RS60794B1

RS60794B1 - Stabilne formulacije koje sadrže anti-pcsk9 antitela

Info

Publication number: RS60794B1
Application number: RS20200956A
Authority: RS
Inventors: Christi L Clogston; Timothy David Osslund
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2012-05-03
Filing date: 2013-05-03
Publication date: 2020-10-30
Also published as: PL2844285T3; EP2844285B1; US20140030270A1; WO2013166448A8; SI2844285T1; SMT202000427T1; HUE050276T2; PT2844285T; EA201792336A2; EP3656399A1; CY1123250T1; CN112390888B; EA039663B1; EP2844285A1; CN104619340A; CN112390888A; WO2013166448A1; TN2013000467A1; ES2810907T3; LT2844285T

Description

Opis

POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava ima prioritet američke privremene prijave br.61/642,363 podnete 3. maja 2012.

POZIVANJE NA LISTU SEKVENCI

[0002] Ova prijava u celosti sadrži celokupan predmet sadržan u priloženoj listi sekvenci koja je u txt formatu koja je identifikovana nazivom datoteke, A-1635-US-NP2_Seq_List.txt, kreirane 1. maja 2013. godine, i njena veličina je 306 KB.

OBLAST PRONALASKA

[0003] Ovaj pronalazak se odnosi na lečenje ili prevenciju poremećaja povezanih sa holesterolom, kao što je hiperholesterolemija, hiperlipidemija ili dislipidemija, pomoću proteina za vezivanje antigena, uključujući antitela, protiv proproteinske konvertaze subtilizin/keksin tipa 9 (PCSK9). Farmaceutske formulacije i postupci proizvodnje navedenih formulacija su takođe opisani.

POZADINA

[0004] „Poremećaji povezani sa holesterolom“ (koji uključuju „poremećaje povezane sa holesterolom u serumu“) uključuju bilo koje jedno ili više od sledećeg: hiperholesterolemija, hiperlipidemija, srčana bolest, metabolički sindrom, dijabetes, koronarna bolest srca, moždani udar, kardiovaskularne bolesti, Alchajmerova bolest i generalno dislipidemije, koje se mogu manifestovati, na primer, povišenim ukupnim holesterolom u serumu, povišenim LDL, povišenim trigliceridima, povišenim VLDL, i/ili niskim HDL. Hiperholesterolemija je zapravo ustanovljeni faktor rizika za koronarnu bolest srca (CHD) kod ljudi. Snižavanje lipoprotena niske gustine (LDL-C) rezultuje smanjenjem kardiovaskularnog rizika i predstavlja primarni cilj u farmakoterapiji za CHD. Statini (inhibitori reduktaze hidroksimetilglutaril koenzima A [HMG CoA]) predstavljaju trenutni odabrani tretman za hiperholesterolemiju. Međutim, noviji podaci pokazuju da je agresivnije lečenje hiperholesterolemije povezano sa nižim rizikom od CHD događaja. Pored toga, podskup pacijenata je netolerantan na, ili ne odgovara adekvatno na terapiju statinom. Stoga, nove terapije koje se mogu koristiti samostalno ili u kombinaciji sa postojećim agensima za efektivnije smanjenje LDL-C mogu biti korisne.

[0005] Utvrđeno je da recikliranje receptora lipoproteina niske gustine (LDLR) površine hepatske ćelije ima ključnu ulogu u održavanju ravnoteže ćelijskog i holesterola u celom telu regulisanjem nivoa plazme u LDL-C. Nedavno se pokazalo da proproteinska konvertaza subtilizin/keksin tipa 9 (PCSK9) ima važnu ulogu u recikliranju i regulisanju LDLR. PCSK9 je član subtilizin porodice proteaza serina i eksprimira se prvenstveno u jetri. Posle sekrecije, prouzrokuje posttranslacionu negativnu regulaciju LDLR površine hepatske ćelije pomoću mehanizma koji uključuje direktno vezivanje za LDLR. Negativna regulacija hepatskog LDLR dovodi do povećanih nivoa cirkulacije LDL-C. Stoga PCSK9 može predstavljati cilj za inhibiciju pomoću novih terapijskih sredstava u utvrđivanju hiperholesterolemije. Izrazit osnov za takav pristup je dostupan iz ispitivanja u predkliničkim modelima i iz nalaza da ljudi sa mutacijama PCSK9 gubitka funkcije imaju nivoe holesterola niže od uobičajenih i smanjenu incidencu CHD. WO 2009/026558 A1 otkriva formulacije koje obuhvataju proteine za vezivanje antigena za PCSK9.

SAŽETAK RAZLIČITIH NAČINA OSTVARIVANJA

[0006] Ovaj pronalazak je onakav kako je definisan u zahtevima. "Načini ostvarivanja" označeni u nastavku predstavljaju načine ostvarivanja koji se štite ili kako su ovde opisani. U nekim ovde opisanim aspektima opisan je postupak snižavanja nivoa LDL holesterola u serumu kod pacijenta. Postupak obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno doze od oko 10 mg do oko 1400 mg najmanje jednog ovde opisanog anti-PCSK9 antitela. U nekim načinima ostvarivanja, doza je oko 10 mg do oko 70 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela datog jednom nedeljno (QW). U nekim načinima ostvarivanja, doza je oko 14 mg do oko 45 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela datog jednom nedeljno. U nekim načinima ostvarivanja, doza je oko 14 mg do oko 35 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela datog jednom nedeljno. U nekim načinima ostvarivanja, doza je oko 70 mg do oko 420 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela datog jednom svake 2 nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 70 mg do oko 350 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela koje se daje svake 2 nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 105 mg do oko 350 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela koje se daje svake 2 nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 140 mg do oko 280 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela koje se daje svake 2 nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 250 mg do oko 480 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela koje se daje svake 4 nedelje (Q4W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 280 mg do oko 420 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela koje se daje svake 2 nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 350 mg do oko 420 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela koje se daje svake 2 nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 80%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 85%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 90%.

[0007] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obuhvata postupak snižavanja nivoa LDL holesterola u serumu pacijenta, pri čemu taj postupak obuhvata davanje pacijentu kojem je to potrebno doze od najmanje jednog anti-PCSK9 antitela, i pri čemu se doza anti-PCSK9 antitela daje prema rasporedu odabranom iz grupe koju čine: (1) najmanje količina od oko 14 mg svake nedelje (QW); (2) najmanje količina od oko 35 mg svake nedelje (QW); (3) najmanje količina od oko 70 mg svake druge nedelje (Q2W); (4) najmanje količina od oko 105 mg svake dve nedelje (Q2W); (5) najmanje količina od oko 140 mg svake druge nedelje (Q2W); (6) najmanje količina od oko 280 mg svake dve nedelje (Q2W); i (7) najmanje količina od oko 280 mg svake četiri nedelje (Q4W); (8) najmanje količina od oko 350 svake četiri nedelje (Q4W); (9) najmanje količina od oko 420 mg svake četiri nedelje (Q4W). U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 80%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 85%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 90%.

[0008] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak snižavanja vrednosti PCSK9 kod pacijenta, pri čemu taj postupak obuhvata davanje doze od najmanje jednog anti-PCSK9 antitela pacijentu kojem je to potrebno, i pri čemu se doza anti-PCSK9 antitela daje prema rasporedu odabranom iz grupe koju čine: (1) najmanje oko 14 mg svake nedelje (QW); (2) najmanje količina od oko 35 mg svake nedelje (QW); (3) najmanje količina od oko 70 mg svake druge nedelje (Q2W); (4) najmanje količina od oko 105 mg svake dve nedelje (Q2W); (5) najmanje količina od oko 140 mg svake druge nedelje (Q2W); (6) najmanje količina od oko 280 mg svake druge nedelje (Q2W); i (7) najmanje količina od oko 280 mg svake četiri nedelje (Q4W); (8) najmanje količina od oko 350 svake četiri nedelje (Q4W); (9) najmanje količina od oko 420 mg svake četiri nedelje (Q4W). U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 80%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 85%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 90%.

[0009] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obuhvata postupak snižavanja nivoa holesterola kod pacijenta, pri čemu taj postupak obuhvata davanje doze od najmanje jednog anti-PCSK9 antitela pacijentu kojem je to potrebno, i pri čemu se doza anti-PCSK9 antitela daje prema rasporedu odabranom iz grupe koju čine: (1) najmanje oko 14 mg svake nedelje (QW); (2) najmanje količina od oko 35 mg svake nedelje (QW); (3) najmanje količina od oko 70 mg svake druge nedelje (QW); (4) najmanje količina od oko 105 mg svake druge nedelje (QW); (5) najmanje količina od oko 140 mg svake druge nedelje (Q2W); (6) najmanje količina od oko 280 mg svake druge nedelje (Q2W); i (7) najmanje količina od oko 280 mg svake četiri nedelje (Q4W); (8) najmanje količina od oko 350 svake četiri nedelje (Q4W); (9) najmanje količina od oko 420 mg svake četiri nedelje (Q4W). U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 20%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 25%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 60%.

[0010] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak snižavanja nivoa ne-HDL holesterola kod pacijenta, pri čemu taj postupak obuhvata davanje doze od najmanje jednog anti-PCSK9 antitela pacijentu kojem je to potrebno, i pri čemu se doza anti-PCSK9 antitela daje prema rasporedu odabranom iz grupe koju čine: (1) najmanje oko 14 mg svake nedelje (QW); (2) najmanje količina od oko 35 mg svake nedelje (QW); (3) najmanje količina od oko 70 mg svake druge nedelje (QW); (4) najmanje količina od oko 105 mg svake druge nedelje (QW); (5) najmanje količina od oko 140 mg svake druge nedelje (Q2W); (6) najmanje količina od oko 280 mg svake druge nedelje (Q2W); i (7) najmanje količina od oko 280 mg svake četiri nedelje (Q4W); (8) najmanje količina od oko 350 svake četiri nedelje (Q4W); (9) najmanje količina od oko 420 mg svake četiri nedelje (Q4W). U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 80%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 85%.

[0011] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obuhvata postupak snižavanja ApoB nivoa kod pacijenta, pri čemu taj postupak obuhvata davanje doze od najmanje jednog anti-PCSK9 antitela pacijentu kojem je to potrebno, i pri čemu se doza anti-PCSK9 antitela daje prema rasporedu odabranom iz grupe koju čine: (1) najmanje oko 14 mg svake nedelje (QW); (2) najmanje količina od oko 35 mg svake nedelje (QW); (3) najmanje količina od oko 70 mg svake druge nedelje (QW); (4) najmanje količina od oko 105 mg svake druge nedelje (QW); (5) najmanje količina od oko 140 mg svake druge nedelje (Q2W); (6) najmanje količina od oko 280 mg svake druge nedelje (Q2W); i (7) najmanje količina od oko 280 mg svake četiri nedelje (Q4W); (8) najmanje količina od oko 350 svake četiri nedelje (Q4W); (9) najmanje količina od oko 420 mg svake četiri nedelje (Q4W). U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 20%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 25%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 75%.

[0012] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obuhvata postupak snižavanja nivoa Lipoproteina A („Lp(a)“) kod pacijenta, pri čemu taj postupak obuhvata davanje doze od najmanje jednog anti-PCSK9 antitela pacijentu kojem je to potrebno, i pri čemu se doza anti-PCSK9 antitela daje prema rasporedu odabranom iz grupe koju čine: (1) najmanje oko 14 mg svake nedelje (QW); (2) najmanje količina od oko 35 mg svake nedelje (QW); (3) najmanje količina od oko 70 mg svake druge nedelje (QW); (4) najmanje količina od oko 105 mg svake druge nedelje (QW); (5) najmanje količina od oko 140 mg svake druge nedelje (Q2W); (6) najmanje količina od oko 280 mg svake druge nedelje (Q2W); i (7) najmanje količina od oko 280 mg svake četiri nedelje (Q4W); (8) najmanje količina od oko 350 svake četiri nedelje (Q4W); (9) najmanje količina od oko 420 mg svake četiri nedelje (Q4W). U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 10%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 15%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 20%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 25%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 65%.

[0013] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obuhvata postupak za lečenje ili prevenciju poremećaja povezanog sa holesterolom kod pacijenta, pri čemu taj postupak obuhvata davanje doze od oko 10 mg do oko 480 mg najmanje jednog ovde opisanog anti-PCSK9 antitela. U nekim načinima ostvarivanja, doza je oko 10 mg do oko 70 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela pacijentu kojem je to potrebno jednom nedeljno (QW). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 14 mg do oko 35 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela jednom nedeljno. U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 70 mg do oko 420 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela datog jednom svake 2 nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 70 mg do oko 350 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela svake 2 nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 105 mg do oko 350 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela svake 2 nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 140 mg do oko 280 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela svake dve nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 250 mg do oko 480 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela svake 4 nedelje (Q4W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 280 mg do oko 420 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela svake dvr nedelje (Q2W). U nekim načinima ostvarivanja, doza iznosi oko 350 mg do oko 420 mg najmanje jednog anti-PCSK9 antitela datog jednom svake druge nedelje (Q4W). U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 80%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 85%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je snižen za najmanje oko 90%. U nekim načinima ostvarivanja, poremećaj povezan sa holesterolom je hiperholesterolemija, hiperlipidemija ili dislipidemija.

[0014] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje postupak lečenja ili sprečavanja poremećaja povezanog sa holesterolom kod pacijenta, pri čemu postupak obuhvata davanje pacijentu kome je to potrebno, doze najmanje jednog anti-PCSK9 antitela, i pri čemu se ta doza anti-PCSK9 antitela daje prema rasporedu izabranom iz grupe koju čine: (1) najmanje oko 14 mg svake nedelje (QW); (2) najmanje količine od oko 35 mg svake nedelje (QW); (3) najmanje količine od oko 70 mg svake druge nedelje (QW); (4) najmanje količine od oko 105 mg svake druge nedelje (QW); (5) najmanje količine od oko 140 mg svake druge nedelje (Q2W); (6) najmanje količine od oko 280 mg svake druge nedelje (Q2W); i (7) najmanje količine od oko 280 mg svake četiri nedelje (Q4W); (8) najmanje količine od oko 350 svake četiri nedelje (Q4W); (9) najmanje količine od oko 420 mg svake četiri nedelje (Q4W). U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 80%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 85%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 90%.

[0015] U nekim načinima ostvarivanja, anti-PCSK9 antitelo je 21B12, 26H5, 31H4, 8A3, 11F1 i/ili 8A1.

[0016] U nekim načinima ostvarivanja, poremećaj povezan sa holesterolom je hiperholesterolemija, hiperlipidemija ili dislipidemija.

[0017] U nekim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje farmaceutske formulacije koje obuhvataju najmanje jedno anti-PCSK9 antitelo izabrano iz grupe koju čine 21B12, 26H5, 31H4, 8A3, 11F1 i 8A1.

[0018] Drugi načini ostvarivanja biće očigledni iz ovde obezbeđenog otkrivanja.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0019]

FIG.1A prikazuje sekvencu aminokiseline zrelog oblika od PCSK9 sa podvučenim prodomenom. FIG.1B1-1B4prikazuju sekvence aminokiseline i nukleinske kiseline od PCSK9 sa podvučenim pro-domenom i podebljanom signalnom sekvencom.

FIG.2A-2D su tabele za upoređivanje sekvenci različitih lakih lanaca različitih proteina za vezivanje antigena. FIG.2C je nastavak sekvence započete na FIG.2A. FIG.2D je nastavak sekvence započete na FIG.2B.

FIG.3A-3D su tabele za upoređivanje sekvenci različitih teških lanaca različitih proteina za vezivanje antigena. FIG.3C je nastavak sekvence započete na FIG.3A. FIG.3D je nastavak sekvence započete na FIG.3B.

FIG.3E-3JJ prikazuju sekvence aminokiseline i nukleinske kiseline za različite domene nekih načina ostvarivanja proteina za vezivanje antigena.

FIG.3KK prikazuje sekvence aminokiseline za različite konstantne domene.

FIG.3LL-3BBB prikazuju sekvence aminokiseline i nukleinske kiseline za različite domene nekih načina ostvarivanja proteina za vezivanje antigena.

FIG.3CCC-3JJJ su tabele za upoređivanje sekvenci različitih teških i lakih lanaca nekih načina ostvarivanja proteina za vezivanje antigena.

FIG.4A je kriva vezivanja proteina za vezivanje antigena sa humanim PCSK9.

FIG.4B je kriva vezivanja proteina za vezivanje antigena sa humanim PCSK9.

FIG.4C je kriva vezivanja proteina za vezivanje antigena sa PCSK9 makaki rakojeda.

FIG.4D je kriva vezivanja proteina za vezivanje antigena sa PCSK9 makaki rakojeda.

FIG.4E je kriva vezivanja proteina za vezivanje antigena sa mišjim PCSK9.

FIG.4F je kriva vezivanja proteina za vezivanje antigena sa mišjim PCSK9.

FIG.5A prikazuje rezultate SDS PAGE eksperimenta koji uključuje PCSK9 i različite proteine za vezivanje antigena koji demonstriraju relativnu čistoću i koncentraciju proteina.

FIG.5B i 5C prikazuju grafikone iz Biacore analize ekvilibrijuma rastvora za 21B12.

FIG.5D prikazuje grafikon kinetike iz Biacore analize zarobljavanja.

FIG.5E prikazuje trakasti grafikon koji demonstrira rezultate razvrstavanja za tri ABP-a.

FIG.6A je kriva inhibicije proteina za vezivanje antigena 31H4 IgG2 sa PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR analizi vezivanja

FIG.6B je kriva inhibicije proteina za vezivanje antigena 31H4 IgG4 sa PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR analizi vezivanja.

FIG.6C je kriva inhibicije proteina za vezivanje antigena 21B12 IgG2 sa PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR analizi vezivanja.

FIG.6D je kriva inhibicije proteina za vezivanje antigena 21B12 IgG4 sa PCSK9 u in vitro PCSK9:LDLR analizi vezivanja.

FIG.7A je kriva inhibicije proteina za vezivanje antigena 31H4 IgG2 u analizi ćelijske apsorpcije LDL koja pokazuje dejstvo ABP u smanjenju apsorpcije LDL koja blokira dejstvo PCSK9 FIG.7B je kriva inhibicije proteina za vezivanje antigena 31H4 IgG4 u analizi ćelijske apsorpcije LDL koja pokazuje dejstvo ABP u smanjenju apsorpcije LDL koja blokira dejstvo PCSK9 FIG.7C je kriva inhibicije proteina za vezivanje antigena 21B12 IgG2 u analizi ćelijske apsorpcije LDL koja pokazuje dejstvo ABP u smanjenju apsorpcije LDL koja blokira dejstvo PCSK9 FIG.7D je kriva inhibicije proteina za vezivanje antigena 21B12 IgG4 u analizi ćelijske apsorpcije LDL koja pokazuje dejstvo ABP u smanjenju apsorpcije LDL koja blokira dejstvo PCSK9 FIG.8A je grafikon koji prikazuje sposobnost ABP 31H4 da snižava holesterol u serumu kod miševa, sa promenama u odnosu na IgG kontrolne tretirane miševe (* p< 0,01).

FIG.8B je grafikon koji prikazuje sposobnost ABP 31H4 da snižava holesterol u serumu kod miševa, sa promenama u odnosu na vreme = nula sati (# p, 0,05).

FIG.8C je grafikon koji prikazuje dejstvo ABP 31H4 na nivoe HDL holesterola kod C57B1/6 miševa (* p< 0,01).

FIG.8D je grafikon koji prikazuje dejstvo ABP 31H4 na nivoe HDL holesterola kod C57B1/6 miševa (# p< 0,05).

FIG.9 prikazuje western blot analizu sposobnosti ABP 31H4 da pojačava količinu LDLR proteina u jetri prisutnog posle određenih vremenskih tačaka.

FIG.10A je grafikon koji prikazuje sposobnost proteina za vezivanje antigena 31H4 da snižava ukupan holesterol u serumu kod divljeg tipa miševa, relativno.

1

FIG.10B je grafikon koji prikazuje sposobnost proteina za vezivanje antigena 31H4 da snižava HDL kod divljeg tipa miševa.

FIG.10C je grafikon koji prikazuje sposobnost različitih proteina za vezivanje antigena 31H4 i 16F12 da snižavaju holesterol u serumu.

FIG.11A prikazuje protokol ubrizgavanja za testiranje trajanja i sposobnosti proteina za vezivanje antigena da snižava holesterol u serumu.

FIG.11B je grafikon koji prikazuje rezultate protokola na FIG.11A.

FIG.12A prikazuje nivoe LDLR kao odgovor na kombinaciju statina i ABP 21B12 u HepG2 ćelijama.

FIG.12B prikazuje nivoe LDLR kao odgovor na kombinaciju statina i ABP 31H4 u HepG2 ćelijama. FIG.12C prikazuje nivoe LDLR kao odgovor na kombinaciju statina i ABP 25A7.1, neneutralizujućeg antitela, (naspram „25A7“ neutralizujućeg antitela) u HepG2 ćelijama.

FIG.12D prikazuje nivoe LDLR kao odgovor na kombinaciju statina i ABP 21B12 u HepG2 ćelijama koje preterano eksprimiraju PCSK9.

FIG.12E prikazuje nivoe LDLR kao odgovor na kombinaciju statina i ABP 31H4 u HepG2 ćelijama koje preterano eksprimiraju PCSK9.

FIG.12F prikazuje nivoe LDLR kao odgovor na kombinaciju statina i ABP 25A7.1, neneutralizujućeg antitela, (naspram „25A7“ neutralizujućeg antitela) u HepG2 ćelijama koje preterano eksprimiraju PCSK9.

FIG.13A prikazuje različite sekvence aminokiseline lakog lanca različitih ABP-ova do PCSK9. Tačke (.) označavaju da nema aminokiselina.

FIG.13B prikazuje kladogram lakog lanca za različite ABP-ove do PCSK9.

FIG.13C prikazuje različite sekvence aminokiseline teškog lanca različitih ABP-ova do PCSK9. Tačke (.) označavaju da nema aminokiselina.

FIG.13D prikazuje dendrogram teškog lanca za različite ABP-ove do PCSK9.

FIG.13E prikazuje poređenje CDR-ova lakog i teškog lanca i konstruisanje grupa iz kojih se izvodi konsenzus.

FIG.13F prikazuje konsenzus sekvence za Grupe 1 i 2.

FIG.13G prikazuje konsenzus sekvence za Grupe 3 i 4.

FIG.13H prikazuje konsenzus sekvence za Grupe 1 i 2. Tačke (.) su označavale identične ostatke. FIG.13I prikazuje konsenzus sekvence za Grupu 2. Tačke (.) su označavale identične ostatke. FIG.13J prikazuje konsenzus sekvence za Grupe 3 i 4. Tačke (.) su označavale identične ostatke. FIG.14 je grafikon koji prikazuje smanjenje nivoa LDL-c kod pacijenata koji primaju višestruke doze anti-PCSK9 antitela (21B12).

FIG.15 je grafikon koji prikazuje smanjenje nivoa LDL-c kod pacijenata koji primaju niske do umerene i visoke doze statina i koji primaju višestruke doze anti-PCSK9 antitela (21B12).

FIG.16 je grafikon koji prikazuje smanjenje nivoa ApoB kod pacijenata koji primaju višestruke doze anti-PCSK9 antitela (21B12).

FIG.17 je trakasti grafikon koji prikazuje smanjenje nivoa lipoproteina a („Lp(a)“) kod pacijenata koji primaju niske do umerene i visoke doze statina i koji primaju višestruke doze anti-PCSK9 antitela (21B12).

FIG.18 je grafikon koji prikazuje smanjenje nivoa LDL-c kod pacijenata koji imaju heterozitognu porodičnu hiperholesterolemiju („HeFH“) i koji primaju višestruke doze anti-PCSK9 antitela (21B12).

FIG.19 je grafikon koji prikazuje smanjenje nivoa PCSK9 kod pacijenata koji imaju heterozigotnu porodičnu hiperholesterolemiju („HeFH“) i koji primaju višestruke doze anti-PCSK9 antitela (21B12).

FIG.20 je grafikon koji prikazuje smanjenje ukupnih nivoa holesterola kod pacijenata koji imaju heterozigotnu porodičnu hiperholesterolemiju („HeFH“) i koji primaju višestruke doze anti-PCSK9 antitela (21B12).

FIG.21 je grafikon koji prikazuje smanjenje nivoa ne-HDL holesterola kod pacijenata koji imaju heterozigotnu porodičnu hiperholesterolemiju („HeFH“) i koji primaju višestruke doze anti-PCSK9 antitela (21B12).

FIG.22 je grafikon koji prikazuje smanjenje nivoa ApoB kod pacijenata koji imaju heterozigotnu porodičnu hiperholesterolemiju („HeFH“) i koji primaju višestruke doze anti-PCSK9 antitela (21B12).

FIG.23 je trakasti grafikon koji prikazuje smanjenje lipoproteina a („Lp(a)“) kod pacijenata koji imaju heterozigotnu porodičnu hiperholesterolemiju („HeFH“) i koji primaju višestruke doze anti-PCSK9 antitela (21B12).

FIG.24A je grafikon koji prikazuje zbirne podatke koji se odnose na smanjenje LDL-C kod pacijenata iz četiri ispitivanja opisana u Primerima 22-25 koji su primili različite doze anti-PCSK9 antitela (21B12) svake druge nedelje (Q2W) tokom perioda od 12 nedelja.

FIG.24B je grafikon koji prikazuje zbirne podatke koji se odnose na smanjenje LDL-C kod pacijenata iz četiri ispitivanja opisana u Primerima 22-25 koji su primili različite doze anti-PCSK9 antitela (21B12) svake četiri nedelje (Q4W) tokom perioda od 12 nedelja.

FIG.25A je trakasti grafikon koji prikazuje zbirne podatke koji se odnose na smanjenje Lp(a) kod pacijenata iz četiri ispitivanja opisana u Primerima 22-25 koji su primili različite doze anti-PCSK9 antitela (21B12) bilo svake druge nedelje (Q2W) ili na svake 4 nedelje (Q4W) tokom perioda od 12 nedelja.

FIG.25B je trakasti grafikon koji prikazuje zbirne podatke koji se odnose na smanjenje HDL-C kod pacijenata iz četiri ispitivanja opisana u Primerima 22-25 koji su primili različite doze anti-PCSK9 antitela (21B12) bilo svake druge nedelje (Q2W) ili svake 4 nedelje (Q4W) tokom perioda od 12 nedelja.

FIG.25C je trakasti grafikon koji prikazuje zbirne podatke koji se odnose na smanjenje triglicerida kod pacijenata iz četiri ispitivanja opisana u Primerima 22-25 koji su primili različite doze anti-PCSK9 antitela (21B12) bilo svake druge nedelje (Q2W) ili svake 4 nedelje (Q4W) tokom perioda od 12 nedelja.

FIG.25D je trakasti grafikon koji prikazuje zbirne podatke koji se odnose na smanjenje VLDL-C kod pacijenata iz četiri ispitivanja opisana u Primerima 22-25 koji su primili različite doze anti-PCSK9 antitela (21B12) bilo svake druge nedelje (Q2W) ili svake 4 nedelje (Q4W) tokom perioda od 12 nedelja.

FIG.26 je trakasti grafikon koji prikazuje viskoznost formulacija anti-PCSK9 antitela (21B12) koje sadrže različite stabilizatore/ekscipijense.

FIG.27 je grafikon koji prikazuje da stabilizator/ekscipijens, prolin, ima sposobnost da snižava viskoznost formulacija anti-PCSK9 antitela (21B12) koje imaju visoke koncentracije proteina. FIG.28A je grafikon koji prikazuje viskoznost različitih koncentracija anti-PCSK9 antitela, 21B12, u formulaciji koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, i 9% saharoze pH 5,2 na 25°C i 40°C.

Fig.28B je grafikon koji prikazuje viskoznost različitih koncentracija anti-PCSK9 antitela, 21B12, u formulaciji koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, i 9% saharoze pH 5,2 na 25°C i 40°C, u poređenju sa formulacijom koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, 125 mM arginina, i 3% saharoze pH 5,0 na 25°C i 40°C.

Fig.28C je grafikon koji prikazuje viskoznost različitih koncentracija anti-PCSK9 antitela, 21B12, u formulaciji koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, i 9% saharoze pH 5,2 na 25°C i 40°C, u poređenju sa formulacijom koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, 100 mM metionina, i 4% saharoze pH 5,0 na 25°C i 40°C.

Fig.28D je grafikon koji prikazuje viskoznost različitih koncentracija anti-PCSK9 antitela, 21B12, u formulaciji koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, i 9% saharoze pH 5,2 na 25°C i 40°C, u poređenju sa formulacijom koja obuhvata 10 mM natrijumacetata i 250 mM prolina, pH 5,0 na 25°C i 40°C.

FIG.29A je trakasti grafikon koji prikazuje broj čestica od 10 µm u različitim formulacijama anti-PCSK9 antitela (tj., 21B12) tokom perioda od 6 meseci.

1

FIG.29B je trakasti grafikon koji prikazuje broj čestica od 25 µm u različitim formulacijama anti-PCSK9 antitela (tj., 21B12) tokom perioda od 6 meseci.

FIG.30A je trakasti grafikon koji prikazuje broj čestica od 10 µm u različitim formulacijama anti-PCSK9 antitela (tj., 11F1) tokom perioda od 4 meseca.

FIG.30B je trakasti grafikon koji prikazuje broj čestica od 25 µm u različitim formulacijama anti-PCSK9 antitela (tj.,11F1) tokom perioda od 4 meseca.

Fig.31 je grafikon koji ilustruje specifičnost vezivanja 11F1 u kompetitivnoj analizi sa PCSKP, PCSK2, PCSK1 PCSK7 i furinom sa OD450na vertikalnoj osi i koncentracijom PCSK9 (ug/ml) na horizontalnoj osi.

Fig.32 je grafikon koji prikazuje krivu doznog odgovora za inhibiciju vezivanja LDLR:D374Y PCSK9 za 11F1 u kompetitivnoj analizi sa OD450na vertikalnoj osi i Log [11F1] (pM) na horizontalnoj osi.

Fig.33 je grafikon koji prikazuje krivu doznog odgovora za inhibiciju vezivanja LDLR: WT PCSK9 sa 11F1 u kompetitivnoj analizi sa OD450na vertikalnoj osi i Log [11f1] (pM) na horizontalnoj osi. Fig.34 je grafikon koji prikazuje krivu doznog odgovora za sposobnost 11F1 da blokira PCSK9-posredovano smanjenje apsorpcije LDL humanog D374Y u HepG2 ćelijama sa relativnim fluorescentnim jedinicama (x10<4>) na vertikalnoj osi i Log [11F1] (nM) na horizontalnoj osi. Fig.35 je grafikon koji prikazuje krivu doznog odgovora za sposobnost 11F1 da blokira PCSK9-posredovano smanjenje apsorpcije LDL humanog WT u HepG2 ćelijama sa relativnim fluorescentnim jedinicama (x10<4>) na vertikalnoj osi i Log [11F1] (nM) na horizontalnoj osi. Fig.36 je trakasti grafikon koji prikazuje dejstvo 11F1 i 8A3 na ne-HDL holesterol u serumu kod miševa koji eksprimiraju humani PCSK9 pomoću AAV sa koncentracijom ne-HDL-C u serumu (mg/ml) na vertikalnoj osi i vremenom posle ubrizgavanja (dani) na horizontalnoj osi.

Fig.37 je trakasti grafikon koji prikazuje dejstvo 11F1 i 8A3 na ukupan holesterol u serumu kod miševa koji eksprimiraju humani PCSK9 by AAV sa ukupnim holesterolom u serumu (mg/ml) na vertikalnoj osi i vremenom posle ubrizgavanja (dani) na horizontalnoj osi.

Fig.38 je trakasti grafikon koji prikazuje dejstvo 11F1 i 8A3 na HDL holesterol (HDL-C) u serumu kod miševa koji eksprimiraju humani PCSK9 pomoću AAV sa HDL-C (mg/ml) na vertikalnoj osi i vremenom posle ubrizgavanja (dani) na horizontalnoj osi.

Fig.39 je grafikon koji prikazuje profile koncentracije IgG2, 8A3 i 11F1 antitela kod miševa koji eksprimiraju humani PCSK9 pomoću AAV sa koncentracijom antitela u serumu (ng/mL) na vertikalnoj osi i vremenom posle ubrizgavanja u danima na horizontalnoj osi.

Fig.40 je tabela koja sumira PK parametre za IgG2, 11F1 i 8A3 kod miševa koji eksprimiraju humani PCSK9 pomoću AAV.

Fig.41 je grafikon koji prikazuje dejstvo jednog subkutanog davanja anti-KLH antitela (kontrola), 21B12, 8A3 i 11F1 na koncentraciju LDL u serumu (LDL-C) kod makaki rakojeda sa LDL-C (mg/dl) na vertikalnoj osi i vremenom posle davanja u danima na horizontalnoj osi.

Fig.42 je grafikon koji prikazuje dejstvo jednog subkutanog davanja anti-KLH antitela (kontrola), 21B12, 8A3 i 11F1 na ukupan holesterol u serumu kod makaki rakojeda sa koncentracijom ukupnog holesterola (mg/dl) na vertikalnoj osi i vremenom posle davanja u danima na horizontalnoj osi.

Fig.43 je grafikon koji prikazuje dejstvo jednog subkutanog davanja anti-KLH antitela (kontrola), 21B12, 8A3 i 11F1 na HDL holesterol u serumu kod makaki rakojeda sa HDL-C (mg/dl) na vertikalnoj osi i vremenom posle davanja u danima na horizontalnoj osi.

Fig.44 je grafikon koji prikazuje dejstvo jednog subkutanog davanja anti-KLH antitela (kontrola), 21B12, 8A3 i 11F1 na trigliceride u serumu kod makaki rakojeda sa koncentracijom triglicerida u serumu (mg/dl) na vertikalnoj osi i vremenom posle davanja u danima na horizontalnoj osi. Fig.45 je grafikon koji prikazuje dejstvo jednog subkutanog davanja anti-KLH antitela (kontrola), 21B12, 8A3 i 11F1 na Apolipoprotein B (ApoB) kod makaki rakojeda sa koncentracijom APOB (mg/dl) na vertikalnoj osi i vremenom posle davanja u danima na horizontalnoj osi.

Fig.46 je grafikon koji prikazuje srednje farmakokinetičke profile za anti--KLH antitelo (kontrola), 21B12, 8A3 i 11F1 kod makaki rakojeda sa koncentracijama antitela (ng/ml) na vertikalnoj osi i vremenom posle davanja u danima na horizontalnoj osi.

Fig.47 je tabela koja sumira PK parametre za anti--KLH antitelo (kontrola), 21B12, 8A3 i 11F1 kod makaki rakojeda.

DETALJAN OPIS ODREĐENIH PRIMERNIH NAČINA OSTVARIVANJA

[0020] Proteini za vezivanje antigena (kao što su antitela i njihovi funkcionalni fragmenti vezivanja) koji se vezuju za PCSK9 su ovde opisani. U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena vezuju se za PCSK9 i sprečavaju funkcionisanje PCSK9 na različite načine. U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena blokiraju ili smanjuju sposobnost PCSK9 za interakciju sa drugim supstancama. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se vezuje za PCSK9 na način koji sprečava ili smanjuje verovatnoću da će se PCSK9 vezati za LDLR. U drugim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena se vezuju za PCSK9, ali ne blokiraju sposobnost PCSK9 za interakciju sa LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena su humana monoklonalna antitela.

[0021] Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, u svetlu ovog otkrivanja, izmena interakcija između PCSK9 i LDLR može povećati količinu LDLR dostupnog za vezivanje sa LDL, čime se smanjuje količina LDL

1

u serumu subjekta, što dovodi do smanjenja nivoa holesterola u serumu subjekta. Kao takvi, proteini za vezivanje antigena sa PCSK9 mogu se koristiti u različitim postupcima i formulacijama za lečenje subjekata sa povišenim nivoima holesterola u serumu, pod rizikom od povišenih nivoa holesterola u serumu, ili koji bi mogli da imaju koristi od smanjenja nivoa holesterola u njihovom serumu. Stoga, različiti postupci i tehnike za snižavanje, održavanje, ili sprečavanje povećanja holesterola u serumu su takođe ovde opisani. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena omogućava vezivanje između PCSK9 i LDLR, ali protein za vezivanje antigena sprečava ili smanjuje negativnu aktivnost PCSK9 na LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena sprečava ili smanjuje vezivanje PCSK9 za LDLR.

[0022] Radi pogodnosti, sledeći odeljci generalno skiciraju različita značenja ovde korišćenih pojmova. Posle ovog dela, govori se o generalnim aspektima koji se tiču proteina za vezivanje antigena, posle čega slede konkretni primeri koji demonstriraju karakteristike različitih načina ostvarivanja proteina za vezivanje antigena i načini na koji se mogu koristiti.

Definicije i načini ostvarivanja

[0023] Treba razumeti da su i prethodni opšti opis i detaljan opis u nastavku samo primerni i u funkciji objašnjenja i ne ograničavaju ovaj pronalazak na patentne zahteve. U ovoj prijavi, upotreba jednine uključuje i množinu, osim ako je drugačije naznačeno. U ovoj prijavi, upotreba reči „ili“ označava „i/ili“, osim ako je drugačije naznačeno. Dalje, upotreba pojma „uključujući“, kao i drugih oblika, kao što su „uključuje“ i „uključeni“, nije ograničavajuća. Takođe, pojmovi kao što su „element“ ili „komponenta“ obuhvataju i elemente i komponente koji obuhvataju jednu jedinicu i elemente i komponente koji obuhvataju više od jedne podjedinice, osim ako je drugačije naznačeno. Takođe, upotreba pojma „deo“ može uključivati deo grupe ili celu grupu.

[0024] Ovde upotrebljena zaglavlja odeljaka su samo u organizacione svrhe i ne treba ih tumačiti tako da ograničavaju opisanu temu. Kako se koriste u skladu sa ovim otkrivanjem, shvata se da sledeći pojmovi, osim ako je drugačije naznačeno, imaju sledeća značenja:

Pojam „proproteinska konvertaza subtilizin keksin tipa 9“ ili „PCSK9“ se odnosi na polipeptid kako je utvrđeno u SEQ ID NO: 1 i/ili 3 ili njihovim fragmentima, kao i na povezane polipeptide, koji uključuju, ali nisu ograničeni na aleličke varijante, splajsovane varijante, izvedene varijante, supstitucione varijante, varijante delecija, i/ili varijante ubacivanja koje uključuju dodavanje metionina N-terminusa, fuzionih polipeptida, i homologa međuvrsta. U određenim načinima ostvarivanja, PCSK9 polipeptid uključuje ostatke terminusa, kao što su, ali bez ograničenja na ostatke liderske sekvence, ciljne ostatke, ostatke metionina amino terminusa, lizinske ostatke, tag ostatke i/ili ostatke fuzionog proteina. „PCSK9“ se takođe navodi kao FH3, NARC1, HCHOLA3, proproteinska konvertaza subtilizin/keksin tipa 9, i konvertaza regulisana neuralnom apoptozom 1. PCSK9 gen kodira protein proproteinske konvertaze koji

1

pripada podporodici proteinaze K porodice sekretorne subtilaze. Pojam „PCSK9“ označava i proprotein i proizvod generisan posle autokatalize proproteina. Kada se navodi samo autokatalizovani proizvod (kao što su proteini za vezivanje antigena koji se selektivno vezuje za razloženi PCSK9), protein se može navesti kao „zreo“, „razložen“, „obrađen“ ili „aktivan“ PCSK9. Kada se navodi samo neaktivni oblik, protein se može navesti kao „neaktivan“, „pro-oblik“, ili „neobrađen“ oblik PCSK9. Pojam PCSK9 kako se ovde koristi takođe uključuje prirodne alele, kao što su mutacija D374Y, S127R i F216L. Pojam PCSK9 takođe obuhvata PCSK9 molekule koji uključuju post-translacione modifikacije PCSK9 sekvence aminokiseline, kao što su PCSK9 sekvence koje su glikolizovane, PEG-ilisane, PCSK9 sekvenci iz kojih je njihova signalna sekvenca razložena, PCSK9 sekvence iz koje je njen pro domen razložen sa katalitičkog domena, ali nije razdvojen od katalitičkog domena (npr., FIG.1A i 1B).

Pojam „aktivnost PCSK9“ uključuje bilo kakvo biološko dejstvo PCSK9. U određenim načinima ostvarivanja, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 za interakciju ili vezivanje za supstrat ili receptor. U nekim načinima ostvarivanja, aktivnost PCSK9 je predstavljena sposobnošću PCSK9 da se vezuje za LDL receptor (LDLR). U nekim načinima ostvarivanja, PCSK9 se vezuje za i katalizuje reakciju koja uključuje LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da menja (npr., smanjuje) dostupnost LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da povećava količinu LDL kod subjekta. U nekim načinima ostvarivanja, aktivnost PCSK9 uključuje sposobnost PCSK9 da smanjuje količinu LDLR koja je dostupna za vezivanje za LDL. U nekim načinima ostvarivanja, „aktivnost PCSK9“ uključuje bilo kakvu biološku aktivnost koja nastaje kao rezultat signalizacije PCSK9. Primerne aktivnosti uključuju, ali nisu ograničene na vezivanje PCSK9 za LDLR, enzimsku aktivnost PCSK9 koja razlaže LDLR ili druge proteine, vezivanje PCSK9 za proteine koji nisu LDLR koji olakšavaju akciju PCSK9, PCSK9 izmenu APOB sekrecije (Sun X-M et al, "Evidence for effect of mutant PCSK9 on apoliprotein B secretion as the cause of unusually severe dominant hypercholesterolemia, Human Molecular Genetics 14: 1161-1169, 2005 and Ouguerram K et al, "Apolipoprotein B100 metabolism in autosomal-dominant hypercholesterolemia related to mutations in PCSK9, Arterioscler thromb Vasc Biol.24: 1448-1453, 2004), ulogu PCSK9 u regeneraciji jetre i diferencijaciji neuronskih ćelija (Seidah NG et al, "The secretory proprotein convertase neural apoptosisregulated convertase 1 (NARC-1): Liver regeneration and neuronal differentiation" PNAS 100: 928-933, 2003), i ulogu PCSK9 u metabolizmu hepatske glukoze (Costet et al., "Hepatic PCSK9 expression is regulated by nutritional status via insulin and sterol regulatory element-binding protein lc" J. Biol.

Chem.281(10):6211-18, 2006).

Pojam „hiperholesterolemija“, kako se ovde koristi, se odnosi na stanje u kojem su nivoi holesterola povišeni iznad željenog nivoa. U nekim načinima ostvarivanja, ovo znači da su nivoi holesterola u

1

serumu povišeni. U nekim načinima ostvarivanja, željeni nivo uzima u obzir različite „faktore rizika“ koji su očigledni stručnjaku iz ove oblasti (i ovde su opisani ili se na njih poziva).

Pojam „polinukleotid“ ili „nukleinska kiselina“ uključuje i jednolančane i dvolančane nukleotidne polimere. Nukleotidi koji obuhvataju polinukleotid mogu biti ribonukleotidi ili dezoksiribonukleotidi ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Navedene modifikacije uključuju modifikacije baze kao što su derivati bromouridina i inozina, modifikacije riboze kao što je 2',3'-didezoksiriboza, i modifikacije internukleotidne veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat i fosforoamidat.

Pojam „oligonukleotid“ označava polinukleotid koji obuhvata 200 ili manje nukleotida. U nekim načinima ostvarivanja, oligonukleotidi imaju 10 ili 60 baza po dužini. U drugim načinima ostvarivanja, oligonukleotidi imaju 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 do 40 nukleotida po dužini. Oligonukleotidi mogu biti jednolančani ili dvolančani, npr., za upotrebu u izgradnji mutantnog gena. Oligonukleotidi mogu biti smisaoni ili antismisaoni oligonukleotidi. Oligonukleotid može uključivati oznaku, uključujući radio oznaku, fluorescentnu oznaku, hapten ili antigensku oznaku, za analize detekcije. Oligonukleotidi se mogu koristiti, na primer, kao PCR prajmeri, prajmeri kloniranja ili sonde za hibridizaciju.

„Izolovani molekul nukleinske kiseline“ označava DNK ili RNK genomskog, mRNK, cDNK, ili sintetičkog porekla ili neku njihovu kombinaciju koja nije povezana sa svim ili delom polinukleotida u kojem se izolovani polinukleotid nalazi u prirodi, ili je povezana sa polinukleotidom sa kojim nije povezana u prirodi. U svrhu ovog otkrivanja, treba razumeti da „molekul nukleinske kiseline koji obuhvata“ određenu nukleotidnu sekvencu ne obuhvata netaknute hromozome. Izolovani molekuli nukleinske kiseline „koji obuhvataju“ naznačene sekvence nukleinske kiseline mogu uključivati, pored naznačenih sekvenci, sekvence kodiranja za do deset ili čak do dvadeset drugih proteina ili njihovih delova, ili mogu uključivati operativno povezane regulatorne sekvence koje kontrolišu ekspresiju regiona kodiranja naznačenih sekvenci nukleinske kiseline, i/ili mogu uključivati sekvence vektora.

Osim ako je drugačije naznačeno, levi kraj bilo koje ovde pomenute sekvence jednolančanog polinukleotida je 5' kraj; levi pravac sekvenci dvolančanog polinukleotida se navodi kao 5' pravac. Pravac 5' do 3' dodavanja razvijajućih RNK transkripata se navodi kao pravac transkripcije; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao i RNK transkript koji su 5' do 5' kraj RNK transkripta se navode kao „uzvodne sekvence“; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao i RNK transkript koji su 3' do 3' kraj RNK transkripta se navode kao „nizvodne sekvence“.

Pojam „kontrolna sekvenca“ se odnosi na polinukleotidnu sekvencu koja može da utiče na ekspresiju i obradu sekvenci kodiranja sa kojima je lizirana. Priroda takvih kontrolnih sekvenci može da zavisi od organizma domaćina. U određenim načinima ostvarivanja, kontrolne sekvence za prokariote mogu uključivati promoter, mesto ribozomnog vezivanja, i sekvencu završetka transkripcije. Na primer,

1

kontrolne sekvence za eukariote mogu uključivati promotere koji obuhvataju jedno ili više mesta prepoznavanja za faktore transkripcije, sekvence pojačivača transkripcije, i sekvencu završetka transkripcije. „Kontrolne sekvence“ mogu uključivati liderske sekvence i/ili fuzione partnerske sekvence. Pojam „vektor“ označava bilo koji molekul ili entitet (npr., nukleinska kiselina, plazmid, bakteriofag ili virus) koji se koristi za prenos informacija o kodiranju proteina u ćeliju domaćina.

Pojam „ekspresioni vektor“ ili „ekspresioni konstrukt“ se odnosi na vektor koji je pogodan za transformaciju ćelije domaćina i sadrži sekvence nukleinske kiseline koje usmeravaju i/ili kontrolišu (u vezi sa ćelijom domaćina) ekspresiju jednog ili više heterolognih regiona kodiranja operativno povezanih sa njim. Ekspresioni konstrukt može uključivati, ali nije ograničen na sekvence koje utiču na ili kontrolišu transkripciju, translaciju i, ako su prisutni introni, utiču na RNK splajsovanje regiona kodiranja operativno povezanog sa njim.

Kako se ovde koristi, „operativno povezan“ označava da su komponente na koje se pojam odnosi u odnosu koji im omogućava da sprovode svoje inherentne funkcije pod pogodnim uslovima. Na primer, kontrolna sekvenca u vektoru koja je „operativno povezana“ sa sekvencom kodiranja proteina je lizirana sa njim tako da se ekspresija sekvence kodiranja proteina ostvaruje pod uslovima kompatibilnim sa transkripcionom aktivnošću kontrolnih sekvenci.

Pojam „ćelija domaćina“ označava ćeliju koja je transformisana, ili može da se transformiše, sa sekvencom nukleinske kiseline i time eksprimira gen od interesa. Ovaj pojam uključuje izdanak majkećelije, bez obzira na to da li je izdanak po morfologiji ili genotipu identičan sa prvobitnom majkomćelijom, sve dok je gen od interesa prisutan.

Pojam „transfekcija“ označava apsorpciju strane ili egzogene DNK od strane ćelije, a ćelija je „transfektovana“ kada se egzogena DNK uvede u ćelijsku membranu. Više tehnika transfekcije je dobro poznato u ovoj oblasti i ovde su opisane. Pogledati, npr., Graham et al., 1973, Virology 52:456;

Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13:197. Takve tehnike mogu se koristiti za uvođenje jednog ili više delova egzogene DNK u pogodne ćelije domaćina.

Pojam „transformacija“ se odnosi na promenu genetskih karakteristika ćelije, a ćelija je transformisana kada se modifikuje da bi sadržala novu DNK ili RNK. Na primer, ćelija je transformisana tamo gde je genetski modifikovana iz matičnog stanja uvođenjem novog genetskog materijala transfekcijom, transdukcijom ili drugim tehnikama. Nakon transfekcije ili transdukcije, transformišuća DNK može da se rekombinuje sa kiselinom ćelije fizičkim integrisanjem u hromozom ćelije, ili se može prelazno održavati kao epizomalni element bez replikacije, ili se može nezavisno replicirati kao plazmid. Smatra se da je ćelija „stabilno transformisana“ kada se transformišuća DNK replicira ćelijskom deobom.

1

Pojmovi „polipeptid“ ili „protein“ označavaju makromolekul koji ima sekvencu aminokiseline prirodnog proteina, odnosno, proteina kojeg proizvodi prirodna i ne-rekombinantna ćelija; ili ga proizvodi genetski konstruisana ili rekombinantna ćelija, i obuhvata molekule koji imaju sekvencu aminokiseline prirodnog proteina, ili molekule koji imaju delecije iz, dodavanja u, i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina prirodne sekvence. Ovaj pojam takođe uključuje polimere aminokiseline u kojima su jedna ili više aminokiselina hemijski analozi odgovarajuće prirodne aminokiseline i polimera. Pojmovi „polipeptid“ i „protein“ konkretno obuhvataju PCSK9 protein za vezivanje antigena, antitela, ili sekvence koje imaju delecije iz, dodavanja u, i/ili supstitucije jedne ili više aminokiselina proteina za vezivanje antigena. Pojam „fragment polipeptida“ se odnosi na polipeptid koji ima deleciju amino-terminusa, deleciju karboksil-terminusa, i/ili unutrašnju deleciju u poređenju sa prirodnim proteinom pune dužine. Takvi fragmenti mogu takođe da sadrže modifikovane aminokiseline u poređenju sa prirodnim proteinom. U određenim načinima ostvarivanja, fragmenti su dugački oko pet do 500 aminokiselina. Na primer, fragmenti mogu biti dugački najmanje 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400, ili 450 aminokiselina. Korisni fragmenti polipeptida uključuju imunološki funkcionalne fragmente antitela, uključujući domene vezivanja. U slučaju antitela koje se vezuje za PCSK9, fragmenti koji se koriste uključuju, ali nisu ograničeni na CDR region, promenljivi domen teškog i/ili lakog lanca, deo lanca antitela ili samo njegov promenljivi region koji uključuje dva CDR-a, i slično.

Pojam "izolovani protein" označava da je predmetni protein (1) oslobođen najmanje nekih drugih proteina sa kojima bi se inače pronašao, (2) je suštinski oslobođen drugih proteina iz istog izvora, npr., iz iste vrste, (3) je eksprimiran od strane ćelije iz različite vrste, (4) je odvojen od najmanje oko 50 procenata polinukleotida, lipida, ugljenih hidrata, ili drugih materijala sa kojima je povezan u prirodi, (5) je operativno povezan (kovalentnom il nekovalentnom interakcijom) sa polipeptidom sa kojim nije povezan u prirodi, ili (6) se ne javlja u prirodi. Obično, „izolovani protein“ čini najmanje oko 5%, najmanje oko 10%, najmanje oko 25%, ili najmanje oko 50% datog uzorka. Genomska DNK, cDNK, mRNK ili druga RNK, sintetičkog porekla, ili bilo koja njihova kombinacija može da kodira takav izolovani protein. Poželjno, izolovani protein je suštinski oslobođen proteina ili polipeptida ili drugih kontaminanata koji se nalaze u njegovom prirodnom okruženju koji bi ometali njegovu terapijsku, dijagnostičku, profilaktičku, istraživačku ili drugu upotrebu.

Pojam „aminokiselina“ uključuje njegovo uobičajeno značenje u ovoj oblasti.

