RS60755B1 - Anti-bcma antitela, bispecifični antigen vezujući molekuli koji se vezuju za bcma i cd3, i njihove upotrebe - Google Patents

Anti-bcma antitela, bispecifični antigen vezujući molekuli koji se vezuju za bcma i cd3, i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS60755B1
RS60755B1 RS20201050A RSP20201050A RS60755B1 RS 60755 B1 RS60755 B1 RS 60755B1 RS 20201050 A RS20201050 A RS 20201050A RS P20201050 A RSP20201050 A RS P20201050A RS 60755 B1 RS60755 B1 RS 60755B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
bcma
antibody
seq
antigen
cells
Prior art date
Application number
RS20201050A
Other languages
English (en)
Inventor
Kodandaram Pillarisetti
Eric Thomas Baldwin
Gordon D Powers
Rosa Maria Fernandes Cardoso
Ricardo Attar
Francois Gaudet
Original Assignee
Janssen Pharmaceutica Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=56740579&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS60755(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Janssen Pharmaceutica Nv filed Critical Janssen Pharmaceutica Nv
Publication of RS60755B1 publication Critical patent/RS60755B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3061—Blood cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Ovde obezbeđen pronalazak se odnosi na monoklonalna antitela koja se imunospecifično vezuju za antigen zrenja B-ćelija (BCMA), multispecifična antitela koja imunospecifično vezuju BCMA i determinantu klastera 3 (CD3), i na postupke za dobijanje i upotrebu opisanih antitela.
Stanje tehnike
[0002] B-ćelijski maturacioni antigen, koji je takođe poznat pod imenom BCMA, CD269, TNFRSF17 (UniProt Q02223), je član superfamilije receptora faktora nekroze tumora koji se preferencijalno eksprimira u diferenciranim plazma ćelijama [Laabi et al. (1992) EMBO J 11(11):3897-3904; Madry et al. (1998) Int Immunol 10(11): 1693-1702]. BCMA je neglikozilovan transmembranski protein tipa I, koji je uključen u maturaciju B ćelija, rast i preživljavanje. BCMA je receptor za dva liganda TNF superfamilije: APRIL (ligand kojim se indukuje proliferacija, CD256, TNFSF13), visoko afinitetni ligand za BCMA i B ćelijski aktivacioni faktor BAFF (THANK, BlyS, B limfocitni stimulator, TALL-1 i zTNF4), nisko afinitetni ligand za BCMA. APRIL i BAFF pokazuju strukturalnu sličnost i preklapanje a ipak različitu specifičnost vezivanja za receptor. Negativni regulator TACI se takođe vezuje za oba BAFF i APRIL. Koordinisano vezivanje APRIL i BAFF za BCMA i/ili TACI aktivira transkripciju NF-κB i povećava ekspresiju članova familije Bcl-2 koji su odgovorni za preživljavanje (npr. Bcl-2, BclxL, Bcl-w, Mcl-1, Al) i smanjeno regulišu ekspresiju pro-apoptotskih faktora (npr. Bid, Bad, Bik, Bim, itd.), prema tome, inhibiraju apoptozu i promovišu preživljavanje. Ovo kombinovano delovanje promoviše diferencijaciju B ćelija, proliferaciju, preživljavanje i proizvodnju antitela (kao što je dato u Rickert RC et al., Immunol Rev (2011) 244 (1): 115-133). U skladu sa ovim nalazom, BCMA takođe podržava rast i preživljavanje malignih humanih B ćelija, uključujući ćelije multiplog mijeloma (MM). Novak et al. su pronašli da MM linije ćelija i sveže izolovane MM ćelije eksprimiraju BCMA i TACI protein na njihovim ćelijskim površinama i imaju različitu ekspresiju BAFF-R proteina na njihovoj ćelijskoj površini (Novak et al., (2004) Blood 103(2):689-694).
[0003] Multipli mijelom (MM) je drugi po redu najzastupljeniji hematološki malignitet i čini 2% od svih smrti uzrokovanih kancerom. MM je heterogena bolest i uglavnom je uzrokovana, između ostalog, hromozomskim translokacijama t(11 ; 14),t(4; 14),t(8;14),del(13),del(17) (Drach et al., (1998) Blood 92(3):802-809; Gertz et al., (2005) Blood 106(8):2837-2840; Facon et al., (2001) Blood 97(6): 1566-1571). Pacijenti koji su pogođeni sa MM mogu da prolaze kroz različite simptome koji su povezani sa bolesti zbog, infiltracije u kostnu srž, destrukcije kosti, otkazivanja bubrega, imunodeficijencije, i psihosocijalnog opterećenja koje nosi dijagnoza kancera. Od 2006, stopa 5-godišnjeg relativnog preživljavanja za MM bila je približno 34% pri čemu se ističe da je MM bolest koja se teško leči gde trenutno ne postoje mogućnosti lečenja.
[0004] Upotreba anti-BCMA antitela za lečenje limfoma i multiplog mijeloma se pominje u WO2002066516 i WO2010104949. Antitela koja su specifična za BCMA su opisana u npr. Gras M-P. et al. Int Immunol. 7 (1995) 1093-1106, WO200124811, i WO200124812. Osim toga, pored činjenice da BCMA, BAFF-R i TACI, tj., B ćelijski receptori pripadaju superfamiliji TNF receptora, i njihovi ligandi BAFF i APRIL podležu terapijama u borbi protiv kancera, još uvek postoji potreba za dostupnim daljim opcijama za lečenje takvih medicinskih stanja.
Suština pronalaska
[0005] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima.
[0006] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje rekombinantno antitelo, ili njegov antigenvezujući koji se imunospecifično vezuje za BCMA, pri čemu antitelo ima teški lanac i laki lanac, pomenuti teški lanac se sastoji iz:
a. region 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR1) koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 6; b. CDR1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca SEQ ID NO: 7, CDR2 teškog laca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 6;
c. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 19;
d. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 8, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 6;
e. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 13, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 19; or
f. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 13, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 8, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 19, pri čemu se pomenuto antitelo dalje sastoji iz CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 24, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 26.
[0007] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov BCMA x CD3 bispecifični vezujući fragment koji se sastoji iz:
a) prvog teškog lanca (HC1);
b) drugog teškog lanca (HC2);
c) prvog lakog lanca (LC1); i
d) drugog lakog lanca (LC2),
pri čemu je HC1 povezan sa LC1 i HC2 je povezan sa LC2 i pri čemu HC1 sadrži SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, i SEQ ID NO: 61 kao CDR1-3 teškog lanca redom, i LC1 sadrži SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, i SEQ ID NO: 64 kao CDR1-3 lakog lanca redom, da se obrazuje prvo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3 i pri čemu HC2 sadrži SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, i SEQ ID NO: 6 kao CDR1-3 teškog lanca redom, i LC2 sadrži SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, i SEQ ID NO: 26 kao CDR1-3 lakog lanca redom, da se obrazuje drugo mesto za vezivanje antigena koje se imunospecifično vezuje za BCMA.
[0008] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje rekombinantnu ćeliju koja eksprimira rekombinanatno BCMA x CD3 bispecifično antitelo iz pronalaska ili njegov BCMA x CD3 bispecifični vezujući fragment.
[0009] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje rekombinantnog BCMA x CD3 bispecifičnog antitela iz pronalaska ili njegov BCMA x CD3 bispecifični vezujući fragment gajenjem u kulturi rekombinantne ćelije iz pronalaska.
[0010] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje polinukleotid koji kodira rekombinantno BCMA x CD3 bispecifično antitelo iz pronalaska ili njegov BCMA x CD3 bispecifični vezujući fragment.
[0011] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje komplet koji se sastoji iz rekombinantnog BCMA x CD3 bispecifičnog antitela iz pronalaska ili njegovog BCMA x CD3 bispecifićnog vezujućeg fragmenta i/ili the polinukleotida iz pronalaska, i njegovog pakovanja.
[0012] Ovd su obezbeđena antitela koja se imunospecifično vezuju za BCMA i njihovi antigen vezujući fragmenti. Takođe se opisuju srodni polinukleotidi koji su sposobni da kodiraju obezbeđena BCMA-specifična antitela i fragmente za vezivanje antigena, ćelije koje eksprimiraju obezbeđena antitela i fragmente za vezivanje antigena, kao i povezane vektore i antitela koja su obeležena za detekciju i antigen vezujuće fragmente. Dodatno, opisani su postupci za upotrebu obezbeđenih antitela i fragmenanta za vezivanje antigena. Na primer, antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena mogu da se koriste za dijagnozu ili praćenje napredovanja kancera koji eksprimira BCMA, regresiju, ili stabilnost; da bi se odredilo da li ili ne pacijent treba da se leči zbog kancera; da bi se odredilo da li ili nije subjekat pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA i na taj način mogu biti podložni tretmanu sa BCMA-specifičnim anti-kancerogenim terapeutikom, kao što su multispecifična antitela prema ovde opisanim BCMA i CD3.
[0013] Ovde su dalje obezbeđena multispecifična antitela koja se imunospecifično vezuju za BCMA i CD3 i njihovi multispecifični antigen-vezujući fragmenti. Takođe su opisani srodni polinukleotidi koji su sposobni da kodiraju obezbeđena BCMA x CD3-multispecifična antitela, ćelije koje eksprimiraju obezbeđena antitela, kao i povezani vektori i multispecifična antitela koja su obeležena za detekciju. Dodatno, opisani su postupci za upotrebu obezbeđenih multispecifičnih antitela. Na primer, BCMA x CD3-multispecifična antitela mogu da se koriste za postavljanje dijagnoze ili za praćenje napredovanje kancera koji eksprimira BCMA, regresiju, ili stabilnost; da bi se odredilo da li ili ne pacijent treba da se leči zbog kancera; ili da bi se odredilo da li ili nije subjekat pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA i na taj način mogu biti podložni tretmanu sa BCMA-specifičnim anti-kancerogenim terapeutikom, kao što su ovde opisana BCMA x CD3-multispecifična antitela.
BCMA-Specifična antitela
[0014] Ovde su opisana rekombinantna antitela i antigen-vezujući fragmenti koji su specifični za BCMA. U nekim izvođenjima, antitela specifična za BCMA i antigen vezujući fragmenti se vezuju za humani BCMA. U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA i antigen vezujući fragmenti se vezuju za humani BCMA i BCMA makaki majmuna. Antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena prema pronalasku vezuju epitop uključujuči jedan ili više ostataka od vanćelijskog domena BCMA (ECD). Ovo antitelo koje je specifično za BCMA ili fragment za vezivanje antigena može da blokira vezivanje APRIL sa najmanje IC50od najmanje 5.9 nM kako je mereno pomoću ELISA. Tabela 1 daje pregled primera nekih ovde opisanih antitela koja su specifična za BCMA:
[0015] U nekim izvođenjima obezbeđeni su BCMA-specifično antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se sastoji iz teškog lanca koji sadrži CDR1, CDR2, i CDR3 prema bilo kom od antitela koja su opisana u Tabeli 1 i lakog lanca koji sadrži CDR1, a CDR2, i CDR3 prema bilo kom od antela koja su opisana u Tabeli 1.
[0016] Klasa IgG je podeljena u četiri izotipa: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 kod ljudu. Oni imaju zajedničko više od 95% homologije u aminokiselinskim sekvencama Fc regiona ali pokazujuvelike razlike u strukturi i kompoziciji aminokiselina u regionu zgloba. Fc region posreduje u efektoriskim funkcijama, kao što je ćelijska citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC) i citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC). U ADCC, Fc region antitela se vezuje za receptore Fc (FcgRs) koji su prisutni na površini imunskih efektorskih ćelija kao što su prirodne ćelije ubice i makrofagi, što dovodi do fagocitoze ili lize ciljanih ćelija. U CDC, antitela ubijaju ciljane ćelije pokretanjem kaskade komplementa na ćelijskog površini. Ovde opisana antitela uključuju antitela sa opisanim karakteristikama varijabilnih domena u kombinaciji sa bilo kojim od izotipova IgG, uključujući modifikovane verzije u kojima je Fc sekvenca modifikovana da bi se postigle različite efektorske funkcije.
[0017] Za mnoge primene terapeutskih antitela, efektorske funkcije koje su posredovane sa Fc nisu deo mehanizma delovanja. Ove efektorske funkcije koje su posredovane sa Fc mogu da budu oštećujuće i potencijalno predstavljaju rizik za bezbednost izazivanjem mehanizma nespecifične toksičnosti. Modifikujuće efektorske funkcije mogu da se postignu inženjeringom Fc regiona kako bi se smanjilo njihovo vezivanje ze FcgRs ili za faktore iz kaskade komplementa. Vezivanje IgG za aktivacione (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa i FcgRIIIb) i inhibitorne (FcgRIIb) FcgRs ili za prvu komponentu komplementa (C1q) zavisi od ostataka koji su locirani u regionu zgloba i domenu CH2. Mutacije su uvedene u IgG1, IgG2 i IgG4 da bi se smanjile ili utišale funkcionalnosti Fc. Ovde opisana antitela mogu da uključe ove modifikacije.
[0018] U jednom izvođenju, antitelo sadrži Fc region sa jednim ili više od sledećih svojstava: (a) smanjenu efektorsku funkciju kada se uporedi sa paretnalnim Fc; (b) smanjen afinitet za Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb i/ili Fcg RIIIa, (c) smanjen afinitet prema FcgRI (d) smanjen afinitet prema FcgRIIa (e) smanjen afinitet prema FcgRIIb, (f) smanjen afinitet prema Fcg RIIIb ili (g) smanjen afinitet prema FcgRIIIa.
[0019] U nekim izvođenjima, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena su IgG, ili njihovi derivati, npr., IgG1, IgG2, IgG3, i izotipovi IgG4. U nekim izvođenjima gde je antitelo izotip IgG4, antitelo sadrži K409R, S228P, L234A, i L235A zamene u njegovom Fc regionu. Ovde opisana antitela mogu da uključe ove modifikacije.
[0020] U nekim izvođenjima opisana antitela su sposobna za inhibiranje vezivanja APRIL sa IC50sa 5.9 nM kako je mereno pomoću ELISA.
[0021] U nekim izvođenjima opisana antitela se vezuju za BCMA-pozitivne ćelijske linije poreklom od multiplog mijeloma.
[0022] Pored opisanih antitela koja su specifična za BCMA i fragmente za vezivanje antigena, takođe su obezbeđene polinukleotidne sekvence koje su sposobne da kodiraju opisana antitela i fragmente za vezivanje antigena. Vektori koji se sastoje iz opisanih polinukleotida su takođe opisani, kao što su ovde obezbeđene ćelije koje eksprimiraju antitela koja su specifična za BCMA ili antigen vezujuće fragmente. Takođe su opisane ćelije koje su sposobne za eksprimiranje prikazanih vektora. Ove ćelije mogu da budu sisarske ćelije (kao što su 293F ćelije, CHO ćelije), ćelije poreklom od insekta (kao što su Sf7 ćelije), ćelije kvasca, ćelije biljaka, ili bakterijske ćelije (kao što je E. coli). Opisana antitela takođe mogu da budu proizvedena od strane hibridoma ćelija.
Postupci za upotrebu antitela koja su specifična za BCMA
[0023] Postupci za upotrebu opisanih BCMA-specifičnih antitela ili fragmenata za vezivanje antigena su takođe prikazani. Posebna antitela za upotrebu u postupcima koji se razmatraju u ovom odeljku uključuju ona sa nizom CDR-a koji su opisani za antitela u Tabeli 1. Na primer, ova antitela ili fragmenti za vezivanje antigena mogu da budu korisni u lečenju kancera, interferiranjem sa interakcijama BCMA-receptor ili gde je antitelo konjugovano sa toksinom, pri čemu je toksin na taj način ciljno usmeren prema kanceru koji eksprimira BCMA. Dalje, ova antitela ili fragmenti za vezivanje antigena mogu da budu korisni za detektovanje prisustva BCMA u biološkom uzorku, kao što je krv ili serum; za kvantifikovanje količine BCMA u biološkom uzorku, kao što je krv ili serum; za dijagnozu kancera koji eksprimira BCMA; određivanje postupka za lečenje subjekta koji je pogođen kancerom; ili praćenje napredovan ja kancera koji eskprimira BCMA kod subjekta. U nekim izvođenjima, kancer koji eksprimira BCMA može da bude limfom, kao što je multipli mijekom (MM). Opisani postupci mogu da budu izvedeni pre nego što subjekat primi tretman za kancer koji eksprimira BCMA, kao što je tretman sa multispecifilnim antitelom protiv BCMA i CD3. Osim toga, opisani postupci mogu da se izvedu nakon što subjekat primi tretman za kancer koji eksprimira BCMA, kao što je tretman sa multispecifičnim antitelom protiv BCMA i CD3 koji je ovde opisan.
[0024] Postupci koji su opisani za detekciju BCMA u biološkom uzorku uključuju izlaganje biološkog uzorka jednom ili više od antitela koja su specifična za BCMA ili ovde opisanim fragmentima za vezivanje antigena.
[0025] Opisani postupci za dijagnozu kancera koji eksprimira BCMA kod subjekta takođe uključuju izlaganje biološkog uzorka jednom ili više od antitela koja su specifična za BCMA ili ovde opisanim fragmentima za vezivanje antigena; međutim, postupci takođe uključuju kvantifikovanje količine BCMA koja je prisutna u uzorku; poređenje količine BCMA koja je prisutna u uzorku sa poznatim standardnom ili referentnim uzorkom; i određivanje da li nivoi BCMA kod subjekta ulaze u nivoe BCMA koji su povezani sa kancerom.
[0026] Ovde su takođe opisani postupci za praćenje kancera koji eksprimira BCMA kod subjekta. Opisani postupci uključuju izlaganje biološkog uzorka jednim ili više od antitela koje je specifično za BCMA ili ovde opisanim fragmentima za vezivanje antigena; kvantifikovanje količine BCMA koja je prisutna u uzorku koje je vezano antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena; poređenje količine BCMA koja je prisutna u uzorku ili sa poznatim standardom ili referentnim uzorkom ili količinom BCMA u sličnom uzorku koji je prethodno dobijen od subjekta; i određivanje da li su nivoi BCMA kod subjekta su pokazatelji progresije kancera, regresije ili stabilne bolesti na osnovu razlike u količini BCMA u upoređenim uzorcima.
[0027] Uzorci koji su dobijeni, ili su poreklom od, subjekata su biološki uzorci kao što su urin, krv, serum, plazma, pljuvačka, asciti, cirkulišuće ćelije, cirkulišuće tumorske ćelije, ćelije koje nisu povezane sa tkivom, tkvina, hirurški resektovano tumorsko tkivo, biopsije, uzorci za aspiraciju dobijeni finom iglom, ili histološki preparati.
[0028] Opisana BCMA-specifična antitela ili fragmenti za vezivanje antigena mogu da budu obeleženi za upotrebu sa opisanim postupcima, ili drugim postupcima koji su poznati stručnjaku iz oblasti tehnike Na primer, ovde opisana antitela, ili njihovi fragmenti za vezivanje antigena, mogu da budu obeležena sa radioobeleživačem, fluorescentnim obeleživačem, tagom za epitop, biotinom, obeleživačem hromoforom, ECL obeleživačem, enzimom, rutenijumom,<111>In-DOTA,<111>In-dietilentriaminpentasirćetnom kiselinom (DTPA), peroksidazom rena, alkalnom fosfatazom i beta galaktozidazom, ili poli-histidinom ili sličnim takvim obeleživačima koji su poznati iz oblasti tehnike.
Kompleti BCMA-Specifičnih antitela
[0029] Ovde su opisani kompleti uključujući prikazana BCMA-specifična antitela ili njihove fragmente za vezivanje antigena. Opisani kompleti mogu da se koriste za izvođenje postupaka za upotrebu BCMA-specifičnih antitela ili ovde obezbeđenih fragmenata za vezivanje antigena, ili drugih postupaka koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. U nekim izvođenjima opisani kompleti mogu da uključe antitela ili ovde opisane fragmente za vezivanje antigena i reagense za upotrebu u detekciji prisustva BCMA u biološkom uzorku. Prema tome, opisani kompleti mogu da uključe jedno ili više od antitela, ili njegovog ovde opisanog antigen vezujućeg fragment(a), i posudu za čuvanje antitela ili fragmenta kada se ne koriste, instrukcije za upotrebu antitela ili fragmenta, antitelo ili fragment koji su pričvrščeni za čvrst nosač, i/ili obeležene oblike antitela ili fragmenta koji se mogu detektovati, kao što je ovde opisano.
BCMA x CD3-Multispecifična Antitela
[0030] Preusmeravanje T-limfocita ka MM ćelijama koje eksprimiraju BCMA pomoću TCR/CD3 kompleksa predstavlja atraktivan alternativni pristup. Kompleks TCR/CD3 T-limfocita se sastoji iz ili TCR alfa (α)/beta ((β) ili TCR gama (γ)/delta (δ) heterodimera koeksprimiranih na ćelijskog površini sa invarijantnim podjedinicama CD3 obeleženg gama (γ), delta (δ), epsilon (ε), zeta (ζ), i eta (η). Humani CD3ε je opisan pod UniProt P07766 (CD3E_HUMAN). Anti CD3ε antitelo koje je opisano u oblasti tehnike je SP34 (Yang SJ, The Journal of Immunology (1986) 137; 1097-1100). SP34 reaguje sa CD3 porekolom od primata i od čoveka. SP34 je dostupan od Pharmingen. Dalje, anti CD3 antitelo koje se opisuje u oblasti tehnike je UCHT-1 (videti WO2000041474). Dalje anti CD3 antitelo koje se opisuje u oblasti tehnike je BC-3 (Fred Hutchinson Cancer Research Institute; korićeno u Fazi I/II ispitivanja GvHD, Anasetti et al., Transplantation 54: 844 (1992)). SP34 se razlikuje od UCHT-1 i BC-3 u tome što SP-34 prepoznaje epitop koji je prisutan samo na ε lancu CD3 (videti Salmeron et al., (1991) J. Immunol. 147: 3047) pri čemu UCHT-1 i BC-3 prepoznaju epitop kome doprinose ε i γ lanci. Sekvenca antitela sa istom sekvencom kao antitelo SP34 je pomenuta u WO2008119565, WO2008119566, WO2008119567, WO2010037836, WO2010037837 i WO2010037838. Sekvenca koja je 96% identična sa varijabilnim domenom teškog lanca (VH)a antitela SP34 je pomenuta u US8236308 (WO2007042261).
[0031] Razna bispecifična antitela protiv CD3 i BCMA su poemnuta u WO2007117600, WO2009132058, WO2012066058, WO2012143498, WO2013072406, WO2013072415, i WO2014122144. Međutim, trenutno nisu dostupni podaci koji opisuju napredak u kliničkom ispitivanju.
[0032] Ovde su opisana rekombinantna multispecifična antitela koja vezuju BCMA i CD3 ("BCMA x CD3 multispecifična antitela") i njihovi multispecifični fragmenti za vezivanje antigena. U nekim izvođenjima obezbeđeno je rekombinantno antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se imunospecifično vezuje za BCMA.
[0033] U nekim izvođenjima, BCMA-specifični kraj (eng. arm) multispecifičnog antitela vezuje humani BCMA i BCMA makaki majmuna. BCMA-specifični kraj BCMA x CD3-multispecifičnih antitela ili fragmenti za vezivanje antigena vezuju vanćelijski domen humanog BCMA. U poželjnim izvođenjima, BCMA x CD3 multispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena je bispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena. U nekim izvođenjima, rekombinantno BCMA x CD3 bispecifično antitelo se sastoji iz: a) prvog teškog lanca (HC1); b) drugog teškog lanca (HC2); c) prvog lakog lanca (LCI); i d) drugog lakog lanca (LC2), pri čemu HC1 i LC1 se sparuju da bi se obrazovalo prvo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifilčno vezuje BCMA, i HC2 i LC2 se sparuju da bi se obrazovalo drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifilčno vezuje CD3, ili je obezbeđen njihov BCMA x CD3-bispecifični vezujući fragment. U drugom izvođenju, obezbeđena je rekombinantna ćelija koja eksprimira antitelo ili bispecifični fragment za vezivanje antigena. U nekim izvođenjima, BCMA-vezujući kraj (ili "BCMA-specifični kraj") BCMA x CD3 multispecifičnog antitela je dobijen od ovde opisanog BCMA antitela (na primer, iz antitela koje ima CDR sekvence koje su navedene u Tabeli 1).
[0034] U nekim izvođenjima, BCMA-specifični kraj BCMA x CD3-multispecifičnih antitela ili fragmenti za vezivanje antigena su IgG, ili njegovi derivati. U nekim izvođenjima opisana BCMA x CD3-multispecifična antitela su sposobna za vezivanje sa BCMA sa konstantnom disocijacije od najmanje 0.18 nM kako je izmereno površinskom plazmon rezonancom. U nekim izvođenjima opisano BCMA x CD3-multispecifično antitelo nije agonist. U nekim izvođenjima opisano BCMA x CD3-multispecifično antitelo ne menja aktivaciju NF-κB u koncentracijama koje su ispod 10 nM.
[0035] U nekim izvođenjima, CD3-vezujući kraj (ili "CD3-specifični kraj") BCMA x CD3 multispecifičnog antitela je dobijen od mišjeg monoklonalnog antitela SP34, mišjeg izotipa IgG3/lambda. (K.R. Abhinandan and A. C. Martin, 2008. Mol. Immunol. 45, 3832-3839). U nekim izvođenjima, CD3-vezujući kraj BCMA x CD3 multispecifičnog antitela sadrži jedan teški lanac i jedan laki lanac koji je izabran iz Tabele 2.
1
Tabela 2. Teški lanci i laki lanci CD3-specifičnih antitela i antigen vezujućih fragmenata.
[0036] Klasa IgG je podeljena u četiri izotipa: IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 kod ljudi. Oni imaju zajedničko više od 95% homologije u aminokiseinskim sekvencama Fc regiona ali pokazuju velike razlike u kompoziciji i strukturi aminokiseline u regionu zgloba. Fc region posreduje u efektorskim funkcijama, kao što je ćelijska citotoksičnost koja je zavisna od antitela (ADCC) i citotoksičnost koja je zavisna od komplementa (CDC). U ADCC, Fc region antitela se vezuje za Fc receptore (FcgRs) koji se nalaze na površini imunskih efektorskih ćelija kao što su prirodne ćelije ubice i makrofagi, pri čemu dolazi do fagocitoze ili lize ciljanih ćelija. U CDC, antitela ubijaju ciljane ćelije pokretanjem kaskade komplementa na površini ćelije.
[0037] Za mnoge primene terapeutskih antitela, Fc-posredovane efektorske funkcije nisu deo mehanizma delovanja. Ove Fc-posredovane efektorske funkcije mogu da budu oštećujuće i potencijalno predstavljaju rizik u bezbednosti uzrokovanjem mehanizma nespecifične toksičnosti. Modifikujuće efektorske funkcije mogu da se postignu inženjeringom Fc regiona kako bi se smanjilo njihovo vezivanje za FcgRs ili za faktore komplementa. Vezivanje IgG aktivacione (FcgRI, FcgRIIa, FcgRIIIa i FcgRIIIb) i inhibitorne (FcgRIIb) FcgR-e ili prvu komponentu komplementa (C1q) zavisi od ostataka koji su locirani na regionu zgloba i domenu CH2. Mutacije su uvedene u IgG1, IgG2 i IgG4 kako bi se smanjile ili utišale Fc funkcionalnosti.
[0038] U jednom izvođenju, antitelo se sastoji iz jednog Fc regiona sa jednim ili više od sledećih svojstava: (a) smanjenom efektorskom funkcijom kada se uporedi sa parentalnim Fc; (b) smanjenim afinitetom prema Fcg RI, Fcg RIIa, Fcg RIIb, Fcg RIIIb i/ili Fcg RIIIa, (c) smanjenim afinitetom prema FcgRI (d) smanjenim afinitetom prema FcgRIIa (e) smanjenim afinitetom prema FcgRIIb, (f) smanjenim afinitetom Fcg RIIIb ili (g) smanjenim afinitetom prema FcgRIIIa.
[0039] U nekim izvođenjima, antitelo koje je specifično za CD3 ili fragment za vezivanje antigena iz koga je CD3-specifični kraj multispecifičnog antitela dobijen je IgG, ili njegov derivat. U nekim izvođenjima, antitelo koje je specifično za CD3 ili fragment za vezivanje antigena iz koga je CD3-specifičan kraj multispecifičnog antitela je dobijeno iz IgG1, ili njegovog derivata. U nekim izvođenjima, na primer, Fc region CD3-specifičnog IgG1 antitela iz koga je dobijen CD3-vezujući kraj sadrži L234A, L235A, i F405L zamene u njegovom Fc regionu. U nekim izvođenjima, antitelo koje je specifično za CD3 ili fragment za vezivanje antigena iz koga je dobijen CD3-specifičan kraj multispecifičnog antitela je IgG4, ili njegov derivat. U nekim izvođenjima, na primer, Fc region CD3-specifičnog IgG4 antitela iz koga je dobijen CD3-vezujući kraj se sastoji iz S228P, L234A, L235A, F405L, i R409K zamena u njegovom Fc regionu. U nekim izvođenjima, antitelo koje je specifično za CD3 ili fragment za vezivanje antigena iz koga je dobijen CD3-specifičan kraj multispecifičnog antitela se vezuje za CD3e na primarnim humanim T ćelijama i/ili primarnim T ćelijama makaki majmuna. U nekim izvođenjima, antitelo koje je specifično za CD3 ili fragment za vezivanje antigena iz koga je dobijen CD3-specifičan kraj multispecifičnog antitela aktivira primarne humane CD4+ T ćelije i/ili primarne CD4+ T ćelije makaki majmuna.
[0040] Pored opisanih BCMA x CD3-multispecifičnih antitela, takođe su obezbeđene polinukleotidne sekvence koje su sposobne da kodiraju opisana BCMA x CD3-multispecifična antitela. U nekim izvođenjima, obezbeđen je izolovani sintetički polinukleotid koji kodira HC1, HC2, LC1 ili LC2 BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog fragmenta za vezivanje antigena. Vektori koji sadrže opisane polinukleotide se takođe opisuju, kao što su ovde obezbeđene ćelije koje eksprimiraju BCMA x CD3-multispecifična antitela. Takođe su opisane ćelije koje su sposobne da eksprimiraju prikazane vektore. Ove ćelije mogu da budu sisarske ćelije (kao što su 293F ćelije, CHO ćelije), ćelije insekta (kao đto su Sf7 ćelije), ćelije kvasca, ćelije biljaka, ili bakterijske ćelije (kao što jr E. coli). Opisana antitela takođe mogu da budu proizvedena od strane hibridoma ćelija. U nekim izvođenjima, postupci za dobijanje BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog fragmenta za vezivanje su obezbeđeni gajenjem ćelija u kulturi.
[0041] Dalje, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozicije koje se sastoje iz BCMA x CD3 multispecifičnih antitela ili fragmenata za vezivanje antigena i farmaceutski prihvatljivog nosača.
Postupci za upotrebu BCMA x CD3-Multispecifičnih Antitela
[0042] Postupci za upotrebu opisanih BCMA x CD3-multispecifičnih antitela i njihovih multispecifičnih fragmenata za vezivanje antigena su takođe prikazani. Na primer, BCMA x CD3-multispecifična antitela i njihovi multispecifični antigen-vezujući fragmenti mogu da budu korisni u lečenju kancera koji eksprimira BCMA kod subjekta kome je potrebno. U nekim izvođenjima, kancer koji eksprimira BCMA je limfom, kao što je multipli mijelom.
[0043] Opisani postupci lečenja kancera koji eksprimira BCMA kod subjekta kome je potrebno uključuju davanje subjektu terapeutski efikasne količine BCMA x CD3-multispecifičnog antitela ili njegovog multispecifičnog antigen-vezujućeg fragmenta. U nekim izvođenjima, subjekat je sisar, poželjno čovek. U poželjnim izvođenjima obezbeđeni su postupci za lečenje subjekta koji ima kancer davanjem terapeutski efikasne količine BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog antigen vezujućeg fragmenta pacijentu kome je potrebno u vremenskom periodu koji je dovoljan za lečenje kancera.
[0044] Dalje, ovde su obezbeđeni postupci za inhibiranje rasta ili proliferacije ćelija kancera, davanjem terapeutski efikasne količine BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifični vezujući fragment za inhibiranje rasta ili proliferacije ćelija kancera.
[0045] Ovde su takođe obezbeđeni postupci za preusmeravanje T ćelija prema ćelijama kancera koje eksprimiraju BCMA davanjem terapeutski efikasne količine BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog vezujućeg fragmenta za preusmeravanje T ćelije prema kanceru.
Kompleti BCMA x CD3-Specifičnih antitela
[0046] Ovde su opisani kompleti uključujući prikazana BCMA x CD3-multispecifična antitela. Opisani kompleti mogu da se koriste za izvođenje postupaka za upotrebu ovde obezbeđenih BCMA x CD3-multispecifičnih antitela, ili drugih postupaka koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike U nekim izvođenjima opisani su kompleti koji mogu da uključe ovde opisana antitela i reagense za upotrebu u lečenju kancera koji eksprimira BCMA. Prema tome, opisani kompleti mogu da uključe jedan ili više od multispecifičnih antitela, ili njihove multispecifične antigen-vezujuće fragment(e), koji se ovde opisuju i posudu za skladištenje antitela ili fragmenta kada se ne koriste, i/ili instrukcije za upotrebu antitela ili fragmenta, antitela ili fragmenta koji je pričvršćen za čvrst nosač, i/ili obeležene oblike antitela ili fragmenta koji se mogu detektovati, kao što je ovde opisano.
Detaljan opis ilustrativnih izvođenja
[0047] Ponalazak je definisan patentnim zahtevima.
1
Definicije
[0048] Razni termini koji su povezani sa aspektima opisa su korišćeni kroz specifikaciju i patentne zahteve. Takvim terminima treba dati njihovo uobičajeno značenje u oblasti tehnike osim ukoliko nije drugačije naznačeno. Druge specifično definisane termine treba tumačiti na način koji je u skladu sa ovde obezbeđenim definicijama.
[0049] Kao što se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim patentnim zahtevima, oblici u jednini uključuju pozivanja na množinu osim ukoliko sadržaj jasno ne ukazuje drugačije. Prema tome, na primer, pozivanje na "ćeliju" uključuje kombinaciju dve ili više ćelija, i slično.
[0050] Termin "oko" kao što je ovde korišćen se odnosi na vrednost koja se može izmeriti kao što je količina, vremensko trajanje, i slično, i namenjena je da obuhvati varijacije do ±10% od navedene vrednosti, kao što su takve varijacije odgovarajuće za izvođenje prikazanih postupaka. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno, svi brojevi koji iskazuju količinu sastojaka, svojstva kao što je molekulska masa, reakcioni uslovi, i tako dalje koji su korišćeni u specifikaciji i patentnim zahtevima treba razumeti kao modifikovane u svim slučajevima sa terminom "oko." Prema tome, osim ukoliko nije suprotno naznačeno, numerički parametri koji su predstavljeni i specifikaciji koja sledi i povezani patentni zahtevi su približne vrednosti koje mogu da se razlikuju u zavisnosti od željenih svojstava koja su tražena da se dobiju predmetnim pronalaskom. U najmanju ruku, a ne kao pokušaj da se ograniči primerna doktrine ekvivalenata na obim patentnih zahteva, svaki numerički parametar trebalo bi tumačiti bar u svetlu broja prijavljenih značajnih cifara i primenom uobičajenih postupaka za zaokruživanje.
[0051] Pored toga što su numerički opsezi i parametri koji predstavljaju širok opseg pronalaska približne vrednosti, numeričke vrednosti koje su predstavljene u specifičnim primerima su prijavljene kao precizne što je više moguće. Bilo koja numerička vrednost, međutim, inherentno sadrži određene greške koje nužno nastaju od standardne devijacijacije koja se nalazi u njihovim određenim merenjima za testiranje.
