RS60598B1 - Postupak sinteze inhibitora indolamin 2,3-dioksigenaze - Google Patents

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Ova prijava se odnosi na postupke i intermedijere za proizvodnju 4-({2-[(aminosulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamida, koji je inhibitor indolamin 2,3-dioksigenaze koristan u lečenju kancera i drugih poremećaja.

Stanje tehnike

[0002] Triptofan (Trp) je esencijalna aminokiselina potrebna za biosintezu proteina, niacina i neurotransmitera 5-hidroksitriptamina (serotonin). Enzim indolamin 2,3-dioksigenaza (takođe poznat kao INDO ili IDO) katalizuje prvi i ograničavajući korak u degradaciji L-triptofana u N-formil-kinurenin. U humanim ćelijama, trošenje Trp kao rezultat IDO aktivnosti je istaknut antimikrobni efektorni mehanizam indukovan interferonom gama (IFN-y). IFN-γ stimulacija indukuje aktiviranje IDO, što dovodi do trošenja Trp, čime se zaustavlja rast Trp-zavisnih intracelularnih patogena kao što su Toxoplasma gondii i Chlamydia trachomatis. IDO aktivnost takođe ima antiproliferativni efekat na mnoge ćelije tumora, a IDO indukcija je primećena in vivo prilikom odbacivanja alogenih tumora, ukazujući na moguću ulogu ovog enzima u postupku odbacivanja tumora (Daubener, et al., 1999, Adv. Exp. Med. Biol., 467: 517-24; Taylor, et al., 1991, FASEB J., 5: 2516-22).

[0003] Uočeno je da su HeLa ćelije ko-kultivisane sa limfocitima periferne krvi (PBLs) stekle imunoinhibitorni fenotip kroz ushodno regulisanu aktivnost IDO. Veruje se da smanjenje proliferacije PBL nakon tretmana sa interleukin-2 (IL2) ishoduje od IDO oslobođenog iz ćelija tumora u odgovoru na IFNG sekreciju od strane PBLs. Ovaj efekat je obrnut u odnosu na tretman 1-metil-triptofanom (1MT), specifičnim IDO inhibitorom. Predloženo je da aktivnost IDO u ćelijama tumora može da posluži da oslabi antitumorske odgovore (Logan, et al., 2002, Immunology, 105: 478-87).

[0004] Nedavno, imunoregulatorna uloga trošenja Trp je dobila mnogo pažnje. Nekoliko dokaza sugerišu da je IDO uključen u indukciju imuno tolerancije. Istraživanja trudnoće sisara, otpornosti tumora, hronične infekcije i autoimunih bolesti su pokazala da ćelije eksprimujući IDO mogu da potisnu odgovore T-ćelija i unaprede toleranciju. Ubrzani katabolizam Trp je primećen kod bolesti i poremećaja povezanih sa ćelijskom imuno aktivacijom, kao što su infekcija, malignitet, autoimune bolesti i AIDS, kao i za vreme trudnoće. Na primer, povećani nivoi IFNs i povišeni nivoi urinarnih Trp metabolita su uočeni u autoimunim bolestima; pretpostavlja se da sistemsko ili lokalno trošenje Trp koje se javlja u autoimunim bolestima može odnositi na degeneraciju i gubitak simptoma ovih bolesti. U prilog ovoj hipotezi, viskoi nivoi IDO su uočeni u ćelijama izolovanim iz sinovijalne tečnosti artritičnih zglobava. IFNs su takođe povišeni kod pacijenata sa virusom humane imunodeficijencije (HIV) a povećanja nivoa IFN su povezana sa pogoršanjem prognoze. Prema tome, predloženo je da je IDO indukovan hroničnom HIV infekcijom, a dodatno je povećan oportunističkim infekcijama, a da hronični gubitak Trp pokreće mehanizme koji su odgovorni za kaheksiju, demenciju i dijareju i moguće imunosupresiju kod pacijenata sa AIDS (Brown, et al., 1991, Adv. Exp. Med. Biol., 294: 425-35). U ovom zaključku, nedavno je pokazano da ihibicija IDO može povećati nivoe virus-specifičnih T ćelija i, istovremeno, smanjiti broj makrofaga inficiranih virusom u mišijem modelu HIV-a (Portula et al., 2005, Blood, 106: 2382-90).

[0005] Smatra se da IDO ima ulogu u imunosupresivnim procesima koji sprečavaju odbacivanje fetusa u materici. Pre više od 40 godina, primećeno je da, dok traje trudnoća, koncept genetski različitih sisara preživljava uprkos onom što bi se predvidelo imunologijom transplatacije tkiva (Medawar, 1953, Symp. Soc. Exp. Biol. 7: 320-38). Anatomsko odvajanje majke i ploda i antigena nezrelost ploda ne mogu u potpunosti objasniti preživljavanje fetalnog alografta. Nedavno pažnja je fokusirana na imunološku toleranciju majke. Zato što se IDO eksprimuje u ćelijama humanog sincitiotrofoblasta a koncentracija sistemskog triptofana pada tokom normalne trudnoće, pretpostavljeno je da je IDO ekspresija na međupovršini majke i fetusa neophodna da se spreči imunološko odbacivanje fetalnih alografta. Za testiranje ove hipoteze, trudne ženke miševa (koje nose singene ili alogene fetuse) su bile izložene 1MT, i brzo, primećeno je odbacivanje svih alogenih koncepta indukovanih T ćelijama. Prema tome, katabolizovanjem triptofana, koncept sisara čini se da suzbija aktivnost T-ćelija i brani se od odbacivanja, a blokiranjem katabolizma triptofana tokom mišije trudnoće omogućava majčinskim T ćelijama da izazovu odbacivanje fetalnog alografta (Munn, et al., 1998, Science, 281: 1191-3).

[0006] Dalji dokaz za imuno rezistentni mehanizam na tumore zasnovan na razgradnji triptofana od strane IDO dolazi od posmatranja da većina humanih tumora konstitutivno eksprimuje IDO, a ta ekspresija IDO imunogenim ćelijama tumora miša sprečava njihovo odbacivanje preimunizovanim miševima. Ovaj efekat je praćen nedostatkom akumulacije specifičnih T ćelija na mestu tumora i mogu se delimično vratiti sistemskim tretmanom miševa sa inhibitorom IDO, uodsustvu primetne toksičnosti. Prema tome, predloženo je da se efikasnost terapeutske vakcinacije pacijenata obolelih od kancera može poboljšati istovremenim davanjem inhibitora IDO (Uyttenhove et al., 2003, Nature Med., 9: 1269-74). Takođe je pokazano da se inhibitor IDO, 1-MT, može udružiti sa hemoterapeutskim sredstvima da smanji rast tumora kod miševa, sugerišući da inhibicija IDO može takođe poboljšati antitumorsku aktivnost konvencionalnih citotoksičnih terapija (Muller et al., 2005, Nature Med., 11: 312-9).

[0007] Jedan mehanizam koji doprinosi imunološkom nereagovanju prema tumorima može biti predstavljanje antigena tumora od strane tolerogenskog domaćina APCs. Takođe je opisan podskup humanih IDO-eksprimujućih ćelija koje predstavljaju antigen (APCs) koje koeksprimuju CD123 (IL3RA) i CCR6 i inhibirana proliferacija T-ćelija. I zrele i nezrele CD123-pozitivne dendritske ćelije suzbijale su aktivnost T-ćelija, a ova suzbijena aktivnost IDO je blokirana od strane 1MT (Munn, et al., 2002, Science, 297: 1867-70). Takođe je pokazano da limfni čvorovi koji dreniraju tumore miševa (TDLNs) sadrže podskup plazmocitoidnih dendritskih ćelija (pDCs) koje konstitutivno eksprimuju imunosupresivne nivoe IDO. Uprkos tome što sadrže samo 0,5% ćelija limfnog čvora, in vitro, ove pDCs snažno potiskuju odgovore T ćelija na prisutne antigene od strane samih pDCs a takođe, na dominantan način, potiskuju odgovore T ćelija prema antigenima drugih proizvođača (eng. third-party) predstavljene od nesupresivnih APCs. Unutar populacije pDCs, većina funkcionalnih potisnutih aktivnosti posredovanih od IDO je odvojena sa novim podsetom pDCs koji je koeksprimovao B-linearni marker CD19. Prema tome, pretpostavljeno je da IDO-posredovano potiskivanje od strane pDCs u TDLNs stvara lokalnu mikrosredinu koja snažno potiskuje odgovore antitumorskih T ćelija domaćina (Munn, et al., 2004, J. Clin. Invest., 114(2): 280-90).

[0008] IDO degradira indolnu grupu triptofana, serotonina i melatonina, i podstiče proizvodnju neuroaktivnih i imunoregulatornih metabolita, zajedno poznatih kao kinurenini. Lokalno trošeći triptofani povećavajući proapoptotske kinurenine, IDO eksprimovan od strane dendritnih ćelija (DCs) može u velikoj meri uticati na proliferaciju T ćelija i opstanak. IDO indukcija u DCs može biti uobičajeni mehanizam tolerancije na trošenje vođene pomoću regulatornih T ćelija. Pošto se može očekivati da će takvi tolerogeni odgovori delovati u različitim fiziopatološkim uslovima, metabolizam triptofana i proizvodnja kinurenina mogu predstavljati ključnu vezu između imunog i nervnog sistema (Grohmann, et al., 2003, Trends Immunol., 24: 242-8). U stanjima trajne imune aktivacije , dostupnost slobodnog seruma Trp je smanjena i, kao posledica smanjene proizvodnje serotonina, serotonergične funkcije takođe mogu biti izmenjene (Wirleitner, et al., 2003, Curr. Med. Chem., 10: 1581-91).

[0009] Zanimljivo, primećeno je da davanje interferona-a izaziva neuropsihijatrijske neželjene efekte, kao što su simptomi depresije i promene kognitivne funkcije. Direktan uticaj na serotonergičnu neurotransmisiju može da doprinese ovim sporednim efektima. Pored toga, pošto aktivacija IDO dovodi do smanjenog nivoa triptofana, prekursora serotonina (5-HT), IDO ido može da igra ulogu u ovim neuropsihijatrijskim sporednim efektima smanjenjem centralne 5-HT sinteze. Osim toga, metaboliti kinurenina kao što su 3-hidroksi-kinurenin (3-OH-KYN) i hinolinska kiselina (QUIN) imaju toksične efekte na funkciju mozga. 3-OH-KYN je u stanju da proizvede oksidativni stres povećanjem proizvodnje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS), a QUIN može da proizvede prekomernu stimulaciju hipokampalnih receptora N-metil-D-aspartata (NMDA), što vodi do apoptoze i hipokampalne atrofije. I prekomerna proizvodnja ROS i hipokampalna atrofija izazvana prekomernom stimulacijom NMDA povezane su sa depresijom (Wichers and Maes, 2004, J. Psychiatry Neurosci., 29: 11-17). Prema tome, aktivnost IDO može igrati ulogu u depresiji.

[0010] Inhibitori malih molekula IDO se razvijaju za lečenje ili sprečavanje bolesti povezanih sa IDO, kao što su one prethodno opisane. Na primer, oksadiazol i drugi heterociklični inhibitori IDO su prikazani u US 2006/0258719 i US 2007/0185165. PCT objava WO 99/29310 prikazuje postupke za promenu imuniteta posredovanog T ćelijama, koji sadrže promenu lokalnih vanćelijskih koncentracija triptofana i metabolita triptofana, upotrebom inhibitora IDO kao što su 1-metil-DL-triptofan, p-(3-benzofuranil)-DL-alanin, p-[3-benzo(b)tienil] -DL-alanin, i 6-nitro-L-triptofan) (Munn, 1999). Prijavljeno u WO 03/087347, takođe objavljeno kao Evropski patent 1501918, su postupci izrade antigenpredstavljanje ćelija za povećanje ili smanjenje tolerancije T ćelija (Munn, 2003). Jedinjenja koja sadrže inhibitornu aktivnost indolamin-2,3-dioksigenaza (IDO) dalje su prikazana u WO 2004/094409; i US objavljena patentna prijava br.2004/0234623 je usmerena na postupke lečenja subjekta sa kancerom ili infekcijom davanjem inhibitora indolamin-2,3-dioksigenaze u kombinaciji sa drugim terapeutskim modalitetima.

[0011] U svetlu eksperimentalnih podataka koji ukazuju na ulogu IDO u imunosupresiji, otpornosti na tumor i/ili odbacivanje, hronične infekcije, HIV-infekciju, AIDS (uključujući njegove manifestacije kao što su kaheksija, demencija i dijareja), autoimune bolesti ili poremećaji (kao što je reumatoidni artritis), i imunološkoj toleranciji i prevenciji odbacivanja fetusa u materici, poželjna su terapeutska sredstva usmerena na suzbijanje razgradnje triptofana inhibiranjem aktivnosti IDO. Inhibitori IDO mogu se koristiti za aktiviranje T ćelija i time povećavaju aktivaciju T ćelija kada su T ćelije suzbijene trudnoćom, malignitetom ili virusom kao što je HIV. Inhibicija IDO može takođe biti važna strategija u lečenju za pacijente sa neurološkim ili neuropsihijatrijskim bolestima ili poremećajima kao što je depresija.

[0012] WO 2010/005958 opisuje derivate 1,2,5-oksadiazola koji su inhibitori IDO i postupke i intermedijere za dobijanje takvih derivata 1,2,5-oksadiazola.

[0013] Zbog korisnosti inhibitora IDO, postoji potreba za razvojem novih postupaka za dobijanje inhibitora IDO. Ova prijava je usmerena na ovu potrebu i druge.

SUŠTINA PRONALASKA

[0014] Jedinjenje 4-({2-[(aminosulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamid koje ima formulu I:

je inhibitor enzima indolamin 2,3-dioksigenaze (takođe poznat kao IDO). Jedinjenje formule I, isto kao i njegovo pripremanje i upotreba, je opisano u US patentu br.8,088,803. Intermedijeri i postupci koji su ovde obezbeđeni pomažu da se zadovolji stalna potreba za razvojem inhibitora IDO za lečenje ozbiljnih bolesti.

[0015] Ova prijava obezbeđuje, između ostalog, intermedijere i postupke dobijanja jedinjenja formule I:

[0016] Prema tome, ova prijava obezbeđuje postupak koji uključuje reakciju jedinjenja formule F5:

sa aldehidom formule F6:

da se dobije jedinjenje formule F7:

pri čemu je Pg<1>definisan u nastavku.

[0017] Ova prijava dalje obezbeđuje postupak koji uključuje reakciju jedinjenja formule F15:

sa jedinjenjem formule F5 da se dobije jedinjenje formule F16:

pri čemu su R<1>i R<3>definisani u nastavku.

[0018] Ova prijava dalje obezbeđuje postupak koji uključuje reakciju jedinjenja formule F17:

sa jedinjenjem formule F5 da se dobije jedinjenje formule F18:

pri čemu je R<4>definisan u nastavku.

DETALJAN OPIS

[0019] Iako su određeni koraci postupaka prikazani u šemama koje se nalaze u nastavku, predviđeno je da pojedinačni koraci postupka mogu biti zahtevani pojedinačno ili u bilo kojoj kombinaciji (npr., u šemi I, koraci E, F, G, H, i I mogu se zahtevati pojedinačno ili u kombinaciji). Nije predviđeno da se postupci ograniče na postupak u celosti koji ima svaki korak u šemama u nastavku.

[0020] Prema tome, opšta šema za pripremanje jedinjenja formule I je opisana u šemi 1.

Šema 1

[0021] Prema tome, ova prijava obezbeđuje postupak koji uključuje reakciju jedinjenja formule F5:

sa aldehidom formule F6:

pri čemu je Pg<1>amino zaštitna grupa, da se dobije jedinjenje formule F7:

[0022] Amino zaštitne grupe Pg<1>mogu da se koriste za sprečavanje neželjenih reakcija amino grupe tokom izvođenja željene transformacije. Amino zaštitne grupe dopuštaju lako kovalentno vezivanje za atom azota kao i selektivno otcepljivanje od atoma azota. Pogodne "amino zaštitne grupe", kao što su alkoksikarbonil (kao što su etoksikarbonil, terc-butoksikarbonil (Boc), benziloksikarbonil (Cbz), 9-fluorenilmetiloksikarbonil (Fmoc), i slično), acil (kao što su acetil (Ac), benzoil (Bz), i slično), sulfonil (kao što su metansulfonil, trifluorometansulfonil, i slično), arilalkil (kao što su benzil, 4-metoksibenzil, difenilmetil, trifenilmetil (tritil), i slično), alkenilalkil (kao što su alil, prenil, i slično), diarilmetilenil (kao što su (C6H5)2C=N, i slično), i silil (kao što su terc-butildimetilsilil, triizopropilsilil, i slično), su poznate stručnjaku iz ove oblasti. Hemija amino zaštitne grupe može da se nađe u Wuts and Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., pp 696-926, John Wiley & Sons: New York, 2006.

[0023] U nekim izvođenjima, Pg<1>je etoksikarbonil, terc-butoksikarbonil, benziloksikarbonil, ili 9-fluorenilmetiloksikarbonil.

[0024] U nekim izvođenjima, Pg<1>je C1-6alkoksikarbonil.

[0025] U nekim izvođenjima, Pg<1>je terc-butoksikarbonil.

[0026] Odgovarajući rastvarači za korak E uključuju, ali nisu ograničeni na, metanol ili tetrahidrofuran (THF), acetonitril i slično. Halogenizovani ugljovodonični rastvarači (tj., halogenizovani alkani, kao što su dihlormetan, hloroform, dihloretan ili tetrahloretan) takođe mogu da se koriste.

[0027] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži tetrahidrofuran. Kao što se ovde koristi, komponenta rastvarača može da se odnosi na jedan rastvarač ili smešu rastvarača. U nekim izvođenjima, komponenta rastvarača je organski rastvarač. U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži halogenizovani ugljovodonični rastvarač. U nekim izvođenjima, pomenuti halogenizovani ugljovodonični rastvarač je dihlormetan.

[0028] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži acetonitril.

[0029] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži dihlormetan i acetonitril.

[0030] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u prisustvu redukcionog sredstva.

[0031] Redukciono sredstvo može da bude bilo koje jedinjenje koje je sposobno za redukciju organskog jedinjenja do nižeg oksidacionog stanja. Redukcija obično uključuje dodavanje atoma vodonika ili uklanjanje atoma kiseonika iz grupe. Na primer, aldehidi kao što je F6 mogu se redukovati u prisustvu amina formule F5 (korak E, šema 1) dodavanjem vodonika, bilo u obliku gasovitog vodonika (H2) ili upotrebom hidridnog reagensa (kao što su NaB(OAc)3H, NaBH4, LiAlH4, i slično); upotrebom trifenilfosfina; ili upotrebom kombinacije natrijum jodida, hlortrimetilsilana, i metanola. U nekim izvođenjima, ovaj korak se može izvesti u kiselim uslovima u prisustvu kiseline (kao što je trifluorosirćetna kiselina). U nekim izvođenjima, ovaj korak se može izvesti na temperaturi od oko -15 °C do oko 30 °C, npr., od oko -15 °C do oko 0 °C, od oko -5 °C do oko 5 °C, od oko -5 °C do oko 0 °C, ili od oko 0 °C do oko 45 °C.

[0032] U nekim izvođenjima, pomenuto redukukciono sredstvo je borhidridno redukciono sredstvo (npr., NaB(OAc)3H, NaBH4, ili drugo hidridno redukciono sredstvo koje sadrži bor).

[0033] U nekim izvođenjima, pomenuto borhidridno redukciono sredstvo je natrijum triacetoksiborhidrid.

[0034] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u prisustvu trifluorosirćetne kiseline.

[0035] U nekim izvođenjima, postupak dalje uključuje uklanjanje zaštite pomenutog jedinjenja formule F7 da bi se dobilo jedinjenje formule F8:

[0036] Sredstva za uklanjanje zaštite amino grupe koja sukorisna za ovaj korak F su poznata stručnjacima iz ove oblasti, kao što su ona kod Wuts i Greene (gore). Posebno, amino zaštitne grupe prethodno opisane mogu se pogodno ukloniti upotrebom mnogih dostupnih sredstva za uklanjanje zaštite amino grupe koji su specifični za gore pomenute različite grupe bez uticaja drugih željenih delova jedinjenja. Terc-butoksikarbonilna grupa može biti uklonjena (npr., hidrolizovana) od atoma azota, na primer, tretiranjem sa kiselinom (kao što je hlorovodonična kiselina, trifluorosirćetna kiselina, toluensulfonska kiselina, i slično); kombinacijom reagenasa (npr., smešom acetil hlorida i metanola) za koje se zna da stvaraju kiselinu; ili Luisovom kiselinom (npr., BF3·Et2O). Benziloksikarbonil grupa može biti uklonjena (npr., hidrogenolizovana) od atoma azota, na primer, tretiranjem vodonikom i katalizatorom (kao što je paladijum na ugljeniku).

[0037] U nekim izvođenjima, sredstvo za uklanjanje zaštite amino grupe je trifluorosirćetna kiselina. U nekim izvođenjima, sredstvo za uklanjanje zaštite amino grupe sadrži trifluorosirćetnu kiselinu i >0,5% zapreminskih vode, npr., >1,0% zapreminskih vode, >1,5% zapreminskih vode, >2,0% zapreminskih vode, od oko 2% do oko 10% zapreminskih vode, od oko 10% do oko 20% zapreminskih vode, ili od oko 20% do oko 50% zapreminskih vode. U nekim izvođenjima, sredstvo za uklanjanje zaštite amino grupe može da bude smeša trifluorosirćetne kiseline i vode u zapreminskom odnosu od oko 98:2. U nekim izvođenjima, sredstvo za uklanjanje zaštite amino grupe može da bude hlorovodonična kiselina, opciono u rastvaraču (npr., voda, THF, dioksan, etil acetat, itd.). U nekim izvođenjima, rastvarač je etil acetat. U nekim izvođenjima, sredstvo za uklanjanje zaštite amino grupe može da bude hlorovodonična kiselina opciono u rastvaraču kao što je alkohol (kao što su izopropanol, metanol ili etanol). Halogenizovani ugljovodonični rastvarači (npr., dihlormetan, hloroform, dihloretan ili tetrahloretan) takođe mogu da se koriste. U nekim izvođenjima, molarni odnos hlorovodonične kiseline i jedinjenja formule F7 je oko 6,0, oko 5,0, oko 4,0, oko 3,0 oko 2,0, oko 1,0, ili oko 1,1. U nekim izvođenjima, korak F može da se izvodi na temperaturi od oko -10 °C do oko 60 °C, npr., od oko -10 °C do oko 0 °C, od oko 0 °C do oko 25 °C, od oko 25 °C do oko 45 °C, ili od oko 45 °C do oko 60 °C.