„Varijanta“ polipeptida (npr., protein za vezivanje antigena, ili antitelo) obuhvata sekvencu aminokiseline, pri čemu se jedan ili više ostataka aminokiseline ubacuju u, brišu iz i/ili supstituišu u sekvenci aminokiseline u odnosu na drugu sekvencu polipeptida. Varijante uključuju fuzione proteine. Pojam „identičnost“ se odnosi na odnos između sekvenci dva ili više molekula polipeptida ili dva ili više molekula nukleinske kiseline, kako je utvrđeno poravnavanjem i upoređivanjem sekvenci. „Procentualna

2

identičnost“ označava procenat identičnih ostataka između aminokiselina ili nukleotida u upoređenim molekulima i izračunava se na osnovu veličine najmanjeg od molekula koji se porede. Za ova izračunavanja, praznine u poravnanjima (ako ih ima) se poželjno navode po određenom matematičkom modelu ili kompjuterskom programu (tj., „algoritam“). Postupci koji se mogu koristiti za izračunavanje identičnosti poravnatih nukleinskih kiselina ili polipeptida uključuju one opisane u Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Human Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press;

Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press; and Carillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math.48:1073.

[0025] Prilikom izračunavanja procentualne identičnosti, sekvence koje se porede se obično poravnavaju na način kojim se ostvaruje najveće uklapanje između sekvenci. Jedan primer kompjuterskog programa koji se može koristiti za utvrđivanje procentualne identičnosti je GCG programski paket, koji uključuje GAP (Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res.12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI). Kompjuterski algoritam GAP se koristi za poravnavanje dva polipeptida ili polinukleotida za koje treba utvrditi procentualnu identičnost sekvenci. Sekvence se poravnavaju za optimalno uklapanje njihove respektivne aminokiseline ili nukleotida („uklopljeni opseg“, kako je utvrđeno algoritmom). Vrednost otvaranja praznina (koja se izračunava kao 3x prosečne dijagonale, pri čemu „prosečna dijagonala“ predstavlja prosek dijagonale uporedne matrice koja se koristi; „dijagonala“ je rezultat ili broj dodeljen svakom savršenom spoju aminokiseline od određene uporedne matrice) i vrednost proširenja praznina (koja je obično 1/10 puta veća od vrednosti otvaranja praznina), kao i uporedna matrica kao što je PAM 250 ili BLOSum 62 se koriste u vezi sa algoritmom. U određenim načinima ostvarivanja, algoritam takođe koristi standardnu uporednu matricu (pogledati, Dayhoff et al., 1978, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 for the PAM 250 comparison matrix; Henikoff et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:10915-10919 for the BLOSum 62 comparison matrix).

[0026] Primeri parametara koji se mogu koristiti za utvrđivanje procentualne identičnosti za polipeptide ili nukleotidne sekvence pomoću GAP programa su sledeći:

● Algoritam: Needleman et al., 1970, J. Mol. Biol.48:443-453

● Uporedna matrica: BLOSum 62 from Henikoff et al., 1992, supra

● Vrednost praznina: 12 (ali bez vrednosti za praznine kraja)

● Vrednost praznina po dužini: 4

● Prag sličnosti: 0

[0027] Određene šeme poravnavanja za poravnavanje dve sekvence aminokiseline mogu da dovedu do spajanja samo jednog kratkog regiona dve sekvence, a ovaj mali poravnati region može imati veoma visoku identičnost sekvenci, čak i ako ne postoji značajniji odnos između dve sekvence pune dužine. U skladu sa tim, odabrani postupak poravnavanja (GAP program) može da se podesi po želji kako bi doveo do poravnanja koje obuhvata najmanje 50 ili drugi broj susednih aminokiselina ciljnog polipeptida.

[0028] Kako se ovde koristi, dvadeset konvencionalnih (npr., prirodnih) aminokiselina i njihove skraćenice prate konvencionalnu upotrebu. Pogledati Immunology--A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub and D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr., D-aminokiseline) dvadeset konvencionalnih aminokiselina, neprirodne aminokiseline kao što su α-, αdisupstituisane aminokiseline, N-alkil aminokiselina, mlečna kiselina, i druge nekonvencionalne aminokiseline takođe mogu biti pogodne komponente za polipeptide ovog pronalaska. Primeri nekonvencionalnih aminokiselina uključuju: 4-hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε-N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin, i druge slične aminokiseline i iminokiseline (npr., 4-hidroksiprolin). U notaciji polipeptida koja se ovde koristi, levi pravac je pravac amino terminusa, a desni pravac je pravac karboksi-terminusa, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.

[0029] Slično tome, osim ako je drugačije naznačeno, levi kraj jednolančanih polinukleotidnih sekvenci je 5' kraj; levi pravac dvolančanih polinukleotidnih sekvenci se navodi kao 5' pravac. Pravac 5' do 3' dodavanja razvijajućih RNK transkripata se navodi kao pravac transkripcije; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 5' do 5' kraj RNK transkripta se navode kao „uzvodne sekvence“; regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 3' do 3' kraj RNK transkripta se navode kao „nizvodne sekvence“.

[0030] Konzervativne supstitucije aminokiseline mogu obuhvatati ostatke neprirodne aminokiseline, koji su obično uključeni sintezom hemijskih peptida, a ne sintezom u biološkim sistemima. One uključuju peptidomimetike i druge reverzne ili invertovane oblike grupa aminokiseline.

[0031] Prirodni ostaci se mogu podeliti u klase na osnovu zajedničkih karakteristika bočnog lanca:

1) hidrofobni: norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

2) neutralni hidrofilni: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) kiseli: Asp, Glu;

4) bazni: His, Lys, Arg;

5) ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i

6) aromatični: Trp, Tyr, Phe.

Na primer, nekonzervativne supstitucije mogu uključivati razmenu člana jednog od ovih klasa za člana druge klase. Takvi supstituisani ostaci mogu se uvesti, na primer, u regione humanog antitela koji su homologni sa ne-humanim antitelima, ili u nehomologne regione molekula.

[0032] Prilikom izmena proteina za vezivanje antigena ili PCSK9 proteina, prema određenim načinima ostvarivanja, može se uzeti u obzir hidropatski indeks aminokiseline. Svakoj aminokiselini je dodeljen hidropatski indeks na osnovu njene hidrofobičnosti i karakteristika naboja. To su: izoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin (+3,8); fenilalanin (+2,8); cistein/cistin (+2,5); metionin (+1,9); alanin (+1,8); glicin (-0,4); treonin (-0,7); serin (-0,8); triptofan (-0,9); tirozin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamat (-3,5); glutamin (-3,5); aspartat (-3,5); asparagin (-3,5); lizin (-3,9); i arginin (-4,5).

[0033] Važnost hidropatskog indeksa aminokiseline za raspodelu interaktivne biološke funkcije na proteinu je shvaćena u ovoj oblasti. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Poznato je da određene aminokiseline mogu biti supstituisane drugim aminokiselinama koje imaju sličan hidropatski indeks ili rezultat i zadržavaju sličnu biološku aktivnost. Prilikom izmena na osnovu hidropatskog indeksa, u određenim načinima ostvarivanja, supstitucija aminokiselina čiji hidropatski indeksi su u okviru ±2 je uključena. U određenim načinima ostvarivanja, oni koji su u okviru ±1 su uključeni, a u određenim načinima ostvarivanja uključeni su oni u okviru ±0,5.

[0034] U ovoj oblasti je takođe shvaćeno da supstitucija sličnih aminokiselina može biti efektivno izvedena na osnovu hidrofilnosti, naročito ako je protein sa biološkom funkcijom ili na taj način kreiran peptid predviđen za upotrebu u imunološkim načinima ostvarivanja, kao u ovom slučaju. U određenim načinima ostvarivanja, najveća lokalna prosečna hidrofilnost proteina, prema hidrofilnosti njegovih susednih aminokiselina, je u korelaciji sa njegovom imunogeničnošću i antigeničnošću, tj., sa biološkom karakteristikom proteina.

[0035] Sledeće hidrofilne vrednosti su dodeljene ovim ostacima aminokiseline: arginin (+3,0); lizin (+3,0); aspartat (+3,0 ± 1); glutamat (+3,0 ± 1); serin (+0,3); asparagin (+0,2); glutamin (+0,2); glicin (0); treonin (-0,4); prolin (-0,5 ± 1); alanin (-0,5); histidin (-0,5); cistein (-1,0); metionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); izoleucin (-1,8); tirozin (-2,3); fenilalanin (-2,5) i triptofan (-3,4). Prilikom izmena na osnovu sličnih hidrofilnih vrednosti, u određenim načinima ostvarivanja, supstitucija aminokiselina čije hidrofilne vrednosti su u okviru ±2 je uključena, u određenim načinima ostvarivanja one koje su u okviru ±1 su uključene, a u određenim načinima ostvarivanja one u okviru ±0,5 su uključene. Mogu se takođe identifikovati epitopi iz primarnih sekvenci aminokiseline na osnovu hidrofilnosti. Ovi regioni se takođe navode kao „regioni jezgra epitopa“.

[0036] Primerne supstitucije aminokiseline su utvrđene u tabeli 1.

2

TABELA 1

Pojam „derivat“ se odnosi na molekul koji uključuje hemijsku modifikaciju koja ne uključuje ubacivanje, deleciju, ili supstituciju aminokiselina (ili nukleinskih kiselina). U određenim načinima ostvarivanja, derivati uključuju kovalentne modifikacije, uključujući, ali bez ograničenja na hemijsko vezivanje sa polimerima, lipidima, ili drugim organskim ili neorganskim delovima. U određenim načinima ostvarivanja, hemijski modifikovani protein za vezivanje antigena može imati veće cirkulišući poluživot od proteina za vezivanje antigena koji nije hemijski modifikovan. U određenim načinima ostvarivanja, hemijski modifikovani protein za vezivanje antigena može imati poboljšan kapacitet ciljanja za željene ćelije, tkiva, i/ili organe. U nekim načinima ostvarivanja, izvedeni protein za vezivanje antigena je kovalentno modifikovan da uključuje jedan ili više polimernih dodataka rastvorljivih u vodi, uključujući, ali bez ograničenja na polietilenglikol, polioksietilenglikol, ili polipropilenglikol. Pogledati, npr., U.S. Patent Nos.: 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 i 4,179,337. U određenim načinima ostvarivanja, derivat proteina za vezivanje antigena obuhvata jedan ili više polimera, uključujući, ali bez ograničenja na monometoksi-polietilenglikol, dekstran, celulozu, ili druge polimere na bazi ugljenih hidrata, poli-(N-vinil pirolidon)-polietilenglikol, homopolimere propilen glikola, polipropilen oksid/etilen oksid ko-polimer, polioksietilisane poliole (npr., glicerol) i polivinil alkohol, kao i kompozicije takvih polimera.

U određenim načinima ostvarivanja, derivat je kovalentno modifikovan sa podjedinicama polietilenglikola (PEG). U određenim načinima ostvarivanja, jedan ili više polimera rastvorljivih u vodi se vezuje u jednom ili više konkretnih položaja, na primer na amino terminusu, derivata. U određenim načinima ostvarivanja, jedan ili više polimera rastvorljivih u vodi se nasumično postavlja na jedan ili više bočnih lanaca derivata. U određenim načinima ostvarivanja, PEG se koristi da poboljša terapijski kapacitet za protein za vezivanje antigena. U određenim načinima ostvarivanja, PEG se koristi da poboljša terapijski kapacitet za humanizovano antitelo. Određeni takvi postupci se navode, na primer, u U.S. Patent No.6,133,426.

Analozi peptida se obično koriste u farmaceutskoj industriji kao ne-peptidni lekovi sa karakteristikama sličnim onima od uzorka peptida. Ovi tipovi ne-peptidnih jedinjenja se nazivaju „mimetici peptida“ ili „peptidomimetici“. Fauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29 (1986); Veber & Freidinger, TINS, p.392 (1985); and Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229 (1987). Takva jedinjenja se često razvijaju uz pomoć kompjuterizovanog molekulskog modelovanja. Mimetici peptida koji su strukturno slični terapijski korisnim peptidima mogu se koristiti za proizvodnju sličnog terapijskog ili profilaktičkog dejstva.

Generalno, peptidomimetici su strukturno slični paradigmatskom polipeptidu (tj., polipeptidu koji poseduje biohemijsku karakteristiku ili farmakološku aktivnost), kao što je humano antitelo, ali imaju jednu ili više peptidnih veza koje opciono zamenjuje veza odabrana od: --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH-(cis i trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2--, i --CH2SO--, pomoću postupaka dobro poznatih u ovoj oblasti. Sistematska supstitucija jedne ili više aminokiselina konsenzus sekvence sa D-aminokiselinom istog tipa (npr., D-lizin na mestu L-lizina) može se koristiti u određenim načinima ostvarivanja kako bi se generisali stabilniji peptidi. Pored toga, zadržani peptidi koji obuhvataju konsenzus sekvencu ili suštinski identičnu varijaciju konsenzus sekvence mogu se generisati pomoću postupaka poznatih u ovoj oblasti (Rizo and Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387 (1992)); na primer, dodavanjem unutrašnjih ostataka cisteina koji mogu da formiraju intramolekulske disulfidne mostove koji ciklizuju peptid.

2

Pojam „prirodni“ kako se koristi u specifikaciji u vezi sa biološkim materijalima kao što su polipeptidi, nukleinske kiseline, ćelija domaćina, i slično, se odnosi na materijale koji se nalaze u prirodi ili oblik materijala koji se nalazi u prirodi.

„Protein za vezivanje antigena“ („ABP“) kako se ovde koristi označava bilo koji protein koji vezuje naznačeni ciljni antigen. U ovoj prijavi, naznačeni ciljni antigen je PCSK9 protein ili njegov fragment. „Protein za vezivanje antigena“ uključuje, ali nije ograničen na antitela njihove vezne delove, kao što su imunološki funkcionalni fragmenti. Peptitela su još jedan primer proteina za vezivanje antigena. Pojam „imunološki funkcionalan fragment“ (ili jednostavno „fragment“) antitela ili protein za vezivanje antitela lanca imunoglobulina (teški 27 ili laki lanac), kako se ovde koristi, je vrsta proteina za vezivanje antigena koji obuhvata deo (bez obzira na to kako je taj deo dobijen ili sintetizovan) antitela kojem nedostaje najmanje neka od aminokiselina prisutnih u lancu pune dužine, ali koje i dalje može da se specifilno vezuje za antigen. Takvi fragmenti su biološki aktivni po tome što se vezuju za ciljni antigen i mogu se takmičiti sa drugim proteinima za vezivanje antigena, uključujući netaknuta antitela, za vezivanje sa datim epitopom. U nekim načinima ostvarivanja, fragmenti su neutralizujući fragmenti. U nekim načinima ostvarivanja, fragmenti mogu da blokiraju ili smanje verovatnoću interakcije između LDLR i PCSK9. U jednom aspektu, takav fragment će zadržati najmanje jedan CDR prisutan u lakom ili teškom lancu pune dužine, a u nekim načinima ostvarivanja će obuhvatati jedan teški lanac i/ili laki lanac ili njegov deo. Ovi biološki aktivni fragmenti mogu da se proizvedu pomoću rekombinantnih DNK tehnika, ili se mogu da se proizvedu enzimskim ili hemijskim razlaganjem proteina za vezivanje antigena, uključujući netaknuta antitela. Imunološki funkcionalni fragmenti imunoglobulina uključuju, ali nisu ograničeni na Fab, diatelo (promenljivi domen teškog lanca na istom polipeptidu kao promenljivi domen lakog lanca, povezan preko veznika kratkog peptida koji je prekratak da bi omogućio uparivanje između dva domena na istom lancu), Fab', F(ab')2, Fv, antitela domena i jednolančana antitela, i mogu da se izvedu iz bilo kog sisarskog izvora, uključujući, ali bez ograničenja na ljude, miševe, pacove, kamile ili zečeve. Dalje se razmatra da se ovde opisan funkcionalni deo proteina za vezivanje antigena, na primer, jedan ili više CDR-ova, može kovalentno da se veže za drugi protein ili za mali molekul kako bi se kreirao terapijski agens usmeren na određeni cilj u telu, koji poseduje bifunkcionalne terapijske karakteristike, ili koji poseduje produženi poluživot u serumu. Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, protein za vezivanje antigena može uključivati neproteinske komponente. U nekim delovima ovog otlrivanja, primeri ABP-ova su ovde opisani po pojmovima „broj/slovo/broj“ (npr., 25A7). U ovim slučajevima, tačan naziv označava konkretno antitelo. Odnosno, ABP nazvan 25A7 nije nužno isti kao antitelo nazvano 25A7.1, (osim ako su izričito navedene kao iste u specifikaciji, npr., 25A7 i 25A7.3). Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, u nekim načinima ostvarivanja LDLR nije protein za vezivanje antigena. U nekim načinima ostvarivanja, vezujući poddelovi LDLR nisu proteini za vezivanje antigena, npr., EGFa. U

2

nekim načinima ostvarivanja, drugi molekuli kroz koje PCSK9 šalje signale in vivo nisu proteini za vezivanje antigena. Takvi načini ostvarivanja biće izričito identifikovani kao takvi.

Određeni ovde opisani proteini za vezivanje antigena su antitela ili su izvedeni iz antitela. U određenim načinima ostvarivanja, polipeptidna struktura proteina za vezivanje antigena se zasniva na antitelima, uključujući, ali bez ograničenja na monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, antitela domena, sintetička antitela (koja se ovde ponekad nazivaju „mimetici antitela“), himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzije antitela (koje se ovde ponekad nazivaju „konjugati antitela“) i njihove fragmente, redom. U nekim načinima ostvarivanja, ABP obuhvata ili se sastoji od avimera (peptid čvrstog vezivanja). Ovi različiti proteini za vezivanje antigena su ovde dalje opisani. „Fc“ region obuhvata dva fragmenta teškog lanca koji obuhvataju CH1 i CH2 domene antitela. Dva fragmenta teškog lanca se spajaju pomoću dve ili više disulfidnih veza i pomoću hidrofobnih interakcija CH3 domena.

„Fab fragment“ obuhvata jedan laki lanac i CH1 i promenljive regione jednog teškog lanca. Teški lanac Fab molekula ne može da formira disulfidnu vezu sa drugim molekulom teškog lanca.

„Fab' fragment“ obuhvata jedan laki lanac i deo jednog teškog lanca koji sadrži VH domen i CH1 domen, a takođe i region između CH1 i CH2 domena, tako da međulančana disulfidna veza može da se formira između dva teška lanca dva Fab' fragmenta radi formiranja F(ab')2molekula.

„F(ab')2fragment“ sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantnog regiona između CH1 i CH2 domena, tako da se međulančana disulfidna veza formira između dva teška lanca. F(ab')2fragment se stoga sastoji od dva Fab' fragmenta spojena disulfidnom vezom između dva teška lanca. „Fv region“ obuhvata promenljive regione i teških i lakih lanaca, ali mu nedostaju konstantni regioni. „Jednolančana antitela“ su Fv molekuli u kojima su promenljivi regioni teškog i lakog lanca spojeni fleksibilnim veznikom kako bi se formirao jedan polipeptidni lanac, koji formira region za vezivanje antigena. Jednolančana antitela su detaljno opisana u Patent Application Publication No. WO 88/01649 i United States Patent Nos.4,946,778 i No.5,260,203.

„Antitelo domena“ je imunološki funkcionalan fragment imunoglobulina koji sadrži samo promenljivi region teškog lanca ili promenljivi region lakog lanca. U nekim slučajevima, dva ili više VHregiona su kovalentno spojeni sa peptidnim veznikom radi stvaranja bivalentnog antitela domena. Dva VHregiona bivalentnog antitela domena mogu da ciljaju iste ili različite antigene.

„Bivalentni protein za vezivanje antigena“ ili „bivalentno antitelo“ obuhvata dva mesta za vezivanje antigena. U nekim primerima, dva mesta za vezivanje imaju iste specifičnosti antigena. Bivalentni proteini za vezivanje antigena i bivalentna antitela mogu biti bispecifični, pogledati, infra. Obično se shvata da bivalentno antitelo koje nije „multispecifično“ ili „multifunkcionalno“ antitelo, u određenim načinima ostvarivanja, ima identično svako od njegovih mesta za vezivanje.

2

„Multispecifični protein za vezivanje antigena“ ili „multispecifično antitelo“ je ono koje cilja više od jednog antigena ili epitopa.

„Bispecifični“, „dualno specifični“ ili „bifunkcionalni“ protein za vezivanje antigena ili antitelo je hibridni protein za vezivanje antigena ili antitelo, redom, koji ima dva različita mesta za vezivanje antigena. Bispecifični proteini za vezivanje antigena i antitela su vrsta multispecifičnog proteina za vezivanje antigena ili antitela i mogu da se proizvedu različitim postupcima uključujući, ali bez ograničenja na fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Pogledati, npr., Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol.79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol.148:1547-1553. Dva mesta za vezivanje bispecifičnog proteina za vezivanje antigena ili antitela vezivaće se za dva različita epitopa, koji se mogu da se nalaze na istim ili različitim proteinskim ciljevima.

Tvrdi se da se protein za vezivanje antigena „specifično vezuje“ za svoj ciljni antigen kada disocijaciona konstanta (Kd) iznosi ≤10<-7>M. ABP se specifično vezuje za antigen sa „visokim afinitetom“ kada Kdiznosi ≤5 x 10<-9>M, i sa „veoma visokim afinitetom“ kada Kdiznosi ≤5x 10<-10>M. U jednom načinu ostvarivanja, ABP ima Kdod <10<-9>M. U jednom načinu ostvarivanja, disocijacija je <1 x 10<-5>. U drugim načinima ostvarivanja, ABP-ovi će se vezivati za humani PCSK9 sa Kdizmeđu oko 10<-9>M i 10<-13>M, a u drugom načinu ostvarivanja ABP-ovi će se vezivati sa Kd≤5 x 10<-10>. Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, u nekim načinima ostvarivanja, bilo koji ili svi fragmenti za vezivanje antigena mogu specifično da se vezuju zaPCSK9.

Protein za vezivanje antigena je „selektivan“ kada se čvršće vezuje za jedan cilj nego kada se vezuje za drugi cilj.

„Region za vezivanje antigena“ označava protein, ili deo proteina, koji se specifično vezuje za naznačeni antigen (npr., paratop). Na primer, deo proteina za vezivanje antigena koji sadrži ostatke aminokiseline koji su u interakciji sa antigenom i dodeljuju proteinu za vezivanje antigena svoju specifičnost i afinitet za antigen se naziva „region za vezivanje antigena“. Region za vezivanje antigena obično uključuje jedan ili više „regiona komplementarnog vezivanja“ („CDR-ovi“). Određeni regioni za vezivanje antigena takođe uključuju jedan ili više „okvirnih“ regiona. „CDR“ je sekvenca aminokiseline koja doprinosi specifičnosti i afinitetu vezivanja antigena. „Okvirni“ regioni mogu da pomognu u održavanju pravilne konformacije CDR-ova kako bi se pospešilo vezivanje između regiona za vezivanje antigena i antigena. Strukturno, okvirni regioni mogu da se nalaze u antitelima između CDR-ova. Primeri okvirnih i CDR regiona su prikazani na FIG.2A-3D, 3CCC-3JJJ. U nekim načinima ostvarivanja, sekvence za CDR-ove za laki lanac antitela 3B6 su sledeće: CDR1 TLSSGYSSYEVD (SEQ ID NO: 279); CDR2 VDTGGIVGSKGE (SEQ ID NO: 280); CDR3 GADHGSGTNFVVV (SEQ ID NO: 281), a FR-ovi su sledeći: FR1 QPVLTQPLFASASLGASVTLTC (SEQ ID NO: 282); FR2 WYQQRPGKGPRFVMR (SEQ ID NO: 283); FR3 GIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC (SEQ ID NO: 284); i FR4 FGGGTKLTVL (SEQ ID NO: 285).

2

U određenim aspektima, obezbeđeni su rekombinantni proteini za vezivanje antigena koji vezuju PCSK9, na primer humani PCSK9. U ovom kontekstu, „rekombinantni protein za vezivanje antigena“ je protein napravljen pomoću rekombinantnih tehnika, tj., kroz ekspresiju rekombinantne nukleinske kiseline kako je ovde opisano. Postupci i tehnike za proizvodnju rekombinantnih proteina su dobro poznati u ovoj oblasti.

Pojam „antitelo“ se odnosi na netaknuti imunoglobulin bilo kog izotopa, ili njegov fragment koji se može takmičiti sa netaknutim antitelom za specifično vezivanje sa ciljnim antigenom, i uključuje, na primer, himerna, humanizovana, potpuno humana, i bispecifična antitela. „Antitelo“ je vrsta proteina za vezivanje antigena. Netaknuto antitelo će generalno obuhvatati najmanje dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, ali u nekim primerima može uključivati manje lanaca kao što su antitela koja se prirodno javljaju kod kamila, koja mogu da obuhvataju samo teške lance. Antitela mogu biti izvedena isključivo iz jednog izvora, ili mogu biti „himerna“, odnosno različiti delovi antitela mogu biti izvedeni iz dva različita antitela kako je opisano u nastavku. Proteini za vezivanje antigena, antitela, ili fragmenti vezivanja mogu da se proizvedu u hibridomima, pomoću rekombinantnih DNK tehnika, ili enzimskim ili hemijskim cepanjem netaknutih antitela. Osim ako je drugačije naznačeno, pojam „antitelo“ uključuje, pored antitela koja obuhvataju dva teška lanca pune dužine i dva laka lanca pune dužine, njihove derivate, varijante, fragmente i muteine, čiji su primeri opisani u nastavku. Dalje, osim ako je to izričito isključeno, antitela uključuju monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, antitela domena, sintetička antitela (koja se ovde ponekad navode kao „mimetici antitela“), himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzije antitela (koje se ovde ponekad navode kao „konjugati antitela“), i njihove fragmente, redom. U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pojam takođe obuhvata peptitela.

Strukturne jedinice prirodnog antitela obično obuhvataju tetramer. Svaki takav tetramer se obično sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan „laki“ (u određenim načinima ostvarivanja, oko 25 kDa) i jedan „teški“ lanac pune dužine (u određenim načinima ostvarivanja, oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca obično uključuje promenljivi region od oko 100 do 110 ili više aminokiselina koji je obično odgovoran za prepoznavanje antigena. Karboksiterminalni deo svakog lanca obično definiše konstantni region koji može biti odgovoran za funkciju efektora. Humani laki lanci se obično klasifikuju kao kapa i lambda laki lanci. Teški lanci se obično klasifikuju kao mu, delta, gama, alfa, ili epsilon, i definišu izotip antitela kao IgM, IgD, IgG, IgA, i IgE, redom. IgG ima nekoliko podklasa, uključujući, ali bez ograničenja na IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. IgM ima podklase koje uključuju, ali nisu ograničene na IgM1 i IgM2. IgA je slično podeljen na podklase koje uključuju, ali nisu ograničene na IgA1 i IgA2. Obično se u okviru lakih i teških lanaca pune dužine promenljivi i konstantni regioni spajaju pomoću „J“ regiona od oko 12 ili više aminokiselina, pri čemu

2

teški lanac takođe uključuje „D“ region od oko još 10 aminokiselina. Pogledati, npr., Fundamental Immunology, Ch.7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Promenljivi regioni svakog para lakog/teškog lanca obično formiraju mesto za vezivanje antigena.

Promenljivi regioni obično imaju istu generalnu strukturu relativno očuvanih okvirnih regiona (FR) kojima se pridružuju tri hiper promenljiva regiona, koji se takođe nazivaju regioni utvrđivanja komplementarnosti ili CDR-ovi. CDR-ove iz dva lanca svakog para obično poravnavaju regioni, koji mogu da omoguće vezivanje za specifični epitop. Od N-terminusa do C-terminusa, promenljivi regioni i lakog i teškog lanca obično obuhvataju domene FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Dodela aminokiselina svakom domenu je obično u skladu sa definicijama iz Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), ili Chothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:878-883 (1989).

U određenim načinima ostvarivanja, teški lanac antitela se vezuje za antigen u odsustvu lakog lanca antitela. U određenim načinima ostvarivanja, laki lanac antitela se vezuje za antigen u odsustvu teškog lanca antitela. U određenim načinima ostvarivanja, region vezivanja antitela se vezuje za antigen u odsustvu lakog lanca antitela. U određenim načinima ostvarivanja, region vezivanja antitela se vezuje za antigen u odsustvu teškog lanca antitela. U određenim načinima ostvarivanja, pojedinačni promenljivi region se specifično vezuje za antigen u odsustvu drugih promenljivih regiona.

U određenim načinima ostvarivanja, definitivna delineacija CDR-a i identifikacija ostataka koji obuhvataju mesto vezivanja antitela se ostvaruje rešavanjem strukture antitela i/ili rešavanjem strukture kompleksa antitelo-ligand. U određenim načinima ostvarivanja, to može da se ostvari pomoću bilo koje od mnogih tehnika poznatih stručnjacima iz ove oblasti, kao što je X-zračna kristalografija. U određenim načinima ostvarivanja, različiti postupci analize mogu da se koriste za identifikaciju ili približno utvrđivanje CDR regiona. Primeri takvih postupaka uključuju, ali nisu ograničeni na Kabat definiciju, Chothia definiciju, AbM definiciju i kontaktnu definiciju.

Kabat definicija je standard za numerisanje ostataka u antitelu i obično se koristi za identifikaciju CDR regiona. Pogledati, npr., Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28: 214-8 (2000). Chothia definicija je slična Kabat definiciji, ali Chothia definicija uzima u obzir položaje određenih regiona strukturne petlje.

Pogledati, npr., Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-17 (1986); Chothia et al., Nature, 342: 877-83 (1989). AbM definicija koristi integrisani skup kompjuterskih programa koje proizvodi Oxford Molecular Group i koji modeluju strukturu antitela. Pogledati, npr., Martin et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268-9272 (1989); "AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd. AbM definicija modeluje tercijarnu strukturu antitela iz primarne sekvence pomoću kombinacije baza podataka znanja i ab initio postupaka, kao što su oni opisani u Samudrala et al., "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194-198 (1999). Kontaktna definicija je zasnovana na analizi dostupnih kompleksnih kristalnih struktura. Pogledati, npr., MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45 (1996).

Prema konvenciji, CDR regioni u teškom lancu suobično označeni kao HI, H2, i H3 i sekvencijalno su numerisani u pravcu od amino terminusa do karboksi terminusa. CDR regioni u lakom lancu su obično označeni kao L1, L2, i L3 i sekvencijalno su numerisani u pravcu od amino terminusa do karboksi terminusa.

Pojam „laki lanac“ uključuje laki lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljno sekvenci promenljivog regiona za dodelu specifičnosti vezivanja. Laki lanac pune dužine uključuje domen promenljivog regiona, VL, i domen konstantnog regiona, CL. Domen promenljivog regiona lakog lanca je na amino-terminusu polipeptida. Laki lanci uključuju kapa lance i lambda lance.

Pojam „teški lanac“ uključuje teški lanac pune dužine i njegove fragmente koji imaju dovoljno sekvenci promenljivog regiona za dodelu specifičnosti vezivanja. Teški lanac pune dužine uključuje domen promenljivog regiona, VH, i tri domena konstantnog regiona, CH1, CH2, i CH3. VHdomen je na aminoterminusu polipeptida, a CHdomeni su na karboksil-terminusu, pri čemu je CH3 najbliži karboksiterminusu polipeptida. Teški lanci mogu biti bilo kog izotopa, uključujući IgG (uključujući IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4 podtipove), IgA (uključujući IgA1 i IgA2 podtipove), IgM i IgE.

Obično je bispecifično ili bifunkcionalno antitelo je veštačko hibridno antitelo koje ima dva različita para teškog/lakog lanca i dva različita mesta za vezivanje. Bispecifična antitela se mogu proizvesti pomoću različitih postupaka koji uključuju, ali nisu ograničeni na fuziju hibridoma ili vezivanje Fab' fragmenata. Pogledati, npr., Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79: 315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992).

Neke vrste sisara takođe proizvode antitela koja imaju samo jedan teški lanac.

Svaki pojedinačni lanac imunoglobulina se obično sastoji od više „domena imunoglobulina“, pri čemu se svaki sastoji od oko 90 do 110 aminokiselina i ima karakterističan obrazac savijanja. Ovi domeni su osnovne jedinice od kojih su sačinjeni polipeptidi antitela. Kod ljudi, IgA i IgD izotipovi sadrže četiri teška lanca i četiri laka lanca; IgG i IgE izotipovi sadrže dva teška lanca i dva laka lanca; a IgM izotip sadrži pet teških lanaca i pet lakih lanaca. C regioni teškog lanca obično obuhvataju jedan ili više domena koji mogu biti odgovorni za funkciju efektora. Broj domena konstantnog regiona teškog lanca zavisiće od izotipa. IgG teški lanci, na primer, sadrže tri domena C regiona poznata kao CH1, CH2 i CH3. Antitela koja su obezbeđena mogu imati bilo koje od ovih izotipova i podtipova. U određenim načinima ostvarivanja, anti-PCSK9 antitelo je od IgG2 ili IgG4 podtipa.

Pojam „promenljivi region“ ili „promenljivi domen“ se odnosi na deo lakih i/ili teških lanaca antitela, koji obično uključuje otprilike amino-terminus od 120 do 130 aminokiselina u teškom lancu i amino-

1

terminus od oko 100 do 110 aminokiselina u lakom lancu. U određenim načinima ostvarivanja, promenljivi regioni različitih antitela razlikuju se uglavnom u sekvenci aminokiseline čak i među antitelima iste vrste. Promenljivi region antitela obično utvrđuje specifičnost određenog antitela za njegov cilj.

Pojam „neutralizujući protein za vezivanje antigena“ ili „neutralizujuće antitelo“ se odnosi na protein za vezivanje antigena ili antitelo, redom, koje se vezuje za ligand i sprečava ili smanjuje biološko dejstvo tog liganda. Ovo može da se postigne, na primer, direktnim blokiranjem mesta za vezivanje na ligandu ili vezivanjem za ligand i izmenom sposobnosti liganda da se vezuje indirektnim sredstvima (kao što su strukturne ili energetske izmene liganda). U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pojam takođe može da označava protein za vezivanje antigena koji sprečava protein za koji je vezan da vrši biološku funkciju. Prilikom procene vezivanja i/ili specifičnosti proteina za vezivanje antigena, npr., antitela ili njegovog imunološki funkcionalnog fragmenta, antitelo ili fragment mogu suštinski da inhibiraju vezivanje liganda sa njegovim vezivnim partnerom kada višak antitela smanjuje količinu vezivnog partnera vezanog za ligand za najmanje oko 1-20, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-98%, 98-99% ili više (kako je izmereno u in vitro kompetitivnoj analizi vezivanja). U nekim načinima ostvarivanja, u slučaju PCSK9 proteina za vezivanje antigena, takav neutralizujući molekul može umanjiti sposobnost PCSK9 da se vezuje za LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, neutralizujuća sposobnost se karakteriše i/ili opisuje preko kompetitivne analize. U nekim načinima ostvarivanja, neutralizujuća sposobnost se opisuje u pogledu IC50ili EC50vrednosti. U nekim načinima ostvarivanja, ABP-ovi 27B2, 13H1, 13B5 i 3C4 su ne-neutralizujući ABP-ovi, 3B6, 9C9 i 31A4 su slabi neutralizatori, a preostali ABP-ovi u tabeli 2 su jaki neutralizatori. U nekim načinima ostvarivanja, antitela ili proteini za vezivanje antigena vrše neutralizaciju vezivanjem za PCSK9 i sprečavaju PCSK9 da se vezuje za LDLR (ili smanjuju sposobnost PCSK9 da se vezuje za LDLR). U nekim načinima ostvarivanja, antitela ili ABP-ovi vrše neutralizaciju vezivanjem za PCSK9, i dok omogućavaju PCSK9 da se vezuje za LDLR, sprečavaju ili smanjuju PCSK9-posredovanu degradaciju LDLR. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, neutralizujući ABP ili antitelo mogu i dalje da omoguće PCSK9/LDLR vezivanje, ali će sprečiti (ili smanjiti) kasniju degradaciju LDLR sa učešćem PCSK9.

Pojam „cilj“ se odnosi na molekul ili deo molekula koji može da se vezuje za protein za vezivanje antigena. U određenim načinima ostvarivanja, cilj može imati jedan ili više epitopa. U određenim načinima ostvarivanja, cilj je antigen. Upotreba „antigena“ u izrazu „protein za vezivanje antigena“ jednostavno označava da se proteinska sekvenca koja obuhvata antigen može vezati za antitelo. U ovom kontekstu, nije neophodno da protein bude strani ili da bude sposoban da indukuje imuni odgovor. Pojam „takmičiti“ kada se koristi u kontekstu proteina za vezivanje antigena (npr., neutralizujućih proteina za vezivanje antigena ili neutralizujućih antitela) koji se takmiče za isti epitop označava

2

takmičenje između proteina za vezivanje antigena kako je utvrđeno analizom u kojoj protein za vezivanje antigena (npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalan fragment) koji se ispituje sprečava ili inhibira (npr., smanjuje) specifično vezivanje referentnog proteina za vezivanje antigena (npr., ligand, ili referentno antitelo) za zajednički antigen (npr., PCSK9 ili njegov fragment). Mnoge vrste kompetitivnih analiza vezivanja mogu se koristiti za utvrđivanje da li se jedan protein za vezivanje antigena takmiči sa drugim, na primer: direktna ili indirektna radioimunoanaliza (RIA) čvrste faze, direktna ili indirektna enzimska imunoanaliza (EIA) čvrste faze, sendvič kompetitivna analiza (pogledati, npr., Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); direktna biotin-avidin EIA čvrste faze (pogledati, npr., Kirkland et al., 1986, J. Immunol.137:3614-3619), direktna označena analiza čvrste faze, direktna označena sendvič analiza čvrste faze (pogledati, npr., Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); direktna označena RIA čvrste faze koja koristi 1-125 oznaku (pogledati, npr., Morel et al., 1988, Molec. Immunol.25:7-15); direktna biotin-avidin EIA čvrste faze (pogledati, npr., Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552); i direktna označena RIA (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol.32:77-82). Obično, takva analiza uključuje upotrebu prečišćenog antigena vezanog za čvrstu površinu ili ćelija koje nose bilo koji od njih, neoznačenog test proteina za vezivanje antigena i označenog referentnog proteina za vezivanje antigena. Kompetitivna inhibicija se meri utvrđivanjem količine oznake koja se vezuje za čvrstu površinu ili ćelija u prisustvu test proteina za vezivanje antigena. Obično je prisutan višak test proteina za vezivanje antigena. Proteini za vezivanje antigena identifikovani kompetitivnom analizom (kompetitivni proteini za vezivanje antigena) uključuju proteine za vezivanje antigena koji se vezuju za isti epitop kao referentni proteini za vezivanje antigena i proteine za vezivanje antigena koji se vezuju za susedni epitop koji je dovoljno blizu epitopa koji se vezuje za referentni protein za vezivanje antigena kako bi došlo do sternog ometanja. Dodatni detalji koji se tiču postupaka za utvrđivanje kompetitivnog vezivanja su obezbeđeni u primerima. Obično, kada je prisutan višak kompetitivnog proteina za vezivanje antigena, inhibiraće (npr., smanjiće) specifično vezivanje referentnog proteina za vezivanje antigena za zajednički antigen za najmanje 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% ili 75% ili više. U nekim primerima, vezivanje je inhibirano za najmanje 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, ili 97% ili više.

Pojam „antigen“ se odnosi na molekul ili deo molekula koji može da se vezuje za agens selektivnog vezivanja, kao što je protein za vezivanje antigena (uključujući, npr., antitelo ili njegov imunološki funkcionalan fragment). U nekim načinima ostvarivanja, antigen može da se koristi kod životinja kako bi proizveo antitela koja mogu da se vezuju za taj antigen. Antigen može da poseduje jedan ili više epitopa koji su sposobni za interakciju sa različitim proteinima za vezivanje antigena, npr., antitelima.

Pojam „epitop“ uključuje bilo koju determinantu koja može da se vezuje za protein za vezivanje antigena, kao što je antitelo ili za receptor T-ćelije. Epitop je region antigena koji se vezuje za protein za vezivanje antigena koji cilja taj antigen, a kada je antigen protein, uključuje specifične aminokiseline koje su direktno u kontaktu sa proteinom za vezivanje antigena. Najčešće, epitopi se nalaze na proteinima, ali u nekim primerima mogu da se nalaze na drugim vrstama molekula, kao što su nukleinske kiseline. Determinante epitopa mogu da uključe hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šećera, grupe fosforila ili sulfonila, i mogu da imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, i/ili specifične karakteristike punjenja. Generalno, antitela specifična za određeni ciljni antigen će poželjno prepoznati epitop na ciljnom antigenu u kompleksnoj kompoziciji proteina i/ili makromolekula.

Kako se ovde koristi, „suštinski čisto“ označava da je opisana vrsta molekula dominantna prisutna vrsta, odnosno na molarnoj osnovi je obilnija nego bilo koja druga pojedinačna vrsta u istoj kompoziciji. U određenim načinima ostvarivanja, suštinski čist molekul je kompozicija u kojoj predmetna vrsta obuhvata najmanje 50% (na molarnoj osnovi) svih prisutnih makromolekulskih vrsta. U drugim načinima ostvarivanja, suštinski čista kompozicija će obuhvatati najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, ili 99% svih makromolekulskih vrsta prisutnih u kompoziciji. U drugim načinima ostvarivanja, predmetna vrsta je prečišćena do suštinske homogenosti, pri čemu se kontaminirajuće vrste ne mogu detektovati u kompoziciji pomoću konvencionalnih postupaka detekcije i stoga se kompozicija sastoji od jedne detektabilne makromolekulske vrste.

Pojam „agens“ se ovde koristi za označavanje hemijskog jedinjenja, kompozicije hemijskih jedinjenja, biološkog makromolekula, ili ekstrakta napravljenog od bioloških materijala.

Kako se ovde koriste, pojmovi „oznaka“ ili „označeno“ odnose se na uključivanje detektabilnog markera, npr., uključivanjem radiooznačene aminokiseline ili spajanjem polipeptida i grupa biotina koji se mogu detektovati markiranim avidinom (npr., streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kolorimetrijskim postupcima). U određenim načinima ostvarivanja, oznaka ili marker takođe mogu biti terapijski. Različiti postupci označavanja polipeptida i glikoproteina su poznati u ovoj oblasti i mogu se koristiti. Primeri oznaka za polipeptide uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne oznake (npr., FITC, rodamin, fosfori lantanida), enzimske oznake (npr., peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminescentne, biotinil grupe, unapred utvrđene epitope polipeptida koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., sekvence para leucinskog zatvarača, mesta za vezivanje za sekundarna antitela, domeni vezivanja metala, tagovi epitopa). U određenim načinima ostvarivanja, oznake su prikačene pomoću odstojnika različite dužine kako bi se smanjilo potencijalno sterno ometanje.

Pojam „biološki uzorak“, kako se ovde koristi, uključuje, ali nije ograničen na bilo koju količinu supstance iz žive stvari ili nekada živih stvari. Takve žive stvari uključuju, ali nisu ograničene na ljude, miševe,

4

majmune, pacove, zečeve, i druge životinje. Takve supstance uključuju, ali nisu ograničene na krv, serum, urin, ćelije, organe, tkiva, kost, koštanu srž, limfne čvorove, i kožu.

Pojam „kompozicija farmaceutskog agensa“ (ili agens ili lek) kako se ovde koristi se odnosi na hemijsko jedinjenje, kompoziciju, agens ili lek koji može da indukuje željeno terapijsko dejstvo kada se pravilno daje pacijentu. To ne zahteva nužno više od jedne vrste sastojka.

Pojam „terapijski efektivna količina“ se odnosi na količinu PCSK9 proteina za vezivanje antigena za koju je utvrđeno da proizvodi terapijski odgovor kod sisara. Takve terapijski efektivne količine može odmah da utvrdi stručnjak iz ove oblasti.

Pojam „modulator“, kako se ovde koristi, je jedinjenje koje menja ili izmenjuje aktivnost ili funkciju molekula. Na primer, modulator može prouzrokovati povećanje ili smanjenje jačine određenog dejstva ili funkcije molekula u poređenju sa jačinom dejstva ili funkcije primećene u odsustvu modulatora. U određenim načinima ostvarivanja, modulator je inhibitor, koji smanjuje jačinu najmanje jednog dejstva ili funkcije molekula. Određene primerne aktivnosti i funkcije molekula uključuju, ali nisu ograničene na afinitet vezivanja, enzimsku aktivnost i transdukciju signala. Određeni primerni inhibitori uključuju, ali nisu ograničeni na proteine, peptide, antitela, peptitela, ugljene hidrate ili male organske molekule. Peptitela su opisana u, npr., U.S. Patent No.6,660,843 (koji odgovara PCT Application No. WO 01/83525).

Pojmovi „pacijent“ i „subjekat“ se naizmenično koriste i uključuju humane i ne-humane životinjske subjekte, kao i one sa formalno dijagnostikovanim poremećajima, one bez formalno prepoznatih poremećaja, one koji primaju zdravstvenu negu, one pod rizikom od razvoja poremećaja, itd.

Pojam „lečiti“ i „lečenje“ uključuje terapijska lečenja, profilaktička lečenja, i primene tokom kojih se smanjuje rizik da će subjekat razviti poremećaj ili drugi faktor rizika. Lečenje ne zahteva potpuno izlečenje poremećaja i obuhvata načine ostvarivanja u kojima se smanjuju simptomi ili postojeći faktori rizika.

Pojam „sprečiti“ ne zahteva 100% eliminaciju mogućnosti događaja. Umesto toga, to znači da je verovatnoća nastupanja događaja smanjena u prisustvu jedinjenja ili postupka.

Standardne tehnike mogu da se koriste za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, i kultivisanje i transformaciju tkiva (npr., elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu da se izvode prema specifikacijama proizvođača ili kako se obično to čini u ovoj oblasti ili kako je ovde opisano. Prethodne tehnike i postupci generalno mogu da se izvode prema konvencionalnim postupcima dobro poznatim u ovoj oblasti i kako je opisano u različitim opštim i konkretnijim referencama koje su navedene i pomenute u ovoj specifikaciji. Pogledati, npr., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Osim ako su obezbeđene konkretne definicije, nomenklature upotrebljene u vezi sa, i laboratorijski postupci i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koji su ovde opisani su dobro poznati i često se upotrebljavaju u ovoj oblasti. Standardne tehnike mogu da se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku pripremu, formulaciju i davanje, i lečenje pacijenata.

Proteini za vezivanje antigena sa PCSK9

[0037] Proproteinska konvertaza subtilizin keksin tipa 9 (PCSK9) je serinska proteaza uključena u regulisanje nivoa proteina receptora lipoproteina niske gustine (LDLR) (Horton et al., 2007; Seidah and Prat, 2007). PCSK9 je prohormonska-proproteinska konvertaza u porodici subtilizina (S8) serinskih proteaza (Seidah et al., 2003). Primerna humana PCSK9 sekvenca aminokiseline je predstavljena kao SEQ ID NOs: 1 i 3. na FIG.1A (prikazuje „pro“ domen proteina kako je podvučeno) i FIG.1B (prikazuje signalnu sekvencu podebljano i pro domen podvučeno). Primerna humana PCSK9 sekvenca kodiranja je predstavljena kao SEQ ID NO: 2 (FIG.1B). Kako je ovde opisano, PCSK9 proteini takođe mogu uključivati fragmente PCSK9 proteina pune dužine. Strukturu PCSK9 proteina rešavaju dve grupe (Cunningham et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, and Piper et al., Structure, 15:1-8, 2007). PCSK9 uključuje signalnu sekvencu, prodomen N-terminusa, katalitički domen kao što je subtilizin i domen C-terminusa.

[0038] Proteini za vezivanje antigena (ABP-ovi) koji vezuju PCSK9, uključujući humani PCSK9, su ovde obezbeđeni. U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđeni proteini za vezivanje antigena su polipeptidi koji obuhvataju jedan ili više regiona za utvrđivanje komplementarnosti (CDR-ovi), kako je ovde opisano. U nekim proteinima za vezivanje antigena, CDR-ovi su ugrađeni u „okvirni“ region, koji orijentiše CDR(ove) tako da se ostvaruju pravilne karakteristike vezivanja antigena CDR(ova). U nekim načinima ostvarivanja, ovde obezbeđeni proteini za vezivanje antigena mogu da ometaju, blokiraju, smanjuju ili moduliraju interakciju između PCSK9 i LDLR. Takvi proteini za vezivanje antigena se označavaju kao „neutralizujući“. U nekim načinima ostvarivanja, i dalje može da dođe do vezivanja između PCSK9 i LDLR, čak i ako je protein za vezivanje antigena neutralizujući i vezan za PCSK9. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, ABP sprečava ili smanjuje negativan uticaj PCSK9 na LDLR bez blokiranja mesta za vezivanje LDLR na PCSK9. Stoga, u nekim načinima ostvarivanja, ABP modulira ili menja sposobnost PCSK9 da dovede do degradacije LDLR, bez potrebe da se sprečava interakcija vezivanja između PCSK9 i LDLR. Takvi ABP-ovi mogu specifično da se opišu kao „ne-kompetitivno neutralizujući“ ABP-ovi. U nekim načinima ostvarivanja, neutralizujući ABP se vezuje za PCSK9 na mestu i/ili na način koji sprečava PCSK9 da se vezuje za LDLR. Takvi ABP-ovi mogu se specifično opisati kao „kompetitivno neutralizujući“ ABP-ovi. Oba gore navedena neutralizatora mogu da dovedu do veće količine slobodnog LDLR prisutnog u subjektu, što za rezultat ima veće vezivanje LDLR za LDL (čime se smanjuje količina LDL u subjektu). Sa druge strane, ovo dovodi do smanjene količine holesterola u serumu prisutnog u subjektu.

[0039] U nekim načinima ostvarivanja, ovde obezbeđeni proteini za vezivanje antigena mogu da inhibiraju PCSK9-posredovanu aktivnost (uključujući vezivanje). U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena koji se vezuju za ove epitope inhibiraju, između ostalog, interakcije između PCSK9 i LDLR i druge fiziološke efekte posredovane preko PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena su humani, kao što su potpuno humana antitela za PCSK9.

[0040] U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za katalitički domen PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za zreli oblik PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja ABP se vezuje u prodomenu PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se selektivno vezuje za zreli oblik PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za katalitički domen tako da PCSK9 ne može da se vezuje ili jednako efektivno vezuje za LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se ne vezuje za c-terminus katalitičkog domena. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se ne vezuje za n-terminus katalitičkog domena. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se ne vezuje za nili c-terminus PCSK9 proteina. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za bilo koji od epitopa vezanih za ovde pomenuta antitela. U nekim načinima ostvarivanja, ovo se može utvrditi kompetitivnim analizama između ovde opisanih antitela i drugih antitela. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za epitop vezan za jedno od antitela opisanih u tabeli 2. U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena se vezuju za specifično konformaciono stanje PCSK9 kako bi se sprečila interakcija PCSK9 sa LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za V domen od PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za V domen od PCSK9 i sprečava (ili smanjuje) vezivanje PCSK9 za LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za V domen od PCSK9, i dok ne sprečava (ili smanjuje) vezivanje PCSK9 za LDLR, ABP sprečava ili smanjuje negativne aktivnosti posredovane preko PCSK9 na LDLR.

[0041] Proteini za vezivanje antigena koji su ovde opisani imaju višestruku primenu. Neki od proteina za vezivanje antigena se, na primer, koriste u specifičnim analizama vezivanja, afinitetnom prečišćavanju PCSK9, određenije humanog PCSK9 iili njegovih liganda i u analizama skrininga za identifikaciju drugih antagonista aktivnosti PCSK9. Neki od proteina za vezivanje antigena se koriste za inhibiranje vezivanja PCSK9 za LDLR, ili inhibiranje PCSK9-posredovanih aktivnosti.

[0042] Proteini za vezivanje antigena mogu se koristiti u različitim terapijskim primenama, kako je ovde objašnjeno. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja PCSK9 proteini za vezivanje antigena su korisni za lečenje stanja povezanih sa PCSK9, kao što su poremećaji povezani sa holesterolom (ili „poremećaji povezani sa holesterolom u serumu“) kao što je hiperholesterolemija, kako je ovde dalje opisano. Druge upotrebe proteina za vezivanje antigena uključuju, na primer, dijagnozu PCSK9-povezanih bolesti ili stanja i skrining analize za utvrđivanje prisustva ili odsustva PCSK9. Neki od ovde opisanih proteina za vezivanje antigena se koriste u lečenju posledica, simptoma, i/ili patologije povezane sa aktivnošću PCSK9.