[0052] "Izolovani" označava biološku komponentu (kao što je nukleinska kiselina, peptid ili protein) koja je u suštini razvojedna, proizvedena odvojeno od, ili je prečiščena od ostalih bioloških komponenti organizma u kome se komponenta pojavljuje prirodno, tj., druga hromozomalna ili vanhromozomalna DNK i RNK, i proteini. Nukleinske kiseline, peptidi i proteini su bili "izolovani" prema tome uključuje nukleinske kiseline i proteine koji su prečipčeni standardnim postupcima za prečišćavanje. "Izolovane" nukleinske kiseline, peptidi i proteini mogu da budu deo kompozicije i dalje mogu da se izoluju ukoliko takva kompozicija nije deo nativnog okruženja nukleinske kiseline, peptida, ili proteina. Termin takođe obuhvata nukleinske kiseline, peptide i proteine koji su dobijeni rekombinantnom ekspresijom u ćeliji domaćinu kao i hemijski sintetisanim nukleinskim kiselinama. "Izolovano" antitelo ili fragment za vezivanje antigena, kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na antitelo ili na fragment za vezivanje antitela koje je u suštini slobodno od drugih antitela ili fragmenti za vezivanje antigena imaju različite antigene specifičnosti (na primer, izolovano antitelo koje se specifično vezuje za BCMA je u suštini slobodno od drugih antitela koja specifično vezuju antigene koji nisu BCMA). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop izooblik ili varijantu BCMA može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost sa drugim srodnim antigenima, na primer koji su poreklom iz drugih vrsta (kao što su homolozi vrsta BCMA).
[0053] "Polinukleotid," koji se kao sinonim zove "molekul nukleinske kiseline," "nukleotidi" ili "nukleinske kiseline," odnosi se na bilo koji poliribonukleotid ili polideoksiribonukleotid, koji može da bude nemodifikovana RNK ili DNK ili modifikovana RNK ili DNK. "Polinukleotidi" uključuju, bez ograničenja jedno i dvostruko-lančane molekule DNK, DNK koje je smeša jednoi dvostruko lančanih regiona, jedno- i dvostruko lančanu RNK, i RNK koja je smeša jedno- i dvostruko-lančanih regiona, hibridnih molekula koji sadrže DNK i RNK koji mogu da budu jedno-lančani ili, određenije, dvostruko lančani ili smeša jedno- i dvostruko lančanih regiona. Pored toga, "polinukleotid" se odnosi na trostruko-lančane regione koji sadrže RNK ili DNK ili obe RNK i DNK. Termin polinukleotid takođe uključuje DNK-e ili RNK-e koji sadrže jednu ili više modifikovanih baza DNA-a ili RNK-a sa bočnim nizom koji je modifikovan modified za stabilnost ili za druge razloge. "Modifikovane" baze uključuju, na primer, tritilovane baze i neuobičajene baze kao što je inozin. Razne modifikacije mogu da se naprave na molekulu DNK i RNK; prema tome, "polinukleotid" obuhvata hemijski, enzimski ili metabolički modifikovane oblike polinukleotida kao što se obično nalaze u prirodi, kao i hemijske oblike DNK i RNK karakteristične za viruse i ćelije. "Polinukleotid" takođe relativno obuhvata nukleinske kiseline kratkog lanca, koje su često naznačene kao oligonukleotidi.
[0054] Značenje "u suštini isto" može da se razlikuje u zavisnosti od konteksta u kome se termin koristi. Zbog toga što se varijacija u prirodnoj sekvenci verovatno nalazi između teških i lakih lanaca i gena koji ih kodiraju, treba očekivati da će se neki nivo varijacije pronaći u aminokiselinskim sekvencama ili genima koji kodiraju antitela ili ovde opisanim fragmentima za vezivanje antigena, sa malo ili bez uticaja na njihova jedinstvena svojstva vezivanja (npr., specifičnost i afinitet). Takvo očekivanje je delom zbog degenerisanosti genetičkog koda, kao i zahvaljujući evolutivnom uspehu varijacija konzervativne aminokiselinske sekvence, koja značajno ne menja prirodu kodiranog proteina. Prema tome, u kontekstu sekvenci nukleinskih kiselina, "u suštini isto" označnava najmanje 65% identitet između dve ili više sekvenci. Poželjno, termin se odnosi na najmanje 70% identitet između dve ili više sekvenci, poželjnije najmanje 75% identitet, poželjnije najmanje 80% identitet, još poželjnije najmanje 85% identitet, još poželjnije najmanje 90% identitet, još poželjnije najmanje 91% identitet, još poželjnije najmanje 92% identitet, još poželjnije najmanje 93% identitet, još poželjnije najmanje 94% identitet, još poželjnije najmanje 95% identitet, još poželjnije najmanje 96% identitet, još poželjnije najmanje 97% identitet, još poželjnije najmanje 98% identitet, i još poželjnije najmanje 99% ili veći identitet. Procenat identiteta između dve sekvence je funkcija broja identičnih pozicija koje dele sekvence (tj., % homologoka = # identičnih pozicija/ukupan # pozicija x 100), uzimajuči u obzir brojeve „gaps“, i dužinu svakog „gap“, koji treba da bude uveden za optimalno poravnanje dve sekvence. Procenat identiteta između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence može da bude npr. određen upotrebom algoritma od E. Meyers i W. Miller, Comput Appl. Biosci 4, 11-17 (1988) koji je uključen u ALIGN program (verzija 2.0), upotrebom PAM120 „weight residue table“, „gap length penalty“ od 12 i „gap penalty of 4“. Pored toga, procenat identiteta izmešu dve aminoliselinske sekvence može da se odredi upotrebom Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.48, 444-453 (1970) algoritma.
1
[0055] Stepen varijacije koji može da se dogodi u aminokiselinskog sekvenci proteina bez da ima suštinski efekat na funkciju proteina mnogo je niži od onog za sekvencu nuklelinske kiseline, s obzirom na to da isti principi degenerisanosti ne mogu da se primene na aminokiselinske sekvence. Prema tome, u kontekstu antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta, "u suštini isti" označava antitela ili antigen vezujuće fragmente sa 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identitetom sa antitelima ili opisanim antigen vezujućim fragmentima. Druga izvođenja uključuju antitela koja su specifična za BCMA, ili antigen vezujuće fragmente, koji imaju okvir čitanja, skelu, ili druge ne-vezujuće regione koji nemaju značajan zajednički identitet sa antitelima i ovde opisanim antigen vezujućim fragmentima, ali uključuju jedan ili više CDR-a ili drugih sekvenci koje su potrebne da bi se potvrdilo vezivanje koje je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identično sa takvim ovde opisanim sekvencama.
[0056] "Vektor" je replikon, kao što je plazmid, fag, kozmid, ili virus u kome segment druge nukleinske kiseline može operativno da bude insertovan tako da dovede do replikacije ili ekspresije segmenta
[0057] "Klon" je populacija ćelija koja se dobija od jedne ćelije ili zajedničkog pretka ćelije putem mitoze. "Ćelijska linija" je klon primarne ćelije koja je sposobna za stabilan rast in vitro u mnogim generacijama. U nekim ovde obezbeđenim primerima, ćelije su transformirane transfekcijom ćelija sa DNK.
[0058] Termini "eksprimirati" i "proizvesti" ovde se koriste kao sinonimi, i odnose se na biosintezu genskog proizvoda Ovi termini obuhvataju prepisivanje gena u RNK. Ovi termini takođe obuhvataju prevođenje RNK u jedan ili više polipeptida, i dalje obuhvataju sve posttranskripcione i post-translacione modifikacije koje se dešavaju u prirodi. Eksprimiranje ili proizvodnja antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena može da bude u citoplazmi ćelije, ili u vanćelijskom miljeu kao što je medijum za rast ćelijske kulture.
[0059] Termini "lečiti" ili "tretman" se odnosi na bilo kakav uspeh ili je pokazatelj uspeha u ublažavanju ili poboljšanju povrede, patologije ili stanja, uključujući bilo koji objektivni ili subjektivni parametar kao što je ublažavanje, remisija, umanjenje simptoma ili stvaranje stanja koje je podnošljivije za pacijenta, usporavanja u brzini degeneracije ili opadanja, što čini krajnju tačku degeneracije manje iscrpljujućom, čime se poboljšava fizičko ili mentalno stanje subjekta , ili produžavanja dužine preživljavanja. Tretman može da bude procenjen objektivnim ili subjektivnim parametrima; uključujući rezultate fizičkog ispitivanja, neurološkog ispitivanja, ili psihijatrijskih procena.
[0060] "Efikasna količina" ili "terapeutski efikasna količina" se odnosi, u doziranju i tokom potrebnih vremenskih perioda, da bi se postigao željeni terapeutski rezultat. Terapeutski efikasna količina BCMA x CD3 antitela može da se razlikuje prema faktorima kao što su stanje bolesti, starosna dob, pol, i težina individue, i sposobnost antitela da pokrene željeni odgovor kod individue. Terapeutski efikasna količina je takođe ona u kojoj bilo koji toksični ili oštećujući efekti antitela ili porcije antitela su nadmašeni terapeutski korisnim efektima.
[0061] "Antitelo" se odnosi na sve izotipove imunoglobulina (IgG, IgA, IgE, IgM, IgD, i IgY) uključujući različite monomerne, polimerne i himerne oblike, osim ukoliko nije drugačije
1
naznačeno. Specifično obuhvaćeni terminom "antitelo" su poliklonalna antitela, monoklonalna antitela (mAt-a), i polipeptidi koji su slični antitelu, kao što su himerna antitela i humanizovana antitela.
[0062] "Fragmenti za vezivanje antigena" su bilo koja proteinasta struktura koja može da ispolji afinitet vezivanja za određen antigen. Fragmenti za vezivanje antigena uključuju one koji su obuhvaćeni bilo kojim poznatim postupkom, kao što je enzimsko cepanje, sinteza peptida, i postupci rekombinancije. Neki fragmenti za vezivanje antigena se sastoje iz delova intaktinih antitela koji zadržavaju specifičnost za vezivanje antigena parentalnog molekula antitela. Na primer, fragmenti za vezivanje antigena mogu da sadrže najmanje jedan varijabilni region (varijabilni region ili teškog lanaca ili lakog lanca) ili jedan ili više CDR-a antitela koji je poznat da se vezuje za određen antigen. Primeri pogodnih fragmenata za vezivanje antigena uključuju, bez ograničenja diatela i jednolančani molekuli kao što su Fab, F(ab’)2, Fc, Fabc, i Fv molekule, jednolačana (Sc) antitela, laki lanci individualnog antitela, teški lanci individualnog antitela, himerna spajanja između lanaca antitela ili CDR-a i drugih proteina, proteinskih skela, monomera ili dimera teškog lanca, monomera ili dimera lakog lanca, dimera koji se sastoje iz jednog teškog i jednog lakog lanca, monovalentnog fragmenta koji se sastoji iz VL, VH, CL iCH1 domena, ili monovalentnog antitela kao što je opisano u WO2007059782, bivalentnih fragmenata koji se sastoje iz dva Fab fragmenta koja su povezana disulfidnim mostom u regionu zgloba, Fd fragment koji se u suštini sastoji od V.pod.H i C.pod.H1 domena; Fv fragmenta koji se u suštini sastoji iz VL i VH domena jednog kraja antitela, fragmenta dAt (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), koji se u suštini sastoji iz VH domena i takođe se naziva domenska antitela (Holt et al; Trends Biotechnol. 2003 Nov.; 21(11):484-90); kamilja ili nanotela (Revets et al; Expert Opin Biol Ther.2005 Jan.; 5(1):111-24); izolovanog regiona za određivanje komplementarnosti (CDR), i slično. Svi izotipovi antitela mogu da se koriste da bi se proizveli fragmenti za vezivanje antigena. Dodatno, fragmenti za vezivanje antigena mogu da uključe proteinogene okvire čitanja koji nisu deo antitela koji uspešno mogu da uključe polipeptidne segmente u orijentaciji koja daje afinitet za dati antigen od interesa, kao što su proteinske skele. Fragmenti za vezivanje antigena mogu rekombinantno da budu proizvedeni ili proizvedeni sa enzimskim ili hemijskim cepanjem intaktnih antitela. Fraza "antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena" mogu da se koriste da bi se označilo da dati fragment za vezivanje antigena uključuje jedan ili više aminokiselinskih segmenata antitela koji su naznačeni u izrazu.
[0063] Termin "epitop" označava proteinsku determinantu koja je sposobna da se specifično veže sa antitelom. Epitopi se obično sastoje iz površinskih grupacija molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične tri dimenzione strukturalne karakteristike, kao i specifične karakteristike u naelektrisanju. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje sa prvim ali ne kasnijim gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop može da sadrži aminokiselinske ostatke direktno uključene u vezivanju i druge aminokiselinske ostatke, koji nisu direktno uključeni u vezivanju, kao što su aminokiselinski ostaci koji su efikasno blokirani ili su pokriveni sa specifičnim antigen vezujućim peptidom (drugim rečima, aminokiselinski ostatak je u otisku specifičnog antigen vezujućeg peptida).
1
[0064] "Specifično vezivanje" ili "imunospecifično vezivanje" ili njegovi derivati kada se koriste u kontekstu antitela, ili fragmenata antitela, predstavlja vezivanje pomoću domena kodiranog sa imunoglobulinskim genima ili fragmentima imunoglobulinskih gena prema jednom ili više epitopa proteina od interesa, bez preferencijalnog vezivanja drugih molekula u uzorku koji sadrži pomešanu populaciju molekula. Obično, antitelo se vezuje za srodni antigen sa Kdmanjom od oko 1x10<-8>M, kao što je mereno testom površinske plazmonske rezonancije ili testom ćelijskog vezivanja. Fraze kao što su "[antigen]-specifično" antitelo (npr., BCMA-specifično antitelo) imaju za cilj sa prenesu da se navedeno antitelo specifično vezuje za navedeni antigen.
[0065] Termin "KD", kao što se ovde koristi, se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije određene interakcije antitela-antigena.
[0066] Termin "subjekat" se odnosi na humane i ne-humane životinje, uključujući sve kičmenjake, npr., sisare i nesisare, kao što su ne-humani primati, miševi, zečevi, ovce, psi, mačke, konji, krave, kokoši, vodozemci, i reptili. U mnogim izvođenjima postupaka koji se opisuju, subjekat je čovek.
[0067] Termin "uzorak" kao što se ovde koristi odnosi se na kolekciju sličnih tečnosti, ćelija, ili tkiva (npr., hirurški resecirano tumorsko tkivo, biopsije, uključujući aspiraciju finom iglom), izolovanje iz subjekta, kao i tečnosti, ćelje, ili tkiva koja se nalaze u subjektu. U nekim izvođenjima uzorak je biološka tečnost. Biološke tečnosti su obično tečnosti na fiziološkim temperaturama i mogu da uključe tečnosti koje se prirodno pojavljuju i prisutne su u, povučene su od, eksprimirane ili na drugi način ekstrahovane iz subjekta ili iz biološkog uzorka. Određene biološke tečnosti dobijaju se iz određenih tkiva, organa ili lokalizovanih regiona i određene druge biološke tečnosti mogu da budu više globalno ili sistemski prisutne u subjektu ili biološkom izvoru. Primeri bioloških tečnosti uključuju krv, serum i serzalne tečnosti, plazmu, limfu, urin, salivu, cističnu tečnost, suzne kapi, feces, sputum, mukozalne sekrete sekretornih tkiva i organa, vaginalne sekrete, ascitne tečnosti kao što su one koje su poveuzane sa nesolidnim tumorima, tečnosti pleuralnih, pericardijalnih, peritonealnih, abdominalnih i drugih telesnih šupljina, tečnosti koje su sakupljene bronhijalnom lavažom i slično. Biološke tečnosti mogu da takođe uključe tečne rastvore koji su kontaktirani sa subjektom subject ili biološkim izvorom, na primer, ćelija i medijum kulture organa koji uključuje ćeliju ili kondicionirani medijum organa, lavažne tečnosti i slično. Termin "uzorak," kao što se ovde koristi, obuhvata materijale koji su ukloneni iz subjekta ili materijali koji se nalaze kod subjekta.
[0068] "Poznati standard" može da bude rastvor koji ima poznatu količinu ili koncentraciju BCMA, pri čemu rastvor može da bude rastvor koji se pojavljuje u prirodi, kao što je uzorak za pacijenta za koga je poznato da ima rani, umereni, kasni, progresivni, ili statički kancer, ili rastvor može da bude sintetički rastvor kao što je puferovana voda koji nosi poznatu količinu razblaženog BCMA. Poznati standardi, koji se ovde opisuju mogu da uključe BCMA koji je izolovan iz subjekta, rekombinantni ili prečišćeni BCMA protein, ili vrednost koncentracije BCMA koja je povezana sa stanjem bolesti.
[0069] Termin "BCMA" kao što se odnosi na humani B ćelijski antigen zrenja, takođe poznat pod imenom BCMA, CD269, i TNFRSF17 (UniProt Q02223), koji je član superfamilije receptora
1
nekroze tumora koji je preferencijalno eksprimiran u diferenciranim plazma ćelijama. Vanćelijski domen humanog BCMA se sastoji, prema UniProt od aminokiselina 1 - 54 (ili 5-51). Termin "antitelo protiv BCMA, anti BCMA antitelo" kao što se ovde koristi se odnosi na antitelo koje se imunospecifično vezuje za BCMA.
[0070] Termin "CD3" se odnosi na humani CD3 proteinski multi-podjedinični kompleks. CD3 proteinski multi-podjedinični kompeks se sastoji iz 6 različitih polipeptidnih lanaca. Oni uključuju CD3γ lanac (SwissProt P09693), CD3δ lanac (Swiss-Prot P04234), dva CD3e lanca (SwissProt P07766), i jedan homodimer CD3 ζ lanca (SwissProt 20963), i koji je povezan sa α i β lancem T ćelijskog receptora. Termin "CD3" uključuje bilo koju varijantu CD3, izooblik i homolog vrsta koja je eksprimirana od strane ćelija (uključujući T ćelije) ili može da bude eksprimirana na ćelijama koje su transfektovane sa genima ili cDNK koja kodira ove peptide, osim ukoliko nije naznačeno.
[0071] "BCMA x CD3 antitelo" je multispecifično antitelo, opciono bispecifično antitelo, koje se sastoji iz dva različita regiona za vezivanje antigena, od kojih se jedno specifično vezuje za antigen BCMA i jedno koje se specifično vezuje za CD3. Multispecifično antitelo može da bude bispecifično antitelo, diatelo, ili sličan molekul (videti na primer PNAS USA 90(14), 6444-8 (1993) za opis diatela). Bispecifična antitela, diatela, i slično, koja su ovde obezbeđena mogu da vežu bilo koju pogodnu metu pored dela BCMA. Termin "bispecifično antitelo" treba razumeti kao antitelo koje ima dva različita regiona za vezivanje antigena koja su definisana sa različitim sekvencama antitela. Ovo može da se razume kao različito ciljno vezivanje ali takođe uključuje vezivanje za različite epitope u jednoj meti
[0072] "Referentni uzorak" je uzorak koji može da se uporedi sa drugim uzorkom, kao što je uzorak koji se ispituje, da se omogući karakterizacija upoređenog uzorka. Referentni uzorak će imati neko karakteristično svojstvo koje služi kao osnova za poređenje sa uzorkom koji se ispituje. Na primer, referentni uzorak može da se koristi kao merilo za nivoe BCMA koji ukazuju na to da osoba ima rak. Referentni uzorak ne mora nužno da se analizira paralelno sa uzorkom koji se ispituje, prema tome u nekim slučajevima referentni uzorak može da bude numerička vrednost ili opseg koji je prethodno određen da karakteriše dato stanje, kao su nivoi BCMA koji ukazuju na kancer kod subjekta. Izraz takođe uključuje uzorke koji su korišćeni za svrhe upoređivanja koji su poznati da su povezani sa fiziološkim stanjem ili stanjem bolesti, kao što je kancer koji eksprimira BCMA, ali koji imaju nepoznatu količinu BCMA.
[0073] Izraz "progresija," kao što je korišćen u kontekstu progresije kancera koji eksprimira BCMA, uključuje promenu u kanceru od manje teškog do ozbiljnijeg stanja. Ovo može da uključi povećanje u broju ili težini tumora, stepenu metastaze, brzinu kojom kancer raste ili se širi, i slično. Na primer, "progresija kancera debelog creva" uključuje progresiju takvog kancera od manje teškog do ozbiljnijeg stanja, kao što je progresija od stadijuma I do stadijuma II, od stadijuma II do stadijuma III, itd.
[0074] Izraz "regresija," kao što je korišćen u kontekstu regresije kancera koji eksprimira BCMA, uključuje promenu kancera od težeg do manje teškog stanja. Ovo može da uključi smanjenje u broju ili težini tumora, stepenu metastaze, brzinu kojom kancer raste ili se širi, i slično. Na primer, "regresija kancera debelog creva" uključuje regresiju takvog kancera od
1
težeg do manje teškog stanja, kao što je progresija od stadijuma III do stadijuma II, od stadijuma II do stadijuma I, itd.
[0075] Izraz "stabilan" kao što se koristi u kontekstu stabilnog kancera koji eksprimira BCMA, je namenjen da opiše stanje bolesti koje nije, ili nema, se značajno dovoljno promenilo tokom klinički relevantnog vremenskog perioda da bi se smatrao karcinomom koji napreduje ili nazaduje.
[0076] Ovde opisana izvođenja nisu ograničena na određene postupke, reagense, jedinjenja, kompozicije ili biološke sisteme, koji mogu, naravno, da se razlikuju.
Antitela koja su specifična prema BCMA i Fragmenti za vezivanje antigena
[0077] Ovde su opisana rekombinantna monoklonalna antitela ili fragmenti za vezivanje antigena koji specifično vezuju BCMA. Opšta struktura molekula antitela se sastoji domena za vezivanje antigena, koji uključuje teške i lake lance, i Fc domen, koji služi za različite funkcije, uključujući fiksiranje komplementa i vezivanje za receptore za antitela.
[0078] Opisana BCMA-specifična antitela ili fragmenti za vezivanje antigena uključuju sve izotipove, IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, i sintetičke multimere četvorolančane imunoglobulinske strukture. Opisana antitela ili fragmenti za vezivanje antigena takođe uključuju IgY izotip koji se generalno nalazi u serumu kokoši ili ćuretine i žumancetu kokoši ili ćuretine.
[0079] Antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena mogu da se dobiju iz bilo koje vrste korišćenjem rekombinantnih postupaka. Na primer, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena mogu da budu mišji, od pacova, koze, konja, svinje, govečeta, kokoši, zeca, kamile, magarca, čoveka, ili njihove himerne verzije. Za upotrebu u davanju ljudima, nehumana izvedena antitela ili fragmenti za vezivanje antigena mogu da budu genetički ili strukturalno izmenjeni tako da budu manje antigeni nakon davanja humanom pacijentu.
[0080] U nekim izvođenjima, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena su himerni. Kao što se ovde koristi, termin "himerni" se odnosi na antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, koji ima najmanje deo najmanje jednog varijabilnog domena koji je dobijen iz aminokiselinske sekvence ne-humanog sisara, glodara, ili reptila, dok preostali delovi antitela, ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena, su dobijeni od čoveka.
[0081] U nekim izvođenjima, antitela su humanizovana antitela. Humanizovana antitela mogu da budu himerni, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2 ili druge antigen-vezujuće podsekvence antitela) koje sadrže minimalnu sekvencu koja se dobija iz ne-humanog imunoglobulina. U većem delu, humanizovana antitela su humanizovani imunoglobulini (recipijentno antitelo) u kome ostati iz regiona koji određuje komplementarnost (CDR) recipijenta su zamenjeni sa ostacima CDR iz ne-humanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov ili zec koja imaju željenu specifičnost, afinitet, i kapacitet. Generalno, humanizovano antitelo će u suštini sadržati sve od najmanje jednog, i obično dva, varijabilna domena, u kojima svaki ili u suštini svaki od CDR regiona odgovara onom u ne-humanom imunoglobulinu i svaki ili u suštini svaki od regiona okvira čitanja su oni od humane imunoglobulinske sekvence. Humanizovano antitelo može da uključi najmanje deo imunoglobulinskog konstantnog regiona (Fc), obično od humanog imunoglobulina.
2
[0082] Antitela ili ovde opisani fragmenti za vezivanje antigena mogu da se pojave u različitim oblicima, ali će uključiti jedan ili više od CDR-a koji su prikazani u Tabeli 1.
[0083] Ovde su opisana rekombinantna antitela i fragmenti za vezivanje antigena koji se imunospecifično vezuju za BCMA. U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA ili fragmenti za vezivanje antigena su humani IgG, ili njegovi derivati. Dok antitela koja su specifična za BCMA ili fragmenti za vezivanje antigena koji su ovde prikazani su humani, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena koji su predstavljeni primerima mogu da budu himerizovani.
[0084] U nekim izvođenjima obezbeđeno je BCMA-specifično antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se sastoji iz teškog lanca koji se sastoji iz CDR1, CDR2, i CDR3 bio kog od antitela opisanih u Tabeli 1 i lakog lanca koji se sastoji iz CDR1, CDR2, i CDR3 bilo kog od antitela opisanih u Tabeli 1.
[0085] U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena sastoje se iz CDR1 teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 5, CDR3 teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 6, CDR1 lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 24, CDR2 lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 26. Ovo BCMA-specifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da sadrži sekvence humanog regiona okvira čitanja. Ovo BCMA-specifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena mogu da blokiraju vezivanje APRIL sa ICso od najmanje 5.9 nM. U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 27. U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 27 i varijabilni domen lakog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 28. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela koja se razmatraju u ovom paragrafu su pogodni za uključivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan kraj je anti-BCMA kraj.
[0086] U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena se sastoje se iz CDR1 teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 7, CDR2 teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 5, CDR3 teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 6, CDR1 lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 24, CDR2 lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 26. Ovo BCMA-specifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena može da sadrži sadrži sekvence humanog regiona okvira čitanja. U nekim izvođenjima, BCMA- specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena sastoje se iz varijabilnog domena teškog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 57. U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena sastoje se iz varijabilnog domena teškog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 57 i varijabilnog domena lakog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 28. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela koja se razmatraju u ovom paragrafu su pogodni za uključivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan kraj je anti-BCMA kraj.
[0087] U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena se sastoje se iz CDR1 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 7, CDR2 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 5, CDR3 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 6, CDR1 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 24, CDR2 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 26. Ovo BCMA- specifično antitelo i fragment za vezivanje antigena mogu da sadrže humane sekvence regiona okvira čitanja. U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 34. U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 34 i varijabilni domen lakog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 28. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela koji su razmotreni u ovom paragrafu su pogodni za uključivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan kraj je anti-BCMA kraj.
[0088] U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena se sastoje iz CDR1 teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 5, CDR3 teškog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 19, CDR1 lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 24, CDR2 lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 26. Ovo BCMA-specifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena mogu da sadrže humane sekvence regiona okvira čitanja. U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 39. U nekim izvođenjima, BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 39 i varijabilni domen lakog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 28. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca of antitela koji se razmatraju u ovom paragrafu su pogodni za uključivanje u bispecifične konstrukte u kojima jedan kraj je anti-BCMA kraj.
[0089] U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena sadrže CDR1 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 8, CDR3 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 6, CDR1 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 24, CDR2 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 26. Ovo antitelo koje je specifično za BCMA ili fragment za vezivanje antigena mogu da sadrže sekvence humanog okvira čitanja. U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca u suštini isti, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 40. U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca u suštini isti, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 40 i varijabilni domen lakog lanca u suštini isti, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 28. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela koja su u ovom paragrafu razmotrena su pogodna za uključivanje u bispecifične konstrukte u kojima je jedan kraj anti-BCMA kraj.
[0090] U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena sadrže CDR1 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 13, CDR2 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 5, CDR3 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 19, CDR1 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 24, CDR2 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 26. Ovo antitelo koje je specifično za BCMA ili njegov fragment za vezivanje antigena mogu da sadrže sekvence humanog okvira čitanja. U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini isti, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 58. U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini isti, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 58 i varijabilni domen lakog lanca koji je u suštini isti, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 28. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela koja su u ovom paragrafu razmotrena su pogodni za uključivanje u bispecifične konstrukte u kojima je jedan kraj anti-BCMA kraj.
[0091] U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena sastoje se CDR1 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 13, CDR2 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 8, CDR3 teškog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 19, CDR1 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 24, CDR2 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji se sastoji iz SEQ ID NO: 26. Ovo antitelo specifično za BCMA ili fragment za vezivanje antigena mogu da sadrže sekvence humanog okvira čitanja. U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini isti kao, ili identičan sa, SEQ ID NO: 43. U nekim izvođenjima, antitela koja su specifična za BCMA i fragmenti za vezivanje antigena sadrže varijabilni domen teškog lanca koji je u suštini isti kao, ili je identičan sa, SEQ ID NO: 43 i varijabilni domen lakog lanca koji je u suštini isti kao, ili identičan sa, SEQ ID NO: 28. Varijabilni domen teškog lanca i varijabilni domen lakog lanca antitela koja su u ovom paragrafu razmotrena su pogodni za uključivanje u bispecifične konstrukte u kojima je jedan kraj anti-BCMA kraj.
[0092] U nekim izvođenjima, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena su IgG, ili njegovi derivati, npr., IgG1, IgG2, IgG3, i izotipovi IgG4. U nekim izvođenjima gde je antitelo izotip IgG1, antitelo sadrži Fc region IgG1 (SEQ ID NO.74).
U nekim izvođenjima u kojima je antitelo izotip IgG4, antitelo sadrži S228P, L234A, i L235A zamene u njegovom Fc regiou (SEQ ID NO.73).
2
Specifična antitela koja su definisana sa CDR i/ili sekvence varijabilnog domena koje se razmatraju u gornjim paragrafima mogu da uključe ove regione Fc IgG.
[0093] Takođe su prikazani izolovani sintetički polinukleotidi koji kodiraju antitela ili fragmente za vezivanje antigena koji se imunospecifično vezuju za BCMA. Izolovani polinukleotidi koji su sposobni za kodiranje ovde obezbeđenih segmenata varijabilnih domena mogu da budu uključeni na istom, ili različitim, vektorima da bi se proizvela antitela ili fragmenti za vezivanje antigena.
[0094] Polinukleotidi koji kodiraju rekombinantne antigen-vezujuće proteine takođe su obuhvaćeni obimom pronalaska. U nekim izvođenjima, opisani polinukleotidi (i peptidi koje kodiraju) uključuju vodeću sekvencu. Može da se koristi bilo koja vodeća sekvenca koja je poznata u oblasti tehnike. Vodeća sekvenca može da uključi, ali nije ograničena na, restrikciono mesto ili start mesto za translaciju.
[0095] BCMA-specifična antitela ili ovde opisani fragmenti za vezivanje antigena uključuju varijante sa jednom ili više aminokiselinskih zamena, delecija, ili adicija koje zadržavaju biološka svojstva (npr., afinitet vezivanja ili imunsku efektorsku aktivnost) opisanih BCMA-specifičnih antitela ili fragmenata za vezivanje antigena. U kontekstu predmetnog pronalaska sledeće oznake su, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, korišćene za opisivanje mutacije; i) zamena aminokiseline u datoj poziciji je napisana npr. K409R što označava zamenu lizina u poziciji 409 sa argininom; i ii) za specifične varijante korišćeni su specifični kodovi od tri ili jednog slova, uključujući kodove Xaa i X da bi se označio aminokiselinski ostatak. Prema tome, zamena arginina umesto lizina u poziciji 409 je označena sa: K409R, ili zamena bilo kog aminokiselinskog ostatka za lizin u poziciji 409 je označena sa K409X. U slučaju uklanjanja lizina u poziciji 409 naznačeno je sa K409*. Stručnjak iz oblasti tehnike može da proizvede mnoge varijante koje imaju jednu ili više aminokiselinskih zamena, delecija, ili adicija.
[0096] Ove varijante mogu da uključe: (a) varijante u kojima je jedan ili više aminokiselinskih ostataka zamenjen sa konzervativnim ili nekonzervativnim aminokiselinama, (b) varijante u kojima je jedna ili više aminokiselina dodato na ili je uklonjeno sa polipeptida, (c) varijante u kojima jedna ili više aminokiselina uključuje supstituentnu grupu, i (d) varijante u kojima je polipeptid spojen sa drugim peptidom ili polipetidom kao što je partner za spajanje, proteinski obeleživač ili drugi hemijski ostatak, koji mogu da daju korisna svojstva polipeptidu, kao što su, na primer, epitop za antitelo, polihistidinska sekvenca, ostatak biotina i slično. Antitela ili ovde opisani fragmenti za vezivanje antigena mogu da uključe varijante u kojima aminokiselinski ostaci iz jedne vrste su zamenjeni sa odgovarajućim ostatkom u drugim vrstama, ili na konzervisanim ili nekonzervisanim pozicijama. U drugim izvođenjima, aminokiselinski ostaci na nekonzervisanim pozicijama su zamenjeni sa konzervisanim ili nekonzervisanim ostacima. Postupci za dobijanje ovih varijanti, uključujući genetičke (delecije, mutacije, itd.), hemijski, i enzimski postupci, su poznati osobama koji su uobičajeno verzirani u oblast tehnike
[0097] BCMA-specifična antitela ili fragmetni za vezivanje antigena koji se ovde opisuju mogu da obuhvate nekoliko izotipova antitela, kao što su IgM, IgD, IgG, IgA i IgE. U nekim izvođenjima izotip antitela je IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 izotip, poželjno IgG1 ili IgG4 izotip.
Specifičnost antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena je uglavnom određena aminokiselinskom sekvencom, i aranžmanom, CDR-a. Prema tome, CDR-i u jednom izotipu mogu da budu preneti na drugi izotip bez izmene antigenske specifičnosti. Alternativno, uspostavljeni su postupci koji uzrokuju prelaz za proizvodnju jednog izotipa antitela ka drugom (izotipsko prekopčavanja) bez menjanja antigenske specifičnosti. Prema tome, takvi izotipovi antitela su obuhvaćeni obimom antitela ili fragmenata za vezivanje antigena.
[0098] BCMA-specifična antitela ili ovde opisani fragmenti za vezivanje antigena imaju vrednosti IC50manje od 5.9 nM za vezivanje za APRIL. IC50opisanih BCMA-specifičnih antitela, ili fragmenata za vezivanje antigena, mogu da se odrede različitim postupcima koji su poznati u oblasti tehnike, kao što su postupci koji su zasnovani na ELISA ili protočna citometrija (FACS). Testovi za merenje IC50sa ELISA imaju BCMA vezan za ploču u prisusutvu ili odsusutvu BCMA specifičnog antitela i korišćene su različite koncentracije APRIL. Antitelo za BCMA koje blokira vezivanje APRIL sa BCMA je da se "blokira APRIL kao što je mereno sa ELISA."
[0099] Takođe su obezbeđei vektori koji se sastoje iz ovde opisanih polinukleotida. Vektori mogu da budu ekspresioni vektori. Rekombinantni ekspresioni vektori koji sadrže sekvencu koja kodira polipeptid od interesa su prema tome obuhvaćeni obimom prikaza. Ekspresioni vektor može da sadrži jednu ili više dodatnih sekvenci kao što su ali bez ograničenja na regulatorne sekvence (npr., promotor, pojačivač), marker za selekciju, i signal za poliadenilaciju. Vektori za transformaciju raznih ćelija domaćina su dobro poznati i uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide, fagemide, kozmide, bakuloviruse, bakmide, bakterijske veštačke hromozome (BAC-e), veštačke hromozome kvasca (YAC-e), kao i druge bakterijske, kvašćeve i virusne vektore.
[0100] Rekombinantni ekspresioni vektori koji su obuhvaćeni obimom opisa uključuju sintetičke, genomske, ili izvedene iz cDNK fragmente nukleinske kiseline koji kodiraju najmanje jedan rekombinantni protein koji može operativno da bude povezan sa odgovarajućim regulatornim elementima. Takvi regulatorni elementi mogu da uključe transkripcioni promotor, sekvence koje kodiraju odgovarajuća mesta za vezivanje iRNK u ribozomu, i sekvence koje kontrolišu terminaciju transkripcije i translacije. Ekspresioni vektori, posebno sisarski ekspresioni vektori, mogu takođe da uključe jedan ili više elemenata koji se ne prepisuju kao što je mesto početka replikacije, odgovarajući promotor i pojačivač koji su povezani sa genom koji treba da se eksprimira, druge 5’ ili 3’ sekvence koje ograničavaju a koje se ne prepisuju, 5’ ili 3’ netranslatirajuće sekvence (kao što su neophodna mesta za vezivanje ribozoma), mesto za poliadenilaciju, donorska i akceptorska mesta splajsovanja, ili sekvence za terminaciju transkripcije. Početak replikacije koji daje mogućnost replikacije u domaćinu takođe može da bude uključen.
