens apsorbovan ili inkapsuliran. Gde se koristi sprava za implantaciju, sprava je u jednom aspektu implantirana u bilo koje pogodno tkivo, i isporuka željenog agensa i/ili dodatnog agensa je, u različitim izvođenjima, izvršena putem difuzije, bolom sa oslobađanjem u vremenu, ili kontinuiranom primenom. U drugim izvođenjima, sredstvo i opciono dodatno sredstvo se direktno primenjuje na izloženom tkivu tokom hirurških postupaka ili lečenja povrede, ili se primenjuje transfuzijom krvnih proizvoda. Pristupi u terapeutskoj isporuci su dobro poznati stručnjaku iz oblasti tehnike, od kojih se neki dalje opisuju, na primer, u U.S. patentu br.5,399,363.

[0106] U nekim izvođenjima koji olakšavaju primenu, sredstvo i opciono dodatno sredstvo u jednom izvođenju je formulisano u fiziološki-prihvatljivu kompoziciju koja obuhvata nosač (tj., nosač, adjuvans, pufer, ili razblaživač). Određeni nosač koji se koristi je ograničen samo hemijsko-fizičkim razmatranjima, kao što je rastvorljivost i nedostatak reaktivnosti sa agensom i/ili dodatnim agensom, načinom primene, i zahtevom kompatibilnosti sa organizom recipijentom. Fiziološki prihvatljivi nosači su dobro poznati u oblasti tehnike. Ilustrativni farmaceutski oblici pogodni za upotrebu ubrizgavanjem uključuju, bez ograničenja, sterilne vodene rastvore ili disperzije i sterilne praškove za neposrednu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora ili disperzija (na primer, videti U.S. patent br. 5,466,468). Injektabilne formulacije su dalje opisane u, npr., Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J. B. Lippincott Co., Philadelphia. Pa., Banker and Chalmers. eds., stranice 238-250 (1982), i ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4th ed., stranice 622-630 (1986).

[0107] Farmaceutska kompozicija koja obuhvata sredstvo i opciono dodatno sredstvo kao što je ovde obezbeđeno se po potrebi nalazi u kontejnerima/kompletima, zajedno sa materijalima za pakovanje koji pružaju uputstva za upotrebu takvih farmaceutskih kompozicija. Generalno, takve instrukcije uključuju direktno navođenje koje opisuje koncentraciju reagensa, kao i, u određenim izvođenjima, relativne količine sastojaka ekscipijenta ili razblaživača koji mogu da budu potrebi za rekonstituciju farmaceutske kompozicije.

[0108] Ovaj prikaz prema tome uključuje davanje subjektu jednog ili više agen(a)sa, u kombinaciji sa jednim ili više dodatnim agensom(ima), svaki se daje prema režimu koji je pogodan za tu vrstu leka. Strategije davanja uključuju istovremenu primenu (tj., suštinski istovremenu primenu) i primenu koja nije istovremena (tj., davanje u različitim vremenima, bilo kojim redom, bilo sa preklapanjem ili bez) sredstva i jednog ili više dodatnih sredstv(va)a. Treba razumeti da se različite komponente po potrebi primenjuju u istim ili različitim kompozicijama, i sa istim ili različitim načinima davanja.

[0109] Ceo dokument je namenjen je namenjen da se odnosi kao jedinstveni prikaz, i treba razumeti da se razmatraju sve kombinacije ovde opisanih karakteristika, čak i ako se kombinacije karakteristika ne nalaze zajedno u istoj rečenici, ili paragrafu, ili odeljku ovog dokumenta. Na primer, gde se opisuje proteinska terapija, posebno se razmatraju izvođenja koja uključuju polinukleotidnu terapiju (upotrebom polinukleotida/vektora koji kodiraju protein), i obrnuto je takođe tačno. U odnosu na elemente koji su opisani kao jedan ili više članova skupa, treba razumeti da se razmatraju sve takve kombinacije unutar skupa.

