RS60795B1

RS60795B1 - Vezujući molekuli specifični za il-21 i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS60795B1
Application number: RS20201046A
Authority: RS
Inventors: Catherine Ettinger; Jodi Karnell; Melissa Damschroder; Partha Chowdhury; Xiaodong Xiao; Ping Tsui; Reena Varkey; Stacey Drabic; Laura Carter; Ronald Herbst; Qun Du; Brian Michael Naiman
Original assignee: Boston Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2014-04-08
Filing date: 2015-04-07
Publication date: 2020-10-30
Also published as: SI3128997T1; KR20170018814A; US20230201346A1; EP3689325A1; CA2948275C; WO2015157238A3; TW201620934A; EP3128997B1; NZ725735A; KR102546611B1; IL273641A; CN111560071B; US20180318416A1; CN111560071A; ZA201707489B; SG10201913627TA; IL248709A0; US10588969B2; ES2814150T3; CN106794129B

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Ovo otkrivanje obezbeđuje kompozicije koje se specifično vezuju za IL-21 i postupke za upotrebu takvih kompozicija, na primer, za lečenje ili prevenciju inflamatorne ili autoimune bolesti ili poremećaja.

[0002] IL-21 pripada porodici citokina koja uključuje IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 i IL-15, od kojih se svi vezuju za pojedinačne (ili deljene) receptore u kompleksu sa zajedničkim gama lancem citokinskih receptora (yc). Većina citokina u ovoj porodici je od suštinske važnosti i za održavanje i za funkcionisanje T-ćelija, B-ćelija i NK ćelija. Receptor za IL-21 je široko rasprostranjen na limfo-hematopoetskim i nehematopoetskim ćelijama, a IL-21 igra razne uloge.

[0003] Na primer, angažovanje IL-21R od strane IL-21 vodi aktivaciji nekoliko signalnih puteva, uključujući Jak/STAT put (Davis, ID, et al., (2007) Clin Cancer Res 13, 3630-3636; Fuqua, CF, et al, (2008) Cytokine 44, 101-107; Habib, T, et al, (2002) Biochemistry 41, 8725-8731). Tačnije, IL-21 aktivira STAT1, STAT3 i STAT5, koji su ukazani uvećanom fosforilacijom ovih molekula unutar ćelije (Asao, H, etal, (2001) J Immunol 167, 1-5; Diehl, SA, etal, (2008) J Immunol 180, 4805-4815; Scheeren, FA, etal, (2008) Blood 111, 4706-4715; Zeng, R, etal, (2007) Blood 109, 4135-4142). Naročito se pokazalo da aktivacija STAT3 igra ključnu ulogu u regulisanju odgovora humanih B-ćelija na IL-21 (Avery, DT, et al, (2008) J Immunol 181, 1767-1779; Avery, DT, et al., JExp Med 207, 155-171).

[0004] Štaviše, IL-21 doprinosi održavanju i funkcionisanju CD8+ memorijskih T-ćelija i NK ćelija, promoviše stvaranje Thl7 i folikularnih pomoćničkih T-ćelija (Tfh) kod miša (i moguće čoveka) i inhibira ćelijsko stvaranje regulatornih T-ćelija (Treg). Pokazalo se da IL-21 modulira aktivnost NK ćelija uključujući efekte na njihov razvoj, rast i citolitičku aktivnost (Spolski, R, and Leonard, WJ, (2008) Curr Opin Immunol 20, 295-301). Uz to se pokazalo da IL-21 promoviše IFNγ proizvodnju i od strane primarnih NK ćelija kao i od strane humanih NK ćelijskih linija, NK-92 (Kasaian, MT, et al, (2002) Immunity 16, 559-569; Strengell, M, et al, (2003) J Immunol 170, 5464-5469). IL-21 takođe ima mnoštvo efekata na nehematopoetske ćelije, poput stromalnih ćelija gde on prouzrokuje zapaljenje otpuštanjem matrične metaloproteinaze (MMP) (Monteleone et al, (2006) Gut 55, 1774-1780).

[0005] Jedna glavna neredundantna uloga IL-21 jeste promocija aktivacije, diferencijacije ili smrti B-ćelija tokom odgovora humoralnog imuniteta. Efekat IL-21 na humane B-ćelije iscrpno je ispitivan. IL-21 ima jak uticaj na preživljavanje B-ćelija, aktivaciju i proliferaciju kao i diferencijaciju B-ćelija u Ig sekretorne plazma ćelije (PC-ovi) (Avery, DT, et al, (2008) J Immunol 181, 1767-1779; Avery, DT, etal, J Exp Med 207, 155-171); Bryant, VL, et al, (2007) J Immunol 179, 8180-8190; Ettinger, R, et al, (2005) J Immunol 175, 7867-7879; Parrish-Novak, J, et al, (2000) Nature 408, 57-63; Pene, J, et al, (2004) J Immunol 172, 5154-5157). Nadalje, uvećana IL-21 proizvodnja je karakteristika određenih autoimunih bolesti i moguće je da doprinosi proizvodnji autoantitela kao i patoloških svojstava autoimune bolesti. Aktivacija B-ćelija in vivo može se pokrenuti interakcijama sa aktiviranim T-ćelijama koje eksprimiraju kostimulatorne molekule poput CD40L i proizvode tropne citokine B-ćelija poput IL-21.

[0006] Prekomerna ekspresija IL-21 je karakteristika mnogih zapaljenskih, imunski posredovanih ili autoimunih bolesti ili poremećaja i verovatno će biti važan pokretač proizvodnje autoantitela kao i patoloških karakteristika autoimune bolesti (Nakou et al, (2013) Clin. Exp. Rheumatol.31, 172-179). Ključna uloga IL-21 u promovisanju odgovora humoralnog imuniteta čini ga važnim fokusom potencijalnih terapijskih intervencija u stanjima koje odlikuju prekomerna proizvodnja i IL-21 i patogenih autoantitela (Dolff et al, (2011) Arthritis Res. Ther.13, R157; Kang et al, (2011) Arthritis Res. Ther.13, R179; McGuire et al, (2011) Immunity 34, 602-615; Liu et al, (2012) Arthritis Res. Ther.14, R255; Terrier etal, (2012) Arthritis Rheum.64, 2001-2011; Li Q et al, (2013) PLoS One 8, e68145; Li Y et al, (2014) Neurol. Sci.35, 29-34). Stoga je očekivano da neutralizacija IL-21 u postavkama autoimuniteta utiče na nekoliko populacija ćelija za koje se veruje da su uključene u patogenezu imunski posredovanih bolesti. Takve bolesti ili poremećaji uključuju, bez ograničavanja, vaskulitis, na primer, antineutrofilnih citoplazmatskih antitela (ANCA) ili vaskulitis tipa arteritis džinovskih ćelija (GCA), Šergenov sindrom, zapaljensku bolest creva, vulgarni pemfigus, lupus nefritis, psorijazu, tiroiditis, dijabetes tipa I, idiopatsku trombocitopeničnu purpuru (ITP), ankilozirajući spondilitis, multiplu sklerozu, sistemski eritemski lupus, reumatoidni artritis, Kronovu bolest, mijasteniju gravis i bolest kalem protiv domaćina (GVHD).

[0007] Patogeneza vaskulitisa (AAV) povezanog sa antineutrofilnim citoplazmatskim antitelima (ANCA) je tipizirana glavnim autoantitelima na proteinazu 3 (PR3) i mijeloperoksidazu (MPO). CD4+ T-ćelije koje proizvode IL-21 šire se u krvi (Abdulahad et al, (2013) Arth Res & Ther 15:R70). Povišen IL-21 je prisutan u AAV serumu u odnosu na zdrave kontrole, a egzogeni IL-21 prouzrokuje in vitro sekreciju ANCA autoantitela iz PBMC-ova izolovanih iz AAV pacijenata in vitro. AAV čine granulomatoza sa poliangitisom, prethodno Vegenerova granulomatoza, (GPA), eozinoflina granulomatoza sa poliangitisom, takođe poznata i kao Čarg-Štrausov sindrom (CSS) i mikroskopski poliangitis (MPA). One su obično su povezane, ali su prevalenca i distribucija epidemiološki različite. Trenutna lečenja uključuju kortikosteroide, biološke, na primer, rituksimab, imunosupresivne lekove, antibiotike ili plazmaferezu, ali prognoza za pacijente ostaje slaba. Neostvarena ostaje potreba za pronalaskom lečenja za AAV.

[0008] Šergenov sindrom (SS) je autoimuna bolest koju odlikuju autoantitela poput reumatoidnog faktora (RF) kao i autoantitela za nekoliko nuklearnih antigena poput Ro/La. SS je drugo najprisutnije autoimuno stanje posle RA. Postoji najmanje 1 milion pacijenata sa primarnim Šergenovim sindromom u SAD-u, od čega su 90% žene. SS utiče na pljuvačne žlezde, što prouzrokuje, na primer, suva usta i oči. Uz to, SS može uticati na druge telesne organe, uključujući bubrege, krvne sudove, pluća, jetru, pankreas, periferni nervni sistem i mozak i povezan je sa drugim autoimunim bolestima poput lupusa i reumatoidnog artritisa. Veoma povišeni nivoi IL-21 u serumu su u uzajamnoj vezi sa povišenim IgGl i prisustvom autoantitela (Kang, 2011). Povišeni nivoi IL-21 i IL-21R mogu se pronaći u ektopičnim folikulima pljuvačne žlezde (Kang, 2011). Štaviše, poznato je da IL-21 igra direktnu ulogu u aktivaciji NK ćelija i citotoksičnosti. U pljuvačnim žlezdama kod pacijenata sa primarnim Šergenovim sindromom pronađen je uvećan broj NK ćelija koje se nalaze u tkivu, koje imaju prekomernu ekspresiju aktivirajućeg receptora NKp30 i u uzajamnoj je vezi sa fokus skorom (Rusakiewicz etal, (2013) Sci. Transl. Med.5, 195ra96). Ove NK ćelije uključene su u patogenezu bolesti direktnim NK ćelija-stromalna ćelija preklapanjem što rezultuje u oštećenju tkiva. IL-21 i njegov receptor se takođe eksprimiraju na infiltratima pluvačne žlezde (Kang, 2011), a prijavljeno je da se CCR9+ CD4+ Tfh memorijske ćelije koje proizvode IL-21 šire u cirkulaciji većine SS pacijenata (McGuire, 2011). Uz to, povećan nivo Tfh ćelija kod pacijenata sa povišenim IL-21 povezan je sa ekstraglandularnim manifestacijama (Szabo etal, (2013) Clinical Immunol 147, 95-104). Preklinički životinjski modeli prikazali su benefit od inhibicije IL-21 (Liu et al. (2012) J Oral Pathol Med). Ne postoji lek za SS; trenutna lečenja imaju ograničenu efikasnost i nijedno se ne može smatrati lečenjem koje menja tok bolesti. Blaga do umerena bolest simptomatično se leči lekovima za čije izdavanje nije potreban lekarski recept. Ozbiljna bolest trenutno se leči hidroksihlorokinom, steroidima, metotreksatom, azatioprinom ili neregistrovanom primenom rituksimaba. Neostvarena ostaje potreba za pronalaskom efektivnih lečenja SS-a.

[0009] Neutralizacija IL-21 ima potencijalnu upotrebnu vrednost u nekoliko indikacija, uključujući primarni SS i vaskulitis (Kang, 2011; Bae et al., (2012) Allergy Asthma Immunol Res.4, 351-356; Terrier, 2012; Abdulahad, 2013; Szabo, 2013).

[0010] Efekat IL-21 na bolest kalem protiv domaćina (GVHD) detaljno je ispitivan. Kada ga dostavi hidrodinamički genski sistem, pokazalo se da IL-21 umnogome ubrzava čovek-na-miša ksenogenu GVHD i pronađeno je da umnožava B-ćelije, plazma ćelije i imunoglobulin (Wu et al, (2013) Protein Cell 4, 863-871). Suprotno tome, prijavljeno je da blokada IL-21 u ovom sistemu smanjuje povrede gastrointestinalnog trakta, splenične Thl citokine i štiti od letaliteta (Hippen et al, (2012) Blood 119, 619-628). Štaviše, prijavljeno je da zaštita od GVHD-a zavisi od stvaranja Treg-ova (Hippen et al, 2012).

[0011] Ovo otkrivanje obezbeđuje kompozicije koje se specifično vezuju za IL-21 i postupke za upotrebu takvih kompozicija, na primer, za lečenje ili prevenciju zapaljenske, imunski posredovane ili autoimune bolesti ili poremećaja.

[0012] U naročitom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje lečenje ili prevenciju GVHD-a pomoću kompozicije koja obuhvata antitelo ili njegov fragment koji se specifično vezuje za IL-21. Na primer, na ksenogenom mišjem modelu GVHD-a pokazano je da anti-IL-21 kompozicija blokira de novo proizvedeni humani IL-21. Ova kompozicija potentno inhibira GVHD-om prouzrokovanu sušičastu bolest i letalnost kada se daje i profilaktički, kao i terapijski.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

[0013] Ovaj pronalazak izložen je u patentnim zahtevima. Ovaj pronalazak naročito se odnosi na sledeće:

1. Izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21 koji obuhvata varijabilni region (VH) lakog lanca i varijabilni region (VL) teškog lanca, pri čemu

(a) VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19; i

(b) VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21.

2. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema stavki 1, koji dalje obuhvata konstantni region teškog lanca, pri čemu konstantni region teškog lanca predstavlja IgG konstantni domen.

3. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema stavki 2, pri čemu konstantni domen obuhvata jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u odnosu na IgG konstantni domen divljeg tipa, i ima uvećano poluvreme eliminacije u poređenju sa poluvremenom eliminacije IgG koji ima IgG konstantni domen divljeg tipa.

4. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema stavki 2 ili 3, pri čemu IgG konstantni domen predstavlja humani IgG1 konstantni domen.

5. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki 1-4, pri čemu teški lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 ili SEQ ID NO: 24; ili pri čemu laki lanac sadrži humani kapa konstanti region i obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 26; ili

pri čemu teški lanac i laki lanac obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 22.

6. Antitelo prema bilo kojoj od stavki 1-5, pri čemu to antitelo predstavlja humanizovano antitelo, himerno antitelo, monoklonsko antitelo ili rekombinantno antitelo.

7. Antigen vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki 1-6, pri čemu taj antigen vezujući fragment predstavlja Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv i sc(Fv)2.

8. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki 1-7, pri čemu se antitelo ili antigen vezujući fragment konjuguje u agens odabran iz grupe koju čine antimikrobni agens, terapijski agens, prolek, peptid, protein, enzim, lipid, modifikator biološkog odgovora, farmaceutski agens, limfokin, heterologno antitelo ili njegov fragment, oznaka koja se može detektovati, polietilenglikol (PEG) i bilo koja njihova kombinacija.

9. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki 1-8, i opciono jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, ili razblaživač.

10. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 8 ili kompozicija prema stavki 9 za upotrebu u lečenju ili prevenciji autoimune bolesti ili poremećaja kod subjekta, pri čemu autoimuna bolest predstavlja Šergenov sindrom (SS), vaskulitis povezan sa ANCA-om (AAV), vaskulitis tipa arteritis džinovskih ćelija (GCA), sistemski eritemski lupus, lupus nefritis, reumatoidni artritis (RA), Kronovu bolest, mijasteniju gravis, vulgarni pemfigus, idiopatsku trombocitopeničnu purpuru (ITP), dijabetes tipa I, bolest povezanu sa IgG4-om ili bilo koju njihovu kombinaciju.

11. Antitelo ili antigen-vezujući fragment ili kompozicija za upotrebu prema stavki 10, pri čemu autoimuna bolest predstavlja sistemski eritemski lupus.

12. Postupak za detektovanje nivoa ekspresije IL-21 u uzorku koji obuhvata (a) dovođenje u kontakt pomenutog uzorka sa antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom prema bilo kojoj od stavki 1 do 8; i (b) detektovanje vezivanja za IL-21 u pomenutom uzorku.

13. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kojoj od stavki 1 do 8 ili kompozicija prema stavki 9 za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti kalem protiv domaćina kod subjekta.

KRATAK SADRŽAJ OVOG OTKRIVANJA

[0014] U nastavku su sumirani neki od glavnih aspekata ovog otkrivanja. Dodatni aspekti opisani su u odeljcima ovog otkrivanja: Detaljan opis ovog otkrivanja, Primeri, Crteži i Patentni zahtevi. Opis u svakom odeljku ovog otkrivanja treba čitati u konjunkciji sa ostalim odeljcima. Nadalje, različiti aspekti opisani u svakom odeljku ovog otkrivanja mogu se kombinovati na različite načine, a sve te kombinacije treba da budu unutar obima ovog otkrivanja.

[0015] Ovo otkrivanje obezbeđuje IL-21 vezujuće molekule, na primer, anti-IL-21 antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente, na primer, monoklonska antitela sposobna da inhibiraju interakciju IL-21 i njegovog receptora i da inhibiraju aktivnost IL-21.

[0016] U nekim slučajevima, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za epitop IL-21, u kom se vezujući molekul specifično vezuje za isti epitop IL-21 kao i antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata varijabilni region (VH) teškog lanca i varijabilni region (VH) lakog lanca od 19E3, 9F11, 8B6 ili 9H10.

[0017] U nekim slučajevima, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21 i kompetitivno inhibira vezivanje IL-21 od strane antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta obuhvata VH i VL od 19E3, 9F11, 8B6 ili 9H10. U nekim slučajevima, VH i VL od 19E3 respektivno obuhvataju SEQ ID NO: 6 i 11, VH i VL od 9F11 respektivno obuhvataju SEQ ID NO: 28 i 33, VH i VL od 8B6 respektivno obuhvataju SEQ ID NO: 42 i 47 i VH i VL od 9H10 respektivno obuhvataju SEQ ID NO: 52 i 57.

[0018] U nekim slučajevima, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21 obuhvata VL antitelo, u kom VL obuhvata VL-CDR1, VL-CDR2 i VL-CDR3 aminokiselinske sekvence identične, ili identične osim za četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više VL-CDR-ova: SEQ ID NO: 12, 13 i 14, SEQ ID NO: 34, 35 i 36, SEQ ID NO: 48, 49 i 50 ili SEQ ID NO: 58, 59 i 60, respektivno.

[0019] U nekim slučajevima, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21 obuhvata VH antitelo, u kom VH obuhvata VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 aminokiselinske sekvence identične, ili identične osim za četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više VH-CDR-ova: SEQ ID NO: 7, 8 i 9, SEQ ID NO: 29, 30 i 31, SEQ ID NO: 43, 44 i 45 ili SEQ ID NO: 53, 54 i 55, respektivno.

[0020] U nekim slučajevima, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21 obuhvata VL antitelo, u kom VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47 i SEQ ID NO: 57.

[0021] U nekim slučajevima, izolovani vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21 obuhvata VH antitelo, u kom VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 52.

[0022] U nekim slučajevima, vezujući molekul ili njegov fragment obuhvata antitelo ili njegov antigenvezujući fragment.

[0023] U nekim slučajevima, izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21 obuhvata VL i VH koji obuhvataju VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 aminokiselinske sekvence identične ili identične osim za četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više CRD-ova: SEQ ID NO: 12, 13, 14, 7, 8 i 9, SEQ ID NO: 34, 35, 36, 29, 30 i 31, SEQ ID NO: 48, 49, 50, 43, 44 i 45 ili SEQ ID NO: 58, 59, 60, 53, 54 i 55, respektivno.

[0024] U nekim slučajevima, izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21, u kom antitelo ili antigen-vezujući fragment obuhvata VH i VL, pri čemu VH i VL respektivno obuhvataju aminokiselinske sekvence najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% identične referentnim aminokiselinskim sekvencama odabranim iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 i SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 i SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37 i SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 37 i 40, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 47, i SEQ ID NO: 52 i SEQ ID NO: 57, respektivno.

[0025] U nekim slučajevima, antitelo ili antigen-vezujući fragment obuhvata VH i VL, pri čemu VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19, a VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21. U nekim slučajevima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata konstantni region teškog lanca ili njegov fragment. U nekim slučajevima, konstantni region teškog lanca ili njegov fragment je IgG konstantni region. U nekim slučajevima, IgG konstantni domen obuhvata jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u odnosu na IgG konstantni domen divljeg tipa pri čemu modifikovani IgG ima uvećano poluvreme eliminacije u poređenju sa poluvremenom eliminacije IgG koji ima IgG konstantni domen divljeg tipa. U nekim slučajevima, IgG konstantni domen obuhvata jednu ili više aminokiselinskih supstitucija aminokiselinskih ostataka na položajima 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 i 428-436, pri čemu je numerisanje aminokiselinskih položaja u skladu sa EU indeksom kakav je izložen u Kabatu. U nekim slučajevima, najmanje jedna aminokiselinska supstitucija IgG konstantnog domena odabrana je iz grupe koju čine:

(a) supstitucija aminokiseline na Kabat položaju 252 tirozinom (Y), fenilalaninom (F), triptofanom (W) ili treoninom (T),

(b) supstitucija aminokiseline na Kabat položaju 254 treoninom (T),

(c) supstitucija aminokiseline na Kabat položaju 256 serinom (S), argininom (R), glutaminom (Q), glutaminskom kiselinom (E), asparaginskom kiselinom (D) ili treoninom (T),

(d) supstitucija aminokiseline na Kabat položaju 257 leucinom (L),

(e) supstitucija aminokiseline na Kabat položaju 309 prolinom (P),

(f) supstitucija aminokiseline na Kabat položaju 311 serinom (S),

(g) supstitucija aminokiseline na Kabat položaju 428 treoninom (T), leucinom (L), fenilalaninom (F) ili serinom (S),

(h) supstitucija aminokiseline na Kabat položaju 433 argininom (R), serinom (S), izoleucinom (I), prolinom (P) ili glutaminom (Q),

(i) supstitucija aminokiseline na Kabat položaju 434 triptofanom (W), metioninom (M), serinom (S), histidinom (H), fenilalaninom (F) ili tirozinom, i

(j) kombinacija dve ili više supstiticija.

[0026] U nekim slučajevima, humani IgG konstantni domen obuhvata aminokiselinske supstitucije u odnosu na humani IgG konstantni domen divljeg tipa na Kabat položajima 252, 254 i 256, gde je

(a) aminokiselina na Kabat položaju 252 supstituisana tirozinom (Y),

(b) aminokiselina na Kabat položaju 254 supstituisana treoninom (T), i

(c) aminokiselina na Kabat položaju 256 supstituisana glutaminskom kiselinom (E).

[0027] U nekim slučajevima, humani IgG konstantni domen je humani IgGl konstantni domen.

[0028] U nekim slučajevima, teški lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 ili SEQ ID NO: 24. U nekim slučajevima, konstantni region lakog lanca odabran je iz grupe koju čine humani kapa konstanti region i humani lambda konstantni region. U nekim slučajevima, konstantni region lakog lanca je humani kapa konstanti region. U nekim slučajevima, teški lanac i laki lanac obuhvataju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 22, ili SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 26, respektivno.

[0029] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je mišje antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, monoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, multispecifično antitelo, ili njegov antigen-vezujući fragment. U nekim slučajevima, antigenvezujući fragment je Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv i sc(Fv)2.

[0030] U nekim se slučajevima antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može vezivati za humani IL-21 i IL-21 makaki (cino) rakojeda.

[0031] U nekim se slučajevima antitelo ili njegov fragment ne vezuje specifično za humani IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 ili IL-15.

[0032] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov fragment inhibira vezivanje IL-21 za IL-21 receptor.

[0033] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov fragment je antagonist aktivnosti IL-21.

[0034] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov fragment može inhibirati STAT3 fosforilaciju u humanim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) posredovanu IL-21.

[0035] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov fragment može inhibirati STAT3 fosforilaciju u humanim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC) posredovanu humanim i IL-21 makaki rakojeda.

[0036] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov fragment može inhibirati proizvodnju interferon-game (IFN-y) od strane NK ćelija posredovanu IL-21.

[0037] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov fragment može inhibirati proizvodnju interferon-game (IFN-y) od strane NK ćelija posredovanu humanim i IL-21 makaki rakojeda. U nekim slučajevima, NK ćelije su kultivisane NK-92 ćelije.

[0038] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov fragment može inhibirati diferencijaciju B-ćelija u plazma ćelije posredovanu IL-21.

[0039] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov fragment može inhibirati diferencijaciju stimulisanih Bćelija u plazma ćelije posredovanu humanim i IL-21 makaki rakojeda.

[0040] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov fragment može inhibirati diferencijaciju B-ćelija aktiviranih CD4+ T-ćelijama u plazma ćelije.

[0041] U nekim slučajevima antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifično se vezuje za humani IL-21 sa afinitetom koji odlikuje konstanta disocijacije (KD) od oko 100 pM do oko 0.1 pM izmerena na Kinetic Exclusion Assay (KinExA) 3000 platformi.

[0042] U nekim slučajevima antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifično se vezuje za IL-21 makaki rakojeda sa afinitetom koji odlikuje konstanta disocijacije (KD) od oko 100 pM do oko 0.1 pM izmerena na Kinetic Exclusion Assay (KinExA) 3000 platformi.

[0043] U nekim slučajevima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u kom je KDza humani IL-21 oko 0.515 pM, a KDza IL-21 makaki rakojeda je oko 0.352 pM.

[0044] U nekim slučajevima antitelo ili njegov fragment konjuguje se u agens odabran iz grupe koju čine antimikrobni agens, terapijski agens, prolek, peptid, protein, enzim, lipid, modifikator biološkog odgovora, farmaceutski agens, limfokin, heterologno antitelo ili njegov fragment, oznaka koja se može detektovati, polietilenglikol (PEG) i kombinacija dva ili više bilo kojih pomenutih agenasa.

[0045] U nekim slučajevima, kompozicija obuhvata antitelo ili njegov fragment kao što je ovde opisano, i nosač. Taj nosač je poželjno farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0046] U nekim slučajevima, izolovani polinukleotid obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL antitelo, u kom VL obuhvata VL-CDR1, VL-CDR2 i VL-CDR3 aminokiselinske sekvence identične, ili identične osim za četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više VL-CDR-ova: SEQ ID NO: 12, 13 i 14, SEQ ID NO: 34, 35 i 36, SEQ ID NO: 48, 49 i 50, ili SEQ ID NO: 58, 59, i 60, respektivno.

[0047] U nekim slučajevima, izolovani polinukleotid obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH antitelo, u kom VH obuhvata VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 aminokiselinske sekvence identične, ili identične osim za četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više VH-CDR-ova: SEQ ID NO: 7, 8 i 9, SEQ ID NO: 29, 30 i 31, SEQ ID NO: 43, 44 i 45, ili SEQ ID NO: 53, 54, i 55, respektivno.

[0048] U nekim slučajevima, izolovani polinukleotid obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL antitelo, u kom VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47 i SEQ ID NO: 57. U nekim slučajevima, izolovani polinukleotid obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH antitelo, u kom VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 52.

[0049] U nekim slučajevima, ovde opisani polinukleotid obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata ovde opisane VH ili VL koji se specifično vezuju za IL-21. U nekim slučajevima antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifično se vezuju za isti epitop

1

kao antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata VH i VL od 19E3, 9F11, 8B6 ili 9H10.

[0050] U nekim slučajevima, ovde opisani polinukleotid obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata VH ili VL, može se vezivati za humani i IL-21 makaki rakojeda.

[0051] U nekim slučajevima, obezbeđen je vektor koji obuhvata ovde opisani polinukleotid.

[0052] U nekim slučajevima, obezbeđena je kompozicija koja obuhvata ovde opisani polinukleotid ili ovde opisani vektor.

[0053] U nekim slučajevima, obezbeđen je polinukleotid ili kombinacija polinukleotida koja kodira vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment kao što je ovde opisano.

[0054] U nekim slučajevima, obezbeđen je polinukleotid ili kombinacija polinukleotida koja kodira ovde opisano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment.

[0055] U nekim slučajevima, kompozicija obuhvata polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH i polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL, pri čemu VL i VH obuhvataju VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 aminokiselinske sekvence identične ili identične osim za četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više CDR-ova: SEQ ID NO: 12, 13, 14, 7, 8 i 9, SEQ ID NO: 34, 35, 36, 29, 30 i 31, SEQ ID NO: 48, 49, 50, 43, 44 i 45, ili SEQ ID NO: 58, 59, 60, 53, 54 i 55, respektivno.

