RS60413B1 - Farmaceutski sastav koji obuhvata rekombinantni hcg - Google Patents

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na gonadotropine koji se koriste u tretmanu neplodnosti. Posebno se odnosi na ljudski horionski gonadotropin (hCG).

[0002] Gonadotropini su grupa heterodimernih glikoprotein hormona koji regulišu gonadnu funkciju kod muškaraca i žena. Oni uključuju hormon koji stimuliše folikule (FSH), luteinizirajući hormon (LH) i horionski gonadotropin (CG). Rekombinantni FSH je poznat iz WO2009/127826.

[0003] Ljudski horionski gonadotropin (hCG) se prirodno luči od strane prednje hipofize i funkcioniše tako što podržava razvoj folikula i ovulaciju. hCG sadrži alfa podjedinicu od 92 aminokiseline, takođe zajedničku ostalim glikoprotein LH i FSH hormonima, i beta podjedinicu od 145 aminokiselina, jedinstvenu za hCG, koja diktira specifičnost hormona. Svaka podjedinica se naknadno modifikuje dodavanjem složenih ugljenih hidrata. Alfa podjedinica sadrži 2-N-vezana mesta glikozolacije u aminokiselinama 52 i 78, dok beta podjedinica sadrži 2-N-vezana mesta glikozolacije u aminokiselinama 13 i 30, i četiri O-vezana mesta glikozilacije u aminokiselinama 121, 127, 132 i 138.

[0004] hCG izvučen iz urina trudnica [Choragon (Ferring)] koristi se duži niz godina u tretmanu neplodnosti. Proizvodnja hCG izvučenog iz urina uključuje prikupljanje i obradu velike količine urina. Dostupna je rekombinantna verzija hCG, Ovitrelle (Serono) - pogledati https://pdf.hres.ca/dpd_pm/00040699.PDF. Ona se eksprimira u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO). Poznati rekombinantni hCG proizvod ima različit farmakokinetički profil u odnosu na hCG proizveden iz ljudskog urina. Poželjno je da postoji hCG proizvod koji bliže replicira ili oponaša farmakokinetički profil proizvoda proizvedenog iz ljudskog urina.

Proizvodi koji uključuju FSH i hCG su poznati iz WO2004105788.

[0005] Postoji značajna heterogenost koja je povezana sa hCG preparatima, koja se odnosi na razlike u količinama različitih izoformnih oblika. Pojedini hCG izoformi pokazuju identične sekvence aminokiselina, ali se razlikuju u obimu u kom su post-translaciono modifikovani; određene izoforme karakteriše heterogenost grana ugljenih hidrata i različite količine ugradnje sijalinske kiseline (terminalnog šećera), i izgleda da obe utiču na specifičnu bioaktivnost izoforma.

[0006] Glikozilacija prirodnog hCG je veoma složena. Glikani u prirodno dobijenom hCG hipofize mogu da sadrže širok spektar struktura koje mogu da sadrže kombinacije bi-, tri- i tetra-antenarnih glikana. Glikani mogu da nose dalje modifikacije: fukozilacija jezgra, razbijanje glukozamina, lanci prošireni acetil laktozaminom, delimična ili potpuna sijalilacija, sijalilacija sa α2,3 i α2,6 vezama, i sulfatirani galaktozamin supstituisan galaktozom. Dalje, postoje razlike između raspodele glikanskih struktura na pojedinim mestima glikozilacije. HARD K I DR, , EUROPEAN JOURNAL OF BIOCHEMISTRY 1992 DE, (1992), vol.205, br. 2, ISSN 0014-2956, strane 785 - 798 i KESSLER M J I DR, JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, (1979), vol.254, br.16, ISSN 0021-9258, strane 7909 - 7914, XP002563495 [X] 1,9,11-15,17 govore o strukturi elemenata hCG.

[0007] Glikozilacija rekombinantnih hCG proizvoda („rhCG“) odražava raspon glikoziltransferaza prisutnih u ćelijskoj liniji domaćina. Postojeći rhCG proizvod, Ovitrelle, izveden je iz sintetičkih jajnih ćelija kineskog hrčka (CHO ćelije). Raspon modifikacija glikona u rhCG dobijenom iz CHO je ograničeniji nego u prirodnim proizvodima dobijenim iz urina. Primeri smanjene heterogenosti glikana koji se nalaze u rhCG dobijenom iz CHO uključuju nedostatak glukozamina koji se razgrađuje i smanjeni sadržaj fukozilacije jezgra i ekstenzija acetil laktozamina. Pored toga, CHO ćelije mogu samo da dodaju sijalinsku kiselinu koristeći α2,3 vezu (Kagawa i dr, 1988, Takeuchi i dr, 1988, Svensson i dr., 1990). Ovo se razlikuje od prirodno proizvedenog hCG koji sadrži glikane sa mešavinom sijalinske kiseline α2,3 i α2,6.

[0008] Pokazano je da se rekombinantni FSH preparat (Organon) razlikuje u količini FSH sa izoelektričnom tačkom (pI) ispod 4 (smatra se kiselim izoformima) u poređenju sa hipofizom, serumom ili FSH post-menopauznog urina (Ulloa-Aguirre i dr., 1995). Količina kiselih izoforma u urinarnim pripremama FSH bila je mnogo veća u poređenju sa rekombinantnim proizvodima, Gonal-f (Serono) i Puregon (Organon) (Andersen i dr., 2004). Ovo mora da odražava niži molarni sadržaj sijalinske kiseline u rFSH jer je sadržaj negativno naelektrisanog glikona modifikovanog sulfatom nizak kod FSH. Niži sadržaj sijalinske kiseline u poređenju s prirodnim FSH karakteristika je i komercijalno dostupnih FSH proizvoda i stoga mora odražavati ograničenje u procesu proizvodnje (Bassett i Driebergen, 2005). Životni vek cirkulacije FSH je dokumentovan za materijale iz različitih izvora. Neki od ovih materijala su fragmentisani na osnovu ukupnog molekularnog naelektrisanja, koje je karakteristično po njihovom pi, gde više kiseline znači veće negativno naelektrisanje. Glavni doprinos ukupnom molekularnom naelektrisanju je ukupni sijalinski sadržaj u svakom FSH molekulu. Na primer, rFSH (Organon) ima udeo sijalinske kiseline od oko 8 mol/mol, dok FSH dobijen iz mokraće ima veći sadržaj sijalinske kiseline (de Leeuw i dr., 1996).

Odgovarajuće stope klirensa u plazmi kod pacova su 0,34 i 0,14 ml/min (Ulloa-Aguirre i dr.

2003). U drugom primeru gde je uzorak rekombinantnog FSH podeljen na visoke i niske pI fragmente, in vivo sposobnost fragmenta visokog pI (niži sadržaj sijalinske kiseline) je smanjena i imao je kraći poluživot u plazmi (D'Antonio i dr 1999). Podnosioci zahteva su otkrili da, slično FSH, poznati rekombinantni hCG proizvod dobijen iz CHO (npr. Ovitrelle) takođe ima nižu količinu hCG sa izoelektričnom tačkom (pI) ispod 4 (smatra se kiselim izoformima) u odnosu na urinarni hCG, što takođe odražava niži sadržaj sijalinske kiseline poznatog rhCG proizvoda u poređenju sa urinarnim hCG.