[0043] U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena koji su obezbeđeni obuhvataju jedan ili više CDR-ova (npr., 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 CDR-ova). U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata (a) strukturu polipeptida i (b) jedan ili više CDR-ova koji se ubacuju u i/ili spajaju sa strukturom polipeptida. Struktura polipeptida može da ima mnogo različitih oblika. Na primer, može da bude, ili da obuhvata, okvir prirodnog antitela, ili njegov fragment ili varijantu, ili može biti potpuno sintetička po prirodi. Primeri različitih struktura polipeptida su ovde dalje opisani.

[0044] U određenim načinima ostvarivanja, struktura polipeptida proteina za vezivanje antigena je antitelo ili je izvedena iz antitela, uključujući, ali bez ograničenja na monoklonalna antitela, bispecifična antitela, minitela, antitela domena, sintetička antitela (koja su ovde ponekad označena kao „mimetici antitela“), himerna antitela, humanizovana antitela, fuzije antitela (koja su ovde ponekad označena kao „konjugati antitela“), i delove ili fragmente svakog, redom. U nekim primerima, protein za vezivanje antigena je imunološki fragment antitela (npr., Fab, Fab', F(ab')2, ili scFv). Različite strukture su ovde dalje opisane i definisane.

[0045] Određeni proteini za vezivanje antigena kako su ovde obezbeđeni se specifično i/ili selektivno vezuju za humani PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se specifično i/ili selektivno vezuje za humani PCSK9 protein koji ima i/ili se sastoji od ostataka 153-692 od SEQ ID NO: 3. U nekim načinima ostvarivanja ABP se specifično i/ili selektivno vezuje za humani PCSK9 koji ima i/ili se sastoji od ostataka 31-152 od SEQ ID NO: 3. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se selektivno vezuje za humani PCSK9 protein kako je prikazano na FIG.1A (SEQ ID NO: 1). U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se specifično vezuje za najmanje fragment PCSK9 proteina i/ili PCSK9 protein pune dužine, sa ili bez signalne sekvence.

[0046] U načinima ostvarivanja u kojima se protein za vezivanje antigena koristi za terapijske primene, protein za vezivanje antigena može da inhibira, ometa ili modulira jednu ili više bioloških aktivnosti PCSK9. U jednom načinu ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se vezuje specifično za humani PCSK9 i/ili suštinski inhibira vezivanje humanog PCSK9 za LDLR za najmanje oko 20%-40%, 40-60%, 60-80%, 80-85%, ili više (na primer, merenjem vezivanja u in vitro kompetitivnoj analizi vezivanja). Neki od proteina za vezivanje antigena koji su ovde obezbeđeni su antitela. U nekim načinima ostvarivanja, ABP ima Kdmanje (uz čvršće vezivanje) od 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>M. U nekim načinima ostvarivanja, ABP ima IC50za blokiranje vezivanja LDLR za PCSK9 (D374Y, varijanta sa visokim afinitetom) manje od 1 mikroM, 1000 nM do 100 nM, 100nM do 10 nM, 10nM do 1 nM, 1000pM do 500pM, 500 pM do 200 pM, manje od 200 pM, 200 pM do 150 pM, 200 pM do 100 pM, 100 pM do 10 pM, 10 pM do 1 pM.

[0047] Jedan primer IgG2 konstantnog domena teškog lanca anti-PCSK9 antitela ovog pronalaska ima sekvence aminokiseline prikazane u SEQ ID NO: 154, FIG.3KK.

[0048] Jedan primer IgG4 konstantnog domena teškog lanca anti-PCSK9 antitela ovog pronalaska ima sekvence aminokiseline prikazane u SEQ ID NO: 155, FIG.3KK.

[0049] Jedan primer kapa konstantnog domena lakog lanca anti-PCSK9 antitela ima sekvence aminokiseline prikazane u SEQ ID NO: 157, FIG.3KK.

[0050] Jedan primer lambda konstantnog domena lakog lanca anti-PCSK9 antitela ima sekvence aminokiseline prikazane u SEQ ID NO: 156, FIG.3KK.

[0051] Promenljivi regioni imunoglobulinskih lanaca generalno ispoljavaju istu ukupnu strukturu, koja obuhvata relativno očuvane okvirne regione (FR) spojene sa tri hiperpromenljiva regiona, koji se češće nazivaju „regioni za utvrđivanje kompatibilnosti“ ili CDR-ovi. CDR-ovi iz dva lanca svakog gore pomenutog para teškog lanca/lakog lanca se obično poravnavaju pomoću okvirnih regiona za formiranje strukture koja se specifično vezuje za specifični epitop na ciljnom proteinu (npr., PCSK9). Od N-terminusa do C-terminusa, promenljivi regioni prirodnog lakog i teškog lanca su tipično usaglašeni sa sledećim redosledom ovih elemenata: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 i FR4. Numerički sistem je predviđen za dodelu brojeva aminokiselinama koji zauzimaju položaje u svakom od ovih domena. Ovaj numerički sistem je definisan u Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (1987 and 1991, NIH, Bethesda, MD), ili Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol.196:901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342:878-883.

[0052] Različiti promenljivi regioni teškog lanca i lakog lanca su ovde obezbeđeni i prikazani na FIG.2A-3JJ i 3LL-3BBB. U nekim načinima ostvarivanja, svaki od ovih promenljivih regiona može biti spojen sa gore navedenim konstantnim regionima teškog i lakog lanca kako bi se formirao kompletan teški i laki lanac antitela, redom. Dalje, svaka od ovako generisanih sekvenci teškog i lakog lanca može se kombinovati kako bi se formirala kompletna struktura antitela.

[0053] Konkretni primeri nekih od promenljivih regiona lakih i teških lanaca antitela koji su obezbeđeni i njihove odgovarajuće sekvence aminokiseline su sažeti u TABELI 2.

TABELA 2: Primerni promenljivi regioni teškog i lakog lanca

4

[0054] Ponovo, svaki od primernih promenljivih teških lanaca navedenih u tabeli 2 može da se kombinuje sa bilo kojim od primernih promenljivih lakih lanaca prikazanih u tabeli 2 radi formiranja antitela. Tabela 2 prikazuje primerne parove lakog i teškog lanca koji se nalaze u nekoliko ovde opisanih antitela. U nekim primerima, antitela uključuju najmanje jedan promenljivi teški lanac i jedan promenljivi laki lanac od onih navedenih u tabeli 2. U drugim primerima, antitela sadrže dva identična laka lanca i dva identična teška lanca. Kao primer, antitelo ili protein za vezivanje antigena može uključivati teški lanac i laki lanac, dva teška lanca, ili dva laka lanca. U nekim načinima ostvarivanja protein za vezivanje antigena obuhvata (i/ili se sastoji) od 1, 2, i/ili 3 teška i/ili laka CDR-a iz najmanje jedne od sekvenci navedenih u tabeli 2 (CDR-ovi za sekvence su naznačeni na FIG.2A-3D, a drugi načini ostvarivanja na FIG.3CCC-3JJJ i 15A-15D). U nekim načinima ostvarivanja, svih 6 CDR-ova (CDR1-3 sa lakog (CDRL1, CDRL2, CDRL3) i CDR1-3 sa teškog (CDRH1, CDRH2, i CDRH3)) su deo ABP. U nekim načinima ostvarivanja, 1, 2, 3, 4, 5, ili više CDR-ova je uključeno u ABP. U nekim načinima ostvarivanja, jedan teški i jedan laki CDR iz CDR-ova u sekvencama u tabeli 2 je uključen u ABP (CDR-ovi za sekvence u tabeli 2 su naznačeni na FIG.2A-3D). U nekim načinima ostvarivanja, dodatni odeljci (npr., kako je prikazano na FIG.2A-2D, 3A-3D, i drugi načini ostvarivanja na 3CCC-3JJJ i 15A-15D) su takođe uključeni u ABP. Primeri CDR-ova i FR-ova za teške i lake lance navedene u tabeli 2 su naznačeni na FIG.2A-3D (a drugi načini ostvarivanja na FIG.3CCC-3JJJ i 15A-15D). Opcione promenljive sekvence lakog lanca (uključujući CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, i FR4) mogu se odabrati od sledećeg: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, 46, 421, 425, 429, 433, 437, 441, 445, 449, 453, 457, 461,465, 469, 473, 477, 481, i 485.. Opcione promenljive sekvence teškog lanca (uključujući CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3, i FR4) mogu se odabrati od sledećeg: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81,60, 419, 423, 427, 431, 435, 439, 443, 447, 451, 455, 459, 463, 467, 471, 475, 479, i 483.. U nekim od ulaza na FIG.2A-3D, varijacije sekvenci ili alternativne granice CDR-ova i FR-ova su identifikovane. Ove alternative su identifikovane sa „v1“ posle ABP imena. Pošto je većina ovih alternativa mala u prirodi, samo delovi sa razlikama su prikazani u tabeli. Razume se da je preostali deo lakog ili teškog lanca isti kako je prikazano za bazni ABP u drugim panelima. Stoga, na primer, 19H9v1 na FIG.2C ima isti FR1, CDR1, i FR2 kao 19H9 na FIG.2A, pošto je jedina razlika primećena na FIG.2C. Za tri sekvence nukleinske kiseline (ABP-ovi 26E10, 30B9, i 31B12), dodatne alternativne sekvence nukleinske kiseline su obezbeđene na crtežima. Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, zapravo najviše jedna takva sekvenca treba da se koristi u stvaranju antitela ili ABP-a. Zaista, u nekim načinima ostvarivanja, potrebno je da samo jedna ili nijedna od specifičnih nukleinskih kiselina teškog ili lakog lanca bude prisutna.

[0055] U nekim načinima ostvarivanja, ABP kodira sekvenca nukleinske kiseline koja može da kodira bilo koju od sekvenci proteina u tabeli 2.

[0056] U nekim načinima ostvarivanja, ABP se selektivno vezuje za oblik PCSK9 koji se vezuje za LDLR (npr., autokatalizni oblik molekula). U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se ne vezuje za c-terminus katalitičkog domena (npr., 5.5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40 većine aminokiselina u c-terminusu). U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se ne vezuje za n-terminus katalitičkog domena (npr., 5.5-10, 10-15, 15-20, 20-25, 25-30, 30-40 većine aminokiselina u n-terminusu). U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za aminokiseline u okviru aminokiselina 1-100 zrelog oblika PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za aminokiseline u okviru (i/ili sekvence aminokiseline koje se sastoje od) aminokiselina 31-100, 100-200, 31-152, 153-692, 200-300, 300-400, 452-683, 400-500, 500-600, 31-692, 31-449, i/ili 600-692. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za katalitički domen. U nekim načinima ostvarivanja, neutralizujući i/ili ne-neutralizujući ABP se vezuje za prodomen. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje i za katalitičke i za pro domene. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za katalitički domen kako bi se ometala površina na katalitičkom domenu koja ima interakciju sa pro domenom. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za katalitički domen na lokaciji ili površini sa kojom pro-domen ima interakciju kako je naznačeno u Piper et al. (Structure 15:1-8 (2007), uključujući strukturalne prikaze date tamo). U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za katalitički domen i ograničava pokretljivost prodomena. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za katalitički domen bez vezivanja za pro-domen. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za katalitički domen, bez vezivanja za pro-domen, istovremeno sprečavajući da se pro-domen reorijentiše kako bi se omogućilo da se PCSK9 vezuje za LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje u istom epitopu kao i okolni ostaci 149-152 pro-domena u Piper et al. U nekim načinima ostvarivanja, ABP-ovi se vezuju za žleb (kako je naznačeno u Piper et al.) na V domenu. U nekim načinima ostvarivanja, ABP-ovi se vezuju za histidinom obogaćenu zakrpu blizu žleba na V domenu. U nekim načinima ostvarivanja, takva antitela (koja se vezuju za V domen) nisu neutralizujuća. U nekim načinima ostvarivanja, antitela koja se vezuju za V domen su neutralizujuća. U nekim načinima ostvarivanja, neutralizujući ABP-ovi sprečavaju vezivanje PCSK9 za LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, nautralizujući ABP-ovi, dok sprečavaju PCSK9 degradaciju LDLR, ne sprečavaju vezivanje PCSK9 za LDLR (na primer ABP 31A4). U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za ili blokira najmanje jedan od histidina prikazanih na Fig.4 u dokumentu Piper et al.. U nekim načinima ostvarivanja, ABP blokira katalitičku trijadu u PCSK9.

[0057] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo se selektivno vezuje za varijantu PCSK9 proteina, npr., D374Y u odnosu na divlji tip PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja, ova antitela se vezuju za varijantu najmanje dva puta jaču od divljeg tipa, a poželjno 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000, 1000-10.000 puta ili više za mutant nego za divlji tip (kako je izmereno preko Kd). U nekim načinima ostvarivanja, antitelo selektivno inhibira interakciju varijante D374Y PCSK9 sa LDLR u odnosu sposobnost divljeg tipa PCSK9 za interakciju sa LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, ova antitela blokiraju sposobnost ove varijante da se vezuje za LDLR jače od sposobnosti divljeg tipa, npr., najmanje dva puta jače od divljeg tipa, a poželjno 2-5, 5-10, 10-100, 100-1000 puta ili više za mutant nego za divlji tip (kako je izmereno preko IC50). U nekim načinima ostvarivanja, antitelo se vezuje za i neutrališe i divlji tip PCSK9 i varijantne oblike PCSK9, kao što je D374Y na sličnim nivoima. U nekim načinima ostvarivanja, antitelo se vezuje za PCSK9 kako bi se sprečilo da se varijante LDLR vezuju za PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja, varijante LDLR su najmanje 50% identične humanom LDLR. Napominjemo da su varijante LDLR poznate stručnjacima iz ove oblasti (npr., Brown MS et al, "Calcium cages, acid baths and recycling receptors" Nature 388: 629-630, 1997). U nekim načinima ostvarivanja, ABP može da podigne nivo efektivnog LDLR u heterozigotnoj porodičnoj hiperholesterolemiji (gde je prisutna varijanta LDLR sa gubitkom funkcije).

[0058] U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za (ali ne blokira) varijante PCSK9 koje su najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili u većem procentu identične obliku PCSK9 prikazanom

4

na FIG.1A i/ili FIG.1B. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za (ali ne blokira) varijante PCSK9 koje su najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili u većem procentu identične zrelom obliku PCSK9 prikazanom na FIG.1A i/ili FIG.1B. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za i sprečava varijante PCSK9 koje su najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili u većem procentu identične obliku PCSK9 prikazanom na FIG.1A i/ili FIG.1B da stupaju u interakciju sa LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za i sprečava varijante PCSK9 koje su najmanje 50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-95, 95-99, ili u većem procentu identične zrelom obliku PCSK9 prikazanom na FIG.1B da stupaju u interakciju sa LDLR. U nekim načinima ostvarivanja, varijanta PCSK9 je humana varijanta, kao što su varijante u položaju 474, E620G, i/ili E670G. U nekim načinima ostvarivanja, aminokiselina u položaju 474 je valin (kao kod drugih ljudi) ili treonin (kao kod makaki rakojeda i miševa). S obzirom na ovde predstavljene podatke o unakrsnoj reaktivnosti, smatra se da će ova antitela biti spremna za vezivanje sa gore navedenim varijantama.

[0059] U nekim načinima ostvarivanja, ABP se vezuje za epitop vezan za jedno od antitela opisanih u tabeli 2. U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena se vezuju za specifično konformaciono stanje PCSK9 kako bi se sprečila interakcija PCSK9 sa LDLR.

Humanizovani proteini za vezivanje antigena (npr., antitela)

[0060] Kako je ovde opisano, protein za vezivanje antigena sa PCSK9 može obuhvatati humanizovano antitelo i/ili njegov deo. Važna praktična primena takve strategije je „humanizacija“ mišjeg humoralnog imunog sistema.

[0061] U određenim načinima ostvarivanja, humanizovano antitelo ima suštinski isti afinitet za cilj kao antitelo od druge vrste iz koje se izvodi humanizovano antitelo. Pogledati, npr., U.S. Patent 5,530,101, U.S. Patent 5,693,761; U.S. Patent 5,693,762; U.S. Patent 5,585,089.

[0062] U određenim načinima ostvarivanja, identifikovane su aminokiseline promenljivog domena antitela koje mogu da se modifikuju bez umanjivanja prirodnog afiniteta domena za vezivanje antigena, uz istovremeno smanjivanje njegove imunogeničnosti. Pogledati, npr., U.S. Patent No.5,766,886 i 5,869,619.

[0063] U određenim načinima ostvarivanja, obično je predviđeno da modifikacija antitela pomoću postupaka poznatih u ovoj oblasti ostvari povećan afinitet za vezivanje za cilj i/ili da smanji imunogeničnost antitela kod primaoca. U određenim načinima ostvarivanja, humanizovana antitela su modifikovana radi eliminacije mesta glikozilacije kako bi se povećao afinitet antitela za njemu srodni antigen. Pogledati, npr., Co et al., Mol. Immunol., 30:1361-1367 (1993). U određenim načinima ostvarivanja, tehnike kao što su „ponovno oblikovanje“, „hiperhimerizacija“ ili „oblaganje/presvlačenje“ se koriste za proizvodnju humanizovanih antitela. Pogledati, npr., Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol.81:105 (1998); Roguska et al., Prot. Engineer., 9:895-904 (1996); i U.S. Patent No.

6,072,035. U određenim takvim načinima ostvarivanja, takve tehnike obično smanjuju imunogeničnost antitela smanjenjem broja stranih ostataka, ali ne sprečavaju anti-idiotipske i anti-alotipske odgovore posle ponovljenog davanja antitela. Određeni drugi postupci za smanjenje imunogeničnosti su opisani, npr., u Gilliland et al., J. Immunol., 62(6): 3663-71 (1999).

[0064] U određenim primerima, humanizovanje antitela dovodi do gubitka kapaciteta vezivanja za antigen. U određenim načinima ostvarivanja, humanizovana antitela su „reverzno mutirana“. U određenim takvim načinima ostvarivanja, humanizovano antitelo je mutirano kako bi uključivalo jedan ili više ostataka aminokiseline koji se nalaze u antitelu donora. Pogledati, npr., Saldanha et al., Mol Immunol 36:709-19 (1999).

[0065] U određenim načinima ostvarivanja regioni za utvrđivanje komplementarnosti (CDR-ovi) promenljivih regiona lakog i teškog lanca antitela za PCSK9 mogu se nakalemiti na okvirne regione (FR-ove) iz iste ili druge vrste. U određenim načinima ostvarivanja, CDR-ovi promenljivih regiona lakog i teškog lanca antitela za PCSK9 mogu se nakalemiti na konsenzus humane FR-ove. Da bi se kreirali konsenzus humani FR-ovi, u određenim načinima ostvarivanja, FR-ovi iz nekoliko humanih sekvenci aminokiseline teških lanaca ili lakih lanaca su poravnati kako bi se identifikovala konsenzus sekvenca aminokiseline. U određenim načinima ostvarivanja, FR-ovi antitela za PCSK9 teškog lanca ili lakog lanca se zamenjuju sa FR-ovima sa različitog teškog lanca ili lakog lanca. U određenim načinima ostvarivanja, retke aminokiseline u FR-ovima teških i lakih lanaca antitela za PCSK9 nisu zamenjene, dok je ostatak FR aminokiselina zamenjen. Retke aminokiseline su specifične aminokiseline koje su na položajima na kojima se obično ne nalaze u FR-ovima. U određenim načinima ostvarivanja, nakalemljeni promenljivi regioni iz antitela za PCSK9 mogu da se koriste sa konstantnim regionom koji se razlikuje od konstantnog regiona antitela za PCSK9. U određenim načinima ostvarivanja, nakalemljeni promenljivi regioni su deo jednolančanog Fv antitela. Kalemljenje CDR je opisano, npr., u U.S. Patent Nos.6,180,370, 6,054,297, 5,693,762, 5,859,205, 5,693,761, 5,565,332, 5,585,089, i 5,530,101, i u Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), Winter, FEBS Letts., 430:92-94 (1998).

Humani proteini za vezivanje antigena (npr., antitela)

[0066] Kako je ovde opisano, protein za vezivanje antigena koji se vezuje za PCSK9 može da obuhvati humano (tj., potpuno humano) antitelo i/ili njegov deo. U određenim načinima ostvarivanja, obezbeđene su nukleotidne sekvence koje kodiraju, i sekvence aminokiseline koje obuhvataju, molekule imunoglobulina teškog i lakog lanca, naročito sekvence koje odgovaraju promenljivim regionima. U određenim načinima ostvarivanja, obezbeđene su sekvence koje odgovaraju regionima za utvrđivanje

4

komplementarnosti (CDR-ovi), konkretno od CDR1 kroz CDR3. Prema određenim načinima ostvarivanja, obezbeđena je ćelijska linija hibridoma koja eksprimira takav molekul imunoglobulina. Prema određenim načinima ostvarivanja, obezbeđena je ćelijska linija hibridoma koja eksprimira takvo monoklonalno antitelo. U određenim načinima ostvarivanja ćelijska linija hibridoma je odabrana od najmanje jedne od ćelijskih linija opisanih u tabeli 2, npr., 21B12, 16F12 i 31H4. U određenim načinima ostvarivanja, obezbeđeno je prečišćeno humano monoklonalno antitelo za humani PCSK9.

[0067] Mogu da se konstruišu mišji sojevi kojima nedostaje proizvodnja mišjeg antitela sa velikim fragmentima humanih Ig lokusa u iščekivanju da će ti miševi proizvesti humana antitela u odsustvu mišjih antitela. Veliki humani Ig fragmenti mogu da očuvaju veliki diverzitet promenljivih gena, kao i pravilnu regulaciju proizvodnje i ekspresije antitela. Iskorišćavanjem mišje mašinerije za diverzifikaciju i selekciju antitela i usled nedostatka imunološke tolerancije na humane proteine, reprodukovani repertoar humanog antitela u ovim mišjim sojevima može prineti visok afinitet potpuno humanih antitela u odnosu na bilo koji antigen od interesa, uključujući humane antigene. Pomoću tehnologije hibridoma, humani MAb-ovi specifični za antigen sa željenom specifičnošću mogu da se proizvedu i odrede. Određeni primerni postupci su opisani u WO 98/24893, U.S. Patent No.5,545,807, EP 546073, i EP 546073.

[0068] U određenim načinima ostvarivanja, mogu se koristiti konstantni regioni vrsta koje nisu humane zajedno sa humanim promenljivim regionom(ima).

[0069] Sposobnost kloniranja i rekonstrukcije humanih lokusa veličine megabaze u veštačkim hromozomima kvasca (YAC-ovi) i njihovog uvođenja u mišju germinativnu ćeliju obezbeđuje pristup za razjašnjavanje funkcionalnih komponenti veoma velikih ili sirovo mapiranih lokusa, kao i generisanje korisnih modela humane bolesti. Dalje, upotreba takve tehnologije za supstituciju mišjih lokusa sa njihovim humanim ekvivalentima može obezbediti uvid u ekspresiju i regulaciju proizvoda humanog gena tokom razvoja, njihovu komunikaciju sa drugim sistemima, i njihovu uključenost u indukciju i progresiju bolesti.

[0070] Humana antitela izbegavaju neke od problema povezane sa antitelima koja poseduju mišje ili pacovske promenljive i/ili konstantne regione. Prisustvo takvih proteina izvedenih od miša ili pacova može da dovede do rapidnog klirensa antitela ili može da dovede do generisanja imunog odgovora na antitelo od strane pacijenta. Kako bi se izbegla upotreba antitela izvedenih od miša ili pacova, potpuno humana antitela mogu da se generišu kroz uvođenje funkcionalnih lokusa humanog antitela u glodara, drugog sisara ili životinju tako da glodar, drugi sisar ili životinja proizvodi potpuno humana antitela.

[0071] Humanizovana antitela su ona antitela kojima su, dok u početku sadrže sekvence aminokiseline antitela koje nisu humane, najmanje neke od ovih ne-humanih sekvenci aminokiseline antitela

4

zamenjene sa humanim sekvencama antitela. Ovo je kontrast u odnosu na humana antitela, kod kojih je antitelo kodirano (ili sposobno da bude kodirano) od strane gena koje poseduje čovek.

Varijante proteina za vezivanje antigena

[0072] Druga antitela koja su obezbeđena su gore navedene varijante ABP-ova formirane kombinacijom ili poddelovima promenljivih teških i promenljivih lakih lanaca prikazanih u tabeli 2 i obuhvataju promenljive lake i/ili promenljive teške lance od kojih svaki ima najmanje 50%, 50-60, 60-70, 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 97-99%, ili više od 99% identičnosti sa sekvencama aminokiseline sekvenci u tabeli 2 (bilo celokupna sekvenca ili poddeo sekvence, npr., jedan ili više CDR-ova). U nekim primerima, takva antitela uključuju najmanje jedan teški lanac i jedan laki lanac, dok u drugim primerima oblici varijante sadrže dva identična laka lanca i dva identična teška lanca (ili njihove poddelove). U nekim načinima ostvarivanja, poređenje sekvence na FIG.2A-3D (i 13A-13J, i drugi načini ostvarivanja na 15A-15D) može se koristiti radi identifikacije delova antitela koji se mogu modifikovati posmatranjem onih varijacija koje utiču na vezivanje i onih varijacija za koje se čini da ne utiču na vezivanje. Na primer, poređenjem sličnih sekvenci, mogu da se identifikuju oni delovi (npr., određene aminokiseline) koji mogu da se modifikuju i način njihove modifikacije, dok se istovremeno zadržava (ili poboljšava) funkcionalnost ABP. U nekim načinima ostvarivanja, varijante ABP-ova uključuju one konsenzus grupe i sekvence prikazane na FIG.13A, 13C, 13F, 13G, 13H, 13I, i/ili 13J, a varijacije su dopuštene na položajima koji su identifikovani kao promenljivi u nacrtu. CDR-ovi prikazani na FIG.13A, 13C, 13F i 13G su definisani na osnovu hibridne kombinacije Chothia postupka (na osnovu lokacije regiona strukturne petlje, pogledati, npr., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins," Bissan Al-Lazikani, Arthur M. Lesk and Cyrus Chothia, Journal of Molecular Biology, 273(4): 927-948, 7 November (1997)) i Kabat postupka (na osnovu promenljivosti sekvence, pogledati, npr., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No.91-3242, Kabat et al., (1991)). Svaki ostatak utvrđen bilo kojim postupkom je uključen u završnu listu CDR ostataka (i predstavljen je na FIG.13A, 13C, 13F i 13G). CDR-ovi na FIG.13H, 13I, i 13J su dobijeni samo Kabat postupkom. Osim ako je drugačije naznačeno, definisane konsenzus sekvence, CDR-ovi, i FR-ovi na FIG.

13H-13J će definisati i kontrolisati zabeležene CDR-ove i FR-ove za navedene ABP-ove na FIG.13.

[0073] U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata teški lanac koji obuhvata promenljivi region koji obuhvata sekvencu aminokiseline najmanje 90% identičnu sa sekvencom aminokiseline odabranom iz najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata teški lanac koji obuhvata promenljivi region koji obuhvata sekvencu aminokiseline najmanje 95% identičnu sa sekvencom

4

aminokiseline odabranom iz najmanje jedne od sekvenci SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata teški lanac koji obuhvata promenljivi region koji obuhvata sekvencu aminokiseline najmanje 99% identičnu sa sekvencom aminokiseline odabranom iz najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60.

[0074] U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična jednom ili više CDR-ova od CDR-ova u najmanje jednoj od sekvenci od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60. U nekim načinima ostvarivanja, 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 CDR-ova (pri čemu je svaki najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identičan sa gore navedenim sekvencama) je prisutno.

[0075] U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična jednom ili više FR-ova od FR-ova u najmanje jednoj od sekvenci od SEQ ID NO: 74, 85, 71, 72, 67, 87, 58, 52, 51, 53, 48, 54, 55, 56, 49, 57, 50, 91, 64, 62, 89, 65, 79, 80, 76, 77, 78, 83, 69, 81, i 60. U nekim načinima ostvarivanja, 1, 2, 3, ili 4 FR-a (pri čemu je svaki najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identičan gore navedenim sekvencama) su prisutna.

[0076] U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata laki lanac koji obuhvata promenljivi region koji obuhvata sekvencu aminokiseline najmanje 90% identičnu sekvenci aminokiseline odabranoj iz najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata laki lanac koji obuhvata promenljivi region koji obuhvata sekvencu aminokiseline najmanje 95% identičnu sekvenci aminokiseline odabranoj iz najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata laki lanac koji obuhvata promenljivi region koji obuhvata sekvencu aminokiseline najmanje 99% identičnu sekvenci aminokiseline odabranoj iz najmanje jedne od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46.

[0077] U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična jednom ili više CDR-ova od CDR-ova u najmanje jednoj od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U nekim načinima ostvarivanja, 1, 2, 3, 4, 5, ili 6 CDR-ova (pri čemu je svaki najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identičan gore navedenim sekvencama) je prisutno.

4

[0078] U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena obuhvata sekvencu koja je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identična jednom ili više FR-ova od FR-ova u najmanje jednoj od sekvenci od SEQ ID NO: 5, 7, 9, 10, 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 42, 44, i 46. U nekim načinima ostvarivanja, 1, 2, 3, ili 4 FR-a (pri čemu je najmanje 90%, 90-95%, i/ili 95-99% identično gore navedenim sekvencama) su prisutna.

[0079] U svetlu ovog otkrivanja, stručnjak iz ove oblasti će moći da utvrdi pogodne varijante ABP-ova kako je ovde utvrđeno pomoću dobro poznatih tehnika. U određenim načinima ostvarivanja, stručnjak iz ove oblasti može da identifikuje pogodne površine molekula koje se mogu izmeniti bez aktivnosti uništavanja ciljanjem regiona za koje se smatra da nisu važni za aktivnost. U određenim načinima ostvarivanja, mogu se identifikovati ostaci i delovi molekula koji su sačuvani među sličnim polipeptidima. U određenim načinima ostvarivanja, čak i površine koje mogu biti važne za biološku aktivnost ili za strukturu mogu biti podvrgnute konzervativnim supstitucijama aminokiseline bez uništavanja biološke aktivnosti ili bez negativnog dejstva na strukturu polipeptida.

[0080] Pored toga, stručnjak iz ove oblasti može da pregleda ispitivanja funkcije strukture u kojima se identifikuju ostaci u sličnim polipeptidima koji su važni za aktivnost ili strukturu. Imajući u vidu takvo poređenje, može se predvideti važnost ostataka aminokiseline u proteinu koji odgovaraju ostacima aminokiseline koji su važni za aktivnost ili strukturu u sličnim proteinima. Stručnjak iz ove oblasti može da se opredeli za hemijski slične supstitucije aminokiseline za takve predviđene važne ostatke aminokiseline.

[0081] Stručnjak iz ove oblasti može takođe da analizira trodimenzionalnu strukturu i sekvencu aminokiseline u odnosu na tu strukturu u sličnim ABP-ovima. Imajući u vidu takve informacije, stručnjak iz ove oblasti može da predvidi poravnanje ostataka aminokiseline antitela u pogledu njegove trodimenzionalne strukture. U određenim načinima ostvarivanja, stručnjak iz ove oblasti može da odabere da ne vrši radikalne izmene ostataka aminokiseline predviđenih da budu na površini proteina, pošto takvi ostaci mogu biti uključeni u važne interakcije sa drugim molekulima. Dalje, stručnjak iz ove oblasti može da generiše probne varijante koje sadrže jednu supstituciju aminokiseline na svakom željenom ostatku aminokiseline. Varijante se zatim mogu skriningovati pomoću analiza aktivnosti koje su poznate stručnjacima iz ove oblasti. Takve varijante se mogu koristiti za prikupljanje informacija o pogodnim varijantama. Na primer, ako se otkrije da je izmena određenog ostatka aminokiseline rezultovala uništenom, nepoželjno smanjenom, ili nepogodnom aktivnošću, varijante sa takvom izmenom mogu se izbeći. Drugim rečima, na osnovu informacija prikupljenih iz takvih rutinskih eksperimenata, stručnjak iz ove oblasti može spremno da utvrdi aminokiseline kod kojih dalje supstitucje treba izbegavati bilo samostalno ili u kombinaciji sa drugim mutacijama.

4

[0082] Više naučnih publikacija je posvećeno predviđanju sekundarne strukture. Pogledati Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47:45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 i Chou et al., Biophys. J., 26:367-384 (1979). Dalje, trenutno su dostupni kompjuterski programi za pomoć u predviđanju sekundarne strukture. Jedan postupak predviđanja sekundarne strukture je zasnovan na homolognom modelovanju. Na primer, dva polipeptida ili proteina koji imaju identičnost sekvence veću od 30%, ili sličnost veću od 40% često imaju slične strukturne topologije. Nedavni porast strukturne baze podataka proteina (PDB) je obezbedio pojačanu mogućnost predviđanja sekundarne strukture, uključujući potencijalni broj savijanja u strukturi polipeptida ili proteina. Pogledati Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27(1):244-247 (1999). Navodi se (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) da postoji ograničen broj savijanja u datom polipeptidu ili proteinu i da će, kada kritičan broj struktura bude rešen, strukturno predviđanje postati drastično tačnije.

[0083] Dodatni postupci predviđanja sekundarne strukture uključuju „navijanje“ (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1):15-19 (1996)), „analizu profila“ (Bowie et al., Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 84(13):4355-4358 (1987)), i „evolutivno povezivanje“ (Pogledati Holm, supra (1999), and Brenner, supra (1997)).

[0084] U određenim načinima ostvarivanja, varijante proteina za vezivanje antigena uključuju varijante glikozilacije u kojima je broj i/ili tip mesta glikozilacije izmenjen u poređenju sa sekvencama aminokiseline matičnog polipeptida. U određenim načinima ostvarivanja, varijante proteina obuhvataju veći ili manji broj N-povezanih mesta glikozilacije od prirodnog proteina. N-povezano mesto glikozilacije je karakterisano sekvencom: Asn-X-Ser ili Asn-X-Thr, pri čemu ostatak aminokiseline označen kao X može biti bilo koji ostatak aminokiseline osim prolina. Supstitucija ostataka aminokiseline za kreiranje ove sekvence obezbeđuje potencijalno novo mesto za dodavanje N-povezanog lanca ugljenog hidrata. Alternativno, supstitucije koje eliminišu ovu sekvencu ukloniće postojeći N-povezani lanac ugljenog hidrata. Takođe je obezbeđena preraspodela N-povezanih lanaca ugljenog hidrata, pri čemu se jedno ili više N-povezanih mesta glikozilacije (obično onih koja su prirodna) eliminiše, a jedno ili više novih N-povezanih mesta se stvara. Dodatne poželjne varijante antitela uključuju varijante cisteina u kojima se jedan ili više ostataka cisteina briše iz ili supstituiše za drugu aminokiselinu (npr., serin) u poređenju sa matičnom sekvencom aminokiseline. Varijante cisteina mogu da se koriste kada antitela moraju biti ponovo savijena u biološki aktivnu konformaciju, kao posle izolacije nerastvorljivih tela za uključivanje. Varijante cisteina generalno imaju manje ostataka cisteina od prirodnog proteina, i obično imaju paran broj za minimizaciju interakcija koje rezultuju iz neuparenih cisteina.

[0085] Prema određenim načinima ostvarivanja, supstitucije aminokiseline su one koje: (1) smanjuju podložnost proteolizi, (2) smanjuju podložnost oksidaciji, (3) menjaju afinitet vezivanja za formiranje kompleksa proteina, (4) menjaju afinitete vezivanja, i/ili (4) dodeljuju ili modifikuju druge fizičkohemijske ili funkcionalne karakteristike na takvim polipeptidima. Prema određenim načinima ostvarivanja, jedna ili više supstitucija aminokiseline (u određenim načinima ostvarivanja, konzervativne supstitucije aminokiseline) mogu se napraviti u prirodnoj sekvenci (u određenim načinima ostvarivanja, u delu polipeptida izvan domena koji formira(ju) intermolekulske kontakte). U određenim načinima ostvarivanja, konzervativna supstitucija aminokiseline obično ne mora suštinski da izmeni strukturne karakteristike matične sekvence (npr., zamenska aminokiselina ne treba da bude sklona razbijanju heliksa, što se događa u matičnoj sekvenci, ili da ometa druge tipove sekundarne strukture, što karakteriše matičnu sekvencu). Primeri sekundarnih i tercijarnih struktura polipeptida priznatih u ovoj oblasti su opisani u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden & J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton et al., Nature, 354:105 (1991).

[0086] U nekim načinima ostvarivanja, varijante su varijante sekvenci nukleinske kiseline ovde opisanih ABP-ova. Stručnjak iz ove oblasti će shvatiti da se gore navedeni tekst može koristiti za identifikaciju, procenu, i/kreiranje varijanti ABP proteina, a takođe i za sekvence nukleinske kiseline koje mogu kodirati ove varijante proteina. Stoga, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju ove varijante proteina (kao i sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju ABP-ove u tabeli 2, ali se razlikuju od onih koje su ovde izričito opisane) su uzete u obzir. Na primer, varijanta ABP-a može imati najmanje 80, 80-85, 85-90, 90-95, 95-97, 97-99 ili veću identičnost sa najmanje jednom sekvencom nukleinske kiseline opisanom u SEQ ID NOs: 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151 ili najmanje jednim do šest (i njihovim različitim kombinacijama) CDR(ova) koje kodiraju sekvence nukleinske kiseline u SEQ ID NOs: 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, i 151.

[0087] U nekim načinima ostvarivanja, antitelo (ili sekvenca nukleinske kiseline koja ga kodira) je varijanta ako sekvenca nukleinske kiseline koja kodira određeni ABP (ili sama sekvenca nukleinske kiseline) može selektivno da hibridizuje bilo koju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira proteine u tabeli 2 (kao što su, ali bez ograničenja na SEQ ID NO: 152, 153, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122,

1

123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, i 151) pod strogim uslovima. U jednom načinu ostvarivanja, pogodni umereno strogi uslovi uključuju prethodno ispiranje u rastvoru od 5XSSC; 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8:0); hibridizacija na 50° C, -65° C, 5xSSC, preko noći ili, u slučaju unakrsne homologije vrsta, na 45° C sa 0,5xSSC; posle čega sledi ispiranje dva puta na 65° C tokom 20 minuta sa svakim od 2x, 0,5x i 0,2xSSC koji sadrži 0,1% SDS. Takve hibridizujuće DNK sekvence su takođe u opsegu ove objave, kao što su nukleotidne sekvence koje, zbog degeneracije koda, kodiraju polipeptid antitela koji kodira hibridizujuća DNK sekvenca i sekvence aminokiseline koje kodiraju ove sekvence nukleinske kiseline. U nekim načinima ostvarivanja, varijante CDR-ova uključuju sekvence nukleinske kiseline i sekvence aminokiseline koje kodiraju one sekvence koje hibridizuju jedan ili više CDR-ova u gore navedenim sekvencama (pojedinačni CDR-ovi se mogu odmah utvrditi u svetlu FIG.2A-3D, i drugih načina ostvarivanja na FIG.3CCC-3JJJ i 15A-15D). Izraz „selektivno hibridizovati“ naveden u ovom kontekstu označava detektabilno i selektivno vezivanje. Polinukleotidi, oligonukleotidi i njihovi fragmenti u skladu sa objavom selektivno hibridizuju lance nukleinske kiseline u uslovima hibridizacije i ispiranja koji smanjuju značajne količine detektabilnog vezivanja za nespecifične nukleinske kiseline. Izrazito strogi uslovi se mogu koristiti za ostvarenje uslova selektivne hibridizacije kako je poznato u ovoj oblasti i ovde navedeno. Generalno, homologija sekvence nukleinske kiseline između polinukleotida, oligonukleotida i fragmenata ove objave i sekvence nukleinske kiseline od interesa biće najmanje 80%, a češće sa poželjno povećanim homologijama od najmanje 85%, 90%, 95%, 99%, i 100%. Dve sekvence aminokiseline su homologne ako postoji delimična ili potpuna identičnost između njihovih sekvenci. Na primer, homologija od 85% znači da je 85% aminokiselina identično kada su dve sekvence poravnate za maksimalno spajanje. Praznine (u bilo kojoj od dve spojene sekvence) su dopuštene tokom maksimalnog spajanja; dužine praznine od 5 ili manje su poželjne, pri čemu su 2 ili manje poželjnije. Alternativno i poželjno, dve sekvence proteina (ili sekvence polipeptida izvedene iz njih od najmanje 30 aminokiselina po dužini) su homologne, pošto se ovaj pojam ovde koristi, ako imaju rezultat poravnanja veći od 5 (u jedinicama standardne devijacije) pomoću programa ALIGN sa matricom podataka o mutaciji i vrednošću praznine od 6 ili više. Pogledati Dayhoff, M. O., u Atlas of Protein Sequence and Structure, pp.

101-110 (Volume 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) i Supplement 2 to this volume, pp. 1-10. Ove dve sekvence ili njihovi delovi su poželjnije homologni ako su njihove aminokiseline veće od ili jednake 50% identičnosti kada se optimalno poravnaju pomoću ALIGN programa. Pojam „odgovara“ se ovde koristi da označi da je polinukleotidna sekvenca homologna (tj., identična, ne striktno evolutivno povezana) sa svim ili delom referentne polinukleotidne sekvence, ili da je sekvenca polipeptida identična referentnoj sekvenci polipeptida. Kao kontradistinkcija, pojam „komplementaran“ se ovde koristi da označi da je komplementarna sekvenca homologna celokupnoj ili delu referentne

2

polinukleotidne sekvence. Radi ilustracije, nukleotidna sekvenca „TATAC“ odgovara referentnoj sekvenci „TATAC“ i komplementarna je referentnoj sekvenci „GTATA“.

Priprema proteina za vezivanje antigena (npr., antitela)

[0088] U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena (kao što je antitelo) se proizvode imunizacijom sa antigenom (npr., PCSK9). U određenim načinima ostvarivanja, antitela se mogu proizvesti imunizacijom sa PCSK9 pune dužine, rastvorljivim oblikom PCSK9, samim katalitičkim domenom, zrelim oblikom PCSK9 prikazanim na FIG.1A, splajsovanim oblikom, ili njihovim fragmentima. U određenim načinima ostvarivanja, antitela prema ovom pronalasku su monoklonalana, i/ili mogu biti rekombinantna antitela. U određenim načinima ostvarivanja, antitela prema ovom otkrivanju su humana antitela pripremljena, na primer, imunizacijom transgenih životinja koje mogu da proizvode humana antitela (pogledati, na primer, PCT objavljenu prijavu br. WO 93/12227).

[0089] U određenim načinima ostvarivanja, određene strategije se mogu koristiti za upravljanje inherentnim karakteristikama antitela, kao što je afinitet antitela za njegov cilj. Takve strategije uključuju, ali nisu ograničene na upotrebu mutageneze specifične za mesto ili nasumične mutageneze polinukleotidnog molekula koji kodira antitelo radi generisanja varijante antitela. U određenim načinima ostvarivanja, posle takvog generisanja sledi skrining za varijante antitela koje iskazuju željenu promenu, npr. povećan ili smanjen afinitet.

[0090] U određenim načinima ostvarivanja, ostaci aminokiseline ciljani u mutagenim strategijama su oni u CDR-ovima. U određenim načinima ostvarivanja, aminokiseline u okvirnim regionima promenljivih domena su ciljani. U određenim načinima ostvarivanja, pokazalo se da takvi okvirni regioni doprinose karakteristikama ciljnog vezivanja određenih antitela. Pogledati, npr., Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9:395-402 (1999) i reference u njima.

[0091] U određenim načinima ostvarivanja, manje i efektivnije skriningovane biblioteke varijanti antitela se proizvode ograničavanjem nasumične ili mutageneze usmerene na lokaciju na mesta hiper-mutacije u CDR-ovima, što su mesta koja odgovaraju površinama sklonim mutacijama tokom somatskog procesa sazrevanja afiniteta. Pogledati, npr., Chowdhury & Pastan, Nature Biotech., 17: 568-572 (1999) i reference u njima. U određenim načinima ostvarivanja, određeni tipovi DNK elemenata se mogu koristiti za identifikaciju mesta hiper-mutacije uključujući, ali bez ograničenja na određena direktna i invertovana ponavljanja, određene konsenzus sekvence, određene sekundarne strukture, i određene palindrome. Na primer, takvi DNK elementi koji se mogu koristiti za identifikaciju mesta hiper-mutacije uključuju, ali nisu ograničeni na sekvencu tetrabaze koja obuhvata purin (A ili G), posle čega sledi guanin (G), posle čega sledi pirimidin (C ili T), posle čega sledi ili adenozin ili timidin (A ili T) (tj., A/G-G-C/T-A/T). Još jedan primer DNK elementa koji se može koristiti za identifikaciju mesta hiper-mutacije je kodon serina, A-G-C/T.

Priprema potpuno humanih ABP-ova (npr., antitela)

[0092] U određenim načinima ostvarivanja, tehnika prikaza faga se koristi za generisanje monoklonalnih antitela. U određenim načinima ostvarivanja, takvim tehnikama se proizvode potpuno humana monoklonalna antitela. U određenim načinima ostvarivanja, polinukleotid koji kodira jedan fragment Fab ili Fv antitela se eksprimira na površini čestice faga. Pogledati, npr., Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J Mol Biol 222: 581 (1991); U.S. Patent No.5,885,793. U određenim načinima ostvarivanja, fagovi se „skrininguju“ radi identifikacije onih fragmenata antitela koji imaju afinitet za cilj. Stoga, određeni takvi procesi podražavaju imuni odabir kroz prikaz repertoara fragmenta antitela na površini tankog bakteriofaga, i kasnijim odabirom faga njihovim vezivanjem za cilj. U određenim takvim postupcima, funkcionalni neutralizujući fragmenti antitela sa visokim afinitetom su izolovani. U određenim takvim načinima ostvarivanja (detaljnije opisanim u nastavku), kompletan repertoar gena humanog antitela se stvara kloniranjem prirodno preraspoređenih humanih V gena iz limfocita u perifernoj krvi. Pogledati, npr., Mullinax et al., Proc Natl Acad Sci (USA), 87: 8095-8099 (1990).

[0093] Prema određenim načinima ostvarivanja, antitela ovog pronalaska se pripremaju upotrebom transgenog miša kojem je umetnut značajan deo humanog antitela koji proizvodi genom, ali za koji se smatra da ne može da proizvodi endogena mišja antitela. Takvi miševi zatim mogu da proizvode molekule i antitela humanog imunoglobulina i antitela, a ne mogu da proizvode molekule i antitela mišjeg imunoglobulina. Tehnologije koje se koriste za dostizanje ovog rezultata su opisane u patentima, prijavama i referencama objavljenim u ovoj specifikaciji. U određenim načinima ostvarivanja, mogu da se koriste postupci kao što su oni opisani u PCT Published Application No. WO 98/24893 ili u Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997).

[0094] Generalno, potpuno humani monoklonalni ABP-ovi (npr., antitela) specifični za PCSK9 mogu da se proizvedu na sledeći način. Transgeni miševi koji sadrže gene humanog imunoglobulina su imunizovani sa antigenom od interesa, npr. PCSK9, a dobijene su limfne ćelije (kao što su B-ćelije) iz miševa koji eksprimiraju antitela. Takve dobijene ćelije se fuzionišu sa ćelijskom linijom mijeloidnog tipa radi pripreme besmrtnih ćelijskih linija hibridoma, a takve ćelijske linije hibridoma se skrininguju i biraju za identifikaciju ćelijskih linija hibridoma koje proizvode antitela specifična za antigen od interesa. U određenim načinima ostvarivanja, obzebeđena je proizvodnja ćelijske linije hibridoma koja proizvodi antitela specifična za PCSK9.

4

[0095] U određenim načinima ostvarivanja, potpuno humana antitela se proizvode izlaganjem humanih splenocita (B ili T ćelija) antigenu in vitro, a zatim rekonstituisanjem izloženih ćelija u imunokompromitovanom mišu, npr. SCID ili nod/SCID. Pogledati, npr., Brams et al., J.Immunol.160: 2051-2058 (1998); Carballido et al., Nat. Med., 6: 103-106 (2000). U određenim takvim pristupima, kalemljenje humanog fetalnog tkiva u SCID miševe (SCID-hu) dovodi do dugoročne hematopoeze i razvoja humanih T-ćelija. Pogledati, npr., McCune et al., Science, 241:1532-1639 (1988); Ifversen et al., Sem. Immunol., 8:243-248 (1996). U određenim primerima, humoralni imuni odgovor kod takvih himernih miševa zavisi od istovremenog razvoja humanih T-ćelija kod životinja. Pogledati, npr., Martensson et al., Immunol., 83:1271-179 (1994). U određenim pristupima, humani limfociti u perifernoj krvi se transplantuju u SCID miševe. Pogledati, npr., Mosier et al., Nature, 335:256-259 (1988). U određenim takvim načinima ostvarivanja, kada se takve transplantovane ćelije obrađuju bilo agensom prajmovanja, kao što je enterotoksin stafilokoka A (SEA), ili anti-humani CD40 monoklonalna antitela, detektuju se viši nivoi proizvodnje B ćelija. Pogledati, npr., Martensson et al., Immunol., 84: 224-230 (1995); Murphy et al., Blood, 86:1946-1953 (1995).

[0096] Stoga, u određenim načinima ostvarivanja, potpuno humana antitela se mogu proizvesti ekspresijom rekombinantne DNK u ćelijama domaćina ili ekspresijom u ćelijama hibridoma. U drugim načinima ostvarivanja, antitela se mogu proizvesti pomoću ovde opisanih tehnika prikaza faga.

[0097] Ovde opisana antitela su pripremljena upotrebom XenoMouse® tehnologije, kako je ovde opisano. Takvi miševi su zatim sposobni da proizvode molekule i antitela humanog imunoglobulina, a ne mogu da proizvode molekule i antitela mišjeg imunoglobulina. Tehnologije upotrebljene za ostvarenje istog su opisane u patentima, prijavama i referencama objavljenim u poslednjem odeljku ovog dokumenta. Određenije, međutim, poželjan način ostvarivanja transgene proizvodnje miševa i antitela iz njih je opisan u U.S. Patent Application Serial No.08/759,620, podnetoj 3. decembra 1996. i u International Patent Application Nos. WO 98/24893, objavljenoj 11. juna 1998. i WO 00/76310, objavljenoj 21. decembra 2000. Takođe pogledati Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156 (1997).

[0098] Upotrebom takve tehnologije, proizvedena su potpuno humana monoklonalna antitela za različite antigene. Suštinski, XenoMouse® linije miševa su imunizovane sa antigenom od interesa (npr. PCSK9), limfne ćelije (kao što su B-ćelije) su dobijene od hiper-imunizovanih miševa, a dobijeni limfociti su fuzionisani sa ćelijskom linijom mijeloidnog tipa za pripremu besmrtnih ćelijskih linija hibridoma. Ove ćelijske linije hibridoma su skriningovane i odabrane za identifikaciju ćelijskih linija hibridoma koje su proizvele antitela specifična za antigen od interesa. Ovde su obezbeđeni postupci za proizvodnju više ćelijskih linija hibridoma koje proizvode antitela specifična za PCSK9. Dalje, ovde je obezbeđena karakterizacija antitela koje proizvode takve ćelijske linije, uključujući analize nukleotidne i sekvence aminokiseline teških i lakih lanaca takvih antitela.

[0099] Proizvodnja XenoMouse® sojeva miševa se dalje navodi i skicira u U.S. Patent Application Serial Nos.07/466,008, podnetoj 12. januara 1990., 07/610,515, podnetoj 8. novembra 1990., 07/919,297, podnetoj 24. jula 1992., 07/922,649, podnetoj 30. jula 1992., 08/031,801, podnetoj 15. marta 1993., 08/112,848, podnetoj 27. avgusta 1993., 08/234,145, podnetoj 28. aprila 1994., 08/376,279, podnetoj 20. januara 1995., 08/430, 938, podnetoj 27. aprila 1995., 08/464,584, podnetoj 5. juna 1995., 08/464,582, podnetoj 5. juna 1995., 08/463,191, podnetoj 5. juna 1995., 08/462,837, podnetoj 5. juna 1995., 08/486,853, podnetoj 5. juna 1995., 08/486,857, podnetoj 5. juna 1995., 08/486,859, podnetoj 5. juna 1995., 08/462,513, podnetoj 5. juna 1995., 08/724,752, podnetoj 2. oktobra 1996., 08/759,620, podnetoj 3. decembra 1996., U.S. Publication 2003/0093820, podnetoj 30. novembra 2001. i U.S. Patent Nos.6,162,963, 6,150,584, 6,114,598, 6,075,181, i 5,939,598 i Japanese Patent Nos.3068180 B2, 3068506 B2, i 3068507 B2. Takođe pogledati European Patent No., EP 0 463151 B1, dodela objavljena 12. juna 1996., International Patent Application No., WO 94/02602, objavljenu 3. februara 1994., International Patent Application No., WO 96/34096, objavljenu 31. oktobra 1996., WO 98/24893, objavljenu 11. juna 1998., WO 00/76310, objavljenu 21. decembra 2000.