[0056] U nekim slučajevima, kompozicija obuhvata polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH i polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL, pri čemu VL i VH respektivno obuhvataju aminokiselinske sekvence najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% identične referentnim aminokiselinskim sekvencama odabranim iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 i SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 i SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37 i SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 37 i 40, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 47, i SEQ ID NO: 52 i SEQ ID NO: 57, respektivno.

[0057] U nekim slučajevima, VH i VL su kodirane od strane sekvenci nukleinskih kiselina najmanje 85%, 90%, 95% ili 100% identičnih referentnim sekvencama nukleinskih kiselina odabranim iz grupe koju čine SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:27 i SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 41 i SEQ ID NO:46, ili SEQ ID NO: 51 i SEQ ID NO:56, respektivno.

[0058] U nekim su slučajevima polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH i polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL u istom vektoru. U nekim slučajevima, obezbeđen je vektor kao što je ovde opisan.

[0059] U nekim su slučajevima polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH i polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL u različitim vektorima. U nekim slučajevima, obezbeđeni su vektori kao što su ovde opisani.

[0060] U nekim slučajevima, kompozicije kao što su ovde opisane uključuju antitelo ili njegov antigenvezujući fragment koji obuhvata pomenuti VH i pomenuti VL koji se mogu specifično vezivati za IL-21. U nekim slučajevima antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata VH ili VL može se vezivati za humani i IL-21 makaki rakojeda. U nekim slučajevima antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se specifično vezivati za isti epitop kao i antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata VH i VL od 19E3, 9F11, 8B6 ili 9H10.

[0061] U nekim slučajevima, obezbeđene su ćelije domaćini koje obuhvataju polinukleotide kao što su ovde opisani, kompozicije kao što su ovde opisane, ili vektor ili vektore kao što su ovde opisani.

[0062] U nekim slučajevima, postupak za stvaranje antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan obuhvata (a) kultivisanje ćelije kao što je ovde opisano; i (b) izolovanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta.

[0063] U nekim slučajevima, obezbeđen je dijagnostički reagens ili komplet koji obuhvata ovde opisano antitelo ili antigen-vezujući fragment.

[0064] U nekim slučajevima, postupak za smanjivanje STAT3 fosforilacije u IL-21R-ekspresionoj ćeliji prouzrokovane IL-21, uključuje dovođenje u kontakt te ćelije sa vezujućim molekulom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kao što je ovde opisan, antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kao što je ovde opisan ili kompozicijom kao što je ovde opisana.

[0065] U nekim slučajevima, postupak za smanjivanje proizvodnje IFN y od strane NK ćelije posredovane IL-21, uključuje dovođenje u kontakt te NK ćelije sa vezujućim molekulom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kao što je ovde opisan, antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kao što je ovde opisan ili kompozicijom kao što je ovde opisana.

[0066] U nekim slučajevima, postupak za smanjivanje diferencijacije naivnih ili memorijskih B-ćelija u plazma ćelije posredovane IL-21, uključuje dovođenje u kontakt naivnih ili memorijskih B-ćelija sa vezujućim molekulom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kao što je ovde opisan, antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kao što je ovde opisan ili kompozicijom kao što je ovde opisana.

[0067] U nekim slučajevima, CD4+ T-ćelije aktiviraju diferencijaciju plazma ćelija.

[0068] U nekim slučajevima, postupak za lečenje zapaljenske, imunski posredovane ili autoimune bolesti ili poremećaja kod subjekta, uključuje davanje efektivne količine vezujućeg molekula ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan, antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan ili kompozicije kao što je ovde opisana subjektu kom je potrebno lečenje.

[0069] U nekim slučajevima, postupak za prevenciju zapaljenske, imunski posredovane ili autoimune bolesti ili poremećaja kod subjekta, uključuje davanje efektivne količine vezujućeg molekula ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan, antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan ili kompozicije kao što je ovde opisana subjektu podložnom takvoj bolesti ili poremećaju.

[0070] U nekim slučajevima, autoimuna bolest je Šergenov sindrom (SS), vaskulitis (ANCA/GCA), sistemski eritemski lupus ili lupus nefritis, reumatoidni artritis (RA), Kronova bolest, mijastenija gravis ili bilo koja njihova kombinacija.

[0071] U nekim slučajevima, imunski posredovana bolest ili poremećaj je GVHD.

[0072] U nekim slučajevima, postupak za prevenciju GVHD-a uključuje smanjivanje ili eliminisanje simptoma GVHD-a.

[0073] U nekom slučaju, smanjeni ili eliminisani simptomi GVHD-a su osipi, plikovi, mučnina, gubitak apetita, povraćanje, brzo zasićenje hranom, dijareja, abdominalna nelagodnost, abdominalno nadimanje, krv u stolici, žutica, taman urin, nelagodnost u gornjem abdomenu, zadržavanje vode u telu (ili oticanje), simptomi slični artritisu, bol i ukočenost, suve oči, iritacija očiju, bolovi u grlu, neprestani kašalj, kratak dah, otežano disanje.

[0074] U nekim slučajevima, postupak za inhibiciju gubitka telesne mase usled GVHD-a, uključuje davanje vezujućeg molekula ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan, antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan ili kompozicije kao što je ovde opisana subjektu koji boluje od GVHD-a ili koji je podložan GVHD-u.

[0075] U nekim slučajevima, postupak za smanjivanje anemije usled GVHD-a, uključuje davanje vezujućeg molekula ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan, antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan ili kompozicije kao što je ovde opisana subjektu koji boluje od GVHD-a ili koji je podložan GVHD-u.

[0076] U nekim slučajevima, postupak za inhibiciju širenja T-ćelija, uključuje davanje vezujućeg molekula ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan, antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan ili kompozicije kao što je ovde opisana subjektu koji boluje od GVHD-a ili koji je podložan GVHD-u.

[0077] U nekim slučajevima, postupak za smanjivanje citokina kod subjekta koji boluje od GVHD-a ili koji je podložan GVHD-u, uključuje davanje subjektu vezujućeg molekula ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan, antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde opisan ili kompozicije kao što je ovde opisana.

[0078] U nekim slučajevima, postupak za detektovanje nivoa ekspresije IL-21 u uzorku uključuje (a) dovođenje u kontakt pomenutog uzorka sa vezujućim molekulom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kao što je ovde opisan, antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kao što je ovde opisan ili kompozicijom kao što je ovde opisana i (b) detektovanje vezivanja za IL-21 u pomenutom uzorku.

KRATAK OPIS NACRTA/CRTEŽA

[0079]

1

FIG.1A prikazuje poravnanja varijabilnih regiona mišjeg monoklonskog antitela 9F11 (VH: SEQ ID NO:28, VL: SEQ ID NO:33) i tri humanizovane varijante (VH-4 i VH-11: SEQ ID NO:41, VH-6: SEQ ID NO:42, VL-4 i VL-6: SEQ ID NO:43, VL-11: SEQ ID NO:44). Dvostruko podvučeni su ostaci koji se razlikuju između humanih i mišjih u regionima okvira. Mišje povratne mutacije u regionima okvira su podebljane, a CDR regioni su podvučeni. FIG. IB prikazuje poravnanja varijabilnih regiona mišjeg monoklonskog antitela 19E3 (VH: SEQ ID NO:6, VL: SEQ ID NO:11) i tri humanizovane VH varijante (SEQ ID No 61, 62 i 63) i dve humanizovane VL varijante (SEQ ID NO: 64 i 65). Dvostruko podvučeni su ostaci koji se razlikuju između humanih i mišjih u regionima okvira. Mišje povratne mutacije u regionima okvira su podebljane, a CDR regioni su podvučeni.

FIG.2A i FIG.2B prikazuju KinExA Dual Curve Fit od 500 fM i 50 pM koncentracija K44VHa-N56Q (MEDI7169) IgG u kompeticiji u fazi rastvora sa humanim (FIG.2A) i IL-21 makaki rakojeda (FIG 2B).

FIG.3A prikazuje efekat humanog ili IL-21 makaki rakojeda na STAT3 fosforilaciju humanih PBMC-ova. FIG 3B prikazuje inhibiciju ushodne regulacije STAT3 fosforilacije humanih PBMC-ova od strane anti-IL-21 antitela K2Ha-N56Q (obrnuti trouglovi), K44VHa-N56Q (MEDI7169) (dijamanti), i K44VHa6-N56Q (krugovi) prouzrokovane humanim i IL-21 makaki rakojeda.

FIG.4 prikazuje inhibiciju IFNy od strane NK-92 ćelija prouzrokovanu humanim (FIG.4A) i IL-21 makaki rakojeda (FIG.4B).

FIG.5 prikazuje inhibiciju diferencijacije humanih B-ćelija u plazma ćelije od strane ili humanog (FIG 5A) ili IL-21 makaki rakojeda (FIG 5B) prouzrokovane IL-21. Grafik prikazuje smanjivanje u nivou IgD<->CD38<hi>PC-ova u poređenju sa kontrolama. FIG 5C prikazuje da je u kontrolisanim uslovima, stimulacija IL-21, anti-CD40 i anti-IgM koja je rezultovala proizvodnjom Ig u opsegu od 30-40 µg/ml do dana 6, a 19E3.1 i 9F11.1 inhibirala proizvodnju Ig.

FIG.6A prikazuje da je kokultivacija B-ćelija sa aktiviranim CD4+ T-ćelijama rezultovala pojavljivanjem IgD<->CD38<hi>PC populacije, sa 68.5% CD19+ ćelija koje su eksprimirale ovaj PC fenotip do dana 7. FIG.6B i 6C prikazuju inhibiciju PC diferencijacije dodavanjem 19E3.1 ili 9F11.1.

FIG.7 prikazuje da anti-IL21 antitelo (19E3.1) blokira širenje T-ćelija prouzrokovano IL-21. Humane T-ćelije stimulisane su rekombinantnim humanim IL-21 u kombinaciji sa anti-CD3. Antitelo 19E3.1 dodato je pri naznačenim koncentracijama, a širenje T-ćelija kvantifikovano je četvrtog dana. Sva stanja su dvostruko testirana. Ogled je izveden sa dva jedinstvena donora. Prikazan je jedan reprezentativni donor.

FIG.8 prikazuje da K44VHa-N56Q (MEDI7169) blokira sušičastu bolest prouzrokovanu GVHD-om ograničavanjem širenja CD4+ T-ćelija. PBMC-ovi Donora 1 (12.71 x 10<6>) ili PBMC-ovi Donora 2 (13.46 x 10<6>) prebačeni su u NOD/SCID/yc miševe na Dan 0 ispitivanja. Miševi su primili 200 µg ili Kontrolno mAb (FIG.8A) ili K44VHa-N56Q (FIG.8B) koji se daju tri puta nedeljno počevši od Dana -1. Miševima je uzimana krv svake druge nedelje i procenjivana protočnom citometrijom kako bi se odredio broj i fenotip humanih CD45+ ćelija. FIG.8C i FIG.8D prikazuju procenat humanih CD45+ ćelija sakupljenih iz miševa koji respektivno dobijaju Kontrolno mAB ili K44VHa-N56Q, (od Dana 21, Donor 1; n = 3 Kontrolno mAb, n = 5 K44VHa-N56Q). FIG.8E i FIG.

8F prikazuju procenat CD4+ ili CD8+ ćelija unutar humane CD45+ frakcije u miševima koji respektivno primaju Kontrolno mAb ili K44VHa-N56Q, (od Dana 35, Donor 2; n = 10 Kontrolno mAb PBS nosilac/n = 5 K44VHa-N56Q). Sva stanja obojila su 100 µL krvi i sakupljena su na protočnom citometru za isti vremenski period, stoga se broj prikazanih događaja odražava na relativni broj ćelija. Prosečna ± standardna greška apsolutnih brojeva humanih CD45+ ćelija sakupljenih iz krvi na Dan 21 bila je za Donora 1, Kontrolno mAb, n=3 (729, 111 ± 113,899) naspram K44VHa-N56Q, n=5 (39,104 ± 5,159), P<0.0357. Za Donora 2, Kontrolno mAb i PBS zajedno, n=10 (237,294 ± 35,628) naspram K44VHa-N56Q, n=5, (14,980 ± 2,275) P=0.0007. FIG.9 prikazuje da K44VHa-N56Q reverzibilno inhibira širenje humanih ćelija u miševima primaocima. PBMC-ovi Donora 2 (13.46 x 10<6>) prebačeni su u NOD/SCID/yc miševe na Dan 0 ispitivanja. Miševi su primili 200 µL PBS nosioca (kvadrati), ili 200 µg ili K44VHa-N56Q (trouglovi) ili Kontrolno mAb (krugovi) koji se daju tri puta nedeljno počevši od Dana -1 do Dana 44.

Miševima je krv uzimana svake druge nedelje i procenjivana protočnom citometrijom kako bi se odredio broj humanih CD45+ ćelija. Podaci označavaju broj sakupljenih humanih ćelija. Sva stanja obojila su 100 µL krvi i ista je zapremina sakupljena na protočnom citometru, stoga se prikazani broj događaja odražava na relativni broj ćelija.

FIG.10 prikazuje da K44VHa-N56Q štiti od gubitka mase i smrti prouzrokovane GVHD-om. PBMC-ovi Donora 1 (12.71 x 10<6>) prebačeni su u NOD/SCID/yc miševe na Dan 0 ispitivanja i pratio se gubitak mase (FIG.10A) i smrt (FIG.10B) miševa. Ili K44VHa-N56Q (trouglovi) ili Kontrolno mAb (puni krugovi) daje se tri puta nedeljno po 200 µg/miš počevši od Dana -1 do Dana 31. Naivne (prazni krugovi) životinje nisu primile humane ćelije ni mAb. Procenat preživljavanja predstavlja ili uginule miševe ili one koje su dostigli 20% telesne mase i bili žrtvovani. Prikazan je jedan od dva nezavisna ogleda od dva različita Donora PBMC-ova.

FIG.11 prikazuje inhibiciju proliferacije ćelija i proizvodnje citokina od strane K44VHa-N56Q. PBMC-ovi Donora 2 (13.46 x 10<6>) prebačeni su u NOD/SCID/yc miševe na Dan 0 ispitivanja i ubrizgavani su sa ili 200 µg K44VHa-N56Q ili Kontrolim mAb tri puta nedeljno počevši na Dan -1. Miševima je uzimana krv i procenjena je količina citokina u serumima na prisustvo citokina pomoću Millipore's MILLIPLEX MAP system human Thl7 kompleta. Nivoi u serumu (pg/mL) prikazani su za IL-21 (FIG.11A), interferon gamu (FIG.11B), faktor nekroze tumora-alfa (FIG. 11C), IL-9 (FIG.11D), faktor stimulacije kolonija granulocita i makrofaga (FIG. HE), IL-10 (FIG. 11F) i IL-5 (FIG.11G).

1

FIG.12 prikazuje da je inhibicija proliferacije ćelija i proizvodnje citokina od strane anti-IL-21 reverzibilna. PBMC-ovi Donora 1 (12.71 x 10<6>) prebačeni su u NOD/SCID/yc miševe na Dan 0 i ubrizgavani sa ili 200 µg K44VHa-N56Q (puni simboli) ili Kontrolim mAb (otvoreni simboli) tri puta nedeljno počevši od Dana -1 do Dana 31, kada je zaustavljen K44VHa-N56Q. Miševima je uzimana krv na Dane 15, 28, 43 i 57, a količina interferon game (FIG.12A), faktora nekroze tumora-alfa (FIG.12B) i IL-10 (FIG.12C) u serumima u ovim vremenskim tačkama određena je pomoću Millipore's MILLIPLEX MAP system human Thl7 kompleta. Miševima je takođe uzeta krv na Dane 7, 21, 35, 51 i 57 i određen je broj humanih CD45+ ćelija (FIG.12D). Svi miševi koji su primili kontrolno mAb uginuli su do Dana 28 ispitivanja; dakle, postoji samo jedna vremenska tačka za citokine za ove životinje.

FIG.13 prikazuje da terapijski K44VHa-N56Q štiti subjekte od GVHD-a. PBMC-ovi Donora 1 (12.0 x 10<6>) prebačeni su u NOD/SCID/yc miševe na Dan 0 ispitivanja i praćeno je preživljavanje.

Davano je ili Kontrolno mAb počevši na Dan 7 ispitivanja (krugovi), K44VHa-N56Q počevši na Dan 7 ispitivanja (trouglovi), ili K44VHa-N56Q počevši na Dan 14 ispitivanja (obrnuti trouglovi), tri puta nedeljno po 200 µg/miš. Miševi su eutanizovani kada je određeno da su izgubili 20% telesne mase ili ako je miš oslabio/bio na umoru ili na drugi način trpeo bol ili neprijatnost. Smrt i humana eutanazija koriste se kao sinonimi za potrebe praćenja preživljavanja.

FIG.14 prikazuje da K44VHa-N56Q može zaštiti od anemije prouzrokovane GVHD-om. Miševi su podvrgnuti ubrizgavanju i tretirani su kao što je opisano za FIG.13. Miševi su bili naivni, to jest, nisu im bile date ćelije (zvezdice) ili su im dati humani PBMC-ovi praćeni Kontrolim mAb počevši na Dan 7 ispitivanja (krugovi), K44VHa-N56Q počevši na Dan 7 ispitivanja (trouglovi), ili K44VHa-N56Q počevši na Dan 14 ispitivanja (obrnuti trouglovi), koji se daju tri puta nedeljno po 200 µg/miš. Heparizovani celi uzorci krvi prikupljeni iz retroorbitalnog sinusa razblaženi su 1:10 pre analize automatskim hematološkim analizatorom (Sysmex XT-2000iv). Rezultujući broj ukupnih belih krvnih zrnaca (FIG.14A) i crvenih krvnih zrnaca (FIG.14C), vrednosti hematokrita (FIG. 14B) i hemoglobina (FIG.14D) pomnoženi su faktorom razblaživanja od deset.

DETALJAN OPIS OVOG OTKRIVANJA

[0080] Ovo otkrivanje obezbeđuje molekule i njihove antigen-vezujuće fragmente koji se vezuju za IL-21. U nekim aspektima, takvi molekuli su antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti koji se specifično vezuju za IL-21. Obezbeđeni su takođe pridruženi polinukleotidi, kompozicije koje obuhvataju anti-IL-21 antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente i postupci za stvaranje anti-IL-21 antitela i njihovih antigen-vezujućih fragmenata. Dalje su obezbeđeni postupci za upotrebu novih anti-IL-21 antitela, poput postupaka za lečenje zapaljenske, imunski posredovane ili autoimune bolesti ili poremećaja kod subjekta i dijagnostičke upotrebe.

1

[0081] Kako bi se ovo otkrivanje moglo lakše razumeti, prvo su definisani određeni termini. Dodatne definicije izložene su kroz detaljni opis.

I. Definicije

[0082] Kao što se koriste u ovoj specifikaciji i pridruženim patentnim zahtevima, oblici jednine „jedanˮ, „nekiˮ i „ovajˮ uključuju oblike množine osim ukoliko kontekst jasno ne nalaže drugačije. Termini „jedanˮ (ili „nekiˮ), kao i termini „jedan ili višeˮ i „najmanje jedanˮ mogu se ovde koristiti jedan umesto drugog.

[0083] Nadalje, „i/iliˮ treba shvatiti kao specifičan opis svakog od dva specifična svojstva ili komponente sa ili bez druge. Stoga termin „i/iliˮ kao što je upotrebljen u rečenici poput „A i/ili Bˮ ima za cijl da uključi „A i Bˮ, „A ili Bˮ, „Aˮ (samo) i „Bˮ (samo). Isto je tako termin „i/iliˮ kao što je upotrebljen u rečenici poput „A, B, i/ili Cˮ ima za cilj da obuhvati svaki od sledećih aspekata: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (samo); B (samo); i C (samo).

[0084] Svi ovde upotrebljeni tehnički i naučni termini imaju isto značenje kao što se uobičajeno shvataju od strane stručnjaka iz ove oblasti kome je ovo otkrivanje namenjeno, osim ako nisu drugačije definisani. Na primer, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; i the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press, obezbeđuju stručnjaka iz ove oblasti sa opštim rečnikom mnogih termina koji se koriste u ovom otkrivanju.

[0085] Jedinice, prefiksi i simboli označeni su u njihovim oblicima prihvaćenim u skladu sa Međunarodnim sistemom jedinica (SI). Numerički opsezi uključuju brojeve koji definišu opseg.

Aminokiselinske sekvence se pišu sleva nadesno u amino prema karboksi orijentaciji, osim ako nije drugačije naznačeno. Ovde obezbeđeni naslovi nisu ograničenja raznih aspekata ovog otkrivanja, koji se mogu uzeti kao pozivanje na specifikaciju kao celinu.

[0086] Gde god se načini ostvarivanja ili aspekti opisuju sa „koji obuhvatajuˮ, obezbeđeni su takođe inače analogni načini ostvarivanja ili aspekti koji se opisuju terminima „koji se sastoje odˮ i/ili „koji se suštinski sastoje odˮ.

[0087] Aminokiseline se ovde označavaju njihovim opštepoznatim troslovnim simbolima ili jednoslovnim simbolima preporučenim od strane IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission. Isto se tako nukleotidi označavaju njihovim opšteprihvaćenim jednoslovnim kodovima.

[0088] Termin „IL-21ˮ odnosi se na citokin interleukin-21 i/ili njegove aktivne fragmente. IL-21 se vezuje za IL-21 receptor na različitim ćelijama imunog sistema, prouzrokujući prenos signala u tim ćelijama kao što je ovde već opisano na drugom mestu. IL-21 je okarakterisan u većini uobičajenih sistema životinjskog modela. cDNK i aminokiselinske sekvence humanog IL-21 mogu se naći, na primer, u

1

GenBank pristupnim brojevima BC066260.1 (SEQ ID NO:1) i AAH69124.1 (SEQ ID NO:2). cDNK i aminokiselinske sekvence IL-21 makaki rakojeda (Macaca fascicularis) mogu se naći, na primer, kao SEQ ID NO: 3 (SEQ ID NO:3) i 4 (SEQ ID NO:4) u US Application Publication No.2008-0267910 A1.

[0089] Termini „inhibiraˮ, „blokiraˮ i „suzbijaˮ ovde se koriste jedni umesto drugih i označavaju svako statistički značajno smanjivanje biološke aktivnosti, uključujući potpuno blokiranje aktivnosti. Na primer, „inhibicijaˮ može označavati smanjivanje biološke aktivnosti od oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 100%. Prema tome, kada se termini „inhibicijaˮ ili „suzbijanjeˮ koriste da opišu, na primer, efekat na IL-21 put prenosa signala, na primer, na prenos signala u ćeliju koja eksprimira IL-21 receptor (IL-21R) u prisustvu IL-21, (na primer, STAT3 fosforilacija, proizvodnja interferon-game IFN-γ u NK ćelijama, diferencijacija B-ćelija u plazma ćelije ili inhibicija proliferacije humanih naivnih CD4+ T-ćelija pokrenuta IL-21), pri čemu termini označavaju mogućnost IL-21 vezujućih molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, da statistički značajno smanje prenos signala kroz IL-21 R prouzrokovan IL-21 u odnosu na prenos signala u netretiranim (kontrolnim) ćelijama. Ćelija koja eksprimira IL-21R može biti ćelija ili ćelijska linija koja se javlja prirodno (na primer, T-ćelija, B-ćelija, ćelija ubica (NK), dendritska ćelija ili drugi tip limfoidne ćelije) ili se može rekombinantno proizvesti uvođenjem nukleinske kiseline koja kodira IL-21 R u ćeliju domaćina. U jednom aspektu, IL-21 vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može inhibirati prenos signala u IL-21R-ekspresionu ćeliju posredovan IL-21 za najmanje 10%, ili najmanje 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90% ili oko 100%, kao što je određeno, na primer, protočnom citometrijom, vestern blotovanjem, ELISA-om ili drugim testovima kao što je opisano u Primerima u nastavku.

[0090] Termini „antiteloˮ ili „imunoglobulinˮ, kao što se ovde koriste jedan umesto drugog, uključuju cela antitela i njihov bilo koji antigen-vezujući fragment ili pojedinačni lanac.

[0091] Tipično antitelo obuhvata najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki se teški lanac sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca sastoji se od tri domena, CHI, CH2 i CH3. Svaki laki lanac sastoji se od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca sastoji se od jednog domena, CI. VH i VL regioni mogu se dalje deliti na hipervarijabilne regione, nazvane regionima koji određuju komplementarnost (CDR), ukrštene sa regionima koji su više očuvani, nazvani regioni okvira (FW). Svaki se VH i VL sastoji od tri CDR-a i četiri FW-a, raspoređenih od amino-terminusa do karboksi-terminusa u sledećem redu: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji ulazi u interakcije sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunog sistema (na primer, efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplemenata. Primerna antitela ovog otkrivanja uključuju hibridomom proizvedena mišja monoklonska antitela 19E3, 9F11, 8H10 i 8B6, humanizovana, sa

1

optimizovanim afinitetom, isklijana i/ili druge verzije ovih antitela i sa optimizovanim poluvremenom eliminacije u serumu anti-IL-21 YTE antitela (na primer, K44VHa-N56Q K44VHa6-N56Q ili K2Ha-N56Q).

[0092] Termin „isklijavanjeˮ znači da aminokiseline na specifičnim položajima u antitelu mutiraju nazad u liniju klice.

[0093] Termin „antiteloˮ može označavati molekul imunoglobulina koji prepoznaje i specifično se vezuje cilj, poput proteina, polipeptida, peptida, ugljenog hidrata, polinukleotida, lipida ili kombinacije prethodnih kroz najmanje jedno mesto prepoznavanja antigena unutar varijabilnog regiona molekula imunoglobulina. Termin „antiteloˮ kako se ovde koristi, obuhvata netaknuta poliklonska antitela, netaknuta monoklonska antitela, fragmente antitela (poput Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmenata), jednolančane Fv (scFv) mutante, multispecifična antitela poput bispecifičnih antitela dobijenih od najmanje dva netaknuta antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuziona proteina koja obuhvataju deo antitela koji određuje antigen, i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji obuhvata mesto prepoznavanja antigena dokle god antitela prikazuju željenu biološku aktivnost. Antitelo može pripadati bilo kojoj od pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM ili njegovim podklasama (izotipima) (na primer IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl i IgA2), na osnovu identiteta njihovih konstantnih domena teškog lanca koji se respektivno obeležavaju kao alfa, delta, epsilon, gama i mu. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije. Antitela mogu biti bez spoljnog omotača ili konjugovana do drugih molekula poput toksina, radioizotopa, itd.

[0094] „Blokirajućeˮ antitelo ili „antagonističkoˮ antitelo je ono koje inhibira ili smanjuje biološku aktivnost antigena kog vezuje, poput IL-21. U određenim aspektima, blokirajuća antitela ili antagonistička antitela suštinski ili potpuno inhibiraju biološku aktivnost antigena. Biološka aktivnost je poželjno smanjena za 10%, 20%, 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% ili čak 100%.

[0095] Termin „IL-21 antiteloˮ ili „antitelo koje se vezuje za IL-21ˮ ili „anti-IL-21ˮ označava antitelo koje je sposobno za vezivanje IL-21 sa zadovoljavajućim afinitetom tako da je to antitelo korisno kao terapijski agens ili dijagnostički reagens u ciljanju IL-21. Opseg vezivanja anti-IL-21 antitela za nepovezani, ne-IL-21 protein je manji od oko 10% od vezivanja antitela za IL-21 izmeren, na primer, radioimunotestom (RIA), BIACORE®-om (pomoću rekombinantnog IL-21 kao analita i antitela kao liganda ili obrnuto), KINEXA®-om ili drugim testovima vezivanja poznatim u struci. U određenim aspektima, antitelo koje se vezuje za IL-21 ima konstantu disocijacije (KD) od ≤ 1 µM, <100 nM, <10 nM, ≤ 1 nM, <0.1 nM, <10 pM, ≤ 1 pM ili <0.1 pM.

[0096] Termin „antigen-vezujući fragmentˮ označava deo netaknutog antitela i označava varijabilne regione koji određuju komplementarnost netaknutog antitela. Fragmenti antitela pune dužine mogu biti antigen-vezujući fragmenti antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente, linearna antitela, jednolančana antitela (na primer, ScFvs) i multispecifična antitela izvedena iz fragmenata antitela.