[0101] Sekvence za kontrolu transkripcije i translacije u ekspresionim vektorima koje trebaju da se koriste u transformaciji ćelija kičmenjaka mogu da se obezbede od virusnih izvora. Primeri vektora mogu da se dobiju kao što je opisano od strane Okayama and Berg, 3 Mol. Cell. Biol.280 (1983).
[0102] U nekim izvođenjima, antitelo- ili kodirajuća sekvenca fragmenta za vezivanje antigena se nalazi pod kontrolom moćnog konstitutivnog promotora, kao što su promotori za sledeće
2
gene: hipoksantin fosforibozil transferazu (HPRT), adenozin deaminazu, piruvat kinazu, betaaktin, humani miozin, humani hemoglobin, humani mišićni kreatin, i drugi. Dodatno, mnogi virusni promotori funkcionišu konstitutivno u eukariotskim ćelijama i pogodni su za upotrebu sa opisanim izvođenjima. Takvi virusni promotori uključuju bez ograničenja, Citomegalovirusni (CMV) trenutni rani promotor, rani i kasni promotori SV40, promotor virusa mišeg tumora dojke (MMTV), dugi terminalni ponovci (LTRs) Maloney virusa leukemije, Virusa humane imunodeficijencije (HIV), Epstein Barov Virus (EBV), Rous Sarkoma Virus (RSV), i drugi retrovirusi, i timidin kinazni promotor Herpes Simpleks Virusa. U jednom izvođenju, kodirajuća sekvenca BCMA-specifičnog antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena je postavljena pod kontolom inducibilnog promotora kao što je metalotioneinski promotor, tetraciklin-inducibilni promotor, doksiciklin-inducibilni promotor, promotori koji sadrže jedan ili više interferonom-stimulisanih elemenata odgovora (ISRE) kao što je protein kinazne R 2’,5’-oligoadenilatne sintetaze, Mx geni, ADAR1, i slično.
[0103] Ovde opisani vekori mgu da sadrže jedno ili više Internalnih mesto(a) ulaza ribozoma (IRES). Uključivanje IRES sekvence u spojene vektore može da bude od koristi za pojačanje ekspresije nekih protena. U nekim izvođenjima sistem vektora će uključiti jedno ili više mesta za poliadenilaciju (npr., SV40), koja mogu da budu uzvodno ili nizvodno od bilo koje od gorepomenutih sekvenci nukleinskih kiselina. Komponente vektora mogu da budu spojene u kontinuitetu, ili aranžirane na način koji obezbeđuje optimalan razmak za eksprimiranje genskih proizvoda (tj., uvođenjem nukleotida "razmaka" između ORF-a), ili pozicioniranjem na drugi način. Regulatorni elementi, kao što je IRES motiv, mogu takođe da budu uređeni da obezbede optimalan razmak za ekspresiju.
[0104] Vektori mogu da sadrže selekcione markere, koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Selekcioni markeri uključuju pozitivne i negativne selekcione markere, na primer, gene za rezistentnost na antibiotike (npr., gen za rezistentnost na neomicin, gen za rezistentnost na higromicin, gen za rezistentnost na kanamicin, gen za rezistentnost na tetraciklin, gen za rezistentnost na penicilin, gen za rezistentnost na puromicin, gen za rezistentnost na blasticidin), geni za glutamat sintazu, HSV-TK, HSV-TK derivati za selekciju ganciklovira, ili bakterijski gen za purin nukleozid fosforilazu za selekciju 6-metilpurina (Gadi et al., 7 Gene Ther. 1738-1743 (2000)). Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira selekcioni marker ili mesto kloniranja mogu da budu uzvodno ili nizvodno od sekvence nukleinske kiseline koja kodira polipeptid od interesa ili mesto kloniranja.
[0105] Ovde opisani vektori mogu da se koriste za transformisanje raznih ćelija sa opisanim antitelima ili fragmentima za vezivanje antigena. Na primer, vektori mogu da se koriste za dobijanje ćelija koje proizvode BCMA-specifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena. Prema tome, drugi aspekt karakterišu ćelije domaćina koje su transformisane sa vektorima koji se sastoje iz sekvence nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena koji se specifično vezuje za BCMA, kao što su antitela ili fragmenti za vezivanje koji su opisani i ovde predstavljeni primerima.
[0106] U oblasti tehnike su poznati brojni postupci za uvođenje stranih gena u ćelije i mogu da se koriste za konstrukciju rekombinantnih ćelija za svrhe izvođenja opisanih postupaka, u skladu sa različitim izvođenjima koji su ovde opisani i predstavljeni primerima. Korišćeni
2
postupci trebaju da obezbede stabilan transfer heterologne genske sekvence u ćeliju domaćina, tako da je heterologna genska sekvenca nasledna i može da se eksprimira od stane ćelija potomaka, i tako da neophodne razvojne i fiziološke funkcije recipijentnih ćelija nisu narušene. Postupci koji mogu da se koriste uključuju ali nisu ograničeni na hromozomski transfer (npr., spajanje ćelija, transfer gena koji je posredovan hromozomom, mikro ćelijski posredovani transfer gena), fizički postupci (npr., transfekcija, spajanje sferoblasta, mikroinjekcija, elekroporacija, nosač lipozoma), transfer virusnog vektora (npr., rekombinantni DNK virusi, rekombinantni RNK virusi) i slično (opisano u Cline, 29 Pharmac. Ther. 69-92 (1985)). Taloženje kalcijum fosfata i polietilen glikolom indukovano (PEG) spajanje bakterijskih protoplasta sa sisarskim ćelijama takođe mogu da se koriste za transformisanje ćelija.
[0107] Ćelije koje su pogodne za upotrebu u eksprimiranju ovde opisanih BCMA-specifičnih antitela ili fragmenata za vezivanje antigena su poželjno eukariotske ćelije, najpoželjnije ćelije biljaka, glodara, ili humanog porekla, na primer ali bez ograničenja na NSO, CHO, CHOK1, perC.6, Tk-ts13, BHK, HEK293 ćelije, COS-7, T98G, CV-1/EBNA, L ćelije, C127, 3T3, HeLa, NS1, Sp2/0 ćelije mijeloma, i BHK ćelijske linije, između ostalih. Dodatno, eksprimiranje antitela može da se postigne upotrebom ćelija mijeloma. Postupci za proizvodnju hibridoma su dobro uspostavljeni u oblasti tehnike.
[0108] Ovde opisane ćelije koje su transformisane sa ekspresionim vektorima mogu da budu izabrane ili ispitane za rekombinantnu ekspresiju ovde opisanih antitela ili fragmenata za vezivanje antigena. Rekombinantno-pozitivne ćelije su proširene i ispitane su za podklonove koji ispoljavaju željeni fenotip, kao što je visok nivo ekspresije, pojačana svojstva rastva, ili sposobnost za dobijanje proteina sa željenim biohemijskim karakteristikama, na primer, zbog modifikacije proteina ili izmenjenih post-translacionih modifikacija. Ovi fenotipovi mogu da budu zbog inherentnih svojstava datog podklona ili mutacije. Mutacije mogu da budu pogođene kroz upotrebu hemikalija, svetlosti UV-talasne dužine, zračenja, virusa, insercionih mutagena, inhibicije popravke pogrešno sparene DNK, ili kombinacijom takvih postupaka.
Postupci za upotrebu BCMA-specifičnih antitela za lečenje
[0109] Ovde su obezbeđena BCMA-specifična antitela ili njihovi fragmenti za vezivanje za upotrebu u terapiji. Posebno, ova antitela ili fragmenti za vezivanje antigena mogu da budu korisni u lečenju kancera, kao što je kancer koji eksprimira BCMA. Prema tome, pronalazak obezbeđuje antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, kao što je definisano u zahtevima, za upotrebu u postupku lečenja kancera koji se sastoji iz davanja antitela. Na primer, upotreba može da bude interferiranje sa interakcijama receptora sa BCMA ili gde je antitelo konjugovano sa toksinom, tako da se toksin cilja na kancer koji eksprimira BCMA. U nekim izvođenjima kancer koji eksprimira BCMA uključuje limfom, kao što je multipli mijelom (MM). Antitela za upotrebu u ovim postupcima uključuju ona koja su ovde u tekstu opisana, na primer, antitelo koje je specifično za BCMA ili fragment za vezivanje antigena sa karakteristikama koje su navedene u Tabeli 1, na primer CDR-i ili sekvence varijabilnog domena, i u daljem razmatranju ovih antitela.
2
[0110] U nekim ovde opisanim izvođenjima, imunska efektorska svojstva antitela koja su specifična za BCMA mogu da budu pojačana ili utišana preko modifikacija Fc sa postupcima koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Na primer, Fc efektorske funkcije kao što je vezivanje Clq, citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), ćelijski posredovana citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC), ćelijski posredovana fagocitoza koja zavisi od antitela (ADCP), smanjena regulacija ćelijskih površinskih receptora (npr., B ćelijski receptor; BCR), itd. mogu da se dobiju i/ili kontrolišu modifikacijom ostataka u Fc koji je odgovoran za ove aktivnosti.
[0111] " Ćelijski posredovana citotoksičnost koja zavisi od antitela " ili "ADCC" se odnosi na reakciju koja je posredovana ćelijom u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcRs) (npr. prirodne ćelije ubice (NK), neutrofili, i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji i nakon toga uzrokuju liziranje ciljne ćelije.
[0112] Sposobnost monoklonskih antitela da indukuju ADCC može da bude pojačana inženjeringom njihove oligosaharidne komponente. Humani IgG1 ili IgG3 su N-glikozilovani na Asn297 sa većinom glikana u dobro poznatim biantenarnim G0, G0F, G1, G1F, G2 ili G2F oblicima. Antitela koja su proizvedena ne-inženjerizovanim CHO ćelijama obično imaju sadržaj glikana fukoze od oko najmanje 85%. Uklanjanje jezgra fukoze sa oligosaharida tipa biantenarnog kompleksa koji su vezani za Fc regione pojačava ADCC antitela preko unapređenog Fc.gama.RIIIa vezivanja bez menjana vezivanja antigena ili aktivnosti CDC. Takva mAt-a mogu da se postignu upotrebom različitih postupaka za koje je prijavljeno da dovode do uspešne ekspresije relativno visoko defukozilovanih antitela koja nose tip biantenarnog kompleksa Fc oligosaharida kao što je kontrola osmolarnosti kulture (Konno et al., Cytotechnology 64:249-65, 2012), primena varijante CHO linije Lec13 kao linije ćelije domaćina (Shields et al., J Biol Chem 277:26733-26740, 2002), primena varijante CHO linije EB66 kao linije ćelije domaćina (Olivier et al., MAbs; 2(4), 2010; Epub ispred štampe; PMID:20562582), primena ćelijske linije hibridoma pacova YB2/0 kao linije ćelije domaćina (Shinkawa et al., J Biol Chem 278:3466-3473, 2003), uvođenje male interferirajuće RNK specifično protiv .alpha. 1,6-fukoziltrasferaze (FUT8) gena (Mori et al., Biotechnol Bioeng 88:901-908, 2004), ili istovremena ekspresija β-1,4-N-acetilglukozaminiltransferaze III i goldži α-manozidaze II ili potentnog inhibitora alfa-manosidaze I, kifunensin (Ferrara et al., J Biol Chem 281:5032-5036, 2006, Ferrara et al., Biotechnol Bioeng 93:851-861, 2006; Xhou et al., Biotechnol Bioeng 99:652-65, 2008).
[0113] U nekim ovde opisanim izvođenjima, ADCC koja je pokrenuta sa BCMA antitelima može takođe da bude pojačana sa određenim zamenana u Fc regionu antitela. Primeri zamena su na primer zamene u aminokiselinskim pozicijama 256, 290, 298, 312, 356, 330, 333, 334, 360, 378 or 430 (numerisanje ostataka prema EU indeksu) kao što je opisano u U.S. Pat. Br.
6,737,056.
Postupci za detekciju BCMA
[0114] Ovde su obezbeđeni postupci za detekciju BCMA u biološkom uzorku dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, kao što je ovde opisano. Kao što je ovde opisano, uzorak može da se dobije iz urina, krvi, seruma, plazme,
2
pljuvačke ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu vezane za tkivo (tj., slobodne ćelije), tkiva (npr., hirurški resektovanog tumorskog tkiva, biopsija, uključujući aspiracije sa finom iglom), histološke preparate, i slično. U nekim izvođenjima opisani postupci uključuju detekciju BCMA u biološkom uzorku dovođenjem u kontakt uzorka sa bilo kojim od BCMA-specifičnih antitela ili njihovih fragmenata za vezivanje antigena koji su ovde opisani.
[0115] U nekim izvođenjima uzorak može da bude doveden u kontakt sa više od jednim od BCMA-specifičnim antitelima ili fragmentima za vezivanje antigena koji se ovde opisuju. Na primer, uzorak može da se dovede u kontakt sa prvim BCMA-specifičnim antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, i zatim može da se dovede u kontakt sa drugim BCMA-specifičnim antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, pri čemu prvo antitelo ili fragment za vezivanje antigena i drugo antitelo ili fragment za vezivanje antigena nisu isto antitelo ili fragment za vezivanje antigena. U nekim izvođenjima, prvo antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, mogu da budu pričvršćeni za površinu, kao što je ploča sa većim brojem bunarića, čip, ili sličan supstrat pre dovođenja u kontakt sa uzorkom. U drugim izvođenjima prvo antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, može da ne bude pričvršćen za površinu, ili vezan, za bilo šta pre dovođenja u kontakt sa uzorkom.
[0116] Opisana BCMA-specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena mogu da budu obeleženi za detekciju. U nekim izvođenjima obeležena antitela i fragmenti za vezivanje za antigen mogu da olakšaju detekciju BCMA pomoću postupaka koji se ovde opisuju. Mnogi takvi obeleživači su već poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Na primer, odgovarajući obeleživači uključuju, ali ne treba se smatrati da su ograničeni na, radioobeleživače, fluorescentne obeleživače, tagove za epitope, biotin, obeleživače hromofore, ECL obeleživače, ili enzime. Određenije, opisani obeleživači uključuju rutenijum,<111>In-DOTA,<111>Indietilentriaminpentasirćentnu kiselinu (DTPA), peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu i betagalaktozidazu, poli-histidin (HIS tag), akridinske boje, cijaninske boje, fluoron boje, oksazin boje, fenantridin boje, rodamin boje, Alexafluor® boje, i slično.
[0117] Opisana BCMA- specifična antitela i fragmenti za vezivanje antigena mogu da se koriste u različitim testovima za detekciju BCMA u biološkom uzorku. Neki pogodni testovi uključuju, ali ne treba ih smatrati da su ograničeni na, western blot analizu, radioimunotest, površinsku plazmonsku rezonancu, imunofluorimetriju, imunoprecipitaciju, ravnotežnu dijalizu, imunodifuziju, elektrohemiluminiscentni (ECL) imunotest, imunohistohemiju, sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS) ili ELISA test.
[0118] U nekim ovde opisanim izvođenjima detekcija ćelija kancera koje eksprimiraju BCMA kod subjekta može da se koristi za određivanje da li subjekt može da se leči sa terapeutskim agensom koji je usmeren prema BCMA.
[0119] BCMA se nalazi u detektabilnim nivoima u uzorcima krvi i seruma. Prema tome, ovde su obezbeđeni postupci za detekciju BCMA u uzorku koji je dobijen iz krvi, kao što je uzorak seruma, dovođenjem u kontak uzorka sa antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koji specifično vezuje BCMA. Uzorak krvi, ili njegov derivat, mogu da budu razblaženi, podeljeni, ili na drugi način obrađeni da se dobije uzorak na kome se može izvršiti opisani postupak. U nekim izvođenjima, BCMA može da se detektuje u uzorku krvi, ili kao njegov
2
derivat, bilo kojim brojnim testovima koji su poznati iz oblasti tehnike, kao što su, ali bez ograničenja na, western blot analizu, radioimunotest, površinsku plazmonsku rezonanciju, imunofluorimetriju, imunoprecipitaciju, ravnotežnu dijalizu, imunodifuziju, elektrohemiluminiscentni (ECL) imunotest, imunohistohemiju, sortiranje ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS) ili ELISA testom.
Postupci za dijagnozu kancera
[0120] Ovde su obezbeđeni postupci za dijagnozu kancera koji eksprimira BCMA kod subjekta U nekim izvođenjima kancer koji eksprimira BCMA uključuje limfome kao što je, multipli mijelom (MM). U nekim izvođenjima, kao što je opisano gore u tekstu, detekcija BCMA u biološkom uzorku, kao što je uzorak krvi ili uzorak seruma, obezbeđuje sposobnost za dijagnozu kancera kod subjekta od koga je uzorak dobijen. Alternativno, u nekim izvođenjima drugi uzorci kao što je histološki uzorak, uzorak aspirata finom iglom, resektovano tumorsko tkivo, cirkulišuće ćelije, cirkulišuće tumorske ćelije i slično, mogu takođe da se koriste za ispitivanje da li subjekat od koga je uzorak dobijen ima kancer. U nekim izvođenjima, može takođe već da bude poznato da subjekat od koga je uzorak dobijen ima kancer, ali tip kancera koji pogađa subjekta može još da ne bude dijagnoziran ili preliminarna dijagnoza može još uvek da ne bude jasna, prema tome detekcija BCMA u biološkom uzorku koji je dobijen od subjekta omogućava za, ili razjašnjava, dijagnozu kancera. Na primer, može da bude poznato da subjekat ima kancer, ali može da ne bude poznato, ili može da bude nejasno, da li je kancer subjekta takav da eksprimira BCMA.
[0121] U nekim izvođenjima opisani postupci uključuju ispitivanje da li je subjekt pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA određivanjem količine BCMA koja je prisutna u biološkom uzorku koji se dobija od subjekta; i poređenjem uočene količine BCMA sa količinom BCMA u kontroli, ili referenci, uzorka, pri čemu razlika između količine BCMA u uzorku koji je dobijen iz subjekta i količine BCMA u kontroli, ili referenci, uzorka je indikacija da je subjekat pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA. U drugom izvođenju količina BCMA koja je uočena u biološkom uzorku dobijenom od subjekta može da se uporedi sa nivoima BCMA za koje je poznato da su povezani sa oblicima ili stadijumima kancera, da bi se odredio oblik ili stadijum kancera subjekta. U nekim izvođenjima količina BCMA u uzorku koji je dobijen od subjekta se se ispituje dovođenjem u kontakt subjekta sa antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koje imunospecifično vezuje BCMA, kao što su ovde opisana antitela koja su specifična za BCMA. Uzorak koji je ispitan za BCMA može da bude dobijen iz urina, krvi, seruma, plazme, salive, ascitnih tečnosti, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu vezane za tkivo (tj., slobodne ćelije), tkiva (npr., hirurški resektovano tumorsko tkivo, biopsije, uključujući aspiraciju finom iglom), histološke preparate, i slično. U nekim izvođenjima kancer koji eksprimira BCMA uključuje hematološki kancer, kao što je multipli mijelom (MM). U nekim izvođenjima subjekat je čovek.
[0122] U nekim izvođenjima postupak za dijagnozu kancera koji eksprimira BCMA će uključiti: dovođenje u kontakt biološkog uzorka subjekta sa BCMA-specifičnim antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena (kao što su oni koji se dobijaju od antitela i fragmenata obezbeđenih u Tabeli 1), kvantifikovanje količine BCMA koja se nalazi u uzorku koja je vezana od strane antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena, poređenjem količine BCMA koja se nalazi u uzorku sa poznatim standardom ili referentnim uzorkom; i određivanje da li nivoi BCMA kod subjekta spadaju u nivoe BCMA koji su povezani sa kancerom. U dodatnom izvođenju, dijagnostički postupak može da prati dodatni korak davanja ili prepisivanja tretmana koji je specifičan za kancer. U drugom izvođenju, dijagnostički postupak može da prati dodatni korak prenošenja rezultata radi određivanja lakšeg lečenja kancera. U nekim izvođenjima tretman koji je specifičan za kancer može da bude usmeren prema kancerima koji eksprimiraju BCMA, kao što su ovde opisana BCMA x CD3 multispecifična antitela.
[0123] U nekim izvođenjima opisani postupci uključuju ispitivanje da li je subjekat pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA određivanjem količine BCMA koja je prisutna u uzorku krvi ili seruma koji se dobija iz subjekta; i poređenja uočene količine BCMA sa količinom BCMA u kontroli, ili referenci, uzorku, pri čemu razlika između količine BCMA u uzorku koji je dobijen od subjekta i količine BCMA u kontroli, ili referenci, uzorka je indikacija da je subjekat pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA.
[0124] U nekim izvođenjima kontrola, ili referenca, uzorka mogu da se dobiju od subjekta koji nije pogođen da kancerom koji eksprimira BCMA. U nekim izvođenjima kontrola, ili referenca, uzorka mogu da se dobiju od subjekta koji je pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA. U nekim izvođenjima gde kontrola, ili referenca, uzorka je dobijena od subjekta koji nije pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA, uočeno povećanje u količini BCMA koje je prisutno u uzorku koji se ispituje, u odnosu na ono koje se uočava za kontrolu ili referentni uzorak, je indikacija da je subjekat koji se ispituje pogođen da kancero koji eksprimira BCMA. U nekim izvođenjima gde je kontrolni uzorak dobijen od subjekta koji nije pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA, uočeno opadanje ili sličnost u količini BCMA koja je prisutna u uzorku koji se ispituje, u odnosu na onu koja se uočava za kontrolu ili referentni uzorak, je indikacija da subjekat koji se ispituje nije pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA. U nekim izvođenjima gde kontrola ili referentni uzorak je dobijen od uzorka koji je pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA, uočena sličnost u količini BCMA koji je prisutan u uzorku koji se ispituje, u odnosu na onaj koji se uočava za kontrolu ili referentni uzorak, je indikacija da subjekat koji se ispituje je pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA. U nekim izvođenjima gde kontrolni ili referentni uzorak je dobijen od subjekta koji je pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA, uočeno opadanje u količini BCMA koji je prisutan u uzorku koji se ispituje, u odnosu na uočen kod kontrole ili referentnog uzorka, je indikacija da subjekat koji se ispituje nije pogođen sa kancerom koji eksprimira BCMA.
[0125] U nekim izvođenjima količina BCMA u uzorku koji je dobijen od subjekta se ispituje dovođenjem u kontakt subjekta sa antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koje specifično vezuje BCMA, kao što su antitela koja su ovde opisana. Uzorak koji se ispituje za prisustvo BCMA može da se dobije iz uzorka krvi, uzorka seruma, cirkulišućih ćelija, cirkulišućih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu vezane za tkivo (tj., slobodne ćelije), tkiva (npr., hirurški resektovano tumorsko tkivo, biopsije, uključujući aspiraciju finom iglom), histološke preparate, i slično.
[0126] U različitim aspektima, količina BCMA je određena dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koje specifično vezuje BCMA. U nekim izvođenjima, uzorak može da se dovede u kontakt sa više od jednim tipom antitela, ili
1
njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koje specifično vezuje BCMA. U nekim izvođenjima, uzorak može da se dovede u kontakt sa prvim antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koje specifično vezuje BCMA i nakon toga da se dovede u kontakt sa drugim antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koje specifično vezuje BCMA. BCMA-specifično antitelo ili fragmenti za vezivanje antigena kao što su oni koji se ovde opisuju mogu da se koriste u ovom svojstvu.
[0127] Različite kombinacije BCMA-specifičnih antitela i fragmenata za vezivanje antigena mogu da se koriste da se obezbede "prvo" i "drugo" antitelo ili fragment za vezivanje antigena da se izvedu opisani dijagnostički postupci. U nekim izvođenjima kancer koji eksprimira BCMA-uključuje limfome, kao što je multipli mijelom (MM).
[0128] U određenim izvođenjima, količina BCMA je određena sa western blot analizom, radioimunotestom, imunofluorimetrijom, imunoprecipitacijom, ravnotežnom dijalizom, imunodifuzijom, elektrohemiluminiscencijom (ECL) imunotestom, imunohistohemijom, sortiranjem ćelija aktiviranih fluoroscencijiom (FACS) ili ELISA testom.
[0129] U različitim izvođenjima opisanih dijagnostičkih postupaka korišćen je kontrolni ili referentni uzorak. Ovaj uzorak može da bude pozitivna ili negativna kontrola testa koja osigurava da je test koji se koristi ispravan; na primer, kontrola testa ovog tipa može često da se koristi za imunohistohemijske testove. Alternativno, uzorak može da bude standardizovana referenca za količinu BCMA u biološkom uzorku iz zdravog subjekta. U nekim izvođenjima, uočeni nivoi BCMA subjekta koji se ispituje mogu da se uporede sa nivoima BCMA koji su uočeni u uzorcima iz subjekata za koje je poznato da ima kancer koji eksprimira BCMA. I U nekim izvođenjima, kontrolni subjekat može da bude pogođen sa odgovarajućim kancerom od interesa. U nekim izvođenjima, poznato je da kontrolni subjekat ima kancer u ranom stadijumu, koji može ili ne mora da bude kancer koji eksprimira BCMA. U nekim izvođenjima, poznato je da subjekat ima srednji stadijum kancera, koji može i ne mora da bude kancer koji eksprimira BCMA. U nekim izvođenjima, poznato je da kontrolni subjekat ima kasni stadijum, koji može i ne mora da bude kancer koji eksprimira BCMA.
Postupci za praćenje kancera
[0130] Ovde su obezbeđeni postupci za praćenje kancera koji eksprimira BCMA kod subjekta U nekim izvođenjima kancer koji eksprimira BCMA uključuje linfome, kao što je multipli mijelom (MM). U nekim izvođenjima opisani postupci uključuju procenu da li kancer koji eksprimira BCMA napreduje, povlači se, ili ostaje stabilna određivanjem količine BCMA koja se nalazi u uzorku koji se ispituje od subjekta; i upoređenje uočene količine BCMA sa količinom BCMA u dobijenom biološkom uzorku, na sličan način, iz subjekta u ranijem vremenskom periodu, pri čemu razlika između količine BCMA u uzorku koji se ispituje i ranijem uzorku obezbeđuje indikaciju da li kancer napreduje, povlači se, ili ostaje stabilan. U tom pogledu, uzorak koji se ispituje sa povećanom količinom BCMA, u odnosu na količinu koja je uočena za raniji uzorak, može da ukazuje na napredovanje kancera koji eksprimira BCMA. Suprotno tome, uzorak koji se ispituje sa povećanom količinom BCMA, u odnosu na količinu koja se uočava za raniji uzorak može da ukaže na povlačenje kancera koji eksprimira BCMA.
2
[0131] Prema tome, uzorak koji se ispituje sa neznačajnom razlikom u količini BCMA, relativno sa količinom koja je uočena za raniji uzorak, može da ukaže na stabilno stanje bolesti za kancer koji eksprimira BCMA. U nekim izvođenjima količina BCMA u biološkom uzorku koji je dobijen od subjekta je ispitana dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom, ili njegovim fragmentom antitela, koje specifično vezuje BCMA, kao što su ovde opisana antitela. Uzorak koji se ispituje za prisustvo BCMA može da se dobije iz urina, krvi, seruma, plazme, pljuvačke, ascita, cirkulišućih ćelija, cirkulišućuih tumorskih ćelija, ćelija koje nisu povezane sa tkivom (tj., slobodne ćelije), tkiva (npr., hirurški uklonjeno tumorsko tkivo, biopsija, uključujući aspiraciju finom iglom), histološki preparati, i slično. U nekim izvođenjima subjekat je čovek.
[0132] U nekim izvođenjima postupci za praćenje kancera koji eksprimira BCMA će uključiti: dovođenje u kontakt biološkog uzorka subjekta sa BCMA-specifičnim antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena (kao što su ono koji su dobijeni od antitela i fragmenata obezbeđenih u Tabeli 1), kvantifikovanja količine BCMA koja je prisutna u uzorku, poređenja količine BCMA koja je prisutna u uzorku sa količinom BCMA koja je utvrđena da se nalazi u dobijenom biološkom uzorku, na sličan način, iz istog subjekta u ranijem trenutku; i određivanje da li se nivo BCMA kod subjekta promenio tokom vremena. Uzorak koji se ispituje sa povećanom količinom BCMA, u odnosu na količinu koja se uočava za raniji uzorak, može da ukaže na napredovanje kancera. Suprotno tome, uzorak koji se ispituje sa smanjenom količinom BCMA, u odnosu na količinu koja se uočava za raniji uzorak, može da ukaže na povlačenje kancera koji eksprimira BCMA. Prema tome, uzorak koji se ispituje sa neznačajnom razlikom u BCMA, u odnosu na količinu koja se uočava za raniji uzorak, može da ukaže na stanje stabilne bolesti za kancer koji eksprimira BCMA. U nekim izvođenjima, nivoi BCMA iz uzorka mogu da se uporede sa poznatim standardnom ili referentnim uzorkom, zasebno ili pored nivoa BCMA koji su uočeni za uzorak koji je ispitan ranije tokom vremena. U dodatnom izvođenju, dijagnostički postupak može da prati dodatni korak davanja kancer-specifičnog tretmana U nekim izvođenjima kancer specifičan tretman može da bude usmeren prema kancerima koji eksprimiraju BCMA, kao što su ovde opisana BCMA x CD3 multispecifična antitela.
[0133] U različitim aspektima, količina BCMA je određena dovođenjem u kontakt uzorka sa antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koji specifično vezuje BCMA. U nekim izvođenjima, uzorak može da se dovede u kontakt sa više od jednim antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koji specifično vezuje BCMA. U nekim izvođenjima, uzorak može da se dovede u kontakt sa prvim antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koje specifično vezuje BCMA i nakon toga da se dovede u kontakt sa drugim antitelom, ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena, koji specifično vezuje BCMA. Antitela kao što su ona koja se ovde opisuju mogu da se koriste u ovom svojstvu.
[0134] Različite kombinacije antitela i fragmenata za vezivanje antigena koji su opisani u Tabeli 1 mogu da se koriste da bi se obezbedilo "prvo" i "drugo" antitelo ili fragment za vezivanje antigena kako bi se sproveli opisani postupci praćenja. U nekim izvođenjima kancer koji eksprimira BCMA uključuje hematološki kancer, kao što je akutna mijeloidna leukemija (AML).
[0135] U određenim izvođenjima, količina BCMA je određena western blot analizom, radioimunotestom, imunofluorimetrijom, imunoprecipitacijom, ravnotežnom dijalizom, imunodifuzijom, elektrohemiluminiscencijom (ECL) imunotestom, imunohistohemijom, sortiranjem ćelija aktiviranih fluorescencijom (FACS) ili ELISA testom.
Kompleti za detekciju BCMA
[0136] Ovde su obezbeđeni kompleti za detekciju BCMA u biološkom uzorku. Ovi kompleti uključuju jedan ili više od ovde opisanih antitela koja su specifična za BCMA, ili njihove fragmente za vezivanje antigena, i instrukcije za upotrebu kompleta.
[0137] Obezbeđeno antitelo koje je specifično za BCMA, ili fragment za vezivanje antigena, mogu da budu u rastvoru; liofilizovani; pričvršćeni na supstrat, nosač, ili ploču; ili obeležen za detekciju.
[0138] Opisani kompleti mogu takođe da uključe dodatne komponente koje su korisne za izvođenje ovde opisanih postupaka. Kao primer, kompleti mogu da sadrže sredstva za dobijanje uzorka iz subjekta, kontrolni ili referentni uzorak, npr., uzorak iz subjekta koji ima sporo napredujući kancer i/ili subjekta koji nema kancer, jedan ili više kompartmenta za uzorak, i/ili materijal za instrukcije koji opisuje izvođenje postupka iz prikaza i tkivno specifičnih kontrola ili standarda.
[0139] Sredstva za određivanje nivoa BCMA mogu dalje da uključe, na primer, pufere ili druge reagense za upotrebu u testu za određivanje nivoa BCMA. Instrukcije mogu da budu, na primer, štampane instrukcije za izvođenje testa i/ili instrukcije za procenu nivoa ekspresije BCMA.
[0140] Opisani kompleti mogu takođe da uključe sredstva za izolovanje uzorka iz subjekta. Ova sredstva mogu da sadrže jednu ili više predmeta opreme ili reagenasa koji mogu da se koriste za dobijanje tečnosti ili tkiva iz subjekta. Sredstva za dobijanje uzorka iz subjekta mogu takođe da sadrže sredstva za izolovanje komponenti iz krvi, kao što je serum, iz uzorka krvi. Poželjno, komplet je dizajniran za upotrebu za humanog subjekta.
Multispecifična antitela
[0141] Vezujući domeni ovde opisanih anti-BCMA antitela prepoznaju ćelije koje eksprimiraju BCMA na njihovoj površini. Kao što je gore naznačeno, ekspresija BCMA može da ukazuje na kanceroznu ćeliju. Specifičnije, ciljanje ka određenim podsetovima ćelija može da se postigne kreiranjem bispecifičnih molekula, kao što su antitela ili fragmenti antitela, koji se vezuju za BCMA i za drugu metu kao, što je CD3. Ovo je postignuto dobijanjem molekula koji se sastoji iz prvog regiona za vezivanje BCMA i drugog vezujućeg regiona koji se vezuje za drugi ciljni antigen. Antigen-vezujući regioni mogu da budu bilo kog oblika koji omogućava specifično prepoznavanje mete, na primer region za vezivanje može da bude ili može da uključi varijabilni domen teškog lanca, Fv (kombinaciju varijabilnog domena teškog lanca i varijabilnog domena lakog lanca), domen za vezivanje koji je zasnovan na fibronektinskom tipa III domenu (kao što je od fibronektina, ili je zasnovan na konsenzusu tipa III domena od fibronektina, ili od tenascina ili je zasnovan na konsenzusu tipa III domena od tenascina, kao što su Centyrin molekuli od Janssen Biotech, Inc., videti npr. WO2010/051274 i WO2010/093627). Prema tome, obezbeđeni su bispecifični molekuli koji se sastoje iz dva različita regiona za vezivanje antigena koji redom vezuju BCMA i drugi antigen.
4
[0142] Neka od ovde opisanih multispecifičnih antitela se sastoje iz dva različita regiona za vezivanje antigena koji vezuju redom BCMA i CD3. U poželjnim izvođenjima, multispecifična antitela koja vezuju BCMA i CD3 (BCMA x CD3-multispecifična antitela) i njihovi multispecifični fragmenti za vezivanje antigena su obezbeđeni. U nekim izvođenjima, BCMA x CD3-multispecifično antitelo se sastoji iz prvog teškog lanca (HC1) i prvog lakog lanca (LC1) koji se sparuju da bi se obrazovalo prvo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje BCMA i drugog teškog lanca (HC2) i drugog lakog lanca (LC2) koji se sparuju da bi se obrazovalo drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3. U poželjnim izvođenjima, BCMA x CD3-multispecifično antitelo je bispecifično antitelo koje se sastoji iz BCMA-specifičnog kraja koji se sastoji iz prvog teškog lanca (HC1) i prvog lakog lanca (LC1) koji se sparajuju da bi se obrazovalo prvo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3 i CD3-specifičan kraj koji se sastoji iz drugog teškog lanca (HC2) i drugog lakog lanca (LC2) koji se sparuju da bi se obrazovalo drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje BCMA. U nekim izvođenjima, bispecifična antitela iz pronalaska uključuju antitela koja imaju strukturu antitela pune dužine. "Antitelo pune dužine" kao što se ovde koristi se odnosi na antitelo koje ima dva teška lanca antitela pune dužine i dva laka lanca antitela pune dužine. Težak lanac antitela pune dužine (HC) uključuje varijabilne i konstante domene VH, CHI, CH2, i CH3 teškog lanca. Laki lanac antitela pune dužine (LC) uključuje varijabilne i konstante domene VL i CL lakog lanca. Antitelo pune dužine može da nema Cterminalni lizin (K) u bilo kom ili u oba teška lanca. Izraz "Fab-kraj" ili "pola molekula" se odnosi na jedan par teškog lanca lakog lanca koji specifično vezuje antigen. U nekim izvođenjima, jedan od domena za vezivanje antigena je domen za vezivanje koji se ne zasniva na antitelu, npr. domen za vezivanje koji je zasnovan na domenu fibronektina tipa 3, npr. Centyrin.