[0009] Ukupni sadržaj sijalinske kiseline hCG i rhCG nije direktno uporediv jer se sijalinske kiseline obično povezuju na dva načina. Hipofiza/serum/mokraćni hCG sadrže i α2,3 i α2,6-vezane sijalinske kiseline, gde su prve pretežne. Međutim, rekombinanti dobijeni iz CHO ćelija sadrže samo α2,3 (Kagawa i dr, 1988, Takeuchi i dr, 1988, Svensson i dr., 1990).

Drugim rečima, rekombinantni proteini eksprimirani korišćenjem CHO sistema razlikovaće se od svojih prirodnih pandana po svojoj vrsti terminalnih veza sijalinske kiseline. Ovo je još jedna razlika između prirodnih i trenutnih rekombinantnih proizvoda, pored nižeg ukupnog sadržaja sijalinske kiseline kod potonjih, i važno je razmatranje u proizvodnji bioloških agenasa za farmaceutsku upotrebu jer ugljeni hidrati mogu da doprinesu farmakološkim atributima molekula.

[0010] WO2005080585 obelodanjuje proizvodnju glikoproteina. WO03/038100 obelodanjuje proizvodnju proteina. WO2005/076013 obelodanjuje postupak za skrining antitela specifičnih za glikoform.

[0011] Zbog toga je poželjno da postoji rhCG proizvod koji bliže replicira ili oponaša fiziohemijski i farmakokinetički profil proizvoda proizvedenog iz ljudskog urina. Poželjno je da postoji rhCG proizvod koji ima poboljšano farmakokinetičko svojstvo ili svojstva u poređenju sa poznatim rekombinantnim proizvodom.

[0012] Prema predmetnom pronalasku, predviđen je postupak proizvodnje rekombinantnog hCG („rhCG“ ili „rechCG“), uključujući a2,3- i α2,6-sijalilaciju koji sadrži korak proizvodnje ili eksprimiranja rhCG u Per.C6 ćelijskoj liniji, gde je Per.C6 ćelijska linija modifikovana da prekomerno eksprimira α2,3sijaliltransferazu.

[0013] Podnosioci zahteva su razvili ljudski rekombinantni hCG koji ima kiseliji profil od proizvoda dobijenog iz CHO, Ovitrelle, i koji ima veći udeo sijalinske kiseline. Istraživanje podnosioca prijave pokazuje da tip veze sa sijalinskom kiselinom, α2,3- ili α2,6-, može dramatično uticati na biološki klirens hCG. Ljudske ćelijske linije, za razliku od CHO ćelijskih linija, mogu da eksprimiraju rekombinantni hCG sa sijalinskim kiselinama vezanim i α2,3 i α2,6 vezama.

[0014] Rekombinantni hCG sa mešavinom α2,3 i α2,6-vezane sijalinske kiseline dobijen je inženjeringom ljudske ćelijske linije za eksprimiranje i rhCG i α2,3 sijaliltransferaze (Primeri 4, 5a i 5b). Eksprimirani proizvod je visoko kiseo i sadrži mešavinu sijalinske kiseline povezane sa α2,3- i α2,6; gde je potonja pružena od strane aktivnosti endogene sijalil transferaze. To ima dve prednosti u odnosu na rhCG eksprimiran u konvencionalnim CHO ćelijama: prvo je materijal mnogo sijalilovaniji zahvaljujući kombinovanim aktivnostima dve sijaliltransferaze; i drugo, materijal više podseća na prirodni hCG. Ovo će verovatno biti biološki prihvatljivije u poređenju sa rekombinantnim proizvodima dobijenim iz CHO ćelija koji proizvode samo α2,3 povezane sijalinske kiseline i imaju smanjeni sadržaj sijalinske kiseline.

[0015] Podnosioci zahteva su iznenađujuće otkrili da rhCG proizveden postupcima prema pronalasku može bliže replicirati ili oponašati fiziohemijski i farmakokinetički profil prirodnog ljudskog urinarnog proizvoda u odnosu na ostale rekombinantne proizvode. Drugim rečima, rhCG predmetnog pronalaska može biti bliži „prirodnom“ hCG. Ovo može imati značajne prednosti u pogledu doziranja itd. dalje, proizvod koji je više „prirodan“ ili više „ljudski“ može biti poželjniji za pacijenta, koji želi terapiju, koja iako je suštinski veštačka, ovo je čini „što prirodnijom“. Mogu postojati i druge prednosti (npr. farmakokinetičke prednosti) u rekombinantnom hCG proizvodu koji ima ugljovodoničnu (npr. glikansku) strukturu koja je bliža prirodnom (npr. ljudskom urinarnom) hCG u odnosu na druge rekombinantne proizvode.

[0016] Pronalazak je, prema tome, postupak proizvodnje rekombinantne verzije hCG koja sadrži mešavinu α2,3 i α2,6 sijalinske kiseline i zbog toga više podseća na prirodni hCG. Očekuje se da će upotreba ovog jedinjenja za kontrolisanu stimulaciju jajnika, u IVF tehnikama, i indukciji ovulacije rezultovati prirodnijom stimulacijom jajnika u poređenju sa postojećim rekombinantnim proizvodima.

[0017] Prema predmetnom pronalasku, predviđen je postupak proizvodnje rekombinantnog hCG („rhCG“ ili „rechCG“), uključujući α2,3- i α2,6-sijalilaciju koji sadrži korak proizvodnje ili eksprimiranja rhCG u Per.C6 ćelijskoj liniji, gde je Per.C6 ćelijska linija modifikovana da prekomerno eksprimira α2,3sijaliltransferazu. rhCG proizveden postupcima prema pronalasku može opciono dalje da uključuje α2, 8 sijalilaciju.

[0018] rhCG proizveden postupcima prema pronalasku može biti prisutan kao pojedinačni izoform ili kao smeša izoforma.

[0019] rhCG proizveden postupcima prema pronalasku može imati sadržaj sijalinske kiseline [izražen u smislu odnosa molova sijalinske kiseline i molova proteina] od 15 mol/mol ili više (Primer 8), na primer od 15 mol/mol do 25 mol/mol, na primer od 17 mol/mol do 24 mol/mol, na primer od 17,7 mol/mol do 23 mol/mol, na primer od 18 mol/mol do 22 mol/mol, na primer od 19 mol/mol do 21 mol/mol, na primer od 19 mol/mol do 20 mol/mol.