[0038] U nekim izvođenjima, pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reakciju jedinjenja formule F7 sa hlorovodoničnom kiselinom.

[0039] U nekim izvođenjima, pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reakciju jedinjenja formule F7 sa hlorovodoničnom kiselinom u komponenti rastvarača koja sadrži izopropanol.

[0040] U nekim izvođenjima, pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reakciju jedinjenja formule F7 sa hlorovodoničnom kiselinom u komponenti rastvarača koja sadrži halogenizovani ugljovodonični rastvarač.

[0041] U nekim izvođenjima, pomenuti halogenizovani ugljovodonični rastvarač je dihlormetan.

[0042] U nekim izvođenjima, pronalazak dalje uključuje reakciju pomenutog jedinjenja formule F8, sa Pg<2>-NH-SO2-X, u prisustvu organske baze da se dobije jedinjenje formule F9:

pri čemu:

Pg<2>je amino zaštitna grupa;

i X je halo.

[0043] U nekim izvođenjima, Pg<2>-NH-SO2Cl može da se pripremi i odmah koristi u reakciji sa jedinjenjem formule F8. Zaštitna grupa Pg<2>može da se izabere iz bilo koje od zaštitnih grupa poznatih u struci koje se koriste za zaštitu amina ili sulfonamida (kao što su one prethodno opisane za Pg<1>). U nekim izvođenjima, Pg<2>može da bude alkoksikarbonilna grupa (kao što je terc-butoksikarbonil).

[0044] Odgovarajući rastvarači uključuju, ali nisu ograničeni na, halogenizovane ugljovodonične rastvarače kao što je dihlormetan i slično. Organska baza može da bude bilo koja baza koja služi za neutralizaciju HCl koja nastaje tokom reakcije jedinjenja formule F8 i zaštićenog amino-sulfonil hlorida. Organska baza može da uključi aciklične tercijarne amine kao što je tri(C1-6)alkilamin (npr., trietilamin, diizopropiletilamin (DIPEA) i slično), ciklične tercijarne amine (npr., N-metil piperidin, 1,4-diazabiciklo[2.2.2]oktan (DABCO) i slično). U nekim izvođenjima, organska baza može da bude trietilamin. U nekim izvođenjima, ovaj korak se može izvesti na temperaturi od oko -15 °C do oko 60 °C, npr., od oko -15 °C do oko 0 °C, od oko 0 °C do oko 25 °C, od oko 25 °C do oko 45 °C, ili od oko 45 °C do oko 60 °C.

[0045] U takvim izvođenjima, Pg<2>-NH-SO2Cl može da se dobije reakcijom alkohola (kao što su, etanol, terc-butil alkohol i slično) sa hlorsulfonil izocijanatom (ClS(O)2NCO).

1

[0046] U nekim izvođenjima, Pg<2>je etoksikarbonil, terc-butoksikarbonil, benziloksikarbonil, ili 9-fluorenilmetil-oksikarbonil.

[0047] U nekim izvođenjima, Pg<2>je C1-6alkoksikarbonil.

[0048] U nekim izvođenjima, Pg<2>je terc-butoksikarbonil.

[0049] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži halogenizovani ugljovodonični rastvarač.

[0050] U nekim izvođenjima, pomenuti halogenizovani ugljovodonični rastvarač je dihlormetan.

[0051] U nekim izvođenjima, pomenuta organska baza uključuje tri(C1-6)alkilamin.

[0052] U nekim izvođenjima, pomenuta organska baza je trietilamin.

[0053] U nekim izvođenjima, X je hlor.

[0054] U nekim izvođenjima, pronalazak dalje uključuje uklanjanje zaštite pomenutog jedinjenja formule F9 da se dobije jedinjenje formule F10:

[0055] U nekim izvođenjima, pogodna sredstva za uklanjanje zaštitnih grupa mogu obuhvatiti ona koja su prethodno opisana za uklanjanje zaštitnih grupa jedinjenja formule F7.

[0056] U nekim izvođenjima, pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reakciju jedinjenja formule F9 sa hlorovodoničnom kiselinom. U nekim izvođenjima, pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reakciju jedinjenja formule F9 sa hlorovodoničnom kiselinom u komponenti rastvarača koja sadrži alkohol. U nekim izvođenjima, pomenuti alkohol je etanol. U nekim izvođenjima, pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reakciju jedinjenja formule F9 sa hlorovodoničnom kiselinom u komponenti rastvarača koja sadrži etil acetat.

[0057] U nekim izvođenjima, pronalazak dalje uključuje reakciju pomenutog jedinjenja formule F10 sa bazom da se dobije jedinjenje formule I:

[0058] Baza može da se koristi za pretvaranje (npr., hidrolizom) oksadiazolonskog prstena u F10 da otkrije amidoksim u jedinjenju formule I, opciono u rastvaraču (korak I, šema 1). Zaštita amidoksima kao oksadiazolona može biti korisna za sprečavanje neželjenih reakcija hidroksilne grupe ili amidoksima u celini. Baza može biti ili neorganska baza kao što su hidroksidi alkalnih metala (npr., NaOH, LiOH, KOH, Mg(OH)2, itd.); ili organska baza kao što su aciklični amini (npr., trietilamin, diizopropiletilamin (DIPEA), itd.) ili ciklični amini (npr., pirolidin, piperidin, itd). Baza može da bude dostupna u obliku smole (kao što je Amberlite® i slično). U nekim daljim izvođenjima, baza može da se obezbedi u obliku rastvora u vodi (npr., oko 0,5 N rastvor, oko 1 N rastvor, oko 1,5 N rastvor, oko 2,5 N rastvor, od oko 3 N do oko 5 N rastvor, od oko 5 N do oko 10 N rastvor). U nekim izvođenjima, baza je hidroksid alkalnog metala (kao što je, natrijum hidroksid). U nekim izvođenjima, baza može da bude 2 N NaOH rastvor u vodi. U nekim izvođenjima, rastvarač može da bude etanol ili tetrahidrofuran (THF). U nekim izvođenjima, rastvarač može da bude smeša etanola i vode. U nekim izvođenjima, reakcija jedinjenja formule F10 sa bazom da se dobije jedinjenje formule I može da se izvodi na temperaturi od oko -10 °C do oko 60 °C, npr., od oko -10 °C do oko 20 °C, od oko 0 °C do oko 30 °C, od oko 0 °C do oko 10 °C, ili od oko 0 °C do oko 5 °C.

[0059] U nekim izvođenjima, pomenuta baza uključuje hidroksid alkalnog metala.

[0060] U nekim izvođenjima, pomenut hidroksid alkalnog metala je natrijum hidroksid.

[0061] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži tetrahidrofuran, vodu i etanol.

[0062] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F5, može da se dobije u nizu koraka koji su prikazani u šemi 2. Pripremanje intermedijera, 4-amino-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamida F2, je opisano u J. Heterocycl. Chem. (1965), 2, 253, a njegovo pretvaranje u hlor oksim F3 je opisano u Synth. Commun. (1988), 18, 1427,. U nekim izvođenjima, hlor oksim formule F3 može da se spoji sa 3-bromo-4-fluoroanilinom, opciono u rastvaraču (kao što je voda), posle čega sledi dodavanje natrijum bikarbonata, da se dobije amidoksim formule F4. Funkcionalnost amidooksima jedinjenja F4 može se zatim pretvoriti u oksadiazolon ili formulu F5 korišćenjem N,N-karbonildiimidazola (DCI) u rastvaraču (kao što su etil acetat, dioksan, THF i slično), na povišenim temperaturama kao što su oko 50 °C, oko 60 °C, oko 70 °C, oko 80 °C, oko 90 °C, ili oko 100 °C.

Šema 2

[0063] Alternativno, jedinjenje formule F10 može da se dobije kroz niz koraka prikazanih u šemi 3.

Šema 3

[0064] U nekim izvođenjima, ova prijava obezbeđuje postupak, koji obuhvata reakciju jedinjenja formule F15:

sa jedinjenjem formule F5:

da se dobije jedinjenje formule F16:

pri čemu:

1

svaki R<1>je nezavisno amino zaštitna grupa; i

R<3>je C1-6alkil ili benzil.

[0065] U nekim izvođenjima, R<1>je C2-4alkenil-C1-3alkil ili fenil-C1-3alkil, pri čemu je pomenuti fenil-C1-3alkil opciono supstituisan sa 1, 2, ili 3 nezavisno odabranih C1-4alkoksi grupa.

[0066] U nekim izvođenjima, R<1>je C2-4alkenil-C1-3alkil ili fenil-C1-3alkil, pri čemu je pomenuti fenil-C1-3alkil opciono supstituisan sa 1, 2, ili 3 metoksi groupama.

[0067] U nekim izvođenjima, R<1>je alil.

[0068] U nekim izvođenjima, R<1>je 4-metoksibenzil.

[0069] U nekim izvođenjima, R<3>je C1-6alkil.

[0070] U nekim izvođenjima, R<3>je terc-butil.

[0071] U nekim izvođenjima, R<3>je C1-4alkil.

[0072] U nekim izvođenjima, R<3>je butil.

[0073] Poželjno, reakcija se izvodi u prisustvu redukcionog sredstva. Redukciono sredstvo može da bude bilo koje jedinjenje koje je sposobno za redukciju organskog jedinjenja do nižeg oksidacionog stanja. U nekim izvođenjima, redukciono sredstvo može da bude vodonični gas u prisustvu katalizatora ili hidridnog reagensa (kao što su NaB(OAc)3H, NaBH4, LiAlH4i slično); korišćenjem trifenilfosfina; ili korišćenjem kombinacije natrijum jodida, hlortrimetilsilana, i metanola. U nekim izvođenjima, ovaj korak se može izvesti u prisustvu kiseline kao što je trifluorosirćetna kiselina. Pogodni rastvarači za ovaj korak uključuju izopropil alkohol, THF, dioksan, ili slično. U nekim izvođenjima, ovaj korak se može izvesti na temperaturi od oko -15 °C do oko 30 °C, npr., od oko -15 °C do oko 0 °C, od oko -5 °C do oko 5 °C, od oko -5 °C do oko 0 °C, od oko 0 to 5 °C, ili od oko 0 °C do oko 45 °C.

[0074] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži tetrahidrofuran.

[0075] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u prisustvu redukcionog sredstva.

[0076] U nekim izvođenjima, pomenuto redukciono sredstvo je borhidridno redukciono sredstvo.

[0077] U nekim izvođenjima, pomenuto borhidridno redukciono sredstvo je natrijum triacetoksiborhidrid.

[0078] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u prisustvu trifluorosirćetne kiseline.

[0079] U nekim izvođenjima, pronalazak dalje uključuje uklanjanje zaštite pomenutog jedinjenja formule F16 da se dobije jedinjenje formule F10:

[0080] Tretiranje jedinjenja F16 da bi se zamenio R<1>N sa NH2može da se postigne postupcima za uklanjanje zaštite posebno amino zaštitne grupe koji su poznati stručnjacima iz ove oblasti tehnike, kao što su oni u Wuts and Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., pp 696-926, John Wiley & Sons: New York, 2006. U nekim izvođenjima, kada je R<1>alil, sredstvo za uklanjanje zaštite može da bude katalizator paladijum (npr., Pd(Ph3P)4, Pd/C, ili Pd(dba)DPPB). U nekim izvođenjima, kada je R<1>4-metoksibenzil, sredstvo za uklanjanje zaštite može da uključi organsku kiselinu (kao što je trifluorosirćetna kiselina ili metansulfonska kiselina, i slično); neorgansku kiselinu (kao što je hlorovodonična kiselina); vodonik i paladijum; ili natrijum u tečnom amonijaku. Uklanjanje zaštite može da se izvodi na temperaturi od oko 30 °C do oko 90 °C, npr., od oko 50 °C do oko 100 °C, ili od oko 60 °C do oko 80 °C.

[0081] U nekim izvođenjima, pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reakciju jedinjenja formule F16 sa trifluorosirćetnom kiselinom.

[0082] U nekim izvođenjima, pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reakciju jedinjenja formule F16 sa hlorovodoničnom kiselinom.

[0083] Jedinjenje F15 se može dobiti postupkom u tri koraka (koraci J, K i L) iz hlorsulfonilizocijanata, kao što je prikazano u šemi 4.

Šema 4

[0084] Prema tome, ova prijava dalje obezbeđuje postupak pri čemu se pomenuto jedinjenje formule F15 dobija postupkom koji obuhvata tretiranje jedinjenja formule F14:

1

Sa redukcionim sredstvom da se dobije pomenuto jedinjenje formule F15; pri čemu R<2>je C1-4alkil; i R<3>je definisan gore.

[0085] U nekim izvođenjima, R<2>je metil.

[0086] U nekim izvođenjima, R<2>je etil.

[0087] U nekim izvođenjima, redukcija može da se izvede sa diizobutilaluminijum hidridom (DIBAL-H). Pogodni rastvarači uključuju halogenizovane ugljovodonične rastvarače kao što su dihlormetan, hloroform, dihloretan, tetrahloretan, i slično. U nekim izvođenjima, redukcija može da se izvodi na oko sobne temperature npr., od oko -80 °C do oko 30 °C, od oko -78 °C do oko 0 °C, od oko 0 °C do oko 30 °C, ili od oko 25 °C do oko 30 °C.

[0088] U nekim izvođenjima, pomenuto tretiranje se izvodi u halogenizovanom ugljovodoničnom rastvaraču.

[0089] U nekim izvođenjima, pomenuti halogenizovani ugljovodonični rastvarač je dihlormetan.

[0090] U nekim izvođenjima, pomenuto redukciono sredstvo je diizobutilaluminijum hidrid.

[0091] U nekim izvođenjima, pomenuto jedinjenje formule F14 se dobija postupkom koji obuhvata zaštitu jedinjenja formule F13:

Sa jednim ili više nezavisno odabranih sredstava za zaštitu amino grupe da se dobije jedinjenje formule F14.

[0092] Zaštitna grupa R<1>na F14 može da bude izabrana od različitih amino zaštitnih grupa poznatih u struci (gore). U nekim izvođenjima, sredstvo za zaštitu amino grupe je alil bromid ili 4-metoksibenzil hlorid.

[0093] U nekim izvođenjima, pomenuto jedno ili više sredstava za zaštitu amino grupe je izabrano od alil bromida i 4-metoksibenzil hlorida.

[0094] U nekim izvođenjima, pomenuta zaštita se izvodi u prisustvu baze.

[0095] U nekim izvođenjima, poenuta baza je kalijum karbonat.

[0096] U nekim izvođenjima, pomenuta zaštita se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži acetonitril.

1

[0097] U nekim izvođenjima, pripremanje jedinjenja F13 može da se dobije tretiranjem hlorsulfonilizocijanata sa alkoholom R<3>OH (gde je R<3>definisan iznad) i glicinskog estra H2NCH2CO2R<2>, pri čemu je R<2>C1-4alkil. U nekim izvođenjima, ovaj korak J se izvodi u prisustvu organske kiseline (kao što su sirćetna kiselina, benzojeva kiselina, trifluorosirćetna kiselina). Pogodni rastvarači za ovaj korak uključuju dihlormetan, hloroform, dihloretan, tetrahloretan, i slično.

[0098] U nekim izvođenjima, ova prijava obezbeđuje jedinjenje formule F13:

pri čemu:

R<2>je C1-4alkil; i

R<3>je C1-6alkil ili benzil.

[0099] U nekim izvođenjima, R<2>je metil.

[0100] U nekim izvođenjima, R<2>je etil.

[0101] U nekim izvođenjima, R<3>je C1-6alkil.

[0102] U nekim izvođenjima, R<3>je terc-butil.

[0103] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F13 je etil-2-((N-(terc-butoksikarbonil)sulfamoil)-amino)acetat:

[0104] U nekim izvođenjima, pronalazak dalje obezbeđuje jedinjenje formule F14:

pri čemu:

svaki R<1>je nezavisno amino zaštitna grupa;

R<2>je C1-4alkil; i

R<3>je C1-6alkil ili benzil.

[0105] U nekim izvođenjima, R<1>je C2-4alkenil-C1-3alkil ili fenil-C1-3alkil, pri čemu je pomenuti fenil-C1-3alkil opciono supstituisan sa 1, 2, ili 3 nezavisno izabranih C1-4alkoksi grupa.

[0106] U nekim izvođenjima, R<1>je alil.

1

[0107] U nekim izvođenjima, R<1>je 4-metoksibenzil.

[0108] U nekim izvođenjima, R<2>je metil.

[0109] U nekim izvođenjima, R<2>je etil.

[0110] U nekim izvođenjima, R<3>je C1-6alkil.

[0111] U nekim izvođenjima, R<3>je terc-butil.

[0112] U nekim izvođenjima, R<3>je C1-4alkil.

[0113] U nekim izvođenjima, R<3>je butil.

[0114] U nekim izvođenjima, R<3>je C1-4alkil.

[0115] U nekim izvođenjima, R<3>je butil.

[0116] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F14 je etil-2-(alil(N-alil-N-(terc-butoksikarbonil)-sulfamoil)amino) acetat:

[0117] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F14 je etil-2-(4-metoksibenzil(N-4-metoksibenzil-N-(terc-butoksikarbonil) sulfamoil)amino)acetat:

[0118] U nekim izvođenjima, ova prijava obezbeđuje jedinjenje formule F15:

pri čemu:

R<3>je C1-6alkil ili benzil; i

svaki R<1>je nezavisno amino zaštitna grupa.

1

[0119] U nekim izvođenjima, R<1>je C2-4alkenil-C1-3alkil ili fenil-C1-3alkil, pri čemu je pomenuti fenil-C1-3alkil opciono supstituisan sa 1, 2, ili 3 nezavisno izabrane C1-4alkoksi grupe.

[0120] U nekim izvođenjima, R<1>je alil.

[0121] U nekim izvođenjima, R<1>je 4-metoksibenzil.

[0122] U nekim izvođenjima, R<3>je C1-6alkil.

[0123] U nekim izvođenjima, R<3>je terc-butil.

[0124] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F15 je terc-butil alil {[alil(2-oksoetil)amino]-sulfonil}karbamat:

[0125] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F15 je terc-butil(4-metoksibenzil){[(4-metoksibenzil)-(2-oksoetil)amino]sulfonil}karbamat:

[0126] U nekim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule F16:

pri čemu R<3>je C1-6alkil ili benzil i svaki R<1>je nezavisno amino zaštitna grupa.

[0127] U nekim izvođenjima, R<1>je C2-4alkenil-C1-3alkil ili fenil-C1-3alkil, pri čemu je pomenuti fenil-C1-3alkil opciono supstituisan sa 1, 2, ili 3 nezavisno odabrane C1-4alkoksi grupe.

[0128] U nekim izvođenjima, R<1>je alil.

[0129] U nekim izvođenjima, R<1>je 4-metoksibenzil.

[0130] U nekim izvođenjima, R<3>je C1-6alkil.

1

[0131] U nekim izvođenjima, R<3>je terc-butil.

[0132] U nekim izvođenjima, R<3>je C1-4alkil.

[0133] U nekim izvođenjima, R<3>je butil.

[0134] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F16 je terc-butil alil(N-alil-N-(2-(4-(4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)-1,2,5-oksadiazol-3-ilamino)etil)sulfamoil)-karbamat:

[0135] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F16 je terc-butil (4-metoksibenzil)-(N-(4-metoksibenzil)-N-(2-(4-(4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)-1,2,5-oksadiazol-3-ilamino)etil)sulfamoil)karbamat:

[0136] Šema 5 prikazuje alternativni put za pripremanje jedinjenja formule F10.

Šema 5

sredstvo za uklanjanje

amino zaštitne grupe

[0137] Ova prijava takođe obezbeđuje postupak koji uključuje reakciju jedinjenja formule F17:

2

pri čemu R<4>je C1-6alkil, C1-6haloalkil, benzil, ili 9H-fluoren-9-ilmetil sa jedinjenjem formule F5:

da se dobije jedinjenje formule F18:

[0138] U nekim izvođenjima, R<4>je terc-butil.

[0139] U nekim izvođenjima, R<4>je benzil.

[0140] U nekim izvođenjima, R<4>je etil.

[0141] U nekim izvođenjima, R<4>je C1-3haloalkil.

[0142] U nekim izvođenjima, R<4>je 2,2,2-trihloretil.

[0143] U nekim izvođenjima, R<4>je 9H-fluoren-9-ilmetil.

[0144] U ovom koraku Q, jedinjenja F18 mogu da se pripreme, u nekim izvođenjima, reagovanjem F17 sa aminom jedinjenja formule F5 u prisustvu redukcionog sredstva.

[0145] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u prisustvu redukcionog sredstva.

[0146] Redukciono sredstvo može da bude bilo koje jedinjenje sposobno da redukuje organsko jedinjenje do nižeg oksidacionog stanja, na primer upotrebom organosilana kao što je tri(C1-3alkil)silan (npr., trietilsilan); elementarni vodonik ili upotrebom hidridnog reagensa (kao što su NaB(OAc)3H, NaBH4, LiAlH4i slično); upotrebom trifenilfosfina; ili upotrebom kombinacije natrijum jodida, hlortrimetilsilana, i metanola. U nekim izvođenjima, ovaj korak se može izvesti u prisustvu kiseline kao što je trifluorosirćetna kiselina. Pogodni rastvarači uključuju, ali nisu ograničeni na halogenizovane ugljovodonične rastvarače (npr., dihlormetan, hloroform, dihloretan ili tetrahloretan). U nekim izvođenjima, halogenizovani ugljovodonični rastvarač je 1,2-dihloretan.