1

[0097] „Monoklonsko antiteloˮ (mAb) označava homogenu populaciju antitela uključenu u visokospecifično prepoznavanje i vezivanje pojedinačne antigenske determinante ili epitopa. Ovo je suprotno poliklonskim antitelima koja tipično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih antigenskih determinanti. Termin „monoklonsko antiteloˮ obuhvata i netaknuta i monoklonska tela pune dužine kao i fragmente antitela (poput Fab, Fab', F(ab')2, Fv), jednolančane (scFv) mutante, fuzione proteine koje obuhvataju deo antitela i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji obuhvata mesto prepoznavanja antigena. Nadalje, „monoklonsko antiteloˮ označava takva antitela stvorena na mnoštvo načina uključujući, ali ne ograničavajući se na, hibridomom, selekcijom faga, rekombinantnom ekspresijom i transgene životinje.

[0098] Termin „humanizovano antiteloˮ označava antitelo izvedeno iz nehumanog (na primer, mišjeg) imunoglobulina, koje je konstruisano da sadrži minimalno nehumanih (na primer, mišjih) sekvenci. Tipično, humanizovana antitela su humani imunoglobulini u kojima se ostaci od regiona koji određuju komplementarnost (CDR) zamenjuju ostacima iz CDR-a nehumanih vrsta (na primer, miša, pacova, zeca ili hrčka) koji imaju željenu specifičnost, afinitet i sposobnost (Jones etal, 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann etal, 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al, 1988, Science, 239:1534-1536). U nekim se slučajevima ostaci Fv regiona okvira (FW) humanog imunoglobulina zamenjuju odgovarajućim ostacima u antitelu iz nehumanih vrsta koje imaju željenu specifičnost, afinitet i sposobnost.

[0099] Humanizovana antitela mogu se modifikovati supstitucijom dodatnih ostataka ili u Fv regionu okvira i/ili unutar zamenjenih nehumanih ostataka radi rafiniranja i optimizacije specifičnosti, afiniteta, i/ili sposobnosti antitela. Humanizovana antitela će uglavnom obuhvatati suštinski sve od najmanje jednog, a tipično dva ili tri, varijabilna domena koja sadrže sve ili suštinski sve CDR regione koji odgovaraju nehumanom imunoglobulinu dok su svi ili suštinski svi FR regioni oni od konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo može takođe obuhvatati najmanje deo konstantnog regiona ili domena (Fc) imunoglobulina, tipično onog od humanog imunoglobulina. Primeri postupaka korišćenih za stvaranje humanizovanih antitela opisani su u U.S. Pat. Nos.5,225,539 ili 5,639,641.

[0100] „Varijabilni regionˮ antitela označava varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, ili same ili u kombinaciji. Svaki od varijabilnih regiona teškog i lakog lanca sastoji se od četiri regiona okvira (FW) povezanih trima regionima koji određuju komplementarnost (CDR-ovi) takođe poznatih kao hipervarijabilni regioni. CDR-ovi se u svakom lancu drže zajedno u neposrednoj blizini FW regiona i, sa CDR-ovima sa drugog lanca, doprinose obrazovanju antigen-vezujućeg mesta antitela. Postoje najmanje tehnike za određivanje CDR-ova: (1) pristup zasnovan na varijabilnosti sekvenci među vrstama (to jest, Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.)); i (2) pristup zasnovan na kristalografskim ispitivanjima antigen-antitelo kompleksa (Al-lazikani et al. (1997) J. Molec. Biol.273:927-948)). Uz to se kombinacije ova dva pristupa ponekad koriste u struci radi određivanja CDR-ova.

[0101] Kabatov sistem numerisanja uobičajeno se koristi kada se upućuje na ostatak u varijabilnom

2

domenu (otprilike ostaci 1-107 lakog lanca i ostaci 1-113 teškog lanca) (na primer, Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[0102] Numerisanje položaja aminokiselina kao u Kabatu, upućuje na sistem numerisanja koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca kompilacije antitela u Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). Upotrebom ovog sistema numerisanja, stvarna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju, ili umetanju u, FW ili CDR varijabilnog domena. Na primer, varijabilni domen teškog lanca može uključivati jedan aminokiselinski umetak (ostatak 52a prema Kabatu) posle ostatka 52 od H2 i umetnute ostatke (na primer, ostaci 82a, 82b i 82c, itd. prema Kabatu) posle ostatka 82 FW teškog lanca.

TABELA 1

[0103] Kabat numerisanje ostataka može se odrediti za dato antitelo poravnanjem kod regiona homologije sekvenci antitela sa „standardnomˮ Kabat numerisanom sekvencom. Umesto toga, Chothia upućuje na lokaciju strukturnih eza (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). Kada se numeriše pomoću konvencije Kabat numerisanja kraj Chothia CDR-H1 eze varira između H32 i H34 u zavisnosti od dužine eze (zato što Kabat šema numerisanja postavlja umetke kod H35A i H35B; ako ni 35A ni 35B nije prisutan, eza se završava na 32; ako je samo 35A prisutan, eza se završava na 33; ako su prisutni i 35A i 35B, eza se završava na 34). AbM hipervarijabilni regioni predstavljaju kompromis između Kabat CDR-ova i Chothia strukturnih eza, a koristi ih Oxford Molecular’s AbM antibody modeling softver.

Vidi Tabelu 1.

[0104] IMGT (ImMunoGeneTics) takođe obezbeđuje sistem numerisanja za varijabilne regione imunoglobulina, uključujući CDR-ove. Vidi na primer, Lefranc, M.P. et al., Dev. Comp. Immunol.27: 55-77(2003). IMGT sistem numerisanja zasnovan je na poravnanju više od 5,000 sekvenci, strukturnih podataka i karakterizacije hipervarijabilnih eza i dozvoljava lagano poređenje varijabilnih i CDR regiona za sve vrste. Prema IMGT šemi numerisanja VH-CDR1 je na položajima 26 do 35, VH-CDR2 je na položajima 51 do 57, VH-CDR3 je na položajima 93 do 102, VL-CDR1 je na položajima 27 do 32, VL-CDR2 je na položajima 50 do 52 i VL-CDR3 je na položajima 89 do 97.

[0105] Kao što se koriste kroz specifikaciju, opisane VH CDR sekvence odgovaraju klasičnim lokacijama prema Kabat numerisanju, to jest Kabat VH-CDR1 je na položajima 31-35, VH-CDR2 je na položajima 50-65 i VH-CDR3 je na položajima 95-102. VL-CDR1, VL-CDR2 i VL-CDR3 takođe odgovaraju klasičnim lokacijama prema Kabat numerisanju, to jest položajima 24-34, 50-56 i 89-97, respektivno.

[0106] Termin „humano antiteloˮ označava antitelo proizvedeno od strane čoveka ili antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara antitelu koje je proizveo čovek stvoreno pomoću bilo koje tehnike poznate struci. Ova definicija humanog antitela uključuje netaknuta ili antitela pune dužine, njihove fragmente i/ili antitela koja obuhvataju najmanje jedan polipeptid humanog teškog i/ili lakog lanca poput, na primer, antitela koje obuhvata polipeptide mišjeg lakog lanca i humanog teškog lanca.

[0107] Termin „himerna antitelaˮ označava antitela u kojima je aminokiselinska sekvenca molekula imunoglobulina izvedena iz dve ili više vrsta. Tipično, varijabilni region i lakog i teškog lanca odgovara varijabilnom regionu antitela izvedenog iz jedne vrste sisara (na primer, miša, pacova, zeca, itd) sa željenom specifičnošću, afinitetom i sposobnošću dok su konstantni regioni homologni sekvencama u antitelima izvedenim iz druge (obično čoveka) kako bi se izbeglo izazivanje imunog odgovora kod te vrste.

[0108] Termini „YTEˮ ili „YTE mutantˮ označavaju mutaciju u IgGl Fc koja rezultuje povećanjem vezivanja za humani FcRn i unapređuje poluvreme eliminacije antitela koje ima mutaciju u serumu. YTE mutant obuhvata kombinaciju tri mutacije, M252Y/S254T/T256E (EU numbering Kabat etal. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Public Health Service, National Institutes of Health, Washington, D.C.), uvedene u teški lanac IgGl. Vidi U.S. Patent No.7,658,921. Pokazalo se da YTE mutant povećava poluvreme eliminacije antitela u serumu približno četiri puta u poređenju sa verzijama divljeg tipa istog antitela (Dall’Acqua et al., J. Biol. Chem.281:23514-24 (2006); Robbie et al., (2013) Antimicrob. Agents Chemother.57, 6147-6153). Vidi takođe U.S. Patent No.7,083,784.

[0109] „Vezujući afinitetˮ uobičajeno označava čvrstinu ukupnog rezultata nekovalentnih interakcija između pojedinačnog vezujućeg mesta molekula (na primer, antitela) i njegovog vezujućeg partnera (na primer, antigena). „Vezujući afinitetˮ, kao što se ovde koristi, označava intrinzični vezujući afinitet koji odražava 1:1 interakciju između članova vezujućeg para (na primer, antitela i antigena), osim ukoliko je drugačije naznačeno. Afinitet molekula X za njegovog partnera Y može se uobičajeno predstaviti konstantom disocijacije (KD). Afinitet se može izmeriti uobičajenim postupcima poznatim u struci, uključujući one koji su ovde opisani. Antitela niskog afiniteta uobičajeno sporo vezuju antigen i imaju tendenciju da se brzo razdvoje, dok antitela visokog afiniteta uobičajeno brže vezuju antigen i imaju tendenciju da ostanu vezani duže. U struci je poznato mnoštvo postupaka za merenje vezujućeg afiniteta i bilo koji od njih se može koristiti za potrebe ovog otkrivanja.

[0110] „Potencijaˮ se obično eksprimira kao IC50vrednost, u nM ili pM osim ukoliko je drugačije navedeno. IC50je srednja inhibitorna koncentracija molekula antitela. U funkcionalnim testovima, IC50je koncentracija koja smanjuje biološki odgovor za 50% od njegovog maksimuma. U ispitivanjima vezivanja liganda, IC50je koncentracija koja smanjuje vezivanje receptora za 50% od maksimalnog specifičnog nivoa vezivanja. IC50se može izračunati bilo kojim od raznih sredstava poznatim u struci.

[0111] Poboljšanje u potenciji za antitela ili polipeptide prema ovom otkrivanju u poređenju sa referentnim antitelom može biti najmanje od oko 2 puta, najmanje od oko 4 puta, najmanje od oko 6 puta, najmanje od oko 8 puta, najmanje od oko 10 puta, najmanje od oko 20 puta, najmanje od oko 30 puta, najmanje od oko 40 puta, najmanje od oko 50 puta, najmanje od oko 60 puta, najmanje od oko 70 puta, najmanje od oko 80 puta, najmanje od oko 90 puta, najmanje od oko 100 puta, najmanje od oko 110 puta, najmanje od oko 120 puta, najmanje od oko 130 puta, najmanje od oko 140 puta, najmanje od oko 150 puta, najmanje od oko 160 puta, najmanje od oko 170 puta ili najmanje od oko 180 puta ili više.

[0112] „Citotoksičnost koja zavisi od antitela ˮ ili „ADCCˮ označava oblik citotoksičnosti u kojoj sekretovani Ig vezan za Fc receptore (FcR) prisutan u određenim citotoksičnim ćelijama (na primer, ćelijama ubicama (NK), neutrofilima i makrofagima) omogućava da se ove citotoksične efektorske ćelije specifično vezuju za ciljanu ćeliju koja nosi antigen i kasnije ubiju ciljanu ćeliju citotoksinima. Specifična IgG antitela visokog afiniteta usmerena ka površini ciljanih ćelija „naoružavajuˮ citotoksične ćelije i apsolutno su potrebne za takvo ubijanje. Liza ciljane ćelije je vanćelijska, zahteva direktan ćelija-na-ćeliju kontakt, i ne uključuje komplement. Smatra se da će, uz antitela, drugi proteini koji obuhvataju Fc regione, specifično Fc fuzioni proteini, koji imaju sposobnost da se specifično vezuju za ciljanu ćeliju koja nosi antigen moći da utiču na citotoksičnost posredovanu ćelijom. Radi jednostavnosti, ovde se citotoksičnost posredovana ćelijom koja rezultuje iz aktivnosti Fc fuzionog proteina takođe označava kao ADCC aktivnost.

[0113] Polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili kompozicija koja je „izolovanaˮ predstavlja polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćeliju ili kompoziciju koja je u obliku koji se ne može pronaći u prirodi. Izolovani polipeptidi, antitela, polinukleotidi, vektori, ćelije ili kompozicije uključuju one koje su prečišćene do stepena da više nisu u obliku u kom se mogu naći u prirodi. U nekim je aspektima antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili kompozicija koja je izolovana je suštinski čista.

[0114] Pod „subjektomˮ ili „individuomˮ ili „životinjomˮ ili „pacijentomˮ ili „sisaromˮ podrazumeva se bilo koji subjekat, naročito sisarski subjekat, za kog je poželjna dijagnoza, prognoza ili terapija. Sisarski subjekti uključuju ljude, domaće životinje, životinje sa farme, životinje u sportu i životinje iz zoo vrta

2

uključujući, na primer, ljude, nehumane primate, kučiće, mačiće, morske prasiće, zečeve, pacove, miševe, konje, goveda, medvede i tako dalje.

[0115] Termin „farmaceutska kompozicijaˮ označava preparat koji je u takvom obliku da dozvoljava da biološka aktivnost aktivne komponenta bude efektivna i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksične za subjekta kom bi se kompozicija davala. Takva kompozicija može biti sterilna.

[0116] „Efektivna količinaˮ antitela kao što je ovde opisana jeste količina dovoljna da izvede specifično navedeni cilj. „Efektivna količinaˮ može se odrediti empirijski i na rutinski način, u odnosu na navedeni cilj.

[0117] Reč „oznakaˮ kada se ovde koristi označava jedinjenje ili kompoziciju koja se može detektovati, koja je konjugovana direktno ili indirektno u antitelo da bi se stvorilo „označenoˮ antitelo. Oznaka može biti podložna detektovanju sama po sebi (na primer, radioizotopske oznake ili fluorescentne oznake) ili, u slučaju enzimske oznake, može katalizovati hemijsku alteraciju jedinjenja ili kompozicije supstrata koji se može detektovati.

[0118] Termini poput „tretiranjeˮ ili „lečenjeˮ ili „lečitiˮ ili „ublažavanjeˮ ili „ublažitiˮ označavaju terapijske mere koje leče, usporavaju, smanjuju simptome i/ili zaustavljaju napredovanje dijagnostikovanog patološkog stanja ili poremećaja. Dakle, oni kojima je lečenje potrebno uključuju one koji već boluju od poremećaja. U određenim aspektima, subjekat se uspešno „lečiˮ od zapaljenske, imunski posredovane ili autoimune bolesti ili poremećaja u skladu sa ovde obezbeđenim postupcima ukoliko pacijent pokazuje, na primer, potpuno, delimično ili prolazno ublažavanje ili eliminaciju simptoma povezanih sa bolešću ili poremećajem.

[0119] „Sprečitiˮ ili „prevencijaˮ označava profilaktičke ili preventivne mere koje sprečavaju i/ili usporavaju razvoj ciljanog patološkog stanja ili poremećaja. Dakle, oni kojima je prevencija potrebna uključuju one koji su skloni ili podložni poremećaju. U određenim je aspektima zapaljenska, imunski posredovana ili autoimuna bolest ili poremećaj uspešno sprečena u skladu sa ovde obezbeđenim postupcima ukoliko pacijent razvije, na primer, tranzijetno ili permanento, manje ili manje opasne simptome povezane sa bolešću ili poremećajem ili u slučaju kasnijeg javljanja simptoma povezanih sa bolešću ili poremećajem od pacijenta koji nije bio subjekat ovih postupaka prema ovom otkrivanju.

[0120] „Polinukleotidˮ kao što se ovde koristi može uključivati jednu ili više „nukleinskih kiselinaˮ, „molekula nukleinskih kiselinaˮ ili „sekvenci nukleinskih kiselinaˮ i označava polimer nukleotida bilo koje dužine i uključuje DNK i RNK. Polinukleotidi mogu biti dezoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze i/ili njihovi analozi ili bilo koji supstrat koji se DNK ili RNK polimerazom može inkorporisati u polimer. Polinukleotid može obuhvatati modifikovane nukleotide, poput metilovanih nukleotida i njihovih analoga. Ovaj prethodni opis odnosi se na ovde označene polinukleotide, uključujući RNK i DNK.

[0121] Termin „vektorˮ označava konstrukt, koji je sposoban da dostavi, i u nekim aspektima, da eksprimira, jedan ili više gena ili sekvenci od interesa u ćeliji domaćinu. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, viralne vektore, DNK ili RNK ekspresione vektore bez spoljnog omotača, plazmid, kozmid ili fagne vektore, DNK ili RNK ekspresione vektore povezane sa katjonskim kondenzujućim agensima, DNK ili RNK ekspresione vektore inkapsulirane u lipozomima i određene eukariotske ćelije, poput proizvodnih ćelija.

[0122] Termini „polipeptidˮ, „peptidˮ i „proteinˮ ovde se koriste jedan umesto drugog da označe polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti linearan ili račvast, može obuhvatati modifikovane aminokiseline, a neaminokiseline ih mogu prekinuti. Termini takođe obuhvataju aminokiselinski polimer koji je prirodno ili intervencijom modifikovan; na primer, obrazovanjem disulfidne veze, glikozilacijom, lipidacijom, acetilacijom, fosforilacijom ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, poput konjugacije sa komponentom za označavanje. Takođe su uključeni unutar definicije, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiselina (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline, itd), kao i druge modifikacije poznate u struci.

Podrazumeva se da se u određenim aspektima polipeptidi mogu javiti kao pojedinačni lanci ili povezani lanci jer su polipeptidi prema ovom otkrivanju zasnovani na antitelima.

[0123] Termini „identičanˮ ili procenat „identičnostiˮ u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptida, označavaju dve ili više sekvence ili subsekvence koje su iste ili imaju specifičan postotak nukleotida ili aminokiselinske ostatke koji su isti, kada se uporede i poravnaju (uvodeći razmake, ukoliko je potrebno) radi maksimalnog podudaranja, ne računajući bilo koje konzervativne aminokiselinske supstitucije kao deo identiteta sekvence. Procenat identičnosti može se izmeriti pomoću softvera ili algoritama za poređenje sekvenci ili vizualnim pregledom. U struci su poznati različiti algoritmi i softveri koji mogu se koristiti za dobijanje poravnanja aminokiselinskih ili nukleotidnih sekvenci.

[0124] Jedan takav neograničavajući primer algoritma za poravnanje sekvenci je algoritam opisan u Karlin et al, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268, kao što je modifikovan u Karlin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:5873-5877, i inkorporisan u NBLAST i XBLAST programe (Altschul et al., 1991, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402). U određenim aspektima, Gapped BLAST se može koristiti kao što je opisano u Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402. BLAST-2, WU-BLAST-2 (Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology, 266:460-480), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) ili Megalign (DNASTAR) su dodatni javno dostupni softverski programi koji se mogu koristiti za poravnanje sekvenci. U određenim aspektima, procenat identičnosti između dve nukleotidne sekvence određuje se pomoću GAP programa u GCG softverskom paketu (na primer, pomoću NWSgapdna.CMP matrice i razmaka reda veličine od 40, 50, 60, 70 ili 90 i dužine reda veličine od 1, 2, 3, 4, 5 ili 6). U određenim alternativnim aspektima, GAP program u GCG softverskom paketu, koji inkorporiše algoritam od Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) može se koristiti za određivanje procenta identičnosti između dve aminokiselinske sekvence (na primer, pomoću ili BLOSUM 62 matrice ili PAM250 matrice i razmaka reda veličine od 16, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i dužine reda veličine od 1, 2, 3, 4, 5). Alternativno, u određenim se aspektima procenat identičnosti između nukleotidnih ili aminokiselinskih

2

sekvenci određuje pomoću algoritma od Myers and Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)). Na primer, procenat identičnosti može se odrediti pomoću ALIGN programa (verzije 2.0) i pomoću PAM120 sa tabelom ostataka, sa prekoračenjem dužine razmaka od 12 i prekoračenjem razmaka od 4. Stručnjak iz ove oblasti može odrediti prigodne parametre za maksimalno poravnanje naročitim softverom za poravnanje. U određenim se aspektima koriste podrazumevane vrednosti softvera za poravnanje.

[0125] U određenim aspektima, postotak identičnosti „Xˮ prve aminokiselinske sekvence sa drugom aminokiselinskom sekvencom izračunat je kao 100 x (Y/Z), gde je Y broj aminokiselinskih ostataka dobijen kao broj identičnih poklapanja u poravnanju prve i druge sekvence (poravnate vizuelnim pregledom ili naročitim programom za poravnanje sekvenci), a Z je ukupan broj ostataka u drugoj sekvenci. Ako je prva sekvenca duža od druge sekvence, procenat identičnosti prve sekvence sa drugom sekvencom biće viši od procenta identičnosti druge sekvence sa prvom sekvencom.

[0126] „Konzervativna aminokiselinska supstitucijaˮ je ona u kojoj je jedan aminokiselinski ostatak zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koje imaju slične bočne lance definisane su u stanju tehnike, uključujući bazne bočne lance (na primer, lizina, arginina, histidina), kisele bočne lance (na primer, asparaginske kiseline, glutaminske kiseline), nenaelektrisane polarne bočne lance (na primer, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirozina, cisteina), nepolarne bočne lance (na primer, glicina, alanina, valina, leucina, izoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofana), beta-račvaste bočne lance (na primer, treonina, valina, izoleucina) i aromatične bočne lance (na primer, tirozina, fenilalanina, triptofana, histidina). Na primer, supstitucija fenilalanina tirozinom je konzervativna supstitucija. U određenim aspektima, konzervativne supstitucije u sekvencama polipeptida i antitela prema ovom otkrivanju ne ukidaju vezivanje polipeptida ili antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu, za antigen(e), to jest, IL-21 za koji se polipeptid ili antitelo vezuje. Postupci za identifikovanje nukleotidnih i aminokiselinskih konzervativnih supstitucija koje ne eliminišu antigen-vezujući dobro su poznati u struci (vidi, na primer, Brummell etal, Biochem.32: 1180-1187 (1993); Kobayashi etal, Protein Eng.12(10):879-884 (1999); i Burks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:.412-417 (1997)).

II. Anti-IL-21-vezujući molekuli

[0127] Ovo otkrivanje obezbeđuje IL-21 vezujuće molekule, na primer, anti-IL-21 antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji se specifično vezuju za IL-21. U stanju tehnike su poznate aminokiselinske (aa) i nukleotidne (nt) sekvence pune dužine za IL-21. Vidi, na primer, GenBank pristupni br. BC066260.1 (SEQ ID NO:1) i AAH69124.1 (SEQ ID NO:2), respektivno, za humani IL-21 ili US Patent Application Publication No.2008-0267910 A1 za IL-21 makaki rakojeda (Macaca fasciculari) (SEQ ID NO: 3 i 4, respektivno). U nekim aspektima, IL-21 vezujući molekuli, na primer, ovde obezbeđena anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti su mišja antitela, humanizovana antitela ili humana

2

antitela. U određenim aspektima, IL-21 vezujući molekuli su antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti. U nekim aspektima, IL-21 vezujući molekuli, na primer, anti-IL-21 antitela ili njihovi antigenvezujući fragmenti obuhvataju Fab, Fab', F(ab')2, Fd, jednolančani Fv ili scFv, disulfid vezan za Fv, V-NAR domen, IgNar, intratelo, IgGACH2, minitelo, F(ab')3 tetratelo, triatelo, diatelo, antitelo sa jednim domenom, DVD-Ig, Fcab, mAb<2>, (scFv)2ili scFv-Fc. U nekim aspektima, antitelo je iz IgGl podtipa i obuhvata trostruki mutirani YTE, koji je opisan supra u odeljku Definicije. Određena anti-IL-21 antitela ili njihovi fragmenti obezbeđeni su u Tabeli 2 u odeljku sa primerima.

[0128] U određenim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje IL-21 vezujući molekul ili njegov antigenvezujući fragment, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se može specifično vezivati za isti IL-21 epitop kao i antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata varijabilni region (VH) teškog lanca i varijabilni region (VH) lakog lanca od 19E3, 9F11, 8B6 ili 9H10. Takođe je obezbeđen IL-21 vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji može kompetitivno inhibirati ili se može vezivati za IL-21 sa većim afinitetom od antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta koji obuhvata VH i VL od 19E3, 9F11, 8B6 ili 9H10. Kao što je ovde obezbeđeno, VH i VL od 19E3 respektivno obuhvataju SEQ ID NO: 6 i 11, VH i VL od 9F11 respektivno obuhvataju SEQ ID NO: 28 i 33, VH i VL od 8B6 respektivno obuhvataju SEQ ID NO: 42 i 47, i VH i VL od 9H10 respektivno obuhvataju SEQ ID NO: 52 i 57.

[0129] Ovo otkrivanje dalje obezbeđuje IL-21 vezujući molekul ili antigen-vezujući fragment, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, uključujući VL region antitela. U određenim aspektima VL region uključuje jedan, dva ili tri VL-CDR-a poput VLCDR1 identičnog, ili identičnog osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 48 ili SEQ ID NO: 58, VLCDR2 identičnog ili identičnog osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 59 ili VLCDR3 identičnog ili identičnog osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 50 ili SEQ ID NO: 60. U određenim aspektima VL region sadrži VL-CDR1, VL-CDR2 i VL-CDR3 aminokiselinske sekvence identične, ili identične osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više VL-CDR-ova: SEQ ID NO: 12, 13 i 14, SEQ ID NO: 34, 35 i 36, SEQ ID NO: 48, 49 i 50 ili SEQ ID NO: 58, 59 i 60, respektivno. U određenim aspektima, VL region obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47 ili SEQ ID NO: 57.

[0130] Dalje je obezbeđen vezujući molekul ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji uključuje VH region antitela. U određenim aspektima VH region uključuje jedan, dva ili tri VH-CDR-a poput VHCDR1 identičnog ili identičnog osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku

2

supstituciju SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 43 ili SEQ ID NO: 53, VHCDR2 identičnog ili identičnog osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 44 ili SEQ ID NO: 54 ili VHCDR3 identičnog ili identičnog osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 45 ili SEQ ID NO: 55. U određenim aspektima VH region sadrži VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 aminokiselinske sekvence identične ili identične osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više VH-CDR-ova: SEQ ID NO: 7, 8 i 9, SEQ ID NO: 29, 30 i 31, SEQ ID NO: 43, 44 i 45 ili SEQ ID NO: 53, 54 i 55, respektivno. U određenim aspektima, VH region obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42 ili SEQ ID NO: 52.

[0131] U naročitim aspektima, ovde obezbeđeni IL-21 vezujući molekul obuhvata anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. Na primer, ovo otkrivanje obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21 koji obuhvata VL region i VH region, gde VL i VH zajednički obuhvataju VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 aminokiselinske sekvence identične ili identične osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više CDR-ova: SEQ ID NO: 12, 13, 14, 7, 8 i 9, SEQ ID NO: 34, 35, 36, 29, 30 i 31, SEQ ID NO: 48, 49, 50, 43, 44 i 45 ili SEQ ID NO: 58, 59, 60, 53, 54 i 55, respektivno.

[0132] Na primer, ovo otkrivanje obezbeđuje izolovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21 koji obuhvata VH i VL, gde VH i VL respektivno sadrže aminokiselinske sekvence najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identične referentnim aminokiselinskim sekvencama SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 i SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 i SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37 i SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 37 i 40, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 47 ili SEQ ID NO: 52 i SEQ ID NO: 57, respektivno.

[0133] U jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata VH i VL od K44VHa-N56Q, VH aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19 i VL aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21.

[0134] Ovde obezbeđeno anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, na primer, kao što je gore opisano može biti, na primer, mišje antitelo, humanizovano antitelo, himerno antitelo, monoklonsko antitelo, poliklonsko antitelo, rekombinantno antitelo, multispecifično antitelo ili bilo koja njihova kombinacija. Antigen-vezujući fragment anti-IL-21 antitela može biti Fv fragment, Fab fragment, F(ab')2 fragment, Fab' fragment, dsFv fragment, scFv fragment ili sc(Fv)2 fragment.

[0135] U jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se može vezivati za IL-21 molekule raznih vrsta, na primer, antitelo ili fragment može se vezati za mišji IL-21, IL-21 pacova, zečji IL-21, humani IL-21 i/ili IL-21 makaki rakojeda. Na primer, antitelo

2

ili fragment može se vezati za humani IL-21 i IL-21 makaki rakojeda. U daljem se primeru antitelo ili fragment može takođe vezivati za mišji IL-21.