2

PRIMERI

Primer 1

Odnos strukture-funkcije između regiona koji je bogat prolinom LTBP4 i proteolitička osetljivost [0110] Podaci obezbeđeni u ovom Primeru pokazuju da region bogat prolinom LTBP4 doprinosi njegovoj proteolitičkoj osetljivosti.

[0111] LTBP4 se vezuje za TGFβ u vanćelijskom matriksu (ECM), gde služi kao odmah dostupno mesto skladištenja TGFβ. Delecija od 36-nukleotida je identifikovana u domenu bogatom prolinom mišjeg LTBP4 koji se vezuje sa pojačanim patogenim karakteristikama mišićne distrofije kod miševa. Ovaj region u mišjem LTBP4 je povezan sa promenjivom osetljivošću na proteolizu. Analiza poređenja sekvenci između LTBP4 iz miša i ljudi otkriva čak veću deleciju u regionu bogatom prolinom humanog LTBP4. Prema tome, u skladu sa mišjom delecijom koja je povezana sa patogenim karakteristikama i varijabilnom proteolizom [videti Heydemann et al., J Clin Invest.119(12): 3703-12 (2009)], razmotrena je da veća delecija regiona bogatom prolinom humanog LTBP4 je povezana sa pojačanom osetljivosti na proteolitičko cepanje.

[0112] Da bi se ispitala ova mogućnost, porcija humanog LTBP4 kodirajućeg regiona je povezana ligacijom sa ekspesionim vektorom da bi se eksprimirao region koji je bogat prolinom. Fragment TP (amino kiseline 483-565 humanog LTBP4 proteina (SEQ ID NO: 1)) je eksprimiran i migriran kao 3.5 KDa protein iako je njegova predviđena molekulska masa 8.9 KDa. Takođe je eksprimiran drugi fragment, TP2E fragment (amino kiseline 357-586 humanog LTBP4 proteina (SEQ ID NO: 1)). Njegova predviđena molekulska masa je 24.5 KDa, iako je elektroforetski migrirao kao 31 KDa protein. TP2E uključuje dva EGF-slična domena koja ograničavaju region LTBP4 koji je bogat prolinom zajedno sa amino terminalnim 8-cisteinskim bogatim regionom odmah posle amino-terminalnog regiona koji je bogat prolinom. Mišji TP2E i TP svaki sadrže dodatnih 44 amino kiselina u poređenju sa humanim sekvencama, što odražava veći region koji je bogat prolinom. Mišji TP2E elektroforetski migrira kao 35 KDa protein dok je njegova izračunata molekulska masa 30.58 KDa.

Osetljivost na proteolizu in vitro

[0113] Humani i mišji TP2E fragmenti se eksprimiraju in vitro upotrebom transkripciono-translacionog kuplovanog testa (Promega TnT® Quick in vitro kuplovani Transkripciono/Translacioni sistem) i eksprimirani fragmenti se obeležavaju upotrebom 35S-Cisteina. Ekperimenti sa doznim odgovorom i vremenskim trajanjem se izvode sa elastazom i plazminom, gde su obe serin proteaze koje cepaju LTBP4, da se odredi diferencijalna digestija humanih i mišjih TP2E fragmenata. Podaci iz ovih eksperimenata pokazuju da se humani TP2E fragment brže cepa u odnosu na mišju LTBP4 sekvencu (Slika 3).

Efekti manjih fragmenata LTBP4 na TGFβ signalizaciju

[0114] Antitelo specifično za region bogat prolinom humanog LTBP4 je dobijeno kako bi se inhibiralo cepanje LTBP4. Ovo antitelo je ispitano i potvrđeno je da se imunoblotom prepoznaje i vezuje se za humani LTBP4 pune dužine.Uslovi su nakon toga optimizovani za digestiju pune dužine humanog LTBP4 sa plazminom, i ispitana je inhibicija proteolize upotrebom antitela. Podaci na Slici 4 pokazuju da anti-LTBP4 antitelo specifično inhibira digestiju proteina u poređenju sa nesrodnim antitelima koja nastaju u istim vrstama (Slika 4).