[0147] U nekim izvođenjima, pomenuto redukciono sredstvo je organosilan.

[0148] U nekim izvođenjima, pomenuto redukciono sredstvo je tri(C1-3alkil)silan.

[0149] U nekim izvođenjima, pomenuto redukciono sredstvo je trietilsilan.

[0150] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u prisustvu organske kiseline.

[0151] U nekim izvođenjima, pomenuta organska kiselina je trifluorosirćetna kiselina.

[0152] U nekim izvođenjima, pomenuta organska kiselina je metansulfonska kiselina.

[0153] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u komponenti rastvarača koji sadrži halogenizovani ugljovodonični rastvarač.

[0154] U nekim izvođenjima, pomenuti halogenizovani ugljovodonični rastvarač je dihlormetan.

[0155] U nekim izvođenjima, pomenuti halogenizovani ugljovodonični rastvarač je 1,2-dihloretan.

[0156] U nekim izvođenjima, postupak dalje uključuje uklanjanje zaštite pomenutog jedinjenja formule F18 da se dobije jedinjenje formule F10:

[0157] U nekim izvođenjima, postupci za uklanjanje zaštite specifičnih amino zaštitnih grupa (kao što su karbamati) su poznati stručnjacima iz ove oblasti, kao što su oni u Wuts and Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., pp 696-926, John Wiley & Sons: New York, 2006. Na primer, terc-butoksikarbonilna grupa (npr., kada je R<4>terc-butil) može da se ukloni (npr., hidrolizuje) od atoma azota, na primer, tretiranjem sa kiselinom (kao što je hlorovodonična kiselina, trifluorosirćetna kiselina, toluensulfonska kiselina, i slično); kombinacijom reagenasa (npr., smešom acetil hlorida i metanola) za koje se zna da stvaraju kiselinu; ili Luisovom kiselinom (npr., BF3·Et2O). Benziloksikarbonilna grupa (npr., kada je R<4>benzil) može da se ukloni (npr., hidrogenolizuje) od atoma azota, na primer, tretiranjem sa vodonikom i katalizatorom (kao što je paladijum na ugljeniku). Metoksikarbonilna i etoksikarbonilna groupa (tj., kada je R<4>metil ili etil) može da se ukloni tretiranjem sa neorganskom bazom (kao što su KOH ili K2CO3); kombinacijom reagenasa (npr., smeša acetil hlorida, natrijum jodida i acetonitrila); ili tretiranjem sa kiselinom (npr., HBr, AcOH). 2,2,2-trihloretoksikarbonilna grupa može biti uklonjena, na primer tretiranjem sa katalizatorom (npr., Zn/AcOH ili Cd/AcOH). Pogodni rastvarači za ovaj korak uključuju, ali nisu ograničeni na, metanol ili tetrahidrofuran (THF), acetonitril i slično. U nekim izvođenjima, tretiranje se izvodi na temperaturi od oko 30 °C do oko 90 °C, npr., od oko 50 °C do oko 100 °C, ili od oko 60 °C do oko 80 °C.

[0158] U nekim izvođenjima, pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reakciju jedinjenja formule F18 sa cinkom u prisustvu sirćetne kiseline.

[0159] U nekim izvođenjima, pomenuto uklanjanje zaštite se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži tetrahidrofuran.

[0160] U nekim izvođenjima, postupak dalje uključuje reakciju pomenutog jedinjenja formule F10 sa bazom da se dobije jedinjenje formule I:

[0161] U nekim izvođenjima, pomenuta baza sadrži hidroksid alkalnog metala.

[0162] U nekim izvođenjima, pomenuti hidroksid alkalnog metala je natrijum hidroksid.

[0163] U nekim izvođenjima, pomenuta reakcija se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži tetrahidrofuran, vodu i etanol.

[0164] U nekim izvođenjima, postupak dalje uključuje pretvaranje pomenutog jedinjenja formule F18 u jedinjenje formule I:

pri čemu pomenuto pretvaranje uključuje spajanje jedinjenja formule F18 sa bazom da bi se formirala prva smeša. U nekim izvođenjima, baza je N,N-bis(2-aminoetil)etan-1,2-diamin.

[0165] U nekim izvođenjima, pretvaranje dalje uključuje dodavanje kiseline u prvu smešu. U nekim izvođenjima, pomenuta kiselina je vodena jaka kiselina. U nekim izvođenjima, pomenuta vodena jaka kiselina je vodena hlorovodonična kiselina.

[0166] U nekim izvođenjima, pomenuto pretvaranje se izvodi u komponenti rastvarača koja sadrži tetrahidrofuran i etil acetat.

[0167] Ova prijava takođe obezbeđuje postupak koji obuhvata:

i) reakciju jedinjenja formule F19:

sa jedinjenjem formule F5:

2

u prisustvu trietilsilana i metansulfonske kiseline da se dobije jedinjenje formule F20:

i

ii) pretvaranje pomenutog jedinjenja formule F20 u jedinjenje formule I:

pri čemu pomenuto pretvaranje uključuje spajanje pomenutog jedinjenja formule F20 sa N,N-bis(2-aminoetil)etan-1,2-diaminom. U nekim izvođenjima, pomenuto pretvaranje dalje uključuje dodavanje vodene hlorovodonične kiseline nakon pomenutog spajanja.

[0168] Jedinjenje F17 može da se napravi u postupku od jednog koraka (korak P) iz hlorsulfonilizocijanata, kao što je prikazano u šemi 6.

Šema 6

baza

[0169] U nekim izvođenjima, pripremanje jedinjenja formule F17 može se dobiti tretiranjem hlorsulfonilizocijanata sa 2,2-dimetoksietanaminom i alkoholom R<4>OH (R<4>je definisan kao gore), opciono u rastvaraču (npr., halogenizovani ugljovodonični rastvarač kao što je dihlormetan, hloroform, dihloretan, tetrahloretan). U nekim izvođenjima, ovaj korak se izvodi u prisustvu a base. Baza može da bude bilo organska baza kao što je aciklični amin (npr., trietilamin, diizopropiletilamin (DIPEA), itd.) ili ciklični amin (npr., pirolidin, piperidin, itd.); ili neorganska baza kao što su alkalije (npr., NaOH, LiOH, KOH, Mg(OH)2, itd.). U nekim izvođenjima, reakcija se izvodi u rastvaraču, na primer, halogenizovani ugljovodonični rastvarač kao što je dihlormetan, hloroform, dihloretan, ili tetrahloretan.

[0170] U nekim izvođenjima, ova prijava dalje obezbeđuje jedinjenje formule F17:

pri čemu je R<4>C1-6haloalkil, ili benzil.

[0171] U nekim izvođenjima, R<4>je terc-butil.

[0172] U nekim izvođenjima, R<4>je benzil.

[0173] U nekim izvođenjima, R<4>je etil.

[0174] U nekim izvođenjima, R<4>je C1-3haloalkil.

[0175] U nekim izvođenjima, R<4>je 2,2,2-trihloretil.

[0176] U nekim izvođenjima, R<4>je 9H-fluoren-9-ilmetil.

[0177] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F17 je terc-butil N-(2,2-dimetoksietil) sulfamoilkarbamat.

[0178] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F17 je benzil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat.

[0179] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F17 je etil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat.

[0180] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F17 je 2,2,2-trihloretil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat.

[0181] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F17 je (9H-fluoren-9-il)metil N-(2,2-dimetoksietil) sulfamoilkarbamat.

[0182] U nekim izvođenjima, ova prijava dalje obezbeđuje jedinjenje formule F18:

pri čemu R<4>je C1-6alkil, C1-6haloalkil, ili benzil.

[0183] U nekim izvođenjima, R<4>je terc-butil.

[0184] U nekim izvođenjima, R<4>je benzil.

[0185] U nekim izvođenjima, R<4>je etil.

[0186] U nekim izvođenjima, R<4>je C1-3haloalkil.

[0187] U nekim izvođenjima, R<4>je 2,2,2-trihloretil.

2

[0188] U nekim izvođenjima, R<4>je 9H-fluoren-9-ilmetil.

[0189] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F18 je benzil ({[2-({[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino} sulfonil)karbamat:

[0190] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F18 je etil ({[2-({[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino} sulfonil)karbamat:

[0191] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F18 je 2,2,2-trihloretil ({[2-({[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)-karbamat:

[0192] U nekim izvođenjima, jedinjenje formule F18 je (9H-fluoren-9-il)metil N-(2-((4-(4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)-1-2,5-oksadiazol-3-il)amino)etil)sulfamoilkarbamat:

[0193] Kao što se ovde koristi, izraz "alkil," kada se koristi sam ili zajedno sa dodatnim izrazima za grupe, odnosi se na pravolančane ili razgranate, zaisćene ugljovodonične grupe koje imaju od 1 do 6 ugljenikovih atoma, 1 do 4 ugljenikovih atoma, ili 1 do 3 ugljenikovih atoma. Primer alkilnih grupa uključuje metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, izobutil, sek-butil, terc-butil, i slično.

2

[0194] Kao što se ovde koristi, "alkenil" se odnosi na alkilnu grupu koja ima jednu ili više dvostrukih ugljenik-ugljenik veza. U nekim izvođenjima, pomenuta alkilna grupa ima od 2 do 6 ugljenikovih atoma, 2 do 4 ugljenikova atoma, ili 2 do 3 ugljenikova atoma. Primer alkenil grupa uključuje etenil (vinil), propenil, i slično.

[0195] Kao što se ovde koristi, "alkenilalkil" se odnosi na grupu formule -alkil-alkenil. U nekim izvođenjima, alkenilalkilna grupa je alil.

[0196] Kao što se ovde koristi, izraz "haloalkil," kada se koristi sam ili zajedno sa dodanom grupom, odnosi se na alkilnu grupu supstituisanu sa jednim ili više atoma halogena nezavisno izabranih od F, Cl, Br, i I. Primer haloalkilnih grupa uključuje CF3, CHF2, CH2CF3, i slično.

[0197] Kao što se ovde koristi, izraz "alkoksi" se odnosi na -O-alkilnu grupu. U nekim izvođenjima, alkilna grupa ima 1 do 6 ugljenikovih atoma, 1 do 4 ugljenikova atoma, ili 1 do 3 ugljenikova atoma. Primer alkoksi grupa uključuje metoksi, etoksi, propoksi (npr., n-propoksi i izopropoksi), t-butoksi, i slično.

[0198] Kao što se ovde koristi, "trialkilamin" se odnosi na atom azota supstituisan sa tri nezavisno odabrane alkilne grupe. U nekim izvođenjima, svaka alkilna grupa ima od 2 do 6 ugljenikovih atoma, 2 do 4 ugljenikova atoma, ili 2 do 3 ugljenikova atoma. Primer trialkilamin grupa uključuje trimetilamin, trietilamin, i slično.

[0199] Kao što se ovde koristi, izraz "alkoksikarbonil" se odnosi na grupu formule -C(O)-O-alkil. U nekim izvođenjima, alkilna grupa ima od 2 do 6 ugljenikovih atoma, 2 do 4 ugljenikova atoma, ili 2 do 3 ugljenikova atoma. Primer alkoksikarbonilnih grupa uključuje etoksikarbonil, terc-butoksikarbonil (Boc), i slično.

[0200] Halogenizovani ugljovodonični rastvarači se odnose na halogenizovane alkane, kao što su dihlormetan, hloroform, dihloretan ili tetrahloretan, pri čemu alkan može biti razgranat ili ravan lanac koji ima 1 do 12 ugljenikovih atoma, 1 do 6 ugljenikovih atoma, ili 1 do 4 ugljenikova atoma sa jednim ili više atoma halogena. U nekim izvođenjima, halogenizovani ugljovodonični rastvarač je hlorovani alkan od 1 do 12 ugljenikovih atoma, 1 do 6 ugljenikovih atoma, ili 1 do 4 ugljenikova atoma.

[0201] Na različitim mestima u ovom opisu, supstituenti jedinjenja ovog pronalaska mogu biti opisani u grupama ili u rasponima. Posebno je predviđeno da pronalazak obuhvata svaku pojedinačnu potkombinaciju članova takvih grupa i raspona.

[0202] Predviđeno je da jedinjenja iz ovog pronalaska budu stabilna. Kao što se ovde koristi, "stabilno" se odnosi na jedinjenje koje je dovoljno robusno da izdrži izolovanje iz reakcione smeše do oblika korisnog stepena čistoće, i poželjno sposobno za formulaciju u efikasno terapeutsko sredstvo.

[0203] Dalje se ceni da izvesne karakteristike ovog pronalaska, koje su, radi jasnoće, opisane u kontekstu odvojenih izvođenja, takođe mogu biti obezbeđene u kombinaciji u jednom izvođenju. Suprotno tome, razne karakteristike ovog pronalaska koje su, zbog sažetosti, opisane u kontekstu pojedinačnog izvođenja, mogu takođe biti obezbeđene odvojeno ili u bilo kojoj pogodnoj potkombinaciji.

2

[0204] Dalje je predviđeno da jedinjenja ovog pronalaska uključuju sve moguće geometrijske izomere. Opisani su cis i trans geometrijski isomeri jedinjenja i mogu se izolovati kao smeša izomera ili kao odvojeni izomerini oblici.

[0205] Jedinjenja pronalaska takođe uključuju tautomerne oblike. Tautomerni oblici nastaju iz izmenjivanja proste i susedne dvostruke veze zajedno sa pratećom migracijom protona.

[0206] Jedinjenja pronalaska mogu takođe da uključe sve izotope atoma koji se javljaju u intermedijerima ili krajnjim jedinjenjima. Izotopi uključuju one atome koji imaju isti atomski broj ali različite masene brojeve. Na primer, izotopi vodonika uključuju tricijum i deuterijum.

[0207] U nekim izvođenjima, jedinjenja pronalaska, i njihove soli, su suštinski izolovana. Pod "suštinski izolovan" se podrazumeva da je jedinjenje bar delimično ili suštinski odvojeno od sredine u kojoj je nastalo ili otkriveno. Delimično odvajanje može da uključi, na primer, kompoziciju obogaćenu jedinjenjem pronalaska. Suštinsko odvajanje može da uključi kompozicije koje sadrže najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, najmanje oko 95%, najmanje oko 97%, ili najmanje oko 99% po masi jedinjenje pronalaska, ili njegove soli. Postupci za izolovanje jedinjenjai njihovih soli su rutinske u struci.

[0208] Ova prijava takođe uključuje soli jedinjenja koja su ovde opisana. Kao što se ovde koristi, "soli" se odnosi na derivate opisanih jedinjenja pri čemu se osnovno jedinjenje menja pomoću pretvaranja postojeće kiselinske ili bazne grupe u njegov oblik soli. Primeri soli uključuju, ali nisu ograničeni na, mineralne kiseline (kao što su HCl, HBr, H2SO4) ili organske kiseline (kao što su sirćetna kiselina, benzojeva kiselina, trifluorosirćetna kiselina) soli baznih ostataka kao što su amini; alkalije (kao što su Li, Na, K, Mg, Ca) ili organske (kao što je trialkilamonijum) soli kiselinskih ostataka kao što su karboksilne kiseline; i slično. Soli ove prijave mogu se sintetizovati iz osnovnog jedinjenja koje sadrži baznu ili kiselinsku grupu uobičajenim hemijskim postupcima. Uopšteno, takve soli mogu da se pripreme reakcijom slobodnih oblika kiseline ili baze ovih jedinjenja sa stoihiometrijskom količinom odgovarajuće baze ili kiseline u vodi ili u organskom rastvaraču, ili u smeši ova dva; uopšteno, nevodene sredine kao etar, etil acetat, etanol, izopropanol, ili acetonitril (ACN) su poželjne.

[0209] Ova prijava takođe uključuje farmaceutski prihvatljive soli jedinjenja koja su ovde opisana. "Farmaceutski prihvatljive soli" uključuju podskup "soli" prethodno opisanih koje su, uobičajene netoksične soli osnovnog jedinjenja nastale, na primer, iz netoksičnih neorganskih ili organskih kiselina. Liste odgovarajućih soli se nalaze u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, p. 1418 i Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977). Izraz "farmaceutski prihvatljiv" je ovde korišćen da se odnosi na ona jedinjenja, materijale, kompozicije, i/ili dozne oblike koji su, u obimu zdravog medicinskog rasuđivanja, pogodne za upotrebu u dodiru sa tkivima ljudi i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora, ili drugog problema ili komplikacije, srazmerni sa razumnim odnosom korist/rizik.

[0210] Postupci koji su ovde opisani mogu se pratiti bilo kojom pogodnom metodom poznatom u ovoj tehničkoj oblasti. Na primer, nastajanje proizvoda može da se prati spektroskopskim sredstvima, kao što su nuklearna magnetno rezonantna spektroskopija (npr.,<1>H ili<13>C), infracrvena spektroskopija, spektrofotometrija (npr., UV-vidljiva), ili masena spektrometrija; ili pomoću hromatografije kao što je visoko efikasna tečna hromatografija (HPLC) ili hromatografija na tankom sloju. Jedinjenja dobijena reakcijama mogu da se prečiste bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u struci. Na primer,

2

hromatografijom (srednji pritisak) na pogodnom adsorbensu (npr., silikagel, aluminijum oksid i slično), HPLC, ili preparativnom tankoslojnom hromatografijom; destilacijom; sublimacijom, triturisanjem, ili rekristalizacijom. Čistoća jedinjenja, uopšteno, se određuje pomoću fizičkih metoda kao što su merenje tačke topljenja (u slučaju čvrste supstance), dobijanjem NMR spektra, ili izvođenjem odvajanja pomoću HPLC. Ako se tačka topljenja smanjuje, ako se smanje neželjeni signali u NMR spektru, ili ako se uklone eksterni pikovi u tragu HPLC, za jedinjenje se može reći da je prečišćeno. U nekim izvođenjima, jedinjenja su suštinski prečišćena.

[0211] Pripremanje jedinjenja može uključiti zaštitu i uklanjanje zaštite različitih hemijskih grupa. Potreba za zaštitom i uklanjanjem zaštite, i izbor odgovarajuće zaštitne grupe može lako da odredi stručnjak iz ove oblasti tehnike. Hemija zaštitnih grupa može da se nađe, na primer, u Wuts and Greene, Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis, 4th Ed., John Wiley & Sons: New York, 2006.

[0212] Reakcije ovde opisanih postupaka mogu da se izvode u pogodnim rastvaračima koji mogu lako da se izaberu od strane stručnjaka u oblasti organskih sinteza. Pogodni rastvarači mogu biti suštinski nereaktivni sa polaznim materijalima (reaktanti), intermedijerima, ili proizvodima na temperaturama na kojima se reakcije izvode, tj., temperaturama koje mogu varirati od temperature smrzavanja rastvarača do temperature ključanja rastvarača. Data reakcija može da se izvede u jednom rastvaraču ili u smeši više od jednog rastvarača. U zavisnosti od koraka reakcije, može da se izabere pogodan rastvarač(i) za taj određeni reakcioni korak. Odgovarajući rastvarači uključuju vodu, alkane (kao što su pentani, heksani, heptani, cikloheksan, itd., ili njihova smeša), aromatične rastvarače (kao što su benzen, toluen, ksilen, itd.), alkohole (kao što su metanol, etanol, izopropanol, itd.), etre (kao što su dialkiletri, metil terc-butil etar (MTBE), tetrahidrofuran (THF), dioksan, itd.), estre (kao što su etil acetat, butil acetat, itd.), halogenizovane ugljovodonične rastvarače (kao što su dihlormetan (DCM), hloroform, dihloretan, tetrahloretan), dimetilformamid (DMF), dimetilsulfoksid (DMSO), aceton, acetonitril (ACN), heksametilfosforamid (HMPA) i N-metil pirolidon (NMP). Takvi rastvarači mogu da se koriste bilo u njihovom vlažnom ili anhidrovanom obliku.

[0213] Razdvajanje racemskih smeša jedinjenja može da se izvede bilo kojim od brojnih postupaka poznatih u ovoj oblasti tehnike. Jedan primer postupka uključuje frakcionu rekristalizaciju korišćenjem "kiseline za hiralno razdvajanje" koja je optički aktivna, organska kiselina koja obrazuje so. Pogodna sredstva za razdvajanje za postupke frakcione rekristalizacije su, na primer, optički aktivne kiseline, kao što su D i L oblici vinske kiseline, diacetilvinske kiseline, dibenzoilvinske kiseline, bademove kiseline, jabučne kiseline, mlečne kiseline i raznih optički aktivnih camforsulfonskih kiselina. Razdvajanje racemskih smeša takođe može da se izvede eluiranjem na koloni koja je napunjena optički aktivnim sredstvom za razdvajanje (npr., dinitrobenzoilfenilglicin). Pogodan sastav rastvarača za eluiranje može da odredi stručnjak iz ove oblasti tehnike.

Postupci upotrebe

[0214] Jedinjenje formule I može da inhibira aktivnost enzima indolamin-2,3-dioksigenaza (IDO). Na primer, jedinjenje formule I može da se koristi za inhibiciju IDO u ćeliji ili u pojedincu kojem je potrebna modulacija enzima davanjem inhibirajuće količine jedinjenje formule I.

[0215] Jedinjenja formule I mogu da se upotrebe u postupcima inhibiranja razgradnje triptofana u sistemu koji sadrži ćelije koje eksprimuju IDO kao što je tkivo, živi organizam, ili ćelijska kultura. Takođe su opisani postupci menjanja (npr., povećanje) ekstracelularnih nivoa triptofana kod sisara davanjem

2

efikasne količine jedinjenja formule I. Metode za merenje nivoa triptofana i razgradnje triptofana su rutinske tehnike.

[0216] Jedinjenja formule I mogu da se upotrebe u postupcima inhibicije imunosupresije kao što je IDO-posredovana imunosupresija kod pacijenta, davanjem pacijentu efikasne količine jedinjenja formule I. IDO- posredovana imunosupresija je povezana sa, na primer, kancerima, rastom tumora, metastazama, virusnom infekcijom, virusnom replikacijom, itd.