[0143] BCMA-vezujući kraj ovde obezbeđenih multispecifičnih antitela mogu da se dobiju od bilo kojih gore opisanih BCMAspecifičnih antitela. U nekim primerima izvođenja takvih BCMA-vezujućih krajeva, prvi region za vezivanje antigena koji vezuje BCMA sastoji se iz CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca koji su dobijeni od klona antitela kao što je opisano u Tabeli 1. U nekim primerima izvođenja takvi BCMA-vezujući krajevi, prvi region za vezivanje antigena koji se vezuje za BCMA sastoji se iz CDR1, CDR2, i CDR3 teškog lanca i CDR1, CDR2 lakog lanca, i CDR3 koji je dobijen iz klona antitela kao što je opisanu u Tabeli 1. U nekim primerima izvođenja takvi BCMA-vezujući krajevi, prvog regiona za vezivanje antigena koji se vezuje za BCMA sastoji se iz CDR1, CDR2 teškog lanca, i CDR3 klona BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176, ili BCMB177. U nekim primerima izvođenja takvih BCMA-vezujućih krajeva, prvi region za vezivanje antigena koji vezuje BCMA sastoji se iz CDR1, CDR2, teškog lanca i CDR3 i CDR1, CDR2, lakog lanca i CDR3 klona BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176, ili BCMB177. U nekim primerima izvođenja takvih BCMA-vezujućih krajeva, prvi region za vezivanje antigena koji vezuje BCMA sastoji se iz varijabilnog domena teškog lanca koji je dobijen iz klona antitela kao što je opisano u Tabeli 1. U nekim primerima izvođenja takvih BCMA-vezujućih krajeva, prvi region za vezivanje antigena koji vezuje BCMA se sastoji iz varijabilnog domena teškog lanca i varijabilnog domena lakog lanca koji su dobijeni za klona antitela kao što se opisuje u Tabeli 1. U nekim primerima izvođenja takvih BCMA-vezujućih krajeva, prvi region za vezivanje antigena koji vezuje BCMA sastoji se iz varijabilnog domena teškog lanca klona BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176, ili BCMB177. U nekim primerima izvođenja takvih BCMA- vezujućih krajeva, prvi region za vezivanje antigena koji vezuje BCMA sastoji se iz varijabilnog domena teškog lanca i varijabilnog domena lakog lanca klona BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176, ili BCMB177.
Tabela 3 obezbeđuje listu BCMA x CD3 bispecifičnih antitela sa jednim parom teškog i lakog lanca koji je specifična za BCMA i drugim parom teškog i lakog lanca koji je specifičan za CD3, gde je ID određenog antiteka naveden da bi se opisali antigenspecifični krajevi antitela koji su korišćeni da bi se proizvelo željeno izvođenje
Tabela 3:
[0144] U nekim izvođenjima bispecifičnih antitela, BCMA-vezujući kraj vezuje takođe vezuje BCMA makaki majmuna, poželjno njegov vanćelijski domen.
[0145] U nekim izvođenjima, BCMA-vezujući kraj multispecifičnog antitela je IgG, ili njegov derivat, npr., IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4 izotipovi. U nekim izvođenjima u kojima BCMA-vezujući ima izotip IgG4, on sadrži S228P, L234A, i L235A zamenu(e) u njegovom Fc regionu.
[0146] U nekim izvođenjima bispecifičnih antitela, drugi kraj za vezivanje antigena vezuje humani CD3. U nekim poželjnim izvođenjima, CD3-specifičan kraj BCMA x CD3 bispecifičnog antitela je dobijen od CD3-specifičnog antitela koje se vezuje i aktivira humane primarne T ćelije i/ili primarne T ćelije makaki majmuna. U nekim izvođenjima, CD3-vezujući kraj vezuje se za epitop na N-kraju CD3ε. U nekim izvođenjima, CD3-vezujući kraj dolazi u kontakt sa epitopom uključujući šest N-terminalnih aminokiselina CD3ε. U nekim izvođenjima, CD3-specifičan vezujući kraj bispecifičnog antitela je dobijen od mišjeg monoklonalnog antitela SP34, mišjeg IgG3/lambda izotipa. U nekim izvođenjima, CD3- vezujući kraj se sastoji iz CDR-a antitela SP34. Takvi CD3-vezujući krajevi mogu da se vežu za CD3 sa afinitetom of 5x10<-7>M ili manje, kao što je 1x10<-7>M ili manje, 5x10<-8>M ili manje, 1x10<-8>M ili manje, 5x10<-9>M ili manje, ili 1x10<-9>M ili manje. CD3-specifičan kraj za vezivanje može da bude humanizovana verzija kraja mišjeg monoklonalnog antitela SP34. Prilagođavanje humanog okvira čitanja (HFA) može da se koristi da bi se humanizovalo anti-CD3 antitelo od koga je dobijen CD3-specifičan kraj. U nekim izvođenjima bispecifičnih antitela, CD3-vezujući kraj se sastoji iz para teškog lanca i lakog lanca koji su izabrani iz Tabele 2. U drugim izvođenjima bispecifičnih antitela, CD3-vezujući kraj se sastoji iz CDR1, CDR2, teškog lanca i CDR3 i CDR1, CDR2, lakog lanca i CDR3 sekvence koje su predstavljene u Tabeli 2. Na primer, CDR sekvence teškog lanca i lakog lanca iz nekih izvođenja CD3-vezujućeg kraja ovde opisanih bispecifičnih antitela mogu da uključe sledeće aminokiselinske sekvence: Hc CDR1, SEQ ID NO: 59; Hc CDR2: SEQ ID NO: 60; Hc CDR3, SEQ ID NO: 61; Lc CDR1, SEQ ID NO: 62; Lc CDR2: SEQ ID NO: 63; i Lc CDR3, SEQ ID NO: 64.
[0147] U nekim izvođenjima, CD3-vezujući kraj je IgG, ili njegov derivat. U nekim izvođenjima, CD3-vezujući kraj je IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. U nekim izvođenjima gde CD3-vezujući kraj je izotipa IgG4, sadrži S228P, L234A, L235A, F405L, i R409K zamenu(e) u njegovom Fc regionu. U nekim izvođenjima, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena vezuju CD3ε na primarnim humanim T ćelijama. U nekim izvođenjima, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena vezuju CD3ε na primarnim T ćelijama makaki majmuna. U nekim izvođenjima, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena vezuju CD3ε na primarnim humanim i T ćelijama makaki majmuna. U nekim izvođenjima, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena aktiviraju primarne humane CD4<+>T ćelije. U nekim izvođenjima, antitela ili fragmenti za vezivanje antigena aktiviraju primarne CD4<+>T ćelije makaki majmuna.
[0148] U nekim izvođenjima obezbeđeni su BCMA x CD3 bispecifično antitelo koje ima BCMA-vezujući kraj koji se sastoji iz teškog lanca antitela klona BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176, ili BCMB177. U nekim izvođenjima obezbeđeni su BCMA x CD3 bispecifično antitelo koje ima BCMA-vezujući kraj koji se sastoji iz teškog lanca i lakog lanca antitela klona BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176, ili BCMB177. U nekim izvođenjima obezbeđeni su BCMA x CD3 bispecifično antitelo koje ima CD3-vezujući kraj koji se sastoji iz teškog lanca antitela klona CD3B219. U nekim izvođenjima obezbeđeni su BCMA x CD3 bispecifično antitelo koje ima CD3-vezujući kraj koji se sastoji iz teškog lanca i lakog lanca antitela klona CD3B219. U nekim izvođenjima obezbeđeni su BCMA x CD3 bispecifično antitelo koje ima BCMA-vezujući kraj koji se sastoji iz teškog lanca antitela klona BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176, ili BCMB177 i CD3-vezujućeg kraja koji se sastoji iz teškog lanca antitela klona CD3B219. U nekim izvođenjima obezbeđeno je BCMA x CD3 bispecifično antitelo koje ima BCMA-vezujući kraj koji se sastoji iz teškog lanca i lakog lanca antitela klona BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176, ili BCMB177 i CD3-vezujući kraj koji se sastoji iz teškog lanca i lakog lanca klona CD3B219.
[0149] Primer BCMA x CD3 bispecifičnog antitela je obezbeđen u Tabelama 9.
[0150] Različiti formati bispecifičnih antitela su opisani i nedavno je izašao njihov pregled od stane Chames i Baty (2009) Curr Opin Drug Disc Dev 12: 276.
[0151] U nekim izvođenjima, bispecifično antitelo iz predmetnog pronalaska je diatelo, ukršteno-telo, ili bispecifično antitelo koje je dobijeno pomoću kontrolisane razmene Fab kraja kao što su ona koja se opisuju u predmetnom pronalasku.
[0152] U nekim izvođenjima, bispecifična antitela uključuju IgG-slične molekule sa komplementarnim CH3 domenima da bi se forsirala heterodimerizacija; rekombinantni IgG-slični dualni molekuli za ciljanje, gde u dve strane molekula svaka sadrži Fab fragment ili deo Fab fragmenta najmanje dva različita antitela; spojeni IgG molekuli, pri čemu IgG antitela u punoj dužini su spojena sa eksta Fab fragmentom ili delovima Fab fragmenta; spojeni Fc molekuli, pri čemu jednolančani Fv molekuli ili stabilizovana diatela su spojeni sa konstantnim domenima teškog lanca, Fc-regioni ili njegovi delovi; spojeni Fab molekuli, pri čemu različiti Fab-fragmenti su spojeni zajedno; ScFv- i diatelo zasnovani i teški lanci antitela (npr., domenska antitela, nanotela) pri čemu različiti jednolančani Fv molekuli ili različita diatela ili različiti teški lanci antitela (npr. domenska antitela, nanotela) su spojeni jedan sa drugim ili sa drugim proteinom ili molekulom nosačem.
[0153] U nekim izvođenjima, IgG-slični molekuli sa komplementarnim molekulima CH3 domena uključuju Triomab/ Quadroma (Trion Pharma/Fresenius Biotech), Knobs-into-Holes (Genentech), CrossMAbs (Roche) i elektrostatički usklađena (Amgen), LUZ-Y (Genentech), „Strand Exchange Engineered Domain body“ (SEEDbody)(EMD Serono), Biclonic (Merus) i DuoBody® (Genmab A/S).
[0154] U nekim izvođenjima, rekombinantni IgG-slični dualni molekuli za ciljanje uključuju Dual Targeting (DT)-Ig (GSK/Domantis), Dva-u-jednom Antitelo (Genentech), Unakrsno-vezana Mat-a (Karmanos Cancer Center), mAt2 (F-Star) i CovX-telo (CovX/Pfizer).
[0155] U nekim izvođenjima, IgG spojeni molekuli uključuju Dualni Variabilni Domen (DVD)-Ig (Abbott), IgG-sličan Bispecifični (InnClone/Eli Lilly), Ts2At (MedImmune/AZ) i BsAt (Zymogenetics), HERCULES (Biogen Idec) i TvAb (Roche).
[0156] U nekim izvođenjima, Fc spojeni molekuli uključuju ScFv/Fc Fuzije (Academic Institution), SCORPION (Emergent BioSolutions/Trubion, Zymogenetics/BMS), Dual Affinity Retargeting Technology (Fc-DART) (MacroGenics) i Dual(ScFv).sub.2-Fab (National Research Center for Antibody Medicine--China).
[0157] U nekim izvođenjima, Fab spojena bispecifična antitela uključuju F(ab)2 (Medarex/AMGEN), Dual-Action ili Bis-Fab (Genentech), Dock-and-Lock (DNL) (ImmunoMedics), Bivalentna Bispecifična (Biotecnol) i Fab-Fv (UCB-Celltech). ScFv-, diatelozasnovana i domenska antitela uključuju ali nisu ograničena na Bispecific T Cell Engager (BITE) (Micromet), Tandem Diabody (Tandab) (Affimed), Dual Affinity Retargeting Technology (DART) (MacroGenics), Jedno-lančano Diatelo (Academic), TCR-slična Antitela (AIT, ReceptorLogics), Fuziju Humanog albumina iz seruma ScFv Fusion (Merrimack) i COMBODY (Epigen Biotech), dualna ciljana nanotela (Ablynx), dualna ciljana antitela sa jedinim domenom u teškom lancu.
[0158] Bispecifična antitela iz pronalaska pune dužine mogu da se dobiju na primer upotrebom zamene Fab kraja (ili zamene pola molekula) između dva mono specifična bivalentna antitela uvođenjem zamena na površini CH3 u teškom lancu u svakoj polovini molekula da bi se favorizovalo obrazovanje heterodimera dve polovine molekula antitela koje imaju različitu specifičnost ili in vitro u okruženju oslobođenom od ćelija ili upotrebom istovremene ekspresije. Reakcija zamene Fab kraja je rezultat reakcije izomerizacije disulfidne veze i disocijacije-asocijacije domena CH3. Disulfidne veze teškog lanca u regionima zgloba parentalnih mono specifičnih antitela su redukovane. Dobijeni slobodni cisteini jednog od parentalnih monospecifičnih antitela obrazuju inter disulfidne veze u teškom lancu sa cisteinskim ostacima drugog parentalnog mono specifičnog molekula antitela i istovremeno CH3 domeni parentalnih antitela se oslobađaju release i ponovo spajaju disocijacijomasocijacijom. Domeni CH3 krajeva Fab mogu da budu dizajnirani da favorizuju heterodimerizaciju u odnosu na homodimerizaciju. Dobijeni proizvod je bispecifično antitelo koje ima dva Fab kraja ili polovina molekula gde svaki vezuje epitop koji se razlikuje, tj. epitop na BCMA i epitop na CD3.
[0159] "Homodimerizacija" kao što se ovde koristi se odnosi na interakciju dva teška lanca koji imaju identične aminokiselinske sekvence u CH3. "Homodimer" kao što se ovde koristi se odnosi na antitelo koje ima dva teška lanca sa identičnim aminokiselinskim sekvencama u CH3.
[0160] "Heterodimerizacija" kao što se ovde koristi se odnosi na interakciju dva teška lanca koja imaju ne-identične aminokiselinske sekvence u CH3. "Heterodimer" kao što se ovde koristi se odnosi na antitelo koje ima dva teška lanca sa ne-identičnim aminokiselinskin sekvencama CH3.
[0161] Strategija "knob-in-hole" (videti, npr., PCT Inti. Objav. br. WO 2006/028936) može da se koristi za dobijanje bispecifičnih antitela pune dužine. Ukratko, izabrane aminokiseline koje obrazuju površinu domena CH3 u humanom IgG mogu da budu mutirane na položajima koji pogađaju interakcije domea CH3 da bi se promovisalo obrazovanje heterodimera. Aminokiselina sa malim bočnim lancem (rupom) je uvedena u teški lanac antitela koje se specifično vezuje za prvi antigen i aminokiselina sa velikim bočnim lancem (knob) je uvedena u težak lanac antitela koje se specifično vezuje za drugi antigen. Posle istovremene ekspresije dva antitela, heterodimer se obrazuje kao rezultat preferencijalne interakcije teškog lanca sa "hole" sa teškim lancem sa"knob". Primer parova zamene CH3 koji obrazuje knob i hole su (ekspimirani kao modifikovana pozicija u prvom CH3 domenu prvog teškog lanca/modifikovana pozicija u drugom CH3 domenu drugog teškog lanca): T366Y/F405A, T366W/F405W, F405W/Y407A, T394W/Y407T, T394S/Y407A, T366W/T394S, F405W/T394S i T366W/T366S_L368A_Y407V.
[0162] Druge strategije kao što su promovisanje heterodimerizacije teškog lanca upotrebom electrostatičkih interakcija zamenom pozitivno naelektrisanih ostataka na površini jednog CH3 i negativno naelektrisanih ostataka na površini drugog CH3 mogu da se koriste, kao što je opisano u US Pat. Obj. br. US2010/0015133; US Pat. Obj. br. US2009/0182127; US Pat Obj. br. US2010/028637 ili US Pat Obj. br. US2011/0123532. U drugim strategijama, heterodimerizacija može da bude promovisana sledećim zamenama (koje su eksprimirane kao modifikovane pozicije u prvom CH3 domenu prvog teškog lanca/modifikovana pozicija u drugom CH3 domenu drugog teškog lanca): L351Y_F405AY407V/T394W,T366I_K392M_T394W/F405A_Y407V, T366L_K392M_T394W/F405A_Y407V, L351Y_Y407A/T366A_K409F, L351Y_Y407A/T366V K409F Y407A/T366A_K409F, or T350V_L351Y_F405A Y407V/T350V_T366L_K392L_T394W kao što je opisano u U.S. Pat. Obj. br. US2012/0149876 ili U.S. Pat Obj. br. US2013/0195849.
[0163] Pored goreopisanih postupaka, bispecifična antitela iz pronalaska mogu da se dizajniraju in vitro u okruženju koje je oslobođeno od ćelije uvođenjem asimteričnih mutacija u regionima CH3 dva monospecifična homodimerna antitela i obrazovanjem bispecifičnog heterodimernog antitela od dva parentalna monospecifična homodimerna antitela u redukujućim uslovima da se omogući izomerizacija disulfidne veze u skladu sa postupcima koji su opisani u Inti. Pat. Obj. Br. WO2011/131746. U postupcima, prvo monospecifično bivalentno antitelo (npr., anti-BCMA antitelo) i drugo monospecifično bivalentno antitelo (npr., anti-CD3 antitelo) su dizajnirani da imaju određene zamene u domenu CH3 koji promoviše stabilnost heterodimera; antitela su zajedno inkubirana pod redukcionim uslovima koj su dovoljni da se cisteinima u regionu zgloba omogući da prođu kroz izomerizaciju disulfidne veze; čime se dobija bispecifično antitelo sa zamenom Fab kraja. Uslovi inkubacije mogu optimalno da se vrate u neredukcione uslove. Primer redukcionih agenasa koji mogu da se koriste su 2-merkaptoetilamin (2-MEA), ditiotreitol (DTT), ditioeritritol (DTE), glutation, tris (2-karboksietil)fosfin (TCEP), L-cistein i beta-merkaptoetanol, poželjno redukcini agens je izabran iz grupe koja se sastoji iz: 2-merkaptoetilamina, ditiotreitola i tris (2-karboksietil)fosfina. Na primer, inkubacija za najmanje 90 min na temperaturi od najmanje 20° C u prisustvo najmanje 25 mM 2-MEA ili u prisustvu najmanje 0.5 mM ditiotreitola na pH od 5-8, na primer na pH 7.0 ili na pH od 7.4 mogu da se koriste.
[0164] Pored opisanih BCMA x CD3-multispecifičnih antitela, takođe su obezbeđene polinukleotidne sekvence koje su sposobne da kodiraju opisana BCMA x CD3-multispecifična antitela. Vektori koji se sastoji je iz opisanih polinukleotida su takođe opisani, kao što su ćelčije koje eksprimiraju BCMA x CD3-multispecifična antitela ovde obezbeđena. Takođe su opisane ćelije koje su sposobne za eksprimiranje prikazanih vektora. Ove ćelije mogu da budu sisarske ćelije (kao što su 293F ćelije, CHO ćelije), ćelije insekta (kao što su Sf7 ćelije), ćelije kvasca, biljne ćelije, ili bakterijske ćelije (kao što je E. coli). Opisana antitela mogu takođe da budu proizvedena od strane ćelija hibridoma.
Terapeutska kompozicija i postupci za lečenje upotrebom multispecifičnih antitela i njihovih multispecifičnih fragmenata za vezivanje antigena
[0165] BCMA bispecifična antitela koja se razmatraju gore u tekstu, na primer BCMA x CD3 bispecifična antitela koja se gore razmatraju, su korisna u terapiji. Posebno, BCMA bispecifična antitela su korisna u lečenju kancera. Ovde su takođe obezbeđene terapeutske kompozicije za lečenje hiperproliferativnog poremeća kod sisara koji se sastoji iz terapeutski efikasne količine multispecifičnog antitela ili ovde opisanog multispecifičnog fragmenta za vezivanje antigena i farmaceutski prihvatljivog nosača. U poželjnim izvođenjima, multispecifično antitelo je BCMA x CD3-multispecifično antitelo kao što se ovde prikazuje, ili njegov multispecifični fragment za vezivanje antigena, i poželjnije BCMA x CD3-bispecifično antitelo kao što se ovde opisuje, ili BCMA x CD3 njegov bispecifičan fragment za vezivanje antigena. U jednom izvođenju pomenuta farmaceutska kompozicija je za lečenje kancera koji eksprimira BCMA, uključujući (ali bez ograničenja na) sledeće: B ćelijske kancere koji eksprimiraju BCMA, kao što je multipli mijelom (MM); i drugi kanceri koji još treba da se odrede u kojima je eksprimiran BCMA. Posebna bispecifična antitela koja mogu da se koriste za lečenje kancera, kao što je hematološki kancer, uključujući specifične kancere koji se razmatraju gore u tekstu, uključuju antitela BCMB69, BCMB117, BCMB123, BCMB128, BCMB129, BCMB176, ili BCMB177 ili CD3B219. Jedan primer korisnog bispecifičnog antitela za lečenje kancera, kao što je hematološki kancer, uključujući ove specifične kancere je BCMB72.
[0166] Ovde obezbeđene farmaceutske kompozicije se sastoje iz: a) efikasne količine multispecifičnog antitela ili fragmenta antitela iz predmednog pronalaska, i b) farmaceutski
4
prihvatljivog nosača, koji može da bude inertan ili fiziološki aktivan. U poželjnim izvođenjima, multispecifično antitelo je BCMA x CD3-multispecifično antitelo kao što se ovde opisuje, ili njegov multispecifičan fragment za vezivanje antigena, i poželjnije BCMA x CD3-bispecifično antitelo kao što se ovde opisuje, ili BCMA x CD3-bispecifičan njegov fragment za vezivanje antigena. Kao što se ovde koristi, termin "farmaceutski prihvatljivi nosači" uključuje bilo koji is sve rastvarače, medijume za disperziju, sredstva za oblaganje, antibakterijske i antifungalne agense, i slično koji su fiziološki kompatibilni. Primeri pogodnih nosača, rastvarača i/ili ekscipijenata uključuju jedan ili više od vode, slanog rastvora, fiziološkog rastvora u puferu sa fosfatom, dekstrozu, glicerol, etanol, i slično, kao i bilo koju njihovu kombinaciju. U mnogim slučajevima, poželjno će biti da se uključe izotonični agensi, kao što su šećeri, polialkoholi, ili natrijum hlorid u kompoziciji. Posebno, relevantni primeri pogodnog nosača uključuju: (1) Dulbekov fiziološki rastvor koji je puferovan sa fosfatom, pH.oko.7.4, koji sadrži ili ne sadrži oko 1 mg/mL do 25 mg/mL alumina iz humanog seruma, (2) 0.9% rastvora soli (0.9% mas/v natrijum hlorida (NaCl)), i (3) 5% (mas/v) dekstroze; i može takođe da sadrži antioksidans kao što je triptamin i stabilizujući agens kao što je Tween 20 ®.
[0167] Ovde navedene kompozicije mogu takođe dalje da sadrže terapeutski agens, što je neophodno da bi se određeni poremećaj lečio being. Poželjno, multispecifično antitelo ili fragment antitela i dopunsko aktivno jedinjenje će imati komplementarne aktivnosti koje nemaju štetan uticaj jedna na drugu. U poželjnom izvođenju, dalji terapeutski agens je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid, ili interleukin 2. U poželjnom izvođenju, dalji terapeutski agens je hemoterapeutski agens
[0168] Kompozicije iz pronalaska mogu da budu u različitim oblicima. Oni na primer uključuju tečne, polu-tečne, i čvrste dozne oblike, ali poželjni oblik zavisi od namenjenog načina davanja i terapeutske primene. Obične poželjne kompozicije su u obliku injektabinih ili rastvora koji se mogu davati putem infuzija. Poželjni način davanja je parenteralni (npr. intravenozni, intramuskularni, intraperinonealni, subkutanozni). U poželjnom izvođenju, kompozicije iz pronalaska se daju intravenozno kao bolus ili kontinuiranom infuzijom u vremenskom periodu. U drugom poželjnom izvođenju, oni su dati injekcijom intramuskularnim, subkutanoznim, intra-artikularnim, intrasinovijalnim, intratumoralnim, peritumoralnim, intralezionalnim, ili perilezionalnim načinima davanja, da bi se ispoljili lokalni kao i sistemski terapeutski efekti.
[0169] Sterilne kompozicije za parenteralno davanje mogu da se dobiju uključivanjem antitela, fragmenta antitela ili konjugata antitela iz predmetnog pronalaska u željenoj količini u odgovarajućem rastvaraču, nakon čega sledi sterilizacija pomoću mikroceđenja. Kao rastvarač ili nosač, gde može da se koristi voda, slani rastvor, fiziološki rastvor koji je puferovan sa fosfatom, dekstroza, glicerol, etanol, i slično, kao i njihova kombinacija. U mnogim slučajevima, poželjno će biti da se uključe isotonični agensi, kao što su šećeri, polialkoholi, ili natrijum hlorid u kompoziciji. Ove kompozicije mogu da sadrže adjuvanse, posebno sredstva za vlaženje, izotonizovanje, emulgovanje, disperziju i agense za stabilizovanje. Sterilne kompozicije za parenteralno davanje mogu takođe da se dobiju u obliku of sterilnih čvrstih kompozicija koje mogu da se razblaže tokom upotrebe u sterilnoj vodi ili u bilo kom drugom injektabilnom sterilnom medijumu.
[0170] Multispecifično antitelo ili fragment antitela može da se daje oralno. Kao čvrste kompozicije za oralno davanje, tablete, pilule, prahovi (želatinske kapsule, kesice) ili granule mogu da se koriste. U ovim kompozicijama, aktivni sastojak prema pronalasku je pomešan sa jednim ili više inertnih rastvarača, kao što su skrob, celuloza, saharoza, laktoza ili silika, pod atmosferom argona. Ove kompozicije takođe mogu da sadrže supstance koje nisu razblaživači, na primer jedan ili više lubrikanata kao što su magnezijum stearat ili talk, sredstvo za bojenje, sredstvo za oblaganje (tablete obložene šećerom) ili glazura.
[0171] Kao što su tečne kompozicije za oralno davanje, mogu da se koriste farmaceutski prihvatljivi rastvori, suspenzije, emulzije, sirupi i eliksiri koji sadrže inertne razblaživače kao što su voda, etanol, glicerol, biljna ulja ili parafinsko ulje. Ove kompozicije mogu da sadrže supstance koje nisu razblaživači, na primer sredstva za vlaženje, zaslađivanje, stvrdnjavanje, davanje arome ili proizvode za stabilizovanje.
[0172] Doze zavise od željenog efekta, trajanja tretmana i načina korišćenog davanja; generalno su između 5 mg i 1000 mg po danu oralno za adulta sa jediničnim dozama opsega od 1 mg do 250 mg aktivne supstance. Generalno, doktor će odrediti odgovarajuću dozu u zavisnosti od starosti, težine i bilo kojih drugih fakora koji su specifični za subjekta koji treba da se leči.
[0173] Takođe su obezbeđeni postupci za ubijanje BCMA ćelija davanjem pacijentu kome je potrebno multispecifičnog antitela koje se vezuje za pomenuti BCMA i sposoban je da regrutuje T ćelije da ubiju pomenutu BCMA ćeliju (tj., T ćelijsko preusmeravanje). Bilo koje od multispecifičnih antitela ili fragmenata antitela iz pronalaska mogu da se koriste terapeutski. Na primer, u jednom izvođenju BCMA x CD3-multispecifično antitelo BCMB72 može da se koristi terapeutski za lečenje kancera kod subjekta
[0174] U poželjnom izvođenju, multispecifična antitela ili fragmenti antitela iz pronalaska su korišćena za lečenje hiperproliferativnog poremećaja kod sisara. U poželjnijem izvođenju, jedna od farmaceutskih kompozicija koje su prikazane gore u tekstu, i koja sadrži multispecifično antitelo ili fragment antitela iz pronalaska, je korišćena za lečenje hiperproliferativnog poremećaja kod sisara. U jednom izvođenju, poremećaj je kancer. Posebno, kancer je kancer koji eksprimira BCMA, uključujući (ali bez ograničenja na) sledeće: kancere B ćelija koji eksprimiraju BCMA, kao što je multipli mijelom (MM); i drugi kanceri koji još trebaju da se odrede u kojima je eksprimiran BCMA. U poželjnim izvođenjima, multispecifično antitelo je BCMA x CD3-multispecifično antitelo kao što se ovde opisuje, ili njegov multispecifičan fragment za vezivanje antigena kao što se ovde opisuje, i poželjnije BCMA x CD3-bispecifično antitelo kao što se ovde opisuje, ili njegov BCMA x CD3-bispecifičan fragment za vezivanje antigena.
[0175] Prema tome, farmaceutske kompozicije iz pronalaska su korisne u lečenju ili prevenciji različitih kancera, uključujući (ali bez ograničenja na) sledeće: kancer koji ekspimira BCMA, uključujući (ali bez ograničenja na) sledeće: kancere B ćelija koji eksprimiraju BCMA, kao što je multipli mijelom (MM); i drugi kanceri koji tek trebaju da se odrede kod kojih je eksprimiran BCMA.
[0176] Slično tome, ovde je dalje obezbeđen postupak za inhibiranje rasta odabranih ćelijski populacija koji se sastoji iz dovođenja u kontakt ciljnih ćelija koje eksprimiraju BCMA, ili tkiva koje sadrži takve ciljne ćelije sa, efikasnom količinom multispecifičnog antitela ili fragmenta antitela iz predmetnog pronalaska, ili zasebno ili u kombinaciji sa drugim citotoksičnim ili terapeutskim agensima, u prisustvu mononuklearnih ćelija iz periferne krvi (PBMC). U poželjnim izvođenjima, multispecifično antitelo je BCMA x CD3-multispecifično antitelo kao što se ovde opisuje, ili njegov multispecifičan fragment za vezivanje antigena, i poželjnije BCMA x CD3-bispecifično antitelo kao što se ovde opisuje, ili njegov BCMA x CD3-bispecifičan fragment za vezivanje antigena. U poželjnom izvođenju, dalji terapeutski agens je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid, ili interleukin 2. U poželjnom izvođenju, dalji terapeutski agens je hemoterapeutski agens. Postupak za inhibiranje rasta odabranih ćelijskih populacija može da se praktikuje in vitro, in vivo, ili ex vivo.
[0177] Primeri in vitro upotreba uključuju lečenje autolognom koštanom srži pre njenog transplantiranja u istom pacijentu da bi se ubile bolesne ili maligne ćelije; tretmani koštanom srži pre njenog transplantiranja da bi se ubile kompetentne T ćelije i sprečila bolest graft protiv domaćina (GVHD); tretmani ćelijskim kulturama da bi se ubile sve ćelije osim željenih varijanti koje ne eksprimiraju ciljni antigen; ili da bi se ubile varijante koje eksprimiraju neželjen antigen. Stanja ne-kliničke in vitro upotrebe se brzo određuju od strane stručnjaka iz oblasti tehnike.
[0178] Primeri kliničke ex vivo upotrebe su da se uklone tumorske ćelije iz koštane srži pre autologne transplantacije u lečenju kancera. Tretman može da se izvede kao što sledi. Koštana srž je sakupljena iz pacijenta ili druge individue i zatim je inkubirana u medijumu koji sadrži serum u koji se dodaje citotoksični agens iz pronalaska. Opseg koncentracija od oko 10 uM do 1 uM, za oko 30 min do oko 48 h na oko 37 °C. Tačni uslovi koncentracije i vremena inkubacije, tj., doza, su brzo određeni od strane stručnjaka iz oblasti tehnike. Posle inkubacije, ćelije koštane srži su isprane sa medijumom koji sadrži serum i vraćene su u pacijenta sa i.v. infuzijom prema poznatim postupcima. U slučajevima gde pacijent prima drugi tretman kao što je kurs ablativne hemoterapije ili zračenje celog tela između vremena sakupljanja koštane srži i reinfuzije tretiranih ćelija, tretirane ćelije koštane srži se čuvaju zamrznute u tečnom azotu korišćenjem standardne medicinske opreme
[0179] Za kliničku in vivo upotrebu, terapeutski efikasna količina multispecifičnog antitela ili fragmenta za vezivanje antigena se daje subjektu kome je potrebna. Na primer, BCMA x CD3-multispecifična antitela i njihovi multispecifični fragmenti za vezivanje antigena mogu da budu korisni u lečenju kancera koji eksprimira BCMA kod subjekta kome je potrebno. U nekim izvođenjima, kancer koji eksprimira BCMA je kancer B-ćelija, kao što je multipli mijelom (MM). U poželjnim izvođenjima, multispecifično antitelo je BCMA x CD3-multispecifično antitelo kao što se ovde opisuje, ili njegov multispecifičan fragment za vezivanje antigena, i poželjnije BCMA x CD3-bispecifično antitelo kao što se ovde opisuje, ili njegov BCMA x CD3-bispecifičan fragment za vezivanje antigena. U nekim izvođenjima, subjekat je sisar, poželjno čovek. U nekim izvođenjima, multispecifično antitelo ili fragment za vezivanje antigena će se davati kao rastvor koji je prethodno ispitan za sterilnost.
4
[0180] Dozni režimi u gore navedenim postupcima lečenja i upotrebe su podešeni da se obezbedi optimum željenog odgovora (tj., terapeutski odgovor). Na primer, jedna bolusna doza može da se daje, nekoliko podeljenih doza mogu da se daju tokom vremena ili može da bude proporcionalno smanjena ili povećana kao što je naznačeno sa potrebama terapeutske situacije. Parenteralne kompozicije mogu da budu formulisani u jediničnom doznom obliku za jednostavnost davanja i jednoobraznost doze.
[0181] Efikasne doze i dozni režimi za multispecifična antitela i fragmente zavise od bolesti ili stanja koje treba da se leči i mogu da se odrede od strane stručnjaka iz oblasti tehnike. Primer, ne-ograničavajući opseg za terapeutski efikasnu količinu jedinjenja iz predmetnog pronalaska je oko 0.001-10 mg/kg, kao što je oko 0.001-5 mg/kg, na primer oko 0.001-2 mg/kg, kao što je oko 0.001-1 mg/kg, na primer oko 0.001, oko 0.01, oko 0.1, oko 1 ili oko 10 mg/kg.
[0182] Lekar ili veterinar koji su uobičajeno verzirani u stanje tehnike mogu brzo da odrede i prepišu efikasnu količinu farmaceutske kompozicije koja je potrebna. Na primer, lekar ili veterinar mogu da počnu sa dozama multispecifičnog antitela ili fragmenta koji se koristi u farmaceutskoj kompoziciji na nižim nivoima od onih koji su zahtevani da bi se postigao željeni terapeutski efekat i postepeno povećanje doze dok se ne postigne željeni efekat. Generalno, odgovarajuća dnevna doza bispecifičnog antitela iz predmetnog pronalaska će biti ona količina jedinjenja koja je najniža doza koja je efikasna da se proizvede terapeutski efekat. Davanje može da bude npr. parenteralno, kao što je intravenozno, intramuskularno ili subkutanozno. U jednom izvođenju, multispecifično antitelo ili fragment mogu da se daju infuzijom u nedeljnoj dozi izračunatoj sa mg/m<2>. Takve doze mogu, na primer, da budu zasnovane na mg/kg doza koje su obezbeđene gore u tekstu prema sledećem: doza (mg/kg)x70: 1.8. Takvo davanje može da bude ponovljeno, npr., 1 do 8 puta, kao što je 3 do 5 puta. Davanje može da se izvede kontinuiranom infuzijom tokom perioda od oko 2 do 24 h, kao što je od oko 2 do 12 h. U jednom izvođenju, multispecifično antitelo ili fragment mogu da se daju sporom neprekidnom infuzijom tokom dužeg perioda, kao što je više od 24 h, da bi se smanjili toksični neželjeni sporedni efekti.