[0100] U alternativnom pristupu, drugi, uključujući GenPharm International, Inc., su koristili pristup „minilokusa“. U pristupu minilokusa, ezgozeni Ig lokus se podražava uključivanjem delova (pojedinačnih gena) iz Ig lokusa. Stoga, jedan ili više VHgena, jedan ili više DHgena, jedan ili više JHgena, mu konstantni region, i obično drugi konstantni region (poželjno gama konstantni region) se formiraju u konstruktu za ubacivanje u životinju. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patent No.5,545,807 za Surani et al. i U.S. Patent Nos.5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,877,397, 5,874,299, i 6,255,458, svaki za Lonberg & Kay, U.S. Patent No.5,591,669 i 6,023.010 za Krimpsenfort & Berns, U.S. Patent Nos.5,612,205, 5,721,367, i 5,789,215 za Berns et al., i U.S. Patent No.5,643,763 za Choi & Dunn, i GenPharm International U.S. Patent Application Serial Nos.07/574,748, podnetoj 29. avgusta 1990., 07/575,962, podnetoj 31. avgusta 1990., 07/810,279, podnetoj 17. decembra 1991., 07/853,408, podnetoj 18. marta 1992., 07/904,068, podnetoj 23. juna 1992., 07/990,860, podnetoj 16. decembra 1992., 08/053,131, podnetoj 26. aprila 1993., 08/096,762, podnetoj 22. jula 1993., 08/155,301, podnetoj 18. novembra 1993., 08161,739, podnetoj 3. decembra 1993., 08/165,699, podnetoj 10. decembra 1993., 08/209,741, podnetoj 9. marta 1994. Takođe pogledati European Patent No.0546073 B1, International Patent Application Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, i WO 98/24884 i U.S. Patent No.5,981,175. Pogledati dalje Taylor et al., 1992, Chen et al., 1993, Tuaillon et al., 1993, Choi et al., 1993, Lonberg et al., (1994), Taylor et al., (1994), i Tuaillon et al., (1995), Fishwild et al., (1996).

[0101] Kirin je takođe demonstrirao generisanje humanih antitela iz miševa u koje su, kroz fuziju mikroćelija, uvedeni veliki delovi hromozoma, ili celokupni hromozomi. Pogledati European Patent Application Nos.773288 i 843961. Pored toga, generisani su KM™ miševi, koji su rezultat ukrštanja Kirinovih Tc miševa sa Medareksovim minilokus (Humab) miševima. Ovi miševi poseduju humani IgH transhromozom Kirinovih miševa i transgen kapa lanca Genpharm miševa (Ishida et al., Cloning Stem Cells, (2002) 4:91-102).

[0102] Humana antitela se takođe mogu izvesti in vitro postupcima. Pogodni primeri uključuju, ali nisu ograničeni na prikaz faga (CAT, Morphosys, Dyax, Biosite/Medarex, Xoma, Symphogen, Alexion (ranije Proliferon), Affimed), prikaz ribozoma (CAT), prikaz kvasca, i slično.

[0103] U nekim načinima ostvarivanja, ovde opisana antitela poseduju humane IgG4 teške lance, kao i IgG2 teške lance. Antitela takođe mogu biti od drugih humanih izotipova, uključujući IgG1. Antitela su posedovala visoke afinitete, a obično poseduju Kd od oko 10<-6>do oko 10<-13>M ili niže, prilikom merenja pomoću različitih tehnika.

[0104] Kao što će biti shvaćeno, antitela se mogu eksprimirati u ćelijskim linijama koje nisu ćelijske linije hibridoma. Sekvence koje kodiraju određena antitela mogu se koristiti za transformisanje pogodne sisarske ćelije domaćina. Transformacija se može sprovesti bilo kojim poznatim postupkom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer, pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukciju ćelije domaćina sa virusom (ili vektorom) ili postupcima transfekcije poznatim u ovoj oblasti, kako je navedeno u U.S. Patent Nos.4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455.

Upotrebljen postupak transformacije zavisi od domaćina koji se transformiše. Postupci za uvođenje heterolognih polinukleotida u sisarske ćelije su dobro poznati u ovoj oblasti i uključuju transfekciju posredstvom dekstrana, taloženje kalcijumfosfata, transfekciju posredstvom polibrena, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida(a) u lipozomima, i direktno mikroubrizgavanje DNK u jezgra.

[0105] Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u ovoj oblasti i uključuju mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne iz American Type Culture Collection (ATCC), uključujući, ali bez ograničenja na ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatoćelijskog karcinoma (npr., Hep G2), ćelije humanog epitelnog bubrega 293, i mnoge druge ćelijske linije. Naročito poželjne ćelijske linije su odabrane utvrđivanjem koje ćelijske linije imaju visoke nivoe ekspresije i proizvode antitela sa karakteristikama vezivanja konstitutivnog PCSK9.

[0106] U određenim načinima ostvarivanja, antitela i/ili ABP se proizvode pomoću najmanje jednog od sledećih hibridoma: 21B12, 31H4, 16F12, bilo kojih drugih hibridoma navedenih u tabeli 2 ili otkrivenih u primerima. U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena se vezuju za PCSK9 sa disocijacionom konstantom (KD) manjom od oko 1 nM, npr., 1000pM do 100 pM, 100 pM do 10 pM, 10 pM do 1 pM, i/ili 1 pM do 0,1 pM ili manje.

[0107] U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju molekul imunoglobulina najmanje jednog od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, Ig E, IgA, IgD, i IgM izotipa. U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju humani kapa laki lanac i/ili humani teški lanac. U određenim načinima ostvarivanja, teški lanac je od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, ili IgM izotipa. U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena su klonirani za ekspresiju u sisarskim ćelijama. U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju konstantni region koji nije nijedan od konstantnih regiona od IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD, i IgM izotipa.

[0108] U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgG2 teški lanac. U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgG4 teški lanac. U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju humani lambda laki lanac i humani IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD ili IgM teški lanac. U drugim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG2 teški lanac. U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG4 teški lanac. U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju humani kapa laki lanac i humani IgG1, IgG3, IgE, IgA, IgD ili IgM teški lanac. U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju promenljive regione antitela lizirane za konstantni region koji nije ni konstantni region za IgG2 izotip, ni konstantni region za IgG4 izotip. U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena su klonirani za ekspresiju u sisarskim ćelijama.

[0109] U određenim načinima ostvarivanja, konzervativne modifikacije teških i lakih lanaca antitela od najmanje jedne od linija hibridoma: 21B12, 31H4 i 16F12 (i odgovarajuće modifikacije za nukleotide kodiranja) će proizvesti antitela za PCSK9 koja imaju funkcionalne i hemijske karakteristike slične onima za antitela iz linija hibridoma: 21B12, 31H4 i 16F12. Nasuprot tome, u određenim načinima ostvarivanja, suštinske modifikacije u funkcionalnim i/ili hemijskim karakteristikama antitela za PCSK9 mogu se ostvariti odabirom supstitucija u sekvenci aminokiseline teških i lakih lanaca koji se značajno razlikuju po njihovom dejstvu na održavanje (a) strukture molekulske kičme na površini supstitucije, na primer, kao omotač ili helična konformacija, (b) naboja ili hidrofobičnosti molekula na ciljnom mestu, ili (c) povećanja zapremine bočnog lanca.

[0110] Na primer, „konzervativna supstitucija aminokiseline“ može uključivati supstituciju prirodnog ostatka aminokiseline sa ne-prirodnim ostatkom tako da je prisutno malo ili nikakvo dejstvo na polarnost ili naboj ostatka aminokiseline u tom položaju. Dalje, bilo koji prirodni ostatak u polipeptidu može se takođe supstituisati sa alaninom, što je prethodno opisano kao „mutageneza skeniranja alanina“.

[0111] Željene supstitucije aminokiseline (konzervativne ili ne-konzervativne) mogu utvrditi stručnjaci iz ove oblasti u trenutku kada su takve supstitucije poželjne. U određenim načinima ostvarivanja, supstitucije aminokiseline mogu da se koriste za identifikaciju važnih ostataka antitela za PCSK9, ili za povećanje ili smanjenje afiniteta antitela za PCSK9 kako je ovde opisano.

[0112] U određenim načinima ostvarivanja, antitela ovog pronalaska mogu da se eksprimiraju u ćelijskim linijama koje nisu ćelijske linije hibridoma. U određenim načinima ostvarivanja, sekvence koje kodiraju određena antitela mogu se koristiti za transformaciju pogodne sisarske ćelije domaćina. Prema određenim načinima ostvarivanja, transformacija se može sprovesti bilo kojim poznatim postupkom za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina, uključujući, na primer, pakovanje polinukleotida u virus (ili u virusni vektor) i transdukciju ćelije domaćina sa virusom (ili vektorom) ili pomoću postupaka transfekcije poznatih u ovoj oblasti, prema primerima u U.S. Patent Nos.4,399,216, 4,912,040, 4,740,461, i 4,959,455. U određenim načinima ostvarivanja, upotrebljen postupak transformacije može zavisiti od domaćina koji se transformiše. Postupci za uvođenje heterolognih polinukleotida u sisarske ćelije su dobro poznati u ovoj oblasti i uključuju, ali nisu ograničeni na transfekciju posredstvom dekstrana, taloženje kalcijumfosfata, transfekciju posredstvom polibrena, fuziju protoplasta, elektroporaciju, inkapsulaciju polinukleotida, i direktno mikroubrizgavanje DNK u jezgra.

[0113] Sisarske ćelijske linije dostupne kao domaćini za ekspresiju su dobro poznate u ovoj oblasti i uključuju, ali nisu ograničene na mnoge imortalizovane ćelijske linije dostupne iz American Type Culture Collection (ATCC), uključujući, ali bez ograničenja na ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega bebe hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatoćelijskog karcinoma (npr., Hep G2), i mnoge druge ćelijske linije. U određenim načinima ostvarivanja, ćelijske linije se mogu odabrati utvrđivanjem koje ćelijske linije imaju visoke nivoe ekspresije i proizvode antitela sa konstitutivnim karakteristikama HGF vezivanja. Odgovarajući ekspresioni vektori za sisarske ćelije domaćina su dobro poznati.

[0114] U određenim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena obuhvataju jedan ili više polipeptida. U određenim načinima ostvarivanja, bilo koji od različitih ekspresionih vektora/sistema domaćina može se koristiti za ekspresiju molekula polinukleotida koji kodiraju polipeptide koji obuhvata jednu ili više ABP komponenti ili sam ABP. Takvi sistemi uključuju, ali nisu ograničeni na mikroorganizme, kao što su bakterije transformisane sa rekombinantnim bakteriofagovima, plazmidi ili DNK ekspresioni vektori kozmida; kvasac transformisan sa ekspresionim vektorima kvasca; ćelijske sisteme insekata zaražene sa virusnim ekspresionim vektorima (npr., bakulovirus); ćelijske sisteme biljaka transfektovane sa virusnim ekspresionim vektorima (npr., virus mozaika karfiola, CaMV, virus mozaika duvana, TMV) ili transformisane sa bakterijskim ekspresionim vektorima (npr., Ti ili pBR322 plazmid); ili ćelijske sisteme životinja.

[0115] U određenim načinima ostvarivanja, polipeptid koji obuhvata jednu ili više ABP komponenti ili sam ABP se rekombinantno eksprimira u kvascu. Određeni takvi načini ostvarivanja koriste komercijalno dostupne sisteme ekspresije, npr., Pichia sistem ekspresije (Invitrogen, San Diego, CA), uz praćenje uputstava proizvođača. U određenim načinima ostvarivanja, takav sistem se oslanja na pre-pro-alfa sekvencu za usmeravanje sekrecije. U određenim načinima ostvarivanja, transkripcija umetka se pokreće preko promotera oksidaze alkohola (AOX1) po uvođenju preko metanola.

[0116] U određenim načinima ostvarivanja, lučeni polipeptid koji obuhvata jednu ili više ABP komponenti ili sam ABP je prečišćen sa podloge za rast kvasca. U određenim načinima ostvarivanja, upotrebljeni postupci za prečišćavanje polipeptida sa podloge za rast kvasca su isti kao i oni koji se koriste za prečišćavanje polipeptida iz bakterijskih i supernatanata sisarske ćelije.

[0117] U određenim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira polipeptid koji obuhvata jednu ili više ABP komponenti ili sam ABP je klonirana u bakulovirusni ekspresioni vektor, kao što je pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). U određenim načinima ostvarivanja, takav vektor se može koristiti prema uputstvima proizvođača (PharMingen) za infekciju Spodoptera frugiperda ćelija na sF9 podlogama bez proteina i za proizvodnju rekombinantnog polipeptida. U određenim načinima ostvarivanja, polipeptid je prečišćen i koncentrovan sa takvih podloga pomoću heparin-sefaroze kolone (Pharmacia).

[0118] U određenim načinima ostvarivanja, polipeptid koji obuhvata jednu ili više ABP komponenti ili sam ABP se eksprimira u sistemu insekata. Određeni sistemi insekata za ekspresiju polipeptida su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti. U jednom takvom sistemu, Autografikona californica virus nuklearne polihedroze (AcNPV) se koristi kao vektor za ekspresiju stranih gena u Spodoptera frugiperda ćelijama ili u Trichoplusia larvama. U određenim načinima ostvarivanja, molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid može se umetati u ne-esencijalni gen virusa, na primer, u gen polihedrina, i staviti pod kontrolu promotera za taj gen. U određenim načinima ostvarivanja, uspešno ubacivanje molekula nukleinske kiseline će učiniti ne-esencijalni gen neaktivnim. U određenim načinima ostvarivanja, ta neaktivnost rezultuje detektabilnim karakteristikama. Na primer, neaktivnost gena polihedrina rezultuje proizvodnjom virusa kojem nedostaje proteinski omotač.

[0119] U određenim načinima ostvarivanja, rekombinantni virusi se mogu koristiti za inficiranje S. frugiperda ćelija ili Trichoplusia larvi. Pogledati, npr., Smith et al., J. Virol., 46: 584 (1983); Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91: 3224-7 (1994).

[0120] U određenim načinima ostvarivanja, polipeptidi koji obuhvataju jednu ili više ABP komponenti ili sam ABP napravljeni u bakterijskim ćelijama se proizvode kao nerastvorljiva inkluzivna tela u bakterijama. U određenim načinima ostvarivanja, ćelije domaćina koje obuhvataju takva inkluzivna tela se sakupljaju centrifugacijom; ispiraju u 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA; i obrađuju sa 0,1 mg/ml lizozima (Sigma, St. Louis, MO) tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. U određenim načinima ostvarivanja, lizat je očišćen sonikacijom, a ćelijski otpad se peletuje centrifugacijom tokom 10 minuta na 12.000 X g. U određenim načinima ostvarivanja, pelet koji sadrži polipeptid se resuspenduje u 50 mM Tris, pH 8, i 10 mM EDTA; slaže na 50% glicerola; i centrifugira tokom 30 minuta na 6000 X g. U određenim načinima ostvarivanja, ovaj pelet se može resuspendovati u standardnom slanom fosfatnom puferu (PBS) bez Mg<++>i Ca<++>. U određenim načinima ostvarivanja, polipepid je dalje prečišćen deljenjem resuspendovanog peleta u denaturizovanom SDS poliakrilamid gelu (Pogledati, npr., Sambrook et al., supra). U određenim načinima ostvarivanja, takav gel se može umočiti u 0,4 M KC1 za vizuelizaciju proteina, koji može biti eksciziran i elektroeluiran u puferu gela kojem nedostaje SDS. Prema određenim načinima ostvarivanja, fuzioni protein glutation-S-transferaze (GST) se proizvodi u bakterijama kao rastvorljivi protein. U određenim načinima ostvarivanja, takav GST fuzioni protein se prečišćava pomoću GST modula prečišćavanja (Pharmacia).

[0121] U određenim načinima ostvarivanja, poželjno je „ponovo saviti“ određene polipeptide, npr., polipeptide koji obuhvataju jednu ili više ABP komponenti ili sam ABP. U određenim načinima ostvarivanja, takvi polipeptidi se proizvode upotrebom određenih rekombinantnih sistema koji se ovde navode. U određenim načinima ostvarivanja, polipeptidi su „ponovo savijeni“ i/ili oksidizovani kako bi se formirala željena tercijarna struktura i/ili kako bi se generisale disulfidne veze. U određenim načinima ostvarivanja, takva struktura i/ili veze su povezani sa određenom biološkom aktivnošću polipeptida. U određenim načinima ostvarivanja, ponovno savijanje se ostvaruje pomoću bilo kog od više postupaka poznatih u ovoj oblasti. Primerni postupci uključuju, ali nisu ograničeni na izlaganje rastvorenog agensa polipeptida pH vrednosti obično iznad 7 u prisustvu haotropskog agensa. Primerni haotropski agens je guanidin. U određenim načinima ostvarivanja, rastvor ponovnog savijanja/oksidacije takođe sadrži agens redukcije i oksidisani oblik tog agensa redukcije. U određenim načinima ostvarivanja, agens redukcije i njegov oksidisani oblik su prisutni u odnosu koji će generisati određeni redoks potencijal koji omogućava da nastupi kombinovanje disulfida. U određenim načinima ostvarivanja, takvo kombinovanje omogućava formiranje cisteinskih mostova. Primerni redoks parovi uključuju, ali nisu ograničeni na, cistein/cistamin, glutation/ditiobisGSH, bakar(II)hlorid, ditiotreitol DTT/ditian DTT, i 2-merkaptoetanol (bME)/ditio-bME. U određenim načinima ostvarivanja, ko-rastvarač se koristi za povećanje efikasnosti ponovnog savijanja. Primerni ko-rastvarači uključuju, ali nisu ograničeni na glicerol, polietilenglikol različitih molekulskih masa, i arginin.

[0122] U određenim načinima ostvarivanja, suštinski se prečišćava polipeptid koji obuhvata jednu ili više ABP komponenti ili sam ABP. Određene tehnike prečišćavanja proteina su poznate stručnjacima iz ove

1

oblasti. U određenim načinima ostvarivanja, prečišćavanje proteina uključuje sirovu frakcionaciju frakcionacija polipeptida iz ne-polipeptidnih frakcija. U određenim načinima ostvarivanja, polipeptidi se prečišćavaju pomoću hromatografskih i/ili elektroforetičkih tehnika. Primerni postupci prečišćavanja uključuju, ali nisu ograničeni na taloženje sa amonijumsulfatom; taloženje sa PEG; imunotaloženje; toplotnu denaturaciju posle koje sledi centrifugacija; hromatografiju, uključujući, ali bez ograničenja na hromatografiju afiniteta (npr., protein-A-sefaroza), hromatografiju izmene jona, hromatografiju isključivanja, i hromatografiju reverzne faze; filtraciju gela; hromatografiju hidroksiapatita; izoelektrično fokusiranje; elektroforezu poliakrilamid gela; i kombinacije tih i drugih tehnika. U određenim načinima ostvarivanja, polipeptid se prečišćava brzom tečnom hromatografijom proteina ili tečnom hromatografijom visokog pritiska (HPLC). U određenim načinima ostvarivanja, faze prečišćavanja se mogu menjati ili se određene faze mogu preskočiti, a rezultat i dalje može biti pogodan postupak za pripremu suštinski prečišćenog polipeptida.

[0123] U određenim načinima ostvarivanja, kvantifikuje se stepen prečišćavanja preparata polipeptida. Određeni postupci za kvantifikaciju stepena prečišćavanja su poznati stručnjacima iz ove oblasti.

Određeni primerni postupci uključuju, ali nisu ograničeni na utvrđivanje specifične aktivnosti vezivanja preparata i procenu količine polipeptida u preparatu pomoću SDS/PAGE analize. Određeni primerni postupci za procenu količine prečišćavanja preparata polipeptida obuhvataju izračunavanje aktivnosti vezivanja preparata i njegovo upoređivanje sa aktivnošću vezivanja početnog ekstrakta. U određenim načinima ostvarivanja, rezultati takvog izračunavanja se izražavaju kao „broj prečišćavanja“. Jedinice koje se koriste za predstavljanje količine aktivnosti vezivanja zavise od određene analize koja je izvedena.

[0124] U određenim načinima ostvarivanja, polipeptid koji obuhvata jednu ili više ABP komponenti ili sam ABP je naročito prečišćen. U određenim načinima ostvarivanja, delimično prečišćavanje se može ostvariti pomoću manje faza prečišćavanja ili upotrebom različitih oblika iste opšte šeme prečišćavanja. Na primer, u određenim načinima ostvarivanja, hromatografija na koloni izmene katjona izvedena pomoću HPLC uređaja će generalno rezultovati većim „brojem prečišćavanja“ u odnosu na istu tehniku koja koristi sistem hromatografije niskog pritiska. U određenim načinima ostvarivanja, postupci koji dovode do nižeg nivoa prečišćavanja mogu imati prednosti u ukupnom dobijanju polipeptida, ili u održavanju aktivnosti vezivanja polipeptida.

[0125] U određenim primerima, elektroforetička migracija polipeptida se može razlikovati, ponekad i značajno, sa različitim uslovima SDS/PAGE. Pogledati, npr., Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res.

Comm., 76: 425 (1977). Biće shvaćeno da se pod različitim uslovima elektroforeze mogu razlikovati očigledne molekulske mase prečišćenog ili delimično prečišćenog polipeptida.

2

Primerni epitopi

[0126] Obezbeđeni su epitopi za koje se vezuju anti-PCSK9 antitela. U nekim načinima ostvarivanja, epitopi za koje se vezuju ovde opisana antitela su naročito korisni. U nekim načinima ostvarivanja, koriste se proteini za vezivanje antigena koji se vezuju za bilo koji od epitopa za koje se vezuju ovde opisana antitela. U nekim načinima ostvarivanja, epitopi za koje se vezuju bilo koja od antitela navedenih u tabeli 2 i FIG.2 i 3 su naročito korisni. U nekim načinima ostvarivanja, epitop je na katalitičkom domenu PCSK9.

[0127] U određenim načinima ostvarivanja, epitop PCSK9 se može koristiti da spreči (npr., smanji) vezivanje anti-PCSK9 antitela ili proteina za vezivanje antigena za PCSK9. U određenim načinima ostvarivanja, epitop PCSK9 se može koristiti da smanji vezivanje anti-PCSK9 antitela ili proteina za vezivanje antigena za PCSK9. U određenim načinima ostvarivanja, epitop PCSK9 se može koristiti da suštinski inhibira vezivanje anti-PCSK9 antitela ili proteina za vezivanje antigena za PCSK9.

[0128] U određenim načinima ostvarivanja, epitop PCSK9 se može koristiti za izolovanje antitela ili proteina za vezivanje antigena koji se vezuju za PCSK9. U određenim načinima ostvarivanja, epitop PCSK9 se može koristiti za generisanje antitela ili proteina za vezivanje antigena koji se vezuju za PCSK9. U određenim načinima ostvarivanja, epitop PCSK9 ili sekvenca koja obuhvata epitop PCSK9 može se koristiti kao imunogen za generisanje antitela ili proteina za vezivanje antigena koji se vezuju za PCSK9. U određenim načinima ostvarivanja, epitop PCSK9 se može davati životinji, a antitela koja se vezuju za PCSK9 mogu se kasnije dobiti od životinje. U određenim načinima ostvarivanja,epitop PCSK9 ili sekvenca koji obuhvata epitop PCSK9 može se koristiti za ometanje uobičajene PCSK9-posredovane aktivnosti, kao što je spajanje PCSK9 sa LDLR.

[0129] U nekim načinima ostvarivanja, ovde otkriveni proteini za vezivanje antigena se specifično vezuju za prodomen N-terminusa, katalitički domen kao što je subtilizin i/ili domen C-terminusa. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se vezuje za žleb PCSK-9 koji se vezuje za supstrat (opisan u Cunningham et al.).

[0130] U nekim načinima ostvarivanja, domen(i)/regiona koji sadrži(e) ostatke koji su u kontaktu sa ili koje je zakopalo antitelo može (mogu) se identifikovati mutacijom specifičnih ostataka u PCSK9 (npr., divlji tip antigena) i utvrđivanjem da li se protein za vezivanje antigena može vezivati za mutirani ili varijantni PCSK9 protein. Pravljenjem više pojedinačnih mutacija, ostaci koji imaju direktnu ulogu u vezivanju ili koji su dovoljno blizu antitela tako da mutacija može da utiče na vezivanje između proteina za vezivanje antigena i antigena mogu biti identifikovani. Poznavanjem ovih aminokiselina, domen(i) ili region(i) antigena koji sadrži(e) ostatke u kontaktu sa proteinom za vezivanje antigena ili koje pokriva antitelo mogu biti razjašnjeni. Takav domen može uključivati epitop vezivanja proteina za vezivanje antigena. Jedan konkretan primer ovog opšteg pristupa koristi protokol skeniranja arginina/glutaminske kiseline (pogledati, npr., Nanevicz, T., et al., 1995, J. Biol. Chem., 270:37, 21619-21625 i Zupnick, A., et al., 2006, J. Biol. Chem., 281:29, 20464-20473). Generalno, arginin i glutaminske kiseline se supstituišu (obično pojedinačno) sa aminokiselinom u divljem tipu polipeptida zato što ove aminokiseline imaju naboj i masivne su, i stoga imaju potencijal da ometaju vezivanje između proteina za vezivanje antigena i antigena u regionu antigena gde se uvodi mutacija. Arginini koji postoje u divljem tipu antigena se zamenjuju glutaminskom kiselinom. Dobija se mnoštvo takvih pojedinačnih mutanata, a sakupljeni rezultati vezivanja se analiziraju kako bi se utvrdilo koji ostaci utiču na vezivanje.

[0131] Izmena (na primer smanjenje ili povećanje) vezivanja između proteina za vezivanje antigena i varijantnog PCSK9 kako se ovde koristi znači da je prisutna izmena afiniteta vezivanja (npr., kako je izmereno poznatim postupcima kao što je Biacore testiranje ili analize na bazi perli opisanoj u nastavku u primerima), EC50, i/ili izmena (na primer smanjenje) ukupnog kapaciteta vezivanja proteina za vezivanje antigena (na primer, kako se vidi iz smanjenja u Bmax u seriji koncentracije proteina za vezivanje antigena naspram koncentracije antigena). Značajna izmena vezivanja označava da je mutirani ostatak direktno uključen u vezivanje za protein za vezivanje antigena ili je u blizini vezujućeg proteina kada je vezujući protein vezan za antigen.

[0132] U nekim načinima ostvarivanja, značajno smanjenje vezivanja označava da je afinitet vezivanja, EC50, i/ili kapacitet između proteina za vezivanje antigena i mutantnog PCSK9 antigena smanjen za više od 10%, više od 20%, više od 40 %, više od 50 %, više od 55 %, više od 60 %, više od 65 %, više od 70 %, više od 75 %, više od 80 %, više od 85 %, više od 90% ili više od 95% u odnosu na vezivanje između proteina za vezivanje antigena i divljeg tipa PCSK9 (npr., prikazano u SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: (303). U određenim načinima ostvarivanja, vezivanje se smanjuje ispod detektabilnih granica. U nekim načinima ostvarivanja, značajno smanjenje vezivanja se primećuje kada je vezivanje proteina za vezivanje antigena sa varijantnim PCSK9 proteinom manje od 50% (na primer, manje od 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15% ili 10%) vezivanja primećenog između proteina za vezivanje antigena i divljeg tipa PCSK9 proteina (na primer, protein od SEQ ID NO: 1 i/ili SEQ ID NO: (303). Takva merenja vezivanja se mogu sprovesti pomoću različitih analiza vezivanja poznatih u ovoj oblasti.

[0133] U nekim načinima ostvarivanja, obezbeđeni su proteini za vezivanje antigena koji iskazuju značajno niže vezivanje za varijantni PCSK9 protein u kojem je ostatak u divljem tipu PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303 je supstituisan sa argininom ili glutaminskom kiselinom. U nekim načinima ostvarivanja, vezivanje proteina za vezivanje antigena je značajno smanjeno ili povećano za varijantni PCSK9 protein koji ima bilo koju jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ili 244) od sledećih mutacija: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U kratkoj notaciji koja je ovde

4

upotrebljena, format je: Ostatak divljeg tipa: Položaj u polipeptidu: Ostatak mutanta, sa numerisanjem ostataka kako je naznačeno u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303.

[0134] U nekim načinima ostvarivanja, vezivanje proteina za vezivanje antigena je značajno smanjeno ili povećano za mutantni PCSK9 protein koji ima jedan ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, ili više) mutacija u sledećim položajima: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, kako je prikazano u SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim načinima ostvarivanja, vezivanje proteina za vezivanje antigena je smanjeno ili povećano za mutantni PCSK9 protein koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, ili više) mutacija u sledećim položajima: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, kako je prikazano u SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim načinima ostvarivanja, vezivanje proteina za vezivanje antigena je značajno smanjeno ili povećano za mutantni PCSK9 protein koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, ili više) mutacija u sledećim položajima: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554, u okviru SEQ ID NO: 1 u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303.

[0135] U nekim načinima ostvarivanja, vezivanje ABP-a je značajno smanjeno ili povećano za mutantni PCSK9 protein koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, itd.) sledećih mutacija: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, E582R, D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R u okviru SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303, u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303).

[0136] U nekim načinima ostvarivanja, vezivanje ABP-a je značajno smanjeno ili povećano za mutantni PCSK9 protein koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, itd.) sledećih mutacija: R207E, D208R, R185E, R439E, E513R, V538R, E539R, T132R, S351R, A390R, A413R, i E582R u okviru SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303, u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303). U nekim načinima ostvarivanja, vezivanje je smanjeno. U nekim načinima ostvarivanja, smanjenje vezivanja se posmatra kao izmena u EC50. U nekim načinima ostvarivanja, izmena u EC50 je povećanje numeričke vrednosti od EC50 (i stoga je to povećanje vezivanja).

[0137] U nekim načinima ostvarivanja, vezivanje ABP-a je značajno smanjeno ili povećano za mutantni PCSK9 protein koji ima jednu ili više (npr., 1, 2, 3, 4, 5, itd.) sledećih mutacija: D162R, R164E, E167R, S123R, E129R, A311R, D313R, D337R, R519E, H521R, i Q554R u okviru SEQ ID NO: 1, u poređenju sa divljim tipom PCSK9 proteina (npr., SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303). U nekim načinima ostvarivanja, vezivanje je smanjeno. U nekim načinima ostvarivanja, smanjenje vezivanja se posmatra kao izmena u Bmax. U nekim načinima ostvarivanja, promena u Bmax je smanjenje maksimalnog signala koji generiše ABP. U nekim načinima ostvarivanja, da bi aminokiselina bila deo epitopa, Bmax je smanjen za najmanje 10%, na primer, smanjenje za najmanje bilo koju od sledećih količina: 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 99, ili 100 procenata može, u nekim načinima ostvarivanja, označiti da je ostatak deo epitopa.

[0138] Iako se na upravo navedene varijantne oblike pozivamo u pogledu sekvence divljeg tipa prikazane u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303, biće shvaćeno da se u aleličkoj varijanti PCSK9 aminokiseline u označenom položaju može razlikovati. Proteini za vezivanje antigena koji prikazuju značajno niže vezivanje za takve aleličke oblike PCSK9 su takođe razmatrani. U skladu sa tim, u nekim načinima ostvarivanja, bilo koji od gore navedenih načina ostvarivanja se može uporediti sa aleličkom sekvencom, umesto čistog divljeg tipa sekvence prikazanog na FIG.1A.

[0139] U nekim načinima ostvarivanja, vezivanje proteina za vezivanje antigena je značajno smanjeno za varijantni PCSK9 protein u kojem je ostatak u odabranom položaju divljeg tipa PCSK9 proteina mutiran u bilo koji drugi ostatak. U nekim načinima ostvarivanja, ovde opisane zamene arginina/glutaminske kiseline se koriste za identifikovane položaje. U nekim načinima ostvarivanja, alanin se koristi za identifikovane položaje.

[0140] Kako je gore navedeno, ostaci direktno uključeni u vezivanje ili pokriveni proteinom za vezivanje antigena mogu se identifikovati iz rezultata skeniranja. Ovi ostaci stoga mogu da obezbede indikaciju domena ili regiona od SEQ ID NO: 1 (ili SEQ ID NO: 303 ili SEQ ID NO: 3) koji sadrže region(e) vezivanja za koje se vezuju proteini za vezivanje antigena. Kao što se može videti iz rezultata sažetih u primeru 39, u nekim načinima ostvarivanja protein za vezivanje antigena se vezuje za domen koji sadrži najmanje jednu od aminokiselina: 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se vezuje za region koji sadrži najmanje jednu od aminokiselina 207, 208, 185, 181, 439, 513, 538, 539, 132, 351, 390, 413, 582, 162, 164, 167, 123, 129, 311, 313, 337, 519, 521, i 554 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303.

[0141] U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se vezuje za region koji sadrži najmanje jednu od aminokiselina 162, 164, 167, 207 i/ili 208 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim načinima ostvarivanja, više od jednog (npr., 2, 3, 4, ili 5) identifikovanih ostataka su deo regiona koji se vezuje za ABP. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se takmiči sa ABP 21B12.

[0142] U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se vezuje za region koji sadrži najmanje jednu od aminokiseline 185 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se takmiči sa ABP 31H4.

[0143] U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se vezuje za region koji sadrži najmanje jednu od aminokiselina 439, 513, 538, i/ili 539 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim načinima ostvarivanja, više od jednog (npr., 2, 3, ili 4) ideitifikovanog ostatka je deo regiona koji se vezuje za ABP. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se takmiči sa ABP 31A4.

[0144] U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se vezuje za region koji sadrži najmanje jednu od aminokiselina 123, 129, 311, 313, 337, 132, 351, 390, i/ili 413 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim načinima ostvarivanja, više od jednog (npr., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili 9) identifikovanih ostataka je deo regiona koji se vezuje za ABP. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se takmiči sa ABP 12H 11.

[0145] U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se vezuje za region koji sadrži najmanje jednu od aminokiseline 582, 519, 521, i/ili 554 od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303. U nekim načinima ostvarivanja, više od jednog (npr., 2, 3, ili 4) identifikovanog ostatka je deo regiona koji se vezuje za ABP. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se takmiči sa ABP 3C4.

[0146] U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena se vezuju za prethodne regione unutar fragmenta ili sekvence od SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303 u punoj dužini. U drugim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena se vezuju za polipeptide koji se sastoje od ovih regiona. Referenca na „SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 303“ označava da jedna ili obe ove sekvence mogu biti upotrebljene ili relevantne. Ovaj izraz ne označava da treba koristiti samo jednu.

[0147] Kao što je gore navedeno, gornji opis se poziva konkretne položaje aminokiseline uz pozivanje na SEQ ID NO: 1. Međutim, generalno u ovoj specifikaciji, pozivamo se na Pro/Cat domen koji počinje u položaju 31, koji je obezbeđen u SEQ ID NO: 3. Kako je navedeno u nastavku, SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO: 303 nemaju signalnu sekvencu od PCSK9. Kao takvo, bilo kakvo poređenje između ovih različitih objava treba da uzme u obzir ovu razliku u numerisanju. Određenije, bilo kakav položaj aminokiseline u SEQ ID NO: 1, će odgovarati položaju 30 aminokiseline dalje u proteinu u SEQ ID NO: 3. Na primer, položaj 207 od SEQ ID NO: 1, odgovara položaju 237 od SEQ ID NO: 3 (sekvenca u punoj dužini, i numerički sistem koji se generalno koristi u ovoj specifikaciji). Tabela 39.6 prikazuje kako gore navedeni položaji, uz pozivanje na SEQ ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303) odgovaraju SEQ ID NO: 3 (koji uključuje signalnu sekvencu). Stoga, bilo koji od gore navedenih načina ostvarivanja opisanih u vezi sa SEQ ID NO: 1 (i/ili SEQ ID NO: 303) opisani su u pozivanju na SEQ ID NO: 3 prema navedenim odgovarajućim položajima.

[0148] U nekim načinima ostvarivanja, ABP 21B12 se vezuje za epitop koji uključuje ostatke 162-167 (npr., ostaci D162-E167 od SEQ ID NO: 1). U nekim načinima ostvarivanja, ABP 12H11 se vezuje za epitop koji uključuje ostatke 123-132 (npr., S123-T132 od SEQ ID NO: 1). U nekim načinima ostvarivanja, ABP 12H11 se vezuje za epitop koji uključuje ostatke 311-313 (npr., A311-D313 od SEQ ID NO: 1). U nekim načinima ostvarivanja, ABP-ovi se mogu vezivati za epitop koji uključuje bilo koji jedan od ovih lanaca sekvenci.

Konkurentni proteini za vezivanje antigena

[0149] U drugom aspektu, obezbeđeni su proteini za vezivanje antigena koji se takmiče sa jednim od primernih antitela ili funkcionalnim fragmentima koji se vezuju za ovde opisan epitop za konkretno vezivanje za PCSK9. Takvi proteini za vezivanje antigena se takođe mogu vezivati za isti epitop kao i jedan od ovde opisanih proteina za vezivanje antigena, ili za preklapajući epitop. Od proteina za vezivanje antigena i fragmenata koji se takmiče sa ili vezuju za isti epitop kao i primerni proteini za vezivanje antigena se očekuje da iskazuju slične funkcionalne karakteristike. Primerni proteini za vezivanje antigena i fragmenti uključuju one gore opisane, uključujući one sa teškim i lakim lancima, domene promenljivog regiona i CDR-ove uključene u TABELI 2 i/ili FIG.2-3. Stoga, kao konkretan primer, proteini za vezivanje antigena koji su obezbeđeni uključuju one koji se takmiče sa antitelom ili proteinom za vezivanje antigena koji ima:

(a) svih 6 CDR-ova navedenih za antitelo navedeno na FIG.2-3;

(b) VH i VL naveden za antitelo navedeno u tabeli 2; ili

(c) dva laka lanca i dva teška lanca kako je naznačeno za antitelo navedeno u tabeli 2.

Terapijske farmaceutske formulacije i davanje

[0150] Ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske formulacije koje sadrže proteine za vezivanje antigena za PCSK9. Kako se ovde koristi, „farmaceutska formulacija“ je sterilna kompozicija farmaceutski aktivnog leka, konkretno, najmanje jednog proteina za vezivanje antigena za PCSK9, koji je pogodan za parenteralno davanje (uključujući, ali bez ograničenja na intravensko, intramuskularno, subkutano, aerosolno, intrapulmonarno, intranazalno, ili intratekalno) pacijentu kojem je to potrebno i uključuje samo farmaceutski prihvatljive ekscipijense, razblaživače, i druge aditive koje Federalna agencija za lekove ili drugi strani nacionalni organi smatraju bezbednim. Farmaceutske formulacije uključuju tečne, npr., vodene, rastvore koji se mogu direktno davati, i liofilizovane prahove koji se mogu rekonstituisati u rastvore dodavanjem razblaživača pre davanja. Specifično isključene iz područja pojma „farmaceutska formulacija“ su kompozicije za topikalno davanje pacijentima, kompozicije za oralnu ingestiju, i kompozicije za parenteralno davanje.

[0151] U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija je stabilna farmaceutska formulacija. Kako se ovde koriste, izrazi „stabilna farmaceutska formulacija“, „stabilna formulacija“ ili „farmaceutska formulacija je stabilna“ odnose se na farmaceutsku formulaciju biološki aktivnih proteina koji iskazuju povećanu agregaciju i/ili smanjeni gubitak biološke aktivnosti ne veći od 5% kada se čuvaju na 2-8°C tokom najmanje 1 meseca, ili 2 meseca, ili 3 meseca, ili 6 meseci, ili 1 godine ili 2 godine u poređenju sa kontrolnim uzorkom formule. Stabilnost formulacije može jednostavno utvrditi stručnjak iz ove oblasti pomoću bilo kog broja standardnih analiza, uključujući, ali bez ograničenja na HPLC koja isključuje veličinu („SEC-HPLC“), HPLC izmene katjona (CEX-HPLC), detekciju teško vidljivih čestica pomoću pomračenja svetlosti i/ili vizuelnu proveru.

[0152] U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata bilo koji od proteina za vezivanje antigena za PCSK9 prikazan u tabeli 2 i FIG.2 i/ili 3 i FIG.48A i 48B. U nekim načinima ostvarivanja farmaceutska formulacija obuhvata bilo koji od 21B12, 26H5, 31H4, 8A3, 1IF1 ili 8A1.

[0153] U nekim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata više od jednog različitog proteina za vezivanje antigena za PCSK9. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutske formulacije obuhvataju više od jednog proteina za vezivanje antigena za PCSK9, pri čemu proteini za vezivanje antigena za vezuju za PCSK9 više od jednog epitopa. U nekim načinima ostvarivanja, različiti proteini za vezivanje antigena se neće takmičiti jedan sa drugim za vezivanje za PCSK9. U nekim načinima ostvarivanja, bilo koji od proteina za vezivanje antigena prikazanih u tabeli 2 i FIG.2 i/ili 3 mogu se kombinovati zajedno u farmaceutskoj formulaciji.

[0154] U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 i/ili terapijski molekul se vezuje za prenosnik produženog vremena poluživota poznat u ovoj oblasti. Takvi prenosnici uključuju, ali nisu ograničeni na polietilenglikol, glikogen (npr., glikozilacija ABP-a), i dekstran. Takvi prenosnici su opisani, npr., u U.S. Application Serial No.09/428,082, sada U.S. Application Serial No. 6,660,843 i u objavljenoj PCT prijavi br. WO 99/25044.

[0155] U određenim načinima ostvarivanja, prihvatljivi materijali formulacije su poželjno netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste. U nekim načinima ostvarivanja, materijal(i) formulacije su za s.c. i/ili I.V. davanje. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata materijale formulacije za modifikovanje, održavanje ili očuvanje, na primer, pH vrednosti, osmolalnosti, viskoznosti, jasnoće, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobađanja, adsorpcije ili penetracije kompozicije.

[0156] U određenim načinima ostvarivanja, pogodni materijali formulacije uključuju, ali nisu ograničeni na aminokiseline (kao što su prolin, arginin, lizin, metionin, taurin, glicin, glutamin, ili asparagin); antimikrobe; antioksidanse (kao što su askorbinska kiselina, natrijumsulfit ili natrijumhidrogen-sulfit); pufere (kao što su borat, bikarbonat, natrijumfosfat („NaOAC“), Tris-HC1, Tris pufer, citrat, fosfatni pufer, fosfatni slani rastvor (tj., PBS pufera) ili druge organske kiseline); agense povećanja zapremine (kao što je manitol ili glicin); helatne agense (kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (EDTA)); agense kompleksije (kao što su kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin ili hidroksipropil-betaciklodekstrin); punioce; monosaharide; disaharide; i druge ugljene hidrate (kao što su glukoz, saharoz, fruktoz, laktoz, manoz, trehaloza, ili dekstrin); proteine (kao što su albumin u serumu, želatin ili imunoglobulin); agense bojenja, dodavanja ukusa i razblaživanja; agense emulzifikacije; hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon); polipeptide male molekulske mase; kontra jone koji formiraju so (kao što je natrijum); konzervanse (kao što su benzalkonijumhlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerozal, fenetilalkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina ili vodonikperoksid); rastvarače (kao što je glicerin, propilenglikol ili poletilenglikol); šećerne alkohole (kao što je manitol ili sorbitol); agense suspenzije; surfaktante ili agense vlaženja (kao što su pluronik, PEG, estri sorbitana, polisorbat kao što su polisorbat 20, polisorbat 80, triton, trometamin, lecitin, holesterol, tiloksapal); agense pojačavanja stabilnosti (kao što je saharoz ili sorbitol); agense pojačavanja toničnosti (kao što su halidi alkalnih metala, poželjno natrijuma ili kalijumhlorida, manitola, sorbitola); prenosnike davanja; razblaživače; ekscipijense i/ili farmaceutske adjuvanse. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1995).

[0157] U određenim načinima ostvarivanja, optimalnu farmaceutsku formulaciju utvrdiće stručnjak iz ove oblasti u zavisnosti od, na primer, predviđenog puta davanja, formata davanja u željene doze. Pogledati, na primer, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra. U određenim načinima ostvarivanja, takve formulacije mogu uticati na fizičko stanje, stabilnost, brzinu in vivo oslobađanja i brzinu in vivo klirensa antitela ovog pronalaska.

[0158] U jednom aspektu, farmaceutska formulacija obuhvata visoke koncentracije proteina za vezivanje antigena za PCSK9. U određenim načinima ostvarivanja, ABP koncentracija je u opsegu od oko 70 mg/ml do oko 250 mg/ml, npr., oko 70 mg/ml, oko 80 mg/ml, oko 90 mg/ml, oko 100 mg/ml, oko 100 mg/ml, oko 120 mg/ml, oko 130 mg/ml, oko 140 mg/ml, oko 150 mg/ml, oko 160 mg/ml, oko 170 mg/ml, oko 180 mg/ml, oko 190 mg/ml, oko 200 mg/ml, oko 210 mg/ml, oko 220 mg/ml, oko 230 mg/ml, oko 240 mg/ml, ili oko 250 mg/ml, i uključujući sve vrednosti između. U nekim načinima ostvarivanja, koncentracija 21B12, 26H5, ili 31H4 je u opsegu od oko 100 mg/ml do oko 150 mg/ml, npr., 100 mg/ml, oko 100 mg/ml, oko 120 mg/ml, oko 130 mg/ml, oko 140 mg/ml, ili oko 150 mg/ml. U nekim načinima ostvarivanja, koncentracija 8A3, 11F1 ili 8A1 je u opsegu od oko 140 mg/ml do oko 220 mg/ml, npr., 140 mg/ml, oko 150 mg/ml, oko 160 mg/ml, oko 170 mg/ml, oko 180 mg/ml, oko 190 mg/ml, oko 200 mg/ml, oko 210 mg/ml, oko 220 mg/ml, ili oko 250 mg/ml.

[0159] U drugom aspektu, farmaceutska formulacija obuhvata najmanje jedan puferni agens kao što je, na primer, natrijumacetat, natrijumhlorid, fosfat, fosfatom puferisani slani rastvor („PBS“), i/ili Tris pufer od oko pH 7,0-8,5. Pufer služi za održavanje fiziološki pogodne pH vrednosti. Pored toga, pufer može služiti za pojačanje izotoničnosti i hemijske stabilnosti farmaceutske formulacije. U određenim načinima ostvarivanja, puferni agens je u opsegu od oko 0,05 mM do oko 40 mM, npr., oko 0,05 mM, oko 0,1 mM, oko 0,5 mM, oko 1,0 mM, oko 5,0 mM, oko 10 mM, oko 15 mM, oko 20 mM, oko 30 mM, oko 40 mM, oko 50 mM, oko 60 mM, oko 70 mM, oko 80 mM, oko 90 mM, ili oko 100nM pufernog agensa, uključujući sve vrednosti između. U određenim načinima ostvarivanja, puferni agens je NaOAC.

Primerne pH vrednosti farmaceutske formulacije uključuju od oko 4 do oko 6, ili od oko 4,8 do oko 5,8, ili od oko 5,0 do oko 5,2, ili oko 5, ili oko 5,2.

[0160] U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija je izotonična sa osmolalnošću u opsegu od između oko 250 do oko 350 miliosmol/kg, npr., oko 250 mOsm/kg, oko 260 mOsm/kg, oko 270 mOsm/kg, oko 280 mOsm/kg, oko 290 mOsm/kg, oko 300 mOsm/kg, oko 310 mOsm/kg, oko 320 mOsm/kg, oko 330 mOsm/kg, oko 340 mOsm/kg, ili oko 350 mOsm/kg, i uključujući sve vrednosti između. Kako se ovde koristi, „osmolalnost“ je mera odnosa otopine i zapremine fluida. Drugim rečima, to je broj molekula i jona (ili molekula) po kilogramu rastvora. Osmolalnost se može izmeriti na analitičkom instrumentu koji se naziva osmometar, kao što je Advanced Instruments 2020 Multi-sample Osmometer, Norwood, MA. Advanced Instruments 2020 Multi-sample Osmometer meri osmolalnost upotrebom postupka depresije tačke smrzavanja. Što je više osmolita u rastvoru, temperatura u kojoj će se smrznuti je niža. Osmolalnost se takođe može izmeriti pomoću bilo kojih drugih postupaka i u bilo kojim drugim jedinicama poznatim u ovoj oblasti, kao što je linearna ekstrapolacija.

[0161] U još jednom aspektu, farmaceutska formulacija obuhvata najmanje jedan surfaktant, uključujući, ali bez ograničenja na polisorbat-80, polisorbat-60, polisorbat-40, i polisorbat-20. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata surfaktant u koncentraciji koja je u opsegu od oko 0,004% do oko 10% masenih procenata („,mas./vol.%“) formulacije, npr., oko 0,004, oko 0,005, oko 0,006, oko 0,007, oko 0,008, oko 0,009, oko 0,01, oko 0,05, oko 0,1, oko 0,5, oko 1, oko 5, ili oko 10 mas./vol.% formulacije. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata polisorbat 80 u koncentraciji koja je u opsegu od oko 0,004 do oko 0,1 mas./vol.% formulacije. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata polisorbat 20 u koncentraciji koja je u opsegu od oko 0,004 do oko 0,1 mas./vol.% formulacije.

[0162] U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata najmanje jedan agens stabilizacije, kao što je polihidroksi ugljeni hidrat (uključujući, ali bez ograničenja na sorbitol, manitol, glicerol and dulcitol) i/ili disaharida (uključujući, ali bez ograničenja na saharozu, laktozu, maltozu i trehalozu) i/ili aminokiseline (uključujući, ali bez ograničenja na prolin, arginin, lizin, metionin, i taurin) i/ili benzilalkohol; pri čemu je ukupna količina navedenog polihidroksi ugljenog hidrata i/ili disaharida i/ili aminokiseline i/ili benzilalkohola oko 0,5 do oko 10 mas./vol.% formulacije. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata agens stabilizacije u koncentraciji od oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7%, oko 8%, oko 9% ili oko 10% saharoze. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata agens stabilizacije u koncentraciji od oko 5% saharoze. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata agens stabilizacije u koncentraciji od oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5%, oko 6%, oko 7%, oko 8%, oko 9% ili oko 10% sorbitola. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata agens stabilizacije u

1

koncentraciji od oko 9% sorbitola. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata agens stabilizacije u koncentraciji od oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5% prolina, arginina, lizina, metionina, i/ili taurina. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata agens stabilizacije u koncentraciji od između oko 2-3% prolina. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata agens stabilizacije u koncentraciji od oko 1%, oko 2%, oko 3%, oko 4%, oko 5% benzilalkohola. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija obuhvata agens stabilizacije u koncentraciji od između oko 1-2% benzilalkohola.

[0163] U jednom aspektu, farmaceutska formulacija ima nivo viskoznosti manji od oko 30 centipuaza (cP) prema merenju na sobnoj temperaturi (tj., 25C). Kako se ovde koristi, „viskoznost“ je otpornost fluida na protok, i može se izmeriti u jedinicama centipuaz (cP) ili milipaskal-sekunda (mPa-s), gde 1 cP=1 mPa-s, pri datoj brzini smicanja. Viskoznost se može izmeriti upotrebom viskozimetra, npr., Brookfield Engineering Dial Reading Viscometer, model LVT. Viskoznost se takođe može izmeriti upotrebom bilo kojih drugih postupaka i u bilo kojim drugim jedinicama poznatim u ovoj oblasti (npr., apsolutna, kinematička ili dinamička viskoznost ili apsolutna viskoznost). U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija ima nivo viskoznosti manji od oko 25 cP, oko 20 cP, oko 18 cP, oko 15 cP, oko 12 cP, oko 10 cP; oko 8 cP, oko 6 cP, oko 4 cP; oko 2 cP; ili oko 1 cP.