2

Primer 2

Efekat ekspresije humanog LTBP4 na mišićne i srčane fenotipove

[0115] LTBP4 igra kritičnu ulogu u sekreciji TGFβ i aktivaciji srčanog mišića, skeletnog mišića i pluća. Humani LTBP4 ima veću deleciju u regionu koji je bogat prolinom u poređenju sa mutantnim mišjim LTBP4, sa mišjim LTBP4 divljeg tipa koji je korišćen kao referenca. Prema tome, predpostavlja se da je humani LTBP4 povezan sa povećanom patogenom TGFβ signalizacijom i, prema tome, biće povezano sa težim oblikom bolesti kod miševa sa mišićnom distrofijom.

Transgeni miševi koji eksprimiraju humani LTBP4

[0116] Miš koji nosi humani LTBP4 gen je dobijen u skladu sa standardim protokolima [videti, npr., Heintz, Nat Rev Neurosci. 2(12):861-70 (2001)]. Bakterijski veštački hromozom (BAC) koji uključuje kompletni humani LTBP4 gen; BAC transgeni-pozitivni (Tg+) miševi su naznačeni sa hLTBP4 Tg+. D bi se dobili hLTBP4 Tg+ miševi, pojedinačni, nemodifikovani BAC klon (broj klona CDT-2166J9) je korišćan za ubrizgavanje oplođene oocite korišćenjem konvencionalne metodologije [videti, npr., Heintz, Nat Rev Neurosci.2(12):861-70 (2001)]. Humana sekvenca ovog BAC (Genbank pristupni broj AC010412.9; SEQ ID NO: 7) sadrži 155085 bp sa hromozoma 19. LTBP4 gen je raspona od 19891 do 57891 bp ovog klona. Jedanaest osnivačkih linija je procenjeno pomoću PCR i pronađeno je da sadrži humani LTBP4 pune dužine, uključujući regione promotora. Šest linija je odabrano za uzgoj da se osigura da će ovi miševi preneti BAC u njihovoj germinativnoj liniji. Upotrebom RT-PCR, određeno je da je iRNK za humani LTBP4 eksprimirana u srčanom i skeletnom mišiću transgenih miševa. U ovom trenutku, ne postoji anitelo koje pravi razliku između humanu LTBP4 od mišjeg LTBP4; humani i mišji LTBP4 su 98% slični. Sveukupno, ekspresija LTBP4 ekspresija može da bude blago povišena kod hLTBP4 Tg+ miševa u poređenju sa kontrolama iz legla. hLTBP4 Tg+ miševi su spolja normalni i normalno se razmnožavaju. Histološki pregled pokazuje krajnje normalnu histologiju u mozgu, bubregu, plućima, srcu i mišiću. Zanimljivo, hLTBP4 Tg+ vlakna skeletnog mišića su značajno veća nego kod transgenih negativnih kontrolnih miševa iz legla. Podrazumeva se da čak i umerena ekspresija LTBP4 u višku može da bude doovlja sa se veže za članove TGFβ superfamilije kao što su miostatin, i sevestracija miostatina će inhibrati aktivnost miostatina i očekuju se kao rezultat većim mišićnim vlaknima.

[0117] hLTBP4 Tg+ životinja će se uzgajati sa mišjim mdx modelom Dišenove mišićne distofije i biće ispitan fenotip i signalni kapacitet TGFβ. Biće generisano deset miševa svakog genotipa (hLTBP4 Tg+/mdx, mdx, hLTBP4+ i WT). Osnovna neuromišićna funkcija će biti procenjena upotrebom SHIRPA protokola. SHIRPA je kombinacija neuroloških testova koji ispituju neuromišiću funkciju [Rafael et al., Mamm Genome.11(9): 725-8 (2000)]. Na primer i bez ograničenja, snagu stezanja, kapacitet trčanja, manevar na žici i rotorod su osnovni testovi koji će se koristiti za ispitivanje mišićne funkcije. Pored toga, funkcija srca će biti ispitana upotrebom ehokardiografije, i histološko ispitivanje će se sprovesti da bi se procenila fibroza i permeabilnost membrane upotrebom preuzimanja boje Evans plavo. Sve analize će se sprovesti na mužjacima miševa 8 nedelja starosti. Kohort miševa će takođe ostariti da bi se ispitao efekat na miševima u kasnijoj vremenskoj tački(ama). Iz ovih miševa takođe će se izolovati fiibroblasti da bi se odredio njihov nivo SMAD signalizacije upotrebom postupaka kao što je pretodno opisano [Heydemann et al., J Clin Invest.119(12): 3703-12 (2009)]. Očekuje se da će insercija humanog LTBP4 rezultovati u povećanoj SMAD signalizaciji i unapređenju mdx fenotipa.