[0183] U jednom aspektu, multispecifično antitelo ili fragment mogu se davati u izračunatoj nedeljnoj dozi kao fiksna doza do osam puta, na primer od četiri do šest puta kada se daje jednom nedeljno. Takav režim može se ponoviti jedan ili više puta po potrebi, na primer, nakon šest meseci ili dvanaest meseci. Takve fiksne doze se mogu, na primer, zasnivati na gore navedenim dozama mg / kg, sa procenjenom telesnom masom od 70 kg. Doza može biti određena ili prilagođena merenjem količine bispecifičnog antitela ovog pronalaska u krvi posle primene na primer vađenjem biološkog uzorka i upotrebom anti-idiotipskih antitela koja ciljaju BCMA region vezivanja antigena multispecifičnih antitela ovog pronalaska.
[0184] U jednom izvođenju, multispecifično antitelo ili fragment mogu biti davani kao terapija za održavanje, kao što je npr., jednom nedeljnom u toku perioda od šest meseci ili više.
[0185] Multispecifično antitelo ili fragment mogu takođe biti davani profilaktički u cilju smanjenja rizika od razvijanja kancera, odlaganja početka javljanja slučaja napredovanja kancera i/ili smanjenje rizika ponovnog javljanja kada je kancer u remisiji.
[0186] Multispecifična antitela i njihovi fragmenti kako je ovde opisano mogu takođe biti davani u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovani sa drugim terapeutskim sredstvima relevantnim za bolest ili stanje koje se leči. Prema tome, u jednom izvođenju, lek koji sadrži antitelo je za kombinaciju jednog ili više drugih terapeutskih sredstava, kao što je hemoterapeutsko sredstvo. U nekim izvođenjima, drugo terapeutsko sredstvo je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid, ili interleukin 2. Tako kombinovana davanja mogu biti simultana, odvojena ili sekvencionalna, bilo kojim redom. Za simultano davanje sredstva mogu biti davana kao jedna kompozicija ili kao odvojene kompozicije, kada je to pogodno.
[0187] U jednom izvođenju, postupak za lečenje poremećaja koji uključuje ćelije koje eksprimuju BCMA kod subjekta, obezbeđen je postupak koji obuhvata davanje terapeutski efikasne količine multispecifičnog antitela ili fragmenata, kao što je ovde opisano BCMA x CD3 bispecifčno antitelo, i radioterapije subjektu kome je to potrebno. U jednom izvođenju je obezbeđen postupak za lečenje ili prevenciju kancera, gde postupak obuhvata davanje terapeutski efikasne količine multispecifičnog antitela ili fragmenta, kao što je ovde opisano BCMA x CD3 antitelo, i radioterapije subjektu kome je to potrebno. Radioterapija može obuhvatati zraćenje ili je pacijentu obezbeđeno prateće davanje radiofarmaceutika. Izvor zračenja može biti ili spoljašnji ili unutrađnji u odnosu na pacijenta koji se leči (lečenje zračenjem , može na primer biti u obliku terapije zračenja spljašnjim snopom (EBRT) ili brahiterapije (BT)). Radioaktivni elementi koji mogu biti mogu biti korišćeni u praktičnom izvođenju ovih postupaka uključuju, npr., radijum, cezijum-137, iridijum-192, americijum-241, zlato-198, kobalt-57, bakar-67, tehnecijum-99, jodid-123, jodid-131, i indijum-111.
Kompleti
[0188] Takođe su ovde obezbeđeni kompleti, npr., koji obuhvataju multispecifična antitela ili njegove fragmente koji vezuju antigen i uputstva za upotrebu antitela ili fragmenta za ubijanje određenih tipova ćelija. U poželjnim izvođenjima, multispecifično antitelo koje je ovde opisano je BCMA x CD3-multispecifično antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, i poželjnije BCMA x CD3-bispecifično antitelo kako je ovde opisano, ili njegov fraagment koji vezuje BCMA x CD3-bispecifični antigen. Instrukcije mogu uključivati uputstva za korišćenje multispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen in vitro, in vivo ili ex vivo.
[0189] Tipično, komplet će imati odeljak koji sadrži multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. Multispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen može biti u liofilizovanom obliku, tečnom obliku ili drugom obliku koji je promenjiv da bi se uključilo u komplet. Komplet može takođe sadržati dodatne elemente koji su potrebni da bi se izveo postupak prema uputstvima u kompletu, kao što je sterilizovani rastvor za rekonstrukciju liofilizovanog praha, dodatna sredstva za kombinovanje sa multispecifičnim antitelom ili njegovim fragmentom koji vezuje antigen pre davanja pacijentu, i oruđe koje pomaže davanju multispecifičnog antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen pacijentu.
Diagnostičke upotrebe
[0190] Multispecifična antitela i fragmenti koji su ovde opisani mogu takođe biti korišćeni za dijagnostičke svrhe. Prema tome, takođe su obezbeđene dijagnostičke kompozicije koje sadrže multispecifično antitelo ili fragmente kako je ovde definisano, i njihova upotreba. U
4
poželjnim izvođenjima, multispecifično antitelo je BCMA x CD3-multispecifično antitelo kako je ovde opisano, ili njegov multispecifični fragment koji vezuje antigen, i poželjnije BCMA x CD3-bispecifično antitelo kako je ovde opisano, ili njegov fragment koji vezuje BCMA x CD3-bispecifični antigen. U jednom izvođenju, prikazani pronalazak obezbeđuje dijagnostički komplet za kancer koji obuhvata sud koji sadrži bispecifično BCMA x CD3 antitelo, i jedan ili više reagenasa za detektovanje vezivanja antitela za BCMA. Reagensi mogu uključivati, na primer, fluorescentne obeleživače, enzimske obeleživače ili druge detektabilne obleživače. Reagensi mogu takođe uključivati sekundarna ili tercijarna antitela ili reagense za enzimske reakcije, gde enzinska reakcija daje proizvod koji može biti vizuelizovan. Na primer, ovde opisana multispecifična antiela, ili njegovi fragmenti koji vezuju antigen, mogu biti obeleženi sa radioobeleživačima, fluorescentni obeleživač, epitopski obeleživač, biotin, hromoforni obeleživač, ECL obeleživač, enzim, rutenijum, 111In-DOTA, 111Indietilentriaminpentasirćetna kiselina (DTPA), peroksidaza rena, alkalina fosfataza i beta-galaktozidaza, ili poli-histidin ili slični obeleživači koji su poznati u stanju tehnike.
Primeri izvođenja opisanog predmeta pronalaska
[0191] Da bi se ovde bolje i potpunije opisao predmetni pronalazak, ovaj odeljak obezbeđuje numerisane primere izvođenja predstavljenog predmetnog pronalaska.
Numerisana izvođenja:
[0192]
1. Rekombinantno antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se vezuje imunospecifično za BCMA, gde antitelo ima teški lanac i laki lanac, pomenuti teški lanac sadrži:
a. region 1 koji određuje komplementarnost (CDR1) teškog lanaca ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6;
b. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6;
c. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6;
d. CDR1 teškog lanaca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanaca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19;
e. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6;
4
f. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19;
g. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 13, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19,
i gde pomenuto antitelo dalje sadrži CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 24, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 26.
2. Antitelo ili fragment koji vezujue antitelo prema izvođenju 1, gde teški lanac antitela (a) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 27; teški lanac antitela (b) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 57; teški lanac antitela (f) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 34; teški lanac antitela (k) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 39; teški lanac antitela (1) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 40; teški lanac antitela (m) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 58 ili teški lanac antitela (n) sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 43.
3. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema izvođenju 1 ili izvođenju 2, gde laki lanac antitela sadrži aminokiselinsku sekvencuSEQ ID NO: 28.
4. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom izvođenju 1 do 3 gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen vezuje se za ekstracelularni domen humanog BCMA.
5. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo komod izvođenja 1 do 4 gde antitelo ili fragment koji se vezuje za antigen je humano antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen
6. Fragment koji se vezuje za antigen prema bilo kom od izvođenja 1 do 5 gde fragment koji se vezuje za antigen je Fab fragment, Fab2 fragment, ili jednolančano antitelo.
7. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od izvođenja 1 do 6 gde antitelo ili njegov fragment koji se veže za antigen inhibira interakciju BCMA i APRIL.
8. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema izvođenju 7, gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen pokazuje ICso za interakciju BCMA i APRIL od oko 5.9 nM mereno sa ELISA.
9. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od izvođenja 1 do 8 gde antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je IgG.
10. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od izvođenja1 do 9 je izotip IgG4.
11. Antitelo prema izvođenju 10 gde IgG4 ima S228P supstituciju, L234A supstituciju i L235A supstituciju u njegovom Fc regionu.
4
12. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od izvođenja 1 do 11 gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen imunospecifično se veže za humani BCMA i unakrsno reaguje sa BCMA cinomogulus majmuna.
13. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od izvođenja 1 do 12 gde antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen se vezuje za BCMA na površini humanih ćelija mijeloma.
14. Antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od izvođenja 1 do 13 gde antitelo ili njegov fragment koji se veže za antigen vezuje se za BCMA na površini humanih ćelija mijeloma.
15. Rekombinanta ćelija koja eksprimuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen prema bilo kom od izvođenja 1 do 14.
16. Ćelija prema izvođenju 15 gde je ćelija hibridom.
17. Ćelija prema izvođenju 15 gde je antitelo proizvedeno rekombinanto.
18. Rekombinanto BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov fragment koji vezuje bispecifični BCMA x CD3 koji sadrži:
a) prvi teški lanac(HC1);
b) drugi teški lanac(HC2);
c) prvi lak lanac (LC1); i
d) drugi lak lanac (LC2),
gde HC1 je povezan sa LC1 i HC2 je povezan sa LC2 i gde HC1 sadrži SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, i SEQ ID NO: 61 i LC1 sadrži SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, i SEQ ID NO: 64 da bi se obazovalo prvo mesto vezivanja antigena koje imunospecifično veže CD3 i gde HC2 sadrži SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, i SEQ ID NO: 6 i LC2 sadrži SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, i SEQ ID NO: 26 da bi se obrazovalo drugo mesto vezivanja antigena koje imunospecifično veže BCMA.
19. Rekombinanto BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov fragment iz izvođenja 18 koje sadrži HC1 koji sadrži SEQ ID NO: 55, LC1 koji sadrži SEQ ID NO: 56, HC2 koji sadrži SEQ ID NO: 65, i LC2 koji sadrži: a) SEQ ID NO: 66 ili b) SEQ ID NO: 76.
20. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični vezujući fragmet iz izvođenja 19 gde antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragmet je IgG.
21. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični vezujući frgamet prema bilo kom od izvođenja 18, izvođenju 19 ili izvođenju 20 gde antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment je IgG4 izotipa.
22. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični vezujući fragment prema izvođenju 18 do 21 gde antitelo ili bispecifični vezujući fragment imunospecifično se vezuje za humani BCMA sa afinitetom od bar 0.22 nM kako je mereno površinskom plazmon rezonancom.
4
23. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični vezujući fragment prema izvođenjima 18 do 22 gde antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment se vezuje za BCMA na površini humanih ćelija mijeloma.
24. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifični fragment prema izvođenjima 18 do 23 gde antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment vezuje se za BCMA na površini humanih ćelija multiplog mijeloma.
25 BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment prema izvođenjima 18 do 24 gde antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment izazivaju aktivaciju humanih T-ćelija in vitro sa EC50 manjim od oko 0.37 nM.
26. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment iz izvođenja 18 do 25 gde antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment izazivaju T-ćelijski zavisnu citotoksičnost BCMA-eksprimujućih ćelija in vitro sa EC50 manjim od oko 0.45 nM.
27. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment iz izvođenja 18 do 26 gde antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment nije BCMA agonist.
28. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment iz izvođenja 18 do 27 gde antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment ne menja NF-κB aktivaciju na koncentracijama ispod 10 nM.
29. Rekombinanto ćelijski eksprimovano antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment prema bilo kom od izvođenja18 do 28.
30. Ćelija prema izvođenju 29 gde je ćelija hibridoma.
31. Postupak za lečenje subjekta koji ima kancer, pomenuti postupak obuhvata davanje terapeutski efikasne količine BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili njegovog bispecifičnog vezujućeg fragmenta prema bilo kom od izvođenja 18 do 28 subjektu kome je to potrebno u dovoljnom vremenu za lečenje kancera.
32. Postupak za inhibiranje rasta ili proliferacije ćelija kancera, pomenuti postupak obuhvata davanje terapeutski efikasne količine BCMA CD3 bispecifičnog antitela ili njegovog bispecifičnog vezujućeg fragmenta prema bilo kom od izvođenja 18 do 28 da bi se inhibirao rast ili proliferacija ćelija kancera.
33. Postupak preusmeravanja T ćelija do ćelija kancera koje eksprimuju BCMA, pomenuti postupak obuhvata davanje terapeutski efikasne količine BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili njegovog bispecifičnog vezujućeg fragmenta prema bilo kom od izvođenja 18 do 28 da bi se preusmerile T ćelije na kancer.
34. Postupak prema izvođenju 31, 32, ili 33 gde je kancer hematološki kancer.
35. Postupak prema izvođenju 34 gde je hematološki kancer kancer B ćelija koje ekspirimuju BCMA.
36. Postupak prema izvođenju 35 gde je kancer B- ćelija koji eksprimuje BCMA multipli mijelom.
4
37. Postupak prema izvođenju 31 koji dalje obuhvata davanje drugog terapeutskog sredstva.
38. Postupak prema izvođenju 37 gde je drugo terapeutsko sredstvo hemoterapeutsko sredstvo ili ciljana terapija protiv kancera.
39. Postupak prema izvođenju 38 gde je hemoterapeutsko sredstvo citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid, ili interleukin 2.
40. Farmaceutska kompozicija koja sadrži BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment prema bilo kom od izvođenja 18 do 28 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
41. Postupak za stvaranje BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili njegovog bispecifičnog vezujućeg fragmenta prema bilo kom od izvođenja 18 do 28 kultivisanjem ćelija prema bilo kom od izvođenja 29 do 30.
42. Izolovani sintetički polinukleotid koji kodira HC1, HC2, LC1 ili LC2 BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili njegovog bispecifičnog vezujućeg fragmenta prema bilo kom od izvođenja18 do 28.
43. Komplet koji sadrži BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov bispecifični vezujući fragment kako je definisano u bilo kom od izvođenja 18 do 28 i/ili polinukleotid kako je definisano u zahtevu 43 i pakovanje za isti.
Kratak opis nacrta
[0193]
Slika 1A i 1B. Vektori korišćeni za kloniranje humanog BCMA (Slika 1A) i „cyno“ BCMA (Slika 1B).
Slika 2A-2D. Lociranje epitopa BCMB69 i interakcije između humanog BCMA i BCMB69. (Slika 2A) Pregled položaja epitopa. BCMB69 se vezuje za konkavnu površinu BCMA (crni regioni). (Slika 2B) Mapa interakcije pokazuje direktne kontakte između BCMA i BCMB69. Ostaci iz svih CDRs osim CDR-L1 imaju kontakt sa BCMA. Van der Waals-ove interakcije su prikazane kao isprekidane linije, H-veze su pune linije sa strelicama koje označavaju H veze backbone i upućuju na backbone atome. Ostaci BCMA koji dolaze u kontakt i sa BCMB69 i APRIL imaju crni okvir. Granična vrednost udaljenosti od 4 Å je korišćena za identifikovanje ostataka u kontaktu (3.5 Å prag udaljenosti za H veze). (Slika 2C i Slika 2D) Blizak prikaz glavnih interakcija BCMA sa BCMB69 lakim (Slika 2C) i teškim (Slika 2D) lancima. H veze su prikazane kao isprekidane linije sa distancama u Angstromima.
Slika 3. Ostaci epitopa i paratopa BCMB69. Ostaci epitopa i paratopa su zasenčeni, regioni CDR su podvučeni (Kabat definition), i ostaci BCMA koji se razlikuju od humanog su tamne boje iskošeni. Prikazane su samo sekvence BCMB69 Fab i vanćelijskog BCMA.
Slika 4A i 4B. Regioni sudara između BCMB69 Fab i APRIL (Slika 4A) i BCMB69 Fab BAFF (Slika 4B). Strukturalno preklapanje BCMA/BCMB69 kompleksa na BCMA/APRIL i BCMA/BAFF komplekse pokazuje regione sudara između Fab i liganda. Prikazana je površina BCMA koja je dostupna za rastvarač. Fab i molekuli liganda su redom prikazani kao sivi i crni crteži. Preklapanje je postignuto superpozicijom ekivivalentnih BCMA Cα atoma u oba kompleksa (RMSD od 0.9 Å za APRIL kompleksa i 1.2Å za BAFF).
Slika 5. SPR podaci za BCMB72 pokazuju da se molekul vezuje za humani, cyno i mišji BCMA. Srednja KDza cyno i mišji BCMA je oko 36-puta i 402-puta, redom kada se uporedi sa humanim BCMA.
Slika 6. EC50određivanje BCMB72 vezivanja za BCMA<+>ćelijske linije. Ćelijske linije su obojene za BCMA upotrebom BCMB72. Geometrijske srednje vrednosti intenziteta fluorescencije vezivanja BCMB72 za ćelije su prikazane. EC50su naznačene u legendi. Zasićenje je postignuto pri koncentraciji od oko 100 nM Srednja vrednost intenziteta fluorescencije je smatrana da izvodi EC50vrednosti za U2932 (EC50= 7.92 nM), MM1R (EC50= 8.74 nM), H929 (EC50= 14.7 nM), EJM (EC50= 17.5 nM) i LP1 (EC50= 22.3 nM) ćelije. Predstavljanje grafikom i podešavanje podataka je urađeno u GraphPad Prism 6 korišćenjem nelinearne regresije sa varijabilnom funkcijom nagiba (četiri parametra).
Slika 7. Profil vezivanja BCMB72 u punoj krvi. Puna krv iz tri normalna humana donora je obojena sa monoklonalnim ili poliklonalnim antitelima protiv BCMA ili BCMB72. Analiza podešavanja kanala je izvedena da se identifikuju limfociti u leukocitnoj populaciji upotrebom standardnih markera koji su specifični za ćeliju. Intenzitet bojenja za jednog reprezentativnog donora je prikazan u panelima, gde su pune crne linije antitela od interesa i istačkane linije sa sa punim sivim su odgovarajući izotip. Ekspresija BMCA nije uočena na limfocitima, monocitima, granulocitima ili plazmacitoidnim DC-a kod tri normalna donora. BCMB72 pokazuje vezivanje za CD3<+>T ćelije u sva tri donota sa intenzitetima koji se razlikuju između donora. BCMB72 se nije vezao za bilo koji drugi ćelijski tip koji je ispitan u ovom testu.
Slika 8A-8E. BCMB72-zavisna T-ćelijska aktivacija u prisustvu različitih MM ćelijskih linija. H929 (Slika 9A), MM.1R (Slika 9B), RPMI 8226 (Slika 9C), U266 (Slika 9D) i Mv4-11 (Slika 9E) ćelije su izložene naznačenim antitelima u prisustvu T ćelija iz šest normalnih donora (prikazane su srednje vrednosti donora ±SEM) i blokatora Fc (2 mg/mL) za 48 h. EC50vrednosti su naznačene na graficima. Statistička analiza: Pored jednostavne činjenice konvergencije modela, širina 95% intervala poverenja oko L0gEC50su smatrane da procenjuju adekvatnost uklapanja. (Interval poverenja oko L0gEC50je korišćen zbog toga što je simetričan; intervali poverenja oko EC50sami nisu) Interval manji od /- 2 (ili ukupno 95% interval poverenja sa širinom manjom od 4) je smatran adekvatnim.
Slika 9. Pregled EC50i maksimuma vrednosti T ćelijske aktivacije iz dva nezavisna eksperimenta upotrebom T ćelija iz brojnih normalnih donora. Individualne donorske vrednosti i srednje vrednosti donora su prikazane za svaku ćelijsku liniju i za svaki eksperiment Bez podatka = nije ispitano; bez uklapanja = softver nije bio sposoban da generiše krivu; ~ vrednosti = aproksimacija zasnovana na modelu ekstrapolacije.
Slika 10A-10E. T-ćelijski posredovana BCMB72-zavisna citotoksičnost različitih linija ćelija mijeloma. H929 (Slika 11A), MM.1R (Slika 11B), RPMI 8226 (Slika 11C), U266 (Slika 11D) i Mv4-11 (Slika 11E) ćelije su izložene naznačenoj koncentraciji antitela u prisustvu T ćelija
1
iz šest normalnih donora (prikazane su srednje vrednosti donora ±SEM) i Fc blokatora (2 mg/mL) za 48 h. EC50vrednosti su naznačene na graficima. Statistička analiza: Pored jednostavne činjenice konvergencije modela, širina 95% intervala poverenja oko LogEC50je smatrana da procenjuje adekvatnost uklapanja (Interval poverenja oko L0gEC50je korišćen zbog toga što je simetričan; intervali poverenja oko EC50sami nisu) Interval manji od /- 2 (ili ukupno 95% interval poverenja širine manje 4) je smatran adekvatnim.
Slika 11. Pregled EC50i maksimalnih vrednosti lize iz dva nezavisna eksperimenta upotrebom T ćelija iz brojnih normalnih donora. Individualne donorske vrednosti i srednje vrednosti donora su prikazane za svaku ćelijsku liniju i za svaki eksperiment. Bez podatka = nije ispitano; bez uklapanja = softver nije bio sposoban da generiše krivu; ~ vrednosti = aproksimacija zasnovana na modelu ekstrapolacije.
Slika 12. Citotoksičnost i T ćelijska aktivacija u H929 ćelijama. BCMAxCD3 bispecifična antitela (Mutantni molekuli BCMB72) su ispitana u T-ćelijski posredovanom testu za određivanje citotoksičnosti. BCMA-pozitivna ćelijska linija (H929) je inkubirana sa različitim koncentracijama antitela tokom 48 h u prisustvu egzogenih humanih T ćelija iz normalnih donora (ID broj donora: M5763 i M6576). Posle 48 h inkubacije ubijanje ćelija je izmereno pristupom zasnovanim na protočnoj citometriji (FACS) i prijavljeno je kao % citotoksičnosti na Slici 12A. Slika 12B pokazuje T-ćelijsku aktivaciju kao što je, procenjeno pojačanom regulacijom CD25 na T-ćelijskoj površini. Generalno, tačke podataka su čvrsto poravnate duž krive generisanog uklapanja i bilo je malo varijabilnosti između donora T ćelija i ponovljenih ispitivanja.
Slika 13. Pregled EC50vrednosti za BCMB72-posredovano oslobađanje citokina. RPMI 8226 ćelijski supernatanti iz eksperimenata za određivanje citotoksičnosti (videti Primer 12, Slku 8) su sakupljeni i analizirani za šest različitih nivoa citokina upotrebom MSD zasnovanog multipleksnog testa. BCMB72 (BCMA x CD3) i kontrolna antitela (BCMA x null i null x CD3) su korišćeni u različitim koncentracijama.
Slika 14A i 14B. T-ćelijski posredovan BCMB72-zavisan test citotoksičnosti je izveden upotrebom BCMA pozitivne H929 ćelijske linije. Ćelije su izložene BCMB72 pri različitim koncentracijama u prisustvu T ćelija iz brojnih normalnih donora (pregled za tri donora M7197, M5137 i M6457 je prikazan kao reprezentativan) i Fc blokator (2 mg/mL) tokom 48 h. Odnos efektor /meta (E/T) je bio 5:1. Slika 14A ukazuje na potencijal citotoksičnosti i Slika 14B sa desne strane pokazuje krive T-ćelijske aktivacije koje su slične između različitih serija BCMB72.
Slika 15. H929 ćelije su tretirane sa BCMB72 (BCMA x CD3) i kontrolnim antitelom (BCMA x null i null x CD3) tokom 30 minuta na dozama koje su naznačene na X-osi u gore navednom grafiku i ukupni protein je analiziran upotrebom jednostavnog postupka Western analize prema standardnom protokolu kao prema ProteinSimple uputstvu za korišćenje. Podaci su normalizovani upotrebom akttina kao „housekeeping“ gena i odnosi su prikazani na Y-osi. APRIL i BAFF indukuju fosforilaciju P38 kao što je očekivano i antitela nemaju stimulatorni efekat na bilo kojoj ispitanoj koncentraciji.
2
Slika 16A-16F. HEK-NFκB ćelije koje eksprimiraju BCMA (Slika 16A, Slika 16C i Slika 16E) ili parentalne ćelije (Slika 16B, Slika 16D i Slika 16F) su stimulisani sa TNFa i različitim koncentracijama APRIL ili BCMB72. Tri vremenske tačke, 16 h. (Slika 16A i Slika 16B), 24 h. (Slika 16C i Slika 16D) i 48 h (Slika 16E i Slika 16F) su analizirane. TNFa je indukovao aktivaciju NF-kB u obe HEK-Nf-kB parentalne ćelije i HEK-NF-kBBCMA ćelijama, pri čemu, APRIL indukcija je uočena samo u BCMA specifičnom ćelijskom tipu. BCMB72 nije imao efekat na parentalnu ćelijsku liniju i pokazao je aktivaciju samo na visokim koncentracijama u ćelijama koje eksprimiraju BCMA.
Slika 17A i 17B. T ćelije ne ispoljavaju sBCMA-posredovanu i BCMB72-zavisnu aktivaciju. BCMB72 (Slika 17A) i null x CD3 kontrolno antitelo (Slika 17B) su titrirani sa T ćelijama iz dva normalna donora (M7077 i M5137) u prisustvu različitih doza rastvorljivog BCMA ECD. Podaci: Srednja vrednost ±SEM.
Slika 18A- 18F. Efekat rastvorljivih faktora, sBCMA, APRIL i BAFF na T ćelijsku aktivaciju i T ćelijski posredovan citotoksični potencijal BCMB72 u H929 ćelijama. Ćelije su izložene testu ubijanja 48 h upotrebom donorskih T ćelija (M7077 & M6521) i BCMB72. Ciljna citotoksičnost je prikazana graficima na levoj strani i T ćelijska aktivacija je prikazana graficima na desnoj strani (n=2). EC50vrednosti za svaki tretman su naznačene u legendama. Ćelijska citotoksičnost u prisustvu sBCMA (Slika 18A), APRIL (Slika 18B) i BAFF (Slika 18C) su prikazane. T ćelijska aktivacija u prisustvu sBCMA (Slika 18D), APRIL (Slika 18E) i BAFF (Slika 18F) su prikazane. Podaci: Srednja vrednost ±SEM.
Slika 19A u 19B. Signali iz dva nezavisna eksperimenta su normalizovani do maksimalnog signala vezivanja BCMAFc za APRI1 i BAFF u odsustvu antitela u kompeticiji. Vezivanje BCMA za APRIL (Slika 19A) i BAFF (Slika 19B) je predstavljeno kao funkcija koncentacije BCMB72 i kontrolnog antitela (null x CD3).
Slika 20A-20E. Potencijal citotoksičnosti BCMB72 protiv humanih primarnih plazma ćelija MM. Zamrznute mononuklearne ćelije poreklom iz koštane srži iz pet različitih pacijenata (MM240BM (Slika 20A), MM259BM (Slika 20B), MM270BM (Slika 20C), MM276BM (Slika 20D) i MM277BM (Slika 20E)) su korišćeni za ispitivanje vezivanja BCMB72, u poređenju sa IgG4 izotipom (CNTO 9412, levi panel) kontrolom, plazma ćelijska citotoksičnost (srednji) i T ćelijska aktivacija (desni). Za test citotoksičnosti, T ćelije iz M7077 normalnog zdravog donora su egzogeno dodate u BMMC uzorke pacijenta i inkubirane su sa BCMB72 (BCMA X CD3), BC3B4 (BCMA X null) ili CNTO 7008 (null X CD3) tokom 48 h. BCMB72 se vezuje za plazma ćelije u dozno zavisnom načinu za sve uzorke donora i srednji intenziteti fluorescencije su zabeleženi na Y-osi. Primetiti gubitak živih plazma ćelija (CD138<+>) i istovremenu pojačanu regulaciju CD25 na T ćelijama u odgovoru na BCMB72 tretman. EC50vrednosti za T ćelijsku aktivaciju su naznačene na graficima.
Slika 21. BCMB72 in vivo efikasnost u H929 profilaktičkom modelu.
Slika 22. Nivoi BCMA rastvorljivog u serumu kod H929 ksenografta miševa. Koncetracija BCMA rastvorljivog u serumu je detektovana korišćenjem BCMA ELISA kompleta (R&D Sistemi). Nivoi rastvorljivosti BCMA su značajno niži kod tretmana miševa sa 1 mg i 0.5 mg/miševima BCMB72 u poređenju sa PBS kontrolom koja je u finoj korelaciji sa tumorskim opterećenjem kod ovih životinja . Niže doze BCMB72 (0.1 mg/miševima) nisu imali efekat na sBCMA nivoe ili na veličinu tumora.
Primeri
[0194] Primeri koji slede su obezbeđeni da dopune prethodni prikaz i da obezbede bolje razumevanje ovde prikazanog predmetnog prikaza. Ove eksperimente ne treba posmatrati da ograničavaju opisani predmetni prikaz. Treba razumeti da primeri i ovde opisana izvošenja su samo za ilustrativne svrhe i da različite modifikacije ili promene u njihovom prikazu mogu da budu očigledne stručnjacima iz oblastu tehnike i ne treba da budu uključeni u, i mogu da se naprave bez odstupanja od, pravog obima pronalaska, koji se definiše u patentnim zahtevima.
Primer 1: Materijali
BCMA ECD molecules
[0195] Rekombinantni humani (h) BCMA-Fc spojeni protein (katalog # 193-BC-050), koji odgovara aminokiselini 1 do 54 od hBCMA (SEQ ID NO:1) i rekombinantni mišji (m) BCMA-Fc spojeni protein (katalog# 593-BC-050) koji odgovara aminokiselini 1 do 49 od mBCMA (SEQ ID NO:2) je dobijen od R&D Sistema. Rekombinantni cyno BCMA protein koji je dobijen od cDNK koja se dobija iz postupaka sinteze gena (U.S. Pat br.6,670,127; U.S. Pat. br.6,521,427). Svi proteini su ispitani za endotoksin pre upotrebe i biotinilovani su za ispitivanja za ispitivanja „phage panning“. Ovi materijali su takođe korišćeni za vezivanje i merenje afiniteta.
[0196] Rastvorljivi humani BCMA je dobijen od AB Biosciences (Catalog br. P011Xp, serija br.
033-013) i korišćen je za ispitivanja karakterizacije.
4
APRIL, BAFF, BAFF-R i TACI molekuli
[0197] Rastvoljivi hAPRIL (katalog #DY884), hBAFF (katalog #2149-BF), hBAFF-R (katalog #1162-BR), koji odgovaraju aminokiselinama 7 do 71 of hBAFF-R, i hTAC1, koji odgovaraju aminokiselinama 2 do 166 TACI su dobijeni od R&D Sistema. BAFF-R i TAC1 su biotinilovani za SPR ispitivanja.
Dobijanje BCMA ćelijskih linija
[0198] Vektori koji prikazuju humani BCMA (Slika 1A) i cyno BCMA (Slika 1B) su prolazno transfektovani u HEK293 expi ćelije upotrebom standardnih postupaka. Transfektovane 293F adherentne ćelije su odabrane za stabilnu integraciju u plazmid, zatim je pojedinačna ćelija sortirana i ekspresija BCMA površinskog receptora je kvantifikovana sa FACS upotrebom antihumanog BCMAPE obeleženog antitela (R&D Sistemi FAB193P).
Primer 2: Izolovanje hibridoma koji eksprimiraju humano BCMA monoklonalno antitelo
[0199] Humani imunoglobulinski transgeni soj pacova (OmniRat ®; OMT, Inc.) je korišćen za razvijanje ćelija hibridoma koje eksprimiraju humano BCMA monoklonalno antitelo. OmniRat® sadrži himerni humani/pacovski IgH lokus (koji se sastoji iz 22 humana VHS, sve humanog D i JH segmenata u prirodnoj konformaciji koji su povezani sa CH lokusom pacova) zajedno sa potpuno humanim IgL lokusima (12 Vκs koji su povezani sa Jκ-Cκ i 16 Vλs koji su povezani sa Jλ-Cλ). (videti npr., Osborn, et al. (2013) J Immunol 190(4): 1481-1490). Prema tome, pacovi koji ispoljavaju smanjenu ekspresiju pacovskog IgM ili κ, i u odgovoru na imunizaciju, uvedeni humani transgeni teškog ilakog lanca prolaze kroz promenu klase i somatske mutacije da se dobiju visokoafinitetna humana IgG monoklonalna antitela. Dobijanje i upotreba OmniRat®, i genomskih modifikacija koje nose takvi pacovi, je opisano u PCT Objavi WO 14/093908 prema Bruggemann et al.
[0200] Kada se imunizuju sa rekombinantnim humanim BCMA (rhBCMA), ovaj transgeni pacov proizvodi humana IgG antitela koja su specifična za humani BCMA.
[0201] Šema imunizacije je izvedena prema sledećem: šest pacova je imunizovano sa hBCMA-Fc fuzijom. Nakon režima imunizacije od 21 dana, slezine i limfni čvorovi iz imunizovanih pacova su sakupljeni i korišćeni su za dobijanje četiri ukupne biblioteke hibridoma. Biblioteke su titrirane i ispitane su sa ELISA da se identifikuju mAt-a koja ispoljavaju vezivanje za biotinilovani hBCMA. mAt-a su uhvaćena na MSD Streptavidin ploči. Nakon daljih konfirmatornih ispitivanja, supernatanti hibridoma koji ispoljavaju vezivanje specifično za humani BCMA i cyno BCMA su sekvencirani, klonirani i eksprimirani i konvertovani u oba humana IgG1 i IgG4.
Primer 3: Prečišćavanje BCMA antitela
[0202] BCMA antitela u prečišćenim supernatantima kulture su uhvaćeni sa MabSelect SuRe Proteinskom A smolom i eluirani su sa 100 mM natrijum acetatom (pH 3.5). Delovi koji sadrže antitela su sakupljeni i brzo su neutralizovani sa 2.5 M Tris HC1 (pH 7.2), nakon čega je pufer izmenjen u 1xD-PBS ili u druge željene pufere ukoliko je naznačeno. Koncentracija proteina je određena merenjem OD280 na NanoDrop spektrofotometru i izračunata je korišćenjem njegovog koeficijenta apsorbancije. Čistoća i homogenost antitela je ispitana sa SDS-PAGE i SEHPLC. SEC korak poliranja koristeći Superdex 200 je izveden ukoliko monomer spada ispod 95% po SE-HPLC.
Primer 4: Karakterizacija BCMA antitela Ćelijskog vezivanja za BCMA
[0203] Vezivanje BCMA antitela za ćelije dobijene inženjeringom koje eksprimiraju BCMA i linije ćelija kancera U2392, EJM, MMIR, U266, OPM2, i RPMI-18226 je ispitano upotrebom MSD (Mesoscale) testa za vezivanje ćelija i protočne citometrije. Cilj testa ispitivanja je da se identifikuju antitela koja su vezana za ćelije koje eksprimiraju BCMA kao i unakrsna reaktivnost sa ćelijama koje eksprimiraju cyno BCMA.