[0020] rhCG proizveden postupcima prema pronalasku može imati 10% ili više ukupne sijalilacije koja je α2,3-sijalilacija. Na primer, 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80 ili 90% ili više ukupne sijalilacije može biti α2,3-sijalilacija. rhCG može da sadrži α2,3-sijalilaciju u količini koja iznosi od 45% do 80% ukupne sijalilacije, na primer 50% do 70% ukupne sijalilacije, na primer 55 do 65% ukupne sijalilacije. rhCG može da uključuje α2,3-sijalilaciju u količini koja iznosi od 65 do 85% ukupne sijalilacije, na primer od 70 do 80% ukupne sijalilacije, na primer od 71 do 79% ukupne sijalilacije. rhCG proizveden postupcima prema pronalasku može imati 50% ili manje ukupne sijalilacije koja je α2,6-sijalilacija. Na primer 45, 40, 30, 20, 10, 5% ili manje ukupne sijalilacije može biti α2,6-sijalilacija. rhCG može da uključuje α2,6-sijalilaciju u količini koja iznosi od 20-55% ukupne sijalilacije, na primer, 30-50% ukupne sijalilacije, na primer 35-45% ukupne sijalilacije. rhCG može da uključuje α2,6-sijalilaciju u količini koja iznosi od 15 do 35% ukupne sijalilacije, na primer od 20 do 30% ukupne sijalilacije, na primer od 21 do 29% ukupne sijalilacije. rhCG proizveden postupcima prema pronalasku može imati 5% ili manje ukupne sijalilacije koja je α2,8-sijalilacija. Na primer, 2,5% ili manje ukupne sijalilacije može biti α2,8-sijalilacija. rhCG može da uključuje α2,8-sijalilaciju u količini koja iznosi od 0 do 4% ukupne sijalilacije, na primer 0,1 do 4% ukupne sijalilacije, na primer od 0,5 do 3% ukupne sijalilacije, na primer od 0,5 do 2,5% ukupne sijalilacije. rhCG predmetnog pronalaska može da nema α2,8-sijalilaciju. Pod sijalilacijom podrazumeva se količina sijalinskih ostataka prisutnih na hCG karbohidratnim strukturama. α2,3-sijalilacija znači sijalilacija na položaju 2,3 (kao što je dobro poznato u struci) i α2,6 sijalilacija je na položaju 2,6 (takođe dobro poznato u struci). Prema tome, „% ukupne sijalilacije može biti α 2,3 sijalilacija“ odnosi se na % od ukupnog broja ostataka sijalinske kiseline prisutnih u hCG koji su sijalilovani na položaju 2,3. Izraz „% ukupne sijalilacije koji je α2,6-sijalilacija“ odnosi se na % od ukupnog broja ostataka sijalinske kiseline prisutnih u hCG koji su sijalilovani na položaju 2,6.

[0021] rhCG proizveden postupcima prema pronalasku može imati sadržaj sijalinske kiseline (količina sijalilacije po hCG molekuli) od (na osnovu mase proteina, pre nego mase proteina plus ugljeni hidrat) od 6% ili veći (npr. između 6 % i 15%, npr. između 7% i 13%, npr. između 8% i 12%, npr. između 11% i 15%, npr. između 12% i 14%).

[0022] Rekombinantni hCG eksprimiran u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) uključuje isključivo α 2, 3 sijalilaciju.

[0023] rhCG predmetnog pronalaska se proizvodi ili eksprimira u ljudskoj ćelijskoj liniji. Ovo može pojednostaviti (i učiniti efikasnijim) način proizvodnje, jer manipulacija i kontrola, npr. medijuma za rast ćelija da zadrži sijalilaciju mogu biti manje kritični nego kod poznatih procesa. Postupak takođe može biti efikasniji jer se proizvodi manje baznog rhCG nego pri proizvodnji poznatih rhCG proizvoda; stvara se kiseliji rhCG, i odvajanje/uklanjanje baznog hCG je manje problematično. rhCG se proizvodi ili eksprimira u Per.C6 ćelijskoj liniji modifikovanoj da prekomerno eksprimira α2,3-sijaliltransferazu. rhCG može da uključuje α2,6-vezane sijalinske kiseline (α2,6 sijalilacija) pružene aktivnosti endogene sijalil transferaze [ćelijske linije]. Alternativno ili dodatno, ćelijska linija može biti modifikovana koristeći α2,6-sijaliltransferazu.

[0024] rhCG (proizvedena postupcima prema pronalasku) struktura sadrži glikanske delove. Razgranavanje se može dogoditi tako da glikan može imati 1, 2, 3, 4 ili više terminalnih ostataka šećera ili „antena", kao što je dobro poznato u struci. rhCG proizveden postupcima prema pronalasku može imati glikane sa prisustvom sijalilacije na mono-antenskim i/ili diantenskim i/ili tri-antenskim i/ili tetra antenskim strukturama. Poželjno, rekombinantni hCG proizveden postupcima prema pronalasku uključuje mono(1S), di(2S), tri(3S) i tetra(4S) sijalilovane strukture. Poželjno je da relativne količine sijalilovane strukture budu u narednim odnosima (1S:2S:3S:4S):0,2-1%:35-40%:2,5-7%:0,5-1% (npr. kao što je prikazano WAX analizom naelektrisanih glikana, kao što je navedeno u Primeru 8 D).

[0025] Farmaceutski sastav može da sadrži rhCG proizveden postupcima prema pronalasku (npr. kako je gore navedeno). Farmaceutski sastav može dalje da sadrži FSH i/ili LH.

[0026] FSH se može dobiti bilo kojim načinom poznatim u struci. FSH, kako se ovde koristi, uključuje FSH dobijen iz ljudi i rekombinantni FSH. FSH dobijen iz ljudi može se prečistiti iz bilo kog odgovarajućeg izvora (npr. urina) bilo kojim postupkom poznatim u struci. FSH može biti rekombinantni FSH - na primer eksprimiran u ljudskoj ćelijskoj liniji. Postupci eksprimiranja i prečišćavanja rekombinantnog FSH dobro su poznati u struci.

[0027] LH se može dobiti bilo kojim načinom poznatim u struci. LH, kako se ovde koristi, uključuje LH dobijen iz ljudi i rekombinantni LH. LH dobijen iz ljudi može se prečistiti iz bilo kog odgovarajućeg izvora (npr. urina) bilo kojim postupkom poznatim u struci. Postupci eksprimiranja i prečišćavanja rekombinantnog LH poznati su u struci.

[0028] Farmaceutski sastav može biti za tretman neplodnosti, npr. za upotrebu u npr. asistiranim reproduktivnim tehnologijama (ART), indukciji ovulacije ili intrauterusnoj inseminaciji (IUI). Farmaceutski sastav se može koristiti, na primer, u medicinskim indikacijama gde se koriste poznati hCG preparati. Farmaceutski sastav može biti formulisan u dobro poznate sastave za bilo koji put primene lekova, npr. oralni, rektalni, parenteralni, transdermalni (npr. patch tehnologija), intravenski, intramuskularni, potkožni, intrasusternalni, intravaginalni, intraperitonealni, lokalni (prašci, masti ili kapi) ili kao bukalni ili nazalni sprej. Tipičan sastav sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, kao što je vodeni rastvor, netoksične ekscipijense, uključujući soli i konzervanse, pufere i slično, kao što je opisano u Remington's Pharmaceutical Sciences petnaesto izdanje (Matt Publishing Company, 1975), na stranama 1405 do 1412 i 1461 - 87, i National Formulary XIV četrnaesto izdanje (American Pharmaceutical Association, 1975), između ostalog.