[0136] IL-21 receptor deli zajednički gama lanac sa mnoštvom drugih citokinskih receptora, na primer, IL-2R, IL-4R, IL-7R, IL-9R i IL-15R. U ovde obezbeđenim određenim aspektima, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen vezujući fragment može se specifično vezivati za IL-21, na primer, humani IL-21 i IL-21 makaki rakojeda i mišji IL-21, ali se ne vezuje specifično za humani IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 ili IL-15.

[0137] Ovde obezbeđeno anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, na primer, kao što je ovde opisano, može uključivati, uz VH i VL, konstantni region teškog lanca ili njegov fragment. U određenim aspektima konstantni region teškog lanca je humani konstantni region teškog lanca, na primer, humani IgG konstantni region, na primer, humani IgGl konstantni region. Kao što je ovde opisano na drugom mestu, u određenim aspektima konstantni region teškog lanca ili njegov fragment, na primer, humani IgG konstantni region ili njegov fragment, može uključivati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u odnosu na IgG konstantni domen divljeg tipa pri čemu modifikovani IgG ima uvećano poluvreme eliminacije u poređenju sa poluvremenom eliminacije IgG koji ima IgG konstantni domen divljeg tipa. Na primer, IgG konstantni domen može sadržati jednu ili više aminokiselinskih supstitucija aminokiselinskih ostataka na položajima 251-257, 285-290, 308-314, 385-389 i 428-436, pri čemu je numerisanje aminokiselinskih položaja u skladu sa EU indeksom kakav je izložen u Kabatu. U određenim aspektima IgG konstantni domen može sadržati jednu ili više supstitucija aminokiseline na Kabat položaju 252 tirozinom (Y), fenilalaninom (F), triptofanom (W) ili treoninom (T), supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 254 treoninom (T), supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 256 serinom (S), argininom (R), glutaminom (Q), glutaminskom kiselinom (E), asparaginskom kiselinom (D) ili treoninom (T), supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 257 leucinom (L), supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 309 prolinom (P), supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 311 serinom (S), supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 428 treoninom (T), leucinom (L), fenilalaninom (F) ili serinom (S), supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 433 argininom (R), serinom (S), izoleucinom (I), prolinom (P) ili glutaminom (Q) ili supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 434 triptofanom (W), metioninom (M), serinom (S), histidinom (H), fenilalaninom (F) ili tirozinom. Tačnije, IgG konstantni domen može sadržati aminokiselinske supstitucije u odnosu na humani IgG konstantni domen divljeg tipa koji uključuje kao supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 252 tirozinom (Y), supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 254 treoninom (T) i supstituciju aminokiseline na Kabat položaju 256 glutaminskom kiselinom (E).

[0138] Ovo otkrivanje obezbeđuje anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment gde teški lanac predstavlja humanog IgGl YTE mutanta, na primer, teški lanac može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu teškog lanca najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 ili SEQ ID NO: 24.

[0139] Ovde obezbeđeno anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, na primer, kao što je

2

gore opisano, može uključivati, uz VH i VL, i opciono konstantni region teškog lanca ili njegov fragment, konstantni region lakog lanca ili njegov fragment. U određenim aspektima konstantni region lakog lanca je kapa lambda konstantni region lakog lanca, na primer, humani kapa konstanti region ili humani lambda konstantni region. U specifičnom aspektu, konstantni region lakog lanca je humani kapa konstanti region.

[0140] Ovo otkrivanje obezbeđuje anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment gde laki lanac sadrži humani kapa konstanti region, na primer, laki lanac može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu lakog lanca najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 26. U određenim aspektima ovo otkrivanje obezbeđuje anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata humani IgGl YTE teški lanac i humani kapa laki lanac, gde se antitelo respektivno sastoji od SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 24 i SEQ ID NO: 26 ili bilo koji njegov antigen-vezujući fragment.

[0141] Ovde obezbeđena anti-IL-21 antitela ili njihovi fragmenti mogu imati blagotvorna svojstva. Na primer, antitelo ili njegov fragment može inhibirati, suzbijati ili blokirati vezivanje IL-21 za IL-21 receptor, na primer, eksprimiran na T-ćeliji, B-ćeliji, NK ćeliji, NKT ćeliji ili dendritskoj ćeliji ili rekombinantno eksprimiran na nelimfoidnoj ćeliji. Kao dalji primer, antitelo ili njegov fragment može inhibirati vezivanje humanog ili cino IL-21 za humani ili cino IL-21 receptor, ali ne inhibira vezivanje mišjeg IL-21 za mišji IL-21 receptor. Takvo anti-IL-21 antitelo ili njegov fragment može dalje inhibirati, suzbijati ili blokirati različite aktivnosti posredovane IL-21, to jest, antitelo ili fragment može biti antagonist aktivnosti IL-21. U određenim aspektima, ovde obezbeđeno anti-IL-21 antitelo ili njegov fragment može inhibirati, suzbijati ili blokirati fosforilaciju u Jak/STAT putu posredovanu IL-21, na primer, inhibirati, suzbijati ili blokirati STAT3 fosforilaciju, u IL-21R-ekspresionim ćelijama, na primer, u humanim mononuklearnim ćelijama periferne krvi (PBMC).

[0142] U određenim aspektima, ovde obezbeđeno anti-IL-21 antitelo ili njegov fragment može inhibirati, suzbijati ili blokirati proizvodnju interferon-game (IFN-y) od strane NK ćelija posredovanu IL-21. Takva inhibicija može biti od NK ćelija koje se prirodno mogu javiti, na primer, humanih NK ćelija ili kultivisanih NK ćelija, na primer, NK-92 ćelija.

[0143] U naročitim aspektima, ovde obezbeđeno anti-IL-21 antitelo ili njegov fragment može inhibirati, suzbijati ili blokirati aktivaciju, diferencijaciju ili smrt B-ćelije posredovanu IL-21 tokom odgovora humoralnog imuniteta. Na primer, ovde obezbeđeno anti-IL-21 antitelo ili njegov fragment može inhibirati, suzbijati ili blokirati B-ćelijsku diferencijaciju stimulisanih B-ćelija u plazma ćelije posredovanu IL-21. Određena ovde obezbeđena antitela mogu inhibirati, suzbijati ili blokirati diferencijaciju stimulisanih B-ćelija u plazma ćelije posredovanu humanim i IL-21 makaki rakojeda. U određenim aspektima, B-ćelije mogu biti izolovane B-ćelije kojima se egzogeno dodaje IL-21. U drugim aspektima B-ćelije mogu biti u kontaktu sa, ili prirodno ili kokultivacijom, aktiviranim CD4+ T-ćelijama koje eksprimiraju IL-21. U drugim aspektima humane B-ćelije mogu biti u kontaktu sa, ili prirodno ili kokultivacijom, humanim aktiviranim CD4+ T-ćelijama koje eksprimiraju IL-21.

[0144] U određenim aspektima, ovde obezbeđeno antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se vezati za IL-21 sa vezujućim afinitetom koji odlikuje konstanta disocijacije (KD) od oko 100 pM do oko 0.1 pM izmerena na Kinetic Exclusion Assay (KinExA) 3000 platformi.

[0145] U određenim se aspektima anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može specifično vezivati za IL-21, na primer, humani IL-21 ili IL-21 makaki rakojeda, i njegove antigenske fragmente sa konstantom disocijacije ili KDmanjom od 10<∼6>M ili manjom od 10<∼7>M ili manjom od 10-

<8>M ili manjom od 10<-9>M ili manjom od 10<-10>M ili manjom od 10<-11>M, manjom od 10<-12>M, manjom od 10<-13>M, manjom od 10<-14>M ili manjom od 10<-15>M izmerenom, na primer, KINEXA®-om ili BIACORE®-om. U jednom aspektu, humanizovano anti-IL-21 antitelo K44VHa-N56Q može se vezivati za humani IL-21 sa KDoko 515 fM (515 x 10<-15>M) i IL-21 makaki rakojeda sa KDod oko 352 fM (352 x 10<∼15>M) izmerenom KINEXA®-om.

[0146] U drugom aspektu anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom otkrivanju vezuje se za IL-21 i/ili njegove antigenske fragmente sa Koffmanjom od 1x1O<-3>s<-1>ili manjom od 2x10<∼3>s-

<1>. U drugim aspektima, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment vezuje se za IL-21 i njegove antigenske fragmente sa Koffmanjom od 10<∼3>s-<1>, manjom od 5x10<∼3>s-<1>, manjom od 1O<-4>s-<1>, manjom od 5X10<-4>s-<1>, manjom od 10<-5>s<-1>, manjom od 5x10<-5>s<-1>, manjom od 10<-6>s<-1>, manjom od 5X10<-6>s-

<1>, manjom od 5x10<-7>s<-1>, manjom od 10<-8>s<-1>, manjom od 5x10<-8>s<-1>, manjom od 10<-9>s<-1>, manjom od 5x10-

<9>s<-1>ili manjom od 10<-10>s<-1>izmerenom, na primer, KINEXA®-om ili BIACORE®-om.

[0147] U drugom aspektu anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment prema ovom otkrivanju vezuje se za IL-21 i/ili njegove antigenske fragmente sa konstantom brzine vezivanja ili kon brzinom od najmanje 10<5>M-<1>s-<1>, najmanje 5x10<5>M-<1>s-<1>, najmanje 10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 5x10<6>M<-1>s<-1>, najmanje 10<7>M<-1>s<-1>, najmanje 5x10<7>M<-1>s<-1>, ili najmanje 10<8>M<-1>s<-1>ili najmanje 10<9>M<-1>s<-1>izmerenom, na primer, KINEXA®-om ili BIACORE®-om.

[0148] Kao što je gore navedeno, VH i/ili VL aminokiselinska sekvenca može biti, na primer, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% slična ovde izloženoj sekvenci i/ili obuhvata 1, 2, 3, 4, 5 ili više supstitucija, na primer, konzervativnih supstitucija u odnosu na ovde izloženu sekvencu. IL-21 antitelo koje ima VH i VL regione koji imaju određeni procenat sličnosti sa VH regionom ili VL regionom ili ima jednu ili više supstitucija, na primer, konzervativnih supstitucija može se dobiti mutagenezom (na primer, usmerenom ka mestu ili PCR-posredovanom mutagenezom) molekula nukleinske kiseline koji kodiraju ovde opisane VH i/ili VL regione, praćenom testiranjem kodiranog alteriranog antitela na vezivanje za IL-21 i opciono testiranjem na zadržanu funkciju pomoću ovde opisanih funkcionalnih testova.

[0149] Afinitet ili avidnost antitela za antigenom može se eksperimentalno utvrditi pomoću bilo kog postupka dobro poznatog u struci, na primer, protočnom citometrijom, imunoenzimskom probom (ELISA) ili radioimunotestom (RIA) ili kinetikama (na primer, KINEXA® ili BIACORE™ analizom). Formati

1

testova za direktno vezivanje kao i testova za kompetitivno vezivanje mogu se lako primeniti. (Vidi, na primer, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, N.Y. (1984); Kuby, Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, N.Y. (1992); i ovde opisane postupke). Izmereni afinitet naročite antitelo-antigen interakcije može varirati ako se meri pod različitim uslovima (na primer, koncentracija soli, pH, temperatura). Dakle, merenja afiniteta i drugih antigen-vezujućih parametara (na primer, 3⁄4 ili Kd, Kon, Koff) izvedena su sa standardizovanim rastvorima antitela i antigena, i standardizovanim puferom, kakvi su poznati u struci i poput ovde opisanog pufera.

[0150] Ovo otkrivanje dalje obezbeđuje gore opisano anti-IL-21 antitelo ili njegov fragment, gde se antitelo konjuguje u heterologni agens. U određenim aspektima taj agens može biti antimikrobni agens, terapijski agens, prolek, peptid, protein, enzim, lipid, modifikator biološkog odgovora, farmaceutski agens, limfokin, heterologno antitelo ili njegov fragment, oznaka koja se može detektovati, polietilenglikol (PEG) ili kombinacija dva ili više bilo kojih pomenutih agenasa. Heterokonjugovana anti-IL-21 antitela su ovde detaljnije razmotrena na drugom mestu.

[0151] U određenim aspektima, IL-21-vezujući molekul je polipeptid koji nije antitelo. U struci je poznato mnoštvo postupaka za identifikovanje i proizvodnju polipeptida koji nisu antitela, koji se vezuju sa velikim afinitetom za ciljani protein. Vidi, na primer, Skerra, Curr. Opin. BiotechnoL, 18:295-304 (2007), Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006), Gill et al., Curr. Opin. BiotechnoL, 17:653-658 (2006), Nygren, FEBS J., 275:2668-76 (2008) i Skerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008). U određenim aspektima, tehnologija prikaza faga može se koristiti za identifikovanje/proizvodnju IL-21-vezujućeg polipeptida. U određenim aspektima, polipeptid obuhvata tip proteinske osnove odabran iz grupe koju čine protein A, lipokalin, fibronektinski domen, domen ankirinskog konsenzusnog ponavljanja i tioredoksin.

III. Vezujući molekuli koji se vezuju za isti epitop kao anti-IL-21 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti

[0152] U određenim aspektima ovo otkrivanje obezbeđuje IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za isti epitop kao to što čine razna ovde opisana anti-IL-21 antitela. Termin „epitopˮ kako se ovde koristi označava ciljnu proteinsku determinantu koja je u stanju da se vezuje za antitelo prema ovom otkrivanju. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula poput aminokiselinskih ili bočnih lanaca šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Razlika između konformacionih i nekonformacionih epitopa je u tome što se vezivanje za prve, ali ne i druge gubi u prisustvu denaturizujućih rastvarača. Takva se antitela mogu identifikovati na osnovu njihove mogućnosti da budu u unakrsnoj kompeticiji (na primer, da kompetitivno inhibiraju vezivanje, na statistički značajan način) sa antitelima poput 19E3, 9F11, 9H10 ili 8B6 u standardnim

2

testovima vezivanja ili aktivnosti IL-21. Prema tome, u jednom aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje anti-IL-21 antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente, na primer, monoklonska antitela, koja su u kompeticiji u vezivanju za IL-21 sa drugim anti-IL-21 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom prema ovom otkrivanju, poput mišjih monoklonskih antitela 19E3, 9F11, 9H10 ili 8B6 ili ovde opisanih humanizovanih varijanti. Mogućnost testnog antitela da inhibira vezivanje, na primer, 19E3, 9F11, 9H10 ili 8B6 pokazuje da testno antitelo može biti u kompeticiji sa tim antitelom u vezivanju za IL-21; takvo se antitelo može, u skladu sa neograničavajućom teorijom, vezivati za isti ili povezani (na primer, strukturno sličan ili prostorno bliski) epitop na IL-21 kao anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sa kojim je u kompeticiji. U jednom aspektu, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za isti epitop na IL-21 kao, na primer, mišja monoklonska antitela 19E3, 9F11, 9H10 ili 8B6.

IV. Aktivnost IL-21 vezujućih molekula

[0153] U nekim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment može suzbijati prenos signala u IL-21R-ekspresionim ćelijama posredovan IL-21. Na primer, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može suzbijati STAT3 fosforilaciju posredovanu IL-21. Uz to, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može suzbijati proizvodnju IFNy od strane NK ćelija. Štaviše, IL-21- vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući može inhibirati diferencijaciju stimulisanih B-ćelija u plazma ćelije.

[0154] U nekim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment može suzbijati STAT3 fosforilaciju u IL-21R-ekspresionim ćelijama (na primer, PBMC-ovima) posredovanu IL-21 izmerenu protočnom citometrijom, sa IC50manjom od oko 500 pM, manjom od oko 350 pM, manjom od oko 250 pM, manjom od oko 150 pM, manjom od oko 100 pM, manjom od oko 75 pM, manjom od oko 60 pM, manjom od oko 50 pM, manjom od oko 40 pM, manjom od oko 30 pM, manjom od oko 20 pM, manjom od oko 15 pM, manjom od oko 10 pM ili manjom od oko 5 pM. U određenim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može suzbijati STAT3 fosforilaciju u IL-21R-ekspresionim ćelijama (na primer, PBMC-ovima) posredovanu humanim IL-21 izmerenu protočnom citometrijom, sa IC50od oko 22 pM, oko 19 pM, oko 17 pM, oko 14 pM, oko 13 pM, oko 12 pM, oko 6 pM, oko 5 pM ili oko 3 pM. U određenim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može suzbijati STAT3 fosforilaciju u IL-21 R-ekspresionim ćelijama (na primer, PBMC-ovima) posredovanu IL-21 makaki rakojeda izmerenu protočnom citometrijom, sa IC50od oko 52 pM, oko 51 pM, oko 46 pM, oko 19 pM, oko 16 pM, oko 10 pM ili oko 6 pM.

[0155] U nekim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment može suzbijati proizvodnju IFNy od strane NK ćelija posredovanu IL-21 izmerenu MSD human IFNγ single-plex testom sa IC50manjom od oko 100 pM, manjom od oko 400 pM, manjom od oko 100 pM, manjom od oko 75 pM, manjom od oko 60 pM, manjom od oko 50 pM, manjom od oko 40 pM, manjom od oko 30 pM, manjom od oko 20 pM, manjom od oko 15 pM, manjom od oko 10 pM ili manjom od oko 5 pM. U određenim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može suzbijati proizvodnju IFNy od strane NK -92 ćelijske linije posredovanu humanim IL-21 izmerenu MSD human IFNy single-plex testom sa IC50od oko 99 pM, oko 93 pM, oko 55 pM, oko 41 pM ili oko 20 pM. U određenim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može suzbijati proizvodnju IFNy od strane NK-92 ćelijske linije posredovanu IL-21 makaki rakojeda izmerenu MSD human IFNy single-plex testom sa IC50od oko 83 pM, oko 81 pM, oko 60 pM, oko 37 pM ili oko 3 pM.

[0156] U nekim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment može suzbijati IL-21 posredovanu diferencijaciju stimulisanih B-ćelija, na primer, naivnih B-ćelija i/ili memorijskih B-ćelija stimulisanih sa anti-CD40 i anti-IgM F(ab')2, u plazma ćelije, na primer, plazma ćelije koje proizvode IgG, izmerenu protočnom citometrijom ili ELISA-om sa IC50manjom od oko 150 nM, manjom od oko 75 nM, manjom od oko 50 nM, manjom od oko 30 nM, manjom od oko 10 nM, manjom od oko 1,600 pM, manjom od oko 1,400 pM, manjom od oko 1000 pM, manjom od oko 800 pM, manjom od oko 700 pM ili manjom od oko 600 pM. U određenim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može suzbijati diferencijaciju stimulisanih B-ćelija posredovanu humanim IL-21, na primer, naivnih B-ćelija i/ili memorijskih B-ćelija stimulisanih sa anti-CD40 i anti-IgM F(ab')2, u plazma ćelije, na primer, plazma ćelije koje proizvode IgG, izmerenu protočnom citometrijom ili ELISA-om sa IC50od oko 115 nM, oko 47 nM, oko 1.5 nM, oko 777 pM, oko 618 pM ili oko 573 pM. U određenim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može suzbijati diferencijaciju stimulisanih humanih B-ćelija posredovanu IL-21 makaki rakojeda, na primer, naivnih B-ćelija i/ili memorijskih B-ćelija stimulisanih sa anti-CD40 i anti-IgM F(ab')2, u plazma ćelije, na primer, plazma ćelije koje proizvode IgG, izmerenu protočnom citometrijom ili ELISA-om sa IC50od oko 74 nM, oko 30 nM, oko 9 nM, oko 1.3 nM, oko 1.0 nM, oko 775 pM ili oko 659 pM. U određenim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može suzbijati diferencijaciju stimulisanih B-ćelija u plazma ćelije posredovanu IL-21 makaki rakojeda, ali ne i diferencijaciju B-ćelija u plazma ćelije posredovanu humanim IL-21.

[0157] U određenim aspektima IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment može suzbijati diferencijaciju B-ćelija u plazma ćelije pokrenutu aktiviranim CD4+ T-ćelijama koje proizvode kostimulatorne molekule poput CD40L i B-ćelijskih tropnih citokina poput IL-21. U drugim aspektima, IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može inhibirati proliferaciju humanih naivnih CD4+ T-ćelija pokrenutu IL-21.

4

V. Priprema anti-IL-21 antitela i antigen-vezujućih fragmenata

[0158] Monoklonska anti-IL-21 antitela mogu se pripremiti pomoću hibridom postupaka, poput onih opisanih od strane Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495. Upotrebom hibridom postupka imunizuje se miš, hrčak ili druga odgovarajuća životinja domaćin kao što je gore opisano kako bi se izazvala proizvodnja antitela koja će se specifično vezivati za imunizujući antigen od strane limfocita. Limfociti se takođe mogu imunizovati in vitro. Posle imunizacije, limfociti se izoluju i spajaju sa pogodnom ćelijskom linijom mijeloma pomoću, na primer, polietilenglikola, radi obrazovanja hibridom ćelija koje će zatim biti odvojene od nespojenih limfocita i ćelija mijeloma. Hibridomi koji proizvode monoklonska antitela usmerena specifično protiv odabranog antigena koji se određuje imunoprecipitacijom, imunoblotovanjem ili in vitro testom vezivanja (na primer radioimunotestom (RIA); imunoenzimskom probom (ELISA)) mogu se zatim umnožavati ili u in vitro kultivisanju pomoću standardnih postupaka (Coding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986) ili in vivo kao ascitni tumori kod životinje. Monoklonska antitela mogu se zatim prečistiti od podloge za kultivisanje ili ascitne tečnosti kao što je gore opisano za poliklonska antitela.

[0159] Alternativno se anti-IL-21 monoklonska antitela mogu stvarati pomoću rekombinantnih DNK postupaka kao što je opisano u U.S. Patent No.4,816,567. Polinukleotidi koji kodiraju monoklonsko antitelo izolovani su iz zrelih B-ćelija ili ćelija hibridoma, poput RT-PCR-om pomoću oligonukleotidnih prajmera koji specifično umnožavaju gene koji kodiraju teške i lake lance antitela, a njihove se sekvence određuju pomoću konvencionalnih postupaka. Izolovani polinukleotidi koji kodiraju teške i lake lance se zatim kloniraju u pogodne ekspresione vektore, koji kada se transfektuju u ćelije domaćine poput ćelija E. coli, majmunskih COS ćelija, ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelija mijeloma koje inače ne proizvode imunoglobulinski protein, pri čemu ćelije domaćini stvaraju monoklonska antitela. Takođe, rekombinantna anti-IL-21 monoklonska antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti željene vrste mogu se izolovati iz biblioteka prikaza faga koje eksprimiraju CDR-ove željenih vrsta kao što je opisano (McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al, 1991, Nature, 352:624-628; i Marks et al, 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597).

[0160] Polinukleotid(i) koji kodira(ju) anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može(gu) se dalje modifikovati na mnoštvo različitih načina pomoću rekombinantne DNK tehnologije radi stvaranja alternativnih antitela. U nekim aspektima, konstantni domeni lakih i teških lanaca, na primer, mišjeg monoklonskog antitela mogu se supstituisati (1) tim regionima, na primer, humanog antitela radi stvaranja himernog antitela ili (2) neimunoglobulinskim polipeptidom radi stvaranja fuzionog antitela. U nekim aspektima, konstantni regioni su skraćeni ili uklonjeni radi stvaranja željenog fragmenta antitela monoklonskog antitela. Mutageneza usmerena ka mestu ili visoke gustine varijabilnog regiona može se koristiti za optimizovanje specifičnosti, afiniteta, itd. monoklonskog antitela.

[0161] U određenim aspektima, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment je humano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment. Humana antitela mogu se direktno pripremiti pomoću različitih tehnika poznatih u struci. Mogu se stvoriti besmrtni humani B limfociti imunizovani in vitro ili izolovani iz imunizovane individue koja proizvodi antitelo usmereno protiv ciljanog antigena (Vidi, na primer, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; i U.S. Patent 5,750,373).

[0162] Takođe, anti-IL-21 humano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se odabrati iz biblioteke faga, gde ta biblioteka faga eksprimira humana antitela, kao što su opisana, na primer, u Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat’l. Acad. Sci., 95:6157-6162, Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381, and Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Tehnike za stvaranje i upotrebu biblioteka fag antitela takođe su opisane u U.S. Patent Nos.

5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; i 7,264,963; i Rothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi: 10.1016/j.jmb.2007.12.018.

[0163] U struci su poznate strategije sazrevanja afiniteta i strategije mešanja lanaca (Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783) i mogu se koristiti za stvaranje humanih antitela visokog afiniteta ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata.

[0164] U nekim aspektima, anti-IL-21 monoklonsko antitelo može biti humanizovano antitelo. Mogu se takođe koristiti postupci za konstruisanje, humanizovanje ili ponovno izlaženje na površinu nehumanih ili humanih antitela i dobro su poznati u struci. Humanizovano, ponovo izašlo na površinu ili slično konstruisano antitelo može imati jedan ili više aminokiselinskih ostataka iz izvora koji nije ljudski, na primer, ali ne ograničavajući se na, miša, pacova, zeca, nehumanog primata ili drugog sisara. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci zamenjuju se ostacima koji se često nazivaju „importˮ ostaci, koji su obično uzeti iz „importˮ varijabilnog, konstantnog ili drugog domena poznate humane sekvence. Takve importovane sekvence mogu se koristiti da smanje imunogenost ili da smanje, povećaju ili modifikuju vezivanje, afinitet, brzinu spajanja, brzinu razdvajanja, avidnost, specifičnost, poluvreme eliminacije ili bilo koju drugu pogodnu karakteristiku, kao što je poznato u struci. Uopšteno, CDR ostaci su direktno i najznačajnije uključeni u uticanje na IL-21 vezivanje. Prema tome se deo ili cele nehumane ili humane CDR sekvence zadržavaju dok se nehumane sekvence varijabilnih i konstantnih regiona mogu zameniti humanim ili drugim aminokiselinama.

[0165] Antitela mogu takođe opciono biti humanizovana, ponovo izašla na površinu, konstruisana ili humana antitela konstruisana sa zadržavanjem visokog afiniteta za IL-21 antigen i drugih poželjnih bioloških svojstava. Kako bi se ovaj cilj postigao, humanizovana (ili humana) ili konstruisana anti-IL-21 antitela i antitela ponovo izašla na površinu mogu se opciono pripremati postupkom za analizu roditeljskih sekvenci i različitih humanizovanih i konstruisanih konceptualnih produkata pomoću trodimenzionalnih modela roditeljskih, konstruisanih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su uobičajeno dostupni i poznati stručnjaku iz ove oblasti. Dostupni su kompjuterski programi koji ilustruju i prikazuju moguće trodimenzionalne konformacione strukture odabranih kandidata za imunoglobulinske sekvence. Pregled ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju kandidata za imunoglobulinsku sekvencu, to jest, analizu ostataka koji utiču na mogućnost kandidata za imunoglobulin da vezuje njegov antigen, poput IL-21. Na taj se način ostaci (FW) okvira mogu izabrati i kombinovati iz konsenzus i import sekvenci tako da se postigne željena karakteristika antitela, poput uvećanog afinitet za ciljani(e) antigen(e).

[0166] Humanizovanje, ponovno izlaženje na površinu ili konstruisanje anti-IL-21 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata prema ovom otkrivanju može se izvoditi pomoću bilo kog poznatog postupka, poput, ali ne ograničavajući se na, one opisane u Jones et al., Nature 321:522 (1986);

Riechmann et al, Nature 332:323 (1988); Verhoeyen et al, Science 239:1534 (1988)), Sims et al, J.

Immunol.151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol.196:901 (1987), Carter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89:4285 (1992); Presta et al, J. Immunol.151:2623 (1993), U.S. Pat. Nos.5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5,763,192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6,180,370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567, 7,557,189; 7,538,195; i 7,342,110; International Patent Application Publication Nos. PCT/US98/16280; PCT/US96/18978;

PCT/US91/09630; PCT/US91/05939; PCT/US94/01234; PCT/GB89/01334; PCT/GB91/01134;

PCT/GB92/01755; International Patent Application Publication Nos. WO90/14443; WO90/14424;

WO90/14430; i European Patent Publication No. EP 229246.

[0167] Anti-IL-21 humanizovana antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu se takođe stvarati u transgenim miševima koji sadrže humane imunoglobulinske lokuse koji su sposobni da posle imunizovanja proizvode cele receptore humanih antitela u nedostatku proizvodnje endogenog imunoglobulina. Ovaj pristup opisan je u U.S. Patent Nos.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016.