[0164] U jednom aspektu, farmaceutska formulacija je stabilna prema merenju pomoću najmanje jedne analize stabilnosti poznate stručnjaku iz ove oblasti, kao što su analize koje ispituju biofizičke ili biohemijske karakteristike biološki aktivnih proteina tokom vremena. Kako je gore pomenuto, stabilna farmaceutska formulacija prema ovom pronalasku je farmaceutska formulacija biološki aktivnih proteina koja pokazuje povećanu agregaciju i/ili smanjeni gubitak biološke aktivnosti ne više od 5% prilikom čuvanja na 2-8°C tokom najmanje 1 meseca, ili 2 meseca, ili 3 meseca, ili 6 meseci, ili 1 godine ili 2 godine u poređenju sa kontrolnim uzorkom formule. U određenim načinima ostvarivanja, stabilnost farmaceutske formulacije se meri upotrebom HPLC koja isključuje veličinu („SEC-HPLC“). SEC-HPLC razdvaja proteine na osnovu razlika u njihovim hidrodinamičkim zapreminama. Molekuli sa većim hidrodinamičkim zapreminama proteina eluiraju ranije od molekula sa manjim zapreminama. U slučaju SEC-HPLC, stabilna farmaceutska formulacija bi trebalo da pokazuje najviše oko 5% povećanja kod vrsta sa visokom molekulskom masom u poređenju sa kontrolnim uzorkom. U određenim drugim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija bi trebalo da pokazuje najviše oko 4%, najviše oko 3%, najviše oko 2%, najviše oko 1%, najviše oko 0,5% povećanja kod vrsta sa visokom molekulskom masom u poređenju sa kontrolnim uzorkom.

[0165] U određenim načinima ostvarivanja, stabilnost farmaceutske formulacije se meri pomoću HPLC izmene katjona (CEX-HPLC). CEX-HPLC razdvaja proteine na osnovu razlika u naboju njihove površine. Pri podešenoj pH vrednosti, izoforme sa nabojem od anti-PCSK9 ABP-a su razdvojene na koloni za izmenu

2

katjona i eluirane pomoću gradijenta soli. Eluent se prati UV apsorbancom. Distribucija izoforma sa nabojem se procenjuje utvrđivanjem vršne površine svake izoforme kao procenat ukupne vršne površine. U slučaju CEX-HPLC, stabilna farmaceutska formulacija bi trebalo da pokazuje najviše oko 5% smanjenja u vrhu glavne izoforme u poređenju sa kontrolnim uzorkom. U određenim drugim načinima ostvarivanja, stabilna farmaceutska formulacija bi trebalo da pokazuje najviše oko 3% do oko 5% smanjenja u vrhu glavne izoforme u poređenju sa kontrolnim uzorkom. U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija bi trebalo da pokazuje najviše oko 4% smanjenja, najviše oko 3% smanjenja, najviše oko 2% smanjenja, najviše oko 1% smanjenja, najviše oko 0,5% smanjenja u vrhu glavne izoforme u poređenju sa kontrolnim uzorkom.

[0166] U određenim načinima ostvarivanja, stabilnost farmaceutske formulacije se meri pomoću detekcije teško vidljivih čestica pomoću pomračenja svetlosti . Elektronski sistem brojanja čestica na bazi tečnosti (HIAC/Royco 9703 ili ekvivalentno) koji sadrži senzor za pomračenje svetlosti (HIAC/Royco HRLD-150 ili ekvivalentno) sa uzorkivačem tečnosti kvantifikuje broj čestica i njihov opseg veličine u datom probnom primeru. Kada čestice u tečnosti prolaze između izvora svetlosti i detektora, one umanjuju ili „pomračuju“ snop svetlosti koji pada na detektor. Kada je koncentracija čestica u uobičajenom opsegu senzora, ove čestice se detektuju jedna po jedna. Prolazak svake čestice kroz zonu detekcije smanjuje incidentno svetlo na foto detektoru, a izlazni napon foto detektora se momentalno smanjuje. Izmene u naponu se beleže kao električni pulsevi koje instrument konvertuje u broj prisutnih čestica. Postupak je ne-specifičan i meri čestice bez obzira na njihovo poreklo. Veličine čestice koje se prate su generalno 10 um, i 25 um. U slučaju HIAC, stabilna farmaceutska formulacija bi trebalo da pokazuje najviše 600010p,m čestica po posudi (ili jedinici), u poređenju sa kontrolnim uzorkom. U određenim načinima ostvarivanja, stabilna farmaceutska formulacija bi trebalo da pokazuje najviše 5000, najviše 4000, najviše 3000, najviše 2000, najviše 1000 čestica od 10p,m po posudi (ili jedinici) u poređenju sa kontrolnim uzorkom. U drugim načinima ostvarivanja, stabilna farmaceutska formulacija bi trebalo da pokazuje najviše 600 čestica od 25um po posudi (ili jedinici) u poređenju sa kontrolnim uzorkom. U određenim načinima ostvarivanja, stabilna farmaceutska formulacija bi trebalo da pokazuje najviše 500, najviše 400, najviše 300, najviše 200, najviše 100, najviše 50 čestica od 25µm po posudi (ili jedinici) u poređenju sa kontrolnim uzorkom.

[0167] U određenim načinima ostvarivanja, stabilnost farmaceutske formulacije se meri pomoću vizuelne procene. Vizuelna procena je kvalitativni postupak koji se koristi za opis vidljivih fizičkih karakteristika uzorka. Uzorak se posmatra na crnoj i/ili beloj pozadini kabine za posmatranje, u zavisnosti od karakteristika koje se procenjuju (npr., boja, jasnoća, prisustvo čestice ili strane materije). Uzorci se takođe posmatraju u odnosu na referentni standard opalescencije i referentne standarde boje.

U slučaju vizuelne procene, stabilna farmaceutska formulacija ne bi trebalo da pokazuje značajnije promene boje, jasnoće, prisustva čestica ili strane materije u poređenju sa kontrolnim uzorkom.

[0168] Jedan aspekt ovog pronalaska je farmaceutska formulacija koja obuhvata: (i) oko 70 mg/ml do oko 250 mg/ml proteina za vezivanje antigena za PCSK9; (ii) oko 0,05 mM do oko 40 mM pufera kao što je natrijumacetat („NaOAC“) koji služi kao puferni agens; (iii) oko 1% do oko 5% prolina, arginina, lizina, metionina, ili taurina (takođe poznat kao 2-aminoetansulfonska kiselina) i/ili 0,5% do oko 5% benzilalkohola koji služi kao agens stabilizacije; i (iv) oko 0,004 do oko 10 mas./vol.% formulacije nejonskog surfaktanta (uključujući, ali bez ograničenja na polisorbat-80, polisorbat-60, polisorbat-40, i polisorbat-20); pri čemu navedena formulacija ima pH vrednost u opsegu od oko 4,0 do 6,0. U određenim drugim načinim ostvarivanja, farmaceutske formulacije ovog otkrivanja obuhvataju (i) najmanje oko 70 mg/ml, oko 100 mg/ml, oko 120 mg/ml, oko 140 mg/ml, oko 150 mg/ml, oko 160 mg/ml, oko 170 mg/ml, oko 180 mg/ml, oko 190 mg/ml, oko 200 mg/ml anti-PCSK9 antitela; (ii) oko 10 mM NAOAC; (iii) oko 0,01% polisorbata 80; i (iv) između oko 2%-3% prolina (ili oko 250 mM do oko 270 mM prolina), pri čemu formulacija ima pH vrednost od oko 5. U određenim drugim načinima ostvarivanja, farmaceutske formulacije ovog otkrivanja obuhvataju (i) najmanje oko 70 mg/ml, oko 100 mg/ml, oko 120 mg/ml, oko 140 mg/ml anti-PCSK9 antitela, 21B12, 26H5 i/ili 31H4; (ii) oko 10 mM NAOAC; (iii) oko 0,01% polisorbata 80; i (iv) između oko 2%-3% prolina (ili oko 250 mM do oko 270 mM prolina), pri čemu formulacija ima pH vrednost od oko 5. U određenim drugim načinima ostvarivanja, farmaceutske formulacije ovog otkrivanja obuhvataju (i) najmanje oko 150 mg/ml, oko 160 mg/ml, oko 170 mg/ml, oko 180 mg/ml, oko 190 mg/ml, oko 200 mg/ml anti-PCSK9 antitela, 8A3, 11F1 i/ili 8A1; (ii) oko 10 mM NAOAC; (iii) oko 0,01% polisorbata 80; i (iv) između oko 2%-3% prolina (ili oko 250 mM do oko 270 mM prolina), pri čemu formulacija ima pH vrednost od oko 5.

[0169] Jedan aspekt ovog otkrivanja je farmaceutska formulacija koja obuhvata (i) najmanje oko 70 mg/ml do oko 250 mg/ml anti-PCSK9 antitela; (ii) oko 5 mM do oko 20 mM pufera, kao što je NAOAC; (iii) oko 1 do oko 10 mas./vol.% formulacije obuhvata polihidroksi ugljeni hidrat kao što je sorbitol, ili disaharid kao što je saharoza; i (iv) oko 0,004 do oko 10 mas./vol.% formulacije surfaktanta, kao što je polisorbat 20 ili polisorbat 80; pri čemu navedena formulacija ima pH vrednost u opsegu od oko 4,8 do 5,8; i pri čemu farmaceutska formulacija opciono obuhvata oko 80 mM do oko 300 mM prolina, arginina, lizina, metionina, ili taurina i/ili 0,5% do oko 5% benzilalkohola koji služi za smanjivanje viskoznosti. U određenim drugim načinima ostvarivanja, farmaceutske formulacije ovog otkrivanja obuhvataju (i) najmanje oko 70 mg/ml do oko 250 mg/ml anti-PCSK9 antitela; (ii) oko 10 mM NAOAC; (iii) oko 9% saharoze; i (iv) oko 0,004% polisorbata 20, pri čemu formulacija ima pH vrednost od oko 5,2. U određenim drugim načinima ostvarivanja, farmaceutske formulacije ovog otkrivanja obuhvataju (i) najmanje oko 70 mg/ml, oko 100 mg/ml, oko 120 mg/ml, oko 140 mg/ml, oko 160 mg/ml, oko 180

4

mg/ml, oko 200 mg/ml anti-PCSK9 antitela; (ii) oko 15 mM NAOAC; (iii) oko 9% saharoze; i (iv) oko 0,01% polisorbata 20, pri čemu formulacija ima pH vrednost od oko 5,2. U određenim drugim načinima ostvarivanja, farmaceutske formulacije ovog otkrivanja obuhvataju (i) najmanje oko 70 mg/ml, oko 100 mg/ml, oko 120 mg/ml, oko 140 mg/ml, oko 160 mg/ml, oko 180 mg/ml, oko 200 mg/ml anti-PCSK9 antitela; (ii) oko 20 mM NAOAC; (iii) oko 9% saharoze; i (iv) oko 0,01% polisorbata 20, pri čemu formulacija ima pH vrednost od oko 5,2. U određenim drugim načinima ostvarivanja, farmaceutske formulacije ovog otkrivanja obuhvataju (i) najmanje oko 70 mg/ml, oko 100 mg/ml, oko 120 mg/ml, oko 140 mg/ml, oko 160 mg/ml, oko 180 mg/ml, oko 200 mg/ml anti-PCSK9 antitela; (ii) oko 10 mM NAOAC; (iii) oko 9% saharoze; (iv) oko 0,01% polisorbata 80; i (v) oko 250 mM prolina, pri čemu formulacija ima pH vrednost od oko 5.

[0170] Farmaceutske formulacije ovog pronalaska mogu da se daju u kombinovanoj terapiji, tj., kombinovano sa drugim agensima. U određenim načinima ostvarivanja, kombinovana terapija obuhvata protein za vezivanje antigena sposoba za vezivanje PCSK9, u kombinaciji sa najmanje jednim antiholesterolnim agensom. Agensi uključuju, ali nisu ograničeni na in vitro sintetički pripremljene hemijske formulacije, antitela, regione za vezivanje antigena, i njihove kombinacije i konjugate. U određenim načinima ostvarivanja, agens može da deluje kao agonist, antagonist, alosterički modulator, ili toksin. U određenim načinima ostvarivanja, agens može da deluje tako da inhibira ili stimuliše svoj cilj (npr., aktivacija ili inhibicija receptora ili enzima), čime se pospešuje povećana ekspresija LDLR ili smanjuju nivoi holesterola u serumu.

[0171] U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 može da se daje pre, istovremeno sa, i posle lečenja agensom snižavanja holesterola (holesterol u serumu i/ili ukupan holesterol). U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 može da se daje profilaktički za sprečavanje ili ublažavanje početka hiperholesterolemije, srčane bolesti, dijabetesa, i/ili bilo kog poremećaja povezanog sa holesterolom. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 može da se daje za lečenje postojećeg stanja hiperholesterolemije. U nekim načinima ostvarivanja, ABP odlaže početak poremećaja i/ili simptoma povezanih sa poremećajem. U nekim načinima ostvarivanja, ABP je obezbeđen subjektu koji nema nikakve simptome bilo kog od poremećaja povezanih sa holesterolom ili njihovog podskupa.

[0172] U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi sa određenim terapijskim agensima za lečenje različitih poremećaja povezanih sa holesterolom, kao što je hiperholesterolemija. U određenim načinima ostvarivanja, imajući u vidu stanje i željeni nivo lečenja, mogu da se daju dva, tri, ili više agenasa. U određenim načinima ostvarivanja, takvi agensi mogu biti zajedno obezbeđeni uključivanjem u istu formulaciju. U određenim načinima ostvarivanja, takav (takvi) agens(i) i protein za vezivanje antigena za PCSK9 mogu biti zajedno obezbeđeni uključivanjem u istu formulaciju. U određenim načinima ostvarivanja, takvi agensi se mogu formulisati zasebno i obezbediti zajedno uključivanjem u komplet za lečenje. U određenim načinima ostvarivanja, takvi agensi i protein za vezivanje antigena za PCSK9 mogu biti zasebno formulisani i zajedno obezbeđeni uključivanjem u komplet za lečenje. U određenim načinima ostvarivanja, takvi agensi mogu biti zasebno obezbeđeni.

[0173] U određenim načinima ostvarivanja, formulacija koja obuhvata protein za vezivanje antigena za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapijskog agensa, može se pripremiti za čuvanje mešanjem odabrane formulacije koja ima željeni stepen čistoće sa opcionim agensima formulacije (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) u obliku liofilizovanog kolača ili vodenog rastvora. Dalje, u određenim načinima ostvarivanja, formulacija koja obuhvata protein za vezivanje antigena za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapijskog agensa, može se formulisati kao liofilizat upotrebom odgovarajućih ekscipijenasa.

[0174] U određenim načinima ostvarivanja, kada se razmatra parenteralno davanje, terapijska formulacija može biti u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora koji ne sadrži pirogen koji obuhvata željeni protein za vezivanje antigena za PCSK9, sa ili bez dodatnih terapijskih agenasa, u farmaceutski prihvatljivom prenosniku. U određenim načinima ostvarivanja, prenosnik za parenteralno ubrizgavanje je sterilna destilovana voda u kojoj je protein za vezivanje antigena za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapijskog agensa, formulisan kao sterilan, izotoničan rastvor, pravilno sačuvan. U određenim načinima ostvarivanja, priprema može uključivati formulaciju željenog molekula sa agensom, kao što su injektabilni mikrosferi, bio-erozivne čestice, polimerna jedinjenja (kao što je polimlečna kiselina ili poliglikolna kiselina), perli ili lipozoma, koji mogu obezbediti kontrolisano ili zadržano oslobađanje proizvoda koji se zatim mogu dati depo ubrizgavanjem. U određenim načinima ostvarivanja, hijaluronska kiselina se takođe može koristiti, i može imati dejstvo pospešivanja zadržanog trajanja u cirkulaciji. U određenim načinima ostvarivanja, za uvođenje željenog molekula mogu da se koriste implantabilni uređaji za davanje leka.

[0175] U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija se može formulisati za inhalaciju. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapijskog agensa, može se formulisati kao suvi prah za inhalaciju. U određenim načinima ostvarivanja, inhalacioni rastvor koji obuhvata protein za vezivanje antigena za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapijskog agensa, može se formulisati sa propelantom za aerosolno davanje. U određenim načinima ostvarivanja, rastvori mogu biti raspršeni. Pulmonarno davanje je dalje opisano u PCT prijavi br. PCT/US94/001875, koja opisuje pulmonarno davanje hemijski modifikovanih proteina.

[0176] U određenim načinima ostvarivanja, farmaceutska formulacija može uključivati efektivnu količinu proteina za vezivanje antigena za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapijskog agensa, u kompoziciji sa ne-toksičnim ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju tableta. U određenim načinima ostvarivanja, rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi, ili drugom odgovarajućem prenosniku, rastvori se mogu pripremiti u jediničnom doznom obliku. U određenim načinima ostvarivanja, pogodni ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na inertne razblaživače, kao što su kalcijumkarbonat, natrijumkarbonat ili bikarbonat, laktoza, ili kalcijumfosfat; ili agense vezivanja, kao što su skrob, želatin, ili akacij; ili agense lubrikacije kao što je magnezijumstearat, stearinska kiselina, ili talk.

[0177] Dodatne farmaceutske formulacije biće očigledne stručnjacima iz ove oblasti, uključujući formulacije koje uključuju proteine za vezivanje antigena za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapijskog agen(a)sa, u formulacijama zadržanog ili kontrolisanog davanja. U određenim načinima ostvarivanja, tehnike za formulisanje mnoštva drugih sredstava zadržanog ili kontrolisanog davanja, kao što su lipozomni nosači, bio-erozivne mikročestice ili porozne perle i depo ubrizgavanja, su takođe poznate stručnjacima iz ove oblasti. Pogledati na primer PCT prijavu br. PCT/US93/00829 koja opisuje kontrolisano oslobađanje poroznih polimernih mikročestica za davanje farmaceutskih formulacija. U određenim načinima ostvarivanja, preparati sa produženim oslobađanjem mogu uključivati polupropustljive polimerne matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmova, ili mikrokapsula.

Matrice zadržanog oslobađanja mogu uključivati poliestre, hidrogele, polilaktide (U.S.3,773,919 i EP 058,481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli (2-hidroksietil-metakrilat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) and Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), etilen vinil acetat (Langer et al., supra) ili poli-D(-)-3-hidroksibuternu kiselinu (EP 133,988). U određenim načinima ostvarivanja, formulacije zadržanog oslobađanja mogu takođe uključivati lipozome, koji se mogu pripremiti bilo kojim od nekoliko postupaka poznatih u ovoj oblasti. Pogledati, npr., Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); EP 036,676; EP 088,046 i EP 143,949.

[0178] Farmaceutska formulacija koja se koristi za in vivo davanje je obično sterilna. U određenim načinima ostvarivanja, ovo se može ostvariti filtracijom putem filtracije kroz sterilne membrane. U određenim načinima ostvarivanja, gde je formulacija liofilizovana, sterilizacija koja primenjuje postupak može se sprovesti ili pre ili posle liofilizacije i rekonstitucije. U određenim načinima ostvarivanja, formulacija za parenteralno davanje se može čuvati u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. U određenim načinima ostvarivanja, parenteralne formulacije se generalno stavljaju u posudu koja ima sterilni ulazni deo, na primer, vrećicu za intravenski rastvor ili ampulu koja ima odstojnik koji probija hipodermička igla za ubrizgavanje.

[0179] U određenim načinima ostvarivanja, kada se farmaceutska formulacija formuliše, može se čuvati u sterilnim ampulama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta materija, ili kao dehidrirani ili liofilizovani prah. U određenim načinima ostvarivanja, takve formulacije mogu se čuvati ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr., liofilizovanom) koji se rekonstituiše pre davanja.

[0180] U određenim načinima ostvarivanja, kada se farmaceutska formulacija formuliše, može se čuvati u prethodno napunjenim špricevima kao rastvor ili suspenzija u obliku spremnom za upotrebu.

[0181] U određenim načinima ostvarivanja, obezbeđeni su kompleti za proizvodnju jedinice za davanje u jednoj dozi. U određenim načinima ostvarivanja, komplet može da sadrži i prvu posudu koja ima osušeni protein i drugu posudu koja ima vodenu formulaciju. U određenim načinima ostvarivanja, kompleti koji sadrže prethodno napunjene špriceve sa jednom i više komora (npr., špricevi sa tečnošću i liošpricevi) su uključeni.

[0182] U određenim načinima ostvarivanja, efektivna količina farmaceutske formulacije koja obuhvata protein za vezivanje antigena za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapijskog agensa, koja se terapijski koristi zavisiće, na primer, od terapijskog konteksta i predmeta. Stručnjak iz ove oblasti će shvatiti da će se odgovarajući dozni nivoi za lečenje, prema određenim načinima ostvarivanja, stoga razlikovati delimično u zavisnosti od molekula koji se daje, indikacije za koju se protein za vezivanje antigena za PCSK9, sa ili bez najmanje jednog dodatnog terapijskog agensa, koristi, puta davanja, i veličine (telesne mase, telesne površine ili veličine organa) i/ili stanja (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta. U određenim načinima ostvarivanja, lekar može titrirati dozu i modifikovati put davanja kako bi se dobilo optimalno terapijsko dejstvo.

[0183] U određenim načinima ostvarivanja, formulacija se može davati lokalno preko implantacije membrane, sunđera ili drugog odgovarajućeg materijala na koji se željeni molekul apsorbuje ili inkapsulira. U određenim načinima ostvarivanja, kada se koristi uređaj za implantaciju, uređaj se može implantirati u bilo koje pogodno tkivo ili organ, a davanje željenog molekula može se sprovesti preko difuzije, bolusa sa programiranim oslobađanjem, ili kontinualnim davanjem.

Doza i dozni režimi

[0184] Bilo koji od proteina za vezivanje antigena za PCSK9 prikazanih u tabeli 2 i na FIG.2 i/ili 3 mogu da se daju pacijentu prema postupcima ovog otkrivanja. U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 uključuju 21B12, 26H5, 31H4, 8A3, 11F1 ili 8A1.

[0185] Količina proteina za vezivanje antigena za PCSK9 (npr., anti-PCSK9 antitelo) koja se daje pacijentu prema postupcima ovog otkrivanja je, generalno, terapijski efektivna količina. Količina ABP-a može se eksprimirati u smislu miligrama antitela (tj., mg) ili miligrama antitela po kilogramu telesne mase pacijenta (tj., mg/kg). U određenim načinima ostvarivanja, uobičajena doza PCSK9 proteina za vezivanje antigena može biti u opsegu od oko 0,1 µg/kg do oko 100 mg/kg ili više proteina za vezivanje antigena za PCSK9. U određenim načinima ostvarivanja, doza može biti u opsegu od 0,1 µg/kg do oko 100 mg/kg; ili 1 µg/kg do oko 100 mg/kg; ili 5 µg/kg do oko 100 mg/kg proteina za vezivanje antigena za PCSK9; ili 1 mg/kg do oko 50 mg/kg proteina za vezivanje antigena za PCSK9; ili 2 mg/kg do oko 20 mg/kg proteina za vezivanje antigena za PCSK9; ili 2 mg/kg do oko 10 mg/kg proteina za vezivanje antigena za PCSK9.

[0186] U određenim načinima ostvarivanja, količina (ili doza) proteina za vezivanje antigena za PCSK9 može biti u opsegu od najmanje oko 10 mg do oko 1400mg; ili oko 14 mg do oko 1200 mg; ili oko 14 mg do oko 1000 mg; ili oko 14 mg do oko 800 mg; ili oko 14 mg do oko 700 mg; ili oko 14 mg do oko 480 mg; ili oko 20 mg do oko 480 mg; ili oko 70 mg do oko 480 mg; ili oko 80 mg do oko 480 mg; ili oko 90 mg do oko 480 mg; ili oko 100 mg do oko 480 mg, ili oko 105 mg do oko 480 mg; ili oko 110 mg do oko 480 mg; ili oko 115 mg do oko 480 mg; ili oko 120 mg do oko 480 mg; ili oko 125 mg do oko 480 mg; ili oko 130 mg do oko 480 mg; ili oko 135 mg do oko 480 mg; ili oko 140 mg do oko 480 mg; ili oko 145 mg do oko 480 mg; ili oko 150 mg do oko 480 mg; ili oko 160 mg do oko 480 mg; ili oko 170 mg do oko 480 mg; ili oko 180 mg do oko 480 mg ili oko 190 mg do oko 480 mg ili oko 200 mg do oko 480 mg; ili oko 210 mg do oko 480 mg; ili oko 220 mg do oko 480 mg; ili oko 230 mg do oko 480 mg; ili oko 240 mg do oko 480 mg; ili oko 250 mg do oko 480 mg; ili oko 260 mg do oko 480 mg; ili oko 270 mg do oko 480 mg; ili oko 280 mg do oko 480 mg; ili oko 290 mg do oko 480 mg; ili oko 300 mg do oko 480 mg; ili oko 310 mg do oko 480 mg; ili oko 320 mg do oko 480 mg; ili oko 330 mg do oko 480 mg; ili oko 340 mg do oko 480 mg; ili oko 350 mg do oko 480 mg; ili oko 360 mg do oko 480 mg; ili oko 370 mg do oko 480 mg; ili oko 380 mg do oko 480 mg; ili oko 390 mg do oko 480 mg; ili oko 400 mg do oko 480 mg; ili oko 410 mg do oko 480 mg; ili oko 420 mg do oko 480 mg; ili oko 430 mg do oko 480 mg; ili oko 440 mg do oko 480 mg; ili oko 450 mg do oko 480 mg; ili oko 460 mg do oko 480 mg; ili oko 470 mg do oko 480 mg proteina za vezivanje antigena za PCSK9.

[0187] U određenim načinima ostvarivanja, učestalost doziranja će uzeti u obzir farmakokinetičke parametre proteina za vezivanje antigena za PCSK9 i/ili bilo kojih dodatnih terapijskih agenasa u formulaciji koja se koristi. U određenim načinima ostvarivanja, lekar će davati formulaciju dok se ne dostigne doza koja ostvaruje željeno dejstvo. U određenim načinima ostvarivanja, formulacija se stoga može davati kao jedna doza, ili kao dve, tri, četiri ili više doza (koje mogu ili ne moraju sadržati istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao kontinualna infuzija preko uređaja za implantaciju ili katetera. Formulacija se takođe može dati subkutano ili intravenski sa standardnom iglom i špricem. Pored toga, u pogledu subkutane isporuke, uređaji za isporuku olovkom, kao i uređaji za isporuke autoinjekcijom, imaju primene u isporučivanju farmaceutske formulacije ovog otkrivanja. Dalje prečišćavanje odgovarajuće doze će rutinski sprovesti stručnjaci iz ove oblasti i to se sprovodi u okviru zadataka koje oni rutinski obavljaju. U određenim načinima ostvarivanja, odgovarajuće doze se mogu proceniti upotrebom odgovarajućih podataka o doznom odgovoru. U nekim načinima ostvarivanja, količina i učestalost davanja mogu uzeti u obzir željeni nivo holesterola (u serumu i/ili ukupno) koji treba dobiti i trenutni nivo holesterola subjekta, nivo LDL, i/ili nivoe LDLR, što se sve može dobiti postupcima koji su dobro poznati stručnjacima iz ove oblasti.

[0188] U određenim načinima ostvarivanja, doza od najmanje oko 10 mg; ili do oko 14 mg; ili do oko 20 mg; ili do oko 35 mg; ili do oko 40 mg, ili do oko 45 mg, ili do oko 50 mg; ili do oko 70 mg proteina za vezivanje antigena za PCSK9 se daje jednom nedeljno (QW) pacijentu kojem je to potrebno.

[0189] U nekim drugim načinima ostvarivanja, doza od najmanje oko 70 mg, ili do oko 100 mg; ili do oko 105 mg, ili do oko 110 mg; ili do oko 115 mg, ili do oko 120 mg; ili do oko 140 mg; ili do oko 160 mg; ili do oko 200 mg; ili do oko 250 mg; ili do 280 mg; ili do 300 mg; ili do 350 mg; ili do 400 mg; ili do 420 mg proteina za vezivanje antigena za PCSK9 se daje svake druge nedelje, (ili svake dve nedelje) (Q2W) pacijentu kojem je to potrebno.

[0190] U određenim drugim načinima ostvarivanja, doza od najmanje oko 250 mg; ili do oko 280 mg; ili do oko 300 mg; ili do oko 350 mg; ili do oko 400 mg; ili do oko 420 mg; ili do oko 450 mg; ili do 480 mg proteina za vezivanje antigena za PCSK9 se daje svake četiri nedelje (ili jednom mesečno) pacijentu kojem je to potrebno.

[0191] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 80%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 85%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 90%.

[0192] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 30% a smanjenje je produženo za period od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0193] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 35% a smanjenje je produženo za period od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0194] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 40% a smanjenje je produženo za period od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0195] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 45% a smanjenje je produženo za period od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0196] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 50% a smanjenje se zadržava tokom perioda od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0197] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 55% a smanjenje se zadržava tokom perioda od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0198] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 60%, a smanjenje se zadržava tokom perioda od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0199] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 65% a smanjenje se zadržava tokom perioda od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0200] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 70% a smanjenje se zadržava tokom perioda od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0201] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 75% a smanjenje se zadržava tokom perioda od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0202] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 80% a smanjenje se zadržava tokom perioda od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7

1

dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0203] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 85% a smanjenje se zadržava tokom perioda od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

[0204] U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 90% a smanjenje se zadržava tokom perioda od najmanje oko 3 dana, najmanje oko 5 dana, najmanje oko 7 dana, najmanje oko 10 dana, najmanje oko 14 dana, najmanje oko 21 dan, najmanje oko 25 dana, najmanje oko 28 dana, ili najmanje oko 31 dan u odnosu na pred-dozni nivo.

Određene terapijske primene

[0205] Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, poremećaji koji se odnose na, uključuju, ili mogu biti pod uticajem različitih nivoa holesterola, LDL, LDLR, PCSK9, VLDL-C, apoproteina B („ApoB“), lipoproteina A („Lp(a)“), triglicerida, HDL-C, ne-HDL-C, i ukupnih nivoa holesterola mogu se lečiti pomoću proteina za vezivanje antigena za PCSK9 opisanih u ovom pronalasku. U jednom aspektu, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 se mogu koristiti u postupcima za lečenje i/ili prevenciju i/ili smanjenje rizika od poremećaja koji se odnose na povišene nivoe holesterola u serumu ili kod kojih su povišeni nivoi holesterola u serumu relevantni. U jednom aspektu, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 se mogu koristiti u postupcima za lečenje i/ili prevenciju i/ili smanjenje rizika od poremećaja koji se odnose na povišene vrednosti PCSK9 ili kod kojih su povišene vrednosti PCSK9 relevantne. U jednom aspektu, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 se mogu koristiti u postupcima za lečenje i/ili prevenciju i/ili smanjenje rizika od poremećaja koji se odnose na povišene ukupne nivoe holesterola ili kod kojih su povišeni ukupni nivoi holesterola relevantni. U jednom aspektu, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 se mogu koristiti u postupcima za lečenje i/ili prevenciju i/ili smanjenje rizika od poremećaja koji se odnose na povišene nivoe ne-HDL holesterola ili kod kojih su povišeni nivoi ne-HDL holesterola relevantni. U jednom aspektu, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 se mogu koristiti u postupcima za lečenje i/ili prevenciju i/ili smanjivanje rizika od poremećaja koji se odnose na povišene nivoe ApoB ili kod kojih su povišeni nivoi ApoB relevantni. U jednom aspektu, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 se mogu koristiti u postupcima za lečenje i/ili prevenciju i/ili smanjenje rizika od poremećaja koji se odnose na povišene nivoe Lp(a) ili kod kojih su povišeni nivoi Lp(a) relevantni. U jednom aspektu, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 se mogu koristiti u postupcima za lečenje i/ili prevenciju i/ili smanjenje rizika od poremećaja koji se odnose na povišene nivoe triglicerida ili kod kojih su povišeni nivoi triglicerida relevantni. U jednom aspektu, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 se

2

mogu koristiti u postupcima za lečenje i/ili prevenciju i/ili smanjenje rizika od poremećaja koji se odnose na povišene nivoe VLDL-C ili kod kojih su povišeni nivoi VLDL-C relevantni.

[0206] U jednom aspektu, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za modulaciju nivoa LDL holesterola u serumu kod pacijenta. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za smanjenje količine LDL holesterola u serumu sa abnormalno visokog nivoa ili čak sa uobičajenog nivoa. U određenim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 30%. U određenim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 35%. U određenim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 40%. U određenim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 45%. U određenim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 50%. U određenim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 80%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 85%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo LDL holesterola u serumu je smanjen za najmanje oko 90%.

[0207] U jednom aspektu, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za modulaciju vrednosti PCSK9 u serumu pacijenta. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 je neutralizujući. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za smanjenje vrednosti PCSK9 sa abnormalno visokog nivoa ili čak sa uobičajenog nivoa. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 80%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 85%. U nekim načinima ostvarivanja, vrednost PCSK9 u serumu je smanjena za najmanje oko 90%.

[0208] U jednom aspektu, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za modulaciju nivoa ukupnog holesterola kod pacijenta. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 je nautralizujući. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za smanjenje ukupne količine holesterola sa abnormalno visokog nivoa ili čak sa uobičajenog nivoa. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 20%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 25%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, ukupan nivo holesterola je smanjen za najmanje oko 60%.

[0209] U jednom aspektu, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za modulaciju nivoa ne-HDL holesterola kod pacijenta. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 je neutralizujući. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za smanjenje ne-HDL holesterola sa abnormalno visokog nivoa ili čak sa uobičajenog nivoa. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 75%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 80%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ne-HDL holesterola je smanjen za najmanje oko 85%.

[0210] U jednom aspektu, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za modulaciju nivoa ApoB kod pacijenta. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 je neutralizujući. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za smanjenje količine ApoB sa abnormalno visokog nivoa ili čak sa uobičajenog nivoa. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 25%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 65%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je

4

smanjen za najmanje oko 70%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo ApoB je smanjen za najmanje oko 75%.

[0211] U jednom aspektu, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za modulaciju nivoa Lp(a) kod pacijenta. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 je neutralizujući. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za smanjenje količine Lp(a) sa abnormalno visokog nivoa ili čak sa uobičajenog nivoa. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 5%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 10%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 15%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 20%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 25%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 30%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 35%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 40%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 45%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 50%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 55%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 60%. U nekim načinima ostvarivanja, nivo Lp(a) je smanjen za najmanje oko 65%.

[0212] Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 ovog pronalaska mogu biti terapijski korisni u lečenju i/ili prevenciji poremećaja povezanih sa holesterolom. U nekim načinima ostvarivanja, „poremećaj povezan sa holesterolom“ (što uključuje „poremećaje povezane sa holesterolom u serumu“) uključuje bilo koje jedno ili više od sledećeg: porodičnu hiperholesterolemiju, ne-porodičnu hiperholesterolemiju, hiperlipidemiju, srčanu bolest, metabolički sindrom, dijabetes, koronarnu bolest srca, moždani udar, kardiovaskularne bolesti, Alchajmerovu bolest i generalno dislipidemije, koje se mogu manifestovati, na primer, povišenim ukupnim holesterolom u serumu, povišenim LDL, povišenim trigliceridima, povišenim VLDL, i/ili niskim HDL. Neki neograničavajući primeri primarnih i sekundarnih dislipidemija koje se mogu lečiti pomoću ABP, samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili više drugih agenasa uključuju metabolički sindrom, dijabetes melitus, porodičnu kombinovanu hiperlipidemiju, porodičnu hipertrigliceridemiju, porodične hiperholesterolemije, uključujući heterozigotnu hiperholesterolemiju, homozigotnu hiperholesterolemiju, porodični defektivni apolipoprotein B-100; poligenu hiperholesterolemiju; disbetalipoproteinemiju, nedostatak hepatske lipaze; dislipidemiju sekundarnu bilo čemu od sledećeg: dijetarnoj indiskreciji, hipotiroidizmu, lekovima uključujući terapiju estrogenom i progestinom, betablokatorima, i tiazidima sličnim diureticima; nefrotski sindrom, hroničnu bubrežnu insuficijenciju, Kašingov sindrom, primarnu bilijarnu cirozu, bolesti skladištenja glikogena, hepatom, holestazu, akromegaliju, insulinom, izolovani nedostatak hormona rasta, i alkoholom indukovanu hipertrigliceridemiju. ABP se takođe može koristiti u prevenciji ili lečenju aterosklerotičnih bolesti, kao što su, na primer, kardiovaskularna smrt, ne-kardiovaskularna ili ukupna smrtnost, koronarna bolest srca, koronarna bolest arterija, periferna arterijska bolest, moždani udar (ishemijski i hemoragijski), angine pektoris, ili cerebrovaskularna bolest i akutni koronarni sindrom, infarkt miokarda i nestabilna angina. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se koristi za smanjenje rizika od: fatalnih i nefatalnih srčanih udara, fatalnih i nefatalnih moždanih udara, određenih vrsta operacija srca, hopitalizacije zbog otkazivanja srca, bola u grudima kod pacijenata sa bolestima srca, i/ili kardiovaskularnih događaja usled ustanovljene srčane bolesti kao što je prethodni srčani udar, prethodna operacija srca, i/ili bol u grudima sa dokazanim začepljenjem arterija i/ili arterijske bolesti povezane sa transplantom. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se koristi u prevenciji ili smanjenju kardiovaskularnog rizika zbog povišenog CRP ili hsCRP. U nekim načinima ostvarivanja, ABP i postupci se mogu koristiti za smanjenje rizika od rekurentnih kardiovaskularnih događaja.

[0213] Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, bolesti ili poremećaji koji se generalno mogu regulisati (lečenjem ili prevencijom) upotrebom statina mogu takođe imati koristi od primene instant proteina za vezivanje antigena. Pored toga, u nekim načinima ostvarivanja, poremećaji ili bolesti koje mogu imati koristi od prevencije sinteze holesterola ili povećane ekspresije LDLR mogu se takođe lečiti različitim načinima ostvarivanja proteina za vezivanje antigena. Pored toga, kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, upotreba anti-PCSK9 antitela može biti naročito korisna u lečenju dijabetesa. Ne samo da je dijabetes faktor rizika za koronarnu bolest srca, već i insulin povećava ekspresiju PCSK9. Odnosno, ljudi oboleli od dijabetesa imaju povišene nivoe lipida u plazmi (koji mogu biti povezani sa visokim nivoima PCSK9) i mogu imati koristi od snižavanja ovih nivoa. Ovo se generalno detaljnije navodi u Costet et al. ("Hepatic PCSK9 Expression is Regulated by Nutritional Status via Insulin and Sterol Regulatory Elementbinding Protein 1C", J. Biol. Chem., 281: 6211-6218, 2006).

[0214] U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se daje onima koji imaju dijabetes melitus, abdominalnu aneurizmu aorte, aterosklerozu i/ili perifernu arterijsku bolest kako bi se smanjili nivoi holesterola u serumu na bezbedniji opseg. U nekim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena se daje pacijentima pod rizikom od razvijanja bilo kog od ovde opisanih poremećaja. U nekim načinima ostvarivanja, ABP-ovi se daju subjektima koji puše, ili su nekada pušili (tj., bivšim pušačima), koji imaju hipertenziju ili porodičnu istoriju ranih srčanih udara.

[0215] U nekim načinima ostvarivanja, subjektu se daje ABP ako su pod umerenim ili višim rizikom prema 2004 NCEP ciljevima lečenja. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se daje subjektu ako je nivo LDL holesterola subjekta viši od 160 mg/dl. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se daje ako je nivo LDL holesterola subjekata viši od 130 (i ako su pod umerenim ili umereno visokim rizikom prema 2004 NCEP ciljevima lečenja). U nekim načinima ostvarivanja, ABP se daje ako je nivo LDL holesterola subjekata viši od 100 (i ako su pod visokim ili veoma visokim rizikom prema 2004 NCEP ciljevima lečenja). U nekim načinima ostvarivanja, ABP se daje ako je nivo LDL holesterola subjekata viši od 80 mg/dL. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se daje ako je nivo LDL holesterola subjekata viši od 70 mg/dL.

[0216] Lekar će moći da odabere odgovarajuće indikacije lečenja i da cilja nivoe lipida u zavisnosti od pojedinačnog profila određenog pacijenta. Jedan prihvaćeni standard za usmeravanje lečenja hiperlipidemije je Third Report of the National Holesterol Education Program (NCEP) Expert Panel on Detection, Evaluation, and Treatment of the High Blood Holesterol in Adults (Adult Treatment Panel III) Final Report, National Institutes of Health, NIH Publication No.02-5215 (2002).

[0217] U nekim načinima ostvarivanja, proteini za vezivanje antigena za PCSK9 se koriste za lečenje ili prevenciju hiperholesterolemije, hiperlipidemije ili dislipidemije i/ili u pripremi lekova za iste i/ili za druge poremećaje povezane sa holesterolom (kao što su oni ovde navedeni). U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se koristi za lečenje ili prevenciju stanja kao što je hiperholesterolemija kod koje je aktivnost PCSK9 uobičajena. Kod takvih stanja, na primer, smanjenje aktivnosti PCSK9 na ispod uobičajene može obezbediti terapijsko dejstvo.

Kombinovane terapije

[0218] U određenim načinima ostvarivanja, obezbeđeni su postupci lečenja poremećaja povezanog sa holesterolom, kao što su hiperholesterolemija, hiperlipidemija ili dislipidemija, koji obuhvataju davanje terapijski efektivne količine jednog ili više proteina za vezivanje antigena za PCSK9 i drugog terapijskog agensa. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se daje pre davanja najmanje jednog drugog terapijskog agensa. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se daje istovremeno sa davanjem najmanje jednog drugog terapijskog agensa. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 se daje posle davanja najmanje jednog drugog terapijskog agensa.

[0219] Terapijski agensi (osim proteina za vezivanje antigena) uključuju, ali nisu ograničeni na najmanje jedan drugi agens snižavanja holesterola (u serumu i/ili ukupnog holesterola u telu). U nekim načinima ostvarivanja, primećeno je da agens koji povećava ekspresiju LDLR povećava nivoe HDL u serumu, snižava nivoe LDL ili snižava nivoe triglicerida. Primerni agensi uključuju, ali nisu ograničeni na statine (atorvastatin, cerivastatin, fluvastatin, lovastatin, mevastatin, pitavastatin, pravastatin, rosuvastatin, simvastatin), nikotinsku kiselinu (Niacin) (NIACOR, NIASPAN (niacin sporog oslobađanja), SLO-NIACIN (niacin sporog oslobađanja), CORDAPTIVE (laropiprant)), fibrinsku kiselinu (LOPID (Gemfibrozil), TRICOR (fenofibrat), sekvestrante žučne kiseline (QUESTRAN (holestiramin), kolesevelam (WELCHOL), COLESTID (kolestipol)), inhibitore apsorpcije holesterola (ZETIA (ezetimib)), kombinaciju nikotinske kiseline sa statinom (ADVICOR (LOVASTATIN i NIASPAN), kombinaciju statina sa inhibitorom apsorpcije (VYTORIN (ZOCOR i ZETIA) i/ili agense modifikacije lipida. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se kombinuje sa PPAR gama agonistima, PPAR alfa/gama agonistima, inhibitorima sintaze skvalena, CETP inhibitorima, anti-hipertenzivima, anti-dijabetskim agensima (kao što su sulfoniluree, insulin, GLP-1 analog, DDPIV inhibitor, npr., metaformin), ApoB modulatorima, kao što su mipomersan, MTP inhibitor i/ili tretman za arteriosclerosis obliterans. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se kombinuje sa agensom koji povećava nivo LDLR proteina kod subjekta, kao što je statin, određenih citokina kao što su onkostatin M, estrogen, i/ili određeni biljni sastojci kao što je berberin. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se kombinuje sa agensom koji povećava nivoe holesterola u serumu subjekta (kao što su određeni anti-psihotični agensi, određenii inhibitori HIV proteaze, dijetarni faktori kao što su visok nivo fruktoze, saharoze, holesterola ili određenih masnih kiselina i određenih agonista nuklearnih receptora i antagonista za RXR, RAR, LXR, FXR). U nekim načinima ostvarivanja, ABP se kombinuje sa agensom koji povećava nivo PCSK9 kod subjekta, kao što je statin i/ili insulin. Kombinacija ova dva može omogućiti da ABP ublaži nepoželjna neželjena dejstva drugih agenasa.

[0220] U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 može se koristiti sa najmanje jednim terapijskim agensom za zapaljenje. U određenim načinima ostvarivanja, protein za vezivanje antigena za PCSK9 može se koristiti sa najmanje jednim terapijskim agensom za poremećaj imunog sistema. Primerni terapijski agensi za zapaljenje i poremećaje imunog sistema uključuju, ali nisu ograničeni na inhibitore ciklooksigenaze tipa 1 (COX-1) i ciklooksigenaze tipa 2 (COX-2) modulatora malih molekula od 38 kDa mitogenom aktivirane proteinske kinaze (p38-MAPK); modulatore malih molekula intraćelijskih molekula uključenih u zapaljenske puteve, pri čemu takvi intraćelijski molekuli uključuju, ali nisu ograničeni na jnk, IKK, NF-KB, ZAP70, i lck. Određeni primerni terapijski agensi za zapaljenje su opisani, npr., u C.A. Dinarello & L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A Primer for Clinicians Third Edition (2001) Amgen Inc. Thousand Oaks, CA.

Dijagnostičke primene

[0221] U nekim načinima ostvarivanja, ABP se koristi kao dijagnostički alat. ABP se može koristiti za analizu količine PCSK9 prisutnog u uzorku i/ili subjektu. Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, takvi ABP-ovi ne moraju da budu neutralizujući ABP-ovi. U nekim načinima ostvarivanja, dijagnostički ABP nije neutralizujući ABP. U nekim načinima ostvarivanja, dijagnostički ABP se vezuje za drugačiji epitop u odnosu na neutralizujući ABP. U nekim načinima ostvarivanja, dva ABP-a nisu konkurentni jedan drugom.

[0222] U nekim načinima ostvarivanja, ovde opisani ABP-ovi se koriste ili su obezbeđeni u kompletu za analizu i/ili postupku za detekciju PCSK9 u sisarskim tkivima ili ćelijama u cilju skrininga/dijagnoze za bolest ili poremećaj povezan sa promenama nivoa PCSK9. Komplet obuhvata ABP koji se vezuje PCSK9 i sredstva za označavanje vezivanja ABP-a sa PCSK9, ako ga ima, i opciono nivoa proteina u PCSK9.

Različita sredstva za označavanje prisustva ABP-a se mogu koristiti. Na primer, fluorofori, druge molekulske sonde, ili enzimi mogu biti povezani sa ABP-om i prisustvo ABP-a se može primetiti na različite načine. Postupak za skrining takvih poremećaja može uključivati upotrebu kompleta, ili jednostavno upotrebu jednog od opisanih ABP-ova i utvrđivanje da li se ABP vezuje za PCSK9 u uzorku. Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, visoki ili povišeni nivoi PCSK9 će rezultovati time da se veće količine ABP-a vezuju za PCSK9 u uzorku. Stoga, stepen vezivanja ABP-a se može koristiti za utvrđivanje količine PCSK9 u uzorku. Subjekti ili uzorci sa količinom PCSK9 koja je veća od unapred utvrđene količine (npr., količina ili opseg koji bi imala osoba bez poremećaja povezanog sa PCSK9) mogu da se okarakterišu tako da imaju PCSK9-posredovani poremećaj. U nekim načinima ostvarivanja, ABP se daje subjektu koji uzima statin, kako bi se utvrdilo da li statin povećava količinu PCSK9 kod subjekta.

[0223] U nekim načinima ostvarivanja, ABP je ne-neutralizujući ABP i koristi se za utvrđivanje količine PCSK9 kod subjekta koji prima terapiju ABP-om i/ili statinom.

PRIMERI

[0224] Sledeći primeri, uključujući izvedene eksperimente i ostvarene rezultate, su obezbeđeni samo u ilustrativne svrhe i ne treba ih tumačiti kao ograničavanje ovog pronalaska.

PRIMER 1

Imunizacija i titracija

Generisanje anti-PCSK9 antitela i hibridoma

[0225] Antitela u zrelom obliku PCSK9 (prikazana kao sekvenca na FIG.1A, sa podvučenim prodomenom) su uzgajana u XenoMouse® miševima (Abgenix, Fremont, CA), koji sadrže gene humanog imunoglobulina. Dve grupe XenoMouse® miševa, grupa 1 i 2, su upotrebljene za proizvodnju antitela za PCSK9. Grupa 1 je uključivala miševe XenoMouse® soja XMG2-KL, koji proizvodi potpuno humana IgG2κi IgG2X antitela. Miševi iz grupe 1 su imunizovani humanim PCSK9. PCSK9 je pripremljen pomoću standardnih rekombinantnih tehnika upotrebom GenBank sekvence kao reference (NM_174936). Grupa 2 je uključivala miševe XenoMouse® soja XMG4-KL, koji proizvode potpuno humana IgG4κi IgG4λ antitela. Miševi iz grupe 2 su takođe imunizovani humanim PCSK9.

[0226] Miševima iz obe grupe je jedanaest puta ubrizgan antigen, prema rasporedu u tabeli 3. Tokom početnih imunizacija, svakom mišu je ubrizgano ukupno 10 µg antigena datog intraperitonealno u abdomen. Kasnije povećane doze su doze od 5ug, a postupak ubrizgavanja je izveden između intraperitonealnih ubrizgavanja u abdomen i subkutanih ubrizgavanja u koren repa. Za intraperitonealna ubrizgavanja antigen je pripremljen kao emulzija sa TiterMax® Gold (Sigma, Cat # T2684), a za subkutana ubrizgavanja antigen je pomešan sa Alum (aluminijumfosfat) i CpG oligoima. Kod ubrizgavanja 2 do 8 i 10, svakom mišu je ubrizgano ukupno 5 µg antigena u alum gel adjuvansu. Konačna injekcija od 5 µg antigena po mišu je isporučena u fosfatom puferisnom slanom rastvoru na 2 mesta 50% IP u abdomen i 50% SQ u koren repa. Programi imunizacije su sažeti u tabeli 3 u nastavku.

TABELA 3

[0227] Protokol upotrebljen za titraciju XenoMouse životinja je sledeći: ploče za vezivanje Costar 3368 podloge su obložene neutravadinom @ 8ug/ml (50ul/bazenčić) i inkubirane na 4°C u 1XPBS/0,05% azida preko noći. Isprane su pomoću TiterTek 3 ciklusa ispiranja sa RO vodom. Ploče su blokirane pomoću 250ul od 1XPBS/1% mleka i inkubirane tokom najmanje 30 minuta na RT. Blok je ispran pomoću TiterTek 3 ciklusa ispiranja sa RO vodom. Zatim je zarobljen b-humani PCSK9 @ 2ug/ml u IXPBS/I% mleka/10mM Ca2+ (test razblaživač) 50ul/bazenčić i inkubiran tokom 1 sata na RT. Zatim je ispran pomoću TiterTek 3 ciklusa ispiranja sa RO vodom. Za primarno antitelo, serumi su titrirani 1:3 u duplikatu od 1:100. Ovo je izvedeno u test razblaživaču 50ul/bazenčić i inkubirano tokom 1 sata na RT. Zatim je obavljeno ispiranje pomoću TiterTek 3 ciklusa ispiranja sa RO vodom. Sekundarno antitelo je kozje anti humano IgG Fc HRP @ 400 ng/ml u test razblaživaču na 50ul/bazenčić. Inkubirano je tokom 1 sata na RT. Zatim je isprano pomoću TiterTek 3 ciklusa ispiranja sa RO vodom i osušeno na papirnim ubrusima. Za supstrat, jednofazni TMB rastvor (Neogen, Lexington, Kentucky) je upotrebljen (50ul/bazenčić) i ostavljen je da se razvija tokom 30 min na RT.