[0204] MSD test vezivanja ćelja, ćelije su imobilizovane i uzorci BCMA antitela su testirani u triplikatu. Ukratko, supernatanti ekspresije prečišćenih BCMA antitela su normalizovani sa 10 µg/mL. 5000 ćelija po bunariću je zasejano na ploču sa 384 bunarića (MA6000, kat L21XB, MSD) i omogućeno je vezivanje od 2 h. Ćelije su nakon toga blokirane sa 20% FBS u PBS (Gibco) tokom 15 minuta. Supernatanti antitela su nakon toga dodati i ostavljeni su na RT tokom 1 h. Ćelije su isprane 3 puta sa PBS i nakon toga je dodato sekundarno antitelo koje je obeleženo rutenijumom (Jackson Immuno Research) na 1 µg/mL i inkubirano je 1 h na sobnoj temperaturi. Dalji korak ispiranja je primenjen nakon toga i 35 µL po bunarići MSD Read pufer T (bez surfaktanta) je zatim dodato i inkubirano 30 min za detekciju. Ploče su nakon toga očitavane upotrebom MSD Sector 6000. Podaci su normalizovani prema kontrolama i predstavljeni grafikom upotrebom GraphPad Prism Verzije 5. Utvrđeno je da je pozitivno vezivanje pogodaka sa signalom koji je 3x veći od pozadinskog. Test je ponovljen radi doslednosti podataka i vezivanja na vrhu su odabrana za dalje razvijanje.
[0205] Za protočnu citometrijum, ćelije su inkubirane sa bojama za vijabilnost i 100,000 ćelija je dodato u ploču sa dnom oblika U i centrifugirano je do dobijanja peleta ćelija. Titrirana BCMA antitela su dodata na ćelije. Posle perioda inkubacije, ćelije su peletirane i isprane. AlexaFluor 647 obeležene vrste specifičnog sekundarnog antitela su dodate na ćelije i omogućeno je inkubiranje. Ćelije su peletirane i isprane su nekoliko puta. Ćelije su resuspendovane u odgovarajućoj količini pufera i analizirane su korišćenjem FACS CantoII. Ćelije su gejtovane sa FSC-A u odnosu na SSC-A za veličinu, SSCA u odnosu na SSC-H za singlete i za vijabilnost boje. geoMFI vrednosti populacije živih ćelija su prikazani grafikom i korišćeni su za računanje EC50vrednosti ukoliko je moguće, tj., ukoliko su krive u potpunosti sigmoidalne.
Inhibicija vezivanja APRIL liganda
[0206] Panel BCMA antitela je ispitan u kompetitivnom ELISA testu APRIL vezivanja. Rastvorljivi humani April je kupljen od R&D sistema Katalog # DY884) procenjena je sposobnost anti-BCMA antitela da blokiraju vezivanje April za imobilizovan BCMA.
[0207] Ukratko, bistre maksisorb ploče sa 96-bunarića su tretirane sa 100 µL 0.5 µg/mL BCMA-ECD dobijenog u PBS i inkubirane su na sobnoj temperaturi preko noći Ploče su nakon toga tri puta isprane sa ELISA puferom za ispiranje koji sadrži 0.05% Tween-20 n PBS (R&D Sistemi Katalog # WA126), i nakon toga su blokirane sa 300 µL/bunarići reagensa razblaživača koji sadrži 1% BSA5 u PBS (R&D Sistemi katalog # DY995). ). Za kompetitivno vezivanje, BCMA antitela su dodata na ploču u zapremini od 100 µL i inkubiranas su 30 minuta pre dodavanja APRIL. Posle 30 minuta, 1 ng APRIL je dodat po bunariću i ploče su inkubirane preko noći na 4 °C. Nevezan APRIL je ispran sa ELISA puferom za ispiranje i vezan biotinilovan APRIL je detektovan upotrebom SA-HRP konjugata na optičkog gustini od 450 nm.
Primer 5: Pogodak procene i odabira
[0208] Nakon završetka eksperimenata karakterizacije, antitelo koje je dobijeno od M2 hibridoma-pod imenom BCMB69- određeno je da ima sledeće karakteristike:
• Vezuje se za rekombinantno humano BCMA
• Vezuje se za rekombinantno cyno BCMA
• Ispoljava slabo vezivanje za mišji BCMA
• Vezuje se za oba HEK-koji eksprimira humani BCMA i HEK-koji eksprimira cyno BCMA kao što je mereno protočnom citometrijom
• Vezuje se za linije humanog kancera koje eksprimiraju BCMA (U2392, EJM, MMIR, U266, OPM2, i RPMI-18226)
• Blokira vezivanje APRIL sa IC50= 5.9 nM
Kao rezultat, BCMB69 (Tabela 4 i Tabela 5) je eksprimiran i prečišćen za svrhu dobijanja BCMA x CD3 bispecifičnih antitela.
i)
rad
zag
u
ena
đ
be
obez
je
O NID
SEQ
a
ntn
leva
(re
B69
BCM
nce
kve
se
R
D
4.C
ela
Tab
Tabela 5: VHi VLsekvence BCMB69
Primer 6: Kristalna struktura anti-BCMA Fab
[0209] Kristalna struktura jednog anti-BCMA antitela (BCMB69) je određena u slobodnom obliku Fab, kao i kada je vezan za humani BCMA, da bi se karakterisale interakcije antitelo/antigen u atomskim detaljima, porast našeg razumevanja mehanizma dejstva antitela, i podrška za sve potebne napore inženjeringa antitela.
Materijali
[0210] His-obeležen BCMA Fab (SEQ ID NOs: 75 i 76; ove jednostavno BCMB69 Fab) je eksprimiran u HEK293 ćelijama i prečišćen je upotrebom afinitetnih i hromatografija za isključivanje po veličini. Fab je primljen u 130 mM NaCl, 20 mM MES, pH 7.4.
[0211] Humani vanćelijski domen BCMA (ostaci 5-51 of SEQ ID NO:1; ovde jednostavno BCMA) sa C-terminalnim His obeleživačem je eksprimiran korišćenjem bakulovirusnog sistema i prečišćen je po afinitetu i hromatografijom za isključivanje po veličini. Protein je primljen u 50 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8.
Kristalizacija
BCMA/BCMB69 Fab Kompleks
[0212] Kompleks Fab/antigen je dobijen mešanjem BCMA sa BCMB69 Fab u molarnom odnosu 3.8 : 1 (višak BCMA) u trajanju od 16 h na 4°C dok je pufer izmenjen do 20 mM Hepes pH 7.5. Kompleks je zatim eluiran sa monoS 5/50 kolone sa gradijentom 51-63 mM NaCl u 20 mM Hepes pH 7.5 i koncentrovan je do 17 mg/mL. Kristali koji su pogodni za rasipanje X-zraka su dobijeni od 25% PEG 3kDa, 0.2M MgCl2, 0.1M Mes pH 6.5 postupkom difuzije isparenja pare u sedećem položaju na 20°C sa mikro-sejanjem.
BCMB69 Fab
[0213] BCMB69 Fab je koncentrovan do 9 mg/mL bez daljeg prečišćavanja. Kristali koji su pogodni za rasipanje X-zraka su dobijeni od 2M (NH4)2SO4, 5% MPD, 0.1M Mes pH 6.5 upotrebom postupka difuzije isparenja pare u sedećem položaju na 20°C.
Sakupljanje podataka X-zraka i određivanje strukture
[0214] Za sakupljanje podataka X-zraka, kristali su bili natopljeni nekoliko sekundi u criozaštitnom rastvoru koji sadrži odgovarajuću matičnu tečnost dopunjenu sa 20% glicerolom, i brzo su zamrznuti u tečnom azotu. Podaci rasipanja X-zraka za BCMA/BCMB69 kompleks su sakupljeni sa Rayonix 300HS CCD detektorom u snopu zraka CMCF-08ID kanadskog izvora svetlosti (CLS), dok su podaci X-zraka za slobodni BCMB69 Fab sakupljeni sa Dectris Pilatus 6M Pixel Array detektorom na snopu zraka 17-ID Unapređenog izvora protona (APS) u Argonne Nacionalnoj Laboratoriji. Podaci rasipanja zraka su obrađeni sa programom HKL (Otwinowski, Z. & Minor, W. (1997). Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology 276: 307-326.).
[0215] Struktre su rešene molekularnom zamenom (MR) sa Phaser (Read, R. J. (2001). Pushing the boundaries of molecular replacement with maximum likelihood. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57: 1373-82). U sličaju slobodne Fab strukture, model pretrage za MR je bio antiinfluenca hemaglutinin 5j8 Fab (PDB kod: 4M5Y). U slučaju BCMA/Fab kompleksa, modeli pretrage za MR su bile kristalne strukture BCMA (PDB kod: 1XU2) i BCMB69 slobodna Fab struktira. Strukture su prečišćene sa PHENIX (Adams, P. D., Gopal, K., Grosse-Kunstleve, R. W., Hung, L. W., Ioerger, T. R., McCoy, A. J., Moriarty, N. W., Pai, R. K., Read, R. J., Romo, T. D., Sacchettini, J. C., Sauter, N. K., Storoni, L. C. & Terwilliger, T. C. (2004). Recent developments in the PHENIX software for automated crystallographic structure determination. J Synchrotron Radiat 11: 53-5.) i podešavanje modela je izvedeno upotrebom COOT (Emsley P. & Cowtan, K. (2004). Coot: Model building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D60: 2126-2132). Sva druga kristalografska izračunavanja su izvedena sa CCP4 paketom programa (Collaborative Computational Project Number 4, 1994). Svi molekularni grafici su dobijeni pomoću PyMol (DeLano, W. (2002). The PyMOL molecular graphics system. Palo Alto, CA, USA; Delano Scientific). Statistike podataka za oba BCMB69 slobodnu Fab struktiru i kompleks su prikazane u Tabeli 6.
Tabela 6. Kristalografski podaci za BCMA/BCMB69 Fab kompleks i slobodan BCMB69 Fab.
1 Epitop, paratop i interakcije
[0216] BCMB69 prepoznaje konformacioni epitop koji se sastoji iz epitopa u β-ukosnici (ostaci Y13-H19) i heliks-petlja-heliks (ostaci L26, R27, i N31-L35) regionima u BCMA (Slike 3 i 4). BCMB69 epitop se sastoji iz površine od oko 830 Å<2>ns BCMA i sadrži ligand-vezujući DXL motiv (ostaci D15-L18 u tipu I okreta β-ukosnice), koji izviruju u plitku šupljinu ograničenu sa regionima koji određuju komplementarnost antitela (CDR-a). Leucin 17, na vrhu DXL okreta, je u potpunosti pokriven u šupljini antitela i ima intenzivne interakcije sa BCMB69. Još jedan rasprostranjeni ostatak epitopa je Arg27, koji je na 310-heliks h1 i obrazuje nekoliko kontakata vodoničnim vezana sa CDRs-ima u teškom lancu.
[0217] BCMB69 paratop se sastoji iz ostataka od svih CDR-a osim CDR-L1 (Slike 2 i 3). Težak lanac ima dva puta veći broj kontakata sa BCMA u poređenju sa lakim lancem. Mali bočni lanci u CDR-H3 vrhui petlje (102-GAVAG-106) (SEQ ID NO: 77) olakšavaju inserciju CDR-H3 u BCMA i uspostavljanje intenzivnih kontakata antitelo/antigen (40% od ukupnih kontakata su napravljeni od strane CDR-H3). BCMB69 CDR-i se pakuju na konkavnoj površini BCMA strukture slične stolici sa CDR-L2 (ostaci Y48, D52, P54, S55), CDR-H1 (ostaci G32-Y34), i CDRH3 (D101, A103, V104, Y110) dolaze u kontakt sa "sedištem" koje obrazuju h1 heliks i h1h2 petlja, dok CDR-L3 (ostaci W90, S92, D95), CDR-H1 (F35), CDR-H2 (Y54, Y60), i CDR-H3 (H100, G102, A103, A105) interaguju sa "leđima" koje obrazuje β-ukosnica BCMA. Leu35, jedini ostatak epitopa u "nozi stolice" (h2 heliks), ostvaruje van der Waals-ove kontakte sa CDRL2 ostatkom D52.
[0218] BCMA ima mali (oko 50 ostataka) i kompaktni vanćelijski domen. Postoji ograničena površina za vezivanje ne-kompetitivnih antitela ili liganada za BCMA. Većina ostataka BCMB69 epitopa su takođe ostaci za vezivanje za APRIL (12 od 14 ostataka epitopa) i BAFF (9 od 14 ostataka). U slučaju za APRIL, koji je najveći afinitetni ligand BCMA, jedini ostaci epitopa koji se ne deli su F14 i S16 (Slka 2B), dok za BAFF ostaci koji se ne dele su F14, L26, T32, P33, i L35. DXL petlja je prekrivena sa oba ligand i BCMB69.
Predloženi mehanizmi za delovanje BCMB69
[0219] BCMB69 je kandidat za preusmeravanje T-ćelija ka ćelijama kancera MM. Ubijanje ćelija kancera koje je posredovano sa BCMB69 x anti-CD3 bispecifičnim antitelom nije očekivano da bude narušeno strukturom i položajem epitopa BCMB69. Pristupači položaj of epitopa omogućava vezivanje BCMB69 Fab kraja za membranski vezani BCMA, dok je drugi Fab kraj još uvek vezan za CD3 u T-ćelijskoj membrani.
[0220] BCMB69 može takođe da naruši signalne puteve APRIL BAFF u plazma ćelijama kroz sternu okluziju i direktnom kompeticijom za BCMA vezujuće mesto. The overlay of the BCMA/BCMB69 structure onto the BCMA/APRIL and BCMA/BAFF structures (Liu, Y., Hong, X., Kappler, J., Jiang, L., Zhang, R, Xu, L., Pan, C.H., Martin, W.E., Murphy, R.C., Shu, H.B., Dai, S. & Zhang, G. (2003). Nature 423: 49-56; Hymowitz, S.G., Patel, D.R., Wallweber, H.J.A., Runyon,
S., Yan, M, Yin, J., Shriver, S.K., Gordon, N.C., Pan, B., Skelton, N.J., Kelley, R.F. & Starovasnik, M.A. (2005). J. Biol. Chem.280: 7218-7227.) pokazuje regione sudara između BCMB69 i APRIL, BAFF (Slike 2B i Slike 4A 4B), što ih čini mogućim da se BCMA veže istovremeno za antitelo i za
2
prirodni ligand. APRIL i BAFF mogu da prenose signale korišćenjem drugih receptora, kao što su TACI i BAFF-R, i miševi sa uklonjenim genom za BCMA i dalje mogu da budu vijabilni. Prema tome, blokiranje APRIL i BAFF aktivnosti preko BCMA okluzije može da ne bude kritično toksično za MM pacijente.
Primer 7: Dizajn BCMB69 mutanata koji je zasnovan na strukturi
[0221] Računarske procene post-translacionih motiva modifikacije i rizika nakupljanja nevezanog BCMB69 varijabilnog domena otkriva srednji rizik izomerizacije za D101-G102 ostatke (CDR-H3) i 486 Å2 hidrofobni deo u CDR regionu koji može da predstavlja rizik za nakupljanje. Naviše izloženi hidrogobni ostaci u delu su 158 (CDR-H2), F35 (CDR-H1), i V104 (CDR-H3; V104 jw bio relevantan u Fv modelu homologije, ali ne u kristalnoj strukturi Fab). Da bi se uklonila izomerizacija i rizici od nakupljanja u varijabilnom domenu BCMB69, različite mutacije su racionalno dizajnirane (Tabela 7).
Tabela 7: Panel BCMB69 mutanata
(nastavak)
4
Sekvence CDR i VH i VL sekvence za BCMB69 mutante koji su zasnovani na strukturi prikazani su redom u Tabelama 8 i 9.
di) gra zau đen ezb obeje O N ID SEQ
anvantele (r ta nata u m B69
BCM
ce en v SekR CD
8: ela Tab
ak) av t (nas
Tabela 9: Vh i V1 sekvence BCMB69 mutanata
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
1
2
(nastavak)
[0222] Prema tome, pored BCMB69, 28 mutanata je eksprimirano i prečišćeno kao što se opisuje u Primeru 3 i karakterisano je za vezivanje za ćelije koje eksprimiraju BCMA protočnom citometrijom kao što se opisuje u Primeru 4. Sedam od 28 mutanata koji su vezani za ćelije koje eksprimiraju BCMA i pomereni su napred za svrhu dobijanja BCMA x CD3 bispecifičnog panela.
Primer 8: Dobijanje BCMA i CD3 Antitela u Bispecifičnom formatu u IgG4 S228P, L234A, L235A
[0223] BCMA antitela su eksprimirana kao IgG4, koja imaju zamene u Fc tipa S228P, L234A, i L235A (numerisanje prema EU indeksu). Monospecifično anti-CD3 antitelo CD3B19 je takođe dobijeno koje se sastoji iz teških i lakih lanaca koji imaju sekvence predstavljene u SEQ ID NO: 55 i SEQ ID NO: 56, redom.
[0224] Monospecifična antitela su prečišćena upotrebom standardnih postupaka kolone sa Proteinom A (HiTrap MabSelect SuRe kolona). Posle elucije, sakupljeni ostaci su dializirani na D-PBS, pH 7.2.
[0225] Bispecifična BCMA x CD3 antitela su dobijena kombinovanjem monospecifičnog CD3 mAt i monospecifičnog BCMA mAt in-vitro zamenom Fab kraja (kao što je opisano u WO2011/131746). Ukratko, oko 1-20 mg/mL u molarnom odnosu od 1:1 anti-BCMA/anti-CD3 antitela (ili u nekim slučajevima 6% viška jednog parentalnog antitela da bi se potrošilo drugo) u PBS, pH 7-7.4 i 75 mM 2-merkaptoetanolamin (2-MEA) su pomešani zajedno i inkubirani su na 31 °C. tokom 5 h, nakon čega sledi uklanjanje 2-MEA dializom, diaceđenjem, tangencijalnim protočnim ceđenjem i/ili ceđenjem okretanjem ćelija korišćenjem standardnih postupaka. Obrazovanje bispecifičnih BCMA x CD3 antitela je analizirano ili sa katjonskom izmenjivačkom (CEX) HPLC ili hromatografijom hidrofobnih interakcija (HIC) HPLC. Ukolko je poželjno, bispecifično BCMA x CD3 antitelo je doterano sa preparativnom CEX ili HIC da bi se uklonili preostali parental(nih)
[0226] Teški i Laki lanci za reprezentativna BCMA x CD3 bispecifična antitela su prikazani ispod u Tabeli 10. BCMB178 ima slabu ekspresiju kada se kombinuje sa CD3 krajem, i kao rezultat, nije dalje karakterisan.
Tabela 10. Sekvence Teškog i Lakog lanca za Bispecifična Antitela
4
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
1 (nastavak)
2 Primer 9: Određivanja afiniteta BCMA za BCMA antitela BCMA X CD3 bispecifična
[0227] Površinska Plazmonska Resonanca (SPR) je korišćena za merenje vrednosti afiniteta humanog BCMA antitela koja su specifična za BCMA korišćena su za dobijanje CD3 bispecifičnih. Protokol koji sledi za SPR je sličan onome koji se opisuje u Primeru 4. Rezultati koji su prikazani u Tabeli 11 ukazuju da su svi uzorci vezani za monomerni BCMA antigen sa afinitetima koji se razlikuju. Parentalno mAt (BCMB69) je imalo afinitete vezivanja od ∼ 1.4 nM BCMB117 i BCMB128 je imalo afinitete u opsegu BCMB69, pri čemu BCMB123, BCMB129, BCMB176 i BCMB177 su imali relativno slabije afinitete (3 do 15-puta) zbog većih stopa disocijacije. U cilju procene ponovljivosti podataka, svi uzorci se nanose najmanje u triplikatima triplicates i prijavljene su standardne devijacije.
Tabela 11. Afiniteti vezivanjna anti-BCMA mAt-a sa monomernim humanim BCMA pomoću
SPR
[0228] SPR se takođe koristi za merenje vrednosti afiniteta BCMA x CD3 bispecifičnih antitela za humano i cyno BCMA. Rezulltati u Tabeli 12 ukazuju da su svi uzorci vezani za Fc-BCMA antigene sa afinitetima koji se razlikuju. BC3B7 i BC3B9 su imali afinitete u opsegu BCMB72 za humani BCMA gde su preostala bispecifična imala 2-3 puta slabije afinitete kada se uporede sa BCMB72. Za cyno Fc-BCMA, BC3B7 i BC3B9 je imao 2-3 puta jače afinitete za BCMB72 (KD 0.65-0.37 nM, redom), gde su preostala mAt-a zadržala slično vezivanje kao BCMB72 (KD ∼0.8-1.2 nM). U cilju procene ponovljivosti podataka, svi uzorci se nanose najmanje u triplikatima triplicates i prijavljene su standardne devijacije.
Tabela 12. Afiniteti vezivanja BCMA x CD3 antitela za Fc-BCMA određeno sa SPR
[0229] Afiniteti vezivanja anti-BCMA x CD3 bispecifičnog antitela (BCMB72) sa Fc-spojenim BCMA proteinima (humanim, makak (cyno) i miš) su mereni sa Površinskom Plazmnoskom Rezonancom (SPR) upotrebom Biacore T200 sistema (GE Healthcare, NJ).
[0230] Ćelije iz protoka 2, 3 i 4 streptavidin-derivatizovanog senzorskog čipa (GE Healthcare, Prod# BR-1005-31) su imobilizovane sa biotinilovanim Fc-spojenim humanim, makaki ili mišjim BCMA, redom (nivoi imobilizovanog BCMA između 12-16 jedinica odgovora (RU); Fc-BCMA proteini: čovek (R&D Sistemi; Prod# 193-FC), makaki (interno (in-house); Kat# BCMW6.001) i mišjim (R&D Sistemi; Prod# 593-BC) su biotinilovani interno). Nijedan protein nije imobilizovan na protoku ćelije 1 i korišćen je kao referentna površina. Eksperimenti kinetika vezivanja su izvedeni na 25 °C u puferu koji se kreće (PBS pH 7.4, 0.005% P20, 3 mM EDTA). BCMB72 je dobijen u puferu koji se kreće sa početkom od 100 nM do 0.16 nM na 5-strukim razblaženjima. Ovi rastvori su ubrizgani tokom 5 min (faza vezivanja) na 50 µL/min i disocijacija je praćena tokom 15 min protočnim puferom. Površina čipa je regenerisana sa kratkim injekcijama glicina (pH 1.5) i protočnim puferom na 100 mL/min. Analize kinetika vezivanja interakcija BCMB72 sa Fc-BCMA je izvedena sa dvostrukim refernciranjem podataka oduzimanjem krivih koje su dobijene ubrizgavanjem pufera od referentno oduzetih krivih za injekcije analiza. Globalno uklapanje kinetika senzorgrama je izvedeno upotrebom modela vezivanja Dva-Stadijuma upotrebom Biacore T200 softvera za procenu (GE Healthcare, NJ).
4
Rezultati afiniteta vezivanja iz upotrebom modela vezivanja Dva-Stadijuma za različite BCMA vrste i prijavljeni su kao Prvi kompleks (KD1) i Finalni kompleks (KD) (Slika 5).
Primer 10: Ciljano-specifična T-ćelijska aktivacija i citotoksična potentnost BCMA x CD3 antitela u prisustvu imortalizovanih ćelijskih linija pozadine multiplog mijeloma
[0231] Aktivacija T-ćelija koja je posredovana sa BCMA x CD3 antitelima je procenjena. Ukratko, BCMB72 (BCMA x CD3) i kontrolna antitela (BCMA x null i null x CD3) su razblaženi do 800 µg/ml u PBS. Titracija je dobijena u 4-strukim serijskim razblaženjima u PBS u ploči da dnom oblika U sa 96 bunarića. Poslednja kolona je ostavljena samo kao PBS (kontrola nosača).
[0232] Ciljane ćelije su gajene u kulturi u RPMI 1640 medijumu bez antibiotika koji je dopunjen sa GlutaMAX, 10% FBS i 25mM HEPES (medijum kulture). U danu postavke (Dan 1), ciljne ćelije su izbrojane i 10 miliona ćelija je centrifugirano na 1350 oum tokom 3 minuta nakon čega, su supernatanti odliveni. CellTrace FCSE boja za proliferaciju je rekonstituisana u 18 µl sterilnog DMSO i 1 µl rastvora je razblažen u 10 ml sterilnog PBS. Ćelijske plelete su resuspendovane u 1 ml CFSE razblaženja i inkubirane su na sobnoj temperaturi 8 minuta sakrivene od direktnog svetla. Posle inkubacije, 1 ml HI FBS je dodat u ćelijsku suspenziju da bi se ugasio višak CFSE. Ćelije su dva puta isprane sa RPMI-1640 sa 10% FBS. Nakon rekonstitucije u 10 ml RPMI, ćelije su izbrojane i ćelijska vijabilnost je zabeležena u tabeli. Ćelije su razblažene do 2.2x10^5/ml i inkubirane su na 37°C do upotrebe.
[0233] Pan T ćelije iz normalnih donora su otopljene na 37°C u vodenom kupatilu, posle čega su sadržaji zamrznutih bočica preneti na 50-ml konusnih bočica i rekonstutuisani su sa 15 ml hladnog medijuma kulture. Ćelije su nakon toga centrifugirane na 1350 oum na 4°C tokom 3 minuta. Supernatanti su izliveni i ćelijske pelete su rekonstituisane sa 5 do 10 ml medijuma kulture. T ćelije su izbrojane i zabeležena je vijabilnost. Ćelije su zatim rekonstituisane u medijumu u kulturi do 1.1x10^6/ml.
[0234] 2x10^5 ciljnih ćelija je dodato u bunariće na ploču sa dnom oblika U sa 96 bunarića, nakon čega se dodaje Fc blokator (do finalne koncentracije 2mg/ml). Sve ćelijske linije su inkubirane na sobnoj temperaturi 10 minuta da bi se blokirala aktivnost Fc receptora. 1x10^5 T ćelija je dodato u bunariće (5:1 efektor:meta odnos). Nakon što su ciljne ćelije i T ćelije pomešane, 20 µl razblaženih BCMA x CD3 antitela je dodato u svaki bunarić. Ploče su inkubirane na 37°C sa 5% CO2tokom 48 h.
[0235] Dva dana kasnije, ploče su centrifugirane na 1350 oum tokom 3 minuta na 4°C i 100 µl supernatanta je preneto na odvojenu ploču i skladišteno je na -80°C za test oslobađanja citokina. Ćelije su isprane u 200 µl PBS i inkubirane su u 50 µl near-IR Live/Dead boje (1:200 razblaženje) i anti-CD25 PE antitelom (1:50 razblaženje) 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su jednom isprane u 200 µl FACS pufera i konačno su rekonstituisane u 150 µl FACS pufera. Ćelije su analizirane upotrebom FACSCanto II i FlowJo 7.6 za ciljanu citotoksičnost (% mete) i T ćelijsku aktivaciju CD25+ (% živih T ćelija). Predstavljanje grafikom i podešavanje podataka je urađeno u GraphPad Prism 6 korišćenjem ne-linearne regresije sa varijabilnom funkcijom nagiba (četiri parametra) upotrebom postupka najmanjih kvadrata.
[0236] Slika 8 pokazuje da BCMB72 promoviše konzistentnu ciljanu-specifičnu T ćelijsku aktivaciju, kao što je procenjeno sa pojačanom regulacijom CD25 na T ćelijskoj površini. Fc blokator je korišćen da bi se sprečilo vezivanje antitela koje zavisi od Fc receptora za ciljne ćelije. Generalno, tačke podataka su čvrsto poravnate duž dobijene krive uklapanja i bilo je malo razlika između donora T ćelija. Maksimalna aktivacija od 45 - 85% je postignuta za BCMA<+>ćelije i 4 -10 % (ekvivalentno sa pozadinskim nivoom) za BCMA-ćelije. Pregled EC50i maksimuma vrednosti T ćelijske aktivacije iz dva nezavisna eksperimenta upotrebom T ćelija iz brojnih normalnih donora je prikazana na Slici 9.
[0237] Slika 10 pokazuje da BCMB72 je imao konzistentno jaku citotoksičnost protiv BCMA<+>ćelijskih linija. Fc blokator je korišćen da bi se sprečilo vezivanje BCMB72 za ciljne ćelije koje zavisi od Fc receptora. Generalno, tačke podataka su čvrsto poravnate duž dobijene krive uklapanja bilo je malo razlika između donora T ćelija. Maksimalna liza 62 - 97% je postignuta za BCMA<+>ćelije i 4 -18 % za BCMA<->ćelije. Pregled EC50i maksimuma vrednosti lize iz dva nezavinsna eksperimenta upotrebom T ćelija iz brojnih normalnih donora je prikazana na Slici 11.
[0238] Drugih šest BCMA X CD3 antitela je pokazalo maksimalnu citotoksičnost 83 do 93% (Slika 12 A) i T ćelijsku aktivaciju u opsegu od 74 do 83% za BCMA<+>H929 ćelije upotrebom dva različita donora T ćelija (Slika 12B). Ovih šest molekula BCMA x CD3 antitela su potentni u ubijanju BCMA<+>ciljnih ćelija na vrednosti EC50koja je opsega od 0.04 do 0.09 nM
Primer 11: Efikasnost vezivanja BCMB72 na BCMA<+>ćelijskim linijama
[0239] Procenjene su EC50vrednosti za vezivanje BCMB72 sa različitim BCMA<+>ćelijskim linijama maligne pozadine. Ukratko, bispecifično antitelo BCMB72 (BCMA x CD3) je razblaženo do 750 µg/ml u PBS. Titracija je dobijena u 3-strukim serijskim razblaženjima u PBS u ploči sa dnom oblika U sa 96-bunarića. Poslednja kolona je ostavljena kao sam PBS (kontrola nosača). H929 ciljne ćelije su gajene u kulturi u RPMI 1640 medijumu koji je bez antibiotika koji je dopunjen sa GlutaMAX, 10% FBS i 25mM HEPES (medijum kulture). Za test, gustina ciljnih ćelija i vijabilnost su izmereni i ćelije su nakon toga centrifugirane na 1000 oum tokom 5 minuta na 4°C. Ćelijske pelete su nakon toga oprane u 10 ml PBS i ponovo su centrifugirane na 1000 oum tokom 5 minuta. Ćelije su resuspendovane u PBS na 5.5x105 ćelija/ml i 90 µl suspenzije ćelija je alikvotirano po bunariću ploče sa 96-bunarića U oblika dna, nakon čega sledi 10 µl/bunariću razblaženja BCMB72. Ploče su inkubirane na 4°C tokom 1 h u mraku, zatim su centrifugirane na 1000 oum tokom 5 minuta i supernatanti su odliveni. Ćelijske pelete su dva puta isprane u 200 µl FACS puferu. PE obeleženo sekundarno antitelo protiv humanog IgG4 Fc je razblaženo u FACS puferu na 1:25 i 50 µl miksa je dodato u odgovarajuće bunariće. Uzorci su inkubirani 20 minuta na 4°C, isprani su u FACS puferu kao što je gore opisano, i rekonstituisani su u 150 µl FACS pufera za analizu na FACSCanto II. Podaci su analizirani upotrebom FlowJo 7.6 za BCMB72 vezivanje i predstavljanje grafikom i podešavanje podataka je urađeno u GraphPad Prism 6 korišćenjem ne-linearne regresije sa varijabilnom funkcijom nagiba upotrebom postupka najmanjih kvadrata.
[0240] Kao što je uočeno na Slici 6, BCMB72 je sposoban da se veže za svaku od BCMA<+>ćelijskih linija koje se ispituju. EC50za vezivanje za H929 ćelije je bio 14.7 nM, prema MM 1R ćelijama je bio 9.74 nM, prema EJM ćelijama je bio 17.5 nM, prema LP1 ćelijama je bio 22.3 nM i prema U-2932 ćelijama je bio 7.92 nM.
Primer 12: Analiza ekspresije BCMA i vezivanja BCMB72 u ex vivo punoj krvi od normalnih humanih donora
[0241] Ekspresija BCMA i vezivanje BCMB72 na leukocitima je ispitano u ex vivo punoj krvi iz tri normalna humana donora. Ukratko, sveža krv sa periferije iz normalnih humanih donora je skladištena u epruvetama koje su obložene heparinom pre eksperimenta Krv je pipetirana na ploču sa 96-bunarića U-oblika dna u 100 µl alikvotama. Antitela za bojenje su dobijena u master miksu, kako je naznačeno u eksperimentalnoj tabeli Master miks se dodaje direktno u krv, zajedno sa antitelima koja su specifična za BCMA ili BCMB72. Posle 30 minutne inkubacije na sobnoj temperaturi, ploča sa krvlju je centrifugirana na 1350 oum tokom 3 minuta na 4°C. Supernatant plazme je odliven i pelete su bile podvrgnute četiri uzastopna kruga lize RBC, sa 5 minutnim inkubacijama između svakog ispiranja. Nakon što je liza kompletirana, pelete su jednom isprane sa PBS i nakon toga su obojene sa PBS sa 1:200 Živ/Mrtav near-IR bojom i 1:50 anti-IgG4 PE (samo za bunariće sa BCMB72). Ploče su dalje inkubirane tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Kasnije uzorci su isprani sa 200 µl FACS pufera i konačno su rekonstituisani u 150 µl FACS pufera za analizu na LSRFortessa. Približno 100,000 događaja je sakupljeno iz svakog bunarića. Analiza je sprovedena u FlowJo 7.6.
[0242] Kao što je prikazano na Slici 7, nije uočena ekspresija BMCA na limfocitima, monocitima, granulocitima ili plazmacitoidnim DC-a kod tri normalna donora. BCMB72 je pokazalo vezivanje za CD3<+>T ćelije u sva tri donora sa različitim intenzitetom između donora. BCMB72 se nije vezao za bilo koji drugi tip ćelije koja se ispituje u ovom testu.
Primer 13: BCMB72 efekat na profil citokina
[0243] Profil citokina u supernatantu iz testova za ubijanje koji su posredovani sa T ćelijama upotrebom BCMB72 i kontrolnim antitelima. T ćelije i antitela su zasejane kao test za ispitivanje citotoksičnosti koja je posredovana sa T-ćelijama (videti Primer 10). Posle inkubacije od 48 h, ćelijski supernatanti su sakupljeni i različiti citokini su (10/30 Plex) mereni upotrebom MSD zasnovane ELISA. Nivoi citokina su izraženi sa pg/mL i predstavljanje grafikom i podešavanje podataka je urađeno u GraphPad Prism 6 korišćenjem ne-linearne regresije sa varijabilnom funkcijom nagiba (četiri parametara). EC50vrednosti šest citokina iz RPMI8226 ćelijske linije upotrebom šest donora T ćelija i prikazani su na Slici 13. Podaci pokazuju značajno oslobađanje citokina koje je rezultat aktivacije T ćelije. Nisko/bez oslobađanja citokina se uočava sa kontrolim antitelima (podaci nisu prikazani).
Primer 14: Funkcionalno poređenje HEK- i CHO-proizvedenih BCMB72 (prolazne & stabilne ćelijske linije) u aktivaciji T-ćelija i ciljnog ubijanja ćelija koje je posredovano sa T-ćelijama
[0244] Bispecifična antitela koja su proizvedena u različitim ćelijama i pod različitim načinima eksprimiranja mogu da se razlikuju u aktivnosti. Prema tome, in vitro efikasnost BCMB72 proizvednih u HEK (prolazna ekspresija) ili CHO ćelijama (prolazna ili stabilna ekspresija) je procenjena.
[0245] BCMB72 je razblažen do 800 µg/ml u PBS. Kao što je naznačeno u svakom eksperimentu, titracija je dobijena ili u 3-strukim ili 4-strukim serijskim razblaženjima u PBS u ploči sa 96-bunarića sa U-oblikom dna. Poslednja kolona je ostavljena samo kao PBS (kontrola nosača).
[0246] H929 ciljane ćelije su gajene u kulturi u RPMI 1640 medijumu koji je bez antibiotika koji je dopunjen sa GlutaMAX, 10% FBS i 25mM HEPES (medijum kulture). U danu postavke (Dan 1), ciljne ćelije su izbrojane i 10 miliona ćelija je izbrojano na 1350 oum tokom 3 minuta nakon čega su supernatanti odliveni. CellTrace FCSE boja za proliferaciju je rekonstituisana u 18 µl sterilnog DMSO i 1 µl rastvora je razblažen u 10 ml sterilnog PBS. Ćelijske plelete H929 su resuspendovane u 1 ml CFSE razblaženja i inkubirane su na sobnoj temperaturi 8 minuta sakrivene od direktnog svetla. Posle inkubacije, 1 ml HI FBS je dodat u ćelijsku suspenziju da bi se ugasio višak CFSE. Ćelije su dva puta isprane sa RPMI-1640 sa 10% FBS. Nakon rekonstitucije u 10 ml RPMI, ćelije su izbrojane i ćelijska vijabilnost je zabeležena u tabeli. Ćelije su razblažene do naznačene koncentacije i inkubirane su na 37°C do upotrebe.