[0168] U određenim aspektima obezbeđeno je anti-IL-21 antitelo. Poznate su različite tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Ovi se fragmenti tradicionalno izvode proteolitičkom digestijom netaknutih antitela (na primer Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81). U određenim se aspektima anti-IL-21 fragmenti antitela proizvode rekombinantno. Fab, Fv i scFv fragmenti antitela mogu se svi eksprimirati u i selektovati iz E. coli ili drugih ćelija domaćina, čime se dopušta proizvodnja velikih količina ovih fragmenata. Takvi fragmenti anti-IL-21 antitela mogu se takođe izolovati iz gore razmatranih biblioteka fag antitela. Fragmenti anti-IL-21 antitela mogu takođe biti linearna antitela kao što je opisano u U.S. Patent No.5,641,870. Druge tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledne stručnjaku iz ove oblasti.

[0169] Prema ovom otkrivanju, tehnike se mogu prilagoditi za proizvodnju jednolančanih antitela specifičnih za IL-21 (vidi, na primer, U.S. Pat. No.4,946,778). Uz to se postupci mogu prilagoditi za konstrukciju Fab ekspresionih biblioteka (vidi, na primer, Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)) radi dopuštanja brze i efektivne identifikacije monoklonskih Fab fragmenata sa željenom specifičnošću za IL-21, ili njihovih derivata, fragmenata, analoga ili homologa. Fragmenti antitela mogu se proizvoditi tehnikama iz stanja tehnike uključujući, ali ne ograničavajući se na: (a) F(ab')2 fragment proizveden pepsinskom digestijom molekula antitela; (b) Fab fragment stvoren smanjivanjem disulfidnih mostova na F(ab')2 fragmentu, (c) Fab fragment stvoren tretiranjem molekula papainom i redukujućim agensom, i (d) Fv fragmente.

[0170] U određenim aspektima, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se modifikovati kako bi se povećalo njegovo poluvreme eliminacije u serumu. Ovo se može postići, na primer, inkorporacijom epitopa koji vezuje receptor ponovne upotrebe u antitelo ili fragment antitela mutacijom odgovarajućeg regiona u antitelu ili fragmentu antitela ili inkorporacijom epitopa u peptidnu oznaku koja se onda spaja sa antitelom ili fragmentom antitela na bilo kom kraju ili u sredini (na primer, DNK ili peptidnom sintezom) ili YTE mutacijom. U struci su poznati i drugi postupci za uvećanje poluvremena eliminacije antitela u serumu ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, na primer, konjugacijom u heterologni molekul poput PEG-a.

[0171] Heterokonjugovana anti-IL-21 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti takođe su unutar obima ovog otkrivanja. Heterokonjugovana antitela sastoje se od dva kovalentno spojena antitela. Takva se antitela, na primer, predlažu za ciljanje imunih ćelija ka neželjenim ćelijama (vidi, na primer, U.S. Pat. No.4,676,980). Smatra se da se heterokonjugovana anti-IL-21 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu pripremiti in vitro pomoću poznatih postupaka u hemiji sintetičkih proteina, uključujući one koje obuhvataju agense za umrežavanje. Na primer, imunotoksini se mogu konstruisati pomoću reakcije disulfidne razmene ili obrazovanjem tioetarske veze. Primeri pogodnih reagenasa za ovaj cilj uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat.

[0172] Modifikovana anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti kao što su ovde opisani mogu obuhvatati varijabilni region bilo kog tipa, koji obezbeđuje spajanje antitela ili polipeptida sa IL-21. S tim u vezi, varijabilni region može obuhvatati ili biti izveden iz bilo kog tipa sisara koji se može biti izazvan da povisi humoralni odgovor i da stvara imunoglobuline protiv željenog antigena. Kao takav, varijabilni region anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta može biti, na primer, humanog, mišjeg, nehumanog primatskog (na primer, makaki rakojeda, makakija, itd) ili vučjeg porekla. U nekim su aspektima i varijabilni i konstantni regioni modifikovanih anti-IL-21 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata humani. U drugim aspektima varijabilni regioni kompatibilnih antitela (obično izvedenih iz nehumanog izvora) mogu biti konstruisani ili specijalno napravljeni da poboljšaju vezujuća svojstva ili da smanje imunogenost molekula. S tim u vezi, varijabilni regioni korisni u ovom otkrivanju mogu biti humanizovani ili na drugi način alterirani inkluzijom importovanih aminokiselinskih sekvenci.

[0173] U određenim su aspektima varijabilni domeni i u teškom i u lakom lancu anti-IL-21 antitela ili njegovom antigen-vezujućem fragmentu alterirani najmanje delimičnom zamenom jednog ili više CDRova i/ili delimičnom zamenom regiona okvira i menjanjem sekvenci. Iako se CDR-ovi mogu izvoditi iz antitela iste klase ili čak podklase kao i antitelo iz kog su regioni okvira izvedeni, predviđa se da će se CDR-ovi izvoditi iz antitela različite klase i u određenim aspektima iz antitela od različitih vrsta. Nije neophodno zameniti sve CDR-ove kompletnim CDR-ovima iz varijabilnog regiona donora kako bi se antigen-vezujući kapacitet jednog varijabilnog domena prebacio na drugi. Radije je samo neophodno prebaciti one ostatke koji su neophodni za održavanje aktivnosti antigen-vezujućeg mesta. S obzirom na objašnjenja izložena u U.S. Pat. Nos.5,585,089, 5,693,761 i 5,693,762, svakako će unutar kompetencije stručnjaka iz ove oblasti biti dobijanje antitela sa smanjenom imunogenošću ili izvođenjem rutinskog eksperimentisanja ili testiranjem putem pokušaja i grešaka.

[0174] Uprkos izmenama u varijabilnom regionu, stručnjaci iz ove oblasti će ceniti to što će modifikovana anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti prema ovom otkrivanju obuhvatati antitela (na primer, antitela pune dužine ili njihove antigen-vezujuće fragmente) u kojima je najmanje deo jednog ili više domena konstantnog regiona izbrisan ili na drugi način alteriran kako bi se obezbedile željene biohemijske karakteristike poput uvećane lokalizacije tumora ili smanjenog poluvremena eliminacije u serumu u poređenju sa antitelom otprilike iste imunogenosti koje obuhvata prirodni ili nepromenjeni konstantni region. U nekim aspektima, konstantni region modifikovanog antitela obuhvataće humani konstantni region. Modifikacije konstantnog regiona kompatibilne sa ovim otkrivanjem obuhvataju dodavanja, brisanja ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u jednom ili više domena. To jest, ovde opisana modifikovana antitela mogu obuhvatati izmene ili modifikacije jednog ili više od tri konstantna domena teškog lanca (CHI, CH2 ili CH3) i/ili konstantnog domena lakog lanca (CL). U nekim aspektima, razmatraju se modifikovani konstantni regioni u kojima su jedan ili više domena delimično ili potpuno obrisani. U nekim aspektima, modifikovana antitela obuhvataće domen obrisanih konstrukata ili varijanti u kojima je ceo CH2 domen uklonjen (ACH2 konstrukti). U nekim aspektima, izostavljeni domen konstantnog regiona može se zameniti kratkim aminokiselinskim spejserom (na primer, 10 ostataka) što obezbeđuje nešto molekulske fleksibilnosti koju tipično donosi odsutni konstantni region.

[0175] Pored njihove konfiguracije, u struci je poznato da konstantni region posreduje u nekoliko efektorskih funkcija. Na primer, vezivanje CI komponente komplementa za antitela aktivira sistem komplemenata. Aktivacija komplementa je važna u opsonizaciji i lizi ćelijskih patogena. Aktivacija komplementa takođe stimuliše zapaljenski odgovor i može takođe biti uključena u autoimunoj preosetljivosti. Dalje, antitela se vezuju za ćelije preko Fc regiona, sa Fc receptorskim mestom na FC regionu antitela koji se vezuje za Fc receptor (FcR) na ćeliji. Postoji mnoštvo Fc receptora koji su specifični za različite klase antitela, uključujući IgG (gama receptori), IgE (eta receptori), IgA (alfa receptori) i IgM (mu receptori). Vezivanje antitela za Fc receptore na površinama ćelija pokreće mnoštvo važnih i različitih bioloških odgovora uključujući zahvatanje i uništavanje čestica obloženih antitelom, klirens imunih kompleksa, lizu ciljanih ćelija obloženih antitelom od strane ćelija ubica (zvanu citotoksičnost koja zavisi od antitela ili ADCC), otpuštanje zapaljenskih medijatora, placentni transfer i kontrolu proizvodnje imunoglobulina.

[0176] U određenim aspektima, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obezbeđuje izmenjene efektorske funkcije koje, redom, utiču na biološki profil datog antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta. Na primer, brisanje ili inaktivacija (putem genskih mutacija ili drugih sredstava) domena konstantnog regiona može smanjiti vezivanje Fc receptora cirkulišućeg modifikovanog antitela. U drugim se slučajevima može desiti da modifikacije konstantnog regiona, konzistentne sa ovim otkrivanjem, ublažavaju vezivanje komplementa i time smanjuju poluvreme eliminacije u serumu i nespecifično vezivanje konjugovanog citotoksina. Još drugih modifikacija konstantnog regiona mogu se koristiti za eliminaciju disulfidnih veza ili oligosaharidnih polovina koje dopuštaju poboljšanu lokalizaciju usled povećane antigenske specifičnosti ili fleksibilnosti antitela. Slično tome, modifikacije konstantnog regiona u skladu sa ovim otkrivanjem mogu se lagano izvesti pomoću dobro poznatih biohemijskih ili molekularnih tehnika konstruisanja koje su svakako u okviru sposobnosti stručnjaka iz ove oblasti.

[0177] U određenim aspektima, IL-21 vezujući molekul to jest antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment nema jednu ili više efektorskih funkcija. Na primer, u nekim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment nema aktivnost citotoksičnosti koja zavisi od antitela (ADCC) i/ili nema aktivnost citotoksičnosti koja zavisi od komplementa (CDC). U određenim se aspektima anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ne vezuje za Fc receptor i/ili faktore komplemenata. U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment nema efektorsku funkciju.

[0178] U određenim se aspektima anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može konstruisati tako da direktno spaja CH3 domen za region šarke odgovarajućih modifikovanih antitela ili njihovih fragmenata. U drugim se konstruktima peptidni spejser može umetnuti između regiona šarke i modifikovanih CH2 i/ili CH3 domena. Na primer, kompatibilni konstrukti mogu biti eksprimirani gde je CH2 domen izbrisan, a preostali CH3 domen (modifikovan ili nemodifikovan) spojen sa regionom šarke 5-20 aminokiselinskim spejserom. Takav se spejser može dodati, na primer, kako bi se osiguralo da regulatorni elementi konstantnog domena ostanu slobodni i dostupni ili kako bi region šarke ostao fleksibilan. U nekim se slučajevima aminokiselinski spejseri mogu pokazati kao imunogenski i mogu izazvati nepoželjni imuni odgovor protiv konstrukta. Prema tome, u određenim aspektima, bilo koji spejser dodat konstruktu može biti relativno neimunogenski, ili čak u potpunosti izostavljen, kako bi se održali željeni biohemijski kvaliteti modifikovanog antitela.

[0179] Pored brisanja celih domena konstantnog regiona, ovde obezbeđena anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti mogu se modifikovati delimičnim brisanjem ili supstitucijom nekoliko ili čak jedne aminokiseline u konstantnom regionu. Na primer, mutacija jedne aminokiseline u odabranim oblastima CH2 domena može biti dovoljna da se suštinski smanji Fc vezivanje i time poveća lokalizacija tumora. Slično tome, jedan ili više domena konstantnog regiona koji kontrolišu efektorsku funkciju (na primer, vezivanje C1Q komplementa) mogu se potpuno ili delimično izbrisati. Takva delimična brisanja

4

konstantnih regiona mogu poboljšati odabrane karakteristike antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta (na primer, poluvreme eliminacije u serumu) ostavljajući druge poželjne funkcije povezane sa konstantnim regionom subjekta netaknute. Štaviše, konstantni regioni otkrivenih anti-IL-21 antitela i njihovih antigen-vezujućih fragmenata mogu se modifikovati mutacijom ili supstitucijom jedne ili više aminokiselina koje poboljšavaju profil rezultujućeg konstrukta. S tim u vezi, moguće je poremetiti aktivnost obezbeđenu od strane očuvanog vezujućeg mesta (na primer, Fc vezivanja) dok se suštinski održava konfiguracija i imunogeni profil modifikovanog antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta. Određeni aspekti mogu obuhvatati dodavanje jedne ili više aminokiselina konstantnom regionu radi poboljšanja poželjnih karakteristika poput smanjivanja ili povećanja efektorske funkcije ili obezbeđivanja više citotoksina ili vezivanja ugljenih hidrata. U takvim aspektima može biti poželjno umetnuti ili replikovati specifične sekvence izvedene iz odabranih domena konstantnog regiona.

[0180] Ovo otkrivanje dalje prihvata varijante i ekvivalente koji su suštinski homologni ovde izloženim mišjim, himernim, humanizovanim ili humanim anti-IL-21 antitelima ili njihovim antigen-vezujućim fragmentima. Oni mogu sadržati, na primer, mutacije konzervativne supstitucije, to jest, supstituciju jedne ili više aminokiselina sličnim aminokiselinama. Na primer, konzervativna supstitucija označava supstituciju jedne aminokiseline drugom unutar iste klase poput, na primer, jedne kisele aminokiseline drugom kiselom aminokiselinom, jedne bazne aminokiseline drugom baznom aminokiselinom ili jedne neutralne aminokiseline drugom neutralnom aminokiselinom.

[0181] Anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se dalje modifikovati da sadrži dodatne hemijske polovine koje obično nisu deo proteina. Te izvedene polovine mogu unaprediti rastvorljivost, biološko poluvreme eliminacije ili apsorpciju proteina. Ove polovine mogu takođe smanjiti ili eliminisati bilo koje poželjne nuspojave proteina i slično. Pregled ovih polovina može se naći u Remington’s Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).

VI. Polinukleotidi koji kodiraju IL-21-vezujuće molekule i njihova ekspresija

[0182] Ovo otkrivanje obezbeđuje polinukleotide koji obuhvataju sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju polipeptid koji specifično vezuje IL-21 ili njegov antigen-vezujući fragment. Na primer, ovo otkrivanje obezbeđuje polinukleotid koji obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja kodira anti-IL-21 antitelo ili kodira antigen-vezujući fragment takvog antitela. Polinukleotidi prema ovom otkrivanju mogu biti u obliku RNK ili u obliku DNK. DNK uključuje cDNK, genomsku DNK i sintetičku DNK; i mogu biti dvolančani ili jednolančani, a ukoliko su jednolančani mogu biti kodirajući niz ili nekodirajući (antisens) niz.

[0183] U određenim se aspektima polinukleotid može izolovati. U određenim aspektima, polinukleotid može biti suštinski čist. U određenim aspektima polinukleotid može biti cDNK ili izveden iz cDNK. U određenim se aspektima polinukleotid može rekominantno proizvesti. U određenim aspektima polinukleotid može obuhvatati kodirajuću sekvencu za zreo polipeptid spojen u istom okviru čitanja sa polinukleotidom koji pomaže, na primer, u ekspresiji i sekreciji polipeptida iz ćelije domaćina (na primer, vodeća sekvenca koja funkcioniše kao sekretorna sekvenca za kontrolisanje prebacivanja polipeptida iz te ćelije). Polipeptid koji ima vodeću sekvencu je preprotein i može imati vodeću sekvencu koju cepa ćelija domaćin radi obrazovanja zrelog oblika polipeptida. Polinukleotidi mogu takođe kodirati IL-21-vezujući proprotein što je zreo protein sa dodatnim 5' aminokiselinskim ostacima.

[0184] U određenim aspektima ovo otkrivanje obezbeđuje izolovani polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL antitelo, u kom VL obuhvata VL-CDR1, VL-CDR2 i VL-CDR3 aminokiselinske sekvence identične ili identične osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više VL-CDR-ova: SEQ ID NO: 12, 13 i 14, SEQ ID NO: 34, 35 i 36, SEQ ID NO: 48, 49 i 50 ili SEQ ID NO: 58, 59 i 60, respektivno.

[0185] Ovo otkrivanje dalje obezbeđuje izolovani polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH antitelo, u kom VH obuhvata VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 aminokiselinske sekvence identične ili identične osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više VH-CDR-ova: SEQ ID NO: 7, 8 i 9, SEQ ID NO: 29, 30 i 31, SEQ ID NO: 43, 44 i 45 ili SEQ ID NO: 53, 54 i 55, respektivno.

[0186] Ovo otkrivanje dalje obezbeđuje izolovani polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL antitelo, u kom VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 47 i SEQ ID NO: 57.

[0187] Štaviše, ovo otkrivanje obezbeđuje izolovani polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH antitelo, u kom VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnu referentnoj aminokiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 52.

[0188] U određenim aspektima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata VH ili VL kodiran polinukleotidom kao što je gore opisano, može se specifično vezivati za IL-21, na primer, humani ili IL-21 makaki rakojeda. U određenim slučajevima antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se specifično vezivati za isti epitop kao i antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata VH i VL od 19E3, 9F11, 8B6 ili 9H10. U određenim aspektima ovo otkrivanje obezbeđuje polinukleotid ili kombinaciju polinukleotida koja kodira vezujući molekul, na primer, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za IL-21.

[0189] Dalje je obezbeđen vektor koji obuhvata polinukleotid kao što je gore opisano. Pogodni vektori su ovde opisani na drugom mestu i poznati su stručnjacima iz ove oblasti.

[0190] U određenim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje kompoziciju, na primer, farmaceutsku kompoziciju, koja obuhvata polinukleotid ili vektor koji se štiti kao što je gore opisano, koja opciono dalje obuhvata jedan ili više nosača, razblaživača, ekspicijenasa ili drugih aditiva.

[0191] U određenim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje polinukleotidnu kompoziciju koja obuhvata: polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH i polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL. Prema ovom aspektu, VL i VH zajedno mogu obuhvatati VL-CDR1, VL-CRD2, VL-CDR3, VH-CDR1, VH-CDR2 i VH-CDR3 aminokiselinske sekvence identične ili identične osim za osam, sedam, šest, pet, četiri, tri, dve ili jednu aminokiselinsku supstituciju u jednom ili više CDR-ova: SEQ ID NO: 12, 13, 14, 7, 8 i 9, SEQ ID NO: 34, 35, 36, 29, 30 i 31, SEQ ID NO: 48, 49, 50, 43, 44 i 45 ili SEQ ID NO: 58, 59, 60, 53, 54 i 55, respektivno.

[0192] U daljim aspektima, ovo otkrivanje obezbeđuje polinukleotidnu kompoziciju koja obuhvata: polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH i polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL, u kom VL i VH respektivno obuhvataju aminokiselinske sekvence najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identične referentnim aminokiselinskim sekvencama: SEQ ID NO: 6 i SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15 i SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19 i SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23 i SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28 i SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 40 i SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 37 i SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 38 i SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 37 i 40, SEQ ID NO: 42 i SEQ ID NO: 47 ili SEQ ID NO: 52 i SEQ ID NO: 57, respektivno.

[0193] U određenim su aspektima VH i VL kodirani sekvencama nukleinskih kiselina najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ili 100% identičnih referentnim sekvencama nukleinskih kiselina SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:27 i SEQ ID NO:32, SEQ ID NO: 41 i SEQ ID NO:46 ili SEQ ID NO: 51 i SEQ ID NO:56, respektivno.

[0194] U polinukleotidnoj kompoziciji kao što je gore opisana polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VH i polinukleotid koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira VL mogu se nalaziti u jednom vektoru ili mogu biti u zasebnim vektorima. Prema tome ovo otkrivanje obezbeđuje jedan ili više vektora koji obuhvataju gore opisanu polinukleotidnu kompoziciju.

[0195] U nekim slučajevima, polinukleotidna kompozicija koja kodira VH i VL kao što je gore opisano može kodirati antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se može specifično vezivati za IL-21, na primer, humani ili IL-21 makaki rakojeda. U nekim aspektima ta polinukleotidna kompozicija kodira antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično može vezivati za isti epitop kao i antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji obuhvata VH i VL od 19E3, 9F11, 8B6 ili 9H10.

[0196] Ovo otkrivanje dalje obezbeđuje ćeliju domaćina koja obuhvata polinukleotid, polinukleotidnu kompoziciju ili vektor kao što su gore obezbeđeni, gde ćelija domaćin može, u nekim slučajevima, eksprimirati antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21. Takva se ćelija domaćin može koristiti u postupku za stvaranje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta kao što je ovde obezbeđeno, pri čemu postupak uključuje (a) kultivisanje ćelije domaćina i (b) izolovanje antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta eksprimiranog od ćelije domaćina.

4

[0197] U određenim aspektima polinukleotidi obuhvataju kodirajuću sekvencu za zreo IL-21-vezujući polipeptid, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment spojen u istom okviru čitanja sa markirnom sekvencom koja omogućava, na primer, prečišćavanje kodiranog polipeptida. Na primer, markirna sekvenca može biti heksahistidinska oznaka obezbeđena od strane pQE-9 vektora radi obezbeđivanja prečišćavanja zrelog polipeptida spojenog sa markerom u slučaju bakterijskog domaćina ili se koristi markirna sekvenca koja može biti hemaglutininska (HA) oznaka izvedena iz hemaglutininskog proteina gripa sa sisarskim domaćinom (na primer, COS-7 ćelije).

[0198] Takođe su obezbeđene polinukleotidne varijante. Polinukleotidne varijante mogu sadržati alteracije u kodirajućim regionima, nekodirajućim regionima ili oba. U nekim aspektima polinukleotidne varijante sadrže alteracije koje proizvode tihe supstitucije, dodavanja ili brisanja, ali ne menjaju svojstva ili aktivnosti kodiranog polipeptida. U nekim se aspektima polinukleotidne varijante proizvode tihim supstitucijama usled degeneracije genetičkog koda. Polinukleotidne varijante mogu se proizvesti iz raznih razloga, na primer, radi optimizacije ekspresije kodona za naročitog domaćina (promena kodona u humanoj mRNK u one poželjne od strane bakterijskog domaćina poput E. coli). Takođe su obezbeđeni vektori i ćelije koje obuhvataju ovde opisane polinukleotide.

[0199] U nekim aspektima DNK sekvenca koja kodira IL-21-vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment može se konstruisati hemijskom sintezom pomoću oligonukleotidnog sintetizera. Takvi se oligonukleotidi mogu konstruisati na osnovu aminokiselinske sekvence željenog polipeptida i biranjem onih kodona koji su poželjni u ćeliji domaćinu u kojoj će se proizvoditi rekombinantni polipeptid od interesa proizvoditi. Standardni postupci mogu se primeniti radi sintetisanja izolovane polinukleotidne sekvence koja kodira izolovani polipeptid od interesa. Na primer, kompletna aminokiselinska sekvenca može se koristiti za konstrukciju unazad translatovanog gena. Nadalje se može sintetisati DNK oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira izolovani polipeptd. Na primer, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida mogu se sintetisati i zatim biti podvrgnuti ligaciji. Pojedinačni oligonukleotidi tipično sadrže 5' ili 3' prepuste za komplementarno sklapanje.

[0200] Kad se sklope (sintezom, mutagenezom usmerenom ka mestu ili drugim postupkom), polinukleotidne sekvence koje kodiraju naročiti izolovani polipeptid od interesa mogu se umetnuti u ekspresioni vektor i operativno povezati sa sekvencom kontrole ekspresije pogodnom za ekspresiju proteina u željenom domaćinu. Pravi sklop se može potvrditi, na primer, nukleotidnim sekvenciranjem, mapiranjem restrikcija i/ili ekspresijom biološki aktivnog polipeptida u pogodnom domaćinu. Kako bi se dobili visoki nivoi ekspresije transfektovanog gena u domaćinu, taj se gen može operativno povezati ili spojiti sa kontrolnim sekvencama transkripcione i translacione ekspresije koje su funkcionalne u izabranom ekspresionom domaćinu.

[0201] U određenim se aspektima vektori rekombinantne ekspresije koriste da pojačaju i da eksprimiraju DNK koja kodira anti-IL-21 antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente. Vektori rekombinantne ekspresije su replikabilni DNK konstrukti koji imaju sintetičke ili cDNK-izvedene DNK fragmente koji kodiraju polipeptidni lanac anti-IL-21 antitela ili njegov antigen-vezujući fragment, operativno povezani sa pogodnim transkripcionim ili translacionim regulatornim elementima izvedenim iz sisarskih, mikrobnih, virusnih ili gena insekata. Jedinica za transkripciju obično obuhvata sklop (1) genetskog elementa ili elemenata koji imaju regulatornu ulogu u ekspresiji gena, na primer, transkripcionih promotera ili pojačivača, (2) strukturne ili kodirajuće sekvence koja se transkribuje u mRNK i translatuje u protein i (3) odgovarajućih transkripcionih i translacionih inicijacionih i terminalnih sekvenci, kao što će biti detaljno opisano u nastavku. Takvi regulatorni elementi mogu uključivati operator sekvencu radi kontrole transkripcije. Dodatno se mogu inkorporisati mogućnost replikacije u domaćinu, obično dobijena od izvora replikacije, i selekcija gena radi olakšavanja rekognicije transformanata. DNK regioni su operativno povezani kada su u funkcionalnom odnosu jedni sa drugima. Na primer, DNK za signalni peptid (sekretorni vođa) je operativno povezan sa DNK-om za polipeptid ako je eksprimiran kao prekursor koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promoter je operativno povezan sa kodirajućom sekvencom ako kontroliše transkripciju sekvence; ili je mesto za vezivanje ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da dozvoljava translaciju. Strukturni elementi namenjeni za upotrebu u sistemima za ekspresiju kvasca uključuju vodeću sekvencu koja omogućava vanćelijsku sekreciju translatovanog proteina od strane ćelije domaćina. Alternativno, tamo gde je rekombinantni protein eksprimiran bez vodeće ili transportne sekvence, protein može uključivati N-terminalni metioninski ostatak. Ovaj ostatak može opciono biti naknadno pocepan od eksprimiranog rekombinantnog proteina kako bi se obezbedio konačni proizvod.

[0202] Izbor sekvence za kontrolu ekspresije i ekspresionog vektora zavisiće od izbora domaćina. Može se upotrebiti mnoštvo ekspresionih kombinacija domaćin/vektor. Korisni ekspresioni vektori za eukariotske domaćine, uključuju, na primer, vektore koji obuhvataju sekvence za kontrolu ekspresije iz SV40, goveđeg papiloma virusa, adenovirusa i citomegalovirusa. Korisni ekspresioni vektori za bakterijske domaćine uključuju poznate bakterijske plazmide, poput plazmida iz E. coli, uključujući pCR 1, pBR322, pMB9 i njihove derivate, plazmide sa širim opsegom domaćina, poput M13 i filamentoznih jednolačnanih DNK faga.

[0203] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju IL-21-vezujućeg molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta uključuju prokariote, kvasac, insektske ili više eukariotske ćelije pod kontrolom odgovarajućih promotera. Prokariote uključuju gram negativne ili gram pozitivne organizme, na primer E. coli ili bacile. Više eukariotske ćelije uključuju postojeće ćelijske linije sisarskog porekla kao što je opisano u nastavku. Mogu se takođe koristiti translacioni sistemi bez ćelija. Dodatne informacije u pogledu postupaka za proizvodnju proteina, uključujući proizvodnu antitela, mogu se naći, na primer, u U.S. Patent Publication No.2008/0187954, U.S. Patent Nos.6,413,746 i 6,660,501 i International Patent Publication No. WO 04009823.

[0204] Različiti sistemi kultivisanja sisarskih ili insekatskih ćelija mogu se takođe poželjno koristiti za

4

ekspresiju rekombinantnih IL-21-vezujućih molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njihovih antigenvezujućih fragmenata. Ekspresija rekombinantnih proteina u ćelijama sisara može se izvoditi jer su takvi proteini obično tačno savijeni, prigodno modifikovani i potpuno funkcionalni. Primeri pogodnih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju HEK-293 i HEK-293T, COS-7 linije bubrežnih ćelija majmuna, opisane od strane Gluzman (Cell 23:175, 1981) i druge ćelijske linije uključujući, na primer, L-ćelije, C127, 3T3, ćelijske linije jajnika kineskog hrčka (CHO), HeLa i BHK. Sisarski ekspresioni vektori mogu obuhvatati netranskribovane elemente poput izvora replikacije, pogodnog promotera i pojačivača povezanog sa genom kog treba eksprimirati, i druge 5' ili 3' bočne netranskribovane sekvence, i 5' ili 3' netraslatovane sekvence, poput neophodnih mesta za vezivanja ribozoma, mesta za poliadenilaciju, splajsnih mesta donora i primaoca, i transkripcione sekvence terminacije. Bakulovirusni sistemi za proizvodnju heterolognih proteina u insekatskim ćelijama ispitani su od strane Luckow and Summers, BioTechnology 6:47 (1988).