[0217] Jedinjenja formule I takođe mogu da se koriste u postupcima lečenja bolesti povezanih sa aktivnošću ili ekspresijom, uključujući abnormalnu aktivnost i/ili prekomernu ekspresiju, od IDO u pojedincu (npr., pacijent) davanjem pojedincu kojem je potrebno takvo lečenje terapeutski efikasne količine ili doze jedinjenja formule I ili njegove farmaceutske kompozicije. Primeri bolesti mogu da uključe bilo koju bolest, poremećaj ili stanje koje je direktno ili indirektno povezano sa ekspresijom ili aktivnošću enzima IDO, kao što je prekomerna ekspresija ili abnormalna aktivnost. Bolesti udružene sa IDO mogu da uključe bilo koju bolest, poremećaj ili stanje koje se može sprečiti, poboljšati, ili izlečiti podešavanjem enzimske aktivnosti. Primeri IDO-udruženih bolesti uključuju kancer, virusnu infekcju kao što je HIV infekcija, HCV infekciju, depresiju, neurodegenerativne poremećaje kao što su Alchajmerova bolest i Hantingtonova bolest, traumu, katarakte povezane sa godinama, transplantaciju organa (npr., odbacivanje organa za transplantaciju), i autoimune bolesti uključujući astmu, reumatoidni artritis, multiplu sklerozu, alergijsku upalu, upalnu bolest creva, psorijazu i sistemski eritemski lupus. Primer kancera koji seleče ovim postupcima uključuju kancer debelog creva, pankreasa, dojke, prostate, pluća, mozga, jajnika, grlića materice, testisa, bubrega, glave i vrata, limfom, leukemiju, melanom, i slično. Jedinjenje formule I takođe može biti korisno u lečenju gojaznosti i ishemije.

[0218] Kao što se ovde koristi, izraz "ćelija" znači da se odnosi na ćeliju koja je in vitro, ex vivo ili in vivo. U nekim izvođenjima, ex vivo može biti deo uzorka tkiva isečenog iz organizma kao što je sisar. U nekim izvođenjima, in vitro ćelija može biti ćelija u ćelijskoj kulturi. U nekim izvođenjima, in vivo ćelija je ćelija koja živi u organizmu kao što je sisar.

[0219] Kao što se ovde koristi, izraz "kontaktiranje" odnosi se na okupljanje naznačenih delova u in vitro sistemu ili in vivo sistemu. Na primer,"kontaktiranje" enzima IDO sa jedinjenjem formule I uključuje davanje jedinjenja formule I pojedincu ili pacijentu, kao što je čovek, koji ima IDO, isto kao, na primer, uvođenje jedinjenja formule I u uzorak koji sadrži ćelijski ili prečišćen preparat koji sadrži enzim IDO.

[0220] Kao što se ovde koristi, izraz "pojedinac" ili "pacijent," korišćen naizmenično, odnosi se na bilo koju životinju, uključujući sisare, poželjno miševe, pacove, druge glodare, zečeve, pse, mačke, svinju, goveče, ovcu, konje, ili primate, i najpoželjnije ljude.

[0221] Kao što se ovde koristi, izraz "terapeutski efikasna količina" se odnosi na količinu aktivnog jedinjenja ili farmaceutskog sredstva koja izaziva biološki ili medicinski odgovor u tkivu, sistemu, životinji, pojedincu ili čoveku koje traži istraživač, veterinar, lekar ili drugi kliničar.

[0222] Kao što se ovde koristi izraz "lečenje" ili "tretman" odnosi se na 1) sprečavanje bolesti; na primer, sprečavanje bolesti, stanja ili poremećaja kod pojedinca koji može biti predisponiran za bolest, stanje ili poremećaj ali još ne doživljava ili ne pokazuje patologiju ili simptomatologiju bolesti; 2) sprečavanje bolesti; na primer, sprečavanje bolesti, stanja ili poremećaja kod pojedinca koji doživljava ili pokazuje patologiju ili simptomatologiju bolesti, stanja ili poremećaja (tj., zaustavljanje daljeg razvoja patologije i/ili simptomatologije), ili 3) ublažavanje bolesti; na primer, ublažavanje bolesti, stanja ili poremećaja kod pojedinca koji doživljava ili pokazuje patologiju ili simptomatologiju bolesti, stanja ili poremećaja (tj., reverziju patologije i/ili simptomatologije).

Kombinovana terapija

[0223] Jedno ili više dodatnih farmaceutskih sredstava ili postupaka lčenja kao što su, na primer, antivirusna sredstva, hemoterapeutici ili druga antikancerna sredstva, imunološki pojačivači, imunosupresanti, zračenje, antitumorske i antivirusne vakcine, lečenje citokinima (npr., IL2, GM-CSF, itd.), i/ili inhibitorima tirozin kinaze mogu da se koriste u kombinaciji sa jedinjenjem formule I za lečenjef IDO-povezanih bolesti, poremećaja ili stanja. Sredstva mogu da se kombinuju sa jedinjenjem formule I u jednom doznom obliku, ili sredstva mogu da se daju istovremeno ili uzastopno kao odvojeni dozni oblici.

[0224] Pogodna antivirusna sredstva predviđena za upotrebu u kombinaciji sa jedinjenjem formule I mogu da sadrže inhibitore nukleozidnih i nukleotidnih reverznih transkriptaza (NRTIs), inhibitore nenukleozidnih reverznih transkriptaza (NNRTIs), proteazne inhibitore i druge antivirusne lekove.

[0225] Primer pogodnih NRTIs uključuje zidovudin (AZT); didanozin (ddl); zalcitabin (ddC); stavudin (d4T); lamivudin (3TC); abakavir (1592U89); adefovir dipivoksil [bis(POM)-PMEA]; lobukavir (BMS-180194); BCH-10652; emitricitabin [(-)-FTC]; beta-L-FD4 (takođe nazvan beta-L-D4C i nazvan beta-L-2’, 3’-dikleoksy-5-fluoro-citiden); DAPD, ((-)-beta-D-2,6,-diamino-purin dioksolan); i lodenozin (FddA). Tipični pogodni NNRTIs uključuju nevirapin (BI-RG-587); delaviradin (BHAP, U-90152); efavirenz (DMP-266); PNU-142721; AG-1549; MKC-442 (1-(etoksi-metil)-5-(1-metiletil)-6-(fenilmetil)-(2,4(1H,3H)-pirimidindion); i (+)-kalanolid A (NSC-675451) i B. Tipični pogodni proteazni inhibitori uključuju sakvinavir (Ro 31-8959); ritonavir (ABT-538); indinavir (MK-639); nelfnavir (AG-1343); amprenavir (141W94); lazinavir (BMS-234475); DMP-450; BMS-2322623; ABT-378; i AG-1549. Druga antivirusna sredstva uključuju hidroksiureu, ribavirin, IL-2, IL-12, pentafuzid i Yissum Project No.11607.

[0226] Pogodni hemoterapeutici i druga antikancerna sredstva uključuju, na primer, alkilovana sredstva (uključujući, bez ograničenja, azotne iperite, derivate etilenimina, alkilne sulfonate, nitrozouree i triazene) kao što su uracil iperit, hlormetin, ciklofosfamid (Cytoxan™), ifosfamid, melfalan, hlorambucil, pipobroman, trietilen-melamin, trietilentiofosforamin, busulfan, karmustin, lomustin, streptozocin, dakarbazin, i temozolomid.

[0227] U lečenju melanoma, pogodna sredstva za upotrebu u kombinaciji sa jedinjenjem formule I uključuju: dakarbazin (DTIC), opciono, zajedno sa drugim hemoterapeutskim lekovima kao što su karmustin (BCNU) i cisplatin; "Dartmouth režim," koji se sastoji od DTIC, BCNU, cisplatina i tamoksifena; kombinaciju cisplatina, vinblastina, i DTIC; ili temozolomida. Jedinjenja prema pronalasku mogu takođe da se kombinuju sa imunoterapeutskim lekovima, uključujući citokine kao što su interferon alfa, interleukin 2, i faktor nekroze tumora (TNF) u lečenju melanoma.

[0228] Jedinjenje formule I može takođe da se koristi u kombinaciji sa terapijom vakcine u lečenju melanoma. Antimelanomske vakcine su, na neki način, slične antivirusnim vakcinama koje se koriste za sprečavanje bolesti uzrokovane virusima kao što su dečija paraliza, rubeole, i zauške. Oslabljene

1

ćelije melanoma ili delove ćelija melanoma koje se zovu antigeni mogu biti injektirane u pacijenta da stimulišu imunološki sistem tela da uništi ćelije melanoma.

[0229] Melanomi koji su ograničeni na rukama ili nogama mogu se takođe tretirati sa kombinacijom sredstava uključujući jedinjenje formule I, koristeći tehniku izolovane hipertermičke perfuzije ekstremiteta. Ovaj protokol lečenja privremeno odvaja cirkulaciju zahvaćenog ekstremiteta od ostatka tela i injektira visoke doze chemoterapije u arteriju koja ishranjuje ekstremitet, čime se obezbeđuju visoke doze u oblast tumora tumor bez izlaganja unutrašnjih organa ovim dozama koje bi inače mogle da izazovu ozbiljne sporedne efekte. Obično se tečnost zagreva na 102° do 104° F. Melfalan je lek najčešće korišćen u ovom postupku hemoterapije. Ovo se može davati sa drugim sredstvom pod nazivom faktor nekroze tumora (TNF) (videti pasus o citokinima).

[0230] Pogodna hemoterapeutska ili druga antikancerogena sredstva uključuju, na primer, antimetabolite (uključujući, bez ograničenja, antagoniste folne kiseline, analoge pirimidina, analoge purina i inhibitore adenozin deaminaze) kao što su metotreksat, 5-fluorouracil, floksuridin, citarabin, 6-merkaptopurin, 6-tioguanin, fludarabin fosfat, pentostatin, i gemcitabin.

[0231] Pogodna hemoterapeutska ili druga antikancerogena sredstva dalje uključuju, na primer, određene prirodne proizvode i njihove derivate (na primer, vinka alkaloide, antitumorske antibiotike, enzime, limfokine i epipodofilotoksine) kao što su vinblastin, vinkristin, vindezin, bleomicin, daktinomicin, daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, ara-C, paklitaksel (TAXOL™), mitramicin, deoksikoformicin, mitomicin-C, L-asparaginaza, interferoni (posebno IFN-a), etopozid, i tenipozid.

[0232] Druga citotoksična sredstva uključuju navelben, CPT-11, anastrazol, letrazol, kapecitabin, reloksafin, ciklofosfamid, ifozamid, i droloksafin.

[0233] Takođe su pogodna citotoksična sredstva kao što su epidofilotoksin; antineoplastični enzim; inhibitor topoizomeraze; prokarbazin; mitoksantron; platinski coordinacioni compleksi kao što su cisplatin i karboplatin; modifikatori biološkog odgovora; inhibitori rasta; antihormonska terapeutska sredstva; leukovorin; tegafur; i haematopoetski faktori rasta.

[0234] Drugo antikancerno sredstvo(a) uključuje terapijska antitela kao što su trastuzumab (Herceptin), antitela za kostimulatorne molekule kao što su CTLA-4, 4-1BB i PD-1, antitela za citokine (IL-10, TGF-β, itd.).

[0235] Druga antikancerogena sredstva takođe uključuju ona koja blokiraju migraciju imunoloških ćelija kao što su antagonisti na receptore hemokina, uključujući CCR2 i CCR4.

[0236] Druga antikancerogena sredstva takođe uključuju ona koja povećavaju imuni sistem kao što su adjuvanti ili adaptivni prenos T ćelija.

[0237] Antikancerne vakcine uključuju dendritske ćelije, sintetičke peptide, DNA vakcine i rekombinantne viruse.

[0238] Postupci za sigurnu i efikasnu primenu većine od ovih hemoterapijskih sredstava su poznati stručnjacima iz ove oblasti. Dodatno, njihova primena je opisana u standardnoj literaturi. Na primer,

2

primena mnogih hemoterapijskih sredstava je opisana u "Physicians’ Desk Reference" (PDR, npr., 1996 edition, Medical Economics Company, Montvale, NJ).

Farmaceutske formulacije i dozni oblici

[0239] Kada se koristi kao lek, jedinjenje formule I može da se daje u obliku farmaceutske kompozicije koja je kombinacija jedinjenja formule I i farmaceutski prihvatljivog nosača. Ove kompozicije se mogu pripremiti na način dobro poznat u farmaceutskoj struci, i mogu se davati na različite načine, u zavisnosti od toga da li je poželjno lokalno ili sistemsko lečenje i po oblasti koja se leči. Davanje može biti topikalno (uključujući oftalmološko i na sluzokožu uključujući intranazalnu, vaginalnu i rektalnu isporuku), plućno (npr., inhalacijom ili insuflacijom praha ili aerosola, uključujući nebulizatorom; intratrahealno, intranazalno, epidermalno i transdermalno), okularno, oralno ili parenteralno. Postupci za okularnu isporuku mogu da uključe topikalno davanje (kapi za oči), subkonjunktivno, periokularnom ili intravitrealnom injekcijom ili uvođenje balon kateterom ili oftalmološkim umecima hiruški postavljenim u konjuktivalnu kesu. Parenteralno davanje uključuje intravensku, intraarterijsku, subkutanu, intraperitonealnu, ili intramuskularnu injekciju ili infuziju; ili intrakranijalno, npr., intratekalno ili intraventrikularno, davanje. Parenteralno davanje može biti u obliku pojedinačne bolus doze, ili može biti, na primer, kontinualna perfuzijska pumpa. Farmaceutske kompozicije i formulacije za topikalno davanje mogu da uključe transdermalne flastere, masti, losione, kreme, gelove, kapi, supozitorije, sprejeve, tečnosti i praškove. Konvencionalni farmaceutski nosači, vodeni, praškasti ili uljane baze, sredstvo za zgušnjavanje i slično mogu biti potrebni ili poželjni.

[0240] Farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje formule I mogu da se pripreme u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača. U pravljenju kompozicija ovog pronalaska, aktivan sastojak se obično meša sa ekscipijensom, razblažuje ekscipijensom ili se zatvara unutar takvog nosača u obliku, na primer, kapsule, kesice, papira, ili druge posude. Kada ekscipijens služi kao razblaživač, on može biti čvrst, polučvrst, ili tečan materijal, koji deluje kao nosač, ili medijum za aktivan sastojak. Prema tome, kompozicije mogu biti u obliku tableta, pilula, prahova, pastila, kesica, kašeta, eliksira, suspenzija, emulzija, rastvora, sirupa, aerosola (u čvrstom ili u tečnom medijumu), masti koje sadrže, na primer, do 10 % mase aktivnog jedinjenja, mekih i tvrdih želatinskih kapsula, supozitorija, sterilnih injektabilnih rastvora, i sterilno upakovanih prahova.

[0241] U pripremanju formulacije, aktivno jedinjenje može biti samleveno da se obezbedi odgovarajuća veličina čestica pre kombinovanja sa drugim sastojcima. Ukoliko je aktivno jedinjenje u suštini nerastvorno, može biti samleveno do veličine čestica manje od 200 meša. Ako je aktivno jedinjenje u suštini rastvorno u vodi, veličina čestica može biti prilagođena mlevenjem da obezbedi suštinski jednoobraznu raspodelu u formulaciji, npr. oko 40 meša.

[0242] Neki primeri pogodnih ekscipijenasa uključuju laktozu, dekstrozu, saharozu, sorbitol, manitol, skrobove, gumu akaciju, kalcijum fosfat, alginate, tragakant, želatin, kalcijum silikat, mikrokristalnu celulozu, polivinilpirolidon, celulozu, vodu, sirup, i metil celulozu. Formulacije mogu dodatno da uključe: sredstva za podmazivanje kao što je talk, magnezijum stearat, i mineralno ulje; sredstva za kvašenje; sredstva za emulgovanje i sredstva za suspendovanje; sredstva za održavanje kao što su metil- i propilhidroksi-benzoati; sredstva za zaslađivanje; i sredstva za aromu. Kompozicije ovog pronalaska mogu biti formulisane tako da obezbeđuju brzo, održano ili odloženo oslobađanje aktivnog sastojka posle primene kod pacijenta korišćenjem postupaka poznatih u ovoj oblasti.

[0243] Kompozicije mogu biti formulisane u jediničnom doznom obliku, pri čemu svaki dozni oblik sadrži od oko 5 do oko 100 mg, uobičajenije oko 10 do oko 30 mg, aktivnog sastojka. Izraz "jedinični dozni oblici" se odnosi na fizički diskretne jedinice pogodne za pojedinačne doze za humane subjekte i druge sisare, svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog materijala izračunatog da proizvede željeni terapeutski efekat, zajedno sa pogodnim farmaceutskim ekscipijensom.

[0244] Aktivno jedinjenje može biti efikasno u širokom rasponu doza i generalno se daje u farmaceutski efikasnoj količini. Podrazumeva se, međutim, da količina jedinjenja koja se stvarno daje će uglavnom biti određena od strane lekara, prema relevantnim okolnostima, uključujući stanje koje se leči, odabrani način davanja, konkretno jedinjenje koje se daje, staroste, masu, i odgovor pojedinačnog pacijenta, ozbiljnost simptoma koje ima pacijent, i slično.

[0245] Za pripremanje čvrstih kompozicija kao što su tablete, glavni aktivni sastojak se meša sa farmaceutskim ekscipijensom da bi se obrazovala čvrsta kompozicija za preformulaciju koja sadrži homogenu smešu jedinjenja formule I. Kada se poziva na ove kompozicije za preformulaciju kao homogene, aktivan sastojak je tipično dispergovan ravnomerno kroz kompoziciju tako da kompozicija može biti lako podeljena u jednake efikasne jedinične dozne oblike kao što su tablete, pilule i kapsule. Ova čvrsta preformulacija je zatim izdeljena u jedinične dozne oblike tipa opisanog iznad koji sadrže od, na primer, 0,1 do oko 500 mg aktivnog sastojka iz ove prijave.

[0246] Tablete ili pilule koje sadrže jedinjenje formule I mogu biti obložene ili na drugi način formulisane da se dobije dozni oblik koji ima prednost produženog dejstva. Na primer, tableta ili pilula može da sadrži unutrašnju dozu i spoljašnju doznu komponentu, pri čemu je poslednja u obliku omotača preko prethodne. Dve komponente mogu biti odvojene sa entero slojem koji služi da spreči dezintegraciju u želucu i da dozvoli unutrašnjoj komponenti da prođe neoštećena u dvanaestopalačno crevo ili da bude odloženo oslobođena. Razni materijali se mogu koristiti za takve entero slojeve ili obloge, takvi materijali uključuju brojne polimerne kiseline i smeše polimernih kiselina sa takvim materijalima kao što je šelak, cetil alkohol, i celulozni acetat.

[0247] Tečni oblici u kojima jedinjenja i kompozicije iz ove prijave mogu biti uključeni za davanje oralno ili injekcijom uključuju vodene rastvore, prikladno aromatizovane sirupe, vodene ili uljane suspenzije, i aromatizovane emulzije sa jestivim uljima kao što su ulje semena pamuka, susamovo ulje, kokosovo ulje,ili ulje kikirikija, kao i eliksire i slične farmaceutske nosače.

[0248] Kompozicije za inhalaciju ili insuflaciju uključuju rastvore i suspenzije u farmaceutski prihvatljivim, vodenim ili organskim rastvaračima, ili njihovim smešama, i praškove. Tečne ili čvrste kompozicije mogu da sadrže pogodne farmaceutski prihvatljive ekscipijense kao što je prethodno opisano. U nekim izvođenjima, kompozicije mogu da se daju oralnim ili nazalnim respiratornim putem za lokalni ili sistemski efekat. Kompozicije mogu biti nebulizovane upotrebom inertnih gasova. Nebulizovani rastvori mogu biti udisani direktno iz uređaja za nebuliziranje ili uređaj za nebuliziranje može biti vezan za masku za lice, ili mašinom za disanje sa povremenim pozitivnim potiskom. Kompozicije rastvora, suspenzija, ili praškova mogu da se daju oralno ili nazalno iz uređaja koji isporučuje formulaciju na odgovarajući način.

[0249] Količina jedinjenja ili kompozicije koja se daje pacijentu će varirati u zavisnosti od toga šta se daje, svrhe davanja, kao što je profilaksa ili terapija, stanja pacijenta, načina davanja, i slično. U terapeutskim primenama, kompozicije mogu da se daju pacijentu koji već pati od bolesti u količini

4

dovoljnoj da izleči ili bar delom zaustavi simptome bolesti i njene komplikacije. Efikasne doze će zavisiti od stanja bolesti koje se leči kao i od procene lekara u zavisnosti od faktora kao što su ozbiljnost bolesti, starost, masa i opšte stanje pacijenta, i slično.

[0250] Kompozicije koje se daju pacijentu mogu biti u obliku prethodno opisanih farmaceutskih kompozicija. Ove kompozicije mogu biti sterilizovane konvencionalnim tehnikama sterilizacije, ili mogu biti sterilno filtrirane. Vodeni rastvori mogu biti spakovani za upotrebu kao takvi, ili liofilizirani, gde se liofilizirani preparat kombinuje sa sterilnim vodenim nosačem pre davanja. pH preparata jedinjenja tipično će biti između 3 i 11, poželjnije od 5 do 9 i najpoželjnije od 7 do 8. Podrazumeva se da će upotreba izvesnih navedenih ekscipicijenasa, nosača, ili stabilizatora dovesti do obrazovanja farmaceutskih soli.