2

Primer 3

LTBP4 peptidi i dobijanje antitela

[0118] Antitela su dobijena upotrebom multiplih različitih peptida uključujući mišje i humane LTBP4 sekvence (videti Tabela 1, ispod). Svaki od peptida u Tabeli 1 unakrsno reaguje sa humanim proteinom kako je određeno imunoblotovanjem. Duži LTBP4 peptid, FLPTHRLEPRPEPRPDPRPGPELPLPSIPAWTGPEIPESGPSS (SEQ ID NO: 6), je takođe predviđen za upotrebu prema pronalasku. Takođe će biti dobijena humanizovana monoklonska antitela usmerena protiv LTBP4.

Tabela 1. LTBP4 peptidi korišćeni za dobijanje antitela. "Vrste" pokazuje izvor antitela.

[0119] Tabela 1 pokazuje da svako antitelo prepoznaje protein veličine humanog LTBP4, kao što je određeno imunoblotom. Podaci u tabeli takođe ukazuju da antitelo koje dobijeno protiv humane sekvence (SEQ ID NO: 3) štiti LTBP4 od proteolize in vitro (Slika 6, opisano u tekstu ispod) i, uzimajući u obzir ukrštenu reaktivnost, očekuje se da druga anti-hLTBP4 antitela takođe štite hLTBP4 od proteolize. Enzimom-spojeni imunosorbentni testovi (ELISA) se takođe izvode da se uporedi relativni afinitet antitela prema svakom peptidu korišćenjem seruma i prečišćenih antitela.

Proteoliza LTBP4 može da bude inhibirana sa LTBP4 antitelima

[0120] Razmatra se da insercioni/delecioni polimorfizam u mišjem Ltbp4 kao je ovde gore u tekstu naznačeno ukazuje da je region bogat prolinom važan s obzirom da prisustvo ili odsustvo 12 dodatnih amino kiselina u ovom regionu objašnjava njegovu sposobnost da smanji curenje membrane i suprimira fibrozu, dve aktivnosti koje se prepisuju sposobnosti LTBP4-a da sekvestrira TGFβ. Ova pozicija je konzistentna sa različitom osetljivosti na proteolizu različitih oblika LTBP4 i povezane aktivnosti TGFβ u obliku nuklearnog pSMAD [Heydemann et al., J Clin Invest.119: 3703-12 (2009)].

2

[0121] Da bi se pokazalo da je region bogat prolinom humanog LTBP4 podložan proteolizi, proteinski domeni su eksprimirani upotrebom in vitro transkripcije i translacije u skladu sa postupcima koji su pretodno opisnani [Heydemann et al., J Clin Invest.119(12): 3703-12 (2009)]. Prema dizajnu, obeležen je samo karboksi-kraj ovih eksprimiranih proteina. Eksprimriani fragmenti su izloženi plazminu. Mišji LTBP4 sa insercijom 12-amino-kiselina je uglavnom bio otporan na proteolizu dok mišji LTBP4 koji je deletiran za 12 amino kiselina je brzo degradiran (Slika 5, srednje i desne trake). Humani LTBP4 je najlakše bio degradiran (Slika 5, leve trake). Slični rezultati u dobijeni sa elastazom. Smatra se da ovaj region (tj., region koji je uključen u TP i TP2E sekvence) je generalno meta serin proteaze. Dobijena su antitela koja su usmerena prema regionu koji je bogat prolinom i pronađeno je da ova antitela inhibiraju cepanje LTBP4 in vitro (Slika 6). Nespecifično antitelo koje je dobijeno iz istih vrsta nije pokazalo efekat blokiranja. Dobijena su dodatna anti-LTBP4 antitela, i Fab fragmenti će biti prečišćeni i ispitani zbog toga što se očekuje da ovi fragmenti budu korisniji za in vivo isporuku.