[0029] Primeri pogodnih vodenih i bezvodnih farmaceutskih nosača, razređivača, rastvarača ili nosača uključuju vodu, etanol, poliol (poput glicerola, propilen glikola, polietilen glikola i slično), karboksimetilcelulozu i njene pogodne smeše, biljna ulja (poput maslinovog ulja), i organske estre koji se mogu injektirati, kao što je etil oleat.

[0030] Sastavi takođe mogu da sadrže aditive kao što su, ali bez ograničavanja na, konzervanse, agense za vlaženje, emulgatore i agense za raspršivanje. Antibakterijski i antifungalni agensi mogu biti uključeni da spreče rast mikroba i uključuju, na primer, paraben, hlorobutanol, fenol, sorbinsku kiselinu i slično. Dalje, može biti poželjno uključiti izotonične agense poput šećera, natrijum hlorida i slično.

[0031] U nekim slučajevima, kako bi se postiglo produženo delovanje, poželjno je usporiti apsorpciju hCG (i drugih aktivnih sastojaka, ako postoje) iz potkožne ili intramuskularne injekcije. To se može postići upotrebom tečne suspenzije kristalnog ili amorfnog materijala sa slabom rastvorljivošću u vodi. Brzina apsorpcije hCG tada zavisi od njegove brzine rastvaranja koja zauzvrat može zavisiti od veličine kristala i kristalnog oblika. Alternativno, odgođena apsorpcija parenteralno primenjenog hCG kombinacionog oblika postiže se rastvaranjem ili suspenzijom hCG kombinacije u uljanom nosaču.

[0032] Oblici depoa za injekcije se mogu napraviti formiranjem mikrokapsulirajućih matrica hCG (i drugih agenasa, ako postoje) u biorazgradivim polimerima kao što je polaktidpoliglikolid. U zavisnosti od odnosa hCG i polimera, i prirode određenog polimera koji se koristi, može se kontrolisati brzina oslobađanja hCG. Primeri drugih biorazgradivih polimera uključuju polivinilpirolidone, poli(ortoestere), poli(anhidride) itd. Depoi formulacija za injekcije se takođe pripremaju uvlačenjem hCG u lipozome ili mikroemulzije koje su kompatibilne sa telesnim tkivima.

[0033] Formulacije za injekcije mogu se sterilisati, na primer, filtriranjem kroz filter koji zadržava bakterije, ili ugrađivanjem agenasa za sterilizaciju u obliku sterilnih čvrstih sastava koji se mogu rastvarati ili raspršiti u sterilnoj vodi ili drugom sterilnom medijumu za injekcije neposredno pre upotrebe. Formulacije za injekcije mogu se isporučiti u bilo kom pogodnom kontejneru, npr. bočici, unapred napunjenom špricu, patroni za injekcije i slično.

[0034] Formulacije za injekcije mogu se isporučiti kao proizvod koji sadrži farmaceutske sastave koji sadrže hCG (opciono sa FSH, LH itd.) Ako postoji više od jednog aktivnog sastojka (tj. HCG i npr. FSH ili LH), oni mogu biti pogodni za primenu odvojeno ili zajedno. Ako se primenjuju odvojeno, primena može biti sekvencijalna. Proizvod se može isporučiti u bilo kom odgovarajućem pakovanju. Na primer, proizvod može da sadrži određeni broj unapred napunjenih špriceva koje sadrže bilo hCG, FSH ili kombinaciju FSH i hCG, špriceva upakovanih u blister pakovanje ili na drugi način za održavanje sterilnosti. Proizvod po izboru može da sadrži uputstva za upotrebu hCG i FSH formulacija.

[0035] pH i tačna koncentracija različitih sastojaka farmaceutskog sastave podešavaju se u skladu sa rutinskom praksom u ovoj oblasti. Pogledati GOODMAN & GILMAN's THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICES, 7. izdanje. U poželjnom otelotvorenju, sastavi predmetnog pronalaska se isporučuju kao sastavi za parenteralnu primenu. Opšti postupci za dobijanje parenteralnih formulacija su poznati u struci i opisani su u REMINGTON; THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, supra, na stranama 780-820. Parenteralni sastavi se mogu isporučiti u tečnoj formulaciji ili kao čvrsta supstanca koja će biti pomešana sa sterilnim medijumom za injekcije neposredno pre primene. U posebno poželjnom ostvarenju, parenteralni sastavi se isporučuju u obliku dozne jedinice za lakši primenu i uniformnost doziranja.

Detaljan opis pronalaska

[0036] Predmetni pronalazak će sada biti detaljnije opisan sa referencama na naredne primere i priložene slike na kojima:

Slika 1 prikazuje plazmidnu mapu phCGalfa/beta vektora eksprimiranja;

Slika 2 prikazuje vektor eksprimiranja α2,3-sijaliltransferaze (ST3GAL4);

Slika 3 prikazuje vektor eksprimiranja α2,6-sijaliltransferaze (ST6GAL1);

Slika 4 prikazuje detektovanje rhCG izoforma u rekombinantnim hCG preparatima dobijenim od ljudske ćelijske linije prema pronalasku (linija 3, 4) pomoću IEF obojenih sa Coomassie

1

Blue, u poređenju sa sastavima prethodnog stanja tehnike (linija 1, 2);

Slika 5 prikazuje stope metaboličkog klirensa (MCR) α2,3-sijaliltransferaze sintetičkih Per.C6 rhCG uzoraka; i

Slika 6 prikazuje dugoročni MCR α2,3 sijaliltransferaze sintetičkih Per.C6 rhCG uzoraka.

Odabir sekvenci

Ljudski hCG

[0037] Kodirajući region gena za hCG alfa polipeptid korišćen je prema Fiddes i Goodman (1979). Sekvenca je zapisana kao AH007338, i u vreme konstrukcije nije bilo drugih varijanti ove proteinske sekvence. Sekvenca se ovde naziva SEQ ID 1.

[0038] Kodirajući region gena za hCG beta polipeptid korišćen je prema Fiddes i Goodman (1980). Sekvenca je zapisana kao NP_000728 i u skladu je sa proteinskim sekvencama CGbeta3, CGbeta5 i CGbeta7. Sekvenca je ovde navedena kao SEQ ID 2

Sijaliltransferaza

[0039] α2,3-Sijaliltransferaza - Kodirajući region gena za beta-galaktozid alfa-2,3-sijaliltransferazu 4 (α2,3-sijaliltransferaza, ST3GAL4) korišćen je prema Kitagawa i Paulson (1994). Sekvenca je zapisana kao L23767 i ovde se naziva SEQ ID 3.