[0251] Terapeutska doza jedinjenja formule I može varirati prema, na primer, naročitoj primeni za koju je napravljen tretman, načina davanja jedinjenja, zdravlja i stanja pacijenta, i procene nadležnog lekara. Odnos ili koncentracija jedinjenja formule I u farmaceutskoj kompoziciji može da varira u zavisnosti od brojnih faktora uključujući dozu, hemijske karakteristike (npr., hidrofobnost), i način davanja. Na primer, jedinjenje formule I može da se obezbedi u vodenom rastvoru fiziološkog pufera koji sadrži oko 0,1 do oko 10% mas/v jedinjenja za parenteralno davanje. Neki tipični dozni opsezi su od oko 1 µg/kg do oko 1 g/kg telesne mase po danu. U nekim izvođenjima, dozni opseg je od oko 0,01 mg/kg do oko 100 mg/kg telesne mase po danu. Doziranje verovatno zavisi od takvih promenljivih kao što je tip i obim progresije bolesti ili poremećaja, celokupnog zdravstvenog stanja određenog pacijenta, relativne biološke efikasnosti odabranog jedinjenja, formulacije ekscipijenasa, i načina davanja. Efikasne doze mogu biti ekstrapolirane iz krivih doza-odgovor koje potiču iz test sistema modela in vitro ili životinjskog modela.

[0252] Jedinjenje formule I može takođe biti formulisano u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih aktivnih sastojaka koji mogu da uključe bilo koje farmaceutsko sredstvo kao što su antivirusna sredstva, vakcine, antitela, imunološki pojačivači, imuno supresanti, antiinflamatorna sredstva i slično.

[0253] Ova prijava takođe uključuje farmaceutske kitove korisne, na primer, u lečenju ili prevenciji bolesti i poremećaja povezanih sa IDO, gojaznosti, dijabetesa i drugih bolesti navedenih ovde koje uključuju jedan ili više kontejnera koji sadrži farmaceutsku kompoziciju koja sadrži terapeutski efikasnu količinu jedinjenja formule I. Takvi kitovi mogu dalje sadržati, ako je poželjno, jednu ili više raznovrsnih konvencionalnih farmaceutskih komponenti kita, kao što su, na primer, kontejneri sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, dodatni kontejneri, itd., kao što će biti očigledno stručnjacima iz ove oblasti. Uputstva, bilo kao umeci ili kao nalepnice, koja ukazuju na količinu komponenti koje se daju, uputstvo za davanje, i/ili uputstvo za mešanje komponenti, mogu takođe biti uključeni u kit.

PRIMERI

[0254] Pronalazak će biti detaljnije opisan pomoću specifičnih primera. Sledeći primeri su ponuđeni u ilustrativne svrhe, i nisu namenjeni da ograniče pronalazak na bilo koji način. Stručnjaci iz ove oblasti će lako prepoznati razne nekritične parametre koji mogu biti promenjeni ili modifikovani da bi se dobili u suštini isti rezultati.

Primer 1. Sinteza 4-({2-[(aminosulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamida

Korak A: 4-amino-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamid (2)

[0256]

[0257] Malononitril [Aldrich, proizvod # M1407] (320,5 g, 5 mol) je dodat u vodu (7 L), prethodno zagrejanu na 45 °C i mešan na 45 °C tokom 5 min. Dobijeni rastvor je ohlađen u ledenom kupatilu i dodat je natrijum nitrit (380 g, 5,5 mol, 1,1 ekviv.). Kada je temperatura dostigla 10 °C, dodata je 6 N hlorovodonična kiselina (55 mL). Usledila je blaga egzotermna reakcija sa postizanjem temperature od 16 °C. Nakon 15 min hladno kupatilo je uklonjeno i reakciona smeša je mešana tokom 1,5 h na 16-18 °C. Reakciona smeša je ohlađena na 13 °C i dodato je odjednom 50% vodenog hidroksilamin hidrohlorida (990 g, 15 mol, 3,0 ekviv.). Temperatura je porasla na 26 °C. Kada se egzotermna reakcija smirila hladno kupatilo je uklonjeno i mešanje je nastavljeno tokom 1 h na 26 -27 °C, a zatim je polako dovedena do refluksa. Refluks je održavan tokom 2 h a zatim je omogućeno da se reakciona smeša ohladi preko noći. Reakciona smeša je mešana na ledenom kupatilu i dodata je 6 N hlorovodonična kiselina 800 mL) u porcijama tokom 40 min da se podesi na pH 7,0. Mešanje je nastavljeno u ledenom kupatilu na 5 °C. Talog je sakupljen ceđenjem, ispran dobro sa vodom i osušen u vakuum sušnici (50 °C) da bi se dobio željen proizvod (644 g, 90%) kao beličasta čvrsta supstanca.<13>C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 156.0, 145.9, 141.3; C3H5N5O2(MW 143.10), LCMS (EI) m/e 144.0 (M<+>+ H).

Korak B: 4-amino-N-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidoil hlorid (3)

[0258]

[0259] 4-amino-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamid (422 g, 2,95 mol) je dodat u smešu vode (5,9 L), sirćetne kiseline (3 L) i 6 N hlorovodonične kiseline (1,475 L, 3,0 ekviv.) i suspenzija je mešana na 42 -45 °C dok nije postignut bistar rastvor. Dodat je natrijum hlorid (518 g, 3,0 ekviv.) i ovaj rastvor je mešan u kupatilu led/voda/metanol. Rastvor natrijum nitrita (199,5 g, 0,98 ekviv.) u vodi (700 mL) je dodat tokom 3,5 h dok je temperatura održavana ispod 0 °C. Posle kompletnog dodavanja, mešanje je nastavljeno u ledenom kupatilu tokom 1,5 h a zatim je omogućeno da se reakciona smeša zagreje na 15 °C. Talog je sakupljen ceđenjem, ispran dobro sa vodom, sakupljen etil acetatom (3.4 L), tretiran sa anhidrovanim natrijum sulfatom (500 g) i mešan na sobnoj temperaturi tokom 1 h. Ova suspenzija je proceđena kroz natrijum sulfat (200 g) i filtrat je koncentrovan na rotacionom uparivaču. Ostatak je rastvoren u metil terc-butil etru (5.5 L), tretiran sa aktivnim ugljem (40 g), mešan na sobnoj temperaturi tokom 40 min i proceđen kroz celit. Rastvarač je uklonjen u rotacionom uparivaču a dobijeni proizvod je osušen u vakuum sušnici (45 °C) da bi se dobio željen proizvod (256 g, 53,4%) kao beličasta čvrsta supstanca.<13>C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 155.8, 143.4, 129.7; C3H3ClN4O2(MW 162.53), LCMS (EI) m/e 163/165 (M<+>+ H).

Korak C: 4-amino-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamid (4)

[0260]

[0261] 4-amino-N-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidoil hlorid (33,8 g, 208 mmol) je pomešan sa vodom (300 mL). Na 60 °C, 3-bromo-4-fluoroanilin (Sigma-Aldrich) (43,6 g, 229 mmol, 1,1 ekviv.) je dodat u suspenziju mešanjem tokom 10 min. Rastvor natrijum bikarbonata (26,3 g, 313 mmol, 1,5 ekviv.) u vodi (300 mL) je dodat tokom 15 min uz mešanje na 60 °C. Posle mešanja 20 min, LCMS je pokazala da je reakcija završena. Reakciona smeša je zatim ohlađena na sobnu temperaturu i ekstrahovana sa etil acetatom (2 x 300 mL). Spojeni rastvor etil acetata je osušen iznad anhidrovanog natrijum sulfata i koncentrovan da bi se dobio željen proizvod (65 g, 99%) kao beličasta čvrsta supstanca, koja je korišćena u narednoj reakciji bez daljeg prečišćavanja. C9H7BrFN5O2(MW 316.09), LCMS (EI) m/e 316/318 (M<+>+ H).

Korak D: 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-on (5)

[0262]

[0263] Smeša 4-amino-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamida (65,7 g,208 mmol), N,N-karbonildiimidazola (Sigma-Aldrich) (50,6 g, 312 mmol, 1,5 ekviv.), i etil acetata (750 mL) je zagrevana do 60 °C i mešana tokom 20 min. LCMS je pokazao da je reakcija završena. Reakcija je ohlađena na sobnoj temperaturi, isprana sa 1 N hlorovodoničnom kiselinom (2 x 750 mL), osušena preko natrijum sulfata, i koncentrovana. Sirov proizvod je triturisan sa smešom dihlormetana, etil acetata, i dietil etra da bi se dobio željen proizvod (60,2 g, 85%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.05 (m, 1H), 7.69 (m, 1H), 7.57 (t, 1H, J= 8.7 Hz), 6.58 (s, 2H); C10H5BrFN5O3(MW 342.08), LCMS (EI) m/e 342/344 (M<+>+ H).

Korak E: terc-butil [2-({4-[2-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-2,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]karbamat (7)

[0264]

[0265] U rastvor trifluorosirćetne kiseline (20,0 mL) i tetrahidrofurana (10,0 mL) je dodat u porcijama natrijum triacetoksiborhidrid (10,59 g, 49,97 mmol, 10,0 ekviv.) uz mešanje pod azotom. Ova smeša je mešana tokom 10 min na sobnoj temperaturi a zatim ohlađena na -5 °C. Rastvor 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona (1,71 g, 5,0 mmol) i terc-butil (2-oksoetil)karbamata (Sigma-Aldrich) (1,99 g, 12,5 mmol, 2,5 ekviv.) u THF (15,0 mL) je dodat u kapima tokom 30 min uz mešanje dok je temperatura održavana ispod 0 °C. Reakcija je mešana na -5 do 0 °C i dodatne porcije terc-butil (2-oksoetil)karbamata (0,20 g, 1,2 mmol, 0,24 ekviv.) u THF (1,0 mL) su dodate u kapima u intervalima na 20 min, 40 min na 4 h. HPLC je pokazao da je reakcija završena nakon 5,25 h. Reakciona smeša je sipana u ledeno hladan natrijum bikarbonat (500 mL) i ovaj rastvor je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Talog je sakupljen ceđenjem i ispran sa rastvorom soli. Dobijeni ostatak je pomešan sa heptanom (40 mL) i dietil etrom (40 mL) i mešan na sobnoj temperaturi tokom 5 h. Talog je sakupljen ceđenjem, ispran sa dietil etrom i osušen u vakuum sušnici da bi se dobio željen proizvod (1953 mg, 80,5%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.08 (m, 1H), 7.71 (m, 1H), 7.59 (t, 1H, J= 8.7 Hz), 6.94 (m, 1H), 6.52 (m, 1H), 3.32 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 1.36 (s, 9H); C17H18BrFN6O5(MW 485.26); LCMS (EI) m/e 507/509 (M<+>+ Na).

Korak F: 3-{4-[(2-aminoetil)amino]-1,2,5-oksadiazol-3-il}-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-on hidrohlorid (8)

[0266]

Postupak A (pripremljen iz terc-butil [2-({4-[2-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-2,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]karbamata; korak E):

[0267] U sud od 500-mL sipan je terc-butil[2-({4-[2-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-2,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]karbamat (20 g, 41,2 mmol) i izopropanol (255 mL). Suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi. Gas hlorovodonik (7,55g, 207 mmol, 5,0 ekviv.) je dodat u suspenziju sa staklenom cevi ispod površine tokom 16 min. Zatim je u sadržaj dodat etil acetat (111 mL) i reakcija je zagrevana do 43 °C i mešana tokom 7,5 h. Sadržaj je ohlađen na 19 °C i dodat je etil acetat (44 mL). Suspenzija je proceđena a dobijeni ostatak je ispran sa etil acetatom (2 x 55 mL). Izolovana čvrsta supstanca je osušena pod sniženim pritiskom na 45 °C tokom 15 h da bi se dobio željeni proizvod (16,61 g ,95,5% prinos) kao beličasta do bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.11 (bs, 3H), 7.78 (m, 1H), 7.73 (m, 1H), 7.59 (t, 1H, J= 8.7 Hz), 6.74 (t, 1H, J = 6.1 Hz), 3.50 (m, 2H), 3.02 (m, 2H); C12H11BrClFN6O3, (MW 421.61; C12H10BrFN6O3za slobodnu bazu, MW 385.15), LCMS (EI) m/e 385/387 (M<+>+ H).

Postupak B (pripremljen direktno iz 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona; korak D):

[0268] Natrijum triacetoksiborhidrid (2,33 g, 11,0 mmol, 11,0 ekviv.) je pomešan sa trifluorosirćetnom kiselinom (12,0 mL, 155,8 mmol, 155,8 ekviv.). Dobijeni rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 30 min. Rastvor 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona (5, 0,342 g, 1,0 mmol) i terc-butil (2-oksoetil)karbamata (Sigma-Aldrich) (1,04 g, 6,51 mmol, 6,5 ekviv.) u dihlormetanu (10,0 mL) i acetonitril (6,0 mL) je mešan pod N2. Ovaj rastvor je ohlađen na -5 °C i rastvor natrijum triacetoksiborhidrida i trifluorosirćetne kiseline je dodat u kapima tokom 5 min. Reakcija je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 h. HPLC i LC-MS (M<+>-Boc H: 385/387, bromidni uzorak) je pokazao da je odnos željenog proizvoda i polaznog materijala 4 prema 1. Smeša je koncentrovana i razblažena sa dihlormetanom (10 mL). Rastvor je ohlađen na 0 °C i 4 N natrijum hidroksid je lagano dodavan uz održavanje temperature na 0 -5 °C da bi se podesila pH na 8 -9. Vodeni sloj je ekstrahovan sa dihlormetanom (3 x 10 mL). Spojeni rastvor dihlormetana je ispran sa natrijum bikarbonatom i rastvorom soli, osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan. Sirovi ostatak je zatim rastvoren u dihlormetanu (6,0 mL) a dobijeni rastvor je ohlađen na 0 °C.4 N hlorovodonična kiselina u dioksanu (3,0 mL) je dodata u kapima na 0 -5 °C. Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 20 min. Talog je sakupljen ceđenjem, ispran sa dietil etrom, i osušen u vakuumu da bi se dobio željeni proizvod (289 mg, 54%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.11 (bs, 3H), 7.78 (m, 1H), 7.73 (m, 1H), 7.59 (t, 1H, J = 8.7 Hz), 6.74 (t, 1H, J = 6.1 Hz), 3.50 (m, 2H), 3.02 (m, 2H); C12H11BrClFN6O3, (MW 421.61; C12H10BrFN6O3za slobodnu bazu, MW 385.15), LCMS (EI) m/e 385/387 (M<+>+ H).

Korak G: terc-butil ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)karbamat (9)

[0269]

[0270] Stakleni reaktor od 20-L je napunjen sa 3-{4-[(2-aminoetil)amino]-1,2,5-oksadiazol-3-il}-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-on hidrohloridom (1200 g, 2,846 mol) i dihlormetanom (6,5 L) na sobnoj temperaturi. Trietilamin (950 g, 9,39 mol, 3,3 ekviv.) je dodat u šaržu tokom 7 minuta. Šarža je zatim ohlađena na -14.6 °C.

[0271] Balon sa okruglim dnom od 5-L je napunjen sa terc-butanolom (253 g, 3,41 mol, 1,2 ekviv.) i dihlormetanom (2,6 L). Rastvor je ohlađen na 0,9 °C. U ovaj rastvor je dodat hlorsulfonil izocijanat (463 g, 3,27 mol, 1,15 ekviv.) tokom 43 minuta uz održavanje temperature šarže ispod 10 °C. Dobijeni rastvor terc-butil (hlorsulfonil)karbamata je držan na 3 -5 °C tokom 1 h.

[0272] Rastvor terc-butil (hlorsulfonil)karbamata je dodat u reaktor 73 min uz održavanje temperature šarže ispod 0 °C. Smeša je zatim zagrevana na 10 °C tokom 1 h a zatim mešana na 10 -14 °C tokom 1 h. Voda (4,8 L) je dodata u šaržu i ugašena reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 14,5 h. Šarža je ostavljena da se slegne a faze odvoje. Rastvor dihlormetana je izolovan čuvan u reaktoru i dodata mu je sirćetna kiselina (513 g) tokom 25 min da bi se istaložio proizvod. Dobijena suspenzija je mešana na 20 °C tokom 2,5 h. Proizvod je izolovan ceđenjem i ispran sa dihlormetanom (1,8 L). Proizvod je osušen pod sniženim pritiskom (-30 u Hg) na 45 °C tokom 16 h da bi se dobio željeni proizvod (1342 g, 83,5% prinos) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.90 (s, 1 H), 8.08 (dd, J = 6.2, 2.5 Hz, 1 H), 7.72 (m, 1 H), 7.59 (t, J = 8.6 Hz, 1 H), 6.58 (t, J = 5.7 Hz, 1 H), 3.38 (dd, J= 12.7, 6.2 Hz, 2 H), 3.10 (dd, J= 12.1, 5.9 Hz, 2 H), 1.41 (s, 9 H). C17H19BrFN7O7S (MW 564.34), LCMS (EI) m/e 585.9/587.9 (M<+>+ Na).

Korak H: N-[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]sulfamid (10)

[0273]

4

[0274] U sud od 20-L koji sadrži terc-butil ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)karbamat (1200 g, 2,126 mol) je dodat etanol (12 L) na 20 °C. Dobijena smeša je mešana na sobnoj temperaturi i napunjena gasovitim hlorovodonikom (472 g, 12,9 mol, 6.07 ekviv.). Šarža je zagrevana do 50 °C a temperatura je održavana tokom 3 h do završetka reakcije. Rastvarač je uklonjen destilacijom u vakuumu na 33 -39 °C i 6 Kg destilata je sakupljeno. Etil acetat (6,8 L, 6,1 Kg) je dodat u šaržu i destilovan da sakupi 5,1 Kg destilata. Etil acetat (7,2 L, 6,48 Kg) je dodat u šaržu i destilovan da sakupi 5,1 Kg destilata. Etil acetat (2,4 L, 2,14 Kg) je dodat u šaržu da bi se podesio odnos rastvarača.<1>H NMR je pokazao da je molarni odnos etil acetata prem etanolu bio 1,0: 0,1. Rastvor je zagrevan do 65 °C. n-heptan (4,1 kg) je dodat u rastvor na 60 -65 °C tokom 43 min. Dobijena suspenzija je mešana na 65 °C tokom 1 h. Suspenzija je ohlađena na 20 °C tokom 2,5 h i mešana na toj temperaturi tokom 15 h. Proizvod je sakupljen ceđenjem i ispran sa n-heptanom (2,42 L). Proizvod je osušen pod sniženim pritiskom na 45 °C tokom 65 h da bi se dobio željeni proizvod (906 g, 91,8% prinos) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.08 (dd, J = 6.2) 7.72 (m, 1 H), 7.59 (t, J = 8.7 Hz, 1 H), 6.67 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 6.55 (s, 2H) 6.52 (t, J = 6.0 Hz, 1 H), 3.38 (dd, J = 12.7, 6.3 Hz, 2 H), 3.11 (dd, J = 12.3, 6.3 Hz, 2H); C12H11BrFN7O5S (MW 464.23), LCMS (EI) m/e 485.8/487.8 (M<+>- C5H8O2+ Na).

Korak I: 4-({2-[(aminosulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol -3-karboksimidamid (11)

[0275]

[0276] U stakleni reaktor od 20-L je dodat N-[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]sulfamid (799,4 g, 1,72 mol) i THF (3,2 L). Dobijeni rastvor je mešan na 20 °C tokom 7 min. a zatim napunjen sa vodom (1,6 L). Šarža je ohlađena na 2 °C i napunjena sa rastvorom 30 % mas. natrijum hidroksida (475 mL, 666,4 g, 4,99 mol, 2,9 ekviv.) tokom 8 minuta. Šarža je zagrejana na 20 °C a temperatura je održavana tokom 16 h. Smeša je zatim napunjena sa metil terc-butil etrom (8,0 L) preko 23 minuta. Voda (2,7 L) je dodata i šarža je ohlađena do oko 0 °C. Smeša je zatim napunjena sa 85 % mas. fosforne kiseline (370,7 g, 3,22 mol, 1,9 ekviv.) tokom 9 minuta. Šarža je zagrejana na 20 °C i mešana u toku 1 h. Šarža je ostavljena da se slegne a faze su odvojene. Organski sloj je zadržan u reaktoru i napunjen sa vodom (2,9 L) i 85 % mas. fosforne kiseline (370,7g, 3,22 mol) i mešan na 20 °C tokom 1 h. Šarža je ostavljena da se slegne a faze su odvojene. Organski sloj je zadržan u reaktoru i napunjen sa vodom (3,2 L) i mešan na 20 °C tokom 1 h. Šarža je ostavljena da se slegne a faze su odvojene. Organski rastvor je zadržan u reaktoru i destilovan pod sniženim pritiskom na 20 °C da se ukloni 3,4 Kg destilata. Etanol (4,8 L) je dodat u šaržu i šarža je destilovana do zapremine od 3,2 L. Ovaj postupak destilacije je ponovljen još jednom. Etanol (0,6 L) je dodat u šaržu da bi se podesilazapremina šarže na 4 L. Šarža je mešana na 20 °C tokom 16 h a zatim napunjena sa vodom (6,39 L). Nastala suspenzija je mešana na 20 °C tokom 5 h. Proizvod je sakupljen ceđenjem i ispran dva puta smešom etanola (529 mL) i vode (1059 mL). Proizvod je osušen pod sniženim pritiskom na 45 °C tokom 65 h da bi se dobio željeni proizvod (719,6 g, 95.4%) kao bela čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 11.51 (s, 1 H), 8.90 (s, 1 H), 7.17 (t, J= 8.8 Hz, 1 H), 7.11 (dd, J = 6.1, 2.7 Hz, 1 H), 6.76 (m, 1 H), 6.71 (t, J= 6.0 Hz, 1 H), 6.59 (s, 2 H), 6.23 (t, J = 6.1 Hz, 1 H), 3.35 (dd, J = 10.9, 7.0 Hz, 2 H), 3.10 (dd, J= 12.1, 6.2 Hz, 2 H); C11H13BrFN7O4S (MW 438.23), LCMS (EI) m/e 437.9/439.9 (M<+>+ H).