[0122] LTBP4 protein pune-dužine, proizveden iz ćelija koje su gajene u kulturi, takođe je podložan proteolizi plazminom (Slika 6). Sa povredom mišića, kao što je povreda koja se pojavljuje u DMD, očekuje se da oslobađanje proteaza u ekstracelularni matriks ima za rezulat cepanje LTBP4. Izvori ovih proteaza in vivo mogu da budu inflamatorne ćelije, fibroblasti ili miovlakna. Pokazano je da je povećano cepanje LTBP4 u korelaciji sa pojačanom fibrozom, povećanim curenjem mišićne membrane, pojačanom mišinom slabosti i pojačanom TGFβ signalizacijom [Heydemann et al., J Clin Invest. 119(12): 3703-12 (2009)]. Pokazano je da smanjenje u TGFβ signalizaciji dovodi do boljeg ishoda u mišićnoj distrofiji [Cohn et al., Nat Med. 13(2): 204-10 (2007); Goldstein et al., Hum Mol Genet. 20(5): 894-904 (2011)].

[0123] Ovaj primer pokazuje da proteoliza regiona bogatog prolinom LTBP4 može da bude inhibirana sa ovde obezbeđenim antitelima.

Primer 4

Transgeni miševi koji nose humani Ltbp4

[0124] Humani bakterijski veštački hromozom (BAC) koji nosi humani LTBP4 gen pune dužine je izolovan i karakterisan. Ovaj BAC je ubrizgan u miševe i karakterisano je nekoliko linija transgenih miševa. Humani LTBP4 (hLTBP4-BAC) transgeni miševi su uzgajani sa mdx miševima. Humani LTBP4 BAC u normalnoj pozadini je rezultirao u većem prečniku miovlakna, što predstavlja znak hipertrofije. Kada je humani LTBP4 BAC bio u mdx pozadini, za rezultat je imao povećanu fibrozu u skeletnom i srčanom mišiću kao i smanjenom snagom stezanja, u odnosu na kontrolne miševe koji nisu nosioci transgena (Slika 7). Ovo podržava opažanje da sekvenca humanog LTBP4, sa njenom većom delecijom u regionu koji je bogat prolinom, pojačava fenotip mišićne distrofije. Ovi miševi će se dalje koristiti da se ispita da li antitela koja su usmerena prema humanom LTBP4 mogu da smanje fibrozu kod mišićn distrofije i curenje mišićne membrane.

Primer 5

Ispitivanja in vivo

[0125] Kratkoročna ispitivanja su sprovedena kod distrofičnih miševa (tj., mdx i udno-pojasne mišićne distrofije (LGMD)) da se odredi bezbednost i efikasnost inibicije in vivo cepanja LTBP4. Tretirane su životinje od 3 nedelje do 8 nedelja starosti sa injekcijama antitela, tri puta nedeljno, intraperitonealnom injekcijom. Određena je reaktivnost na dozu. Ehokardiografija, pletizmografija, sakupljanje mišića i ex vivo mišićne mehanike su sprovedene na tretiranim životinjama i kontrolama. Ispitana su ciljna tkiva, uključujući srce, dijafragmu, kvadricepse, gluteus/kvadricepsi,

2

gastroknemius/soleus, tricepsi i abdominalni mišići, u skladu sa prethodno definisanim protokolima [Heydemann et al., Neuromuscul Disord.15: 601-9 (2005); Heydemann, et al., J Clin Invest.119: 3703-12 (2009); Swaggart et al., Physiol Genomics.43: 24-31 (2011)]. Takođe je određena signalizacija TGFβ.