[0040] α2,6-sijaliltransferaza - Kodirajući region gena za beta-galaktozamid alfa-2,6-sijaliltransferazu 1 (α2,6-sijaliltransferaza, ST6GAL1) korišćen je prema Grundmann i dr. (1990). Sekvenca je zapisana kao NM_003032 i ovde se naziva SEQ ID 4.

PRIMERI

Primer 1 Konstrukcija hCG vektora eksprimiranja

[0041] Kodirajuće sekvence hCG alfa polipeptida (AH007338, SEQ ID 1) i hCG beta polipeptida (NP_000728, SEQ ID 2) su amplifikovane pomoću PCR korišćenjem kombinacija prajmera CGa-fw i Cga-rev i CGb-fw i Cgb-rec, respektivno.

CGa-fw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGGATTACTACAGAAAAATATGC-3'

CGa-rev 5'-GGATGGCTAGCTTAAGATTTGTGATAATAAC-3'

CGb-fw 5'-CCAGGCGCGCCACCATGGAGATGTTCCAGGGGCTGC -3'

CGb-rev 5'- CCGGGTTAACTTATTGTGGGAGGATCGGGG-3'

[0042] Dobijena amplifikovana hCG beta DNK je digestirana restrikcionim enzimima AscI i HpaI i umetnuta u AscI i HpaI mesta na CMV-vođenom sisarskom vektoru eksprimiranja koji nosi nose marker selekcije neomicina. Slično tome, hCG alfa DNK je digestirana sa BamHI i NheI i umetnuna na BamHI i NheI mesta na vektoru eksprimiranja koji već sadrži hCG beta polipeptidnu DNK.

[0043] Vektorska DNK korišćena je za transformaciju DH5α soja E.coli. Kolonije su odabrane za amplifikaciju i, od broja koji je uključivao vektor koji sadrži i hCG alfa i beta, dvadeset je odabrano za sekvenciranje. Sve kolonije odabrane za sekvenciranje sadrže ispravne sekvence prema SEQ ID 1 i SEQ ID 2. Za transfekciju je odabran plazmid phCG A+B (Slika 1).

Primer 2 Konstrukcija ST3 vektora eksprimiranja

[0044] Kodirajuća sekvenca beta-galaktozid alfa-2,3-sijaliltransferaze 4 (ST3, L23767, SEQ ID 3) je amplifikovana pomoću PCR koristeći kombinaciju prajmera 2,3STfw i 2,3STrev. 2,3STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGTGTCCTGCAGGCTGGAAGC-3'

2,3STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTCAGAAGGACGTGAGGTTCTTG-3'

[0045] Dobijena amplifikovana ST3 DNK je razgrađena restrikcionim enzimima BamHI i Af/II i umetnuta u BamHI i Af/II mesta na CMV-vođenom sisarskom vektoru eksprimiranja koji nose marker otpornosti na higromicin. Vektor je pojačan kao što je prethodno opisano i sekvencioniran. Klon pST3#1 (Slika 2) sadrži tačnu sekvencu prema SEQ ID 3 i izabran je za transfekciju.

Primer 3 Konstrukcija ST6 vektora eksprimiranja

[0046] Kodirajuća sekvenca beta-galaktozamid alfa-2,6-sijaliltransferaze 1 (ST6, NM_003032, SEQ ID 4) je amplifikovana pomoću PCR korišćenjem kombinacije prajmera 2,6STfw i 2,6STrev.

2,6STfw 5'-CCAGGATCCGCCACCATGATTCACACCAACCTGAAG-3'

2,6STrev 5'-TTTTTTTCTTAAGTTAGCAGTGAATGGTCCGG-3'

[0047] Dobijena amplifikovana ST6 DNK je digestirana restrikcionim enzimima BamHI i Af/II i umetnuta u BamHI i Af/II mesta na CMV-vođenom sisarskom vektoru eksprimiranja koji nose marker otpornosti na higromicin. Vektor je pojačan kao što je prethodno opisano i sekvencioniran. Klon pST6#11 (Slika 3) je sadržao tačnu sekvencu prema SEQ ID 4 i izabran je za transfekciju.

Primer 4: Stabilno eksprimiranje phCG A+B u PER.C6 ćelijama. Izolacija transfekcije i skrining klonova.

[0048] Per.C6 klonovi koji proizvode hCG generisani su eksprimiranjem oba polipeptidna lanca hCG iz jednog plazmida (pogledati Primer 1).

[0049] Kako bi se dobili stabilni klonovi, korišten je agens za transfekciju na bazi lipozoma sa phCG A+B konstrukcijom. Stabilni klonovi su odabrani u Per.C6 selekcionom medijumu dopunjenom sa 10% FCS i koji sadrži G418. Tri nedelje nakon transfekcije, klonovi otporni na G418 su narasli. Ukupno je izabrano 389 klonova za izolaciju. Izolovani klonovi su kultivisani u medijumu za selekciju do 70-80% konfluencije. Supernatanti su testirani na sadržaj hCG proteina korišćenjem hCG selektivnog ELISA i farmakološkom aktivnošću na hCG receptoru u kloniranoj ćelijskoj liniji, koristeći cAMP test akumulacije. Klonovi (118) koji eksprimiraju funkcionalni protein napredovali su za ekspanziju kulture u 24 komorice, 6 komorica i T80 bocama.

[0050] Studije za utvrđivanje produktivnosti i kvaliteta materijala iz 47 klona su započete u T80 bocama da bi se dobilo dovoljno materijala. Ćelije su kultivisane u dopunjenom medijumu, kao što je prethodno opisano, tokom 7 dana i supernatant je sakupljen.

Produktivnost je određena korišćenjem hCG selektivnog ELISA. Određen je izoelektrični profil materijala (korišćenjem postupka opisanog u Primeru 6). Informacije iz IEF su korišćene za odabir klonova za analizu brzine metaboličkog klirensa. Za inženjering sijaliltransferaze odabrani su klonovi dovoljne produktivnosti i kvaliteta.

1

Primer 5a Nivo sijalilacije je povećan u ćelijama koje prekomerno eksprimiraju α2,3-sijaliltransferazu. Stabilno eksprimiranje pST3 u hCG eksprimirajućim PER.C6 ćelijama; Izolacija transfekcije i skrining klonova.

[0051] Per.C6 klonovi koji proizvode visoko sijalilovani hCG generisani su eksprimiranjem α2,3 sijaliltransferaze iz zasebnih plazmida (pogledati Primer 2) u Per.C6 ćelijama koje već eksprimiraju oba polipeptidna lanca od hCG (pogledati Primer 4). Klonovi proizvedeni iz PER.C6® ćelija kao što je navedeno u Primeru 4, odabrani su zbog svojih karakteristika, uključujući produktivnost, dobar profil rasta, proizvodnju funkcionalnog proteina i proizveden hCG koji uključuje nešto sijalilacije.

[0052] Stabilni klonovi su generisani kao što je prethodno opisano u Primeru 4. Klonovi iz programa α2,3-sijaliltransferaze su izolovani, prošireni i analizirani. Konačni broj klonova za α2,3 ispitivanje bio je pet. Klonovi α2,3-sijaliltransferaze bili su prilagođeni uslovima medijuma i suspenzije bez seruma.