Primer 2. Alternativno pripremanje N-[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]sulfamida

[0277]

Korak 1: Etil {[(terc-butoksikarbonil)-amino]sulfonil}aminoacetat (13)

[0278]

[0279] Rastvor hlorsulfonilizocijanata (Sigma-Aldrich) (5,0 mL, 57,4 mmol) u dihlormetanu (100 mL) je ohlađen na 0 °C. Terc-butil alkohol (4,26 g, 57,4 mmol, 1,0 ekviv.) je dodat dihlormetanu (100 mL) preko kapalice. Ovaj rastvor je mešan na 0 °C tokom 30 min. Glicinski etil estar hidrohlorid (8,82 g, 63,2 mmol, 1,1 ekviv.) je dodat nakon čega sledi dodavanje trietilamina u kapima (20,0 mL, 144 mmol, 2,5 ekviv.) na 0 °C. Ova reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 4 h. Reakcija je razblažena sa dihlormetanom (100 mL) i isprana sa 0,1 N hlorovodoničnom kiselinom i rastvorom soli. Organski sloj je osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan da bi se dobio željen proizvod (13,2 g, 81,4 %) kao sirova beličasta čvrsta supstanca, koja je korišćena u narednoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.88 (s, 1H), 8.07 (t, 1H, J = 6.1 Hz), 4.08 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 3.78 (d, 2H, J = 6.1 Hz), 1.40 (s, 9H), 1.18 (t, 3H, J = 7.1 Hz).

Korak 2a. Etil (alil{[alil(terc-butoksikarbonil)amino]sulfonil}amino)acetat (14a)

[0280]

[0281] Etil ({[(terc-butoksikarbonil)amino]sulfonil}aminoacetat (1,0 g, 3,54 mmol) je pomešan sa kalijum karbonatom (2,45 g, 17,7 mmol, 5,0 ekviv.) i acetonitrilom (23,0 mL) pod N2na sobnoj temperaturi. Alil bromid (1,84 mL, 21,2 mmol, 6,0 ekviv.) je dodat u kapima. Ova reakciona smeša je zagrevana do 70 °C i mešana na toj temperaturi tokom 14 h. HPLC i LCMS su pokazali da je reakcija završena. Reakcija je proceđena i filtrat je koncentrovan. Ostatak je rastvoren u dihlormetanu i ispran sa natrijum bikarbonatom i rastvorom soli. Organski sloj je osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan da bi se dobio željen proizvod (1,11 g, 87 %) kao sirova beličasta čvrsta supstanca, koja je korišćena u narednoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 5.75 (m, 2H), 5.20 (m, 4H), 4.12 (m, 6H), 3.89 (m, 2H), 1.43 (s, 9H), 1.18 (t, 3H, J = 8.7 Hz).

Korak 2b. Etil [{[(terc-butoksikarbonil)(4-metoksibenzil)amino]sulfonil}(4-metoksibenzil)amino]acetat (14b)

[0282]

[0283] Etil ({[(terc-butoksikarbonil)amino]sulfonil}amino)acetat (1,00 g, 4,0 mmol) je pomešan sa N,N-dimetil-formamidom (DMF, 6,0 mL) i mešan na sobnoj temperaturi. Natrijum jodid (0,01 g, 0,1 mmol, 0,025 ekviv.), kalijum karbonat (2,40 g, 20 mmol, 5,0 ekviv.) i para-metoksibenzil hlorid (2,64 mL, 19,5 mmol, 4,875 ekviv.) su dodati u smešu. Ova reakcija je zagrevana na 80 °C i mešana na 80 °C tokom 2 h. LCMS je pokazala da je reakcija završena. Reakcija je ohlađena na sobnoj temperaturi i proceđena kroz celit. Celit je ispran sa dihlormetanom i spojeni organski filtrati su koncentrovani. Koncentrovan ostatak je rastvoren u dihlormetanu (20 mL) i ispran sa natrijum bikarbonatom (5 x 12 mL) i rastvorom soli. Organski sloj je osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan. Ostatak je prečišćen na silikagelu (0 -40% etil acetat/heksan gradijent eluiranja) da bi se dobio željen proizvod (1,39 g, 80%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 7.22 (m, 2H), 7.14 (m, 2H), 6.88 (m, 4H), 4.64 (s, 2H), 4.33 (s, 2H), 4.03 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 3.92 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 1.39 (s, 9H), 1.14 (t, 3H, J = 7.1 Hz).

4

Korak 3a. terc-butil alil{[alil(2-oksoetil)amino]sulfonil}karbamat (15a)

[0284]

[0285] Rastvor etil (alil{[alil(terc-butoksikarbonil)amino]sulfonil}amino)acetata (1,11 g, 3,05 mmol) u dihlormetanu (15 mL) na -78 °C ispod N2je tretiran sa 1,0 M diizobutilaluminijum hidridom u dihlormetanu (3.,66 mL, 3,66 mmol, 1,2 ekviv.). Reakciona smeša je mešana na -78 °C tokom 1 h a zatim zaustavljena sa metanolom (1,5 mL) i tretirana sa zasićenim rastvorom natrijum kalijum tartrata (65 mL). Ovaj rastvor je mešan na sobnoj temperaturi preko noćit. Vodeni sloj je zatim ekstrahovan sa dihlormetanom (3 x 20 mL). Spojeni rastvor dihlormetana je ispran sa rastvorom soli, osušen iznad natrijum sulfata, proceđen, i koncentrovan da bi se dobio željen proizvod (0,62 g, 64 %) kao sirovo gusto bezbojno ulje, koje je korišćeno u sledećoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.45 (s, 1H), 5.76 (m, 2H), 5.18 (m, 4H), 4.15 (m, 4H), 3.72 (m, 2H), 1.43 (s, 9H).

Korak 3b. terc-butil (4-metoksibenzil){[(4-metoksibenzil)(2-oksoetil)amino]sulfonil}karbamat (15b)

[0286]

[0287] Rastvor etil [{[(terc-butoksikarbonil)(4-metoksibenzil)amino]sulfonil}(4-metoksibenzil)amino] acetata (5,30 g, 10 mmol) u dihlormetanu (20,0 mL) na -78 °C pod N2je tretiran sa 1,0 M diizobutilaluminijum hidridom u dihlormetanu (12,2 mL, 12,2 mmol, 1,22 ekviv.). Reakciona smeša je mešana na -78 °C tokom 3 h. Reakcija je zatim zaustavljena sa metanolom (3 mL) i tretirana sa dihlormetanom (100 mL) i zasićenim rastvorom natrijum kalijum tartrata (150 mL). Ovaj rastvor je mešan na sobnoj temperaturi preko noći. Vodeni sloj je zatim ekstrahovan sa dihlormetanom (3 x 20 mL). Spojeni rastvor dihlormetana je ispran sa rastvorom soli, osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan. Ostatak je zatim prečišćen na silikagelu (0 -30% etil acetat/ heksan gradijent eluiranja) da bi se dobio željen proizvod (3,45 g, 71%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 9.24 (s, 1H), 7.23 (m, 4H), 6.88 (m, 4H), 4.68 (s, 2H), 4.31 (s, 2H), 4.07 (s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.71 (s, 3H), 1.40 (s, 9H).

Korak 4a. terc-butil alil(N-alil-N-(2-(4-(4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)-1,2,5-oksadiazol-3-ilamino)etil)sulfamoil)karbamat (16a)

[0288]

[0289] U sud od 50-mL je dodat natrijum triacetoksiborhidrid (1,06 g, 5,0 mmol, 1,0 ekviv.), trifluorosirćetna kiselina (TFA, 2,0 mL, 26 mmol) i tetrahidrofuran (THF, 1,0 mL) na temperaturi okoline. Ova smeša je ohlađena na -5 °C pod N2i mešana na 0 -5 °C tokom 10 min. U ovaj rastvor je dodat 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-on (0,171 g, 5,0 mmol; korak D) i terc-butil alil{[alil(2-oksoetil)amino]sulfonil}karbamat (0,398 g, 2,5 mmol, 0,5 ekviv.) u THF (1,5 mL) u kapima na 0 -5 °C tokom 5 min. Dobijena reakciona smeša je mešana pod N2na 0 -5 °C. U vremenskim tačkama na 20 min, 40 min, i 2,5 h, rastvor terc-butil alil{[alil(2oksoetil)-amino]sulfonil}karbamata (0,040 g, 0,125 mmol, 0,25 ekviv.) u THF (0,20 mL) je dodat u kapima na 0 -5 °C. Na 2,5 h, rastvor natrijum triacetoksiborhidrida (0,211 g, 1,0 mmol, 0,2 ekviv.) u trifluorosirćetnoj kiselini (TFA, 1,5 mL, 9,5 mmol) je dodat na 0 -5 °C. Reakcija je zagrevana do sobne temperature i mešana preko noći. Reakciona smeša je zatim sipana u ledeno hladan zasićen rastvor natrijum karbonata (50 mL) i ekstrahovan sa dihlormetanom (3 x 20 mL). Spojeni ekstrakti dihlormetana su isprani sa rastvorom soli, osušeni iznad natrijum sulfata, i koncentrovani. Ostatak je zatim prečišćen na silikagelu (0 -75% etil acetat/heksan gradijent eluiranja) da bi se dobio željen proizvod (0,239 g, 74,2%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.07 (m, 1H), 7.71 (m, 1H), 7.58 (t, 1H, J = 8.7 Hz), 6.62 (m, 1H), 5.77 (m, 2H), 5.19 (m, 4H), 4.17 (m, 2H), 3.89 (m, 2H), 3.44 (m, 2H), 3.38 (m, 2H), 1.42 (s, 9H); C23H27BrFN7O7S (MW 644.47), LCMS (EI) m/e 544/546 (M<+>- Boc H).

Korak 4b. terc-butil N-(2-(4-(4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il)-1,2,5-oksadiazol-3-ilamino)etil)-N-(4-metoksibenzil)sulfamoil(4-metoksibenzil)karbamat (16b)

[0290]

[0291] U sud od 50-mL je dodat natrijum triacetoksiborhidrid (0,50 g, 2,37 mmol, 4,74 ekviv.), trifluorosirćetna kiselina (TFA, 1,0 mL, 13 mmol) i tetrahidrofuran na temperaturi okoline. Ova smeša je ohlađena na 0 -5 °C pod N2i mešana na 0 -5 °C tokom 10 min. U ovaj rastvor je dodat terc-butil (4-metoksibenzil){[(4-metoksibenzil)(2-oksoetil)amino]sulfonil}karbamat (0,40 g, 0,84 mmol, 1,68 equiv) i 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-on (0,17 g, 0,50 mmol; korak D) u tetrahidrofuranu (THF, 1,50 mL) na 0 -5 °C. Reakcija je mešana na 0 -5 °C tokom 45 min a zatim je dodat rastvor terc-butil (4-metoksibenzil){[(4-metoksibenzil)(2-oksoetil)amino]sulfonil}-karbamata (0,12 g, 0,20 mmol, 0,4 ekviv.) u THF (0,50 mL) na 0 -5 °C. Posle mešanja na 0 -5 °C tokom 1 h, reakcija je postepeno zagrevana do sobne temperature uz mešanje. U vremenskim tačkama na 2,5 h i 4,5 h, dodata je trifluorosirćetna kiselina (0,25 mL). Na 5 h, dodat je rastvor terc-butil (4-

4

metoksibenzil) {[(4-metoksibenzil)(2-oksoetil)amino]sulfonil}karbamata (0,060 g, 0,1 mmol, 0,2 ekviv.) u THF (0,20 mL). Na 6,5 h, dodat je rastvor natrijum triacetoksiborhidrida (0,060 g, 0,24 mmol, 0,48 ekviv.) u trifluorosirćetnoj kiselini (0,25 mL). HPLC je pokazala da je još uvek preostalo približno 4% 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona polaznog materijala (iz koraka D). Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. HPLC je pokazala da je reakcija završena. Reakciona smeša je sipana u ledeno hladan zasićen rastvor natrijum karbonata (50 mL) i smeša je ekstrahovana sa dihlormetanom (3 x 20 mL). Spojeni ekstrakti dihlormetana su isprani sa rastvorom soli, osušeni iznad natrijum sulfata, i koncentrovani. Ostatak je zatim prečišćen na silikagelu (0 -30% etil acetat/heksan gradijent eluiranja) da bi se dobio željen proizvod (0,33 g, 82,5%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8.06 (m, 1H), 7.69 (m, 1H), 7.57 (t, 1H, J = 8.7 Hz), 7.22 (m, 4H), 6.87 (m, 4H), 6.48 (m, 1H), 4.72 (s, 2H), 4.36 (s, 2H), 3.70 (S, 6H), 3.39 (m, 2H), 3.31 (m, 2H), 1.37 (s, 9H); C33H35BrFN7O9S (MW 804.64), LCMS (EI) m/e 826/828 (M<+>-Boc Na).

Korak 5: N-[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol -3-il}amino)etil]sulfamid (10)

[0292]

[0293] U sud od 25-mL je dodat terc-butil {[[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil](4-metoksibenzil)amino]sulfonil}(4-metoksibenzil)karbamat (40,2 mg, 0,050 mmol) u trifluorosirćetnoj kiselini (TFA, 0,50 mL, 6,5 mmol) na temperaturi okoline. Ova reakciona smeša je zagrevana do 70 °C pod N2i mešana tokom 1 h. HPLC je pokazao da je reakcija završena. Reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i TFA je uparen. Preostali TFA je uklonjen tretiranjem sa dihlormetanom (3 x 10 mL)nakon čega sledi uparavanje u vakuumu. Ostatak je triturisan sa dihlormetanom i metanolom da bi se dobio željen proizvod (20 mg, 87%) kao sirova beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.08 (dd, J = 6.2, 2.5 Hz, 1 H), 7.72 (m, 1 H), 7.59 (t, J = 8.7 Hz, 1 H), 6.67 (t, J = 5.9 Hz, 1H), 6.55 (s, 2H) 6.52 (t, J = 6.0 Hz, 1 H), 3.38 (dd, J = 12.7, 6.3 Hz, 2 H), 3.11 (dd, J = 12.3, 6.3 Hz, 2H); C12H11BrFN7O5S (MW 464.23), LCMS (EI) m/e 487.8/489.8 (M<+>+ Na).

Primer 3. Alternativno pripremanje N-[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il)amino)etil]sulfamida

[0294]

4

Korak 1a. terc-butil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat (17a)

[0295]

[0296] Rastvor hlorsulfonilizocijanata (11,32 g, 80 mmol) u dihlormetanu (120 mL) je ohlađen na 0 °C. Terc-butil alkohol (7,65 mL, 80,0 mmol, ,.0 ekviv.) je dodat preko kapalice. Smeša je mešana na 0 °C tokom 1,5 h. U ovua smešu, dodat je rastvor aminoacetaldehid dimetil acetala (8,76 mL, 80,0 mmol, 1,0 ekviv.) i trietilamina (TEA, 33,4 mL, 240 mmol, 3,0 ekviv.) u metilen hloridu (DCM 120.0 mL) u kapima preko kapalice. Reakcija je zagrevana do sobne temperature i mešana preko noći. Reakcija je tretirana sa 0,1 N hlorovodoničnom kiselinom a organski sloj je ispran sa rastvorom soli, osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan da bi se dobio željen proizvod (15,6 g, 68,5 %) kao sirova beličasta čvrsta supstanca, koja je korišćena za sledeću reakciju bez daljeg prečišćavanja:<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.84 (s, 1H), 7.62 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 4.38 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 3.24 (s, 6H), 2.96 (dd, 2H, J = 5.8 Hz), 1.41(s, 9H).

Korak 1b. Benzil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat (17b)

[0297]

4

[0298] Rastvor hlorsulfonilizocijanata (16,26 g, 114,9 mmol) u dihlormetanu (100 mL) je ohlađen na 0 °C. Benzil alkohol (12,44g, 115,0 mmol, 1,0 ekviv.) je dodat preko kapalice. Smeša je mešana na 0 °C tokom 0,5 h. U ovu smešu je dodata smeša aminoacetaldehid dimetil acetala (13,25 g,126,0 mmol, 1,1 ekviv.) i trietilamina (TEA, 17,4 g, 172 mmol, 1,5 ekviv.) u kapima preko kapalice na ispod 15 °C. Reakcija je zagrevana do sobne temperature i mešana preko noći. Reakciona smeša je tretirana sa 0,5 N hlorovodoničnom kiselinom (100 mL) i sakupljena organska faza isprana sa rastvorom soli, osušena iznad natrijum sulfata i koncentrovana u vakuumu da bi se dobio željen proizvod (23,5 g, 64,3 %) kao sirova beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.29 (s, 1H), 7.90 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 7.37 (m, 5H), 5.12 (s, 2H), 4.35 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 3.21 (s, 6H), 2.97 (dd, 2H, J = 5.8 Hz).

Korak 1c. Etil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat (17c)

[0299]

[0300] Rastvor hlorsulfonilizocijanata (11,32 g, 80 mmol) u dihlormetanu (120 mL) je ohlađen na 0 °C. Etanol (4,67 mL, 80,0 mmol, 1,0 ekviv.) je dodat preko kapalice. Smeša je mešana na 0 °C tokom 1,5 h. U ovu smešu je dodat rastvor aminoacetaldehid dimetil acetala (8,76 mL,80,0 mmol, 1,0 ekviv.), trietilamina (TEA, 33,4 mL, 240 mmol, 3,0 ekviv.) u dihlormetanu (DCM, 120,0 mL) u kapima preko kapalice 0 °C. Reakcija je zagrevana do sobne temperature i mešana preko noći. Reakcija je tretirana sa 0,1 N hlorovodoničnom kiselinom i sakupljena organska faza isprana sa rastvorom soli, osušena iznad natrijum sulfata i koncentrovana u vakuumu da bi se dobio željen proizvod (11,2 g, 55 %) kao sirova beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.13 (s, 1H), 7.81 (t, 1H, J = 6.0 Hz), 4.37 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 4.09 (q, 2H, J = 7.1 Hz), 3.23 (s, 6H), 2.97 (dd, 2H, J = 5.8 Hz), 1.19 (t, 3H, J = 7.1 Hz).

Korak 1d.2,2,2-trihloretil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat (17d)

[0301]

[0302] Rastvor hlorsulfonilizocijanata (6,96 mL, 80 mmol) u dihlormetanu (120 mL) je ohlađen na 0 °C. Dodat je 2,2,2-trihloretanol (7,67 mL, 80,0 mmol, 1,0 ekviv.) preko kapalice na 0 °C. Ova smeša je mešana na 0 °C tokom 1,5 h. U ovu smešu je zatim dodat rastvor aminoacetaldehid dimetil acetala (8,76 mL,80,0 mmol, 1,0 ekviv.) i dodat je trietilamin (TEA, 33,4 mL, 240 mmol, 3,0 ekviv.) u dihlormetanu (DCM, 120,0 mL) u kapima preko kapalice na 0 °C. Reakcija je zagrevana do sobne temperature i mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Reakcija je tretirana sa 0,1 N hlorovodoničnom kiselinom i sakupljena organska faza isprana sa rastvorom soli, osušena iznad Na2SO4, i koncentrovana da bi se dobio željen proizvod (28,01 g, 97 %) kao sirova beličasta čvrsta supstanca, koja je korišćena u narednoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.79 (s, 1H), 8.08 (t, 1H, J = 5.9 Hz), 4.90 (s, 2H), 4.37 (t, 1H, J = 5.5 Hz), 3.23 (s, 6H), 3.00 (dd, 2H, J = 5.7 Hz).

4

Korak 2a. Terc-butil ({[2-({[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)karbamat (18a)

[0303]

[0304] Smeša 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona (103 mg, 0,302 mmol, 1,5 ekviv.; korak D) i terc-butil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamata (57,2 mg, 0,201 mmol) u dihlormetanu (1,0 mL) je mešana pod N2na sobnoj temperaturi. U ovu smešu je dodata trifluorosirćetna kiselina (0,50 mL, 6,5 mmol) i trietilsilan (80,2 mL, 0,502 mmol, 2,5 ekviv.) u kapima. Ova reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 2 h. HPLC je pokazao približno 30% konverzije. Reakciona smeša je ohlađena na 0 °C i zaustavljena sa zasićenim natrijum bikarbonatom na pH ∼ 8. Smeša je ekstrahovana u etil acetatu (3 x 10 mL). Spojeni organski ekstrakti su isprani sa rastvorom soli, osušeni iznad natrijum sulfata i koncentrovani. Ostatak je prečišćen prepatrativnom TLC (50% etil acetat/heksan) da bi se dobio željeni proizvod (27,5 mg, 29,5%) kao beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ 10.90 (s, 1H), 8.08 (dd, J = 6.2, 2.5Hz, 1H), 7.72 (m, 1H), 7.59 (t, J = 8.6Hz, 1H), 6.58 (t, J = 5.7Hz, 1H), 3.38 (dd, J = 12.7, 6.2Hz, 2H), 3.10 (dd, J = 12.1, 5.9Hz, 2H), 1.41 (s, 9H). C17H19BrFN7O7S (MW 564.34), LCMS (EI) m/e 485.8/487.8 (M<+>- C5H8O2+ Na).

Korak 2b. Benzil ({[2-({[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)karbamat (18b)

[0305]

[0306] Smeša 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona (68 mg, 0,20 mmol; iz koraka D) i benzil {[(2,2-dimetoksietil)amino]sulfonil}karbamata (191 mg, 0,60 mmol, 3,0 ekviv.) u 1,2-dihloretanu (3,0 mL) je ohlađena na 0 °C. U ovu smešu je dodata trifluorosirćetna kiselina (1,0 mL, 13,0 mmol) i trietilsilan (105 µL, 0,66 mmol, 3,3 ekviv.) u kapima. Ova reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 2 h. HPLC je pokazala da je reakcija završena. Reakciona smeša je ohlađena na 0 °C i ugašena sa zasićenim natrijum bikarbonatom na pH ∼ 8. i ugašena reakciona smeša je ekstrahovana sa EtOAc (3 x 10 mL). Spojeni organski ekstrakti su isprani sa rastvorom soli, osušeni iznad natrijum sulfata i koncentrovani. Ostatak je zatim mešan u smeši heptana i dietil etra preko noći. Čvrste supstance su sakupljene ceđenjem, isprane sa heptanom i osušene u vakuumu da bi se dobio željeni proizvod (125 mg, 99%) kao sirova beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR

4

(300 MHz, DMSO-d6) δ 11.31 (s, 1H), 8.05 (m, 1H), 7.87 (m, 1H), 7.68 (m, 1H), 7.56 (m, 1H), 7.32 (m, 5H), 6.54 (m, 1H), 5.07 (s, 2H), 3.29 (m, 2H), 3.09 (m, 2H); C20H17BrFN7O7S (MW 598.36), LCMS m/e 598/600 (M<+>+ H).