[0228] Protokoli praćeni u ELISA analizama su sledeći: Za uzorke koji obuhvataju b-PCSK9 bez V5His taga upotrebljen je sledeći protokol: ploče za vezivanje Costar 3368 podloge (Corning Life Sciences) su upotrebljene. Ploče su obložene neutravadinom na 8 µg/ml u 1XPBS/0,05% azida, (50 µ1/bazenčić). Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek M384 ispirača ploče (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Ploče su blokirane sa 250 µl od 1XPBS/1% mleka i inkubirane oko 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću M384 ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Zarobljavanje je bilo b-hu PCSK9, bez V5 taga, i dodato je na 2 µg/ml u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>(40 µ1/bazenčić). Ploče su zatim inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Serumi su titrirani 1:3 u duplikatu od 1:100, a red H je bio prazan za serume. Titracija je izvedena u test razblaživaču, u zapremini od 50 µl/bazenčić. Ploče su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Zatim je izvedeno ispiranje u 3 ciklusa. Kozje anti

1

humano IgG Fc HRP na 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>(50 µ1/bazenčić) je dodato na ploču i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su još jednom isprane pomoću 3 ciklusa ispiranja. Ploče su zatim osušene papirnim ubrusom. Na kraju, jednofazni TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 µl/bazenčić) je dodat na ploču i ugašen pomoću IN hlorovodonične kiseline (50 µ1/bazenčić) posle 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm pomoću Titertek čitača ploče.

[0229] Pozitivne kontrole za detekciju PCSK9 vezanog za ploču su bile rastvorljivi LDL receptor (R&D Systems, Cat #2148LD/CF) i poliklonalno zečje anti-PCSK9 antitelo (Caymen Chemical #10007185) titrirano 1:3 u duplikatu od 3 µg/ml u test razblaživaču. LDLR je detektovan pomoću kozjeg anti LDLR (R&D Systems, Cat #AF2148) i zečjeg antikozjeg IgGFc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml; zečje poliklonalno antitelo je detektovano pomoću kozjeg antizečjeg IgG Fc u koncentraciji od 400 ng/ml u test razblaživaču. Negativna kontrola su bili naivni XMG2-KL i XMG4-KL serumi titrirani na 1:3 u duplikatu od 1:100 u test razblaživaču.

[0230] Za uzorke koji obuhvataju b-PCSK9 sa V5His tagom upotrebljen je sledeći protokol: ploče za vezivanje Costar 3368 podloge (Corning Life Sciences) su upotrebljene. Ploče su obložene neutravadinom na 8 µg/ml u 1XPBS/0,05% azida, (50 µ1/bazenčić). Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek M384 ispirača ploče (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Ploče su blokirane sa 250 µl od 1XPBS/1% mleka i inkubirane oko 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću M384 ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Zarobljavanje je izvedeno b-hu PCSK9, sa V5 tagom, i dodato je na 2 µg/ml u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>(40 µl/bazenčić). Ploče su zatim inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Serumi su titrirani 1:3 u duplikatu od 1:100, a red H je bio prazan za serume. Titracija je izvedena u test razblaživaču, u zapremini od 50 µl/bazenčić. Ploče su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Zatim, ploče su isprane pomoću M384 ispirača ploče koji radi pomoću ispiranja u 3 ciklusa. Kozje antihumano IgG Fc HRP na 400 ng/ml u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>je dodato u 50 µl/bazenčić na ploči, a ploča je inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su još jednom isprane, pomoću ispiranja u 3 ciklusa. Ploče su zatim osušene papirnim ubrusom. Na kraju, jednofazni TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) (50 µ1/bazenčić) je dodat na ploču, a ploča je ugašena pomoću IN hlorovodonične kiseline (50 µ1/bazenčić) posle 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm pomoću Titertek čitača ploče.

[0231] Pozitivna kontrola je bio LDLR, zečji anti-PCSK9 titriran 1:3 u duplikatu od 3 µg/ml u test razblaživaču. LDLR je detektovan sa kozjim anti-LDLR (R&D Systems, Cat #AF2148) i zečjim antikozjim IgG Fc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml; zečje poli detektovano sa kozjim antizečjim IgG Fc u koncentraciji od 400 ng/ml u test razblaživaču. Humano anti-His 1.2,3 i anti-V51.7.1 titrirano 1:3 u

2

duplikatu od 1 µg/ml u test razblaživaču; oba su detektovana sa kozjim anti-humanim IgG Fc HRP u koncentraciji od 400 ng/ml u test razblaživaču. Negativna kontrola su bili naivni XMG2-KL i XMG4-KL serumi titrirani 1:3 u duplikatu od 1:100 u test razblaživaču.

[0232] Titeri antitela u odnosu na humani PCSK9 su testirani ELISA testom za miševe imunizovane pomoću rastvorljivog antigena prema opisu. Tabela 4 sažima ELISA podatke i pokazuje da je bilo nekih miševa za koje se čini da su specifični za PCSK9. Pogledati, npr., tabelu 4. Stoga, na kraju programa imunizacije, 10 miševa (podebljano u tabeli 4) je odabrano za sakupljanje, a splenociti i limfociti su izolovani iz slezina i limfnih čvorova redom, kako je ovde opisano.

TABELA 4

PRIMER 2

Dobijanje limfocita, izolacija B-ćelija, fuzija i generisanje hibridoma

[0233] Ovaj primer opisuje kako su dobijene imune ćelije i kako su generisani hibridomi. Odabrani imunizovani miševi su žrtvovani cervikalnom dislokacijom, a drenažni limfni čvorovi su sakupljeni i grupisani iz svake kohorte. B ćelije su izdvojene iz limfnog tkiva brušenjem u DMEM radi oslobađanja ćelija iz tkiva, a ćelije su suspendovane u DMEM. Ćelije su izbrojane, a 0,9 ml DMEM po 100 miliona limfocita je dodato u pelet ćelije radi lagane, ali potpune resuspenzije ćelija.

[0234] Limfociti su pomešani sa nesekretornim ćelijama mijeloma P3X63Ag8.653 nabavljenim od ATCC, cat.# CRL 1580 (Kearney et al., (1979) J. Immunol.123, 1548-1550) u odnosu 1:4. Kompozicija ćelija je lagano peletovana centrifugiranjem na 400 x g 4 min. Posle presipanja supernatanta, ćelije su lagano mešane pomoću 1 ml pipete. Prethodno zagrejani PEG/DMSO rastvor od Sigma (cat# P7306) (1 ml po milion B-ćelija) je lagano dodat uz blago mešanje više od 1 min, posle čega sledi 1 min mešanja.

Prethodno zagrejani IDMEM (2 ml po milion B ćelija) (DMEM bez glutamina, L-glutamina, pen/strep, MEM neesencijalnih aminokiselina (sve od Invitrogen) je zatim dodavan više od 2 minuta uz lagano mešanje. Na kraju, prethodno zagrejani IDMEM (8 ml po 10<6>B-ćelija) je dodavan preko 3 minuta.

[0235] Fuzionisane ćelije su obrtane 400 x g 6 min i resuspendovane u 20 ml selekcione podloge (DMEM (Invitrogen), 15 % FBS (Hyclone), dopunjene L-glutaminom, pen/strep, MEM neesencijalnim aminokiselinama, natrijumpiruvatom, 2-merkaptoetanolom (sve od Invitrogen), HA-azaserin hipoksantinom i OPI (oksaloacetat, piruvat, goveđi insulin) (oba od Sigma) i IL-6 (Boehringer Mannheim)) po milion B-ćelija. Ćelije su inkubirane tokom 20-30 min na 37C, a zatim resuspendovane u 200 ml selekcione podloge i kultivisane tokom 3-4 dana u T175 flasku pre zasađivanja u 96 bazenčića. Stoga, hibridomi koji su proizveli proteine za vezivanje antigena za PCSK9 su proizvedeni.

PRIMER 3

Odabir PCSK9 antitela

4

[0236] Ovaj primer opisuje kako su različiti PCSK9 proteini za vezivanje antigena karakterisani i odabrani. Vezivanje sekretovanih antitela (proizvedenih od hibridoma proizvedenih u Primerima 1 i 2) za PCSK9 je procenjeno. Odabir antitela je zasnovan na podacima o vezivanju i inhibiciji vezivanja PCSK9 za LDLR i afinitetu. Vezivanje za rastvorljivi PCSK9 je analizirano pomoću ELISA, kako je opisano u nastavku.

BIAcore® (rezonancija površinskog plazmona) je upotrebljena za kvantifikovanje afiniteta vezivanja.

Primarni skrining

[0237] Primarni skrining za antitela koja se vezuju za divlji tip PCSK9 je izveden. Primarni skrining je izveden prilikom dva sakupljanja. Primarni skrining je obuhvatao ELISA analizu i izveden je pomoću sledećeg protokola: ploče za vezivanje Costar 3702 podloge sa 384 bazenčića (Corning Life Sciences) su upotrebljene. Ploče su obložene neutravadinom u koncentraciji od 4 µl/ml u 1XPBS/0,05% azida, u zapremini od 40 µl/bazenčić. Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1% mleka i inkubirane oko 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane.

Ponovo, izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Uzorak zarobljavanja je biotinilisan PCSK9, bez V5 taga, i dodat je na 0,9 µg/ml u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 µl/bazenčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Zatim, ploče su isprane pomoću Titertek ispirača ploča ispiranjem u 3 ciklusa.10 µl supernatanta je preneto u 40 µl od 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>i inkubirano 1,5 sati na sobnoj temperaturi. Ponovo, ploče su isprane pomoću Titertek ispirača ploče ispiranjem u 3 ciklusa.

40 µl/bazenčić kozjeg anti-humanog IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>je dodato na ploču i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su još jednom isprane u 3 ciklusa ispiranja. Na kraju, 40 µl/bazenčić jednofaznog TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodato na ploču, a ugašenje sa 40 µl/bazenčić IN hlorovodoničnom kiselinom je izvedeno posle 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm pomoću Titertek čitača ploče.

[0238] Primarni skrining je rezultovao identifikacijom ukupno 3104 hibridoma specifičnih za antigen iz dva sakupljanja. Na osnovu najvišeg ELISA OD, 1500 hibridoma po sakupljanju je izvedeno za ukupno 3000 pozitiva.

Potvrdni skrining

[0239] 3000 pozitiva je zatim reskriningovano za vezivanje za divlji tip PCSK9 kako bi se potvrdilo uspostavljanje stabilnih hibridoma. Skrining je izveden na sledeći način: ploče za vezivanje Costar 3702 podloge sa 384 ploče bazenčića (Corning Life Sciences) su upotrebljene. Ploče su obložene neutravadinom na 3 µg/ml u 1XPBS/0,05% azida u zapremini od 40 µl/bazenčić. Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1% mleka i inkubirane oko 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću M384 ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Uzorak zarobljavanja je bio b-PCSK9, bez V5 taga, i dodat je na 0,9 µg/ml u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 µl/bazenčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Zatim, ploče su isprane u 3 ciklusa.10 µl supernatanta je preneto u 40 µl od 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>i inkubirano tokom 1,5 sati na sobnoj temperaturi. Ponovo, ploče su isprane pomoću Titertek ispirača ploče u 3 ciklusa ispiranja.40 µl/bazenčić od kozjeg anti-humanog IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>je dodato na ploču, a ploča je inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su još jednom isprane pomoću Titertek ispirača ploče u 3 ciklusa ispiranja. Na kraju, 40 µl/bazenčić jednofaznog TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodato na ploču i ugašeno sa 40 µl/bazenčić IN hlorovodonične kiseline posle 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm pomoću Titertek čitača ploče. Ukupno 2441 pozitiv je ponovljen u drugom skriningu. Ova antitela su zatim upotrebljena u kasnijim skrininzima.

Skrining unakrsne reaktivnosti kod miševa

[0240] Ploča sa hibridomima je zatim skriningovana za unakrsnu reaktivnost sa mišjim PCSK9 kako bi se potvrdilo da antitela mogu da se vezuju i za humani i za mišji PCSK9. Sledeći protokol je upotrebljen u skriningu unakrsne reaktivnosti: ploče za vezivanje Costar 3702 podloge sa 384 ploče bazenčića (Corning Life Sciences) su upotrebljene. Ploče su obložene neutravadinom na 3 µg/ml u 1XPBS/0,05% azida u zapremini od 40 µl/bazenčić. Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1% mleka i inkubirane oko 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Uzorak zarobljavanja je biotinilisan mišji PCSK9, i dodat je na 1 µg/ml u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 µl/bazenčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Zatim, ploče su isprane pomoću Titertek ispirača ploče u 3 ciklusa.50 µl supernatanta je preneto na ploče i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane u 3 ciklusa ispiranja.40 µl/bazenčić kozjeg anti-humanog IgG Fc POD u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>je dodato na ploču i ploča je inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su još jednom isprane u 3 ciklusa. Na kraju, 40 µl/bazenčić jednofaznog TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodato na ploču i ugašeno sa 40 µl/bazenčić IN hlorovodonične kiseline posle 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm pomoću Titertek čitača ploče. Primećeno je da 579 antitela unakrsno reaguje sa mišjim PCSK9. Ova antitela su zatim upotrebljena u kasnijim skrininzima.

Skrining vezivanja mutantnog D374Y

[0241] Mutacija D374Y u PCSK9 je dokumentovana u ljudskoj populaciji (npr., Timms KM et al, "A mutation in PCSK9 causing autosomal-dominant hypercholesterolemy in a Utah pedigree", Hum. Genet.

114: 349-353, 2004). Kako bi se utvrdilo da li su antitela specifična za divlji tip ili se takođe vezuju za D374Y oblik od PCSK9, uzorci su skriningovani za vezivanje za sekvencu mutantnog PCSK9 koja obuhvata mutaciju D374Y. Protokol za skrining je sledeći: ploče za vezivanje Costar 3702 podloge sa 384 bazenčića (Corning Life Sciences) su upotrebljene u skriningu. Ploče su obložene neutravadinom na 4 µg/ml u 1XPBS/0,05% azida u zapremini od 40 µl/bazenčić. Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1% mleka i inkubirane oko 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Ploče su obložene biotinilisanim humanim PCSK9 D374Y u koncentraciji od 1 µg/ml u 1XPBS/1% mleka/10mMCa<2+>i inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Ispušteni supernatant kulture hibridoma je razblažen 1:5 u PBS/mleko/Ca<2+>(10 ml plus 40 ml) i inkubiran tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Zatim, 40 µl/bazenčić zečjeg anti-humanog PCSK9 (Cayman Chemical) i humanog anti-His 1.2.31:2 na 1ug/ml u 1XPBS/1% mleka/10mMCa<2+>je titrirano na ploče, koje su zatim inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa.40 µl/bazenčić kozjeg anti-humanog IgG Fc HRP u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>je dodato na ploču, a ploča je inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi.40 µl/bazenčić kozjeg anti-zečjeg IgG Fc HRP u koncentraciji od 100 ng/ml (1:4000) u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>je dodato na ploču, a ploča je inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Na kraju, 40 µl/bazenčić jednofaznog TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodato na ploču i ugašeno sa 40 µl/bazenčić IN hlorovodonične kiseline posle 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm pomoću Titertek čitača ploče. Preko 96% pozitivnih pogodaka na divljem tipu PCSK9 se takođe vezivalo za mutantni PCSK9.

Opsežni skrining blokiranja liganda receptora

[0242] Za skrining antitela koja blokiraju vezivanje PCSK9 za LDLR razvijena je analiza pomoću D374Y PCSK9 mutanta. Mutant je upotrebljen za ovu analizu zato što ima viši afinitet vezivanja za LDLR, što omogućava razvoj senzitivnije analize blokiranja liganda receptora. Sledeći protokol je upotrebljen u skriningu blokiranja liganda receptora: ploče za vezivanje Costar 3702 podloge sa 384 bazenčića (Corning Life Sciences) su upotrebljene u skriningu. Ploče su obložene kozjim anti-LDLR (R&D Cat #AF2148) na 2 µg/ml u 1XPBS/0,05% azida u zapremini od 40 µl/bazenčić. Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1% mleka i inkubirane oko 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Uzorak zarobljavanja je LDLR (R&D, Cat #2148LD/CF), i dodat je na 0,4 µg/ml u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 µl/bazenčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 sata i 10 minuta na sobnoj temperaturi. Istovremeno, 20 ng/ml biotinilisanog humanog D374Y PCSK9 je inkubirano sa 15 mikrolitara ispuštenog supernatanta hibridoma na Nunc predinkubirane tokom oko 1 sata i 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim, ploče su isprane pomoću Titertek ispirača ploče u 3 ciklusa ispiranja.50 µl/bazenčić predinkubirane kompozicije je preneto na LDLR-om obložene ELISA ploče i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Za detekciju LDLR-vezanog b-PCSK9, 40 µl/bazenčić streptavidin HRP na 500 ng/ml u test razblaživaču je dodato na ploče. Ploče su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su ponovo isprane pomoću Titertek ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Na kraju, 40 µl/bazenčić jednofaznog TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodat na ploču i ugašen sa 40 µl/bazenčić IN hlorovodonične kiseline posle 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm pomoću Titertek čitača ploče. Skrining je identifikovao 384 antitela koja su blokirala interakciju između PCSK9 i LDLR bazenčića, od čega je 100 antitela snažno blokiralo interakciju (OD < 0,3). Ova antitela su inhibirala interakciju vezivanja PCSK9 i LDLR više od 90% (više od 90% inhibicije).

Analiza vezivanja liganda receptora na podskupu blokera

[0243] Analiza liganda receptora je zatim ponovljena pomoću mutantnog enzima na podskupu neutralizatora od 384 člana identifikovana u prvoj opsežnoj analizi inhibicije liganda receptora. Isti protokol je primenjen u analizi podskupa blokera od 384 člana kao i u opsežnom skriningu blokiranja liganda receptora. Ovaj ponovljeni skrining je potvrdio početne podatke iz skrininga.

[0244] Ovaj skrining podskupa od 384 člana je identifikovao 85 antitela koja su blokirala interakciju između PCSK9 mutantnog enzima i LDLR za više od 90%.

Analiza vezivanja liganda receptora blokera koji se vezuju za divlji tip PCSK9, ali ne i za mutantni D374Y [0245] U početnoj ploči od 3000 supernatanata pokazalo se da se 86 antitela specifično vezuje za divlji tip PCSK9, a ne za mutantni huPCSK9(D374Y). Ovih 86 supernatanata je testirano za sposobnost blokiranja vezivanja divljeg tipa PCSK9 za LDLR receptor. Upotrebljen je sledeći protokol: ploče za vezivanje Costar 3702 podloge sa 384 bazenčića (Corning Life Sciences) su upotrebljene u skriningu. Ploče su obložene sa anti-His 1.2.3 na 10 µg/ml u 1XPBS/0,05% azida u zapremini od 40 µl/bazenčić.

Ploče su inkubirane na 4°C preko noći. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče (Titertek, Huntsville, AL). Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Ploče su blokirane sa 90 µl od 1XPBS/1% mleka i inkubirane oko 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. LDLR (R&D Systems, #2148LD/CF ili R&D Systems, #2148LD) je dodat na 5 µg/ml u 1XPBS/1% mleka/10mM Ca<2+>u zapremini od 40 µl/bazenčić. Ploče su zatim inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Zatim, ploče su isprane pomoću Titertek ispirača ploča u 3 ciklusa.

Istovremeno, biotinilisani humani divlji tip PCSK9 je predinkubiran sa ispuštenim supernatantom hibridoma u Nunc polipropilenskim pločama.22 µl supernatanta hibridoma je preneto u 33ul od b-PCSK9 u koncentraciji od 583 ng/ml u 1XPBS/1% mleko/10mMCa2+, što je dalo krajnju b-PCSK9 koncentraciju = 350 ng/ml i ispušteni supernatant u krajnjem rastvoru od 1:2.5. Ploče su predinkubirane tokom oko 1 sata i 30 minuta na sobnoj temperaturi.50 µl/bazenčić predinkubirane kompozicije je preneto na LDLR zarobljene ELISA ploče i inkubirano tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa.40 µl/bazenčić streptavidina HRP u 500 ng/ml u test razblaživaču je dodato na ploče. Ploče su inkubirane tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su zatim isprane pomoću Titertek ispirača ploče. Izvedeno je ispiranje u 3 ciklusa. Na kraju, 40 µl/bazenčić jendofaznog TMB (Neogen, Lexington, Kentucky) je dodato na ploču i ugašeno sa 40 µl/bazenčić IN hlorovodonične kiseline posle 30 minuta na sobnoj temperaturi. OD-ovi su odmah očitani na 450 nm pomoću Titertek čitača ploče.

Rezultati skrininga

[0246] Na osnovu rezultata opisanih analiza, identifikovano je nekoliko linija hibridoma koje proizvode antitela sa željenim interakcijama sa PCSK9. Ograničavajući rastvor je upotrebljen za izolovanje upravljivog broja klonova sa svake linije. Klonovi su označeni po broju linije hibridoma (npr.21B12) i broju klona (npr.21B12.1). Generalno, u ovde opisanim funkcionalnim analizama nije detektovana nikakva razlika između različitih klonova određene linije. U nekoliko slučajeva, identifikovani su klonovi sa određene linije koji su se drugačije ponašali u funkcionalnim analizama, na primer, utvrđeno je da 25A7.1 ne blokira PCSK9/LDLR, ali je 25A7.3 (ovde se navodi kao 25A7) neutralizujući. Svaki izolovani klon je proširen u 50-100 ml podloge hibridoma i ostavljen da raste do ispuštanja, (tj., manje od oko 10% vijabilnosti ćelije). Koncentracija i potentnost antitela za PCSK9 u supernatantima ovih kultura su utvrđeni pomoću ELISA i pomoću in vitro funkcionalnog testiranja, kako je ovde opisano. Kao rezultat ovde opisanog skrininga, hibridomi sa najvišim titrom antitela za PCSK9 su identifikovani. Odabrani hibridomi su prikazani na FIG.2A-3D i u tabeli 2.

PRIMER 4.1

Proizvodnja humanih 31H4 IgG4 antitela iz hibridoma

[0247] Ovaj primer generalno opisuje kako je jedan od proteina za vezivanje antigena proizveden sa linije hibridoma. U proizvodnji je upotrebljeno 50ml generisanog ispuštenog supernatanta, posle čega je usledilo prečišćavanje proteina A. Proizvodnja Integra je proširena i izvedena je kasnije. Linija hibridoma 31H4 je uzgajana u T75 flaskovima u 20 ml podloge (Integra podloga, tabela 5). Kada je hibridom skoro uliven u T75 flaskove, prenet je u Integra flask (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).

[0248] Integra flask je flask za uzgajanje ćelija koji je podeljen pomoću membrane u dve komore, malu komoru i veliku komoru. Zapremina od 20-30 ml ćelija hibridoma u minimalnoj gustini ćelije od 1x10<6>ćelija po ml sa 31H4 linije hibridoma je postavljena u malu komoru Integra flaska na Integra podlozi (pogledati Tabelu 5 za komponente Integra podloge). Sama Integra podloga (1L) je postavljena u velike komore Integra flaskova. Membrana koja razdvaja ove dve komore je propustljiva za nutrijente male molekulske mase, ali je nepropustljiva za ćelije hibridoma i antitela koja te ćelije proizvode. Stoga, ćelije hibridoma i antitela koja proizvode ove ćelije hibridoma su zadržane u maloj komori.

[0249] Posle jedne nedelje, podloga je uklonjena iz obe komore Integra flaska i zamenjena je svežom Integra podlogom. Sakupljena podloga iz male komore je zasebno zadržana. Posle druge nedelje rasta, podloga iz male komore je ponovo sakupljena. Sakupljene podloge od nedelje 1 sa linije hibridoma je kombinovana sa sakupljenom podlogom iz nedelje 2 sa linije hibridoma. Rezultujući uzorak sakupljene podloge sa linije hibridoma je okrenut radi uklanjanja ćelija i ostataka (15 minuta na 3000rpm), a rezultujući supernatant je filtriran (0,22µm). Klarifikovana kondicionirana podloga je postavljena na kolonu Protein A-sefaroze. Opciono, podloge se prvo mogu koncentrovati, a zatim postaviti na kolonu Protein A sefaroze. Ne-specifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim PBS ispiranjem. Vezani proteini antitela na koloni Proteina A su dobijeni standardnom elucijom kiselog antitela iz kolona proteina A (kao što je 50 mM citrata, pH 3,0). Nakupljeni i proteini antitela u grupi protein A sefaroze su uklonjeni hromatografijom koja isključuje veličinu ili vezivanjem hromatografije izmene jona na smoli za izmenjivanje anjona p kao što je Q sefaroza smola. Specifični IEX uslovi za 31H4 proteine su Q-sefaroza HP na pH 7,8-8,0. Antitelo je eluirano sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapremina kolone.

TABELA 5

1

PRIMER 4.2

Proizvodnja rekombinantnog 31H4 humanog IgG2

Antitela iz transfektovanih ćelija

[0250] Ovaj primer prikazuje kako su 31H4 IgG2 antitela proizvedena iz transfektovanih ćelija.293 ćelije za prelaznu ekspresiju i CHO ćelije za stabilnu ekspresiju su transfektovane sa plazmidima koji kodiraju 31H4 teške i lake lance. Kondicionirana podloga iz transfektovanih ćelija je dobijena uklanjanjem ćelija i ćelijskih ostataka. Klarifikovana kondicionirana podloga je postavljena na kolonu protein A-sefaroze. Opciono, podloga se prvo može koncentrovati, a zatim postaviti na kolonu protein A sefaroze. Nespecifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim PBS ispiranjem. Vezani proteini antitela na koloni Proteina A su dobijeni standardnom elucijom kiselog antitela sa kolona proteina A (kao što je 50 mM citrata, pH 3,0). Nakupljeni proteini antitela u grupi Protein A sefaroze su uklonjeni hromatografijom koja isključuje veličinu ili vezivanjem hromatografije izmene jona na smoli za izmenjivanje anjona kao što je Q sefaroza smola. Specifični IEX uslovi za 31H4 proteine su Q-sefaroza HP na pH 7,8-8,0. Antitelo je eluirano sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapremina kolone.

PRIMER 5

Proizvodnja humanih 21B12 IgG4 antitela iz hibridoma

[0251] Ovaj primer prikazuje kako je antitelo 21B12 IgG4 proizvedeno iz hibridoma. Linija hibridoma 21B12 je uzgajana u T75 flaskovima na podlozi (Integra podloga, tabela 5). Kada su hibridomi skoro uliveni u T75 flaskove, preneti su u Integra flaskove (Integra Biosciences, Integra CL1000, cat# 90005).

[0252] Integra flask je flask za uzgajanje ćelija koji je podeljen pomoću membrane u dve komore, malu komoru i veliku komoru. Zapremina od 20-30 ml ćelija hibridoma u minimalnoj gustini ćelije od 1x10<6>ćelija po ml iz 31H4 linine hibridoma je postavljena u malu komoru Integra flaska na Integra podlozi (pogledati Tabelu 5 za komponente Integra podloge). Sama Integra podloga (1L) je postavljena u velike komore Integra flaskova. Membrana koja razdvaja ove dve komore je propustljiva za nutrijente male molekulske mase, ali je nepropustljiva za ćelije hibridoma i antitela koja proizvode te ćelije. Stoga, ćelije hibridoma i antitela koja proizvode te ćelije hibridoma su zadržane u maloj komori.

Posle jedne nedelje, podloga je uklonjena iz obe komore Integra flaska i zamenjena je sa svežom Integra podlogom. Sakupljena podloga iz male komore je zasebno zadržana. Posle druge nedelje rasta, podloga iz male komore je ponovo sakupljena. Sakupljena podloga iz nedelje 1 sa linije hibridoma je

1 1

kombinovana sa sakupljenom podlogom iz nedelje 2 sa linije hibridoma. Dobijeni uzorak sakupljene podloge sa linije hibridoma je okrenut radi uklanjanja ćelija i ostataka (15 minuta na 3000 rpm), a rezultujući supernatant je filtriran (0,22 µm). Klarifikovana kondicionirana podloga je postavljena na kolonu protein A sefaroze. Opciono, podloga je prvo koncentrovana, a zatim postavljena na kolonu Protein A sefaroze. Ne-specifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim PBS ispiranjem. Vezani proteini antitela na koloni Proteina A su dobijeni standardnom elucijom kiselog antitela iz kolona Proteina A (kao što je 50 mM citrata, pH 3,0). Nakupljeni proteini antitela u grupi Protein A sefaroze su uklonjeni hromatografijom koja isključuje veličinu ili vezivanjem hromatografije izmene jona na smoli za izmenjivanje anjona kao što je Q sefaroza smola. Specifični IEX uslovi za 21B12 proteine su Q-sefaroza HP na pH 7,8-8,0. Antitelo je eluirano sa NaCl gradijentom od 10 mM-500 mM u 25 zapremina kolone.

PRIMER 6

Proizvodnja humanih 21B12 IgG2 antitela

Iz transfektovanih ćelija

[0253] Ovaj primer prikazuje kako su 21B12 IgG2 antitela proizvedena iz transfektovanih ćelija. Ćelije (293 ćelije za prelaznu ekspresiju i CHO ćelije za stabilnu ekspresiju) su transfektovane sa plazmidima koji kodiraju 21B12 teške i lake lance. Kondicionirane podloge iz ćelija hibridoma su dobijene uklanjapjem ćelija i ćelijskih ostataka. Klarifikovane kondicionirane podloge su postavljene na kolonu Protein A-sefaroze. Opciono, podloge mogu prvo biti koncentrovane, a zatim postavljene na kolonu protein A sefaroze. Ne-specifična vezivanja su uklonjena ekstenzivnim PBS ispiranjem. Vezani proteini antitela na koloni proteina A su dobijeni standardnom elucijom kiselog antitela sa kolona proteina A (50 mM citrat, pH 3,0). Nakupljeni proteini antitela u grupi protein A sefaroze su uklonjeni hromatografijom koja isključuje veličinu ili vezivanjem hromatografije izmene jona na smoli za izmenjivanje katjona kao što je SP-sefaroza smola. Specifični IEX uslovi za 21B12 proteine su SP-sefaroza HP na pH 5,2. Antitela su eluirana sa 25 zapremina kolone pufera koje sadrže NaCl gradijent od 10 mM-500 mM u 20 mM puferu natrijumacetata.

PRIMER 7

Analiza sekvence teških i lakih lanaca antitela

[0254] Sekvence nukleinske kiseline i aminokiseline za lake i teške lance gore navedenih antitela su zatim utvrđene pomoću Sangerovog (didezoksi) nukleotidnog sekvenciranja. Sekvence aminokiseline su zatim dedukovane za sekvence nukleinske kiseline. Sekvence nukleinske kiseline za promenljive domene su prikazane na FIG.3E-3JJ.

1 2

[0255] cDNK sekvence za promenljive regione lambda lakog lanca 31H4, 21B12, i 16F12 su utvrđene i opisane kao SEQ ID NOs: 153, 95, i 105 redom.

[0256] cDNK sekvence za promenljive regione teškog lanca 31H4, 21B12, i 16F12 su utvrđene i opisane kao SEQ ID NOs: 152, 94, i 104 redom.

[0257] Konstantni region lambda lakog lanca (SEQ ID NO: 156), i IgG2 i IgG4 konstantni regioni teškog lanca (SEQ ID NOs: 154 i 155) su prikazani na FIG.3KK.

[0258] Polipeptidne sekvence predviđene sa svake od ovih cDNK sekvenci su utvrđene. Predviđene polipeptidne sekvence za promenljive regione lambda lakog lanca 31H4, 21B12, i 16F12 su predviđene i otkrivene kao SEQ ID NOs: 12, 23, i 35 redom, pri čemu su konstantni region lambda lakog lanca (SEQ ID NO: 156), promenljivi regioni teškog lanca 31H4, 21B12, i 16F12 su predviđeni i otkriveni kao (SEQ. ID NOs.67, 49, i 79 redom. IgG2 i IgG4 konstantni regioni teškog lanca (SEQ ID NOs: 154 i 155).

[0259] FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 podele su prikazane na FIG 2A-3D.

[0260] Na osnovu podataka o sekvenci, utvrđeni su geni germinativnih ćelija iz kojih je izveden svaki teški lanac ili promenljivi region lakog lanca. Identičnost gena germinativnih ćelija je naznačena pored odgovarajuće linije hibridoma na FIG.2A-3D i svaki je predstavljen jedinstvenim SEQ ID NO. FIG.2A-3D takođe prikazuju utvrđene sekvence aminokiseline za dodatna antitela koja su karakterisana.

PRIMER 8

Karakterizacija vezivanja antitela za PCSK9

[0261] Posle identifikacije više antitela koja se vezuju za PCSK9, nekoliko pristupa je upotrebljeno za kvantifikaciju i dalju karakterizaciju prirode vezivanja. U jednom aspektu ispitivanja, izvedena je Biacore analiza afiniteta. U drugom aspektu ispitivanja izvedena je KinExA® analiza afiniteta. Uzorci i puferi upotrebljeni u ovim ispitivanjima su predstavljeni u tabeli 6 u nastavku.

TABELA 6

BIAcore® merenja afiniteta

1

[0262] BIAcore® (uređaj za rezonanciju površinskog plazmona, Biacore, Inc., Piscataway, NJ) analiza afiniteta 21B12 antitela za PCSK9 opisana u ovom Primeru je izvedena prema uputstvima proizvođača.

[0263] Ukratko, eksperimenti sa rezonancijom površinskog plazmona su izvedeni sa Biacore 2000 optičkim biosenzorima (Biacore, GE Healthcare, Piscataway, NJ). Svako pojedinačno anti-PCSK9 antitelo je imobilisano za CM5 čip biosenzora za istraživanje spajanjem amina na nivoima koji su pružili maksimalan odgovor na vezivanje analita (Rmax) od najviše 200 jedinica rezonancije (RU). Koncentracija PCSK9 proteina je promenjena u dvostrukim intervalima (analit) i ubrizgana na površini imobilisanog antitela (brzinom protoka od 100 µl/min tokom 1,5 minuta). Sveži HBS-P pufer (pH 7,4, 0,01 M Hepes, 0,15 M NaCl, 0,005% surfaktanta P-20, Biacore) dopunjen sa 0,01% BSA je upotrebljen kao pufer vezivanja. Afiniteti vezivanja svakog anti-PCSK9 antitela su izmereni u zasebnim eksperimentima u odnosu na svaki humani, mišji i PCSK9 protein makaki rakojeda u pH 7,4 (upotrebljene koncentracije su bile 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, i 0 nM).

[0264] Pored toga, afiniteti vezivanja antitela za humani PCSK9 su takođe izmereni na pH 6,0 sa pH 6,0 HBS-P puferom (pH 6,0, 0,01 M Hepes, 0,15 M NaCl, 0,005% surfaktanta P-20, Biacore) i dopunjeni sa 0,01% BSA. Dobijeni signal vezivanja je bio proporcionalan slobodnom PCSK9 u rastvoru. Konstanta ekvilibrijuma disocijacije (KD) je dobijena iz analize nelinearne regresije kompetitivnih kriva pomoću modela homogenog vezivanja dvostruke krive na jednom mestu (KinExA® softver, Sapidyne Instruments Inc., Boise, ID) (n=1 za 6,0 pH). Interesantno, izgleda da su antitela iskazala čvršći afinitet vezivanja na nižoj pH vrednosti (gde je Kd bila 12,5, 7,3, i 29 pM za 31H4, 21B12, i 16F12 redom).

[0265] Kinetički parametri vezivanja antitela uključujući ka(konstantu brzine asocijacije), kd(konstantu brzine disocijacije), i KD(konstantu ekvilibrijuma disocijacije) su utvrđeni pomoću BIA procene 3.1 kompjuterskog programa (BIAcore, Inc. Piscataway, NJ). Niže konstante ekvilibrijuma disocijacije označavaju veći afinitet antitela za PCSK9. KDvrednosti utvrđene pomoću BIAcore® analize afiniteta su predstavljene u tabeli 7.1 u nastavku.

TABELA 7.1

Tabela 7.2 prikazuje brzine koni koff.

TABELA 7.2

1 4

KinExA® merenja afiniteta

[0266] KinExA® (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, ID) analiza afiniteta 16F12 i 31H4 je izvedena prema uputstvima proizvođača. Ukratko, Reacti-Gel™ (6x) (Pierce) je prethodno obložen jednim od humanih, V5-označenih PCSK9 proteina makaki rakojeda ili His-označenih mišjih PCSK9 proteina i blokiran sa BSA.

10 ili 100 pM antitela 31H4 i jedan od PCSK9 proteina je zatim inkubiran sa različitim koncentracijama (0,1 pM - 25 nM) PCSK9 proteina na sobnoj temperaturi tokom 8 sati pre prolaska kroz perle obložene PCSK9. Količina perlama vezanog 31H4 je kvantifikovana pomoću fluorescentno (Cy5) obeleženih kozjih anti-humanih IgG (H+L) antitela (Jackson Immuno Research). Signal vezivanja je proporcionalan koncentraciji slobodnog 31H4 u ekvilibrijumu vezivanja. Konstanta ekvilibrijuma disocijacije (KD) je dobijena iz nelinearne regresije dva skupa kompetitivnih kriva pomoću modela homogenog vezivanja na jednom mestu. KinExA® Pro softver je upotrebljen u ovoj analizi. Krive vezivanja generisane u ovoj analizi su predstavljene kao FIG.4A-4F.

[0267] I 16F12 i 31H4 antitela su iskazala sličan afinitet za humani i PCSK9 makaki rakojeda, ali približno 10-250 puta niži afinitet za mišji PCSK9. Od ova dva antitela testirana pomoću KinExA® sistema, antitelo 31H4 je iskazalo viši afinitet za humani i PCSK9 makaki rakojeda sa 3 i 2 pM KD, redom.16F12 je iskazao malo slabiji afinitet na 15pM KDza humani PCSK9 i 16 pM KDza PCSK9 makaki rakojeda.

[0268] Rezultati KinExA® analize afiniteta su sažeti u tabeli 8.1 u nastavku.

TABELA 8.1

1

[0269] Pored toga, SDS PAGE je pokrenut radi provere kvaliteta i kvantiteta uzoraka i prikazan je na FIG.

5A. cPCSK9 je iskazao oko 50% manje na gelu, a takođe i iz koncentracije aktivnog vezivanja izračunate iz KinExA® analize. Stoga, KDod mAbs do cPCSK9 je prilagođen kao 50% aktivnog cPCSK9 u trenutku.

[0270] BIAcore analiza vezivanja ekvilibrijuma rastvora je upotrebljena za merenje Kd vrednosti za ABP 21B12.21B12.1 je iskazao mali signal upotrebom KinExA analize, stoga je primenjena biacore analiza vezivanja ekvilibrijuma rastvora. Pošto nikakvo značajnije vezivanje nije primećeno na vezivanju antitela za imobilizanu PCSK9 površinu, 21B12 antitelo je imobilisano na protoku ćelije 4 od CM5 čipa pomoću spajanja amina sa gustinom oko 7000 RU. Protok ćelije 3 je upotrebljen kao pozadinska kontrola.0,3, 1, i 3 nM humanog PCSK9 ili PCSK9 makaki rakojeda je pomešano sa serijskim razblaživanjima uzoraka 21B12.1 antitela (u opsegu od 0,001~25 nM) u PBS plus 0,1mg/ml BSA, 0,005% P20. Vezivanje slobodnog PCSK9 u mešanim rastvorima je izmereno ubrizgavanjem preko površine 21B12.1 antitela. 100% signal vezivanja PCSK9 na 21B12.1 površini je utvrđen u odsustvu mAb u rastvoru. Smanjeni odgovor vezivanja PCSK9 sa povećanim koncentracijama mAb označava vezivanje PCSK9 za mAb u rastvoru, čime je blokirano vezivanje PCSK9 za imobilisanu površinu peptitela. Prilikom postavljanja signala vezivanja PCSK9 naspram mAb koncentracija, KDje izračunata iz tri skupa kriva (0,3, 1 i 3nM fiksna koncentracija PCSK9) pomoću modela homogenog vezivanja na jednom mestu u KinExA Pro™ softveru. Iako cPCSK9 ima nižu koncentraciju proteina primećenu u KinExA analizi i SDS-gel, njegova koncentracija ovde nije prilagođena, pošto koncentracija cPCSK9 nije upotrebljena za izračunavanje KD. Rezultati su prikazani u tabeli 8.2 u nastavku i na FIG.5B-5D. FIG.5B prikazuje rezultate iz analize ekvilibrijuma rastvora u tri različite koncentracije hPCSK9 za hPCSK9. FIG.5C prikazuje sličan skup rezultata za mPCSK9. FIG.5D prikazuje rezultate iz gore navedene biacore analize zarobljavanja.

TABELA 8.2

PRIMER 9

Efikasnost 31H4 i 21B12 za blokiranje D374Y PCSK9/LDLR vezivanja

[0271] Ovaj primer obezbeđuje IC50 vrednosti za dva antitela u blokiranju sposobnosti D374Y PCSK9 da se vezuje za LDLR. Čiste ploče od 384 bazenčića (Costar) su obložene sa 2 mikrograma/ml kozjeg anti-LDL receptor antitela (R&D Systems) razblaženih u puferu A (100 mM natrijumkakodilat, pH 7,4). Ploče su temeljno isprane puferom A, a zatim blokirane tokom 2 sata puferom B (1% mleka u puferu A). Posle ispiranja, ploče su inkubirane tokom 1,5 sati sa 0,4 mikrograma/ml LDL receptora (R&D Systems)

1

razblaženog u puferu C (pufer B je dopunjen sa 10 mM CaCl2). Istovremeno sa ovom inkubacijom, 20 ng/ml biotinilisanog D374Y PCSK9 je inkubirano sa različitim koncentracijama 31H4 IgG2, 31H4 IgG4, 21B12 IgG2 ili 21B12 IgG4 antitela, koje je razblaženo u puferu A, ili samog pufera A (kontrola). Ploče koje sadrže LDL receptor su isprane, a biotinilisana kompozicija D374Y PCSK9/antitela je preneta do njih i inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Vezivanje biotinilisanog D374Y za LDL receptor je detektovano inkubacijom sa streptavidin-HRP (Biosource) na 500 ng/ml u puferu C, posle čega sledi TMB supstrat (KPL). Signal je prekinut sa IN HCl, a apsorbancija je očitana na 450 nm.

[0272] Rezultati ovog ispitivanja vezivanja su prikazani na FIG.6A-6D. Ukratko, IC50vrednosti su utvrđene za svako antitelo i utvrđeno je da iznose 199 pM za 31H4 IgG2 (FIG.6A), 156 pM za 31H4 IgG4 (FIG.6B), 170 pM za 21B12 IgG2 (FIG.6C), i 169 pM za 21B12 IgG4 (FIG.6D).

[0273] Antitela su takođe blokirala vezivanje divljeg tipa PCSK9 za LDLR u ovoj analizi.

PRIMER 10

Analiza ćelijske apsorpcije LDL

[0274] Ovaj primer demonstrira sposobnost različitih proteina za vezivanje antigena da smanjuju apsorpciju LDL od strane ćelija. Humane HepG2 ćelije su zasađene na crnim pločama čistog dna od 96 bazenčića (Costar) u koncentraciji od 5x10<5>ćelija po bazenčiću na DMEM podlozi (Mediatech, Inc) dopunjenih sa 10% FBS i inkubiranih na 37°C (5% CO2) preko noći. Za formiranje kompleksa PCSK9 i antitela, 2 µg/ml od D374Y humanog PCSK9 je inkubirano sa različitim koncentracijama antitela razblaženog u apsorpcionom puferu (DMEM sa 1% FBS) ili samog apsorpcionog pufera (kontrola) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja ćelija sa PBS, kompozicija D374Y PCSK9/antitelo je preneta u ćelije, posle čega sledi LDL-BODIPY (Invitrogen) razblažen u apsorpcionom puferu u krajnjoj koncentraciji od 6 µg/ml. Posle inkubacije tokom 3 sata na 37°C (5% CO2), ćelije su temeljno isprane sa PBS, a signal ćelijske fluorescentnosti je detektovan pomoću Safire™ (TECAN) na 480-520nm (ekscitacija) i 520-600nm (emisija).

[0275] Rezultati analize ćelijske apsorpcije su prikazani na FIG.7A-7D. Ukratko, IC50vrednosti su utvrđene za svako antitelo i ustanovljeno je da su 16,7 nM za 31H4 IgG2 (FIG.7A), 13,3 nM za 31H4 IgG4 (FIG.7B), 13,3 nM za 21B12 IgG2 (FIG.7C), i 18 nM za 21B12 IgG4 (FIG.7D). Ovi rezultati pokazuju da primenjeni proteini za vezivanje antigena mogu smanjiti dejstvo PCSK9 (D374Y) za blokiranje apsorpcije LDL od strane ćelija. Antitela su takođe blokirala dejstvo divljeg tipa PCSK9 u ovoj analizi.

PRIMER 11

Dejstvo snižavanja holesterola u serumu od strane 31H4 antitela u ispitivanju od 6 dana

1

[0276] Kako bi se procenilo snižavanje ukupnog holesterola u serumu (TC) kod divljeg tipa (WT) miševa preko terapije antitelom u odnosu na PCSK9 protein, izveden je sledeći postupak.

[0277] Mužjaci WT miševa (C57BL/6 soj, starosti 9-10 nedelja, 17-27 g) dobijeni iz Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) su hranjeni uobičajenom hranom (Harland-Teklad, Diet 2918) tokom trajanja ovog eksperimenta. Miševima je davano ili anti-PCSK9 antitelo 31H4 (2 mg/ml u PBS) ili kontrolno IgG (2 mg/ml u PBS) u nivou od 10mg/kg kroz venu mišjeg repa u T=0. Naivni miševi su takođe ostavljeni sa strane kao naivna kontrolna grupa. Dozne grupe i vreme žrtvovanja su prikazani u tabeli 9.

TABELA 9

[0278] Miševi su žrtvovani gušenjem sa CO2 u unapred utvrđenim vremenskim tačkama prikazanim u tabeli 9. Krv je sakupljena preko šuplje vene u pipete i ostavljena je da se zgruša na sobnoj temperaturi tokom 30 minuta. Uzorci su zatim okrenuti na gornjoj centrifugi na 12.000xg tokom 10 minuta radi razdvajanja seruma. Ukupan holesterol u serumu i HDL-C su izmereni pomoću Hitachi 912 kliničkog analizatora i Roche/Hitachi TC i HDL-C kompleta.

[0279] Rezultati eksperimenta su prikazani na FIG.8A-8D. Ukratko, miševi kojima je dato antitelo 31H4 su pokazali smanjene nivoe holesterola u serumu tokom eksperimenta (FIG.8A i FIG.8B). Pored toga, zabeleženo je da su miševi takođe pokazali smanjene nivoe HDL (FIG.8C i FIG.8D). Za FIG.8A i FIG.8C, promena procenta je u vezi sa kontrolnim IgG u istoj vremenskoj tački (*P<0,01, # P<0,05). Za FIG.8B i FIG 8D, promena procenta je u vezi sa ukupnim holesterolom u serumu i nivoima HDL izmerenim kod naivnih životinja u t=0 sati (*P<0,01, # P<0,05).

[0280] U pogledu sniženih nivoa HDL, napominjemo da će stručnjak iz ove oblasti shvatiti da smanjenje HDL kod miševa ne znači da će smanjenje HDL nastupiti kod ljudi i dalje reflektuje da je nivo holesterola u serumu u organizmu smanjen. Napominjemo da miševi transportuju većinu holesterola u serumu u

1

česticama lipoproteina visoke gustine (HDL), za razliku od ljudi koji nose veći deo holesterola u serumu na LDL česticama. Kod miševa, merenje ukupnog holesterola u serumu najviše podseća na nivo HDL-C u serumu. Mišji HDL sadrži apolipoprotein E (apoE) koji je ligand za LDL receptor (LDLR) i omogućava da ga očisti LDLR. Stoga, ispitivanje HDL je odgovarajući indikator za ovaj primer kod miševa (uz razumevanje da se smanjenje HDL ne očekuje kod ljudi). Na primer, humani HDL, nasuprot tome, ne sadrži apoE i nije ligand za LDLR. Pošto PCSK9 antitela povećavaju ekspresiju LDLR kod miševa, jetra može da očisti više HDL, a time i da snizi nivoe HDL-C u serumu.

PRIMER 12

Dejstvo antitela 31H4 na nivoe LDLR u ispitivanju od 6 dana

[0281] Ovaj primer pokazuje da protein za vezivanje antigena menja nivo LDLR u subjektu, prema predviđanjima, tokom vremena. Western blot analiza je izvedena kako bi se utvrdilo dejstvo antitela 31H4 na nivoe LDLR.50-100 mg tkiva jetre dobijenog od žrtvovanih miševa opisanih u primeru 13 je homogenizovano u 0,3 ml RIPA pufera (Santa Cruz Biotechnology Inc.) koji sadrži kompletni inhibitor proteaze (Roche). Homogenat je inkubiran na ledu tokom 30 minuta i centrifugiran za peletovanje ćelijskih odstataka. Koncentracija proteina u supernatantu je izmerena pomoću BioRad reagenasa za analizu proteina (BioRad laboratories).100µg proteina je denaturisano na 70°C tokom 10 minuta i razdvojeno na 4-12% Bis-Tris SDS gelu gradijenta (Invitrogen). Proteini su transfektovani na 0,45 µm PVDF membranu (Invitrogen) i blokirani u puferu za ispiranje (50mM Tris PH7.5, 150mM NaCL, 2mM CaCl2i 0,05% Tween 20) koji sadrži 5% nemasnog mleka tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Blot je zatim sondiran kozjim anti-mišjim LDLR antitelom (R&D sistem) 1:2000 ili anti-B aktinom (sigma) 1:2000 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Blot je kratko ispran i inkubiran goveđim anti-kozjim IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) 1:2000 ili kozjim anti-mišjim IgG-HRP (Upstate) 1:2000. Posle 1 sata inkubacije na sobnoj temperaturi, blot je temeljno ispran i imunoreaktivne trake su detektovane pomoću ECL plus kompleta (Amersham biosciences). Western blot je pokazao povećanje nivoa LDLR proteina u prisustvu antitela 31H4, kako je prikazano na FIG.9.

PRIMER 13

Dejstvo snižavanja holesterola u serumu od strane antitela 31H4 u ispitivanju od 13 dana

[0282] Kako bi se procenilo snižavanje ukupnog holesterola u serumu (TC) kod divljeg tipa (WT) miševa preko terapije antitelom u odnosu na PCSK9 protein u ispitivanju od 13 dana, izveden je sledeći postupak.

[0283] Mužjaci WT miševa (C57BL/6 soj, starosti 9-10 nedelja, 17-27 g) dobijeni iz Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) su hranjeni uobičajenom hranom (Harland-Teklad, Diet 2918) tokom ovog

1

eksperimenta. Miševima je davano ili anti-PCSK9 antitelo 31H4 (2 mg/ml u PBS) ili kontrolno IgG (2 mg/ml u PBS) na nivou od 10 mg/kg kroz venu mišjeg repa na T=0. Naivni miševi su takođe izdvojeni kao naivna kontrolna grupa.

[0284] Dozne grupe i vreme žrtvovanja su prikazani u tabeli 10. Životinje su žrtvovane, a jetre su ekstrahovane i pripremljene kao u primeru 13.

TABELA 10

[0285] Kada je eksperiment od 6 dana produžen na ispitivanje od 13 dana, isto dejstvo snižavanja holesterola u serumu primećeno u ispitivanju od 6 dana je takođe primećeno u ispitivanju od 13 dana. Konkretnije, životinje kojima je data doza na 10 mg/kg su pokazale 31% smanjenja holesterola u serumu 3. dana, koji se postepeno vratio na preddozne nivoe do 13. Dana. FIG.10A prikazuje rezultate ovog eksperimenta. FIG.10C prikazuje rezultate ponavljanja gore navedenog postupka sa 10mg/kg dozom 31H4, i sa drugim antitelom, 16F12, takođe na 10mg/kg. Dozne grupe i vreme žrtvovanja su prikazani u tabeli 11.

11

TABELA 11

[0286] Kako je prikazano na FIG.10C, i 16F12 i 31H4 su doveli do značajnog i suštinskog smanjenja ukupnog holesterola u serumu posle samo jedne doze i obezbedili su prednosti za više od jedne nedelje (10 dana ili više). Rezultati ponovljenog ispitivanja od 13 dana su bili u skladu sa rezultatima prvog ispitivanja od 13 dana, sa primećenim smanjenjem nivoa holesterola u serumu od 26% u danu 3. Za FIG.

10A i FIG.10B, procenat promene je u vezi sa kontrolnim IgG u istoj vremenskoj tački (*P<0,01). Za FIG.

10C, procenat promene je u vezi sa kontrolnim IgG u istoj vremenskoj tački (*P<0,05).

PRIMER 14

Dejstvo antitela 31H4 na nivoe HDL u ispitivanju od 13 dana

[0287] Nivoi HDL za životinje u primeru 15 su takođe ispitivani. Nivoi HDL su se smanjili kod miševa. Konkretnije, životinje kojima je davana doza od 10 mg/kg su pokazale povećanje nivoa HDL od 33% 3. dana, koji su se postepeno vratili na preddozne nivoe do 13. dana FIG.10B prikazuje rezultate eksperimenta. Bilo je prisutno smanjenje nivoa HDL od 34% 3. Dana. FIG.10B prikazuje rezultate ponovljenog eksperimenta od 13 dana.