[0126] Kod distrofičnih miševa su sprovedene dugotrajna ispitivanja da bi se odredila bezbednost i efikasnost lečenja. Jednom kada je doziranje određeno, kohorti miševa su tretirani od 3 nedelje do 1 godine starosti. Preduzeta je slična analiza efikasnosti, kao što je razmatrano gore u tekstu (tj., ehokardiografija, pletizmografija, sakupljanje mišića i ex vivo mišićne mehanike). Uključena je analiza drugih organa, uključujući pluća, debelo crevo, bubreg, mozak, i druga tkiva. Miševi koji su „null“ za LTBP4 razvijaju kardiomiopatiju, pluću fibrozu i kancer debelog creva. Zbog toga što LTBP4 nije ukinut u ovim ispitivanjima, ovi kardiomiopatski, plućno fibrozni i defekti kancera debelog creva nisu očekivani, u skladu sa gore opisanim genetičkim studijama. Osim toga, takođe se analiziraju tkiva koja nisu mete.

[0127] Očekuje se da gore opisana ispitivanja pokažu da inhibicija cepanja LTBP4 in vivo rezultuje smanjenom TGFβ signalizacijom, koja se dalje očekuje da dovede do smanjenja u permeabilnosti membrane kao i smanjenja u fibrozi u mišićima kod distrofičnih miševa. Ovi rezultati će biti dokazani poboljšanjem ili nedostatkom pada u terapijskim ciljevima kao što je ovde opisano, na taj način se utvrđuje da je blokiranje proteolize LTBP4 robustni terapeutik u lečenju bolesti povezanih sa TGFβ superfamilijom proteina.

Primer 6

LTBP4 interaguje sa miostatinom in vitro

[0128] Takođe je ispitana sposobnost LTBP4 da direktno interaguje sa miostatinom, članom TGF-β superfamilije. Postupci koji su korišćni za ispitivanje ove interakcije su bili sledeći. LTBP4 pune dužine je kloniran u ekspresioni vektor (pcDNA3.1, Life Technologies (Invitrogen), Grand Island, NY) i Xpress epitop obeleživač (Life Technologies (Invitrogen), Grand Island, NY) je dodat na njegov 5’ kraj/amino terminusa. Miostatin pune dužine, koji kodira propeptid i zrele regione, obeležen je na njegovom 3’ kraju/karboksi terminusu sa myc epitop obeleživačem. Oba plazmida su uneta u HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) ćelije. Ćelije su lizirane i proteini su blotovani ili imunoprecipitirai sa ili antitelom 28200 ili, u odvojenom eksperimentu, antitelom 28199 (videti Tablu 1). Oba od ovih zečjih poliklonalnih antitela su usmerena prema LTBP4 regionu bogatom prolinom. Imuoprecipitirani materijal je nakon toga blotovan sa anti-myc antitelom, pokazujući da se miostatin povezuje sa LTBP4 (Slika 8).

[0129] Ovaj Primer pokazuje da je LTBP4 sposoban da direktno interaguje sa miostatinom. Rezultati ukazuju da, inbiranjem proteolize LTBP4 prema predmetnom pronalasku, miostatin može da se izdvoji i da se spreči njegovo aktiviranje i rezultujuća nishodna signalizacija. Zbog toga što je miostatin poznati negativni regulator mišićnog rasta, očekuje se da inhibicija signalizacije miostatina rezultira povećanjem mišićnog rasta i povećanjem jačine mišića.