Korak 2c. Etil ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etilamino}sulfonil)karbamat (18c)

[0307]

[0308] Smeša 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona (68 mg, 0,20 mmol; iz koraka D) i etil {[(2,2-dimetoksietil)amino]sulfonil}karbamata (154 mg, 0,600 mmol, 3,0 ekviv.) u 1,2-dihloretanu (2,50 mL, 31,7 mmol) je mešana na 0 °C. U ovu smešu je dodata trifluorosirćetna kiselina (1,00 mL, 13,0 mmol) i trietilsilan (105 µL, 0,66 mmol, 3,3 ekviv.) = u kapima. Reakciona smeša je mešana na 0 °C tokom 3 h. HPLC je pokazao 97,5% konverzije u željeni proizvod. Reakciona smeša je ohlađena na 0 °C i zaustavljena sa zasićenim natrijum bikarbonatom na pH ∼ 8. Smeša je ekstrahovana u etil acetatu (3 x 10 mL). Spojeni organski ekstrakti su isprani sa rastvorom soli, osušeni iznad natrijum sulfata i koncentrovani. Ostatak je mešan u smeši heptana i dietil etra preko noći. Čvrste supstance su sakupljene ceđenjem, isprane sa heptanom da bi se dobio željeni proizvod (95 mg, 88%) kao sirova beličasta čvrsta supstanca.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.18 (s, 1H), 8.08 (m, 1H), 7.70 (m, 2H), 7.59 (t, 1H, J = 8.7 Hz), 6.56 (s, 1H), 4.04 (d, 2H, J = 7.2 Hz), 3.35 (m, 2H), 3.11 (m, 2H), 1.15 (t, 3H, J = 7.2 Hz); C15H15BrFN7O7S (MW 536.29), LCMS (EI) m/e 536/538 (M<+>+ H).

Korak 2d. 2,2,2-trihloretil ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)karbamat (18d)

[0309]

[0310] Suspenzija 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol-5(4H)-ona (5, 0,680 g, 1,99 mmol) i 2,2,2-trihloretil {[(2,2-dimetoksietil)amino]sulfonil}karbamata (17d, 2,22 g, 6,17 mmol, 3,1 ekviv.) u dihlormetanu (DCM, 6,0 mL) je mešana na sobnoj temperaturi. U ovu smešu je dodat trietilsilan (1,27 mL, 7,95 mmol, 4,0 ekviv.) i rastvor trifluorosirćetne kiseline (TFA, 3,0 mL, 39,0 mmol) u dihlormetanu (DCM, 2,0 mL) dok je temperatura reakcije održavana ispod 30 °C. Reakciona smeša je postala homogena nakon 5 min uz mućkanje na sobnoj temperaturi i mešana je na sobnoj temperaturi tokom 1 h. HPLC je pokazala da je reakcija završena. Reakcija je proceđena a talog je suspendovan u smeši dihlormetana i heptana (odnos dihlormetana prema heptanu je bio 1 prema 9 po zapremini). Suspenzija je mešana na sobnoj temperaturi preko noći. Talog je sakupljen ceđenjem i ispran sa 10% dihlormetana u heptanu i osušen u vakuumu da bi se dobio željeni proizvod (1,15 g, 90,4%) kao beličasta čvrsta supstanca, koja je korišćena u narednoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.85 (s, 1H), 8.07 (m, 2H), 7.70 (m, 1H), 7.57 (t, 1H, J = 8.7 Hz), 6.56 (m, 1H), 4.88 (m, 2H), 3.37 (m, 2H), 3.16 (m, 2H); C15H12BrCl3FN7O7S (MW 639.62), LCMS (EI) m/e 638/640/642 (M<+>+ H).

Korak 3. N-[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol -3-il}amino)etil]sulfamid (10)

[0311]

[0312] Rastvor 2,2,2-trihloretil ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)karbamata (320 mg, 0,50 mmol; iz koraka Q, postupak D) u tetrahidrofuranu (THF, 4,0 mL) je mešan na sobnoj temperaturi. Sirćetna kiselina (0,30 mL, 5,3 mmol) i pahuljice cinka (160 mg, 2,5 mmol, 5,0 ekviv.) su uzastopno dodavani. Ova reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 3 h. HPLC je pokazala da je reakcija završena. Reakciona smeša je proceđena kroz celit i celit je ispran sa THF. Spojeni filtrat je koncentrovan u vakuumu a dobijeni ostatak je rastvoren u etil acetatu (20 mL). Rastvor etil acetata je ispran sa zasićenim natrijum karbonatom i rastvorom soli, osušen iznad natrijum sulfata i koncentrovan. Sirov materijal je kristalizovao iz etil acetata i dietil etra da bi se dobio željeni proizvod (147 mg, 63%) kao beličasta čvrsta supstanca.

Primer 4. Alternativno pripremanje 4-({2-[(aminosulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamida

[0313]

1

Korak 1. (9H-fluoren-9-il)metil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat

[0314]

[0315] U sušnici osušen balon sa okruglim dnom sa 4 grla od 2 L je napunjen sa 9-fluorenilmetanolom (50,0 g, 255 mmol) i anhidrovanim DCM (382 mL) na sobnoj temperaturi. Dobijena suspenzija je ohlađena u ledenom kupatilu do oko 0 -5 °C. Rastvor hlorsulfonil izocijanata (CSI, 23,0 mL, 264 mmol) u anhidrovanom DCM (127 mL) je dodat u kapima u suspenziju preko kapalice tokom 22 minuta, održavajući temperaturu reakcione smeše na < 5°C. Dobijena smeša je mešana na 0 -5 °C tokom 1,75 h, stvarajući gustu belu suspenziju. Rastvor aminoacetaldehid dimetil acetala (27,9 mL, 255 mmol) u anhidrovanom DCM (382 mL) i 4-metilmorfolina (84,0 mL, 764 mmol) su dodati u smešu na oko 0 -5 °C tokom 71 minuta. Dobijena reakciona smeša je zatim mešana u ledenom kupatilu tokom 1,5 sati. Kada je HPLC pokazala da je reakcija završena, reakciona smeša je zakišeljena dodavanjem u kapima 1,0 M fosforne kiseline (H3PO4, aq., 640 mL) tokom 22 minuta na pH 1 -2. Voda (300 mL), EtOAc (2150 mL) i heptan (250 mL) su zatim dodati i dobijena smeša je mešana tokom 10 minuta. Dve faze su odvojene i organska faza je isprana uzastopno sa vodom (500 mL), heptanom (300 mL) i vodom (2 x 500 mL) i osušena iznad MgSO4. Filtrat je koncentrovan pod vakuumom do suva. Dobijene čvrste supstance su ponovo rastvorene u EtOAc (600 mL) na 65 °C i topao rastvor je proceđen u čist balon sa okruglim dnom od 3 L. Filtrat je ohlađen na sobnu temperaturu i mešan tokom 2,5 h pre heptana (1200 mL) koji je zatim dodat preko kapalice tokom 80 min. Posle mešanja preko noći na sobnoj temperaturi, smeša je zatim ohlađena na ledenom kupatilu tokom 1 h. Dobijene čvrste supstance su sakupljene ceđenjem, isprane sa 25% EtOAc/heptan (250 mL), i osušene preko noći na oko 40 -45°C pod vakuumom da bi se dobio 9H-fluoren-9-ilmetil {[(2,2-dimetoksietil)amino]sulfonil}karbamat (91,3 g, 88% prinos) kao beli

2

prah.<1>H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11.43 (s, 1H), 7.98 -7.85 (m, 3H), 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.43 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 7.33 (td, J = 7.4, 1.1 Hz, 2H), 4.44 -4.33 (m, 3H), 4.33 -4.22 (m, 1H), 3.23 (s, 6H), 2.99 (t, J = 5.8 Hz, 2H) ppm.

Korak 2.9H-fluoren-9-ilmetil ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino}sulfonil)karbamat

[0316]

[0317] U mešanu suspenziju 3-(4-amino-1,2,5-oksadiazol-3-il)-4-(3-bromo-4-fluorofenil)-1,2,4-oksadiazol- (4H)-ona (10,00 g, 29,23 mmol) u DCM (160 mL) dodata je metansulfonska kiselina (MeSO3H, 8,46 g, 88,04 mmol) i trietilsilan (Et3SiH, 8,37 g, 71,96 mmol) na temperaturi okoline tokom 10 minuta da se dobije suspenzija. Čvrst 9H-fluoren-9-ilmetil{[(2,2-dimetoksietil)-amino]sulfonil}karbamat (12,25 g, 30,14 mmol) je dodat u porcijama (1 g/3 -4 min; tokom 1 h) dok se održavala unutrašnja temperatura na manje od oko 20 °C upotrebom vodenog kupatila. Nakon dodavanja, dobijena smeša je mešana na oko 13 do 22 °C tokom 3 dana. Dodatni trietilsilan (Et3SiH, 0,1755 g, 1,51 mmol) i 9H-fluoren-9-ilmetil{[(2,2-dimetoksietil)amino]-sulfonil}karbamat (0,3082 g, 0,76 mmol) su dodati i dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline tokom dodatnih 23 h. Dodat je izopropil alkohol (IPA, 15 mL) i dobijena smeša je mešana na temperaturi okoline tokom 1 h. Dodat je heptan (100 mL) i smeša je mešana na temperaturi okoline tokom dodatnih 2 h. Čvrste supstance su sakupljene ceđenjem, isprane sa IPA/heptan (1/5; 2 x 30 mL) i heptanom (2 x 30 mL), i osušene pod vakuumom da bi se dobio 9H-fluoren-9-ilmetil ({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]-amino}sulfonil)karbamat kao bela čvrsta supstanca (18,30 g, 91,1% prinos).<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 11.44 (s, 1H), 8.07 (dd, J = 6.2, 2.5 Hz, 1H), 7.90 (t, J = 5.6 Hz, 1H), 7.88 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.72 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.71 (ddd, J = 8.9, 4.3, 2.6 Hz, 1H), 7.57 (dd, J = 8.7, 8.7 Hz, 1H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.31 (td, J = 7.4, 1.0 Hz, 2H), 6.55 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 4.35 (d, J = 7.3 Hz, 2H), 4.25 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 3.39 (q, J = 6.4 Hz, 2H), 3.15 (q, J = 6.3 Hz, 2H);<13>C NMR (126 MHz, DMSO-d6) δ 159.03 (d, J = 248.7 Hz), 156.61 (s), 155.22 (s), 151.55 (s), 148.67 (s), 143.29 (s), 140.68 (s), 133.82 (s), 133.39 (s), 130.05 (d, J = 8.5 Hz), 128.54 (d, J = 3.2 Hz), 127.73 (s), 127.07 (s), 125.24 (s), 120.11 (s), 117.42 (d, J = 24.0 Hz), 108.19 (d, J = 22.5 Hz), 66.70 (s), 46.17 (s), 43.34 (s), 40.79 (s) ppm;<19>F NMR (376 MHz, DMSO-d6) δ -103.99 --107.39 (m) ppm.

Korak 3. 4-({2-[(aminosulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamid

[0318]

[0319] Balon sa okruglim dnom sa 4 grla od 1 L je napunjen sa 9H-fluoren-9-ilmetil({[2-({4-[4-(3-bromo-4-fluorofenil)-5-okso-4,5-dihidro-1,2,4-oksadiazol-3-il]-1,2,5-oksadiazol-3-il}amino)etil]amino} sulfonil)karbamatom (25,0 g, 36,4 mmol) i anhidrovanim THF (250 mL) na temperaturi okoline da se dobije homogeni rastvor. Rastvor je zatim ohlađen na 0 -5 °C na ledenom kupatilu pre N,N-bis(2-aminoetil)etan-1,2-diamina (114 mL, 728 mmol) koji je dodat u kapima tokom 35 minuta preko kapalice. Kapalica je isprana sa anhidrovanim THF (50 mL) i ispiranje je dodato u reakcionu smešu. Hladno kupatilo je uklonjeno i reakcija je postepeno zagrevana do temperature okoline i mešana na temperaturi okoline tokom 2,5 h. Dodat je EtOAc (400 mL) i dobijena smeša je preneta u balon sa okruglim dnom sa 4 grla od 2 L i ohlađena do oko 0 -5 °C na ledenom kupatilu. Rastvor 2,0 M vodenog HCl (400 mL, 800,0 mmol) je dodat u kapima preko kapalice, uz održavanje unutrašnje temperature ispod 10 °C. Dve faze su odvojene a vodena faza je ekstrahovana sa EtOAc (200 mL). Organske frakcije su spojene i ohlađene do oko 6-7 °C. Rastvor 2,0 M vodenog HCl (200,0 mL, 400,0 mmol) je dodat u kapima u hladnu organsku frakciju, održavajući unutrašnju temperaturu ispod 10°C. Dve faze su odvojene i organska faza je isprana sa vodom (2 x 400 mL), osušena iznad MgSO4, i koncentrovana pod sniženim pritiskom do svetlo žutog sirupa. Sirup je rastvoren u EtOAc (60,0 mL) da se dobije homogeni rastvor. U rastvor je dodat rastvor DCM (250,0 mL) i terc-butil metil etar (TBME, 100,0 mL) u kapima. Dobijena suspenzija je mešana preko noći na sobnoj temperaturi, zatim ohlađena na ledenom kupatilu tokom 1 h. Čvrste supstance su sakupljene ceđenjem, isprane sa 250 mL ledeno hladnim rastvorom DCM (150 mL) i TBME (100 mL), i osušene pod vakuumom da se dobije 14,4 g sirovog željenog proizvoda kao bele čvrste supstance.

[0320] Sirov proizvod je rastvoren u EtOAc (140,0 mL) na 60 °C i topao rastvor je proceđen. Filtrat je ohlađen na sobnu temperaturu pre heptana (100,0 mL) koji je dodat u kapima tokom 55 min. Dobijena smeša je zatim mešana preko noći na sobnoj temperaturi. Čvrste supstance su sakupljene ceđenjem, isprane sa a 2:1 smešom heptana i EtOAc (75 mL), i osušene pod vakuumom na 40 -50 °C do konstantne mase da bi se dobio 4-({2-[(aminosulfonil)amino]etil}amino)-N-(3-bromo-4-fluorofenil)-N’-hidroksi-1,2,5-oksadiazol-3-karboksimidamid (12,9 g, 81% prinos) kao bela čvrsta supstanca.

Primer A: Test humanog enzima indolamin 2,3-dioksigenaze (IDO)

[0321] Humana indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO) sa N-terminalnim His tag je eksprimovana u E.coli i prečišćena do homogenosti. IDO katalizuje oksidativno cepanje pirolovog prstena indolovog jezgra triptofana da bi se dobio N’-formilkinurenin. Testovi su izvedenid na sobnoj temperaturi kako je opisano u literaturi pomoću 95 nM IDO i 2 mM D-Trp u prisustvu 20 mM askorbata, 5 µM metilen plavog i 0,2 mg/mL catalaze u 50 mM kalijum fosfatnom puferu (pH 6,5). Početne reakcione brzine su zabeležene kontinualnim praćenjem povećanja apsorbancena 321 nm usled obrazovanja N’-formlilkinurenina (Videti: Sono, M., et al., 1980, J. Biol. Chem.255, 1339-1345). Jedinjenje formule I je testirano u ogledu iz primera A i nađeno je da ima IC50od < 200 nM.

4

Primer B: Određivanje inhibitorne aktivnosti u indolamin 2,3-dioksigenaza (IDO)/kinureninskom testu na HeLa ćelijama

[0322] HeLa cells (#CCL-2) su dobijene iz American Type Tissue Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) i rutinski održavane u minimumu esencijalnog medijuma (eagle) sa 2 mM L-glutaminom i Earle’s BSS prilagođenom da sadrži 1,5 g/L natrijum bikarbonata, 0,1 mM neesencijalne aminokiseline, 1 mM natrijum piruvata i 10 % fetalnog goveđeg seruma (svi iz Invitrogen). Ćelije su držane na 37 °C u vlažnom inkubatoru koji je snabdeven sa 5 % CO2. Test je izveden kao što sledi: HeLa ćelije su zasejane na pločama sa 96bunarčića pri gustini od 5 x 10<3>po bunarčiću i gajene preko noći. Sledećeg dana, IFN-γ (50 ng/mL krajnja koncentracija) i serijska razblaženja jedinjenja (u ukupnoj zapremini od 200 µL medijuma kulture) su dodati u ćelije. Posle 48 sati inkubacije, 140 µL supernatanta po bunarčiću je preneto na novu ploču sa 96 bunarčića. 10 µL 6,1 N trihlorsirćetne kiseline (#T0699, Sigma) je pomešano u svaki bunarčić i inkubirano na 50 °C tokom 30 min da hidrolizuje N-formilkinurenin dobijen sa indolamin 2,3-dioksigenazom do kinurenina. Reakciona smeša je zatim centrifugirana tokom 10 min na 2500 oum da bi se uklonili sedimenti.100 µL supernatanta po bunarčiću je preneto na drugu ploču sa 96 bunarčića i pomešano sa 100 µl 2% (mas/v) p-dimetilaminobenzaldehida (#15647-7, Sigma-Aldrich) u sirćetnoj kiselini. Žuta boja koja potiče iz kinurenina je merena na 480 nm pomoću SPECTRAmax 250 čitača mikropločar (Molecular Devices). L-kinurenin (#K8625, Sigma) je korišćen kao standard. Standardi (240, 120, 60, 30, 15, 7,5, 3,75, 1,87 µM) su pripremljeni u 100 µL medijuma kulture i pomešani sa jednakom zapreminom2 % (mas/v) p-dimetilaminobenzaldehida. Određen je procenat inhibicije pojedinačnih koncentracija i dobijene su prosečne vrednosti duplikata. Podaci su analizirani korišćenjem nelinearne regresije da bi se stvorile IC50vrednosti (Prism Graphpad). Videti: Takikawa O, et al., 1988, J. Biol. Chem., 263(4): 2041-8.

Primer C: Određivanje efekta IDO inhibitora na proliferaciju T ćelija koja je suprimovana sa dendritnim ćelijama koje eksprimuju IDO

[0323] Monociti su sakupljeni iz humanih perifernih mononuklearnih ćelija pomoću leukoforeze. Monociti su zatim zasejani pri gustini od 1 x 10<6>ćelija/bunarčić na ploči sa 96 bunarčića, pomoću RPMI 1640 medijuma obogaćenog sa 10 % fetalnim goveđim serumom i 2 mM L-glutamina (svi iz Invitrogen). Prionule ćelije su zadržane na ploči posle kultivisanja preko noći na 37 °C. Prionuli monociti su zatim stimulisani u toku 5-7 dana sa 100 ng/ml GM-CSF (# 300-03, PeproTech) i 250 ng/ml IL-4 (#200-04, PeproTech), a zatim aktivacijom sa 5 µg/mL LPS iz Salmonella typhimurium (#437650, Sigma) i 50 ng/mL IFN-γ (# 285-IF, R&D Systems) u toku dodatnal 2 dana da bi se izazvalo sazrevanje dendritnih ćelija.

[0324] Posle aktivacije dendritnih ćelija, medijum je zamenjen sa kompletnim RPMI 1640 obogaćenim sa 100-200 U/mL IL-2 (#CYT-209, ProSpec-Tany TechnoGene) i 100 ng/mL anti-CD3 antitela (#555336, PharMingen), T ćelijama (2-3 x 10<5>ćelija/bunarčić), i serijskim razblaženjem IDO jedinjenja. Posle inkubacije u toku još 2 dana, proliferacija T ćelija je merena pomoću testa BrdU inkorporacije, pomoću kolorimetrijske ćelijske proliferacije ELISA kitom prema uputstvu proizvođača (#1647229, Roche Molecular Biochemicals). Ćelije su kontinualno kultivisane u tokur 16-18 sati u prisustvu 10 µM BrdU obeleženog rastvora. Zatim, medijum za obeležavanje je uklonjen, i 200 µL FixDenat po bunarčiću je dodato u ćelije i inkubirano u toku 30 minuta na sobnoj temperaturi. FixDenat rastvor je uklonjen i dodato je 100 µL/bunarčić rastvora konjugata anti-BrdU-POD antitela. Reakcija je izvedena u toku 90 minuta na sobnoj temperaturi. Konjugat antitela je zatim uklonjen, i ćelije su isprane tri puta sa 200 µL/bunarčić rastvora za ispiranje. Na kraju, dodato je 100 µL/bunarčić rastvora supstrata i rezultati su dobijeni pomoću čitača mikroploča (Spectra Max PLUS, Molecular Devices) u toku razvijanja boje. Višestruka očitavanja u različitim vremenskim tačkama su dobijana da se osiguraju podaci u okviru linearnog opsega. Podaci su rutinski dobijeni iz višestrukih eksperimenata, i obuhvaćene su odgovarajuće kontrole. Videti: Terness P, et al.2002, J. Exp. Med., 196(4): 447-57; and Hwu, P, et al.

2000, J. Immunol., 164(7): 3596-9.

Primer D: In vivo testiranje IDO inhibitora za antitumorsku aktivnost

[0325] In vivo anti-tumorska efikasnost može biti testirana pomoću modifikovanih protokola tumora alograft/ksenograft. Na primer, opisano je u literaturi da IDO inhibicija može biti u sinergiji sa citotoksičnom hemoterapijom u imuno-kompetentnom mišu (Muller, A.J., et al. 2005, Nat. Med.

11:312-319). Ova sinergija je pokazana da je zavisna od T-ćelija poređenjem sinergijskih efekata ispitivanih IDO inhibitora na mišijim modelima ksenografta tumora (npr. B16 i slične varijante, CT-26, LLC) gajenim kod imuno kompetentnih miševa onih primećenih kod sinergijski tretiranih miševa sa neutralizućim anti-CD4 antitelima, ili istim tumorima gajenim u imuno-kompromitovanim miševima (npr. nu/nu).