[0053] Kao i pre, klonovi su ispitivani pomoću hCG selektivnog ELISA, funkcionalne reakcije u ćelijskoj liniji hCG receptora, IEF (Primer 6). Takođe je procenjena stopa metaboličkog klirensa (Primer 9) i USP hCG biološka analiza (Primer 10). Rezultati su upoređeni sa komercijalno dostupnim rekombinantnim hCG (Ovitrelle, Serono) i roditeljskim hCG Per.C6 ćelijskim linijama. Reprezentativni uzorci su prikazani u Primerima i na Slikama.

[0054] Kao zaključan, eksprimiranje hCG zajedno sa α2,3-sijaliltransferazom u Per.C6 ćelijama rezultuje povećanim nivoom sijalilovanog hCG u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju samo hCG.

Primer 5b Stabilno eksprimiranje pST3 u hCG eksprimirajućim PER.C6 ćelijama -drugačiji postupak

[0055] Alfa beta heterodimer proizveden iznad (Primer 4) imao je nizak nivo sijalilacije, što je rezultovalo vrlo baznim IEF profilom. Kao što je prethodno navedeno (Primer 5a) eksprimiranje hCG zajedno sa α2,3-sijaliltransferazom u Per.C6 ćelijama rezultuje u povećanom nivou sijalilovanog hCG u poređenju sa ćelijama koje eksprimiraju samo hCG.

[0056] Izvršena je dvostruka transfekcija gena hCG alfa i beta podjedinica zajedno sa genom enzima α2,3 sijaliltransferaze u Per.C6 ćelijama u formatu suspenzione ćelijske kulture.

Ćelijske linije su generisane ko-transfekcijom hCG vektora (dualni alfa/beta, Primer 1) i vektora koji kodira α2,3-sijaliltransferazu (primer 2) u uslovima bez seruma. Klonovi proizvedeni iz PER.C6® ćelija su odabrani zbog svojih karakteristika, uključujući produktivnost, dobar profil rasta, proizvodnju funkcionalnog proteina i proizveden hCG koji uključuje nešto sijalilacije. Klonovi su izolovani, prošireni i analizirani.

[0057] Kao i pre, klonovi su ispitivani pomoću hCG selektivnog ELISA, funkcionalni odgovor u ćelijskoj liniji hCG receptora, IEF (Primer 6). Takođe je procenjena stopa metaboličkog klirensa (Primer 9) i USP hCG biološka analiza (primer 10). Rezultati su upoređeni sa komercijalno dostupnim rekombinantnim hCG (Ovitrelle, Serono) i roditeljskim hCG Per.C6 ćelijskim linijama. Reprezentativni uzorci su prikazani u primerima i slikama (pogledati Primere 6, 9, 10, Slike 4 i 5). Rekombinantni hCG proizveden od strane klonova (to jest, rekombinantni hCG proizveden postupcima prema pronalasku) je značajno poboljšao sijalilaciju (tj. u proseku više hCG izoforma sa velikim brojem sijalinske kiseline), u poređenju sa hCG eksprimiranim bez α2,3-sijaliltransferaze i Ovitrelle (pogledati Primere 6 i 8, Slika 4).

Primer 6 Analiza izoelektrične tačke pI Per.C6 proizvela je hCG izoformu izoelektričnim fokusiranjem.

[0058] Elektroforeza se definiše kao transport naelektrisanih molekula kroz rastvarač pomoću električnog polja. Mobilnost biološkog molekula kroz električno polje zavisiće od snage polja, neto naelektrisanja na molekulu, veličine i oblika molekula, jonske snage i svojstava medijuma kroz koji molekuli migriraju.

[0059] Izoelektrično fokusiranje (IEF) je elektroforetska tehnika za odvajanje proteina na osnovu njihovog pi. pI je pH pri kom protein nema neto naelektrisanje i neće migrirati u električnom polju. Sadržaj sijalinske kiseline u hCG izoformima suptilno menja pI tačku za svaki izoform, što se može iskoristiti ovom tehnikom za vizuelizaciju Per.C6 hCG izoforma iz svakog klona.

1

[0060] Izoelektrične tačke per.C6 proizvedenih hCG izoforma u supernatantima ćelijske kulture analizirane su koristeći izoelektrično fokusiranje. Medijum ćelijske kulture iz Per.C6 hCG klonova proizveden je kao što je opisano u Primerima 4, 5a i 5b.

[0061] Per.C6 hCG uzorci su razdvojeni na Novex® IEF gelovima koji sadrže 5% poliakrilamida pod prirodnim uslovima, na pH 3,0 -7,0 gradijentu u rastvoru amfolita pH 3,0 – 7,0. Proteini su vizuelizovani upotrebom Coomassie Blue bojenja, koristeći postupke dobro poznate u struci.

[0062] Slika 4 prikazuje detekciju rhCG izoforma pomoću IEF obojenih sa Coomassie Blue u sastavima prema pronalasku (Linija 3, 10 µg i Linija 4, 15 µg) i sastavom dobijenim iz CHO, iz stanja tehnike, Ovitrelle (Linija 1, Ovitrelle, 10 µg i Linija 2, Ovitrelle, 15 µg). Trake predstavljaju izoforme hCG koji sadrže različit broj molekula sijalinske kiseline. Pomoću ovog postupka identifikovani su klonovi koji proizvode hCG izoform sa većim brojem molekula sijalinske kiseline. Slika 4 pokazuje da rekombinantni hCG iz ljudske ćelijske linije konstruisani sa α2,3-sijaliltransferazom (sastavi dobijeni postupcima prema pronalasku) imaju kiseliji profil od Ovitrelle.

Primer 7 Analiza veza sijalinske kiseline za Per.C6 hCG

[0063] Glikokonjugati su analizirani korišćenjem postupka diferencijacije na bazi lektana. Ovim postupkom mogu se karakterisati glikoproteini i glikokonjuagati vezani za nitrocelulozu. Lektini selektivno prepoznaju određenu jedinicu, na primer α2,3 vezane sijalinske kiseline. Lektini koji su primenjeni konjugovani su sa steroidnim hapten digoksigeninom koji omogućava imunološku detekciju vezanih lektina.

[0064] Prečišćeni Per.C6 hCG iz roditeljskog klona (bez dodatne sijaliltransferaze) i klon konstruisan sa α2,3-sijaliltransferazom razdvojeni su standardnim SDS-PAGE tehnikama. Komercijalno dostupan rekombinantni hCG (Ovitrelle, Serono) korišćen je kao standard.

[0065] Sijalinska kiselina je analizirana korišćenjem DIG Glican Diferenciation Kit (Kat. Br.