[0205] IL-21-vezujući molekuli, na primer, anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti proizvedeni od strane transformisanog domaćina mogu se prečistiti u skladu sa bilo kojim pogodnim postupkom. Ovi standardni postupci uključuju hromatografiju (na primer, jonoizmenjivačku, afinitetnu i hromatografiju sortiranu po velični kolone), centrifugiranje, diferencijalnu rastvorljivost ili bilo koju drugu standardnu tehniku za prečišćavanje proteina. Oznake afiniteta poput heksahistidina, domena koji vezuje maltozu, influenca oblažuće sekvence i glutation-S-transferaze mogu se vezati za protein radi omogućavanja lakšeg prečišćavanja prelaskom preko kolone sa odgovarajućim afinitetom. Izolovani proteini mogu se takođe fizički okarakterisati pomoću tehnika poput proteolize, nuklearne magnetne rezonance i rendgentske kristalografije.

[0206] Na primer, supernatantni iz sistema koji sekretuju rekombinantni protein u podlogu za kultivisanje mogu se prvo koncentrovati pomoću komercijalno dostupnog filtera za koncentrovanje proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon jedinice za ultrafiltraciju. Nakon faze koncentrovanja, koncentrat se može primeniti na pogodnu matricu za prečišćavanje. Alternativno se može koristiti anjonoizmenjivačka smola, na primer, matrica ili supstrat koji ima viseće dietilaminoetilske (DEAE) grupe. Matrice mogu biti akrilamidne, agarozne, dekstranske, celulozne ili drugog tipa uobičajeno korišćenog u prečišćavanju proteina. Alternativno se može primeniti faza katjonske izmene. Pogodni katjonski izmenjivači uključuju različite nerastvorljive matrice koje obuhvataju sulfopropilne ili karboksimetilne grupe. Konačno, jedna ili više faza tečnih hromatografija visokih performansi na reverznim fazama (RP-HPLC) koje upotrebljavaju hidrofobne RP-HPLC podloge, na primer, silikagel koji ima viseće metilne ili druge alifatične grupe, mogu se upotrebljavati za dalje prečišćavanje IL-21-vezujućeg molekula. Neke ili sve prethodne faze prečišćavanja, u različitim kombinacijama, mogu se takođe upotrebljavati za obezbeđivanje homogenog rekombinantnog proteina.

[0207] Rekombinantni IL-21-vezujući protein, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment proizveden u bakterijskoj kulturi može se izolovati, na primer, inicijalnom ekstrakcijom iz

4

ćelijskih peleta, praćenom jednim ili više koncentrovanja, isoljavanjem, vodenom jonoizmenjivačkom ili fazama hromatografije na molekulskim sitima. Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) može se koristiti za konačne faze prečišćavanja. Mikrobne ćelije koje se koriste u ekspresiji rekombinantnog proteina mogu se poremetiti bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući, ciklus zamrzavanjeodmrzavanje, sonikaciju, mehaničku razgradnju ili upotrebu agenasa za ćelijsku lizu.

[0208] U struci poznati postupci za prečišćavanje antitela i drugih proteina takođe uključuju, na primer, one opisane u U.S. Patent Publication Nos.2008/0312425, 2008/0177048 i 2009/0187005.

VI. Postupci za lečenje pomoću terapijskih anti-IL-21 antitela

[0209] Obezbeđeni su postupci za upotrebu IL-21 vezujućih molekula, na primer, anti-IL-21 antitela, uključujući njegove antigen-vezujuće fragmente, varijante i derivate, za lečenje pacijenata koji boluju od bolesti povezane sa ekspresijom IL-21 ili IL-21-sekretornih ćelija. Pod „IL-21-sekretornim ćelijamaˮ podrazumevaju se ćelije koje eksprimiraju IL-21, na primer, aktivirane pomagačkim T-ćelijama. U struci su dobro poznati postupci za detektovanje ekspresije IL-21 i uključuju, ali nisu ograničeni na, PCR tehinke, imunohistohemiju, protočnu citometriju, vestern blot, ELISA-u i slično.

[0210] Sledeće razmatranje odnosi se na postupke za dijagnostikovanje i postupke za lečenje raznih bolesti i poremećaja IL-21-vezujućim molekulom, na primer, anti-IL-21 antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom, varijantom ili derivatom koji zadržava željena svojstva ovde obezbeđenog anti-IL-21 antitela, na primer, koji je sposoban za specifično vezivanje IL-21 i antagonizovanje aktivnosti IL-21. U nekim aspektima, IL-21-vezujući molekuli su mišja, humana ili humanizovana antitela. U nekim je aspektima IL-21-antitelo identično jednom od mišjih monoklonskih antitela 19E3, 9F11, 9H10 ili 8B6. U nekim se aspektima IL-21-antitelo izvodi iz jednog od mišjih monoklonskih antitela 19E3, 9F11, 9H10 ili 8B6. U određenim aspektima izvedeno antitelo je humanizovano antitelo. U drugim aspektima, IL-21 -vezujući molekul obuhvata YTE-mutirani humani IgGl konstantni region. U specifičnim aspektima, IL-21-vezujući molekul je K44VHa-N56Q.

[0211] U jednom aspektu, lečenje uključuje primenu ili davanje subjektu ili pacijentu IL-21 vezujućih molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata kao što je ovde obezbeđeno ili primenu ili davanje IL-21 vezujućeg molekula izolovanom tkivu ili ćelijskoj liniji iz subjekta ili pacijenta, gde subjekt ili pacijent boluje od bolesti, simptoma bolesti ili predispozicije prema bolesti. U drugom aspektu, lečenje može takođe uključivati primenu ili davanje farmaceutske kompozicije koja obuhvata IL-21 vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, varijantu ili derivat subjektu ili pacijentu kao što je ovde obezbeđeno, ili primenu ili davanje farmaceutske kompozicije koja obuhvata IL-21 vezujući molekul izolovanom tkivu ili ćelijskoj liniji iz subjekta ili pacijenta, koji boluje od bolesti, simptoma bolesti ili predispozicije prema bolesti.

[0212] IL-21 vezujući molekuli, na primer, ovde obezbeđena anti-IL-21 antitela ili njegovi antigen-

4

vezujući fragmenti, varijante ili derivati korisni su za lečenje raznih zapaljenskih, imunski posredovanih ili autoimunih bolesti ili poremećaja. Takve zapaljenske, imunski posredovane ili autoimune bolesti ili poremećaji mogu biti bolest pokrenuta B-ćelijama ili bolest pokrenuta T-ćelijama. U jednom aspektu, IL-21 vezujući molekuli, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati obezbeđeni su za upotrebu u lečenju ili profilaksi zapaljenske, imunski posredovane ili autoimune bolesti ili poremećaja. Primeri zapaljenskih, imunski posredovanih ili autoimunih bolesti ili poremećaja uključuju, ali nisu ograničene na vaskulitis, na primer, antineutrofilnih citoplazmatskih antitela (ANCA), vaskulitis povezan sa ANCA-om (AAV) ili vaskulitis tipa arteritis džinovskih ćelija (GCA), Šergenov sindrom, zapaljensku bolest creva (IBD), vulgarni pemfigus, lupus nefritis, psorijazu, tiroiditis, dijabetes tipa I, idiopatsku trombocitopeničnu purpuru (ITP), ankilozirajući spondilitis, multiplu sklerozu, sistemski eritemski lupus (SLE), reumatoidni artritis, Kronovu bolest, mijasteniju gravis, neuromijelitis optiku (NMO), bolest povezanu sa IgG4-om, sistemsku sklerozu, insulin zavisni dijabetes melitus (IDDM), akilozirajući spondilitis, atopijski dermatitis, uveitis i bolest kalem protiv domaćina (GVHD). U jednom aspektu, IL-21 vezujući molekuli, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati obezbeđeni su za upotrebu u lečenju ili profilaksi bolesti ili malignacija pokrenutih B-ćelijama. Primer malignacije pokrenute B-ćelijama može uključivati folikularni limfom (FL), difuzni limfom velikih B-ćelija (DLBCL), Hodžkinov limfom (HL), hroničnu limfocitna leukemija (CLL), limfom beta ćelija limfocita, Burkitov limfom, Valdenstromovu makroglobulinemija i multipli mijelom (MM). U jednom aspektu, IL-21 vezujući molekuli, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati obezbeđeni su za upotrebu u lečenju ili profilaksi bolesti ili malignacija pokrenutih T-ćelijama. Primer malignacije pokrenute T-ćelijama može uključivati angioimunoblastični limfom T-ćelija koji je malignacija izvedena iz folikularnih pomagačkih T-ćelija (Tfh), anaplastični limfom velikih ćelija, T-ćelijska leukemija kod odraslih, kožni T-ćelijski limfom i Sezarijev sindrom.

[0213] U skladu sa postupcima prema ovom otkrivanju, najmanje jedan IL-21 vezujući molekul, na primer, anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, varijanta ili derivat kao što je ovde definisan na drugom mestu koristi se za promovisanje pozitivnog terapijskog odgovora u odnosu na autoimuni odgovor. Pod „pozitivnim terapijskim odgovoromˮ u odnosu na autoimuno lečenje podrazumeva se bilo kakvo poboljšanje u stanjima bolesti povezanim sa aktivnošću ovih vezujućih molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, varijanata ili derivata i/ili poboljšanje u simptomima povezanim sa bolešću. Dakle, na primer, poboljšanje u bolesti može se okarakterisati kao potpun odgovor. Pod „potpunim odgovoromˮ podrazumeva se odsustvo bolesti koja se može klinički detektovati sa normalizacijom bilo kojih prethodnih rezultata testa. Takav odgovor može u nekim slučajevima potrajati, na primer, najmanje jedan mesec posle lečenja u skladu sa postupcima prema ovom otkrivanju. Alternativno se poboljšanje u bolesti može kategorisati kao delimičan odgovor.

[0214] Klinički odgovor može se proceniti pomoću skrining tehnika poput skeniranja magnetnom rezonantnom tomografijom (MRI), snimanja rendgen aparatom, skeniranja kompjuterskom

4

tomografijom (CT), protočne citometrije ili analize ćelijskog sortiranja aktiviranog fluorescencijom (FACS), histologije, mikroskopske patologije i krvnog testa, uključujući, ali ne ograničavajući se na, promene koje se mogu detektovati ELISA-om, ELISPOT-om, RIA-om, hromatografijom i sličnim. Uz ove pozitivne terapijske odgovore, subjekat u toku lečenja IL-21 vezujućim molekulom, na primer, anti-IL-21 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom, varijantom ili derivatom, može osetiti blagotvorne efekte poboljšanja u simptomima povezanim sa bolešću.

[0215] Takođe je obezbeđena upotreba IL-21 vezujućih molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, varijanata ili derivata, za dijagnostičko praćenje nivoa proteina (na primer, IL-21 nivoa) u krvi ili tkivu kao deo kliničkog ispitnog postupka, na primer, radi utvrđivanja efikasnosti datog režima lečenja. Na primer, otkrivanje se može olakšati spajanjem antitela sa supstancom koja se može detektovati. Primeri supstanci koje se mogu detektovati uključuju razne enzime, prostetske grupe, fluorescentne materijale, luminescentne materijale, bioluminescentne materijale i radioaktivne materijale. Primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, beta-galaktozidazu ili acetilholinesterazu; primeri pogodne prostetske grupe kompleksa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju umbellferon, fluorescein, fluorescein izocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, danzil hlorid ili fikoeritrin; primer luminescentnog materijala uključuje luminol; primeri bioluminescentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin i ekvorin; a primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju<125>I,<131>I,

<35>S ili<3>H.

VII. Farmaceutske kompozicije i postupci za davanje

[0216] Dobro su poznati postupci za pripremanje i davanje IL-21 vezujućih molekula, na primer, ovde obezbeđenih anti-IL-21 antitela ili njihovih antigen-vezujućih fragmenata, varijanata ili derivata subjektu kom su oni potrebni i stručnjak iz ove oblasti ih lako određuje. Način davanja IL-21 vezujućeg molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata može biti, na primer, oralno, parenteralno, inhalacijom ili topikalno. Termin parenteralno kao što je ovde upotrebljen uključuje, na primer, intravensko, intraarterijsko, intraperitonealno, intramuskularno, subkutano, rektalno ili vaginalno davanje. Iako se očigledno podrazumeva da su svi ovi oblici davanja unutar obima ovog otkrivanja, drugi primer oblika davanja mogao bi biti rastvor za injekciju, naročito za intravensku ili intraarterijalnu injekciju ili ukapavanje. Pogodna farmaceutska kompozicija može obično obuhvatati pufer (na primer acetatni, fosfatni ili citratni pufer), surfaktant (na primer polisorbat), opcioni stabilizatorski agens (na primer humani albumin), itd. U drugim postupcima kompatibilnim sa učenjima ovde, IL-21 vezujući molekuli, na primer, anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati kao što su ovde obezbeđeni mogu se direktno dostavljati na mesto nepovoljne populacije ćelija čime se povećava izloženost bolesnog tkiva terapijskom agensu. U jednom aspektu,

4

davanje je direktno u vazdušni put, na primer, inhalacijom ili intranazalnim davanjem.

[0217] Kao što je ovde razmatrano, IL-21 vezujući molekuli, na primer, ovde obezbeđena anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu se davati u farmaceutski efektivnoj količini za in vivo lečenje bolesti posredovane IL-21 poput zapaljenskih, imunski posredovanih ili autoimunih bolesti ili poremećaja. S tim u vezi, ceniće se ako se opisani vezujući molekuli mogu formulisati tako da olakšavaju davanje i promovišu stabilnost aktivnog agensa. Farmaceutske kompozicije u skladu sa ovim otkrivanjem mogu obuhvatati farmaceutski prihvatljiv, netoksičan, sterilan nosač poput fiziološkog rastvora, netoksičnih pufera, konzervanasa i sličnih. Za potrebe trenutne primene, farmaceutski efektivna količina IL-21 vezujućeg molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata, konjugovanog ili nekonjugovanog, označava količinu dovoljnu da se postigne efektivno vezivanje za cilj i da se postigne benefit, na primer, da se učine podnošljivijim simptomi bolesti ili stanja ili da se detektuje supstanca ili ćelija. Pogodne formulacije za upotrebu u ovde opisanim postupcima za lečenje opisane su u Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.) 16th ed. (1980).

[0218] Određene ovde obezbeđene farmaceutske kompozicije mogu se davati oralno u prihvatljivim dozirnim oblicima koji uključuju, na primer, kapsule, tablete, vodene suspenzije ili rastvore. Određene se farmaceutske kompozicije mogu davati nazalnim aerosolom ili inhalacijom. Takve se kompozicije mogu pripremati kao rastvori u fiziološkom rastvoru, koristeći benzil alkohol ili druge pogodne konzervanse, promotere apsorpcije radi poboljšanja biodostupnosti i/ili drugih konvencionalnih agenasa za rastvaranje ili disperziju.

[0219] Količina IL-21 vezujućeg molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, koja se može kombinovati sa nosačkim materijalima radi proizvodnje pojedinačnog dozirnog oblika variraće u zavisnosti od subjekta koji se leči i naročitog načina davanja. Kompozicija se može davati kao pojedinačna doza, više doza ili tokom određenog vremenskog perioda u infuziji. Režimi doziranja mogu se takođe prilagoditi radi obezbeđivanja optimuma željenog odgovora (na primer, terapijskog ili profilaktičkog odgovora).

[0220] Zadržavajući se u obimu ovog otkrivanja, anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu se davati čoveku ili drugoj životinji u skladu sa gorepomenutim postupcima za lečenje u količinama dovoljnim da proizvedu terapijski efekat. Ovde obezbeđena anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu se davati takvom čoveku ili drugoj životinji u konvencionalnim dozirnim oblicima pripremljenim kombinacijom antitela ili njegovog antigenvezujućeg fragmenta, varijante ili derivata prema ovom otkrivanju sa konvencionalnim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili razblaživačem u skladu sa poznatim tehnikama. Oblik i karakter farmaceutski prihvatljivog nosača ili razblaživača može se diktirati količinom aktivne komponente sa kojom se kombinuje, načinom davanja i drugim dobro poznatim varijablama. Može se takođe koristiti i koktel koji obuhvata jednu ili više vrsta IL-21 vezujućih molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njihovih antigenvezujućih fragmenata, varijanata ili derivata, prema ovom otkrivanju.

[0221] Pod „terapijski efektivnom dozom ili količinomˮ ili „efektivnom količinomˮ podrazumeva se količina IL-21 vezujućeg molekula, na primer, antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata, koja će, kada se da, doneti pozitivan terapijski odgovor u odnosu na lečenje pacijenta koji boluje od bolesti ili stanja kog treba lečiti.

[0222] Terapijski efektivne doze kompozicija prema ovom otkrivanju, za lečenje bolesti posredovane IL-21 poput zapaljenske, imunski posredovane ili autoimune bolesti ili poremećaja variraju u zavisnosti od mnogo različitih faktora, uključujući sredstva davanja, ciljano mesto, fiziološko stanje pacijenta, da li je pacijent čovek ili životinja, druge date medikamente i da li je lečenje profilaktičko ili terapijsko. Pacijent je obično čovek, ali se mogu lečiti i nehumani sisari uključujući transgene sisare. Doze za lečenje mogu se titrirati pomoću rutinskih postupaka poznatih stručnjacima iz ove oblasti radi optimizacije bezbednosti i efikasnosti.

[0223] S obzirom na ovo otkrivanje, stručnjak iz ove oblasti lako određuje količinu najmanje jednog IL-21 vezujućeg molekula, na primer, antitela ili njegovog vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata kog treba dati, bez nepotrebnog eksperimentisanja. Faktori koji utiču na način davanja i odgovarajuću količinu najmanje jednog IL-21 vezujućeg molekula, na primer, antitela, njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata uključuju, ali nisu ograničeni na, ozbiljnost bolesti, istoriju bolesti i starost, visinu, težinu, zdravlje i fizičko stanje individue koja se podvrgava terapiji. Slično tome, količina IL-21 vezujućeg molekula, na primer, antitela ili njegovog fragmenta, varijante ili derivata, koju treba dati zavisiće od načina davanja i od toga da li će se subjekat podvrgnuti jednoj dozi ili više doza ovog agensa.

[0224] Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje upotrebu IL-21 vezujućeg molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata, za upotrebu u lečenju zapaljenske, imunski posredovane ili autoimune bolesti ili poremećaja, na primer, vaskulitisa, na primer, ANCA ili GCA vaskulitisa, Šergenovog sindroma, sistemskog eritemskog lupusa i/ili lupus nefritisa, reumatoidnog artritisa, Kronove bolesti, mijastenije gravis ili GVHD-a.

[0225] Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje upotrebu IL-21 vezujućeg molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata, u proizvodnji medikamenta za lečenje zapaljenske, imunski posredovane ili autoimune bolesti ili poremećaja, na primer, vaskulitisa, na primer, ANCA ili GCA vaskulitisa, Šergenovog sindroma, sistemskog eritemskog lupusa i/ili lupus nefritisa, reumatoidnog artritisa, Kronove bolesti, mijastenije gravis ili GVHD-a.

VIII. Dijagnostike

[0226] Ovo otkrivanje dalje obezbeđuje postupak za dijagnostiku koristan tokom dijagnoze bolesti posredovane IL-21 poput određenih zapaljenskih, imunski posredovanih ili autoimunih bolesti ili poremećaja, koja uključuje merenje nivoa ekspresije IL-21 proteina u tkivu ili telesnoj tečnosti kod

1

individue i upoređivanje izmerenog nivoa ekspresije sa standardnim nivoom ekspresije IL-21 u normalnom tkivu ili telesnoj tečnosti, pri čemu je povećanje nivoa ekspresije u poređenju sa standardom naznaka poremećaja koji se može lečiti IL-21 vezujućim molekulom, na primer, anti-IL-21 antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom kao što je ovde obezbeđeno.

[0227] Ovde obezbeđena anti-IL-21 antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante i derivati mogu se koristiti za testiranje IL-21 proteinskih nivoa u biološkom uzorku pomoću klasičnih postupaka za imunohistologiju poznatih stručnjaku iz ove oblasti (na primer, vidi Jalkanen, et al, J. Cell. Biol.101:916-985 (1985); Jalkanen et ah, J. Cell Biol.105:3087-3096 (1987)). Drugi postupci za detektovanje IL-21 proteinske ekspresije zasnovani na antitelima uključuju imunotestove, poput imunoenzimske probe (ELISA), imunoprecipitacije ili vestern blotovanja.

[0228] Pod „ispitivanjem nivoa ekspresije IL-21 polipeptidaˮ podrazumeva se kvalitativno ili kvantitativno merenje ili procenjivanje nivoa IL-21 polipeptida u prvom biološkom uzorku ili direktno (na primer, određivanjem ili procenom apsolutnog nivoa proteina) ili relativno (na primer, poređenjem sa nivoom polipeptida povezanog sa bolešću u drugom biološkom uzorku). Nivo ekspresije IL-21 u prvom biološkom uzorku može se izmeriti ili proceniti i uporediti u odnosu na standardni nivo IL-21 polipeptida, pri čemu je standard uzet iz drugog biološkog uzorka dobijenog od individue koja ne boluje od poremećaja ili je određen uprosečavanjem nivoa populacije individua koje ne boluju od poremećaja. Jednom kada se sazna „standardniˮ nivo IL-21 polipeptida, može se iznova koristiti kao standard u poređenju što će se ceniti u struci.

[0229] Pod „biološkim uzorkomˮ podrazumeva se bilo koji biološki uzorak dobijen od individue, ćelijske linije, kulture tkiva ili drugog izvora ćelije koji potencijalno eksprimira IL-21. U struci su takođe poznati postupci za dobijanje biopsija tkiva i telesnih tečnosti iz sisara.

IX. Kompleti koji obuhvataju IL-21-vezujuće molekule

[0230] Ovo otkrivanje dalje obezbeđuje komplete koji obuhvataju IL-21 vezujući molekul, na primer, ovde opisano anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i koji se mogu koristiti za izvođenje ovde opisanih postupaka. U određenim aspektima, komplet obuhvata najmanje jedno prečišćeno anti-IL-21 antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment u jednom ili više kontejnera. U nekim aspektima, kompleti obuhvataju sve neophodne komponente i/ili dovoljno za izvođenje testa detekcije, uključujući sve kontrole, uputstva za izvođenje testova i bilo koji neophodni softver za analizu i predstavljanje rezultata. Stručnjak iz ove oblasti će lako prepoznati da se opisani IL-21-vezujući molekuli, na primer, anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti lako mogu inkorporisati u jedan od postojećih formata kompleta koji je dobro poznat u struci.

X. Imunotestovi

2

[0231] Ovde obezbeđeni IL-21 vezujući molekuli, na primer, ovde obezbeđena anti-IL-21 antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti, varijante ili derivati molekula mogu se testirati na imunospecifično vezivanje bilo kojim u struci poznatim postupkom. Imunotestovi koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, kompetitivne i nekopetitivne ispitne sisteme koji koriste tehnike poput vestern blotova, radioimunotestova, ELISA-e (imunoenzimske probe), ELISPOT-a, „sendvičˮ imunotestova, testova imunoprecipitacije, reakcija precipitina, gel difuzionih reakcija precipitina, testova imunodifuzije, testova aglutinacije, testova fiksacije komplementa, imunoradiometričkih testova, imunotestova proteina A, da navedemo samo neke. Takvi testovi su rutinski i dobro poznati u struci (vidi, na primer, Ausubel et al., eds, (1994) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., NY) Vol.1).

[0232] IL-21-vezujući molekuli, na primer, ovde obezbeđena anti-IL-21 antitela ili njihovi antigenvezujući fragmenti, varijante ili derivati mogu se koristiti histološki, kao u imunoflorescenciji, imunoelektronskoj mikroskopiji ili neimunološkim testovima, za in situ detekciju IL-21 ili njegovih očuvanih varijanti ili peptidnih fragmenata. In situ detekcija može se postići uklanjanjem histološkog uzorka iz pacijenta, i primenom na njega označenog IL-21-vezujućeg molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata, na primer, primenjenog prekrivanjem označenog IL-21-vezujućeg molekula (na primer, i antitela ili fragmenta) na biološki uzorak. Korišćenjem takvog postupka, moguće je odrediti ne samo prisustvo IL-21 ili očuvane varijante ili peptidnih fragmenata, nego i njegovu distribuciju u ispitivanom tkivu. Upotrebom ovog otkrivanja, stručnjaci iz ove oblasti će lako opaziti da se bilo koji iz širokog spektra postupaka za histologiju (poput postupaka za bojenje) može modifikovati kako bi se postigla takva in situ detekcija.

[0233] Vezujuća aktivnost date serije IL-21-vezujućeg molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili derivata može se odrediti u skladu sa dobro poznatim postupcima. Stručnjaci iz ove oblasti moći će da odrede operativne i optimalne ispitne uslove za svako određivanje primenom rutinskog eksperimentisanja.

[0234] Poznati su u struci i/ili su komercijalno dostupni postupci i reagensi pogodni za određivanje vezujućih karakteristika izolovanog IL-21-vezujućeg molekula, na primer, anti-IL-21 antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, varijante ili alteriranog/mutiranog derivata. Oprema i softver konstruisan za takve kinetičke analize su komercijalno dostupni (na primer, BIAcore®, BIAevaluation® softver, GE Healthcare; KINEXA® Softver, Sapidyne Instruments).

[0235] U praksi će se u skladu sa ovim otkrivanjem upotrebljavati, osim ukoliko je drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike citologije, ćelijske kultivacije, molekularne biologije, transgenske biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK i imunologije, koje su u okviru veština iz ove oblasti. Ove su tehnike temeljno objašnjene u literaturi. Vidi, na primer, Sambrook et al., ed. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2nd ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrook et al., ed. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D.N. Glover ed., (1985) DNA Cloning, Volumes I and II; Gait, ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Mullis et al. U.S. Pat. No. 4,683,195; Hames and Higgins, eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins, eds. (1984) Transcription And Translation; Freshney (1987) Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984) A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells, (Cold Spring Harbor Laboratory); Wu et al., eds., Methods In Enzymology, Vols.

154 and 155; Mayer and Walker, eds. (1987) Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, London); Weir and Blackwell, eds., (1986) Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1986); i u Ausubel et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

[0236] Generalni principi konstruisanja antitela izloženi su u Borrebaeck, ed. (1995) Antibody Engineering (2nd ed.; Oxford Univ. Press). Generalni principi proteinskog konstruisanja izloženi su u Rickwood et al., eds. (1995) Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Eng.). Generalni principi vezivanja antitela i hapten-antitela izloženi su u: Nisonoff (1984) Molecular Immunology (2nd ed.; Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); i Steward (1984) Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, New York, N.Y.). Uz to su standardni postupci u imunologiji poznati u struci i nisu specifično opisani generalno navedeni kao u Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Stites et al., eds. (1994) Basic and Clinical Immunology (8th ed; Appleton & Lange, Norwalk, Conn.) and Mishell and Shiigi (eds) (1980) Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).

[0237] Standardni referentni radovi koji izlažu generalne principe imunologije uključuju Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, New York; Klein (1982) J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennett et al., eds. (1980) Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984) "Monoclonal Antibody Technology" in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burden et al., (Elsevere, Amsterdam); Goldsby et al., eds. (2000) Kuby Immunology (4th ed.; H. Freemand & Co.); Roitt et al. (2001) Immunology (6th ed.; London: Mosby); Abbas et al. (2005) Cellular and Molecular Immunology (5th ed.; Elsevier Health Sciences Division); Kontermann and Dubel (2001) Antibody Engineering (Springer Verlan); Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003) Genes VIII (Prentice Hall 2003); Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach and Dveksler (2003) PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

PRIMERI

4

[0238] Aspekti prema ovom otkrivanju mogu se dalje definisati uz pozivanje na sledeće neograničavajuće primere, koji detaljno opisuju pripremanje određenih antitela prema ovom otkrivanju i postupke za upotrebu antitela prema ovom otkrivanju. Stručnjacima iz ove oblasti biće očigledno da se mnoge modifikacije, i u materijalima i u postupcima, mogu izvršiti bez izlaska iz obima ovog pronalaska.