[0247] T ćelije iz normalnih donora su otopljene na 37°C u vodenom kupatilu, posle čega su sadržaji zamrznutih bočica preneti na 50-ml konusnih bočica i rekonstutuisani su sa 15 ml hladnog medijuma kulture. Ćelije su nakon toga centrifugirane na 1350 oum na 4°C tokom 3 minuta. Supernatanti su izliveni i ćelijske pelete su rekonstituisane sa 5 do 10 ml medijuma kulture. T ćelije su izbrojane i rekonstituisane u medijumu u kulturi do odgovarajuće koncentracije (pogledajte tabelu za svaki eksperiment).
[0248] H929 ćelije su dodate u bunariće, zatim se dodaju T ćelije (5:1 Efektor:Meta odnos). U ovoj postavci ispitivanja nije korišćen Fc blokator. Nakon što su ciljne ćelije i T ćelije pomešane 20 µl razblaženja BCMB72 je dodato u svaki bunarić. Ploče su inkubirane na 37°C sa 5% CO2tokom 48 h. Posle 2 dana ploče koje sadrže ćelije su centrifugirane i supernatanti su ili odliveni ili su skladišteni za ispitivanje oslobađanja citokina. Ćelije su isprane u 200 µl PBS i inkubirane su u 50 µl near-IR Živ/Mrtav boje (1:200 razblaženje) i anti-CD25 PE antitelu (1:50 razblaženje) tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su jednom isprane u 200 µl FACS pufera i finalno su rekonstituisane u 150 µl FACS pufera. Ćelije su ispitane protočnom citometrijom istog dana upotrebom FACSCanto II i analizirane su u FlowJo 7.6 za ciljanu citotoksičnost (% mete) i T ćelijsku aktivaciju CD25<+>(% živih T ćelija). Predstavljanje grafikom i podešavanje podataka je urađeno u GraphPad Prism 6 korišćenjem ne-linearne regresije sa varijabilnom funkcijom nagiba (četiri parametra) i postupka najmanjih kvadrata.
[0249] Kao što se uočava na Slici 14, BCMB72 proizveden u HEK ćelijama i oni koji su proizvedeni u CHO ćelijama izvode praktično identično u testu T ćelijskog preusmeravanja u terminima citotoksičnosti prema ciljnim ćelijama i stimulaciji prema T ćelijama. Maksimalno ubijanje od 85% i T ćelijska aktivacija od 80% su generalno postignuti. Srednje EC50vrednosti za citotoksičnost su bile 0.29 nM za BCMB72 koji je proizveden u HEK ćelijama i 0.42- 0.47 nM za BCMB72 koji je proizveden u CHO ćelijama. Srednje EC50vrednosti za aktivaciju T ćelija su bile 0.28 nM za BCMB72 koji je proizveden u HEK ćelijama i 0.37-0.41 nM za BCMB72 koji je proizveden u CHO ćelijama. Komparativna analiza upotrebom Studentovog T-testa nije pokazala značajnu statističku razliku između EC50vrednosti.
Primer 15: Aktivacija signalizacije P38 sa BCMB72
[0250] Oba, BAFF i APRIL se vezuju za dva receptora BCMA (antigen B ćelijiskog zrenja B, TNFRSF 17) i TACI (transmembranski aktivator i CAML interaktor, TNFRSF 13b). Angažovanje BCMA aktivira JNK i P38 MAPK signalni put. Moguće je da BCMA X CD3 bispecifično antitelo, BCMB72, može da ispolji agonstički efekat prema BCMA. Ovo ispitivanje uključuje dva dela.1. Razvijanje jednostavnog testa western analize da bi se pratile P38a MAPK promene u H929 ili MM1.R ćelijama posle tretmana sa APRIL ili BAFF. 2. Upotreba novorazvijenog testa da se proveri da li BCMB72 ima bilo koji agonstički efekat prema BCMA.
Ćelijski tretman
[0251] H929 ili MM1.R ćelije su zasejane na 1.5e6/ml u RPMI medijumu oslobođenom od seruma tokom 24 h na 37°C u prisustvu 5% CO2pre tretmana. U danu izvođenja eksperimenta, ćelije su oborene i resuspendovane su u RPMI bez seruma na 1.5e6/ml. Tokom vremena trajanja testa, čelije su alikvotirane u 5 ml po epruveti za 10 epruveta. Svaka epruveta ćelija je tretirana sa 1000 ng/ml APRIL (R&D Sistemi kat#5860-AP-010) ili 1000ng/ml BAFF (R&D Sistemi kat#2149- BF-010) tokom 0, 5, 15, 30 i 60 min, redom na 37°C u prisustvu 5% CO2. Posle inkubacije, ćelije su odmah peletirane i zamrznute su na -80°C za dobijanje ćelijskog lizata. Za test kojim se ispituje efekat agonista BCMB72, grupe H929 ćelijskog tretmana su navedene u Tabeli 13. Test kojim se ispituje efekat agonista BCMB72 je sproveden dva puta.
Tabela 13. Grupe tretmana za Test kojim se ispituje efekat agonista BCMB72
Dobijanje ćelijskog lizata za Simple Western analizu
[0252] Ćelije su lizirane se RIPA puferom, koji sadrži fosfatazu i proteazne inhibitore. Koncentracija proteina je merena na SpectraMax Plus 384 mikročitaču ploča (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) upotrebom BioRad DC Proteinskog Testa (BioRad # 500-0112) i standarda albumina iz goveđeg serima.
Simple Western analiza
[0253] Simple Western analize se izvode sa Wes-Rabbit (12-230 KDa) Master kompletom (ProteinSimple # PSMK01) prema ProteinSimple uputstvu za korišćenje. Ukratko, uzorci ćelijskog lizata su pomešani sa master miksom do finalne koncentracije od 1x pufer uzorka, 1x fluorescentni obeleživači molekularnih masa, i 40 mM ditiotreitol (DTT) i zatim se zagrevaju na 95 °C tokom 5 min. Uzorci, reagensi za blokiranje, primarna antitela fosfor-p38 MAPK (ThermoFisher: VWR# MA5-15182) ili Aktin-beta (Cell Signaling, # 8457S), HRP-konjugovana sekundarna antitela, hemiluminiscentni supstrat, i matrice za razdvajanje i slaganje su takođe raspršeni u naznačene bunariće u Simple Wes mikroploče, Posle nalivanja na ploče, koraci razdvajanja elektroforezom i imunodetekcija se dešavaju u kapilarnom sistemu i u potpunosti su automatizovani. Tokom elektroforeze, proteini su razdvojeni na osnovu molekularne težine na osnovu matrica za slaganje i razdvajanje i imobilizovani su na kapilarnom zidu upotrebom vlasničke fotokaktivirane hemije hvatanja. Primarna antiteka su razblažena 1:50 sa razblaživačem antitela II (ProteinSimple #042-203). Ciljni proteini su imunotestirani sa primarnim antitelima 60 min, zatim sa HRP-konjugovanim sekundarnim antitelima. Simonsimple Western analiza je izvedena na sobnoj temperaturi, i korišćena su podrazumevana podešavanja instrumenta. Digitalna slika je analizirana sa Compass softverom (ProteinSimple), i kvantifikovani podaci detektovanog proteina su su prijavljeni kao molekulska težina, signal/intenzitet pika, i površina pika.
Rezultati
[0254] Na osnovu informacije koja je dobijena tokom trajanja ovog ispitivanja, izveden je test BCMB72 agonista sa H929 ćelijama upotrebom 15 min inkubacije krajnje tačke p38 MAPK signali su normalizovani sa signalima humanog beta Aktina. Srednja vrednost normalizovanih p38 MAPK signala iz dva testa je prikazana na Slici 15. Test BCMB72 agoniste je pokazao da BCMB72 nema agonistički efekat prema BCMA u H929 ćelijama.
Primer 16: NFκB signalizacija sa BCMB72
[0255] BCMA je površinski receptor koji pokreće NF-κB signalizaciju u odgovoru na endogene ligande. Efekat vezivanja BCMB72 na BCMA u aktivaciji NF-κB puta je procenjen upotrebom reporterske ćelijske linije koja eksprimira BCMA koja eksprimira alkalnu fosfatazu (SEAP) pod NFκB promotorom.
[0256] Ćelije su gajene u kulturi u DMEM medijumu koji je dopunjen sa GlutaMAX i 10% FBS (medijum kulture). Uveče pre nego što su ćelije eksperimenta sakupljene tripsinizacijom (5 minuta u prethodno zagrejanom 0.25% Tripsinu na 37°C) i isprane su u 30 ml medijuma kulture. Ćelije su zatim centrifugirane na 1,000 oum tokom 5 minuta na 4°C i rekonstituisane su u DMEM bez seruma (sa GlutaMax) na 2.5x10^5 ćelija/ml. 5x10^4 ćelija je dodato u bunariće sa ravnim dnom u ploču sa 96 bunarića i inkubirani su na 37°C tokom 16 h.
[0257] Sledećeg jutra, različiti stimulatorni reagensi (TNFα, APRIL, BCMB72) su dodati u odgovarajuće bunariće (videti eksperimentalne mape ploča) i ploče su inkubirane na 37°C dodatnih 16 h, 24 h ili 48 h, koji predstavljaju rane, srednje i kasne vremenske tačke signalizacije, redom. Posle svake vremenske tačke, 10 µl kondicioniranog medijuma kulture je sakupljeno iz bunarića, preneto na čvrstu ploču sa 96-bunarića koja je obezbeđena u SEAP kompletu (Cayman, 600272), i pokrivena je sa poklopcem. SEAP standardi su dobijeni rastvaranjem glavnog standardna (5 U/ml) 1:10 u DMEM bez seruma (with GlutaMax) i nakon toga pripremanjem 1:2 serijskih razblaženja; opseg razblaženja je 50-0.78 mU/ml. Ploča sa uzorcima je inkubirana na 65°C tokom 30 minuta da bi se inaktivirala endogena alkalna fosfataza; SEAP eksprimiran u ovom testu je stabilan pod ovim uslovima za inkubiranje.10 µl standardnih razblaženja su dodati u odgovarajuće bunariće nakon čega su ploče inkubirane na sobnoj temperaturi. 50 µl rastvora supstrata je dodato u svaki bunarić i uzorci su blago mešani da bi se rastvor rasporedio u bunarićima. Uzorci su inkubirani 20-30 minuta i hemiluminiscencija je ispitana upotrebom PerkinElmer EnVision 2104 Multilabel Čitača. Sva očitavanja luminiscenicije su prevedene u aktivnost jedničnih koncentracija na osnovu standardne krive i vrednosti su analizirane u Microsoft Excel 2010 i unete su u Graph Prism 6 za grafičku analizu.
[0258] Slika 16 pokazuje da gde je APRIL sposoban da stimuliše BCMA na koncentracijama kao što su niske 0.46 nM, generalno, BCMB72 ne aktivira put NF-κB kod ćelija koje su transdukovane sa BCMA u koncentracijama koje su ispod 10 nM Umerena aktivacija koja je zavina od BCMB72-je uočena na visokim (44-133 nM) BCMB72 koncentracijama.
Primer 17: Efekat egzogenog davanja vanćelijskog domena BCMA na aktivaciju T ćelija u odsustvu ciljnih ćelija
[0259] Vanćelijski domen BCMA (ECD) može da obrazuje trimere u rastvoru. Prema tome, postoji mogućnost da višestruka bispecifična antitela mogu da se vežu za BCMA ECD trimere i unakrsno povezuju TCR komplekse u odsustvu ciljnih ćelija. Ovo sa druge strane može da aktivira T ćelije na način koji ne zavisi od mete. Ova studija je ispitivala da li egzogeno dodat ECD BCMA može da pokrene T ćelijsku aktivaciju na nivou ekspresije CD25 bez interakcije sa ciljnim ćelijama.
[0260] BCMB72 (BCMA x CD3) i kontrola (null x CD3) su razblaženi do 800 µg/ml u PBS. Titracija je dobijena u 3-strukim serijskim razblaženjima u PBS u ploči sa 96-bunarića sa U oblikom dna. Poslednja kolona je ostavljena kao samo PBS (kontrola nosača).
[0261] Rastvorljivi BCMA ECD (sBCMA) je razblažen do 36 µg/ml (6.67 µM) u PBS. Titracija je dobijena u 3-strukim serijskim razblaženjima u PBS u ploči sa 96-bunarića sa U oblikom dna. Bunarić na vrhu je ostavljen kao sam PBS (kontrola nosača).
[0262] Pan T ćelije iz normalnih donora su otopljene na 37°C u vodenom kupatilu, nakon čega su sadržaji zamrznutih bočica preneti na 50-ml konusnih bočica i rekonstutuisani su sa 30 ml hladnog medijuma kulture. Ćelije su nakon toga centrifugirane na 1350 oum na 4°C tokom 3
1
minuta. Supernatanti su izliveni i ćelijske pelete su rekonstituisane sa 5 do 10 ml medijuma kulture. T ćelije su izbrojane i vijabilnost je zabeležena. Ćelije su rekonstituisane u medijumu u kulturi do 0.525x10^/ml.
[0263] 1x10^5 T ćelija (190 µl) je dodato u bunariće, zatim se dodaje 5 µl razblaženih sBCMA i 5 µl razblaženih BCMB72. Ploče su inkubirane na 37°C sa 5% CO2tokom 48 h.
[0264] Posle dva dana, ploče su centrifugirane na 1500 oum tokom 3 minuta na 4°C i supernatanti su odliveni. Ćelijske pelete su isprane u 200 µl PBS i inkubirane su u 50 µl near-IR Live/Dead boje (1:200 razblaženje) i anti-CD25 PE antitelu (1:50 razblaženje) tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su isprane jednom u 200 µl FACS puferu i konačno su rekonstituisane u 150 µl FACS puferu. Ćelije su analizirane upotrebom FACSCanto II i FlowJo 7.6 za T ćelijsku aktivaciju CD25<+>(% živih T ćelija). Predstavljanje grafikom i uklapanje podataka je urađeno u GraphPad Prism 6 upotrebom nelinearne regresije sa postupkom uklapanja najmanjih kvadrata.
[0265] T ćelije iz normalih donora nisu ispoljile sBCMA ECD-posredovanu aktivaciju u prisustvu BCMB72. Slaba aktivacija malog procenta T ćelija (10-15%) je uočena na visokim koncentracijama (>40 nM) BCMB72 u sBCMA-zavisnom načinu (Slika 17).
Primer 18: Efekat rastvorljivog ECD BCMA, APRIL, i BAFF na T ćelijsku aktivaciju i BCMB72-zavisnu citotoksičnost
[0266] Rastvorljivi BCMA ECD može da služi kao „sink“ za BCMA x CD3 antitela, dok APRIL i BAFF mogu da budu kompetitivni inhibitori interakcije između površinskog receptora i BCMA x CD3 antitela. Efekti rastvorljivog BCMA ECD i endogenog liganda APRIL i BAFF na in vitro citotoksični potencijal BCMB72-zavisnog ćelijskog ubijanja su procenjeni u testovima T ćelijskog preusmeravanja upotrebom imortalizovane ćelijske linije H929 i pan T ćelija iz normalnog donora M7077.
[0267] BCMB72 je razblažen do 800 µg/ml u PBS. Tiracija je pripremljena u 3-strukim serijskim razblaženjima u PBS u ploči sa dnom oblika sa 96 bunarića. Poslednja kolona je ostavljena samo kao PBS (kolona nosača). Rastvorljivi BCMA ECD je razblažen do 9 µg/ml i APRIL i BAFF su razblaženi do 10 µg/ml. Titracije za oba reagensa su pripremljene u 3-strukim serijskim razblaženjima u PBS u ploči sa U dno koja sadrži 96 bunarića.
[0268] H929 ciljane ćelije su gajene u kulturi u RPMI 1640 medijumu bez antibiotika koji je dopunjen sa GlutaMAX, 10% FBS i 25mM HEPES (medijum kulture). U danu postavke (Dan 1), ciljne ćelije su izbrojane i 10 miliona ćelija je centrifugirano na na 1350 oum tokom 3 minuta nakon čega, su supernatanti odliveni. CellTrace FCSE boja za proliferaciju je rekonstituisana u 18 µl sterilnog DMSO i 1 µl rastvora je razblažen u 10 ml sterilnog PBS. Ćelijske plelete su resuspendovane u 1 ml CFSE razblaženja i inkubirane su na sobnoj temperaturi 8 minuta sakrivene od direktnog svetla. Posle inkubacije, 1 ml HI FBS je dodat u ćelijsku suspenziju da bi se ugasio višak CFSE. Ćelije su dva puta isprane sa RPMI-1640 sa 10% FBS. Nakon rekonstitucije u 10 ml RPMI, ćelije su izbrojane i ćelijska vijabilnost je zabeležena u tabeli. Ćelije su razblažene do 2.2x10^5/ml i inkubirane su na 37°C do upotrebe.
2
[0269] Pan T ćelije iz normalnog donora su otopljene na 37°C u vodenom kupatilu, nakon lega su sadržaji smrznutih pločica preneti na 50-ml konusnih bočica i rekonstutuisani su sa 30 ml hladnog medijuma kulture. Ćelije su nakon toga centrifugirane na 1350 oum na 4°C tokom 3 minuta. Supernatanti su izliveni i ćelijske pelete su rekonstituisane sa 5 do 10 ml medijuma kulture. T ćelije su izbrojane i zabeležena je vijabilnost. Ćelije su zatim rekonstituisane u medijumu u kulturi do 1.1x10^/ml.
[0270] 2x10^5 H929 je dodato u bunariće na ploči sa U dnom sa 96-bunarića; inkubacija sa Fc blokatorom nije bila potrebna u ovom ispitivanju. 1x10^5 T ćelija je dodato u bunariće (5:1 Efector: Meta odnos). Posle mešanja meta i T ćelija, 20 µl ili sBCMA, APRIL ili BAFF su dodati u bunariće nakon čega slede razblaženja sa 5 µl antitela. Ploče su inkubirane na 37°C sa 5% CO2tokom 48 h.
[0271] Posle 2 dana, ploče su centrifugirane na 1500 oum tokom 3 minuta na 4°C i supernatanti su odliveni. Ćelije su isprane u 200 µl PBS i inkubirane su u 50 ml of near-IR Live/Dead boji (1:200 razblaženje) i anti-CD25 PE antitelu (1:50 razblaženje) tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su isprane jednom sa 200 µl FACS pufera i konačno su rekonstituosane u 150 µl FACS pufera. Ćelije su analizirane upotrebom FACSCanto II i FlowJo 7.6 za ciljanu citotoksičnost (% mete) i T ćelijsku aktivaciju CD25<+>(% živih T ćelija). Predstavljanje grafikom i uklapanje podataka je izvedeno u GraphPad Prism 6 upotrebom nelinearne regresije sa varijabilnom funkcijom nagiba (četiri parametra) upotrebom postupka najmanjih kvadrata.
[0272] BCMB72 je sposoban da ispolji citotoksičnost na H929 ćelijama u prisustvu rastvorljivog BCMA ECD, sa samo manjim efektom (2-struko povećanje) na EC50na većim dozama (>160 nM) sBCMA ECD; T ćelijska aktivacija je slično pogođena (videti Slike 18A i 18D). APRIL povećanje EC50vrednosti za ćelijsku citotoksičnost i T ćelijsku aktivaciju šest puta na visokim dozama (46 nM), dok minimalno ima uticaja na test na nižim dozama (videti Sliku 18B i 18E). Maksimalno ubijanje nije pogođeno sa sBCMA ili APRIL. Suprotno tome, egzogeni BAFF nije imao uticaj na BCMB72-posredovanu citotoksičnost na koncentracijama do 51 nM (videti Sliku 18C). Potencijal T ćelijske aktivacije u svim slučajevima je bio u dobroj korelaciji sa podacima za ubijanje, kao što je očekivano (videti Sliku 18F).
Primer 19: Kompeticija BCMB72, APRIL i BAFF za vezivanje za BCMA in vitro
[0273] Dva TNF liganda, APRIL i BAFF mogu da se vežu za BCMA i da indukuju signalnu kaskadu koja dovodi do ćelijskog preživljavanja i proliferacije. Vanćelijski domen BCMA je kratki fragment od 54 aminokiseline koji se vezuje za ova dva liganda kao i antitela koja su pokrenuta protiv ovog motiva. Ovde se ispituje kompetitivna priroda ovih liganada protiv BCMB72.
[0274] Test je postavljen u formatu koji se zasniva na ELISA U pripremi za kompetitivni test, BCMA-Fc je obeležen sa MSD SulfoTag.50ug bočice BCMA-Fc je rekonstitisano u 500uL PBS da se dobije prinost 0.1g/mL (3.125uM monomer). 150nmol NHS-sulfoTag je razblažen u 50uL vode da se dobije 3mM rastvor. 5.2uL 3mM NHS-SulfoTag (15.6nmol) je dodato u 500uL BCMA-Fc (1.56nmol monomer) za 10x višak za reakciju obeležavanja. Reakcija je ostavljena 2h na RT u mraku.50uL 1M tris je dodat da bi se ugasila NHS koja nije izreagovala. Višak Sulfotag i tris su uklonjeni zamenom pufera sa PBS koji je ekvilibrisan 2mL 7k MWCO Zeba spin kolonom Konačna zapremina je bila ∼30uL, prema tome, finalni SulfoTag- BCMA-Fc je korišćen kao 2.5uM.
[0275] Za kompetitivni test, anti-BAFF (100ug) i anti-APRIL (100ug) su rekonstituisani u 200uL PBS da se dobije 0.5mg/mL štok rastvora.30uL (6ug) anti-APRIL i anti-BAFF su svaki razblaženi u in 2.97mL PBS da se dobije 2ug/mL rastvora. U svaki bunarić MSD ploče sa visokim vezivanjem sa 96 bunarića, 25uL 2ug/mL anti-APRIL was added. To every well of a second 96 well MSD high bind plate, dodaje se 25uL 2ug/mL anti-BAFF. Ploče su držane na 4C preko noći da bi se antitela imobilizovala. Ploče koje su obložene sa anti-APRIL i anti-BAFF su bačene i dodaje se 300uL/bunariću SuperBlock. Posle 1h blokiranja na RT, ploče su isprane 3x sa PBS-T. 10ug svakog rekombinantog APRIL i BAFF su resuspendovani u 100uL PBS da se dobije 0.1g/mL rastvora. 3mL 2ug/mL rastvora svakog APRIL i BAFF su dobijeni razblaživanjem 60uL sveže rekonstituisanog proteina u 2.94mL SuperBlock.25uL 2ug/mL APRIL je dodato u svaki bunarić anti-APRIL obložene ploče, i 25uL 2ug/mL BAFF je dodato u svaki bunarić anti-BAFF obložene ploče. Posle 1h držanja na RT, ploče su isprane sa 3x sa PBS-T. 500ug anti-BCMA (R&D Sys Mab193) je rekonstituisan sa 1mL PBS da se dobije štok rastvora od 0.5mg/mL (3.3uM). Anti-BCMA Mab193, BCMB72.004, i kontrolno antitelo (null x CD3), su razblaženi do 1uM u superbloku. 11pt trostruke serije serijskih razblaženja su dobijene mešanjem 100uL antitela u 200uL SuperBlock. 6mL 30nM SulfoTag-BCMA-FC je dobijen razblaživanjem 72uL proteina koji je gore naveden u 5.928mL SuperBlock. 25uL svakog antitela iz koraka 11 se dodaje u svaki bunarić ploča koje su obložene sa APRIL/BAFF prema mapi ploče ispod na slici 1. 25uL 30nM Sulfotag-BCMA-Fc je dodat u svaki bunarić na obe ploče. Posle 1h na RT, ploče su isprane 3x sa PBS-T.150uL 1x MSD pufera za čitanje T je dodato u svaki bunarić, i ploče su skenirane u sektoru 6000 skenera. Eksperiment je ponovljen tačno kako je gore opisano da bi se dobio drugi nezavisni set rezultata.
[0276] Kao može da se vidi na Slici 19, kada se inkubira sa rastućim količinama BCMB72 ali ne sa kontrolnim antitelom (null x CD3), BCMA-Fc je sprečen od vezivanja za APRIL BAFF i koji su vezani za ploču. Posmatranje je konzistentno između dva nezavisna eksperimenta, svaki sa tri replikata.
Primr 20: Vezivanje BCMB72 i citotoksičnost CD138 pozitivnih ćelija kosne srži kod pacijenta sa multiplim mijelomom.
[0277] Da bi se ispitala potentnost BCMB72 u primarnim uzrorcima iz pacijenata koji boluju od multiplog mijeloma, ispitali smo ovo antitelo u testu citotoksičnog ubijanja upotrebom zamrznutih uzoraka kosne srži multiplog mijeloma iz 5 pacijenata i T ćelija iz zdravih donora. Takođe su mereni vezivanje antitela i potencijal T ćelijske aktivacije.
Test vezivanja BCMB72
[0278] 100 µl ćelijske suspenzije je alikvotirano po bunariću u ploči sa 96 bunarića sa U-oblikom dna, nakon čega se dodaje 95 µl medijuma za kulturu. Zatim je 5 µl serijskih razblaženja BCMB72 ili kontrola dodato u bunariće i ploča je inkubirana 1 h na 4°C. Posle bojenja, ćelije su centrifugirane na 1,200 oum tokom 3 minuta i jednom su isprane sa 200 µl PBS. Ćelije su još jednom centrifugirane; supernatanti su odliveni, nakon čega su pelete rekonstituisane u 50 µl near IR Live/Dead boje (1:200 razblaženje), anti-humanom IgG4 Fc PE
4
antitelu (1:50 razblaženje), anti-CD138 (MI151:50 i DL-1011:50 razblaženja) i inkubirane su 20 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Ćelije su zatim centrifugirane i isprane sa 200 µl FACS pufera i konačno su rekonstituisane u 150 µl FACS pufera. Uzorci su analizirani upotrebom FACSCanto II i FlowJo 7.6 za intenzitet vezivanja BCMB72 na CD138<+>MNCs. Uklapanje podataka je spovedeno u GraphPad Prism 6 upotrebom ne-linearne regresije sa varijabilnom funkcijom nagiba (četiri parametra) upotrebom postupka najmanjih kvadrata.
Test preusmeravanja T ćelije
[0279] 1x10^5 ciljne su dodate u bunariće ploče sa 96-bunarića sa pločom U oblika dna, koga prate 1x10^5 T ćelije (5:1 Efektor: Meta približni odnosi, obezbeđuje srednju vrednost 20% broja plazma ćelija u mast ćelijama koje su poreklom iz koštane srži). Nakon što su pomešane ciljne ćelije i T ćelije, 5 µl razblaženja BCMB72 je dodato u svaki bunarić. Ploče su inkubirane na 37°C sa 5% CO2u trajanju od 48 h.
[0280] Dva dana kasnije, ploče su centrifugirane i supernatanti su odliveni. Ćelije su isprane u 200 µl PBS i inkubirane su u 50 µl PBS with near-IR Live/Dead boji (1:200 razblaženje), anti-CD138 (MI151:50 i DL-1011:50 razblaženja), anti-TCR alii (1:50 razblaženje) i anti-CD25 PE (1:50 razblaženje) tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim, ćelije su jednom isprane u 200 µl FACS pufera i finalno su rekonstituisane u 150 µl FACS pufera. Ćelije su analizirane upotrebom FACSCanto II i FlowJo 7.6 za citotoksičnost plazma ćelija (% mrtvih CD138<+>ćelija) i za aktivaciju T ćelija CD25<+>(% procenat živih T ćelija). Predstavljanje grafikom i uklapanje podataka je izvedeno u GraphPad Prism 6 upotrebom ne-linearne regresije sa varijabilnom funkcijom nagiba (četiri parametra) upotrebom postupka najmanjih kvadrata.
Rezultati
[0281] Slika 20 pokazuje da se BCMB72 vezuje i indukuje ubijanje svih uzoraka pacijenta na način koji zavisi od doze posle 48 h kao što je dokazano gubitkom CD138<+>plazma ćelija. Podaci za aktivaciju T ćelije su u korelaciji sa podacima ubijanja kao što je očekitvano. Srednja EC50za T ćelijsku aktivaciju je bila u 1 nM opsegu. Ovi podaci potvrđuju sa BCMB72 može da ubije primarne ćelije multiplog mijeloma kostne srži in vitro.
Primer 21: Anti-Tumorska Efikasnost BCMB72 u prevenciji tumorogeneze H929 Humanih ksenografta multiplog mijeloma u PBMC-Humanizovanim NSG Miševima
[0282] Ova studija je ispitala efikasnost BCMB72 u sprečavanju tumorogeneze H929 humanih multiple mijeloma (MM) ksenografta kod PBMC (mononuklearnih ćelija iz periferne krvi)-humanizovanih NSG (NOD SCID Gamma) miševa. NSG miš je imunokompromitovan soj kome nedostaju zrele funkcionalne T, B i ćelije prirodne ubice (NK). Uparenim po starosti ženkama NSG miševa je intravenozno ubrizgano 1 x 10<7>humanih PBMC u danu ispitivanja -7. U danu 1 posle inokulacije PBMC, svaki miš je subkutanozno implantiran sa (sc) H929 ćelijama humanog MM (5 x 10<6>ćelije u 200 µL PBS) na desnom zadnjem leđnom boku, nakon čega je sledilo intravenozno davanje (IV) PBS i BCMB720.1 µg (0.005 mg/kg), 0.5 µg (0.025 mg/kg) i 1 µg (0.05 mg/kg) po životinji. PBS kontrola i BCMB72 su davani svakog drugog danas ili svaka tri dana za ukupno pet tretmana. H929 sc tumori su bili detektabilni u PBS i 0.1 µg BCMB72 tretiranim grupama već 8 dana nakon implantiranja tumorske ćelije. Tumori iz ove dve grupe su nastavili da rastu sve dok srednje vrednosti zapremine tumora nisu bile >500 mm<3>u danu 22. Do dana 24, srednja vrednost zapremine tumora u PBS kontrolnoj grupi je prešla preko 1000 mm<3>. Zanimljivo, sc H929 tumori nisu rasli kod miševa koji su bili tretirani sa 0.5 µg i 1 µg BCMB72 (Slika 21). Prema tome, BCMB72 inhibira tumorogenezu H929 ksenografta humanog MM kod svih životinja koje su tretirane sa 0.5 i 1 µg/animal.
Primer 22: Kvantifikovanje rastvorljivog BCMA u mišjem serumu od H929 (ćelije humanog multiplog mijeloma) ksenografta kod PBMC-Humanizovanih NSG Miševa tretiranih sa BCMB72
[0283] Ovo ispitivanje je dizajnirano da bi se kvantifikovali nivoi rastvorljivog BMCA u serumu iz H929 ksenografta miševa i da bi se postavila korelacija nivoa rastvoljivog BCMA sa tumorskim opterećenjem kod ovih životinja.
[0284] Ukratko, serumi iz ispitivanja uzoraka ksenografta su analizirani sa BCMA enzimomvezanim imunosorbetnim testom (ELISA), koji je dobijen od R&D Sistema. Serum je otopljen i razblažen je sa 1:50 u reagensu razbleživaču i inkubiran je preko noći na 4° C. BCMA ELISA was je izvedena u skladu sa protokolom proizvođača. ELISA ploče su analizirane upotrebom MD SpectraMax čitača za ploče M5 (Molecular Devices, Sunnyvale CA) koji je podešen na 450 nm. Svaki bunarić u ELISA odgovara serumu iz jednog miša u originalnom ispitivanju ksenografta.
[0285] Postoji značajno smanje koncentracije rastvorljivog BCMA u mišjem serumu kod miševa koji su tretirani sa 1 µg i 0.5 µg BCMB72 kada se uporede sa samim PBS ili BCMB72 na 0.1 µg/miševima (Slika 22). Ovi podaci podržavaju ispitivanje ksenografta, gde su miševi tretirani sa 1 µg i 0.5 µg BCMB72 nisu imali ili su imali minimalni tumorski rast. Ovi podaci ukazuju da bi rastvorljivi BCMA u uzorcima seruma mogao da bude značajan kao potencijalni biomarker za procenu indikacije multiplog mijeloma; ispitovanje rastvorljivog BCMA moglo bi da bude od pomoći u praćenju opterećenjem bolesti.
Kratak opis liste sekvenci
[0286]
(nastavak)
(nastavak)
(nastavak)
1
11
(nastavak)
12
(nastavak)
1
(nastavak)
14
(nastavak)
1
(nastavak)
1
1 (nastavak)
(nastavak)
1
(nastavak)
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14
14
14
14
��
��
14
�
11
12
1
14
1
�
1
�
�
11
��
14
�
�
1
�
1
12
�
��
1
�
�
1
�
1
11
12
�
14

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Rekombinantno antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se imunospecifično vezuje za BCMA, pri čemu antitelo ima teški lanac i laki lanac, pomenuti teški lanac se sastoji iz:
a. regiona 1 za određivanje komplementarnosti teškog lanca (CDR1) koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 6;
b. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 7, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 6;
c. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 19;
d. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 4, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 8, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 6;
e. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 13, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 5, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 19; ili
f. CDR1 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 13, CDR2 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 8, i CDR3 teškog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 19, pri čemu se pomenuto antitelo dalje sastoji iz CDR1 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 24, CDR2 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 25, i CDR3 lakog lanca koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 26.
2. Antitelo, ili fragment za vezivanje antigena, prema zahtevu 1, pri čemu težak lanac antitela pod (a) se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 27; težak lanac antitela pod (a) se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 57; težak lanac antitela pod (c) se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 39; težak lanac antitela pod (d) se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 40; ili težak lanac antitela pod (e) se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 58.
3. Antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema zahtevu 2, pri čemu laki lanac antitela e sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena uSEQ ID NO: 28.
4. Antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 3 pri čemu:
i) antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena se vezuje za vanćelijski domen čovekog BCMA;
ii) antitelo ili fragment za vezivanje antigena je humano antitelo ili fragment za vezivanje antigena;
iii) fragment za vezivanje antigena je Fab fragment, Fab2 fragment, ili jednolančano antitelo;
iv) antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena inhibira interakciju BCMA i APRIL, kao što gde antitelo ili fragment za vezivanje antigena ispoljava IC50za interakciju BCMA i APRIL od oko 5.9 nM kao što je mereno sa ELISA;
v) antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena je IgG;
vi) antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena je IgG4 izotipa, na primer pri čemu IgG4 ima S228P zamenu, L234A zamenu i L235A zamenu u njegovom Fc regionu;
vii) antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena imunospecifično vezuje humani BCMA i ukršteno reaguje sa BCMA makaki majmuna;
viii) antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena vezuje BCMA na površini humanih ćelija mijeloma; i/ili
ix) antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena vezuje BCMA na površini humanih ćelija multiplog mijeloma.
5. Rekombinantna ćelija koja eksprimira antitelo ili fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od zahteva 1 do 4, opciono pri čemu je ćelija hibridom ili je antitelo rekombinantno proizvedeno.
6. Rekombinantno BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov BCMA x CD3 bispecifičan fragment koji se sastoji iz:
a) prvog teškog lanca (HC1);
b) drugog teškog lanca (HC2);
c) prvog lakog lanca (LC1); i
d) drugog lakog lanca (LC2),
pri čemu je HC1 povezan sa LC1 i HC2 je povezan sa LC2 i pri čemu HC1 sadrži SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, i SEQ ID NO: 61 kao CDR1-3 teškog lanca redom, i LC1 sadrži SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, i SEQ ID NO: 64 kao CDR1-3 lakog lanca redom, da bi se obrazovalo prvo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje CD3 i pri čemu HC2 sadrži SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, i SEQ ID NO: 6 kao CDR1-3 teškog lanca redom, i LC2 sadrži SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, i SEQ ID NO: 26 kao CDR1-3 lakog lanca redom, da bi se obrazovalo drugo mesto za vezivanje antigena koje imunospecifično vezuje BCMA.