11 210 238 001, Roche) prema uputstvima proizvođača. Pozitivne reakcije sa Sambucus nigra aglutininom (SNA) ukazivale su na terminalno povezanu (2-6) sijalinsku kiselinu. Pozitivne reakcije sa Maackia amurensis aglutininom II (MAA): naznačena je terminano povezana (α2-

1

3) sijalinska kiselina

[0066] Ukratko, roditeljski klon je sadržao niske nivoe i α2,3- i α2,6-sijalinske kiseline.

Klonovi konstruisani sa α2,3-sijaliltransferazom sadržali su visoke nivoe veza α2,3-sijalinske kiseline i niske nivoe veza α2,6-sijalinske kiseline. Standardni kontrolni Ovitrelle sadrži samo veze α2,3-sijalinske kiseline. To je u skladu sa onim što se zna o rekombinantnim proteinima proizvedenim u ćelijama jajnika kineskog hrčka (CHO) (Kagawa i dr, 1988, Takeuchi i dr, 1988, Svensson i dr., 1990).

[0067] Zaključno, inženjering Per.C6 hCG ćelija sa α2,3-sijaliltransferazom uspešno je povećao broj molekula sijalinske kiseline konjugovanih sa rekombinantnim hCG u uzorku.

Primeri 8A i 8B Kvantifikacija ukupne sijalinske kiseline

[0068] Sijalinska kiselina je proteinski-vezan ugljeni hidrat koji se smatra monosaharidom i javlja se u kombinaciji sa drugim monosaharidima poput galaktoze, manoze, glukozamina, galaktozamina i fukoze. Ukupna sijalinska kiselina na prečišćenom rhCG prema pronalasku je merena korišćenjem postupka zasnovanog na postupku od Stanton et. al. (J. Biochem.

Biophys. Methods. 30 (1995), 37 - 48).

Primer 8A

[0069] Izmeren je ukupni sadržaj sijalinske kiseline u Per.C6 rekombinantnom hCG modifikovanom sa α2,3-sijaliltransferazom (npr. Primer 5a, Primer 5b) i utvrđeno je da je veći od 15 mol/mol, [izražen u smislu odnosa molova sijalinske kiseline i molova proteina], na primer veći od 18 mol/mol, na primer 19,1 mol/mol. Ovo se može uporediti sa Ovitrelle, koji ima ukupni udeo sijalinske kiseline od 17,6 mol/mol.

Primer 8B

[0070] Izmeren je ukupni sadržaj sijalinske kiseline u Per.C6 rekombinantnom hCG modifikovanom sa α2,3-sijaliltransferazom 080019-19 (pripremljen postupcima Primera 5b iznad) i utvrđeno je da iznosi 20 mol/mol, [izražen u smislu odnosa molova sijalinske kiseline i molova proteina]. Opet, ovo se može povoljno uporediti sa Ovitrelle koji ima ukupni udeo

1

sijalinske kiseline od 17,6 mol/mol. Ovaj primer (080019-19) je testiran da utvrdi relativne količine α2,3 i α2,6 sijalinske kiseline (Primer 8C).

Primer 8C - Kvantifikacija relativnih količina α2,3 i α2,6 sijalinske kiseline

[0071] Relativne procentne količine α2,3 i α2,6 sijalinske kiseline na prečišćenom rhCG [Primer (080019-19) i dva druga primera pripremljena postupcima Primera 5] merene su pomoću poznatih tehnika - HPLC sa normalnom fazom (NP).

[0072] Za kvantifikaciju alfa 2,3 i 2,6 sijalinske kiseline u O-povezanim glikanima, izvedena je naredna analiza. O-povezani glikani su razdvojeni od hCG uzorka koristćei Orela Glycan Release Kit i razdvojeni na NP-HPLC. Uzorci ekstrahovanih, sakupljenih glikana (ekstrahovani kao iznad) razgrađeni su sa različitim sijalidazama kako bi se odredile veze. Ova enzimska razgradnja glikana izvedena je korišćenjem alfa 2-3,6,8 sijalidaze i alfa 2-3, sijalidaze. Enzimski razgrađeni glikani ponovo su razdvojeni na NP koloni, i O-Glikani su identifikovani na NP-HPLC koristeći pripremljene standarde. Relativni procenti su izračunati i prikazani su u narednoj tabeli (SA = sijalinska kiselina).

[0073] Otkriveno je da su relativni procenti u rasponu 55% - 65% (npr.59%) za α2,3 sijalilaciju; i 35 do 45% (npr.41%) za α2,6 sijalilaciju .

Primer 8D Kvantifikacija relativnih količina mono, di, tri i tetra antenskih sijalilovanih struktura

[0074] Relativni procenti mono, di, tri i tetra sijalilovanih struktura na glikanima izdvojenim iz prečišćenog rhCG (tri uzorka korišćena u Primeru 8C) su mereni pomoću poznatih tehnika.

[0075] Svaki rhCG uzorak je imobilizovan (gel blok), ispran, redukovan, alkilovan i razgrađen sa PNGase F preko noći. Zatim su N-glikani ekstrahovani i prerađeni. N-glikani za NP-HPLC i WAX-HPLC analizu su obeleženi fluoroforom 2AB kako je detaljno opisano kod Royle i dr.

1

[0076] Slaba anjonska razmena (WAX) HPLC za razdvajanje N-glikana pomoću naelektrisanja (Primer 8C) izvedena je kao što je navedeno kod Royle i dr, gde je Fetuin N-glikan standard kao referenca. Glikani su eluirani prema broju sijalinskih kiselina koje su sadržali. Svi uzorci uključuju mono (1S), di (2S), tri (3S) i tetra (4S) sijalilovane strukture.

[0077] Poželjan primer, 080019-19, uključuje mono (1S), di (2S), tri (3S) i tetra (4S) sijalilovane strukture.

Primer 9 Određivanje brzine metaboličkog klirensa rhCG

[0078] Kako bi se odredila stopa metaboličkog klirensa (MCR) hCG Per.C6 uzoraka konstruisanih pomoću α2,3-sijaliltransferaze (npr. Primer 5a, 5b), svesnim ženkama pacova (3 životinje po klonu) date su injekcije u repnu venu u nultom vremenu sa bolusom od rhCG (1 -10 µg/pacov, na osnovu ELISA kvantifikacije uzoraka, DRG EIA 1288). Uzorci krvi (400 µl) uzeti su sa vrha repa 1, 2, 4, 8, 12, 24 i 32 sata nakon injekcije sa test uzorkom. Serum je sakupljen centrifugiranjem i ispitivan na hCG sadržaj pomoću ELISA (DRG EIA 1288). MCR uzoraka hCG Per.C6 proizveden pomoću α2,3-sijaliltransferaze pokazao je da je poluživot sličan standardnom (Slika 5). Slika 6 pokazuje da su i drugi hCG uzorci napravljeni korišćenjem α2,3-sijaliltransferaze možda poboljšali poluživot u odnosu na standard (Slika 6).