Primer 1. Proizvodnja i humanizacija anti-IL-21 mišjih monoklonskih antitela

Imunizacija miševa i stvaranje anti-IL-21 hibridoma

[0239] Šest meseci stare ženke Balb/c miševa primile su 8 krugova intraperitonealnih (IP) i metatarzalnih injekcija prečišćenog rekombinantnog humanog IL-21 naizmenično sa IL-21 makaki rakojeda proteinom konjugovanim do BSA (Imject Maleimide-Activated BSA Komplet, Pierce). Ukratko, počevši od dana 1 miševi su imunizovani sa 10 µg IP i 2.5 µg metatarzalno imunogenom emulsifikovanim u Imject Alum (Thermo Scientific) prema uputstvima proizvođača. Imunizacija je trajala 28 dana u intervalima od 4 dana. Ispitni uzorci krvi prikupljeni su na dan 15 i 28 retro-orbitalnim uzimanjem krvi u serum separacione epruvete. Serumi su testirani ELISA-om na direktno vezivanje za IL-21 i kompeticiju sa IL-21R. Na osnovu neutralizujućih titara u kompetitivnoj ELISA-i, miševi su odabrani da prime predfuziono pojačano davanje sa 10 µg humanog IL-21 konjugovanog do BSA i žrtvovani na dan 30. Splenocitne i ćelije limfnih čvorova sakupljene su i spojene P3-X63-Ag8.653 mijelomu pomoću PEG-a da bi se stvorili hibridomi. Anti-IL-21 specifični hibridomi identifikovani su skriningom supernatanata hibridoma u direktnom vezivanju i kompetitivnom ELISA-om kao što je gore opisano. Pozitivni hibridomi su dalje testirani na neutralizujuću aktivnost u ćeliji na osnovu testa koji koristi modulaciju nadole STAT3 fosforilacije kako je očitano (IL-21 signali kroz STAT3). Neutralizujući hibridomi su zatim klonirani ograničavanjem razblaženosti i prošireni radi prečišćavanja antitela.

[0240] Kompetitivna ELISA korišćena je tokom kampanje hibridoma da identifikuje miševe sa dobrim odgovorom posle IL-21 imunizacije, praćene skriningom sa istim postupkom za neutralizaciju hibridoma. Ukratko, Maxisorp ELISA ploča (NUNC) obložena je sa 2 µg/ml IL-21R-Fc u fiziološkom rastvoru puferovanom fosfatom (PBS) na 4° C preko noći. Ploča je zatim blokirana sa 3% BSA u PBST-u (PBS 0.1% Tween) na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Paralelno, ispitni uzorci krvi su serijski razblaženi (radi skrinovanja dobrih odgovora) ili su IgG koncentracije supernatanata hibridom kulture normalizovani i prethodno inkubirani sa 2 nM biotinilovanog IL-21. Posle preinkubacije, mešavina je zatim dodata u svaki bazenčić ELISA ploče i dalje inkubirana na sobnoj temperaturi tokom pola sata. Posle ispiranja, streptavidin-HRP je dodat u svaki bazenčić da detektuje nivo vezanog IL-21 kao merač inhibicije IL-21/IL-21R-Fc interakcije ispitnim uzorcima krvi ili hibridom IgG-ovima.

Izolacija, kloniranje, sekvenciranje, ekspresija i prečišćavanje anti-IL-21 mišjih mAb-ova

[0241] Supernatantni hibridom kulture analizirani su na njihovu inhibitornu sposobnost protiv IL-21/IL-21R-Fc interakcije prateći postupak opisan u kompetitivnoj ELISA-i. Pozitivni su podvrgnuti postupku za kloniranje ograničenim razblaživanjem (LDC) kako bi se garantovala klonalnost. Kada se funkcionalnosti subklonova potvrde, oni se podvrgavaju molekulskom kloniranju.

[0242] mRNK se iz hibridoma izoluje pomoću Dynabeads mRNA Direct Kompleta prema uputstvima proizvođača. mRNK se zatim konvertuje u cDNK lančanom reakcijom reverzne transkriptaze polimeraze pomoću Superscript III Reverzne Transkriptaze. Dva skupa cDNK se sintetizuju da bi se izbegle PCR netačnosti. cDNK-ovi se koriste kao obrasci za pojačavanje varijabilnih regiona lakog lanca i teškog lanca (VL i VH) antitela. PCR se izvodi pomoću Invitrogenove Taq polimeraze visoke vrednosti i Novagenovog seta mišjih Ig prajmera, koji uključuju šest setova VH prajmera i sedam setova VL prajmera. Pojačani VL i VH PCR proizvodi su prečišćeni i klonirani u Invitrogenovim pCR 2.1 Topo vektorima, koji lako podvrgavaju ligaciji DNK sekvence sa T-A kompatibilnim krajevima. Transformisana E. coli je postavljena na X-gal/Carb agarne ploče. Kolonije bakterija koje sadrže PCR umetke pojavljuju se kao bele. Nasumične bele kolonije odabrane su za PCR kako bi se dalje verifikovalo umetanje.

[0243] Za sekvenciranje je odabrano četrdesetosam belih kolonija iz svake transformacije. Kolonije su bile inokulirane u ploči sa 96 bazenčića sa LB/Carb podlogama, a zatim otisnute na LB/Carb agarne ploče. Kolonije koje su porasle na agarnim pločama sekvencirane su pomoću M13 naprednog prajmera. Na osnovu rezultata sekvenciranja, stvoreni su prajmeri koji bi omogućili PCR umnožavanje VL i VH dodajući mesta restrikcionih enzima koja su kompatibilna sa humanim IgG pOE ekspresionim vektorom. Digestija restrikcionih enzima i ligacija izvedene su radi kloniranja VL i VH u vektor koji rezultuje konstruktom himernog antitela koje sadrži mišji varijabilni region i humani konstantni region. DNK plazmid je transfektovan u 293F ćelije pomoću 293 transfektnog reagensa. Octet-om su procenjeni IgG nivoi ekspresije u ćelijskim supernatantima. IgG u supernatantu je prečišćen pomoću Protein-A kolona.

Prečišćeni IgG analiziran je na SDS-PAGE-u.

[0244] ELISA je korišćena za testiranje unakrsne reaktivnosti vodećih klonova. Testirani citokini uključuju 11-2, IL-4, IL-7, IL-9 i IL-15. Maxisorp ELISA ploča (NUNC) obložena je sa 2 µg/ml različitih citokina u PBS-u na 4°C preko noći. Ploča je zatim blokirana sa 3% BSA u PBST-u (PBS 0.1% Tween) na sobnoj temperaturi tokom jednog sata. Prečišćeni vodeći klonovi IgG-ova su serijski razblaženi u PBST+3% BSA, a mešavina je potom dodata u svaki ELISA ploča bazenčić i dalje inkubirana na sobnoj temperaturi tokom pola sata. Posle ispiranja sekundarno antitelo-HRP dodato je u svaki bazenčić na 1 sat. Bazenčići su takođe isprani prvo PBST-om, a zatim PBS-om i TMB rastvor od Pierce-a je dodat da detektuje sekundarno antitelo. Posle 5' reakcija je zaustavljena dodavanjem IN sumporne kiseline. Ploče su zatim očitane u ELISA čitaču na 450 nm radi detektovanja vezivanja.

Humanizacija različitih anti-IL-21 mišjih mAb-ova

[0245] Mišije mAb 9F11 koje pokazuje željenu biološku aktivnost sa KD za vezivanje od 10 nM za IL-21 stvoreno je i okarakterisano od strane Medlmmune-a. Humanizacioni posao izveden je u Shanghai ChemPartner Co. pomoću CDR tehnologije kalemljenja. Svojstva kandidata sa uspešno humanizovanim antitelima, 9F11-4, 9F11-6 i 9F11-11, su verifikovana (rezultati su predstavljeni u nastavku). Sekvence V regiona od 9F11 i humanizovanih 9F11 klonova prikazane su na FIG.1A.

[0246] Humanizacija mišjeg mAb 19E3 izvedena je kalemljenjem CDR-ova od 19E3 u odabrane humane regione okvira linije klice. Sekvence varijabilnog regiona (VH) teškog lanca i varijabilnog regiona (VL) lakog lanca mišjeg mAb 19E3 poređene su sa sekvencama humanog antitela linije klice dostupnim u javnim NCBI bazama podataka. Humani akceptorski okviri identifikovani su na osnovu najviše homologije sekvenci. Pri biranju optimalnog akceptorskog okvira, korišćeno je nekoliko drugih kriterijuma, uključujući poklapanje kritičnih ostataka (ostaci Vernijeove zone, kanonske klase i VH/VL ostaci interfejsa), imunogenosti (frekvencija linije klice), stabilnosti i ekspresije. U ovom je slučaju identifikovana jedna porodica linije klice kao akceptorski okvir za VH: VH1-46. Geni J-segmenta upoređeni su sa roditeljskim sekvencama preko Okvira 4 i J-segmenata i JH4 je odabran za VH. Ovaj potpuno humani akceptorski obrazac linije klice imenovan je kao Ha. Kako bi se postigla najviša homologija VL akceptorske sekvence, individualni regioni okvira iz tri različite humane linije klice su kombinovani radi konstrukcije optimalne hibridne akceptorske sekvence linije klice. Humani obrazac odabran za VL lanac, imenovan kao K1, bio je kombinacija 014 (Okvirl), 018 (Okvir2), L23 (Okvir3) i JK1 (Okvir 4). Homologija okvira između mišje sekvence i humanog obrasca bila je oko 71% za VH i 79% za VL.

[0247] Kritični ostaci mišjeg okvira za koje se mislio da utiču na CDR eze, stabilizuju strukturu varijabilnih regiona i utiču na međulančano pakovanje VH i VL i/ili interakciju identifikovani su i selektivno uvedeni nazad u humane okvire linije klice kako bi se najbolje očuvao 19E3 vezujući epitop i afinitet. U ovom slučaju, mišji ostaci na 44V i 87F mutirani su nazad u humani obrazac VL lanaca kao drugi obrazac akceptorskog okvira, nazvan K2. Poravnanje roditeljskog VL lanca sa ovim akceptorskim okvirima prikazano je na FIG. IB.

[0248] Dva dodatna humana obrasca akceptorskog okvira konstruisana su za VH lanac kao alati za identifikaciju okvira koji može uticati na vezujuću aktivnost 19E3, ako potpuno humani akceptorski obrazac (Ha) izgubi vezujući afinitet. Jedan obrazac, nazvan Hb, konstruisan je spajanjem mišjeg okvira 1 sa VH1-46/JH4 humanim obrascem; drugi obrazac, nazvan He, konstruisan je spajanjem mišjeg okvira 3 sa VH1-46/JH4 humanim obrascem. Poravnanje roditeljskog VH lanca sa ovim akceptorskim okvirima prikazano je na FIG. IB.

[0249] CDR ostaci kako ih definiše Kabat spojeni su u konstruisane akceptorske okvire i za VH i za VL radi stvaranja humanizovanog antitela. Ukupno, tri humanizovana VH gena (Ha, Hb i He) i dva VL gena (K1 i K2) sintetisani su pomoću GeneART-a, zatim klonirana u IgGl ekspresioni vektor. Izrađen je panel humanizovanih varijanti i okarakterisan u biohemijskim i biološkim testovima. Test kompeticije HTRF epitopa razvijen je za testiranje IL-21 vezujućih aktivnosti humanizovanih varijanti. Potpuno humanizovan VH obrazac Ha pokazao je sličnu IL-21 vezujuću aktivnost mišjem 19E3 VH, kao i hibridne varijante Hb i He. K2, humanizovani VL obrazac sa dva mišja ostatka na položajima 44V i 87F prikazao je bolju vezujuću aktivnost od potpuno humanizovane K1 varijante. Pokazalo se da rezultantna humanizovana varijanta (K2Ha) poseduje antigen-vezujući afinitet i epitopsku specifičnost sličnu 19E3. Kako bi se minimalizovao sadržaj mišjeg ostatka u humanizovanoj varijanti koja se najbolje ponaša (K2Ha), mišji ostatak na 87F zamenjen je sličnim humanim ostatkom, ali ne i 44V koji je od suštinskog značaja za zadržavanje vezujuće aktivnosti za IL-21. Visoko rizično N-povezano mesto glikozilacije (NYT) identifikovano je u 19E3 teškom lancu na položaju 56 u CDR2 i uklonjeno je zamenom N sa Q. Konačno humanizovano antitelo (K44VHaN56Q) sa samo jednim mišjim ostatkom prikazalo je nerazlučivu vezujuću aktivnost u poređenju sa mišjim 19E3 i pokazalo biološke aktivnosti unutar 2-3 puta od 19E3 u svim testiranim biološkim analizama.

[0250] Mišje mAb 9F11 pokazalo je željenu biološku aktivnost sa KDza vezivanje od 10 nM za IL-21. Humanizacioni posao izveden je u Shanghai ChemPartner Co. pomoću CDR tehnologije kalemljenja. Svojstva kandidata sa uspešno humanizovanim antitelima, 9F11-4, 9F11-6 i 9F11-11, su verifikovana, pokazujući da su antitela potpuno zadržala vezujući afinitet i biološku aktivnost za IL-21, u poređenju sa roditeljskim mišjim 9F11. Sekvence V regiona 9F11 i humanizovanih 9F11 klonova prikazane su na FIG.1.

[0251] Svojstva različitih ovde obezbeđenih anti-IL-21 antitela prikazana su u Tabeli 2.

TABELA 2: Primerna anti-IL-21 antitela

ND: Nije urađeno

Primer 2. Vezujući afinitet K44VHa-N56Q za rekombinantni humani i IL-21 makaki rakojeda

[0252] Ovaj Primer pokazuje određivanje ravnoteže vezujućih konstanti (KD) u fazi rastvora za interakciju K44VHa-N56Q sa humanim i proteinima IL-21 makaki rakojeda. Ravnoteža konstante disocijacije (KD) za interakciju K44VHa-N56Q sa rekombinantnim humanim (hu) i IL-21 makaki rakojeda (cino) izmerena je pomoću KinExA (Kinetic Exclusion Assay) 3000 platforme (Sapidyne, Boise, ID). Zasebne 50 mg količine Azlactone perli (Thermo Scientific, Rockford, IL) obložene su sa huIL-21 (dobijenog iz Protein Sciences/ADPE) ili cinoIL-21 (dobijenog iz Protein Sciences/ADPE) pri koncentracijama od 75 ili 150 µg/mL prema uputstvima proizvođača instrumenta. Perle su isprane i blokirane u 1 M Tris puferu, pH 8 (Invitrogen, Carlsbad, CA), koji sadrži 10 mg/mL albumin goveđeg seruma (BSA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MPO) i koji je skladišten na 4° C dok nije upotrebljen. Zapremine serija K44VHa-N56Q pripremljene su pri koncentracijama od 500 fM i 50 pM (500 fM i 50 pM K44VHa-N56Q serije, respektivno) u puferu za uzorke (fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS, Invitrogen), pH 7.4, 0.1% BSA, 0.02% natrijum azida (NaN3, Sigma-Aldrich)); svaka je izbačena u 2 zasebna skupa od 13 epruveta (1 za svaku seriju). Humani ili IL-21 makaki rakojeda dodat je u 1 epruvetu iz svake serije pri koncentraciji od ili 4 nM (50 pM K44VHa-N56Q) ili 100 pM (500 fM K44VHa-N56Q serija), zatim serijski razblažen preko 11 preostalih epruveta, ostavljajući 1 epruvetu za uzorak u svakoj seriji kao K44VHa-N56Q, kontrolu samo receptora. Konačne koncentracije humanog ili IL-21 makaki rakojeda u pojedinačnim mešavinama uzorka su u rasponu od 1.95 fM do 100 pM (500 fM K44VHa-N56Q) i 78.1 fM do 4 nM (50 pM K44VHa-N56Q). Ove su mešavine uzoraka uravnotežene na sobnoj temperaturi tokom 2 do 7 dana i analizirane na KinExA platformi. Guste suspenzije Azlactone perli obloženih sa IL-21 razblažene su do 30 mL sa instrumentalnim puferom (PBS, pH 7.4, 0.02% NaN3) u bočici za perle i prikačeni na KinExA instrument. Program u kom korisnik definiše tajming koristi se za sekvencijalni transfer IL-21/Azlactone perli u kapilarne protočne ćelije u instrumentu, a pojedinačne mešavine uzorka se ubrizgavaju preko perli obloženih IL-21. Nevezani rastvor uzorka uklonjen je ispiranjem perli instrumentalnim puferom.1- or 2^g/mL rastvor DyLight649-obeleženog, kozjeg-anti-huIgG(H+L) sekundarnog reagensa (Thermo Scientific) prelazi preko perli radi detekcije (K44VHa-N56Q) koji je ostao vezan za perle obložene IL-21. Perle se ponovo ispiraju instrumentalnim puferom radi uklanjanja viška (nevezane) oznake. Izmerena je količina fluorescencije koja je ostala povezana sa perlama, a signal je pretvoren u procenat slobodnog receptora (K44VHa-N56Q). Između uzoraka, pakovanje perli je isprano od protočne ćelije i ispunjeno svežim Azlactone perlama obloženim sa IL-21 u pripremanju za sledeći uzorak. Kada se podaci prikupe za sve uzorke u svakoj seriji (500 fM i 50 pM K44VHa-N56Q), stvara se izoterma, koja iscrtava količinu slobodnog K44VHa-N56Q detektovanog u svakoj koncentraciji IL-21. Rezultujuće 2 vezujuće krive su zatim procenjene u analizi dvostrukih krivih pomoću softvera za evaluaciju instrumenta (KinExA Pro Softver, v.2.0.1.26, Sapidyne) iz kog se izvode individuanlni KD-ovi za svaku interakciju.

[0253] Vezivanje K44VHa-N56Q za humani i IL-21 makaki rakojeda izmereno je KinExA-om. K44VHa-N56Q je pripremljen u 2 serije koncentracija: 500 fM i 50 pM, a humani IL-21 ili protien IL-21 makaki rakojeda je serijski razblažen preko svake serije. Kada se postigne ravnoteža, KinExA instument je korišćen za merenje koncentracije slobodnog K44VHa-N56Q koji je ostao u svakoj mešavini uzorka. Ovo je urađeno beleženjem količine fluorescencije koja je ostala povezana sa perlama obloženim IL-21 pošto su uzorci svake mešavine prešli preko perli, a zatim izloženi fluorescentno obeleženom, anti-IgG reagensu. Izrađen je grafik količine zabeleženog slobodnog K44VHa-N56Q nasuprot koncentracije huIL-21 ili cinoIL-21 proteina, a softver procenjivanja KinExA platforme je upotrebljen da uklopi svaki skup podataka u afinitetni model jednog mesta. KinExA softver globalno uklapa obe krive vezivanja (500 fM i 50 pM IgG) u analizi dvostruke krive (FIG.2A i 2B, respektivno, dajući optimalne solucije za nekoliko parametara istovremeno i računajući pravu vezujuću konstantu u fazi rastvora. Pod ovim uslovima, izračunato je da je KDza vezivanje K44VHa-N56Q za huIL-21 protein 515 fM (95% CI za KD: 279 do 844 fM), dok je izračunao da je vezivanje ili K44VHa-N56Q za cinoIL-21 protein 352 fM (95% CI za KD: 134 do 685 fM).

[0254] Prikazano je da se K44VHa-N56Q slabo vezuje za mišji IL-21 sa µM afinitetom, kao što je izmereno na KinExA platformi.

Primer 3. Mehanizam akcionih ispitivanja za anti-IL-21 monoklonska antitela

Anti-IL-21 klonovi blokiraju STAT3 fosforilaciju prouzrokovanu IL-21

[0255] Kao što je opisano u nastavku, određena je mogućnost prečišćenih anti-IL-21 antitela da inhibiraju STAT3 fosforilaciju (pSTAT3) prouzrokovanu humanim ili cino IL-21.

[0256] Ukratko, ukupne humane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC-ovi) izolovane su iz CPT epruveta (BD Vacutainer) posle centrifugiranja prema uputstvima proizvođača. Anti-IL-21 antitela su prethodno inkubirana sa humanim ili cino IL-21 (20 pM) u pločama okruglog dna sa 96 bazenčića tokom 60 minuta na 37 stepeni. Posle ove inkubacije, PBMC-ovi (0.4x10<6>po bazenčiću) su brzo dodati svakom bazenčiću i inkubirani sa IL-21/IgG tokom 15 minuta na 37 stepeni. Posle stimulacije, ćelije su fiksirane tokom 10 minuta (na 37 stepeni) sa 100 µḯ/bazenčić prethodno zagrejanim Liza/Fiksiranim Puferom (BD Phosflow) praćeno permeabilizacijom na ledu tokom 30 minuta sa 225 µḯ/bazenčić Perm Puferom III (BD Phosflow). Ćelije su isprane dva puta (PBS/2% BSA) i obeležene anti-pSTAT3 (pY705, BD Phosflow) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su isprane sa puferom za bojenje i analizirane na LSR II protočnom citometru (BD Biosciences) pomoću FACSDiva softvera.

[0257] Stimulacija humanim i cino IL-21 kao što je opisana prouzrokovala je uvećanje u nivoima pSTAT3 u ukupnim humanim PBMC-ovima 3-5 puta (FIG.3A). Reprezentativni grafici koji predstavljaju inhibiciju ushodne regulacije pSTAT3 od strane anti-IL-21 antitela prouzrokovane IL-21 prikazani su na FIG.3B. Svi testirani klonovi dostigli su 100% inhibicije u ovom testu. IC50 vrednosti anti-IL-21 klonova u pSTAT3 testu sumirane su u Tabeli 3. Ovi podaci pokazuju da su opisana anti-IL-21 antitela u stanju da inhibiraju rane signalne događaje nizvodno od IL-21R.

Tabela 3: IC50 vrednosti anti-IL-21 antitela u pSTAT3 testu

1

[0258] Pokazalo se da se K44VHa-N56Q slabo vezuje za mišji IL-21. Stimulacija mišjih splenocita mišjim IL-21 prouzrokovala je povećanje od 4 puta u intraćelijskim nivoima fosforilovanog STAT3. K44VHa-N56Q nije bio u stanju da inhibira STAT3 fosforilaciju prouzrokovanu mišjim IL-21. Ovi podaci sugerišu da K44VHa-N56Q ne neutrališe bioaktivnost mišjeg IL-21.

[0259] IL-21 je član γcreceptorske citokine porodice koja koristi zajednički gama lanac u saradnji sa specifičnim receptorom(ima) radi posredovanja biološke aktivnosti. Humani krvni limfociti stimulisani su γclancem koristeći IL-2, IL-4, IL-7, IL-15 ili IL-21 citokine u prisustvu ili odsustvu K44VHa-N56Q ili kontrolnog humanog IgGl-YTE antitela. Nizvodna signalizacija izmerena je procenom fosforilacije STAT molekula odgovarajućih za svaki citokin. K44VHa-N56Q nije imao efekta na nizvodnu signalizaciju povezanih IL-2, IL-4, IL-7 ili IL-15 citokina. Ovi podaci pokazuju da K44VHa-N56Q specifično deluje da neutrališe IL-21 put u humanim ćelijama.

[0260] IL-21 signalizacija kroz njegov srodni receptor vodi aktivaciji i fosforilaciji STAT3. Ovde opisani podaci pokazuju da K44VHa-N56Q može inhibirati ushodnu regulaciju pSTAT3 kao odgovor na i humani i cino IL-21, ali ne i mišji IL-21. Nadalje, ova je inhibicija specifična za IL-21 jer K44VHa-N56Q ne utiče na aktivaciju STAT molekula nizvodno od povezanih γccitokinskih receptora poput receptora za IL-2, IL-4, IL-7 i IL-15. Shodno tome, K44VHa-N56Q je potentan i specifičan inhibitor IL-21R signalizacionih događaja.

IL-21 blokada suzbija proizvodnju IFNy od strane NK-92 ćelija

[0261] Na sledeći način je procenjen efekat prečišćenih anti-IL-21 antitela na proizvodnju IFNy od strane NK-92 ćelija prouzrokovanu IL-21.

[0262] NK-92 ćelije su uzgajane u kompletnoj podlozi za uzgajanje koja se sastoji od MEM alpha Glutamax osnove podloge suplementirane natrijumbikarbonatom (1.5 g/L), inozitolom (0.2 mM, Sigma Aldrich), 2-merkaptoetanolom (0.1 mM), folnom kiselinom (0.02 mM, Sigma Aldrich), rekombinantnim IL-2 (100 U/ml, R&D Systems), konjskim serumom (12.5%) i serumom fetusa goveda (12.5%). Svi reagensi su kupljeni od Invitrogen-a osim ako nije drugačije naznačeno. Ćelije su isprane i ponovo suspendovane u podlozi koja nije sadržala IL-2 tokom 16-24 sati pre stimulacije sa IL-21. Radi procene potencije anti-IL-21 klonova, antitela su prethodno inkubirana sa humanim ili cino IL-21 (200 pM) u pločama ravnog dna sa 96 bazenčića tokom 60 minuta na 37 stepeni.0.5x10<5>NK-92 ćelije su zatim

2

dodate na ploču i inkubirane na 37 stepeni tokom 24 sata. Proizvodnja IFNy je kvantifikovana u supernatantu pomoću MSD human IFNy single-plex testa prema uputstvima proizvođača (Meso Scale Discovery).

[0263] Mogućnost anti-IL-21 klonova da inhibiraju humani i cino IL-21 prouzrokovani IFNy od strane NK-92 ćelija prikazana je na FIG.4. Klonovi K2Ha-N56Q, K(44V)Ha-N56Q i K(44V)Ha6-N56Q bili su u stanju da potpuno inhibiraju proizvodnju IFNy u ovim kulturama, sa sličnom potencijom protiv humanog i cino IL-21. Pregled IC50 vrednosti klonova testiranih u NK-92 ćelijskom testu obezbeđen je u Tabeli 4. Ovi podaci prikazuju da testirana anti-IL-21 antitela moduliraju aktivnost NK-92 ćelija kao što je prikazano potpunim blokiranjem proizvodnje IFNy na 24 sata.

Tabela 4 IC50 vrednosti anti-IL-21 antitela u NK-92 testu

Anti-IL-21 klonovi inhibiraju diferencijaciju plazma ćelija prouzrokovanu egzogenim IL-21

[0264] Kako bi se odredio efekat anti-IL-21 antitela na aktivnost B-ćelija, izveden je test diferencijacije plazma ćelija.

[0265] Humani PBMC-ovi su izolovani iz CPT epruveta (BD Vacutainer) posle centrifugiranja prema uputstvima proizvođača. B-ćelije su negativno odabrane pomoću MACS reagenasa za ćelijsku separaciju (Komplet II za izolaciju humanih B-ćelija, Miltenyi Biotec). Rutinska čistoća B-ćelija pomoću ove tehnike bila je >97%. Treba napomenuti da, ukupni preparati B-ćelija izolovani pomoću ovog postupka sadrže populacije i naivnih i memorijskih B-ćelija, ali PC-ovi su odstranjeni usled ekspresije CD43, kog cilja sekretorni koktel antitela MACS kompleta. Podloga za kultivisanje u ovim eksperimentima bila je RPMI 1640 (Invitrogen) suplementirana 10% FCS-om, penicilin-streptomicinom (100 jedinica/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina), 2-merkaptoetanolom (55 µM), L-glutaminom (2 mM) i HEPES-om (5 mM).

Anti-IL-21 antitela bila su prethodno inkubirana u pločama okruglog dna sa 96 bazenčića sa stimulacionim koktelom koji je uključivao humani ili cino IL-21 (2 nM), anti-CD40 (0.1 µg/ml, kozji IgG, R&D Systems) i anti-IgM F(ab')2 (5.0 µg/ml, Jackson ImmunoResearch Laboratories) tokom 60 minuta na 37 stepeni.0.5-1.0 x 10<5>B-ćelije su zatim dodate na ploču za konačnu zapreminu od 150µl.