[0288] Kao što će shvatiti stručnjak iz ove oblasti, dok će antitela sniziti mišji HDL, to se ne očekuje kod ljudi zbog razlika u HDL kod ljudi i drugih organizama (kao što su miševi). Stoga, smanjenje mišjeg HDL nije pokazatelj smanjenja humanog HDL.

PRIMER 15

Ponovljeno davanje antitela proizvodi kontinuirane prednosti peptida za vezivanje antigena

[0289] Radi provere da li se rezultati dobijeni u gore navedenim primerima mogu produžiti za dalje prednosti sa dodatnim dozama, eksperimenti u primerima 15 i 16 su ponovljeni sa doznim rasporedom prikazanim na FIG.11A. Rezultati su prikazani na FIG.11B. Kao što se može videti u grafikonu na FIG. 11B, dok su oba skupa miševa prikazala značajno smanjenje ukupnog holesterola u serumu zbog toga što su svi miševi primili početno ubrizgavanje 31H4 proteina za vezivanje antigena, miševi koji su primili dodatna ubrizgavanja 31H4 ABP su iskazali kontinuirano smanjenje ukupnog holesterola u serumu, dok su oni miševi koji su primili samo kontrolno ubrizgavanje na kraju iskazali povećanje ukupnog holesterola u serumu. Za FIG.11, procenat promene je u vezi sa naivnim životinjama u t=0 sati (*P<0,01, **P<0,001).

[0290] Rezultati iz ovog primera pokazuju da, za razliku od drugih postupaka lečenja holesterola, kod kojih ponovljene primene dovode do smanjenja efikasnosti zbog bioloških prilagođavanja subjekta, ovaj pristup se izgleda ne susreće sa ovim problemima tokom ispitanog vremenskog perioda. Dalje, ovo ukazuje da povratak ukupnog holesterola u serumu ili nivoa HDL holesterola na osnovnu liniju primećen u prethodnim primerima ne nastupa zbog toga što subjekat razvija nekakvu otpornost na lečenje koje se razvija, već zbog smanjene dostupnosti antitela kod subjekta.

PRIMER 16

Upotrebe PCSK9 antitela za lečenje poremećaja povezanih sa holesterolom

Poremećaji povezani sa holesterolom

[0291] Ljudskom pacijentu koji ispoljava poremećaj povezan sa holesterolom (kod kojeg smanjenje holesterola (kao što je holesterol u serumu) može biti korisno) se daje terapijski efektivna količina PCSK9 antitela, 31H4 (ili, na primer, 21B12). Tokom lečenja, pacijent se periodično prati kako bi se utvrdilo da li su se simptomi poremećaja povukli. Posle lečenja, utvrđeno je da su kod pacijenata podvrgnutih lečenju PCSK9 antitelom smanjeni nivoi holesterola u serumu, u poređenju sa pacijentima koji nisu lečeni.

PRIMER 17

Upotrebe PCSK9 antitela za lečenje hiperholesterolemije

[0292] Ljudskom pacijentu koji iskazuje simptome hiperholesterolemije se daje terapijski efektivna količina PCSK9 antitela, kao što je 31H4 (ili, na primer, 21B12). Tokom lečenja humani pacijent se periodično prati kako bi se utvrdilo da li je nivo holesterola u serumu opao. Posle lečenja, utvrđeno je da su kod pacijenta koji prima lečenje PCSK9 antitelima smanjeni nivoi holesterola u serumu u poređenju sa pacijentima obolelim od artritisa koji se ne leče.

PRIMER 18

Upotrebe PCSK9 antitela za prevenciju koronarne bolesti srca i/ili rekurentnih kardiovaskularnih događaja

Koronarna bolest srca i/ili ponavljani kardiovaskularni događaji

[0293] Identifikovan je humani pacijent pod rizikom od razvoja koronarne bolesti srca. Pacijentu se daje terapijski efektivna količina PCSK9 antitela, kao što je 31H4 (ili, na primer, 21B12), bilo samostalno, istovremeno ili posle statina, npr., simvastatina. Tokom lečenja humani pacijent se periodično prati kako bi se utvrdilo da li se ukupan nivo holesterola u serumu menja. Tokom preventivnog lečenja, utvrđeno je da je kod pacijenta koji prima lečenje PCSK9 antitelima smanjem holesterol u serumu, čime je smanjen rizik od koronarnih bolesti srca ili rekurentnih kardiovaskularnih događaja u poređenju sa pacijentima koji se ne leče.

PRIMER 19

Upotreba PCSK9 proteina za vezivanje antigena za prevenciju hiperholesterolemije

Sprečavanje hiperholesterolemije

[0294] Humani pacijent kod kojeg je prisutan rizik od razvoja hiperholesterolemije je identifikovan preko analize porodične istorije i/ili načina života, i/ili trenutnih nivoa holesterola. Subjektu se redovno daje (npr., jednom nedeljno) terapijski efektivna količina PCSK9 antitela, 31H4 (ili, na primer, 21B12). Tokom lečenja pacijent se periodično prati kako bi se utvrdilo da li su se nivoi holesterola u serumu smanjili. Posle lečenja, utvrđeno je da su kod subjekata podvrgnutih preventivnom lečenju PCSK9 antitelom sniženi nivoi holesterola u serumu, u poređenju sa subjektima koji se ne leče.

PRIMER 20

11

Faza 1, randomizovano, dvostruko slepo, placebo kontrolisano, rastuće jednodozno ispitivanje za procenu bezbednosti, tolerabilnosti, farmakokineze i farmakodinamike humanog anti-PCSK9 antitela kod zdravih subjekata

[0295] Ovo ispitivanje je bilo randomizovano, dvostruko slepo, placebo kontrolisano, rastuće jednodozno ispitivanje za procenu bezbednosti, tolerabilnosti, PK, farmakodinamike (PD) (LDL-C), i imunogeničnosti humanog anti-PCSK9 antitela (monoklonalno antitelo 21B12) kod zdravih subjekata. Subjekti su randomizovani u odnosu 3:1 (21B12:placebo; 8 subjekata po kohorti doze za ukupno 56 subjekata u 7 kohorti) kako bi primili 21B12 u dozama od 7, 21, 70, 210, ili 420 mg SC, ili odgovarajući placebo; ili 21B12 u dozama od 21 ili 420 mg IV, ili odgovarajući placebo.

[0296] Pedeset šest subjekata je randomizovano i primilo je proizvod koji se ispituje (4221B12, 14 placebo); 40 subjekata (3021B12, 10 placebo) je primilo proizvod koji se ispituje SC putem davanja, i 16 subjekata (1221B12, 4 placebo) je primilo proizvod koji se ispituje IV putem. Pedeset tri od 56 subjekata (95%) koji su primili proizvod koji se ispituje je završilo ispitivanje. Tri subjekta koja su primila 21B12 su povukla puni pristanak i nisu završila ispitivanje.

[0297] Populacija koja je ispitivana se primarno sastojala od muškaraca (54 [96%]) i imala je srednju starost od 31,2 (opseg: 20 do 45) godina. Osamdeset šest procenata subjekata su bili belci, a posle njih sledi 9% Hispano/Latinoamerikanaca, 4% crnaca i 1% ostalih. Srednje osnovne linije LDL-C su bile slične između grupa lečenja i bile su u opsegu od 113 do 143 mg/dL.

[0298] U ovom ispitivanju, 21B12 je smanjio LDL-C u proseku za 55% do 60% u jednoj dozi ≥ 70 mg SC, pri čemu je trajanje dejstva dozno zavisno. Najniža tačka LDL-C je primećena u roku od 2 nedelje od doziranja. Potpuna supresija PCSK9 je primećena u jednoj dozi ≥ 70 mg SC, što je bilo u dobroj korelaciji sa dejstvima primećenim na cirkulišućem LDL-C.

[0299] PK analize su pokazale da je 21B12 ispoljio nelinearnu (zavisnu od koncentracije) eliminaciju. Srednji tmaxje bio u opsegu od 4 do 6 dana. Prema očekivanju, najviša srednja maksimalna primećena koncentracija (Cmax) i površina pod krivom koncentracije i vremena od vremena 0 do beskonačnosti (AUC0-inf) se javila u grupi IV koja je primala 420 mg i iznosila je 139 µg/mL i 1550 dnevno•µg/mL, redom.

[0300] Negativni događaji koji su nastupili tokom lečenja su prijavljeni za 29 od 42 subjekta (69%) koji su primili 21B12 u bilo kojoj dozi, i za 10 od 14 subjekata (71%) koji su primili placebo. Nikakva veza nije bila očigledna između incidence negativnih događaja kod subjekta i doze 21B12, ili između incidence negativnih događaja kod subjekta i puta davanja 21B12 (SC naspram IV).

[0301] Nijedan negativan događaj nije prijavljen kao ozbiljan, i nijedan subjekat nije prekinuo ispitivanje zbog negativnog događaja. Nije bilo smrtnih slučajeva tokom ispitivanja.

[0302] Negativni događaji povezani sa lečenjem su prijavljeni za 18 od 42 subjekta (43%) koji su primili 21B12 i za 10 od 14 subjekata (71%) koji su primili placebo. Nikakva veza nije bila očigledna između incidence negativnih događaja povezanih sa lečenjem kod subjekata i doze 21B12, ili između incidence negativnih događaja povezanih sa lečenjem kod subjekata i puta davanja 21B12 (SC naspram IV).

[0303] Nije bilo trendova koji pokazuju klinički važna dejstva 21B12 na odabrane laboratorijske varijable, elektrokardiograme (EKG), ili vitalne znakove.

[0304] U ovom ispitivanju, izgleda da je 21B12 dobro tolerisana u jednoj SC i IV dozi do 420 mg.

[0305] Uzorci seruma subjekata prijavljenih u ovom ispitivanju su testirani za prisustvo (osnovna linija) ili razvoj (posle lečenja) anti-21B12 antitela. Uzorci sva 42 subjekta koja su primila 21B12 su bili negativni za anti-21B12 antitela.

PRIMER 21

Faza 1 randomizovano, dvostruko slepo, placebo kontrolisano, rastuće višedozno ispitivanje za procenu bezbednosti, tolerabilnosti, farmakokineze i farmakodinamike humanog anti-PCSK9 antitela kod subjekata sa hiperlipidemijom na stabilnim dozama statina

[0306] Ovo ispitivanje je u fazi 1b, randomizovano, dvostruko slepo, placebo kontrolisano, rastuće, višedozno ispitivanje koje koristi humano anti-PCSK9 antitelo (monoklonalno antitelo 21B12) kod hiperlipidemičnih (npr., hiperholesterolemičnih) subjekata koji su trenutno na stabilnim dozama statina. Ispitivanje je imalo sedam kohorti. Predmeti za sve kohorte su uključivali karakterizaciju bezbednosti, tolerabilnosti, i imunogeničnosti 21B12, i karakterizaciju PK i PD (LDL-C i PCSK9). Kohorte 1 do 5 ovog ispitivanja su predstavljale deo dozne eskalacije 21B12, kod hiperholesterolemičnih subjekata na stabilnim niskim do umerenim dozama statina. Subjekti u kohortama 1 do 5 (n = 8 po kohorti) sa LDL-C (70-200 mg/dL) na stabilnoj dnevnoj dozi rosuvastatina <40 mg, atorvastatina <80 mg ili simvastatina 20-80 mg za ≥1 mesec su randomizovani u odnosu 3:1 za prijem 1 od 5 SC doza 21B12 (14 ili 35 mg QW 6 puta; ili 140 mg ili 280 mg Q2W 3 puta; ili 420 mg Q4W 2 puta) ili odgovarajućeg placeba, redom. Kohorta 6 je izvedena kod hiperholesterolemičnih subjekata na visokim dozama statina (atorvastatin 80 mg ili rosuvastatin 40 mg). Subjekti u ovoj kohorti (n=12) su bili ili na rosuvastatinu 40 mg ili atorvastatinu 80 mg i bili su randomizovani u odnosu 3:1 za prijem 21B12 (140 mg SC Q2W 3 puta) ili odgovarajućeg placeba, redom. Kohorta 7 je izvedena kod subjekata sa heterozigotnom porodičnom hiperholesterolemijom (identifikovani upotrebom WHO kriterijuma); subjekti u ovoj kohorti (n = 6) su randomizovani u odnosu 2:1 za prijem 21B12 (140 mg SC Q2W 3 puta) ili odgovarajućeg placeba, redom.

[0307] Preliminarni rezultati su dobijeni od 40 subjekata koji su prijavljeni i randomizovani na 21B12 ili placebu. Od ovih 40 subjekata, 28 subjekata je primilo ≥ 1 doze proizvoda koji se ispituje (21B12 ili placebo) i stoga je predstavljalo preliminarni skup za analizu bezbednosti (za slepo lečenje). Preliminarni slepi podaci o bezbednosti su bili dostupni za ovih 28 subjekata, od kojih su svi bili iz kohorti 1 do 4.

11

Nikakvi smrtni slučajevi, ozbiljni negativni događaji, ili rana povlačenja zbog negativnih događaja nisu prijavljeni. Ukupno, najmanje 1 negativni događaj je prijavljen za 15 od 28 subjekata (54%) koji su primili ≥ 1 doze proizvoda koji se ispituje. Najnegativniji događaji (za slepo lečenje) su prijavljeni za jedne subjekte, sa izuzetkom umora, artralgije, konstipacije i virusne infekcije gornjeg respiratornog trakta, od kojih je svaki prijavljen za 2 od 28 subjekata (7%).

[0308] Preliminarni farmakodinamički rezultati (za slepo lečenje) su bili dostupni za kohorte 1, 2, i 3. Dozno zavisno smanjenje 21B12 u cirkulišućem LDL-C je primećeno kod subjekata na stabilnim umerenim dozama statina. Najniža tačka LDL-C je primećena tokom 2 nedelje od početne doze i bila je u opsegu od 60% do 80% smanjenja u kohorti 3 (140 mg Q2W SC 3 puta). Gotovo potpuna supresija PCSK9 je primećena u kohorti 3, koja je dobro korelirala sa dejstvima primećenim na cirkulišućem LDL-C.

[0309] U krajnjim rezultatima, subjekti (N=51) u kohortama 1-6 su randomizovani za primanje 21B12 (N=39) ili placeba (N=12); 26 subjekata (51%) su bili muškarci; srednja (SD) starost je bila 58 (7) godina. Nikakvi smrtni slučajevi ili ozbiljni negativni događaji (AE-ovi) nisu prijavljeni i nijedan subjekat nije prekinuo ispitivanje zbog AE. Nikakva neutralizujuća antitela za 21B12 nisu detektovana.

[0310] Subjekti u kohortama 1-5 na niskim do umerenim dozama statina su imali srednja smanjenja LDL-C do 81% naspram placeba sa maksimalnim smanjenjem i 75% naspram placeba na kraju doznog intervala (tj., u nedelji 6) posle 3 dvonedeljne SC doze 21B12, i 66% na kraju doznog intervala (tj., u nedelji 8) posle 2, svake 4 nedelje SC doza. Subjekti u kohortama 1-5 na niskim do umerenim dozama statina su imali maksimalno smanjenje LDL-C do 81% naspram placeba sa maksimalnim smanjenjem i 75% naspram placeba na kraju doznog intervala (Fig.14). Jačina i trajanje dejstva su bili dozno zavisni. PCSK9 u plazmi je bio nedetektabilan u višim dozama. Slično tome, na kraju doznog intervala posle 3 dvonedeljne doze, subjekti na visokoj dozi statina (kohorta 6) su imali srednje smanjenje LDL-C od 63% naspram placeba, i maksimalno smanjenje LDL-C od 73% naspram placeba (Fig.15).

[0311] Ovi podaci pokazuju da su ponovljene SC doze 21B12 tokom 6 nedelja smanjile cirkulisanje LDL-C do 81% naspram placeba, u zavisnosti od doznog režima, kod subjekata na niskoj do umerenoj ili visokoj dozi statina, bez ozbiljnijih AE-ova. Dejstvo 21B12 na snižavanje LDL-C je bilo uporedivo između grupe sa visokom dozom statina i grupe sa niskom do umerenom dozom statina.

[0312] Subjekti u kohortama 1-5 na niskim do umerenim dozama statina su imali srednje smanjenje nivoa PCSK9 do 94% naspram placeba na kraju doznog intervala, a podaci nisu prikazani. Subjekti u kohortama 1-5 na niskim do umerenim dozama statina su imali srednja smanjenja ApoB do 54% naspram placeba na kraju doznog intervala, i maksimalna smanjenja do 59% naspram placeba (Fig.16). Pored toga, subjekti u kohortama 1-6 na niskim do umerenim i visokim dozama statina su imali srednja smanjenja Lp(a) do 43% naspram placeba na kraju doznog intervala (Fig.17).

11

[0313] Subjekti u kohorti 7 sa heFH su imali srednje smanjenje LDL-C od 65% naspram placeba na kraju doznog intervala (tj., nedelje 6, 2 nedelje posle treće dvonedeljne SC doze 21B12), i maksimalno smanjenje LDL-C od 70% naspram placeba (Fig.18). Smanjenja LDL-C tokom doznog intervala su bila uporediva sa onim primećenim kod subjekata bez heFH. Posle lečenja 21B12, cirkulišuće PCSK9 je bilo nedetektabilno kod heFH subjekata.

[0314] Subjekti u kohorti 7 sa heFH su imali srednje smanjenje vrednosti PCSK9 u serumu od 78% naspram placeba na kraju doznog intervala (tj., nedelje 6, 2 nedelje posle treće dvonedeljne SC doze 21B12) (Fig.19). Subjekti u kohorti 7 sa heFH su imali srednje smanjenje ukupnog holesterola do 42% naspram placeba na kraju doznog intervala (tj., nedelje 6, 2 nedelje posle treće dvonedeljne SC doze 21B12), i maksimalno smanjenje ukupnog holesterola od 47% naspram placeba (Fig.20). Subjekti u kohorti 7 sa heFH su imali srednje smanjenje ne-HDL holesterola od 61% naspram placeba na kraju doznog intervala (tj., nedelje 6, 2 nedelje posle treće dvonedeljne SC doze 21B12), i maksimalno smanjenje ne-HDL holesterola od 67% naspram placeba (Fig.21). Subjekti u kohorti 7 sa heFH su imali srednje smanjenje nivoa ApoB do 47% naspram placeba na kraju doznog intervala (tj., nedelje 6, 2 nedelje posle treće dvonedeljne SC doze 21B12), i maksimalno smanjenje ApoB od 57% naspram placeba (Fig.22). Subjekti u kohorti 7 sa heFH su imali srednje smanjenje lipoproteina a (Lp(a)) od 50% naspram placeba na kraju doznog intervala (tj., nedelje 6, 2 nedelje posle treće dvonedeljne SC doze 21B12) (Fig.23).

[0315] U kohorti 7, 21B12 je smanjio nivoe nevezanog PCSK9 i značajno snizio nivoe cirkulišućeg LDL-C kod subjekata sa heFH i hiperlipidemijom koji su primali standardnu terapiju. Testirana dvonedeljna doza je obezbedila smanjenja LDL-C kod heFH subjekata koja su bila uporediva sa onim kod ne-heFH subjekata. Nikakvi ozbiljniji AE-ovi nisu prijavljeni.

PRIMER 22

Dvostruko slepo, randomizovano, placebo kontrolisano ispitivanje za procenu tolerabilnosti i efikasnosti humanog anti-PCSK9 antitela kod pacijenata sa heterozigotnom porodičnom hiperholesterolemijom [0316] Cilj ovog ispitivanja jeste procena dejstva od 12 nedelja subkutanog (SC) humanog, anti-PCSK9 antitela (monoklonalno antitelo 21B12) u poređenju sa placebom, na procenat promene od osnovne linije holesterola u lipoproteinu niske gustine (LDL-C) kod subjekata sa heterozigotnom porodičnom hiperholesterolemijom (HeFH).

[0317] Ovo ispitivanje je dvostruko slepo, randomizovano, stratifikovano, placebo kontrolisano kliničko ispitivanje kojim se procenjuje bezbednost, tolerabilnost, i efikasnost monoklonalnog antitela 21B12 kod subjekata kojima je dijagnostikovana HeFH. Planirana je prijava ukupno 150 subjekata. Subjekti koji ispinjavaju sve kriterijume uključivanja/isključivanja biće randomizovani sa jednakom alokacijom u 3

11

grupe lečenja: monoklonalno antitelo, 21B12 na 350 mg ili 420 mg Q4W SC (svake 4 nedelje, subkutano) ili placebo Q4W SC. Randomizacija će biti stratifikovana po nivou skrininga LDL-C (< 130 mg/dL [3,4 mmol/L] naspram ≥ 130 mg/dL) i upotrebi ezetimiba na osnovnoj liniji (da naspram ne). Randomizacija treba da nastupi tokom 5 - 10 dana od procene skrininga LDL-C upotrebljene za utvrđivanje pogodnosti. Monoklonalno antitelo, 21B12, i placebo će biti slepi. Vizite tokom ispitivanja se sprovode u nedeljama 2, 4, 8, i 12. Krajnje davanje monoklonalnog antitela, 21B12, ili placeba je u nedelji 8. Vizita na kraju ispitivanja (EOS) i poslednja procena lipida je u nedelji 12.

[0318] Muškarci i žene, ≥ 18 do ≤ 75 godina starosti, i sa dijagnozom heterozigotne porodične hiperholesterolemije po dijagnostičkim kriterijumima Simon Broome Register Group (SBRG), su pogodni za ovo ispitivanje. Za prijavu, subjekti moraju uzimati odobren statin, sa stabilnom(im) dozom(ama) za sve dozvoljene (npr. ezetimib, smola za sekvestraciju žučne kiseline, stanoli, ili zakonski odobreni i reklamirani niacin (npr., Niaspan ili Niacor)) lekove za regulaciju lipida tokom najmanje 4 nedelje pre LDL-C skrininga i, po mišljenju ispitivača, koji ne zahtevaju postepeno povećanje doze. LDL-C na prazan stomak mora biti ≥ 100 mg/dL (2,6 mmol/L), a trigliceridi na prazan stomak ≤ 400 mg/dL (4,5 mmol/L) u centralnoj laboratoriji prilikom skrininga.

[0319] Preliminarni podaci (podaci nisu prikazani) su pokazali da subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju najmanje srednje kvadratno (LS) smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 38,46% na kraju doznog intervala, a subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 45,68%. Subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 21,69% na kraju doznog intervala, a subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 28,23%. Subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 15,39% na kraju doznog intervala, a subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 6,77%.

Subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 17,16% na kraju doznog intervala, a subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 18,49%. Subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 17,24% na kraju doznog intervala, a subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 4,56%. Subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ne-HDL holesterola od 36,16% na kraju doznog intervala, a subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ne-HDL holesterola od 41,81%. Na kraju, subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 24,82% na kraju doznog intervala, a subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 29,45%. (podaci nisu prikazani)

11

[0320] Fig.24 je grafikon koji predstavlja podatke o smanjenju LDL-C za sledeće doze 21B12: 70 mg, 105 mg i 140 mg (Q2W ili svake druge nedelje) i 280 mg, 350 mg i 420 (Q4W ili jednom mesečno). Ovi podaci su zbirni podaci iz ispitivanja opisanih u Primerima 22-25). Ukratko, zbirni podaci pokazuju da 140 mg Q2W rezultuje smanjenjem od oko 60% od osnovne linije u LDL-C u nedelji 12 i lakim održavanjem smanjenja LDL-C. Pored toga, ovi podaci pokazuju da 420 mg Q4W dovodi do smanjenja od oko 56% od osnovne linije u LDL-C u nedelji 12 i manjim povraćajem na kraju doznog intervala.

[0321] Fig.25A-25D su trakasti grafikoni koji prikazuju korisna dejstva doza 21B12 na Lp(a), HDL-C, trigliceride i VLDL-C, redom, izvedena iz zbirnih podataka iz ispitivanja opisanih u Primerima 22-25. Pored toga, dozno zavisna smanjenja od osnovne linije su primećena za ukupan holesterol (25-37%, p vrednosti <0,001), ne-HDL-C (36-53%, p vrednosti <0,001), i ApoB (36-53%, p vrednosti < 0,001) (podaci nisu prikazani).

PRIMER 23

Randomizovano ispitivanje za procenu tolerabilnosti i efikasnosti humanog anti-PCSK9 antitela na LDL-C u poređenju sa ezetimibom kod hiperholesterolemičnih pacijenata koji ne mogu da tolerišu efektivnu dozu HMG-Co-A inhibitora reduktaze

[0322] Predmet ovog ispitivanja jeste procena dejstva 12 nedelja subkutanog (SC) humanog, anti-PCSK9 antitela (monoklonalnog antitela 21B12) u poređenju sa ezetimibom, na procenat promene od osnovne linije holesterola u lipoproteinu niske gustine (LDL-C) kod hiperholesterolemičnih subjekata koji ne mogu da tolerišu efektivnu dozu HMG-CoA inhibitora reduktaze.

[0323] Ovo ispitivanje je randomizovano, stratifikovano, paralelno grupno kliničko ispitivanje za humano anti-PCSK9 antitelo, monoklonalno antitelo, 21B12. Planirana je prijava 150 subjekata. Subjekti koji ispunjavaju sve kriterijume uključivanja/isključivanja biće randomizovani sa jednakom alokacijom u 5 grupa lečenja: monoklonalno antitelo, 21B12 na 280 mg, 350 mg ili 420 mg Q4W SC (jednom svake 4 nedelje, subkutano); ezetimib na 10 mg dnevno (QD) oralno (PO) sa monoklonalnim antitelom, 21B12 na 420 mg Q4W SC; ili ezetimib 10 mg QD PO sa placebom Q4W SC. Randomizacija će biti stratifikovana skriningom nivoa LDL-C (< 130 mg/dL [3,4 mmol/L] naspram ≥ 130 mg/dL) i upotrebom statina na osnovnoj liniji (da naspram ne). Randomizacija treba da nastupi u roku od 5 -10 dana od procene skrininga LDL-C koja se koristi da utvrđivanje pogodnosti. Monoklonalno antitelo, 21B12, i placebo će biti slepi. Grupa koja prima ezetimib nije slepa. Vizite tokom ispitivanja se sprovode u nedeljama 2, 4, 8, i 12. Poslednje davanje monoklonalnog antitela, 21B12, ili placeba je u nedelji 8. Vizita na kraju ispitivanja i poslednja procena lipida je u nedelji 12.

[0324] Muškarci i žene, ≥ 18 do ≤ 75 godina starosti, su pogodni za ovo ispitivanje. Subjekat je morao da primi najmanje 1 statin i ne može da toleriše bilo kakvu dozu ili povećanje doze statina iznad sledećih

11

ukupnih nedeljnih maksimalnih doza zbog mialgije ili miopatije: atorvastatin ≤ 70 mg, simvastatin ≤ 140 mg, pravastatin ≤ 140 mg, rosuvastatin ≤ 35 mg, lovastatin ≤ 140 mg, fluvastatin ≤ 280 mg. Za nenavedene statine, maksimalna ukupna nedeljna doza ne treba da prelazi 7 puta najmanje dostupne veličine tablete. Simptomi se moraju povući kada se prekine davanje statina ili se smanji doza. Ako se prima statin (ne više od maksimalne doze gore definisane), smola za sekvestriranje žučne kiseline, i/ili stanol, doza(e) mora(ju) biti stabilna(e) tokom najmanje 4 nedelje pre skrininga LDL-C. Ako je subjekat na ezetimibu na početku skrininga, davanje ezetimiba se mora prekinuti tokom ≥ 4 nedelje pre skrininga LDL -C. U zavisnosti od kategorije rizika (na osnovu NCEP ATP III ciljeva lečenja) subjekti moraju ispuniti sledeće kriterijume za uzimanje LDL-C na prazan stomak (iz centralne laboratorije) tokom skrininga: ≥ 100 mg/dL (2,6 mmol/L) za subjekte sa dijagnostikovanom koronarnom bolešću srca (CHD) ili rizikom od ekvivalenta CHD; ≥ 130 mg/dL (3,4 mmol/L) za subjekte bez dijagnostikovane CHD ili rizika od ekvivalenta i 2 ili više faktora rizika; ≥ 160 mg/dL (4,1 mmol/L) za subjekte bez dijagnostikovane CHD ili rizika od ekvivalenta i sa 1 ili nijednim faktorom rizika. Trigliceridi na prazan stomak moraju biti ≤ 400 mg/dL (4,5 mmol/L) kako je utvrdila analiza centralne laboratorije prilikom skrininga.

[0325] Preliminarni podaci (podaci nisu prikazani) su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 38,79% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 40,01% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 50,63% Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 27,38% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 16,04% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 23,84%. Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 8,62% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 4,62% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 7,55%. Preliminarni podaci su pokazali su subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 31,02% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 38,14% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 37,27%. Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 15,35% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 19,22% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju

12

LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 19,55%. Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 31,03% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 34,46% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 42,23%. Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ne-HDL-C od 39,92% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ne-HDL-C od 42,86% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ne-HDL-C od 53,49%.

PRIMER 24

[0326] Randomizovano, placebo i ezetimibom kontrolisano ispitivanje u doznom opsegu za procenu tolerabilnosti i efikasnosti humanog anti-PCSK9 antitela na LDL-C kod hiperholesterolemičnih pacijenata sa 10-godišnjim Framingham skorom rizika od 10% ili manje Cilj ovog ispitivanja jeste procena dejstva tokom 12 nedelja subkutanog (SC) humanog, anti-PCSK9 antitela (monoklonalno antitelo 21B12) svake 2 nedelje (Q2W) ili svake 4 nedelje (Q4W), u poređenju sa placebom, na procenat promene od osnovne linije holesterola u lipoproteinu niske gustine (LDL-C) prilikom upotrebe kao monoterapija kod hiperholesterolemičnih subjekata sa 10-godišnjim Framingham skorom rizika od 10% ili manje.

[0327] Ovo ispitivanje je bilo randomizovano, stratifikovano, placebo i ezetimibom kontrolisano, paralelno grupno kliničko ispitivanje u doznom opsegu za humano anti-PCSK9 antitelo, monoklonalno antitelo, 21B12, sa prijavljenih 411 subjekata. Subjekti koji ispunjavaju sve kriterijume uključivanja/isključivanja su randomizovani sa jednakom alokacijom u 9 grupa lečenja: 1 od 6 doznih režima za monoklonalno antitelo, 21B12 (70 mg, 105 mg, ili 140 mg Q2W SC, ili 280 mg, 350 mg ili 420 mg Q4W SC (svake 4 nedelje, subkutano), placebo sa bilo Q2W ili Q4W SC davanjem, ili ezetimib sa dnevnim (QD) oralnim (PO) davanjem. Randomizacija je stratifikovana skriningom nivoa LDL-C (<130 mg/dL [3,4 mmol/L] naspram > 130 mg/dL). Randomizacija je nastupila u roku od 5 -10 dana od procene skrininga LDL-C koja se koristi za utvrđivanje pogodnosti. Vizite tokom ispitivanja su sprovođenje svake 2 nedelje, bez obzira na to da li subjekat prima lečenje Q2W SC ili Q4W ili ezetimibom.3 Q2W dozne grupe za monoklonalno antitelo, 21B12, i 1 Q2W placebo grupa su slepe jedna u odnosu na drugu, i 3 Q4W dozne grupe i 1 Q4W placebo grupa su slepe jedna u odnosu na drugu. Grupa koja prima ezetimib nije slepa. Vizita na kraju ispitivanja i poslednja procena lipida izvedene su u nedelji 12 za subjekte na Q4W IP rasporedu ili na ezetimibu i u nedelji 14 za subjekte na Q2W IP rasporedu.

[0328] Muškarci i žene, ≥ 18 do ≤ 75 godina starosti, su pogodni za ovo ispitivanje. LDL-C na prazan stomak je bio ≥ 100 mg/dL (2,6 mmol/L) i < 190 mg/dL (4,9 mmol/L), a trigliceridi na prazan stomak ≤ 400 mg/dL (4,5 mmol/L) u centralnoj laboratoriji prilikom skrininga. Subjekti su imali Framingham skor rizika od 10% ili manje prema National Holesterol Education Panel Adult Treatment Panel III (NCEP ATP III).

[0329] Primarna krajnja tačka je bio procenat promene od osnovne linije u LDL-C u nedelji 12.

Sekundarne krajnje tačke su uključivale procente promene u apolipoproteinu B (ApoB), lipoproteinu (a) (Lp(a)), i u odnosu ukupnog holesterola i lipoproteina visoke gustine (HDL)-C. Tolerabilnost i bezbednost su takođe procenjeni.

[0330] Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 70 mg 21B12 (Q2W) imaju srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 41,21% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 105 mg 21B12 (Q2W) imaju srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 45,44% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 140 mg 21B12 (Q2W) imaju srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 51,56% (podaci nisu prikazani).

[0331] Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 (Q4W) imaju srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 37,53% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 42,16% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 47,52% (podaci nisu prikazani).

[0332] Krajnji podaci su pokazali da u nedelji 12 subjekti koji primaju 21B12 imaju najmanje srednje kvadratno (LS) smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C do 51% (tabela 12); procenat promene od osnovne linije za ezetimib je bio 14%. Promena od osnovne linije do nedelje 12 je bila do 72 mg/dL veća sa 21B12 nego sa placebom. Subjekti koji primaju 21B12 imali su LDL-C smanjenje od osnovne linije 37%- 53% više od placeba i 37% više od ezetimiba. Srednja smanjenja od osnovne linije za ApoB (do 44%), Lp(a) (do 29%) i odnosa ukupnog holesterola/HDL (do 38%) su bila veća sa 21B12 nego sa placebom.

TABELA 12:

PRIMER 25

Dvostruko slepo, randomizovano, placebo kontrolisano ispitivanje u doznom opsegu za procenu tolerabilnosti i efikasnosti humanog anti-PCSK9 antitela na LDL-C u kombinaciji sa HMG-Co-A inhibitorima reduktaze kod hiperholesterolemičnih pacijenata

[0333] Cilj ovog ispitivanja je procena dejstva 12 nedelja subkutanog (SC) humanog, anti-PCSK9 antitela (monoklonalno antitelo 21B12) svake 2 nedelje (Q2W) ili svake 4 nedelje (Q4W), u poređenju sa placebom, na procenat promene od osnovne linije holesterola u lipoproteinu niske gustine (LDL-C) prilikom upotrebe uz HMG-Co-A inhibitor reduktaze (npr., statin) kod subjekata sa hiperholesterolemijom.

[0334] Ovo ispitivanje je dvostruko slepo, randomizovano, stratifikovano, placebo kontrolisano, paralelno grupno kliničko ispitivanje u doznom opsegu za humano anti-PCSK9 antitelo, monoklonalno antitelo, 21B12, za koje je prijavljen 631 subjekat. Subjekti koji su na stabilnoj(im) dozi(ama) tokom najmanje 4 nedelje terapije statinom sa ili bez ezetimiba i koji ispunjavaju sve kriterijume uključivanja/isključivanja biće randomizovani sa jednakom alokacijom u 8 grupa lečenja: monoklonalno antitelo, 21B12 subkutano (SC) (70 mg Q2W, 105 mg Q2W, 140 mg Q2W, 280 mg Q4W, 350 mg Q4W, i 420 mg Q4W, placebo Q2W SC, ili placebo Q4W SC). Randomizacija će biti stratifikovana skriningom nivoa LDL-C (<130 mg/dL [3,4 mmol/L] naspram ≥ 130 mg/dL) i upotrebom ezetimiba na osnovnoj liniji (da naspram ne). Randomizacija treba da nastupi u roku od 5 -10 dana od procene skrininga LDL-C koja se koristi za utvrđivanje pogodnosti. Vizite tokom ispitivanja se sprovode svake 2 nedelje, bez obzira na to da li subjekat prima Q2W SC ili Q4W lečenje.3 Q2W dozne grupe monoklonalnog antitela, 21B12, i 1 Q2W placebo grupa će biti slepe jedna u odnosu na drugu, i 3 Q4W dozne grupe i 1 Q4W placebo grupa će biti slepe jedna u odnosu na drugu. Vizita na kraju ispitivanja i poslednja procena lipida je na kraju nedelje 12 za subjekte na Q4W IP rasporedu i nedelje 14 za subjekte na Q2W IP rasporedu.

12

[0335] Muškarci i žene, ≥ 18 do ≤ 80 godina starosti, su pogodni za ovo ispitivanje. Za prijavljivanje, subjekti moraju biti na statinu, sa ili bez ezetimiba, sa stabilnom(im) dozom(ama) tokom najmanje 4 nedelje pre skrininga LDL-C i ne zahtevaju postepeno povećanje doze. LDL-C na prazan stomak tokom skrininga mora biti ≥ 85 mg/dL (2,2 mmol/L). Prijavljivanje subjekata sa skriningom LDL-C na prazan stomak između ≥ 85 mg/dL (2,2 mmol/L) i < 100 mg/dL (2,6 mmol/L) biće ograničeno na najviše oko 20% ukupno planiranih prijavljivanja. Trigliceridi na prazan stomak moraju biti ≤ 400 mg/dL (4,5 mmol/L) kako je utvrđeno analizom u centralnoj laboratoriji tokom skrininga.

[0336] Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 70 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 39,22% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 105 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 56,38% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 140 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 68,76% (podaci nisu prikazani). Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 70 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 21,17% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 105 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 33,41% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 140 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 33,87% (podaci nisu prikazani).

Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 70 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 21,17% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 105 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 6,80% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 140 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 8,43% (podaci nisu prikazani). Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 70 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 14,84% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 105 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 12,75% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 140 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 45,14% (podaci nisu prikazani). Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 70 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 7,20% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 105 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 5,65% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 140 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 17,60% (podaci nisu prikazani). Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 70 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u ne-HDL-C od 36,20% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 105 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u ne-HDL-C od 51,20% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 140 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u ne-HDL-C od 64,61% (podaci nisu prikazani). Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 70 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 26,33% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 105 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 36,91% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 140 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 46,17% (podaci nisu prikazani).

[0337] Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 (Q4W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 42,62% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 56,84% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u LDL-C od 52,19% (podaci nisu prikazani). Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 22,54% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 29,43% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u Lp(a) od 23,29% (podaci nisu prikazani).

Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 2,17% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 6,92% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje povećanje procenta od osnovne linije u HDL-C od 7,42% (podaci nisu prikazani). Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 18,12% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 20,89% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije u VLDL-C od 28,66% (podaci nisu prikazani). Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 6,75% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 9,17% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije triglicerida od 11,13% (podaci nisu prikazani). Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ne-HDL-C od 38,89% na kraju doznog intervala; subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ne-HDL-C od 50,83% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ne-HDL-C od 48,54% (podaci nisu prikazani). Preliminarni podaci su pokazali da subjekti lečeni sa 280 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 28,08% na kraju doznog intervala;

12

subjekti lečeni sa 350 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 36,04% na kraju doznog intervala; i subjekti lečeni sa 420 mg 21B12 (Q2W) imaju LS srednje smanjenje procenta od osnovne linije ukupnog holesterola od 42,76% (podaci nisu prikazani).

PRIMER 26

PCSK9 ABP-ovi koji dalje pozitivno regulišu LDLR u prisustvu statina

[0338] Ovaj primer pokazuje da su ABP-ovi za PCSK9 proizveli dalja povećanja dostupnosti LDLR prilikom upotrebe u prisustvu statina, što pokazuje da se dalje prednosti mogu ostvariti kombinovanom upotrebom ova dva.

[0339] HepG2 ćelije su zasejane u DMEM sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i uzgajane do -90% slivanja. Ćelije su obrađene sa naznačenim količinama mevinolina (statin, Sigma) i PCSK9 ABP-ova (FIG.

12A-12C) u DMEM sa 3% FBS tokom 48 sati. Ukupni ćelijski lizati su pripremljeni.50 mg ukupnih proteina je razdvojeno elektroforezom gela i preneto u PVDF membranu. Imunoblotovi su izvedeni pomoću receptora zečjeg anti-humanog LDL antitela (Fitzgerald) ili zečjeg anti-humanog b-aktin antitela. Poboljšani hemiluminescentni rezultati su prikazani u gornjim panelima na FIG.12A-12C. Intenzitet traka je kvantifikovan pomoću ImageJ softvera i normalizovan pomoću b-aktina. Relativni nivoi LDLR su prikazani u donjim panelima na FIG.12A-12C. ABP-ovi 21B12 i 31H4 su PCSK9 neutralizujuća antitela, dok je 25A7.1 ne-neutralizujuće antitelo.

[0340] HepG2-PCSK9 ćelije su takođe kreirane. U pitanju je HepG2 ćelijska linija transfektovana sa humanim PCSK9. Ćelije su zasađene u DMEM sa 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) i uzgajane do -90% slivanja. Ćelije su obrađene sa naznačenim količinama mevinolina (Sigma) i PCSK9 ABP-ova (FIG.12D-12F) u DMEM sa 3% FBS tokom 48 sati. Ukupni ćelijski lizati su pripremljeni.50 mg ukupnih proteina je razdvojeno elektroforezom gela i preneto u PVDF membranu. Imunoblotovi su izvedeni pomoću receptora zečjeg anti-humanog LDL antitela (Fitzgerald) ili zečjeg anti-humanog b-aktin antitela.

Poboljšani hemiluminescentni rezultati su prikazani u gornjim panelima. Intenzitet traka je kvantifikovan pomoću ImageJ softvera i normalizovan pomoću b-aktina.

[0341] Kao što se može videti iz rezultata prikazanih na FIG.12A-12F, povećane količine neutralizujućeg antitela i povećane količine statina generalno su dovele do povećanja nivoa LDLR. Ovo povećanje efektivnosti za povećane nivoe ABP-a je naročito očigledno na FIG.12D-12F, na kojima su ćelije takođe transfektovane sa PCSK9, što omogućava ABP-ovima da iskažu svoju efektivnost u većoj meri.

[0342] Interesantno, kao što su pokazali rezultati u upoređivanju FIG.12D-12F do 12A-12C, uticaj koncentracija ABP-a na nivoe LDLR se drastično povećao kada su ćelije proizvodile PCSK9. Pored toga, jasno je da je neutralizovanje ABP-ova (21B12 and 31H4) dovelo do većeg porasta nivoa LDLR, čak i u

12

prisustvu statina, u odnosu na 25A7.1 ABP (ne-neutralizator), što pokazuje da se dodatne prednosti mogu postići upotrebom i statina i ABP-ova za PCSK9.

PRIMER 27

Konsenzus sekvence

[0343] Konsenzus sekvence su utvrđene pomoću standardnih filogenih analiza CDR-ova koji odgovaraju VHi VLod anti-PCSK9 ABP-ova. Konsenzus sekvence su utvrđene čuvanjem CDR-ova kao susednih unutar iste sekvence koja odgovara VHili VL. Ukratko, sekvence aminokiseline koje odgovaraju celokupnim promenljivim domenima bilo VHili VLsu konvertovani FASTA formatiranjem radi jednostavnije obrade komparativnih poravnanja i izvedenih filogenija. Zatim, okvirni regioni ovih sekvenci su zamenjeni sa veštačkom sekvencom veznika („bbbbbbbbbb“ držači, ne-specifični konstrukt nukleinske kiseline) tako da se ispitivanje samih CDR-ova može sprovesti bez uvođenja bilo kakve masene pristrasnosti položaja aminokiseline zbog istovremenih događaja (npr., kao što su nepovezana antitela koja slučajno dele isti nasledni okvir germinativne ćelije), uz istovremeno čuvanje CDR-ova kao susednih unutar iste sekvence koja odgovara VHili VL. VHili VLsekvence ovog formata su zatim podvrgnute ispitivanju poravnanja sličnosti sekvenci pomoću programa koji koristi standardni algoritam kao što je ClutalW (pogledati, Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res.22:4673-4680). Vrednost otvaranja praznina od 8,0 je upotrebljena zajedno sa vrednošću proširenja praznina od 2,0. Ovaj program je na isti način generisao filograme (filogene ilustracije drveta) na bazi poravnanja sličnosti sekvence bilo pomoću UPGMA (postupak hijerarhijskog klasterisanja koji koristi aritmetičku sredinu) ili postupaka spajanja suseda (pogledati, Saitou and Nei, 1987, Molecular Biology and Evolution 4:406-425) radi izgradnje i ilustracije sličnosti i distinkcije grupa sekvenci preko upoređivanja i grupisanja dužine grane. Oba postupka su proizvela slične rezultate, ali je na kraju upotrebljeno drveće izvedeno iz UPGMA postupka, pošto ovaj postupak koristi jednostavniji i konzervativniji skup pretpostavki. Drveće izvedeno iz UPGMA postupka je generisano tamo gde su slične grupe sekvenci definisane kao one koje imaju manje od 15 supstitucija po 100 ostataka (pogledati, legenda u ilustracijama drveta za skaliranje) među pojedinačnim sekvencama unutar grupe i upotrebljeno je za definisanje zbirki konsenzus sekvenci. Rezultati upoređivanja su prikazani na FIG.13A-13J. Na FIG.13E, grupe su odabrane tako da sekvence u lakom lancu koje su kladusi takođe budu kladusi u teškom lancu i imaju manje od 15 supstitucija.

PRIMER 28

Priprema PCSK9 formulacija ABP-a

UF/DF – metodologija ultrafiltracije/diafiltracije

12

[0344] Supstanca leka, npr., antitelo 21B12 i antitelo 11F1, je puferski izmenjena u pufer formulacije, uključujući stabilizator, sa Millipore TFF UF/DF sistemom za manja testiranja koji koristi Millipore Pellicon XL Filter, 50 cm<2>veličine (regenerisana celuloza, odbitak molekulske mase od 30.000) membrane. Faza diafiltracije je sprovođena dok najmanje deset zapremina diafiltracionog pufera nije izmenjeno. Kada je faza diafiltracije završena, UF/DF sistem je prebačen na režim ultrafiltracije, a svaka formulacija je koncentrovana na ciljne nivoe koncentracije.

[0345] Posle završetka UF/DF faze, odgovarajuća količina polisorbata 20 ili 80 je dodata u svaku formulaciju od 1,0% (mas.%) sveže pripremljenog osnovnog rastvora polisorbata („PS“) kako bi se dostigla željena koncentracija polisorbata.

[0346] Pre punjenja primarnih posuda, svaka formulacija je aseptički filtrirana u kabinetu laminarnog protoka i pomoću filtera od 0,2 mikrona. Punjenje je takođe izvedeno aseptički i ručno ili automatski pomoću odgovarajućih instrumenata za punjenje.

Primer 29

[0347] PCSK9 formulacije ABP-a visoke koncentracije sa sniženom viskoznošću Za procenu dejstava različitih ekscipijenasa na viskoznost visokih koncentracija proteina, skrining viskoznosti, stabilnosti i rastvorljivosti je upotrebljen za istraživanje modulatora viskoznosti ekscipijensa za formulacije proteina visoke koncentracije. Konkretno, priprema svih uzoraka, npr., uzorka antitela 21B12, je izvedena aseptički u kabinetu laminarnog protoka. Liofilizacija uzoraka koji se testiraju je omogućila jednostavan postupak za dostizanje visokih koncentracija proteina.1,5 mL od 70 mg/mL proteina (npr., 21B12) je pipetovano u 3cc staklene ampule za liofilizaciju. Liofilizacija je izvedena pomoću generičkog ciklusa liofilizacije na VirTis Lab Scale liofilizatoru. Pufer liofilizacije je bio 10mM L-glutamat sa 1,0% saharoze, pH 4,8. Liofilizovani uzorci (npr., liofilizovani 21B12 uzorak) su rekonstituisani pojedinačno sa oko 0,65 mL pufera ekscipijensa, prikazanih u tabeli 13 u nastavku, do krajnje koncentracije proteina od 150-200 mg/mL. Rekonstituisani uzorci su ostavljeni preko noći kako bi se omogućilo potpuno rastvaranje. Viskoznost je zatim izmerena kako je opisano u nastavku.

TABELA 13

12

[0348] Rezultati skrininga viskoznosti, stabilnosti i rastvorljivosti su pokazali izmene u viskoznosti 21B12 posle dodavanja različitih ekscipijenasa (Fig.26). Nisu svi ekscipijensi upotrebljeni u svrhu skrininga doveli do snižavanja viskoznosti rastvora; dodavanje L-alanina, glicerola, natrijumsulfata, saharoze i cinkhlorida je rezultovalo višoj viskoznosti u poređenju sa kontrolnim uzorkom. Nekoliko ekscipijenasa upotrebljenih u ovom skriningu su se pokazali kao dobri kandidati za modulaciju viskoznosti, na primer, L-arginin, karnitin, kreatinin, L-metionin i taurin.

[0349] Za procenu dejstava različitih formulacija na viskoznost specifičnog PCSK9 ABP, kompozicije 21B12 su formulisane u šest različitih formulacija prikazanih u tabeli 29.2 u nastavku. Koncentracija 21B12 u svim formulacijama je bila 134 mg/ml. Kompozicije su napunjene do krajnje zapremine od 1,0 ml u ampulama. Kompozicije su inkubirane na sobnoj temperaturi (tj., 25°C).

Dijaliza i koncentracija 21B12

[0350] Uklanjanje saharoze iz 21B12 prvobitno u 10 mM natrijumacetata, 9,0% (mas.%) saharoze je ostvareno dijalizom dodavanjem oko 10 mL 21B12 u Pierce Slide-A-Lyzer (Rockford, IL) kasete za dijalizu i dijalizom na 2 L pufera na 4°C tokom 3 ciklusa (2 sata x 2 i 16 sati x 1) za kompletnu izmenu pufera. Pufer za dijalizu je sadržao 10 mM natrijumacetata (napravljenog od sirćetne kiseline) na pH 5,0. Svi uzorci su kasnije koncentrovani pomoću Millipore Amicon UltraPrep uređaja (Billerica, MA) u Beckman

12

Coulter Allegra 6R centrifugi (Fulerton, Kalifornija) koja se okreće na 3000 rpm dok zapremina uzorka ne bude malo ispod zapremine neophodne za željenu koncentraciju.

[0351] Utvrđivanje koncentracije je zatim izvedeno merenjem apsorbancije na A280 pomoću Agilent 8453 spektrofotometra (Santa Klara, Kalifornija). Koncentracija proteina je izračunata pomoću odgovarajućeg koeficijenta ekstinkcije. Odgovarajuća količina pufera je zatim dodata uzorku za ponovno rastvaranje do željene koncentracije, i još jedan A280 je izveden kako bi se dobila krajnja koncentracija za eksperiment.

Dodavanje stabilizatora koji takođe mogu delovati tako da snižavaju viskoznost:

[0352] Ekscipijensi, kao što su prolin, benzilalkohol, kreatinin, metionin, taurin, itd. su testirani u pokušaju snižavanja viskoznosti. Ovi ekscipijensi su pojedinačno dodavani u uzorke 21B12 formulacije iz osnovnog rastvora visoke koncentracije.

Merenja viskoznosti

[0353] Viskoznost je izmerena pomoću Brookfield LV-DVII kupastog i ravnog viskozimetra (Midlboro, Masačusets) sa CPE-40 vretenom, pri čemu odgovarajuću temperaturu čašice sa uzorkom reguliše kada sa vodom koja protiče na konstantnih 25C.500 ul uzorka je dodato u čašicu sa uzorkom sa pipetorom za pozitivan razmak. Posle pričvršćivanja čašice sa uzorkom, rotaciona brzina vretena je postepeno povećavana dok nije ostvaren obrtni momenat od oko 80%. U ovom trenutku, rotaciona brzina je zaustavljena, a očitavanje viskoznosti je generisano Rheocalc softverom.

TABELA 14

[0354] Rezultati pokazuju da su L-prolin, benzilalkohol, kreatinin, metionin i taurin imali značajno dejstvo snižavanja viskoznosti u visokim koncentracijama PCSK9 ABP, 21B12 (pogledati tabelu 14).

1

[0355] Za dalju procenu dejstava različitih formulacija na specifični PCSK9 ABP, kompozicije 21B12 su formulisane u različitim formulacijama prikazanim u tabeli 15 u nastavku. Formulacije su podeljene u tri grupe: (1) skup različitih koncentracija 21B12 u puferu 10 mM natrijumacetata, pH 5,2, (2) skup različitih koncentracija 21B12 u puferu 10 mM natrijumacetata, pH 5,2 sa 3% (oko 261 mM) L-prolina sipanog u svaki uzorak, i (3) skup 21B12 uzoraka koncentrovanih na oko 117-134 mg/mL u puferu 10 mM natrijumacetata na različitim pH nivoima (4,0 do 5,5) uz još dva uzorka u puferu 10 mM natrijumacetata, pH 5,2 bilo sa dodatim NaCl ili kombinacijom L-Metionina/Benzilalkohola.