1
7. Rekombinantno BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili njegov fragment prema zahtevu 6 koji se sastoji iz HC1 koji sadrži SEQ ID NO: 55, LC1 koji sadrži SEQ ID NO: 56, HC2 koji sadrži SEQ ID NO: 65, i LC2 koji sadrži SEQ ID NO: 76, kao što je pri čemu, antitelo ili bispecifičan fragment za vezivanje je IgG.
8. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifičan fragment za vezivanje prema zahtevu 6 ili zahtevu 7 pri čemu antitelo ili bispecifičan fragment za vezivanje:
i) je IgG4 izotipa;
ii) imunospecifično vezuje humani BCMA sa afinitetom od najmanje 0.22 nM kao što je mereno površinskom plazmon rezonancom;
iii) vezuje BCMA na površini humanih ćelija mijeloma;
iv) vezuje BCMA na površini humanih ćelija multiplog mijeloma;
v) indukuje aktivaciju humanih T-ćelija in vitro sa EC50manjom od oko 0.37 nM;
vi) indukuje T-ćelijski zavisnu citotoksičnost ćelija koje eksprimiraju BCMA in vitro sa EC50manjom od oko 0.45 nM;
vii) nije BCMA agonist; i/ili
viii) ne menja aktivaciju NF-κB i koncentracijama koje su ispod 10 nM.
9. Rekombinantna ćelija koja eksprimira antitelo ili bispecifičan fragment za vezivanje prema bilo kom od zahteva 6 do 8, kao što gde je ćelija hibridom.
10. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifičan fragment za vezivanje prema bilo kom od zahteva 6 do 8 za upotrebu u postupku:
i) za lečenje subjekta koji ima kancer, opciono dalje obuhvata davanje drugog terapeutskog agensa, na primer pri čemu drugi terapeutski agens je hemoterapeutski agens ili ciljana anti-kancerogena terapija, kao što gde hemoterapeutski agens je citarabin, antraciklin, histamin dihidrohlorid, ili interleukin 2;
ii) za inhibiranje rasta ili proliferacije ćelija kancera; ili
iii) preusmeravanja T ćelija ka ćelijama kancera koje eksprimiraju BCMA.
11. BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifičan fragment za vezivanje za upotrebu prema zahtevu 10 pri čemu je kancer hematološki kancer, na primer pri čemu je kancer hematološki kancer B ćelija koje eksprimiraju BCMA, kao što je gde je kancer B ćelija koje eksprimiraju BCMA je multipli mijelom.
12. Farmacetuska kompozicija koja se sastoji iz BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog fragmenta za vezivanje prema bilo kom od zahteva 6 do 8 i farmaceutski prihvatljivog nosača.
13. Postupak za dobijanje BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog fragmenta za vezivanje prema bilo kom od zahteva 6 do 8 kultivacijom ćelije prema zahtevu 9.
1
14. Izolovani sintetički polinukleotid koji kodira BCMA x CD3 bispecifično antitelo ili bispecifičan fragment za vezivanje prema bilo kom od zahteva 6 do 8.
15. Komplet koji se sastoji iz BCMA x CD3 bispecifičnog antitela ili bispecifičnog vezujućeg fragmenta kao što je definisano u bilo kom od zahteva 6 do 8 i/ili polinukleotid kako je definisano u zahtevu 14 i njegovo pakovanje.
1
RS20201050A 2015-08-17 2016-08-16 Anti-bcma antitela, bispecifični antigen vezujući molekuli koji se vezuju za bcma i cd3, i njihove upotrebe RS60755B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562206246P 2015-08-17 2015-08-17
EP16754148.1A EP3337824B1 (en) 2015-08-17 2016-08-16 Anti-bcma antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind bcma and cd3, and uses thereof
PCT/US2016/047146 WO2017031104A1 (en) 2015-08-17 2016-08-16 Anti-bcma antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind bcma and cd3, and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS60755B1 true RS60755B1 (sr) 2020-10-30

Family

ID=56740579

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20201050A RS60755B1 (sr) 2015-08-17 2016-08-16 Anti-bcma antitela, bispecifični antigen vezujući molekuli koji se vezuju za bcma i cd3, i njihove upotrebe

Country Status (40)

Country Link
US (1) US10072088B2 (sr)
EP (3) EP3757131A1 (sr)
JP (4) JP2018525005A (sr)
KR (2) KR20250007058A (sr)
CN (1) CN108350076B (sr)
AR (2) AR105724A1 (sr)
AU (1) AU2016308567B2 (sr)
CA (1) CA2995754A1 (sr)
CL (1) CL2018000431A1 (sr)
CO (1) CO2018001524A2 (sr)
CY (2) CY1123297T1 (sr)
DK (1) DK3337824T3 (sr)
EA (1) EA201890513A1 (sr)
EC (1) ECSP18019568A (sr)
ES (1) ES2814550T3 (sr)
FI (1) FIC20230012I1 (sr)
FR (2) FR23C1011I1 (sr)
HR (1) HRP20201375T1 (sr)
HU (2) HUE050556T2 (sr)
IL (3) IL298041B2 (sr)
JO (1) JO3799B1 (sr)
LT (2) LT3337824T (sr)
LU (1) LUC00301I2 (sr)
MA (1) MA53750A (sr)
MX (2) MX2018002043A (sr)
MY (1) MY191325A (sr)
NI (1) NI201800027A (sr)
NL (1) NL301219I2 (sr)
PE (1) PE20180795A1 (sr)
PH (1) PH12018500361A1 (sr)
PL (1) PL3337824T3 (sr)
PT (1) PT3337824T (sr)
RS (1) RS60755B1 (sr)
SI (1) SI3337824T1 (sr)
SV (1) SV2018005634A (sr)
TW (3) TWI811023B (sr)
UA (1) UA127515C2 (sr)
UY (2) UY36859A (sr)
WO (1) WO2017031104A1 (sr)
ZA (1) ZA201801789B (sr)

Families Citing this family (167)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10126301B2 (en) 2013-02-08 2018-11-13 Institute For Myeloma & Bone Cancer Research Diagnostic, prognostic, and monitoring methods for multiple myeloma, chronic lymphocytic leukemia, and B-cell non-hodgkin lymphoma
GB201317928D0 (en) * 2013-10-10 2013-11-27 Ucl Business Plc Molecule
MY181834A (en) 2014-07-21 2021-01-08 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
MX383614B (es) 2015-05-21 2025-03-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas de union triespecificas y metodos de uso.
EA039859B1 (ru) 2015-07-31 2022-03-21 Эмджен Рисерч (Мюник) Гмбх Биспецифические конструкты антител, связывающие egfrviii и cd3
TWI796283B (zh) 2015-07-31 2023-03-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｍｓｌｎ及ｃｄ３抗體構築體
TWI744242B (zh) 2015-07-31 2021-11-01 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Egfrviii及cd3抗體構築體
TWI829617B (zh) 2015-07-31 2024-01-21 德商安美基研究（慕尼黑）公司 Ｆｌｔ３及ｃｄ３抗體構築體
WO2017031104A1 (en) * 2015-08-17 2017-02-23 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-bcma antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind bcma and cd3, and uses thereof
ES2898329T3 (es) 2016-01-12 2022-03-07 Oncotracker Inc Métodos mejorados para supervisar el estado inmunitario de un sujeto
CA3011942A1 (en) 2016-02-03 2017-08-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Psma and cd3 bispecific t cell engaging antibody constructs
IL311107A (en) 2016-02-17 2024-04-01 Seagen Inc BCMA antibodies and their use for the treatment of cancer and immune disorders
US10968279B2 (en) * 2016-05-09 2021-04-06 Bristol-Myers Squibb Company TL1A antibodies and uses thereof
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
US10100106B2 (en) 2016-05-20 2018-10-16 Harpoon Therapeutics, Inc. Single domain serum albumin binding protein
US20190233533A1 (en) 2016-06-28 2019-08-01 Umc Utrecht Holding B.V. Treatment Of IgE-Mediated Diseases With Antibodies That Specifically Bind CD38
TWI781108B (zh) 2016-07-20 2022-10-21 比利時商健生藥品公司 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗體、結合ｇｐｒｃ５ｄ與ｃｄ３之雙特異性抗原結合分子及其用途
MY200988A (en) 2016-09-14 2024-01-27 Teneobio Inc CD3 Binding Antibodies
KR102745676B1 (ko) 2016-12-21 2024-12-24 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
CN110121505B (zh) 2016-12-28 2023-08-01 株式会社绿十字细胞治疗 嵌合抗原受体和表达其的自然杀伤细胞
JP2020506700A (ja) 2017-01-31 2020-03-05 ノバルティス アーゲー 多重特異性を有するキメラｔ細胞受容体タンパク質を用いた癌の治療
WO2018160754A2 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Harpoon Therapeutics, Inc. Inducible monovalent antigen binding protein
US20200179511A1 (en) 2017-04-28 2020-06-11 Novartis Ag Bcma-targeting agent, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
US20200055948A1 (en) 2017-04-28 2020-02-20 Novartis Ag Cells expressing a bcma-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapy with a gamma secretase inhibitor
AU2018265856B2 (en) 2017-05-12 2023-04-27 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
WO2018231944A1 (en) 2017-06-13 2018-12-20 Berenson James R Diagnostic, prognostic, and monitoring methods for solid tumor cancers
WO2018237006A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Teneoone, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
IL312322B2 (en) 2017-06-20 2026-05-01 Teneobio Inc Antibodies against BCMA containing only heavy chains
WO2019000223A1 (en) * 2017-06-27 2019-01-03 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. ENABLERS OF IMMUNE EFFECTOR CELLS OF CHIMERIC ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF
SG11202000499RA (en) * 2017-08-01 2020-02-27 Medimmune Llc Bcma monoclonal antibody-drug conjugate
WO2019035938A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Elstar Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC MOLECULES BINDING TO BCMA AND USES THEREOF
CN111655280B (zh) * 2017-09-01 2025-01-14 达纳-法伯癌症研究所股份有限公司 用于治疗癌症的bcma和taci抗原特异的免疫原性肽
SI3694529T1 (sl) * 2017-10-13 2024-10-30 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecifične beljakovine in načini uporabe
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
KR20200086278A (ko) 2017-10-18 2020-07-16 노파르티스 아게 선택적 단백질 분해를 위한 조성물 및 방법
MX2020004572A (es) 2017-11-01 2020-10-07 Juno Therapeutics Inc Receptores de antigenos quimericos especificos para el antigeno de maduracion de celulas b y polinucleotidos que codifican los mismos.
CA3080904A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
EP3706754A1 (en) 2017-11-06 2020-09-16 Juno Therapeutics, Inc. Combination of a cell therapy and a gamma secretase inhibitor
US11649294B2 (en) 2017-11-14 2023-05-16 GC Cell Corporation Anti-HER2 antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor comprising same
SG11202004512XA (en) 2017-11-15 2020-06-29 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, cd19-targeting chimeric antigen receptor, and combination therapies
WO2019108900A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 Novartis Ag Bcma-targeting chimeric antigen receptor, and uses thereof
CN112218651A (zh) 2018-01-08 2021-01-12 诺华公司 用于与嵌合抗原受体疗法组合的免疫增强rna
WO2019139987A1 (en) 2018-01-09 2019-07-18 Elstar Therapeutics, Inc. Calreticulin binding constructs and engineered t cells for the treatment of diseases
AU2019215031C1 (en) 2018-01-31 2026-02-26 Novartis Ag Combination therapy using a chimeric antigen receptor
WO2019160956A1 (en) 2018-02-13 2019-08-22 Novartis Ag Chimeric antigen receptor therapy in combination with il-15r and il15
US12152073B2 (en) 2018-03-14 2024-11-26 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to calreticulin and uses thereof
WO2019190969A1 (en) * 2018-03-26 2019-10-03 Sutro Biopharma, Inc. Anti-bcma receptor antibodies, compositions comprising anti bcma receptor antibodies and methods of making and using anti-bcma antibodies
EP3774914A2 (en) * 2018-04-13 2021-02-17 Affimed GmbH Nk cell engaging antibody fusion constructs
BR112020023330A2 (pt) 2018-05-14 2021-04-20 Harpoon Therapeutics, Inc. porção de ligação para ativação condicional de moléculas de imunoglobulina
SG11202011306TA (en) * 2018-05-16 2020-12-30 Janssen Biotech Inc Bcma/cd3 and gprdc5d/cd3 bispecific antibodies for use in cancer therapy
AU2019277029C1 (en) * 2018-06-01 2024-01-04 Novartis Ag Binding molecules against BCMA and uses thereof
AU2019284911B2 (en) 2018-06-13 2026-04-09 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
CN112243381B (zh) * 2018-06-14 2025-02-07 2赛文缇生物公司 抗bcma car抗体、缀合物和使用方法
CA3100187A1 (en) 2018-06-26 2020-01-02 Abl Bio, Inc. Anti-bcma antibody and use thereof
WO2020010250A2 (en) 2018-07-03 2020-01-09 Elstar Therapeutics, Inc. Anti-tcr antibody molecules and uses thereof
MX2021000532A (es) 2018-07-19 2021-04-12 Regeneron Pharma Receptores antigénicos quiméricos con especificidad para bcma y usos de estos.
TWI838389B (zh) 2018-07-19 2024-04-11 美商再生元醫藥公司 雙特異性抗-BCMAｘ抗-CD3抗體及其用途
EP3830122A1 (en) * 2018-07-31 2021-06-09 Amgen Research (Munich) GmbH Dosing regimen for bcma-cd3 bispecific antibodies
EP3833392A4 (en) * 2018-08-08 2022-05-18 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR BINDING CD33, NKG2D AND CD16 AND METHODS OF USE
WO2020047449A2 (en) 2018-08-31 2020-03-05 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
PT3844267T (pt) 2018-08-31 2025-09-30 Novartis Ag Métodos de preparação de células que expressam recetor de antigénio quimérico
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
EP3856771A4 (en) 2018-09-25 2022-06-29 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
US12116415B2 (en) 2018-10-09 2024-10-15 Single Cell Technology, Inc. Anti-BCMA antibodies
JP7410143B2 (ja) * 2018-11-01 2024-01-09 山▲東▼新▲時▼代▲薬▼▲業▼有限公司 二重特異性抗体及びその用途
SG11202104188VA (en) 2018-11-01 2021-05-28 Juno Therapeutics Inc Methods for treatment using chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen
CN113412124A (zh) * 2018-12-19 2021-09-17 希望之城 Baff-r双特异性t细胞衔接子抗体
WO2020160375A1 (en) * 2019-02-01 2020-08-06 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Combination treatments for cancer comprising belantamab mafodotin and an anti ox40 antibody and uses and methods thereof
GB2597851B (en) 2019-02-21 2024-05-29 Marengo Therapeutics Inc Antibody molecules that bind to NKP30 and uses thereof
AU2020226893B2 (en) 2019-02-21 2025-02-27 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules that bind to T cell related cancer cells and uses thereof
AU2020229806A1 (en) 2019-02-25 2021-07-29 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
JP7554759B2 (ja) * 2019-02-26 2024-09-20 ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド Ｂｃｍａに結合する抗原結合性タンパク質
US12448429B2 (en) 2019-03-06 2025-10-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. T cell receptors specific to b-cell maturation antigen for treatment of cancer
SG11202109002XA (en) 2019-03-21 2021-09-29 Regeneron Pharma Combination of il-4/il-13 pathway inhibitors and plasma cell ablation for treating allergy
US20230074800A1 (en) 2019-03-21 2023-03-09 Novartis Ag Car-t cell therapies with enhanced efficacy
CR20210500A (es) 2019-04-05 2021-11-05 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada que se unen al psma
US20220168389A1 (en) 2019-04-12 2022-06-02 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
EP3959320A1 (en) 2019-04-24 2022-03-02 Novartis AG Compositions and methods for selective protein degradation
EP3733707A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-04 Celyad S.A. Car t-cells targeting bcma and uses thereof
JP2022531001A (ja) * 2019-05-03 2022-07-05 セルジーン コーポレーション 抗ｂｃｍａ抗体コンジュゲート、そのコンジュゲートを含む組成物ならびにそのコンジュゲートの製造および使用方法
KR20220008866A (ko) 2019-05-14 2022-01-21 하푼 테라퓨틱스, 인크. EpCAM 결합 단백질 및 사용 방법
CN118994397A (zh) 2019-05-21 2024-11-22 诺华股份有限公司 针对bcma的三特异性结合分子及其用途
UY38701A (es) 2019-05-21 2020-12-31 Novartis Ag Moléculas de unión a cd19, conjugados, composiciones que las comprenden y usos de las mismas
JP7665538B2 (ja) 2019-06-14 2025-04-21 テネオバイオ， インコーポレイテッド Ｃｄ２２及びｃｄ３に結合する多重特異性重鎖抗体
CN110229232B (zh) 2019-06-19 2020-05-19 北京智仁美博生物科技有限公司 双特异性抗体及其用途
BR112022001546A2 (pt) 2019-07-30 2022-03-22 Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co Ltd Anticorpo anti-bcma, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uso médico do mesmo
WO2021092060A1 (en) * 2019-11-05 2021-05-14 Engmab Sarl Methods of treatment
SI3819007T1 (sl) 2019-11-11 2024-10-30 Amgen Inc. Režim odmerjanja sredstev proti BCMA
EP4065158A2 (en) 2019-11-26 2022-10-05 Novartis AG Chimeric antigen receptors binding bcma and cd19 and uses thereof
CN114929343B (zh) * 2019-12-06 2025-03-18 瑞泽恩制药公司 用双特异性抗BCMA x抗CD3抗体治疗多发性骨髓瘤的方法
AU2020400801B2 (en) 2019-12-10 2024-11-14 Abl Bio, Inc. Anti-BCMA/anti-4-1BB bispecific antibodies and uses thereof
WO2021132746A1 (en) * 2019-12-24 2021-07-01 Abl Bio, Inc. Anti-bcma/anti-4-1bb bispecific antibodies and uses thereof
CN114929277A (zh) * 2019-12-16 2022-08-19 2赛文缇生物公司 抗bcma car抗体、缀合物及使用方法
AU2020416273A1 (en) 2020-01-03 2022-07-28 Marengo Therapeutics, Inc. Anti-TCR antibody molecules and uses thereof
WO2021136308A1 (en) * 2020-01-03 2021-07-08 Biosion Inc. Antibodies binding bcma and uses thereof
MX2022010685A (es) 2020-02-27 2022-09-23 Novartis Ag Metodos de produccion de celulas que expresan receptores de antigeno quimericos.
CN115175695A (zh) 2020-02-27 2022-10-11 诺华股份有限公司 制备表达嵌合抗原受体的细胞的方法
IL296358A (en) * 2020-03-13 2022-11-01 Janssen Biotech Inc Materials and methods for modulating delta chain mediated immunity
TW202144425A (zh) * 2020-04-17 2021-12-01 大陸商上海翰森生物醫藥科技有限公司 特異性抗原結合分子，其製備方法及醫藥用途
IL297601A (en) * 2020-04-29 2022-12-01 Teneobio Inc Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
WO2021222578A1 (en) * 2020-04-29 2021-11-04 Teneobio, Inc. Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
PH12022553023A1 (en) 2020-05-11 2024-03-04 Janssen Biotech Inc Methods for treating multiple myeloma
CN113637073B (zh) * 2020-05-11 2024-04-12 上海赛比曼生物科技有限公司 Bcma抗体及其制备和应用
CN115666727A (zh) 2020-05-19 2023-01-31 詹森生物科技公司 包含t细胞重定向治疗剂和vla-4粘附途径抑制剂的组合物
CN116096862A (zh) 2020-06-11 2023-05-09 诺华股份有限公司 Zbtb32抑制剂及其用途
WO2022002033A1 (zh) * 2020-06-30 2022-01-06 和铂医药(上海)有限责任公司 具有H2L2与HCAb结构的结合蛋白
PE20230464A1 (es) 2020-06-30 2023-03-14 Teneobio Inc Union de anticuerpos multiespecificos a bcma
CN114075287B (zh) * 2020-08-18 2023-07-21 湖南远泰生物技术有限公司 人源化bcma抗体和bcma-car-t细胞
TW202227124A (zh) 2020-08-21 2022-07-16 瑞士商諾華公司 用於體內產生ｃａｒ表現細胞的組成物和方法
CN116615456A (zh) * 2020-09-11 2023-08-18 詹森生物科技公司 用于调节β链介导的免疫的方法和组合物
CN116194105A (zh) * 2020-09-14 2023-05-30 辉瑞大药厂 治疗癌症的方法、疗法及用途
WO2022060901A1 (en) 2020-09-16 2022-03-24 Amgen Inc. Methods for administering therapeutic doses of bispecific t-cell engaging molecules for the treatment of cancer
WO2022098771A1 (en) * 2020-11-03 2022-05-12 Ab Studio Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
WO2022098787A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Juno Therapeutics, Inc. Cells expressing a chimeric receptor from a modified invariant cd3 immunoglobulin superfamily chain locus and related polynucleotides and methods
CN118878694A (zh) * 2020-11-23 2024-11-01 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种双特异性抗体及其用途
CN114573703A (zh) * 2020-12-02 2022-06-03 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种t细胞衔接器治疗剂的开发和应用
WO2022135468A1 (zh) * 2020-12-23 2022-06-30 信达生物制药(苏州)有限公司 抗bcma×cd3双特异性抗体及其用途
RS66868B1 (sr) 2021-01-28 2025-06-30 Regeneron Pharma Kompozicije i postupci za lečenje sindroma oslobađanja citokina
IL305144A (en) 2021-02-16 2023-10-01 Janssen Pharmaceutica Nv Trispecific antibodies targeting BCMA, GPRC5D and CD3
US12162945B2 (en) 2021-03-05 2024-12-10 Immunome, Inc. EPHA2 antibodies
CA3214594A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Janssen Biotech, Inc. Trispecific antibody targeting cd79b, cd20, and cd3
JP2024515591A (ja) 2021-04-08 2024-04-10 マレンゴ・セラピューティクス，インコーポレーテッド Ｔｃｒに結合する多機能性分子およびその使用
TW202309294A (zh) 2021-04-27 2023-03-01 瑞士商諾華公司 病毒載體生產系統
US11931420B2 (en) 2021-04-30 2024-03-19 Celgene Corporation Combination therapies using an anti-BCMA antibody drug conjugate (ADC) in combination with a gamma secretase inhibitor (GSI)
TW202309522A (zh) 2021-05-11 2023-03-01 美商健生生物科技公司 用於監測復發性及／或難治性多發性骨髓瘤之治療的方法及組成物
MX2023014139A (es) 2021-05-28 2023-12-13 Janssen Biotech Inc Bcma como un objetivo para anticuerpos de redireccionamiento de celulas t en linfomas de celulas b.
CN119569887A (zh) * 2021-06-24 2025-03-07 益科思特(北京)医药科技发展有限公司 结合bcma和cd3的双特异性抗体及其制备方法与应用
CN115569191A (zh) * 2021-07-05 2023-01-06 山东新时代药业有限公司 一种重组人源化抗bcma/cd3双特异性抗体冻干制剂
WO2023020474A1 (en) * 2021-08-16 2023-02-23 Utc Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Bcma targetting antibodies and uses thereof in cancer therapies
JP2024531364A (ja) 2021-08-20 2024-08-29 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体発現細胞を作製する方法
IL311570A (en) 2021-10-14 2024-05-01 Arsenal Biosciences Inc Immune cells with common expression chain and logic gate systems
US20250130233A1 (en) * 2021-10-27 2025-04-24 Janssen Biotech, Inc. Methods for enhanced bcma immunohistochemistry detection in human and monkey tissue
US20230134748A1 (en) 2021-11-03 2023-05-04 Janssen Biotech, Inc. Corticosteriod Reduction in Treatment with Anti-CD38 Antibody
WO2023081705A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating cancers and enhancing efficacy of bcmaxcd3 bispecific antibodies
US20230279136A1 (en) * 2021-11-10 2023-09-07 Janssen Biotech, Inc. Stable formulations comprising a bispecific bcma/cd3 antibody
CN118696058A (zh) * 2021-12-03 2024-09-24 山东先声生物制药有限公司 抗bcma纳米抗体及其应用
CA3247475A1 (en) 2022-04-11 2023-10-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. COMPOSITIONS AND METHODS FOR THE DESTRUCTION OF UNIVERSAL TUMOR CELLS
CN117003871A (zh) 2022-04-28 2023-11-07 北京天广实生物技术股份有限公司 结合bcma和cd3的抗体及其用途
CN116023504B (zh) * 2022-06-07 2025-09-30 江苏蒙彼利生物科技有限公司 双特异性嵌合抗原受体（car）及其制备方法
AU2023369684A1 (en) 2022-10-26 2025-04-17 Novartis Ag Lentiviral formulations
IL320562A (en) 2022-11-02 2025-07-01 Janssen Biotech Inc Cancer treatment methods
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)
EP4626476A1 (en) * 2022-12-02 2025-10-08 Artiva Biotherapeutics, Inc. Anti-bcma antibody or antigen-binding fragment thereof, and chimeric antigen receptor comprising same
CN117186228B (zh) * 2022-12-06 2024-03-22 成都赛恩吉诺生物科技有限公司 包含长cdr3序列的抗人bcma纳米抗体的双特异性抗体及应用
WO2024124088A1 (en) * 2022-12-09 2024-06-13 Sana Biotechnology, Inc. Bcma-specific antibody constructs and compositions thereof
JP2026506095A (ja) 2023-02-17 2026-02-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｃｄ３／ｔａａ二重特異性抗体に応答する誘導ｎｋ細胞
CN121263449A (zh) 2023-03-21 2026-01-02 拜格拉夫55公司 Cd19/cd38多特异性抗体
US20250242019A2 (en) * 2023-04-19 2025-07-31 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma
CN121358776A (zh) 2023-05-09 2026-01-16 詹森生物科技公司 包含高浓度的双特异性bcma/cd3抗体的药物组合物
AU2024279278A1 (en) 2023-05-31 2025-12-18 Capstan Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations and compositions
CN121335930A (zh) 2023-06-06 2026-01-13 信达生物制药(苏州)有限公司 抗gprc5d/bcma/cd3三特异性抗体的制备及其用途
WO2025059162A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Car-engager containing il-2 variants to enhance the functionality of car t cells
WO2025076113A1 (en) 2023-10-05 2025-04-10 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids with conserved spacing and lipid nanoparticles
IL327045A (en) 2023-10-05 2026-05-01 Capstan Therapeutics Inc Structure-restricted ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025096717A1 (en) * 2023-11-01 2025-05-08 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma
WO2025094107A1 (en) 2023-11-01 2025-05-08 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating high-risk smoldering multiple myeloma
WO2025131075A1 (zh) * 2023-12-21 2025-06-26 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗cd3和抗cd3多特异性抗体及用途
US20250242018A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination immunosuppression for inhibiting an immune response and enabling immunogen administration and re-administration
US20250242056A1 (en) 2024-01-26 2025-07-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for using plasma cell depleting agents and/or b cell depleting agents to suppress host anti-aav antibody response and enable aav transduction and re-dosing
WO2025184567A1 (en) 2024-03-01 2025-09-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for re-dosing aav using anti-cd40 antagonistic antibody to suppress host anti-aav antibody response
WO2025217452A1 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Constrained ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025217454A2 (en) 2024-04-11 2025-10-16 Capstan Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles
WO2025231372A2 (en) 2024-05-03 2025-11-06 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma with car-t cells and bispecific antibodies
WO2025243241A1 (en) 2024-05-23 2025-11-27 Janssen Biotech, Inc. Methods for treating multiple myeloma
WO2026033437A1 (en) 2024-08-07 2026-02-12 Janssen Biotech, Inc. Methods of treating autoimmune diseases comprising the administration of anti-bcma therapeutics
WO2026050572A2 (en) 2024-08-29 2026-03-05 Marengo Therapeutics, Inc. Multifunctional molecules binding to tcr and uses thereof
WO2026072671A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 City Of Hope Methods comprising oncolytic viruses expressing bcmat and bcma-targeted therapies

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1538206B1 (en) 1997-09-16 2010-03-24 Centocor, Inc. Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20020142000A1 (en) 1999-01-15 2002-10-03 Digan Mary Ellen Anti-CD3 immunotoxins and therapeutic uses therefor
UA74798C2 (uk) 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
AU6232899A (en) 1999-10-06 2001-05-10 Campina Melkunie B.V. Use of transforming growth factor beta and growth factors in the treatment and prevention of diseases of the intestinal mucosa
CA2438682A1 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
CA2577082A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Genentech, Inc. Heteromultimeric molecules
CN101198698B (zh) 2005-03-31 2014-03-19 中外制药株式会社 通过调节多肽缔合制备多肽的方法
DE102005028778A1 (de) 2005-06-22 2006-12-28 SUNJÜT Deutschland GmbH Mehrlagige Folie mit einer Barriere- und einer antistatischen Lage
JP5686953B2 (ja) 2005-10-11 2015-03-18 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 交差種特異的（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体を含む組成物および該組成物の使用
US10155816B2 (en) 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2007117600A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Macrogenics, Inc. Combination therapy for treating autoimmune diseases
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
CN109456410B (zh) 2007-04-03 2022-01-28 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
SG10201808730VA (en) 2007-04-03 2018-11-29 Amgen Res Munich Gmbh Cross-species-specific binding domain
US20100183615A1 (en) 2007-04-03 2010-07-22 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
CA2720682A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Zymogenetics, Inc. Levels of bcma protein expression on b cells and use in diagnostic methods
EP4180458A1 (en) 2008-10-01 2023-05-17 Amgen Research (Munich) GmbH Cross-species-specific psma x cd3 bispecific single chain antibody
CA2738568C (en) 2008-10-01 2024-02-20 Micromet Ag Cross-species-specific single domain bispecific single chain antibody
DK2352763T4 (da) 2008-10-01 2022-10-17 Amgen Res Munich Gmbh Bispecifikke enkeltkædede antistoffer med specificitet for højmolekylære målantigener
BRPI0919881B1 (pt) 2008-10-31 2021-09-08 Centocor Ortho Biotech Inc Proteína de arcabouço e seu método de geração, biblioteca e seu método de construção, molécula de ácido nucleico, vetor de ácido nucleico, célula hospedeira, composição, dispositivo médico e artigo de fabricação
WO2010093627A2 (en) 2009-02-12 2010-08-19 Centocor Ortho Biotech Inc. Fibronectin type iii domain based scaffold compositions, methods and uses
KR101589785B1 (ko) 2009-03-10 2016-01-28 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 항-ｂｃｍａ 항체
AU2010245011B2 (en) 2009-04-27 2015-09-03 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
JP6040148B2 (ja) 2010-04-20 2016-12-07 ゲンマブ エー／エス ヘテロ二量体抗体Ｆｃ含有タンパク質およびその産生方法
PL2635607T3 (pl) 2010-11-05 2020-05-18 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerowego z mutacjami w domenie FC
US20130273055A1 (en) * 2010-11-16 2013-10-17 Eric Borges Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
US20130101599A1 (en) 2011-04-21 2013-04-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bcma-based stratification and therapy for multiple myeloma patients
WO2012158818A2 (en) * 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
CN104114186B (zh) * 2011-08-03 2017-05-03 儿童医疗中心有限公司 识别流行性感冒血凝素的受体‑结合袋状结构的广泛中和人类抗体
PL2773671T3 (pl) 2011-11-04 2022-01-24 Zymeworks Inc. Projekt stabilnego przeciwciała heterodimerycznego z mutacjami w domenie fc
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
SG11201504676VA (en) 2012-12-14 2015-07-30 Omt Inc Polynucleotides encoding rodent antibodies with human idiotypes and animals comprising same
US9963513B2 (en) 2013-02-05 2018-05-08 Engmab Sàrl Method for the selection of antibodies against BCMA
EP2762497A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
WO2017031104A1 (en) * 2015-08-17 2017-02-23 Janssen Pharmaceutica Nv Anti-bcma antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind bcma and cd3, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
TWI811023B (zh) 2023-08-01
IL257468A (en) 2018-04-30
HUE050556T2 (hu) 2020-12-28
EP3757131A1 (en) 2020-12-30
HRP20201375T1 (hr) 2020-11-27
MX2018002043A (es) 2018-07-06
JP7621324B2 (ja) 2025-01-24
IL298041B1 (en) 2025-06-01
CY2023007I1 (el) 2023-06-09
IL257468B2 (en) 2023-06-01
LTC3337824I2 (sr) 2024-10-25
IL298041A (en) 2023-01-01
PE20180795A1 (es) 2018-05-09
CN108350076A (zh) 2018-07-31
JP2018525005A (ja) 2018-09-06
NI201800027A (es) 2018-08-30
JO3799B1 (ar) 2021-01-31
FIC20230012I1 (fi) 2023-02-22
IL320478A (en) 2025-06-01
AU2016308567A1 (en) 2018-03-08
KR20250007058A (ko) 2025-01-13
PH12018500361A1 (en) 2018-09-03
BR112018003017A2 (pt) 2018-09-25
FR23C1012I1 (fr) 2023-04-14
ECSP18019568A (es) 2018-04-30
IL298041B2 (en) 2025-10-01
DK3337824T3 (da) 2020-08-24
EP4667058A3 (en) 2026-04-01
ZA201801789B (en) 2019-10-30
TW202307000A (zh) 2023-02-16
US10072088B2 (en) 2018-09-11
CL2018000431A1 (es) 2018-11-23
MX2022006650A (es) 2022-07-05
CY1123297T1 (el) 2021-12-31
MA53750A (fr) 2021-09-15
JP2025013894A (ja) 2025-01-28
LT3337824T (lt) 2020-09-25
PL3337824T3 (pl) 2021-04-19
WO2017031104A1 (en) 2017-02-23
CN108350076B (zh) 2022-06-07
FR23C1011I1 (fr) 2023-04-14
TW202406935A (zh) 2024-02-16
SI3337824T1 (sl) 2020-10-30
PT3337824T (pt) 2020-09-10
LTPA2023509I1 (sr) 2023-03-10
EA201890513A1 (ru) 2018-11-30
AR134557A2 (es) 2026-01-28
TWI777924B (zh) 2022-09-21
KR102890745B1 (ko) 2025-11-26
JP2021184721A (ja) 2021-12-09
MY191325A (en) 2022-06-15
EP3337824A1 (en) 2018-06-27
UY40513A (es) 2023-11-30
TW201718651A (zh) 2017-06-01
SV2018005634A (es) 2018-06-26
AU2016308567B2 (en) 2022-10-27
JP2023027228A (ja) 2023-03-01
UY36859A (es) 2017-04-28
AR105724A1 (es) 2017-11-01
EP4667058A2 (en) 2025-12-24
JP7194240B2 (ja) 2022-12-21
NL301219I1 (sr) 2023-03-01
LUC00301I2 (sr) 2025-09-22
ES2814550T3 (es) 2021-03-29
UA127515C2 (uk) 2023-09-20
CO2018001524A2 (es) 2018-07-10
US20170051068A1 (en) 2017-02-23
KR20180040671A (ko) 2018-04-20
EP3337824B1 (en) 2020-06-03
NL301219I2 (nl) 2023-04-04
NZ739862A (en) 2025-05-02
HUS2300011I1 (hu) 2023-03-28
CY2023007I2 (el) 2023-11-15
FR23C1012I2 (fr) 2025-01-10
CA2995754A1 (en) 2017-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7621324B2 (ja) 抗ｂｃｍａ抗体、ｂｃｍａ及びｃｄ３に結合する二重特異性抗原結合分子、並びにそれらの使用
JP7469432B2 (ja) 抗ｇｐｒｃ５ｄ抗体、ｇｐｒｃ５ｄとｃｄ３を結合する二重特異性抗原結合分子、及びその使用
JP2024507180A (ja) Ｂｃｍａ、ｇｐｒｃ５ｄ、及びｃｄ３を標的とする三重特異的抗体
RS60305B1 (sr) Agensi koji vezuju cd123 i njihove upotrebe
EA046105B1 (ru) Антитела к bcma, биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с bcma и cd3, и их применение
EA052138B1 (ru) Фармацевтическая композиция, содержащая антитело, которое связывается с bcma, выделенный синтетический полинуклеотид и набор, содержащий указанное антитело или указанный полинуклеотид
EA044685B1 (ru) Антитела к gprc5d, биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связывают gprc5d и cd3, и их применение
BR122025011670A2 (pt) Anticorpos anti-bcma, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam a bcma e cd3, e usos dos mesmos