Primer 10 - hCG biološki test prema USP

[0079] Izvršen je hCG biološki test za ispitivanje specifične aktivnosti hCG. Aktivnost je merena prema USP (USP Monographs: Chorionic Gonadotropin, USPC Official 8/1/09-11/30/09), koristeći Ovitrelle kao standard. Ovitrelle ima biološku aktivnost od 26.000 IU/mg (Curr Med Res Opin.2005 Dec; 21(12): 1969 - 76). Granica prihvatljivosti bila je > 21.000 IU hCG/mg. Biološka aktivnost za uzorak rekombinantne hCG dobijene iz ljudske ćelijske linije konstruisane sa α2,3-sijaliltransferazom (koja sadrži udeo sijalinske kiseline 19,1 mol/mol - pogledati Primer 8) iznosila je 27.477 IU hCG/mg.

Primer 11 Pregled proizvodnje i pročišćavanja

[0080] Razvijen je postupak za proizvodnju rekombinantnog hCG u PER.C6 ćelijama koje su

1

kultivisane u suspenziji u medijumu bez seruma. Postupak je opisan u nastavku i primenjen je na nekoliko ćelijskih linija koje proizvode hCG.

[0081] Rekombinantni hCG iz α2,3-klona je pripremljen korišćenjem modifikacije postupka koji je opisan kod Lowry i dr. (1976).

[0082] Za proizvodnju PER.C6-hCG, ćelijske linije su prilagođene medijumu bez seruma, tj. Excell 525 (JRH Biosciences). Ćelije su najpre kultivisane kako bi se u T80 boci sa kulturom formirao monosloj sa 70% -90% konfluencijom. Po prolasku ćelije su ponovo suspendovane u medijumu bez seruma, Excell 525 4 mM L-glutamina, do gustine ćelija od 0,3x10<6>ćelija/ml. 25 ml suspenzije ćelija je stavljeno u bocu od 250 ml i mućkano pri 100 o/min na 37°C pri 5% CO2. Nakon dostizanja ćelijske gustine >IxI0<6>ćelija/ml, ćelije su pod-kultivisane do ćelijske gustine 0,2 ili 0,3x10<6>ćelija/ml, i dalje kultivisane u bocama za mućkanje na 37°C, 5% CO2 i 100 o/min.

[0083] Za proizvodnju hCG, ćelije su prebačene u proizvodni medijum bez seruma, tj. VPRO (JRH Biosciences), koji podržava rast PER.C6 ćelija do vrlo velike ćelijske gustine (obično > 10<7>ćelija/ml u kulturi serije). Najpre su ćelije kultivisane do > 1x10<6>ćelija/ml u Excell 525, zatim su centrifugirane 5 minuta pri 1000 o/min i zatim suspendovane u VPRO medijumu 6 mM L-glutamina do gustine 1x10<6>ćelija/ml Ćelije su zatim kultivisane u boci za mešanje 7-10 dana na 37°C, 5% CO2i 100 o/min. Tokom ovog perioda ćelije su porasle do gustine> 10<7>ćelija/ml. Medijum za kulturu je skupljen nakon što je vitalnost ćelija počela da opada. Ćelije su centrifugirane 5 minuta pri 1000 o/min i supernatant je korišćen za kvantifikaciju i prečišćavanje hCG. Koncentracija hCG je određena korišćenjem ELISA (DRG EIA 1288).

[0084] Nakon toga, prečišćavanje hCG izvedeno je primenom modifikacije postupka opisanog kod Lowry i dr. (1976). Ovo je postignuto hromatografijom na DEAE celulozi, gel filtracijom na Sephadex G100, adsorpcionom hromatografijom na hidroksiapatitu i preparativnom poliakrilamidnom elektroforezom.

[0085] Tokom svih hromatografskih postupaka, RIA (DRG EIA 1288) i IEF (primer 6) su potvrdili prisustvo imunoreaktivnog rekombinantnog hCG.

Reference

2

Andersen CY, Westergaard LG, and van Wely M. (2004). FSH isoform composition of commercial gonadotrophin preparations: a neglected aspect? Reprod Biomed Online.9(2), 231-236.

Bassett RM, and Driebergen R. (2005). Continued improvements in the quality and consistency of follitropin alfa, recombinant human FSH. Reprod Biomed Online. 10(2), 169-177.

D'Antonio M., Borrelli F. , Datola A., Bucci R. , Mascia M. , Polletta P., Piscitelli D., and Papoian R. (1999) Biological characterization of recombinant human follicle stimulating hormone isoforms. Human Reproduction 14, 1160-1167

Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1979) Isolation, cloning and sequence analysis of the cDNA for the alpha-subunit of human chorionic gonadotropin. Nature, 281, 351-356.

Fiddes, J. C. and Goodman, H. M. (1980) The cDNA for the beta-subunit of human chorionic gonadotropin suggests evolution of a gene by readthrough into the 3'-untranslated region. Nature, 286, 684-387.

Kagawa Y, Takasaki S, Utsumi J, Hosoi K, Shimizu H, Kochibe N, and Kobata A. (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1 produced by three different mammalian cells. J Biol Chem. 263(33), 17508-17515.

Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193(1), 265-75.

Lowry, PJ, McLean, C, Jones RL and Satgunasingam N. (1976) Purification of anterior pituitary and hypothalamic hormones Clin Pathol Suppl (Assoc Clin Pathol).7, 16-21.

Royle L, Radcliffe CM, Dwek RA and Rudd PM (2006) Methods in Molecular Biology, ed I Brockhausen-Schutzbach (Humana Press), 347: Glycobiology protocols, 125-144.

Steelman SL, and Pohley FM. (1953) Assay of the follicle stimulating hormone based on the augmentation with human chorionic gonadotropin. Endocrinology.53(6), 604-616.

Svensson EC, Soreghan B, and Paulson JC. (1990) Organization of the beta-galactoside alpha 2,6-sialyltransferase gene. Evidence for the transcriptional regulation of terminal glycosylation. J Biol Chem.265(34):20863-20868.

Takeuchi M, Takasaki S, Miyazaki H, Kato T, Hoshi S, Kochibe N, and Kobata A (1988). Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of human erythropoietins purified from urine and the culture medium of recombinant Chinese hamster ovary cells. J Biol Chem.

263(8), 3657-3663.

Ulloa-Aguirre A, Midgley AR Jr, Beitins IZ, and Padmanabhan V. (1995). Folliclestimulating isohormones: characterization and physiological relevance. Endocr Rev.16(6), 765-787.

Ulloa-Aguirre A, Timossi C, Barrios-de-Tomasi J, Maldonado A, and Nayudu P. (2003). Impact of carbohydrate heterogeneity in function of follicle-stimulating hormone: studies derived from in vitro and in vivo models. Biol Reprod.69(2), 379-389.

Claims (2)

Patentni zahtevi

1. Postupak proizvodnje rekombinantnog hCG (rhCG), gde postupak uključuje α2,3- i α2,6-sijalilaciju i sadrži korak proizvodnje ili eksprimiranja rhCG u Per.C6 ćelijskoj liniji, gde je Per.C6 ćelijska linija modifikovana da prekomerno eksprimira α2,3sijaliltransferazu.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde Per.C6 ćelijska linija uključuje aktivnost endogene sijalil transferaze.

2