[0356] Rezultati su pokazali da je L-prolin imao značajno dejstvo snižavanja viskoznosti u visokim koncentracijama PCSK9 ABP, 21B12 (pogledati Fig.27).

[0357] Za dalju proveru dejstava različitih formulacija na konkretni PCSK9 ABP, kompozicije 21B12 su formulisane u različitim formulacijama prikazanim u tabeli 16 u nastavku.

TABELA 16

1 1

[0358] Rezultati pokazuju da 21B12 formulacije formulisane sa 1,5% ili 2,0% prolina (oko 131 nM - 174 mM prolin) i 1% benzilalkohola imaju značajno dejstvo snižavanja viskoznosti u visokim koncentracijama PCSK9 ABP, 21B12.

[0359] Za dalju proveru dejstava različitih formulacija na specifični PCSK9 ABP, kompozicije 21B12 su formulisane u različitim formulacijama prikazanim u tabeli 17 u nastavku.

1 2

[0360] Rezultati pokazuju sposobnost dobijanja visokih koncentracija 21B12 proteina uz smanjenu viskoznost sa formulacijama koje imaju specifične stabilizatore/ekscipijense (pogledati Fig.28A-28D). Konkretno, Fig.28A je grafikon koji prikazuje viskoznost različitih koncentracija anti-PCSK9 antitela, 21B12, u formulaciji koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, i 9% saharoze pH 5,2 na 25°C i 40°C.

[0361] Fig.28B je grafikon koji prikazuje viskoznost različitih koncentracija anti-PCSK9 antitela, 21B12, u formulaciji koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, i 9% saharoze pH 5,2 na 25°C i 40°C, u poređenju sa formulacijom koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, 125 mM arginina, i 3% saharoze pH 5,0 na 25°C i 40°C.

[0362] Fig.28C je grafikon koji prikazuje viskoznost različitih koncentracija anti-PCSK9 antitela, 21B12, u formulaciji koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, i 9% saharoze pH 5,2 na 25°C i 40°C, u poređenju sa formulacijom koja obuhvata 10 mM natrijumacetata, 100 mM metionina, i 4% saharoze pH 5,0 na 25°C i 40°C.

[0363] Fig.28D je grafikon koji prikazuje viskoznost različitih koncentracija anti-PCSK9 antitela, 21B12, u formulaciji koja obuhvata 10 mM natrijumacetata i 9% saharoze pH 5,2 na 25°C i 40°C, u poređenju sa formulacijom koja obuhvata 10 mM natrijumacetata i 250 mM prolina, pH 5,0 na 25°C i 40°C.

PRIMER 30

Ispitivanja viskoznosti visoke koncentracije 11F1

[0364] Tabela 30 prikazuje viskoznost 11F1 antitela na 25 stepeni Celzijusa u različitim koncentracijama antitela i u različitim formulacijama.

[0365] Osnovni rastvor visoke koncentracije 11F1 je pripremljen slično kao što je opisano za 21B12 u primeru 29 gore. Utvrđivanje koncentracije je zatim izvedeno merenjem apsorbancije na A280 pomoću Agilent 8453 spektrofotometra (Santa Klara, Kalifornija). Koncentracija proteina je izračunata pomoću odgovarajućeg koeficijenta ekstinkcije. Odgovarajuća količina pufera je zatim dodata u uzorak kako bi se ponovo rastvorila do željene koncentracije i još jedan A280 je izveden da bi se dobila krajnja koncentracija za eksperiment. Ekscipijensi su pojedinačno dodati u uzorke 11F1 formulacija izvedene iz osnovnog rastvora visoke koncentracije.

[0366] Viskoznost je izmerena pomoću Brookfield LV-DVII kupastog i ravnog viskozimetra (Midlboro, Masačusets) sa CPE-40 vretenom, pri čemu odgovarajuću temperaturu čašice sa uzorkom reguliše kada sa vodom koja protiče na konstantnih 25°C.500 µL uzorka je dodato u čašicu sa uzorkom sa pipetorom pozitivnog razmaka. Posle pričvršćivanja čašice sa uzorkom, rotaciona brzina vretena se postepeno povećava dok se ne dostigne obrtni momenat od oko 80%. U ovom trenutku rotaciona brzina je zaustavljena, a očitavanje viskoznosti je generisano pomoću Rheocalc softvera.

1

[0367] Formulacije proteina visoke koncentracije su ponekad merene pomoću drugačije vrste viskozimetra, Anton Paar Physica Model MCR300 sa CP50-1 vretenom. Uzorak od 600 uL se koristi u ovom instrumentu i Rheoplus softver verzija 3.4 je upotrebljena za izračunavanje viskoznosti rastvora. Nije utvrđena velika razlika u merenjima pomoću bilo kog viskozimetra.

[0368] Rezultati prikazani u tabeli 30 pokazuju sposobnost dobijanja visokih koncentracija 11F1 antitela sa relativno niskom viskoznošću u formulacijama koje imaju specifične stabilizatore/ekscipijense. Formulacije koje obuhvataju stabilizatore metionin, prolin, arginin, glicin, serin i alanin su pokazale naročito nižu viskoznost.

PRIMER 31

1 4

Ispitivanje stabilnosti PCSK9 formulacija ABP-a visoke koncentracije

[0369] Za procenu dejstava stabilnosti na visokoproteinske ABP formulacije PCSK9, kompozicije 21B12 su formulisane u različitim formulacijama prikazanim u tabeli 31.1 u nastavku. Formulacije su inkubirane u naznačenim posudama na -30 °C ili 4°C tokom 0 nedelja, 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, i 6 meseci, i 1 godine. Za svaku formulaciju u svakoj vremenskoj tački, uzorak je uklonjen iz svakog paketa za praćenje monomera antitela prirodnom HPLC koja isključuje veličinu (SEC-HPLC) i detekcijom slabo vidljivih čestica pomoću pomračenja svetlosti (HIAC).

SEC-HPLC:

[0370] SEC-HPLC razdvaja proteine na osnovu razlika u njihovim hidrodinamičkim zapreminama.

Molekuli sa većim hidrodinamičkim zapreminama proteina eluiraju ranije od molekula sa manjim zapreminama. Matični SEC-HPLC je izveden pomoću TSK-GEL G3000SWXL 7,8 mm x 300 mm kolone (Tosoh Bioscience), sa veličinom čestice od 5 µm, na Agilent HPLC sa detektorom promenljive talasne dužine. Mobilna faza je bila 100 mM natrijumfosfat, 250 mM natrijumhlorid, pH 6,8 ± 0,1. Brzina protoka je bila 0,5 mL/minut. Eluat kolone je praćen na 280 nm. Integrisane površine pikova u hromatogramima su upotrebljene za kvantifikaciju količina monomera i vrsta sa visokom molekulskom

1

masom.

[0371] Tabela 31.2 prikazuje rezultate analize prirodne SEC-HPLC od 21B12 formulacija navedenih u tabeli 31.1 inkubiranih na X°C tokom 0 nedelja, 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, i 6 meseci. „% HMW“ odražava kvantitet monomera 21B12 velike molekulske mase u uzorku. Ovi rezultati pokazuju da nikakvi problemi sa formulacijom nisu primećeni posle 6 meseci; međutim, neke vrste sa visokom molekulskom masom su povećale prisustvo u formulaciji metionina (tj., formulacije 2, 5 i 8).

Detekcija teško vidljivih čestica pomoću pomračenja svetlosti (HIAC):

[0372] Sistem za brojanje elektronskih tečnih čestica (HIAC/Royco 9703 ili ekvivalent) koji sadrži senzor za pomračenje svetlosti (HIAC/Royco HRLD-150 ili ekvivalent) sa tečnim uzorkivačem kvantifikuje broj čestica i njihov opseg veličine u datom uzorku testa. Kada čestice u tečnosti prolaze između izvora svetlosti i detektora, smanjuju ili „pomračuju“ snop svetlosti koji pada na detektor. Kada je koncentracija čestica u uobičajenom opsegu senzora, ove čestice se detektuju jedna po jedna. Prolazak svake čestice kroz zonu detekcije smanjuje incidentno svetlo na foto-detektoru, a izlazni napon fotodetektora se momentalno smanjuje. Izmene napona se beleže kao električni pulsevi koje instrument

1

konvertuje u broj prisutnih čestica. Ovaj postupak je ne-specifičan i meri čestice bez obzira na njihovo poreklo. Veličine čestica koje su praćene su 10 µm i 25 µm.

[0373] U ovom primeru, HIAC analiza je izvedena pomoću uzoraka koji se čuvaju na 4°C. Konkretno, uzorci 21B12 formulacija u tabeli 31.1 su podvrgnuti vakuumu (takođe se naziva „degaziranje“) kako bi se uklonili mehurići vazduha koji se mogu detektovati kao čestice u sistemu za brojanje čestica. Za 21B12 uzorke, ovaj postupak je podvrgavao uzorke vakuumu na 75 torova tokom 1 do 2 sata. Brojanje čestica je izvedeno u roku od 2 sata od završetka postupka degaziranja.

[0374] Fig.29A i 29B prikazuju rezultate HIAC analiza za gore identifikovane formulacije inkubirane u posudama tokom 0 nedelja, 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, i 6 meseci. Čestice od 10 µm i 25 µm su izbrojane. Fig.29A i 29B pokazuju da su sve formulacije 21B12 stabilne po merenju sa HIAC. Iako su formulacije u staklenim špricevima, tj., formulacije 4-6, iskazale više nivoe čestica u koncentraciji proteina i formulaciji, ova brojanja čestica su ispod USP granica za veličinu svake čestice (10 µm i 25 µm). USP granice za čestice od 10 µm su 6000 po posudi, a za čestice od 25 µm 600 po posudi.

PRIMER 32

Ispitivanja stabilnosti 11F1

[0375] Za ispitivanja formulacija visoke koncentracije (150 mg/mL) 11F1, nekoliko formulacija je napravljeno pomoću kandidata ekscipijenasa kako je navedeno u tabeli 32A u nastavku. Formulacije su čuvane u naznačenim posudama na -30 °C ili 4°C tokom najmanje šest meseci.

Tabela 32A: Ispitane formulacije

ja

1

[0376] %HMW vrsta je procenjena pomoću HPLC koja isključuje veličinu posle čuvanja na -30°C i 4°C u vremenskim tačkama naznačenim u tabeli 32B u nastavku. Ukratko, HPLC koja isključuje veličinu razdvaja proteine na osnovu razlika u njihovim hidrodinamičkim zapreminama. Molekuli sa većim hidrodinamičkim zapreminama proteina eluiraju ranije od molekula sa manjim zapreminama. Prirodna SEC-HPLC je izvedena pomoću TSK-GEL G3000SWXL 7,8 mm x 300 mm kolone (Tosoh Bioscience), sa česticom veličine 5 µm, na Agilent HPLC sa detektorom promenljive talasne dužine. Mobilna faza je bila 100 mM natrijumfosfat, 250 mM natrijumhlorid, pH 6,8 /- 0,1. Brzina protoka je bila 0,5 mL/minut. Eluat kolone je praćen na 280 nm. Integrisane vršne površine u hromatogramima su upotrebljene za kvantifikaciju količina monomera i vrsta sa velikom molekulskom masom.

TABELA 32 B

[0377] Tabela 32B prikazuje rezultate matične SEC-HPLC analize 11F1 formulacija navedenih u tabeli 32A inkubiranih na 4°C ili -30°C tokom 0 nedelja, 2 meseca, 4 meseca, ili 6 meseci. „% HMW“ odražava količinu velike molekulske mase 11F1 u uzorku. Ovi rezultati pokazuju da nikakvi problemi sa formulacijama nisu primećeni do 6 meseci, međutim neke vrste sa velikom molekulskom masom su povećale prisustvo u formulacijama metionina čuvanim na -30°C (tj. formulacije 3, i 6).

[0378] Stabilnost dodatnih formulacija sa visokom koncentracijom 11F1 je procenjena pripremom formulacija u primarnim posudama kako je naznačeno u tabeli 32C u nastavku:

1

Tabela 32 C

[0379] Formulacije su inkubirane na 4 ° celzijusa tokom jedne godine. U vremenskim tačkama naznačenim u tabeli 32D u nastavku, uzorak je uklonjen iz svake posude i analiziran pomoću SEC-HPLC kako je opisano za tabelu 32B iznad.

Tabela 32D

1

[0380] U vremenskim tačkama naznačenim u tabeli 32E u nastavku, uzorak je uklonjen iz svake posude i analiziran pomoću HPLC izmene katjona (CEX-HPLC). HPLC izmene katjona razdvaja proteine na osnovu razlika u njihovom površinskom naboju. Na podešenoj pH vrednosti, izoforme 11F1 sa nabojem se razdvajaju na koloni izmene katjona i eluiraju pomoću gradijenta soli. Eluent se prati pomoću UV apsorbancije. Distribucija izoformi sa nabojem se procenjuje utvrđivanjem površine pika svake izoforme kao procenat ukupne površine pika.

[0381] Prirodna CEX-HPLC je izvedena pomoću Dionex G3000SWXL 4,0 mm ID x 250 mm kolone (Tosoh Bioscience), sa česticom veličine 10 µm, na Agilent HPLC sa detektorom promenljive talasne dužine. Mobilna faza je bio linearni gradijent od 20 mM MES, pH 6,0 /-0,1 i isti pufer sa 500 mM natrijumhlorid. Brzina protoka je bila 0,6 mL/minut. Eluat kolone je praćen na 280 nm. Integrisane površine pikova u hromatogramima su upotrebljene za kvantifikaciju količina izoformi sa različitim nabojem.

Tabela 32E

14

[0382] Obe tabele 32D i 32E pokazuju da su opisane 11F1 formulacije iskazale manje od 5% povećanja u %HMW (SEC-HPLC) ili manje od 3-5 % varijacije na vrhu glavne izoforme (KATJON HPLC) prilikom čuvanja do 1 godine na 4°C. Zapravo, promene u oba parametra su bile veoma male, što je pokazatelj visoke stabilnosti formulacija.

Detekcija teško vidljivih čestica pomoću pomračenja svetlosti (HIAC):

[0383] Sistem za brojanje elektronskih tečnih čestica (HIAC/Royco 9703 ili ekvivalent) koji sadrži senzor za pomračenje svetlosti (HIAC/Royco HRLD-150 ili ekvivalent) sa tečnim uzorkivačem kvantifikuje broj čestica i njihov opseg veličine u datom uzorku testa. Kada čestice u tečnosti prolaze između izvora svetlosti i detektora, smanjuju ili „pomračuju“ snop svetlosti koji pada na detektor. Kada je koncentracija čestica u uobičajenom opsegu senzora, ove čestice se detektuju jedna po jedna. Prolazak svake čestice kroz zonu detekcije smanjuje incidentno svetlo na foto-detektoru, a izlazni napon fotodetektora se momentalno smanjuje. Izmene napona se beleže kao električni pulsevi koje instrument konvertuje u broj prisutnih čestica. Ovaj postupak je ne-specifičan i meri čestice bez obzira na njihovo poreklo. Veličine čestica koje su praćene su 10 µm i 25 µm.

[0384] U ovom primeru, HIAC analiza je izvedena pomoću uzoraka koji se čuvaju na 4°C. Konkretno, uzorci 11F1 formulacija u tabeli 32a su podvrgnuti vakuumu (takođe se naziva „degasiranje“) kako bi se uklonili mehurići vazduha koji se mogu detektovati kao čestice u sistemu za brojanje čestica. Za 11F1 uzorke, ovaj postupak je podvrgavao uzorke vakuumu na 75 torova tokom 1 do 2 sata. Brojanje čestica je izvedeno u roku od 2 sata od završetka postupka degasiranja.

[0385] Fig.30A i 30B prikazuju rezultate HIAC analiza za gore identifikovane formulacije inkubirane u posudama tokom 0 nedelja, i četiri meseca. Čestice od 10 µm i 25 µm su izbrojane. Fig.30A i 30B pokazuju da su sve formulacije 11F1 stabilne po merenju sa HIAC. Brojanja čestica su ispod USP granica za veličinu svake čestice (10 µm i 25 µm). USP granice za čestice od 10 µm su 6000 po posudi, a za čestice od 25 µm 600 po posudi.

Primer 33

Specifičnost vezivanja 11F1

[0386] Rezultati ove analize pokazuju da se 11F1 vezuje za PCSK9, a ne za PCSK1, PCSK2, PCSK7, ili furin, što pokazuje specifičnost 11F1 za PCSK9.

[0387] Biotinilisani PCSK9, razblažen u puferu A (25 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% tween, pH 7,5) je vezan za neutravidinom obložene ploče od 96 bazenčića u koncentraciji od 0,2 µg/mL, tokom inkubacije od jednog sata na sobnoj temperaturi. Zasebno, 0,4 µg/mL od 11F1 je inkubirano tokom jednog sata na sobnoj temperaturi sa različitim koncentracijama (u opsegu od 0 do 20 µg/mL) bilo kog od PCSK1, PCSK2, PCSK7, PCSK9 ili furina (R&D Systems, Minneapolis, MN) (razblažen u puferu A w/o tween). Inhibitor furina, na 4,5 µg/mL, je uključen sa svim reakcijama koje sadrže furin. PCSK9 ploča obložena streptavidinom je isprana puferom A, a kompozicija antitelo/proproteinska konvertaza je dodata na ploču i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Posle ispiranja, vezano antitelo je detektovano inkubacijom sa kozjim-α-humanim Fc-HRP (160 ng/mL, razblaženo u puferu A) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) posle čega sledi TMB supstrat. Reakcija je zaustavljena sa 1 N HCl, a apsorbancija je očitana na talasnoj dužini od 450 nm na Spectramax Plus 384 spektrofotometru (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA).

[0388] Ova analiza se oslanjala na sposobnost proproteinske konvertaze u rastvoru da se takmiči za vezivanje 11F1 sa PCSK9 zarobljenim na ploči. Predinkubacija 11F1 i PCSK9 u rastvoru je dozno zavisno i robusno smanjila količinu vezivanja 11F1 za PCSK9 zarobljen na ploči i detektovan kao smanjeni OD450 (Fig.31). Svi rezultati su izraženi kao srednja OD450 vrednost ± standardna devijacija naspram koncentracije proproteinske konvertaze. Predinkubacija 11F1 sa PCSK1, PCSK2, PCSK7, ili furinom u rastvoru nije značajnije uticala na vezivanje 11F1 za PCSK9 zarobljen na ploči. Stoga, u ispitanim koncentracijama proteina, 11F1 se vezuje samo za PCSK9, a ne i za druge testirane članove porodice proproteinske konvertaze.

Primer 33

Efikasnost inhibicije vezivanja LDLR:PCSK9 od strane 11F1

[0389] Ovaj primer pokazuje da nanomolarne koncentracije 11F1 mogu inhibirati vezivanje i D374Y i divljeg tipa PCSK9 za LDLR pod uslovima ove analize.

[0390] Ukratko, čiste ploče od 384 bazenčića su obložene sa 2 µg/mL receptora kozjeg anti-LDL antitela (R&D Systems, Minneapolis, MN), razblaženog u PBS, inkubacijom preko noći na 4°C. Ploče su temeljno isprane sa puferom A (100 mM natrijumkakodilat pH 7,5), a zatim blokirane sa puferom B (1% nemasnog suvog mleka [Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA] u puferu A) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja, ploče su inkubirane sa 0,4 µg/mL LDL receptora (R&D Systems, Minneapolis, MN) razblaženog u puferu C (pufer B dopunjen sa 10 mM CaCI2) tokom 1,5 sati na sobnoj temperaturi. Istovremeno sa ovom inkubacijom, 20 ng/mL biotinilisanog D374Y PCSK9 ili 100 ng/mL biotinilisanog WT PCSK9 je inkubirano sa različitim koncentracijama anti-PCSK9 antitela 11F1 razblaženog u puferu A (krajnje koncentracije u opsegu od 6,0 ng/mL do 200 ug/mL za D374Y PCSK9 analizu ili 3,1 ng/mL do 25 ug/mL za WT PCSK9 analizu). LDLR-obložene ploče su isprane i kompozicija biotinilisanog PCSK9/antitelo je dodata. LDLR ploča je inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Vezivanje biotinilisanog PCSK9 za LDLR je detektovano inkubacijom sa streptavidin-HRP (500 ng/mL u puferu C) posle čega sledi TMB supstrat. Reakcija je zaustavljena sa IN HCl, a apsorbancija je očitana na talasnoj dužini od 450 nm na SpectraMax Plus 384 spektrofotometru (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA). GrafikonPad Prism (v 4.01) softver je upotrebljen za postavljanje logaritma koncentracije antitela naspram OD450 kako bi se utvrdile IC50 vrednosti nelinearnom regresijom.

[0391] 11F1 je inhibirao vezivanje LDLR:PCSK9. IC50 vrednosti za 11F1 u analizi D374Y PCSK9 su bile u opsegu od 7,3 nM do 10,1 nM sa prosekom (± SD) od 9,1 nM ± 1,5 nM (n=3). IC50 vrednosti za 11F1 u analizi divljeg tipa PCSK9 su bile u opsegu od 4,4 nM do 8,1 nM sa prosekom (± SD) od 5,9 nM ±1,9 nM (n=3). Treba napomenuti da ove IC50 vrednosti zavise od količine rekombinantnog D374Y PCSK9 ili WT PCSK9 upotrebljenih u analizi vezivanja. Reprezentativna kriva doznog odgovora za analize D374Y i divljeg tipa je predstavljena na Fig.32 i Fig.33, redom.

Primer 34

Efikasnost 11F1 u blokiranju ćelijske apsorpcije LDL

[0392] 11F1 blokira interakciju između PCSK9 i LDLR in vitro i može da spreči PCSK9-posredovano smanjenje apsorpcije LDL u HepG2 ćelijama.

[0393] Ukratko, ćelije humanog HepG2 su zasađene na crnim pločama sa čistim dnom od 96 bazenčića (Fisher Scientific CO LLC, Santa Clara, CA) u gustini od 5x104 ćelija po bazenčiću u DMEM (Mediatech Inc., Herndon, VA) dopunjenih sa 10% FBS i 1% antibiotik-antimikotik rastvora (Mediatech Inc., Herndon, VA). Ćelije su inkubirane na 37°C (5% CO2) preko noći. Za formiranje kompleksa između D374Y PCSK9 antitela ili WT PCSK9 i antitela, serijska razblaživanja (1:2) od 11F1, od 666,7 nM do 0,7 nM (za blokiranje D374Y PCSK9) ili od 3,3 µm do 3,3 nM (za blokiranje WT PCSK9) su pripremljena u puferu formulacije (25 mM HEPES, pH 7,5, 0,15 M NaCL). Bilo D374Y PCSK9 (2 µg/mL) ili WT PCSK9 (25 µg/mL) je razblažen u puferu apsorpcije (DMEM koji sadrži 1% FBS) i inkubiran sa različitim koncentracijama 11F1 ili samog pufera apsorpcije (negativna kontrola) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi uz mućkanje. BODIPY-LDL (Invitrogen, Carlsbad, CA) je razblažen u puferu apsorpcije do koncentracije od 12 µg/mL. Posle inkubacije preko noći, HepG2 ćelije su dva puta isprane sa DPBS (Mediatech Inc., Herndon, VA). Dvadeset pet mikrolitara D374Y PCSK9 ili WT PCSK9 kompleksa sa 11F1 i 25 µL razblaženog BODIPY-LDL (Invitrogen, Carlsbad, CA) je dodato u ćelije i inkubirano na 37°C (5% CO2) tokom 3 sata. Ćelije su isprane sa DPBS 5 puta i resuspendovane u 100 µL DPBS. Fluorescentni signali su detektovani pomoću

14

Safire čitača ploče (Tecan Systems Inc., San Jose, CA) na 480~520 nm (ekscitacija) i 520~600 nm (emisija) i izraženi kao relativna fluorescentna jedinica (RFU).

[0394] GrafikonPad Prism (Version 4.02, GraphPad Software Inc., San Diego, CA) softver je upotrebljen za postavljanje logaritma koncentracije antitela naspram RFU i za utvrđivanje EC50 vrednosti nelinearnom regresijom upotrebom programa prilagođavanja krive sigmoidnog doznog odgovora (promenljivi nagib).

[0395] Ovaj primer pokazuje da 11F1 blokira D374Y PCSK9 ili WT PCSK9-posredovano smanjenje apsorpcije LDL u HepG2 ćelijama na dozno zavisni način. Dodavanje rekombinantnog prečišćenog D374Y PCSK9 (2 µg/mL) ili WT PCSK9 (25 µg/mL) u HepG2 ćelije smanjilo je apsorpciju BODIPY-LDL do -50 na 60% i -40% nivoa izmerenog u neobrađenim ćelijama, redom. Antitela su dozno zavisno vratila apsorpciju LDL na nivo primećen u neobrađenim ćelijama. Srednja (± SD) EC50 vrednost za sposobnost 11F1 da blokira D374Y PCSK9-posredovano smanjenje apsorpcije LDL je iznosila 35,3 ± 9,1 nM (n = 6, Fig. 34). EC50 vrednost za sposobnost 11F1 da blokira WT PCSK9-posredovano smanjenje apsorpcije LDL je iznosila 124,2 ± 28,5 nM (n = 3, Fig.35). Treba napomenuti da su ove EC50 vrednosti funkcija količine rekombinantnog D374Y PCSK9 ili WT PCSK9 upotrebljenog u analizi ćelija. EC50 vrednost je niža u odnosu na D374Y PCSK9 od WT PCSK9, pošto je manje D374Y PCSK9 upotrebljeno u analizi zbog toga što je njegov afinitet vezivanja za LDLR 5 do 30 puta veći od onog od WT PCSK9 (Cunningham et al, 2007; Fisher et al, 2007; Kwon et al, 2008).

[0396] Ovde navedene EC50 vrednosti su reprezentativne za srednje vrednosti izvedene iz 3 do 6 zasebnih merenja za 11F1.

Primer 35

Efikasnost 11F1 i 8A3 u blokiranju humanog PCSK9 eksprimiranog preko adeno-povezanog virusa u mišjem modelu

[0397] Jedno intravensko bolusno davanje anti-PCSK9 antitela 11F1 ili 8A3 dovodi do značajnog smanjenja ne-HDL-C i TC u serumu miševa koji eksprimiraju humani PCSK9 pomoću AAV. Ovaj primer pokazuje efektivnost oba anti-PCSK9 antitela u blokiranju funkcije humanog PCSK9 in vivo.

[0398] Ukratko, 120 C57BL/6 miševi koji eksprimiraju humani PCSK9 su bili generisani infekcijom konstruisanim adeno-povezanim virusom (AAV) koji kodira za humani PCSK9, što je dovelo do povišenih nivoa cirkulišućeg holesterola u lipoproteinu niske gustine (LDL-C). Analiza holesterola u serumu je izvedena pomoću Cobas Integra 400 plus chemistry analizatora (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). Životinje su randomizovane u grupe lečenja sa sličnim nivoima ne-HDL-C (LDL-C i VLDL-C), HDL-C i TC. Na dan lečenja 0 (T=0) podgrupa miševa je eutanazirana, a serum je sakupljen kako bi se utvrdile osnovne linije za taj dan. Preostalim miševima je zatim dato 11F1, 8A3 ili (KLH) IgG2 kontrolno antitelo antihemocijanina puža prilepka na 30 mg/kg ubrizgavanjem u venu repa. U danima 1 do 5 posle ubrizgavanja, podgrupe miševa su eutanazirane i celokupna krv je sakupljena iz šuplje vene i ostavljena da se zgrušava tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Posle centrifugacije na 12.000 rpm sa bench top centrifugom tokom 10 minuta, serum je sakupljen. Analiza holesterola u serumu je izvedena pomoću Cobas Integra 400 plus chemistry analizatora.

[0399] Koncentracije PCSK9 u serumu su utvrđene pomoću sendvič ELISA analize. Čiste ploče od 96 bazenčića su obložene preko noći sa 2 µg/ml monoklonalnog anti-PCSK9 antitela (31H4) razblaženog u IX PBS. Ploče su temeljno isprane sa IX PBS/.05% tween, a zatim blokirane tokom 2 sata sa 3% BSA/1XPBS. Posle ispiranja, ploče su inkubirane tokom 2 sata sa serumom razblaženim u diluentima za opštu analizu (Immunochemistry Technologies, Bloomington, MN). Rekombinantni humani PCSK9 (1 ng/ml do 500 ng/ml) je istovremeno analiziran i upotrebljen za generisanje standardne krive na svakoj ELISA ploči. Zečje poliklonalno biotinilisano anti-PCSK9 antitelo (D8773, Amgen Inc, CA) je dodato na 1 ug/ml (u 1%BSA/PBS), posle čega je usledio neutravidin-HRP na 200 ng/ml (u 1% BSA/PBS). Vezani PCSK9 je detektovan inkubacijom sa TMB supstratom. Reakcija je zaustavljena dodavanjem IN HCl i apsorbancija je izmerena na 450 nm na Spectra Max Plus 384 spektrofotometru (Molecular Devices Inc, Sunnyvale, CA). Standardna kriva (logističko podešavanje sa 4 parametra) generisana sa rekombinantnim humanim PCSK9 je korišćena za utvrđivanje odgovarajuće koncentracije PCSK9 u uzorcima seruma.

[0400] Koncentracije antitela u serumu su utvrđene pomoću sendvič ELISA analize. Poliklonalno kozje anti-humano Fc IgG i HRP-obeleženi kozji anti-humani IgG Fcγ poliklonalni reagens (oba iz Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc, West Grove, PA) su upotrebljeni kao antitelo zarobljavanja i antitelo detekcije, redom. Rastvor 3,3',5,5'tetrametilbenzidin (TMB) supstrata je reagovao sa peroksidom, i u prisustvu peroksidaze rena je kreirao kolorimetrijski signal koji je proporcionalan količini redomg anti-PCSK9 antitela vezanog za reagens zarobljavanja. Intenzitet boje (optička gustina, OD) je izmeren na 450 nm minus 650 nm pomoću čitača mikroploče (Spectra Max Plus 384). Podaci su analizirani pomoću Watson version 7.0.0.01 (Thermo Scientific, Waltham, MA) paketa za smanjenje podataka sa logističkom (auto-procena) regresijom zasebno pripremljenih standardnih kriva. Donja granica kvantifikacije (LLOQ) za analizu je iznosila 34,4 ng/mL.

Izračunavanje farmakokinetičkih parametara kod AAV miševa

[0401] Nekompartmentalna analiza (NCA) je izvedena za koncentracije u serumu pomoću unapred utvrđenih nominalnih vremenskih tačaka za svaki subjekat upotrebom WinNonlin Enterprise, version 5.1.1 (Pharsight, St. Louis, MO). Tačke podataka za procenu terminalnih konstanti brzine eliminacije i vremena poluživota su odabrane vizuelnom inspekcijom profila koncentracije i vremena. Prijavljeni NCA

14

parametri uključuju: očigledno vreme poluživota (t1/2), površinu pod krivom vremena i koncentracije u serumu od vremena nula do poslednje izmerene koncentracije (AUC0-t), i očigledni klirens seruma (CL0-t). AUC0-t je utvrđen pomoću linearnog logaritamskog trapezoidnog postupka, a CL0-t je izračunat pomoću doza/AUC0-t za 11F1, 8A3, i 31H4 antitela. Analiza rastvora doze posle ispitivanja je pokazala da su stvarne doze unutar 20% cilja od 30 mg/kg. Međutim, za IgG2 kontrolu, analiza je pokazala da je stvarna doza samo 40% predviđenog cilja. Stoga, ispravljena doza od 12 mg/kg je upotrebljena za CL0-t izračunavanje za IgG2 kontrolu. Parametri su prijavljeni za tri različite cifre, osim za vreme poluživota koje je prijavljeno za dve značajne cifre.

Statistička analiza

[0402] Svi rezultati holesterola su izraženi kao srednja ± standardna greška sredine. Svi farmakokinetički podaci su izraženi kao srednja ± standardna devijacija. p vrednost od 0,05, utvrđena pomoću jednosmernog ANOVA, je upotrebljena kao prag za utvrđivanje statističkog značaja između životinja kojima je ubrizgano anti-KLH IgG2 kontrolno antitelo i onih doziranih sa anti-PCSK9 antitelom u istoj vremenskoj tački.

Dejstvo anti-PCSK9 antitela na ne-HDL-C, HDL-C, i TC u serumu

[0403] Za utvrđivanje osnovne linije, podgrupa miševa koji eksprimiraju humani PCSK9 je eutanazirana pre ubrizgavanja antitela i krv je sakupljena. Nivoi ne-HDL-C, HDL-C i TC kod ovih životinja su bili 33 ± 4, 117 ± 4 i 183 ± 9 mg/dL, redom (srednje ± SEM). Utvrđeno je da su nivoi PCSK9 kod naivnih životinja 4921 ng/mL ± 2044 ng/mL.

[0404] U poređenju sa miševima kojima je ubrizgano anti-KLH IgG2 kontrolno antitelo (kontrolne životinje), ubrizgavanje 11F1 je proizvelo značajno snižavanje ne-HDL-C u danima 1, 2, i 4 posle ubrizgavanja (uz maksimum od 59%), dok je TC značajno snižen samo 4. dana (za 22%) (Fig.36, Fig.37). Nikakvo značajnije snižavanje HDL-C nije primećeno ni u jednoj vremenskoj tački (Fig.38).

[0405] U poređenju sa kontrolnim životinjama, ubrizgavanje 8A3 je proizvelo značajno snižavanje ne-HDL-C u danima 1, 2, i 4 posle ubrizgavanja (uz maksimum od 65%), dok je TC značajno snižen 2. dana posle ubrizgavanja (uz maksimum od 24%) (Fig.36, Fig.37). Nikakvo značajnije snižavanje HDL-C nije primećeno ni u jednoj vremenskoj tački (Fig.38).

Farmakokinetika

[0406] U intravenskoj dozi od 30 mg/kg, 11F1 i 8A3 su pokazali veoma slično farmakokinetičko ponašanje (Fig.39). Za ova dva molekula, AUC0-t izlaganja, procenjeni CL0-t i očigledna vremena poluživota su bili jednaki (tabela na Fig.40). Anti-KLH IgG2 kontrolno antitelo je imalo neočekivano niže

14

AUC0-t izlaganje od 11F1 i 8A3, ali razlog za ovo je verovatno to što se antitelo daje u nižoj dozi od predviđene (12 mg/kg naspram 30 mg/kg; analiza rastvora doze je pokazala da je koncentracija antitela 40% cilja. Anti-KLH IgG2 kontrolno antitelo CL0-t je bilo slično onom od 11F1 i 8A3, prilikom izračunavanja upotrebom ispravljene doze, a očigledno vreme poluživota anti-KLH IgG2 kontrolnog antitela je procenjeno na >120 sati. Ovi podaci su pokazali da su dejstva liganda PCSK9 na dispoziciju antitela manje naglašena za 11F1 i 8A3 u poređenju sa drugim antitelima doziranim u AAV modelu zbog toga što su 11F1 i 8A3 CL0-t vrednosti sličnije anti-KLH IgG2 kontrolnom antitelu.

Sažetak.

[0407] Ekspresija humanog PCSK9 pomoću AAV kod miševa (oko 5 ug/mL) je dovela do nivoa ne-HDL-C u serumu od oko 33 mg/dL. Posle 30 mg/kg ubrizgavanja 11F1, značajnije snižavanje ne-HDL-C u serumu je primećeno 1., 2, i 4. dana posle ubrizgavanja (uz maksimum od 59% u poređenju sa kontrolnim životinjama). Značajnije snižavanje TC je primećeno samo u danu 4. Ubrizgavanje 8A3 je dalo sličan obrazac snižavanja ne-HDL-C uz maksimum od 65% u poređenju sa kontrolnim životinjama. Međutim, davanje 8A3 je dalo značajno snižavanje TC samo 2 dana posle ubrizgavanja, uz maksimum od 24%. Nikakvo značajnije snižavanje HDL-C nije primećeno kod životinja kojima je dato bilo 11F1 ili 8A3.

Analiza nivoa 11F1 i 8A3 antitela u serumu je pokazala profil sličan anti-KLH IgG2 kontrolnom antitelu.

Primer 36

Dejstvo jedne subkutane doze 11F1, 21B12 i 8A3 na lipide u serumu kod makaki rakojeda

[0408] Pojedinačno SC davanje 11F1, 8A3 ili 21B12 makaki rakojedima dovodi do značajnog snižavanja LDL-C i TC u serumu. Ovo ispitivanje je pokazalo sposobnost anti-PCSK9 antitela da snižava holesterol u serumu kod ne-humanih primata.

[0409] Ukratko, naivni mužjaci makaki rakojeda su aklimatizovani na svoje okruženje najmanje 2 nedelje pre eksperimenta. Životinje su randomizovane u grupe lečenja na osnovu predskrininga nivoa TC, HDL-C, LDL-C, i triglicerida u serumu, i njihove telesne mase. Posle 1 nedelje, životinjama je uskraćena hrana preko noći i krvarile su iz periferne vaskulature (cefalična ili potkožna vena), radi merenja osnovne linije nivoa lipida u serumu u vremenskoj tački označenoj sa T = 0. Životinjama je zatim ubrizgano SC ili anti-KLH IgG2 kontrolno antitelo, 11F1, 21B12, ili 8A3 (sve u 10 mM NaOAc pH 5,2, 9% saharoza) na 0,5 mg/kg (sve u 0,4 mL/kg telesne mase). Uzorci krvi bez unosa hrane su zatim sakupljeni od životinja u predviđenim vremenskim tačkama tokom perioda od 45 dana.

Eksperimentalni dizajn

14

[0410] U naznačenim vremenskim tačkama, krv je sakupljena od životinja pod uslovima bez unosa hrane preko noći iz periferne vaskulature (cefalična ili potkožna vena). Celokupna krv je ostavljena da se zgrušava tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Posle centrifugacije na 3.000 rpm tokom 20 minuta, sakupljen je serum. Direktna analiza holesterola u serumu je izvedena pomoću Cobas Integra 400 analizatora (Roche Diagnostics Inc, Indianapolis, IN). Nivoi apolipoproteina B u serumu su utvrđeni u naznačenim vremenskim tačkama (dan 0, 3, 6, 15, 24 i 33) od strane Anilytics, MD, uz sledeću metodologiju. Alikvot od 17 µL uzorka (bez pripreme) je upotrebljen za analizu sa Hitachi 717 analizatorom pomoću standardne krive od 6 tačaka. Ako je početna vrednost uzorka bila viša od linearnosti standardne krive, uzorak je razblažen i ponovljen, pri čemu je rezultat pomnožen sa odgovarajućim faktorom razblaživanja. Reagensi za analizu (APO-B komplet reagensa # 86071, set antitela # 86060, kontrolni set # 86103) su dobijeni iz DiaSorin (Stillwater, MN).

[0411] Koncentracije antitela u serumu su utvrđene pomoću enzimski povezane analize imunosorbenta (ELISA) sa opsegom analize od 34,4 do 3000 ng/mL (34,4 ng/mL je donja granica kvantitacije [LLOQ]).

[0412] Nekompartmentalna analiza (NCA) je izvedena na koncentracijama u serumu upotrebom prethodno utvrđenih nominalnih vremenskih tačaka za svaki subjekat pomoću Watson® LIMS, verzija 7.0.0.01 (Thermo Scientific, Waltham, MA). Tačke podataka za procenu konstanta brzine terminalne eliminacije i vremena poluživota su odabrane vizuelnom proverom profila koncentracije i vremena i najpogodnijih linearnih vrednosti (obično od 360 h dok koncentracije antitela ne padnu ispod donje granice kvantitacije). Prijavljeni NCA parametri uključuju: terminalno vreme poluživota (t1/2,z), maksimalnu koncentraciju u serumu (Cmax), površinu pod krivom vremena i koncentracije u serumu od vremena nula do beskonačnosti (AUC0-inf), i očigledan klirens seruma (CL/F). AUC0-inf je izračunat pomoću linearnog logaritamskog trapezoidnog postupka. Svi parametri su prijavljeni za tri značajne cifre, osim vremena poluživota koje je prijavljeno za dve značajne cifre.

Statistička analiza

[0413] Statistički model koji razmatra osnovnu liniju kao kovarijat i grupu lečenja kao fiksno je prilagođen transformisanom logaritamskom odgovoru u svakoj vremenskoj tački za LDL-C, HDL-C, TC, i

14

trigliceride. Tukey-eva ispravka višestrukog poređenja je primenjena za prilagođavanje poređenja u parovima u svakoj vremenskoj tački. Statistički značaj je procenjen kao alfa=0,05 upotrebom prilagođenih p-vrednosti.

Dejstvo 11F1, 21B12, i 8A3 na LDL holesterol u serumu

[0414] Maksimalno snižavanje LDL-C za 11F1 je primećeno 9 dana posle ubrizgavanja, uz snižavanje LDL-C od 57% u poređenju sa majmunima tretiranim anti-KLH IgG2 kontrolnim antitelom (kontrolne životinje). LDL-C se vratio na nivoe slične onim primećenim kod kontrolnih životinja do 27. dana.

Maksimalno snižavanje LDL-C za 21B12 je primećeno 3 dana posle ubrizgavanja, uz snižavanje LDL-C od 64% u poređenju sa kontrolnim životinjama. LDL-C se vratio na nivoe slične kontrolnim životinjama do 6. dana. Maksimalno snižavanje LDL-C za 8A3 je primećeno 4 dana posle ubrizgavanja, uz snižavanje LDL-C od 54% u poređenju sa kontrolnim životinjama. LDL-C se vratio na nivoe slične onim primećenim kod kontrolnih životinja do 27. dana (Fig.41).

Dejstvo 11F1, 21B12, i 8A3 na ukupan holesterol u serumu

[0415] Maksimalno snižavanje TC za 11F1 je primećeno 9 dana posle ubrizgavanja, uz snižavanje TC od 27% u poređenju sa majmunima tretiranim anti-KLH IgG2 kontrolnim antitelom (kontrolne životinje). TC se vratio na nivoe slične onima primećenim kod kontrolnih životinja do 27. dana. Maksimalno snižavanje TC za 21B12 je primećeno 3 dana posle ubrizgavanja, uz snižavanje TC od 20% u poređenju sa kontrolnim životinjama. TC se prelazno vratio na nivoe slične onima primećenim kod majmuna tretiranih prenosnikom do 4. dana, ali su bili značajno niži između 14. i 18. dana, inkluzivno. Maksimalno snižavanje TC za 8A3 je primećeno 9 dana posle ubrizgavanja, uz snižavanje TC od 22% u poređenju sa kontrolnim životinjama. TC se vratio na nivoe slične onima primećenim kod kontrolnih životinja do 30. dana (Fig.42).

Dejstvo 11F1, 21B12, i 8A3 na HDL holesterol i trigliceride u serumu

[0416] U proseku i u svakoj vremenskoj tački, nivoi HDL-C ili triglicerida za životinje tretirane sa 11F1 ili 8A3 nisu se značajno razlikovali (na osnovu alfa = 0,05 nivo značaja) od onih primećenih kod majmuna tretiranih anti-KLH IgG2 kontrolnim antitelom. Međutim, 21B12 jeste indukovao statistički značajnu promenu HDL-C u jednoj vremenskoj tački (dan 18 posle ubrizgavanja) (Fig.43 i Fig.45).

Dejstvo 11F1, 21B12, i 8A3 na apolipoprotein B (ApoB)

[0417] Nivoi ApoB u serumu su izmereni 3., 6., 15., 24. i 33. dana posle ubrizgavanja.11F1 i 8A3 su povezani sa snižavanjem ApoB 3. do 24. dana, u poređenju sa majmunima tretiranim anti-KLH IgG2

14

kontrolnim antitelom (Fig.46).21B12 je povezan sa statistički značajno nižim nivoima ApoB samo 3. dana.

Farmakokinetički profili 11F1, 21B12, i 8A3

[0418] Sažetak srednjih profila koncentracije i vremena po lečenju je prikazan u 748. Procenjeni srednji farmakokinetički parametri za životinje koje primaju 11F1, 21B12, 8A3, i anti-KLH IgG2 kontrolno antitelo su prikazani u tabeli na Fig.47.

[0419] Apsorpcija antitela u svim grupama je bila konzistentna i karakteristična za subkutano davanje antitela. Farmakokinetičko ponašanje 21B12 u pogledu CL/F, Cmax, i AUC0-inf je bilo konzistentno sa onim koje je primećeno u prethodnim ispitivanjima gde je 21B12 dat u istoj dozi. Farmakokinetika 11F1 i 8A3 se značajno razlikovala od 21B12, gde je primećen niži CL/F (oko 15% od 21B12 CL/F) i procenjena su duža vremena poluživota (oko 200 h u poređenju sa 40 h za 21B12).

[0420] Značajno je da se farmakokinetika 11F1 i 8A3 nije razlikovala ni međusobno niti od anti-KLH IgG2 kontrolnog antitela. Ovi podaci navode da je dispozicija 11F1 i 8A3 u mnogo manjoj meri pod uticajem usled spajanja sa PCSK9 ciljem u odnosu na 21B12, budući da 11F1 i 8A3 imaju isti profil izloženosti kao anti-KLH IgG2 kontrolno antitelo bez afiniteta za PCSK9.

Sažetak rezultata

[0421] Tokom ispitivanja od 45 dana, statistički značajno snižavanje TC i LDL-C je primećeno kod životinja kojima je dat 11F1, 21B12, ili 8A3 u poređenju sa anti-KLH IgG2 kontrolnim antitelom.11F1 je povezan sa statistički značajnim snižavanjem LDL-C (naspram anti-KLH IgG2 kontrolnog antitela) od 2. dana do 24. dana inkluzivno.21B12 je pokazao statistički značajno snižavanje LDL-C (naspram anti-KLH IgG2 kontrolnog antitela) od 1. dana do 4. dana inkluzivno.8A3 je pokazao statistički značajno snižavanje LDL-C (naspram anti-KLH IgG2 kontrolnog antitela) od 1. dana do 24. dana inkluzivno.

Promene u TC i ApoB su odražavale promene primećene kod LDL-C za sve grupe.11F1 je dostigao maksimalno snižavanje LDL-C (naspram anti-KLH IgG2 kontrolnog antitela u istoj vremenskoj tački) 9 dana posle ubrizgavanja (-57%).21B12 je dostigao maksimalno snižavanje LDL-C (naspram anti-KLH IgG2 kontrolnog antitela u istoj vremenskoj tački) 3 dana posle ubrizgavanja (-64%).8A3 je ostvario maksimalno snižavanje LDL-C (naspram anti-KLH IgG2 kontrolnog antitela u istoj vremenskoj tački) 4 dana posle ubrizgavanja (-54%).21B12 je snizio HDL-C u jednoj vremenskoj tački, 18 dana posle ubrizgavanja. Nikakve statistički značajne promene nisu primećene u nivoima HDL-C posle davanja 11F1 ili 8A3. Nikakve statistički značajne promene nisu primećene u nivoima triglicerida posle davanja 11F1, 21B12, ili 8A3.

1

Claims

Patentni zahtevi

1. Stabilna formulacija koja obuhvata

monoklonalno antitelo koje se specifično vezuje za PCSK9, pri čemu PCSK9 obuhvata aminokiseline SEQ ID NO:1, monoklonalno antitelo u količini od 100 mg/ml do 150 mg/ml, i

farmaceutski prihvatljiv pufer u količini od 0.05 mM do 40 mM, pri čemu taj farmaceutski prihvatljiv pufer predstavlja natrijumacetatni pufer, i

farmaceutski prihvatljiv surfaktant u količini koja je 0.004 mas./vol.% do 0.01 mas./vol.%, pri čemu taj farmaceutski prihvatljiv surfaktant predstavlja polisorbat 80, polisorbat 60, polisorbat 40 ili polisorbat 20, i

najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv stabilizator od 0.5 mas./vol.% do 10 mas./vol.%,

pri čemu ta stabilna formulacija ima pH između 4.0 do 6.0,

pri čemu pomenuti farmaceutski prihvatljiv stabilizator predstavlja prolin, i

pri čemu monoklonalno antitelo obuhvata

varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23 ili njenu varijantu, pri čemu ta varijanta obuhvata jedno ubacivanje, deleciju i/ ili supstituciju aminokiseline u odnosu na SEQ ID NO:23; i

varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49 ili njenu varijantu, pri čemu ta varijanta obuhvata jedno ubacivanje, deleciju i/ ili supstituciju aminokiseline u odnosu na SEQ ID NO:49, i

konstantni region lakog lanca SEQ ID NO:156 i konstantni region teškog lanca SEQ ID NO:154 ili SEQ ID NO:155.

2. Stabilna formulacija prema zahtevu 1, u kojoj je farmaceutski prihvatljiv pufer prisutan u količini od 10-20 mM.

3. Stabilna formulacija prema bilo kom od zahteva 1-2, u kojoj pomenuti farmaceutski prihvatljiv surfaktant predstavlja polisorbat 80 ili polisorbat 20.

4. Stabilna formulacija prema zahtevu 1, u kojoj je prolin prisutan u količini od između 2% i 3 mas./vol.%.

5. Stabilna formulacija prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu ta formulacija

a) ima pH između 5.0 do 5.5;

b) obuhvata viskoznost od 30 cP ili manje na 25°C;

c) obuhvata viskoznost od 12 cP ili manje na 25°C; i/ili

d) obuhvata osmolalitet između 250 mOsmol/kg do 350 mOsmol/kg.

6. Stabilna formulacija prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu ta stabilna formulacija ostaje stabilna najmanje 3, 6, 12 ili 24 meseca.

7. Stabilna formulacija prema zahtevu 1 koja obuhvata:

(a) monoklonalno antitelo u količini od 100 mg/ml do 150 mg/ml, pri čemu pomenuto monoklonalno antitelo obuhvata:

varijabilni region lakog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:23 ili njenu varijantu, pri čemu ta varijanta obuhvata jedno ubacivanje, deleciju i/ ili supstituciju aminokiseline u odnosu na SEQ TD NO:23; i

varijabilni region teškog lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:49 ili njenu varijantu, pri čemu ta varijanta obuhvata jedno ubacivanje, deleciju i/ ili supstituciju aminokiseline u odnosu na SEQ ID NO:49; i

konstantni region lakog lanca SEQ ID NO:156; i

konstantni region teškog lanca SEQ ID NO:154 ili SEQ ID NO:155

(b) 10-20 mM natrijumacetata;

(c) između 2.0% do 3.0 mas./vol.% prolina;

(d) 0.01 mas./vol.% polisorbata 20 ili polisorbata 80; i

(e) pH od 5.0 do 5.5.

8. Stabilna formulacija prema zahtevu 7 koja obuhvata:

(b) 10 mM natrijumacetata;

(c) između 2.0% do 3.0 mas./vol.% prolina;

(d) 0.01 mas./vol.% polisorbata 20 ili polisorbata 80; i

(e) pH od 5.0.

9. Stabilna formulacija prema zahtevu 8, koja obuhvata:

(a) 120 mg/ml; ili

(b) 140 mg/ml;

pomenutog monoklonalnog antitela.

10. Stabilna formulacija prema bilo kom od zahteva 1-9 za upotrebu u lečenju ili sprečavanju poremećaja povezanog sa holesterolom kod pacijenta.

11. Stabilna formulacija za upotrebu prema zahtevu 10 pri čemu je poremećaj povezan sa holesterolom izabran iz grupe koju čine familijarna hiperholesterolemija, ne-familijarna hiperholesterolemija, povišen lipoprotein (a), bolest srca, metabolički sindrom, dijabetes, koronarna bolest srca, moždani udar, kardiovaskularna bolest, Alchajmerova bolest, periferna arterijska bolest, hiperlipidemija i dislipidemija.

12. Stabilna formulacija za upotrebu prema zahtevu 11, pri čemu familijarna hiperholesterolemija uključuje heterozigotnu familijarnu hiperholesterolemiju i homozigotnu familijarnu hiperholesterolemiju.

13. Stabilna formulacija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 10 do 12, koja obuhvata davanje pacijentu doze od:

(a) do 140 mg pomenutog antitela jednom svake druge nedelje (Q2W);

(b) do 420 mg pomenutog antitela jednom svake druge nedelje (Q2W); ili

(c) do 420 mg pomenutog antitela jednom svake četiri nedelje (Q4W).

1