[0326] Koncept diferencijalnog anti-tumorskog efekta na imuno-kompetentne nasuprot imunokompromitovanih miševa može takođe dozvoliti testiranje istraživanih IDO inhibitora kao pojedinačnih sredstava. Na primer, LLC tumori rastu dobro u njihovom sinergijskom domaćinskom soju, C57B1/6. Međutim, ukoliko su ovi miševi tretirani sa IDO inhibitorom 1-MT (naspram placeba) obrazovanje tumora je značajno usporeno, ukazujući da je IDO inhibicija bila inhibirajuća za rast (Friberg, M., et al.

2002, Int. J. Cancer 101:151-155). Sledeći ovu logiku, neko može ispitivati efikasnost IDO inhibicije na modelu rasta LLC ksenografta tumora na C57B1/6 imuno kompetentnim miševima i poređenje toga sa efektima IDO inhibitora na rast LLC tumoa kod golih miševa ili SCID miševa (ili C57B1/6 miševa tretiranih sa antitelima koja neutralizuju aktivnost T-ćelija). Kao efekti otkrivanja tumorom posredovane imuno supresivne aktivnosti IDO će se verovatno razlikovati u zavisnosti od imunogenog potencijala različitih modela tumora, genetske modifikacije mogu biti napravljene na ćelijama tumora da bi se povećao njihov imunogeni potencijal. Na primer, ekspresija GM-CSF u B16.F10 ćelijama povećava njihov imunogeni potencijal (Dranoff, G., et al. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:3539-3543). Kao takav, na nekim modelima tumora (npr. B16.F10) neko može stvoriti [poli]klonove koji eksprimuju imuno stimulatorne proteine kao što su GM-CSF i testiraju efekte inhibicije rasta inhibitora IDO naspram tumora ustanovljenih iz njihovih ćelija tumora kod imuno-kompetentnih i -kompromitovanih miševa.

[0327] Treći put za procenu efikasnosti IDO inhibitora in vivo koristi ’pre-imunizaciju’ mišijeg modela allografta/ksenografta tumora. Na ovim modelima, imuno-kompetentni miševi su senzitivirani na specifične antigene tumora ili antigene na mimike terapeutske antitumorne vakcine. Ovo priprema miševe za antitumorne odgovore posredovane imunim sistemom kada su miševi naknadno izazvani sa mišijim linijama ćelija tumora (poseduju slične tumorske antigene kao oni korišćeni za imunizaciju) u eksperimentima sa ksenograftima. Pokazano je da ekspresija IDO smanjuje antitumorni odgovor i dozovljava ksenograftima da rastu brže. Važno, rast tumora u ovom modelu je inhibiran sa IDO inhibitorom 1-MT (Uyttenhove, C., et al. 2003, Nat. Med. 9:1269-1274). Ovaj model je naročito atraktivan kada IDO aktivnost dopušta rast tumora P815 i specifična inhibicija IDO je prema tome ihibirajuća za rast.

[0328] Na kraju, terapeutska imunizacija može biti korišćena za procenjivanje uticaja IDO inhibitora in vivo. Na primer, pokazano je da korišćenje B16-BL6 ćelija može izazvati Blk/6 miševe sa intravenskom injekcijom ćelija tumoa praćenom sa tretmanom sa dobro karakterizovanim imunogenim peptidima (npr. TRP-2) eksprimovanim od strane ćelija tumora (Ji, et al., 2005, J. Immunol, 175: 1456-63). Važno, modifikatori imunog sistema, kao što su anti-CTL-4 antitela, mogu poboljšati odgovore na takve terapeutske imunizacije. Uticaj IDO inhibitora može biti procenjivan na sličan način imunizacijom sa peptidima tumora sa ili bez IDO inhibitora. Efikasnost je procenjena sa preživljavanjem bolesti (vreme prema smrtnosti) ili merenjem metastaza tumora na plućima i/ili drugim organima u različitim vremenskim tačkama.

[0329] U bilo kom/svim gore pomenutim modelimas, takođe može biti moguće da se direktno i/ili indirektno meri broj i/ili aktivnosti tumor reaktivnih imunih ćelija. Postupci za merenje broja i/ili aktivnosti tumor reaktivnih imunih ćelija su dobro ustanovljeni i mogu da se izvodu korišćenjem tehnika koje su slične onima poznatim u ovoj oblasti (Current Protocols in Immunology, Vol.4, Coligan, J. E., et al.; Immunotherapy of Cancer, Human Press, 2006, Disis, M.L. i reference u njima). Konceptualno, smanjenje imunih supresivnih efekata IDO može dovesti do povećanih brojeva ili reaktivnostif tumor specifičnih imunih ćelija. Dalje, IDO inhibicija može dalje povećati broj ili reaktivnost tumor specifičnih imunih ćelija kada se kombinuju sa drugim terapeuticima, na primer hemoterapeuticima i/ili imunim modulatorima (np r. anti-CTLA4 antitelom).

[0330] Svi eksperimenti alograft/ksenograft mogu da se izvode pomoću standardnih tehnika za tumore (prikazanih od strane Corbett, et al., In Cancer Drug Discovery and Development: Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, and Approval, 2nd Ed. Teicher, B.A. and Andrews, P.A., Gumana Press Inc.: Totowa, NJ, 2004). Kloniranje i uvođenje gena (npr. IDO, GM-CSF) u ćelijske linije tumora, može da se izvodi korišćenjem tehnika sličnih onima opisanim u stanju tehnike (prikazanih u Sambrook, J. and Russel, D., Molecular Cloning: A laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, NY, 2001).

Primer E: In vivo testiranje IDO inhibitora na modelu encefalitisa humanog immunodeficientnog virusa-1 (HIV-1)

1. Ćelijska izolacija i virusna infekcija

[0331] Monociti i PBL mogu biti dobijeni protivstrujnom centrifugalnom elutriacijom leukofereznih pakovanja iz HIV-1, 2 i seronegativnih donora hepatitisa B. Monociti su kultivisani u kulturi suspenzije pomoću Teflon balona u Dulbecco’s modifikovanom Eagle’s medijumu (DMEM, Sigma-Aldrich) obogaćenom sa 10 % toplotom-inaktiviranim sakupljenim humanim serumom, 1 % glutaminom, 50 µg/mL gentamicinom, 10 µg/mL ciprofloksacinom (Sigma), i 1000 U/mL visoko prečišćenim rekombinantnim humanim stimulišućim faktorom kolonije makrofaga. Posle sedam dana u kulturi, MDM su inficirane sa HIV-1ADAsa multipletnošću infekcije od 0,01.

2. Hu-PBL-NOD/SCID HIVE miševi

[0332] Četiri nedelje stari mužjaci miša NOD/C.B-17 SCID se mogu kupiti (Jackson Laboratory). Životinje su održavane u sterilnim mikroizolatorskim kavezima u uslovima bez patogena. Sve životinje su injektirane intraperitonealno sa pacovskim anti-CD122 (0,25 mg/miš) tri dana pre PBL transplantacije i dva puta sa zečijim asialo-GMl antitelima (0,2 mg/miš) (Wako) jedan dan pre i tri dana posle PBL injekcije (20 3 10<6>ćelija/miš). HIV-1ADA-inficirani MDM (3 3 10<5>ćelija u 10 µL) su injektirane intrakranijalno (i.k.) osam dana posle PBL rekonstrukcije stvarajući hu-PBL-NOD/SCID HIVE miševe. Neposredno posle i.k. injektiranja HIV-1 inficirani MDM hu-PBL-NOD/SCID HIVE miševi su subkutano (s.k) implantirani sa kontrolom (nosačem) ili peletama jedinjenja (14 ili 28 dana sporo oslobađanje, Innovative Research). Inicijalni eksperimenti su napravljeni da potvrde indukciju virus-specifičnih CTL u hu PBL-NOD/SCID HIVE životinjama tretiranim sa IDO jedinjenjima. Ovo je potvrđeno sa bojenjem tetramerom i neuropatološkim analizama MDM eliminacije iz tkiva mozga. Zatim, eksperiment je napravljen da analizira humanu limfocitnu rekonstituciju, humoralne imune odgovore, i neuropatološke promene. U ovim eksperimentima, životinje su iskrvarile dana 7 i žrtvovane dana 14 i 21 posle i.k. injekcije humane MDM. Krv je skupljena u epruvete koje sadrže EDTA- korišćena je za protočnu citometriju a plazma je korišćena za detekciju HIV-1 p24 pomoću ELISA (Beckman Coulter™). HIV-1-specifična antitela su detektovana sa Western blot testovima prema uputstvima proizvođača (Cambridge Biotech HIV-1 Western blot kit, Calypte Biomedical). Slična količina virus-specifičnih antitela je detektovana u kontroli i životinjama tretiranim sa jedinjenjem. Ukupno tri nezavisna eksperimenta mogu da se izvedu pomoću tri različita humana donora leukocita.

3. FAC skeniranje periferne krvi i slezine u hu PBL-NOD/SCID HIVE miševima

[0333] Dvobojna FACS analiza može da se izvodi na perifernoj krvi 1-3 ned. i splenocitima 2 i 3 ned. posle i.k. injekcije humane MDM. Ćelije su inkubirane sa fluorohrom-konjugovanim monoklonalnim Abs (mAbs) prema humanim CD4, CD8, CD56, CD3, IFN-γ (eBioscience) u toku 30 min na 4 °C. Da bi se procenio ćelijski imuni odgovor, IFN-γ intraćelijsko bojenje je izvedeno u kombinaciji sa anti-humanim CD8 i FITC-konjugovanim anti-mišijim CD45 da bi se isključile mišije ćelije. Da bi se odredio Ag-specifični CTL, bojenje sa alofikocijanin-konjugovanim tetramerom za HIV-1<gag>(pl7 (aa77-85) SLYNTVATL, SL-9) i HIV-1<pol>[(aa476-485) ILKEPVHGV, IL-9] je izvedeno na fitohemaglutinin/interleukin-2 (PHA/IL-2)-stimulisanim splenocitima. Ćelije su bojene prema preporukama NIH/National Institute of Allergy and Infections Disease, National Tetramer Core Facilities. Podaci su analizirani sa FACS Calibur™ pomoću CellQuest softvera (Becton Dickinson Immunocytometry System).

4. Histopatologija i analiza slike

[0334] Tkivo mozga je sakupljeno na dane 14 i 21 posle i.k. injekcije MDM, fiksirano u 4 % fosfatnopuferisanom para-formaldehidu i smešteno u parafin ili smrznuto na -80 °C za kasniju upotrebu. Koronalni preseci iz ugrađenih blokova su odsečeni u cilju identifikovanja injekcionog mesta. Za svakog miša, 30-100 (5-µm-debljine) serijski preseci su isečeni sa humanog MDM injekcionog mesta i 3-7 isečaka (razdvojenih sa 10 preseka) je analizirano. Preseci mozga su deparafinizovani sa ksilenom i hidratisani u gradijentu alkohola. Imunohistohemijsko bojenje je sledilo osnovni indirektni protokol, korišćenjem povraćenih antigena zagrevanjem do 95 °C u 0,01 mol/L citratnom puferu 30 min za povraćaj antigenal. Da bi se identifikovale humane ćelije u mozgovima miša, korišćen je mAb prema vimentinu (1:50, klon 3B4, Dako Corporation), koji identifikuje sve humane leukocite. Humani MDM i CD8<+>limfociti su detektovani sa CD68 (1:50 razblaženje, klon KP 1) i CD8 (1:50 razblaženej, klon 144B) antitelima, respektivno. Ćelije inficirane sa virusom su obeležene sa mAb do HIV-1 p24 (1:10, klon Kal-1, svi iz Dako). Reaktivne mišije mikroglijalne ćelije su detektovane sa Iba-1 antitelom (1:500, Wako). Ekspresija humanih IDO (huIDO) je vizuelizovana sa Abs dobijenim iz Department of Cell Pharmacology, Central Research Institute, Graduate School of Medicine, Hokkaido University, Sapporo, Japan. Primarna antitela su detektovana sa odgovarajućim biotinilovanim sekundarnim antitelima i vizuelizovana sa kompleksima avidin-biotin (Vectastain Elite ABC kit, Vector Laboratories) i peroksidazom rena (HRP) kuplovanom sa polimerima dekstrana (EnVision, Dako Corporation). Imunoobojeni preseci su suprotno bojeni Mayer-ovim hematoksilinom. Preseci iz kojih je primarno antitelo obrisano ili nebitno IgG izotip je ugrađen da služi kao kontrola. Dva nezavisna posmatrača su brojala na slepo CD8<+>limfocite, CD68<+>MDM i HIV-1 p24<+>ćelije u svakom preseku od svakog miša. Ispitivanje svetlosnim mikroskopom je izvedeno sa Nikon Eclipse 800 mikroskopom (Nikon Instruments Inc). Polukvantitativna analiza za Iba1 (procenat površine zauzet imunobojenjem) je izvedena sa analizom slike uz pomoć računara (Image-Pro®Plus, Media Cybernetics) kako je ranije opisano.

5. Statistička analiza

[0335] Podaci su analizirani pomoću Prism (Graph Pad) sa poređenjem sa Studentovim t-testom za poređenje i ANOVA. P-vrednosti < 0,05 su smatrane značajnim.

6. Reference

[0336] Poluektova LY, Munn DH, Persidsky Y, and Gendelman HE (2002). Generation of cytotoxic T cells against virus-infected human brain macrophages in a murine model of HIV-1 encephalitis. J. Immunol.

168(8):3941-9.

Claims (29)

1. Patentni zahtevi 1. Postupak koji obuhvata reagovanje jedinjenja formule F5:

   sa aldehidom formule F6:

   pri čemu je Pg<1>amino zaštitna grupa, da se dobije jedinjenje formule F7:
2. 2. Postupak prema zahtevu 1, pri čemu je Pg<1>: (a) etoksikarbonil, terc-butoksikarbonil, benziloksikarbonil, ili 9-fluorenilmetiloksikarbonil; ili (b) terc-butoksikarbonil.
3. 3. Postupak prema bilo kom zahtevu 1-2, pri čemu se pomenuta reakcija izvodi u prisustvu redukcionog sredstva, gde je pomenuto redukciono sredstvo: (a) borhidridno redukciono sredstvo; ili (b) borhidridno redukciono sredstvo koje je natrijum triacetoksiborhidrid.
4. 4. Postupak prema bilo kom zahtevu 1-3, koji dalje obuhvata uklanjanje zaštite pomenutog jedinjenja formule F7 da se dobije jedinjenje formule F8:

   opciono gde pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reagovanje jedinjenja formule F7 sa hlorovodoničnom kiselinom.
5. 5. Postupak prema zahtevu 4, koji dalje obuhvata reagovanje pomenutog jedinjenja formule F8, sa Pg<2>-NH-SO2-X, u prisustvu organske baze da se dobije jedinjenje formule F9:

   pri čemu: Pg<2>je amino zaštitna grupa; i X je halo.
6. 6. Postupak prema zahtevu 5, pri čemu je Pg<2>: (a) etoksikarbonil, terc-butoksikarbonil, benziloksikarbonil, ili 9-fluorenilmetiloksikarbonil; ili (b) terc-butoksikarbonil; i pri čemu X je hlor.
7. 7. Postupak prema bilo kom zahtevu 5-6, koji dalje obuhvatai uklanjanje zaštite pomenutog jedinjenja formule F9 da se dobije jedinjenje formule F10:

   opciono gde pomenuto uklanjanje zaštitne grupe obuhvata reagovanje jedinjenje formule F9 sa hlorovodoničnom kiselinom.
8. 8. Postupak prema zahtevu 7, koji dalje obuhvata reagovanje pomenutog jedinjenja formule F10 sa bazom da se dobije jedinjenje formule I: 1

   opciono gde je pomenuta baza natrijum hidroksid.
9. 9. Postupak, koji obuhvata reagovanje jedinjenja formule F15:

   sa jedinjenjem formule F5:

   da se dobije jedinjenje formule F16:

   pri čemu: svaki R<1>je nezavisno amino zaštitna grupa izabrana od C2-4alkenil-C1-3alkil ili fenil-C1-3alkil, pri čemu je pomenuti fenil-C1-3alkil opciono supstituisan sa 1, 2, ili 3 nezavisno izabranih C1-4alkoksi grupa; i R<3>je C1-6alkil ili benzil.
10. 10. Postupak prema zahtevu 9, pri čemu: (a) svaki R<1>je alil; (b) svaki R<1>je 4-metoksibenzil; (c) R<3>je C1-6alkil; ili (d) R<3>je terc-butil. 2
11. 11. Postupak prema bilo kom zahtevu 9-10, pri čemu pomenuta reakcija se izvodi u prisustvu redukcionog sredstva, gde je pomenuto redukciono sredstvo: (a) borhidridno redukciono sredstvo; ili (b) borhidridno redukciono sredstvo koje je natrijum triacetoksiborhidrid; i gde se pomenuta reakcija izvodi u prisustvu trifluorosirćetne kiseline.
12. 12. Postupak prema bilo kom zahtevu 9-11, koji dalje obuhvata uklanjanje zaštite pomenutog jedinjenja formule F16 da se dobije jedinjenje formule F10:

    pri čemu pomenuto uklanjanje zaštite obuhvata: (a) reagovanje jedinjenja formule F16 sa trifluorosirćetnom kiselinom; ili (b) reagovanje jedinjenja formule F16 sa hlorovodoničnom kiselinom.
13. 13. Postupak prema bilo kom zahtevu 9-12, pri čemu je pomenuto jedinjenje formule F15 dobijeno postupkom koji obuhvata tretiranje jedinjenja formule F14:

    sa redukcionim sredstvom da se dobije pomenuto jedinjenje formule F15; pri čemu R<2>je C1-4alkil; opciono gde je pomenuto redukciono sredstvo diizobutilaluminijum hidrid.
14. 14. Postupak prema zahtevu 13, pri čemu je pomenuto jedinjenje formule F14 dobijeno postupkom koji obuhvata zaštitu jedinjenja formule F13:

    sa jednim ili više nezavisno izabranih amino zaštitnih sredstava da se dobije jedinjenje formule F14; opciono gde je pomenuto jedno ili više amino zaštitnih sredstava izabrano od alil bromida i 4-metoksibenzil hlorida, i gde se pomenuta zaštita izvodi u prisustvu baze.
15. 15. Jedinjenje formule F15:

    pri čemu: R<3>je C1-6alkil ili benzil; i svaki R<1>je nezavisno amino zaštitna grupa.
16. 16. Jedinjenje prema zahtevu 15, koje je: (a) terc-butil alil{[alil(2-oksoetil)amino] sulfonil} karbamat; ili (b) terc-butil(4-metoksibenzil){[(4-metoksibenzil)(2-oksoetil)amino] sulfonil} karbamat.
17. 17. Postupak, koji obuhvata reagovanje jedinjenja formule F17:

    pri čemu R<4>je C1-6alkil, C1-6haloalkil, benzil, ili 9H-fluoren-9-ilmetil sa jedinjenjem formule F5:

    da se dobije jedinjenje formule F18:
18. 18. Postupak prema zahtevu 17, pri čemu R<4>je: (a) terc-butil; (b) benzil; (c) etil; ili (d) 2,2,2-trihloretil. 4
19. 19. Postupak prema zahtevu 18, pri čemu se pomenuta reakcija izvodi u prisustvu redukcionog sredstva; opciono gde je pomenuto redukciono sredstvo trietilsilan, i gde se pomenuta reakcija izvodi u prisustvu organske kiseline; opciono gde je pomenuta organska kiselina trifluorosirćetna kiselina.
20. 20. Postupak prema bilo kom zahtevu 18-19, koji dalje obuhvata uklanjanje zaštite pomenutog jedinjenja formule F18 da se dobije jedinjenje formule F10:

    opciono gde pomenuto uklanjanje zaštitne grupe uključuje reagovanje jedinjenja formule F18 sa cinkom u prisustvu sirćetne kiseline.
21. 21. Postupak prema zahtevu 20, koji dalje obuhvata reagovanje pomenutog jedinjenja formule F10 sa bazom da se dobije jedinjenje formule I:

    opciono gde je pomenuta baza natrijum hidroksid.
22. 22. Postupak prema zahtevu 17, pri čemu R<4>je 9H-fluoren-9-ilmetil.
23. 23. Postupak prema zahtevu 22, pri čemu se pomenuta reakcija izvodi u prisustvu redukcionog sredstva; opciono gde je pomenuto redukciono sredstvo trietilsilan; i gde se pomenuta reakcija izvodi u prisustvu organske kiseline; opciono gde je pomenuta organska kiselina metansulfonska kiselina.
24. 24. Postupak prema bilo kom zahtevu 22-23, koji dalje obuhvata pretvaranje pomenutog jedinjenja formule F18 u jedinjenje formule I:

    pri čemu pomenuto pretvaranje obuhvata spajanje jedinjenja formule F18 sa bazom da bi se obrazovala prva smeša; opciono gde je pomenuta baza N,N-bis(2-aminoetil)etan-1,2-diamin.
25. 25. Postupak prema zahtevu 24, pri čemu pomenuto pretvaranje dalje obuhvata dodavanje vodene hlorovodonične kiseline u pomenutu prvu smešu.
26. 26. Jedinjenje formule F17:

    gde je R<4>C1-6haloalkil, benzil, ili 9H-fluoren-9-ilmetil.
27. 27. Jedinjenje prema zahtevu 26, koje je: (a) benzil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat; (b) 2,2,2-trihloretil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat; ili (c) (9H-fluoren-9-il)metil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat.
28. 28. Jedinjenje koje je: (a) terc-butil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat; ili (b) etil N-(2,2-dimetoksietil)sulfamoilkarbamat.
29. 29. Postupak, koji obuhvata: i) reagovanje jedinjenja formule F19:

    sa jedinjenjem formule F5:

    u prisustvu trietilsilana i metansulfonske kiseline da se dobije jedinjenje formule F20:

    i ii) pretvaranje pomenutog jedinjenja formule F20 u jedinjenje formule I:

    gde pomenuto pretvaranje obuhvata spajanje pomenutog jedinjenja formule F20 sa N,N-bis(2-aminoetil)etan-1,2-diaminom. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5