Primer 7

Ekspresija humanog LTBP4 kod miševa dovodi do pojačanog oštećenja nakon povrede izazvane kardiotoksiom

[0130] Miševi su generisani da eksprimiraju humani LTBP4 gen na bakterijskom veštačkom hromozomu, i ovi transgeni miševi su označeni sa hLTBP4 Tg+ miševi. Humani LTBP4 protein se lakše proteolizuje zbog svog kraćeg regiona bogatog prolinom. Navedena povećana proteoliza dovodi do pojačanog oštećenja u mišiću zbog povećanog oslobađanja TGFβ. Kardiotoksin je ubrizgan u prednji potkolenični mišić (tibialis anterior muscle) normalnih (WT w/CTX) i hLTBP4 transgenih miševa (hLTBP4 Tg+ w/CTX). Transgeni miševi ispoljavaju pojačanu povredu nakon povrede kardiotoksinom koja se uočava kao veći infiltrat inflamatornih mononuklearnih ćelija i fibroza i deponovanje masti u povređenom mišići (Slika 9A), slično onom što se uočava u mišićnoj distrofiji.

[0131] Normalni (WT) i hLTBP4 mišić su ubrizgani sa kardiotoksinom da bi se indukovala povreda. Imunobloting sa anti-LTBP4 antitelom je pokazalo povećane nivoe LTBP4 proteina indukovane povredom u oba normalna i u hLTBP4 transgenom mišiću (Slika 9B). Takođe je pronađeno da je hLTBP4 mišić povezan sa povećanom TGFβ signalizacijom koji se vidi kao fosforilovani SMAD koji je lokalizovan u nukleusu.

[0132] Rezultati su pokazali da ekspresija humanog LTBP4 proteina u mišiću dovodi do pojačanog oštećenja mišića koja prati povredu kardiotoksinom.

Primer 8

Anti-LTBP4 antitela ublažavaju povredu mišića in vivo

[0133] Da bi se ispitalo da li anti-LTBP4 antitelo ublažuje povredu skeletnog mišića u mišićnoj distrofiji, eksperimenti su izvedeni upotrebom hLTBP4/mdx miševa. Kardiotoksin, za koga je poznato da uzrokuje nekrozu skeletnih miićnih ćelija, ubrizgan je u prednji mišić potkolenice (tibialis anterior) da se indukuje pojačana povreda. Ovaj model povrede se razrešava tokom 2 nedelje zbog niske zapremine injekcije od 10 ml koja se koristi. hLTBP4/mdx miševi (8 nedelja starosti) su prethodno tretirani u danu 0 sa ili (i) PBS ili (ii) antitelom prema LTBP4-831 antitelu u koncentraciji od 5 mg/Kg intraperitonealno. U danu 1, kardiotoksin je ubrizgran u prednji mišić potkolenice. LTBP4-831 antitelo je ubrizgano u danima 1, 3, i 5, svaki put isporučujući 5 mg/Kg doze intraperitonealno. Miševi su žrtvovani dana 7 i prednji mišić potkolenice je sakupljen za ovo ispitivanje. Eksperimentalni dizajn žrtvovanja miševa u danu 7 je korišćen zbog toga što je LTBP4-831 antitelo je antitelo kokoške koje je očekivano da bude prepoznato kao strano posle 2-3 nedelje.

[0134] Nakon sakupljanja, mišić je obrađen za analizu brzim zamrzavanjem u tečnom azotuohlađenom izopentanu. Zamrznuti mišić je isečen i isečci su izloženi bojenju hematoksilinom i eozinom (H&E).

[0135] Rezultati eksperimenta pokazuju da, u poređenju sa miševima kojima je ubrizgan PBS, miševi koji su tretirani sa LTBP4-831 antitelima su pokazali smanjenu centralnu nukleaciju i smanjenu fibrozu (Slika 10A i 10B). Centralizovana jezgra ukazuju na novoformirana (tj., regenerišuća) miovlakna, i smanjenu centralnu nukleaciju u mišiću životinja koja su primila LTBP4-831 antitelo obezbeđuje dokaz da je antitelo ublažilo povredu mišića kod miševa.