[0266] Posle 6 dana stimulacije, ćelije su obojene i analizirane pomoću protočne citometrije radi kvantifikovanja frekvencije plazma ćelija u kulturi. Ćelije su isprane (PBS/2% FBS) i obojene tokom 30 minuta na 4 stepen sa anti-IgD (FITC ili PE); anti-CD38 (alofikocijanin, klon HB7) (BD Pharmingen) i analizirane na LSRII protočnom citometru pomoću FACSDiva Softvera. Uz to, supernatanti su sakupljeni i Ig proizvodnja je kvantifikovana ELISA-om. Ukratko, ploče ravnog dna sa 96 bazenčića obložene su preko noći na 4°C sa 5 µg/ml kozjeg anti-humanog IgG razblaženog u PBS-u (Bethyl Laboratories). Ploče su isprane i blokirane sa 0.2% BSA u PBS. Supernatanti su razblaženi i inkubirani na pločama preko noći. Vezani Ig detektovan je kozjom anti-humanom IgG-alkalin fosfatazom (0.2 µg/ml, Bethyl Laboratories) razblaženom u blokirajućem puferu. Ploče su razvijene sa SigmaFast p-Nitrofenilfosfat tabletama (Sigma Aldrich), a specifična apsorbancija je izmerena na 405 nm pomoću SpectraMax čitača ploča (Molecular Devices).

[0267] Stimulacija humanih B-ćelija kao što je gore opisano ili humanim ili cino IL-21 rezultovala je u stvaranju IgD<->CD38<hi>PC populacije (FIG.5A i 5B). Nekoliko klonova uključujući 19E3.1, 9F11.1 i 9H10.1 bili su u stanju da potpuno inhibiraju PC diferencijaciju pod ovim uslovima (FIG.5A i 5B). Klon 8B6.1 je inhibirao PC diferencijaciju prouzrokovanu cino, ali ne i humanim IL-21. IC50 vrednosti za anti-IL-21 klonove sumirani su u Tabeli 5. Uz to, u kontrolnim uslovima, stimulacija IL-21, anti-CD40 i anti-IgM rezultovala je u Ig proizvodnji u opsegu od 30-40 µg/ml do dana 6 (FIG.5C). Klonovi 19E3.1 i 9F11.1 inhibiraju Ig sekreciju od strane humanih B-ćelija u načinu zavisnom od doze (FIG.5C). Klon 19E3.1 je bio u stanju da inhibira IgG proizvodnju kao odgovor na i humani i cino IL-21 za >99%, dok je IgG proizvodnja inhibirana 9F11.1 od strane humanog i cino IL-21 za 97% i 79% respektivno. Kumulativno, ovi podaci sugerišu da su opisani anti-IL-21 klonovi u stanju da značajno inhibiraju humanu diferencijaciju Plazma ćelija i Ig sekreciju prouzrokovanu egzogenim humanim i cino IL-21.

Tabela 5: IC50 vrednosti za anti-IL-21 antitela u testu diferencijacije plazma ćelija

4

Anti-IL-21 klonovi inhibiraju PC diferencijaciju prouzrokovanu aktiviranim CD4+ T-ćelijama

[0268] Anti-IL-21 klonovi su testirani na njihovu mogućnost da blokiraju diferencijaciju plazma ćelija prouzrokovanu aktiviranim CD4+ T-ćelijama u testu kokultivacije kao što je opisano u nastavku.

[0269] Humani PBMC-ovi su izolovani iz CPT epruveta (BD Biosciences) posle centrifugiranja. B-ćelije i CD4+ T-ćelije su negativno odabrane pomoću MACS reagenasa za ćelijsku separaciju (Miltenyi Biotec). Rutinska čistoća svih B-ćelija i CD4+ T-ćelija bila je >97%. CD4+ T-ćelije su mitomicin-C tretirane (30 µg/ml, Sigma Aldrich) tokom 30 minuta na 37°C zatim isprane i ostavljene u kompletnoj podlozi na 37°C tokom dodatnih 30 minuta.1.0 x 10<5>mitomicin-C tretiranih CD4+ T-ćelija i 0.5 x 10<5>prečišćenih B-ćelija (po bazenčiću) je kokultivisano u konačnoj zapremini od 200 µḯ sa anti-CD3/anti-CD28 perlama (5:1 odnos T-ćelija prema perlama). Podloga za kultivisanje za sve oglede bila je RPMI 1640 (Invitrogen) suplementirana 10% FCS-om, penicilin-streptomicinom (100 jedinica/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina), 2-merkaptoetanolom (55 µM), L-glutaminom (2 mM) i HEPES-om (5 mM). Anti-IL-21 antitela su dodata u kulture pri koncentraciji od 0-200 nM. Posle 7 dana kultivacije, plazma ćelije su kvantifikovane pomoću protočne citometrije. Ćelije su isprane (PBS/2% FBS) i obojene tokom 30 minuta na 4 stepena sa anti-IgD (FITC ili PE); anti-CD38 (alofikocijanin, klon HB7) (BD Pharmingen) i analizirane na LSRII protočnom citometru pomoću FACSDiva Softvera. Svi uslovi su prikupljeni za isto vreme, stoga se broj prikazanih događaja odražava na relativni broj ćelija. Međutim, ukupan broj ćelija određen je pomoću AccuCount Particles (Spherotech).

[0270] Kokultivacija B-ćelija sa aktiviranim CD4+ T-ćelijama rezultovala je u pojavljivanju IgD<->CD38<hi>PC populacije, sa 68.5% CD19+ ćelija koje eksprimiraju ovaj PC fenotip do dana 7 (FIG.6A). Dodavanje 19E3.1 ili 9F11.1 inhibiralo je PC diferencijaciju u načinu zavisnom od doza, a svaki je postigao maksimalnu inhibiciju od 80% i 78%, respektivno (FIG.6B i 6C). Ovi podaci sugerišu da anti-IL-21 klonovi mogu uveliko blokirati diferencijaciju plazma ćelija prouzrokovanu de novo IL-21 proizvodnjom od aktiviranih T-ćelija.

Anti IL-21 klon inhibira širenje naivnih CD4+ T-ćelija

[0271] Pokazalo se da IL-21 podržava proliferaciju CD4+ T-ćelija u suboptimalnim uslovima prajmovanja. Humane naivne CD4+ T-ćelije su prečišćene i stimulisane in vitro anti-CD3 i IL-21 u prisustvu ili odsustvu roditeljskog antitela 19E3.1. Proliferacija je procenjena merenjem akumulacije ATP-a posle četiri dana u kulturi. Kao što je prethodno prijavljeno, količina detektovanog ATP-a je direktno proporcionalna broju metabolički aktivnih ćelija u kulturi.19E3.1 je zatupio proliferaciju prouzrokovanu IL-21 (prosek IC50 = 61.02 pM za dva donora) u načinu zavisnom od doze. Ovi podaci pokazuju da K44VHa-N56Q (MEDI7169) roditeljsko antitelo 19E3.1 inhibira proliferaciju humanih naivnih CD4+ T-ćelija pokrenutu IL-21 (FIG.7).

Farmakokinetici

[0272] Farmakokinetici (PK) K44VHaN56Q, YTE antitelo, procenjeno je u tri ispitivanja koja su koristila majmune kao životinjski model, koje može predvideti humane PK sa razumnom preciznošću (Oitate et al, Drug Metab. Pharmacokinet.26 (4): 423-430 (2011)). Klirens je glavni PK parametar za predikciju humanog PK-a skaliranog od životinjskih podataka; manja CL vrednost sugeriše da molekul može ostati duže u telu. CL vrednosti za K44VHaN56Q u majmunima su u opsegu od 1.08 do 4.37 mL/d/kg. Tipična terapijska antitela poput Bevacizumaba (Avastin®), Daklizumaba (Zenapax®), Infliksimaba (Remicade®) i Rituksimaba (Rituxan®) povezana su sa odgovarajućim CL vrednostima poput 5.78, 5.30, 11.5 i 17.0 (mL/d/kg) (Dong et al, Clin Pharmacokinet.50(2): 131-142 (2011). Pretpostavlja se da je telesna masa majmuna bila 3 kg). Ove su CL vrednosti veće nego što su procenjene za K44VHaN56Q. Stoga se očekuje da K44VHaN56Q ostaje duže u telu od tipičnog terapijskog antitela.

Primer 4. Prevencija bolesti kalem protiv domaćina (GVHD) pomoću anti-IL-21 monoklonskih antitela

Ksenogeni mišji model GVHD-a

[0273] GVHD se razvija kada prebačene (donorske) T-ćelije opaze strane antigene predstavljene od strane MHC/HLA molekula domaćina (primaoca). Miševima koji nemaju NOD/SCID/IL-2 receptor γ (NSG) nedostaju zrele T i B-ćelije, funkcionalne NK ćelije i makrofagi. Ovi miševi prikazuju smanjenje u citokinskoj signalizaciji usled gubitka γc receptora.

[0274] U ksenogenom modelu GVHD-a, humani PMBC-ovi su prebačeni su u NSG mišje primaoce. Pošto su miševi imunokompromitovani, mišji imuni sistem ne odbija humane ćelije. Humane ćelije prepoznaju mišje okruženje kao strano i postaju aktivne i proliferativne. Aktivirane humane ćelije proizvode „citokinsku oluju”, koja vodi ozbiljnoj imunoreaktivnoj kaskadi, utičući na jetru, gastrointestinalni trakt i kožu, što naposletku rezultuje uginućem životinje. Veliki broj ćelija sposobnih za proizvodnju IL-21 može se izolovati iz krvi GVHD miševa.

[0275] U profilaktičkom ispitivanju korišćeno je trideset pet ženki NSG miševa (NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ; The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Miševi su bili stari 5-7 nedelja i težili 16.8-22.4 grama na početku ovog ispitivanja.

Izolacija humane periferne krvi

[0276] Humana krv uzeta je od dva zdrava donora u Cell Preparation Tubes (CPT) (Becton Dickinson, San Jose, CA) koje sadrže natrijumheparin. Mononuklearne ćelije su izolovane iz CPT epruveta prema uputstvima proizvođača. Ukratko, epruvete su centrifugirane na sobnoj temperaturi tokom 25 minuta pri 1700 x g. Posle centrifugiranja, mononuklearne ćelije su sakupljene. Ćelije su dvaput isprane u PBS-u centrifugiranjem tokom 10 minuta pri relativnoj centrifugalnoj sili od 400 x g. Ćelije su zatim prebrojane i ponovo suspendovane u odgovarajućoj količini PBS-a i održavane na sobnoj temperaturi do ubrizgavanja (odmah nakon završnog ispiranja).

Antitela

[0277] Humani IgGl κ-YTE (NIP-228-YTE; Medlmmune, Cambridge, UK) je korišćen kao Kontrolno mAb u ovom primeru. Kontrolno mAb je alikvotirano i zaleđeno kao štok rastvor na -80°C. Pufer za formulaciju bio je 25 mM histidina, 7% saharoze, 0.02% (w/v) polisorbata 80, pri pH 6.0. Dozirni rastvor pripremljen je razblaživanjem alikvota štok rastvora (60.6 mg/mL) fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom PBS do 1 mg/mL. Radni preparati skladišteni su na 4-8°C.

[0278] K44VHa-N56Q (MEDI7169) je skladišten na -80°C kao alikvotiran i zaleđen štok rastvor. Pufer za formulaciju bio je 25 mM histidina, 205 mM saharoze, 0.02% (w/v) polisorbata 80, pri pH 6.0. Dozirni rastvor pripremljen je razblaživanjem alikvota štok rastvora (47.6 mg/mL) sa PBS-om do 1 mg/mL. Radni preparati skladišteni su na 4-8°C.

Ubrizgavanje humanih ćelija, tretmani i procena GVHD-a

[0279] Doziranje je izvođeno kao što je prikazano u Tabeli 6. Ukratko, 12.71 x 10<6>prečišćenih humanih PBMC'-ova Donora 1 ili 13.46 x10<6>prečišćenih PBMC'-ova Donora 2 ubrizgano je IP u 5-7 nedelja stare ženke NSG miševa na Dan 0. Dve stotine mikrograma (u 200 µL zapremine) K44VHa-N56Q (MEDI7169), Kontrolnog mAb ili je podjednaka zapremina PBS-a (nosioc) sama davana IP, tri puta nedeljno počevši od Dana -1, pre ubrizgavanja humanih PBMC-ova.

Tabela 6. Određivanje grupa i nivoa doza u profilaktičkom ispitivanju

[0280] Telesna masa je individualno merena tokom ispitivanja, najmanje jednom nedeljno. Miševi su eutanizovani kada je određeno da su izgubili 20% telesne mase ili ukoliko je miš oslabio/bio na umoru ili na drugi način trpeo bol ili neprijatnost. Smrt i humana eutanazija se koriste kao sinonimi za potrebe praćenja preživljavanja.

Procena broja T-ćelija i fenotipa protočnom citometrijom

[0281] Miševima je krv uzimana iz retroorbitalnog sinusa u heparin mikrokontejnerske epruvete. U svim ogledima u svim vremenskim tačkama, korišćeno je 100 µL krvi. Faza lize crvenih krvnih zrnaca izvođena je pomoću ACK lizirajućeg pufera (Life Technologies, Grand Island, NY), preostale ćelije su inkubirane sa TruStain Fc blokerom (BioLegend, San Diego, CA), razblažene 1:4, tokom 10 minuta, zatim obojene tokom 30 minuta na 4°C sa sledećim koktelom antitela radi vizualizacije CD4 i CD8 T-ćelija: V500-konjugovani anti-humani CD45 (klon HI130; BioLegend, San Diego, CA), AF700-konjugovani anti-humani CD4 (klon RPA-T4; BioLegend, CA) i BV711-konjugovani anti-humani CD8 (klon RPA-T8; BioLegend, San Diego, CA). Uzorci su isprani, fiksirani u 2% paraformaldehidu i testirani u Becton Dickinson LSR II protočnom citometru pomoću FACSDiva softvera. Uzorci su analizirani pomoću FlowJo softvera (verzije 9). Humane ćelije su identifikovane onima koje eksprimiraju humani CD45 antigen. Obojena krv (100 µL) za sve uslove je sakupljena na LSRII u istoj zapremini, stoga se broj prikazani broj događaja odražava na relativni broj ćelija za različite tretmane.

Procena humanih citokina u serumu iz tretiranih miševa Multiplex ELISA-om

[0282] Uzorci longitudinalnog seruma sakupljeni su i analizirani pomoću humanog Thl7 multiplex kompleta (magnenta perla, prethodno mešan) (Merck Millipore, Billerica, MA) sa Luminex 200 analizatorom; praćena su uputstva proizvođača.

[0283] Korišćen je GraphPad Prism (verzija 6.0d za Mac OS X). Rezultati citokinskog seruma iz K44VHa-N56Q (MEDI7169) tretiranih miševa upoređeni su sa onima od miševa tretiranih Kontrolnim mAb (Donor 1) ili onima od miševa tretiranih Kontrolim mAb i PBS-om (nosilac) zajedno (Donor 2). Ovi podaci su analizirani pomoću neuparenih t-testova sa Velšovom korekcijom, osim ukoliko je utvrđeno da su varijacije značajno različite na F-testu i zatim se izvode Man Vitnijevi testovi. P < 0.05 za sve značajne razlike.

K44VHa-N56Q (MEDI7169) inhibira trošenje i širenje T-ćelija prouzrokovano ksenogenim GVHD-om

[0284] Prijavljeno je da IL-21 utiče na funkciju T-ćelija. Dakle, ispitivana je sposobnost K44VHa-N56Q (MEDI7169) da inhibira ksenogenu GVHD, koja je uveliko posredovana CD4+ T-ćelijama. Humani PBMC-ovi su ubrizgani imunokompromitovanim NSG miševima, kao što je gore opisano, a sušičasta bolest je primećena na Dan 21 kod miševa koji su primili Kontrolno mAb (humano IgGl mAb) (FIG.8A) ili PBS Nosioc. Miševi koji su primali 200 µg K44VHa-N56Q (MEDI7169) tri puta nedeljno počevši na Dan -1 delovali su zdravo (FIG.8B) i nisu se moguli razlikovati od kontrolnih miševa koji nisu primili humane ćelije. Analiza krvi pokazala je da su se u miševima koji su primili Kontrolno mAb (ili PBS), humane CD45+ ćelije raširile (FIG.8C). Poređenja radi, miševi koji su primili K44VHa-N56Q (MEDI7169) imali su značajno smanjen broj humanih CD45+ ćelija prisutnih u krvi (FIG.8D). U miševima tretiranim Kontrolnim mAb (i PBS-om), ovo širenje humanih CD45+ ćelija sastojalo se većinom od CD4 pozitivnih ćelija (FIG.8E), dok je procenat CD4 pozitivnih ćelija bio značajno smanjen u miševima tretiranim K44VHa-N56Q (MEDI7169), kao što je zabeleženo na Dan 35 (FIG.8F). Ovi rezultati su u skladu sa K44VHa-N56Q (MEDI7169) inhibicijom širenja humanih CD4+ T-ćelija posle transplantacije humanih PBMC-ova u imunokompromitovane miševe.

[0285] Kada su tokom vremena miševi praćeni, pronađeno je da životinje koje su primile PBS nosilac ili Kontrolno mAb imaju stabilan rast u broju humanih CD45+ ćelija. Međutim, ove se ćelije nisu širile u miševima koji su primili K44VHa-N56Q (MEDI7169) (FIG.9). Ono što je važno, otprilike 3 nedelje posle prekida davanja K44VHa-N56Q (MEDI7169), pronađeno je da su humane CD45+ ćelije započele širenje, koje je ponovo opalo po nastavku tretmana (FIG.9). Ovi podaci prikazuju da K44VHa-N56Q (MEDI7169) može značajno inhibirati širenje T-ćelija, što je reverzibilno po prekidu davanja.

K44VHa-N56Q (MEDI7169) sprečava gubitak mase i smrt prouzrokovanu GVHD-om

[0286] Gubitak telesne mase i preživljavanje praćeni su kod miševa koji ili nisu primili humane ćelije (naivni) ili su primili humane PBMC-ove sa PBS nosiocem, Kontrolno mAb ili K44VHa-N56Q (MEDI7169) počevši jednog dana (Dan -1) pre nego što su miševi primili humane PBMC-ove. Pronađeno je da su miševi koji su primili PBS ili Kontrolno mAb brzo gubili masu (FIG.10A) i ili su uginuli ili su bili eutanizovani kada je telesna masa opala za 20%. Svi miševi (n=16) kojima je ubrizgavan PBS ili Kontrolno mAb u dva zasebna ispitivanja su ili uginuli ili bili eutanizovani do dana 37 ispitivanja po primanju humanih PBMC-ova (FIG.10B). Suprotno tome, svi miševi (n=10) koji su primili K44VHa-N56Q (MEDI7169) preživeli su i ostali zdravi dok nije prekinuto davanje K44VHa-N56Q (MEDI7169) (FIG. 10B). U jednom ogledu, miševi su ostali zdravi otprilike 20 dana posle prekida davanja K44VHa-N56Q (MEDI7169), a zatim brzo opali i uginuli ili su bili eutanizovani ubrzo nakon Dana 31 ispitivanja (FIG. 10B). U zasebnom ispitivanju koje koristi humane PBMC-ove drugog donora, miševi su ostali vijabilni otprilike 40 dana pošto je K44VHa-N56Q (MEDI7169) prekinut. Ovi podaci pokazuju da K44VHa-N56Q (MEDI7169) štiti protiv letalnosti, što je reverzibilno kada se prekine davanje.

K44VHa-N56Q (MEDI7169) inhibira proizvodnju nekoliko citokina i reverzibilan je

[0287] Serumi iz miševa kojima su ubrizgane ćelije Donora 2 (FIG.11) ili Donora 1 (FIG.12), prikupljeni su u različitim vremenskim tačkama i analizirani na ekspresiju 25 citokina pomoću Millipore's MILLIPLEX MAP sistema. Više od polovine ispitanih citokina bili su ispod nivoa detekcije. Kod citokina koji su se mogli detektovati, K44VHa-N56Q (MEDI7169) je prouzrokovao značajno smanjenje u GM-CSF, IL-10 i TNF u dva zasebna ogleda. U jednom ogledu IFNy je značajno smanjen, a u drugom ogledu je opadajuć. Pronađeno je da su IL-17A i IL-9 značajno smanjeni u jednom od dva ogleda. U oba ogleda, pronađeno je da je IL-5 značajno uvećan (FIG.11). Kompletna krvna slika (CBC) izvedena je pomoću Sysmex XT-2000iv hematološkog analizatora, i što je važno, porast eozinofila nije primećen kod miševa sa povećanim IL-5. Pronađeno je da je IL-21 bio povećan u oba ogleda. Povećanje IL-21 je u skladu sa onim dobijenim u ispitivanju toksičnosti kod makaki rakojeda u kojima je povećani IL-21 bio odraz količine leka koji cirkuliše, koji se vezivao za i neutralizovao citokin.

[0288] Kao što je prikazano na FIG.9, K44VHa-N56Q (MEDI7169) je inhibirao širenje CD4+ T-ćelija, što je reverzibilno kada se prekine davanje leka. Ovo je potvrđeno u drugom ispitivanju (FIG.12). Važno je istaći da je posle širenja ćelija, nekoliko citokina takođe uvećalo, uključujući TNF, IFNy i IL-10 (FIG.

12). Ovi podaci pokazuju da i anti-IL-21 antitelo, to jest, K44VHa-N56Q (MEDI7169) inhibira ekspanziju T-ćelija i proizvodnju citokina, koje su obe reverzibilne kada K44VHa-N56Q (MEDI7169) prestane.

Primer 5. Tretiranje bolesti kalem protiv domaćina (GVHD) pomoću anti-IL-21 monoklonskih antitela

Dizajn ogleda

[0289] Dvadeset ženki NSG miševa (NOD.Cg-Prkdcscid I12rgtmlWjl/SzJ; The Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) korišćeno je u terapijskom ispitivanju. Miševi su bili 8 nedelja stari i težili su 18.0-22.3 grama na početku ispitivanja.

[0290] Humana krv je prikupljena i pripremljena kako je opisano u Primeru 4.

[0291] Kontrolni i ispitni mAb-ovi su dobijeni, obrađeni i skladišteni kao što je opisano u Primeru 4.

[0292] Doziranje je izvedeno kao što je prikazano na Tabeli 7. Ukratko, 12 x 10<6>prečišćeni PBMC'-ovi Donora 1 ubrizgani su IP u 8 nedelja stare ženke NSG miševa na Dan 0. Dve stotine mikrograma (u 200 µL zapremine) K44VHa-N56Q (MEDI7169) ili kontrolno mAb ubrizgavani su IP tri puta nedeljno počevši na Dan 7. Drugoj grupi je ubrizgavan K44VHa-N56Q (MEDI7169) (200 µg u 200 µL) IP tri puta nedeljno počevši na Dan 14.

Tabela 7. Određivanje grupe i nivoa doza u terapijskom ispitivanju

1

[0293] Procena GVHD-a, broja T-ćelija T i fenotipa, i humanih citokina u serumu izvedena je kao što je gore opisano u Primeru 4.

Automatizovana procena kompletne krvne slike

[0294] Sysmex XT-2000iv automatizovan hematološki analizator (Sysmex America, Mundelein, IL) korišćen je u proceni ukupnog borja belih krvnih zrnaca, kao i crvenih krvnih zrnaca, vrednosti hematokrita i hemoglobina. Na Dane 7, 14 i 21, miševima je uzimana krv iz retroorbitalnog sinusa u heparin mikrokontejnerske epruvete. Izvođeno je 1:10 razblaživanje (20 µL od svakog celog uzorka krvi razblaženo je u 180 µL PBS-a), pri čemu su uzorci pri ulasku u analizator i rezultujući podaci podeljeni faktorom razblaživanja od deset.

Terapijsko tretiranje sa K44VHa-N56Q (MEDI7169) štiti miševe od GVHD-a

[0295] Kako bi se odredilo da li K44VHa-N56Q (MEDI7169) koji je dat terapijski ima mogućnost da zaštiti miševe od GVHD-a, pri čemu su humani PBMC'-ovi ubrizgavani kao što je gore opisano i K44VHa-N56Q (MEDI7169) se davao ili posle 7 ili 14 dana posle ubrizgavanja humanih ćelija. Kao što je prikazano na FIG.13, miševi koji su primili Kontrolno mAb počeli su da umiru u roku od dve nedelje po primanju humanih ćelija, a svi su uginuli do Dana 26. Miševi koji su primili K44VHa-N56Q (MEDI7169) na Dan 7 bili su potpuno zaštićeni od smrti prouzrokovane GVHD-om. Miševi koji su primili K44VHa-N56Q (MEDI7169) na Dan 14 (pošto su kontrolni miševi počeli da umiru) bili su delimično zaštićeni; 2 od 5 miševa iz grupe Dan 14 preživeli su Dan 26, kada su svi kontrolni miševi uginuli. Miševi koji su primili humane ćelije i Kontrolno mAb na Dan 7 razvili su ozbiljnu anemiju prouzrokovanu GVHD-om. Miševi koji su primili K44VHa-N56Q (MEDI7169) počevši na Dan 7 su bili u mogućnosti da održe više normalnih crvenih krvnih zrnaca, vrednosti hematokrita i hemoglobina, koje su bile bliže onima od naivnih životinja nego onima koje nisu primile ćelije (FIG.14).

[0296] Ovi podaci pokazuju da je anti-IL-21 antitelo, to jest, K44VHa-N56Q, štitilo miševe od GVHD-a smanjivanjem ili eliminisanjem simptoma povezanih sa bolešću.

2

4

1

2

�

1

2

4

1

11

12

1

14

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovano antitelo ili njegov antigen vezujući fragment koji se specifično vezuje za IL-21 koji obuhvata varijabilni region (VH) teškog lanca i varijabilni region (VL) lakog lanca, pri čemu

(a) VH obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 19; i

(b) VL obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 21.

2. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema zahtevu 1, koji dalje obuhvata konstantni region teškog lanca, pri čemu konstantni region teškog lanca predstavlja IgG konstantni domen.

3. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema zahtevu 2, pri čemu IgG konstantni domen obuhvata jednu ili više aminokiselinskih supstitucija u odnosu na IgG konstantni domen divljeg tipa, i ima uvećano poluvreme eliminacije u poređenju sa poluvremenom eliminacije IgG koji ima IgG konstantni domen divljeg tipa.

4. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema zahtevu 2 ili 3, pri čemu IgG konstantni domen predstavlja humani IgG1 konstantni domen.

5. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-4, pri čemu teški lanac obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 20 ili SEQ ID NO: 24; ili

pri čemu laki lanac sadrži humani kapa konstantni region i obuhvata aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22 ili SEQ ID NO: 26; ili

6. Antitelo prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu to antitelo predstavlja humanizovano antitelo, himerno antitelo, monoklonsko antitelo ili rekombinantno antitelo.

7. Antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-6, pri čemu taj antigen vezujući fragment predstavlja Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv i sc(Fv)2.

8. Antitelo ili antigen vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-7, pri čemu se antitelo ili antigen vezujući fragment konjuguje u agens odabran iz grupe koju čine antimikrobni agens, terapijski agens, prolek, peptid, protein, enzim, lipid, modifikator biološkog odgovora, farmaceutski agens, limfokin, heterologno antitelo ili njegov fragment, oznaka koja se može detektovati, polietilenglikol (PEG) i bilo koja njihova kombinacija.

9. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1-8, i opciono jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, ili razblaživač.

10. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili kompozicija prema zahtevu 9 za upotrebu u lečenju ili prevenciji autoimune bolesti ili poremećaja kod subjekta, pri čemu autoimuna bolest predstavlja Šergenov sindrom (SS), vaskulitis povezan sa ANCA-om (AAV), vaskulitis tipa arteritis džinovskih ćelija (GCA), sistemski eritemski lupus, lupus nefritis, reumatoidni artritis (RA), Kronovu bolest, mijasteniju gravis, vulgarni pemfigus, idiopatsku trombocitopeničnu purpuru (ITP), dijabetes tipa I, bolest povezanu sa IgG4-om, ili bilo koju njihovu kombinaciju.

11. Antitelo ili antigen-vezujući fragment ili kompozicija za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu autoimuna bolest predstavlja sistemski eritemski lupus.

12. Postupak za detektovanje nivoa ekspresije IL-21 u uzorku koji obuhvata (a) dovođenje u kontakt pomenutog uzorka sa antitelom ili antigen-vezujućim fragmentom prema bilo kom od zahteva 1 do 8; i (b) detektovanje vezivanja za IL-21 u pomenutom uzorku.

13. Antitelo ili antigen-vezujući fragment prema bilo kom od zahteva 1 do 8 ili kompozicija prema zahtevu 9 za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti kalem protiv domaćina kod subjekta.

1