Primer 9

Povećani inflamatorni infiltrat u hLTBP4/mdx miševima u poređenju sa mdx miševima

[0136] Mišići kvadricepsa dobijeni iz oba mdx i hLTPB4/mdx miševa su obojeni sa F4/80 antitelima koji prepoznaju i vezuju se za aktivirane makrofage (prikazani kao mrlje u mišiću). Imunofluorescentno bojenje je pokazalo povećanje u aktiviranim makrofagima u hLTBP4/mdx mišiću u poređenju sa mdx mišićem (Slika 11A). hLTBP4/mdx mišić je pokazao povećanje u cepanju LTBP4 proteina u poređenju sa mdx, dok je mali LTBP4 protein uočen u divljem tipu i hLTBP4 mišiću u odsustvu povrede ili mišićne distrofije (Slika 11B).

1

2

�

4

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

�

11

��

�

��

�

�

�

�

�

11

11

11

11

11

11

11

��

��

Claims (9)

Patentni zahtevi

1. Agens koji inhibira proteolizu latentnog TGFβ vezujućeg proteina 4 (LTBP4) za upotrebu u lečenju pacijenta koji pati od bolesti koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz Dišenove mišićne distrofije, udno pojasne mišićne distrofije, Bekerove mišićne distrofije, miopatije, cistične fibroze, plućne fibroze, kardiomiopatije, akutne povrede pluća, akutne povrede mišića, i akutne miokardijalne povrede, gde je agens izolovano antitelo koje se specifično vezuje za peptid koji se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 6.

2. Agens za upotrebu prema zahtevu 1 gde upotreba dalje obuhvata davanje efikasne količine drugog agensa koje je izabrano iz grupe koja se sastoji iz inhibitora inflamatornog odgovora, promotera mišićnog rasta, i inhibitora fibroze, gde inhibitor inflamatornog odgovora je agonist beta2-adrenergičkog receptora, inhibitor nuklearnog faktora kapa-B (NF-κB), antagonist faktora nekroze tumora alfa (TNF-α), ili ciklosporin.

3. Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za peptid koji se sastoji iz sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 6.

4. Farmaceutska formulacija koja sadrži efikasnu količinu antitela prema zahtevu 3 i farmaceutski prihvatljivog nosača ili rastvarača.

5. Formulacija prema zahtevu 4 koja sadrži efikasnu količinu antitela prema zahtevu 3 i dalje sadrži efikasnu količinu drugog agensa, gde je drugi agens izabran iz grupe koja se sastoji od inhibitora inflamatornog odgovora, promotera mišićnog rasta, hemoterapeutskog agensa i inhibitora fibroze, gde inhibitor inflamatornog odgovora je agonist beta2-adrenergičkog receptora, inhibitor nuklearnog faktora kapa-B (NF-κB), antagonist faktora nekroze tumora alfa (TNF-α), ili ciklosporin.

6. Formulacija prema zahtevu 5 gde je drugi agens promoter mišićnog rasta izabran iz grupe koja se sastoji iz insulinu-sličnog faktora rasta-1 (IGF-1), Akt/proteinske kinaze B, klenbuterola, kreatina, dekorina, steroida i testosterona.

7. Formulacija prema zahtevu 5 gde je drugi agens izabran iz grupe koja se sastoji iz antitela specifičnog za faktor-8 rasta i diferencijacije (GDF-8), antitela za GDF-8 receptor, rastvorljivog GDF-8 receptora, GDF-8 propeptida, folistatina, i proteina koji sadrži domen za folistatin.

8. Formulacija prema zahtevu 5 gde je drugi agens inhibitor fibroze izabran iz grupe koja se sastoji iz pirfenidona, inhibitora angiotenzin-konvertujućeg enzima (ACE), antagonista TGFβ, antagonista VEGF, antagonista receptora za VEGF, antagonista za TGFβ receptor, blokatora receptora za angiotenzin, i antagonista aldosterona.

9. Formulacija prema zahtevu 4 za upotrebu u lečenju pacijenta koji pati od bolesti koja je izabrana iz grupe koja se sastoji iz Dišenove mišićne distrofije, udno pojasne mišićne distrofije, Bekerove mišićne distrofije, miopatije, cistične fibroze, plućne fibroze, kardiomiopatije, akutne povrede pluća, akutne povrede mišića, i akutne miokardijalne povrede.